MXPA98000489A

MXPA98000489A - Constructo de acido nucleico para expresar sustancias activas que pueden ser activadas por proteasas, y su preparacion y utilizacion

Info

Publication number: MXPA98000489A
Application number: MXPA/A/1998/000489A
Authority: MX
Inventors: Sedlacek Hansharald; Heinrich Heidtmann Hans; Muller Rolf
Original assignee: Hoechst Aktiengesellschaft
Priority date: 1997-01-16
Filing date: 1998-01-15
Publication date: 1999-02-24

Abstract

La presente invención se refiere a una construcción deácido nucleico para expresar una sustancia activa que es activada por una enzima que es liberada por células de mamífero, comprendiendo la construcción los componentes siguientes:a) al menos un elemento promotor, b) al menos una secuencia de ADN que codifica un compuesto activo (proteína B), c) al menos una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos (estructura parcial C) que puede ser escindida específicamente por una enzima que es liberada por una célula de mamífero, y d) al menos una secuencia de ADN que codifica un péptido o proteína (estructura parcial D) que estáunida al compuesto activo (proteína B) por la vía de la secuencia de aminoácidos escindible (estructura parcial C) e inhibe la actividad del compuesto activo (proteína B), y también al uso de la construción deácido nucleico para preparar un fármaco destinado al tratamiento de enfermedades.

Description

Constructo de ácido nucleico para expresar sustancias activas que pueden ser activadas por proteasas , y su preparación y utilización La presente invención se refiere a un construsto de ácido nucleico para expresar sustancias activas que pueden ser activadas por proteasas, y a su preparación y utilización. Como las áreas inflamadas, los tumores se distinguen del tejido normal circundante por un aumento sustancial en la formación y sesreción de proteasas [Schmitt et al., Fibrinol. 6, 3 (1992), Cottam et al., Int. J. Oncol 2, 861 (1993), Tryggvason et al., Breast Canser Res. and Treatm 24, 209 (1993), Leto et al., Anticancer Res. 12, 235 (1992), Hart, Fibrinol. 6, 11 (1992), Albini et al., J. Nati. Cáncer Inst. S3, 735 (1991)]. Ejemplos de estas proteasas son antígenos específisos prostáticos activadores del plasminógeno, catepsinas y metaloproteinasas de la matriz. Una función esencial de estas proteasas de los tumores es disolver la matriz extracelular para permitir que las células tumorales invadan el tejido normal, y se desarrollen de manera infiltrante en el mismo. Asimismo, estas proteasas protegen el tumor contra los mecanismos de defensa del cuerpo en la medida en que los compuestos activos que son necesarios para la defensa son escindidos y con ello inactivados, por las proteasas que son formadas por el tumor. Asi, por ejemplo, anticuerpos, citoquinas y factores de crecimiento, factores del complemento, factores de coagulación y mediadores son inactivados por las proteasas de los tumores. En el pasado, el objetivo ha sido, por consiguiente, inhibir el crecimiento infiltrante y el crecimiento metastásico de los tumores, y la inactivación de los mecanismos de defensa del suerpo, por inhibición de las proteasas de las células tumorales [Hocman, Int. J. Biochem. 24, 1365 (1992), Troll et al., «JNCI 73, 1245 (1984), Ray et al., Eur., Respir. 7, 2062 (1994), Koop et al., Cáncer Res. 54, 4791 (1994), Chiriri et al., Int. J. Cáncer 58, 460 (1994), Denhardt et al., 59, 329 (1993), Melshiori et al., Canser Res. 52, 2353 (1992)]. Sin embargo, particularmente por razones esteguiomé-tricas y farmacocinéticas, se ha alcanzado con anterioridad poco éxito en la inhibición de las proteasas de las células tumorales . Por esta razón, se realizó un intento de utilizar las proteasas de las células tumorales para activar toxinas bacterianas tales como la a-hemolisina de Staphylococcus aureus [Panchal et al., Nature Biotechn. 14, 852 (1996)] . Para esto, se insertó una secuencia de aminoácidos, a saber XX-Arg-X, en las posiciones 129 a 132 de la a-hemolisina y de este modo se produjeron mutantes inactivos que eran únicamente escindidos, y por consi<guiente activados, por proteasas tumorales tales como la catepsina B. Sobre la base de estos resultados, se propusieron proin-munolisinas [Panchal et al., Nature Biotechn. 14., 852 (1996) ] , proinmunolisinas que comprenden un anticuerpo que se acopla a una cx-hemolisina de Staphylococcus aureus que puede ser activada por proteasas tumorales o a una equinatosina II de anémona marina, determinando el anticuerpo la especificidad para las células diana del producto de acoplamiento. Sin embargo, el concepto propuesto presenta las desventajas siguientes en relación con su uso en terapia de tumores : En primer lugar, los autores seleccionaron lisinas y/o toxinas xenógenas no endógenas que son inmunogénicas para el organismo huésped (los pacientes) y como resultado inducen una reacción inmune en el organismo huésped, reacción inmune que neutraliza e inactiva el conjugado anticuerpo/toxina. En segundo lugar, es sabido [Sedlacek et al., Antibodies as Carriers of Cytotoxicity, Contrib. to Oncol. 43., Karger Ver-lag, Munich, 1992] «que, debido a su tamaño molecular y a las condiciones reológicas en el tumor, los anticuerpos e inmuno-toxinas específicos de los tumores se acumulan solamente en cantidades muy pequeñas (0,01-0,001% del anticuerpo o inmuno-toxina dado/g de tumor) en el tumor y penetran solamente en el tumor en una proporción incompleta, de tal manera que no es posible destruir todas las células tumorales o es únicamente posible destruir una pequeña porción de las células de un tumor. Además, la extensión en la que los antígenos tumo-rales, contra los cuales está dirigido el anticuerpo, se expresan difiere usualmente entre las células tumorales individuales, y las células tumorales variables, antígeno-negati-vas, eluden fácilmente el ataque por los anticuerpos o las inmunotoxinas . Adicionalmente, los antígenos que son secretados por las células tumorales neutralizan los anticuerpos en la periferia del tumor (Sedlacek et al., Monoclonal Antibodies in Tumor Therapy, Contrib. to Oncol., Karger Verlag, 1988) . En consecuencia, existe todavía una gran necesidad de una terapia específica para las células diana en cuanto a los tumores y las inflamaciones. El objeto de la presente invención es, por consiguiente, proporcionar un compuesto activo contra tumores e inflamaciones, compuesto activo que no presenta dichas desventajas. La presente invención se refiere por consiguiente a una nueva técnica que utiliza la secreción de enzimas en tumores o áreas de inflamación para conseguir la liberación local de compuestos activos cuyos precursores inactivos se expresan en células tumorales, células asociadas a los tumores o células inflamatorias . Una parte de la materia objeto de la presente invención es, así pues, un constructo de ácido nucleico para expresar una sustancia activa que es activada por una enzima que es liberada por células de mamífero, sustancia activa que comprende los componentes siguientes: a) al menos un elemento promotor, b) al menos una secuencia de ADN que codifica un compuesto activo (proteína B) , c) alómenos una secuencia de ADN que codifica una secuencia de" aminoácidos (estructura parcial C) que puede ser escindida específicamente por una enzima que es liberada por una célula de mamífero, y d) al menos una secuencia de ADN que codifica un péptido o proteína (estructura parcial D) que está unida al compuesto activo (proteína B) por la vía de la secuencia de aminoácidos escindible (estrustura parsial C) e inhibe la actividad del compuesto activo (proteína B) . En su forma más simple, los componentes individuales pueden estar dispuestos, por ejemplo, como se muestra en la Figura 1. En este caso, la expresión de una proteína BCD, codificada por los componentes b) , c) y d) , es inducida por activación de la secuencia promotora [componte a) ] . La secuencia de aminoácidos C del producto de expresión es escindida luego por enzimas selulares, p.ej. proteasas, como resultado de lo cual la proteína B, que constituye el compuesto activo, se libera. Dentro del significado de la presente invención, debe entenderse gue las proteasas o enzimas son una o más proteasas o enzimas. En otra realización, dicha enzima es una proteasa, en particular un antígeno específiso prostátiso astivador del plasminógeno, una sa-tepsina o una metaloproteinasa de la matriz. Dishas células de mamífero son preferiblemente células tumorales, células de leucemia, células endoteliales, macrófagos, linfocitos, células musculares, células epiteliales, células de glía, células sinoviales o células infectadas por virus . Las enzimas son liberadas preferiblemente, en un organismo, por turmores y células tumorales y también por células que están involucradas en un proceso inflamatorio [Barrett et al., Mammalian Protea-ses, Academic Press, Londres (1980) ; Sedlacek y Móróy, Immune Reactions, Springer Verlag, (1995) ] . De acuerdo con la presente invención, el componente c) se seles-ciona por consiguiente de tal manera gue la proteína expresada, p. ej . BCD, es escindida preferiblemente, en su estructura parcial C, por proteasas que se forman en tumores o son secretadas por células tumo-rales o células inflamatorias. Ejemplos de estas proteasas son activa-dores del plasminógeno, tales como el activador de plasminógeno del tipo uroguinasa o antígeno específico prostático activador del plasminógeno tisular; catepsinas, tales como catepsina B, catepsina D, ca-tepsina L, catepsina E o catepsina H, o sus precursores (proca-tepsinas) ; metaloproteinasas de la matriz (MMP) , tales como colagena-sas, por ejemplo de los grupos I, II, IIT, IV o V; estromelisina 1, estromelisina 2 o estromelisina 3; metrilisinas ; gelatinasas, tales como gelatinasa A (MMP 2) y progelatinasa B (MMP 9) y progelatinasa A [Pappot et al., Lung Cáncer 12, 1 (1995), Schmitt et al., Fibrinolysis 614 , 3 (1992), Monsky et al., Cáncer Biol. 4., 251 (1993), Rochefort et al., Medicine/Sciences 7, 30 (1991), Kao et al., 46, 1349 (1986), Fridman et al., Cáncer Res. 55, 2548 (1995), Ray et al., Eur. Respir. J. 7, 2062 (1994), Cottam et al., Int. J. Oncol. 2 , 861 (1993), Tryggvason et al., Breast Cáncer Res. and Treatm. 24, 209 (1993)]; proteasas superficiales de las células tumorales [proteasas expresadas en la superficie = seprasa; Monsky et al., Cáncer Res. 54, 5702 (1994)]; elastasa [Kao et al., Cáncer Res. 46, 1355 (1986)] ; antígeno específico prostático [Lund all, Biochem. Biophys. Res. Commun. 161, 1151 (1989), Riegman et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 159 , 95 (1989)] o tripsinógenos pancreáticos [Miszuk-Jamska et al., FEBS Lett. 294, 175 (1991)]. De acuerdo con otra realización de la presente invención, la secuencia de nucleótidos para el componente b) puede extenderse por la adición de un componente b' ) * Este componente b') codifica un ligando (estructura parcial B') que puede fijar el compuesto activo a una estructura diana. El componente b' ) se dispone, por ejemplo, como se muestra en la Figura 2. La expresión del constructo de ácido nucleico co-rrespondiente a la Figura 2 da como resultado una proteína, es decir, B'BCD, que se fija a una estructura diana por la via del ligando (estructura parcial B' ) . La estructura parcial C es escindida luego por proteasas celulares, liberando con ello el compuesto activo, es decir la proteína B'B. En una realización particular, dicha proteína B y la estructura parcial D son partes de los precursores naturales de compuestos proteínicos activos, habiéndose reemplazado la secuencia de escisión natural, que conecta las estructuras parciales B y D, por la estructura parcial C; en particular, dicha estructura parcial D es la estructura parcial de un precursor natural de un compuesto proteínico activo.

Los nuevos constructos de ácido nucleico están compuestos preferiblemente por ADN. Debe entenderse que la expresión "constructos de ácido nucleico" significa estructuras artificiales de ácido nucleico que pueden ser transcritas en las células diana. Dichos constructos se insertan preferiblemente en un vector, siendo particularmente preferidos vectores plasmídicos o vectores víricos . Dependiendo de la elección del elemento promotor [componente a) ] , los nuevos constructos de ácido nucleico expresan un gen estructural [componentes b) + c) + d) o b' ) + b) + c) + d) ] sea inespecíficamente, con especificidad celular, con especificidad vírica, en condiciones metabólicas particulares, con especificidad para el ciclo celular o en presencia de tetraciclina. Al menos dos elementos promotores idénticos o diferentes pueden combinarse también entre sí para el propósito de modificar la expresión del gen estructural dependiendo de la elección de estos elementos promotores. El componente a) es activado preferiblemente en células endoteliales, en células adjuntas a células endoteliales activadas, en células musculares, en células de leucemia, en células de tumor, en células de glía, en linfocitos, en macrófagos y/o en células sinoviales. La estructura parcial B (proteína B) de la proteina codificada por el nuevo gen estructural constituye el com-puesto activo real nuevo que es liberado o activado por la escisión de la estructura parcial C y convertido por ello del estado inhibido, p.ej. como proteína BCD o como proteína B'BCD, al estado activo, p.ej. como proteína B o como proteína B'B. De acuerdo con la invención, este compuesto activo puede ser una enzima que activa o inhibe una cascada de activación biológica y/o es un componente activo de esta cascada. Ejemplos de cascadas de activación biológica de esta naturaleza son el sistema de la coagulación, que puede ser activado o inhibido, la fibrinólisis, que es preferiblemente activada, el sistema del complemento, que asimismo es preferiblemente activado, o el sistema de las quininas, que es también prefe-riblemente activado. El compuesto activo puede ser también una enzima que convierte el precursor inactivo de una sustancia farmacológica en la sustancia activa o que es por sí mismo una sustancia farmacológicamente activa. Se da prefe-rencia particular a un compuesto activo (proteína B) que es un factor de coagulación que se selecciona de trombina, factor Va, factor Vlla, factor IXa, factor Xa, fragmentos TF activos en la coagulación o factor Xlla,- trombina, que está mutada en la región del sitio de escisión con Arg-Thr (posi-ción de aminoácidos 327/328) ; una proteína fibrinolítica que se selecciona de uroquinasa, tPA o sus híbridos funcionales; un factor del complemento que se selecciona de CVF, C3b o sus productos de escisión funcionales; una proteína antitrombótica que se selecciona de proteína C, inhibidor C-1S, al-anti-tripsina, hirudina, AT-III, TFPI, PAI-1, PAI-2 o PAI-3; una calicreína,- una proteína citostática, citotóxica o provocadora de inflamación; una proteína antiangiogénica; una proteína inmunomoduladora, una proteína anti-inflamatoria; una proteína que reduce el deterioro del sistema nervioso; una proteína que inhibe o neutraliza el efecto neurotóxico de TNFa; una proteína estimulante de la angiogénesis; una proteína hipor tensiva; una proteína antivírica; una citoquina; un interferón; un factor de necrosis de tumores; oncostatina M o LIF; un receptor de citoquinas; el resto de un receptor de cito-quinas que es exterior a la célula; un antagonista de cito-quinas ; un factor de crecimiento; un receptor de factor de crecimiento; el resto de un receptor de factor de crecimiento que es exterior a la célula; una quimioquina; angiostatina; factor 4 de las plaquetas; TIMP 1, TIMP 2 o TIMP 3; una ni-trorreductasa; una /?-glucuronidasa; una carboxipeptidasa; una 3-lactamasa; una citosina-desaminasa; una catalasa; una peroxidasa; una fosfatasa; una oxidasa; calicreína o una oxido nítrico-sintasa de las células endoteliales. La estructura parcial B' de la proteína codificada por el nuevo gen estructural constituye el nuevo ligando para fijación del compuesto activo (proteína B) a una estructura diana. Una estructura diana preferida es la superficie de las células, preferiblemente un receptor de la membrana celular, un antígeno de la membrana celular, una molécula de adhesión localizada en la membrana celular, o la matriz extracelular, por ejemplo de células endoteliales, en particular de células endoteliales activadas o proliferantes, células tumorales, células musculares, en particular células de la musculatura lisa, fibroblastos, macrófagos, linfocitos, células hepáticas, células renales, células sinoviales, células inflamatorias, células infectadas por virus, células del epitelio bronquial, células de glía, células de leucemia o células de otros tejidos y órganos. Una estructura diana particularmente preferida es la superficie de células endoteliales activadas y/o proliferantes. Otra estructura diana preferida está constituida por componentes de la matriz extracelular, por ejemplo colágenos [Prockop et al., Annu. Rev. Biochem. 64, 403 (1995), Wetzens et al., Am. J. Pathol. 139, 451 (1991)]; ficolina [Ichijo et al., -J. Biol. Chem. 268, 14505 (1993)]; sialoproteína [Be-llahcene et al., Cáncer Res. 54, 2823 (1994)] ; laminina [von der Mark et al., Biochem. Biophys. Acta 823 , 147 (1985); Hunt, Expl . Cell Biol. 57, 165 (1989)]; proteoglicanos [Schmidtchen et al., Biomed. Chromatography 7, 48 (1993)] o tenascina [Oyama et al., Cáncer Res. 51, 4876 (1991) ; Herlyn et al., Cáncer Res. 51, 4853 (1991)]. El nuevo ligando (estructura parcial B' ) puede, por ejemplo, ser un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, tal como el resto de fijación de epítope de un anticuerpo, Fab, Fv, Fv o Fc monocatenario, que se fija específicamente a un antígeno de la membrana celular o a un antígeno de la matriz extracelular, u otro péptido o proteína que se fija a un receptor en la membrana celular pertinente. Estos incluyen, por ejemplo, factores de crecimiento, citoquinas, interferones, factor de necrosis tumoral, quimioquinas , sus secuencias parciales de fijación de receptores, hormonas peptídicas, angiotensina, quinina o ácido fólico. El ligando puede ser también una molécula de adhesión o su secuencia de adhesión que se fija a una molécula correspondiente en la membrana celular o en la matriz extracelular, o el resto de fijación a células diana, un resto extracelular de un receptor Fc, una glicoproteína de fijación a las células diana de un virus que tiene tropismo para células seleccionadas, o una secuencia parcial de la glucoproteína que se fija a estas células, o un péptido mediante cuya ayuda el compuesto activo se ancla en la membrana celular de la célula que lo expresa. Ejemplos de estos péptidos de anclaje son los dominios transmembrana de receptores o proteínas víricas o anclas de glucofosfolípidos . El componente d) codifica un péptido (estructura parcial D) que se une a la proteína B o la proteína B'B por la vía de la estructura parcial C e inhibe con ello la actividad de la proteína B. El componente d) puede ser cualquier secuencia arbitraria de ácido nucleico. Preferiblemente, sin embargo, está compuesto de secuencias de ácido nucleico que codifican péptidos o proteínas endógenos (as) , a fin de evitar o reducir el peligro de una reacción inmune. En otra realización preferida, los componentes b) y d) del nuevo gen estructural codifican proteínas o péptidos endógenos (as) . Un número considerable de compuestos proteínicos activos existen en la naturaleza en forma de precursores inactivos (proteína BSD) . Un precursor de este tipo es activado por enzimas que escinden dicho precursor en una estructura parcial que constituye el compuesto proteínico activo real (pro-teína B) y en una estructura parcial inactiva (estructura parcial D) . Este precursor es escindido en al menos una secuencia de aminoácidos definida, es decir, la denominada secuencia de escisión (estructura parcial S) . Es una parte particular de la materia objeto de esta invención que esta secuencia de escisión (estructura parcial S) que existe naturalmente en precursores de compuestos proteínicos activos se reemplaza por la estructura parcial C. Este reemplazamiento se efectúa al ser reemplazada la secuencia codificante de la estructura parcial S por el componente c) , que codifica la estructura parcial C, en la secuencia de ácido nucleico que codifica el precursor natural (proteína BSD) . Después que se han añadido los componentes a) y, en caso apropiado, b' ) , se produce un nuevo constructo de ácido nucleico que comprende, por ejemplo, los componentes a)b')b)-c)d) o a)b)c)d), la estructura parcial C de cuyo producto de expresión, es decir la proteína B'BCD o BCD, respectivamente, es escindida por proteasas que se forman en los tumores o son secretadas por células tumorales o células inflamatorias, de tal manera que puede formarse el compuesto activo, es decir la proteína B'B o B. En otra realización, el nuevo constructo comprende al menos dos componentes idénticos o diferentes b)c)d) y/o b')-b)c)d), componentes que están enlazados entre sí por la vía de un denominado sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) .

Una vez que se ha insertado en un vector no vírico o vector vírico, el nuevo constructo de ácido nucleico se admi-nistra por regla general, para la profilaxis y/o terapia de los trastornos, localmente o se inyecta en la circulación sanguínea. Estos trastornos incluyen particularmente enfermedades tumorales e inflamaciones. Dichas inflamaciones pueden ser desencadenadas, por ejemplo, por deterioro físico-quí i-co, por una infección o por una reacción inmune contra tejido endógeno o extraño. La presente invención se refiere adicionalmente, por consiguiente, al uso de un nuevo constructo de ácido nucleico para preparar un fármaco destinado a la administración local o sistémica para la profilaxis y/o terapia de tumores, leucemias, alergias, enfermedades autoinmunes , infecciones, inflamaciones, reacciones de rechazo de trasplantes, trombosis, oclusiones de vasos sanguíneos, perturbaciones de la coagulación de la sangre y la circulación de la sangre, y lesiones a tejidos y/o deterioro del sistema nervioso. La elección de los componentes del nuevo constructo de ácido nucleico depende de la enfermedad de gue se vaya a ser tratada por administración del constructo de ácido nucleico, y puede hacerse como sigue: Secuencias promotoras [componente a) ] : De acuerdo con presente invención, se da preferencia particular, por una parte, a secuencias promotoras [componen- - li te a) ] que son promotores y secuencias activadoras que pueden ser activadas de una manera no restringida, tales como el promotor de la ARN-polimerasa III, en promotor de ARN-polime-rasa II, etc., el promotor CMV y el intensificador CMV, o el promotor SV40, y, por otra parte, a secuencias promotoras y activadoras víricas, tales como HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV o HIV. Por ejemplo, en el caso del promotor HIV, la secuencia LTR completa, que incluye la secuencia TAR [posiciones = -453 a = -80, Rosen et al., Cell 41, 813 (1985)] pueden utilizarse como un promotor específico de virus . Secuencias promotoras e intensificadoras activables metabólicamente, tales como el intensificador inducible por hipoxia, promotores que pueden ser activados de una manera específica del ciclo celular, tales como los promotores del gen cdc25C, el gen de la ciclina A, el gen cdc2 , el gen Bmyb, el gen DHFR o el gen E2F-1, o promotores activables por te-traciclinas, tales como el operador tetraciclina en combinación con un represor apropiado, se prefieren también particu-larmente como componente a) . De acuerdo con la presente invención, secuencias nucleo-tídicas que, después de fijarse a factores de transcripción, activan la transcripción de un gen estructural que se une a ellas en el extremo 3' , deben utilizarse también como secuen-cias promotoras. Adicionalmente, promotores que pueden ser activados de una manera específica de las células se prefieren particularmente como componente a) . Estos promotores incluyen preferiblemente promotores o secuencias activadoras compuestos (as) de promotores o intensificadores de aquellos genes que codifican preferiblemente proteínas en células seleccionadas. Por ejemplo, promotores para las proteínas siguientes deben utilizarse preferiblemente en las células siguientes: Secuencias promotoras y activadoras que se activan en células endoteliales, tales como el transportador endotelial de glucosa- I específico del cerebro, endoglina, el receptor VEGF 2 (flt-1) , el receptor VEGF 2 (flk-1, KDR) , tiel-1 o tiel-2, el receptor B61 (receptor Eck) , B61, endotelina, especialmente endotelina B y endotelina 1, receptores de endotelina, en particular el receptor de endotelina B, receptores de manosa-6-fosfato, factor von Willebrand, IL-la, IL-Iß , receptor IL-1, molécula de adhesión a las células vasculares (VCAM 1) o secuencias activadoras sintéticas. Como alternativa a los promotores naturales específicos de las células endoteliales, se puede hacer uso también de secuencias activadoras sintéticas que se componen de sitios de fijación oligomerizados para factores de transcripción que son preferente o selectivamente activos en células endoteliales . Un ejemplo es el factor de transcripción GATA 2, cuyo sitio de fijación en el gen de endotelina 1 es 5'-TTATCT-3' [Lee et al., Biol. Chem. 266, 16188 (1991), Dormann et al., J. Biol. Chem. 267, 1279 (1992) y Wilson et al., Mol. Cell. Biol. 10, 4854 (1990) ] . Promotores o secuencias activadoras que son activados-(as) en células que se encuentran en la proximidad de células endoteliales activadas, en particular en células de la muscu-latura lisa, están presentes, por ejemplo, en el gen VEGF. Las secuencias reguladoras génicas para el gen VEGF son la región flanqueante 5' , la región flanqueante 3' , el gen c-Src o el gen v-Src. Son también adecuados receptores de hormonas esteroida-les y sus elementos promotores, en particular el promotor del virus de tumor mamario del ratón, o elementos promotores del gen codificante de tropomiosina, cf-actina, a-miosina, el receptor para PDGF, el receptor para FGF, MRF-4, fosfofructo-«quinasa A, fosfoglicerato-mutasa, troponina C, miógenos, receptores de endotelina A, promotores de desmina o "artificiales" separados. Elementos promotores a los cuales pueden fijarse los factores de la familia hélice-anillo-hélice (HLH) (MyoD, Myf 5, miógenos y MRF4 [revisión en Olson y Klein, Genes Dev. 8_, 1 (1994) ] ) como los factores de transcripción específicos de los músculos, son análogamente adecuados. Los factores de transcripción específicos de los músculos incluyen también la proteína de dedo de zinc GATA-4 (Arceci et al., Mol. Cell Biol. 13, 2935 (1993), Ip et al., Mol. Cell Biol. 14, 7517 (1994)] y los grupos de los factores de transcripción de MEF [Yu et al., Gene Dev., 6, 783, (1992)] . Las proteínas HLH, y también GATA 4 exhiben una trans-cripción similar específica de los músculos no solo con promotores procedentes de genes específicos de los músculos, sino también en un contexto heterólogo, es decir con promotores "artificiales". Ejemplos de dichos promotores artificiales son copias múltiples del sitio de fijación (ADN) para proteínas HLH específicas de los músculos, tales como la caja E (myo D) , p.ej. 4x AGCAGGTGTTGGGAGGC, [Weintraub et al., PNAS 87, 5623 (1990)] o copias múltiples de sitio de fijación de ADN para GATA 4 del gen de la cadena pesada de a-miosina, p.ej . 5' - GGCCGATGGGCAGATAGAGGGGGCCGATGGGCAGATAGAGG3' [Molkentin et al., Mol. Cell Biol. 14, 4947 (1994)]. Ejemplos de promotores y secuencias activadoras que se activan en las células de leucemia son promotores para c-myc, HSP 70, bcl-1/ciclina D-1, bcl-2, IL-6, IL-10, TNFa, TNF/3, HOX-11, BCR-Abl, E2A-PBX-1 o PML-RATA. Ejemplos de promotores o secuencias activadoras que se activan en células tumorales son secuencias promotoras o activadoras que interaccionan con los factores de transcripción que se forman, o son activos, en células tumorales. Estas secuencias promotoras o activadoras preferidas incluyen secuencias reguladoras de genes o elementos de genes que codifican proteínas que se forman, en particular, en células de cáncer o células de sarcoma. Así, por ejemplo, el promotor de la proteína N-CAM se utiliza en el caso de los carcinomas bronquiales de células pequeñas, el promotor del receptor del factor del crecimiento de la hepatitis o de L-plastina se utiliza en el caso de los carcinomas de ovario, y el promotor de L-plastina o de la mucina epitelial polimórfica (PEM) se utiliza en el caso de los carcinomas de páncreas. Los promotores y las secuencias activadoras que se activan en células de glía son, en particular, las secuencias re«guladoras de genes o elementos de genes que codifican, por ejemplo, las proteínas siguientes: la proteína especificada de las células de Schwann periaxina, glutamina-sintetasa, proteína específica de las células de glía (proteína acida fibrilar glial = GFAP) , la proteína de las células de glía S-100b, IL-6 (CNTF), receptores 5-HT, TNFa, IL-10, receptor del factor del crecimiento afín a la insulina I y II o VEGF. Las secuencias reguladoras de genes para el gen VEGF han sido ya enumeradas anteriormente . Ejemplos de promotores y secuencias activadoras que se activan en linfocitos y/o macrófagos son las secuencias promotoras y activadoras de las citoquinas codificantes de genes, receptores de citoguinas y moléculas de adhesión, así como receptores para el fragmento Fc de anticuerpos. Ejemplos de éstos son: receptor de IL-1, IL-la, IL-3. IL-2, receptor de IL-2, IL-3, receptor de IL-3 (subunidad a) , receptor de IL-3 (subunidad ß ) , IL-4, receptor de IL-4, IL-5, IL-6, receptor de IL-6, factor 1 regulador de interferón (IRF-1) , (el promotor de IRF-1 es activado en la misma proporción por IL-6 que por IFN ? o IFN3) , el promotor de respuesta a IFN ?, IL-7, IL-8, IL-10, IL-11, IFN ?, GM-CSF, receptor de GM-CSF (cadena a) , IL-13, LIF, receptor del factor estimulante de colonias de macrófagos (MCSF) , receptores de los agentes de barrido de macrófagos tipos I y II, MAC-1 (antígeno funcional de leucocitos) , LFA-la (antígeno funcional de leucocitos) o pl50,95 (antígeno funcional de leucocitos). Ejemplos de secuencias promotoras y activadoras que se activan en células sinoviales son las secuencias promotoras para metaloproteinasas de la matriz (MMP) , por ejemplo para: MMP-l (colagenasa intersticial) , o MMP-3 (estromelisina-tran-sina) . Estas incluyen también las secuencias promotoras para inhibidores tisulares de metaloproteinasas (TIMP) , por ejemplo TIMP-1, TIMP-2 y TIMP-3. De acuerdo con la presente invención, varias de las secuencias promotoras que se han enumerado a modo de ejemplo pueden combinarse entre sí a fin de obtener la especificidad máxima posible de células diana en la expresión del nuevo constructo de ácido nucleico. Pueden combinarse también dos promotores idénticos. Se pueden combinar varias secuencias promotoras, por ejemplo, utilizando promotores quiméricos o promotores híbridos . Un promotor quimérico es la combinación , de una secuencia activadora de aguas arriba, que puede estar activada con especificidad celular, metabólicamente o con especificidad vírica, con un módulo promotor de aguas abajo que fija los factores de transcripción de las familias CDF y CHF o las familias E2F y CHF y puede inhibir con ello la activación de la secuencia activadora de aguas arriba en las fases GO y Gl del ciclo celular (Lucibello et al., EMBO J. En el caso de promotores híbridos, la caja TATA de un promotor se somete a mutación, por ejemplo, estando compensada esta mutación por una mutación correspondiente en el gen de una proteína de fijación de TATA, encontrándose a su vez esta proteína de fijación de TATA bajo el control de otro promotor. Secuencia de ácido nucleico [componente b')] , que codifica un ligando (estructura -parcial B'); De acuerdo con la presente invención, el ligando es una sustancia que fija un antígeno de membrana a un receptor o a una molécula de adhesión en la célula diana o «que se integra en la membrana celular y/o se fija a la matriz extracelular. Revisiones de las citoquinas y factores de crecimiento impor- tantes así como de sus receptores, moléculas de adhesión y proteínas de la matriz extracelular, han sido proporcionadas por Ayad et al., The Extracellular Matrix, Academic Press 1994; Callard et al., The Cytokine, Academic Press 1994; Pigott et al., The Adhesión Molecule, Academic Press 1994, y Barclay et al., The Leucocyte Antigen, Academic Press 1994.

Ejemplos de sustancias que se fijan a receptores son factores de crecimiento, tales como VEGF, PDGF, EGF, TGFQÍ, TGF/?, KGF, SDGF, FGF, IGF, HGF, NGF, BDNF, neurotrofinas, BMF, bombesina, M-CSF, trombopoyetina, eritropoyetina, SCF, SDGF, oncostatina, PDEGF o endotelina-1, citoquinas, tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, interferones a, ß y ?, factores de necrosis tumoral TNFa y TNF/S, quimioquinas , tales como RANTES, MCAF, MlP-la o MP-1/3, NAP, o /3-tromboglo-bulina, hormonas peptídicas, tales como SRH, SIH o STH, MRH o MSH, PRH, PIH o prolactina, LH-RH, FSH-RH, LH/ICSH o FSH, TRH o THS, CRH o ACTH, angiotensina, quininas, homólogos o análogos de los mismos, o vitaminas, tales como ácido fólico. De acuerdo con la presente invención, el ligando puede ser también una molécula de adhesión, una parte de una molécula de adhesión o un análogo de una molécula de adhesión que se fija a una molécula de adhesión correspondiente que está localizada en la membrana celular o a otra estructura de fijación específica para una molécula de adhesión en la célula diana o en la matriz extracelular. Ejemplos de moléculas de adhesión de este tipo que son capaces de funcionar como ligandos son Lewis X (para GMP-140), S Lewis X (para ELAM-1) , LFA-1 (para ICAM-1 e ICAM-2), MAC-1 (para ICA -1) , VLA-4 (para VCAM-1) , PECAM (para PECAM) , vitronectina (para el receptor de vitronectina) , GMP-140 (para Lewis X) , S Lewis X (para ELAM-1) , ICAM-1, ICAM-2 (pa-ra LFA-1 y AC-1) , VCAM-1 (para VLA-4) , fibronectina (para VLA-4) , laminina (para VLA-6) , laminina (para VLA-1, VLA-2 y VLA-3), fibrinógeno (para GPIIb-IIIa) , B7 (para CD28) , CD28 (para B7) , CD40 (para CD40L) , o CD40L (para CD40) . De acuerdo con la presente invención, el ligando puede ser también el resto extracelular de un receptor Fc [Dougherty, et al., Transfusión Science 1J7, 121 (1996)] . Adicionalmente, el ligando puede ser también una molécula de anticuerpo o el resto de fijación de epítope de una molécula de anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales murinos deberían em-plearse preferiblemente en forma humanizada. La humanización se efectúa de la manera descrita por Winter et al., Nature, 349 , 293 (1991) y Hoogenbooms et al. Rev. Tr. Transfus . Hemobiol. 36, 19 (1993) . Los fragmentos de anticuerpos recombinantes se preparan o bien directamente a partir de hibridomas existentes o se aislan a partir de genotecas de fragmentos de anticuerpos murinos o humanos [Winter et al., Annu. Rev. Immunol . 12, 433 (1994)] utilizando la técnica de presentación de fago [Smith, Science 228, 1315 (1985)]. Los fragmentos de anticuerpos se emplean luego directamente, a nivel genético, para manipulaciones ulteriores, p.ej. para fusión con otras proteínas. Con objeto de preparar fragmentos de anticuerpos recombinantes a partir de hibridomas, la información genética que codifica los dominios de fijación de antígeno (VH y VL) de los anticuerpos se obtiene por aislamiento del ARNm, por transcripción inversa del ARN en ADNc y multiplicación pósterior del ADNc por medio de la reacción en cadena de la polimerasa [Saiki et al., Science 230 , 1350 (1985)] y utilización de oligonucleótidos que son complementarios para los extremos 5' y 3' de los fragmentos variables (Orlandi et al., 1989) . Los fragmentos VH y VL se clonan luego en vectores de expresión bacterianos, por ejemplo en la forma de fragmentos Fv [Skerra & Plückthun, Science 240, 1038 (1988)], fragmentos Fv monocatenarios (scFv) [Bird et al., Science 242 , 423 (1988), Huston et al., PNAS-USA 85, 5879(1988)] o como fragmentos Fab [Better et al., Science 240, 1041 (1988)]. La técnica de presentación de fago puede utilizarse también para aislar nuevos fragmentos de anticuerpos directamente a partir de genotecas de anticuerpos (genotecas inmunes o genotecas naturales) de origen murino o humano. En la presentación de fago a partir de fragmentos de anticuerpos, los dominios de fijación de antígeno se someten a clonación, como proteínas de fusión con la proteína de la cubierta g3P de bacteriófagos filamentosos, sea en el genoma del fago [McCafferty et al., Nature 348 , 552 (1990)] o en vectores de fáge-mido [Breitling et al., Gene 104, 147 (1991)] en la forma de fragmentos scFv [McCafferty et al., Nature, 348, 552 (1990)] o como fragmentos Fab [Hoogenboom et al . , Nucí . Acid Res . 19, 4133 (1991), Barbas et al., PNAS-USA 88, 7978 (1991)]. Los fagos de fijación de antígeno se seleccionan en recipientes de plástico cargados con antígeno (lavado en batea) [Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 (1991)], en bolitas paramagnéti-cas conjugadas con antígeno [Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226, 889 (1992)] o por fijación a superficies celulares [Marks et al., Bio/Technol. 11, 1145 (1993)]. Se preparan genotecas inmunes sometiendo los fragmentos variables de anticuerpos procedentes de los linfocitos B de animales inmunizados [Sastry et al., PNAS-USA 86., 5728 (1989), Ward et al., Nature, 341, 544 (1989), Clackson et al., Nature 352 , 624 (1991)] o pacientes [Mullinax et al., PNAS-USA, 87, 8095 (1990), Barbas et al., PNAS-USA, 88, 7978 (1991) ] a multiplicación por PCR. Para esto, se hace uso de combinaciones de oligonucleótidos que son específicos para genes de inmunoglobulina de murino [Orlandi et al., PNAS-USA, 86/ 3833 (1989), Sastry et al., PNAS-USA, 86, 5728 (1989)] o genes de inmunoglobulina humanos [Larrick et al., BBRC, 160 , 1250 (1989)] o para las familias de genes de inmunoglobulina humanos [Marks et al., Eur. J. Immunol . 21, 985 (1991)]. Pueden prepararse genotecas naturales, por ejemplo, utilizando donantes no inmunizados como fuente de los genes de inmunoglobulina [Marks et al., J. Mol. Biol. 222 , 581 (1991) ] . Alternativamente, los genes de la línea germinal de inmunoglobulina pueden utilizarse para preparar repertorios de anticuerpos semisintéticos, multiplicándose la región 3 determinante de la complementariedad de los fragmentos variables por PCR utilizando iniciadores degenerados [Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227, 381 (1992), Barbas et al., PNAS-USA, 89, 4457 (1992), Nissim et al., EMBO J. 13, 692 (1994), Griffiths et al., EMBO J. 13, 3945 (1994)]. En comparación con genotecas inmunes, estas denominadas genotecas de un solo recipiente tienen la ventaja de que pueden aislarse fragmentos de anticuerpos contra un gran número de antígenos a par-tir de una sola genoteca [Nissim et al., EMBO J. 13., 692 (1994)] . La técnica de presentación de fago puede utilizarse para aumentar todavía más la afinidad de fragmentos de anticuerpos, preparándose genotecas nuevas a partir de fragmentos de anticuerpos ya existentes por mutagénesis aleatoria [Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226, 889 (1992), Gram et al., PNAS-USA, 89 , 3576 (1992)], basada en codones [Glaser et al., J. Immu-nol. 149, 3903 (1992)] o dirigida al sitio [Balint & Larrick, Gene 137, 109 (1993)], por mezcla desordenada de las cadenas de dominios individuales con las de fragmentos procedentes de repertorios naturales [Marks et al., Bio/Technol. 10, 779 (1992)] o empleando cadenas de mutantes bacterianos [Low et al., J. Mol. Biol. 26., 359 (1996)], y por aislamiento de fragmentos de anticuerpos que tienen propiedades mejoradas mediante reselección en condiciones severas [Hawkins et al . , J. Mol. Biol. 226, 889 (1992)]. Adicionalmente, pueden húmanizarse fragmentos de anticuerpos murinos por un reemplazamiento escalonado de uno de los dominios variables con un repertorio humano y selección posterior con el antígeno original (selección guiada) [Jespers et al., Bio/Technol, 12, 889 (1994)] . Alternativamente, se humanizan anticuerpos muri-nos por reemplazamiento específico de las reacciones hiperva-riables de anticuerpos humanos con las regiones correspondientes del anticuerpo murino original [Jones et al., Nature, 321, 522 (1987) ] . De acuerdo con la presente invención, el ligando puede ser también l'a secuencia nucleotídica que codifica una proteína de la cubierta, o una parte de una proteína de la cubierta, de virus que se fijan específicamente a células seleccionadas por la vía de su proteína de cubierta. El ligando puede ser también un péptido, con cuya ayuda el compuesto activo (proteína B) se ancla en la membrana celular de las células de expresión. Estos péptidos de anclaje incluyen los dominios transmembrana de receptores localizados en la membrana celular o de proteínas víricas, tales como la secuencia trans-membrana del factor estimulante de colonias de macrófagos humanos [posición en el ADN = 1485 a = 1554; [Cosman et al., Behring Inst. Mitt. 83., 15 (1988)] o la secuencia de ADN para las regiones de señal y transmembrana de la glucoproteína G del virus sincitial respiratorio (RSV) humano [aminoácidos 1 a 63 o sus secuencias parciales, aminoácidos 38 a 63; Vijaya et al., Mol. Cell Biol. 8., 1709 (1988); Lichtenstein et al., J. Gen. Virol. 77, 109 (1996)] o la secuencia de ADN para la región de señal y transmembrana de la neuraminidasa del virus de la influenza [aminoácidos 7 a 35 o la secuencia parcial de aminoácidos 7 a 27, Brown et al., «J. Virol. 62, 3824 (1988)]. Sin embargo, la secuencia nucleotídica para una ancla de glucofosfolípido [revisión de las proteínas de membrana ancladas por glucofosfolípidos en Ferguson et al., (Ann. Rev. Biochem. 57, 285 (1988))] puede insertarse también con e? propósito de anclar el compuesto activo en la membrana celular de las células sometidas a transducción que forman el compuesto activo. Anclas de glucofosfolípido han sido descritas, por ejemplo, para CEA [posición en el ADN < 893 a > 1079; Berling et al., Cáncer Res. 50, 6534 (1990)], para N-CAM [Cunningham et al., Science 236, 799 (1987)] y para otras proteínas de membrana tales como Thy-1 [Clissold, Biochem. J. 281, 129 (1992)] o CD 16 [Selvaray et al., Nature, 331, 565 (1988)] . La elección del ligando depende, ante todo y principalmente, de la célula diana que ha de someterse a transducción con el constructo de ácido nucleico. Ligandos para células endoteliales activadas son ejemplos de esto. Dentro del significado de la invención, estos ligandos incluyen anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que están dirigidos contra estructuras de membrana de células endoteliales, como ha sido descrito, por ejemplo, por Burrows et al., Pharmac . Ther. 64., 155 (1994), Hughes et al., Cáncer Res. 49., 6914 (1989) y Maruyama et al., PNAS-USA 87., 5744 (1990). En particular, estos anticuerpos incluyen anticuerpos contra actina, receptores de angiotensina II, anticuerpos contra receptores para factores de crecimiento tales como VEGF, FGF, PDGF o EGF, y anticuerpos contra moléculas de adhesión, por ejemplo contra el receptor de vitronectina o ICAM 3. Los ligandos incluyen adicionalmente todos los compuestos activos que se fijan a estructuras de membrana o receptores de membrana en células endoteliales. Ejemplos de éstos son IL-l o factores de crecimiento, o sus fra«gmentos o secuencias parciales de los mismos, que se fijan a receptores que son expresados en células endotelíales, por ejemplo PDGF, bFGF, VEGF o TGF3 [Pusztain et al., J. Pathol. 169, 191 (1993) ] . Los ligandos incluyen adicionalmente moléculas de adhe-sión que se fijan a células endoteliales activadas y/o proliferantes. Moléculas de adhesión de esta naturaleza, tales como Slex, LFA-1, MAC-1, LECAM-1, VLA-4 o vitronectina, han sido ya descritos [Augustin-Voss et al., J. Cell Biol. 119 , 483 (1992), Pauli et al., Cáncer Metast . Rev. 9, 175 (1990), Honn et al., Cáncer Metast. Rev. 11, 353 (1992), Pigott et al., The Adhesión Molecule, Academic Press (1994)]. Los ligandos comprendidos dentro del significado de esta invención incluyen también, en particular, glucoproteínas procedentes de las cubiertas de virus que tienen un tropismo determinado para células endoteliales. Ejemplos de estos virus son filovirus, tales como el virus Marburg con sus proteínas de cubierta GP (glucoproteínas) y sGP (segunda glu-c'oproteína) o el virus Ebola, en cada caso con sus proteínas de cubierta GP y sG, citomegalovirus, particularmente con su proteína gB, el virus del herpes símplex tipo I, el virus HIV-l. el virus del sarampión, el virus Hantaan, alfavirus, tales como el virus de la selva Semliki, el virus de la fiebre hemorrágica epidémica, poliovirus o enterovirus, tales como ECHO 9 , ECHO 12 y Coxsackie B3. Anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que están dirigidos contra estructuras de membrana de células musculares, en particular de las células de la musculatura lisa son ejemplos de ligandos para células musculares. Ejemplos de anticuerpos de' esta naturaleza son el anticuerpo 10F3, anticuer-pos contra actina, anticuerpos contra los receptores de la angiotensina II, anticuerpos contra los receptores de factores de crecimiento o anticuerpos, por ejemplo, contra receptores de EGF, contra receptores de PDGF o contra receptores de FGF, o anticuerpos contra receptores de la endotelina A. Los ligandos incluyen adicionalmente secuencias nucleo-tídicas para sustancias activas que se fijan a estructuras de membrana o receptores de membrana en células musculares [Pus-ztai et al., J. Pathol. 169, 191 (1993), Harris, Curr. Opin. Biotechnol. 2 , 260 (1991)]. Ejemplos de estos ligandos son factores de crecimiento, o sus fragmentos o secuencias parciales de los mismos, que se fijan a receptores que son ex-presados en células de la musculatura lisa, por ejemplo PDGF, EGF, TGF/3, TGFo;, FGF o endotelina A. Los ligandos incluyen también glucoproteínas procedentes de las cubiertas de aquellos virus que tienen cierto tropismo para las células musculares. Un ejemplo de estos virus es el citomegalovirus [Speir, et al., Science 265 , 391 (1994)] . Ejemplos de ligandos para macrófagos activados y/o linfocitos activados son, adicionalmente, secuencias nucleotídi-cas que codifican sustancias que se fijan específicamente a la superficie de células inmunes . Estas sustancias incluyen anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que están dirigidos contra estructuras de membrana de células inmunes, como ha sido descrito, por ejemplo, por Powelson et al., Biotech. Adv. ü, 725 (1993) y Barclay et al., The Leucocyte Antigen, Academic Press (1994) . Los ligandos incluyen también anti-cuerpos monoclonales o policlonales o fra«gmentos de anticuerpos «que se fijan, por su resto variable de fijación de antígeno, a receptores Fc?, Fce o Fcµ de células inmunes [Rojana-sakul et al., Pharm. Res. 11, 1731 (1994)] . Dichos fragmentos incluyen también el fra«gmento Fc de la inmunoglobulina humana monoclonal o policlonal. Los ligandos incluyen adicionalmente todas aquellas sustancias que se fijan a receptores de membrana en la superficie de células inmunes. Estas sustancias incluyen citoquinas, tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-10, TNFa, GM-CSF y M-CSF, y también factores de crecimiento, tales como EGF, TGF, FGF, IGF o PDGF, o sus fragmentos o secuencias parciales de los mismos, que se fijan a receptores que se expresan en células inmunes [Callard, et al., The Cytokine, Academic Press (1994)] . Los ligandos incluyen también molé-culas de adhesión y otros ligandos que se fijan a las estructuras de la membrana celular en macrófagos, y en el bazo, hígado, pulmón y otros tejidos [Pigott et al., The Adhesión Molecule, Academic Press (1994), Perales et al., Eur. J. Biochem. 226, 255 (1994)]. Los ligandos comprendidos en el significado de esta invención incluyen también glucoproteínas de las cubiertas de aquellos virus que tienen cierto tropismo para linfocitos y/o macrófagos. Ejemplos de estos virus infectantes de macrófagos son HIV-l, en particular aquellas cepas que tienen mutaciones en la región V3 de gpl20 que dan como resultado una fijación incrementada a macrófagos, HIV-2, Hantavirus, por ejemplo Punmalavirus, citomegalovirus, virus sincitial respiratorio, virus del herpes símplex o filovirus. Ejemplos de virus infectantes de linfocitos son el virus zóster de la varicela (VZV) , dado que VZV infecta las células T en particular, el herpesvirus 6 (HHV 6) , dado que HHV 6 in-fecta análogamente las células T en particular, el virus de la rabia, dado que la proteína de la cubierta del virus de la rabia se fija las células TH2 en particular, HIV-1, dado que la glucoproteína gpl20 se fija preferiblemente a la molécula CD4 de las células T, HTLV-II, dado que HTLV-II infecta las células B en particular, HTLV-I, dado que HTLV-I infecta las células T en particular, los virus C de la influenza, dado que los virus C de la influenza se fijan al ácido N-acetil-9-/ß-acetilneuramínico (Neu 5,9 Ac) , que se encuentra preferencialmente en los linfocitos B y en menor proporción, o no se encuentra en absoluto, en los linfocitos T, por la vía de la proteína de fusión hemaglutinina-esterasa (HEFS) , los virus C de la influenza que tienen una mutación en la posición del nucleótido 872, que codifica la posición 284 de la secuencia de aminoácidos de la HEF, por ejemplo, por reemplazamiento de la treonina con isoleucina, dado que la proteína HEF de la superficie que posee esta mutación tiene una afinidad notablemente más fuerte para el receptor del ácido N-acetil-9-O-acetilneuramínico que lo hace el virus de tipo salvaje, productos de escisión de la proteína HEF del virus C de la in-fluenza que contienen la estructura para fijación al ácido N-acetil-9-/3-acetilneuramínico. Esta estructura de fijación está definida por la triada catalítica serina 71, histidina 368 ó 369 y ácido aspártico 261, el virus Epstein-Barr, dado que EBV infecta las células B en particular, el virus 2 del herpes símplex, dado que HSV-2 infecta células T en particular o el virus del sarampión. Ejemplos de ligandos para células sinoviales y células inflamatorias que deben mencionarse son secuencias de ácido nucleico que codifican anticuerpos o fragmentos de anticuerpos «que se fijan, por sus dominios variables, a estructuras de membrana de células sinoviales o células inflamatorias. Ejemplos de estas estructuras de membrana son vimentina [Miettinen et al., Am. J. Pathol. 117, 18 (1984)], fibronectina [Wojciak et al., Clin. Exp. Immunol . 93, 108 (1993)] o receptores Fc . Estos ligandos incluyen también anticuerpos o fra mentos de anticuerpos que se fijan al receptor Fc por sus dominios constantes [Rojanasakul et al., Pharm. Res. 11., 1731 (1994) ] . Estos ligandos incluyen adicionalmente todos los compuestos activos que se fijan a estructuras de membrana o receptores de membrana en células sinoviales. Ejemplos de éstos son citoguinas o factores de crecimiento, o sus fragmentos o secuencias parciales de los mismos, gue se fijan a receptores que son expresados por células sinoviales por ejemplo IL-l-RA, TNFa!, IL-4, IL-6, IL-10, IGF o TGFß [Callard et al., The Cytokine, Academic Press (1994)]. Ejemplos de ligandos para células infectadas por virus que deben mencionarse son constructos de ácido nucleico que codifican anticuerpos o fragmentos de anticuerpos gue están dirigidos contra los antígenos víricos que se localizan en la membrana celular de las células infectadas por virus. Anti-cuerpos de esta naturaleza están dirigidos, por ejemplo, contra antígenos de HBV, HCV, HSV, HPV, HIV, EBV o HTLV. Ejemplos de ligandos para células hepáticas y células de otros tejidos son todas las sustancias gue se fijan a las estructuras de membrana o receptores de membrana en la super-ficie de las células hepáticas. Ejemplos de éstos son factores del crecimiento, tales como cito«quinas, EGF, TGF, FGF o PDGF, o sus fracjmentos o secuencias parciales de los mismos, que se fijan a receptores que se expresan en células de esta naturaleza. Estos ligandos incluyen adicionalmente ligandos que se fijan a estructuras de la membrana celular que son selectivas para tejidos particulares. Ejemplos son: Estos ligandos y estructuras de membrana han sido revisados en Perales et al., Eur. J. Biochem. 226, 255 (1994).

Los ligandos incluyen particularmente glucoproteínas de las cubiertas de virus que tienen cierto tropismo para célu-las seleccionadas, tal como para las células del epitelio bronquial (virus sincitial respiratorio) , células hepáticas (virus de la hepatitis C) , filovirus, virus Marburg por la vía del receptor de asialoglucoproteína de las células h páticas, virus de la hepatitis B, fijándose preferiblemente las células hepáticas a los dominios preS2 y preSl de HBV por la vía del receptor de asialoglucoproteína, virus de la hepatitis D, células sinusoidales del hígado, y virus de la hepatitis B, fijándose HBV por la vía de la fibronectina. Ejemplos de ligandos para células de glía son secuencias de ácido nucleico que codifican anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que están dirigidos contra estructuras de membrana de las células de glía, como ha sido comunicado, por ejemplo, por Mirsky et al., [Cell and Tissue Res. 240 , 723 (1985)], Coakham et al., [Prog. Exp. Tumor Res. 29., 57 (1985)] y McKeever et al., [Neurobiol . 6, 119 (1991)]. Estas estructuras de membrana incluyen adicionalmente moléculas de adhesión neural tales como N-CAM, en particular su cadena polipeptídica C [Nybroe et al., J. Cell Biol. 101, 2310 (1985)]. Estos ligandos incluyen adicionalmente todos los compuestos activos que se fijan a estructuras de membrana o receptores de membrana en las células de glía. Ejemplos de estos compuestos activos son insulina y el factor de creci-miento afín a la insulina, y aquellos fragmentos de estos factores de crecimiento que se fijan a los receptores de membrana pertinentes. Los ligandos comprendidos dentro del significado de la invención incluyen adicionalmente secuencias de ácido nuclei-co que codifican glucoproteínas de las cubiertas de aquellos virus que tienen cierto tropismo para las células de glía.

Estos virus incluyen, por ejemplo, HIV-1, subtipo JRF1 o el virus I del herpes símplex. Ejemplos de ligandos para células de leucemia incluyen constructos de ácido nucleico que codifican anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que están dirigidos contra las estructuras de membrana de las células de leucemia. Han sido ya descritos un gran número de anticuerpos monoclonales de esta naturaleza para procedimientos diagnósticos y terapéuti-cos [Kristensen, Danish Medical Bulletin 41, 52' (1994) ; Sch-ranz, Therapia Hungarica 3.8, 3 (1990); Drexler et al., Leuk. Res. 10, 279 (1986); Naeim, Dis. Markers 7, 1 (1989); Stick-ney et al., Curr. Opin. Oncol. 4, 847 (1992); Drexler et al., Blut 57, 327 (1988); Freedman et al., Cáncer Invest. 9, 69 (1991)] . Dependiendo del tipo de leucemia son, por ejemplo, adecuados como ligandos anticuerpos monoclonales o sus fragmentos de anticuerpos fijadores de antígeno, de la especificidad siguiente: Células AML que tienen los antígenos de membrana CD13 , CD14, CD15, CD33, CAMAL y siaiosil-LE; células B-CLL que tienen los antígenos de membrana CD5, CDlc y CD23, así como idiotipos e isotipos de las inmunoglobulinas de membrana; células T-CLL «que tienen los antígenos de membrana CD33, M38, receptores de IL-2 y receptores de las células T; y células ALL que tienen los antígenos de membrana CALLA y CD19, así como células de linfoma no Hodgkin.

Los ligandos incluyen además todos los compuestos activos que se fijan a estructuras de membrana o receptores de membrana de las células de leucemia. Ejemplos de éstos son factores del crecimiento, o sus fracjmentos o secuencias par-cíales de los mismos, que se fijan a receptores que son expresados en las células de leucemia. Factores del crecimiento de esta naturaleza han sido ya descritos [revisiones en Cross et al., Cell 64, 271 (1991); Aulitzky et al., Drugs 48., 667 (1994); Moore, Clin. Cáncer Res. 1, (1995); Van Kooten et al., Leuk. Lymph. 12, 27 (1993)] . Por ejemplo, aquéllos incluyen IFNa, en el caso de los linfornas no Hodgkin, IL-2, particularmente en el caso de leucemias de las células T, FGF en el caso de las leucemias de las células T, monocíticas, mieloides, eritrocíticas y megacarioblásticas, TGF/3 en el caso de leucemias, o retinoides, p.ej. ácido retinoico, en el caso de la leucemia promie-locítica a«guda. Ejemplos de ligandos para células tumorales incluyen secuencias de ácido nucleico que codifican anticuerpos, y fracjmentos de estos anticuerpos, que están dirigidos contra estructuras de membrana en células tumorales. Anticuerpos de esta naturaleza han sido revisados, por ejemplo, por Sedlacek et al., Contrib. to Oncol. 32., Karger Verlag, Munich (1988) y Contrib. to Oncol. 43., Karger Verlag, Munich (1992) . Otros ejemplos son anticuerpos contra sialil Lewis, péptidos de tumores que son reconocidos por las células T, proteínas expresadas por oncogenes, gangliósidos tales como GD3 , GD2, GM2, 9-0-acetil-GD3 y fucosil-GMl, antígenos de grupo sanguíneo y sus precursores, antígenos que se encuen-tran en la mucina polimórfica epitelial o antígenos que se encuentran en las proteínas del choque térmico. Secuencia de ácido nucleico [componente b) ] que codifica un compuesto activo (proteína B) : El compuesto activo (proteína B) se acuerdo con la pre-senté invención puede ser una sustancia que, por ejemplo, interviene en una cascada de activación biológica y/o es un componente activo de esta cascada. Estas sustancias incluyen compuestos activos que activan la cascada de coagulación, por ejemplo la trombina [MacGillivray et al., Ann. N.Y. Acad.' Sci. 485 , 73 (1986)], trombina que está mutada en la región del sitio de escisión Arg-Thr (posición de aminoácidos 327-328), factor Va [Cripe et al., Biochem. 31, 3777 (1992), Jenny et al., PNAS-USA 84, 4846 (1987)]. Factor Vlla [O'Hara et al., PNAS-USA 84, 5158 (1987)], factor IXa [Yoshitake et al., Biochem. 24., 3736 (1985)], factor Xa [Messier et al., Gene 99., 291 (1991)] o factor tisular y sus fragmentos acti-vos en la coagulación [Morrissey et al., Cell 50., 29 (1987); Scarpati et al., Biochem. 26, 5234 (1987); Spicer et al., PNAS-USA 84, 5148 (1987); Rehemtulla et al . , Thromb. Heamost. 65, 521 (1991)] o que inhiben la cascada de la coagulación o que activan la fibrinólisis, por ejemplo, los inhibidores del activador del plasminógeno PAI-1, PAl-2 y PAl-3, hirudina, proteína C, inhibidores de serina-proteinasa, tales como el inhibidor C-1S, al-antitripsina o antitrombina III, inhibidor del camino del factor tisular (TFPI) , activadores del plasminógeno tales como uroquinasa, activador del plasminógeno tisular (tPA) , o híbridos de los mismos, o que activan la cascada del complemento, por ejemplo factor de veneno de cobra (CVF) o secuencias parciales de CVF que corresponden funcionalmente al factor del complemento humano C3b, es decir que son capaces de fijarse al factor B del complemento y que, después de haber sido escindidos por el factor D, constituyen una convertasa C3 (la secuencia de ADN para CVF y sus secuencias parciales fueron descritas por Fritzinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91, 12775 (1994)), factor C3b del complemento humano (la secuencia de ADN para C3 y sus secuencias parciales fueron publicadas por De Bruijn et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 8_2, 708 (1985), productos de escisión del factor C3 del complemento humano que se asemejan a CVF funcional y estructuralmente (productos de escisión de este tipo han sido descritos por O'Keefe et al., J. Biol. Chem. 263 , '12690 (1988) o que activan el sistema de las quininas, el sistema del"complemento y/o el sistema de la coagulación, por ejemplo el factor Hagemann activado (F Xlla) [Shibuya et al., Biochem. Biophys. Acta 1206, 63 (1994), Que et al., Biochem. 25, 1525 (1986), Tripodi et al., Nucí. Acid Res. 14, 3146 (1986)] o calicreína [Chen et al., Biochem. J. 307, 481 (199-5), Fukushima et al., Biochem. 24, 8037 (1985)]. El compuesto activo (proteína B) puede ser también una proteína citostática, citotóxica o provocadora de inflamación, tal como perforina, granzima, citoquinas, tales como IL-1, IL-2, TL-4, IL-12, IL-3, IL-5, factor inhibidor de la leucemia humana (LIF) , IL-7, IL-11, IL-13, GM-CSF, G-CSFb o M-CSF, interferones, tales como IFNa, IFN/? o IFN?, TNF, tal como TNFa o TNF/3, oncostatina M, esfingomielinasa [Jarvis et al. , PNAS USA 9JL, 73 (1994) ] , magainina y derivados de magai-nina [Cruciani et al., PNAS USA 88., 3792 (1991)],- Jacob et al., Ciba Found. symp. 186, 197 (1994); Peck-Miller et al., Cáncer Chemother. Pharmac . 32., 109 (1993)] o quimioquinas , tales como RANTES (MCP-2) , factor quimiotáctico y activador de los monocitos (MCAF) , IL-8, proteína 1 inflamatoria de los macrófagos (MIP-la o MlP-lß) o proteína 2 activadora de los neutrófilos (NAP-2) . El compuesto activo (proteína B) , puede ser también una proteína antiangiogénica, tal como angiostatina, interferones, tales como IFNa, IFN/3 o IFN?, factor plaquetario 4, IL-12, TIMP-l, TIMP-2 O TIMP-3. El compuesto activo (proteína B) puede ser también una enzima «que es capaz de convertir un precursor inactivo de una sustancia farmacológica activa, por ejemplo un agente citos-tático, en la sustancia activa propiamente dicha. Ejemplos de tales compuestos activos son nitrorreductasa bacteriana, ß-glucuronidasa bacteriana, ¿ß-glucuronidasa de las plantas derivada de Sécale cereale, /3-glucuronidasa humana, carboxi-peptidasa humana (CB) , p.ej. CB-A de los mastocitos o CB-B pancreática, o carboxipeptidasa bacteriana, /3-lactamasa bacteriana, citosina-desaminasa bacteriana, catalasa o peroxidasa humana, fosfatasa, en particular fosfatasa alcalina humana o fosfatasa prostática acida humana, fosfatasa acida tipo 5, oxidasa, en particular lisil-oxidasa humana o D-aminooxidasa acida humana, peroxidasa, en particular glutatión-peroxidasa humana, peroxidasa de los eosinófilos humanos o peroxidasa del tiroides humano. ?l compuesto activo (proteína B) puede ser también una proteína que afecta al sistema inmune, por ejemplo una pro-teína que tiene un efecto antialérgico, tal como IFN3, IFN?, IL-10, receptores de IL-4 solubles, IL-12 o TGF3, o una proteína que puede prevenir el rechazo de órganos trasplantados, tal como IL-10, TGF/3, receptores de IL-1 solubles, receptores de IL-2 solubles, antagonistas de receptores de IL-2 o recep-tores de IL-6 solubles, o una proteína para la terapia de enfermedades autoinmunes mediadas por anticuerpos, por ejemplo TGF3, IFNo!, IFN?, IFN?, IL-12, receptores de IL-4 solubles o receptores de IL-6 solubles, o una proteína para la terapia de enfermedades autoinmunes mediadas por células, por ejemplo IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, TNFa;, IL-4 o TNF3 , o una proteína para la terapia de la artritis . De acuerdo con la presente invención, pueden seleccionarse también genes estructurales cuya proteína expresada inhibe directa o indirectamente la inflamación, por ejemplo en una articulación, y/o promueve la reconstitución de la matriz extracelular (tejido cartilaginoso y conjuntivo) en la articulación. Estas proteínas expresadas incluyen, por ejemplo, antagonistas de ios receptores de IL-1 (IL-l-RA) , dado que IL-l-RA inhibe la fijación de IL-la; e IL-10, receptor de IL-1 soluble, dado que el receptor de IL-1 soluble se fija a IL-1 y la inactiva, IL-6, dado que IL-6 aumenta la secreción de TIMP y superóxidos y disminuye la secreción de IL-1 y TNFo; por las células sino-viales y los condrocitos, el receptor de TNF soluble, dado que el receptor de TNF soluble se fija a TNF y lo activa, IL-4, dado que IL-4 inhibe la formación y secreción de IL-1, TNFa! y MMP, IL-10, dado que IL-10 inhibe la formación y secreción de IL-l, TNFa y MMP y aumenta la secreción de TIMP, factor de crecimiento afín a la insulina (IGF-1) , dado que IGF-1 estimula la síntesis de la matriz extracelular, TGF/3, especialmente TGF/31 y TGFJ2 , dado que TGFJ estimula la síntesis de la superóxido-dismutasa de la matriz extracelular, o TIMP (inhibidores tisulares de las metaloproteinasas) , especialmente TIMP-1, TIMP-2 o TIMP-3. El compuesto activo (proteína B) puede ser también una proteína para reducir el deterioro del sistema nervioso, por ejemplo un factor del crecimiento, tal como FGF, factor del crecimiento de los nervios (NGF) , factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), neurotrofina 3 (NT-3), neurotrofina 4 (NT-4) o factor neurotrófico ciliar (CNTF) , o una citoquina, o un inhibidor de citoquina, que es capaz de inhibir o neu-tralizar el efecto neurotóxico de TNFa!, por ejemplo TGFJ, receptores de TNF solubles, IL-10, dado que IL-10 inhibe la formación de IFN?, TNFa!, IL-2 e IL-4, receptores de IL-1 solubles, tales como el receptor I de IL-1 o el receptor II de IL-l, dado que los receptores de IL-1 solubles neutralizan la actividad de IL-1, antagonista de los receptores de IL-1 o receptores de IL-6 solubles. El compuesto activo (proteína B) puede ser también una proteína que estimula la angiogénesis, por ejemplo VEGF o FGF. El compuesto activo (proteína B) puede ser, adicionalmente, una proteína que disminuye la presión sanguínea, por ejemplo calicreína o la óxido nítrico-sintasa de las células endoteliales . El compuesto activo (proteína B) puede ser también una proteína para la terapia de enfermedades infecciosas crónicas, por ejemplo una proteína que exhibe efectos citostáticos o citotóxicos, o una enzima que escinde un precursor de una sustancia antivírica o citotóxica en la sustancia activa, o una citotoxina que tiene un efecto antivírico o un factor del crecimiento que tiene un efecto antivírico. Ejemplos son IFNa!, IFNS, IFN?, TNF/3, TNFa!, IL-1 o TGF/3. La presente invención se refiere además a un constructo de ácido nucleico en el cual están combinadas dos secuencias de ADN idénticas o diferentes, que codifican compuestos acti-vos idénticos o diferentes (proteína B) [componente b) y b")] .

Con objeto de asegurar que se expresen ambas secuencias de ADN, el ADNc de un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) se intercala preferiblemente, como un elemento regulador, entre las dos estructuras. Un sitio de entrada de ribo-soma interno hace que sea posible expresar dos secuencias de ADN que están enlazadas una a otra por la vía de un IRES. Sitios IRES de esta naturaleza han sido descritos, por ejemplo, por Montford y Smith TIG 11, 179 (1995) ; Kaufman et al., Nucí. Acids Res. 19, 4485 (1991); Morgan et al., Nucí. Acids Res. 20, 1293 (1992); Dirks et al., Gene 128, 247 (1993) ,- Pelletier y Sonenberg, Nature 334, 320 (1988) y Sugi-tomo et al., BioTechn. 12, 694 (1994). Así, por ejemplo, el ADNc para la secuencia IRES del poliovirus (posiciones = 140 a = 630 de UTR 5') [Pelletier y Sonenberg, Nature 334, 320 (1988)] pueden utilizarse para enlazar el ADN del componente c) al ADN del componente d) . Secuencias de ácido nucleico [componente c) ] que codifican la estructura parcial C escindible por proteasas: De acuerdo con la presente invención, la estructura parcial C comprende una secuencia de aminoácidos «gue es escindida por proteasas que se forman en los tumores o por células tumorales o células inflamatorias . La secuencia de ácido nucleico para esta estructura parcial C está insertada, por ejemplo, en la secuencia de ácido nucleico del precursor existente naturalmente (proteína BSD, donde S es la secuencia de escisión existente naturalmente) del compuesto activo pertinente (proteína B) en lugar de la secuencia S de escisión, tal que este ácido nucleico recombinante expresa la proteína BCD o B'BCD. La secuencia de ácido nucleico que codifica la estructura parcial C se elige dependiendo de la proteasa que es secretada predominantemente en el tumor o en la inflamación. Las estructuras parciales C siguientes pueden, por ejemplo, emplearse para las enzimas siguientes [Barrett et'al., Mammalian Proteases, Academic Press, Londres (1980), Panchal et al., Nature Biotechnol. 14, 852 (1996); Pigott et al., Ayad et al., The Extracellular Matrix, Academic Press (1994) ; Yoshida et al., Int. J. Cáncer 6J3, 863 (1995), Petersen et al., J. Biol. Chem. 265, 6104 (1990); Cramer et al., J. Uro-logy 156, 526 (1995); Forsgen et al., FEBS Lett. 213, 254 (1987), Zhang et al., Chin. Chem. 41, 1567 (1995)]: Enzima Activador del plasmindgeno Antígeno específico de próstata Las posiciones de los aminoácidos (A1-A6 y A-l y A-2) se definieron de acuerdo con Schechter y Berger, Biochem. Biophys. Res. Comm. 27, 157 (1967) .

Secuencias de ácido nucleico [componente d) 1 «jue codifican la estructura parcial D: De acuerdo con la presente invención, la secuencia de ácido nucleico [componente d) ] codifica un péptido (estructu-ra parcial D) que se fija al compuesto activo (estructura parcial B) por la vía de la estructura parcial C e inactiva este compuesto activo por medio de dicha fijación. Preferiblemente, para la estructura parcial D se utilizan aquellas secuencias de ácido nucleico que codifican la estructura parcial D en los precursores existentes naturalmente (proteína BSD) , siendo la estructura parcial S la secuencia de escisión natural existente en la proteína BSD. Las estructuras de los precursores existentes naturalmente de los compuestos activos (proteína B) han sido ya revisadas, por ejemplo por Bartett et al., Mammalian Proteases, Academic Press, Londres (1980) en el caso de los factores de coagulación, factores del complemento y calicreína, por Callard et al., The Cytokine Facts Book, Academic Press (1994) en el caso de interleuquinas, quimioquinas y factores de crecimiento, y por Denhardt et al., Pharmac . Ther. 59., 329 (1993) en el caso de inhibidores tisulares de metaloproteinasas (TIMPs) . Cuando se seleccionan compuestos activos que no tienen ningún precursor existente naturalmente, y en el caso de los compuestos activos xenógenos, debería hacerse uso de secuencias de ácido nucleico, como componente d) , que codifiquen cualquier péptido, preferiblemente, sin embargo, de secuencias de ácido nucleico que codifiquen aquellas estructuras parciales D que existen naturalmente en los precursores de compuestos activos humanos. Con objeto de facilitar la secreción de la proteína BCD, o B'BCD, que es expresada por la nueva secuencia de ácido nucleico, la secuencia de señal homologa que puede estar presente en la secuencia de ADN del componente b) puede reem-plazarse por una secuencia de señal heteróloga que aumenta la secreción extracelular. Así, por ejemplo, pueden insertarse la secuencia de señal para inmunoglobulina [posiciones de ADN = 63 = 107; Riechmann et al., Nature 332, 323 (1988)] o la secuencia de señal para CEA [posiciones de ADN = 33 a = 134, Schrewe et al., Mol. Cell Biol. 10, 2738 (1990); Berling et al., Cáncer Res. 50., 5634 (1990)] o la secuencia de señal de las glucoproteínas del virus sincitial respiratorio humano [ADNc de aminoácidos = 38 a = 50 ó 48 a 65 ; Lichtenstein et al., J. Gen. Virol. 77, 109 (1996)]. Adicionalmente, con objeto de aumentar la traducción, la secuencia nucleotídica GCCACC o GCCGCC [Kozak, J. Cell Biol. 108, 299 (1989)] puede insertarse en el extremo 3' de la secuencia promotora y directamente en el extremo 5 ' de la señal de iniciación (ATG) de la secuencia de señal. Preparación de los nuevos constructos de ácido nucleico Los nuevos constructos de ácido nucleico que se han descrito se preparan enlazando los componentes individuales unos a otros con empleo de métodos estándar de biología molecular. Aplicaciones : El nuevo constructo de ácido nucleico es particularmente adecuado para tratar enfermedades que van acompañadas por una formación local incrementada de proteasas, tales como enfermedades tumorales, leucemias, alergias, enfermedades autoin-munes, infecciones, inflamaciones, reacciones de rechazo de trasplantes, trombosis y oclusiones de vasos sanguíneos así como otras alteraciones de la coagulación sanguínea y de la circulación sanguínea, y lesiones tisulares, con inclusión de lesiones al sistema nervioso central y deterioro del sistema nervioso. La administración se efectúa localmente (p.ej. sobre la piel), o por vías nasal, oral, gastrointestinal, intrabronquial, intravesical, intravaginal , en el útero, por las vías subcutánea, intramuscular, periarticular, intraarti-cular, en el fluido cerebroespinal, en el tejido cerebral, en la médula espinal, en las heridas, por vía intraperitoneal o intrapleural, o sistémicamente, p.ej. por vías intravenosa, intraarterial, intraportal o en el corazón. En general, el fármaco comprende, en caso apropiado además de los aditivos y sustancias auxiliares habituales, el nuevo constructo de ácido nucleico o una célula que es capaz de expresar el nuevo constructo de ácido nucleico. El fármaco puede administrarse para la profilaxis o terapia de una enfermedad, como se ha descrito ya en detalle anteriormente. Dicha célula se prepara, por ejemplo, por transformación o transfección de células con el nuevo constructo de ácido nucleico utilizando métodos conocidos por las personas expertas . Ejemplos de células adecuadas son células endoteliales, linfocitos, macrófagos, células de glía, fibroblastos, células hepáticas, células renales, células musculares, células del tejido óseo o cartilaginoso, células sinoviales, células peritoneales, células de la piel, células epiteliales, células de leucemia y/o células tumorales. Las nuevas células son adecuadas también para preparar la proteína que es codificada por el nuevo constructo de ácido nucleico y que puede utilizarse directamente como fármaco . La presente invención se refiere adicionalmente, por consiguiente, al uso del nuevo constructo de ácido nucleico para preparar una célula alterada por medios recombinantes, por introducción del constructo de ácido nucleico en las células, al uso del nuevo constructo de ácido nucleico para preparar una proteína que es codificada por el constructo de ácido nucleico, haciendo que el constructo de ácido nucleico se exprese en una célula adecuada y aislando la proteína que se forma, y a una célula que aloja el nuevo constructo de ácido nucleico. Las células descritas anteriormente son las células preferidas . La selección sicuiente puede hacerse, por ejemplo, a partir de los ejemplos mencionados anteriormente de secuencias promotoras y genes estructurales (para la proteína BCD o B'BCD) dependiendo de la naturaleza y el sitio de la enfermedad y de la célula diana que deba ser sometida a transduc-ción: Terapia de tumores Promotores [componente a) ] : Específicos de las células endoteliales y específicos del ciclo celular o inespecíficos de las células o específicos de células musculares y específicos del ciclo celular o específicos de células tumorales (tumores sólidos, leucemias) . Ligandos para las células diana siguientes [componente b')] : Células endoteliales proliferantes o células de estroma y células musculares adyacentes a la célula endotelial o células tumorales o células de leucemia. Genes estructurales [componente b)c)d)] : para factores inductores de la coagulación, para factores del complemento, para inhibidores de la angiogénesis, para proteínas citostáticas o citotóxicas, para inductores de inflamaciones o para enzimas para precursores de activación de agentes citostáticos, por ejemplo para enzimas que escinden sustancias precursoras inactivas (profármacos) formando de este modo agentes citostáticos activos (fármacos) . Terapia de enfermedades autoinmunes e inflamaciones: Promotores [componente a) ] : Específicos de células endoteliales y específicos del ciclo celular, o específicos de macrófagos y/o específicos de linfocitos y/o específicos del ciclo celular o específicos de células sinoviales y/o específicos del ciclo celular. Ligandos para las células diana siguientes [componente b')]: Células endoteliales proliferantes, macrófagos y/o linfocitos o células sinoviales . Genes estructurales [componente b)c)d)]: Para la terapia de enfermedades autoinmunes mediadas por anticuerpos, para inhibidores de la proliferación celular, proteínas citostáticas o citotóxicas, enzimas para precursores de activación de agentes citostáticos o para la terapia de la artritis . Terapia del deterioro del sistema nervioso: Promotores [componente a) ] : Específicos de células del glía, específicos de células endoteliales y específicos o inespecíficos del ciclo celular y específicos del ciclo celular. Ligandos para las células diana siguientes [componente b')] : Células de glía o células endoteliales proliferantes. Genes estructurales [componente b)c)d)]: Para factores del crecimiento neuronal, por ejemplo para la citoquinas e inhibidores de citoquinas que inhiben o neu-tralizan el efecto neurotóxico de TNFa!. Terapia de perturbaciones del sistema de coagulación de la sangre y el sistema de circulación de la sangre: Promotores [componente a) ] : Inespecíficos de las células, inespecíficos de las células y específicos del ciclo celular o específicos para células endoteliales, células de la musculatura lisa o macrófagos, o específicos para células endoteliales, células de la musculatura lisa o macrófagos y específicos' del ciclo celular. Ligandos para las células diana siguientes [componente b')] : Células endoteliales, células endoteliales proliferantes o células somáticas en la proximidad de células endoteliales y células de la musculatura lisa o macrófagos . Genes estructurales [componente b)c)d)]: Para la inhibición de la coagulación o para la promoción de la fibrinólisis, para factores de angiogénesis, para pép- ' tidos hipotensivos, para una proteína antiproliferativa, citostática o citotóxica o para una enzima para escindir precursores de agentes citostáticos, formando de este modo agentes citostáticos, para inhibición de la proliferación de las células de la musculatura lisa consecutiva a la lesión de la capa endotelial o para proteínas del plasma sanguíneo, tales como el inactivador Cl, colinesterasa sérica o a!l-anti-tripsina. Terapia de enfermedades infecciosas crónicas : Promotores [componente a) ] : Específicos de virus, específicos de células o específicos de virus o específicos de células y específicos del ciclo celular. Ligandos para las células diana siguientes [componente b')] : Células hepáticas, linfocitos y/o macrófagos, célula epitelial o célula endotelial . Genes estructurales [componentes b)c)d)]: Para una proteína que exhibe efectos citostáticos o citotóxicos, una enzima que escinde un precursor de una sustancia antivírica o citotóxica formando de este modo la sustancia activa, o para proteínas antivíricas tales como cito-clinas con actividad antivírica y factores de crecimiento. La invención se explica con mayor detalle con ayuda de los ejemplos y figuras siguientes, sin estar limitada a ellos : Descripción de las figuras Figura 1: Representación diagramática de un nuevo constructo de ácido nucleico que comprende componentes a)b)c) y d) . Figura 2 : Representación diagramática de un nuevo constructo de ácido nucleico que se ha ampliado por adición del componente b' ) . Figura 3 : Representación diagramática de un constructo de ácido nucleico para el factor X activable por PSA.

Ejemplo 1. Preparación de un constructo de ácido nucleico que codifica FX activable por el antígeno específico de próstata (PSA) Este ejemplo se refiere a la preparación de un agente terapéutico para tratamiento de las metástasis del carcinoma prostático. A pesar de la eliminación quirúrgica de una próstata que ha llegado a hacerse carcinomatosa, se producen frecuentemente metástasis del carcinoma de próstata que ac-tualmente son todavía en gran parte intratables y que conducen a la muerte del paciente. Dichas metástasis de carcinoma prostático inducen a angiogénesis. Además, las metástasis de carcinoma de próstata secretan una enzima específica del tejido, a saber el antígeno específico de próstata (PSA) . De acuerdo con la invención, se prepara un constructo de ácido nucleico que, una vez introducido en las células endoteliales proliferantes, conduce a la expresión de un factor de coagulación FX modificado. La modificación comprende reemplaza miento, en el gen del FX natural, la secuencia nucleotídica para el sitio de escisión natural, cuya escisión da como resultado FXa activo en la coagulación, por una secuencia nucleotídica que codifica un sitio de escisión específico del PSA. Como resultado, el PSA que es secretado por las metástasis del carcinoma prostático es capaz de activar específicamente el FX modificado que es secretado por células endoteliales proliferantes en la proximidad de las metástasis y de iniciar de este modo la coagulación que conduce a que el suministro de sangre a las metástasis se interrumpa y en consecuencia a la necrosis de la metástasis. El constructo de ácido nucleico para el FX activable por PSA se prepara de acuerdo con un esquema que se representa en la Figura 3. Las secuencias de ADN de los componentes individuales se unen entre sí, en la dirección 5' a 3', como sigue: El componente a) , que contiene la secuencia promotora del gen cdc25C [ácidos nucleicos: -290 a +121; Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995); Zwicker et al., Nucí. Acids Res. 23, 3822 (1995); EMBO J. 14, 4514 (1995)], la secuencia GCC-ACC (Kozak, J. Cell Biol. 108., 229 (1989)) y el ADNc para el péptido de señal de inmunoglobulina [secuencia nucleotídica = 63 a = 107; Riechmann et al., Nature 332, 323 (1988)], se fusiona al componente b)c)d), que contiene el ADNc para FX humano (secuencia nucleotídica 1 a = 1468) [Messier et al., Gene 9J9, 291 (1991)] en el que se ha mutado el aminoácido 194 de Arg a Tyr. Los componentes individuales del constructo se enlazan por la vía de sitios de restricción adecuados que se introducen en los extremos de los diferentes elementos por la vía de multiplicación por PCR. El enlace se efectúa utilizando enzi-mas que son específicas para los sitios de restricción y que son conocidas por los expertos, y ADN-ligasas. Estas enzimas pueden obtenerse comercialmente . El constructo nucleotídico que se ha preparado de este modo se clona en pUC 18/19 o vectores de plásmido derivados de Bluescript. 2. Expresión en células renales de embrión humano Células renales de embrión humano proliferantes [HEK 293; Racchi et al., J. Biol. Chem. 268, 5735 (1993)] que se mantienen en cultivo se someten a transfección con el plásmido descrito anteriormente utilizando el método conocido por las personas expertas [Graham y van der Eb, Virol. 52., 456 (1973) ] . El factor X mutado se purifica del sobrenadante proce-dente de aproximadamente 107 células HEK 293 transfectadas [Watzke et al., J. Clin. Invest. 88., 1685 (1991)] y se ensaya en un ensayo de coagulación para factor X con y sin la adición de PSA. El PSA purificado se obtiene de Chemicon (Teme-cula, CA, EE.UU. ) . En este ensayo, el defecto de coagulación en el plasma humano deficiente en FX es contrarrestado por FXa funcionalmente activo. Se emplea como control positivo FX no mutado (tipo salvaje) (que se activa mediante veneno de víbora de Russel) . Además de la mezcla de ensayo que carece de PSA, se utiliza como control negativo una preparación falsa del sobrenadante de células HEK 293 no transfectadas . La actividad de coagulación del FX mutado se mide por el tiempo de recalcificación (Seitz R. et al., Int. J. Cáncer 53: 514-520, 1993) . Se incuban 100 µl de plasma deficiente en FX (Behringwerke, Marburg) , a 37°C durante 120 s, con 100 µl de la preparación de FX procedente del sobrenadante celular. La preparación de FX contiene como activador PSA. No se añade cantidad alguna de PSA en el caso del control negativo. Como control positivo se emplean FX (tipo salvaje) y veneno de víbora de Russel (RW) . La reacción de coagulación se aumenta por adición de 100 µl de CaCl2 0,02 M y se determina en un coagulómetro. Se obtienen los resultados siguientes : Los controles negativos sin activación alguna de la coagulación dan un tiempo de coagulación de aprox. 200 s. En contraste, se alcanzan tiempos de coagulación significativamente más cortos, de 50 s, cuando se utiliza FX activado (FX mutado y PSA o FX de tipo salvaje y RW) . A partir de esto, se puede llegar a la conclusión de que las células HEK 293 sometidas a transducción expresan FX mutado que, en presencia adicional de PSA, contrarresta el defecto de coagulación del plasma deficiente en FX. 3. Expresión en células endoteliales humanas Células endoteliales de cordón umbilical humano que se mantienen en cultivo se someten a transfección con el plásmido descrito anteriormente utilizando el método conocido por los expertos (Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995). Con objeto de comprobar la especificidad del ciclo celular, las células endoteliales se sincronizan en G0/G1 por eliminación de metionina durante un período de 48 horas. Después de tinción con Hoechst 33258 (Hoechst AG, Frankfurt) , se determina el contenido de ADN de las células en un clasificador celular activado por fluorescencia ((Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995) . La expresión del constructo de ácido nucleico se ensaya en el sobrenadante procedente de las células endoteliales en analogía con la investigación realizada sobre las células HEK 293. Se obtienen los resultados siguientes: La proteína que es expresada por las células endoteliales transfectadas contrarresta el defecto de coagulación del plasma deficiente en FX, en contraste con las preparaciones falsas del sobrenadante procedente de células endoteliales no transfectadas . Puede detectarse una concentración de FX mutado notablemente mayor en el sobrenadante procedente de células endoteliales proliferantes sometidas a transducción (ADN > 2S) en comparación con el sobrenadante de células endoteliales que se han sincronizado en G0/G1 (ADN = 2S) . En consecuencia, el constructo de ácido nucleico descrito anteriormente conduce a que el gen del FX mutado se exprese de una manera dependiente del ciclo celular en las células endoteliales, y este FX mutado puede ser activado por PSA de tal manera que produce la coagulación en el plasma deficiente en FX.

Claims

R E I V I N D I C A C I O N E S 1.- Un construsto de ácido nucleico para expresar una sustancia activa que es activada por una enzima que es liberada por células de mamífero, comprendiendo el constructo los componentes siguientes : a) al menos un elemento promotor, b) al menos una secuencia de ADN que codifica un compuesto activo (proteína B) , c) al menos una secuencia de ADN «que codifica una secuensia de aminoásidos (estructura parcial C) «que puede ser essindida específicamente por una enzima que es liberada por una célula de mamífero, y d) al menos una secuensia de ADN que sodifisa un péptido o proteína (estructura parcial D) que está unida al compuesto - activo (proteína B) por la vía de la secuencia de aminoácidos escindible (estructura parcial C) e inhibe la actividad del compuesto activo (proteína B) .
2.- Un constructo de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual dicha enzima es una proteasa.
3.- Un constructo de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el cual dicha enzima es un antígeno específico prostático activador del poasminógeno, una catepsina o una metaloproteinasa de la matriz.
4. - Un constructo de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dichas células de mamífero son células tumorales, células de leucemia, células endoteliales, macrófagos, linfocitos, células musculares, células epiteliales, células de glía, células sinoviales o células infectadas por virus.
5. - Un constructo de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, en el cual el construsto de ásido nusleiso se extiende por adición del somponente b'), componente que codifica un ligando (estructura parcial B' ) que fija el compuesto activo (proteína B) a una estructura diana.
6.- Un construsto de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, en el cual dicha proteína B y la estructura parcial D son partes de los precursores naturales de compuestos proteínicos activos, habiéndose reemplazado la secuencia de escisión natural, que conecta las estructuras parciales B y D, por la estructura parcial C.
7. - Un constructo de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6, en el cual dicha estructura parcial D es la estructura parcial de un precursor natural de un compuesto proteínico activo.
8. - Un constructo de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7, en el cual el mismo está insertado en un plásmido o un vector vírico.
9. - Un constructo de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8, en el cual el componente a) es una secuencia promotora que puede activarse inespecíficamen-te, con especificidad celular, con especificidad vírica, metabólicamente, con especificidad para el ciclo celular y/o por tetraciclina.
10. - Un constructo de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9, en el cual el componente a) es una combinación de al menos dos secuencias promotoras idénticas o diferentes .
11.- Un constructo de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 9 ó 10, en el cual el componente a) está activado preferiblemente en células endoteliales, en células próximas a células endoteliales activadas, en células musculares, en células de leucemia, en células tumorales, en células de glía, en linfocitos, en macrófagos y /o en células sinoviales .
12. - Un constructo de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 11, en el cual dicho compuesto activo (proteína B) activa o inhibe una cascada biológica de activación y/o es un componente activo de esta cascada, activa o inhibe preferiblemente el sistema de coagulación, activa la fibrinólisis, activa el sistema del complemento y/o activa el sistema de las quininas, o es una enzima que convierte el precursor inactivo de una sustancia farmacológica en la sus-tancia activa, o que en sí mismo es una sustancia farmacológicamente activa.
13. - Un constructo de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 12, en el cual dicho compuesto activo (proteí-na B) es un factor de coagulación que se selecciona de trombina, factor Va, factor Vlla, factor IXa, factor Xa, fragmentos TF activos en la coagulación o factor Xlla,- trombina que está mutada en la región del sitio de escisión Arg-Thr (posición de aminoácidos 327/328) ; una proteína fibrinolítica que se selecciona de uroquinasa, tPA o sus híbridos funcionales; un factor del complemento que se selecciona de CVF, C3b o sus productos de escisión funcionales; una proteína antitrombótica que se selecciona de proteína C, inhibidor C-1S, aíl-anti-tripsina, hirudina, AT-III, TFPI, PAI-1, PAI-2 o PAI-3; una calicreína; una proteína citostática, citotóxica o provocadora de inflamación; una proteína antiangiogénica; una proteína inmunomoduladora,- una proteína anti-inflamatoria; una proteína que reduce el deterioro del sistema nervioso; una proteína que inhibe o neutraliza el efecto neurotóxico de TNFa!; una proteína estimulante de la angiogénesis; una proteína hipo-tensiva; una proteína antivírica; una citoquina; un interferón; un factor de necrosis de tumores,- oncostatina M o LIF; un receptor de citoquinas,- el resto de un receptor de cito-quinas que es externo a la célula; un antagonista de citoqui-ñas; un factor de crecimiento; un receptor de factor de crecimiento,- el resto de un receptor de factor de crecimiento que es externo a la célula; una quimioquina; angiostatina,-factor 4 de las plaquetas,- TIMP-1, TIMP-2 o TIMP-3; una ni-trorreductasa,- una /?-glucuronidasa; una carboxipeptidasa,- una jß-lactamása; una citosina-desaminasa,- una catalasa; una peroxidasa; una fosfatasa; una oxidasa; calicreína o una óxido nítrico-sintasa de células endoteliales.
14.- Un constructo de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 13 , en el cual el componente b') codifica un ligando (estructura parcial B' ) que se fija a la superficie de las células, preferiblemente a un receptor de la membrana celular, a un antígeno de la membrana celular, a una molécula de adhesión localizada en la membrana celular, o a la matriz extracelular o un componente de la misma.
15. - Un constructo de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 14 , en el cual el ligando es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se fija específicamente a un antígeno de membrana celular o a un antígeno de la matriz extracelular, o es un péptido o proteína que se fija a un receptor de la membrana celular, preferiblemente un factor de crecimiento, una citoquina, un interferón, un factor de necrosis tumoral, una quimioquina, una secuencia parcial de fijación de receptores de estos ligandos, una hormona peptídica, angiotensina, quinina, ácido fólico, una molécula de adhesión o la secuencia parcial de la molécula de adhesión que se fija a la molécula de adhesión correspondiente o a la matriz extracelular, un resto extracelular de un receptor Fc, una glucoproteína de un virus, una secuencia parcial de la glucoproteína que se fija a estas células, el dominio transmembrana de un receptor o de una glucoproteína vírica, o una ancla glucofosfolipídica .
16.- Un constructo de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 14 ó 15, en el cual el ligando se fija a células endoteliales, preferiblemente a células endoteliales activadas o proliferantes, a células tumorales, a células musculares, preferiblemente células de la musculatura lisa, a fibroblastos, a macrófagos, a linfocitos, a células hepáticas, a células renales, a células sinoviales, a células inflamatorias, a células infectadas por virus, a células epiteliales bronquiales, a células de glía o a células de leucemia .
17.- Un constructo de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 16, en el cual el constructo comprende al menos dos componentes idénticos o diferentes b)c)d) o b')b)c)d) , componentes que están unidos unos a otros por la vía de un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) .
18.- Un procedimiento para preparar un constructo de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 17, que comprende unir dichos componentes entre sí.
19. - El uso de un constructo de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 17, para preparar un fármaco destinado a administración local o sistémica para la profilaxis y/o la terapia de tumores, leucemias, alergias, enfermedades autoinmunes, infecciones, inflamaciones, reacciones de rechazo de trasplantes, trombosis, oclusiones de vasos sanguíneos, perturbaciones de la coagulación de la sangre y de la circulación de la sangre, lesiones a tejidos y/o deterioro del sistema nervioso.
20.- El uso de un constructo de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-17, para preparar una célula alterada por medios recombinantes, en el cual dicho constructo de ácido nucleico se introduce en una célula adecuada .
21.- El uso de un constructo de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-17, para preparar una proteína que es codificada por dicho constructo de ácido nucleico, en el cual se hace que dicho constructo de ácido nucleico se exprese en un célula adecuada y se aisla la pro-teína que se forma.
22.- El uso de acuerdo con la reivindicación 20 ó 21, en el cual dicha célula es una célula endotelial, un linfocito, un macrófago, una célula de glía, un fibroblasto, una célula hepática, una célula renal, una célula muscular, una célula del tejido óseo o cartilaginoso, una célula sinovial, una célula peritoneal, una célula epidérmica, una célula epitelial, una célula de leucemia y/o una célula de tumor.
23.- Una célula que aloja un constructo de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-17.