MXPA98001957A - Promotor del gen cdc25b, su preparacion y uso - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al promotor del gen cdc25B, a un procedimiento para encontrar promotores de cdc25B y a su uso para preparar un producto farmacéutico.

Description

Promotor del gen cdc25B, su preparación y uso La invención se refiere al promotor del gen cdc25B, a un procedimiento para encontrar promotores de cdc25B y al uso del promotor de cdc25B para preparar un producto farmacéutico. La división de la célula se subdivide en las fases consecutivas G0 o G1# S, G2 y M. La fase S es la fase de la síntesis de ADN; es seguida de la fase de transición G2 (fase G2) que, a su vez, es seguida por la fase de mitosis (fase M) , en la que célula progenitora se divide en dos células hijas. La fase de reposo G0 (fase G0) o la fase de transición Gx (fase G está situada entre la fase M y la fase S. La división celular es impulsada por un grupo de proteína quinasas, es decir los complejos de ciclina/cdk. Estos comprenden una subunidad catalítica [quinasa dependiente de ciclina (cdk, por ejemplo cdkl, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) y una subunidad reguladora, es decir ciclina (por ejemplo ciclina A, B1-B3, D1-D3, E, H o C] . Los diferentes complejos de cdk son particularmente activos en cada fase del ciclo celular, por ejemplo los complejos de cdk cdk4/ciclina Dl-3 y cdkd/ciclina Dl-3 en la fase media Gl t el complejo de cdk cdk2/ciclina E en la fase taría Gl t el complejo de cdk cdk2/ciclina A en la fase S y los complejos de cdk cdkl/ciclina Bl-3 y cdkl/cilina A en la fase de transición G2/M. La actividad de los complejos de ciclina/cdk comprende fosforilar y, por consiguiente, activar o inactivar proteínas que están directa o indirectamente implicadas en la regulación de la síntesis de ADN y en la mitosis . En correspondencia con su función en el ciclo celular, los genes para algunas ciclinas y cdk's son periódicamente transcritos y/o periódisamente activados o inhibidos, por ejemplo por medio de la degradasión sontrolada de ciclinas, por medio de la unión espesífisa de la fase del ciclo celular de inhibidores (por ejemplo pl6IMK4A, pl5INK4A, p21Clpl,p27Kxpl, pl8INK4C, pl9INK D y P57) o por medio de una modificación activando (por ejemplo fosfatasas cdc25 o cdk7/ciclina H) o inhibiendo (por ejemplo ee 1 quinasa) enzimas (revisiones en Zwicker y Müller, Progr . Cell Cycle Res., 1, 91 (1995); La Thangue, Curr. Opin. Cell Biol., 6, 443 (1994),- MacLachlan et al., Crit. Rev. Eukaryotic Gene Expr., 5, 127 (1995)). Los eucariotas superiores poseen al menos tres fosfata- sas cdc25, a saber cdc25A, cdc25B y cdc25C. Los ADNc's de los genes para estas fosfatasas ya han sido clonados y analizados (Okazaki et al., Gene 178, 111 (1996); Galaktiono et al., Cell 67, 1181 (199D) . Las tres fosfatasas aparecen periódi- samente en el ciclo celular. Sin embargo, las funciones activantes de estas fosfatasas cdc25 son evidentemente diferentes (Jinno et al., EMBO J. 13, 1549 (1994); Honda et al., FEBS Lett. 318, 331 (1993); Hoffmann et al., EMBO J. 13, 4302 (1994) ) : cdc25A se expresa predominantemente en la fase tardía G, y, en particular, regula la transición de la fase Gt a la fase S (inicio del ciclo celular) activando complejos de - cdk/ciclina; es propiamente regulada por Myc (transcripsión) y Raf (actividad) . cds25B desfosforila las tirosinas (tirosina 14 y tirosina 15) en la bolsa de unión a ATP de sdkl, condusiendo con ello a su activación; además, se puede estimular por parte de ciclina B (1-3) independientemente de cdkl, y su expresión se desrregula y aumenta en células infectadas con virus (SV40 o PVH) . sds25s desfosforila las tirosinas (tirosina 14 y tirosina 15) en la bolsa de unión a ATP de cdkl, conduciendo con ello a su activación; se expresa, en particular, en la fase G2 y regula la entrada en la fase M. La expresión periódica de cdc25C en la fase G2 del ciclo celular está esencialmente regulada por un elemento (CDE-CHR) en la región del promotor de cdc25C, elemento que es ocupado por una proteína represora en la fase Go/G^ y está libre en la fase G2. Aun cuando la secuencia de nucleótidos de este elemento del promotor ha sido identificada e, igualmente, también se ha encontrado en los promotores de los genes para la ciclina A y cdkl, en el promotor para Bmyb se ha detectado una secuencia de nucleótidos (E2FBS-CHR) que difiere en cierta medida. La investigación del modo de funcionamiento dependiente del ciclo celular de estos elementos del promotor ha demostrado que su bloqueo en la fase GQ/G-L es seguido por una suprarregulación de la transcripción del gen relevante, suprarregulación que tiene lugar particularmente en una fase temprana (en la fase Gí media) en el caso del gen B-myb, en la fase de transición G /S en el caso de la ciclina A, en la fase S en el caso del gen cdkl, y sólo en la fase tardía S en el caso del gen cdc25C (Zwicker y Müller, Progress in Cell Cycle Res. 1, 91 (1995); Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995); Liu et al., Nucí. Acids Res. 24, 2905 (1995) ,-Z icker et al., Nucí. Acids Res. 23, 3822 (1995); EMBO J. 14, 4514 (1995) ) . Se ha encontrado, además, que el elemento CDE-CHR (del promotor para ciclina 25C, ciclina A y el gen cdkl) y el elemento E2FBS-CHR (del promotor para el gen B-myb) no sólo son capaces de inhibir la activación y la transcripción de los genes homólogos en la fase GQ/G-L, sino que son también capaces de inhibir la activación y transcripción de otros genes (véanse, por ejemplo, los documentos WO96/06943, DE19605274.2, DE19617851.7 , WO96/06940, O96/06938, O96/06941 y O96/06939) . Estas solicitudes de patente describen la combinación de un promotor dependiente del ciclo celular con un promotor no específico, específico de la célula, específico del virus o activable metabólicamente con el fin de activar la transcripción de un gen efector que codifica una proteína para la profilaxis y/o terapia de una enfermedad, de una manera regulada. Enfermedades de este tipo pueden ser, por ejemplo, enfermedades tumorales, leusemias, enfermedades autoinmunes, artritis, alergias, inflamasiones, reshase de órganos trasplantados, enfermedades del sistema sirsulatorio sanguíneo o del sistema de la coagulación sanguínea, o infecciones o lesiones del sistema nervioso central. El denominado promotor quimérico es un ejemplo particular de esta posibilidad de combinar diferentes promotores con un elemento del promotor específico del ciclo celular. En este promotor quimérico, la actividad de una secuencia de activasión (o secuencia de promotor) no espesífica, específica de la célula, específica del virus o metabólicamente activable está en gran medida restringida a las fases S y G2 del ciclo celular por el elemento del promotor CDE-CHR o E2FBS-CRH que inmediatamente se une a ella más ab jo. Subsiguientes investigaciones sobre el modo de actuación del elemento del promotor CDE-CHR revelaron, en particular, que la regulación dependiente del ciclo celular por parte del elemento CDE-CHR de una secuencia de activador situada más arriba depende, en gran medida, de si la secuencia de activación es activada por factores de transcripción que tienen dominios de activación ricos en glutamina (Z icker et al., Nucí. Acids Res. 23, 3822 (1995)). Ejemplos de estos factores de transcripción son Spl y NF-Y. Esto limita, por consiguiente, el uso del elemento del promotor CDE-CHR para promotores quiméricos. Lo mismo ha de ser asumido como cierto para el elemento del promotor E2F-BS--CHB del gen B-myb (Zwicker et al., Nucí. Acids Res. 23, 3822 (1995) ) . Por lo tanto, el objeto de la presente invención es encontrar promotores específicos del ciclo celular y elementos de promotor cuya represión específica de G0 y específica de G_ dependa de circunstancias distintas a las que está sometido el elemento del promotor CDE-CHR. Cuando se analizaron la secuencia de nucleótidos del promotor del gen cdc25B urínico y la secuencia de nucleótidos de la región 5' no codificante situada inmediatamente más abajo, incluida la región de iniciación (o partida) del gen cdc25B (secuencia de nucleótidos -950 a +167) , se encontró que las regiones funcionales de la secuencia del promotor cdc25B contiene dos cajas E, dos sitios de unión a E2F (putativos) , cuatro sitios de unión a SP1 (putativos) , un sitio de unión a NF-Y (putativo) y una caja TATA. Sorprenden-temente, no era posible encontrar ninguna secuencia de nucleótidos con una homología con CDE-CHR o E2FBS-CHR. Por consiguiente, las regiones funcionales de la secuencia del promotor cdc25B son claramente diferentes de las regiones funcionales del promotor de cdc25C, de ciclina A, del gen cdkl y del gen B-myb. Además, es sorprendente que hasta ahora no exista ningún informe de un promotor del gen del ciclo celular que contenga una caja TATA funcional. Por lo tanto, la presente invención se refiere al promotor del gen cdc25B, promotor que contiene una secuencia que es inhibida, en condiciones rigurosas, con una secuencia, según se describe en la Tabla 1 (SEQ ID No : 7) o una parte funcional de la misma, en particular al promotor que tiene la secuencia descrita en la Tabla 1 (SEQ ID No : 7) o una parte funcional de la misma. La secuencia completa, o fragmentos, del promotor de cdc25B se clonaron en un plásmido situado más arriba de un gen luciferasa, y estos plásmidos se transfestaron en fibroblastos en reposo y proliferantes, de ratón o ser humano, y se midió la cantidad de lusiferasa expresada. Se encontró que (en contraposición con la posición en células proliferantes) la secuencia cdc25B clonada (región de promotor y 5' no codificante; aproximadamente -950 a aproximadamente +167) conducía a una fuerte supresión de la expresión del gen luciferasa en células en reposo, reduciéndose esta supresión de una manera escalonada haciendo deleciones en el extremo 5' del promotor de cdc25B (desde aproximadamente -950 a aproximadamente +167 a aproximadamente -30 a aproximadamente +167) . Los fragmentos de deleción que eran menores que aproxi-madamente -180 a aproximadamente +167 condujeron a que se redujera también la actividad del promotor en células proliferantes.

Dentro del significado de la presente invención, las partes funcionales han de entenderse, por lo tanto, que son, en particular, los sitios de unión al factor de transcripción detallados anteriormente, especialmente cuando abarcan más de aproximadamente 50% del promotor completo. Se da una particular preferencia a las partes funcionales que contienen la caja TATA, al menos un sitio de unión a SP1, al menos un sitio de unión a NFY y, en caso apropiado, al menos un sitio de unión a E2F y, cuando es apropiado, al menos una caja E, de modo que sea posible lograr una expresión, dependiente del ciclo celular, de un gen efector. Estas secuencias de promotor incluyen, en particular, secuencias de promotor del gen cdc25B murínico,- sin embargo, también incluyen las secuencias de promotor del gen cdc25B humano. Otras partes preferidas del nuevo promotor son, de acuerdo con la Tabla 1, los nucleótidos desde aproximadamente -950 a aproximadamente +167, desde aproximadamente -950 a aproximadamente +3, desde aproximadamente -930 a aproximadamente +3, desde aproximadamente -720 a aproximadamente +3, desde aproximadamente -340 a aproximadamente +3, desde aproximadamente -180 a aproximadamente +3, desde aproximadamente -100 hasta aproximadamente +3, desde aproximadamente -80 a aproximadamente +3, desde aproximadamente -60 a aproximadamente +3 o desde aproximadamente -30 a aproximadamente +3, y también partes de las mismas que contienen los correspondientes elementos reguladores cis funcionales de acuerdo con la figura 6, en particular deleciones en 5' y/o deleciones en 3' . La presente invención también se refiere a un procedí -miento para encontrar promotores de cdc25B, en el que un nuevo promotor o una parte del mismo es marcado, preferiblemente marcado radiactivamente, y las genotecas de ADN genómicas, preferiblemente de células de -mamíferos, se rastrean por medio de hibridación en condiciones rigurosas. A la persona experta en la materia le resulta familiar, por ejemplo a partir de Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, la preparación de genotecas de ADN genómicas y la hibridación en condiciones rigurosas . Las condiciones de hibridación pueden optimizarse, por ejemplo, tal como se describe por Szostak, J.W. et al. (1979) Hybridization with synthetic oligonucleotides, Methods in Enzymol. 68, 419-482. Por ejemplo, con el fin de aislar el promotor de cdc25B murínico, una genoteca de fagos genómica murínica que, por ejemplo, se obtuvo de la raza de ratón 129 FVJ, Stratagene, se puede rastrear con una sonda que contiene una parte de la secuencia descrita en la Tabla 1 (SEQ ID NO: 7) , que contiene preferiblemente la secuencia SEQ ID NO : 4. La presente invención se refiere adicionalmente a una construcción de ácido nucleico que contiene al menos un nuevo promotor. Preferiblemente, la secuencia del nuevo promotor del gen cdc25B se combina con un gen estructural, es decir en general con un gen que codifica una proteína o un ARN en la forma de un compuesto activo. En el caso más simple, esta combinación puede constituir una construcción de ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos del nuevo promotor para el gen cdc25B y un gen estructural, activando el promotor la transcripción del gen estructural, preferiblemente de una manera dependiente del ciclo celular. El nuevo promotor se dispone preferiblemente más arriba del gen estructural . En otra realización preferida, la región 5' no codificadora del gen cdc25B (sesuencia de nucleótidos desde +1 a aproximadamente +167) se inserta entre el nuevo promotor y el gen estrustural . En otra realización preferida, el nuevo promotor se combina con al menos una secuencia de activación adicional no específica, espesífisa del virus, metabólisamente específica, específica de la célula, específica del ciclo selular y/o dependiente de la proliferasión celular con el fin de regular la expresión de un gen estrustural. Son ejemplos promotores que son activados en células endoteliales, células perito-neales, células pleurales, células epiteliales de la piel, células del pulmón, células del tracto gastrointestinal, células del riñon y vías del drenaje de orina, células musculares, células del tejido sonjuntivo, células hematopo-yétisas, macrófagos, linfocitos,' sélulas de leucemia, células tumorales o células glía; sesuensias de promotor de virus, tales como HBV, HSV, HPV, EBV, HTLV, CMV o VIH; secuencias de promotor o reforzador que son activadas por hipoxia, secuencias de activación específicas del ciclo celular de los genes que codifican cdc25C, ciclina A, cdc2, E2F-1, B-myb y DHFR, y/o secuencias de unión, tales como monómeros o multímeros de la caja Myc E, para factores de transcripción que aparecen o son activados de una manera dependiente de la proliferación celular. • Para combinar el nuevo promotor con al menos un promotor adicional se pueden utilizar diversas técnicas. Estas técnicas se describen, por ejemplo, en los documentos DE19617851.7, DE19639103.2 y DE19651443.6. En otra realización preferida de esta invención, se selecciona una construcción de ácido nucleico para la combinación del nuevo promotor con al menos un promotor o reforzador adicional que contiene al nuevo promotor en una forma en la que está mutado en al menos un sitio de unión para un factor de transcripsión. Esta mutación bloquea la iniciación de la transcripción del gen estructural . Otros componentes de la construcsión de ácido nucleico son, cuando es apropiado, el gen estructural, al menos una secuencia de promotor o una secuensia de reforzador adicionales que pueden ser astivadas de una manera no específica, específica de la célula o específica del virus, por parte de tetraciclina y/o de una manera específica del ciclo celular, y que activa la transcripción de al menos un gen estructural adicional que codifica al menos un factor de transcripción que está mutado, de modo que se une al o a los sitios de unión imitados del nuevo promotor y activa a este promotor, y/o el gen estructural que codifica un factor de transcripción.

La disposición de los componentes individuales se representa, a título de ejemplo, por el diagrama de la figura 1. En una realización ejemplar de esta invención, la mutación puede ser una mutación de la caja TATA del nuevo pro-motor. La caja TATA (TATAAA o TATATAA) es reconocida como un sitio de unión para el complejo de iniciación de las ARN-po-limerasas II y III que están presentes en el núcleo de la célula. La iniciación de la transcripción, aproximadamente 30 bases más abajo de la caja TATA, se efectúa mediante unión de la proteína de unión a la caja TATA (TBP) que está implicada en la reacción de transcripción de todas las ARN-polimerasas (I, II y III) que están presentes en el núcleo de la célula. Un ejemplo de un promotor estrictamente dependiente de la caja TATA es el promotor para el gen U6 , que se transcribe por parte de ARN-polimerasa III y cuyo producto génico está implicado en el corte y empalme de ARNm. Un ejemplo de una mutación de la secuencia de la caja TATA puede ser TGTATAA. Como resultado de esta mutación, el sitio de unión a ADN de la TBP normal ya no se reconoce y el gen codificante no se transcribe más de forma eficaz. En el caso de una mutación de este tipo, el gen que codifica el factor de transcripción es una secuencia de ácido nucleico que codifica una TBP comutada. Como resultado de esta cotnu-tación, la TBP se une a la caja TATA mutada (por ejemplo a TGTATAA) y, con ello, conduce a una transcripción eficaz del gen estructural . Comutaciones de este tipo del gen de TBP han sido descritas, por ejemplo, por Strubin y Struhl (Cell, 68, 721 (1992)) y por Heard et al. (EMBO J. , 12, 3519 (1993)). Una realización particularmente preferida es una cons-trucsión de ásido nusleiso, que comprende (1) el nuevo promotor de la caja TATA que incluye el gen cdc25B, estando la secuencia de la caja TATA mutada en TGTA, (2) la secuencia GCCACC, (3) el ADNc para el péptido señal de inmunoglobulina (secuencia de nucleótidos = 63 a = 107) , (4) el ADNc para el péptido señal de inmunoglobulina (secuencia de nucleótidos = 93 a = 1982), (5) el promotor del gen vWF (secuencia de nucleótidos -487 a +247) , y (6) el ADNc para la proteína de unión a la caja TATA (secuencia de ácidos nucleicos de 1 a 1001, que está mutada en las posiciones del ácido nucleico 862 (A reemplazado por T) , 889 y 890 (GT reemplazado por AC) y 895 (C reemplazado por G) ) . En otra realización preferida de esta invención, se selecciona una construcción de ácido nucleico para la combinación del nuevo promotor con al menos un promotor adicional que se denomina un promotor múltiple que tiene una señal de retención nuclear y un factor de exportación y que comprende los siguientes componentes: a) una primera secuencia (I) de promotor o reforzador no específica, específica de la célula o específica del virus que puede ser activada metabólicamente y/o de forma específica del ciclo celular que activa la transcripción basal de un gen estructural, b) un gen estructural, c) una señal de retención nuclear (NRS) , cuyo ADNc está enlazado, directamente o indirectamente, en su extremo 5', al extremo 3' del gen estructural, teniendo preferí- blemente el producto de transcripción de la señal de retención nuclear una estructura para unir un factor de exportación nuclear, d) una secuencia (II) de promotor o reforzador adicional, que activa la transcripción basal de un factor de exportación nuclear (NEF) , y e) un ácido nucleico que codifica un factor de exportación nuclear (NEF) que se une al producto de transcripción de la señal de retención nuclear y, con ello, interviene en el transporte del producto de transcripción del gen estructural fuera del núcleo de la célula. Dentro del significado de esta invención, al menos uno de los componentes del promotor constituye el nuevo promotor. La primera (I) secuencia de promotor o reforzador (a) y la segunda (II) secuencia de promotor o reforzador (d) pueden ser idénticas o diferentes y, cuando es apropiado, pueden ser activables de forma no específica, de forma específica de la célula, de forma específisa del virus o metabólicamente, en particular por hipoxia, o constituir un promotor espesífico del cislo celular adicional . La disposición de los componentes individuales está representada, por ejemplo, en la figura 2. En las nuevas construcciones de ácido nucleico, los componentes d) y e) pueden estar situados más arriba o más abajo de los componentes a) , b) y c) (véase también la figura 2) . Preferiblemente, el gen que codifica la señal de retención nuclear (NRS) se selecciona del elemento que responde a rev (RRE) de VIH-1 o VIH-2, la señal de retención equivalente a RRE de retrovirus o la señal de retención equivalente a RRE de HBV. El gen que codifica el factor de exportación nuclear (NEF) es preferiblemente un gen que se selecciona del gen rev de los virus VIH-1 o VIH-2, virus visna-maedi, virus de la artritis-encefalitis caprina, virus de la anemia infecciosa equina, virus de la inmunodeficiencia felina, retrovirus o HTLV, codificando el gen la proteína hnRNP-Al o codificando el gen el factor de transcripción TFIII-A. En otra realización preferida, al menos una secuencia de promotor o reforzador (componente a) o d) ) en las nuevas construcciones de ácido nucleico es una construcción de un gen que se denomina una unidad de promotor que responde al activador y que comprende preferiblemente los siguientes somponentes : f) una o más secuencias de promotor o reforzador idénticas o diferentes que pueden ser activadas, por ejemplo, de forma específica del ciclo celular, de forma dependiente de la proliferación celular, de forma metabólica, de forma específica de la célula o de forma específica del virus, o tanto de forma específica del ciclo celular como metabólicamente, de forma específica de la célula o de forma específica del virus (los denominados promotores quiméricos) , g) una o más subunidades de activador idénticas o diferentes que están en cada caso situadas más abajo de las secuencias de promotor o reforzador y cuya transcripción basal es activada por estas secuencias, h) un promotor que responde al activador que es activado por los productos de expresión de una o más subunidades de activador. En la figura 3 se ilustra la disposición de los componentes individuales de una unidad de promotor que responde al activador preferida. La inserción de una unidad de promotor que responde al activador preferida en una nueva construcción de ácido nucleico se ilustra, por ejemplo, en la figura 4. En estas unidades de promotor que responden al activa-dor, que se representan a título de ejemplo en las figuras 3 y 4, al menos un promotor (I, II, III o IV) puede constituir el nuevo promotor. En una realización preferida, las unidades de promotor que responde al activador pueden constituir secuencias de unión para factores de transcripción quiméricos que están constituidos por dominios de unión a ADN, dominios de interacción proteína/proteína y dominios de transactivación. Todos los sitios de unión del fastor de transcripsión que se mensionan en la presente invención pueden estar presentes una vez (monómeros) o en varias copias (multímeros, por ejemplo hasta aproximadamente 10 copias) . El operador LexA en combinación con el promotor de SV40 es un ejemplo de un promotor que responde al activador (h) que es activado por dos subunidades de activador (g y g' ) . Este promotor contiene, por ejemplo, las siguientes subunidades de activador: (1) la primera subunidad de activador (g) contiene el ADNc que codifica los aminoácidos 1-81 ó 1-202 de la proteína de unión a ADN de LexA, cuyo extremo 3' está enlazado al extremo 5' del ADNc que codifica la proteína Gal80 (aminoácidos 1-435), y (2) la segunda subunidad de activador (g' ) contiene el ADNc que codifica el dominio de unión a Gal80 de la proteína Gal4 que codifisa los aminoásidos 851-881, cuyo extremo 3' está enlazado al extremo 5' del ADNc que codifica los aminoácidos 126-132 del antígeno T grande de SV40, cuyo extremo 3' está enlazado al extremo 5' del ADNc que codifica los aminoácidos 406-488 del dominio de transactivación VP16 de HSV-1. La secuencia de unión para la proteína Gal4 en combináción con el promotor de SV40 es otro ejemplo de un promotor que responde al activador que es activado por dos subunidades de activador (g y g' ) . Este promotor contiene, por ejemplo, las siguientes subunidades de activador: (1) la primera subunidad de activador (g) contiene el ADNc que codifica el dominio de unión a ADN de la proteína Gal4 (aminoásidos 1-147), suyo extremo 3' está enlazado al extremo 5' del ADNc para la proteína Gal80 (aminoácidos 1-435) , y (2) la segunda subunidad de activador (g' ) contiene el ADNc que codifica el dominio de unión a Gal80 de Gal4 (aminoácidos 851 a 881), cuyo extremo 3' está enlazado al extremo 5' del ADNc que codifica la señal de localización nuclear de SV40 (T grande de SV40, aminoácidos 126- -132), cuyo extremo 3' está enlazado al extremo 5' del ADNc que codifica los aminoácidos 406-488 del dominio de transactivación VP16 de HSV-l. Otro ejemplo de dos subunidades de activador (g y g' ) que activan el promotor que responde al activador que contiene la secuencia para unir la proteína Gal4 y el promotor de SV40 es (1) la unidad de activasión (g) que contiene el ADNs que codifica el dominio citoplásmico del antígeno CD4 de células T (aminoácidos 397-435), cuyo extremo 5' está enlazado al extremo 3' del ADNc para el dominio de transactivacíón VP16 de HSV-1 (aminoácidos 406-488) , cuyo extremo 5' está enlazado, a su vez, al extremo 3' del ADNc para la señal de localización nuclear de SV40 (T grande de SV40, aminoácidos 16-132) , y (2) la unidad de activación (g' ) que contiene el ADNc que codifica la señal de localizasión nuslear de SV40 (T grande de SV40, aminoácidos 126-132), y el ADNc para el dominio de unión a ADN de la proteína Gal4 (aminoácidos 1-147) , cuyo extremo 3' está enlazado al extremo 5' del ADNc para la secuencia de unión a CD4 de la proteína p56 Ick (aminoácidos 1-71) . Por lo tanto, una realización preferida es una construcción de ácido nucleico que contiene (1) una o más subunidades de activador idénticas o diferentes, cuya transcripción basal es activada por un promotor o reforzador, y (2) un promotor que responde al activador que es activado por el producto de expresión de dicha subunidad de activador, y una realización particularmente preferida es una construc-ción de ácido nucleico que contiene, como subunidad de activador (A) , (1) el nuevo promotor, (2) la señal de localización nuclear (NLS) de SV40 (T grande de SV40, aminoácidos 126-132; PKKKRKV) , (3) el dominio de transactivación ácido (TAD) VP16 de HSV-1 (aminoácidos 406 a 488) , y (4) el ADNc que codifica la parte citoplásmica de la glicoproteína CD4 (aminoácidos 397-435) ; y, como otra subunidad de activador (B) , (1) el promotor del gen cdc25C (ácidos nucleicos -290 a (2) la señal de localización nuclear (NLS) de SV40 (T grande de SV40; aminoácidos 126-132; PKKKRKV) ; (3) el ADNc para el dominio de unión a ADN de la proteína Gal4 (aminoácidos 1 a 147) , y (4) el ADNc para la secuencia de unión a CD4 de la proteína p56 Ick (aminoácidos 1-71) y también el promotor que responde al activador que contiene hasta aproximadamente 10 copias de la secuencia de unión para la proteína de unión Gal4, que tiene la secuencia de nucleó-tidos 5' -CGGACAATGTTGACCG-3' , y el promotor de SV40 basal (secuencia de nucleótidos 48 a 5191) ; y, en caso apropiado, un gen estructural, preferiblemente un ADNc completo que codifica un compuesto activo, una enzima o una proteína de fusión que está constituida por un ligando y un compuesto activo o por un ligando y una enzima. Como norma, el gen estructural es un gen que codifica un compuesto farmacológicamente activo que se selecciona preferiblemente de enzimas, proteínas de fusión, citoquinas, qui-mioquinas, factores de crecimiento, receptores para citoqui-ñas, receptores para quimioquinas , receptores para factores de crecimiento, péptidos o proteínas con un efecto antiproliferante o citostático o apoptótico, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, inhibidores de la angiogénesis, hormonas pep-tídisas, factores de coagulasión, inhibidores de la coagula-ción, péptidos o proteínas fibrinolíticos, péptidos o proteínas que tienen un efesto sobre la circulación sanguínea, proteínas del plasma sanguíneo, antígenos de agentes infecciosos, tales como antígenos bacterianos y antígenos parásitos, antígenos de células o antígenos de tumores, realizando el antígeno una acción inmune, sustancias inductores de trombosis, proteínas activantes del complemento, proteínas de revestimiento de virus y/o ribozimas. En el caso de una ribozima, el gen estructural es preferiblemente un gen que codifica una ribozima que inactiva el ARNm que codifica una proteína que se selecciona de proteínas para el control del ciclo celular, en particular, ciclina A, ciclina B, ciclina DI, ciclina E, E2F1-5, cdc2, cdc25C o DPI, proteínas de virus, citoquinas, factores de crecimiento o sus receptores . En otra realización preferida, el gen estructural puede ser un gen que codifica una enzima que essinde un precursor de un fármaco en un fármaco. En otra realización preferida, el gen estructural puede codificar una proteína de fusión de ligando/efector, siendo posible que el ligando sea un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una citoquina, un factor de crecimiento, una molécula de adhesión o una hormona peptídica, y el efector un compuesto farmacológiocamente activo según se ha descrito antes, o una enzima. Por ejemplo, el gen estructural puede codificar una proteína de fusión de ligando/enzima, escindiendo la enzima un precursor de un fármaco en un fármaco y uniéndose el ligando a la superficie de la célula, preferiblemente a células endoteliales o células tumorales . Las construcciones de ácido nucleiso están sonstituidas preferiblemente por ADN. La expresión construcciones de ácido nucleico ha de entenderse en general como estrusturas artificiales constituidas por ásidos nucleicos que pueden ser transcritos en las células diana. Preferiblemente, se insertan en un vector, siendo particularmente preferidos vectores de plásmidos o vectores virales. En general, estos vectores se administran a pacientes por vía externa o interna, local, peroral, intravesical, nasal, intrabronquial, intramuscular, subcutánea en una cavidad del cuerpo, en un órgano, en la circulación sanguínea, en el tracto respiratorio, en el tracto gastrointestinal y /o en el tracto urogenital, y se utilizan para la profilaxis o terapia de una enfermedad. Utilizando las nuevas construcciones de ácido nucleico, un gen estructural se puede expresar de forma específica de la célula, de forma espec fica del virus, en condiciones metabólicas designadas y/o de forma específica del ciclo celular, siendo el gen estructural preferiblemente un gen que codifisa un compuesto farmacológicamente activo o bien una enzima que escinde un precursor inactivo de un fármaco en un fármaco activo. El gen estructural se puede seleccionar de modo que el compuesto farmacológicamente activo o la enzima se exprese junto con un ligando como una proteína de fusión, y este ligando se une a la superfisie de células, por ejemplo células endoteliales proliferantes o células tumorales. La presente invención se refiere, además, a un procedimiento para preparar una nueva construcción de ácido nuclei- co, en el que los componentes individuales de la construcción de ácido nucleico se conectan uno con otro. La conexión de los componentes individuales se puede efectuar utilizando métodos generalmente conocidos, por ejemplo de modo enzimático o utilizando ligasas. La presente invención se refiere, adicionalmente, a células, en particular células de levaduras o de mamíferos, que albergan una nueva construcción de ácido nucleico. En una 'realización particularmente preferida, las construcciones de ácidos nucleicos se introducen en las líneas de células que pueden utilizarse, después de la transfección, para expresar el transgen. Por consiguiente, estas células se pueden utilizar para proporcionar un fármaco para pacientes. Un uso preferido de la nueva construcción de ácido nucleico comprende tratar una enfermedad, con la provisión del fármaco que comprende introducir una construcción de ácido nucleico en una célula diana y expresar la construcción de una manera específica del virus o específica de la célula diana o específica de modo metabólico o no específica y específica del ciclo celular. En general, la administración se efectúa precisamente como en el caso de las nuevas construcciones de ácido nucleiso y se utilizan igualmente para la profilaxis o terapia de enfermedades . Con el fin de preparar un fármaco, las células endoteliales se pueden aislar, por ejemplo, a partir de la sangre y transfectar in vitro con la nueva construcción de ácido nucleico, después de que son reinyectadas en el paciente, por ejemplo por vía intravenosa. Células de este tipo que han sido transfectadas in vítro también se pueden administrar a pacientes en cominación con un nuevo vector. Esta combinación tiene la ventaja de que las células y los vectores pueden ser administrados o inyectados en cada caso de modo simultáneo o en instantes diferentes, en sitios iguales o diferentes . Por lo tanto, la presente invención se refiere, además, al uso de una nueva construcción de ásido nucleico o de una nueva célula para preparar un fármaco para el tratamiento de una enfermedad que se selecciona de enfermedades tumorales, leucemias, enfermedades autoinmunes, alergias, artritis, inflamaciones, rechazos de órganos, reacciones de injerto frente a hospedante, enfermedades de la circulación sanguí-nea, enfermedades circulatorias, anemia, infecciones, enfermedades hormonales y/o lesión del sistema nervioso central. Se da particular preferencia a utilizar una célula endotelial para preparar un nuevo fármaco . Las nuevas contrucciones de ácido nucleico no se produ-cen de esta forma en la naturaleza, es decir el gen estructural no se combina de forma natural con el nuevo promotor. La aplicación en cada caso determina la elección de los promotores y del gen estructural. Los siguientes ejemplos sirven como guía a este respecto. Los documentos WO96/06940, WO96/06938, WO96/06941, WO96/06939, DE19605274.2 , DE19617851.7 , DE19639103.2 y DE19651443.6 proporsionan una dessripsión detallada de los somponentes individuales.

I) Secuencias de promotor Dentro del significado de la presente invención, secuencias de nucleótidos que, en general, después de unir factores de transcripción, activan la transcripción de un gen estruc-tural que se une al extremo 3' se han de utilizar como secuencias de promotor [componentes a), c) , f) o f')] • La elección de la o las secuencias de promotor que han de combinarse con el promotor de cdc25B depende de la enfermedad a tratar y de la célula diana a transducir. Así, es posible que la secuencia de promotor adicional sea astivable de una manera ilimitada, de una manera espesífisa de la célula diana, en condiciones metabólicas definidas, de una manera específica del ciclo celular o de una manera espesífica del virus. Además, en los componentes a), c) , f) y/o f ' ) se pueden emplear secuencias de promotor idénticas o diferentes. Ejemplos de las secuencias de promotor a seleccionar son.-secuencias de promotor y activador que se pueden activar de una manera ilimitada, tal como el promotor de ARN-polimerasa III, el promotor de ARN-polimerasa II, el promotor de CMV y el reforzador de CMV, o el promotor de SV40; secuencias de promotor y secuencias de activador virales, tales como las de HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV o VIH. Cuando se utiliza el promotor de VIH, se da preferencia a utilizar la secuencia LTR completa incluida la secuencia TAR [posición -453 a -80, Rosen et al., Cell 41, 813 (1985)] como un promotor específi-co del virus. Las secuencias de promotor incluyen, además, secuencias de promotor y reforzador activables de modo metabólico, tal como el reforzador inducible por hipoxia (Semenza et al., PNAS 88, 5680 (1991); McBurney et al., Nucí. Acids Res. 19, 5755 (1991)]; promotores astivables de modo específico del cislo celular, tales como el promotor del gen cdc25C, del gen cislina A, del gen cdc2 , del gen B-myb, del gen DHFR o del gen E2F-1, o secuencias de unión para factores de transcripción que aparecen o son activados durante la proliferación celular, tales como secuencias de unión para proteínas c-myc, incluyendo estas secuencias de unión monómeros o multímeros de la secuencia de nucleótidos que se designa la caja Myc E [5' -GGAAGCAGACCACGTGGTCTGCTTCC-3' ; Blackwood y Eisenmann, Sciense 251, 1211, (1991)]; promotores astivables por tetra-ciclina, tal como el operador de tetraciclina en combinación con un represor apropiado,- promotores quiméricos que consti-tuyen una combinación de una secuencia de activador situada más arriba que puede ser activada de modo específico de la célula, metabólicamente o de modo específico del virus, con un módulo del promotor situado más abajo que contiene, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos CDE-CHR o E2FBS-CHR, a la que se unen proteínas supresoras y, con ello, son capaces de inhibir la activación de la secuencia de activador situada más arriba en la fase G0 y en la fase G2 del ciclo celular (documento WO96/06943; Lucibello et al., EMBO J. 14, 12 (1994) ) ; promotores activables de manera específica de la célula, tales como secuencias de promotor o activador procedentes de promotores o reforzadores de los genes que codifisan proteínas que se forman preferiblemente en las células seleccionadas . Ejemplos de los promotores activables de manera específica de la célula son secuencias de promotor y activador que son activadas en células endoteliales , tales como las secuencias de promotor y activador de los genes que codifican el transportador de glucosa-1 endotelial específico del cerebro, endoglina, receptor 1 de VEGF (flt-1) , receptor 2 de VEGF (flk-1 o KDR) , til-1 o til-2, receptor de B61 (receptor Esk) , B61, endotelina, espesialmente endotelina B o endoteli-na 1, reseptores de endotelina, en particular el receptor de endotelina B, receptores de mañosa 6-fosfato, factor de von Willebrand, receptor de IL-la, IL-1/3, IL-1, molécula de adhesión de células vascular (VCAM-1) o secuencias de activador sintéticas que comprenden sitios oligomerizados para unir factores de transcripción que son preferente o selectivamente activos, por ejemplo células endoteliales. Un ejemplo es el factor de transcripción GATA 2, cuyo sitio de unión en el gen endotelina 1 es 5'-TTATCT-3' [Lee et al., Biol. Chem. 266, 16188 (1991), Dor ann et al., J. Biol. Chem. 267, 1279 (1992) y Wilson et al., Mol. Cell Biol. 10, 4854 (1990)] . Promotores activables de manera específica de la célula adicionales son secuensias de promotor o astivador que son activadas en células en la proximidad de células endoteliales activadas, tales como las secuencias de promotor y activador de los genes que codifican VEGF, siendo las secuencias reguladoras de genes para el gen VEGF la región 5' -flanqueante, la región 3 ' -flanqueante, el gen c-Src o el gen v-Src, o receptores de hormonas esteroides y sus elementos promotores (Truss y Beato, Endocr. Rev. 14, 459 (1993)), en partisular el promotor del virus de tumor mamario en ratones . Ejemplos de secuencias de promotor o activador que son activadas en las células de la musculatura, en particular en las células de la musculatura lisa, son secuencias de promotor y activador de los genes que codifican tropomiosina, a-actina, a-miosina, receptor de PDGF, receptor de FGF, MRF--4, fosfofructoquinasa A, fosfoglicerato mutasa, troponina C, miogenina, receptores de endotelina A, desmina, VEGF, ha-biéndose ya descrito antes las secuencias reguladores de genes para el gen VEGF, o promotores "artificiales". Ejemplos de promotores artificiales de este tipo son copias múltiples del sitio de unión (a ADN) para proteínas de hélice-bucle--hélice (HLH) específicas del músculo, tales como la caja E (Myo D) (por ejemplo 4x AGCAGGTGTTGGGAGGC, SEQ ID N0.:1) o copias múltiples del sitio de unión GATA 4 de la proteína del dedo de zinc de ADN del gen de la cadena pesada de a-miosina (por ejemplo 5' -GGCCGATGGGCAGATAGAGGGGGCCGATGGGCAGATAGAGG3 ' , SEQ ID NO.: 2) . Ejemplos de proteínas HLH son MyoD, Myf-5, miogenina o MRF4. Las proteínas HLH y, también, GATA 4, exhiben una transcripción específica del músculo no sólo con promotores de genes específicos del músculo, sino también en un contexto heterólogo, es decir también con promotores artificiales . Las secuencias de promotor y activador que son activadas en células glía son, en partisular, las secuencias o elementos reguladores de genes que, por ejemplo, codifican las siguientes proteínas: la proteína específica de las células de Schwann periaxina, glutamina-sintetasa, la proteína específica de células glía (proteína acida fibrilar glial = GFAP) , la proteína de células glía SlOOb, IL-6 (CNTF) , recep-tores 5-HT,TNF?!, IL-10, receptor del factor de crecimiento similar a insulina 1 y II o VEGF, habiéndose ya enumerado las secuencias reguladoras de genes para el gen VEGF. Las secuencias de promotor y activador que son activadas en sélulas hematopoyéticas son secuencias de promotor para genes para una citoquina o su recepetor que se expresan en células hematopoyéticas o en células adyacentes, tales como el estroma. Estas secuencias de promotor incluyen, por ejemplo, secuencias de promotor para las siguientes citoquinas y sus receptores: receptor del factor de células del tallo, factor de células del tallo, IL-Ia, receptor de IL-1, IL-3, receptor de IL-3 (subunidad ot) , receptor de IL-3 (subunidad ß ) , IL-6, receptor de IL-6, GM-CSF, receptor de GM-CSF (cadena a) , factor regulador del interferon 1 (IRF-1) , siendo activado el promotor de IRF-1 en igual medida por parte de IL-6 y por parte de IFN? o IFN3, eritropoyetina o receptor de eritropoyetina . Ejemplos de secuencias de promotor y activador que son activadas en linfocitos y/o macrófagos son las secuencias de promotor y activador de genes para citoquinas, receptores de citoquinas y moléculas de adhesión y receptores para el fragmento Fc de anticuerpos. Son ejemplos las secuencias de promotor para las si-guientes proteínas: receptor de IL-1, IL-lar, IL-1/3, IL-2, receptor de IL-2, IL-3, receptor de IL-3 (subunidad a) , receptor de IL-3 (subunidad ß) , IL-4, receptor de IL-4, IL-5, IL-6, receptor de IL-6, factor regulador de interferón 1 (IRF-1) , siendo activado el promotor de IRF-1 en igual medida por parte de IL-6 como por parte de IFN? o IFNJ, promotor que responde a IFN?, IL-7, IL-8, IL-10, IL-11, IFN?, GM-CSF, receptor de GM-GSF (cadena a) , IL-13, LIF, receptor del factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) , receptores depuradores de macrófagos tipo I y tipo II, MAC-1 (antígeno de la función de leucocitos) , LFA-la (antígeno de la función de leucocitos) o pl50,96 (antígeno de la función de leucoci-tos) . Las secuencias de promotor y activador que son activadas en células sinoviales son, por ejemplo, las secuencias de promotor para metaloproteinasas de la matriz (MMP) , por ejemplo para MMP1 (colagenasa intersticial) o MMP3 (estrome-lisina/transina) . Además, incluyen las secuencias de promotor para inhibidores de tejidos de metaloproteinasas (TIMP) , por ejemplo TIMP-1, TIMP-2 o TIMP-3. Ejemplos de secuencias de promotor y activador que son activadas en células de leucemia son promotores para c-myc, HSP70, bcl-1/ciclina DI, bsl-2, IL-6, IL-10, TFNa, TNF/3, HOX11, BCR-Abl, E2A-PBX1, PML-RARA (receptor de ácido retinoico de leucemia promielocítica) o c-myc, uniéndose las proteínas c-myc a multímeros de la secuencia de nucleótidos denominada una saja Myc E (5 ' -GGAAGCAGACCAGCTGGTCTGCTTCC-3 ' , SEQ ID NO.: 3) y activándolos. Un ejemplo de secuencia de promotor o activador que son activadas en células tumorales es una secuencia de nucleóti-dos reguladora de genes con la que interactúan factores de transcripción que se forman o son activos en células tumorales . Dentro del significado de esta invención, las secuencias de promotor o activador preferidas incluyen sesuensias regu-ladoras de genes o elementos procedentes de genes que, en particular, codifican proteínas que so forman en células cancerígenas o en células de sarcoma. Así, se da preferencia a utilizar el promotor de la proteína N-CAM en el caso de carcinomas bronquiales de células pequeñas, a utilizar el promotor del receptor del factor de crecimiento de la hepatitis o de L-plastina en el caso de carcinomas de ovario y a utilizar el promotor de L-plastina o de mucina epitelial polimórfica (PEM) en el caso de carcinomas pancreáticos.

II) Señales de exportación nuclear y factores de exportación nuclear En una realización preferida, la señal de retención nuclear (NRS) es una secuencia de nucleótidos que impide el transporte de un ARN premensajero, que está enlazado a la misma, a través de la membrana nuclear, pero que, por otra parte, también constituye una estructura para unir una proteína de exportasión. Esta proteína de exportación interviene en el transporte de un ARN premensajero o mensajero que contiene NRS fuera del núcleo de la célula al interior del citoplasma. Un ARN premensajero que contiene la NRS se secreta, por consiguiente, fuera del núcleo de la célula al ser unido a la proteína de exportación (Fischer et al., Cell, 82, 475 (1995) ) . Las señales de exportación nuclear (NES) son preferiblemente la secuencia del elemento que responde a rev (RRE) re-troviral . En el caso de VIH-1, este RRE es una secuencia en el gen env que abarca 243 nucleótidos (nucleótidos 7362--7595) . Sin embargo, la señal de exportación nuclear (NES) también puede ser cualquier secuencia de nucleótidos homologa y/o funcionalmente similar (análoga) , tal como el elemento equivalente a RRE del virus HBV (Huang et al., Mol. Cell Biol. , 13, 7476 (1993) ) . En las nuevas construcciones de ácido nucleico, el factor de exportación nuclear (NEF) es una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que se une al ARNm de la NRS e interviene en el transporte de ARN premensajero o ARN mensajero que contiene NRS fuera del núcleo de la célula y al interior del citoplasma (o fuera del citoplasma y al interior del núcleo de la célula) . En particular, se utiliza el gen rev procedente de retrovirus, especialmente del virus VIH-1 o VIH-2. La proteína rev procedente del gen rev retroviral se une por su dominio N-merminal al RRE en el pre-ARNm. La unión entre el RRE y la proteína rev permite que el ARN premensajero no escindido, y también cualquier otro ARN que contenga un RRE, sea transportado fuera del núcleo de la célula y al interior del citoplasma y, con ello, aumente esencialmente la traducción.

Dentro del significado de la presente invención, secuencias de nucleótidos que codifican proteínas que son homologas y funcionalmente similares a la proteína rev de VIH-1 (Bogerd et al., Cell, 82, 485 (1995)), tal como el gen rev del virus visna-maedi (VMV) o el gen rev del virus de la artritis-encefalitis caprina (CAEV) también se pueden utilizar como NEF's. Sin embargo, también se pueden emplear los genes que codifiquen proteínas que, aún cuando sólo posean una homología ligera o ninguna homología con la proteína rev, no obs-tante sean funcionalmente similares a la proteína rev de VIH-1. Ejemplos son el gen rev de HTLV-1 y los genes rev del virus de la anemia infecciosa equina (EIAV) y del virus de la inmunodeficiencia felina (FIV) . En una realización alternativa, los NEF's también pueden ser secuencias de nucleótidos para proteínas que llevan a cabo la secreción de ARN fuera del núcleo, sin que este ARN sea retenido en el núcleo por medio de una NRS. Ejemplos de estas proteínas son el factor de transcripción TFIIIA o la proteína ribonuclear nuclear heterogénea Al (proteina hnRNPAl) . En un sentido más amplio, las proteínas de transporte nuclear también incluyen la proteína de choque térmico 70 (hsc70) y el inhibidor de la proteína quinasa CPKI . Características compartidas en común por el NEF y sus proteínas homologas y análogas son un dominio que está si-tuado más hacia delante del extremo amino, uniéndose la proteína monomérica al ARN de la NRS, y un dominio que es habitualmente rico en leucina (la hnRNPAl es una exsepción de ello) y que se requiere para la función de transporte del NEF. Dentro del significado de esta invención, la expresión del gen NEF está bajo el control de una secuensia de promotor que está situada más arriba en el extremo 5' del gen NEF, tal como ya se ha descrito anteriormente en detalle.

III) Genes estructurales Dentro del significado de la invención, los genes estructurales [componente b) ] codifican un compuesto activo para la profilaxis y/o terapia de una enfermedad. Se han de selecsionar genes estructurales y secuencias de promotor con respecto a la naturaleza de la terapia de la enfermedad y tomando en consideración la célula diana a transducir. Por ejemplo, las siguientes combinaciones de secuencias de promotor y genes estructurales se han de seleccionar en asociación con las siguientes enfermedades. Una descripción detallada ya se ha dado en las solicitudes de patente WO96/06940, DE19605274.2 , DE19617851.7 , DE19639103.2 y DE19651443.6, que se incorporan en esta memoria como referencia . Ejemplos de células diana que se seleccionan para la terapia de tumores son: células endoteliales proliferantes, células del estroma y células de la musculatura que se unen a la célula endotelial, o células tumorales o células de leucemia. Los promotores son espesífisos de la célula endotelial y específisos del sislo celular o no específicos de la célula o específicos de la célula de la musculatura y específicos del ciclo celular o específicos de la célula tumoral (tumores sólidos y leucemias) y específicos del ciclo celular. Cuando se seleccionan genes estructurales para inhibido-res de la proliferación celular, por ejemplo para la proteína de retinoblastoma (pRb = pllO) o las proteínas pl07 y pl30 relacionadas, se puede elegir la siguiente estrategia: La proteína de retinoblastoma (pRb/pllO) y las proteínas pl07 y pl30 relacionadas se inactivan por fosforilación. Se da preferencia a utilizar los genes de estos inhibidores del ciclo celular que exhiban mutaciones para los sitios de inactivación de las proteínas expresadas, sin que con ello se perjudique su función. Ejemplos de estas mutaciones se han descrito para pllO. La sesuencia de ADN para la proteína pl07 o la proteína pl30 se puede mutar de una manera análoga. La proteína p53 es otro inhibidor de la proliferación celular. La proteína p53 se inactiva en la célula uniéndose a proteínas especiales, tal como MDM2 , o por oligomerización de la p53 mediante la serina-C terminal desfosforilada . Por consiguiente, se da preferencia a utilizar una secuencia de ADN para una proteína p53 que ha sido truncada por la pérdida de la serina 392 en el extremo C. Otros inhibidores son p21 (WAF-1) , la proteína pl6, otros inhibidores cdk, la proteína GADD45 o la proteína bak. Genes estructurales para factores inductores de la coagulación e inhibidores de la angiogénesis codifican, por ejemplo, el inhibidor del activador de plasminógeno l (PAI--1), PAI-2, PAI-3, angiostatina, interferones (IFNo;, IFNß o IFN) , factor de plaquetas 4, IL-12, TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3, factor inhibidor de la leucemia (LIF) o factor de tejidos (TF) y sus fragmentos que son activos en la coagulación. Genes estructurales para proteínas citostáticas y citotóxicas codifican, por ejemplo, perforina, granzima, IL--2, IL-4, IL-12, interferones, tal como IFNa, IFNS o IFN, TNF, tal como TNFa o TNF/3, oncostatina M, esfingomielinasa o magainina y derivados de magainina. Genes estructurales que codifican anticuerpos citostáti-cos o citotóxicos y proteínas de fusión entre fragmentos de anticuerpos que se unen al antígeno y proteínas cistostáti-sas, citotóxicas o inflamatorias o enzimas se pueden elegir de acuerdo con la siguiente estrategia: Los anticuerpos citostáticos o citotóxicos incluyen, por ejemplo, los que están dirigidos contra estructuras de la membrana de células endoteliales, tal como se ha descrito, por ejemplo, por Burrows et al. (Pharmac. Ther., 64, 155 (1994)), Hughes et al., (Cáncer Res., 49, 6214 (1989)) y Maruyama et al., (PNAS USA, 87, 5744 (1990)) . Estos anticuerpos incluyen, en particular, anticuerpos contra los receptores de VEGF. Además, incluyen anticuerpos citostáticos o citotóxicos que están dirigidos contra estructuras de la membrana en células tumorales. Estos anticuerpos han sido revisados, por ejemplo, por Sedlacek et al., Contrib. to Oncol . , 32, editorial Karger, Munich (1988) y Contrib. to Onsol . , 43, editorial Karger, Munish (1992) . Otros ejemplos son anticuerpos contra sialilo Lewis,• contra péptidos en tumores que son reconocidos por células T; contra proteínas que se expresan a partir de oncogenes; contra gangliósidos , tales como GD3 , GD2 , GM2 , 9-0-acetil GD3 y fucosil GM1 ,-contra antígenos del grupo sanguíneo y sus precursores,-contra antígenos en mucina epitelial polimórfica,- y contra antígenos en proteínas de choque térmico. Además, incluyen anticuerpos que están dirigidos contra estructuras de la membrana de células de leucemia. Un gran número de anticuerpos monoclonales de este tipo ya ha sido descrito para procesos de diagnóstico y terapéuticos (revisiones en Kristensen, Danish Medical Bulletin, 47, 52 (1994); Schranz, Therapia Hungarica, 38, 3 (1990); Drexler et al., Leuk. Res., 10, 279 (1986); Naeim, Dis., Markers, 71 (1989); Stickney et al., Curr.. Opin. Oncol., 4, 847 (1992); Drexler et al., Blut, 57, 327 (1988); Freedman et al., Cáncer Invest., 9, 69 (1991) ) . Dependiendo del tipo de leusemia, para uso como ligando son adecuados anticuerpos monoclonales o sus fragmentos de anticuerpo que se unen al antígeno, que están dirigidos contra los siguientes antígenos de la membrana, por ejemplo : Células Antícreno de la membrana AML CD13 CD15 CD33 CAMAL sialosilo-Le B-CLL CD5 CDlc CD23 idiotipos e isotipos de las inmunoglobulinas de la membrana T-CLL CD33 M38 receptores de IL-2 receptores de células T ALL CALLA CD19 linfoma no de Hodgkin La humanización de antisuerpos murínicos, y la preparación y optimizasión de genes para fragmentos Fab y Fv recombinantes se llevan a cabo de acuerdo con la técnica sonosida por la persona experta en la materia (Winter et al., Nature, 349, 293 (1991); Hoogenbooms et al., Rev. Tr. Transfus. Hemobiol . , 36, 19 (1993); Girol . Mol. Immunol . , 28, 1379 (1991) o Huston et al., Intern. Rev. Immunol . , 10, 195 (1993)) . Los fragmentos de Fv recombinantes se fusionan igualmente con genes para proteínas citostáticas, citotóxicas o inflamatorias o enzimas de acuerdo con el estado de la técnica' conocido por la persona experta en la materia. Genes estructurales que codifican proteínas de fusión entre ligandos que se unen a células diana y proteínas citostáticas y citotóxicas se pueden seleccionar de acuerdo con la siguiente estrategia. Los ligandos incluyen, por ejemplo, todas las sustancias que se unen a las estructuras de la membrana o receptores de la membrana en células endoteliales. Ejemplos de estas sustancias son citoquinas, tal como IL-1, o factores de crecimiento, o sus fragmentos o secuencias parciales de los mismos, que se unen a receptores que son expresados por células endoteliales, por ejemplo PDGF, bFGF, VEGF, TGF . Además, insluyen moléculas de adhesión que se unen a células endoteliales activadas y/o proliferantes. Ejemplos de ellos son SLex, LFA-1, MAC-1, LECAM-1, VLA-4 o vitronectina . Además, insluyen sustancias que se unen a estructuras de la membrana o receptores de la membrana de células tumorales o de' leucemia. Ejemplos son factores de crecimiento o sus fragmentos o secuencias parciales de los mismos que se unen a receptores que son expresados por sélulas de leucemia o células tumorales. Factores de crecimiento de este tipo ya han sido descritos (revisiones en Cross et al., Cell, 64, 271 (1991), Aulitzky et al., Drugs, 48, 667 (1994), Moore, Clin.

Cáncer Res . , 1, 3 (1995), Van Kooten et al., Leuk. Lymph., 27 (1993)) . Los genes para estos ligandos que se unen a la célula diana se fusionan con los genes para proteínas citostáticas, citotóxicas o inflamatorias o enzimas de acuerdo con el estado de la técnica utilizando métodos que son conocidos por la persona experta en la materia. Genes estructurales para inductores de la inflamación codifican, por ejemplo, IL-1, IL-2, RANTES (MCP-2), factor quimiotáctico y activante de monocitos (MCAF) , IL-8, proteína inflamatoria de macrófagos 1 (MIP-la, MIP-1/3) , proteína activante de neutrófilos 2 (NAP-2), IL-3, IL-5, factor inhibidor de la leucemia humana (LIF) , IL-7, IL-11, IL-13, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, factor del veneno de cobra (CVF) o secuensias parciales de CVF que corresponden funcionalmente al factor del complemento humano C3b, es decir que son capaces de unirse al factor B del complemento y, después de la escisión por parte del factor D, constituyen una C3 convertasa, un complemento humano C3 o su secuencia parcial C3b, productos de escisión del factor de complemento humano C3 que se ase-mejan funcional y estructuralmente a CVF, o proteínas bacterianas que activan un complemento o inducen inflamaciones, por ejemplo porinas de Salmonella typhimurium, fastores de aglutinasión de Staphylosoccus aureus, modulinas, particularmente procedentes de bacterias Gram-negativas, proteína de la membrana externa principal procedente de legionellas o de Haemophilus influenzae tipo B o de Klebsiellas o moléculas M procedentes de Streptococci del grupo G. Genes estructurales que codifican enzimas para activar precursores de agentes citostáticos, por ejemplo que codifi-can enzimas que escinden los precursores inactivos (profármacos) en agentes citostáticos activos (fármacos) y los profármacos y fármacos relevantes en cada caso ya han sido revisados por Deonarain et al. (British Journal Cáncer, 70, 786 (1994)), Mullen, Pharmas . Ther., 63, 199 (1994)) y Harris et al. (Gene Ther., 1, 170 (1994)). Por ejemplo, se puede utilizar la sesuensia de ADN para una de las siguientes enzimas: timidina-quinasa del virus herpes simplex, timidina--quinasa del virus varicella zoster, nitrorreductasa bacteriana, /3-glucuronidasa bacteriana, /3-glucuronídasa de plantas prosedente de Sécale cereale, /3-glucuronidasa humana, carbo-xipeptidasa (CB) humana, por ejemplo CB-A de células cebadas, CB-B, carboxipeptidasa pancreática o bacteriana, ß-lactamasa bacteriana, citosina-desaminasa bacteriana, catalasa o peroxidasa humana, fosfatasa, en particular fosfatasa alcalina humana, fosfatasa acida de la próstata humana o fosfatasa acida de tipo 5, oxidasa, en particular lisil-oxidasa humana o D-aminooxidasa acida humana, peroxidasa, en particular glutation-peroxidasa humana, peroxidasa eosinófila humana o peroxidasa tiroidea humana, o galactosidasa . Además, la terapia de enfermedades autoinmunes e inflamaciones se describe en los documentos WO/06941 y DE19651443.6 que se incorporan con ello como referencia. Ejemplos de células diana adecuadas son células endoteliales proliferantes, macrófagos y/o linfositos o células sinoviales. Los promotores son, por ejemplo, específicos de las sélulas endoteliales y espesíficos del ciclo celular o específisos de macrófagos y/o espesífisos de linfocitos y/o específicos del ciclo celular o específicos de las células sinoviales y/o específicos del ciclo celular. Los genes estructurales para la terapia de alergias codifican, por ejemplo, IFN/3, IFN?, IL-10, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos contra IL-4, receptores de IL-4 solubles, IL-12 o TGF3. Los genes estructurales para prevenir el rechazo de órganos trasplantados codifican, por ejemplo, IL-10, TGF0, receptores de IL-1 solubles, receptores de IL-2 solubles, antagonistas de receptores de IL-1, receptores de IL-6 solubles o anticuerpos inmunosupresores o sus fragmentos que contienen VH y que contienen VL o sus fragmentos VH y VL que están conectados a modo de un enlazador. Ejemplos de anti-cuerpos inmunosupresores son anticuerpos que son específicos para el receptor de células T o su complejo CD3 , o están dirigidos contra CD4 o CD8 y, además, contra el receptor de IL-2, el receptor de IL-1 o el reseptor de IL-4 o contra las moléculas de adhesión CD2 , LFA-1, CD28 o CD40. Los genes estructurales para la terapia de enfermedades autoinmunes en las que intervienen anticuerpos codifican, por ejemplo, TGF0, IFNa, IFN/3, IFN?, IL-12, receptores de IL-4 solubles, receptores de IL-6 solubles o anticuerpos inmunosu-presores o sus fragmentos que contienen VH y que contienen VL.

Los genes estructurales para la terapia de enfermedades autoinmunes en las que intervienen células codifican, por ejemplo, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, TNFa o TNF/3, IL-13 o un anticuerpo in unosupresor o sus fragmentos que contienen VH y que contienen VL. Los genes estructurales para inhibidores de la prolife-ración celular, proteínas citotóstátisas o citotóxicas y enzimas para activar precursores de agentes citostáticos ya han sido enumerados anteriormente en relación con la terapia de tumores . De la misma forma a la ya descrita en ese punto, dentro del significado de la presente invención se puede hacer uso de genes estructurales que codifican proteínas de fusión que comprenden anticuerpos o fragmentos Fab o Fv recombinantes de estos anticuerpos, u otros ligandos que son específicos para la célula diana, y las citoquinas, los factores de crecimien-to, receptores, las proteínas citostáticas o citotóxicas y enzimas antes mencionados. Dentro del significado de la invención, genes estructurales cuya proteína expresada inhibe directa o indirectamente la inflamación, por ejemplo en una articulación, y/o fomenta la reconstitución de la matriz extracelular (cartílago y tejido conjuntivo) en la articulación se seleccionan para la terapia de artritis. Ejemplos de estas proteínas son el antagonista del receptor de IL-l (IL-l-RA) , ya que IL-l-RA inhibe la unión de IL-lo! e IL-3, el receptor de IL-1 soluble, ya que el receptor de IL-1 soluble se une e inactiva a IL-1, IL-6, dado que IL-6 aumenta la secreción de TIMP y superóxidos y disminuye la secreción de IL-1 y TNFa por parte de células sinoviales y condrocitos, receptor de TNF soluble, dado que el receptor de TNF soluble se une e inactiva a TNF, IL-4, dado que IL-4 inhibe la formación y secreción de IL-1, TNFa y MMP, IL-10, dado que IL-10 inhibe la formación y secreción de IL-1, TNFa y MMP y aumenta la sesresión de TIMP, el fastor de crecimiento similar a insulina (IGF-1) , dado que IGF-1 estimula la síntesis de la matriz extracelular, TGFß , especialmente TGFßl y TGF/32 , dado que TGF/3 estimula la síntesis de la matriz extracelular y superóxido-dismutasa o TIMP, especilamente TIMP-1, TIMP-2 o TIMP-3. La terapia de la formación deficiente de células de la sangre ya ha sido descrita en detalle en el documento WO96/06941 que se incorpora con ello como referencia. Ejemplos de células diana adecuadas son células proliferantes inmaduras del sistema hematopoyético o células del estroma que están adyasentes a las sélulas hematopoyéticas . Los promotores son, por ejemplo, específicos para las células hematopoyéticas y/o son específicos del cislo celular o no específicos de la célula y específicos del ciclo celular. Un gen estructural para la terapia de la anemia codifica, por ejemplo, eritropoyetina. Genes estructurales para la terapia de la leucopenia codifican, por ejemplo, G-CSF, GM--CSF o M-CSF. Genes estrusturales para la terapia de la trombocitopenia codifican, por ejemplo, IL-3, el factor inhibidor de la leucemia (LIF) , IL-11 o trombopoyetina. Células diana adecuadas para la terapia de la lesión del sistema nervioso son: células glía o células endoteliales proliferantes. En este caso, los promotores son específicos de las células glía y específicos del ciclo selular o específicos de las sélulas endoteliales y específicos del ciclo celular o no específisos y específisos del ciclo celular. Los genes estructurales para los factores de crecimiento neuronal codifican, por ejemplo, FGF, factor del crecimiento de los nervios (NGF) , factor neurotrófico derivado del cere-bro (BDNF), neurotrofina 3 (NT-3), neurotrofina 4 (NT-4) o factor neurotrófico ciliar (CNTF) . Los genes estructurales para enzimas codifican, por ejemplo, tirosina-hidroxilasa o dopa-descarboxilasa . Los genes estructurales para citoquinas y sus inhibidores que inhiben o neutralizan el efecto neu-rotóxico de TNFa' codifican, por ejemplo, TGF/3, receptores de TNF solubles, los receptores TNF neutralizan TNFa, IL-10, dado que IL-10 inhibe la formación de IFN?, TNFa, IL-2 e IL-4, receptores de IL-l solubles, receptor I de IL-1, receptor II de IL-1, dado que los receptores de IL-1 solubles neutralizan la actividad de IL-1, antagonista del receptor de IL-l o receptores de IL-6 solubles. La terapia de trastornos del sistema de la coagulación sanguínea y del sistema circulatorio sanguíneo ya ha sido descrita en detalle en las solicitudes de patente WO96/06938, DE19617851.7 y DE19639103.2 que se incorporan en esta memoria como referencia. Ejemplos de células diana adecuadas son células endoteliales , células endoteliales proliferantes, células somáticas en la proximidad de células endoteliales y células de la musculatura lisa o macrófagos. Los promotores son, por ejemplo, no específicos de la célula y específicos del ciclo celular o específicos para células endoteliales, células de la musculatura lisa o macrófagos y específicos del ciclo celular. Genes estructurales para la inhibición de la coagulación o para fomentar la fibrinolisis codifican, por ejemplo, el activador del plasminógeno de tejidos (tPA) , el activador de plasminógeno de tipo uroquinasa (uPA) , híbridos de tPA y uPA, proteína C, hirudina, inhibidores de serina-proteinasa (serpinas) , tales como inhibidor de C-1S, al-antitripsina o antitrombina III o el inhibidor de la vía del factor de tejidos (TFPI) . Genes estructurales para fomentar la coagulación codifican, por ejemplo, F VIII, F IX, factor de von Willebrand, F XIII, PAI-1, PAI-2 o factor tisular y fragmen-tos de los mismos. Genes estructurales para los factores de la angiogénesis codifican, por ejemplo, VEGF o FGF. Genes estructurales par reducir la presión sanguínea codifican, por ejemplo, calicreína u óxido-sintasa nítrica de células endoteliales. Genes estructurales para inhibir la proliferación de las células de la musculatura lisa después de la lesión de la capa endotelial codifican, por ejemplo, una proteína antiproliferante, citostática o citotóxica o una enzima para escindir precursores de agentes citostáticos en agentes citostáticos, tal como ya se ha citado anteriormente en la terapia de tumores, o una proteína de fusión de uno de estos compuestos activos con un ligando, por ejemplo un anticuerpo o fragmentos de anticuerpos que es o son específicos para las células de la musculatura. Genes estructurales para otras proteínas del plasma sanguíneo codifican, por ejemplo, albúmina, inactivador de Cl, colinesterasa de suero, transferrina o 1-antitripsina . El uso de las construcciones de ácido nucleico para vacunas ya ha sido descrito en detalle en las solicitudes de patente WO96/06941, DE19617851.7 , DE19639103.2 y DE19651443.6, que se incorporan con ello como referencia. Ejemplos de células diana adecuadas son células de la musculatura, macrófagos y/o linfocitos o células endoteliales. Los promotores son, por ejemplo, no específisos y específicos del ciclo celular o específicos de las células diana y específicos del ciclo celular. El ADN para una proteína que se forma por un agente infeccioso y que conduce, al inducir una reacción inmune, es decir por medio de la unión al anticuerpo y/o por medio de linfocitos T citotóxicos, a la neutralización y/o destrucción del agente se utiliza, por ejemplo, como un gen estructural para la profilaxis de enfermedades infecciosas. Los llamados agentes de neutralización ya se emplean en calidad de agentes de vacunación (véase revisión en Ellis, Adv. Exp. Med. Biol., 327, 263 (1992) ) . Sin embargo, las posibilidades de preparar vacunas eficaces están convencionalmente limitadas. Además, las vacunas de ADN plantean cuestiones con respecto a la eficacia (Fynan et al., Int. J. Immunopharm. , 17, 79 (1995); Donnelly et al., Immunol . 2, 20 (1994)) . Una ventaja de la presente invención es que es posible confiar en que la eficacia sea mayor. Por lo tanto, se da preferencia, dentro del significado de la presente invención, a un ADN que codifica antígenos de neutralización procedentes de los siguientes agentes patógenos: virus de la influenza A, VIH, virus de la rabia, HSV (virus del herpes simplex) , RSV (virus sincitial respiratorio) , virus de parainfluenza, rotavirus, VZV (virus varicella zoster) , CMV (citomegalovirus) , virus del sarampión, HPV (papilomavirus humano) , HBV (virus de la hepatitis B) , HCV (virus de la hepatitis C) , HDV (virus de la hepatitis D) , HEV (virus de la hepatitis E) , HAV (virus de la hepatitis A) , antígeno vibrio cólera, Borrelia burgdorferi o Helicobacter pylori o antígeno de la malaria. Sin embargo, sustancias activas de esta naturaleza incluyen también el ADN para un anticuerpo anti-idiotipo, o sus fragmentos de unión al antígeno, cuyas estructuras de unión al antígeno (las regiones determinantes de la comple-mentari.edad) constituyen copias de la estructura proteína o de la estructura hidrato de carbono del antígeno de neutralización del agente infeccioso. Anticuerpos anti-idiotipo pueden, en particular, reemplazar antígenos de hidratos de carbonos en el caso de agentes infecciosos bacterianos . Anticuerpos anti-idiotipo y sus productos de escisión han sido revisados por Hawkins et al. (J. Immunother., 14, 273 (1993)) y Westerink y Apicella (Springer Seminars in Immuno-pathol. , 15, 227 (1993) ) . Ejemplos de genes estructurales para "vacunas de tumo-res" son genes que codifican antígenos en células tumorales. Estos antígenos han sido revisados, por ejemplo, por Sedlacek et al., Contrib. to Oncol., 32, editorial Karger, Munich (1988) y Contrib. to Oncol, 43, editorial Karger, Munich (1992) . Otros ejemplos son genes que codifican los siguientes antígenos o los siguientes anticuerpos anti-idiotipo: sialilo Lewis, péptidos en tumores que son reconosidos por sélulas T, proteínas que son expresadas a partir de oncogenes, antígenos de los grupos sanguíneos y sus precursores, antígenos en mucina epitelial polimórfica o antígenos en proteínas de choque térmico . La terapia de enfermedades infecciosas crónicas ya ha sido descrita en detalle en las solicitudes de patente WO96/06941, Del9617851.7 , DE19639103.2 y DE19651443.6 , que se incorporan con ello como referencia. Una célula diana ade-cuada es una célula del hígado, un linfocito y/o macrófago, una célula epitelial o una célula endotelial. Los promotores son, por ejemplo, específicos del virus o específicos de la célula y específicos del ciclo celular. Genes estructurales codifican, por ejemplo, una proteína que exhibe efectos citostáticos, apoptóticos o citotóxicos, o una enzima que escinde un precursor de una sustancia antiviral o citotóxica de este tipo en la sustancia activa. Ejemplos de genes estructurales que codifican proteínas antivirales son los genes para citoquinas y factores de crecimiento que tienen un efecto antivírico, por ejemplo IFNa, IFN/J, IFN?, TNFß, TNFa, IL-1 o TGF?, o anticuerpos que tienen una especifisidad que inactiva el virus relevante, o sus fragmentos que contienen VH y que contienen VL, o sus fragmentos VH y VL que están unidos por medio de un enlazador, tal como ya se ha descrito. Ejemplos de anticuerpos contra el antígeno del virus son: anti-HBV, anti-HCV, anti-HSV, anti--HPV, anti-VIH, anti-EBV, anti-HTLV, anti-virus Coxsackie o anti-virus Hantaan. Otro ejemplo de una proteína antivírica es la proteína de unión a rev. Esta proteína se une al ARN de rev e inhibe las etapas posttranscripcionales dependientes de rev en la expresión de genes de retrovirus. Ejemplos de estas proteínas que se unen a rev son RBP9-27, RBP1-8U, RBP1-8D o pseudogenes de RBP1-8. Otro gen estructural vírico codifica ribozimas que digieren el ARNm de genes para las proteínas del control del ciclo celular o el ARNm de virus. Ribozimas que son catalíticas para VIH han sido revisadas, por ejemplo, por Christof-fersen et al., J. Med. Chem., 38, 2033 (1995). Ejemplos de genes estructurales que codifican proteínas antibacterianas son genes para anticuerpos que neutralizan toxinas bacterianas u opsonizan bacterias. Ejemplos de estos anticuerpos son anticuerpos contra meningococos C o B, E. coli, Borrelia, Pseudomonas, Helicobacter pylori o Staphyloco-ccus aureus .

IV) Combinación de genes estructurales idénticos o diferentes Ya se ha dado una descripción detallada en los documen-tos WO96/06941, WO96/06939, WO96/06940, WO96/06938, DE19639103.2 y DE19651443.6 que se incorporan en esta memoria como referencia. Un ejemplo de una combinación de genes estructurales es un sistema de expresión autorreforzante, en caso apropiado farmacológicamente controlable, en el que existe una combinación de las secuencias de ADN de dos genes estructurales idénticos o de dos genes estructurales diferentes [componente c) y e')]. Una secuencia de promotor adicional o, preferiblemente, el ADNc para un sitio de entrada al ribosoma interno (IRES) está intercalado, en calidad de un elemento regulador, entre los dos genes estructurales con el fin de expresar las dos secuencias de ADN. Un IRES hace posible expresar dos secuencias de ADN que están unidas una a otra por medio de un IRES. IRES's de este tipo han sido descritos, por ejemplo, por Montford y Smith (TIG, 11, 179 (1995); Kaufman et al., Nucí. Acids Res., 19, 4485 (1991),- Morgan et al., Nucí. Acids Res., 20, 1293 (1992); Dirks et al., Gene, 128, 247 (1993); Pelletier y Sonenberg, Nature, 334, 320 (1988) y Sugitomo et al., BioTeshn., 12, 694 (1994) ) . Así, se puede utilizar, por ejemplo, el ADNc para la secuencia IRES del virus de la poli (posición = 140 = 630 de 5' UTR) .

Se da preferencia a genes estructurales que exhiben un efesto aditivo y que están enlazados por medio de secuencias de promotor adicionales o una sesuensia IRES . Combinaciones preferidas de genes estrusturales para la terapia de tumores sodifican, por ejemplo, proteínas citostáticas, apoptóticas, citotóxicas o inflamatorias idénticas o diferentes y/o enzimas idénticas o diferentes para la escisión del precursor de un agente citostático; combinaciones preferidas para la terapia de enfermedades autoinmunes codifican diferentes citoquinas o receptores con un efesto sinérgiso, para inhibir la reacción inmune celular y/o humoral o TIMP's diferentes o idénticos; combinaciones preferidas para la terapia de la formación deficiente de células de la sangre codifican diferentes citoquinas jerárquicamente consecutivas, tales como IL-1, IL-3, IL-6 o GM-CSF y eritropoyetina, G-CSF o trombopoyetina,- combinaciones preferidas para la terapia de la lesión de células nerviosas codifican un factor de crecimiento neuronal y una citoquina o el inhibidor de una citoquina; sombinasiones preferidas para la terapia de perturbasiones del sistema de la sirculación sanguínea y del sistema circulatorio sanguíneo codifican un agente antitrombótico y un agente fibrinolítico (por ejemplo tPA o uPA) o una proteína citostática, apoptótica o citotóxica y un agente antitrombótico o un agente fibrinolítico, o varios factores de coagulación de la sangre diferentes que actúan de forma sinérgica, por ejemplo F VIII y vWF o F VIII y F IX; combinaciones preferidas para vacunas codifican un antígeno y una citoquina inmunoestimul dora, por ejemplo receptor de IL-la, IL-1/3, IL-2, GM-CSF, IL-3 o IL-4, diferentes antígenos de un agente infeccioso o de diferentes agentes infecciosos, o diferentes antígenos de un tipo de tumor o de diferentes tipos de tumores,- combinaciones preferidas para la terapia de enfermedades infesciosas víricas sodifisan una proteína antivírica y una proteína citostática, apoptótica o citotóxi-ca, o anticuerpos sontra diferentes antígenos de superficie de un virus o varios virus ; y combinaciones preferidas para la terapia de enfermedades infecciosas bacterianas codifican anticuerpos contra diferentes antígenos de superficie y/o toxinas de un organismo sausativo.

V) Inserción de secuencias de señal y dominios de t ansme rana Una descripción detallada ya ha sido dada en las solicitudes de patente DE19639103.2 y DE19651443.6 que se incorporan en esta memoria como referencia. Con el fin de mejorar la traducsión, la secuencia de nucleótidos GCCACC o GCCGCC (Kozak, J. Cell Biol., 108, 299 (1989) ) se puede insertar en el extremo 3' de la secuencia de promotor y directamente en el extremo 5' de la señal de iniciación (ATG) de la secuencia de señal o de transmembrana. Con el fin de facilitar la secreción del producto de expresión del gen estructural, la secuencia de señal homologa que se puede presentar en la secuencia de ADN del gen estructural puede ser reemplazada por una secuencia de señal hete-róloga que mejora la secreción extracelular. Así, por ejemplo, se puede insertar la secuencia de señal para ínmunoglo-bulina (posición 63 a 107 de ADN; Riechmann et al., Nature, 332, 323 (1988)) o la secuencia de señal para CEA (posición 33 a 134 de ADN; Schre e et al., Mol. Cell Biol., 10, 2738 (1990); Berling et al., Cáncer Res., 50, 6534 (1990)) o la secuencia de señal de la glicoproteína del virus sincitial respiratorio humano (ADNc para los aminoácidos 38 a 50 o 48 a 65; Lishtensteín et al., J. Gen. Virol., 77, 109 (1996)).

Una secuencia para un dominio de la transmembrana se puede insertar, como alternativa o, adicionalmente a la secuencia de señal, con el fin de anclar el compuesto activo en la membrana celular de la célula transducida que está formando el compuesto activo. Por ejemplo, la secuencia de la transmembrana del fastor estimulante de colonias de macrófa-gos humano (posisión 1485 a 1554 de ADN; Cosman et al., Behring Inst. "Mitt., 77, 15 (1988)) o la secuencia de ADN para las regiones de señal y de transmembrana de la glicoproteína G del virus sincitial respiratorio (RSV) humano (aminoásidos 1 a 63 o sus secuencias parciales, aminoácidos 38 a 63; Vijaya et al., Mol. Cell Biol., 8, 1709 (1988); Lichtens-tein et al., J. Gen. Virol., 77, 109 (1996)) o la secuencia de ADN para las regiones de señal y de transmembrana de la neuroaminidasa del virus de la influenza (aminoácido 7 a 35 o los aminoácidos 7 a 27 de la secuencia parcial; Brown et al, J. Virol, 62, 3824 (1988)) se pueden insertar, por ejemplo, entre la secuencia de promotor y la secuencia del gen estructural. Sin embargo, la secuencia de nucleótidos para un anclaje de glicofosfolípidos también se puede insertar con el fin de anclar el compuesto activo en la membrana celular de las células transdusidas que están formando el compuesto activo. Un anclaje glicofosfolípido se inserta en el extremo 3' de la secuencia de nucleótidos para el gen estructural, siendo con ello posible que tenga lugar esta inserción además de insertar una secuencia de señal . Los anclajes de glicofosfolipídos se han descrito, por ejemplo, para CEA, para N-CAM y para otras proteínas de la membrana, por ejemplo Thy-1 (véase revisión en Ferguson et al., Ann. Rev. Biochem., 57, 285 (1988)). Otra opción para anclar compuestos activos a la membrana celular de acuerdo con la presente invención es la de utilizar una secuencia de ADN para una proteína de fusión de ligando/compuesto activo. La especificidad del ligando de esta proteína de fusión está dirigida contra una estructura de la membrana en la membrana celular de la célula diana seleccionada . Los ligandos que se unen a la superficie de células incluyen, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que están dirigidos contra estructuras en la superficie de, por ejemplo, células endoteliales. Estos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos insluyen, en particular, anticuer-pos contra los receptores VEGF o contra receptores de quinina. También pueden estar dirigidos contra células de la musculatura, tales como anticuerpos contra actina o anticuerpos contra receptores de angiotensina II o anticuerpos contra receptores para factores de crecimiento, tales como contra receptores de EGF o sontra receptores de PDGF o contra receptores de FGF, o anticuerpos contra receptores de endotelina A. Los ligandos incluyen también anticuerpos o sus fragmentos que están dirigidos contra antígenos específicos de tumores o asociados a tumores en la membrana de la célula tumoral. Anticuerpos de esta naturaleza ya han sido descritos . Los anticuerpos monoclonales murínicos han de emplearse preferiblemente en forma humanizada. Los fragmentos Fab y Fv recombinantes y sus productos de fusión se preparan utilizando métodos que son conocidos por la persona experta en la materia, tal como ya se ha descrito. Los ligandos incluyen, además, todos los compuestos activos tales como citoquinas o moléculas de adhesión, factores de crecimiento o sus fragmentos o secuencias parciales de los mismos, mediadores u hormonas peptídicas que se unen a las estructuras de la membrana o receptores de la membrana en la célula seleccionada relevante. Ejemplos son ligandos para células endoteliales, tales como IL-1, PDGF, bFGF, VEGF, TGGß (Pusztain et al., J. Pathol., 169, 191 (1993)) o quinina y derivados o análogos de quinina. Estos ligandos incluyen también moléculas de adhesión. Moléculas de adhesión dé esta naturaleza, tales como SLex, LFA-1, MAC-1, LeCAM-1, VLA-4 o vitronectina o derivados o análogos de vitronectina, ya han sido descritos para células endoteliales (revisiones en Augustin-Voss et al . , J. Cell Biol., 119, 483 (1992); Pauli et al., Canser Metast. Rev., 9, 175 (1990); Honn et al., Cáncer Metast. Rev., 11, 353 (1992); Varner et al., Cell Adh. Commun., 3, 367 (1995)). La invención se clarifica con ayuda de las siguientes figuras, tablas y ejemplos sin estar limitada a los mismos.

Descripción de las figuras v tablas Figura 1: Descripción diagramática de una nueva construcción de ácido nucleico que comprende los componentes a)-d) Figura 2 : Descripción diagramática de una nueva construcción de ácido nucleico que comprende los componentes a)-e) Figura 3.- Descripción diagramática de una unidad de promotor que responde al activador Figura 4: Descripción diagramática de una nueva construcción de ácido nucleico que comprende una unidad de promotor que responde al activador Figura 5: Estructura genómica de la región de promotor/reforzador de cdc25B murínico. Al llevar a cabo la digestión por restricción con diversas enzimas, se preparó un mapa del lugar genómico a partir de tres clones de fagos aislados. Un fragmento de 4 , 6 kb que bordea directamente la región 5 ' del ADNc se escindió a partir del fago VI y se subclonó en el vector Bluescript SKII (Stratagene) . a) = clon del fago b) = fragmento subclonado Figura 6: Mutantes de deleción del promotor de cdc25b murínico. La figura describe diferentes deleciones 5' y una deleción 3' del promotor, y los sitios de unión al fastor de transcripción putativos que están situados en esta región del promotor. La designación de las construcciones de deleción individuales se basa en la posición del extremo 5' en la secuensia. Los fragmentos se purifisaron a través de columnas giratorias QIAquickR (Qiagen) y se clonaron en el vestor pGL3 (Promega) . Tabla 1: Región sesuenciada del promotor de cds25B murínico. La región que directamente se une al extremo 5 ' de la secuencia de ADNc publicada (Kakizuka et al., Genes Dev. 6, 587 (1992)) se secuenció. La tabla muestra la disposición de los sitios de unión putativos y el inicio de la transcripción. Por una parte, los sitios de unión putativos son activadores, tales como los que se producen en muchos promotores específicos del ciclo celular que están regulados por la represión. Además, existen lugares de unión a E2F putativos y, en la región 5', dos cajas E a la que se fija la actividad del represor. La caja TATA que se describe es un elemento de la secuencia que es inusual para genes que son regulados de una manera específica del ciclo celular y que evidentemente es funcionalmente importante en este promotor dado que especifica la posición del inicio de la transcrip- ción. Tabla 2: Actividad del promotor de las diferentes construcciones de deleción. La tabla muestra la actividad relativa de luciferasa en células NIH-3T3 en crecimiento y desprovistas de suero de las cons- trucciones descritas en la figura 6. La inducción del ciclo celular del promotor, que se determina a partir del cociente de los valores para células en desarrollo frente a células agotadas, se da en la columna final. A este respecto, el valor para la construcción más larga en células en desarrollo se establece en 100, comparándose los valres restantes con este valor de referencia Tabla 2a: Deleciones de un tamaño relativamente grande para determinar regiones funcio- nales en el promotor, y mutación puntual de la saja TATA. Tabla 2b: Deleción secuencial del sitio de unión a Spl proximal y del sitio de unión a NF- -Y, y mutación puntual del sitio de unión a NF-Y. En este caso, la actividad de células en desarrollo de la construc- 'sión que sontiene todos estos sitios de unión al astivador se establese de nuevo, por motivos de simplicidad, en 100 (la astividad real no se corresponde con la de la construcción B-950) . a) Construcciones de deleción sometidas a ensayo (véase la figura 6) b) Actividad del promotor en células en desarrollo c) Actividad del promotor en células en reposo (desprovistas de suero) d) Inducción del ciclo celular (Cociente de la actividad del promotor en sélulas en desarrollo en comparación con la de células en reposo) Ejemplos 1. Clonación y análisis del promotor de cdc25B urínico Con el fin de clonar el promotor de cdc25B murínico, aproximadamente 10s placas de fagos procedentes de una genoteca de fagos genómica murínica (raza de ratón 129 FVJ, Stratagene) se rastrearon en A-Fix (Stratagene) . La sonda utilizada en este rastreo era un oligonucleótido de 80 pb que estaba dirigido contra la región 5' externa del ADNc de cdc25B muríniso (Kakizuka et al., Genes Dev., 6, 587 (1992)) . La secuencia es : Sonda 1 : 5'TCTAGCTAGCCTTTGCCCGCCCCGCCAC- GATGGAGGTACCCCTGCAGAAGTCTGCGCCGGGTT- CAGCTCTCAGTCCTGCC-3'. SEQ ID NO.: 4) Tres de los seis clones de fagos resultantes se aislaron, amplificaron y representaron en un mapa por medio de digestión por restricción (enzimas procedentes de Gibco) y se utilizaron dos sondas adicionales que se dirigieron contra otras sesuencias situadas en 3 ' del ADNc de cdc25B murínico ( figura 5 ) . Sonda 2 : 5'GGTCATTCAAAATGAGCAGTTACCATAAAACGCTTCCGATC CTTACCAGTGAGGCTTGCTGGAACACAGTCCGGTGCTG-3' (SEQ ID NO.: 5) Sonda 3 : 5'GTTAAAGAAGCATTGTTATTATGGGGAGGGGGGAGCAACCT CTGGGTTCAGAATCTACATATGCTGGAAGGCCCCAATGA-3' (SEQ ID NO.: 6) Finalmente, un fragmento de 4,6 kb procedente de la región de reforzador proximal, que bordea al ADNc publicado (Kakizuka et al., véase antes) se escindió del fago VI utilizando las enzimas EcoRI y Sal I (Gibco) purificadas por electroforesis en gel de agarosa y utilizando columnas giratorias QIAquickR (Qiagen) y se insertaron en un vector Bluescript SKII (Stratagene) (figura 5) . 1,5 kb de la región 3' del fragmento de 4,6 kb clonado se sesuenciaron y se identificó, comparando la secuencia con secuencias de ADNc de sdc25B de diversas especies, que era el homólogo murínico del gen cdc25B. Diversos fragmentos se escindieron a partir de esta región secuenciada, se clonaron en un vector informador de luciferasa pGL3 (Promega) y se sometieron a ensayo en cuanto a la actividad de promotor en fibroblastos de ratón NIH-3T3 (ATCC) . La transfección (transitoria) se llevó a cabo utilizando el método de DEAE/dextrano (modificado después por Sompayrac et al., PNAS, 78, 7575 (1981)). Los testigos utilizados en estos experimentos eran el promotor basal SV40 en el vector pGL3 (Promega) , promotor que no está sometido a ninguna regulación del siclo celular significativa y, en calidad de testigo positivo, un fragmento del promotor de cdc25B humano (C290, Lucibello et al., EMBO J., 14, 132 (1995) ) , que también se clonó en el vector pGL3. La actividad de luciferasa se determinó según se describe (Herber et al., Oncogene, 9, 1295 (1994)). Se encontró que la secuencia de nucleótidos -950 +167 era el promotor del gen c25B murínico (SEQ ID NO. : 7, véase la tabla 1) . Diversos fragmentos de deleción se escindieron del promotor del gen cdc25B muríniso (figura 6) , se clonaron en un vestor informador de luciferasa pGL3 (Promega) y se sometieron a ensayo en cuanto a la actividad de promotor, según se ha descrito antes, en fibroblastos de ratón NIH-3T3.

Con el fin de analizar la reacción del ciclo celular de las diferentes construcciones de deleción, se compararon en cada caso células de desarrollo normal, transitoriamente transfectadas, con células similares que estaban desprovistas de suero después de la transfección, según se describe (Lucibello et al., EMBO J., 14, 132 (1995)). Los resultados se resumen en la tabla 2. En este contexto, la construcción más larga, es decir B-950 (secuensia de nucleótidos -950 a +167) exhibía una regulación del ciclo celular de 10,1 que era equiparable con la de la construcción de cdc25C humana (no listada en la tabla 2) . La deleción de la región 3' hacia abajo hasta +3 (véase la figura 6) no dio como resultado ninguna pérdida de actividad ni de la regulación del ciclo celular del promotor, siendo, por lo tanto, posible delimitar todavía adicionalmente la región responsable de la regulación del promotor. Las deleciones de la región 5' del promotor dieron lugar a dos efectos diferentes; por una parte, la delesión de la construcción más larga, es decir B-950, hacia abajo hasta B-340 dio como resultado un aumento de la activi-dad en células de G0/G1( correspondiente a una desregulación. Deleciones adicionales determinan una reducción de la actividad del promotor hasta la última deleción, que luego determina una desregulación renovada (tabla 2a) . El sitio de iniciación se determinó por extensión del cebador. Para ello, ARN se aisló a partir de fibroblastos de ratón NIH-3T3 de desarrollo normal y la reacción se llevó a cabo utilizando diferentes cebadores y transcriptasa inversa de MMLV (Gibco) . El sitio de iniciación representado en el mapa está situado en un elemento de la secuencia similar al iniciador, 24 pares de bases en la posición 3' de la caja TATA (SEQ ID NO.: 7, véase la tabla 3). Si la actividad del promotor en las construcciones de deleción se observa frente al fondo de los sitios de unión al factor de transcripción putativos listados en la tabla 3, es evidente entonces que estos efectos son mediados por la de-leción de sitios de unión específicos : la delesión de las cajas E situadas en la región 5', al igual que la deleción del sitio de unión a E2F putativo situado en la proximidad de la caja TATA conduce a la desrepresión del promotor. Por otra parte, las deleciones de los sitios de unión al activador putativos (predominantemente sitios de unión a SP1) y un sitio de unión a NF-Y disminuyen la actividad del promotor (véase la tabla 2b) . En este contexto, la mutación puntual del sitio NF-Y putativo dio como resultado una pérdida de actividad de más del 74% en comparación con la construcción de tipo salvaje (véase la tabla 2b) . Ensayos de desplazamiento de la movilidad electroforétisos (EMSA's según se describe en Zwicker et al., Nucleic Acids Res. 23, n° 19, pág. 3822 y siguientes, 1995) utilizando anticuerpos específicos contra Spl/Sp3 y NF-Y (Santa Cruz) y experimentos competitivos cruzados son sitios de unión a Spl o NF-Y bona fide demostraron una unión específica de Spl/Sp3 y NF-Y a los sitios de unión putativos respectivos . Mientras que la construcción más corta (B-30) que contiene la saja TATA y el sitio de inisio mostrado en el mapa está en gran medida desregulada, exhibe una astividad que es doscientas veces mayor que la actividad del fondo del vector pGL3. Además, la mutación puntual de la caja TATA dio como resultado una pérdida de más del 25% de la actividad del promotor (véase la Tabla 2a) , confirmando con ello su papel funcional en la regulación de la actividad del promotor. Los sitios de unión al factor de transcripción (princi-pálmente SP1 y NF-Y) corresponden a los muchos genes descritos que son regulados de una manera específica del ciclo celular por represión o activasión (para la revisión, véase Zwicker y Müller, TiGS 14, 3 (1997)); sin embargo, no se ha descrito previamente ningún promotor del gen del ciclo celular que contenga una caja TATA funcional. El promotor del gen sdc25B murínico abarca, por consiguiente, los nucleótidos = -950 a = +167 o secuencias parciales de estas secuencias de nucleótidos, por ejemplo = -950 a = +1, -930 a +167, -720 a +167, -340 a +167, -180 a 167, -100 a +167, -80 a +167, -60 a +167 ó -30 a +167, y/o correspondientes sesuencias parciales hasta +3 ó +1. Partiendo de las secuencias de promotor murínicas que los autores de esta invención han ensontrado, es una cuestión simple ahora para una persona experta en la materia encontrar promotores de cdc25B no murínisos que sean homólogos al promotor de cdc25B murínico marcando, preferiblemente marcando de forma radiastiva el promotor murínico y rastreando geno-tecas de ADN genómicas obtenidas a partir de sélulas de mamífero por medio de hibridación en sondicíones rigurosas. 2. Preparación de construcciones de genes utilizando una ^ tecnología de promotor múltiple a) Preparación de una unidad de promotor que responde al activador La nueva unidad de promotor que responde al activador comprende las siguientes secuensias de nucleótidos diferentes que se suceden una a otra en la dirección hacia abajo: Subunidad A de activador el promotor del gen cdc25B (ácidos nucleicos -950 a +167) la señal de localización nuclear (NLS) de SV40 (T grande de SV40, aminoácidos 126-132; PKKKRKV, Dingwall et al., TIBS, 16, 478 (1991)) el dominio de transactivación ácido (TAD) de VP16 de HSV-l (aminoácidos 406 a 488; Triezenberg et al., Genes Developm. , 2, 718 (1988); Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Develop ., 5, 190 (1995)) - el ADNc para la parte citoplásmica de la glicoproteína CD4 (aminoácidos 397-435; Simpson et al., Oncogene, 4, 1141 (1989); Maddon et al., Cell, 93 (1985)) Subunidad B de activador el promotor del gen cdc25C (ácidos nucleicos -290 a +121; Zwicker et al., EMBO J., 14, 4514 (1995); Zwicker et al., Nucí. Acids Res., 23, 3822 (1995)) la señal de localización nuclear (NLS) de SV40 (T grande de SV40; aminoácidos 126-132; PKKKRKV, Dingwall et al., TIBS, 16, 478 (1991)) - el ADNc para el dominio de unión a ADN de la proteína Gal4 (aminoácidos 1 a 147, Chasman y Kornberg, Mol. Cell. Biol., 10, 2916 (1990)) el ADNc para la secuensia de unión a CD4 de la proteína p56 Ick (aminoácidos 1-71; Shaw et al., Cell, 59, 627 (1989); Turner et al., Cell, 60, 755 (1990); Perlmutter et al., J. Cell. Biochem., 38, 117 (1988)) Promotores que responden al activador lOx la secuencia de unión para la proteína de unión Gal4 que tiene la secuencia de nucleótidos 5'- CGGACAATGTTGACCG-3' (Chasman y Kornberg, Mol. Cell. Biol. 10, 2916 (1989)) el promotor SV40 basal (ácidos nucleisos 48 a 5191; Tooze (comp) . gen efector de virus tumorales de ADN (Cold Spring Harbor Nueva York, Nueva York, Cold Spring Harbor Laboratory) el ADNs para luciferasa (Nordeen BioTeshniques, 6, 454 (1988) ) La sesuencia de activador descrita funciona como sigue: El promotor de cdc25B regula la transcripción de los ADNc's combinados para el dominio de astivación de VP16 y la parte sitoplásmisa de CD4 (subunidad A de activación) de una manera específica del ciclo celular. El promotor de cdc25C regula la transsripción de los ADNc's combinados para la proteína de unión a ADN de Gal4 y la parte de unión a CD4 de la proteína p56 Ick (subunidad B de activación) de una mane-ra específica del ciclo celular. Los productos de expresión de las subunidades A y B del activador se dimerizan por parte de la unión del dominio CD4 al dominio p56 Ick. La proteína dimérica constituye un factor de transcripción quimérico para el promotor que responde al activador (secuensia de ADN para los dominios de unión Gal4/el promotor SV40) para la transcripción del gen efector (= gen luciferasa) . Los componentes individuales de la construcción están enlazados entre sí por medio de sitios de restricción adecuados que se añaden en los extremos de los diferentes elementos durante la amplificación por PCR. El enlace se efectúa utilizando enzimas que son conocidas por la persona experta en la materia y que son específicas para los sitios de restricción, y ADN ligasas. Estas enzimas se pueden obtener comersialmente. La construcción de nucleótidos que ha sido preparada de esta manera se clona en el vector del plásmido pXP2 (Nordeen, BioTechniques, 6, 454 (1988)) que, a continuasión, se utiliza directamente o en sistemas de dispersión coloidal, para una aplicación in vivo. Fibroblastos 3T3 que se mantienen en cultivos se transfectan con el plásmido descrito utilizando el método conocido por la persona experta en la materia (Lucibello et al., EMBO J., 14, 132 (1995)) y se mide la cantidad de luciferasa producida por los fibroblastos, según se describe por Herber et al. (Oncogene, 9, 1295 (1994)) y Lucibello et al. (EMBO J., 14, 132 (1995)). Con el fin de verificar la especificidad del ciclo celular, los fibroblastos se sincronizan en GQ/GÍ separando suero a lo largo de un período de 48 horas. El contenido en ADN de las células se determina en un clasificador de células activado por fluorescencia después de la tinción con Hoechst 33258 (Lucibello et al., EMBO J., 14, 132 (1995)).

Se obtienen los siguientes resultados: En el fibroblasto transfectado se puede confirmar un incremento acusado en luciferasa en comparación con fibroblastos no transfectados. Los fibroblastos proliferantes (ADN > 2S) forman esencialmente más luciferasa que lo hacen los fibroblastos que están sincronizados en G0/Gx (ADN = 2S) . Por consiguiente, la unidad de promotor que responde al activador que ha sido dessrita conduce a una expresión dependiente del ciclo celular del gen informador luciferasa. b) Preparación de un promotor híbrido El nuevo promotor híbrido comprende las siguientes secuencias de nucleótidos diferentes que se suceden una tras otra en la dirección hacia abajo: el promotor del gen cdc25B (ácidos nusleicos -950 a +167. La caja TATA (ácidos nucleicos TATATAA en la posición -30 a -23 se mutan en TGTATAA) ) . - la secuencia GCCACC (Kodak, J. Cell Biol., 108, 229 (1989)) el ADNc para el péptido señal de inmunoglobulina (secuencia de nucleótidos < 63 a > 107; Riechmann et al., Nature 332, 323 (1988)) - el ADNc para -glucuronidasa secuencia de nucleótidos = 93 a = 1982; Oshima et al., PNAS USA, 84, 685 (1987)) el promotor del gen del factor de von Willebrand (wWF) (ácidos nucleicos -487 a +247; Jahroudi y Lynch, Mol. Cell Biol. 14, 999 (1994)) el gen para la proteína de unión a la caja TATA (secuensia de ácidos nusleicos +1 a +1001, que está mutada en los ácidos nucleicos 862 (A reemplazada por T) , 889 y 890 (GT reemplazada por AC) y 895 (C reempla- zada por G) (Strubin y Struhl, Cell, 68, 721 (1992) ; Heard et al., EMBO J., 12, 3519 (1993)) Los componentes individuales de la construcción están enlazados por medio de sitios de restricción adecuados que se introducen en los extremos de los diferentes elementos durante la amplificación por PCR. El enlace se efectúa utilizando enzimas que son conocidas por la persona experta en la materia y son específicas para los sitios de restricción, y ADN ligasas . La construcción de nucleótidos que ha sido preparada de esta manera se clona en un vector del plásmido pUC18/l9 que se usa directamente o en sistemas de dispersión coloidal para una aplicación in vivo. Células endoteliales del cordón umbilisal humanas y fibroblastos (Wi-38) que se mantienen en cultivo se transfectan con el plásmido descrito utilizando el método conocido por el experto en la materia (Lucibello, et al., EMBO J., 14, 132 (1995)), y la cantidad de /3-glucuroni-dasa que se produce por parte de las células endoteliales se mide utilizando 4-metilumbeliferil-3-glucurónido como sustrato. Con el fin de verificar la especificidad del ciclo celular, células endoteliales se sincronizan en GQ/GJ^ separando metionina durante un período de 48 horas. El contenido en ADN de las sélulas se determina en un clasificador de células activado por fluorescencia después de la tinción con Hoechst 33258 (Lucibello et al., EMBO J. , 14, 132 (1995)). Se obtienen los siguientes resultados: En los fibroblastos transfectados no se puede confirmar ningún incremento en /3-glucuronidasa en comparasión con fibroblastos no transfestados . Las células endoteliales transfestadas expresan más /3-glusuronidasa que lo que lo hacen las células endoteliales no transfectadas. Células endoteliales proliferantes (ADN > 2S; S = conjunto simple de cromosomas) secretan esencialmente más /3-glucuronidasa que lo hacen las sélulas endoteliales que están sinsronizadas en GO/G-L (ADN = 2S) . Por consiguiente, la unidad de promotor múltiple que ha sido dessrita sonduse a una expresión específica de la célula y dependiente del ciclo celular del gen estructural £?-glucuronidasa . c) Preparación de un promotor múltiple con una señal de retención nuclear (NRS) y un factor de exportación nuclear (NEF) El nuevo promotor múltiple comprende las siguientes secuencias de nucleótidos diferentes que se suceden una tras otra en la dirección hacia abajo: - el promotor del gen cdc25B (ásidos nusleisos -950 a +167) la secuencia GCCACC; Seq. ID. No.: 1 (Kodak, J. Cell Biol., 108, 229 (1989)) el ADNc para el péptido señal de inmunoglobulina (se- cuencia de nucleótidos = 63 a = 107; Rieshmann et al., Nature 332, 323 (1988)) el ADNc para -glucuronidasa (secuencia de nucleótidos = 93 a = 1982; Oshima et al., PNAS USA, 84, 685 (1987)) - el ADNc para RER del virus VIH-1 en calidad de la señal de retención nuclear (NRS) (secuencia de nucleótidos 7357 a 7602; Ratner et al., Nature, 313, 277 (1985); Malim et al., Nature, 338, 254 (1989) ) - el promotor del gen del factor de von Willebrand (wWF) (ácidos nucleicos -487 a +247; Jahroudi y Lynch, Mol.

Cell Biol. 14, 999 (1994)) El ADNc para el REV del virus VIH-1 en calidad del factor de exportación nuclear (NEF) (sesuencia de aminoácidos 1-117; Ratner et al., Nature, 313, 277 (1985) ) . Los somponentes individuales de la construcción están enlazados por medio de sitios de restricción adecuados que se introducen en los extremos de los diferentes elementos durante la amplifisasión por PCR. El enlace se efectúa utilizando enzimas que son sonocidas por la persona experta en la materia y que son específicas para los sitios de restricción, y ADN ligasas. Estas enzimas se pueden obtener comercialmente. La construcción de nucleótidos que ha sido preparada de esta manera se clona en un vector del plásmido pUC18/l9 que se usa directamente o en sistemas de dispersión coloidal para una aplicación in vivo. Células endoteliales del cordón umbilical humanas y fibroblastos (Wi-38) que se mantienen en cultivo se transfectan con el plásmido descrito utilizando el método conocido por el experto en la materia (Lucibello, et al., EMBO J., 14, 132 (1995)), y la cantidad de /3-glucuronidasa que se produce por parte de las células endoteliales se mide utilizando 4-metilumbeliferil-3-glucuró-nido como sustrato. Con el fin de verificar la especificidad del ciclo celular, células endoteliales se sincronizan en GQ/G-L separando metionina durante un período de 48 horas. El contenido en ADN de las células se determina en un clasificador de células activado por fluorescencia después de la tinción con Hoechst 33258 (Lusibello et al., EMBO J., 14, 132 (1995)). Se obtienen los siguientes resultados: En los fibroblastos transfestados no se puede confirmar ningún incremento de ß-glucuronidasa en comparación con fibroblastos no transfectados. Las células endoteliales transfectadas expresan esencialmente más /3-glucuronidasa que lo que lo hacen las células endoteliales no transfectadas. Células endoteliales proliferantes (ADN > 2S; S = conjunto simple de cromosomas) secretan esencialmente más -glucuroni-dasa que lo hacen las células endoteliales que están sincronizadas en G0/Gx (ADN = 2S) . Por consiguiente, la unidad de promotor múltiple descrita conduce a una expresión específica de la célula y dependiente del ciclo celular del gen estructural /3-glucuronidas .

Aplicación Un compuesto activo de asuerdo con los ejemplos que se han descrito asegura, después de la administración local, por ejemplo en el sitio del tumor, o después de la administración intracraneal o subaracnoidea, o sistémica, preferiblemente la administración intravenosa o intraarterial que, como resulta-do de la especificidad del ciclo celular y de la especificidad de las células endoteliales de la unidad de promotor múltiple son principalmente, si no de forma exclusiva sólo las células endoteliales proliferantes las que secretan ß --glucuronidasa. Esta 3-glucuronidasa escinde un doxorrubicin--/3-glucurónido bien tolerado (Jasquesy et al., documento EPO 0 511 917 Al) que se inyecta ahora en doxorrubicina, que tiene un efecto citostátiso. La doxorrubicina inhibe la proliferación de las células endoteliales y ejerce un efecto citostátiso sobre estas sélulas y también sobre células tumorales adyacentes . Esto da como resultado el que se inhiba el desarrollo del tumor.

Claims (39)

REIVINDICACIONES

1.- Un promotor del gen cds25B, que somprende una secuensia que se híbrida con una secuensia según se describe en la Tabla 1 (SEQ ID No: 7) o una parte funcional de la misma en condiciones rigurosas .

2.- Un promotor según la reivindicasión 1, en el que el promotor comprende la sesuencia descrita en la Tabla 1 (SEQ ID No : 7) o parte funcional de la misma.

3. - Un promotor según la reivindicación 1 ó 2, en el que la parte funcional comprende la caja TATA, al menos un sitio de unión a Spl y al menos un sitio de unión a NF-Y y, cuando sea apropiado, al menos un sitio de unión a E2F y, también cuando sea apropiado, al menos una saja E.

4.- Un promotor según una de las reivindicaciones 1-3, que comprende la secuencia que abarca los nucleótidos desde aproximadamente -950 hasta aproximadamente +167 de la Tabla 1 o fragmentos de los mismos que todavia comprenden la totalidad de los elementos cis-reguladores funcionales de la sesuencia del promotor de los nucleótidos desde aproximadamente -950 hasta aproximadamente +167 según se describe en la figura 6.

5.- Un promotor según una de las reivindicaciones 1-3, que comprende la secuensia que abarca los nucleótidos desde aproximadamente -950 hasta aproximadamente +3 de la Tabla 1 o fragmentos de los mismos que todavía comprenden la totalidad de los elementos cis-reguladores funcionales de la secuensia del promotor de los nucleótidos desde aproximada-mente -950 hasta aproximadamente +3 según se describe en la figura 6. 6. - Un promotor según una de las reivindicaciones 1-3, que somprende la sesuensia que abarca los nucleótidos desde aproximadamente -930 hasta aproximadamente +3 de la Tabla 1 o fragmentos de los mismos que todavía comprenden la totalidad de los elementos cis-reguladores funcionales de la secuencia del promotor de los nucleótidos desde aproximadamente -930 hasta aproximadamente +3 según se describe en la figura

6.

7.- Un promotor según una de las reivindicaciones 1-3, que comprende la secuencia que abarca los nucleótidos desde aproximadamente -720 hasta aproximadamente +3 de la Tabla 1 o fragmentos de los mismos que todavía comprenden la totalidad de los elementos cis-reguladores funcionales de la secuencia del promotor de los nucleótidos desde aproximada-mente -720 hasta aproximadamente +3 según se describe en la figura 6.

8. - Un promotor según una de las reivindicaciones 1-3, que comprende la secuencia que abarca los nucleótidos desde aproximadamente -340 hasta aproximadamente 3 de la Tabla 1 o fragmentos de los mismos que todavía comprenden la totalidad de los elementos cis-reguladores funcionales de la secuencia del promotor de los nucleótidos desde aproximadamente -340 hasta aproximadamente +3 según se describe en la figura 6.

9.- Un promotor según una de las reivindicaciones 1-3, que comprende la secuencia que abarca los nucleótidos desde aproximadamente -180 hasta aproximadamente +3 de la Tabla 1 o fragmentos de los mismos que todavía comprenden la totalidad de los elementos cis-reguladores funcionales de la secuencia del promotor de los nucleótidos desde aproximada-mente -180 hasta aproximadamente +3 según se describe en la figura 6.

10.- Un promotor según una de las reivindicaciones 1-3, que comprende la secuencia que abarca los nucleótidos desde aproximadamente -100 hasta aproximadamente +3 de la Tabla 1 o fragmentos de los mismos que todavía comprenden la totalidad de los elementos cis-reguladores funcionales de la secuencia del promotor de los nucleótidos desde aproximadamente -100 hasta aproximadamente +3 según se describe en la figura 6.

11.- Un promotor según una de las reivindicaciones 1-3, que comprende la secuencia que abarca los nucleótidos desde aproximadamente -80 hasta aproximadamente +3 de la Tabla 1 o fragmentos de los mismos que todavía comprenden la totalidad de los elementos cis-reguladores funcionales de la secuencia del promotor de los nucleótidos desde aproximadamente -80 hasta aproximadamente +3 según se describe en la figura 6.

12.- Un promotor según una de las reivindicaciones 1-3, que comprende la sesuencia que abarca los nucleótidos desde aproximadamente -60 hasta aproximadamente +3 de la Tabla 1 o fragmentos de los mismos que todavía comprenden la totalidad de los elementos cis-reguladores funsionales de la secuencia del promotor de los nucleótidos desde aproximadamente -60 hasta aproximadamente +3 según se describe en la figura 6.

13.- Un promotor según una de las reivindicaciones 1-3, que comprende la secuencia que abarca los nucleótidos desde aproximadamente -30 hasta aproximadamente +3 de la Tabla 1 o fragmentos de los mismos que todavía comprenden la totalidad de los elementos cis -reguladores funcionales de la secuencia del promotor de los nucleótidos desde aproximadamente -30 hasta aproximadamente +3 según se dessribe en la figura 6.

14. - Un prosedimiento para encontrar promotores de cdc25B, que comprende marcar, preferiblemente marcar de forma radiastiva un promotor según una o más de las reivindicaciones 1 a 13 , y rastrear genotecas de ADN genómicas, preferiblemente de células de mamíferos, por medio de hibridación en condiciones rigurosas .

15.- Un procedimiento para aislar el promotor de cdc25B murínico, que comprende una genoteca de fagos genómica murí-nisa, obtenida de la raza de ratón 129FVJ, con una sonda que sontiene una parte de la sesuencia descrita en la Tabla 1 (SEQ ID NO: 7) , preferiblemente que contiene la secuencia SEQ ID NO: 4.

16.- Una construcción de ácido nucleico que comprende al menos un promotor según una de las reivindicaciones 1 a 13.

17. - Una construcción de ácido nucleico según la reivin-dicación 16, que comprende adicionalmente un gen estructural.

18. - Una construcción de ácido nucleico según la reivin-dicación 16, en el que dicho promotor está dispuesto más arriba del gen estructural .

19.- Una construcción de ácido nucleico según la reivindicación 17 ó 18, en la que la región 5' no codificadora del gen cdc25B tiene la secuencia de nucleótidos desde +1 hasta aproximadamente +167 insertada entre dicho promotor y el gen estructural .

20.- Una construcción de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 16-19, en la que el promotor según una de las reivindicaciones 1-13 está combinada con al menos una secuensia de astivación adicional, seleccionándose esta secuencia de activación adicional de una secuencia de activación no específica, específica del virus, metabólicamente específica, específica de la célula, específica del ciclo celular y/o dependiente de la proliferación celular.

21.- Una construcción de ácido nucleico según la reivindicación 20, en la que la secuencia de activación adicional se selecciona de promotores que están activados en células endoteliales, células peritoneales, células pleura-les, células epiteliales de la piel, células del pulmón, células del tracto gastrointestinal, células del riñon y vías del drenaje de orina, células musculares, células del tejido conjuntivo, células hematopoyéticas, macrófagos, linfocitos, células de leucemia, células tumorales o células glía; secuencias de promotor de virus, tales como HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV, CMV o VIH; secuencias de promotor o reforzador que son activadas por hipoxia, secuencias de activación específicas del ciclo celular de los genes que codifican cdc25C, ciclina A, cdc2, E2F-1, B-myb y DHFR, y/o secuencias de unión, tales como monómeros o multímeros de la caja Myc E, para fastores de transsripsión que aparesen o son activados de una manera dependiente de la proliferación celular.

22. - Una construcción de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 16-21, en la que el promotor según una de las reivindicaciones 1-13 está presente en una forma en la que está mutado al menos un sitio de unión para un factor de transcripción .

23.- Una construcsión de ácido nusleico según la reivindicasión 22, en la que está mutada la saja TATA.

24. - Una construcción de ácido nucleico según la reivin-dicación 22 ó 23, en la que, además de un gen estructural, está presente una secuensia de promotor o una secuencia de reforzador adicionales que pueden ser activadas de una manera no específica, específica de la célula o específica del virus, por parte de tetraciclina y/o de una manera específica del ciclo celular, y que activa la transcripción de al menos un gen estructural adicional que codifica al menos un factor de transcripción que está mutado, de modo que se une al o a los sitios de unión mutados del promotor según la reivindicación 22 ó 23 y activa a este promotor, y/o el gen estructural que codifica un factor de transcripsión.

25.- Una construcción de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 22-24, en la que el factor de transcripción es una proteína (TBP) que se une a una caja TATA mutada.

26.- Una construcsión de ácido nucleico según la reivindicación 25, que comprende (1) el promotor según una de las reivindicaciones 1-13, incluida la caja TATA, estando la secuencia de la caja TATA mutada en TGTA, (2) la secuencia GCCACC, (3) el ADNc para el péptido señal de inmunoglobulina (secuensia de nusleótidos = 63 a = 107) , (4) el /ADNc para /3-glusuronidasa (secuencia de nucleótidos = 93 a > 1982), (5) el promotor del gen vWF (secuensia de nucleótidos -487 a +247) , y (6) el ADNc para la proteína de unión a la caja TATA (secuencia de ácidos nucleicos de 1 a 1001, que está mutada en las posiciones del ácido nucleico 862 (A reemplazado por T), 889 y 890 (GT reemplazado por AC) y 895 (C reemplazado por G) ) .

27.- Una construcción de ácido nucleiso que somprende un promotor y un gen estructural, a cuyo extremo 3' se añade una señal de retención nuslear (NRS) , y un promotor adisional que astiva la transcripción del gen que codifisa un factor de exportación nuclear (NEF) , uniéndose este NEF al ARNm de la NRS, en donde al menos uno de dichos promotores es un promotor según una de las reivindicaciones 1-13.

28.- Una construcción de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 20-27, en donde al menos un promotor o reforzador está reemplazado por una unidad promotora que responde al activador.

29.- Una construcción de ácido nucleico según la reivindicación 28, en donde la unidad de promotor que responde al activador comprende al menos los siguientes componentes : (1) una o más subunidades de activador, idénticas o diferen- tes, cuya transcripción basal es activada por un promotor o reforzador y (2) un promotor que responde al activador que es activado por el producto de expresión de dicha subunidad de activador.

30.- Una construcción de ácido nusleiso según la reivindicasión 28 ó 29, que comprende, somo subunidad (A) de astivador, (1) el promotor según una de las reivindicaciones 1-13, (2) la señal de localización nuclear (NLS) de SV40 (T grande de SV40, aminoácidos 126-132; PKKKRKV) , (3) el dominio de transactivación ácido (TAD) VP16 de HSV-1 (aminoácidos 406 a 488) , y (4) el ADNc que codifisa la parte citoplásmica de la glicoproteína CD4 (aminoácidos 397-435) ; y, como una segunda subunidad (B) de activador, (1) el promotor del gen sdc25C (ácidos nusleicos -290 a +121) , (2) la señal de localización nuclear (NLS) de SV40 (T grande de SV40; aminoácidos 126-132; PKKKRKV); (3) el ADNc para el dominio de unión a ADN de la proteína Gal4 (aminoásidos 1 a 147) , y (4) el ADNc para la secuencia de unión a CD4 de la proteína p56 Ick (aminoácidos 1-71) y también el promotor que responde al activador que contiene hasta aproximadamente 10 copias de la secuencia de unión para la proteína de unión Gal4, que tiene la secuencia de nucleótidos 5' -CGGACAATGTTGACCG-3' , y el promotor de SV40 basal (secuencia de nucleótidos 48 a 5191) ; y, en caso apropiado, un gen estructural, preferiblemente un ADNc completo que codifica un compuesto activo, una enzima o una proteína de fusión que está constituida por un ligando y un compuesto activo o por un ligando y una enzima.

31.- Una construcción de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 17 a 30, en la que el gen estructural es un gen que codifica un compuesto activo que se selecciona de enzimas, proteínas de fusión, citoquinas, quimioquinas, factores de crecimiento, receptores para citoquinas, receptores para quimioquinas, receptores para factores de crecimiento, péptidos o proteínas con un efecto antiproliferante o citostático o apoptótico, anticuerpos, fragmentos de anti-cuerpos, inhibidores de la angiogénesis, hormonas peptídicas, factores de coagulación, inhibidores de la coagulación, proteínas fibrinolíticas , péptidos o proteínas que tienen un efecto sobre la circulación sanguínea, proteínas del plasma sanguíneo, antígenos de agentes infecciosos, antígenos de células o antígenos de tumores, sustancias inductoras de trombosis, proteínas activantes del complemento, proteínas de revestimiento de virus y/o ribozimas.

32.- Una construcsión de ásido nucleico según la reivindicasión 31, en la que el gen estructural es un gen que codifica una enzima que escinde un precursor de un fármaco en un fármaco .

33.- Una construcción de ácido nucleico según las reivindicaciones 31 ó 32, en la que el gen estructural es un gen que codifica una proteína de fusión de ligando/compuesto activo o una proteína de fusión de ligando/enzima, seleccionándose el ligando de citoquinas, factores de crecimiento, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, hormonas peptídicas, mediadores y/o proteínas de adhesión celular.

34.- Una construcción de ácido nucleico según las reivindicaciones 16-33 en la que es ácido nucleico es ADN.

35.- Una construcción de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 16-34, en la que la construcción de ácido nucleico se inserta en un vector, preferiblemente un vector de plásmido o un vector viral .

36.- Un procedimiento para preparar una construcción de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 16 a 35, que comprende unir los componentes individuales uno con otro.

37.- Una célula que alberga una construcción de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 16-35.

38.- El uso de una construsción de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 16-35, o de una célula según la reivindicasión 37, para preparar un producto farmacéutico para tratar una enfermedad que se selecciona de enfermedades tumorales, leucemias, enfermedades autoinmunes, alergias, artritis, inflamasiones, rechazos de órganos, reacciones de injerto frente a hospedante, enfermedades de la circulación sanguínea, enfermedades cirsulatorias, anemia, infecciones, enfermedades hormonales y/o lesión del sistema nervioso central .

39.- El uso de una célula según la reivindicación 38, en el que la célula es una célula endotelial.