MXPA98001277A - Ente artificial de acidos nucleicos para la expresion de genes estructurales regulada por el ciclo celular - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un ente artificial o constructo deácidos nucleicos que comprende al menos una secuencia activadora, al menos un módulo promotor quimérico, que comprende una secuencia de nucleótidos que se une a una proteína de la familia E2F y a una proteína de la familia CDF-1, y al menos un gen estructural, en el que dicho módulo promotor quimérico produce una regulación"up"de la expresión génica en el ciclo celular más tarde que el promotor B-myb pero antes que el promotor de cdc25C, y la proteína CDF-1.

Description

Ente artificial de ácidos nucleicos para la expresidn de genes estructurales regulada por el ciclo celular.

La invención se refiere a un ente' artificial de ácidos nucleicos que comprende al menos una secuencia activadora, al menos un módulo promotor que comprende una secuencia de nucleótidos que se une a una proteína de la familia E2F y a una proteína de la familia CDF-1, y al menos un gen estructural . Uno de los factores implicados en la represión regulada por el ciclo celular es el E2F, que puede formar complejos de represores de unión de DNA a través de su interacción con proteínas "pocket" o "bolsillo", tales como pRb ( eintraub et al., Nature 358, 259 (1992); Helin y Harlow, Trends Cell Biol. 3, 43 (1993); Zamanian y La Thangue, Mol. Biol. Cell. 4, 389 (1993) ) . El E2F es un factor de transcripción heterodímero compuesto por miembros de las familias multi-genes E2F y DP (Ne-vins, Science 258, 424 (1992); Müller, Trends Genet. 11, 173 (1995); La Thangue, Transactions 24, 54 (1996)). Otro factor de transcripción perteneciente a la familia de genes E2F es, p. ej . , E2F-5 (WO 96/25494). La activación de la transcripción por E2F es modulada durante el ciclo celular por proteínas "pocket" de la familia pRb. El E2F es reprimido en G0 y G-, temprano, pero durante la progresión del ciclo celular tanto el resto DP/E2F como las proteínas "pocket" asociadas son hiperfosforiladas por quinasas dependientes de ciclina específica de Gx que conducen a la disociación del complejo ternario inhibidor (DeCaprio et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89, 1795 (1992); Fagan et al., Cell 78, 799 (1994); Hatakeyama et al., Genes Dev. 8, 1759 (1994); Weinberg, Cell 81, 323 (1995) ) . Esta disociación genera "E2F libre" trans-cripcionalmente activo y conduce a la activación de genes regulados por E2F. Por consiguiente, p. ej . un vector que co -prende un ácido nucleico que codifica un regulador E2F y/o regulador ElA, ha sido ya usado para transfectar una neurona diferenciada que induce la síntesis de DNA (WO 95/16774) . Entre los promotores controlados por la represión de la transcripción por E2FBSs, están E2F-1, orc-1 y B-myb (Lam y Watson, EMBO J. 12, 2705 (1993); Hsiao et al., Genes Dev. 8424, 1526 (1994); Johnson et al., Genes Dev. 8424, 1514 (1994); Ohtani et al., Mol. Cell. Biol. 16, 6977 (1996)). El papel de E2F, sin embargo, no es exclusivamente activador. Esto ha sido demostrado por primera vez para el gen B-myb de ratón (Lam y Watson, EMBO J. 12, 2705 (1993); Lam et al., EMBO J. 13, 871 (1994); Lam et al., Gene 160, 277 (1995); Zwicker et al., Science 271, 1595 (1996)). La utación del sitio de unión de E2F (E2FBS) en el promotor B-myb conduce a una actividad drásticamente aumentada selectivamente en G0 y en consecuencia a una pérdida de regulación del ciclo celu-lar. Otros ejemplos en este contexto son los promotores E2F, pl07, histona H2A y orcl, en los que mutaciones de E2FBSs anulan también la represión y la regulación del ciclo celular (Hsiao et al., Genes Dev. 8424, 1526 (1994); Johnson et al., Genes Dev. 8424, 1514 (1994); Zhu et al., Mol. Cell. Biol 15, 3552 (1995); Ohtani et al., Mol. Cell. Biol. 16, 6977 (1996); Oswald et al., Mol. Cell. Biol. 16, 1889 (1996)). La identificación de varios genes que son reprimidos por E2FBSs sugiere que la represión de la trancripción mediada por E2F es un mecanismo frecuente de la transcrición regulada por el ciclo celular. Sin embargo, el mecanismo de represión del gen B-myb se aparta de todos los modelos propuestos para la acción de E2F en que requiere un segundo elemento situado directamente aguas abajo del E2FBS (Bennet et al., Oncogene 13, 1073 (1996); Zwicker et al., Science 271, 1595 (1996)).

Además, la ocupación en la célula del E2FBS de B-myb está regulada por el ciclo celular y se observa solamente durante fases de represión (Zwicker et al., Science 271, 1595 (1996) ) . Estas observaciones son muy similares a las realiza-das con otros promotores, tales como cdc25C, cdc2 y cycl±n A, que son periódicamente reprimidos por dos elementos coopera-dores, el CDE similar a E2FBS y el CHR adyacente (Zwicker et al., EMBO J. 14, 4514 (1995)). El mecanismo de transcripción regulada por el ciclo celular fue descubierto a través del análisis de genes que son expresados en estadios tardíos del ciclo celular. Cuando se estudió el promotor cdc25C, que es regulado "up" en S/G2 tardío, mediante análisis mutacional y de hollado in vivo, fue identificado un nuevo elemento represor, el "elemento dependiente, del ciclo celular" (CDE) (Lucibello et al., EMBO J- 14, 132 (1995)) . El CDE es ocupado en GQ-G-¡_ y su ocupación se pierde en G2, cuando se expresa cdc25C. Esa represión mediada por CDE desempeña un papel en la regulación de otros promotores como se demostró por la presencia de CDEs funcionales en los promotores cyclin A y cdc2 que son desreprimidos en G./S tardío (Zwicker et al., EMBO J. 14, 4514 (1995) ) . Estos estudios llevaron también al descubrimiento de un elemento adicional contiguo al CDE, que es idéntico en los tres promotores. Este elemento se denominó "región de homología de genes del ciclo celular" (CHR) (Zwicker et al., EMBO J. 14, 4514 (1995)). La mutación del CDE o bien del CHR en el promotor cdc25C, cdc2 o cyclin A anula en gran medida la represión en G2. Estos datos funcionales se vieron apoyados por la demostración de la unión de proteína específica de G0-G;. al CDE y al CHR en el hollado genómico. Es interesante que el CDE se pone en contacto en la hendidura mayor del DNA mientras que la unión al CHR ocurre en la hendidura menor (Zwicker et al. , EMBO J. 14, 4514 (1995)). La secuencia de nucleótidos del CDE-CHR y su uso para diagnóstico, cribado y terapia génica, ha sido ya reivindicado en el documento WO 96/06943. El descubrimiento de que el CHR coopera con un CDE en la represión de promotores y la identificación de secuencias similares a CHR adyacentes al E2FBS en el promotor B-i77y-b, inspiró investigaciones detalladas en el mecanismo de la represión de B-myb. Estos estudios indicaron que la región similar a CHR es indispensable para la represión y actúa como elemento co-represor junto con el E2FBS (Bennett et al., Oncogene 13, 1073 (1996)) . Esta región ha sido llamada Bmyb-CHR (Bennett et al., Oncogene 13, 1073 (1996)) o DRS (Bennett et al., Oncogene 13, 1073 (1996)). Además, el hollado genómico indicó claramente una pérdida de ocupación del sitio E2F que es paralela a la desrepresión de B-myb en G. media (Zwicker et al., Science 271, 1595 (1996)) . Estas observaciones indicaron que los sitios E2F-CHR regulan la transcripción de genes inducida en G1 tardío, de manera similar a como los sitios CDE-CHR conducen a la desrepresión de genes en S o G2. Además, estos hallazgos indican que los sitios de represión de E2F difieren de los sitios de activación de E2F por la ausencia de un elemento co-represor CHR contiguo. Tomadas juntas, tanto la represión mediada por E2F como por CDE, que actúan en diferentes estadios en el ciclo celular, dependen de elementos CHR específicos del promotor (Liu, N. et al., Nucleic Acids Res. 24, 2905, n° 15 (1996) ) . El CDE es idéntico a las secuencias núcleo de E2FBS, ta-les como en el promotor B-myb (GGCGG) (Zwicker et al., EMBO J. 14, 4514 (1995)), pero sigue escapándose qué es lo que determina la distinción de un E2FBS de un CDE. Además, hasta ahora no se han identificado actividades de unión de CDE o CDE-CHR, y no está clara la relación del factor o los fac-tores de unión de CDE a la familia E2F de factores de transcripción. Ambos módulos represores reprimen secuencias de activación situadas aguas arriba de E2FBS-Bymb-CHR o CDE-CHR. El elemento Bmyb-CHR inhibe una secuencia activadora aguas arri-ba en la fase temprana (fase G0 a Gx media) , el CDE-CHR hasta una fase tardía (fase G0 a S) del ciclo celular. Este hallazgo condujo a la construcción de genes que contienen una secuencia activadora no específica de la célula, específica de la célula, específica del virus y/o específica metabólica, un módulo promotor específico del ciclo celular como CDE-CHR o E2FBS-Bmyb-CHR que controla la activación de la secuencia activadora, y un gen estructural que codifica una proteína terapéutica. Tales entes artificiales génicos han sido reivindicados para terapia génica de varias enfermedades (véanse p. ej . los documentos WO 96/06943, D196.05274.2, D196.17851.7, WO 96/ 06940, WO 96/06938, WO 96/06941 y WO 96/06939) . Un objetivo de la presente invención fue encontrar nuevos entes artificiales de ácidos nucleicos con una diferente expresión génica dependiente del ciclo celular. Sorprendentemente se ha encontrado que los factores que intervienen en la represión de B-myb y los promotores regulados CDE-CHR son diferentes. Se demuestra que el gen B-myb es reprimido por complejos E2F junto con un factor de unión de CHR, mientras que el promotor cdc25C es reprimido por una nueva actividad identificada en la presente invención y denominada factor- l de unión de CDE-CHR (CDF-1) . Subsiguientemente, se analizó la interacción de CDF-1 con los elementos represores en varios genes regulados por el ciclo celular. Usando hollado de DMS in vivo e in vitro, EMSA y ensayos funcionales de entes artificiales de luciferasa promotores, fue posible identificar la siguiente actividad de CDF-1: (a) CDF-1 interacciona de forma cooperadora con el CDE y el CHR en el promotor cdc25C, que está de acuerdo con la ocupación del CDE dependiente de CHR observada en la célula. (b) CDF-l interacciona con restos G en el CDE (hendidura mayor) y con restos A en el CHR (hendidura menor) . Este patrón de protección es idéntico al encontrado mediante hollado in vivo (Zwicker et al., EMBO J. 14, 4514 (1995)). (c) La unión de CDF-1 a secuencias que contienen motivos CDE o CHR imitados se correlaciona con precisión con la función de tales elementos mutados en la represión regulada por el ciclo celular. (d) CDF-1 se une con eficacia similar a todos los promotores regulados por CDE-CHR conocidos, es decir, cdc2?C, cdc2 y cyclin A, pero solo lo hace débilmente con B-myb. (e) Pudo demostrarse que CDF-1 se une a promotores que contienen CDE-CHR de los genes cdc25C, cdc2 y cyclin A con afinidad igualmente elevada, mientras que la interacción con el módulo E2FBS-CHR del promotor B-myb era comparativamente débil . (f) E2F no puede mediar la represión a través del elemento CDE-CHR de cdc25C y, viceversa, CDF-1 es incapaz de me- diar la represión a través del E2FBS-Bmyb-CHR.

La proteína CDF-l puede ser aislada de extractos nucleares de cultivos en suspensión de HeLa por extracción con elevado contenido salino y purificación mediante cromatografía de afinidad, en presencia de motivos de la secuencia de CDE-CHR. Por ello, una primera realización de la presente invención concierne a la proteína CDF-l obtenible mediante los pasos siguientes : (a) preparar un extracto nuclear de células HeLa, y (b) purificar el extracto de la etapa (a) mediante cromatografía de afinidad en presencia de un oligonucleótido que contiene un motivo de la secuencia de CDE-CHR, en particular en presencia de un motivo que contiene la secuencia GGCTG GCGGA AGGTT TGAAT, y en particular en presencia de un motivo que contiene la secuencia GGCTG GCGGA AGGTT TGAAT GGCTG GCGGA AGGTT TGAAT.

En una realización particularmente preferida, el oligonucleótido que contiene el motivo de la secuencia de CDE-CHR está acoplado con agarosa, p. ej . a través de estreptavidina. En general, el extracto nuclear de acuerdo con la etapa (a) se prepara mediante extración salina de células HeLa, en particular mediante extracción con elevada concentración salina, p. ej . de acuerdo con Dignam, J.D. (1983) Nucleic Acids Res., 11, 1475-1489. La proteína CDF-1 puede ser eluida de la columna de cromatografía mediante aumento por etapas de la concentración de sal, p. ej . aumentando la concentración de KCl hasta 1 M. La proteína CDF-l es útil en particular para la identificación de inhibidores o estimuladores de CDF-l, en particular de la función represora de CDF-1. Otro resultado del aislamiento y caracterización funcional de CDF-l fue la identificación de nucleótidos que son esenciales para la unión y la función represora de E2F/DP y CDF-l. En general, la unión era dependiente de la presencia de versiones intactas del -CDE y CHR. La secuencia consenso del CDE pudo definirse como G/CGC/TGG/C (GGCGG en cdc25C; (Zwic-kler et al., EMBO J. 14, 4514 (1995)) y la secuencia de CHR de cdc25C como la secuencia TTTGAA. A diferencia de los nucleótidos en esta región, los nucleótidos entre el CDE y el CHR (AAGG, véanse las Tablas 1, 2) y los nucleótidos aguas abajo a partir del CHR (TGG, véanse las Tablas 1, 2) pueden ser alterados sin efectos detectables sobre la función represora. Un patrón similar de interacción específico del sitio de unión fue observado con CDF-1 parcialmente purificado. Los nucleótidos en el E2FBS de B-myb y el CDE de cdc25C que son responsables de la discriminación entre la unión de E2F y CDF-l son los nucleótidos directamente adyacentes al núcleo de E2FBS/CDE (GGCGG) . Así, los dos nucleótidos aguas arriba (CT én B-myb) y un nucleótido aguas abajo (G en B--y-) generalmente causan la unión de E2F, pero no la unión de CDF-1. Basándose en este hallazgo, fue posible ensayar la función de un promotor B-myb mutante con una unión de E2F intensamente reducida pero con interacción normal con CDF-l, y demostrar que la represión de este ente artificial está menoscabada. Este dato indica que la interacción con E2F es en general esencial, y que la unión de CDF-1 es insuficiente para conferir cualquier regulación del ciclo celular en el promotor B- myb. La situación es muy diferente para el promotor cdc25C reprimido con CDE-CHR. En este caso, no se observa unión de E2F, y la intensa interacción con CDF-l depende generalmente del CHR. Así, el sitio de unión de E2F es mayor (es decir, al menos 9 nucleótidos) que el CDE de 5 nucleótidos (Zwickler et al., EMBO J. 14, 4514 (1995)), pero no incluye el CHR, mientras que el sitio de unión de CDF-1 consiste en el CDE de 5 nucleótidos y el CHR de 6 nucleótidos contiguo. Por tanto, fue posible crear promotores que poseen la capacidad de interaccionar tanto con E2F como con CDF-l con elevada eficacia, bien sea cambiando el Bmyb-CHR a un cdc25C CHR (B-C4 véase la tabla 2) o bien cambiando los nucleótidos flanqueantes de CDE de cdc25C a sus contrapartidas de B-myb (véase la tabla 2, C-Bl,2) . Es interesante que estos promotores mostraron nuevas propiedades con respecto a la temporización de la desrepresión durante el ciclo celular, en que se observó una actividad mitad de la máxima más tarde que con B-myb pero antes que con cdc25C, es decir, en la fase S media temprana. Estas observaciones indican que la unión diferencial de E2F y CDF-l contribuye a la temporización de la regulación. En concordancia con esta oservación, se encontró que un mutante del promotor B-myb que muestra unión preferencial e intensa de CDF-1 (véase la tabla 2, B-C1,3,4) muestra cinética de expresión similar a cdc25C. Por consiguiente, otra realización de la presente invención es un ente artificial de ácidos nucleicos que comprende: a) al menos una secuencia activadora, b) al menos un módulo promotor quimérico que comprende una secuencia de nucleótidos que se une a una proteína de la familia de E2F y a una proteína de la familia de CDF-l; y c) al menos un gen estructural. en el que dicho módulo promotor quimérico produce una regula-ción " up" de la expresión génica en el ciclo celular más tarde que el promotor B-myb pero antes que el promotor cdc25C. En una realización preferida, la secuencia activadora está localizada aguas arriba del módulo promotor quimérico.

Se ha encontrado que el módulo promotor E2FBS-Bmyb-CHR del gen B-myb (se subrayan las posiciones de las mutaciones) ACTTGGCGGGAGATAGGAAA (Zwicker et al., Science 271:1595 (1996)) mutado a ACTTGGCGGGAGATTTGAAT (ID. SEC. NO.: 1) com-prende un E2F de alta afinidad, así como un sitio de unión de CDF-l. La unión de E2F así como la de CDF-1 a esta secuencia de nucleótidos in vivo (dentro de la célula) está confinada a las fases G0 y G-, y es indetectable en la fase S, G2 y M, y el nucleótido de ID. SEC. NO. : 1 es muy capaz de reprimir en la fase G0 y G. del ciclo celular la actividad de una secuencia activadora (situada aguas arriba de la ID. SEC. NO. : 1) paira activar la transcripción de un gen estructural (situado aguas abajo de ID. SEC. NO.: 1). También se ha encontrado que el módulo promotor CDE-CHR del gen cdc25C (se subrayan las posiciones de las mutasiones) GGCTGGCGGAAGGTTTGAAT (EMBO J. 14, 4514 (1995)) mutado a GCTTGGCGGGAGGTTTGAAT (ID. SEC. NO.: 2) comprende un CDF-1 de alta afinidad así como un sitio de unión de E2F. La unión de CDF-l así como la de E2F a esta secuencia de nucleótidos in vivo (dentro de la célula) está confinada a las fases G0 y Gx y es indetectable en la fase S, G y M y la ID. SEC. NO. : 2 es muy capaz de reprimir, en la fase G0 y Gx del ciclo celular, la actividad de una secuencia activadora (situada aguas arriba de la SEC. ID. NO. : 2) para activar la transcripción de un gen estructural (situado aguas abajo de SEC. ID. NO. : 2) . Por consiguiente, una realización preferida de la presente invención se refiere a un ente artificial de ácidos nucleicos con un módulo promotor quimérico que comprende al menos una secuencia de nucleótidos que se elige entre el grupo formado por ACTTGGCGGGAGATTTGAAT (ID. SEC. NP. : 1) y ACTTGGCGGGAGGTTTGAAT (ID. SEC. NP . : 2) . En general, el módulo promotor interacciona con la secuencia activadora, y dicha interacción afecta a la expresión del gen estructural. El activador funciona generalmente por medio de una activación no específica, específica de la célula, específica del virus y/o específica metabólica, de la transcripción basal. El gen estructural se expresa generalmente de manera específica del ciclo celular, específica de la célula y depen-diente del ciclo celular, específica del virus y dependiente del ciclo celular y/o específica metabólica y dependiente del ciclo celular. El ente artificial de ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención consiste preferentemente en DNA. La expre-sión "ente artificial de ácidos nucleicos", como se usa en el presente texto, significa una estructura artificial de ácidos nucleicos que puede ser transcrita en las células diana. Tal ente artificial puede ser insertado en un vector. Pueden usarse vectores no virales, tales como vectores de plásmido, o vectores virales. El tipo de vectores y la técnica de inserción del ente artificial de ácidos nucleicos según esta invención son conocidos por el experto. Un ente artificial de ácidos nucleicos según la invención no se presenta en la naturaleza en la disposición descrita por la presente inven-ción. En otras palabras, el gen estructural del ente artificial de ácidos nucleicos no se combina de forma natural con la secuencia activadora y el módulo promotor quimérico. Otra realización de la presente invención se refiere a una célula que comprende un ente artificial de ácidos nuclei-eos o un vector de la presente invención. Un ente artificial de ácidos nucleicos según la invención hace posible que un gen estructural experimente expresión específica del ciclo celular o expresión específica de la célula y del ciclo celular, o específica del virus y del ciclo celular, o específica metabólica y del ciclo celular. En una realización preferida, el gen estructural es un gen que codifica una sustancia farmacológicamente activa. En otra realización preferida, el gen estructural codifica una enzima que segmenta un precursor inactivo de un producto farmacéutico dando un producto farmacéutico ("profármaco" en fármaco) . Ejemplos de tal precursor farmacéutico de productos farmacéuticos se describen en Sedlacek et al., Contrib. to Oncol. 43, Karger Verlag (1992) ; Hay et al., Drugs of the Future 21, 917 (1996) . La "secuencia activadora" significa una secuencia de nu-cleótidos que es parte de un gen y a la cual pueden unirse proteínas reguladoras, llamadas factores de transcripción, y, como resultado de esa unión, activan la transcripción del gen estructural que está situado aguas abajo. Las regiones denominadas como secuencias "aguas abajo" son las situadas en la dirección de la trancripción, mientras que las secuencias dispuestas en la dirección opuesta se denominan secuencias "aguas arriba". En una realización de la presente invención, la secuencia activadora puede ser no específica, específica de la cé-lula o específica del virus o específica metabólica. Como se usa en la presente memoria, "específica de la célula" significa que la secuencia activadora se elige entre un gen que codifica una proteína que se expresa específicamente en una célula dada, y "específica del virus" significa que la se-cuencia activadora se elige entre un gen viral; específica metabólica significa que la secuencia activadora se elige entre un gen que codifica una proteína que se expresa específicamente bajo unas condiciones metabólicas definidas. Así, en otra realización preferida, la secuencia activadora se elige entre el grupo de promotores o intensificadores que activan la transcripción en células endotélicas, células se-rosales, células de la musculatura lisa, células sinoviales, células hematopoyéticas, macrófagos, linfocitos, células leucémicas, células tumorales o células queratinocitos, célu-las gliales, o de secuencias promotoras o secuencias intensi-ficadoras de los virus HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV, CMV, SV40 O HIV. Ejemplos de secuencias activadoras específicas de la célula, específicas del virus y específicas metabólicas se describen en los documentos WO 96/06940, WO 96/06938, WO 96/ 06941 y WO 96/05994. La secuencia activadora puede ser un promotor o un intensificador. El módulo promotor quimérico según esta invención comprende un sitio de unión para una proteína de la familia E2F así como CDF-l. Ejemplos para tales módulos promotores son ID. SEC. NO.: 1 y ID. SEC. NO.: 2. En una realización preferida de esta invención, este módulo promotor quimérico está situado aguas abajo de la secuencia activadora. En otra realización preferida de esta invención, el módulo promotor puede ser combinado con la secuencia activa-dora de acuerdo con la tecnología descrita en el documento D196.17851.7. En esta solicitud de patente se describen varios ejemplos para combinar varios promotores. Un ejemplo es la unidad promotora de respuesta al activador. Consiste en dos subunidades activadoras diferentes, A y B. Los productos de expresión de A y B se fusionan entre sí y forman así un factor de transcripción que activa a un promotor de respuesta al activador. La expresión de las subunidades activadoras A y B está bajo el control de un promotor para A y un promotor para B. Estos promotores pueden ser idénticos o distintos. En otra realización preferida de esta invención, el módulo promotor quimérico puede combinarse con un segundo promotor a elegir entre una serie de promotores, que comprende promotores fuertes activables no específicamente tales como el promotor de RNA polimerasa III, promotor de RNA polimerasa II, promotor e intensificador CMV y/o promotor SV40; o una secuencia promotora viral y/o activadora tal como la secuencia activadora de HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV y/o HIV; o secuencias intensificadoras o promotoras activables metabólicamente, p. ej . un intensificador o promotor induci-bles por hipoxia; u otro promotor específico del ciclo celular, p. ej . el promotor del gen cdc25C, gen cyclin A, gen cdc2, el gen B- yb, el gen DHFR o el gen E2F-1; o un promotor activable por tetraciclina, p. ej . el operador de tetraciclina en combinación con el correspondiente represor; o un promotor activable específico de la célula; a esos promotores pertenecen secuencias de activación aguas arriba de tales genes que codifican proteínas expresadas de forma predominante o exclusiva en el tipo de célula elegido. Los entes artificiales de ácidos nucleicos de la presente invención pueden ser usados en ingeniería genética y, en particular, en terapia génica. En terapia génica, los genes que se pretende expresar en el organismo son introducidos en el organismo. La regulación de la expresión de estos genes es importante para el efecto terapéutico de la terapia génica. La presente invención por consiguiente se refiere también a entes artificiales de ácidos nucleicos que pueden ser usados en terapia génica. Las técnicas de terapia génica son bien conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los documentos WO 93/24640 y WO 95/11984 describen métodos y composiciones para la terapia génica in vivo con una tecnología de vector viral o no viral. En otro ejemplo, el documento WO 95/06743 describe un método por el que entes artificiales terapéuticos de ácidos nucleicos son introducidos en células epiteliales de las vías respiratorias aisladas de un paciente, mediante transforma-ción con un vector viral (AAV) que contiene un ente artificial. Las células transformadas son después administradas al paciente. Además, el documento FR 2735789 describe composiciones farmacéuticas que contienen un adenovirus recombinante. Las tecnologías para los diversos vectores no virales que pueden ser usados como vehículos para los entes artificiales de esta invención y aplicados a células in vitro, o inyectadas o aplicados in vivo a pacientes, son igualmente bien conocidas por los expertos. En una realización preferida, el ente artificial de ácidos nucleicos puede ser usado para expresión específica de la célula y regulada por el ciclo celular de al menos un gen estructural. En otra realización preferida, el ente artificial de ácidos nucleicos puede ser usado para expresión específica del virus y regulada por el ciclo celular de al menos un gen estructural. En otra realización preferida más, el ente artificial de ácidos nucleicos puede ser usado para una expresión específica metabólica y regulada por el ciclo celular de al menos un gen estructural. El ente artificial de ácidos nucleicos o la célula según la presente invención se usa preferentemente en el tratamiento de un trastorno que se caracteriza por, o se asocia con la proliferación celular. Tal tratamiento comprende, p. ej . , la introducción de dicho ente artificial de ácidos nucleicos en una célula diana. Ejemplos de trastornos caracterizados por o asociados con la proliferación celular son enfermedades tumorales, leucemias, enfermedades cardiovasculares, reacciones inflamatorias, reacciones autoirimunitarias, alergias, artritis, psoriasis, rechazo inminente de órganos trasplantados, daños al SNC, enfermedades infecciosas, trastornos de la coagulación sanguínea e infecciones virales crónicas. Tales enfermedades pueden ser tratadas por aplicación sistémica o local de los entes artificiales o células de la presente invención. La expresión de tales entes artificiales en la correspondiente población celular proliferante puede ser controlada por la secuencia activadora específica de la célula, específica metabólica o específica del virus y el módulo promotor específico del ciclo celular. El producto de expresión del ente artificial de la invención puede directa o indirectamente inhi-bir la proliferación de la célula o matar las células proliferantes . En virtud de la estructura del ente artificial, éste puede expresarse durante el estadio de proliferación celular.

Para el tratamiento de otros trastornos, la secuencia activadora y el gen estructural para la sustancia activa en los entes artificiales de ácidos nucleicos según la presente invención se eligen dependiendo de su uso final pretendido. En general, el gen estructural codifica una sustancia que se elige entre el grupo formado por una citocina, un factor de crecimiento, un receptor de citocína, un receptor del factor de crecimiento, una proteína que tiene un efecto anti-proliferante, una proteína que tiene un efecto apoptótico, una proteína que tiene un efecto citostático, una proteína que tiene un efecto citotóxico, una proteína que tiene un efecto inflamatorio, una proteína que tiene un efecto antiin-flamatorio, una proteína que tiene un efecto inmunosupresor, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un inhibidor de la angiogénesis, un factor de coagulación, un compuesto fibrinolítico y un anticoagulante, una proteína sanguínea, un antígeno viral, un antígeno bacteriano y un antígeno tumoral y una proteína de fusión entre un ligando tal como un factor de crecimiento, una citocina o un anticuerpo, y una de las sustancias anteriormente mencionadas . En este aspecto, la invención comprende los entes artificiales y métodos terapéuticos siguientes. 1. Terapia de tumores e inflamaciones crónicas mediante la inhibición de la proliferación de células endotélicas.

Los tumores, al igual que las inflamaciones crónicas, se caracterizan por la formación de nuevos vasos sanguíneos por las células endotélicas proliferantes. En una realización, tales células endotélicas proliferantes son las células diana para ser transducidas por los entes artificiales de esta invención para que expresen una proteína que directa o indirec-tamente inhibe la proliferación de las células endotélicas y/o mata las células endotélicas proliferantes y las células tumorales adyacentes. 1.1 Secuencias activadoras activadas en células endotélicas. En una realización, las secuencias activadoras activadas en células endotélicas incluyen las secuencias reguladoras de genes y elementos de promotores para genes que codifican proteínas que son detectables en particular en células endotélicas. Los ejemplos de estas proteínas específicas de las células endotélicas y las secuencias promotoras de sus egenes, se describen el documento WO 96/06940. A esos promotores pertenecen secuencias promotoras o activadoras de genes que codifican el transportador de glucosa-1 endotélico específico del cerebro, Endoglina, receptor-l de VEGF (flt-1), receptor-2 de VEGF (flk-1, KDR) , tie-l ó tie-2, receptor B6l (receptor Eck) , B61, Endotelina, p. ej . Endotelina B o Endotelina- 1, receptor de Endotelina, especialmente el receptor de Endotelina B, receptores de mañosa- 6-fosfato, factor de von Willebrand, receptor IL-la, IL-lß, Il-l, molécula de adherencia celular vascular (VCAM-l) , secuencias ac-tivadoras sintéticas, p. ej . secuencias activadoras que comprenden y/o que unen 5'-TTATCT-3' el factor de transcripción GATA-2. 1.2 Secuencias activadoras activadas en células adyacentes a células endotélicas activadas. Cuando las células endotélicas están proliferando, las células adyacentes se hacen accesibles a macromoléculas de la sangre debido a "uniones herméticas". Estas interrelaciones funcionales y anatómicas significan que las células en la proximidad de células endotélicas activadas son células diana para el propósito de esta invención. Ejemplos de secuencias activadoras que son activadas en células adyacentes se describen en el documento WO 96/06940. A estas secuencias activadoras o promotores pertenecen promotores o secuencias activadoras de genes que codifican VEGF. La secuencias reguladoras de genes para el gen VEGF son la región flanqueante 5 ' o la región flanqueante 3 ' o el gen c-Src o el gen v-Src. Otros ejemplos son receptores de hormona esteoroide y sus elementos promotores (Truss y Beato, Enocrin. Rev. 14, 459 (1993) ) , especialmente el promotor del virus del tumor mamario murino. 1.3 Genes estructurales para sustancias con actividad anti- tumoral o antiinflamatoria. Una sustancia "antiinflamatoria" puede tener una o más de las características siguientes: inhibición de la proliferación de células endotélicas, inhibición de la angiogénesis, formulación de trombos, propiedades citostáticas o citotóxicas, capacidad para inducir la apoptosis o la capacidad para convertir un profármaco en un fármaco activo con propiedades citotóxicas, citostáticas o antiinflamatorias. Como se usa en esta solicitud, una sustancia "antitumoral" puede tener una o más de las propiedades precedentes. Además, una sustancia "antitumoral" puede ser una sustancia que induce inflamación. Ejemplos de estas sustancias y sus genes se describen en los documentos WO 96/06940, WO 96/06941 y D19617851.7. Los genes que codifican estas sustancias son por ejemplo genes estru'cturales para inhibidores de la proliferación celular, p. ej . para la proteína de retinoblastoma (pRB=pll0) o la proteína relacionada pl07 y pl30, la proteína p53, la proteína p21 (WAF-1) , la proteíona pl6, otros inhibidores de cdk, la proteína GADD45 o la proteína bak. La proteína de retinoblastoma (pRb=ll0) y proteínas relacionadas pl07 y pl30 son desactivadas por fosforilación; se prefieren los genes de estos inhibidores del ciclo celular que contienen mutaciones para los sitios de inactivación de las proteínas expresadas, pero sin menoscabar la función de estos inhibidores. Otros ejemplos son genes estructurales de factores que inducen trombosis y/o inhibidores de angiogénesis, p. ej . para el inhibidor-1 del activador del plasminógeno (PAI-1) , PAl-2, PAI-3, angiostatina, interferones, p. ej . iFNa, iFNß, IFN?, factor plaquetario 4, IL-12, TIMP-l, TIMP-2, TIMP-3, factor inhibidor de leucemia (LIF) o factor tisular (TF) y sus fragmentos activos. Otros ejemplos son genes estructurales para proteínas citostáticas o citotóxicas, p. ej . para perforina, granzima, IL-2, IL-4, IL-12, interferones, p. ej . iFNa, IFNß, iFN?, TNF, TNFa, TNFß, oncostatina M, esfingomielinasa o magainina y derivados de magainina. 1.4 Genes estructurales para anticuerpos citostáticos o citotóxicos, fragmentos de anticuerpos y para proteínas de fusión entre anticuerpos de unión de antígeno o fragmentos de anticuerpos y enzimas o proteínas citostáticas, citotóxicas o inflamatorias.

A los anticuerpos citostáticos o citotóxicos pertenecen los dirigidos contra estructuras membranosas o células endotélicas o en células de tumores o leucemia. Tales anticuerpos fueron descritos, por ejemplo, por Sedlacek et al., Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag, Munich (1988) y Contrib. to Oncol. 43, Karger Verlag, Munich (1992) . Otros ejemplos son anticuerpos específicos para Sialyl Lewis, péptidos en tumores que son reconocidos por linfocitos T, proteínas expresadas por oncogenes, gangliósidos, p. e . GD3, GD2, GM, 9-0-acetil GD3, fucosil GMl, antígenos del grupo sanguíneo y sus precursores, antígenos en mucina epitelial polimórfica, antígenos en proteínas de choque térmico o CD13, CD15, CD33, CAMAL, CD5, CDlc, CD23, idiotipos e isotipos de inmunoglobulinas de la membrana, CD33, M38, receptores IL-2, receptores de célu-las T, CALLA, CD19 o linfoma no de Hodgkin. 1.5 Genes estructurales para proteínas de fusión entre ligandos de unión de célula diana y enzimas o proteínas citostáticas o citotóxicas. A tales ligandos pertenecen todas la proteínas que se unen a la membrana celular de las células endotélicas, p. ej . factores de crecimiento o fragmentos de factores de crecimiento como PDGF, bFGF, VEGF, TGFß. Además, a tales ligandos pertenecen moléculas de adherencia que se unen a células en-dotélicas activadas y/o proliferantes, p. ej . , Slex, LFA-1, MAC-l, LECAM-l, VLA-4 o vitronectina. Además, a tales ligan-dos pertenecen compuestos que se unen a la membrana celular o receptores de membrana de células tumorales o leucémicas, p. ej . factores de crecimiento o fragmentos de factores de crecimiento. Tales factores de crecimiento fueron ya descri-tos por Cross et al., Cell 64, 271 (1991), Aulitzky et al., Drugs 48, 667 (1994), Moore, Clin. Cáncer Res. 1, 3 (1995), Van Kooten et al., Leuk. Ly ph. 12, 27 (1993)). 1.6 Genes estructurales para inductores de inflamación. A los genes estructurales para inductores de inflamación pertenecen tales como RANTES (MCP-2) , factor activador y qui-miotáctico de monocitos (MCAF) , IL-8, proteína-1 inflamatoria de macrófago (MIP-l, -ß), proteína-2 activadora de neutrófilos (NAP-2) , IL-3, IL-5, factor inhibidor de la leucemia hu-mana (LIF) , L-7, IL-11, IL-13, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, factor de Cobra venu (CVF) o secuencias de CVF que funcionalmente corresponde al factor de complemento humano C3b, factor de complemento humano C3 o secuencias de C3b, productos de segmentación de factores de complemento humano C3 que son fun-cionalmente y estructuralmente similares a CVF o proteínas bacterianas que activan el complento o inducen inflamaciones, p. ej . porinas de Salmonella typhi murium, factores de "aglutinación" de Staphylococcus aureus, modulinas de bacterias gram-negativas, "proteína de la membrana externa mayor" de legionella o de haemophilius influenza tipo B o de Klebsiella, o moléculas M de Streptococcusm grupo G. i .7 Genes estructurales para enzimas que convierten un profármaco en un fármaco. A los genes estructurales para enzimas que p. ej . convierten o segmentan profármacos dando citostáticos activos pertenecen, por ejemplo, enzimas tales como timidinaquinasa del virus Herpes simplex, timidinaquinasa del virus varizella zoster, nitrorreductasa bacteriana, ß-glucuronidasa bacteria-na, ß-glucuronidasa de Sécale cereale, ß-glucuronidasa humana, carboxi-peptidasa humana (CB) , p. ej . CB-A de células ce-badas, CB-B del páncreas, carboxi-peptidasa bacteriana, ß-lactamasa bacteriana, citosina desaminasa bacteriana, fosfatasa, p. ej . fosfatasa alcalina humana, fosfatasa acida de próstata humana, fosfatasa acida tipo 5, p. ej . lisil-oxidasa humana, D-amino oxidasa acida humana, peroxidasa, p. ej . glu-tation peroxidasa humana, peroxidasa eosinófila humana, peroxidasa tiroidea humana o galactosidasa. 2. Sustancia activa para remediar la producción deficiente de células sanguíneas. 2.1 Selección de la secuencia activadora para células hematopoyéticas . La secuencia activadora usada para células hematopoyéti-cas puede ser una secuencia reguladora de genes o un elemento de un gen que codifica una proteína que se expresa de un modo particularmente intenso o selectivo en células hematopoyéticas. Las secuencias reguladoras de genes de este tipo incluyen secuencias promotoras para genes de una citocina o su re-ceptor, cuya expresión en células hematopoyéticas inmaduras o en células adyacentes, tales como, por ejemplo, las células de estroma de la médula ósea, precede a la subsiguiente citocina que actúa sobre las células hematopoyéticas y se requiere como sustancia activa. Citocinas de este tipo que actúan sobre células hematopoyéticas inmaduras son, por ejemplo, tales como el factor de células tronco, IL-1, IL-3, IL-6, GM-CSF o trombocitopoyetina o receptores de estas citocinas. Referencias para tales citocinas se dan en el documento WO 96/06941. A estas secuencias activadoras pertenecen la se-cuencia promotora del gen de p. ej . el receptor del factor de células tronco, factor de células tronco, IL-la, receptor de IL-l, IL-3, receptor de IL-3 (subunidad a) , receptor de IL-3 (subunidad ß) , IL-6, receptor de IL-6, GM-CSF, receptor de GM-CSF (cadena a) , factor 1 regulador de interferón (IRF-1) , eritropoyetina o receptor de eritropoyetina. En otra realización preferida, la secuencia activadora puede ser específica metabólica. Ejemplos de secuencias activadoras activables metabólicamente (p. ej . por hipoxia) fueron descritos por Semenza et al., PNAS 88, 5680 (1991) o Me Burney et al., Nucí. Acids Res. 19, 5755 (1991). 2.2 Selección de los genes estructurales para sustancia activa para células hematopoyéticas . Una "sustancia activa para células hematopoyéticas" significa generalmente una proteína que efectúa proliferación y/o diferenciación de células sanguíneas. Ejemplos de genes para tal sustancia se exponen en el documento WO 96/06941. A estos pertenencen genes estructurales para la terapia de la anemia, p. ej . para eritropoyetina, genes estructurales para la terapia de la leucopenia, p. ej . para G-CSF, GM-CSF, genes estructurales para la terapia de la trombocitopenia, p. ej . para IL-3, factor inhibidor de la leucemia (LIF) , IL-11 o trombopoyetina. 3. Sustancia activa para la terapia de enfermedades autoin- --.unitarias, alergias, inflamaciones y para prevenir el rechazo de órganos. 3.1 Selección de la secuencia activadora. Las secuencias activadoras que pueden ser usadas son las secuencias promotoras de genes fuertemente activadas en macrófagos o linfocitos o de genes para proteínas que son producidas extensivamente durante la respuesta inmunitaria en acrófagos y/o en linfocitos. Ejemplos de secuencias promotoras de genes que codifican tales proteínas se describen en el documento WO 96/06941. A estas proteínas pertenecen el receptor de IL-1, IL-Ia, IL-Iß, IL-2, receptor de IL-2, IL-3, receptor de IL-3 (subunidad a) , receptor de IL-3 (subunidad ß) , IL-4, receptor de IL-4, IL-5, IL-6, factor 1 regulador de interferón (IRF-1) , promotor de respuesnta a IFN, IL-7, IL-8, IL-10, IL-11, GM-CSF, receptor de GM-CSF (cadena a) , IL-13, LIF, receptor del factor de estimulación de la colonia de ma-crófagos (M-CSF) , receptores eliminadores de macrófagos tipo I y II, MAC-l (antígeno de función de leucocitos) , LFA-la (antígeno de función de leucocitos) o pl50,95 (antígeno de función de leucocitos) . 3.2 Selección de los genes para sustancias activas. La sustancia activa para este fin puede ser la secuencia de DNA para una citocina, una quimiocina, un factor de crecimiento o uno de sus inhibidores, la porción extracelular de un recptor para una citocina o factor de crecimiento, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un inhibidor de enzima o una enzima. La elección de la sustancia activa depende del trastorno básico a tratar y de la secuencia promotora elegida. Ejemplos para la selección de un gen estructural apropiáda para el tratamiento de las enfermedades autoinmunitarias, alergia, inflamación, o para la prevención del rechazo de órganos se dan en el documento WO 96/06941. A estos ejemplos pertenecen p. ej . genes estructurales para la terapia de alergias, p. ej . codifican IFNß, FN?, IL-10, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos específicos para IL-4, receptores de IL-4 solubles, IL-12 o TGFß. Los genes estructurales para prevenir el rechazo de órganos trasplantados, p. ej . codifican IL-10, TGFß, receptores de IL-1 solubles, receptores de IL-2 solubles, antagonistas del receptor de IL-1, receptores de IL-6 solubles, anticuerpos inmunosupresores o fragmentos que contienen fragmentos VH y VL de estos anticuerpos o fragmentos VH. y VL conjugados por un enlazador. Los anticuerpos son específicos para el receptor de células T o su complejo CD3, contra CD4 o CD8, contra el receptor de IL-2, receptor de IL-l o receptor de IL-4 o contra las moléculas de adherencia CD2, LFA-1, CD28 o CD40. Los genes estructurales para la terapia de enfermedades autoinmunitarias mediadas por anticuerpos, p. ej . codifican TGFß, iFNa, iFNß, iFN?, IL-12, receptores de IL-4 solubles, receptores de IL-6 solubles o anticuerpos inmunosupresores o sus fragmentos que contienen VH y VL.

Los genes estructurales para la terapia de enfermedades autoinmunitarias mediadas por células, p. ej . codifican IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, TNFa, IL-4, TNFß o un anticuerpo inmunosupresor o sus fragmentos que contienen VH y VL. Los genes estructurales codifican inhibidores de la proliferación celular, proteínas citostáticas o citotóxicas o enzimas para la conversión o activación de profármacos en citostáticos o proteínas de fusión pueden ser los mismos que los genes estructurales para la terapia de tumores. 4. Sustancia activa para el tratamiento de artritis. 4.1 Selección de la secuencia activadora para artritis. La secuencia activadora significa generalmente una secuencia promotora o intensificadora con la cual se forman factores de transcripción o interacciona activamente, p. ej . , en células sinoviales y células inflamatorias. Para los fines de esta invención, las secuencias promotoras preferidas incluyen secuencias reguladoras de genes y elementos de genes que codifican proteínas que se expresan en particular en células sinoviales y células inflamatorias. Ejemplos de tales proteínas se bosquejan en el documento WO 96/06941. A estas proteínas pertenecen p. ej . MMP-1 (colagenasa intersticial), MMP-3 (estro elisina/transina) o inhibidoras tisulares de me-taloproteinasas (TIMP) , p. ej . TlMP-l, TIMP-2 o TIMP-3. 4.2 Selección de los genes estructurales para sustancias activas para la artritis. La sustancia activa con este propósito significa gene-raímente una secuencia de DNA cuya proteína expresada inhibe directa o indirectamente las inflamaciones, por ejemplo en la articulación, y/o promociona la reconstitución de la matriz extracelular tal como cartílago y/o tejido conjuntivo en la articulación. Ejemplos de tales proteínas se dan en el docu-mentó WO 96/06941. A estas proteínas pertenecen p. ej . el antagonista del receptor de IL-l, receptor de ?L-l soluble, IL-6, receptor de TNF soluble, IL-4, IL-10, factor de crecimiento similar a la insulina, TGFß, superóxidodismutasa o TIMP, p. ej . TIMP-1, TIMP-2 O TIMP-3.

. Sustancia antiinfecciosa.

En general, la sustancia activa puede ser preparada de dos formas fundamentalmente diferentes : para la terapia de infecciones virales e invasiones por parásitos o para la profilaxis de enfermedades infecciosas debidas a virus, bacterias o parásitos. Generalmente se usan vacunas para la profilaxis de enfermedades infecciosas. Sin embargo, las posibilidades de preparar vacunas eficaces por medios convencionales son limitadas. Así, se ha desarrollado la tecnología de vacunas de DNA. Sin embargo, estas vacunas de DNA suscitan cuestiones acerca de la seguridad y efectos secundarios (Fy-nan et al., Int. J. Immunopharm. 17, 79 (1995); Donnelly et al., Immunol. 2, 20 (1994)). Los entes artificiales siguientes para la profilaxis de enfermedades infecciosas pueden distinguirse de sustancias de la técnica anterior por su especificidad celular y regulación del ciclo celular que proporciona un alto grado de seguridad a estas sustancias. .1 Selección de la secuencia activadora. .1.1 Terapia de enfermedades infecciosas . La secuencia activadora que puede ser elegida para la terapia de enfermedades infecciosas comprende secuencias promotoras de genes celulares cuya actividad es alterada en par-ticular por infecciones con bacterias o parásitos, o las secuencias promotoras a elegir son las de virus que transforman las células infectadas por ellos y estimulan la proliferación. Estos virus incluyen, por ejemplo, HBV, HCV, HSV, HPV, HIV, EBV y HTLV. Ejemplos de esas secuencias activadoras se describen en el documento WO 96/06941. .1.2 Profilaxis de enfermedades infecciosas. La secuencia activadora que puede ser elegida para la profilaxis de enfermedades infecciosas comprende secuencias promotoras que son generalmente fuertemente activadas en cé-lulas endotélicas, células musculares, linfocitos o macrófagos o que pertenecen a genes celulares que codifican proteínas que son generalmente altamente expresadas en células endotélicas, células musculares, macrófagos o linfocitos. Ejemplos de estas secuencias activadoras se dan en los capítulos precedentes y subsiguientes. .2 Selección de los genes estructurales para sustancias activas . .2.1 Terapia de enfermedades infecciosas. La sustancia activa que puede ser seleccionada es el DNA para una proteína que tiene efectos citostático, citotóxico, antibacteriano o antiviral, o que puede ser una enzima que transforma el precursor inactivo en un fármaco citostático, citotóxico, antibacteriano o antiviral. Ejemplos de proteínas citotóxicas o citostáticas y de citocinas y factores de crecimiento con actividad antiviral se describieron en el documento WO 96/06941. A estas sustancias pertenecen, por ejemplo, citocinas activas antivirales y factores de crecimiento, p. ej . IFNa, IFNß, IFN?, TNFß, TNFa, IL-1 o TGFß. Otros ejemplos son anticuerpos que desactivan un virus específico o fragmentos de los mismos que contienen VH y VL o sus fragmentos VH y VL conjugados por un enlazador. Ejemplos de anticuerpos antivirales son anticuerpos específicos para HBV, HCV, HSV, HPV, HIV, EBV, HTLV, virus de Coxsackie o virus de Hantaan. Otros ejemplos son una proteína de unión rev., p. ej . , RBP9-27, RBP1-8U, RBP1-8D o pseudogen de RBP1-8. A estas sustancias pertenecen también p. ej . una ribo-zima que cataliza el mRNA de genes para proteínas de control del ciclo celular o el mRNA del virus respectivo o genes estructurales para proteínas antibacterianas, p. ej . anti-cuerpos que neutralizan toxinas bacterianas u opsonizan bacterias, p. ej . anticuerpos específicos para meningococos C o B, E. coli, borrelia, pseudomonas, Helicobacter pylori o Staphylococcus aureus. Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos son ejemplarmente proteínas antibacterianas o antivirales . Como se señaló anteriormente, para algunas sustancias puede requerirse la conversión enzimática de un precursor en la forma activa. En tal caso, la sustancia antibacteriana, antiviral, ci-totóxica o antiparásita es añadida después de haber sido ya administrado un ente artificial de acuerdo con la invención. Ejemplos para enzimas que convierten tales profármacos y los genes para tales enzimas fueron descritos en los documentos WO 96/06940 y WO 96/06941 y en el capítulo precedente. .2.2 Profilaxis de enfermedades infecciosas. En una realización, la sustancia activa puede ser un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo específico para el patógeno. En otra realización, la sustancia activa puede ser una proteína que es formada por el patógeno y que conduce, a través de una respuesta inmunitaria, es decir por unión de anticuerpo y/o por linfocitos citotóxicos, a la neutralización y/o a la muerte del patógeno. Agentes neutralizantes de este tipo se están usando ya como antígenos de inmunización (véase la revisión de Ellis, Adv. Exp. Med. Biol. 327, 263 (1992)) . Las secuencias de DNA que codifican tales proteínas se usan para preparar entes artificiales de acuerdo con la invención. Ejemplos de esos genes fueron descritos en WO 96/06941, p. ej . , genes que codifican el antígeno del virus de la influenza A, antígenos del HIV, antígeno del virus de la rabia, antígeno del HSV (virus Herpes simplex) , antígeno del RSV (virus sincitial repiratorio) , antígeno del virus de la parainfluenza, antígeno del rotavirus, antígeno del VZV (virus varizella zoster) , antígeno del CMV (citomegalovirus) , antígeno del virus del sarampión, antígeno del HPV (virus del papiloma humano) , antígeno del HBV (virus de la hepatitis B) , antígeno del HCV (virus de la hepatitis C) , antígeno del HDV (virus de la hepatitis D) , antígeno del HEV (virus de la hepatitis E) , antígeno del HAV (virus de la hepatitis A) , antígeno del vibrio cólera, antígeno de borrelia Burgdorferi, antígeno de Helicobacter pylori, antígeno de la malaria o un anticuerpo antiidiotipo o sus fragmentos de unión de anticuerpo, cuyas regiones determinantes complementarias son copias de la estructura de proteína o de carbohidrato del antígeno de neutralización del organismo infeccioso. 6. Sustancia activa para el tratamiento de leucemias v tumores. 6.1 Selección de la secuencia activadora para leucemias y tumores . La secuencia activadora proporcionada puede ser una secuencia promotora o intensificadora con la que interaccionan factores de transcripción formados o activos en células leucémicas o tumorales. Sin embargo, para los fines de esta in-vención, las secuencias activadoras preferidas incluyen secuencias reguladoras de genes y elementos de genes que codifican proteínas formadas en particular en células tumorales o células leucémicas. Se citan ejemplos en el documento WO 96/06941, p. ej . promotores de genes que codifican c-myc, HPS-70, bcl-1/cyclin D-1, bcl-2, IL-6, IL-10, NFa, TNFß, HOX-11, BCR-Abl, E2A-PBX-1, PML-RATA (receptor leucemia promielo-cí ica - ácido retinoico) , c-myc, proteínas N-CAM, receptor del factor de crecimiento de la hepatitis, L-plastina o mucina epitelial polimórfica (PEM) . 6.2 Selección de los genes estructurales para sustancias activas para leucemias y células tumorales. La sustancia activa para este propósito significa generalmente una proteína que inhibe la proliferación de células, en particular también de células tumorales o células leucémicas. Estos inhibidores de la proliferación celular incluyen, por ejemplo, las secuencias de DNA para proteínas inhibidoras, citostáticas, apoptóticas y citotóxicas y enzimas para segmentación de profármacos que han sido ya descritas. Un inhibidor de la proliferación celular significa ade-más una secuencia de DNA que expresa una proteína que, directa o indirectamente, tiene un efecto citostático o citotóxico sobre leucemias o tumores. Tales proteínas han sido ya descritas en los capítulos precedentes . Las secuencias de DNA que codifican tales proteínas pueden ser usadas para preparar entes artificiales de acuerdo con la presente invención. Un inhibidor de la proliferación celular, además, significa generalmente una secuencia de DNA que codifica proteínas o péptidos que inducen una respuesta inmunitaria humoral o celular, citotóxica o citostática para el tumor. A tales pro-teínas o péptidos pertenecen p. ej . genes estructurales para vacunas tumorales . A ellas pertenecen antígenos en células tumorales. Por ejemplo tales antígenos fueron revisados por Sedlacek et al . , Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag, Munich (1988) y Contrib. to Oncol. 43, Karger Verlag, Munich (1992) . Ejemplos adicionales son antígenos o los genes que codifican Sialyl Lewis, péptidos en células tumorales reconocibles por células T, proteínas expresadas por oncogenes, antígenos del grupo sanguíneo y sus precursores, antígenos de la mucina epitelial polimórfica o las proteínas de choque térmico. 7. Sustancia activa para inhibir la proliferación de células de la musculatura lisa en oclusiones vasculares. 7.1 Selección de la secuencia activadora para células de la musculatura lisa. En una realización, las secuencias activadoras pueden ser secuencias reguladoras de genes o elementos de genes que codifican proteínas que se forman particularmente en células de la musculatura lisa. Ejemplos de promotores de genes que codifican tales proteínas se describen en los documentos WO 96/06938 y WO 96/06940. A estos pertenecen tropomiosina, a-actina, a-miosina, receptor para PDGF, receptor para FGF, MRF-4, fosfofructoquinasa A, troponina C, íogenina, receptores para endotelina A, desmina, VEGF o promotores artificiales. Además, factores de la familia de Helix-Loop-Helix (HLH) (hélice-lazo-hélice) (MyoD, Myf-5, miógenos MRF4) y la proteína de Zinkfinger GATA-4 son descritos como activadores de transcripción específicos del músculo. Las proteínas HLH así como GATA-4 muestran transcripción específica del músculo no sólo con promotores de genes específicos del músculo sino también en un contexto heterólogo, p. ej . con promotores artificiales. Tales promotores artificiales son por ejemplo: copias múltiples de (p. ej . 4x) 5 ' -AGCAGGTGTTGGGAGGC-3 ' (ID. SEC. NO.: 3) o copias múltiples de 5 ' -GGCCGATGGGCAGATAGAGGG-GGCCGATGGGCAGATAGAGG-3 ' (ID. SEC. NO.: 4). 7.2 Selección de los genes estructurales para sustancias activas para células de la musculatura lisa. La sustancia activa para este propósito significa gene-raímente una proteína que inhibe la proliferación de células de la musculatura lisa. Ejemplos de estos inhibidores de proliferación fueron descritos ya en los capítulos precedentes. 8. Sustancia activa para inhibir o activar la coagulación. 8.1 Selección de la secuencia activadora para inhibir o activar la coagulación. Las secuencias activadoras a usar para este fin pueden ser generalmente secuencias reguladoras de genes o elementos de genes que codifican proteínas detectables en células de la musculatura lisa, en células endotélicas activadas, en macrófagos activados o en linfocitos activados. 8.1.1 Células de la musculatura lisa. Ejemplos de secuencias promotoras para genes en células de la musculatura lisa han sido ya mencionados en el documen-to WO 96/06938 y en el capítulo precedente. 8.1.2 Células endotélicas activadas o células adyacentes a células endotélicas activadas. Ejemplos de proteínas que se forman particularmente en células endotélicas activadas han sido ya descritos en los documentos O 96/06938 y WO 96/06940 y en los capítulos precedentes . 8.1.3 Macrófagos activados y/o linfocitos activados. Una secuencia activadora para este propósito significa generalmente una secuencia promotora procedente de un gen que codifica una proteína que se forma extensivamente durante la respuesta inmunitaria en macrófagos y/o en linfocitos. Ya se han descrito ejemplos en los documentos WO 96/06941 y WO 96/ 06938 y en los capítulos precedentes. 8.2 Selección de los genes estructurales para sustancias activas para inhibir o activar la coagulación o para modu- lar el sistema cardiovascular. En una realización, la sustancia activa a usar para este propósito puede ser una proteína que inhibe, directa o indirectamente, la agregación plaquetaria o un factor de coagulación, o estimula la fibrinólisis. Así, una sustancia activa de este tipo se denomina anticoagulante. Los anticoagulantes a emplear son genes, por ejemplo, para activadores del plasminógeno (PA) , por ejemplo PA tisular (tPA) o PA similar a uroquinasa (uPA) o híbridos de tPA y uPA o proteína C, antitrombina III, inhibidor C-1S, antitripsina al, el inhibidor de la ruta del factor tisular (TFPI) o hirudina. En otra realización, la sustancia activa a usar para este propósito puede ser también una proteína que promociona la coagulación sanguínea. Ejemplos de tales proteínas son, por ejemplo, proteínas del plasma sanguíneo tales como el factor VIII, factor IX, factor de von Willebrand, F XIII, PAI-1 o PAI-2.

En una tercera realización la sustancia activa a usar para este propósito puede ser también una proteína que modula el sistema cardiovascular induciendo la angiogénesis o reduciendo la presión sanguínea. Ejemplos de genes que codifican tales proteínas son factores de angiogénesis, p. ej . VEGF o FGF o péptidos para reducir la presión sanguínea, p. ej . ca-licreína u "óxido nítrico sintetasa" de la célula endotélica.

En una realización adicional la sustancia activa a usar para este fin puede ser un gen que codifica una proteína sanguinea. Ejemplos de tales proteínas sanguíneas son albúmina, inactivador de Cl, colinesterasa sérica, transferrina o 1-antitripsina. 9. Sustancia activa para la protección frente a daños del SNC. 9. l Secuencias activadoras para una sustancia activa para la protección frente a daños del SNC. 9.1.1 Secuencias activadoras activadas en células endotélicas. En una realización, este tipo de activador puede incluir las secuencias promotoras para genes de proteínas específicas para las células endotélicas. Ejemplos de esas secuencias promotoras se exponen en el documento WO 96/06939 y han sido ya descritos en los capítulos precedentes. 9.1.2 Secuencias activadoras activadas en células gliales. Una secuencia activadora preferida es una secuencia promotora o intensificadora con la que interaccionan factores de transcripción formados o activos hasta un grado particular en células gliales. Ejemplos de esas secuencias activadoras se exponen en el documento WO 96/06939. A ellas pertenecen pro-motores de genes que codifican la proteína específica de las células de Schwann periaxina, glutaminsintetasa, la proteína específica de células gliales (proteína acida fibrilar glial = GFAP) , la proteína de célula glial SlOOb, IL-6 (CNTF) , receptor de 5-HT, TNFa, IL-10, receptor I y II del factor de crecimiento similar a la insulina o VEGF. 9.2 Elección de los genes estructurales para factores neuro- específicos. ün "factor neuroespecífico" para el propósito de la presente invención puede ser una secuencia de DNA que codifica un factor de crecimiento neuronal o un inhibidor o supresor de TNFa. Ejemplos de estos genes se exponen en el documento WO 96/06939. A estos pertenecen genes que codifican FGF, factor de crecimiento nervioso (NGF) , factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) , neurotrofina-3 (NT-3) , neurotrofina-4 (NT-4) , factor neurotrófico ciliar (CNTF) , TGFß, receptores de TNF solubles, IL-10, receptores de II-1 soluble, receptor I de IL-l, receptor II de IL-1, antagonista del receptor de IL-1 o receptores de IL-6 solubles. Los entes artificiales según la presente invención se aplican o se inyectan preferentemente en tejidos dañados, en la zona de nervios dañados o en la médula espinal o en el cerebro para transducir células endotélicas o células gliales para que expresen la proteína terapéutica.

. Uso terapéutico.

Como ejemplo, un ente artificial de los descritos en las secciones anteriormente expuestas puede ser administrado a un paciente en necesidad de tratamiento de una enfermedad, por ejemplo un tumor, una leucemia, un trastorno inflamatorio, un trastorno caracterizado por un exceso de proliferación de células endotélicas, una producción deficiente de células sanguíneas, una enfermedad autoinmunitaria, una alergia, un inminente rechazo de un órgano trasplantado, una artritis, una infección, una trastorno de la coagulación o un daño en el SNC.

Para la administración, el ente artificial descrito puede ser insertado en un vector de plásmido o vector viral de acuerdo con la tecnología bien conocida por el experto. El vector puede ser aplicado al paciente localmente o ser inyec- . tado en el sistema cardiovascular, por vía intrapleural, intraperitoneal, intracerebroespinal, intravesical, intrabronquial, intragastrointestinal, o inyectado en uno de los distintos tej idos u órganos . En caso de que el gen estructural del ente artificial codifique una enzima que segmente o transforme un profármaco no tóxico y no eficaz para dar un fármaco eficaz, este profármaco se aplica al paciente después de la inyección del ente artificial de esta invención. La presente invención se explica con más detalle por me-dio de los ejemplos y tablas que siguen, que ilustran el alcance de la invención, sin limitarlo.

Descripción de las Tablas .

Tabla i Análisis de estructura-función del CHR de cdc25. Las mutaciones de los entes artificiales del promotor cdc25C (basado en C290; Zwicker et al., EMBO J. 14, 4514 (1995)) en la región CHR fueron analizadas en cuanto a la regulación del ciclo celular en células NIH3T3. Las posiciones -16 a -12 representan el CDE definido anteriormente (Zwicker et al., EMBO J. 14, 4514 (1995)). Los resultados de ensayos de luciferasa transitorios se expresan como la razón de RLUs observadas con células en crecimiento relativa a la actividad en células en reposo. Los resultados mostrados en la tabla resumen los datos de 4 experimentos independientes usadno al menos dos preparados independientes de DNA plasmídico. Los valores representan promedios; en todos los casos las desviaciones tí-picas no eran mayores que ± 1,5. Un plásmido reportero SV40 fue incluido en cada experimento para estandarizar el factor de inducción (el reportero SV40 dio típicamente un valor 1,5 veces más alto en células en crecimiento en comparación con células en reposo) .

Tabla 2.

Efectos de intercambios de nucleótidos específicos entre el módulo E2FBS-CHR de B-myb y el motivo CDE-CHR de cdc2?C sobre la regulación del ciclo celular y la unión de DNA de comple-jos E2F y CDF-1. Los módulos represores B-myb y cdc25C se muestran en la parte superior. Cinco posiciones en las que las secuencias difieren entre sí fueron designadas región 1-5. Cada uno de los mutantes indicados abajo alberga intercambios específicos entre los dos promotores en una base de pro-motor B-myb (bloque superior) o cdc25C (bloque inferior) . La "B" y la "C" indican si el mutante en particular contiene nucleótidos de cdc25C (C) o B-myb (B) en las regiones 1-5 (p. ej . B-Cl es una secuencia de B-myb que contiene los nucleótidos de cdc25C en la región 1) . La regulación del ciclo celu-lar se midió primero comparando la actividad de entes artificiales de tipo silvestre y mutantes en células NIH3T3 en reposo. La columna designada "represión" resume los resultados de este análisis, (razón +: mutante tipo silvestre: <2 : razón - mutante tipo silvestre: >3. Los entes artificiales del promotor funcional fueron después analizados en cuanto a la temporización de la regulación del ciclo celular en células NIH3T3 estimuladas con suero y se determinaron los tiempos de actividades mitad de la máxima. Las flechas huecas indican cinéticas que difieren claramente de ambos promotores de tipo silvestre B-myb y cdc25C. Se obtuvieron datos de unión de CDF-l y E2F mediante EMSA con sondas E2FBS-CHR de B-myb de tipo silvestre y mutado y con sondas CDE-CHR de cdc25C de tipo silvestre y mutado usando extracto nuclear de células HeLa o CDF-l parcialmente purificado. Para demostrar los efectos de cambios de nucleótidos específicos sobre la temporización de la transcripción regu-lada por el ciclo celular a partir de los promotores B-myb y cdc25C, célµlas NIH3T3 fueron transfectadas transitoriamente con los entes artificiales indicados, sincronizados en G0 mediante privación de suero y estimuladas añadiendo 10% de FCS. Los datos se basan en 12 experimentos diferentes, excepto para el gráfico C-Bl,2 que se basa en 4 experimentos. Los datos fueron normalizados a 100 a 20 horas para cada ente artificial con el fin de facilitar la comparación de los valores de expresión mitad de la máxima.

Ejemplos i. Materiales y métodos. 1.1 Cultivo de células, transfección de DNA y ensayos de luciferasa. Se cultivaron células en medio de Eagle modificado por Dulbecco-Vogt (DMEM) suplementado con 10% de suero de ternera fetal, penicilina y estreptomicina. Se desarrollaron células HeLa en DMEM más 5% de suero de ternera recién nacida. Se transfectaron células NIH3T3 mediante la técnica de dextrano DEAE (Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995)) . Para la sincronización en G0, las células fueron mantenidas en medio libre de suero durante 2 días 12 hr después de la transfec-ción y se reestimularon con FCS al 10%. La determinación de las actividades de luciferasa y la estandarización de los resultados usando entes artificiales reportero impulsados por promotor SV40 se realizaron como se ha publicado (Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995)). 1.2 Análisis de la secuencia y entes artificiales de luciferasa. Los entes artificiales de luciferasa impulsados por promotores cdc25C y B-myb han sido descritos por Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995) y Zwicker et al., EMBO J. 14, 4514 (1995) . Se introdujeron mutaciones mediante estrategias de PCR como se describió anteriormente (Good y Nazar, Nucí. Acids Res. 20, 4934 (1992); Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995)) . Todos los fragmentos amplificados mediante PCR fueron identificados mediante secuenciación del DNA usando el método de terminación de cadena de didesoxinucleótido usando Sequenasa (USB) o Tth polimerasa (Pharmacia) . 1.3 EMSA Se realizó análisis de desplazamiento de movilidad electroforética (EMSA) como se ha descrito (Zwicker et al., Science 271, 1595 (1996)). Cuando se usó CDF-1 parcialmente purificado, el EMSA se realizó en ausencia de desoxicolato sódico y NP-40. Se usaron las siguientes sondas bicatenarias: - cdc25C-wt: 5 : -ACTGGGCTGGCGGAAGG-T-TT?-íAaTGGTCAA (ID. SEC. NO. : 5) (CDE en negrita; CHR en cursiva) . TI, T4, T7 (también denominada cdc25C-mCDE) , A8 y C9 son mutadas (Zwicker et al., Nucleic Acids Res. 23, 3822 (1995)) en las posiciones -19, -16, -13, -12 y -11 (Tabla 1), res- pectivamente, como se ha descrito. cdc25C- 10/- 7 : 5 ' -ACTGGGCTGGCGGAc ttgTTGAATGGTCAA (ID SEC. NO. : 6) cdc25C- &/-3 (también denominada cdc25C-mCHR) : 5 ' -ACTGGGCTGGCGGAAGGTggrtcATGGTCAA (ID. SEC. NO.: 7) - cdc25C- 1/+2 : 5 ' -ACTGGGCTGGCG5AAGGTTTGAA7cttTCAA (ID. SEC. NO. : 8) cdc25C-2 : 5 ' -ACTGGGCTGGCGGAAGGTT^TGAcTGGTCAA (ID. SEC. NO. : 9) .

Las secuencias de los demás oligonucleótidos, incluyendo B-myb han sido descritas en otra parte (Zwicker et al., Science 271, 1595 (1996)) o están indicadas en la Tabla 2. El oligonucleótido al azar contiene una secuencia irrelevante (Zwicker et al., EMBO J. 14, 4514 (1995)). Se usaron los siguientes anticuerpos: E2F-1 (Santa Cruz SC-251X) , E2F-2 (Santa Cruz SC-632X) , E2F-3 (Santa Cruz SC-879X) , E2F-4 (Santa Cruz SC-512X) , E2F-5 (Santa Cruz SC-999X) , DP-1 (obtenido de N. La Thangue) , DP-2 (Santa Cruz SC-830X) . 1.4 Purificación parcial del CDF-l. Se prepararon extractos nucleares a partir de cultivos en suspensión de HeLa en tampón de extracción con alto contenido de sal (Dignam et al., Nucí. Nucí. Acids. Res. 11, 1475 (1983) ) en presencia de los inhibidores de proteasa leupepti-na (50 ng/ml) , pepstatina A (5 /xg/ml) y aprotinina (80 ng/ ml) . Un olia/onucleótido biotinilado que contiene dos motivos CDE-CHR de cdcC25 en tándem fue acoplado a estreptavidina agarosa y usado para cromatografía de afinidad como se ha descrito (Kadonaga y Tjian, PNAS 83, 5889 (1986)), usándolas mismas condiciones que para EMSA (véase anteriormente) excepto que se usó DNA de esperma de salmón en vez de Poly(dA:dT) como competidor no específico. La elución se llevó a cabo aumentando por etapas la concentración de KCl hasta 1M. 1.5 Hollado con DMS in vitro. El hollado con DMS in vitro de la hebra de codificación de oligonucleótido de cdc25C se realizó como se ha descrito (Zwicker et al., Science 271, 1595 (1996)). 1.6 Hollado genómico de transfectantes estables. Para la generación de líneas celulares estables, el ente artificial de luciferasa de cdc25C de tipo silvestre C290 y el mutante de CHR C290mCHR5/6 (TTTGAA mutado a TagGAA) fueron insertados en el vector pAGLu que contiene una región de fi-jación a la matriz (SAR) e introducidos en células NIH3T3 por electroporación. Se aislaron clones transfectados establemente bajo selección G418 y se analizaron en cuanto a la expresión de luciferasa en células en reposo y en crecimiento. Los clones con el patrón de expresión esperado fueron expandidos y analizados mediante hollado genómico (Pfeifer et al., Science 246, 810 (1989) ) como se ha descrito (Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995)) con la excepción de que el primer cebador (Pl) era específico para el gen de la luciferasa 5' -GTAACACAAAGGAATTCAAGC (ID. SEC. NO.: 10). 2. Resultados. 2.1 identificación de CDF-l. 2.1.1 Caracterización del CHR de cdc25C. Recientemente, la secuencia de consenso del CDE fue definida como G/CGC/TGG/C (GGCGG en cdc25? (Zwicker et al., EMBO J. 14, 4514 (1995)) . Sin embargo, para el CHR no se dispone aún de tal información. Con el fin de delinear los límites del CHR y de identificar posiciones de nucleótido críti-cas, fueron introducidas varias mutaciones en el CHR del promotor cdc25C y la función de estos entes artificiales mutantes fue analizada midiendo su represión en células NIH3T3 sincronizada en GO . Los datos de la Tabla 1 indican claramente que el CHR se extiende de -7 a -2, y que todas las po-siciones de nucleótidos en esta región son esenciales. En cambio, las posiciones de nucleótidos entre el CDE y el CHR (-11 a -8; AAGG) y los nucleótidos aguas abajo del CHR ( = 1; TGG...) pueden alterarse sin efectos detectables sobre la función represora. El CHR de cdc25C puede entonces ser defi-nido como la secuencia TTTGAA. 2.1.2 La ocupación de CDE in vivo depende de un CHR intacto. Datos anteriores han indicado claramente que el CDE y CHR en promotores diferentes funcionan de manera sinérgica ya que las mutaciones en cualquiera de los elementos destruyen la represión en GO (Zwicker et al., EMBO J. 14, 4514 (1995)) . Esto podría significar que el o los factores de interacción se unen cooperativamente a ambos elementos. Esta cuestión fue aclarada por hollado genómico de una línea celular NIH3T3 transfectada establemente que lleva un ente artificial de promotor cdc25C con una mutación desactivadora en el CHR (ccíc-25C-mCHR5/6: TTTGAA cambiado a TagGAA) . El patrón de protección esperado fue observado en una línea testigo que expresa establemente un ente artificial de promotor cdc25C de tipo silvestre. En cambio, la línea celular que alberga el promotor cdc25C con la mutación de CHR no mostró ninguna protección en la región del CDE y el CHR mutado, mientras que la ocupación de dos sitios de unión constitutivos aguas arriba para NF-Y (Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995)) es-taba sin cambios en el promotor mutante. Así, se ha llegado a la conclusión de que la ocupación de CDE depende de un CHR intacto, lo que indica unión cooperativa dentro de la célula. Esta conclusión viene apoyada por la observación de que la inserción de 5 pb o de 10 pb entre el CDE y el CHR en el promotor cdc25C anula la represión. 2.1.3 Identificación del CDF-l. El análisis de desplazamiento de la movilidad electroforética (EMSA) de extracto nuclear de células HeLa condujo a la identificación de una actividad que interacciona de manera cooperativa tanto con CDE como con CHR del promotor cdc25C. Además, la unión de esta actividad a elementos represores mutantes se relacionó fuertemente con las propiedades funcionales de estos elementos. Los mutantes (T por G en -19; C por A en -11 o deleción de -1/+2) exhibieron una función represora de tipo silvestre, mostraron la misma capacidad para competir en el ensayo de unión que la secuencia de tipo silvestre (auto-competencia) . En cambio, otros mutantes en el CDE (T por G en -16; T por G en -13 ó A por G en -12) o bien en el CHR (deleción de -10/-1, deleción de -6/-3 ó C por A en -2) que conducen a una represión disminuida o menoscabada en células GO, mostraron también una capacidad disminuida para competir por la unión. La unión cooperativa observada tomoda juntamente con las correlaciones establecidas por el análisis de estructura-función están de acuerdo con las propiedades esperadas del factor de unión de CDE-CHR. Esta actividad se denomina CDF-l. 2 . 1.4 El CDF-l contacta con el CDE en la hendidura mayor y con el CHR en la hendidura menor. Para obtener una evidencia adicional de que el CDF-l es la actividad que interacciona con los elementos represores in vivo, se analizó la interacción de CDF-1 con DNA mediante hollado de protección de metilación in vitro. Anteriormente se ha demostrado que in vivo el CDE se pone en contacto en la hendidura mayor mientras que el CHR es ocupado en la hendidura menor (Zwicker et al., EMBO J. 14, 4514 (1995)). Un resultado muy similar se obtuvo mediante hollado in vitro de la hebra superior. Los cuatro restos G en el CDE eran específicamente protegidos indicando contactos en la hendidura mayor (N-7) y los restos A en el CHR eran también específicamente protegidos indicando contactos en la hendidura menor (N-3) . El modo de interacción entre CDF-1 y el CDE-CHR in vitro es así totalmente compatible con las observaciones hechas intracelularmente. 2.1.5 Interacción de CDF-1 con promotores múltiples que contienen módulos CDE-CHR. Estudios previos han indicado que módulos CDE-CHR funcionales están presentes en diferentes promotores, incluyendo cdc25C, cdc2 y cyclin A (Zwicker et al., EMBO J. 14, 4514 (1995) ) . Además, una similar configuración de sitios de unión se encuentra en el promotor B-myb en el que un sitio E2F con una secuencia de núcleo idéntica al CDE de cdc25C está sitúa-, da inmediatamente aguas arriba de un elemento similar al CHR (Bennett et al., Oncogene 13, 1073 (1996); Zwicker et al., Science 271, 1595 (1996) ) . Por tanto, era de interés obvio investigar si la actividad de CDF-l identificada anteriormente interaccionaría con los sitios represores en estos promotores. Pudo observarse que ambos promotores que contienen CDE-CHR, es decir cdc2 y cyclin A, se unen a la actividad de CDF-l con una eficacia similar que el promotor cdc25C. En los tres casos la unión era dependiente de una unión cooperativa tanto a CDE como a CHR, ya que la mutación (véase Materiales y métodos) en cualquier sitio deterioró la competición con la sonda cdc25C. A una relación sonda: competidor (1:20) idénti- ca, la competición por el módulo E2FBS-CHR del promotor B-myb fue insignificante, aunque pudo obervarse cierta competición a concentraciones de competidor más elevadas. El hecho de que la actividad de CDF-1 indique una específica e intensa interacción con los tres promotores que contienen CDE-CHR, propor- ciona una evidencia adicional para la relevancia de la actividad identificada en el presente estudio. 2.1.6 El CDF-l no contiene miembros de la familia E2F conocidos. En vista de la similitud del CDE con un E2FBS, se procuró investigar si la actividad de CDF-CHR identificada anteriormente podría contener miembros de la familia E2F o DP conocidos. Con este fin, se llevó a cabo un EMSA en presencia de anticuerpos dirigidos contra proteínas de DP y E2F especí- ficas. Se ha demostrado que todos estos anticuerpos inducen superdesplazamientos o bien extinguen la unión de E2F/DP en diferentes disposiciones. Sin embargo, pudo demostrarse claramente que ninguno de los anticuerpos usados afectaba a la formación del complejo CDF1-DNA, indicando que el CDF-1 no " contiene ninguno de los miembros de la familia E2F o DP conocidos . 2.2 Identificación de nucleótidos que determinan unión preferencial con E2F o CDF-1 o E2F y CDF-1. La identificación de secuencias de nucleótidos que unen E2F y CDF-l era complicada por el hecho de que los complejos DP/E2F y CDF-1 muestran una movilidad electroforética muy parecida en EMSA. Por consiguiente, el extracto nuclear de HeLa fue fraccionado mediante cromatografía de afinidad de DNA usando una secuencia CDE-CHR de cdc25C de 20 pb (véase Materiales y métodos para más detalles) . Este procedimiento proporcionó CDF-l parcialmente purificado que muestra propiedades de unión muy similares a las de CDF-1 en extractos crudos, y dio una separación completa de CDF-l de la actividad de unión de E2F. Para el análisis de complejos E2F se incluyó oligonucleótido competidor de CDE-CHR de cdc25C en las reacciones de unión para evitar la formación de complejos CDF-1 radiomarcados . Para determinar los sitios de unión de DP/E2F y CDF-1, nucleótidos específicos fueron trocados entre los promotores B-myb y cdc25C en cinco regiones específicas en las que los módulos represores difieren entre sí (señaladas 1-5 en la parte superior de la Tabla 2) . Las correspondientes secuencias fueron primero ensayadas en cuanto a unión de E2F (es decir, unión de DP1/E2F-1, -3 y -4 en extracto nuclear de HeLa) e interacción con CDF-l parcialmente purificado. Este estudio proporcionó dos resultados claros. 1. Los nucleótidos que flanquean el CDE o el núcleo de E2FBS (regiones 1 y 2) desempeñan un importante papel en la unión de E2F. En cambio, los mismos restos no influyen de forma apreciable sobre la unión de CDF-1. Aunque los nucleótidos en la región 1 (CT en B-myb) influyen sobre la máxima unión de DP1/E2F-4 (B-Cl en la Tabla 2) , el resto G en la región 2 es crucial para la interacción con todos los complejos E2F (B-C,2 y B-C2 en la Tabla 2) . En concordancia con esta conclusión, la introducción de regiones i y 2 de B-myb pero no de región i sólo, confiere en el CDE de cdc25C la capacidad de interaccionar con complejos DP1/E2F-1, -3 y -4 con elevada efica- cia (C-Bl,2 en la Tabla 2) . En cambio, ninguno de estos cambios de nucleótidos alrededor del núcleo de E2FBS o del CDE afectó a la unión de CDF-l (B-Cl y B-C1,2; B-C; C-Bl y C-Bl,2 en la Tabla 2) . 2. Lo contrario era cierto para la unión de CDF-l: la es- tructura del CHR tenía un fuerte impacto sobre la unión de CDF-1 aunque no inluía sobre la unión de E2F, y en este aspecto la región 4 era la crucial. Así, el intercambio de dos nucleótidos en esta región entre cdc25C y B-myb condujo a un fuerte aumento de la unión de CDF-l al promotor B-myb (B-C4 en la Tabla 2) , mientras que el intercambio contrario destruyó la unión de CDF-l al promotor cdc25C (C-B4 en la Tabla 2) . Por el contrario, los cambios en el CHR en la región 4 no afectó a la unión de complejos E2F. Dado que era formalmente posible que el B yb-CHR se extendiese más allá de los límites determi- nados para el CHR de cdc2?C y los dos promotores difiriesen en estas posiciones (regiones 3 y 5 en la tabla) no pudo excluirse que C-B4 no interaccione con CDF-1 debido a un Bmyb-CHR incompleto. Por consiguiente los nucleótidos de B-myb encontrados en las regiones 3 y 5 fueron también introducidos en la secuencia de cdc25C además del cambio en la región 4 (C-B3,4, C-B3,4,5 y C- B4,5 en la Tabla 2). Sin embargo, estas alteraciones adicionales pudieron restablecer la unión de CDF-l solamente hasta un alcance marginal, confirmando que las se- cuencias Bmyb-CHR y cdc25C-CHR no son equivalentes con respecto a interacción con proteínas .

Finalmente se analizó cómo la interacción diferencial de complejos E2F y CDF con B-myb y cdc25C observada anteriormen-te afectaría a la represión de la transcripción regulada por el ciclo celular y a la temporizacion de la regulación. Las mismas secuencias ensayadas para la unión de E2F y CDF-l fueron introducidas en entes artificiales de luciferasa del promotor B-myb y cdc25C y ensayadas en cuanto a la actividad en células NIH3T3 estimuladas por suero que habían sido sincronizadas en G0. Los datos de la Tabla 2 indican que la anulación de la unión de E2F al promotor B-myb en presencia de unión de CDF-1 similar al tipo silvestre deteriora la represión en G0 (véase B-Cl, 2) . Esta observación indicó intensa-mente que los complejos E2F, en vez de los CDF-1, son responsables de la transcripción del gen B-myb regulada por el ci-cío celular lo que está de acuerdo con la relativamente baja afinidad de CDF-l por el promotor B-myb. En cambio, se pudo encontrar que mutaciones en el CDE de cdc25C que anulan la unión de CDF-1 también deterioran la regulación del ciclo celular. Del mismo modo, la sustitución del cdc25C con la de B-myb abóle la unión de CDF-l así como la represión en G0 (C-B4; C-B3,4 y D-B3,4,5 en la Tabla 2) . El ente artificial contrario que alberga un CHR de cdc2?C en una base de promotor B-myb (B-C4) indicó una cinética de ciclo celular intermedia, es decir, un retardo en la desrepresión de la transcripción relativo al B- yb de tipo silvestre de 3 horas. 2.3 Ejemplo de la construcción y uso de un ente artificial génico para la terapia génica de acuerdo con la inven- ción. El ente artificial génico seleccionado tiene los siguientes componentes de DNA (listados aguas abajo a partir de 5 ' a 3 ' ) : la región promotor/intensificador temprano del SV40 (nucleótidos 48 a 5191; Tooze (ed.), DNA tumor Viruses (Cold Spring Harbor, Nueva York, Nueva York, Cold Spring Harbor Laboratory; Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995)) unida a la ID. SEC. NO. : 1 unida a la secuencia GCCACC (Kodak, J. Cell Biol., 108, 229 (1989)) unida al cDNA para el péptido señal de la inmunoglobulina (secuencia de nucleótidos = 63 a = 107; Riechmann et al., Nature 332, 323 (1988)) unida al cDNA para ß-glucuronidasa (secuencia de nucleótidos = 93 a = 1982; Oshima et al., PNAS USA 84, 665 (1987)). El ente artificial génico se clona en un vector de plásmido pUC18/l9. El ligamiento de los diferentes componentes del ente artificial génico se hace a través de sitios adecuados que son preservados en los términos de cada componente mediante amplificación por PCR. Además, se usan ligasas específicas para los sitios de restricción elegidos. Estas ligasas son comercialmente disponibles y conocidas por los exper-tos en la técnica. Células endotélicas del cordón umbilical humano cultiva-das (HuVEC) son transfectadas con los plásmidos descritos anteriormente de acuerdo con el método descrito por Lucibello et al. (EMBO J. 14, 132 (1995)). La cantidad de ß-glucuronidasa producida por las HuVECs se mide usando 4-metilumbeliferil-ß-glucurónido como sustrato. Para ensayar la especificidad específica del ciclo celular, células endotélicas son sincronizadas en G0/Gx mediante privación de metionina durante 48 horas. El contenido de DNA de las células se mide mediante análisis de FACS tiñendo con Hoechst 33258 (Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995)). Pueden conseguirse los resultados siguientes: 1. Las HuVECs transfectadas segregan mucha más ß-glucuronidasa en comparación con las HuVECs no transfectadas . 2. Las HuVECs en proliferación (DNA > 2S) segregan significativamente más glucuronidasa que las HuVECs sincronizadas en G0/G1. 3. En consecuencia, la ID. SEC. NO.: 1 conduce a una expresión específica del ciclo celular de ß-glucuronidasa en HuVECs transfectadas con un ente artificial génico descrito anteriormente.

Tabla 1 : entes artificiales de mutaciones Tabla 2: 15

Claims (3)

1. REIVINDICACIONES Ia . Un ente artificial de ácidos nucleicos que comprende: a) al menos una secuencia activadora; b) al menos un módulo promotor quimérico que comprende una secuencia de nucleótidos que se une a una proteína de la familia E2F y a una proteína de la familia CDF-l; y c) al menos un gen estructural, en el que dicho módulo promotor quimérico provoca una regulación " up" de la expresión génica en el ciclo celular más tarde que el promotor B-myb pero antes que el promotor cdc25C.
2. 2*. Un ente artificial de ácidos nucleicos según la reivindicación Ia, en el que dicha secuencia activadora está aguas arriba de dicho módulo promotor quimérico.
3. 3*. Un ente artificial de ácidos nucleicos según las reivindicaciones la o 2a, en el que dicho módulo promotor quimérico comprende al menos una secuencia de nucleótidos que se elige entre el grupo formado por ACTTGGCGGGAGATTTGAAT (ID. SEC. NO.: 1) y GCTTGGCGG^AGGTTTGAAT (ID. SEC. NO.: 2). 4a. Un ente artificial de ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones 1" a 3a, en el que dicho módulo promotor quimérico interacciona con dicha secuencia activadora, y en el que dicha interacción afecta a la expresión de dicho gen estructural. 5a. Un ente artificial de ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones Ia a 4a, en el que dicha secuencia activadora es específica de la célula, específica metabólica o específica del virus. 6a. Un ente artificial de ácidos nucleicos según la reivindicación 5a, en el que dicha secuencia activadora específica de la célula es activada en una célula elegida entre el grupo formado por una célula endotélica, una célula se-rosal, una célula de la musculatura lisa, una célula muscu-lar, una célula sinovial, un macrófago, un linfocito, una célula leucémica, una célula tumoral, una célula de queratino-cito y una célula glial. 7a . Un ente artificial de ácidos nucleicos según la reivindicación 5a, en el que dicha secuencia activadora específica del virus es una secuencia promotora o intensificadora derivada de un virus elegido entre el grupo formado por HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV, CMV, SV40 y HIV. 8a. Un ente artificial de ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones Ia a 7a, en el que dicho gen estructural codifica una enzima o una proteína de fusión entre un ligando y una enzima que convierte o segmenta un precursor de un producto farmacéutico para producir un producto farmacéutico. 9a. Un ente artificial de ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones 6a a 12a, en el que dicho gen estructural codifica una sustancia que se elige entre el gru-po formado por una citocina, un factor de crecimiento, un receptor de citocina, un receptor del factor de crecimiento, una proteína que tiene un efecto antiproliferante, una proteína que tiene un efecto apoptótico, una proteína que tiene un efecto citostático, una proteína que tiene un efecto ci-totóxico, una proteína que tiene un efecto inflamatorio, una proteína que tiene un efecto antiinflamatorio, una proteína que tiene un efecto inmunosupresor, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un inhibidor de la angiogénesis, un factor de coagulación, un compuesto fibrinolítico y un autocoa-guiante, una proteína sanguínea, un antígeno viral, un antígeno bacteriano y un antígeno tumoral y una proteína de fu-sión entre un ligando y una de las sustancias anteriormente mencionadas . 10a. Un ente artificial de ácidos nucleicos según las reivindicaciones 8a o 9a, en el que dicho ligando se elige entre el grupo formado por un factor de crecimiento, una citocina o un anticuerpo. 11a. Un ente artificial de ácidos nucleicos según cual-quiera de las reivindicaciones Ia a 10a, en el que dicho ácido nucleico es DNA. 12a. Un ente artificial de ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones Ia a 11a, en el que dicho ente artificial contiene los siguientes componentes en dirección 5' - 3' : nucleótidos 48 a 5191 de la región promotor/intensificador temprano del SV40 unida a un fragmento de DNA que contiene la secuencia ACTTGGCGGGAGATTTGAAT (ID. SEC. NO. : 1) unida a los nucleótidos 63 a 107 que codifican el péptido señal de una inmunoglobulina unida a los nucleótidos 93 a 1982 del cDNA de ß-glucuronidasa. 13a. Un vector que comprende un ente artificial de ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones Ia a 12a. 14a. Un vector según la reivindicación 13a, en el que dicho vector es un vector no viral . 15a. Un vector según la reivindicación 13a, en el que dicho vector es un vector viral . 16a. Una célula que comprende un ente artificial de ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones Ia a 12* o un vector según cualquiera de las reivindicaciones 13a a 15a . 17a. Un procedimiento para preparar un ente artificial de ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones Ia a 12a o un vector según cualquiera de las reivindicaciones 13a a 16a, en el que los elementos de dicho ente artificial son ligados por etapas . 18a . El uso de un ente artificial de ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones Ia a 12a o de un vector según cualquiera de las reivindicaciones 13a a 16a, para preparar un producto farmacéutico para el tratamiento de una enfermedad tumoral, una leucemia, una enfermedad cardiovascular, reacciones inflamatorias, una enfermedad autoinmu-nitaria, una alergia, una artritis, una enfermedad psoriási-ca, un rechazo inminente de un órgano trasplantado, un daño en el SNC, una enfermedad infecciosa, un trastorno de la coagulación sanguínea y/o una infección viral crónica. 19a. Proteína CDF-l que puede obtenerse mediante las etapas siguientes: (a) preparar un extracto nuclear de células HeLa, y (b) purificar el extracto de la etapa (a) mediante cromatografía de afinidad en presencia de un oligonucleótido que contiene un motivo de la secuencia de CDE-CHR. 20a. Proteína CDF-l según la reivindicación 19a, en la que el motivo de la secuencia de CDE-CHR contiene la secuencia GGCTG GCGGA AGGTT TGAAT. 21a. Proteína CDF-l según la reivindicación 19a, en la que el motivo de la secuencia de CDE-CHR contiene la secuencia GGCTG GCGGA AGGTT TGAAT GGCTG GCGGA AGGTT TGAAT. 22a. Proteína CDF-l según cualquiera de las reivindica-ciones 19a a 21a, en la que dicho oligonucleótido se acopla con agarosa. 23a. Proteína CDF-l según cualquiera de las reivindicaciones 19a a 22a, en la que el extracto nuclear se prepara mediante extracción salina de células HeLa. 24a. El uso de la proteína CDF-l según cualquiera de las reivindicaciones 19a a 23a para identificar inhibidores o estimuladores de CDF-l.