MXPA98000686A - Nueva proteina hmw humana mp52s - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona proteínas llamadas HMW humano MP52s que tienen alguna secuencia aminoácido de SEC ID NO.:1 que se produce en células CHO. La presente invención también proporciona un proceso para la producción de HMW humano MP52s y una composición farmacéutica que contiene como ingrediente activo HMW humano MP52s. HMW humano MP52s puede usarse para tratar o prevenir enfermedades de hueso, etc. debido a su propiedad de promover la morfogénesis de hueso.

Description

MUEVA PROTEINA HMW HUMANA MP52a Descripción Detallada de la Invención (1) Campo de la Invención Esta invención se refiere a la nueva prsteína HW huraña MP52s y a una composición médica inter aJia para promover la morfogénesis de cartílago y hueso que comprende la HMW humana MP52s. En particular la composición médica es útil para tratar enfermedades de hueso causadas por metabolismo anormal del hueso tal como osteoporosis, para tratar fractura de *, hueso y para el propósito de reconstrucción ortopédica, transplante de hueso, cirugía estética y terapéuticas dentales. Además, es útil para tratar desordenes de cartílago. (2) Descripción del Arte Anterior Las composiciones farmacéuticas que incluyen vitamina D3, calcitonina, estrógeno y derivados de bisfosfonato se han usado en práctica clínica para tratar enfermedades de hueso. Sus resultados terapéuticos, sin embargo, no son enteramente satisfactorios, y se desea grandemente una mejor composición farmacéutica. La familia TGF-li de factores de crecimiento tales como BMP, TGF, y proteínas inhibidoras relacionadas han reportado REF,: 26670 ser útiles para curar la herida y reparar el tejido. También ha sido mostrada la actividad morfogenética del hueso de algunas de estas proteínas. La solicitud de Patente PCT WO 93/16099 y WO 95/04819 expone las secuencias de ADN humano que codifican proteínas tipo TGF-ß, y como una proteína humana preferida MP52. E.E. Storm et al. reporta en Nature, 1994, vol. 368, p.639-642 tres factores de crecimiento/diferenciación de ratón, p. ej . GDF5, GDF6 y GDF7 se identificaron como miembros nuevos de la superfamilia TGF-ß y que las mutaciones en el gen GDF5 causó braquipodismo en ratones. El GDFS déf ratln tiene la misma secuencia de aminoácido de la forma /madura predicha como la humana de MP52 excepto un aminoácido. Sin embargo, no hay indicación en esta publicación para usar esas proteínas para el tratamiento de enfermedades de hueso. Esto fue por consiguiente el objetivo de la presente invención para proveer un factor de crecimiento adicional que es útil como un agente para la estimulación de formación - del hueso o cartílaao. (3) Descripción Detallada de la Invención. MP52 madura se considera como una proteína que tiene 120 aminoácidos. Esta secuencia aminoácido es desde 355 a 474 de SEC ID NO.rl de la Secuencia Listada (WO 95/04819) . De hecho, se ha encontrado sorpresivamente por los inventores que hay líneas celulares las cuales, cuando expresan una secuencia de ADN adecuado, forman proteínas que tienen variaciones de longitud de la secuencia aminoácido, es decir MP52 madura y HMW humana MP52s (peso molecular alto) . Para la primera vez la invención consiguió probar de HMW humana MP52s que tiene actividad morfogenética de hueso y son útiles para prevenir y/o tratar enfermedades del hueso. La presente invención se refiere a HMW humana MP52s que cae dentro de alguna de las siguientes definiciones: (1) una proteína dimérica que contiene péptidos que tiene secuencia aminoácido de 1 a 474 de SEC ID NO..-1. I « (2) una proteína dimérica que contiene péptidos que tiene secuencia aminoácido de 121 a 474 de SEC ID NO.:l. (3) una proteína dimérica que contiene péptidos que tiene secuencia aminoácido de 122 a 474 de SEC ID NO.:l. (4) una proteína dimérica que contiene péptidos que tiene secuencia aminoácido de 121 a 474 de SEC ID NO.:l y un péptido que tiene secuencia aminoácido de 122 a 474 de SEC ID NO.:l. (5) una proteína dimérica que contiene péptidos que tiene secuencia aminoácido de 1 a 474 de SEC ID NO.:l y un péptido que tiene secuencia aminoácido de 121 y/o 122 a 474 de SEC ID NO. :1. (6) una proteína dimérica que contiene péptidos que tiene secuencia aminoácido de 1 a 474 de SEC ID NO.:l y un péptido que tiene secuencia aminoácido de 355 a 474 de SEC ID NO. :1. (7) una proteína dimérica que contiene péptidos que tiene secuencia aminoácido de 121 y/o 122 a 474 de SEC ID N0..1 y un péptido que tiene secuencia aminoácido de 355 a 474 de SEC ID N0.:1. Las proteínas existen usualmente como dímeros a través de enlaces -S-S- formados por cisteínas. El péptido en esta especificación significa un monómero. HMW humana MP52s induce formación de cartílago de células mesenquimales no diferenciadas y estimula la diferenciación y maduración de osteoblastos. Por eso, las HMW*. humana MP52s son efectivas para prevenir y/o tratar enfermedades del hueso causadas por metabolismo anormal del hueso tal como osteoporosis. También aceleran el proceso de curación de las fracturas de hueso. Además, son útiles para reconstrucción ortopédica, transplantaciones de hueso y terapéutica dental debido a su actividad morfogenética de hueso. Además, HMW humana MP52s son efectivas para prevenir y/o tratar desordenes de cartílago causados por metabolismo anormal del cartílago. Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un proceso para la producción de HMW humana MP52s, donde la secuencia de ADN que codifica para HMW humana MP52s como se muestra en SEC ID NO.:l se introduce en una célula huésped adecuada y se cultiva bajo condiciones que favorecen expresión de la secuencia del ADN y formación de proteínas, seguido por aislamiento de dicha proteína de otras proteínas recuperadas de dicha célula huésped. Con la estructura de la presente invención, la secuencia del ADN representada en SEC ID NO.:l podría ser usada para producir HMW humana MP52s, sin embargo, también porciones más pequeñas de las mismas, proporcionan todavía HMW humano MP52s codificado y es posible la expresión de la secuencia de ADN en un sistema celular vector/huésped adecuado. Los sistemas de expresión adecuados son conocidos por un experto en el arte y puede determinarse fácilmente por experimentación de*, rutina cuales son los requerimientos mínimos para la longitud de la secuencia de ADN de SEC ID NO.:l. Subsecuente a la formación de la proteína, las proteínas son recuperadas de la célula huésped por métodos conocidos per se y finalmente HMW humano MP52s se aislan de las mismas. En particular el aislamiento de HMW humano MP52s puede llevarse a cabo usando métodos de separación por diferenciación muy precisos que son conocidos por un experto en el arte. Por ejemplo, la HPLC de fase inversa podría ser considerada para este fin. Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica que contiene HMW humano MP52s. Opcionalmente, esta composición también podría incluir substancias de vehículos usuales, substancias auxiliares, diluyentes y/o rellenos. La composición farmacéutica de acuerdo a la invención es útil para promover morfogenación de hueso, tratamiento o prevención de daño a hueso, cartílago, tejidos conectivos, piel, membranas mucosas, epitelio o dientes, para aplicación en implantes dentales y para aplicación en curación de herida y procesos de regeneración de tejido. Es posible administrar una de la HMW humano MP52s separadamente o en una forma de mezcla de HMW humano MP52s. Para el tratamiento de enfermedades del hueso causadas por metabolismo anormal del hueso, HMW humano MP52s se*; administran sistémicamente por inyección tal como inyección intravenosa, inyección intramuscular e inyección intraperitoneal, administración oral, administración parenteral tal como supositorio, y cualquier otro método convencional. Para el tratamiento de fractura de hueso, se administran sistémica y localmente por inyección, administración oral y parenteral. También las matrices que contienen HMW humano MP52s se implantan preferiblemente en el área cerrada del hueso fracturado. Matrices adecuadas son polímeros naturales tales como colágeno y pegamento de fibrina, y polímeros artificiales degradables en el cuerpo viviente tal como ácido glicólico poli lactado. En caso de reconstrucción ortopédica, cirugía estética, transplante de hueso e implantación dental, las HMW humano MP52s por ejemplo pueden recubrir la superficie del hueso y diente para ser implantado por medio de pasta de colágeno, pegamento de fibrina y otros materiales adherentes. Esto también puede ser aplicado al tejido, al hueso o hueso alveolar alrededor del cual se transplanta el hueso y diente. En caso de transplante de hueso esto puede ser usado para hueso natural y artificial. Como el material de hueso y diente artificial, se usan materiales convencionales tales como metales, cerámicas, cristal y otras substancias inorgánicas naturales o artificiales. La hidroxiapatita es*, una substancia artificial preferible. El hueso artificial puede ser construido por material denso en la parte interior y material poroso en la otra parte. Por ejemplo, puede citarse acero macizo y acero poroso. La hidroxiapatita porosa es uno de los materiales para producir hueso artificial. Cuando tal material poroso es usado, HMW humano MP52s pueden penetrarlo. La superficie del hueso artificial puede ser rugosa para conservar HMW humano MP52s en la superficie. Esto también beneficia a la aplicación HMW humano MP52s en la parte del cual se removió tejido canceroso del hueso para acelerar la reconstrucción del hueso. La dosis de HMW humano MP52s administrada se decide dependiendo del propósito y el método de aplicación. En general, cuando se administra sistémicamente, la dosis es de 1 µg a 100 µg/kg. Cuando se usa implantación, la dosis preferida es de 30µg a 30 mg por sitio. Estas HMW humano MP52s purificadas pueden formularse en cualauier forma convencional tal como líquido de inyección, pildoras, cápsulas y supositorio. Para administración local de HMW humano MP52s puede incluirse en una matriz tal como colágeno, pegamento de fibrina y ácido glicólico pol i lactado. Para el uso de la implantación y transplante se aplicó a la superficie o en la parte porosa del hueso y diente. Esta invención es ilustrada por los ejemplos. t Ejemplo 1 Producción de HMW humano MP52s (1) Construcción del vector de expresión para HMW humano MP52s El vector pSK52s que contiene el gen de MP52 humano, el que se proporcionó por Dr. Hótten de Biopharm GmbH, se digirió con Hind III y el fragmento de ADN que contiene el gen de MP52 humano se aisló por la extracción de 0.8% de geles de agarosa de bajo punto de fusión y se unió al sitio Hind III del vector pABstop, que es abastecido por Dr. Gerd Zettlmeissl de Behringwerke AG. La estructura del vector de expresión de HMW humano MP52s, pMSS99 (5.0 kb) como se muestra en la Fig. 1, se confirmó por la secuencia del ADN y el mapeo con la enzima de restricción. La secuencia de ADN de HMW humano MP52s en pMSS99 fueron los nucleótidos desde el 576 al 2279 mostrados en la SEC ID NO: 1 del Listado de Secuencias. (2) Establecimiento de clones de CHO productores de MP52 humano Células CH0-DUKX-B11, mutantes de células CHO, que se suministraron por Dr. Zettlmeissl de Behringwerke AG, se co-transfectaron con pMSS99 y pSVOAdhfr que también se proporcionaron por Dr. Zettlmeissl, por el método de Transferencia de ADN por medio de fosfato de calcio. Después se establecieron los clones altamente productores de HMW humano MPS2s por el protocolo de ampliación de gen que usa *-. metotrexato (MTX) . Diez µg de pMSS99 y 2 µg de pSVOAdhfr se disolvieron en 1 mi de HEPES 25 M-NaCl 140 mM-Na2HP04 0.75 mM (pH 7.05), entonces se mezcló con 50 µl de CaCl22.5 M. Los precipitados resultantes se recubrieron para células CHO-DUKX-B11 en una placa de 10 cm y se paró a temperatura ambiente durante 30 min. Entonces 8 mi de MEM ALPHA con ribo - y desoxirribo -nucleósidos (MEM +) conteniendo 10% de suero de feto de bovino (FBS) se agregó a la capa celular para incubar en una incubadora de C02 durante 4-6 h. Después del tratamiento con 10% glicerol en MEMa+ que contiene 10% FBS a temperatura ambiente durante 3 min, las células se cultivaron en MEM + conteniendo 10% FBS durante 2 días. Entonces las células se recolocaron en MEM ALPHA sin ribo- y desoxirribonucleósidos (MEMcr) conteniendo 10% FBS dializado para seleccionar los transformados. Los clones transformados se aislaron y probaron para la expresión de HMW humano MP52s por el análisis de Western blot como se describe en la próxima sesión. El HMW humano MP52s que produce clones se seleccionó además aumentando las concentraciones escalonadamente de metotrexato (MTX) para amplificar el gen MP52 de acuerdo con el gen pSVOAdhfr. Varios clones se obtuvieron para producir 1-3 µg de HMW humano MPS2s/106 células/24 h a 400 nM de MTX. * (3) Detección de HMW humano MP52S en los sobrenadantes del cultivo Los clones se examinaron para la expresión de HMW humano MP52 por análisis de Western blot como se indica a continuación: los sobrenadantes del cultivo (1-15 µl) se aplicaron sobre SDS-PAGE (15-25% de gradiente de gel de poliacrilamida, Daiichi Puré Chemicals) bajo condiciones seductoras, después las proteínas se transfirieron a una membrana PVDF (Clear Blot Membrane-P, ATTO) . La membrana se bloqueó con el Block Ace (Dai-Nihon Seiyaku) durante 1 h, se lavó con amortiguador Tris salino (TBS), después trató con 10 µg/ml de anticuerpos de pollo contra HMW humano MP52s diluido 10-veces en Block Ace toda noche. Después de lavar la membrana con 0.1% de Tween 20 en TBS (TTBS), la membrana se trató con anticuerpos de conejo contra IgG de pollo conjugado con ALP (Siqma A 9171) durante 1 hr. en Block Ace diluido 10 veces La membrana se lavó con TTBS, después, reaccionó con fosfatasa Alcalina del Estuche de Sustrato Conjugado (BIO-RAD) para visualizar las bandas que corresponden a MP52. (4) El cultivo celular de HMW humano MP52s que produce la línea celular CHO La línea celular CHO con la productividad más alta de HMW humano MPS2s, MC-2 (Depósito No. FERM BP-5142), creció en botellas giratorias que contienen MEM -complementadas con 10%*.

FBS, MTX 400 nM, Penicilina 100 U/ml, Estreptomicina 100 µg/ml. Después las células MC-2 estuvieron hasta confluencia, se lavaron con suero libre de MEMa- y después se cultivaron en suero libre de DME/F12 complementadas con HEPES 10 mM (pH 7.3), Aprotinina 10 KIU, butirato de sodio 1 mM, selenato de sodio 6 µg/ml, transferrina 5 µg/ml, etanol amina 18 µg/ml, insulina 9 µg/ml, Penicilina 100 U/ml, Estreptomicina 100 µg/ml . El medio acondicionado se colectó todos los días por una semana. (5) Purificación de HMW humano MP52s El sobrenadante del cultivo de CHO y 0.1 vol. de amortiguador de fosfato de sodio 0.2 M, pH 6.0, se mezclaron y aplicaron a columna POROS HS (10 mi, PerSeptive Biosystems) previamente equilibrado con NaCl 50 mM, amortiguador de fosfato de sodio 20 M, pH 6.0. Las proteínas se eluyeron por gradiente lineal de NaCl de 0.05 a 2 M y se colectaron con 20 fracciones de 10 mi. El eluido MP52s se observó como tres tipos de monómeros y se determinaron sus pesos moleculares aparentes de aproximadamente 52, 40 y 14 kD por análisis SDS-PAGE bajo condición reducida. Estos monómeros forman tres tipos de homodímeros (104 kD, 80 kD y 28 kD) y tres tipos de heterodímeros (92 kD: 40 kD-52 kD, 66 kD: 14 kD-52 kD, y 54 kD: 14 kD-40 kD) y todos los dímeros se nombraron HMW (alto*, peso molecular) humano MP52s excepto el homodímero de 28 kD que aparentó ser conocido como un homodímero de MP52 humano (WO 95/04819) . De esta manera, el homodímero de 104 kD y el homodímero de 80 kD se aislaron de las fracciones anteriores para examinar la secuencia de aminoácidos N-terminal y las actividades biológicas. Las fracciones de la 5S a la 9^ se combinaron y concentraron aproximadamente 10 veces. El concentrado se cargó a Superdex 200 pg (1.6 I.D. x 60 cm, Pharmacia) previamente equilibrados con amortiguador de fosfato de sodio 20 mM, pH 7.1, que contiene NaCl 1 M. La elución se realizó a una velocidad de flujo de 0.5 ml/min. Las fracciones que contienen el homodímero de 104 kD y las fracciones que contienen el homodímero de 80 kD se combinaron separadamente. Cada una se aplicó a columna de HPLC de fase inversa (RESOURCE RPC, 3 mi, Pharmacia) y estas se eluyeron con acetonitrilo 35-40%. Las concentraciones de HMW humano MPS2s aislado se determinaron por densitometría de las bandas de proteínas en gel SDS-PAGE. El análisis de la secuencia de aminoácido N-terminal se realizó usando un pulso líquido en secuenciador de fase gas (Applied Biosystems model 476) para el homodímero de 80 kD y el homodímero de 104 kD, respectivamente. Los resultados se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1 HMW MP52s aminoácido N-terminal 80 kD Lys Ala Arg Glu Pro Gly Pro Pro Arg Glu Pro Ala Arg Glu Pro Gly Pro Pro Arg Glu Pro Lys 104 kD Ala Pro Asp Leu Gly Gln Arg Pro Gln Gly Thr Las secuencias aminoácido de 80 kD fueron de Lys 121 o Ala 122 a Arg 474 y la de 104 kD fue de Ala 1 a Arg 474 en SEC ID N0.:1 de la Lista Secuencias. Se encontró nuevamente que las células CHO produjeron 3 tipos de homodímeros, 104 kD, 80 kD y 28 kD, y 3 tipos de heterodímeros, llamados dímeros de 92 kD, 66 kD y 54 kD.

Ejemplo 2 actividad Biológica Células ROB-C26 tipo osteoprogenitor (Calcif. Tissue Int. vol. 49, pp. 221-225, 1991) clonadas de células calvarías de rata recién nacida se plaquearon en placas multipozo de 40 pozos (Coaster) a una densidad de 1.5 x 104 células/pozo y se pre-incubaron durante 3 días en MEMa" conteniendo 10% FBS. Después de la remoción del medio de cultivo, MEMa" fresco conteniendo 10% de FBS y diluido serialmente el HMW humano MP52s de 80 kD o 104 kD en HCl 10 mM (2 µl/ml) se adicionó a los cultivos e incubaron durante 6 días cambiando el medio y los aditivos en el día 3. Las capas celulares se lavaron con amortiguador salino de fosfato, y extrajeron con 0.2% de Nonidet conteniendo MgCl2 • 1 mM. Las actividades de fosfatasa Alcalina se determinaron de acuerdo al procedimiento de Takuwa et al. (Am. J. Physiol. vol. 257, p. E797-E803, 1989). Como se muestra en la Tabla 2, el tratamiento de células ROB-C26 con HMW humano MP52s de 80 kD o 104 kD aumentaron las actividades totales de ALP por pozo dependiendo de la concentración.

Tabla 2. Influencia de HMW humano MP52s de 80 kD y 104 kD sobre la actividad ALP de la línea celular ROB-C26.

Compuesto Concentración Actividad ALP (ng/ml) (nmol/min/pozo) Vehículo (HCl mM 5.47 ± 0.81 1 -control tratado HMW humano MP52s 8.6 5.42 ± 1.09 de 80 kD 29 7.00 ± 0.89 86 14.30 ± 0.24* 290 16.28 ± 0.19* 860 18.41 ± 1.95* HMW humano MP52s 11 6.51 ± 0.90 de 104 kD 38 7.54 ± 0.29 110 8.32 ± 0.12* 380 12.07 ± 0.53* 1100 16.98 ± 0.47* Los valores representan medias ± S.D. de 3 o 4 cultivos. *p< 0.01 comparado vehículo control tratado (prueba de Dunnett) .

"Lista de Secuencias" SEC ID N0:1 TIPO DE SECUENCIA: nucleótido con la proteína correspondiente LONGITUD DE LA SECUENCIA: 2703 HEBRA: doble TOPOLOGÍA: lineal TIPO DE MOLÉCULA: cADN para mARN FUENTE ORIGINAL ORGANISMO: homo sapiens CARACTERÍSTICAS: señal péptido de 640 a 720 bp péptido maduro de 1783 a 2142 bp PROPIETARIOS: embrión humano DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:l: CCATGGCCTC GAAAGGGCAG CGGTGATTTT TTTCACAT?? ATATATCGCA CTTAAATCAG 60 TTTAGACAGC ATGACATCAG AGAGTAATTA AATTGGTTTG GGTTGGAATT CCGTTTCCAA 120 TTCCTGAGTT CAGGTTTGTA AAAGATTTTT CTGAGCACCT GCAGGCCTGT GAGTGTGTGT 180 GTGTGTGTGT GTGTGTGTGT GTGTGTGTGA AGTATTTTCA CTGGAAAGGA TTCAAAACTA 240 GGGGGAAAAA AAAACTGGAG CACACAGGCA GCATTACGCC ATTCTTCCTT CTTGGAAAAA 300 TCCCTCAGCC TTATACAAGC CTCCTTCAAG CCCTCAGTCA GTTGTGCACG AGAAAGGGSß 360 CGGTTGGCTT TCTCCTTTCA AGAACGAGTT ATTTTCAGCT GCTGACTGGA GACGGTGCAC 420 GTCTGGATAC GAGAGCATTT CCACTATGGG ACTGGATACA AACACACACC CSGCAGACTT 480 CAAGAGTCTC AGACTGAGGA GAAAGCCTTT CCTTCTGCTG CTACTGCTGC TGCCCCTGCT -540 TTTGAAAGTC CACTCCTTTC ATGGTTTTTC CTGCCAAACC AGAGGCACCT TTGCTGCTGC 600 CGCTGTTCTC TTTGGTGTCA TTCAGCCGCT GGCCAGAGG ATG AGA CTC CCC AAA 654 Mat Arg Leu Pro Lys -25 CTC CTC ACT TTC TTG CTT TGG TAC CTG GCT TGG CTG GAC CTG GAA TTC 702 Leu Leu T r Phß L«u Lsu Trp Tyr Leu Ala Trp au Asp Leu Glu Phß -20 -15 -10 ATC TGC ACT GTG TTG GGT GCC CCT GAC TTG GGC CAG AGA CCC CAG GGG 750 II* Cys Thr Val su Gly Ais Pro Asp Leu Gly Gln Ara Pro Gln Gly -5 1 5 10 ACC AGG CCA GGA TTG GCC AAA GC? GAG GCC AAG GAG AGG CCC CCC CTG 798 Thr Aro Pro Gly Leu A s Lys A s Glu Ala Lys Glu Arg Pro Pro Lou 15 20 25 GCC CGG AAC GTC TTC AGG CCA GGG GGT CAC AGC TAT GGT GGG GGG GCC 846 Ala Arg Asn Val Phß Arg Pro Cly Gly His Ser Tyr Gly Gly Gly Ala 30 35 40 ACC AAT GC? AAT GCC AGG GCA AAG GGA GGC ACC GGG CAG ACÁ GGA GGC 894 Thr Asn Ala Asn Ala Arg Ala Lys Gly Gly Thr Gly Gln Thr Gly Gly 45 50 55 CTG ACÁ CAG CCC AAG AAG GAT GAA CCC AAA AAG CTG CCC CCC AGA CCG 942 Leu Thr G n Pro Lys Lys Asp Glu Pro Lys Lys Lau Pro Pro Arg Pro 60 65 70 GGC GGC CCT GAA CCC AAG CCA GGA CAC CCT CCC CAÁ ACÁ AGG CAG GCT 990 Gly Gly Pro Glu Pro Lys Pro Gly His Pro Pro Gln Thr Arg Gln Ala 75 80 85 90 ACÁ GCC CGG ACT GTG ACC CCA AAA GGA CAG CTT CCC GGA GGC AAG GCA 1038 Thr Ala Arg Thr Val Thr Pro Lys Gly G n Leu Pro Gly Gly Lys Ala 95 100 105 CCC CCA AAA GCA GGA TCT GTC CCC AGC TCC TTC CTG CTG AAG AAG GCC 1086 Pro Pro Lys Ala Gly Ser Val Pro Ser Ser Phe Leu Leu Lys Lys Ala 110 115 120 AGG GAG CCC GGG CCC CCA CGA GAG CCC AAG GAG CCG TTT CGC CCA CCC 1134 Arg Glu Pro Gly Pro Pro Arg Glu Pro Lys Glu Pro Phe Arg Pro Pro 125 130 135 CCC ATC ACÁ CCC CAC GAG TAC ATG CTC TCG CTG TAC AGG ACG CTG TCC 1182 Pro lie Thr Pro His Glu Tyr Mee Leu Ser Leu Tyr Arg Thr Leu Ser 140 145 150 GAT GCT GAC AGA AAG GGA GGC AAC AGC AGC GTG AAG TTG GAG GCT GGC 1230 Asp Ala Asp Arg Lys Gly Gly Asn Ser Ser Val Lys Leu Glu Ala Gly 155 160 165 170 CTG GCC AAC ACC ATC ACC AGC TTT ATT GAC AAA GGG CAÁ GAT GAC CGA 1278 Leu Ala Asn Thr lie Thr Ser Phe lie Asp Lys Gly Gln Asp Asp Arg 175 180 185 GGT CCC GTG GTC AGG AAG CAG AGG TAC GTG TTT GAC ATT AGT GCC CTG 1326 Gly Pro Val Val Arg Lys Gln Arg Tyr Val Phe Asp lie Ser Ala Leu 190 195 200 GAG AAG GAT GGG CTG CTG GGG GCC GAG CTG CGG ATC TTG CGG AAG AAG 1374 Glu Lys Asp Gly Leu Leu Gly Ala Glu Leu Arg lie Leu Arg Lys Lys 205 210 215 ccc tcs GAC ?CG GCC AAG CCA GCG GCC CCC GGA GGC GGG CGG GCT scc 1422 Pro Ser Aso Thr Ala Lys Pro Ala Ala Pro Gly Gly Gly Arg Ala Ala 220 225 230 CAG CTG AAG CTG TCC AGC TGC CCC AGC GGC CGG CAG CCG GCC TCC TTG 1470 Gln Leu Lys Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gly Arg Gln Pro Ala Ser Leu 235 240 245 250 CTG GAT GTG CGC TCC GTG CCA GGC CTG GAC GGA TCT GGC TGG GAG GTG 1518 Leu Asp Val Arg Ser Val Pro Gly Leu Asp Gly Ser Gly Trp Glu Val 255 260 265 TTC GAC ATC TGG AAG CTC TTC CGA AAC TTT AAG AAC TCG GCC CAG CTG 1566 Phe Asp lie Trp Lys Leu Phe Arg Asn Phe Lys Aan Ser Ala Gln Leu 270 275 280 TGC CTG GAG CTG GAG GCC TGG GAA CGG GGC AGG GCC GTG GAC CTC CGT 1614 Cys Leu Glu Leu Glu Ala Trp Glu Arg Gly Arg Ala Val Asp Leu Arg 285 290 295 GGC CTG GGC TTC GAC CGC GCC GCC CGG CAG GTC CAC GAG AAG GCC CTG 1662 Gly Leu Gly Phe Asp Arg Ala Ala Arg Gln Val His Glu Lys Ala Leu 300 305 310 TTC CTG GTG TTT GGC CGC ACC AAG AAA CGG GAC CTG TTC TTT AAT GAG 1710 Phe Leu Val Phe Gly Arg Thr Lys Lys Arg Asp Leu Phß Phe Asn Glu 315 320 325 330 ATT AAG GCC CGC TCT GGC CAG GAC GAT AAG ACC GTG TAT GAG TAC CTG 1758 lia Lys Ala Arg Ser Gly Gln Asp Asp Lys Thr Val Tyr Glu Tyr Leu 335 340 345 TTC AGC CAG CGG CGA AAA CGG CGG GCC CCA CTG GCC ACT CGC CAG GGC 1806 Phe Ser Gln Arg Arg Lys Arg Arg Ala Pro Leu Ala Thr Arg Gln Gly 350 355 360 AAG CGA CCC AGC AAG AAC CTT AAG GCT CGC TGC AGT CGG AAG GCA CTG 1854 Lys Arg Pro Ser Lys Asn Leu Lys Ala Arg Cya Ser Arg Lya Ala Leu 365 370 375 CAT GTC AAC TTC AAG GAC ATG GGC TGG GAC GAC TGG ATC ATC GCA CCC 1902 His Val Asn Phß Lys Asp Mee Gly Trp Asp Asp Trp lie lie Ala Pro 380 385 390 CTT GAG TAC GAG GCT TTC CAC TGC GAG GGG CTG TGC GAG TTC CCA TTG 1950 Leu Glu Tyr Glu Ala Ph* His Cys Glu Gly Leu Cys Glu Phß Pro Leu 395 400 405 410 CGC TCC CAC CTG GAG CCC ACG AAT CAT GCA GTC ATC CAO ACC CTG ATG 1998 Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn His Ala Val lie Gln Thr Leu Met 415 420 425 AAC TCC ATG GAC CCC GAG TCC ACÁ CC? CCC ACC TGC TGT GTG CCC ACG 2046 Asn Ser Met Asp Pro Glu Ser Thr Pro Pro Thr Cys Cys Val Pro Thr 430 435 440 CGG CTG AGT CCC ATC AGC ATC CTC TTC ATT GAC TCT GCC AAC AAC GTG 2094 Arg Leu Ser Pro lie Ser lie Leu Phe He Asp Ser Ala ?sn Asn Val 445 450 455 GTG TAT AAG CAG TAT GAG GAC ATG GTC GTG GAG TCG TGT GGC TGC AGG 2142 Val Tyr Lyß Gln Tyr Glu Asp Mee Val Val Glu Ser Cys Gly Cys Arg 460 465 470 TAG CAGCACTGGC CCTCTGTCTT CCTGGGTGGC ACATCCCAAG AGCCCCTTCC 2195 *•* 475 TGCACTCCTG GAATCACAGA GGGGTCAGGA AGCTGTGGC? GGAGCATCTA CACAGCTTGG 2255 GTGAAAGGGG ATTCCAATAA GCTTGCTCGC TCTCTGAGTG TGACTTGGGC TAAAGGCCCC 2315 CTTTTATCCA CAAGTTCCCC TGGCTGAGGA TTGCTGCCCG TCTGCTGATG TGACCAGTGG 2375 CAGGCACAGG TCCAGGGAGA CAGACTCTGA ATGGGACTGA GTCCCAGGAA ACAGTGCTTT 2435 CCGATGAGAC TCAGCCCACC ATTTCTCCTC ACCTGGGCCT TCTCAGCCTC TGGACTCTCC 2495 TAAGCACCTC TCAGGAGAGC CACAGGTGCC ACTGCCTCCT CAAATCACAT TTGTGCCTGG 2555 TGACTTCCTG TCCCTGGGAC AGTTGAGAAG CTGACTGGGC AAGAGTGGGA GAGAAGAGGA 2615 GAGGGCTTGG ATAGAGTTGA GGAGTGTGAG GCTGTTAGAC TGTTAGATTT AAATGTATAT 2675 TGATGAGATA AAAAGCAAAA CTGTGCCT 2703 4. Breve Descripción de los Dibujos La Fig. 1 muestra un mapa de plásmido de un vector de expresión HMW humano MP52s, pMSS99 (5.0 kb) . La secuencia de ADN de HMW humano MP52s en pMSS99 son los nucleótidos de 576 a 2279 mostrados en la SEC ID NO:l de la Lista de Secuencias.

Claims (6)

Reivindicaciones

1.- Una proteína llamada HMW humano MP52, caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste de: (1) una proteína dimérica que contiene péptidos que tiene secuencia de aminoácido de 1 a 474 de SEC ID N0.:1. (2) una proteína dimérica que contiene péptidos que tiene secuencia de aminoácido de 121 a 474 de SEC ID N0.:1. i (3) una proteína dimérica que contiene péptidos que tiene secuencia aminoácido de 122 a 474 de SEC ID N0.:1. (4) una proteína dimérica que contiene un péptido que tiene secuencia de aminoácido de 121 a 474 de SEC ID NO.:l y un péptido que tiene secuencia aminoácido de 122 a 474 de SEC ID N0.:1. (5) una proteína dimérica que contiene un péptido que tiene secuencia de aminoácido de 1 a 474 de SEC ID NO.:l y un péptido que tiene secuencia de aminoácido 121 y/o 122 a 474 de SEC ID NO. :1. (6) una proteína dimérica que contiene un péptido que tiene secuencia de aminoácido de 1 a 474 de SEC ID NO.:l y un péptido que tiene secuencia aminoácido de 355 a 474 de SEC ID NO. :1. (7) una proteína dimérica que contiene un péptido que tiene secuencia .de aminoácido de 121 y/o 122 a 474 de SEC ID NO.:l y un péptido que tiene secuencia de aminoácido de 355 a 474 de SEC ID N0.:1. y la mezcla la misma.

2.- Un proceso para la producción de HMW humano MP52s definido en reivindicación 1, caracterizado porque comprende*. la introducción de ADN que contiene la secuencia de ADN de al menos 721 a 2145 como se muestra en SEC ID NO.:l en una célula huésped adecuada y que cultiva la célula huésped bajo condiciones que permiten la expresión de la secuencia del ADN y formación de la proteína.

3. Una composición farmacéutica, caracterizada porque contiene como ingrediente activo al menos una de HMW humano MP52s definido en reivindicación 1.

4. La composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 3 para el uso de reconstrucción ortopédica, transplante de hueso, cirugía estética o implantación dental.

5. Uso de la composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 3, caracterizado porque promueve la morfogénesis de hueso, tratamiento o prevención de daño a hueso, cartílago, tejido conectivo, piel, membranas mucosas, epitelio o dientes, para aplicación en implantes dentales y para aplicación en curación de herida y procesos de regeneración de tejido.

6. Uso de la composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 3, caracterizado porque trata osteoporosis o fractura de hueso. *.