MXPA01010772A - Monocapa y electrodo para detectar un blanco que tiene marca y metodo de uso del mismo - Google Patents

Abstract

Un electrodo para detectar interacciones entre miembros de un par de unión, cuyo electrodo se ha modificado mediante formación de una monocapa autoensamblada no conductiva, y un método para detectar biomoléculas, tales comoácidos nucleicos u otros objetivos, incluyendo receptores, ligandos, antígenos o anticuerpos, utilizando dicho electrodo;cuando se pone en contacto con unácido nucleico objetivo, una sonda de oligonucleótido acoplada a la monocapa autoensamblada reacciona con elácido nucleico objetivo para formar unácido nucleico hibridado sobre la superficie de electrodo modificada;elácido nucleico hibridado reacciona con un complejo de metal de transición capaz de oxidar una base preseleccionada en elácido nucleico hibridado en una reacción de oxidación-reducción, la reacción de oxidación-reducción se detecta, y la presencia o ausencia delácido nucleico se determina a partir de la reacción de oxidación- reducción detectada.

Description

MONOCAPA Y ELECTRODO PARA DETECTAR UN BLANCO QUE CONTIENE MARCA Y MÉTODO DE USO DEL MISMO REFERENCIA RECIPROCA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud es una continuación en parte de una solicitud copendiente número de serie 09/179,665, presentada el 27 de octubre de 1998, la cual es una solicitud divisional del número de serie 08/667,338, presentada el 20 de junio de 19996, actualmente patente de E.U.A. No. 5,871 ,918; la cual es una continuación en parte de la solicitud número de serie 08/495,817, presentada el 27 de junio de 1995 (actualmente abandonada); y una continuación en parte de la solicitud copendiente número de serie 08/950,503, presentada el 14 de octubre de 1997, la cual es una continuación en parte de la solicitud número de serie 08/667,338, presentada el 20 de junio de 1996, actualmente patente de E.U.A. No. 5,871 ,918; la cual es una continuación en parte de la solicitud número de serie 08/495,817, presentada el 27 de junio de 1995 (actualmente abandonada), la descripción de estas solicitudes se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a electrodos modificados para el análisis de interacciones de unión en par y el uso de estos electrodos, especialmente en análisis de ácidos nucleicos e interacciones proteína-proteína.

DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA La presente invención se refiere a electrodos para detectar interacciones entre miembros de un par unido, cuyos electrodos han sido modificados mediante la formación de una monocapa no conductiva autoensamblada, y a los métodos para detectar biomoléculas, tales como ácidos nucleicos u otros blancos, incluyendo receptores, ligandos, antígenos o anticuerpos, utilizando dichos electrodos. La detección de la hibridación de ácido nucleico en superficies sólidas se ha utilizado para la identificación de organismos infecciosos en los especímenes clínicos (Spargo, C.A. et al., 1993, Molecular and Cellular Probes 7, 395-404; Martin, W. J., 1994; Infectious Diseases, In The Polymerase Chain Reaction (K. B. Mullís, F. Ferré y R. A. Gibbs, eds.), pp. 406-417, Berkhauser, Boston), la cuantificación de ARNm para análisis de expresión del gen (Schena, M., et al., 1995,. Science 270, 467-470), y la secuenciación o resecuenciacíón de ADN genómico en arreglos en "placa" de alta densidad (Chee, M., et al., 1996, Science 27 A, 610-613). Las descripciones de las publicaciones y solicitudes de patentes referidas en la presente se incorporan aquí como referencia. Actualmente, esta detección implica la unión de una marca fluorescente al ácido nucleico blanco, el cual entonces se híbrida con una superficie modificada por la sonda y se detecta después de lavar el ADN no hibridado fuera de la superficie sólida. Puesto que la detección de los fotones se requiere para la detección de hibridación, los análisis de arreglos marcados de esta manera requieren microscopios fluorescentes de alta resolución. Alternativamente, la detección indirecta de hibridación puede lograrse utilizando ensayos intercalados en donde la hibridación unida a la superficie se híbrida subsecuentemente a una sonda señal adicional que porta una o más marcas o enzimas fluorescentes que convierten un sustrato no fluorescente a uno fluorescente (Spargo, C.A. et al., 1993, Molecular and Cellular Probes 7, 395-404). Al unir múltiples enzima a los sonda señal, se pueden lograr señales de amplificación mayores (Holodniy, M. Et al., 1995, J. Virology 69, 3510-1516); sin embargo, la preparación de estos sistemas enzimáticos múltiples es compleja. Otros trabajadores han desarrollado un método de detección del gen utilizando una sonda de ácido nucleico inmovilizada sobre un vehículo y una sustancia de reconocimiento específica para la doble tinción del ácido nucleico, pero estos métodos no permiten el reconocimiento de los blancos de una sola hebra debido a que la intercalación del grupo reportero en el ácido nucleico se requiere (Hasinoto et al., patente de E.U.A. No. 5,776,672). Las patentes de Heller (patente de E.U.A. Nos. 5,532,129; 5,565,322; 5,605,662; y 5,632,957) describen el uso de un electrodo con una capa de permeación la cual es un gel de agarosa colocado sobre el electrodo. La aplicación de un potencial al electrodo coloca a la sonda o al ácido nucleico blanco en el sitio de reacción sobre el electrodo pero no es parte del paso de detección que procede mediante el uso de sondas fluorescentes. Los organosilanos pueden unirse covalentemente en posiciones seleccionadas de una superficie hidroxilada de un sustrato, tal como un dióxido de silicón, para formar una monocapa de organosilano o película en bicapa o revestimiento, como se establece en la patente de Chrisey et al. (patente de E.U.A. No. 5,688,642). Los organosilanos se han utilizado para que tengan al menos un sitio reactivo para la unión de la superficie hidroxilada o del sustrato y otro sitio reactivo que es incapaz de unirse ya sea a otras moléculas de organosilano para el revestimiento o al sustrato, pero que está disponible para la unión de una molécula distinta a partir de estas, tal como ácido nucleico modificado mediante la adición de un grupo tiol o un grupo amíno. Las proteínas marcadas y los reactivos solubles se han utilizado para detectar interacciones proteína-proteína. Por ejemplo, la patente de Weetall (patente de E.U.A. No. 5,066,372) describe una capa de soporte sobre un electrodo de trabajo que es porosa a los reactivos y en la cual la proteína puede ser inmovilizada. Véase también patente de E.U.A. Nos. 4,945,045 de Hill, 4,545,382 de Higgins, y 5,378,628 de Gratzel. El artículo de Wang et al. (Wang et al., 1997, Anal.Chem. 69, 4056-4059), describe un electrodo de carbón revestido por una membrana para el análisis de oligonucleótidos en la presencia de ácidos nucleicos poliméricos. El propósito de la membrana es excluir el ADN polimérico, mientras que pequeñas moléculas pueden pasar a través de la membrana para el electroanálisis mediante el electrodo de carbón. La membrana no se utiliza para la unión de las sondas y los electrodos revestidos de membrana no ofrecen discriminación en el nivel de secuencia. Las solicitudes precedentes, cuyas especificaciones completas, dibujos, y reivindicaciones se incorporan específicamente en la presente como referencia, describen, entre otras invenciones, secuenciación y métodos para detectar cualitativamente y cuantitativamente hibridación de ácido nucleico. Dichas invenciones representan un avance principal en la técnica y proveen complejos óxido-reducción que funcionan en una manera catalítica sin la adición de una enzima o marca fluorescente, proveyendo una corriente catalítica para dar la concentración de guanina, o una base alterna, de una manera útil para determinar la presencia o ausencia de un ácido nucleico blanco, y proveyendo una prueba extremadamente precisa. La formación de monocapas autoensambladas sobre superficies ha permitido el diseño de nuevas interfases para el estudio de nuevos elementos de análisis específicos de actividad redox, conversión de energía solar y electroquímica fundamental. Las monocapas anteriores se han formado mediante unión de alcanetiol-oro y uniones relacionadas entre carboxilatos y fosfonatos y superficies de óxido metálico, tales como óxido de indio impurificado, estaño. Por lo tanto, el autoensamblaje se ha utilizado para controlar la estructura de monocapas de ADN oligomérico sobre oro en concentraciones altas en sal con ADN funcionalizado en el extremo 5' con un grupo tiol conectado al oligonucleótido mediante un enlace hexametileno. El ADN aparentemente permanece unido a través de este grupo tiol terminal mientras que hace contacto entre las estructuras base de ADN y la superficie están prevenidos por la formación de una monocapa de mercapto hexanol. La sonda de ácido nucleico oligomérico fácilmente híbrida con su secuencia complementaria. (Levicky, R. et al., 1998, J. Amer. Chem. Soc, 120, 9787). Otros sistemas que se han diseñado utilizando transferencia de electrón directa a partir de ácidos nucleicos que han estado en contacto con un electrodo, pero que no utilizan transferencia mediada por electrón ni monocapas autoensambladas incluyen aquellas de Hall et al., PCT/GB93/00631. Para el uso en la modificación de la superficie de semiconductores de amplio espacio de banda o para reacciones sintéticas de transferencia de electrón interfacial interrogante, los complejos rutenio y piridilo funcionalizados mediante carboxilato pueden ser usados junto con películas de bióxido de titanio nanocristalino de lata área como una manera para obtener unión a la superficie. Otra forma de lograr el anclaje a la superficie del Ti02 nanocristalino en la película (electrodo) o forma coloidal, y para la retención subsecuente de la molécula sobre un amplio intervalo de pH es la hexafosfonación de Ru(bpy)32+(Yan, S. G. Et al., 1996, J. Physical Chem., 100, 6867). Esta técnica antecedente no se relaciona con la electroquímica mediada por solución como una invención habitual, sino que más bien se relaciona con la transferencia directa del electrón, utilizando luz como un estímulo en lugar de un voltaje. El trabajo precedente con monocapas autoensambladas ha incluido la formación de monocapas terminadas mediante constituyentes tales como metil o hidróxido en los cuales los miembros de pares unidos no pueden unirse y los cuales se utilizan para propósitos diferentes a partir de, y generalmente inconsistentes, la unión de biomoléculas a las monocapas. Por ejemplo, las monocapas de autoensamblado de ácidos alcanehidroxámicos de cadena larga absorbidos sobre óxidos de metal, y terminados mediante metilo o hidroxílo, se han utilizado para inhibición de la corrosión de los metales (Folkers, J.P. et al., 1995, Langmuir, 11 , 813 y Laibinis, P.E: et al., 1989, Science, 245, 845) y las monocapas terminadas en tiol autoensambladas se han formado que unen metales electrostáticamente (Tarlov, M.J. y Bowden, E.F., 1991 , J. Am. Chem. Soc, 113, 1847). El trabajo inicial en relación a la invención describe aquí lo que se hizo con la formación de monocapas de 1 , 12-ácido dodecanedicarboxílico (DDCA) sobre electrodos de óxido de estaño indio (ITO), con los electrodos estando además derivados con ADN mediante la reacción de carboxilato pendiente con aminas endógenas de las nucleobases siguiendo a la activación con carbodiimida soluble en agua (Napier, M. Et al., 1997, Langmuir, 13, 6342). La unión de ADN al electrodo lleva a una gran mejora catalítica debido a la oxidación de guanina por el complejo de metal oxidado Ru(bpy)33+. La interface carboxilato-ITO es compatible con la electroquímica de Ru(bpy)32+/3+ a E-?/2= 1.05 V (contra Ag/AgCI), lo cual puede no ser el caso con monocapas de oro-tiol. Sin embargo, las monocapas de 1 , 12-ácido dodecanedicarboxílico no es estable bajo estrés termal, y, en comparación con el fosfonato de la invención presente, las monocapas de carboxilato no forman reproducibilidad debido a su baja estabilidad.

Antes de la invención actual las monocapas autoensambladas no habían sido descritas que permitieran la unión hacia delante de sondas oligonucleótidas y la detección electroquímica de ADN inmovilizado mediante la oxidación de guanina. Las monocapas autoensambladas de esta invención son térmicamente estables, resistentes a la oxidación, y se forman rápidamente y reproduciblemente. Cuando el carboxilato se utiliza como el grupo terminal, la unión no especifica se minimiza. Adicionalmente, los compuestos fosfonato preferidos que se utilizan en la presente invención no estaban previamente disponibles o eran muy difíciles de sintetizar (con solamente el carboxifosfonato de C3 y el aminofosfonato de C3 siendo conocido como comercialmente disponibles). El trabajo precedente con otros compuestos fosfonatos ha sido en solución, por ejemplo, para mejorar la separación cromatográfica (Lukes, I et al., 1994, J. Am. Chem. Soc, 116, 1737), para formar capas de multicapas aislantes (por ejemplo, tiol fosfonato en Hong, H-G, et al., 1991 , Langmuir, 7, 2362, y alcanebisfosfonato metálico en Yang, H. C. Et al., 1993, J. Am. Chem. Xoc, 115, 11855) o monocapas aislantes (Kayyem, J. et al., PCT/US97/20014, para proveer un agente de pasividad sobre la superficie del electrodo que la distancia a partir del oligonucleótido del electrodo, que mantiene la carga lejos de la superficie del electrodo bloquea la accesibilidad del solvente al electrodo de manera que la transferencia del electrón solamente ocurre en las ubicaciones deseadas), o al estudio de la reacción del ácido fosfórico con una superficie metálica (Gao, W. et al., 1996, Langmuir, 12, 6429). Los sistemas para autoensamblaje ortogonal o tioles funcionalizados, ácidos carboxílícos o ácido fosfónico, marcado, por ejemplo, con ferroceno se estudiaron por Gardner , Ru(bpy)33+. T. J. et al., 1995, J. Am. Chem. Soc. 117, 6927. Ninguno de estos trabajos se refiere a la unión de un miembro de un par de unión a una capa de fosfonato autoensamblada sobre un electrodo. Cuando el ADN sea inmovilizado sobre dicha película precedente, esto ha sido vía la intercalación del ADN en un ADN de doble hebra mediante unión electrostática y no mediante anclaje covalente (Xu, X-H et al., 1994, J. Am. Chem. Soc, 116, 8386). Otro trabajo con capas sobre electrodos se refiere no a las monocapas sino a las bicapas, por ejemplo, investigando el contenido de lípidos de las bicapas ensambladas sobre S¡02 y las interacciones de ligandos con biomoléculas (Boxer et al., PCT/US97/21835), o bicapas que tienen espacio entre la membrana y el electrodo utilizado para detectar secuencias de ácidos nucleicos seleccionadas (Harding et al., PCT/AU97/00316); a capas polimerizadas (Ribi (EP 0 4020917 B1 ) utilizando biosensores que emplean señales eléctricas, ópticas y mecánicas que tienen una capa de agente tensioactivo conductivo eléctricamente a la cual están unidos los miembros de un par de unión específico, el cual puede estar presente en una capa uniformemente orientada que eléctricamente conduce como un resultado de la polimerización de grupos poliinsaturados en la película de agente tensioactivo, formada mediante tecnología estándar de monocapas de lípídos; o a membranas semipermeables utilizadas para propósitos completamente diferentes (Maley et al., patente de E.U.A. No. 5,711 ,868, en la que un sensor electroquímico se utiliza para detectar glucosa mediante una enzima en el cual el electrodo de trabajo se reviste con una membrana semiimpermeable). Por lo tanto es un objetivo de la invención proveer un método para inmovilizar una sonda oligonucleotídica o sustancias de unión a proteínas sobre la superficie de un electrodo, tal como ITO, de manea que estas estén disponibles para la hibridación a un ácido nucleico blanco o para la unión a una proteína blanco, y detección subsecuente vía una reacción de oxidación-reducción. Es un objetivo adicional de la invención proveer un método para hacer una monocapa autoensamblada no conductiva sobre un electrodo que puede utilizarse para la detección y cuantificación de biomoléculas blanco, tales como ácidos nucleicos u otros blancos, incluyendo reporteros, ligandos, antígenos o anticuerpos. Otros objetivos y ventajas serán completamente aparentes a partir de la siguiente descripción y reivindicaciones anexas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención en la presente es una monocapa de fosfonato autoensamblada sobre un electrodo, la cual en la modalidad preferida es un fosfonato de carboxialquilo sobre una superficie ITO, en la cual un miembro del par de unión está covalentemente unido. La presente invención también incluye un método para usar el material de monocapa para formar una monocapa autoensamblada sobre una superficie del electrodo y un método para inmovilizar los miembros de pares de unión sobre la superficie del electrodo modificado. El electrodo con la monocapa autoensamblada en una modalidad preferida se utiliza para la detección electroquímica de una base preseleccionada en un ácido nucleico y para determinar la presencia de un ácido nucleico blanco en una muestra. Cuando se pone en contracto con el ácido nucleico blanco, una sonda de nucleótido acoplada a la monocapa autoensamblada reacciona con el ácido nucleico blanco para formar un ácido nucleico hibridado sobre la superficie del electrodo modificado. El ácido nucleico hibridado se hace reaccionar con un complejo de metal de transición capaz de oxidar una base preseleccionada en el ácido nucleico hibridado en una reacción de oxidación-reducción, la reacción de oxidación-reducción se detecta; y la presencia o ausencia de ácido nucleico hibridado se determina a partir de la detección de reacción de oxidación-reducción. La reacción de oxidación-reducción puede detectarse de conformidad con la presente invención debido a que sigue a la transferencia de electrones a partir del par de unión inmovilizado al complejo de metal de transición, la monocapa permite que el complejo de metal de transición transporte los electrones a la superficie del electrodo, en donde se detectan. Por lo tanto, la monocapa autoensamblada es no conductiva, y sirve para inmovilizar reactivos cerca de la superficie del electrodo, y permite que el complejo de metal de transición se mueva libremente a partir de los reactivos inmovilizados a la superficie de trabajo conductiva del electrodo para permitir la transferencia del electrón. En algunos casos, pueden utilizarse en conjunción con la invención las técnicas de amplificación como se conocen en la técnica. La invención también puede utilizarse para detectar otros blancos (por ejemplo, receptores, ligandos, antígenos, anticuerpos, etc). Por ejemplo, la proteína blanco en una muestra puede detectarse mediante hacer reaccionar a la proteína blanco con una sustancia de unión proteica tal como un anticuerpo unido a la monocapa autoensamblada de la invención, seguido por la adición de una segunda sustancia de unión a la proteína tal como un segundo anticuerpo que se ha unido a esta a un nivel capaz de ser oxidada en una reacción de oxidación-reducción. Así como los ácidos nucleicos, la marca se hace reaccionar con un complejo de metal de transición capaz de oxidar la marca en una reacción de oxidación-reducción. La detección de la reacción de oxidación-reducción permite la determinación de la presencia o ausencia de la proteína blanco. Una marca adecuada para su uso en esta invención es un oligonucleótido. Otros objetivos y características de las invenciones serán más aparentes a partir de la siguiente descripción y reivindicaciones anexas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las figura 1a y 1 b son gráficas de la cantidad de oligonucleótído unido que contiene guanina, en picomoles, en contra del tiempo de ensamblaje de la monocapa autoensamblada de la invención ilustrando los efectos del tiempo de autoensamblaje sobre la formación de monocapas como una función de la cantidad de sonda oligonucleotídica que la monocapa es capaz de unir. La figura 2 ilustra gráficamente el efecto de la concentración de carboxifosfonato de C?2 en la solución de autoensamblado sobre la formación de la monocapa, como se indica por la respuesta electroquímica del oligonucleótido que contiene guanina acoplado a la monocapa autoensamblada. Las mediciones electroquímicas se hicieron utilizando voltametría cíclica a una velocidad de barrido de 20 V/s y una concentración de Ru(bpy)32+ de 100 µM.

La figura 3 ilustra gráficamente la estabilidad de la monocapa oligonucleotídica que contiene guanina hecha de conformidad con la invención que utiliza el 12-carbón carboxi-alquilfosfonato. Las mediciones electroquímicas se hicieron utilizando voltametría cíclica a una velocidad de barrido 20 V/s y a una concentración de Ru(bpy)32+ de 100 µM. La figura 4 es una serie de voltamogramos cíclicos que ilustran una respuesta a la dosis para monocapas acopladas a oligonucleótidos que tienen una cantidad variable de oligonucleótido que contiene guanina unido.

Las mediciones electroquímicas se hicieron utilizando voltametría cíclica a una velocidad de barrido 20 V/s y a una concentración de Ru(bpy)32+ de 100 µM. La figura 5 ilustra gráficamente la respuesta a la dosis mostrada en la figura 4. Las mediciones electroquímicas se hicieron utilizando voltametría cíclica a una velocidad de barrido de 20 V/s y a una concentración de Ru(bpy)32+ de 100 µM.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Y MODALIDADES PREFERIDAS DE LA MSIMA La presente invención provee una monocapa de fosfonato autoensamblada con un miembro unido covalentemente de un par de unión sobre un electrodo y el método para utilizar estas monocapas autoensambladas.

Como se utiliza en la presente, el término "monocapa" no conductiva incluye una capa única que recubre la superficie de trabajo conductiva del electrodo, preferiblemente que comprende alquilfosfonato autoensamblado a partir de la solución sobre una superficie del electrodo de ITO, lo que ha sido determinado un enlace "dativo" o "de coordinación" entre los oxígenos sobre los átomos de fosfonato y de metal en el electrodo (en la modalidad preferida). La formación de la monocapa de la invención no incluye la formación de enlaces covalentes verdaderos, tales como los que se encuentran entre dos no metales, tales como C, N y O, los cuales son capaces de compartir electrones para formar un enlace covalente verdadero. La presente invención tampoco incluye membranas poliméricas. Específicamente, la monocapa autoensamblada de la invención se forma a partir de moléculas de fosfonato capaces de adherirse y modificar un electrodo, tal como un electrodo ITO. Las moléculas utilizadas en la invención son moléculas multifuncionales que tienen a lo mínimo al menos un grupo funcional activo de superficie que se une a la superficie ITO, preferiblemente fosfonato, y al menos un grupo terminal, R-i, tal como carboxi, amino, hidroxilo o metilo, al cual un miembro de un par de unión está covalentemente unido. Además, estas moléculas pueden tener un espaciador orgánico R2, preferiblemente que contiene uno o más átomos de carbono y los sustituyentes asociados (generalmente hidrógeno), entre el grupo fosfonato y el grupo R-i. Preferiblemente la monocapa de fosfonato comprende un carboxi-alquil fosfonato (en donde Ri =-C02H y R2=-(CH2)n-), y, como se discute con más detalle a continuación, más preferiblemente es ácido 11-carboxiundecano fosfónico (donde R?=-C02H y R2=-(CH2)n-). Como se utiliza aquí, el término "miembro de un par de unión" incluye todas las biomoléculas las cuales se pueden unir entre sí tal como ácidos nucleicos, receptores, ligandos, anticuerpos, antígenos y carbohidratos. Mientras que los ejemplos en la presente principalmente se refieren al uso de oligonucleótidos, un experto en la técnica puede utilizar estos ejemplos y la presente descripción para otras biomoléculas. El electrodo utilizado en la invención comprende un substrato conductivo o un substrato con la superficie externa que funciona como una superficie de trabajo conductivo. El substrato puede el mismo ser conductivo o puede ser no conductivo pero tener una superficie de trabajo conductiva. El electrodo puede tener cualquier forma que sea convencional en esta técnica, tal como electrodo cilindrico que tiene una superficie de trabajo conductiva sobre el exterior del mismo sobre una lámina plana que tiene la superficie de trabajo conductiva formada sobre un lado de la misma. El substrato conductivo sobre el cual se ensambla la monocapa puede ser cualquier material metal o no metal convencionalmente utilizado, incluyendo carbón, tal como grafito, carbón vidriado, grafito pirolítico, pasta de carbón, y fibra de carbón; óxidos impurificados y no impurificados, tales como óxido de estaño impurificado de indio (ITO), óxido de estaño, óxido de titanio, óxido de manganeso, y óxido de plomo; y materiales semiconductores, tales como Si, Ge, ZnO, CdS, Ti02, y GaAs; y los similares. Se prefiere utilizar ITO debido a que sus propiedades se conocen relativamente bien, debido a que no es caro, y debido a su alto límite de potencial oxidativo en agua a pH neutral y una corriente de carga relativamente baja. La invención se describirá adicionalmente en conexión con el mismo. Los metales tales como oro que tienen dioles o disulfuros absorbidos no pueden utilizarse con esta invención, debido a que estos oxidarán a potenciales más bajos que aquellos necesitados para oxidación de guanidina. Un aparato para la determinación de la presencia de un blanco que contiene marca puede, por ejemplo, incluir un recipiente de la muestra para guardar una muestra fluida; un electrodo, que comprende un substrato que tiene una superficie de trabajo conductiva sobre éste; y una monocapa auto ensamblada no conductiva sobre dicha superficie de trabajo conductiva, dicha monocapa comprendiendo moléculas de fosfonato, cada una de las cuales de las moléculas de fosfonato tienen al mínimo al menos un grupo fosfonato y al menos un grupo R-i, donde el grupo R1 está covalentemente unido a un miembro de un par de unión, a través de cuya monocapa un complejo de metal de transición puede moverse libremente a partir de los reactivos inmovilizados a la superficie de trabajo conductiva para transferir electrones a la superficie de trabajo conductiva; y un potenciostato en comunicación electrónica con la monocapa. El aparato además comprende un miembro de un par de unión, tal como una sonda oligonucleótida unida a la monocapa ensamblada o un substrato de unión a la proteína unido a la monocapa auto ensamblada.

Generalmente, el método para determinar la presencia de un ácido nucleico blanco en una muestra comprende poner en contacto una monocapa auto ensamblada sobre un electrodo con una sonda oligonucleótida de manera que la sonda oligonucleótida se vuelve covalentemente unida a la monocapa; poner en contacto la monocapa modificada por la sonda sobre el electrodo con la solución de ácido nucleico de manera que el ácido nucleico blanco y la sonda oligonucleótida forman un ácido nucleico hibridado sobre el electrodo modificado; hacer reaccionar el ácido nucleico hibridado con un complejo de metal de transición capaz de oxidar una base preseleccionada en el ácido nucleico hibridado en una reacción de oxidación-reducción; detectar la reacción de oxidación-reducción; y determinar la presencia o ausencia del ácido nucleico a partir de la reacción de oxidación-reducción detectada. Alternativamente, la sonda oligonucleótida puede acoplarse al fosfonato antes del ensamblado de la monocapa sobre el electrodo. Para las proteínas, la determinación de la presencia de una proteína blanco en una muestra comprende poner en contacto una monocapa autoensamblada sobre un electrodo con una sustancia de unión a proteína de manera que la sustancia de unión se vuelve covalentemente unida a la monocapa de conformidad con la invención: poner en contacto la monocapa modificada por proteína sobre el electrodo con la muestra; poner en contacto el electrodo modificado con una segunda sustancia de unión a proteína que sea modificado para que contenga una marca; hacer reaccionar la monocapa con un complejo de metal de transición capaz de oxidar la marca en una reacción de oxidación-reducción; detectar la reacción de oxidación-reducción; y determinar la presencia o ausencia de la proteína blanco a partir de la reacción de oxidación-reducción detectada. Una marca adecuada para utilizar en esta invención es un oligonucleótido. Alternativamente, la sustancia de unión a proteína puede acoplarse a la monocapa de fosfonato antes del ensamblado de la monocapa sobre el electrodo.

Fosfonatos Como se discutió anteriormente, las moléculas que forman la monocapa autoensamblada de la invención comprende un grupo fosfonato (-P03H2), el cual se une a la superficie del electrodo ITO, y un grupo R-i el cual es capa de unirse covalentemente con un miembro de un par de unión. El grupo fosfonato puede ser porciones monofosfonato, difosfonato, trifosfonato, tetrafosfonato o polifosfonato. El grupo terminal R-i incluye, pero no se limita a, carboxilo, ácido de haliduro, ácido anhídrido, hidroxilo, epóxido, aldehido, cetona, sulfhidrilo, nitrilo y grupos amino. Preferiblemente, el grupo fosfonato y R-i están unidos mediante un espaciador orgánico o adaptador Ri, el cual, cuando esta presente, puede comprender alquilo, alquenilo, alquinilo, y estructuras aromáticas, que pueden ser lineales, ramificadas, cíclicas o estructuras poliméricas. R2, puede sustituirse con cualquier número de moléculas fosfonato que pueden unirse a la superficie ITO.

Preferiblemente la fuente fosfonato es un carboxi alquil fosfonato. En la monocapa autoensamblada de la invención, la porción fosfonato de un fosfonato de carboxi alquilo se une a ITO, el cual incrementa la estabilidad conforme el número de carbonos en la porción alquilo se incrementa. La porción carboxi da una carga negativa a la monocapa y es el grupo carboxi el que se acopla al miembro del par de unión. Un amino alquil fosfonato puede utilizarse si una carga de monocapa positiva se desea y un fosfonato de metilo de hídroxilo puede utilizarse para una carga de superficie neutral. El carboxi-alquil fosfonato que es más preferido, basándose en las pruebas hechas hasta la fecha, es el 12-carbón carboxi-alquil fosfonato (también referido aquí como ácido 11 -carboxundecano fosfónico) (véase ejemplo 2 para métodos de preparación recientemente preferidos). Este 12-carbono fosfonato se utilizó principalmente en las pruebas descritas en los ejemplos en la presente. Las pruebas indican que los carboxi-alquilfosfonatos que tienen 2-14 carbonos en el grupo alquilo trabajan para formar una monocapa auto-ensamblada con estabilidad suficiente y las características requeridas para su uso en la invención en la presente. En orden de utilidad en disminución en la invención después del 12-carboxi-alquilfosfonato, juzgado cuando se utiliza sólo en la monocapa están los 3-carbon amino-alquilfosfonato y el 3-carbon carboxil-alquilfosfonato. Conforme el número de carbonos en la cadena del fosfonato se incrementa, hay una estabilidad incrementada para la monocapa resultante.

Las síntesis del carboxi-alquilfosfonato como se estableció en más detalle en el ejemplo 2, generalmente implica: (1) convertir ácidos bromoalquilcarboxílicos a intermediarios de ácido clorhídrico mediante la reacción con cloruro de oxalilo; seguido por (2) convertir los intermediarios de ácido clorhídrico hacía esteres de bromoalquilo mediante la reacción con un alcohol, tal como etanol, bajo condiciones alcalinas de manera que (3) los intermediarios del éster de bromoalquilo pueden convertirse hacia carboxi-fosfonatos mediante la reacción con trietilfosfita (o trimetilfosfita) seguido por la hidrólisis acida para regenerar el ácido. La monocapa auto-ensamblada de fosfonato discutida en los ejemplos a continuación es químicamente homogénea, por ejemplo, consiste de solamente fosfonatos de carboxi-alquilo. La invención incluye, sin embargo, monocapas heterogéneas auto-ensambladas en las que estos fosfonatos se suplementan con otros materiales, por ejemplo, fosfonatos de amino-alquilo, fosfonatos de hidroxi-alquilo, fosfonatos de metoxi-alquilo, fosfonatos de metil-alquilo, fosfonatos de tiol-alquilo, fosfonatos de aldehido-alquilo, fosfonatos de trifluorometel-alquilo y fosfonatos zwitteriónícos de varias longitudes, que alteran las características físicas y químicas de la monocapa, por ejemplo, cambio general o distribución de carga sobre la monocapa. Estos materiales pueden o no ser capaces de unirse covalentemente con un miembro de un par de unión. Las monocapas mezcladas bajo condiciones específicas pueden mejorar la unión de moléculas blanco específicas al miembro del par de unión y/o reducir la unión específica de las moléculas no blanco a la superficie del electrodo.

Muestras de pruebas El método puede llevarse a cabo sobre una muestra de prueba que contiene el ácido nucleico blanco u otras biomoléculas blanco tales como proteínas. Cualquier muestra de prueba sospechosa de que contenga el blanco puede utilizarse, incluyendo, pero no limitado a, muestras de tejido tales como muestras de biopsia y fluidos biológicos tales como sangre, esputo, orina y muestras de semen, cultivos bacterianos, muestras de suciedad, muestra de comida, cultivos celulares, etc. El blanco puede ser de cualquier origen, incluyendo animal, plata o microbiológico (por ejemplo, viral, procarionte, y organismos eucariontes, incluyendo bacterias, protozoos, y hongos, etc.) dependiendo del propósito particular de la prueba. Los ejemplos incluyen especímenes quirúrgicos, especímenes utilizados para diagnósticos médicos, especímenes utilizados para pruebas genéticas, especímenes ambientales, especímenes de cultivo celular, especímenes de alimento, especímenes dentales y especímenes veterinario. La muestra puede procesarse o purificarse antes de llevar a cabo el presente método de conformidad con las técnicas conocidas o aparente aquellos expertos en la técnica; y ácido nucleicos en donde puede digerirse, fragmentarse, y/o amplificarse (véase a continuación) antes de llevar a cabo el presente método, sí se desea.

Amplificación Puesto que los procedimientos que utilizan un electrodo que tiene un monocapa auto-ensamblada de conformidad con la presente invención implica el poner en contacto la muestra de ácido nucleico blanco con una sonda oligonucleótida para producir un ácido nucleico hibridado, puede ser deseable para ciertas aplicaciones utilizar la invención para amplificar ácido nucleico antes de ponerlo en contacto con la sonda oligonucleótida. La amplificación de una secuencia de ácido nucleico seleccionada, o blanco, puede llevarse a cabo mediante cualesquiera métodos, tales como aquellos descritos y discutidos en la solicitud del copendiente (SN 09/179,665 y SN 08/950,503).

Detección de ácido nucleico Como se evidenció anteriormente, un electrodo de la invención presente sobre el cual la monocapa auto-ensamblada ha sido formada, y los métodos para utilizar este electrodo capacitan la detección de ácido nucleico hibridado. En este método, un ácido nucleico blanco se pone en contacto con una sonda oligonucleótida unida a una monocapa auto-ensamblada para formar un ácido nucleico híbridado. Las sondas oligonucleótidas que son útiles en los métodos de la presente invención pueden ser cualesquiera sondas que comprenden de entre aproximadamente 4 o 6 base a más a aproximadamente 80 o 100 bases o más, más preferiblemente entre aproximadamente 8 y aproximadamente 30 bases. Las sondas oligonucleótidas pueden prepararse que tengan cualquiera de una amplia variedad de secuencias de bases de conformidad con las técnicas que son bien conocidas en la técnica. Las bases adecuadas para preparar la sonda oligonucleótído pueden seleccionarse a partir de bases nucleotídicas que ocurren naturalmente tales como adenina, citocina, guanidina, uracilo, y timina; y bases nucleotídicas que no ocurren naturalmente o "sintéticas" tales como8-oxo-guanina, 6-mecaptoguanina, 4-acetilcitidina, 5-(carboxihidroxietíl)ur¡dina, 2'-0-metilcitidina, 5-carboximetilamino-metil-2-tíouridina, 5-carboximetilaminometiluridina, dihidrouridina, 2'-0-metilpseudouridina, ß,D-galactosilqueosina, 2'-0-metilguanosina, inosína, 7-deazaguanina, N6-ísopenteniladenosína, 1-metiladenosina, 2,2-dimetilguanosina, 2-metíldenosina, 2-metilguanosina, 3-metilcitidina, 5-metilcítidina, N6-metiladenosina, 7-metilguanosina, 5-metilaminometiluridina, 5-metoxh¡amínometil-2-tiouridina, ß,D-manosilqueosina, 5-metoxicarbonilmetiluridina, 5-metoxiurídina, 2-metíltio-N6-isopenteniladenosina, N-((9-ß-D-ribofuranosil-2-metiltiopurina-6-il)carbamoil)treonina, N-((9-ß-D-ribofuranosilpurina-6-il)N-metil-carbamoil)treonina, uridina-5- ácido oxiacético metiléster, uridina-5- ácido oxiacético, wibutoxosina, pseudouridina, queosina, 2-tiocitidina, 5-metil-2-tiouridina, 2-tiouridina, 5-metiluridina, N-((9-ß-D-ribofuranosilpurina-6-¡l)carbamoil)treonina, 2'-0-metil-5-metiluridina, 2'-0-metiluridina, wíbutosina, 3-(3-amino-3-carboxipropil)uridina, 2'-0-metiladenina, y 2'-0-metilinosina. Cualesquiera de las estructuras oligonucleótidas pueden emplearse, incluyendo ADN, ARN, azúcares modificados tales como carbociclos, y azúcares que contienen sustituciones 2' tales como fluoro y metoxi. Los oligonucleótidos pueden ser oligonucleótidos en donde al menos uno, o todos, de los residuos de fosfato que enlazan ¡nternucleótidos son fosfatos modificados, tales como metilfosfonatos, metilfosfonotionatos, fosforomorfolinatos, fosforopiperazidatos y fosforoamidatos (por ejemplo, cualesquiera otra de los residuos internucleotídicos de fosfato pueden modificarse como se describió). El oligonucleótido puede ser un "ácido nucleico peptídico" tal como se describe en P. Nielsen et al., 1991 , Science 254, 1497-1500. El único requerimiento es que la sonda oligonucleótida deba poseer una secuencia en donde al menos una porción de la cual es complementaria a una porción de la secuencia del ácido nucleico blanco. Puede ser deseable en algunas aplicaciones poner en contacto la muestra de ácido nucleico con un número de sondas oligonucleótidas que tienen diferentes secuencias de bases (por ejemplo, en donde hay dos o más ácidos nucleicos blanco en la muestra, o en donde un ácido nucleico único blanco se híbrida a dos o más ondas oligonucleótidas en un ensayo "intercalado").

Base preseleccionada. Después de la hibridación, el ácido nucleico blanco hibridado a la sonda oligonucleótida unida a la monocapa auto-ensambladas sobre el electrodo se hace reaccionar con un mediador adecuado el cual es capaz de oxidar una base preseleccionada en una reacción de óxido reducción. La base preseleccionada puede ser cualquiera que ocurran naturalmente o una base nucleotídica sintética la cual lleva a cabo oxidación después de la reacción con el mediador seleccionado. La base preseleccionada exhibe una velocidad de oxidación única cuando se acopla en comparación con la base preseleccionada cuando está desacoplada. La base preseleccionada debe exhibir una velocidad de oxidación única cuando se acopla con cada una de las cuatro bases que ocurren naturalmente. Generalmente, las bases cuyos 5'-mononucleótido (por ejemplo, el 5'-desoxir¡bonucleótido o 5'-ribonucleótido) exhibe relaciones constantes superiores a 104 M"1s"1 que pueden detectarse utilizando la reacción catalítica. Los ejemplos de bases adecuadas preseleccionadas incluyen pero no se limitan a guanina, adenina, 8-oxo-guanina, 8-oxo-adenina, 8-bromo-guanina, xantina, pseudouridina, 6-mercaptoguanina, 8-mecaptoguanina, 2-tioxantina, 6-tíoixantina, 6-mecaptopurina, 2-amino-6-crboximetil-mercaptopurina, 2-merpcaptopurina, 6-metoxipurína, 2-acetilamino-6-hidroxipurina,6-metiltio-2-hidroxipurina, 2-dimetilamino-6-hidroxpurina, 2-hiroxipurina, 2-aminopurina, 6-amino-2-dimetílalil-purina, 2-tioadenina, 8-hidroxiadenina, y 8-metoxiadenina. Típicamente, la base preseleccionada se selecciona a partir del grupo que consiste de guanina, adenina, 6-mercaptoguanina, 8-oxo-guanina, y 8-oxo-adenina, con guanina siendo la base preseleccionada actualmente preferida que ocurre naturalmente y 8-oxo-guanina o 6-mercaptoguanina la base preseleccionada sintética actualmente preferida.

Mediador El mediador que se necesita para capacitar la transferencia del electrón puede ser cualquier molécula tal como una molécula catiónica, aniónica, no iónica, o zwitteriónica que es reactiva con la base preseleccionada en un potencial de oxidación único para transferir electrones a partir del ácido nucleico al electrodo. Por lo tanto la selección del mediador será dependiente de la base preseleccionada particular elegida, y será fácilmente determinado por los expertos en la técnica. Los mediadores particularmente preferidos incluyen complejos de metal de transición que son capaces de transferir electrones metal-ácido nucleico con la base preseleccionada de manera que la forma reducida del complejo metálico se regenera, completando un sitio catalítico. Los ejemplos de complejos de metales de transición adecuados para utilizar en los métodos de la presente invención incluyen, por ejemplo, Rutenio2+ (2,3'-bipiridin)3("Ru(bpy)32+ ), Rutenio2+(4>4'dimet¡l-2,2'-b¡pir¡din)3("Ru(Me2-bpy)32+ "), Rutenio2+(5,6-dimetil-1 , 10-fenantrolin)3("Ru(Me2-f3n)32+"), lron2+(2,2'-bipiridin)3("Fe(bpy)32+"), lron2+(5-clorofenantrolin)3("Fe(5-CI-fen)32+ "), Osmio2+(2,2'-bipiridin)3 ("Os(bpy)32+"), Osmio2+(5-clorofenantrolin)3 ("Os(5-CI-fen)32+"), doxorenio1+fosfina, y dioxorenio1+ piridina ("Re02(pi)41+ ). Algunos complejos aniónicos útiles como mediadores son Ru(bpy)((S03)2-bpy)22+ y Ru(bpy)((C02)2-bpy)22" y algunos complejos zwitteriónicos útiles como mediadores son Ru(bpy)((S03)2-bpy) y Ru(bpy)((C02)2-bpy) donde (S03)2-BPY2" es 4,4'-disolfonato-2,2'-bipir¡dina y (CO2)2-bpy2" es 4,4'-dicarboxi-2,2'- bipiridina. Los derivados sustituidos adecuadamente de los grupos piridina, piridina, bipiridina y fenantrolina también pueden emplearse en complejos con cualesquiera de los metales precedentes. Los derivados sustituidos adecuados incluyen pero no se limitan a 4-aminopiridina, 4-dimetílpiridina, 4-acetilpridina, 4-nitropiridina, 4,4'-diamino-2,2'-bipiridina, 5,5'-díanimo-2,2'-bipridina, 5,6'-diamino-2,2'-bipiridina, 4,4'-diet¡lendiamina-2,2'-bipiridina, 5,5'-d¡et¡lendiam¡na-2,2'.-bipiridina, 6,6'-diatilendiamina-2,2'-bipirid¡na, 4,4'-dihidroxil-2,2'-bipiridína, 5,5'-d¡hisroxil-2,2'-bipiridna, 6,6'-dihidroxil-2,2'-bipiridina, 4,4'4"-tr¡amino-2,2'I2"-terpir¡d¡na, 4)4'I4"-trietilendíamina-2,2',2"-terpiridina, 4,4',4"-tr¡h¡droxi-2,2',2"-terpirid¡na, 4,4'-4"-trinitro-2,2',2"-terpirídina, 4,4',4"tr¡fenil-2,2',2"-terpiridina, 4,7-dianino-1 ,10-fenantrolina, 3,8-día ino-1 ,10-fenantrolina, 4,7-díetilnendiamina-1 ,10-fenantrolina, 3,8-dietilendiamina-1 ,10-fenantrolina, 4,7-dihidroxil-1 ,1 '-fenantrolina, 3,8-dihidroxil-1 ,10-fenantrolina, 4,7-dinitro-1 ,1 '-fenantrolina, 3,8-dinitro-1 ,10-fenantrolina, 4,7-difenil-1 ,10-fenantrolina, 3,8-difenil-1 ,10-fenantrolina, 4,7-disperamina-1 ,10-fenantrolina, 3,8-disperamina-1 ,10-fenantrolina, dipirido[3,2-a:2',2'-.c]fenanzina, 6,6'-dicloro-2,2'-b¡píridina, ftalocianinas y porfirinas.

Reacción óxido-reducción El mediador puede hacerse reaccionar con el ácido nucleico hibridado bajo condiciones adecuadas para efectuar la reacción de oxidación-reducción del mediador con la base preseleccionada. El solvente en el que la reacción óxido-reducción toma lugar puede ser cualquier solvente adecuado para ácidos nucleicos solubilizados, y preferiblemente comprende agua. Las condiciones adecuadas para permitir la reacción de oxidación-reducción que ocurra se conocerán por los expertos en la técnica.

Detección de reacción de oxidación-reducción La ocurrencia de la reacción de óxido-reducción puede detectarse sobre un electrodo que tiene una monocapa autoensamblada de conformidad con la presente invención para observar un cambio en la señal electrónica la cual es indicativa de la ocurrencia de la reacción de oxidación-reducción. El electrodo se coloca en contacto con la solución del mediador y generalmente, un electrodo de referencia y un electrodo auxiliar también se colocan en contacto con la solución en conjunción con el electrodo de trabajo (con la mayoría de la corriente pasando a través del electrodo auxiliar). Simílarmente, los electrodos de referencia adecuados también se conocerán en la técnica e incluyen, por ejemplo, electrodos de plata/cloruro de plata. Un electrodo auxiliar adecuado es un electrodo de Pt. La detección de la señal electrónica asociada con la reacción de oxidación-reducción permite la determinación de la presencia o ausencia del blanco. El paso para determinar la presencia o ausencia de blanco típicamente ocurre (i) al medir la velocidad de reacción de la reacción de oxidación-reducción, (ii) comparar la velocidad de la reacción medida con la velocidad de la reacción de oxidación-reducción del complejo de metal de transición con o sin ácido nucleico, y luego (iii) determinar si o no la reacción medida velocidad es esencialmente la misma que la velocidad de reacción de oxidación-reducción para el metal de complejo de transición con o sin blanco. El paso para medir la velocidad de reacción puede llevarse a cabo mediante cualesquiera métodos adecuados. Por ejemplo, la velocidad de reacción relativa puede determinarse al comparar la corriente en la misma velocidad de barrido, concentración de sonda, concentración de blanco, mediador, amortiguador, temperatura, y/o método electroquímico. La velocidad de la reacción de oxidación-reducción puede medirse de conformidad con métodos adecuados conocidos por los expertos en la técnica. Típicamente, la velocidad de reacción de oxidación-reducción se mide el medir la señal electrónica asociada con la ocurrencia de reacción de oxidación-reducción. Por ejemplo, la señal electrónica asociada con la reacción de oxidación-reducción puede medirse al proveer un aparato adecuado en comunicación electrónica con un electrodo revestido con una monocapa autoensamblada como se describe en la presente. Un aparato adecuado es un potentiostato capaz de medir la señal electrónica la cual se genera de manera que se provee una medición para la velocidad de la reacción de oxidación-reducción de la reacción entre el ácido nucleico hibridado y el mediador. Cuando una proteína es el blanco a ser detectado, el detector ha unido a ésta una marca capaz de ser oxidada en una reacción de oxidación-reducción, con una de dichas marcas siendo un oligonucleótido que contiene la base preseleccionada.

La salida electrónica puede ser característica de cualquier método electroquímico, incluyendo voltametría cíclica, voltametría de pulso normal, cronoamperometría, cronocoulometría, o voltametría de onda cuadrada, con voltametría cíclica y cronoamperometría siendo las formas preferidas corrientemente. Una computadora como se conoce en la técnica puede utilizarse para controlar el uso del electrodo y para registrar resultados de dicho uso. El método más frecuentemente utilizado para analizar ácidos nucleicos sobre monocapas autoensambladas en electrodos ITO de conformidad con la invención es voltametría cíclica. En la voltametría cíclica, el potencial del sistema electroquímico varía linealmente a partir del potencial inicial (0-800 mV) a un potencial final (1300-2000 mV). Cuando el potencial final se alcanza, la dirección del barrido se revierte y el mismo intervalo potencial se coloca en la dirección opuesta. El potencial varía a una velocidad de barrido constante (por ejemplo, de aproximadamente 10 mV/s a aproximadamente 5000 V/s). Para la mayoría de los experimentos, el potencial inicial se establece a 0 mV y el potencial final se determina experimentalmente por la velocidad de barrido. La velocidad de barrido actualmente preferida es de 20 V/s con un potencial final de 1600 mV. La corriente se colecta en cada potencial y los datos se grafican como corriente contra espectro de potencial. Como una alternativa a la voltametría cíclica, los métodos del paso de potencial tales como cronocoulometría o cronoamperometría pueden utilizarse para analizar ácidos nucleicos sobre monocapas de la invención. En la cronocoulometría, el sistema electroquímico se coloca directamente a partir del potencial inicial (0 mV-800 mV) al potencial final (1000 mV-1600 mV). El sistema electroquímico se mantiene en el potencial final por algún periodo de tiempo especificado (50 µs a 30s) y la carga se colecta como una función del tiempo. Aunque no se hace actualmente, si se desea, el potencial puede ser revertido al potencial inicial y la carga puede colectarse en el potencial inicial como una función del tiempo. En la cronoamperometría, el sistema electroquímico se establece a partir de un potencial inicial (OmV-800 mV) directamente a un potencial final (1000-1600 mV) por algún periodo de tiempo específico ( 50 µs a 30 s) y la corriente se colecta como una función del tiempo. Si se desea, el potencial puede revertirse al potencial inicial, y la corriente puede colectarse en el potencial inicial como una función del tiempo. El paso de potencial preferido es 1100 mV con tiempo de colección de 500 ms aunque los pasos de potencial y tiempos preferidos pueden variar con diferentes parámetros de ensayo.

Método de detección La detección de una base preseleccionada sobre un ácido nucleico blanco utilizando un electrodo con una monocapa autoensamblada no conductiva de conformidad con la presente invención comprende (a) poner en contacto la muestra blanco con una sonda oligonucleótida, unir una monocapa de conformidad con la invención, y unir específicamente un ácido nucleico blanco para formar un ácido nucleico hibridado; (b) poner en contacto el ácido nucleico hibridado con un complejo de metal de transición que oxida la base preseleccionada en una reacción de oxidación-reducción; (c) detectar la presencia o ausencia de la reacción de oxidación-reducción asociada con el ácido nucleico hibridado y (d) determinar la presencia o ausencia del ácido nucleico blanco en la muestra blanco a partir de la reacción de oxidación-reducción detectada en la base preseleccionada. Preferiblemente, el ácido nucleico blanco contiene al menos aproximadamente 10 más de las bases preseleccionadas que la sonda oligonucleótida, o más preferiblemente al menos 50 ó 100 más bases preseleccionadas de las contiene que la sonda oligonucleótida. Una corriente mejoradora más grande se obtiene ventajosamente cuando el ácido nucleico blanco contiene muchas más bases de las preseleccionadas que la sonda oligonucleótida. El ácido nucleico blanco preferiblemente es más largo que la sonda oligonucleótida, y al menos una de las bases preseleccionadas está "sobrante" como se describe en la patente de E.U.A. No. 5,871 ,918 y no se híbrida con la sonda oligonucleótida en el ácido nucleico hibridado. Preferiblemente, a menos 10, 50 ó 100 de las bases preseleccionadas son bases "sobrantes", por lo tanto proveen amplificación sustancial de la señal electroquímica detectada. Opcionalmente, pero preferiblemente, la secuencia de la sonda oligonucleótida está libre de la base preseleccionada. Cuando dicha secuencia de bases que ocurren naturalmente se hibridan convenientemente con el ácido nucleico blanco pero no contienen la base preseleccionada que no está disponible, la estrategia de las bases alternadas empleadas es que se puede emplear un redox inactivo (descrito a continuación). Por ejemplo, puede elegirse una secuencia de sonda oligonucleótida que no contiene ningún residuo de guanina (por ejemplo, solamente A, T y C). El voltamogramo cíclico de Ru(bpyb)32+ en la presencia de esta hebra es muy similar a la que se encuentra sin el oligómero. La sonda oligonucleótida entonces se híbrida con una hebra de ácido nucleico blanco que contiene guanina ya sea en las regiones de bases acopladas sobrantes y/o en regiones sobrantes si los ácidos nucleicos blancos son más grandes que las sondas oligonucleótidas. Debido a las múltiples guaninas que se detectan, la señal se amplifica en relación al número de híbridos formados. En un caso en donde un ADN o ARN genómico es la hebra de ácido nucleico blanco, se encuentran grandes números de guaninas sobrantes, lo cual puede dar una tremenda señal de amplificación. En una modalidad preferida, el ensayo de la base preseleccíonada sobre la hebra de ácido nucleico blanco implica la inmovilización de la hebra de sonda oligonucleótida (preferiblemente redox-silenciosa) sobre la monocapa autoensamblada en la superficie del electrodo, que provee una señal de fondo baja cuando se escudriña en presencia del mediador. La monocapa se pone en contacto entonces con una solución del ácido nucleico objetivo, que contiene la base preseleccionada. Si ocurre hibridación, el ácido nucleico objetivo estará en proximidad cercana al electrodo, y se detectará una mejora de corriente en presencia del mediador. Se puede utilizar una base alterna que sustituiría a la guanina (es decir, una base que, igual que guanina, fiene una afinidad de unión más grande para citosina que las otras bases en un ácido nucleico duplicado) en la cadena de sonda de oligonucleótidos pero no se oxidaría por el mediador bajo las condiciones de reacción aplicables. Cuando la base preseleccionada en el ácido nucleico objetivo es guanina y el ácido nucleico objetivo también contiene citosina (que normalmente se une con guanina en la sonda de oligonucleótidos) entonces la sonda contiene una base alterna que se une a citosina en el ácido nucleico híbridado. La base alterna puede ser inosina que es tres órdenes de magnitud menos reactiva electroquímicamente que la guanina. El paso de reacción comprende típicamente hacer reaccionar el complejo de metal de transición con el ácido nucleico bajo condiciones suficientes para efectuar la oxidación selectiva de la base preseleccionada sin oxidar la base alterna. Por consiguiente, un método para detectar un ácido nucleico objetivo, en donde el ácido nucleico objetivo contiene al menos una base preseleccionada, y la sonda de oligonucleótidos contiene bases inactivas de rédox alternas, comprende: (a) poner el contacto el ácido nucleico objetivo con una sonda de oligonucleótidos complementaria que se une específicamente al ácido nucleico objetivo para formar un ácido nucleico híbridado; (b) hacer reaccionar el ácido nucleico hibridado con un complejo de metal de transición capaz de oxidar la base preseleccionada en una reacción de oxidación-reducción; (c) detectar la reacción de oxidación-reducción; y (d) determinar la presencia o ausencia del ácido nucleico hibridado a partir de la reacción de oxidación-reducción en la base preseleccionada.

Cuantificación de ácidos nucleicos El método descrito anteriormente está particularmente bien adecuado para la detección cuantitativa de ácidos nucleicos. En el caso que se describe en esta sección, la velocidad constante para oxidación del ácido nucleico hibridado mediante el mediador (por ejemplo, Ru(bpy)32+) se puede determinar a partir del voltamograma cíclico mediante simulación digital. Bajo la mayoría de las condiciones, esta reacción obedecerá cinéticas de segundo orden, de manera que la velocidad =k[Ru(bpy)32+][ADN] en donde k es la constante de velocidad que es específica para el híbrido particular de sonda de olígonucleótidos-ácído nucleico objetivo, [Ru(bpy)32+] es la concentración de mediador, y [ADN] es la concentración del ácido nucleico hibridado (el cual podría ser un híbrido de ADN-ARN). Sí k y [Ru(bpy)32+] se conocen, entonces la cantidad del ácido nucleico hibridado se puede determinar. En la práctica, una curva de calibración para mejoras de corriente obtenidas con diferentes cantidades de soluciones estándar que contienen ácido nucleico objetivo se construye y la mejora de corriente se utiliza para obtener la cantidad de ácido nucleico hibridado directamente. Esta cantidad se relaciona después directamente con la cantidad de material que contiene ácido nucleico objetivo (por ejemplo organismo infeccioso en una muestra clínica). Consultar, e.g., M. Holodniy et al., 1995, J. Virol. 69, 3510-3516; J. Mellors et al., 1996, Science 272, 1167-1170.

Uso con proteínas La monocapa autoensamblada sobre la superficie de trabajo conductora de un electrodo también se puede utilizar para detección de biomoléculas diferentes a los ácidos nucleicos tales como proteínas utilizando la descripción de la invención presente junto con métodos de manipulación con proteínas conocidos para los expertos en la técnica. Como con los ácidos nucleicos, no se requiere marca de enzima para uso de la invención con otras biomoléculas. Por ejemplo, un método para detectar una proteína objetivo en una muestra comprende: (a) adherir una sustancia que une a proteína a una monocapa que se ha autoensamblado en una superficie de trabajo conductora; (b) poner en contacto la proteína objetivo con la sustancia de unión a proteína acoplada a la monocapa; (c) poner en contacto la proteína objetivo unida a la monocapa con una segunda sustancia de unión de proteína que se ha unido a una marca capaz de oxidarse en una reacción de oxidación-reducción; (d) hacer reaccionar la marca sobre la segunda sustancia de unión a proteína unida a la proteína objetivo con un complejo de metal de transición capaz de oxidar la marca en una reacción de oxidación-reducción; (e) detectar la reacción de oxidación-reducción; (f) determinar la presencia o ausencia de la proteína objetivo a partir de la reacción de oxidación-reducción detectada. Las características de la presente invención se entenderán más claramente mediante referencia a los siguientes ejemplos, los cuales no se deben considerar como limitantes de la invención.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Reactivos y ADN Los reactivos inorgánicos que se utilizaron en estos experimentos fueron de grado analítico o superior. Las fuentes de los reactivos son de la siguiente manera: carboxialquilfosfonatos elaborados de acuerdo con el ejemplo 2 o por Sigma Chemicals (St. Louís, MO) o Aldrich (Mílwaukee, Wl); 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), N-hidroxisuccinimida (NHS) y etanolamina (Sigma o Aldrich); [?-32P] adenosina trifosfato (ATP) (Pharmacia Biotech, Inc. Piscataway, NJ); agua (sistema de purificación Milli-Q Plus de Millípore, Bedford, MA); oligonucleótidos sintéticos (Oligos Etc., Inc. Wilsonvílle, OR); ácido 1-bromododecanoico, N,N'-dimetílformamida, y trietilfosfito (Sigma); cloruro de oxalilo, diclorometano, etanol anhidro, y trietilamina (Aldrich), y Na2HP04, BaH2PO4, NaCI y HCl concentrado (Fisher, Pittsbrugh, PA).

EJEMPLO 2 Método preferido de preparación de fosfonato de C-12 Aunque ciertos ácidos fosfónicos están disponibles comercialmente actualmente, por ejemplo, ácido aminopropilfosfónico y ácido 2-carboxietílfosfónico (Sigma o Aldrich), se prefiere utilizar un ácido fosfónico de carbono superior, tal como ácido 11 -carboxiundecanefosfónico (fosfonato de C-12). El fosfonato de C-12 se puede preparar de la siguiente manera: ácido bromododecanoico, 1.12g (4 mmoles) se disuelve en 10 mL de diclorometano en un matraz de fondo redondo de 50 mL. Se añade cloruro de oxalilo (2 mL de 2M) con agitación bajo una atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente y la reacción se inicia mediante la adición de 100 µl de N,N '-dimetilformamida (DMF). A uno o dos minutos después de empezar la reacción, 100 µL de DMF adicionales se añaden a la solución. Después de 15 minutos, se añaden 8 mL de diclorometano a la mezcla de reacción y continua la agitación bajo nitrógeno durante 15 minutos. El solvente se remueve entonces del intermediario de cloruro ácido con una corriente de nitrógeno. El intermediario de cloruro ácido es dísuelto inmediatamente en 10 ml de diclorometano y mientras se agita rápidamente, se añade etanol (350 µl) y trietílamina (835 µl). El pH de la solución cuando se prueba con papel de pH es de entre 7 y 8. La solución se agita durante una hora a temperatura ambiente. El solvente se evapora, y el producto se disuelve en 10 ml de hexano y se lava con 10 ml de agua. La fase de hexano se recupera y se evapora a sequedad para recuperar el intermediario de éster etílico. Triefilfosfito (1.5 ml) se añade al intermediario de éster etílico en un matraz de fondo redondo de 100 ml y la solución se somete a reflujo bajo nitrógeno. Después de 1.5 horas, se añade trietilfosfito adicional (1.5 ml) a la mezcla de reacción y se somete a reflujo bajo nitrógeno durante 4.5 horas. La mezcla de reacción se enfría a aproximadamente 50°C y se añade 13.2 ml de HCl concentrado. Después de reflujo durante 16 horas, la mezcla de reacción se pipetea en un vaso picudo de análisis y se añaden 5 ml de agua. Conforme la mezcla de reacción se enfría a temperatura ambiente, el producto de ácido 12-fosfonododecanoico se precipita fuera de la solución. El producto se recolecta mediante filtración, se lava con agua y se seca.

EJEMPLO 3 Preparación de monocapa sobre electrodos Electrodos ITO sobre vidrio (Delta Techologies, Stillwater, MN) de tamaño y forma deseada, por ejemplo, 15 mm x 15 mm cuadrados con una resistividad de 10 ohms/cuadrado y una capa ITO de 1400-1600 Angstroms de grueso con una sub-capa de 2000 Angstrom de Si02, se limpian antes de utilizarse y se dejan secar al aire. Los electrodos limpios y secos se exponen a un carboxialquilfosfonato seleccionado disuelto en un solvente orgánico (por ejemplo metanol o etanol) a temperatura ambiente. Se prefiere el metanol debido a que los carboxialquilfosfonatos son muy solubles y se auto-ensamblan bien del metanol. La concentración de carboxialquilfosfonatos está en la escala de mm-20 mm con 2-5 mm carboxialquílfosfonato preferido para proveer suficiente formación de monocapa. Los tiempos de auto-ensamble adecuados pueden variar de tres segundos a 20 horas con 30 minutos siendo preferido actualmente. El carboxialquilfosfonato no adherido se enjuaga de los electrodos ITO con tres lavados de agua y se deja secar los electrodos. Si hay insuficiente fosfonato, la monocapa se puede ordenar de manera deficiente y el grupo carboxilato puede no ser accesible para activación y adhesión de la sonda de olígonucleótidos. Un exceso de monocapa actúa como una barrera de electrón inhibiendo el movimiento del complejo de metal de transición desde el oligonucleótido a la superficie del electrodo. Además, un exceso de monocapa de carboxialquilfosfonato puede conducir a inhibición electrostática de unión de sonda de oligonucleótidos e hibridación de objetivo. La colocación de reactivos sobre la monocapa/electrodo ITO de la invención se estandariza como se conoce la técnica, por ejemplo, marcando el electrodo sobre el lado no conductivo.

EJEMPLO 4 Activación de monocapas sobre electrodo El electrodo ITO que tiene en el mismo la monocapa de acuerdo con el ejemplo 3 se expone a los compuestos de activación/acoplamiento 1-etíl-3-(3-dimet¡laminopropil)carbod¡imida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) en una relación molar de 4:1. La concentración de EDC está en la escala de 20-400 mm y la concentración de NHS está en la escala de 5-100 mm. Las concentraciones que se prefieren actualmente son 400 mM EDC y 100 mM NHS. Treinta microlitros de la solución de EDC/NHS se pipetean en cada electrodo ITO/monocapa y se incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente. La EDC/NHS no adherida se enjuaga de los electrodos ITO con tres lavados de agua y después los electrodos se dejan secar al aire.

EJEMPLO 5 Adhesión de sonda ADN Una sonda de oligonucleótidos con un enlazador de alquilamina sobre el extremo 3'- o 5' se acopla a la monocapa activada. La longitud de la alquílamina debe ser al menos de tres carbonos, y preferiblemente entre tres y doce carbonos con la longitud actualmente preferida siendo de seis carbonos. La sonda de oligonucleótidos (20 µl) a concentraciones de 20 a 10 µM en 1M NaC1/0.25 M NaHCO3, pH 9, se pipetea sobre la monocapa activada y se incuba a temperatura ambiente (aproximadamente 25°C durante 30 minutos).

La solución de sonda de oligonucleótidos se remueve y el electrodo se lava mediante inmersión en agua seguido por lavados en 0.1 M de solución reguladora de pH de fosfato de sodio pH, 7, 1.0 M NaCI y agua. El grado de adhesión de la sonda de oligonucleótídos a la monocapa se puede evaluar radioquímicamente mediante la adición de sonda de oligonucleótidos marcada 32P- a la mezcla de reacción. Los grupos carboxilo activados que no reaccionan con la sonda de oligonucleótidos se bloquean con etanolamina para reducir la unión no específica de objetivo. Los electrodos se sumergen en 0.1 M etanolamina, pH 8 a 25°C durante 20 minutos. La etanolamina se enjuaga de los electrodos con tres lavados de agua y los electrodos se dejan secar al aire. La concentración de sonda de oligonucleótídos, el pH, el tiempo de incubación, la temperatura y el agente de bloqueo pueden variar como será evidente para un experto en la técnica.

EJEMPLO 6 Exposición de electrodo a ácido nucleico objetivo Una ácido nucleico objetivo, con una secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria a una porción de la secuencia de sonda de oligonucleótidos, se permite hibridar a la sonda. Actualmente se utiliza un oligonucleótido sintético complementario que contiene 23 guaninas. El ácido nucleico objetivo (20 µl en 0.8 M NaCI y 0.5 M NaH2P04> pH 7.0) se pipetea sobre la sonda de olígonucleótidos/monocapa y se incuba a 25°C durante una hora. La solución de ácido nucleico objetivo se remueve y el electrodo se lava en agua seguido por lavados en 0.1 M NaH2P04, pH 7.0, 1.0 M NaCI y agua. Las condiciones de hibridación se pueden variar como será evidente para un experto en la técnica. El grado de hibridación del ácido nucleico objetivo a la sonda de oligonucleótidos se puede evaluar radioquímicamente mediante la adición de ácido nucleico objetivo marcado 32P- a la mezcla de reacción.

EJEMPLO 7 Electroquímica de electrodos El método actualmente preferido de interrogación electroquímica a los electrodos es voltametría cíclica, aunque los métodos de interrogación electroquímica tales como cronamperometría, cronocoulometría y voltametría escalonada también son útiles. La voltametría cíclica se realiza sobre cada electrodo ITO de la siguiente manera. Las velocidades de escudriñamiento adecuadas incluyen velocidades de escudriñamiento de 50 mV/s-5000 V/s con una velocidad de escudriñamiento preferida de 20 V/s. A esta velocidad de escudriñamiento, existe una señal máxima desde el ADN libre y una señal mínima desde el fondo. El potencial se barre primero en la dirección positiva, con un potencial de partida de 0 V y un potencial de conmutación entre 1.3 y 1.8 V dependiendo de la velocidad de escudriñamiento. Se utiliza una instalación de tres electrodos: un electrodo de referencia Ag/AgCI, un electrodo auxiliar de alambre Pt y un electrodo de trabajo ITO modificado de acuerdo con la invención. El electrodo ITO modificado se coloca en una celda electroquímica y 200 µl de 100 µM Ru(bpy)32+ en 50 mM de regulador de pH de fosfato de sodio (pH 7.0) se coloca arriba del electrodo modificado. El regulador de pH puede contener NaCI (generalmente hasta 1 M o como se desee para el sistema particular bajo estudio) lo cual en algunos casos incrementa la separación de señal. El electrodo de referencia y el electrodo Pt se colocan en la celda electroquímica en contacto con la solución de Ru(bpy)32+. La muestra se interroga, y los datos se recolectan, se almacenan y analizan.

EJEMPLO 8 Evaluación de formación de monocapa Las figuras 1a y 1 b muestran el efecto de tiempo de auto-ensamble sobre formación de monocapa como se indica por la cantidad de sonda de oligonucleótido que la monocapa es capaz de unir, en picomoles. La figura 1a es para tiempos de auto-ensamble de hasta 2 horas y la figura 1 b es para tiempos de hasta 90 horas. La cantidad de sonda de oligonucleótidos unida a la monocapa es una medida indirecta de formación de monocapa. Para fiempos de auto-ensamble de hasta 10 horas, el tiempo de auto-ensamble no parece que impacte sustancialmente la capacidad de la monocapa para unirse a la sonda de oligonucleótidos. Después de 20 horas de auto-ensamble, la capacidad de la monocapa para unirse a la sonda de oligonucleótidos cae dramáticamente. La cantidad de sonda de oligonucleótidos unida a la monocapa se descubrió que es constante para tiempos de incubación de 3 segundos a 10 horas. La formación de monocapas se evaluó como una función de la concentración de solución de fosfonato a la cual está expuesta el electrodo. Esta evaluación se condujo examinando corriente por arriba del fondo (separación de corriente) por pmol de guanina de la cadena de oligonucleótidos como se muestra en la figura 2. Las monocapas se formaron utilizando un tiempo de auto ensamble de 2 horas en todas las concentraciones y las mediciones electroquímicas se hicieron utilizando voltametría cíclica a 20 V/s y una concentración de Ru(bpy)32+ de 100 µM. La respuesta electroquímica se midió como µA de separación máxima sobre fondo por picomol de guanina acoplada a la monocapa. Las concentraciones del carboxialquilfosfonato de 12 carbonos en la solución de auto ensamble variaron de 0.1 a 20 mM. El efecto de la concentración de la solución de fosfonato fue mínimo. La estabilidad de las capas auto ensambladas con y sin oligonucleótídos se evaluó. En el día 0, la monocapa se auto ensambló sobre electrodos ITO y el oligonucleótido que contiene guanina se adhirió a 60% de los electrodos. Todos los electrodos se colocaron entonces en almacenamiento refrigerado. En los días 1 , 2, 3, 6 y 7 cinco electrodos (2 con monocapa únicamente y 3 con monocapa más olígonucleótídos) se seleccionaron y se analizaron electroquímicamente para determinar la señal generada. Las mediciones electroquímicas se hicieron utilizando voltametría cíclica a 20 V/s y una concentración de Ru(bpy)3 + de 100 µM. Las muestras se evaluaron para determinar el µA de la señal generada (corriente) sobre fondo por pmol de guanina en la cadena de oligonucleótidos adherida al electrodo. Durante los siete días no hubo cambio apreciable en la respuesta electroquímica, y por consiguiente, se encontró que las monocapas son estables más de 7 días bajo estas condiciones (figura 3).

EJEMPLO 9 Voltamograma cíclico de monocapa La figura 4 muestra la respuesta de dosis de electrodos de monocapa autoensamblados con diferentes cantidades de oligonucleótido adherido que contiene guanina. La cantidad de oligonucleótidos acoplados a la monocapa varió de 0.008 a 0.466 picomoles de cadena de oligonucleótidos sobre cada electrodo. El oligonucleótido fue un 34-mer sintético con 23 guaninas por cadena. Las mediciones electroquímicas se hicieron utilizando voltametría cíclica a 20 V/s y una concentración de Ru(bpy)32+ de 100 µM. Esta cantidad muestra que se puede diferenciar entre monocapas que tienen cantidades que difieren de oligonucleótidos adheridos. La señal (corriente) es proporcional al número de guaninas sobre cada electrodo.

La figura 5 es una representación gráfica de la figura 4, en donde el µA de la señal sobre el fondo vs. pmoles de guanina en la cadena de oligonucleótidos sobre cada electrodo está graficada. Las monocapas se prepararon las cuales tuvieron cantidades variables de oligonucleótídos y la respuesta electroquímica (µA de separación máxima sobre el fondo) se midió y gráfico como una función de la cantidad de guanina (en pico moles) en el oligonucleótido acoplado a la monocapa. La gráfica muestra la correlación directa entre la respuesta electroquímica y la cantidad de guanina.

EJEMPL0 10 Método alterno para inmovilizar oligonucleótidos por medio de carboxialquilfosfonatos Un método alterno para formar monocapas autoensambladas con oligonucleótidos adheridos es acoplar carboxialquilfosfonato al oligonucleótido antes de la formación de la monocapa autoensamblada. Un olígonucleótido con un enlazador de alquilamina sobre el extremo 3'- o 5' se añade a una solución de sulfóxido de dimetilo que contiene 0.005-1 mM carboxialquilfosfonato, 0.2 M 1-et¡l-3-(3-dimetilaminopropil) carbodíimida (EDC) y 0.05 M N-hidroxísuccinimida (NHS). El volumen final de la mezcla de reacción es de 100-200 µl y la concentración del oligonucleótído es de 20 µM. La mezcla de reacción se puede incubar durante 6-8 horas a 25°C. El oligonucleótido radio marcado se puede utilizar si el grado de adhesión de oligonucleótido-fosfonato al electrodo se va ha cuantificar. La mezcla de reacción (20 µl) que contiene el conjugado de carboxialquilfosfonato oligonucleótídos se pipetea sobre un electrodo ITO de vidrio y se incuba durante 2-4 horas a 25°C para permitir que se forme la monocapa. El material no adherido se remueve y el electrodo se lava en secuencia con agua, 0.1 M NaH2P04l pH 7.0, 1.0 M NaCI y agua. Generalmente, este método de acoplamiento del carboxialquílfosfonato al oligonucleótido produce productos heterogéneos que tienen uno o más grupos carboxialquilfosfonato adheridos al oligonucleótido, el sitio de adhesión principal siendo la alquilamína sobre el extremo 3'- o 5' del oligonucleótido, con otras aminas exocíclicas sobre las bases sirviendo como sitios de adhesión secundarios para el carboxialquilfosfonato. La adhesión al electrodo ITO y la hibridación de moléculas de ácido nucleico objetivo se puede impactar por qué tantos grupos de carboxialquilfosfonatos están presentes en los oligonucleótidos. Se pueden utilizar otros métodos para preparar productos de oligonucleótidos-fosfonato utilizando oligonucleótidos con grupos amino exocíclicos bloqueados de manera que únicamente un carboxíalquilfosfonato se adhiere a cada oligonucleótido por medio de la alquilamina sobre el extremo 5'- o 3'. Por ejemplo, una carbodiímina en una mezcla de solvente acuoso- no acuoso se puede utilizar para acoplar el carboxialquilfosfonato al oligonucleótido que está inmovilizado sobre esferas de vidrio después de síntesis y aún mantener los grupos protectores sobre las aminas exocíclícas.

Después de conjugación de los carboxialquilfosfonatos, los reactivos se pueden lavar fácilmente para producir un producto puro. El conjugado puro de carboxialquilfosfonato oligonucleótidos se adhiere preferiblemente a electrodos ITO disolviendo primero el conjugado en sulfóxido de dimefilo al 85-100%. El carboxialquílfosfonato libre se añade a la solución para dar una solución de alquilfosfonato que tiene una concentración de 5 µM-5 Mm. Esta mezcla (20 µl) se pipetea sobre un electrodo ITO de vidrio y se incuba durante 2-4 horas a 25°C para permitir que se forme la monocapa. El material no adherido se remueve, y el electrodo se lava secuencialmente con agua, 0.1 M de fosfato de sodio, pH 70 M NaCI, y agua. Aunque la invención se ha descrito con referencia a modalidades específicas, se apreciará que numerosas variaciones, modificaciones y modalidades son posibles, y de acuerdo con esto, todas estas variaciones, modificaciones y modalidades se deben considerar como que están dentro del espíritu y alcance de la invención.

Claims (3)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Un electrodo caracterizado porque comprende: a) un substrato que tiene una superficie de trabajo conductiva en el mismo; y b) una monocapa autoensamblada no conductiva sobre dicha superficie de trabajo conductiva, dicha monocapa comprende moléculas de fosfonato que tienen por lo menos un grupo fosfonato y al menos un grupo Ri, en la cual el grupo Ri está unido de manera covalente a un miembro de un par de unión, y a través de cuya monocapa un complejo de metal de transición se puede mover libremente a partir de reactivos inmovilizados sobre la monocapa a la superficie de trabajo conductiva para transferir electrones a la superficie de trabajo conductiva; en donde las moléculas de fosfonato comprenden un carboxialquílfosfonato; con la condición de que los carboxialquílfosfonatos tengan grupos alquilo de C5 o menos están excluidos del mismo. 2.- El electrodo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el carboxíalquilfosfonato es ácido 11-carboxiundecano fosfónico. 3.- El electrodo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la superficie de trabajo conductiva comprende una superficie ITO. 4.- El electrodo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el grupo Ri está acoplado al miembro del par de unión antes de la formación de la monocapa autoensamblada. 5.- El electrodo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el miembro de par de unión comprende una sonda de oligonucleótidos. 6.- El electrodo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el miembro del par de unión comprende una sustancia de unión a proteína. 7 - El electrodo de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque la sustancia de unión a proteína comprende una proteína. 8.- El electrodo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el grupo R-i se ha activado con un agente de acoplamiento. 9.- El electrodo de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque el agente de acoplamiento comprende una carbodiimida. 10.- El electrodo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el substrato se selecciona del grupo consistente de substratos metálicos y substratos no metálicos. 11.- Un aparato caracterizado porque comprende: a) un envase de muestra para contener una muestra de fluido; b) un electrodo, que comprende un substrato que tiene una superficie de trabajo conductiva en el mismo; y una monocapa autoensamblada no conductiva sobre dicha superficie de trabajo conductiva, dicha monocapa comprende moléculas de fosfonato que tienen al menos un grupo fosfonato y al menos un grupo R-i, en la cual el grupo R-\ está unido de manera covalente a un miembro de un par de unión, a través de dicha monocapa se puede mover libremente un complejo de metal de transición a partir de reactivos inmovilizados a la superficie de trabajo conductiva para transferir electrones a la superficie de trabajo conductiva; en el cual las moléculas de fosfonato comprenden un carboxialquilfosfonato; con la condición de que los carboxialquilfosfonatos tengan grupos alquilo de C5 o menores están excluidos de la misma; y c) un potentiostato en comunicación electrónica con el electrodo. 12.- El aparato de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque el miembro del par de unión comprende una sonda de oligonucleótidos. 13.- El aparato de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado además porque el miembro del par de unión comprende una sustancia de unión a proteína. 14.- Una monocapa autoensamblada no conductiva sobre un substrato, caracterizada porque comprende moléculas de fosfonato que tienen al menos un grupo fosfonato y al menos un grupo R-i, en la cual el grupo Ri está unido de manera covalente a un miembro de un par de unión; en el cual las moléculas de fosfonato comprenden un carboxialquilfosfonato; con la condición de que los carboxialquilfosfonatos que tienen grupos alquilo de C5 o menores están excluidos de la misma. 15.- La monocapa autoensamblada de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque el carboxialquilfosfonato es ácido 11 -carboxíundecano fosfónico. 16.- La monocapa autoensamblada de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque el substrato tiene una superficie de trabajo conductiva que comprende una superficie ITO. 17.- La monocapa autoensamblada de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque el grupo Ri está acoplado al miembro del par de unión antes del ensamble de la monocapa autoensamblada. 18.- La monocapa autoensamblada de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque el miembro del par de unión comprende una sonda de oligonucleótidos. 19.- La monocapa autoensamblada de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada además porque el miembro del par de unión comprende una sustancia de unión a proteína. 20.- La monocapa autoensamblada de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada además porque la sustancia de unión a proteína comprende una proteína. 21.- La monocapa autoensamblada de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque el grupo Ri está activado con un agente de acoplamiento antes de unirse de manera covalente al miembro del par de unión. 22.- La monocapa autoensamblada de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizada además porque el agente de acoplamiento comprende una carbodiimida. 23.- La monocapa autoensamblada de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada además porque el substrato se selecciona del grupo consistente de substratos metálicos y substratos no metálicos. 24.- Un método para determinar la presencia de un objetivo que lleva una marca en una muestra, caracterizado porque comprende: a) poner en contacto una monocapa autoensamblada no conductiva sobre un electrodo que tiene una superficie de trabajo conductiva, dicha monocapa comprende moléculas de fosfonato que tienen al menos un grupo fosfonato y al menos un grupo R-i unidos de manera covalente a un miembro de un par de unión, y a través de cuya monocapa un complejo de metal de transición se puede mover libremente desde reactivos inmovilizados sobre la monocapa a la superficie de trabajo conductiva para transferir electrones a la superficie de trabajo conductiva, con una muestra que se sospecha que contiene un objetivo que lleva una marca, que es capaz de oxidarse en una reacción de oxidación-reducción, de manera que el miembro inmovilizado del par de unión y el objetivo, si están presentes, forman un complejo objetivo sobre la monocapa; en donde las moléculas de fosfonato comprenden un carboxialquilfosfonato; con la condición de que los carboxialquílfosfonatos que tienen grupos alquilo de C5 o menos estén excluidos de la misma; b) poner en contacto la monocapa y el complejo objetivo, si están presentes, con un complejo de metal de transición capaz de oxidar el objetivo que lleva la marca en una reacción de oxidación-reducción; c) detectar la reacción de oxidación-reducción; y d) determinar la presencia o ausencia del objetivo a partir de la reacción de oxidación-reducción detectada. 25.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque el complejo de metal de transición es Ru(bpy)32+ y la reacción de oxidación-reducción detectada es oxidación de guanina. 26.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque el carboxialquilfosfonato es ácido 11-carboxíundecano fosfónico. 27.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque el objetivo que lleva marca se selecciona del grupo consistente de ácidos nucleicos, proteínas y carbohidratos. 28.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque la superficie de trabajo conductiva comprende una superficie ITO. 29.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque el objetivo que lleva marca es un ácido nucleico que contiene guanina y el miembro inmovilizado del par de unión es una sonda de oligonucleótido hidrolizable con dicho objetivo para formar un complejo objetivo hibridado. 30.- El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque comprende adicionalmente amplificar el ácido nucleico objetivo para producir una solución de ácido nucleico amplificado antes de poner en contacto la monocapa autoensamblada con el objetivo. 31.- El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque la amplificación se lleva a cabo mediante un método seleccionado del grupo consistente en reacción de cadena de polimerasa, amplificación por desplazamiento de cadena, reacción de cadena de ligasa, y amplificación a base de secuencia de ácido nucleico. 32.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque el elemento del par de unión comprende una sonda de oligonucleótido. 33.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque el elemento del par de unión comprende una sustancia de unión a proteína. 34.- El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque la sustancia de unión a proteína comprende una proteína. 35.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque la muestra se selecciona del grupo consistente en: oligonucleótidos sintéticos o naturales, muestras quirúrgicas, muestras utilizadas para diagnósticos médicos, muestras utilizadas para pruebas genéticas, muestras de medio ambiente, muestras de cultivos celulares, muestras de alimentos, muestras dentales y muestras veterinarias. 36.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque antes del paso (a) el grupo R-i se unió de 5 manera covalente a un elemento de un par de unión y las moléculas de fosfonato resultantes se aplicaron entonces al electrodo. 37.- Un método para determinar la presencia de un objetivo que lleva una marca en una muestra, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto un electrodo que tiene una superficie de trabajo conductiva con 10 moléculas de fosfonato que tienen al menos un grupo fosfonato y al menos un grupo R-i, en el cual el grupo R-i está unido de manera covalente a un elemento de un par de unión o es capaz de unirse de manera covalente a un elemento de un par de unión, para formar una monocapa autoensamblada no conductiva sobre dicho electrodo, a través de cuya monocapa un complejo de 15 metal de transición se puede mover libremente desde reactivos inmovilizados sobre la monocapa a la superficie de trabajo conductiva para transferir electrones a la superficie de trabajo conductiva; en el cual las moléculas de fosfonato comprenden un carboxialquilfosfonato; con la condición de que los carboxialquilfosfonatos que tienen grupos alquilo de C5 o menos están 20 excluidos de la misma; (b) unir el grupo Ri al elemento del par de unión sí es que no está ya unido al activar el grupo R-i con un agente de acoplamiento y poniendo en contacto el grupo Ri con un elemento de un par de unión capaz de unirse a un objetivo para inmovilizar el elemento del par de unión; (c) poner m**á * * * ** en contacto la monocapa autoensamblada que tiene el elemento del par de unión inmovilizado en la misma con una muestra que se sospecha que contiene un objetivo que lleva una marca que es capaz de oxidarse en una reacción de oxidación-reducción, de manera que el elemento inmovilizado del par de unión y el objefivo forman un complejo objetivo sobre la monocapa; (d) poner en contacto la monocapa y el complejo objetivo, si está presente, con un complejo de metal de transición capaz de oxidar el objetivo que lleva la marca en una reacción de oxidación-reducción; (e) detectar la reacción de oxidación-reducción; y (f) determinar la presencia o ausencia del objetivo a partir de la reacción de oxidación-reducción detectada. 38.- El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque el complejo de metal de transición es Ru(bpy)32+ y la reacción de oxidación-reducción detectada es oxidación de guanina. 39.- El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado además porque el carboxialquilfosfonato es ácido 11-carboxiundecanfosfoníco ácido. 40.- El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque el objetivo que lleva una marca se selecciona del grupo consistente en ácidos nucleicos, proteínas y carbohidratos. 41.- El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque la superficie de trabajo conductiva comprende una superficie ITO. 42.- El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque el objetivo que lleva marca es un ácido nucleico que contiene guanina y el elemento inmovilizado del par de unión es una sonda de oligonucleótido que se puede hibridar con dicho objetivo para formar un complejo objetivo hibridado. 43.- El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado además porque comprende adicionalmente amplificar el ácido nucleico objetivo para producir una solución de ácido nucleico amplificado antes de poner en contacto la monocapa autoensamblada con el objetivo. 44.- El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado además porque la amplificación se lleva a cabo mediante un método seleccionado del grupo consistente en reacción de cadena de polimerasa, amplificación de desplazamiento de cadena, reacción de cadena de ligasa, y amplificación de secuencia de bases de ácido nucleico. 45.- El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque el elemento del par de unión comprende una sonda de oligonucleótido. 46.- El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque el elemento de par de unión comprende una sustancia de unión a proteína. 47.- El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado además porque la sustancia de unión a proteína comprende una proteína. 48.- El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque el agente de acoplamiento comprende una carbodiimida. 49.- El método de conformidad con la reivindicación 37, 5 caracterizado además porque la muestra se selecciona del grupo consistente en: oligonucleótidos sintéticos o naturales, muestras quirúrgicas, muestras utilizadas para diagnósticos médicos, muestras utilizadas para pruebas genéticas, muestras de medio ambiente, muestras de cultivos celulares, muestras de alimentos, muestras dentales y muestras veterinarias. 10 50.- Un método para preparar una monocapa autoensamblada sobre un electrodo, caracterizado porque comprende: (a) proveer un sustrato que tiene una superficie de trabajo conductiva; (b) proveer moléculas de fosfonato que tienen al menos un grupo fosfonato y al menos un grupo R-i, en el cual el grupo R-i es capaz de unión covalente con un elemento de un par de 15 unión, en el cual dicha monocapa autoensamblada es no conductiva y un complejo de metal de transición se puede mover libremente a través de la monocapa desde reactivos inmovilizados sobre la monocapa a la superficie de trabajo conductiva para transferir electrones a la superficie de trabajo conductiva; en el cual las moléculas de fosfonato comprenden un 20 carboxialquilfosfonato; con la condición de que los carboxíalquilfosfonatos que tienen grupos alquilo de C5 o menos sean excluidos de la misma; y (c) poner en contacto el sustrato con las moléculas de fosfonato para formar una monocapa autoensamblada. ^^^^u^ 51.- El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado además porque el carboxíalquilfosfonato es ácido 11-carboxiundecanfosfónico. 52.- El método de conformidad con la reivindicación 51 , caracterizado además porque la superficie de trabajo comprende una superficie ITO. 53.- El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado además porque el grupo Ri está acoplado al elemento del par de unión antes de la formación de la monocapa autoensamblada. 54.- El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado además porque el elemento del par de unión comprende una sonda de oligonucleótido. 55.- El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado además porque el elemento del par de unión comprende una sustancia de unión a proteína. 56.- El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado además porque la sustancia de unión a proteína comprende una proteína. 57.- El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado además porque comprende adícionalmente activar el grupo R-i con un agente de acoplamiento. 58.- El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado además porque el agente de acoplamiento comprende una carbodiimida. 59.- Un método para inmovilizar un miembro de un par de unión sobre una superficie de electrodo, que comprende: (a) proveer un electrodo que tiene una superficie de trabajo conductiva; (b) exponer la superficie a moléculas de fosfonato seleccionadas bajo condiciones conductivas para formar una monocapa autoensamblada no conductiva sobre dicha superficie, dichas moléculas de fosfonato tienen al menos un grupo fosfonato y al menos un grupo Ri, en el cual el grupo Ri es capaz de unión covalente con un miembro de un par de unión, y a través de cuya monocapa un complejo de metal de transición se puede mover libremente desde reactivos inmovilizados sobre la monocapa a la superficie de trabajo conductiva para transferir electrones a la superficie de trabajo conductiva; en la cual las moléculas de fosfonato comprenden un carboxialquilfosfonato; con la condición de que los carboxialquilfosfonatos que tienen grupos alquilo de C5 o menos están excluidos del mismo; (c) activar el grupo R-i con un agente de acoplamiento; y (d) poner en contacto la monocapa autoensamblada con el miembro del par de unión. 60.- El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado además porque el carboxíalquilfosfonato es ácido 11-carboxiundecanofosfónico. 61.- El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado además porque la superficie de trabajo conductiva comprende una superficie ITO. 62.- El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado además porque el grupo R-i se acopla al miembro del par de unión antes de la formación de la monocapa autoensamblada. 63.- El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado además porque el miembro del par de unión comprende una sonda de oligonucleótido. 64.- El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado además porque el miembro del par de unión comprende una sustancia de unión a proteína. 65.- El método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado además porque la sustancia de unión a proteína comprende una proteína. 66.- El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado además porque el agente de acoplamiento comprende una carbodiimida. 67.- Un método para determinar la presencia de un ácido nucleico objetivo en una muestra, que comprende: (a) proveer una monocapa autoensamblada no conductiva sobre un electrodo que tiene una superficie de trabajo conductiva, dicha monocapa comprende moléculas de fosfonato que tiene al menos un grupo fosfonato y al menos un grupo Ri unido de manera covalente a una sonda de oligonucleótido, y a través de cuya monocapa un complejo de metal de transición se puede mover libremente desde reactivos inmovilizados sobre la monocapa a la superficie de trabajo conductiva para transferir electrones a la superficie de trabajo conductiva; en el cual las moléculas de fosfonato comprenden un carboxialquilfosfonato; con la condición de que los carboxialquilfosfonatos que tienen grupos alquilo de C5 o menos están excluidos del mismos; (b) poner en contacto la monocapa autoensamblada que tiene la sonda de oligonucleótidos inmovilizada en la misma con una muestra que se sospecha que contiene ácido nucleico objetivo que es capaz de oxidarse en una reacción de oxidación-reducción de manera que la sonda de oligonucleótido inmovilizada y el ácido nucleico objetivo, si está presente, forman un complejo objetivo sobre la monocapa; (c) poner en contacto la monocapa y el complejo objetivo, si está presente, con un complejo de metal de transición capaz de oxidar el ácido nucleico objetivo en una reacción de oxidación-reducción; (d) detectar la reacción de oxidación-reducción; y (e) determinar la presencia o ausencia del ácido nucleico objetivo a partir de la reacción de oxidación-reducción detectada. 68.- El método de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado además porque el complejo de metal de transición es Ru(bpy)32+ y se detecta oxidación de guanina. 69.- El método de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado además porque el carboxialquilfosfonato es ácido 11-carboxiundecanofosfónico. 70.- El método de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado además porque la superficie de trabajo conductiva comprende una superficie ITO. 71.- El método de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado además porque el grupo R-i está acoplado al miembro del par de unión antes de la formación de la monocapa autoensamblada. 72.- El método de conformidad con la reivindicación 67, que comprende adicionalmente amplificar el ácido nucleico objetivo para producir una solución de ácido nucleico amplificado antes de poner en contacto la monocapa autoensamblada con el objetivo. 73.- El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado además porque la amplificación se lleva a cabo mediante un método seleccionado del grupo consistente de reacción de cadena de polimerasa, amplificación de desplazamiento de cadena, reacción de cadena de ligasa, y amplificación a base de secuencia de ácido nucleico. 74.- El método de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado además porque la muestra se selecciona del grupo consistente de: olígonucleótidos sintéticos o naturales, muestras quirúrgicas, muestras utilizadas para diagnósticos médicos, muestras utilizadas para pruebas genéticas, muestras de medio ambiente, muestras de cultivo celular, muestras de alimentos, muestras dentales y muestras veterinarias. 75.- Un método para determinar la presencia de una proteína objetivo en una muestra, que comprende: (a) proveer una monocapa autoensamblada no conductiva sobre un electrodo que tiene una superficie de trabajo conductiva, dicha monocapa comprende moléculas de fosfonato que tienen al menos un grupo fosfonato y al menos un grupo Ri unidos de manera covalente a una sustancia de unión a proteína, y a través de cuya monocapa un complejo de metal de transición se puede mover libremente desde reactivos inmovilizados sobre la monocapa a la superficie de trabajo conductiva para transferir electrones a la superficie de trabajo conductiva; en el cual las moléculas de fosfonato comprenden un carboxialquilfosfonato; con la condición de que los carboxialquilfosfonatos que tienen grupos alquilo de C5 o menos están excluidos del mismo; (b) poner en contacto la monocapa autoensamblada que tiene la superficie de unión a proteína inmovilizada en la misma con una muestra que se sospecha que contiene una proteína objetivo; (c) poner en contacto la proteína objetivo unida a la monocapa, si está presente, con una segunda sustancia de unión a proteína la cual tiene unida una marca capaz de oxidarse en una reacción de oxidación-reducción de manera que la sustancia de unión a proteína y la proteína objetivo, si está presente, forma un complejo objetivo sobre la monocapa; (d) poner en contacto la monocapa y el complejo objetivo, sí está presente, con un complejo de metal de transición capaz de oxidar la marca en una reacción de oxidación-reducción; (e) detectar la reacción de oxidación-reducción; y (f) determinar la presencia o ausencia de la proteína objetivo a partir de la reacción de oxidación-reducción detectada. 76.- El método de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado además porque la marca comprende un olígonucleótído. 77.- El método de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado además porque la sustancia de unión a proteína es una proteína. 78.- El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado además porque el carboxialquilfosfonato es ácido 11-carboxiundecano fosfónico. 79.- El método de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado además porque la superficie de trabajo conductiva comprende una superficie ITO. 80.- El método de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado además porque la muestra se selecciona del grupo consistente de oligonucleótidos sintéticos o naturales, muestras quirúrgicas, muestras utilizadas para diagnóstico médico, muestras utilizadas para prueba genética, muestras de medio ambiente, muestras de cultivo celular, muestras de alimentos, muestras dentales y muestras dentales y muestras veterinarias. 81.- Un método para determinar la presencia de una proteína objetivo en una muestra, que comprende: (a) proveer una monocapa autoensamblada no conductiva sobre un electrodo que tiene una superficie de trabajo conductiva, dicha monocapa comprende moléculas de fosfonato que tienen al menos un grupo fosfonato y al menos un grupo Ri unidos de manera covalente a una sustancia de unión a proteína, y a través de cuya monocapa 84.- El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el carboxialquilfosfonato es ácido 11-carboxiundecano fosfónico. 85.- El método de conformidad con la reivindicación 81 , caracterizado además porque la superficie de trabajo conductiva comprende una superficie ITO. 86.- La molécula de fosfonato que tiene al menos un grupo fosfonato y al menos un grupo Ri unido de manera covalente a un miembro de un par de unión; en el cual la molécula de fosfonato comprende un carboxialquilfosfonato; con la condición de que carboxialquilfosfonatos que tienen grupos alquilo de C5 o menos están excluidos del mismo. 87.- La molécula de fosfonato de conformidad con la reivindicación 86, caracterizado porque el carboxíalquilfosfonato es ácido 11-carboxiundecano fosfónico. 88.- La molécula de fosfonato de conformidad con la reivindicación 86, caracterizada además porque el miembro del par de unión comprende una sonda de oligonucleótido. 89.- La molécula de fosfonato de conformidad con la reivindicación 86, caracterizada además porque el miembro del par de unión comprende una sustancia de unión a proteína. 90.- La molécula de fosfonato de conformidad con la reivindicación 89, caracterizada además porque la sustancia de unión a proteína comprende una proteína.