MXPA98000050A

MXPA98000050A - Deteccion electroquimica de la hibridacion del acido nucleico

Info

Publication number: MXPA98000050A
Application number: MXPA/A/1998/000050A
Authority: MX
Inventors: Thorp H Holden; H Johnston Dean
Original assignee: H Johnston Dean; The University Of North Carolina At Chapel Hill; Thorp H Holden
Priority date: 1995-06-27
Filing date: 1998-01-07
Publication date: 1998-11-12

Abstract

Un método para detectar unácido nucleico (v.gr., ADN, ARN) que contiene por lo menos una base preseleccionada (v.gr., adenina, guanina, 6-mercaptaguanina, B-oxo-guanina y 8-oxo-adenina) comprende:hacer reaccionar elácido nucleico con un complejo de metal de trasición capaz de oxidar la base preseleccionada en una reacción de oxidación-reducción;Detectara la reacción de oxidación-reducción y determinar la presencia o ausencia delácido nucleico a partir de la reacción de oxidación-reducción detectada en la base preseleccionada;el método se puede usar en una variedad de aplicaciones, incluyendo secuenciación de ADN, pruebas de diagnóstico y análisis cuantitativos.

Description

DETECCIÓN ELECTROQUÍMICA DE Lñ HIBRIDACIÓN DEL ACIDO NUCLEICO CfltIPO DE Lfl INVENCIÓN La presente invención se refiere a la hibridación y sec?enc ción del acido nucleico, y particularmente a métodos para delectar cualitativa y cuantitativamente l hi ridación del acido nucleico y a métodos de secuenciacion del acido n?cleí co.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La detección de secuencias de RDN i d iduales en muestras heterogéneas de ADN provee una base para identificar genes, perfiles de ADN y enfoques novedosos a la secuenciación del ADN. Un enfoque para la detección de la hibridación del ADN incluye el uso de secuencias de ADN unidas en superficie que pueden ser probadas usando una respuesta analítica q?e indique la hibridación del oligornero unido en la superficie a una secuencia en la muestra heterogénea. Estos métodos analíticos incluyen generalmente la f uorescencia inducida por láser q?e se origina a partir de una e+iqueta fijada covalentemente sobre la cadena del ADN objetivo, que no es sensible a desaparearmentos de una base en el dúplex un do a la superficie. Por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 5,143,854 y 5,405,783 a Pirrung y otros, Fodor, y otros, Nature 364:555 (199:)); IJairis, Ageu. Chern.107 : 356 (1995) y Noble, Analitical Chernis+ry 67(5) ¡201A (1995) proponen superficies o "f agmentos" par-a esta aplicación. En un método alternativo, propuesto por Hall, y otros, Biochem and Molec. Bio. ínter. 32(1) :21 (1994), se detecta la hibridación del ADN por medio de un método electroquímico que incluye la observaci n del comportamiento redox de un ADN de cadena sencilla comparado con un ADN de doble cadena. Esta técnica tampoco es sensible a de aparearmen-t os de una base en la rnues+ra de ADN. Las -técnicas para detectar desapareamientos de una base incluyen los estudios del corte químico o enzirnático tales corno aquéllos propuestos en la patente de E.U.A. No. 5,194,372 a Nagai y otros. S n embargo, estas técnicas son desventajosas toda vez que requieren rnas tiempo y tecnología de separación. La pa-tente de E.U.A. No. 5,312,527 a M H-elson y otros, describe un sensor selectivo de secuencia vol tarnetrico para detectar acido nucleico objetivo, en el cual un ácido nucleico de doble cadena es puesto en contacto con un complejo redox-activo. El complejo se liga no específicamente al ADN de doble cadena. Debido a q?e el complejo mismo es el compuesto redox-act vo que provee un señal voltametrica, el complejo no funciona de ?na manera catalítica. La patente de E.U.A. No. 4,840,893 a Hill y otros, describe una prueba electroquímica para ácidos nucleicos, en la cual un evento de ligadura competitivo entre un ligando y ?n antiligando es a su vez detectado electroquímicamente.

En consecuencia, permanece una necesidad en la técnica por ?n método para detectar la hibridación del ADN, q?e incluye un método para detectar desaparearnientos de una base, que sea tanto rápido corno sensible, y que pueda ser aplicado rápidamente en linea.

BREVE DESCRIPCIÓN DE Lñ INVENCIÓN En general, la presente invención provee un método para detectar un acido nucleico que contiene por lo enos una base preseleccionada (v.gr., adenma, guanina, 6-mercaptog?anma, 8-oxo-guamna y 8-oxo-aden?r?a) . El método comprende (a) llevar a reacción al acido nucleico con ?n complejo de rnetal de transición capaz de oxidar la base preseleccionada en una reacción de oxidación-reducción; (b) detectar La reacción de oxidación-reducción; y (c) determinar la presencia o ausencia del acido nucleico a partir de la reacción de oxidación-reducción detectada en la base preseleccionada. Dependiendo de la modalidad particular del método, y del objeto en particular deseado, el método puede incluir opcionalmente el paso de hacer contacto entre el acido nucleico y un acido nucleico complementario para formar un ácido nucleico hibridado. Como un primer aspecto, la presente invención provee un método para detectar la hibridación del ADN. El método incluye (a) hacer contacto entre una muestra de ADN y una sonda de oligonucleotido para formar un ADN hidpdado, (b) llevar a reacción el ADN hidpdado con un complejo de rnetal de •transición capaz de oxidar una base preseleccionada en la sonda de ol igonucleotido en una reacción de oxidación-reducción, en donde la sonda de olí gonucleó i do tiene por lo menos una de las bases preseleccionadas, (c) detectar la reacción de oxidación-reducción y (d) determinar la presencia o ausencia de ADN hidpdado a partir de la reacción de oxidación-reducción detectada en la base preseleccionada. Corno se mencionara en detalle posteriormente, el paso de detectar la reacción de oxi dación- reducción puede llevarse a cabo, en general, midiendo el flujo de electrones desde la base preseleccionada. Corno ?n segundo aspecto, la presente invención provee otro rnetodo para detectar la hibridación del ADN. El método incluye (a) hacer contacto entre una muestra de ADN y una sonda de oligonucleótido para formar un ADN hibridado, (b) llevar a reacción el ADN hibpdado con un complejo de rnetal de transición capaz de oxidar una base preseleccionada en la sonda de oligon?cleotido en una reacción de oxidación-reducción, en donde la sonda de oligonucleotido tiene por lo menos una de las bases preseleccionadas, (c) detectar la reacción de oxidación-reducción, (d) medir la velocidad de reacción de la reacción de oxidación-reducción detectada, (e) comparar la velocidad de reacción medida con la velocidad de reacción de oxidación-reducción del complejo de rnetal de transición con un ADN de ?na cadena y después ( f) determinar si la velocidad de reacción medida es esencialmente la misma que la velocidad de reacción de oxidación -reducción del complejo de rnetal de -transición con ADN de ?na cadena. Corno un tercer aspecto, la presente invención provee ?n aparato para detectar la hibridación del ADN. El aparato incluye (a) una pluralidad de contenedores de muestra de ADN, (b) medios para el manejo de muestra que portan la pluralidad de contenedores de muestras de ADN, (c) un medio de suministro de sonda de oligon?cleotí do para suministrar la sonda de oligonucleotí o a cada uno de los contenedores de muestra de ADN, (d) un medio de liberación de complejo de rnetal de transición para liberar- el complejo de metal de transición a cada uno de la pluralidad de contenedores de muestra de ADN, y (e) un detector de reacción de oxidación-reducción para detectar una reacción de oxidaci n- reducción. Corno un cuarto aspecto, la presente invención provee un segundo aparato para detectar la hibridación del AUN. El aparato incluye (a) un contenedor de muestra de ADN, (b) un medio de suministro de sonda de oligon?cleotido para suministrar una pluralidad de sondas de oligon?cleotido al contenedor de muestra de ADN, (c) un medio de liberación de complejo de rnetal de transición para liberar el complejo de metal de transición en el contenedor de muestra de ADN, y (d) un detector de reacción de oxidación- reducción para detectar una reacción de oxidación-reducción. Corno un quinto aspecto, la presente invención provee un método de sec?enciacion del ADN. El rnetodo incluye (a) hacer-contacto entre una rnues*< ra de ADN y una sonda de oligon?cleotido para formar una ADN hibpdado, en donde la sonda de oligonucleotido incluye una base sintética preseleccionada que tiene un potencial de oxidación un LCO, (b) llevar- a reacci n el ADN hibra dado con un complejo de metal de transición capaz de oxidar la base sintética preselecdonada en la sonda de oligonucleótido en una reacción de oxidación-reducción, en donde la sonda de oligonucleotido tiene un numero predeterminado de las base sintéticas preseleccionadas, (c) detectar la reacción de oxidación-reducción, (d) rnedir la velocidad de reacción de la reacción de oxidación-reducción detectada, y (e) identificar la base apareada con la base sintética preseleccionada. Los anteriores y otros aspectos de la presente invención se explican en detalle en la descripción detallada poster or.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra los voltamogramas cíclicos de Ru(bpy)32+ con y sin ADN de timo de becerro. La linea sólida representa el escudriñamiento de 50µM de Ru(bpy)32+ a 25 rnV/s en 700 mil de NaCl/50 rnM de regulador de pH de fosfato de sodio. La linea punteada representa el voltamograrna de 50µM de Ru(bpy)32+ y 3.0 rnri de ADN de timo de becerro (nucleótido).

La figura 2 muestra los v ltarno ramas cíclicos de Ru(b?y)3-2+ en presencia de 5 '-AAATATAGTATAAAA corno una sola cadena (C) e ha bri ado a cadenas complementarias (A y B). La velocidad de escudriñamiento es 25 rnV/s. (A) representa 25 µM de Ru(bpy)32+ + 100 µM de ADN completamente hl bridado de doble cadena (en nucleotidos de guanina) ( 5 '-AAATATAGTATAAAA) (3'-TTTATATCATATTTT) . (B) representa Ru(b?y)32+ con un dúplex que contiene un desapareamiento de GA ( 5 '-AAATATAGTATAAAA) (3'-TTTATATAATATTT) , y (C) representa Ru(hpy)32+, una cadena sencilla que contiene un n?cleo i o de guanina (5'~ AAATATAGTATAAAA) . La figura 3 es una ilustración esquemática de un aparato ilustrativo q?e es útil para llevar a cabo los métodos de la presente invención. La figura 4 es una ilustración esquemática de un rnetodo de detección particularmente ventajoso para l a detección cuantitativa de ADN, en donde la base preseleccionada esta localizada sobre el acido nucleico objetivo. la figura 5 muestra los voltarnograrnas cíclicos de Ru(bpy)32+ (25 µM ) a una velocidad de escudriñamiento de 25 rnV/s en 50 mM de regulador de pH de fosfato de sodio con NaCl de 0.7 M, pH 7. (A) No hay nucleótido añadido. (B) Con 75 µM de i[5'~TTTTATACTATATTT]. (C) Con 75 µM del híbrido del oligórnero de B y d C5'-GGGAAATATAGTATAAAAGGG] . Electrodo de trabajo: oxido de indio impurificado con estaño. Electrodo de referencia: Ag/AgCl. Contraelectrodo: alambre de Pt. La estructura secundaria del híbrido de C se indica en la figura. La figura 6 muestra los vol tarnograrnas cíclicos de (A) R?(bpy)32+ (25 µM), (B) R?(b?y)3 + (25 µM) con ' -monofosfato de inosma (0.3 rnM), y (C) Ru(bpy)3 + (25 µM) con 5'-rnonofosfato de g?anosina. Las estructuras de la mosi a y la guanina se muestran en la figura. La figura 7 ilustra esquem ticamente una modalidad alternativa de la invención de la figura 4, en donde las bases preseleccionadas est n sobre un producto de alargamiento de la transferasa -terminal. La figura 8 ilustra esquemáticamente una modalidad alternativa de la invención de la figura 4, llevada a cabo en un formato de prueba de emparedado. La figura 9 es una ilustración esquemática de vista de planta superior de un dispositivo rnicroelectronico util para llevar a cabo los métodos de la presente invención. La figura 10 es una vista seccional lateral de una porción del dispositivo ilustrado en la figura 9. La figura 11 muestra los voltarnogramas cíclicos que usan electrodos ITO modificados con nylon, de Ru(bp )3 + (200 µM) en nylon empapado con ADN en regulador de pH de alta sal (700 rnM de NaCl añadidos), y Ru(bpy)32+ (200 µM) en nylon empapado con ADN en regulador de pH de baja sal (es decir, no se añadió NaCl ) . La figura 12 muestra los voltarnogramas cíclicos de 0s(bpy)3 + (200 µM) usando electrodos ITO modificados con nylon empapados con legulador de pH o ADN. La figura L2A muestra el voltarnograrna cíclico con P00 rnM de NaCl añadidos. La figura 12B muestra el vol amograma cíclico sin MaOl añadido. La figura 13 muestra los voltamogramas cíclicos en electrodos 1T0 modificados con nylon que muestran vol t amograma cíclicos de Ru(b?y)32+ (200 µM) en nylon empapado con regulador de pH, Ru(b?y)32+ (200 µM) en nylon empapado con ARNt en alta sal (700 mM de NaCl añadidos), y Ru(bpy)32+ (200 µM) en nylon empapado con ARNt en regulador de baja sal (sin NaCl añadido). La figura 14 muestra el voltamograma cíclico de Ru(bpy)3 + (25 µM) solo y con (100 µM en cadenas) de 5 ' -AAATATAG„TATAAAA en donde n = 1 (G), 2 (GG), o 3 (GGG). La velocidad de escudriñamiento es 25 rnV/s. La figura 15 muestra el voltamograma cíclico de Ru(b?y)32+ (25 µM) solo y con (100 µM en cadenas) de 5'AAATAT(AGT)„ATAAAA en donde n = 1, 2 , o 3. La velocidad de escudriñamiento es 25 rnV/s. La figura 16 muestra el voltarnograrna cíclico de 25 µM de 4,4 '-d?rnet ib ??pd?na)32+ de rutenio (o "Ru(4,4-Me2-bpy)32+") solo (solido) y con (100 µM en cadenas) de 5'-AAATATAGTATAAAA (punteado) y 5 ' -AAATATAGGGTATAAAA (en guiones). La velocidad de escudriñamiento es 25 rnV/s. La figura 17 muestra el voltamograma cíclico de 0.20 mM de Ru(4,4 ' - e-2~bpy)3 + en regulador de fosfato de sodio de 50 M (pH 7) con NaCl de 0.7 M a una velocidad de escudriñamiento de 25 mV/s. La curva (A) representa Ru(4,4'- e2-l?y)32+ solo. La curva (B) representa R?(4 , '-Me?-bpy )32 + en presencia de 5 ' -monofosfato de 6-rnercaptoguanos?na de 0.70 rnM. La figura 18 muestra voltarnogramas cíclicos de 200 µM de Ru(bpy)32+ en electi odos de trabajo ITO a los cuales esta fijada una membrana de nylon Hybond N+. Las membranas son impregnadas con pol CC y sometidas al protocolo de hibridación en regulador de pH (A) y una solución concentrada de poliCG] (B). La figura 19 muestra voltarnogramas cíclicos de 200 µM de Ru(b?y)32+ en electrodos de trabajo ITO a los cuales está fijada una membrana de nylon Hybond N**-. Las membranas son impregnadas con poliCC] y sometidas al protocolo de hibridación en regulador de pH (A) y una solución concentrada de ADN de timo de becerro desnaturalizado (B). La figura 20 muestra los voltarnogramas cíclicos (velocidad de escudriñamiento = 25 mV/s) de 200 µM de Ru(bµy)32+ en un electrodo de carbono vidrioso modificado con nylon (A) sin ADN o (B) después de la adsorción de ADN a la película de nylon.

DESCRIPCIÓN DETñLLñDfl DE Lfl INVENCIÓN El termino "acido nucleico" se usa en la presente para referirse a cualquier acido nucleico, incluyendo tanto ADN como ARN. Los ácidos nucleicos de la presente invención son típicamente ácidos polmucleicos; es decir, polímeros de nucleotidos individuales que son unidos covalentemente por ligaduras de fosfod est-er 3 ',5'. El tenni.no "acido nucleico complementario" se usa en la presente para referirse a cualquier ácido nucleico, incluyendo sondas de oligonucleótido que se liga específicamente a otro acido nucleico para formar un ácido nucleico hLbri ado. La frase "determinar la presencia o ausencia de" esta diseñada para incluir tanto la determinación cualitativa como la determi ación cuantitativa de la presencia o ausencia del evento detectado (v.gr., hibridación del ADN, hibridación del ARN, detección del acido nucleico objetivo, etc.). Los términos "ADN hibpdado" y "acido nucleico hibpdado" se refieren a un ADN de cadena sencilla que es hí ridado para formar un ADN o acido nucleico de doble cadena que es hibridado para formar un ADN o acido nucleico de triple hélice. Aunque los métodos y aparatos de la presente invención se explican algunas veces con respecto al ADN de la presente, esto es por propósitos de claridad y debe entenderse que los métodos y aparatos de la presente invención pueden aplicarse a otros ácidos nucleicos tales como el ARN. fl. Métodos de ampli icación del ácido nucleico Toda vez que los procedimientos de la presente invención mcluyen poner en contacto una muestra de ADN con una sonda de oligonucleotido para producir un ADN hibridado, puede ser deseable para ciertas aplicaciones amplificar el ADN antes de hacer contacto con la sonda. La amplificación de una secuencia de acido nucleico seleccionada u objetivo se puede llevar a cabo mediante cualquier medio adecuado. Ver generalmente D. Kwoh y R. K?oh, Arn. Biotechnol. Lab. 8, 14-25 (1990). Ejemplos de técnicas de ampl ficación adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, la reacción en cadena de polirnerasa (incluyendo, para la amplificaci n del ARN, la reacción en cadena de la polirnerasa de transcpptasa inversa), la reacción en cadena de ligasa, la amplificación del desplazamiento de cadena, la amplificación a base de transcripción (ver D. Kuoh y otros, Proc. Nati. Acad ci. E.U.A. 86, 1173-1177 (1989)), la replicación de secuencia autosostenida (o "3SR") (ver 3. G?atelli y otros, Proc. Nati. Acad. Sci E.U.A. 87, 1874-1878 (1990)), el sistema Qß replicasa (ver. P.Lizardi y otros, Biotechnology 6, 1197-1202 (1988)), la amplificación basada en secuencias de acido nucleico (o "NASBA") (ver R. Le is, Genetic Engmeepng News 12 (9), 1 (1992)), la reacción en cadena de reparación (o "RCR") (ver R. Lewis, supra), y la amplificación del ADN de bumerang (o "BDA") (ver R. Le?is, s?pra). Las bases incorporadas en el producto de amplificación pueden ser bases naturales o modificadas (modificadas antes o después de la amplificación), y las bases se pueden seleccionar para optimizar pasos de detección electroquímica subsecuentes. También puede llevarse a cabo la reacción en cadena de polirnerasa (PCR) de acuerdo con técnicas conocidas. Ver-, v.gr., las patentes de E.U.A. No. 4,683,195; 4,683,202; 4,800,159 y 4,965,188 (la descripción de todas las referencias a patentes de E.U.A. citadas aquí están incorporadas en la presente a manera de referencia). En general, la PCR incluye, primero, tratar una muestra de acido nucleico (v.gr., en presencia de una polirnerasa de ADN estable en calor) con un iniciador de oligonucleotido para cada cadena de la secuencia especifica q?e será detectada bajo condiciones de hibridación para q?e un producto de extensión de cada iniciador sea sintetizado y sea complementario con cada cadena de acido nucleico, con los iniciadores suficientemente complementarios a cada cadena de la secuencia específica para hibp darse con los rnisrnos para que el producto de extensión sintetizado a partir de cada iniciador, cuando sea separado de s? complemento, pueda servir como un patrón para la síntesis del producto de extensión del otro iniciador, y después tratando la muestra bajo condiciones de desnaturalización para separar los productos de extensión del iniciador de sus patrones si la secuencia o secuencias que ser n detectadas están presentes. Estos pasos se repiten cíclicamente hasta que se obtiene el grado de amplificación deseado. La detección de la secuencia amplificada se puede llevar a cabo añadiendo al producto de reacción una sonda de oligonucleótido capaz de hibridarse al producto de reacción (v.gr., una sonda de oligonucleótido de la presente invención), portando la sonda una etiqueta detectable, y después detectando la etiqueta de acuerdo con t cnicas conocidas. En donde el ácido nucleico que sera amplificado es ARN, ia amplificación se puede llevar a cabo mediante la conversión inicial del ADN por t ranscriptasa inversa de acuerdo con técnicas conocidas. La amplificación del desplazamiento de cadena (SDA) se puede llevar a cabo de acuerdo con técnicas conocidas. Ver generalmente G. Ualker y otros, Proc. Nati. Acad. Soi. E.U.A. 09, 392-396 (1992); G. lall-er y otros, Nucleic Acids Res. 20, 1691-1696 (1992). Por ejemplo, la SDA se puede llevar a cabo con un solo iniciador de amplificación o un par de iniciadores de amplificación, lográndose la amplificación exponencial con estos últimos. En general, los iniciadores de la amplificación SDA comprenden, en la dirección 5' a 3', una secuencia de flanqueo (cuya secuencia de ADN no es critica), un sitio de restricción para la enzima de restricción empleada en la reacción, y una secuencia de oligonucleot do (v.gr., una sonda de oligonucleotido de la presente invención) que se hibpdiza a la secuencia objetivo que sera amplificada y/o detectada. La secuencia de flanqueo, que sirve para facilitar la ligadura de la enzima de restricción al sitio de reconocimiento y que provee ?n sitio de iniciación de polirnerasa de ADN después de q?e el sitio de restricción ha sido cortado, tiene preferiblemente de aproximadamente 15 a 20 n?cleótidos de longitud; el si io de restricción es funcional en la reacción de SDA (es decir, las ligaduras de fosforotioato incorporados en la cadena iniciadora no inhiben el cortado subsecuente -una condición que puede satis facerse a través del uso de un sitio de reconocimiento nopalindromico) ; la porción de la sonda de oligonucleotido tiene preferiblemente de aproximadamente 13 a 15 nucleotidos de longitud. La reacción en cadena de ligasa (LCR) también se lleva a cabo de acuerdo con técnicas conocidas. Ver, v.gr., R. Ueiss, Science 254, 1292 (1991). En general, la reacción se lleva a cabo con dos par-es de sondas de oligon?cleotí do: un par se liga a una cadena de la secuencia que sera detectada; el otro par se liga a la otra cadena de la secuencia que sera detectada. Cada par junto traslapa completamente la cadena a la cual cor-responde. La reacción se lleva a cabo, primero, desnaturalizando (v.gr., separando) lae cadenas de la secuencia que sera de*tectada, después llevando a reacción las cadenas con los dos pares de sondas de oligonucleotido en presencia de una ligasa estable al calor para que cada par de sondas de oligonucleótido sea ligado entre sí, después separando el producto de reacción y posteriormente repitiendo cíclicamente el procedimiento hasta que la secuencia haya sido amplificada hasta el grado deseado. La detección puede entonces llevarse a cabo en forma similar a la descrita con respecto a la PCR.

B. Sondas de oligonucleótido Corno se señalo anteriormente, los procedimientos de la presente invención son útiles par-a detectar la hibridación del ADN. El primer- paso del procedimiento incluye hacer con*t acto entre una muestra de ADN y una sonda de oligon?cleotí do para formar un ADN hibpdado. Las sondas de oligon?cleotido q?e son útiles en los métodos de la presente invención pueden ser cualquier sonda comprendida de entre aproximadamente 4 o 6 bases hasta aproximadamente 800 o 100 bases o mas, rn?y preferiblemente entre aproximadamente 8 y aproximadamente 15 basee. Se pueden preparar sondas de oligonucleotido q?e tengan cualquiera de una amplia var'iedad de secuencias de base de acuerdo con técnicas que son bien conocidas en la técnica. Las bases adecuadas para preparar las sondas de oligonucleotido se pueden seleccionar a partir de bases de nucleotidos que ocurren naturalmente tales corno ademna, c tosina, guanina, uracil y tirnina; y bases de nucleotidos que ocurren no naturalmente o "sintéticas" tales como 8-oxo~guan?na, 6-rnercaptoguanma, 4-acet?lc?t?dma, 5-(carbox?h?drox?et?l)u ?dma, 2'-0-met?lc?t?d?na, 5-carbox?met?lam?no-rnet?l-2-t?opd?na, 5-carboxírnetilarmnometil-?ridma, dihidro?ridina, 2'-0-rnet?lpseudour?d?na, (3-D-galactosilqueosma, 2 '-0-rnet?lguanos?na, inosina, N6-ísopente iladenosina, 1-rnet?iadenos?na, 1-met?lpseudour?dma, 1-met?ig?anos?na, 1-met?lmos?na, 2,2-d?met?iguanos?na, 2-metiladenosina, 2-rnet?lguanosma, 3-met?lc?t?dma, 5- me t l ci t d na, N6-rnet?iadenos? a, 7-me lguanosma, 5-rneti larninornetiiupd na, 5-rnetox?arn?nornet?i~2-t?our?d?na, ß-D-manos lqueosma, 5-metox?carbon?lrnet?l ur' dina, 5-rnetox?ur-?d?na, 2-rnet?lt?o-N6-?so?enten?ladenos?na, N-( ( 9-ß-D~pbofu anos?l-2-rnet?lt?op?pn-6-?l )carbamo?l )treomna, N-( (9-ß-D-p bof?ranosil-pur?n-6- l )N-rnet?l-carbarno?l )treon?na, éster metílico de ácido upd?n~5-ox?acet?co, acido updin -5-ox?acét?co, wibutoxosma, pseudoup dina, queosina, 2-t?oc?t?d?na, 5-met?l-2-t o?pd?na, 2-t?o?r?dma, 2-t?oupd?na, 5-rnet?lurd? na, N~((9-ß-D-r?bofuranos?l?ur?n-6-?i)carba?no?l Jtreonina, 2 '-0-rnet?l-5-rnetil?ridina, 2'-0-rnet?i?rd?na, wibutosma y 3-(3-am?no-3-carboxiprop Dupdi na. Se puede emplear cualquier estructura de base de oligonucleotido, incluyendo ADN, ARN (aunque se prefiere rnenos el ARN que el ADN), azucares modificados tales como carbociclos y azucares que contienen sustituciones 2' tales como fluoro y rnetox . Los olí gon?cleotidos pueden ser oligon?cleotidos en los que por lo menos uno o todos los residuos de fosfato de puenteo de mternucleotí do sean fosfatos modificados, tales corno rnetii fosfonatos, rnetil fosfonotioatos, fósforornorfolidatos, fósforopiperazidatos y fosforamidatos (por ejernplo, cualesquiera de los demás residuos de fosfato de puenteo de íntern?cleotido pueden modificarse corno se describió). El oligonucleotido puede ser un "ácido nucleico de peptido" tal corno el descrito en P. Nielsen y otros, Science 254, 1497-1500 (1991). El único requerimiento es que las sonda de oligon?cleotido debe poseer una secuencia por lo rnenos una porción de la cual sea capaz de puentearse a una porción conocida de la secuencia de la muestra de ADN. Puede ser-deseable en algunas aplicaciones hacer- contacto entre La muestra de ADN y un numero de sondas de oligonucleot ido que tengan diferentes secuencias de base (v.gr., cuando existan dos o mas ácidos nucleicos objetivo en la muestra, o cuando un acido nucleico objetivo sencillo sea hibridado a dos o rnas sondas en una pr-ueba de "emparedado").

C. Metodología de hibridación La muestra de ADN (o acido nucleico) puede ser puesta en contacto con la sonda de oligonucleotido en cualquier manera adecuada conocida por aque los expertos en la técnica. Por ejemplo, la muestra de ADN puede ser solubilizada en solución y puesta en contacto con la sonda de oligon?cleotí do solubilizando la sonda de oligon?cleótido en una solución con la muestra de ADN bajo condiciones que permitan la hibridación. Las condiciones adecuadas son bien conocidas por aquellos expertoe en la técnica (ver, v.gr., patente de E.U.A. No. 4,358,535 a Fal ow y otros, y otras referencias a patentes de E.U.A. que citen la misma) e incluyen condiciones de alta concentración de sal. En forma alternativa, la muestra de ADN puede ser solubilizada en solución estando inmovilizada la sonda de oligonucleotido sobre un soporte sólido, con lo cual la muestra de ADN pueda ser puesta en contacto con la sonda de oligonucleótido sumergiendo al soporte sólido que tiene la sonda de olagonucleotido mrnobil zada sobre el mismo en la solución que con iene la muestra de ADN.

D. Agentes oxidantes y reacciones de oxidación-reducción Cuando un paso de hibridación precede al paso de oxidación, después de la hibridación el ADN (o ácido nucleico) hibridado es después llevado a reacción con un agente oxidante adecuado que sea capaz de oxidar una base preseleccionada en la sonda de ol igon?oleó-t ido en una reacción de ox dacion-reducción. La base preseleccionada puede ser cualquier base de nucleotido que ocurra naturalmente o sint tica en la sonda de oligon?cleotido que sea sometida a la oxidación después de la reacción con el agente oxidante seleccionado. La base preseleccionada exhibe una velocidad de oxidación única cuando es apareada en comparación a cuando la base preseleccionada es desapareada. La base preseleccionada debe de exhibí velocidades de oxidación únicas cuando sea apareada con cada una de las cuatro bases que ocurren naturalmente. Generalmente, se pueden detectar las bases cuyos 5 ' -mononucleotidos (v.gr-., el 5' -deoxipbon?cleotido o 5 ' -pbonucleotido) exhiben constantes de velocidad por encima de l0* -is_1 usando la reacción catalítica. Ejemplos de bases preseleccionadas adecuadas incluyen pero no están limitados a guanina, adenina, 8-oxo-guan?na, y 8-oxo-aderuna, 8-bromo-g?amna, guanosma, xantosina, wiosma, pseudo?ridma, 6-mercaptog?an?na, 8-rnercaptoguanina, 2-t?oxant?na, 6-t?oxant?na, 6-rnerca?to?ur?na, 2-am?no-6~carbox?met?l-rnercaptopur?na, 2-rnerca?topup a, 6-metoxip?pna, 2-acet?larn?no-6-h?drox??upna, 6-rnet? lt?o-2-hidroxip?rina, 2-d?rnet lam?no-6-h drox?pur?na, 2--h?drox?pupna, 2-arnmopur?na, 6-am?no-2-d?rnet?lal?l-pur?na, 2-t?oaden?na, 8-hidroxiademna y 8-metox?aden?na. Típicamente, la base preseleccionada se selecciona del grupo que consiste de guanina, adenma, 6-rnercaptoguan?na, 8-oxo-guan? na y 8-oxo-aden na, siendo rnas preferida la guanina corno una base preseleccionada que ocurre naturalmente y la 6-rnerca?toguanma corno la base preseleccionada sintética actualmente preferida. El agente oxidante puede ser cualquier molécula cargada tal corno una molécula catiónica, amónica o zw +epónica q?e se reactiva con la baee preseleccionada en ?n potencial de oxidación único. De esta manera, la selección del agente oxidante dependerá de la base preseleccionada elegida en particular, y sera f cilmente deterrnmable por aquellos expertos en la técnica. Los agentes oxidantes particularmente preferidos incluyen los complejos de rnetal de transición q?e son capaces de la transferencia electrones de ADN de metal con la base preseleccionada para que la forrna reducida del complejo de rnetal sea regenerada, completando un ciclo catalítico. Ejemplos de complejos de metal de transición adecuados para usarse en los métodos de la presente invención incluyen, por e emplo, 2+ (2,2' -b?p?pdina)3 de rutenio ( "Ru(bpy)3 + " ) , 2+ (4,4'-d?met?l-2,2'-b?p?r?dma)3 de rutenio ( "R?(Me2 - py)32 , 2+ (5,6-d?met?l-l,10-fenantrol?na)3 de rutenio ( "Ru( e2-fen)32 / 2+(2,2'~b?p?r?d na)3 de fierro ( "Fe( bpy )32+ " ) , 2+(5-clorofenan*t rolma)3 de (ierro ( "Fe( -Cl~fen)32+ " ) , +(2,2'-b???r?d?na)3 de osmio ( "0s( bpy )32+ " ) 2+ (5-clorofenantrol?na)3 de osmio ( "0s(5-Cl-fen)32+ " ) , i+fosfina de dioxoremo y i+piridma de dioxoremo ( "Re?2 (py U1+ ) - Algunos complejos amónicos útiles como agentes oxidantes son: Ruíbpy) ( (SO3 )2 -bpy)22- y Ruíbpy) ( (CO2 )2 -bpy)22" y algunos complejos z?i terio cos útiles corno agentes oxidantes son: Ru(bpy)2 ( (SO3 )2-b?y) y Ruíbpy )2 ( (CO2 )2 -bpy , en donde (803)2--bpy2- es 4,4 '-d?sulfonato-2, 2' -bipipdina y (CO2 )2"-bpy2- es 4, ' -d?carbox?-2,2' -bipipdma. Los derivados sustituidos adecuados de la pipdma, bipiridina y fenantrolina y sus grupos pueden también ser empleados en complejos con cualesquiera de los metales anteriores. Los derivados sustituidos adecuados incluyen pero no est n limitados a 4-ami nop idina, 4-d?rnet?l??r?dma, 4-acet?l??r?d?na, 4-n t ropiridina, 4,4 ' -d?a?nmo-2, 2 '-bipir dma, 5,5' -d?a?n?no-2, 2' -bi pin di na, 6,6' -d?am?no-2 ,2' -bipiridma, 4 ,4 ' -dietilendiamina-2,2' -bipipdina, 5 , 5 ' -d?et?lend?arn?na-2 , 2 ' -bipipdina, 6,6'-d?et?lend?am?na-2, ' -bipipdina, 4,4'-d?h?drox?l-2,2 '-bi pin di na, 5,5'-d?h?drox?l-2,2'-b?p?pd?na, 6,6' -dihidroxil-2,2 '-bipindina, 4,4' , 4"-tpa ?no-2 , 2 ' 2"-terp?r?d?na, 4,4' ,4"-t r?et?lend?arn?n-2,2' , 2"-terp?pd?na, 4,4' ,4"-trih?drox?- 2,2' ,2"-terp?r?d?na, 4,4' ,4"-tr?mtro-2, 2' ,2"-terp?r?d?na, 4,4' ,4"-tr?feml-2,2' , 2"-terp?r?d?na, 4 , 7-d?am?no-l , 10-fenantrolina, 3 , 8-d?arnmo-l , 10-fenant rolina, 4,7- 1 d?et?iend am?na-1 , 10-fenant roliría, 3 ,8~d?et?lend?arnma-l ,10-*( enantroli na, 4 , 7-d?h?drox?l-l, 10-fenantrol? na, 3 ,8- ?h?drox?l-1 , LO- feriant rol na, , P-dm tro-L, 10- fenantroli a, 1 ,8-dm?tro-1, 10-fenantrol?na, 4, 7-d?fen?l-i , 10-fenantrol?na, 3, 8-d? em 1-1,10-fenantrol?na, 4, 7-d?sper-amm-l , 10-fenantrolma, 3,8-d?sperarnm-1 , 10-fenantrol ina y d?p?r? oC3,2-a:2',2' -cJIfenazma. El agente oxidante puede ser llevado a reacción con el ADN hi bridado de acuerdo con cualquier técnica adecuada, para llevar a cabo la reacción de oxidación- reducci n del agente oxidante con la base preseleccionada. Lo único que se requiere es que el agente oxidante sea llevado a reacción con la muestra de ADN hibpdado bajo condiciones suficientes como para efectuar la oxidación selectiva de la base preseleccionada. Por ejemplo, el metal de transición puede ser llevado a reacción con ADN hibridado solubilizado mediante la sol?bil zacion del agente oxidante en la solución que contiene al ADN hibridado solubilizado bajo condiciones suficientes corno para permitir q?e ocurra la reacción de oxidación- reducción entre el agente oxidante y la base preseleccionada. En forma alternativa, en la modalidad en la que el ADN hibridado es inmovilizado sobre un soporte solido, el agente oxidante puede ser llevado a reacción con el ADN hibridado inmovilizando al agente oxidante sobre el mismo soporte solido y sumergiendo el soporte solido en una solución bajo condiciones suficientes corno para permitir que ocurra la reacción de oxidación-reducción del agente oxidante y de la base preseleccionada. El solvente en el cual tiene lugar la reacción de oxidación-reducción puede cer cualquier- solvente adecuado para solubilizar ADN; y preferiblemente comprende agua. Las condiciones adecuadas para permitir que ocurra la reacción de oxidación-reducción serán conocidas por aquellos expertos en la técnica. En un ADN o acido nucleico hibridado, los agentes oxidantes se Ligan en la ranura menor del ADN, y de esta manera se lleva a cabo un contacto intimo entre la base preseleccionada y el agente oxidante por la estr-uctura u ca de la hélice doble (o triple). Esta protección del residuo de la base preseleccionada crea la necesidad de ?n túnel para electrones a través del solvente, lo cual disminuye la velocidad de la transferencia de electrones. La accesibilidad del solvente vana con la naturaleza de la base de n?cleótido q?e es apareada con la base preseleccionada. La distancia del túnel se puede calcular de acuerdo con la formula: l-Vkes = exp(-ß b.r) en donde r es el cambio en distancia en el dúplex comparado con la cadena sencilla, y ss es la constante de velocidad para la oxidación de la base preseleccionada en la muestra de ADN de cadena sencilla. De esta manera, la distancia del túnel entre la base preseleccionada y el agente oxidante es diferente para cada apareamiento de base y para cada ADN desapareado. Por lo tanto, la constante de velocidad de transferencia de electrones indica la identidad de la base apareada (o desapareada). Si la fuerza de impulso para la transferencia de electrones es significativamente menor- que la energía reorganizac onal ( ?), una gráfica de RT en contra la fuerza de impulsión, corregida para términos de trabajo asociados con el alcance de los reactivos, produce una línea recta con una inclinación de 1/2, de acuerdo con la teoría de Marcus. En base a la teoría de Marcus entonces, las constantes de velocidad absoluta pueden calcularse median-te la siguiente ecuaci n: 1- - v expC-ß(r-ro )lexpt-( ,G+ ?)2/4 XRT3 en la q?e v es la constante de velocidad en el limite de difusión controlada ( lO^M-i s-i ) , r es la distancia entre el reactivo y el producto en el complejo activado, ro es la distancia del acercamiento rnas cercano del reactivo y el producto y ß es la influencia del medio que interviene. Debido a que la base preseleccionada, co o se señaló anteriormente, es incorporada en el interior del ADN hibpdado, esto impone una distancia finita a través de la cual el electrón debe pasar hacia el agente oxidante. De esta manera, r no es igual a ro . ß para el ag?a es aproximadamente Sfi-1. Este valor relativamente grande para ß indica que serán llevados a cabo cambios significativos en las constantes de velocidad de transferencia de electrones por muy pocos cambios en la distancia del túnel. Ya que la conformación del ADN entre la base preseleccionada y la base apareada con la base preseleccionada depende de la baee apareada con la base preseleccionada, la baee apareada con la base preseleccionada afecta la distancia del túnel a travée del cual el electrón debe pasar- entre la base preseleccionada y el agente oxidante. Por lo tanto, se establece una correlación entr-e la distancia del túnel y la base especifica apareada con la base preselecc onada.

E. Detección de reacciones de oxidación-reducción Puede detectarse la ocurrencia de la reacción de oxidación-reducción de acuerdo con cualquier medio adecuado conocido ?ar-a el experto en la materia. Por ejemplo, puede detectarse la ocurrencia de la reacción de oxidación-reducción usando un electrodo de detección para observar un cambio en la señal electrónica q?e es indicativa de la ocurrencia de la reacción de oxidación-reducción. Típicamente, se pone en contacto un electrodo de detección, sensible a la transferencia de electrones entre el agente oxidante y el ADN híbrido, con la solución que contiene el ADN híbrido que reacciona y el agente oxidante. Junto con el electrodo de detección, generalmente también se ponen en contacto con la solución un electrodo de referencia y un electrodo auxiliar (la mayor- parte de la corriente pasa a través del electrodo auxiliar). Los electrodos de detecci n adecuados son bien conocidos para el experto en la materia e incluyen, por ejemplo, un electrodo de carbono cristalino o un electrodo de oxido de indio y estaño. De manera similar, los electrodos de referencia adecuados son conocidos en la técnica e incluyen por ejemplo electrodos de plata/cloruro de plata.

La detección de la señal electrónica asociada con la reacción de oxidación- reducción permite la determinación de la presencia o ausencia de ADN híbrido. El paso de la determinac ón de la presencia o ausencia de ADN híbrido incluye típicamente i) medir la velocidad de reacción de la oxidacion- educc on, 11) comparar la velocidad de reacción medida con la velocidad de reacción de oxidación- reducción del complejo de metal de transición con un ADN de una sola cadena, y después m) determinar si la velocidad de reacción medida es esencialmente la misma que la velocidad de reacción de oxidación- reducción del complejo de rnetal de transición con ADN de una sola cadena. El paso de medición de la velocidad de reacción puede llevarse a cabo mediante cualquier medio adecuado. Por ejemplo, la velocidad de reacción relativa puede determinarse comparando la corriente como una función de velocidad de escudriñamiento, concentración de sonda, concentración de objetivo, mediador-, regulador- de pH, temperatura, y/o rnetodo electroquímico. La velocidad de reacción de oxidación-reducción puede medirse de acuerdo con los medios adecuados conocidos por el experto en la materia. Típicamente, la velocidad de reacción de oxidación- reducción se mide determinando la señal electrónica asociada con la ocurrencia de la reacción de oxidación-reducción. Por ejemplo, la señal electrónica asociada con la reacción de oxidación-reducción puede medirse proveyendo un aparato adecuado en comunicación electrónica con el electrodo de detecci n. Un aparato adecuado sera capaz de rnedir la señal elect ro ca que es generada, de tal manera de proveer una medición de la velocidad de reacción de oxidación-reducción de la reacción del ADN híbrido y el agente oxidante. La señal electrónica puede ser característica de cualquier método electroquímico, incluyendo voltametria cíclica; vol ametraa de pulso normal, cronoamperornetria, y voltametría de onda cuadrada, siendo la voltarnetria cíclica la forma actualmente pre e ida. La velocidad de reacción medida puede compararse después con la velocidad de reacción de oxidación- reducción conocida del complejo de rnetal de transición con un ADN de una sola cadena. Corno se discutió en detalle anteriormente, la distancia de túnel entre el agente oxidante y la baee seleccionada en el ADN, ya sea híbrido o de una sola cadena, afecta la velocidad de reacción de oxidación- reducción entre el agente oxidante y la base preselecc onada. Por lo tanto, eL ADN híbrido exhibe una velocidad de reacción de oxidación-reducción diferente a la del ADN de una sola cadena. Puede determinarse la presencia o ausencia de ADN híbrido en la base preseleccionada determinando si la velocidad de reacción de oxido-reducción medida es o no la misma que la velocidad de reacción de oxido-red?ccion del agente oxidante y la base preseleccionada en el ADN de una sola cadena. Además, la distancia de túnel entre el agente oxidante y la base preseleccionada difiere de acuerdo con la distancia de la ligadura entre la base preseleccionada y su par, de modo que puede distinguirse cada apareamiento de base posible de las otras. La distancia de ligadura entre La base preseleccionada y su par de base depende de la base que se aparea < on la base preseleccionada. Por- ejemplo, la velocidad de reacción de oxidación- reducción para la oxidación de guanina apareada con ademna difiere de la velocidad de reacción de oxidacion-r-educcion para la oxidación de guanina apareada con citosina, que a su vez es diferente de la velocidad de reacción de oxidación-reducción para la oxidación de guanina apareada con guanina, que también es diferente de la velocidad de reacción de oxidación-reducción para la oxidación de guanina apareada con tirnina. Mas específicamente, las velocidades de reacción de oxidación-reducción par-a la oxidación de guanina siguen la tendencia en la que la de guanina de una sola cadena es rnayor que la de guanina apareada con ademna, que es mayor que la de guanina apareada con guanina, que es mayor que la de guanina apareada con timma, q?e es mayor que la de guanina apareada con citoeina. Por lo tanto, los métodos de la presente invención son útiles para detectar desapareamientos de un solo par de bases en la base preselecc onada o en el par de bases adyacente a la base preseleccionada. De manera ventajosa, la distinción entre las velocidades de reacción de oxidación- reducción de la oxidación de la base preseleccionada cuando se aparea con cada una de las diferentes bases de ocurrencia natural, permite también la identificación de la base apareada con la base preseleccionada. La base apareada con la base preseleccionada puede identificarse i) midiendo la velocidad de reacción de oxidación-reducción detectada, 11) comparando la velocidad de reacción medida con cada una de las cuatro diferentes velocidades de reacción de oxidación-reducción conocidas del agente oxidante con un ADN que tiene ademna, citosma, guanina, o timina unidas a la base preseleccionada, y m) determinando cual de las velocidades de reacción de oxidacion-reducción conocidas es esencialmente la misma que la velocidad de reacción medida. La velocidad de reacción puede medirse de acuerdo con las técnicas descritas anteriormente. Similarrnente, pueden medirse de acuerdo con las mismas técnicas las velocidades de reacción de cada una de las cuatro diferentes reacciones de oxidación- reducción del agente oxidante con un ADN que tiene adenina, citosma, guanina o tintina unidas a la base preseleccionada, de tal manera que estas velocidades de reacción sean conocidas. La velocidad de reacción medida de la reacci n de oxidación- reducción del agente oxidante con el ADN híbrido puede compararse después con las velocidades de reacción de oxidación-reducción conocidas del agente oxidante con ADN que tiene ademna, citosína, guanina o tirnma unidas a la base preseleccionada. Por ejemplo, se determina la base apareada con la base preseleccionada determinando el apareamiento de la base conocida que tiene la velocidad de reacción de oxidación-reducción esencialmente igual a la velocidad de reacci n de o idacion- reducción medida.

F. Determinación de la secuencia de fl N La presente invención también provee un rnetodo de Determinación de la secuencia de ADN que comprende a) poner en contacto una muestra de ADN con una sonda de oligonucleotido para formar un ADN híbrido; la sonda de oligon?cleota do incluye una base sintética preseleccionada que tiene un potencial de oxidación umco; b) hacer reaccionar el ADN híbrido con un agente oxidante tal corno un complejo de rnetal de transición, capaz de oxidar la base sintética preseleccionada en la sonda de nucleotido en una reacción de oxidación-reducción, la sonda de oligonucleótido tiene un numero predeterminado de las bases sintéticas preseleccionadas; c) detectar la reacción de oxidación-reducción; d) medir la velocidad de la reacción de oxidaci n-reducción detectada; y e) identificar la base apareada con la base sintética preseleccionada. Corno en los métodos discutidos antes en la presente, la muestra de ADN puede ser amplificada antes del paso de contacto con la sonda de oligonucleotido, de acuerdo con las técnicas conocidas para el experto en la materia. La base sintética puede seleccionarse del grupo de bases descritas antes en la preeente y otras bases sintéticas conocidas para el experto en la materia. La única limitación es que la base sintética debe poseer un potencial de oxidación único en comparación con los potenciales de oxidación de lae cuatro bases que ocurren en la naturaleza, es decir, adenina, citosma, guanina y t rnina. Los pasos de poner- en contacto la muestra de ADN con la sonda de oligonucleótido; la reacción del ADN híbrido con el agente oxidante, la detección de la reacción de oxidación-reducción, y la medición de la velocidad de reacción, pueden llevarse a cabo corno se describió antes en la presente. El paso de identificación de la base apareada con la base sintética preseleccionada incluye los pasos de (i) comparar la velocidad de reacción medida par-a cada una de las cuatro diferentes velocidades de reacción de oxidación-reducción conocidas del agente oxidante con el ADN que tiene adenina, citosina, guanina o tirnina ligadas a la base sintética preseleccionada; (11) determinar cual de las velocidades de reacción conocidas de oxi dación-reducción es esencialmente la misma que la velocidad de reacción medida. En otra modalidad, la sonda de oligon?cleotido incluye también una segunda base sintética preseleccionada. La segunda base sintética preseleccionada tiene un potencial de oxidación único que es diferente del potencial de oxidación de la primera base sintética preeeleccionada. En eeta modalidad, el paso de detecci n de la reacción de oxidación- reducción del agente oxidante con la base preseleccionada incluye también la detección de la reacción de oxidación- reducción del agente oxidante también con la segunda base sintética preseleccionada. Además, el paso de medición de la velocidad de reacci n de oxidación- reducción incluye también medir la velocidad de reacción de oxidación- reducción de la oxidación de la segunda base preseleccionada por- medio del agente oxidante. Además, el paso de iden ificaci n de la base apareada con la base sintética pf-ß-sel eccionada incluye también identificar la base apareada tambi n con la segunda base sintética preseleccionada. De conformidad con esta modalidad, las reacciones de oxidacion-reduccion de ambas bases preselecc lonadas pueden detectarse de manera tal q?e finalmente las bases que están apareadas con cada base sintética preseleccionada pueden ser identificadas usando el método descrito antes en la presente. Corno sera evidente para el experto en la materia, el rnetodo anterior puede llevarse a cabo con rnás de dos bases sintéticas preseleccionadas, siempre que cada base sintética preseleccionada exhiba un potencial único de oxidación diferente del potencial de oxidación de todas las otras bases sintéticas preseleccionadas, y diferente del potencial de oxidación de cada una de las cuatro bases que ocurren en la naturaleza. Puesto q?e cada base que se aparea con ?na base preseleccionada puede ser identificada de acuerdo con los métodos descritos en la presente, puede determinarse la secuencia del ADN repitiendo los pasos del método anterior con un número suficiente de sondas diferentes del oligonucleotido q?e tiene la base sintética preseleccionada en diferentes sitios para identificar cada base en la muestra de ADN. En otras palabras, puede determinarse la secuencia del ADN de la muestra proveyendo un numero suficiente de sondas de oligonucleotido en el cual cada secuencia de sonda incluye por lo rnenos una de las bases sintéticas preseleccionadas, y la base sintética esta Localizada en un sitio diferente y calculado a lo largo de la secuencia de la sonda en cada sonda de oligonucleótido. De esta manera, la detección repetida de La reacción de oxidación- reducción del ADN híbrido con un agente oxidante, la medición de la velocidad de reacción de oxidación-reducción, y la identificación de la base apareada con la base sintética preseleccionada darán corno resultado la identificación base por base de la secuencia de la muestra de ADN.

T. Aparato La presente invención también provee un aparato util para llevar a cabo los métodos de la presente invención. Uno de estos apar-atos ilustrativos se muestra esquemáticamente en la figura 3. En general, el aparato comprende una pluralidad de contenedores 10 de m?es*< ra de ADN. Un ensamble de conducción 11 sirve como un medio de manejo de muestras para llevar la pluralidad de contenedores de muestra de ADN. Un depósito líquido 12, una linea de alimentación 13 y una válvula 14 sirven corno un medio de liberación de sonda de oligonucleótido para liberar la sonda de ol gonucleótido en cada uno de loe contenedoree de mueetra de ADN, y un depósito correspondiente de líquido 15, línea de alimentación 16 y válvula 17 sirven corno un medio de liberación de agente oxidante par-a liberar el complejo de metal de transición a cada uno de la pluralidad de contenedores de rnuest a de ADN. Un ensamble de sonda 20 que incluye un conductor 21 y una sonda 22 sirve corno un medio detector de reacci n de oxidación- reducción para detectar una reacción de oxidación-reducción. En operación, las muestras de ADN se predepositan en Los contenedores de muestra 10. El ensamble de conducción 11 transporta después consecutivamente los contenedores de muestra 10 debajo de los medios de liberación de sonda de ol igonucleot do y los medios de liberación de agente oxidante para liberar los reactivos respectivos en Los mismos. Después de la liberación del reactivo, el respectivo contenedor de muestra avanza por medio de los medios de conducción hasta una posición por abajo de la sonda 22, y la sonda 22 avanza por medio del conductor 21 y hacia el contenedor de muestra para detección ié la reacción de oxidación-reducción. Con la sonda 22 son llevados electrodos adicionales, necesarios para llevar a cabo el voltamograrna cíclico. La operación de los diferentes componentes y la recolección de datos puede llevarse a cabo con un controlador adecuado 30, tal co o un programa de software que corre sobre una computadora adecuada para uso general. Por supuesto, para el experto en la materia serán evidentes fácilmente numerosas variaciones sobre el aparato anterior. La pluralidad de contendores de muestra de ADN puede ser de cualquier contenedor adecuado conocido para el experto en la materia, e incluye placas de microtítulo, tubos de ensayo, cajas de Petri, frascos de cultivo, soportes solidos y similares, que son capaces de contener la muestra de ADN. L s medios de manejo de muestra pueden ser cualquier medio de manejo de contenedores de muestra diseñados adecuadamente, conocidos para el experto en la materia, que son capaces de llevar loe contenedores de muestra de ADN. Los medios de liberación de sonda de oligonucleótido adecuados para liberar la sonda de oligonucleotido a cada uno de los contenedores de muestra de ADN son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, de acuerdo con una modalidad, los medios de liberación de sonda de oligonucleotido comprenden un soporte solido sobre el cual se inmoviliza la sonda de oligonucleotido. Los medios de liberación de sonda de oligonucleotido deben permitir suficiente contacto entre la muestra de ADN y la sonda de oligonucleótido ba o condiciones apropiadas para efectuar la hibridación de la muestra de ADN y la sonda de oligonucleótido. Los medios de liberación de agente oxidante adecuados para liberar el agente oxidante a cada uno de la pluralidad de contenedores de muestra de ADN son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, de conformidad con una modalidad, el agente oxidante está fijo a un soporte sólido q?e comprende el medio de liberación de agente oxidante. El detector de reacción de oxidación-reducción para detectar una reacción de oxidación-reducción, de conformidad con una modalidad, puede comprender-uno o más electrodoe que son capaces de detectar La oxidación de la base preseleccionada. Los electrodos de detección y electrodos de referencia adecuados se describieron antes en La presente con referencia a los métodos de la presente invención. De preferencia, los electrodos están en comunicación electrónica con un medio para rnedir la velocidad de reacción de oxidación-reducción. Los medios adecuados para medir la velocidad de reacción de oxidación-reducción son conocidos para el experto en la materia, según se describió antes en la presente. En una modalidad alternativa del aparato de la presente invención, el aparato para detectar la hibridación de ADN compr-ende (a) un contenedor de muestra de ADN; (b) un medio de liberación de sonda de oligonucleótido para liberar una pluralidad de sondas de oligonucleotido al contenedor de muestra de ADN; (c) un medio de liberación de agente oxidante para liberar el agente oxidante al contenedor e muestra de ADN; (d) un detector de reacción de oxidación-reducción para detectar una reacción de oxidación-reducción; este aparato esta adaptado para usarse con sondas inmovilizadas tales corno las q?e se describen en las patentes de los E. U. A. No. 5,143,854 y 5,405,783 para Pirrung y otros; Fondor, y otros, Nature 364:555 (1993); Bams, Agnew. Chem. 107:356 (1995); y Noble, Analitical Chernistry 67(5) :21 (1995), las descripciones de las cuales se incorporan en la presente como referencia en s? totalidad. Co o se indicó antes, el contenedor de muestra de ADN puede sei cualquier contenedor adecuado conocido para el experto <hn La materia. El medio de Liberación de sonda de oligonucleótido es pre eriblemente un soporte solido que -tiene una pluraLidad de sondas de oligonucleotido inmovilizadas sobre el mis o, que es capaz de liberar las sondas al contenedor de iuest r-a de AUN. Por ejemplo, de conformidad con una modalidad, el soporte solido que tLene la pluralidad de sondas de ol gonucleotido inmovilizada sobre el mismo, se pone en contacto con ía muestra de ADN dentro del contenedor- de muestra de ADN ba o condiciones suficientes para permitir la hibridación de la muestra de ADN con una o más sondas de oligonucleótido. Los medios de liberación de agente oxidante adecuados para liberar el agente oxidante al contenedor de muestra de ADN se describieron antes en la pr-esente. Los medios de liberación de agente oxidante preferidos comprenden un soporte sólido q?e tiene al agente oxidante inmovilizado sobre el rnisrno. De conformidad con una modalidad preferida, el agente oxidante y la pluralidad de sondas de oligonucleo í do se inmovilizan sobre el mismo soporte solido. El aparato de conformidad con la presente invención es util para efectuar pruebas de diagnostico de ?na variedad de muestras de ADN. La pluralidad de sondas de oligonucleótido permite la prueba y detección de una variedad de ADNs dentro de una sola muestra, proveyendo asi una herramienta útil para la selección de una sola muestra de ?na variedad de ADNs, incluyendo de patógenos, de virus, y similares.

H. Detección de hibridación de ñRN, secuenciación de flRN, y detección de desapareamiento de flRN También se describen en la presente métodos de detección de hibridación de ARN, métodos de secuenciacion de ARN y métodos de detección de desaparearniento de ARN. El ARN util para llevar a cabo estos métodos incluye, pero no se limita a, ARN ribosomal, ARN de transferencia o ARN genomico (por ejemplo, ARN obtenido de virus de ARN -tal corno retrovirus, VIH-l, etc.). Un primer aspecto de la presente invención es, por- lo tanto, un método de detección de hibridación de ARN que comprende: (a) poner en contacto una muestra de ARN con una sonda de oligonucleotido para formar un ARN híbrido; (b) hacer reaccionar el ARN híbrido con un complejo de metal de transición capaz de oxidar una base preselecc onada en la sonda de oligonucleota do en una reacción de oxi dación- reducción, la sonda de oligonucleótido tiene por lo menos una de las bases preseleccionadas; (c) detectar' la reacción de oxidacion-reducción; (d) determinar la presencia o ausencia de ARN híbrido de la reacción de oxidación- reducción detectada en la base preseleccionada. Más particularmente, un método de detección de hibridación de ARN comprende: (a) poner en contacto una muestra de ARN con una sonda de oligonucleotido para formar un ARN híbrido; (b) hacer reaccionar el ARN híbrido con ?n complejo de rnetal de transición capaz de oxidar una base preseleccionada en la sonda de olí gon?cleotido en una reacción de oxidacion-red?cc on, la sonda de ola gon?cleotido tiene por lo menos una de las bases preseLeccionadas; (c) detectar la reacci n de oxidación-reducción; (d) edir- la velocidad de reacción de la oxidación-reducción detectada; (e) comparar La velocidad de reacción medida con la velocidad de reacci n de oxidación-reducción del complejo de rnetal de transición con un ARN de una sola cadena; y después (f) determinar si La velocidad de reacción medida es la misma q?e la velocidad de reacción de ox idacion- reducción del complejo de rnetal de transición con ARN de una sola cadena. Un método de secuencí ación de ARN comprende: (a) poner- en contacto una muestra de ARN con una sonda de oligonucleotido para formar un ARN híbrido, la sonda de oligonucleótido incluye una base preseleccionada que tiene una velocidad única de oxidación; (b) hacer reaccionar- el ARN híbrido con un complejo de rnetal de transición capaz de oxidarla base preseleccionada en la sonda de oligon?cleotí do en una reacción de oxidación-reducción, la sonda de oligonucleótido tiene un numero predeterminado de bases preseleccionadas; (c) detectar la reacción de oxidación- reducción; (d) rnedir la velocidad de reacción de la reacción detectada de oxidación-reducción; y (e) identificar la base apareada con la base preselecc onada. Las sondas de oligonucleótido, metodología de hibridación, agentes de oxidación, detección de reacciones de oxidac ón- reducción y aparatos útiles para llevar a cabo estos métodos son esenci lmente como se señalaron en las secciones A-H anteriores, adaptadas para usarse con ARN corno La muestra de ácido nucleico, de conformidad con los principios conocidos para el experto en la materia (por ejemplo el uracilo reemplaza a la tirnina corno base).

I. Detección de la base preseleccionada sobre el ácido nucleico ob.ietivo En los métodos descritos específicamente anteriormente, los complejos de rnetal se usan para obtener una corriente electroquímica a partir- de ADN o ácidos nucleicos de una sola cadena o de doble cadena. Las bases preseleccionadas tales corno guanina dan una señal electroquímica, y esta señal es mucho mas débil para ADN de doble cadena. Estos métodos exhiben ventajosamente una sensibilidad estructural alta, y pueden resolver un solo desapareamiento de bases. Por lo tanto, estos métodos son particularmente ventajosos para la sec?enciacion de ADN. S n embargo, dos desventajas de estos métodos son q?e: (a) hay una señal negativa que marcha de la cadena de la sonda hacia el híbrido, y (b) no hay amplificación de la señal. Las siguientes técnicas proveen soluciones a este problema. Ademas, las siguientes técnicas son particularmente útiles para pruebas de diagnóstico, y son particularmente útiles para la detección cuantitativa de ácidos nucleicos.

En vista de lo anterior-, también se describe en la presente un rnetodo de detección de la presencia o ausencia de ?n acido nucleico objetivo en una muestra de prueba que se sospecha que contiene el mismo, en la cual el acido nucleico objetivo contiene por lo menos una base preselecc onada. En contraste con los métodos descritos anteriormente, en el presente método la base preseleccionada esta localizada sobre el acido nucleico objetivo, en lugar de estar sobre la sonda de oligonucleotido. El método puede llevarse a cabo en una muestra de prueba que contiene el acido nucleico objetivo. Puede usarse cualquier muestra de prueba que se sospecha que contiene el acido nucleico objetivo, incluyendo (pero sin limitarse a) muestras de tejido tales como muestrae de biopsia y fluidos biológicos tales corno muestras de sangre, esputo, orina y semen, cultivos bacterianos, muestras de suelo, muestras de alimento, etc. El acido nucleico objetivo puede ser de cualquier origen, incluyendo animal, vegetal o microbiano (por ejemplo, viral, bacteriano procariótico y eucanótico, de protozoano, f?ngico, de protistas, etc.), dependiendo del propósito particular de la prueba. La rnueetra puede tratarse o purificarse antes de llevar a cabo el presente método de conformidad con técnicas conocidas o evidentes para el experto en la materia; y si así se desea, los cidos nucleicos en la presente pueden digerirse, fragmentarse, y/o amplificarse (ver lo anterior) antes de llevar a cabo el presente método.

Corno se ilustra esquemáticamente en la Figura 4, el rnetodo comprende (a) poner en contacto la muestra de prueba con una sonda de oligonucleotido que se une específicamente al acido nucleico objetivo para formar un ácido nucleico híbrido; (b) poner en contacto el ácido nucleico híbrido con un complejo de metal de transición q?e oxida la base preseleccionada en una reacci n de oxidación- reducción; (c) detectar la presencia o ausencia de la reacción de oxidación- reducción asociada con el acido nucleico híbrido; y (d) determinar la presencia o ausencia del acido nucleico objetivo en la muestra de prueba de la reacción detectada de oxidación- reducción en la base preseleccionada. Como se ilustra en la Figura 4, la sonda de oligonucleotido puede ser inmovilizada sobre un soporte sólido para facilitar la separación de la muestra de prueba del acido nucleico híbrido, ocurriendo el paso de separación antes del paso de detección (por ejemplo, entre los pasos (a) y (b) o entre los pasos (b) y (c)). Alternativamente, la sonda de oligonucleótido puede proveerse Libre en solución, y pueden proveerse otros medios para separar el acido nucleico híbrido de la muestra (por ejemplo mediante un ácido nucleico rnediador q?e se une a la sonda de oligonucleóti o, o mediante una interacción de unión biotma-avidina, en la cual la biotma se une a la sonda del oligonucleot do y la avidina es inmovilizada sobre un soporte sólido) . De preferencia, el ácido nucleico objetivo contiene por lo menos diez más de la base preseleccionada que la sonda de olí gonucleot do, o rnuy preferiblemente por lo rnenos 50 o 100 rnas de l a base preseleccionada que la sonda de oligonucleót i do. Se obtiene ventajosamente un incremento mayor de corriente cuando el acido nucleico objetivo contiene mas de la base preseleccionada que la sonda de oligonucleot ido. Opcionalrnente, pero preferiblemente, la sonda de oligonucleotido esta libre de la base preseleccionada, o esta por lo menos esencialmente libre de la base preseleccionada (es decir, contiene suficientemente rnenos de la base preseleccionada para que la señal de la sonda no interfiera con ela, m sea tornada por equivocación corno una señal del acido nucleico objetivo). En donde no se tiene disponible una secuencia de bases de ocurrencia natural que se hibride convementemente con el ácido nucleico objetivo, puede usarse la estrategia de emplear bases alternativas que son inactivas para oxidorreduccion (se discute rnas adelante). El acido nucleico objetivo es preferiblemente rnas grande que la sonda de oligonucleotido, y por lo menos una de las bases preseleccionadas no se híbrida con la sonda de oligonucleotido en el acido nucleico híbrido (es decir, es una base "colgante"), corno se ilustra en la Figura 4. Preferiblemente, por lo rnenos 10, 50 o 100 de las bases preseleccionadas son bases "colgantes", proveyendo con ello amplificación substancial de la señal electroquímica detectada. Por ejemplo, puede usarse una sonda de oligonucleótido que no contiene ningún residuo de guanina (por ejempLo, solamente A, T y C). El voltarnograrna cíclico de R?(bpy)32+ en presencia de esta cadena es rnuy similar al que no tiene el oligomero. Esta cadena se híbrida después con una cadena objetivo que contiene guaninas, ya sea en las regiones de bases apareadas de traslapo o en las regiones colgantes, o en ambas (corno se ilustra en la Figura 4 por medio de una "G" adyacente a la cadena de acido nucleico objetivo), si el acido nucleico objetivo es rnas grande que la sonda de oligonucleotido. Debido a que se detectan guaninas múltiples, la señal es amplificada en relación con el numero de híbridos formados. En el caso en el cual la cadena objetivo es ADN o ARN genórnico, se encuentran grandes números de guaninas colgantes, las cuales darían una amplificación de señal enorme. Por ejemplo, el ARN ribosomal puede contener hasta 1,000 guaninas para un organismo particular, y por lo tanto podría proveer aproxirnadarnente una amplificación de 1,000 veces por evento de hibridación. Por ejemplo, en una modalidad preferida, la prueba para la base preseleccionada sobre la cadena objetivo incluye la inmovilización de la cadena de la sonda (preferiblemente inactiva a la oxidorred?cción) sobre una superficie sólida orientada cerca de la superficie del electrodo, que provee una señal de base ba a cuando ee escudriñada en presencia del mediador. La superficie solida después hace contacto con una solución de la cadena objetivo, que contiene la base preseleccionada. Si ocurre hibridación, la cadena objetivo estar ahora en estr-echa proximidad con el electrodo, y sera detectado un incremento de corriente. Cuantificación de ácidos nucleicos. El presente método es particul rmente bien adecuado para la detección cuantitativa de ácidos nucleicos. En los casos descritos en esta sección, la constante de velocidad para oxidación del híbrido por medio del agente oxidante (v.gr., R?(bpy)33+), puede determinarse del voltarnograrna cíclico (u otra señal elec*t i ornea) mediante simulación digital. Bajo la mayoría de las condiciones, esta reacción sigue la cinética de segundo orden, de rnodo que La velocidad = H_Rui bpy)3 + HADN] , en donde k es la constante de velocidad que es especifica para el híbrido particular sonda-objetivo, CRu(b?y)32+1 es la concentración del agente oxidante, y CADN] es la concentración del híbrido (que podría ser un híbrido ADN-ARN). Si se conocen y CRu( b?y)32+ ] , entonces puede determinarse la cantidad del híbrido. En la practica, se construye una curva de calibración para incrementos de corriente obtenidos con cantidades diferentes de soluciones patrón que contienen ADN o ARN objetivo, y el incremento de comente se usa para obtener la cantidad de híbrido directamente. Esta cantidad se relaciona después directamente con la cantidad de material objetivo (por ejemplo, organismos infecciosos en una muestra clínica). Ver por ejemplo, M. Holodniy y otros., 3. Virol. 69, 3510-3516 (1995); 3. MeLlors y otros, Science 272, 116-1170 (1996). Las sondas de oligonucleotido, la metodología de hibridación, los agentes oxidantes y los métodos de reacción de oxidación-reducción, la de*<eccion de reacciones de oxidacion-red?ccion, y los aparatos útiles para llevar a cabo estos métodos son corno se indicaron en las secciones A-H anteriores. 3. Bases alternativas que son inactivas para la oxidación- reducción Una desventaja del método descrito en La sección H anterior es que la '--onda de ol gonucleótido preferiblemente no contiene un número substancial de la base preseleccionada (por ejemplo, guanina). Una solución a este problema es usar una base alternativa q?e pudiera substituir- a la guanina (es decir, una base q?e, como La guanina, tenga una afinidad mayor de unión por citocma que las otras bases en una cadena doble de acido nucleico) en la cadena de la sonda, pero que no sea oxidada por el agente oxidante ba o las condiciones de reacción aplicables. Los ejemplos de estas bases alternativas cuando la guanina es la base preseleccionada son inosina y 7-desazag?amna. De esta manera, un método de detecci n de un acido nucleico objetivo en donde el acido nucleico contiene por lo rnenos una base preseleccionada y la sonda o acido nucleico de captura contiene bases alternativas inactivas a la oxidorreducción comprende: a) poner en contacto el acido nucleico objetivo con un ácido nucleico complementario que se une específicamente al ácido nucleico objetivo para formar un acido nucleico híbrido; b) hacer reaccionar- el acido nucleico híbrido con un complejo de rnetal de transición capaz de oxidar la base preseleccionada en una reacción de oxidación- educción; c) detectar la reacción de oxidación-reducción; y d) determinar la presencia o ausencia de acido nucleico de la reacción de oxidación- reducción detectada en la base preseleccionada. Cuando la base preseleccionada en el acido nucleico objetivo es La guanina y el acido nucleico objetivo contiene citocina (La cual ordin ri mente se uniría con la guanina en el acido nucleico complementario), entonces el acido nucleico complementario contiene una base alternativa que se une a la citocma en el acido nucleico híbrido. La base alternativa puede se eccionarse del grupo que consiste de inosina y 7-desazag?ana na. El paso de reacción comprende típica ent e la reacción del complejo de rnetal de transición con el acido nucl aco ba o condiciones suficientes para efectuar la oxidación selectiva de la base preseleccionada sin oxidar la base alternativa. Las sondas de oligonucleotido, la metodología de hibridación, los agentes oxidantes, métodos de reacción de oxidación-- reducción, la detección de reacciones de óxido-reducción y los aparatos útiles para llevar a cabo estos métodos, son corno se indicaron en las secciones A-I anteriores.

K. Polimerización de la base preseleccionada con transferasa terminal Una modalidad alternativa del rnetodo descrito en la sección H anterior incluye alargar el acido nucleico objetivo con transferasa terminal para proveer sobre el mismo bases adicionales a las preseleccionadas. Corno se ilustra en la Figura 7, este método comprende: a) poner en contacto la muestra de prueba con una sonda oligonucleotido que se une eepeci ficarnente al acido nucleico objetivo para formar un ácido nucleico híbrido, la sonda de oligonucleotido tiene extremos terminales que °stan bloquados para alargamiento por transferasa terminal; b) poner en contacto las sondas de oligon?cleótido con una solución que contiene una base preseleccionada en presencia de transferasa terminal para producir un prod?c*<o de extensión del acido nucleico objetivo, el producto de extensión comprende la base preeeleccaonada; c) poner en contacto la sonda oligonucleotido con ?n complejo de rnetal de transición que oxida la base preseleccionada en una reacción de oxidaci n-reducción; d) detectar la presencia o ausencia de la reacción de oxidación-reducción; y e) determinar la presencia o ausencia del acido nucleico objetivo en la muestra de prueba a partir de la reacción de oxidación-reducción detectada en la base preseleccionada. La muestras de prueba se separan preferiblemente de la sonda de oligonucleótido antes del paso de detección, y se separan muy preferiblemente de la sonda entre los pasoe a) y b) antenoree.

La separación puede Llevarse a cabo mediante ol uso de una sonda inmovilizada, o la sonda puede proveerse libre en solución, corno se discuti en la sección H anterior. Las sondas de ol gon?cleotido, la rne-t odologia de hibridación, los métodos de reacción de oxidación- reducción y los agentes oxidantes, la detección tle Las reacciones de ox idacion- educción y los aparatos útiles para llevar a cabo estos métodos, son corno se indican en las secciones A-1 anterior es.

L. Pruebas de emparedado Una modalidad adicional del método de la sección H anterior es la prueba denominada "emparedado" , ilustrada esquemáticamente en la Figura 8. En una prueba de emparedado, el acido nucleico objetivo es parte de un híbrido de tres (o mas) miembros, comprendido de una sonda de captura, el ácido nucleico objetivo y la sonda de señal. Un rnetodo de detección de la presencia o ausencia de un ácido nucleico objetivo en una muestra de prueba que se sospecha q?e contiene el rnisrno, comprende: a) proveer una sonda de captura de oligonucleotido, en donde la sonda de captura se une específicamente al acido nucleico objetivo; b) poner en contacto la muestra de prueba con la sonda de captura para formar un ácido nucleico híbrido; c) poner en contacto una sonda de señal de oligonucleotido con el ácido nucleico híbrido, en donde la sonda de señal se une específicamente con el acido nucleico objetivo, y en donde La sonda de señal contiene por lo menos una base preseleccionada, para producir ?n emparedado de acido nucleico híbrido; d) poner en contacto el empar-edado de acido nucleico híbrido con un complejo de metal de transición que oxida la base preseleccionada en una reacción de oxidación- educción; e) detectar la presencia o ausencia de la reacción de oxidación- reducción asociada con el acido nucleico híbrido; y f) determinar la presencia o ausencia de acido nucleico objetivo en la muestra de prueba a partir de la reacción de oxidación-reducción detectada en la base preselecc onada. Preferiblemente, la muestr-a de prueba se separa de la sonda de captur-a; este paso de separación puede ocurrir entre el paso b) y paso c) anteriores, o entre el paso c) y paso d) anteriores. Dependiendo del formato de la prueba (por ejemplo, heterogéneo u homogéneo), la sonda de captura de oligonucleotido puede estar inmovilizada sobre un soporte solido (por ejemplo, un glóbulo polirnepco, una placa o la superficie interna de un pozo de placa de rnicrotí t?lo) , o medios alternativos provistos para separar el ácido nucleico híbrido de la muestra de prueba, según se discutió anteriormente. Se conocen numerosos formatos de prueba "emparedado". La elección del formato de prueba no es critico, y puede emplearse cualquier formato adecuado para llevar a cabo la presente invención. Por ejemplo, la sonda de captura de oligonucleótido puede estar inmovilizada sobre un soporte solido, según se describe en la Patente de los E.U.A. No. 4,486,539 ar Ran i y otros. Las sondas de oligonucleotido pueden contener una unidad formadora de polímero, corno se describe en La Patente de los E.U.A. No. 4,868,104 para Kurn y otros, y puede separarse del mismo el emparedado de acido nucleico híbrido mediante polimerización. La sonda de señal puede ser lineal o ramificada, como se describe en M.S. Urdea, Climcal Chern. 39, 725-726 (1993). Puede emplearse un pol a nucí eot ido mediador que se une a la sonda de captura de olí gonucleot do para ?n polmucleotido inmovilizado, según se describe en la Patente de Los E.U.A. No. 4,751,177 para Stabinsky. La sonda de oligonucleotido puede estar unida a un miembro de un par de unión especifico (por ejemplo, b otma), y el ernpar-edado de ácido nucleico híbrido puede separarse de la muestra de prueba por medio de una segunda interacción de unión con el otro miembro del par de unión, q?e está inmovilizado sobr-e un sopor-te sólido (por ejemplo, avidma), como se describe en R. Goodson, Solicitud EPO 0 238 332: U. Harpson, Solicitud EPO 0 139 489, y N, Dattagupta, Solicitud EPO 0 192 168. Las sondas de oligonucleótido, la metodología de hibridación, los agentes de oxidación y los métodos de reacción de oxidación-reducción, la detección de reacciones de oxidación- reducción, y el aparato que se utiliza para llevar a cabo estos métodos, se dan como en las secciones A-K anteriores.

M. Detección de la base preseleccionada en presencia de la señal de guanina de fondo La presencia de una base preseleccionada en una sonda de oligonucleotido puede detectarse incluso en presencia de una señal de fondo producida a partir de la oxidación de la guanina. Debido a que la detección de los no apareamientos depende de la capacidad para detectar una base preseleccionada en la sonda de oligonucleotido en presencia de las cuatro bases nativas (A, T/U, C y G), por lo tanto, la base preseleccionada debe ser capaz de ser oxidada rnas rápidamente que las otras cuatro bases. La presente invención provee una sonda de oligonucleótido util par-a la detección electroquímica de una base preseleccionada en presencia de la señal de guanina de fondo. La sonda de oligonucleotido puede consistir de cualquier sonda de oligonucleótido corno se da en la sección B anterior, en donde por lo menos una base de purina en la sonda de oligonucleóti do es un s?bstit?yente de purina de la formula I: La sonda de oligonucleotido puede contener tantas bases de la formula anterior corno se desee (por- ejemplo, 1, 2 o 3, hasta 5, 10, 15 o mas), dependiendo del complemento de umon deseado de la misma. Ejemplos específicos de dichas sondas de oligonucleotido, y nucleotidos útiles para la preparación de las mismas, son los compuestos de la formula II: en donde: Ri es HO-P(O) (0H)-0- , un nucleótido, o un oligonucleotido; R2 es -H, un nucleótido o un oligonucleotido; R3 es -H,-0H, halógeno (por ejemplo, flúor, cloro), alcoxi (por ejernplo, alcoxi de C1-C4, tal corno metoxi o etoxi), arnino, o azido; y R* es -0- o -CH2~. Las sondas de oligon?cleótido descritas en relación a las formulas I y II anteriores se hacen de conformidad con técnicas conocidas, modificadas a la luz de loe ejemplos que se describen a continuación, como sera fácilmente evidente para los exper-tos en la técnica. En una modalidad preferida del compuesto de la fórmula TI, Ri es HO-P(O) (OH)-O-. En otra modalidad preferida del compuesto de la formula T, R es -H. Cuando Ri es un nucleotido o un oligon?cleot ido, la ligadura fosfodiester es par-a el extremo 3' terminal. Cuando R2 es un nucleótido u oligonucleotido, La Ligadura fosfodiester es para el extremo 5' terminal . Los compuestos de la formula I se incluyen de manera ventajosa corno una base en una sonda de oligonucleotido que puede utilizarse en los métodos de la presente invención, corno se describió en las secciones A-M anteriores. La sonda de oligonucleotido puede incluir, de hecho, bases múltiples, pero debe incluir por lo menos una base de la formula T cuando la sonda de oligonucleótido va a utilizarse para la detección de una base preseleccionada en presencia de la guanina de fondo. La sonda de oligonucleotido puede ser de 5, 10, 50 o hasta 100 pares de bases de longitud. Un ejemplo particular de un compuesto de la fórmula II es 6-mercaptoguanos?na 5'-rnonofosfato (6-S-GMP).

N. Estructuras de electrodo Un electrodo util para la detección electroquímica de una base preseleccionada en un acido nucleico de conformidad con los métodos descritos anteriormente comprende: (a) un substrato conductor que tiene ?na superficie activa formada sobre el rnierno; y (b) una capa de polímero conectada a la superficie activa. La capa de polímero es una que se une al acido nucleico (por ejemplo, mediante interacción hidrofóbica o cualquier otra técnica de unión adecuada), y s porosa al complejo de metal de transición (es decir, el complejo de metal de transición puede rnigrar hacia el acido nucleico ligado al polímero). El substrato conductor puede ser un substrato met lico o un «substrato no metálico, incluyendo substratos serna conductores (por ejemplo, oro, carbón vitreo, oxido de estaño impuri icado con indio, etc.). Cl substrato conductor-puede tornar cualquier for-rna física, tal corno una sonda alargada que tiene una superficie activa formada sobre un extro o de la misma, o una lamina delgada que tiene la superficie activa formada sobre un lado de la misma. La capa de polímero puede conectarse n la superficie activa mediante cualquier medio adecuado, tal como mediante sujeción de La capa de polímero a La superficie activa, evaporación de una solución del polímero sobre el electrodo, o electropol irnepzacion. Polímeros ejemplares incluyen, pero no est n limitados por-, nylon, t rocelulosa, poliestireno y poli ( milp ridina ) . El espesor-de la capa de polímero no es critico, pero puede ser de 100 Angstroms (fl) hasta 1, 10 o incluso 100 mieras. El electrodo puede utilizarse en esencialmente todos los métodos descritos en las secciones A-M anteriores. Asi, en general, la presente invención provee un método para detectar un ácido nucleico, dicho acido nucleico conteniendo por lo menos una base preseleccionada, el método comprendiendo: (a) poner en contacto una muestra que contiene dicho acido nucleico con un electrodo, el electrodo comprendiendo un substrato conductor que tiene una superficie activa formada a partir del mismo y una capa de polímero corno se describió anteriormente en relación a la superficie activa; (b) hacer reaccionar el acido nucleico con un complejo de metal de t ansición capaz de oxidar La base preseleccionada en una reacción de oxidación- educción; (c) detectar dicha reacción de oxidación- reducción midiendo el flujo de corriente a través de dicho electrodo; y (d) determinar la presencia o ausencia del acido nucleico a partir-de la reacción detectada de oxidación- reducción en la base preselecdonada» O. Dispositivos microelectrónicos Una ventaja de las técnicas descritas anteriormente es que pueden llevarse a cabo con un dispositivo rnicroelectromco. Un dispositivo microelectrómco út l para 1 A detección electroquímica de una especie de acido nucleico en los métodos descritos anteriormente, comprende un substrato rnicroelect romeo que tiene primera y segunda superficies opuestas; un electrodo conductor- en la primera superficie; y una sonda de captura de oligonucleótido inmovilizada sobre la primera superficie adyacente al electrodo conductor. La sonda de captura esta separada suficientemente cerca del electrodo adyacente (por ejemplo, de alrededor de 0.1, 1 o 2 µ, hasta aproximadamente 50, 100, 500 o incluso 1000 µ), de rnodo que una reacción de oxidación-reducción que ocurra en esa sonda, o en un acido nucleico objetivo hibpdado con esa sonda, se detecta h l en el electrodo adyacente. En la modalidad preferida mostrada en las figuras 9 y 10, un dispositivo mi croelectromeo 20 tiene una pluralidad de electrodos separados 21 sobre la primera superficie opuesta, y una pluralidad de sondas de captura de oligonucleótido separadas 22 inmovilizadas adyacentes a cada uno de los electrodos separados. Suministrando una pluralidad de sondas de olí go ucleót i do separadas, difiriendo entre sí, cada una con un electrodo asociado, se provee un dispositivo compacto individual que puede detectar varios eventos distintos de hibridaci n. Cada electrodo esta conectado el ctricamente a un contacto adecuado 23, de rnodo que el dispositivo puede conectarse o de otra manera asociarse operativamente con el equipo electrónico necesario para llevar a cabo los pasos de detección y determinación de los métodos descritos en la presente nvención. El acido nucleico puede inmovilizarse selectivamente en el sitio adecuado sobre el substrato microelectromco mediante técnicas conocidas. Véase, por ejemplo, la Patente de E.U.A. No. 5,405,783 por Pirrung y otros. El substrato microelect romeo puede ser un semiconductor (por ejemplo, de silicio), o materiales no semiconductores que pueden procesarse utilizando técnicas rnicroelectromcas convencionalee (por ejemplo, vidrio). El electrodo puede ser rnetal o un material conductor no metálico, tal como silicio policristalmo. El electrodo puede formarse utilizando técnicas convencionales de procesamiento rnicroelectromco, tales co o grabado con acido por- deposición. Varias es ucturas in croelect romeas y técnicas de fabricación adecuadas son bien conocidas por los exper-tos on la técnica. Véase, por ejemplo, S.M. Sze, VLSI Technology (1983); S.K. Ghandhi, VLSI Fabncation Principies (1983). Los siguientes ejemplos se proveen para describir la presente invención, y no deben considerarse corno limitantes de la rnisrna. En estos ejemplos, crn2/s significa centímetros cuadrados por segundo. M significa concentraci n molar, -is-1 significa rnoles por- segundo, eV significa electrovolts, V significa volts, nrn signi ica nanornetros, GMP significa guanosma 5' -monofosfato, e ITO significa electrodo de oxido de indio impurificado con estaño. Se reunieron voltanograrnas cíclicos con un potenciostaf o/galvanostato EG+G Modelo 273A de Ppnceton Applied Research, de conformidad con técnicas conocidas. Los electrodos de trabajo de TTO se fabrican a partir de una lamina de vidrio de sosa-cal revestida con ITO, numero de parte CH-50IN-1514 , disponible a partir de Delta Technologies, Ltd, 13960 North 47th Street , St llwater, Minnesota 55082-1234 E.U.A.. La película de nylon esta disponible como membrana de nylon HYBOND-N+, numero de catalogo RPN 1210B, a partir de Arnersharn Corp, 2636 Clearbrook Drive, Arlington Heights, IL 60005 E.U.A..

EJEMPLO 1 Medición del voltamograma cíclico de Ru(bpy)32+ Los voltamograrnas cíclicos de Ru(b?y)3 +, con y sin ADN de timo de becerro, se muestran en la figura 1, con el incremento catalítico producido por las rotaciones múltiples de la oxidación del ADN por la forma oxidada del complejo de rnetal que se observan durante un barrido electrónico voltarnétpco individual. La voltarnetraa de todo par redox la gado al ADN debe analizarse en t rminos de un esquema cuadrático que relaciona las formas ligadas y no ligadas debido a que el coeficiente de difusión del ADN es mucho menor (es decir, 2.0 x 10-7 crn2/s) que aquel del complejo de rnetal (8.0 x LO-6 cm2/s). Este fenómeno conduce generalmente a corra entes dram ti amente disminuidas para la forrna ligada; sin embargo, a resistencia i nica alta suficiente [Na+] = 0.8 M), la unión del complejo de rnetal es demasiado debal para afectar la respuesta a la corriente. En este caso, la corriente puede analizarse en términos de un mecanismo simple de EC.

R?(b?y)32+ » Ru(bpy)33+ (E) Ru(bpy)33+ + ADN »- R?(bpy)32+ + ADN0? (O EJEMPLO 2 Análisis de voltamogramas cíclicos Se analizaron voltarnogramas cíclicos ajustando las curvas completas de potencial de corriente, restándose el fondo, utilizando el paquete de análisis de datos DTGISIMMR . Los parámetros de entrada fueron E1/2 para el complejo de metal y los coeficientes de difusión para el complejo de rnetal y el ADN, todos los cuales se determinaron orí experimentos separados. Por lo tanto, el único parámetro obtenido a partir del ajuste fue La constante de velocidad de segundo orden para la ecuación 2, k=9.0 x lOSM-is"1. Esta misma constante de velocadad se determino sobre una amplia escala de velocidades de escudriñamiento. La constante de velocidad para la oxidación del ADN por Ru( ?y)33+ se confirmó en dos experimentos separados. Primero, se utilizaron voltamogramas de onda cuadrada para obtener una pseudo kobs de primer orden para la ecuación 2 mediante ajuste con el algoritmo Je C00LMR . El algoritmo de COOLMR utiliza un enfoque de ajuste que es significativamente distinto de DIGISIMMR ; sin embargo, las gráficas de l'ab* contra ADN fueron lineales y dieron una constante de velocidad de segundo orden de k=8.2 x 103 M-is-i, que concuerda con la constante de velocidad obtenida a partir del ajuste de voltamogramas cíclicos con DIGISirfiR . En segundo lugar, se prepararon e hicieron reaccionar muestras autenticas de bl Ru(bpy)33+ con ADN directamente en un flujo bloqueado de escudriñamiento r pido. El análisis global de los espectros dependientes dol tiempo entre 350 y 600 nrn mostró q?e R?(b?y)33+ se convirtió limpiamente en Ru(bpy)3~2 sin ningún intermediario y a una constante de velocidad de 12 x 103 M-is-1.. Asi, la constante de velocidad para La oxidación del ADN por R?(bpy)33+ se estableció f rmemente mediante dos mediciones electroquímicas independientes con protocolos de ajuste dramáticamente distintos y mediante ?na técnica no electroquímica de flujo bloqueado con ajuste de los espectros visibles completos.

EJEMPLO 3 Análisis de voltamogramas cíclicos Si la fuerza directriz para La trans erencia de electrones es significativamente menor que La energía reorganizacional (X), una gráfica del ln 1 de RT contra la fuerza directriz (cuando se corrigen par-a términos útiles asociados con el enfoque de los reactivos) debe dar- una linea recta con una pendiente de 1/2. Las constantes de velocidad para la oxidación del ADN por vanos derivados de Metal (bpy)33+ con potenciales redox distintos, se muestran en el cuadro 1 a continuación. Dado que la teoría de Marcus describe la dependencia de la fuerza directriz de la velocidad de transferencia de eLectrones, Las constantes de velocidad absolutas pueden analizarse en términos de la sa guíente ecuación: K = v expr-ß(r-ro) ]exp[-(^G+ k)2/4 > R? donde v es la constante de velocidad en el límite controlado por difusión (1011 _is-i), r es la dastancia ent re el reactivo y el producto en el complejo activado, ro es la distancia de la aproximación rnas cercana del reactivo y el producto, y ß describe el efecto del medio intermedio. La incorporación del donador- de guanina en el interior- de la doble hélice impone una distancia finita a través de la cual el electrón debe abrirse paso hasta el complejo de rnetal ligado, es decir, r<»ro . Sin embargo, s se utiliza guanosina 5 '-monofosfato (GMP) como donador de electrones, es posible la colisi n da r-ecta de la guanina con el complejo de rnetal (r=ro). Par-a Fe(bpy)33+ GMP, la constante de velocidad medida mediante flujo bloqueado es de 2.6 x 103 -is-i. Los valores conocidos de X para las reacciones relacionadas están en la escala de 1-1.5 eV, que da una para el par guanina*10 de 1.1 ± 0.1 V.

CUADRO 1 Constantes de velocidad para la oxidación de la guanina por Rui bpy>3 en oligómeros de RDN *Las concentraciones de ADN utilizadas para determinar las constantes de velocidad se basaron en los rnoles de nucleótidos de guanina. b Distancia calculada de apertura de paso a través del solvente. Las distancias calculadas de acuerdo con !-*/«,, -expU-ß £>r3 , fueron ß(H2?)=3A~? y ks«=1.8 x J0-5M-iß-?. cDado que las constantes de velocidad son en relación a las concentraciones de guanina, la velocidad observada para el no apareamiento de GG se ha normalizado r-especto a los otros oligomeros que contienen una sola guanina. En la figura 2 están los voltarnogra as cíclicos de Ru(bpy)32+ en presencia de 5' -AAATATAGTATAAAA corno una cadena individual (C) e hibndada con su cadena complementaria (A).

Corno en el caso de GMP, r *=ro para la cadena individual, y la constante de velocidad de 1.8 x 105 n-1,-1 da?.G(guamna+/o ) = 1.1 V y ? = 1.3 eV, q?e est n de acuerdo con los valores de oxidación de GMP. Aun cuando existe un incremento dramático para la cadena individual, se observa solamente un incremento ligero para el dúplex totalmente hibpdado a esta velocidad de escudriñamiento, dando corno resultado una reducción de cuatro veces la corriente después de la hibridación. Se sabe que complejos de rnetal tales corno Ru(b?y)32 ee unen al ADN en la ranura menor, de rnodo q?e la constante de velocidad 150 veces rnás lenta (1.2 x 103 para la oxidación del dúplex debe ser el resultado de la distancia entre el residuo de guanina y el complejo ligado a la superficie. Cuando el complejo de rnetal se acorta en la ranura menor, la guanina y el complejo de metal no pueden entrar en contacto intimo, por lo que el electr n debe abrirse paso a través del solvente que separa el residuo de guanina y el complejo de metal. El desplazamiento a través del agua es mucho menos eficiente que a través de medios no polares, y se calcula que el valor de ß para el agua es de aproximadamente 3 ß_1. La distancia de recorrido puede calcularse, por lo tanto, de acuerdo a: donde r es el cambio en distancia en el dúplex comparativamente a la cadena individual. A partir de este análisis, kr para el dúplex totalmente hibridado es de 1.7 fl. El valor grande de ß para el agua sugiere que cambios importantes en Las constantes de velocidad de la transferencia de electrones serán efectuados por- cambios muy pequeños en la distancia de recorrido, lo cual a su vez reflejaría pequeñas alteraciones en la estructur-a del ADN. También mostrado en la figura 2 está el voltarnograrna de Ru(bpy)32 en presencia del misino dúplex, donde el par de bases GC ha sido reemplazado por ?n no apareamiento GA. La incorporación del no apareamiento GA da corno resultado un incremento de dos veces la corriente general comparativamente con el dúplex autentico, lo cual se traduce en un cambio de 16 veces la constante de velocidad (RGA - 1.9 x 10 M-iß_1). Los datos de velocidad para la cadena individual, el dúplex totalmente hibridado, y los tres no apareamientos GX, se dan en el cuadro 1. Se muestran también las distancias de recorrido calculadas Lr respecto a la cadena individual. Co o es de esperarse, el residuo de guanina en los no apaream entos de G-purina es mas accesible al complejo de rnetal que en el no apareamiento GT, donde las dos bases están todavía unidas por dos ligaduras de hidrogeno en un par-oscilante. Sin embargo, el no apareamiento GT causa aún un cambio de 4 veces la constante de velocidad, que es fácilmente detectable. Por lo tanto, las constantes de velocidad de oxidación siguen la tendencia de G (cadena individual) > GA > GG > GT >GC. La capacidad para distinguir cada uno de estoe no aparearníentoe entre sí, provee la base para la detección de la hibridación sensible al no apareamiento que es sensible incluso a los no apareamientos de pares de baees individuales en el par de bases adyacentes a la base preselecclonada.

EJEMPLO 4 Bases modificadas para evitar la oxidación en la cadena de la sonda: substitución de guanina por inosina Se reunieron voltamogramas cíclicos utilizando un electrodo de trabajo de oxido de indio-estaño (TTO) (área = 0.32 cm2), cont raelect rodo de alambre de Pt y un electrodo de referencia de Ag/AgCl. En la figura 5, una muestra que contiene Ru(bpy)32 a 25 µM y oligonucleotido a 75 µM disueltos en regulador de pH de fosfato de Na a 50 rnM (pH 7) con NaCl a 0.70 M, se escudriño a 25 rnV/s. En la figura 6, una muestra que contiene Ru(bpy)3 + a 50 µM y 0.3 rnM de 5'-GMP o 5'-IMP disueltos en soluciones acuosas reguladas en s? pH y conteniendo NaCl a 700 rnM y regulador de pH de fosfato de Na a 50 mM (pH = 6.8, CNa+ ] = 780 rnM) se escudriño a 2.5 mV/s desde 0.0 V a 1.4 V. Los escudriñamientos de los mononucleotidos en ausencia de R?(bpy)32 no mostraron corriente oxidativa apreciable. Un electrodo de ITO recién limpio se utilizó para cada experimento, y ?n escudriñamiento de fondo de regulador de pH solo se sustrajo de los escudriñamientos subsecuentes. Se determinaron las constantes de velocidad de segundo orden de la oxidación de guanina ajustando los datos voltarnétricos cíclicos a un mecanismo de dos pasos utilizando el paquete de software DIGISIMMR. Todos los parámetros aparte de la velocidad de oxidación se determi aron a partir de voltarnogramas del complejo del rnetal solo en el ismo electrodo. El 5' -GMP se adquirió a partir de Sigma, y el 5'IMP se adquirió a partir de U.S. Biochernical, y ambos se utilizaron sin purificación adicional. Se prepararon ol gonucleotidos en el UNC Department of Pathology, y se hicieron pasar a través de un filtro de corte de peso molecular- 3000 para remover los rnononucleótidos. La pureza se evaluó mediante CLAR de fase inversa. La concentración se determinó a partir de la absorción óptica a 260 nrn, como se describe en Fasman, G.D. CRC Handboo of Biochernist ry and Molecular Biology; CRC Press, Boca Ratón, FL, 1975; Vol.l. El híbrido en la figura 5 se preparó calentando las cadenas complementarias de 90°C durante 5 minutos y enfriando lentamente a 25°C durante 2 horas. Estos datos indican que la guanina puede sustituirse por mosina en la cadena de la sonda para proveer una cadena de sonda inactiva de oxidación- reducción.

EJEMPLO 5 Bases modificadas para evitar la oxidación en la cadena de la sonda: 7-Deaza-Guanina Este ejemplo se lleva a cabo esencialmente en la misma manera como el Ejemplo 4 anterior, excepto q?e se utiliza 7-deaza-guamna como la base modificada como una alternativa para la guanina para proveer una cadena de sonda inactiva de o idación- educción. La 7 - deaza- uaní na se oxida a una velocidad de solo 103 r-l-ig-i, que es dos ordenes de magnitud rnas lenta que la guanina y es suficientemente lenta par-a proveer una cadena de sonda inactiva de oxidaci n-- reducción EJEMPLO 6 Detección utilizando ADN de timo de becerro ligado a la membrana de nylon fija al electrodo de ITO La película de nylon se corta en una forma circular, aproximadamente 6 rnrn de diámetro a fin de ajustarse en la celda electroquímica y cubrir la porción del electrodo de ITO expuesta a la solución. Para los experi entos en los que solo se obtiene el vol arnograrna cíclico del complejo de rnetal, el electrodo de ITO se acondiciona primero con regulador de pH. El disco de nylon (s n ADN) se inserta después en La celda electroquímica y se pipetean en la celda 200 µL de una solución del complejo de metal a 200 µM. Para los experimentos con 0s(bpy)32+ ?n tiempo de equilibrio de 6 minutos se utiliza antes del análisis electroquímico. Para los experimentos con Ru(bpy)3 +, un tiempo de equilibrio de 15 minutos se utiliza antes del análisis electroquímico. Se colectan voltamog ramas cíclicos utilizando un potenciostato PAR 273A a una velocidad de escudriñamiento de 25 rnV/s.

Para Los experimentos de ADN, el disco de nylon empapado con ADN se inserta en la celda electroquímica después de acondicionar el electrodo de ITO en ol regulador de pH adecuado. 200 µL de una soluci n del complejo de rnetal a 200 µM en eL regulador do pH adecuado se pipetean en ia celda, y ?n voi tainograma cíclico se torna despu s del tiempo de equilibrio adecuado (6 minutos para 0s(b?y)3 + y 15 minutos para Ru(bpy)32+ a una velocidad de escudriñamiento de 25 mV/s. Los discos de nylon se empapan durante aproximadamente minutos en una solución de ADN de timo de becerro a 5.8 rnM di suelta en agua. Se investigaron vanos tiempos de inmersión variando de 5 minutos a 18 horas. El ADN se asocia r pidamente (en pocos minutos) con La película de nylon, de modo que se utilizan típicamente tiempos de inmersión breves. Bajo condiciones de bajo contenido de sales, se utiliza un regulador de pH de fosfato de Na a 50 rnM (pH = 6.8,CNa+] = 80 rnM. Bajo condiciones de alto contenido de sales, se utiliza una soluci n de regulador de pH de Na a 50 rnM y NaCl a 700 rnM ( H = 6.8,CNa+] = 700 inM) . El voltamograma cíclico de Ru(bpy)32+ en el electrodo de ITO-nylon se muestra en la figura 11. La linea punteada muestra el voltamograma cuando la membrana de nylon se empapa en el ADN de timo de becerro antes de la fijación al electrodo. Existe una gran comente catalítica par'a la membrana marcada con ADN que se iguala a aquella observada en la solución. El experimento demuestra que Ru(bpy)3 + se difunde libremente en La película de nylon, y que no se requiere la difusión del ADN para reaLizar la corriente catalítica. La figura 11 muestra también que se observa una corriente catalítica mayor a bajas concent aciones de sales, debido a la interacción incrementada ent r-o el mediador y el ADN inmovilizado. La figura 12A muestra el rnisrno experimento utilizando 0s(bpy)32+ co o el mediador. El complejo de osmio no oxida la guanina, de rnodo que cualquier- incremento de corriente ?bser-vado en presencia de la guanina tendría que surgir debido a la preconcent ración del mediador debido a la unión del ADN. De hecho, la corriente para 0s(b?y)32+ eß menor en presencia del ADN en el electrodo de nylon que en ausencia del ADN. El experimento demuestra q?e la corriente incrementada para Ru(b?y)32+ cuando el ADN est ligado al electrodo de nylon se debe únicamente a la reacción catalítica y no a una diferencia de unión trivial. El efecto de la concent ación de sales se muestra en La figura 12B, y se observa que es pequeña comparativamente con el gran efecto que se observa para la reacción catalítica. Uniendo el ADN a la membrana de nylon fija al electrodo de TTO, se ha demostrado que el ADN puede detectarse incluso en la modalidad en donde el ADN no se está difundiendo, pero el mediador sí. Este hallazgo permite detectar- el ADN donde las sondas inmovilizadas están suficientemente cerca del electrodo, de rnodo que los híbridos marcados con sonda residen en la capa de difusión del mediador.

EJEMPLO 7 Detección de ARN ligado a la membrana de nylon fija al electrodo de ITO El experimento se lleva a cabo corno se describe en el Ejemplo 0 , excepto que se utiliza ARNt de Levadura de Bakers (adquirido a partir del Sigrna) en lugar de ADN de timo de becerro. Se empapo un disco de película de nylon en una solución de ARNt corno se describe en el Ejemplo 6. La voltarnetria cíclica en presencia de Ru(bpy)3 + se muestra en la figura L3. Corno en el caso del ADN, se observa corriente catalítica para ambos reguladores de pH con rnas corriente a bajo contenido de sales. La diferencia observada en la corriente entre las altas y bajas concentraciones de sales no es tan dramática corno aquella obser-vada con el ADN en el Fjernplo G, debido a que el ARNt no une cationes así corno también ADN y, por lo tanto, los efectos de las sales son rnenos dramáticos. Los resultados en la figura 13 demuestran que el ARN puede detectarse en una manera idéntica a aquella para el ADN, lo cual ocurre debido q?e tanto el ARN corno el ADN contienen guanina. Por lo tanto, la composición química de la estructura de base de azúcar- fosfato no afecta la corriente catalítica. Con base en esta observación, pueden detectarse ADN y ARN de cadena individual y doble, híbridos de ADN-ARN, así corno también cadenas individuales o dúplex que contienen otras estructuras de base modificadas tales corno PNA's, carbociclos, fosforot loatos, u otras 1 ?gadur-as de ribosa subs ituidos.

EJEMPLO 8 Detección de flRN Para la detección cuantitativa de ARN, una sonda de ADN (o ARN, PNA u otra estructura de base alternativa) se inmoviliza sobre un sopor-te solido. La sonda puede modificarse para ser inerte a oxidación-reducción mediante substitución de Las guaninas por inosina o 7-deaza-guamna en la cadena de La sonda. La sonda inmovili ada se pone en contacto después con ?na solución de ARN objetivo (por ejemplo, del VIH o del virus de la hepatitis C). La superficie solida contiene entonces una sonda inmovilizada inerte a oxidación-reducción con una cadena de ARN. La superficie sólida se pone en contacto después con una soluci n de Ru(bpy)3 +, y se ina de el voltarnograina cíclico del mediador. La corriente catalítica señala el evento de hibr-a dación, y la magnitud de la corriente se utiliza para cuantif car la cadena de ARN ligada con base en el número conocido de guaninas en la cadena. Para la detección de los no apareamientos del ARN, una sonda de ADN (o ARN, PNA u otra alternativa) se inmoviliza a una superficie solida. La base preseleccionada en la cadena de la sonda se oxida rnas fácilmente que las otras bases. La superficie se pone en contacto con una solución de ARN 71 objetivo , y después se pone en contacto con una solución de Ru ( bpy )32 + u otr o medi ador . El grado de hi bri daci ón ( apareami nto perfecto , sin apareamiento o no ap reamiento ) se determina después en la base p'-esel eccionada en l a isma manera corno para el ADN .

EJEMPLO 9 Detección de una secuencia de base preseleccionada Fl método se llevo a cabo corno se describe en el Ejemplo 3. Los voltamogramas cíclicos mostrados en la figura 14 demuestran que La corriente debida a 5'~G es mucho menor- que aquella para 5'-GG que es mucho menor q?e aquella para 5' -GGG. Este incremento notable en la corriente se observa tanto para cadenas individuales corno para dúplex que contienen secuencias de GG y GGG. El incremento en la corriente no se debe simplemente al incremento en el numero de G's ya que, corno se muestra en la figura 15, el incremento en la corriente debido a la adición de G's a la misma cadena es mucho menor que si las G's están entremezcladas. Dado que 5'-G de GGG es mucho más fácil de oxidar que una G individual, es posible seleccionar un mediador (con un potencial de oxidación- reducción menor) que sea capaz de oxidar a GGG pero no a G. En la figura 16 se muestra el voltarnograrna cíclico de Ru( 4,4 ' ~d?rnet?l-b?p?r?d?na)3 + junto con escudriñamientos de repetición en presencia del oligonucleotido de G individual y r* el oli onucleótido de GGG. Co o se muestra, la corriente catalítica se observa únicamente en presencia del oligonucleot do de GGG. Este ejemplo muestra la capacidad par-a afinar el potencial del mediador, a fin de que una secuencia rnás fácilmente oxidada pueda detectarse en presencia de la guanina de fondo. Puede aplicarse la misma estrategia para detectar- una base sintética individual que se deriva para hacer-la rnas fácilmente oxidada que la guanina. El experimento demuestra que es posible disminuir el potencial «Jel mediador y distinguir aun una base o secuencia «ie bases mas fácilmente oxidables.

EJEMPLO 10 Detección de un derivado de guanina preseleccionado en presencia de la guanina nativa de fondo La sal de disodio de 6-mercaptoguanos?na 5'- nonofosfato (6-S-GMP) (6-S- GMP) se prepara mediante fosforilación de 6-rnercaptoguanosina existente en el comercio (a partir de Sigrna). La fosforilación se lleva a cabo utilizando POCI3 de acuerdo al procedimiento de M. Yoshikawa y ot os, Bull. Chern. Soc. Jpn. 42:3505 (1 69). La sal de disodao de 6-S-GMP se purifica mediante CLAR previa a an li is voltametpco. Los voltarnogramas cíe Lieos se Llevan a cabo a resistencia iónica alta corno en ol ejemplo de la ?nos?na-5' -monofosfato. El electrodo de trabajo es un ITO con una membrana de Hybond N+ nylon fija a la superficie para evitar la oxidación directa del 6-S-GMP. El contraelect odo es un alambre de Pt. El electrodo de referencia eß de Ag/AgCl. La velocidad de escudr amiento es de 25 rnV/s. Los resultados del voltarnograrna cíclico se muestran gráficamente en la figura 17, donde La curva A muestra Ru(4,4'- e2- py)32+ sólo con ( 4 , 4 ' - ß2 -bpy = 4 , 4 ' -d?rnet?l-2-2 ' -bipindina). Después de la adición de 5'-GMP, no se observa incremento alguno de la onda de Ru(Me2 bpy )32+ ; ein embargo, la adición de 6-?nerca?tog?anosina 5' -mono fosfato (6-S-GMP) conduce a un incremento de corriente dramático (curva B). La corriente máxima en presencia de 5' -GMP) es idéntica a aquella en la cur-va A. Los datos demuestran que es posible detectar baees de 6-rnercaptoguan?na en presencia de guanina nativa fundamental.

EJEMPLO 11 Detección de hibridación de ADN con la base preseleccionada sobre la cadena objetivo Membranas de nylon (Hybond N+, Arnersham, 480-600 µg/cm ) se cortan en formas circulares, de aproximadamente 6 mrn <le diámetro. Los discos «le nylon se colocan en una solución concentrada de acido pola citida 1 a co (disponible de sigma) en agua y <-e dejan remojar- durante 1 hora. Los discos después son removidos de la solución de acido policitidilico (poliTC]) y colocados sobre Parafilm y se dejan secar-, A medida que los discos se secan, se añade 15 µL de solución de poli [CU adicional a las películas en tres alícuotas de 5 µL. Los discos se dejan secar completamente. Los discos de nylon secos después se lavan con el regulador de pH de bajo contenido de sal (fosfato de Na a 50 rnM, pH=6.8, CNa+ 1 =80 rnM) para remover cuaLqu er poliCC] que no sea fuertemente ligado durante el procedimiento de remoción. Corno un experimento de control, un disco impregnado con poliCC] se coloca a través de un procedimiento de hibridación de imitación en el cual no se expone a ningún acido nucleico adicional, pero se expone a todos Los dernas pasos de hibridación. EL disco se coloca en 400 µL de agua rnili-Q, se calienta a 48°C durante 1 hora y se deja enfriar a temperatura ambiente. El disco se remueve del agua y se lava en un regulador de pH de bajo contenido de sal antes deL análisis electroquímico. Los discos preparados de esta manera representan los escudriñamientos de fondo (A) en las Figuras 18 y 19. Un disco impregnado con poliCC] se coloca en 400 µL de ?n acido polig?amlico (disponible de sigma) en solución de agua, se calienta a 48°C durante 1 hora y se deja enfriar a temperatura ambiente. El disco despu s es removido de lá solución de acido poLi guaní 1 a co (polifGJ) y se lava en un regulatJor de pH con bajo contenido de sal antes del análisis olec roq?imico. El ADN de timo de ternera (disponible de s grna) en agua es desnaturalizado (fundido) calentando a 90°C durante 10 minutos. Un disco impregnado con poliCC] se coloca en la solución de ADN de ti o de ternera desnaturalizado, se calienta a 48°C dur-ante 1 hora y se deja enfriar a temperatura ambiente. El disco es removido de la solución de ADN de timo de ternera y se lava en solución reguladora de pH de ba o contenido de sal antes del análisis electroquímico. Corno un control, un disco de nylon que no ha sido impregnado con poliCC] también es sometido al mis o procedimiento. El enlace y la detección de ADN de tuno de terner-a por absorción en la película de nylon (no por hibridación) se observa en la membrana de control. Fl disco de nylon tr-atado como se describi antes, se inserta en la celda electroquímica, despu s del acondicionamiento del electrodo de ITO con el regulador de pH de bajo contenido de sal. 200 µL de una solución de Ru( bpy Í3 + a 200 µM se aplican con pipeta a la celda y se obtiene un vol arnograrna cíclico después de un tiempo de equilibrio de 15 minutos. La velocidad de escudriñamiento es de 25 inV/seg. El voltamograma cíclico se reporta en la Figura 18. El politC] <ie secuencia de sonda es inmovilizado en una membrana de nylon Hybond N+ y el protocolo «Je hibridación se lleva a cabo en el regulador de pH ("hibridación de imit ci n"). La memb ana se fija al electrodo de trabajo de ITO y se obtiene (A) un vol tamo ra a cíclico de R?(bpy)32+. ?_a membrana se sumerge en una solución de poliTG] y la hibridación se realiza de acuerdo con el mismo protocolo. El voltarnograrna cíclico de Ru(b?y)32+ ee m de «Jespues (B), y se obtiene un gran incremento de corriente debido a la oxidación catalítica del objetivo de poliCG] hl br dado. Corno se muestra en la Figura 19, la pr-ueba es especifica para la secuencia apropiada. La Figura 19 compara la voltarnetria para la membrana poliTC] en donde ol procedimiento de hibridación se lleva a cabo en un regulador de pH (A) o en una solución «ie ADN de timo de ternera de una sola cadena (B). La Figura 19 muestra que si no está presente la secuencia objetivo, no se obtiene incremento de corriente.

EJEMPLO 12 Detección de flDN en electrodos de carbón vitreo modificados con nylon La Figura 20 muestra el voltamograma cíclico (o "CV") de un electrodo de carbón vitreo con un película de nylon f?ja«Ja antes (A) y después (B) «Je la inmovilización de ADN sobre la película de nylon. La membrana de nylon (Zeta-Probe, Bio-Rad, 80-100 µg/cm2) se corto en formas circulares, de aproximadamente 5 mm de diámetro. El disco de nylon tal como está configurado cubre La superficie del electrodo de carbón vitreo y se mantiene en su posici n por inedao de un manguito de plástico. Para Los experimentos en los cuales solo se obtLene el vol tamograma cíclico del complejo metálico, el electrodo de carbón vitreo primario se acondiciono con un regulador de pH de fosfato de Na a 50 rnM con bajo contení do de sal (?H=6.8, CNa+3 =80 rnM). El disco de nylon (sin ADN) se fijo después al electrodo y 400 µL e una solución de Ru(bµy)32+ a 200 µM se aplicaron con pipeta a la celda elect roquírnica. Un tiempo de e«|u?l?br?o de 15 minutos se usó antes del análisis electro«}u m?<"o. Se obtuvieron voltamogramas cíclicos usando un pentios o PAR 273A que usaba una velocidad de escudriñamiento de 25 rnV/s. En un experimento de ADN típico, el electrodo de carbón vitreo primero se acondiciona en el regulador de pH de fosfato de sodio con bajo contenido de sal. Un disco de nylon se remojo durante aproximadamente 5 minutos en una solución de ADN de timo de ternera a 5.8 inM disuelto en agua. El disco después se removió de la solución y se coloco sobre el electrodo de carbón vitreo usando el manguito para sostenerlo en su lugar-. 400 µL del Ru(bpy)3 + a 200 µM se aplicaron con pipeta a la celda electroquímica y después de un equilibrio de 15 minutos se obtuvo un voltarnograma cíclico usando ?n velocidad de escudriñamiento de 25 inV/s. Lo anterior es ilustrativo de la presente invención y no debe considerarse como limitante de la misma. La invención se define mediante las siguientes reivindicaciones con 00 equi alentes de las reivindicaciones que se han de incluir en l misma.

Claims

NOVEDAD DE Lfl INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. - Un rnetodo para detectar hibridación de ADN «|ue compr'ende: a) poner en contacto una muestra «le ADN con una son«1a de oligonucleotido par-a formar- un ADN hibndado; b) hacer roaccionar dicho ADN hi bridado con un complejo de rnetal de transici n capaz de oxidar una Liase preseleceíonada en dicha sonda de oligonucleotulo en una reacción do oxidac on-reduccaon, da cha sonda de oligonucleotido teniendo por- lo rnenos una de dichas bases preseleccionadas; e) detectar- dicha reacción de oxidación-reducción; d) determinar la presencia o ausencia de ADN hibridado a par-t r de dicha reacción de oxidación- educción detectada en la base preseleccionada; y e) identificar la base variada con dicha base preseleccionada o la base pareada con la base adyacente a la base prese Leccaonada. 2.- El método «Je conformidad con La reivindicación 1, caracterizado además porque el paso de determinación comprende ademas los pasos de: i) medir la velocuJad de reacción «Je dicha reacción de oxidación-reducción, n) comparar dicha velocidad de reacción medida con la velocidad de reacción de oxidación-reducción del complejo de rnetal «Je transición con un ADN de una sola cadena; y «Jespues m) determinar si la velocidad de reacción medida es esencialmente la misma que la velocidad de reacción «Je oxidación- reducción del complejo de rnetal de transMion con ADN de una sola cadena. 3.- El m todo de conformidad con la reivindicaci n l, caracterizado ademas porque dicha muestra de ADN es una rnuest ra de ADN de una sola cadena, dicho ADN hibpdado es un dúplex. 4.- El rnetodo de conformidad con La reivindicación i, caracterizado ademas porque dicha sonda de oligonucleotido incluye de alrededor de 4 a aproximadamente 100 bases. 5.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado ademas porque dicha base proselecci?nada es guanina. 6. - El rnetodo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado ademas porque dicha base preseleccionada es aderuna. 7.- El m todo de conformidad con la reivind cación 1, caracterizado ademas porque dicho complejo de metal de transición se selecciona del grupo que consiste de Ru(bpy)32+/ Ru(Me2~t)py)32+ , Ruí e? -phen)32+ , Fe(b?y)32+, Feí 5-Cl-?hen)32+ , 0s(5-Cl-phen)32+ y Re?2(?yU1 + 8.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracter zado ademas porque dicho paso de reacción comprende hacer- reaccionar complejo de rnetal de transición con la muestra de ADN hibridado bajo con«i?c?ones suficientes para efectuar la oxidación selectiva <Je la base preseleccionada. 9.- El rnetodo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado ademas porque comprende el paso de amplificar e hibpdar ADN antes del paso de contacto. S33 LO..- El rnetodo de conformidad con la r i indicación 9, car acteraza«io ademas ?or«jue dicho paso de amplificar La muestra de ADN se lleva a cabo por reacción de cadena de poLirnerasa, amplificación de desplazamiento de cadena, reacción de cadena de ligasa o amplificación basada en secuencia de ácidos nucleicos. 11.- El rnetodo de confopm dad con la reivi dicaci n 2, caracterizado ademas por-que dicho paso de edir la velocidad de reacci n do la reacción de oxidación- reduceion cornpende rnedi r el vol tarnograna cíclico de la leaccion. 12.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado ademas por-que dicho paso de comparación comprende comparar el voltamograma cíclico de la reacción «Jel complejo de metal de transición con la muestra de ADN hibpdada contra el voltamograrna cíclico conocido de la reacción del complejo de rnetal de transición con ADN de una sola cadena. 13.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque dicha sonda de oligonucleot do es inmovilizada sobre una superficie sólida. 14.- El rneto«Jo de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque dicho complejo de rnetal de transición es inmovilizado sobre la superficie solida. 15.- El rnetodo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque dicho paso de identificación comprende además los pasos de: i) medir la velocidad de reacción de dicha reacción de oxidación-reducción detectada, U 11 ) comparar la velocidad de reacción rne«ia<1a de cada una de las cuatro diferentes velocidades de reacci n de oxidación-reducción conocidas del complejo de rnetal de transici n con ?n ADN «jue taone adonina, eitosi a, gunina o t uniría ligadas a 1 A base preseleccionada; lai) determinar cuaL de dichas veloci ades de reacción de ox idacion- educción conocidas es esencialmente la rnasrna que la velocidad de reacción medida. 16.- Un método para detectar- hibridación de ADN que comprende: a) poner en contacto una muest a de ADN con una sonda de oligonucleotido para formar un ADN hibrdado; b) hacer reaccionar dicho ADN ha bridado con un complejo de rnetal de transición capaz de oxidar- una base preseleccionada en dicha sonda de oligonucleotido en una reacción de oxidación-reducción, dicha sonda de ol igonueleotuJo teniendo por lo rnenos una de dichas bases preseleccionadas; c) detectar- dicha reacción de oxidación-reducción; d) medir- la velocidad de reacción de dicha reacción de oxidación-reducción; e) comparar dieha velocidad de reacción medida con La velocidad do reacción de oxidación-reducción del complejo de metal de transición con un ADN de una sola cadena; f) determinar si la velocidad de reacción medida es la misma q?e la velocidad de reacción de oxidación-reducción del complejo de rnetal de transición con ADN de una sola cadena; y g) identificar la base variada con dicha base preseleccionada o la base pareada con la base adyacente a la base preseleccionada. 17.- El rnetodo de conformidad con la reivindicación B5 16, caracteri ado ademas popjue dicha base preselecc onada es guaní na. 10.- Fl método do conformidad con l a reivindicación 16, caracterizado ademas por«??e dicha base prese! eccionada es ado na. 19.- EL método de conformidad con la reivindicaci n 16, caí acter-Lzado ademas porque dicho complejo de rnetal de transición se selecciona del grupo que consiste de Ru(bpy)32+, Ru(Me2-t*py)32+ , RulMe2 - ?hen)32+ , Fe(b?y)32+, Fe( 5-Cl ~phen)32+ , Os(5-Cl-?hen)32+ y Re?2(?yU1 + 20.- El método de conformidad con la reivi dicación 16, caracterizado ademas porque dicho paso de reacción comprende poner en contacto dicho complejo de metal de transici n con la rnuest ra de ADN bajo condiciones suficientes ?ar-a efectuar la oxidación selectiva de dicha base pres leccionada. ?!.- Fl método de conformidad con la reivi dicaci n 16, caracterizado ademas porque comprende el paso de amplificar dicho ADN antes del paso de reacción. 22.- El rnetodo de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado ademas porque dicho paso de amplificación del ADN hi bridado se lleva a cabo por reacción de ca«Jer?a de pol rnerasa, amplificación de desplazamiento de cadena, reacción de cadena de ligasa o ampli icación de secuencias de bases de ácido nucleico. 23.- El rnetodo de conformidad con la reivindicación L6, caracterizado ademas porque dicho paso de medición comprende medir el voltamograma cíclico de dicha reacción. 24.- Fl método de conformidad eon la reivindicaci n 16, caracteri ado ademas porque dicho paso de comparación comprende comparar el vol tamogra a cíclico de la reacción del complejo de rnetal de transición con La muestra «le ADN hibridada contra el voltamograma cíclico conocido de La reacción del complejo de metal de transición con ADN de una sola cadena. 25.- El rnetodo de conformidad con la reivindicaci n 16, caracterizado además por'que dicha sonda de oligonucleotido es inmovilizada sobre una superficie solida. 26.- El rnetodo de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado ademas porque dicho complejo de metal de transición es inmovilizado sobre la superficie solida. 27.- El método de conformidad con la reivindicaci n 16, caracterizado ademas porque dicho paso (g) de identificación de base comprende i) comparar- la velocidad de reacción medida de cada una de las cuatro diferentes velocidades de reacción de ox dación- reducción conocidas del complejo de metal de transición con un ADN que tiene adenina, citosina, guanina o timina ligadas a la base preseleccionada; li) determinar cuál de dichas velocidades de reacción de oxidación- reducción conocidas es esencialmente la misma que la velocidad de reacción medida. 28.- Un aparato para detectar hibridación de ADN q?e comprende: a) una pluralidad de contenedores de muestra de ADN; b) medios de manejo de muestra para portar- dicha pluralidad de contene«lor es do muestra de ADN; c) medios de surtido de sonda de oligonucleotido par-a surtir dicha sonda de oligonucleotido a cada uno de los contenedores de muestra de ADN; d) medios de surtido <Je complejo de metal de transición par-a surtir dicho complejo de metal de transición a cada uno de una pluralidad de contenedores de muestra de ADN; e) un detector «Je reacción de oxidación-reducción par-a detectar una reacción de oxidacion-reduccion; y f) medios para medir la velocidad de reacción de oxidación-reducción de dicha reacción de oxidación-reducción detectada. 29.- Fl apar-ato de conformidad con la reivindicación 28, car-acten zado ademas porque dicho detector de reacción de oxidación- reducción comprende un electrodo. 30.- El apar-ato de conformidad con la reivindicación 28, carácter-izado además porque dichos medios de surtidos de sonda de ol onucleót i do comprende una superficie solida que tiene una sonda de ol i go ucleótido inmovilizada sobre los mi mos. 31.- Un aparato para detectar hibridación de ADN q?e comprende: a) un contenedor de muestra de ADN; b) medios de surtidos «Je sonda de ol ?gon?cleot?«Jo para surtir una pluralidad de sonda de oligonucleótido a dicho contenedor de muestra de ADN; c) medios «Je surtido de complejo de rnetal «Je transición para surtir dicho complejo de metal «Je transici n al contenedor de muestra de ADN; y d) un detector de reacción de oxidación- 00 reducción para detectar una reacción de o idación- reducción; y o) medio--- para medi - la velocidad de reacci n de ox dacion-reduccion de dicha reacción de oxi ae i on-reduecion detectada. 32.- El aparato de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado ademas porque dicho detector de reacción «Je ox niacion- reducción comprende un electrodo. 33.- El aparato de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado ademas por-que dichos medios de surtido de sonda de oligon?cleo ido comprenden una superficie sólida que tiene una pluralidad de sondas de ol igonucleotidos inmovilizadas sobre los mismos, en donde cada una de las sondas de oligonucleotidos es diferente de otra. 34.- El aparato de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado ademas porque dichos medios de surtido de complejo de rnetal de transición comprende una superficie solida «jue tiene una pluralidad de sondas de ol gonucleótidos y dicho complejo de metal de transición inmovilizado sobre Los rnisrnos. 35.- Un rnetodo de secuenc acion de ADN que comprende: a) poner en contacto una muestra de ADN con una sonda de oligonucleotido para formar- un ADN hibpdado, dicha sonda de oli onucleótido incluyendo una base preseleccionada que tiene una velocidad de oxidación única; b) hacer reaccionar dicho ADN hibridado con ?n complejo de metal de transición capaz de oxidar la base preseleccionada de dicha sonda de ol gon?cleótido en una reacción de oxi dación- reducción, dicha sonda de oligonucleótido teniendo un número predetermina«Jo de bases µreseleccionadas; c) detectar dicha reacción de oxidación- reducei J?; d) medir La velocidad de reacci n de dicha reacción «Je oxidación-reducción detectada; y e) identificar- la base pareada con la base prese leccionada. 36.- Fl rnetodo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado ademas porque dicho paso de identificación comprende: i) comparar la velocidad de reacción medida de cada una de las cuatro diferentes velocidades de reacción de oxidación- reducción conocidas del complejo de metal de transición con un ADN que tiene adeni a, ci tosí na, guanina o ti mina ligadas a La base preseleccionada; n) determinar cuál de dichas velocidades de reacción de oxidación- reducción conocidas es esencialmente la misma que la velocidad de reacci n medida. 37.- El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado ademas porque dicha sonda de oligon?cleotido incluye ademas una segunda base preseleccionada que tiene una velocidad de oxidación única, en donde la velocidad de oxidación de dicha segunda base preseleccionada es diferente de la velocidad de oxidación de la base preseleccionada. 38.- El rnetodo de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque dicho paso de detección comprende además detectar la reacción de oxidación-reducción del complejo de metal de transición con dicha segunda base preseleccionada; en don«Je el paso de medición comprende ademas medir la velocidad de reacción de dicha reacción de oxidación-reducci n «jetectada del complejo de rnetal de transición con la segunda base presel cc íonada y en donde dicho paso de identificación comprende ademas identificar- ia base pareada con la segunda base prese! eccionada. 39.- El rnetoiJo de conformidad eon la reivindicación 35, caracterizado ademas porque comprende repetir los pasos a) a e) con un numero suficiente de sondas de ol igonucleótidos que tienen dicha base preseleccionada en diferentes sitios para identificar cada base en dicha muestra de ADN. 40.- Un rnetodo para detectar hibridación de ARN «jue comprende: a) poner en contacto una muestra de ARN con una sonda de oligonucleótido para formar un ARN hibpdizado; b) hacer- reaccionar dicho ARN hibpdizado con un complejo de metal «Je transición capaz de oxidar una base preseleccionada en dicha sonda de oligonueleót ?Jo en una reacción de oxidación-reducción, dicha sonda de oligonucleotido teniendo por lo menos una de dichas bases preseleccionadas; c) detectar dicha reacción de oxidación-reducción; d) determinar la presencia o aueencia de ARN hibndizado a partir de dicha reacción de oxidación-reducción detectada en la baee preseleccionada; y e) identi icar la base variada con dicha base preseleccionada o la base pareada con la base adyacente a la base preseleccionada. 41.- El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado además porque el paso de determinación comprende ademas los pasos de: i) medir la velocidad de reacción de dicha reacción de oxidación-reducción, n) comparar dicha veLocidad de reacci n medida eon la velocidad de reacción de oxidación- reducción del complejo de metal de transición con un ARN de una sola cadena; y después m) determinar si la velocidad «Je reacción medida es esencialmente la misma que la velocidad de reacción de oxidación- educe ion del complejo de metal de transición con ARN de una sola cadena. 42.- El método de conformidad con ia reivindicación 40, caracterizado ademas porque dicha muestr-a de ARN es una muestra de ARN de una sola cadena, dicho ARN hibpdado es un dúplex. 43.- El rneto«Jo de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado ademas por-que dicha sonda de oligonucleótido incluye de alrededor de 4 a aproximadamente 100 bases. 44.- El netodo de conformidad con la reivindicación 40, carácterLzado ademas porque dicha base preseleccionada es guanina. 45.- El rnetodo de conformidad con la reivi dicación 40, caracterizado ademas porque dicha base preseleccionada es ademna. 46.- El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado ademas porque dicho complejo de metal de transición se selecciona del grupo que consiste de Ru(bpy)3 + R?(Me2-bpy)32+ , Ru(Mß2 - ?hen)32+ , Fe(bpy)32+, Fe(5-Cl-phen)32+ , 0s(5-Cl-?hen)32+ y Re?2Í?y)/i1 + 47.- El rnetodo de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado además porque dicho paso de reacción comprende hacer reaccionar complejo de rnetal de transición con la rnuest ra de ARN liibridado bajo condiciones suficientes para efectuar la oxidación selectiva de la base preseleccionada. 48.- El método de conformnlad con l a rei indicación 40, caracterizado ademas porque comprende el paso de amplificar e hibpdar ARN antes del paso de contacto. 49.- El método de conformidad con la reivindicac ón 48, caracterizado ademas por-que dicho paso de amplificar dicha muestra de ARN se lleva a cabo por medio de la reacción de cadena de polimerizaci n de transcppt asa inversa. 50.- El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado además porque dicho paso de rnedir la velocidad de reacción de la reacdon de oxi dacion-reduccion comprende medir- el voltarnograma cíclico de la reacción. 51.- El rnetodo de conformidad con la reiv ndicación 41, caracterizado ademas porque dicho paso de comparación comprende comparar el voltamograma cíclico de la reacción del complejo de metal de transición con la muestra de ARN hibpdada contra el voltarnograrna cíclico conocido «Je la reacción del complejo de metal de transición con ARN de una sola cadena. 52.- El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado además porque dicha sonda de olí gonucleotido es inmovilizada sobre una superficie solida. 53.- El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado ademas porque dicho complejo de metal de transición es inmovilizado sobre la superficie solida. 5 .. El método de conformidad con la reivi ndicaci?n 40, caracterizado ademas porcjue dicho paso de iden ificación comprende ademas los pasos de: i) medir la velocidad de reacción de dicha reacción de oxi dacion-red?ccion detectada, ii ) comparar la velocidad de reacción medida de cada una de las cuatro diferentes velocidades de reacción de oxidacion-reduecion conocidas del complejo de metal de transici n con un ARN que tiene adenina, citosina, guanina o tirnina ligadas a la base preseleccionada; m) determinar cual de dichas velocidades de reacción de oxidación-reducción conocidas es esencialmente la misma que la velocidad de reacción medida. 55.- Un meto«lo para detectar hibridación de ARN que comprende: a) poner- en contacto una muestra de ARN con una sonda de oligon?cleotido para formar un ARN hibpdado; b) hacer reaccionar dicho ARN hibridado con un complejo de rnetal de transición capaz de oxidar ?na base preseleccionada en «Jicha sonda de oligon?cleótido en una reacción de oxidac on-reduccion, dicha sonda de oligon?cleotido teniendo por- lo menos una de dichas bases preseleccionadas; c) detectar dicha reacción de oxidación- reducción; d) medir la velocidad de reacción de dicha reacción de oxidación- reducción; e) comparar dicha velocidad de reacción medida con la velocidad de reacción de oxidación- reducción de complejo de rnetal de transición con un ARN de una sola cadena; y después f) determinar si la velocidad de reacción medí «Ja es la misma que la velocidad de reacci n de oxidación-reducción del complejo de metal de 9« transici n con ARN de una sola cadena; y g) identificar la base variada con dicha base preseieccionada o la base paireada con la base adyacente a la base preseleccionada. 56.- El método de conformidad con la r ivindicación 55, caraet erizado ademas por-que dicha base preseleccionada es guanina. 57.- El método de conforma dad con la reivindicación 55, caracterizado ademas porque dicha base preseleccionada es a eni na. 58.- El método de conformidad con la re vindicación 55, caracterizado ademas porque dicho complejo de rnetal de transici n se selecciona del grupo que consiste de R?(b?y)32+, Ru(Me2-bpy)32+ , R?(Mß2-phen)32+ , Feíbpy )32+ , Fe(5-Cl-phen)32+ , 0s(5-01-phen)32+ y Re?2 ( py 1 + 59..- El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado ademas porque dicho paso de reacción comprende poner en contacto dicho complejo de rnetal de transición con la muestra de ARN bajo condiciones suficientes para efectuar- la oxidación selectiva de dicha base prese! eccionada. 60.- El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado ademas porque comprende el paso de amplificar dicho ARN antes del paso de reacción. 61.- El método de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado ademas porque dicho paso de amplificación del ARN hibridado se lleva a cabo por reacción de cadena «Je polimerasa, amplificación de desplazamiento «Je cadena, reacci n de cadena de ligasa o amplif cación de secuencias de bases de acido nucleico. 62.- El método de conformidad con la reiv ndicación 55, carac erizado ademas por-que dicho paso de medición comprende medir el volt rnograrna cíclico de dicha reacción. 63.- El rnetodo de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado ademas porque dicho paso de comparación comprende comparar el voltamograma cíclico de la reacción del complejo de metal de transición con la muestra de ARN hibridada contra el vol tamograma cíclico conocido de la reacción del complejo de rnetal de transici n con ARN «Je una sola cadena. 64.- El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado además porque dicha sonda de oligonucleotido es inmovilizada sobro una superficie solida. 65.- El método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado ademas porque dicho complejo de rnetal de transición es movilizado sobre la superficie solida. 66.- El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado ademas porque dicho paso «Je identificación comprende ademas los pasos de: i ) comparar la velocidad de reacción medida de cada una de las 4 diferentes velocidades de reacción de oxidación-reducción conocidas del complejo de metal «le transición con un ARN que tiene adenina, citosma, guanina o tirnina ligadas a la base preseleccionada; n) determinar cual de dichas velocuJades «Je reacción «Je oxnJación-reduccion conocidas es esencialmente la isma que la velocidad de reacci n medida. 67.- Un método de secuenciacion de ARN que comprende: a) poner en contacto una muestra de ARN con una sonda de oligonucleotido para formar un ARN hibridado, dicha sonda de ol gonucleotido incluyendo una base preseieccionada que tiene una velocidad de oxidación única; b) hacer reaccionar- dicho ARN hibpdado con un complejo de rnetal «Je transición capaz de oxidar la base preseleccionada de dicha sonda de oligonucleotKjo en una reacción de oxidación-reducción, dicha sonda «Je oligonucleótido teniendo ?n numero pred terrm ado de bases preseleccionadas; c) detectar dicha reacción de oxidación- reducción; d) rnedir la velocidad de reacción de dicha reacción de oxidación- reducción detectada; y e) identificar la base pareada con la base prese! eccionada. 68.- El método de conforrn?da«J con la reivindicación 67, caracterizado ademas porque dicho paso de identificación comprende ademas los pasos de: i) comparar la velocidad de reacción medida de cada una de las cuatro diferentes velocidades de reacción de oxidación-reducción conocidas del complejo <Je metal de transición con un ARN que tiene ademna, citosma, guanina o tirnina ligadas a la base preseleccionada; n ) determinar cual de dichas velocidades de reacción de oxidación- reducción conocidas es esencialmente la misma que la velocidad de reacción rned?«Ja. 69.- El método de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado además porciue dicha sonda de oligonucleot do incluye ademas una segunda base preseleccionada que tiene una velocidad de oxidación única, en donde la velocidad de oxidación de dicha segunda base ?reselecc?ona«Ja es diferente de la veloc da«J de oxidación de la base preseleccionada. 70.- El método de conformidad con la reivmdi cacion 69, caracterizado ademas por-que dicho paso de detección comprende ademas detectar la reacción de ox idacion- reducción del complejo de metal de transición con dicha segunda base preseleccionada; en donde el paso de medición comprende adernas medir la velocidad de reacción de dicha reacción de oxidación-reducción detectada del complejo de rnetal de transición con la segunda base preseleccionada y en donde dicho paso de identificación comprende además identificar la base pareada con la segunda base preseleccionada. 71.- El rnetodo de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado ademas porque comprende repetir los pasos a) a e) con ?n número suficiente de sondas de ol igonucleótidos que tienen dicha base preseleccionada en diferentes sitios para identificar cada base en dicha muestra de ARN. 72.- Un método para detectar acido nucleico, dicho ácido nucleico conteniendo por lo menos una base preseleccionada, dicho rnetodo comprendiendo: a) poner en contacto dicho ácido nucleico con un ácido nucleico complementario para formar- un ácido nucleico hibndado; b) hacer reaccionar dicho ácido nucleico con un complejo de rnetal 90 de transición capaz de oxidar dicha L>ase preseleccionada en ?na reacción de oxidación- reducción; c) detectar- dicha reacción de oxidación-reducción; y d) determinar la presencia o ausencia de dicho acido nucleico de l a reacción de oxidación-reducción detectada en la base preseleecionada ; y e) identificar la baso pareada con la base preseleccionada o la base pareada con la base adyacente a Ja base preseleccionada. 73.- El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado ademas porque dicho paso de determi aci n comprende además los pasos de: i) medir- la velocidad «Je reacci n de dicha reacción de oxi dación- reducción, n) cornparar «Jicha velocidad de reacción medida con la velocidad de reacci n «Je oxidación-reducción del complejo de rnetal de transición con un acido nucleico de una sola cadena; y después m) deterrninar si la velocidad de reacción medida es esencialmente la misma q?e la velocidad de reacción de oxidación- reducción del complejo de metal de transición con acido nucleico de una sola cadena. 74.- El rnetodo de conformidad con la reivindicac ón 73, caracterizado además porque dicho paso de medición de la velocidad de reacción de la reacción de oxidación- reducción comprende medir' el voltarnograma cíclico de la reacción. 75.- El método de conformidad con la reivindicación 73, caracterizado además porque el paso «Je comparación comprende comparar el voltarnograma cíclico de la reacción del complejo de rnetal de transición con la muestra «Je ácido nucleico hibpdada contr-a el voltarnograma cíclico conocido de la reacción del complejo de metal de transición con ae?«Jo nucleico do una sola cadena. 76 „ - Ei rnetodo de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado además poniue dicho paso de identificación cornpren«Je los pasos de: (i) rnedir la velocidad de reacción «Je dicha reacción de oxidación-reducción detectada, (n) cornparar dicha velocidad de reacción medida con cada una de ias cinco diferentes velocidades de reacción de oxidación- reducción conocidas del complejo de metal de transición con un acido nucleico que tiene ademna, citocina, guanina, tunina o uracilo unidos a dicha base preseleecionada; y (m) determinar cual de dichas velocidad de reacción de oxidación-reducción conocida es esencialmente la misma que la velocidad de reacción medida. 77.- El rnetodo de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado ademas porque dicho ácido nucleico incluye de alrededor de 4 a aproximadamente 100 bases. 78.- El rnetodo de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado ademas porque dicha base preseleccionada se selecciona del grupo que consiste «Je guanina y ademna. 79.- El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado además porque dicho complejo de rnetal de transición se selecciona del grupo que consiste de Ru(bpy)32+, Ru(M?2-bpy)32+ , Ru(Me2-?hen)32+ , Fe(bpy)32+, Fe(5-Cl-?hen)32+ , 0s(5-Cl-phen)32+ y Re?2(?y 1+. 80.- Un rnetodo «Je conformidad con la reivindicación ino 72, caract rizado ademas porque dicho acido nucleico es ADN. 01.- un método de conformidad con La reivindicaci n 72, carac rizado ademas porque dicho «ci o nucleico os ARN. 82.- El método de conformidad con la eivindicación 72, caracterizado ademas ?or«|ue dicho paso de reacción comprende hacer reaccionar el complejo de metal de transición con el acido nucleico bajo condiciones suficientes para efectuar la oxniación selectiva de la base preselecc lonada. 83.- El método «Je conformidad con la reivindicación 72, caracterizado ademas porque comprende el paso do arnplificar ei acido nucleico antes del paso de reacción. 84.- El rnetodo de conformidad eon la reivi ndi cacion 83, caracterizado ademas porque dicho paso de arnplLficar el acido nucleico se lleva a cabo por reacción de cadena de polirnerasa, ampli icación de «Jesplazamiento de cadena, reacción de cadena «Je ligasa o ampli icación basada en secuencia de ácidos nucleicos.. 85.- El método de conformidad con la reivi dicac on 72, caracterizado ademas porque dicho acido nucleico es ?nrnov?l?za«Jo sobre una superficie solida. 86.- El método de conformidad con la reivindicación 85, caracterizado además porque dicho complejo de rnetal de transición es inmovilizado sobre la superficie sólida. 87.- Un método para detectar la presencia o ausencia «Je ?n acido nucleico objetivo en una muestra de prueba que se sospecha que contiene el rnisrno, en donde dicho acido nucleico objetivo contiene por- lo menos una base ?reselece?ona«la, dicho rnetodo comprendiendo: (a) poner en contacto dicha muestra de prueba con una sonda de oligon?cleotido que se uno específicamente al acido nucleico objetivo para formar un ácido nucleico hibridado; en donde dicho aculo nucleico objetivo eont ißne por lo rnenos diez o rnás de dicha base preseleccionada que la sonda «je oligonucleotido; (b) poner en contacto dicho acido nucleico hibridado con un complejo de metal de transición que oxida la base preseleccionada en una reacción de oxidacion-reducción; (c) detectar la presencia o ausencia de dicha reacci n de oxidación-reducción asociada con el acido nucleico hi bridado; y (d) determinar la presencia o ausencia de dicho acido nucleico objetivo en la muestra de prueba a partir- de dicha reacción de oxi dación- reducción detectada en la base presol accionada. 88.- Un método de conformidad eon la reivindicación 87 u 89, caracterizado ademas porque comprende el paso de: separar la muestra de prueba del acido nucleico h?t>pdado antes del paso de detección. 89.- Un rnetodo para detectar la presencia o ausencia de un acido nucleico objetivo en una muestra de prueba que se sospecha que contiene el mismo, en donde dicho acido nucleico objetivo contiene por lo rnenos ?na base preeeleccionada, dicho rnetodo cornprendiemJo: (a) poner en contacto la muestra de pr-ueba con una sonda de oligonucleótido que se une específicamente al ácido nucleico objetivo para formar un ácido 10? nucLeico hibpdado; en donde dicha sonda de ol ígonucleotido es libr-e de dicha base preseJeccionada; (b) ponei en contacto dicho acido nucleico hibpdado con un compiejo de metal de transición «j?e oxida la base preseleccionada en una reacción de oxidación- reducción; fc) detectar La presencia o ausencia de dicha reacción de oxidación- educción asoc a«Ja con dicho acido nucleico hibpdado; y (d) determinar la presencia o ausencia do dicho acido nucleico objetivo en la muestra e prueba a partir de la reacción de ox i daci n -reducción «Jeteetada on la base preseleccionada. 90.- Un método de conforrn?«Jad con la reivindicación 87 u 89, caracterizado ademas porque dicho ácido nucleico objetivo es mas largo que la sonda de olí gonucleotido y porque por- lo rnenos una de la base preseleccionada no es hibpdada a la sonda de oligon?cleotido en dicho acido nucleico hi ridado. 91.- Un método de conformidad con la reivindicación 87 u 89, caracter?za«lo ademas porque dicho paso de determinación es un paso cuantitativamente determinante. 92.- Un método de conformidad con la reivindicación 87 u 89, carácter-izado ademas popjue dicho paso de determinación comprende ademas los pasos de: (i) medir la velocidad de reacción de dicha reacción de oxidación-reducción detectada, (ii) comparar la velocidad de reacción medida con la velocidad de reacción «Je oxidación-reducción del complejo de metal de transición con un acido nucleico objetivo de ?na sola cadena; y después (in) determinar si la velocidad de reacción medida es esencialmente la misma que la velocidad de reacción de oxidaci n- 1 -educe ion del complejo de metal de ransición con acido nucleico objetivo de una sola cadena. 93.- El rnetodo de conformidad con l a reivindicación 92, caracteri ado adernas porque el paso de medición de la velocidad de reacción de la reacción de oxidación- r educción comprende rneiJ r el vol amograma cíclico de la reacción. 94.- Fl rnetodo de conformidad con la reivindicación 9?, caracterizado a«Jernas porque el paso de comparaci n comprende comparar el voltarnograma cíclico do la reacción del comp Lejo de rnetal de transición con la muestra de ácido nucleico objetivo hibridada contra el voltamograma cíclico conocido de la reacción del complejo de etal de transición con ácido nucleico objetivo de una sola cadena. 95.- Un método de conformidad con la reivindicación 87 u 89, caracterizado ademas porque dicho acido nucleico objetivo incluye de alrededor de 4 a aproximadamente 100 bases. 96.- Un método de conformidad con la reivindicación 87 ? 89, caracterizado a«Jernás porque dicha base preeeleccionada se selecciona del grupo que consiste de guanina y adenina. 97.- Un método de conformidad con la reivindicación 87 u 89, caracterizado además porque dicho complejo de rnetal de transici n se selecciona del grupo que consiste de Ru(b?y)32+, Ru(Me2-t"py)32+ Ru(Mß2 -?hen)32+ , Fe(b?y)32+, Fe(5-Cl-?hen)32+ , ?s(5-Cl-phen)32+ y ReCfe (?y)«?+ . 98.- Un método de conformidad con la reivindicación 07 u 89, ca acteri ado ademas porque dicho acido nucleico objetivo ws ADN. 99.- On método de conformidad eon la reivindicación H7 u 89, caracterizado adernas por-que dicho acido nucleico objetivo os ARN. 100.- Un m todo de confoimidud con la i eivi ndicacion 87 u 89, caracteri ado ademas por-que dicho paso de reacción comprende hacer- reaccionar el complejo de etal de transición con dicho acido nucleico objetivo bajo condiciones <*|ue arectan la oxidación selectiva de la base presel eccionada. 101.- (In método de conformidad con la rei indicación 87 u 89, carácter-izado ademas porque corn?ren«Je el paso de amplificar- el ácido nucleico objetivo antes del paso de reacción. 102.- Fl rnetoílo de conformidad con la reivindicación 101, caracterizado ademas porque el paso de ampli icaci n de dicha muestra (Je ácido nucleico objetivo se lleva a cabo por reacción de cadena de polirnerasa, ampli icación de desplazamiento de cadena, reacción de cadena de ligasa o amplificación basada en secuencia de ácidos nucleicos. 103.- Un método de conformidad con la reivindicación 87 u 89, caracterizado además porque dicha sonda de oligonucleotido es inmovilizada sobre una superficie sólida. 104.- El método de conformidad con la reivindicación 103, caracterizado ademas porque dicho complejo de rnetal de transición es inmovilizado sobre dicha superficie solida. L05.~ Un método para detectar la presencia o ausencia de un acido nucleico objetivo en una muestra de prueba que se sospecha que contiene el rnisrno, en donde dLcho acido nucleico objetivo contiene por lo rnenos una base preseleccionada, dicho método comprendiendo: (a) poner en contacto dicha muestra de prueba con una sonda de oligon?cleótido que se une específicamente al acido nucleico objetivo para formar- un ácido nucleico hibridado; en donde dicha sonda de oligonucleótido es libre de dicha base preseleccionada; (b) poner en contacto dicho ácido nucleico hibridado con un complejo de rnetal de transición que oxida la base preseleccionada en una reacción de oxidación-reducción; (c) detectar la presencia o ausencia de dicha reacción de oxidación- reducción asociada con el acido nucleico hibpdado; y (d) determinar la presencia o ausencia de dicho acido nucleico objetivo en la muestra de prueba a partir-de dicha reacción de oxidación- reducción detectada en la base preseleccionada; en donde dicha base preseleccionada en el acido nucleico objetivo es guanina; dicho acido nucleico objetivo contiene citoci a y dicha sonda de oligonucleot do contiene una base alterna que se une a la citocma en dicho ácido nucleico hibpdado; y en «Jonde la base alterna se selecciona del grupo que consiste de inosina y 7-deaza-gua a. 106.- El método de conformidad con la reivindicación 105, caracterizado ademas porque el paso de contacto comprende hacer reaccionar el complejo de metal de transición con ácido nucleico bajo condiciones suficientes para efectuar la oxidación selectiva de dicha base preseleccionada sin oxidar la base alt er na. L07.- El método de conformidad con la reivi ndi cacion 105, caracterizado ademas porque el paso de detección comprende ademas los pasos de: (i) medir Ja velocidad de reacción de dicha reacción de oxidación- reducción detectada, (n) compararla velocidad de reacción medida con la velocidad de reacción de oxidación- reducción del complejo de rnetal de transición con un ácido nucleico de una sola cadena; y después (111) «Jeterminar si la velocidad de reacción medida es esencialmente la misma que la velocidad de reacción de oxidación-reducción del complejo de metal de transición con acido nucleico de una sola cadena. 108.- El rnetodo «Je conformidad con la reivindicación 105, caracterizado además porque el paso de rnedir la velocidad de reacción de la reacción de oxidación- reducción comprende medir el voltamograma cíclico de la reacci n. 109.- El método de conformidad con la reivindicación 107, caracterizado ademas porque el paso «Je comparación corn?ren«Je comparar- el volta ograrna cíclico de la reacción del complejo de metal de transición con la muestra de acido nucleico objetivo hibpdada contra el voltarnograma cíclico conocido de la reacción «Jel complejo de metal de transición con ácido nucleico objetivo de una sola cadena. 110.- El método de conformidad con la reivindicación 105, caracterizado ademas porque dicho ácido nucleico objetivo L07 incluye de alrededor de 4 a aproximadamente 100 bases. 111.- El rnetodo de conformidad con la reivindicación 105, caracterizado además porque dicho complejo de metal de transición se selecciona del grupo que consiste de Ru(b?y)3 +, R?(Mß2-bpy)32+ , R?(Me2-?hen)32+ , Fe (bpy )32+ , Fe(5-Cl-?hen)32+ , 0s(5-Cl-?hen)32+ y Re?2(?y)«1+. 112.- Un método de conformidad con la reivindicación 105, caracterizado además porque dicho acido nucleico objetivo es ADN. 113.- Un rnetodo de conformidad con la reivindicación 105, caracterizado ademas porque dicho acido nucleico objetivo es ARN. 114.- El meto«Jo de conformidad con la reivindicación 105, caracterizado ademas porque comprende el paso de amplificar el acido nucleico objetivo antes del paso de reacción. 115.- El método de conformidad con la reivindicación 114, caracterizado además porque el paso de amplificación de dicha muestra de ácido nucleico objetivo se lleva a cabo por reacción de cadena de polimerasa, amplificación de desplazamiento de cadena, reacción de cadena de ligasa o amplificación basada en secuencia de ácidos nucleicos. 116.- El método de conformidad con la reivindicación 105, caracterizado además porque dicha son«Ja de oligonucleótido es inmovilizada sobre una superficie sóli«Ja. 117.- El método «Je conformidad con la reivindicación 116, caracterizado ademas porque dicho complejo «Je rnetal de transici n es inmovilizado sobre dicha superficie sólida. 118»- Un método para detectar- la presencia o ausencia «Je un acido nucleico objetivo en una muestra de prueba que se sospecha que contiene el mismo, dicho método comprendiendo: (a) poner en contacto la muestra de prueba con una sonda de oligonucleotido c|ue específicamente se une al acido nucleico objetivo para formar un acido nucleico hibridado, dicha sonda de oligonucleotido teniendo terminales extremas que son bloqueadas para alargamiento por transferasa terminal; (b) poner en contacto dicho acido nucleico hibpdado a una solución que contiene una base preseleccionada en presencia de transferasa terminal para producir un producto de extensión de dicho ácido nucleico objetivo, con dicho producto de extensión compuesto de la base preseleccionada; (c) poner en contacto dicha sonda de oligonucleot do a un complejo de rnetal de transición que oxida la base preseleccionada en una reacción de oxidación- reducción; (d) detectar la presencia o ausencia de dicha reacción de oxidación-reducción; y (e) determinar la presencia o ausencia de dicho ácido nucleico objetivo en la muestra «Je prueba a partir de dicha reacción de oxidación-reducción detectada en la base preseleccionada. 119.- Un método de conformidad con la reivindicación 118, caracterizado además porque comprende el paso de: separar dicha muestra de prueba del ácido nucleico h?br?«Ja«Jo antes del paso de detección. 120.- Un método para detectar la presencia o ausencia de ?n ácido nucleico objetivo en una muestra de prueba que se sospecha que contiene el mismo, dicho rnetodo comprendiendo: (a) proveer una sonda de captura de olí gon?cleotidos, en donde dicha sonda de captura se une específicamente al ác?lo nucleico objetivo; (b) poner en contacto la muestra de prueba con dicha sonda de captura par-a formar un acido nucleico h?bpda«Jo; (c) poner- en contacto una sonda de señal «Je oligonucleotidos a dicho acido nucleico hibridado, en donde dicha sonda de señal específicamente se une al ácido nucleico objetivo en el rnisrno, y en donde dicha sonda de señal contiene por lo menos una base preseleccionada, para producir un emparedado de acido nucleico hibpdado; (d) p>oner en contacto dicho emparedado de ácido nucleico hibridado con un complejo de metal de transición que oxida la base preseleccionada en una reacción de oxidación-reducción; (e) detectar la presencia o ausencia de dicha reacción de oxi dación-reducción asociada con el emparedado de acido nucleico hibpdado; y (f) determinar la presencia o ausencia de dicho acido nucleico objetivo en la muestra de prueba a partir de la reacción de oxidación-reducción detectada en dicha base preseleccionada. 121.- Un método de conformidad con la reivindicación 120, caracterizado además porque comprende el paso de: separar dicha muestra de prueba del ácido nucleico hibri ado antes del paso de detección. 122.- Un método de conformidad con la reivindicación 121, caracterizado ademas porque el paso de separación se lleva a cabo entre el paso (b) y el paso (c), o entre ei paso (c) y el paso (d) . 123.- Un electrodo util para la detección electroquímica de una Liase preseleccionada en un ácido nucleico, haciendo reaccionar dicho acido nucleico con un complejo de rnetal de transición capaz de oxidar dicha base preseleccionada en una reacción de oxidación-reducción, dicho electrodo comprendiendo: (a) un substrato conductor q?e tiene una superficie de rabajo formada sobre el rnisrno; y (b) una capa de polímero no conductora conectada a dicha superficie de trabajo, en donde dicha capa de polímero es porosa a dicho complejo de rnetal de transición, y en donde dicha capa de polímero une el acido nucleico al mismo. 124.- Un electrodo de conformidad con la reivindicación 123, caracterizado ademas porque comprende un acido nucleico unido a 1 A capa de polímero, dicho acido nucleico conteniendo por lo rnenos una de dicha base preseleccionada . 125.- Un método para detectar un acido nucleico, dicho acido nucleico conteniendo por lo menos ?na base preseleccionada, dicho método comprendiendo: (a) poner en contacto una muestra que contiene ácido nucleico a un electrodo, dicho electrodo comprendiendo (i) un substrato conductor que tiene una superficie «Je trabajo forma«Ja sobre el misrno; y (ii) una capa «Je polímero no conductora conectada a dicha superficie de trabajo, en donde dicha capa de polímero une el acido nucleico al mismo; (b) hacer reaccionar el ácido nucleico con un complejo de metal de transición capaz de oxidar dicha base ?reselecc?ona«Ja en una reacción de oxidacion-reducción, y en donde dicha capa de polímero es porosa al complejo de metal de transición; (c) detectai- dicha reacción de oxidación-reducción midiendo el flujo de corriente a través del eLectrodo; y (d) determinar la presencia o ausencia de acido nucleico a partir de la reacción de oxidación- educción detectada en la base preseleccionada. 126.- Un rnetodo «Je conformidad con la reivindicación 125, caracterizado ademas porque dicho paso de reacción es preferido por el paso de: poner en contacto dicho acido nucleico con ac?«Jo nucleico complementario para formar un acido nucleico hi ridado.