MXPA97008011A - Nueva proteina y proceso para su preparacion - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SECUENCIA DE IDENTIFICACION NO. 1, en el Listado de Secuencia y que se origina MP52 humana y el dímero de esta proteína. Esta proteína dimérica puede ser obtenida por la construcción de un plásmido que contiene un ADN, en el que un codón que codifica para la metionina es agregado al extremo 5'de la secuencia de ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos mencionada en lo anterior, transformar Eschericha coli por este plásmido, incubando la E. coli transformante, solubilizar y purificar los cuerpos de inclusión obtenidos para dar una proteína monomérica y luego renaturalizar la proteína monomérica obtenida en el dímero, seguida por purificación. Esta proteína dimérica esútil en el tratamiento de enfermedades del cartílago y del hueso.

Description

NUEVA PROTEINA Y PROCESO PARA SU PREPARACIÓN ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 1. CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona con una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN N0:1 del Listado de Secuencias derivada de MP52. La invención también se relaciona con una proteína de homodímero de la proteína y una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades del cartílago y el hueso que contienen la proteína dimérica como el ingrediente activo. La invención se relaciona también con un proceso para preparar la proteína descrita en lo anterior en una cantidad grande y con pureza elevada por el cultivo de E. coli , la cual se transformó con un plásmido que contiene una secuencia de ADN capaz de expresar la proteína descrita en lo anterior. La invención además se relaciona con un método para el tratamiento de enfermedades del cartílago y el hueso, el cual comprende administrar a un humano una composición farmacéutica que contiene, como un ingrediente activo, una cantidad efectiva de la proteína homodimérica.

REP: 25946 2. DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA ANTERIOR Las composiciones farmacéuticas comprende vitamina D3, calcitonina, estrógeno o sus derivados, así como también derivados de bisfosfonato, han sido utilizados en la práctica clínica para pre-evitar y tratar enfermedades óseas. Recientemente, la proteína morfogenética ósea (de aquí en adelante BMP) , la superfamilia del gen TGF-ß comprende BMP-2 hasta BMP-9 y las proteínas relacionadas, han sido reportadas que tienen actividad morfogenética ósea. Además, la actividad morfogenética ósea de una de estas proteínas llamadas MP52 también ha sido reportada (WO 93/16099 y WO 95/04819) . Una región madura de la proteína MP52 es considerada que es una proteína que consiste de 120 residuos aminoácidos, que tienen alanina N-terminal y su secuencia de aminoácidos se describe en estas publicaciones. Una proteína llamada GDF-5, que tiene una secuencia de aminoácidos análoga con MP52, también se describe en Nature, vol. 368, p. 639-643 (1994) y WO 94/15949. Sin embargo, estas proteínas no pueden ser preparadas fácilmente en una forma purificada en una escala industrial. Las líneas celulares de mamífero tales como las células L han sido tratadas para la producción de MP52 con tecnología de ingeniería genética. Sin embargo, no se ha encontrado fácil preparar MP52 en una forma purificada y en alto rendimiento con los sistemas de expresión.

BREVE EXPLICACIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra un mapa del plásmido del vector de expresión (pKOT245) para la proteína de la invención obtenida en el Ejemplo 1 (2) . La Figura 2 muestra una radiografía de rayos X, suave del tejido calcificado inducido en el muslo de ratón en el Ejemplo 4 (1) . La Figura 3 muestra una fotografía de microscopio de luz del tejido calcificado teñido en el muslo de ratón en el Ejemplo 4 (1) . La Figura 4 muestra una fotografía de microscopio de luz del transcurso del tiempo del tejido calcificado teñido en el muslo de ratón en el Ejemplo 4 (2) . La Figura 5 muestra una fotografía de microscopio de luz del hueso parietal de rata teñido en el Ejemplo 4 (3) . La Figura 6 muestra una fotografía de microscopio de luz de los defectos del cartílago articular teñidos en la cabeza femoral de conejo en el Ejemplo 4 (4) . La Figura 7 muestra una radiografía de rayos X, suave de la formacidn ósea en los defectos óseos del fémur de la rata en el Ejemplo 4 (5) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los presentes inventores han tratado de preparar MP52 utilizando E. coli en una escala grande por la tecnología ingeniería genética. En resumen, los inventores han tratado de preparar MP52 utilizando E. coli agregando un codón que codifica para metionina al ADN que codifica para la región madura de MP52, el cual inicia desde la alanina. El producto resultante no fue MP52 solamente, sino una mezcla de MP52, una proteína de 121 residuos aminoácidos que tiene metionina N-terminal y una proteína de 119 residuos aminoácidos que tiene la alanina N-terminal separada y comenzando desde la prolina. Fue extremadamente difícil aislar la MP52 pura por lo menos con la región madura a partir de la mezcla. Los inventores han encontrado que una proteína en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:l del Listado de Secuencias, que comienza a partir de la prolina en el N-terminal puede ser producida selectivamente en un rendimiento extremadamente elevado por construcción de un plásmido, donde un codón que codifica para la metionina está unido a la secuencia de ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:l del Listado de Secuencias que consiste de 119 residuos aminoácidos con eliminación de la alanina N-terminal de la MP52 y utilizando el plásmido obtenido, introducido en E. coli para la expresión. Además, el homodí ero de la proteína descrito en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN N0:1 en el Listado de Secuencias se confirmó para tener actividad morfogenética de cartílago y hueso, y de esta forma se completó la invención. Un objeto de la invención es el de proporcionar una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN N0.-1 del Listado de Secuencias. La proteína consiste de 119 residuos aminoácidos y corresponde a una en la cual la alanina N-terminal es eliminada de la MP52 humana, la cual se considera como una región madura que consiste de 120 residuos aminoácidos. La proteína de acuerdo con la invención es soluble en agua. Además, la proteína es poco tóxica por sí misma, debido a que es derivada del humano. Otro objeto de la invención es el de proporcionar una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades del cartílago y/o hueso, la cual comprende como un ingrediente activo un homodímero de la proteína tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN N0:1 del Listado de Secuencias. Más en detalle, la invención se relaciona con una composición farmacéutica para prevenir y tratar la osteoporosis, osteoartritis tal como gonartritis deformans y malum coxae deformans, o artrosteitis, lesión cartilaginosa tal como lesión del menisco articular, reconstrucción en las partes defectuosas del hueso y cartílago, provocadas por lesión y oncoecto ía, defecto del hueso y cartílago, fractura del hueso, enfermedad del cartílago y hueso congénita tal como condrodisplasia, condrohipoplasia, acondrogénesis, palatosquisis y oesteodisplasia, y además defectos radiculares y arveculares, ya que la proteína homodímera de acuerdo con la invención, tiene actividad morfogenética en el cartílago y el hueso. Además, la proteína homodímera puede ser aplicada para un tratamiento de injerto de hueso en cirugía cosmética. Estos tratamientos también incluyen aquellos en el área de la cirugía veterinaria. Otro objeto de la invención es el de proporcionar un proceso para preparar una proteína que consiste de 119 residuos aminoácidos, derivada de MP52 humana mostrada en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:l del Listado de Secuencias utilizando E. coli . En particular, la invención se relaciona con la construcción de un plásmido que contiene una secuencia de ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos que consiste de 119 residuos aminoácidos, mostrada en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:l del Listado de Secuencias con una metionina adicional en el N-terminal. Solamente la región madura del ADNc de MP52 humano se amplificó por la reacción en cadena de la polimerasa (método PCR) por la utilización, como un ADN plantilla, un vector plásmido que contiene el ADNc descrito en la WO 93/16099. El método PCR se refiere en la presente generalmente que significa multiplicar cantidades muy pequeñas de fragmentos de ADN o ARN por el método descrito en la Patente de los Estados Unidos 4,683,195. Es necesario para la preparación de la proteína de la invención, construir vectores de expresión apropiados que contienen ADN que codifica para la proteína, los cuales entonces son introducidos en la cepa huésped de E. coli deseada por tecnología de ingeniería genética. Los siguientes dos procesos mejorados fueron aplicados para una producción a gran escala de la proteína; 1) Un proceso para aumentar la productividad de las proteínas objetivo por el aumento de la eficiencia de la traducción como se reportó por M. Nobuhara et al. {Agrie. Biol. Chem., 52 (6), 1331-1338, 1988}, viz. el método de aumentar el contenido de AT alrededor del codón de iniciación ATG, y 2) Un proceso para aumentar un número de copias promedio de plásmidos por célula, viz. el método de reemplazar la región orí por el origen de replicación del vector pBR por aquel del vector pUV. Además, el vector de expresión (pKOT245) de la invención, se construyó por ligazón directa de la región promotora con la secuencia de ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO : 1 del Listado de Secuencias con una metionina adicional en su N-terminal. La E. colí que contiene el vector se depositó (No. de Acceso BIKOKEN-KI P-14895) en el National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, el cual está ubicado en 1-3, Higashi 1-chome, Yatake-cho-Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japan el 14 de abril de 1995 y transferido a un depósito (No. de Acceso BIKOKEN-KI BP-5499) el 10 de abril de 1996 de acuerdo con el Tratado de Budapest en el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos. Esta invención se relaciona con un proceso para preparar proteínas monoméricas, que comprende las etapas de: construir un plásmido que contiene el ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:l del Listado de Secuencias con una metionina en su N-terminal, introducir el plásmido en E. coli para la transformación, cultivar la E. coli para obtener cuerpos de inclusión, solubilizar y purificar los cuerpos de inclusión para obtener proteínas monoméricas, y con un proceso para preparar la proteína homodimérica de la proteína en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN N0:1 del Listado de Secuencias por replegado y purificación de las proteínas monoméricas obtenidas en lo anterior. En resumen, las proteínas de la invención se prepararon por solubilización de los cuerpos de inclusión de E. coli , seguido por la carga en una columna de SP-Sepharose FF y la columna Sephacryl S-200 para obtener monómero de MP52 sulfonatado, purificado, el cual se sometió a replegado y precipitación isoeléctrica, entonces la columna RESOURCE RPC de CLAP de fase inversa para obtener la fracción dimérica purificada de la proteína. Las propiedades fisicoquímicas de las proteínas, se analizaron en la base de la secuencia de aminoácidos N-terminal y la composición de aminoácidos y por electroforesis . Esta invención además se relaciona con un proceso para cultivar E. coli , las cuales se introdujeron con el vector de expresión de la invención bajo las condiciones del medio de cultivo a 28-34°C, pH 6-8 y una concentración de oxígeno disuelto de 20-50%. Esta invención además se relaciona con un método para tratar enfermedades del cartílago y el hueso, el cual comprende administrar a un humano una composición farmacéutica que contiene, como un ingrediente activo, una cantidad efectiva de la proteína homodimérica. La activación biológica de la proteína homodimérica se determinaron por análisis de radiografías de rayos X suaves, análisis de tinción de tejido y análisis de tiempo-curso de la formación de cartílago/hueso ectópico. Además, de los resultados del efecto sobre la osificación intrame branosa, el efecto sobre la regeneración del cartílago articular y el efecto sobre la cicatrización de la fractura del hueso y defectos, la proteína homodimérica de la presente invención se prueba para ser benéfica para las terapias de regeneración de cartílago y/o hueso. La proteína homodimérica de la invención puede ser administrada en forma sistémica por inyección intravenosa, intramuscular o intra-peritoneal. En el caso de la administración intravenosa, una infusión de gotas intravenosas también puede ser utilizada, además de las inyecciones intravenosas convencionales. Las preparaciones inyectables pueden ser formuladas, por ejemplo en la forma de polvo inyectable. En ese caso, el polvo puede ser preparado agregando uno o más de excipientes solubles en agua, adecuados tales como manitol, sacarosa, lactosa, maltosa, glucosa, fructosa y similares, a un ingrediente activo, disolviendo la mezcla en agua, dividiéndola en frascos o ampolletas seguida por liofilización y sellado hermético. En el caso de la administración local, la proteína homodimérica puede ser recubierta sobre la superficie del cartílago, hueso o diente que va a ser tratado con pasta de colágeno, pegamento de fibrina u otros materiales adherentes. En el caso del injerto de hueso, ambos del hueso natural y el hueso artificial convencional pueden ser utilizados. El hueso artificial significa el hueso hecho de metal, cerámica, vidrio y otras sustancias inorgánicas naturales o artificiales. La hidroxiapatita es citada como la sustancia artificial preferida. Por ejemplo, el hueso artificial puede ser construido por acero como material denso en la parte interior y la hidroxiapatita como material poroso en la parte exterior. Además, es beneficioso aplicar la proteína homodimérica a la parte de la cual el tejido óseo canceroso es eliminado, para acelerar la reconstrucción del hueso. También puede ser aplicado al injerto de cartílago. La dosis puede ser variada dependiendo de los diversos factores que influyen en la actividad de la proteína, tal como el peso del hueso y cartílago que va a ser reconstruido, sitio lesionado del hueso y cartílago y los síntomas, edad y sexo de los pacientes, severidad de la infección, intervalos de administración y otros factores clínicos. La dosis también puede variarse dependiendo de los tipos de portadores que van a ser utilizados para la restructuración con la proteína dimérica. En general, la dosis está en el rango de aproximadamente 10-10^ ng de la proteína homodimérica por peso húmedo de hueso y cartílago deseados, cuando se administran como una composición que contiene un portador. En el caso de la administración local y sistémica por inyección, es preferible administrar 0.1-104 µg en una frecuencia de una vez a la semana a una vez al día. Un efecto sinergístico puede ser esperado por la administración de la proteína homodimérica simultáneamente con factores del crecimiento conocidos, por ejemplo, factor-I del crecimiento similar a la insulina para la regeneración del hueso y cartílago. Nunca se había reportado de un proceso para preparar la proteína de la invención a una escala industrial y en una forma purificada como se describió en lo anterior, y la proteína homodimérica es útil como una composición médica para el tratamiento de enfermedades del cartílago y el hueso, ya que tiene actividad morfogenética del cartílago y el hueso. Además, el proceso de la preparación de la proteína de la presente invención, puede ser aplicable para la preparación de otras proteínas de los miembros de la superfamilia TGF-ß descrita en lo anterior, de los cuales solamente fueron exitosos en cuanto a la preparación por la utilización de líneas celulares de mamífero. Esta invención además está ilustrada por los siguientes ejemplos. Sin embargo, no debe considerarse que la invención esté limitada a estos ejemplos específicos.

Ejemplo Ejemplo 1 Construcción del vector de expresión (1) Aislamiento de la región madura de MP52 Una región madura de ADNc de MP52 humano se amplificó por PCR utilizando el vector plásmido (pSK52s) que contiene el ADNc descrito en la WO 93/16099 como un ADN plantilla. De acuerdo con el proceso para aumentar la productividad de la proteína objetivo reportada por M. Nobuhara, et al. {Agrie. Biol. Chem., 52 (6), 1331-1338, 1988}, una parte del ADN de la región madura del gen MP52 fue sustituida para aumentar el contenido de AT alrededor del codón de iniciación ATG. La mutagénesis se introduce por el método PCR utilizando el iniciador de la PCR corriente arriba 5' diseñado, que abarca la mutación de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO : 2 del Listado de Secuencias. Para la secuencia de ADN de los iniciadores de la PCR se utilizaron el ADN en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO : 2 como un iniciador hacia el extremo 5 ' , y el ADN en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 3 del Listado de Secuencias como el iniciador corriente abajo 3' . La PCR se realizó agregando el ADN plantilla (10 ng) , 50 pmoles de cada uno de los iniciadores de PCR en orden de dirección y en una dirección inversa, dNTP (0.2 mmoles) y MgCl2 (1.5 mmoles) en el mismo tubo de prueba, junto con la Taq ADN polimerasa (5 U) . Treinta ciclos de la PCR se realizaron; las condiciones de cada ciclo fueron 94°C durante un minuto para la desnaturalización, 55°C durante un minuto para recocer el iniciador y 72°C durante 2 minutos para la extensión del iniciador. Los productos obtenidos a partir de la PCR se aislaron por electroforesis en 1.5% de agarosa de bajo punto de fusión (comprado de FMC) , y los fragmentos de aproximadamente 360 pb se aislaron (Fragmento 1) . (2) Construcción del vector de expresión de E. coli para la proteína de la invención Para aumentar un número de copias del plásmido por bacteria, la región orí para el origen de replicación se cambió de aquel de pBR al vector pUC. El vector de expresión de E. coli pKK223-3 disponible en el mercado (comprado de Pharmacia Biotech) se utilizó para aislar la región promotora tac por digestión con las endonucleasas de restricción SspI y EcoRI y también para aislar la región terminadora rrnBt1t2 utilizando Salí y SspI . Un fragmento de ADN de la región promotora, el cual había sido tratado con Nucleasa de Garbanzo (Takara Shuzo Co., Ltd.) se ligó por la T4 ADN ligasa con el Fragmento 1, el cual se obtuvo en lo anterior. El fragmento de ADN resultante se digirió por Salí y religó con la región rrnBt1t2 • El fragmento de ADN se ligó en el sitio S al del vector pUC18 para construir el vector de expresión {pKOT245 (No. de Acceso BIKOKEN-KI P-14895) } (Figura 1) para la producción de la proteína. La longitud del ADN pKOT245 es de 3.7 kb. La secuencia de nucleótidos del vector de expresión construido para la proteína se analizó por la secuencia de ADN por ALF de Pharmacia. (3) Transformación La transformación se realizó de acuerdo con el método de transformación con cloruro de rubidio por Kushner et al. (Genetic Engineering, p. 17. Elsevier, 1978). En resumen, el pKOT245 se utilizó para transformar la cepa huésped de E. coli W3110M de acuerdo con el método descrito en lo anterior para producir transformantes de E. coli para la producción de la proteína.

Ejemplo 2 Cultivo (1) Cultivo La E. coli que expresa la proteína de la invención, se precultivó en medio SOC modificado (triptona 20 g/1 Bacto, extracto de levadura Bacto 5 g/1, NaCl 0.5 g/1, MgCl2 • 6H20 2.03 g/1, Glucosa 3.6 g/1). 100 ml de la suspensión bacteriana se utilizaron para inocular 5 1 del medio de producción (triptona Bacto 5 g/1, Acido cítrico 4.3 g/1, K2HP04 4.675 g/1, KH2P04 1.275 g/1, NaCl 0.865 g/1, FeS04-7H20 100 mg/l, CuS04 • 5H20 1 mg/l, MnS04 • nH20 0.5 mg/l, CaCl2-2H20 2 mg/l, Na2B407 • 10H2O 0.225 mg/l, (NH4)6Mo7024-4H20 0.1 mg/l, ZnS04 • 7H20 2.25 mg/l, CoCl2 • .6H20 6 mg/l, MgS04-7H20 2.2 g/1, Tiamina HCl 5.0 mg/l, Glucosa 3 g/1) , la cual se cultivó en un fermentador de 10 litros con aireación-agitación y luego alcanzando la etapa temprana de la fase de crecimiento logarítmico (D055Q = 5.0). isopropil-ß-D-tio-galactopiranósido a una concentración final de 1 mM se agrega y el cultivo se continúa hasta que alcanza la DO550 = 150, Durante el cultivo, la temperatura se mantuvo a 32°C y el valor del pH de 7.15 por la adición de amoníaco. Para evitar la disminución de una concentración de oxígeno disuelto, una agitación fuer acelerada para mantener la concentración de oxígeno disuelto a 50% de saturación de aire. Se procedió el cultivo agregando 50% de solución de glucosa a una concentración de 0.2%, para obtener alta densidad de células, con una indicación de un aumento brusco de la concentración de oxígeno disuelto. (2) Preparación de los cuerpos de inclusión de E. coli El caldo de cultivo obtenido por el método descrito en lo anterior, se centrifugó para cosechar las células, las cuales entonces se suspendieron en amortiguador Tris-HCl 25 mM que contiene ácido etilendiaminotetraacético 10 mM (pH de 7.3). Las células se disgregaron por el paso a través de un homogenizador (hecho por APV Gaulin Inc.) y se centrifugan nuevamente para cosechar el precipitado que contiene los cuerpos de inclusión.

Ejemplo 3 Purificación (1) Solubilización de los cuerpos de inclusión de E. coli Después de lavar con 1% de Tritón X-100 tres veces, los cuerpos de inclusión de E. coli se centrifugaron a 3,000 x g durante 30 minutos a 4°C y luego el precipitado resultante se solubilizó por tratamiento con sonido en amortiguador Tris-HCl 20 mM, pH de 8.3, urea 8 M, DTT 10 mM y EDTA 1 mM. (2) Preparación de los monómeros La solución solubilizada se centrifugó a 20,000 x g durante 30 minutos a 4°C y el sobrenadante resultante se recolectó. El sobrenadante obtenido se sometió a SP-Sepharose FF (Pharmacia AB) equilibrada con amortiguador Tris-HCl 20 mM, pH de 8.3, urea 6 M y EDTA 1 mM y entonces, después de lavar con la misma solución, se eluyó con la misma solución que contiene NaCl 0.5 M. La proteína en el eluido se sulfonató por la adición de Na2S03 y Na2S40g para leer la concentración final respectivamente a lll M y 13 mM y por incubación a 4°C durante 15 horas. La solución de sulfonato se filtró en gel en Sephacryl S-200 HR (Pharmacia AB) en equilibro con amortiguador Tris-HCl 20 mM, pH de 8.3, urea 6 M, NaCl 0.2 M y EDTA 1 mM para obtener el monómero sulfonatado purificado de la proteína de la invención. (3) Replegado La solución del monómero de sulfonato se agregó en un volumen de 9 veces de amortiguador de Na-Glicina 50 mM, pH de 9.8, NaCl 0.2 M, CHAPS 16 mM, EDTA 5 mM, GSH 2 mM (reducción tipo glutatión) , GSSG 1 mM (glutatión tipo oxidación) con agitación y luego se incuba durante 24 horas a 4°C para oxidar y replegar la proteína de la invención. (4) Preparación de los homodímeros La solución de replegado se diluyó con el mismo volumen de agua purificada y luego agregando NaCl 6 N valor del pH ajustado a aproximadamente 7.4 y colocado para la precipitación isoeléctrica. La precipitación recolectada por centrifugación a 3,000 x g durante 20 minutos se solubilizaron en una solución con 30% de acetonitrilo que contiene 0.1% de TFA. La solución se diluyó con el mismo volumen de agua purificada y se carga en una columna RESOURCE RPC (Pharmacia AB) de una CLAP de fase inversa, preequilibrada con 25% de acetonitrilo que contiene 0.05% de TFA, y luego se eluye con un gradiente lineal de 25-45% de acetonitrilo que contiene 0.05% de TFA. El material eluido se monitoreó a 280 nm de absorbancia. Las fracciones de proteína homodimérica purificadas se recolectaron y liofilizaron por el Concentrador SpeedVac (Servant Co.). (5) Determinación de las propiedades fisicoquímicas de proteína purificada de la invención a) Análisis de la secuencia de aminoácidos N-terminal El análisis de la secuencia de aminoácidos N-terminal para las proteínas purificadas se realizó utilizando un secuenciador de aminoácidos Modelo 476A (Applied Biosystems Inc.) para confirmar la secuencia de aminoácidos del N-terminal para el 30avo aminoácido como se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO:l del Listado de Secuencias. b) Análisis de la composición de aminoácidos El análisis de la composición de aminoácidos de las proteínas purificadas obtenidas en lo anterior, se realizó por un secuenciador de aminoácidos (PICO TAG Systems, Waters). El resultado se muestra en la Tabla 1. El número descrito en la Tabla 1 indica el número de residuos aminoácidos por una proteína monomérica.

Tabla 1 Aminoácido Número de Práctica Número Esperado Asx 11.5 12 Glx 10.9 11 Ser 8.4 9 Gly 4.3 4 Hia 4.0 4 Arg 7.7 7 Thr 5.4 6 Ala 7.3 7 Pro 10.2 10 Tyr 2.9 3 Val 5.7 7 Met 5.1 4 l/2Cys 2.6 7 lie 4.9 6 Leu 10.0 10 Lya 5.9 6 Typ •• 2 longitud de la secuencia 119 sin detectar c) Análisis por electroforesis El peso molecular de la proteína purificada obtenida en lo anterior, se confirmó que es de aproximadamente 28 unidades KDa en SDS-PAGE bajo condiciones n reductoras . De los resultados mostrados en a) , b) y e) anteriores, se encontró que la proteína de la invención, consiste de 119 residuos aminoácidos comenzando desde Pro N-terminal individual.

Ejemplo 4 Determinación de las actividades biológicas (1) Actividad en la formación de hueso tópico en ratones. Aproximadamente 500 µg de la proteína homodimérica obtenida en el Ejemplo 3, se disolvió y diluyó en 50 µl de ácido clorhídrico 10 mM, y 1 µg/10 µl, 10 µg/10 µl y 100 µg/10 µl de concentraciones de la solución se prepararon. Diez µl de cada solución se mezclaron con 150 µl de la solución de colágeno del tipo I del tendón porcino (Koken, 0.5%, pH 3, I-AC) , se neutralizó, liofilizó y la mezcla resultante se implantó en la cavidad creada en los músculos del muslo de ratones ICR machos de 8 semanas de edad. En el día 21 desde la implantación, los animales fueron sacrificados y los muslos se extirparon. Después de retirar las pieles por desprendimiento, la incidencia de tejidos calcificados se evaluó por radiografía de rayos X suave. Como se muestra en la Tabla 2, la implantación de 1 µg/sitio o más de la proteína dimérica induce tejido calcificado en parte del grupo de los ratones y 10 y más dosis que inducen tejido calcificado en todos los ratones utilizados. Tabla2 Dosis de la proteina homodimérica Incidencia de tejido calcificado Control (colágeno sólo del Tipo I) 0/4 1 µg/sitio 3/4 10 µg/sitio 4/4 100 µg/sitio 4/4 La Figura 2 muestra los ejemplos típicos de radiografía de rayos X suaves de tejido calcificado inducido por diferentes dosis de la proteína MP52. Las Figuras 2A, 2B y 2C muestran ejemplos de radiografía de rayos X suaves de 1 µg de la proteína homodimérica/sitio-, lOµg/sitio - y 100 µg/sitio-muslo de ratón implantados, respectivamente. Estas radiografías indican que la proteína homodimérica indujo el tejido calcificado en el muslo de ratón y aumentó en una forma dependiente de la dosis. Para verificar si el tejido calcificado formado fue cartílago o hueso, las secciones de los muslos de ratón fijos en los cuales µg/sitio de la proteína homodimérica se implantó, se tiñeron con von Kossa, azul de Alcian o Hematoxilina-eosina. La Figura 3 muestra fotografías microscópicas de luz de las secciones teñidas con los métodos de tinción respectivos. En la Figura 3A (tinción von Kossa), las áreas indicadas por ct y cc mostraron tejido calcificado y condrocitos calcificados, respectivamente. En la Figura 3B (tinción de azul Alcian) , un área indicada por rc mostró tejido de cartílago que permanece. En la Figura 3C (tinción con Hematoxilina-eosina) , los elementos indicados por ad, bm, Ib, ob y wb son un adipocito, células de médula ósea, hueso lamelar, osteoblastos y hueso poroso, respectivamente. De esta forma, es evidente que la implantación de la proteína homodimérica con colágeno de Tipo I en los muslos de ratón induce condrocitos calcificados, osteoblastos y células de médula ósea en el sitio. De esta forma, la proteína homodimérica fue demostrada que posee actividad en el cartílago ectópico y la formación de hueso. (2) Análisis del curso del tiempo de la formación del hueso tópico en los ratones. La proteína dimérica (3 µg) obtenida en el Ejemplo 3, se mezcló con solución de colágeno del Tipo-I y se neutralizó como se describió en el Ejemplo 4 (1) , y los materiales liofilizados se implantaron en los muslos de ratón ICR machos. En los días 3, 7, 10, 14, 21 y 28 a partir de la implantación, los muslos se extirparon y se fijaron en 10% de formalina y después, las secciones se tiñeron con Hematoxilina-eosina o von Kossa. La Figura 4 muestra las fotografías de microscopio de luz de las secciones teñidas. En el día 3 (Figura 4A, tinción con Hematoxilina-eosina) , células mesenquimales sin diferenciar ( e) incluyendo células conectivas morfológicamente fibrosas aparecieron en el espacio entre las fibras de colágeno (co) implantadas y las células del músculo (m) . Entre los días 7 y 10 (Figuras 4B y 4C, respectivamente, la tinción con Hematoxilina-eosina) , el espacio se llenó con células mesenquimales sin diferenciar (me) y estas células se hipertrofiaron y diferenciaron en tejido precartilaginoso. En el día 14 (Figura 4D, tinción de Hematoxilina-eosina y Figura 4E, tinción von Kossa), tejido de cartílago calcificado (cc) y tejido óseo (b) se observaron. En el día 21 (Figura 4D, tinción de Hematoxilina-eosina y Figura 4E, tinción de von Kossa), no se observó tejido de cartílago calcificado para nada y el tejido observado en el día 14 pareció ser reemplazado en el hueso (b) con médula ósea (bm) . En el día 28 (Figura 4H) , tinción con Hematoxilina-eosina) , hubo un gran monte de células de médula ósea y el hueso formado pareció estar bajo un proceso de resorción. De esta forma, es evidente que la proteína homodimérica induce la osificación endocondrial por medio de la formación de cartílago en sitios tópicos, como se reportó por la utilización de otros BMP. (3) Efectos sobre la osificación intramembranosa La proteína homodimérica obtenida en el ejemplo 3, se disolvió en solución salina amortiguada con fosfato (ph 3.4) que contiene 0.01% de albúmina de suero humano y 0.01 µg/20 µl-, 0.1 µg/20 µl-, y 1 µg/20 µl- concentraciones de soluciones fueron preparadas. Veinte µl-porción de cada solución se inyectó 12 veces una vez al día en el perioseo del hueso parietal de rata neonatal utilizando una microjeringa desde el día 1 después del nacimiento. El mismo volumen del vehículo se inyectó sobre el lado contrario del hueso parietal de cada rata. El mismo volumen del vehículo también se inyecto en ambos lados de los huesos parietales de las ratas control. En el día 1 a partir de la inyección final, las ratas se sacrificaron y ambos lados de los huesos parietales se extirparon y fijaron y entonces la sección descalcificada se tiñó con Hematoxilina-eosina, se prepararon para medir el espesor del hueso parietal en los sitios inyectados sobre las fotografías microscópicas. La relación de la proteína homodimérica-sitio inyectado/vehículo-sitio inyectado en hueso parietal, se calculó el espesor de cada rata. Como se muestra en la Tabla 3, la proteína homodimérica aumentó el espesor del hueso parietal en una forma dependiente de la dosis. Un ejemplo típico de las fotografías microscópicas de la sección en una proteína homodimérica 0.1 µg/sitio-sitio inyectado se muestra en la Figura 5B en comparación con aquella de los lados contrarios del sitio inyectado con el vehículo (Figura 5A) . La inyección de la proteína homodimérica induce la activación y proliferación de células periostiales (p) y los osteoblastos activados (ob) se observaron en y sobre el hueso parietal (b) . Estos resultados indican que la proteína homodimérica estimuló la osificación intramembranosa cuando se inyectó localmente y que la proteína homodimérica es benéfica para las terapias de la osteoporosis, fractura del hueso y defectos del reborde alveolar periodontal . Tabla 3 Dosis de la proteína h pw-imárir- Esoasor dal hueso oarietal .um- proteina µg/sitio/dia Sitio da inyección dai vehículo (A) Sitio da inyección MPS2 (B) (B/A) 0 (vehículo) 123 ± 7 141 ± 20 1.10 ± 0.16 3 .01 134 t 9 167 ± 30 1.27 ± 0.33 0.1 119 ± 19 190 t 29 1.60 ± 0.10* 1 132 ± 9 225 ± 23 1.70 ± 0 .14** Los valores representan medias ± SD (n=4) , *p<0.05, **p<0.01 contra la relación del grupo en el cual el vehículo se inyecto en ambos de los sitios (prueba de Williams) . (4) Efectos sobre la regeneración del cartílago articular. Seis conejos blancos de Nueva Zelanda machos de 12 semanas se utilizaron para este estudio. La piel de la rodilla derecha y la cápsula articular se corta y se crea un defecto osteocondrial del espesor completo del 5 x 5 mm en la ranura patelar utilizando una fresa dental mientras que no dañe los tendones circundantes. Los defectos se llenaron con ya sea una esponja de colágeno del tipo-I liofilizada o con una esponja de colágeno del Tipo- I liofilizado que contiene 10 µg de la proteína homodimérica, preparada como se describió en el Ejemplo 4 (1) , y entonces el corte de la cápsula articular y la piel se sutura. Tres semanas postoperación, los conejos se sacrificaron y las cabezas femorales se extirparon y se fijaron en 10% de formalina, y después, las secciones descalcificadas se tiñeron con azul Alcian. Los ejemplos típicos de las fotografías microscópicas de las secciones se mostraron en la Figura 6. Los defectos tratados por la proteína dimérica (Figuras 6C y 6D) demostraron la regeneración de los condrocitos (ch) con matrices extracelulares, los cuales se tiñeron intensivamente con azul Alcian, cuando se compara con defectos controlados implantados con esponja colágeno del Tipo-I (Figuras 6A y 6B) los cuales se llenaron con tejido fibroso (f) . El tejido de cartílago inducido por la proteína dimérica mostró estructura de zona e incluye condrocitos en reposo, condrocitos en crecimiento y condrocitos hipertrofiados, similar a aquél del cartílago articular normal. La condroinducción por la proteína MP52 se observó en los defectos de todos los conejos utilizados (n=3) . Estos resultados indican que la proteína dimérica es efectiva para la reparación del tejido de cartílago dañado en pacientes tales como osteoartritis. (5) Efectos sobre la cicatrización de la fractura de hueso y defectos. Treinta ratas Sprague-Dawley machos (aproximadamente 15 semanas de edad) se utilizaron para este estudio. Utilizando un enfoque lateral para el fémur, todo músculo y el tejido periosteal se retiró de la diáfisis. Se creó un defecto del hueso segmentado de 5 mm en la región media del fémur derecho con el uso de la fresa dental y entonces, una placa de polietileno hecha especialmente se fijó con tornillos de acero inoxidable, a lo largo de la corteza del fémur. Las esponjas de colágeno del Tipo- I que contienen 0, 1, 10 y 100 µg de la proteína homodimérica se prepararon como se describió en el Ejemplo 4 (1) , e implantaron en los defectos del hueso segmentado y luego la herida se suturó. Justo después de la operación y 12 semanas post-operación, los defectos se evaluaron por radiografía de rayos X suave. Como se muestra en la Figura 7, 10 y 100 µg/sitio de callo estimulado con la proteína homodimérica (cs) la formación en los defectos y uniones óseas formadas, pero el efecto a un 1 µg/sitio no estuvo claro cuando se comparó con el defecto implantado con colágeno control, en el cual solamente la formación de hueso endosteal, marginal, se observó. Doce semanas post-operación, la rata se sacrificó y el fémur con un defecto se extirpó y se midió el contenido de hueso mineral (acumulado una de la mitad-tres exploraciones en el defecto) por absorptiometría de rayos X de energía doble (Aloka, Modelo DCS-600) en un modo con exploración de 1 mm de ancho y después de retirar la placa de polietileno. Ambos extremos del fémur con la resina se fijaron, entonces, la resistencia torsional máxima para romper la unión de las muestras se midió por un sistema medidor de la tensión ósea (Malto, modelo MZ-500D) a una velocidad de envío con 180°/mm (Tabla 4) . Esto muestra que la proteína homodimérica aumentó ambos del contenido de mineral óseo y la resistencia ósea en el defecto del fémur de la rata, en el cual la proteína es implantada e indica la eficacia de la proteína presente para cicatrizar la fractura y la reconstrucción del hueso del defecto. Tabla4 Dosis de proteína Contenido Mineral en Hueso an al Resistencia Torsional Número homodimérica (µg sitio) defecto en el fémur de rata (mg) máxima (Kgfan) colágeno solo 120 .2 t 24.5 2 .92 ¿ 0.09 6 1 176. 9 ± 36 , 4 6.24 ± 1 .00 ? 10 277.4 i 63.9 9 .35 ± 3. 14 ß 100 374.8 ± 67 . 1* 40.34 t 7 . 64* a Los valores representan medias ± SE, *p<0.05, contra el grupo solo con colágeno (prueba de Student) . De los resultados en el Ejemplo 4, la proteína homodimérica de la invención se encontró que tiene una actividad morfogenética de cartílago y hueso. La proteína compuesta de un homodímero de la proteína que tiene una secuencia de aminoácidos en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO. 1 del Listado de Secuencia tiene actividad morfogenética de cartílago y hueso y es útil como una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades del cartílago y el hueso. Además, la proteína de la invención puede ser preparada en una escala industrial y en una forma pura por un gen por ingeniería genética, el proceso de cultivo E. coli transformado con un vector de expresión con mayor número de copias para la proteína.

"Lista de Secuencias" SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN No . : 1 Longitud de la Secuencia: 119 Tipo de la Secuencia: aminoácido Topología: Lineal Tipo de Molécula: péptido Tipo de Fragmento: fragmento N-terminal Fuente Original Organismo: homo sapiens Nombre del tejido: Feto Características : Otra información: Secuencia de 383 a 501 de la secuencia de aminoácidos de MP52. Descripción de la Secuencia: SEC. de IDENT. No.: 1: CCA CTG GCC ?CT CGC C?G GGC AAG CG? CCC AGC A?G ?AC CTT AAG GCT 48 Pro Leu Ala Thr Arg Gln Gly Lya Arg Pro S«r Lys Asn Leu Lyß Ala 5 10 15 CGC TGC AGT CGG ??G GCA CTG CAT GTC AAC TTC AAG G?C ?TG GGC TGG 96 Arq Cys Sßr Axqr Lys Ala Leu His Val Asn Phe Lyß Asp Mßt Gly Trp 20 25 30 GAC G?C TGG ATC ?C GCA CCC CTT GAG TAC GAG GCT TTC CAC TGC G?ß 144 Asp Asp Trp ile Xle ?la Pro Leu Glu Tyr Glu ?la Phe His Cys Glu 35 40 45 GGG CTG TGC GAG TTC CCA TTG CGC TCC CAC CTG GAG CCC ACG AAT CAT 192 Gly Leu Cyß Glu Phe Pro Leu Arg Ser Hls Leu Glu Pro Thr Asp His 50 55 60 GCA GTC ATC CAG ACC CTG ATG AAC TCC ATG GAC CCC GAß TCC ACA CCA 240 Ala Val He Gln Thr Leu Mat Asn Ser Mee Asp Pro Glu Ser Thr Pro 65 70 75 80 CCC ACC TGC TOT GTG CCC ACG CGA CTG AGT CCC ?TC AGC ATC CTC TTC 288 Pro Thr Cys Cys Val Pro Thr Arg Leu Ser Pro Zle Ser Zle Leu Phe 85 90 95 ATT GAC TCT GCC AAC AAC GTG GTG TAT AAG CAG TAT GAS GAC ATß GTC 336 r e Aap Ser Ala Asn Asn Val Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met Val 100 105 HO GTG GAG TCG TGT GGC TGC AGß 357 Val Glu Ser Cys Gly Cys Arg 115 SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN No . : 2 Longitud de la Secuencia : 27 Tipo de la Secuencia : ácido nucleico Forma de la cadena : sencilla Topología : lineal Tipo de Molécula : otro ácido nucleico Fuente Original : ninguna Organismo : ninguno Cadena : ninguna Características: iniciador de MP52 de tipo maduro hacia el extremo 5' de la PCR. Descripción de la Secuencia: SEC. de IDENT. No.: 2: ATAATGCCAC TAGCAACTCG TCAGGGC 27 SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN No . : 3 Longitud de la Secuencia: 26 Tipo de la Secuencia: ácido nucleico Forma de la cadena: sencilla Topología: lineal Tipo de Molécula: otro ácido nucleico Fuente Original: ninguna Organismo: ninguno Nombre del tejido: ninguno Características : Otra información: iniciador de MP52 de tipo maduro hacia el extremo 3' de la PCR. Descripción de la Secuencia: SEC. de IDENT. No.: 3: CGTCGACTAC CTGCAGCCAC ACGACT 26 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES 1. Una proteína caracterizada porque tiene una secuencia de aminoácido en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO. 1. del Listado de Secuencias. 2. La proteína homodimérica de conformidad con la reivindicación 1. 3. Una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades del cartílago y el hueso, caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína de conformidad con la reivindicación 2, y un portador farmacéutico. 4. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque las enfermedades del cartílago y el hueso son osteoporosis.

. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicacidn 3, caracterizada porque las enfermedades del cartílago y el hueso son osteoartritis o artrosteitis . 6. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque las enfermedades

Claims (1)

1. del cartílago y el hueso son fractura del hueso y defecto del hueso. 7. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque las enfermedades del cartílago y el hueso son defectos radicular y arvecular. 8. El proceso para la preparación de la proteína de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende cultivar E. coli transformada con un plásmido que contiene la secuencia de ADN, la cual es capaz de expresar a la proteína. 9. El proceso de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque el plásmido contiene un ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO. 1. del Listado de Secuencias con una metionina en el N-terminal. 10. El proceso para preparar la proteína dimérica de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende las etapas de: construir un plásmido que contiene el ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO. 1 del Listado de Secuencias con una metionina en el N-terminal, introducir el plásmido en E. coli para la transformación, solubilizar los cuerpos de inclusión obtenidos por el cultivo de E. coli, purificar la proteína monomérica de la solución solubilizada, replegar la proteína monomérica en una proteína dimérica y purificar la misma. 11. El método para el tratamiento de enfermedades del cartílago y el hueso, caracterizado porque comprende administrar a un humano una composición farmacéutica que contiene, como un ingrediente activo, una cantidad efectiva de la proteína homodimérica de conformidad con la reivindicación 2. 12. El método para el tratamiento de enfermedades del cartílago y el hueso de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la enfermedad es osteoporosis. 13. El método para el tratamiento de enfermedades del cartílago y el hueso de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la enfermedad es osteoartritis o artrosteitis . 14. El método para el tratamiento de enfermedades del cartílago y el hueso de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la enfermedad es fractura del hueso y defecto del hueso. 15. El método para el tratamiento de enfermedades del cartílago y el hueso de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la enfermedad es defectos radicular y arvecular. RESUMEN DE LA INVENCIÓN Una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO. 1, en el Listado de Secuencia y que se origina en MP52 humana y el dímero de esta proteína. Esta proteína dimérica puede ser obtenida por la construcción de un plásmido que contiene un ADN, en el que un codón que codifica para la metionina es agregado al extremo 5' de la secuencia de ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos mencionada en lo anterior, transformar Escherichia coli por este plásmido, incubando la E. coli transformante, solubilizar y purificar los cuerpos de inclusión obtenidos para dar una proteína monomérica y luego renaturalizar la proteína monomérica obtenida en el dímero, seguida por purificación. Esta proteína dimérica es útil en el tratamiento de enfermedades del cartílago y del hueso. NUEVA PROTEINA Y PROCESO PARA SU PREPARACIÓN RESUMEN DE LA INVENCIÓN Una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO. 1, en el Listado de Secuencia y que se origina en MP52 humana y el dímero de esta proteína. Esta proteína dimérica puede ser obtenida por la construcción de un plásmido que contiene un ADN, en el que un codón que codifica para la metionina es agregado al extremo 5' de la secuencia de ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos mencionada en lo anterior, transformar Escherichia coli por este plásmido, incubando la E. coli transformante, solubilizar y purificar los cuerpos de inclusión obtenidos para dar una proteína monomérica y luego renaturalizar la proteína monomérica obtenida en el dímero, seguida por purificación. Esta proteína dimérica es útil en el tratamiento de enfermedades del cartílago y del hueso.