MX2014011044A

MX2014011044A - Reduccion genetica de la fertilidad masculina en plantas.

Info

Publication number: MX2014011044A
Application number: MX2014011044A
Authority: MX
Inventors: Mei Guo; Carl R Simmons; Bo Shen; Kevin R Hayes; Mary A Rupe; Yongzhong Wu
Original assignee: Pioneer Hi Bred Int
Priority date: 2012-03-13
Filing date: 2013-03-12
Publication date: 2015-05-15
Also published as: US20150240254A1; EP2825552A2; WO2013138363A3; WO2013138363A2; CA2867386A1; BR112014022702A2; CN104203973A

Abstract

Se proporcionan plantas con esterilidad genética masculina en las que las construcciones complementarias resultan en la supresión de un fenotipo parental en la progenie. Se proporcionan métodos para generar y mantener tales plantas y métodos de uso de dichas plantas, que incluyen el uso de plantas parentales para producir plantas estériles para la producción de semillas híbridas.

Description

REDUCCIÓN GENÉTICA DE LA FERTILIDAD MASCULINA EN PLANTAS REFERENCIA CRUZADA Esta solicitud reivindica prioridad y el beneficio de la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos núm. 61/610,243 presentada el 13 de marzo de 2012, solicitud del PCT núm. PCT/US2013/30406 presentada el 12 de marzo de 2013 y solicitud del PCT núm. PCT/US2013/30455 presentada el 12 de marzo de 2013, cuyas descripciones se incorporan como referencia a la presente invención.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La descripción se refiere, generalmente, al campo de la biología molecular, específicamente, a la modulación de la fertilidad de las plantas para mejorar la tolerancia de las plantas al estrés.

INFORMACIÓN DE ANTECEDENTES La domesticación de muchas plantas se correlaciona con el aumento drástico en el rendimiento. La mayor parte de la variación fenotípica que ocurre en las poblaciones naturales es continua y se ve afectada por la influencia de múltiples genes. La identificación de genes específicos responsables de las drásticas diferencias en el rendimiento en plantas domesticadas se ha convertido en un punto importante de la investigación agrícola.

Las plantas distribuyen fotosintatos, nutrientes minerales y otros componentes del crecimiento entre varios tejidos vegetales durante el ciclo de vida. En el maíz, por ejemplo, la espiga y la panoja son estructuras de inflorescencia femenina y masculina específicas que comparten ciertos procesos de desarrollo y compiten entre sí por los nutrientes requeridos. La dominancia apical de la panoja puede limitar el crecimiento de la espiga y el potencial del rendimiento de granos en las plantas de maíz. Los métodos y composiciones para mejorar el rendimiento de granos se describen en la presente.

SUMARIO Un método para aumentar el rendimiento o mantener la estabilidad de rendimiento en una planta, el método incluye reducir la fertilidad masculina y, de ese modo, aumentar la distribución de nutrientes al tejido reproductivo femenino durante el desarrollo simultáneo de tejido masculino y femenino. En una modalidad, la fertilidad masculina se reduce en la planta mediante la alteración de la expresión o actividad de un gen de fertilidad masculina genética. En una modalidad, la planta se cultiva bajo estrés abiótico. En una modalidad, el nutriente limitado es nitrógeno. En una modalidad, la planta con fertilidad masculina reducida tiene un parámetro agronómico seleccionado del grupo que consiste en aumento del valor SPAD, aumento de la emergencia de estigmas, aumento de la longitud de la espiga, aumento del ancho de la espiga, aumento del número de semillas por espiga, aumento del peso de las semillas por espiga, y semilla con aumento del tamaño del embrión. En una modalidad, la planta se cultiva bajo un estrés por sequía. En una modalidad, la tolerancia de la planta a la sequía mejora mediante la esterilidad masculina.

Un método para aumentar el rendimiento o mantener la estabilidad del rendimiento en una planta de maíz, el método incluye reducir la fertilidad masculina y, de ese modo, aumentar la distribución de nutrientes al tejido reproductor femenino durante el desarrollo concurrente de los tejidos masculino y femenino. En una modalidad, la planta incluye una mutación en un gen nuclear que resulta en esterilidad masculina genética dominante.

En una modalidad, la fertilidad masculina de las plantas descritas en la presente descripción se reduce mediante la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido de sec. con núm. de ident: 14 o 153. En una modalidad, el polinucleótido se selecciona del grupo que consiste en las sec. con nú . de ident: 13, 15, y 152.

En una modalidad, la fertilidad masculina se reduce al expresar un ácido nucleico supresor de panoja bajo un elemento regulador seleccionado del grupo que consiste en las sec. con núm. de ident: 64-106, 134, 137, 142, 143, 144, 149 y 150.

En una modalidad, la fertilidad masculina se reduce al expresar un ácido nucleico que suprime la expresión de un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident: 107 bajo un elemento regulador seleccionado del grupo que consiste en las sec. con núm. de ident: 64-106, 134, 137, 142, 143, 144, 149 y 150.

En una modalidad, la fertilidad masculina se reduce por la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una mutación correspondiente a la posición de aminoácido 37 de la sec. con núm. de ident: 14, en donde el polipéptido se selecciona del grupo que consiste en las sec. con núm. de ident: 14, 108-130. En una modalidad, la mutación resulta en un procesamiento incorrecto del péptido señal.

En una modalidad, la planta que exhibe una fertilidad masculina reducida es una planta no transgénica de maíz. En una modalidad, el desarrollo del tejido femenino es el desarrollo de la espiga en el maíz.

En una modalidad, la mutación que produce una fertilidad masculina reducida se diseña en un gen endógeno de fertilidad de la planta.

Un método para aumentar el rendimiento de maíz en un campo que tiene una primera población de plantas de maíz, el método incluye cultivar una población de plantas de maíz en el campo, en donde las plantas de maíz exhiben esterilidad masculina dominante debido a la presencia de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident: 14 o un homólogo de esta y en donde el campo comprende, además, una segunda población de plantas de maíz que producen una cantidad eficaz de polen para fertilizar la primera población de plantas de maíz en el campo, de ese modo, aumenta el rendimiento en comparación con un campo control que no contiene la primera población de plantas. En una modalidad, la primera población de plantas incluye aproximadamente 50 % a aproximadamente 90 % de las plantas de maíz del campo. En una modalidad, la primera población de plantas incluye aproximadamente 80 % de las plantas de maíz del campo. En una modalidad, la primera población de plantas incluye aproximadamente 75 % de las plantas de maíz del campo. En una modalidad, la primera población de plantas incluye aproximadamente 85 % de las plantas de maíz del campo. En una modalidad, la primera ión de plantas incluye aproximadamente 70 % de las plantas de maíz del campo. En una modalidad, la primera población de plantas incluye aproximadamente 95 % de las plantas de maíz del campo. En una modalidad, la progenie resultante es fértil.

Una población de plantas de maíz cultivadas en un campo, en donde la población de plantas de maíz incluye una primera subpoblación que tiene una fertilidad masculina reducida y una segunda subpoblación que exhibe fertilidad masculina normal, en donde la población de plantas de maíz resulta en aumento del rendimiento de granos en comparación con una población de plantas control. En una modalidad, las semillas se producen a partir de las plantas de maíz, en donde las semillas producen plantas que son fértiles.

Una molécula de ácido nucleico aislada que tiene un polinucleótido que inicia la transcripción en una célula de una planta y comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: a. región promotora de sec. con núm. de ident: 13 y 62, sec. con núm. de ident: 64-106, 134, 137, 142, 143, 144, 149 y 150; b. al menos 100 nucleótidos contiguos de las sec. con núm. de ident.: 13, 62, 64-106, 134, 137, 142, 143, 144, 149 y 150; y c. una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con toda la extensión de las sec. con núm. de ident: 13, 62, 64-106, 134, 137, 142, 143, 144, 149 y 150.

Un casete de expresión tiene un polinucleótido que inicia la transcripción como se describe en la presente descripción y se une, operativamente, a un polinucleótido de interés. En una modalidad, un vector incluye el casete de expresión descrito en la presente descripción. En una modalidad, una célula vegetal ha incorporado, establemente, en su genoma el casete de expresión descrito en la presente descripción. En una modalidad, la célula vegetal es de una monocotiledónea. En una modalidad, monocotiledónea es maíz, cebada, trigo, avena, centeno, sorgo o arroz.

En una modalidad, se incluye una planta que tiene incorporado de manera estable en su genoma los casetes de expresión descritos en la presente. En una modalidad, la planta es una monocotiledónea. En una modalidad, la planta es maíz, cebada, trigo, avena, centeno, sorgo, o arroz.

Se describe una semilla transgénica de la planta descrita en la presente descripción. En una modalidad, se describe un polinucleótido que codifica un producto génico que confiere resistencia a patógenos o insectos.

En una modalidad, la planta incluye, además, un polinucleótido que codifica un polipéptido implicado en la captación de nutrientes, en la eficiencia del uso de nitrógeno, en la tolerancia a la sequía, en la resistencia de la raíz, en la resistencia al encamado de la raíz, en el manejo de plagas del suelo, en la resistencia al gusano de la raíz del maíz, en el metabolismo de carbohidratos, en el metabolismo de proteínas, en el metabolismo de ácidos grasos o en la biosíntesis de fitohormonas.

Una unidad de semillas de maíz que incluye una proporción de semillas con esterilidad masculina que son transgénicas y una proporción de semillas con fertilidad masculina que son transgénicas, en donde la proporción de las semillas transgénicas con esterilidad masculina se encuentra en el intervalo de aproximadamente 50 % a aproximadamente 95 % con respecto al total de semillas de maíz de la unidad. En una modalidad, una unidad es una bolsa de semillas de maíz.

Una mezcla de semillas de las semillas de maíz que incluye una proporción de semillas con esterilidad masculina que son transgénicas y una proporción de semillas con fertilidad masculina que son transgénicas, en donde la proporción de las semillas transgénicas con esterilidad masculina está en el intervalo de aproximadamente 50 % a aproximadamente 95 % con respecto al total de semillas de maíz de la unidad. En una modalidad, la mezcla de semillas está en una bolsa de semillas de maíz. En una modalidad, las semillas con esterilidad masculina están en una bolsa separada. En una modalidad, las semillas con esterilidad masculina se mezclan en la misma bolsa con las semillas con fertilidad masculina.

En una modalidad, el gen de fertilidad masculina codifica una proteina de la sec. con núm. de ident.: 10. En una modalidad, el gen de fertilidad masculina incluye una secuencia de nucleótidos de la sec. con núm. de ident.: 13. En una modalidad, el gen de fertilidad masculina codifica un polipéptido de la sec. con núm. de ident.: 14.

En una modalidad, la reducción de la fertilidad masculina o hacer que la planta tenga esterilidad masculina se efectúa mediante una sola sustitución de nucleótido de G a una A en la posición 118 con relación al primer codón de Met de la sec. con núm. de ident: 13, lo que resulta en un cambio de aminoácido en el aminoácido 37, de Alanina a Treonina en la proteina predicha. En una modalidad, la reducción de la fertilidad masculina o hacer que la planta tenga esterilidad masculina se efectúa mediante una sola sustitución de nucleótido de C a una T en la posición 119 con relación al primer codón de Met de la sec. con núm. de ident: 2629, lo que resulta en un cambio de aminoácido en el aminoácido 37, de Alanina a Valina en la proteina predicha. En una modalidad, el gen de fertilidad masculina dominante se une, operativamente, a un promotor seleccionado del grupo que consiste en: un promotor inducible, un promotor preferido para el tejido, un promotor regulado temporalmente o un elemento de estos. Por ejemplo, el promotor dirige, preferentemente, la expresión en el tejido reproductivo masculino.

En una modalidad, la fertilidad masculina se reduce en la planta hembra (por ejemplo, una linea endogámica femenina) de un par reproductor.

En una modalidad, una planta o una célula o una semilla o una progenie de estas incluye la secuencia de fertilidad masculina reducida que codifica la secuencia de aminoácidos 43 - 101 de la sec. con núm. de ident.: 10 en su genoma y en donde la expresión del gen de fertilidad masculina confiere el rasgo de esterilidad masculina dominante.

Una molécula de ácido nucleico aislada incluye un polinucleótido capaz de iniciar la transcripción en la célula de una planta e incluye una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: sec. con núm. de ident.: 15; al menos 100 nucleótidos contiguos de la sec. con núm. de ident.: 15 y una secuencia que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con toda la extensión de la sec. con núm. de ident.: 15. En una modalidad, un casete de expresión o un vector incluye la sec. con núm. de ident.: 15 descrita en la presente descripción unida operativamente a un polinucleótido de interés.

Las plantas adecuadas para los materiales y métodos descritos en la presente descripción incluyen por ejemplo, maíz, sorgo, cañóla, trigo, cebada, centeno, triticale, arroz, caña de azúcar, césped, mijo perla, frijoles de soja y algodón.

En una modalidad, una planta con fertilidad reducida o cualquier otro rasgo descrito en la presente descripción exhibe, opcionalmente, uno o más polinucleótidos que confieren el siguiente fenotipo o rasgo de interés: captación de nutrientes, eficiencia en el uso de nitrógeno, tolerancia a la sequía, resistencia de la raíz, resistencia de encamado de la raíz, manejo de plagas del suelo, resistencia al gusano de la raíz del maíz, tolerancia a herbicidas, resistencia a enfermedades, resistencia a insectos, metabolismo de carbohidratos, metabolismo de proteínas, metabolismo de ácidos grasos o biosíntesis de fitohor onas.

Un método para aumentar el rendimiento o mantener la estabilidad del rendimiento en plantas incluye reducir el desarrollo del tejido reproductivo masculino mediante la expresión de un transgén controlado por un promotor preferido para el tejido reproductivo masculino; y aumentar la distribución de nutrientes al tejido reproductivo femenino durante el desarrollo simultáneo del tejido masculino y femenino.

En una modalidad, el tejido reproductivo masculino es panoja. En una modalidad, el desarrollo del tejido reproductivo masculino se reduce mediante la expresión de un gen unido operativamente a un promotor que comprende al menos 100 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada de las seos. con núm. de ident.: 64 - 106. Los subconjuntos de las secuencias de los promotores descritas en la presente descripción, por ejemplo, las sec. con núm. de ident.: 64-70; 70-75; 75-80; 85-90; 90-95; 100-106 son, además, adecuados para conducir la expresión preferida para el tejido de los polinucleótidos de interés descritos en la presente descripción.

En una modalidad, una planta o una célula de una planta o una semilla que expresa, transgénicamente, un polinucleótido de interés (por ejemplo, Ms44 que tiene la mutación de esterilidad masculina dominante) controlado por un promotor preferido para la panoja descrito en la presente descripción exhibe parámetros agronómicos mejorados, tales como una distribución mayor de nutrientes a las espigas durante el desarrollo reproductivo.

Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un polinucleótido que inicia la transcripción en una célula de una planta y comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: una secuencia seleccionada de las sec. con núm. de ident.: 64 - 106; al menos 100 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada de las sec. con núm. de ident.: 64 106 y una secuencia que tiene un porcentaje de al menos 70 % a aproximadamente 95 % de identidad de secuencia con toda la extensión de una secuencia seleccionada de las sec. con núm. de ident.: 64 - 106 o regiones de promotores secundarios de esta.

En una modalidad, una planta o una célula de una planta o una semilla que expresa transgénicamente un polinucleótido de interés (por ejemplo, una secuencia de supresión de iARN dirigida a un polinucleótido implicado en el desarrollo de la panoja) controlado por un promotor preferido para la panoja descrito en la presente descripción exhibe parámetros agronómicos mejorados, tales como una distribución mayor de nutrientes a las espigas durante el desarrollo reproductor.

Un método para aumentar el rendimiento o mantener la estabilidad del rendimiento en plantas incluye reducir la fertilidad masculina y aumentar la distribución de nutrientes al tejido reproductivo femenino durante el desarrollo simultáneo de tejido masculino y femenino. En una modalidad, la fertilidad masculina se reduce en una planta mediante la alteración de la expresión de un gen de fertilidad masculina. En una modalidad, la planta se cultiva en condiciones de estrés. En una modalidad, la planta se cultiva en condiciones de nutrientes limitados, por ejemplo, una menor cantidad de nitrógeno disponible.

En una modalidad, las plantas con fertilidad masculina reducida y en donde el nutriente se distribuye más al tejido reproductivo femenino durante el desarrollo simultáneo del tejido masculino y femenino exhiben uno o más de los siguientes parámetros relevantes agronómicamente: mayor valor SPAD; mayor emergencia de estigmas, mayor longitud de la espiga; mayor ancho de la espiga; mayor cantidad de semillas por espiga; mayor peso de semillas por espiga y mayor tamaño del embrión.

En una modalidad, las plantas con fertilidad masculina reducida y en donde el nutriente se distribuye más al tejido reproductivo femenino durante el desarrollo simultáneo de tejido masculino y femenino se cultivan en condiciones de estrés por sequía. En una modalidad, la tolerancia de las plantas a la sequía mejora mediante la esterilidad masculina.

Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un polinucleótido que inicia la transcripción en una célula de una planta de manera preferida para el tejido incluye una secuencia seleccionada de: sec. con núms. de ident.: 13, 62 y 64-106; al menos 100 nucleótidos contiguos de las sec. con núm. de ident.: 13, 62 y 64-106 y una secuencia que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con toda la extensión de las sec. con núm. de ident.: 13, 62 y 64-106.

En una modalidad, un método para aumentar la estabilidad del rendimiento en plantas en condiciones de estrés incluye expresar un elemento que afecta la fertilidad masculina bajo un promotor preferido para la panoja descrito en la presente descripción y, de esa manera, reducir la competencia por los nutrientes durante la fase de desarrollo reproductor de la planta y aumentar el rendimiento.

Un método para aumentar el rendimiento o mantener la estabilidad del rendimiento en plantas en condiciones de limitación de nitrógeno y/o condiciones normales de nitrógeno incluye reducir el desarrollo del tejido reproductivo masculino y aumentar la distribución de nutrientes al tejido reproductivo femenino durante el desarrollo simultáneo de tejido masculino y femenino.

En una modalidad, el tejido reproductivo masculino es panoja y el desarrollo del tejido reproductivo masculino se reduce mediante la reducción de la expresión de una proteina NIP3-1 o similar a NIP3-1. En una modalidad, la proteina NIP3-1 tiene una secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 107. El desarrollo del tejido reproductivo masculino se reduce mediante el aumento de la expresión de la sec. con núm. de ident.: 63.

En una modalidad, el desarrollo del tejido reproductivo masculino se reduce mediante el impacto en la función de un gen implicado en la formación de la panoja, por ejemplo, el gen tassel-less.

En una modalidad, el desarrollo del tejido reproductivo masculino se reduce en una planta transformada con un casete de expresión dirigido a la supresión de un gen que codifica la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 107 o una secuencia que es al menos 70 % u 80 % u 85 % o 90 % o 95 % idéntica a la sec. con núm. de ident.: 107. Además, en la presente descripción se describen plantas con mutaciones nativas en el alelo del Tlsl.

En una modalidad, un promotor dirige, preferentemente, la expresión de un gen de interés en el tejido reproductivo masculino. En una modalidad, el promotor es un promotor especifico para el tejido, un promotor constitutivo o un promotor inducible. En una modalidad, el promotor preferido para el tejido es un promotor especifico para la panoja.

Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un polinucleótido que incluye una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: sec. con núm. de ident.: 63; al menos 100 nucleótidos contiguos de la sec. con núm. de ident.: 63 y una secuencia que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con toda la extensión de la sec. con núm. de ident.: 63. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un polinucleótido que codifica la proteina TLS1 que comprende una secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 107 o una secuencia que es al menos 70 % u 80 % u 85 % o 90 % o 95 ¾ idéntica a la sec. con núm. de ident.: 107.

Un método para producir semillas híbridas masculinas estériles incluye transformar una linea endogámica heterocigota para la esterilidad masculina dominante con una construcción génica que incluye un primer elemento que suprime el fenotipo de esterilidad masculina dominante, un segundo elemento que interrumpe la función del polen y, opcionalmente, un marcador seleccionable, en donde la expresión de la construcción en la linea endogámica hace que el macho de la línea sea fértil. En una modalidad, este método incluye, además, autopolinizar estas plantas con fertilidad masculina y producir una progenie homocigótica que tiene esterilidad masculina dominante. El método incluye, además, identificar aquellas semillas que tienen genotipos homocigotas de esterilidad masculina dominante como la linea endogámica femenina; opcionalmente, aumentar la linea endogámica femenina al cruzarla con la linea mantenedora transgénica, lo que resulta en 100 % de semillas homocigotas para la esterilidad masculina dominante sin la construcción; y cruzar la progenie de la semilla con esterilidad masculina dominante con un progenitor masculino para producir híbridos heterocigotos para la esterilidad masculina dominante y que muestran el fenotipo estéril masculino dominante.

En una modalidad, el fenotipo de esterilidad masculina dominante es conferido por una secuencia de polinucleótidos que incluye al menos 100 nucleótidos consecutivos de la sec. con núm. de ident.: 15 y comprende, además, un codón en las posiciones 109 a 111, que codifica una Treonina en lugar de una Alanina en la posición 37 de la sec. con núm. de ident: 14 (la secuencia de aminoácidos codificada por la sec. con núm. de ident.: 15).

En una modalidad, el elemento de supresión incluye una secuencia de repetición invertida del promotor específica para la sec. con núm. de ident: 15. En una modalidad, la secuencia de repetición invertida incluye un fragmento funcional de al menos 100 nucleótidos consecutivos de la sec. con núm. de ident.: 15. En una modalidad, el elemento de supresión es una construcción de iARN diseñada para suprimir la expresión del gen Ms44 dominante en la linea endogámica femenina con esterilidad masculina. En una modalidad, el elemento de supresión es un supresor genético que actúa en forma dominante para suprimir el fenotipo dominante de la mutación de Ms44 en una planta. Opcionalmente, si el elemento de supresión suprime, además, el ms44 normal endógeno, la construcción puede incluir un elemento que restablece la función normal del gen ms44, por ejemplo, el gen ms44 controlado por su propio promotor o por un promotor heterólogo.

En una modalidad se describe una planta o una célula de una planta o una semilla o una progenie de la planta derivada a partir de los métodos descritos en la presente descripción.

En una modalidad, un método para producir semillas híbridas incluye expresar en una linea endogámica femenina un gen de esterilidad masculina dominante unido operativamente a un promotor heterólogo sensible a la inactivación de la repetición invertida; polinizar la planta masculina estéril con polen de una planta masculina fértil que contiene una repetición invertida especifica para el promotor heterólogo. En una modalidad, el polen comprende la repetición invertida especifica para el promotor heterólogo con especificidad de inactivación de la repetición invertida. En una modalidad, el gen de esterilidad masculina dominante se une a un promotor 5126 del arroz.

En una modalidad, el gen de la esterilidad masculina dominante usado en el contexto de la producción de semillas híbridas es cualquier gen que actúa en forma dominante para obtener esterilidad masculina y, opcionalmente, es sensible a la supresión para mantener la línea endogámica femenina con esterilidad masculina. En una modalidad, el gen de esterilidad masculina dominante se selecciona del grupo que comprende: barnasa, DAM metilasa, MS41 y MS42.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Diagrama del sistema de esterilidad masculina genética dominante para producir una planta híbrida con esterilidad masculina. Se ha encontrado que la reducción genética de la fertilidad masculina en una planta por medio del uso de un gen masculino estéril de núcleo dominante y/o un promotor específico de la panoja o promotor preferido para la panoja y/o un gen específico de la panoja y/o preferido para la panoja aumenta el desarrollo del tejido de la espiga, mejora el uso de nutrientes en la planta en crecimiento, aumenta la tolerancia al estrés y/o aumenta las mediciones de las semillas, lo que en última instancia mejora el rendimiento.

Figura 2. Alineamiento de secuencias relacionadas con MS44 (Figuras 2 A - C). Los residuos idénticos se identifican en negritas y todos los residuos similares están subrayados y en letra cursiva.

Figura 3. Diagrama del método para producir una planta híbrida masculina estéril con el uso de un gen masculino estéril recesivo. El progenitor femenino y el progenitor masculino tienen los alelos recesivos homocigotas que confieren esterilidad. Sin embargo, el progenitor masculino contiene el alelo restaurador dentro de una construcción que evita la transmisión del alelo restaurador a través del polen. La semilla híbrida resultante produce una planta híbrida masculina estéril.

Figura 4. Diagrama del método para producir semillas híbridas masculinas estériles con el uso de un gen de esterilidad masculina dominante: 4A- Una línea endogámica femenina heterocigota para la esterilidad masculina dominante se transforma con una construcción génica que comprende un elemento que suprime la esterilidad masculina dominante, un segundo elemento que interrumpe la función del polen y, opcionalmente, un marcador seleccionable. La expresión de esta construcción en la línea endogámica hace que las plantas sean plantas masculinas fértiles. 4B. Las plantas se autopolinizan para producir semillas. 4C y 4D - Las semillas o las plantas de la progenie se genotipan para identificar aquellas que son homocigotas para la esterilidad masculina dominante. 4E - La línea endogámica femenina puede aumentarse al cruzarla con la línea mantenedora transgénica, lo que resulta en semillas 100 % homocigotas para la esterilidad masculina dominante. 4F - Las plantas masculinas estériles dominantes se polinizan mediante una segunda línea endogámica para producir híbridos heterocigotas para la esterilidad masculina dominante y exhiben el fenotipo estéril masculino dominante.

Figura 5. La Figura 5A muestra la respuesta en rendimiento del híbrido de MS44 a la fertilidad en N -Prueba 1. La Figura 5B muestra la respuesta en rendimiento del híbrido de MS44 a la fertilidad en N - Prueba 2.

La Figura 6 muestra el peso seco de la espiga del híbrido de MS44 (Rl) en comparación con el tipo silvestre.

Figura 7. La Figura 7A muestra la respuesta en rendimiento del híbrido de MS44 a la población de plantas -Prueba 1. La Figura 7B muestra la respuesta en rendimiento del híbrido de MS44 a la población de plantas - Prueba 2.

La Figura 8 muestra el fenotipo mutante tlsl. A) Panoja de una planta silvestre. B) Planta tlsl homocigota con un fenotipo de panoja pequeña. C) Planta tlsl homocigota sin panoja. D) Las plantas con los fenotipos más severos son propensas a tener múltiples espigas con cascarillas largas y sin emergencia de estigmas (flechas). E) Variedad de fenotipos de espiga. F) Variedad de fenotipos de hojas. WT = planta silvestre homocigota; ST = planta tlsl homocigota con una panoja pequeña; NT = planta tlsl homocigota sin panoja.

La Figura 9 muestra la clonación de tlsl basada en el mapa.

La Figura 10 muestra la validación del gen candidato de tlsl. La desactivación de ZmNIP3-l produce el fenotipo de tlsl. Figura 10A. Planta silvestre con ZmNIP3-l intacto. Figura 10B. Planta con la inserción Mu en ZmNIP3.1 que exhibe el fenotipo tlsl.

La Figura 11 muestra la cantidad de ramificaciones de la panoja en el mutante, silvestre y mutante rociado con boro.

La Figura 12 muestra la longitud de las ramificaciones de la panoja en el mutante, silvestre y mutante rociado con boro.

La Figura 13 muestra la longitud de la espiga en el mutante, silvestre y mutante rociado con boro.

La Figura 14 muestra que las plantas tlsl son menos sensibles a las condiciones tóxicas derivadas de la presencia de 50 ppm de boro. Figura 14 A. Comparación lado a lado de plantas tipo silvestre y tlsl homocigotas y plantas mutantes que se observan más altas y más largas. Figura 14B. En las plantas silvestres, el nodo de la segunda hoja más joven totalmente expandida se extiende por encima del nodo de la hoja más joven totalmente expandida, mientras que las plantas mutantes se ven normales. Figura 14C. La hoja más joven totalmente expandida del mutante es más ancha que la del tipo silvestre.

La Figura 15 muestra que ZmNIP3-l es similar a las proteínas del canal de boro. Figura 15A. El árbol filogenético muestra que ZmNIP3.1 está estrechamente relacionado con OsNIP3.1 y AtNIP5.1 (resaltado), que se han caracterizado como proteínas del canal de boro. Figura 15B. Alineamiento de secuencias de proteínas resaltadas en la Figura 15A; ZmNIP3.1 es 84.4 y 67.3 por ciento idéntica a 0sNIP3.1 y AtNIP5.1 respectivamente.

Figura 16. Secuencias de Ms44 de especies seleccionadas. En este alineamiento, la mutación de aminoácidos para la secuencia de polipéptidos dominante de Ms44 se indica en negritas y subrayado en la posición 42, como T en el alelo MS44dom (sec. con núm. de ident.: 14) o V en el alelo Ms44-2629 (sec. con núm. de ident.: 153), en donde todas las otras secuencias tienen A en esa posición.

DESCRIPCIÓN DETALLADA El contenido y las descripciones de la solicitud PCT núm. PCT/US2013/30406 presentada el 12 de marzo de 2013 y la solicitud PCT núm. PCT/US2013/30455 presentada el 12 de marzo de 2013, se incorporan en la presente descripción como referencia en su totalidad. Los métodos y las modalidades de estas relacionados con la fertilidad masculina se incorporan en la presente descripción como referencia.

Los genes de eficiencia de uso del nitrógeno (NUE) afectan el rendimiento y tienen utilidad para mejorar el uso del nitrógeno en plantas de cultivo, especialmente maíz. El aumento de la eficiencia de uso del nitrógeno puede resultar de la captación y asimilación mejoradas del fertilizante nitrogenado y/o la removilización y reuso posterior de las reservas acumuladas de nitrógeno, asi como del aumento de la tolerancia de las plantas a situaciones estresantes tales como ambientes bajos en nitrógeno. Los genes pueden usarse para alterar la composición genética de las plantas, lo que las hace más productivas con los estándares actuales de aplicación del fertilizante o mantiene sus indices de producción con una disponibilidad significativamente reducida de fertilizante o de nitrógeno. Mejorar la NUE en el maíz podría aumentar el rendimiento cosechable del maíz por unidad de fertilizante nitrogenado invertido, tanto en naciones en desarrollo, en donde el acceso al fertilizante nitrogenado está limitado, como en naciones desarrolladas, en donde el nivel de uso del nitrógeno sigue siendo alto. Las mejoras en el uso de nitrógeno permiten, además, disminuir los costos de inversión en la granja, disminuir el uso y dependencia de las fuentes de energía no renovables requeridas para la producción de fertilizante nitrogenado y reducir el impacto medio ambiental de la fabricación y uso agrícola del fertilizante nitrogenado.

Se proporcionan métodos y composiciones para mejorar el rendimiento de las plantas. En algunas modalidades, el rendimiento de las plantas se mejora bajo estrés, particularmente estrés abiótico, tales como condiciones de limitación de nitrógeno. Los métodos para mejorar el rendimiento de las plantas incluyen inhibir la fertilidad de la planta. La fertilidad masculina de una planta se puede inhibir con el uso de cualquier método conocido en la materia que incluye, pero no se limita a, la interrupción de un gen del desarrollo de la panoja o una reducción en la expresión del gen a través del uso de cosupresión, ARN complementario o silenciamiento o interferencia de ARN. Se puede obtener otras plantas masculinas estériles con el uso de mutantes genéticos masculinos estériles.

La inhibición de la fertilidad masculina en una planta puede mejorar la tolerancia de la planta al estrés por nitrógeno y esas plantas pueden mantener sus índices de producción con un aporte de fertilizante nitrogenado significativamente menor y/o exhibir una captación y asimilación mejorada del fertilizante nitrogenado y/o removilización y reuso de las reservas de nitrógeno acumuladas. Además de un aumento general en el rendimiento, la mejora de la tolerancia al estrés por nitrógeno a través de la reducción en la fertilidad masculina puede resultar, además, en un aumento de la masa y/o longitud de la raíz, aumento del tamaño de la espiga, hoja, semilla y/o endosperma, y/o crecimiento erguido mejorado. En correspondencia, en algunas modalidades los métodos comprenden, además, cultivar dichas plantas en condiciones de limitación de nitrógeno y, opcionalmente, seleccionar las plantas que muestren mayor tolerancia a los niveles de nitrógeno bajo.

Adicionalmente, los métodos y composiciones se proporcionan para mejorar el rendimiento bajo estrés abiótico y estos incluyen evaluar las condiciones ambientales de un área de cultivo para determinar los factores de estrés abiótico (por ejemplo, niveles bajos de nitrógeno en el suelo) y plantar semillas o plantas con fertilidad masculina reducida, en ambientes estresantes.

En la presente descripción se proporcionan, además, construcciones y casetes de expresión que comprenden secuencias de nucleótidos que pueden reducir eficientemente la fertilidad masculina.

Otros métodos incluyen, pero no se limitan a: Un método para aumentar el rendimiento mediante el incremento de uno o más componentes de producción en una planta incluye reducir la fertilidad masculina mediante el impacto en la expresión o actividad de un componente de núcleo codificado en la planta y cultivar la planta en condiciones de cultivo de plantas, en donde el componente exhibe un fenotipo dominante. En una modalidad, el componente de núcleo codificado es un gen de fertilidad masculina o un gen de esterilidad masculina que tiene un fenotipo dominante. Opcionalmente, el gen de fertilidad masculina o el gen de esterilidad masculina es un transgen.

La estructura reproductora femenina en desarrollo compite con las estructuras reproductoras masculinas por el nitrógeno, carbono y otros nutrientes durante el desarrollo de estas estructuras reproductoras. Esto se demuestra por la cuantificación de la disponibilidad de nitrógeno de las espigas y panojas de maíz en desarrollo cuando las plantas se cultivan en niveles crecientes de fertilizante nitrogenado. Cuando el maíz se cultiva en cantidades menores de fertilizante nitrogenado, la disponibilidad de nitrógeno de la espiga es negativa o durante el desarrollo la espiga pierde nitrógeno captado por otras partes de la planta cuando el nitrógeno es limitado. La disponibilidad de nitrógeno de la espiga mejora a medida que la cantidad de fertilizante nitrogenado proporcionado a la planta aumenta hasta que la espiga mantiene un aumento positivo en la cantidad de nitrógeno hasta la emergencia de estigmas. En contraposición, la panoja mantiene una disponibilidad de nitrógeno positiva independientemente del nivel de fertilidad en el cual se cultiva la planta. La panoja y la espiga compiten por el nitrógeno durante el desarrollo reproductor y la panoja en desarrollo domina sobre la espiga en desarrollo. La espiga y la panoja probablemente compiten por varios nutrientes durante el desarrollo y la competencia se vuelve más severa en condiciones de estrés. La espiga compite con la panoja durante el desarrollo reproductor antes de la antesis, de manera que se reduce la capacidad de la espiga en desarrollo para acumular nutrientes bajo estrés y se genera una espiga menos desarrollada y de menor tamaño con menos granos. El estrés más severo y extendido puede impedir que la espiga genere estigmas y produzca granos. La reducción genética en la fertilidad masculina reduciría el requerimiento de nutrientes para el desarrollo de panojas lo que produce un desarrollo de la espiga mejorado en la antesis. Se cultivaron plantas genéticas “hermanas” masculinas estériles y fértiles en diversos niveles de fertilidad nitrogenada y se muestrearon a ~50 % de esparcimiento del polen. Las plantas masculinas estériles produjeron espigas más grandes en ambos niveles de fertilidad nitrogenada. La proporción de plantas masculinas estériles que exhibieron emergencia de estigmas fue, además, mayor que la de sus contrapartes fértiles. A pesar de que la biomasa (peso seco total de la planta por encima del suelo menos el peso seco de la espiga) fue mayor en las plantas cultivadas bajo una fertilidad nitrogenada mayor, no se produjo un efecto de esterilidad masculina en la biomasa. Esto muestra que el efecto positivo de la esterilidad masculina recae específicamente en la capacidad de la planta para producir una espiga (estigmas) más desarrollada sin afectar el crecimiento vegetativo general.

No se han realizado experimentos del rendimiento con híbridos derivados con esterilidad masculina genética ya que hasta hace poco tiempo no había un método razonable para producir semillas híbridas con el uso de esta fuente de esterilidad masculina. Dado que la mayoría de los estériles masculinos genéticos son recesivos, la producción de híbridos estériles masculinos requeriría el retrocruzamiento de la fuente de esterilidad masculina en ambos progenitores del híbrido. El progenitor femenino debería ser recesivo homocigota (masculino estéril) y el progenitor masculino debería ser heterocigoto (masculino fértil) para que el híbrido segregue una proporción 1:1 para la esterilidad masculina. En contraposición, MS44, un estéril masculino genético dominante, solo requiere retrocruzamiento en el progenitor femenino para producir una semilla híbrida que se segregue una proporción 1:1 para la esterilidad masculina. La esterilidad masculina dominante es especialmente útil en plantas poliploides tales como trigo, en donde el mantenimiento de la esterilidad recesiva homocigota es más compleja .

Se encontró que el proceso para expresar un gen estéril masculino genético dominante en una planta, opcionalmente combinado con promotores específicos del tejido de la panoja y genes preferidos de la panoja aumenta el desarrollo del tejido de la espiga, mejora el uso de nutrientes en la planta en crecimiento y aumenta las mediciones de las semillas, lo que en última instancia mejora el rendimiento. (Figura 1) La esterilidad masculina genética es mucho más probable que produzca una respuesta en rendimiento porque el desarrollo del polen falla mucho antes en mutantes genéticos masculinos estériles. La mayoría de los mutantes genéticos masculinos estériles fallan poco después de la liberación de la tétrada de polen (Albertson y Phillips, (1981) Can. J. Genet. Cytol. 23:195-208) que se produce durante etapas muy tempranas del desarrollo femenino (espiga). La esterilidad masculina CMS derivada no se determina hasta 10 días antes de la antesis tal como se juzga por las interacciones ambientales asociadas con la estabilidad de la CMS (Weider, et al. , (2009) Crop Sci. 49:77-84). La mayor parte del desarrollo de la espiga ya habría ocurrido antes de 10 días antes de la antesis. Mientras, una falla temprana de la esterilidad masculina genética sería un método para reducir la competencia por los nutrientes de la espiga en desarrollo con el desarrollo de la panoja cuando la espiga está en etapas iniciales de desarrollo. Las mejoras en rendimiento asociadas con los híbridos estériles masculinos dirigidas a través de un desarrollo de espiga mejorado concuerdan con la reducción en la competencia del desarrollo de espigas con el desarrollo de panojas.

La respuesta en rendimiento a la fertilidad N se probó en híbridos estériles masculinos citoplasmáticos (CMS) restaurados (masculinos fértiles) y no restaurados (masculinos estériles). Un híbrido se transformó en un híbrido masculino fértil debido a las condiciones ambientales durante la floración y el otro híbrido no mostró efectos en rendimiento significativos debido a la esterilidad masculina. Estos resultados indican que la esterilidad masculina determinada a través de genes citoplasmáticos no puede establecerse hasta muy tarde en el desarrollo de la panoja y espiga, tal como se juzga por las interacciones ambientales asociadas con la estabilidad de la CMS. El desarrollo masivo de la espiga se ha producido antes de que se establezca la esterilidad masculina CMS (10 días antes de la antesis) lo que genera poca reducción en la competencia de la panoja durante el desarrollo de la espiga. Por lo tanto, el desarrollo de la panoja en un estéril masculino genético se reducirla durante todo el periodo de desarrollo de la espiga y, por lo tanto, competiría menos con el desarrollo de la espiga. Los mutantes con esterilidad masculina genética no se afectan de manera significativa por las condiciones ambientales.

La reducción de la competencia entre la panoja en desarrollo y la espiga podría obtenerse, además, por esterilidad masculina inducida químicamente. Además, una combinación de sustancias químicas y manipulación genética podría inducir la esterilidad masculina. La tolerancia modificada a herbicidas regulada por promotores con menor eficacia en el tejido reproductivo masculino o el uso de pro-gametocidas (Dotson, et al . , (1996) The Plant Journal 10:383-392) y (Mayer and Jefferson, (2004) Molecular Methods for Hybrid Rice Production. Además, los inhibidores de una manera específica de tejido serían medios eficaces de practicar esta descripción.

En varios casos se expresa un rasgo de la planta particular mediante el mantenimiento de una condición recesiva homocigota. Se requieren pasos adicionales para mantener la condición homocigota cuando debe usarse un gen de restauración transgénica para el mantenimiento. Por ejemplo, el gen MS45 en el maíz (patente de los Estados Unidos núm. 5,478,369) contribuye a la fertilidad masculina. Las plantas heterocigotas o hemicigotas para el alelo de MS45 dominante son totalmente fértiles debido a la naturaleza esporofitica del rasgo de fertilidad de MS45. Una mutación natural en el gen MS45, designada ms45, imparte un fenotipo de esterilidad masculina a las plantas cuando este alelo mutante está en el estado homocigota. Esta esterilidad se puede revertir (es decir, la fertilidad se puede restaurar) cuando la forma no mutante del gen se introduce en la planta, ya sea a través de métodos de cruzamiento normal o complementación transgénica. Sin embargo, la restauración de la fertilidad por cruzamiento elimina la condición recesiva homocigota deseada y ambos métodos restauran la fertilidad masculina total y evitan el mantenimiento de lineas maternales estériles masculinas puras.

Un método para mantener la condición recesiva homocigota deseada se describe en las patentes de los Estados Unidos núm. 7,696,405 y 7,517,975, en donde una linea mantenedora se usa para el cruzamiento con ejemplares hermanos estériles masculinos recesivos ho ocigotas. La linea mantenedora está en la condición recesiva homocigota deseada para la esterilidad masculina, pero, además, contiene una construcción transgénica hemicigota que consiste en un gen de fertilidad masculina dominante para complementar la condición de esterilidad masculina; un gen de ablación del polen, que evita la transferencia de la construcción transgénica a través del polen al hermano con esterilidad masculina pero permite la transferencia del alelo recesivo de esterilidad masculina a través de granos de polen no transgénicos y un gen marcador de semillas que permite la clasificación de semillas o plantas transgénicas de mantenimiento y semillas o plantas de esterilidad masculina no transgénicas.

La teenología de producción de semillas (SPT, por sus siglas en inglés) proporciona métodos para mantener la condición recesiva homocigota de un gen de esterilidad masculina en una planta. Ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. 7,696,405. SPT usa una línea mantenedora que es la fuente de polen para la fertilización de sus hermanos estériles masculinos recesivos homocigotas. La línea mantenedora está en la condición recesiva homocigota deseada para la esterilidad masculina, pero, además, contiene una construcción transgénica hemicigota (“construcción de SPT”). En ciertas modalidades, la construcción de SPT comprende los tres elementos siguientes: (1) un gen de fertilidad masculina dominante para complementar la condición recesiva estéril masculina; (2) un gen que codifica un producto que interfiere con la formación, función o dispersión de gametos masculinos y (3) un gen marcador que permite clasificar semillas/plantas mantenedoras transgénicas a partir de aquellas que carecen del transgen. La interferencia con la formación, función o dispersión del polen evita la transferencia a través del polen de la construcción transgénica; el polen funcional carece del transgen. Las semillas resultantes producen plantas masculinas estériles. Después, estas plantas endogámicas masculinas estériles se usan para la producción de híbridos mediante la polinización con un progenitor masculino que puede ser una línea endogámica homocigota no relacionada para el alelo dominante del gen de fertilidad masculina. Las semillas híbridas resultantes producen plantas masculinas estériles.

Para crear la progenie masculina estéril híbrida, el progenitor masculino se usaría como la línea mantenedora para el cruzamiento con líneas femeninas con esterilidad masculina, (que aumentan con el uso de una línea mantenedora separada), para producir plantas híbridas estériles completamente masculinas. Ver, por ejemplo, la Figura 3.

El uso de un enfoque dominante es otro método para lograr esterilidad masculina o reducción de la fertilidad masculina. Un método de esterilidad masculina dominante es ventajoso con respecto al uso de la esterilidad masculina recesiva porque solamente una copia simple del gen dominante es necesaria para la esterilidad completa. Sin embargo, si no se dispone de los métodos para crear una línea estéril masculina dominante homocigota, entonces la progenie resultante segregará 50 % para la esterilidad masculina.

Esta situación se puede mitigar mediante la vinculación transgénica de un marcador detectable o seleccionable con el gen de esterilidad masculina dominante y la detección o selección de semillas o plantas de la progenie que contengan el marcador· En el caso de un alelo masculino estéril dominante se podría usar los marcadores genéticos vinculados o un fenotipo vinculado para clasificar la progenie. Los métodos útiles para describir un sistema de esterilidad masculina dominante reversible se describen en la patente de los Estados Unidos núm. 5,962,769, en donde se aplica una sustancia química a plantas masculinas estériles dominantes de manera que el fenotipo se invierte y se produce fertilidad masculina, y ello permite la autopolinización por la cual se puede obtener plantas masculinas estériles dominantes homocigotas. En otros métodos contemplados para crear una planta masculina estéril dominante homocigota podría usarse un promotor inducible que controla un gen que reprime o interfiere con la función del gen masculino estéril dominante. La planta es constitutivamente estéril y se transforma en fértil solamente cuando se induce el promotor, lo que permite la expresión del represor que interrumpe la función del gen masculino estéril dominante. Un represor podría ser un gen anticodificante iARN, una repetición invertida dirigida al gen masculino estéril dominante propiamente dicho o a su promotor o un producto génico capaz de unir o inactivar el producto del gen masculino estéril dominante.

Otro método para producir 100 % de esterilidad masculina en la progenie a partir de la esterilidad masculina dominante podría ser el uso de secuencias de proteínas de corte y empalme. Una secuencia de proteína de corte y empalme es un segmento de una proteína que puede autoescindirse y unir nuevamente la porción o porciones restantes con un enlace peptídico. Las secuencias de proteínas de corte y empalme se pueden autoempalmar y pueden unir, nuevamente, las porciones restantes en los estados cis y trans. Un gen masculino estéril dominante podría modificarse de tal manera que las regiones que codifican para las regiones de proteínas N y C se separan en construcciones transgénicas diferentes, acopladas con una secuencia que codifica para una secuencia de proteínas de corte y empalme. Una planta que contiene una sola construcción sería una planta masculina fértil ya que la proteína está truncada y no es funcional, de manera que se puede autofertilizar para crear una planta homocigota. Después, las plantas homocigotas para la construcción N-DMS-N-secuencia de proteína de corte y empalme se pueden cruzar con plantas homocigotas para la construcción C-secuencia de proteína de corte y empalme-C-proteína DMS. Toda la progenie de este cruzamiento sería una progenie masculina estéril a través de la escisión de cada secuencia de proteína de corte y empalme y la unión de las secuencias N y C para crear una proteina masculina estéril dominante funcional.

Se usó una serie de experimentos en campo para cuantificar la respuesta en rendimiento de la esterilidad masculina genética en diversas variables ambientales. Se usaron dos variables: dosis de fertilizante nitrogenado y densidad de la planta, para exponer a las plantas a varios grados de estrés. Estos tratamientos continuos del estrés permitieron separar claramente el rendimiento de la planta debido a una mayor partición de asimilados a espigas de las plantas masculinas estériles genéticas. Estos métodos se usaron para cuantificar y demostrar los efectos positivos del rendimiento en un ambiente representativo del follaje del cultivo en el campo. Estos datos validaron las respuestas más tempranas de las plantas individuales medidas en estudios en invernaderos.

La esterilidad masculina se manifiesta en los cambios en el desarrollo de tejidos vegetales específicos. La espiga y la panoja del maíz son estructuras de inflorescencia femenina que comparten procesos de desarrollo comunes y que están controladas por un conjunto común de genes. Los tejidos compiten entre sí por los nutrientes requeridos. Sin embargo, la panoja tiene la ventaja de la dominancia apical sobre la espiga, que es desfavorable para el crecimiento de la espiga y el potencial de producción en las plantas de maíz. La reducción de la dominancia apical de la panoja podría usarse para desviar más recursos para el crecimiento de la espiga, cantidad o tamaño del grano y, en última instancia, aumentar el rendimiento de granos.

Existen múltiples métodos para reducir la competencia de la panoja, tal como la esterilidad masculina, la reducción del tamaño de la panoja o la eliminación de la panoja (una planta de maíz sin panoja). Si bien las mutaciones genéticas (mutantes) de genes, tal como los genes de esterilidad masculina, pueden usarse para reducir la competencia de la panoja con la espiga, la manipulación transgénica ofrece alternativas o proporciona herramientas para este propósito. Dado gue los genes involucrados en el desarrollo de la panoja están implicados, frecuentemente, en el desarrollo de la espiga, la reducción del desarrollo de la panoja mediante la interrupción de estos genes puede afectar, además, el desarrollo de la espiga. La mutación del gen tasseless (Tsll) es un ejemplo, en el cual la planta sin panoja tampoco tiene espiga. Para permitir la reducción del crecimiento de la panoja sin interferir con el desarrollo de la espiga se requiere un promotor específico de la panoja para dirigir la interrupción de genes solamente en los tejidos de la panoja.

Todas las referencias citadas se incorporan en la presente descripción como referencia.

A menos que se defina específicamente de cualquier otra manera, todos los términos téenicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que comprende comúnmente una persona con experiencia en la materia a la cual pertenece la presente descripción. A menos que se mencione de cualquier otra manera, las técnicas usadas o contempladas en la presente descripción son metodologías estándar muy conocidas para un experto en la técnica. Los materiales, métodos y ejemplos son únicamente ilustrativos y no limitantes. Lo siguiente se presenta en forma de ilustración y no pretende limitar el alcance de la descripción.

Una persona experimentada en la técnica puede pensar en cualquier modificación y otras modalidades de las descripciones expuestas en la presente relacionadas con estas descripciones con la utilidad de las enseñanzas presentadas en las descripciones precedentes y las figuras asociadas. Por lo tanto, se entiende que las descripciones no se limitan a las modalidades específicas descritas y esas modificaciones y otras modalidades están incluidas dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Aunque en la presente descripción se usa términos específicos, estos se usan únicamente en un sentido genérico y descriptivo y no con propósitos de limitación.

La práctica de la presente descripción usará, a menos que se indique de cualquier otra manera, téenicas convencionales de botánica, microbiología, cultivo de tejido, biología molecular, química, bioquímica y de ingeniería genética, las cuales están dentro de la habilidad de la técnica.

Las unidades, los prefijos y los símbolos pueden indicarse en su forma aceptada en el SI (Sistema Internacional de Unidades). A menos que se indique de cualquier otra manera, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en orientación de 5' a 3' ; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en la orientación del extremo amino al carboxi, respectivamente. Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. En la presente descripción, los aminoácidos se pueden indicar con sus símbolos de tres letras conocidos o con los símbolos de una letra que recomienda la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Además, los nucleótidos se pueden indicar con sus códigos de única letra generalmente aceptados. Los términos definidos a continuación se definen en mayor detalle en referencia a la especificación como un todo.

Se usarán los siguientes términos para describir la presente descripción, y se pretende que se definan tal como se indica a continuación.

“Microbio” se refiere a cualquier microorganismo (incluso microorganismos eucariotas y procariotas), tal como hongos, levadura, bacterias, actinomicetos, algas y protozoarios, asi como otras estructuras unicelulares.

Por “amplificado” se entiende la construcción de copias múltiples de una secuencia de ácido nucleico o copias múltiples complementarias a la secuencia de ácido nucleico con el uso de por lo menos una de las secuencias de ácido nucleico como un patrón. Los sistemas de amplificación incluyen el sistema de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), el sistema de reacción en cadena de la ligasa (LCR), la amplificación en base a la secuencia de ácido nucleico (NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario), los sistemas de la Q -Beta replicasa, el sistema de amplificación en base a la transcripción (TAS) y la amplificación por desplazamiento de la hebra (SDA). Ver, por ejemplo, Diagnostic Molecular Microbiology: Principies and Applications, Persing, et al . , eds., American Society for Microbiology, Washington, DC (1993). El producto de la amplificación se denomina amplicón.

El término “variantes conservativamente modificadas” aplica tanto al aminoácido como a las secuencias de ácido nucleico. Con respecto a las secuencias particulares de ácido nucleico, las variantes conservativamente modificadas se refiere a los ácido nucleicos que codifican variantes conservativamente modificadas o idénticas de las secuencias de aminoácidos. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteina dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican el aminoácido alanina. Asi, en cada posición en donde se especifica una alanina por un codón, el codón puede alterarse a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones de ácido nucleico son “variaciones silentes” y representan una especie de la variación conservativamente modificada. Cada secuencia de ácido nucleico en la presente descripción que codifica un polipéptido describe, además, cada variación silente posible del ácido nucleico. Una persona con experiencia en la téenica reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que es normalmente el único codón para metionina; una excepción es Micrococcus rubens, para el cual GTG es el codón de metionina (Ishizuka, et al . , (1993) J. Gen. Microbiol . 139:425-32) y puede modificarse para producir una molécula funcionalmente idéntica. En consecuencia, cada variación silenciosa de un ácido nucleico, que codifica un polipéptido de la presente descripción, está implícita en cada secuencia de polipéptidos descrita e incorporada en la presente descripción como referencia.

Como para las secuencias de aminoácidos, una persona con experiencia reconocerá que las sustituciones, deleciones o adiciones individuales a una secuencia de ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteina que altera, adiciona o elimina un solo aminoácido o un porcentaje pequeño de aminoácidos en la secuencia codificada es una “variante conservativamente modificada” cuando la alteración resulta en la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Así, puede alterarse cualquier número de residuos de aminoácidos seleccionado del grupo de enteros que consisten de 1 a 15. Así, por ejemplo, se puede hacer 1, 2, 3, 4, 5, 7 o 10 alteraciones. Las variantes conservativamente modificadas proporcionan, típicamente, una actividad biológica similar que las secuencias de polipéptidos sin modificar a partir de la que se derivan. Por ejemplo, la especificidad del sustrato, actividad de la enzima o unión ligando/receptor es, generalmente, al menos 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %, preferentemente 60-90 % de la proteína natural por su sustrato natural Las tablas de la sustitución conservativa que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares se conocen bien en la téenica.

Los siguientes seis grupos contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservativas de uno a otro: 1) alanina (A), serina (S), treonina (T); 2) ácido aspártico (D), ácido glutámico (E); 3) asparagina (N), glutamina (Q); 4) arginina (R), lisina (K); 5) isoleucina (I), leucina (L), metionina (M), valina (V) y 6) fenilalanina (F), tirosina (Y), triptófano (W). Ver, además, Creighton, Proteins, W.H. Freeman and Co. (1984).

Como se usa en la presente descripción, “que consiste prácticamente en” significa la inclusión de secuencias adicionales en un polinucleótido o polipéptido objetivo, en donde las secuencias adicionales no afectan materialmente la función básica de las secuencias de polinucleótidos o polipéptidos reivindicadas.

El término “construcción” se usa para hacer referencia, generalmente, a una combinación artificial de secuencias de polinucleótidos, por ejemplo, una combinación que no es de origen natural, que comprende, normalmente, uno o más elementos reguladores y una o más secuencias codificantes. El término puede incluir la referencia a los casetes de expresión y/o secuencias de vectores, como sea adecuado para el contexto.

Un “control”, “planta control” o “célula vegetal control” proporciona un punto de referencia para determinar los cambios en el fenotipo de una planta o célula vegetal sujeto en la que ha ocurrido una alteración genética, tal como una transformación, en un gen de interés. Una planta o célula vegetal sujeto puede descender de una planta o célula alterada y comprender la alteración.

Una planta control o célula vegetal control puede comprender, por ejemplo: (a) una planta o célula silvestre, es decir, del mismo genotipo que el material inicial para la alteración genética que resultó en la planta o célula sujeto; (b) una planta o célula vegetal del mismo genotipo que el material inicial, pero que se transformó con una construcción nula (es decir, con una construcción que no tiene efecto conocido en el rasgo de interés, tal como una construcción que comprende un gen marcador); (c) una planta o célula vegetal que es un segregante no transformado entre la progenie de una planta o célula vegetal sujeto; (d) una planta o célula vegetal genéticamente idéntica a la planta o célula vegetal sujeto, pero que no está expuesta a condiciones o estímulos que inducirían la expresión del gen de interés o (e) la propia planta o célula vegetal sujeto, bajo condiciones en las que no se expresa el gen de interés. Una planta control puede ser, además, una planta transformada con una construcción alternativa de regulación negativa.

La frase “que codifica” o “codificado” con respecto a un ácido nucleico especifico se refiere a que comprende la información para la traducción en la proteina especificada. Un ácido nucleico que codifica una proteina puede comprender secuencias no traducidas (por ejemplo, intrones) dentro de las regiones traducidas del ácido nucleico o puede carecer de tales secuencias no traducidas intermedias (por ejemplo, como en ADNc). La información por la cual se codifica una proteina se especifica con el uso de codones. Típicamente, la secuencia de aminoácidos se encuentra codificada por el ácido nucleico mediante el uso del código genético “universal”. Sin embargo, las variantes del código universal, tales como las presentes en la mitocondria de algunas plantas, animales y hongos, la bacteria Mycoplasma capricolum (Yamao, et al . , (1985) Proc. Nati . Acad. Sci . USA, 82:2306-9) o el macronúcleo ciliado, pueden usarse cuando el ácido nucleico se expresa por medio del uso de esos organismos.

Cuando el ácido nucleico se prepara o altera sintéticamente, se puede tomar ventaja de las preferencias del codón conocidas de los huéspedes deseados, en donde el ácido nucleico se va a expresar. Por ejemplo, aunque las secuencias de ácido nucleico de la presente descripción pueden expresarse en especies de plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, las secuencias pueden modificarse para responder a las preferencias específicas del codón y del contenido de GC de plantas monocotiledóneas o plantas dicotiledóneas ya que se demostró que estas preferencias son distintas (Murray, et al . , (1989) Nucleic Acids Res. 17:477- 98, incorporada en la presente descripción como referencia). Asi, el codón preferido de maíz para un aminoácido particular podría derivarse de secuencias de genes conocidas de maíz. El uso de codones en maíz para los 28 genes de plantas de maíz se enumera en la Tabla 4 de Murray, et al . , más arriba .

Como se usa en la presente descripción, “heterólogo”, con referencia a un ácido nucleico, es un ácido nucleico que se origina de una especie extraña o, si es de la misma especie, se encuentra sustancialmente modificada de su forma natural en la composición y/o locus genómico mediante intervención humana intencional. Por ejemplo, un promotor unido operativamente a un gen estructural heterólogo es de una especie distinta a la especie de la cual se derivó el gen estructural o, si es de la misma especie, uno o ambos están sustancialmente modificados de su forma original. Una proteína heteróloga se puede originar de una especie extraña o, si es de la misma especie, se modifica sustancialmente de su forma original mediante intervención humana intencional.

“Célula huésped” se refiere a una célula que comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo de la descripción, que contiene un vector y soporta la replicación y/o expresión del vector de expresión. Las células huésped pueden ser células procariotas, tales como E. coli, o células eucariotas, tales como células de levadura, insectos, planta, anfibios o mamíferos. Preferentemente, las células huésped son células de plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas que incluyen, pero no se limitan a, maíz, sorgo, girasol, frijol de soya, trigo, alfalfa, arroz, algodón, cañóla, cebada, mijo y tomate. Una célula huésped monocotiledónea particularmente preferida es una célula huésped de maíz.

El término “complejo de hibridación” incluye la referencia a una estructura de ácido nucleico híbrida formada por dos secuencias de ácido nucleico monocatenarias hibridizadas selectivamente entre sí.

El término “introducido” en el contexto de insertar un ácido nucleico en una célula significa “transíección”, “transformación” o “transducción” e incluye la referencia a la incorporación de un ácido nucleico en una célula eucariota o procariota, en donde el ácido nucleico puede incorporarse en el geno a de la célula (por ejemplo, ADN cromosómico, plasmídico, plástido o mitocondrial), convertido en un replicón autónomo o expresado temporalmente (por ejemplo, ARNm transfectado).

Los términos “aislado” se refiere al material, tal como un ácido nucleico o una proteína, que se encuentra sustancialmente o prácticamente libre de componentes que normalmente acompañan o interactúan con este tal como se encuentra en su medio natural. Los términos “de origen no natural”; “mutado”, “recombinante”; “expresado recombinantemente”; “heterólogo” o “expresado heterólogamente” son materiales biológicos representativos que no están presentes en su ambiente de origen natural.

El término “ácido nucleico NUE” significa un ácido nucleico que comprende un polinucleótido (“polinucleótido NUE”) que codifica un polipéptido de longitud total o longitud parcial.

Como se usa en la presente descripción, “ácido nucleico” incluye la referencia a un polímero desoxirribonucleótido o ribonucleótido en forma monocatenaria o bicatenaria y, a menos que se limite de cualquier otra manera, abarca los análogos conocidos que tienen la naturaleza esencial de los nucleótidos naturales en que se hibridizan a ácidos nucleicos monocatenarios de una manera similar a los nucleótidos de origen natural (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos).

“Genoteca de ácidos nucleicos” se refiere a una recolección de moléculas aisladas de ADN o ARN que comprenden y representan sustancialmente la fracción completa transcrita de un genoma de un organismo específico. La creación de genotecas de ácidos nucleicos ilustrativas, tales como genotecas de ADN genómico y de ADNc se enseña en referencias de biología molecular estándar, tales como Berger and Kimel, (1987) Guide To Molecular Cloning Techniques, de la serie Methods in Enzymology, vol. 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Sambrook, et al . , (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.° ed., vols. 1-3; y Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, et al . , eds, Current Protocols, empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wilcy & Sons, Inc. (Suplemento de 1994).

Como se usa en la presente descripción, “unido operativamente” incluye una referencia a un enlace funcional entre una primera secuencia, tal como un promotor, y una segunda secuencia, en donde la secuencia promotora inicia e intercede la transcripción del ADN correspondiente a la segunda secuencia. Generalmente, operativamente unido significa que las secuencias de ácido nucleico que están unidas son contiguas y en donde sea necesario se unen a dos regiones codificantes de proteina, contiguas y en el mismo marco de lectura.

Como se usa en la presente descripción, el término “planta” incluye la referencia a las plantas completas, órganos de las plantas (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), semillas y células vegetales, así como progenie de estas. Las células vegetales, como se usa en la presente descripción, incluyen, sin limitarse a, semillas, cultivos en suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejido calloso, hojas, raíces, brotes, gametofitos, esporofitos, polen, y microsporas. La clase de plantas que se puede usar en los métodos de la descripción, es generalmente tan amplio como la clase de las plantas superiores susceptibles a las téenicas de transformación, que incluyen las plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas e incluyen las especies del género: Cucúrbita, Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus , Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis , Majorana, Ciahorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis , Cucumis, Browaalia, Glycine, Pisum, Phaseolus, Lolium, Oryza, Avena, Hordeum, Secale, Allium y Triticum. Una planta particularmente preferida es Zea mays.

Como se usa en la presente descripción, “rendimiento” puede incluir la referencia a bushel por aere de un cultivo de granos en la cosecha, ajustado por la humedad del grano (por ejemplo, para el maíz, típicamente 15 %) y el volumen de la biomasa generada (para los cultivos de forraje, tales como alfalfa y tamaño de la raíz de la planta para cultivos múltiples). La humedad del grano se mide en el grano en la cosecha. El peso de prueba ajustado del grano se determina como el peso en libras por bushel, ajustado para el nivel de humedad del grano en la cosecha. La biomasa se mide como el peso del material cosechadle de la planta generado.

Como se usa en la presente descripción, “polinucleótido” incluye la referencia a un desoxirribopolinucleótido, ribopolinucleótido o análogos de estos que tienen la naturaleza esencial de un ribonucleótido natural en que se hibridizan, en condiciones rigurosas de hibridación, para prácticamente la misma secuencia de nucleótidos que los nucleótidos de origen natural y/o permiten la traducción en el(los) mismo(s) aminoácido(s) que el (los) nucleótido(s) de origen natural. Un polinucleótido puede ser de longitud completa o una subsecuencia de un gen estructural o regulador natural o heterólogo. A menos que se indique de cualquier otra forma, el término incluye referencia a la secuencia especificada asi como la secuencia complementaria de esta.

Los términos “polipéptido”, “péptido” y “proteína” se usan indistintamente en la presente descripción para hacer referencia a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos, en donde uno o más residuos de aminoácidos es o son un análogo químico artificial de un aminoácido correspondiente de origen natural, así como polímeros de aminoácidos de origen natural.

Como se usa en la presente descripción, “promotor” incluye una referencia a una región de ADN corriente arriba del inicio de la transcripción e involucrada en el reconocimiento y unión de la ARN poli erasa y otras proteínas para iniciar la transcripción. Un “promotor vegetal” es un promotor con la capacidad de iniciar la transcripción en células vegetales. Los promotores de plantas ilustrativos incluyen, pero sin limitarse a, aquellos que se obtienen de plantas, virus de plantas y bacterias los cuales comprenden genes expresados en células vegetales tales como Agrobacterium o Rhizobium. Los ejemplos son promotores que inician, preferentemente, la transcripción en ciertos tejidos, tales como hojas, raíces, semillas, fibras, vasos del xilema, traqueidas o esclerénquima. Tales promotores se mencionan como “específicos del tejido”. Un promotor específico de “tipos celulares” dirige, principalmente, la expresión en ciertos tipos de células en uno o más órganos, por ejemplo, células vasculares de raíces u hojas. Un “promotor inducible” o “regulable” es un promotor que está bajo control medio ambiental. Los ejemplos de condiciones ambientales que pueden afectar la transcripción por los promotores inducibles incluyen condiciones anaeróbicas o la presencia de luz. Otro tipo de promotor es un promotor regulado por el desarrollo, por ejemplo, un promotor que conduce la expresión durante el desarrollo del polen. Los promotores inducibles y regulados por el desarrollo, de tipo de célula específico, de tejido preferido constituyen la clase de promotores “no constitutivos”. Un promotor “constitutivo” es un promotor que está activo en prácticamente todos los tejidos de una planta, bajo la mayoría de las condiciones ambientales y estados de desarrollo o diferenciación celular.

El término “polipéptido” se refiere a una o más secuencia de aminoácidos. El término incluye, además, los fragmentos, variantes, homólogos, alelos o precursores (por ejemplo, preproproteínas o proproteínas) de estos. Una “proteína NUE” comprende un polipéptido. A menos que se indique de otra manera, el término “ácido nucleico NUE” se refiere a un ácido nucleico que comprende un polinucleótido (“polinucleótido NUE”) que codifica un polipéptido.

Como se usa en la presente descripción, “recombinante” incluye la referencia a una célula o vector que se ha modificado mediante la introducción de un ácido nucleico heterólogo o que la célula se deriva de una célula modificada de esa manera. Así, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran de forma idéntica dentro de la forma natural (no recombinante) de la célula o expresa genes naturales que se expresan de cualquier otra forma anormalmente, expresados o no expresados como resultado de la intervención humana intencional o pueden tener una expresión reducida o eliminada de un gen natural. El término “recombinante”, como se usa en la presente descripción, no abarca la alteración de la célula o vector por eventos de origen natural (por ejemplo, mutación espontánea, transíormación/transducción/transposición natural), tales como los que ocurren sin intervención humana intencional.

Como se usa en la presente descripción, un “casete de expresión recombinante” es un constructo de ácido nucleico generada de manera recombinante o sintética, con una serie de elementos de ácido nucleico especificados que permiten la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula objetivo. El casete de expresión recombinante puede incorporarse en un plásmido, cromosoma, ADN mitocondrial, ADN plastidio, virus o fragmento de ácido nucleico. Típicamente, la porción del casete de expresión recombinante de un vector de expresión incluye, entre otras secuencias, un ácido nucleico a transcribirse y un promotor.

El término “se hibridiza selectivamente” incluye la referencia a la hibridación, en condiciones rigurosas de hibridación, de una secuencia de ácido nucleico a una secuencia objetivo específica de ácido nucleico en un grado detectadle mayor (por ejemplo, por lo menos el doble por encima del base) que su hibridación en secuencias de ácido nucleico no objetivo y con la exclusión sustancial de ácidos nucleicos no objetivo. Las secuencias de hibridación selectiva tienen, típicamente, aproximadamente al menos 40 % de identidad de secuencia, preferentemente, 60-90 % de identidad de secuencia y, con la máxima preferencia, 100 % de identidad de secuencia (es decir, complementarias) entre si.

Los términos “condiciones rigurosas” y “condiciones rigurosas de hibridación” se refieren a las condiciones bajo las cuales una sonda se hibridiza a su secuencia objetivo a un grado detectable mayor que otras secuencias (por ejemplo, por lo menos 2 veces el valor de base). Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán diferentes en circunstancias diferentes. Al controlar el rigor de las condiciones de hibridación y/o lavado, pueden identificarse las secuencias objetivo que pueden ser hasta 100 % complementarias de la sonda (sonda homologa). Alternativamente, pueden ajustarse las condiciones de rigor para permitir cierta falta de coincidencia de las secuencias con el fin de detectar grados más bajos de similitud (sonda heteróloga). Óptimamente, la sonda es de una longitud de aproximadamente 500 nucleótidos, pero puede variar grandemente en longitud de menor que 500 nucleótidos a igual a toda la longitud de la secuencia objetivo.

Típicamente, serán condiciones rigurosas aquellas en las cuales la concentración de sal es menor que aproximadamente 1.5 M de iones Na, típicamente, una concentración de aproximadamente 0.01 a 1.0 M de iones Na (u otras sales) con un H 7.0 a 8.3 y la temperatura es por lo menos aproximadamente 30 °C para las sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y por lo menos aproximadamente 60 para las sondas largas (por ejemplo, más de 50 nucleótidos). Las condiciones rigurosas se pueden obtener, además, con la adición de agentes desestabilizadores, tales como formamida o solución de Denhardt. Las condiciones de rigurosidad baja ilustrativas incluyen la hibridación con una solución amortiguadora de formamida al 30-35 %, NaCl 1 M, SDS (dodecil sulfato de sodio) a 37 °C y un lavado en SSC IX a 2X (SSC 20X =- NaCl 3.0 M/citrato trisódico 0.3 M) a 50 a 55 °C. Las condiciones moderadamente rigurosas ilustrativas incluyen la hibridación en formamida al 40 a 45 %, 1 M de NaCl, SDS al 1 % a 37 °C y un lavado en 0.5X a IX SSC a 55 a 60 °C. Las condiciones de rigor alto ilustrativas incluyen hibridación en formamida al 50 %, NaCl 1 M, SDS al 1 % a 37 °C y un lavado en SSC 0,1X a 60 hasta 65 °C. La especificidad es, típicamente, la función de los lavados posteriores a la hibridación; los factores críticos son la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para los híbridos ADN-ADN, la Tm puede aproximarse a la ecuación de Meinkoth and Wahl, (1984) Anal . Biochem. , 138:267-84: Tm = 81.5 °C + 16.6 (log M) + 0.41 (%GC) - 0.61 (¾ for ) -500/L; en donde M es la molaridad de cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN, % form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación y L es la longitud del híbrido en pares de bases.

Tm es la temperatura (con la fuerza iónica y el pH definidos a continuación) a la cual se hibridiza el 50 % a una secuencia objetivo complementaria con una sonda perfectamente apareada. Tm se reduce en aproximadamente 1 °C por cada 1 % de apareamiento erróneo; por lo tanto, la Tm, las condiciones de hibridación y/o lavado pueden ajustarse para hibridizarse con las secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se busca secuencias con ³90 % de identidad, la Tm se puede disminuir 10 °C. Generalmente, se seleccionan las condiciones de rigor para que sean aproximadamente 5 °C menores que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia especifica y su complemento, con una fuerza iónica y un pH definidos. Sin embargo, las condiciones severamente rigurosas pueden usar una hibridación y/o lavado a 1, 2, 3 o 4 °C menos que la temperatura de fusión térmica (Tm); Las condiciones de rigor moderado pueden usar una hibridación y/o lavado a 6, 7, 8, 9 o 10 °C por debajo del punto de fusión térmica(Tm); Las condiciones poco rigurosas pueden usar hibridación y/o lavado a 11, 12, 13, 14, 15 o 20 °C menos que la temperatura de fusión térmica (Tm). Al usar la ecuación, las composiciones de hibridación y lavado, y la Tm deseada, las personas con conocimiento ordinario en la téenica comprenderán que se describen esencialmente variaciones en el rigor de las soluciones de hibridación y/o lavado. Si el grado de no coincidencia deseado resulta en una Tm menor que 45 °C (solución acuosa) o 32 °C (solución de formamida), se prefiere aumentar la concentración del SSC de tal manera que pueda usarse una temperatura más alta. Una guia extensa sobre la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology -Hybridization with Nucleic Acid Probes, parte I, capitulo 2, “OverView of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays,” Elsevier, New York (1993); y Current Protocole in Molecular Biology, capitulo 2, Ausubel, et al. , eds, Greene Publishing and Wilcy-Interscience, New York (1995). A menos que se indique de cualquier otra manera, en la presente solicitud “alta rigurosidad” se define como la hibridación en SSC 4X, solución de Denhardt 5X (5 g de Ficoll, 5 g de polivinilpirrolidona, 5 g de albúmina sérica bovina en 500 mi de agua), ADN de esperma de salmón hervido a 0.1 mg/l y 25 mM de fosfato de Na a 65 °C y un lavado en SSC 0.1X, SDS al 0.1 % a 65 °C.

Como se usa en la presente descripción, “planta transgénica” incluye lo referente a una planta que comprende en su geno a un polinucleótido heterólogo. Generalmente, el polinucleótido heterólogo está integrado de manera estable dentro del genoma de manera tal que el polinucleótido se transmita a las generaciones sucesivas. El polinucleótido heterólogo se puede integrar en el genoma solo o como parte de un casete de expresión recombinante. El término “transgénico” se usa en la presente descripción para incluir cualquier célula, linea celular, callo, tejido, parte de una planta o planta cuyo genotipo ha sido alterado con la presencia de ácidos nucleicos heterólogos que incluyen los transgénicos alterados inicialmente, asi como los creados por cruces sexuales o propagación asexual a partir del transgénico inicial. Como se usa en la presente descripción, el término “transgénico” no abarca la alteración del genoma (cromosómico o extracromosómico) por métodos convencionales de cultivo vegetal o por eventos de origen natural, tales como fertilización cruzada aleatoria, infección viral no recombinante, transformación bacteriana no recombinante, transposición no recombinante o mutación espontánea.

Como se usa en la presente descripción, “vector” incluye la referencia a un ácido nucleico que se usa en la transfección de una célula huésped y en la cual puede insertarse un polinucleótido. Los vectores son, frecuentemente, replicones. Los vectores de expresión permiten la transcripción de un ácido nucleico insertado allí.

Los siguientes términos se usan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más ácidos nucleicos o polinucleótidos o polipéptidos: (a) “secuencia de referencia”, (b) “ventana de comparación”, (c) “identidad de secuencia”, (d) “porcentaje de identidad de secuencia” y (e) “identidad sustancial”.

Como se usa en la presente descripción, “secuencia de referencia” es una secuencia definida que se usa como base para la comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la totalidad de una secuencia especificada; por ejemplo, como un segmento de ADNc de longitud completa o secuencia génica o el ADNc completo o secuencia génica.

Como se usa en la presente descripción, “ventana de comparación” significa que incluye la referencia a un segmento contiguo y especifico de una secuencia de polinucleótidos, en donde la secuencia de polinucleótidos puede compararse con una secuencia de referencia, y en donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, interrupciones) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones ni deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. Generalmente, la ventana de comparación tiene por lo menos 20 nucleótidos contiguos de longitud y, opcionalmente, puede tener 30, 40, 50, 100 o más. Los expertos en la téenica comprenden que para evitar una alta similitud con una secuencia de referencia debido a la inclusión de interrupciones, se introduce en la secuencia de polinucleótidos, típicamente, una penalización de interrupción y se sustrae de la cantidad de coincidencias.

Los métodos de alineamiento de nucleótidos y las secuencias de aminoácidos para la comparación se conocen bien en la téenica. El algoritmo de homología local (BESTFIT) de Smith y Waterman, (1981) Adv. Appl . Math 2:482, puede realizar un alineamiento óptimo de las secuencias para su comparación; por el algoritmo de alineamiento de homología (GAP) de Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol . 48:443-53; por la búsqueda del método de similitud (Tfasta y Fasta) de Pearson y Lipman, (1988) Proc. Nati . Acad. Sel. USA 85:2444; por implementaciones computarizadas de estos algoritmos que incluyen, sin limitarse a: CLUSTAL en el programa PC/Gene de Intelligenetics, Mountain View, California, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el paquete de programas Wisconsin Genetics, versión 8 (disponible de Genetics Computer Group (programas GCG® (Accelrys, Inc., San Diego, CA).). El programa CLUSTAL fue descrito en detalle por Higgins y Sharp, (1988) Gene 73:237-44; Higgins y Sharp, (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet, et al. , (1988) Nucleic Acid Res. 16:10881-90; Huang, et al. , (1992) Computer Applications in the Biosciences 8:155-65 y Pearson, et al . , (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-31. El programa preferido para usar para el alineamiento global óptimo de múltiples secuencias es PileUp (Feng and Doolittle, (1987) J. Mol. Evol. , 25:351-60 que es similar al método descrito por Higgins y Sharp, (1989) CABIOS 5:151-53 y que se incorpora de esta manera en la presente descripción como referencia). La familia de programas de BLAST que puede usarse para búsquedas de similitud en la base de datos incluye: BLASTN para búsquedas de secuencias de nucleótidos en bases de datos de secuencias de nucleótidos; BLASTX para búsquedas de secuencias de nucleótidos en bases de datos de secuencias de proteínas; BLASTP para búsquedas de secuencias de proteínas en bases de datos de secuencias de proteínas; TBLASTN para búsquedas de secuencias de proteínas en bases de datos de secuencias de nucleótidos y TBLASTX para búsquedas de secuencias de nucleótidos en bases de datos de secuencias de nucleótidos. Ver, Current Protocole in Molecular Biology, Capítulo 19, Ausubel et al . , eds., Greene Publishing and Wilcy-Interscience, New York (1995).

El GAP usa el algoritmo de Needleman y Wunsch, más arriba, para buscar el alineamiento de dos secuencias completas que maximizan el número de coincidencias y minimiza el número de interrupciones. GAP toma en consideración todos los alineamientos posibles, así como las posiciones de interrupción y crea el alineamiento con la mayor cantidad de bases coincidentes y la menor cantidad de interrupciones. Permite proporcionar la penalización de creación de interrupciones y una penalización de extensión de interrupciones en unidades de bases coincidentes. GAP debe beneficiarse de la cantidad de penalizaciones de creación de interrupciones de coincidencias para cada interrupción que inserta. Si se selecciona una penalización de extensión de interrupciones mayor que cero, GAP debe, adicionalmente, obtener beneficios para cada interrupción insertada de la longitud por la penalización de extensión de interrupción. Los valores predeterminados de penalización de creación de interrupciones y de penalización de extensión de interrupciones en la versión 10 del paquete de programas de Wisconsin Genetics Software Package son 8 y 2, respectivamente. La creación de interrupciones y las penalizaciones de creación de interrupciones pueden expresarse como un entero seleccionado del grupo de enteros que consisten en 0 a 100. Asi, por ejemplo, la creación de interrupciones y las penalizaciones de creación de interrupciones pueden ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50 o mayores.

Como entenderán las personas de habilidad ordinaria en la materia, las búsquedas BLAST asumen que las proteínas pueden modelarse como secuencias aleatorias. Sin embargo, muchas proteínas reales comprenden regiones de secuencias no aleatorias, las que pueden ser tractos homopoliméricos , repeticiones de período corto, o regiones enriquecidas en uno o más aminoácidos. Tales regiones de baja complejidad pueden alinearse entre proteínas no reguladas aunque otras regiones de la proteína son completamente disímiles. Un número de programas filtro de baja-comple idad pueden emplearse para reducir esos alineamientos de baja-complejidad. Por ejemplo, los filtros SEG (Wooten y Federhen, (1993) Comput. Chem. 17:149-63) y XNU (Claverie y States, (1993) Comput. Chem. 17:191-201) de baja complejidad pueden emplearse solos o combinados.

Como se usa en la presente descripción, “identidad de secuencia” o “identidad” en el contexto de dos secuencias de ácido nucleico o polipéptidos incluyen referencia a los residuos en las dos secuencias, las que son iguales cuando están alineadas para la máxima correspondencia en una ventana de comparación especifica. Cuando el porcentaje de identidad de secuencia se usa en referencia a proteínas, se reconoce que las posiciones de los residuos que no son idénticas difieren, frecuentemente, por sustituciones de aminoácidos conservadoras, en donde los residuos de aminoácidos se sustituyen por otros residuos de aminoácidos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y, por lo tanto, no alteran las propiedades funcionales de la molécula. En donde las secuencias difieren de sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencias se puede ajustar ascendentemente para lograr la naturaleza conservadora de la sustitución. Las secuencias que difieren en sustituciones conservadoras, se dice que tiene “similitud de secuencia” o “similitud”. Los medios para hacer este ajuste son conocidos por aquellos con experiencia en la téenica.

Típicamente, esto requiere el puntaje de una sustitución conservativa como una falta de coincidencia parcial y no completa; así, se incrementa el porcentaje de identidad de secuencia. Por lo tanto, por ejemplo, en donde a un aminoácido idéntico se le da un puntaje de 1 y a una sustitución no conservadora se le da un puntaje de 0, a una sustitución conservadora se le da un puntaje entre 0 y 1. Los puntajes de las sustituciones conservadoras se calculan, por ejemplo, de acuerdo con el algoritmo de Mcyers y Miller, (1988) Computer Applic. Biol . Sci . 4:11-17, por ejemplo, como se implemento en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California, Estados Unidos).

Como se usa en la presente descripción, “porcentaje de identidad de secuencias” se refiere al valor determinado por la comparación de dos secuencias óptimamente alineadas en una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, interrupciones) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones ni deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. Para calcular el porcentaje se determina la cantidad de posiciones en las cuales se produce la base de ácido nucleico o el residuo de aminoácidos idéntico en las dos secuencias para obtener la cantidad de posiciones coincidentes, se divide la cantidad total de posiciones coincidentes por la cantidad total de posiciones en la ventana de comparación y el resultado se multiplica por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia.

El término “identidad sustancial” de secuencias de polinucleótidos se refiere a un polinucleótido que comprende una secuencia que tiene entre 50 y 100 % de identidad de secuencia, preferentemente al menos 50 % de identidad de secuencia, preferentemente al menos 60 % de identidad de secuencia, preferentemente, al menos 70 ¾, con mayor preferencia, al menos 80 %, con mayor preferencia, al menos 90 % y, con la máxima preferencia, al menos 95 %, en comparación con una secuencia de referencia mediante el uso de uno de los programas de alineamiento descritos mediante el uso de parámetros estándares. Una persona con experiencia reconocerá que esos valores pueden ajustarse adecuadamente para determinar la identidad de proteínas correspondiente codificada por dos secuencias de nucleótidos al tener en cuenta la degeneración del codón, la similitud del aminoácido, el posicionamiento del marco de lectura y similares. La identidad sustancial de la secuencia de aminoácidos para estos propósitos normalmente significa una identidad de secuencia de entre 55 y 100 %, preferentemente, al menos 55 %, preferentemente, al menos 60 %, con mayor preferencia, al menos 70 %, 80 %, 90 % y, con la máxima preferencia, al menos 95 %.

Los términos “identidad sustancial” en el contexto de un péptido indica que un péptido comprende una secuencia con entre 55 y 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de referencia, preferentemente, al menos 55 % de identidad de secuencia, preferentemente, 60 % preferentemente, 70 %, con mayor preferencia, 80 %, con la máxima preferencia, al menos 90 % o 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de referencia en una ventana de comparación especificada Preferentemente, el alineamiento óptimo se realiza con el uso del algoritmo de alineamiento por homología de Needleman y Wunsch, más arriba. Una indicación de que dos secuencias de péptidos son prácticamente idénticas es que un péptido es inmunológicamente reactivo con anticuerpos obtenidos contra el segundo péptido. Así, un péptido es prácticamente idéntico a un segundo péptido, por ejemplo, en donde los dos péptidos difieren solamente en una sustitución conservadora. Adicionalmente, un péptido puede ser prácticamente idéntico a un segundo péptido cuando difiere en un cambio no conservador si el epítopo que reconoce el anticuerpo es prácticamente idéntico. Los péptidos que son “prácticamente similares” comparten secuencias como se denotó anteriormente, excepto que las posiciones del residuo que no son idénticas pueden diferir por cambios conservadores del aminoácido.

Tabla 1 Construcción de ácidos nucleicos Los ácidos nucleicos aislados de la presente descripción pueden elaborarse con el uso de (a) métodos recombinantes estándar, (b) téenicas de síntesis o combinaciones de estos. En algunas modalidades, los polinucleótidos de la presente descripción se clonarán, amplificarán o de cualquier otra forma se construirán a partir de un hongo o una bacteria.

UTR y preferencia codónica Generalmente, se encontró que la eficiencia de la traducción se regula por medio de elementos específicos de la secuencia en la región no codificante o la región sin traducir 5' (5' UTR) del ARN. Los motivos secuenciales positivos incluyen secuencias consenso de iniciación de la transcripción (Kozak, (1987) Nucleic Acids Res.15:8125) y las estructuras 5 <G> 7 metil GpppG ARN cap (Drummond, et al . , (1985) Nucleic Acids Res. 13:7375). Los elementos negativos incluyen estructuras de tallo-lazo intramolecular 5' UTR estables (Muesing, et al . , (1988) Cell 48:691) y secuencias AUG o marcos de lectura abiertos cortos precedidos por una AUG adecuada en el 5' UTR (Kozak, más arriba, Rao, et al . , (1988) Mol . and Cell . Biol.8:284). Por lo tanto, la presente descripción proporciona regiones UTR 5' y/o 3' para modular la traducción de las secuencias codificantes heterólogas.

Además, los segmentos codificadores de polipéptidos de los polinucleótidos de la presente descripción pueden modificarse para alterar el uso de codones. El uso alterado de codones puede emplearse para alterar la eficiencia traduccional y/o para optimizar la secuencia codificante para la expresión en un huésped deseado o para optimizar el uso de codones en una secuencia heteróloga para la expresión en maíz. El uso de codones en las regiones codificantes de los polinucleótidos de la presente descripción puede analizarse estadísticamente con el uso de paquetes de programas disponibles comercialmente, tales como el de “preferencia codónica” disponible de la University of Wisconsin Genetics Computer Group. Ver, Devereaux, et al . , (1984) Nucleic Acids Res. 12:387-395) o MacVector 4.1 (Eastman Kodak Co., New Haven, CN). Por lo tanto, la presente descripción proporciona una frecuencia del uso de codones característica de la región codificante de por lo menos uno de los polinucleótidos de la presente descripción. El número de polinucleótidos (3 nucleótidos por aminoácido) que pueden usarse para determinar una frecuencia del uso de codones puede ser cualquier entero desde 3 hasta el número de polinucleótidos de la presente descripción que se proporciona en la presente descripción. Opcionalmente, los polinucleótidos serán secuencias de longitud completa. Un número ilustrativo de secuencias para el análisis estadístico puede ser al menos 1, 5, 10, 20, 50 o 100.

Barajado de secuencias La presente descripción proporciona métodos para el barajado de secuencias con el uso de polinucleótidos de la presente descripción y composiciones resultantes de estos. La permutación de secuencias se describe en publicación PCT número 1996/19256. Ver, además, Zhang, et al . , (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94:4504-9 y Zhao, et al. , (1998) Nature Biotech 16:258-61. Generalmente, la permutación de secuencias proporciona un medio para generar genotecas de polinucleótidos que tienen una característica deseada, que puede seleccionarse o ensayarse. Las genotecas de polinucleótidos recombinantes se generan a partir de una población de polinucleótidos de secuencias relacionadas, que comprenden regiones de secuencias que tienen una identidad de secuencia sustancial y pueden recombinarse homólogamente in vitro o in vivo. La población polinucleótidos de secuencias recombinadas comprende una subpoblación de polinucleótidos que poseen características deseables o ventajosas y las que pueden seleccionarse por un método de selección o ensayo adecuado. Las características pueden ser cualquier propiedad o atributo que se pueda seleccionar o detectar en un sistema de selección, y pueden incluir las propiedades de: una proteína codificada, un elemento transcripcional, una secuencia de control de la transcripción, procesamiento de ARN, estabilidad del ARN, conformación de cromatina, traducción u otra propiedad de expresión de un gen o transgen, un elemento replicador, un elemento de unión a la proteina o similares, tales como cualquier característica que confiera una propiedad seleccionable o detectable. En algunas modalidades, la característica seleccionada será una Km y/o Kcat alterada sobre la proteína silvestre como se proporciona en la presente descripción. En otras modalidades, una proteína o polinucleótido generado a partir de la permutación de secuencias tendrá una afinidad de unión del ligando mayor que el polinucleótido silvestre sin permutar. En aún otras modalidades, una proteína o polinucleótido generado a partir de la permutación de secuencias tendrá un pH óptimo alterado cuando se compara con el polinucleótido silvestre sin permutar. El incremento en esas propiedades puede ser al menos 110 %, 120 %, 130 %, 140 % o mayor que 150 % del valor silvestre.

Casetes de expresión recombinante La presente descripción proporciona, además, casetes de expresión recombinante que comprenden un ácido nucleico de la presente descripción. Una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polinucleótido deseado de la presente descripción, por ejemplo, un ADNc o una secuencia genómica que codifica un polipéptido con la longitud suficiente para codificar una proteina activa de la presente descripción, puede usarse para construir un casete de expresión recombinante que puede introducirse en la célula huésped deseada. Un casete de expresión recombinante comprende, típicamente, un polinucleótido de la presente descripción unido operativamente a secuencias reguladoras de la iniciación transcripcional que dirigen la transcripción del polinucleótido en la célula huésped deseada, tales como tejidos de una planta transformada.

Por ejemplo, los vectores de expresión de la planta pueden incluir (1) un gen de la planta clonado bajo el control transcripcional de las secuencias reguladoras 5' y 3' y (2) un marcador seleccionable dominante. Esos vectores de expresión de la planta pueden contener, además, si se desea, una región promotora reguladora (por ejemplo, una que otorgue una expresión selectiva/especifica de una célula o tejido, que sea inducible o constitutiva, regulada ambientalmente o en relación con el desarrollo), un sitio de iniciación de la transcripción, un sitio de unión con el ribosoma, una señal de procesamiento de ARN, un sitio de terminación de la transcripción y/o una señal de poliadenilación.

Puede usarse un fragmento promotor de la planta para dirigir la expresión de un polinucleótido de la presente descripción, prácticamente, en todos los tejidos de una planta regenerada. Tales promotores se mencionan en la presente descripción como promotores “constitutivos” y se encuentran activos en la mayoría de condiciones ambientales y estados de desarrollo o diferenciación celular. Los ejemplos de promotores constitutivos incluyen el promotor 1' o 2' derivado de AD -T de Agrobacterium turne faciens , el promotor Smas, el promotor de alcohol cinamílico deshidrogenasa (patente de los EE. UU. núm.5,683,439), el promotor Nos, el promotor rubisco, el promotor GRP1-8, el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), tal como se describe en Odell, et al . , (1985) Nature 313:810-2; actina de arroz (McElroy, et al . , (1990) Plant Cell 163-171); ubiquitina (Christensen, et al . , (1992) Plant Mol . Biol . 12:619-632 y Christensen, et al . , (1992) Plant Mol . Biol . 18:675-89); pEMÜ (Last, et al . , (1991) Theor.

Appl . Genet. 81:581-8); MAS (Velten, et al . , (1984) EMBO J. 3:2723-30) e histona H3 de maíz (Lepetit, et al . , (1992) Mol . Gen. Genet. 231:276-85 y Atanassvoa, et al . , (1992) Plant Journal 2(3):291-300); el promotor ALS, tal como se describe en la solicitud del PCT núm. WO 1996/30530 y otras regiones de iniciación de la transcripción de varios genes de plantas conocidos para las personas con experiencia en la materia. Para la presente descripción, la ubiquitina es el promotor preferido para la expresión en plantas monocotiledóneas.

Alternativamente, el promotor de la planta puede dirigir la expresión de un polinucleótido de la presente descripción en un tejido especifico o puede estar de cualquier otra manera bajo un control del desarrollo o medioambiental más preciso. Tales promotores pueden ser promotores “inducibles” . Las condiciones ambientales que pueden efectuar la transcripción por los promotores inducibles incluyen ataque de patógenos, condiciones anaerobias o la presencia de luz. Los ejemplos de promotores inducibles son el promotor Adhl, que es inducible por hipoxia o estrés por frío, el promotor Hsp70, que es inducible por estrés al calor y el promotor PPDK, que es inducible por la luz. Además, se conocen los promotores diurnos que son activos en momentos diferentes durante el ritmo circadiano (publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos nú . 2011/0167517, incorporada en la presente descripción como referencia).

Como ejemplos de promotores bajo control de desarrollo se incluyen aquellos que inician la transcripción solamente o, preferentemente, en ciertos tejidos tales como hojas, raíces, frutos, semillas o flores. La operación de un promotor puede variar, además, dependiendo de su lugar en el genoma. Así, un promotor inducible puede hacerse completamente o parcialmente constitutivo en ciertos lugares.

Si se desea la expresión del polipéptido, se prefiere, generalmente, incluir una región de poliadenilación en el extremo 3' de una región codificante del polinucleótido. La región de poliadenilación puede derivarse de una variedad de genes de las plantas, o de T-ADN. La secuencia del extremo 3' que se añadirá puede obtenerse, por ejemplo, de los genes de nopalina sintasa o de octopina sintasa o, alternativamente, de otro gen vegetal o, con menor preferencia, de cualquier otro gen eucariota. Los ejemplos de tales elementos reguladores incluyen, pero no se limitan a, las regiones de poliadenilación y/o terminación en 3', tales como las del gen de nopalina sintasa (nos) de Agrobacterium tumefaciens (Bevan, et al . , (1983) Nucleic Acids Res. 12:369-85); el gen inhibidor de la proteinasa de la papa II (PINII) (Keil, et al. , (1986) Nucleic Acids Res. 14:5641-50 y An, et al. , (1989) Plant Cell 1:115-22) y el gen CaMV 19S (Mogen, et al . , (1990) Plant Cell 2:1261-72).

Se puede agregar una secuencia de intrones a la región 5' no traducida o la secuencia codificante de la secuencia codificante parcial para incrementar la cantidad de mensaje maduro que se acumula en el citosol. La inclusión de un intrón divisible en la unidad de transcripción en las construcciones de expresión, tanto de plantas como de animales, demostró que aumenta la expresión génica tanto en los niveles de ARNm y proteina hasta 1000 veces (Buchman y Berg, (1988) Mol . Cell Biol . 8:4395-4405; Callis, et al . , (1987) Genes Dev. 1:1183-200). Dicho mejoramiento de intrones de expresión genética es, típicamente, mayor cuando se coloca cerca del extremo 5' de la unidad de transcripción. Se conoce en la materia el uso de intrones de maíz Adhl-S intrón 1, 2 y 6, el intrón Bronze-1. Ver, generalmente, The Maize Handbook, Capítulo 116, Freeling and Walbot, eds., Springer, New York (1994).

Las secuencias señales de la planta incluyen, pero no se limitan al, péptido señal que codifica las secuencias de ADN/ARN que dirige las proteínas a la matriz extracelular de la célula vegetal (Dratewka-Kos, et al . , (1989) J. Biol . Chem. 264:4896-900), tal como el gen de extensión de Nicotiana plumbaginí folia (DeLoose, et ai., (1991) Gene 99:95-100); los péptidos señal que orientan las proteínas a la vacuola, tal como el gen de la esporamina de boniato (Matsuka, et ai., (1991) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 88:834) y el gen de la lectina de la cebada (Wilkins, et al. , (1990) Plant Cell, 2:301-13); los péptidos señal que permiten la secreción de proteínas, tales como PRIb (Lind, et al. , (1992) Plant Mol. Biol. 18:47-53) o la alfa amilasa de cebada (BAA) (Rahmatullah, et al . , (1989) Plant Mol . Biol. 12:119 y, de este modo, incorporada como referencia) o los péptidos señal que dirigen las proteínas a los plastidios tales como el de enoil-Acp reductasa de semilla de colza (Verwaert, et al . , (1994) Plant Mol. Biol . 26:189-202) son útiles en la presente descripción.

El vector que comprende las secuencias de un polinucleótido de la presente descripción comprende, típicamente, un gen marcador, que confiere un fenotipo seleccionable en las células vegetales. Usualmente, el gen marcador seleccionable codificará para la resistencia a los antibióticos, con los genes adecuados que incluyen los genes que codifican para la resistencia al antibiótico espectinomicina (por ejemplo, el gen aada), el gen de estreptomicina fosfotransferasa (SPT) que codifica para la resistencia a la estreptomicina, el gen de neomicina fosfotransferasa (NPTII) que codifica para la resistencia a la canamicina o geneticina, el gen higromicina fosfotransferasa (HPT) que codifica para la resistencia a la higromicina, los genes que codifican para la resistencia a herbicidas que actúan para inhibir la acción de la acetolactato sintasa (ALS), particularmente los herbicidas de tipo sulfonilurea (por ejemplo, el gen de acetolactato sintasa (ALS) que contiene mutaciones que conducen a esa resistencia particularmente las mutaciones S4 y/o Hra), los genes que codifican para la resistencia a herbicidas que actúan para inhibir la acción de la glutamina sintasa, tales como fosfinotricina o basta (por ejemplo, el gen bar) , u otros genes de este tipo conocidos en la materia. El gen bar codifica para la resistencia al herbicida basta y el gen ALS codifica para la resistencia al herbicida clorsulfurón.

Los vectores típicos útiles para la expresión de genes en las plantas superiores se conocen bien en la téenica e incluyen los vectores derivados del plásmido inductor de tumores (Ti) de Agrobacterium turne faciens descrito por Rogers, et al . (1987), Meth . Enzymol . 153:253-77. Estos vectores son vectores integrantes de plantas en que en la transformación, los vectores integran una porción del vector ADN en el genoma de la planta huésped. Los vectores de A. tumefaciens ilustrativos útiles en la presente descripción son los plásmidos pKYLX6 y pKYLX7 de Schardl, et al . , (1989) Gene 61:1-11 y Berger, et al., (1987) Proc. Nati . Acad. Sci . USA, 86:8402-6. Otro vector útil en la presente descripción es el plásmido pBI101.2 disponible de CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA).

Expresión de proteínas en células huésped Con el uso de los ácidos nucleicos de la presente descripción se puede expresar una proteína de la presente descripción en una célula modificada de manera recombinante, tales como células bacterianas, de levadura, insectos, mamíferos o, preferentemente, células vegetales. Las células producen la proteína en una condición no natural (por ejemplo, en cantidad, composición, lugar y/o tiempo), debido a que se alteraron genéticamente a través de la intervención humana para hacerlo.

Se espera que las personas con experiencia en la téenica conozcan los numerosos sistemas de expresión disponibles para la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteina de la presente descripción. No se hará ningún intento para describir en detalle los diversos métodos conocidos para la expresión de proteínas en procariotas o eucariotas.

Un experto reconocería que es posible hacer modificaciones a una proteína de la presente descripción sin disminuir su actividad biológica. Algunas modificaciones pueden realizarse para facilitar la clonación, expresión o incorporación de la molécula objetivo en una proteína de fusión. Las personas con experiencia en la técnica conocen bien tales modificaciones e incluyen, por ejemplo, una metionina añadida en el terminal amino para proporcionar un sitio de iniciación o aminoácidos adicionales (por ejemplo, poliHis) situados en cada terminal para crear sitios de restricción convenientemente localizados o codones de terminación o secuencias de purificación.

Expresión en procariotas Las células procariotas pueden usarse como huéspedes para la expresión. Con mayor frecuencia, las procariotas están representadas por diversas cepas de E. coli no obstante, también pueden usarse otras cepas microbianas. Las secuencias control procariotas usadas comúnmente que se definen en la presente descripción para incluir los promotores para la iniciación de la transcripción, opcionalmente con un operador, conjuntamente con las secuencias del sitio de unión al ribosoma, incluyen esos promotores usados comúnmente como los sistemas promotores de beta lactamasa (penicilinasa) y lactosa (lac) (Chang, et al., (1977) Nature 198:1056), el sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel, et al., (1980) Nucleic Acids Res. 8:4057) y el promotor P L derivado de lambda y el sitio de unión al ribosoma del gen N (Shimatake, et al., (1981) Nature 292:128). Además, es útil la inclusión de marcadores de selección en los vectores de ADN transíectados en E. coli . Los ejemplos de tales marcadores incluyen genes de resistencia específica a la ampicilina, tetracielina o cloranfenicol.

El vector se selecciona para permitir la introducción del gen de interés en la célula huésped adecuada. Los vectores bacterianos son, típicamente, de origen plásmido o fago. Las células bacterianas adecuadas se infectan con las partículas del vector fago o transfectadas con ADN del vector fago desnudo. Si se usa un vector plásmido, las células bacterianas se transfectan con el ADN del vector plásmido. Los sistemas de expresión para expresar una proteína de la presente descripción están disponibles con el uso de Bacillus sp. y Salmonella (Palva, et al., (1983) Gene 22:229-35; Mosbach, et al . , (1983) Na ture 302:543-5). El vector plasmídico pGEX-4T-l de Pharmacia es el vector de expresión de E. coli preferido para la presente descripción .

Expresión en eucariotas Una variedad de sistemas de expresión eucariotas tales como levadura, lineas celulares de insectos, células vegetales y de mamífero, son del conocimiento de las personas con experiencia en la téenica. Como se explica brevemente a continuación, la presente descripción puede expresarse en estos sistemas eucariotas. En algunas modalidades, las células vegetales transformadas/transfectadas, como se menciona más abajo, se usan como sistemas de expresión para la producción de proteínas de la presente descripción.

La síntesis de proteínas heterólogas en levadura es muy conocida. Sherman, et al . , (1982) Methods in Yeast Genetics , Coid Spring Harbor Laboratory es un trabajo conocido que describe varios métodos disponibles para producir la proteína en levadura. Dos levaduras ampliamente usadas para la producción de proteínas eucariotas son Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris . Los vectores, cepas y protocolos de expresión en Saccharomyces y Pichia se conocen en la técnica y están disponibles de suministradores comerciales (por ejemplo, Invitrogen). Los vectores adecuados tienen, generalmente, secuencias control de expresión, tales como los promotores, que incluyen 3-fosfoglicerato quinasa o alcohol oxidasa y un origen de replicación, secuencias de terminación y similares según se desee.

Una proteina de la presente descripción, una vez expresada, puede aislarse de la levadura mediante el lisado de las células y la aplicación de téenicas estándar de aislamiento de proteínas a los lisados o microesferas. El monitoreo del proceso de purificación puede llevarse a cabo mediante el uso de técnicas de Membrana de Western o por radioinmunoensayo de otras técnicas de inmunoensayo estándar.

Los vectores adecuados para expresar las proteínas de la presente descripción en células de insectos se derivan, usualmente, del baculovirus SF9. Las líneas celulares de insectos adecuadas incluyen las líneas celulares de larvas de mosquito, gusano de seda, gusano soldado, polilla y Drosophila, tales como una línea celular Schneider (ver, por ejemplo, Schneider, (1987) J. Embryol . Esp. Morphol . 27:353-65).

Al igual que con la levadura, cuando se emplean células vegetales huésped o de animal superiores, las secuencias terminadoras de la transcripción o de poliadenilación se incorporan, típicamente, en el vector. Un ejemplo de una secuencia terminadora es la secuencia de poliadenilación del gen de la hormona del crecimiento bovino. Pueden incluirse, además, las secuencias para un empalme preciso de la transcripción. Un ejemplo de una secuencia de empalme es el intrón VP1 de SV40 (Sprague, et al . , (1983) J. Virol . 45:773-81). Además, las secuencias de genes para controlar la replicación en la célula huésped se pueden incorporar en el vector, tales como las que se encuentran en los vectores tipo virus del papiloma bovino (Saveria-Campo, “Bovine Papilloma Virus DNA a Eukaryotic Cloning Vector” en DNA Cloning : A Practical Approach, vol. II, Glover, ed., IRL Press, Arlington, VA, págs.213-38 (1985)).

Además, el gen NUE ubicado en el vector de expresión de la planta adecuado puede usarse para transformar células vegetales. El polipéptido puede aislarse después del callo de la planta o las células transformadas pueden usarse para regenerar las plantas transgénicas. Tales plantas transgénicas pueden cosecharse, y los tejidos adecuados (semilla u hojas, por ejemplo) pueden someterse a téenicas de purificación y extracción de proteina a gran escala.

¡Métodos de transformación de las plantas Se conoce una gran cantidad de métodos para introducir genes extraños en plantas y pueden usarse para insertar un polinucleótido NUE en una planta huésped, que incluyen los protocolos biológicos y físicos de transformación de la planta. Ver, por ejemplo, Miki et al . , “Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants” en Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick and Thompson, eds., CRC Press, Inc., Boca Ratón, págs.67-88 (1993). Los métodos elegidos varían en función de la planta huésped e incluyen métodos de transfección química, tales como fosfato cálcico, transferencia de genes mediada por microorganismos tales como Agrobacteríum (Horsch, et al . , (1985) Science 227:1229-31), electroporación, microinyección y bombardeo biolístico.

Los casetes de expresión y vectores y los métodos de cultivo in vitro para la transformación y regeneración de tejido o célula vegetal de plantas se conocen y se encuentran disponibles. Ver, por ejemplo, Gruber, et al . , “Vectors for Plant Transí ormation” en Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, supra, págs. 89-119.

Los polinucleótidos o polipéptidos aislados pueden introducirse en la planta por una o más téenicas típicamente usadas para la entrega directa en las células. Tales protocolos pueden variar según el tipo de organismo, célula, planta o célula vegetal, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea que se selecciona para la modificación génica. Los métodos adecuados para transformar células vegetales incluyen la transferencia directa de genes (Paszkowski et al . , (1984) EMBO J. 3:2717-2722) y la aceleración balística de partículas (ver, por ejemplo, Sanford, et al., patente de los Estados Unidos núm. 4,945,050; patente núm. WO 1991/10725 y McCabe, et al., (1988) Biotechnology 6:923-926). Ver, además, Tomes, et al., “Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells Via Microprojectile Bombardment” págs. 197-213 en Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Fundamental Methods . eds. Gamborg and Phillips. Springer-Verlag Berlín Heidelberg New York, 1995; patente de los EE. UU. núm. 5,736,369 (meristema); Weissinger, et al., (1988) Ann . Rev. Genet. 22:421-477; Sanford, et al., (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebolla); Christou, et al., (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (frijol de soja); Datta, et al., (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein, et ai., (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (maíz); Klein, et al., (1988) Biotechnology 6:559-563 (maíz); patente núm. WO 91/10725 (maíz); Klein, et al., (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (maíz); Fromm, et al., (1990) Biotechnology 8:833-839 y Gordon-Ka , et al., (1990) Plant Cell 2:603-618 (maíz); Hooydaas-Van Slogteren and Hooykaas, (1984) Nature (Londres) 311:763-764; Bytebierm, et al., (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet, et al., (1985) en The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. G.P. Chapman, et al., págs. 197-209. Longman, NY (polen); Kaeppler, y otros, (1990) Plant Cell Reporte 9:415-418 y Kaeppler, y otros, (1992) Theor. Appl.

Genet. 84:560-566 (transformación mediada por triquitas); patente de los EE. UU. núm. 5,693,512 (sonicación); D'Halluin, et ai., (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporación); Li, y otros, (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 and Christou and Ford, (1995) Annals of Botany 75:407-413 (rice); Osjoda, et ai., (1996) Nature Biotech. 14:745-750; Transformación del maíz mediada por Agrobacterium (patente de los EE. Uü. núm. 5,981,840); métodos con filamentos de carburo de silicio (Frame, et al . , (1994) Plant J. 6:941-948); métodos con láser (Guo, et al . , (1995) Physiologia Plantarum 93:19-24); métodos de sonicación (Bao, et al . , (1997) Ul trasound in Medicine & Biology 23:953-959; Finer y Finer, (2000) Lett Appl Microbiol . 30:406-10; Amoah, et al . , (2001) J Exp Bot 52:1135-42); métodos con polietilenglicol (Krens, et al . , (1982) Nature 296:72-77); los protoplastos de células onocotiledóneas y dicotiledóneas se pueden transformar mediante electroporación (From, et al . , (1985) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 82:5824-5828) y microinyección (Crossway, et al . , (1986) Mol . Gen . Genet. 202:179-185), todas las cuales se incorporan en la presente descripción como referencia.

Transformación mediada por Agrobacterium El método más ampliamente usado para introducir un vector de expresión en las plantas se basa en el sistema de transformación natural de Agrobacterium. A. tumefaciens y A. rhizogenes son bacterias del suelo patogénicas de la planta que transforman, genéticamente, las células vegetales. Los plásmidos Ti y Ri de A. tumefaciens y A. rhizogenes portan, respectivamente, los genes responsables de la transformación genética de plantas. Ver, por ejemplo, Kado, (1991) Crit . Rev. Plant Sci . 10:1. Las descripciones de los sistemas y métodos de vectores de Agrobacterium para la transferencia génica mediada por Agrobacterium se proporcionan en Gruber, et al . , más arriba; Miki, et al . , supra y Moloncy, et al . , (1989) Plant Cell Reporte 8:238.

Igualmente, el gen puede insertarse en la región de T-ADN de un plásmido Ti o Ri derivado de A. tumefaciens o A. rhizogenes , respectivamente. Asi, los casetes de expresión pueden construirse como anteriormente, mediante el uso de estos plásmidos. Se conocen muchas secuencias que al acoplarse a una secuencia codificante heteróloga y transformarse en un organismo huésped muestran fidelidad en la expresión del gen con respecto a la especificidad al tejido/órgano de su secuencia codificante original. Ver, por ejemplo, Benfey and Chua, (1989) Science 244:174-81. Las secuencias de control particularmente adecuadas para usar en estos plásmidos son promotores para la expresión constitutiva especifica de las hojas del gen en varias plantas objetivo. Otras secuencias control útiles incluyen un promotor y terminador del gen de la nopalina sintasa (NOS). El promotor y terminador NOS están presentes en el plásmido pARC2, disponible de American Type Culture Collection y designados ATCC 67238. Si se usa tal sistema, el gen de virulencia (vir) de cada plásmido Ti o Ri debe estar presente, además, conjuntamente con la porción ADN-t o a través de un sistema binario, en donde el gen vir está presente en un vector separado. Tales sistemas, los vectores para usar en ellos y los métodos para transformar células vegetales se describen en la patente de los EE. UU. núm.4,658,082; la solicitud de patente de los EE. UU. serie núm.913,914, presentada el l.° de octubre de 1986, tal como se cita en la patente de los EE. UU. núm. 5,262,306, publicada el 16 de noviembre de 1993 y Simpson, et al . , (1986) Plant Mol . Biol . 6:403-15 (incluida, además, como referencia en la patente '306), todas incorporadas como referencia en su totalidad.

Una vez que se construyen, estos plásmidos pueden colocarse en A. rhizogenes o A. tumefaciens y estos vectores se usan para transformar las células de las especies de plantas que son, normalmente, sensibles a la infección por Fusarium o Alternaría . Varias otras plantas transgénicas se contemplan, además, en la presente descripción e incluyen, sin limitarse a, soja, maíz, sorgo, alfalfa, arroz, trébol, col, banana, café, apio, tabaco, caupi, algodón, melón y pimienta. La selección de A. tumefaciens o A. rhizogenes dependerá de la planta que se transforme de esa manera. Generalmente, A. tumefaciens es el organismo preferido para la transformación. La mayoría de las plantas dicotiledóneas, algunas gimnospermas y unas cuantas plantas monocotiledóneas (por ejemplo, ciertos miembros de las Liliales y Arales) son susceptibles a la infección con A. tumefaciens. La A. rhizogenes tiene, además, un amplio intervalo de huéspedes gue abarca la mayoría de las dicotiledóneas y algunas gimnospermas que incluyen miembros de la Leguminosae, Compositae y Chenopodiaceae. Las plantas monocotiledóneas pueden transformarse ahora con algún éxito. La solicitud de patente de europea EP núm.604 662 Al describe un método para transformar monocotiledóneas mediante el uso de Agrobacterium. La solicitud de patente de europea EP núm.672 752 Al describe un método para transformar monocotiledóneas con Agrobacterium mediante el uso del escutelo de embriones inmaduros. Ishida, et al . , describen un método para transformar el maíz al exponer los embriones inmaduros a A. tumefaciens {Nature Biotechnology 14:745-50 (1996)).

Una vez transformadas, estas células pueden usarse para regenerar plantas transgénicas. Por ejemplo, las plantas completas pueden infectarse con estos vectores mediante heridas en la planta y después por la introducción del vector en el sitio de la herida. Cualquier parte de la planta puede herirse, e incluye hojas, tallos y raíces. Alternativamente, el tejido de la planta, en forma de un explanto, tales como los tejidos cotiledonares o discos de la hoja, puede inocularse con estos vectores, y cultivarse bajo condiciones que estimulen la regeneración de la planta. Las raíces o brotes transformados por inoculación del tejido de la planta con A. rhizogenes o A. tumefaciens , que contienen el gen que codifica para la enzima de degradación de fumonisina, puede usarse como una fuente de tejido de la planta para regenerar plantas transgénicas resistentes a la fumonisina, a través de la organogénesis o embriogénesis somática. Ejemplos de tales métodos para regenerar el tejido de la planta se describen en Shahin, (1985) Theor. Appl. Gene t . 69:235-40; patente de los Estados Unidos núm. 4,658,082; Simpson, et al . , supra, y las solicitudes de patente de los EE. UU. serie núm. 913,913 y 913,914, ambas presentadas el l.° de octubre de 1986, a las que se hace referencia en la patente de los EE. UU. núm. 5,262,306, publicada el 16 de noviembre de 1993, cuyas descripciones completas se incorporan en la presente descripción como referencia.

Transferencia directa de genes A pesar del hecho de que el intervalo de huéspedes para la transformación mediada por Agrobacterium es amplio, algunas especies principales de cultivo de cereal y gimnospermas se muestran, generalmente, reacias a este modo de transferencia génica, aunque recientemente se ha alcanzado algún éxito en el arroz (Hiei, et al . , (1994) The Plan Journal 6:271-82). Varios métodos de transformación de la planta, mencionados colectivamente como transferencia directa de genes, se desarrollaron como una alternativa a la transformación mediada por Agrobacterium.

Un método de transformación de la planta generalmente aplicable es la transformación mediada por microproyectiles, en donde el ADN se porta en la superficie de los microproyectiles y mide aproximadamente 1 a 4 qm. El vector de expresión se introduce en los tejidos de la planta con un dispositivo biolistico que acelera los microproyectiles a velocidades de 300 a 600 m/s que es suficiente para penetrar las paredes y membranas de la célula vegetal (Sanford, et al . , (1987) Part . Sel . Technol . 5:27; Sanford, (1988) Trends Biotech 6:299; Sanford, (1990) Physiol . Plant 79:206 and Klein, et al . , (1992) Biotechnology 10:268).

Reducción de la actividad y/o nivel de un polipéptido Se proporcionan métodos para reducir o eliminar la actividad de un polipéptido de la descripción mediante la transformación de una célula vegetal con un casete de expresión que expresa un polinucleótido que inhibe la expresión del polipéptido. El polinucleótido puede inhibir la expresión del polipéptido directamente, al evitar la transcripción o traducción del ARN mensajero, o bien indirectamente, al codificar un polipéptido que inhibe la transcripción o traducción de un gen que codifica un polipéptido. Los métodos para inhibir o eliminar la expresión de un gen en una planta son muy conocidos en la materia y cualquiera de estos métodos se puede usar en la presente descripción para inhibir la expresión de un polipéptido .

De conformidad con la presente descripción, la expresión del polipéptido se inhibe si el nivel de proteina del polipéptido es menor que 70 % del nivel de la proteina del mismo polipéptido en una planta que no se ha modificado genéticamente o mutagenizado para inhibir la expresión de ese polipéptido. En modalidades particulares de la descripción, el nivel de la proteina del polipéptido en una planta modificada de conformidad con la presente descripción es menor que 60 %, menor que 50 %, menor que 40 %, menor que 30 %, menor que 20 %, menor que 10 %, menor que 5 % o menor que 2 % del nivel de la proteina del mismo polipéptido en una planta que no es un mutante ni ha sido modificada genéticamente para inhibir la expresión de ese polipéptido. El nivel de expresión del polipéptido puede determinarse directamente, por ejemplo, mediante ensayos del nivel del polipéptido expresado en la célula vegetal o planta o, indirectamente, por ejemplo, cuando se determina la actividad de captación de nitrógeno del polipéptido en la célula vegetal o planta o cuando se determina los cambios fenotipicos en la planta. Los métodos para realizar tales ensayos se describen en otra sección de la presente invención.

En otras modalidades de la descripción, la actividad de los polipéptidos se reduce o se elimina mediante la transformación de una célula vegetal con un casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que inhibe la actividad de un polipéptido. La actividad mejorada del uso de nitrógeno de un polipéptido se inhibe de conformidad con la presente descripción si la actividad del polipéptido es menor que 70 % de la actividad del mismo polipéptido en una planta que no se ha modificado para inhibir la actividad de ese polipéptido. En modalidades particulares de la descripción, la actividad del polipéptido en una planta modificada de conformidad con la descripción es menor que 60 %, menor que 50 %, menor que 40 %, menor que 30 %, menor que 20 %, menor que 10 % o menor que 5 % de la actividad del mismo polipéptido en una planta que no se ha modificado para inhibir la expresión de ese polipéptido. La actividad de un polipéptido se “elimina” de conformidad con la descripción cuando no es detectadle por los métodos de ensayo descritos en otra sección de la presente descripción. Los métodos para determinar la alteración de la actividad de utilización del nitrógeno de un polipéptido se describen en otra sección de la presente descripción.

En otras modalidades, la actividad de un polipéptido se puede reducir o eliminar mediante la alteración del gen que codifica el polipéptido. La descripción abarca plantas mutagenizadas que portan mutaciones en los genes, en donde las mutaciones reducen la expresión del gen o inhiben la actividad de utilización del nitrógeno del polipéptido codificado.

Por lo tanto, para reducir o eliminar la actividad de un polipéptido se puede usar diversos métodos. Adicionalmente, se puede usar más de un método para reducir la actividad de un solo polipéptido. 1._ Métodos a base de polinucleótidos: En algunas modalidades de la presente descripción, una planta se transforma con un casete de expresión con la capacidad de expresar un polinucleótido que inhibe la expresión de un polipéptido de la descripción. El término “expresión”, como se usa en la presente descripción, se refiere a la biosintesis de un producto génico, que incluye la transcripción y/o traducción de dicho producto génico. Por ejemplo, para los propósitos de la presente invención, un casete de expresión capaz de expresar un polinucleótido que inhibe la expresión de al menos un polipéptido es un casete de expresión capaz de producir una molécula de ARN que inhibe la transcripción y/o traducción de al menos un polipéptido de la invención. La “expresión” o “producción” de .una proteina o polipéptido a partir de una molécula de ADN se refiere a la transcripción y traducción de la secuencia codificante para producir la proteina o polipéptido, mientras que la “expresión” o “producción” de una proteina o polipéptido a partir de una molécula de ARN se refiere a la traducción de la secuencia codificante de ARN para producir la proteina o polipéptido.

Los ejemplos de polinucleótidos que inhiben la expresión de un polipéptido se presentan más abajo. i._ Supresión codificante/cosupresión En algunas modalidades de la descripción, la inhibición de la expresión de un polipéptido se puede lograr con la supresión codificante o cosupresión. Para la cosupresión, se diseña un casete de expresión que expresa una molécula de ARN correspondiente a la totalidad o parte de un ARN mensajero que codifica un polipéptido en la orientación “codificante”. La sobre expresión de la molécula de ARN puede resultar en una expresión reducida del gen natural. Por lo tanto, se evalúa múltiples lineas de plantas transformadas con el casete de expresión de cosupresión para identificar aquellas que muestran el grado deseado de inhibición de la expresión del polipéptido.

El polinucleótido usado para la cosupresión puede corresponder a la totalidad o parte de la secuencia que codifica el polipéptido, la totalidad o parte de la región 5' y/o 3' no traducida de una transcripción del polipéptido o la totalidad o parte tanto de la secuencia codificante como de las regiones·no traducidas de una transcripción que codifica un polipéptido. En algunas modalidades, en donde el polinucleótido comprende la totalidad o parte de la región codificante para el polipéptido, el casete de expresión se diseña para eliminar el codón de inicio del polinucleótido de manera que ningún producto de proteina se traduzca.

La cosupresión pueden usarse para inhibir la expresión de los genes de las plantas para producir plantas que tienen niveles indetectables de proteina para las proteínas codificadas por estos genes. Ver, por ejemplo, Broin, et al., (2002) Plant Cell 14:1417-1432. La cosupresión puede usarse, además, para inhibir la expresión de múltiples proteínas en la misma planta. Ver, por ejemplo, la patente de los EE. UU. núm. 5,942,657. Los métodos para usar la cosupresión para inhibir la expresión de genes endógenos en las plantas se describen en Flavell, et al. , (1994) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 91:3490-3496; Jorgensen, et al., (1996) Plant Mol . Biol . 31:957-973; Johansen and Carrington, (2001) Plant Physiol . 126:930-938; Broin, et al., (2002) Plant Cell 14:1417-1432; Stoutjesdijk, et al., (2002) Plant Physiol . 129:1723-1731; Yu, et al . , (2003) Phytochemistry 63:753-763 y las patentes de los Estados Unidos núm. 5,034,323, 5,283,184 y 5,942,657, cada una de las cuales se incorpora en la presente descripción como referencia. La eficacia de la cosupresión puede aumentarse al incluir una región poli-dT en el casete de expresión en una posición 3' a la secuencia codificante y 5' de la señal de poliadenilación. Ver, la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2002/0048814, incorporada en la presente descripción como referencia. Típicamente, tal secuencia de nucleótidos tiene la similitud sustancial de secuencias para la secuencia de la transcripción del gen endógeno, óptimamente, mayor que aproximadamente 65 % de identidad de secuencias, de manera más óptima, mayor que aproximadamente 85 % de identidad de secuencias y, más óptimamente, mayor que aproximadamente 95 % de identidad de secuencias. Ver las patentes de los EE. UU. núm. 5,283,184 y 5,034,323, incorporadas en la presente descripción como referencia. ii. Supresión no codificante En algunas modalidades de la descripción, la inhibición de la expresión del polipéptido se puede obtener por supresión no codificante. Para la supresión no codificante, el casete de expresión se diseña para expresar una molécula de ARN complementario a la totalidad o parte de un ARN mensajero que codifica el polipéptido. La sobreexpresión de la molécula de ARN no codificante puede producir una expresión reducida del gen objetivo. Por lo tanto, se evalúa múltiples lineas de plantas transformadas con el casete de expresión de supresión anticodificante para identificar aquellas que muestran el grado deseado de inhibición de la expresión del polipéptido.

El polinucleótido para usar en la supresión no codificante puede corresponder a la totalidad o parte del complemento de la secuencia que codifica el polipéptido, la totalidad o parte del complemento de la región 5' y/o 3' no traducida de la transcripción objetivo o la totalidad o parte del complemento tanto de la secuencia codificante como de las regiones no traducidas de una transcripción que codifica el polipéptido. Adicionalmente, el polinucleótido no codificante puede ser completamente complementario (es decir, 100 % idéntico al complemento de la secuencia diana) o parcialmente complementario (es decir, menos de 100 % de identidad con el complemento de la secuencia diana) a la secuencia diana. La supresión no codificante se puede usar para inhibir la expresión de múltiples proteínas en la misma planta. Ver, por ejemplo, la patente de los EE. UU. núm. 5,942,657. Además, se puede usar porciones de los nucleótidos no codificantes para alterar la expresión del gen objetivo. Generalmente, se puede usar secuencias de por lo menos 50 nucleótidos, 100 nucleótidos, 200 nucleótidos, 300, 400, 450, 500, 550 o más.

Los métodos para usar la supresión no codificante para inhibir la expresión de genes endógenos en las plantas se describen, por ejemplo, en Liu, et al . , (2002) Plant Physiol . 129:1732-1743 y patente de los Estados Unidos núm. 5,759,829 y 5,942,657, que se incorporan en la presente descripción como referencia. La eficacia de la supresión no codificante puede aumentarse al incluir una región poli-dT en el casete de expresión en una posición 3' a la secuencia no codificante y 5' de la señal de poliadenilación. Ver, la publicación de la solicitud de patente de los EE. UU. núm. 2002/0048814, incorporada en la presente descripción como referencia. iii. Interferencia por ARN bicatenario En algunas modalidades de la descripción, la inhibición de la expresión de un polipéptido se puede obtener mediante interferencia por ARN bicatenario (ARNbc). Para la interferencia de ARNbc, una molécula de ARN sentido como la descrita anteriormente para la cosupresión y una molécula de ARN no codificante que es completa o parcialmente complementaria a la molécula de ARN sentido se expresan en la misma célula, lo que resulta en la inhibición de la expresión del ARN mensajero endógeno correspondiente.

La expresión de moléculas codificantes y no codificantes puede llevarse a cabo mediante el diseño del casete de expresión para comprender la secuencia codificante y una secuencia no codificante. Alternativamente, pueden usarse casetes de expresión separados para las secuencias codificantes y no codificantes. Después, se evalúa múltiples lineas de plantas transformadas con el casete o casetes de expresión de interferencia por ARNbc para identificar las lineas de plantas que muestran el grado deseado de inhibición de la expresión del polipéptido. Los métodos para usar la interferencia por ARNbc para inhibir la expresión de genes endógenos de las plantas se describen en Waterhouse, et al . , (1998) Proc. Nati . Acad. Sel . USA, 95:13959-13964, Liu, et . al . , (2002) Plant Physiol . 129:1732-1743 y patentes núm. WO 1999/49029, WO 1999/53050, WO 1999/61631 y WO 2000/49035, cada una de las cuales se incorpora en la presente descripción como referencia. iv. Interferencia por ARN en horquilla e interferencia por ARN en horquilla con intrones En algunas modalidades de la descripción, la inhibición de la expresión de un polipéptido se puede obtener mediante interferencia por ARN en horquilla (ARNhp) o interferencia por ARN en horquilla con intrones (ARNhpi). Estos métodos son muy eficientes para inhibir la expresión de los genes endógenos. Ver, Waterhouse and Helliwell, (2003) Wat. Rev. Genet . 4:29-38 y las referencias mencionadas en la presente descripción.

Para la interferencia ARNhp, el casete de expresión se designa para expresar una molécula de ARN que híbrida consigo misma para formar una estructura de horquilla que comprende una región lazo de cadena simple y un tallo de base pareada. La región de tallo de base pareada comprende una secuencia sentido que corresponde a todo o parte del ARN mensajero endógeno que codifica el gen cuya expresión se inhibe, y una secuencia antisentido que es completa o parcialmente complementaria a la secuencia sentido. Alternativamente, la región del tallo de base pareada puede corresponder a una porción de una secuencia de un promotor que controla la expresión del gen cuya expresión va a inhibirse. Por lo tanto, la región del tallo de base pareada de la molécula determina, generalmente, la especificidad de la interferencia por ARN. Las moléculas de ARNhp son altamente eficientes para inhibir la expresión de los genes endógenos y la interferencia por ARN que inducen se hereda por generaciones posteriores de las plantas. Ver, por ejemplo, Chuang y Mcyerowitz, (2000) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 97:4985-4990; Stoutjesdijk, et al . , (2002) Plant Physiol . 129:1723-1731 y Waterhouse and Helliwell, (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38. Los métodos para usar la interferencia del ARNhp para inhibir o silenciar la expresión de genes se describen, por ejemplo, en Chuang and Meyerowitz, (2000) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 97:4985-4990; Stoutjesdijk, et al . , (2002) Plant Physiol . 129:1723-1731; Waterhouse and Helliwell, (2003) Nat. Rev.

Genet.4:29-38; Pandolfini et al . , BMC Biotechnology 3:7 y la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2003/0175965, cada una de las cuales se incorpora en la presente descripción como referencia. Un ensayo transitorio para la eficacia de las construcciones de ARNhp para silenciar la expresión del gen in vivo se describió por Panstruga, et al . , (2003) Mol . Biol . Rep. 30:135-140, incorporada en la presente descripción como referencia.

Para el ARNhpi, las moléculas interferentes tienen la misma estructura general que para el ARNhp, pero la molécula de ARN comprende, adicionalmente, un intrón capaz de dividirse en la célula en la cual se expresa el ARNhpi. El uso de un intrón minimiza el tamaño del lazo en la molécula de ARN horquilla después de la división, y esto aumenta la eficacia de la interferencia. Ver, por ejemplo, Smith, et al . , (2000) Nature 407:319-320. De hecho, Smith, et al . , muestran 100 % supresión de la expresión del gen endógeno mediante el uso de la interferencia mediada por ARNhpi. Los métodos para usar la interferencia de ARNhpi para inhibir la expresión de los genes endógenos de las plantas se describen, por ejemplo, en Smith, et al. , (2000) Nature 407:319-320; Weslcy, et al . , (2001) Plant J. 27:581-590; Wang and Waterhouse, (2001) Curr. Opin. Plant Biol . 5:146-150; Waterhouse and Helliwell, (2003) Na t . Rev. Genet. 4:29-38; Helliwell y Waterhouse, (2003) Methods 30:289-295 y la publicación de la solicitud de patente de los EE. UU. núm. 2003/0180945, cada una de las cuales se incorpora en la presente descripción como referencia.

El casete de expresión para la interferencia del ARNhp puede diseñarse, además, para que la secuencia codificante y la secuencia no codificante no correspondan a un ARN endógeno. En esta modalidad, la secuencia codificante y no codificante flanquean una secuencia lazo que comprende una secuencia de nucleótidos que corresponde a todo o parte del ARN mensajero endógeno del gen objetivo. Asi, la región lazo es la que determina la especificidad de la interferencia del ARN. Ver, por ejemplo, la patente núm. WO 2002/00904; Mette, et al., (2000) EMBO J 19:5194-5201; Matzke, et al., (2001) Curr. Opin . Genet . Devel . 11:221-227; Scheid, et al . , (2002) Proc. Nati . Acad. Sci . , USA 99:13659-13662; Aufsaftz, et al., (2002) Proc. Nat 'l . Acad. Sci . 99 (4):16499-16506; Sijen, et al . , Curr. Biol . (2001) 11:436-440), incorporada en la presente descripción como referencia. v._ Interferencia mediada por amplicones Los casetes de expresión del amplicón comprenden una secuencia derivada de virus de plantas que contiene todo o parte del gen objetivo pero generalmente no todos los genes del virus natural. Las secuencias virales presentes en el producto de transcripción del casete de expresión permite que el producto de transcripción dirija su propia replicación. Las transcripciones producidas por el amplicón pueden ser codificantes o no codificantes con relación a la secuencia objetivo (es decir, el ARN mensajero para el polipéptido). Los métodos de uso de amplicones para inhibir la expresión de los genes endógenos de las plantas se describen, por ejemplo, en Angelí and Baulcombe, (1997) EMBO J. 16:3675-3684, Angelí and Baulcombe, (1999) Plan t J. 20:357-362 y la patente de los Estados Unidos núm. 6,646,805, cada una de las cuales se incorpora en la presente descripción como referencia. vi. Ribozimas En algunas modalidades, el polinucleótido expresado por el casete de expresión de la descripción es ARN catalítico o tiene actividad ribozima específica para el ARN mensajero del polipéptido. Por lo tanto, el polinucleótido causa la degradación del ARN mensajero endógeno, y produce una expresión reducida del polipéptido. Este método se describe, por ejemplo, en la patente de los EE. UU. núm. 4,987,071, incorporada en la presente descripción como referencia. vii. ARN pequeño de interferencia o micro ARN En algunas modalidades de la descripción, la inhibición de la expresión de un polipéptido se puede obtener por interferencia del ARN por expresión de un gen que codifica un micro ARN (ARNmi). Los ARNmi son agentes reguladores que consisten en aproximadamente 22 ribonucleótidos . Los ARNmi son altamente eficientes para inhibir la expresión de genes endógenos. Ver, por ejemplo, Javier, et al . , (2003) Nature 425:257-263, incorporada en la presente descripción como referencia.

Para la interferencia del ARNmi, el casete de expresión se diseña para expresar una molécula de ARN que se modela en un gen ARNmi endógeno. Por ejemplo, el gen ARNmi codifica un ARN que forma una estructura de horquilla que contiene una secuencia de 22 nucleótidos que es complementaria con otro gen endógeno (secuencia objetivo). Para la supresión de la expresión de NUE, la secuencia de 22 nucleótidos se selecciona de una secuencia de transcripción de NUE y contiene 22 nucleótidos de esa secuencia de NUE en una orientación codificante y nucleótidos de una secuencia anticodificante correspondiente complementaria a la secuencia codificante. Un gen de la fertilidad, ya sea endógeno o exógeno, puede ser un ARNmi objetivo. Las moléculas de ARNmi son altamente eficientes para inhibir la expresión de genes endógenos y la interferencia por ARN que inducen se hereda por generaciones de plantas posteriores. 2. Inhibición a base de polipeptidos de expresión génica En una modalidad, el polinucleótido codifica una proteina con dedos de zinc que se une a un gen que codifica un polipéptido, lo que resulta en la expresión reducida del gen. En modalidades particulares, la proteína con dedos de zinc se une a una región reguladora de un gen NUE. En otras modalidades, la proteína con dedos de zinc se une a un ARN mensajero que codifica un polipéptido y evita su traducción. Los métodos para seleccionar sitios para el mareaje por las proteínas de dedo de cinc se describieron, por ejemplo, en la patente de los EE. UU. núm.6,453,242, y los métodos para usar las proteínas de dedo de cinc para inhibir la expresión de los genes en las plantas se describen, por ejemplo, en la publicación de la solicitud de patente de los EE. UU. núm. 2003/0037355, cada una de las cuales se incorpora en la presente descripción como referencia. 3_._ Inhibición a base de polipéptidos de la actividad proteica En algunas modalidades de la descripción, el polinucleótido codifica un anticuerpo que se une, por lo menos, a un polipéptido y reduce la actividad mejorada de utilización de nitrógeno del polipéptido. En otra modalidad, la unión del anticuerpo genera un aumento del movimiento del complejo anticuerpo-NUE por mecanismos celulares de control de calidad. La expresión de los anticuerpos en células vegetales y la inhibición de las rutas moleculares por la expresión y unión de los anticuerpos a las proteínas en las células vegetales se conocen bien en la téenica. Ver, por ejemplo, Conrad and Sonnewald, (2003) Nature Biotech. 21:35-36, incorporado en la presente descripción como referencia. 4._ Interrupción genética En algunas modalidades de la presente descripción, la actividad de un polipéptido se reduce o elimina mediante la alteración del gen que codifica el polipéptido. El gen que codifica el polipéptido se puede alterar mediante cualquier método conocido en la materia. Por ejemplo, en una modalidad, el gen se interrumpe por etiquetado del transposón. En otra modalidad, el gen se perturba por la mutagénesis de las plantas mediante el uso de mutagénesis aleatoria o dirigida y la selección de las plantas que tienen una actividad de uso de nitrógeno reducida. i_._ Etiquetado de transposones En una modalidad de la descripción, el etiquetado de transposones se usa para reducir o eliminar la actividad de uno o más polipéptidos. El etiquetado de transposones comprende insertar un transposón en un gen endógeno NUE para reducir o eliminar la expresión del polipéptido. Por “gen NUE” se entiende el gen que codifica un polipéptido de acuerdo con la descripción.

En esta modalidad, la expresión de uno o más polipéptidos se reduce o elimina mediante la inserción de un transposón dentro de una región reguladora o región codificante del gen que codifica el polipéptido. Un transposón que está dentro de un exón, intrón, secuencia no traducida 5' o 3', un promotor o cualquier otra secuencia reguladora de un gen NUE se puede usar para reducir o eliminar la expresión y/o actividad del polipéptido codificado.

Los métodos para el etiquetado del transposón de genes específicos en plantas se conoce bien en la téenica. Ver, por ejemplo, Maes, et al., (1999) Trends Plant Sci . 4:90-96; Dharmapuri y Sonti, (1999) FEMS Microbiol . Lett. 179:53-59; Meissner, et al., (2000) Plant J. 22:265-274; Phogat, et al., (2000) J. Biosci . 25:57-63; Walbot, (2000) Curr. Opin . Plant Biol . 2:103-107; Gai, et al., (2000) Nucleic Acids Res . 28:94-96; Fitzmaurice, et al . , (1999) Genetícs 153:1919-1928). Además, el proceso TUSC para seleccionar las inserciones Mu en genes seleccionados ha sido descrito en Bensen, et al., (1995) célula de una planta 7:75-84; Mena, et al . , (1996) Science 274:1537-1540 y la patente de los EE. UU. nú . 5,962,764, cada una de las cuales se incorpora en la presente descripción como referencia . ii. Plantas mutantes con actividad reducida Los métodos adicionales para disminuir o eliminar la expresión de genes endógenos en plantas se conocen, además, en la materia y pueden aplicarse igualmente a la presente descripción. Estos métodos incluyen otras formas de mutagénesis, tales como mutagénesis inducida por etil etanosulfonato, mutagénesis de deleción y mutagénesis por deleción de neutrones rápidos que se usan en un sentido genético inverso (con PCR) para identificar lineas de plantas en las cuales el gen endógeno se eliminó. Para conocer ejemplos de estos métodos, ver Ohshima, et al . , (1998) Virology 243:472-481; Okubara, et al . , (2000) Genetics 137:867-874 y Quesada, et al . , (1994) Genetics 154:421-436, cada una de los cuales se incorpora en la presente descripción como referencia. Adicionalmente, en la presente descripción puede aplicarse un método rápido y automatizadle para analizar las mutaciones inducidas químicamente, el método TILLING (detección de lesiones locales inducidas en genomas), con el uso de HPLC desnaturalizante o digestión selectiva de endonucleasa de productos de PCR seleccionados. Ver, McCallum, et al . , (2000) Wat. Biotechnol . 18:455-457, incorporada en la presente descripción como referencia.

Las mutaciones que tienen un impacto en la expresión génica o que interfieren con la función (mejor actividad de utilización de nitrógeno) de la proteina codificada se conocen bien en la materia. Las mutaciones insercionales en los exones del gen resultan generalmente en mutantes nulos. Las mutaciones en los residuos conservados son particularmente efectivas para inhibir la actividad de la proteina codificada. Se han descrito los residuos conservados de los polipéptidos de la planta adecuados para la mutagénesis con el objetivo de eliminar la actividad. Tales mutantes pueden aislarse de acuerdo con procedimientos bien conocidos y las mutaciones en los loci NUE diferentes pueden combinarse por cruzamiento genético. Ver, por ejemplo, Gruís, et al . , (2002) Plant Cell 14:2863-2882.

En otra modalidad de la presente invención, es posible usar mutantes dominantes para desencadenar el silenciamiento del ARN debido a la inversión y recombinación de genes de un locus del gen duplicado. Ver, por ejemplo, Kusaba, et al., (2003) Plan t Cell 15:1455-1467.

La presente descripción abarca métodos adicionales para reducir o eliminar la actividad de uno o más polipéptidos. Los ejemplos de otros métodos para alterar o mutar una secuencia genómica de nucleótidos en una planta se conocen en la téenica e incluyen, pero no se limitan a, el uso de vectores ARN:ADN, vectores de mutación ARN:ADN, vectores reparadores ARN:ADN, oligonucleótidos bicatenarios mezclados, oligonucleótidos de AR zADN auto-complementarios y oligonucleobases recombinógenas. Esos vectores y los métodos de uso se conocen en la téenica. Ver, por ejemplo, las patentes de los EE. UU. núms.5,565,350; 5,731,181; 5,756,325; 5,760,012; 5,795,972 y 5,871,984, cada una de las cuales se incorpora en la presente descripción como referencia. Ver, además, las patentes núm. WO 1998/49350, WO 1999/07865, WO 1999/25821 y Beetham, et al., (1999) Proc. Nati . Acad. Sci. USA, 96:8774-8778, cada una de las cuales se incorpora en la presente descripción como referencia. iii. Modulación de la actividad de uso del nitrógeno En métodos específicos, el nivel y/o la actividad de un regulador NUE en una planta se reduce mediante el aumento del nivel o la actividad del polipéptido en la planta. La expresión incrementada de una molécula reguladora negativa puede reducir el nivel de expresión de uno o más genes corriente abajo responsables por un fenotipo NUE mejorado.

Los métodos para incrementar el nivel y/o actividad de los polipéptidos en una planta se describen en otra sección de la presente descripción. En resumen, tales métodos comprenden proporcionar un polipéptido de la descripción a una planta y, de esa manera, aumentar el nivel y/o la actividad del polipéptido. En otras modalidades se puede proporcionar una secuencia de nucleótidos NUE que codifica un polipéptido por medio de la introducción en la planta de un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos NUE de la descripción, la expresión de la secuencia NUE, el incremento de la actividad del polipéptido y, de esta manera, la reducción del número de células del tejido en la planta o parte de la planta. En otras modalidades, la construcción de nucleótidos NUE introducida en la planta se incorpora de manera estable en el genoma de la planta.

En otros métodos, el crecimiento de tejido de una planta se incrementa mediante la reducción del nivel y/o actividad del polipéptido en la planta. Tales métodos se describen detalladamente en otra sección de la presente descripción. En un método de estas características se introduce una secuencia de nucleótidos NUE en la planta y la expresión de esa secuencia de nucleótidos NUE reduce la actividad del polipéptido y, de esta manera, aumenta el crecimiento del tejido en la planta o parte de esta. En otras modalidades, la construcción de nucleótidos NUE introducida en la planta se incorpora de manera estable en el genoma de la planta.

Como se mencionó anteriormente, una persona con experiencia en la materia reconocerá el promotor adecuado para modular el nivel/actividad de una NUE en la planta. Los promotores ilustrativos para esta modalidad se describen en otra sección de la presente descripción.

En otras modalidades, tales plantas tienen incorporada de manera estable en su genoma una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos NUE de la descripción unidos operativamente a un promotor que dirige la expresión en la célula vegetal. iv. Modulación del desarrollo radicular Se proporciona los métodos para modular el desarrollo radicular en una planta. “Modulación del desarrollo radicular” se refiere a cualquier alteración en el desarrollo de la raíz de la planta en comparación con una planta control. Esas alteraciones en el desarrollo radicular incluyen, pero no se limitan a, alteraciones en el indice de crecimiento de la raíz primaria, el peso de la raíz fresca, la extensión de la formación lateral y espontánea de la raíz, el sistema de vasculatura, el desarrollo del meristemo o la expansión radial.

Se proporciona los métodos para modular el desarrollo radicular en una planta. Los métodos comprenden modular el nivel y/o actividad del polipéptido en la planta. En un método, se proporciona a la planta una secuencia NUE de la descripción. En otro método, la secuencia de nucleótidos NUE se proporciona mediante la introducción en la planta de un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos NUE de la descripción, la expresión de la secuencia NUE y , de ese modo, la modificación del desarrollo radicular. En otros métodos, la construcción de nucleótidos NUE introducida en la planta se incorpora de manera estable en el genoma de la planta.

En otros métodos, el desarrollo radicular se modula mediante la alteración del nivel o actividad del polipéptido en la planta. Un cambio en la actividad puede producir por lo menos una o más de las siguientes alteraciones en el desarrollo radicular que incluyen, pero no se limitan a, alteraciones en la biomasa y longitud de la raíz.

Como se usa en la presente descripción, “crecimiento de la raíz” abarca todos los aspectos del crecimiento de las diferentes partes que conforman el sistema radicular en diferentes etapas de su desarrollo en las plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas. Se entenderá que el crecimiento mejorado de la raíz puede derivarse del aumento del crecimiento de una o más de sus partes que incluyen la raíz primaria, las raíces laterales, las raíces espontáneas, etc.

Los métodos de medir esas alteraciones en el desarrollo del sistema radicular se conocen en la téenica. Ver, por ejemplo, la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm.2003/0074698 y Werner, et al . , (2001) PNAS 18:10487-10492, que se incorporan en la presente descripción como referencia.

Como se mencionó anteriormente, un experto reconocerá el promotor adecuado para usar para modular el desarrollo radicular en la planta. Los promotores ilustrativos para esta modalidad incluyen los promotores constitutivos y los promotores preferidos de raíz. Los promotores ilustrativos preferidos de raíz se describen en otras partes en la presente descripción.

La estimulación del crecimiento radicular y el incremento de la masa radicular mediante la disminución de la actividad y/o el nivel del polipéptido es útil, además, para mejorar el crecimiento erguido de una planta. El término “resistencia al encamado” o “crecimiento erguido” se refiere a la capacidad de una planta para fijarse por sí misma al suelo. Para las plantas con un patrón de crecimiento erecto o semierecto, este término se refiere, además, a la capacidad para mantener una posición derecha en condiciones (medio ambientales) adversas. Este rasgo se relaciona con el tamaño, profundidad y morfología del sistema radicular. Adicionalmente, la estimulación del crecimiento radicular y el incremento de la masa radicular mediante la alteración del nivel y/o la actividad del polipéptido es útil, además, para estimular la propagación de explantos in vitro.

Además, la producción superior biomasa de la raíz debido a la actividad tiene un efecto directo en el rendimiento y un efecto indirecto en la producción de compuestos producidos por células de la raíz o células transgénicas de la raíz o cultivos de células de dichas células transgénicas de la raíz. Un ejemplo de un compuesto interesante producido en cultivos celulares es shikonin, cuya producción se puede mejorar favorablemente mediante tales métodos.

Por lo tanto, la presente descripción proporciona, además, plantas con un desarrollo radicular modulado en comparación con el desarrollo radicular de una planta control. En algunas modalidades, la planta de la descripción tiene un nivel/actividad mayor del polipéptido de la descripción y un mayor crecimiento radicular y/o biomasa radicular. En otras modalidades, tales plantas tienen incorporada de manera estable en su genoma una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos NUE de la descripción unida operativamente a un promotor que dirige la expresión en la célula vegetal. v_._ Modulación del desarrollo de brotes y hojas Se proporciona, además, métodos para modular el desarrollo de brotes y hojas en una planta. Por “modular el desarrollo de brotes y/u hojas” se entiende cualquier alteración en el desarrollo de brotes y/u hojas de la planta. Esas alteraciones en desarrollo del brote y/o la hoja incluyen, pero no se limitan a, alteraciones en el desarrollo del meristema del brote, en el número de hojas, tamaño de la hoja, vasculatura del tallo y la hoja, longitud del internodo y senescencia de la hoja. Como se usa en la presente descripción, “desarrollo de la hoja” y “desarrollo del brote” abarca todos los aspectos del crecimiento de las diferentes partes que conforman el sistema de las hojas y el sistema de los brotes, respectivamente, en diferentes etapas de su desarrollo, en plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los métodos para medir esas alteraciones del desarrollo en el sistema de hojas y brotes se conocen en la téenica. Ver, por ejemplo, Werner, et al . , (2001) PNAS 98:10487-10492 y la publicación de la solicitud de patente de los EE. UU. núm. 2003/0074698, cada una de las cuales se incorpora en la presente descripción como referencia.

El método para modular el desarrollo de brotes y/u hojas en una planta comprende modular la actividad y/o el nivel de un polipéptido de la descripción. En una modalidad, se proporciona una secuencia NUE de la descripción. En otras modalidades, la secuencia de nucleótidos NUE se puede proporcionar mediante la introducción en la planta de un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos NUE de la descripción, la expresión de la secuencia NUE y, de esta manera, la modificación del desarrollo de brotes y/u « hojas. En otras modalidades, la construcción de nucleótidos NUE introducida en la planta se incorpora de manera estable en el genoma de la planta.

En modalidades especificas, el desarrollo de brotes u hojas se modula mediante la alteración del nivel y/o actividad del polipéptido en la planta. Un cambio en la actividad puede producir por lo menos una o más de las siguientes alteraciones en el desarrollo de brotes y/u hojas que incluyen, pero no se limitan a, cambios en el número de hojas, superficie de la hoja alterada, vasculatura alterada, internodos y crecimiento de la planta y alteraciones en la senescencia foliar, en comparación con una planta control.

Como se describió anteriormente, una persona experimentada reconocerá el promotor adecuado para usar para modular el desarrollo de brotes y hojas de la planta. Los promotores ilustrativos para esta modalidad incluyen promotores constitutivos, promotores preferidos de raíz, promotores preferidos del meristema de la raíz y promotores preferidos de las hojas. Los promotores ilustrativos se describen en otras partes en la presente descripción.

El aumento de la actividad y/o el nivel en una planta resulta en internodos y crecimiento alterados. Por lo tanto, los métodos de la descripción son útiles para producir plantas modificadas. Adicionalmente, como se mencionó anteriormente, la actividad en la planta modula el crecimiento de la raíz y de los brotes. Por lo tanto, la presente descripción proporciona, además, métodos para alterar la relación raiz/brotes. El desarrollo de los brotes o de las hojas puede modularse, además, mediante la alteración del nivel y/o actividad del polipéptido en la planta.

Por lo tanto, la presente descripción proporciona, además, plantas con un desarrollo modulado de brotes y/u hojas en comparación con una planta control. En algunas modalidades, la planta de la descripción tiene un nivel/actividad mayor del polipéptido de la descripción. En otras modalidades, la planta de la descripción tiene un nivel/actividad aumentada del polipéptido de la descripción. vi. Modulación del desarrollo de tejidos reproductivos Se proporciona métodos para modular desarrollo de tejidos reproductivos. En una modalidad se proporcionan métodos para modular el desarrollo floral en una planta. “Modular el desarrollo floral” hace referencia a cualquier alteración en la estructura del tejido reproductivo de una planta en comparación con una planta control, en donde la actividad o el nivel del polipéptido no se ha modulado. “Modular el desarrollo floral” incluye, además, cualquier alteración en el tiempo de desarrollo de un tejido reproductivo de la planta (es decir, un tiempo retardado o acelerado del desarrollo floral) cuando se compara con una planta de control en la que la actividad o nivel del polipéptido no se moduló. Las alteraciones macroscópicas pueden incluir cambios en tamaño, forma, número o lugar de los órganos reproductivos, el periodo de tiempo de desarrollo en que se forman estas estructuras o la capacidad para mantener o proceder a través del proceso de floración en momentos de estrés ambiental. Las alteraciones microscópicas pueden incluir cambios en los tipos o formas de las células que conforman los órganos reproductivos.

El método para modular el desarrollo floral en una planta comprende modular la actividad en una planta. En un método, se proporciona una secuencia NUE de la descripción. Una secuencia de nucleótidos NUE se puede proporcionar mediante la introducción en la planta de un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos NUE de la descripción, la expresión de la secuencia y, de esta manera, la modificación del desarrollo floral. En otras modalidades, la construcción de nucleótidos NUE introducida en la planta se incorpora de manera estable en el genoma de la planta.

En métodos específicos, el desarrollo floral se modula mediante el incremento del nivel o actividad del polipéptido en la planta. Un cambio en la actividad puede producir por lo menos una o más de las siguientes alteraciones en el desarrollo floral, que incluyen pero no se limitan a, floración alterada, número de flores alterado, esterilidad masculina modificada y grupo de semillas alterado, en comparación con una planta control. La inducción de la floración retardada o la inhibición de la floración se puede usar para mejorar la producción en los cultivos de forraje, tales como alfalfa. Los métodos para determinar tales alteraciones de desarrollo en el desarrollo floral son muy conocidos en la téenica. Ver, por ejemplo, Mouradov, et al . , (2002) The Plant Cell S111-S130, que se incorpora en la presente descripción como referencia.

Como se mencionó anteriormente, un experto reconocerá el promotor adecuado para usar para modular el desarrollo floral de la planta. Los promotores ilustrativos para esta modalidad incluyen promotores constitutivos, promotores inducibles, promotores específicos de los brotes y promotores específicos de la inflorescencia.

En otros métodos, el desarrollo floral se modula mediante la alteración del nivel y/o actividad de la secuencia NUE de la descripción. Tales métodos pueden comprender introducir una secuencia de nucleótidos NUE en la planta y modificar la actividad del polipéptido. En otros métodos, la construcción de nucleótidos NUE introducida en la planta se incorpora de manera estable en el genoma de la planta. La alteración de la expresión de la secuencia NUE de la descripción puede modular el desarrollo floral durante periodos de estrés. Esos métodos se describen en otras partes en la presente descripción. Por lo tanto, la presente descripción proporciona, además, plantas que tienen desarrollo floral modulado en comparación con el desarrollo floral de una planta control. Las composiciones incluyen plantas que tienen un nivel/actividad alterada del polipéptido de la descripción y que tienen un desarrollo floral alterado. Las composiciones incluyen, además, plantas que tienen una modificación en el nivel/actividad del polipéptido de la descripción, en donde la planta se mantiene o continúa a lo largo del proceso de floración en periodos de estrés.

Además, se proporcionan métodos para usar las secuencias NUE de la descripción para incrementar el tamaño y/o peso de las semillas. El método comprende incrementar la actividad de las secuencias NUE en una planta o parte de una planta, tal como la semilla. Un incremento en el tamaño y/o peso de las semillas comprende un tamaño o peso reducido de la semilla y/o un incremento en el tamaño o peso de una o más partes de la semilla que incluyen, por ejemplo, el embrión, endosperma, cáscara, aleurona o cotiledón.

Como se mencionó anteriormente, un experto reconocerá el promotor adecuado para usar para incrementar el tamaño y/o peso de las semillas. Los promotores ilustrativos de esta modalidad incluyen los promotores constitutivos, los promotores inducibles, los promotores preferidos de semilla, los promotores preferidos del embrión y los promotores preferidos de endosperma.

El método para alterar el tamaño de la semilla y/o el peso de la semilla en una planta comprende el aumento de la actividad en la planta. En una modalidad, la secuencia de nucleótidos NUE se puede proporcionar mediante la introducción en la planta de un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos NUE de la descripción, la expresión de la secuencia NUE y, de esta manera, la reducción del peso y/o tamaño de la semilla. En otras modalidades, la construcción de nucleótidos NUE introducida en la planta se incorpora de manera estable en el genoma de la planta.

Se reconoce, además, que el incremento del tamaño y/o peso de las semillas puede estar acompañado, además, por el incremento en la velocidad de crecimiento de las plántulas o un incremento en el vigor temprano. Como se usa en la presente descripción, el término “vigor temprano” se refiere a la capacidad de una planta para crecer rápidamente durante el desarrollo prematuro y se relaciona con el establecimiento exitoso, después de la germinación, de un sistema radicular bien desarrollado y un aparato fotosintético bien desarrollado. Adicionalmente, un incremento en el tamaño y/o peso de las semillas puede producir, además, un incremento en la producción de la planta en comparación con una planta control.

En consecuencia, la presente descripción proporciona, además, plantas que tienen un peso de la semilla y/o tamaño de la semilla aumentado cuando se compara con una planta de control. En otras modalidades se proporciona, además, plantas que tienen mayor vigor y producción de la planta. En algunas modalidades, la planta de la descripción tiene un nivel/actividad modificada del polipéptido de la descripción y un mayor peso y/o tamaño de las semillas. En otras modalidades, tales plantas tienen incorporada de manera estable en el genoma una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos NUE de la descripción unida operativamente a un promotor que dirige la expresión en la célula vegetal. vii. Método de uso para el polinucleótido NUE, casetes de expresión y polinucleótidos adicionales Los nucleótidos, casetes de expresión y métodos descritos en la presente descripción son útiles para regular la expresión de cualquier secuencia heteróloga de nucleótidos en una planta huésped para variar el fenotipo de una planta. Varios cambios de interés en el fenotipo incluyen modificar la composición de ácido graso en una planta, alterar el contenido de aminoácidos de una planta, alterar un mecanismo de defensa contra un patógeno de una planta, y similares. Estos resultados pueden lograrse al proporcionar la expresión de productos heterólogos o el aumento de la expresión de productos endógenos en las plantas. Alternativamente, los resultados pueden lograrse al proporcionar una reducción de la expresión de uno o más productos endógenos, particularmente, enzimas o cofactores en la planta. Estos cambios resultan en un cambio en el fenotipo de la planta transformada.

Los genes de interés son el reflejo de los mercados comerciales y el interés de aquellos involucrados en el desarrollo del cultivo. Los cultivos y mercados de interés cambian y, como las naciones en desarrollo se abren a los mercados mundiales, emergerán también nuevos cultivos y teenologías. Adicionalmente, ya que el conocimiento de los rasgos y características agronómicas tales como rendimiento y heterosis aumenta, la selección de los genes para la transformación cambiará en correspondencia. Las categorías generales de genes de interés incluyen, por ejemplo, los genes involucrados en la información, tales como dedos de zinc, los involucrados en la comunicación, tales como las quinasas, y los involucrados en todas las células, tales como proteínas de choque térmico. Las categorías más específicas de transgenes, por ejemplo, incluyen genes que codifican rasgos importantes para la agronomía, resistencia a los insectos, resistencia a las enfermedades, resistencia a los herbicidas, esterilidad, características del grano y productos comerciales. Los genes de interés incluyen, generalmente, los involucrados en el metabolismo del aceite, almidón, carbohidratos o nutrientes, asi como los que afectan el tamaño del grano, la carga de sacarosa y similares.

En ciertas modalidades, las secuencias de ácidos nucleicos de la presente descripción pueden usarse en conjunto (“agrupadas”) con otras secuencias de polinucleótidos de interés para crear plantas con un fenotipo deseado. Las combinaciones generadas pueden incluir múltiples copias de uno cualquiera o más de los polinucleótidos de interés. Los polinucleótidos de la presente descripción se pueden agrupar con cualquier gen o combinación de genes para producir plantas con una variedad de combinaciones de rasgos deseados, que incluyen, sin limitarse a, rasgos deseables para alimento de animales, tales como genes con alto contenido oleico (por ejemplo, la patente de los EE. UU. núm. 6,232,529); aminoácidos balanceados (por ejemplo, hordotioninas (patentes de los EE. UU. núms. 5,990,389; 5,885,801; 5,885,802 y 5,703,409); cebada con alto contenido de lisina (Williamson, et al., (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106 y patente núm. WO 1998/20122) y proteínas con alto contenido de metionina (Pedersen, et al . , (1986) J. Biol . Chem. 261:6279; Kirihara, et al . , (1988) Gene 71:359 y Musumura, et al . , (1989) Plant Mol . Biol . 12:123)); digestibilidad aumentada (por ejemplo, proteínas de almacenamiento modificadas (solicitud de patente de los EE. UU. serie núm.10/053,410, presentada el 7 de noviembre de 2001) y tiorredoxinas (solicitud de patente de los EE. UU. serie núm.10/005,429, presentada el 3 de diciembre de 2001)), cuyas descripciones se incorporan en la presente descripción como referencia. Los polinucleótidos de la presente descripción se pueden agrupar, además, con rasgos deseables para la resistencia a insectos, enfermedades o herbicidas (por ejemplo, proteínas tóxicas de Bacillus thuringiensis (patentes de los EE. UU. núms. 5,366,892; 5,747,450; 5,737,514; 5723,756; 5,593,881; Geiser, et al . , (1986) Gene 48:109); (Van Damme, et al . , (1994) Plant Mol . Biol . 24:825); genes de desintoxicación de fumonisinas (patente de los EE. UU. núm. 5,792,931); genes de avirulencia y de resistencia a enfermedades (Jones, et al . , (1994) Science 266:789; Martin, et al . , (1993) Science 262:1432; Mindrinos, et al . , (1994) Cell 78:1089); mutantes de acetolactato sintasa (ALS) que conducen a resistencia a herbicidas, tales como mutaciones de S4 y/o Hra; inhibidores de glutamina sintasa tales como fosfinotricina o basta (p. ej., gen bar); y resistencia al glifosato (gen EPSPS)) y rasgos deseables para el procesamiento o productos del procesamiento, tales como aceites alto oleicos (por ejemplo, patente de los Estados Unidos núm. 6,232,529); aceites modificados (por ejemplo, genes desaturasa de ácidos grasos (patente de los EE. UU. núm. 5,952,544; la patente núm. WO 1994/11516)); almidones modificados (por ejemplo, pirofosforilasas ADPG (AGPase), sintasas de almidón (SS), enzimas de ramificación del almidón (SBE) y enzimas de desramificación del almidón (SOBE)) y polímeros o bioplásticos (por ejemplo, la patente de los EE. UU. núm. 5,602,321; beta-cetotiolasa, polihidroxibutirato sintasa y acetoacetil-CoA reductasa (Schubert, et al . , (1988) J. Bacteriol . 170:5837-5847) facilitan la expresión de polihidroxialcanoatos (PHA)), cuyas descripciones se incorporan en la presente descripción como referencia. Se pueden combinar, además, los polinucleótidos de la presente descripción con polinucleótidos que afectan los rasgos agronómicos, tales como esterilidad de los machos (por ejemplo, ver la patente de los EE. UU. núm 5.583,210), resistencia del tallo, tiempo de floración o rasgos de la teenología de transformación, tales como regulación del ciclo celular o selección de genes (por ejemplo, las patentes núm. WO 1999/61619; WO 2000/17364; WO 1999/25821) cuyas descripciones se incorporan en la presente descripción como referencia.

Las plantas transgénicas derivadas o que comprenden células de plantas o plantas nativas con fertilidad masculina reducida de esta descripción se pueden mejorar aún más con rasgos combinados, por ejemplo, una planta de cultivo que tiene un rasgo mejorado producido por la expresión del ADN descrito en la presente descripción en conjunto con rasgos de tolerancia a herbicidas y/o resistencia a plagas. Por ejemplo, las plantas con fertilidad masculina reducida pueden combinarse con otros rasgos de interés para la agronomía, tal como un rasgo que proporciona resistencia a herbicidas y/o resistencia a los insectos, tal como el uso de un gen de Bacillus thuringensis para proporcionar resistencia contra uno o más lepidópteros, coleópteros, homópteros, hemípteros y otros insectos. Los genes conocidos que confieren tolerancia a herbicidas, tales como, por ejemplo, herbicidas de auxina, HPPD, glifosato, dicamba, glufosinato, sulfonilurea, bromoxinilo y norflurazon pueden combinarse ya sea como una combinación molecular o una combinación de cultivo con plantas que expresan los rasgos descritos en la presente descripción. Las moléculas de polinucleótidos que codifican proteínas implicadas en la tolerancia a herbicidas incluyen, pero no se limitan a, una molécula de polinucleótido que codifica 5-enolpiruvilshikimate-3-fosfato sintasa (EPSPS) descrita en las patentes de los Estados Unidos núms.39,247; 6,566,587 y para impartir tolerancia al glifosato; moléculas de polinucleótidos que codifican una glifosato oxidorreductasa (GOX) descrita en la patente de los Estados Unidos núm. 5,463,175 y una glifosato-N-acetil transferasa (GAT) descrita en las patentes de los Estados Unidos núms 7,622,641; 7,462,481; 7,531,339; 7,527,955; 7,709,709; 7,714,188 y 7,666,643, además, para proporcionar tolerancia al glifosato; dicamba monooxigenasa descrita en la patente de los Estados Unidos núm. 7,022,896 y patente núm. WO 2007/146706 A2 para proporcionar tolerancia a la dicamba; una molécula de polinucleótido que codifica AAD12 descrita en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2005/731044 o patente núm. WO 2007/053482 A2 o que codifica AAD1 descrita en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2011/0124503 Al o patente de los Estados Unidos núm. 7,838,733 para proporcionar tolerancia a herbicidas de auxina (2,4-D); una molécula de polinucleótido que codifica hidroxifenilpiruvato dioxigenasa (HPPD) para proporcionar tolerancia a inhibidores de HPPD (por ejemplo, hidroxifenilpiruvato dioxigenasa) descritos, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos núm. 7,935,869; publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2009/0055976 Al y 2011/0023180 Al, cada publicación se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.

Otros ejemplos de rasgos de tolerancia a herbicidas que podrían combinarse con los rasgos descritos en la presente descripción incluyen aquellos conferidos por polinucleótidos que codifican una fosfinotricina acetiltransferasa exógena, tal como se describe en las patentes de los Estados Unidos núms. 5,969,213; 5,489,520; 5,550,318; 5,874,265; 5,919,675; 5,561,236; 5,648,477; 5,646,024; 6,177,616 y 5,879,903. Las plantas que contienen una fosfinotricina acetiltransferasa exógena pueden exhibir una mayor tolerancia a los herbicidas de glufosinato, que inhiben la enzima glutamina sintasa. Otros ejemplos de rasgos de tolerancia a herbicidas incluyen aquellos conferidos por polinucleótidos que confieren actividad de protoporfirinógeno oxidasa (protox) alterada, tal como se describe en las patentes de los Estados Unidos núms. 6,288,306 Bl; 6,282,837 Bl y 5,767,373 y en la publicación internacional patente nú . WO 2001/12825. Las plantas que contienen dichos polinucleótidos pueden exhibir una mayor tolerancia a diversos herbicidas dirigidos a la enzima protox (mencionados, además, como “inhibidores de protox”).

En una modalidad, las secuencias de interés mejoran el crecimiento de la planta y/o los rendimientos del cultivo. Por ejemplo, las secuencias de interés incluyen genes agronómicamente importantes que resultan en sistemas mejorados de la raíz primaria o lateral. Tales genes incluyen, pero no se limitan a, transportares de nutrientes/agua e inductores del crecimiento. Los ejemplos de esos genes incluyen, pero no se limitan a, H+-ATPasa (MHA2) de la membrana plasmática de maíz (Frías, et al., (1996) Plant Cell 8:1533-44); AKT1, un componente del aparato de captación de potasio en Arabidopsis, (Spalding, et al . , (1999) J Gen Physiol 113:909-18); genes RML que activan el ciclo de división celular en las células apicales de la raíz (Cheng, et al . , (1995) Plant Physiol 108:881); genes de glutamina sintetasa de maíz (Sukanya, et al . , (1994) Plant Mol Biol 26:1935-46) y hemoglobina (Duff, et al . , (1997) J. Biol . Chem 27:16749-16752, Arredondo-Peter, et al . , (1997) Plant Physiol . 115:1259-1266; Arredondo-Peter, et al . , (1997) Plant Physiol 114:493-500 y las referencias citadas en ellas). La secuencia de interés puede ser útil, además, para expresar las secuencias nucleotidicas antisentido de genes que afectan, negativamente, el desarrollo de la raíz.

Rasgos adicionales agronómicamente importantes tales como contenido de aceite, almidón y proteina pueden alterarse genéticamente, adicionalmente, mediante el uso de métodos de cultivo tradicionales. Las modificaciones incluyen aumentar el contenido de ácido oléico, aceites saturados e insaturados, aumentar los niveles de U sina y azufre, proporcionar aminoácidos esenciales y, además, la modificación del almidón. Las modificaciones a la proteina hordotionina se describen en las patentes de los EE. UU. núm. 5,703,049, 5,885,801, 5,885,802 y 5,990,389, incorporadas en la presente descripción como referencia. Otro ejemplo es la proteina de la semilla rica en lisina y/o azufre codificada por la albúmina del frijol de soya 2S descrita en la patente de los Estados Unidos núm. 5,850,016 y el inhibidor de quimotripsina de cebada descrito en Williamson, et al . , (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106, cuyas descripciones se incorporan en la presente descripción como referencia.

Los derivados de las secuencias codificantes pueden realizarse por mutagénesis dirigida al sitio para aumentar el nivel de aminoácidos preseleccionados en el polipéptido codificado. Por ejemplo, el gen que codifica el polipéptido con alto contenido de lisina en cebada (BHL) se deriva del inhibidor de quimotripsina de cebada, solicitud de patente de los Estados Unidos núm. de serie 08/740,682, presentada el 1 de noviembre de 1996 y patente núm. WO 1998/20133, cuyas descripciones se incorporan en la presente descripción como referencia. Otras proteínas incluyen las proteínas de plantas ricas en metionina, tales como las proteínas de la semilla de girasol (Lillcy, et al . , (1989) Proceedings of the World Congress on Vegetable Proteín Utilization in Human Foods and Animal Feedstuffs, ed. Applewhite (American Oil Chemists Society, Champaign, Illinois), págs. 497-502; que se incorporan en la presente descripción como referencia); maíz (Pedersen, et al . , (1986) J. Biol . Chem. 261:6279; Kirihara, et al . , (1989) Gene 71:359, las cuales se incorporan en la presente descripción como referencia) y arroz (Musumura, et al . , (1988) Plant Mol . Biol . 12:123 incorporada en la presente descripción como referencia). Otros genes agronómicamente importantes codifican para el látex, Floury 2, factores de crecimiento, factores de almacenamiento de semilla y factores de transcripción.

Los genes de resistencia a los insectos pueden codificar la resistencia a las plagas que tienen una gran capacidad de adherencia tales como gusano de la raíz, gusano cortador, taladro europeo del maíz y similares. Tales genes incluyen, por ejemplo, los genes de proteínas tóxicas de Bacillus thuringiensis (patentes de los EE. UU . núms. 5,366,892; 5,747,450; 5,736,514; 5,723,756; 5,593,881 y Geiser, et al., (1986) Gene 48:109) y similares.

Los genes que codifican los rasgos de resistencia a enfermedades incluyen genes de desintoxicación, tales como anti-fumonosina (patente de los EE. UU. núm. 5,792,931); genes de avirulencia (avr) y resistencia a enfermedades (R) (Jones, et al., (1994) Science 266:789; Martin, et al., (1993) Science 262:1432 y Mindrinos, et al., (1994) Cell 78:1089) y similares.

Los rasgos de resistencia a los herbicidas pueden incluir genes que codifican para la resistencia a los herbicidas que actúan para inhibir la acción de la acetolactato sintasa (ALS), particularmente los herbicidas tipo sulfonilurea (por ejemplo, el gen de la acetolactato sintasa (ALS) que contiene mutaciones que conducen a tal resistencia, particularmente las mutaciones S4 y/o Hra), genes que codifican para la resistencia a los herbicidas que actúan para inhibir la acción de la glutamina sintasa, tales como fosfinotricina o basta (por ejemplo, el gen bar) u otros genes conocidos en la téenica. El gen bar codifica para la resistencia al herbicida basta, el gen npt codifica para la resistencia a los antibióticos canamicina y geneticina y los utantes del gen ALS codifican para la resistencia al herbicida clorsulfurón.

Los genes de esterilidad pueden codificarse, además, en un casete de expresión y proporcionan una alternativa al desespigamiento físico. Los ejemplos de genes usados de esa manera incluyen genes preferidos del tejido masculino y genes con fenotipos de esterilidad masculina tales como QM, descritos en la patente de los EE. UU. núm. 5,583,210. Otros genes incluyen las quinasas y los que codifican compuestos tóxicos para el desarrollo gametofítico masculino o femenino.

La calidad del grano se refleja en rasgos tales como los niveles y tipos de aceites, si son saturados e insaturados, la calidad y cantidad de aminoácidos esenciales y los niveles de celulosa. En maíz, las proteínas de hordotionina modificadas se describen en la patente de los EE. UU. núm.5,703,049, 5,885,801, 5,885,802 y 5,990,389.

Los rasgos comerciales pueden codificarse, además, en un gen o genes que podrían aumentar, por ejemplo, el almidón para la producción de etanol o proporcionar la expresión de proteínas. Otro uso comercial importante de las plantas transformadas es la producción de polímeros y bioplásticos tales como los descritos en la patente de los EE. UU. núm.5,602,321. Los genes tales como b-cetotiolasa, PHBase (polihidroxibutirato sintasa) y acetoacetil-CoA reductasa (ver, Schubert, et al., (1988) J. Bacteriol . 170:5837-5847) facilitan la expresión de polihidroxialcanoatos (PHA).

Los productos exógenos incluyen enzimas y productos vegetales así como de otras fuentes que incluyen procariotas y otros eucariotas. Tales productos incluyen enzimas, cofactores, hormonas y similares. Puede incrementarse el nivel de proteínas, particularmente las proteínas modificadas que tienen una distribución mejorada de aminoácidos para mejorar el valor nutriente de la planta. Esto se logra por la expresión de tales proteínas que tienen un contenido mejorado de aminoácidos.

El promotor, que se une, operativamente, a la secuencia de nucleótidos, puede ser cualquier promotor que está activo en células vegetales, particularmente un promotor que está activo (o puede activarse) en los tejidos reproductivos de una planta (por ejemplo, estambres u ovarios). Como tal, el promotor puede ser, por ejemplo, un promotor constitutivamente activo, un promotor inducible, un promotor especifico del tejido o un promotor especifico de la etapa de desarrollo. Además, el promotor de la primera molécula exógena de ácido nucleico puede ser el mismo que o diferente del promotor de la segunda molécula exógena de ácido nucleico.

Generalmente, un promotor se selecciona con base en, por ejemplo, si los genes endógenos de fertilidad a inhibir son genes de fertilidad masculina o genes de fertilidad femenina. Asi, donde los genes endógenos a inhibir son genes de fertilidad masculina (por ejemplo, un gen BS7 y un gen SB200), el promotor puede ser un promotor especifico de estambre y/o especifico de polen tal como un promotor del gen MS45 (patente de los Estados Unidos núm.6,037,523), un promotor del gen 5126 (patente de los Estados Unidos núm. 5,837,851), un promotor del gen BS7 (solicitud de patente núm. WO 2002/063021), un promotor del gen SB200 (solicitud de patente núm. WO 2002/26789), un promotor del gen TA29 ( Nature 347:737 (1990)), un promotor del gen PG47 (patente de los Estados Unidos núm. 5,412,085; patente de los Estados Unidos núm. 5,545,546; Plant J 3(2):261-271 (1993)) un promotor del gen SGB6 (patente de los Estados Unidos núm.5,470,359) un promotor del gen G9 (patentes de los Estados Unidos núm. 5,837,850 y 5,589,610) o similares, de manera que el hpRNA se exprese en las anteras y/o el polen o en los tejidos que dan lugar a células de las anteras y/o el polen, lo que, de ese modo, reduce o inhibe la expresión de los genes endógenos de fertilidad masculina (es decir, inactiva los genes endógenos de fertilidad masculina). En comparación, donde los genes endógenos a inhibir son genes de fertilidad femenina, el promotor puede ser un promotor especifico de ovario, por ejemplo. Sin embargo, como se describe en la presente descripción, puede usarse cualquier promotor que dirija la expresión en el tejido de interés que incluye, por ejemplo, un promotor constitutivamente activo, tal como un promotor de ubiquitina que realiza, generalmente, la transcripción en la mayoría o en todas las células vegetales.

Corrección de genomas y mutagénesis inducida Generalmente, se dispone de métodos para modificar o alterar el ADN genómico endógeno del hospedero. Esto incluye alterar la secuencia de ADN natural del hospedero o una secuencia transgénica preexistente que incluye elementos reguladores, secuencias codificantes y no codificantes. Estos métodos son útiles, además, para dirigir los ácidos nucleicos a secuencias de reconocimiento dirigidas prediseñadas por ingeniería genética en el genoma. Como ejemplo, la célula o planta modificada genéticamente descrita en la presente descripción se genera con el uso de meganucleasas “específicas” producidas para modificar los genomas de las plantas (ver, por ejemplo, la patente núm. WO 2009/114321; Gao, et al . , (2010) Plant Journal 1:176-187). El desarrollo mediante ingeniería genética dirigido a otro sitio se realiza por medio del uso del reconocimiento del dominio de dedo de zinc acoplado con las propiedades de restricción de la enzima de restricción. Ver, por ejemplo, Urnov, et al., (2010) Nat Rev Genet. 11 (9):636-46; Shukla, et ai., (2009) Nature 459(7245):437-41.

Generalmente, se dispone de métodos para modificar o alterar el ADN genómico endógeno del hospedero. Esto incluye alterar la secuencia de ADN natural del hospedero o una secuencia transgénica preexistente que incluye elementos reguladores, secuencias codificantes y no codificantes. Estos métodos son útiles, además, para dirigir los ácidos nucleicos a secuencias de reconocimiento dirigidas prediseñadas por ingeniería genética en el genoma.

Corrección genómica mediada por dedos de Zinc Como un ejemplo, la célula o planta modificada genéticamente descrita en la presente descripción, se genera mediante el uso de un proceso de corrección genómica mediado por nucleasas con dedos de zinc. El proceso para corregir una secuencia cromosómica incluye, por ejemplo: (a) introducir en una célula al menos un ácido nucleico que codifica una nucleasa con dedos de zinc que reconoce una secuencia objetivo en la secuencia cromosómica y es capaz de escindir un sitio en la secuencia cromosómica, y, opcionalmente, (i) al menos un polinucleótido donante que incluye una secuencia de integración flanqueada por una secuencia corriente arriba y una secuencia corriente abajo que exhiben una identidad de secuencia sustancial con cualquiera de los lados del sitio de escisión, o (ii) al menos un polinucleótido de intercambio que comprende una secuencia que es sustancialmente idéntica a una porción de la secuencia cromosómica en el sitio de escisión y que comprende además al menos un cambio de nucleótido; y (b) cultivar la célula para permitir la expresión de la nucleasa con dedos de zinc de manera que la nucleasa con dedos de zinc introduzca una rotura de la doble cadena en la secuencia cromosómica, y en donde la ruptura de la doble cadena se repara mediante (i) un proceso de reparación por unión de extremos no homólogos de manera que se introduce una mutación inactivante en la secuencia cromosómica, o (ii) un proceso de reparación dirigida por homología de manera que la secuencia en el polinucleótido donante se integra en la secuencia cromosómica o la secuencia en el polinucleótido de intercambio se intercambia con la porción de la secuencia cromosómica.

Una nucleasa con dedos de zinc incluye un dominio de unión al ADN (es decir, dedos de cinc) y un dominio de escisión (es decir, nucleasa). El ácido nucleico que codifica una nucleasa con dedos de zinc puede incluir ADN o ARN. Los dominios de unión por dedos de zinc pueden diseñarse para reconocer y unirse a cualquier secuencia de ácido nucleico de elección. Véase, por ejemplo, Beerli et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol.10:411-416; y Doyon et al. (2008) Nat. Biotechnol. 26:702-708; Santiago et al. (2008) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 105:5809-5814; Urnov, et al., (2010) Nat Rev Genet . 11(9):636-46; y Shukla, et al., (2009) Nature 459 (7245):437-41. Un dominio de unión por dedos de zinc diseñado puede tener una especificidad de unión nueva en comparación con una proteina con dedos de zinc de origen natural. Como ejemplo, el algoritmo descrito en la patente de los Estados Unidos núm. 6,453,242 puede usarse para diseñar un dominio de unión por dedos de zinc para dirigirse a una secuencia preseleccionada. Las tablas de códigos de reconocimiento no degenerados pueden usarse, además, para diseñar un dominio de unión por dedos de zinc para dirigirse a una secuencia especifica (Sera et al. (2002) Biochemistry 41: 7074-7081). Pueden usarse herramientas para identificar posibles sitios objetivos en las secuencias de ADN y diseñar dominios de unión con dedos de zinc (Mandell et al. (2006) Nuc. Acid Res.34:W516-W523; Sander et al. (2007) Nuc. Acid Res. 35:W599-W605).

Un dominio de unión al ADN por dedos de zinc ilustrativo reconoce y une una secuencia que tiene al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia con la secuencia objetivo deseado. En otras modalidades, la identidad de secuencia puede ser aproximadamente 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 %.

Una nucleasa con dedos de zinc incluye, además, un dominio de escisión. La porción del dominio de escisión de las nucleasas con dedos de zinc puede obtenerse a partir de cualquier endonucleasa o exonucleasa. Los ejemplos no limitantes de endonucleasas de las que puede derivarse un dominio de escisión incluyen, pero no se limitan a, endonucleasas de restricción y endonucleasas autodireccionales. Véase, por ejemplo, 2010-2011 Catalog, New England Biolabs, Beverly, Mass.; y Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388. Se conocen enzimas adicionales que escinden ADN (por ejemplo, SI nucleasa, nucleasa de frijol mungo, DNasa I pancreática; nucleasa micrococcal; endonucleasa HO de levadura). Una o más de estas enzimas (o fragmentos funcionales de estas) pueden usarse como fuente de dominios de escisión.

Corrección genómica basada en meganucleasa Otro ejemplo para modificar genéticamente la célula o planta descrita en la presente descripción, es mediante el uso de meganucleasas “específicas” producidas para modificar los genomas de las plantas (véase, por ejemplo la patente núm. WO 2009/114321; Gao et al. (2010) Plant Journal 1:176-187. El término “meganucleasa” se refiere, generalmente, a una endonucleasa autodireccional de origen natural que se une al ADN de doble cadena en una secuencia de reconocimiento que es mayor que 12 pares de base y abarca el correspondiente sitio de inserción del intrón. Las meganucleasas de origen natural pueden ser monoméricas (por ejemplo, I-Scel) o diméricas (por ejemplo, I-Creí). El término meganucleasa, como se usa en la presente descripción, puede usarse para referirse a meganucleasas monoméricas, meganucleasas diméricas, o a los monómeros que se asocian para formar una meganucleasa dimérica.

Las meganucleasas de origen natural, por ejemplo, de la familia LAGLIDADG, se han usado para promover la modificación del genoma especifica de un sitio en plantas, levaduras, Drosophila, células de mamíferos y ratones. Se conocen meganucleasas diseñadas por ingeniería genética tales como, por ejemplo, meganucleasas LIG-34, que reconocen y cortan una secuencia de ADN de 22 pares de bases que se encuentra en el genoma de Zea mays (maíz) (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm.20110113509).

Endonucleasas TAL (TALEN) Los efectores TAL (similares a un activador de la transcripción) a partir de Xanthomonas patógenas de plantas son factores de virulencia importantes que actúan como activadores transcripcionales en el núcleo de la célula vegetal, donde se unen, directamente, al ADN a través de un dominio central de repeticiones en tándem. Un efector similar a un activador de la transcripción (TAL) y enzimas modificadoras del ADN (TALE o TALEN) se usan, además, para diseñar cambios genéticos. Véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. US20110145940, Boch et al., (2009), Science 326(5959): 1509-12. Las fusiones de efectores TAL con la nucleasa Fokl proporcionan TALEN que se unen y escinden el ADN en lugares específicos. La especificidad objetivo se determina mediante el desarrollo de repeticiones personalizadas de aminoácidos en los efectores TAL.

La “detección de lesiones locales inducidas EN genomas” o “TILLING”, por sus siglas en inglés, se refiere a una teenología de mutagénesis útil para generar y/o identificar y, en última instancia, para aislar variantes mutagenizadas de un ácido nucleico específico con expresión y/o actividad modulada (McCallum, et al., (2000), Plant Physiology 123:439-442; McCallum, et al., (2000) Nature Biotechnology 18:455-457 y Colbert, et al . , (2001) Plant Physiology 126:480-484).

Además, para introducir mutaciones en el gen MS44 pueden usarse otros métodos mutagénicos. Los métodos para introducir mutaciones genéticas en genes de plantas y seleccionar plantas con rasgos deseados son muy conocidos. Por ejemplo, las semillas u otro material vegetal se pueden tratar con una sustancia química mutagénica, de conformidad con téenicas estándar. Tales sustancias químicas incluyen, pero no se limitan a, las siguientes: sulfato de dietilo, etilenimina y N-nitroso-N-etilurea. Alternativamente, se puede usar radiación ionizante de fuentes tales como rayos X o rayos gamma.

Las modalidades de la descripción reflejan la determinación de que el genotipo de un organismo puede modificarse para contener alelos supresores dominantes o construcciones transgénicas que suprimen (es decir, reducen, pero no extirpan) la actividad de un gen, en donde el fenotipo del organismo no se afecta sustancialmente.

En algunas modalidades, la descripción de la presente se ilustra con respecto a la fertilidad de la planta y, más particularmente, con respecto a la fertilidad masculina de la planta.

La producción de semillas híbridas requiere la eliminación o inactivación del polen producido por el progenitor femenino. La remoción o inactivación incompleta del polen proporciona el potencial para la autofertilización y eleva el riesgo de recolectar involuntariamente la semilla autopolinizada accidentalmente y envasada con la semilla híbrida. Una vez que la semilla se plantó, las plantas autofertilizadas se pueden identificar y seleccionar; las plantas autofetilizadas son genéticamente equivalentes a la línea endogámica femenina usada para producir el híbrido. Típicamente, las plantas autofertilizadas se identifican y seleccionan en función de su vigor disminuido con respecto a las plantas híbridas. Por ejemplo, las plantas de maíz femeninas autofertilizadas se identifican por su aspecto menos vigoroso con respecto a las características vegetativas y/o reproductivas, que incluyen una menor altura de la planta, un tamaño pequeño de la espiga, la forma de la espiga y el grano, el color de la mazorca u otras características. Las líneas autofertilizadas se pueden identificar, además, con el uso de análisis de marcadores moleculares (ver, por ejemplo, Smith and Wych, (1995) Seed Sci. Technol . 14:1-8). El uso de tales métodos permite verificar la homocigosidad de la línea autopolinizada mediante el análisis de la composición alélica en varios loci en el genoma.

Dado que las plantas híbridas son cultivos de campo importantes y valiosos, los cultivadores trabajan continuamente para desarrollar híbridos de alta producción agronómicamente adecuados en función de las líneas endógamas estables. La disponibilidad de tales híbridos permite producir una cantidad máxima de cultivo con los materiales usados y, al mismo tiempo, minimizar la sensibilidad a las plagas y al estrés ambiental. Para lograr esta meta, el cultivador debe desarrollar lineas parentales endógamas superiores para producir híbridos mediante la identificación y selección de individuos genéticamente únicos que se producen en una población segregante. La presente descripción contribuye a esta meta, por ejemplo, ya que proporciona plantas que, cuando se cruzan, generan progenie estéril masculina que se puede usar como plantas parentales femeninas para generar plantas híbridas.

Se identificó un gran número de genes por ser preferidos de panoja en su patrón de expresión. Tal como se describe en la presente descripción, los métodos de supresión en el maíz proporcionan un medio rápido alternativo para identificar genes relacionados directamente con el desarrollo del polen en el maíz. Como se usa en la presente descripción, el término “endógeno”, cuando se usa en referencia a un gen, se refiere a un gen normalmente presente en el genoma de las células de un organismo especificado y está presente en su estado normal en las células (es decir, presente en el genoma en el estado en el cual está normalmente presente en la naturaleza). El término “exógeno” se usa en la presente descripción para referirse a cualquier material que se introduce en una célula. El término “molécula de ácido nucleico exógena” o “transgén” se refiere a cualquier molécula de ácido nucleico que normalmente no está presente en un el genoma de una célula o se introduce en una célula. Dichas moléculas de ácido nucleico exógenas son, generalmente, moléculas de ácido nucleico recombinante, que se generan con el uso de métodos de ADN recombinante, tal como se describen en la presente descripción o se conocen de cualquier otra manera en la materia. En varias modalidades, un organismo no humano transgénico tal como se describe en la presente descripción puede contener, por ejemplo, un primer transgén y un segundo transgén. Dichos primeros y segundos transgenes se pueden introducir en una célula, por ejemplo, una célula progenitora de un organismo transgénico, ya sea como moléculas de ácido nucleico individuales o como una sola unidad (por ejemplo, contenida en distintos vectores o contenida en un solo vector, respectivamente). En cualquier caso, se puede confirmar que una célula a partir de la cual se derivará el organismo transgénico contiene ambos transgenes con el uso de métodos de rutina y muy conocidos, tal como la expresión de genes marcadores o hibridación de ácido nucleico o análisis por PCR. Alternativamente o adicionalmente, la confirmación de la presencia de transgenes puede producirse más tarde, por ejemplo, después de la regeneración de una planta a partir de una célula transformada putativamente.

Los promotores útiles para expresar una molécula de ácido nucleico de interés pueden estar comprendidos en cualquier intervalo de promotores de origen natural conocidos como promotores operativos en plantas o animales, según se desee. Los promotores que dirigen la expresión en células de órganos reproductores masculinos o femeninos de una planta son útiles para generar una planta transgénica o par reproductor de plantas de la descripción. Los promotores útiles en la presente descripción pueden incluir promotores constitutivos que, generalmente, son activos en la mayoría o en todos los tejidos de una planta; promotores inducibles que, generalmente, son inactivos o exhiben un nivel basal bajo de expresión y pueden inducirse hasta una actividad relativamente alta cuando se produce el contacto de células con un agente inductor adecuado; promotores específicos del tejido (o preferidos para el tejido) que, generalmente, se expresan en uno solo o en pocos tipos celulares particulares (por ejemplo, células de anteras de plantas) y promotores específicos del desarrollo o de etapas, que son activos solamente en un periodo definido del crecimiento o desarrollo de una planta. Si es necesario modificar el nivel de expresión los promotores, frecuentemente, se pueden modificar. Ciertas modalidades comprenden promotores exógenos a las especies que se manipulan. Por ejemplo, el gen Ms45 introducido en el germoplasma del maíz ms45ms45 puede estar dirigido por un promotor aislado de otra especie de planta; después, se puede diseñar una construcción de horquilla que dirija al promotor de la planta exógeno de manera tal que se reduce la posibilidad de interacción entre la horquilla y los promotores de maíz endógenos no dirigidos.

Los promotores constitutivos ilustrativos incluyen el promotor del virus del mosaico de la coliflor 35S (CaMV) (Odell, et al., (1985) Nature 313:810-812), el promotor de la ubiquitina del maíz (Christensen, et al . , (1989) Plan t Mol . Biol . 12:619-632 y Christensen, et al . , (1992) Plant Mol . Biol. 18:675-689); el promotor principal del promotor Rsyn7 y otros promotores constitutivos descritos en la patente núm. WO 1999/43838 y la patente de los Estados Unidos núm.6,072,050; actina del arroz (McElroy, et al . , (1990) Plant Cell 2:163-171); pEMU (Last, et al . , (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten, et al . , (1984) EMBO J. 3:2723-2730); promotor ALS (patente de los Estados Unidos núm.5,659,026); promotor de la actina del arroz (patente de los Estados Unidos núm. 5,641,876; patente núm. WO 2000/70067), promotor de la histona del maíz (Brignon, et al. , (1993) Plant Mol Bio 22(6):1007-1015; Rasco-Gaunt, et al . , (2003) Plant Cell Rep. 21(6):569-576) y similares. Otros promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, aquellos descritos en las patentes de los Estados Unidos núms.5,608,144 y 6,177,611 y la publicación del PCT núm. WO 2003/102198.

Los elementos reguladores específicos del tejido, preferidos del tejido o específicos de la etapa incluyen, además, por ejemplo, el elemento regulador AGL8/FRUITFULL, que se activa cuando se produce la inducción floral (Hempel, et al., (1997) Development 124:3845-3853); los elementos reguladores específicos de la raíz tales como los elementos reguladores del gen RCP1 y el gen LRP1 (Tsugeki and Fedoroff, (1999) Proc. Nati. Acad. , USA 96:12941-12946; Smith and Fedoroff, (1995) Plant Cell 7:735-745); los elementos reguladores específicos de la flor tales como los elementos reguladores del gen LEAFY y el gen APETALA1 (Blazquez, et al., (1997) Development 124:3835-3844; Hempel, et al., supra, 1997); los elementos reguladores específicos de la semilla tal como el elemento regulador del gen de oleosina (Plant, et al., (1994) Plant Mol. Biol. 25:193-205) y el elemento regulador específico de la zona de dehiscencia. Otros elementos reguladores específicos del tejido o específicos de la etapa incluyen el promotor Znl3, que es un promotor específico del polen (Hamilton, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 18:211-218); el promotor UNUSUAL FLORAL ORGANS (UFO), que está activo en el meristema del brote apical; el promotor activo en los meristemas de brotes (Atanassova, et al., (1992) Plant J. 2:291), el promotor cdc2 y el promotor cyc07 (véase, por ejemplo, Ito, et al., (1994) Plant Mol. Biol. 24:863-878; Martínez, et al., (1992) Proc. Nati. Acad. Sci., USA 89:7360); los promotores meri-5 y H3 preferidos meristemáticos (Medford, et al., (1991) Plant Cell 3:359; Terada, et al., (1993) Plant J. 3:241); los promotores meristemáticos y preferidos del floema de genes relacionados con Myb en la cebada (Wissenbach, et al . , (1993) Plant J. 4:411); cyc3aAt y cyclAt de Arabidopsis (Shaul, et al . , (1996) Proc. Nati . Acad. Sci . 93:4868-4872); ciclinas CYS y CYM de C. roseus (Ito, et al . , (1997) Plant J. 11:983-992); y Nícotiana CyclinBl (Trehin, et al . , (1997) Plant Mol . Biol . 35:667-672); el promotor del gen APETALA3 que está activo en los meristemas florales (Jack, et al . , (1994) Cell 76:703; Hempel, et al . , supra, 1997); un promotor de un miembro de la familia de tipo Agamous (AGL), por ejemplo, AGL8, que está activo en el meristema del brote cuando se produce la transición a la floración (Hempel, et al . , supra, 1997); promotores de la zona de abscisión floral; promotores específicos de Ll; el promotor de poligalacturonasa del tomate mejorado para la maduración (Nicholass, et al . , (1995) Plant Mol . Biol . 28:423-435), el promotor E8 (Deikman, et al . , (1992) Plant Physiol . 100:2013-2017) y el promotor específico del fruto 2A1, los promotores de ARNnp U2 y U5 del maíz, el promotor Z4 de un gen que codifica la proteína zeína Z4 de 22 kD, el promotor Z10 de un gen que codifica una proteína zeína de 10 kD, un promotor Z27 de un gen que codifica una proteína zeína de 27 kD, el promotor A20 del gen que codifica una proteína zeína de 19 kD, y similares. Se pueden aislar otros promotores específicos del tejido con el uso de métodos muy conocidos (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. 5,589,379). Los promotores preferidos del brote incluyen los promotores preferidos del meristema del brote tales como los promotores descritos en Weigel, et al., (1992) Cell 69:843-859 (número de registro M91208); número de registro AJ131822; número de registro Z71981; número de registro AF049870 y los promotores preferidos del brote descritos en McAvoy, et al . , (2003) Acta Hort . ( ISHS ) 625:379-385. Los promotores preferidos de la inflorescencia incluyen el promotor de chalcona sintasa (Van der Meer, et al . , (1992) Plant J. 2(4):525-535), especifico de la antera LAT52 (Twell, et al . , (1989) Mol . Gen. Genet . 217:240-245), especifico del polen Bp4 (Albani, et al., (1990) Plant Mol Biol . 15:605, gen especifico del polen del maíz Zml3 (Hamilton, et al., (1992) Plant Mol . Biol . 18:211-218; Guerrero, et al . , (1993) Mol . Gen . Genet. 224:161-168), promotores específicos de microesporas tal como el promotor del gen apg (Twell, et al., (1993) Sex. Plant Reprod. 6:217-224) y los promotores específicos del tapetum tal como el promotor del gen TA29 (Mariani, et al., (1990) Nature 347:737; patente de los Estados Unidos núm. 6,372,967) y otros promotores específicos del estambre tales como el promotor del gen MS45, el promotor del gen 5126, el promotor del gen BS7, el promotor del gen PG47 (patente de los Estados Unidos núm. 5,412,085; patente de los Estados Unidos núm.5,545,546; Plan t J 3(2):261-271 (1993)), el promotor del gen SGB6 (patente de los Estados Unidos núm. 5,470,359), el promotor del gen G9 (patente de los Estados Unidos núm.5,8937,850; patente de los Estados Unidos núm. 5,589,610), promotor del gen SB200 (documento WO 2002/26789), o similares (ver, Ejemplo 1). Los promotores de interés preferidos del tejido incluyen, además, un gen expresado en el polen del girasol SF3 (Baltz, et al., (1992) The Plan Journal 2:713-721), genes específicos del polen de B. napus (Am oldo, et al., (1992) J. Cell. Biochem, resumen número Y101204). Los promotores preferidos del tejido incluyen, además, aquellos reportados por Yamamoto, et al., (1997) Plant J. 12 (2):255-265 (psaDb); Kawamata, et al., (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803 (PsPALl); Hansen, et al., (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343 (ORF13); Russell, et al., (1997) Transgenic Res. 6(2):157-168 (ceroso o Z GBS; zeína de 27kDa, ZmZ27; osAGP; osGTl); Rinehart, et al., (1996) Plant Physiol. 112(3):1331-1341 (Fbl2A del algodón); Van Camp, et al., (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535 (Nicotiana SodAl y SodA2); Canevascini, et al., (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524 ( Nicotiana ltpl); Yamamoto, et al., (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778 (promotor Pinus cab-6); Lam, (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco, et al., (1993) Plant Mol Biol . 23(6):1129-1138 (rubisco activasa (Rea) de la espinaca); Matsuoka, et al., (1993) Proc Nati. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590 (promotor PPDK) y Guevara-Garcia, et al., (1993) Plant J. 4(3):495-505 (promotor pmas de Agrobacterium) . Un promotor específico para el tejido que está activo en células de órganos reproductores masculinos o femeninos puede ser, particularmente, útil en ciertos aspectos de la presente descripción.

Los promotores “preferidos de la semilla” incluyen tanto los promotores “de desarrollo de semillas” (aquellos promotores activos durante el desarrollo de las semillas, tales como los promotores de proteínas de almacenamiento de semillas) como los promotores de “germinación de semillas” (aquellos promotores activos durante la germinación de las semillas). Ver, Thompson, et al . , (1989) BioEssays 10:108. Tales promotores preferidos de la semilla incluyen, pero no se limitan a, Ciml (mensaje inducido por citocinina), CZ19B1 (zeína de 19 kDa del maíz), milps (mio-inositol-1-fosfato sintasa); ver, la patente núm. WO 2000/11177 y la patente de los Estados Unidos núm. 6,225,529. La gama-zeína es un promotor específico de endosperma. La globulina-1 (Glob-1) es un promotor representativo específico del embrión. Para las dicotiledóneas, los promotores específicos de semillas incluyen, pero no se limitan a, b-faseolina del frijol, napina, b-conglicinina, lectina de frijol de soya, cruciferina y similares. Para las monocotiledóneas, los promotores específicos de semillas incluyen, pero no se limitan a, zeína de maíz de 15 kDa, zeína de 22 kDa, zeína de 27 kDa, gamma-zeína, waxy, shrunken 1, shrunken 2, globulina 1, etc. Ver, además, la patente núm. WO 2000/12733 y la patente de los Estados Unidos núm. 6,528,704, en donde se describen los promotores preferidos de semillas de los genes endl y end.2. Otros promotores específicos de los embriones se describen en Sato, et al . , (1996) Proc. Nati . Acad. Sci . 93:8117-8122 (caja homeótica del arroz, OSH1) y Postma-Haarsma, et al . , (1999) Plant Mol . Biol . 39:257-71 (genes KNOX del arroz). Otros promotores específicos del endosperma se describen en Albani, et al. , (1984) EMBO 3:1405-15; Albani, et al . , (1999) Theor. Appl . Gen. 98:1253-62; Albani, et al . , (1993) Plant J. 4:343-55; Mena, et al . , (1998) The Plan Journal 116:53-62 (DOF de la cebada); Opsahl-Ferstad, et al . , (1997) Plant J 12:235-46 (Esr del maíz) y Wu, et al . , (1998) Plant Cell Physiology 39:885-889 (GluA-3, GluB-1, NRP33, RAG-1 del arroz).

Un elemento regulador inducible es aquel capaz de activar, directa o indirectamente, la transcripción de una o más secuencias o genes de ADN en respuesta a un inductor. El inductor puede ser un agente químico tal como una proteína, metabolito, regulador del crecimiento, herbicida o compuesto fenólico o un estrés fisiológico, tal como el impuesto directamente por calor, frío, sal o elementos tóxicos, o indirectamente a través de la acción de un agente patógeno o de una enfermedad tal como un virus u otro agente biológico o físico o condición ambiental. Una célula vegetal que contiene un elemento regulador inducible puede exponerse a un inductor por medio de la aplicación externa del inductor a la célula o planta tal como mediante rociado, riego, calentamiento o métodos similares. Un agente inductor útil para inducir la expresión a partir de un promotor inducible se selecciona sobre la base del elemento regulador inducible particular. En respuesta a la exposición a un agente inductor, la transcripción a partir del elemento regulador inducible se inicia, generalmente, de novo o aumenta por encima de un nivel de expresión basal o constitutivo. Típicamente, el factor de proteína que se une específicamente a un elemento regulador inducible para activar la transcripción está presente en una forma inactiva que, después, se convierte directa o indirectamente a la forma activa por medio del inductor. En la presente descripción se puede usar cualquier promotor inducible (ver, Ward, et al., (1993) Plant Mol . Biol . 22:361-366).

Los ejemplos de elementos reguladores inducibles incluyen un elemento regulador de metalotioneína, un elemento regulador inducible por cobre o un elemento regulador inducible por tetracielína, la transcripción de los cuales puede realizarse en respuesta a iones metálicos divalentes, cobre o tetraciclína, respectivamente (Furst, et al., (1988) Cell 55:705-717; Mett, et al., (1993) Proc. Nati . Acad. Sci . , USA 90:4567-4571; Gatz, et al . , (1992) Plant J. 2:397-404; Roder, et al . , (1994) Mol . Gen. Genet . 243:32-38). Los elementos reguladores inducibles incluyen, además, un elemento regulador de ecdisona o un elemento regulador de glucocorticoide, la transcripción de los cuales puede realizarse en respuesta a la ecdisona u otro esteroide (Christopherson, et al., (1992) Proc. Nati. Acad. Sel., USA 89:6314-6318; Schena, et al., (1991) Proc. Nati. Acad. Sci.

USA 88:10421-10425; patente de los Estados Unidos núm. 6,504,082); un elemento regulador sensible al frió o un elemento regulador de choque térmico, la transcripción de los cuales puede realizarse en respuesta a la exposición al frío o calor, respectivamente (Takahashi, et al., (1992) Plant Physiol. 99:383-390); El promotor del gen de alcohol deshidrogenasa (Gerlach, et al., (1982) PNAS USA 79:2981-2985; Walker, et al., (1987) PNAS 84 (19):6624-6628), inducible por condiciones anaerobias; y el promotor inducible por luz derivado del gen rbcS del chícharo o el gen psaDb del chícharo (Yamamoto, et al., (1997) Plant J. 12 (2):255-265); un elemento regulador inducible por luz (Feinbaum, et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 226:449; Lam and Chua, (1990) Science 248:471; Matsuoka, et al., (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90 (20):9586-9590; Orozco, et al., (1993) Plant Mol. Bio. 23(6):1129-1138), un elemento regulador inducible por la hormona de la planta (Yamaguchi-Shinozaki, et al., (1990) Plant Mol. Biol. 15:905; Kares, et al., (1990) Plant Mol. Biol. 15:225), y similares. Un elemento regulador inducible puede ser, además, el promotor del gen del maíz In2-1 o In2-2, que se activa mediante protectores herbicidas de bencensulf onamida (Hershey, et al., (1991) Mol. Gen. Gene. 227:229-237; Gatz, et al., (1994) Mol. Gen. Genet . 243:32-38) y el represor Tet del transposón TnlO (Gatz, et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 221:229-231) . Los promotores inducibles por estrés incluyen los promotores inducibles por estrés de sal/agua tales como P5CS (Zang, et al., (1997) Plant Sciences 129:81-89); los promotores inducibles por frío, tales como corl5a (Hajela, et al., (1990) Plant Physiol. 93:1246-1252), corl5b (Wlihelm, et al., (1993) Plant Mol Biol 23:1073-1077), wscl20 (Ouellet, et al., (1998) FEBS Lett. 423:324-328), ci7 (Kirch, et al., (1997) Plant Mol Biol. 33:897-909), ci21A (Schneider, et al., (1997) Plant Physiol. 113:335-45); los promotores inducibles por sequía, tales como Trg-31 (Chaudhary, et al., (1996) Plant Mol. Biol. 30:1247-57), rd29 (Kasuga, et al., (1999) Nature Biotechnology 18:287- 291); los promotores inducibles osmóticos, tales como Rabl7 (Vilardell, et al., (1991) Plant Mol. Biol. 17:985-93) y osmotina (Raghothama, et al., (1993) Plant Mol Biol 23:1117-28) y los promotores inducibles por calor, tales como las proteínas de choque térmico (Barros, et al., (1992) Plant Mol. 19:665-75; Marrs, et al., (1993) Dev. Genet. 14:27-41), smHSP (Waters, et al., (1996) J. Experimental Botany 47:325-338) y el elemento inducible por choque térmico del promotor de la ubiquitina del perejil (patente núm. WO 03/102198). Otros promotores inducibles por estrés incluyen rip2 (patente de los Estados Unidos núm.5,332,808 y publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2003/0217393) y rd29a (Yamaguchi-Shinozaki, et al . , (1993) Mol . Gen . Genetics 236:331-340). Ciertos promotores son inducibles por lesiones e incluyen el promotor pmas de Agrobacterium (Guevara-Garcia, et al . , (1993) Plant J. 4 (3):495-505) y el promotor ORF13 de Agrobacterium (Hansen, et al . , (1997) Mol . Gen . Genet. 254(3):337-343).

Otros elementos reguladores activos en las células vegetales y útiles en los métodos o composiciones de ·la descripción incluyen, por ejemplo, el elemento regulador del gen nitrito reductasa de la espinaca (Back, et al . , (1991) Plant Mol . Biol . 17:9); un promotor de gamma zeina, un promotor de oleosina olel6, un promotor de globulina I, un promotor de actina I, un promotor de actina el, un promotor de sacarosa sintetasa, un promotor INOPS, un promotor EXM5, un promotor globulin2, un promotor b-32, ADPG-pirofosforilasa, un promotor Ltpl, un promotor Ltp2, un promotor de oleosina olel7, un promotor de oleosina olel8, un promotor de actina 2, un promotor de proteina especifico del polen, un promotor del gen de pectato liasa especifico del polen, o un promotor del gen PG47, un promotor del gen RTS2 especifico de anteras, promotor del gen SGB6 o promotor del gen G9, un promotor del gen RAB24 especifico del tapetum, un promotor subunidad alfa de antranilato sintasa, un promotor de alfa zeina, un promotor de la subunidad beta de antranilato sintasa, un promotor de dihidrodipicolinato sintasa, un promotor Thi 1, un promotor de alcohol deshidrogenasa, un promotor de la proteina de unión cab, un promotor H3C4, un promotor de la enzima de ramificación de almidón RUBISCO SS, un promotor de actin3, un promotor de actin7, un promotor de la proteina reguladora GF14-12, un promotor de la proteina ribosomal L9, un promotor de la enzima biosintética de celulosa, un promotor de S-adenosil-L-homocisteína hidrolasa, un promotor de superóxido dismutasa, un promotor del receptor de C-quinasa, un promotor de fosfoglicerato mutasa, un promotor de ARNm RCc3 especifico de la raíz, un promotor de glucosa-6 fosfato isomerasa, un promotor de pirofosfato-fructosa 6-fosfato-1-fosfotransferasa, un promotor de beta-cetoacil-ACP sintasa, un promotor del fotosistema 11 de 33 kDa, un promotor de la proteina de desarrollo de oxigeno, un promotor de la subunidad de ATPasa vacuolar de 69 kDa, un promotor de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, un promotor de la proteina de tipo inducible de ABA y de maduración, un promotor de fenilalanina amoniaco liasa, un promotor de adenosina trifosfatasa S-adenosil-L-homocisteína hidrolasa, un promotor de chalcona sintasa, un promotor de zeina, un promotor de globulina-1, un promotor de la proteina de unión a auxina, un promotor del gen de UDP glucosa flavonoide glicosil-transferasa, un promotor de NTI, un promotor de actina y un promotor de opaque 2.

Las plantas adecuadas para los propósitos de la presente descripción pueden ser monocotiledóneas o dicotiledóneas e incluyen, pero no se limitan a, maíz, trigo, cebada, centeno, camote, frijol, chícharo, achicoria, lechuga, col, coliflor, brócoli, nabo, rábano, espinaca, espárrago, cebolla, ajo, pimiento, apio, calabacín, calabaza común, cáñamo, calabacitas, manzana, pera, membrillo, melón, ciruela, cereza, melocotón, nectarina, chabacano, frutilla, uva, frambuesa, zarzamora, piña, aguacate, papaya, mango, plátano, frijol de soja, tomate, sorgo, caña de azúcar, betabel, girasol, semilla de colza, clavo, tabaco, zanahoria, algodón, alfalfa, arroz, papa, berenjena, pepino, Arabidopsis thaliana y plantas leñosas tales como los árboles coniferos y caducifolios en la medida que la alteración en la fertilidad masculina resulte en la utilización aumentada de nutrientes o el rendimiento de grano según el caso.

La homocigosidad es una condición genética existente cuando alelos idénticos se encuentran en loci correspondientes en cromosomas homólogos. La heterocigosidad es una condición genética existente cuando alelos distintos se encuentran en loci correspondientes en cromosomas homólogos. La hemicigosidad es una condición genética existente cuando hay una sola copia de un gen (o conjunto de genes) sin una contraparte alélica en el cromosoma hermano.

Los métodos de cultivo de plantas agrícolas usados en la presente descripción son conocidos para una persona con experiencia en la materia. Una descripción sobre las téenicas de cultivo de plantas agrícolas se encuentra disponible en Poehlman, (1987) Breeding Field Crops AVI Publication Co., Westport Conn. Muchas plantas especialmente preferidas en este método se cultivan a través de técnicas que emplean el método de polinización de la planta.

Para introducir un gen en las plantas se puede usar métodos de retrocruzamiento. Esta técnica se ha usado por décadas para introducir rasgos en una planta. Un ejemplo de una descripción de esta y otras metodologías de cultivo de plantas agrícolas muy conocidas pueden encontrarse en referencias tales como Plant Breeding Methodology, edit. Neal Jensen, John Wilcy & Sons, Inc. (1988). En un protocolo de retrocruzamiento típico, la variedad original de interés (progenitor recurrente) se cruza con una segunda variedad (progenitor no recurrente) que contiene el único gen de interés que se transferirá. Después, la progenie que resulta de este cruzamiento se cruza otra vez con el progenitor recurrente y el proceso se repite hasta que se obtiene una planta, en donde prácticamente todas las características morfológicas y fisiológicas deseadas para el progenitor recurrente se recuperan en la planta convertida, además del único gen transferido desde el progenitor no recurrente.

Transgen se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico que se introduce en el genoma de una célula mediante téenicas de ingeniería genética. Un transgén puede ser una secuencia de ADN nativo o una secuencia de ADN heterólogo (es decir, “ADN extraño”). El término secuencia de ADN nativo se refiere a una secuencia de nucleótidos que se encuentra, naturalmente, en la célula, pero que puede haberse modificado con respecto a su forma original.

Ciertas construcciones descritas en la presente descripción comprenden un elemento que interfiere con la formación, función o dispersión de gametos masculinos. Como ejemplo no limitante, esto puede incluir el uso de genes que expresan un producto citotóxico para los gametos masculinos (ver, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos núms. 5,792,853; 5,689,049; PCT/EP89/0095); inhiben la formación del producto de otro gen importante para la función o formación del gameto masculino (ver, las patentes de los Estados Unidos núm. 5,859,341; 6,297,426); se combinan con otro producto génico para producir una sustancia que evita la formación o función de genes (ver, las patentes de los Estados Unidos núms. 6,162,964; 6,013,859; 6,281,348; 6,399,856; 6,248,935; 6,750,868; 5,792,853); son anticodificantes para o causan la cosupresión de un gen fundamental para la función o formación de gametos masculinos (ver, las patentes de los Estados Unidos núms. 6,184,439; 5,728,926; 6,191,343; 5,728,558; 5,741,684); interfieren con la expresión a través del uso de formaciones de horquilla (Smith, et al., (2000) Nature 407:319-320; patente núm. WO 1999/53050 y patente núm. WO 1998/53083) o similares. Se conoce muchas secuencias de nucleótidos que inhiben la formación o función del polen y cualquier secuencia que logra esta función será suficiente. Una discusión sobre genes que pueden afectar el desarrollo o función apropiada se incluye en la patente de los Estados Unidos núm. 6,399,856 e incluye genes negativos dominantes, tales como genes de citotoxina, genes de metilasa y genes inhibidores del crecimiento. Los genes negativos dominantes incluyen el gen de la cadena A de la toxina de la difteria (Czako and An, (1991) Plant Physiol . 95:687-692. y Greenfield, et al., (1983) PNAS 80:6853, Palmiter, et al., (1987) Cell 50:435); mutantes de la división del ciclo celular tales como CDC en maíz (Colasanti, et al . , (1991) PNAS 88:3377-3381); el gen WT (Farmer, et al., (1994) Hum. Mol . Genet . 3:723-728) y P68 (Chen, et al., (1991) PNAS 88:315-319).

Otros ejemplos de los genes conocidos como “citotóxicos” se describieron anteriormente y pueden incluir, pero sin limitarse al, gen pectato liasa pelE, de Erwinia chrysanthermi (Kenn, et al., (1986) J. Bacteroil 168:595); el gen T-urfl3 de los genomas mitocondriales del maíz cms-T (Braun, et al. , (1990) Plant Cell 2:153; Dewcy, et al . , (1987) PNAS 84:5374); el gen de la toxina CytA de Bacillus thuringiensis Israeliensis que causa la alteración de la membrana celular (McLean, et al . , (1987) J. Bacteriol 169:1017, patente de los Estados Unidos núm. 4,918,006); DNAses, RNAses, (patente de los Estados Unidos núm. 5,633,441); proteasas o genes que expresan ARN anticodificante. Un gen adecuado puede codificar, además, una proteina implicada en la inhibición del desarrollo del pistilo, interacciones entre el polen y estigma, crecimiento o fertilización del tubo de polen o una combinación de estos. Además, pueden ser adecuados los genes que interfieren con la acumulación normal de almidón en el polen o afectan el equilibrio osmótico dentro del polen. Estos pueden incluir, por ejemplo, el gen alfa-amilasa del maíz, el gen beta-amilasa del maíz, enzimas de desramificación tales como Sugaryl y pululanasa, glucanasa y SacB.

En una modalidad ilustrativa, se usa el gen DAM-metilasa descrito anteriormente y en las patentes de los Estados Unidos núms. 5,792,852 y 5,689,049, el producto de expresión de los cuales cataliza la metilación de residuos de adenina en el ADN de la planta. En otra modalidad, un gen alfa-amilasa puede usarse con un promotor preferido para el tejido masculino. Durante el periodo de germinación inicial de las semillas de cereales, las células de la capa de aleurona sintetizarán .alfa.-amilasa, que participa en la hidrolización del almidón para formar glucosa y maltosa, para proporcionar los nutrientes necesarios para el crecimiento del germen (Rogers and Milliman, (1984) J. Biol . Chem. 259(19):12234-12240; Rogers, (1985) J. Biol . Chem. 260:3731-3738). En una modalidad, el gen .alfa.-amilasa que se usa puede ser el gen a-amilasa-1 de Zea mays. Véase, por ejemplo, Young, et al . , Plant Physiol . 105(2):759-760 y los números de acceso al GenBank L25805, GI:426481. Véase, además, la patente de los Estados Unidos núm. 8,013,218. Típicamente, las secuencias que codifican la oí-amilasa no se encuentran en células de polen y, cuando la expresión se dirige al tejido masculino, el resultado es una descomposición de la fuente de energía para los granos de polen y la represión de la función del polen.

Una persona con experiencia en esta área entenderá fácilmente que los métodos descritos en la presente descripción son particularmente aplicables a cualquier otro cultivo con potencial para el exocruzamiento. En forma ilustrativa, pero sin limitarse a, esto puede incluir maíz frijol de soja, sorgo o cualquier planta con capacidad para exocruzamiento.

La descripción contempla el uso de promotores que proporcionan una expresión preferida para el tejido que incluyen promotores que se expresan preferentemente en el tejido del gameto, masculino o femenino, de la planta. La descripción no requiere el uso de ningún promotor preferido para el tejido del gameto especifico en el proceso, y puede usarse cualquiera de los distintos promotores conocidos para una persona con experiencia en la materia. Como ejemplo, pero sin ser limitante, uno de esos promotores es el promotor 5126 que, preferentemente, dirige la expresión del gen al cual está unido al tejido masculino de las plantas, tal como se describe en las patentes de los Estados Unidos núms. 5,837,851 y 5,689,051. Otros ejemplos incluyen el promotor MS45 descrito en la patente de los Estados Unidos núm. 6,037,523, el promotor SF3 descrito en la patente de los Estados Unidos núm.6,452,069, el promotor BS92-7 o BS7 descrito en la patente núm. WO 2002/063021, el promotor SBMu200 descrito en la patente núm. WO 2002/26789, un elemento regulador de SGB6 descrito en la patente de los Estados Unidos núm. 5,470,359 y TA39 (Koltunow, et al . , (1990) Plant Cell 2:1201-1224; Goldberg, et al., (1993) Plant Cell 5:1217-1229 y patente de los Estados Unidos núm. 6,399,856. Ver, además, Nadeau, et al . , (1996) Plant Cell 8(2):213-39 y Lu, et al., (1996) Plant Cell 8(12):2155-68.

Preferentemente, las plantas incluyen maíz, frijol de soja, girasol, cártamo, cañóla, trigo, cebada, centeno, alfalfa y sorgo.

Toda la secuencia del promotor o porciones de esta pueden usarse como una sonda capaz de hibridarse específicamente a secuencias de promotores correspondientes. Para lograr la hibridación especifica en una gran variedad de condiciones, estas sondas incluyen secuencias que son únicas y tienen, preferentemente, una longitud de al menos aproximadamente 10 nucleótidos y, con la máxima preferencia, una longitud de al menos aproximadamente 20 nucleótidos. Tales sondas pueden usarse para amplificar secuencias de promotores correspondientes a partir de un organismo elegido mediante el proceso de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) conocido. Esta téenica se puede usar para aislar secuencias de promotores adicionales a partir de un organismo deseado o como un ensayo de diagnóstico para determinar la presencia de la secuencia del promotor en un organismo. Los ejemplos incluyen la selección por hibridación de genotecas de ADN cultivadas en placas (ya sea en placas o colonias; ver, por ejemplo, Innis, et al., (1990) PCR Protocole, A Guide to Methods and Applications, eds., Academic Press).

Generalmente, las secuencias que corresponden a una secuencia de un promotor de la presente descripción y que se hibridan a una secuencia de un promotor descrita en la presente descripción serán al menos 50 % homologas, 55 % homologas, 60 % homologas, 65 % homologas, 70 % homologas, 75 % homologas, 80 % homologas, 85 % homologas, 90 % homologas, 95 % homologas y aun 98 % homologas o más con la secuencia descrita.

Los fragmentos de una secuencia particular de un promotor descrita en la presente descripción pueden actuar para promover la expresión preferida para el polen de una secuencia de nucleótidos aislados unida operativamente. Estos fragmentos comprenderán al menos aproximadamente 20 nucleótidos contiguos, preferentemente, al menos aproximadamente 50 nucleótidos contiguos, con mayor preferencia, al menos aproximadamente 75 nucleótidos contiguos, aún con mayor preferencia, al menos aproximadamente 100 nucleótidos contiguos de las secuencias de nucleótidos particulares del promotor descritas en la presente descripción. Los nucleótidos de tales fragmentos comprenden, usualmente, la secuencia de reconocimiento TATA de la secuencia promotora particular. Tales fragmentos se pueden obtener mediante el uso de enzimas de restricción para escindir las secuencias de los promotores de origen natural descritas en la presente descripción; mediante síntesis de una secuencia de nucleótidos a partir de la secuencia de ADN de origen natural o a través del uso de teenología de PCR. Ver, particularmente, Mullís, et al., (1987) Methods Enzymol. 155:335-350 y Erlich, ed. (1989) PCR Technology (Stockton Press, New-York). Otra vez, las composiciones de la presente descripción abarcan las variantes de estos fragmentos, tal como aquellos que resultan de la mutagénesis sitio dirigida.

Por lo tanto, abarcan las secuencias de nucleótidos que comprenden al menos aproximadamente 20 nucleótidos contiguos de las secuencias expuestas en las sec. con núm. de ident.: 64 - 106/ 134-137; 142; 144; 149; 150. Estas secuencias se pueden aislar mediante hibridación, PCR, y similares. Tales secuencias abarcan fragmentos capaces de conducir la expresión preferida del polen, fragmentos útiles como sondas para identificar secuencias similares, asi como elementos responsables por la especificidad temporal o del tejido.

Las composiciones de la presente descripción también abarcan variantes biológicamente activas de la secuencia del promotor. Una “variante” reguladora es una forma modificada de un promotor, en donde una o más bases se han modificado, eliminado o añadido. Por ejemplo, una forma habitual para eliminar parte de una secuencia de ADN es usar una exonucleasa en conjunto con amplificación de ADN para producir deleciones anidadas unidireccionales de clones de ADN bicatenario. Un kit comercial para este propósito se vende con el nombre comercial Exo-Size™ (New England Biolabs, Beverly, Mass.). En síntesis, este procedimiento implica la incubación de exonucleasa III con ADN para eliminar progresivamente los nucleótidos en la dirección 3' a 5' en extremos de cadena simple, extremos romos o rupturas en 5' en la plantilla de ADN. Sin embargo, la exonucleasa III es incapaz de eliminar nucleótidos en extremos de cadena simple de 4 bases en 3'. Las digestiones temporizadas de un clon con esta enzima producen deleciones anidadas unidireccionales.

Un ejemplo de una variante de una secuencia reguladora es un promotor que se forma cuando se genera una o más deleciones en un promotor más grande. La deleción de la porción 5' de un promotor hasta la caja TATA cerca del sitio de inicio de la transcripción se puede realizar sin eliminar la actividad del promotor, tal como se describe en Zhu, et al . , (1995) The Plant Cell 7:1681-89. Tales variantes deberían retener la actividad del promotor, particularmente, la capacidad para dirigir la expresión en tejidos específicos. Las variantes biológicamente activas incluyen, por ejemplo, las secuencias reguladoras naturales de la descripción que tienen una o más sustituciones, deleciones o inserciones de nucleótidos. La actividad se puede medir mediante análisis Northern blot, mediciones de la actividad del reportero cuando se usan fusiones de transcripción y similares. Ver, por ejemplo, Sambrook, et al . , (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2.° ed. Coid Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.), incorporado en la presente descripción como referencia.

Las secuencias de nucleótidos para los promotores preferidos del polen descritos en la presente descripción, así como las variantes y fragmentos de estos, son útiles en la manipulación genética de cualquier planta cuando se unen operativamente con una secuencia de nucleótidos aislada cuya expresión se controlará para obtener una respuesta fenotípica deseada.

La regulación de la fertilidad masculina se mide, generalmente, en términos de su efecto sobre células individuales. Por ejemplo, se requiere una supresión en 99.99 % de los granos de polen para lograr una esterilidad confiable para uso comercial. Sin embargo, la supresión o la restauración exitosa de la expresión de otros rasgos pueden realizarse con menor rigurosidad. Dentro de un tejido específico, por ejemplo, la expresión en un porcentaje de 98 %, 95 %, 90 %, 80 % o menor de células puede producir el fenotipo deseado. Además, para la modificación de la partición de asimilación y/o competencia reducida por nitrógeno entre estructuras reproductoras masculinas y femeninas, la supresión de la fertilidad masculina en 50 % o aún menos puede ser eficaz y deseable.

Ejemplos Ejemplo 1. Aislamiento y caracterización de Ms44 El gen estéril masculino dominante, Ms44, surgió a través de un tratamiento de mutagénesis con EMS con base en la semilla de la línea de maíz W23 y se descubrió que estaba fuertemente vinculado al locus C2 en el cromosoma 4 (unión entre Ms44 y C2, Albertsen and Trimnell, (1992). MNL 66:49). Se realizó un método de clonación basado en mapas para identificar el gen Ms44. Se usó una población inicial de 414 individuos para el mapeo general de s44 al cromosoma 4. Se usó otra población de 2686 individuos para el mapeo específico. La genotipificación de Marker Lab redujo la región de la mutación a un intervalo de 0.43 cM en el cromosoma 4.

Se desarrollaron otros marcadores para el mapeo específico con el uso de los 39 recombinantes. La mutación de Ms44 se mapeó a la región de ~80 kb entre los marcadores preparados a partir de las secuencias AZM5_9212 (cinco recombinantes) y AZM5_2221 (2 recombinantes).

Se usaron iniciadores AZM5_9212 For4 (sec. con núm. de ident.: 1) y AZ 5_9212 Rev4 (sec. con núm. de ident.: 2) para una ronda inicial de PCR seguido de una segunda ronda de PCR con el uso de los iniciadores AZM5_9212 ForNest4 (sec. con núm. de ident.: 3) y AZM5_9212 RevNest4 (sec. con núm. de ident.: 4). Se realizó la digestión del producto de PCR con spI y se analizó el patrón de bandeo para determinar los genotipos en este locus.

Se usaron los iniciadores AZM5_2221 For3 (sec. con núm. de ident.: 5) y AZM5_2221 Rev3 (sec. con núm. de ident.: 6) para una ronda inicial de PCR seguido de una segunda ronda de PCR con el uso de los iniciadores AZM5_2221 ForNest3 (sec. con núm. de ident.: 7) y AZM5_2221 RevNest3 (sec. con núm. de ident.: 8). Se realizó la digestión del producto de PCR con Bsgl y se analizó el patrón de bandeo para determinar los genotipos en este locus.

Dentro del intervalo de ~80 kb Ms44, había una interrupción de secuenciación entre los BAC. La interrupción se secuenció y, dentro de esta región, se identificó un gen, pco641570. El primer codón Met se encontró en el nucleótido 1201, con un intrón de 101 bp en los nucleótidos 1505-1605 y el codón de terminación que finaliza en el nucleótido 1613 (sec. con núm. de ident.: 9). El gen tiene un marco de lectura abierto de 312 bp que codifica una proteína prevista de 104 aminoácidos (que incluye el codón de terminación) (sec. con núm. de ident.: 10). La proteína prevista tiene homología a diversas proteínas y contiene el dominio de acceso a InterProscan IPR003612, un dominio encontrado en los inhibidores de proteínas de transferencia de lípidos en las plantas/almacenamiento de semillas/tripsina-alfa amilasa. Se previo un sitio de escisión de la secuencia señal secretora (SSS) con el uso del análisis SigCleave en el aminoácido 23. (von Heijne, G. “A new method for predicting signal sequence cleavage sites” Nucleic Acids Res.: 14:4683 (1986). Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.O., Bendtsen JD, Nielsen H, von Heijne G, Brunak S., J Mol Biol. 2004, Jul 16;340(4):783-95. Von Heijne, G. “Sequence Analysis in Molecular Biology: Treasure Trove or Trivial Pursuit” Acad. Press (1987) 113-117. Ver, además, el programa SIGCLEAVE en el conjunto de aplicaciones en linea EMBOSS (European Molecular Biology Open Software Site)).

Sin embargo, el análisis SigCleave de ortólogos de ms44 en especies monocotiledóneas relacionadas muestra otro sitio de escisión potencial entre los aminoácidos 37 y 38. La proteina es rica en cisteina y el análisis BlastP muestra la mayor homología a genes específicos del tapetu o antera de la planta tales como los genes Lims o A9. (The characterization of tapetum-specific cDNAs isolated from a Lilium henryi L. meiocyte subtractive cDNA library. Crosslcy, et al., (1995) Planta . 196(3):523-529. The isolation and characterization of the tapetum-specific Arabidopsis thaliana A9 gene. Paul, et al . , (1992) Plant Mol Biol . 19(4):611-22.).

El análisis de RT-PCR se realizó en ADNc de hojas y anteras en desarrollo para evaluar la expresión del gen ms44. Los iniciadores específicos de Ms44 pco641570-5' (sec. con núm. de ident: 11) y pco641570-3'-2 (sec. con núm. de ident.: 12) en una reacción de RT-PCR con plantilla de ADNc de anteras de 0.5 m, 1.0 mm, 1.5 mm y 2.0 m; anteras en célula madre del polen (PMC), Quartet, etapas tempranas uninucleares y binucleares del desarrollo de microesporas/polen y hoja. Se usó, además, ADN genómico como una plantilla. La expresión de ms44 se inicia temprano en la etapa de la PMC y continúa a través de las etapas de microesporas nucleadas tempranas y de cuarteto, pero está ausente en la etapa binuclear del desarrollo del polen. No se detectó expresión en las hojas.

El gen pco641570 se secuenció a partir del mutante Ms44. El primer codón Met se encuentra en el nucleótido 1222, con un intrón de 101 bp en los nucleótidos 1526-1626 y el codón de terminación que finaliza en el nucleótido 1634 (sec. con nú . de ident.: 13). El análisis de secuencias reveló un cambio de nucleótidos que produce un cambio traduccional de un residuo de alanina a un residuo de treonina en el aminoácido 37 en la proteina prevista (sec. con núm. de ident.: 14). Este cambio de nucleótidos creó, además, un sitio de restricción de BsmFl en el mutante del alelo que no se encuentra en el tipo silvestre lo que permite distinguir los dos alelos mediante amplificación de ambos alelos de Ms44 por PCR y la digestión posterior de los productos por BsmFl.

MsD-2629 es otro mutante estéril masculino dominante encontrado en el maiz y, además, se generó a través de mutagénesis con EMS. Este mutante se mapeó y se determinó que se encuentra en el cromosoma 4 muy cerca del gen Ms44. Para determinar si MsD-2629 era un alelo de Ms44, el gen Ms44 se amplificó por PCR y se secuenció a partir de plantas estériles masculinas de MsD-2629. Se encontró dos alelos diferentes a través de secuenciación. Uno era el alelo silvestre y el segundo alelo tenia un solo cambio de nucleótido (sec. con núm. de ident.: 152) que produce un cambio traduccional a partir del mismo residuo de alanina que Ms44, pero a una valina en el aminoácido 37 en la proteina prevista (sec. con núm. de ident.:153). Este alelo se encontró en todas las plantas estériles masculinas MsD-2629 probadas y no estaba presente en hermanos fértiles masculinos. El mutante MsD-2629 representa un segundo alelo Ms44 y se designó como Ms44-2629.

Ambas mutaciones en MS44 afectan el mismo residuo de Alanina en la posición 37 y ese aminoácido está implicado a través del análisis de SignalCleave como el posible sitio de escisión -1 SS, se realizaron reacciones de transcripción/traducción (TNT) in vitro (EasyXpress Insect Kit II, Qiagen, Cat # 32561) para evaluar la escisión de variantes de proteínas MS44 que se hablan diseñado con varias sustituciones de aminoácidos sobre la base de la conservación de aminoácidos alrededor de los sitios de escisión SS (Patterns of Amino Acids near Signal-Sequence Cleavage Sites. Gunnar Von Heijne (1983) Eur. J. Biochem. 133,17-21). El ensayo TnT in vitro mostró que la proteína ms44 silvestre (-1 Ala) se procesa hasta una forma madura más pequeña, mientras que no sucede lo mismo con el mutante Ms44 (-1 Thr). La proteina Ms44-2629 (-1 Val) no se procesa, ni la +1 Pro, pero una proteina control -1 Gly se procesa, normalmente, (Figura 16). Este resultado confirma que el sitio de escisión SS está entre los aminoácidos 37 y 38.

Para confirmar que esta mutación era responsable del fenotipo estéril masculino dominante, la región genómica se clonó para este alelo que contenia aproximadamente 1.2 Kb de secuencia corriente arriba (el promotor putativo) y aproximadamente 0.75 KB de secuencia corriente abajo del codón de terminación. Esta secuencia genómica se subclonó en un vector de transformación y se designó como PHP42163. El vector se usó para transformar plantas de maíz a través de transformación mediada por Agrobacterium. Se cultivaron treinta y seis plantas T0 hasta la madurez y las panojas se fenotipificaron para determinar la presencia o ausencia de polen. Treinta y cuatro de las treinta y seis plantas eran completamente masculinas estériles. El ADN de estas plantas transgénicas se genotipificaron con el uso de los iniciadores pco641570-5' (sec. con nú . de ident.: 11) y pco641570-3'-2 (sec. con núm. de ident.: 12) en una reacción de PCR y, después, se procesaron por digestión con BsmFl y se probaron en un gel de agarosa al 1 %. Las treinta y cuatro plantas estériles masculinas contenían el alelo del mutante Ms44 tal como se evidenció por la presencia de dos bandas más pequeñas producidas por digestión con BsmFl. Por genotipado se encontró que las dos plantas fértiles masculinas restantes no contenían el alelo MS44 y muy probablemente surgieron a través de algún reordenamiento en el vector durante la transformación. Esto confirma que el único cambio de nucleótido en el alelo Ms44 produce un fenotipo estéril masculino dominante.

La mutación puntual en el gen Ms44 cambia un codón de Ala a un Thr, con un segundo alelo que tiene un cambio de Ala a Val. Se propone que el aminoácido afectado está en la posición -1 del sitio de escisión de SS y las dos mutaciones eliminan la escisión de SS de MS44 tal como se muestra mediante los ensayos TnT in vitro. Sin limitaciones teóricas de ninguna especie, la dominancia de la mutación puede ser el resultado de un defecto en el procesamiento de la proteína a través del retículo endoplasmático (ER) y no de un rol funcional del producto del gen ms44 como una proteína de transferencia de lípidos. Dado que la proteína MS44 es rica en cisteína, una proteína Ms44 unida al ER se puede reticular a través de puentes disulfuro e inhibir el procesamiento total de la proteína en la antera lo que es requerido, en última instancia, para la fertilidad masculina.

Ejemplo 2. Identificación del promotor preferido de la panoja En los transgénicos, se puede combinar un vector de genes negativos dirigidos por el promotor preferido de la panoja o mutantes de esterilidad masculina con otros vectores que mejoran el crecimiento vegetativo o de la espiga. La combinación entre la reducción de la panoja y la mejora de otros órganos puede ser eficaz para desviar nutrientes a la espiga para mejorar el rendimiento.

Los promotores preferidos de la panoja pueden usarse para dirigir el silenciamiento del gen Tlsl en la panoja para reducir o desactivar la función del gen en este tejido. Esto reducirá el desarrollo de la panoja, mientras que la función del gen en la espiga permanece sin afectación significativa. El uso de los promotores preferidos de la panoja no se limita al gen Tlsl, este puede aplicarse al direccionamiento de la expresión de cualquier gen en tejidos de panoja para afectar negativamente el crecimiento del tejido, por ejemplo, para afectar la antera, el polen, o cualquier célula que pueda afectar, en última instancia, la fertilidad masculina. Los candidatos del promotor especifico de la panoja se identifican sobre la base de sus patrones de expresión nativa y se clonan y prueban en plantas transgénicas para confirmar su especificidad por la panoja.

En una modalidad, los promotores preferidos de la panoja pueden usarse, además, para expresar o suprimir un gen, de manera que la expresión o supresión resulta en un mayor desarrollo de la panoja. caracterización del mutante tlsl El mutante tassel-less ( tlsl) se describió y mapeó en el brazo largo del cromosoma 1 (Albertsen, et al . , (1993) Maize Genetics Newsle tter 67:51-52). Una población F2 pequeña de 75 individuos generada por el cruzamiento de plantas homocigotas tlsl (fondo desconocido) con Mol7, se genotipificó para confirmar la posición de tlsl identificada anteriormente. Se encontró que la mutación estaba ubicada entre dos marcadores de SNP, MZA5484-22 y MZA10765-46. Estos marcadores se usaron para identificar recombinantes en una población F2 más grande, de 2985 individuos. Todos los recombinantes se seleccionaron para autopolinización y se recolectaron 177 espigas de F3. Se cultivaron 177 familias de F3 en filas en el campo. Se consideraron los fenotipos para todos los individuos en filas para determinar cada linea de F2 como tlsl homocigota tipo silvestre, heterocigota u homocigota. Se agruparon perforaciones de hojas de 8 individuos de cada familia de F3 para la genotipificación. Con el uso de estas lineas se confirmó que tlsl estaba entre los marcadores MZA5484 y MZA10765 que se transformaron en marcadores CAPS.

Los iniciadores MZA5484-F768 (sec. con núm. de ident.: 28) y MZA5484-R (sec. con núm. de ident.: 29) se usaron para amplificar el locus de MZA5484. Se realizó la digestión del producto de PCR con Mwol y se analizó el patrón de bandeo para determinar los genotipos en este locus.

Los iniciadores MZA10765-F429 (sec. con núm. de ident.: 30) y MZA10765-R1062 (sec. con núm. de ident.: 31) se usaron para amplificar el locus de MZA10765. Se realizó la digestión del producto de PCR con Bsll y se analizó el patrón de bandeo para determinar los genotipos en este locus.

Se usaron marcadores adicionales para el mapeo especifico de la mutación de s con las 177 familias de F3. La mutación de t s se mapeó entre los marcadores c0375b06_10 y c0260el3_35.

Los iniciadores c0375b06_10-For (sec. con núm. de ident.: 32) y c0375bl6_10-Rev (sec. con núm. de ident.: 33) se usaron para amplificar el locus c0375b06_10. El producto de PCR para esta reacción se usó como plantilla para una segunda reacción con el uso de los iniciadores c0375b06_10-ForNest (sec. con núm. de ident.: 34) y c0375b06_10-RevNest (sec. con núm. de ident.: 35). Este producto de PCR se procesó por digestión con MboII y se analizó el patrón de bandeo para determinar los genotipos en este locus.

Los iniciadores c0260el3_35-For (sec. con núm. de ident.: 36) y c0260el3_35-Rev (sec. con núm. de ident.: 37) se usaron para amplificar el locus c0260el3_35. El producto de PCR para esta reacción se usó como plantilla para una segunda reacción con el uso de los iniciadores c0260el3_35-ForNest (sec. con núm. de ident.: 38) y c0260el3_35-RevNest (sec. con núm. de ident.: 39). Este producto de PCR se procesó por digestión con Hphl y se analizó el patrón de bandeo para determinar los genotipos en este locus.

El intervalo físico entre los marcadores flanqueantes c0375b06_10 y c0260el3_35 contenían aproximadamente cuatro clones BAC secuenciados sobre la base del mapa físico de B73. La secuenciación de regiones con un número bajo de copias dentro de este intervalo reveló un nivel muy bajo de polimorfismo y los pocos marcadores disponibles se cosegregaron con el fenotipo de . Todos los genes anotados en este intervalo se secuenciaron para identificar la mutación causante. Un gen, anotado como proteína de la membrana integral de tipo NOD26/aquaporina/ZmNIP3-l (de aqui en adelante mencionado como NIP3-1) (sec. con núm. de ident.: 62 - secuencia genómica de B73; sec. con núm. de ident.: 63 - CDS de B73, sec. con núm. de ident.: 107 proteína NIP3-1) no se pudo amplificar en individuos t s homocigotas, pero si se amplificó en líneas heterocigotas y homocigotas tipo silvestre.

Los pares de iniciadores c0297ol2_75-For (sec. con núm. de ident.: 40) y c0297ol2_75-Rev (sec. con núm. de ident.: 41), c0297ol2_76-For (sec. con núm. de ident.: 44) y c0297ol2_76-Rev (sec. con núm. de ident.: 45), c0297ol2_77- For (sec. con núm. de ident.: 48) y c0297ol2_77-Rev (sec. con núm. de ident.: 49), c0297ol2_78-For (sec. con núm. de ident.: 52) y c0297ol2_78-Rev (sec. con núm. de ident.: 53) se usaron para amplificar el NIP3-1 que abarcaba la región genómica. Los productos de PCR a partir de estas reacciones se usaron como plantillas para segundas reacciones con el uso de los pares de iniciadores correspondientes: c0297ol2_75-ForNest (sec. con núm. de ident.: 42) y c0297ol2_75-RevNest (sec. con núm. de ident.: 43), c0297ol2_76-ForNest (sec. con núm. de ident.: 46) y c0297ol2 76-RevNest (sec. con núm. de ident.: 47), c0297ol2 77-ForNest (sec. con núm. de ident.: 50) y c0297ol2_77-RevNest (sec. con núm. de ident.: 51), c0297ol2_78-ForNest (sec. con núm. de ident.: 54) y c0297ol2_78-RevNest (sec. con núm. de ident.: 55).

Se construyó una genoteca de BAC a partir de plantas s homocigotas para determinar la naturaleza de la mutación. La secuenciación de clones de BAC que cubren el locus de s reveló una deleción de aproximadamente 6.6 kb en comparación con el genoma de referencia de B73 que corresponde a la región de NIP3-1. Además, en su lugar había aproximadamente 9 kb de secuencia repetitiva. Por lo tanto, es probable que el fenotipo de t s se deba a la deleción de NIP3-1 en plantas mutantes homocigotas.

Validación del candidato Las lineas TUSC con inserciones de Mutator (Mu) en el NIP3.1 se identificaron para validar el gen candidato. Se confirmó que dos lineas TUSC independientes, put-tlsl-P30D5 y put-tlsl-Pl77FlO, mediante PCR y secuenciación, tenían inserciones Mu dentro de NIP3-1.

Se usaron los iniciadores específicos de NIP3-1 D0143578 (sec. con núm. de ident.: 56), D0143579 (sec. con núm. de ident.: 57), D0143584 (sec. con núm. de ident.: 58), o D0143583 (sec. con núm. de ident.: 59) en conjunto con el iniciador específico de Mu, MuExt22D (sec. con núm. de ident.: 60) para amplificar las regiones de unión de NIP3-1 y Mutator. Los productos de PCR a partir de estas reacciones se usaron como plantillas para segundas reacciones con el uso de los mismos iniciadores específicos de NIP3-1 en conjunto con otro iniciador específico de Mu, Mulntl9 (sec. con núm. de ident.: 61). El producto de PCR se probó en un gel, las bandas principales se eliminaron, el ADN se extrajo con el uso de un kit de purificación en gel (Qiagen) y se secuenció. Los resultados de la secuenciación se analizaron en BLAST para confirmar la inserción de Mu en NIP3-1.

Las lineas de TUSC mencionadas anteriormente, que contenían una inserción Mu en NIP3-1, se usaron en una prueba de alelismo. Las lineas de TUCS que eran heterocigotas para la inserción de Mu se usaron para polinizar plantas F3 heterocigotas en el locus tlsl . Las progenies resultantes se fenotipificaron y genotipificaron. Las plantas se genotipificaron tal como se describe más abajo: Para confirmar que una progenie de la prueba de alelismo contenía una inserción Mu en NIP3-1 se usó c0297ol2_75-Rev (sec. con núm. de ident.: 41), c0297ol2_76-For (sec. con núm. de ident.: 44), c0297ol2_76-Rev (sec. con núm. de ident.: 45), c0297ol2_77-For (sec. con núm. de ident.: 48), c0297ol2_77-Rev (sec. con núm. de ident.: 49), D0143583 (sec. con núm. de ident.: 59) y D0143584 (sec. con núm. de ident.: 58) en conjunto con el iniciador específico de Mu, MuExt22D (sec. con núm. de ident.: 60). Los productos de PCR de estas reacciones se usaron como plantillas para segundas reacciones con el uso de c0297ol2_75-RevNest (sec. con núm. de ident.: 43), c0297ol2_76-ForNest (sec. con núm. de ident.: 46), c0297ol276-RevNest (sec. con núm. de ident.: 47), c0297ol277-ForNest (sec. con núm. de ident.: 50), c0297ol2_77-RevNest (sec. con núm. de ident.: 51), D0143583 (sec. con núm. de ident.: 59) y D0143584 (sec. con núm. de ident.: 58), respectivamente, en conjunto con el iniciador especifico de Mu, Mulntl9 (sec. con núm. de ident.: 61). Un producto de PCR positivo indicó la presencia de una inserción de Mu.

Para determinar si una progenie de la prueba de alelismo heredó el alelo de s tipo silvestre o de referencia, se usó c0297ol2_75-For (sec. con núm. de ident.: 40) en conjunto con c0297ol2_75-Rev (sec. con núm. de ident.: 41) y c0297ol2_77-For (sec. con núm. de ident.: 48) se usó en conjunto con c0297ol2_77-Rev (sec. con núm. de ident.: 49). Los productos de PCR de estas reacciones se usaron como plantillas para segundas reacciones con el uso de c0297ol2_75-ForNest (sec. con núm. de ident.: 42) en conjunto con c0297ol2_75-RevNest (sec. con núm. de ident.: 43) y c0297ol2_77-ForNest (sec. con núm. de ident.: 50) en conjunto con c0297ol2_77- RevNest (sec. con núm. de ident.: 51), respectivamente.

Los resultados de la tipificación fenotipica de la prueba de alelismo se compararon con los resultados de la genotipificación. Los individuos sin una inserción Mu eran tipo silvestre. De los individuos que contenían una inserción Mu, aquellos que contenían el alelo tipo silvestre de NIP3-1 tenían un fenotipo tipo silvestre mientras que aquellos que tenían el alelo mutante de NIP3-1 tenían mayormente un fenotipo tlsl. Las pocas aberraciones se atribuyeron a la penetración incompleta del fenotipo de tsll, que se ha observado en la descripción original del mutante de tlsl ( MNL 67:51-52) y en el presente estudio.

Ejemplo 4. Protocolo de ensayo de plántulas con bajo contenido de nitrógeno Las semillas producidas por las plantas transgénicas se separan en transgén (heterocigotas) y semilla nula por medio del uso de un marcador de color de la semilla. Se hicieron dos asignaciones aleatorias diferentes de tratamientos para cada bloque de 54 macetas, arregladas en 6 filas por 9 columnas y con el uso de 9 réplicas de todos los tratamientos. En un caso, la semilla nula de 5 eventos de la misma construcción se mezcla y se usa como control para la comparación de los 5 eventos positivos en este bloque, y se realizan 6 combinaciones de tratamiento en cada bloque. En el segundo caso, 3 tratamientos transgénicos positivos y sus correspondientes nulos se asignan aleatoriamente a las 54 macetas del bloque, y se realizan 6 combinaciones de tratamiento para cada bloque, que contiene 9 réplicas de todas las combinaciones de tratamiento. En el primer caso, los parámetros transgénicos se comparan con una construcción nula agrupada; en el segundo caso, los parámetros transgénicos se comparan con el evento nulo correspondiente. En los casos en donde habían 10, 15 o 20 eventos en una construcción, los eventos se asignan en grupos de 5 eventos, las varianzas se calcularon para cada bloque de 54 macetas, pero los promedios del bloque nulo se agruparon a través de los bloques antes que se realizaran las comparaciones promedio.

Dos semillas de cada tratamiento se siembran en macetas de 10 cm cuadrados (4 pulgadas cuadradas) que contienen TURFACE®-MVP en 20 cm (8 pulgadas), centros escalonados y se riegan cuatro veces cada día con una solución que contiene los siguientes nutrientes: 1 mM CaC12 2 mM MgS04 0.5 mM KH2P04 83 ppm Sprint330 3 mM KC1 1 mM KN03 1 uM ZnS04 1 uM MnC12 3 uM H3B04 1 uM MnC12 0.1 uM CuS04 0.1 uM NaMo04 Después de la emergencia, las plantas se dispersan a una semilla por maceta. Los tratamientos de rutina se siembran un lunes, emergen el siguiente viernes y se cosechan 18 dias después de sembrarlos. En la cosecha, las plantas se retiran de las macetas y se lava la Turface® de las raíces. Las raíces se separan del brote, se colocan en una bolsa de papel y se secan a 70 °C durante 70 h. Las partes secas de la planta (raíces y brotes) se pesan y se colocan en un tubo cónico de 50 mi con aproximadamente 20 bolas de acero de 0.39 cm (5/32 pulgadas) y se trituran por medio de agitación en una mezcladora de pintura. Aproximadamente, 30 mg del tejido triturado se hidroliza (peso registrado para ajuste posterior) en 2 mi de ¾(¾ al 20 % y 6 M de H2SO4 durante 30 min a 170 °C. Después de enfriar se agrega agua hasta 20 i, se mezcla completamente y se retira una alícuota de 50 ml y se añade a 950 ml de Na2CO3 1 M. En esta solución se usa amoníaco para calcular el total de nitrógeno reducido en la planta al colocar 100 m? de esta solución en los pocilios individuales de una placa de 96 pocilios seguido de la adición de 50 m? de solución OPA. La fluorescencia, excitación = 360 nM/emisión = 530 nM se determina y se compara con los estándares de NH4C1 disuelto en una solución similar y tratado con solución OPA.

OPA solución - 5 ul mercaptoetanol + 1 mi OPA solución madre (preparada fresca, diariamente) OPA materia prima - 50 mg o-ftadialdehído (OPA - Sig a núm. P0657) disuelto en 1.5 mi de metanol + 4.4 mi 1 M de regulador de borato pH9.5 (3.09 g de H3B04 + 1 g de NaOH en 50 mi de agua) + 0.55 mi 20 % SDS (preparada fresca, semanalmente) Los siguientes parámetros se miden con el uso de estos datos y los medios se comparan con los parámetros del medio nulo con el uso de una prueba t de Student: Biomasa total de la planta Biomasa radicular Biomasa de los brotes Relación raiz/brote Concentración N de la planta Total N de la planta La variación se calcula dentro de cada bloque con el uso de cálculos de elementos afines, asi como mediante el análisis de varianza (ANOV) con el uso de un modelo de diseño completamente aleatorio (CRD). Se calculó un efecto global del tratamiento para cada bloque con el uso de una estadística F por medio de dividir el cuadrado promedio del tratamiento global del bloque por el cuadrado promedio del error global del bloque.

Ejemplo 5. Ensayo de lineas de maíz derivadas de Gaspe Bay Flint en condiciones de limitación de nitrógeno Las plantas transgénicas contendrán dos o tres dosis de Gaspe Flint-3 con una dosis de GS3 (GS3/(Gaspe-3)2X o de GS3/(Gaspe-3)3X) y segregarán 1:1 para un transgén dominante. Las plantas se sembrarán en TURFACE®, un medio comercial para macetas y se regarán cuatro veces cada día con 1 M del medio de crecimiento de KN03 y con 2 mM del medio de crecimiento de KNO3 o más, medio de crecimiento. Las plantas de control cultivadas en medio de 1 mM de KN03 son menos verdes, producen menos biomasa y tienen una espiga más pequeña en antesis. Los resultados se analizan por su importancia estadística.

La expresión de un transgén resultará en plantas con crecimiento mejorado en 1 mM de KNO3 cuando se compara con un nulo transgénico. Asi, la biomasa y el verdor serán monitoreados durante el crecimiento y comparado con un nulo transgénico. Las mejoras en el crecimiento, verdor y tamaño de la espiga en antesis serán indicadores de la eficacia aumentada de uso del nitrógeno.

Ejemplo 6. Pruebas para determinar alteraciones en la arquitectura radicular en el maíz Las plantas de maíz transgénico se analizan para identificar cambios en la arquitectura radicular en la etapa de plántula, al momento de floración o de madurez. Las pruebas para medir las alteraciones en la arquitectura radicular de las plantas de maíz incluyen, pero no se limitan a, los métodos descritos a continuación. Para facilitar las pruebas manuales o automatizadas de las alteraciones en la arquitectura radicular, las plantas de maíz se pueden cultivar en macetas vacías. 1) Masa de la raíz (pesos secos). Las plantas se cultivan en Turface®, un medio de crecimiento que permite la separación fácil de las raíces.

Los tejidos de brotes y raíces que se secan en el horno se pesan y se calcula una relación raíz/brote. 2) Niveles de ramificación de raíces laterales. La cantidad de lateral de ramificaciones de las raíces laterales (por ejemplo, la cantidad de raíces laterales, la longitud de las raíces laterales) se determina mediante el submuestreo de un sistema radicular completo, la obtención de imágenes con un escáner de base plana o una cámara digital y el análisis con el programa WinRHIZO™ (Regent Instruments Inc.). 3) Mediciones de la anchura de la banda radicular.

La banda radicular es la banda o masa de raíces que se forma en el fondo de las macetas de invernadero conforme la planta madura. El espesor de la banda radicular se mide en mm en la madurez como un cálculo aproximado de la masa de la raiz. 4) Conteo de raíces nodales. El número de raíces de corona que surgen de los nodulos superiores se puede determinar después de separar la raíz del medio de soporte (por ejemplo, mezcla para macetas). Además, puede medirse el ángulo de las raíces de corona y/o raíces de anclaje. El análisis digital de las raíces nodales y la cantidad de ramificaciones de las raíces nodales forman otra extensión del método manual mencionado anteriormente.

Todos los datos tomados del fenotipo radicular están sujetos al análisis estadístico, normalmente, una prueba t para comparar las raíces transgénicas con las raíces de plantas hermanas no transgénicas. La prueba ANOVA unidireccional también se puede usar en casos en donde se involucran múltiples eventos y/o construcciones en el análisis .

Ejemplo 7. Ensayo de NUE para el crecimiento de la planta Las semillas de Arabidopsis thaliana (línea control y transgénica), ecotipo Columbia, se esterilizan en la superficie (Sánchez, et al. , 2002) y, después, se siembran en el medio Murashige y Skoog (MS) que contiene Bacto™-Agar (Difeo) al 0.8 % (p/v). Las placas se incuban por 3 días en la oscuridad a 4 °C para romper el reposo (estratificación) y se transfieren a cámaras de crecimiento (Conviron, Manitoba, Canadá) a una temperatura de 20 °C bajo un ciclo 16-h luz/8-h oscuridad. La intensidad promedio de la luz es 120 pE/m2/s. Las plántulas se cultivan por 12 días y, después, se transfieren a macetas en el suelo. Las plantas en macetas se cultivan en un suelo libre de nutrientes LB2 Metro-Mix® 200 (Scott's Sierra Horticultural Products, Marysville, OH, Estados Unidos) en macetas individuales de 3.8 cm (1.5 pulgadas) (Arabidopsis system; Lehle Seeds, Round Rock, TX, Estados Unidos) en cámaras de crecimiento, tal como se describió anteriormente. Las plantas se riegan con 0.6 o 6.5 mM de nitrato de potasio en la solución nutriente basado en el medio de Murashige y Skoog (MS sin nitrógeno). La humedad relativa se mantiene alrededor del 70 %. Los brotes de las plantas se recolectan 16-18 dias después para evaluar las lecturas de biomasa y SPAD.

Ejemplo 8. Transformación de maíz mediada por Agrobacterium Las plantas de maíz pueden transformarse para sobreexpresar una secuencia de ácido nucleico de interés para examinar el fenotipo resultante.

La transformación de maíz mediada por Agrobacterium se realiza prácticamente como lo describen Zhao, et al . , (2006) Meth . Mol . Biol . 318:315-323 (ver, además, Zhao, et ai., (2001) Mol . Breed. 8:323-333 y la patente de los EE. UU. núm. 5,981,840 concedida el 9 de noviembre de 1999, incorporada en la presente descripción como referencia). El proceso de transformación requiere inoculación bacteriana, cocultivo, reposo, selección y regeneración vegetal. 1. Preparación de embriones inmaduros Los embriones inmaduros se separan de los cariopsos y se colocan en un microtubo de 2 mi que contiene 2 mi de medio PHI-A. 2. Infección de Agrobacterium y cocultivo de embriones 2.1 Etapa de infección El medio PHI-A se elimina con una micropipeta de 1 mi y se agrega 1 mi de suspensión de Agrobacterium. El tubo se invierte cuidadosamente para mezclar. La mezcla se incuba durante 5 min a temperatura ambiente. 2.2 Etapa de cocultivo La suspensión de Agrobacterium se retira de la etapa de infección con una micropipeta de 1 mi. Con el uso de una espátula estéril, los embriones se desprenden del tubo y se transfieren a una placa de medio PHI-B en una caja petri de 100x15 mm. Los embriones se orientan con su eje hacia abajo sobre la superficie del medio. Las placas con los embriones se cultivan a 20 °C, en la oscuridad, durante 3 dias. Se puede usar L-cisteina en la fase de cocultivo. Con el vector binario estándar, el medio de cocultivo proporcionado con 100-400 mg/1 de L-cisteina es critico.para recuperar eventos transgénicos estables. 3. Selección de eventos transgénicos putativos A cada placa del medio PHI-D en una caja Petri 100x15 mm, se transfiere 10 embriones, se mantiene la orientación y se sellan las placas con Parafilm®. Las placas se incuban en la oscuridad a 28 °C. Se espera que los eventos putativos de crecimiento activo, tales como el tejido embriónico amarillo pálido, sean visibles en 6-8 semanas. Los embriones que no producen eventos pueden ser cafés y necróticos y el poco crecimiento de tejido friable es evidente. El tejido embriónico transgénico putativo se subcultiva en placas de PHI-D fresco en intervalos de 2-3 semanas, dependiendo del indice de crecimiento. Se registran los eventos. 4. Regeneración de plantas TQ El tejido embriónico propagado en medio PHI-D se subcultiva hasta el medio PHI-E (medio de maduración de embriones somáticos) en placas Petri de 100x25 mm y se incuba a 28 °C, en la oscuridad, hasta que los embriones somáticos maduran durante aproximadamente de 10 a 18 dias. Los embriones somáticos maduros e individuales con escutelo y coleóptilo bien definidos se transfieren al medio de germinación de embriones PHI-F y se incuban a 28 °C en la luz (aproximadamente a 80 mE de las lámparas de luz blanca o lámparas fluorescentes equivalentes). En 7-10 dias, las plantas regeneradas de aproximadamente 10 cm de altura se colocan en macetas en una mezcla hortícola y endurecida con el uso de métodos hortícolas estándar.

Medios para la transformación vegetal 1. PHI-A: 4 g/1 de sales básales de CHU, 1.0 ml/1 de mezcla de vitaminas de Eriksson 1000X, 0.5 mg/1 de tiamina HCL, 1.5 mg/1 de 2,4-D, 0.69 g/1 de L-prolina, 68.5 g/1 de sacarosa, 5 36 g/1 de glucosa, pH 5.2. Adicionar 100 mM acetosiringona, filtrar de manera esteril antes de usar. 2. PHI-B: PHI-A sin glucosa, 2,4-D incrementado a 2 mg/1, sacarosa reducida a 30 g/1 y 10 suplementado con 0.85 mg/1 de nitrato de plata (esterilizado con filtro), 3.0 g/1 de Gelrite®, 100 mM de acetosiringona (esterilizada con filtro), pH 5.8. 3. PHI-C: PHI-B sin Gelrite® y acetosiringona, 15 2,4-D reducido a 1.5 mg/1 y suplementado con 8.0 g/1 de agar, 0.5 g/1 de regulador Ms-ácido morfolino etano sulfónico (MES), 100 mg/1 de carbenicilina (esterilizada con filtro). 4. PHI-D: PHI-C complementado con 3 mg/1 de 20 bialafos (esterilizado con filtro). 5. PHI-E: 4.3 g/1 de sales de Murashige y Skoog (MS), (Gibco, BRL 11117-074), 0.5 mg/1 de ácido nicotinico, 0.1 mg/1 de tiamina HCl, 0.5 mg/1 de piridoxina HC1, 2.0 mg/1 de glicina, 0.1 g/1 de 25 mio-inositol, 0.5 mg/1 de zeatina (Sigma, cat. núm. Z—0164), 1 mg/1 de ácido indol acético (AIA), 26.4 mg/l de ácido abscisico (ABA), 60 g/1 de sacarosa, 3 mg/1 de bialafos (esterilizado con filtro), 100 mg/1 de carbenicilina (esterilizada con filtro), 8 g/1 de agar, pH 5.6. 6. PHI-F: PHI-E sin zeatina, IAA, ABA; sacarosa reducida a 40 g/1; reemplazo del agar con 1.5 g/1 de Gelrite®; pH 5.6.

Las plantas se pueden regenerar a partir de los callos transgénicos si se transfiere primero grupos de tejido a medio N6 suplementado con 0.2 mg por litro de 2,4-D. Después de dos semanas, el tejido se puede transferir a medio de regeneración (From , et al . , (1990) Bio/Technology 8:833-839).

Se puede realizar el análisis fenotipico de las plantas transgénicas TO y TI.

Las plantas TI se pueden analizar para cambios fenotipicos. Con el uso del análisis de imágenes se puede analizar las plantas TI para cambios fenotipicos en el área de la planta; el volumen, el índice de crecimiento y el análisis del color varias veces durante el crecimiento de las plantas. La alteración en la arquitectura radicular se puede analizar como se describe en la presente descripción.

El análisis posterior de las alteraciones en las características agronómicas se puede realizar para determinar si las plantas que contienen la secuencia de ácido nucleico de interés tiene una mejora de al menos una característica agronómica, cuando se compara con las plantas de control (o de referencia) que no se han transformado de esta manera. Las alteraciones también se pueden estudiar bajo varias condiciones ambientales.

Las construcciones de expresión que contienen la secuencia de ácido nucleico de interés que resulta en una alteración significativa en la biomasa de la raíz y/o brote, color verde mejorado, espiga más larga en la antesis o rendimiento se considerarán evidencia de que la secuencia de ácido nucleico de interés funciona en el maíz para alterar la eficacia en el uso del nitrógeno.

Ejemplo 9. Electroporación de LBA44Q4 de Agrobacterium tumefaciens Las células competentes de electroporación (40 ml), tales como LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens (que contienen PHP10523), se descongelan en hielo (20-30 in). El PHP10523 contiene genes VIR para la transferencia de T-ADN, un origen de replicación de plásmido con un número de copia bajo de Agrobacterium, un gen de resistencia a la tetracielina y un sitio eos para la recombinación biomolecular de ADN in vivo. Mientras tanto, la cubeta de electroporación se enfría en hielo. La configuración del electroporador se determina para ser 2.1 kV.

Una alícuota de ADN (0.5 mL de ADN parental de JT (patente de los Estados Unidos núm. 7,087,812) a una concentración de 0.2 mg -1.0 pg en regulador con poco contenido de sal o H2O destilada dos veces) se mezcla con las células de Agrobacterium descongeladas mientras se mantienen en hielo. La mezcla se transfiere al fondo de la cubeta de electroporación y se mantiene en reposo sobre hielo por 1-2 min. Las células se electroporan (electroporador Eppendorf 2510) para lo cual se presiona el botón “Pulse” dos veces (idealmente se logra un pulso de 4.0 ms). Posteriormente, se agrega un medio de 0.5 mi 2xYT (o un medio de SOC) a la cubeta y se transfiere a un tubo Falcon de 15 mi. Las células se incuban de 28 a 30 °C, 200 a 250 rpm durante 3 h.

Las alícuotas de 250 ml se dispersan en placas núm. 30B (YM + 50 mg/ml de espectinomicina) y se incuban 3 días de 28 a 30 °C. Para incrementar la cantidad de transformantes, se puede realizar uno de dos pasos opcionales: Opción 1. Cubrir las placas con 30 pl de rifampicina 15 mg/ l. El LBA4404 tiene un gen de resistencia cromosómica para la rifampicina. Esta selección adicional elimina algunas colonias contaminantes observadas cuando se usa preparaciones más deficientes de células competentes de LBA4404.

Opción 2. Realizar dos réplicas de la electroporación para compensar las células electrocompetentes más deficientes.

Identificación de transformantes: Cuatro colonias independientes se escogen y se dispersan en un medio mínimo AB con 50 mg/ml de placas de espectinomicina (medio núm. 12S) para aislar las colonias simples. Las placas se incubaron a 28 °C durante 2 a 3 dias.

Se escoge una sola colonia para cada cointegrado putativo y se inocula con 4 mi de núm. 60A con 50 mg/1 de espectinomicina. La mezcla se incuba durante 24 h a 28 °C con agitación. El ADN plasmídico de los 4 mi de cultivo se aísla con el uso de la minipreparación de Qiagen + lavado PB opcional. El ADN se lava en 30 ml. Se usa alícuotas de 2 ml para electroporar 20 m? de DHlOb + 20 m? de dd H2O según lo anterior.

Opcionalmente, puede usarse una alícuota de 15 m? para transformar 75-100 m? de Invitrogen™ Library Efficiency DH5OÍ. Las células se diseminan en medio LB con 50 mg/ml de placas de espectinomicina (medio núm. 34T) y se incuban a 37 °C durante la noche.

Tres a cuatro colonias independientes se escogen para cada cointegrado putativo y se inoculan con 4 mi de 2xYT (núm. 60A) con 50 mg/ml de espectinomicina. Las células se incuban a 37 °C durante la noche con agitación.

El ADN plasmídico se aisla de los 4 mi de cultivo con el uso de la minipreparación de QIAprep® con lavado PB opcional (lavado en 50 ml) y se usa 8 ml para la digestión con Salí (con el uso de JT parental y PHP10523 como controles).

Se realizan otras tres digestiones más con el uso de las enzimas de restricción BamHI, EcoRI y HindIII para 4 plásmidos que representan 2 cointegrados putativos con patrón de digestión de Salí correcto (con el uso de ADN parental y PHP10523 como controles). Se recomienda geles electrónicos para comparación.

Ejemplo 10. Bombardeo mediado por partículas para la transformación de maíz Un vector puede transformarse en callos embriogénicos de maíz por bombardeo de partículas, generalmente, como se describe en Tomes et ai., Plant Cell, Tissue and Organ Culture: Fundamental Methods, Eds. Gamborg y Phillips, capítulo 8, págs. 197-213 (1995) y como se esboza brevemente más abajo. Las plantas de maíz transgénico pueden producirse por bombardeo de embriones inmaduros embriogénicamente sensible con partículas de tungsteno asociadas con ADN plásmidos. Los plásmidos comprenden o consisten, típicamente, en un marcador seleccionable y un gen estructural no seleccionado, o un marcador seleccionable y una secuencia o subsecuencia de polinucleótido o similares .

Preparación de las partículas Quince mg de partículas de tungsteno (General Electric), 0.5 a 1.8 m, preferentemente, 1 a 1.8 m y, con la máxima preferencia, 1 m, se añaden a 2 mi de ácido nítrico concentrado. Esta suspensión se sometió a ondas sonoras a 0 °C por 20 minutos (Branson Sonifier Model 450, 40 % salida, ciclo de trabajo constante). Las partículas de tungsteno se convierten en bolillas por centrifugación a 10000 rpm (Biofuge) por un minuto y el sobrenadante se elimina. Dos mililitros de agua destilada estéril se añaden a la bolilla y se usa una breve sonicación para resuspender las partículas. La suspensión se convierte en bolillas, se añade un mililitro de etanol absoluto a la bolilla y se usa una breve sonicación para resuspender las partículas. El enjuague, conversión en bolilla y resuspensión de las partículas se realiza dos veces más con agua destilada estéril y, finalmente, las partículas se resuspenden en dos mililitros de agua destilada estéril. Las partículas se subdividen en alícuotas de 250 ml y se almacenan congeladas.

Preparación de la asociación partícula-ADN plásmido La materia prima de partículas de tungsteno se sónica brevemente en un sonicador de baño de agua (Branson Sonifier Model 450, 20 % salida, ciclo de trabajo constante) y 50 ml se transfieren a un tubo de microfuga. Los vectores son, típicamente, cis: es decir, el marcador seleccionable y el gen (u otra secuencia de polinucleótidos) de interés están en el mismo plásmido.

El ADN plásmido se añade a las partículas para una cantidad de ADN final de 0.1 a 10 mg en un volumen total de 10 ml y se sónica brevemente. Preferentemente, 10 pg (1 mg/ml en regulador TE) de ADN total se usa para mezclar el ADN y las partículas para el bombardeo. Cincuenta microlitros (50 m?) de 2.5 M CaCl2 estéril acuoso se añaden y la mezcla se sónica brevemente y se centrifuga. Veinte microlitros (20 m?) de 0.1 M spermidina estéril acuosa se añaden y la mezcla se sónica brevemente y se centrifuga. La mezcla se incuba a temperatura ambiente por 20 minutos con breve sonicación intermitente. La suspensión de partículas se centrifuga y el sobrenadante se elimina. Doscientos cincuenta microlitros (250 m?) de etanol absoluto se añaden a la bolilla, seguido por breve sonicación. La suspensión se convierte en bolilla, el sobrenadante se elimina y se añaden 60 m? de etanol absoluto. La suspensión se sónica brevemente antes de cargar la aglomeración partícula-ADN en los macroportadores.

Preparación del tejido Los embriones inmaduros de maíz son el objetivo para la transformación mediada por el bombardeo de partículas. Las espigas de las plantas F1 son autofertilizadas o hermanas y los embriones se diseccionan asépticamente a partir de las cariópsides en desarrollo cuando el escutelo primero se torna opaco. Esta etapa ocurre aproximadamente 9 - 13 días pospolinización y, con la máxima frecuencia, aproximadamente 10 días pospolinización, dependiendo de las condiciones de crecimiento. Los embriones son aproximadamente 0.75 a 1.5 milímetros de largo. Las espigas se esterilizan en la superficie con 2050 % Clorox® por 30 minutos, seguido por tres enjuagues con agua destilada estéril.

Los embriones inmaduros se cultivan con el escutelo orientado hacia arriba, en el medio de inducción embriogénico formado de sales básales N6, vitaminas Eriksson, 0.5 mg/1 de tiamina HCl, 30 gm/1 de sacarosa, 2.88 gm/1 de L-prolina, 1 mg/1 de ácido 2,4-diclorofenoxiacético, 2 gm/1 de Gelrite® y 8.5 mg/1 de AgNÜ3, Chu, et al . , (1975) Sci . Sin . 18:659; Eriksson, (1965) Physiol . Plant 18:976. El medio se esteriliza en autoclave a 121 °C durante 15 minutos y se reparte en 100x25 mm cajas Petri El AgN03 se filtra de manera estéril y se adiciona al medio después del autoclave. Los tejidos se cultivan en completa oscuridad a 28 °C. Después de aproximadamente 3 a 7 dias, con la máxima frecuencia, aproximadamente 4 dias, el escutelo de los embriones se hincha a aproximadamente el doble de su tamaño original y las protuberancias en la superficie coleorhizal del escutelo indican el inicio del tejido embriogénico. Hasta 100 % de los embriones muestran esta respuesta pero, con la máxima frecuencia, la frecuencia de respuesta embriogénica es aproximadamente 80 %.

Cuando se observa la respuesta embriogénica, los embriones se transfieren a un medio que comprende el medio de inducción modificado para contener 120 gm/1 sacarosa. Los embriones se orientan con el polo coleorhizal, el tejido embriogénicamente sensibles, hacia arriba a partir del medio de cultivo. Diez embriones por caja Petri se localizan en el centro de una caja Petri en un área de aproximadamente 2 cm de diámetro. Los embriones se mantienen en este medio por 3 a 16 horas, preferentemente, 4 horas, en completa oscuridad a 28 °C justo hasta antes del bombardeo con partículas asociadas con los ADN plásmido que contienen los genes marcadores seleccionables y no seleccionables.

Para efectuar el bombardeo de partículas de los embriones, los aglomerados particula-ADN se aceleran por medio del uso de un dispositivo de aceleración de partículas DuPont PDS-1000. La aglomeración partícula-ADN se sónica brevemente y 10 ml se depositan en los macroportadores y el etanol se deja evaporar. El macroportador se acelera en una pantalla de interrupción de acero inoxidable por la ruptura de un diafragma de polímero (disco de ruptura). La ruptura se efectúa por helio presurizado. La velocidad de la aceleración partícula-ADN se determina en base a la presión de rotura del disco de ruptura. Se usan presiones del disco de ruptura de 1.38 a 12.4 MPa (200 a 1800 psi), preferentemente, de 4.48 a 7.58 MPa (650 a 1100 psi) y, con la máxima preferencia, aproximadamente 6.20 MPa (900 psi). Se usan múltiples discos para efectuar un intervalo de presiones de ruptura.

El anaquel que contiene la placa con los embriones se coloca 5.1 cm por encima del fondo de una plataforma del macroportador (anaquel núm. 3). Para efectuar el bombardeo de partículas de embriones inmaduros cultivados, un disco de ruptura y un macroportador con los aglomerados partícula-ADN secos se instalan en el dispositivo. La presión de He que se suministra al dispositivo se ajusta a 1.37 MPa (200 psi) por encima de la presión de rotura del disco de ruptura. Una caja Petri con los embriones objetivo se coloca en la cámara de vacío y se localiza en el paso proyectado de las partículas aceleradas. Se crea un vacío en la cámara, preferentemente, aproximadamente 94.9 kPa (28 en Hg) .

Después de la operación del dispositivo, se libera el vacio y la caja Petri se elimina.

Los embriones bombardeados permanecen en el medio osmóticamente ajustado durante el bombardeo, y 1 a 4 dias posteriores. Los embriones se transfieren al medio de selección formado por sales básales N6, vitaminas de Eriksson, 0.5 mg/1 tiamina HCl, 30 gm/1 sacarosa, 1 mg/1 ácido 2,4-diclorofenoxiacético, 2 gm/1 Gelrite®, 0.85 mg/1 Ag N03 y 3 mg/1 bialafos (Herbiace, Meiji). El bialafos se añade por filtrado estéril. Los embriones se subcultivan en medio de selección fresco a intervalos de 10 a 14 dias. Después de aproximadamente 7 semanas, el tejido embriogénico, putativamente transformado por los genes marcadores seleccionadles y no seleccionadles, prolifera a partir de una fracción de los embriones bombardeados. El tejido transgénico putativo se rescata y ese tejido que se deriva de los embriones individuales se considera ser un evento y se propaga independientemente del medio de selección. Se alcanzan dos ciclos de propagación clonal por selección visual de los fragmentos contiguos más pequeños del tejido embriogénico organizado.

Una muestra de tejido de cada evento se procesa para recuperar el ADN. El ADN se restringe con una endonucleasa de restricción y se prueba con secuencias del iniciador diseñadas para amplificar secuencias de ADN que solapan la porción codificante y no codificante del plásmido. El tejido embriogénico con secuencia amplificable se adelanta a la regeneración de la planta.

Para la regeneración de plantas transgénicas, el tejido embriogénico se subcultiva en un medio que comprende sales de MS y vitaminas (Murashige y Skoog, (1962) Physiol . Plant 15:473), 100 mg/L de mio-inositol, 60 gm/L de sacarosa, 3 gm/L de Gelrite®, 0.5 mg/L de zeatina, 1 mg/L de ácido indol-3-acético, 26.4 ng/L de ácido cis-trans-abscísico r 3 mg/L de bialafos en 100X25 mm cajas Petri y se incuba en la oscuridad a 28 °C hasta que se observa el desarrollo de embriones somáticos bien formados, maduros. Esto requiere aproximadamente 14 dias. Los embriones somáticos bien formado son opacos y de color crema y están formados de un escutelo y coleóptilo identificable. Los embriones se subcultivan individualmente en un medio de germinación que comprende sales MS y vitaminas, 100 mg/1 de mio-inositol, 40 grn/1 de sacarosa y 1.5 gm/1 de Gelrite® en cajas Petri de 100x25 mm y se incuban bajo un fotoperiodo de 16 horas luz:8 horas oscuridad y 40 microeinsteins por m2 por segundo de los tubos fluorescentes blancos fríos. Después de aproximadamente 7 días, los embriones somáticos germinan y producen una raíz y brote bien definidos. Las plantas individuales se subcultivan en el medio de germinación en tubos de vidrio 125x25 mm para permitir el desarrollo posterior de la planta. Las plantas se mantienen bajo un periodo de exposición a la luz de 16 horas de luz:8 horas de oscuridad y 40 microeinsteins por m2 por segundo de los tubos fluorescentes blancos fríos. Después de aproximadamente 7 días, las plantas se establecieron bien y se transplantaron al suelo de horticultura, se fortalecieron y se sembraron en macetas en una mezcla suelo para invernaderos comercial y crecen hasta la madurez sexual en un invernadero. Una línea endogámica elite se usa como un macho para polinizar las plantas transgénicas regeneradas.

Ejemplo 11. Transformación de embriones de frijol de soya Los embriones de frijol de soja se bombardean con un plásmido que comprende un promotor preferido unido operativamente a una secuencia de nucleótidos heteróloga que comprende una secuencia o subsecuencia de polinucleótidos, de la siguiente manera. Para producir embriones somáticos, cotiledones de 3 a 5 mm de longitud se separan de la superficie esterilizada, las semillas inmaduras del cultivar A2872 del frijol de soya se pueden cultivar en la luz o en la oscuridad a 26 °C en un medio de agar apropiado durante seis a diez semanas. Los embriones somáticos que producen embriones secundarios se separan después y se colocan en un medio líquido adecuado. Después de la selección repetida para los grupos de embriones somáticos que se multiplican como embriones prematuros en fase globular, las suspensiones se conservan como se describe a continuación.

Los cultivos embriogénicos en suspensión de frijol de soya se pueden mantener en 35 mi de medio liquido en un agitador giratorio de 150 rpm, a 26 °C con luces fluorescentes con un horario de 16:8 horas dia/noche. Los cultivos se subcultivan cada dos semanas mediante la inoculación de aproximadamente 35 mg de tejido en 35 mi de medio liquido.

Los cultivos embriogénicos en suspensión de frijol de soja se pueden transformar mediante el método de bombardeo de partículas (Klein, et al . , (1987) Na ture ( Londres ) 327:70-73, patente de los Estados Unidos nú . 4,945,050). Se puede usar un instrumento PDS1000/HE de DuPont Biolistic™ (retroajuste de helio) para estas transformaciones.

Un gen marcador seleccionable que se puede usar para facilitar la transformación del frijol de soja es un transgén compuesto del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (Odell, et al . , (1985) Nature 313:810-812), el gen de higromicina fosfotransferasa del plásmido pJR225 (de E. coli; Gritz, et al . , (1983) Gene 25:179-188) y la región 3' del gen de la nopalina sintasa del T-ADN del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens. El casete de expresión de interés, que comprende el promotor preferido y un polinucleótido heterólogo, puede aislarse como un fragmento de restricción. Este fragmento puede ser insertado en un sitio de restricción único del vector portador del gen marcador .

En 50 ml una suspensión de partículas de oro de SO mg/ml 1 mm se añade (en el siguiente orden): 5 ml de ADN (1 mg/ml), 20 m? de espermidina (0.1 M) y 50 m? de CaCl2 (2.5 M). Después, la preparación de partículas se mezcla durante tres minutos, se centrifuga en un microcentrifugador durante 10 segundos y el sobrenadante se retira. Después, las partículas cubiertas de ADN se lavan una sola vez en 400 m? de etanol al 70 % y se resuspenden en 40 m? de etanol anhidro. La suspensión de ADN/partículas se puede sonicar tres veces durante un segundo cada una. Después, se carga 5 microlitros de las partículas de oro cubiertas de ADN en cada disco del macroportador.

Aproximadamente 300-400 mg de un cultivo en suspensión de dos semanas se coloca en una placa petri de 60X5 mm vacía y el líquido restante del tejido se retira con una pipeta. Para cada experimento de transformación se bombardea, normalmente, aproximadamente 5-10 placas de tejido. La fuerza de ruptura de la membrana se ajusta a 0.758 MPa (1100 psi) y la cámara se evacúa al vacío con 94.9 kPa (28 pulgadas de mercurio). El tejido se coloca aproximadamente a 8.9 cm (3.5 pulgadas) del ensayo de retención y se bombardea tres veces. Después del bombardeo, el tejido se puede dividir a la mitad y se puede colocar nuevamente en el liquido para cultivarlo como se describió anteriormente.

Cinco a siete dias después del bombardeo, los medios líquidos se pueden intercambiar con medios frescos y once a doce días después del bombardeo con medios frescos que contienen 50 mg/ml de higromicina. Estos medios selectivos se pueden refrescar semanalmente. Siete a ocho semanas después del bombardeo, se puede observar tejido verde transformado que crece de grupos embriogénicos necróticos no transformados. El tejido verde aislado se extrae e inocula en matraces individuales para generar cultivos en suspensión embriogénicos nuevos, transformados y propagados por clonación. Cada línea nueva se puede tratar como un evento de transformación independiente. Estas suspensiones se pueden subcultivar y mantener como grupos de embriones inmaduros o se pueden regenerar en plantas completas mediante la maduración y germinación de embriones somáticos individuales.

Ejemplo 12. Desarrollo de la espiga en diferentes niveles de Nitrógeno en estériles en comparación con fértiles La esterilidad masculina reduciría el requerimiento de nutrientes para el desarrollo de panojas, lo que produce un desarrollo de la espiga mejorado en la antesis. En este experimento, se cultivaron plantas hermanas masculinas estériles en diversos niveles de fertilidad nitrogenada y se muestrearon a ~50 % de esparcimiento del polen. Las plantas masculinas estériles produjeron espigas más grandes en ambos niveles de fertilidad nitrogenada. La proporción de plantas masculinas estériles que exhibieron emergencia de estigmas fue, además, mayor que la de sus contrapartes fértiles. A pesar de que la biomasa (peso seco total de la planta por encima del suelo menos el peso seco de la espiga) fue mayor en las plantas cultivadas bajo una fertilidad nitrogenada no se produjo un efecto de esterilidad masculina en la biomasa. Esto muestra que el efecto positivo de la esterilidad masculina recae específicamente en la capacidad de la planta para producir una espiga (estigmas) más desarrollada sin afectar el crecimiento vegetativo general.

Ejemplo 13. Estudio de la disponibilidad de nitrógeno Se realizó un estudio para cuantificar la disponibilidad de nitrógeno de panojas y espigas de maíz en desarrollo cuando las plantas se cultivan en niveles crecientes de fertilizante nitrogenado. Cuando el maíz se cultiva en cantidades menores de fertilizante nitrogenado, la disponibilidad de nitrógeno de la espiga es negativa o durante el desarrollo la espiga pierde nitrógeno captado por otras partes de la planta cuando el nitrógeno es limitado. La disponibilidad de nitrógeno de la espiga mejora a medida que la cantidad de fertilizante nitrogenado proporcionado a la planta aumenta hasta que la espiga mantiene un aumento positivo en la cantidad de nitrógeno hasta la emergencia de estigmas. En contraposición, la panoja mantiene una disponibilidad de nitrógeno positiva independientemente del nivel de fertilidad en el cual se cultiva la planta. Este resultado muestra claramente que la panoja y la espiga compiten por el nitrógeno durante el desarrollo reproductor y la panoja en desarrollo domina sobre la espiga en desarrollo. Las mejoras en rendimiento asociadas con los híbridos estériles masculinos dirigidas a través de un desarrollo de espiga mejorado concuerdan considerablemente con la reducción en la competencia del desarrollo de espigas con el desarrollo de panojas.

Ejemplo 14. Experimentos de campo con plantas masculinas estériles Los híbridos estériles masculinos genéticos mostraron, además, un mejor rendimiento en experimentos de campo. Se realizaron dos experimentos de campo. En un experimento se modificó el fertilizante nitrogenado con segregación de híbridos masculinos estériles y masculinos fértiles dentro de cada fertilidad nitrogenada. La densidad de la población de plantas se modificó en el segundo experimento, nuevamente, con segregación de híbridos masculinos estériles y masculinos fértiles dentro de las densidades de la población de plantas. Como diseño experimental para ambos experimentos se usó un diseño en lotes divididos. La dosis de fertilizante nitrogenado se usó como criterio del lote principal para el experimento de dosis múltiples de nitrógeno y la esterilidad masculina o fertilidad masculina se usó para el lote secundario. En el experimento de la población, la población de la planta se usó como el lote principal y la esterilidad masculina o fertilidad masculina se usó para el lote secundario. En el experimento de dosis múltiples de N se usaron dosis de fertilizante nitrogenado de 0, 30, 60, 90, 120 y 150 unidades (libras por acre) aplicadas en la etapa V3 del desarrollo. La población de plantas usada en el experimento de dosis múltiples de nitrógeno fue de 32,000 plantas por acre-1, mientras que se usaron densidades de 32,000, 48,000 y 64,000 plantas por acre1 en el estudio de la población de plantas. El régimen de fertilidad de N en el estudio de la población era de 180 unidades de N por acre1 aplicadas antes de la plantación para todas las poblaciones seguido de 95 -unidades de N por acre1 aplicadas lateralmente en V6 (275 unidades de N acre1 en total) en todos los lotes. Los lotes de 48,000 plantas por acre1 se suplementaron con un adicional de 50 unidades de N por acre-110 días antes de la floración (325 unidades de N por acre-1 en total) y los lotes de 64,000 plantas por acre1 se suplementaron con 100 unidades adicionales de N por acre1 10 días antes de la floración (375 unidades de N por acre1 en total).

En los dos experimentos se observó efectos significativos de esterilidad masculina. Además, se observó un efecto significativo de la fertilidad nitrogenada en la producción, pero no hubo un efecto significativo de la densidad de población en la producción. A continuación se presentan los resultados para cada experimento.

Experimento de dosis múltiples de N Se analizó el nivel de importancia total (P > F) de cada parámetro. Generalmente, las plantas masculinas estériles exhibieron una producción de granos significativamente mayor estadísticamente (P > F <0.001) del rendimiento de granos, cantidad de espigas por lote1, mayor SPAD, más estigmas, tuvieron espigas más grandes y más anchas y más granos por espiga1. Además, estos parámetros variaron significativamente con la fertilidad de N. Hubo una interacción significativa de la fertilidad de N x esterilidad/fertilidad masculina en las espigas por lote1 y los granos por espiga1. Esto fue debido al hecho de que el número de espigas en plantas fértiles por parcela1 aumentó con el aumento de la fertilidad de N mientras que las plantas estériles tenían un número constante de espigas por parcela-1 en todos los niveles de fertilidad de N. Además, se observaron interacciones significativas del tratamiento en la cantidad de estigmas y granos por espiga-1 probablemente debido a un índice de aumento mucho mayor en la cantidad de estigmas con la fertilidad de N en las plantas masculinas estériles que en las plantas masculinas fértiles. La diferencia en rendimiento entre las plantas masculinas fértiles y masculinas estériles fue mucho mayor a un nivel bajo de N que a un nivel de N más alto. A una dosis de N de 0 por acre-1 la diferencia entre las plantas masculinas estériles y masculinas fértiles fue de 84 % mientras que la diferencia en rendimiento entre las plantas masculinas estériles y masculinas fértiles fue 15 % a una dosis de N de 150 Ib por acre-1. En una prueba de híbridos que implicó el uso de mutantes MS44 se observó un aumento promedio de aproximadamente 37 bu acre-1. En otra prueba de híbridos, el aumento promedio fue 13 bu por acre-1. (Figuras 5A-5B).

El SPAD fue significativamente diferente en respuesta a la fertilidad de N y en respuesta a la esterilidad masculina, pero la respuesta a la fertilidad de N de plantas masculinas estériles y plantas masculinas fértiles fue paralela, lo que indica que SPAD no podría responder por la diferencia en rendimiento entre las plantas masculinas estériles y masculinas fértiles en respuesta a la fertilidad de N.

La cantidad de granos de las plantas masculinas estériles y masculinas fértiles en respuesta a la fertilidad de N mostró pendientes diferentes, igualmente que en la respuesta en rendimiento de las plantas masculinas estériles y masculinas fértiles a la a fertilidad de N lo que sugiere que el aumento en el rendimiento de las plantas masculinas estériles podría relacionarse con un mayor número de granos. Las diferencias en rendimiento entre híbridos masculinos estériles y masculinos fértiles entre las fertilidades de N podrían justificarse, sustancialmente, mediante la suma de las diferencias en espigas por lote1 y granos por espiga1 entre híbridos masculinos estériles y masculinos fértiles entre las fertilidades de N. Estos datos están en conformidad con la hipótesis de que el desarrollo de la espiga se ve menos obstaculizado por el desarrollo de la panoja en plantas masculinas estériles lo que resulta en espigas más completamente desarrolladas (granos por espiga1) con una tasa de éxito mayor en la producción de espigas (espigas por lote1) con niveles bajos de N. En una de las pruebas de híbridos, el peso seco de la espiga aumentó aproximadamente 62 % en comparación con la espiga de plantas fértiles normales.

Experimento de _la población/esterilidad masculina Además, la respuesta del híbrido genético masculino estéril en el experimento de estrés de la población fue mejor que la del híbrido masculino fértil. Aunque no hubo efecto del estrés de la población sobre el rendimiento en granos, el híbrido masculino estéril genético se desempeñó mejor que el híbrido masculino fértil en un 40 % (59 bu por acre1) en todas las poblaciones probadas (ver, Figura 7A). Adicionalmente, en una prueba separada, se observó un aumento promedio de aproximadamente 8 bu por acre1(ver, Figura 7B).

Ejemplo 15. Caracterización del gen s y uso de este para mejorar el rendimiento El fenotipo del mutante de tlsl se muestra en la Figura 8. Se realizó un método de clonación de posición para clonar tlsl (Figura 9). La región del tlsl se apeó de manera general en Chrl con el uso de 75 individuos de una población tlsl x Mol7 F2. A) La primera ronda del mapeo específico está representada por las letras en rojo, tlsl se redujo hasta una región de 15 cM con el uso de 2985 individuos de F2. Los 177 recombinantes resultantes se autofertilizaron y la progenie de cada línea se agrupó para un mapeo específico adicional, representado por las letras en verde. Las 177 familias F3 se usaron para reducir el intervalo de tlsl hasta una región de cuatro BAC que no contenía marcadores informativos adicionales. Los genes en el intervalo de cuatro BAC se secuenciaron y la única diferencia evidente era que ZmNIP3;l no se podía amplificar por PCR en el mutante. Se creó una genoteca de BAC a partir de plantas tlsl homocigotas y los BAC que abarcaban el gen ZmNIP3;l se secuenciaron para determinar la naturaleza de la mutación. B) Resultados de la secuenciación de BAC. Una linea amarilla indica la secuencia que podría alinearse a la secuencia de referencia de B73. Una línea azul indica una secuencia repetitiva que no podría alinearse a la secuencia de referencia de B73. El mutante carece de ZmNIP3;l y en su lugar hay ~9 kb de secuencia repetitiva. Se indican los genes vecinos más cercanos, citocromo P450 e IMP deshidrogenase. Las Figuras 2A y 2B no están representadas en escala. El análisis de secuencias de NIP3-1 del maíz reveló un nivel alto de similitud con NIP5/1 de Arabidopsis (AtNIP5;l) y NIP3;1 del arroz (OsNIP3;l) y los estudios filogenéticos mostraron que son proteínas estrechamente relacionadas en el subgrupo de NIP II (Liu, et al . , (2009) BCM Genomics 10:1471-2164). (Figura 15). Estos resultados indican que NIP3-1 en el maíz está implicado en la captación de boro y el boro es necesario para el desarrollo de la reproducción.

Se pueden realizar estudios que manipulan la expresión de tlsl en el desarrollo de maíz híbrido para mejorar el rendimiento en condiciones normales y de estrés (por ejemplo, estrés por nitrógeno y agua). NIP3-1 se regularía a la baja de manera específica para el tejido (es decir, en la panoja), y produciría plantas sin panojas que no exhiben efectos pleotrópicos asociados con la deficiencia de boro (por ejemplo, espigas poco desarrolladas). En este caso, los recursos que serian necesarios para el desarrollo de la panoja se pueden asignar a la espiga y se minimizarían los efectos de sombreo de las panojas y, en consecuencia, mejoraría el rendimiento en comparación con otras téenicas de esterilidad masculina en las cuales está presente la panoja. El mismo método puede aplicarse a cualquier gen implicado en el transporte de boro.

Fenotipo del mutante de t s rescatado con la aplicación de boro Se plantaron plantas silvestres y mutantes de la población de mapeo de F2 de x Mol7. La mitad de las plantas mutantes y tipo silvestre se trataron una vez a la semana de la etapa ~V2 a ~V6 con un rociador de boro para hojas que consistía en 0.0792 % de B202 y 0.0246 % de boro elemental. Se observó que las plantas mutantes tratadas con el rociador de boro tenían panojas con más ramificaciones, que eran más largas y parecían tipo silvestre en comparación con las plantas mutantes no tratadas. Además, las espigas de las plantas mutantes tratadas también parecían haberse recuperado. Las plantas tipo silvestre tratadas con boro no exhibieron una diferencia notable con respecto a las plantas tipo silvestre no tratadas. Las plantas mutantes recuperadas se autopolinizaron para una prueba de progenie.

La progenie de la autofertilización de las plantas mutantes recuperadas se plantó junto con el tipo silvestre para un control. La mitad de la progenie mutante se trató con el rociador de boro tal como se describió anteriormente y la mitad se dejó sin tratar. Se midió la cantidad de ramificaciones de la panoja (Figura 11), la longitud de la ramificación (Figura 12) y la longitud de la espiga (Figura 13) a partir de 24 plantas tipo silvestre, 26 plantas mutantes tratadas con el rociador de boro y 29 plantas mutantes no tratadas. En comparación con las plantas mutantes no tratadas, las plantas mutantes tratadas con el rociador de boro exhibieron una cantidad mayor de ramificaciones de la panoja, una mayor longitud de la ramificación de la panoja y una mayor longitud de la espiga similar a las plantas tipo silvestre (Figuras 11-13). Además, la observación de que la progenie de plantas mutantes recuperadas aun exhibían el fenotipo de s cuando no se trataron, indica que los efectos del tratamiento con el rociador de boro no se transmiten a generaciones posteriores.

Los mutantes de t s son más tolerantes a la toxicidad por boro Los resultados preliminares indican que el mutante tlsl puede ser más tolerante a las condiciones tóxicas del boro que las plantas tipo silvestre. Las plantas tipo silvestre y mutantes se cultivaron hidropónicamente con el uso de medio Hoagland que contenia una concentración normal de boro (0.5 ppm) o 50 ppm de boro. En la etapa ~V7 no se podía distinguir entre las plantas mutantes y tipo silvestre cultivadas en condiciones normales de boro (Figura 14). Sin embargo, cuando se cultivaron en 50 ppm de boro, las plantas mutantes exhibieron un crecimiento general mayor y sus hojas eran más anchas. Además, en las plantas tipo silvestre cultivadas en 50 ppm de boro, el nodo de la segunda hoja más joven totalmente expandida se extendió por encima del nodo de la hoja más joven totalmente expandida, mientras que las plantas mutantes se veían normales.

Rescate de mutantes y producción de semillas mediante la aplicación de boro Las plantas de tlsl homocigotas tienen un crecimiento de panoja reducido o prácticamente carecen de panoja funcional para el desarrollo normal de la espiga. Por lo tanto, la cantidad de semillas de las plantas mutantes de tlsl o plantas con un desarrollo de panoja reducido debido a una deficiencia en la captación de boro no se encuentra en los niveles necesarios para la producción de semillas a gran escala. Dado que la aplicación de boro exógeno rescata el desarrollo y crecimiento de la panoja en el fondo del mutante de tlsl, la aplicación de boro es una opción para aumentar el rendimiento de semillas a partir de plantas tlsl. Dependiendo de la necesidad y el modo de aplicación, el boro exógeno (por ejemplo, como un rociador foliar) se puede aplicar en varias etapas del crecimiento reproductivo (por ejemplo, V2-V12 o V2-V8) y con diversos niveles de boro (por ejemplo, 10-1000 ppm). En una modalidad, la aplicación de boro puede coincidir con la transición del estado vegetativo al estado reproductor, por ejemplo, V4-V5, dependiendo de las condiciones de crecimiento de la planta.

Alelos de tlsl Sobre la base de la descripción y orientación proporcionadas en la presente descripción se obtienen alelos de tlsl adicionales más débiles o más fuertes cuando se aplican los métodos disponibles, por ejemplo, a través de detección de lesiones locales inducidas en genomas (TILLING), McCallum, et al . , (2000) Nat Biotechnol 18:455-457. Otros alelos de Tlsl pueden incluir aquellas variantes que bloquean completamente el transporte de boro y producen una pérdida sustancial del crecimiento y desarrollo de la panoja y aquellas variantes que producen, por ejemplo, una reducción de 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 ¾, 80 %, 90 % o 95 % en el desarrollo de la panoja, tal como se evidencia por una producción menor de polen u otro parámetro adecuado que conocen aquellos con experiencia en la materia.

Ejemplo 16, Experimentos de campo en plantas de fertilidad masculina reducida con tratamientos de estrés por sequía En un estudio de campo se evalúa el efecto de la fertilidad masculina reducida en el rendimiento del maíz cultivado en condiciones de estrés por sequía. El estudio de campo se realizó en un ambiente de campo de estrés controlado. Las lluvias en el campo del estudio son escasas o nulas durante la estación de cultivo lo que permite la imposición de estrés por sequía mediante la eliminación del riego en varias etapas del desarrollo. En este campo no existe presión impuesta por insectos o enfermedades que interfieran con la interpretación del rendimiento del híbrido bajo sequía.

Las versiones masculinas estériles y fértiles de un solo híbrido se plantaron en 10 réplicas de un diseño en lotes divididos mediante el uso de prácticas de plantación estándar. Las plantas se redujeron hasta una densidad estándar de manera que el uso del agua en las plantas por lote debería ser uniforme. Un tratamiento de estrés se impuso al eliminar el riego de los lotes que comenzó en la etapa V8 del desarrollo. Las plantas continuaron con el uso del agua que quedaba en el perfil del suelo. Después de aproximadamente 3 semanas, la planta tendrá un déficit de agua, tal como indica el enrollamiento de la hoja y un menor crecimiento de la planta. Las plantas se mantuvieron bajo esta condición de déficit de agua hasta aproximadamente 2 semanas después de la floración, cuando de nuevo se les adicionó agua a todos los lotes estresados por la sequía. Así la duración total del tratamiento por estrés fue de aproximadamente de 5 a 6 semanas, con un paréntesis en el periodo de floración del desarrollo.

El maíz es extremadamente sensible al estrés por sequía durante el periodo de floración. Típicamente, el estrés por sequía inhibe el desarrollo de las espigas, la generación de los estigmas y la polinización de los ovarios. La sensibilidad de estos procesos es un factor principal en la reducción del rendimiento bajo estrés por sequía. La reducción de esta sensibilidad es un método eficaz para mejorar el estrés por sequía en el maíz. Las plantas masculinas estériles generarán una mayor partición de asimilados para la espiga durante este periodo crítico, lo que las hace más tolerantes a este estrés. Las plantas masculinas estériles generarán estigmas con mayor rapidez, lo que resulta en una polinización más eficaz de esos ovarios y una mayor cantidad final de granos por planta-1. La mejora de este proceso reproductor crítico incrementa el rendimiento en la cosecha.

En este estudio, los datos confirmaron que se mejoró la tolerancia a la sequía mediante la reducción de la fertilidad masculina. El rendimiento de las plantas masculinas estériles en el tratamiento por estrés fue de 106.7 bu por acre1, mientras que el rendimiento de las plantas masculinas fértiles en el tratamiento por estrés fue de 62.6 bu por acre1. La cantidad total de granos por espiga1 en las plantas masculinas estériles fue de 204.3, en comparación con 130.2 para las plantas masculinas fértiles, lo que confirma que se mejoró el desarrollo de la espiga y granos establecidos bajo estrés en las plantas masculinas estériles.

Ejemplo 17. Creación de progenie de híbridos masculinos estériles Se proporciona un método para producir plantas híbridas masculinas estériles. En el campo de producción de híbridos, en una modalidad, las plantas parentales femeninas (masculinas estériles) de la linea endogámica A, homocigotas recesivas para un gen de fertilidad masculina, se fertilizan con plantas de la línea endogámica B. La línea endogámica B es similarmente homocigota recesiva para el gen de fertilidad masculina; sin embargo, la linea endogámica B es hemicigota para una construcción heteróloga. Esta construcción comprende (a) el alelo dominante del gen de fertilidad masculina que complementa el genotipo recesivo y restablece la fertilidad a la linea endogámica B; (b) un elemento genético que produce una interrupción en la formación, función o dispersión del polen; (c) opcionalmente, un gen marcador que puede ser un marcador expresado en la semilla. Como resultado, las semillas producidas en la linea endogámica A son homocigotas recesivas para el gen de fertilidad masculina y producirán una progenie masculina estéril. Estas progenies no son transgénicas con respecto a la construcción descrita, porque el elemento “b” evita la transmisión de la construcción a través del polen. Ver, por ejemplo, la Figura 3.

Dado que estas plantas híbridas son masculinas estériles, es necesario proporcionar un polinizador. Una forma práctica para plantar estas semillas híbridas en un campo de producción de granos consiste en mezclar la semilla híbrida con la semilla del polinizador. La semilla del polinizador estará presente en la cantidad mínima necesaria para lograr una polinización adecuada de una porción sustancial de las plantas producidas a partir de la semilla mezclada. Preferentemente, una cantidad de al menos 1 % a 50 ¾, con mayor preferencia, menor que 25 %, con la máxima preferencia, menor que 15 % de la mezcla (en peso) serán semillas del polinizador. Especialmente se prefiere una mezcla, en donde las semillas del polinizador estén presentes en una cantidad de aproximadamente 1 % a 10 % en peso. Una porción sustancial sería de aproximadamente 90 % de las plantas producidas, con mayor preferencia, aproximadamente 95 %, con la máxima preferencia, aproximadamente 98 % o más de las plantas producidas por la mezcla.

Ejemplo 18. Creación de progenie masculina esteril híbrida con el uso de Ms44 dominante En este ejemplo se usa el gen masculino estéril dominante clonado Ms44 para producir plantas híbridas masculinas estériles. Ver, por ejemplo, la Figura 4. Una línea endogámica femenina que contiene Ms44 en el estado heterocigótico se transforma con una construcción SAM heteróloga que comprende (1) un elemento de supresión, por ejemplo una repetición invertida (IR) diseñada para el promotor Ms44 o la región codificante de Ms44; (2) un gen de Ablación de polen que produce la interrupción de la formación, función o dispersión del polen; (3) un gen Marcador, que puede ser un gen de color de la semilla. El elemento de supresión interrumpe la transcripción o la traducción del alelo dominante de Ms44, de manera que la planta de otra manera masculina estéril es masculina fértil y puede autofertilizarse. Dado que el elemento 2 evita la transmisión del transgén a través del polen, la progenie resultante en la espiga segregará 50:50 con respecto a la construcción SAM hemicigota y 25 % de toda la progenie será homocigota para el alelo dominante de Ms44. Las semillas que comprenden la construcción SAM pueden identificarse por la presencia del marcador. La progenie de estas semillas se puede genotipificar para identificar la progenie Ms44 homocigota con la construcción SAM; éstas se denominan como la linea mantenedora. La progenie homocigota Ms44 sin la construcción SAM se denomina como la linea endogámica femenina con esterilidad masculina (o linea “endogámica masculina estéril”).

Las semillas de la linea endogámica masculina estéril pueden aumentarse al cruzar la linea mantenedora con las lineas endogámicas femeninas con esterilidad masculina. La progenie obtenida es una linea endogámica femenina Ms44 homocigota con esterilidad masculina, porque la construcción SAM no pasa a la progenie a través del polen. De esta manera, la linea mantenedora transgénica se usa para mantener, propagar o aumentar las plantas masculinas estériles.

En un cruce para la producción de híbridos, la línea endogámica masculina se cruza normalmente con esta línea endogámica femenina con esterilidad masculina, y no se requiere desespigamiento. Sin embargo, dado que el gen Ms44 es un gen de esterilidad masculina dominante y es homocigoto en la línea endogámica femenina, el 100 % de las semillas híbridas contendrán un alelo Ms44 dominante y las plantas producidas a partir de esas semillas serán masculinas estériles.

Una forma práctica para plantar estas semillas híbridas en un campo de producción de granos consiste en mezclarlas con la semilla del polinizador. La semilla del polinizador está presente en la cantidad mínima necesaria suficiente para permitir la polinización adecuada de las plantas producidas a partir de la mezcla. Preferentemente, una cantidad de al menos 1 % a 50 %, con mayor preferencia, menor que 25 %, con la máxima preferencia, menor que 15 % de la mezcla (en peso) será semillas del polinizador. Especialmente se prefiere una mezcla, en donde las semillas del polinizador estén presentes en una cantidad de aproximadamente 1 a 10 % en peso. La semilla del polinizador debería estar presente en la mezcla solo en una cantidad suficiente para polinizar una porción sustancial de las plantas producidas por la mezcla. Una porción sustancial sería de aproximadamente 90 % de las plantas producidas, con mayor preferencia, aproximadamente 95 %, con la máxima preferencia, aproximadamente 98 ¾ o más de las plantas producidas por la mezcla.

Alternativamente, las mezclas de polinizadores en la cosecha de grano híbrido podrían predeterminarse en el campo de producción de semillas al mezclar el progenitor endogámico femenino heterocigoto para MS44 con el progenitor endogámico femenino homocigoto para MS44. Ya que la mitad de la progenie producida a partir de un cruce de un progenitor masculino estéril dominante heterocigoto se segregará como masculinos fértiles, la proporción de polinizadores en la cosecha de granos híbridos puede preajustarse al mezclar dos veces la proporción de líneas endogámicas femeninas heterocigotas para MS44 con respecto a la proporción deseada de polinizadores masculinos fértiles en la cosecha de granos híbridos. Si se desea una proporción final del polinizador masculino fértil de 10 %, entonces podría mezclarse 20 % de las semillas de producción femeninas como una línea endogá ica femenina heterocigota para MS44. Cualquier proporción de polinizador hasta el 50 % en la cosecha de grano híbrido puede producirse de esta manera. El progenitor femenino heterocigoto para MS44 puede producirse al cruzar una línea endogámica homocigota para MS44 con la versión silvestre de la misma línea endogámica. Toda la progenie de este cruce será heterocigota para MS44 y con esterilidad masculina para efectuar la polinización cruzada en el campo de producción de semillas.

Alternativamente, el gen dominante Ms44 podría introducirse transgenéticamente, unido operativamente a un promotor heterólogo que es sensible a la inactivación por IR pero se expresa, de manera que se logra la esterilidad masculina dominante. Esto garantizaría que la expresión de MS44 nativo no se inhibe por IR. El promotor rice5126 puede ser adecuado, ya que tiene un patrón de expresión que es similar al del gen ms44 y se ha utilizado con éxito para la inactivación por IR del promotor.

Este método puede aplicarse para el aumento del rendimiento durante el estrés, pero, además, es útil para cualquier cultivo que se puede exocruzar con especies de maleza, tal como el sorgo, mediante la reducción de la tendencia al exocruzamiento y la minimización del riesgo de presencia accidental. Por ejemplo, la industria de los biocombustibles actualmente usa enzimas de manera transgénica para facilitar la digestibilidad de sustratos (es decir, celulosa) usados en la producción de etanol. La vinculación de estos tipos de transgenes al gen Ms44 evitaría el exocruzamiento a través de polen en un campo de producción. Uno o más rasgos dominantes podrían vincularse a Ms44 para evitar un exocruzamiento accidental con especies de malezas.

Ejemplo 19. Esterilidad masculina dominante en híbridos El gen Ms44 de esterilidad masculina dominante (DMS) se introgresa en una línea endogámica femenina de maíz. Dado que este gen actúa de manera dominante, al autofertilización de estas líneas no es posible y la mutación segregará 50:50 en la progenie exocruzada resultante. Los marcadores genéticos unidos pueden emplearse para identificar aquellas plantas que contienen el gen de DMS de manera que la linea endogámica masculina de maíz puede usarse para cruzarse específicamente con aquellas plantas para crear semillas híbridas Fl. Otra vez, esta semilla híbrida segregará 50 % para esterilidad masculina. Ms41 y Ms42 representan otros mutantes de DMS conocidos que son dominantes en maíz. (Liu and Cande, (1992) MNL 66:25-26; y Albertsen, et al., (1993) MNL 67:64) Un método alternativo consiste en usar un gen Ms44 transgénico para la esterilidad dominante. Este gen podría estar unido a un gen marcador de semillas y transformarse dentro de una línea endogámica femenina. Después las semillas a partir de esta línea podrían clasificarse en base a la presencia del gen marcador de semillas para asegurar una población pura de la progenie masculina estéril con Ms44 a partir de la línea femenina. Después, estas progenies se cruzarían con una línea endogámica masculina en un campo de producción de híbridos para producir 50 % de esterilidad masculina en la progenie de híbridos resultante.

Ejemplo 20. Variantes de secuencias descritas Otras secuencias mutantes MS44 se pueden generar por medios conocidos que incluyen, pero no se limitan a, truncamientos y mutaciones puntuales. Estas variantes pueden evaluarse para determinar su impacto en la fertilidad masculina mediante el uso de protocolos de transformación estándar, regeneración y evaluación.

A. Variantes de secuencias de nucleótidos que no alteran la secuencia de aminoácidos codificados Las secuencias de nucleótidos descritas se usan para generar variantes de secuencias de nucleótidos cuyas secuencias de nucleótidos del marco de lectura abierta (ORF) tienen aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % y 95 % de identidad de secuencia de nucleótidos cuando se comparan con las secuencias de nucleótidos del ORF inicial no alterado de la sec. con núm. de ident. correspondiente. Estas variantes funcionales se generan por medio del uso de una tabla de codones estándar. Aunque la secuencia de nucleótidos de las variantes se altere, la secuencia de aminoácidos codificada por los marcos de lectura abierta no cambia. Estas variantes se asocian con rasgos de componentes que determinan la producción y calidad de la biomasa. Aquellos que muestran asociación se usan como marcadores para seleccionar los rasgos de cada componente.

B. Variantes de secuencias de nucleótidos en las regiones no codificantes Las secuencias de nucleótidos descritas se usan para generar variantes de secuencias de nucleótidos que tienen la secuencia de nucleótidos de la región 5' no traducida, región 3' no traducida o región promotora que es aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % y 95 % idéntica a la secuencia de nucleótidos original de la sec. con núm. de ident. correspondiente. Después, estas variantes se asocian con la variación natural en el germoplasma para rasgos de componentes relacionados con la producción y calidad de la biomasa. Las variantes asociadas se usan como haplotipos marcadores para seleccionar los rasgos deseables.

C. Variantes de secuencias de aminoácidos de polipéptidos descritos Se genera variantes de secuencias de aminoácidos de los polipéptidos descritos. En este ejemplo se altera un aminoácido. Especifreamente, se revisa los marcos de lectura abierta para determinar la alteración apropiada de los aminoácidos. La selección del aminoácido que cambiará se realiza al consultar el alineamiento de proteínas (con los otros ortólogos y otros miembros de la familia de genes de varias especies) . Se selecciona un aminoácido que se considera que no está bajo alta presión de selección (que no está altamente conservado) y que es más bien fácilmente sustituible por un aminoácido con características químicas similares (es decir, de cadena lateral funcional similar). Puede cambiarse un aminoácido adecuado mediante el uso de un alineamiento de proteína. Una vez que se identifica el aminoácido objetivo se sigue el procedimiento descrito en la sección 11 siguiente. Con el uso de este método se genera variantes que tienen aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % y 95 % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos. Después, estas variantes se asocian con la variación natural en el germoplasma para rasgos de componentes relacionados con la producción y calidad de la biomasa. Las variantes asociadas se usan como haplotipos marcadores para seleccionar los rasgos deseables.

D. Variantes adicionales de secuencias de aminoácidos de polipéptidos descritos En este ejemplo se crea secuencias proteicas artificiales con 80 %, 85 %, 90 % y 95 % de identidad en comparación con la secuencia proteica de referencia. Este último esfuerzo requiere identificar las regiones conservadas y variables del alineamiento y, después, la aplicación acertada de una tabla de sustituciones de aminoácidos. Estas partes se describirán detalladamente a continuación.

En gran medida, las secuencias de aminoácidos que se alteran se determinan con base en las regiones conservadas dentro de cada proteina o dentro de los otros polipéptidos descritos. En base al alineamiento de la secuencia, las múltiples regiones del polipéptido descrito que potencialmente se pueden alterar se representan con letras minúsculas, mientras que las regiones conservadas se representan con letras mayúsculas. Se sabe que es posible hacer sustituciones conservadoras en las regiones conservadas a continuación sin alterar la función. Además, un experto comprenderá que las variantes funcionales de la secuencia descrita en la descripción pueden tener alteraciones menores no conservadas de aminoácidos en el dominio conservado.

Posteriormente, se crea secuencias proteicas artificiales que son distintas a las originales con intervalos de identidad de 80-85 %, 85-90 %, 90-95 % y 95-100 %. El objetivo es alcanzar los puntos intermedios de estos intervalos con una flexibilidad de más o menos 1 %, por ejemplo. Las sustituciones de aminoácidos se realizarán por una programación Perl personalizada. La tabla de sustituciones se proporciona a continuación en la Tabla 2.

Tabla 2. Tabla de sustituciones Primero, se identifica cualquier aminoácido conservado en la proteina que no se debe cambiar y se “señala” para el aislamiento de la sustitución. Naturalmente, la metionina inicial se agregará automáticamente a la lista. Después, se realiza los cambios.

H, C y P no se cambian en ninguna circunstancias. Los cambios ocurrirán, primero, con isoleucina desde el N-terminal hasta el C-terminal. Después, la leucina, y asi sucesivamente por toda la lista hacia abajo hasta alcanzar el objetivo deseado. Es posible realizar una cantidad parcial de sustituciones a manera de que no se inviertan los cambios. La lista se ordena de 1 a 17, para empezar con los cambios de isoleucina que sean necesarios antes que empezar con la leucina y sucesivamente hasta la metionina. Claramente, de esta manera, muchos aminoácidos no necesitarán cambios. L, I y V implican una sustitución 50:50 de las 2 sustituciones óptimas alternas.

Las variantes de secuencias de aminoácidos aparece escritas como impresión. Se usa la programación Perl para calcular las similitudes porcentuales. Con el uso de este procedimiento se generan variantes de los polipéptidos descritos que tienen aproximadamente 80 %, 85 %, 90 % y 95 % de identidad de aminoácidos con la secuencia de nucleótidos del ORF inicial no alterado.

E. Variantes de secuencias de aminoácidos de polipéptidos descritos que interfieren con el procesamiento del péptido señal Se genera variantes de secuencias de aminoácidos de los polipéptidos descritos. En este ejemplo, se altera uno o más aminoácidos. Específicamente, la secuencia señal (SS) secretora N-terminal se revisa para determinar la alteración posible de uno o varios aminoácidos. La selección del aminoácido que se cambiará se realiza mediante la predicción del sitio de escisión de SS con el uso de programas de predicción disponibles tales como SignalP (von Heijne, G. “A new method for predicting signal sequence cleavage sites” Nucleic Acids Res.: 14:4683 (1986). Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0., Bendtsen JD, Nielsen H, von Heijne G, Brunak S., J Mol Biol. jul. de 200416;340( ):783-95.) Se selecciona un aminoácido considerado como necesario para el procesamiento y secreción de proteínas apropiados. Las proteínas secretoras se sintetizan en ribosomas unidos al ER rugoso. En la célula vegetal, la secuencia señal, una secuencia de aminoácidos hidrofóbicos usualmente en el extremo N-terminal, se une mediante una partícula de reconocimiento de la señal (SRP), que a su vez se une mediante un receptor de SRP en la membrana del ER rugoso. La SRP dirige la unión del ribosoma a la membrana del ER, y el enhebrado de la proteína a través del canal transmembrana, denominado traslocón, en donde se procesa hasta su forma madura por escisión de peptidasa señal de la SS. El cambio de un aminoácido que interrumpe la unión a SRP o la escisión de la peptidasa señal podría inhibir el procesamiento y secreción normal de la proteína. Para la proteína Ms44, estos tipos de sustituciones de aminoácidos llevarían a un fenotipo dominante de esterilidad masculina.

Todas las publicaciones y solicitudes de patente en esta descripción son indicativas del nivel de conocimiento del experto en la téenica a la que pertenece esta descripción. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan en la presente descripción como referencia en la misma medida que si cada publicación o solicitud de patente individual fuera específicamente e individualmente indicada como referencia.

La presente descripción se ha descrito con referencia a varias modalidades y técnicas específicas y preferidas. Sin embargo, se debe comprender que es posible realizar muchas variaciones y modificaciones, siempre y cuando se conserve el espíritu y el alcance de la descripción.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para aumentar el rendimiento o mantener la estabilidad del rendimiento en plantas al: a) reducir el desarrollo del tejido reproductor masculino mediante la expresión de un transgén bajo el control de un promotor preferido para el tejido reproductor masculino; y b) aumentar la distribución de nutrientes al tejido reproductivo femenino durante el desarrollo simultáneo del tejido masculino y femenino.

2. El método de la reivindicación 1, caracterizado además porque el tejido reproductor masculino es la panoja.

3. El método de la reivindicación 2, caracterizado además porque el desarrollo del tejido reproductor masculino disminuye mediante la expresión de un gen unido operativamente a un promotor que comprende al menos 100 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada a partir de la lista.

4. Una planta derivada del método de la reivindicación 1.

5. Una célula de una planta de la reivindicación 4.

6. La semilla o progenie de la planta de la reivindicación 4.

7. Una molécula aislada de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que inicia la transcripción en una célula vegetal y comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: a) una secuencia seleccionada de la sec. con núm. de ident: 64 - 106; 134-137; 142; 144; 149; 150; b) al menos 100 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada de la sec. con núm. de ident: 64 - 106;134-137; 142; 144; 149; 150 y c) una secuencia que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con toda la extensión de una secuencia seleccionada de la sec. con núm. de ident.: 64 -106;134-137; 142; 144; 149; 150.

8. Un casete de expresión que comprende un polinucleótido de la reivindicación 7 unido operativamente a un polinucleótido de interés.

9. Un vector que comprende el casete de expresión de conformidad con la reivindicación 8.

10. Una célula vegetal que tiene incorporado establemente en su genoma el casete de expresión de la reivindicación 8.

11. La célula vegetal de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizada además porque la célula vegetal proviene de una monocotiledónea.

12. La célula vegetal de la reivindicación 11, caracterizada además porque la monocotiledónea es maíz, cebada, trigo, avena, centeno, sorgo o arroz.

13. Una planta que incorpora, establemente, en su geno a el casete de expresión de la reivindicación 8.

14. La planta de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque la planta es una monocotiledónea.

15. La planta de la reivindicación 14, caracterizada además porque la monocotiledónea es maiz, cebada, trigo, avena, centeno, sorgo o arroz.

16. Una semilla transgénica de la planta de la reivindicación 13.

17. La planta de la reivindicación 13, caracterizada además porque el polinucleótido de interés codifica un producto génico que confiere resistencia a patógenos o insectos.

18. La planta de la reivindicación 13, caracterizada además porque el casete de expresión codifica un polipéptido implicado en la captación de nutrientes, la eficiencia del uso de nitrógeno, la tolerancia a la sequía, la resistencia de la raíz, la resistencia al encamado de la raíz, el manejo de plagas del suelo, la resistencia al gusano de la raíz del maíz, el metabolismo de carbohidratos, el metabolismo de proteínas, el metabolismo de ácidos grasos, o la biosíntesis de fitohormonas.