MXPA97009310A - Secuencia de adn de un gen de la hidroxifenil-piruvato- dioxigenasa y obtencion de plantas que contienen un gen de la hidroxifenil-piruvato-dioxigenasa, tolerantes a ciertos herbicidas - Google Patents

Abstract

Se describe una secuencia de ADN de un gen de la hidroxifenil-piruvato-dioxigenasa, y la obtención de plantas que contienen un gen de la hidroxifenil-piruvato dioxigenasa, resistentes a los herbicidas. La secuencia de ADN de un gen de la hidroxifenil-piruvato-dioxigenasa;el aislamiento a partir de una bacteria o de una planta;la utilización para la obtención de plantas tolerantes a los herbicidas.

Description

SECUENCIA DE ADN DE UN GEN DE LA HIDROXIFENIL-PIRUVATO- DIOXIGENASA Y OBTENCIÓN DE PLANTAS QUE CONTIENEN UN GEN DE LA HIDROXIFENIL -PIRUVATO-DIOXIGENASA, TOLERANTES A CIERTOS HERBICIDAS.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un gen de la hidroxifenil-piruvato-dioxigenasa (HPPD) , un gen quimérico que contiene este gen como " secuencia codificante, y su utilización para la obtención de plantas resistentes a ciertos herbicidas. Se conocen ciertos herbicidas tales como los isoxazoles descritos principalmente en las solicitudes de Patente Francesa Nos. 95 06800 y 95 13570 y principalmente el isoxaflutol, herbicida selectivo del maiz, los dicetonitrilos tales como aquellos descritos en las solicitudes Europeas 0 496 630, 0496 631, en particular la 2-ciano-3-ciclopropil-l- (2-S02CH3-4-CF3-fenil) -propan-1, 3-diona y la 2-ciano-3-ciclopropil-l- (2- SO-CH3-2, 3-Cl2-fenil) -propan-1, 3-diona, las tricetonas descritas en las solicitudes Europeas 0 625 505 y 0 625 508, en particular la sulcotriona. No obstante, ningún gen de tolerancia a tales herbicidas ha sido aun descrito. REF: 26299 La hidroxifenil-piruvato-dioxigenasa es una enzima que cataliza la reacción de transformación del parahidroxifenil-piruvato en homogentisato . Por otro lado, la secuencia de aminoácidos de la hidroxifenil-piruvato-dioxigenasa proveniente de Pseudomonas sp . P.J 874 ha sido descrita, sin que haya existido descripción de su papel en la tolerancia de las plantas a los herbicidas (Rüestschi y colaboradores: Eur. J. Biochem 205, 459-466, 1992) . Este documento no da descripción del gen que codifica para esta proteina. Se ha descubierto ahora la secuencia de un gen de este tipo y que una secuencia tal podria, una vez incorporada en las células vegetales, proporcionar una sobreexpresión o una activación de la HPPD en las plantas, confiriendo a estas últimas una tolerancia interesante contra ciertos herbicidas recientes, tales como aquellos de la familia de los iosaxoles o aquellos de las tricetonas. La presente invención tiene por objetivo una secuencia de ADN de un gen de origen no humano y de un origen bacteriano no marino, o incluso de un gen vegetal, aislado, o una secuencia que puede hibridarse con esa secuencia aislada, caracterizada porque ésta expresa una hidroxifenil-piruvato-dioxigenasa (HPPD) .

Más particularmente, la secuencia puede ser de origen bacteriano, principalmente tal como el género Pseudomona s o incluso de origen vegetal, principalmente de las plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas, principalmente de Arabi dopsi s o las umbelíferas como por ejemplo la zanahoria (Da ucus carot ta ) . Ésta puede ser nativa o silvestre o eventualmente mutada siempre conservando fundamentalmente una propiedad de tolerancia herbicida contra los inhibidores de HPPD, tales como los herbicidas de la familia de los isoxasoles o de aquellas de las tricetonas. La invención comprende igualmente un procedimiento de aislamiento del gen anteriormente mencionado, caracterizado porque: - se eligen, como cebadores, cualesquiera oligonucleótidos provenientes de la secuencia de aminoácidos de una HPPD, - a partir de estos cebadores, se sintetizan los fragmentos de amplificación por PCR - se aisla en gen mediante creación y selección de un banco genómico y - se clona el gen. De preferencia, se utilizan cebadores provenientes de la secuencia de HPPD de una bacteria del género de Pseudomonas . De manera particularmente preferida, éstos son provenientes de Pseudomonas fl uorescens . La invención tiene incluso por objetivo la utilización de un gen que codifica para la HPPD en un procedimiento para la transformación de plantas, como el gen marcador o como secuencia codificante que permite conferir a la planta una tolerancia a ciertos herbicidas. Éste puede ser igualmente utilizado en asociación con otros genes marcadores y/o secuencia codificante para una propiedad agronómica. El gen codificante puede ser de cualquier origen, nativo o silvestre, o eventualmente imitado siempre conservado fundamentalmente una propiedad de tolerancia herbicida contra los inhibidores de la HPPD, tales como los herbicidas de la familia de los isoxasoles o aquellas de las tricetonas. Como secuencia codificante se puede utilizar principalmente aquella de acuerdo a la invención tal como se describe anteriormente . La transformación de las células vegetales puede ser obtenida mediante cualquier medio conocido, apropiado. Una serie de métodos consiste en bombardear las células o los protoplastos con partículas a las cuales están ancladas o unidas las secuencias de ADN.

Otra serie de métodos consiste en utilizar como medio de transferencia en la planta, un gen quimérico insertado en un plásmido Ti de Agrobac t eri um t umefaci ens o Ri de Agroba c t eri um rhi zogenes . La presente invención tiene incluso por objetivo un gen quimérico que comprende, en el sentido de la transcripción, al menos una secuencia de regulación promotora, una secuencia codificante heteróloga que expresa la hidroxifenil-piruvato-dioxigenasa y al menos una secuencia de regulación ter inadora o de poliadenilación. Como secuencia de regulación promotora, se puede utilizar cualquier secuencia promotora de un gen que se expresa naturalmente en las plantas, en particular un promotor de origen bacteriano, viral o vegetal tal como, por ejemplo, aquel de un gen de la pequeña subunidad de ribulosa-biscarboxilasa (RuBisCo) o de aquel de un gen de la a-tubulina (solicitud Europea EP No. 0 652 286), o incluso de un gen de virus de planta tal como, por ejemplo, aquel del mosaico de coliflor (CAMV 195 o 35S) , pero puede ser utilizado cualquier promotor conveniente, conocido. De preferencia, se ha recurrido a una secuencia de regulación promotora que favorece la sobreexpresión de la secuencia codificante, tal como por ejemplo, aquella que comprenda al menos un promotor de histona tal como se describe en la solicitud europea EP 0507698. De acuerdo a la invención se pueden igualmente utilizar, en asociación con la secuencia de regulación promotora, otras secuencias de regulación, que están situadas entre el promotor y la secuencia codificante, tales como los activadores de la transcripción "aumentadores", como por ejemplo el activador de la traducción del virus de la roya del tabaco, (TEV) descrito en la solicitud WO87/07644, o péptidos de tránsito, ya sea simples, o bien dobles, y en este caso, eventualmente separados por una secuencia intermediaria, es decir que comprende, en el sentido de la transcripción, una secuencia que codifica para un péptido de tránsito de un gen vegetal que codifica para una enzima para localización plastidial, una parte de secuencia de la parte madura N-terminal de un gen vegetal que codifica para una enzima de localización plastidial, después de una secuencia que codifica para un segundo péptido de tránsito de un gen vegetal que codifica para una enzima de localización plastidial, constituida de una parte de secuencia de la parte madura N-terminal de un gen vegetal que codifica para una enzima de localización plastidial, tal como se describe en la solicitud europea No. 0 508 909.

Como secuencia de regulación terminadora o de poiiadenilación, se puede utilizar cualquier secuencia correspondiente de origen bacteriano, como por ejemplo el terminador nos de Agrobact eri um t umefaci ens, o incluso de origen vegetal, como por ejemplo un terminador de histona tal como se describe en la solicitud europea EP No. 0 633 317. La presente invención tiene incluso por objetivo las células vegetales, de plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas, principalmente de cultivos, transformadas de acuerdo a uno de los procedimientos descritos anteriormente, y que contienen en su genoma una cantidad eficaz de un gen que expresa la hidroxifenil-piruvato-dioxigenasa (HPPD) . Se ha observado que las plantas transformadas de esta manera presentan una tolerancia importante a ciertos herbicidas recientes, tales como los isoxasoles descritos principalmente en las solicitudes de patente francesa Nos. 95 06800 y 95 13570 y principalmente del 4-[4-CF3-2- (metilsulfonil) benzoil] -5-ciclopropil-isoxasol, y principalmente el isoxaflurotol, herbicida selectivo del maiz, los dicetonitrilos tal como aquellos descritos en las solicitudes europeas 0 496 639, 0 496 631, en particular 2-ciano-3-ciclopropil-l- (2-S02CH3-4-CF3fenil ) -propan-1 , 3-diona y la 2-ciano-3-ciclopropil-l- (2-SO-CH3- 4-2,3-Cl -fenil) -propan-1, 3-diona, las tricetonas descritas en las solicitudes europeas 0 625 505 y 0 625 508, en particular la sulcotriona. La invención tiene finalmente por objetivo un procedimiento de desyerbado de plantas, principalmente de cultivos, con la ayuda de un herbicida de este tipo, caracterizado porque se aplica este herbicida sobre plantas transformadas de acuerdo a la invención, tanto en presiembra, en pretoma de muestra como en post-toma de muestra del cultivo. La invención tiene incluso por objetivo la utilización del gen HPPD como gen marcador en el curso del ciclo "transformación-regeneración" de una especie vegetal y selección sobre el herbicida anteriormente mencionado. Los diferentes aspectos de la invención serán comprendidos mejor con la ayuda de los ejemplos experimentales siguientes.

Ejemplo 1: Aislamiento del gen del HPPD de P. fl uorescens A32.

A partir de la secuencia de aminoácidos de la HPPD de Pseudomonas sp . P.J. 874 (publicado por Rüetschi u y colaboradores 1992, Eur. J. Biochem. 205: 459-466), se deduce la secuencia de diferentes oligonucleótidos para amplificar mediante PCR una parte de la secuencia codificante de HPPD de P . fl uorescens A32 (aislado por McKellar, R.C. 1982, J. Appl Bacteriol. 53:305-316). Un fragmento de amplificación del gen de esta HPPD ha sido utilizado para seleccionar un banco genómico parcial de P . fl uorescens A32, y asi aislar el gen que codifica para esta enzima.

A) Preparación del ADN genómico de P fl uorescens A32.

La bacteria ha sido cultivada en 40 ml de medio minimo M63 (KH2P04 13.6 g/1, (NH4)2S04 0.2 g/1, MgS04 0.2 g/1, FeSC 0.005 g/1 pH 7 más L-tirosina 10 mM como única fuente de carbono) a 28° C durante 48 horas. Después del lavado, las células son recogidas en 1 ml de amortiguador de lisis (tris-HCl 100 mM pH 8.3, NaCl 1.4 M y EDTA 10 mM) e incubadas 10 minutos a 65°C. Después de un tratamiento con fenol/cloroformo (24/1) y un tratamiento con cloroformo, los ácidos nucleicos son precipitados mediante la adición de un volumen de isopropanol, y después se recogen en 300 µl de agua estéril y se tratan con la ARNasa 10 µm/ml final. El ADN es nuevamente tratado con fenol/cloroformo, con cloroformo y se vuelve a precipitar mediante la adición de 1/10 en volumen de acetato de sodio 3M pH 5, y 2 volúmenes de etanol. El ADN es enseguida recogido en agua estéril y dosificado.

B) Elección de los oligonucleótidos y síntesis.

A partir de la secuencia de aminoácidos de la HPPD de Pseudomona s sp P.J. 874 se eligen cinco oligonucleótidos, dos dirigidos en el sentido NH2 terminal de la proteina hacia el extremo COOH de la próteina, y tres dirigidos en el sentido inverso (ver figura 1) . La elección ha sido dictada por las dos reglas siguientes: - un extremo 3' del oligonucleótido estable, es decir al menos dos bases sin ambigüedad. - una degeneración lo más débil posible. Los oligonucleótidos elegidos tienen las secuencias siguientes: Pl 5'TA(C/T)GA(G/A)AA(C/T) CCIATGGG3' P2 5'GA(G/A)ACIGGICCIATGGA3' P3 5'AA(C/T)TGCATIA(G/A) (G/A) AA (C/T) TC (C/T) TC3' P4 5'AAIGCIAC (G/A) TG(C/T) TG ( T/G/A) ATICC3 ' P5 5'GC(C/T) TT(A/G)AA(A/G) TTICC (C/T) TCICC3 ' Éstos han sido sintetizados sobre el sintetizador "Clyclone plus DNA Synthesizer" de marca MILLPORE. Con estos cinco oligonucleótidos mediante PCR, los fragmentos de amplificación que se deben obtener teóricamente después de la SEQ ID No. 1, tienen los siguientes tamaños: con los cebadores Pl y P3 aproximadamente 690 pb con los cebadores Pl y P4 »• aproximadamente 720 pb con los cebadores Pl y P5 > aproximadamente 1000 pb con los cebadores P2 y P3 aproximadamente 390 pb con los cebadores P2 y P4 * aproximadamente 420 pb con los cebadores P2 y P5 > aproximadamente 700 pb C) Amplificación de una parte codificante de la HPPD de P . fl uorescens A32.

Las amplificaciones han sido realizadas sobre un aparato PCR PERKIN ELMER 9600 y con la polimerasa Taq de PERKIN ELMER, son su amortiguador en las condiciones estándares, es decir para 50 µl de reacción existen los dNTP a 200 µM, los cebadores a 20 µM, 2.5 unidades de polimerasa Taq y 2.5 µg de ADN P . fl uorescens A32.

El programa de amplificación utilizado es, 5 minutos a 95°C más 35 ciclos a <45 seg. a 95°C, 45 seg. a 49°C, 1 min. a 72°C > seguidos de 5 minutos a 72°C. En estas condiciones, todos los fragmentos de amplificación obtenidos tienen un tamaño compatible con los tamaños teóricos dados anteriormente, lo que es una buena indicación de la especificidad de las amplificaciones . Los fragmentos de amplificación obtenidos con los juegos de cebadores P1/P4, P1/P5 y P2/P4 son ligados en pBSII SK(-) después de digestión de esta plásmido con EcoRV y tratamiento con la transferasa terminal en presencia de ddTTP como se describe en HOLTON T.A y GRAHAM M.W 1991. N.A.R. vol. 19, No. p 1156. Un clon de cada uno de estos tres tipos es secuenciado parcialmente; lo que permite confirmar que se ha amplificado bien en los tres casos en una parte de la región codificante de la HPPD de P. fl uorescens A32. El fragmento P1/P4 es retenido como sonda para seleccionar un banco genómico parcial de P. fl uorescens A32, y aislar el gen completo de la HPPD.

D) Aislamiento del gen.

Mediante transferencia de Southern, se muestra que un fragmento de 7 Kpb después de la digestión de ADN de P. fl uorescens A32 con el signo de restricción BamHI, se hibrida con la sonda HPPD P1/P4. Se han digerido pues 400 µg de ADN de P. fl uorescens A32 con la enzima de restricción BamHI y se purifican sobre gel de agarosa los fragmentos de ADN que son de aproximadamente 7 Kpb. Estos fragmentos son ligados en pBSII SK(-), igualmente digerido con BamHI y desfosforilado por tratamiento con la fosfatasa alcalina. Después de transformación en E. coli DHlOb, el banco genómico parcial es seleccionado con la sonda HPPD P1/P4. Ha sido aislado un clon positivo y denominado pRP A. Su carta simplificada se da en la figura 2. Sobre esta carta o mapa se indica la posición de la parte codificante del gen HPPD. Ésta está compuesta de 1077 nucleótidos que codifican para 358 aminoácidos (ver SEQ ID No. 1) . La HPPD de P. fl uorescens A32 presenta una buena homología de aminoácidos con aquella de Pseudomonas sp cepa P.J.874, existiendo en efecto 92% de identidad entre estas dos proteinas (ver figura 3) .

Ejemplo 2: Construcción de dos genes quiméricos Para conferir la tolerancia de las plantas a los herbicidas que inhiben la HPPD, se construyen dos genes quiméricos: El primero consiste en poner la parte codificante del gen de la HPPD de P. fl uorescens A32 bajo el control del promotor doble de histona (Solicitud de Patente europea No. 0 507 698) seguido del aumentador tradicional del virus mosaico del tabaco (TEV) (pRTL-GUS (Carrington y Freed, 1990; J. Virol. 64: 1590-1597)) con el terminador del gen de la nopalin-sintasa. La HPPD será luego localizada en el citoplasma. El segundo será idéntico al primero, más cerca que entre el activador de la traducción TEV y la parte codificante de la HPPD, se intercala el péptido de tránsito optimizado (OTP) (Solicitud europea EP No. 0 508 909). La HPPD será luego localizada en el cloroplasto .

A) Construcción del vector pRPA-RD-153 - pRPA-RD-11: Un derivado de pBS-II SK(-) (Stratagene catálogo #212206) que contiene el sitio de poliadenilación de la nopalin-sintasa (NOS poliA) (Solicitud europea EP No. 0 652 286) se clona entre los sitios Kpnl y Salí. El sitio Kpnl es transformado en un sitio Notl mediante tratamiento con la ADN-polimerasa I de T4 en presencia de 150 µm de trifosfatos de desoxmucleótido y después ligadura con un ligador Notl (Stratagene catálogo #1029). Asi se obtiene un cásete de clonación NOS poliA. pRPA-RD-127: Un derivado de pRPA-BL-466 (Solicitud europea EP No. 0 337 899) clonado en pRPA-RD-11 creando un cásete de expresión del gen oxy y que contiene el promotor de la pequeña subunidad de la ribulosa-biscarboxilasa: "promotor (SSU) -gen-oxy-NOS poliA" Para crear este plásmido, pRPA-BL-488 ha sido digerido con Xbal y HindIII para aislar un fragmento de 1.9 kpb que contiene el promotor SSU y el gen oxy que ha sido ligado en el plásmido pRPA-RD-11 digerido con las enzimas compatibles. - pRPA-RD-132: es un derivado de pRPA-BL-488 (Solicitud europea EP No. 0 507 698) clonado en pRPA-RD- 127 con la creación de un cásete de expresión del gen oxy con el promotor de doble histona: promotor de doble histona - gen oxy - NOS poliA" Para fabricar este plásmido, pRPA-BL-466 es digerido con HindIII tratado con Klenow y después digerido nuevamente con Ncol. El fragmento de 1.35 kpb purificado que contiene el promotor doble de histona H3A748 es ligado con el plásmido pRPA-RD-127 que habla sido digerido con Xbal, tratado con Klenow y redigerido con Ncol. - pRPA-RD-153: es un derivado de pRPA-RD-132 que contiene el activador de traducción del virus de la roya del tabaco (TEV) . pRTL-GUS (Carrington y Freed 1990; J. Virol. 64: 1590-1597) es digerido con Ncol y EcorI y el fragmento de 150 pb es ligado en pRPA-RD-132 digerido con las mismas enzimas. Entonces se ha creado un cásete de expresión que contiene el promotor: "promotor de histona doble -TEV-gen oxy-NOS poliA" B) Construcción del vector pRPA-RD-185: PUC19/GECA: Un derivado de pUC19 (Gibco catálogo #15364-011) que contienen numerosos sitios de clonación. pUC19 es digerido con EcorI y ligado con el oligonucleótido ligador 1: Ligador 1 : AATTGGGCCA GTCAGGCCGT TTAAACCCTA GGGGGCCCG CCCGGT CAGTCCGGCA AATTTGGGAT CCCCCGGGC TTAA El clon seleccionado contiene un sitio EcoRI seguido del poliligador que contiene los sitios siguientes: EcoRI , Apa l, Avrll, P el, Sfi l, Sacl, Kpnl, Sma l, BamHI, Xba l, Sal í, Ps t I, Sphl y HindIII . pRPS-RD-185: es un derivado de pUC19/GECA que contiene un poliligador modificado. pUC19/GECA es digerido con HindIII y ligado con el oligonucleótido ligador 2 : Ligador 2: AGCTTTTAAT TAAGGCGCGC CCTCGAGCCT GGTTCAGGG AAATTA ATTCCGCGCG GGAGCTCGGA CCAAGTCCC TCGA El clon seleccionado contiene un sitio HindIII por medio del poliligador que contiene ahora los siguientes sitios: EcoRI, Apa l, Avrll, Pmel, Sfi l, Sacl, Kpnl, Sma l, BamHI, Xba l, Sal í, Ps t I, Sphl, HindIII, Pací, AscI, Xhol, y EcoNI.

C) Construcción del vector pRP T: pRP 0: un derivado de pRPA-RD-153 que contiene un cásete de expresión HPPD, promotor de histona doble-TEV-gen HPPD-terminador Nos. Para fabricar pRP 0, pRPA-RD-153 es digerido con HindIII, tratado con el fragmento Klenow y después redigerido con Ncol para tomar el gen oxy y remplazarlo por el gen HPPD proveniente del plásmido pRP A, mediante digestión con BstEII, tratamiento con Klenow y digestión nuevamente con Ncol . - pRP R: para obtener el plásmido, pRP 0 ha sido digerido con PvuII y Sacl, el gen quimérico ha sido purificado, después ligado en pRPA-RD-185, digerido luego con PvuII y Sacl. pRP T: éste ha sido obtenido mediante ligadura del gen quimérico proveniente de pRP R y después digestión con Sacl y HindIII en el plásmido pRPA-BL 150 alfa2, digerido con las mismas enzimas (Solicitud europea EP No. 0 508 909) . El gen quimérico del vector pRP T tiene pues la siguiente estructura: Promotor de TEV Región codificante de Terminador histona doble HPPD nos D) Construcción del vector pRP V pRP P: éste es un derivado de pRPA-RD-7 (Solicitud europea EP No. 0 652 286) que contiene el péptido de tránsito optimizado, seguido del gen de la HPPD. Éste ha sido obtenido mediante ligadura de la parte codificante de HPPD proveniente de pRP A, mediante digestión BstEII y Ncol, tratamiento con Klenow y del plásmido pRPA-RD-7, éste mismo digerido con Sphl y Accl y tratado con la ADNasa de la polimerasa T4. - pRP Q: un derivado de pRPA-RD-153 que contiene un cásete de expresión de la HPPD, promotor de histona doble -TEV-OTP-gen HPPD-terminador Nos. Para construir el plásmido, pRPA-RD-153 es digerido con Salí, tratado con Klenow y después redigerido con Ncol para tomar el gen oxy y remplazarlo por el gen HPPD proveniente del plásmido pRP P mediante digestión BstEII, tratamiento con Klenow y redigestión con Ncol. - pRP S: para obtenerlo, el plásmido pRP Q ha sido digerido con PvuII y Sacl para obtener el gen quimérico que ha sido ligado en pRPA-RD-185, y después digerido con PvuII y Sacl. pRP V: éste ha sido obtenido mediante ligadura del gen quimérico proveniente de pRP S, después de la digestión con Sacl y HindIII en el plásmido pRPA-BL-150 alfa2 (Solicitud europea EP No. 0 508 909) .

El gen quimérico del vector pRP Q tiene pues la siguiente estructura: Ejemplo 3: Transformación del PBD6 industrial de tabaco.

Con el fin de determinar la eficacia de estos dos genes quiméricos, éstos han sido transferidos en el tabaco industrial PBD6 de acuerdo a los procedimientos de transformación y de regeneración ya descritos en la Solicitud europea EP No. 0 508 909. 1) Transformación: El vector es introducido en la cepa no oncogénica de Agrobacterium EHA 101 (Hood y colaboradores 1987) portador del cósmido pTVK 291 (Komari y colaboradores 1986). La técnica de transformación está basada en el procedimiento de Horsh R. y colaboradores (1985) Science, 227, 1229-1231. 2) Regeneración: La regeneración del tabaco PBD6 (proveniente de SEITA Francia) a partir de explantes foliares, es realizada sobre un medio de base de Murashige y Skoog (MS) que comprende 30 g/1 sacarosa asi como 200 µg/ml de kanamicina. Los explantes foliares son tomados de plantas en invernadero o in vitro, y transformados de acuerdo a la técnica de discos foliares (Science 1985, Vol. 227, p. 1229-1231) en tres etapas sucesivas: la primera comprende la inducción de brotes sobre un medio MS adicionado de 30 g/1 de sacarosa que contiene 0.05 mg/l de ácido naftilacético (ANA) y 2 mg/l de bencilaminopurina (BAP) durante 15 dias. Los brotes formados en el curso de esta etapa son enseguida desarrollados por cultivo en un medio MS adicionado de 30 g/1 de sacarosa pero que no contiene hormona, durante 10 dias. Después se toman los brotes desarrollados y se les cultiva sobre un medio de enraizamiento MS con proporción media de sales, vitaminas y azúcares, y que no contiene hormona. Al cabo de aproximadamente 15 dias, los brotes enraizados son pasados a tierra.

Ejemplo 4: Medición de la tolerancia del tabaco a 4-[4-CF3-2-Ímetilsul fonil) benzoil ]-5-ciclopropil-isoxasol: tratamiento postlevantamiento .

Al salir de la prueba in vitro, las plántulas de tabaco transformadas fueron aclimatadas en invernadero (60% de humedad relativa; temperatura 20°C por la noche, 23°C por el dia) durante cinco semanas y después tratadas con 4-[4-CF3-2- (metilsulfonil) benzoil] -5-ciclopropil-isoxasol . El tabaco testigo no transformado y tratado con 4-[4-CF3-2- (metilsul fonil) benzoil] -5-ciclopropil-isoxasol a dosis que van de 50 a 400 g/ha, desarrollaron en aproximadamente 72 horas clorosis, que se intensifica para evolucionar a necrosis muy pronunciadas en una semana (que cubren aproximadamente 80% de las hojas terminales) . Después de la transformación esta misma planta de tabaco, que sobreexpresa la HPPD de P. fl uorescens, está muy bien protegida contra un tratamiento con 4-[4-CF3-2- (metilsulfonil) benzoil] -5-ciclopropil-isoxasol a las dosis de 400 g/ha. Si la enzima sobreexpresada está en el citoplasma, es decir si la transformación ha sido hecha con el gen portado por el vector pRP T, posteriormente la planta presenta muy ligeras clorosis todas localizadas sobre las hojas intermedias. Si la enzima sobreexpresada está en el cloroplasto, es decir si la transformación ha sido hecha con el gen portado por el vector pRP V, entonces la planta está perfectamente protegida, y no presenta ningún síntoma.

Ejemplo 5: Medición de la tolerancia del tabaco al 4-[4-CF3-2- (metilsul fonil) benzoil] -5-ciclopropil-isoxasol : Tratamiento de toma previa a) prueba in vitro: Se utilizan granos de tabaco recolectados a partir de plantas salidas del ciclo de "transformación -regeneración" resistentes a un tratamiento foliar de isoxaflutol a la dosis de 400 g/ha descritos en los ejemplos 1 al 3. Estos granos han sido sembrados sobre cajas que contienen fitoagar a 10 g/1 e isoxaflutol a diferentes concentraciones que van de 0 a 1 mg/l. La germinación ha sido hecha en seguida a 25°C con un fotoperiodo de 12 horas de luz/12 de obscuridad.

De acuerdo a este protocolo los granos de tabaco silvestres han sido puestos a germinar, asi como los granos de dos tipos de tabacos transgénicos es decir tabacos CY, con localización de la HPPD en el citoplasma, y los tabacos CO con localización de la HPPD en el cloroplasto. Las mediciones de las resistencias son realizadas visualmente entre 2 y 3 semanas después de la siembra. Los resultados son reportados en la tabla siguiente . concentración tabaco tabaco CY tabaco CO de isoxaflutol silvestre 0 mg/l 100% de 100% de 100% de granos granos granos germinan sin germinan sin germinan sin síntomas0 síntomas0 síntomas 0.05 mg/l 20% de J -OS 75% de los 75% de los granos granos granos germinan y germinan* sin germinan* sin presentan síntomas0 síntomas0 síntomas0 0.1 mg/l paso de 75% de los 75% de los germinación granos granos germinan* sin germinan* sin síntomas0 síntomas0 0.5 mg/l paso de 75% de los 75% de los germinación granos granos germinan* sin germinan* sin síntomas0 síntomas0 1 mg/l paso de 75% de los 75% de los germinación granos granos germinan* con germinan* sin ligeros síntomas0 síntomas0 0 los síntomas que presentan las plántulas en el curso de la germinación son deformaciones de los cotiledones, más o menos importantes y sobre todo un blanqueamiento de los tejidos normalmente fotosintéticos y por lo tanto verdes. * 75% de los granos germinan porque han sido sembrados de granos provenientes de la autofecundación de plantas mono-locus que provienen del ciclo "transformación-regeneración" que no incluyen pues el gen de tolerancia más que sobre un cromosoma. Operando de la misma manera con los productos siguientes, producto No. 51 de la patente americana 4 780 127, se obtienen los mismos resultados a una concentración de 0 mg/l y 0.1 mg/l sobre tabaco silvestre y tabaco CO. b) prueba en invernadero: Se opera como en el ejemplo 4, con la diferencia de que el tratamiento se efectuó en pretoma, 24 horas antes de la siembra. La siembra silvestre se efectúa normalmente. En estas condiciones se observa que para la siembra de testigos no tratados, no existe germinación para toda la dosis de herbicida al menos igual a 10 g/ha. Por el contrario, los tabacos CY no presentan ningún síntoma, tal como se definen en el párrafo a), comprendidos hasta 100 g/ha. De igual modo los tabacos CO no presentan ningún síntoma, tal como se definen en el párrafo a) comprendidos hasta 200 g/ha. Estos resultados muestran claramente que el gen de la HPPD de P. fl uorescens confiere una tolerancia al tabaco contra los tratamientos en pretoma al isoxaflutol. Esta tolerancia es mejor si la proteina está localizada en el cloroplasto en lugar de en el citoplasto .

Ejemplo 6: Con el objetivo de estudiar si el gen de la HPPD de P. fl uorescens puede ser utilizado como gen marcador en el curso del ciclo de "transformación-regeneración" de una especie vegetal, el tabaco ha sido transformado con el gen de la HPPD y las plantas transformadas han sido obtenidas después de la selección sobre isoxaflutol.

Material, métodos y resultados El gen quimérico pRP V descrito anteriormente es transferido en el tabaco industrial PBD6 de acuerdo a les procedimientos de transformación y de regeneración ya descritos en la solicitud europea EP No. 0 508 909. El gen quimérico del vector pRP V tiene la siguiente estructura: Trans formación: El vector es introducido en la cepa no oncogénica de Agrobac t eri um EHA 101(Hood y colaboradores 1987) portadora del cósmido pTVK 291 (Komari y colaboradores 1986) . La técnica de transformación está basada en el procedimiento de Horsh y colaboradores (1985) . 2) Regeneración: La regeneración del tabaco PBD6 (proveniente de SEITA Francia) a partir de explantes foliares es realizada sobre un medio de base Murashige y Skoog (MS) que comprende 30 g/1 de sacarosa asi como 350 mq/1 de cefotaxima y 1 mg/l de isoxaflutol. Los explantes foliares son tomados de las plantas en invernadero o in vitro, y transformados de acuerdo a la técnica de discos foliares (Science 1985, Vol. 227, p. 1229-1231) en tres etapas sucesivas: la primera comprende la inducción de brotes sobre un medio MS adicionado de 30 g/1 de sacarosa que contiene 0.05 mg/l de ácido naftilacético (ANA) y 2 mg/l de bencilaminopurina (BAP) durante 15 dias y 1 mg/l de isoxaflutol. Los brotes verdes formados en el curso de esta etapa son enseguida desarrollados por cultivo sobre un medio MS adicionado de 30 g/1 de sacarosa y 1 mg/l de isoxaflutol, pero que no contiene hormona, durante 10 dias. Después se toman los explantes desarrollados y se les cultiva sobre un medio de enraizamiento MS a una proporción media de sales, vitaminas y azúcares y 1 mg/l de isoxaflutol, y que no contiene hormona. Al cabo de aproximadamente 15 dias, los brotes enraizados son pasados a tierra.

Todas las plántulas obtenidas de acuerdo a este protocolo son analizadas mediante PCR con los cebadores específicos de la HPPD de P. fl uorescens . Este análisis de PCR ha permitido confirmar que todas las plantas obtenidas asi, tienen bien integrado el gen de la HPPD. En conclusión, este ensayo confirma que el gen de la HPPD puede ser utilizado como el gen marcador y que, asociado a este gen, el isoxaflutol puede ser un buen agente de selección.

Ejemplos 7 y 8: Aislamiento del gen de la HPPD de Arabi dopsi s thal i ana y del gen de la HPPD de zanahoria { Daucus carot ta) a) Construcción de los bancos de ADNc.

Los ARNm extraídos de plántulas jóvenes de Arabidopsi s thaliana , y los ARNms extraídos de células de zanahoria en cultivo, han servido para construir dos bancos de ADNc en el vector Uni Zap*R XR comercializado por la compañía Stratagen, de acuerdo al protocolo postulado por esta compañía. b) Selección de bancos de ADNc.

Estos dos bancos han sido seleccionados con la ayuda de una sonda correspondiente a un ADNc de Arabi dopsi s thal i ana de longitud parcial, obtenido via la Arabidopsis Biological Resource Center (Ohio, E.U A) y clasificado: EST clon No. 91B13T7. Este clon está constituido de aproximadamente 500 pares de bases donde solamente 228 hablan sido secuenciadas por el MSU-DOE Plant Research Laboratory en el marco del secuenciamiento al azar del ADNc de Arabidopsi s thal i ana . En la presente se han secuenciado completamente los 500 pares de bases antes de utilizar este clon, para seleccionar los bancos de ADNc de Arabidopsi s thaliana y de zanahoria con la ayuda de la técnica clásica de hibridación de placas de lisis ( ¿referencia?) . c) Ha sido obtenido un ANDc de Arabidopsi s thaliana (SEQ ID No. 2) correspondiente a 1338 pares de bases. Este ADNc posee un codón de inicio de la traducción en la posición 25, y un codón de final de la traducción en la posición 1336. Este ADNc, es pues completo y codifica para una proteina de 445 aminoácidos. d) Ha sido obtenido un ADNc de zanahoria { Da ucus ca ro t ta ) (SEQ ID No. 3) correspondiente a 1329 pares de bases. Este ADNc posee un codón de inicio de la traducción en la posición 1, y un codón de final de la traducción en la posición 1329. Este ADNc esta pues completo y codifica para una proteina de 442 aminoácidos .

Las secuencias ilustradas son las siguientes: SEQ ID No. 1 Secuencia del gen de la HPPD de Pseudomonas fluorescens A32. SEQ ID No. 2 Secuencia de ADNc de HPPD de Arabidopsi s thali ana SEQ ID No. 3 Secuencia de ADNc de HPPD de Da ucus caro t ta Las figuras siguientes son dadas a manera indicativa para ilustrar la invención.

La Figura 1 representa la secuencia proteica de la HPPD de Pseudomona s sp . cepa P.J 874, y la secuencia nucleotidica teórica de la parte codificante correspondiente; los cinco oligonucleótidos elegidos para realizar la amplificación de una parte de esta región codificante son simbolizados por las cinco flechas.

La Figura 2 representa la cartografía del plásmido con el fragmento de ADN genómico de 7 kb, que contiene el gen de la HPPD de P . fl uorescens A32.

La Figura 3 da la comparación de las secuencias de aminoácidos de la HPPD de P. fl uorescens A32 y del HPPD de Pseudomonas sp cepa P.J 874 (solo se indican los aminoácidos divergentes entre las dos secuencias) asi como la secuencia consensual. ->-•> LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL (i) SOLICITANTE: Sailland, Alain Rolland, Anne Matringe, Michel Pallet, Kenneth E. (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: SECUENCIA DE ADN DE UN GEN DE LA HIDROXIFENIL-PIRUVATO-DIOXIGENASA Y OBTENCIÓN DE PLANTAS QUE CONTIENEN UN GEN DE LA HIDROXIFENIIL-PIRUVATO-DIOXIGENASA, TOLERANTES A CIERTOS HERBICIDAS. (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 3 (iv) DOMICILIO PARA CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: Francois Chretien (B) CALLE: 14-20 rué Pierre BAIZET (C) CIUDAD: Lyon Cedex 09 (E) PAÍS: Francia (F) CÓDIGO POSTAL: 69263 (v) FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco Flexible (B) COMPUTADORA: PC compatible con IBM (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentin Reléase #1.0, Versión #1.25 (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: (A) NUMERO DE SOLICITUD: FR PH95033 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 02-JUN-1995 (C) CLASIFICACIÓN: (vii) INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE (A) NOMBRE: Chretien, Francois (ix) INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN: (A) TELÉFONO: 72-29-26-42 (B) TELEFAX: 72-29-28-43 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID No. 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1077 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ii! HIPOTÉTICO: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Pseudomonas fluorescens (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID No. 1 ATGGCAGATC TATACGAAAA CCCAATGGGC CTGATGGGCT TTGAATTCAT CGAATTAGCG 6 TCGCCGACGC CGGGTACCCT GGAGCCGATC TTCGAGATCA TGGGCTTCAC CAAAGTCGCG 12 ACCCACCGTT CCAAGAACGT GCACCTGTAC CGCCAGGGCG AGATCAACCT GATCCTCAAC 19 AACGAGCCCA ACAGCATCGC CTCCTACTTT GCGGCCGAAC ACGGCCCGTC GGTGTGCGGC 24 ATGGCGTTCC GCGTGAAGGA CTCGCAAAAG GCCTACAACC GCGCCCTGGA ACTCGGCGCC 30 CAGCCGATCC ATATTGACAC CGGGCCGATG GAATTGAACC TGCCGGCGAT CAAGGGCATC 36 GGCGGCGCGC CGTTGTACCT GATCGACCGT TTCGGCGAAG GCAGCTCGAT CTACGACATC 42 GACTTCGTGT ACCTCGAAGG TGTGGAGCGC AATCCGGTCG GTGCAGGTCT CAAAGTCATC 48 GACCACCTGA CCCACAACGT CTATCGCGGC CGCATGGTCT ACTGGGCCAA CTTCTACGAG 54 AAATTGTTCA ACTTCCGTGA AGCGCGTTAC TTCGATATCA AGGGCGAGTA CACCGGCCTG 60 ACTTCCAAGG CCATGAGTGC GCCGGACGGC ATGATCCGCA TCCCGCTGAA CGAAGAGTCG 66 TCCAAGGGCG CGGGGCAGAT CGAAGAGTTC CTGATGCAGT TCAACGGCGA AGGCATCCAG 72 CACGTGGCGT TCCTCACCGA CGACCTGGTC AAGACCTGGG ACGCGTTGAA GAAAATCGGC 78 ATGCGCTTCA TGACCGCGCC GCCAGACACT TATTACGAAA TGCTCGAAGG CCGCCTGCCT 84 GACCACGGCG AGCCGGTGGA TCAACTGCAG GCACGCGGTA TCCTGCTGGA CGGATCTTCC 90 GTGGAAGGCG ACAAACGCCT GCTGCTGCAG ATCTTCTCGG AAACCCTGAT GGGCCCGGTG 96 TTCTTCGAAT TCATCCAGCG CAAGGGCGAC GATGGGTTTG GCGAGGGCAA CTTCAAGGCG 102 CTGTTCGAGT CCATCGAACG TGACCAGGTG CGTCGTGGTG TATTGACCGC CGATTAA 107 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID No. 2 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 1338 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: Lineal 0 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ii) HIPOTÉTICO: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Arabidopsis thaliana (B) CEPA: Columbia (d) ETAPA DE DESARROLLO: Planta verde joven 0 . (vii) FUENTE INMEDIATA (A) GENOTECA: Uni zap XR STRATAGENE .'xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID No. 2: ATGGGCCACC AAAACGCCGC CGTTTCAGAG AATCAAAACC ATGATGACGG CGCTGCGTCG 6 TCGCCGGGAT TCAAGCTCGT CGGATTTTCC AAGTTCGTAA GAAAGAATCC AAAGTCTGAT 12 AAATTCAAGG TTAAGCGCTT CCATCACATC GAGTTCTGGT GCGGCGACGC AACCAACGTC 18 GCTCGTCGCT TCTCCTGGGG TCTGGGGATG AGATTCTCCG CCAAATCCGA TCTTTCCACC 24 GGAAACATGG TTCACGCCTC TTACCTACTC ACCTCCGGTG ACCTCCGATT CCTTTTCACT 30 GCTCCTTACT CTCCGTCTCT CTCCGCCGGA GAGATTAAAC CGACAACCAC AGCTTCTATC 36 CCAAGTTTCG ATCACGGCTC TTGTCGTTCC TTCTTCTCTT CACATGGTCT CGGTGTTAGA 42 GCCGTTGCGA TTGAAGTAGA AGACGCAGAG TCAGCTTTCT CCATCAGTGT AGCTAATGGC 48 GCTATTCCTT CGTCGCCTCC TATCGTCCTC AATGAAGCAG TTACGATCGC TGAGGTTAAA 54 CTATACGGCG ATGTTGTTCT CCGATATGTT AGTTACAAAG CAGAAGATAC CGAAAAATCC 60 GAATTCTTGC CAGGGTTCGA GCGTGTAGAG GATGCGTCGT CGTTCCCATT GGATTATGGT 66 ATCCGGCGGC TTGACCACGC CGTGGGAAAC GTTCCTATTG TTGGTCCGGC TTTAACTTAT 72 GTAGCGGGGT TCACTGGTTT TCACCAATTC GCAGAGTTCA CAGCAGACGA CGTTGGAACC 78 GCCGAGAGCG GTTTAAATTC AGCGGTCCTG GCTAGCAATG ATGAAATGGT TCTTCTACCG 84 ATTAACGAGC CAGTGCACGG AACAAAGAGG AAGAGTCAGA TTCAGACGTA TTTGGAACAT 90 AACGAAGGCG CAGGGCTACA ACATCTGGCT CTGATGAGTG AAGACATATT CAGGACCCTG 96 AGAGAGATGA GGAAGAGGAG CAGTATTGGA GGATTCGACT TCATGCCTTC TCCTCCGCCT 102 ACTTACTACC AGAATCTCAA GAAACGGGTC GGCGACGTGC TCAGCGATGA TCAGATCAAG 108 GAGTGTGAGG AATTAGGGAT TCTTGTAGAC AGAGATGATC AAGGGACGTT GCTTCAAATC 114 TTCACAAAAC CACTAGGTGA CAGGCCGACG ATATTTATAG CGATAATCCA GAGAGTAGGA 120 TGCATGATGA AAGATGAGGA AGGGAAGGCT TACCAGAGTG GAGGATGTGG TGGTTTTGGC 126 AAAGGCAATT TCTCTGAGCT CTTCCAGTCC ATTGAAGAAT ACGAAAAGAC TCTTGAAGCC 132 AAACAGTTAG TGGGATGA 133 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID No. 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 1329 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal 0 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ii) HIPOTÉTICO: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Daucus carotta (D) ETAPA DE DESARROLLO: Células en suspensión (vii) FUENTE INMEDIATA 0 (A) GENOTECA: Uni zap XR STRATAGENE (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID No 3: ATGGGGAAAA AACAATCGGA AGCTGAAATT CTCTCAAGCA ATTCATCAAA CACCTCTCCT 6 GAAACATTCA AGCTGGTCGG TTTCAACAAC TTCGTCCGCG CCAACCCCAA GTCCGATCAC 12 TTCGCCGTGA AGCGGTTCCA CCACATTGAG TTCTGGTGCG GCGACGCCAC CAACACGTCG 18 CGGCGGTTCT CGTGGGGCCT CGGCATGCCT TTGGTGGCGA AATCGGATCT CTCTACTGGA 24 AACTCTGTTC ACGCTTCTTA TCTTGTTCGC TCGGCGAATC TCAGTTTCGT CTTCACCGCT 30 CCTTACTCTC CGTCCACGAC CACTTCCTCT GGTTCAGCTG CCATCCCGTC TTTTTCGGCA 36 TCGGGTTTTC ACTCTTTTGC GGCCAAACAC GGCCTTGCTG TTCGGGCTAT TGCTCTTGAA 42 GTTGCTGACG TGGCTGCTGC GTTTGAGGCC AGTGTTGCGC GTGGGGCCAG GCCGGCTTCG 48 GCTCCTGTTG AATTGGACGA CCAGGCGTGG TTGGCTGAGG TGGAGTTGTA CGGAGATGTG 54 GTCTTGAGGT TTGTTAGTTT TGGGAGGGAG GAGGGTTTGT TTTTGCCTGG ATTCGAGGCG 60 GTGGAGGGGA CGGCGTCGTT TCCGGATTTG GATTATGGAA TTAGAAGGCT TGATCATGCG 66 GTGGGGAATG TTACCGAGTT GGGGCCTGTG GTGGAGTATA TTAAAGGGTT TACGGGGTTT 72 CATGAATTTG CGGAGTTTAC AGCGGAGGAT GTGGGGACTT TGGAGAGTGG GTTGAATTCG 79 GTGGTGTTGG CGAATAATGA GGAGATGGTT CTGTTGCCCT TGAATGGGCC TGTGTATGGG 94 ACCAAGAGGA AGAGTCAGAT ACAGACTTAC TTGGAGCACA ATGAAGGGGC TGGAGTGCAG 90 CATTTGGCTT TAGTGAGTGA GGATATTTTT AGGACTTTAA GGGAGATGAG GAAGAGGAGT 96 TGCCTTGGTG GTTTTGAGTT TATGCCTTCG CCACCGCCTA CGTATTACAA GAATTTGAAG 102 AATAGGGTCG GGGATGTGTT GAGTGATGAA CAGATCAAGG AGTGTGAAGA TTTGGGGATT 108 TTGGTGGATA GGGATGATCA GGGTACATTG CTTCAAATCT TTACCAAGCC TGTAGGTGAC 114 AGGCCTACCT TATTCATAGA GATCATTCAG AGGGTAGGGT GCATGCTCAA GGACGATGCA 120 GGGCAGATGT ACCAGAAGGG CGGGTGCGGA GGATTTGGGA AGGGGAACTT CTCAGAGCTG 126 TTCAAGTCCA TCGAAGAATA TGAAAAAACA CTTGAAGCTA AACAAATCAC TGGATCTGCT 132 GCTGCATGA 132 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes :

Claims (28)

REIVINDICACIONES

1. La secuencia de un gen de origen no humano o de una bacteria no marina, aislada, o la secuencia que puede hibridarse con esta secuencia, caracterizada porque ésta expresa una hidroxifenil-piruvato dioxigenasa (HPPD) .

2. La secuencia de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque ésta e-s de origen bacteriano o de planta.

3. La secuencia de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque ésta es proveniente de Pseudomona s sp .

4. La secuencia de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque ésta es proveniente de Pseudomona s fl uorescens .

5. La secuencia de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque ésta es de origen vegetal . ß.

La secuencia de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque ésta es proveniente de Arabi dopsi s .

7. La secuencia de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque ésta es proveniente de una Umbellifera .

8. El procedimiento de aislamiento del gen de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 4, caracterizado porque: se eligen, como cebadores, algunos oligonucleótidos provenientes de la secuencia de aminoácidos de una HPPD. - a partir de estos cebadores, se sintetizan los fragmentos de amplificación por PCR - se aisla el gen mediante creación y selección de un banco genómico y - se clona el gen.

9. El gen quimérico para la transformación genética de plantas que comprenden, en el sentido de la transcripción : al menos una secuencia de regulación promotora proveniente de un gen que se expresa naturalmente en las plantas, - una secuencia codificante heteróloga, - al menos una secuencia de poliadenilación, caracterizado porque la secuencia codificante es una secuencia de un gen que expresa la hidroxifenil-piruvato dioxigenasa (HPPD) .

10. El gen quimérico de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la secuencia de regulación promotora favorece la sobreexpresión de la secuencia codificante.

11. El gen quimérico de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la secuencia de regulación promotora comprende al menos un promotor de histona.

12. El gen quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a la 11, caracterizado porque comprende, entre la secuencia de regulación promotora y la secuencia codificante, un péptido de tránsito.

13. El gen quimérico de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque comprende, entre la secuencia de regulación promotora y la secuencia codificante, un péptido de tránsito optimizado que comprende, en el sentido de la transcripción, una secuencia codificante para un péptido de tránsito de un gen vegetal que codifica para una enzima de localización plastidial, una parte de la secuencia de la porción madura N-terminal de un gen vegetal que codifica para una enzima de localización plastidial, posteriormente una secuencia que codifica para un segundo péptido de tránsito de un gen vegetal que codifica para una enzima de localización plastidial.

14. El gen quimérico de conformidad con las reivindicaciones 9 a la 13, caracterizado porque comprende, entre la secuencia de regulación promotora y la secuencia codificante, una secuencia de un activador de transcripción (aumentador).

15. El vector utilizable para la transformación genética de plantas, caracterizado porque comprende un gen quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a la 14.

16. Una célula vegetal, caracterizada porque comprende un gen quimérico de conformidad con cualquiera de las reividicaciones 9 a la 14.

17. Una planta, caracterizada porque ésta es regenerada a partir de células de conformidad con la reivindicación 16.

18. La planta de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque pertenece a la familia de las dicotiledóneas.

19. El procedimiento de transformación de plantas para hacerlas tolerantes a los inhibidores de la HPPD, caracterizado el procedimiento porque se introduce en la célula vegetal un gen que expresa una HPPD exógena .

20. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la transferencia se efectúa con Agrobacteri um t umefaci ens o Agrobacteri um rhi zogenes .

21. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la transferencia se efectúa mediante aportación por bombardeo con la ayuda de partículas cargadas de ADN.

22. El procedimiento de transformación de plantas, caracterizado porque se introduce en la célula vegetal un gen que expresa una HPPD exógena como marcador de selección.

23. El procedimiento de tratamiento herbicida selectivo de plantas, caracterizado porque se aplica un inhibidor del gen de la HPPD a una planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 y 18.

24. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el inhibidor del gen de la HPPD es un isoxazol.

25. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el isoxasol es el 4-[4-CF3-2- (metilsulfonil ) benzoil) -5-ciclopropil-isoxazol .

26. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el inhibidor del gen de la HPPD es un dicetonitrilo .

27. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el inhibidor del gen de la HPPD es una tricetona.

28. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el inhibidor del gen de la HPPD es una sulcotriona.