MX2014008604A - Nuevos derivados de morofolinilo utiles como inhibidores de mogat-2. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a compuestos de Fórmula I o una sal farmacéutica de los mismos, métodos para tratar hipertrigliceridemia usando los compuestos; y a un proceso para preparar los compuestos. (ver Fórmula).

Description

NUEVOS DERIVADOS DE OROFOLI NILO ÚTILES COMO INHIBIDORES DE MOGAT-2 La ingestión de exceso de grasa en la dieta es una causa que lleva a obesidad inducida por la dieta y puede tener profundo efecto perjudicial en una población saludable. Más del 90% de la grasa en la dieta para humanos es triacilglicerol (o triglicéridos), los cuales son casi completamente absorbidos por el intestino delgado. La enzim^i acil CoA:monoacilglicerol aciltransferasa-2 (MOGAT-2) se cree que juerga un papel importante en la absorción de grasa en la dieta en el intestino delgado. Se ha demostrado que ratones deficientes en MOGAT-2 cuando comen una dieta alta en grasa están protegidos contra el desarrcjllo de obesidad, intolerancia a la glucosa, hipercolesterolemia y desarrollar un hígado graso. Además, también se ha demostrado que ratones deficientes en MOGAT-2 exhiben bajos niveles de triacilgliceíol en plasma después de una estimulación con aceite de oliva en la dieta (Yen, et al., Nat. Med. 2009, 15(4), 442-446.) Existe una necesidad de fármacos adicionales para los tratamientos de hipertrigliceridemia. Existe también una necesidad para nuevos inhibidores del receptor MOGAT-2. La presente invencjón se refiere a una o más de estas necesidades para proporcionar compuestos alternativos y métodos de tratamiento, los cuales pueden ser adecuados para el tratamiento de hipertrigliceridemia.

La presente invención proporciona un compuesto de conformidad con la Fórmula I en donde R1 se selecciona a partir de: -CH3 y -CF3; R2 se selecciona a partir de: H y -CH3; R3 se selecciona a partir de: H y -CH3; R4 se selecciona a partir de: H, -Oalquilo C1.3, y halógeno; R5 se selecciona a partir de: H, -CF3, -OCH3, y halógeno; R6 se selecciona a partir de: H y halógeno; siempre que al menos uno de R4, R5, y R6 sea H; o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

Los compuestos de la presente invención pueden tener uno o más centros quirales. En los compuestos de Fórmula II abajo, uno de los centros quirales es identificado con un asterisco (*). Cuando R1 es - CH3, los compuestos preferidos tienen la configuración (R) en este centro quiral. Cuando R1 es -CF3, los compuestos preferidos tienen la configuración (S).

En una modalidad R1 es -CH3. En otra modalidad R1 es - Preferiblemente R2 es H.

Preferiblemente R3 es H.

Preferiblemente R4 se selecciona a partir de: H, -OCH(CH3)2, y halógeno. Más preferiblemente R4 se selecciona a partir de: H y halógeno. Todavía más preferiblemente R4 se selecciona a partir de: H y Cl.

Preferiblemente R5 se selecciona a partir de: H, -CF3 -OCH3, F, y Cl. Más preferiblemente R5 se selecciona a partir de: H, -CF3, F, y Cl. Todavía más preferiblemente R5 es H.

Preferiblemente R6 se selecciona a partir de H y F. Preferiblemente R6 es F.

La presente invención proporciona un compuesto de Fórmula III siguiente: o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

La presente invención proporciona un compuesto de conformidad con ya sea las Fórmulas I o II en donde: R1 es -CH3; R2 se selecciona a partir de H y -CH3; R3 se selecciona a partir de H y -CH3; R4 se selecciona a partir de: H, -OCH(CH3)2, y halógeno; R5 se selecciona a partir de: H -CF3, -OCH3, Cl, y F; y R6 se selecciona a partir de H o F; o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

La presente invención proporciona un compuesto de conformidad con ya sea las Fórmulas I o II en donde R1 es -CH3; R2 se selecciona a partir de H y -CH3; R3 se selecciona a partir de H y -CH3; R4 se selecciona a partir de: H, y halógeno; R5 se selecciona a partir de: H, -CF3, F, y Cl; y R6 se selecciona a partir de: H y F; o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

La presente invención proporciona un compuesto de conformidad con ya sea las Fórmulas I o II en donde: R1 es -CH3; R2 se selecciona a partir de: H y -CH3; R3 se selecciona a partir de: H y—CH3; R4 se selecciona a partir de: H y halógeno; R5 se selecciona a partir de: H, F, y Cl; y R6 se selecciona a partir de H o F; o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

La presente invención proporciona un compuesto de conformidad con ya sea la Fórmula I o II en donde: R1 es -CH3; R2 es H; R3 es H; R4 se selecciona a partir de: H, y Cl; R5 sea H, Cl, y F; y R6 se selecciona a partir de H o F; o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

La presente invención proporciona un compuesto de conformidad con ya sea la Fórmula I o II en donde: R1 es -CH3; R2 es H; R3 es H; R4 se selecciona a partir de: H, y Cl; R5 sea H; y R6 se selecciona a partir de H o F; o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

La presente invención proporciona un compuesto de conformidad con ya sea la Fórmula I o II en donde: R1 es -CH3; cada uno de R2, R3, R4, y R5 es H; y R6 es F.

La presente invención proporciona un compuesto de conformidad con ya sea las Fórmulas I o II en donde: R1 es -CF3; R2 se selecciona a partir de H y -CH3; R3 se selecciona a partir de H y -CH3; R4 se selecciona a partir de: H, -OCH(CH3)2, y halógeno; R5 se selecciona a partir de: H -CF3, -OCH3, Cl, y F; y R6 se selecciona a partir de H o F; o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

La presente invención proporciona un compuesto de conformidad con ya sea las Fórmulas I o II en donde R1 es -CF3; R2 se selecciona a partir de H y -CH3; R3 se selecciona a partir de H y -CH3; R4 se selecciona a partir de: H, y halógeno; R5 se selecciona a partir de: H, -CF3, F, y Cl; y R6 se selecciona a partir de: H y F; o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

La presente invención proporciona un compuesto de conformidad con ya sea las Fórmulas I o II en donde: R1 es -CF3; R2 se selecciona a partir de: H y -CH3; R3 se selecciona a partir de: H y -CH3; R4 se selecciona a partir de: H y halógeno; R5 se selecciona a partir de: H, F, y Cl; y R6 se selecciona a partir de H o F; o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

La presente invención proporciona un compuesto de conformidad con ya sea la Fórmula I o II en donde: R1 es -CF3; R2 es H; R3 es H; R4 se selecciona a partir de: H, y Cl; R5 es H, Cl, y F; y R6 se selecciona a partir de H o F; o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

La presente invención proporciona un compuesto de conformidad con ya sea la Fórmula I o II en donde: R1 es -CF3; R2 es H; R3 es H; R4 se selecciona a partir de: H, y Cl; R5 sea H; y R6 se selecciona a partir de H o F; o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

La presente invención proporciona un compuesto de conformidad con ya sea la Fórmula I o II en donde: R1 es -CF3; cada uno de R2, R3, R4, y R5 sea H; y R6 es F.

Preferiblemente la sal farmacéuticamente aceptable se selecciona a partir de: una sal de cloruro y una sal de maleato. Más preferiblemente la sal farmacéuticamente aceptable es sal de maleato.

Los compuestos preferidos son N-[(1R)-1-(4-{[(2S)-2-(4-Fluorofenil)morfolin-4-il]metil}fenil)etil]metansulfonamida; clorhidrato de N-[(1 R)-1-(4-{[(2S)-2-(4-Fluorofenil)morfolin-4-il]metil}fenil)etil]metansulfonamida; y ácido maleico de N-[(1 R)-1 -(4-{[(2S)-2-(4- Fluorofenil)morfolin-4-il]metil}fenil)etil]metansulfonamida.

La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de las Fórmulas I, II, o III como se describe anteriormente o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, y al menos uno de un portador, diluyente, o excipiente farmacéuticamente aceptable.

La presente invención también proporciona un método para tratar un paciente en necesidad de tratamiento por hipertrigliceridemia, el método comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de un compuesto, de conformidad con las Fórmulas I, II o III anteriores.

La presente invención proporciona un compuesto, de conformidad con las Fórmulas I, II, o III anteriores para uso en el tratamiento de hipertrigliceridemia.

La presente invención se proporciona para el uso de un compuesto de conformidad con las Fórmulas I, II, o III anteriores en la manufactura de un medicamento para tratar hipertrigliceridemia.

El término "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal del compuesto de la invención considerada por ser aceptable para uso clínico y/o farmacéutico. Sales farmacéuticamente aceptables y metodología común para prepararlas son bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, P. Stahl, et al., Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, (VCHA/Wiley-VCH, 2002); S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, No. 1, Enero 1977.

Formulaciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser preparadas por procedimientos conocidos en la técnica usando aditivos conocidos o fácilmente disponibles. El término "portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable" como se usa en la presente, se refiere a uno o más portadores, diluyentes, y excipientes que son compatibles con los otros ingredientes de la formulación y no perjudiciales a un paciente. Composiciones farmacéuticas y procesos para su preparación se conocen en la técnica y se pueden encontrar ejemplos en Remington, "The Science and Practice of Pharmacy" (A. Gennaro, et al. eds. 19a ed. Mack Publishing Co.). Ejemplos no limitantes de portadores, excipientes y diluyentes farmacéuticamente aceptables que son adecuados para tales formulaciones incluyen los siguientes: almidón, azúcares, manitol y derivados de sílice; agentes enlazantes tales como carboximetilcelulosa y otros derivados de celulosa, alginatos, gelatina y poliviniipirrolidona; agentes humectantes tales como glicerol; agentes desintegrantes tales como carbonato de calcio y bicarbonato de sodio.

Como se usa en la presente, paciente se refiere a un animal en necesidad de tratamiento, preferiblemente no exclusivamente un mamífero, el cual es preferiblemente un humano; o alternativamente un animal de compañía. Tal como un perro o gato; o un ave.

A menos que se note lo contrario, los compuestos ilustrados en la presente son nombrados y numerados usando ya sea ACDLABS o Symyx Draw 3.2.

Química General Como se usa en la presente, los siguientes términos tienen los significados indicados "ACN" se refiere a acetonitrilo; "DCM" se refiere a diclorometano; "DEA" se refiere a dietilamina; "DMEA" se refiere a dimetiletilamina; "DMF" se refiere a dimetilformamida; "ee" se refiere a exceso enantiomérico; "EtOAc" se refiere a acetato de etilo; "EtOH" se refiere a etanol; "h" se refiere a hora(s); "HPLC" se refiere a cromatografía líquida de alta resolución; "IPA" se refiere a alcohol isopropílico; "Isómero 1" se refiere al primero isómero de elución; "Isómero 2" se refiere al segundo isómero de elución; "LC/MS" se refiere a cromatografía líquida seguida por espectroscopia de masas; "MeOH" se refiere a metanol; "min" se refiere a minuto(s); "MS" se refiere a espectroscopia de masas; "NMR" se refiere a resonancia magnética nuclear; "SFC" se refiere a cromatografía de fluido supercrítico; "THF" se refiere a tetrahidrofurano.

Esquema de reacción 1 El Esquema de reacción 1 ilustra la síntesis general del compuesto de Fórmula I.

Un compuesto de morfolina sustituido 1, el cual es ya sea comercialmente disponible o sintetizado por métodos conocidos en la literatura, reacciona con un aldehido o cetona 2 bajo condiciones de aminación reductiva para proporcionar el compuesto de Fórmula I. ((Véase: Richard C. Larock, Comprehensive Orqanic Transformations: a guide to functional group preparations, 2a edición, Página 835-846, Wiley-VCH, (1999)). Preferiblemente, el compuesto de morfolina 1 reacciona con el compuesto 2 con la existencia de un agente reductor tal como triacetoxiborohidruro y un ácido tal como ácido acético en diclorometano para proporcionar el compuesto de Fórmula I, el cual puede ser convertido a una sal adecuada con ácidos apropiados, por ejemplo, HCI para formar la sal de clorhidrato.

Preparación 1 (N-Z)-N-[(4-Bromofenil)metilen]-(R)-2-metil-propan-2-sulfinamida Se agregó (R)-2-metilpropan-2-sulfinamida (40.5 g, 0.33 mol) en forma de porciones a una solución de 4-bromobenzaldehído (65.57 g, 0.35 mol) en tolueno (283 ml_). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente por 15 minutos y después se agregó hidróxido de sodio (1.34 g, 0.33 mol). Se agitó la suspensión a temperatura ambiente por 12 h. Se agregó sulfato de sodio (16 g) y Celite® (16 g) y se agitó la suspensión por 15 minutos. Se filtró y concentró lo filtrado bajo presión reducida. Se purificó el residuo por cromatografía en gel de sílice eluyendo con hexano/EtOAc (100% a 70% de hexano) para proporcionar el compuesto del título como un sólido blanco (85.5 g, 88% de rendimiento). S (m/z): 288 (M + 1).

Preparación 2 N-[(1S)-1-(4-Bromofenil)-2,2,2-trifluoro-etil]-(R)-2-metil-propan-2- sulfinamida Se agregó (trifluorometil)trimetilsilano puro (109 mL, 0.74 mol) a 0 °C a una solución agitada de acetato de tetrabutilamonio (88 g, 0.29 mol) y (N-Z)-N-[(4-bromofenil)metilen]-(R)-2-metil-propan-2- sulfinamida (85 g, 0.29 mol) en DMF (1.2 L) a 0 °C. Se agitó la mezcla a 0-5°C por 90 minutos. Se agregó solución acuosa saturada de cloruro de amonio (1.2 L) y se extrajo con EtOAc (4 x 400 mL). Se combinaron los extractos y secuencialmente se lavaron con agua después salmuera (2 x 1 L); se secaron sobre sulfato de magnesio; se filtraron; y se concentró lo filtrado bajo presión reducida. Se trituró el residuo con hexano (200 mL) por 10 minutos; se filtró; y se secó lo filtrado bajo presión reducida para proporcionar el compuesto del título como un sólido amarillo (81 g, 76% de rendimiento, >98 de). S (m/z): 358 (M + 1).

Preparación 3 (1S)-1-(4-Bromofenil)-2,2,2-trifluoroetanamina Se agregó HCI (4M en dioxano, 226 mL, 0.9 mol) a una suspensión de N-[(1S)-1-(4-bromofenil)-2,2,2-trifluoro-etil]-(R)-2-metil- propan-2-sulfinamida (81 g, 0.23 mol) en MeOH (670 ml_). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente por una hora. Se removió el solvente bajo presión reducida y se trituró el residuo con metil ter-butil éter (200 mL) por 10 minutos para dar la sal de HCI como un sólido marrón. Se disolvió la sal en agua (1.2) y se agregó suficiente solución de NaOH 2N para elevar el pH de la solución acuosa a un pH de 10. Se extrajo la mezcla con metil ter-butil éter (3 x 500 mL). Se lavó la fase orgánica con agua después salmuera (500 mL cada una); se secó sobre sulfato de magnesio; se filtró; y concentró lo filtrado bajo presión reducida para dar el compuesto del título como un sólido amarillo (46 g, 80% de rendimiento, 98% ee). MS (m/z): 358 (M + 1).

Preparación 4 N-[(1 S)-1-(4-Bromofenil)-2,2,2-trifluoro-etil]metansulfonamida Se agregó cloruro de metansulfonilo (16.42 mL, 0.21 mol) por goteo a una mezcla de (1S)-1-(4-bromofenil)-2,2,2-trifluoroetanamina (49 g, 0.19 mol), 4-dimetilaminopiridina (1.18 g, 9.0 mmol), 2,6-lutidina (67 mL, 0.57 mol) en DCM (250 mL) a 0°C. Se calentó la mezcla a temperatura ambiente y se agitó a esta temperatura por 20 horas. Se diluyó la mezcla de reacción con DCM (300 mL) y se lavó secuencialmente con HCI 2M (2 x 200 mL), agua (250 mL), después salmuera (250 mL). Se recolectó la fase orgánica y se secó sobre sulfato de magnesio; se filtró; y concentró lo filtrado bajo presión reducida. Se trituró el residuo con hexano (200 ml_) por 10 minutos; se filtró; y se secó lo sólido bajo presión reducida para dar el compuesto del título como un sólido marrón pálido (60 g, 93% de rendimiento, 98% ee). MS (m/z): 332 (M + 1).

Preparación 5 N-[(1 S)-2,2,2-Trifluoro-1-(4-formilfenil)etil]metansulfonamida Se agregó N-[(1 S)-1 -(4-bromofenil)-2,2,2-trifluoro-etiljmetansulfonamida (30 g, 90 mmol), acetato de paladio(ll) (0.81 g, 3.6 mmol), butildi-1 -adamantilfosfina (3.89 g, 10.84 mmol), y tetrametiletilendiamina (10.50 g, 90 mmol) en tolueno (1.5 mL) a un reactor PARR de 2 L. Se selló el reactor y se presurizó con gas de síntesis (1:1 CO/H2 a 75 psi. Se agitó la mezcla de reacción por 16 horas mientras se mantiene la temperatura a 95°C. Se enfrió la mezcla; se ventiló; y abrió el reactor. Se filtró la mezcla a través de Celite® y se concentró lo filtrado bajo presión reducida. Se purificó el residuo crudo por cromatografía en gel de sílice eluyendo con hexano/EtOAc (8:2 a 1:1) para proporcionar el compuesto del título (22.8 g, 90 %, 80% ee). Se enriqueció la pureza quiral del compuesto eluyéndolo a través de una columna quiral: Chiralpak AS-H (2.1x25cm, 5 µ?) C02/EtOH (9:1) para proporcionar el compuesto del título (19 g, 75 % de rendimiento, 98 % ee). MS (miz): 282 (M + 1).

Preparación 6 N-[(1 R)-1-(4-Bromofenil)etil]metansulfonamida Se agregó cloruro de metansulfonilo (13.44 mL, 0.17 mmol) a una mezcla de (1 R)-1-(4-bromofenil)etanamina (25 g, 0.12 mol) y trietilamina (51 ml_, 0.36 mol) en DCM (250 mL) a 0 °C. Se calentó a temperatura ambiente y se agitó por 2.5 horas. Se lavó la mezcla de reacción con HCI acuoso 2M (100 mi). Después se lavó secuencialmente la fase orgánica con agua después salmuera (2 x 100 mL). Se secó la fase orgánica sobre sulfato de sodio anhidro; se filtró; y concentró lo filtrado bajo presión reducida para dar un residuo. Se trituró el residuo con hexano (150 mL); se filtró y se secó bajo presión reducida para proporcionar el compuesto del título como un sólido amarillo (33.24 g, 96 %, ee > 98%). MS (m/z): 278 (M+1).

Preparación 7 N-[(1 R)-1-(4-Formilfenil)etil]metansulfonamida Se combinó N-[(1 R)-1-(4-bromofenil)etil]-metansulfonamida (10 g, 35 mmol), cloruro de (1 ,1 '-bis(difenilfosfino)-ferroceno)paladio(ll) (733 mg, 0.9 mmol), carbonato de sodio (3.81 g, 35 mmol) y DMF (50ml_) en un reactor PARR de 300 mL Se agregó trietilsilano (11.6 ml_, 0.72 mmol) y se purgó el reactor con monóxido de carbono tres veces. El reactor se cargó con monóxido de carbono (50 psi) y se agitó la mezcla a 90°C por 15 horas. Se enfrió el reactor a temperatura ambiente; se abrió; se filtró la mezcla a través de una almohadilla de Celite®; y se lavó la almohadilla con DCM (150 mL). Secuencialmente se lavó lo filtrado con agua después salmuera (2 x 80 mL). Se concentró la fase orgánica bajo presión reducida para obtener el residuo como un aceite anaranjado. Se purificó el aceite anaranjado por cromatografía instantánea en gel de sílice eluyendo con hexano/EtOAc (0 a 30% EtAc) para proporcionar el compuesto del título (5.6 g, 70%, ee> 98%). MS (m/z): 228 ( + 1).

Preparación 8 (1S)-2-Bromo-1-(4-fluorofenil)etanol Bajo una atmósfera de nitrógeno, se cargó un matraz de fondo redondo de 30 litros con una solución de (S)-1 -metil-3,3-difenil-3a,4,5,6-tetrahidropirrolo[1 ,2-c][1 ,3,2]oxazaborol (1 M en tolueno; 44 mL; 44 mmol) a 22 °C. Se agregó una solución de complejo de borano- ?,?-dietilanilina (1230 g; 7540 mmol) en metil t-butil éter (4.5 L). Se calentó y mantiene la mezcla a 40°C por 30 min. Se agregó una solución de bromo-4-fluoroacetofenona (1640 g; 7530 mmol) en metil t-butil éter (4.5 L) por goteo durante 30 min. Se agitó la mezcla a 40 °C por 2 horas. Se enfrió a 10 °C usando un baño de agua helada; después lentamente se agregó MeOH (590 mL) para apagar la reacción. Se agitó la mezcla por 30 min mientras se mantiene a 10-20 °C. Se agregó ácido clorhídrico (3.0 M, 7.5 L) a la mezcla mientras está a 10 °C. Se agitó por una hora y se filtró. Se recolectó lo filtrado. Se separaron las capas en lo filtrado; se extrajo la fase acuosa con metil ter-butil éter (1x 3 L); se combinaron las fases orgánicas y se lavaron con salmuera; se secó sobre Na2S04; y filtró; y se removieron los volátiles de lo filtrado bajo presión reducida para dar el compuesto del título como un aceite amarillo pálido (1650 g, 99%). MS (m/z): 201 (M-OH); valor ee: 97.5% (columna AD-H 250 mm x 4.6 mm x 5 µ?? usando 99:1 hexanos:EtOH a 25 °C con una velocidad de flujo de 1.0 mL/min).

Preparación 9 (S)-2-(4-Fluorofenil)oxirano Se disolvió (1 S)-2-bromo-1 -(4-fluorofenil)etanol (1650 g, 7.53 mol) en 6.8 L de metil ter-butil éter. Se agregó NaOH (2M, en H20; 4.93 L) mientras la mezcla está a 20 °C. Se agitó la mezcla por 3 h mientras se mantiene a 20-22 °C. Se separaron las capas y se extrajo la capa acuosa con metil ter-butil éter (1 x 2 L). Se combinaron las fases orgánicas; se lavaron las fases orgánicas con salmuera (1 x 2 L); se secaron sobre Na2S04; y filtraron; se concentró lo filtrado para dar un residuo. Se purificó mediante cromatografía en columna instantánea de gel de sílice usando una mezcla 50:1 de éter de petroleo.EtOAce para eluir el producto. Se concentraron las fracciones del producto para dar el compuesto del título como un aceite amarillo pálido (880 g, 84%). 1H NMR (300 MHz, CDCI3): 7.27-7.21 (m, 2H), 7.06-7.01 (m, 2H), 3.86 (dd, J= 2.6, 4.0 Hz, 1H), 3.16 (dd, J= 4.1, 5.5 Hz, 1H), 2.79 (dd, J= 2.6, 5.4 Hz, 1H); valor ee : 97.5% (columna AD-H 250 mm x 4.6 mm x 5 µ?t? usando 99:5 hexanos.alcohol etílico a 25 °C con una velocidad de flujo de 1.0 mL/min).

Preparación 10 (1 S)-2-(Bencilamino)-1-(4-fluorofenil)etanol Se cargó un matraz de fondo redondo de 10 L con (S)-2-(4-fluorofenil)oxirano (880 g, 6.38 mol) bajo una atmósfera de nitrógeno. Se agregó bencilamina (2047 g, 19.13 mol) mientras la mezcla se mantiene a 20 °C. Se calentó la mezcla a 80 °C y se agitó a tal temperatura por 5 h. Se enfrió a 22 °C y se agitó por 16 h. Se agregó H20 (3 L) para apagar la reacción. Se filtró y lavó la torta de filtro con agua (2 x 1 L).

Se suspendió el sólido obtenido con heptano (2 L) y se filtró para dar el compuesto del título (1216 g, 77%). S (m/z): 246 (M + 1); valor ee: 99.0 % (columna AD-H 250 mm x 4.6 mm x 5 µ?? usando 90:10 hexanos (con 0.02% de dietilamina):EtOH a 25 °C con una velocidad de flujo de 1.0 mL/min).

Preparación 11 N-Bencil-2-cloro-N-[(2S)-2-(4-fluorofenil)-2-hidroxietil]acetamida Se disolvió (1S)-2-(bencilamino)-1-(4-fluorofenil)etanol (1215 g, 4.96 mol) en 12.15 L de DCM y se enfrió la mezcla a 0 °C. Se agregó NaOH (1M en H20, 5.46 L, 5.46 mol) por goteo durante 30 min. Se agitó la mezcla vigorosamente por 10 min mientras se mantiene a 0-3 °C; después se agregó una solución de cloruro de cloroacetilo (616.5 g, 5.46 mol) en 4.86 L de DCM por goteo durante 1 h manteniendo la temperatura por debajo de 6 °C. Se agitó la mezcla por 1 h a 0 °C; se separaron las capas; y se extrajo la fase acuosa con DCM (1 x 2 L). Se combinó la capa orgánica y los extractos; se lavaron con 10% de ácido clorhídrico (1.5 L), agua (1.5 L) y 1M de NaOH (1 L). Se secaron sobre Na2S04 y se filtró. Se recolectó lo filtrado y se removió el solvente bajo presión reducida para proporcionar el compuesto del título como un aceite incoloro (1440 g, 90%). MS (m/z): 322(M+1).

Preparación 12 (6S)-4-Bencil-6-(4-fluorofenil) morfolin-3-ona Se agregó N-bencil-2-cloro-N-[(2S)-2-(4-fluorofenil)-2-hidroxietil]acetamida (1440 g, 4.48 mol) a alcohol ter-butílico (14.5 L) y se agregó ter-butóxido de potasio (753 g, 6.73 mol) en forma de porciones mientras se mantiene la mezcla a 22 °C. Se mantiene la mezcla a 22 °C y se agita por 1.5 horas. Se agregó una solución acuosa saturada de cloruro de amonio (1306 g) para apagar la reacción. Se agitó por 1 hora adicional y después se agregó H20 (2 L). Se extrajo con EtOAc (2 x 10 L); se combinaron los extractos; y se concentraron los extractos bajo presión reducida para proporcionar un residuo. Se disolvió nuevamente el residuo en EtOAc (20 L) y se lavó con H20 (10 L). Se secó la solución de EtOAc sobre Na2S04 y se filtró. Se recolectó lo filtrado y se removió el solvente bajo presión reducida para proporcionar el compuesto del título como un aceite incoloro (1250 g, 98%). MS (m/z): 286 (M + 1).

Preparación 13 (2S)-4-Bencil-2-(4-fluorofenil)morfolina Bajo una atmósfera de nitrógeno, por goteo se agregó una solución de (6S)-4-bencil-6-(4-fluorofenil) morfolin-3-ona (625 g, 2.1 9 mol) en THF (22 L) a hidruro de aluminio y litio en THF (1 M en THF, 5.0 L, 5 mol) mientras se mantiene la temperatura a 20 °C. Se calentó la mezcla a 70 °C y se agitó por 1 .5 h. Se enfrió la mezcla a 0 °C y se agregó H20 (200 mL) para apagar la reacción, seguido por NaOH acuoso (4 M, 1 .25 L), después se agregó más H20 (600 mL). Se agitó la mezcla resultante por 30 min; se filtró; y se enjuagó el sólido con EtOAc (10 L). Se recolectó lo filtrado y se concentró bajo presión reducida para proporcionar el com puesto del título (561 g, 94%). MS (m/z): 272 (M + 1 ).

Preparación 14 clorhidrato de (2S)-2-(4-fluorofenil)morfol Se disolvió (2S)-4-bencil-2-(4-fluorofenil)morfolina (948 g, 3.5 mol) en 1 ,2-dicloroetano (17 L). Se calentó la mezcla a 70 °C y se agregó cloroformiato de 1 -cloroetil (1 500 g , 1 0.5 mol) por goteo mientras se calienta. Se agitó la mezcla a 70 °C por 3 h y después se concentró la mezcla para dar un residuo. Se disolvió el residuo en MeOH (10 L) y se calentó a 70 °C mientras se agita por 1 h. Se concentró la solución bajo presión reducida para dar un residuo. Se forma en suspensión el residuo con EtOAc (5 L); se filtró; y se lavó el sólido con EtOAc (1 L) para proporcionar un sólido blancuzco. Se forma en suspensión el sólido con 10:1 EtOAc/MeOH (10:1. 3 L); se filtró; se recolectó el sólido para proporcionar el compuesto del título como un sólido blanco (300 g). Se concentró el licor madre para proporcionar material adicional. Se forma en suspensión este material con una mezcla de EtOAc/MeOH (2:1; 1 L) y se filtró para dar un adicional de 105 g del compuesto del título como un sólido blanco. Se mezclaron los lotes del producto para dar el compuesto del título (405 g, 53%). MS (m/z): 182 (M-CI). valor ee 100 % (columna AD-H 250 mm x 4.6 mm x 5 um usando 90:10 hexanos (con 0.02% DEA):alcohol etílico a 25 °C con una velocidad de flujo de 1.0 mL/min).

Preparación 15 2-Bromo-1-(2-isopropoxifenil)etanona Se disolvió 1-(2-isopropoxifenil)etanona (1.0 g, 6 mmol) en Et20 (25 mL) y se agregó bromo (0.3 mL, 6 mmol) por goteo mientras se agita la mezcla en la oscuridad a temperatura ambiente. Se lavó la mezcla de reacción con una solución acuosa saturada de Na2C03. Se secó sobre MgS04; se filtró; se recolectó lo filtrado; se removieron los volátiles bajo presión reducida para proporcionar el compuesto del título (1.5 g, 83%). MS (m/z): 258 (M + 1).

Preparación 16 4-Bencil-2-(2-cloro-4-fluoro-fenil)morfolina Se combinó ácido fórmico (98-100%; 0.30 ml_, 8 mmol) y 2-bencilaminoetanol (1.21 g, 8 mmol) y se enfrió la mezcla resultante con un baño de hielo. Se agregó 2-bromo-1-(2-cloro-4-fluoro-fenil)etanona (1.0 g, 4 mmol); se calentó la mezcla a reflujo; y se agitó a tal temperatura por 20 h. Se diluyó la mezcla con DCM y se lavó con solución acuosa saturada de Na2C03. Se secaron las fases orgánicas sobre MgS04; se filtró; se recolectó lo filtrado; y se concentró bajo presión reducida. Se purificó mediante cromatografía en columna instantánea eluyendo con un gradiente de 0-20% de metil terciario-butil éter en hexanos. Se combinaron las fracciones del producto y se removieron los solventes bajo presión reducida para dar el compuesto del título como un aceite amarillo (1.22 g, 43%). MS (m/z): 306 (M + 1).

Preparación 17 4-Bencil-2-(2-isopropoxifenil)morfolina Se preparó 4-bencil-2-(2-isopropoxifenil)morfolina esencialmente por el método de Preparación 16. S m/z 312 (M + 1).

Preparación 18 2-(6-Cloro-4-fluoro-ciclohexa-2,4-dien-1-il)morfolina Se disolvió 4-bencil-2-(2-cloro-4-fluoro-fenil)morfolina (529 mg, 1.73 mmol) en DCM (2.5 ml_). Se agregó cloroformiato de 1-cloroetilo (1.25 g, 8.65 mmol); se calentó a 80 °C; y se agitó durante la noche. Se agregó MeOH (2.5 ml_) y se agitó a 65 °C por 3 horas. Se concentró bajo presión reducida y se purificó mediante cromatografía SCX eluyendo con un gradiente de 0-100% de (2N NH3/MeOH) en MeOH. Se combinaron las fracciones del producto y se removieron los solventes bajo presión reducida para proporcionar el compuesto del título como un sólido blanco (345 mg, 92%). MS (m/z): 216(M + 1).

Preparación 19 2-(2-lsopropoxifenil)morfolina Bajo una atmósfera de nitrógeno se combinó 4-bencil-2-(2-isopropoxifenil)morfolina (0.51 g, 2 mmol), 10% de PdOH/Carbono (0.51 g, 10 mol%) y formiato de amonio anhidro (0.53 g, 10 mmol). Se calentó la mezcla resultante a reflujo y se agitó. Se monitoreó el progreso de la reacción mediante cromatografía de capa delgada. Después de la terminación, se filtró la mezcla de reacción a través de una almohadilla de Celite ®; se recolectó lo filtrado; y se removió el solvente bajo presión reducida para dar el compuesto del título como un aceite (0.25 g, 63%). MS (m/z): 433 (M+1).

Preparación 20 N-[2-[2-Bromo-1-(3-metoxifenil)etoxi]etil]-4-nitro-bencensulfonamida Se agregó óxido de etileno (11 ml_, 220 mmol) todo a la vez a DCM enfriado a 0 °C; después se agregó 1-metoxi-3-vinilbenceno (7.09 g, 52.82 mmol) mediante una jeringa. Se agitó la mezcla mientras se mantiene a 0 °C. Se agregó N-bromosuccinimida (9.4 g, 52.82 mmol) y 4-nitrobencensulfonamida (8.9 g, 44.02 mmol). Se envolvió el matraz en papel aluminio y se agitó la mezcla de reacción por 20 h mientras se mantiene a temperatura ambiente. Se concentró bajo presión reducida; se filtró; y se concentró lo filtrado bajo presión reducida para proporcionar un residuo. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna instantánea eluyendo con un gradiente 5-40% de EtOAc en hexanos. Se combinaron las fracciones del producto, y se removieron los solventes bajo presión reducida para proporcionar el compuesto del título como un aceite amarillo oscuro ( 14.22 g , 70.3%) . MS (m/z) : 459(M+ 1 ) .

Preparación 21 2-(3-Metoxifenil)-4-(4-nitrofenil)sulfonil-morfolina Se disolvió N-[2-[2-bromo-1 -(3-metoxifenil)etoxi]etil]-4-nitro- bencensulfonamida ( 14.22 g, 30.96 moles) en ACN (200 mL) ; se agregó carbonato de potasio (6.42 g, 46.44 mmol); y se calentó la mezcla a reflujo. Se agitó la mezcla por 3 h mientras se somete a reflujo. Se enfrió la mezcla resultante a temperatura ambiente y se diluyó con EtOAc. Se filtró a través de Celite ®; se concentró lo filtrado bajo presión reducida para proporcionar un residuo. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna instantánea eluyendo con un gradiente 50-80% de EtOAc en hexanos. Se combinaron las fracciones del producto y se removieron los solventes bajo presión reducida para proporcionar el compuesto del título como un sólido anaranjado (11.2 g, 95.6%). MS (m/z): 379(M + 1).

Preparación 22 2-(3-Metoxifenil)morfolina Se disolvió 2-(3-metoxifenil)-4-(4-nitrofenil)sulfonil-morfolina (11.2 g, 29.6 mmol) en ACN (150 mL) y agua (2.67 mL). Se agregó LiOH (6.21 g, 147.99 mmol) mientras se agita la mezcla y seguida por 1-propanotiol (13.42 mL, 147.99 mmol). Se agitó la mezcla por 25 h a temperatura ambiente. Se diluyó la mezcla con EtOAc y se agregó salmuera. Se extrajo dos veces con EtOAc. Se recolectaron y se concentraron los extractos a ~ 200 mL bajo presión reducida, después se lavaron tres veces con HCI 1N. Se combinaron los extractos de ácido acuosos y se agregó Na2C03 hasta que la mezcla es básica. Se extrajo la solución básica tres veces con EtOAc; se combinaron los extractos; se lavaron los extractos con salmuera; y se secó sobre Na2S04 Se filtró; se recolectó lo filtrado; y se removieron los solventes bajo presión reducida para proporcionar un residuo. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna instantánea eluyendo con EtOAc, seguido por un gradiente 5-100% de (10% 2M NH3 en MeOH)/DCM. Se combinaron las fracciones del producto, y se removieron los solventes bajo presión reducida para proporcionar el compuesto del título como un aceite amarillo (3.09 g, 15.99 mmol). MS (m/z): 194(M+1).

Preparación 23 N-[(1 R)-1-(4-Acetilfenil)etil]metansulfon amida Se cargó un tubo con N-[(1 R)-1-(4-bromofenil)etil]metansulfonamida (29 g, 104 mmol), butil vinil éter (34.23 mL, 261 mmol), acetato de paladio (II) (14.04 g, 63 mmol), bis-(1,3-difenilfosfino)propano (52.7 g, 125 mmol) y carbonato de potasio (17.3 g, 125 mmol). Se desgasificó el tubo con nitrógeno por 2 minutos, y después se agregó H20 (69.5 mL) y DMF (69.5 mL). Se selló el tubo y se agitó a 110 °C por 20 h. Se enfrió la mezcla de reacción a temperatura ambiente y se agregó HCI (2N, 60 mL). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente por 10 min. Se ajustó el pH de la mezcla a un pH de 7 usando pelotillas de NaOH; se diluyó con DCM (220 mL); se filtró a través de una almohadilla de Celite ®; y secuencialmente se lavó lo filtrado con K2C03 acuoso (2x 120 mL), salmuera (2x 100 mL), y H20 (100 mL). Se secó la mezcla sobre MgS04; se filtró; y se concentró lo filtrado bajo presión reducida para proporcionar un residuo. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna instantánea eluyendo con EtOAc en hexanos (gradiente de etapa de 0, 5, 10, 20, 30 y finalmente 40% de EtOAc). Se combinaron las fracciones del producto y se removieron los solventes bajo presión reducida para dar el compuesto del título (1 7.6 g, 70.0%) como un aceite amarillo. MS (m/z) : 242 (M + 1 ).

Preparación 24 N-[( 1 R)-1 -[4-(1 -Hidroxietil)fenil]etil]metansulfonamida, isómero 2 Se disolvió N-[( 1 R)-1 -(4-acetilfenil)etil]metansulfonamida ( 1 5 g, 62 mmol) en EtOH (1 55.4 mL) y se enfrió con un baño de hielo. Se agregó borohidruro de sodio (1 .2 g , 31 .1 mmol) y se agitó la mezcla resultante en el baño de hielo por 2 h. Se apagó la reacción con H20 (20 mL) y se concentró bajo presión reducida. Se diluyó el residuo con EtOAc (90 mL) y H20 (50 mL). Se separaron las capas y se lavó la capa orgánica con salmuera (2x 50 mL), se secó sobre MgS04; se filtró; y se concentró lo filtrado bajo presión reducida para proporcionar un residuo. Se purificó y separaron los isómeros usando condiciones de cromatografía K (véase abajo) se recolectó el segundo isómero de elución como el compuesto del título (2.01 g , 1 3%). MS (m/z): 261 (M+1 8).

Ejemplo 1 N-[(1 R)-1 -(4-{[(2S)-2-(4-Fluorofenil)morfolin-4- il]metil}fenil)etil]metansulfonamida Bajo una atmósfera de nitrógeno, se suspendió clorhidrato de (2S)-2-(4-fluorofenil)morfolina (29.5 g, 128.8 mmol) en DCM (1 7 L) a 22 "C y se agregó trietilamina (35.89 ml_, 257.5 mmol). Se agregó N-[(1 R)-1 -(4-formilfenil)etil]metansulfonamida (29.26 g, 128.8 mmol) y se agitó la solución resultante por 30 min. Se agregó ácido acético (8.85 mL, 1 54.5 mmol), después triacetoxiborohidruro de sodio (86.17 g , 386.3 mmol) en forma de porciones en 3 lotes. Se agitó por 3 h; se monitoreó la reacción mediante LCMS hasta la terminación . Se apagó la reacción mediante la adición lenta de una solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio (259.31 mL) para dar una solución con un pH de 8. Se separaron las capas, y se extrajo la capa acuosa con 200 mL DCM. Se combinaron las capas orgánicas, se lavaron con bicarbonato de sodio saturado, agua, salmuera, y después se secaron sobre MgS04. Se filtró; se recolectó lo filtrado; y se concentró para dar un residuo. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna instantánea de gel de sílice, usando un gradiente de 1 00% de DCM a DCM: MeOH (95: 5). Se combinaron las fracciones del producto, y se concentró para proporcionar el producto del título como un aceite amarillo viscoso (41 g, 81.13 %). MS (m/z): 393 (M+1) Ejemplo 2 Maleato de N-[(1 R)-1 -(4-{[(2S)-2-(4-Fluorofenil)morfolin-4- il]metil}fenil)etil]metansulfonamida Método 1 : Se disolvió N-[(1R)-1-(4-{[(2S)-2-(4-fluorofenil)morfolin-4-il]metil}fenil)etil]metansulfonamida (250.47 mg) en EtOAc (10 ml_). Se agregó ácido maleico (85 mg) se disolvió en EtOAc (2 mL) a 60 °C. Se enfrió a temperatura ambiente y se agitó la mezcla por 30 min. Se filtró la suspensión y se enjuagó con EtOAc (5 mL). Se recolectó y se secó la torta de filtro bajo presión reducida para proporcionar el compuesto del título como un sólido (280 mg, 97.7%). MS (m/z): 393 (M-ácido maleico+1 ).

Método 2: Se disolvió N-[(1R)-1-(4-{[(2S)-2-(4-fluorofenil)morfolin-4-il]metil}fenil)etil]metansulfonamida (270 g) en EtOAc (10 L). Se calentó la mezcla a 60 °C y se agregó ácido maleico (96 g, 1.1 eq) en EtOAc (2.8L). La mezcla se dejó enfriar a temperatura ambiente y se agitó la mezcla resultante por 14 h. Se filtró la suspensión; se enjuagó el sólido con EtOAc (5L); y se secó la torta de filtro bajo presión reducida. Se disolvió el sólido en 5 volúmenes de EtOH (1.4L); se calentó a 90°C; y se agregó agua (280 mL). Se calentó la mezcla a 90 °C por 1h, y después se enfrió a temperatura ambiente durante la noche. Se filtró lo precipitado, se secó en un horno a vacío a 40 °C para proporcionar el compuesto del título como un sólido blanco (256 g, 70%). MS (miz): 393 ( -ácido maleico+1).

Ejemplo 3 Clorhidrato de N-[(1 R)-1 -(4-{[(2S)-2-(4-fluorofenil)morfolin-4- il]metil}fenil)etil]metansulfonamida disolvió N-[(1R)-1-(4-{[(2S)-2-(4-fluorofenil)morfolin-4-il]metil}fenil)etil]metansulfonamida (50 g, 127.39 mmol) en alcohol isopropílico (200 mL). Se agregó HCI (4M en dioxanos; 63.70 mL, 254.78 mmol) por goteo a la solución y se agitó a temperatura ambiente por 50 min. Se removieron los volátiles bajo presión reducida; se agregó H20 (200 mL); después se evaporó el agua. Se agregó H20 (200 mL) y alcohol isopropílico (100 mL), y se concentró a un volumen total de 80 mL. Se filtró la suspensión viscosa resultante; se lavó el sólido con H20; se recolectó por filtración; y se secó la torta de filtro bajo presión reducida a 55 °C para proporcionar el compuesto del título como un sólido blanco (40.6 g , 75%). MS (m/z): 393 (M-CI) .

Ejemplo 4 Clorhidrato de N-[( 1 R)-1 -(4-{1 -[(2S)2-(4-fluorofenil)morfolin-4- il]etil}fenil)etil]metansulfonamida, Isómero 1 ABS Se prep Isómero 1 N-[( 1 R)-1 -(4-{1 -[2-(4-fluorofenil)morfolin-4-il]etil}fenil)etil]metansulfonamida, isómero 1 esencialmente por el método del Ejemplo 3. MS (m/z) 407 (M-CI).

Ejemplo 5 Clorhidrato de N-[(1 S)-1 -(4-{[2-(2-clorofenil)morfolin-4-il]metil}fenil)- 2,2,2-trifluoroetil]metansulfonamida, Isómero 2 Se combinó 2-(2-clorofenil)morfolina, sal de ácido oxálico (200 mg, 0.696 mmol), trietilamina (193 pL, 1.39 mmol), N-[(1 S)-2,2,2-trifluoro-1 -(4-formilfenil)-etil]-metansulfonamida (205.3 mg, 0.73 mmol) y DCM (15 mL). Se agregó ácido acético (47.8 µ?, 0.83 mmol) y triacetoxiborohidruro de sodio (465 mg, 2.09 mmol), y se agitó por 5 h a temperatura ambiente. Se ajustó el pH de la mezcla a 10 con una solución acuosa saturada de NaHC03. Se agitó hasta que el desprendimiento del gas cesó; se separaron las capas; y se extrajo la capa acuosa dos veces con DCM. Se combinaron los extractos orgánicos; se lavaron con salmuera; y se secaron sobre MgS04. Se filtró la mezcla; se recolectó lo filtrado; y se concentró bajo presión reducida para dar un residuo. El residuo se purificó en un cartucho de 10 g de SCX, se lavó el cartucho con DCM, 50% de MeOH/DCM, 100% de MeOH, después se eluyó con NH3 en MeOH (2N). Se concentraron las fracciones del producto bajo presión reducida para proporcionar el producto crudo como un aceite. Se purificó el aceite mediante HPLC quiral, usando condiciones E (véase abajo) para proporcionar la base libre (104 mg, 32.3%) como el segundo isómero de elución. Se disolvió la base libre (104 mg, 0.224 mmol) en 1 mL de DCM y se agregó HCI en Et20 (2 M, 561.6 pL, 1.12 mmol) por goteo. Se agitó a temperatura ambiente por 5 minutos y después se removieron los solventes bajo presión reducida para dar el compuesto del título (99 mg, 88.2%). MS (m/z): 463(M-CI).

Los siguientes compuestos se prepararon esencialmente por el método del Ejemplo 5. Todos los siguientes Ejemplos en la Tabla 1 son aislados como isómeros individuales ya sea partiendo de materiales de partida quirales y/o usando las columnas cromatográficas y condiciones identificadas abajo. La separación puede ser realizada con la base libre o con su forma de sal.

Tabla 1 Ejemplo 17 N-[(1R)-1-[4-[1-[(2S)2-(4-Fluorofenil)morfolin-4- ¡l]etil]fenil]et¡l]metansulfonamida, Isómero 1 ABS Se combinó N-[(1R)-1-[4-(1-hidroxietil)fenil]etil]- metansulfonamida isómero 2 (420 mg, 1.73 mmol) y DCM (5 mL). Se enfrió la mezcla a 0 °C y se purgó con nitrógeno. Se agregó bromuro de acetilo (295.8 µ?_, 3.45 mmol) y se agitó la reacción por 10 min mientras se mantiene a 0 °C. Se agregó una cantidad adicional de bromuro de acetilo (519.5 µ?_, 6.90 mmol) y se agitó por unos 10 minutos adicionales. Se diluyó la reacción con DCM, y los solventes se evaporaron bajo presión reducida para proporcionar un residuo. Se disolvió el residuo en DMF (2 mL) y se agregó clorhidrato de (2S)-2-(4-fluorofenil)morfolina (71.1 mg, 0.327 mmol), K2C03 (135.4 mg, 0.980 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Se filtró la reacción, y se purificó lo filtrado usando cromatografía SCX con un orden de elución de DCM, DCM/MeOH (1:1), MeOH, y finalmente 2M de NH3/MeOH. Se combinaron las fracciones del producto y se removieron los solventes bajo presión reducida para proporcionar un residuo. El residuo se purificó mediante HPLC de fase inversa (columna XTerra MS C18, pH 8) se recolectó el primer isómero de elución (isómero 1) como el compuesto del título (9.6 mg, 7.2%). MS (miz): 407 (M + 1).

Condiciones de cromatografía: Tabla 2 Ensayo Inhibidor de MOGAT-2 Se evaluó la actividad inhibidora in vitro de compuestos contra MOGAT-2 humano en este ensayo. MOGAT-2 transfiere un grupo oleoilo a monooleoilo-glicerol ("MAG") de oleoil-CoA para formar dioleoil-glicerol ("DAG") en la trayectoria de re-síntesis de triglicéridos intestinales. El ensayo toma ventaja de extracción Microscint, estas moléculas hidrofóbicas se extraen selectivamente sobre unas hidrofílicas para separar el 14C-oleoil-CoA de 14C-DAG.

Se diseñaron por ingeniería genética células SF9 de insecto que expresan MOGAT-2 humano. Se preparó Usado celular en 20 mM de NaCI con inhibidor de proteasa (Roche Cat# 11873580001). Se homogenizaron las células SF9 que expresan MOGAT-2 humano a 15,000 rpm ó 20x2 segundos (PT-3100 Polytrone). Se centrifugó lo homogenado a 1000 g por 10 minutos a 4°C. Se recolectó lo sobrenadante en un tubo separado para cuantificación de proteína y prueba de actividad. Se purificó el sustrato de monooleato de glicerol (Spectrum Chemical, CAS#25496-72-4) cromatográficamente. Se preparó el sustrato de monoacilglicerol (MAG) en vesículas de fosfolípidos (dioleoil fosfatidilcolina "DOPC"). Se prepararon las vesículas MAG/DOPC a concentración 20 mM de lípidos totales (MAG y DOPC). Se prepararon diferentes proporciones molares de MAG a lípidos totales ya sea para selección de compuesto (8.9%) o estudios cinéticos del compuesto (2.6-40%). Se mezcló la cantidad apropiada de MAG y DOPC purificados (Avanti Polar Lipids # 850375C) en cloroformo en un tubo de vidrio. Secuencialmente, se evaporó el cloroformo bajo 4 una corriente de gas N2 y entonces se secó bajo presión reducida por 30 minutos. Se agregó una cantidad apropiada de amortiguador (Tris-CI pH 7.4, 250 m sacarosa, 1 mM EDTA) a la mezcla MAG/DOPC seca para la concentración de lípido total deseada. Se sónico la solución MAG/DOPC hasta que la solución fue clara. Se midió el tamaño de vesícula usando dispersión de luz dinámica para confirmar uniformidad.

El amortiguador de ensayo consiste de Tris 100 mM, pH 7.5 (Invitrogen 15567-022), DMSO al 11%, sacarosa 250 mM (Sigma S-0389), EDTA 1 mM, y Coctel de Inhibidor de Proteasa completo (Roche Diagnostic 12454800). Se agregaron los compuestos de prueba al amortiguador junto con los sustratos y enzimas. La concentración final para la reacción es 0.016 mg/ml de extracto de célula SF9, oleoil-CoA 20 µ? (3.5 µ? 1 C-oleoil-CoA), lípido total 1.26 mM en la forma de vesículas sonicadas, compuestas de 8.9:91.1 (relación molar) MAG:DOPC. Se detuvo la reacción después de 90 minutos de incubación a temperatura ambiente agregando AESSM (12.5% de EtOH desnaturalizado al 100%; H20 DI al 11%; NaOH 1.0N al 2.5%; Isopropanol a 59% (Mallinckrodt 3031-08); Heptano a 15% (Omni Solv HX0078)), en volumen. Se agregó Microscint E y después se sellaron las placas y se cuantificó en un contador de escintilación después de al menos 4 horas de equilibrio a temperatura ambiente. Se calculó el IC50 (concentración para alcanzar la inhibición máxima media) usando el software Excel Fit (versión 4; Se analizaron los datos usando una ecuación logística no lineal de 4 parámetros (ABase Equation 205)) representando la concentración contra actividad MOGAT-2 relativa.

Todos los compuestos ejemplificados en la presente exhiben una IC50 de menos de 100 nM, y el Ejemplo 2 exhibe una IC50 de 12 nM en este ensayo ¡n vitro de MOGAT-2.

Actividad Inhibidora en Ensayo de Célula MOGAT-2 Se evaluó la actividad inhibidora de compuestos contra MOGAT-2 humano en un ambiente celular en este ensayo. Caco-2 es una línea celular de carcinoma de colon humano y es a menudo usada como modelo para células epiteliales intestinales. Caco-2 no expresa MOGAT-2, y, así, MOGAT-2 humano es diseñado por ingeniería en una línea celular a través de una transfección estable. Un análogo de MAG, 2-O-Hexadecilglicerol (HDG), se utiliza para detectar actividad de MOGAT-2 celular, porque HDG no se hidroliza y el producto resultante es fácilmente monitoreado por espectrometría de masa. El sustrato se suministra a las células usándolo como una mezcla con DOPC en la forma de vesículas sonicadas.

Se sembraron las células Caco2 en discos de 100 mm para ser confluentes al 80% después de 24 horas en medio completo (DMEM 3/1: F12 + FBS 10% + HEPES 20mM + gentamicina). Se transfectaron las células con plásmido hMOGAT-2 (MOGAT-2-pCDNA3.1-Hygro) usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen). Después de unas 6 horas de exposición a la mezcla de transfectación, se lavaron las células tres veces en PBS y después se agregó el medio. Se incubaron las células por unas 18 horas adicionales de incubación, las células se tripsinizaron y se diluyeron en serie en discos de 100 mm. Se agregó medio completo + 400 g/ml de higromicina y se incubó hasta que aparecieron clones. Se aislaron y transfirieron los clones en discos de 24 cavidades y se hicieron crecer a confluencia. Se prepararon los RNAs de estos clones usando un kit RNAeasy Qiagen. Se realizó el análisis Taqman usando un ensayo inventariado ABI (HS00228262) en un Sistema de Detección de Secuencia 900 (ABI). Se analizaron los lisados de estos clones por análisis de manchado Western usando un anticuerpo policlonal de cabra (Santa Cruz, SC-32392 para confirmar la expresión de MOGAT-2 humano de una proteína 38 kD que corresponde a MOGAT-2.

Se mezclaron 2-O-hexadecilglicerol ("HDG", Biosynth Chemistry & Biology, # H-1806, 562.7 µ? de 20 mg/ml) y DOPC (14.3 mi de 20 mg/ml) en cloroformo en un tubo de vidrio; primero se secó bajo gas N2; y después bajo presión reducida por 30 minutos adicionales. Se agregó 20 mi de amortiguador (Tris-CI 150 mM, pH 7.4, sacarosa 250 mM, EDTA 1 mM) a la mezcla HDG/DOPC seca mientras se somete a sonicación hasta que la solución llega a ser clara. Se colocaron las células Caco2 en una placa de 96 cavidades revestidas de poli-D-lisina (la "Placa Celular") a 37°C, C02 al 5% durante la noche. Se removió el medio de crecimiento y se pretrataron las células con el compuesto de prueba en medio DMEMF12 (3:1) (GIBCO 93-0152DK) que contiene BSA al 2% (Sigma) por 30 minutos. Se trataron las células con un compuesto de prueba en medio DMEMF12 BSA al 2% (3:1) que contiene 40 µ? de ácido oleico y 800 µ? de 8.9:91.9 (relación molar) HDG/DOPC por 4 horas. Se tripsinizaron las células con 50 µ? de solución de tripsina y se agregó 50 µ? de PBS. Inmediatamente se congelaron las células en hielo seco y se almacenaron a -20°C para análisis LC-MS. Se extrajeron las células con cloroformo/metano como sigue: se transfirieron las células a una placa de 2 mi; se lavó la placa celular con 200 µ? de metanol y después se transfirió lo lavado con metanol a la placa de 2 mi; se lavó la placa celular nuevamente con 200 µ? de PBS y se transfirió lo lavado con PBS a la placa de 2 mi. Se agregó cloroformo (400 µ?) con DAG estándar interno (19.52 ng/ml) (15:0,15:0 (Sigma)), D5-TAG (39.03 ng/mL) CDN (16,16,16) a la placa de 2 mi. Se giró la Placa sellada de 2 ml_ arriba y abajo (10x), después sometió a vórtices y centrifugación. Se removieron 400 µ?_ de la capa inferior de la placa de 2 mi y se agregaron a las cavidades de otra placa la "Placa Final". Se agregó CHCI3:MeOH (400 µ? 2:1) A la placa de 2 mi. Nuevamente se giró I aplaca sellada de 2 ml_ arriba y abajo (10x), sometió a vórtices y centrifugó. Se removieron 220 il de la capa inferior de la placa de 2 mi y se agregaron a la Placa Final. Se secó la Placa Final y reconstituyó con 500 ml_ de IPA. Se selló la Placa Final y sacudió por 5 min. Se inyectaron 10 µ? de una muestra de la Placa Final sobre una columna Halo C8 (2.1 x 50, 2.7 uL de tamaño de partícula) se mantuvo a 60°C usando un automuestreador Leap con un bucle de 10 µ?_, se sometió a interfaz con un sistema de suministro de solvente Shimadzu. Se monitorearon los canales para recolectar datos para el estándar interno D5 C16 TAG así como también el TAG de éter, y C52 y TAGSs C54 naturales. El Solvente A es 80/20 de H20/Metanol con 20 µ? de acetato de amonio. El Solvente B es 50/50 de IPA/THF con 20 µ? de acetato de amonio. La velocidad de flujo es 0.4 mL/min. Los solventes de lavado fueron H20/MeOH y DCM. Usando software Xcali bur se extrajeron las áreas de los picos de interés, y exportaron los datos a Excel el cual usa la siguiente fórmula : (área de TAG de éter/área de TAG natural C54)/Área de I S . Esta relación efectivamente se considera para varianza del número de células en cada una de las cavidades . Los resultados para este ensayo a base de cél ulas MOGAT-2 se proporcionan abajo en la Tabla 6. Los resultados del ensayo a base de células MOGAT-2 demuestran que los Ejemplos listados en la Tabla 6 inhiben las MOGAT-2 humanas en el ambiente celular.

Tabla 3 Efectos Farmacológicos en Modelo de Bolo de Aceite en Perro La i nhibición de MOGAT-2 encontrada en el intesti no delgado puede ser útil para tratar hipertrig liceridem ia causada por absorción de grasa excesiva. Para evaluar la capacidad de los com puestos ejempl ificados para inhibir la absorción de TAG , vei ntiún Beag les macho (n=7 por grupo de tratamiento) son enrolados para cada 4 estudio, cada perro seleccionado por tener un peso corporal entre 9-13 kg. Se alojaron perros en las jaulas en un ciclo de luz estándar (12 horas de luz y 12 horas de oscuridad); a temperatura ambiente: 72 ± 8°F; y a 30% - 70% de humedad relativa. Se ayunaron los perros por 16 horas previo al inicio del estudio, después se dosificaron los perros ayunados con vehículo (1% HEC, 0.25%, Tween 80, Antiespuma) o uno de los compuestos de prueba en tal vehículo. Se sangraron los perros una hora después de la dosificación, (0.5 mi de la vena yugular) para una muestra de tiempo 0. Se dosificaron los perros con aceite de oliva (Sigma Catálogo*: 0-1514, 5 ml/kg) inmediatamente después de la recolección de la muestra al tiempo 9. Se recolectaron las muestras en un tubo de EDTA con hielo a 1.5, 2, 3, 5, 7, y 9 hrs post dosificación del compuesto/vehículo. Se centrifugaron las muestras a 9000 cpm por 15 min y analizaron (Roche Cat. no. 1877771) para triglicéridos totales en plasma usando un Roche Hitachi 917. Para medición de TAG18.1_18.1_18.1 en plasma, se extrajeron las muestras y realizó análisis de LC/MS/MS de manera similar a aquel descrito en el Ensayo de Células MOGAT-2 usando 10 µ? de plasma/.

El analito es el ión [M + NH4]+ de TAG 18:1 18:1 18:1, el cual tiene una masa de 902.8 m/z; el estándar interno es D5 TAG 16:0 16:0 16:0, el cual tiene una masa de 829.8 m/z. Se reportó la relación de cambios del fragmento de ión 603.5 m/z de 902.8 m/z (TAG 18:1 18:1 18:1) y el fragmento de ión de 556.5 m/z de 829.8 m/z (D5 TAG 16:0 16:0 16:0 de estándar interno) en cantidad relativa de TAG 18:1 18:1 18:1. Se calculó el AUC de TAG de plasma neto del AUG de TAG total menos el AUC de TAG de línea base usando Graphpad Prism4: (Net AUCTAG = bolo de aceite post AUCTAG - AUCTAG a 0 horas). El porcentaje de inhibición de triglicéridos en plasma se calcula como sigue: el (media del grupo de bolo de aceite de AUC de TAG neto - media del grupo de bolo de aceite de AUG de TAG neto con tratamiento con compuesto/media de grupo de bolo de aceite de TAG AUC neto) * 100. Los análisis estadísticos finales usan el método de Dunnett de Anova de una Forma para comparación con el control. Todos los valores de AUG de TAG neto son transformados a AUC promediado clasificado por comparación para limitar la variabilidad dentro de los estudios. La capacidad de los compuestos ejemplificados de la presente invención para inhibir la actividad de MOGAT-2 y reducir la absorción de TAG in vivo puede ser además evaluada de conformidad con este ensayo.

El Ejemplo 2 se evaluó en este modelo en tres estudios a 30 mg/kg de dosis y en dos estudios a la dosis de 75 mg/kg. La combinación de resultados a partir de estos estudios demuestra reducción estadísticamente significante (p< 0.05) en la excursión de triglicéridos postprandiales. Los resultados fueron como sigue: 43% de inhibición de absorción de TAG (45% de 18.1 de TAG) a 30 mg/kg de PO y 64% de inhibición de absorción TAG (63% de 18.1 de TAG) a 75 mg/kg de PO.

El compuesto ejemplificado de la presente invención puede ser fácilmente formulado en composiciones farmacéuticas de conformidad con prácticas aceptadas tales como las encontradas en Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co. Easton Pa. 1990. Un especialista tratante u otra persona médica será capaz de determinar una cantidad efectiva del compuesto para tratamiento de una persona en necesidad, particularmente para el tratamiento de hipertrigliceridemia. Composiciones farmacéuticas preferidas pueden ser formuladas como una tableta o cápsula para administración oral. La tableta o cápsula pueden incluir un compuesto de la presente invención en una cantidad efectiva para tratar un paciente en necesidad del tratamiento.

Claims (19)

1. REIVINDICACIONES Un compuesto de la fórmula siguiente: caracterizado porque RR11 ssee sseelleecccciioonnaa aa p paarrttir de: -CH3 y -CF3; R2 se selecciona a part r de: H y -CH3¡ R3 se selecciona a part r de: H y -CH3; R4 se selecciona a part r de: H, -Oalquilo C1 -3, y halógeno; R5 se selecciona a part r de: H , -CF3, -OCH3, y halógeno; RR66 ssee sseelleecccciioonnaa aa ppaarrttir de: H y halógeno; siempre que al menos uno de R4, R5, y R6 sea H ; o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.
2. 2. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque R1 es -CH3.
3. 3. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque R 1 es -CF3.
4. 4. Un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque R2 es H .
5. 5. Un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque R3 es H .
6. 6. Un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque R4 se selecciona a partir de H y halógeno.
7. 7. Un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque R5 se selecciona a partir de: H, -CF3, F, y Cl.
8. 8. Un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque R5 es H.
9. 9. Un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque R6 es F.
10. 10. Un compuesto caracterizado porque es de la fórmula siguiente: o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.
11. 11. Un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la sal farmacéuticamente aceptable se selecciona a partir de: una sal de cloruro y una sal de maleato.
12. 12. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la sal farmacéuticamente aceptable es una sal de maleato.
13. 13. Un compuesto caracterizado porque es clorhidrato de N-[(1R)-1-(4-{[(2S)-2-(4-Fluorofenil)morfolin-4-¡l]metil}fenil)etil]metansulfonamida.
14. 14. Un compuesto caracterizado porque es ácido maleico de N-[(1 R)-1-(4-{[(2S)-2-(4-Fluorofenil)morfolin-4-il]metil}fenil)etil]metansulfonamida.
15. 15. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 y al menos uno de un portador, diluyente, o excipiente farmacéuticamente aceptable.
16. 16. Un método para tratar un paciente en necesidad de tratamiento por hipertrigliceridemia, caracterizado porque el método comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de un compuesto, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.
17. 17. Un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para uso en terapia.
18. 18. Un compuesto, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para uso en el tratamiento de hipertrigliceridemia.
19. 19. Uso de un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la manufactura de un medicamento para tratar hipertrigliceridemia.