MX2007005755A

MX2007005755A - Histidina quinasas con actividad sensora de citoquinina y metodos de uso de las mismas

Info

Publication number: MX2007005755A
Application number: MXMX/A/2007/005755A
Authority: MX
Inventors: J Meister Robert; Sivasankar Shoba
Original assignee: J Meister Robert; Pioneer Hibred International Inc; Sivasankar Shoba
Priority date: 2004-11-12
Filing date: 2007-05-11
Publication date: 2008-10-03

Abstract

Polinucleótidos aislados que codifican polipéptidos de histidina quinasa con actividad sensora de citoquinina, y los polipéptidos codificados por los mismos. Se describen casetes de expresión que comprenden los polinucleótidos de la invención y plantas y células vegetales transformadas con los polinucleótidos. Además se describen métodos de uso de los polinucléotidos y polipéptidos de histidina quinasa con actividad sensora de citoquinina para modular la actividad histidina quinasa y/o los niveles de histidina quinasa en plantas y células vegetales.

Description

HISTIDINA QUINASAS CON ACTIVIDAD SENSORA DE CITOQU1NINA Y MÉTODOS DE USO DE LAS MISMAS Esta solicitud reivindica prioridad, e incorpora en la presente a modo de referencia, las Solicitudes de Patente Provisional de EE.UU . N°: 60/627.394, presentada el 12 de noviembre, 2004, y 60/706.787, presentada el 9 de agosto, 2005. CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención está dirigida al campo de la biología molecular de plantas, en particular a moléculas de ácido nucleico que codifican histidina quinasas de maíz y métodos de uso de las mismas. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las plantas y otros organismos emplean sistemas de transducción de señales para percibir los estímulos ambientales y hormonales y para responder a los mismos a través de procesos celulares alterados mediante cambios en la cantidad o actividad de cascadas de productos genéticos. La fosforilación reversible de las proteínas constituye un mecanismo clave para la transducción intracelular de señales en células eucariotas y procariotas (Urao et al. (2000) Trends Plant Sci. 5:67-74). Dichos mecanismos de fosforilación reversible de proteínas comprenden las proteína quinasas. Las proteína quinasas conocidas por su participación en la transducción de señales se clasifican en tres grupos: serina/treonina proteína quinasas, tirosina proteína quinasas e histidina proteína quinasas (Sakakibara ef al. (2000) Plant Mol. Biol. 42:273-278). Aunque la función específica de las histidina proteína quinasas (también denominadas "histidina quinasas" en la presente) recién se empieza a conocer en plantas, se sabe que las histidina quinasas de bacterias cumplen funciones importantes en la actividad sensora y de transducción de diversos estímulos extracelulares (Urao eí al. (2001 ) Science's STKE doi: 10.1 26/stke.2001 .109. re18). Los sistemas de transducción de señales con los cuales están relacionadas las histidina quinasas se conocen como sistemas de señalización de dos componentes o sistemas His-Asp fosforelé [phosphorelay] (Sakakibara et al. (2000) Plant Mol. Biol. 42:273-278). Los sistemas de dos componentes vegetales están constituidos típicamente por tres dominios: un dominio con actividad sensora (histidina quinasa híbrida), una histidina que contiene un dominio de fosfotransferencia y un dominio receptor (regulador de la respuesta) (Sakakibara et al. (2000) Plant Mol. Biol. 42:273-278; Grefen y Harter (2004) Planta (Primero en línea) doi: 10.1007/s00425-004-1316-4). Además de un dominio histidina quinasa y un residuo histidina invariable que es autofosforilado, las histidina quinasas híbridas incluyen un dominio receptor habitualmente por el extremo COOH terminal que posee un residuo aspartato conservado (Grefen y Harter (2004) Planta (Primero en línea) doi: 0.1007/s00425-004-1316-4). En lugar de transferir el grupo fosforilo directamente al regulador de respuesta, primero es transferido del residuo histidina autofosforilado al residuo aspartato conservado del dominio receptor (Grefen y Harter (2004) Planta (Primero en línea) doi: 10.1007/s00425-004-1316-4). En plantas, las histidina quinasas están relacionadas con los sistemas de dos componentes que intervienen en la actividad osmosensora y la percepción de las hormonas vegetales etileno y citoquinina (Urao eí al. (2001 ) Science's STKE doi: 10.1 126/stke.2001 .109. re18). Según la prevalencia de los genes que codifican histidina quinasas de dos componentes de tipo bacteriano en el genoma de la planta modelo, Arabidopsis thaliana, se espera que las histidina quinasas de dos componentes de tipo bacteriano estén relacionadas con los sistemas de transducción de señales de diversos estímulos ambientales y hormonales. Se han clonado histidina quinasas de plantas incluyendo Arabidopsis thaliana (Chang et al. (1993) Science 262: 539-544; Hua ef al. (1995) Science 269:1712-1714; Kakimoto (1996) Science 274: 982-985; Hua et al. (1998) Plant Cell 10: 1321 — 1332; Sakai et al. (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU. 95: 5812-5817), tomate (Payton et al. (1996) Plant Mol. Biol. 31 : 1227-1231 ; Lashbrook et al. (1998) Plant J. 15: 243-252), Rumex palustris (Vriezen et al., 1997) Plant J. 1 1 :1265-1271 ) y tabaco (Zhang ef al., (2004) Plant Physiol. 136: 2971 -2981 ). Entre las histidina quinasas vegetales, las de Arabidopsis thaliana son las más investigadas hasta la fecha. El análisis de secuencia del genoma de Arabidopsis thaliana ha revelado que existen al menos dieciséis genes que codifican histidina quinasas putativas (Hwang ef al. (2002) Plant Physiol. 129:500-515). Grefen y Harter ((2004) Planta (Primero en línea) doi: 10.1007/s00425-004-1316-40) ha indicado que el análisis de secuencia de todo el genoma de Arabidopsis revela la presencia de ocho histidina quinasas canónicas. Entre las ocho histidina quinasas canónicas de Arabidopsis, cinco (ETR1 , ETR2, EIN4, ERS1 y ERS2) funcionan como receptores de etileno y uno (CRE1 ) actúa como un receptor de citoquinina (Urao et al. (2001 ) Science's STKE doi: 10.1 126/stke.2001 .109. re18). Hay dos histidina quinasas de Arabidopsis adicionales, CKI1 y CKI2, que también son receptores putativos de citoquinina según los análisis genéticos (Urao ef al. (2000) Trends Plant Sci. 5:67-74). Los homólogos de la histidina quinasa de Arabidopsis se dividen en tres familias distintas: los receptores de etileno, los fotorreceptores de fitocromo y la familia AHK, que incluye un receptor de citoquinina (CRE1/AHK4/WOL1 ) y un receptor osmosensor putativo (AtHK1 ) (Hwang et al. (2002) Plant Physiol. 129:500-515). Varias publicaciones hacen referencia al rol putativo in vivo de CKI2(AtCKI2) de Arabidopsis en la transducción de señales de citoquinina (Kakimoto, 1996; Grefen y Harter, 2004; Higuchi et al., 2004). Esta histidina quinasa carece claramente del dominio EXTRACELULAR SENSORIAL ASOCIADA A CICLASAS/HISTIDINA QUINASAS [CYCLASES/HISTIDINE KINASES ASSOCIA TED SENSORY EXTRACELLULAR] (CHASE) de unión a citoquinina (Anantharaman y Aravind, 2001 ; Mougel y Zhulin, 2001 ; Yamada et al., 2001 ). Los datos descritos en dicha publicación indican que AtCKI2 funciona como una única histidina quinasa intracelular. El extremo carboxilo terminal de la proteína AtCKI2 puede interactuar con las proteínas de FOSFOTRANSFERENCIA de HISTIDINA de ARABIDOPSIS así como con una proteína quinasa no descrita hasta ahora. Los análisis de tejido de callos de plantas transgénicas y mutantes CKI2 indican que la proteína puede modular positivamente el crecimiento como respuesta a citoquininas de una manera similar a AHK3. A medida que la población humana mundial continúa aumentando, se necesitan nuevas estrategias para mejorar las plantas de interés agronómico con el fin de afrontar las demandas de una mayor producción de alimentos. Una mejor comprensión de los componentes de los sistemas de transducción de señales ayudará en el desarrollo de nuevas estrategias para mejorar las plantas de cultivo de interés agronómico. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención provee composiciones y métodos para modular los sistemas de transducción de señales en plantas. Las composiciones comprenden polinucleótidos aislados que codifican histidina quinasas y polipéptidos aislados que comprenden histidina quinasas. Los polinucleótidos aislados seleccionados de la invención comprenden una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo formado por: las SEQ ID N°: 1 , 3, 4, 6, 7, 9, 13, 15, 16, 18, 26, 28, 30 y 32; las secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos que se muestran en las SEQ ID N°: 2, 5, 8, 14, 17, 23, 27 y 31 ; y fragmentos y vanantes de las mismas. Asimismo, polipéptidos aislados seleccionados de la invención comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por: las SEQ ID N°: 2, 5, 8, 14, 17, 23, 27 y 31 ; las secuencias de aminoácidos codificadas por las secuencias de nucleótidos que se muestran en las SEQ ID N°: 1 , 3, 4, 6, 7, 9, 13, 15, 16, 18, 26, 28, 30 y 32; y fragmentos y variantes de las mismas. La presente invención provee además casetes de expresión y plantas, tejidos vegetales, células vegetales y semillas transformadas. Los casetes de expresión comprenden al menos un polinucleótido de histidina quinasa de la invención ligado operativamente a un promotor que dirige la expresión en una planta o célula. Las plantas, tejidos vegetales, células vegetales y semillas transformadas comprenden al menos un polinucleótido de histidina quinasa de la invención ligado operativamente a un promotor que dirige la expresión en una planta o una célula de la misma. En un ejemplo de la invención, el polinucleótido de histidina quinasa de la invención es incorporado de forma estable en el genoma de las plantas, tejidos vegetales, células vegetales o semillas transformadas. La presente invención provee un método para incrementar la actividad de un polipéptido en una planta que comprende proveer en la planta un polipéptido de histidina quinasa de la invención. En un ejemplo, el método comprende introducir en la planta o en al menos una célula de la misma un polinucleótido de histidina quinasa de la invención. Si se deseara, el polinucleótido se puede incorporar de forma estable en el genoma de la planta. En otro ejemplo, el método comprende introducir el polipéptido de histidina quinasa en una planta o al menos en una célula de la misma. Las plantas producidas mediante este método presentan un mayor nivel de actividad histidina quinasa con relación a una planta a la cual no se proporcionó un polipéptido de histidina quinasa. La presente invención provee un método para modular el nivel de un polipéptido en una planta que comprende introducir en una planta un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una histidina quinasa de la invención. El polinucleótido puede comprender además un promotor ligado operativamente a la secuencia de nucleótidos que codifica la histidina quinasa, donde dicha secuencia de nucleótidos puede estar orientado en el sentido del marco de lectura o antisentido. Según el resultado deseado, el método se puede usar para incrementar o disminuir el nivel de un polipéptido de histidina quinasa en una planta o una parte de una planta. DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS La Figura 1 es una alineación de histidina quinasas de receptores de tipo híbrido. Homólogos de secuencias de CKI2 de Zea mays (ZmCKI2, SEQ ID N°: 8), Oryza sativum (OsCKI2, SEQ ID N°: 23) y Arabidopsis thaliana (AtCKI2, SEQ ID N°: 14) se alinearon con receptores de citoquinina putativos de Zea mays (ZmHK1 , SEQ ID N°: 22; ZmHK2, SEQ ID N°: 5; ZmHK3, SEQ ID N°: 31 ; y ZmCREI , SEQ ID N°: 1 ) y Arabidopsis thaliana (AtCREI , SEQ ID N°: 21 ; AtAHK2, SEQ ID N°: 19; y AtAHK3, SEQ ID N°: 20) usando una matriz BLOSUM62 del software CLUSTALW. La secuencia ZmCREI es una secuencia de longitud completa basada en un clon EST comercial y una secuencia derivada de una prueba con BAC. Los residuos conservados de la histidina quinasa (sobrerayado) y los dominios reguladores de respuestas (sobrerayado doble) están resaltados (Láminas 3-5) y los sitios de fosforilación putativos están indicados con un asterisco (Hwang et al. (2002) Plant Physiol. 129:500-515). Las regiones amino terminales de los homólogos CKI2 (residuos idénticos resaltados y en cursiva; Láminas 1 -3) contienen un dominio PAS tipo nuclear (subrayado de puntos) (Taylor y Zhulin (1999) Microbio!. Mol. Biol. Rev. 63-479-506) adyacente a una región alfa helicoidal putativa. Por el contrario, los receptores de citoquinina putativos contienen al dominio CHASE de unión a hormonas (Anatharaman y Aravind, (2001 ) Trends Biochem. Sci. 26:579-582) (residuos idénticos resaltados y subrayados; Láminas 1-3). Las regiones no conservadas (texto invertido) incluyen el extremo amino terminal de las proteínas que contienen al dominio CHASE, los residuos flanqueados por las cajas N y G1 del dominio de histidina quinasa y los residuos entre los dominios conservados de histidina quinasa y regulador de respuestas. La Figura 2 es una alineación con ClustalW de las secuencias de aminoácidos de CKI2 de Arabidopsis y arroz. Los residuos idénticos están sombreados y los residuos fosforilados putativos se muestran como texto invertido. AT, Arabidopsis thaliana; OS, Oryza sativum. La Figura 3 muestra los dominios funcionales putativos de AtCKI2. AtCKI2 contiene residuos signatura de ambos dominios histidina quinasa (A) y regulador de respuestas (B) (los residuos idénticos en al menos cuatro secuencias se muestran como texto invertido), incluyendo los residuos histidina y aspartato (asterisco) fosforilados. (C) El extremo amino terminal de CKI2 tiene una región de secuencia identidad con los residuos signatura del dominio PAS nuclear (asterisco). Hay tres regiones adyacentes (sobrerayado de puntos) con un motivo de un residuo hidrofóbico que se repite (resaltado en gris). AT, Arabidopsis thaliana; OS, Oryza sativum; SC, Saccharomyces cerevisiae; dos puntos representan una cantidad variable de aminoácidos que se omitieron a efectos de una mayor claridad; los motivos H, N, G1 , F y G2 de histidina quinasas y cuatro motivos de reguladores de respuestas ya fueron descritos con anterioridad (Stock et al. , 2000). La secuencia de AtETRI que se muestra es de NCBI , N° Acceso AAA 70047 (SEQ ID N°: 33). La secuencia ScSLN I que se muestra es de NCBI, N° Acceso CAA 86131 (SEQ ID N°: 34). Figura 4. Mutantes de inserción de histidina quinasa de Arabidopsis. Se determinó el sitio de inserción genómico de la secuencia del borde izquierdo del ADN-T para (A) cki2-2 (SEQ ID N°: 35), (B) ahk3-4 (SEQ ID N°: 20), y (C) ahk1-1 (SEQ ID N°: 25). En ck¡2-2 y ahk3-4, el producto de traducción en-marco de la secuencia del borde izquierdo, con un punto que representa el codón de terminación, se muestra como texto invertido. La inserción cki2-2 está ubicada entre los motivos II y III del dominio del regulador de respuesta. La inserción ahk3-4 se encuentra dentro de la caja G2 box del dominio histidina quinasa y la inserción ahk1-1 es adyacente a la caja G2, ubicada entre los dominios de histidina quinasa y regulador de respuesta. Figura 5. Árbol filogenético de histidina quinasas de Arabidopsis y maíz. Los nombres de las cajas representan las nuevas secuencias de maíz identificadas. La alineación se efectuó usando una matriz BLOSUM del software CLUSTALW. LISTADO DE SECUENCIAS Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos enumeradas en el listado de secuencias adjunto se muestran usando las abreviaturas de letras estándar para bases de nucleótidos y el código de tres letras para aminoácidos. Para las secuencias de nucleótidos se aplicó la convención estándar de comenzar por el extremo 5' de la secuencia y avanzar hacia el extremo 3' (es decir, de izquierda a derecha en cada línea). Solamente se muestra una cadena de cada secuencia de ácido nucleico, pero se considera que la cadena complementaria está incluida con la referencia a la cadena que se muestra. Para las secuencias de aminoácidos se aplica la convención estándar de comenzar por el extremo amino terminal de la secuencia y avanzar hacia el extremo carboxilo terminal (es decir, de izquierda a derecha en cada línea). Las secuencias de codificación descritas y/o a las que se hace referencia aquí pueden incluir, o no, un codón de terminación. Si se deseara, se puede agregar un codón de terminación a cualquier secuencia de codificación. Dichos codones de terminación incluyen, por ejemplo, TAA, TAG y TGA. En la SEQ ID N°: 1 se muestra la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína ZmCREI de maíz. La secuencia de codificación de la proteína comprende desde el nucleótido 2901 . En la SEQ ID N°: 2 se muestra la secuencia de aminoácidos de ZmCREI que es codificada por la SEQ ID N°: 1 . En la SEQ ID N°: 3 se muestra la secuencia de nucleótidos para la región de codificación de ZmHK3 de la SEQ ID N°: 1 . Los nucleótidos 1 -2901 de la SEQ ID N°: 3 corresponden a los nucleótidos 1 -2901 de la SEQ ID N°: 1 . En la SEQ ID N°: 4 se muestra la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína ZmHK2 de maíz. La secuencia de codificación de la proteína comprende los nucleótidos 1-3021 . En la SEQ ID N°: 5 se muestra la secuencia de aminoácidos de ZmHK2 que es codificada por la SEQ ID N°: 4. En la SEQ ID N°: 6 se muestra la secuencia de nucleótidos para la región de codificación de ZmHK2 de la SEQ ID N°: 1 . Los nucleótidos 1 -3021 de la SEQ ID N°: 6 corresponden a los nucleótidos 1 -3021 de la SEQ ID N°: 4. En la SEQ ID N°: 7 se muestra la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína ZmCKI2 de maíz. La secuencia de codificación de la proteína comprende los nucleótidos 1 -2895.

En la SEQ ID N°: 8 se muestra la secuencia de aminoácidos de ZmCKI2 que es codificada por la SEQ ID N°: 7. En la SEQ ID N°: 9 se muestra la secuencia de nucleótidos para la región de codificación de ZmCKI2 de la SEQ ID N°: 7. Los nucleótidos 1 -2895 de la SEQ ID N°: 9 corresponden a los nucleótidos 1 -2895 de la SEQ ID N°: 7. En la SEQ ID N°: 10 se muestra la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de codificación de longitud parcial de la proteína ZmCREI de maíz. En la SEQ N°: 1 1 se muestra la secuencia de aminoácidos de ZmCREI que es codificada por la SEQ ID N°: 0. En la SEQ N°: 12 se muestra la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de longitud parcial de ZmCREI de la SEQ ID N°: 1 1 . Los nucleótidos 1 -1788 de la SEQ I D N°: 12 corresponden a los nucleótidos 3-1790 de la SEQ ID N°: 10. En la SEQ N°: 13 se muestra la secuencia de nucleótidos que codifica AtCKI2 (NCBI , N° Acceso AAZ98829). En la SEQ N°: 14 se muestra la secuencia de aminoácidos de AtCKI2 que es codificada por la SEQ ID N°: 13. En la SEQ N°: 15 se muestra la secuencia de nucleótidos para la región de codificación de AtCKI2 de la SEQ ID N°: 13. Los nucleótidos 1 a 2769 de la SEQ ID N°: 15 corresponden a los nucleótidos 378-3146 de la SEQ ID N°: 1 3. En la SEQ N°: 16 se muestra la secuencia de nucleótidos que codifica AtAPK3. En la SEQ N°: 17 se muestra la secuencia de aminoácidos de AtAPK3 que es codificada por la SEQ ID N°: 6.

En la SEQ N°: 18 se muestra la secuencia de nucleótidos para la región de codificación de AtAPK3 de la SEQ ID N°: 16. Los nucleótidos 1 a 1428 de la SEQ ID N°: 18 corresponden a los nucleótidos 1 a 1428 de la SEQ ID N°: 16. En la SEQ N°: 19 se muestra la secuencia de aminoácidos de AtAHK2. En la SEQ N°: 20 se muestra la secuencia de aminoácidos de AtAHK3. En la SEQ N°: 21 se muestra la secuencia de aminoácidos de AtCREI . En la SEQ N°: 22 se muestra la secuencia de aminoácidos de ZmHK1. En la SEQ N°: 23 se muestra la secuencia de aminoácidos de OsCKI2. En la SEQ N°: 24 se muestra la secuencia de aminoácidos de AtCKM . En la SEQ N°: 25 se muestra la secuencia de aminoácidos de AtHK1 . En la SEQ N°: 26 se muestra la secuencia de nucleótidos que codifica ZmCKH . En la SEQ N°: 27 se muestra la secuencia de aminoácidos que es codificada por la SEQ ID N°: 26. En la SEQ N°: 28 se muestra la secuencia de nucleótidos para la región de codificación de ZmCKM de la SEQ ID N°: 26. Los nucleótidos 1 a 3180 de la SEQ ID N°: 28 corresponden a los nucleótidos 1 a 3180 de la SEQ ID N°: 26. En la SEQ N°: 29 se muestra una secuencia promotora de AtCKI2. En la SEQ N°: 30 se muestra la secuencia de nucleótidos que codifica ZmHK3. En la SEQ N°: 31 se muestra la secuencia de aminoácidos que es codificada por la SEQ ID N°: 30. En la SEQ N°: 32 se muestra la secuencia de nucleótidos para la región de codificación de ZmHK3 de la SEQ ID N°: 30. Los nucleótidos 1 a 3606 de la SEQ ID N°: 32 corresponden a los nucleótidos 1 a 3606 de la SEQ ID N°: 30.

En la SEQ N°: 33 se muestra la secuencia de aminoácidos de AtETRI (AAA 70047). En la SEQ N°: 34 se muestra la secuencia de aminoácidos de ScSLNI (CAA 86131 ). En la SEQ N°: 35 se muestra el muíante de inserción ck¡2-2 de la Figura 4A. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se proveen polinucleótidos que codifican histidina quinasas, los polipéptidos de histidina quinasa codificados por los mismos y métodos para usar los mismos. Se sabe que dichas histidina quinasas, también denominadas histidina-proteína quinasas, están relacionadas con los sistemas de dos componentes de transducción de señales en plantas y otros organismos eucariotas y en procariotas. En bacterias, las histidina quinasas están relacionadas con la transducción de señales como respuesta a señales extracelulares incluyendo factores quimiotácticos, cambios en la osmolaridad y deficiencia de nutrientes (Urao et al. (2000) Trends Plant Sci. 5:67-74). En plantas, se sabe que las histidina quinasas están relacionadas con la actividad osmosensora, la percepción de etileno y la señalización de citoquinina (Sakakibara et al. (2000) Plant Mol. Biol. 42:273-278; Urao er al. (2000) Trends Plant Sci. 5:67-74). Por consiguiente, los polinucleótidos y polipéptidos de histidina quinasas de la presente invención serán de utilidad en los métodos de modulación de las vías de transducción de señales en plantas para alterar las respuestas de las plantas, en particular de plantas de cultivo de interés agronómico, a estímulos ambientales y/u hormonales. Las composiciones de la invención incluyen polinucleótidos y polipéptidos de histidina quinasas de maiz relacionadas con los sistemas de dos componentes de transducción de señales en plantas. En particular, la presente invención provee polinucleótidos aislados que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos que se muestran en las SEQ ID N°: 2, 5, 8, 14, 17, 27 y 31 , incluyendo los polinucleótidos de las SEQ ID N°: , 3, 4, 6, 7, 9, 13, 15, 16, 18, 26, 28, 30 y 32; los polipéptidos codificados por las mismas; la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 23; y fragmentos y variantes de las mismas. La invención abarca composiciones de polinucleótidos o proteínas aisladas o sustancialmente purificadas. Un polinucleótido o proteina "aislado" o "purificado", o una porción biológicamente activa del mismo, está sustancialmente o esencialmente libre de los componentes que habitualmente acompañan o ¡nteractúan con el polinucleótido o la proteína tal como se hallan en su entorno natural. Por consiguiente, un polinucleótido o proteína aislado o purificado está sustancialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo cuando es producido mediante técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas cuando es sintetizado químicamente. Preferentemente, un polinucleótido "aislado" está libre de las secuencias (preferentemente las secuencias que codifican proteínas) que habitualmente flanquean los polinucleótidos (es decir, secuencias ubicadas en los extremos 5' y 3' del polinucleótido) en el ADN genómico del organismo del cual deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en diversos ejemplos, el polinucleótido aislado puede contener menos que 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb aproximadamente de las secuencias de nucleótidos que habitualmente flanquean que habitualmente flanquean el polinucleótido en el ADN genómico de la célula de la cual deriva el polinucleótido. La proteína que está substancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteínas que poseen menos que un 30%, 20%, 10%, 5% o 1 % (en peso seco) de proteínas contaminantes. Cuando la proteína de la invención o una porción biológicamente activa de la misma es producida de forma recombinante, el medio de cultivo representa preferentemente menos que un 30%, 20%, 10%, 5% o 1 % (en peso seco) aproximadamente de precursores químicos o de sustancias químicas que no son las proteínas de interés. El uso en la presente de los términos "polinucleótido", "molécula de polinucleótido", "molécula de ácido nucleico", "secuencia de nucleótidos" y semejantes no pretende limitar la presente invención a moléculas de polinucleótidos, polinucleótidos, moléculas de ácido nucleico y secuencias de nucleótidos que comprenden ADN. Los especialistas en la técnica comprenderán que también se pueden emplear polinucleótidos y oligonucleótidos compuestos de ribonucleótidos y combinaciones de ribonucleótidos y de desoxirribonucleótidos en los métodos descritos aquí. Por consiguiente, la presente invención abarca todas las construcciones de polinucleótidos que se puedan emplear en los métodos de la presente invención para transformar plantas incluyendo, a modo de ejemplo, las que comprenden desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y combinaciones de los mismos. Dichos desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos incluyen tanto formas naturales como análogos sintéticos. Los polinucleótidos de la invención también abarcan todas las formas de construcciones de nucleótidos incluyendo, a modo de ejemplo, formas de cadena simple, formas de cadena doble, horquillas, estructuras de tallo-y-bucle y semejantes. Los fragmentos y las variantes de los polinucleótidos y las proteínas descritas codificadas por los mismos también están comprendidos en la presente invención. El término "fragmento" significa una porción de la secuencia del polinucleótido o una porción de la secuencia de aminoácidos y por ende de la proteina codificada por el mismo. Los fragmentos de un polinucleótido pueden codificar fragmentos de proteína que retienen la actividad biológica de la proteína nativa y por ende pueden exhibir actividad histidina quinasa. Como alternativa, los fragmentos de polinucleótidos que son de utilidad como sondas de hibridación generalmente no codifican fragmentos de proteína que retienen la actividad biológica. Los fragmentos de una secuencia de nucleótidos pueden estar en un rango de al menos alrededor de 20 nucleótidos, alrededor de 50 nucleótidos, alrededor de 100 nucleótidos y hasta la secuencia de polinucleótidos de longitud total que codifica las proteínas de la invención. Un fragmento de un polinucleótido de histidina quinasa que codifica una porción biológicamente activa de una proteína histidina quinasa de la invención codificará al menos 15, 25, 30, 50, 100, 50, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1 .000, 1 .100 o 1 .200 aminoácidos contiguos, o hasta la cantidad total de aminoácidos presente en una proteína histidina quinasa de la invención (por ejemplo, 966, 1007 y 965, 918, 476, 968 , 1059 y 1201 aminoácidos para las SEQ ID N°: 2, 5, 8, 14, 17, 23, 27 y 31 , respectivamente). En general no es necesario que los fragmentos de polinucleótidos de histidina quinasa que son de utilidad como sondas de hibridación o cebadores para PCR codifiquen una porción biológicamente activa de una proteína histidina quinasa. Por consiguiente, un fragmento de un polinucleótido histidina quinasa puede codificar una porción biológicamente activa de una proteína histidina quinasa o puede ser un fragmento que se puede utilizar como una sonda de hibridación o un cebador para PCR usando los métodos que se describirán más adelante. Una porción biológicamente activa de una proteína histidina quinasa se puede preparar aislando una porción de uno de los polinucleótidos histidina quinasa de la invención, expresando la porción codificada de la proteína histidina quinasa (por ejemplo, por expresión recombinante in vitro) y evaluando la actividad de la porción codificada de la proteína histidina quinasa. Los polinucleótidos que son fragmentos de una secuencia de nucleótidos de histidina quinasa comprenden al menos 16, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1 .000, 1.100, 1 .200, 1.300, 1 .400, 1 .500, 1.750, 2.000, 2.250, 2.500, 3.000, 4.000 ó 4.500 nucleótidos o hasta la cantidad de nucleótidos presentes en un polinucleótido de longitud completa de la secuencia de nucleótidos de histidina quinasa descrita en la presente (por ejemplo, 2901 , 2901 , 3021 , 3021 , 3021 , 2.895, 2.895, 3.291 , 2.754, 1.431 , 1 .428, 3.240, 3.180. 3.606 y 3.606 nucleótidos para las SEQ ID N°: 1 , 3, 4, 6, 7, 9, 13, 15, 16, 18, 26, 28, 30 y 32, respectivamente). El término "variantes" significa secuencias sustancialmente similares. Para los polinucleótidos, una variante comprende la supresión y/o adición de uno o más nucleótidos en uno o más sitios dentro del polinucleótido nativo y/o la sustitución de uno o más nucleótidos en uno o más sitios en dicho polinucleótido nativo. Tal como se utiliza en la presente, un polinucleótido o polipéptido "nativo" comprende una secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos natural, respectivamente. Para los polinucleótidos, las variantes conservadoras incluyen aquellas secuencias que, debido a la degeneración del código genético, codifican la secuencia de aminoácidos de uno de los polipéptidos de histidina quinasa de la invención. Las variantes alélicas naturales como las recién mencionadas pueden ser identificadas utilizando técnicas de biología molecular bien conocidas, como, por ejemplo, las técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de hibridación que se describirán más adelante. Las vahantes de polinucleótidos también incluyen polinucleótidos derivados mediante síntesis, tal como los que se generan, por ejemplo, utilizando mutagénesis dirigida al sitio con la proteína histidina quinasa de la invención. En general, las vanantes de un polinucleótido particular de la invención tendrá al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% aproximadamente o más de identidad de secuencia con dicho polinucleótido particular, determinada con los programas y parámetros de alineación de secuencia descritos en otra parte en la presente. Las variantes de un polinucleótido particular de la invención (es decir, el polinucleótido de referencia) también puede evaluarse por comparación del porcentaje de identidad de secuencia entre el polipéptido codificado por una variante de polinucleótido y el polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Entonces, por ejemplo, se describe un polinucleótido aislado que codifica a polipéptido con un porcentaje dado de identidad de secuencia con el polipéptido de al menos una secuencia seleccionada del grupo formado por las SEQ ID N°: 2, 5, 8, 14, 17, 23, 27 y 31 . El porcentaje de identidad de secuencia entre cualesquiera dos polipéptidos se puede calcular usando los programas de alineación de secuencia y los parámetros descritos en otra parte en este documento. Cuando se evalúa cualquier par de polinucleótidos dado de la invención por comparación del porcentaje de identidad de secuencia compartido por los dos polipéptidos codificados por el mismo, dicho porcentaje de identidad de secuencia entre los dos polipéptidos codificados es de al menos aproximadamente 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia. Una "variante" de proteína significa una proteína derivada de la proteína nativa por supresión o adición de uno o varios aminoácidos en uno o más sitios en la proteína nativa y/o la sustitución de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína nativa. Las variantes de las proteínas comprendidas por la presente invención son biológicamente activas, es decir, aún poseen la actividad biológica deseada de la proteina nativa, en este caso, la actividad histidina quinasa descrita en la presente. Dichas variantes pueden ser el resultado de, por ejemplo, polimorfismos genéticos o de la intervención humana. Las variantes biológicamente activas de la proteína histidina quinasa nativa de la invención tendrán al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% aproximadamente o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la proteína nativa determinada con los programas de alineación de secuencia y los parámetros descritos en otra parte en la presente. Una variante biológicamente activa de una proteína de la invención puede diferir de dicha proteína por tan poco como 1 -15 residuos de aminoácidos, tan poco como 1 -10, tal como 6-10, tan poco como 5, tan poco como 4, 3, 2 o aún 1 residuo de aminoácido. Las proteínas de la invención se pueden alterar de varias maneras, incluyendo substituciones, supresiones, truncamientos e inserciones de aminoácidos. Los métodos para dichas manipulaciones son conocidos en general en la técnica. Por ejemplo, las variantes de la secuencia de aminoácidos y los fragmentos de las proteínas histidina quinasa se pueden preparar mediante mutaciones en el ADN. Los métodos para llevar a cabo la mutagénesis y las alteraciones de los polinucleótidos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc. Nati. Acad. Se/. EE. UU. 82: 488-492; Kunkel ef al. (1987) Methods in Enzymol. 154: 367-382; Patente de EE.UU. N°: 4.873.192; Walker y Gaastra, eds. (1983) Techniques ¡n Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nueva York) y las referencias citadas en las mismas. Los lineamientos para efectuar las sustituciones de aminoácidos apropiadas que no afectan la actividad biológica de la proteína de interés se pueden consultar en el modelo de Dayhoff ef al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Nati.

Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), incorporada en la presente a modo de referencia. Las sustituciones conservadoras, tal como el intercambio de un aminoácido por otro de propiedades similares, son óptimas. Por consiguiente, los genes y polinucleótidos de la invención incluyen tanto las secuencias naturales como las formas mutantes. De la misma manera, las proteínas de la invención abarcan tanto las proteínas naturales como las variaciones y formas modificadas de las mismas. Dichas variantes continúan reteniendo la actividad histidina quinasa deseada. Evidentemente, las mutaciones que se efectuarán en el ADN que codifica las variantes no deben colocar la secuencia fuera del marco de lectura y, con preferencia, no van a crear regiones complementarias que podrían producir una estructura de ARNm secundaria. Véase, la Publicación de la Solicitud de Patente EP N°:75.444 No cabe esperar que las supresiones, inserciones y sustituciones de las secuencias de proteínas comprendidas en la presente produzcan cambios radicales en las características de las proteínas. Sin embargo, cuando es difícil predecir el efecto exacto de la sustitución, supresión o inserción antes de producirla, el especialista en la técnica comprenderá que el efecto será evaluado por medio de ensayos de monitoreo de rutina. Es decir, la actividad se puede evaluar mediante ensayos de la actividad histidina quinasa. Véase, por ejemplo, Posas et al. (1 996) Cell 86:865-875, incorporada por completo en la presente a modo de referencia. Más recientemente, Zhang et al. han presentado demostraciones in vitro de la actividad histidina quinasa, 2004 (Plant Physiol. 36: 2971 -2981 ), incorporada por completo en la presente a modo de referencia. Dado que la función de la proteína SLN1 de levadura como una histidina quinasa ahora está establecida de forma inequívoca, los ensayos de actividad de la histidina quinasa también se pueden efectuar por complementación del mutante sln 1 de levadura (Ueguchi et al. (2001 ) Plant Cell Physiol. 42:231 -235), incorporada por completo en la presente a modo de referencia. Las variantes de polinucleótidos y proteínas también abarcan secuencias y proteínas derivadas de un procedimiento mutagénico y recombinogénico, tal como recombinación/entremezclado de ADN. Con tal procedimiento se pueden manipular una o más secuencias codificantes diferentes para crear una nueva histidina quinasa que posee las propiedades deseadas. De esta manera, se generan bibliotecas de polinucleótidos recombinantes a partir de una población de secuencias de polinucleótidos relacionadas que comprenden regiones de secuencia con una identidad de secuencia sustancial y que pueden ser recombinadas de forma homologa ¡n vitro o ¡n vivo. Por ejemplo, utilizando este enfoque, se pueden recombinar motivos de secuencia que codifican el dominio de interés entre los genes de histidina quinasa de la invención y otros genes de histidina quinasa conocidos con el fin de obtener un gen nuevo que codifique una proteína con mejoras en la propiedad de interés, tal como una mayor Km en el caso de una enzima. Las estrategias para dicho entremezclado de ADN son conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU. 91 : 10747-10751 ; Stemmer (1994) Nature 370:389-391 ; Crameri eí al. (1997) Nature Biotech. 16:436-438; Moore ef al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang ef al. (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU. 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391 :288-291 ; y las Patentes de EE.UU. N°: 5.605.793 y 5.837.458. Los polinucleótidos de la invención se pueden usar para aislar las secuencias correspondientes de otros organismos, en particular otras plantas, más particularmente otras monocotiledóneas. De esta manera, se pueden utilizar métodos tales como PCR, hibridación y semejantes para identificar dichas secuencias sobre la base de su homología de secuencia con las secuencias que se describen en la presente. Las secuencias aisladas sobre la base de su identidad de secuencia con la secuencia completa de histidina quina descrita en la presente o con variantes y fragmentos de la misma están comprendidas por la presente invención. Dichas secuencias incluyen secuencias que son ortólogas de las secuencias descriptas. El término "ortólogos" se refiere a genes derivados de un gen ancestral común que se encuentra en diferentes especies como resultado de la especiación. Los genes presentes en diferentes especies son considerados ortólogos cuando sus secuencias de nucleótidos y/o las secuencias de proteínas codificadas por las mismas comparte al menos un 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia. Las funciones de los ortólogos a menudo están muy conservadas entre las especies. Por consiguiente, los polinucleótidos aislados que codifican una proteína histidina quinasa y que se hibridizan bajo condiciones severas con al menos una de las secuencias de histidina quinasa descritas en la presente, o con variantes o fragmentos de las mismas, están comprendidas en la presente invención. En un enfoque con PCR, se pueden diseñar cebadores de oligonucleótidos para su uso en reacciones de PCR para amplificar las correspondientes secuencias de ADN a partir de ADNc o ADN genómico extraído de cualquier planta de interés. Los métodos para diseñar cebadores para PCR y clonación por PCR son conocidos en general en la técnica y se describen en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York). Véase también Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nueva York); Innis y Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nueva York); e Innis y Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nueva York). Los métodos de PCR conocidos incluyen, a modo de ejemplo, los métodos que emplean cebadores apareados, cebadores anidados, cebadores individuales específicos, cebadores degenerados, cebadores específicos de genes, cebadores específicos de vectores, cebadores parcialmente no coincidentes y semejantes. En las técnicas de hibridación, se utiliza toda o parte de un polinucleótido conocido como una sonda que se hibridice selectivamente con otros polinucleótidos correspondientes presentes en una población de fragmentos de ADN genómico clonado o fragmentos de ADNc (es decir, bibliotecas de ADN genómico o ADNc) de un organismo elegido. Las sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN u otros oligonucleótidos y se pueden marcar con un grupo detectable, tal como 32P o cualquier otro marcador detectable. Así, por ejemplo, las sondas de hibridación se pueden preparar mediante el marcado de oligonucleótidos sintéticos sobre la base de los polinucleótidos de histidina quinasa de la invención. Los métodos de preparación de sondas para la hibridación y para la construcción de bibliotecas de ADNc y genómicas son conocidos en general en la técnica y se describen en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York). Por ejemplo, la secuencia de polinucleótidos completa de histidina quinasa descrita aquí, o una o más porciones de la misma, se pueden utilizar como una sonda capaz de hibridizarse específicamente con los correspondientes polinucleótidos o ARN mensajeros de histidina quinasa. Para obtener una hibridación específica bajo diversas condiciones, dichas sondas incluyen secuencias que son únicas entre las secuencias de polinucleótidos histidina quinasa y preferentemente son de al menos 10 nucleótidos aproximadamente de longitud, y más preferentemente de al menos 20 nucleótidos aproximadamente de longitud. Dichas sondas se pueden usar para amplificar los correspondientes polinucleótidos de histidina quinasa de la planta elegida por PCR. Esta técnica se puede usar para aislar secuencias de codificación adicionales de la planta deseada o como un ensayo de diagnóstico para determinar la presencia de secuencias de codificación en una planta. Las técnicas de hibridación incluyen búsqueda con hibridación de bibliotecas de ADN plaqueadas (ya sean placas o colonias; véase, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York). La hibridación de dichas secuencias se puede llevar a cabo bajo condiciones severas. Los términos "condiciones severas" o "condiciones de hibridación severas" hacen referencia a condiciones bajo las cuales una sonda se hibridizará con su secuencia blanco, hasta un grado detectable mayor que con otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces con respecto al nivel basal). Las condiciones severas dependen de la secuencia y serán diferentes bajo distintas circunstancias. El control de la severidad de las condiciones de hibridación y/o de lavado, permite identificar secuencias blanco que son un 100% complementarias de la sonda (sonda homologas). Como alternativa, es posible ajustar las condiciones de severidad para permitir alguna falta de coincidencia en las secuencias de modo que se detectan grados más bajos de similitud (sondas heterólogas). En general, una sonda tiene menos que aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud, a menudo menos que 500 nucleótidos de longitud. Típicamente, las condiciones severas serán aquellas en las cuales la concentración de sales es menor que aproximadamente 1 ,5 M del ion de Na, típicamente entre 0,01 y 1 ,0 M aproximadamente de concentración del ion de Na (u otras sales) a pH entre 7,0 y 8,3 y la temperatura es de al menos 30 °C aproximadamente para sondas cortas (por ejemplo, entre 10 y 50 nucleótidos) y al menos 60 °C aproximadamente para sondas largas (por ejemplo, más de 50 nucleótidos). Las condiciones severas también se pueden lograr con la adición de agentes desestabilizantes, tal como formamida. Los ejemplos de condiciones de baja severidad incluyen hibridación con una solución amortiguadora de formamida al 30 a 35%, NaCI 1 M, SDS 1 % (dodecilsulfato de sodio) a 37 °C y un lavado en SSC 1 X a 2X (SSC 20X = NaCI 3,0 M / citrato trisódico 0,3 M) a 50-55 °C. Los ejemplos de condiciones de severidad moderada incluyen hibridación en formamida 40 a 45%, NaCI 1 M, SDS 1 % a 37 °C y un lavado en SSC 0,5X a 1 X a 55-60 °C. Los ejemplos de condiciones de severidad alta incluyen hibridación en formamida 50%, NaCI 1 M, SDS 1 % a 37 °C y un lavado en SSC 0.1 X a 60-65 °C. Optativamente, las soluciones amortiguadoras de lavado pueden comprender SDS entre aproximadamente 0, 1 % y aproximadamente 1 %. La duración de la hibridación es en general menor que 24 horas aproximadamente, habitualmente entre aproximadamente 4 y aproximadamente 12 horas. La duración del tiempo de lavado será de un tiempo suficiente como para alcanzar el equilibrio. Típicamente, la duración del lavado será de 1 , 2, 5, 10, 1 5, 20, 30 o más minutos aproximadamente. La especificidad depende típicamente de los lavados de post-hibridación, siendo los factores críticos la fuerza iónica y la temperatura de la solución final de lavado. Para los híbridos ADN-ADN, la Tm se puede aproximar a partir de la ecuación de Meinkoth y Wahl, Anal. Biochem. , 138:267-284: Tm = 81 ,5 °C + 6,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500/I; donde M es la molaridad de los cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de guanosina y nucleótidos de citosina en el ADN, % form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación y L es la longitud del híbrido en pares de bases. La Tm es la temperatura (bajo fuerza iónica y pH definidos) a la cual un 50% de una secuencia blanco complementaria se hibridiza con una sonda perfectamente coincidente. La Tm se reduce en aproximadamente 1 °C por cada 1 % de falta de coincidencia; por lo tanto, es posible ajusfar la Tm, las condiciones de hibridación y/o de lavado para hibridizar las secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con >90% de identidad, la Tm se puede disminuir en 10 °C. En general, las condiciones severas se seleccionan para que sean aproximadamente 5 °C menores que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia especifica y su complemento a una fuerza iónica y pH definidos. Sin embargo, las condiciones muy severas pueden emplear una hibridación y/o un lavado a 1 , 2, 3 ó 4 °C menos que el punto de fusión térmica (Tm); las condiciones moderadamente severas pueden utilizar una hibridación y/o un lavado a 6, 7, 8, 9 ó 10 °C menos que el punto de fusión térmica (Tm); las condiciones de baja severidad pueden emplear una hibridación y/o un lavado a 1 1 , 12, 13, 14, 15 ó 20 °C menos que el punto de fusión térmica (Tm). Usando la ecuación, las composiciones de hibridación y lavado y la Tm deseada, los especialistas comprenderán que se describen inherentemente variaciones en la severidad de las soluciones de hibridación y/o lavado. Si el grado de falta de coincidencia deseado da como resultado una Tm menor que 45 °C (solución acuosa) o 32 °C (solución de formamida) se prefiere incrementar la concentración de SSC para que se pueda usar una temperatura más alta. Se puede consultar una extensa guía para la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I , capítulo 2 (Elsevier, Nueva York); y Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, capítulo 2 (Greene Publishing y Wiley-lnterscience, Nueva York). Véase Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York). Los siguientes términos se utilizan para describir las relaciones de secuencias entre dos o más polinucleótidos o polipéptidos: (a) "secuencia de referencia", (b) "ventana de comparación", (c) "identidad de secuencia", (d) "porcentaje de identidad de secuencia". (a) Tal como se utiliza aquí "secuencia referencia" es una secuencia definida utilizada como base para la comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la totalidad de una secuencia especificada; por ejemplo, un segmento de una secuencia genética o de ADNc de longitud completa o la secuencia completa del gen o del ADNc. (b) Tal como se utiliza en este documento, una "ventana de comparación" hace referencia a un segmento contiguo y especificado de una secuencia de polinucleótidos, donde la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, faltas de coincidencia o huecos) al compararla con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para una alineación óptima de los dos polinucleótidos. En general, la ventana de comparación es de por lo menos 20 nucleótidos contiguos de longitud y, optativamente, puede ser de 30, 40, 50, 100 o más de longitud. Los especialistas en la técnica comprenderán que a fin de evitar una gran similitud con la secuencia de referencia debido a la inclusión de faltas de coincidencia en la secuencia de polinucleótidos, se introduce típicamente una penalización por falta de coincidencia y se resta de la cantidad de coincidencias. Los métodos de alineación de secuencias para una comparación son bien conocidos en la técnica. Por consiguiente, la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias cualesquiera se puede llevar a cabo usando un algoritmo matemático. Los ejemplos no limitativos de dichos algoritmos matemáticos son: el algoritmo de Myers y Milier (1988) CABIOS 4:1 1 -17; el algoritmo de homología local de Smith ef al. (1981 ) Adv. Appl. Math. 2: 482; el algoritmo de alineación por homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453; el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. 85: 2444-2448; el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 872264, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU. 90:5873-5877 Se pueden utilizar las implementaciones computarizadas de estos algoritmos matemáticos para la comparación de secuencias con el fin de determinar la identidad de secuencia. Dichas implementaciones incluyen, a modo de ejemplo: CLUSTAL en el programa PC/Gene (disponible de Intelligenetícs, Mountain View, California); incluyendo CLUSTALV y CLUSTALW; el programa ALIGN (Versión 2.0) y GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el Paquete de Software Wisconsin Genetics, Versión 10 (disponible de Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, California, EE.UU.). Las alineaciones que emplean estos programas se pueden efectuar utilizando los parámetros predeterminados. El programa CLUSTAL está muy bien descrito por Higgins et al., (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins ef al. (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet ef al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881 -90; Huang ef al. (1992) CABIOS: 8:155-65; y Pearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331 . El programa ALIGN se basa en el algoritmo de Myers y Milier (1988) supra. Se puede usar una tabla de peso de residuos PAM120, una restricción para la falta de coincidencia de 12 y una restricción por falta de coincidencia de 4 con el programa ALIGN cuando se comparan secuencias de aminoácidos. Los programas BLAST de Altschul et al (1990) J. Mol. Biol. 215:403 se basan en el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) supra. Las búsquedas de nucleótidos BLAST se pueden efectuar con el programa BLASTN, calificación = 100, longitud de palabra = 1 2, para obtener las secuencias de nucleótidos homologas de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina de la invención. Las búsquedas de proteínas BLAST se pueden efectuar con el programa BLASTX, calificación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener las secuencias de aminoácidos homologas de una proteina o polipéptido de la invención. Con el fin de obtener alineaciones con faltas de coincidencia para efectuar una comparación, se puede emplear Gapped BLAST (en BLAST 2.0) como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Como alternativa, se puede utilizar PSI-BLAST (en BLAST 2.0) para efectuar una búsqueda iterada que permite detectar relaciones distantes entre las moléculas. Véase, Altschul et al. (1997) supra. Cuando se utiliza BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, se pueden usar los parámetros predeterminados de los respectivos programas (por ejemplo, BLASTN para secuencias de nucleótidos, BLASTX para proteínas). Véase las bases de datos y programas que ofrece en línea el Centro Nacional de Información sobre Biotecnología de los EE.UU. del Instituto Nacional de Salud [United States National Center for Bíotechnology Information of the National Institutes of Health]. Los alineamientos también se pueden efectuar mediante inspección manual. GAP emplea el algoritmo de Needleman y Wunsch ( 1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453, para hallar la alineación de dos secuencias completas que maximice la cantidad de coincidencias y minimice la cantidad de faltas de coincidencias. GAP tiene en cuenta todas las alineaciones y posiciones posibles de las coincidencias y crea una alineación con la mayor cantidad de bases coíncidentes y la menor cantidad de faltas de coincidencias. Permite la provisión de un límite de penalidad por creación de faltas de coincidencias y una penalidad por la extensión de las faltas de coincidencias, expresados en unidades de bases coincidentes. GAP debe obtener una ganancia con la penalidad por creación de faltas de coincidencias en cantidades de coincidencias por cada falta de coincidencia que inserta. Si se elige una penalidad por la extensión de las faltas de coincidencias mayor que cero, GAP debe, además, proveer una ganancia por cada falta de coincidencia insertada, cuya longitud es la cantidad de faltas de coincidencia, con respecto a la penalidad por extensión de las faltas de coincidencias. Los valores predeterminados para la creación de faltas de coincidencias y la extensión de las faltas de coincidencias en la Versión 10 del paquete de software GCG® Wisconsin Genetics (Accelrys, Inc., San Diego, California) para secuencias de proteínas son de 8 y 2, respectivamente. Para las secuencias de nucleótidos la penalidad por creación de falta de coincidencia predeterminado es de 50, en tanto la penalidad por falta de coincidencia predeterminado es de 3. La penalidad por creación de faltas de coincidencia y de extensión de las faltas de coincidencia se pueden expresar como un número entero seleccionado del grupo de números enteros de 0 a 200. Así, por ejemplo, los valores de las penalidades por creación de faltas de coincidencia y de extensión de las faltas de coincidencia pueden ser de 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o mayor. A menos que se indique lo contrario, los valores de identidad/similitud de secuencia provistos en este documento se refieren a los valores obtenidos utilizando GAP Versión 10 con los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótidos utilizando un Peso de GAP de 50 (penalización por creación de hueco) y un Peso de Longitud de 3 (penalización por extensión de hueco); y la matriz de calificación de nwsgapdna.cmp; % de identidad y % similitud para una secuencia de aminoácidos usando un Peso GAP de 8 y un Peso de Longitud de 2, y la matriz de calificación BLOSUM62; o cualquier programa equivalente de los mismos. GAP representa un miembro de la familia de mejores alineaciones. Esta familia puede tener muchos miembros, pero ningún otro miembro tiene una mejor calidad. GAP muestra cuatro valores de calificación para las alineaciones: Calidad, Relación, Identidad y Similitud. La Calidad es la métrica maximizada para alinear las secuencias. La Relación es la calidad dividida por la cantidad de bases en el segmento más corto. La Identidad porcentual es el porcentaje de los símbolos que coinciden realmente. La Similitud porcentual es el porcentaje de los símbolos que son similares. No se tienen en cuenta los símbolos que son cruzados con respecto a las faltas de coincidencia. Se califica una similitud cuando el valor de la matriz de calificación para un par de símbolos es mayor o igual que 0,50, como el umbral de similitud. La matriz de calificación usada en la Versión 10 del paquete de software de Wisconsin Genetics GCG es BLOSUM62 (véase, Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 89: 10915). (c) Tal como se utiliza en este documento, la "identidad de secuencia" o "identidad" en el contexto de dos secuencias de polinucleótidos o de polipéptidos se refiere a los residuos en las dos secuencias que son iguales cuando se alinean por correspondencia máxima en la ventana de comparación especificada. Cuando el porcentaje de identidad de secuencias se utiliza con referencia a proteínas se comprenderá que las posiciones de los residuos que no son idénticos a menudo difieren por sustituciones conservadoras de aminoácidos, donde los residuos aminoacídicos son sustituidos por otros residuos aminoacídicos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y por ello no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren por sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencia se puede ajustar hacia arriba con el fin de corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Se dice que las secuencias que difieren por dichas sustituciones conservadoras poseen "similitud de secuencia" o "similitud". Los medios para efectuar este ajuste son bien conocidos por los especialistas en la técnica. Típicamente, comprende la calificación de una sustitución conservadora como una falta de coincidencia parcial en lugar de completa, con lo cual aumenta el porcentaje de identidad de secuencias. Así, por ejemplo, cuando un aminoácido idéntico recibe una calificación de 1 y una sustitución no conservadora recibe una calificación de cero, la sustitución conservadora recibe una calificación entre cero y 1 . La calificación de sustituciones conservadoras se calcula, por ejemplo, como se ¡mplementa en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View. California). (d) Tal como se utiliza aquí, "porcentaje de identidad de secuencia" significa el valor determinado por comparación de dos secuencias óptimamente alineadas en una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (por ejemplo, huecos) cuando se la compara con la secuencia de referencia (la cual no comprende adiciones o supresiones) para alineamientos óptimos de dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando la cantidad de posiciones en las cuales aparece la base de ácido o residuo aminoacídico en ambas secuencias para obtener la cantidad de posiciones coincidentes, dividiendo la cantidad de posiciones coincidentes por la cantidad total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia. Los polinucleótidos de histidina quinasas de la invención se pueden proveer en casetes de expresión para su expresión en la planta de interés. El cásete incluirá secuencias reguladoras 5' y 3' ligadas operativamente a un polinucleótido de histidina quinasa de la invención. El término "ligado operativamente" se refiere a un ligamiento funcional entre dos o más elementos. Por ejemplo, un ligamiento operativo entre un polinucleótido de interés y una secuencia reguladora (es decir, un promotor) es un enlace funcional que permite la expresión del polinucleótido de interés. Los elementos ligados operativamente pueden ser contiguos o no contiguos. Cuando se usan con referencia a la unión de dos regiones de codificación de proteínas, el término ligado operativamente significa que las regiones de codificación están en el mismo marco de lectura. El cásete puede contener además al menos un gen adicional que será cotransformado en el organismo. Como alternativa, el gen o genes pueden ser provistos en múltiples casetes de expresión. Dicho cásete de expresión se provee con a pluralidad de sitios de restricción y/o sitios de recombinación para que la inserción del polinucleótido de histidina quinasa se encuentre bajo la regulación de la transcripción de las regiones reguladoras. El cásete de expresión puede contener además genes marcadores seleccionares. El cásete de expresión incluirá en la dirección de transcripción 5'-3', una región de inicio de la transcripción y de la traducción (es decir, un promotor), un polinucleótido de histidina quinasa de la invención y una región de terminación de la transcripción y de la traducción (es decir, una región de terminación) funcional en plantas. Las regiones reguladoras (es decir, promotores, regiones reguladoras de la transcripción y regiones de terminación de la traducción) y/o el polinucleótido de histidina quinasa de la invención pueden ser nativas/análogas para la célula huésped o entre sí. Como alternativa, las regiones reguladoras y/o el polinucleótido de histidina quinasa de la invención pueden ser heterólogas de la célula huésped o entre sí. Tal como se utiliza en la presente, el término "heteróloga" con referencia a una secuencia es una secuencia originaria de una especie extraña o, si es de la misma especie, está modificada sustancialmente con respecto a su forma nativa en cuanto a composición y/o locus genómico por intervención humana deliberada. Por ejemplo, un promotor ligado operativamente a un polinucleótido heterólogo es de una especie diferente de la especie de la cual deriva el polinucleótido o, si es de la misma especie o una especie análoga, uno o ambos están sustancialmente modificadas con respecto a su forma y/o locus genómico original, o el promotor no es el promotor nativo para el polinucleótido ligado operativamente. Tal como se utiliza en la presente, un gen quimérico comprende una secuencia de codificación ligada operativamente a una región de inicio de la transcripción que es heteróloga con respecto a la secuencia de codificación. Aunque puede ser preferible expresar las secuencias usando promotores heterólogos, se pueden usar las secuencias promotoras nativas. Dichas construcciones cambiarán los niveles de expresión de histidina quinasa en la planta o célula vegetal. Por consiguiente, se altera el fenotipo de la planta o célula vegetal. La región de terminación puede ser nativa con respecto a la región inicio de la transcripción, puede ser nativa con respecto al polinucleótido de histidina quinasa ligado operativamente de interés o con las secuencias promotoras de histidina quinasa, puede ser nativa con respecto a la planta huésped o puede derivar de otra fuente (es decir, extraña o heteróloga) con respecto al promotor, al polinucleótido de histidina quinasa de interés, a la planta huésped o cualquier combinación de los mismos. Las regiones de terminación convenientes se encuentran disponibles del plásmido Ti de A. tumefaciens, tal como las regiones de terminación de la octopina sintetasa y nopalina sintetasa. Véase también Guerineau eí al. (1991 ) Mol. Gen. Genet. 262:141 -144; Proudfoot (1991 ) Cell 64:671 -674; Sanfacon et al. (1991 ) Genes Dev. 5: 141 -149; Mogen eí al. (1990) Plañí Cell 2:1261 -1272; Munroe et al. (1990) Gene 91 :151 -158; Bailas eí al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; y Joshi eí al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:9627-9639. Cuando corresponda, los polinucleótidos pueden ser optimizados para una mayor expresión en la planta transformada. Es decir, los polinucleótidos se pueden sintetizar utilizando los codones vegetales preferidos para una mejor expresión. Véase, por ejemplo, Campbell y Gow (1990) Plant Physiol. 92: 1 -1 1 por una descripción de la utilización de codones preferida para el huésped. Existen métodos disponibles en la técnica para sintetizar los genes con preferencia por plantas. Véase, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N°: 5.380.831 y 5.436.391 , y Murray eí al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, incorporada en este documento a modo de referencia. Se conocen otras modificaciones de secuencia que mejoran la expresión del gen en una célula huésped. Dichas modificaciones incluyen la eliminación de secuencias que codifican señales de poliadenilación espúreas, señales de sitios de procesamiento de exón-intrón, repeticiones tipo transposón y otras secuencias del tipo bien caracterizadas que pueden resultar nocivas para la expresión del gen. El contenido de G-C de la secuencia puede ser ajustado en niveles promedio para una célula huésped dada, calculado con referencia a genes conocidos que se expresan en dicha célula huésped. Cuando fuera posible, la secuencia será modificada a fin de evitar las estructuras de ARNm secundarias en horquilla predichas. Los casetes de expresión pueden, además, contener secuencias directrices '. Dichas secuencias directrices pueden mejorar la traducción. Las directrices de traducción son conocidas en la técnica e incluyen: las directrices de picornavirus, por ejemplo, directriz EMCV (región no codificadora 5' de encefalomiocarditis) (Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. , (86:6126-6130); directrices potivirus, por ejemplo, directriz TEV (virus del etch de tabaco) (Gallie et al. (1995) Gene 165(2):233-238), la directriz MDMV (Virus en Mosaico Enano del Maíz) {Virology 154:9-20), y la proteína de unión a la cadena pesada de la inmunoglobulina humana (BiP) (Macejak et al. ( 1991 ) Nature, 353: directriz no traducida del ARNm de la proteína de la cubierta del virus en mosaico de alfalfa (AMV ARN 4). (Jobling et al., (1987) Nature, 325:622-625); directriz del virus en mosaico de tabaco (TMV), (Gallie et al. (1989) en Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, Nueva York), págs. 237-256); y directriz del virus moteado clorótico de maíz (MCMV) (Lommel et al. (1991 ) Virology 81 :382-385). Véase también, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968. También se pueden utilizar otros métodos conocidos para mejorar la traducción, por ejemplo, ¡ntrones y semejantes. Cuando se prepara el cásete de expresión, se pueden manipular los diversos fragmentos de ADN con el fin de proveer las secuencias de ADN en la orientación apropiada y, según corresponda, en el marco de lectura adecuado. Con este fin se pueden emplear adaptadores o ligadores para unir los fragmentos de ADN o se pueden utilizar otras manipulaciones para proveer sitios de restricción convenientes, eliminar ADN superfluo, eliminar sitios de restricción o semejantes. Con este propósito, se puede utilizar mutagénesis in vitro, reparación de cebadores, digestiones de restricción, alineamiento, resustituciones, por ejemplo transiciones y transversiones. Se puede emplear una cantidad de promotores en la práctica de la invención, incluyendo el promotor nativo de la secuencia de polinucleótidos de interés. Los promotores se pueden seleccionar sobre la base del resultado deseado. Es decir, los ácidos nucleicos se pueden combinar con promotores constitutivos, con preferencia por tejidos u otros promotores para su expresión en plantas. Dichos promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, el promotor nuclear de Rsyn7 y otros promotores constitutivos como se describe en WO 99/43838 y en la Patente de EE.UU. N°: 6.072.050; el promotor nuclear CaMV 35S (Odell et al. (1,985) Nature 3)3:810-812); el promotor de actina de arroz (McEIroy et al. (1990) Plant Cell 2: 163-171 ); el promotor de ubiquitina (Christensen ef al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 y Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675-689); el promotor pEMU (Last ef al. (1991 ) Theor. Appl. Genet. 81 :581 -588); MAS (Velten er al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730); el promotor ALS (Patente de EE.UU. N°: 5.659.026), scpl (WO 97/47756, Patente de EE.UU. N°: 6.555.673), el promotor H2B de histonas (Patente de EE.UU. N°: 6.177.61 1 ) y semejantes. Otros promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, las que se describen en las Patentes de EE.UU. N°: 5.608.149; 5.608.144; 5.604.1 21 ; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; y 5.608.142 y 6.177.61 . Se pueden utilizar promotores regulados por compuestos químicos para modular la expresión de un gen en una planta a través de la aplicación de un regulador químico exógeno. Dependiendo del objetivo a alcanzar, el promotor puede ser un promotor inducible por sustancias químicas, cuando la aplicación de la sustancia química induce la expresión del gen, o un promotor reprimible por compuestos químicos cuando la aplicación del compuesto químico reprime la expresión del gen. Los promotores inducibles por compuestos químicos son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no están limitados al promotor ln2-2 del maíz, que es activado por el herbicida bencensulfonamída, el promotor GST del maíz que es activado por compuestos electrofilicos hidrofóbicos que son utilizados como herbicidas pre-emergentes, y el promotor PR-1 a del tabaco, que es activado por ácido salicílico. Otros promotores regulados por compuestos químicos de interés incluyen promotores que responden a esteroides (véase, por ejemplo, promotores inducibles por glucocorticoides en Schena et al. (1991 ) Proc. Nati. Acad. Sc¡. EE. UU. 88: 10421 -10425 y McNellis et al. (1998) Plant J. 14(2):247-257) y promotores inducibles por tetraciclina y reprimibles por tetraciclina (véase, por ejemplo, Gatz et al. (1991 ) Mol. Gen. Genet. 227:229-237, y las Patentes N°: 5.814.618 y 5.789.156), incorporadas en este documento a modo de referencia. Se pueden utilizar promotores con preferencia por tejidos para obtener una mayor expresión de histidina quinasa en un tejido vegetal particular. Los promotores con preferencia por tejidos incluyen Yamamoto ef al. (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansen er al. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2):1 57-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 1 12(3):1331 -1341 ; Van Camp eí al. (1996) Plant Physiol. 2(2):525-535; Canevascini eí al. (1996) Plant Physiol. 1 12(2):513-524; Yamamoto ef al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 181 -196; Orozco et al. (1993) Plant Mol Biol. 23(6): 1 129-1 138; Matsuoka er al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU. 90(20):9586-9590; y Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3):495-505. Dichos promotores se pueden modificar, si fuera necesario, para obtener una expresión débil. Los promotores con preferencia por hojas son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Yamamoto er al. (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kwon et al. (1994) Plant Physiol. 105:357-67; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Gotor ef al. (1993) Plant J. 3:509-18; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23(6): 1 129-1 138; y Matsuoka ef al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU. 90(20):9586-9590 Los promotores específicos de raíz son conocidos y se pueden seleccionar entre todos los que se encuentran disponibles de la literatura o se pueden aislar de novo a partir de diversas especies compatibles. Véase, por ejemplo, Hire et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20(2):207-218 (gen de la glutamina sintetasa específica de la raíz de soja); Keller y Baumgartner (1991 ) Plant Cell 3(10): 1051 -1061 (elemento de control específico de raíz en el gen GRP 1 .8 de las judías); Sanger et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14(3):433-443 (promotor específico de raíz del gen de la manopina sintetasa (MAS) de Agrobacteríum tumefaciens); y Miao et al. (1991 ) Plant Cell 3(1 ): 1 1 -22 (clon de ADNc de longitud total que codifica la glutamina sintetasa citosólíca (GS), que se expresa en las raíces y en los nodulos de las raíces de la soja). Véase también, Bogusz et al. (1990) Plant Cell 2(7):633-641 , en donde se aislaron dos promotores específicos de raíces de los genes de hemoglobina de la no leguminosa que fija nitrógeno Parasponia andersonii y la no leguminosa que no fija nitrógeno relacionada Trema tomentosa. Los promotores de estos genes se ligaron a un gen informante ß-glucuronidasa y se introdujeron en la especie no leguminosa Nicotiana tabacum y en la especie leguminosa Lotus corniculatus y en ambos casos se conservó la actividad promotora específica de raíz. Leach y Aoyagí (1991 ) describen su análisis de los promotores de los genes inductores de raíz de gran expresión rolC y roID de Agrobacteríum rhizogenes (véase Plant Science (Limerick) 79(1 ):69-76). Ellos concluyeron que los determinantes de ADN potenciadores y de preferencia por tejidos están disociados en dichos promotores. Tee et al. (1989) utilizaron fusión de genes con lacZ para demostrar que el gen de ADN-T de Agrobacteríum codificador de una octopina sintetasa es especialmente activa en la epidermis de la punta de la raíz y que el gen TR2' es específico de raíces en la planta intacta y estimulada por lesiones en el tejido foliar, una combinación de características especialmente deseable para su uso con un gen insecticida o larvicida (véase EMBO J 8(2):343-350) El gen TR1 ', fusionado a nptll (neomicina fosfotransferasa II) presentó características similares. Otros promotores con preferencia por raíces incluyen al promotor del gen VfENOD-GRP3 (Kuster et al (1995) Plant Mol. Biol. 29(4):759-772); y el promotor rolB (Capana ef al. (1994) Plant Mol. Biol. 25(4):681 -691 . Véase también las Patentes de EE.UU. N°: 5.837.876; 5.750.386; 5.633.363; 5.459.252; 5.401 .836; 5.1 10.732; y 5.023.179. Los promotores "con preferencia por semillas" comprenden a los promotores que son activos durante el desarrollo de las semillas, incluyendo los que son activos en el tejido reproductor femenino alrededor del momento de la antesis, o durante la misma, y los promotores de las proteínas de almacenamiento de las semillas. También son de interés los promotores que son activos durante la germinación de las semillas. Véase Thompson ef al. (1989) BioEssays 10:108, incorporada en este documento a modo de referencia. Dichos promotores preferidos de semillas incluyen pero no están limitados a Cim1 (mensajero que induce citoquinina); cZ19B1 (zeína de 19 kDa del maíz); y mílps (mio-ínosítol-1-fosfato sintetasa); (véase, WO 00/1 1 177 y Patente de EE.UU. N°: 6.225.529, incorporadas aquí a modo de referencia). La gamma-zeína es un promotor específico del endosperma. La globulinal (Glb-1 ) es un promotor específico de embriones representativo. Para dicotiledóneas, los promotores con preferencia por semillas incluyen, a modo de ejemplo, /?-faseolina de haba, napina, ?-conglícinina, lectina de soja, cruciferina y semejantes. Para las monocotiledóneas, los promotores con preferencia por semillas incluyen, a modo de ejemplo, la zeina de 15 kDa del maíz, zeína de 22 kDa, zeina de 27 kDa, g-zeina, waxy, shrunken 1 , shrunken 2, globulina 1 , etc. Véase también, WO 00/12733, en donde se divulgan promotores con preferencia por semillas de los genes end1 y end2; incorporados aquí como referencia. Otros promotores específicos de embriones se describen en Sato et al. (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. 93:81 17-8122; Nakase ef al. (1997) Plant J 12:235-46; y Postma-Haarsma ef al. (1999) Plant Mol. Biol. 39:257-71 . Otros promotores con preferencia por el endosperma se describen en Albani ef al. (1984) EMBO 3:1405-15; Albani ef al. (1999) Theor. Appl. Gen. 98: 1253-62; Albani ef al. (1993) Plant J. 4:343-55; Mena et al. (1998) The Plant Journal 1 1 6:53-62, y Wu et al. (1998) Plant Cell Physiology 39:885-889. Como se determinara precedentemente, los promotores de interés incluyen los que son activos en las regiones del meristema, tal como los tejidos de inflorescencias en desarrollo y los promotores que dirigen la expresión en o alrededor del momento de la antesis o durante el desarrollo temprano de los granos. Pueden incluir, por ejemplo, el promotor Zag2.1 de maíz (GenBank X80206; véase también la Solicitud de Patente de EE.UU. N°: 10/817.483); el promotor Zap de maíz (también conocido como ZmMADS; Solicitud de Patente de EE.UU. N°: 10/387.937; WO 03/078590); el promotor ckx1 -2 de maíz (Publicación de Patente de EE.UU. N°: 2002-0152500 A1 ; WO 02/0078438); el promotor eepl de maíz (Solicitud de Patente de EE.UU. N°: 10/817.483); el promotor end2 de maíz (Patente de EE.UU. N°: 6.528.704 y la Solicitud de Patente de EE.UU. N°: 10/310.191 ); el promotor led de maíz (Solicitud de Patente de EE.UU. N°: 09/718.754); el promotor F3.7 de maíz (Baszczynski et al. , Maydica 42: 189-201 (1997)); el promotor tb1 de maíz (Hubbarda et al., Genetics 162: 1927-1935 (2002)); el promotor eep2 de maíz (Solicitud de Patente de EE.UU. N°: 10/817.483); el promotor de tiorredoxina H de maíz (Solicitud de Patente Provisional de EE.UU.

N°: 60/514.123); el promotor Zm40 de maíz (Patente de EE.UU. N°: 6.403.862 y WO 01/2178); el promotor mLIP15 de maíz (Patente de EE.UU. N°: 6.479.734); el promotor ESR de maíz (Solicitud de Patente de EE.UU. N°: 0/786.679); el promotor PCNA2 de maíz (Solicitud de Patente de EE.UU. N°: 10/388.359); los promotores de citoquinína oxidasa de maíz (Solicitud de Patente Provisional de EE.UU. N°: 60/559.252). Los promotores con preferencia por brotes incluyen los promotores con preferencia por brotes meristemáticos, tal como los promotores descritos en Weigal et al. (1992) Ce// 69:843-859; N° Acceso AJ131822; N° Acceso Z71981 ; N° Acceso AF049870; el promotor ZAP (Solicitud de Patente de EE.UU. N°: 10/387.937); el promotor tbl de maíz (Wang ef al. (1999) Nature 398:236-239) y los promotores con preferencia por brotes descritos en McAvoy ef al. (2003) >Acfa Hort. (ISHS) 625:379-385. Los promotores con preferencia por tejidos meristemáticos o células en división se describen en Ito ef al. (1994) Plant Mol. Biol. 24:863-878; Regad et al. (1995) Mol. Gen. Genet. 248:703-71 1 ; Shaul ef al. (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU. 93: 4868-4872; Ito et al. (1997) Plant J. 1 1 :983-992; y Trehin ef al. (1997) Plant Mol. Biol. 35:667-672; Zag1 (Schmidt ef al. (1993) The Plant Cell 5:729-37; y Zag2 de maíz (Theissen et al. (1995) Gene 156:155-166), Genbank N° Acceso X80206, todas incorporadas en este documento a modo de referencia. Los promotores con preferencia por inflorescencias incluyen el promotor de la chalcona sintetasa (Van der Meer ef al. (1990) Plant Mol. Biol. 75:95-109), LAT52 (Twell ef al. (1989) Mol. Gen. Genet. 277:240-245), de genes específicos del polen (Albani ef al (1990) Plant Mol Biol. 15:605, Zm13 (Buerrero ef al. (1993) Mol. Gen. Genet. 224: 161 -168), de genes específicos de polen de maíz (Hamilton ef al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:21 1 -218), del gen que se expresa en polen de girasol (Baltz et al. (1992) The Plant Journal 2:713-721 ), de genes específicos del polen de B. napus (Amoldo et al. (1992) J. Cell. Biochem, N° Resumen Y101204).

Los promotores inducibles por estrés incluyen los promotores inducibles por estrés por sales/agua, tal como P5CS (Zang et al. (1997) Plant Sciences 729:81 -89); promotores inducibles por frío, tal como cor15a (Hajela et al. (1990) Plant Physiol. 93:1246-1252), cor15b (Wilhelm et al. (1993) Plant Mol Biol 23:1073-1077), wsc120 (Ouellet et al. (1998) FEBS Lett. 423-324-328), c¡7 (Kirch er al. (? 997) Plant Mol Biol. 33:897-909), ci21A (Schneider er al. (1997) Plant Physiol. 1 13:335-45); promotores inducibles por sequía, tal como, Trg-31 (Chaudhary et al (1996) Plant Mol. Biol. 30: 1247-57), promotores inducibles por osmosis, tales como Rabí 7 (Vilardell er al. (1991 ) Plant Mol. Biol. 77:985-93) y osmotina (Raghothama er al. (1993) Plant Mol Biol 23:1 1 17-28); y promotores inducibles por calor, tal como las proteínas de shock de calor (Barros eí al. (1992) Plant Mol. 79:665-75; Marrs et al. (1993) Dev. Genet. 74:27-41 ) y smHSP (Waters er al. (1996) J. Experimental Botany 47:325-338). Otros promotores inducibles por estrés incluyen rip2 (Patente de EE.UU. N°: 5.332.808 y la Publicación de Patente de EE.UU. N°: 2003/0217393) y rd29a (Yamaguchi-Shinozaki er al. (1993) Mol. Gen. Genetics 236:331 -340). También son de interés los promotores con preferencia por la senescencia, tales como SEE1 (NCBI AJ494982) y SAG12 (NCBI U37336). Se pueden usar asimismo los promotores que no son sensibles al estrés en los métodos de la invención. El término "no sensibles al estrés" significa que el nivel de expresión de una secuencia ligada operativamente al promotor no es alterado o solamente es alterado mínimamente bajo las condiciones de estrés. También se pueden usar promotores que responden al nitrógeno en los métodos de la invención. Dichos promotores incluyen, a modo de ejemplo, el promotor de zeína de 22 kDa (Spena et al. (1982) EMBO J. 1 : 1589-1594 y Muller eí al. (1995) J. Plant Physiol 745:606-613); el promotor de zeína de 19 kDa (Pedersen eí al. (1982) Cell 29: 1019-1025); el promotor de zeína de 14 kDa (Pedersen eí al. (1986) J. Biol. Chem. 267:6279-6284), el promotor b-32 (Lohmer eí al. (1991 ) EMBO J 70:617-624); y el promotor de nitrito reductasa (NiR) (Rastogi eí al. (? 997) Plant Mol Biol. 34(3):465-76 y Sander eí al. (1995) Plant Mol Biol. 27(1 ):165-77). Por una revisión de las secuencias consenso presentes en los promotores inducidos por nitrógeno, véase por ejemplo, Muller eí al. (1997) The Plant Journal 72:281 -291 ). Cuando se desean bajos niveles de expresión, se podrán utilizar promotores débiles. Generalmente, se propone como "promotor débil" a un promotor que conduce la expresión de una secuencia codificante en un nivel bajo. Se propone como bajo nivel a niveles desde alrededor de 1/1 .000 transcriptos a alrededor de 1/100.000 transcriptos, a alrededor de 1/500.000 transcriptos. Como alternativa, se reconoce que los promotores débiles también abarcan a los promotores que se expresan sólo en unas pocas células y no en otras dando un nivel de expresión total bajo. Cuando un promotor se expresa a niveles inaceptablemente altos, se pueden eliminar porciones de la secuencia del promotor, se lo puede modificar para disminuir los niveles de expresión. Tales promotores constitutivos débiles incluyen, por ejemplo, el promotor nuclear del promotor de Rsyn7 (WO 99/43838 y Patente de EE.UU. N°: 6.072.050), el promotor nuclear de 35S CaMV y semejantes. Otros promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, los que se describen en las Patentes de EE.UU. N°: 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121 ; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; y 5.608.142. Véase también, la Patente de EE.UU. N°: 6.177.61 1 , incorporada en este documento a modo de referencia.

En general, el cásete de expresión comprenderá un gen marcador seleccionare para seleccionar las células transformadas. Los genes marcadores seleccionabas se utilizan para la selección de células o tejidos transformados. Los genes marcadores incluyen genes que codifican resistencia a antibióticos, tal como aquellos que codifican la neomicina fosfotransferasa II (NEO) y la higromicina fosfotransferasa (HPT), así como genes que confieren resistencia a compuestos herbicidas, tal como glufosinato de amonio, bromoxinilo, imidazolinonas y 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Otros marcadores de selección incluyen marcadores fenotípicos, tales como /?-galactosidasa y proteínas fluorescentes tal como la proteína fluorescente verde (GFP) (Su et al. (2004) Biotechnol Bioeng 85:610-9 y Fetter et al. (2004) Plant Cell 16: 215-28), proteína ciano fluorescente (CYP) (Bolte et al. (2004) J. Cell Science 117: 943-54 y Kato er al. (2002) Plant Physiol 129:913-42) y la proteína fluorescente amarilla (PhiYFP™ de Evrogen, véase, Bolte er al. (2004) J. Cell Science 117:943-54). Por otros marcadores de selección adicionales, véase en general, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-51 1 ; Christopherson er al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 89:6314-6318; Yao er al. (1992) Cell 71 :63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley et al. (1980) en The Operon, págs. 177-220; Hu er al. (1987) Cell 48:555-566; Brown et al. (1987) Cell 49:603-612; Figge er al. (1988) Cell 52:713-722; Deuschle er al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 86:5400-5404; Fuerst er al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 86:2549-2553; Deuschle et al. (1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Tesis de Doctorado, Universidad de Heidelberg; Reines er al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 90:1917-1921 ; Labow er al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Zambretti er al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 89:3952-3956; Baim ef al. (1991 ) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 88:5072-5076; Wyborski er al. (1991 ) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb et al. (1991 ) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591 -1595; Kleinschnidt et al. (1998) Biochemistry 27:1094-1 104; Bonin (1993) Tesis de Doctorado, Universidad de Heidelberg; Gossen et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 89:5547-5551 ; Oliva eí al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka eí al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlín); Gilí eí al. (1988) Nature 334:721 -724. Dichas descripciones se incorporan en este documento a modo de referencia.

La lista anterior de genes marcadores seleccionabas no se ofreció en un sentido limitativo. Se puede utilizar cualquier gen marcador seleccionable en la presente invención. En un ejemplo, el polinucleótido de interés es direccionado para su expresión en cloroplastos. De esta manera, cuando el polinucleótido de interés no se inserta directamente en el cloroplasto, el cásete de expresión va a contener además un ácido nucleico que codifica un péptido de tránsito para dirigir el producto genético de interés hacia los cloroplastos. Dichos péptidos de tránsito son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Von Heijne eí al. (1991 ) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark eí al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa eí al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer eí al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421 ; y Shah eí al. (1986) Science 233:478-481 . Las secuencias de direccionamiento a cloroplastos son conocidas en la técnica e incluyen la subunidad pequeña de la ribulosa-1 ,5-bifosfato carboxilasa (Rubisco) de cloroplastos (de Castro Silva Filho eí al. (1996) Plant Mol. Biol. 30:769-780; Schnell eí al. (1991 ) J. Biol. Chem. 266(5):3335-3342); la 5-(enolpiruvil)shikimato-3-fosfato sintetasa (EPSPS) (Archer eí al. (1990) J. Bioenerg. Biomemb. 22(6):789-810); la triptofano sintetasa (Zhao eí al. (1995) J.

Biol. Chem. 270(1 1 ):6081 -6087); plastocianina (Lawrence et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(33):20357-20363); corismato sintetasa (Schmidt ef al. (1993) J. Biol. Chem. 268(36):27447-27457); y la proteína de unión a clorofila a/b secuestrante de luz (LHBP) (Lamppa et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 14996-14999). Véase también Von Heijne ef al. (1991 ) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421 ; y Shah et al. (1986) Science 233:478-481 . Los métodos para transformar cloroplastos son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Svab et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU. 87:8526-8530; Svab y Maliga (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU. 90:913-917; Svab y Maliga (1993) EMBO J. 12:601 -606. El método se basa en la distribución con pistola de partículas de ADN que contiene un marcador seleccionable y el direccionamiento del ADN hacía el genoma de los plástidos a través de una recombinación homologa. Además, la transformación de plástidos se puede efectuar por transactivación de un transgen silente contenido en los plástidos mediante expresión con preferencia por tejidos de una ARN polimerasa codificada en el núcleo y dirigida a plástidos. Dicho sistema se describe en McBride et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU. 91 :7301 -7305. Los polinucleótidos de interés que serán dirigidos a los cloroplastos pueden ser optimizados para su expresión en el cloroplasto a fin de compensar las diferencias en la utilización de codones entre el núcleo de la planta y este organela. De esta manera, el polinucleótido de interés se puede sintetizar usando codones con preferencia por cloroplastos. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N°: 5.380.831 , incorporada en este documento a modo de referencia.

Los métodos de la invención comprenden la introducción de un polipéptido o polinucleótido en una planta. El término "introducir" significa presentar a la planta el polinucleótido o polipéptido de tal manera que la secuencia logra acceder al interior de la célula de una planta. Los métodos de la invención no dependen de un método particular para introducir la secuencia en una planta, solamente que el polinucleótido o polipéptido pueda acceder al interior de al menos una célula de la planta. Los métodos para introducir polinucleótidos o polipéptidos en plantas son conocidos en la técnica e incluyen, a modo de ejemplo, métodos de transformación estable, métodos de transformación transitorios y métodos mediados por virus. Una "transformación estable" significa que la construcción de nucleótidos introducida en la planta se integra en el genoma de la planta y que puede ser heredada por la progenie de la misma. Una "transformación transitoria" significa que el polinucleótido es introducido en la planta y que no se integra en el genoma de la planta o que se introduce un polipéptido en la planta. Los protocolos de transformación, así como los protocolos para introducir secuencias de polipéptidos o polinucleótidos en plantas, pueden variar según el tipo de planta o célula vegetal, es decir monocotiledóneas o dicotiledóneas, pretendido para la transformación. Los métodos para introducir polipéptidos o polinucleótidos en células vegetales adecuados incluyen microinyección Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334; electroporación, Riggs et al. (1986) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 83:5602-5606; transformación mediada por Agrobacteríum (Townsend et al. Patente de EE.UU. N°: 5.563.055; Zhao et al., Patente de EE.UU. N°: 5.981 ,840); transferencia directa de genes (Paszkowski et al., (1984) EMBO J. 3:2717-2722) y aceleración balística de partículas (véase, por ejemplo, Sanford et al., Patente de EE.UU. N°: 4.945.050; Tomes et al., Patente de EE.UU. N°: .879.918; Tomes et al., Patente de EE.UU. N°: 5.886.244; Bidney ef al., Patente de EE.UU. N°: 5.932.782; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells vía Microprojectile Bombardment", en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg y Phillips (Springer-Verlag, Berlín); y McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923-926; y transformación de Lec1 (WO 00/28058). También véase Weissinger et al. (1988) Ann Rev. Genet. 22:421 -477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5: 27-37 (cebolla); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671 -674 (soja); McCabe ef al. (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soja); Finer y McMullen (1991 ) In vitro Cell Dev. Biol. 27P: 175-182 (soja); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja); Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 85:4305-4309 (maíz); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559-563 (maíz); Tomes, Patente de EE.UU. N°: 5.240.855; Buising ef al., Patentes de EE.UU. N°: 5.322.783 y 5.324.646; Tomes ef al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment", en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg (Springer-Verlag, Berlín) (maíz); Klein ef al. (1988) Plant Physiol. 91 :440-444 (maíz); Fromm ef al. (1990) Biotechnology 8:833-839 (maíz); Hooykaas-Van Slogteren ef al. (1984) Nature (Londres) 31 1 :763-764; Bowen et ai, Patente de EE.UU. N°: 5.736.369 (cereales); Bytebier et al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet ef al. (1985) en The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman ef al. (Longman, Nueva York), págs. 197-209 (polen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415-418; y Kaeppler ef al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformación mediada por fibras); D.Halluin ef al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporación); Li ef al. (1993; Plant Cell Reports 12:250-255 y Christou y Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda ef al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (maíz mediante Agrobacterium tumefaciens); cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia. En realizaciones específicas, las secuencias de histidina quinasa de la invención se pueden proveer en una planta usando una variedad de métodos de transformación transitoria. Dichos métodos de transformación transitorios incluyen, a modo de ejemplo, la introducción de la proteína histidina quinasa, o variantes o fragmentos de la misma, directamente en la planta o la introducción de un transcripto de histidina quinasa en la planta. Dichos métodos incluyen, por ejemplo, microinyección o bombardeo de partículas. Véase, por ejemplo, Crossway eí al. (1986) Mol Gen. Genet. 202: 179-185; Nomura eí al. (1986) Plant Sci. 44:53-58; Hepler er al. (? 994) Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU. 91 : 2176-2180 y Hush eí al. (1994) The Journal of Cell Science 707:775-784, cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia. Como alternativa, el polinucleótido de histidina quinasa puede ser transformado transitoriamente en la planta usando técnicas conocidas en la técnica. Dichas técnicas incluyen un sistema de vectores virales y la precipitación del polinucleótido de una manera que impida la posterior liberación del ADN. Por consiguiente, la transcripción del ADN unido a las partículas puede tener lugar, pero la frecuencia que la que es liberado para integrarse en el genoma es muy reducida. Dichos métodos incluyen el uso de partículas recubíertas con polietilimina (PEI; Sigma N° P3143). En otros ejemplos, el polinucleótido de la invención puede ser introducido en plantas por contacto de dichas plantas con un virus o con ácidos nucleicos virales. En general, dichos métodos comprenden la incorporación de una construcción de nucleótidos de la invención en una molécula de ADN o ARN viral. Se considera que la histidina quinasa de la invención puede ser sintetizada inicialmente como parte de una poliproteína viral, que luego puede ser procesada por proteólisis in vivo o in vitro para producir la proteína recombinante deseada. Además, se considera que los promotores de la invención también abarcan los promotores utilizados para la transcripción por las ARN polimerasas virales. Los métodos para introducir polinucleótidos en plantas y expresar una proteína codificada en las mismas, que comprende moléculas de ADN o ARN virales, son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N°: 5.889.191 , 5.889.190, 5.866.785, 5.589.367, 5.316.931 y Porta et al. (1996) Molecular Biotechnology 5:209-221 ; incorporada en este documento a modo de referencia. Son conocidos en la técnica los métodos para una inserción dirigida de un polinucleótido en una ubicación específica en el genoma de la planta. En un ejemplo, la inserción del polinucleótido en una ubicación genómíca deseada se logra usando un sistema de recombínación específico del sitio. Véase, por ejemplo, W099/25821 , W099/25854, WO99/25840, W099/25855 y W099/25853; cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia. Brevemente, el polinucleótido de la invención puede estar contenido en un cásete de transferencia flanqueado por dos sitios de recombinación no idénticos. El cásete de transferencia es introducido en una planta que ha incorporado de forma estable en su genoma su sitio blanco que está flanqueado por dos sitios de recombinación no idénticos que se corresponden con los sitios del cásete de transferencia. Se provee una recombinasa apropiada y el cásete de transferencia es integrado en el sitio blanco. El polinucleótido de interés es integrado así en una posición cromosómica específica en el genoma de la planta. Las células, que fueron transformadas, se pueden cultivar hasta obtener plantas según las maneras convencionales. Véase, por ejemplo, McCormick et al. (1 986) Plant Cell Reports, 5:81 -84. Luego se pueden cultivar estas plantas y se pueden polinizar con la misma cepa transformada o con cepas diferentes y después se puede identificar la progenie resultante que expresa apropiadamente la característica fenotípica deseada. Se pueden cultivar dos o más generaciones para asegurar que la expresión de las características fenotípicas deseadas se mantienen y se heredan establemente y luego cosechar las semillas para asegurar que se lleva a cabo la expresión de las características fenotípicas deseadas. De esta manera, la presente invención provee semillas transformadas (también denominadas "semillas transgénicas") que contienen un polinucleótido de la invención, por ejemplo, un cásete de expresión de la invención, incorporado de forma estable en su genoma. La cría de pedigrí comienza con el cruzamiento de dos genotipos, tal como una línea de élite de interés y alguna otra línea que posea una o más características deseables (es decir, que han incorporado de forma estable un polinucleótido de la invención, que presentan una actividad y/o nivel modulado del polípéptido de la invención, etc.) que complementa la línea de élite de interés. Si los dos progenitores originales no proveen todas las características deseadas, se pueden incluir otras fuentes en la población de cría. En el método del pedigrí, se autocruzan plantas superiores y se seleccionan en sucesivas generaciones filiales. En las subsiguientes generaciones filiales la condición heterocigota da lugar a líneas homogéneas como resultado de auto-polinización y selección. Típicamente, en el método de cría de pedigrí, se practica autocruzamiento y selección en cinco o más generaciones filiales sucesivas: F1 ? F2; F2? F3; F3 ? F4; F4 ? F5, etc. Después de una endogamia suficiente, las sucesivas generaciones filiales servirán para incrementar las semillas del endogámico desarrollado. Preferentemente, la línea endogámica comprende alelos homocigotas en un 95% aproximadamente o más de sus loci.

Además de su uso para crear una conversión por retrocruza, la retrocruza también se puede usar en combinación con la cría de pedigrí para modificar una línea élite de interés y un híbrido obtenido usando la línea élite modificada. Como se describió precedentemente, se puede emplear retrocruza para transferir una o más características específicamente deseables de una linea, el progenitor donante, a un endogámico denominado progenitor recurrente, que presenta características agronómicas generales buenas aunque no posee la o las características deseables. Sin embargo, se puede emplear el mismo procedimiento para mover la progenie hacia el genotipo del progenitor recurrente y retener al mismo tiempo muchos componentes del progenitor no recurrente, deteniendo la retrocruza en una etapa temprana y avanzando con la autocruza y selección. Por ejemplo, se crea una F1 , tal como un híbrido comercial. Este híbrido comercial se puede retrocruzar con una de sus líneas progenítoras para crear una BC1 o BC2. La progenie se autocruza y selecciona de modo tal que el endogámico recién desarrollado posea muchos de los atributos del progenitor recurrente y además varios de los atributos deseados del progenitor no recurrente. Este enfoque permite relevar el valor y la fuerza del progenitor recurrente para su uso en nuevos híbridos y cría. Por ello, un ejemplo de esta invención es un método para elaborar mediante conversión por retrocruza una línea endogámíca de maíz de interés, que comprende los pasos de cruzar una planta de la línea endogámica de maíz de interés con una planta donante que comprende un gen o transgen que confiere una característica deseada (por ejemplo, una mayor expresión de una histidina quinasa de la invención), seleccionar una planta de la progenie F1 que comprende a dicho gen o transgen mutante que confiere la característica deseada y retrocruzar la planta de progenie F1 seleccionada con una planta de la línea endogámica de maíz de interés. Este método puede comprender además el paso de obtener un perfil marcador molecular de la línea endogámica de maíz de interés y usar dicho perfil marcador molecular para seleccionar una planta de progenie con la característica deseada y el perfil marcador molecular de la línea endogámica de interés. De la misma manera, este método se puede usar para producir semillas híbridas F1 por adición de un paso final de cruzamiento de la línea endogámica de maíz de interés convertida a la característica deseada con una planta de maíz diferente para obtener una semilla híbrida F1 de maíz que comprende un gen o transgen muíante que confiere la característica deseada. La selección recurrente es un método utilizado en un programa de cría de plantas para mejorar una población de plantas. El método comprende la polinización cruzada entre plantas individuales entre sí para formar la progenie. Se cultiva la progenie y se selecciona una progenie superior utilizando numerosos métodos de selección, que incluyen plantas individuales, progenie de medio hermanas, progenie de hermanas completas, progenie autocruzada y cruzamiento superior. La progenie seleccionada es sometida a polinización cruzada entre sí para formar la progenie de otra población. Esta población se siembra y nuevamente se seleccionan plantas superiores para volver a someterlas a una polinización cruzada entre sí. La selección recurrente es un proceso cíclico y por ello se puede repetir cuantas veces se desee. El objetivo de la selección recurrente es el de mejorar las características de una población. La población mejorada se puede usar luego como fuente de material de cría para obtener líneas endogámicas que se usarán híbridos o como progenitores para un cultivar sintético. Un cultivar sintético es la progenie resultante formada por el entrecruzamiento de varios endogámicos seleccionados.

La selección en masa es una técnica útil especialmente cuando se usa junto con una selección mejorada por marcadores moleculares. En la selección en masa, las semillas individuales se seleccionan sobre la base del fenotipo y/o genotipo. Estas semillas seleccionadas se agrupan luego y se usan para obtener la siguiente generación. La selección en masa requiere del cultivo de una población de plantas en una parcela de cultivo, la autopolinización de las plantas, la cosecha de las semillas en masa y el posterior uso de una muestra de las semillas cosechadas en masa para plantar la generación siguiente. En lugar de autopolinización, se podría usar una polinización dirigida como parte del programa de cría. Tal como se utiliza en la presente, el término planta incluye células vegetales, protoplastos vegetales, cultivos tisulares de células vegetales a partir de los cuales es posible regenerar una planta, callos vegetales, masas vegetales y células vegetales que están intactas en las plantas o en partes de las plantas tal como embriones, polen, óvulos, semillas, hojas, flores, ramas, frutos, granos, espigas, marlos, chalas, tallos, raíces, puntas de raíces, anteras y semejantes. El término grano se refiere a la semilla madura producida por los criadores comerciales para fines distintos de cultivar o reproducir la especie. La progenie, las variantes y los mutantes de las plantas regeneradas también están incluidos dentro del alcance de la invención, siempre que estas partes comprendan los polinucleótidos introducidos. La presente invención se puede utilizar para la transformación de cualquier especie vegetal, incluyendo monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los ejemplos de especies vegetales de interés incluyen, a modo de ejemplo, maíz (Zea mays), Brassica sp. (por ejemplo, B. napus, B. rapa, B. júncea), en particular aquellas especies de Brassica que son de utilidad como fuentes de aceite de semillas, alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeno (Sécale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), mijo (por ejemplo, mijo perlado (Pennisetum glaucum), mijo proso (Panicum miliaceum), mijo cola de zorro (Setaria itálica), mijo dedo (Eleusine coracana)), girasol (Helianthus annuus), alazor (Carthamus tinctorius), trigo (Tríticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), papa (Solanum tuberosum), maní (Arachis hypogaea), algodón (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Cofea spp.), coco (Cocos nucífera), ananá (Ananas comosus), árboles cítricos (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao), té (Camellia sinensis), banana (Musa spp), palta (Percea americana), higo (Ficus casica), guayava (Psidium guajava), mango (Mangifera indica), olivo (Olea europaea), papaya (Carica papaya), cajú (Anacardium occidentale), macadamia (Macadamia integrifolia), almendra (Prunus amygdalus), remolacha (Beta vulgaris), caña de azúcar (Saccharum spp.), avena, cebada, verduras, ornamentales, pastos y coniferas. Las verduras incluyen tomates (Lycopersicon esculentum), lechuga (por ejemplo, Lactuca sativa), habas verdes (Phaseolus vulgaris), frijol de media luna (Phaseolus limensis), arvejas (Lathyrus spp.) y miembros del género Curcumis tal como pepino (C. sativus), melón cantalupa (C. cantalupensis) y melón amarillo (C. meló). Las plantas ornamentales incluyen azaleas (Rhododendron spp.), hidrangea (Macrophylla hydrangea), hibisco (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipanes (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), petunias (Petunia hybrida), claveles (Dianthus caryophyllus), pastora (Euphorbia pulcherrima) y crisantemos. Las coniferas que pueden ser empleadas en la práctica de la presente invención incluyen, por ejemplo, pinos tales como el pino loblolly, (Pinus taeda), pino del incienso (Pinus elliotii), pino ponderosa (Pinus ponderosa), pino lodgepole (Pinus contorta), y pino de Monterey (Pinus radiata); abeto Douglas (Pseudotsuga menziesii); Tsuga del Oeste (Tsuga canadensis); abeto Sitka (Picea glauca); secoia {Sequoia sempervirens); abetos verdaderos, tales como, abeto de oro {Abies amabilis); y abeto balsam (Abies balsamea); y cedros, tales como el cedro rojo del Oeste ( Thuja plicata) y el cedro amarillo de Alaska (Chamaecyparis nootkatensis). En ejemplos específicos, las plantas de la presente invención son plantas de cultivos (por ejemplo, maíz, alfalfa, girasol, Brassica, soja, algodón, alazor, maní, sorgo, trigo, mijo, tabaco, etc.). En otros ejemplos, se prefieren las plantas de maíz y soja y en otras realizaciones las plantas preferidas son de maíz. Otras plantas de interés incluyen plantas con granos que proveen semillas de interés, plantas de semillas oleaginosas y plantas leguminosas. Las semillas de interés incluyen semillas de granos, tal como maíz, trigo, cebada, arroz, sorgo, centeno, etc. Las plantas de semillas oleaginosas incluyen algodón, soja, alazor, girasol, Brassica, maíz, alfalfa, palmera, coco, etc. Las plantas leguminosas incluyen habas y arvejas. Las habas incluyen guar, semilla de algarroba, fenogreco, soja, habas de jardín, caupí, habichuela, poroto pallar, haba común, lentejas, garbanzos, etc. Las histidina quinasas de la invención se pueden producir en cualquier célula huésped de interés. Los polinucleótidos de la invención se pueden usar para expresar las histidina quinasas de la invención en células huésped no humanas, incluyendo, a modo de ejemplo, células vegetales, células de algas, células bacterianas, células animales y células fúngicas. Dichas células fúngicas incluyen, por ejemplo, células de levadura. Para la expresión en una célula huésped de interés, el polinucleótido de la invención se liga operativamente a un promotor que dirige la expresión en la célula huésped. La invención no depende de un promotor o método particular para transformar una célula huésped con la construcción de polinucleótidos. Se puede usar cualquier promotor y/o cualquier método para transformar la célula huésped de interés en los métodos de la presente invención. Por consiguiente, la presente invención provee además células huésped no humanas transformadas con al menos un polinucleótido de la invención y métodos para obtener dichas células huésped transformadas. Se provee un método para modular la concentración y/o actividad del polipéptido de la presente invención en una planta. En general, la concentración y/o actividad es incrementada o disminuida en al menos un 1 %, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% con relación a la planta, parte de planta o célula control nativa que no contiene la secuencia de la invención introducida. La modulación en la presente invención puede tener lugar durante y/o después del crecimiento de la planta hasta la etapa deseada del desarrollo. En ejemplos específicos, los polipéptidos de la presente invención son modulados en monocotiledóneas, en particular en maíz. El nivel de expresión del polipéptido de histidina quinasa se puede medir directamente, por ejemplo, evaluando el nivel del polipéptido de histidina quinasa en la planta, o indirectamente, por ejemplo, midiendo la actividad histidina quinasa en la planta o monitoreando el fenotipo de la planta. Los métodos para determinar la actividad histidina quinasa se describen en otra parte en la presente. En ejemplos específicos, el polipéptido o el polinucleótido de la invención se introduce en la célula vegetal. Posteriormente, se selecciona una célula vegetal que contiene la secuencia introducida de la invención usando métodos conocidos por los especialistas en la técnica tal como, a modo de ejemplo, análisis de transferencia Southern, secuenciación de ADN, análisis con PCR o análisis fenotípico. La planta o parte de planta alterada o modificada según las realizaciones precedentes se cultiva bajo condiciones formadoras de plantas por el tiempo suficiente como para modular la concentración y/o actividad del polipéptido de histidina quinasa en la planta. Las condiciones formadoras de plantas son bien conocidas en la técnica y se describen brevemente en otra parte de la presente. Se considera también que el nivel y/o actividad del polipéptido puede ser modulado empleando un polinucleótido que no sea capaz de dirigir, en una planta transformada, la expresión de una proteína o un ARN. Por ejemplo, los polinucleótidos de la invención se pueden usar para diseñar construcciones de polinucleótidos que puedan emplearse en los métodos para alterar o mutar una secuencia de nucleótidos genómica en un organismo. Dichas construcciones de polinucleótidos incluyen, a modo de ejemplo, vectores de ARN:ADN, vectores de ARN:ADN de mutación, vectores de reparación de ARN:ADN, oligonucleótidos dobles mixtos, oligonucleótidos de ARN:ADN auto-complementarios y oligonucleobases recombinogénicos. Dichas construcciones de nucleótidos y los métodos de uso de las mismas son conocidos en la técnica. Véase, las Patentes de EE.UU. N°: 5.565.350; 5.731 .181 ; 5.756.325; 5.760.012; 5.795.972; y 5.871 .984; cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia. Véase también, WO 98/49350, WO 99/07865, WO 99/25821 y Beetham et al. (1999) Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU. 96:8774-8778; incorporadas en este documento a modo de referencia. Por ello se considera que los métodos de la presente invención no dependen de la incorporación de todo el polinucleótido en el genoma, sólo que la planta o una célula de la misma sea alterada como resultado de la introducción del polinucleótido en una célula. En un ejemplo de la invención, es posible alterar el genoma después de la introducción del polinucleótido en una célula. Por ejemplo, se puede incorporar el polinucleótido, o cualquier parte del mismo, en el genoma de la planta. Las alteraciones al genoma de la presente invención incluyen, a modo de ejemplo, adiciones, supresiones y sustituciones de nucleótidos en el genoma. En tanto los métodos de la presente invención no dependen de adiciones, supresiones y sustituciones de ninguna cantidad particular de nucleótidos, se considera que dichas adiciones, supresiones o sustituciones comprenden al menos un nucleótido. En un ejemplo, aumenta la actividad y/o el nivel del polipéptido de histidina quinasa de la invención. Dicho incremento en el nivel y/o la actividad de un polipéptido de histidina quinasa de la invención se puede lograr proporcionándole a la planta un polipéptido de histidina quinasa. Como se describe en otra parte de la presente, hay muchos métodos que son conocidos en la técnica por proveer un polipéptido a una planta incluyendo, a modo de ejemplo, la introducción directa del polipéptido en la planta, y la introducción en la planta (de forma transitoria o estable) una construcción de un polinucleótido que codifica un polipéptido que posee actividad histidina quinasa. Se considera también que los métodos de la invención pueden emplear un polinucleótido que no es capaz de dirigir, en la planta transformada, la expresión de una proteina o un ARN. Por consiguiente, se puede incrementar el nivel y/o la actividad de un polipéptido histidina quinasa alterando el gen que codifica al polipéptido histidina quinasa o alterando o afectando su promotor. Véase, por ejemplo, Kmiec, Patente de EE.UU. N°: 5.565.350; Zarling eí al., PCT/US93/03868. Por ello se proveen plantas mutagenizadas que contienen mutaciones en los genes de histidina quinasa, donde dichas mutaciones incrementan la expresión del gen de histidina quinasa o incrementan la actividad histidina quinasa del polipéptido de histidina quinasa codificado. En otros ejemplos, se reduce o elimina la actividad y/o el nivel del polipéptido de histidina quinasa de la invención introduciendo en la planta un polinucleótido que inhibe el nivel o la actividad del polipéptido de histidina quinasa de la invención. El polinucleótido puede inhibir la expresión de histidina quinasa directamente, impidiendo la traducción del ARN mensajero de histidina quinasa, o indirectamente, inhibiendo la transcripción o traducción de un gen de histidina quinasa que codifica una proteína histidina quinasa. Los métodos para inhibir o eliminar la expresión de un gen en una planta son bien conocidos en la técnica y se puede usar cualquiera de dichos métodos en la presente invención para inhibir la expresión de un polipéptido de histidina quinasa. En otros ejemplos de la invención, se reduce o elimina la actividad de un polipéptido de histidina quinasa transformando la célula vegetal con una secuencia que codifica un polipéptido que inhibe la actividad del polipéptido de histidina quinasa. En otras realizaciones, la actividad de un polipéptido histidina quinasa puede ser reducida o eliminada por ruptura del gen que codifica al polipéptido histidina quinasa. La invención abarca plantas mutagenizadas que contienen mutaciones en los genes de histidina quinasa, donde dichas mutaciones reducen la expresión del gen de histidina quinasa o inhiben la actividad histidina quinasa del polipéptido de histidina quinasa codificado. La reducción de la actividad de genes específicos (también conocida como silenciamiento de genes o supresión de genes) resulta deseable para diversos aspectos de ingeniería genética en plantas. Hay muchas técnicas de silienciamíento de genes que son bien conocidas por los especialistas en la técnica, incluyendo, a modo de ejemplo, tecnología antisentido (véase, por ejemplo, Sheehy et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU. 85:8805-8809; y las Patentes de EE.UU. N°: 5.107.065; 5.453.566; y 5.759.829); cosupresión (por ejemplo, Taylor (1997) Plant Cell 9:1245; Jorgensen (1990) Trends Biotech. 8(12):340-344; Flavell (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU. 91 :3490-3496; Finnegan et al. (1994) Bio/Technology 12:883-888; y Neuhuber et al. (1994) Mol.

Gen. Genet. 244:230-241 ); interferencia de ARN (Napoli eí al. (1990) Plant Cell 2:279-289; Patente de EE.UU. N°: 5.034.323; Sharp ( 1999) Genes Dev. 13: 139-141 ; Zamore eí al. (2000) Cell 101 :25-33; y Montgomery et al. (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 95: 15502-15507), silenciamiento de genes inducido por virus (Burton er al. (2000) Plant Cell 12:691 -705; y Baulcombe (1999) Curr. Op. Plant Bio. 2: 109-1 13); ribozimas específicos del ARN blanco (Haseloff et al. (1988) Nature 334: 585-591 ); estructuras en horquilla (Mette eí al. (2002) EMBO J. 19:5194-5201 ; Smith er al. (2000) Nature 407:319-320; WO 99/53050; WO 02/00904; WO 98/53083; Chuang y Meyerowitz (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU. 97:4985-4990; Stoutjesdijk eí al. (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731 ; Waterhouse y Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38; Pandolfini eí al. BMC Biotechnology 3:7, Publicación de Patente de EE.UU. N°: 20030175965; Panstruga eí al. (2003) Mol. Biol. Rep. 30: 135-140; Wesley eí al. (2001 ) Plant J. 27:581 -590; Wang y Waterhouse (2001 ) Curr. Opin. Plant Biol. 5: 146-150; Publicación de Patente de EE.UU. N°: 20030180945; y WO 02/00904, incorporadas todas en este documento a modo de referencia); ribozimas (Steinecke eí al. (1 992) EMBO J. 1 1 : 1 525; y Perriman eí al. (1993) Antisense Res. Dev. 3:253); modificación dirigida mediada por oligonucleótidos (por ejemplo, WO 03/076574 y WO 99/25853); moléculas buscadas por dedos de Zn (por ejemplo, WO 01/52620; WO 03/048345; y WO 00/42219); marcación con transposones (Maes eí al. (1999) Trends Plant Sci. 4:90-96; Dharmapuri y Sonti (1999) FEMS Microbiol. Lett. 179:53-59; Meissner eí al. (2000) Plant J. 22:265-274; Phogat eí al. (2000) J. Biosci. 25:57-63; Walbot (2000) Curr. Opin. Plant Biol. 2:103-107; Gai et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28:94-96; Fitzmaurice eí al. (1999) Genetics 153:1919-1928; Bensen eí al. (1995) Plant Cell 7:75-84; Mena eí al. (1996) Science 274: 1537-1 540; y Patente de EE.UU. N°: 5.962.764); cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia; y otros métodos o combinaciones de los métodos mencionados conocidos por los especialistas en la técnica. Los polinucleótidos de la presente invención se pueden usar orientados en el sentido del marco de lectura para suprimir la expresión de genes endógenos en plantas. Los métodos para suprimir la expresión genética en plantas con polinucleótidos orientados en el sentido del marco de lectura son conocidos en la técnica. Los métodos comprenden generalmente la transformación de plantas con una construcción de ADN que comprende un promotor que dirige la expresión en una planta ligada operativamente a por lo menos una porción de un polinucleótido que corresponde al transcripto del gen endógeno. Típicamente, tal secuencia de nucleótidos presenta una identidad de secuencia sustancial con la secuencia del transcripto del gen endógeno, preferentemente más que un 65% aproximadamente de identidad de secuencia, más preferentemente más que aproximadamente un 85% de identidad de secuencia, con mayor preferencia más que un 95% aproximadamente de identidad de secuencia. La sobreexpresión de la molécula de ARN puede dar como resultado una expresión reducida del gen nativo. Por consiguiente, se examinan múltiples lineas de plantas transformadas con el cásete de expresión de cosupresion para identificar a las que muestran la mayor inhibición de la expresión del polipéptido de histidina quinasa. Véase, las Patentes de EE.UU. N°: 5.283.184 y 5.034.323; incorporadas en este documento a modo de referencia. Por consiguiente, se pueden usar muchos métodos para reducir o eliminar la actividad de un polipéptido de histidina quinasa. Además, se puede usar más de un método para reducir la actividad de un solo polipéptido de histidina quinasa. Además, se pueden emplear combinaciones de los métodos para reducir o eliminar la actividad de los polipéptidos de histidina quinasa.

En algunos ejemplos de la presente invención, se transforma una célula de maíz con un cásete de expresión capaz de expresar un polinucleótido que inhibe la expresión de histidina quinasa. El término "expresión" tal como se utiliza en la presente se refiere a la biosíntesis de un producto genético, incluyendo la transcripción y/o traducción de dicho producto genético. Por ejemplo, a los efectos de la presente invención, un cásete de expresión capaz de expresar un polinucleótido que inhibe la expresión de al menos un polipéptido de histidina quinasa de maíz es un cásete de expresión capaz de producir una molécula de ARN que inhibe la transcripción y/o traducción de al menos un polipéptido de histidina quinasa de maíz de la invención. La "expresión" o "producción" de una proteína o polipéptido a partir de una molécula de ADN se refiere a la transcripción y traducción de la secuencia de codificación para producir la proteína o el polipéptido, en tanto la "expresión" o "producción" de una proteína o polipéptido a partir de una molécula de ARN se refiere a la traducción de la secuencia de codificación del ARN para producir la proteína o el polipéptido. El polinucleótido usado para la cosupresión puede corresponder a toda o una parte de la secuencia que codifica a la histidina quinasa, todo o parte de la región no traducida 5' y/o 3' de un transcripto de histidina quinasa, o todo o parte de la secuencia de codificación y las regiones no traducidas de un transcripto que codifica una histidina quinasa. En algunas realizaciones donde el polinucleótido comprende todo o parte de la región de codificación del polipéptido de histidina quinasa, el cásete de expresión se diseña para eliminar el codón de inicio del polinucleótido de modo que no se traducirá ningún producto proteico. La cosupresión se puede usar para inhibir la expresión de genes vegetales para producir plantas que poseen niveles de no detectables para las proteínas codificadas por estos genes. Véase, por ejemplo, Broin et al. (2002) Plant Cell 14:1417-1432. La cosupresión también se puede usar para inhibir la expresión de múltiples proteínas en la misma planta. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N°: Los métodos para usar cosupresión para inhibir la expresión de genes endógenos en plantas se describen en Flavell et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU. 91 :3490-3496; Jorgensen eí al. (1996) Plant Mol. Biol. 31 :957-973; Johansen y Carrington (2001 ) Plant Physiol. 126:930-938; Broin et al. (2002) Plant Cell 4: 14 7- 432; Stoutjesdijk eí al (2002) Plant Physiol. 129: 723- 731 ; Yu ef al. (2003) Phytochemistry 63:753-763; y Patentes de EE.UU. N°: 5.034.323, 5.283.184 y 5.942.657; cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia. Se puede incrementar la eficacia de la cosupresión incluyendo una región poli-dT en el cásete de expresión en una posición 3' con respecto a la secuencia orientada en el sentido del marco de lectura y 5' con respecto a la señal de poliadenilación. Véase, la Publicación de Patente de EE.UU. N°: 20020048814, incorporada en este documento a modo de referencia. Típicamente, tal secuencia de nucleótidos presenta una identidad de secuencia sustancial con la secuencia del transcripto del gen endógeno, preferentemente más que un 65% aproximadamente de identidad de secuencia, más preferentemente más que aproximadamente un 85% de identidad de secuencia, con mayor preferencia más que un 95% aproximadamente de identidad de secuencia. Véase, las Patentes de EE.UU. N°: 5.283.184 y 5.034.323; incorporadas en este documento a modo de referencia. En algunos ejemplos de la invención, la inhibición de la expresión de la histidina quinasa se puede lograr mediante supresión antisentido. Para la supresión antisentido, el cásete de expresión se diseña para que exprese una molécula de ARN complementaria de todo o parte del ARN mensajero que codifica a la histidina quinasa. La sobreexpresión de la molécula de ARN antisentido puede dar como resultado una expresión reducida del gen nativo. Por consiguiente, se examinan múltiples líneas de plantas transformadas con el cásete de expresión para supresión antisentido con el fin de identificar las que muestran la mayor inhibición de la expresión de histidina quinasa. El polinucleótido de uso en la supresión antisentido se diseña para hibridizarse con el correspondiente ARNm y puede comprender todo o parte del complemento de la secuencia que codifica a la histidina quinasa, todo o parte del complemento de la región no traducida 5' y/o 3' del transcripto de histidina quinasa o todo o parte del complemento de la secuencia de codificación y las regiones no traducidas de un transcripto que codifica a la histidina quinasa. Además, el polinucleótido antisentido puede ser completamente complementario (es decir, 100% idéntico al complemento de la secuencia de interés) o parcialmente complementario (es decir, menos que un 100% idéntico al complemento de la secuencia de interés) de la secuencia de interés. La supresión antisentido se puede usar para inhibir la expresión de múltiples proteínas en la misma planta. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N°: 5.942.657. Aún más, se pueden usar porciones de los nucleótidos antisentido para interrumpir la expresión del gen de interés. En general, se pueden usar secuencias de al menos 50 nucleótidos, 100 nucleótidos, 200 nucleótidos, 300, 400, 450, 500, 550 o más nucleótidos. Los métodos para usar supresión antisentido en la inhibición de la expresión de genes endógenos en plantas se describen, por ejemplo, en Liu ef al. (2002) Plant Physiol. 129:1732-1743 y en las Patentes de EE.UU. N°: 5.759.829 y 5.942.657, cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia. Es posible incrementar la eficacia de la supresión antisentido incluyendo una región poli-dT en el cásete de expresión en una posición 3' con respecto a la secuencia antisentido y 5* con respecto a la señal de poliadenilación. Véase, la Publicación de Patente de EE.UU. N°: 20020048814, incorporada en este documento a modo de referencia. En algunos ejemplos de la invención, la inhibición de la expresión de una histidina quinasa se puede lograr por interferencia con ARN de cadena doble (ARNcd). Para la interferencia con ARNcd, se expresa una molécula de ARN orientada en el sentido del marco de lectura como la que se describió precedentemente para la cosupresión y una molécula de ARN antisentido que es completa o parcialmente complementaria de la molécula de ARN orientada en el sentido del marco de lectura en la misma célula, dando como resultado la inhibición de la expresión del correspondiente ARN mensajero endógeno. La expresión de las moléculas orientadas en el sentido del marco de lectura y antisentido se puede lograr diseñando el cásete de expresión para que contenga una secuencia orientada secuencia orientada en el sentido del marco de lectura y una secuencia antisentido. Como alternativa, se pueden usar casetes de expresión separados para las secuencias orientadas en el sentido del marco de lectura y las secuencias antisentido. Se pueden examinar múltiples líneas de plantas transformadas con el o los casetes de expresión para interferencia con ARNcd con el fin de identificar las líneas de plantas que muestran la mayor inhibición de la expresión de la histidina quinasa. Los métodos para usar interferencia con ARNcd en la inhibición de la expresión de genes endógenos vegetales se describen en Waterhouse et al. (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 95:13959-13964, Liu et al. (2002) Plant Physiol. 129:1732-1743 y WO 99/49029, WO 99/53050, WO 99/61631 y WO 00/49035; cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia. En algunos ejemplos de la invención, la inhibición de la expresión de una o más histidina quínasas se puede obtener mediante la interferencia con ARN en horquilla (ARNh) o la interferencia con ARN en horquilla que contiene intrones (ARNhi). Estos métodos son altamente eficaces para inhibir la expresión de genes endógenos. Véase, Waterhouse y Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38 y las referencias citadas en las mismas. Para la interferencia con ARNh, se diseña un cásete de expresión para que exprese una molécula de ARN que se hibridiza consigo misma para formar una estructura en horquilla que comprende una región de bucle de cadena simple y un tallo con apareamiento de bases. La región del tallo con apareamiento de bases comprende una secuencia orientada en el sentido del marco de lectura correspondiente a todo o parte del ARN mensajero endógeno que codifica al gen cuya expresión se desea inhibir y una secuencia antisentido que es completa o parcialmente complementaria de la secuencia orientada en el sentido del marco de lectura. Como alternativa, la región del tallo con apareamiento de bases puede comprender secuencias complementarias correspondientes a una región promotora seleccionada, dando como resultado el silenciamiento de la secuencia de codificación ligada operativamente a dicho promotor seleccionado. Véase, por ejemplo, Mette et al. (2000) EMBO J 19(19):5194-5201 . Por consiguiente, la región del tronco de bases apareadas de la molécula generalmente determina la especificidad del ARN de interferencia. Las moléculas de ARNhp son sumamente eficaces para inhibir la expresión de los genes endógenos y el ARN de interferencia que inducen es heredado por las generaciones subsiguientes de plantas. Véase, por ejemplo, Chuang y Meyerowitz (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU. 97:4985-4990; Stoutjesdijk eí al. (2002) Plant Physiol. y Waterhouse y Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38. Los métodos para usar la interferencia con ARNh para inhibir o silenciar la expresión de genes se describen, por ejemplo, en Chuang y Meyerowitz (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU. 97:4985-4990; Stoutjesdijk ef al. (2002) Plant Physiol. 129: 1723-1731 ; Waterhouse y Helliwell (2003) Nal Rev. Genet. 4:29-38; Pandolfini ef al. BMC Biotechnology 3:7 y la publicación de Patente de EE.UU. N°: 20030175965; cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia. Panstruga ef al. describieron un ensayo transitorio para determinar la eficacia de construcciones de ARNhp para silenciar la expresión genética in vivo. (2003) Mol. Biol. Rep. 30: 135-140, incorporada en este documento a modo de referencia). Para el ARNhi, las moléculas que interfieren tienen la misma estructura general que para el ARNh, pero la molécula de ARN comprende además un intrón capaz de procesarse en la célula en la cual se expresa el ARNhi. El uso de un intrón minimiza el tamaño del bucle en la molécula de ARN en horquilla después del procesamiento, y esto incrementa la eficacia de la interferencia. Véase, por ejemplo, Smith ef al. (2000) Nature 407:319-320. De hecho, Smith et al. muestran un 100% de supresión de la expresión genética endógena usando interferencia mediada por ARNhi. Los métodos para usar la interferencia con ARNhi para inhibir la expresión de genes endógenos vegetales se describen, por ejemplo, en Smith et al. (2000) Nature 407:319-320; Wesley ef al. (2001 ) Plant J. 27:581 -590; Wang y Waterhouse (2001 ) Curr. Opin. Plant Biol. 5: 146-150; Waterhouse y Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38; Helliwell y Waterhouse (2003) Methods 30:289-295, y la Publicación de Patente de EE.UU . N°: 20030180945, cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia. El cásete de expresión para la interferencia con ARNh también se puede diseñar de modo tal que la secuencia orientada en el sentido del marco de lectura y la secuencia antisentido no corresponden al ARN endógeno. En este caso, la secuencia orientada en el sentido del marco de lectura y la secuencia antisentido flanquean una secuencia en bucle que comprende una secuencia de nucleótidos correspondiente a todo o parte del ARN mensajero endógeno del gen de interés. Por consiguiente, es la región del bucle que determina la especificidad de la interferencia con ARN. Véase, por ejemplo, WO 02/00904, incorporada en este documento a modo de referencia. Los casetes de expresión de amplicones comprenden una secuencia derivada de un virus de plantas que contiene todo o parte del gen de interés pero en general no todos los genes del virus nativo. Las secuencias virales presentes en el producto de transcripción del cásete de expresión permiten que el producto de la transcripción dirija su propia replicación. Los transcriptos producidos por el amplicón pueden estar orientados en el sentido del marco de lectura o antisentido con relación a la secuencia de interés (es decir, el ARN mensajero de la histidina quinasa). Los métodos para usar amplicones en la inhibición de la expresión de genes endógenos vegetales se describen, por ejemplo, en Angelí y Baulcombe (1997) EMBO J. 16:3675-3684, Angelí y Baulcombe ( 1999) Plant J. 20:357-362, y en la Patente de EE.UU. N°: 6.646.805, cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia. En algunos ejemplos, el polinucleótido expresado por el cásete de expresión de la invención es ARN catalítico o posee una actividad ribozima específica del ARN mensajero de la histidina quinasa. Por consiguiente, el polinucleótido causa la degradación del ARN mensajero endógeno, dando como resultando una menor expresión de la histidina quinasa. Este método se describe, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. N°: 4.987.071 , incorporada en este documento a modo de referencia. En algunos ejemplos de la invención, la inhibición de la expresión de una o más histidina quinasas se puede lograr mediante interferencia con ARN por expresión de un gen que codifica un micro ARN (ARNmi). Los ARNmi son agentes reguladores que consisten de 22 ribonucleótidos aproximadamente. Los ARNmi son altamente eficaces en la inhibición de la expresión de genes endógenos. Véase, por ejemplo Javier et al. (2003) Nature 425: 257-263, cuyo contenido se incorpora en este documento a modo de referencia. Para la interferencia con ARNmi, el cásete de expresión es diseñado para que exprese una molécula de ARN que es modelado sobre un gen de ARNmi endógeno. El gen del ARNmi codifica un ARN que forma una estructura en horquilla que contiene una secuencia de 22 nucleótidos que es complementaria de otro gen endógeno (secuencia blanco). Para la supresión de la expresión de histidina quinasa, la secuencia de 22 nucleótidos se selecciona de una secuencia del transcripto de histidina quinasa y contiene 22 nucleótidos de dicha secuencia de histidina quinasa orientados en el sentido del marco de lectura y 21 nucleótidos de una correspondiente secuencia antisentido que es complementaria de la secuencia orientada en el sentido del marco de lectura. Las moléculas de ARNmi son altamente eficaces en la inhibición de la expresión de genes endógenos y la interferencia con ARN que inducen es heredada por las posteriores generaciones de plantas. En un ejemplo, el polinucleótido codifica una proteína en dedo de zinc que se une a un gen que codifica una histidina quinasa de maíz, dando como resultado una menor expresión del gen. En ejemplos particulares, la proteína en dedo de zinc se une a una región reguladora de un gen de histidina quinasa. En otros ejemplos, la proteína en dedo de zinc se une a un ARN mensajero que codifica un polipéptido de histidina quinasa e impide su traducción. Los métodos para seleccionar sitios para el direccionamiento por proteínas en dedo de zinc se describieron, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. N°: 6.453.242, y los métodos para usar proteínas en dedo de zinc para inhibir la expresión de genes en plantas se describen, por ejemplo, en la publicación de Patente de EE.UU. N°: 20030037355; cuyo contenido se incorpora en este documento a modo de referencia. En algunos ejemplos de la invención, el polinucleótido codifica un anticuerpo que se une a por lo menos una histidina quinasa de maíz y reduce la actividad histidina quinasa de la proteina histidina quinasa. En otro ejemplo, la unión del anticuerpo da como resultado un mayor recambio del complejo de anticuerpo-histidina quinasa por los mecanismos de control de calidad celulares. La expresión de anticuerpos en células vegetales y la inhibición de las vías moleculares por expresión y unión de anticuerpos a proteínas en células vegetales son bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Conrad y Sonnewald (2003) Nature Biotech. 21 :35-36, incorporada en este documento a modo de referencia. En algunos ejemplos de la presente invención, se reduce o elimina la actividad histidina quinasa interrumpiendo al gen que codifica dicha histidina quinasa. El gen que codifica la histidina quinasa puede ser interrumpido utilizando cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, en un caso, el gen se interrumpe mediante marcación con transposones. En otro ejemplo, el gen es interrumpido por mutagénesis de plantas de maíz mediante una mutagénesis aleatoria o dirigida y la selección de plantas que presentan una reducción de la actividad histidina quinasa, de los niveles de la proteína histidina quinasa y/o de los niveles de ARNm de histidina quinasa. En un ejemplo de la invención, se usa marcación con transposones para reducir o eliminar la actividad histidina quinasa de una o más histidina quinasas. La marcación con transposones comprende la inserción de un transposón dentro de un gen de histidina quinasa endógeno para reducir o eliminar la expresión de la histidina quinasa. El término "gen de histidina quinasa", se refiere al gen que codifica una histidina quinasa acorde con la invención. En esta realización, se reduce o elimina la expresión de uno o más polipéptidos histidina quinasa insertando un transposón dentro de una región reguladora o región de codificación del gen que codifica al polipéptido histidina quinasa. Un transposón que se encuentra dentro de un exón, intrón, secuencia no traducida 5' o 3', un promotor o cualquier otra secuencia reguladora del gen de histidina quinasa se puede usar para reducir o eliminar la expresión y/o la actividad del polipéptido histidina quinasa codificado. Los métodos de marcación con transposones de genes específicos en plantas son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Maes ef al. (1999) Trends Plant Sci. 4:90-96; Dharmapuri y Sonti (1999) FEMS Microbiol. Lett. 179:53-59; Meissner et al. (2000) Plant J. 22:265-274; Phogat et al. (2000) J. Biosci. 25:57-63; Walbot (2000) Curr. Opin. Plant Biol. 2:103-107; Gai et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28:94-96; Fitzmaurice et al. (1999) Genetics 153: 1919-1928). Además, se describe el proceso TUSC para seleccionar inserciones Mu genes selectos en Bensen et al. (1995) Plant Cell 7:75-84; Mena ef al. (1996) Science 274:1537-1540 y la Solicitud de Patente de EE.UU. N°: 5.962.764, cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia. Hay otros métodos para disminuir o eliminar la expresión de genes endógenos en plantas que también son conocidos en la técnica y que se pueden aplicar de manera similar a la presente invención. Estos métodos incluyen otras formas de mutagénesis, tal como mutagénesis inducida por metansulfonato de etilo, mutagénesis por supresión y mutagénesis por supresión con irradiación rápida de neutrones usada en una genética inversa orientada en el sentido del marco de lectura (con PCR) para identificar líneas de plantas en las cuales se ha suprimido el gen endógeno. Por ejemplos sobre estos métodos véase Ohshima et al. (1998) Virology 243:472-481 ; Okubara er al. (1 994) Genetics 137:867-874; y Quesada et al. 2000, 1 54 y 421 ; cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia. Además, un método rápido y automatizable para rastrear mutaciones inducidas químicamente, el método TILLING (Targeting Induced Local Lesions In Genomes), que emplea HPLC desnaturalizante o digestión selectiva de endonucleasas de productos seleccionados de una PCR también es aplicable en la presente invención. Véase McCallum et al. (2000) Nal Biotechnol. 18:455-457, incorporada en este documento a modo de referencia). Las mutaciones que afectan la expresión genética o que interfieren con la función (por ejemplo, la actividad histidina quinasa o la actividad fosforelé) de la proteína codificada son bien conocidas en la técnica. Las mutaciones por inserción en los exones de los genes habitualmente dan como resultado mutantes nulos. Las mutaciones en los residuos conservados de los sitios son particularmente eficaces para inhibir la actividad histidina quinasa de la proteína codificada. Además, las mutaciones en los residuos de histidina y aspartato que están relacionadas con la función fosforelé también son eficaces para inhibir la actividad de histidina quinasas híbridas. Se han descrito ya los residuos conservados del sitio activo de las histidina quinasas vegetales adecuados para una mutagénesis con el fin de eliminar la actividad histidina quinasa y los que son necesarios para la función fosforelé. Véase, por ejemplo, Hwang er al. (2002) Plant Physiol. 129:500-51 5. Dichos mutantes se pueden aislar de acuerdo con procedimientos bien conocidos y se pueden apilar las mutaciones en diferentes loci de histidina quinasa mediante cruzamiento genético. Véase, por ejemplo, Gruís er al. (2002) Plant Cell 14:2863-2882.

En otro ejemplo de esta invención, se pueden usar los mutantes dominantes para provocar un silenciamiento del ARN debido a la inversión de genes y la recombinación de un locus genético duplicado. Véase, por ejemplo, Kusaba et al. (2003) Plant Cell 15:1455-1467. La invención abarca métodos adicionales para reducir o eliminar la actividad de una o más histidina quinasas. Los ejemplos de otros métodos para alterar o mutar una secuencia de nucleótidos genómica en una planta son conocidos en la técnica e incluyen, a modo de ejemplo, el uso de vectores de ARN:ADN, vectores de ARN:ADN de mutación, vectores de reparación de ARN:ADN, oligonucleótidos dobles mixtos, oligonucleótidos de ARN:ADN auto-complementarios y oligonucleobases recombinogénicos. Dichos vectores y métodos de uso son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N°: 5.565.350; 5.731 .181 ; 5.756.325; 5.760.012; 5.795.972; y 5.871 .984; cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia. Véase también, WO 98/49350, WO 99/07865, WO 99/25821 y Beetham eí al. (1999) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 96:8774-8778; incorporadas en este documento a modo de referencia. A los efectos de la presente invención, a menos que se indique de otra manera o que resulte evidente a partir del contexto, una "planta sujeto" o "célula vegetal sujeto" es uno en que se ha efectuado una alteración genética, tal como una transformación, como en un gen de interés, o es una planta o célula vegetal que desciende de una planta o célula vegetal alterada de esa forma y que comprende dicha alteración. Un "control" o una "planta control" o una "célula vegetal control" provee un punto de referencia para medir los cambios en dicha planta o célula vegetal sujeto.

Una planta control o una célula vegetal control puede comprender, por ejemplo: (a) una planta o célula vegetal de tipo salvaje, es decir, del mismo genotipo que el material inicial para la alteración genética que dio como resultado la planta sujeto o célula vegetal sujeto; (b) una planta o célula vegetal del mismo genotipo que el material inicial pero que ha sido transformado con una construcción nula (es decir, con una construcción que no tiene efecto sobre la característica de interés, tal como una construcción que comprende un gen marcador); (c) una planta o célula vegetal que es un segregante no transformado entre la progenie de dicha planta sujeto o célula vegetal sujeto; (d) una planta o célula vegetal idéntica genéticamente a la planta sujeto o célula vegetal sujeto pero que no fue expuesto a las condiciones o estímulos que inducirían la expresión del gen de interés; o (e) la propia planta sujeto o célula vegetal sujeto, bajo condiciones en las cuales el gen de interés no se expresa. Por ejemplo, en diversos ejemplos de la presente invención se podrían medir los cambios en la actividad histidina quinasa, los niveles de histidina quinasa, la respuesta de citoquinina, la percepción de citoquinina, y/o los cambios en una o más características tales como tiempo de floración, formación de semillas, ramificación, senescencia, tolerancia al estrés o masa radicular, por comparación de la planta sujeto o célula vegetal sujeto con la planta control o célula vegetal control. En determinados ejemplos los polinucleótidos de la presente invención se pueden apilar con cualquier combinación de secuencias de polinucleótidos de interés con el fin de crear plantas con el fenotipo deseado. Por ejemplo, los polinucleótidos de la presente invención se pueden apilar con cualquier otro polinucleótido que codifica un polipéptido con actividad plaguicida y/o insecticida, tal como otras proteínas tóxicas de Bacillus thuringiensis (descritas en las Patentes de EE.UU. N°: 5.366.892; 5.747.450; 5.737.514; 5.723.756; 5.593.881 ; y Geiser ef al. (1986) Gene 48: 109; lectinas (Van Damme ef al. (1994) Plant Mol. Biol. 24:825, pentina (descrita en la Patente de EE.UU. N°: 5.981 .722) y semejantes. Las combinaciones generadas también pueden incluir múltiples copias de cualquiera entre uno o más de los polinucleótidos de interés. Los polinucleótidos de la presente invención también se pueden apilar con cualquier otro gen o combinación de genes para producir plantas con diversas combinaciones de características deseadas incluyendo, a modo de ejemplo, las características deseables para alimentos para animales como genes para un alto contenido de aceites (por ejemplo, la Patente de EE.UU. N°: 6.232.529); aminoácidos balanceados (por ejemplo, hordotioninas (Patentes de EE.UU. N°: 5.990.389; 5.885.801 ; 5.885.802; y 5.703.409); cebada rica en lisina (Williamson et al. (1987) Eur. J. Biochem. 165: 99-106; y WO 98/20122); y proteínas ricas en metionina (Pedersen et al. (1986), J Biol. Chem. 261 : 6279; Kírihara ef al. (1988) Gene 71 : 359; y Musumura et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:123)); mayor dígeribilidad (por ejemplo, proteínas de almacenamiento modificadas (Solicitud de Patente de EE.UU. N°: 10/053.410, presentada el 7 de noviembre, 2001 ); y tiorredoxinas (Solicitud de Patente de EE.UU. N°: 10/005.429, presentada el 3 de diciembre, 2001 )), cuyos contenidos se incorporan en la presente a modo de referencia. Los polinucleótidos de la presente invención se pueden apilar con cualquier gene o combinación de genes, y las combinaciones generadas pueden incluir múltiples copias de uno o más de los polinucleótidos de interés. La combinación deseada puede afectar una o más características; es decir, se pueden crear determinadas combinaciones para modular la expresión genética que afecta la actividad de citoquininas. La modulación de la actividad sensora de citoquinina provista por la presente solicitud se puede combinar con métodos y construcciones para modular los niveles de citoquinina, tal como los que se describen en las Solicitudes Copendientes de Patente de EE.UU. N°: 60/610.656, 60/637.230 y 60/696.405; 1 1 /094.917; 10/817.483; y 09/545.334, incorporadas en este documento a modo de referencia; y en la Publicación de Patente de EE.UU. N°: 2003/0074698 (Schmulling et al.) y la Patente de EE.UU. N°:6.617.497 (Morris). Los polinucleótidos de la presente invención también se pueden apilar con características deseables para la resistencia a enfermedades o herbicidas (por ejemplo, los genes de detoxificación de fumonisina (Patente de EE.UU. N°: 5.792.931 ); avirulencia y genes de resistencia a enfermedades (Jones et al. (1994) Science 266:789; Martin et al. (1993) Science 262: 1432; Mindrinos et al. (1994) Cell 78: 1089); mutantes de acetolactato sintetasa (ALS) que conduce a resistencia a herbicidas, tal como las mutaciones S4 y/o Hra; inhibidores de glutamina sintetasa tal como fosfinotricina o basta (por ejemplo, el gen bar); y resistencia a glifosato (gen EPSPS)); y características deseables para productos de procesamientos o procesos tal como alto contenido de aceites (por ejemplo, Patente de EE.UU. N°:6.232.529); aceites modificados (por ejemplo, genes de ácidos grasos desaturasas (Patente de EE.UU. N°: 5.952.544; WO 94/1 1516)); almidones modificados (por ejemplo, ADPG pirofosforilasas (AGPasa), almidón sintetasa SS), enzimas ramificadoras de almidón (SBE) y enzimas desramificadoras de almidón (SDBE)); y polímeros o bioplásticos (por ejemplo, Patente de EE.UU. N°: 5.602.321 ; beta-cetotiolasa, polihidroxibutirato sintetasa y acetoacetil-CoA reductasa (Schubert et al. (1988) J. Bacteriol. 170: 5837-5847) facilitan la expresión de polihidroxialcanoatos (PHA)), cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia. También se podrían combinar los polinucleótidos de la presente invención con los polinucleótidos que afectan características agronómicas, tal como esterilidad masculina (por ejemplo, véase la Patente de EE.UU. N°: 5.583.210), fuerza de los tallos, tiempo de floración o características de tecnología de transformación tal como regulación del ciclo celular o direccionamiento de genes (por ejemplo, WO 99/61619; WO 00/17364; WO 99/25821 ), cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia. Estas combinaciones apiladas pueden ser creadas mediante cualquier método, incluyendo por ejemplo, cruzamiento de plantas con cualquier metodología convencional o TopCross o transformación genética. Si las características se apilaron por transformación genética de las plantas, se pueden combinar las secuencias de polinucleótidos de interés en cualquier momento y en cualquier orden. Por ejemplo, se puede usar una planta transgénica que comprende una o más de las características deseadas como blanco para introducir otras características mediante una posterior transformación. Las características se pueden introducir simultáneamente en un protocolo de cotransformación con los polinucleótidos de interés provistos por cualquier combinación de casetes de transformación. Por ejemplo, si se introducirán dos secuencias, las dos secuencias pueden estar contenidas en casetes transformación separadas (trans) o pueden estar contenidas en el mismo cásete de transformación (cís). La expresión de las secuencias de interés puede ser dirigida por el mismo promotor o por promotores diferentes. En determinados casos, puede ser deseable introducir un cásete de transformación que suprimirá la expresión del polinucleótido de interés. Esto se puede acompañar con cualquier combinación de otros casetes de supresión o casetes de sobreexpresión para generar la combinación deseada de características en la planta. Se considera además que las secuencias de polinucleótidos se pueden apilar en la ubicación genómica deseada usando un sistema de recombinación específico del sitio. Véase, por ejemplo, W099/25821 , W099/25854, WO99/25840, W099/25855 y W099/25853; también las Patentes de EE.UU. N°: 6.552.248, 6.624.297, 6.573.425, 6.455.315 y 6.458.594, cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia. Además, se pueden ligar operativamente dos regiones de codificación de proteínas en el mismo marco de lectura para producir una proteína de fusión. Se pueden efectuar algunas modificaciones para facilitar la clonación, expresión o incorporación de una proteína de fusión. Dichas modificaciones son bien conocidas por los especialistas en la técnica e incluyen, por ejemplo, la adición de una metionina por el extremo amino terminal para proveer un sitio de inicio o aminoácidos adicionales (por ejemplo, poli His) por ambos extremos para crear secuencias de purificación en ubicaciones convenientes. También se pueden introducir sitios de restricción o codones de terminación. La expresión de secuencias heterólogas de ADN en un huésped vegetal depende de la presencia de elementos reguladores ligados operativamente que son funcionales dentro del huésped vegetal. La elección de la secuencia promotora determinará cuándo y dónde dentro de la planta que se expresará la secuencia heteróloga de ADN. Cuando se desea una expresión continua en todas las células de una planta, se utilizan promotores constitutivos. Por el contrario, cuando se desea una expresión genética como respuesta a un estímulo, los promotores inducíbles constituyen el elemento regulador de elección. Si se desea una expresión en tejidos u órganos específicos, se emplean promotores con preferencia por tejidos. Es decir, estos promotores pueden dirigir la expresión en tejidos u órganos específicos. Se pueden incluir otras secuencias reguladoras 5' y/o 3' con respecto a las secuencias promotoras centrales en los casetes de expresión de los vectores de transformación para obtener niveles variables de expresión de las secuencias de nucleótidos heterólogas en una planta transgénica. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N°: 5.850.018. Las secuencias reguladoras también pueden ser de utilidad para controlar una expresión temporal y/o espacial del ADN endógeno. Algunos ejemplos de la invención comprenden secuencias de nucleótidos que favorecen el inicio de la transcripción en tejidos específicos, incluyendo el tejido vascular y el tejido meristemático de raíces y/o brotes, y en tejido de callos. Un ejemplo de una secuencia de región promotora de una histidina quinasa de la presente invención, AtCKI2, se muestra en la SEQ ID N°: 29. Un "promotor" se refiere a una región de ADN reguladora que habitualmente comprende una caja TATA capaz de dirigir la ARN polimerasa II para iniciar la síntesis de ARN en el sitio de inicio de la transcripción apropiado para una secuencia de codificación particular. Un promotor puede comprender además otras secuencias de reconocimiento ubicadas generalmente 5' con respecto a la caja TATA, denominadas elementos promotores 5', que afectan la velocidad de inicio de la transcripción. Si se considera que habiendo identificado las secuencias de nucleótidos para la región promotora que se describe aquí, pertenece al estado del arte el aislamiento y la identificación de otros elementos reguladores en la región no traducida 5' ubicada en posición 5' con respecto a la región promotora particular identificada en la presente. Por lo tanto, la región promotora que se describe aquí se define en general por comprender elementos reguladores 5', tal como los que son responsables de una expresión con preferencia por tejidos y temporalmente preferida de la secuencia de codificación, potenciadores y semejantes. De la misma manera, los elementos promotores que permiten la expresión en el tejido deseado se pueden identificar, aislar y usar con otros promotores nucleares para confirmar la expresión con preferencia por tejidos. También se pueden identificar y aislar elementos promotores para su uso con otros promotores nucleares. El término "ligado operativamente", tal como se utiliza en la presente, incluye referencia a un ligamiento funcional entre un promotor y una segunda secuencia, donde dicha secuencia promotora inicia e interviene en la transcripción del ADN correspondiente a la segunda secuencia. Generalmente, operablemente unido significa que las secuencias de ácido nucleico están ligadas en forma contigua y, cuando es necesario se las une a dos regiones que codifican proteínas que son contiguas y están en el mismo marco de lectura. Un promotor endógeno está ligado operativamente a la región de codificación endógena que regula. El término promotor "con preferencia por tejidos" se refiere a una secuencia que inicia preferencialmente la transcripción en determinados tejidos, tal como hojas, raíces o semillas. El promotor con preferencia por tejidos también puede dirigir la expresión en determinados tipos de tejidos en uno o más órganos; por ejemplo, en tejidos vasculares de raíces u hojas. La secuencia promotora aislada de la presente invención puede ser modificada para proveer un rango de niveles de expresión de la secuencia de nucleótidos heteróloga. Se puede utilizar menos que la región promotora completa y aún retener la capacidad de dirigir una expresión con preferencia por tejidos. Sin embargo, se considera que es posible disminuir los niveles de expresión de ARNm con la supresión de porciones de la secuencia promotora. Por lo tanto, se puede modificar al promotor para que sea un promotor débil o fuerte. Generalmente, se propone como "promotor débil" a un promotor que conduce la expresión de una secuencia codificante en un nivel bajo. Un "nivel bajo" se refiere a niveles entre aproximadamente 1/10.000 transcriptos y aproximadamente 1/100.000 transcriptos y aproximadamente 1/500.000 transcriptos. A la inversa, un promotor fuerte dirige la expresión de una secuencia de codificación a un nivel alto o a niveles entre aproximadamente 1/ 0 transcriptos y aproximadamente 1/100 transcriptos y aproximadamente 1/1 .000 transcriptos. En general, se usarán al menos 20 nucleótidos aproximadamente de una secuencia promotora aislada para dirigir la expresión de una secuencia de nucleótidos. Se considera que para incrementar los niveles de transcripción, se pueden utilizar potenciadores en combinación con las regiones promotoras de la invención. Los potenciadores son secuencias de nucleótidos que actúan incrementando la expresión de una región promotora. Los potenciadores son conocidos en la técnica e incluyen la región del potenciador SV40, el elemento potenciador 35S y semejantes. Los fragmentos de la secuencia de nucleótidos promotora descrita en la presente también están comprendidas por esta invención. Dichos fragmentos comprenderán al menos 20 nucleótidos contiguos aproximadamente, preferentemente al menos 50 nucleótidos contiguos aproximadamente, más preferentemente al menos 75 nucleótidos contiguos aproximadamente, aún más preferentemente al menos 100 nucleótidos contiguos aproximadamente de la secuencia de nucleótidos promotora que se describe en la presente. Dichos fragmentos comprenderán habitualmente el motivo de reconocimiento TATA de la secuencia promotora. Dichos fragmentos se pueden obtener utilizando enzimas de restricción para clivar las secuencias de nucleótidos promotoras naturales que se describen aquí; sintetizando una secuencia de nucleótidos mediante el uso de tecnología de PCR. Véase en particular, Mullís et al. (1987) Methods Enzymol. 155:335-350 y Erlích, ed. (1989) PCR Technology (Stockton Press, Nueva York). Dichos fragmentos abarcan, por ejemplo, secuencias capaces de dirigir una expresión con preferencia por tejidos, elementos responsables de la especificidad temporal o de tejidos, elementos que responden a una fitohormona y secuencias de utilidad como sondas para identificar secuencias similares. Las variantes biológicamente activas de la secuencia promotora también están comprendidas en la composición de la presente invención, incluyendo variantes debidas a una mutagénesis dirigida al sitio. Una "variante" reguladora es una forma modificada de una secuencia reguladora en la cual se ha modificado, eliminado o añadido una o más bases. Por ejemplo, una manera común de eliminar parte de una secuencia de ADN consiste en utilizar una exonucleasa en combinación con amplificación de ADN para producir supresiones anidadas unidireccionales de clones de ADN de cadena doble. Hay un conjunto de elementos comercial para este fin que se vende bajo el nombre comercial Exo-Size™ (New England Bíolabs, Beverly, Mass.). Brevemente, este procedimiento comprende la incubación de la exonucleasa III con ADN para eliminar progresivamente los nucleótidos en la dirección 3' a 5' en las superposiciones 5', extremos cohesivos o nicks en el templado de ADN. Sin embargo, la exonucleasa III no puede eliminar los nucleótidos en las superposiciones de 4 bases 3'. La digestión cronometrada de un clon con esta enzima produce supresiones anidadas unidireccionales. Un ejemplo de una variante de secuencia reguladora es un promotor formado por una o más supresiones en un promotor más grande. Es posible suprimir la porción 5' de un promotor hasta la caja TATA cerca del sitio de inicio de la transcripción sin anular la actividad promotora, como describieron Zhu et al., The Plant Cell 7: 1681 -89 (1995). Dichas variantes deberían retener la actividad promotora, en particular la capacidad para dirigir la expresión en tejidos específicos. La actividad promotora se puede medir mediante análisis de transferencia Northern, mediciones de la actividad informante cuando se usan fusiones de la transcripción y semejantes. Véase, por ejemplo, Sambrook ef al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.), incorporada en este documento a modo de referencia. La secuencia de nucleótidos para el promotor de la invención, así como fragmentos y variantes de la misma, se puede proveer en casetes de expresión junto con secuencias de nucleótidos heterólogas para su expresión en la planta de interés, más particularmente en tejidos específicos de la planta. Dicho cásete de expresión se provee con una pluralidad de sitios de restricción para insertar la secuencia de nucleótidos bajo el control de transcripción del promotor. Estos casetes de expresión son de utilidad para una manipulación genética de cualquier planta con el fin de obtener la respuesta fenotípica deseada. Esto se puede lograr incrementando la expresión de productos endógenos o exógenos en los tejidos específicos de interés. Como alternativa, se puede reducir la expresión de uno o más productos endógenos, en particular enzimas o cofactores. La región promotora de la invención puede aislarse de cualquier planta, incluyendo, a modo de ejemplo, maíz (Zea mays), cañóla (Brassica napus, Brassica rapa ssp.), alfalfa {Medicago sativa), arroz {Oryza sativa), centeno (Sécale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), girasol (Helianthus annuus), trigo ( Triticum aestivum) y soja (Glycine max). Se pueden aislar secuencias promotoras de otras plantas de acuerdo con técnicas bien conocidas basado en su homología de secuencia con las secuencias promotoras que se describen en la presente. En estas técnicas, se puede usar todo o una parte de la secuencia promotora conocida como sonda que se hibridizará selectivamente con las otras secuencias presentes en una población de fragmentos clonados de ADN genómico (es decir, bibliotecas genómicas) de un organismo elegido. Hay métodos disponibles en la técnica para la hibridación de secuencias de ácido nucleico. Los siguientes ejemplos se ofrecen como ilustraciones y no deben ser interpretados como limitaciones. EJEMPLO 1 Histidina quinasas de Arabidopsis Los sistemas de transducción de señales intervienen en la percepción de los estímulos ambientales y hormonales y la consiguiente activación posterior de las respuestas celulares apropiadas. La ubicación estratégica de estos sistemas al comienzo de las cascadas de señalización los vuelve candidatos ideales para la modulación de características complejas. Los estímulos descritos por ser percibidos por dichos sistemas en plantas incluyen osmolaridad, etíleno y citoquinina, en tanto en bacterias incluyen nitrógeno, fosfato y sales, y en cianobacterias incluyen sales y temperaturas bajas. Un sistema típico de dos componentes consiste de una histidina quinasa con actividad sensora y un regulador de respuestas. La secuencia de aminoácidos de ZmCKI2 (SEQ ID N°: 8) es homologa de la proteína CKI2 de Arabidopsis (SEQ ID N°: 14) en los dominios de histidina quinasa y regulador de respuestas, con una similitud de secuencia general del 55% para toda la proteína (GAP; matriz BLOSUM 62). La CKI2 de Arabidopsis fue aislada originalmente en una prueba con marcas de activación para los mutantes con ganancia de funciones que presentan una respuesta constitutiva a citoquinina en ausencia de la hormona (Kakimoto (1996) Science 274: 982-985). La CKI2 puede modular la transducción de señales de citoquinina a través de un mecanismo único con relación a otros receptores de citoquinina descritos previamente. La proteína AtCKI2 es una histidina quinasa que funciona como uno de los componentes en los sistemas de transducción de señales. La región de codificación de AtCK/2 contiene once intrones, con un intrón adicional dentro de la región no traducida 5'. El marco de lectura abierto más largo se pudo traducir en una proteina de 922 residuos de aminoácidos. El producto e la traducción de uno de los marcos de lectura abiertos predichos de Oryza sativum (Os6G44410) era similar a CKI2 en toda su secuencia de aminoácidos y se denominó OsCA/2 (véase la Figura 2 y la SEQ ID N°: 23). La proteína AtCKI2 contiene tres regiones con identidad de secuencia con los dominios proteicos descritos previamente. Las histidina quinasas cuya actividad ha sido demostrada contienen cinco motivos, las cajas H, N, G1 , F y G2, que son esenciales para la fosforilación, hidrólisis y unión a ATP (Stock et al., 2000). Las histidina quinasas de receptores de tipo híbrido contienen una segunda región, la región reguladora de respuestas, que es similar a los blancos de señalización de las cascadas prototípicas de transducción de señales de dos componentes. Los reguladores de respuestas contienen cuatro motivos que contienen residuos esenciales para la fosforilación (Stock et al., 2000). Los productos de traducción CKI2 predichos tanto de Arabidopsis como de arroz contienen residuos de signatura de las regiones de histidina quinasa y reguladoras de respuestas que son evidentes en las histidina quinasas de receptores de tipo híbridos (Figura 3A y 3B) de organismos divergentes. En plantas, los receptores de citoquinina y etileno que responden a hormonas fueron descritos como histidina quinasas de receptores de tipo híbrido (Schaller et al. , 2002). Sin embargo, la proteína CKI2 es distinta de estos receptores de hormonas por cuanto no presentan similitud de secuencia con los dominios proteicos de unión a citoquinina o etileno descritos para sus extremos amino terminales (Schaller y Bleecker, 1995; Yamada et al., 2001 ). Además, los datos indican que CKI2, similar a ETR1 , puede contener múltiples blancos posteriores en la cascada. Se identificó una tercera región, cerca del extremo amino terminal de CKI2, que presentaba similitud de secuencia con la superfamilia de dominios PER/ANRT/SIM (PAS) ya descrita y contiene residuos de signatura que fueron identificados en una comparación de dominios PAS (Figura 3C) (Taylor y Zhulin, 1999). Hay una secuencia nuclear PAS putativa que es un 59% idéntica (23 de 39 residuos) a secuencias de Arabidopsis y de arroz. Se identificaron tres regiones adyacentes al dominio PAS de CKI2 con un motivo repetido de un residuo hidrofóbico y una estructura terciaria alfa-helicoidal predicha. El dominio único tipo PAS de CKI2 es necesario para su capacidad para modular la reactividad a la citoquinina. Basado en una línea mejorada-trampa y la determinación del perfil de expresión, la expresión CKI2 puede responder a condiciones de crecimiento hipóxicas o a la aplicación de peróxido de hidrógeno (Desikan et al., 2001 ; Baxter-Burrell et al., 2003). Se ha demostrado la existencia de una autorregulación de la transcripción para algunas histidina quinasas bacterianas y de plantas (Urao et al., 1999; Bijlsma y Groisman, 2003; Rashotte et al., 2003) y por consiguiente la CKI2 podría servir como un integrador de dichos estímulos ambientales en la transducción de señales de fitohormonas. En consonancia con esta hipótesis, se ha demostrado que los dominios PAS de algunas proteínas presentan actividad sensora de oxigeno o del potencial redox (Taylor y Zhulin, 1999; Gilles-Gonzalez y González, 2004). La presencia de un dominio PAS de tipo CKI2 en algunas histidina quinasas cianobacterianas permite utilizar estos organismos modelo para posiblemente identificar y caracterizar el estímulo CKI2. La mayoría de las histidina quinasas de receptores están localizadas en la membrana con regiones transmembrana identificables en sus extremos amino termínales (West y Stock, 2001 ; Hwang et al. , 2002). A diferencia de otras histidina quinasas de Arabidopsis, parece que AtCKI2 carece de las regiones transmembrana amino-terminales basado en algoritmos de predicción de estructuras. Para proveer una evidencia experimental de su ubicación subcelular in vivo, se crearon construcciones para producir una región casi de longitud completa o amino terminal de CKI2 fusionado en la traducción a GFP. De manera similar al control GFP, la fluorescencia de la proteína de fusión CKI2(5-355):GFP se localizó tanto en el citosol como en el núcleo durante la expresión transitoria en células epidérmicas de cebolla. Por el contrario, la fluorescencia de una proteína de fusión GFP con la región amino-terminal de AHK1 , AHK1 (1 -500):GFP, que contiene regiones transmembrana identificables (Urao et al., 1999), aparentemente se localizaba en la membrana plasmática. Diversas similitudes cualitativas entre el mutante de pérdida de función de Arabidopsis, ck¡2-2, y el triple mutante cre 1ahk2ahk3 (Nishimura eí al. (2004) Plant Cell 16: 1365-1377) ya se han observado. El crecimiento radicular es afectado en ambos, con una reducción general en la velocidad de crecimiento radicular y alteraciones en la arquitectura radicular. El crecimiento vegetativo general se había reducido; los mutantes tenían hojas más pequeñas, una altura reducida de las plantas y un retardo en la transición al desarrollo reproductor. En Arabidopsis, AtCKI2 se expresa preferencialmente de una manera similar a los dominios de expresión específicos de otros receptores de citoquinina; los tejidos de raíces, hojas inmaduras y de inflorescencias presentan los niveles de expresión detectables más altos. El transcripto endógeno de CKI2 no se pudo detectar por hibridación Northern usando transferencia de ARN total. El uso de RT-PCR permitió amplificar dos regiones adyacentes de la secuencia de codificación 5' de C /2, correspondiente al extremo amino terminal único de CKI2, a partir de ADNc derivado de ARN específico de raices, hojas, tallos o inflorescencias. Cuando se utilizaron los cebadores de ARNr 18S como controles internos, se pudo observar de manera reproducible la acumulación dependiente del ciclo del producto CKI2 en menos ciclos en muestras de raíces y de inflorescencias, lo cual implica la existencia de un mayor nivel de expresión endógena en estos tejidos. Las plantas transgénicas de Arabidopsis que comprenden una fusión de transcripción del promotor AtCKI2 (SEQ I D N°: 29), la región de codificación del gen informante GUS y la PINII región de terminación de la transcripción mostraron una coloración histoquímica para actividad GUS predominantemente en la vasculatura de hojas inmaduras, en la vasculatura de las raíces, hipocótilo y en el meristema radicular. En las plántulas en germinación, la actividad GUS recién era detectable 48 horas después de su transferencia a la luz con un patrón difuso en todos los cotiledones y en el extremo de la raíz. La región con actividad GUS en la punta de la raíz puede incluir al meristema radicular, pero la zona de elongación de las raíces próxima a la punta de la raíz no presentaba actividad del gen informante. A las 72 horas de la transferencia, apareció actividad GUS en el manojo vascular de la raíz, dentro de regiones que presumiblemente habían completado su diferenciación celular (Scheres et al. , 2002). Además, la actividad GUS se volvía más evidente en la vasculatura de los cotiledones y se observó en el meristema de brotes y el hipocótilo adyacente. La actividad espacial de GUS en la punta de la raíz se resumió en el desarrollo de raíces laterales; la actividad GUS se evidenciaba primero por todo el primordio pero luego era restringida a la punta distal y al manojo vascular próximo a la raíz principal. Aunque no era detectable en los primordios emergentes de hojas, la actividad del transgen PROCKI2:GUS se observó difusamente en todo el tejido foliar, incluyendo la vasculatura, en las etapas tempranas del desarrollo. La actividad era detectable en el meristema floral y se observaba difusamente en todos los órganos florales, siendo más pronunciada en la vasculatura. Dentro del gineceo, no se observaba actividad GUS durante un breve período en la antesis y no era detectable en óvulos, semillas en desarrollo o en embriones. La expresión en el extremo de la punta de la raíz de C /2 parece ser bastante diferente de la expresión de otras histidina quinasas de Arabidopsis. Esto resulta especialmente interesante ya que se ha demostrado que esta región es un sitio de acumulación tanto de citoquinina como de auxina según análisis de inmunolocalizacíón y con genes informantes (Scheres et al. , 2002; Aloni et al., 2004). Por consiguiente, CKI2 no está presente durante los eventos primarios de la organogénesis, lo cual excluye su participación en un rol de desarrollo, pero se expresa en regiones de integración de hormonas y puede servir como un constituyente celular para participar en la percepción de dichos estímulos. Entre los reguladores de respuesta examinados, el patrón único de expresión en la punta de la raíz de CKI2 solamente es compartido por ARR5 (D'Agostino et al. , 2000; Aloni et al., 2004). En ausencia de otros receptores de dos componentes en esta región, la CKI2 podría servir como iniciador primario de la transducción de señales de dos componentes, dando como resultado la activación de la transcripción de ARR5. En otros tipos de tejido, tales como meristemas y vasculatura de brotes, para los cuales se ha descrito la expresión de numerosas histidina qu inasas de receptores, la señalización de dos componentes podría ser modul ada con cualquiera de los receptores descritos. Este patrón de expresión de GUS en células en divis ión activa es coherente con la función de CKI2 en la actividad sensora de citoqui nina. La ubicación vascular de la expresión de GUS dirigida por el promotor AtCKI2 es similar a la de AtCREI , AHK2 y AHK3, todas las cuales son conocidas por su participación en la actividad sensora de citoquinina, tal como demostraran Higuchi et al. ((2004) Proc. Nati. Acad. Sc¡. EE. UU. 1 01 :8821 -8826; y Nishimura et al. ((2004 ) Plant Cell 1 6: 1 365-1 377). Los estudios de localización con ZmCKI2 en tejidos de mazorca inmadura de maíz mostraron una expresión clara de ZmCKI2 en los manojos vasculares, lo cual implica nuevamente un rol de actividad sensora de citoquinina durante el transporte de la hormona a través de los manojos vasculares. También se evaluó la actividad de PROCK GUS como respuesta a la aplicación exógena de hormonas tanto en plántulas como en tejido de callos. Se incubaron plántulas de cinco día en presencia ya sea de citoquinina o auxina y se colorearon para observar la actividad GUS. Basado en los ensayos con diversas concentraciones de sustrato GUS, no parecía que la actividad espacial o cuantitativa del transgen fuera afectada por un periodo de tratamiento con hormonas de ya sea una o tres horas. Para examinar la exposición crónica a la aplicación de hormonas, se cultivaron segmentos de hipocótilo de transgénicos PROcw'GUS en oscuridad sobre un medio inductor de callos (CIM). En las plántulas cultivadas en oscuridad con cinco días de crecimiento, la actividad en las regiones de la punta de la ra íz y del meristema de brotes era similar a las plántulas cultivadas con luz. Sin embargo, la actividad GUS era relativamente difusa dentro de los cotiledones, solamente era evidente en la región adyacente al meristema dentro del hipocótilo y no era detectable en la vasculatura del hipocótilo o en la raíz. Se recortaron los hipocótilos y después de siete días de crecimiento sobre CIM , la actividad GUS era evidente en la vasculatura de todo el hipocótilo, así como en pequeños focos que aparentemente se correlacionaban con regiones de proliferación de tejido. A continuación, se transfirieron los segmentos de hipocótilo a diversas proporciones de citoquinina a auxina y luego se evaluó la actividad a los siete, catorce y veintiún días. La actividad GUS era similar con cada uno de los tratamientos con hormona durante todo el transcurso y recordaba la actividad observable in planta. Aunque no se observó en tejido de brotes en desarrollo, la actividad GUS era evidente en el ápice de la raíz y en el manojo vascular, excepto en la región inmediatamente adyacente al meristema de la raíz, de raíces en desarrollo individuales. AtCKI2 también puede interactuar con los intermediarios de señalización de dos componentes canónicos como lo demuestran los ensayos de dos híbridos de levadura. El ensayo de dos híbridos en levadura heteróloga se ha utilizado con éxito para identificar los blancos de señalización de histidina quinasas de Arabidopsis (Urao et al. , 2000) y este ensayo se empleó para definir las cascadas de señalización dependientes de CKI2. Los detalles del ensayo se describirán más adelante en el Ejemplo 4. Se fusionaron para la traducción fragmentos de la secuencia de codificación de CKI2, que contienen ya sea el extremo amino terminal y PAS, o las regiones de histidina quinasa y reguladores de respuestas (ambas en combinación e individualmente), al dominio de unión a ADN GAL4 (GAL4BD) de la secuencia de codificación para su uso en una prueba de dos híbridos. Entre todas las proteínas de fusión examinadas (seis en total), solamente una (GAL4BD:CKI2(590-922) produjo colonias positivas a partir de la prueba primaria que fueron reevaluadas con éxito en ensayos de crecimiento auxotrófico y colorimétricos.

Se identificaron clones que representan dos genes independientes, PROTEÍNA 3 DE FOSFOTRANSFERENCIA DE HISTIDINA DE ARABIDOPSIS (AHP3, At5G39340) y At3G28690, una serina/treonina proteína quinasa putativa, a partir de la biblioteca con GAL4BD:CKI2(590-922). Los AHP son los blancos de señalización descritos de las histidina quinasas de receptores canónicas, tal como CRE1 , AHK1 y ETR1 (Grefen y Harter, 2004). A continuación se evaluaron las proteínas de longitud completa de cuatro AHP que se pueden obtener y mostraron actividad positiva auxotrófica y colorimétrica de histidina, lo cual indica que AtCKI2 podría interactuar con cada una de estas proteínas y además sustentar el rol de esta histidina quinasa en las cascadas de transducción de señales de dos componentes. La At3G28690 es homologa de la PROTEÍNA QUINASA 1 DE ARABIDOPSIS (APK1 ) (Hirayama y Oka, 1992) y APK2 (Ito et al. , 1997) publicadas previamente y se denomina APK3. La prueba original permitió identificar una fusión de proteínas truncadas APK3, APK3(262-476), que solamente contiene una parte del dominio quinasa canónico y la región carboxilo terminal. Al comparar los resultados con este truncamiento, las proteínas de fusión ya sea con APK3 de longitud completa o una segunda proteína truncada, APK3( 15-476), no pudieron interactuar positivamente con GAL4BD:CKI2(590-922) en el ensayo de dos híbridos. Esto sugiere que su extremo amino terminal puede interferir con la interacción de CKI2. Esta observación se podría deber a la presencia de un dominio auto-inhibitorio, como se ha demostrado para la proteína quinasa SOS2 no relacionada (Zhu, 2002). La APK3 se ha clasificado como una Quinasa Citoplasmática de tipo Receptor (RLCK) VI I (Familia 1 .2.2) en Arabidopsis. Véase sitio WEB de la Universidad de Purdue sobre Genómica Funcional de la Fosforilación Vegetal (plantsp.qenomics.purdue.edu) Los experimentos preliminares sugieren que la APK3 endógena se expresa a un nivel relativamente bajo. Continúa su uso en la modulación de las respuestas de crecimiento dependientes de citoquinina mediante análisis transgénicos y de mutantes. El primer alelo de inserción de CKI2, ck¡2- 1 , fue identificado en una prueba para fenotipos de crecimiento independientes de citoquinina de tejido de callos marcados para activación. Los callos Cki2-1 podrían producir tejido de brotes en ausencia de citoquinina exógena, pero este fenotipo no se observó en la progenie de las plantas regeneradas (Kakimoto, 1996, 1998). El ADN-T de cki2-1 se insertó en la región 5' de la secuencia de codificación, que probablemente produciría un ARNm truncado expresado de forma constitutivamente, donde al producto de la traducción le faltaban los 84 residuos de aminoácidos amino terminales (CKI2(85-922)) (Kakimoto, 2002). Una linea de inserción de ADN-T, denominada cki2-2 en la presente, fue caracterizada como un alelo mutante cki2 putativo. El borde izquierdo de la inserción de ADN-T se podría amplificar por PCR, y las plantas hemicigotas se retrocruzaron dos veces con Arabidopsis de tipo salvaje (Acceso Columbia). Un fenotipo mutante evidente (véase su descripción más adelante) cosegregó con las plantas que eran homocigotas para la inserción de ADN-T. La relación de segregación del fenotipo mutante, 4.2: 1 (tipo salvaje:mutante), se había desviado con relación a la relación esperada de 3:1 (prueba de Chi cuadrado; p = 0,05) para un alelo mutante recesivo de un solo gen, lo cual podría deberse a un efecto negativo poco penetrante sobre el desarrollo del gametofito. La falta de actividad GUS observable en tejido esporofítico o gametofítico femenino sugiere que dichos defectos pueden estar limitados al desarrollo de estambres o polen. El borde izquierdo del sitio de inserción del alelo c/a'2-2 está ubicado dentro del décimoprimer exón de CKI2 (Figura 4A). Este sitio de inserción, confirmado usando ADNc derivado de ck¡2-2, daría como resultado un producto de traducción en el cual los 53 residuos carboxilo terminales de la CKI2 endógena habían sido sustituidos por 33 residuos derivados del borde izquierdo del ADN-T. Se habrían perdido dos motivos críticos para la formación del sitio activo de fosforilación del dominio regulador de respuestas (Figura 3) en el producto de traducción cki2-2. Las hibridaciones Northern y RT-PCR indican que la expresión de la secuencia de codificación flanqueadora (At5G10730) no parecía estar afectada en cki2-2. La hibridación Southern del ADN genómico de cki2-2 con un fragmento del promotor 35S del virus en mosaico de la coliflor, que está contenido en el ADN-T del pROK2 (Baulcombe et al., 1986), sugería que se había producido una inserción en tándem dentro de la secuencia de codificación CKI2. Por consiguiente, aunque era posible que cki2- 1 no estuviera afectada en cuanto a la función de la proteína, cki2-2 representa un alelo nulo funcional con respecto a la actividad reguladora de respuestas. Sin embargo, la proteína cki2-2 puede retener la actividad hístidina quinasa y la proteína parcialmente funcional aún puede afectar las vías de señalización posteriores. La capacidad de la región ETR1 de la histidina quinasa para funcionar como un dominio independiente (Gamble et al. , 1998) y las diferencias fenotípicas observadas en las versiones mutantes de histidina quinasa o reguladoras de respuestas de CKI 1 en ensayos con protoplastos (Hwang y Sheen, 2001 ) sustentan dicha propuesta. Además, Nakamura et al. (1999) demostraron que el dominio regulador de respuestas CKI 1 podría facilitar la trans-desfosforilación de dos proteínas AHP y que los dominios reguladores de respuestas de algunas histidina quinasas bacterianas son esenciales para definir la especificidad de interacción de la proteína o la regulación de la actividad histidina quinasa (Bijlsma y Groisman, 2003). Es muy factible que los mutantes de inserción cki2 afecten de manera diferente a la señalización de citoquinina a través de uno de estos mecanismos. Dado que estos efectos potenciales tendrían lugar después de la traducción, probablemente no se observen diferencias detectables en la expresión del gen informante, tal como ARR6 inducible por citoquinina. El fenotipo mutante ck¡2-2 se podría describir como una reducción general del índice de crecimiento y desarrollo vegetal. Las plántulas Ck¡2-2 se podrían identificar sobre la base de un color verde claro con relación al tipo salvaje, que era evidente durante todo su cíelo de vida. El tiempo de floración se había prolongado en las plantas cki2-2, donde la transición a la floración tenía lugar 12-1 5 días después del tipo salvaje, aunque la cantidad de hojas vegetativas presentes durante la transición (doce aproximadamente) era la misma. Las plantas cki2-2 maduras presentaban una reducción tanto de tamaño como de altura, con un promedio del 25% de la longitud del brote primario de tipo salvaje, y mostraba una evidente disminución en la elongación internodal. Sobre la base del crecimiento de plántulas sobre placas, se redujo el crecimiento radicular de cki2-2 con relación al tipo salvaje. El inicio de raíces laterales parecía estar temporalmente demorado en el mutante; sin embargo, a diferencia del tipo salvaje, el crecimiento de raíces primarías adventicias pod ía exceder el del eje de la raíz principal durante la etapa temprana del desarrollo. No se observaron grandes defectos morfológicos en la raíz, órganos vegetativos o florales de cki2-2 y no se había alterado la respuesta skotomorfogénica o etiolada de las plántulas cki2-2 cultivadas en oscuridad. La AtCKI2 se había asociado previamente con la transducción de señales de hormonas basado en una línea marcada por activación , y las observaciones actuales sugieren una cierta superposición de los dominios de expresión con los receptores de citoquinina descritos. Para evaluar las diferencias en las respuestas dependientes de hormonas, se evaluaron plántulas cki2-2 por sus respuestas fisiológicas y moleculares a la citoquinina benciladenina (BA) y a la auxina ácido indolacético (IAA). El crecimiento radicular primario está inhibido en las plántulas de tipo salvaje como respuesta a concentraciones crecientes de citoquinina y auxina (Inoue et al., 2001 ); estas respuestas fenotipicas se observaron asimismo en plántulas cki2-2. Sin embargo, debido al crecimiento radicular relativamente reducido de cki2-2, este efecto era menos pronunciado. Se analizó la activación de la transcripción dependiente de hormonas de genes específicos inducibles por citoquinina y auxina (D'Agostino et al., 2000; Hagen y Guilfoyle, 2002), ARR6 y IAA5 respectivamente, tanto en el tipo salvaje como en cki2-2. Se trataron plántulas de tipo salvaje y ck¡2-2 de siete días con BA o IAA, y la inducción dependiente de hormonas de la expresión del gen informante se pudo observar con RT-PCR semi-cuantitativa. Los resultados indican que las plántulas cki2-2 responden a la aplicación exógena de citoquinina y auxina en ensayos fisiológicos y moleculares in planta, lo cual sugiere que la pérdida de la actividad de CKI2 no anula por completo la capacidad de la planta para percibir estas hormonas. Los mutantes individuales de los receptores de la hormona citoquinina, CRE1 y AHK3, no presentan grandes defectos morfológicos cuando se cultivan bajo condiciones de crecimiento normales pero son demostrablemente hiposensibles a citoquinina en ensayos de crecimiento de callos (Inoue et al., 2001 ; Ueguchi et al., 2001 ; Higuchi et al., 2004; Nishimura et al., 2004). Para explorar más esta observación, se obtuvo una línea de inserción de ADN-T AHK3, denominada ahk3-4 (Figura 4B) en la presente, y se crearon líneas transgénícas que expresaban de forma constitutiva la secuencia de codificación de longitud completa AHK3 con el promotor de UBIQUITINA de Zea mays (PROUBQ)- Se confirmó la ubicación exónica del ADN-T de ahk3-4 y se demostró la expresión constitutiva de las líneas transgénicas utilizando hibridación Northern. Se recortaron muestras duplicadas, independientes de tejido de hipocótilo de líneas de Arabidopsis de tipo salvaje, mutantes o transgénicas (tipo salvaje, ahk3-4, PROUBQ:AHK3, ahk1 -1 , PROUBO:AHK1 , cki2-2, PROUBQ:CKI2, PROUBQ:CKI2(1 -363) y PROUBQ:CKI2(353-922)) y se cultivaron sobre placas que contenían diferentes proporciones de citoquínina:auxina. Se usaron las siguientes concentraciones de trans-zeatina en el gradiente: 0,0; 0,01 ; 0,05; 0,1 ; 0,5; 1 ,0 pg/ml con 0,2 pg/ml de ácido indolbutíhco. Las plantas de las líneas mutante y transgénica no presentaban ningún defecto morfológico evidente bajo condiciones de crecimiento normales. Bajo las condiciones de crecimiento de callos evaluadas, no se observaron diferencias significativas en cuanto a formación de raíces entre callos derivados del tipo salvaje, del mutante y transgénicos. Por el contrario, sí se observaron diferencia en cuanto a la formación de brotes durante el crecimiento del tejido de callos con relación a los callos de tipo salvaje. Con una concentración constante de auxinas, los callos ahk3-4 requirieron de una mayor concentración de citoquinina que los callos de tipo salvaje para producir un verdor de tejidos y formación de brotes significativos. Por el contrario, la expresión constitutiva de AHK3 dio como resultado tejido de callos verde y se inició la formación de brotes a una concentración más baja de citoquinina con relación al tipo salvaje. Por consiguiente, el nivel relativo de expresión de AHK3 funcional puede afectar algunas de las respuestas del tejido de callos a la aplicación exógena de citoquinina pero no parecería alterar el desarrollo de las plantas debido a los niveles de citoquinina endógena.

Se determinaron los efectos de alterar la expresión endógena de la histidina quinasa ? ?? , que carece del dominio CHASE de unión a citoquinina descrito, en los ensayos de crecimiento de hipocótilos para que sirvieran como un potencial control negativo. Se ha sugerido que AHK1 funciona como un osmosensor en Arabidopsis (Urao et al. , 1999), posiblemente como una histidina quinasa constitutivamente activa, y no afectaría hipotéticamente el crecimiento de callos dependiente de citoquinina. Se identificó un muíante ahkl , indicado como ahk1- 1 en la presente (Figura 4C), examinando una población de líneas de inserción de ADN-T. Se crearon líneas transgénicas PROUBQ-'AHK1 y se seleccionaron basado en la expresión detectable del transgene mediante hibridación Northern. Al igual que con la histidina quinasa de receptores AHK3, no se observaron defectos morfológicos importantes en las líneas mutantes y transgénicas bajo condiciones de crecimiento normales. De manera similar, en el ensayo de crecimiento de callos, no se pudo diferenciar el crecimiento dependiente de hormonas de callos mutantes ahk 1-1 y callos transgénicos PROUBQ AHKI con respecto a los callos de tipo salvaje. Estos resultados sugieren que las alteraciones en la expresión endógena de AHK1 no afectan, de forma positiva o negativa, el crecimiento de los callos, lo cual demuestra que no todas las histidina quinasas de Arabidopsis pueden modular la capacidad de respuesta a citoquinina. En experimentos similares, se examinó la capacidad de CKI2 para afectar el crecimiento de los callos. Se crearon líneas transgénicas que expresan de forma constitutiva la secuencia de codificación genómica C /2, confirmada por hibridación Northern. Estas líneas no presentaban defectos morfológicos o de crecimiento evidentes bajo condiciones normales.

Se cultivó tejido de callos de estas líneas mutante ck¡2-2 y transgénicas PROUBQ 'CKI2 sobre placas que contenía proporciones crecientes de citoquinina a auxina. En general, el tejido de callos de cki2-2 parecía ser menos prolífíco que el tipo salvaje. De manera similar a los callos mutantes ahk3-4, parecía ser hiposensible a la concentración de citoquinina basado en el verdor del tejido y la formación de brotes. La expresión constitutiva de CK/2 dio como resultado el crecimiento de callos que parecían ser hipersensibles a citoquinina, pero relativamente menos pronunciado que los transgénicos PROUBQ:AHK3. Para explorar aún más los efectos de crecimiento positivo de la expresión de CKI2, se evaluó el tejido transgénico que expresaba ya sea las secuencias de codificación amino termínales y PAS {PROUBQ:A T-CKI2(1-363)), O la histidina quinasa y el regulador de respuestas (PROUBQ:A T-CKI2(353-922)), por sus diferencias en cuanto al crecimiento de los callos. La expresión de estas dos construcciones no parecía afectar de manera detectable la capacidad de respuesta a hormonas del tejido de callos. Por consiguiente, análogos a los efectos pleiotrópicos negativos observados en las condiciones de crecimiento normales y de manera similar a la hiposensibilidad de los callos ahk3-4, los callos cki2-2 son menos reactivos a la concentración exógena de citoquinina que el tipo salvaje. Los efectos hipersensibles de citoquinina de la expresión de CK/2, observados solamente bajo las condiciones de crecimiento de callos, son fenotípícamente similares a la expresión constitutiva de AHK3 y recuerdan la descripción de la línea marcada para activación CKI2 (Kakimoto, 1996). No se puede duplicar este fenotipo con la expresión de tan solo las regiones de codificación de histidina quinasa y de regulador de respuestas CKI2.

EJEMPLO 2 Histidina quinasas de maíz La secuencia de polinucleótidos ZmCKI2 (SEQ I D N°: 7) se obtuvo con una búsqueda de homología de proteínas de arroz usando la secuencia de la proteína CKI2 de Arabidopsis. Se usó un candidato de arroz superior para buscar las secuencias genómicas de maíz disponibles en las bases de datos de secuencias públicas. Para producir la secuencia de polinucleótidos ZmCKI2, se ensamblaron las secuencias de los extremos 5' y 3' parcialmente identificadas de maíz en un contig y se rellenaron las regiones del medio que faltaban por clonación física usando la información de las secuencias de los extremos. En particular, se extrajo ARN de tejido de mazorca inmadura de maíz y se preparó una agrupación de ADNc a partir del ARN usando transcripción inversa. Se clonó el ADNc de ZmCKI2 por PCR directa a partir de esta agrupación de ADNc. Los otros polinucleótidos de la invención que codifican histidina quinasas de maíz se obtuvieron usando un enfoque similar. Se clonaron físicamente ZmHK2, ZmHK3 y ZmCKI2 a partir de la agrupación del ADNc preparada con ARN de mazorca inmadura de maíz como se describiera precedentemente. La secuencia para ZmCREI (SEQ ID N°: 1 -3) se completó mediante detección con BAC y desplazamiento con cebadores. La secuencia genómica de un clon BAC selecto fue enviada a Sequence Annotation Viewer y se demostró que contenía una secuencia de codificación parcial para el extremo 5' de ZmCREI . Esta secuencia de codificación mostró una superposición perfecta con la secuencia de inserción completa para un EST seleccionado que codifica el extremo 3' de ZmCRE I . La secuencia de codificación identificada a partir del clon de BAC y la secuencia de inserción completa a partir del EST fueron ensamblados para obtener una secuencia de codificación de longitud completa para ZmCRE I .

La secuencia para ZmCKH (SEQ I D N°: 26-28) se obtuvo basado en la información de secuencia parcial reunida por desplazamiento del genoma. Basado en la información de secuencia parcial para ZmCKM identificado mediante búsquedas BLAST, se diseñaron cebadores que permitieron amplificar ubn fragmento de ~3 kb. La confirmación de la secuencia se efectuó con alrededor de 400 bp por ambos extremos de esta secuencia y, cuando esta secuencia se usó en búsquedas BLAST, se identificó un fragmento genómico de 7008 bp. Esta secuencia genómica fue enviada para predecir el ADNc a Sequence Annotation Viewer y se predijo que contenía la secuencia de codificación para ZmCKH . Como se observara con la histidina quinasa de Arabidopsis, AtCKM , la región de codificación de ZmCKM cae dentro del mismo ciado que el osmosensor AHK1 (Fig 5). Esta similitud de secuencia indica que ZmCKM podría estar relacionada con la señalización de citoquinina como se propone para AtCKM , o en el osmosensor como se propone para AHK1 . Las búsquedas de homología también revelaron que la secuencia ZmCKH muestra similitud con la histidina quinasa inducible por frío a partir de Catharanthus roseus. Se usó un ADNc parcial de ZmCKM para explorar su expresión específica del tipo celular en mazorcas inmaduras de B73. De manera similar a ZmCKI2, se encontró que la expresión de este gen en la mazorca estaba confinada a la vasculatura. Los resultados de las comparaciones apareadas de las secuencias de aminoácidos de las secuencias de aminoácidos ZmHK2, ZmHK3 y ZmCREI con cada una de las secuencias de aminoácidos de AtCRE I , AtAHK2 y AtAHK3 se muestran en la Tabla 1 . Los resultados de las comparaciones apareadas de secuencias de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos ZmCKI2 con cada una de las secuencias de aminoácidos AtCKI2 y OsCKI2 se proveen en la Tabla 2.

Para determinar las identidades de secuencia porcentuales presentadas en las Tablas 1 y 2, se alinearon las secuencias de aminoácidos con GAP en combinaciones apareadas usando la matriz de calificación BLOSUM62. Además, en la Figura 1 se provee una alineación múltiple de secuencias de aminoácidos de las secuencias de aminoácidos ZmHK2, ZmHK3, ZmCKI2 y ZmCREI con otras histidina quinasas de receptores de tipo híbrido. Las identidades de secuencia de las Tablas 1 y 2 y el nivel relativamente alto de conservación de las secuencias de aminoácidos dentro de las cinco cajas de histidina quinasa (H , N, G1 , F, G2; véase las Figuras 1 y 3) proveen un sustento adicional para identificar las secuencias de la presente invención como histidina quinasas funcionales. Tabla 1. Identidades de secuencia de aminoácidos porcentuales entre las histidina u i nasa s de rece to re s Tabla 2. Identidades de secuencia de aminoácidos porcentuales entre las histidina uinasas de receptore s Aún más, ambas proteínas ZmHK2 y ZmHK3 de la presente invención contienen al dominio conservado CHASE de unión a citoquinina que se muestra en la Figura 1 , sustentando aún más su rol en la actividad sensora de citoquinina. Yonekura-Sakakibara et al. ((2004) Plant Physiol. 1 34: 1654-1661 ) demostraron que proteínas ZmHK2 y ZmHK3 similares están relacionadas con la actividad sensora de citoquinina. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de las proteínas ZmHK2 (AB102956) y ZmHK3 (AB102957) utilizadas por Yonekura-Sakakibara et al. son similares, pero no idénticas, a las respectivas secuencias ZmHK2 (SEQ ID N°: 4-6) y ZmHK3 (SEQ I D N°: 30-32) de la presente invención. Ejemplo 3 MÉTODOS DE USO DE LOS POLINUCLEÓTIDOS DE LA INVENCIÓN Los polinucleótidos de la invención se pueden usar para alterar el fenotipo de plantas. Por ejemplo, la histidina quinasa con actividad sensora de citoquinina de la presente invención, cuando se expresa bajo la dirección de un promotor con preferencia por tejidos en maíz transgénico, permitirá una mayor actividad sensora de los niveles disponibles de citoquinina, lo cual conducirá a respuestas mejoradas a citoquinina en determinados tejidos. La combinación de la actividad sensora de citoquinina con un gen de la biosíntesis de citoquinina (tal como ¡sopentenil transferasa) en la expresión con preferencia por tejidos en maíz transgénico permitirá mejorar las respuestas a la mayor cantidad de citoquinina producida. Un incremento en la actividad sensora de citoquinina disponible también se podría combinar con una menor expresión de una enzima degradadora de citoquinina, tal como una citoquinina oxidasa, en determinados tejidos. Si se subsensibíliza la actividad sensora de citoquinina, se pueden reducir las respuestas de citoquinina; esto podría ser de utilidad, por ejemplo, en raíces, ya que las citoquininas normalmente inhiben el crecimiento radicular. Además, al introducir en una planta un polinucleótido de la invención que comprende una secuencia de codificación de histidina quinasa funcional, se puede sobreexpresar la histidina quinasa en la planta, induciendo así una típica respuesta de la planta a estímulos ambientales u hormonales en ausencia de dichos estímulos. Por ejemplo, la sobreexpresión de CKI 1 o CKI2 en Arabidopsis induce respuestas típicas de citoquinina, tales como formación de brotes a partir de callos, proliferación celular y semejantes, en ausencia de citoquinina en el medio (Kakimoto (1996) Science 274: 982-985). Por ejemplo, se puede seleccionar tejido reproductor femenino y/o el aparato de fotosíntesis, para la sobreexpresión de una histidina quinasa. En el primer caso, la mayor percepción de citoquinina podría conducir a un mayor crecimiento de las mazorcas, y en el segundo podría conducir a una reducción o retardo de la senescencia. Aún más, los polinucleótidos de la invención, que comprenden secuencias de codificación de histidina quinasas ya sea de longitud completa o de longitud parcial, se pueden usar para subsensibilizar la expresión de histidina quinasas en una planta a través del uso de construcciones antisentido y/o de ARNi. Al subsensibilizar las histidina quinasas de esta manera, se puede inhibir la respuesta normal de una planta a un estímulo ambiental u hormonal. Por ejemplo, la subsensibilización de ZmCKI2 en raíces mediante el uso de un promotor con preferencia por raíces puede alterar las respuestas normales de citoquinina en raíces y por consiguiente dar lugar a un mayor crecimiento radicular. Además, los polinucleótidos de la invención se pueden emplear en métodos para identificar otros componentes de las cascadas de transducción de señales. En los ensayos de dos híbridos de levadura, el uso de dominios proteicos específicos codificados por los polinucleótidos de la invención permitirá identificar a las proteínas que ¡nteractúan in vivo con las histidina quinasas de la invención. Dichas proteínas que intervienen en la interacción pueden ser cruciales para modificar determinadas características complejas. Además, estos dominios se pueden usar como el punto inicial para construir mapas de interacción de proteínas en las correspondientes vías de transducción de señales. Dicha información ayudará en la identificación de una proteína o de un gen en una vía que debería ser el blanco para regular una característica de interés en una planta.

EJEMPLO 4 Ensayos de dos híbridos en levadura Los ensayos de dos híbridos de levadura descritos en el Ejemplo 1 se llevaron a cabo de la siguiente manera. Se aisló ARNm poliadenilado de tejido aéreo de Arabidopsis usando el conjunto de elementos para ARNm FastTrack™ (Invitrogen, Carlsbad , CA, EE.UU .). Se creó una primera cadena de ADNc usando una conjunto de elementos para síntesis de ADNc (Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.), a continuación se clonó en el pGADT7 (Clontech, Palo Alto, CA, EE.UU.) y luego se transformó la biblioteca de ADNc en la cepa de levadura AH 109 (Clontech). Los fragmentos de AtCKI2 fueron amplificados por PCR, insertando los sitios Sfil y BamHI en los extremos 3' y 5', respectivamente, se clonaron en un derivado del pGBKT7 (Clontech), pRSASKI ll , y se secuenciaron. Se transformaron derivados del pRSASKI l l , que contienen AT-CKI2(5-367), pRM242; AT-CKI2(357-922), pRM291 ; AT-CKI2(5-205), pRM362; AT-CKI2(200-367), pRM363; AT-CKI2(357-61 5), pRM431 ; AT-CKI2(590-922), pRM430, en Y187UH, un derivado de Y187 (Clontech) con el gen informante GAL4: :HIS insertado en el locus ura y luego se evaluó la autoactivación del informante HIS. Se apareó Y187UH, que contiene los derivados del pRSASKI ll , con AH 109, que contiene la biblioteca de ADNc, y se dejó que creciera sobre un medio sintético que no contenía leucina, uracilo, histidina y adenina. Se aisló el ADN del plásmido de los transformantes viables usando el conjunto de elementos para plásmidos en levadura EZ (GenoTechnology, St. Louis, MO, EE. UU .) y el inserto pGADT7 se amplificó por PCR usando cebadores específicos del vector que flanqueaban al sitio de clonación. Los fragmentos de la PCR fueron secuenciados y los vectores que contienen genes únicos fueron transformados en Y187UH, con el respectivo derivado pRSASKI l l, para confirmar la auxotrofia de la histidina y la actividad ?- galactosidasa. Se insertaron secuencias de codificación de AT-AHP en los sitios Sfil/BamHI del pGADT7 como pRM751 (AHP1 ), pRM660 (AHP2), pRM661 (AHP3), pRM736 (AHP5). EJEMPLO 5 Transformación y regeneración de las plantas transgenicas de maíz Se bombardearon embriones inmaduros de ma íz provenientes de plantas donantes de invernadero con un plásmido que contiene un polinucleótido de histidina quinasa de maíz de la invención ligado operativamente a un promotor de ubiquitina y el gen marcador seleccionable PAT (Wohlleben et al. (1988) Gene 70:25-37), que confiere resistencia al herbicida Bialaphos. Si se deseara, se pueden usar los promotores de maíz, zag2.1 (NCBI GenBank N° Acceso X80206) o ckxl (Publicación de Patente de EE. UU . N°: 2002/01 52500) en lugar del promotor de ubiquitina. Como alternativa, el gen marcador de selección se provee en un plásmido separado. La transformación se efectúa de la siguiente manera. Los contenidos de los medios se describen más adelante. Preparación del tejido blanco Las espigas son despinochadas y se esterilizaron las superficies con blanqueador Clorox 30% además de detergente Micro 0,5% durante 20 minutos y se lavaron dos veces con agua estéril . Se recortaron los embriones inmaduros y se colocaron con el eje embrionario hacia abajo (el escutelo hacia arriba), a razón de 25 embriones por placa, sobre medio 560Y durante 4 horas y luego se alinearon dentro de la zona blanco de 2,5 cm como preparación para el bombardeo. Preparación del ADN Se obtiene un vector plásmido que comprende un polinucleótido de histidina quinasa de ma íz de la invención ligado operativamente a un promotor de ubiquitina. Este ADN plásmido y el ADN plásmido que contenía el marcador seleccionare PAT se hicieron precipitar sobre partículas de tungsteno de 1 ,1 µ?? (diámetro promedio) utilizando el siguiente procedimiento de precipitación por CaCI2: 100 µ? de partículas de tungsteno preparadas en agua 10 µ? (1 pg) de ADN en solución amortiguadora Tris EDTA (1 pg de ADN total) 100 µ? de CaC12 2,5 M 10 µ? de espermidina 0, 1 M Cada reactivo se agregó sucesivamente a la suspensión de partículas de tungsteno, manteniendo el vortexeo sobre un agitador para múltiples tubos. La mezcla final se sonícó brevemente y se dejó en incubación bajo agitación constante durante 10 minutos. Después del período de precipitación, los tubos se centrifugaron brevemente, se retiró el líquido y el pelet se lavó con 500 mi de etanol 100% y se centrifugó durante 30 segundos. Nuevamente se retiró el líquido y se agregaron 105 µ? de etanol 100% al pelet final de partículas de tungsteno. Para el bombardeo con la pistola de partículas, las partículas de tungsteno/ADN se sonicaron brevemente y se sembraron 10 µ? en forma de manchas sobre el centro de cada macrotransportador y se dejó secar durante aproximadamente 2 minutos antes del bombardeo. Tratamiento con la pistola de partículas Las placas de muestras se bombardearon en el nivel N° 4 de la pistola de partículas N° HE34-1 o N° HE34-2. Todas las muestras recibieron un solo disparo a 650 psí, con un total de diez alícuotas tomadas de cada tubo de partículas/ADN preparado.

Tratamiento subsiguiente Después del bombardeo, los embriones se mantuvieron sobre medio 560Y durante 2 días, luego se transfirieron a medio de selección 560R que contenía Bialaphos 3 mg/litro y se subcultívaron cada 2 semanas. Después de aproximadamente 10 semanas de selección, los clones de los callos resistentes a la selección fueron transferidos a medio 288J para iniciar la regeneración de la planta. Después de la maduración de los embriones somáticos (2-4 semanas), dichos embriones somáticos bien desarrollados se transfirieron a un medio para su germinación y luego se llevaron a la habitación de cultivo con luz. Aproximadamente 7-10 días después, se transfirieron las plántulas en desarrollo al medio 272V libre de hormonas en tubos durante 7-10 días hasta que las plántulas estaban bien establecidas. Las plantas se transfirieron luego a insertos en cajas (equivalentes a macetas de 2,5") que contenían tierra para macetas y se cultivaron durante 1 semana en cámara de crecimiento, después de cultivaron otras 1 -2 semanas en invernadero, luego se transfirieron a las macetas clásicas 600 (1 ,6 galones) y se cultivaron hasta la madurez. Las plantas fueron monitoreadas y calificadas según los incrementos o las disminuciones en la actividad histidina quinasa y/o de los niveles de la proteína histidina quinasa. Bombardeo y medio de cultivo El medio de bombardeo (560Y) comprende sales básales N6 4,0 g/l (SIGMA C-1416), mezcla de vitaminas de Eriksson 1 ,0 ml/l (1000X SIGMA-151 1 ), tiamina HCI 0,5 mg/l, sacarosa 120,0 g/l, 2,4-D 1 ,0 mg/l y L-prolina 2,88 g/l (llevado a volumen con H20 D-l después de ajustar el pH en 5,8 con KOH); Gelhte 2,0 g/l (agregado después de llevar a volumen con H20 D-l ); y nitrato de plata 8,5 mg/l (agregado después de esterilizar el medio y enfriar a temperatura ambiente). El medio de selección (560R) comprende sales básales N6 4,0 g/l (SIGMA C- 1416), mezcla de vitaminas de Eriksson 1 ,0 ml/l ( 1000X SIGMA-1 51 1 ), tiamina HCI 0,5 mg/l, sacarosa 30,0 g/l y 2,4-D 2,0 mg/l (llevado a volumen con H20 D-l después de ajustar el pH en 5,8 con KOH); Geirite 3,0 g/l (agregado después de llevar a volumen con D-l H20); y nitrato de plata 0,85 mg/l y Bialaphos 3,0 mg/l (ambos se agregaron después de esterilizar el medio y enfriar hasta temperatura ambiente). El medio de regeneración (288J) comprende sales MS 4,3 g/l (GIBCO 1 1 1 1 7-074), solución madre de vitaminas MS 5,0 ml/l (0, 100 g de ácido nicotínico, tiamina HCI 0,02 g/l, piridoxina HCI 0, 1 0 g/l y glicina 0,40 g/l llevado a volumen con H20 D-l pulida) (Murashige y Skoog (1962) Physiol. Plant. 1 5: 473), mio-inositol 100 mg/l, zeatina 0,5 mg/l, sacarosa 60 g/l y ácido abscísico 1 ,0 ml/l de 0,1 mM (llevado a volumen con H 0 D-l pulida después de ajustar el pH en 5,6); 3,0 g/l Geirite (se agregó después de llevar a volumen con H20 D-l ); y ácido indolacético 1 ,0 mg/l y Bialaphos 3,0 mg/l (se agregó después de esterilizar el medio y enfriar a 60 °C). El medio libre de hormonas (272V) comprende sales MS 4,3 g/l (GIBCO 1 1 1 1 7-074), solución madre de vitaminas MS 5,0 ml/l (ácido nicotínico 0, 100 g/l, tiamina HCI 0,02 g/l, piridoxina HCI 0, 10 g/l y glicina 0,40 g/l llevado a volumen con H20 D-l pulida), mio-inositol 0, 1 g/l y sacarosa 40,0 g/l (llevado a volumen con H2O D-l pulida después de ajustar el pH en 5,6); y Bactoagar 6 g/l (se agregó después de llevar a volumen con H20 D-l pulida), esterilizado y enfriado a 60 °C. Bombardeo y medio de cultivo El medio de bombardeo (560Y) comprende sales básales N6 4,0 g/l (SIGMA C-1416), mezcla de vitaminas de Eriksson 1 ,0 ml/l ( 1 000X SIGMA-1 51 ), tiamina HCI 0,5 mg/l, sacarosa 120,0 g/l, 2,4-D 1 ,0 mg/l y L-prolina 2,88 g/l (llevado a volumen con H20 D-l después de ajustar el pH en 5,8 con KOH); Geirite 2,0 g/l (agregado después de llevar a volumen con H20 D-l ); y nitrato de plata 8,5 mg/l (agregado después de esterilizar el medio y enfriar a temperatura ambiente). El medio de selección (560R) comprende sales básales N6 4,0 g/l (SIGMA C-1416), mezcla de vitaminas de Eriksson 1 ,0 ml/l ( 1000X SIGMA- 51 1 ), tiamina HCI 0,5 mg/l, sacarosa 30,0 g/l y 2,4-D 2,0 mg/l (llevado a volumen con H20 D-l después de ajustar el pH en 5,8 con KOH); Geirite 3,0 g/l (agregado después de llevar a volumen con D-l H20); y nitrato de plata 0,85 mg/l y Bialaphos 3,0 mg/l (ambos se agregaron después de esterilizar el medio y enfriar hasta temperatura ambiente). El medio de regeneración (288J) comprende sales MS 4,3 g/l (GIBCO 1 1 1 1 7-074), solución madre de vitaminas MS 5,0 ml/l (0, 100 g de ácido nicotínico, tiamina HCI 0,02 g/l, piridoxina HCI 0, 10 g/l y glicina 0,40 g/l llevado a volumen con H20 D-l pulida) (Murashige y Skoog (1962) Physiol. Plant. 5: 473), mio-inositol 100 mg/l, zeatina 0,5 mg/l, sacarosa 60 g/l y ácido abscísico 1 ,0 ml/l de 0,1 mM (llevado a volumen con H20 D-l pulida después de ajustar el pH en 5,6); 3,0 g/l Geirite (se agregó después de llevar a volumen con H20 D-l ); y ácido indolacético 1 ,0 mg/l y Bialaphos 3,0 mg/l (se agregó después de esterilizar el medio y enfriar a 60 °C). El medio libre de hormonas (272V) comprende sales MS 4,3 g/l (GIBCO 1 1 1 1 7-074), solución madre de vitaminas MS 5,0 ml/l (ácido nicotínico 0, 100 g/l, tiamina HCI 0,02 g/l, piridoxina HCI 0, 0 g/l y glicina 0,40 g/l llevado a volumen con H20 D-l pulida), mio-inositol 0, 1 g/l y sacarosa 40,0 g/l (llevado a volumen con H2O D-l pulida después de ajustar el pH en 5,6); y Bactoagar 6 g/l (se agregó después de llevar a volumen con H20 D-l pulida), esterilizado y enfriado a 60 °C.

EJEMPLO 6 Producción de plantas de maíz transformadas mediante una transformación mediada por vía Agrobacterium Para la transformación mediada por Agrobacterium del maíz con un polinucleótido de histidina quinasa de maíz de la invención, se empleó preferentemente el método de Zhao (Patente de EE.UU. N°. 5.981 .840, y Publicación de Patente PCT WO 98/32326; cuyo contenido se incorpora en este documento a modo de referencia). Brevemente, se aislan embriones inmaduros de maíz y los embriones toman contacto con una suspensión de Agrobacterium, donde las bacterias tienen la capacidad de transferir el polinucleótido de histidina quinasa de maíz de la invención a por lo menos una célula de al menos uno de los embriones inmaduros (paso 1 : el paso de infección). Los embriones se cocultivan por un tiempo con Agrobacterium (paso 2: el paso de cocultivo). Después de este período de cocultivo se contempla un paso opcional de "reposo". En este paso de reposo, los embriones se incuban en presencia de al menos un antibiótico conocido por inhibir el crecimiento de Agrobacterium sin la adición de un agente selectivo para los transformantes vegetales (paso 3: paso de reposo). A continuación, los embriones inoculados se cultivan sobre medio que contiene un agente de selección y se recuperan los callos transformados en crecimiento (paso 4: el paso de selección). Los callos se regeneran luego en plantas (paso 5: el paso de selección). EJEMPLO 7 Transformación de embriones de soja y regeneración de plantas de soja transformadas Se bombardearon embriones de soja con un plásmido que contiene un polinucleótido de histidina quinasa de la invención ligado operativamente a un promotor constitutivo, tal como el promotor constitutivo de soja SCP1 (WO 97/47756, Patente de EE.UU. N°: 6.555.673), para evaluar la funcionalidad o a un promotor específico de semillas para una modificación transgénica de la actividad sensora de citoquinina de la siguiente manera. Como alternativa, se pueden usar los promotores de maíz, zag2.1 o ckx en lugar del promotor SCP1 . Con el fin de inducir la formación de embriones somáticos, se pueden cultivar cotiledones de 3-5 mm de longitud disecados de semillas inmaduras, de superficie esterilizada, del cultivar de soja A2872, con luz u oscuridad , a 26 °C sobre un medio de agar apropiado durante 6-10 semanas. Los embriones somáticos que producen embriones secundarios se recortan y colocan en un medio líquido adecuado. Después de una selección repetida de las agrupaciones de embriones somáticos que se multiplicaron como embriones en etapa globular temprana, las suspensiones se mantienen como se describe más adelante. Los cultivos en suspensión de soja embriogénica se pueden mantener en 35 mi de medio líquido sobre un agitador rotatorio, 1 50 rpm, a 26 °C con luz fluorescente, con un programa de 16:8 horas de día/noche. Los cultivos se subcultivan cada dos semanas por inoculación de aproximadamente 35 mg de tejido en 35 mi de medio líquido. Luego se pueden transformar los cultivos en suspensión de soja embriogénica por el método de bombardeo con pistola de partículas (Klein et al. (1987) Nature (Londres) 327:70-73, Patente de EE.UU . N°: 4.945.050). Se puede emplear el equipo DuPont Biolístic PDS 1000/HE (retroalimentación con helio) para estas transformaciones. Un gen marcador de selección que se puede utilizar para facilitar la transformación en soja es un transgen compuesto por el promotor 35S del virus en mosaico de la coliflor (Odell et al. (1985) Nature 31 3: 810-812), el gen de la higromicina fosfotransferasa del plásmido pJR225 (de E. coli; Gritz et al. (1983) Gene 25: 179-188) y la región 3' del gen de la nopalina sintetasa del ADN-T del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens. El cásete de expresión de interés, que comprende al polipéptido de histidina quinasa ligado operativamente al promotor de ubiquitina, se puede aislar como un fragmento de restricción. Este fragmento se puede insertar entonces en un único sitio de restricción en el vector que lleva el gen marcador. A 50 pl de una suspensión 60 mg/ml de partículas de oro de 1 pm se agrega (en el orden dado): 5 µ? de ADN (1 pg/µ?), 20 pl de espermidina (0, 1 M) y 50 µ? de CaC (2,5 M). La preparación de partículas se agita durante tres minutos, se pasa por una microcentrífuga durante 1 0 segundos y se retira el sobrenadante. Las partículas recubiertas con ADN se lavan luego una vez en 400 µ? de etanol 70% y se vuelven a suspender en 40 µ? de etanol anhidro. La suspensión de ADN/partículas se puede sonicar tres veces durante un segundo por vez. Luego se cargan cinco pl de las partículas de oro recubiertas con ADN sobre cada disco macrotransportador. Se colocan aproximadamente 300-400 mg de un cultivo en suspensión de dos semanas en una caja de Petri vacía de 60 x 1 5 mm y el liquido residual se retira del tejido con una pipeta. Para cada experimento de transformación, se bombardean aproximadamente 5-10 placas de tejido. La presión de ruptura de membrana se define en 1 1 00 psi y la cámara se evacúa hasta un vacío de 28 pulgadas de mercurio. El tejido se coloca aproximadamente a 3,5 pulgadas de distancia de la pantalla de retención y se bombardea tres veces. Después del bombardeo, el tejido se puede dividir por la mitad , colocarse nuevamente en el líquido y cultivarse como se describió anteriormente.

Cinco a siete días después del bombardeo, se puede cambiar el medio l íquido por medio fresco y once a doce días después del bombardeo por medio fresco que contiene higromicína 50 mg/ml . Este medio selectivo se puede cambiar semanalmente. Siete a ocho semanas después del bombardeo, se puede observar tejido transformado verde creciendo desde las agrupaciones embriogénicas necróticas, no transformadas. Se retira el tejido verde aislado y se lo inocula en frascos individuales con el fin de generar nuevos cultivos embriogénicos transformados en suspensión, propagados por clonación. Cada línea nueva se puede tratar como un suceso de transformación independiente. Estas suspensiones se pueden subcultivar y mantener como agrupaciones de embriones inmaduros o se pueden regenerar en plantas completas por maduración y germinación de los embriones somáticos individuales. EJEMPLO 8 Transformación de tejido meristemático de girasol y regeneración de plantas de girasol transgénicas Se transformaron tejidos meristemáticos de girasol con un cásete de expresión que contiene un polinucleótido de histidina quinasa de la invención ligado operativamente a un promotor de ubiquitina de la siguiente manera (véase también Patente de Europa N°: EP 0 486233, incorporada en este documento a modo de referencia, y Malone-Schoneberg et al. (1 994) Plant Science 103: 199- 207). Se deshollaron semillas maduras de girasol (Helianthus annuus L.) usando un desgranador para una sola cabeza de trigo. Se esterilizaron las superficies de las semillas durante 30 minutos en una solución blanqueadora Clorox 20% con la adición de dos gotas de Tween 20 por cada 50 mi de solución. Las semillas se lavaron dos veces con agua destilada estéril.

Se prepararon explantes de ejes embrionarios partidos utilizando una modificación de los procedimientos descritos por Schrammeijer et al. (Schrammeijer et a/.( 990) Plant Cell Rep. 9:55-60). Las semillas se embebieron en agua destilada durante 60 minutos después del procedimiento de esterilización de la superficie. Después se parten los cotiledones de cada semilla, produciendo una fractura limpia en el plano del eje embrionario. Después de recortar la punta de la raíz, se disecaron los explantes longitudinalmente entre las hojas primordiales. Las dos mitades se colocan, con la superficie cortada hacia arriba, sobre medio GBA que consiste de sales minerales de Murashige y Skoog (Murashige et al. (1962) Physiol. Plant. , 1 5: 473-497), suplemento vitamínico de Shepard (Shepard (1980) en Emergent Techniques for the Genetic Improvement of Crops (University of Minnesota Press, St. Paul, Minnesota), sulfato de adenina 40 mg/l, sacarosa 30 g/l, 6-bencil-aminopurina (BAP) 0,5 mg/l, ácido indol-3-acético (IAA) 0,25 mg/l, ácido giberélico (GA3) 0, 1 mg/, pH 5,6, y Phytagar 8 g/l. Los explantes fueron sometidos a bombardeo con microproyectiles antes del tratamiento con Agrobacterium (Bidney eí al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:301 -31 3). Se colocan treinta a cuarenta explantes en un círculo en el centro de una placa de 60 X 20 mm para este tratamiento. Se resuspenden aproximadamente 4,7 mg de microproyectiles de tungsteno de 1 ,8 mm en 25 mi de solución amortiguadora TE estéril (Tris HCI 1 0 mM , EDTA 1 mM, pH 8,0) y luego se usaron alícuotas de 1 ,5 mi por bombardeo. Cada placa es bombardeada dos veces a través de una malla de Nytex de 1 50 mm ubicada 2 cm por encima de las muestras en un dispositivo de aceleración de partículas PDS 1000®. Se usa la cepa EHA105 desarmada de Agrobacterium tumefaciens en todos los experimentos de transformación. Se prepara un vector plasmídico binario que comprende al cásete de expresión que contiene al polinucleótido de histidina quinasa ligado operativamente a un promotor constitutivo, tal como el promotor constitutivo de soja SCP1 para evaluar la funcionalidad o a un promotor específico de semillas para una modificación transgénica de la actividad sensora de citoquinina. Como alternativa, se pueden usar los promotores de maíz, zag2.1 o ckxl en lugar del promotor SCP1 . El vector plasmidico binario se introduce en la cepa EHA105 de Agrobacterium mediante congelamiento-descongelamiento como describieron Holsters et al. (1978) Mol. Gen. Genet. 163: 181 -187. Este plásmido comprende además un gen marcador seleccionable de kanamicina (es decir, nptll). Las bacterias para los experimentos de transformación vegetal se cultivan durante la noche (28 °C y agitación continua a 100 RPM) en medio líquido YEP (extracto de levadura 10 gm/l, Bactopeptona 10 gm/l y NaCI 5 gm/l, pH 7,0) con los antibióticos apropiados necesarios para mantener la cepa bacteriana y el plásmido binario. La suspensión se usa cuando alcanza una DO600 entre 0,4 y 0,8 aproximadamente. Las células de Agrobacterium se agrupan en pelets y se resuspenden a una DO600 final de 0,5 en un medio de inoculación compuesto por MES 12,5 mM pH 5,7; NH4CI 1 gm/l y MgS04 0,3 gm/l . Los explantes recién bombardeados se colocan en una suspensión de Agrobacterium, se mezcla todo y se deja en reposo durante 30 minutos. Los explantes son transferidos luego a medio GBA y se co-cultivan, con la superficie cortada hacia abajo, a 26 °C y 18 horas de luz. Después de tres días de co-cultivo, los explantes son transferidos a medio 374B (medio GBA que no contiene reguladores del crecimiento y un nivel reducido de sacarosa del 1 %) suplementado con cefotaxime 250 mg/l y sulfato de kanamicina 50 mg/l. Los explantes se cultivan durante dos a cinco semanas sobre medio de selección y luego son transferidos a medio 374B fresco que no contiene kanamicina durante una a dos semanas de desarrollo continuo. Los explantes con áreas de crecimiento en diferenciación, resistentes a antibióticos que no han producido brotes adecuados para su escisión son transferidos a medio GBA que contiene cefotaxime 250 mg/l para un segundo tratamiento de 3 días con fitohormonas. Se evalúan muestras de hoja de brotes verdes, resistentes a kanamicina, por la presencia de NPTI I mediante un ELISA y por la presencia de la expresión del transgen evaluando la actividad histidina quinasa como se describe en otra parte en la presente. Los brotes positivos para NPTI I son injertados en patrones de plántulas de girasol cultivadas in vitro del híbrido 6440 de Pioneer®. Se hacen germinar semillas de superficie esterilizada en medio 48-0 (sales de Murashige y Skoog de fuerza intermedia, sacarosa 0,5%, Gelrite 0,3%, pH 5,6) y se cultivan bajo las condiciones descritas para el cultivo de explantes. Se retira la porción superior de la plántula, se efectúa un corte vertical de 1 cm en el hipocótilo y el brote transformado se inserta en el corte. Todo el área se envuelve con papel parafinado para asegurar el brote. Las plantas injertadas se pueden transferir a tierra después de una semana de cultivo in vitro. Los injertos en tiene se mantienen bajo condiciones de gran humedad seguido de una adaptación lenta al ambiente del invernadero. Los sectores transformados de las plantas Trj (generación parenteral) que están madurando en el invernadero son identificados mediante NPTI I ELISA y/o mediante un análisis de la actividad histidina quinasa en extractos de hoja, en tanto las semillas transgénicas cosechadas de plantas Trj positivas para NPTI I se identifican mediante un análisis de actividad histidina quinasa de pequeñas porciones de cotiledón de semilla seco.

EJEMPLO 9 Expresión transitoria de histidina quinasa El plásmido que comprende un polinucleótido de histidina quinasa de la invención ligado operativamente a un promotor vegetal es precipitado sobre partículas de oro con polietilímína (PEI; Sigma N° P3143), en tanto el cásete de expresión transgénico (UBI::moPAT~GFPm::pinll) que se desea integrar es precipitado sobre partículas de oro usando el método estándar de Ca++. Brevemente, el recubrimiento de las partículas de oro con PEI se efectúa de la siguiente manera. Primero se lavan las partículas de oro. Se pesan e introducen en un tubo para microcentrífuga treinta y cinco mg de partículas de oro, por ejemplo con un diámetro promedio de 1 ,0 micrón (A.S.I. N° 162-0010) y luego se agregan 1 ,2 mi de EtOH absoluto y se vortexea durante un minuto. El tubo se deja a un lado durante 15 minutos a temperatura ambiente y luego se centrifuga a gran velocidad usando una microcentrífuga durante 15 minutos a 4 °C. Se descarta el sobrenadante y se agrega una alícuota de 1 ,2 mi de EtOH fresco, se vortexea durante un minuto, se centrifuga durante un minuto y nuevamente se descarta el sobrenadante (esto se repite dos veces). Se agrega una alícuota de 1 ,2 mi de EtOH fresco y esta suspensión (partículas de oro en EtOH) se puede guardar a -20 °C por semanas. Para recubrir las partículas con polietilímína (PEI; Sigma N° P3143), se comienza con 250 µ\ de partículas de oro lavadas/EtOH, se centrifuga y se descarta el EtOH. Se lava una vez en 100 µ\ de H2Odd para eliminar el etanol residual. Se agregan 250 µ\ de PEI 0,25 mM, se sónica por pulsos para suspender las partículas y luego se sumerge el tubo en un baño de hielo seco/EtOH para congelar instantáneamente la suspensión. Se liofiliza durante la noche. En este punto, las partículas recubiertas, secas, se pueden guardar a -80 °C durante al menos 3 semanas. Antes de su uso, las partículas se lavan 3 veces con alícuotas de 250 µ? de solución amortiguadora HEPES 2,5 mM, ph 7, 1 , con sonicación por pulsos 1 x y luego un vortexeo rápido antes de cada centrifugación. Se suspende en un volumen final de 250 µ? de solución amortiguadora HEPES. Se introducen alícuotas de 25 µ? en tubos nuevos antes de unir el ADN. Para unir el ADN no recubierto, las partículas se sonican por pulsos, luego se agrega el ADN y se mezcla todo subiendo y bajando la pipeta varias veces. Se deja asentar durante al menos 2 minutos, se centrífuga brevemente (por ejemplo durante 10 segundos), se elimina el sobrenadante y se agregan 60 µ? de EtOH. Se colocan pequeñas cantidades sobre macrotransportadores y se bombardea según el protocolo estándar. Para la precipitación de Ca++ y el bombardeo se emplea el protocolo estándar para PDS-1000. Las dos preparaciones de partículas se mezclan y la mezcla es bombardeada en las células vegetales (algunas células solamente reciben una partícula con el polinucleótido de histídina quínasa, en tanto algunas células solamente reciben una partícula de PAT-GFP y otras células reciben ambas). La precipitación mediada por PEI da como resultado una frecuencia alta de células de expresión transitoria y frecuencias extremadamente bajas de recuperación de transformantes estables (con relación al método de Ca++). Por consiguiente, el cásete que contiene al polinucleótido de histídina quínasa precipitado con PEI expresa de forma transitoria y estimula una ráfaga de actividad del polinucleótido de histídina quínasa, pero este plásmído no se integra. El plásmido PAT-GFP liberado de Ca+7partículas de oro se integra y expresa el marcador seleccionare a una frecuencia que da como resultado una recuperación sustancialmente mejorada de eventos transgénicos. EJEMPLO 10 Expresión transitoria de un polinucleótido y un polipéptido de histidina quinasa La expresión transitoria del producto de polinucleótido de histidina quinasa se puede obtener por distribución de ARN poliadenilado protegido por el extremo 5' de histidina quinasa, casetes de expresión que contienen ADN de histidina quinasa o una proteína histidina quinasa. Todas estas moléculas se pueden distribuir usando una pistola de partículas biolística. Por ejemplo, el ARN poliadenilado protegido por el extremo 5' de histidina quinasa se puede obtener fácilmente ¡n vitro usando el conjunto de elementos mMessage mMachine® de Armbion (Austin, TX, EE.UU.). El ARN es co-distribuido, utilizando el procedimiento descrito precedentemente, junto con ADN que comprende un gen o un fragmento de gen de interés agronómico y un marcador para la selección/rastreo, tal como Ubi::moPAT~GFPm: :pinl l . Las células que reciben el ARN pueden ser validadas como colonias clónales transgénicas porque también expresarán la proteína de fusión PAT-GFP (y por consiguiente mostrarán fluorescencia verde bajo una iluminación apropiada). Las plantas regeneradas a partir de estos embriones pueden ser examinadas luego por la presencia del gen de interés agronómico.

EJEMPLO 1 1 Variantes de histidina quinasa Variantes de secuencias de nucleótidos de las SEQ ID N°: 1 , 3, 4, 6, 7, 9, 1 3, 1 5, 16, 18, 26, 28, 30 y 32 que no alteran la secuencia de aminoácidos codificada Las secuencias de histidina quinasa que se muestran en las SEQ ID N°: 1 , 3, 4, 6, 7, 9, 13, 15, 16, 18, 26, 28, 30 y 32 se usan para generar variantes de secuencias de nucleótidos que poseen una secuencia de nucleótidos para el marco de lectura abierto con un 70%, 76%, 81 %, 86%, 92% y 97% aproximadamente de identidad de secuencia de nucleótidos cuando se comparan con las secuencias de nucleótidos de los ORF iniciales no alterados de las SEQ ID N°: 1 , 3, 4, 6, 7, 9, 13, 1 5, 16, 18, 26, 28, 30 y 32, respectivamente. Estas variants funcionales se generan usando una tabla de codones estándar. En tanto la secuencia de nucleótidos de las variantes está alterada, la secuencia de aminoácidos codificada por el marco de lectura abierto no cambia. B. Variantes de secuencias de aminoácidos de las SEQ ID N°: 2, 8, 14, 1 7, 23 y 27 Se generan variantes de las secuencias de aminoácidos de histidina quinasas. En este ejemplo, se altera un aminoácido. Específicamente, se revisan los marcos de lectura abiertos que se muestran en las SEQ I D N°: 2, 8, 14, 17, 23 ó 27 para determinar la alteración de aminoácidos apropiada. La selección del aminoácido a cambiar se efectúa consultando la alineación de la proteína (con los otros ortólogos y otros miembros de la familia de genes de diversas especies). Véase la Figura 1 . Se selecciona un aminoácido que no se considera bajo una gran presión de selección (no está altamente conservado) y que se puede sustituir con relativa facilidad por un aminoácido de características químicas similares (es decir, cadenas laterales funcionales similares). El uso de la alineación de proteínas que se muestra en la Figura 1 se puede cambiar el aminoácido apropiado. Así, las variantes que poseen un 70%, 75%, 81 %, 86%, 92% y 97% aproximadamente de identidad de secuencia de ácidos nucleicos con las SEQ ID N°: 2, 8, 14, 17, 23 ó 27 son generadas usando este método. C. Variantes adicionales de las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de las SEQ ID N°: 2, 8, 14, 17, 23 y 27 En este ejemplo, se crean secuencias proteicas artificiales que presentan un 82%, 87%, 92% y 97% de identidad con relación a la secuencia proteica de referencia. Este último esfuerzo requiere de la identificación de regiones conservadas y variables de la alineación que se muestra en la Figura 1 y luego la aplicación prudente de una tabla de sustituciones de aminoácidos. Estas partes se describirán con mayor detalle más adelante. Mayormente, la determinación de cuáles de las secuencias de aminoácidos están alteradas se realiza sobre la base de las regiones conservadas entre las proteínas histidína quinasas o entre las demás proteínas histidina quinasa. Véase la Figura 1 . Basado en la alineación de secuencia, las distintas regiones de la histidina quinasa con probabilidad de ser alteradas están representadas con letras minúsculas, en tanto las regiones conservadas están representadas con letras mayúsculas. Se considera que se pueden efectuar sustituciones conservadoras en las regiones conservadas abajo sin alterar la función. Además, el especialista comprenderá que las variantes funcionales de la secuencia de histidina quinasa de la invención pueden contener alteraciones menores de aminoácidos no conservados en el dominio conservado. Las regiones conservadas de las histidina quinasas de receptores de tipo híbrido son evidentes en la Figura 1 y se describen en la descripción breve precedente de la Figura 1 .

Después se crean secuencias proteicas artificiales que son diferentes de la original en los intervalos de 80-85%, 85-90%, 90-95%, y 95-100% de identidad. Se buscan los puntos medios de estos intervalos, con una desviación de más o menos un 1 %, por ejemplo. Las sustituciones de aminoácidos serán efectuadas por el script comercial Perl. A continuación se provee la tabla de sustituciones en la Tabla 3. Tabla 3. Tabla de sustituciones Primero, se identifica todo aminoácido conservado en la proteína que no debe cambiarse y se "marca" para aislarlo de la sustitución. La metionina inicial se agregará por supuesto a esta lista de forma automática. A continuación se efectúan los cambios. H, C y P no se cambian bajo ninguna circunstancia. Los cambios tendrán lugar con isoleucina primero, pasando de N-terminal a C-terminal. Después la leucina, y así sucesivamente avanzando por la lista hasta obtener el blanco deseado. Se pueden efectuar sustituciones interinas como para no causar una inversión de los cambios. La lista está ordenada de 1 -1 7, de modo que se puede comenzar por tantos cambios de isoleucina como sea necesario antes de la leucina y así sucesivamente hasta llegar a la metionina. Resulta claro que de esta manera no será necesario cambiar muchos aminoácidos. L, I y V comprenderán una sustitución de 50: 50 de las dos sustituciones óptimas alternativas. Las variantes de las secuencias de aminoácidos se obtienen por escrito. Se emplea Perl script para calcular las identidades porcentuales. El uso de este procedimiento permite generar variantes de histidina quinasas que poseen un 82%, 87%, 92% y 97% aproximadamente de identidad de aminoácidos con respecto a las secuencias de aminoácidos inalteradas iniciales de las SEQ ID N°: 2, 8, 14, 17, 23 ó 27. El artículo "un" y "una", tal como se usa en la presente, hace referencia a uno o más de uno (es decir, por lo menos uno) de los objetos gramaticales que constituyen el objeto del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa uno o más elementos. Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas del nivel de los especialistas en la técnica a los cuales está dirigida esta invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan en este documento a modo de referencia como si cada publicación o solicitud de patente individual se incorporara específicamente e individualmente en este documento a modo de referencia. Aunque la invención precedente se ha descrito con cierto detalle a modo ilustrativo y de ejemplo a efectos de ofrecer una mayor claridad para su comprensión, resulta evidente que es posible efectuar determinados cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. 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Claims

REIVINDICACIONES: 1 . Un polinucleótido aislado, CARACTERIZADO PORQUE comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo formado por: (a) una secuencia de nucleótidos que comprende las SEO ID N°: 1 , 3, 4, 6, 7, 9, 13, 15, 16, 18, 26, 28, 30 0 32; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende las SEQ ID N°: 2, 5, 8, 14, 17, 27 ó 31 ; (c) una secuencia de nucleótidos que es un 90% idéntica a las SEQ ID N°:

1 . 3, 7, 9, 13, 15, 16, 18, 26 ó 28; (d) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende al menos 50 aminoácidos consecutivos de las SEQ ID N°: 2, 8, 14, 17 ó 27, donde dicho polipéptido retiene la actividad histidina quinasa; y (e) una secuencia de nucleótidos que se hibridiza bajo condiciones severas con el complemento de las SEQ ID N°: 1 , 3, 7, 9, 13, 15, 16, 18, 26 ó 28, donde dichas condiciones severas comprenden hibridación en formamida 50%, NaCI 1 M, SDS 1 % a 37 °C y al menos un lavado en SSC 0,1 X a una temperatura entre 60 °C y 65 °C.

2. Un método para modular la respuesta a citoquinina de una planta, CARACTERIZADO PORQUE comprende transformar dicha planta con un cásete de expresión recombinante que comprende un polinucleótido de la cláusula 1 ligado operativamente a un promotor que dirige la expresión en una planta.

3. El método de la cláusula 2, CARACTERIZADO PORQUE dicho promotor es un promotor constitutivo.

4. El método de la cláusula 2, CARACTERIZADO PORQUE el promotor es un promotor con preferencia por tejidos.

5. El método de la cláusula 4, CARACTERIZADO PORQUE el promotor dirige la expresión en tejido reproductor femenino.

6. El método de la cláusula 2, CARACTERIZADO PORQUE el promotor es un promotor inducible por citoquinina. 7. El método de la cláusula 2, CARACTERIZADO PORQUE dicha modulación da como resultado una mayor sensibilidad a citoquinina. 8. El método de la cláusula 2, CARACTERIZADO PORQUE dicha planta es una monocotiledónea. 9. Un polipéptido aislado, CARACTERIZADO PORQUE comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por: (a) una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID N°: 2, 5, 8, 14, 17, 23, 27 ó 31 ; (b) una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID N°: 2, 8, 14, 17, 23 ó 27, donde dicho polipéptido retiene la actividad histidina quinasa; (c) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibridiza bajo condiciones severas con el complemento de 1 , 3,

7. 9, 13, 1 5, 16, 18, 26 ó 28, donde dichas condiciones severas comprenden hibridación en formamida 50%, NaCI 1 M, SDS 1 % a 37 °C, y al menos un lavado en SSC 0,1 X a una temperatura entre 60 °C y 65°C; y, (d) una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 50 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID N°: 2, 8, 14, 17, 23 ó 27, donde dicho polipéptido retiene la actividad quinasa. 10. Un método para modular la actividad histidina quinasa en una planta, CARACTERIZADO PORQUE comprende proveer a dicha planta un polipéptido de la cláusula 9. 1 1 . Una planta transformada, CARACTERIZADO PORQUE comprende un polinucleótido ligado operativamente a un promotor que dirige la expresión en una planta, donde dicho polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo formado por: (a) una secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID N°: 1 , 3, 4, 6, 7, 9, 13, 15, 16, 18, 26, 28, 30 ó 32; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID N°: 2, 5, 8, 14, 17, 23, 27 ó 31 ; (c) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos un 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID N°: 1 , 3, 7, 9, 13, 15, 16, 18, 26 ó 28, donde dicho polinucleótido codifica un polipéptido con actividad histidina quinasa; (d) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID N°: 2, 8, 14, 17 ó 27, donde dicho polinucleótido codifica un polipéptido que comprende actividad histidina quinasa; (e) una secuencia de nucleótidos que se hibridiza bajo condiciones severas con el complemento de la SEQ ID N°: 1 , 3, 7, 9, 13, 15, 16, 18, 26 ó 28, donde dichas condiciones severas comprenden hibridación en formamida 50%, NaCI 1 M, SDS 1 % a 37 °C, y al menos un lavado en SSC 0,1 X a una temperatura entre 60°C y 65°C; y (f) una secuencia de nucleótidos que es completamente complementaria de al menos una secuencia seleccionada del grupo formado por las secuencias de nucleótidos de (a)-(e). 12. La planta de la cláusula 1 , CARACTERIZADA PORQUE dicha planta es una monocotiledónea. 1 3. La planta de la cláusula 1 2, CARACTERIZADA PORQUE dicha monocotiledóneas es maíz, trigo, arroz, cebada, sorgo o centeno. 14. La planta de la cláusula 1 1 , CARACTERIZADA PORQUE dicha planta es una dicotiledónea. 1 5. La planta de la cláusula 14, CARACTERIZADA PORQUE la dicotiledónea es soja, Brassica, girasol, algodón, Arabidopsis o alfalfa. 16. La planta de la cláusula 1 1 , CARACTERIZADA PORQUE dicho polinucleótido se incorpora de forma estable en el genoma de la planta. 1 7. Una célula transformada, CARACTERIZADA PORQUE es de la planta de la cláusula 1 1 . 1

8. Una semilla transformada, CARACTERIZADA PORQUE es de la planta de la cláusula 1 1 . 1

9. Un método para modular el nivel o la actividad de un polipéptido en una planta, CARACTERIZADO PORQUE comprende transformar dicha planta con una construcción que comprende un fragmento de la SEQ I D N°: 1 , 3, 4, 6, 7, 9, 13, 1 5, 16, 18, 26, 28, 30 ó 32, o un fragmento del complemento de cualquier de ellas, donde la expresión de dicho fragmento interrumpe la transcripción o traducción del correspondiente polinucleótido endógeno o de un polinucleótido endógeno que es un 90% idéntico al mismo. 20. El método de la cláusula 1 9, CARACTERIZADO PORQUE dicho polipéptido es una histidina quinasa. RESUMEN Poíinucleótidos aislados que codifican polipeptidos de histidina quinasa con actividad sensora de citoquinina, y los polipéptidos codificados por los mismos. Se describen casetes de expresión que comprenden los poíinucleótidos de la invención y plantas y células vegetales transformadas con los poíinucleótidos. Además se describen métodos de uso de los poíinucleótidos y polipéptidos de histidina quinasa con actividad sensora de citoquinina para modular la actividad histidina quinasa y/o los niveles de histidina quinasa en plantas y células vegetales.