MX2014015924A - Manipulacion de fosfatasas de proteina de serina/treonina para mejora de cultivo. - Google Patents

Abstract

Métodos y composiciones que se relacionan con alterar el uso y/o captación de nitrógeno o rendimiento en plantas. Se describe casetes de expresión recombinante, células huésped y plantas transgénicas. Las serina-treonina proteína fosfatasas mejoran los rasgos agronómicos de una planta de cultivo.

Description

MANIPULACIÓN DE FOSFATASAS DE PROTEÍNA DE SERINA/TREONINA PARA MEJORA DE CULTIVO CAMPO La descripción se refiere, generalmente, al campo de la biología molecular, específicamente, a la modulación de la fertilidad de ias plantas para mejorar la tolerancia de las plantas al estrés.

ANTECEDENTES La domesticación de muchas plantas se correlaciona con el aumento drástico en el rendimiento. La mayor parte de la variación fenotipica que ocurre en las poblaciones naturales es continua y se produce por la influencia de múltiples genes. La identificación de genes específicos responsables de las diferencias drásticas en el rendimiento en plantas domesticadas se ha convertido en un importante foco de la investigación agrícola.

Se proyecta que la demanda mundial por fertilizante nitrogenado (N) para la producción agrícola, que ya asciende a ~90 millones de toneladas métricas por año, incrementará hasta 240 millones de toneladas métricas para el año 2050. Dado que el nitrato es bastante móvil en el suelo, una cantidad sustancial del N aplicado se pierde por lixiviación, escurrimiento y desnitrificación. Adicionalmente, de incrementar el costo de producción de cultivos, a largo plazo estos procesos de pérdida de N no solamente contaminan el agua subterránea y afectan negativamente la estructura del suelo, sino, además, tienen efectos perjudiciales en el medio ambiente, tales como el incremento en el óxido nítrico, el ozono, etc. Por lo tanto, el desarrollo de variedades de cultivos con una eficacia mejorada para la absorción y uso de N ayuda a mitigar estos problemas en cierto grado. La ‘señalización’ afecta casi todos los aspectos de vida y la fosforilación/desfosforilación de proteínas desempeña una función principal en la regulación de la ‘señalización’ y muchos otros procesos biológicos. La fosforilación y la desfosforilación están catalizadas por proteína quinasas y fosfatasas, respectivamente, que representan ~5 % del geno a de Arabidopsis, lo cual sugiere que tienen una función principal en el ciclo de vida de las plantas. Entre las proteína fosfatasas, la serina-treonina proteína fosfatasa (STPP, por sus siglas en inglés) es la familia multigénica principal en plantas superiores, que incluyen maíz.

SUMARIO Una modalidad se relaciona con un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) la secuencia de nucleótidos que comprende las sec. con núms. de ident.: 48-94, 97-103, 112, 114, 116 y 118 (b) la secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende las sec. con núms. de ident.: 1-47, 104-111, 113, 115 y 117 y (c) la secuencia de nucleótidos que comprende por lo menos 70 % de identidad de secuencias con las sec. con núms. de ident.: 48-94, 97-103, 112, 114, 116 y 118, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido que afecta la actividad de NUE y/o el rendimiento.

Las composiciones incluyen un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) la secuencia de aminoácidos que comprende las sec. con núms. de ident.: 1-47, 104-111, 113, 115 y 117 y (b) la secuencia de aminoácidos que comprende por lo menos 70 % de identidad de secuencias con las sec. con núms. de ident.: 1-47, 104-111, 113, 115 y 117, en donde el polipéptido tiene efectos en la NUE y/o rendimiento.

La modulación de la expresión de STPP en una planta puede mejorar la tolerancia al estrés por nitrógeno de la planta y tales plantas pueden mantener sus índices de producción con significativamente menos aporte de fertilizante nitrogenado y/o mostrar una mejor captación y asimilación del fertilizante nitrogenado y/o removilización y reutilización de las reservas de nitrógeno acumuladas. Además de un incremento general en el rendimiento, la mejoría de la tolerancia al estrés por nitrógeno por medio de la expresión de STPP puede producir, además, un aumento de la masa y/o longitud radicular, un aumento en el tamaño de la espiga, hoja, semilla y/o endosperma y/o un crecimiento erguido mejorado. En correspondencia, en algunas modalidades los métodos comprenden, además, cultivar dichas plantas en condiciones de limitación de nitrógeno y, opcionalmente, seleccionar las plantas que muestren mayor tolerancia a los niveles de nitrógeno bajo.

Adicionalmente, los métodos y composiciones se proporcionan para mejorar el rendimiento bajo estrés abiótico y estos incluyen evaluar las condiciones ambientales de un área de cultivo para determinar los factores de estrés abiótico (por ejemplo, niveles bajos de nitrógeno en el suelo) y plantar semillas o plantas con fertilidad masculina reducida, en ambientes estresantes.

La presente descripción proporciona, además, constructos y casetes de expresión que comprenden secuencias de nucleótidos que pueden modificar eficientemente la expresión de STPP.

Se describe casetes de expresión recombinante que comprenden un ácido nucleico descrito en la presente descripción. Los vectores que contienen los casetes de expresión recombinante pueden facilitar la transcripción y traducción del ácido nucleico en una célula huésped. Se describe células huésped con la capacidad de expresar los polinucleótidos . Es posible usar varias células huésped, tales como, pero no se limitan a, microbianas, de plantas o de insectos.

Las plantas que contienen los polinucleótidos descritos en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, maíz, frijol de soya, girasol, sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada, tomate y mijo. En otra modalidad, la planta transgénica es una planta de maíz o células vegetales. Otra modalidad consiste en las semillas transgénicas a partir del polipéptido transgénico de serina/treonina proteina fosfatasa de la descripción unido operativamente a un promotor que dirige la expresión en la planta. Las plantas de la descripción pueden tener una NUE alterada en comparación con una planta control. En algunas plantas, la NUE se altera en un tejido vegetativo, un tejido reproductor o un tejido vegetativo y un tejido reproductor. Las plantas pueden tener por lo menos uno de los siguientes fenotipos que incluyen, pero no se limitan a: masa radicular incrementada, longitud radicular incrementada, tamaño de la hoja incrementado, tamaño de la espiga incrementado, tamaño de la semilla incrementado, color verde incrementado, tamaño del endosperma incrementado.

Plantas que se han modificado genéticamente en un locus genómico, en donde el locus genómico codifica una serina/treonina proteína fosfatasa tipo I descrita en la presente descripción, por ejemplo, un elemento regulador recombinante que incrementa la expresión de una serina treonina proteína fosfatasa endógena.

Se proporciona métodos para incrementar la actividad de una serina/treonina proteína fosfatasa en una planta. El método puede comprender introducir en la planta polinucleótidos de serina/treonina proteína fosfatasa.

Un método para incrementar el rendimiento o un parámetro agronómico que contribuye al rendimiento; el método incluye incrementar la expresión o actividad de una serina treonina proteína fosfatasa (STPP) en una planta; y cultivar la planta en un ambiente de cultivo de plantas.

En una modalidad, la serina treonina proteína fosfatasa es de tipo 1. En una modalidad, la STPP es STPP3 de maíz .

Un método para mejorar una característica agronómica de una planta; el método incluye incrementar la expresión o actividad de una serina treonina proteína fosfatasa (STPP) en una planta, en donde el polipéptido de STPP comprende un dominio metalofós (PFAM PF00149.22); y mejorar la característica agronómica de la planta al cultivar la planta en un ambiente de cultivo de plantas.

En una modalidad, el polipéptido de STPP comprende un motivo cerca del extremo N-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos de L[L/T]EVR[T/L]ARPGKQVQL (sec. con núm. de ident.: 95), L[L/T]EV[R/K][T/L/N][A/L][R/K]PGK[Q/N][V/AJQL (sec. con núm. de ident.: 119) o LLEV[R/K][T/N]L[R/K]PGK[Q/N][V/A]QL (sec. con núm. de ident.: 120) y un motivo cerca del extremo C-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos de GAMMSVDE [T/N]LMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 96), GAMMSVD [D/E][T/N]LMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 121) o GAMMSVD [D/E]TLMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 122).

En una modalidad, el polipéptido de STPP comprende la secuencia de aminoácidos de VRTARPGKQV (sec. con núm. de ident .: 123).

En una modalidad, el polipéptido de STPP comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que comprende las sec. con núms. de ident.: 1-47, 104-111, 113, 115 y 117 o una variante que es por lo menos 90 % similar a la sec. con núm. de ident.: 1-47, 104-111, 113, 115 o 117.

Una planta incluye en su genoma una serina treonina proteína fosfatasa (STPP) recombinante, en donde la proteína fosfatasa incluye un motivo cerca del extremo N-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos de L [L/T]EVR[T/L]ARPGKQVQL (sec. con núm. de ident.: 95), L[L/T]EV[R/K][T/L/N][A/L][R/K]PGK[Q/N][V/A]QL (sec. con núm. de ident.: 119) o LLEV[R/K][T/N]L[R/K]PGK[Q/N][V/A]QL (sec. con núm. de ident.: 120) y un motivo cerca del extremo C-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos de GAMMSVDE[T/N]LMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 96), GAMMSVD[D/E][T/N]LMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 121) o GAMMSVD[D/E]TLMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 122), un sitio de unión de RVxF, una subunidad catalítica y una subunidad reguladora y en donde la planta muestra una característica agronómica mejorada. En una modalidad, la planta muestra un incremento en la eficacia del uso de nitrógeno en comparación con una planta control que no incluye una STPP recombinante en su genoma.

Una planta incluye en su genoma un elemento regulador heterólogo unido operativamente a una serina treonina proteína fosfatasa (STPP), en donde el elemento regulador heterólogo incrementa la expresión de la proteína fosfatasa; la proteína fosfatasa comprende un motivo cerca del extremo N-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos de L [L/T]EVR[T/L]ARPGKQVQL (sec. con núm. de ident.: 95), L [L/T]EV[R/K][T/L/N][A/L][R/K]PGK[Q/N][V/AJQL (sec. con núm. de ident.: 119) o LLEV[R/K][T/N]L[R/K]PGK[Q/N][V/A]QL (sec. con núm. de ident.: 120) y un motivo cerca del extremo C-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos de GAMMSVDE[T/N]LMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 96), GAMMSVD[D/E][T/N]LMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 121) o GAMMSVD[D/E]TLMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 122), un sitio de unión de RVxF, una subunidad catalítica y una subunidad reguladora y en donde la planta muestra una característica agronómica mejorada. En una modalidad, el elemento regulador heterólogo es un potenciador. En una modalidad, el elemento regulador heterólogo es un promotor.

Un método para identificar y seleccionar un alelo de ZmSTPP3, el alelo produce una expresión incrementada del polipéptido de ZmSTPP3 y/o una actividad enzimática incrementada; el método incluye realizar una evaluación genética en una población de plantas de maíz mutante; identificar una o más plantas de maíz mutante que muestran la expresión incrementada del polipéptido de ZmSTPP3 y/o la actividad enzimática incrementada; e identificar el alelo de ZmSTPP3 a partir de la planta de maíz mutante. En una modalidad, la planta de maíz mutante se secuencia en un locus que comprende ZmSTPP3.

Un método para incrementar la captación de nitrógeno en una planta; el método incluye incrementar la expresión o actividad de una serina treonina proteína fosfatasa (STPP) en una planta, en donde el polipéptido de STPP comprende un dominio metalofós (PFAM PF00149); y mejorar la captación de nitrógeno de la planta al cultivar la planta en un ambiente de cultivo de plantas.

En una modalidad, el polipéptido de STPP comprende la secuencia de aminoácidos de VRTARPGKQV (sec. con nú . de ident .: 123).

Un constructo de ADN recombinante con la capacidad de expresarse en una célula vegetal; el constructo incluye un polinucleótido que expresa una serina treonina proteina fosfatasa (STPP) en una planta, en donde el polipéptido de STPP comprende un dominio metalofós (PFAM PF00149); el promotor heterólogo se une operativamente a la proteina fosfatasa y es funcional en células vegetales; y un terminador transcripcional funcional en células vegetales.

Una planta de maiz incluye los constructos de ADN descritos en la presente descripción. En una modalidad, los constructos de ADN codifican una STPP que incluye una secuencia de polinucleótidos que codifica la proteina fosfatasa que comprende una secuencia que es por lo menos 80 % similar a una seleccionada del grupo que comprende las sec. con núms. de ident.: 48-94, 97-103, 112, 114, 116 y 118.

Un método para mejorar la eficacia de uso de nitrógeno de una planta monocotiledónea; el método incluye incrementar la expresión o actividad de una serina treonina proteina fosfatasa (STPP) en una planta, en donde el polipéptido de STPP comprende un dominio metalofós (PFAM PF00149) y comprende, además, un motivo cerca del extremo N-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos de L [L/T]EVR[T/L]ARPGKQVQL (sec. con núm. de ident.: 95), L [L/T]EV[R/K][T/L/N][A/L][R/K]PGK[Q/N][V/A]QL (sec. con núm. de ident.: 119) o LLEV[R/K][T/N]L[R/K]PGK[Q/N][V/A]QL (sec. con núm. de ident.: 120) y un motivo cerca del extremo C-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos de GAMMSVDE[T/N]LMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 96), GAMMSVD[D/E][T/N]LMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 121) o GAMMSVD[D/E]TLMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 122) y cultivar la planta en condiciones de cultivo de plantas, en donde la proporción de aplicación de un fertilizante nitrogenado es menor que aproximadamente 140 a 160 libras/acre.

Un método para incrementar el rendimiento de campo de una planta monocotiledónea al mejorar la eficacia de uso de nitrógeno de una planta monocotiledónea; el método incluye incrementar la expresión o actividad de una serina treonina proteina fosfatasa (STPP) en una planta, en donde el polipéptido de STPP comprende un dominio metalofós (PFAM PF00149) y comprende, además, un motivo cerca del extremo N-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos de L [L/T]EVR[T/L]ARPGKQVQL (sec. con núm. de ident.: 95), L [L/T]EV [R/K][T/L/N][A/L][R/K]PGK[Q/N][V/A]QL (sec. con núm. de ident.: 119) o LLEV[R/K][T/N]L[R/K]PGK[Q/N][V/A]QL (sec. con núm. de ident.: 120) y un motivo cerca del extremo C-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos de GAMMSVDE [T/N]LMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 96), GAMMSVD [D/E][T/N]LMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 121) o GAMMSVD [D/E]TLMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 122); y cultivar la planta en condiciones de cultivo de plantas, en donde la proporción de aplicación de un fertilizante nitrogenado es de aproximadamente 140 a 160 libras/acre.

Una planta incluye en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido aislado unido operativamente a un promotor funcional en una planta, en donde el polinucleótido incluye (a) la secuencia de nucleótidos seleccionados del grupo que comprende las sec. con núms. de ident.: 48-94, 97-103, 112, 114, 116 y 118; (b) una secuencia de nucleótidos con por lo menos 90 % de identidad de secuencias, según el método de alineamiento Clustal V, en comparación con una seleccionada del grupo que comprende las sec. con núms. de ident.: 48-94, 97-103, 112, 114, 116 y 118 o (c) una secuencia de nucleótidos que puede hibridizarse en condiciones rigurosas con la secuencia de nucleótidos de (a) y en donde la planta muestra una alteración en por lo menos una característica agronómica seleccionada del grupo que consiste en: meristemo de la espiga agrandado, número de hileras de granos, número de semillas, altura de la planta, biomasa y rendimiento, en comparación con una planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante.

En una modalidad, una planta se selecciona del grupo que consiste en: Arabidopsis, tomate, maíz, frijol de soya, girasol, sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada, mijo, caña de azúcar y pasto varilla.

Las semillas de las plantas descritas en la presente descripción muestran una alteración en por lo menos una característica agronómica seleccionada del grupo que consiste en: meristemo de la espiga agrandado, número de hileras de granos, número de semillas, altura de la planta, biomasa y rendimiento, en comparación con una planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante.

Un polinucleótido recombinante que codifica una serina treonina proteina fosftasa (STPP) en una planta, en donde el polipéptido de STPP incluye un dominio metalofós (PFAM PF00149.22) y que incluye, además, un motivo cerca del extremo N-terminal que comprende un aminoácido L[L/T]EVR[T/L]ARPGKQVQL (sec. con núm. de ident.: 95), L [L/T]EV[R/K][T/L/N][A/L][R/K]PGK[Q/N][V/AJQL (sec. con núm. de ident.: 119) o LLEV [R/K][T/N]L[R/K]PGK[Q/N][V/A]QL (sec. con núm. de ident.: 120) y un motivo cerca del extremo C-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos de GAMMSVDE[T/N]LMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 96), GAMMSVD[D/E][T/N]LMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 121) o GAMMSVD[D/E]TLMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 122).

Un método para mejorar el rendimiento de una planta de maíz, el método incluye proporcionar una planta de maíz que tiene en su genoma un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido que es por lo menos 90 % idéntico a la sec. con núm. de ident.: 1 e incrementar el rendimiento de los granos de la planta de maíz al cultivar la planta de maíz en un ambiente de cultivo de plantas. En una modalidad, la planta de maíz transgénico incluye en su genoma un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido que es por lo menos 90 % idéntico a la sec. con núm. de ident.: 1.

Un método para mejorar el rendimiento de una planta de maíz; el método incluye proporcionar una planta de maíz que contiene en su genoma un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido que es por lo menos 90 % idéntico a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las sec. con núms. de ident.: 1-8 e incrementar el rendimiento de los granos de la planta de maíz al cultivar la planta de maíz en un ambiente de cultivo de plantas.

Una planta de maíz transgénico incluye en su genoma un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido que es por lo menos 90 % idéntico a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las sec. con núms. de ident.: 1-8. Una planta de cultivo monocotiledónea y transgénica incluye en su genoma un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido que es por lo menos 90 % idéntico a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las sec. con núms. de ident.: 1-8.

Un método para mejorar el rendimiento de una planta de maíz; el método comprende proporcionar una planta de maíz que comprende en su genoma un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido que es por lo menos 85 % idéntico a la sec. con núm. de ident.: 1 e incrementar el rendimiento de los granos de la planta de maíz al cultivar la planta de maíz en un ambiente de cultivo de plantas. En una modalidad, el polipéptido es aproximadamente 87 % idéntico a la sec. con núm de ident.: 1.

Una planta de maíz transgénico incluye en su genoma un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido que es por lo menos 85 % idéntico a la sec. con núm. de ident.: 1. En una modalidad, la planta de maíz incluye un polipéptido que es aproximadamente 87 % idéntico a la sec. con núm. de ident.: 1. En una modalidad, la planta de maíz transgénico produce por lo menos aproximadamente 3-5 fanegas/aere más en comparación con una planta control que no contiene el polinucleótido recombinante.

Se proporciona métodos para reducir o eliminar la concentración de un polipéptido de serina/treonina proteina fosftasa en la planta. La concentración o actividad del polipéptido se podría, además, reducir o eliminar en tejidos específicos, lo que provoca una alteración en la velocidad de crecimiento de la planta. La reducción de la concentración y/o actividad del polipéptido de serina/treonina proteína fosfatasa podría provocar una estatura menor o un crecimiento más lento de las plantas.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1 (Figura 1A - II) muestra el alineamiento de las secuencias de STPP con motivos conservados identificados: L [L/T]EVR[T/L]ARPGKQVQL (sec. con núm. de ident.: 95), L [L/T]EV [R/K][T/L/N][A/L][R/K]PGK[Q/N][V/A]QL (sec. con núm. de ident.: 119) o LLEV[R/K][T/N]L[R/K]PGK[Q/N][V/A]QL (sec. con núm. de ident.: 120) y un motivo cerca del extremo C-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos de GAMMSVDE[T/N]LMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 96), GAMMSVD[D/E][T/N]LMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 121) o GAMMSVD[D/E]TLMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 122).

La Figura 2 muestra un dendrograma que contiene la relación de las secuencias de STPP y su identificación en ciados. Las designaciones de las agrupaciones de la Tabla 1 corresponden a los puntos de ramificación clave dentro de la Figura 2. La historia evolutiva se dedujo con el uso del método de probabilidad máxima según el modelo a base de matriz JTT. Se muestra el árbol con la probabilidad logarítmica máxima (-5257.1242). El o los árboles iniciales para la búsqueda heurística se obtuvieron automáticamente de la siguiente manera. Cuando la cantidad de sitios comunes fue < 100 o menos de un cuarto de la cantidad total de sitios, se usó el método de parsimonia máxima; de lo contrario, se usó el método BIONJ con la matriz de distancia MCL. El árbol se dibuja a escala, con las longitudes de ramificación determinadas en la cantidad de sustituciones por sitio. El análisis incluyó 55 secuencias de aminoácidos. Todas las posiciones con interrupciones y los datos faltantes se eliminaron. Había un total de 273 posiciones en el grupo de datos final. Los análisis evolutivos se llevaron a cabo en MEGA5.

La Figura 3 demuestra análisis de datos de rendimiento de múltiples eventos/años/especímenes de prueba/ubicaciones de transgénicos que sobreexpresan ZmSTPP3 que se analizan en condiciones de contenido bajo o normal de N. Los análisis BLUP de eventos con un contenido bajo de N (grupo inferior), con un contenido normal de N (grupo medio) y con un contenido combinado bajo de N/normal de N (grupo superior) mostraron un incremento de 2-5 fanegas/acre. Las franjas azules representan los eventos con diferencias estadísticamente significativas. Los datos a partir de 81 replicaciones se presentan en esta figura.

La Figura 4 representa los datos a partir de dos eventos transgénicos de maíz de ciclo rápido de ZmSTPP3 para demostrar los rasgos de espigas mejorados en el ensayo reproductivo de NUE. Los valores representados son un % del incremento de los eventos transgénicos en comparación con las lineas control. * indica P < 0.1.

DESCRIPCIÓN DETALLADA El ZmSTPP3 muestra un mayor rendimiento de los granos de maíz en condiciones con contenido normal y bajo de nitrógeno en múltiples ensayos anuales. Las líneas de maíz que sobreexpresan STPP3 tuvieron una eficacia del uso de nitrógeno significativamente mayor que las líneas control.

Los genes de eficacia de uso de nitrógeno (NUE) afectan el rendimiento y tienen utilidad para mejorar el uso del nitrógeno en plantas de cultivo, especialmente maíz. El aumento de la eficacia de uso de nitrógeno puede resultar de la captación y asimilación mejoradas del fertilizante nitrogenado y/o la removilización y reuso posterior de las reservas acumuladas de nitrógeno, así como al aumento de la tolerancia de las plantas a situaciones estresantes tales como ambientes bajos en nitrógeno. Los genes pueden usarse para alterar la composición genética de las plantas, lo que las hace más productivas con los estándares actuales de aplicación del fertilizante o mantiene sus tasas de producción con una disponibilidad significativamente reducida de fertilizante o de nitrógeno. Mejorar la NUE en el maíz podría aumentar el rendimiento cosechable del maíz por unidad de fertilizante nitrogenado invertido, tanto en naciones en desarrollo, en donde el acceso al fertilizante nitrogenado está limitado, como en naciones desarrolladas, en donde el nivel de uso del nitrógeno sigue siendo alto. Las mejoras en el uso de nitrógeno permiten, además, disminuir los costos de inversión en la granja, disminuir el uso y dependencia de las fuentes de energía no renovables regueridas para la producción de fertilizante nitrogenado y reducir el impacto medio ambiental de la fabricación y uso agrícola del fertilizante nitrogenado.

Se proporciona métodos y composiciones para mejorar el rendimiento de las plantas. En algunas modalidades, el rendimiento de las plantas se mejora bajo estrés, particularmente estrés abiótico, tales como condiciones de limitación de nitrógeno.

Se describe polinucleótidos , polipéptidos relacionados y todas las variantes conservadoramente modificadas de genes STPP involucrados en el metabolismo de nitrógeno en plantas.

Se describe métodos para alterar la composición genética de plantas de cultivo, especialmente, maíz, de manera que tales cultivos puedan ser más productivos con las aplicaciones actuales de fertilizante y/o tan productivos con un aporte de fertilizante significativamente reducido. Se describe la mejora del rendimiento y los costos de fertilizante reducidos con el efecto reducido correspondiente para el medio ambiente.

Las moléculas de STPP descritas comprenden 2 subunidades: la primera es una subunidad catalítica altamente conservada y ubicua; y la segunda es una subunidad reguladora que define diversas funciones y especificidad. La subunidad reguladora se dirige proteínas a sitios celulares y modula sus actividades. Las serina/treonina proteína fosfatasas se categorizaron inicialmente en dos grupos, PP1 y PP2 (PP2A, PP2B, PP2C), según su especificidad del sustrato y sus propiedades farmacológicas. La PP1 es una enzima ubicua y altamente conservada que se encuentra en todos los organismos eucariotas. La PP1 mamífera está involucrada en la regulación de la biosíntesis de glucógeno, ciclo celular y contracción muscular. La función de la PP1 vegetal no se determinó. La PP2A regula las actividades de las enzimas clave, tales como la nitrato reductasa y la sacarosa fosfato sintasa, la señalización hormonal y la señalización de defensas.

Todas las referencias citadas se incorporan en la presente descripción como referencia.

A menos que se defina específicamente de cualquier otra manera, todos los términos téenicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que comprende comúnmente una persona con experiencia en la materia a la cual pertenece la presente descripción. A menos que se mencione de cualquier otra manera, las técnicas usadas o contempladas en la presente descripción son metodologías estándar muy conocidas para un experto en la materia. Los materiales, métodos y ejemplos son únicamente ilustrativos y no limitantes. Lo siguiente se presenta en forma de ilustración y no pretende limitar el alcance de la descripción.

Una persona experimentada en la materia puede pensar en cualquier modificación y otras modalidades de las descripciones descritas en la presente descripción relacionadas con estas descripciones con la utilidad de las enseñanzas presentadas en las descripciones precedentes y las figuras asociadas. Por lo tanto, se entiende que las descripciones no se limitan a las modalidades especificas descritas y esas modificaciones y otras modalidades están incluidas dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Aunque en la presente descripción se usa términos específicos, estos se usan únicamente en un sentido genérico y descriptivo y no con propósitos de limitación.

La práctica de la presente descripción usará, a menos que se indique de cualquier otra manera, téenicas convencionales de botánica, microbiología, cultivo de tejido, biología molecular, química, bioquímica y de ingeniería genética, las cuales están dentro de la habilidad de la materia .

Las unidades, los prefijos y los símbolos pueden indicarse en su forma aceptada en el SI (Sistema Internacional de Unidades) . A menos que se indique de cualquier otra manera, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en orientación de 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en la orientación del extremo amino al carboxi, respectivamente. Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. En la presente descripción, los aminoácidos se pueden indicar con sus símbolos de tres letras conocidos o con los símbolos de una letra que recomienda la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Además, los nucleótidos se pueden indicar con sus códigos de única letra generalmente aceptados. Los términos definidos a continuación se definen en mayor detalle en referencia a la especificación como un todo.

Se usarán los siguientes términos para describir la presente descripción, y se pretende que se definan tal como se indica a continuación.

“Microbio” se refiere a cualquier microorganismo (incluso microorganismos eucariotas y procariotas), tal como hongos, levadura, bacterias, actinomicetos, algas y protozoarios, así como otras estructuras unicelulares.

Por “amplificado” se entiende la construcción de copias múltiples de una secuencia de ácido nucleico o copias múltiples complementarias a la secuencia de ácido nucleico con el uso de por lo menos una de las secuencias de ácido nucleico como un patrón. Los sistemas de amplificación incluyen el sistema de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), el sistema de reacción en cadena de la ligasa (LCR), la amplificación en base a la secuencia de ácido nucleico (NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario), los sistemas de la Q-Beta replicasa, el sistema de amplificación en base a la transcripción (TAS) y la amplificación por desplazamiento de la hebra (SDA). Ver, por ejemplo, Diagnostic Molecular Microbiology: Principies and Applications, Persing, et al . , eds., American Society for Microbiology, Washington, DC (1993). El producto de la amplificación se denomina amplicón.

El término “variantes conservativamente modificadas” aplica tanto al aminoácido como a las secuencias de ácido nucleico. Con respecto a las secuencias particulares de ácido nucleico, las variantes conservativamente modificadas se refiere a los ácido nucleicos que codifican variantes conservativamente modificadas o idénticas de las secuencias de aminoácidos. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteina dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican el aminoácido alanina. Asi, en cada posición en donde se especifica una alanina por un codón, el codón puede alterarse a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones de ácido nucleico son “variaciones silentes” y representan una especie de la variación conservativamente modificada. Cada secuencia de ácido nucleico en la presente descripción que codifica un polipéptido describe, además, cada variación silente posible del ácido nucleico. Una persona con experiencia en la materia reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que es normalmente el único codón para metionina; una excepción es Micrococcus rubens, para el cual GTG es el codón de metionina (Ishizuka, et al . , (1993) J. Gen . Microbiol . 139:425-32) y puede modificarse para producir una molécula funcionalmente idéntica. En consecuencia, cada variación silenciosa de un ácido nucleico, que codifica un polipéptido de la presente descripción, está implícita en cada secuencia de polipéptidos descrita e incorporada en la presente descripción como referencia.

Como para las secuencias de aminoácidos, una persona con experiencia reconocerá que las sustituciones, deleciones o adiciones individuales a una secuencia de ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína que altera, adiciona o elimina un solo aminoácido o un porcentaje pequeño de aminoácidos en la secuencia codificada es una “variante conservativamente modificada” cuando la alteración resulta en la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Así, puede alterarse cualquier número de residuos de aminoácidos seleccionado del grupo de enteros que consisten de 1 a 15. Así por ejemplo, se puede hacer 1, 2, 3, 4, 5, 7 o 10 alteraciones Las variantes conservativamente modificadas proporcionan, típicamente, una actividad biológica similar que las secuencias de polipéptidos sin modificar a partir de la que se derivan. Por ejemplo, la especificidad del sustrato, actividad de la enzima o unión ligando/receptor es, generalmente, al menos 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %, preferentemente, 60-90 % de la proteina natural por su sustrato natural Las tablas de la sustitución conservativa que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares se conocen bien en la materia.

Los siguientes seis grupos contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservativas de uno a otro: 1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) isoleucina (I), leucina (L), metionina (M), valina (V) y 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W). Ver, además, Creighton, Proteins, W.H. Freeman and Co. (1984).

Como se usa en la presente descripción, “que consiste esencialmente en” significa la inclusión de secuencias adicionales en un polinucleótido o polipéptido objetivo, en donde las secuencias adicionales no afectan materialmente la función básica de las secuencias de polinucleótidos o polipéptidos reivindicadas.

El término “construcción” se usa para hacer referencia, generalmente, a una combinación artificial de secuencias de polinucleótidos, por ejemplo, una combinación que no es de origen natural, que comprende, normalmente, uno o más elementos reguladores y una o más secuencias codificantes. El término puede incluir la referencia a los casetes de expresión y/o secuencias de vectores, como sea adecuado para el contexto.

Un “control”, “planta control” o “célula vegetal control” proporciona un punto de referencia para determinar los cambios en el fenotipo de una planta o célula vegetal sujeto en la que ha ocurrido una alteración genética, tal como una transformación, en un gen de interés. Una planta o célula vegetal sujeto puede descender de una planta o célula alterada y comprender la alteración.

Una planta control o célula vegetal control puede comprender, por ejemplo: (a) una planta o célula silvestre, es decir, del mismo genotipo que el material inicial para la alteración genética que resultó en la planta o célula sujeto; (b) una planta o célula vegetal del mismo genotipo que el material inicial, pero que se transformó con una construcción nula (es decir, con una construcción que no tiene efecto conocido en el rasgo de interés, tal como una construcción que comprende un gen marcador); (c) una planta o célula vegetal que es un segregante no transformado entre la progenie de una planta o célula vegetal sujeto; (d) una planta o célula vegetal que es genéticamente idéntica a la planta o célula vegetal sujeto, pero que no se expone a condiciones o estímulos que inducirían la expresión del gen de interés o (e) la planta o célula vegetal sujeto propiamente dicha, en condiciones en las cuales no se expresa el gen de interés. Una planta control puede ser, además, una planta transformada con una construcción de regulación a la baja alternativa.

La frase “que codifica” o “codificado” con respecto a un ácido nucleico específico se refiere a que comprende la información para la traducción en la proteína especificada. Un ácido nucleico que codifica una proteína puede comprender secuencias no traducidas (por ejemplo, intrones) dentro de las regiones traducidas del ácido nucleico o puede carecer de tales secuencias no traducidas intermedias (por ejemplo, como en ADNc). La información por la cual se codifica una proteína se especifica con el uso de codones. Típicamente, la secuencia de aminoácidos se encuentra codificada por el ácido nucleico con el uso del código genético “universal”. Sin embargo, las variantes del código universal, tales como las presentes en la mitocondria de algunas plantas, animales y hongos, la bacteria Mycoplasma capricolum (Yamao, et al . , (1985) Proc. Nati . Acad. Sci . Estados Unidos, 82:2306-9) o el macronúcleo ciliado, se pueden usar cuando el ácido nucleico se expresa por medio del uso de esos organismos.

Cuando el ácido nucleico se prepara o altera sintéticamente, se puede tomar ventaja de las preferencias del codón conocidas de los huéspedes deseados en donde el ácido nucleico se va a expresar. Por ejemplo, aunque las secuencias de ácido nucleico de la presente descripción pueden expresarse en especies de plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, las secuencias pueden modificarse para responder a las preferencias específicas del codón y del contenido de GC de plantas monocotiledóneas o plantas dicotiledóneas ya que se demostró que estas preferencias son distintas (Murray, et ai., (1989) Nucleic Acids Res . 17:477-98, incorporada en la presente descripción como referencia). Así, el codón preferido de maíz para un aminoácido particular podría derivarse de secuencias de genes conocidas de maíz. El uso de codones en maíz para los 28 genes de plantas de maíz se enumera en la Tabla 4 de Murray, et al., más arriba .

Como se usa en la presente descripción, “heterólogo”, con referencia a un ácido nucleico, es un ácido nucleico que se origina de una especie extraña o, si es de la misma especie, se encuentra sustancialmente modificada de su forma natural en la composición y/o locus genómico mediante intervención humana intencional. Por ejemplo, un promotor unido operativamente a un gen estructural heterólogo es de una especie distinta a la especie de la cual se derivó el gen estructural o, si es de la misma especie, uno o ambos están sustancialmente modificados de su forma original. Una proteína heteróloga se puede originar de una especie extraña o, si es de la misma especie, se modifica sustancialmente de su forma original mediante intervención humana intencional.

“Célula hospedera” se refiere a una célula, que comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo de la descripción, que contiene un vector y soporta la reproducción y/o expresión del vector de expresión. Las células huésped pueden ser células procariotas, tales como E. coli, o células eucariotas, tales como células de levadura, insectos, planta, anfibios o mamíferos. Preferentemente, las células huésped son células de plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas que incluyen, pero no se limitan a, maíz, sorgo, girasol, frijol de soya, trigo, alfalfa, arroz, algodón, cañóla, cebada, mijo y tomate. Una célula huésped onocotiledónea particularmente preferida es una célula huésped de maíz.

El término “complejo de hibridación” incluye la referencia a una estructura de ácido nucleico híbrida formada por dos secuencias de ácido nucleico monocatenarias hibridizadas selectivamente entre sí.

El término “introducido” en el contexto de insertar un ácido nucleico en una célula significa “transfección”, “transformación” o “transducción” e incluye la referencia a la incorporación de un ácido nucleico en una célula eucariota o procariota, en donde el ácido nucleico puede incorporarse en el genoma de la célula (por ejemplo, ADN cromosómico, plasmídico, plástido o mitocondrial), convertido en un replicón autónomo o expresado temporalmente (por ejemplo, ARNm transfectado).

Los términos “aislado” se refiere al material, tal como un ácido nucleico o una proteina, que se encuentra sustancialmente o prácticamente libre de componentes que normalmente acompañan o interactúan con este tal como se encuentra en su medio natural. Los términos “de origen no natural”; “mutado”, “recombinante”; “expresado recombinantemente”; “heterólogo” o “expresado heterólogamente” son materiales biológicos representativos que no están presentes en su ambiente de origen natural.

El término “ácido nucleico NUE” significa un ácido nucleico que comprende un polinucleótido (“polinucleótido NUE”) que codifica un polipéptido de longitud total o longitud parcial .

Como se usa en la presente descripción, “ácido nucleico” incluye la referencia a un polímero desoxirribonucleótido o ribonucleótido en forma monocatenaria o bicatenaria y, a menos que se limite de cualquier otra manera, abarca los análogos conocidos que tienen la naturaleza esencial de los nucleótidos naturales en que se hibridizan a ácidos nucleicos monocatenarios de una manera similar a los nucleótidos de origen natural (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos).

“Genoteca de ácidos nucleicos” se refiere a una recolección de moléculas aisladas de ADN o ARN que comprenden y representan sustancialmente la fracción completa transcrita de un genoma de un organismo especifico. La creación de genotecas de ácidos nucleicos ilustrativas, tales como genotecas de ADN genómico y de ADNc se enseña en referencias de biología molecular estándar, tales como Berger and Kimmel, (1987) Guide To Molecular Clonlng Techniques, de la serie Methods in Enzymology, vol. 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Sambrook, et al . , (1989) Molecular Clonlng: A Laboratory Manual , 2.° ed., vols.1-3; y Current Protocole in Molecular Biology, Ausubel, et al . , eds, Current Protocols, empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wilcy & Sons, Inc. (1994 Supplement).

Como se usa en la presente descripción, “unido operativamente” incluye una referencia a un enlace funcional entre una primera secuencia tal como un promotor, y una segunda secuencia, en donde la secuencia promotora inicia y media la transcripción del ADN correspondiente a la segunda secuencia. Generalmente, unido (a) operativamente significa que las secuencias de ácido nucleico que están unidas son contiguas, y, en donde sea necesario, se unen a dos regiones codificantes de proteína, contiguas y en el mismo marco de lectura.

Como se usa en la presente descripción, el término “planta” incluye la referencia a las plantas completas, órganos de las plantas (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), semillas y células vegetales, así como progenie de estas. Célula vegetal, como se usa en la presente descripción, incluye, pero no se limita a, cultivos en suspensión de semillas, embriones, regiones merístemáticas, tejido calloso, hojas, raíces, brotes, gametofitos, esporofitos, polen y microesporas. La clase de plantas que se puede usar en los métodos de la descripción es, generalmente, tan amplio como la clase de las plantas superiores susceptibles a las téenicas de transformación, que incluyen las plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas e incluyen las especies del género: Cuc rbita , Rosa , Vitis, Juglans, Fragaria , Lotus, Medicago , Onobrychis , Trifolium, Trigonella , Vigna , Citrus, Linum, Geranium, Manihot Daucus, Arabidopsis , Brassica , Raphanus, Sinapis, Atropa , Capsicum , Datura, Hyoscyamus , Lycopersicon , Nicotiana , Solanum Petunia , Digitalis , Majorana , Ciahorium, Helianthus , Lactuca , Bromus , Asparagus , Antirrhinum, Heterocallis , Nemesis, Pelargonium , Panieum, Pennisetum, Ranunculus , Senecio, Salpiglossis , Cucumis, Browaalia , Glycine , Pisum, Phaseolus , Lolium, Oryza, Avena , Hordeum, Secale, Allium y Triticum. Una planta particularmente preferida es Zea mays .

Como se usa en la presente descripción, “rendimiento” puede incluir la referencia a bushel por aere de un cultivo de granos en la cosecha ajustado para la humedad del grano (15 % típicamente para el maíz, por ejemplo) y el volumen de la biomasa generada (para los cultivos de forraje, tales como alfalfa y tamaño de la raíz de la planta para cultivos múltiples). La humedad del grano se mide en el grano en la cosecha. El peso de prueba ajustado del grano se determina como el peso en libras por bushel, ajustado para el nivel de humedad del grano en la cosecha. La biomasa se mide como el peso del material cosechable de la planta generado.

Como se usa en la presente descripción, “polinucleótido” incluye la referencia a un desoxirribopolinucleótido, ribopolinucleótido o análogos de estos que tienen la naturaleza esencial de un ribonucleótido natural en que se hibridizan, en condiciones rigurosas de hibridación, para prácticamente la misma secuencia de nucleótidos que los nucleótidos de origen natural y/o permiten la traducción en el(los) mismo(s) aminoácido(s) que el(los) nucleótido (s) de origen natural. Un polinucleótido puede ser de longitud completa o una subsecuencia de un gen estructural o regulador natural o heterólogo. A menos que se indique de cualquier otra forma, el término incluye referencia a la secuencia especificada asi como la secuencia complementaria de esta.

Los términos “polipéptido”, “péptido” y “proteína” se usan indistintamente en la presente descripción para hacer referencia a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos, en donde uno o más residuos de aminoácidos es o son un análogo químico artificial de un aminoácido correspondiente de origen natural, así como polímeros de aminoácidos de origen natural.

Como se usa en la presente descripción “promotor” incluye una referencia a una región de ADN corriente arriba del inicio de la transcripción e involucrada en el reconocimiento y unión de la ARN polimerasa y otras proteínas para iniciar la transcripción. Un “promotor vegetal” es un promotor con la capacidad de iniciar la transcripción en células vegetales. Los promotores de plantas ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, aquellos que se obtienen de plantas, virus de plantas y bacterias los cuales comprenden genes expresados en células vegetales, tales como Agrobacterium o Rhizobium. Los ejemplos son promotores que inician, preferentemente, la transcripción en ciertos tejidos, tales como hojas, raíces, semillas, fibras, vasos del xilema, traqueidas o esclerénquima. Tales promotores se mencionan como “específicos del tejido”. Un promotor específico de “tipos celulares” dirige, principalmente, la expresión en ciertos tipos de células en uno o más órganos, por ejemplo, células vasculares de raíces u hojas. Un “promotor inducible” o “regulable” es un promotor que está bajo control medioambiental. Los ejemplos de condiciones ambientales que pueden afectar la transcripción por los promotores inducibles incluyen condiciones anaerobias o la presencia de luz. Otro tipo de promotor es un promotor regulado por el desarrollo, por ejemplo, un promotor que conduce la expresión durante el desarrollo del polen. Los promotores inducibles y regulados por el desarrollo, de tipo de célula específico, de tejido preferido constituyen la clase de promotores “no constitutivos”. Un promotor “constitutivo” es un promotor que está activo en sustancialmente todos los tejidos de una planta, en casi todas las condiciones ambientales y estados de desarrollo o diferenciación celular.

El término “polipéptido” se refiere a una o más secuencia de aminoácidos. El término incluye, además, los fragmentos, variantes, homólogos, alelos o precursores (por ejemplo, preproproteínas o proproteínas) de estos. Una “proteína NUE” comprende un polipéptido. A menos que se indique de otra manera, el término “ácido nucleico NUE” se refiere a un ácido nucleico que comprende un polinucleótido (“polinucleótido NUE”) que codifica un polipéptido.

Como se usa en la presente descripción, una “secuencia de ácido nucleico no genómica” o “molécula de ácido nucleico no genómica” se refiere a una molécula de ácido nucleico que tiene uno o más cambios en la secuencia de ácido nucleico en comparación con una secuencia de ácido nucleico natural o genómica. En algunas modalidades, el cambio en una molécula de ácido nucleico natural o genómica incluye, pero no se limita a: cambios en la secuencia de ácido nucleico debido a la degeneración del código genético; la optimización por codones de la secuencia de ácido nucleico para la expresión en plantas; cambios en la secuencia de ácido nucleico para introducir por lo menos una sustitución, inserción, deleción y/o adición de aminoácidos en comparación con el polipéptido codificado por la secuencia natural o genómica; que incluye sitios de empalme adicionales o heterólogos dentro del ADN genómico; la eliminación de uno o más intrones asociados con una secuencia de ácido nucleico genómica; la inserción de uno o más intrones heterólogos; la inserción de una o más regiones reguladoras heterólogas corriente arriba o corriente abajo; y la inserción de una región no traducida 5' y/o 3' heteróloga.

Como se usa en la presente descripción, “recombinante” incluye la referencia a una célula o vector que se ha modificado mediante la introducción de un ácido nucleico heterólogo o que la célula se deriva de una célula modificada de esa manera. Asi, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran de forma idéntica dentro de la forma natural (no recombinante) de la célula o expresa genes naturales que se expresan de cualquier otra forma anormalmente, expresados o no expresados como resultado de la intervención humana intencional o pueden tener una expresión reducida o eliminada de un gen natural. El término “recombinante”, como se usa en la presente descripción, no abarca la alteración de la célula o vector por eventos de origen natural (por ejemplo, mutación espontánea, transformación/transducción/transposición natural), tales como los que ocurren sin intervención humana intencional.

Como se usa en la presente descripción, un “casete de expresión recombinante” es un constructo de ácido nucleico generada de manera recombinante o sintética, con una serie de elementos de ácido nucleico especificados que permiten la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula objetivo. El casete de expresión recombinante puede incorporarse en un plásmido, cromosoma, ADN mitocondrial, ADN plastidio, virus o fragmento de ácido nucleico. Típicamente, la porción del casete de expresión recombinante de un vector de expresión incluye, entre otras secuencias, un ácido nucleico a transcribir y un promotor heterólogo.

El término “se hibridiza selectivamente” incluye la referencia a la hibridación, en condiciones rigurosas de hibridación, de una secuencia de ácido nucleico a una secuencia objetivo específica de ácido nucleico en un grado detectadle mayor (por ejemplo, por lo menos el doble por encima del base) que su hibridación en secuencias de ácido nucleico no objetivo y con la exclusión sustancial de ácidos nucleicos no objetivo. Las secuencias de hibridación selectiva tienen, típicamente, aproximadamente al menos 40 % de identidad de secuencia, preferentemente, 60-90 % de identidad de secuencia y, con la máxima preferencia, 100 % de identidad de secuencia (es decir, complementarias) entre si.

Los términos “condiciones rigurosas” y “condiciones rigurosas de hibridación” se refieren a las condiciones bajo las cuales una sonda se hibridiza a su secuencia objetivo a un grado detectadle mayor que otras secuencias (por ejemplo, por lo menos 2 veces el valor de base). Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán diferentes en circunstancias diferentes. Al controlar el rigor de las condiciones de hibridación y/o lavado, pueden identificarse las secuencias objetivo que pueden ser hasta 100 % complementarias de la sonda (sonda homologa). Alternativamente, pueden ajustarse las condiciones de rigor para permitir cierta falta de coincidencia de las secuencias con el fin de detectar grados más bajos de similitud (sonda heteróloga). Óptimamente, la sonda es de una longitud de aproximadamente 500 nucleótidos, pero puede variar grandemente en longitud de menor que 500 nucleótidos a igual a toda la longitud de la secuencia objetivo Típicamente, serán condiciones rigurosas aquellas en las cuales la concentración de sal es menor que aproximadamente 1.5 M de iones Na, típicamente, una concentración de aproximadamente 0,01 a 1,0 M de iones Na (u otras sales) con un pH 7,0 a 8,3, y la temperatura es de por lo menos aproximadamente 30 °C para las sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y por lo menos aproximadamente 60 °C para las sondas largas (por ejemplo, más de 50 nucleótidos). Las condiciones rigurosas se pueden obtener, además, con la adición de agentes desestabilizadores, tales como formamida o solución de Denhardt. Las condiciones de rigurosidad baja ilustrativas incluyen la hibridación con una solución amortiguadora de formamida al 30-35 %, NaCl 1 M, SDS (dodecil sulfato de sodio) al 1 % a 37 °C y un lavado en SSC IX a 2X (SSC 20X = NaCl 3.0 M/citrato trisódico 0.3 M) a 50 a 55 °C. Las condiciones de rigor moderadas ilustrativas incluyen la hibridación en 40 a 45 % formamida, 1 M NaCl, 1 % SDS a 37 °C y un lavado en 0.5X a IX SSC a 55 a 60 °C. Las condiciones de rigurosidad alta ilustrativas incluyen hibridación en formamida al 50 %, NaCl 1 M, SDS al 1 % a 37 °C y un lavado en SSC 0.IX a 60 hasta 65 °C. La especificidad es, típicamente, la función de los lavados posteriores a la hibridación; los factores críticos son la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para los híbridos ADN-ADN, la Tm puede aproximarse a la ecuación de Meinkoth and Wahl, (1984) Anal . Biochem. , 138:267-84: Tm = 81.5 °C + 16.6 (log M) + 0.41 (%GC) - 0.61 (% form) - 500/L; en donde M es la molaridad de cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN, % form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación y L es la longitud del híbrido en pares de bases. Tm es la temperatura (con la fuerza iónica y el pH definidos a continuación) a la cual se hibridiza el 50 % a una secuencia objetivo complementaria con una sonda perfectamente apareada. Tm se reduce aproximadamente 1 °C por cada 1 % de falta de coincidencia; por lo tanto, la Tm, las condiciones de hibridación y/o lavado pueden ajustarse para hibridizarse con las secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se busca secuencias con ³90 % de identidad, la Tm se puede disminuir 10 °C. Generalmente, se seleccionan las condiciones rigurosas para qüe sean aproximadamente 5 °C más bajas que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia especifica y su complemento, con una fuerza iónica y un pH definidos. No obstante, las condiciones muy rigurosas pueden usar una hibridación y/o un lavado a l, 2, 3 o 4 °C menos que el punto de fusión térmica (Tm); las condiciones moderadamente rigurosas pueden usar una hibridación y/o un lavado a 6, 7, 8, 9 o 10 °C menos que el punto de fusión térmica (Tm); las condiciones de baja rigurosidad pueden usar una hibridación y/o un lavado a 11, 12, 13, 14, 15 o 20 °C menos que el punto de fusión térmica (Tm). Al usar la ecuación, las composiciones de hibridación y lavado, y la Tm deseada, las personas con conocimiento ordinario en la materia comprenderán que se describen esencialmente variaciones en el rigor de las soluciones de hibridación y/o lavado. Si el grado de desapareamiento deseado resulta en una Tm menor que 45 °C (solución acuosa) o 32 °C (solución de formamida) se prefiere aumentar la concentración del SSC de manera tal que pueda usarse una temperatura más alta. Una guia extensa sobre la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Laboratory Techniques ín Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, parte I, capitulo 2, “OverView of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays,” Elsevier, New York (1993); y Current Protocols in Molecular Biology, capitulo 2, Ausubel, et al. , eds, Greene Publishing and Wilcy-Interscience, New York (1995). A menos que se indique de cualquier otra manera, en la presente solicitud “alta rigurosidad” se define como la hibridación en SSC 4X, solución de Denhardt 5X (5 g de Ficoll, 5 g de polivinilpirrolidona, 5 g de albúmina sérica bovina en 500 mi de agua), ADN de esperma de salmón hervido a 0.1 mg/ml y 25 mM de fosfato de Na a 65 °C y un lavado en SSC 0.1X, SDS al 0.1 % a 65 °C.

Como se usa en la presente descripción, “planta transgénica” incluye lo referente a una planta que comprende en su genoma un polinucleótido heterólogo. Generalmente, el polinucleótido heterólogo está integrado de manera estable dentro del genoma de manera tal que el polinucleótido se transmita a las generaciones sucesivas. El polinucleótido heterólogo se puede integrar en el genoma solo o como parte de un casete de expresión recombinante. El término “transgénico” se usa en la presente descripción para incluir cualquier célula, linea celular, callo, tejido, parte de una planta o planta cuyo genotipo ha sido alterado con la presencia de ácidos nucleicos heterólogos que incluyen los transgénicos alterados inicialmente, asi como los creados por cruces sexuales o propagación asexual a partir del transgénico inicial. Como se usa en la presente descripción, el término “ transgénico” no abarca la alteración del genoma (cromosómico o extracromosómico) por métodos convencionales de cultivo vegetal o por eventos de origen natural, tales como fertilización cruzada aleatoria, infección viral no recombinante, transformación bacteriana no recombinante, transposición no recombinante o mutación espontánea.

Como se usa en la presente descripción, “vector” incluye la referencia a un ácido nucleico que se usa en la transfección de una célula huésped y en la cual puede insertarse un polinucleótido. Los vectores son, frecuentemente, replicones. Los vectores de expresión permiten la transcripción de un ácido nucleico insertado allí.

Los siguientes términos se usan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más ácidos nucleicos o polinucleótidos o polipéptidos: (a) “secuencia de referencia”, (b) “ventana de comparación”, (c) “identidad de secuencia”, (d) “porcentaje de identidad de secuencia” y (e) “identidad sustancial”.

Como se usa en la presente descripción, “secuencia de referencia” es una secuencia definida que se usa como base para la comparación de secuencias . Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la totalidad de una secuencia especificada; por ejemplo, como un segmento de ADNc de longitud completa o secuencia génica o el ADNc completo o secuencia génica.

Como se usa en la presente descripción, “ventana de comparación” significa que incluye la referencia a un segmento contiguo y especifico de una secuencia de polinucleótidos, en donde la secuencia de polinucleótidos puede compararse con una secuencia de referencia y en donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, interrupciones) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones ni deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. Generalmente, la ventana de comparación tiene por lo menos 20 nucleótidos contiguos de longitud y, opcionalmente, puede tener 30, 40, 50, 100 o más. Los expertos en la materia comprenden que para evitar una alta similitud con una secuencia de referencia debido a la inclusión de interrupciones, se introduce en la secuencia de polinucleótidos, típicamente, una penalización de interrupción y se sustrae de la cantidad de coincidencias.

Los métodos de alineamiento de nucleótidos y las secuencias de aminoácidos para la comparación se conocen bien en la materia. El algoritmo de homología local (BESTFIT) de Smith y Waterman, ( 1981 ) Adv. Appl . Math 2:482, puede realizar un alineamiento óptimo de las secuencias para su comparación; por el algoritmo de alineamiento de homología (GAP) de Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol . Biol . 48:443-53; por la búsqueda del método de similitud (Tfasta y Fasta) de Pearson y Lipman, (1988) Proc. Nati . Acad. Sci . Estados Unidos 85:2444; por implementaciones computerizadas de estos algoritmos que incluyen, pero no se limitan a: CLUSTAL en el programa PC/Gene de Intelligenetics, Mountain View, California, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el paquete de programas Wisconsin Genetics, versión 8 (disponible de Genetics Computer Group (programas GCG® (Accelrys, Inc., San Diego, CA).). El programa CLUSTAL fue descrito en detalle por Higgins y Sharp, (1988) Gene 73:237-44; Higgins y Sharp, (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet, et al . , (1988) ácidos nucleicos Res . 16:10881-90; Huang, et al . , (1992) Computer Applications in the Biosciences 8:155-65 y Pearson, et al . , (1994) Meth . Mol . Biol . 24:307-31. El programa preferido para usar para el alineamiento global óptimo de múltiples secuencias es PileUp (Feng and Doolittle, (1987) J. Mol . Evol . , 25:351-60 que es similar al método descrito por Higgins y Sharp, (1989) CABIOS 5:151-53 y que se incorpora de este modo en la presente descripción como referencia) . La familia de programas de BLAST que puede usarse para búsquedas de similitud en la base de datos incluye: BLASTN para búsquedas de secuencias de nucleótidos en bases de datos de secuencias de nucleótidos; BLASTX para búsquedas de secuencias de nucleótidos en bases de datos de secuencias de proteínas; BLASTP para búsquedas de secuencias de proteínas en bases de datos de secuencias de proteínas; TBLASTN para búsquedas de secuencias de proteínas en bases de datos de secuencias de nucleótidos y TBLASTX para búsquedas de secuencias de nucleótidos en bases de datos de secuencias de nucleótidos. Véase, Current Protocols ín Molecular Biology, Capítulo 19, Ausubel et al. , eds., Greené Publishing and Wilcy-Interscience, New York (1995).

El GAP usa el algoritmo de Needle an y Wunsch, más arriba, para buscar el alineamiento de dos secuencias completas que maximizan el número de coincidencias y minimiza el número de interrupciones. GAP toma en consideración todos los alineamientos posibles, así como las posiciones de interrupción y crea el alineamiento con la mayor cantidad de bases coincidentes y la menor cantidad de interrupciones. Permite proporcionar la penalización de creación de interrupciones y una penalización de extensión de interrupciones en unidades de bases coincidentes. GAP debe beneficiarse de la cantidad de penalizaciones de creación de interrupciones de coincidencias para cada interrupción que inserta. Si se selecciona una penalización de extensión de interrupciones mayor que cero, GAP debe, adicionalmente, obtener beneficios para cada interrupción insertada de la longitud por la penalización de extensión de interrupción. Los valores predeterminados de penalización de creación de interrupciones y de penalización de extensión de interrupciones en la versión 10 del paquete de programas de Wisconsin Genetics Software Package son 8 y 2, respectivamente. La creación de interrupciones y las penalizaciones de creación de interrupciones pueden expresarse como un entero seleccionado del grupo de enteros que consisten en 0 a 100. Asi, por ejemplo, la creación de interrupciones y las penalizaciones de creación de interrupciones pueden ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50 o mayores.

GAP presenta un miembro de la familia de los mejores alineamientos. Puede haber muchos miembros de esta familia, pero ningún otro miembro tiene mejor calidad. GAP muestra cuatro figuras de mérito para alineamientos: calidad, relación, identidad y similitud. La calidad es la medida maximizada para alinear las secuencias. La relación es la calidad dividida por la cantidad de bases en el segmento más corto. La identidad porcentual es el porcentaje de los símbolos que realmente coinciden. La similitud porcentual es el porcentaje de los símbolos que son similares. Los símbolos que están en las interrupciones se ignoran. Una similitud se determina cuando el valor de la matriz de puntajes para un par de símbolos es mayor o igual que 0.50, el umbral de similitud. La matriz de puntajes que se usa en la versión 10 del paquete de programas Wisconsin Genetics Software Package es BLOSUM62 (Ver, Henikoff y Henikoff, (1989) Proc. Nati . Acad. Sci . Estados Unidos 89:10915).

A menos que se indique de otra manera, los valores de identidad/similitud de secuencia proporcionados en la presente descripción se refieren al valor obtenido por medio del uso del paquete de programas BLAST 2.0 que usa parámetros por defecto (Altschul, et ai., (1997) Nucleic Acids Res . 25:3389-402) .

Como entenderán las personas de habilidad ordinaria en la materia, las búsquedas BLAST asumen que las proteínas pueden modelarse como secuencias aleatorias. Sin embargo, muchas proteínas reales comprenden regiones de secuencias no aleatorias, las que pueden ser tractos homopoliméricos, repeticiones de período corto, o regiones enriquecidas en uno o más aminoácidos. Tales regiones de baja-complejidad pueden alinearse entre proteínas no reguladas aunque otras regiones de la proteína son completamente disímiles. Un número de programas filtro de baja-complejidad pueden emplearse para reducir esos alineamientos de baja-complejidad. Por ejemplo, los filtros SEG (Wooten y Federhen, (1993) Comput . Chem. 17:149-63) y XNU (Claverie y States, (1993) Comput . Chem . 17:191-201) de baja complejidad pueden emplearse solos o combinados.

Como se usa en la presente descripción, “identidad de secuencia” o “identidad” en el contexto de dos secuencias de ácido nucleico o polipéptidos incluyen referencia a los residuos en las dos secuencias, los que son iguales cuando están alineadas para la máxima correspondencia en una ventana de comparación especifica. Cuando el porcentaje de identidad de secuencia se usa en referencia a proteínas, se reconoce que las posiciones de los residuos que no son idénticas difieren, frecuentemente, por sustituciones de aminoácidos conservadoras, en donde los residuos de aminoácidos se sustituyen por otros residuos de aminoácidos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y, por lo tanto, no alteran las propiedades funcionales de la molécula. En donde las secuencias difieren de sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencias se puede ajustar ascendentemente para lograr la naturaleza conservadora de la sustitución. Las secuencias que difieren en sustituciones conservadoras, se dice que tiene “similitud de secuencia” o “similitud”. Los medios para hacer este ajuste son conocidos por aquellos con experiencia en la materia. Típicamente, esto requiere el puntaje de una sustitución conservativa como una falta de coincidencia parcial y no completa; así, se incrementa el porcentaje de identidad de secuencia. Por lo tanto, por ejemplo, en donde a un aminoácido idéntico se le da un puntaje de 1 y a una sustitución no conservadora se le da un puntaje de 0, a una sustitución conservadora se le da un puntaje entre 0 y 1. Los puntajes de las sustituciones conservadoras se calculan, por ejemplo, de acuerdo con el algoritmo de Mcyers y Miller, (1988) Computer Applic. Biol . Sci . 4:11-17, por ejemplo, como se implemento en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California, Estados Unidos).

Como se usa en la presente descripción, “porcentaje de identidad de secuencias” se refiere al valor determinado por la comparación de dos secuencias óptimamente alineadas en una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, interrupciones) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones ni deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. Para calcular el porcentaje se determina la cantidad de posiciones en las cuales se produce la base de ácido nucleico o el residuo de aminoácidos idéntico en las dos secuencias para obtener la cantidad de posiciones coincidentes, se divide la cantidad total de posiciones coincidentes por la cantidad total de posiciones en la ventana de comparación y el resultado se multiplica por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia.

El término “identidad sustancial” de secuencias de polinucleótidos se refiere a un polinucleótido que comprende una secuencia que tiene entre 50-100 % de identidad de secuencia, preferentemente, al menos 50 % de identidad de secuencia, preferentemente, al menos 60 % de identidad de secuencia, preferentemente, al menos 70 %, con mayor preferencia, al menos 80 %, con mayor preferencia, al menos 90 % y, con la máxima preferencia, al menos 95 %, comparado con una secuencia de referencia con el uso de uno de los programas de alineamiento descritos por medio del uso de parámetros estándares. Una persona con experiencia reconocerá que esos valores pueden ajustarse adecuadamente para determinar la identidad de proteínas correspondiente codificada por dos secuencias de nucleótidos teniendo en cuenta la degeneración del codón, la similitud del aminoácido, el posicionamiento del marco de lectura y similares. La identidad sustancial de la secuencia de aminoácidos para estos propósitos normalmente significa una identidad de secuencia de entre 55-100 %, preferentemente, al menos 55 %, preferentemente, al menos 60 %, con mayor preferencia, al menos 70 %, 80 %, 90 % y con la máxima preferencia, al menos 95 %.

Los términos “identidad sustancial” en el contexto de un péptido indica que un péptido comprende una secuencia con entre 55-100 % de identidad de secuencia con una secuencia de referencia preferentemente, al menos 55 % de identidad de secuencia, preferentemente, 60 % preferentemente, 70 %, con mayor preferencia, 80 %, con la máxima preferencia, al menos 90 % o 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de referencia en una ventana de comparación especificada Preferentemente, el alineamiento óptimo se realiza con el uso del algoritmo de alineamiento por homología de Needleman y Wunsch, más arriba . Una indicación de que dos secuencias de péptidos son prácticamente idénticas es que un péptido es inmunológicamente reactivo con anticuerpos obtenidos contra el segundo péptido. Así, un péptido es prácticamente idéntico a un segundo péptido, por ejemplo, donde los dos péptidos difieren solamente en una sustitución conservadora. Adicionalmente, un péptido puede ser prácticamente idéntico a un segundo péptido cuando difiere en un cambio no conservador si el epítopo que reconoce el anticuerpo es prácticamente idéntico. Los péptidos que son “prácticamente similares” comparten secuencias como se denotó anteriormente, excepto que las posiciones del residuo que nos son idénticas pueden diferir por cambios conservadores del aminoácido.

Tabla 1 Construcción de ácidos nucleicos Los ácidos nucleicos aislados de la presente descripción pueden elaborarse con el uso de (a) métodos recombinantes estándar, (b) téenicas de síntesis o combinaciones de estos. En algunas modalidades, los polinucleótidos de la presente descripción se clonarán, amplificarán o de cualquier otra forma se construirán a partir de un hongo o una bacteria.

UTR y preferencia codónica Generalmente, se encontró que la eficiencia de la traducción se regula por medio de elementos específicos de la secuencia en la región no codificante o la región sin traducir 5' (5' UTR) del ARN. Los motivos secuenciales positivos incluyen secuencias consenso de iniciación de la transcripción (Kozak, (1987) Nucleic Acids Res. 15:8125) y las estructuras 5 <G> 7 metil GpppG ARN cap (Drummond, et al . , (1985) Nucleic Acids Res . 13:7375). Los elementos negativos incluyen estructuras de tallo-lazo intramolecular 5' UTR estables (Muesing, et ai., (1988) Cell 48:691) y secuencias AUG o marcos de lectura abiertos cortos precedidos por una AUG adecuada en el 5' UTR (Kozak, más arriba, Rao, et ai., (1998) Mol . and Cell . Biol.8:284). Por lo tanto, la présente descripción proporciona regiones UTR 5' y/o 3' para modular la traducción de las secuencias codificantes heterólogas.

Además, los segmentos codificadores de polipéptidos de los polinucleótidos de la presente descripción pueden modificarse para alterar el uso de codones. El uso alterado de codones puede emplearse para alterar la eficiencia traduccional y/o para optimizar la secuencia codificante para la expresión en un huésped deseado o para optimizar el uso de codones en una secuencia heteróloga para la expresión en maíz. El uso de codones en las regiones codificantes de los polinucleótidos de la presente descripción puede analizarse estadísticamente con el uso de paquetes de programas disponibles comercialmente, tales como el de “preferencia codónica” disponible de la University of Wisconsin Genetics Computer Group. Ver, Devereaux, et al . , (1984) Nucleic Acíds Res . 12:387-395) o MacVector 4.1 (Eastman Kodak Co., New Haven, CN). Por lo tanto, la presente descripción proporciona una frecuencia del uso de codones característica de la región codificante de por lo menos uno de los polinucleótidos de la presente descripción. El número de polinucleótidos (3 nucleótidos por aminoácido) que pueden usarse para determinar una frecuencia del uso de codones puede ser cualquier entero desde 3 hasta el número de polinucleótidos de la presente descripción que se proporciona en la presente. Opcionalmente, los polinucleótidos serán secuencias de longitud completa. Un número ilustrativo de secuencias para el análisis estadístico puede ser al menos 1, 5, 10, 20, 50 o 100. jado de secuencias La presente descripción proporciona métodos para el barajado de secuencias con el uso de polinucleótidos de la presente descripción y composiciones resultantes de estos. La permutación de secuencias se describe en la publicación PCT número 1996/19256. Véase, además, Zhang, et ai., (1997) Proc. Nati . Acad. Sci . Estados Unidos 94:4504-9 and Zhao, et al., (1998) Nature Biotech 16:258-61. Generalmente, la permutación de secuencias proporciona un medio para generar genotecas de polinucleótidos que tienen una característica deseada, que puede seleccionarse o ensayarse. Las genotecas de polinucleótidos recombinantes se generan a partir de una población de polinucleótidos de secuencias relacionadas, que comprenden regiones de secuencias que tienen una identidad de secuencia sustancial y pueden recombinarse homólogamente in vitro o in vivo. La población polinucleótidos de secuencias recombinadas comprende una subpoblación de polinucleótidos que poseen características deseables o ventajosas y las que pueden seleccionarse por un método de selección o ensayo adecuado. Las características pueden ser cualquier propiedad o atributo que se pueda seleccionar o detectar en un sistema de selección, y pueden incluir las propiedades de: una proteína codificada, un elemento transcripcional, una secuencia de control de la transcripción, procesamiento de ARN, estabilidad del ARN, conformación de cromatina, traducción u otra propiedad de expresión de un gen o transgén, un elemento replicador, un elemento de unión a la proteina o similares, tales como cualquier característica que confiera una propiedad seleccionable o detectable. En algunas modalidades, la característica seleccionada será una Km y/o Kcat alterada sobre la proteína silvestre como se proporciona en la presente descripción. En otras modalidades, una proteína o polinucleótido generado a partir de la permutación de secuencias tendrá una afinidad de unión del ligando mayor que el polinucleótido silvestre sin permutar. En aún otras modalidades, una proteína o polinucleótido generado a partir de la permutación de secuencias tendrá un pH óptimo alterado cuando se compara con el polinucleótido silvestre sin permutar. El incremento en esas propiedades puede ser al menos 110 ¾, 120 %, 130 %, 140 % o mayor que 150 % del valor silvestre .

Casetes de expresión recombinante La presente descripción proporciona, además, casetes de expresión recombinante que comprenden un ácido nucleico de la presente descripción. Una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polinucleótido deseado de la presente descripción, por ejemplo, un ADNc o una secuencia genómica que codifica un Polipéptido con la longitud suficiente para codificar una proteina activa de la presente descripción, puede usarse para construir un casete de expresión recombinante que puede introducirse en la célula hospedera deseada. Un casete de expresión recombinante comprende, típicamente, un polinucleótido de la presente descripción unido operativamente a secuencias reguladoras de la iniciación transcripcional que dirigen la transcripción del polinucleótido en la célula hospedera deseada, tales cómo tejidos de una planta transformada.

Por ejemplo, los vectores de expresión de la planta pueden incluir (1) un gen de la planta clonado bajo el control transcripcional de las secuencias reguladoras 5' y 3' y (2) un marcador seleccionable dominante. Esos vectores de expresión de la planta pueden contener, además, si se desea, una región promotora reguladora (por ejemplo, una que otorgue una expresión selectiva/específica de una célula o tejido, que sea inducible o constitutiva, regulada ambientalmente o en relación con el desarrollo), un sitio de iniciación de la transcripción, un sitio de unión con el ribosoma, una señal de procesamiento de ARN, un sitio de terminación de la transcripción y/o una señal de poliadenilación.

Puede usarse un fragmento promotor de la planta para dirigir la expresión de un polinucleótido de la presente descripción, esencialmente, en todos los tejidos de una planta regenerada. Tales promotores se mencionan en la presente descripción como promotores “constitutivos” y se encuentran activos en la mayoría de condiciones ambientales y estados de desarrollo o diferenciación celular. Los ejemplos de promotores constitutivos incluyen el promotor 1' o 2 ' derivado de ADN-T de Agrobacterium turne faciens , el promotor Smas, el promotor de alcohol cinamílico deshidrogenasa (patente de los Estados Unidos núm.5,683,439), el promotor Nos, el promotor rubisco, el promotor GRP1-8, el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), tal como se describe en Odell, et al . , (1985) Nature 313:810-2; actina de arroz (McElroy, et al . , (1990) Plant Cell 163-171); ubiquitina (Christensen, et al . , (1992) Plant Mol . Biol . 12:619-632 y Christensen, et ai., (1992) Plant Mol . Biol . 18:675-89); pEMU (Last, et al . , (1991) Theor . Appl . Genet . 81:581-8); MAS (Velten, et al . , (1984) EMBO J. 3:2723-30) e histona H3 de maíz (Lepetit, et al . , (1992) Mol . Gen . Genet . 231:276-85 y Atanassvoa, et al . , (1992) Plant Journal 2 (3):291-300); el promotor ALS, tal como se describe en la solicitud del PCT núm. WO 1996/30530 y otras regiones de iniciación de la transcripción de varios genes de plantas conocidos para las personas con experiencia en la materia. Para la presente descripción, la ubiquitina es el promotor preferido para la expresión en plantas monocotiledóneas.

Alternativamente, el promotor de la planta puede dirigir la expresión de un polinucleótido de la presente descripción en un tejido específico o puede estar de cualquier otra manera bajo un control del desarrollo o medioambiental más preciso. Tales promotores pueden ser promotores “inducibles”. Las condiciones ambientales que pueden efectuar la transcripción por los promotores inducibles incluyen ataque de patógenos, condiciones anerobias o la presencia de luz. Los ejemplos de promotores inducibles son el promotor Adhl, que es inducible por hipoxia o estrés por frío, el promotor Hsp70, que es inducible por estrés al calor y el promotor PPDK, que es inducible por la luz. Además, se conocen los promotores diurnos que son activos en momentos diferentes durante el ritmo circadiano (publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2011/0167517, incorporada en la presente descripción como referencia).

Como ejemplos de promotores bajo control de desarrollo se incluyen aquellos que inician la transcripción solamente o, preferentemente, en ciertos tejidos tales como hojas, raíces, frutos, semillas o flores. La operación de un promotor puede variar, además, dependiendo de su lugar en el genoma. Así, un promotor inducible puede hacerse completamente o parcialmente constitutivo en ciertos lugares.

Si se desea la expresión del polipéptido, se prefiere, generalmente, incluir una región de poliadenilación en el extremo 3' de una región codificante del polinucleótido. La región de poliadenilación puede derivarse de una variedad de genes de las plantas, o de T-ADN. La secuencia del extremo 3' que se añadirá puede obtenerse, por ejemplo, de los genes de nopalina sintasa o de octopina sintasa o, alternativamente, de otro gen vegetal o, con menor preferencia, de cualquier otro gen eucariota. Los ejemplos de tales elementos reguladores incluyen, pero no se limitan a, las regiones de poliadenilación y/o terminación en 3', tales como las del gen de nopalina sintasa (nos) de Agrobacterium tumefaciens (Bevan, et al. , (1983) Nucleic Acíds Res . 12:369-85); el gen inhibidor de la proteinasa de la papa II (PINII) (Keil, et al . , (1986) Nucleic Acíds Res. 14:5641-50 y An, et al . , (1989) Plant Cell 1:115-22) y el gen CaV 19S (Mogen, et al . , (1990) Plant Cell 2:1261-72).

Se puede agregar una secuencia de intrones a la región 5' no traducida o la secuencia codificante de la secuencia codificante parcial para incrementar la cantidad de mensaje maduro que se acumula en el citosol. La inclusión de un intrón divisible en la unidad de transcripción en las construcciones de expresión, tanto de plantas como de animales, demostró que aumenta la expresión génica tanto en los niveles de ARNm y proteina hasta 1000 veces (Buchman y Berg, (1988) Mol . Cell Biol . 8:4395-4405; Callis, et al . , (1987) Genes Dev. 1:1183-200). Dicho mejoramiento de intrones de expresión genética es, típicamente, mayor cuando se coloca cerca del extremo 5' de la unidad de transcripción. Se conoce en la materia el uso de intrones de maíz Adhl-S intrón 1, 2 y 6, el intrón Bronze-1. Véase, generalmente, The Maize Handbook, Capitulo 116, Freeling and Walbot, eds., Springer, New York (1994).

Las secuencias señales de la planta gue incluyen, pero no se limitan al, péptido señal que codifica las secuencias de ADN/ARN que dirige las proteínas a la matriz extracelular de la célula vegetal (Dratewka-Kos, et al . , (1989) J. Biol . Chem. 264:4896-900), tal como el gen de extensión de Nicotiana plumbagini folia (DeLoose, et al . , (1991) Gene 99:95-100); los péptidos señal que orientan las proteínas a la vacuola, tal como el gen de la esporamina de boniato (Matsuka, et al . , (1991) Proc. Nati . Acad. Sci . Estados Unidos 88:834) y el gen de la lectina de la cebada (Wilkins, et al . , (1990) Plant Cell, 2:301-13); los péptidos señal que permiten la secreción de proteínas, tales como PRIb (Lind, et al . , (1992) Plant Mol . Biol . 18:47-53) o la alfa amilasa de cebada (BAA) (Rahmatullah, et al . , (1989) Plant Mol . Biol . 12:119 incorporadas como referencia por medio de la presente) o los péptidos señal que dirigen las proteínas a los plástidos tales como el de enoil-Acp reductasa de semilla de colza (Verwaert, et al . , (1994) Plant Mol . Biol . 26:189-202) son útiles en la presente descripción.

El vector que comprende las secuencias de un polinucleótido de la presente descripción comprende, típicamente, un gen marcador, que confiere un fenotipo seleccionable en las células vegetales. Usualmente, el gen marcador seleccionable codificará para la resistencia a los antibióticos, con los genes adecuados que incluyen los genes que codifican para la resistencia al antibiótico espectinomicina (por ejemplo, el gen aada), el gen de estreptomicina fosfotransferasa (SPT) que codifica para la resistencia a la estreptomicina, el gen de neomicina fosfotransferasa (NPTII) que codifica para la resistencia a la canamicina o geneticina, el gen higromicina fosfotransferasa (HPT) que codifica para la resistencia a la higromicina, los genes que codifican para la resistencia a herbicidas que actúan para inhibir la acción de la acetolactato sintasa (ALS), particularmente los herbicidas de tipo sulfonilurea (por ejemplo, el gen de acetolactato sintasa (ALS) que contiene mutaciones que conducen a esa resistencia particularmente las mutaciones S4 y/o Hra), los genes que codifican para la resistencia a herbicidas que actúan para inhibir la acción de la glutamina sintasa, tales como fosfinotricina o basta (por ejemplo, el gen bar) , u otros genes de este tipo conocidos en la materia. El gen bar codifica para la resistencia al herbicida basta y el gen ALS codifica para la resistencia al herbicida clorsulfurón.

Expresión de inas en células huésped Con el uso de los ácidos nucleicos de la presente descripción se puede expresar una proteina de la presente descripción en una célula modificada de manera recombinante, tales como células bacterianas, de levadura, insectos, mamíferos o, preferentemente, células vegetales. Las células producen la proteína en una condición no natural (por ejemplo, en cantidad, composición, lugar y/o tiempo), debido a que se alteraron genéticamente a través de la intervención humana para hacerlo.

Se espera que las personas con experiencia en la materia conozcan los numerosos sistemas de expresión disponibles para la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteína de la presente descripción. No se hará ningún intento para describir en detalle los diversos métodos conocidos para la expresión de proteínas en procariotas o eucariotas .

En resumen, la expresión de ácidos nucleicos aislados que codifican una proteína de la presente descripción se obtiene, típicamente, cuando se une operativamente, por ejemplo, el ADN o ADNc a un promotor (que es constitutivo o inducible), seguido por la incorporación en un vector de expresión. Los vectores pueden ser adecuados para la replicación e integración en procariotas o eucariotas. Los vectores de expresión típicos contienen terminadores de transcripción y de traducción, secuencias de iniciación y promotores útiles para regular la expresión del ADN que codifica para una proteina de la presente descripción. Para obtener un alto nivel de expresión de un gen clonado, se prefiere construir vectores de expresión que contengan, como mínimo, un promotor fuerte, tal como ubiquitina, para dirigir la transcripción, un sitio de unión al ribosoma para la iniciación traduccional y un terminador de la transcripción/traducción. Los promotores constitutivos se clasifican para facilitar un intervalo de expresión constitutiva. Así, algunos son promotores constitutivos débiles y otros son promotores constitutivos fuertes. Generalmente, “promotor débil” se refiere a un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificante a un nivel bajo. “Nivel bajo” se refiere a niveles de aproximadamente 1/10,000 transcripciones a aproximadamente 1/100,000 transcripciones a aproximadamente 1/500,000 transcripciones. Contrariamente, un “promotor fuerte” dirige la expresión de una secuencia codificante a un “nivel alto” o aproximadamente 1/10 transcripciones a aproximadamente 1/100 transcripciones a aproximadamente 1/1000 transcripciones.

Un experto reconocería que es posible hacer modificaciones a una proteína de la presente descripción sin disminuir su actividad biológica. Algunas modificaciones pueden realizarse para facilitar la clonación, expresión o incorporación de la molécula objetivo en una proteina de fusión. Las personas con experiencia en la materia conocen bien tales modificaciones e incluyen, por ejemplo, una metionina añadida en el terminal amino para proporcionar un sitio de iniciación o aminoácidos adicionales (por ejemplo, poli His) situados en cada terminal para crear sitios de restricción convenientemente localizados o codones de terminación o secuencias de purificación.

Expresión en procariotas Las células procariotas pueden usarse como huéspedes para la expresión. Con mayor frecuencia, las procariotas están representadas por diversas cepas de E. coli; no obstante, también se pueden usar otras cepas microbianas. Las secuencias control procariotas usadas comúnmente que se definen en la presente descripción para incluir los promotores para la iniciación de la transcripción, opcionalmente con un operador, conjuntamente con las secuencias del sitio de unión al ribosoma, incluyen esos promotores usados comúnmente como los sistemas promotores de beta lactamasa (penicilinasa) y lactosa (lac) (Chang, et al., (1977) Nature 198:1056), el sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel, et al., (1980) Nucleic Acíds Res. 8:4057) y el promotor P L derivado de lambda y el sitio de unión al ribosoma del gen N (Shimatake, et al., (1981) Nature 292:128). Además, es útil la inclusión de marcadores de selección en los vectores de ADN transfectados en E. coli . Los ejemplos de tales marcadores incluyen genes de resistencia especifica a la ampicilina, tetracielina o cloranfenicol.

El vector se selecciona para permitir la introducción del gen de interés en la célula huésped adecuada Los vectores bacterianos son, típicamente, de origen plásmido o fago. Las células bacterianas adecuadas se infectan con las partículas del vector fago o transfectadas con ADN del vector fago desnudo. Si se usa un vector plásmido, las células bacterianas se transfectan con el ADN del vector plásmido. Los sistemas de expresión para expresar una proteína de la presente descripción están disponibles con el uso de Bacillus sp. y Salmonella (Palva, et al . , (1983) Gene 22:229-35; Mosbach, et al., (1983) Na ture 302:543-5). El vector plasmídico pGEX-4T-l de Pharmacia es el vector de expresión de E. coli preferido para la presente descripción.

Expresión en eucariotas Una variedad de sistemas de expresión eucariotas tales como levadura, líneas celulares de insectos, células vegetales y de mamífero, son del conocimiento de las personas con experiencia en la materia. Como se explica brevemente a continuación, la presente descripción puede expresarse en estos sistemas eucariotas. En algunas modalidades, las células vegetales transformadas/tránsfectadas, como se menciona más abajo, se usan como sistemas de expresión para la producción de proteínas de la presente descripción.

La síntesis de proteínas heterólogas en levadura es muy conocida. Sherman, et al . , (1982) Methods in Yeast Genetics , Coid Spring Harbor Laboratory es un trabajo conocido que describe varios métodos disponibles para producir la proteína en levadura. Dos levaduras ampliamente usadas para la producción de proteínas eucariotas son Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris. Los vectores, cepas y protocolos de expresión en Saccharomyces y Pichia se conocen en la téenica y están disponibles de suministradores comerciales (por ejemplo, Invitrogen). Los vectores adecuados tienen, generalmente, secuencias control de expresión, tales como los promotores, que incluyen 3-fosfoglicerato quinasa o alcohol oxidasa y un origen de replicación, secuencias de terminación y similares según se desee.

Una proteína de la presente descripción, una vez expresada, puede aislarse de la levadura mediante el lisado de las células y la aplicación de técnicas estándar de aislamiento de proteínas a los Usados o microesferas. El monitoreo del proceso de purificación puede llevarse a cabo con el uso de técnicas de Membrana de Western o por radioinmunoensayo de otras técnicas de inmunoensayo estándar.

Las secuencias que codifican proteínas de la presente descripción pueden ligarse, además, a diversos vectores de expresión para usar en cultivos de células transíectadas, por ejemplo, de mamíferos, de insectos o de plantas. Los sistemas de células de mamíferos estarán, frecuentemente, en forma de monocapas de células, aunque se pueden usar, además, suspensiones de células de mamíferos. Un número de líneas de células huésped adecuadas capaces de expresar las proteínas intactas se desarrollaron en la materia, e incluyen las líneas celulares HEK293, BHK21 y CHO. Los vectores de expresión para estas células pueden incluir las secuencias control de expresión, tales como un origen de replicación, un promotor (por ejemplo, el promotor CMV, un promotor HSV tk o el promotor pgk (fosfoglicerato quinasa)), un potenciador (Queen, et al . , (1986) Immunol . Rev. 89:49) y sitios de información de procesamiento necesarios, tales como los sitios de unión al ribosoma, los sitios de empalme ARN, sitios de poliadenilación (por ejemplo, un sitio de adición poli A SV40 largo T Ag) y secuencias terminadoras transcripcionales. Otras células animales útiles para la producción de proteínas de la presente descripción se encuentran disponibles, por ejemplo, del catálogo Cell Lines and Hybridomas de la Colección americana de cultivos tipo (7.° ed., 1992).

Los vectores adecuados para expresar las proteínas de la presente descripción en células de insectos se derivan, usualmente, del baculovirus SF9. Las líneas celulares de insectos adecuadas incluyen las líneas celulares de larvas de mosquito, gusano de seda, gusano soldado, polilla y Drosophila, tales como una línea celular Schneider (ver, por ejemplo, Schneider, (1987) J. Embryol . Esp. Morphol . 27:353-65).

Al igual que con la levadura, cuando se emplean células vegetales huésped o de animal superiores, las secuencias terminadoras de la transcripción o de poliadenilación se incorporan, típicamente, en el vector. Un ejemplo de una secuencia terminadora es la secuencia de poliadenilación del gen de la hormona del crecimiento bovino. Pueden incluirse, además, las secuencias para un empalme preciso de la transcripción. Un ejemplo de una secuencia de empalme es el intrón VP1 de SV40 (Sprague, et al . , (1983) J. Virol . 45:773-81). Además, las secuencias de genes para controlar la reproducción en la célula huésped se pueden incorporar en el vector, tales como las que se encuentran en los vectores tipo virus del papiloma bovino (Saveria-Campo, “Bovine Papilloma Virus DNA a Eukaryotic Cloning Vector” en DNA Cloning: A Practical Approach, vol. II, Glover, ed., IRL Press, Arlington, VA, págs.213-38 (1985)).

Adicionalmente, el gen NUE situado en el vector de expresión adecuado de la planta puede usarse para transformar las células vegetales. El polipéptido puede aislarse después del callo de la planta o las células transformadas pueden usarse para regenerar las plantas transgénicas. Tales plantas transgénicas pueden cosecharse, y los tejidos adecuados (semilla u hojas, por ejemplo) pueden someterse a téenicas de purificación y extracción de proteina a gran escala.

Métodos de transformación de las plantas Se conocen numerosos métodos para introducir genes extraños en las plantas y pueden usarse para insertar un polinucleótido NUE en un hospedero vegetal, que incluyen los protocolos biológicos y físicos de transformación de la planta. Ver, por ejemplo, Miki et ai., “Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants” en Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick and Thompson, eds., CRC Press, Inc., Boca Ratón, págs.67-88 (1993). Los métodos elegidos varían en función de la planta hospedera e incluyen métodos de transfección química, tales como fosfato cálcico, transferencia de genes mediada por microorganismos tales como Agrobacterium (Horsch, et al . , (1985) Science 227:1229-31), electroporación, microinyección y bombardeo biolístico.

Los casetes de expresión y vectores y los métodos de cultivo in vítro para la transformación y regeneración de tejido o célula vegetal de plantas se conocen y se encuentran disponibles. Ver, por ejemplo, Gruber, et al . , “Vectors for Plant Transíormation” en Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, supra, págs. 89-119.

Los polinucleótidos o polipéptidos aislados pueden introducirse en la planta por una o más téenicas usadas, típicamente, para la entrega directa en las células. Tales protocolos pueden variar según el tipo de organismo, célula, planta o célula vegetal, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea que se selecciona para la modificación génica. Los métodos adecuados para transformar las células vegetales incluyen la microinyección (Crossway, et al. , (1986) Biotechniques 4:320-334 y la patente de los Estados Unidos núm. 6,300,543), electroporación (Riggs, et al . , (1986) Proc. Nati .

Acad. Sci . Estados Unidos 83:5602-5606, transferencia directa de genes (Paszkowski et al . , (1984) EMBO J. 3:2717-2722) y aceleración balística de partículas (ver, por ejemplo, Sanford, et al . , patente de los Estados Unidos núm.4,945,050; patente núm. WO 1991/10725 y McCabe, et al . , (1988) Biotechnology 6:923-926). Ver, además, Tomes, et al . , “Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells Via Microprojectile Bombardment” págs. 197-213 en Plant Cell , Tissue and Organ Culture, Fundamental Methods. eds. Gamborg and Phillips. Springer-Verlag Berlín Heidelberg New York, 1995; patente de los Estados Unidos núm. 5,736,369 (meristema); Weissinger, et al. , (1988) Ann. Rev. Genet . 22:421-477; Sanford, et al . , (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebolla); Christou, et al . , (1988) Plant Physiol . 87:671-674 (frijol de soja); Datta, et al . , (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein, et al . , (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 85:4305-4309 (maíz); Klein, et al., (1988) Biotechnology 6:559-563 (maíz); patente núm. WO 1991/10725 (maíz); Klein, et al., (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (maíz); Fromm, et al., (1990) Biotechnology 8:833-839 y Gordon-Kamm, et al., (1990) Plant Cell 2:603-618 (maíz); Hooydaas-Van Slogteren and Hooykaas, (1984) Nature (Londres) 311:763-764; Bytebierm, et al., (1987) Proc. Nati. Acad. Sci.

Estados Unidos 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet, et al., (1985) en The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. G.P. Chapman, et al., págs. 197-209. Longman, NY (polen); Kaeppler, y otros, (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 and Kaeppler, y otros, (1992) Theor . Appl. Genet . 84:560-566 (transformación mediada por triquitas); patente de los Estados Unidos núm. 5,693,512 (sonicación); D'Halluin, et al., (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporación); Li, y otros, (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 and Christou and Ford, (1995) Annals of Botany 75:407-413 (rice); Osjoda, et al., (1996) Nature Biotech. 14:745-750; Transformación del maíz mediada por Agrobacterium (patente de los Estados Unidos núm. 5,981,840); métodos con filamentos de carburo de silicio (Frame, et al., (1994) Plant J. 6:941-948); métodos con láser (Guo, et al., (1995) Physiologia Plantarum 93:19-24); métodos de sonicación (Bao, et al., (1997) Ultrasound in Medicine & Biology 23:953-959; Finer y Finer, (2000) Lett Appl Microbiol. 30:406-10; Amoah, et al., (2001) J Exp Bot 52:1135-42); métodos con polietilenglicol (Krens, et al . , (1982) Nature 296:72-77); los protoplastos de células monocotiledóneas y dicotiledóneas se pueden transformar mediante electroporación (Fromm, et al . , (1985) Proc. Nati .

Acad. Sci . Estados Unidos 82:5824-5828) y microinyección (Crossway, et al . , (1986) Mol . Gen . Genet. 202:179-185), todas las cuales se incorporan en la presente descripción como referencia.

Transformación mediada por Agrobacterium A. tumefaciens y A. rhizogenes son bacterias del suelo patogénicas de la planta que transforman genéticamente las células vegetales. Los plásmidos Ti y Ri de A. tumefaciens y A. rhizogenes portan, respectivamente, los genes responsables de la transformación genética de plantas. Véase, por ejemplo, Kado, (1991) Crit. Rev. Plant Sci . 10:1. Las descripciones de los sistemas y métodos de vectores de Agrobacterium para la transferencia génica mediada por Agrobacterium se proporcionan en Gruber, et al. , más arriba; Miki, et al . , supra y Moloncy, et al . , (1989) Plant Cell Reports 8:238.

Una vez que se construyen, los plásmidos pueden colocarse en A. rhizogenes o A. tumefaciens y estos vectores pueden usarse para transformar las células de las especies de plantas, que son normalmente susceptibles a una infección por Fusarium o Alternaría . Varias otras plantas transgénicas se contemplan, además, en la presente descripción e incluyen, sin limitarse a, soja, maíz, sorgo, alfalfa, arroz, trébol, col, banana, café, apio, tabaco, caupí, algodón, melón y pimienta. La selección de A. tumefaciens o A. rhizogenes dependerá de la planta que se transforme de ese modo. Generalmente, A. tumefaciens es el organismo preferido para la transformación. La mayoría de las plantas dicotiledóneas, algunas gimnospermas y unas cuantas plantas monocotiledóneas (por ejemplo, ciertos miembros de las Liliales y Arales) son susceptibles a la infección con A. tumefaciens. La A. rhizogenes tiene, además, un amplio intervalo de huéspedes que abarca la mayoría de las dicotiledóneas y algunas gimnospermas que incluyen miembros de la Leguminosae, Compositae y Chenopodiaceae. Las plantas monocotiledóneas pueden transformarse ahora con algún éxito. La solicitud de patente de europea EP núm.604 662 Al describe un método para transformar monocotiledóneas con el uso de Agrobacterium. La solicitud de patente de europea EP núm.672 752 Al describe un método para transformar monocotiledóneas con Agrobacterium con el uso del escutelo de embriones inmaduros. Ishida, et al . , describen un método para transformar el maíz al exponer los embriones inmaduros a A. tumefaciens (Nature Biotechnology 14:745-50 (1996)).

Una vez transformadas, estas células pueden usarse para regenerar plantas transgénicas. Por ejemplo, las plantas completas pueden infectarse con estos vectores mediante heridas en la planta y después por la introducción del vector en el sitio de la herida. Cualquier parte de la planta puede herirse, e incluye hojas, tallos y raíces. Alternativamente, el tejido de la planta, en forma de un explanto, tales como los tejidos cotiledonares o discos de la hoja, puede inocularse con estos vectores, y cultivarse bajo condiciones que estimulen la regeneración de la planta. Las raíces o brotes transformados por inoculación del tejido de la planta con A. rhizogenes o A. tumefaciens, que contienen el gen que codifica para la enzima de degradación de fumonisina, puede usarse como una fuente de tejido de la planta para regenerar plantas transgénicas resistentes a la fumonisina, a través de la organogénesis o embriogénesis somática. Ejemplos de tales métodos para regenerar el tejido de la planta se describen en Shahin, (1985) Theor. Appl . Genet . 69:235-40; patente de los Estados Unidos núm.4,658,082; Simpson, et al., supra, y las solicitudes de patente de los Estados Unidos serie núm. 913,913 y 913,914, ambas presentadas el l.° de octubre de 1986, a las que se hace referencia en la patente de los Estados Unidos núm.5,262,306, publicada el 16 de noviembre de 1993, cuyas descripciones completas se incorporan en la presente descripción como referencia.

Transferencia directa de genes Varios métodos de transformación de la planta, mencionados colectivamente como transferencia directa de genes, se desarrollaron como una alternativa a la transformación mediada por Agrobacterium.

Un método de transformación de la planta generalmente aplicable es la transformación mediada por microproyectiles, en donde el ADN se porta en la superficie de los microproyectiles y mide aproximadamente 1 a 4 pm. El vector de expresión se introduce en los tejidos de la planta con un dispositivo biolístico que acelera los microproyectiles a velocidades de 300 a 600 m/s que es suficiente para penetrar las paredes y membranas de la célula vegetal (Sanford, et al . , (1987) Part . Scí . Technol . 5:27; Sanford, (1988) Trends Biotech 6:299; Sanford, (1990) Physiol . Plant 79:206 and Klein, et al . , (1992) Biotechnology 10:268).

Otro método para el suministro físico de ADN a las plantas es la sonicación de las células objetivo como se describe en Zang, et al . , (1991) BioTechnology 9:996. Alternativamente, las fusiones de esferoplasto o liposomas se han usado para introducir vectores de expresión en las plantas. Ver, por ejemplo, Deshayes, et al . , (1985) EMBO J. 4:2731 and Christou, et al . , (1987) Proc. Nati . Acad. Sci . Estados Unidos 84:3962. Se ha reportado, además, la captación directa de ADN en los protoplastos con el uso de precipitación de CaCl2, alcohol polivinílico, o poli-L-ornitina. Véase, por ejemplo, Hain, et al . , (1985) Mol . Gen . Genet . 199:161 y Draper, et al . , (1982) Plant Cell Physiol .

Reducción de la actividad o nivel de un Se proporciona métodos para reducir o eliminar la actividad de un polipéptido de la descripción mediante la transformación de una célula vegetal con un casete de expresión que expresa un polinucleótido que inhibe la expresión del polipéptido. El polinucleótido puede inhibir la expresión del polipéptido directamente, al evitar la transcripción o traducción del ARN mensajero, o bien indirectamente, al codificar un polipéptido que inhibe la transcripción o traducción de un gen que codifica un polipéptido. Los métodos para inhibir o eliminar la expresión de un gen en una planta son muy conocidos en la materia y cualquiera de estos métodos se puede usar en la presente descripción para inhibir la expresión de un polipéptido.

De conformidad con la presente descripción, la expresión del polipéptido se inhibe si el nivel de proteína del polipéptido es menor que 70 % del nivel de proteína del mismo polipéptido en una planta que no se ha modificado genéticamente o mutagenizado para inhibir la expresión de ese polipéptido. En modalidades particulares de la descripción, el nivel de la proteína del polipéptido en una planta modificada de conformidad con la presente descripción es menor que 60 %, menor que 50 %, menor que 40 %, menor que 30 %, menor que 20 %, menor que 10 %, menor que 5 % o menor que 2 % del nivel de la proteína del mismo polipéptido en una planta que no es un mutante ni ha sido modificada genéticamente para inhibir la expresión de ese polipéptido. El nivel de expresión del polipéptido puede determinarse directamente, por ejemplo, mediante ensayos del nivel del polipéptido expresado en la célula vegetal o planta o, indirectamente, por ejemplo, cuando se determina la actividad de captación de nitrógeno del polipéptido en la célula vegetal o planta o cuando se determina los cambios fenotípicos en la planta. Los métodos para realizar tales ensayos se describen en otra sección de la presente invención.

En otras modalidades de la descripción, la actividad de los polipéptidos se reduce o se elimina mediante la transformación de una célula vegetal con un casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que inhibe la actividad de un polipéptido. La actividad de uso del nitrógeno mejorada de un polipéptido se inhibe de conformidad con la presente descripción si la actividad del polipéptido es menor que 70 % de la actividad del mismo polipéptido en una planta que no se ha modificado para inhibir la actividad de ese polipéptido. En modalidades particulares de la descripción, la actividad del polipéptido en una planta modificada de conformidad con la descripción es menor que 60 I, menor que 50 %, menor que 40 %, menor que 30 %, menor que 20 %, menor que 10 % o menor que 5 % de la actividad del mismo polipéptido en una planta que no se ha modificado para inhibir la expresión de ese polipéptido. La actividad de un polipéptido se “elimina” de conformidad con la descripción cuando no es detectadle por los métodos de ensayo descritos en otra sección de la presente descripción. Los métodos para determinar la alteración de la actividad de uso de nitrógeno de un polipéptido se describen en otra sección de la presente descripción.

En otras modalidades, la actividad de un polipéptido se puede reducir o eliminar mediante la alteración del gen que codifica el polipéptido. La descripción abarca plantas mutagenizadas que portan mutaciones en los genes, en donde las mutaciones reducen la expresión del gen o inhiben la actividad de uso de nitrógeno del polipéptido codificado.

Por lo tanto, para reducir o eliminar la actividad de un polipéptido se puede usar diversos métodos. Adicionalmente, se puede usar más de un método para reducir la actividad de un solo polipéptido. 1._ Métodos a base de polinucleótidos: En algunas modalidades de la presente descripción, una planta se transforma con un casete de expresión con la capacidad de expresar un polinucleótido que inhibe la expresión de un polipéptido de la descripción. El término “expresión”, como se usa en la presente descripción, se refiere a la biosintesis de un producto génico, que incluye la transcripción y/o traducción de dicho producto génico. Por ejemplo, para los propósitos de la presente invención, un casete de expresión capaz de expresar un polinucleótido que inhibe la expresión de al menos un polipéptido es un casete de expresión capaz de producir una molécula de ARN que inhibe la transcripción y/o traducción de al menos un polipéptido de la invención. La “expresión” o “producción” de una proteina o polipéptido a partir de una molécula de ADN se refiere a la transcripción y traducción de la secuencia codificante para producir la proteina o polipéptido, mientras que la “expresión” o “producción” de una proteina o polipéptido a partir de una molécula de ARN se refiere a la traducción de la secuencia codificante de ARN para producir la proteina o polipéptido.

Los ejemplos de polinucleótidos que inhiben la expresión de un polipéptido se presentan más abajo. i._ Supresión codificante/cosupresión En algunas modalidades de la descripción, la inhibición de la expresión de un polipéptido se puede lograr con la supresión codificante o cosupresión. Para la cosupresión, se diseña un casete de expresión que expresa una molécula de ARN correspondiente a la totalidad o parte de un ARN mensajero que codifica un polipéptido en la orientación “codificante”. La sobre expresión de la molécula de ARN puede resultar en una expresión reducida del gen natural. Por lo tanto, se evalúa múltiples lineas de plantas transformadas con el casete de expresión de cosupresión para identificar aquellas que muestran el grado deseado de inhibición de la expresión del polipéptido.

El polinucleótido usado para la cosupresión puede corresponder a la totalidad o parte de la secuencia que codifica el polipéptido, la totalidad o parte de la región 5' y/o 3' no traducida de una transcripción del polipéptido o la totalidad o parte tanto de la secuencia codificante como de las regiones no traducidas de una transcripción que codifica un polipéptido. En algunas modalidades, en donde el polinucleótido comprende la totalidad o parte de la región codificante para el polipéptido, el casete de expresión se diseña para eliminar el codón de inicio del polinucleótido de manera que ningún producto de proteina se traduzca.

La cosupresión se pueden usar para inhibir la expresión de los genes de las plantas para producir plantas que tienen niveles indetectables de proteina para las proteínas codificadas por estos genes. Ver, por ejemplo, Broin, et al . , (2002) Plant Cell 14:1417-1432. La cosupresión puede usarse, además, para inhibir la expresión de múltiples proteínas en la misma planta. Ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. 5,942,657. Los métodos para usar la cosupresión para inhibir la expresión de genes endógenos en las plantas se describen en Flavell, et al . , (1994) Proc. Nati Acad. Sci . Estados Unidos 91:3490-3496; Jorgensen, et al . , (1996) Plant Mol . Biol . 31:957-973; Johansen and Carrington, (2001) Plant Physiol . 126:930-938; Broin, et al . , (2002) Plant Cell 14:1417-1432; Stoutjesdijk, et al . , (2002) Plant Physiol . 129:1723-1731; Yu, et al . , (2003) Phytochemistry 63:753-763 y las patentes de los Estados Unidos núms.5,034,323, 5,283,184 y 5,942,657, cada una de las cuales se incorpora en la presente descripción como referencia. La eficacia de la cosupresión puede aumentarse al incluir una región poli-dT en el casete de expresión en una posición 3' a la secuencia codificante y 5' de la señal de poliadenilación. Ver, la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2002/0048814, incorporada en la presente descripción como referencia. Típicamente, tal secuencia de nucleótidos tiene la similitud sustancial de secuencias para la secuencia de la transcripción del gen endógeno, óptimamente, mayor que aproximadamente 65 % de identidad de secuencias, de manera más óptima, mayor que aproximadamente 85 % de identidad de secuencias y, más óptimamente, mayor que aproximadamente 95 % de identidad de secuencias. Ver las patentes de los Estados Unidos núm.5,283,184 y 5,034,323, incorporadas en la presente descripción como referencia. 11. Supresión no codificante En algunas modalidades de la descripción, la inhibición de la expresión del polipéptido se puede obtener por supresión no codificante. Para la supresión no codificante, el casete de expresión se diseña para expresar una molécula de ARN complementario a la totalidad o parte de un ARN mensajero que codifica el polipéptido. La sobreexpresión de la molécula de ARN no codificante puede producir una expresión reducida del gen objetivo. Por lo tanto, se evalúa múltiples lineas de plantas transformadas con el casete de expresión de supresión no codificante para identificar aquellas que muestran el grado deseado de inhibición de la expresión del polipéptido.

El polinucleótido para usar en la supresión no codificante puede corresponder a la totalidad o parte del complemento de la secuencia que codifica el polipéptido, la totalidad o parte del complemento de la región 5' y/o 3' no traducida de la transcripción objetivo o la totalidad o parte del complemento tanto de la secuencia codificante como de las regiones no traducidas de una transcripción que codifica el polipéptido. Adicionalmente, el polinucleótido no codificante puede ser completamente complementario (es decir, 100 % idéntico al complemento de la secuencia diana) o parcialmente complementario (es decir, menos de 100 % de identidad con el complemento de la secuencia diana) a la secuencia diana. La supresión no codificante se puede usar para inhibir la expresión de múltiples proteínas en la misma planta. Ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. 5,942,657.

Además, se puede usar porciones de los nucleótidos no codificantes para alterar la expresión del gen objetivo. Generalmente, se puede usar secuencias de por lo menos 50 nucleótidos, 100 nucleótidos, 200 nucléotidos, 300, 400, 450, 500, 550 o más. Los métodos para usar la supresión no codificante para inhibir la expresión de genes endógenos en las plantas se describen, por ejemplo, en Liu, et al . , (2002) Plan t Physiol . 129:1732-1743 y patente de los Estados Unidos núm. 5,759,829 y 5,942,657, que se incorporan en la presente descripción como referencia. La eficacia de la supresión no codificante puede aumentarse al incluir una región poli-dT en el casete de expresión en una posición 3' a la secuencia no codificante y 5' de la señal de poliadenilación. Ver, la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2002/0048814, incorporada en la presente descripción como referencia. iii. Interferencia por ARN bicatenario En algunas modalidades de la descripción, la inhibición de la expresión de un polipéptido se puede obtener mediante interferencia por ARN bicatenario (ARNbc). Para la interferencia de ARNbc, una molécula de ARN codificante como la descrita anteriormente para la cosupresión y una molécula de ARN no codificante que es completa o parcialmente complementaria a la molécula de ARN codificante se expresan en la misma célula, lo que resulta en la inhibición de la expresión del ARN mensajero endógeno correspondiente.

La expresión de moléculas codificantes y no codificantes puede llevarse a cabo mediante el diseño del casete de expresión para comprender la secuencia codificante y una secuencia no codificante. Alternativamente, se pueden usar casetes de expresión separados para las secuencias codificantes y no codificantes. Después, se evalúa múltiples líneas de plantas transformadas con el casete o casetes de expresión de interferencia por ARNbc para identificar las líneas de plantas que muestran el grado deseado de inhibición de la expresión del polipéptido. Los métodos para usar la interferencia por ARNbc para inhibir la expresión de genes endógenos de las plantas se describen en Waterhouse, et ai., (1998) Proc. Nati . Acad. Sci . Estados Unidos, 95:13959-13964, Liu, et. ai., (2002) Plant Physiol . 129:1732-1743 y patentes núm. WO 1999/49029, WO 1999/53050, WO 1999/61631 y WO 2000/49035, cada una de las cuales se incorpora en la presente descripción como referencia.

IV. Interferencia por ARN en horquilla e interferencia por ARN en horquilla con intrones En algunas modalidades de la descripción, la inhibición de la expresión de un polipéptido se puede obtener mediante interferencia por ARN en horquilla (ARNhp) o interferencia por ARN en horquilla con intrones (ARNhpi). Estos métodos son muy eficientes para inhibir la expresión de los genes endógenos. Ver Waterhouse and Helliwell, (2003) Nat Rev. Genet . 4:29-38 y las referencias mencionadas en la presente descripción.

Para la interferencia ARNhp, el casete de expresión se designa para expresar una molécula de ARN que híbrida consigo misma para formar una estructura de horquilla que comprende una región lazo de cadena simple y un tallo de base pareada. La región tallo de base pareada comprende una secuencia codificante que corresponde a todo o parte del ARN mensajero endógeno que codifica el gen cuya expresión se inhibe, y una secuencia no codificante que es completa o parcialmente complementaria a la secuencia codificante. Alternativamente, la región del tallo de base pareada puede corresponder a una porción de una secuencia de un promotor que controla la expresión del gen cuya expresión va a inhibirse. Por lo tanto, la región del tallo de base pareada de la molécula determina, generalmente, la especificidad de la interferencia por ARN. Las moléculas de ARNhp son altamente eficientes para inhibir la expresión de los genes endógenos y la interferencia por ARN que inducen se hereda por generaciones posteriores de las plantas. Ver, por ejemplo, Chuang y Mcyerowitz, (2000) Proc. Nati . Acad. Sci . Estados Unidos 97:4985-4990; Stoutjesdijk, et al . , (2002) Plant Physiol . 129:1723-1731 y Waterhouse and Helliwell, (2003) Na t . Rev. Genet . 4:29-38. Los métodos para usar la interferencia del ARNhp para inhibir o silenciar la expresión de genes se describen, por ejemplo, en Chuang and Meyerowitz, (2000) Proc. Nati . Acad. Sci . Estados Unidos 97:4985-4990; Stoutjesdijk, et al . , (2002) Plant Physiol . 129:1723-1731; Waterhouse and Helliwell, (2003) Nat. Rev. Genet . 4:29-38; Pandolfini et al . , BMC Biotechnology 3:7 y la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2003/0175965, cada una de las cuales se incorpora en la presente descripción como referencia Un ensayo transitorio para la eficacia de las construcciones de ARNhp para silenciar la expresión del gen in vivo se describió por Panstruga, et al . , (2003) Mol . Biol . Rep. 30:135-140, incorporada en la presente descripción como referencia.

Para el ARNhpi, las moléculas interferentes tienen la misma estructura general que para el ARNhp, pero la molécula de ARN comprende, adicionalmente, un intrón capaz de dividirse en la célula en la cual se expresa el ARNhpi. El uso de un intrón minimiza el tamaño del lazo én la molécula de ARN horquilla después de la división, y esto aumenta la eficacia de la interferencia. Ver, por ejemplo, Smith, et al . , (2000) Nature 407:319-320. De hecho, Smith, et al . , muestran 100 % supresión de la expresión del gen endógeno con el uso de la interferencia mediada por ARNhpi. Los métodos para usar la interferencia de ARNhpi para inhibir la expresión de los genes endógenos de las plantas se describen, por ejemplo, en Smith, et al . , (2000) Nature 407:319-320; Weslcy, et al . , (2001) Plant J. 27:581-590; Wang y Waterhouse, (2001) Curr. Opin . Plant Biol . 5:146-150; Waterhouse and Helliwell, (2003) Nat . Rev. Genet . 4:29-38; Helliwell y Waterhouse, (2003) Methods 30:289-295 y la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm.2003/0180945, cada una de las cuales se incorpora en la presente descripción como referencia.

El casete de expresión para la interferencia del ARNhp puede diseñarse, además, para que la secuencia codificante y la secuencia no codificante no correspondan a un ARN endógeno. En esta modalidad, la secuencia codificante y no codificante flanquean una secuencia lazo que comprende una secuencia de nucleótidos que corresponde a todo o parte del ARN mensajero endógeno del gen objetivo. Asi, la región lazo es la que determina la especificidad de la interferencia del ARN. Ver, por ejemplo, la patente núm. WO 2002/00904; Mette, et al . , (2000) EMBO J 19:5194-5201; Matzke, et al . , (2001) Curr. Opin . Genet . Devel . 11:221-227; Scheid, et al . , (2002) Proc. Nati . Acad. Sci . , Estados Unidos 99:13659-13662; Aufsaftz, et al . , (2002) Proc. Nat ' l . Acad. Sci . 99(4):16499-16506; Sijen, et al . r Curr. Biol . (2001) 11:436-440), incorporada en la presente descripción como referencia. v._ Interferencia mediada por amplicones Los casetes de expresión del amplicón comprenden una secuencia derivada de virus de plantas que contiene todo o parte del gen objetivo pero generalmente no todos los genes del virus natural. Las secuencias virales presentes en el producto de transcripción del casete de expresión permite que el producto de transcripción dirija su propia replicación. Las transcripciones producidas por el amplicón pueden ser codificantes o no codificantes con relación a la secuencia objetivo (es decir, el ARN mensajero para el polipéptido). Los métodos de uso de amplicones para inhibir la expresión de los genes endógenos de las plantas se describen, por ejemplo, en Angelí and Baulcombe, (1997) EMBO J. 16:3675-3684, Angelí and Baulcombe, (1999) Plant J. 20:357-362 y la patente de los Estados Unidos núm. 6,646,805, cada una de las cuales se incorpora en la presente descripción como referencia. vi. Ribozimas En algunas modalidades, el polinucleótido expresado por el casete de expresión de la descripción es ARN catalítico o tiene actividad de ribozima específica para el ARN mensajero del polipéptido. Por lo tanto, el polinucleótido causa la degradación del ARN mensajero endógeno, y produce una expresión reducida del polipéptido. Este método se describe, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos núm. 4,987,071, incorporada en la presente descripción como referencia. vii. ARN pequeño de interferencia o micro ARN En algunas modalidades de la descripción, la inhibición de la expresión de un polipéptido se puede obtener por interferencia del ARN por expresión de un gen que codifica un micro ARN (miARN). Los miARN son agentes reguladores que consisten en aproximadamente 22 ribonucleótidos . Los miARN son altamente eficientes para inhibir la expresión de genes endógenos. Ver, por ejemplo Javier, et al . , (2003) Nature 425:257-263, incorporada en la presente descripción como referencia.

Para la interferencia del ARNmi, el casete de expresión se diseña para expresar una molécula de ARN que se modela en un gen ARNmi endógeno. Por ejemplo, el gen miARN codifica un ARN que forma una estructura de horquilla que contiene una secuencia de 22 nucleótidos que es complementaria con otro gen endógeno (secuencia objetivo). Para la supresión de la expresión de NUE, la secuencia de 22 nucleótidos se selecciona de una secuencia de transcripción de NUE y contiene 22 nucleótidos de esa secuencia de NUE en una orientación codificante y nucleótidos de una secuencia no codificante correspondiente complementaria a la secuencia codificante. Un gen de la fertilidad, ya sea endógeno o exógeno, puede ser un miARN objetivo. Las moléculas de miARN son altamente eficientes para inhibir la expresión de genes endógenos y la interferencia por ARN que inducen se hereda por generaciones de plantas posteriores. 2,_ Inhibición a base de polipéptidos de expresión génica En una modalidad, el polinucleótido codifica una proteina con dedos de zinc que se une a un gen que codifica un polipéptido, lo que resulta en la expresión reducida del gen. En modalidades particulares, la proteina con dedos de zinc se une a una región reguladora de un gen de NUE. En otras modalidades, la proteina con dedos de zinc se une a un ARN mensajero que codifica un polipéptido y evita su traducción. Los métodos para seleccionar sitios para el mareaje por las proteínas de dedo de cinc se describieron, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos núm.6,453,242, y los métodos para usar las proteínas de dedo de cinc para inhibir la expresión de los genes en las plantas se describen, por ejemplo, en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm.2003/0037355, cada una de las cuales se incorpora en la presente descripción como referencia. 3._ Inhibición a base de polipeptidos de la actividad proteica En algunas modalidades de la descripción, el polinucleótido codifica un anticuerpo que se une, por lo menos, a un polipéptido y reduce la actividad de uso de nitrógeno mejorada del polipéptido. En otra modalidad, la unión del anticuerpo genera un aumento del movimiento del complejo anticuerpo-NUE por mecanismos celulares de control de calidad. La expresión de los anticuerpos en células vegetales y la inhibición de las rutas moleculares por la expresión y unión de los anticuerpos a las proteínas en las células vegetales se conocen bien en la materia. Ver, por ejemplo, Conrad and Sonnewald, (2003) Nature Biotech . 21:35-36, incorporado en la presente descripción como referencia. 4._ Interrupción genética En algunas modalidades de la presente descripción, la actividad de un polipéptido se reduce o elimina mediante la alteración del gen que codifica el polipéptido. El gen que codifica el polipéptido se puede alterar mediante cualquier método conocido en la materia. Por ejemplo, en una modalidad, el gen se perturba por etiquetado del transposón. En otra modalidad, el gen se perturba por la mutagénesis de las plantas con el uso de mutagénesis aleatoria o dirigida y la selección de las plantas que tienen una actividad de uso de nitrógeno reducida. i._ Etiquetado de transposones En una modalidad de la descripción, el etiquetado de transposones se usa para reducir o eliminar la actividad de uno o más polipéptidos. El etiquetado de transposones comprende insertar un transposón dentro de un gen NUE endógeno para reducir o eliminar la expresión del polipéptido. “Gen NUE” se refiere al gen que codifica un polipéptido de conformidad con la presente descripción.

En esta modalidad, la expresión de uno o más polipéptidos se reduce o elimina mediante la inserción de un transposón dentro de una región reguladora o región codificante del gen que codifica el polipéptido. Un transposón que está dentro de un exón, intrón, secuencia no traducida 5' o 3', un promotor o cualquier otra secuencia reguladora de un gen NUE se puede usar para reducir o eliminar la expresión y/o actividad del polipéptido codificado.

Los métodos para el etiquetado del transposón de genes específicos en plantas se conoce bien en la materia. Ver, por ejemplo, Maes, et al . , (1999) Trends Plant Sci . 4:90-96; Dharmapuri y Sonti, (1999) FEMS Microbiol . Lett. 179:53-59; Meissner, et al . (2000) Plant J. 22:265-274; Phogat, et al . (2000) J. Biosci . 25:57-63; Walbot, (2000) Curr. Opin . Plant Biol . 2:103-107; Gai, et al . , (2000) Nucleic Acids Res. 28:94-96; Fitzmaurice, et al . r (1999) Genetics 153:1919-1928). Además, el proceso TUSC para seleccionar las inserciones Mu en genes seleccionados ha sido descrito en Bensen, et al . , (1995) Plant Cell 7:75-84; Mena, et al . , (1996) Science 274:1537-1540 y la patente de los Estados Unidos núm. 5,962,764, cada una de las cuales se incorpora en la presente descripción como referencia. ii. Plantas mutantes con actividad reducida Los métodos adicionales para disminuir o eliminar la expresión de genes endógenos en plantas se conocen, además, en la materia y pueden aplicarse igualmente a la presente invención. Estos métodos incluyen otras formas de mutagénesis, tales como mutagénesis inducida por etil metanosulfonato, mutagénesis de deleción y mutagénesis por deleción de neutrones rápidos que se usan en un sentido genético inverso (con PCR) para identificar lineas de plantas en las cuales el gen endógeno se eliminó. Para conocer ejemplos de estos métodos, ver Ohshima, et al . , (1998) Virology 243:472-481; Okubara, et al . , (2000) Genetics 137:867-874 y Quesada, et al . , (1994) Genetics 154:421-436, cada una de los cuales se incorpora en la presente descripción como referencia. Adicionalmente, un método rápido y automatizable de análisis de las mutaciones químicamente inducidas, TILLING (por sus siglas en inglés) (detección de lesiones locales inducidas en genomas), por medio del uso de HPLC desnaturalizante o la digestión selectiva de endonucleasa de productos PCR seleccionados se aplica, además, a la presente invención. Ver, McCallum, et al . , (2000) Nat . Biotechnol . 18:455-457, incorporada en la presente descripción como referencia.

Las mutaciones que afectan la expresión génica o que interfieren con la función (actividad de uso de nitrógeno mejorada) de la proteína codificada se conocen en la materia. Las mutaciones insercionales en los exones del gen resultan, usualmente, en mutantes nulos. Las mutaciones en los residuos conservados son particularmente efectivas para inhibir la actividad de la proteína codificada. Se han descrito los residuos conservados de los polipéptidos de la planta adecuados para la mutagénesis con el objetivo de eliminar la actividad. Tales mutantes pueden aislarse de acuerdo con procedimientos bien conocidos y las mutaciones en loci de NUE diferentes pueden combinarse por cruzamiento genético. Ver, por ejemplo, Gruís, et al . , (2002) Plant Cell 14:2863-2882.

En otra modalidad de la presente descripción, es posible usar mutantes dominantes para desencadenar el silenciamiento del ARN debido a la inversión y recombinación de genes de un locus del gen duplicado. Ver, por ejemplo, Kusaba, et al . , (2003) Plant Cell 15:1455-1467.

La presente descripción abarca métodos adicionales para reducir o eliminar la actividad de uno o más polipéptidos . Los ejemplos de otros métodos para alterar o mutar una secuencia genómica de nucleótidos en una planta se conocen en la materia e incluyen, pero no se limitan a, el uso de vectores ARNrADN, vectores de mutación ARN:ADN, vectores reparadores ARNrADN, oligonucleótidos bicatenarios mezclados, oligonucleótidos de ARNrADN auto-complementarios y oligonucleobases recombinógenas. Esos vectores y los métodos de uso se conocen en la materia. Ver, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos núms. 5,565,350; 5,731,181; 5,756,325; 5,760,012; 5,795,972 y 5,871,984, cada una de las cuales se incorpora en la presente descripción como referencia. Ver, además, las patentes núm. WO 1998/49350, WO 1999/07865, WO 1999/25821 y Beetham, et al . , (1999) Proc . Na ti . Acad. Sci . Estados Unidos, 96r8774-8778, cada una de las cuales se incorpora en la presente descripción como referencia . iii. Modulación de la actividad de uso del nitrógeno En métodos específicos, el nivel y/o la actividad de un regulador NUE en una planta se reduce mediante el aumento del nivel o la actividad del polipéptido en la planta La expresión incrementada de una molécula reguladora negativa puede reducir el nivel de expresión de uno o más genes corriente abajo responsables por un fenotipo NUE mejorado.

Los métodos para incrementar el nivel y/o actividad de los polipéptidos en una planta se describen en otra sección de la presente descripción. En resumen, tales métodos comprenden proporcionar un polipéptido de la descripción a una planta y, de esta manera, aumentar el nivel y/o la actividad del polipéptido. En otras modalidades se puede proporcionar una secuencia de nucleótidos NUE que codifica un polipéptido por medio de la introducción en la planta de un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos NUE de la descripción, la expresión de la secuencia de NUE, el incremento de la actividad del polipéptido y, de esta manera, la reducción del número de células del tejido en la planta o parte de la planta. En otras modalidades, la construcción de nucleótidos NUE introducida en la planta se incorpora de manera estable en el genoma de la planta.

En otros métodos, el crecimiento de tejido de una planta se incrementa mediante la reducción del nivel y/o actividad del polipéptido en la planta. Tales métodos se describen detalladamente en otra sección de la presente descripción. En un método de estas características se introduce una secuencia de nucleótidos NUE en la planta y la expresión de esa secuencia de nucleótidos NUE reduce la actividad del polipéptido y, de esta manera, aumenta el crecimiento del tejido en la planta o parte de esta. En otras modalidades, la construcción de nucleótidos NUE introducida en la planta se incorpora de manera estable en el genoma de la planta.

Como se mencionó anteriormente, una persona con experiencia en la materia reconocerá el promotor adecuado para modular el nivel/actividad de una NUE en la planta. Los promotores ilustrativos para esta modalidad se describen en otra sección de la presente descripción.

En otras modalidades, tales plantas tienen incorporada de manera estable en su genoma una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos NUE de la descripción unidos operativamente a un promotor que dirige la expresión en la célula vegetal. iv. Modulación del desarrollo radicular Se proporciona los métodos para modular el desarrollo radicular en una planta. “Modulación del desarrollo radicular” se refiere a cualquier alteración en el desarrollo de la raíz de la planta en comparación con una planta control. Esas alteraciones en el desarrollo radicular incluyen, pero no se limitan a, alteraciones en el indice de crecimiento de la raíz primaria, el peso de la raíz fresca, la extensión de la formación lateral y espontánea de la raíz, el sistema de vasculatura, el desarrollo del meristemo o la expansión radial.

Se proporciona los métodos para modular el desarrollo radicular en una planta. Los métodos comprenden modular el nivel y/o actividad del polipéptido en la planta. En un método, se proporciona una secuencia de NUE de la descripción a la planta. En otro método, para proporcionar la secuencia de nucleótidos NUE se introduce en la planta un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos NUE de la descripción, se expresa la secuencia de NUE y, por lo tanto, se modifica el desarrollo radicular. En otros métodos adicionales la construcción de nucleótidos de NUE introducida en la planta se incorpora de manera estable en el genoma de la planta.

En otros métodos, el desarrollo radicular se modula mediante la alteración del nivel o actividad del polipéptido en la planta. Un cambio en la actividad puede producir por lo menos una o más de las siguientes alteraciones en el desarrollo radicular que incluyen, pero no se limitan a, alteraciones en la biomasa y longitud de la raíz.

Como se usa en la presente descripción, “crecimiento de la raíz” abarca todos los aspectos del crecimiento de las diferentes partes que conforman el sistema radicular en diferentes etapas de su desarrollo en las plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas. Se entenderá que el crecimiento mejorado de la raíz puede derivarse del aumento del crecimiento de una o más de sus partes que incluyen la raíz primaria, las raíces laterales, las raíces espontáneas, etc.

Los métodos de medir esas alteraciones en el desarrollo del sistema radicular se conocen en la materia. Ver, por ejemplo, la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2003/0074698 y Werner, et al . , (2001) PNAS 18:10487-10492, que se incorporan en la presente descripción como referencia.

Como se mencionó anteriormente, un experto reconocerá el promotor adecuado para usar para modular el desarrollo radicular en la planta. Los promotores ilustrativos para esta modalidad incluyen los promotores constitutivos y los promotores preferidos de raíz. Los promotores ilustrativos preferidos de raíz se describen en otras partes en la presente descripción.

La estimulación del crecimiento radicular y el incremento de la masa radicular mediante la disminución de la actividad y/o el nivel del polipéptido es útil, además, para mejorar el crecimiento erguido de una planta. El término “resistencia al encamado” o “crecimiento erguido” se refiere a la capacidad de una planta para fijarse por si misma al suelo Para las plantas con un patrón de crecimiento erecto o semierecto, este término se refiere, además, a la capacidad para mantener una posición derecha en condiciones (medio ambientales) adversas. Este rasgo se relaciona con el tamaño, profundidad y morfología del sistema radicular. Adicionalmente, la estimulación del crecimiento radicular y el incremento de la masa radicular mediante la alteración del nivel y/o la actividad del polipéptido es útil, además, para estimular la propagación de explantos in vitro.

Además, una producción mayor de biomasa radicular debido a la actividad tiene un efecto directo en la producción y un efecto indirecto en la producción de compuestos producidos por células radiculares o células radiculares transgénicas o cultivos celulares de esas células radiculares transgénicas. Un ejemplo de un compuesto interesante producido en cultivos celulares es shikonin, cuya producción se puede mejorar favorablemente mediante tales métodos.

En correspondencia, la presente descripción proporciona adicionalmente plantas que tienen un desarrollo modulado de la raíz cuando se compara con el desarrollo de la raíz de una planta de control. En algunas modalidades, la planta de la descripción tiene un nivel/actividad mayor del polipéptido de la descripción y un mayor crecimiento radicular y/o biomasa radicular. En otras modalidades, tales plantas tienen incorporada de manera estable en su genoma una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos NUE de la descripción unidos operativamente a un promotor que dirige la expresión en la célula vegetal. v._ Modulación del desarrollo de brotes y hojas Se proporciona, además, métodos para modular el desarrollo de brotes y hojas en una planta. Por “modular el desarrollo de brotes y/u hojas” se entiende cualquier alteración en el desarrollo de brotes y/u hojas de la planta. Esas alteraciones en desarrollo del brote y/o la hoja incluyen pero no se limitan a, alteraciones en el desarrollo del meristema del brote, en el número de hojas, tamaño de la hoja, vasculatura del tallo y la hoja, longitud del internodo y senescencia de la hoja. Como se usa en la presente descripción “desarrollo de la hoja” y “desarrollo del brote” abarca todos los aspectos del crecimiento de las diferentes partes que conforman el sistema de las hojas y el sistema de los brotes, respectivamente, en diferentes etapas de su desarrollo, en plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los métodos para medir esas alteraciones del desarrollo en el sistema de hojas y brotes se conocen en la materia. Ver, por ejemplo, Werner, et al., (2001) PNAS 98:10487-10492 y la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm.2003/0074698, cada una de las cuales se incorpora en la presente descripción como referencia.

El método para modular el desarrollo de brotes y/u hojas en una planta comprende modular la actividad y/o el nivel de un polipéptido de la descripción. En una modalidad, se proporciona una secuencia de NUE de la descripción. En otras modalidades, para proporcionar la secuencia de nucleótidos NUE se puede introducir en la planta un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos NUE de la descripción, expresar la secuencia de NUE y, por lo tanto, modificar el desarrollo de brotes y/u hojas. En otras modalidades, la construcción de nucleótidos NUE introducida en la planta se incorpora de manera estable en el genoma de la planta.

En modalidades especificas, el desarrollo de brotes u hojas se modula mediante la alteración del nivel y/o actividad del polipéptido en la planta. Un cambio en la actividad puede producir por lo menos una o más de las siguientes alteraciones en el desarrollo de brotes y/u hojas que incluyen, pero no se limitan a, cambios en el número de hojas, superficie de la hoja alterada, vasculatura alterada, internodos y crecimiento de la planta y alteraciones en la senescencia foliar, en comparación con una planta control.

Como se describió anteriormente, una persona experimentada reconocerá el promotor adecuado para usar para modular el desarrollo de brotes y hojas de la planta. Los promotores ilustrativos para esta modalidad incluyen promotores constitutivos, promotores preferidos de raíz, promotores preferidos del meristema de la raiz y promotores preferidos de las hojas. Los promotores ilustrativos se describen en otras partes en la presente descripción.

El incremento de la actividad y/o nivel en una planta produce internodos y crecimiento alterados. Por lo tanto, los métodos de la descripción son útiles para producir plantas modificadas. Adicionalmente, como se mencionó anteriormente, la actividad en la planta modula el crecimiento de la raíz y de los brotes. Por lo tanto, la presente descripción proporciona, además, métodos para alterar la relación raiz/brotes. El desarrollo de los brotes o de las hojas puede modularse, además, mediante la alteración del nivel y/o actividad del polipéptido en la planta.

En correspondencia, la presente descripción proporciona, adicionalmente, plantas que tienen un desarrollo modulado del brote y/o la hoja cuando se compara con una planta de control. En algunas modalidades, la planta de la descripción exhibe un nivel/actividad mayor del polipéptido de la descripción. En otras modalidades, la planta de la descripción exhibe un nivel/actividad menor del polipéptido de la descripción. vi. Modulación del desarrollo de tejidos reproductivos Se proporciona métodos para modular desarrollo de tejidos reproductivos. En una modalidad se proporcionan métodos para modular el desarrollo floral en una planta. “Modular el desarrollo floral” hace referencia a cualquier alteración en la estructura del tejido reproductivo de una planta en comparación con una planta control, en donde la actividad o el nivel del polipéptido no se ha modulado. “Modular el desarrollo floral” incluye, además, cualquier alteración en el tiempo de desarrollo del tejido reproductivo de una planta (es decir, una demora o aceleración en el tiempo de desarrollo floral) en comparación con una planta control, en donde la actividad o el nivel del polipéptido no se ha modulado. Las alteraciones macroscópicas pueden incluir cambios en tamaño, forma, número o lugar de los órganos reproductivos, el periodo de tiempo de desarrollo en que se forman estas estructuras o la capacidad para mantener o proceder a través del proceso de floración en momentos de estrés ambiental. Las alteraciones microscópicas pueden incluir cambios en los tipos o formas de las células que conforman los órganos reproductivos.

El método para modular el desarrollo floral en una planta comprende modular la actividad en una planta. En un método, se proporciona una secuencia de NUE de la descripción Para proporcionar una secuencia de nucleótidos NUE se puede introducir en la planta un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos NUE de la descripción, expresar la secuencia de NUE y, por lo tanto, modificar el desarrollo floral. En otras modalidades, la construcción de nucleótidos NUE introducida en la planta se incorpora de manera estable en el genoma de la planta.

En métodos específicos, el desarrollo floral se modula mediante el incremento del nivel o actividad del polipéptido en la planta. Un cambio en la actividad puede producir por lo menos una o más de las siguientes alteraciones en el desarrollo floral, que incluyen pero no se limitan a, floración alterada, número de flores alterado, esterilidad masculina modificada y grupo de semillas alterado, en comparación con una planta control. La inducción de la floración retardada o la inhibición de la floración se puede usar para mejorar la producción en los cultivos de forraje, tales como alfalfa. Los métodos para determinar tales alteraciones de desarrollo en el desarrollo floral son muy conocidos en la materia. Véase, por ejemplo, Mouradov, et al . , (2002) The Plant Cell S111-S130, que se incorpora en la presente descripción como referencia.

Como se mencionó anteriormente, un experto reconocerá el promotor adecuado para usar para modular el desarrollo floral de la planta. Los promotores ilustrativos para esta modalidad incluyen promotores constitutivos, promotores inducibles, promotores específicos de los brotes y promotores específicos de la inflorescencia.

En otros métodos, el desarrollo floral se modula mediante la alteración del nivel y/o actividad de la secuencia de NUE de la descripción. Tales métodos pueden comprender introducir una secuencia de nucleótidos NUE en la planta y modificar la actividad del polipéptido. En otros métodos, la construcción de nucleótidos NUE introducida en la planta se incorpora de manera estable en el genoma de la planta. La alteración de la expresión de la secuencia de NUE de la descripción puede modular el desarrollo floral durante periodos de estrés. Esos métodos se describen en otras partes en la presente descripción. Por lo tanto, la presente descripción proporciona, además, plantas que tienen desarrollo floral modulado en comparación con el desarrollo floral de una planta control. Las composiciones incluyen plantas que exhiben un nivel/actividad alterada del polipéptido de la descripción y que tienen un desarrollo floral alterado. Las composiciones incluyen, además, plantas que exhiben una modificación en el nivel/actividad del polipéptido de la descripción, en donde la planta se mantiene o continúa su avance a lo largo del proceso de floración en periodos de estrés.

Se proporciona, además, métodos para usar las secuencias de NUE de la descripción para incrementar el tamaño y/o peso de las semillas. El método comprende incrementar la actividad de las secuencias de NUE en una planta o parte de una planta, tal como la semilla. Un incremento en el tamaño y/o peso de las semillas comprende un tamaño o peso reducido de la semilla y/o un incremento en el tamaño o peso de una o más partes de la semilla que incluyen, por ejemplo, el embrión, endosperma, cáscara, aleurona o cotiledón.

Como se menciono anteriormente, un experto reconocerá el promotor adecuado para usar para incrementar el tamaño y/o peso de las semillas. Los promotores ilustrativos de esta modalidad incluyen los promotores constitutivos, los promotores inducibles, los promotores preferidos de semilla, los promotores preferidos del embrión y los promotores preferidos de endosperma.

El método para alterar el tamaño de la semilla y/o el peso de la semilla en una planta comprende aumentar la actividad en la planta. En una modalidad, la secuencia de nucleótidos NUE se puede proporcionar mediante la introducción en la planta de un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos NUE de la descripción, la expresión de la secuencia de NUE y, de esta manera, la reducción del peso y/o tamaño de la semilla. En otras modalidades, la construcción de nucleótidos NUE introducida en la planta se incorpora de manera estable en el genoma de la planta.

Se reconoce, además, que el incremento del tamaño y/o peso de las semillas puede estar acompañado, además, por el incremento en la velocidad de crecimiento de las plántulas o un incremento en el vigor temprano. Como se usa en la presente descripción, el término “vigor temprano” se refiere a la capacidad de una planta para crecer rápidamente durante el desarrollo prematuro y se relaciona con el establecimiento exitoso, después de la germinación, de un sistema radicular bien desarrollado y un aparato fotosintético bien desarrollado.

Adicionalmente, un incremento en el tamaño y/o peso de las semillas puede producir, además, un incremento en la producción de la planta en comparación con una planta control.

Por lo tanto, la presente descripción proporciona, además, plantas que tienen un peso y/o tamaño de semillas mayor en comparación con una planta control. En otras modalidades se proporciona, además, plantas que tienen mayor vigor y producción de la planta. En algunas modalidades, la planta de la descripción exhibe un nivel/actividad modificada del polipéptido de la descripción y un mayor peso y/o tamaño de las semillas. En otras modalidades, tales plantas tienen incorporada de manera estable en su genoma una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos NUE de la descripción unidos operativamente a un promotor que dirige la expresión en la célula vegetal. vii. Método de uso para el polinucleótido NUE, los casetes de expresión y polinucleótidos adicionales Los nucleótidos, casetes de expresión y métodos descritos en la presente descripción son útiles para regular la expresión de cualquier secuencia heteróloga de nucleótidos en una planta hospedera para modificar el fenotipo de una planta. Los diversos cambios de interés en el fenotipo incluyen modificar la composición de ácido graso en una planta, alterar el contenido de aminoácidos de una planta, alterar un mecanismo de defensa contra un patógeno de una planta, y similares. Estos resultados pueden lograrse al proporcionar la expresión de productos heterólogos o el aumento de la expresión de productos endógenos en las plantas. Alternativamente, los resultados pueden lograrse al proporcionar una reducción de la expresión de uno o más productos endógenos, particularmente, enzimas o cofactores en la planta. Estos cambios resultan en un cambio en el fenotipo de la planta transformada.

En ciertas modalidades, las secuencias de ácidos nucleicos de la presente descripción pueden usarse en conjunto (“agrupadas”) con otras secuencias de polinucleótidos de interés para crear plantas con un fenotipo deseado. Las combinaciones generadas pueden incluir múltiples copias de uno cualquiera o más de los polinucleótidos de interés. Los polinucleótidos de la presente descripción se pueden agrupar con cualquier gen o combinación de genes para producir plantas con una variedad de combinaciones de rasgos deseados, que incluyen, sin limitarse a, rasgos deseables para alimento de animales, tales como genes con alto contenido oleico (por ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. 6,232,529); aminoácidos balanceados (por ejemplo, hordotioninas (patentes de los Estados Unidos núms.5,990,389; 5,885,801; 5,885,802 y 5,703,409); cebada con alto contenido de lisina (Williamson, et al . , (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106 y paténte núm. WO 1998/20122) y proteínas con alto contenido de metionina (Pedersen, et al . , (1986) J. Biol . Chem. 261:6279; Kirihara, et al . , (1988) Gene 71:359 y Musumura, et al . , (1989) Plant Mol . Biol . 12:123)); digestibilidad aumentada (por ejemplo, proteínas de almacenamiento modificadas (solicitud de patente de los Estados Unidos serie núm.10/053,410, presentada el 7 de noviembre de 2001) y tiorredoxinas (solicitud de patente de los Estados Unidos serie núm. 10/005,429, presentada el 3 de diciembre de 2001)), cuyas descripciones se incorporan en la presente descripción como referencia. Los polinucleótidos de la presente descripción se pueden agrupar, además, con rasgos deseables para la resistencia a insectos, enfermedades o herbicidas (por ejemplo, proteínas tóxicas de Bacillus thuringiensis (patentes de los Estados Unidos núms.5,366,892; 5,747,450; 5,737,514; 5723,756; 5,593,881; Geiser, et al . , (1986) Gene 48:109); lectinas (Van Da me, et al . , (1994) Plant Mol . Biol . 24:825); genes de desintoxicación de fumonisinas (patente de los Estados Unidos núm. 5,792,931); genes de avirulencia y de resistencia a enfermedades (Jones, et al . , (1994) Science 266:789; Martin, et al . , (1993) Science 262:1432; Mindrinos, et al . , (1994) Cell 78:1089); mutantes de acetolactato sintasa (ALS) que conducen a resistencia a herbicidas, tales como mutaciones de S4 y/o Hra; inhibidores de glutamina sintasa tales como fosfinotricina o basta (p. ej., gen bar); y resistencia al glifosato (gen EPSPS)) y rasgos deseables para el procesamiento o productos del procesamiento, tales como aceites alto oleicos (por ejemplo, patente de los Estados Unidos núm. 6,232,529); aceites modificados (por ejemplo, genes desaturasa de ácidos grasos (patente de los Estados Unidos núm.5,952,544; patente núm. WO 1994/11516)); almidones modificados (por ejemplo, pirofosforilasas ADPG (AGPase), sintasas de almidón (SS), enzimas de ramificación del almidón (SBE) y enzimas de desramificación del almidón (SOBE)) y polímeros o bioplásticos (por ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. 5,602,321; beta-cetotiolasa, polihidroxibutirato sintasa y acetoacetil-CoA reductasa (Schubert, et al . , (1988) J. Bacteriol . 170:5837-5847) facilitan la expresión de polihidroxialcanoatos (PHA)), cuyas descripciones se incorporan en la presente descripción como referencia. Además, pueden combinarse los polinucleótidos de la presente descripción con polinucleótidos que afectan los rasgos agronómicos, tales como la esterilidad masculina (por ejemplo, ver la patente de los Estados Unidos núm. 5.583.210), la fortaleza del pedúnculo, el periodo de floración o los rasgos de la teenología de transformación, tales como la regulación del ciclo celular o etiquetado específico de genes (por ejemplo, patentes núm. WO 1999/61619; WO 2000/17364; W01999//25821), cuyas descripciones quedan incorporadas en la presente descripción como referencia. Los genes conocidos que confieren tolerancia a herbicidas, tales como, por ejemplo, herbicidas de auxina, HPPD, glifosato, dicamba, glufosinato, sulfonilurea, bromoxinilo y norflurazon pueden combinarse ya sea como una combinación molecular o una combinación de cultivo con plantas que expresan los rasgos descritos en la presente descripción. Las moléculas de polinucleótidos que codifican proteínas implicadas en la tolerancia a herbicidas incluyen, pero no se limitan a, una molécula de polinucleótido que codifica 5-enolpiruvilshikimate-3-fosfato sintasa (EPSPS) descrita en las patentes de los Estados Unidos núms.39,247; 6,566,587 y para impartir tolerancia al glifosato; moléculas de polinucleótidos que codifican una glifosato oxidorreductasa (GOX) descrita en la patente de los Estados Unidos núm. 5,463,175 y una glifosato-N-acetil transferasa (GAT) descrita en las patentes de los Estados Unidos núms 7,622,641; 7,462,481; 7,531,339; 7,527,955; 7,709,709; 7,714,188 y 7,666,643, además, para proporcionar tolerancia al glifosato; dicamba monooxigenasa descrita en la patente de los Estados Unidos núm.7,022,896 y patente núm. WO 2007/146706 A2 para proporcionar tolerancia a la dicamba; una molécula de polinucleótido que codifica AAD12 descrita en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2005/731044 o patente núm. WO 2007/053482 A2 o que codifica AAD1 descrita en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm.2011/0124503 Al o patente de los Estados Unidos núm. 7,838,733 para proporcionar tolerancia a herbicidas de auxina (2,4-D); una molécula de polinucleótido que codifica hidroxifenilpiruvato dioxigenasa (HPPD) para proporcionar tolerancia a inhibidores de HPPD (por ejemplo, hidroxifenilpiruvato dioxigenasa) descritos, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos nú . 7,935,869; publicaciones de solicitudes de patente de los Estados Unidos nú s.2009/0055976 Al y 2011/0023180 Al, cada una de las cuales se incorpora en la presente descripción en su totalidad como referencia.

Otros ejemplos de rasgos de tolerancia a herbicidas que podrían combinarse con los rasgos descritos en la presente descripción incluyen aquellos conferidos por polinucleótidos que codifican una fosfinotricina acetiltransferasa exógena, tal como se describe en las patentes de los Estados Unidos núms. 5,969,213; 5,489,520 5,550,318; 5,874,265; 5,919,675; 5,561,236; 5,648,477; 5,646,024; 6,177,616 y 5,879,903. Las plantas que contienen una fosfinotricina acetiltransferasa exógena pueden exhibir una mayor tolerancia a los herbicidas de glufosinato, que inhiben la enzima glutamina sintasa. Otros ejemplos de rasgos de tolerancia a herbicidas incluyen aquellos conferidos por polinucleótidos que confieren actividad de protoporfirinógeno oxidasa (protox) alterada, tal como se describe en las patentes de los Estados Unidos núms. 6,288,306 Bl; 6,282,837 B1 y 5,767,373 y en la publicación internacional patente núm. WO 2001/12825. Las plantas que contienen dichos polinucleótidos pueden exhibir una mayor tolerancia a diversos herbicidas dirigidos a la enzima protox (mencionados, además, como “inhibidores de protox”) En una modalidad, las secuencias de interés mejoran el crecimiento de la planta y/o los rendimientos del cultivo. Por ejemplo, las secuencias de interés incluyen genes agronómicamente importantes que resultan en sistemas mejorados de la raíz primaria o lateral. Tales genes incluyen, pero o se limitan a, transportares de nutrientes/agua e inductores del crecimiento. Los ejemplos de esos genes incluyen, pero no se limitan a, H+-ATPasa (MH?2) de la membrana plasmática de maíz (Frías, et al., (1996) Plant Cell 8: 1533-44); AKT1, un componente del aparato de captación de potasio en Arabidopsis, (Spalding, et al., (1999) J Gen Physiol 113:909-18); genes RML que activan el ciclo de división celular en las células apicales de la raíz (Cheng, et al., (1995) Plant Physiol 108:881); genes de glutamina sintetasa de maíz (Sukanya, et al., (1994) Plant Mol Biol 26:1935-46) y hemoglobina (Duff, et al., (1997) J. Biol . Chem 27:16749-16752, Arredondo-Peter, et al., (1997) Plant Physiol . 115:1259-1266; Arredondo-Peter, et al., (1997) Plant Physiol 114:493-500 y las referencias citadas en ellas). La secuencia de interés puede ser útil, además, para expresar las secuencias nucleotídicas no codificante de genes que afectan negativamente el desarrollo de la raíz.

Rasgos adicionales agronómicamente importantes tales como contenido de aceite, almidón y proteina pueden alterarse genéticamente, adicionalmente, con el uso de métodos de cultivo tradicionales. Las modificaciones incluyen aumentar el contenido de ácido oléico, aceites saturados e insaturados, aumentar los niveles de U sina y azufre, proporcionar aminoácidos esenciales y además la modificación del almidón. Las modificaciones a la proteina hordotionina se describen en las patentes de los Estados Unidos nú . 5,703,049, 5,885,801, 5,885,802 y 5,990,389, incorporadas en la presente descripción como referencia. Otro ejemplo es la proteina de la semilla rica en lisina y/o azufre codificada por la albúmina del frijol de soja 2S descrita en la patente de los Estados Unidos núm. 5,850,016 y el inhibidor de quimotripsina de cebada descrito en Williamson, et al., (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106, cuyas descripciones se incorporan en la presente descripción como referencia.

Los genes de resistencia a los insectos pueden codificar la resistencia a las plagas que tienen una gran capacidad de adherencia tales como gusano de la raíz, gusano cortador, taladro europeo del maíz y similares. Tales genes incluyen, por ejemplo, los genes de proteínas tóxicas de Bacillus thuringiensis (patentes de los Estados Unidos núms. 5,366,892; 5,747,450; 5,736,514; 5,723,756; 5,593,881 y Geiser, et al., (1986) Gene 48:109) y similares.

Los rasgos comerciales pueden codificarse además, en un gen o genes que podría aumentar, por ejemplo, el almidón para la producción de etanol o proporcionar la expresión de proteínas. Otro uso comercial importante de las plantas transformadas es la producción de polímeros y bioplásticos tales como los descritos en la patente de los Estados Unidos núm. 5,602,321. Los genes tales como b-cetotiolasa, PHBase (polihidroxibutirato sintasa) y acetoacetil-CoA reductasa (ver, Schubert, et ai., (1988) J. Bacteriol . 170:5837-5847) facilitan la expresión de polihidroxialcanoatos (PHA).

Los productos exógenos incluyen enzimas y productos vegetales así como de otras fuentes que incluyen procariotas y otros eucariotas. Tales productos incluyen enzimas, cofactores, hormonas y similares. Puede incrementarse el nivel de proteínas, particularmente las proteínas modificadas que tienen una distribución mejorada de aminoácidos para mejorar el valor nutriente de la planta. Esto se logra por la expresión de tales proteínas que tienen un contenido mejorado de aminoácidos.

El promotor, que está unido operativamente a la secuencia de nucleótidos, puede ser cualquier promotor activo en las células vegetales, particularmente, un promotor que está activo (o que puede activarse) en tejidos reproductivos de una planta (por ejemplo, estambres u ovarios). Como tal, el promotor puede ser, por ejemplo, un promotor constitutivamente activo, un promotor inducible, un promotor específico del tejido o un promotor especifico de la etapa de desarrollo. Además, el promotor de la primera molécula de ácido nucleico exógena puede ser un promotor igual o diferente al promotor de la segunda molécula de ácido nucleico exógena.

Generalmente, un promotor se selecciona, por ejemplo, en función de si los genes de fertilidad endógenos que se inhibirán son los genes de fertilidad masculina o genes de fertilidad femenina. Por lo tanto, cuando los genes endógenos que se inhibirán son genes de fertilidad masculina (por ejemplo, un gen BS7 y un gen SB200), el promotor puede ser un promotor especifico del estambre y/o un promotor especifico del polen, tal como un promotor del gen MS45 (patente de los Estados Unidos núm. 6,037,523), un promotor del gen 5126 (patente de los Estados Unidos núm. 5,837,851), un promotor del gen BS7 (patente núm. WO 2002/063021), un promotor del gen SB200 (patente núm. WO 2002/26789), un promotor del gen TA29 ( Nature 347:737 (1990)), un promotor del gen PG47 (patente de los Estados Unidos núm.5,412,085; patente de los Estados Unidos núm. 5,545,546; Plant J 3(2):261-271 (1993)), un promotor del gen SGB6 (patente de los Estados Unidos núm.5,470,359), un promotor del gen G9 (patentes de los Estados Unidos núms. 5,837,850 y 5,589,610) o similares, de manera que el ARNhp se expresa en la antera y/o polen o en tejidos que generan células de anteras y/o polen, y de esta manera se reduce o inhibe la expresión de los genes de fertilidad masculina endógenos (es decir, se inactiva los genes de fertilidad masculina endógenos) En comparación, cuando los genes endógenos que se inhibirán son genes de fertilidad femenina, el promotor puede ser, por ejemplo, un promotor especifico de los ovarios. Sin embargo, tal como se describe en la presente descripción, se puede usar cualquier promotor que dirija la expresión en el tejido de interés que incluye, por ejemplo, un promotor constitutivamente activo, tal como un promotor de ubiquitina que, generalmente, realiza la transcripción en la mayoría o en todas las células vegetales.

Corrección de genomas y mutagénesis inducida Generalmente, se dispone de métodos para modificar o alterar el ADN genómico endógeno del hospedero. Esto incluye alterar la secuencia de ADN natural del hospedero o una secuencia transgénica preexistente que incluye elementos reguladores, secuencias codificantes y no codificantes. Estos métodos son útiles, además, para dirigir los ácidos nucleicos a secuencias de reconocimiento dirigidas prediseñadas por ingeniería genética en el genoma. Como ejemplo, la célula o planta modificada genéticamente descrita en la presente descripción se genera con el uso de meganucleasas “específicas” producidas para modificar los genomas de las plantas (ver, por ejemplo, la patente núm. WO 2009/114321; Gao, et al . , (2010) Plant 10urnal 1 : 176-187) . Otro desarrollo mediante ingeniería genética dirigido a otro sitio se realiza por medio de reconocimiento del dominio de dedo de zinc acoplado con las propiedades de restricción de la enzima de restricción. Ver, por ejemplo, Urnov, et al . , (2010) Nat Rev Genet . 11(9):636-46; Shukla, et al . , (2009) Natura 459 (7245):437-41.

La “detección de lesiones locales inducidas EN genomas” o “TILLING”, por sus siglas en inglés, se refiere a una teenología de mutagénesis útil para generar y/o identificar y, en última instancia, para aislar variantes mutagenizadas de un ácido nucleico especifico con expresión y/o actividad modulada (McCallum, et al . , (2000), Plant Physiology 123:439-442; McCallum, et al . , (2000) Nature Biotechnology 18:455-457 y Colbert, et al . , (2001) Plant Physiology 126:480-484). Los métodos para TILLING son muy conocidos en la materia (patente de los Estados Unidos núm. 8,071,840) .

Además, se puede usar otros métodos mutagénicos para introducir mutaciones en el gen STPP. Los métodos para introducir mutaciones genéticas en genes de plantas y seleccionar plantas con rasgos deseados son muy conocidos. Por ejemplo, las semillas u otro material vegetal se pueden tratar con una sustancia química mutagénica, de conformidad con técnicas estándar. Tales sustancias químicas incluyen, pero no se limitan a, las siguientes: sulfato de dietilo, etilenimina y N-nitroso-N-etilurea. Alternativamente, se puede usar radiación ionizante de fuentes tales como rayos X o rayos gamma.

Los promotores constitutivos ilustrativos incluyen el promotor del virus del mosaico de la coliflor 35S (CaMV) (Odell, et al . , (1985) Nature 313:810-812), el promotor de la ubiquitina del maíz (Christensen, et al . , (1989) Plant Mol . Biol . 12:619-632 y Christensen, et ai., (1992) Plant Mol . Biol . 18:675-689); el promotor principal del promotor Rsyn7 y otros promotores constitutivos descritos en la patente núm. WO 1999/43838 y la patente de los Estados Unidos núm. 6,072,050; actina del arroz (McElroy, et ai., (1990) Plant Cell 2:163-171); pEMU (Last, et al . , (1991) Theor. Appl . Gene t . 81:581-588); MAS (Velten, et ai., (1984) EMBO J. 3:2723-2730); promotor ALS (patente de los Estados Unidos núm.5,659,026); promotor de la actina del arroz (patente de los Estados Unidos núm.5,641,876; patente núm. WO 2000/70067), promotor de la histona del maíz (Brignon, et al . , (1993) Plant Mol Bio 22(6):1007-1015; Rasco-Gaunt, et al . , (2003) Plant Cell Rep. 21(6):569-576) y similares. Otros promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, aquellos descritos en las patentes de los Estados Unidos núms. 5,608,144 y 6,177,611 y la publicación del PCT núm. WO 2003/102198.

Los elementos reguladores específicos del tejido, preferidos del tejido o específicos de la etapa incluyen, además, por ejemplo, el elemento regulador AGL8/FRUITFULL, que se activa cuando se produce la inducción floral (Hempel, et al . , (1997) Development 124:3845-3853); los elementos reguladores específicos de la raíz tales como los elementos reguladores del gen RCP1 y el gen LRP1 (Tsugeki and Fedoroff, (1999) Proc. Nati . Acad. , Estados Unidos 96:12941-12946; Smith and Fedoroff, (1995) Plant Cell 7:735-745); los elementos reguladores específicos de la flor tales como los elementos reguladores del gen LEAFY y el gen APETALA1 (Blazquez, et al . , (1997) Development 124:3835-3844; Hempel, et al . , supra, 1997); los elementos reguladores específicos de la semilla tal como el elemento regulador del gen de oleosina (Plant, et al . , (1994) Plant Mol . Biol . 25:193-205) y el elemento regulador específico de la zona de dehiscencia. Otros elementos reguladores específicos del tejido o específicos de la etapa incluyen el promotor Znl3, que es un promotor específico del polen (Hamilton, et al . , (1992) Plant Mol . Biol . 18:211-218); el promotor UNUSUAL FLORAL ORGANS { UFO) , que es activo en el meristema del brote apical; el promotor activo en los meristemas de brotes (Atanassova, et al . , (1992) Plant J. 2:291), el promotor cdc2 y el promotor cyc07 (ver, por ejemplo, Ito, et al . , (1994) Plant Mol . Biol . 24:863-878; Martínez, et al . , (1992) Proc. Nati . Acad. Sci . , Estados Unidos 89:7360); los promotores meri-5 y H3 preferidos meristemáticos (Medford, et al . , (1991) Plant Cell 3:359; Terada, et al . , (1993) Plant J. 3:241); los promotores meristemáticos y preferidos del floema de genes relacionados con Myb en la cebada (Wissenbach, et al . , (1993) Plant J. 4:411); cyc3aAt y cyclAt de Arabidopsis (Shaul, et al . , (1996) Proc. Nati . Acad. Sel . 93:4868-4872); ciclinas CYS y CYM de C. roseus (Ito, et al . , (1997) Plant J. 11:983-992); y Nicotiana CyclinBl (Trehin, et al . , (1997) Plant Mol . Biol. 35:667-672); el promotor del gen APETALA3 que es activo en los meristemas florales (Jack, et al . , (1994) Cell 76:703; Hempel, et al . , supra, 1997); un promotor de un miembro de la familia de tipo Agamous (AGL), por ejemplo, AGL8, que es activo en el meristema del brote cuando se produce la transición a la floración (Hempel, et al . , supra, 1997); promotores de la zona de abscisión floral; promotores específicos de Ll; el promotor de poligalacturonasa del tomate mejorado para la maduración (Nicholass, et al . , (1995) Plant Mol . Biol . 28:423-435), el promotor E8 (Deikman, et al . , (1992) Plant Physiol . 100:2013-2017) y el promotor específico del fruto 2A1, los promotores de ARNnp U2 y U5 del maíz, el promotor Z4 de un gen que codifica la proteína zeína Z4 de 22 kD, el promotor Z10 de un gen que codifica una proteina de zeína de 10 kD, un promotor Z27 de un gen que codifica una proteína zeína de 27 kD, el promotor A20 del gen que codifica una proteína zeína de 19 kD, y similares. Se puede aislar otros promotores específicos del tejido con el uso de métodos muy conocidos (ver, por ejemplo, patente de los Estados Unidos nú . 5,589,379)). Los promotores preferidos del brote incluyen los promotores preferidos del meristema del brote tales como los promotores descritos en Weigel, et al . , (1992) Cell 69:843-859 (número de registro M91208); número de registro AJ131822; número de registro Z71981; número de registro AF049870 y los promotores preferidos del brote descritos en McAvoy, et al. , (2003) Acta Hort. { ISHS) 625:379-385. Los promotores preferidos de la inflorescencia incluyen el promotor de chalcona sintasa (Van der Meer, et al . , (1992) Plant J. 2(4):525-535), especifico de la antera LAT52 (Twell, et al . , (1989) Mol . Gen. Genet. 217:240-245), especifico del polen Bp4 (Albani, et al . , (1990) Plant Mol Biol . 15:605, gen especifico del polen del maíz Zml3 (Hamilton, et al . , (1992) Plant Mol . Biol . 18:211-218; Guerrero, et al . , (1993) Mol . Gen . Genet. 224:161-168), promotores específicos de microesporas tal como el promotor del gen apg (Twell, et al . , (1993) Sex. Plant Reprod. 6:217-224) y los promotores específicos del tapetum tal como el promotor del gen TA29 (Mariani, et al . , (1990) Nature 347:737; patente de los Estados Unidos núm. 6,372,967) y otros promotores específicos del estambre tales como el promotor del gen MS45, el promotor del gen 5126, el promotor del gen BS7, el promotor del gen PG47 (patente de los Estados Unidos núm. 5,412,085; patente de los Estados Unidos núm.5,545,546; Plant J 3(2):261-271 (1993)), el promotor del gen SGB6 (patente de los Estados Unidos núm.5,470,359), el promotor del gen G9 (patente de los Estados Unidos núm. 5,8937,850; patente de los Estados Unidos núm. 5,589,610), el promotor del gen SB200 (patente núm. WO 2002/26789) o similares (ver el Ejemplo 1). Los promotores de interés preferidos del tejido incluyen, además, un gen expresado en el polen del girasol SF3 (Baltz, et al., (1992) The Plan Journal 2:713-721), genes específicos del polen de B. napus (Am oldo, et al., (1992) J. Cell. Biochem, resumen número Y101204). Los promotores preferidos del tejido incluyen, además, aquellos reportados por Yamamoto, et al., (1997) Plant J. 12(2):255-265 (psaDb); Kawamata, et al., (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803 (PsPALl); Hansen, et al., (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343 (ORF13); Russell, et al., (1997) Transgenic Res. 6(2):157-168 (ceroso o ZmGBS; zeína de 27kDa, ZmZ27; osAGP; osGTl); Rinehart, et al., (1996) Plant Physiol. 112 (3):1331-1341 (Fbl2A del algodón); Van Camp, et al., (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535 ( Nicotiana SodAl y SodA2); Canevascini, et al., (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524 ( Nicotiana ltpl); Yamamoto, et al., (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778 (promotor Pinus cab-6); Lam, (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco, et al., (1993) Plant Mol Biol. 23(6):1129-1138 (rubisco activasa (Rea) de la espinaca); Matsuoka, et al., (1993) Proc Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 90(20):9586-9590 (promotor PPDK) y Guevara-Garcia, et al., (1993) Plant J. 4(3):495-505 (promotor pmas de Agrobacterium) . Un promotor específico del tejido que está activo en células de órganos reproductores masculinos o femeninos puede ser particularmente útil en ciertos aspectos de la presente descripción.

Los promotores “preferidos de la semilla” incluyen tanto los promotores “de desarrollo de semillas” (aquellos promotores activos durante el desarrollo de las semillas, tales como los promotores de proteínas de almacenamiento de semillas) como los promotores de “germinación de semillas” (aquellos promotores activos durante la germinación de las semillas). Ver, Thompson, et al . , (1989) BioEssays 10:108. Tales promotores preferidos de la semilla incluyen, pero no se limitan a, Ciml (mensaje inducido por citocinina), cZ19Bl (zeína de 19 kDa del maíz), milps (mio-inositol-1-fosfato sintasa); ver, la patente núm. WO 2000/11177 y la patente de los Estados Unidos núm. 6,225,529. La gamma-zeína es un promotor específico de endosperma. La globulina-1 (Glob-1) es un promotor representativo específico del embrión. Para las dicotiledóneas, los promotores específicos de semillas incluyen, pero no se limitan a, b-faseolina del frijol, napina, b-conglicinina, lectina de frijol de soya, cruciferina y similares. Para las monocotiledóneas, los promotores específicos de semillas incluyen, pero no se limitan a, zeína de maíz de 15 kDa, zeína de 22 kDa, zeína de 27 kDa, gamma-zeína, waxy, shrunken 1, shrunken 2, globulina 1, etc. Ver, además, la patente núm. WO 2000/12733 y la patente de los Estados Unidos núm. 6,528,704, en donde se describen los promotores preferidos de semillas de los genes endl y end.2. Otros promotores específicos de los embriones se describen en Sato, et al . , (1996) Proc. Nati . Acad. Sel . 93:8117-8122 (caja homeótica del arroz, 0SH1) y Postma-Haars a, et al . , (1999) Plant Mol . Biol . 39:257-71 (genes KNOX del arroz). Otros promotores específicos del endosperma se describen en Albani, et al . , (1984) EMBO 3:1405-15; Albani, et al . , (1999) Theor. Appl. Gen. 98:1253-62; Albani, et al . , (1993) Plant J. 4:343-55; Mena, et al . , (1998) The Plan Journal 116:53-62 (DOF de la cebada); Opsahl-Ferstad, et al . , (1997) Plant J 12:235-46 (Esr del maíz) y Wu, et al . , (1998) Plant Cell Physiology 39:885-889 (GluA-3, GluB-1, NRP33, RAG-1 del arroz).

Un elemento regulador inducible es aquel capaz de activar, directa o indirectamente, la transcripción de una o más secuencias o genes de ADN en respuesta a un inductor. El inductor puede ser un agente químico tal como una proteína, metabolito, regulador del crecimiento, herbicida o compuesto fenólico o un estrés fisiológico, tal como el impuesto directamente por calor, frió, sal o elementos tóxicos, o indirectamente a través de la acción de un agente patógeno o de una enfermedad tal como un virus u otro agente biológico o físico o condición ambiental. Una célula vegetal que contiene un elemento regulador inducible puede exponerse a un inductor por medio de la aplicación externa del inductor a la célula o planta tal como mediante rociado, riégo, calentamiento o métodos similares. Un agente inductor útil para inducir la expresión a partir de un promotor inducible se selecciona sobre la base del elemento regulador inducible particular. En respuesta a la exposición a un agente inductor, la transcripción a partir del elemento regulador inducible se inicia, generalmente, de novo o aumenta por encima de un nivel de expresión basal o constitutivo. Típicamente, el factor de proteina que se une específicamente a un elemento regulador inducible para activar la transcripción está presente en una forma inactiva que, después, se convierte directa o indirectamente a la forma activa por medio del inductor. En la presente descripción se puede usar cualquier promotor inducible (ver, Ward, et al., (1993) Plant Mol . Biol . 22:361-366) .

Los ejemplos de elementos reguladores inducibles incluyen un elemento regulador de metalotioneína, un elemento regulador inducible por cobre o un elemento regulador inducible por tetracielina, la transcripción de los cuales puede realizarse en respuesta a iones metálicos divalentes, cobre o tetraciclina, respectivamente (Furst, et al., (1988) Cell 55:705-717; Mett, et al., (1993) Proc. Nati . Acad. Sci . Estados Unidos 90:4567-4571; Gatz, et al., (1992) Plant J. 2:397-404; Roder, et al., (1994) Mol . Gen . Genet . 243:32-38). Los elementos reguladores inducibles incluyen, además, un elemento regulador de ecdisona o un elemento regulador de glucocorticoide, la transcripción de los cuales puede realizarse en respuesta a la ecdisona u otro esteroide (Christopherson, et al., (1992) Proc. Nati. Acad. Sci., Estados Unidos 89:6314-6318; Schena, et al., (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 88:10421-10425; patente de los Estados Unidos núm. 6,504,082); un elemento regulador sensible al frió o un elemento regulador de choque térmico, la transcripción de los cuales puede realizarse en respuesta a la exposición al frió o calor, respectivamente (Takahashi, et al., (1992) Plant Physiol. 99:383-390); el promotor del gen de alcohol deshidrogenasa (Gerlach, et al., (1982) PNAS Estados Unidos 79:2981-2985; Walker, et al., (1987) PNAS 84 (19):6624-6628), inducible por condiciones anaerobias; y el promotor inducible por luz derivado del gen rbcS del chícharo o el gen psaDb del chícharo (Yamamoto, et al., (1997) Plant J. 12 (2):255-265); un elemento regulador inducible por luz (Feinbaum, et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 226:449; Lam and Chua, (1990) Science 248:471; Matsuoka, et ai., (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 90 (20):9586-9590; Orozco, et al., (1993) Plant Mol. Bio. 23(6):1129-1138), un elemento regulador inducible por la hormona de la planta (Yamaguchi-Shinozaki, et al., (1990) Plant Mol. Biol . 15:905; Kares, et al., (1990) Plant Mol. Biol. 15:225), y similares. Un elemento regulador inducible puede ser, además, el promotor del gen del maíz In2-1 o In2-2, que se activa mediante protectores herbicidas de bencensulfonamida (Hershey, et al., (1991) Mol. Gen. Gene. 227:229-237; Gatz, et al., (1994) Mol. Gen. Genet . 243:32-38) y el represor Tet del transposón TnlO (Gatz, et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237). Los promotores inducibles por estrés incluyen los promotores inducibles por estrés de sal/agua tales como P5CS (Zang, et al., (1997) Plant Sciences 129:81-89); los promotores inducibles por frió, tales como corl5a (Hajela, et al., (1990) Plant Physiol. 93:1246-1252), corl5b (Wlihelm, et al., (1993) Plant Mol Biol 23:1073-1077), wscl20 (Ouellet, et al., (1998) FEBS Lett. 423:324-328), ci7 (Kirch, et al., (1997) Plant Mol Biol. 33:897-909), ci21A (Schneider, et al., (1997) Plant Physiol. 113:335-45); los promotores inducibles por sequía, tales como Trg-31 (Chaudhary, et al., (1996) Plant Mol. Biol. 30:1247-57), rd29 (Kasuga, et al., (1999) Nature Biotechnology 18:287-291); los promotores inducibles osmóticos, tales como Rabl7 (Vilardell, et al., (1991) Plant Mol. Biol. 17:985-93) y osmotina (Raghothama, et al., (1993) Plant Mol Biol 23:1117-28) y los promotores inducibles por calor, tales como las proteínas de choque térmico (Barros, et al., (1992) Plant Mol. 19:665-75; Marrs, et al., (1993) Dev. Genet. 14:27-41), smHSP (Waters, et al., (1996) J.

Experimental Botany 47:325-338) y el elemento inducidle por choque térmico del promotor de la ubiquitina del perejil (patente núm. O 03/102198). Otros promotores inducibles por estrés incluyen rip2 (patente de los Estados Unidos núm. 5,332,808 y publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2003/0217393) y rd29a (Yamaguchi-Shinozaki, et al . , (1993) Mol . Gen . Genetics 236:331-340). Ciertos promotores son inducibles por lesiones e incluyen el promotor pmas de Agrobacterium (Guevara-Garcia, et al . , (1993) Plant J. 4(3):495-505) y el promotor ORF13 de Agrobacterium (Hansen, et al . , (1997) Mol . Gen . Gene t. 254(3):337-343).

Las plantas adecuadas para los propósitos de la presente descripción pueden ser monocotiledóneas o dicotiledóneas e incluyen, pero no se limitan a, maíz, trigo, cebada, centeno, camote, frijol, chícharo, achicoria, lechuga, col, coliflor, brócoli, nabo, rábano, espinaca, espárrago, cebolla, ajo, pimiento, apio, calabacín, calabaza común, cáñamo, calabacitas, manzana, pera, membrillo, melón, ciruela, cereza, melocotón, mandarina, chabacano, frutilla, uva, frambuesa, zarzamora, piña, palta, papaya, mango, plátano, frijol de soja, tomate, sorgo, caña de azúcar, betabel, girasol, semilla de colza, clavo, tabaco, zanahoria, algodón, alfalfa, arroz, papa, berenjena, pepino, Arabidopsis thaliana y plantas leñosas tales como los árboles coniferos y caducifolios . Por lo tanto, una planta transgénica o una célula vegetal modificada genéticamente de la descripción puede ser un angiosperma o gimnosperma.

Las plantas de cereales gue producen un grano comestible incluyen, por ejemplo, maíz, arroz, trigo, cebada avena, centeno, pasto ovillo, pasto de Guinea y sorgo. Las plantas leguminosas incluyen miembros de la familia de chícharos ( Fabaceae ) y producen un fruto característico conocido como una legumbre. Los ejemplos de plantas leguminosas incluyen, por ejemplo, frijol de soja, chícharo, garbanzo, frijol moth, haba, poroto colorado, poroto de lima, lenteja, caupí, frijol seco y cacahuate, así como alfalfa, cuernecillo, trébol y pipirigallo. Las plantas oleaginosas, que tienen semillas útiles como una fuente de aceite, incluyen frijol de soja, girasol, semilla de colza (cañóla) y semilla de algodón. Los angiospermas incluyen, además, árboles de madera dura que son plantas leñosas perennes que tienen, generalmente, un solo tallo (tronco). Los ejemplos de dichos árboles incluyen aliso, fresno, álamo, tilo, haya, abedul, cerezo, chopo, olmo, eucalipto, nogal americano, acacia blanca, arce, roble, caqui, álamo, sicómoro, nogal, secoya y sauce. Los árboles son útiles, por ejemplo, como una fuente de pulpa, papel, material estructural y combustible.

La homocigosidad es una condición genética existente cuando alelos idénticos se encuentran en loci correspondientes en cromosomas homólogos. La heterocigosidad es una condición genética existente cuando alelos distintos se encuentran en loci correspondientes en cromosomas homólogos. La hemicigosidad es una condición genética existente cuando hay una sola copia de un gen (o conjunto de genes) sin una contraparte alélica en el cromosoma hermano.

Los métodos de cultivo de plantas agrícolas usados en la presente descripción son conocidos para una persona con experiencia en la materia. Una descripción sobre las téenicas de cultivo de plantas agrícolas se encuentra disponible en Poehlman, (1987) Breeding Field Crops AVI Publication Co., Westport Conn. Muchas plantas especialmente preferidas en este método se cultivan a través de técnicas que emplean el método de polinación de la planta.

Para introducir un gen en las plantas se puede usar métodos de retrocruzamiento. Esta técnica se ha usado por décadas para introducir rasgos en una planta. Un ejemplo de una descripción de esta y otras metodologías de cultivo de plantas agrícolas muy conocidas pueden encontrarse en referencias tales como Plant Breeding Methodology, edit. Neal Jensen, John Wilcy & Sons, Inc. (1988). En un protocolo de retrocruzamiento típico, la variedad original de interés (progenitor recurrente) se cruza con una segunda variedad (progenitor no recurrente) que contiene el único gen de interés que se transferirá. Después, la progenie que resulta de este cruzamiento se cruza otra vez con el progenitor recurrente y el proceso se repite hasta que se obtiene una planta, en donde esencialmente todas las características morfológicas y fisiológicas deseadas para el progenitor recurrente se recuperan en la planta convertida, además del único gen transferido desde el progenitor no recurrente.

Transgen se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico que se introduce en el genoma de una célula mediante téenicas de ingeniería genética. Un transgen puede ser una secuencia de ADN nativa o una secuencia de ADN heteróloga (es decir, “ADN foráneo”). El término secuencia de ADN nativa se refiere a una secuencia de nucleótidos que se encuentra naturalmente en la célula, pero, que puede haberse modificado con respecto a su forma original.

Con el uso de técnicas muy conocidas se puede aislar secuencias de promotores adicionales en función de su homología de secuencias. En estas técnicas, la totalidad o una parte de una secuencia de un promotor conocido se usa como una sonda que se híbrida selectivamente a otras secuencias presentes en una población de fragmentos de ADN genómico clonado (es decir, genotecas genómicas) a partir de un organismo seleccionado. Se puede usar métodos fácilmente disponibles en la materia para la hibridación de secuencias de ácido nucleico para obtener secuencias que corresponden a estas secuencias de promotores en especies que incluyen, pero no se limitan a, maíz ( Zea mays) , cañóla ( Brassica napus , Brassica rapa ssp. ) , alfalfa ( Medicago sativa) , arroz ( Oryza sa tiva) , centeno ( Secale cereale) , sorgo ( Sorghum bicolor, Sorghum vulgare) , girasol ( Helianthus annuus) , trigo ( Triticum aestivum) , frijol de soja ( Glycine max) , tabaco ( Nícotiana tabacum) , papa ( Solanum tuberosum) , cacahuates (Ar achis hypogaea) , algodón ( Gossypium hirsutum), camote ( Ipomoea batatus) , mandioca ( Manihot esculenta) , café ( Cofea spp. ) , coco ( Cocos nucífera) , piña ( Ananas comosus) , árboles cítricos ( Citrus spp. ) , cacao ( Theobroma cacao) , té ( Camellía sinensis) , plátano ( Musa spp. ), aguacate (Persea americana) , higo ( Ficus casica) , guayaba ( Psidium guajava) , mango ( Mangifera indica) , olivo ( Olea eurüpaea) , avena, cebada, hortalizas, plantas ornamentales y coniferas. Preferentemente, las plantas incluyen maíz, frijol de soja, girasol, cártamo, cañóla, trigo, cebada, centeno, alfalfa y sorgo.

Toda la secuencia del promotor o porciones de esta pueden usarse como una sonda capaz de hibridarse específicamente a secuencias de promotores correspondientes. Para lograr la hibridación específica en una gran variedad de condiciones, estas sondas incluyen secuencias que son únicas y tienen, preferentemente, una longitud de al menos aproximadamente 10 nucleótidos y, con la máxima preferencia, una longitud de al menos aproximadamente 20 nucleótidos. Tales sondas pueden usarse para amplificar secuencias de promotores correspondientes a partir de un organismo elegido mediante el proceso de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) conocido. Esta téenica se puede usar para aislar secuencias de promotores adicionales a partir de un organismo deseado o como un ensayo de diagnóstico para determinar la presencia de la secuencia del promotor en un organismo. Los ejemplos incluyen el análisis por hibridación de genotecas de ADN cultivadas en placas (ya sea en placas o colonias; ver, por ejemplo, Innis, et ai., (1990) PCR Protocole, A Guide to Methods and Applications, eds., Academic Press).

Generalmente, las secuencias que corresponden a una secuencia de un promotor de la presente descripción y que se hibridan a una secuencia de un promotor descrita en la presente descripción serán al menos 50 % homologas, 55 % homologas, 60 % homologas, 65 % homologas, 70 % homologas, 75 % homologas, 80 % homologas, 85 % homologas, 90 % homologas, 95 % homologas y aun 98 % homologas o más con la secuencia descrita.

Los fragmentos de una secuencia promotora particular pueden usarse para dirigir la expresión de un gen de interés. Estos fragmentos comprenderán al menos aproximadamente 20 nucleótidos contiguos, preferentemente, al menos aproximadamente 50 nucleótidos contiguos, con mayor preferencia, al menos aproximadamente 75 nucleótidos contiguos, aún con mayor preferencia, al menos aproximadamente 100 nucleótidos contiguos de las secuencias de nucleótidos particulares del promotor descritas en la presente descripción. Los nucleótidos de tales fragmentos comprenden, usualmente, la secuencia de reconocimiento TATA de la secuencia promotora particular. Tales fragmentos se pueden obtener con el uso de enzimas de restricción para escindir las secuencias de los promotores de origen natural descritas en la presente descripción; mediante síntesis de una secuencia de nucleótidos a partir de la secuencia de ADN de origen natural o a través del uso de teenología de PCR. Ver, particularmente, Mullís, et al., (1987) Methods Enzymol . 155:335-350 y Erlich, ed. (1989) PCR Technology (Stockton Press, New York). Otra vez, las composiciones de la presente descripción abarcan las variantes de estos fragmentos, tal como aquellos que resultan de la mutagénesis sitio dirigida.

La secuencia de nucleótidos unida operativamente a los elementos reguladores descritos en la presente descripción puede ser una secuencia no codificante para un gen objetivo. “Secuencia de nucleótidos de ADN no codificante” se refiere a una secuencia en orientación inversa a la orientación normal 5' a 3' de esa secuencia de nucleótidos. Cuando se suministra en una célula vegetal, la expresión de la secuencia de ADN no codificante evita la expresión normal de la secuencia de nucleótidos del ADN para el gen objetivo. La secuencia de nucleótidos no codificante codifica una transcripción de ARN complementaria a y con la capacidad de hibridarse con el ARN mensajero (ARNm) endógeno producido por transcripción de la secuencia de nucleótidos de ADN para el gen objetivo. En este caso, la producción de la proteína natural codificada por el gen objetivo se inhibe para lograr la respuesta fenotipica deseada. Por lo tanto, las secuencias reguladoras reivindicadas en la presente descripción se pueden unir operativamente a secuencias de ADN no codificante para reducir o inhibir la expresión de una proteína nativa o exógena en la planta.

Ejemplos Ejemplo 1. Creación de una población de Arabidopsis Se creó un constructo que contiene cuatro elementos potenciadores multimerizados derivados del promotor del virus del mosaico de la coliflor 35S. El constructo contiene, además, secuencias de vectores (pUC9) para permitir el rescate de plásmidos, secuencias de transposones (Ds) y el gen bar para permitir la selección de glufosinato de las plantas transgénicas . Los elementos potenciadores pueden inducir la cis-activación de los loci genómicos, seguido por la integración de ADN en el genoma. Las plantas de Arabidopsis se transformaron y la población de plantas de Arabidopsis que portan elementos potenciadores se generó para su análisis posterior.

Se seleccionó un total de 100,000 plántulas Ti resistentes a glufosinato. Las semillas T2 a partir de cada linea se conservaron por separado.

Ejemplo 2: Ensayos para identificar lineas con una arquitectura de raíz alterada Las plántulas de Arabidopsís con rotulación de activación, cultivadas en condiciones de nitrógeno no limitantes, se analizaron para evaluar la arquitectura del sistema radicular alterado en comparación con plántulas control durante el desarrollo prematuro a partir de la población descrita en el Ejemplo 1.

Los genes guia validados a partir de la evaluación interna se sometieron a un ensayo de placas verticales para evaluar el crecimiento radicular mejorado. Los resultados se validaron con el uso de WinRHIZO®, como se describe a continuación. Las semillas TI o T2 se esterilizaron con el uso de blanqueador casero al 50 %, solución X-100 de tritón al .01 % y se colocaron en placas de petri que contienen el medio a continuación: Hoagland libre de N 0.5x, KNO360 mM, sacarosa al 0.1 %, MES 1 mM y Phytagel™ al 1 % a una densidad de 4 semillas/placa o Hoagland libre de N 0.5x, KNO34 mM, sacarosa al 1 %, MES 1 mM y Phytagel™ al 1 % a una densidad de 4 semillas/placa. Las placas se mantuvieron durante tres dias a 4 °C para estratificar las semillas y, después, se mantuvieron verticalmente durante 11 dias a 22 °C de luz y 20 °C de oscuridad. El periodo de exposición a la luz fue de 16 h; 8 h de oscuridad y una intensidad de la luz promedio de ~160 pmol/m2/s. Las placas se colocaron verticalmente en las ocho posiciones centrales de un soporte de 10 placas, en donde en la primera posición y en la última posición se colocan placas vacias. Los soportes y las placas dentro de un soporte se rotaron cada dos dias. Se tomó dos juegos de imágenes para cada placa. El primer juego se tomó a los 14 - 16 dias cuando las raíces principales para la mayoría de líneas habían alcanzado el fondo de la placa, el segundo juego de imágenes se tomó días más tarde, después del desarrollo de más raíces laterales. Este último juego de imágenes se usó, usualmente, para el análisis de datos. Estas plántulas cultivadas en placas verticales se analizaron para evaluar el crecimiento radicular con el programa WinRHIZO® (Regent Instruments Inc), un sistema de análisis de imágenes diseñado, específicamente, para la medición de la raíz. WinRHIZO® usa el contraste en pixeles para distinguir la raíz clara del fondo más oscuro. Para identificar la cantidad máxima de raíces sin levantar el fondo, la clasificación de pixeles fue de 150 - 170 y la característica del filtro se usó para eliminar objetos que tienen una relación longitud/ancho menor que 10.0. El área en las placas analizadas fue desde el borde de las hojas de la planta hasta aproximadamente 1 cm desde el fondo de la placa. Los mismos parámetros exactos de WinRHIZO® y área de análisis se usaron para analizar todas las placas dentro de un grupo. El puntaje de longitud radicular total que proporciona el programa WinRHIZO® para una placa se dividió por la cantidad de plantas que hablan germinado y que se habían cultivado a la mitad de la placa. Para cada línea se cultivó ocho placas y sus puntajes se promediaron. Después, este promedio se comparó con el promedio de ocho placas que contienen semillas silvestres que se cultivaron al mismo tiempo.

Se esperaba que las líneas con características de crecimiento radicular aumentado estuvieran en el extremo superior de las distribuciones del área radicular. Se usó un método de ventana deslizante para calcular la varianza en el área radicular para un soporte específico, asumiendo que podría haber hasta dos valores atípicos en el soporte. Las variaciones ambientales en diversos factores que incluyen medio de crecimiento, temperatura y humedad pueden causar una variación significativa en el crecimiento radicular, especialmente, entre fechas de siembra. Por lo tanto, las líneas se agruparon por fecha de siembra y estante para el análisis de datos. Después, los soportes en un grupo de fechas de siembra/estantes se clasificaron por el área media de la raíz. Las distribuciones del área radicular para las ventanas deslizantes se llevaron a cabo al combinar los datos para un soporte, r¿, con los datos del soporte con los siguientes más bajos, (ri-i y el área media de la raíz siguiente máxima, ri+i. Después, la varianza de la distribución combinada se analizó para identificar valores atípicos en ri con el uso de un método de tipo Grubbs (Barnett, et al . , Outliers in Statistical Data, John Wilcy & Sons, 3.° edición (1994).

Las plantas transgénicas TI que sobreexpresan individualmente ZmSTPP3, AtPPl u otros elementos de la familia AtTOPP se evaluaron en este ensayo. Las plantas transgénicas que sobreexpresan cada una de estas secuencias (ZmSTPP3, sec. con núm. de ident.: 48; AtTOPP4, sec. con núm. de ident.: 53; AtTOPP2, sec. con núm. de ident.: 66; y AtT0PP8, sec. con núm. de ident.: y la sec. con núm. de ident.:86 114) mostraron un crecimiento radicular mejorado en condiciones de nitrato no limitantes, mientras que se consideró que las plantas transgénicas que expresan AtPPl (sec. con núm. de ident.: 85), AtTOPPl (sec. con núm. de ident.: 64), AtT0PP3 (sec. con núm. de ident.: 75), AtTOPP5 (sec. con núm. de ident.: 65), AtT0PP6 (sec. con núm. de ident.: 74) y AtTOPP7 (sec. con núm. de ident.: 67, sec. con núm. de ident.: y sec. con núm. de ident.:116 118) con el promotor CaMV 35S no muestran un fenotipo de arquitectura de la raíz diferente al de las plantas control en estas condiciones de nitrógeno de KN0360 mM. Las plantas transgénicas que sobreexpresan Z STPP3 (sec. con núm. de ident.: 48) demostraron, además, un crecimiento radicular mejorado cuando se cultivaron en placas que contenían KN034 mM.

Ejemplo 3._ Ensayo de colorante indicador de pH para identificar genes involucrados en la captación de nitrato El análisis se llevó a cabo con el uso del siguiente ensayo de colorante indicador de pH para identificar los genes involucrados en la captación de nitrato como se detalla en la solicitud de patente de los Estados Unidos serie núm. 12/166,473, presentada el 3 de julio de 2007. Con el uso del protocolo detallado en la solicitud de patente de los Estados Unidos serie núm.12/166,473, presentada el 3 de julio de 2007, las lineas de Arabidopsis que sobreexpresan AtPPl (sec. con núm. de ident.: 85) con el promotor CaMV 35S tuvieron significativamente menos (p<0.05) nitrato restante en el medio que las lineas control silvestres.

Además de AtPPl, ZmSTPP3 (sec. con núm. de ident.: 48) y otros elementos de Arabidopsis de la familia TOPP (AtTOPPl-8; sec. con núm. de ident.: 64, sec. con núm. de ident.: 66, sec. con núm. de ident.: 75, sec. con núm. de ident.: 53, sec. con núm. de ident.: 65, sec. con núm. de ident.: 74, sec. con núm. de ident.: 67, sec. con núm. de ident.: 116, sec. con núm. de ident.: 118, sec. con núm. de ident.: 114, sec. con núm. de ident.: 86) se sobreexpresaron con el uso del promotor CaMV 35S, se transformaron en Arabidopsis y se analizaron en este ensayo. La sobreexpresión de cada una de estas secuencias produjo significativamente menos (p<0.05) nitrato restante en el medio que las lineas control silvestres. Los elementos de la familia de Arabidopsis que muestran menos nitrato restante en el medio representan cada ciado de la Figura 2.

Ejemplo 4. Análisis de genes en condiciones de limitación de nitrógeno en Arabidopsis La semilla transgénica seleccionada por la presencia del marcador fluorescente YFP puede analizarse, además, para evaluar su tolerancia al crecimiento en condiciones de limitación de nitrógeno. Los individuos transgénicos que expresan los genes de Arabidopsis de interés se colocan en placas con medio con contenido bajo de N (Hoagland libre de N 0.5x, nitrato potásico 0.4 mM, sacarosa al 0.1 %, MES 1 mM y Phytagel™ al 0.25 %), de manera que 32 individuos transgénicos se cultivan al lado de 32 individuos silvestres en una placa. Las plantas se evalúan a los 10, 11, 12 y 13 dias. Si una linea muestra una diferencia estadísticamente significativa con respecto a los controles se considera que la línea es una línea tolerante a la deficiencia de nitrógeno validada. Después de cubrir con cinta la imagen de la placa para eliminar el color de fondo, se recolecta dos mediciones diferentes para cada individuo: el área total de la roseta y el porcentaje de color que cae en un recipiente de color verde En función de los datos del tono, saturación e intensidad (“HSI”, por sus siglas en inglés), el ancho del intervalo del color verde consiste en los tonos 50 a 66. El área total de la roseta se usa como una medida de la biomasa de la planta, mientras que los estudios de respuesta a las dosis muestran que el ancho del intervalo del color verde es un indicador de la asimilación de nitrógeno.

Las plantas transgénicas que sobreexpresan individualmente AtPPl, ZmSTPP3 y otros miembros adicionales de la familia TOPP de Arabidopsis se evaluaron en este ensayo con limitación de nitrógeno. Las plantas transgénicas que sobreexpresan AtPPl (sec. con núm. de ident.: 85), AtT0PP8-l (sec. con núm. de ident.: 114) o AtTOPP4 (sec. con núm. de ident.: 53) mostraron un incremento en el área total de la roseta y una mejoría de color en el recipiente de color verde, mientras que las plantas transgénicas de Arabidopsis que expresan ZmSTPP3 (sec. con núm. de ident.: 48), AtTOPP7-2 (sec. con núm. de ident.: 116) o AtT0PP3 (sec. con núm. de ident.: 75) no se consideraron diferentes de las plantas control para el área de la roseta, pero mostraron menos color en el recipiente de color verde. AtTOPPl (sec. con núm. de ident.: 64). AtT0PP7-l (sec. con núm. de ident.: 67) demostraron un incremento en el área total de la roseta.

Además, las plantas transgénicas que expresan AtTOPP5 (sec. con núm. de ident.: 65) o AtTOPP6 (sec. con núm. de ident.: 74) con el promotor CaMV 35S mostraron una reducción en ambos parámetros (área total de la roseta y color en el recipiente de color verde).

Ejemplo 5. Análisis para evaluar la captación de nitrato mejorada en Arabidopsis Los genes candidatos pueden transformarse en Arabidopsis y sobreexpresarse con un promotor, tal como 35S o promotores de ubiquitina de maíz. Si se observa el mismo fenotipo o uno similar en la linea transgénica como en la linea genitora con rotulación de activación, entonces el gen candidato se considera un “gen guia” validado en Arabidopsis. El gen AtPPl de Arabidopsis (sec. con núm. de ident.: 85) se puede analizar directamente para evaluar su capacidad de mejorar la captación de nitrato en Arabidopsis .

Un constructo de genes 35S-At-PPl se introdujo en el ecotipo de Arabidopsis silvestre Col-0 con el uso de procedimientos convencionales de transformación.

Las semillas transgénicas T2 a partir de múltiples lineas TI independientes pueden seleccionarse por la presencia del marcador fluorescente YFP. Las semillas fluorescentes se sometieron a los ensayos de pH y captación de nitrato de conformidad con los procedimientos descritos en la presente descripción. Las semillas transgénicas T2 se analizaron nuevamente con el uso de 3 o 4 placas por constructo. Cada placa contenia semillas no transformadas Columbra para funcionar como control.

Ejemplo 6. NUE de nitrógeno: Ensayo de carbono Las semillas de Arabidopsis thaliana (control y linea transgénica), ecotipo Columbia, se esterilizaron en la superficie y, después, se colocaron en placas con medio Murashige and Skoog (MS) 0.5X libre de N que contiene KN03 5 mM, sacarosa al 5 % y Phytagel™ (Sigma) al 0.75 % (w/v), de manera que 18 semillas silvestres y 18 semillas transgénicas se encuentran en la misma placa. Las placas se incubaron durante 3 dias en la oscuridad a 4 °C para romper la dormancia (estratificación) y, después, se trasladaron a cámaras de crecimiento a una temperatura de 22 °C durante 16 horas de luz y 20 °C de oscuridad durante 8 horas. La intensidad promedio de la luz es 140 pE/m2/s. Las plántulas se cultivan durante 14 dias y la longitud del eje de cada hoja se determina en el dia 7 y en el día 10.

Ejemplo 7._ Protocolo del ensayo de NUE de plántulas Las semillas de los eventos transgénicos se separan en transgén (heterocigoto) y semilla nula con el uso de un marcador de color de semillas. Se realizó asignaciones aleatorias de los tratamientos para cada bloque de macetas dispuestas con el uso de múltiples réplicas de todos los tratamientos. Las semillas nulas de diversos eventos del mismo constructo se mezclaron y se usaron como control para la comparación de los eventos positivos en este bloque. Los parámetros transgénicos se compararon con un constructo nulo en masa y en el segundo caso, los parámetros transgénicos se compararon con el evento nulo correspondiente. Se usó análisis estadísticos convencionales.

Dos semillas de cada tratamiento se sembraron en macetas cuadradas de 10 cm (4 pulgadas) que contienen TURFACE®-MVP en 20 cm (8 pulgadas), centros escalonados y se regaron cuatro veces cada día con una solución que contiene los siguientes nutrientes: CaCl2, 1 mM MgSO4, 2 mM KH2P04, 0.5 mM 83 ppm Sprint330 KC13 mM KN03, 1mM ZnS04, 1 uM MnCl2, 1 uM H3B043 uM MnCl,, 1 uM CuS04, 0.1 uM NaMo04, 0.1 uM Después de la emergencia, las plantas se redujeron a una semilla por maceta. Los tratamientos de rutina se sembraron un lunes, emergieron el siguiente viernes y se recolectaron 18 días después de la plantación. En la cosecha, las plantas se retiraron de las macetas y la arcilla Turface se lavó de las raíces. Las raíces se separaron del brote, se colocaron en una bolsa de papel y se secaron a 70 °C durante 70 h. Las partes secas de la planta (raíces y brotes) se pesaron y se colocaron en un tubo cónico de 50 mi con bolas de acero de aproximadamente 51 cm (20 5/32 pulgadas) y se trituraron por medio de agitación en una mezcladora de pintura. Aproximadamente, 30 mg del tejido triturado (el peso se registró para su ajuste posterior) se hidrolizaron en 2 mi de H2C>2 al 20 % y H2SO46 M durante 30 min a 170 °C. Después de enfriar, el agua se agregó a 20 mi, se mezcló completamente y se eliminó una alícuota de 50 ml y se agregó a 950 ml de Na2CO3 1 M. El amoníaco en esta solución se usó para calcular el total de nitrógeno reducido en la planta al colocar 100 m? de esta solución en pocilios individuales de una placa de 96 pocilios seguido por la adición de 50 m? de solución OPA. Se determinó la fluorescencia, excitación = 360 nM/emisión = 530 nM y se comparó con los estándares de NH4C1 disuelto en una solución similar y tratado con solución OPA.

Solución OPA - 5 ul de mercaptoetanol + 1 mi de solución base OPA (se produce fresca, diariamente) Solución base OPA - 50 mg de o-ftadialdehído (OPA -Sigma núm. P0657) disueltos en 1.5 mi de metanol + 4.4 mi de regulador de borato 1 M, pH de 9.5 (3.09 g H3B04 + 1 g NaOH en 50 mi de agua) + 0.55 mi de SDS al 20 % (se hace fresco semanalmente) Los siguientes parámetros se determinaron con el uso de estos datos y los medios se comparan con los parámetros del medio nulo con el uso de una prueba t de Student : Biomasa total de la planta Biomasa radicular Biomasa de los brotes Relación raíz/brote Concentración N de la planta Total N de la planta La variación se calculó dentro de cada bloque con el uso de cálculos de elementos afines, asi como mediante el análisis de la varianza (ANOV) con el uso de un modelo de diseño completamente aleatorio (CRD). Se calculó un efecto global del tratamiento para cada bloque con el uso de una estadística F por medio de dividir el cuadrado promedio del tratamiento global del bloque por el cuadrado promedio del error global del bloque.

Ejemplo 8._ Interrelación de proteínas relacionadas Análisis filogeneticos y de motivos para genes PPl en Arabidopsis thaliana , Zea mays , Oryza sativa , Sorghum bicolor, Glycine max, Pennisetum glaucum, Dennstaedtia punctilobula y Paspa lum notatum La serina/treonina específica fosfoproteína fosfatasa (STPP) representa a una gran familia de fosfatasas que desfosforilan las cadenas laterales de Ser/Thr. Esta familia superior de STPP incluye PPl, PP2A y otras subfamilias. Las secuencias de proteínas son altamente conservadas dentro de cada subfamilia de STPP. La actividad, especificidad y ubicación de las subunidades catalíticas de STPP se determinan en gran medida por sus subunidades reguladoras de interacción. El siguiente análisis se enfoca en la subfamilia PPl de las proteínas STPP.

Los homólogos génicos relacionados con STPP en maíz, frijol de soya, sorgo, arroz, helécho, mijo perla y pasto Bahía se recolectaron para las proteínas similares a PPl de Arabidopsis (TAIR10). Un total de 58 homólogos con por lo menos 70 % de identidad y 80 % de cobertura para las proteínas PPl se encuentran en todas las otras siete especies de plantas. Estas secuencias son altamente similares entre sí y comparten un dominio metalofós Pfam común (PF00149). Todas las 58 secuencias de PPl se enumeran en la Tabla 1 en mayor detalle. Se construyó un árbol filogenético (Figura 2) para las 58 secuencias de PPl con el uso del programa MEGA5. Las secuencias de PPl se agrupan adicionalmente en agrupaciones diferentes con respecto a los puntos de ramificación clave en el dendrograma.

El análisis del dominio Pfam mostró que la región central (aproximadamente del aminoácido 69 al 261) contiene un dominio metalofós conservado para las proteínas PPl que se analizaron. La relación funcional que incluye cualquier diferencia para los genes dentro de la subfamilia PPl es probablemente causada por las diferencias en los extremos C y N. El análisis del motivo se llevó a cabo para identificar los motivos conservados en los extremos N y C para las proteínas STPP3 con el uso de las herramientas MEME (Múltiple EM for Motif Elicitation, en inglés) y ClustalX. En una modalidad, se identificó un motivo en el extremo N-terminal L[L/T]EVR[T/L]ARPGKQVQL y un motivo en el extremo C-terminal GAMMSVDE[T/N]LMCSFQ para las proteínas STPP3. Estos motivos se indican en el perfil de alineamiento de múltiples secuencias en la Figura 1. Estos motivos desempeñan probablemente un rol funcional para STPP3 al interactuar con las subunidades reguladoras.

Ejemplo 9._ Composición de genotecas de ADNc; Aislamiento y secuenciación de clones de ADNc Se preparó genotecas de ADNc que representan los ARNm a partir de diversos tejidos de Canna edulis (achira), Momordica charantia (melón amargo), Brassica (mostaza), Cyamopsis tetragonoloba fguar), Zea mays (maíz), Oryza sativa (arroz), Glycine max (frijol de soya), Helianthus annuus (girasol) y Triticum aestivum (trigo). Las genotecas de ADNc se pueden preparar por cualquiera de los diversos métodos disponibles. Por ejemplo, los ADNc pueden introducirse en vectores plásmidos al preparar, primero, las genotecas de ADNc en vectores XR Uni-ZAP™ de conformidad con el protocolo del fabricante (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA).

Los datos de la secuencia de inserto completo (FIS) se generan con el uso de un protocolo de transposición modificado. Los clones identificados por las FIS se recuperan de reservas de glicerol conservadas como colonias únicas y los ADN plasmídicos se aíslan vía lisis alcalina. Las plantillas de ADN aisladas se hacen reaccionar con nucleótidos directos e inversos M13 cebados por el vector en una reacción de secuenciación en base a RCP y se cargan en secuenciadores automatizados. La confirmación de la identificación de clones se realiza por alineamiento de secuencias con la secuencia de EST original de donde se realiza la solicitud de FIS.

Los moldes confirmados se transponen mediante el estuche de transposición Primer Island (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) que se basa en el elemento transponible Tyl de Saccharomyces cerevisiae (Devine y Boeke (1994) Nucleic Acids Res. 22: 3765-3772). El sistema de transposición in vitro coloca aleatoriamente sitios de unión únicos en toda la población de moléculas grandes de ADN. Aleatoriamente, se selecciona múltiples subclones de cada reacción de transposición, los ADN plasmídicos se preparan vía lisis alcalina y las plantillas se someten a secuenciamiento (mezcla tinte-terminador ABI Prism ReadyReaction) hacia afuera del sitio del evento de transposición, con el uso de iniciadores únicos específicos para los sitios de unión dentro del transposón.

La información de las secuencias se recolecta (ABI Prism Collections) y se ensambla con el uso de Phred y Phrap (Ewing et al . (1998) Genome Res . 8:175-185; Ewing and Green, (1998) Genome Res . 8:186-194). El fragmento de ADN resultante se liga en un vector pBluescript con el uso de un kit comercial y de conformidad con el protocolo del fabricante. Este kit se selecciona de muchos disponibles de diversos proveedores que incluyen Invitrogen™ (Carlsbad, CA), Promega Biotech (Madison, WI) y Gibco-BRL (Gaithersburg, MD). El ADN plasmidico se aísla mediante el método de lisis alcalina y se somete a secuenciamiento y ensamble con el uso de Phred/Phrap, como se mencionó anteriormente.

Ejemplo 10. Identificación de clones de ADNc Los clones de ADNc que codifican polipéptidos similares asociados a la captación de nitrato se identificaron con el uso de BLAST (herramienta para búsqueda de alineamiento local básico; Altschul, et al., (1993) J. Mol . Biol . 215:403-410; ver, además, la explicación del algoritmo BLAST en el sitio de la red mundial (World Wide Web) para las búsquedas del National Center for Biotechnology Information at the National Library of Medicine of the National Institutes of Health) para la similitud con las secuencias contenidas en la base de datos “nr” de BLAST (que comprende todas las traducciones no redundantes CDS del GenBank, las secuencias derivadas de la estructura tridimensional Brookhaven Protein Data Bank, el último lanzamiento principal de la base de datos de secuencias de proteínas SWISS-PROT y las bases de datos de EMBL y DDBJ).

Las secuencias de ADNc obtenidas como se describe en la presente descripción se analizaron para evaluar la similitud con todas las secuencias de ADN disponibles al público contenidas en la base de datos “nr” con el uso del algoritmo BLASTN proporcionado por el National Center for Biotechnology Information (NCBI). Las secuencias de ADN se tradujeron en todos los marcos de lectura y se comparó su similitud con todas las secuencias de proteínas disponibles al público contenidas en la base de datos “nr” con el uso del algoritmo BLASTX (Gish and States, (1993) Nat . Genet . 3:266-272) proporcionada por el NCBI. Por conveniencia, el valor P (probabilidad) de observar una coincidencia de una secuencia de ADNc con una secuencia contenida en las bases de datos de búsqueda meramente por casualidad, como lo calcula el BLAST, se reporta en la presente descripción como valores “pLog”, los cuales representan el negativo del logaritmo del valor P reportado. Por lo tanto, mientras mayor sea el valor pLog, mayor es la probabilidad que la secuencia de ADNc y el “acierto” del BLAST representen proteínas homologas.

Las EST sometidas para análisis se comparan con la base de datos del Genbank como se describió anteriormente. Las EST que contienen secuencias más 5 o 3 prima se pueden encontrar con el uso del algoritmo BLASTn (Altschul et al (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.) contra las secuencias de nucleótidos que comparten regiones comunes o traslapadas de homología de secuencias. Cuando hay secuencias comunes o traslapadas entre dos o más fragmentos de ácido nucleico, las secuencias se pueden ensamblar en una sola secuencia de nucleótidos contiguos, lo cual extiende el fragmento original ya sea en la dirección 5 o 3 prima. Una vez que se identifica EST 5-prima máximo, su secuencia completa puede determinarse por secuenciación de inserto total, como se describe en la presente descripción. Para encontrar los genes homólogos que pertenecen a diferentes especies se puede comparar la secuencia de aminoácidos de un gen conocido (ya sea de una fuente registrada o de una base de datos pública) con una base de datos de EST mediante el algoritmo tBLASTn. El algoritmo tBLASTn busca aminoácidos en una base de datos de nucleótidos traducida en los 6 marcos de lectura. Esta búsqueda permite diferencias en el uso de codones de nucleótidos entre especies diferentes y para la degeneración del codón.

Ejemplo 11:_ Preparación de un vector de expresión para plantas Un producto PCR que se obtiene por el uso de los métodos conocidos por una persona con experiencia en la materia puede combinarse con el vector dador Gateway®, tales como pDONR™/Zeo (Invitrogen™). Con el uso de la teenología de Invitrogen™ Gateway® Clonase™, el gen homólogo At3g05580 a partir del clon de entrada puede, después, trasladarse a un vector de destino adecuado para obtener el vector de expresión de una planta para usar con Arabidopsis y maíz. Por ejemplo, un vector de expresión contiene At3g05580 expresado por el promotor de ubiquitina del maíz, un casete de resistencia a los herbicidas y un casete de clasificación de semillas.

Ejemplo 12._ Transformación de maíz mediada por Agrobacterium Las plantas de maíz pueden transformarse para sobreexpresar un gen guia de Arabidopsis validado o los homólogos correspondientes a partir de diversas especies para examinar el fenotipo resultante.

La transformación de maíz mediada por Agrobacterium se realiza esencialmente como lo describen Zhao, et al . , (2006) Meth . Mol . Biol . 318:315-323 (ver, además, Zhao, et al . , (2001) Mol . Breed. 8:323-333 y patente de los Estados Unidos núm. 5,981,840, concedida el 9 de noviembre de 1999, que se incorpora en la presente descripción como referencia). El proceso de transformación incluye la inoculación bacteriana, cocultivo, reposo, selección y regeneración de plantas .

Se puede realizar el análisis fenotipico de las plantas transgénicas T0 y TI.

Las plantas TI se pueden analizar para cambios fehotípicos. Con el uso del análisis de imágenes se puede analizar las plantas TI para identificar cambios fenotipicos en el área de la planta; el volumen, el índice de crecimiento y el análisis del color varias veces durante el crecimiento de las plantas. La alteración en la arquitectura radicular se puede analizar como se describe en la presente descripción.

El análisis posterior de las alteraciones en las características agronómicas se puede realizar para determinar si las plantas que contienen el gen guía de Arabidopsis validado tienen una mejoría de por lo menos una característica agronómica, en comparación con las plantas control (o de referencia) que no contienen el gen guía de Arabidopsis validado. Las alteraciones se pueden, además, estudiar bajo varias condiciones ambientales.

Ejemplo 13._ Transformación de maíz con genes guía validados con el uso de bombardeo de partículas Las plantas de maíz pueden transformarse para sobreexpresar un gen guía de Arabidopsis u otro gen guía validado o los homólogos correspondientes a partir de diversas especies para examinar el fenotipo resultante.

Los clones de entrada Gateway® descritos en el Ejemplo 12 pueden usarse para clonar direccionalmente cada gen hacia un vector de transformación del maíz. La expresión del gen en el maíz puede estar bajo el control de un promotor constitutivo, tal como el promotor de ubiquitina del maíz (Christensen, et al . , (1989) Plant Mol . Biol . 12:619-632 y Christensen, et al . , (1992) Plant Mol . Biol . 18:675-689) Después, la construcción de ADN recombinante descrita anteriormente puede introducirse en células del maíz por el siguiente procedimiento. Se pueden disecar embriones del maíz inmaduros a partir de cariópsides en desarrollo derivados de cruces de las lineas endogámicas de maíz H99 y LH132. Los embriones se aíslan de diez a once días después de la polinización cuando tienen de 1.0 a 1.5 mm de longitud. Después, los embriones se colocan con el lado del eje orientado hacia abajo y en contacto con el medio N6 solidificado con agarosa (Chu, et al. r (1975) Sci . Sin . Peking 18:659-668). Los embriones se conservan en la oscuridad a 27 °C. El callo embriogénico friable que consiste en masas de células no diferenciadas con proembriones somáticos y embriones transportados en estructuras suspensoras prolifera del escutelo de estos embriones inmaduros. El callo embriogénico aislado del explanto primario puede cultivarse en un medio N6 y subcultivarse en este medio cada dos a tres semanas.

El método de bombardeo de partículas (Klein, et al . , (1987) Nature 327:70-73) puede usarse para transferir genes a las células de cultivo de callos. De conformidad con este método se recubren partículas de oro (1 mm de diámetro) con ADN por medio de la siguiente téenica. Se añaden diez mg de ADN plasmídicó en 50 mL de una suspensión de partículas de oro (60 mg por mi). En las partículas se añade cloruro de calcio (50 ml de una solución 2.5 M) y base libre de espermidina (20 ml de una solución 1.0 M). La suspensión se procesa en vórtice durante la adición de estas soluciones. Después de diez minutos, los tubos se centrifugan brevemente (5 s a 15,000 rpm) y se elimina el sobrenadante. Las partículas se resuspenden en 200 m? de etanol absoluto, se centrifugan nuevamente y se elimina el sobrenadante. Se realiza nuevamente el enjuague con etanol y las partículas se resuspenden en un volumen final de 30 m? de etanol. Se puede colocar una alícuota (5 m?) de las partículas de oro recubiertas con ADN en el centro de un disco volante Kapton™ (Bio-Rad Labs). Después, las partículas se aceleran en el tejido de maíz con un instrumento PDS-1000/He de Biolistic® (Bio-Rad Instruments, Hercules CA) con el uso de una presión de helio de 6895 kPa (1000 psi), una distancia de separación de 0.5 cm y una distancia de vuelo de 1.0 cm.

Para el bombardeo, el tejido embriogénico se coloca en papel de filtro sobre el medio N6 solidificado con agarosa. El tejido se dispone como un linón delgado y se cubre un área circular de aproximadamente 5 cm de diámetro. La caja petri que contiene el tejido se puede colocar en la cámara del PDS-1000/He a aproximadamente 8 cm del ensayo de terminación. Después, el aire de la cámara se evacúa a un vacío de 95 kPa (28 pulgadas de Hg). El macroportador se acelera con una onda de choque de helio con el uso de una membrana de ruptura que explota cuando la presión de He en el tubo de choque alcanza 6895 kPa (1000 psij.

Siete días después del bombardeo, el tejido se puede transferir al medio N6 que contiene bialafos (5 mg por litro) y que no contiene caseína o prolina. El tejido continúa creciendo lentamente en este medio. Después de otras dos semanas, el tejido se puede transferir a un medio N6 fresco que contiene bialafos. Después de seis semanas se pueden identificar áreas de aproximadamente 1 cm de diámetro de callos que crecen activamente en algunas de las placas que contiene el medio complementado con bialafos. Estos callos pueden continuar su crecimiento cuando se subcultivan en el medio selectivo.

Las plantas se pueden regenerar a partir de los callos transgénicos si se transfiere primero grupos de tejido a medio N6 complementado con 0.2 mg por litro de 2,4-D. Después de dos semanas, el tejido se puede transferir a medio de regeneración (From, et al., (1990) Bio/Technology 8:833-839). Las plantas transgénicas T0 se pueden regenerar y su fenotipo se puede determinar mediante procedimientos HTP. Se puede recolectar semillas TI.

Las plantas Ti se pueden cultivar y analizar para identificar cambios fenotipicos. Los siguientes parámetros pueden cuantificarse con el uso del análisis de imágenes: el área de la planta, el volumen, el indice de crecimiento y el análisis de color pueden recopilarse y cuantificarse. Los constructos de expresión que producen una alteración de la arquitectura de la raíz o cualquier otra de las características agronómicas enumeradas anteriormente en comparación con las plantas control adecuadas pueden considerarse evidencia de que el gen guía de Arabidopsis funciona en el maíz para alterar la arquitectura de la raíz o la arquitectura de la planta.

Además, un constructo de ADN recombinante que contiene un gen de Arabidopsis validado puede introducirse en una línea de maíz ya sea por transformación directa o por introgresión a partir de una línea transformada por separado.

Las plantas transgénicas, ya sean endogámicas o híbridas, se pueden someter a experimentos de campo más vigorosos para estudiar la arquitectura de la raíz o de la planta, el mejoramiento del rendimiento y/o la resistencia al encamado de la raíz en diversas condiciones ambientales (por ejemplo, variaciones en la disponibilidad de nutrientes y agua).

El análisis posterior de rendimiento puede llevarse a cabo, además, para determinar si las plantas que contienen el gen guía de Arabidopsis validado tienen una mejoría en el rendimiento, en comparación con las plantas control (o de referencia) que no contienen el gen guía de Arabidopsis validado. Las plantas que contienen el gen guía de Arabidopsis validado tendrían un rendimiento mejorado con relación a las plantas control, preferentemente, una pérdida de 50 % del rendimiento en condiciones ambientales adversas o tendrían un mayor rendimiento con relación a las plantas control en diversas condiciones ambientales.

Ejemplo 14. Electroporación de LBA4404 de Agrobacterium turne faciens Las células competentes de electroporación (40 ml), tales como Agrobacterium turne faciens LBA4404 (que contienen PHP10523), se descongelan en hielo (20-30 min). El PHP10523 contiene genes VIR para la transferencia de T-ADN, un origen de reproducción de plásmido con un número de copia bajo de Agrobacterium, un gen de resistencia a la tetracielina y un sitio eos para la recombinación biomolecular de ADN in vivo. Mientras tanto, la cubeta de electroporación se enfria en hielo. La configuración del electroporador se determina para ser 2.1 kV.

Una alícuota de ADN progenitor (0.5 ml de JT (patente de los Estados Unidos núm. 7,087,812) a una concentración de 0.2 mg -1.0 pg en regulador con bajo contenido de sal o H2O destilada dos veces) se mezcla con las células de Agrobacterium descongeladas mientras se mantienen en hielo. La mezcla se transfiere al fondo de la cubeta de electroporación y se mantiene en reposo sobre hielo por 1-2 min. Las células se electroporan (electroporador Eppendorf 2510) al presionar el botón de “Pulse” dos veces (idealmente se logra un pulso de 4.0 ms). Posteriormente, se agrega un medio de 0.5 mi 2xYT (o un medio de SOC) a la cubeta y se transfiere a un tubo Falcon de 15 mi. Las células se incuban a 28-30 °C, 200-250 rpm durante 3 h.

Las alícuotas de 250 ml se dispersan en placas núm. 30B (YM + 50 gg/ml de espectinomicina) y se incuban 3 días a 28-30 °C. Para incrementar la cantidad de transformantes, se puede realizar uno de dos pasos opcionales: Opción 1 : Cubrir las placas con 30 ml de rifampicina 15 mg/ml. El LBA4404 tiene un gen de resistencia cromosómica para la rifampicina. Esta selección adicional elimina algunas colonias contaminantes observadas cuando se usa preparaciones más deficientes de células competentes de LBA4404.

Opción 2: Realizar dos réplicas de la electroporación para compensar las células electrocompetentes más deficientes.

Identificación de transformantes: Cuatro colonias independientes se escogen y se dispersan en un medio mínimo AB con 50 mg/ml de placas de espectinomicina (medio núm. 12S) para aislar las colonias simples. Las células en placas se incuban a 28 °C durante 2-3 días.

Se escoge una sola colonia para cada cointegrado putativo y se inocula con 4 mi de núm. 60A con 50 mg/1 de espectinomicina. La mezcla se incuba durante 24 h a 28 °C con agitación. El ADN plasmidico de los 4 mi de cultivo se aísla con el uso de la minipreparación de Qiagen + lavado PB opcional. El ADN se eluye en 30 ml. Las alícuotas de 2 ml se usan para electroporar 20 m? de DHlOb + 20 m? de ddH2O como se describió anteriormente.

Opcionalmente, puede usarse una alícuota de 15 m? para transformar 75-100 m? de Invitrogen™ Library Efficiency DH5a. Las células se diseminan en medio LB con 50 mg/ml de placas de espectinomicina (medio núm. 34T) y se incuban a 37 °C durante la noche.

Tres a cuatro colonias independientes se escogen para cada cointegrado putativo y se inoculan con 4 i de 2xYT (núm. 60A) con 50 pg/ml de espectinomicina. Las células se incuban a 37 °C durante la noche mientras se agitan.

El ADN plasmidico se aísla de los 4 mi de cultivo con el uso de la minipreparación de QIAprep® con lavado PB opcional (lavado en 50 m?) y se usa 8 m? para la digestión con Salí (con el uso de JT parental y PHP10523 como controles) .

Se realizan otras tres digestiones más con el uso de las enzimas de restricción BamHI, EcoRI y HindIII para 4 plásmidos que representan 2 cointegrados putativos con patrón de digestión de Salí correcto (con el uso de ADN parental y PHP10523 como controles). Se recomienda geles electrónicos para comparación.

Ejemplo 15. Transformación de líneas de maíz derivadas de Gaspe Bay Flint con genes guía validados y los homólogos correspondientes a partir de otras especies Las plantas de maíz pueden transformarse como se describió en los Ejemplos 13-15 para sobreexpresar el gen ZmSTPP3 (sec. con núm. de ident.: 48) y los homólogos correspondientes a partir de otras especies, tales como las enumeradas en la Tabla 1 para examinar el fenotipo resultante. Los promotores que incluyen, pero no se limitan a, el promotor de ubiquitina del maíz, el promotor S2A, el promotor R00TMET2 del maíz, el Cyclo de maíz, el CR1BIO, el CRWAQ81 y otros son útiles para dirigir la expresión de los homólogos de ZmSTPP3 en maíz. Además, una gran variedad de terminadores, tales como, pero sin limitarse al, terminador PINII, pueden usarse para alcanzar la expresión del gen de interés en las líneas de maíz derivadas de Gaspe Bay Flint.

Plantas receptoras Las células vegetales receptoras pueden ser de una línea uniforme del maíz con un ciclo de vida corto (“ciclo rápido”), un tamaño reducido y potencial alto de transformación. Las células vegetales típicas para el maíz son las células vegetales a partir de cualquiera de las variedades de lineas de Gaspe Bay Flint (GBF) disponibles al público. Una posible variedad de linea vegetal candidata es el híbrido F1 de GBF x QTM (Quick Turnaround Maize, una forma de Gaspe Bay Flint disponible al público seleccionada para el crecimiento bajo condiciones de invernadero) que se describe en Tomes, et al . , publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos número 2003/0221212. Las plantas transgénicas obtenidas de esta línea tienen un tamaño tan reducido que pueden cultivarse en macetas de 10 cm (cuatro pulgadas) (1/4 del espacio necesario para una planta de maíz de tamaño normal) y pueden madurar en menos de 2.5 meses. (Tradicionalmente, se requiere 3.5 meses para obtener semillas T0 transgénicas una vez que las plantas transgénicas se aclimatan al invernadero.) Otra línea adecuada es una línea haploide doble de GS3 (una linea altamente transformable) X Gaspe Flint. Otra línea adecuada es una línea endogámica élite transformable que porta un transgén que causa floración prematura, estatura reducida o ambas.

Protocolo de transformación Se puede usar cualquier método adecuado para introducir los transgenes en las células de maíz, que incluyen, pero no se limitan a, procedimientos tipo inoculación con el uso de vectores a base de Agrobacterium como se describe en los Ejemplos 13 y 14. La transformación se puede realizar en embriones inmaduros de la planta receptora (objetivo).

Crecimiento e identificación de las plantas La población de eventos de plantas transgénicas (TO) que resultan de los embriones de maíz transformados se cultiva en un ambiente de invernadero controlado con un diseño de bloque aleatorio modificado para reducir o eliminar el error ambiental. Un diseño de bloque aleatorio es un diseño de planta en el cual las plantas experimentales se dividen en grupos (por ejemplo, treinta plantas por grupo), designados bloques y cada planta se asigna aleatoriamente en un lugar con el bloque.

Para un grupo de treinta plantas, veinticuatro plantas experimentales transformadas y seis plantas control (plantas con un fenotipo determinado) (colectivamente, un “grupo de réplicas”) se colocan en macetas dispuestas en un arreglo (conocido, además, como bloque o grupo de réplicas) sobre una mesa ubicada dentro de un invernadero. A cada planta de control o de experimento se asigna aleatoriamente un lugar en el bloque que se mapea en un lugar físico único en el invernadero y también con respecto al grupo de réplicas. Varios grupos de réplicas de treinta plantas cada uno pueden cultivarse en el mismo invernadero en un solo experimento. La distribución (disposición) de los grupos de réplicas debería determinarse de modo que se minimicen los requerimientos de espacio además de los efectos ambientales dentro del invernadero. Dicha distribución puede mencionarse como una distribución de invernadero comprimida.

Una alternativa para la adición de un grupo control especifico consiste en identificar las plantas transgénicas que no expresan el gen de interés. Varias téenicas tales como RT-PCR pueden aplicarse para evaluar cuantitativamente el nivel de expresión del gen introducido. Las plantas T0 que no expresan el transgén se pueden comparar con las plantas que lo expresan.

Cada planta en la población del evento se identifica a lo largo del proceso de evaluación y los datos recopilados a partir de esa planta se asocian con esa planta de manera que los datos recopilados pueden asociarse con el transgén que porta la planta.

Análisis fenotipico por medio de imágenes tridimensionales Cada planta de invernadero en la población del evento T0, que incluye cualquiera de las plantas control, se analiza para evaluar las características agronómicas de interés y los datos agronómicos para cada planta se registran o se almacenan de tal manera que se asocian con los datos de identificación (ver arriba) para esa planta. Un fenotipo (efecto del gen) se puede confirmar en la generación de Ti con un diseño de experimento similar al descrito anteriormente.

Las plantas T0 se analizan fenotípicamente por medio de teenologías de imágenes cuantitativas y no destructivas durante todo el ciclo de vida de la planta en el invernadero para evaluar los rasgos de interés. Se puede usar cualquier instrumentación adecuada para la obtención de imágenes.

Programa El sistema de análisis para la obtención de imágenes comprende un programa para el análisis de color y arquitectura y una base de datos del servidor para almacenar los datos de aproximadamente 500,000 análisis, que incluyen las fechas de los análisis. Las imágenes originales y las imágenes analizadas se almacenan juntas para que el usuario pueda repetir los análisis todas las veces que desee. La base de datos se puede conectar al equipo físico de imágenes para recabar y almacenar los datos automáticamente. Se puede usar una gran variedad de sistemas de programas disponibles comercialmente para la interpretación cuantitativa de los datos de obtención de imágenes y cualquiera de estos sistemas de programas puede aplicarse al grupo de datos de imágenes.

Iluminación Para la captación de imágenes se puede usar cualquier modo de iluminación adecuado. Por ejemplo, se puede usar una luz superior por encima de un fondo negro. Alternativamente, se puede usar una combinación de luz superior y posterior con un fondo blanco. El área iluminada deberla estar alojada de modo que asegure condiciones de iluminación permanente. El alojamiento deberla ser más grande que el área de medición de modo que la luz sea permanente sin necesidad de abrir o cerrar las puertas. Alternativamente, la iluminación se puede modificar para causar excitación del transgén (por ejemplo, proteina fluorescente verde (GFP, por sus siglas en inglés), proteina fluorescente roja (RFP, por sus siglas en inglés)) o fluoroforos endógenos (por ejemplo, clorofila).

Cálculo de la biomasa basa en imágenes tridimensionales Para un mejor cálculo de la biomasa, las imágenes de la planta se toman desde tres ejes, preferentemente, la vista superior y dos vistas laterales (lados 1 y 2). Después, estas imágenes se analizan para separar la planta del fondo, la maceta y la bolsa de control del polen (si corresponde). El volumen de la planta se puede calcular el siguiente cálculo: Volumen vóxeles)=^Área superior (píxeles)x-^Área lateral 1 (pixeles)x-^Área lateral 2 (pixeles) En la ecuación anterior, las unidades de volumen y área son “unidades arbitrarias”. Las unidades arbitrarias son suficientes para detectar los efectos de los genes en el tamaño y crecimiento de la planta en este sistema ya que se desea identificar las diferencias (tanto las positivas-más grandes como las negativas-más pequeñas) de la media del experimento o media del control. Las unidades arbitrarias de tamaño (por ejemplo, área) se pueden convertir trivialmente en mediciones físicas mediante la adición de una referencia física al proceso de imágenes. Por ejemplo, en los procesos de imágenes superiores y laterales se puede incluir una referencia física de área conocida. En base al área de estas referencias físicas, se puede determinar un factor de conversión para permitir la conversión de píxeles a una unidad de área, tal como centímetros cuadrados (cm2). La referencia física puede ser una muestra independiente. Por ejemplo, la maceta, con un diámetro y altura conocidos podría servir como una referencia física adecuada.

Clasificación del color La teenología de imágenes se puede usar, además, para determinar el color de la planta y para asignar colores de plantas a diversas clases de colores. La asignación de colores de imagen a las clases de color es una característica del programa. La clasificación de colores se puede determinar por medio de diversos métodos informáticos con otros sistemas de programas de análisis de imágenes.

Para determinar los parámetros de crecimiento y tamaño de la planta un esquema de clasificación útil consiste en definir un esquema de color simple que incluye dos o tres tonos de verde y, además, una clase de color para la clorosis, necrosis y decoloración, si se produjeran estas condiciones. Además, se usa una clase de color del fondo que incluye colores distintos a los de las plantas en la imagen (por ejemplo, colores de la maceta y el suelo) y estos pixeles se excluyen específicamente de la determinación del tamaño. Las plantas se analizan bajo una iluminación constante controlada, de manera que se puede cuantificar cualquier cambio dentro de una planta con el tiempo o entre plantas o lotes diferentes de plantas (por ejemplo, diferencias estacionales).

Además de su utilidad para determinar el crecimiento de la planta, la clasificación de color se puede usar para evaluar otros rasgos componentes del rendimiento. Para estos otros rasgos componentes del rendimiento se pueden usar otros esquemas de clasificación del color. Por ejemplo, el rasgo conocido como “madurez fisiológica” que se ha asociado a mejoras en el rendimiento se puede evaluar por medio de una clasificación de color que separa los tonos del verde de los tonos del amarillo y marrón (indicativos de tejidos senescentes). Mediante la aplicación de esta clasificación de color a las imágenes tomadas hacia el final del ciclo de vida de las plantas TO o TI se pueden identificar plantas que tienen mayores cantidades de color verde en comparación con los colores amarillo y marrón (mencionado, por ejemplo, como relación verde/amarillo). Las plantas que exhiben una diferencia significativa en esta relación verde/amarillo pueden identificarse como plantas que portan transgenes que afectan este rasgo agronómico importante.

El biólogo experto en plantas reconocerá que surgen otros colores de plantas que pueden ser indicativos de la salud de la planta o la respuesta al estrés (por ejemplo, antocianina) y que otros esquemas de clasificación de color pueden proporcionar indicadores adicionales de la acción de los genes en rasgos relacionados con esas respuestas.

Análisis de la arquitectura de la planta Es posible identificar los transgenes que modifican los parámetros de la arquitectura de la planta, que incluyen parámetros tales como la altura y el ancho máximos, las distancias entre nodos, el ángulo entre las hojas y el tallo, la cantidad de hojas que comienzan en los nodos y la longitud de las hojas. El programa se puede usar para determinar la arquitectura de la planta de la siguiente manera. La planta se reduce a su arquitectura geométrica principal en una primera etapa de imágenes y, después, en base a esta imagen, se puede realizar la identificación parametrizada de los distintos parámetros de la arquitectura. Los transgenes que modifican cualquiera de estos parámetros de la arquitectura en forma individual o combinada pueden identificarse mediante la aplicación de los métodos estadísticos descritos previamente.

Fecha de esparcimiento del polen La fecha de esparcimiento del polen es un parámetro importante de analizar en una planta transformada y se puede determinar mediante la primera aparición en la planta de una flor macho activa. Para encontrar el elemento de la flor macho, el extremo superior del tallo se clasifica por color para detectar anteras amarillas o violeta. Este análisis de la clasificación de color después se usa para definir una flor activa, que a su vez se puede usar para calcular la fecha de esparcimiento del polen.

Alternativamente, el personal responsable del cuidado de la planta puede registrar la fecha de esparcimiento del polen y otros atributos de la planta fácilmente detectables por medio de la vista (por ejemplo, fecha de polinización, primera fecha de maduración). Para maximizar la integridad de los datos y la eficacia del proceso, esta información se monitorea con el uso de los mismos códigos de barra usados por el dispositivo de análisis digital de espectro de luz. Una computadora con un lector de códigos de barra, un dispositivo de asistencia personal o una computadora portátil puede usarse para facilitar la recopilación de datos, el registro del tiempo de observación, identificador de plantas y el operador que captó los datos.

Orientación de las plantas Las plantas maduras de maíz cultivadas a densidades que se aproximan a la siembra comercial usualmente tienen una arquitectura plana. Es decir, la planta tiene un lado ancho claramente observable y un lado estrecho. La imagen de la planta está determinada por el lado ancho. Para cada planta se asigna una orientación básica bien definida para obtener la máxima diferencia entre el lado ancho y las imágenes de lado. La imagen superior se usa para determinar el eje principal de la planta.

Ejemplo 16. Ensayo de lineas de maíz derivadas de Gaspe Bay Flint en condiciones de limitación de nitrógeno Las plantas transgénicas contendrán dos o tres dosis de Gaspe Flint-3 con una dosis de GS3 (GS3/(Gaspe-3)2X o de GS3/(Gaspe-3)3X) y segregarán 1:1 para un transgén dominante. Las plantas se siembran en TURFACE®, un medio de abono comercial y se riegan cuatro veces cada dia con medio de crecimiento de KN031 mM y con medio de crecimiento KNO32 mM o mayor, medio de crecimiento. Las plantas de control cultivadas en medio de 1 mM de KNO3 son menos verdes, producen menos biomasa y tienen una espiga más pequeña en antesis. El análisis estadístico se usa para decidir si las diferencias observadas entre los tratamientos son diferentes.

La expresión de un transgen resultará en plantas con crecimiento mejorado en 1 mM de KN03 cuando se compara con un nulo transgénico. Por lo tanto, la biomasa y el verdor se monitorean durante el crecimiento y en comparación con un nulo transgénico. Las mejoras en el crecimiento, el verdor y el tamaño de la espiga en antesis son indicadores de la tolerancia al nitrógeno aumentada.

Ejemplo 17._ Plantas de maíz transgénico Se generó plantas de maíz transgénico T0 que contienen el gen de interés bajo el control de un promotor. Estas plantas se cultivaron en condiciones de invernaderos para plantas de maíz derivadas de Gaspe, como se describe en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos número 2003/0221212, solicitud de patente de los Estados Unidos serie núm.10/367,417.

El ensayo de T0 FASTCORN se llevó a cabo con las plantas transgénicas T0 en condición óptima de KN03 desde la siembra hasta la cosecha. El crecimiento se monitoreó hasta antesis cuando se determinó el crecimiento vegetal acumulativo, el índice de crecimiento, el peso de la espiga, la longitud de la espiga, el área de la espiga, el volumen de la espiga y la cantidad de granos por espiga tanto para los eventos positivos de transgenes como para las lineas control nulas de transgenes. La distribución del fenotipo de las plantas individuales se comparó con la distribución de los eventos control nulos de transgenes en el experimento. Las variaciones de cada evento se evaluaron con el uso de puntajes Z al comparar con la variación del grupo control nulo transgénico. Un puntaje Z mayor significa una varianza mayor entre el evento y el grupo control, lo que indica una mayor respuesta a KNO3.

La expresión transgénica de un grupo de STPP3 homologa con el promotor de UBI de maíz mejoró el crecimiento de la espiga y el desarrollo en el ensayo de T0 FASTCORN. Tal como se muestra en la Tabla 4, al nivel del evento, se descubrió que múltiples constructos tienen muchos de los eventos que muestran un incremento significativo en uno o más de los cinco parámetros de espigas determinados al comparar con las lineas control no transgénicas, con el uso de un puntaje Z de dos colas de +/- 1.00 y +/- 1.65, respectivamente.

Al analizar los resultados de T0 a partir de FASTCORN a nivel de un constructo con el uso de una prueba T de dos colas (p£0.1) en donde los eventos individuales se consideran réplicas, múltiples constructos mostraron incrementos de porcentaje significativo en muchos de los parámetros de espigas en comparación con el medio de las lineas control nulas transgénicas en el experimento. Los resultados de este porcentaje de incremento se muestran en la Tabla 5, en donde NS se refiere a que no hay un cambio significativo a p£0.1, en comparación con las lineas control nulas transgénicas. Generalmente, los homólogos a partir de la agrupación 1 y 2 mostraron la eficacia máxima en el ensayo, dado que la mayoría de los homólogos en las dos agrupaciones mostró parámetros agronómicos significativamente mejores que las líneas control.

La progenie TI derivada de la autofertilización de cada planta T0 que contiene una sola copia de cada constructo asociado con la captación de nitrato, que se descubrió que segrega 1:1 para el evento transgénico, se analizó para evaluar el índice de crecimiento mejorado en KNO3 subóptimo. El crecimiento se monitoreó hasta antesis cuando el crecimiento vegetal acumulativo, el indice de crecimiento y el peso de las espigas se determinaron para un transgén positivo y un transgén nulo en el nivel de un evento. La distribución del fenotipo de eventos individuales se comparó con la distribución de un grupo control que es el evento nulo. La media para cada grupo se calculó y se comparó con el uso de una comparación en pares con una prueba T de dos colas (p£0.1), al comparar la media del evento de transgén positivo con la media del grupo control no transgénico en el experimento. Los resultados positivos se compararon con la distribución del transgén dentro del evento para asegurar la segregación de respuesta con el transgén.

La expresión transgénica de ZmSTPP3 con el promotor de UBI de maiz mejora el crecimiento y desarrollo de la espiga en el ensayo reproductivo de NUE de invernadero, en donde las plantas se someten a tratamiento con nitrógeno subóptimo desde la siembra hasta la cosecha. Tal como se muestra en la Figura 4, se descubrió que dos eventos tienen un perímetro de la mazorca significativamente incrementado por 9.0 % y 8.0 % y una longitud de las espigas por 9.8 % y 8.6 % en comparación con las líneas control no transgénicas, respectivamente (p < 0.1). Además, el volumen de la mazorca, el área de la espiga y el ancho de la espiga del evento A son significativamente mayores por 21.2 %, 14.3 % y 5.5 % (p < 0.1) en comparación con las líneas control, respectivamente.

Tabla 4 . 5 a 5 Ejemplo 18._ Análisis transgenico de maíz a partir de parcelas de campo Los eventos transgénicos se caracterizaron molecularmente por el número de copias del transgén y la expresión por PCR. Los eventos que contienen una sola copia del transgén con una expresión del transgén detectable se hicieron avanzar para un análisis de campo. Se produjo semillas de cruces de prueba/híbridas y se analizaron en el campo en experimentos de múltiples años/lugares/réplicas tanto en campos con N normal como con N bajo. Los eventos transgénicos se evaluaron en parcelas de campo en donde el rendimiento se limitó al reducir la aplicación de fertilizante en 30 % o más. Las mejoras estadísticamente significativas en el rendimiento, componentes del rendimiento u otros rasgos agronómicos entre las plantas transgénicas y no transgénicas en estas parcelas de fertilidad con contenido de nitrógeno reducido o normal se usan para evaluar la eficacia de la expresión del transgén. Los constructos con múltiples eventos que muestran mejoras significativas (en comparación con los nulos) en el rendimiento o sus componentes en múltiples ubicaciones se hicieron avanzar para un análisis adicional.

Además de At3g05580, se evaluó, además, tres homólogos de maíz en parcelas de campo. De conformidad con la Tabla 1, At3g05580 es un elemento de la agrupación 3.1 de serina treonina proteina fosfatasa (STPP) y los tres homólogos de maíz representan tres agrupaciones STPP diferentes. STPP1 (sec. con núm. de ident.: 44) es un elemento de la agrupación 3.2, mientras que STPP2 (sec. con núm. de ident.: 29) es un elemento de la agrupación 2.2, en donde STPP3 (sec. con núm. de ident.: 1) es un elemento de la agrupación 1.1. Múltiples eventos transgénicos que sobreexpresan STPP1 homólogo de maíz con un promotor constitutivo produjeron una reducción significativa en el rendimiento en ambas condiciones de nitrógeno. En condiciones limitantes de nitrógeno, múltiples eventos que sobreexpresan la STPP2 homologa de maíz mostraron una reducción significativa en el rendimiento, mientras que múltiples eventos mostraron un incremento significativo en el rendimiento en condiciones normales de nitrógeno. Múltiples eventos transgénicos que sobreexpresan la STPP3 homologa de maíz con un promotor constitutivo mostraron un incremento significativo en el rendimiento en condiciones de contenido normal y bajo de nitrógeno en múltiples especímenes de prueba/años/ubicaciones (Figura 3). Los 3 eventos principales mostraron un incremento de 2-3 fanegas/aere y 4-5 fanegas/acre en condiciones con contenido bajo de N o contenido normal de N, respectivamente (Figura 3). En análisis combinados de rendimiento, los datos a partir del contenido bajo de N y del contenido normal de N representaron un incremento de 3-4 fanegas/acre en los 3 eventos principales (Figura 3). Los eventos transgénicos pueden tener niveles de expresión diferentes del transgén o niveles de proteina diferentes. La STPP3 contiene el motivo en el extremo N-terminal L [L/T]EVR[T/L]ARPGKQVQL (sec. con núm. de ident.: 95) y el motivo en el extremo C-terminal GAMMSVDE[T/N]LMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 96), mientras que la STPP1 no contiene estos motivos.

Ejemplo 19._ Transformación de embriones de frijol de soya Los embriones de frijol de soya se bombardean con un plásmido que contiene secuencias no codificantes asociadas con la captación de nitrato unidas operativamente a un promotor de ubiquitina de la siquiente manera. Para producir embriones somáticos, cotiledones de 3-5 mm de longitud se separan de la superficie esterilizada, las semillas inmaduras del cultivar A2872 del frijol de soya se cultivan en la luz o en la oscuridad a 26 °C en un medio de agar apropiado durante seis a diez semanas. Los embriones somáticos que producen embriones secundarios se separan después y se colocan en un medio liquido adecuado. Después de la selección repetida para los grupos de embriones somáticos que se multiplican como embriones prematuros, en etapa globular, las suspensiones se conservan tal como se describe a continuación.

Los cultivos embriogénicos en suspensión de frijol de soya se pueden mantener en 35 mi de medio liquido en un agitador giratorio de 150 rpm, a 26 °C con luces fluorescentes con un horario de 16:8 horas dia/noche. Los cultivos se subcultivan cada dos semanas mediante la inoculación de aproximadamente 35 mg de tejido en 35 mi de medio liquido.

Los cultivos embriogénicos en suspensión de frijol de soja se pueden transformar mediante el método de bombardeo de partículas (Klein, et al . , (1987) Nature (Londres) 327:70-73, patente de los Estados Unidos núm.4,945,050). Se puede usar un instrumento PDS1000/HE Biolistic de Du Pont (retroajuste de helio) para estas transformaciones.

Ejemplo 20._ Transformación del tejido meristemático del girasol Los tejidos meristemáticos de girasol se transformaron. Las semillas maduras de girasol ( Helianthus annuus L.) se descascaran con el uso de un trillador de una sola cabeza de trigo. Las semillas se esterilizan superficialmente durante 30 minutos en una solución blanqueadora Clorox al 20 % con la adición de dos gotas de Tween 20 por 50 mi de solución. Las semillas se enjuagan dos veces con agua destilada esterilizada. La transformación a base de meristemo de girasol se conoce en la materia.

Ejemplo 21. Transformación del tejido de arroz Confirmación genética del gen asociado con la captación de nitrato Un método para transformar ADN en células de plantas superiores que está disponible para los expertos en la materia es el bombardeo balístico de alta velocidad con el uso de partículas metálicas recubiertas con construcciones de ácidos nucleicos de interés (véase, Klein, y col . , (1987) Nature (London) 327:70-73 y véase, la patente de los Estados Unidos núm. 4,945,050). Se usa un PDS-1000/He biolístico (BioRAD Laboratories, Hercules, CA) para estos experimentos de complementación. Se usa la téenica de bombardeo de partículas para transformar los mutantes y arroz silvestre asociados con la captación de nitrato con fragmentos de ADN.

El gen bacteriano fosfotransferasa (Hpt II) de higromicina B del Streptomyces hygroscoplcus que confiere resistencia al antibiótico se usa como el marcador de selección para la transformación del arroz. En el vector, pML18, el gen Hpt II se diseñó con el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor y las señales de terminación y poliadenilación del gen octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens . El pML18 se describió en la patente núm. WO 1997/47731 que se publicó el 18 de diciembre de 1997 y cuya descripción se incorpora en la presente descripción como referencia.

Los cultivos embriogénicos de callos derivados de escutelos de semillas de arroz de germinación sirven de materia prima para los experimentos de transformación. Esta materia se genera al hacer germinar semillas estériles de arroz en un medio de iniciación de callos (sales MS, vitaminas Nitsch y Nitsch, 1.0 mg/1 de 2,4-D y 10 mM de AgN03) en la oscuridad a 27-28 °C. Los callos embriogénicos que proliferan del escutelo de los embriones se transfieren a medios CM (sales N6, vitaminas Nitsch y Nitsch, 1 mg/1 de 2,4-D, Chu, et al . , 1985, Sci. Sínica 18: 659-668). Los cultivos de callos se mantienen en CM mediante subcultivo de rutina a intervalos de dos semanas y se usan para la transformación en el transcurso de las 10 semanas de iniciación .

El callo se prepara para la transformación por subcultivo de pedazos de 05-1.0 mm separados por aproximadamente 1 mm entre si, dispuestos en un área circular de aproximadamente 4 cm de diámetro en el centro de un circulo de papel Whatman núm. 541 colocado en medio CM. Las placas con callos se incuban en la oscuridad a 27-28 °C durante 3-5 dias. Antes del bombardeo, los filtros con callos se transfieren a CM suplementado con manitol 0.25 M y sorbitol 0.25 M durante 3 h en la oscuridad. Las tapas de las cajas Petri se dejan entreabiertas durante 20-45 minutos en una campana estéril para que se disipe la humedad del tejido.

Cada fragmento de ADN genómico se coprecipita con pMLl8 que contiene el marcador de selección para la transformación del arroz en la superficie de las partículas de oro. Para lograrlo se agrega un total de 10 mg de ADN a razón de 2:1 de traza: ADN del marcador de selección en alícuotas de 50 ml de partículas de oro que se resuspendieron a una concentración de 60 mg mi1. Después, se agrega cloruro cálcico (50 ml de una solución 2.5 M) y espermidina (20 m? de una solución 0.1 M) en la suspensión de oro-ADN mientras que el tubo se agita durante 3 in. Las partículas de oro se centrifugan en un microcentrifugador durante 1 s y el sobrenadante se eliminó. Después, las partículas de oro se lavan dos veces con 1 mi de etanol absoluto y, después, se resuspenden en 50 m? de etanol absoluto y se sonican (sonicador de baño) durante un segundo para dispersar las partículas de oro. La suspensión de oro se incuba a -70 °C durante cinco minutos y se sónica (sonicador de baño) si es necesario para dispersar las partículas. Después, seis m? de partículas de oro recubiertas de ADN se colocan en discos macroportadores mylarr y se deja evaporar el etanol.

Al final del período de secado, una caja Petri que contiene el tejido se coloca en la cámara del PDS-1000/He. Después, el aire en la cámara se evacuó hasta un vacio de 28-98 kPa (29 pulgadas de Hg). El macroportador se acelera con una onda expansiva de helio con el uso de una membrana de ruptura que explota cuando la presión de He en el tubo de choque alcanza 7446-7584 kPa (1080-1100 psi). El tejido se coloca aproximadamente a 8 cm de la pantalla de detención y el callo se bombardea dos veces. Entre dos y cuatro placas de tejido se bombardean de esta manera con las partículas de oro recubiertas de ADN. Después del bombardeo, el tejido calloso se transfiere a medios CM sin sorbitol ni manitol suplementario.

Entre 3-5 dias después del bombardeo el tejido calloso se traslada a medios SM (medio CM que contiene 50 mg/1 de higromicina). Para lograrlo, el tejido calloso se traslada de las placas a tubos cónicos estériles de 50 mi y se pesa. Se agrega agar blando fundido a 40 °C con el uso de 2.5 mi de agar blando/100 mg de callo. Los aglomerados de callos se separan en fragmentos de menos de 2 m de diámetro por medio de dispersión repetida con una pipeta de 10 mi. Alícuotas de 3 mi de suspensión de callos se colocan en placas con medio SM fresco y las placas se incuban en la oscuridad durante 4 semanas a 27-28 °C. Después de 4 semanas, se identifica eventos de callos transgénicos, se transfieren a placas frescas con SM y se cultivan durante 2 semanas más en la oscuridad a 27-28 °C.

El callo en crecimiento se transfiere a un medio RM1 (sales MS, vitaminas Nitsch y Nitsch, sacarosa al 2 %, sorbitol al 3 %, gelrite al 0.4 % + 50 pp de higromicina B) durante 2 semanas en la oscuridad a 25 °C. Después de 2 semanas el callo se transfiere a un medio RM2 (sales MS, vitaminas Nitsch y Nitsch, sacarosa al 3 %, gelrite al 0.4 % + 50 ppm de higromicina B) y se coloca bajo luz blanca fría (~40 pEm_2s1) con un periodo de exposición a la luz de 12 horas a 25 °C y 30- 40 % de humedad. Después de 2-4 semanas en la luz, el callo comenzó a organizarse y a formar brotes. Los brotes se eliminaron del callo/medio circundante y se trasladaron cuidadosamente a medio RM3 (1/2 x sales MS, vitaminas Nitsch y Nitsch, sacarosa al 1 % + 50 ppm de higromicina B) en phytatrays (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) y se continuó la incubación con las mismas condiciones tal como se describió en la etapa anterior.

Las plantas se trasladan de los RM3 a macetas de 10 cm (4") que contienen mezcla 350 Metro después de 2-3 semanas, cuando las raíces y tallos han crecido lo suficiente La semilla obtenida de las plantas transgénicas se examina para analizar la complementación genética de la mutación asociada con la captación de nitrato con el ADN genómico silvestre que contiene el gen asociado con la captación de nitrato.

Ejemplo 22. Pruebas para determinar alteraciones en la arquitectura radicular en el maíz Las plantas de maíz transgénico se analizan para identificar cambios en la arquitectura radicular en la etapa de plántula, al momento de floración o de madurez. Las pruebas para medir las alteraciones en la arquitectura radicular de las plantas de maíz incluyen, pero no se limitan a, los métodos descritos a continuación. Para facilitar las pruebas manuales o automatizadas de las alteraciones en la arquitectura radicular, las plantas de maíz se pueden cultivar en macetas vacias. 1) Masa de la raíz (pesos secos). Las plantas se cultivan en Turface®, un medio de crecimiento que permite la separación fácil de las raíces. Los tejidos de brotes y raíces que se secan en el horno se pesan y se calcula una relación raíz/brote. 2) Niveles de ramificación de raíces laterales. La cantidad de lateral de ramificaciones de las raíces laterales (por ejemplo, la cantidad de raíces laterales, la longitud de las raíces laterales) se determina mediante el submuestreo de un sistema radicular completo, la obtención de imágenes con un escáner de base plana o una cámara digital y el análisis con el programa WinRHIZO™ (Regent Instruments Inc.). 3) Mediciones de la anchura de la banda radicular.

La banda radicular es la banda o masa de raíces que se forma en el fondo de las macetas de invernadero conforme la planta madura. El espesor de la banda radicular se mide en mm en la madurez como un cálculo aproximado de la masa de la raíz. 4) Conteo de raíces nodales. El número de raíces de corona que surgen de los nodulos superiores se puede determinar después de separar la raíz del medio de soporte (por ejemplo, mezcla para macetas). Adicionalmente, se puede medir el ángulo de las raíces de corona y/o raíces de anclaje. El análisis digital de las raíces nodales y la cantidad de ramificaciones de las raíces nodales forman otra extensión del método manual mencionado anteriormente.

Todos los datos tomados del fenotipo radicular están sujetos al análisis estadístico, normalmente, una prueba t para comparar las raíces transgénicas con las raíces de plantas hermanas no transgénicas. La prueba ANOVA unidireccional se puede usar, además, en casos en donde se involucran múltiples eventos y/o construcciones en el análisis.

Ej emplo 23. Variantes de secuencias descritas Las secuencias adicionales se pueden generar por medios conocidos que incluyen, pero no se limitan a, truncamientos y mutaciones puntuales. Estas variantes pueden evaluarse para determinar su efecto en la fertilidad masculina con el uso de protocolos convencionales de transformación, regeneración y evaluación.

A. Variantes de secuencias de nucleótidos que no alteran la secuencia de aminoácidos codificados Las secuencias de nucleótidos descritas se usan para generar variantes de secuencias de nucleótidos cuyas secuencias de nucleótidos del marco de lectura abierta (ORF) tienen aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % y 95 % de identidad de secuencia de nucleótidos cuando se comparan con las secuencias de nucleótidos del ORF inicial no alterado de la sec. con núm. de ident. correspondiente. Estas variantes funcionales se generan por medio del uso de una tabla de codones estándar. Aunque la secuencia de nucleótidos de las variantes se altere, la secuencia de aminoácidos codificada por los marcos de lectura abierta no cambia. Estas variantes se asocian con rasgos de componentes que determinan la producción y calidad de la biomasa. Aquellos que muestran asociación se usan como marcadores para seleccionar los rasgos de cadá componente.

B. Variantes de secuencias de nucleótidos en las re s no codificantes Las secuencias de nucleótidos descritas se usan para generar variantes de secuencias de nucleótidos que tienen la secuencia de nucleótidos de la región 5' no traducida, región 3' no traducida o región promotora que es aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % y 95 % idéntica a la secuencia de nucleótidos original de la sec. con núm. de idént. correspondiente. Después, estas variantes se asocian con la variación natural en el germoplasma para rasgos de componentes relacionados con la producción y calidad de la biomasa. Las variantes asociadas se usan como haplotipos marcadores para seleccionar los rasgos deseables.

C. Variantes de secuencias de aminoácidos de polipéptidos descritos Se genera variantes de secuencias de aminoácidos de los polipéptidos descritos. En este ejemplo se altera un aminoácido. Específicamente, se revisa los marcos de lectura abierta para determinar la alteración apropiada de los aminoácidos. La selección del aminoácido que cambiará se realiza al consultar el alineamiento de proteínas (con los otros ortólogos y otros miembros de la familia de genes de varias especies). Se selecciona un aminoácido que se considera que no está bajo alta presión de selección (que no está altamente conservado) y que es más bien fácilmente sustituible por un aminoácido con características químicas similares (es decir, de cadena lateral funcional similar). Puede cambiarse un aminoácido adecuado con el uso de un alineamiento de proteína. Una vez que se identifica el aminoácido objetivo se sigue el procedimiento descrito en la sección 11 siguiente. Con el uso de este método se genera variantes que tienen aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % y 95 % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos. Después, estas variantes se asocian con la variación natural en el germoplasma para rasgos de componentes relacionados con la producción y calidad de la biomasa. Las variantes asociadas se usan como haplotipos marcadores para seleccionar los rasgos deseables.

D. Variantes adicionales de secuencias de aminoácidos de polipéptidos descritos En este ejemplo se crea secuencias proteicas artificiales con 80 %, 85 %, 90 % y 95 % de identidad en comparación con la secuencia proteica de referencia. Este último esfuerzo requiere identificar las regiones conservadas y variables del alineamiento y, después, la aplicación acertada de una tabla de sustituciones de aminoácidos. Estas partes sé describirán detalladamente a continuación.

En gran medida, las secuencias de aminoácidos que se alteran se determinan con base en las regiones conservadas dentro de cada proteina o dentro de los otros polipéptidos descritos. En base al alineamiento de la secuencia, las múltiples regiones del polipéptido descrito que potencialmente se pueden alterar se representan con letras minúsculas, mientras que las regiones conservadas se representan con letras mayúsculas. Se sabe que es posible hacer sustituciones conservadoras en las regiones conservadas a continuación sin alterar la función. Además, un experto comprenderá que las variantes funcionales de la secuencia descrita en la descripción pueden tener alteraciones menores no conservadas de aminoácidos en el dominio conservado.

Posteriormente, se crea secuencias proteicas artificiales que son distintas a las originales con intervalos de identidad de 80-85 %, 85-90 %, 90-95 % y 95-100 %. El objetivo es alcanzar los puntos intermedios de estos intervalos con una flexibilidad de más o menos 1 %, por ejemplo. Las sustituciones de aminoácidos se realizarán por una programación Perl personalizada. La tabla de sustituciones se proporciona a continuación en la Tabla 2.

Tabla 2. Tabla de sustituciones Primero, se identifica cualquier aminoácido conservado en la proteína que no se debe cambiar y se “señala” para el aislamiento de la sustitución. Naturalmente, la metionina inicial se agregará automáticamente a la lista. Después, se realiza los cambios.

H, C y P no se cambian en ninguna circunstancias. Los cambios ocurrirán, primero, con isoleucina desde el N-terminal hasta el C-terminal. Después, la leucina, y así sucesivamente por toda la lista hacia abajo hasta alcanzar el objetivo deseado. Es posible realizar una cantidad parcial de sustituciones a manera de que no se inviertan los cambios. La lista se ordena de 1 a 17, para empezar con los cambios de isoleucina que sean necesarios antes que empezar con la leucina y sucesivamente hasta la metionina. Claramente, de esta manera, muchos aminoácidos no necesitarán cambios. L, I y V implican una sustitución 50:50 de las 2 sustituciones óptimas alternas.

Las variantes de secuencias de aminoácidos aparece escritas como impresión. Se usa la programación Perl para calcular las similitudes porcentuales. Con el uso de este procedimiento se generan variantes de los polipéptidos descritos que tienen aproximadamente 80 , 85 %, 90 % y 95 % de identidad de aminoácidos con la secuencia de nucleótidos del ORF inicial no alterado.

Todas las publicaciones y solicitudes de patente en esta descripción son indicativas del nivel de conocimiento del experto en la materia a la que pertenece esta descripción Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan en la presente descripción como referencia en la misma medida que si cada publicación o solicitud de patente individual fuera específicamente e individualmente indicada como referencia.

La presente descripción se ha descrito con referencia a varias modalidades y téenicas especificas y preferidas. Sin embargo, se debe comprender que es posible realizar muchas variaciones y modificaciones, siempre y cuando se conserve el espíritu y el alcance de la descripción

Claims (50)

REIVINDICACIONES

1. Un método para incrementar el rendimiento o un parámetro agronómico que contribuye al rendimiento; el método comprende: a. incrementar la expresión o actividad de una serina treonina proteina fosfatasa (STPP) en una planta; y b. cultivar la planta en un ambiente de cultivo de plantas.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque la serina treonina proteina fosfatasa es de tipo 1.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque la STPP es STPP3 de maíz.

4. Un método para mejorar una característica agronómica de una planta; el método comprende: a. incrementar la expresión o actividad de una serina treonina proteína fosfatasa (STPP) en una planta, caracterizado porque el polipéptido de STPP comprende un dominio metalofós (PFA PF00149.22); y b. mejorar la característica agronómica de la planta al cultivar la planta en un ambiente de cultivo de plantas.

5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el polipéptido de STPP comprende un motivo cerca del extremo N-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: a. L[L/T]EVR[T/L]ARPGKQVQL (sec. con núm. de ident.: 95), b. L[L/T]EV[R/K] [T/L/N][A/L][R/K]PGK[Q/N][V/ A]QL (sec. con núm. de ident.: 119) y c. LLEV[R/K][T/N]L[R/K]PGK[Q/N][V/A]QL (sec. con núm. de ident.: 120) y un motivo cerca del extremo C-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: d. GAMMSVDE[T/N]LMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 96), e. GAMMSVD[D/E][T/N]LMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 121) y f. GAMMSVD[D/E]TLMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 122).

6. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el polipéptido de STPP comprende la secuencia de aminoácidos de VRTARPGKQV (sec. con núm. de ident.: 123).

7. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el polipéptido de STPP comprende la secuencia de aminoácidos de seleccionada del grupo que comprende las sec. con núms. de ident.: 1-47, 104- 111, 113, 115 y 117 o una variante que es por lo menos 90 % similar a la sec. con núm. de ident.: 1-47, 104-111, 113, 115 o 117.

8. Una planta transgénica que comprende en su genoma una serina treonina proteina fosfatasa (STPP) recombinante, caracterizada porque la proteina fosfatasa comprende un motivo cerca del extremo N-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: a. L[L/T]EVR[T/L]ARPGKQVQL (sec. con núm. de ident.: 95), b. L[L/T]EV[R/K] [T/L/N][A/L][R/K]PGK[Q/N][V/ A]QL (sec. con núm. de ident.: 119) y C. LLEV[R/K][T/N]L[R/K]PGK[Q/N][V/A]QL (sec. con núm. de ident.: 120) y un motivo cerca del extremo C-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: d. GAMMSVDE[T/N]LMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 96), e. GAMMSVD[D/E][T/N]LMCSFQ (sec. con núm. de ident . : 121 ) y f. GAMMSVD[D/E]TLMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 122); un sitio de unión de RVxF, una subunidad catalítica y una subunidad reguladora, y caracterizada porque la planta muestra una característica agronómica mejorada.

9. La planta de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque la planta muestra un incremento en la eficacia del uso de nitrógeno en comparación con una planta control que no incluye una STPP recombinante en su genoma.

10. Una planta que comprende en su genoma un elemento regulador heterólogo unido operativamente a una serina treonina proteína fosfatasa (STPP), caracterizada porque el elemento regulador heterólogo incrementa la expresión de la proteína fosfatasa; la proteína fosfatasa comprende un motivo cerca del extremo N-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: a. L[L/T]EVR[T/L]ARPGKQVQL (sec. con núm. de ident.: 95), b. L[L/T]EV[R/K][T/L/N][A/L][R/K]PGK[Q/N][V/A]QL (sec. con núm. de ident.: 119) y c. LLEV[R/K][T/N]L[R/K]PGK[Q/N][V/A]QL (sec. con núm. de ident . : 120) y un motivo cerca del extremo C-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: d. GAMMSVDE[T/N]LMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 96), e. GAMMSVD[D/E][T/N]LMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 121) y f. GAMMSVD[D/E]TLMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 122); un sitio de unión de RVxF, una subunidad catalítica y una subunidad reguladora y caracterizada porque la planta muestra una característica agronómica mejorada.

11. La planta de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque el elemento regulador heterólogo es un potenciador.

12. La planta de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque el elemento regulador heterólogo es un promotor.

13. Un método para identificar y seleccionar un alelo de ZmSTPP3, el alelo produce una expresión incrementada del polipéptido de ZmSTPP3 y/o una actividad enzimática incrementada; el método comprende las etapas de: a. realizar una evaluación genética en una población de plantas de maíz mutante; b. identificar una o más plantas de maíz mutante que muestran la expresión incrementada del polipéptido de ZmSTPP3 y/o la actividad enzimática incrementada; y c. identificar el alelo de ZmSTPP3 a partir de la planta de maíz mutante.

14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque la planta de maiz mutante se secuencia en un locus que comprende ZmSTPP3.

15. Un método para incrementar la captación de nitrógeno en una planta; el método comprende a. incrementar la expresión o actividad de una serina treonina proteina fosfatasa (STPP) en una planta, caracterizado porque el polipéptido de STPP comprende un dominio metalofós (PFAM PF00149); y b. mejorar la captación de nitrógeno de la planta al cultivar la planta en un ambiente de cultivo de plantas.

16. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el polipéptido de STPP comprende un motivo cerca del extremo N-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos de seleccionada del grupo que consiste en: a. L[L/T]EVR[T/L]ARPGKQVQL (sec. con núm. de ident . : 95 ) b. L[L/T]EV[R/K][T/L/N][A/L][R/K]PGK [Q/N][V/ A] QL (sec. con núm. de ident.: 119) y c. LLEV[R/K][T/N]L[R/K]PGK[Q/N][V/A]QL (sec. con núm. de ident.: 120) y un motivo cerca del extremo C-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: d. GAMMSVDE[T/N]LMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 96), e. GAMMSVD[D/E][T/N]LMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 121) y f. GAMMSVD[D/E]TLMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 122).

17. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el polipéptido de STPP comprende la secuencia de aminoácidos de VRTARPGKQV (sec. con núm. de ident.: 123).

18. Un constructo de ADN recombinante con la capacidad de expresarse en una célula vegetal; el constructo comprende: a. un polinucleótido que expresa una serina treonina proteina fosfatasa (STPP) en una planta, caracterizado porque el polipéptido de STPP comprende un dominio metalofós (PFAM PF00149); b. un promotor heterólogo unido operativamente a la proteina fosfatasa y es funcional en células vegetales; y c. un terminador transcripcional funcional en células vegetales.

19. Una planta de maíz gue comprende el constructo de ADN de conformidad con la reivindicación 18.

20. El constructo de ADN de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque la STPP comprende una secuencia de polinucleótidos gue codifica la proteina fosfatasa que comprende una secuencia que es por lo menos 80 % similar a una seleccionada del grupo que comprende las sec. con núms. de ident.: 48-94, 97-103, 112, 114, 116 y 118.

21. Un método para mejorar la eficacia de uso de nitrógeno de una planta monocotiledónea; el método comprende: a. incrementar la expresión o actividad de una serina treonina proteina fosfatasa (STPP) en una planta, caracterizado porque el polipéptido de STPP comprende un dominio metalofós (PFAM PF00149) y comprende, además, un motivo cerca del extremo N-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: i. L [L/T]EVR[T/L]ARPGKQVQL (sec. con núm. de ident.: 95), ii. L[L/T]EV[R/K][T/L/N][A/L][R/K]PGK[Q/N] [V/A]QL (sec. con núm. de ident.: 119) y iii. LLEV[R/K][T/N]L[R/K]PGK[Q/N][V/A]QL (sec. con núm. de ident.: 120) y un motivo cerca del extremo C- terminal que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: iv. GAMMSVDE[T/N]LMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 96), v. GAMMSVD[D/E][T/N]LMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 121) y vi. GAMMSVD[D/E]TLMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 122) y b. cultivar la planta en condiciones de cultivo de plantas, caracterizado porque la proporción de aplicación de un fertilizante nitrogenado es menor que aproximadamente 140-160 libras/acre.

22. Un método para incrementar el rendimiento de una planta monocotiledónea cultivada en un campo al mejorar la eficacia de uso de nitrógeno de la planta monocotiledónea; el método comprende a. incrementar la expresión o actividad de una serina treonina proteina fosfatasa (STPP) en una planta, caracterizado porque el polipéptido de STPP comprende un dominio metalofós (PFAM PF00149) y comprende, además, un motivo cerca del extremo N-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: i. L[L/T]EVR[T/L]ARPGKQVQL (sec. con núm. de ident.: 95), ii. L[L/T]EV[R/K][T/L/N][A/L][R/K]PGK[Q/N] [V/AJQL (sec. con núm. de ident.: 119) y iii. LLEV[R/K][T/N]L[R/K]PGK[Q/N][V/A]QL (sec. con núm. de ident.: 120) y un motivo cerca del extremo C- terminal que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: iv. GAMMSVDE[T/N]LMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 96), v. GAMMSVD[D/E][T/N]LMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 121) y vi. GAMMSVD[D/E]TLMCSFQ (sec. con núm. de ident . : 122 ) y b. cultivar la planta en condiciones de cultivo de plantas, caracterizado porque la proporción de aplicación de un fertilizante nitrogenado es de aproximadamente 140 a 160 libras/aere.

23. Una planta que comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido aislado unido operativamente a un promotor funcional en una planta, caracterizada porque el polinucleótido comprende: a. la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que comprende las sec. con núms. de ident.: 48-94, 97-103, 112, 114, 116 y 118. b. una secuencia de nucleótidos con por lo menos 90 % de identidad de secuencias, según el método de alineamiento Clustal V, en comparación con una seleccionada del grupo que comprende las sec. con núms. de ident.: 48-94, 97-103, 112, 114, 116 y 118; c. una secuencia de nucleótidos que puede hibridizarse en condiciones rigurosas con la secuencia de nucleótidos de (a); y caracterizada porque la planta muestra una alteración en por lo menos una característica agronómica seleccionada del grupo que consiste en: meristemo de la espiga agrandado, número de hileras de granos, número de semillas, altura de la planta, biomasa y rendimiento, en comparación con una planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante.

24. La planta de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada además porque la planta se selecciona del grupo que consiste en: Arabidopsis, tomate, maíz, frijol de soya, girasol, sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada, mijo, caña de azúcar y pasto varilla.

25. La semilla de la planta de conformidad con la reivindicación 23 o 24, caracterizada además porque una planta producida a partir de la semilla muestra una alteración en por lo menos una característica agronómica seleccionada del grupo que consiste en: meristemo de la espiga agrandado, número de hileras de granos, número de semillas, altura de la planta, biomasa y rendimiento, en comparación con una planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante.

26. Un polinucleótido recombinante que codifica una serina treonina proteína fosfatasa (STPP) en una planta, caracterizado porque el polipéptido de STPP comprende un dominio metalofós (PFAM PF00149.22) y comprende, además, un motivo cerca del extremo N-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en : a . L [L/T] EVR [T/L] ARPGKQVQL ( sec . con núm. de ident . : 95 ) , b . L[L/T]EV[R/K][T/L/N][A/L][R/K]PGK [Q/N][V/ A]QL (sec. con núm. de ident.: 119) y c. LLEV[R/K][T/N]L[R/K]PGK[Q/N][V/A]QL (sec. con núm. de ident.: 120) y un motivo cerca del extremo C-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: d. GAMMSVDE[T/N]LMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 96), e. GAMMSVD[D/E][T/N]LMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 121) y f.GAMMSVD[D/E]TLMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 122); y caracterizado además porque el polinucleótido comprende un elemento regulador heterólogo.

27. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que comprende las sec. con núms. de ident.: 1-47, 104-111, 113, 115 o 117 o un polipéptido que es 90 % similar a un polipéptido seleccionado del grupo que comprende las sec. con núms. de ident.: 1-47, 104-111, 113, 115 o 117.

28. Una semilla que comprende el polinucleótido recombinante de conformidad con la reivindicación 26.

29. Una planta producida a partir de la semilla de conformidad con la reivindicación 28.

30. Un casete de expresión que comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 26.

31. Un método para mejorar el rendimiento de una planta de maíz; el método comprende proporcionar una planta de maiz transgénico que comprende en su genoma un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido que es por lo menos 90 % idéntico a la sec. con núm. de ident.: 1, e incrementar el rendimiento de los granos de la planta de maiz al cultivar la planta de maiz en un ambiente de cultivo de plantas.

32. Una planta de maiz transgénico que comprende en su genoma un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido que es por lo menos 90 % idéntico a la sec. con núm. de ident.: 1.

33. Un método para mejorar el rendimiento de una planta de maiz; el método comprende proporcionar una planta de maiz transgénico que comprende en su genoma un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido que es por lo menos 90 % idéntico a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las sec. con núms. de ident.: 1-8 e incrementar el rendimiento de los granos de la planta de maiz al cultivar la planta de maiz en un ambiente de cultivo de plantas.

34. Una planta de maiz transgénico que comprende en su genoma un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido que es por lo menos 90 % idéntico a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las sec. con núms. de ident.: 1-8.

35. Una planta de cultivo monocotiledónea y transgénica que comprende en su genoma un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido que es por lo menos 90 % idéntico a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las sec. con núms. de ident.: 1-8.

36. Un método para mejorar el rendimiento de una planta de maiz; el método comprende proporcionar una planta de maiz transgénico que comprende en su genoma un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido que es por lo menos 85 % idéntico a la sec. con núm. de ident.: 1, e incrementar el rendimiento de los granos de la planta de maiz al cultivar la planta de maiz en un ambiente de cultivo de plantas.

37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque el polipéptido es aproximadamente 87 % idéntico a la sec. con núm. de ident.: 1.

38. Una planta de maiz transgénico que comprende en su genoma un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido que es por lo menos 85 % idéntico a la sec. con núm. de ident.: 1.

39. La planta de maíz de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada además porque el polipéptido es aproximadamente 87 % idéntica a la sec. con núm. de ident.: 1.

40. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada además porque la planta de maíz produce por lo menos aproximadamente 3-5 fanegas/acre más en comparación con una planta control que no contiene el polinucleótido recombinante.

41. Una planta de maíz transgénico que comprende en su genoma un elemento regulador heterólogo unido operativamente a una serina treonina proteina fosfatasa (STPP), caracterizada porque el elemento regulador heterólogo incrementa la expresión de la proteína fosfatasa, la proteína fosfatasa comprende un motivo cerca del extremo N-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: a. L[L/T]EVR[T/L]ARPGKQVQL (sec. con núm. de ident.: 95), b. L [L/T]EV[R/K][T/L/N][A/L][R/K]PGK[Q/N][V/ A]QL (sec. con núm. de ident.: 119) y c. LLEV[R/K][T/N]L[R/K]PGK[Q/N][V/A]QL (sec. con núm. de ident.: 120) y un motivo cerca del extremo C-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: d. GAMMSVDE[T/N]LMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 96), e. GAMMSVD[D/E][T/N]LMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 121) y f. GAMMSVD[D/E]TLMCSFQ (sec. con núm. de ident.: 122), un sitio de unión de RVxF, una subunidad catalítica y una subunidad reguladora, y caracterizada porque la planta de maíz muestra mayor rendimiento de los granos.

42. Un método para mejorar la arquitectura de la raíz de una planta; el método comprende expresar un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido que es por lo menos 80 % idéntico a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las sec. con núms. de ident.: 1-8 y mejorar la arquitectura de la raíz de la planta al cultivar la planta en un ambiente de cultivo de plantas.

43. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado además porque la arquitectura de la raíz consiste en un mejor crecimiento radicular o número de raíces en un ambiente con contenido normal o bajo de nitrógeno.

44. Un método para identificar una planta que muestra un parámetro agronómico mejorado; el método comprende evaluar una población de plantas de maíz para una eficacia de uso de nitrógeno mejorada y analizar la secuencia de un polinucleótido que codifica una proteina que comprende un polipéptido seleccionado del grupo que comprende las sec. con núms. de ident.: 1-47,104-111, 113, 115 o 117 o una secuencia reguladora de este e identificar la planta con una eficacia de uso de nitrógeno mejorada.

45. Un método para identificar alelos en plantas o germoplasma de maiz que se relacionan con una mayor eficacia del uso de nitrógeno; el método comprende: a. obtener una población de plantas de maiz, caracterizado porque una o más plantas muestran diversos niveles de tolerancia mejorada a la sequía y/o una eficacia del uso de nitrógeno aumentada; b. evaluar las variaciones alélicas con respecto a la secuencia de polinucleótidos que codifica una proteina que comprende un polinucleótido seleccionado del grupo que comprende: sec. con núm. de ident.: 48-94,97-103, 112, 114, 116 y 118 o en la región genómica que regula la expresión del polinucleótido que codifica la proteína; c. obtener los valores fenotípicos de una eficacia del uso de nitrógeno incrementada para una pluralidad de plantas de maíz en la población; d. asociar las variaciones alélicas en el genoma asociado con un polinucleótido seleccionado del grupo que comprende: sec. con nú . de ident.: 48-94,97-103, 112, 114, 116 y 118 con tal eficacia; y e. identificar los alelos que están asociados con tal eficacia mejorada.

46. Una planta transgénica que comprende en su genoma un constructo recombinante; el constructo recombinante comprende un elemento genético que modula la expresión de un gen endógeno, caracterizado porque el gen endógeno codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que comprende las sec. con núms. de ident.: 1-47,104-111, 113, 115 o 117 o una secuencia que es 90 % idéntica a un polipéptido seleccionado del grupo que comprende las sec. con núms. de ident.: 1-47,104-111, 113, 115 o 117.

47. Una planta que comprende en su genoma una modificación genética que produce una expresión incrementada de un gen que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que comprende las sec. con núms. de ident.: 1-47,104-111, 113, 115 o 117 o una secuencia que es 95 % idéntica a un polipéptido seleccionado del grupo que comprende las sec. con núms. de ident.: 1-47,104-111, 113, 115 o 117 o la actividad incrementada del polipéptido, caracterizada porque la planta muestra uno o más parámetros agronómicos mejorados que contribuyen a la tolerancia a la sequía o rendimiento.

48. Un método para la selección asistida por marcadores de plantas que muestran un parámetro agronómico mejorado; el método comprende llevar a cabo una selección asistida por marcadores de plantas que tienen una o más variaciones en la región genómica que codifica una proteína que comprende un polipéptido seleccionado del grupo que comprende las sec. con núms. de ident.: 1-47,104-111, 113, 115 o 117 o una secuencia reguladora de este e identificar la planta con una eficacia de uso de nitrógeno mejorada.

49. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque la STPP comprende una secuencia de aminoácidos de por lo menos 94 % de identidad con la sec. con núm. de ident.: 1.

50. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque la STPP comprende una secuencia de aminoácidos de por lo menos 95 % de identidad con la sec. con núm. de ident.: 2.