MX2013013534A - Uso de anticuerpos anti-cgrp o anti-cgrp o fragmentos d anticuerpo para tratar o prevenir formas cronicas y agudas de diarrea. - Google Patents

Abstract

La presente invención se dirige a métodos para tratar diarrea, en formas tanto crónicas como agudas, mediante la administración de una cantidad terapéuticamente o profilácticamente de anticuerpos y fragmentos de los mismos que tienen especificidad de enlace para CGRP. En particular los métodos previenen o reducen la diarrea en condiciones o tratamientos que dan por resultado niveles de CGRP elevados, por ejemplo, en el tracto GI (colon) que están asociados con la diarrea y/o excreción inadecuada de electrolitos y fluidos del sistema intestinal o urinario. Más específicamente, esta invención se relaciona a tratamientos utilizando los anticuerpos anti-CGRP y fragmentos descritos en la presente, y fragmentos de enlace de los mismos.

Description

USO DE ANTICUERPOS ANTI-CGRP O ANT -CGRP-R O FRAGMENTOS DE ANTICUERPO PARA TRATAR O PREVENIR FORMAS CRÓNICAS Y AGUDAS DE DIARREA SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional EEUU No. 61/496.873 (Atty. Docket No. 67858.770000) presentada el 14 de junio de 2011, titulada "USO DE ANTICUERPOS ANTI-CGRP Y FRAGMENTOS DE DICHOS ANTICUERPOS PARA TRATAR LA DIARREA EN PACIENTES CON ENFERMEDADES O TRATAMIENTOS QUE RESULTAN EN ELEVADOS NIVELES DE CGRP" Y Solicitud Provisional EEUU No. 61/488.660 (Atty. Docket No. 67858.730300) presentada el 20 de mayo de 2011, titulada "COMPOSICIONES ANTI-CGRP Y USO DE LAS MISMAS" ambas de las cuales se incorporan totalmente por referencia en la presente memoria.

La presente solicitud contiene un Listado de Secuencia que ha sido presentado en formato ASCII via EFS-Web el cual se incorpora totalmente por referencia en la presente memoria. Dica copia ASCII, creada el 18 de mayo de 2012, se denomina 67858o730304.txt y es de tamaño 203.920 bytes.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Terreno de la invención Esta invención concierne el descubrimiento de que los polipéptidos que se unen a CGRP o al receptor de CGRP y/o otros polipéptidos que inhiben la interacción entre CGRP y el receptor de CGRP, tales como anticuerpos anti-CGRP o antireceptor de CGRP y fragmentos de dichos anticuerpos o fragmentos de CGRP o del receptor de CGRP que inhiben la interacción entre CGRP y el receptor de CGRP pueden ser usados para tratar o prevenir la diarrea, especialmente diarrea asociada a estados o tratamientos que producen aumentos en el nivel de CGRP. Estados y tratamientos involucrando aumentos en CGRP se ejemplifican en la presente memoria. La invención se relaciona particularmente con los métodos para inhibir, prevenir o tratar la diarrea y/o mantener el equilibrio de electrolitos y los niveles de fluidos en el colon de un paciente que padece un estado o tratamiento asociado con niveles aumentados de CGRP que provocan diarrea y/o aumento de flujo de electrolitos y fluidos del colon, y que comprende la administración de una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-CGRP o fragmento de anticuerpo anti-CGRP. Los estados ejemplificados incluyen, por ejemplo, trastorno funcional del intestino y enfermedades inflamatorias del intestino, infecciones bacterianas o virales, y más específicamente reflujo gastro-esofágico, dispepsia, síndrome del intestino irritable, síndrome de dolor abdominal funcional, diverticulosis y diverticulitis, enfermedad de Crohn, ileitis, colitis colagenosa, colitis linfocítica, colitis ulcerativa, cánceres o tratamientos para el cáncer asociados con aumento de CGRP y diarrea, tales come quimioterapia, radiación, carcinoma medular tiroidea y cáncer colorrectal .

Además la presente invención proporciona métodos para detectar polipéptidos tales como anticuerpos anti-CGRP o anti-receptor de CGRP o fragmentos de dichos anticuerpos (incluyendo fragmentos Fab) que se unan específicamente con el Péptido Relacionado con el Gen de la Calcitonina (en adelante "CGRP" por su acrónimo en inglés) , como también para detectar fragmentos de CGRP o de un receptor de CGRP en modelos animales para determinar los efectos in vivo de los mismos, particularmente su capacidad para actuar como antagonistas de los efectos secundarios adversos de CGRP y para tratar estados que involucran excesos de CGRP, especialmente estados o tratamientos asociados al CGRP relacionados con la diarrea. La invención también concierne métodos para detectar enfermedades y trastornos asociados a un incremento de CGRP, que están asociados con la diarrea y regímenes terapéuticos específicos para prevenir o tratar las enfermedades y trastornos que involucran diarrea asociada a CGRP mediante la administración de dichos anticuerpos o fragmentos de dichos anticuerpos, solos o asociados a otras sustancias activas.

Descripción de técnicas relacionadas El Péptido Relacionado con el Gen de la Calcitonina (CGRP) se produce como un neuropéptido multifuncional de 37 amino ácidos de largo. Dos formas de CGRP, el CGRP-alfa y el CGRP-beta, existen en humanos y poseen actividades similares. CGRP-alfa y CGRP-beta difieren en tres de sus amino ácidos en humanos, y son productos de distintos genes. La familia de péptidos CGRP incluye amilina, adrenodedulina y calcitonina, aunque cada una de éstos poseen distintos receptores y actividades biológicas. Doods, H., Curr. Op. Invest. Drugs, 2(9):1261-68 (2001).

El CGRP es liberado de numerosos tejidos tales como los nervios trigéminos, los cuales cuando son activados liberan neuropéptidos dentro de las meninges, mediando así la inflamación neurogénica que se caracteriza por vasodilatación, pérdida de liquido de los vasos sanguíneos, y degranulación de los mastocitos. Durham, P.L., New Eng. J. Med., 350 (11) .1073-75 (2004). Los efectos biológicos de CGRP son mediados a través del receptor de CGRP (CGRP-R) , que consiste en un componente de siete dominios trans-membrana que funciona en conjunto con la proteina de membrana asociada al receptor (RAMP por su sigla en inglés) . Además el CGRP-R requiere la actividad de la proteina componente del receptor (RCP por su sigla en inglés), el cual es imprescindible para lograr un acoplamiento eficiente al adenilato ciclasa a través de las proteínas G y la producción de cAMP. Doods, H., Curr. Op. Invest. Drugs, 2(9): 1261-68 (2001).

Las migrañas o jaquecas son trastornos neurovasculares que afectan aproximadamente al 10% de la población adulta en los EEUU, y que se acompañan típicamente de intensas cefaleas (dolores de cabeza) . Aproximadamente 20-30% de pacientes que padecen migraña experimentan un aura, que comprende fenómenos neurológicos focales que preceden y/o acompañan el episodio. Se cree que CGRP desempeña un papel destacado en la el desarrollo de las migrañas. Por ejemplo, se determinó que las concentraciones plasmáticas de CGRP en la vena yugular estaban elevadas durante la fase de dolor de cabeza de las migrañas, mientras que esto no ocurría con otros neuropéptidos . Además, según Arulmozhi et al, se ha identificado lo siguiente en pacientes que sufren migrañas: (1) una fuerte correlación entre concentraciones plasmáticas de CGRP y las migrañas: (2) la infusión de CGRP produjo una cefalea parecida a la migraña: (3) los niveles de base de CGRP se encontraban elevadas; y (4) durante los ataques de migraña hubo una correlación significativa entre los cambios en los niveles plasmáticos de CGRP y la intensidad de la cefalea. Arulmozhi, D.K., et al., Vas. Pharma., 43: 176-187 (2005) . Además, en la publicación elecrónica online del 6 de junio de 2011 en Journal of the International Association for the Study of Pain PII : S0304-3959 ( 11 ) 00313-7 ; doi : 10.1016/j . pain.2011.04.033 , Hou et al. reportaron que la expresión en queratinocitos del CGRP ß tiene repercusiones en los mecanismos de dolor neuropatológicos e inflamatorios.

Un tratamiento efectivo para las migrañas es la administración de triptanos, que son un grupo de fármacos cuyas estructuras se basan en la de la triptamina, y que incluye al sumatriptano y al rizatriptan. Los integrantes de este grupo de fármacos tienen afinidad para una serie de receptores de serotonina, incluyendo 5-HTiB, 5-HTiD y 5-HTiF. Los integrantes de esta familia de fármacos contraen selectivamente a los vasos cerebrales, pero también tienen efectos vasoconstrictores en los vasos coronarios. Durham, P.L., New Eng. J. Med. , 350 (11) .1073-75 (2004) . Existe un riesgo teórico de que ocurra un espasmo coronario luego de administrar triptanos a pacientes con enfermedad cardiaca establecida, y en rara ocasión pueden ocurrir episodios cardiacos luego de tomar triptanos. Se observa que quedan contraindicados para pacientes que sufren enfermedad coronaria vascular.

Asimismo, el dolor puede frecuentemente ser manejado mediante la administración de ciertos narcóticos (tranquilizantes) o fármacos antiinflamatorios no esteroideos (NSAIDs por su sigla en inglés) . Sin embargo, la administración de estos tratamientos puede conllevar el costo de tener ciertas consecuencias negativas. Los NSAIDs poseen la capacidad de causar insuficiencia renal, hemorragia intestinal y disfunción hepática. Los narcóticos poseen la capacidad de causar náuseas, vómitos, funcionamiento cognitivo alterado y adicción. Por lo tanto es deseable identificar tratamientos alternativos para el dolor para evitar algunas de estas consecuencias negativas.

Se cree que CGRP desempeña un papel en un alto número de enfermedades y trastornos, incluyendo pero sin limitarse a las migrañas, las cefaleas y el dolor. Dado el involucramiento percibido de CGRP en estas enfermedades y trastornos, continúa siendo necesario en la técnica desarrollar composiciones y métodos útiles para prevenir o tratar enfermedades y trastornos asociados con CGRP que eviten a la vez efectos secundarios adversos. Especialment continúa siendo necesario en la técnica desarrollar composición y métodos que reduzcan o inhiban las enfermedades o trastornos asociados a CGRP, tales como las migrapas, las cefaleas y el dolor.

Aparte de los estados arriba mencionados, existe la necesidad de tratar otros estados o efector secundarios adversos asociados con el aumento de concentraciones de CGRP. En este sentido se ha reportado evidencia anecdótica en la literatura que sugiere que los aumentos de concentraciones de CGRP pueden desempeñar un papel en algunas enfermedades asociadas con la diarrea. Por ejemplo, Rolston et al. reportaron en Digestive Diseases and Sciences, (April 1989) 3 (4): 612-6, "Intravenous calcitonin gene-related peptide stimulates net water secretion in rat colon in vivo" (Infusión intravenosa de péptido relacionado con el gen de calcitonina estimula secreción neta de agua del colon de rata in vivo) que péptido relacionado con el gen de calcitonina exógeno tiene un efecto sobre el flujo neto de agua y electrolitos en el colon e intestino delgado de rata. Reportaron que en bucles intestinales ligados, la administración de CGRP intravenosa indujo secreción de fluido colónico pero no tuvo ningún efecto en el intestino delgado. También reportaron, usando una técnica de perfusión de una sola pasada, que observaron secreción de agua dosis-dependiente e inmediata en colon de rata cuando administraron CGRP intravenosamente, y también que las secreciones netas de sodio, potasio y cloruro aumentaron. Sugirieron las repercusiones de estas observaciones para el posible involucramiento de altas concentraciones plasmáticas de CGRP en el síndrome de diarrea acuosa que acompaña el carcinoma medular tiroideo.

Además. Keates et al. reportaron en Gastroenterology 114:956-64(1998), "CGRP Upregulation in dorsal root ganglia and ilea mucosa during Clostridium difficile toxin A-induced enteritis in mice" (Regulación a la alza de CGRP en ganglios de las raíces dorsales y mucosa ileal durante enterities inducida por la toxina A de Clostridium difficile en ratones) que CGRP puede desempeñar un papel en la diarrea mediada por la toxina A y que un antagonista de CGRP inhibió sustancialmente a la diarrea e inflamación mediada por la toxina A. [00013] Además, Picard et al. reportaron en International Journal of Radiation Biology , (2001), Vol. 77, No. 3, pp. 349-356, "Presence of protective role of afferent nerves in early intestinal mucosal alterations induced by abdominal irradiation in rats" (Existencia de rol protector de nervios aferentes para con alteraciones tempranas de la mucosa intestinal inducidas por irradiación abdominal en ratas) que los niveles de CGRP aumentan después de la irradiación abdominal, y particularmente en la enteritis por radiación, un estado caracterizado por diarrea y otras reacciones inflamatorias .

BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN Aparte de ser incómodo para el paciente aquejado, la diarrrea sobre todo si es crónica o severa puede poner en riesgo a la vida, especialmente la de pacientes geriátricos e infantes y niños pequeños como también la de pacientes con enfermedades tales como el cáncer e infecciones virales asociadas a la diarrea crónica que pueden agotar considerablemente los niveles de fluidos y electrolitos. ganglios radicales dorsales Existen 2 tipos generales de diarrea, la aguda y la crónica .

La diarrea generalmente se clasifica como el estado de evacuar heces liquidas o blandas tres o más veces por día. Es una causa común de muerte en los países en vías de desarrollo y la segunda causa más común de muerte infantil en el mundo. La pérdida de fluidos causada por la diarrea puede llevar a la deshidratación y a desequilibrios de electrolitos. En el 2009 se estimó que la diarrea causó 1,1 milllones de muertes entre la población de edad de 5 años o más y 1,5 millones de muertes entre niños menores de 5 años. Las soluciones de rehidratación oral (ORS por su sigla en inglés) con cantidades moderadas de electrolitos y comprimidos de zinc son el tratamiento preferido y se estima que han salvado a 50 millones de niños en los últimos 25 años El tratamiento con ORS debe iniciarse tan pronto como sea posible. Aunque se presentan vómitos durante la primera hora o dos del tratamiento con ORS, rara vez impide el éxito en la rehidratacion ya que la mayor parte del fluido de todas maneras se absorbe. La Orgnización Mundial de la Salud (OMS) recomienda que si un niño vomita, que se espere cinco o diez minutos y luego se reinicie el tratmiento más lentamente.

Entre las soluciones caseras recomendadas por OMS se encuentran bebidas saladas (por ejemplo agua de arroz con sal o una bebida de yogur con sal) y sopa de vegetales o de pollo con sal. Si están disponibles, se pueden añadir a la solución casera suplementos de potasio y de zinc, o dar estos junto con la solución. También se recomienda que las personas con diarrea, si pueden, continúen o reanuden la ingestión de alimentos ya que esto acelera la recuperación de la función normal del intestino y generalmente conlleva a una diarrea de más corta duración. Agua limpia sola puede ser uno de varios fluidos que se dan. Existen soluciones comerciales tales como Pedialyte, y organismos de asistencia como UNICEF distribuyen ampliamente sobres de sales y azúcar para la rehidratacion.

Más allá de las designaciones de la diarrea como crónica y aguda, este estado también se clasifica en distintos tipos basado en la causa y manifestaciones de la enfermedad. Uno de estos tipos es la "diarrea secretora." En la diarrea secretora hay un aumento de la secreción activa, o bien hay una inhibición de la absorción. El daño estructural es poco o nada. La causa más común de este tipo de diarrea es una toxina del cólera que estimula la secreción de aniones, especialmente los iones cloruro. En este tipo de diarrea el fluido secretado por el intestino is isotónico con el plasma, aún durante el ayuno . [8] <> Continúa aunque no haya ingestión oral de alimentos.

Un segundo tipo es la "diarrea osmótica." La diarrea osmótica puede ocurrir cuando demasiada agua es atraída al intestina. Si una persona bebe soluciones con demasiada azúcar o demasiada sal, éstos pueden atraer agua del cuerpo hacia el intestino y causar diarrea osmótica. Además, la diarrea osmótica puede resultar de la mala digestión (por ejemplo enfermedad del páncreas o enfermedad celíaca) cuando los nutrientes quedan en el lúmen y atraen agua. O puede ser causada por laxantes osmóticos (que funcionan para aliviar el estreñimiento mediante la atracción de agua al intestino) . En individuos sanos, demasiado magnesio o vitamina C o lactosa sin digerir pueden producir diarrea osmótica y distención del intestino. Una persona que sufre de intolerancia a la lactosa puede tener dificultad para absorber lactosa después de una ingestión extraordinaria de productos lácteos. En auellas personas que padecen de malabsorción de fructosa, ingestión excesiva de fructosa también puede causar diarrea. Alimentos altos en fructosa que también tienen un contenido alto de glucosa son más fáciles de absorber y menos propensos a causar diarrea. La absorción de azúcares alcohólicos como el sorbitol (frecuentemente contenido en alimentos libres de azúcar) es difícil, y en grandes cantidades pueden producir diarrea osmótica.

Un tercer tipo de diarrea es la "diarrea exudativa." En la diarrea exudativa hay sangre y pus en las heces. Esto pasa con enfermedades inflamatorias intestinales, como la enfermedad de Crohn o la colitis ulcerativa, e infecciones como con E. coli u otras formas de intoxicación alimentaria. Un cuarto tipo de diarrea es la "diarrea relacionada con la motilidad." Ésta se debe al tránsito rápido de los alimentos a través del intestino (hipermotilidad) . Si los alimentos pasan demasiado rápidamente a través del intestino, no da el tiempo para la absorción de suficientes nutrientes y agua. Esto puede deberse a una vagotomia o neuropatía diabética, o a una complicación de la menstruación. El hipertiroidismo puede producir hipermotilidad y causar este tipo de diarrea. Esta diarrea se puede tratar con agentes anti-motilidad (tales como la loperamida) . Se puede obsrvar la hipermotilidad en pacientes a quienes se les ha extirpado una porción del intestino, lo que limita el tiempo total para la absorción de alimentos.

Un quinto tipo de diarrea es la "diarrea inflamatoria." La diarrea inflamatoria se produce cuando se ha dañado la mucosa que reviste el intestino o el borde en cepillo, que lleva a una pérdida pasiva de fluidos contniendo altas concentraciones de proteínas, y una disminución de la capacidad para absorber estos fluidos perdidos. Se presentan características de todos los otros tres tipos de diarrea en este tipo. Puede ser causada por infecciones bacterianas, virales o parasíticas o por problemas autoinmunes como las enfermedades inflamatorias intestinales. También puede ser causada por tuberculosis, cáncer de colon y enteritis.

Un estado relacionado con la diarrea es la "disentería." Generalmente, si hay sangre visible en las heces, no es diarrea sino disentería. La sangre señala que el tejido intestinal ha sido invadido. La disentería es síntoma de Shigella, Entamoeba histolytica y Salmonella, entre otros. La causa más común de la diarrea es la infección gastrointestinal viral con rotavirus, que es responsable del 40% de los casos en niños menores de cinco años. Sin embargo entre los viajeros, predominan las infecciones bacterianas. Varias toxinas como la intoxicación con hongos y narcóticos también pueden causar diarrea aguda.

Como se ha mencionado en esta memoria, la diarrea se puede clasificar como crónica o aguda. La diarrea crónica puede ser parte de las presentaciones de varios estados médicos crónicos que afectan al intestino. Las causas comunes incluyen colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, colitis microscópica, enfermedad celiaca, síndrome de colon irritable y malabsorción de ácidos biliares.

Hay muchas causas de la diarrea infecciosa, entre ellas viruses, bacteria y parásitos. El norovirus es la causa más común de la diarrea viral en adultos, pero el rotavirus es la causa más común en niños menores de cinco años. Los adenovirus tipos 40 y 41, y los astrovirus causan un número significativo de infecciones.

La bacteria Campylobacter es una causa común de la diarrea bacteriana, pero las infecciones por Salmonella, Shigella y algunas cepas de Escherichia coli (E. coli) son frecuentes. En la tercera edad, particularmente entre pacientes que han sido tratados con antibióticos por infecciones no relacionados, una toxina producida por Clostridium difficile frecuentemente cause diarrea severa.

Algunos parásitos pueden causar _ diarrea, tales como el protozoario Giardia que puede causar infecciones crónicas si éstas no se diagnostican y tratan con fármacos como la metronidazol, y Entamoeba histolytica.

Entre otras causas de la diarrea crónica se incuyen: deficiencias enzimáticas o anormalidad de la mucosa, como en los casos de las alergias alimentarias y la intolerancia a los alimentos, por ejemplo enfermedad celiaca (intolerancia al gluten) , intolerancia a la lactosa (intolerancia al azúcar de la leche, común entre los no-europeos), y malabsorción de fructosa, la anemia perniciosa, o función intestinal deficiente debido a la falta de capacidad de absorber vitamina B12, pérdida de secreciones pancreáticas que puede deberse a la fibrosis quistica o a la pancreatitis, deficiencias estructurales, como el síndrome de intestino corto (intestino parcialmente extirpado quirúrgicamente) y fibrosis por efecto de radiación, tal como generalmente se produce por tratamientos para el cáncer y por otros fármacos, incluyendo fármacos usados para la quimioterapia, y ciertos fármacos, como orlistat, que inhibe la absorción de la grasa. La colitis ulcerativa se caracteriza por diarrea cróica con sangre e inflamación que afecta principalmente el colon distal próximo al recto. La enfermedad de Crohn típicamente afecta segmentos bastante bien delimitados de intestino en el colon y frecuentemente afecta la parte final del intestino delgado .

Otra causa de la diarrea es el síndrome del colon irritable (IBS por su sigla en inglés) que generalmente se presenta con malestar abdominal aliviado por la evacuación y deposiciones anormales (diarrea o estreñimiento) durante por lo menos 3 días por semana durante los últimos 3 meses. Se pueden manejar los síntomas de IBS en el que predomina la diarrea mediante una combinación de cambio de dieta, suplementos solubles de fibra alimentaria, y/o fármacos tales como loperamida o codeína. Alrededor de 30% de los pacientes con IBS en el que predomina la diarrea presentan malabsorcion de ácidos biliares, que se diagnostica por un resultado anormal en el test SeHCAT.

Otras causas de la diarrea incluyen ingestión crónica de etanol, enfermedad isquémica del intestino, colitis microscópico, malabsorcion de sales biliares (diarrea primaria por ácidos biliares) donde un exceso de ácidos biliares en el colon produce una diarrea secretora, tumores secretores de hormonas (algunas hormonas, por ejemplo la serotonina, pueden causar diarrea si son secretadas en cantidades excesivas, (generalmente por causa de un tumor) ) . Fármacos como loperamida (Imodium) y subsalicilato de bismuto pueden ser útiles para tratar algunos estados de diarrea, sin embargo en ciertas situaciones pueden contraindicarse.

Mientras que los antibióticos son útiles en ciertos tipos de diarrea aguda, generalmente no se utilizan excepto en ciertas situaciones específicas. De hecho, los antibióticos también pueden causar diarrea, y la diarrea asociada al tratamiento con antibióticos es el efecto secundario adverso más común en el tratamiento con antibióticos generales.

Compuestos de bismuto como el contenido en Pepto-Bismol se pueden utilizar para tratar algunos estados de diarrea. También los agentes ant-motilidad se pueden utilizar para tratar algunos estados de diarrea. Entre ellos se encuentra la loperamida. La codeina a veces se utiliza en el tratamiento de la diarrea para enlentecer la peristalsis y el tránsito de la materia fecal a través del intestino. Además, los agentes secuestrantes de ácidos biliares tales como colestiramina, colestipol y colesevelam pueden ser efectivos en el tratamiento de la diarrea crónica debida a la malabsorción de ácidos biliares.

Suplementos con zinc se pueden utilizar para tratar algunos estados crónicos de diarrea. Los probióticos a veces se pueden utilizar para acortar la duración de los síntomas.

Como se ha mencionado en esta memoria, la diarrea aguda es un segundo tipo de diarrea. La causa más común de la diarrea aguda es la infección viral, bacteriana o parasítica. Las bacterias también pueden causar intoxicación alimentaria aguda. Una tercera causa importante de la diarrea aguda es la iniciación de tratamiento con un nuevo medicamento.

Otras causas específicas de la diarrea aguda incluyen la gastroenteritis viral que es la cause más común de la diarrea aguda en todo el mundo. La gastroenteritis viral puede manifestarse en forma esporádica (en un solo individuo) o en forma epidémica (entre grupos de individuos) . La diarrea esporádica probablemente es causada por varios virus distintos y se cree que se contagia por contacto persona a persona. La causa más común de la diarrea epidémica (por ejemplo, en buques cruceros) es la infección con una familia de virus conocidos como los calicivirus, entre los cuales el género norovirus es el más común (por ejemplo, el "agente Norwalk"). Los calicivirus se transmiten en alimentos contaminados por personal de cocina enfermos o por contacto persona a persona.

Otra causa de la diarrea aguda es intoxicación alimentaria debido a toxinas producidas por bacteria. Las toxinas producen dolor abdominal (calambres) y vómitos y también causan la secreción de grandes cantidades de agua en el intestino delgado que provoca diarrea. Los síntomas de intoxicación alimentaria normalmente duran menos de 24 horas. En el caso de algunas bacterias, las toxinas se generan en el alimento antes de que éste se consuma, mientras que en el caso de otras bacterias, las toxinas se generan en el intestino después de consumirse el alimento.

Staphylococcus aureus es un ejemplo de una bacteria que produce toxinas en los alimentos antes de que éstos se consuman. Típicamente, los alimentos contaminados con Stap ylococcus (tales como ensaladas, carne o sandwiches con mayonesa) se ha dejado sin refrigerar a temperatura ambiente por una noche. Los estafilococos multiplican en el alimento y producen toxinas. Clostridium perfringens es un ejemplo de una bacteria que se multiplica en el alimento (generalmente alimento enlatado) , y produce toxinas en el intestino delgado después de consumirse el alimento contaminado.

Otra causa de la diarrea aguda es la diarrea del viajero, generalmente causada por cepas patogénicas de bacterias E. coli. A veces, otras bacterias o parásitos pueden causar diarrea en los viajeros (por ejemplo, Shigella, Giardia, Campylobacte ) . La diarrea causada por estos otros organismos generalmente dura más de 3 días.

Aún otra causa de la diarrea aguda es la enterocolitis bacteriana que se presenta cuando bacterias que provocan enfermedad invaden el intestino delgado y el colon y causan enterocolitis (inflamación del intestino delgado y colon) . La enterocolitis bacteriana se caracteriza por señales de inflamación (sangre o pus en las heces, fiebre) y dolor abdominal y diarrea. Campylobacter jejuni es la bacteria más común en los EEUU que provoca enterocolitis aguda. Otras bacterias que causan enterocolitis incluyen Shigella, Salmonella y EPEC (por su sigla en inglés) . Estas bacterias generalmente se contagian al beber agua contaminada o consumir alimentos contaminados tales como vegetales, pollo y productos lácteos.

La enterocolitis causada por la bacteria Clostridium difficile frecuentemente es causada por el tratamiento con antibióticos. Clostridium difficile también es la infección nosocomial (infección que se contagia en un hospital) que más frecuentemente provoca la diarrea. Por desgracia, las infecciones también están en aumento entre personas que ni se han tratado con antibióticos ni han estado en un hospital. Otra causa de la diarrea aguda es el E. coli 0157 :H7 el cual es una cepa de E. coli que produce una toxina que causa enterocolitis hemorrágica (enterocolitis con sangrado) . Hubo una famosa epidemia de enterocolitis hemorrágica en los EEUU que se rastreó a carne picada contaminada en hamburguesas (por lo que se llama también la colitis de las hamburguesas) . Aproximadamente el 5% de los pacientes infectados con E. coli 0157 :H7, especialmente la población infantil, pueden desarrollar el síndrome urémico hemolítico (HUS por su sigla en inglés) , un síndrome que puede provocar insuficiencia renal. Hay alguna evidencia de que el uso prolongado de agentes anti-diarreicos o el uso de antibióticos puede incrementar el riesgo de desarrollar HUS.

Aún otra causa de la diarrea aguda es la infección parasitaria, más común afuera de los EEUU. Por ejemplo, la infección con Giardia lamblia se presenta entre individuos que hacen senderismo en las montañas o viajan en el exterior y se transmite al beber agua contaminada. Cryptosporidium es otro parásito que puede producir diarrea, y se contagia típicamente al beber agua contaminada.

Aún otra causa de la diarrea aguda es la inducida por fármacos. Los medicamentos que más frecuentemente causan diarrea son los antácidos y suplementos nutricionales que contienen magnesio. Otros tipos de medicamentos que causan diarrea incluyen: fármacos antiinflamatorios no-esteroideos (NSAIDs), medicamentos usados en la quimioterapia, antibióticos, medicamentos para controlar la arritmia (pulso irregular) , y medicamentos para la hipertensión arterial En particular se pueden mencionar misoprostol (Cytotec) , quinidina (Quinaglute, Quinidex) , olsalazina (Dipentum), colchicina (Colchicine) , metoclopramida (Reglan) , y cisaprida (Propulsid, Motilium) .

Entre las causas comunes de la diarrea crónica se encuentran el síndrome del colon irritable, enfermedades transmisibles como infección con Giardia lamblia, infección con SIDA, la proliferación excesiva de bacterias en el intestino delgado, diarrea post-infecciosa en la cual los individuos que siguen el curso de infecciones virales, bacterianas o parasíticas desarrollan diarrea crónica (también denominada IBS post- infecciosa), enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa, y otras enfermedades que provocan la inflamación del intestino delgado y del colon frecuentemente causan diarrea crónica, cáncer de colon, especialmente en la parte inferior del colon, pueden conllevar a la aparición de heces estrechas, estreñimiento severo, malabsorción de carbohidratos (azúcar) , malabsorción por deficiencia de lactasa (también conocida como intolerancia de la lactosa o de la leche) malabsorción de grasas, pancreatitis o cáncer del páncreas, enfermedades del revestimiento del intestino delgado que impiden la absorción de grasas digeridas tales como enfermedad celiaca, enfermedades endocrinologicas tales como el hipertiroidismo o una insuficiente glándula pituitaria o glándula adrenal (enfermedad de Addison) y el abuso de los laxantes.

Tanto la diarrea aguda como la crónica pueden involucrar complicaciones adversas que incluyen la deshidratación resultante de una pérdida excesiva de fluidos y electrolitos del organismo debido a la diarrea. La deshidratación es común entre pacientes adultos con diarrea aguda y que producen abundantes materias fecales, sobre todo cuando la ingestión de fluidos es limitada debido al letargo o se asocia a la náusea y los vómitos, y es común entre infantes y niños pequeños que desarrollan gastroenteritis viral o infecciones bacterianas .

La deshidratación moderada a severa puede causar ipotensión ortostática y sincope (desmayo al pararse debido a un volumen reducido de sangre, que causa hipotensión arterial al pararse) , disminución de la producción de orina, debilidad severa, shock, insuficiencia renal, confusión, acidosis (exceso de acidez en la sangre) y hasta coma.

También los electrolitos (minerales) se pierden con el agua cuando la diarrea es prolongada o severa, y pueden ocurrir deficiencias de minerales o electrolitos. Las deficiencias más comunes son las de sodio y potasio. También se pueden desarrollar anormalidades en las concentrationes de cloruro y bicarbonato. Finalmente, puede ocurrir irritación anal debido al pasaje frecuente de heces acuosas que contienen sustancias irritantes .

En consecuencia, seria beneficioso un método efectivo para prevenir o tratar distintas formas de diarrea como se han descrito en esta memoria, y en particular la diarrea aguda y crónica .

En este sentido, la presente invención proporciona métodos y medicamentos para tratar o prevenir la diarrea asociada al CGRP que comprenden la administración de por lo menos un polipéptido que se une a CGRP o al receptor de CGRP y/o un péptido que inhibe la interacción entre CGRP y el receptor de CGRP. Estos polipéptidos incluyen anticuerpos anti-CGRP o anti-receptor de CGRP, y fragmentos o variantes de CGRP o del receptor de CGRP que inhiben la interacción entre CGRP y el receptor de CGRP. Estas terapias son efectivas para tratar o prevenir la diarrea, especialmente la diarrea provocada como resultado de estados de enfermedad o tratamientos asociados con niveles aumentados de CGRP, por ejemplo niveles aumentados en el sistema gastrointestinal y más especialmente el colon.

La invención se relaciona en particular con métodos de inhibición, prevención o tratamiento de la diarrea y/o el mantenimiento del equilibrio de los electrolitos y los niveles de fluido en el colon de un sujeto que padece un estado (por ejemplo estado gastrointestinal, cáncer, infección viral o contagiosa) o tratamiento relacionado que resulten en el aumento de los niveles de CGRP (tales como la radiación o la quimioterapia) que provocan diarrea y/o un flujo aumentado de electrolitos y fluidos del colon, que comprenden la administración de una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-CGRP o fragmento de anticuerpo anti-CGRP. Dichos estados incluyen por ejemplo trastornos funcionales del intestino y enfermedades inflamatorias intestinales, diarrea inducida por virus o bacterias, radiación y qumioterapias y más específicamente trastornos funcionales del intestino seleccionados dentro del grupo que consiste en reflujo gastroesofagal, dispepsia, síndrome de colon irritable, síndrome de dolor abdominal funcional, diverticulosis y diverticulitis , enfermedades inflamatorias intestinales seleccionadas del grupo que consiste en enfermedad de Crohn, ileitis, colitis colagenosa, colitis linfocítica y colitis ulcerativa, y cánceres asociados con la diarrea como el carcinoma medular tiroideo, y cáncer colorrectal .

La invención se relaciona también con los métodos de screening de anticuerpos y fragmentos de los mismos (incluyendo fragmentos Fab) que se unen específicamente al Péptido Relacionado con el Gen de Calcitonina (en adelante "CGRP") humano o al receptor de CGRP o que inhibe la interacción entre CGRP y el receptor de CGRP en modelos animales para determinar los efectos in vivo de los mismos, especialmente su capacidad para antagonizar los efectos secundarios adversos de CGRP y para tratar o prevenir la diarrea en estados o tratamientos que involucran excesos de CGRP.

Además. la invención supone un método para evaluar la eficacia potencial in vivo de un anticuerpo anti-CGRP camdidato o fragmento de anticuerpo u otro polipéptido que inhibe la interacción entre CGRP y el receptor CGRP para tratar o prevenir la diarrea, comprendiendo la determinación de si el anticuerpo u otro polipéptido inhibe la diarrea en un roedor al que se le administra CGRP exógeno comparado a un roedor al que se le administra CGRP pero en la ausencia del anticuerpo anti-CGRP candidato o fragmento de anticuerpo u otro inhibidor polipéptido.

Además, la invención supone un método de administración de un anticuerpo anti-CGRP o anti-receptor de CGRP o fragmento de anticuerpo u otro polipéptido que inhibe la interacción entre CGRP y el receptor de CGRP para tratar estados neurológicos y de dolor caracterizados por niveles aumentados de CGRP que están asociados a la diarrea.

Además la invención está relacionada con medicamentos para tratar un estado asociado con la diarrea seleccionado de entre reflujo gastroesofagal, dispepsia, síndrome de colon irritable, síndrome de dolor abdominal funcional, diverticulosis, diverticulitis, enfermedad de Crohn, ileitis, colitis colagenosa, colitis linfocítica y colitis ulcerativa, carcinoma medular tiroideo o cáncer colorrectal.

Además la invención está relacionada con métodos de evaluación basados en resultados de CGRP en un modelo animal en roedores de una dosis o régimen de dosificación adecuado del anticuerpo candidato o fragmento de anticuerpo en humanos para prevenir o tratar la diarrea asociada al CGRP.

Además la invención está relacionada con composiciones para inhibir, prevenir o tratar la diarrea y/o mantener el equilibrio de electrolitos y los niveles de fluidos en el colon de un sujeto que padece un estado asociado con niveles elevados de CGRP que resultan en diarrea y/o un flujo aumentado de electrolitos y fluidos del colon y que comprenden una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-CGRP o anti-receptor de CGRP o fragmento de anticuerpo anti-CGRP o anti-receptor de CGRP u optativamente otro agente activo.

Con relación a esto, la invención se relaciona específicamente con composiciones para tratar o prevenir trastornos funcionales del intestino o enfermedades inflamatorias intestinales, diarrea inducida por virus o bacterias, cáncer asociada con la diarrea, tal como carcinoma medular tiroidea o cáncer colorrectal, y trastornos funcionales del intestino o enfermedades inflamatorias intestinales, incluyendo como ejemplo reflujo gastroesofagal, dispepsia, síndrome de colon irritable, síndrome de dolor abdominal funcional, diverticulosis y diverticulitis, o enfermedad inflamatoria intestinal seleccionada de entre el grupo que comprende enfermedad de Crohn, ileitis, colitis colagenosa, colitis linfocítica y colitis ulcerativa. en donde estas terapias administran una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-CGRP o fragmento de anticuerpo que se administra como monoterapia o en combinación con otro agente activo .

En las realizaciones preferidas la presente invención se orienta a la utilización terapéutica de anticuerpos específicos y fragmentos de los mismos para el tratamiento o prevención de la diarrea en enfermedades o tratamientos asociados con niveles aumentado de CGRP; dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos se unen específicamente al CGRP, en particular los anticuerpos que tengan especificidad para los epítopos deseados, alta afinidad o avidez y/o propiedades funcionales. En otras realizaciones preferidas esta invención se relaciona con ensayos y la utilización de los anticuerpos descritos en la preente memoria, comprendiendo las secuencias de los polipéptidos VH, VL y CDR descritos en la preente memoria, y los polinucleótidos que los codifican. Una realización preferida de la invención se orienta hacia los anticuerpos quiméricos o humanizados y fragmentos de los mismos (incluyendo fragmentos Fab) capaces de unirse a CGRP y/o inhibir las actividades biológicas mediadas por la unión de CGRP con el receptor CGRP ("CGRP-R").

En otra realización preferida de la invención, los ensayos y las terapias usan anticuerpos de molécula completa y fragmentos Fab de los mismos para tratar o prevenir la diarrea en enfermedades o estados que provocan niveles aumentados de CGRP que inhiben la producción de cAMP impulsada por CGRP-alfa, CGRP-beta y CGRP de roedores. En otra realización preferida de la invención, se contemplan anticuerpos de molécula entera y fragmentos Fab de los mismos que reducen la vasodilación en sujetos a quienes se los administra .

En otra realización de la invención, anticuerpos quiméricos o humanizados y fragmentos de los mismos (incluyendo fragmentos Fab) capaces de unirse a CGRP o al receptor de CGRP se utilizan en métodos orientados a reducir, tratar o prevenir la diarrea en enfermedades o estados que resultan en niveles aumentados de CGRP tales como la migraña (con o sin aura) , cáncer o tumores, angiogénesis asociado con crecimiento de cáncer o tumores, angiogénesis asociado con la supervivencia de cáncer o tumores, pérdida de peso, dolor, migrañas hemiplágicas, cefaleas racimo, neuralgia asociada a la migraña, cefaleas crónicas, cefaleas tensionales, cefaleas en general, sofocos, hemicrania paroxisomal crónica, cefaleas secundarias debidas a problemas estructurales subyacentes en cabeza o cuello, neuralgia cranial, cefaleas de sinus (tales como por ejemplo las asociadas a la sinusitis) y cefaleas o migrañas inducidas por las alergias En otra realización de la invención, anticuerpos quiméricos o humanizados y fragmentos de los mismos (incluyendo fragmentos Fab) capaces de unirse a CGRP se utilizan en métodos orientados a reducir, tratar o prevenir la diarrea y el dolor visceral asociados con el reflujo gastroesofagal, dispepsia, síndrome de colon irritable, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, ileitis, colitis ulcerativa, cólico renal, dismenorrea, cistitis, periodo menstrual, trabajo de parto, menopausia, prostatitis o pancreatitis.

En otra realización de la invención estos anticuerpos y las versiones humanizadas para el tratamiento o la prevención de la diarrea en enfermedades o estados que resultan en niveles aumentados de CGRP pueden derivarse de células inmunes (linfocitos B) de conejo y pueden ser seleccionados basados en su homología (identidad de su secuencia) con las secuencias de la línea germinal humana. Estos anticuerpos pueden requerir modificaciones mínimas en sus secuencias, facilitando de esta manera la retención de sus propiedades funcionales luego de su humanización. Otra realización de la invención se orienta hacia fragmentos de anticuerpos anti-CGRP abarcando los polipéptidos VH, VL y CDR, por ejemplo derivados de células inmunes de conejo y los polinucleótidos que codifican los mismos, así como la utilización de estos fragmentos de anticuerpos y los polinucleótidos que los codifican para la creación de nuevos anticuerpos y composiciones polipéptidos capaces de unirse a CGRCP y/o complejos CGRP/CGRP-R para el tratamiento o prevención de la diarrea en enfermedades o estados que resultan en niveles aumentados de CGRP.

La invención también contempla los conjugados de anticuerpos anti-CGRP y los fragmentos de los mismos con capacidad de unión conjugados con uno o más fracciones funcionales o detectables para el tratamiento o la prevención de la diarrea en enfermedades o estados que resultan en niveles aumentados de CGRP. La invención también contempla métodos de fabricar dichos anticuerpos anti-CGRP quiméricos o humanizados o anticuerpos anti-complej os CGRP/CGRP-R y fragmentos de los mismos con capacidad de unión para el tratamiento o la prevención de la diarrea en enfermedades o estados que resultan en niveles aumentados de CGRP. En una realización, los fragmentos con capacidad de unión incluyen, sin ser limitados a, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2/ Fv, scFv, SMIPs (moléculas inmunofarmacéuticas modulares pequeñas) , camelbodies, nanobodies y IgNAR.

Las ealizaciones de la invención conciernen la utilización de anticuerpos anti-CGRP y fragmentos de los mismos con capacidad de unión para el diagnóstico, evaluación y tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con CGRP o la expresión aberrante del mismo que resultan en diarrea debido a los niveles aumentados de CGRP. La invención también contempla la utilización de fragmentos de anticuerpos anti-CGRP para el diagnóstico, evaluación y tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con CGRP o la expresión aberrante del mismo tales como enfermedades o estados en los cuales niveles aumentados de CGRP en el intestino resultan en diarrea. Otras realizaciones de la invención están relacionadas con la producción de anticuerpos anti-CGRP o fragmentos de los mismos en células recombinantes hospedadoras , por ejemplo células de mamífero tales como céllulas CHO, NSO o HEK 293, o células de levadura (por ejemplo levadura diploide como Pichia diploide) y otras cepas de levadura.

BREVE DESCRIPCIÓN de LAS DISTINTAS VISTAS de LOS ESQUEMAS La Figura 1 da a conocer secuencias de polinucleótidos y polipéptidos que corresponden al anticuerpo de longitud completa Abl.

La Figura 2 da a conocer secuencias de polinucleótidos y polipéptidos que corresponden al anticuerpo de longitud completa Ab2.

La Figura 3 da a conocer secuencias de polinucleótidos y polipéptidos que corresponden al anticuerpo de longitud completa Ab3.

La Figura 4 da a conocer secuencias de polinucleótidos y polipéptidos que corresponden al anticuerpo de longitud completa Ab4.

La Figura 5 da a conocer secuencias de polinucleótidos y polipéptidos que corresponden al anticuerpo de longitud completa Ab5.

La Figura 6 da a conocer secuencias de polinucleótidos y polipéptidos que corresponden al anticuerpo de longitud completa Ab6.

La Figura 7 da a conocer secuencias de polinucleótidos y polipéptidos que corresponden al anticuerpo de longitud completa Ab7.

La Figura 8 da a conocer secuencias de polinucleótidos y polipéptidos que corresponden al anticuerpo de longitud completa Ab8.

La Figura 9 da a conocer secuencias de polinucleótidos y polipéptidos que corresponden al anticuerpo de longitud completa Ab9.

La Figura 10 da a L conocer secuencias de polinucleótidos y polipéptidos que corresponden al anticuerpo de longitud completa AblO • La Figura 11 da a conocer secuencias de polinucleótidos y polipéptidos que corresponden al anticuerpo de longitud completa Abll La Figura 12 da a conocer secuencias de polinucleótidos polipéptidos que corresponden al anticuerpo de longitud completa Abl2.

La Figura 13 da a conocer secuencias de polinucleótidos y polipéptidos que corresponden al anticuerpo de longitud completa Abl3.

La Figura 14 da a conocer secuencias de polinucleótidos y polipéptidos que corresponden al anticuerpo de longitud completa Abl4.

La Figura 15 da a conocer los datos de unión obtenidos por ELISA correspondientes a CGRP alfa conforme a los resultados obtenidos siguiendo el protocolo que se describe en el Ejemplo 1 más adelante para los anticuerpos Abl, Ab2, Ab3, y Ab4.

La Figura 16 da a conocer los datos de unión obtenidos por ELISA correspondientes a CGRP alfa conforme a los resultados obtenidos siguiendo el protocolo que se describe en el Ejemplo 1 más adelante para los anticuerpos Ab5, Ab6, Ab7, y Ab8.

La Figura 17 da a conocer los datos de unión obtenidos por ELISA correspondientes a CGRP alfa conforme a los resultados obtenidos siguiendo el protocolo que se describe en el Ejemplo 1 más adelante para los anticuerpos Ab9, AblO, y Abl .

La Figura 18 da a conocer los datos de unión obtenidos por ELISA correspondientes a CGRP alfa conforme a los resultados obtenidos siguiendo el protocolo que se describe en el Ejemplo 1 más adelante para los anticuerpos Abll, Abl2, y Abl3.

La Figura 19 demuestra la inhibición de la producción de cAMP promovida por CGRP alfa causada por los anticuerpos Abl, Ab2, y Ab4, conforme a los resultados obtenidos siguiendo el protocolo que se describe en el Ejemplo 1 más adelante.

La Figura 20 demuestra la inhibición de la producción de cAMP promovida por CGRP alfa causada por el anticuerpo Ab3, conforme a los resultados obtenidos siguiendo el protocolo que se describe en el Ejemplo 1 más adelante.

La Figura 21 demuestra la inhibición de la producción de cAMP promovida por CGRP alfa causada por los anticuerpos Ab5 y Ab6, conforme a los resultados obtenidos siguiendo el protocolo que se describe en el Ejemplo 1 más adelante.

La Figura 22 demuestra la inhibición de la producción de cAMP promovida por CGRP alfa causada por los anticuerpos Ab7, Ab8, Ab9, y AblO, conforme a los resultados obtenidos siguiendo el protocolo que se describe en el Ejemplo 1 más adelante.

La Figura 23 demuestra la inhibición de la producción de cAMP promovida por CGRP alfa causada por los anticuerpos Abll, Abl2, y Abl3, conforme a los resultados obtenidos siguiendo el protocolo que se describe en el Ejemplo 1 más adelante.

La Figura 24 demuestra la inhibición de la producción de cAMP promovida por CGRP alfa causada por el anticuerpo Abl4, conforme a los resultados obtenidos siguiendo el protocolo que se describe en el Ejemplo 1 más adelante.

La Figura 25 demuestra la inhibición de La producción de cAMP promovida por CGRP beta causada por los anticuerpos Abl, Ab2r y Ab3, conforme a los resultados obtenidos siguiendo el protocolo que se describe en el Ejemplo 1 más adelante.

La Figura 26 demuestra la inhibición de La producción de cAMP promovida por CGRP beta causada por los anticuerpos Ab4, Ab5, y Ab6, conforme a los resultados obtenidos siguiendo el protocolo que se describe en el Ejemplo 1 más adelante.

La Figura 27 demuestra la inhibición de La producción de cAMP promovida por CGRP beta causada por los anticuerpos Ab7 y Ab8, conforme a los resultados obtenidos siguiendo el protocolo que se describe en el Ejemplo 1 más adelante.

La Figura 28 demuestra la inhibición de La producción de cAMP promovida por CGRP beta causada por los anticuerpos Ab9, AblO, y Abl4, conforme a los resultados obtenidos siguiendo el protocolo que se describe en el Ejemplo 1 más adelante.

La Figura 29 demuestra la inhibición de La producción de cAMP promovida por CGRP beta causada por los anticuerpos Abll, Abl2, y Abl3, conforme a los resultados obtenidos siguiendo el protocolo que se describe en el Ejemplo 1 más adelante.

La Figura 30 demuestra la inhibición de la producción de cAMP promovida por CGRP de rata causada por los anticuerpos Abl, Ab2, Ab4, y Ab5, conforme a los resultados obtenidos siguiendo el protocolo que se describe en el Ejemplo 1 más adelante.

La Figura 31 demuestra la inhibición de rat CGRP -driven cAMP production causada por los anticuerpos Ab3 y Ab6, conforme a los resultados obtenidos siguiendo el protocolo que se describe en el Ejemplo 1 más adelante.

La Figura 32 demuestra la inhibición de la producción de cAMP promovida por CGRP de rata causada por los anticuerpos Ab7 y Ab8, conforme a los resultados obtenidos siguiendo el protocolo que se describe en el Ejemplo 1 más adelante.

La Figura 33 demuestra la inhibición de la producción de cAMP promovida por CGRP de rata causada por el anticuerpo Ab9, conforme a los resultados obtenidos siguiendo el protocolo que se describe en el Ejemplo 1 más adelante.

La Figura 34 demuestra la inhibición de la producción de cAMP promovida por CGRP de rata causada por el anticuerpo AblO, conforme a los resultados obtenidos siguiendo el protocolo que se describe en el Ejemplo 1 más adelante.

La Figura 35 demuestra la inhibición de la producción de cAMP promovida por CGRP de rata causada por los anticuerpos Abll y Abl2, conforme a los resultados obtenidos siguiendo el protocolo que se describe en el Ejemplo 1 más adelante.

La Figura 36 demuestra la inhibición de la producción de cAMP promovida por CGRP de rata causada por el anticuerpo Abl3, conforme a los resultados obtenidos siguiendo el protocolo que se describe en el Ejemplo 1 más adelante.

La Figura 37 demuestra la inhibición de la producción de cAMP promovida por CGRP de rata causada por el anticuerpo Abl4, conforme a los resultados obtenidos siguiendo el protocolo que se describe en el Ejemplo 1 más adelante.

La Figura 38 demuestra la inhibición de la unión de CGRP radiomarcada con CGRP-R causada por los anticuerpos Abl-Abl3, conforme a los resultados obtenidos siguiendo el protocolo que se describe en el Ejemplo 6 más adelante.

La Figura 39 demuestra la disminución de la vasodilatación obtenida mediante la administración de anticuerpos Ab3 y Ab6 a partir de la administración de capsaicina en un modelo en rata, en relación a un anticuerpo control, conforme a los resultados obtenidos siguiendo el protocolo que se describe en el Ejemplo 7 más adelante.

La Figura 40 demuestra la disminución de la vasodilatación obtenida mediante la administración de anticuerpo Ab6 a diferentes concentraciones a partir de la administración de capsaicina en un modelo en rata, en relación a un anticuerpo control, conforme a los resultados obtenidos siguiendo el protocolo que se describe en el Ejemplo 7 más adelante.

La Figura 41 contiene los resultado de experimentos donde se evaluaron los efectos de CGRP en ratones transgénicos Nestin/hRampl . Los datos muestran que la administración de CGRP alfa de rata provocó diarrea en ratones Nestin/hRAMPl tg y que la inyección intraperitoneal de Ab3 (30mgs/kg, -24 hrs. previo al desafio con CGRP) inhibe, diarrea inducida por inyección intra cerebroventricular (ICV) de CGRP alfa de rata en ratones Nestin/hRAMPl tg.

La Figura 42 contiene los resultados de los experimentos que demuestran que la inyección intracerebroventricular de CGRP alfa humano induce la diarrea en forma dosis dependiente en ratones C57BL/6J.

La Figura 43 contiene los resultados de los experimentos que demuestran que la inyección intraperitoneal de Ab3 (30mgs/kg ip, -24 hrs. previo al desafio con CGRP alfa humano) inhibe la diarrea inducida por CGRP humano administrado por inyección intra cerebroventricular en ratones C57/BL6J.

La Figura 44 contiene los resultados de los experimentos que demuestran que Ab3 (30mgs/kg inyección intraperitoneal -24 hrs. previo al desafio con CGRP alfa humano) inhibe la diarrea inducida por CGRP alfa humano inyectado intraperitonealmente en ratones C57/BL6J.

La Figura 45 muestra la prevención de la diarrea inducida por CGRP lograda por Ab3 y Ab6 (ambos administrados en una dosis de 10 mg/kg) . Animales de control negativo (tratados con un anticuerpo control y PBS, barra izquierda) no manifestaron diarrea, y 80% de los animales de control positivo (tratados con CGRP y anticuerpos de control negativo, barra rellenada) manifestaron diarrea. La administración de Ab3 (barra con listones diagonales) y Ab6 (barra sombreada con lineas cruzadas) redujo la incidencia de diarrea al 40% y 60%, respectivamente .

La Figura 46 muestra el peso bruto de las heces que resulta de la diarrea inducida por CGRP en el experimento mostrado en la Figura 45. El peso bruto de las heces aumentó notoriamente mediante la administración de CGRP (segunda barra) en comparación con animales de control negativo (primera barra) . Por el contrario los animales tratados con Ab3 y Ab6 exhibieron una gran reducción del peso bruto de las heces (tercera y cuarta barra, respectivamente) . Los valores mostrados son el promedio de todos los animales en cada grupo de análisis más/menos el error estándar de la media (SEM por su sigla en inglés) .

La Figura 47 confirma la prevención de la diarrea inducida por CGRP por obra de Ab3 y Ab6 en otro experiment (ambos anticuerpos se administraron en dosis de 30 mg/kg) . No se presentó diarrea en animales de control negativo (tratados con un anticuerpo control y PBS, primera barra) pero se observó diarrea en 80% de los animales de control positivo (segunda barra, rellenada) . La incidencia de diarrea se redujo a 20% y 40%, respectivamente, por efecto de Ab3 (tercera barra, listones diagonales) y Ab6 (cuarta barra, sombreada con lineas cruzadas) .

La Figura 48 muestra el peso bruto de las heces que resultaron de la diarrea inducida por CGRP en el experimento mostrado en la Figura 47. El peso bruto de las heces aumentó notoriamente mediante la administración de CGRP (segunda barra, rellenada) en comparación con animales de control negativo (primera barra, sin rellenar) . Sin embargo los animales tratados con Ab6 exhibieron una notoria reducción del peso bruto de las heces (cuarta barra, cuadriculada) y animales tratados con Ab3 (tercera barra, sombreada con lineas cruzadas) exhibieron un peso bruto promedio de las heces comparable al de los animales de control negativo (barra izquierda, sin rellenar) . Los valores mostrados son el promedio de todos los animales en cada grupo de análisis más/menos el error estándar de la media (SE por su sigla en inglés) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS Definiciones Debe entenderse que esta invención no está limitada a la metodología, los protocolos, líneas celulares, especies animales o género y reactivos descritos en particular ya que éstos pueden variar. Asimismo debe entenderse que la terminología utilizada en el presente se utiliza con el fin de describir realizaciones particulares únicamente, y no se pretende que limite el alcance de la presente invención que solamente se verá limitada por las reivindicaciones adjuntas. Como se utiliza en el presente, las formas en singular de "una", "y", y "el/la" incluyen los plurales de las mismas a menos que el contexto claramente indique lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, una referencia a "una célula" incluye una pluralidad de dichas células y una referencia a "la proteína " incluye una referencia a una o más proteínas y equivalentes de las mismas conocidos por los expertos en la técnica, y así sucesivamente. Todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente tienen el mismo significado que tienen comúnmente para los expertos en la técnica a la cual pertenece esta invención a menos que se indique claramente lo contrario .

Péptido Relacionado con el Gen de la Calcitonina (CGRP - por sus siglas en inglés) : Como se utiliza en el presente, CGRP abarca no solamente las siguientes secuencias de aminoácidos de Homo sapiens CGRP-alfa y Homo sapiens CGRP-beta disponibles de American Peptides (Sunnyvale CA) y Bachem (Torrance, CA) : CGRP-alfa: ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF-NH2 (SEQ ID NO: 281), donde la fenilalanina N-terminal está amidada; CGRP-beta: ACNTATCVTHRLAGLLSRSGGMVKSNFVPTNVGSKAF-NH2 (SEQ ID NO: 282), donde la fenilalanina N-terminal está amidada; pero asimismo cualquier forma unida a la membrana de estas secuencias de aminoácidos CGRP, asi como mutantes (mutiens) , variantes de empalme, isoformas, ortólogos, homólogos y variantes de esta secuencia. En particular CGRP en el presente comprende secuencias CGRP de roedores y secuencias CGRP de otros mamíferos.

El "receptor CGRP" en el presente incluye todos los receptores endógenos que están específicamente unidos por CGRP, incluyendo CGRP de humano y roedores y CGRP de otros mamíferos. Asimismo el receptor CGRP" incluye mutantes (mutiens) , variantes de empalme, isoformas, ortólogos, homólogos, fragmentos y variantes de los receptores de CGRP que están específicamente unidos por CGRP. En particular el receptor CGRP del presente comprende receptores de CGRP de humano, rata, murino y primate no humano y secuencias de receptores de CGRP de otros mamíferos.

El "Inhibidor del Receptor de CGRP/CGRP" en el presente se refiere a una molécula, preferentemente un polipéptido como, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que inhibe la interacción de CGRP y de su receptor. Los ejemplos no limitantes de ello incluyen anticuerpos y fragmentos de anticuerpo que específicamente se unen a CGRP o el receptor de CGRP y fragmentos de CGRP o el receptor de CGRP.

"Diarrea" se refiere a un aumento en la frecuencia de movimientos del intestino o a un disminución en la forma de las heces (mayor flojedad de heces) . Si bien los cambios en la frecuencia de los movimientos del intestino y la flojedad de las heces puede variar independientemente una de otra, frecuentemente ocurren cambios en ambos. Debe diferenciarse la diarrea de otras cuatro condiciones. Si bien estas condiciones pueden acompañar la diarrea, a menudo tienen causas diferentes y tratamientos diferentes a la diarrea. Estas otras condiciones son: incontinencia de heces, que es la incapacidad de controlar (retrasar) los movimientos del intestino hasta el momento adecuado, por ejemplo, hasta que uno puede ir al baño, urgencia rectal, que es una necesidad urgente de movimiento del intestino tan fuerte que derivará en incontinencia en caso de no poder llegar al baño inmediatamente, evacuación incompleta, que es la sensación de que es necesario otro movimiento del intestino luego de mover el intestino, y aún asi hay dificultad en moverlo la segunda vez y movimientos del intestino inmediatamente luego de una comida .

La diarrea puede definirse en términos absolutos o relativos en función de la frecuencia de los movimientos del intestino o bien de la consistencia de las heces (flojedad).

Frecuencia de movimientos del intestino. Diarrea absoluta es tener más movimientos del intestino de lo normal. Por lo tanto, como entre los individuos sanos el número máximo de movimientos del intestino por día es de aproximadamente tres, la diarrea puede definirse como cualquier cantidad de heces mayor de tres. Diarrea relativa es tener más movimientos del intestino de lo habitual. Por lo tanto, si un individuo que habitualmente mueve el intestino una vez al día comienza a moverlo dos veces al día, entonces se presenta diarrea - aún cuando no hayan más de tres movimientos del intestino al dia, es decir, no hay diarrea absoluta.

Consistencia de las heces. La diarrea absoluta es más difícil de definir en función de la consistencia de las heces porque la consistencia de las heces puede variar en forma considerable en los individuos sanos dependiendo de su dieta. Por lo tanto, los individuos que ingieren grandes cantidades de vegetales tendrán heces más blandas que los individuos que comen pocos vegetales. Las heces liquidas o aguadas siempre son anormales y se consideran diarreicas. La diarrea relativa es más fácil de definir en función de la consistencia de las heces. Por lo tanto, un individuo que desarrolla heces más blandas de lo habitual tiene diarrea—aún cuando las heces se puedan encontrar dentro del rango de lo normal con respecto a la consistencia.

La diarrea en general se divide en dos tipos, aguda y crónica. La diarrea aguda dura desde unos pocos días hasta una semana. La diarrea crónica puede definirse de varias maneras pero casi siempre dura más de tres semanas. La diarrea aguda y crónica generalmente tienen diferentes causas, requieren pruebas de diagnóstico diferentes y frecuentemente implican diferentes tratamientos.

"Tratamiento o prevención de la diarrea inducida por CGRP" significa que el tratamiento, por ejemplo, la administración de un anticuerpo anti CGRP o fragmento efectivamente inhibe o trata la diarrea y/o mantiene niveles de electrolitos y fluidos apropiados en el colon de un sujeto con necesidad de ello en relación a un sujeto no tratado.

"La diarrea inducida por CGRP o diarrea asociada a CGRP" se refiere a una condición o tratamiento que resulta en niveles elevados de CGRP, especialmente en el sistema gastrointestinal y especialmente en el colon que resulta en uno o más de excreción aumentada de fluido del colon, balance reducido de electrolitos y uno o más movimientos del intestino aguados (diarrea) .

"Tratamientos que resultan en diarrea asociada a CGRP" en el presente se refieren a cualquier tratamiento para una condición de una enfermedad, por ejemplo, radiación, quimioterapia, terapia con fármacos que resulta en el aumento de los niveles de CGRP que se relacionan con la diarrea.

'Enfermedad o condición asociada a CGRP" es cualquier enfermedad o condición que se relaciona con el aumento de los niveles de CGRP en relación a los niveles de CGRP en individuos normales.

Especie de levadura apta para el apareamiento: En la presente invención abarca en forma amplia cualquier levadura diploide o tetraploide que puede crecer en cultivos. Tales especies de levadura pueden existir en forma haploide, diploide, u otras formas poliploides. Las células de un ploide dado pueden proliferar, bajo condiciones apropiadas, para un número indefinido de generaciones en esa forma. Las células diploides pueden asimismo esporular para formar células haploides. El apareamiento secuencial puede resultar en cepas tetraploides mediante apareamiento adicional o fusión de cepas diploides. La presente invención contempla el uso de levadura haploide, asi como diploide u otras células de levadura poliploide producidas, por ejemplo, mediante apareamiento o fusión de esferoplastos .

En una realización de la invención, la levadura apta para apareamiento es un miembro de la familia Saccharomycetaceae, que incluye los géneros Arxiozima; Ascobotriozima; Citeromices; Debaryomyces ; Dekkera; Eremothecium; Issatchenkia; Kazachstania; Kluyveromyces ; Kodamaea; Lodderomyces ; Pachysolen; Pichia; Saccharomyces ; Saturnispora; Tetrapisispora; Torulaspora; illiopsis; y Zygosaccharomyces . Otros tipos de levadura potencialmente útiles en la invención incluyen Yarrowia; Rhodosporidium; Candida; Hansenula; Filobasium; Sporidiobolus ; Bullera; Leucosporidium y Filobasidella .

En una realización preferida de la invención, la levadura apta para apareamiento es miembro del género Pichia. En otra realización preferida de la invención, la levadura apta para apareamiento del género Pichia es una de las siguientes especies: Pichia pastoris, Pichia methanolica, y Hansenula polymorpha (Pichia angusta) . En una realización particularmente preferida de la invención, la levadura apta para apareamiento del género Pichia es la especie Pichia pastoris .

Célula de Levadura Haploide: Célula que tiene una copia simple de cada gen de su complemento genómico normal (cromosómico) .

Célula de Levadura Poliploide: Célula que tiene más de una copia de su complemento genómico normal (cromosómico) .

Célula de levadura Diploide: Célula que tiene dos copias (alelos) de esencialmente cada gen de su complemento genómico normal, típicamente formado por el proceso de fusión (apareamiento) de dos células haploides.

Célula de levadura Tetraploide: Célula que tiene cuatro copias (alelos) de esencialmente cada gen de su complemento genómico normal, típicamente formado por el proceso de fusión (apareamiento) de dos células haploides. Los tetraploides pueden contener dos, tres, cuatro o más casetes de expresión diferentes. Dichos tetraploides pueden obtenerse en S. cerevisiae por apareamiento selectivo heterotálico homozigótico a/a y alfa/alfa diploides y en Pichia por apareamiento secuencial de haploides para obtener diploides auxotróficos . Por ejemplo, un haploide [met his] puede aparearse con haploide [ade his] para obtener diploide [his] ; y un haploide [met arg] puede aparearse con haploide [ade arg] para obtener diploide [arg] ; luego el diploide [his] x diploide [arg] para obtener un protótrofo tetraploide. Los expertos en la técnica comprenderán que la referencia a los beneficios y usos de células diploides pueden asimismo aplicarse a las células tetraploides.

Apareamiento de levaduras: Proceso por el cual dos células de levadura haploide se funden naturalmente para formar una célula de levadura diploide.

Meiosis: Proceso por el cual una célula de levadura diploide se somete a división reductora para formar cuatro productos de esporas haploides. Cada espora puede luego germinar y formar una línea celular haploide que crece vegetativamente. Marcador seleccionable : Un marcador seleccionable es un gen o fragmento de gen que confiere un fenotipo de crecimiento (característica de crecimiento físico) en una célula que recibe ese gen como, por ejemplo, a través de un evento de transformación. El marcador seleccionable permite que la célula sobreviva y crezca en un medio de crecimiento selectivo bajo condiciones en las cuales las células que no reciben ese gen marcador seleccionable no pueden crecer. Los genes marcadores seleccionables en general entran dentro de varios tipos, incluyendo genes marcadores seleccionables positivos como, por ejemplo, un gen que confiere en una célula resistencia a un antibiótico y otra droga, temperatura cuando dos mutantes sensibles a la temperatura ("ts") se cruzan o se transforma un mutante ts; genes marcadores seleccionables negativos como, por ejemplo, un gen biosintético que confiere en una célula la capacidad de crecer en un medio sin un nutriente específico necesario por todas las células que no tienen el gen biosintético, o un gen biosintético mutagenizado que confiere en una célula la incapacidad de crecer por células que no tienen el gen salvaje; y similares. Los marcadores apropiados incluyen, pero no se limitan a: ZEO; G418; LYS3; METI; MET3a; ADEl; ADE3; URA3; y similares.

Vector de expresión: Estos vectores de ADN contienen elementos que facilitan la manipulación para la expresión de una proteina extranjera dentro de la célula hospedera diana. Convenientemente, las secuencias de manipulación y producción de ADN para la transformación se realiza primero en un hospedero bacteriano, por ejemplo, E. coli, y usualmente los vectores incluirán secuencias para facilitar dichas manipulaciones, incluyendo un origen bacteriano de replicación y un marcador de selección bacteriana apropiado. Los marcadores de selección codifican para proteínas necesarias para la supervivencia o crecimiento de células hospederas transformadas cultivadas en un medio de cultivo selectivo. Las células hospederas no transformadas con el vector que contienen el gen de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican para proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) proporcionan nutrientes críticos no disponibles de medios complejos. Los vectores ejemplificantes y métodos para transformación de levadura se describen, por ejemplo, en Burke, D., Dawson, D., & Stearns, T. (2000). Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. Plainview, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Los vectores de expresión para su uso en los métodos de la invención incluirán además secuencias especificas de levadura, incluyendo un marcador de drogas o autotrófico seleccionable para identificar cepas de levadura transformadas. Un marcador de drogas puede utilizarse además para amplificar el número de copias del vector en una célula hospedera de levadura.

La secuencia polipeptidica codificadora de interés está unida operativamente a secuencias regulatorias transcripcionales y traduccionales gue disponen la expresión del polipéptido en las células de levadura. Estos componentes del vector pueden incluir a modo no taxativo, uno o más de los siguientes: un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de transcripción. Las secuencias para la secreción del polipéptido pueden incluir asimismo, por ejemplo, una secuencia de señales, y similares. Un origen de replicación de levadura es opcional, ya que los vectores de expresión están frecuentemente integrados en el genoma de levadura. En una realización de la invención, el polipéptido de interés está ligado operativamente, o fusionado a secuencias que disponen secreción optimizada del polipéptido a partir de células diploides de levadura.

Los ácidos nucleicos están "operativamente ligados" cuando se colocan en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN para una secuencia de señales está operativamente ligado a un ADN para un polipéptido se se expresa como una preproteina que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente unido a una secuencia codificadora si afecta la trascripción de la secuencia. En general, "operativamente unido" significa que las secuencias de ADN unidas son contiguas, y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en marco de lectura. Sin embargo, los potenciadores no necesitan ser contiguos. La unión se realiza por ligazón en sitios de restricción convencionales o en forma alternativa mediante un método PCR/recombinación familiar para los expertos en la técnica (GatewayR Technology; Invitrogen, Carlsbad California) . Si tales sitios no existen, Los adaptadores o conectores oligonucleótidos sintéticos se utilizan de acuerdo con prácticas convencionales .

Los promotores son secuencias no traducidas ubicadas corriente arriba (5') respecto del codón de inicio de un gen estructural (en general dentro de alrededor de 100 a 1000 bp) que controlan la transcripción y traducción de secuencias de ácidos nucleicos particulares a las cuales están operativamente unidos. Tales promotores están comprendidos dentro de varias clases: promotores inducibles, constitutivos y represibles (que aumentan niveles de transcripción en respuesta a la ausencia de un represor) . Los promotores inducibles pueden iniciar el aumento de los niveles de transcripción a partir de ADN bajo su control en respuesta a algún cambio en condiciones de los cultivos, por ejemplo, la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio de temperatura .

El fragmento de promotor de levadura puede asimismo servir como el sitio para recombinación homologa e integración del vector de expresión en el mismo sitio en el genoma de levadura; en forma alternativa se utiliza un marcador seleccionable como el sitio para la recombinación homologa. La transformación Pichia se describe en Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376-3385.

Los ejemplos de promotores adecuados a partir de Pichia incluyen el promotor AOX1 (Cregg et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9:1316-1323); el promotor ICL1 (Menendez et al. (2003) Yeast 20 (13) : 1097-108 ) ; el promotor gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GAP) (Waterham et al. (1997) Gene 186(1) :37- 44); y el promotor FLDl (Shen et al. (1998) Gene 216 ( 1) : 93-102 ) . El promotor GAP es un promotor constitutivo fuerte y los promotores AOX y FLDl son inducibles.

Otros promotores de levadura incluyen ADH1, alcohol deshidrogenasa II, GAL4, PH03, PH05, Pyk, y promotores quiméricos derivados de los mismos. Adicionalmente, pueden utilizarse promotores no de levadura en la invención como, por ejemplo, promotores de mamíferos, insectos, plantas, reptiles, anfibios, virales y aviares. Más típicamente el promotor comprenderá un promotor de mamífero (potencialmente endógeno a los genes expresados) o comprenderá un promotor viral o de levadura que ' proporciona transcripción eficiente en sistemas de levadura.

Los polipéptidos de interés pueden producirse en forma recombinante no solamente directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, por ejemplo, una secuencia de señal u otro polipéptido con un sitio de escisión específico en el terminal N del polipéptido o la proteína madura. En general, la secuencia de señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte de la secuencia codificadora polipeptídica insertada en el vector. La secuencia de señal heteróloga seleccionada es preferentemente una que es reconocida y procesada a través de una de las vías estándar disponibles en la célula hospedera.

La señal pre-pro del factor S. cerevisiae alpha ha demostrado ser efectiva en la secreción de una variedad de proteínas recombinantes de P. pastoris. Otras secuencias de señales de levadura incluyen la secuencia de señal del factor de acoplamiento alpha, la secuencia de señal invertasa, y las secuencias de señal derivadas de otros polipéptidos de levadura secretados. Adicionalmente, estas secuencias de péptidos de señales se pueden diseñar para proporcionar secreción mejorada en sistemas de expresión de levadura diploide. Otras señales de secreción de interés asimismo incluyen secuencias de señales de mamíferos que pueden ser heterólogas a la proteína secretada, o pueden ser una secuencia nativa para la proteína secretada. Las secuencias de señales incluyen secuencias prepeptídicas, y en algunas instancias pueden incluir secuencias propeptídicas . Muchas de esas secuencias de señales son conocidas en la técnica, incluidas las secuencias de señales que se encuentran en las cadenas de inmunoglobulina, por ejemplo, la secuencia de preprotoxina K28, PHA-E, FACE, MCP-1 humano, secuencias de señales de albúmina en suero humano, Ig humano de cadena pesada, Ig humano de cadena ligera, y similares. Por ejemplo, ver Hashimoto et. al. Protein Eng 11(2) 75 (1998); y Kobayashi et . al. Therapeutic Apheresis 2(4) 257 (1998).

Se puede aumentar la transcripción insertando una secuencia de activador transcripcional en el vector. Estos activadores son elementos que actúan en forma cis del ADN, usualmente alrededor de desde 10 hasta 300 bp, que actúan en un promotor para aumentar su transcripción. Los potenciadores transcripcionales son relativamente independientes de la orientación y posición, habiéndose encontrado en la posición 5' y 3' respecto de la unidad de transcripción, en un intron, asi como dentro de la secuencia codificadora misma. El potenciador puede estar empalmado en el vector vector de expresión a una posición 5' o 3' respecto de la secuencia codificadora, pero preferentemente se encuentra ubicado en el sitio 5' del promotor.

Los vectores de expresión utilizados en células hospederas eucarióticas pueden contener asimismo secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Tales secuencias están comúnmente disponibles a partir de la posición 3' respecto del codón de terminación de la traducción, en regiones no traducidas de ADNs o ADNc eucarióticos o virales. Estas regiones contienen segmentos nucleótidos transcriptos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm.

La construcción de vectores apropiados que contienen uno o más de los componentes indicados anteriormente emplea técnicas de ligazón estándar o PCR/métodos de recombinación.

Los plásmidos aislados o fragmentos de ADN son escindidos, adaptados o vueltos a ligar en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos o por métodos de recombinación. Para que el análisis confirme las secuencias correctas en los plásmidos construidos, las mezclas de ligazón se utilizan para transformar células hospederas, y transformantes exitosos seleccionados por resistencia a antibióticos (por ejemplo ampicilina o Zeocin) cuando corresponda. Los plásmidos de los transformantes se preparan, analizan por digestión de endonucleasa de restricción y/o secuenciados. Como alternativa para la restricción y ligazón de fragmentos, pueden utilizarse métodos de recombinación basados en sitios de unión y enzimas de recombinación para insertar secuencias de ADN en un vector. Tales métodos se describen, por ejemplo, por Landy (1989) Ann. Rev. Biochem. 58:913-949; y son conocidos por los expertos en la técnica. Tales métodos utilizan recombinación de ADN intermolecular mediado por una mezcla de lambda y E.coli -proteínas de recombinación codificadas. La recombinación ocurre entre sitios de unión específicos en las moléculas de ADN que interactúan. Para una descripción de los sitios de unión ver eisberg y Landy (1983) Site-Specific Recombination in Phage Lambda, in Lambda II, Weisberg, ed. (Cold Spring Harbor, NY:Cold Spring Harbor Press), pp. 211-250. Los segmentos de ADN que flanquean los sitios de recombinación son intercambiados, de modo que luego de la recombinación, los sitios de unión son secuencias híbridas que comprenden secuencias donadas por cada sector parental. La recombinación puede ocurrir entre ADNs de cualquier topología .

Los sitios de unión pueden introducirse en una secuencia de interés ligando la secuencia de interés en un vector apropiado; generando un producto PCR que contienen una sitios de unión B a través del uso de cebadores específicos; generando una bibilioteca de ADNc clonada en un vector apropiado que contienen sitios de unión; y similares.

Plegamiento, como se utiliza en el presente, se refiere a la estructura tridimensional de polipéptidos y proteínas donde las interacciones entre residuos de aminoácidos actúan para estabilizar la estructura. Si bien son importantes las interacciones no covalentes para determinar estructura, usualmente las proteínas de interés tendrán enlaces disulfuro covalentes intra y/o intermoleculares formados por dos residuos de cisteína. Para las proteínas y polipéptidos naturales o derivados y variantes de los mismos, el plegamiento apropiado es típicamente el arreglo que da lugar a actividad biológica óptima, y puede monitorearse convenientemente por ensayos por actividad, por ejemplo, unión de ligandos, actividad enzimática, etc.

En algunas instancias, por ejemplo, cuando el producto deseado es de origen sintético, los ensayos basados en actividad biológica serán menos significativos. El plegamiento apropiado de tales moléculas puede determinarse sobre la base de propiedades físicas, consideraciones energéticas, estudios de modelos, y similares.

El hospedero de expresión se puede modificar además por la introducción de secuencias que codifican una o más enzimas que potencian el plegamiento y la formación de enlaces disulfuro, es decir foldasas, caperonins, etc. Tales secuencias pueden expresarse en forma constitutiva o por inducción en una célula hospedera de levadura, usando vectores, marcadores, etc. conocidos en la técnica. Preferentemente las secuencias, incluyendo elementos regulatorios transcripcionales suficientes para el patrón deseado de expresión, son integradas en forma estable en el genoma de levadura a través de una metodología diana.

Por ejemplo, PDI eucariótico no es solamente un catalizador eficiente de oxidación de proteína cisterna e isomerización de enlace disulfuro sino también exhibe actividad chaperon. La coexpresión de PDI puede facilitar la producción de proteínas activas que tienen múltiples enlaces disuofuro. También resulta de interés la expresión de BIP (proteína de unión de cadena pesada de inmunoglobulina) ; ciclofilina; y similares. En una realización de la invención, cada una de las cepas parentales haploides expresa una enzima de plegamiento diferente por ejemplo, una cepa puede expresar BIP, y la otra cepa puede expresar PDI o combinaciones de los mismos .

The terms "desired protein" o "desired anticuerpo" are used interchangeably y refer generally to a parent anticuerpo specific to a target, es decir, CGRP o a chimeric o anticuerpo humanizado o a binding portion thereof derived therefrom as described herein. The term "anticuerpo" is intended to include any polypeptide chain-containing molecular structure con a specific shape that fits to y recognizes an epitope, where one o more non-covalent binding interactions stabilize the complex entre the molecular structure y the epitope. The archetypal anticuerpo molecule is the immunoglobulin, y all types de immunoglobulins, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, etc., from all sources, por ejemplo, human, rodent, rabbit, cow, sheep, pig, dog, other mammals, chicken, other avians, etc., are considered to be "antibodies . " A preferred source for producing anticuerpos useful as starting material according to la invención is rabbits. Numerous anticuerpo secuencias codificadoras have been described; y others may be raised by Métodos well-known in the art. Ejemplos thereof include anticuerpos quiméricos, human anticuerpos y other non-human mammalian antibodies, anticuerpos humanizados, single chain anticuerpos (como, por ejemplo, scFvs) , camelbodies, nanobodies, IgNAR (single-chain anticuerpos derived from sharks) , small-modular immunopharmaceuticals (SMIPs) , y fragmentos de anticuerpo como, por ejemplo, Fabs, Fab', F(ab')2 y similares. See Streltsov VA, et al., Structure de a shark IgNAR anticuerpo dominio variable y modeling de an early-developmental isotype, Protein Sci. 2005 Nov; 1 (11) : 2901-9. Epub 2005 Sep 30; Greenberg AS, et al., A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement y extensive somatic diversification in sharks, Nature. 1995 Mar 9;374 (6518) : 168-73; Nuttall SD, et al., Isolation de the new antigen receptor from wobbegong sharks, y use as a scaffold for the display de protein loop librarles, Mol Immunol. 2001 Aug;38 (4) : 313-26; Hamers-Casterman C, et al., Naturally occurring anticuerpos devoid de light chains, Nature. 1993 Jun 3; 363 (6428) : 446-8; Gilí DS, et al., Biopharmaceutical drug discovery using novel protein scaffolds, Curr Opin Biotechnol. 2006 Dec; 17 ( 6) : 653-8. Epub 2006 Oct 19.

Por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión al antigeno may be produced by genetic engineering. In this technique, as con otros métodos, anticuerpo-producing cells are sensitized to the desired antigeno o inmunógeno. The messenger RNA isolated from anticuerpo producing cells is used as a témplate to make cDNA using PCR amplification . A biblioteca de vectors, each containing one cadena pesada gene y one cadena ligera gene retaining the initial antigen specificity, is produced by insertion de appropriate sections de the amplxfied immunoglobulin cDNA into the vectores de expresión. A combinatorial library is constructed combinando la cadena pesada gene library con la cadena ligera gene library. Ello da lugar a a biblioteca de clones which co-express a cadena pesada y ligera (resembling el fragmento Fab o fragmento de unión al antigeno de un anticuerpo molecule) . Los vectores that carry these genes are co-transfected into una célula huésped. When anticuerpo gene synthesis is induced in the transfected host, the proteínas de las cadenas pesada y ligera self-assemble to produce active anticuerpos that can be detected by screening con the antigeno o inmunógeno.

Anticuerpo secuencias codificadoras de interés include those encoded by native secuencias, asi como ácidos nucleicos that, by virtue de the degeneracy de el código genético, are not identical in secuencia to the disclosed ácidos nucleicos, y variants thereof. Variant polypeptides can include amino acid (aa) sustituciones, adiciones o deleciones. The amino acid substitutions can be sustitución de aminoácidos conservadoras o substitutions to eliminate aminoácidos no esenciales, como, por ejemplo, to alter a glicosilación site, o to minimize misfolding by sustitución o deleción de one o more cysteine residues that are not necessary for function. Variants can be designed so as to retain o have enhanced biological activity de a particular región de the protein (por ejemplo, a functional domain, catalytic amino acid residues, etc) . Variants asimismo include fragments de los polipéptidos que se dan a conocer en la presente memoria, particularly biologically active fragments y/o fragments corresponding to functional domains. Techniques for in vitro mutagenesis de cloned genes are known. Also included in the subject invention are polypeptides that have been modified using ordinary molecular biological techniques so as to improve their resistance to proteolytic degradation o to optimize solubility properties o to render them more suitable as a therapeutic agent.

Anticuerpos quiméricos according to la invención para el tratamiento o la prevención de diarrea in enfermedades o condiciones que resulta en el aumento de los niveles de CGRP may be made by recombinant means combinando las regiones variables de las cadenas ligera y pesada (VL y VH) , obtained from anticuerpo producing cells de one species con the regiones constantes de las cadenas ligera y pesada from another. Típicamente anticuerpos quiméricos utilize rodent o rabbit regiones variables y regiones constantes humanas, a fin de produce an anticuerpo con predominantly human domains. La producción de such anticuerpos quiméricos es bien conocida en la técnica, y may be achieved by standard means (as described, por ejemplo, in Patente Estadounidense No. 5,624,659, incorporada por referencia en la presente memoria en su totalidad) . Asimismo, se contempla que the regiones constantes humanas de anticuerpos quiméricos de la invención se seleccionan a partir de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, IgG6, IgG7, IgG8, IgG9, IgGlO, IgGll, IgG12, IgG13, IgG14, IgG15, IgG16, IgG17, IgG18 o IgG19 constant regions.

Anticuerpos humanizados are engineered to contain even more human-like immunoglobulin domains, y incorpórate only las regiones determinantes de la complementariedad de los animal-derived anticuerpo. This is accomplished by carefully examining la secuencia de the hyper-variable loops de the regiones variables de the monoclonal anticuerpo, y fitting them to the structure de the human anticuerpo chains. Although facially complex, the process is straightforward in practice. Ver, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 6,187,287, incorporadas por referencia en la presente memoria en su totalidad.

Además de entire immunoglobulins (or their recombinant counterparts) , fragmentos de inmunoglobulina comprising the sitio de unión al epitopo (por ejemplo, Fab' , F(ab')2, o other fragments) may be synthesized. "Fragment," o minimal immunoglobulins may be designed utilizing recombinant immunoglobulin techniques. For instance "Fv" immunoglobulins for use in la presente invención may be produced by synthesizing a fused región variable de la cadena ligera y a región variable de la cadena pesada. Combinaciones de anticuerpos are asimismo de interest, por ejemplo, diabodies, which comprise dos distinct Fv specificities . En otra realización de la invención, S IPs (small molecule immunopharmaceuticals) , camelbodies, nanobodies, y IgNAR are encompassed by fragmentos de inmunoglobulina .

Immunoglobulins y fragments thereof may be modified post-translationally, por ejemplo, to add effector moieties como, por ejemplo, chemical linkers, detectable moieties, como, por ejemplo, fluorescent dyes, enzymes, toxins, substrates, bioluminescent materials, radioactive materials, chemiluminescent moieties y similares, o specific binding moieties, como, por ejemplo, streptavidin, avidin, o biotin, y similares may be utilized in the Métodos y compositions de la presente invención. Ejemplos de additional effector molecules are provxded más adelante.

Una secuencia de polinucleótidos "corresponde" a una secuencia polipeptídica su si la traducción de la secuencia de polinucleótidos de acuerdo con el código genético proporciona la secuencia polipeptidica (es decir, la secuencia de polinucleótidos "codifica para" la secuencia polipeptidica) , una secuencia de polinucleótidos "corresponde" a otra secuencia de polinucleótidos si las dos secuencias codifican para la misma secuencia de polipéptidos . Una región o dominio heterologo de un constructo de ADN es un segmento identificable de DNA con una molécula de ADN mayor que no se encuentra en asociación con la molécula mayor en la naturaleza. Por lo tanto, la región heteróloga codifica para un gen de mamífero, el gen usualmente estará flanqueado por ADN que no flanquea el ADN genómico de mamífero en el genoma del organismo fuente. Otro ejemplo de una región heteróloga es un constructo donde la secuencia codificadora misma no se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, un ADNc donde la secuencia genómica codificadora contiene intrones, o secuencias sintéticas que tienen codones diferentes a los del gen nativo) . Las variaciones alélicas o eventos mutacionales que ocurren naturalmente no dan lugar a una región heteróloga de ADN como se define en el presente.

Una "secuencia codificadora" es una secuencia enmarcada de codones que (en vista del código genético) corresponde a o codifican para una secuencia proteica o peptídica. Dos secuencias codificadoras se corresponden entre sí si las secuencias o sus secuencias complementarias codifican para las mismas secuencias de aminoácidos. Una secuencia codificadora en asociación con secuencias reguladoras apropiadas pueden transcribirse y traducirse en un polipéptido. Una señal de poliadenilación y secuencia de terminación de transcripción usualmente estará ubicada en la posición 31 respecto de la secuencia codificadora. Una "secuencia promotora" es una región reguladora de ADN capaz de unir polimerasa de ARN en una célula e iniciar la trascripción de una secuencia codificadora corriente abajo (dirección 3'). Las secuencias promotoras típicamente contienen sitios adicionales para la unión de moléculas reguladoras (por ejemplo, factores de transcripción) que afectan la trascripción de the secuencia codificadora. Una secuencia codificadora está "bajo el control" de la secuencia promotora u "operativamente ligada" al promotor cuando la polimerasa de ARN se une a la secuencia promotora en una célula y transcribe la secuencia codificadora en ARNm, que a su vez es traducida en la proteína codificada por la secuencia codificadora.

Se utilizan vectores para introducir una sustancia extraña, como, por ejemplo, DNA, RNA o proteina, into an organism o host cell. Typical vectors include recombinant viruses (for polynucleotides) y liposomes (for polypeptides ) . A "DNA vector" is a replicón, como, por ejemplo, plasmid, phage o cosmid, to which another polynucleotide segment may be attached so as to bring alrededor de the replication de the attached segment. An "vector de expresión" is a DNA vector which contiene regulatory secuencias which will direct polypeptide synthesis by an appropriate host cell. This usually means a promoter to bind RNA polymerase y initiate la trascripción de mRNA, asi como ribosome binding sites y initiation signáis to direct translation de the mRNA into un polipéptido ( s ) . La incorporación de una secuencia de polinucleótidos into an vector de expresión at the proper site y in correct reading frame, followed by transíormation de an appropriate host cell by the vector, enables la producción de a polypepide encoded by said secuencia de polinucleótidos .

"Amplification" de secuencias de polinucleótidos is the in vitro production de múltiple copies de a particular secuencia de ácidos nucleicos. La secuencia amplificada is usually en la forma de DNA. A variety de techniques for carrying out such amplification are described in a review article by Van Brunt (1990, Bio/Technol . , 8 ( 4 ) : 291-294 ) . Polymerase chain reaction o PCR is a prototype de nucleic acid amplification, y use de PCR herein should be considered exemplary de other suitable técnicas de amplificación.

The general structure de anticuerpos in vertebrates now is well understood (Edelman, G. M., Ann. N.Y. Acad. Sci., 190: 5 (1971) ) . anticuerpos consist de dos identical light polypeptide chains de peso molecular aproximadamente 23,000 daltons (the "light chain") , y dos identical cadenas pesadas de peso molecular 53,000-70,000 (the "heavy chain"). The cuatro chains are joined by disulfide bonds in a "Y" configuration donde the light chains bracket the cadenas pesadas starting at the mouth de the "Y" configuration . The "branch" portion de the "Y" configuration is designated the Fab región; the stem portion de the "Y" configuration is designated the FC región. The amino acid secuencia orientation runs from the N-terminal end at the top de the "Y" configuration to the C-terminal end at the bottom de each chain. The N-terminal end possesses la región variable having specificity for the antigen that elicited it, y is aproximadamente 100 amino acids in length, there being slight variations entre cadena ligera y pesada y from anticuerpo to anticuerpo .

La región variable is linked in each chain to a constant región that extends the remaining length de the chain y that within a particular class de anticuerpo does not vary con the specificity del anticuerpo (es decir, the antigen eliciting it) . Hay five known major classes de constant regions that determine la clase de the immunoglobulin molecule (IgG, IgM, IgA, IgD, y IgE corresponding to ?, µ, , d, y e (gamma, mu, alpha, delta, o epsilon) cadena pesada constant regions) . La región constante o class determines subsequent función efectora del anticuerpo, including activation de complement (Kabat, E. A., Structural Concepts in Immunology y Immunochemistry, 2nd Ed. , p. 413-436, Holt, Rinehart, Winston (1976)), y other cellular responses (Andrews, D. ., et al., Clinical Immunobiology, pp 1-18, W. B. Sanders (1980) ; Kohl, S., et al., Immunology, 48: 187 (1983)); while la región variable determines the antigen con which it will react. Light chains are classified as either (kappa) o ? (lambda) . Each cadena pesada class can be prepared con either kappa o lambda light chain. Las cadenas ligera y pesada are covalently bonded entre si, y the "tail" portions de the dos cadenas pesadas are bonded entre si by covalent disulfide linkages when the immunoglobulins are generated either by hybridomas o by B cells.

La expresión "región variable" o "VR" se refiere a the domains within each par de cadenas ligera y pesada in an anticuerpo that are involved directamente in binding the anticuerpo to the antigen. Each cadena pesada posee en un extremo un dominio variable (VH) followed by a number de dominios constantes. Each cadena ligera has un dominio variable (VL) en un extremo y un dominio constante at its other end; the dominio constante de la cadena ligera is aligned con the first dominio constante de la cadena pesada, y la cadena ligerun dominio variable is aligned con the dominio variable de the heavy chain.

Las expresiones "región determinante de la complementariedad, " "regón hipervariable, " o "CDR" se refieren a una o más de the hyper-variable o regiones determinantes de la comprementariedad (CDRs) found in the regiones variables de las cadenas ligeras o pesadas de un anticuerpo (See Kabat, E. A. et al., Secuencias de Proteins de Immunological Interest, National Institutes de Health, Bethesda, Md., (1987)). These expresiones include the regiones hipervariables as defined by Kabat et al. ("Secuencias de Proteins de Immunological Interest," Kabat E., et al., US Dept . de Health y Human Services, 1983) o the hypervariable loops in 3-dimensional structures de anticuerpos (Chothia y Lesk, J Mol. Biol. 196 901-917 (1987)). The CDRs in each chain are held in cióse proximity by regiones framework and, con the CDRs from the other chain, contribute to la formación de the sitio de unión al antigeno. Within the CDRs hay select amino acids that have been described as the selectivity determining regions (SDRs) which represent the critical contact residues used by the CDR in the anticuerpo-antigen interaction (Kashmiri, S., Métodos, 36:25-34 (2005) ) .

Las expresiones "región framework" o "FR" se refieren a uno o más de los regiones framework dentro de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo (See Kabat, E. A. et al., Secuencias de Proteins de Immunological Interest, National Institutes de Health, Bethesda, Md. , (1987)). These expresiones include those regiones de la secuencia de aminoácidos interposed entre the CDRs dentro de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo.

ANTICUERPOS ANTI CGRP Y FRAGMENTOS DE UNIÓN DEL MISMO CON ACTIVIDAD DE UNIÓN PARA CGRP Anticuerpo Abl La presente invención contempla el uso de cualquier anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti CGRP humano para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP en cualquier enfermedad o condición que resulta en el aumento de los niveles de CGRP that are involved in diarrea, y/o increased excreción de fluidos o electrolitos from the colon. Las condiciones y tratamientos que resulta en el aumento de CGRP que se asocia con la diarrea se identifican in esta solicitud.

En una realización preferida, la invención incluye anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia siguiente: QVLTQTASPVSAAVGSTVTINCQASQSVYDNNYLA YQQKPGQPPKQLIYSTSTLASGVSS RFKGSGSGTQFTLTISDLECADAATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTEVVVKR (SEQ ID NO: 1).

La invención asimismo incluye anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la cadena ligera que comprende la secuencia siguiente: QVLTQTASPVSAAVGSTVTINCQASQSVYDNNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTSTLASGVSS RFKGSGSGTQFTLTISDLECADAATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTEVVVKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC ( SEQ ID NO: 2) .

La invención asismismo incluye anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia siguiente: QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGLDLSSYYMQWVRQAPGKGLEWIGVIGINDNTYYASW AKGRFTISRASSTTVDLK TSLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO: 3) .

La invención asimismo incluye anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la cadena pesada que comprende la secuencia siguiente : QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGLDLSSYYMQWVRQAPGKGLEWIGVIGINDNTYYAS AKGRFTISRASSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAP SSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVE ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 4) .

La invención asismismo contempla anticuerpos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que comprenden una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; y SEQ ID NO: 7, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 1 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 2, y/o una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; y SEQ ID NO: 10, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 3 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 4, o combinaciones de estas secuencias polipeptidicas. En otra realización de la invención, los anticuerpos de la invención o fragmentos de ellos comprenden, o en forma alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDRs, las secuencias de las regiones variables de las cadena pesada y ligera, y las secuencias de la cadena pesada y ligera que se especifican más arriba, incluyendo la totalidad de ellas.

La invención asimismo contempla fragmentos del anticuerpo para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP. En una realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la secuencia polipeptidica SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la secuencia polipeptidica SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.

En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; y SEQ ID NO: 7, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 1 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 2.

En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; y SEQ ID NO: 10, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 3 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 4.

La invención asimismo contempla fragmentos de anticuerpo las cuales incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpo que se especifican en la presente memoria para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP. En una realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo la totalidad de los siguientes fragmentos de anticuerpo: la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 1; la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 3; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; y SEQ ID NO: 7) de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 1; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; y SEQ ID NO: 10) de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 3.

En una realización particularmente preferida de la invención, the chimeric anti- anticuerpo CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP es Abl, el cual comprende, o en forma alternativa consiste en, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4, y posee al menos una de las actividades biológicas que se especifican en la presente memoria.

En otra realización particularmente preferida de la invención, los fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmentos de unión al antigeno) que poseen especficidad de unión por CGRP. En lo que refiere al anticuerpo Abl, el fragmento Fab incluye la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 1 y la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 3. Esta realización de la invención asismismo contempla adiciones, deleciones, y las variantes SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 3 en dicho Fab mientras que mantiene la especificidad de unión por CGRP.

En una realización de la invención que se describe en la presente memoria (más adelante) , los fragmentos Fab para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP pueden producirse por digestión enzimática (por ejemplo, papaina) de Abl. En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP tales como Abl o fragmentos Fab del mismo pueden producirse mediante la expresión en células mamiferas tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas de hongos, insectos o microbios tales como las células de levaduras (por ejemplo, levaduras diploides tales como Pichia diploide) y otras cepas de levaduras. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, a modo no taxativo, Pichia pastoris.

Anticuerpo Ab2 En una realización, la invención incluye anticuerpos humanizados para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia siguiente: QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYDNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO: 11) .

La invención asimismo incluye anticuerpos humanizados para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la cadena ligera que comprende la secuencia siguiente : QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYDNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 12) .

La invención asismismo incluye anticuerpos humanizados para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia siguiente: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGLDLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGINDNTYYAS WAKGRFTISRDNSKTTVYLQ NSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 13) .

La invención asimismo incluye anticuerpos humanizados para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la cadena pesada que comprende la secuencia siguiente : EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGLDLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGINDNTYYAS AKGRFTISRDNSKTTVYLQ NSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT L ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 14).

La invención asismismo contempla anticuerpos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que comprenden una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; y SEQ ID NO: 17, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 11 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 12, y/o una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; y SEQ ID NO: 20, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 13 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 14, o combinaciones de estas secuencias polipeptidicas. En otra realización de la invención, los anticuerpos de la invención o fragmentos de ellos comprenden, o en forma alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDRs, las secuencias de las regiones variables de las cadena pesada y ligera, y las secuencias de la cadena pesada y ligera que se especifican más arriba, incluyendo la totalidad de ellas.

La invención asimismo contempla fragmentos del anticuerpo para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP. En una realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la secuencia polipeptidica SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12. En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la secuencia polipeptidica SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14.

En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; y SEQ ID NO: 17, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 11 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 12.

En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; y SEQ ID NO: 20, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 13 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 14.

La invención asimismo contempla fragmentos de anticuerpo las cuales incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpo que se especifican en la presente memoria para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP. En una realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo la totalidad de los siguientes fragmentos de anticuerpo: la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 11; la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 13; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; y SEQ ID NO: 17) de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 11; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; y SEQ ID NO: 20) de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 13. En una realización particularmente preferida de la invención, el anticuerpo anti CGRP humanizado para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP es Ab2, el cual comprende, o en forma alternativa consiste en, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 14, y posee al menos una de las actividades biológicas que se especifican en la presente memoria.

En otra realización particularmente preferida de la invención, los fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmentos de unión al antigeno) que poseen especficidad de unión por CGRP. En lo que refiere al anticuerpo Ab2, el fragmento Fab incluye la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 11 y la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 13. Esta realización de la invención asismismo contempla adiciones, deleciones, y las variantes SEQ ID NO: 11 y/o SEQ ID NO: 13 en dicho Fab mientras que mantiene la especificidad de unión por CGRP.

En una realización de la invención que se describe en la presente memoria (más adelante) , los fragmentos Fab para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP pueden producirse por digestión enzimática (por ejemplo, papaina) de Ab2. En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP tales como Ab2 o fragmentos Fab del mismo pueden producirse mediante la expresión en células mamiferas tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas de hongos, insectos o microbios tales como las células de levaduras (por ejemplo, levaduras diploides tales como Pichia diploide) y otras cepas de levaduras. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, a modo no taxativo, Pichia pastoris.

Anticuerpo Ab3 En una realización, la invención incluye anticuerpos humanizados para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia siguiente: QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYDNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO: 21) .

La invención asimismo incluye anticuerpos humanizados para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la cadena ligera que comprende la secuencia siguiente : QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYDNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 22) .

La invención asismismo incluye anticuerpos humanizados para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia siguiente: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGLDLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGINDNTYYAS WAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 23) .

La invención asimismo incluye anticuerpos humanizados para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la cadena pesada que comprende la secuencia siguiente : EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGLDLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGINDNTYYAS WAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDARVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 24).

La invención asismismo contempla anticuerpos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que comprenden una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; y SEQ ID NO: 27, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 21 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 22, y/o una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; y SEQ ID NO: 30, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 23 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 24, o combinaciones de estas secuencias polipeptidicas. En otra realización de la invención, los anticuerpos de la invención o fragmentos de ellos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDRs, las secuencias de las regiones variables de las cadena pesada y ligera, y las secuencias de la cadena pesada y ligera que se especifican más arriba, incluyendo la totalidad de ellas.

La invención asimismo contempla fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP. En una realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la secuencia polipeptidica SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 22. En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la secuencia polipeptidica SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24.

En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; y SEQ ID NO: 27, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 21 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 22.

En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; y SEQ ID NO: 30, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 23 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 24.

La invención asimismo contempla fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP las cuales incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpo que se especifican en la presente memoria. En una realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo la totalidad de los siguientes fragmentos de anticuerpo: la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 21; la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 23; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; y SEQ ID NO: 27) de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 21; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; y SEQ ID NO: 30) de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 23. En una realización particularmente preferida de la invención, el anticuerpo anti CGRP quimérico para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP es Ab3, el cual comprende, o en forma alternativa consiste en, SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 24, y posee al menos una de las actividades biológicas que se especifican en la presente memoria.

En otra realización particularmente preferida de la invención, los fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmentos de unión al antigeno) que poseen especficidad de unión por CGRP. En lo que refiere al anticuerpo Ab3, el fragmento Fab incluye la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 21 y la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 23. Esta realización de la invención asismismo contempla adiciones, deleciones, y las variantes SEQ ID NO: 21 y/o SEQ ID NO: 23 en dicho Fab mientras que mantiene la especificidad de unión por CGRP.

En una realización de la invención que se describe en la presente memoria (más adelante) , los fragmentos Fab para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP pueden producirse por digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab3. En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP tales como Ab3 o fragmentos Fab del mismo pueden producirse mediante la expresión en células mamiferas tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas de hongos, insectos o microbios tales como las células de levaduras (por ejemplo, levaduras diploides tales como Pichia diploide) y otras cepas de levaduras. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, a modo no taxativo, Pichia pastoris.

Anticuerpo Ab4 En una realización, la invención incluye anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia siguiente: QVLTQTPSPVSAAVGSTVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGQPPKQLIYDASTLASGVPS RFSGSGSGTQFTLTISGVQCNDAAAYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTEVVVKR (SEQ ID NO: 31) .

La invención asimismo incluye anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la cadena ligera que comprende la secuencia siguiente : QVLTQTPSPVSAAVGSTVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGQPPKQLIYDASTLASGVPS RFSGSGSGTQFTLTISGVQCNDAAAYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTEVVVKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 32) .

La invención asismismo incluye anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia siguiente: QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCSVSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWIGVIGINGATYYASW AKGRFTISKTSSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO: 33) .

La invención asimismo incluye anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la cadena pesada que comprende la secuencia siguiente: QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCSVSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWIGVIGINGATYYASW AKGRFTISKTSSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARGDI GPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAP SSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQD LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 34).

La invención asismismo contempla anticuerpos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que comprenden una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; y SEQ ID NO: 37, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 31 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 32, y/o una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; y SEQ ID NO: 40, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 33 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 34, o combinaciones de estas secuencias polipeptidicas. En otra realización de la invención, los anticuerpos de la invención o fragmentos de ellos comprenden, o en forma alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDRs, las secuencias de las regiones variables de las cadena pesada y ligera, y las secuencias de la cadena pesada y ligera que se especifican más arriba, incluyendo la totalidad de ellas.

La invención asimismo contempla fragmentos del anticuerpo para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP. En una realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la secuencia polipeptidica SEQ ID NO: 31 o SEQ ID NO: 32. En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la secuencia polipeptidica SEQ ID NO: 33 o SEQ ID NO: 34.

En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; y SEQ ID NO: 37, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 31 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 32.

En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; y SEQ ID NO: 40, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 33 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 34.

La invención asimismo contempla fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP las cuales incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpo que se especifican en la presente memoria. En una realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo la totalidad de los siguientes fragmentos de anticuerpo: la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 31; la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 33; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; y SEQ ID NO: 37) de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 31; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; y SEQ ID NO: 40) de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 33. En una realización particularmente preferida de la invención, the humanized anticuerpo anti CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP es Ab4, el cual comprende, o en forma alternativa consiste en, SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 34, y posee al menos una de las actividades biológicas que se especifican en la presente memoria.

En otra realización particularmente preferida de la invención, los fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmentos de unión al antigeno) que poseen especficidad de unión por CGRP. En lo que refiere al anticuerpo Ab4, el fragmento Fab incluye la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 31 y la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 33. Esta realización de la invención asismismo contempla adiciones, deleciones, y las variantes SEQ ID NO: 31 y/o SEQ ID NO: 33 en dicho Fab mientras que mantiene la especificidad de unión por CGRP.

En una realización de la invención que se describe en la presente memoria (más adelante) , los fragmentos Fab para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP pueden producirse por digestión enzimática (por ejemplo, papaina) de Ab4. En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP tales como Ab4 o fragmentos Fab del mismo pueden producirse mediante la expresión en células mamiferas tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas de hongos, insectos o microbios tales como las células de levaduras (por ejemplo, levaduras diploides tales como Pichia diploide) y otras cepas de levaduras. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, a modo no taxativo, Pichia pastoris.

Anticuerpo Ab5 En una realización, la invención incluye anticuerpos humanizados para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia siguiente: QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGKVPKQLIYDASTLASGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO: 41) .

La invención asimismo incluye anticuerpos humanizados para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la cadena ligera que comprende la secuencia siguiente : QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGKVPKQLIYDASTLASGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 42) .

La invención asismismo incluye anticuerpos humanizados para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia siguiente: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWVGVIGINGATYYAS AKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 43) .

La invención asimismo incluye anticuerpos humanizados para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la cadena pesada que comprende la secuencia siguiente : EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWVGVIGINGATYYAS WAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDI GQGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQ D LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 44).

La invención asismismo contempla anticuerpos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que comprenden una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46; y SEQ ID NO: 47, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 41 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 42, y/o una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 49; y SEQ ID NO: 50, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 43 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 44, o combinaciones de estas secuencias polipeptidicas. En otra realización de la invención, los anticuerpos de la invención o fragmentos de ellos comprenden, o en forma alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDRs, las secuencias de las regiones variables de las cadena pesada y ligera, y las secuencias de la cadena pesada y ligera gue se especifican más arriba, incluyendo la totalidad de ellas.

La invención asimismo contempla fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP. En una realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la secuencia polipeptidica SEQ ID NO: 41 o SEQ ID NO: 42. En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la secuencia polipeptidica SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO: 44.

En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46; y SEQ ID NO: 47, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 41 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 42.

En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptídicas SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 49; y SEQ ID NO: 50, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 43 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 44.

La invención asimismo contempla fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP las cuales incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpo que se especifican en la presente memoria. En una realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo la totalidad de los siguientes fragmentos de anticuerpo: la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 41; la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 43; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46; y SEQ ID NO: 47) de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 41; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 49; y SEQ ID NO: 50) de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 43. En una realización particularmente preferida de la invención, el anticuerpo anti CGRP quimérico para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP es Ab5, el cual comprende, o en forma alternativa consiste en, SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 44, y posee al menos una de las actividades biológicas que se especifican en la presente memoria.

En otra realización particularmente preferida de la invención, los fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmentos de unión al antigeno) que poseen especficidad de unión por CGRP. En lo que refiere al anticuerpo Ab5, el fragmento Fab incluye la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 41 y la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 43. Esta realización de la invención asismismo contempla adiciones, deleciones, y las variantes SEQ ID NO: 41 y/o SEQ ID NO: 43 en dicho Fab mientras que mantiene la especificidad de unión por CGRP.

En una realización de la invención que se describe en la presente memoria (más adelante) , los fragmentos Fab para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP pueden producirse por digestión enzimática (por ejemplo, papaina) de Ab5. En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP tales como Ab5 o fragmentos Fab del mismo pueden producirse mediante la expresión en células mamíferas tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas de hongos, insectos o microbios tales como las células de levaduras (por ejemplo, levaduras diploides tales como Pichia diploide) y otras cepas de levaduras. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, a modo no taxativo, Pichia pastoris.

Anticuerpo Ab6 En una realización, la invención incluye anticuerpos humanizados para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia siguiente: QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYHNTYLA YQQKPGKVPKQLIYDASTLASGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO: 51) .

La invención asimismo incluye anticuerpos humanizados para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la cadena ligera que comprende la secuencia siguiente : QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYHNTYLA YQQKPGKVPKQLIYDASTLASGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF RGEC (SEQ ID NO: 52) .

La invención asismismo incluye anticuerpos humanizados para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia siguiente: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWVGVIGINGATYYAS WAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 53) .

La invención asimismo incluye anticuerpos humanizados para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la cadena pesada que comprende la secuencia siguiente : EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWVGVIGINGATYYAS WAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDARVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 54).

La invención asismismo contempla anticuerpos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que comprenden una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; y SEQ ID NO: 57, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 51 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 52, y/o una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; y SEQ ID NO: 60, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 53 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 54, o combinaciones de estas secuencias polipeptidicas. En otra realización de la invención, los anticuerpos de la invención o fragmentos de ellos comprenden, o en forma alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDRs, las secuencias de las regiones variables de las cadena pesada y ligera, y las secuencias de la cadena pesada y ligera que se especifican más arriba, incluyendo la totalidad de ellas.

La invención asimismo contempla fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP. En una realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la secuencia polipeptidica SEQ ID NO: 51 o SEQ ID NO: 52. En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la secuencia polipeptidica SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 54.

En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; y SEQ ID NO: 57, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 51 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 52.

En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que posee especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; y SEQ ID NO: 60, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 53 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 54.

La invención asimismo contempla fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP las cuales incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpo que se especifican en la presente memoria. En una realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo la totalidad de los siguientes fragmentos de anticuerpo: la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 51; la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 53; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; y SEQ ID NO: 57) de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 51; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; y SEQ ID NO: 60) de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 53. En una realización particularmente preferida de la invención, el anticuerpo anti CGRP humanizado para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP es Ab6, el cual comprende, o en forma alternativa consiste en, SEQ ID NO: 52 y SEQ ID NO: 54, y posee al menos una de las actividades biológicas que se especifican en la presente memoria.

En otra realización particularmente preferida de la invención, los fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmentos de unión al antigeno) que poseen especficidad de unión por CGRP. En lo que refiere al anticuerpo Ab6, el fragmento Fab incluye la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 51 y la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 53. Esta realización de la invención asismismo contempla adiciones, deleciones, y las variantes SEQ ID NO: 51 y/o SEQ ID NO: 53 en dicho Fab mientras que mantiene la especificidad de unión por CGRP.

En una realización de la invención que se describe en la presente memoria (más adelante) , los fragmentos Fab para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP pueden producirse por digestión enzimática (por ejemplo, papaina) de Ab6. En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP tales como Ab6 o fragmentos Fab del mismo pueden producirse mediante la expresión en células mamiferas tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas de hongos, insectos o microbios tales como las células de levaduras (por ejemplo, levaduras diploides tales como Pichia diploide) y otras cepas de levaduras. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, a modo no taxativo, Pichia pastoris.

Anticuerpo Ahí En una realización, la invención incluye anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia siguiente: QVLTQTASPVSAAVGSTVTINCQASQSVYNYNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTSTLASGVSS RFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCLGSYDCSTGDCFVFGGGTEVVVKR (SEQ ID NO: 61) .

La invención asimismo incluye anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la cadena ligera que comprende la secuencia siguiente: QVLTQTASPVSAAVGSTVTINCQASQSVYNYNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTSTLASGVSS RFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCLGSYDCSTGDCFVFGGGTEVVVKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 62) .

La invención asismismo incluye anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia siguiente: QEQLKESGGRLVTPGTSLTLTCTVSGIDLSNHYMQWVRQAPGKGLEWIGVVGINGRTYYAS WAKGRFTISRTSSTTVDLKMTRLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO: 63) .

La invención asimismo incluye anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la cadena pesada que comprende la secuencia siguiente : QEQLKESGGRLVTPGTSLTLTCTVSGIDLSNHYMQWVRQAPGKGLEWIGVVGINGRTYYAS WAKGRFTISRTSSTTVDLKMTRLTTEDTATYFCARGDI GPGTLVTVSSASTKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 64) .

La invención asismismo contempla anticuerpos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que comprenden una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 66; y SEQ ID NO: 67, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 61 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 62, y/o una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 69; y SEQ ID NO: 70, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 63 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 64, o combinaciones de estas secuencias polipeptidicas. En otra realización de la invención, los anticuerpos de la invención o fragmentos de ellos comprenden, o en forma alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDRs, las secuencias de las regiones variables de las cadena pesada y ligera, y las secuencias de la cadena pesada y ligera que se especifican más arriba, incluyendo la totalidad de ellas.

La invención asimismo contempla fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP. En una realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la secuencia polipeptidica SEQ ID NO: 61 o SEQ ID NO: 62. En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la secuencia polipeptidica SEQ ID NO: 63 o SEQ ID NO: 64.

En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 66; y SEQ ID NO: 67, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 61 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 62.

En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 69; y SEQ ID NO: 70, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 63 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 64.

La invención asimismo contempla fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP las cuales incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpo que se especifican en la presente memoria. En una realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo la totalidad de los siguientes fragmentos de anticuerpo: la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 61; la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 63; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 66; y SEQ ID NO: 67) de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 61; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 69; y SEQ ID NO: 70) de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 63. En una realización particularmente preferida de la invención, el anticuerpo anti CGRP quimérico para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP es Ab7, el cual comprende, o en forma alternativa consiste en, SEQ ID NO: 62 y SEQ ID NO: 64, y posee al menos una de las actividades biológicas que se especifican en la presente memoria.

En otra realización particularmente preferida de la invención, los fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmentos de unión al antigeno) que poseen especficidad de unión por CGRP. En lo que refiere al anticuerpo Ab7, el fragmento Fab incluye la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 61 y la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 63. Esta realización de la invención asismismo contempla adiciones, deleciones, y las variantes SEQ ID NO: 61 y/o SEQ ID NO: 63 en dicho Fab mientras que mantiene la especificidad de unión por CGRP.

En una realización de la invención que se describe en la presente memoria (más adelante) , los fragmentos Fab para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP pueden producirse por digestión enzimática (por ejemplo, papaina) de Ab7. En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP tales como Ab7 o fragmentos Fab del mismo pueden producirse mediante la expresión en células mamiferas tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas de hongos, insectos o microbios tales como las células de levaduras (por ejemplo, levaduras diploides tales como Pichia diploide) y otras cepas de levaduras. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, a modo no taxativo, Pichia pastoris.

Anticuerpo Ab8 En una realización, la invención incluye anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia siguiente: QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYNYNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSTGDCFVFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO: 71) .

La invención asimismo incluye anticuerpos humanizados para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la cadena ligera que comprende la secuencia siguiente : QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYNYNYLA YQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSTGDCFVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC ( SEQ ID NO: 72) .

La invención asismismo incluye anticuerpos humanizados para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia siguiente: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSNHY QWVRQAPGKGLEWVGVVGINGRTYYAS WAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 73) .

La invención asimismo incluye anticuerpos humanizados para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la cadena pesada que comprende la secuencia siguiente : EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSNHYMQWVRQAPGKGLEWVGVVGINGRTYYAS WAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQ D LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 74).

La invención asismismo contempla anticuerpos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que comprenden una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 76; y SEQ ID NO: 77, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 71 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 72, y/o una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 79; y SEQ ID NO: 80, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 73 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 74, o combinaciones de estas secuencias polipeptidicas. En otra realización de la invención, los anticuerpos de la invención o fragmentos de ellos comprenden, o en forma alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDRs, las secuencias de las regiones variables de las cadena pesada y ligera, y las secuencias de la cadena pesada y ligera que se especifican más arriba, incluyendo la totalidad de ellas.

La invención asimismo contempla fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP. En una realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la secuencia polipeptidica SEQ ID NO: 71 o SEQ ID NO: 72. En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la secuencia polipeptidica SEQ ID NO: 73 o SEQ ID NO: 74.

En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 76; y SEQ ID NO: 77, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 71 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 72.

En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 79; y SEQ ID NO: 80, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 73 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 74.

La invención asimismo contempla fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP las cuales incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpo que se especifican en la presente memoria. En una realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo la totalidad de los siguientes fragmentos de anticuerpo: la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 71; la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 73; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 76; y SEQ ID NO: 77) de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 71; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 79; y SEQ ID NO: 80) de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 73. En una realización particularmente preferida de la invención, the humanized anticuerpo anti CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP es Ab8, el cual comprende, o en forma alternativa consiste en, SEQ ID NO: 72 y SEQ ID NO: 74, y posee al menos una de las actividades biológicas que se especifican en la presente memoria.

En otra realización particularmente preferida de la invención, los fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmentos de unión al antigeno) que poseen especficidad de unión por CGRP. En lo que refiere al anticuerpo Ab8, el fragmento Fab incluye la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 71 y la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 73. Esta realización de la invención asismismo contempla adiciones, deleciones, y las variantes SEQ ID NO: 71 y/o SEQ ID NO: 73 en dicho Fab mientras que mantiene la especificidad de unión por CGRP.

En una realización de la invención que se describe en la presente memoria (más adelante) , los fragmentos Fab para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP pueden producirse por digestión enzimática (por ejemplo, papaina) de Ab8. En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP tales como Ab8 o fragmentos Fab del mismo pueden producirse mediante la expresión en células mamiferas tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas de hongos, insectos o microbios tales como las células de levaduras (por ejemplo, levaduras diploides tales como Pichia diploide) y otras cepas de levaduras. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, a modo no taxativo, Pichia pastoris.

Anticuerpo Ab9 En una realización, la invención incluye anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia siguiente: QVLTQTPSPVSAAVGSTVTINCQASQNVYNNNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTSTLASGVSS RFRGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCLGSYDCSRGDCFVFGGGTEVVVKR (SEQ ID NO: 81) .

La invención asimismo incluye anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la cadena ligera que comprende la secuencia siguiente : QVLTQTPSPVSAAVGSTVTINCQASQNVYNNNYLA YQQKPGQPPKQLIYSTSTLASGVSS RFRGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCLGSYDCSRGDCFVFGGGTEVVVKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO : 82) .

La invención asismismo incluye anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia siguiente: QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIGLSSYYMQ VRQSPGRGLEWIGVIGSDGKTYYATW AKGRFTISKTSSTTVDLRMASLTTEDTATYFCTRGDIWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO: 83) .

La invención asimismo incluye anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la cadena pesada que comprende la secuencia siguiente : QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIGLSSYYMQ VRQSPGRGLEWIGVIGSDGKTYYAT AKGRFTISKTSSTTVDLRMASLTTEDTATYFCTRGDIWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAP SSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 84) .

La invención asismismo contempla anticuerpos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que comprenden una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 86; y SEQ ID NO: 87, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 81 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 82, y/o una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; y SEQ ID NO: 90, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 83 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 84, o combinaciones de estas secuencias polipeptidicas. En otra realización de la invención, los anticuerpos de la invención o fragmentos de ellos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDRs, las secuencias de las regiones variables de las cadena pesada y ligera, y las secuencias de la cadena pesada y ligera que se especifican más arriba, incluyendo la totalidad de ellas.

La invención asimismo contempla fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP. En una realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, la secuencia polipeptidica SEQ ID NO: 81 o SEQ ID NO: 82. En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la secuencia polipeptidica SEQ ID NO: 83 o SEQ ID NO: 84.

En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 86; y SEQ ID NO: 87, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 81 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 82.

En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; y SEQ ID NO: 90, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 83 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO : 84.

La invención asimismo contempla fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP las cuales incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpo que se especifican en la presente memoria. En una realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo la totalidad de los siguientes fragmentos de anticuerpo: la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 81; la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 83; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 86; y SEQ ID NO: 87) de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 81; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; y SEQ ID NO: 90) de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 83. En una realización particularmente preferida de la invención, el anticuerpo anti CGRP quimérico para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP es Ab9, el cual comprende, o en forma alternativa consiste en, SEQ ID NO: 82 y SEQ ID NO: 84, y posee al menos una de las actividades biológicas que se especifican en la presente memoria.

En otra realización particularmente preferida de la invención, los fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmentos de unión al antigeno) que poseen especficidad de unión por CGRP. En lo que refiere al anticuerpo Ab9, el fragmento Fab para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP incluye la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 81 y la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 83. Esta realización de la invención asismismo contempla adiciones, deleciones, y las variantes SEQ ID NO: 81 y/o SEQ ID NO: 83 en dicho Fab mientras que mantiene la especificidad de unión por CGRP.

En una realización de la invención que se describe en la presente memoria (más adelante) , los fragmentos Fab para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP pueden producirse por digestión enzimática (por ejemplo, papaina) de Ab9. En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP tales como Ab9 o fragmentos Fab del mismo pueden producirse mediante la expresión en células mamiferas tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas de hongos, insectos o microbios tales como las células de levaduras (por ejemplo, levaduras diploides tales como Pichia diploide) y otras cepas de levaduras. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, a modo no taxativo, Pichia pastoris.

Anticuerpo AblO En una realización, la invención incluye anticuerpos humanizados para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia siguiente: QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQNVYNNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSRGDCFVFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO: 91) .

La invención asimismo incluye anticuerpos humanizados para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la cadena ligera que comprende la secuencia siguiente: QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQNVYNNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSRGDCFVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 92) .

La invención asismismo incluye anticuerpos humanizados para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia siguiente: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIGLSSYY QWVRQAPGKGLEWVGVIGSDGKTYYAT WAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCTRGDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 93) .

La invención asimismo incluye anticuerpos humanizados para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la cadena pesada que comprende la secuencia siguiente: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIGLSSYY QWVRQAPGKGLEWVGVIGSDGKTYYAT AKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCTRGDI GQGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 94).

La invención asismismo contempla anticuerpos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que comprenden una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 95; SEQ ID NO: 96; y SEQ ID NO: 97, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 91 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 92, y/o una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 99; y SEQ ID NO: 100, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 93 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 94, o combinaciones de estas secuencias polipeptidicas. En otra realización de la invención, los anticuerpos de la invención o fragmentos de ellos comprenden, o en forma alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDRs, las secuencias de las regiones variables de las cadena pesada y ligera, y las secuencias de la cadena pesada y ligera que se especifican más arriba, incluyendo la totalidad de ellas.

La invención asimismo contempla fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP. En una realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la secuencia polipeptidica SEQ ID NO: 91 o SEQ ID NO: 92. En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, la secuencia polipeptidica SEQ ID NO: 93 o SEQ ID NO: 94. En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 95; SEQ ID NO: 96; y SEQ ID NO: 97, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 91 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 92.

En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 99; y SEQ ID NO: 100, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 93 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 94.

La invención asimismo contempla fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP las cuales incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpo que se especifican en la presente memoria. En una realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo la totalidad de los siguientes fragmentos de anticuerpo: la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 91; la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 93; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 95; SEQ ID NO: 96; y SEQ ID NO: 97) de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 91; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 99; y SEQ ID NO: 100) de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 93. En una realización particularmente preferida de la invención, the humanized anticuerpo anti CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP es AblO, el cual comprende, o en forma alternativa consiste en, SEQ ID NO: 92 y SEQ ID NO: 94, y posee al menos una de las actividades biológicas que se especifican en la presente memoria.

En otra realización particularmente preferida de la invención, los fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmentos de unión al antigeno) que poseen especficidad de unión por CGRP. En lo que refiere al anticuerpo AblO, el fragmento Fab para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP incluye la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 91 y la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 93. Esta realización de la invención asismismo contempla adiciones, deleciones, y las variantes SEQ ID NO: 91 y/o SEQ ID NO: 93 en dicho Fab mientras que mantiene la especificidad de unión por CGRP.

En una realización de la invención que se describe en la presente memoria (más adelante) , los fragmentos Fab para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP pueden producirse por digestión enzimática (por ejemplo, papaina) de AblO. En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP tales como AblO o fragmentos Fab del mismo pueden producirse mediante la expresión en células mamiferas tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas de hongos, insectos o microbios tales como las células de levaduras (por ejemplo, levaduras diploides tales como Pichia diploide) y otras cepas de levaduras. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, a modo no taxativo, Pichia pastoris.

Anticuerpo Abll En una realización, la invención incluye anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia siguiente: QVLTQTASPVSPAVGSTVTINCRASQSVYYNNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTSTLASGVSS RFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCLGSYDCSNGDCFVFGGGTEVVVKR (SEQ ID NO: 101).

La invención asimismo incluye anticuerpos quiméricos que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la cadena ligera que comprende la secuencia siguiente : QVLTQTASPVSPAVGSTVTINCRASQSVYYNNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTSTLASGVSS RFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCLGSYDCSNGDCFVFGGGTEVVVKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 102) .

La invención asismismo incluye anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia siguiente: QSLEESGGRLVTPGGSLTLTCTVSGIDVTNYYMQWVRQAPGKGLE IGVIGVNGKRYYASW AKGRFTISKTSSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO: 103) .

La invención asimismo incluye anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la cadena pesada que comprende la secuencia siguiente : QSLEESGGRLVTPGGSLTLTCTVSGIDVTNYY QWVRQAPGKGLE IGVIGVNGKRYYASW AKGRFTISKTSSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAP SSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE TKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR QQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 104) .

La invención asismismo contempla anticuerpos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que comprenden una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 106; y SEQ ID NO: 107, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 101 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 102, y/o una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 109; y SEQ ID NO: 110, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 103 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 104, o combinaciones de estas secuencias polipeptidicas. En otra realización de la invención, los anticuerpos de la invención o fragmentos de ellos comprenden, o en forma alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDRs, las secuencias de las regiones variables de las cadena pesada y ligera, y las secuencias de la cadena pesada y ligera que se especifican más arriba, incluyendo la totalidad de ellas.

La invención asimismo contempla fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP. En una realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la secuencia polipeptídica SEQ ID NO: 101 o SEQ ID NO: 102. En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la secuencia polipeptídica SEQ ID NO: 103 o SEQ ID NO: 104. En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 106; y SEQ ID NO: 107, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 101 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 102.

En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 109; y SEQ ID NO: 110, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 103 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 104.

La invención asimismo contempla fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP las cuales incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpo que se especifican en la presente memoria. En una realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo la totalidad de los siguientes fragmentos de anticuerpo: la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 101; la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 103; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 106; y SEQ ID NO: 107) de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 101; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 109; y SEQ ID NO: 110) de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 103.

En una realización particularmente preferida de la invención, el anticuerpo anti CGRP quimérico para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP es Abll, el cual comprende, o en forma alternativa consiste en, SEQ ID NO: 102 y SEQ ID NO: 104, y posee al menos una de las actividades biológicas que se especifican en la presente memoria.

En otra realización particularmente preferida de la invención, los fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmentos de unión al antigeno) que poseen especficidad de unión por CGRP. En lo que refiere al anticuerpo Abll, el fragmento Fab para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP incluye la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 101 y la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 103. Esta realización de la invención asismismo contempla adiciones, deleciones, y las variantes SEQ ID NO: 101 y/o SEQ ID NO: 103 en dicho Fab mientras que mantiene la especificidad de unión por CGRP.

En una realización de la invención que se describe en la presente memoria (más adelante) , los fragmentos Fab para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP pueden producirse por digestión enzimática (por ejemplo, papaina) de Abll. En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP tales como Abll o fragmentos Fab del mismo pueden producirse mediante la expresión en células mamiferas tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas de hongos, insectos o microbios tales como las células de levaduras (por ejemplo, levaduras diploides tales como Pichia diploide) y otras cepas de levaduras. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, a modo no taxativo, Pichia pastoris.

Anticuerpo Abl2 En una realización, la invención incluye anticuerpos humanizados para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia siguiente: QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCRASQSVYYNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSNGDCFVFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO: 111) .

La invención asimismo incluye anticuerpos humanizados para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la cadena ligera que comprende la secuencia siguiente : QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCRASQSVYYNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSNGDCFVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 112).

La invención asismismo incluye anticuerpos humanizados que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia siguiente: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDVTNYYMQ VRQAPGKGLEWVGVIGVNGKRYYAS WAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 113) .

La invención asimismo incluye anticuerpos humanizados para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la cadena pesada que comprende la secuencia siguiente : EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDVTNYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGVNGKRYYAS AKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 114) .

La invención asismismo contempla anticuerpos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que comprenden una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 115; SEQ ID NO: 116; y SEQ ID NO: 117, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 111 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 112, y/o una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 118; SEQ ID NO: 119; y SEQ ID NO: 120, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 113 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 114, o combinaciones de estas secuencias polipeptidicas. En otra realización de la invención, los anticuerpos de la invención o fragmentos de ellos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDRs, las secuencias de las regiones variables de las cadena pesada y ligera, y las secuencias de la cadena pesada y ligera que se especifican más arriba, incluyendo la totalidad de ellas.

La invención asimismo contempla fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP. En una realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, la secuencia polipeptidica SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112. En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la secuencia polipeptidica SEQ ID NO: 113 o SEQ ID NO: 114. En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 115; SEQ ID NO: 116; y SEQ ID NO: 117, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 111 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 112.

En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 118; SEQ ID NO: 119; y SEQ ID NO: 120, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 113 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 114.

La invención asimismo contempla fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP las cuales incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpo que se especifican en la presente memoria. En una realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo la totalidad de los siguientes fragmentos de anticuerpo: la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 111; la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 113; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 115; SEQ ID NO: 116; y SEQ ID NO: 117) de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 111; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 118; SEQ ID NO: 119; y SEQ ID NO: 120) de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 113.

En una realización particularmente preferida de la invención, the humanized anticuerpo anti CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP es Abl2, el cual comprende, o en forma alternativa consiste en, SEQ ID NO: 112 y SEQ ID NO: 114, y posee al menos una de las actividades biológicas que se especifican en la presente memoria.

En otra realización particularmente preferida de la invención, los fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmentos de unión al antigeno) que poseen especficidad de unión por CGRP. En lo que refiere al anticuerpo Abl2, el fragmento Fab para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP incluye la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 111 y la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 113. Esta realización de la invención asismismo contempla adiciones, deleciones, y las variantes SEQ ID NO: 111 y/o SEQ ID NO: 113 en dicho Fab mientras que mantiene la especificidad de unión por CGRP.

En una realización de la invención que se describe en la presente memoria (más adelante) , los fragmentos Fab para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP pueden producirse por digestión enzimática (por ejemplo, papaina) de Abl2. En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP tales como Abl2 o fragmentos Fab del mismo pueden producirse mediante la expresión en células mamiferas tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas de hongos, insectos o microbios tales como las células de levaduras (por ejemplo, levaduras diploides tales como Pichia diploide) y otras cepas de levaduras. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, a modo no taxativo, Pichia pastoris.

Anticuerpo Abl3 En una realización, la invención incluye anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia siguiente: AIVMTQTPSSKSVPVGDTVTINCQASESLYNNNALAWFQQKPGQPPKRLIYDASKLASGVP SRFSGGGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCGGYRSDSVDGVAFAGGTEVVVKR (SEQ ID NO: 121) .

La invención asimismo incluye anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la cadena ligera que comprende la secuencia siguiente: AIVMTQTPSSKSVPVGDTVTINCQASESLYNNNALAWFQQKPGQPPKRLIYDASKLASGVP SRFSGGGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCGGYRSDSVDGVAFAGGTEVVVKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 122) .

La invención asismismo incluye anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia siguiente: QSVEESGGGLVQPEGSLTLTCTASGFDFSSNAMWWVRQAPGKGLEWIGIIYNGDGSTYYAS WVNGRFSISKTSSTTVTLQLNSLTVADTATYYCARDLDLWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO: 123) .

La invención asimismo incluye anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la cadena pesada que comprende la secuencia siguiente : QSVEESGGGLVQPEGSLTLTCTASGFDFSSNAMWWVRQAPGKGLEWIGCIYNGDGSTYYAS VNGRFSISKTSSTTVTLQLNSLTVADTATYYCARDLDLWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQ D LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE TKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 124).

La invención asismismo contempla anticuerpos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que comprenden una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 125; SEQ ID NO: 126; y SEQ ID NO: 127, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 121 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 122, y/o una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 128; SEQ ID NO: 129; y SEQ ID NO: 130, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 123 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 124, o combinaciones de estas secuencias polipeptidicas. En otra realización de la invención, los anticuerpos de la invención o fragmentos de ellos comprenden, o en forma alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDRs, las secuencias de las regiones variables de las cadena pesada y ligera, y las secuencias de la cadena pesada y ligera gue se especifican más arriba, incluyendo la totalidad de ellas.

La invención asimismo contempla fragmentos del anticuerpo para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP. En una realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la secuencia polipeptidica SEQ ID NO: 121 o SEQ ID NO: 122. En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la secuencia polipeptidica SEQ ID NO: 123 o SEQ ID NO: 124.

En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 125; SEQ ID NO: 126; y SEQ ID NO: 127, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 121 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 122.

En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 128; SEQ ID NO: 129; y SEQ ID NO: 130, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 123 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 124.

La invención asimismo contempla fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP las cuales incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpo que se especifican en la presente memoria. En una realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo la totalidad de los siguientes fragmentos de anticuerpo: la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 121; la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 123; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 125; SEQ ID NO: 126; y SEQ ID NO: 127) de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 121; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 128; SEQ ID NO: 129; y SEQ ID NO: 130) de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 123.

En una realización particularmente preferida de la invención, el anticuerpo anti CGRP quimérico para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP es Abl3, el cual comprende, o en forma alternativa consiste en, SEQ ID NO: 122 y SEQ ID NO: 124, y posee al menos una de las actividades biológicas que se especifican en la presente memoria.

En otra realización particularmente preferida de la invención, los fragmentos de anticuerpo comprenden, o en forma alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmentos de unión al antigeno) que poseen especficidad de unión por CGRP. En lo que refiere al anticuerpo Abl3, el fragmento Fab para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP incluye la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 121 y la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 123. Esta realización de la invención asismismo contempla adiciones, deleciones, y las variantes SEQ ID NO: 121 y/o SEQ ID NO: 123 en dicho Fab mientras que mantiene la especificidad de unión por CGRP.

En una realización de la invención que se describe en la presente memoria (más adelante) , los fragmentos Fab para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP pueden producirse por digestión enzimática (por ejemplo, papaina) de Abl3. En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP tales como Abl3 o fragmentos Fab del mismo pueden producirse mediante la expresión en células mamíferas tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas de hongos, insectos o microbios tales como las células de levaduras (por ejemplo, levaduras diploides tales como Pichia diploide) y otras cepas de levaduras. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, a modo no taxativo, Pichia pastoris.

Anticuerpo Abl4 En una realización, la invención incluye anticuerpos humanizados para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia siguiente: QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQNVYNNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSRGDCFVFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO: 131) .

La invención asimismo incluye anticuerpos humanizados para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la cadena ligera que comprende la secuencia siguiente : QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQNVYNNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSRGDCFVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 132) .

La invención asismismo incluye anticuerpos humanizados para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia siguiente: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIGLSSYY QWVRQAPGKGLEWVGVIGSDGKTYYAT AKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCTRGDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 133) .

La invención asimismo incluye anticuerpos humanizados para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que poseen especificidad en la unión a CGRP y que poseen una secuencia de la cadena pesada que comprende la secuencia siguiente : EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIGLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGSDGKTYYAT WAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCTRGDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDARVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEY CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR QQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 134).

La invención asismismo contempla anticuerpos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que comprenden una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 135; SEQ ID NO: 136; y SEQ ID NO: 137, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 131 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 132, y/o una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 138; SEQ ID NO: 139; y SEQ ID NO: 140, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 133 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 134, o combinaciones de estas secuencias polipeptidicas. En otra realización de la invención, los anticuerpos de la invención o fragmentos de ellos comprenden, o en forma alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDRs, las secuencias de las regiones variables de las cadena pesada y ligera, y las secuencias de la cadena pesada y ligera que se especifican más arriba, incluyendo la totalidad de ellas.

La invención asimismo contempla fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP. En una realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, la secuencia polipeptidica SEQ ID NO: 131 o SEQ ID NO: 132. En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la secuencia polipeptidica SEQ ID NO: 133 o SEQ ID NO: 134. En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 135; SEQ ID NO: 136; y SEQ ID NO: 137, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 131 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 132.

En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptidicas SEQ ID NO: 138; SEQ ID NO: 139; y SEQ ID NO: 140, las cuales corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 133 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 134.

La invención asimismo contempla fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP las cuales incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpo que se especifican en la presente memoria. En una realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo que poseen especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo la totalidad de los siguientes fragmentos de anticuerpo: la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 131; la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 133; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 135; SEQ ID NO: 136; y SEQ ID NO: 137) de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 131; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 138; SEQ ID NO: 139; y SEQ ID NO: 140) de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 133.

En una realización particularmente preferida de la invención, the humanized anticuerpo anti CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP es Abl4, el cual comprende, o en forma alternativa consiste en, SEQ ID NO: 132 y SEQ ID NO: 134, y posee al menos una de las actividades biológicas que se especifican en la presente memoria.

En otra realización particularmente preferida de la invención, los fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmentos de unión al antigeno) que poseen especficidad de unión por CGRP. En lo que refiere al anticuerpo Abl4, el fragmento Fab incluye la secuencia de la región variable de~ la cadena ligera SEQ ID NO: 131 y la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 133. Esta realización de la invención asismismo contempla adiciones, deleciones, y las variantes SEQ ID NO: 131 y/o SEQ ID NO: 133 en dicho Fab mientras que mantiene la especificidad de unión por CGRP.

En una realización de la invención que se describe en la presente memoria (más adelante) , los fragmentos Fab para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP pueden producirse por digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Abl4. En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP tales como Abl4 o fragmentos Fab del mismo pueden producirse mediante la expresión en células mamiferas tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas de hongos, insectos o microbios tales como las células de levaduras (por ejemplo, levaduras diploides tales como Pichia diploide) y otras cepas de levaduras. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, a modo no taxativo, Pichia pastoris.

En otra realización, los fragmentos de anticuerpo puede estar presente en una o más de the following non-limiting forms: Fab, Fab', F(ab')2, Fv y single chain Fv anticuerpo forms. En una realización preferida, los anticuerpos anti CGRP gue se describen en la presente memoria para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP further comprende the kappa constant secuencia de la cadena ligera gue comprende la secuencia siguiente: VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKD STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 283) .

In otra realización preferida, los anticuerpos anti CGRP que se describen en la presente memoria para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP further comprende the gamma-1 constant secuencia polipeptidica de la cadena pesada que comprende la secuencia siguiente: ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS NSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 284).

En otra realización, la invención contempla an isolated anticuerpo anti CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP comprising una secuencia polipeptidica de la región variable de la cadena pesada a seleccionar de: SEQ ID NO: 3, 13, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123, o 133, o una variante de ellas; y further comprising una secuencia polipeptidica de la región variable de la cadena ligera a seleccionar de: SEQ ID NO: 1, 11, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, o 131, o una variante de ellas, donde uno o más de los framework residues (residuo FRs) in said VH o VL polypeptide se ha sustituido con otro amino acid residue que resulta en an anticuerpo anti CGRP that se une en forma especifica CGRP. La invención contempla humanized y chimeric forms de these anticuerpos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP. El anticuerpos quiméricos may include an Fe derived from IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, IgG6, IgG7, IgG8, IgG9, IgGlO, IgGll, IgG12, IgG13, IgG14, IgG15, IgG16, IgG17, IgG18 o IgG19 constant regions.

En una realización de la invención, los anticuerpos o VH o VL polypeptides para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP origínate o se seleccionan a partir de one o more rabbit B cell populations previo a initiation de the humanization process referenced herein.

En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP y fragmentos de ellos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP do not have especificidad de unión por CGRP-R. En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP y fragmentos de ellos inhibit the association de CGRP con CGRP-R. En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP y fragmentos de ellos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP inhibit the association de CGRP con CGRP-R y/o additional proteins y/o multimers thereof, y/o antagonizes the biological effects thereof.

As stated in paragraph

[0127] herein, anticuerpos y fragments thereof para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP may be modified post-translationally to add effector moieties como, por ejemplo, chemical linkers, detectable moieties como, por ejemplo, fluorescent dyes, enzymes, substrates, bioluminescent materials, radioactive materials, y chemiluminescent moieties, o functional moieties como, por ejemplo, streptavidin, avidin, biotin, a cytotoxin, a cytotoxic agent, y radioactive materials.

Antibodies o fragments thereof may asimismo be chemically modified to provide additional advantages como, por ejemplo, increased solubility, stability y circulating time (in vivo vida media) de the polypeptide, o decreased immunogenicity (See U.S. Pat . No. 4, 179, 337). The chemical moieties for derivitization se seleccionan a partir de water soluble polymers como, por ejemplo, polyethylene glycol, ethylene glycol/propylene glycol copolymers, carboxymethylcellulose, dextran, polyvinyl alcohol y similares. El anticuerpos y fragments thereof may be modified at random positions within the molecule, o at predetermined positions within the molecule y may include uno, dos, tres o más attached chemical moieties .

The polymer may be de any molecular weight, y may be branched o unbranched. For polyethylene glycol, the preferred peso molecular is entre alrededor de 1 kDa y alrededor de 100 kDa (the term "alrededor de" indicating that in preparations de polyethylene glycol, some molecules will weigh more, some less, than the stated molecular weight) for ease in handling y manufacturing. Other sizes may be used, depending on the desired therapeutic profile (por ejemplo, the duration de sustained reléase desired, the effects, if any on biological activity, the ease in handling, the degree o lack de antigenicity y other known effects de the polyethylene glycol to a therapeutic protein o analog) . Por ejemplo, the polyethylene glycol may have an average peso molecular de alrededor de 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10,000, 10,500, 11,000, 11,500, 12,000, 12,500, 13, 000, 13, 500, 14, 000, 14, 500, 15, 000, 15,500, 16, 000, 16, 500, 17, 000, 17, 500, 18, 000, 18, 500, 19,000, 19, 500, 20, 000, 25, 000, 30, 000, 35, 000, 40, 000, 50,000, 55, 000, 60, 000, 65, 000, 70, 000, 75, 000, 80, 000, 85,000, 90, 000, 95,000, o 100,000 kDa. Branched polyethylene glycols are described, por ejemplo, in U.S. Pat . No. 5, 643,575; orpurgo et al., Appl . Biochem. Biotechnol. 56:59-72 (1996); Vorobjev et al., Nucleosides Nucleotides 18:2745-2750 (1999); y Caliceti et al., Bioconjug. Chem. 10:638-646 (1999), the disclosures de each de which are incorporated herein by reference .

Hay a number de attachment Métodos available to those skilled in the art, See por ejemplo, EP 0 401 384, herein incorporated by reference (coupling PEG to G-CSF) , See asimismo Malik et al., Exp. Hematol. 20:1028-1035 (1992) (reporting pegylation de GM-CSF using tresyl chloride) . Por ejemplo, polyethylene glycol may be covalently bound through amino acid residues via a reactive group, como, por ejemplo,, a free amino o carboxyl group. Reactive groups are those to which an activated polyethylene glycol molecule may be bound. The amino acid residues having a free amino group may include lysine residues y the N-terminal amino acid residues; those having a free carboxyl group may include aspartic acid residues glutamic acid residues y the C-terminal amino acid residue. Sulfhydryl groups may asimismo be used as a reactive group for attaching the polyethylene glycol molecules. Preferred for therapeutic purposes is attachment at an amino group, como, por ejemplo, attachment at the N-terminus o lysine group.

As suggested above, polyethylene glycol may be attached to proteins via linkage to any de a number de amino acid residues. Por ejemplo, polyethylene glycol can be linked to polypeptides via covalent bonds to lysine, histidine, aspartic acid, glutamic acid, o cysteine residues. One o more reaction chemistries may be employed to attach polyethylene glycol to specific amino acid residues (por ejemplo, lysine, histidine, aspartic acid, glutamic acid, o cysteine) o to more than one type de amino acid residue (por ejemplo, lysine, histidine, aspartic acid, glutamic acid, cysteine y combinations thereof) .

En forma alternativa, anticuerpos o fragments thereof para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP may have increased in vivo half lives via fusión con albumin (including but not limited to recombinant human serum albumin o fragments o variants thereof (Ver, por ejemplo, U.S. Pat. No. 5, 876, 969, issued Mar. 2, 1999, EP Patent 0 413 622, y U.S. Pat. No. 5,766,883, issued Jun. 16, 1998, herein incorporated by reference in their entirety) ) o other circulating blood proteins como, por ejemplo, transferrin o ferritin. En una realización preferida, polypeptides y/o anticuerpos de la presente invención (including fragments o variants thereof) are fused con the mature form de human serum albumin (es decir, amino acids 1-585 de human serum albumin as shown in FIGS. 1 y 2 de EP Patent 0 322 094) which se incorpora por referencia en la presente memoria en su totalidad. Polynucleotides encoding fusión proteins de la invención are asimismo encompassed by la invención.

Regarding detectable moieties, further exemplary enzymes include, a modo no taxativo, horseradish peroxidase, acetylcholinesterase, alkaline phosphatase, beta-galactosidase y luciferase. Further exemplary fluorescent materials include, a modo no taxativo, rhodamine, fluorescein, fluorescein isothiocyanate, umbelliferone, dichlorotriazinylamine, phycoerythrin y dansyl chloride. Further exemplary chemiluminescent moieties include, a modo no taxativo, luminol. Further exemplary bioluminescent materials include, a modo no taxativo, luciferin y aequorin. Further exemplary radioactive materials include, a modo no taxativo, Iodine 125 (1251), Carbón 14 (14C), Sulfur 35 (35S), Tritium (3H) y Phosphorus 32 (32P) .

Regarding functional moieties, exemplary cytotoxic agents include, a modo no taxativo, methotrexate , aminopterin, 6-mercaptopurine, 6-thioguanine, cytarabine, 5-fluorouracil decarbazine; alkylating agents como, por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalán, carmustina (BSNU) , mitomicina C, lomustina (CCNü) , 1 - metilnitrosourea, ciclofosfamida, mecloretamina, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, cis - diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino y carboplatino (paraplatino) ; las antraciclinas incluyen daunorubicina (antes daunomicina) , doxorrubicina (adriamicina) , detorubicina, carminomicina, idarubicina, epirubicina, mitoxantrona y bisantreno, los antibióticos incluyen dactinomicina (actinomicina D) , bleomicina, caliqueamicina, mitramicina, y antramicina (AMC) , y agentes antimitóticos como, por ejemplo, los alcaloides de la vinca, vincristina y vinblastina. Otros agentes citotoxicos incluyen el paclitaxel (taxol) , ricina, exotoxina de pseudomonas, gemcitabina, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, etopósido, tenopósido, colchicina, dihidroxi antracin diona , 1 deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaina, tetracaina, lidocaina, propranolol, puromicina, procarbazina, hidroxiurea, asparraginasa, corticosteroides, mitotano (?,?'- (DDD) ) , interferones, y mezclas de estos agentes citotoxicos. Further cytotoxic agents include, a modo no taxativo, chemotherapeutic agents como, por ejemplo, carboplatin, cisplatin, paclitaxel, gemcitabine, calicheamicin, doxorubicin, 5-fluorouracil , mitortiycin C, actinomycin D, cyclophosphamide, vincristine y bleomycin. Toxic enzymes from plants y bacteria como, por ejemplo, ricin, diphtheria toxin y Pseudomonas toxin may be conjugated to the humanized o anticuerpos quiméricos, o binding fragments thereof, para generar cell-type-specific-killing reagents (Youle, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:5483 (1980); Gilliland, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:4539 (1980); Krolick, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:5419 (1980)).

Other cytotoxic agents include cytotoxic ribonucleases as described by Goldenberg in U.S. Pat . No. 6,653,104. Embodiments de la invención asimismo relate to radioimmunoconj ugates where a radionuclide that emits alpha o beta partióles is stably coupled to the anticuerpo, o binding fragments thereof, con o without el uso de a complex-forming agent. Such radionuclides include beta-emitters como, por ejemplo, Phosphorus-32 (32P), Scandium-47 (47Sc), Copper-67 (67Cu), Gallium-67 (67Ga), Yttrium-88 (88Y), Yttrium-90 (90Y), Iodine-125 (1251), Iodine-131 (1311), Samarium-153 (153Sm), Lutetium-177 (177Lu) , Rhenium-186 (186Re) o Rhenium-188 (188Re), y alpha-emitters como, por ejemplo, Astatine-211 (211At), Lead-212 (212Pb) , Bismuth-212 (212BÍ) o -213 (213BÍ) o Actinium-225 (225Ac) .

Métodos are known in the art for conjugating an anticuerpo o binding fragment thereof to a detectable moiety y similares, como, por ejemplo, those Métodos described by Hunter et al, Nature 144:945 (1962); David et al, Biochemistry 13:1014 (1974); Pain et al, J. Immunol . Meth. 40:219 (1981); y Nygren, J. , Histochem. y Cytochem. 30:407 (1982).

Embodiments described herein further include variants y equivalente that are substantially homologous to the antibodies, los fragmentos de anticuerpo, diabodies, SMIPs, camelbodies, nanobodies, IgNAR, polypeptides, regiones variables y CDRs que se especifican en la presente memoria. These may contain, por ejemplo, conservadora substitution mutations, (es decir, the substitution de one o more amino acids by similar amino acids) . Por ejemplo, conservadora substitution se refiere a the substitution de an amino acid con another within la misma general class, por ejemplo, un aminoácido ácido con otro aminoácido ácido, un aminoácido básico con otro aminoácido básico, o un aminoácido neutro by otro aminoácido neutro. What is intended by a sustitución de aminoácidos conservadora es bien conocido en la técnica.

En otra realización, la invención contempla secuencias de polipéptidos que poseen al menos 90% o mayor homología de secuencia a cualquiera o cualesquiera de las secuencias polipeptidicas fragmentos de anticuerpo, regiones variables y CDRs que se especifican en la presente memoria. Más preferentemente, la invención contempla secuencias de polipéptidos que poseen al menos 95% o mayor homología de secuencia, incluso más preferentemente al menos 98% o mayor homología de secuencia, y aun más preferentemente al menos 99% o mayor homología de secuencia a cualquiera o cualesquiera de las secuencias polipeptidicas fragmentos de anticuerpo, regiones variables y CDRs que se especifican en la presente memoria. Los métodos para determiner la homología entre secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos son bien conocidos por cualquiera versado en la técnica.

En otra realización, la invención asismismo contempla polipéptidos homólogos de los antemencionados fragmentos de anticuerpo, regiones variables y CDRs que se especifican en la presente memoria que asimismo poseen actividad anti CGRP. Algunos ejemplos no taxativos de la actividad anti CGRP se describen en la presente memoria, por ejemplo, en los párrafos

[0329] -

[0350] más adelante.

En otra realización, la invención asismismo contempla la generación y el uso de anticuerpos anti idiotípicos que se unen a cualquiera de las secuencias anteriores. En una realización ej emplificativa, dicho anticuerpo anti idiotípico podría administrarse a un sujeto que ha recibido un anticuerpo anti CGRP para modular, disminuir o neutralizar el efecto del anticuerpo anti CGRP. Dichos anticuerpos anti idiotipicos podrían asimismo ser utilizados para el tratamiento de una enfermedad autoinmune que se caracteriza por la presencia de anticuerpos anti CGRP. Otro uso ejemplificativo de dichos anticuerpos anti idiotipicos e la detección de los anticuerpos anti CGRP de la presente invención, por ejemplo, para moitorear los niveles de los anticuerpos anti CGRP que se encuentran presentes en la sangre u otros fluidos corporales de un sujeto.

La presente invención asimismo contempla anticuerpos anti CGRP que comprenden la sustitución de cualquiera de las secuencias de polipéptidos o polinucleótidos que se describen en la presente memoria por cualquiera de las otras secuencias de polinucleótidos que se describen en la presente memoria. Por ejemplo, a modo no taxativo, la presente invención contempla anticuerpos que comprenden la combinación de cualquiera de las secuencias de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada que se describen en la presente memoria, y asimismo contempla anticuerpos que derivan de la sustitución de cualquiera de las secuencias de CDR que se describen en la presente memoria por cualquiera de las otras secuencias de CDR que se describen en la presente memoria. Realizaciones de la invención ejewplificativas adicionales En otra realización, la invención contempla uno o más anticuerpos anti CGRP humano o fragmentos de anticuerpo de ellos para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP el cual se une en forma especifican al mismo epitopo(s) lineal o conformacional y/o compite por la unión al mismo epitopo(s) lineal o conformacional en un polipéptido CGRP humano intacto o fragmento de éste como un anticuerpo anti CGRP humano seleccionado a partir de Abl, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6f Ab7, Ab8, Ab9, AblO, Abll, Abl2, Abl3, o Abl4. En una realización preferida, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti CGRP humano del mismo se une en forma especifica al mismo epitopo(s) lineal o conformacional y/o compite por la unión al mismo epitopo(s) lineal o conformacional en un polipéptido CGRP humano intacto o un fragmento de éste como Ab3, Ab6, Abl3, Abl2 o Abl4.

Una realización preferida de la invención se refiere a anticuerpos quiméricos o humanizados y fragmentos de ellos (incluidos los fragmentos Fab) que poseen especificidad de unión por CGRP y que inhiben las actividades biológicas mediadas por la unión de CGRP al receptor de CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP. En una realización particularmente preferida de la invención, los anticuerpos anti CGRP quiméricos o humanizados para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP se seleccionan a partir de Ab3, Ab6, AblO, Abl3, o Abl4.

A una realización preferida de la invención se refiere a métodos para la identificación de anticuerpos y fragmentos de ellos (incluidos los fragmentos Fab) que posee especificidad en la unión a un péptido relacionado con el gen Calcitonin humano (en adelante "CGRP") en modelos de animales para determinar los efectos in vivo de los mismos, en especial su capacidad para neutralizar los efectos colaterales adversos de CGRP incluida la diarrea asociada a CGRP y para tratar las condiciones que invlucran un exceso de CGRP.

Otra realización preferida más especifica de la invención involucra un método para evaluar la eficacia potencial in vivo de un anticuerpo o fragmento de anti CGRP humano candidato el cual comprende determinar si el anticuerpo inhibe la diarrea asociada a CGRP en comparación a un roedor al que se administra CGRP en la ausencia de un anticuerpo CGRP o fragmento de anticuerpo candidato.

A una realización preferida más especifica de la invención involucra un método para evaluar la eficacia potencial in vivo de un anticuerpo o fragmento de anti CGRP humano candidato para tratar una condición neurológica caracterizada por el aumento en los niveles de CGRP.

Otra realización preferida más especifica de la invención involucra un método para evaluar la eficacia potencial in vivo de un anticuerpo o fragmento de anti CGRP humano candidato para tartar un trastorno asociado a CGRP asociado con la diarrea diarrea como, por ejemplo, migraña o migraña crónica, (con o sin aura) , pérdida de peso, cáncer o tumores, la angiogénesis asociada con el cáncer o crecimiento tumoral, la angiogénesis asociada con el cáncer o la supervivencia del tumor, migrañas hemipléj icas , dolores de cabeza en racimo, neuralgia migrañosa, dolores de cabeza crónicos, dolores de cabeza tensionales, dolores de cabeza generales, sofocos, hemicránea paroxistica crónica, dolores de cabeza secundarios debido a un problema estructural subyacente en la cabeza o el cuello, neuralgias craneales, cefaleas sinusales (como, por ejemplo, asociado con sinusitis), cefaleas o migrañas inducidas por alergia, dolor, dolor inflamatorio, dolor por incisión post-operatoria, síndrome de dolor regional complejo, dolor por cáncer, dolor por cáncer de huesos primario o metastásico, dolor por fractura, dolor crónico, dolor por fractura osteoporótica, dolor resultante de quemaduras, osteoporosis , dolor de articulaciones por gota, dolor abdominal, dolor asociado con la crisis de células falciformes, y otros dolores nocicépticos, así como carcinoma hepatocelular , cáncer de mama , cirrosis hepática , dolor neurogénico , dolor neuropático , dolor nociceptico , neuralgia del trigémino , neuralgia post - herpética , dolor de miembro fantasma , fibromialgia , dolor menstrual , ovarialgia , distrofia simpática refleja , dolor neurogénico , dolor de la osteoartritis o la artritis reumatoide , lumbago , neuropatía diabética, ciática , o dolor o dolor visceral asociado con: reflujo gastroesofágico, dispepsia, síndrome de colon irritable, colon irritable, colon espástico, colitis mucosa, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, ileítis, colitis ulcerosa, cólico renal, dismenorrea, cistitis, período menstrual, parto, menopausia, prostatitis, pancreatitis, cólico renal , dismenorrea , cistitis , incluyendo la cistitis intersticial (IC), cirugía asociada con el íleo, diverticulitis, peritonitis, pericarditis, hepatitis, apendicitis , colitis, colecistitis, endometriosis, pancreatitis crónica y / o aguda, infarto de miocardio, dolor de riñon, dolor pleural , prostatitis, dolor pélvico, traumatismo en un órgano, dolor nociceptivo crónico, dolor neuropático crónico, dolor inflamatorio crónico, fibromialgia, dolor irruptivo y dolor persistente .

Otra realización preferida más específica de la invención involucra un método para utilizer un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti CGRP humano para tratar un trastorno asociado a CGRP asociado con la diarrea donde la condición es dolor por cáncer derivado de malignidad o de cáncer preferentemente a partir de uno o más de: adenocarcinoma en el tejido glandular, blastoma en el tejido embrionario de órganos, carcinoma en el tejido epitelial, la leucemia en los tejidos que forman las células sanguíneas, linfoma de tejido linfático, mieloma en la médula ósea, el sarcoma de tejido de soporte o conectivo, cáncer suprarrenal, linfoma relacionado con el SIDA, la anemia, cáncer de vejiga, cáncer de hueso, cáncer de cerebro, cáncer de mama, tumores carcinoides, cáncer de cuello uterino, Quimioterapia, cáncer de colon, citopenia, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer de cabeza, cáncer de cuello, cáncer hepatobiliar, cáncer de riñon, leucemia, gastric cáncer, head cáncer, neck cáncer, hepatobiliary cáncer, kidney cáncer, leukemia, cáncer de hígado, cáncer de pulmón , linfoma , enfermedad de Hodgkin , linfoma , linfoma no Hodgkin , tumores del sistema nervioso , cáncer oral , cáncer de ovario , cáncer de páncreas , cáncer de próstata , cáncer de recto , cáncer de piel , cáncer de estómago , cáncer testicular , cáncer de tiroides , cáncer de la uretra , cáncer de hueso , cáncer de los sarcomas del tejido conectivo , cáncer del tejido óseo , cáncer de las células formadoras de sangre , cáncer de la médula ósea , mieloma múltiple, leucemia, cáncer de hueso primario o secundario , los tumores que metastatizan al hueso , tumores que infiltran el nervio y viscera hueca , tumores cerca de las estructuras neurales . Más preferentemente el dolor por cáncer comprende el dolor visceral, preferentemente dolor visceral que surge de cáncer de páncreas y / o metástasis en el abdomen. Más preferentemente el dolor por cáncer comprende dolor somático preferentemente debido a uno o más de cáncer de hueso , la metástasis en el hueso , el dolor postquirúrgico , el cáncer de los sarcomas del tejido conectivo , cáncer del tejido óseo , cáncer de células formadoras de sangre de la médula ósea , mieloma múltiple , leukemia, cáncer de hueso primario o secundario .

Otra realización preferida de la invención se refiere a métodos para inhibir, prevenir o tratar diarrea y/o mantener el balance de electrolitos y los niveles de fluidos en los intestinos de un sujeto que posee una condición asociada con el aumento de los niveles de CGRP, el cual ocasionan diarrea y/o un aumento en el flujo de electrolitos y fluidos de los intestinos, los cuales comprenden administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo anti CGRP o fragmento de anticuerpo anti CGRP.

En relación a lo anterior, otra realización preferida de la invención específicamente se refiere a métodos para tratar o prevenir la diarrea en individuos con trastornos funcionales del intestino o una enfermedad inflamatoria intestinal, diarrea bacteriana o viral, el cáncer asociado con la diarrea, como, por ejemplo, carcinoma medular de la tiroides o cáncer colorrectal, y trastornos intestinales más específicamente funcionales o enfermedades inflamatorias del intestino, incluyendo a modo de ejemplo, reflujo gastro-esofágico, dispepsia, síndrome del intestino irritable, síndrome de dolor abdominal funcional, diverticulosis , diverticulitis y o enfermedad inflamatoria del intestino se selecciona a partir del conjunto que consiste en enfermedad de Crohn, ileitis, colitis colagenosa, colitis linfocítica, y colitis ulcerosa donde estas terapias administran una cantidad efectiva de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti CGRP humano el cual se administra como monoterapia o en combinación con otro agente activo.

Otras realizaciones preferidas de la presente invención se refieren a ensayos de screening y el uso terapéutico anticuerpos y fragmentos de anticuerpos específicos que poseen especificidad de unión por CGRP, en particular anticuerpos que poseen el nivel deseado de especificidad por el epítopo, alta afinidad o avidez y/o propiedades funcionales. En realizaciones preferidas la presente invención se refiere a ensayos y al la secuencias de polipéptidos VH, VL y CDR que se describen en la presente memroia, y los polinucleótidos que codifican para ellas. Una realización preferida de la invención se refiere a anticuerpos quiméricos o humanizados y fragmentos de ellos (incluidos los fragmentos Fab) capaces de unirse a CGRP y/o inhibir las actividades biológicas mediadas por la unión de CGRP al receptor de CGRP ("CGRP-R") .

En otra realización de la invención se contempla un método para aliviar, tratar o prevenir enfermedades o trastornos asociados con CGRP entre los que se incluye la diarrea como efecto colateral adverso, el cual consiste en afectar aquellas actividades biológicas mediadas por CGRP, evitando, de esa manera, las actividades biológicas mediadas por la unión de CGRP a CGRP-R. En esta memoria se da a conocer otro listado no taxativo de enfermedades y trastornos asociados con CGRP..

En otra realización de la invención, el anticuerpo anti CGRP humano para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP es un nticuerpo que se une en forma especifica al o a los mismos epitopos lineales o conformacionales en un polipéptico CGRP intacto o fragmento de éste que específicamente está unido a Ab3, Ab6, Abl3, o Abl4 tal como se confirma mediante el mapeo de epitopos utilizando la superposición de fragmentos peptídicos lineales que cubren la longitud completa del polipéptido CGRP humano nativo.

La invención asimismo se refiere a un anticuerpo anti CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que se une al mismo epitopo de CGRP y/o compite con un anticuerpo anti CGRP por la unión a CGRP como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se da a conocer en la presente memoria, incluyendo, a modo no taxativo, un anticuerpo anti CGRP seleccionado a partir de Abl, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, AblO, Abll, Abl2, Abl3, o Abl4.

En otra realización, la invención asimismo se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti CGRP humano aislado para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP el cual comprende una o más de las CDRs contenidas en las secuencias polipeptidicas de la región variable de la cadena pesada a seleccionar de: 3, 13, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123, o 133, o una variante de ellas, y/o una o más de las CDRs contenidas en las secuencias polipeptidicas de la región variable de la cadena ligera a seleccionar de: 1, 11, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, o 131, o una variante de ellas.

En una realización de la invención, el anticuerpo anti CGRP humano que se analiza en los dos párrafos anteriores comprende al menos 2 regiones determinantes de la comprementariedad (CDRs) en cada una de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada que son idénticas a las que contiene un anticuerpo anti CGRP humano seleccionado a partir de Abl, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, AblO, Abll, Abl2, Abl3, o Abl4.

En una realización preferida, el anticuerpo anti CGRP humano que se analiza arriba comprende al menos 2 regiones determinantes de la comprementariedad (CDRs) en cada una de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada las cuales son idénticas a las contenidas en Ab3 o Ab6. En otra realización, todas las CDRs del anticuerpo anti CGRP humano que se analiza arriba son idénticas a las CDRs contenidas en un anticuerpo anti CGRP humano seleccionado a partir de Abl, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, AblO, Abll, Abl2, Abl3, o Abl4. En una realización preferida de la invención, todas las CDRs del anticuerpo anti CGRP humano que se analiza arriba son idénticas a las CDRs contenidas en un anticuerpo anti CGRP humano seleccionado a partir de Ab3 o Ab6.

La invención asismismo contempla que el uno o más anticuerpos anti CGRP humano que se discute (n) arriba para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP que son no glicosilados ; o que se encuentra mínimamente glicosilados , por ejemplo, que carecen de N-glicosilación pero pueden comprender cierto grado de O-glicosilación, como, por ejemplo, los residuos de mañosa, y/o que contienen una región Fe que se ha modificado de modo de alterar la función efectora, vida media, proteólisis, y/o glicosilación; son humanos, humanizados, de cadena sencilla o quiméricos; y son un anticuerpo humanizado derivado de un anticuerpo anti CGRP humano parental de conejo.

La invención asismismo contempla uno o más anticuerpos anti CGRP humano para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP donde las regiones framework (FRs) en la región variable de la cadena ligaera y las regiones variables de la cadena pesada de dicho anticuerpo respectivamente son FRs humanas que no se encuentran modificadas o que se han modificado mediante la sustitución de uno o más residuos FR humanos en la región variable de la cadena ligera o pesada con los correspondientes residuos FR del anticuerpo parental de conejo, y donde dichas FRs se han derivado a partir de secuencias de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de anticuerpo humano que se han seleccionado a partir de una biblioteca de secuencias de anticuerpo de lineas germinales humanas basándose en su nivel de homología con las correspondientes regiones variables pesada o ligera de conejo en relación a otras secuencias de anticuerpo de líneas germinales humanas contenidas en la biblioteca.

En una realización de la invención, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti CGRP humano para el tratamiento o prevención de diarrea asociada a CGRP se une en forma específica a células humanas que expresan CGRP y/o a moléculas solubles de CGRP humano in vivo, incluyendo CGRP expresado en o por células humanas en un paciente con una enfermedad asociada con células que expresan CGRP.

En otra realización, la enfermedad relacionada con CGRP que puede estar asociada con la diarrea se selecciona a partir de migraña o migraña crónica, (con o sin aura) , pérdida de peso, cáncer o tumores, la angiogénesis asociada con el cáncer o crecimiento tumoral, la angiogénesis asociada con el cáncer o la supervivencia del tumor, migrañas hemipléj icas , dolores de cabeza en racimo, neuralgia migrañosa, dolores de cabeza crónicos, dolores de cabeza tensionales, dolores de cabeza generales, sofocos, hemicránea paroxistica crónica, dolores de cabeza secundarios debido a un problema estructural subyacente en la cabeza o el cuello, neuralgias craneales, cefaleas sinusales (como, por ejemplo, asociado con sinusitis) , cefaleas o migrañas inducidas por alergia, dolor, dolor inflamatorio, dolor por incisión post-operatoria, síndrome de dolor regional complejo, dolor por cáncer, dolor por cáncer de huesos primario o metastásico, dolor por fractura, dolor crónico, dolor por fractura osteoporótica, dolor resultante de quemaduras, osteoporosis, dolor de articulaciones por gota, dolor abdominal, dolor asociado con la crisis de células falciformes, y otros dolores nocicépticos, así como carcinoma hepatocelular , cáncer de mama , cirrosis hepática , dolor neurogénico , dolor neuropático , dolor nociceptico , neuralgia del trigémino , neuralgia post - herpética , dolor de miembro fantasma , fibromialgia , dolor menstrual , ovarialgia , distrofia simpática refleja , dolor neurogénico , dolor de la osteoartritis o la artritis reumatoide , lumbago , neuropatía diabética, ciática , o dolor o dolor visceral asociado con: reflujo gastroesofágico, dispepsia, síndrome de colon irritable, colon irritable, colon espástico, colitis mucosa, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, ileítis, colitis ulcerosa, cólico renal, dismenorrea, cistitis, período menstrual, parto, menopausia, prostatitis, pancreatitis, cólico renal , dismenorrea , cistitis , incluyendo la cistitis intersticial (IC), cirugía asociada con el íleo, diverticulitis , peritonitis, pericarditis, hepatitis, apendicitis , colitis, colecistitis, endometriosis, pancreatitis crónica y / o aguda, infarto de miocardio, dolor de riñon, dolor pleural , prostatitis, dolor pélvico, traumatismo en un órgano, dolor nociceptivo crónico, dolor neuropático crónico, dolor inflamatorio crónico, fibromialgia, dolor irruptivo y dolor persistente.

En otra realización de la invención, la enfermedad tratada puede ser asociada con la diarrea es dolor de cáncer que surge a partir de tumors malignos o a partir del cáncer preferentemente a seleccionar a partir de uno o más de: adenocarcinoma en el tejido glandular , blastoma en el tejido embrionario de órganos , el carcinoma en el tejido epitelial , leucemia en los tejidos que forman las células sanguíneas , linfoma de tejido linfático , mieloma en la médula ósea , el sarcoma de tejido de soporte o conectivo , cáncer suprarrenal , linfoma relacionado con el SIDA , la anemia , cáncer de vejiga , cáncer de hueso, cáncer de cerebro , cáncer de mama , tumores carcinoides , cáncer de cuello uterino , Quimioterapia , cáncer de colon , citopenia , , cáncer de endometrio , cáncer de esófago , cáncer gástrico , cáncer de cabeza , cáncer de cuello, cáncer hepatobiliar , cáncer de riñon , leucemia , Cáncer de Hígado , cáncer de pulmón , linfoma , enfermedad de Hodgkin , linfoma , linfoma no Hodgkin , tumores del sistema nervioso , cáncer oral , cáncer de ovario , cáncer de páncreas , cáncer de próstata , cáncer de recto , cáncer de piel , cáncer de estómago , cáncer testicular , cáncer de tiroides , cáncer de la uretra , cáncer de huesos , cáncer de sarcomas del tejido conectivo , cáncer del tejido óseo , cáncer de las células que forman la sangre , cáncer de la médula ósea , mieloma múltiple, leukemia, cáncer de hueso primario o secundario , los tumores que metastatizan al hueso , tumores infiltrantes el nervio y viscera hueca , tumores cerca de estructuras neurales . Más preferentemente el dolor por cáncer comprende el dolor visceral, preferentemente dolor visceral que surge de cáncer de páncreas y / o metástasis en el abdomen. Más preferentemente el dolor por cáncer comprende dolor somático preferentemente debido a uno o más de cáncer de hueso , metástasis en el hueso , el dolor postquirúrgico , el cáncer de los sarcomas del tejido conectivo , cáncer del tejido óseo , cáncer de células formadoras de sangre de la médula ósea , mieloma múltiple, leukemia, cáncer de hueso primario o secundario .

La invención asismismo contempla anticuerpos o fragmentos de anticuerpos anti-CGRP humano diarrea directamente o indirectamente ligados a un marcador detectable o un agente terapéutico.

La invención asimismo contempla una o más secuencias de ácidos nucleicos que dan lugar a la expresión de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti CGRP humano como se da a conocer más arriba, incluyendo aquellos que comprenden, o en forma alternativa consisten en, levadura o los codones preferidos humanos. La invención asimismo contempla vectores (incluyendo plásmidos o vectores virales recombinantes ) que comprenden dicha (s) secuencia (s) de ácidos nucleicos. La invención asimismo contempla células huésped o células huésped recombinantes que expresan al menos uno de los anticuerpos que se dan a conocer más arriba, incluyendo las células mamiferas, de levadura, bacterianas y se insecto. En una realización preferida, la célula huésped es una célula de levadura. En otra realización preferida, la célula de levadura es una célula de levadura diploide. En una realización más preferida, la célula de levadura es una levadura Pichia.

La invención asimismo contempla un método de tratamiento que comprende la administración a un paciente que posee una enfermedad o condición asociada con las células que expresan CGRP que da lugar a diarrea una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti CGRP humano de los que se describen en la presente memoria. La invención asimismo contempla que el método de tratamiento puede involucrar la administración de dos o más anticuerpos anti CGRP o fragmentos de ellos tales como se describen en la presente memoria. Si se administra al paciente uno o más anticuerpos, los anticuerpos múltiples pueden administrarse en forma simultánea o concurrente, o pueden administrarse en forma escalonada. Las enfermedades que pueden tratarse se presentan en el listado no taxativo que se da a conocer más arriba y cualquier otra parte de la presente memoria. En una realización preferida, la enfermedad se selecciona a partir de migraña, dolor de cabeza, pérdida de peso, dolor, dolor por cáncer o dolor neuropático. En otra realización el tratamiento asimismo incluye la administración de otro agente o régimen terapéutico a seleccionar a partir de quimioterapia, radioterapia, administración de citoquinas o terapia genética.

En una realización no taxativa de la invención, otro agente o régimen terapéutico incluye opiáceos, analgésicos como, por ejemplo, NSAIDs, Taxol (paclitaxel) o sus derivados, compuestos de platino como, por ejemplo, carboplatino o cisplatino, antrociclinas como, por ejemplo, doxorrubicina, agentes alquilantes como por ejemplo, ciclofosfamida, antimetabolitos como por ejemplo, 5-fluorouracilo o etopósido .

La invención asismismo contempla un método de imagenología in vivo que detecta la presencia de células que expresan CGRP que comprende la administración de una cantidad diagnósticamente efectiva de al menos un anticuerpo anti CGRP humano. En una realización, dicha administración asimismo incluye la administración de un radionúclido o fluorósforo que facilita la detección del anticuerpo en los sitios de la enfermedad que expresa CGRP. En otra realización, los resultados de dicho método de imagenología in vivo se utilizan para facilitar el diseño de un régimen terapéutico adecuado, incluyendo los regímenes terapéuticos que incluyen radioterapia, quimioterapia o una combinación de ellas.

La actividad anti CGRP de los anticuerpos anti CGRP de la presente invención, y fragmentos de ellos que poseen especificidad en la unión a CGRP diarrea, pueden asimismo describirse según la fuerza de su unión o su afinidad por CGRP. En una realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP de la presente invención, y fragmentos de ellos que poseen especificidad en la unión a CGRP, se unen a CGRP con una constante de disociación (KD) menor que o igual a 5x10-7 M, 10-7 M, 5x10-8 M, 10-8 M, 5x10-9 M, 10-9 M, 5x10-10 M, 10-10 , 5x10-11 M, 10-11 M, 5x10-12 , 10-12 M, 5x10-13 M, o 10-13 M. Preferentemente, los anticuerpos anti CGRP y fragmentos de ellos se unen a CGRP con una constante de disociación menor que o igual a 10-11 M, 5x10-12 M, o 10-12 . En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP de la presente invención, y fragmentos de ellos que poseen especificidad en la unión a CGRP, se unen a un epítopo lineal o conformacional de CGRP.

En otra realización de la invención, la actividad anti CGRP de los anticuerpos anti CGRP de la presente invención, y fragmentos de ellos que poseen especificidad en la unión a CGRP, se unen a CGRP con una velocidad de corte menor que o igual a 10-4 S-l, 5x10-5 S-l, 10-5 S-l, 5x10-6 S-l, 10-6 S-l, 5x10-7 S-l, o 10-7 S-l.

En otra realización de la invención, la actividad anti CGRP de los anticuerpos anti CGRP de la presente invención, y fragmentos de ellos que poseen especificidad en la unión a CGRP, exhiben actividad anti CGRP mediante la prevención, el mejoramiento o la disminución de los síntomas de, o en forma alternativa el tratamiento de, enfermedades y trastornos asociados con CGRP, especialmente diarrea. Algunos ejemplos no taxativos de enfermedades y trastornos asociadas/os con CGRP se dan a conocer en la presente memoria.

Polinucleótidos que codifican para los anticuerpos anti CGRP Anticuerpo Abl La invención asimismo se refiere a polinucleótidos que codifican para los polipéptidos de un anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP. En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptídica de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 1: CAAGTGCTGACCCAGACTGCATCCCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAAGCACAGTCACCATCA ATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATGATAACAACTACCTAGCCTGGTATCAGCAGAAACC AGGGCAGCCTCCCAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCG CGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTG CCGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCAGTTATGATTGTAGTAGTGGTGATTGTTTTGT TTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (SEQ ID NO: 141).

En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la cadena ligera SEQ ID NO: 2: CAAGTGCTGACCCAGACTGCATCCCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAAGCACAGTCACCATCA ATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATGATAACAACTACCTAGCCTGGTATCAGCAGAAACC AGGGCAGCCTCCCAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCG CGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTG CCGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCAGTTATGATTGTAGTAGTGGTGATTGTTTTGT TTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC TTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATA ACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAA CTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACC CTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATC AGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 142) .

En otra realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 3: CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCT GCACAGTCTCTGGACTCGACCTCAGTAGCTACTACATGCAATGGGTCCGCCAGGCTCCAGG GAAGGGGCTGGAATGGATCGGAGTCATTGGTATTAATGATAACACATACTACGCGAGCTGG GCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGCCTCGTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCA GTCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGGGACATCTGGGGCCCAGG CACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 143) .

En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la cadena pesada SEQ ID NO: 4: CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCT GCACAGTCTCTGGACTCGACCTCAGTAGCTACTACATGCAATGGGTCCGCCAGGCTCCAGG GAAGGGGCTGGAATGGATCGGAGTCATTGGTATTAATGATAACACATACTACGCGAGCTGG GCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGCCTCGTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCA GTCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGGGACATCTGGGGCCCAGG CACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCAcCC TCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCC CCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCC GGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGC AGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGG ACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACC TGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATG ATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGG TCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGA GGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGG CTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGA AAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATC CCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCC AGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGC CTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAG CAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCAC TACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 144).

En otra realización de la invenciónlos polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos SEQ ID NO: 145; SEQ ID NO: 146; y SEQ ID NO: 147, las cuales corresponden a los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 1 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 2.

En otra realización de la invenciónlos polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos SEQ ID NO: 148; SEQ ID NO: 149; y SEQ ID NO: 150, las cuales corresponden a los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 3 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 4.

La invención asimismo contempla secuencias de polinucleótidos que incluyen una o más de las secuencias de polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que se especifican en la presente memoria. En una realización de la invenciónlos polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo la totalidad de los siguientes polinucleótidos que codifican para fragmentosde anticuerpo: el polinucleótido SEQ ID NO: 141, el cual codifica para la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 1; el polinucleótido SEQ ID NO: 142, el cual codifica para la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 2; el polinucleótido SEQ ID NO: 143, el cual codifica para la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 3; el polinucleótido SEQ ID NO: 144, el cual codifica para la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 4; los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 145; SEQ ID NO: 146; y SEQ ID NO: 147) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 1 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 2; y los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 148; SEQ ID NO: 149; y SEQ ID NO: 150) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 3 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 4.

En una realización preferida de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, los polinucleótidos que codifican para fragmentos Fab (fragmentos de unión al antigeno) que poseen especficidad de unión por CGRP. En lo que refiere al anticuerpo Abl, los polinucleótidos que codifican para el anticuerpo de longitud completa Abl comprenden, o en forma alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 142, el cual codifica para la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 2 y el polinucleótido SEQ ID NO: 144, el cual codifica para la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 4.

Otra realización de la invención contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para la expresión en células mamiferas tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas de hongos, insectos o microbios tales como las células de levaduras tales como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, a modo no taxativo, Pichia pastoris. En una realización de la invención que se describe en la presente memoria (más adelante) , los fragmentos Fab pueden producirse por digestión enzimática (por ejemplo, papaina) de Abl después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un huésped adecuado. En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP tales como Abl o fragmentos Fab del mismo pueden producirse mediante la expresión de los polinucleótidos de Abl en células mamiferas tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas de hongos, insectos o microbios tales como las células de levaduras (por ejemplo, levaduras diploides tales como Pichia diploide) y otras cepas de levaduras. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, a modo no taxativo, Pichia pastoris.

Anticuerpo Ab2 La invención asimismo se refiere a polinucleótidos que codifican para los polipéptidos de un anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP. En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 11: CAAGTGCTGacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcA ATtgcCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATGATAACAACTACCTAGCCtggtatcagcagaaacc agggaaagttcctaagCAActgatctatTCTACATCCACTCTGGCATCTggggtcccatct cgtttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctg aagatgttgcaacttattactgtCTAGGCAGTTATGATTGTAGTAGTGGTGATTGTTTTGT Tttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgt (SEQ ID NO: 151) .

En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la cadena ligera SEQ ID NO: 12: CAAGTGCTGacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcA ATtgcCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATGATAACAACTACCTAGCCtggtatcagcagaaacc agggaaagttcctaagCAActgatctatTCTACATCCACTCTGGCATCTggggtcccatct cgtttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctg aagatgttgcaacttattactgtCTAGGCAGTTATGATTGTAGTAGTGGTGATTGTTTTGT TttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgtACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC TTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATA ACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAA CTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACC CTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATC AGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 152).

En otra realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 13: gaggtgcagctTgtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactct cctgtgcaGTCtctggaCTCGACCTCagtAGCTACTACATGCAAtgggtccgtcaggctcc agggaaggggctggagtgggtcGGAGTCATTGGTATCAATGATAACACATACTACGCGAGC TGGGCGAAAGGCcgattcaccatctccagagacaattccaagACCACGGTGtatcttcaaa tgaacagcctgagagctgaggacactgctgtgtatTTCtgtGCTAGAGGGGACATCtgggg ccaagggaccctcgtcaccgtcTCGAGC (SEQ ID NO: 153) .

En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la cadena pesada SEQ ID NO: 14: gaggtgcagctTgtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactct cctgtgcaGTCtctggaCTCGACCTCagtAGCTACTACATGCAAtgggtccgtcaggctcc agggaaggggctggagtgggtcGGAGTCATTGGTATCAATGATAACACATACTACGCGAGC TGGGCGAAAGGCcgattcaccatctccagagacaattccaagACCACGGTGtatcttcaaa tgaacagcctgagagctgaggacactgctgtgtatTTCtgtGCTAGAGGGGACATCtgggg ccaagggaccctcgtcaccgtcTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTG GCAcCCTCCTCCaAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACT ACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACAC CTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCC TCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCA AGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCC AGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACC CTCATGaTCTCCCgGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACC CTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCC GCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAG GACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCA TCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCC CCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTC TATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGA CCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGA CAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 154).

En otra realización de la invenciónlos polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos SEQ ID NO: 155; SEQ ID NO: 156; y SEQ ID NO: 157, las cuales corresponden a los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 11 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 12.

En otra realización de la invenciónlos polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos SEQ ID NO: 158; SEQ ID NO: 159/ y SEQ ID NO: 160, las cuales corresponden a los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 13 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 14.

La invención asimismo contempla secuencias de polinucleótidos que incluyen una o más de las secuencias de polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que se especifican en la presente memoria. En una realización de la invenciónlos polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo la totalidad de los siguientes polinucleótidos que codifican para fragmentosde anticuerpo: el polinucleótido SEQ ID NO: 151, el cual codifica para la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 11; el polinucleótido SEQ ID NO: 152, el cual codifica para la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 12; el polinucleótido SEQ ID NO: 153, el cual codifica para la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 13; el polinucleótido SEQ ID NO: 154, el cual codifica para la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 14; los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 155; SEQ ID NO: 156; y SEQ ID NO: 157) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 11 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 12; y los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 158; SEQ ID NO: 159; y SEQ ID NO: 160) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 13 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 14.

En una realización preferida de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, los polinucleótidos que codifican para fragmentos Fab (fragmentos de unión al antigeno) que poseen especficidad de unión por CGRP. En lo que refiere al anticuerpo Ab2, los polinucleótidos que codifican para el anticuerpo de longitud completa Ab2 comprenden, o en forma alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 152, el cual codifica para la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 12 y el polinucleótido SEQ ID NO: 154, el cual codifica para la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 14.

Otra realización de la invención contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para la expresión en células mamiferas tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas de hongos, insectos o microbios tales como las células de levaduras tales como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, a modo no taxativo, Pichia pastoris. En una realización de la invención que se describe en la presente memoria (más adelante) , los fragmentos Fab pueden producirse por digestión enzimática (por ejemplo, papaina) de Ab2 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un huésped adecuado. En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP tales como Ab2 o fragmentos Fab del mismo pueden producirse mediante la expresión de los polinucleótidos de Ab2 en células mamiferas tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas de hongos, insectos o microbios tales como las células de levaduras (por ejemplo, levaduras diploides tales como Pichia diploide) y otras cepas de levaduras. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, a modo no taxativo, Pichia pastoris.

Anticuerpo Ab3 La invención asimismo se refiere a polinucleótidos que codifican para los polipéptidos de un anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP. En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 21: CAAGTGCTGacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcA ATtgcCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATGATAACAACTACCTAGCCtggtatcagcagaaacc agggaaagttcctaagCAActgatctatTCTACATCCACTCTGGCATCTggggtcccatct cgtttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctg aagatgttgcaacttattactgtCTAGGCAGTTATGATTGTAGTAGTGGTGATTGTTTTGT Tttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgt (SEQ ID NO: 161) .

En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la cadena ligera SEQ ID NO: 22: CAAGTGCTGacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcA ATtgcCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATGATAACAACTACCTAGCCtggtatcagcagaaacc agggaaagttcctaagCAActgatctatTCTACATCCACTCTGGCATCTggggtcccatct cgtttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctg aagatgttgcaacttattactgtCTAGGCAGTTATGATTGTAGTAGTGGTGATTGTTTTGT TttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgtACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC TTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATA ACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAA CTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACC CTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATC AGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 162) .

En otra realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 23: gaggtgcagctTgtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactct cctgtgcaGTCtctggaCTCGACCTCagtAGCTACTACATGCAAtgggtccgtcaggctce agggaaggggctggagtgggtcGGAGTCATTGGTATCAATGATAACACATACTACGCGAGC TGGGCGAAAGGCcgattcaccatctccagagacaattccaagACCACGGTGtatcttcaaa tgaacagcctgagagctgaggacactgctgtgtatTTCtgtGCTAGAGGGGACATCtgggg ccaagggaccctcgtcaccgtcTCGAGC (SEQ ID NO: 163) .

En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la cadena pesada SEQ ID NO: 24: gaggtgcagctTgtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactct cctgtgcaGTCtctggaCTCGACCTCagtAGCTACTACATGCAAtgggtccgtcaggctcc agggaaggggctggagtgggtcGGAGTCATTGGTATCAATGATAACACATACTACGCGAGC TGGGCGAAAGGCcgattcaccatctccagagacaattccaagACCACGGTGtatcttcaaa tgaacagcctgagagctgaggacactgctgtgtatTTCtgtGCTAGAGGGGACATCtgggg ccaagggaccctcgtcaccgtcTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTG GCAcCCTCCTCCaAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACT ACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACAC CTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCC TCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCA AGGTGGACGCGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCC AGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACC CTCATGaTCTCCCgGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACC CTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCC GCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAG GACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCA TCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCC CCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTC TATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGA CCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGA CAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 164) .

En otra realización de la invenciónlos polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos SEQ ID NO: 165; SEQ ID NO: 166; y SEQ ID NO: 167, las cuales corresponden a los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 21 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 22.

En otra realización de la invenciónlos polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos SEQ ID NO: 168; SEQ ID NO: 169; y SEQ ID NO: 170, las cuales corresponden a los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 23 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 24.

La invención asimismo contempla secuencias de polinucleótidos que incluyen una o más de las secuencias de polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que se especifican en la presente memoria. En una realización de la invenciónlos polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo la totalidad de los siguientes polinucleótidos que codifican para fragmentosde anticuerpo: el polinucleótido SEQ ID NO: 161, el cual codifica para la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 21; el polinucleótido SEQ ID NO: 162, el cual codifica para la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 22; el polinucleótido SEQ ID NO: 163, el cual codifica para la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 23; el polinucleótido SEQ ID NO: 164, el cual codifica para la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 24; los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 165; SEQ ID NO: 166; y SEQ ID NO: 167) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 21 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 22; y los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 168; SEQ ID NO: 169; y SEQ ID NO: 170) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 23 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 24.

En una realización preferida de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, los polinucleótidos que codifican para fragmentos Fab (fragmentos de unión al antigeno) que poseen especficidad de unión por CGRP. En lo que refiere al anticuerpo Ab3, los polinucleótidos que codifican para el anticuerpo de longitud completa Ab3 comprenden, o en forma alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 162, el cual codifica para la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 22 y el polinucleótido SEQ ID NO: 164, el cual codifica para la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 24.

Otra realización de la invención contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para la expresión en células mamiferas tales como CHO, NSO, HEK- 293, o en sistemas de hongos, insectos o microbios tales como las células de levaduras tales como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, a modo no taxativo, Pichia pastoris. En una realización de la invención que se describe en la presente memoria (más adelante) , los fragmentos Fab pueden producirse por digestión enzimática (por ejemplo, papaina) de Ab3 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un huésped adecuado. En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP tales como Ab3 o fragmentos Fab del mismo pueden producirse mediante la expresión de los polinucleótidos de Ab3 en células mamiferas tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas de hongos, insectos o microbios tales como las células de levaduras (por ejemplo, levaduras diploides tales como Pichia diploide) y otras cepas de levaduras. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, a modo no taxativo, Pichia pastoris.

Anticuerpo Ab4 La invención asimismo se refiere a polinucleótidos que codifican para los polipéptidos de un anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP. En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 31: CAAGTGCTGACCCAGACTCCATCCCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAAGCACAGTCACCATCA ATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATCATAACACCTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAACC AGGGCAGCCTCCCAAACAACTGATCTATGATGCATCCACTCTGGCGTCTGGGGTCCCATCG CGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTA ACGATGCTGCCGCTTACTACTGTCTGGGCAGTTATGATTGTACTAATGGTGATTGTTTTGT TTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (SEQ ID NO: 171).

En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la cadena ligera SEQ ID NO: 32: CAAGTGCTGACCCAGACTCCATCCCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAAGCACAGTCACCATCA ATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATCATAACACCTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAACC AGGGCAGCCTCCCAAACAACTGATCTATGATGCATCCACTCTGGCGTCTGGGGTCCCATCG CGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTA ACGATGCTGCCGCTTACTACTGTCTGGGCAGTTATGATTGTACTAATGGTGATTGTTTTGT TTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC TTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATA ACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAA CTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACC CTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATC AGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 172) .

En otra realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 33: CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCT GTTCCGTCTCTGGCATCGACCTCAGTGGCTACTACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGG GAAGGGGCTGGAATGGATCGGAGTCATTGGTATTAATGGTGCCACATACTACGCGAGCTGG GCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCA GTCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGGGACATCTGGGGCCCGGG CACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 173) .

En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la cadena pesada SEQ ID NO: 34: CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCT GTTCCGTCTCTGGCATCGACCTCAGTGGCTACTACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGG GAAGGGGCTGGAATGGATCGGAGTCATTGGTATTAATGGTGCCACATACTACGCGAGCTGG GCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCA GTCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGGGACATCTGGGGCCCGGG CACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCAcCC TCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCC CCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCC GGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGC AGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGG ACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACC TGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATG ATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGG TCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGA GGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGG CTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGA AAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATC CCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCC AGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGC CTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAG CAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCAC TACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 174).

En otra realización de la invenciónlos polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos SEQ ID NO: 175; SEQ ID NO: 176; y SEQ ID NO: 177, las cuales corresponden a los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 31 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 32.

En otra realización de la invenciónlos polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos SEQ ID NO: 178; SEQ ID NO: 179; y SEQ ID NO: 180, las cuales corresponden a los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 33 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 34.

La invención asimismo contempla secuencias de polinucleótidos que incluyen una o más de las secuencias de polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que se especifican en la presente memoria. En una realización de la invenciónlos polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo la totalidad de los siguientes polinucleótidos que codifican para fragmentosde anticuerpo: el polinucleótido SEQ ID NO: 171, el cual codifica para la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 31; el polinucleótido SEQ ID NO: 172, el cual codifica para la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 32; el polinucleótido SEQ ID NO: 173, el cual codifica para la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 33; el polinucleótido SEQ ID NO: 174, el cual codifica para la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 34; los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 175; SEQ ID NO: 176; y SEQ ID NO: 177) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 31 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 32; y los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 178; SEQ ID NO: 179; y SEQ ID NO: 180) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 33 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 34.

En una realización preferida de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, los polinucleótidos que codifican para fragmentos Fab (fragmentos de unión al antigeno) que poseen especficidad de unión por CGRP. En lo que refiere al anticuerpo Ab4, los polinucleótidos que codifican para el anticuerpo de longitud completa Ab4 comprenden, o en forma alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 172, el cual codifica para la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 32 y el polinucleótido SEQ ID NO: 174, el cual codifica para la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 34.

Otra realización de la invención contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para la expresión en células mamiferas tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas de hongos, insectos o microbios tales como las células de levaduras tales como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, a modo no taxativo, Pichia pastoris. En una realización de la invención que se describe en la presente memoria (más adelante) , los fragmentos Fab pueden producirse por digestión enzimática (por ejemplo, papaina) de Ab4 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un huésped adecuado. En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP tales como Ab4 o fragmentos Fab del mismo pueden producirse mediante la expresión de los polinucleótidos de Ab4 en células mamiferas tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas de hongos, insectos o microbios tales como las células de levaduras (por ejemplo, levaduras diploides tales como Pichia diploide) y otras cepas de levaduras. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, a modo no taxativo, Pichia pastoris.

Anticuerpo Ab5 La invención asimismo se refiere a polinucleótidos que codifican para los polipéptidos de un anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP. En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 41: CAAGTGCTGacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaceatcA ATtgcCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATCATAACACCTACCTGGCCtggtatcagcagaaacc agggaaagttcctaagCAActgatctatGATGCATCCACTCTGGCATCTggggtcccatct cgtttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctg aagatgttgcaacttattactgtCTGGGCAGTTATGATTGTACTAATGGTGATTGTTTTGT Tttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgt (SEQ ID NO: 181).

En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la cadena ligera SEQ ID NO: 42: CAAGTGCTGacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcA ATtgcCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATCATAACACCTACCTGGCCtggtatcagcagaaacc agggaaagttcctaagCAActgatctatGATGCATCCACTCTGGCATCTggggtcccatct cgtttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctg aagatgttgcaacttattactgtCTGGGCAGTTATGATTGTACTAATGGTGATTGTTTTGT TttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgtACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC TTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATA ACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAA CTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACC CTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATC AGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 182) .

En otra realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 43: gaggtgcagctTgtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactct cctgtgcaGTCtctggaATCGACCTCagtGGCTACTACATGAACtgggtccgtcaggctcc agggaaggggctggagtgggtcGGAGTCATTGGTATTAATGGTGCCACATACTACGCGAGC TGGGCGAAAGGCcgattcaccatctccagagacaattccaagACCACGGTGtatcttcaaa tgaacagcctgagagctgaggacactgctgtgtatTTCtgtGCTAGAGGGGACATCtgggg ccaagggaccctcgtcaccgtcTCGAGC (SEQ ID NO: 183) .

En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la cadena pesada SEQ ID NO: 44: gaggtgcagctTgtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactct cctgtgcaGTCtctggaATCGACCTCagtGGCTACTACATGAACtgggtccgtcaggctcc agggaaggggctggagtgggtcGGAGTCATTGGTATTAATGGTGCCACATACTACGCGAGC TGGGCGAAAGGCcgattcaceatctccagagacaattccaagACCACGGTGtatcttcaaa tgaacagcctgagagctgaggacactgctgtgtatTTCtgtGCTAGAGGGGACATCtgggg ccaagggaccctcgtcaccgtcTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTG GCAcCCTCCTCCaAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACT ACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACAC CTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCC TCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCA AGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCC AGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACC CTCATGaTCTCCCgGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACC CTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCC GCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAG GACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCA TCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCC CCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTC TATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGA CCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGA CAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 184) .

En otra realización de la invenciónlos polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos SEQ ID NO: 185; SEQ ID NO: 186; y SEQ ID NO: 187, las cuales corresponden a los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 41 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 42.

En otra realización de la invenciónlos polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos SEQ ID NO: 188; SEQ ID NO: 189; y SEQ ID NO: 190, las cuales corresponden a los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 43 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 44.

La invención asimismo contempla secuencias de polinucleótidos que incluyen una o más de las secuencias de polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que se especifican en la presente memoria. En una realización de la invenciónlos polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo la totalidad de los siguientes polinucleótidos que codifican para fragmentosde anticuerpo: el polinucleótido SEQ ID NO: 181, el cual codifica para la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 41; el polinucleótido SEQ ID NO: 182, el cual codifica para la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 42; el polinucleótido SEQ ID NO: 183, el cual codifica para la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 43; el polinucleótido SEQ ID NO: 184, el cual codifica para la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 44; los polinucleotidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 185; SEQ ID NO: 186; y SEQ ID NO: 187) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 41 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 42; y los polinucleotidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 188; SEQ ID NO: 189; y SEQ ID NO: 190) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 43 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 44.

En una realización preferida de la invención, los polinucleotidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, los polinucleotidos que codifican para fragmentos Fab (fragmentos de unión al antigeno) que poseen especficidad de unión por CGRP. En lo que refiere al anticuerpo Ab5, los polinucleotidos que codifican para el anticuerpo de longitud completa Ab5 comprenden, o en forma alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 182, el cual codifica para la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 42 y el polinucleótido SEQ ID NO: 184, el cual codifica para la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 44.

Otra realización de la invención contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para la expresión en células mamiferas tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas de hongos, insectos o microbios tales como las células de levaduras tales como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, a modo no taxativo, Pichia pastoris. En una realización de la invención que se describe en la presente memoria (más adelante) , los fragmentos Fab pueden producirse por digestión enzimática (por ejemplo, papaina) de Ab5 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un huésped adecuado. En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP tales como Ab5 o fragmentos Fab del mismo pueden producirse mediante la expresión de los polinucleótidos de Ab5 en células mamiferas tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas de hongos, insectos o microbios tales como las células de levaduras (por ejemplo, levaduras diploides tales como Pichia diploide) y otras cepas de levaduras. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, a modo no taxativo, Pichia pastoris.

Anticuerpo Ab6 La invención asimismo se refiere a polinucleótidos que codifican para los polipéptidos de un anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP. En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 51: CAAGTGCTGacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcA ATtgcCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATCATAACACCTACCTGGCCtggtatcagcagaaacc agggaaagttcctaagCAActgatctatGATGCATCCACTCTGGCATCTggggtcccatct cgtttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctg aagatgttgcaacttattactgtCTGGGCAGTTATGATTGTACTAATGGTGATTGTTTTGT Tttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgt (SEQ ID NO: 191) .

En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la cadena ligera SEQ ID NO: 52: CAAGTGCTGacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcA ATtgcCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATCATAACACCTACCTGGCCtggtatcagcagaaacc agggaaagttcctaagCAActgatctatGATGCATCCACTCTGGCATCTggggtcccatct cgtttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctg aagatgttgcaacttattactgtCTGGGCAGTTATGATTGTACTAATGGTGATTGTTTTGT TttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgtACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC TTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATA ACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAA CTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACC CTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATC AGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 192) .

En otra realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 53: gaggtgcagctTgtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactct cctgtgcaGTCtctggaATCGACCTCagtGGCTACTACATGAACtgggtccgtcaggctcc agggaaggggctggagtgggtcGGAGTCATTGGTATTAATGGTGCCACATACTACGCGAGC TGGGCGAAAGGCcgattcaccatctccagagacaattccaagACCACGGTGtatcttcaaa tgaacagcctgagagctgaggacactgctgtgtatTTCtgtGCTAGAGGGGACATCtgggg ccaagggaccctcgtcaccgtcTCGAGC (SEQ ID NO: 193) .

En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la cadena pesada SEQ ID NO: 54: gaggtgcagctTgtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactct cctgtgcaGTCtctggaATCGACCTCagtGGCTACTACATGAACtgggtccgtcaggctcc agggaaggggctggagtgggtcGGAGTCATTGGTATTAATGGTGCCACATACTACGCGAGC TGGGCGAAAGGCcgattcaccatctccagagacaattccaagACCACGGTGtatcttcaaa tgaacagcctgagagctgaggacactgctgtgtatTTCtgtGCTAGAGGGGACATCtgggg ccaagggaccctcgtcaccgtcTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTG GCAcCCTCCTCCaAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACT ACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACAC CTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCC TCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCA AGGTGGACGCGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCC AGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACC CTCATGaTCTCCCgGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACC CTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCC GCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAG GACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCA TCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCC CCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTC TATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGA CCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGA CAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 194) .

En otra realización de la invenciónlos polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos SEQ ID NO: 195; SEQ ID NO: 196; y SEQ ID NO: 197, las cuales corresponden a los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 51 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 52.

En otra realización de la invenciónlos polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos SEQ ID NO: 198; SEQ ID NO: 199; y SEQ ID NO: 200, las cuales corresponden a los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 53 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 54.

La invención asimismo contempla secuencias de polinucleótidos que incluyen una o más de las secuencias de polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que se especifican en la presente memoria. En una realización de la invenciónlos polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo la totalidad de los siguientes polinucleótidos que codifican para fragmentosde anticuerpo: el polinucleótido SEQ ID NO: 191, el cual codifica para la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 51; el polinucleótido SEQ ID NO: 192, el cual codifica para la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 52; el polinucleótido SEQ ID NO: 193, el cual codifica para la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 53; el polinucleótido SEQ ID NO: 194, el cual codifica para la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 54; los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 195; SEQ ID NO: 196; y SEQ ID NO: 197) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 51 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 52; y los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 198; SEQ ID NO: 199; y SEQ ID NO: 200) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 53 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 54.

En una realización preferida de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, los polinucleótidos que codifican para fragmentos Fab (fragmentos de unión al antigeno) que poseen especficidad de unión por CGRP. En lo que refiere al anticuerpo Ab6, los polinucleótidos que codifican para el anticuerpo de longitud completa Ab6 comprenden, o en forma alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 192, el cual codifica para la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 52 y el polinucleótido SEQ ID NO: 194, el cual codifica para la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 54.

Otra realización de la invención contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para la expresión en células mamiferas tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas de hongos, insectos o microbios tales como las células de levaduras tales como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, a modo no taxativo, Pichia pastoris. En una realización de la invención que se describe en la presente memoria (más adelante) , los fragmentos Fab pueden producirse por digestión enzimática (por ejemplo, papaina) de Ab6 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un huésped adecuado. En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP tales como Ab6 o fragmentos Fab del mismo pueden producirse mediante la expresión de los polinucleótidos de Ab6 en células mamiferas tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas de hongos, insectos o microbios tales como las células de levaduras (por ejemplo, levaduras diploides tales como Pichia diploide) y otras cepas de levaduras. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, a modo no taxativo, Pichia pastoris.

Anticuerpo Ahí La invención asimismo se refiere a polinucleótidos que codifican para los polipéptidos de un anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP. En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 61: CAAGTGCTGACCCAGACTGCATCCCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAAGCACAGTCACCATCA TTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATAATTACAACTACCTTGCCTGGTATCAGCAGAAACC AGGGCAGCCTCCCAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCG CGATTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACGTGCAGTGTG ACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCAGTTATGACTGTAGTACTGGTGATTGTTTTGT TTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (SEQ ID NO: 201) .

En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la cadena ligera SEQ ID NO: 62: CAAGTGCTGACCCAGACTGCATCCCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAAGCACAGTCACCATCA ATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATAATTACAACTACCTTGCCTGGTATCAGCAGAAACC AGGGCAGCCTCCCAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCG CGATTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACGTGCAGTGTG ACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCAGTTATGACTGTAGTACTGGTGATTGTTTTGT TTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC TTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATA ACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAA CTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACC CTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATC AGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 202) .

En otra realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 63: CAGGAGCAGCTGAAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACATCCCTGACACTCA CCTGCACCGTCTCTGGAATCGACCTCAGTAACCACTACATGCAATGGGTCCGCCAGGCTCC AGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGAGTCGTTGGTATTAATGGTCGCACATACTACGCGAGC TGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAACCTCGTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGA CCAGGCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGGGACATCTGGGGCCC AGGCACCCTGGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 203) .

En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la cadena pesada SEQ ID NO: 64: CAGGAGCAGCTGAAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACATCCCTGACACTCA CCTGCACCGTCTCTGGAATCGACCTCAGTAACCACTACATGCAATGGGTCCGCCAGGCTCC AGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGAGTCGTTGGTATTAATGGTCGCACATACTACGCGAGC TGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAACCTCGTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGA CCAGGCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGGGACATCTGGGGCCC AGGCACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCA cCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACT TCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTT CCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCC AGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGG TGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGC ACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC ATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTG AGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCG GGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGAC TGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCG AGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCC ATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTAT CCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCA CGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAA GAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAAC CACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 204). En otra realización de la invenciónlos polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos SEQ ID NO: 205; SEQ ID NO: 206; y SEQ ID NO: 207, las cuales corresponden a los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 61 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 62.

En otra realización de la invenciónlos polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos SEQ ID NO: 208; SEQ ID NO: 209; y SEQ ID NO: 210, las cuales corresponden a los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 63 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 64.

La invención asimismo contempla secuencias de polinucleótidos que incluyen una o más de las secuencias de polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que se especifican en la presente memoria. En una realización de la invenciónlos polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo la totalidad de los siguientes polinucleótidos que codifican para fragmentosde anticuerpo: el polinucleótido SEQ ID NO: 201, el cual codifica para la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 61; el polinucleótido SEQ ID NO: 202, el cual codifica para la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 62; el polinucleótido SEQ ID NO: 203, el cual codifica para la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 63; el polinucleótido SEQ ID NO: 204, el cual codifica para la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 64; los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 205; SEQ ID NO: 206; y SEQ ID NO: 207) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 61 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 62; y los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 208; SEQ ID NO: 209; y SEQ ID NO: 210) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 63 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 64.

En una realización preferida de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, los polinucleótidos que codifican para fragmentos Fab (fragmentos de unión al antigeno) que poseen especficidad de unión por CGRP. En lo que refiere al anticuerpo Ab7, los polinucleótidos que codifican para el anticuerpo de longitud completa Ab7 comprenden, o en forma alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 202, el cual codifica para la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 62 y el polinucleótido SEQ ID NO: 204, el cual codifica para la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 64.

Otra realización de la invención contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para la expresión en células mamiferas tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas de hongos, insectos o microbios tales como las células de levaduras tales como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, a modo no taxativo, Pichia pastoris. En una realización de la invención que se describe en la presente memoria (más adelante) , los fragmentos Fab pueden producirse por digestión enzimática (por ejemplo, papaina) de Ab7 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un huésped adecuado. En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP tales como Ab7 o fragmentos Fab del mismo pueden producirse mediante la expresión de los polinucleótidos de Ab7 en células mamiferas tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas de hongos, insectos o microbios tales como las células de levaduras (por ejemplo, levaduras diploides tales como Pichia diploide) y otras cepas de levaduras. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, a modo no taxativo, Pichia pastoris.

Anticuerpo Ab8 La invención asimismo se refiere a polinucleótidos que codifican para los polipéptidos de un anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP. En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 71: CAAGTGCTGacccagtctceatcetccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaceatcA ATtgcCAGGCCAGTCAGAGTGTTTAcAATTACAACTACCTTGCCtggtatcagcagaaacc agggaaagttcctaagCAActgatctatTCTACATCCACTCTGGCATCTggggtcccatct cgtttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctg aagatgttgcaacttattactgtCTGGGCAGTTATGATTGTAGTACTGGTGATTGTTTTGT Tttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgt (SEQ ID NO: 211).

En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la cadena ligera SEQ ID NO: 72: CAAGTGCTGacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcA ATtgcCAGGCCAGTCAGAGTGTTTAcAATTACAACTACCTTGCCtggtatcagcagaaacc agggaaagttcctaagCAActgatctatTCTACATCCACTCTGGCATCTggggtcccatct cgtttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctg aagatgttgcaacttattactgtCTGGGCAGTTATGATTGTAGTACTGGTGATTGTTTTGT TttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgtACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC TTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATA ACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAA CTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACC CTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATC AGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 212) .

En otra realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 73: gaggtgcagctTgtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactct cctgtgcaGTCtctggaATCGACCTCagtAACCACTACATGCAAtgggtccgtcaggctcc agggaaggggctggagtgggtcGGAGTCGTTGGTATcAATGGTCGCACATACTACGCGAGC TGGGCGAAAGGCcgattcaccatctccagagacaattccaagACCACGGTGtatcttcaaa tgaacagcctgagagctgaggacactgctgtgtatTTCtgtGCTAGAGGGGACATCtgggg ccaagggaccctcgtcaccgtcTCGAGC (SEQ ID NO: 213) .

En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la cadena pesada SEQ ID NO: 74: gaggtgcagctTgtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactct cctgtgcaGTCtctggaATCGACCTCagtAACCACTACATGCAAtgggtccgtcaggctcc agggaaggggctggagtgggtcGGAGTCGTTGGTATcAATGGTCGCACATACTACGCGAGC TGGGCGAAAGGCcgattcaccatctccagagacaattccaagACCACGGTGtatcttcaaa tgaacagcctgagagctgaggacactgctgtgtatTTCtgtGCTAGAGGGGACATCtgggg ccaagggaccctcgtcaccgtcTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTG GCAcCCTCCTCCaAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACT ACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACAC CTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCC TCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCA AGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCC AGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACC CTCATGaTCTCCCgGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACC CTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCC GCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAG GACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCA TCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCC CCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTC TATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGA CCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGA CAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 214) .

En otra realización de la invenciónlos polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos SEQ ID NO: 215; SEQ ID NO: 216; y SEQ ID NO: 217, las cuales corresponden a los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 71 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 72.

En otra realización de la invenciónlos polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos SEQ ID NO: 218; SEQ ID NO: 219; y SEQ ID NO: 220, las cuales corresponden a los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 73 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 74.

La invención asimismo contempla secuencias de polinucleótidos que incluyen una o más de las secuencias de polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que se especifican en la presente memoria. En una realización de la invenciónlos polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo la totalidad de los siguientes polinucleótidos que codifican para fragmentosde anticuerpo: el polinucleótido SEQ ID NO: 211, el cual codifica para la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 71; el polinucleótido SEQ ID NO: 212, el cual codifica para la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 72; el polinucleótido SEQ ID NO: 213, el cual codifica para la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 73; el polinucleótido SEQ ID NO: 214, el cual codifica para la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 74; los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 215; SEQ ID NO: 216; y SEQ ID NO: 217) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 71 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 72; y los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 218; SEQ ID NO: 219; y SEQ ID NO: 220) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 73 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 74.

En una realización preferida de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, los polinucleótidos que codifican para fragmentos Fab (fragmentos de unión al antigeno) que poseen especficidad de unión por CGRP. En lo que refiere al anticuerpo Ab8, los polinucleótidos que codifican para el anticuerpo de longitud completa Ab8 comprenden, o en forma alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 212, el cual codifica para la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 72 y el polinucleótido SEQ ID NO: 214, el cual codifica para la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 74.

Otra realización de la invención contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para la expresión en células mamiferas tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas de hongos, insectos o microbios tales como las células de levaduras tales como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, a modo no taxativo, Pichia pastoris. En una realización de la invención que se describe en la presente memoria (más adelante) , los fragmentos Fab pueden producirse por digestión enzimática (por ejemplo, papaina) de Ab8 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un huésped adecuado. En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP tales como Ab8 o fragmentos Fab del mismo pueden producirse mediante la expresión de los polinucleótidos de Ab8 en células mamiferas tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas de hongos, insectos o microbios tales como las células de levaduras (por ejemplo, levaduras diploides tales como Pichia diploide) y otras cepas de levaduras. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, a modo no taxativo, Pichia pastoris.

Anticuerpo Ab9 La invención asimismo se refiere a polinucleótidos que codifican para los polipéptidos de un anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP. En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 81: CAAGTGCTGACCCAGACTCCATCCCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAAGCACAGTCACCATCA ATTGCCAGGCCAGTCAGAATGTTTATAATAACAACTACCTAGCCTGGTATCAGCAGAAACC AGGGCAGCCTCCCAAGCAACTGATCTATTCTACGTCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCG CGATTCAGAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACGTGCAGTGTG ACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCAGTTATGATTGTAGTCGTGGTGATTGTTTTGT TTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (SEQ ID NO: 221) .

En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la cadena ligera SEQ ID NO: 82: CAAGTGCTGACCCAGACTCCATCCCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAAGCACAGTCACCATCA ATTGCCAGGCCAGTCAGAATGTTTATAATAACAACTACCTAGCCTGGTATCAGCAGAAACC AGGGCAGCCTCCCAAGCAACTGATCTATTCTACGTCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCG CGATTCAGAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACGTGCAGTGTG ACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCAGTTATGATTGTAGTCGTGGTGATTGTTTTGT TTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC TTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATA ACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAA CTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACC CTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATC AGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 222) .

En otra realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 83: CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCT GCACAGTCTCTGGAATCGGCCTCAGTAGCTACTACATGCAGTGGGTCCGCCAGTCTCCAGG GAGGGGGCTGGAATGGATCGGAGTCATTGGTAGTGATGGTAAGACATACTACGCGACCTGG GCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAGACCTCGTCGACCACGGTGGATCTGAGAATGGCCA GTCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTACCAGAGGGGACATCTGGGGCCCGGG GACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 223) .

En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la cadena pesada SEQ ID NO: 84: CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCT GCACAGTCTCTGGAATCGGCCTCAGTAGCTACTACATGCAGTGGGTCCGCCAGTCTCCAGG GAGGGGGCTGGAATGGATCGGAGTCATTGGTAGTGATGGTAAGACATACTACGCGACCTGG GCGAAAGGCCGATTCACCATCTCC-¾AGACCTCGTCGACCACGGTGGATCTGAGAATGGCCA GTCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTACCAGAGGGGACATCTGGGGCCCGGG GACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCAcCC TCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCC CCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCC GGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGC AGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGG AC AGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGAC AAACTCACAC TGCCCACCGTGCCCAGC CC TGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATG ATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGG TCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGA GGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGG CTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGA AAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATC CCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCC AGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGC CTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAG CAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCAC TACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 224).

En otra realización de la invenciónlos polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos SEQ ID NO: 225; SEQ ID NO: 226; y SEQ ID NO: 227, las cuales corresponden a los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 81 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 82.

En otra realización de la invencionlos polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos SEQ ID NO: 228; SEQ ID NO: 229; y SEQ ID NO: 230, las cuales corresponden a los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 83 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 84.

La invención asimismo contempla secuencias de polinucleótidos que incluyen una o más de las secuencias de polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que se especifican en la presente memoria. En una realización de la invencionlos polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo la totalidad de los siguientes polinucleótidos que codifican para fragmentosde anticuerpo: el polinucleótido SEQ ID NO: 221, el cual codifica para la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 81; el polinucleótido SEQ ID NO: 222, el cual codifica para la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 82; el polinucleótido SEQ ID NO: 223, el cual codifica para la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 83; el polinucleótido SEQ ID NO: 224, el cual codifica para la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 84; los polinucleotidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 225; SEQ ID NO: 226; y SEQ ID NO: 227) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 81 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 82; y los polinucleotidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 228; SEQ ID NO: 229; y SEQ ID NO: 230) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 83 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 84.

En una realización preferida de la invención, los polinucleotidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, los polinucleotidos que codifican para fragmentos Fab (fragmentos de unión al antigeno) que_ poseen especficidad de unión por CGRP. En lo que refiere al anticuerpo Ab9, los polinucleotidos que codifican para el anticuerpo de longitud completa Ab9 comprenden, o en forma alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 222, el cual codifica para la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 82 y el polinucleótido SEQ ID NO: 224, el cual codifica para la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 84.

Otra realización de la invención contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para la expresión en células martilieras tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas de hongos, insectos o microbios tales como las células de levaduras tales como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, a modo no taxativo, Pichia pastoris. En una realización de la invención que se describe en la presente memoria (más adelante) , los fragmentos Fab pueden producirse por digestión enzimática (por ejemplo, papaina) de Ab9 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un huésped adecuado. En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP tales como Ab9 o fragmentos Fab del mismo pueden producirse mediante la expresión de los polinucleótidos de Ab9 en células mamiferas tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas de hongos, insectos o microbios tales como las células de levaduras (por ejemplo, levaduras diploides tales como Pichia diploide) y otras cepas de levaduras. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, a modo no taxativo, Pichia pastoris.

Anticuerpo AblO La invención asimismo se refiere a polinucleótidos que codifican para los polipéptidos de un anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP. En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 91: CAAGTGCTGacccagtctceatcetccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaceatcA ATtgcCAGGCCAGTCAGAATGTTTAcAATAACAACTACCTAGCCtggtatcagcagaaacc agggaaagttcctaagCAActgatctatTCTACATCCACTCTGGCATCTggggtcccatct cgtttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctg aagatgttgcaacttattactgtCTGGGCAGTTATGATTGTAGTCGTGGTGATTGTTTTGT Tttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgt (SEQ ID NO: 231).

En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la cadena ligera SEQ ID NO: 92: CAAGTGCTGacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcA ATtgcCAGGCCAGTCAGAATGTTTAcAATAACAACTACCTAGCCtggtatcagcagaaacc agggaaagttcctaagCAActgatctatTCTACATCCACTCTGGCATCTggggtcccatct cgtttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctg aagatgttgcaacttattactgtCTGGGCAGTTATGATTGTAGTCGTGGTGATTGTTTTGT TttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgtACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC TTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATA ACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAA CTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACC CTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATC AGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 232) .

En otra realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 93: gaggtgcagctTgtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactct cctgtgcaGTCtctggaATCGGCCTCagtAGCTACTACATGCAAtgggtccgtcaggctcc agggaaggggctggagtgggtcGGAGTCATTGGTAGTGATGGTAAGACATACTACGCGACC TGGGCGAAAGGCcgattcaccatctccagagacaattccaagACCACGGTGtatcttcaaa tgaacagcctgagagctgaggacactgctgtgtatTTCtgtACCAGAGGGGACATCtgggg ccaagggaccctcgtcaccgtcTCGAGC (SEQ ID NO: 233) .

En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la cadena pesada SEQ ID NO: 94: gaggtgcagctTgtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactct cctgtgcaGTCtctggaATCGGCCTCagtAGCTACTACATGCAAtgggtccgtcaggctcc agggaaggggctggagtgggtcGGAGTCATTGGTAGTGATGGTAAGACATACTACGCGACC TGGGCGAAAGGCcgattcaccatctccagagacaattccaagACCACGGTGtatcttcaaa tgaacagcctgagagctgaggacactgctgtgtatTTCtgtACCAGAGGGGACATCtgggg ccaagggaccctcgtcaccgtcTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTG GCAcCCTCCTCCaAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACT ACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACAC CTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCC TCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCA AGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCC AGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACC CTCATGaTCTCCCgGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACC CTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCC GCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAG GACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCA TCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCC CCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTC TATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGA CCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGA CAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 234) .

En otra realización de la invenciónlos polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos SEQ ID NO: 235; SEQ ID NO: 236; y SEQ ID NO: 237, las cuales corresponden a los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 91 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 92.

En otra realización de la invenciónlos polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos SEQ ID NO: 238; SEQ ID NO: 239; y SEQ ID NO: 240, las cuales corresponden a los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 93 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 94.

La invención asimismo contempla secuencias de polinucleótidos que incluyen una o más de las secuencias de polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que se especifican en la presente memoria. En una realización de la invenciónlos polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo la totalidad de los siguientes polinucleótidos que codifican para fragmentosde anticuerpo: el polinucleótido SEQ ID NO: 231, el cual codifica para la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 91; el polinucleótido SEQ ID NO: 232, el cual codifica para la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 92; el polinucleótido SEQ ID NO: 233, el cual codifica para la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 93; el polinucleótido SEQ ID NO: 234, el cual codifica para la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 94; los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 235; SEQ ID NO: 236; y SEQ ID NO: 237) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 91 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 92; y los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 238; SEQ ID NO: 239; y SEQ ID NO: 240) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 93 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 94.

En una realización preferida de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, los polinucleótidos que codifican para fragmentos Fab (fragmentos de unión al antigeno) que poseen especficidad de unión por CGRP. En lo que refiere al anticuerpo AblO, los polinucleótidos que codifican para el anticuerpo de longitud completa AblO comprenden, o en forma alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 232, el cual codifica para la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 92 y el polinucleótido SEQ ID NO: 234, el cual codifica para la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 94.

Otra realización de la invención contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para la expresión en células mamiferas tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas de hongos, insectos o microbios tales como las células de levaduras tales como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, a modo no taxativo, Pichia pastoris. En una realización de la invención que se describe en la presente memoria (más adelante) , los fragmentos Fab pueden producirse por digestión enzimática (por ejemplo, papaina) de AblO después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un huésped adecuado. En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP tales como AblO o fragmentos Fab del mismo pueden producirse mediante la expresión de los polinucleótidos de AblO en células mamiferas tales como células CHO, NSO o HE 293, sistemas de hongos, insectos o microbios tales como las células de levaduras (por ejemplo, levaduras diploides tales como Pichia diploide) y otras cepas de levaduras. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, a modo no taxativo, Pichia pastoris.

Anticuerpo Abll La invención asimismo se refiere a polinucleótidos que codifican para los polipéptidos de un anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP. En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 101: CAGGTGCTGACCCAGACTGCATCCCCCGTGTCTCCAGCTGTGGGAAGCACAGTCACCATCA ATTGCCGGGCCAGTCAGAGTGTTTATTATAACAACTACCTAGCCTGGTATCAGCAGAAACC AGGGCAGCCTCCCAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCG CGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACGTGCAGTGTG ACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCAGTTATGATTGTAGTAATGGTGATTGTTTTGT TTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (SEQ ID NO: 241) .

En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la cadena ligera SEQ ID NO: 102: CAGGTGCTGACCCAGACTGCATCCCCCGTGTCTCCAGCTGTGGGAAGCACAGTCACCATCA ATTGCCGGGCCAGTCAGAGTGTTTATTATAACAACTACCTAGCCTGGTATCAGCAGAAACC AGGGCAGCCTCCCAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCG CGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACGTGCAGTGTG ACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCAGTTATGATTGTAGTAATGGTGATTGTTTTGT TTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC TTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATA ACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAA CTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACC CTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATC AGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 242) .

En otra realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 103: CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGAGGATCCCTGACACTCACCT GCACAGTCTCTGGAATCGACGTCACTAACTACTATATGCAATGGGTCCGCCAGGCTCCAGG GAAGGGGCTGGAATGGATCGGAGTCATTGGTGTGAATGGTAAGAGATACTACGCGAGCTGG GCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCA GTCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGCGACATCTGGGGCCCGGG GACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 243) .

En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la cadena pesada SEQ ID NO: 104: CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGAGGATCCCTGACACTCACCT GCACAGTCTCTGGAATCGACGTCACTAACTACTATATGCAATGGGTCCGCCAGGCTCCAGG GAAGGGGCTGGAATGGATCGGAGTCATTGGTGTGAATGGTAAGAGATACTACGCGAGCTGG GCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCA GTCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGCGACATCTGGGGCCCGGG GACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCAcCC TCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCC CCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCC GGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGC AGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGG ACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACC TGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATG ATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGG TCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGA GGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGG CTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGA AAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATC CCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCC AGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGC CTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAG CAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCAC TACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 244).

En otra realización de la invenciónlos polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos SEQ ID NO: 245; SEQ ID NO: 246; y SEQ ID NO: 247, las cuales corresponden a los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 101 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 102. En otra realización de la invenciónlos polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos SEQ ID NO: 248; SEQ ID NO: 249; y SEQ ID NO: 250, las cuales corresponden a los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 103 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 104. La invención asimismo contempla secuencias de polinucleótidos que incluyen una o más de las secuencias de polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que se especifican en la presente memoria. En una realización de la invenciónlos polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo la totalidad de los siguientes polinucleotidos que codifican para fragmentosde anticuerpo: el polinucleótido SEQ ID NO: 241, el cual codifica para la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 101; el polinucleótido SEQ ID NO: 242, el cual codifica para la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 102; el polinucleótido SEQ ID NO: 243, el cual codifica para la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 103; el polinucleótido SEQ ID NO: 244, el cual codifica para la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 104; los polinucleotidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 245; SEQ ID NO: 246; y SEQ ID NO: 247) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 101 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 102; y los polinucleotidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 248; SEQ ID NO: 249; y SEQ ID NO: 250) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 103 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 104.

En una realización preferida de la invención, los polinucleotidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, los polinucleotidos que codifican para fragmentos Fab (fragmentos de unión al antigeno) que poseen especficidad de unión por CGRP. En lo que refiere al anticuerpo Abll, los polinucleótidos que codifican para el anticuerpo de longitud completa Abll comprenden, o en forma alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 242, el cual codifica para la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 102 y el polinucleótido SEQ ID NO: 244, el cual codifica para la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 104.

Otra realización de la invención contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para la expresión en células mamiferas tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas de hongos, insectos o microbios tales como las células de levaduras tales como la levadura Pic ia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, a modo no taxativo, Pichia pastoris. En una realización de la invención que se describe en la presente memoria (más adelante) , los fragmentos Fab pueden producirse por digestión enzimática (por ejemplo, papaina) de Abll después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un huésped adecuado. En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP tales como Abll o fragmentos Fab del mismo pueden producirse mediante la expresión de los polinucleótidos de Abll en células mamiferas tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas de hongos, insectos o microbios tales como las células de levaduras (por ejemplo, levaduras diploides tales como Pichia diploide) y otras cepas de levaduras. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, a modo no taxativo, Pichia pastoris.

Anticuerpo Abl2 La invención asimismo se refiere a polinucleótidos que codifican para los polipéptidos de un anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP. En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 111: CAAGTGCTGacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcA ATtgcCGGGCCAGTCAGAGTGTTTAcTATAACAACTACCTAGCCtggtatcagcagaaacc agggaaagttcctaagCAActgatctatTCTACATCCACTCTGGCATCTggggtcccatct cgtttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctg aagatgttgcaacttattactgtCTGGGCAGTTATGATTGTAGTAATGGTGATTGTTTTGT Tttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgt (SEQ ID NO: 251) .

En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la cadena ligera SEQ ID NO: 112: CAAGTGCTGacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcA ATtgcCGGGCCAGTCAGAGTGTTTAcTATAACAACTACCTAGCCtggtatcagcagaaacc agggaaagttcctaagCAActgatctatTCTACATCCACTCTGGCATCTggggtcccatct cgtttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctg aagatgttgcaacttattactgtCTGGGCAGTTATGATTGTAGTAATGGTGATTGTTTTGT TttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgtACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC TTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATA ACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAA CTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACC CTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATC AGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 252) .

En otra realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 113: gaggtgcagctTgtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactct cctgtgcaGTCtctggaATCGACGTCACTAACTACTACATGCAAtgggtccgtcaggctcc agggaaggggctggagtgggtcGGAGTCATTGGTGTGAATGGTAAGAGATACTACGCGAGC TGGGCGAAAGGCcgattcaccatctccagagacaattccaagACCACGGTGtatcttcaaa tgaacagcctgagagctgaggacactgctgtgtatTTCtgtGCCAGAGGGGACATCtgggg ccaagggaccctcgtcaccgtcTCGAGC (SEQ ID NO: 253) .

En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la cadena pesada SEQ ID NO: 114: gaggtgcagctTgtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactct cctgtgcaGTCtctggaATCGACGTCACTAACTACTACATGCAAtgggtccgtcaggctcc agggaaggggctggagtgggtcGGAGTCATTGGTGTGAATGGTAAGAGATACTACGCGAGC TGGGCGAAAGGCcgattcaccatctccagagacaattccaagACCACGGTGtatcttcaaa tgaacagcctgagagctgaggacactgctgtgtatTTCtgtGCCAGAGGGGACATCtgggg ccaagggaccctcgtcaccgtcTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTG GCAcCCTCCTCCaAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACT ACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACAC CTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCC TCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCA AGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCC AGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACC CTCATGaTCTCCCgGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACC CTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCC GCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAG GACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCA TCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCC CCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTC TATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGA CCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGA CAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 254) .

En otra realización de la invenciónlos polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos SEQ ID NO: 255; SEQ ID NO: 256; y SEQ ID NO: 257, las cuales corresponden a los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 111 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 112. En otra realización de la invenciónlos polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos SEQ ID NO: 258; SEQ ID NO: 259; y SEQ ID NO: 260, las cuales corresponden a los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 113 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 114. La invención asimismo contempla secuencias de polinucleótidos que incluyen una o más de las secuencias de polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que se especifican en la presente memoria. En una realización de la invenciónlos polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo la totalidad de los siguientes polinucleótidos que codifican para fragmentosde anticuerpo: el polinucleótido SEQ ID NO: 251, el cual codifica para la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 111; el polinucleótido SEQ ID NO: 252, el cual codifica para la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 112; el polinucleótido SEQ ID NO: 253, el cual codifica para la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 113; el polinucleótido SEQ ID NO: 254, el cual codifica para la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 114; los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 255; SEQ ID NO: 256; y SEQ ID NO: 257) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 111 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 112; y los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 258; SEQ ID NO: 259; y SEQ ID NO: 260) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 113 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 114.

En una realización preferida de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, los polinucleótidos que codifican para fragmentos Fab (fragmentos de unión al antigeno) que poseen especficidad de unión por CGRP. En lo que refiere al anticuerpo Abl2, los polinucleótidos que codifican para el anticuerpo de longitud completa Abl2 comprenden, o en forma alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 252, el cual codifica para la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 112 y el polinucleótido SEQ ID NO: 254, el cual codifica para la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 114.

Otra realización de la invención contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para la expresión en células mamiferas tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas de hongos, insectos o microbios tales como las células de levaduras tales como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, a modo no taxativo, Pichia pastoris. En una realización de la invención que se describe en la presente memoria (más adelante) , los fragmentos Fab pueden producirse por digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Abl2 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un huésped adecuado. En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP tales como Abl2 o fragmentos Fab del mismo pueden producirse mediante la expresión de los polinucleótidos de Abl2 en células mamiferas tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas de hongos, insectos o microbios tales como las células de levaduras (por ejemplo, levaduras diploides tales como Pichia diploide) y otras cepas de levaduras. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, a modo no taxativo, Pichia pastoris.

Anticuerpo Abl3 La invención asimismo se refiere a polinucleótidos que codifican para los polipéptidos de un anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP. En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 121: GCCATCGTGATGACCCAGACTCCATCTTCCAAGTCTGTCCCTGTGGGAGACACAGTCACCA TCAATTGCCAGGCCAGTGAGAGTCTTTATAATAACAACGCCTTGGCCTGGTTTCAGCAGAA ACCAGGGCAGCCTCCCAAGCGCCTGATCTATGATGCATCCAAACTGGCATCTGGGGTCCCA TCGCGGTTCAGTGGCGGTGGGTCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGTGGCGTGCAGT GTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTGGAGGCTACAGAAGTGATAGTGTTGATGGTGTTGC TTTCGCCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (SEQ ID NO: 261).

En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la cadena ligera SEQ ID NO: 122: GCCATCGTGATGACCCAGACTCCATCTTCCAAGTCTGTCCCTGTGGGAGACACAGTCACCA TCAATTGCCAGGCCAGTGAGAGTCTTTATAATAACAACGCCTTGGCCTGGTTTCAGCAGAA ACCAGGGCAGCCTCCCAAGCGCCTGATCTATGATGCATCCAAACTGGCATCTGGGGTCCCA TCGCGGTTCAGTGGCGGTGGGTCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGTGGCGTGCAGT GTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTGGAGGCTACAGAAGTGATAGTGTTGATGGTGTTGC TTTCGCCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC TTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATA ACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAA CTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACC CTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATC AGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 262) .

En otra realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma¦ alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 123: CAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGAGGCCTGGTCCAGCCTGAGGGATCCCTGACACTCACCT GCACAGCCTCTGGATTCGACTTCAGTAGCAATGCAATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGG GAAGGGGCTGGAGTGGATCGGATGCATTTAcAATGGTGATGGCAGCACATACTACGCGAGC TGGGTGAATGGCCGATTCTCCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAACTGA ATAGTCTGACAGTCGCGGACACGGCCACGTATTATTGTGCGAGAGATCTTGACTTGTGGGG CCCGGGCACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 263) .

En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptídica de la cadena pesada SEQ ID NO: 124: CAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGAGGCCTGGTCCAGCCTGAGGGATCCCTGACACTCACCT GCACAGCCTCTGGATTCGACTTCAGTAGCAATGCAATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGG GAAGGGGCTGGAGTGGATCGGATGCATTTAcAATGGTGATGGCAGCACATACTACGCGAGC TGGGTGAATGGCCGATTCTCCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAACTGA ATAGTCTGACAGTCGCGGACACGGCCACGTATTATTGTGCGAGAGATCTTGACTTGTGGGG CCCGGGCACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTG GCAcCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACT ACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACAC CTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCC TCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCA AGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCC AGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACC CTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACC CTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCC GCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAG GACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCA. TCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCC CCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTC TATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGA CCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGA CAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 264) .

En otra realización de la invenciónlos polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos SEQ ID NO: 265; SEQ ID NO: 266; y SEQ ID NO: 267, las cuales corresponden a los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 121 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 122. En otra realización de la invenciónlos polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos SEQ ID NO: 268; SEQ ID NO: 269; y SEQ ID NO: 270, las cuales corresponden a los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 123 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 124. La invención asimismo contempla secuencias de polinucleótidos que incluyen una o más de las secuencias de polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que se especifican en la presente memoria. En una realización de la invenciónlos polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo la totalidad de los siguientes polinucleótidos que codifican para fragmentosde anticuerpo: el polinucleótido SEQ ID NO: 261, el cual codifica para la secuencia de la región variable de la* cadena ligera SEQ ID NO: 121; el polinucleótido SEQ ID NO: 262, el cual codifica para la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 122; el polinucleótido SEQ ID NO: 263, el cual codifica para la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 123; el polinucleótido SEQ ID NO: 264, el cual codifica para la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 124; los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 265; SEQ ID NO: 266; y SEQ ID NO: 267) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 121 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 122; y los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 268; SEQ ID NO: 269; y SEQ ID NO: 270) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 123 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 124.

En una realización preferida de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, los polinucleótidos que codifican para fragmentos Fab (fragmentos de unión al antigeno) que poseen especficidad de unión por CGRP. En lo que refiere al anticuerpo Abl3, los polinucleótidos que codifican para el anticuerpo de longitud completa Abl3 comprenden, o en forma alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 262, el cual codifica para la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 122 y el polinucleótido SEQ ID NO: 264, el cual codifica para la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 124.

Otra realización de la invención contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para la expresión en células mamiferas tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas de hongos, insectos o microbios tales como las células de levaduras tales como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, a modo no taxativo, Pichia pastoris. En una realización de la invención que se describe en la presente memoria (más adelante) , los fragmentos Fab pueden producirse por digestión enzimática (por ejemplo, papaina) de Abl3 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un huésped adecuado. En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP tales como Abl3 o fragmentos Fab del mismo pueden producirse mediante la expresión de los polinucleótidos de Abl3 en células mamiferas tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas de hongos, insectos o microbios tales como las células de levaduras (por ejemplo, levaduras diploides tales como Pichia diploide) y otras cepas de levaduras. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, a modo no taxativo, Pichia pastoris.

Anticuerpo Abl4 La invención asimismo se refiere a polinucleótidos que codifican para los polipéptidos de un anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP. En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 131: CAAGTGCTGacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcA ATtgcCAGGCCAGTCAGAATGTTTAcAATAACAACTACCTAGCCtggtatcagcagaaacc agggaaagttcctaagCAActgatctatTCTACATCCACTCTGGCATCTggggtcccatct cgtttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctg aagatgttgcaacttattactgtCTGGGCAGTTATGATTGTAGTCGTGGTGATTGTTTTGT Tttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgt (SEQ ID NO: 271) .

En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la cadena ligera SEQ ID NO: 132: CAAGTGCTGacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcA ATtgcCAGGCCAGTCAGAATGTTTAcAATAACAACTACCTAGCCtggtatcagcagaaacc agggaaagttcctaagCAActgatctatTCTACATCCACTCTGGCATCTggggtcccatct cgtttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctg aagatgttgcaacttattactgtCTGGGCAGTTATGATTGTAGTCGTGGTGATTGTTTTGT TttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgtACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC TTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATA ACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAA CTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACC CTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATC AGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 272) .

En otra realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 133: gaggtgcagctTgtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactct cctgtgcaGTCtctggaATCGGCCTCagtAGCTACTACATGCAAtgggtccgtcaggctcc agggaaggggctggagtgggtcGGAGTCATTGGTAGTGATGGTAAGACATACTACGCGACC TGGGCGAAAGGCcgattcaccatctccagagacaattccaagACCACGGTGtatcttcaaa tgaacagcctgagagctgaggacactgctgtgtatTTCtgtACCAGAGGGGACATCtgggg ccaagggaccctcgtcaccgtcTCGAGC (SEQ ID NO: 273) .

En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia polipeptidica de la cadena pesada SEQ ID NO: 134: gaggtgcagctTgtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactct cctgtgcaGTCtctggaATCGGCCTCagtAGCTACTAQATGCAAtgggtccgtcaggctcc agggaaggggctggagtgggtcGGAGTCATTGGTAGTGATGGTAAGACATACTACGCGACC TGGGCGAAAGGCcgattcaccatctccagagacaattccaagACCACGGTGtatcttcaaa tgaacagcctgagagctgaggacactgctgtgtatTTCtgtACCAGAGGGGACATCtgggg ccaagggaccctcgtcaccgtcTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTG GCAcCCTCCTCCaAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACT ACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACAC CTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCC TCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCA AGGTGGACGCGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCC AGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACC CTCATGaTCTCCCgGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACC CTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCC GCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAG GACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCA TCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCC CCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTC TATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGA CCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGA CAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 274) .

En otra realización de la invenciónlos polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos SEQ ID NO: 275; SEQ ID NO: 276; y SEQ ID NO: 277, las cuales corresponden a los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 131 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 132. En otra realización de la invenciónlos polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos SEQ ID NO: 278; SEQ ID NO: 279; y SEQ ID NO: 280, las cuales corresponden a los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 133 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 134. La invención asimismo contempla secuencias de polinucleótidos que incluyen una o más de las secuencias de polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que se especifican en la presente memoria. En una realización de la invenciónlos polinucleótidos que codifican para fragmentos de anticuerpo que posee especificidad en la unión a CGRP comprenden, o en forma alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo la totalidad de los siguientes polinucleótidos que codifican para fragmentosde anticuerpo: el polinucleótido SEQ ID NO: 271, el cual codifica para la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 131; el polinucleótido SEQ ID NO: 272, el cual codifica para la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 132; el polinucleótido SEQ ID NO: 273, el cual codifica para la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 133; el polinucleótido SEQ ID NO: 274, el cual codifica para la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 134; los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 275; SEQ ID NO: 276; y SEQ ID NO: 277) de la secuencia de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 131 o la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 132; y los polinucleótidos que codifican para las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 278; SEQ ID NO: 279; y SEQ ID NO: 280) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 133 o la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 134.

En una realización preferida de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o en forma alternativa consisten en, los polinucleótidos que codifican para fragmentos Fab (fragmentos de unión al antigeno) que poseen especficidad de unión por CGRP. En lo que refiere al anticuerpo Abl4, los polinucleótidos que codifican para el anticuerpo de longitud completa Abl4 comprenden, o en forma alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 272, el cual codifica para la secuencia de la cadena ligera SEQ ID NO: 132 y el polinucleótido SEQ ID NO: 274, el cual codifica para la secuencia de la cadena pesada SEQ ID NO: 134.

Otra realización de la invención contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para la expresión en células mamiferas tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas de hongos, insectos o microbios tales como las células de levaduras tales como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, a modo no taxativo, Pichia pastoris. En una realización de la invención que se describe en la presente memoria (más adelante) , los fragmentos Fab pueden producirse por digestión enzimática (por ejemplo, papaina) de Abl4 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un huésped adecuado. En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP tales como Abl4 o fragmentos Fab del mismo pueden producirse mediante la expresión de los polinucleótidos de Abl4 en células mamiferas tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas de hongos, insectos o microbios tales como las células de levaduras (por ejemplo, levaduras diploides tales como Pichia diploide) y otras cepas de levaduras. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, a modo no taxativo, Pichia pastoris.

En una realización, la invención se refiere a un polinucleótido aislado que comprende un polinucleótido que codifica para una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de un anticuerpo anti CGRP a seleccionar a partir de SEQ ID NO: 3, 13, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123, o 133, o que codifica para una variante de ellas donde al menos un residuo framework (residuo FR) se ha sustituido con un aminoácido que está presente en la posición correspondiente en a polipéptido de la región variable de la cadena pesada de un anticuerpo anti CGRP de rata o a sustitución de aminoácidos conservadora.

En otra realización, la invención se refiere a un polinucleótido aislado que comprende la secuencia de polinucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de un anticuerpo anti CGRP a seleccionar a partir de 1, 11, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, o 131, o que codifica para una variante de ellas donde al menos un residuo framework (residuo FR) se ha sustituido con un aminoácido que está presente en la posición correspondiente en un polipéptido de la región variable de la cadena ligera de un anticuerpo anti CGRP de rata o una sustitución de aminoácidos conservadora .

En incluso otra realización, la invención se refiere a uno o más polinucleótidos heterólogos que compenden una secuencia que codifica para los polipéptidos contenidos en SEQ ID NO:l y SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO:53, SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO: 73; SEQ ID NO: 81 y SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 91 y SEQ ID NO: 93; SEQ ID NO: 101 y SEQ ID NO:103; SEQ ID NO:lll y SEQ ID NO: 113; SEQ ID N0.121 y SEQ ID NO:123; o SEQ ID NO:131 y SEQ ID NO:133.

En otra realización, la invención se refiere a un polinucleótido aislado que expresa un polipéptido que contiene al menos un polipéptido correspondiente a una CDR derivado a partir de un anticuerpo anti CGRP donde donde dicho polipéptido expresado en si mismo se une específicamente a CGRP o se une específicamente a CGRP cuando se expresa en asociación con otra secuencia de polinucleótidos que expresa un polipéptido que contiene al menos un polipéptido correspondiente a una CDR derivado a partir de an anticuerpo anti CGRP donde dicha al menos una CDR se selecciona a partir de aquellas contenidas en las secuencias de polipéptidos VL o VH SEQ ID NO: 1, 3, 11, 13, 21, 23, 31, 33, 41, 43, 51, 53, 61, 63, 71, 73, 81, 83, 91, 93, 101, 103, 111, 113, 121, 123, 131, o SEQ ID NO:133.

Asimismo, se contemplan las células huésped y vectors que comprenden dichos polinucleótidos.

La invención asismismo contempla vectores que comprenden las secuencias de polinucleótidos que codifican para las secuencias de polipéptidos de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, asi como las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, o regiones hipervariables ) individuales, tal como se especifica en la presente memoria, asi como las células huésped que comprenden dichas secuencias de vector. En una realización de la invención, la célula huésped es una célula de levadura. En otra realización de la invención, la célula de levadura huésped pertenece al género Pichia .

Detección y aislamiento de células B En una realización, la presente invención contempla la preparación y el aislamiento de una población clonal de células B especificas para el antigeno que puede utilizarse para aislar al menos una célula especifica para el antigeno CGRP, la cual puede utilizarse para producri el anticuerpo monoclonal contra CGRP, el cual es especifico para un antigeno CGRP deseado, o una secuencia de ácidos nucleicos que corresponde a dicho anticuerpo. Los métodos para la preparación y el aislamiento de dicha población clonal de células B especificas para el antigeno se divulgan, por ejemplo, en la Publicación de Patente Estadounidense No. US 2007/0269868 to Carvalho-Jensen et al., cuya divulgación se incorpora por referencia en la presente memoria en su totalidad. Los métodos para la preparación y el aislamiento de dicha población clonal de células B especificas para el antigeno se divulgan asimismo en la presente memoria en los Ejemplos. Los métodos para "enriqucer" una población de células en tamaño o densidad son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Patente Estadounidense 5,627,052. Estos pasos pueden utilizarse además para enriquecer la población de células en especificidad por el antigeno.

Métodos para humanizar anticuerpos En otra realización, la presente invención contempla métodos para humanizar las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo. Los métodos para humanizar las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo que pueden aplicarse a anticuerpos anti CGRP se divulgan, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense No. US 2009/0022659 de Olson et al., y in Patente Estadounidense No. 7,935,340 de Garcia-Martinez et al., cuyas divulgaciones se incorporan por referencia en la presente memoria en su totalidad.

Métodos para producir anticuerpos y fragmentos de ellos En otra realización, la presente invención contempla métodos para producir anticuerpos anti CGRP y fragmentos de ellos diarrea. Los métodos para producir anticuerpos anti CGRP y fragmentos de ellos secretados por cepas poliploides, preferentemente diploides o tetraploides strains de levaduras aptas para el apareamiento se divulgan, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense No. US 2009/0022659 to Olson et al., y en la Patente Estadounidense No. 7,935,340 de Garcia-Martinez et al., cuyas divulgaciones se incorporan por referencia en la presente memoria en su totalidad .

Otros métodos para producir anticuerpos son bien conocidos por cualquiera versado en la técnica. Por ejemplo, ahora son bien conocidos en la técnica los métodos para producir anticuerpos quiméricos (Ver, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 4,816,567 de Cabilly et al.; Morrison et al., P.N.A.S. USA, 81:8651-55 (1984); Neuberger, M.S. et al., Nature, 314:268-270 (1985); Boulianne, G.L. et al., Nature, 312:643-46 (1984), cuyas divulgaciones se incorporan por referencia en la presente memoria en su totalidad) .

Asimismo, other métodos para producir anticuerpos humanizados son bien conocidos en la técnica en la actualidad (Ver, por ejemplo, Patente Estadounidense Nos. 5,530,101, 5,585,089, 5,693,762, y 6,180,370 de Queen et al; Patente Estadounidense Nos. 5,225,539 y 6,548,640 de Winter; Patente Estadounidense Nos. 6,054,297, 6,407,213 y 6,639,055 to Cárter et al; Patente Estadounidense No. 6,632,927 de Adair; Jones, P.T. et al, Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann, L., et al, Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen, M, et al, Science, 239:1534-36 (1988), cuyas divulgaciones se incorporan por referencia en la presente memoria en su totalidad) .

Los polipéptidos de anticuerpo de la invención que poseen Especificidad de unión por CGRP diarrea pueden asimismo producirse mediante la construcción, utilizando técnicas bien conocidas por cualquiera versado en la técnica, de un vector de expresión que contiene un operón y una secuencia de DNA que codifica para la cadena pesada de un anticuerpo en la cual la secuencia de DNA que codifica para las CDRs requeridas para la especificidad del anticuerpo se deriva de una fuente de células no humanas, preferentemente una fuente de células B de conejo, mientras que la secuencia de DNA que codifica para las restantes partes de la cadena del anticuerpo se deriva a partir de una fuente de células humanas .

Se produce un vector de expresión utilizando el mismo método convencional bien conocido por cualquiera versado en la técnica, siendo que dicho vector de expresión contiene un operón y una secuencia de DNA que codifica para la cadena ligera de un anticuerpo en la cual la secuencia de DNA que codifiaca para las CDRs requeridas para la especificidad del anticuerpo se deriva a partir de una fuente de células no humanas, preferentemente una fuente de células B de conejo, mientras que la secuencia de DNA que codifica para las restantes partes de la cadena del anticuerpo se deriva a partir de una fuente de células humanas.

Los vectores de expresión se transfectan en una célula huésped mediante técnicas convencionales bien conocidas por cualquiera versado en la técnica para producir una célula huésped trasfectada, siendo que dicha célula huésped trasfectada se cultiva mediante técnicas convencioales bien conocidas por cualquiera versado en la técnica para producir dichos polipéptidos de anticuerpo.

La célula huésped puede ser cotransfectada con los dos vectores de expresión que se describen arriba, siendo que el primer vector de expresión contiene DNA que codifica para un opérón y un polipéptido derivado de la cadena ligera y el segundo vector contiene DNA que codifica para un operón y un polipéptido derivado de la cadena psada. Los dos vectores contienen marcadores seleccionables diferentes, pero preferentemente alcanzan una expresión sustancialmente igual de los polipéptidos de las cadenas pesada y ligera. En forma alternativa, puede utilizarse un único vector, siendo que el vector incluye DNA que codifica tanto para los polipéptidos de la cadena pesada como para los de la cadena ligera. Las secuencias codificadoras para las cadenas pesada y ligera pueden comprender cDNA, DNA genómico, o ambos.

Las células huésped utilizadas para expresar los polipéptidos de anticuerpo pueden ser ya sea céluas bacterianas como, por ejemplo, E. coli, o una célula eucariota como, por ejemplo, P. pastoris. En una realización de la invención, puede utilizarse una célula mamifera de un tipo bien definido para este propósito, como, por ejemplo, una célula de mieloma, una linea de células de ovario de hámster chino (CHO) , una linea de células NSO, o una linea de células HEK293.

Los métodos generáis mediante los cuales pueden construirse los vectores, los métodos de trasfección que se requieren para producir la célula huésped y los métodos de cultivo que se requieren para producir el polipéptidos de anticuerpo a partir de dichas células huésped son los convencionales en la técnica. Aunque la linea de células que se utiliza para producir el anticuerpo ee una linea de céluas mamíferas, puede utilizarse en forma alternativa cualquier otra linea de células adecuada, como, por ejemplo, una linea de células bacterianas como, por ejemplo, una cepa bacteriana derivada de E. coli, o una linea de células de levaduras.

De manera similar, una vez producidos, los polipéptidos de anticuerpo pueden purificarse conforme a los procedimientos estándares utilizados en la técnica, como, por ejemplo, filtración de flujo cruzado, precipitación con sulfato de amonio, cromatografía de columna de afinidad y similares.

Los polipéptidos de anticuerpo que se describen en la presente memoria pueden asimismo utilizarse para el diseño y síntesis de miméticos tanto peptídicos como no peptídicos que podrían ser útiles para las mismas aplicaciones terapéuticas que los polipéptidos de anticuerpo de la invención. Ver, por ejemplo, Saragobi et al, Science, 253:792-795 (1991), cuyo contenido se incorpora por referencia en la presente memoria en su totalidad.

Ensayos de screening La invención asimismo incluye ensayos de screening diseñados para ayudar en la identificación de enfermedades y trastornos asociados con CGRP y diarrea en pacientes que exhiben los síntomas de una enfermedad o trastorno asociado con CGRP.

En una realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP de la invención, o fragmentos de unión a CGRP de los mismos, se utilizan para detectar la presencia de CGRP en una muestra biológica obtenida a partir de un paciente que exhibe los síntomas de una enfermedad o trastorno asociado con CGRP y diarrea. La presencia de CGRP, o los niveles elevados de éste especialmente en el colon en comparación a los niveles de CGRP previo a la enfermedad en una muestra biológica comparable, pueden ser beneficiosos para el diagnósitco de una enfermedad o trastorno asociado con CGRP asociada/o con la diarrea.

Otra realización de la invención da a conocer un ensayo de diagnóstico o screening para ayudar en la diagnosis de enfermedades o trastornos asociados con CGRP en pacientes que exhiben los síntomas de una enfermedad o trastorno asociado con CGRP de las/os que se especifican en la presente memoria, el cual comprende el ensayo del nivel de epresión de CGRP en una muestra biológica de dicho paciente utilizando un anticuerpo anti CGRP o fragmento de unión de éste modificado después de la traducción. El anticuerpo anti CGRP o fragmento de unión de éste puede modificarse después de la traducción de modo de incluir una estructura detectable como, por ejemplo, las que se dan a conocer en esta memoria.

El nivel de CGRP en la muestra biológica se determina utilzando un anticuerpo anti CGRP o fragmento de unión de éste modificado tal como se especifica en la presente memoria, y comparando el nivel de CGRP en la muestra biológica contra un nivel de CGRP de referencia (por ejemplo, el nivel en las muestras biológicas normales). Cualquiera versado en la técnica comprendería que puede existir cierta variabilidad entre las muestras biológicas y tomaría ese hecho en consideración al evaluar los resultados. En una realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP de la invención pueden utilizarse para correlacionar los niveles de expresión de CGRP con una etapa particular del desarrollo canceroso. Cualquiera versado en la técnica sería capaz de medir CGRP en varios sujetos a fin de establecer rangos de expresión de CGRP que corresponden a etapas clínicamente definidas del desarrollo canceroso. Estos rangos permitrán al técnico medir CGRP en un sujeto diagnosticado con cáncer y correlacionar los niveles en cada sujeto con un rango que corresponde a la etapa de dicho cáncer. Cualquiera versado en la técnica comprendería que midiendo CGRP en el paciente a diferentes intervalos, puede determinarse el progreso del cáncer .

En antedicho ensayo puede asimismo ser útil para el monitoreo de una enfermedad o trastorno, cuando el nivel de CGRP obtenido en una muestra biológica de un paciente que, se cree, posee una enfermedad o trastorno asociada/o con CGRP se compara con el nivel de CGRP en muestras biológicas previas del mismo patiente, a fin de asegurar si el nivel de CGRP en dicho paciente a cambiado con, por ejemplo, un régimen de tratamiento .

La invención asimismo se refiere a un método para la imagenologia in vivo que detecta la presencia de células que expresan CGRP el cual comprende la administración de una cantidad diagnósticamente efectiva de una composición diagnóstica. Dicha imagenologia invivo es útil para la detección o imagenologia de tumores o tetástasis que expresan CGRP, por ejemplo, y pueden ser útiles como parte de un régimen de planivficación para el diseño de un protocolo efectivo para el tratamiento del cáncer. El protocolo del tratamiento puede incluir, por ejemplo, uno o más de radiación, quimioterapia, terapia de citoquinas, terapia genética, y terapia de anticuerpos, asi como un anticuerpo anti CGRP o un fragmento de éste.

La presente invención asimismo da a conocer un kit par detectar la unión de un anticuerpo anti CGRP de la invención a CGRP. En particular, el kit puede utilizarse para detectar la presencia de un CGRP específicamente reactivo con un anticuerpo anti CGRP de la invención o un fragmento inmunoreactivo del mismo. El kit puede asimismo incluir un anticuerpo ligado a un sustrato, un Segundo anticuerpo reactive con el antigeno y un reactivo para detectar una reacción del segundo anticurpo con el antigeno. Dicho kit puede ser un kit ELISA y puede comprender el sustrato, los anticuerpos primario y secundario cuando sea apropiado, y cualesquiera otros reactivos necesarios como, por ejemplo, estructuras detectables, sustratos enzimáticos, y reactivos de color, como, por ejemplo, los que se describen en la presente memoria. El kit de diagnóstico puede asimismo encontrarse en la forma de un kit de inmunoblot. El kit de diagnóstico puede asimismo encontrarse en la forma de un kit de quimioluminiscencia (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) . El kit de diagnostic puede asimismo ser un kit de detección basado en lantánidos (PerkinElmer, San José, CA) . Cualquiera versado en la técnica comprenderla que una muestra biológica incluye, a modo no taxativo, suero, plasma, orina, saliva, mucosa, fluido pleural, fluido sinovial y fluido espinal .

Métodos para mejorar o disminuir los síntomas de, o tratar, o prevenir enfermedades y trastornos asociados con CGRP El anticuerpos anti CGRP que se describe en la presente memoria, o fragmentos de los mismos, son útiles para mejorar o disminuir los síntomas de, o tratar, o prevenir, enfermedades y trastornos asociados con CGRP, especialmente diarrea. En una realización preferida, los anticuerpos anti o fragmentos de anticuerpo CGRP demostrarán ser eficaces (bloquean los efectos colaterales adversos asociados con el exceso de CGRP circulante, incluyendo la diarrea en el modelo de animal roedor que se divulga en el Ejemplo 8.

Los anticuerpos anti CGRP que se describen en la presente memoria, o fragmentos de ellos, así como sus combinaciones, pueden asimismo administrarse en una cantidad terapéuticamente efectiva a pacientes que necesiten el tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con CGRP en la forma de una composición farmacéutica como se describe en mayor detalle a continuación.

En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP que se describen en la presente memoria, o fragmentos de ellos, son útiles para mejorar o disminuir los síntomas de, o tratar, o prevenir la diarrea en las condiciones asociadas con CGRP incluidas migrañas (con o sin aura) , pérdida de peso, cáncer o tumores, angiogénesis asociada con el crecimiento tumoral del cáncer o tumor, la angiogénesis asociada con el cáncer o la supervivencia del tumor, dolor, migrañas hemiplágicas, cefalea en racimos, neuralgia migrañosa, dolores de cabeza crónicos, dolores de cabeza tensionales, dolores de cabeza generales , sofocos, hemicránea paroxistica crónica, dolores de cabeza secundarios debido a un problema estructural subyacente en la cabeza o el cuello, neuralgias craneales, cefaleas sinusales (como, por ejemplo, asociado con sinusitis), y cefaleas inducidas por alergia o migrañas.

En una realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP que se describen en la presente memoria, o fragementos de ellos y/o con un segundo agente, son útiles para mejorar o disminuir los síntomas de, o tratar, o prevenir la diarrea asociada con el siguiente listado no taxativo de enfermedades y trastornos relacionados con CGRP: dolor , dolor inflamatorio , dolor de incisión post-operatorio , síndrome de dolor regional complejo , dolor por cáncer , dolor del cáncer de hueso primario o metastásico , dolor por fractura, dolor crónico , dolor por fractura osteoporótica , dolor resultante de quemaduras , osteoporosis , dolor en las articulaciones por gota , dolor abdominal , dolor asociado con la crisis de células falciformes , y otros dolores nocicepticos , carcinoma hepatocelular y , cáncer de mama , cirrosis del hígado , dolor neurogénico , dolor neuropático , dolor nociceptico , neuralgia trigeminal, neuralgia post -herpética , dolor del miembro fantasma , fibromialgia , dolor menstrual, ovarialgia , distrofia simpática refleja , dolor neurogénico , osteoartritis o dolor de la artritis reumatoide, dolor de espalda , neuropatía diabética, ciática o dolor visceral asociado con : reflujo gastroesofágico, dispepsia, síndrome de colon irritable, colon irritable, colon espástico, colitis mucosa , enfermedad inflamatoria del intestino , enfermedad de Crohn , ileítis , colitis ulcerosa , cólico renal , dismenorrea , cistitis , período menstrual , parto , menopausia , prostatitis , pancreatitis , cólico renal , dismenorrea , cistitis , incluyendo la cistitis intersticial ( IC ) , cirugía asociada con la íleo , diverticulitis , peritonitis , pericarditis , hepatitis , apendicitis , colitis , colecistitis , endometriosis , pancreatitis aguda y/o crónica , infarto de miocardio , dolor de riñon , dolor pleural , la prostatitis , dolor pélvico , un traumatismo en un órgano , dolor nociceptivo crónico o neuropático crónico, el dolor inflamatorio crónico , fibromialgia, dolor irruptivo y dolor persistente, el dolor por cáncer y que surge de malignidad o de cáncer preferentemente seleccionado entre uno o más de : adenocarcinoma en el tejido glandular , blastoma en el tejido embrionario de órganos , el carcinoma en el tejido epitelial , leucemia en tejidos que forman las células sanguíneas, linfoma de tejido linfático , mieloma en la médula ósea , el sarcoma de tejido de soporte o conectivo , cáncer adrenal , linfoma relacionado con el SIDA , anemia , cáncer de vejiga , cáncer de huesos , cáncer cerebral , cáncer de mama , tumores carcinoides , el cáncer cervical , Quimioterapia , cáncer de colon, citopenia , cáncer de endometrio , cáncer de esófago , cáncer gástrico, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatobiliar , cáncer de riñon , leucemia , cáncer de Hígado , cáncer de pulmón , linfoma , enfermedad de Hodgkin , linfoma no Hodgkin , tumores del sistema nervioso , cáncer oral, cáncer de ovario , cáncer de páncreas , cáncer de próstata , cáncer de recto , cáncer de piel , cáncer de estómago , cáncer testicular , cáncer de tiroides , cáncer de la uretra , cáncer de hueso, cáncer de los sarcomas del tejido conectivo , cáncer del tejido óseo , cáncer de las células que forman la sangre, el cáncer de la médula ósea , mieloma múltiple, cáncer de hueso, primario o secundario, leucemia, los tumores que metastatizan al hueso , tumores infiltrantes del nervio y viscera hueca , tumores cerca de estructuras neurales. Más preferentemente el dolor por cáncer comprende el dolor visceral, preferentemente dolor visceral que surge de cáncer de páncreas y / o metástasis en el abdomen. Más preferentemente el dolor por cáncer comprende dolor somático preferentemente debido a uno o más de cáncer de hueso , la metástasis en el hueso , el dolor postquirúrgico , el cáncer de los sarcomas del tejido conectivo , cáncer del tejido óseo, cáncer de células formadoras de sangre de la médula ósea , mieloma múltiple , cáncer de hueso primerio o secundario, leucemia.

En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP que se describen en la presente memoria, o fragmentos de ellos y/o con un segundo agente, son útiles para mejorar o disminuirlos síntomas de, o tratar, o prevenir, el siguiente listado no taxativo de enfermedades y trastornos: cáncer o tumores, la angiogénesis asociada con el cáncer o crecimiento tumoral, la angiogénesis asociada con el cáncer o la supervivencia del tumor.

En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP que se describen en la presente memoria, o fragmentos de ellos y/o con un segundo agente, son útiles para mejorar o disminuirlos síntomas de, o tratar, o prevenir, el siguiente listado no taxativo de enfermedades y trastornos: neurogenic, neuropathic o nociceptic pain. Neuropathic pain may include, a modo no taxativo, trigeminal neuralgia, post-herpetic neuralgia, phantom limb pain, fibromyalgia, menstrual pain, ovarialgia, reflex sympathetic dystrophy y neurogenic pain. In otras realizaciones preferidas, osteoarthritis o rheumatoid arthritis pain, lower back pain, diabetic neuropathy, sciatica, y other neuropathic pain.

En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP que se describen en la presente memoria, o fragmentos de ellos y/o con un segundo agente, son útiles para mejorar o disminuirlos síntomas de, o tratar, o prevenir, el siguiente listado no taxativo de enfermedades y trastornos: diarrea, y dolor visceral asociado con el reflujo gastroesofágico, dispepsia, síndrome del intestino irritable, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, ileítis, colitis ulcerosa, cólico renal, dismenorrea, cistitis, período menstrual, parto, menopausia, prostatitis, o pancreatitis .

Administración En una realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP que se describen en la presente memoria, o fragmentos de unión a CGRP de los mismos, así como combinaciones de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, se administran a un paciente a una concentración de entre alrededor de 0.1 y 100.0 mg/kg de peso corporal del sujeto receptor. En una realización preferida de la invención, los anticuerpos anti CGRP que se describen en la presente memoria, o fragmentos de unión a CGRP de los mismos, así como combinaciones de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, se administran a un paciente a una concentración de alrededor de 0.4 mg/kg de peso corporal del sujeto receptor. En una realización preferida de la invención, los anticuerpos anti CGRP que se describen en la presente memoria, o fragmentos de unión a CGRP de los mismos, asi como combinaciones de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, se administra a un sujeto receptor con una frecuencia de una vez cada 26 semanas o menos, como, por ejemplo, una vez cada 16 semanas o menos, una vez cada ocho semanas o menos, una vez cada cuatro semanas o menos, una vez cada dos semanas o menos, una vez cada semana o menos, o una vez por dia o menos.

Los Fragmentos Fab pueden administrarse cada dos semanas o menos, cada una semana o menos, una vez por dia o menos, varias veces por dia, y/o cada pocas horas. En una realización de la invención, un paciente recibe fragmentos Fab de 0.1 mg/kg a 40 mg/kg por dia en dosis divididas de 1 a 6 veces por dia, o en una forma de liberación sostenida, efectiva para obtener los resultados deseados.

Debe comprenderse que la concentración del anticuerpo o Fab que se administra a un paciente dado puede ser mayor o menor que las concentraciones de administración ej emplificativas que se dan a conocer más arriba en los párrafos

[0566] y

[0567] .

Cualquiera versado en la técnica sería capaz de deterinar una dosis y una frecuencia de administración efectiva mediante la experimentación de rutina, por ejemplo, siguiendo las guías que sde divulgan en la presente memoria y lo divulgado en Goodman, L. S., Gilman, A., Brunton, L. L. , Lazo, J. S., & Parker, K. L. (2006). Goodman & Gilman's the pharmacological basis de therapeutics . New York: McGraw-Hill ; Howland, R. D., Mycek, M. J. , Harvey, R. A., Champe, P. C. , & Mycek, M. J. (2006). Pharmacology . Lippincott ' s illustrated reviews. Philadelphia : Lippincott Williams & Wilkins; y Golan, D. E. (2008). Principies de pharmacology: the pathophysiologic basis de drug therapy. Philadelphia, Pa., [etc.]: Lippincott Williams & Wilkins.

En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP que se describen en la presente memoria, o fragmentos de unión a CGRP de los mismos, asi como combinaciones de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, se administran a un paciente en una formulación farmacéutica.

Una "composicióni farmacéutica" se refiere a una composición química o biológica adecuada para la administración a un mamífero. Dichas composiciones pueden formularse de manera específica para la administración por una o más de un número de rutas, incluyendo a modo no taxativo buccal, epicutaneous, epidural, inhalation, intraarterial, intracardial, intracerebroventricular, intradermal, intramuscular, intranasal, intraocular, intraperitoneal, intraspinal, intrathecal, intravenous, oral, parenteral, rectally via an enema o suppository, subcutaneous, subdermal, sublingual, transdermal, y transmucosal . Por otra parte, la administración puede llearse a cabo mediante inyección, polvo, liquido, gel, gotas u otros medios de adminsitracion. En una realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP que se describen en la presente memoria, o fragmentos de unión a CGRP de los mismos, asi como combinaciones de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, pueden opcionalmente administrarse en combinación con uno o más agentes activos. Dichos agentes activos incluyen agentes analgesic, anti-histamine, antipyretic, anti-inflammatory, antibiotic, antiviral, y anti-cytokine . Los agentes activos incluyen agonistas, antagonistas, y moduladores de TNF-a, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-18, IFN-a, IFN-?, BAFF, CXCL13, IP-10, VEGF, EPO, EGF, HRG, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) , Hepcidina, incluyendo los anticuerpos reactivos contra culquiera de los anteriores, y los anticuerpos reactivos contra culquiera de sus receptores. Los agentes activso asimismo incluyen a modo no taxativo Ácidos 2 arilpropiónicos , aceclofenaco, Acemetacina , ácido acetilsalicilico ( aspirina ) , alclofenac , alminoprofeno , Amoxiprin , Ampyrone , ácidos arilalcanoicos , azapropazona benorilato / Benorilate , benoxaprofeno , Bromfenac , Carprofen , Celecoxib , salicilato de colina y magnesio , Clofezone , inhibidores de la COX - 2 , dexibuprofeno , Dexketoprofeno , diclofenaco , diflunisal , droxicam , etenzamida , Etodolac , etoricoxib , Faislamine , ácidos fenámico , Fenbufen , fenoprofeno , ácido flufenámico, flunoxaprofen , flurbiprofeno , ibuprofeno , ibuproxam , indometacina , indoprofeno , Kebuzone , ketoprofeno , ketorolaco , lornoxicam , Loxoprofeno , lurairacoxib , salicilato de magnesio, ácido meclofenámico , ácido mefenámico , meloxicam , Metamizol , salicilato de metilo , mofebutazona , Nabumetone , naproxeno , ácido N-Arilantranilico , factor de crecimiento nervioso (NGF ) , Oxametacin , Oxaprozin , oxicams , Oxifenbutazona , parecoxib , Fenazona , fenilbutazona , fenilbutazona , piroxicam , pirprofeno , profenos , Proglumetacin , pirazolidina derivados, rofecoxib , salicilato salicilico , Salicilamida , salicilatos, sustancia P, sulfinpirazona , sulindac , Suprofeno , Tenoxicam , ácido tiaprofénico, ácido tolfenámico, Tolmetin, y valdecoxib.

Un anti histaminico puede ser cualquier compuesto que se opone a la acción de la histamina o su liberación a partir de las células (por ejemplo, mast cells) . Los anti histaminicos incluyen a modo no taxativo acrivastine, astemizole, azatadine, azelastine, betatastine, brompheniramine, buclizine, cetirizine, cetirizine analogues, chlorpheniramine, clemastine, CS 560, cyproheptadine, desloratadine, dexchlorpheniramine, ebastine, epinastine, fexofenadine, HSR 609, hydroxyzine, levocabastine, loratidine, methscopolamine, mizolastine, norastemizole, phenindamine, promethazine, pyrilamine, terfenadine, y tranilast .

Los antibióticos incluyen a modo no taxativo Amikacina, antibióticos aminoglucósidos , Amoxicilina, Ampicilina, ansamicinas, arsfenamina, azitromicin, Azlocilina, aztreonam , bacitracina, carbacefem , carbapenems , carbenicilina, cefaclor, cefadroxilo, cefalexina, Cefalothin , Cefalotina , Cefamandole , cefazolina, cefdinir , Cefditoren , cefepima , cefixima , cefoperazona , cefotaxima , cefoxitina , cefpodoxima , Cefprozil , ceftazidima , Ceftibuten, Ceftizoxima , Ceftobiprole , ceftriaxona, cefuroxima , cefalosporinas , cloramfenicol , Cilastatin , ciprofloxacina , claritromicina , clindamicina , cloxacilina , colistina , cotrimoxazol , dalfopristina, demeclociclina , dicloxacilina , Dirithromycin , doripenem, doxiciclina , Enoxacina , ertapenem , eritromicina , etambutol , Flucloxacillin , fosfomicina , furazolidona , ácido fusidico , gatifloxacina , Geldanamicina , gentamicina, glucopéptidos, herbimicina, imipenem, isoniazida, canamicina , levofloxacino , lincomicina , linezolid, lomefloxacina , loracarbef , macrólidos , mafenida , Meropenem , meticilina, metronidazol Mezlocillin , rainociclina , monobactamas , moxifloxacina mupirocina, nafcilina , neomicina , netilmicina nitrofurantoina , norfloxacina , ofloxacina , oxacilina oxitetraciclina , paromomiciña , penicilina , penicilinas piperacilina , Platensimicina, polimixina B, polipéptidos Prontosil , pirazinamida Qunolones , Qunupristin rifampicina , rifampicina , roxitromicina , espectinomicina estreptomicina , sulfacetamida , Sulfametizola Sulfanilimide , sulfasalazina , sulfisoxazol , sulfonamidas teicoplanina , telitromicina , tetraciclina , tetraciclinas ticarcilina , tinidazol , tobramicina , trimetoprim trimetoprim - sulfametoxazol , troleandomicina Trovafloxacino , y vancomicina.

Los agentes activos asimismo incluyen aldosterona beclometasona, betametasona, a los corticosteroides Cortisol, acetato de cortisona, acetato desoxicorticosterona dexametasona, acetato de fludrocortisona, glucocorticoides hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona esferoides, y triamcinolona . Asimismo se contempla cualquier combinación adecuada de estos agentes activos.

Un "excipiente farmacéutico" o un "excipiente farmacéuticamente aceptable" es un vehículo, usualmente un líquido, en el cual se formula un agente terapéutico activo.

En una realización de la invención, el agente terapéutico activo es un anticuerpo humanizado de los que se describen en la presente memoria, o uno o más fragmentos del mismo. El excipiente generalmente no proporciona ninguna actividad farmacológica a la formulación, aunque puede proporcionar estabilidad química y/o biológica, y características de liberación. Pueden encontrarse ejemplos de formulaciones en, por ejemplo, Remington' s Pharmaceutical Sciences, 19th Ed. , Grennaro, A., Ed., 1995, la cual se incorpora por referencia en la presente memoria.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "vehículo farmacéuticamente aceptable" o "excipiente" incluye cualquiera y todeos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retardo de la absorción que sean fisiológicamente compatibles. En una realización, el vehículo es adecuado para la administración parenteral. En forma alternativa, el vehículo puede ser adecuado para la administración intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, o sublingual. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen las soluciones o dispersiones acuosas estériles y los polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de dichos medios y agentes para las sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto active, se contempla su utilización en las composiciones farmacéuticas de la invención. Asimismo pueden incorporarse compuestos activos suplementarios en las composiciones .

Las composiciones farmacéuticas típicamente deben ser estériles y estables bajo las condiciones de manufactura y almacenamiento. La invención contempola que la composición farmacéutica está presente en forma liofilizada. La composición puede formularse como una solución, una microemulsión, un liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco. El vehículo puede ser un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido) , y mezclas adecuadas de ellos. La invención asismismo contempla la incorporación de un estabilizador en la composición farmacéutica. La adecuada fluidez puede mantenerse, por ejemplo, manteniendo el tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensoiactivos . In muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes como, por ejemplo, manitol, sorbitol, o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectalbes puede propiciarse mediante la inclusión en la composición de un agente que retarda la absorción, por ejemplo sales de monoestearato y gelatina. Por otra parte, el polipéptido alcalino puede formularse en una formulación de liberación programada en el tiempo, por ejemplo, en una composición que incluye u n polímero de liberación lenta. Los compuestos activos pueden prepararse con vehículos que protegerán el compuesto contra la liberación rápida, como, por ejemplo, una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de entrega de microcápsulas . Pueden utilizarse polímeros bxodegradables y biocompatibles , como, por ejemplo, etileno acetato de vinilo, polianhídridos , ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, ácido polliláctico y copolímeros polilácticos y poliglicólicos (PLG). Cualquiera versado en la técnica conoce varios métodos para la preparación de dichas formulaciones.

Para cada una de las realizaciones que se dan a conocer en la presente memoria, los compuestos pueden administrarse mediante una variedad de formas de dosificación. Se contemplan cualesquiera formas de dosificación biológicamente acceptables conocidas por cualquiera versado en la técnica y las combinaciones de ellas. Los ejemplos de dichas formas incluyen a modo no taxativo los polvos reconstituibles, jarables, líquidos, soluciones, suspensiones, emulsiones, polvos, gránulos, partículas, micropartículas, gránulos dispersables, cachets, inhalables, inhalables en aerosol, parches, inhalables particulados, implantes, implantes de , particle inhalants, implants, implantes de depósito, inyectables (incluyendo inyeccióni subcutánea, intramuscular, intravenous, e intradermal) , infusiones, y combinaciones de ellos .

La descripción anterior de varias realizaciones de la invención que se ilustran no ha de entenderse como exhaustiva o como que limita la invención a la forma en que se divulga. Mientras que en la presente memoria se describen algunas realizaciones específicas y ejemplos de la invención con propósitos ilustrativos, es posible realizar varias modificaciones dentro del alcance de la invención, tal como podrá reconocer cualquiera versado en la técnica. Las divulgaciones que se dan a concoer en la presente memoria pueden aplicarse a otros propósitos que los de los ejemplos que se describen arriba.

Pueden realizarse estos y otros cambios en la invención a la luz de la anterior descripción detallada. En general, en las siguientes reivindicaciones, los términos utilizados no han de entenderse como que limitan la invención a las realizaciones específicas que se divulgan en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones. Conforme a ello, la invención no se ve limitada por la divulgación, sino que de lo contrario el alcance de la invención está determinado exclusivamente por las siguientes reivindicaciones.

La invención puede llevarse a la práctica en formas diferentes a las que se describen en la anterior descripción y ejemplos. Son posibles numerosas modificaciones y variaciones de la invención a la luz ade las divulgaciones anteriores, y, por tanto, caerán dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Ciertas técnicas relacionadas con métodos para obtener una población clonal de células B especificas para el antigeno se divulgaron en Solicitud de Patente Estadounidense Provisoria No. 60/801,412, presentada el 19 de mayo de 2006, cuya divulgación se incorpora por referencia en la presente memoria en su totalidad.

Ciertas técnicas relacionadas con la humanización de los anticuerpos monoclonales derivados de conejo y las modificaciones de secuencia preferidas para mantener la afinidad de unión al antigeno se divulgaron en Solicitud Internacional No. PCT/US2008/064421, correspondiente a la Publicación Internacional No. WO/2008/144757 , con el titulo "Novel Rabbit Anticuerpo Humanization Methods and Humanized Rabbit Antibodies", presentada el 21 de mayo de 2008, cuya divulgación se incorpora por referencia en la presente memoria en su totalidad.

Ciertas técnicas relacionadas con la producción de anticuerpos o fragmentos de ellos utilizando levaduras aptas para el apareamiento y los correspondientes métodos se divulgaron en Solicitud de Patente Estadounidense No. 11/429, 053, presentada el 8 de mayo de 2006, (Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense No. US2006/0270045) , cuya divulgación se incorpora por referencia en la presente memoria en su totalidad.

Ciertos polinucleótidos y polipéptidos de anticuerpos anti CGRP se divulgan en el listado de secuencias que acompaña a esta presentación de solicitud, y la divulgación de dicho listado de secuencias se incorpora por referencia en la presente memoria en su totalidad.

La totalidad de la divulgación de cada documento citado (incluyendo patentes, solicitudes de patente, artículos en revistas, resúmenes, manuales, libros, u otras divulgaciones) en los Antecedentes, la Descripción Detallada, y Ejemplos de la invención se incorpora por referencia en la presente memoria en su totalidad.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para brindar al experto en la técnica una divulgación complete y una descripcioón de cómo llevar a cabo y utilizar la invención en cuestión, y no se proporcionan a modo taxativo tales que limitan el alcance de lo que se entiende como invención. Re han realizado esfuerzos para asegurar la precisión con respect a los numerous utilizados (por ejemplo cantidades, temperaturas, concentraciones, etc.) pero han de tomarse en cuenta ciertos errores y desviaciones. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular promedio, temperatura es en grados centígrados, y la presión es equivalente o cercana a la atmosférica.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Preparación de anticuerpos que se unen a CGRP Utilizando el protocol de selección del anticuerpo que se describe en la presente memroia, puede ganerarse un panel extensive de anticuerpos.

Estrategia de inmunización Se inmunizaron Conejos con CGRP alfa humano (American Peptides, Sunnyvale CA y Bachem, Torrance CA) . La inmunización consistió de una primera inyección subcutánea de 100 µg de antigeno mezclado con 100 µg de KLH en adyuvante de Freund completo (CFA) (Sigma) seguido de dos picos, con una separación de dos semanas entre los mismos y conteniendo 50 µg de antigeno mezclado con 50 µg en adyuvante de Freund incompleto (IFA) (Sigma) . Los animales se sangraon en el dia 55, y se determinaron los títulos en suero mediante ELISA (reconocimiento del antígeno) y mediante la inhibición del aumento de cAMP promovido por CGRP en SK-N-MC.

Evaluación del título para la selección del anticuerpo A fin de identificar y caracterizar los anticuerpos que se unen a CGRP alfa humano, se ensayaron soluciones que contienen el anticuerpo mediante ELISA. Brevemente, se cubrieron placas recubiertas con neutravidin (Thermo Scientific) con CGRP alfa humano N-biotinilado (50 L por pocilio, 1 g/mL) diluido en buffer de ELISA (0.5% gelatina de piel de pescado en PBS pH 7.4,) ya sea durante aproximadamente lhr a temperatura ambiente o en forma alternativa durante la noche a 4°C. Las placas luego se bloquearon con buffer de ELISA durante una hora a temperatura ambiente y se lavaron utilizando buffer de lavado (PBS, 0.05% tween 20) . Se realizaron diluciones en serie de las muestras de suero ensayadas utilzando buffer de ELISA. Se transíifieron 50 microlitros de muestras de sueros diluidas a los pocilios y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. Después de esta incubación, la placa se lavó con buffer de lavado. Durante el desarrollo, se agregó un Fc-HRP especifico anti conejo (dilución 1:5000 en buffer de ELISA) en los pocilios y se uncubó durante 45 min a temperatura ambiente. Después de un paso de 3x lavado con solución de lavado, la placa se desarrolló utilizando sustrato TMB durante dos minutos a temperatura ambiente y la reacción se detuvo utilizando 0.5M HC1. Se leyó la absorbancia del pocilio a 450 nm.

Determinación del título de las muestras de suero mediante actividad functional (inhibición de los niveles de cAMP ocasionados por CGRP) A fin de identificar y caracterizar los anticuerpos con actividad functional, se llevó a cabo un ensayo del aumento en los niveles de cAMP ocasionado por la inhibición de CGRP utilizando electroquimioluminiscencia (Meso Scale Discovery, MSD) . Brevemente, se realizaron diluciones en serie de las preparaciones de anticuerpos a ensayar en buffer de ensayo MSD (Hepes, MgC12, pH 7.3, Img/mL blocker A, Meso Scale Discovery) en una placa de fondo redondeado de 96 pocilios de poliestireno (Costar) . A esta placa se agregó CGRP alfa humano (concentración final de 10ng/mL) diluido en buffer de ensayo MSD y se incubó durante una hora a 37 °C. Se utilizaron los controles adecuados sugeridos por el fabricante del kit de ensayo. Se separaron las células de neuroepxtelioma humano (SK-N-MC, ATCC) utilizando una solución de EDTA (5mM in PBS) y se lavaron utilizando medio de crecimiento (MEM, 10% FBS, antibióticos) con centrifugación. El número de células se ajustó a 2 millones de células por mL en buffer de ensayo, y se agregó IBMX ( 3-Isobutil-lMetilxantina, Sigma) a una concentración final de 0.2mM justo antes de cargar las células en la placa de ensayo para cAMP. Después de que la solución de anticuerpo anti CGRP alfa humano se incubó durante una hora se trafirieron 20 microlitros de la solución que contenia las células a la placa de ensayo para cAMP. Todas las muestras ensayadas se ensayaron por duplicado con los controles adecuados. Se agregaron 10 microlitros de células a los pocilios y la placa se incubó durante 30 minutos con agitación de balanceo a temperatura ambiente. Mientras las células se incubaban con solución de CGRP, se preparó la solución stop realizando una solución 1:200 de cAMP marcado con TAG (MSD) en buffer de lisis (MSD) . Para detener la incubación de las células con CGRP, se agregaron 20 microlitros de solución stop a las células y la placa se incubó durante una hora con agitación de balanceo a temperatura ambiente. El buffer de lectura (MSD) se diluyó cuatro veces con agua y se agregaron 100 microlitros a todos los pocilios de la placa. La placa luego se leyó utilizando un Sector Imager 2400 (MSD) y el software Prism se utilizó para el ajuste de los datos y la deterinación de IC50.

Recolección de tejido Una vez que se establecieron los títulos aceptables, se sacrificaron los conejos. Se recolectaron el bazo, los nodulos linfáticos y la sangre entera y se procesaron de la siguiene manera: El bazo y los nodulos linfáticos se procesaron para dar una suspensión de células individuales mediante la disociación del tejido y haciéndolo pasar a través de una malla de alambre estéril de 70 µp? (Fisher) presionándolo con un émbolo de una jeringa de 20 ce. Se recolectaron las células en PBS. Las células se lavaron dos veces con centrifugación. Después del ultimo lavado, se determine la densidad de células mediante trypan blue. Las células se centrifugaron a 1500 rpm durante 10 minutos; se descartó el sobrenadante. Las células se resuspendieron en el volumen apropiado de 10% dimetil sulfóxido (DMSO, Sigma) en FBS (Hyclone) y se dispensaron a razón de 1 ml/recipiente . Los recipientes se almacenaron a -70 °C en una cámara de congelamiento lento durante 24 horas y se almacenaron en nitrógeno liquido.

Las células mononucleares de sangre periférica (PB Cs) se aislaron mediante la mezcla de sangre entera con partes iguales del medio de baja glucose que se describe arriba sin FBS. Se colocó una capa de 35 mi de mezcla de sangre entera cuidadosamente sobre 8 mi de Lympholyte Rabbit (Cedarlane) en un tubo cónico de 45 mi (Corning) y se centrifugó durante 30 minutos a 2500 rpm a temperatura ambiente sin frenado. Después de la centrifugación, se retiraron cuidadosamente las capas de PBMC utilizando una pipeta Pasteur de vidrio (VWR) , se combinaron, y se colocaron en un recipiente limpio de 50 mi. Las células se lavaron dos veces con el medio modificado descrito arriba mediante centrifugación a 1500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente, y se determinó la densidad de células mediante tinción con trypan blue. Después del último lavado, las células se resuspendieron en un volumen adecuado de 10% DMSO/medio FBS y se congelaron como se describe arriba .

Selección, enriquecimiento y condiciones de cultivo de células B En el dia de establecer el cultivo de células B, se descongelaron para su uso recipientes de PBMC, esplenocitos , o nodulos linfáticos. Se retiraron los recipientes del tanque de LN2 y se colocaron en un baño de agua a 37 °C hasta que se descongelaron. Se transfirió el contenido de los recipientes a un tubo de 15 mi (Corning) para centrifuga y se agregaron en el tubo lentamentelO mi de RPMI modificado tal como se describe arriba. se centrifugaron las células durante 5 minutos a 2K RPM, y se descartó el sobrenadante. Las células se resuspendieron en 10 mi de medio nuevo. Se determine la densidad y viabilidad de células mediante trypan blue.

El siguiente protocolo se utilizó para Abl y Abl3 Se mezclaron previamente las células con el CGRP alfa humano biotinilado de la siguiente manera. Se lavaron nuevamente las células y se resuspendieron a razón de 1E07 células/80 µ?? medio. Se agregó CGRP alfa humano biotinilado a la suspensión de células a una concentración final de 5 ug/mL y se incubaron durante 30 minutos a 4°C. Se retiró el CGRP alfa humano biotinilado no unido realizndo dos lavados con 10 mi de PBF [PBS libre de Ca/Mg (Hyclone) , 2 mM ácido etilenediamintetraacético (EDTA) , 0.5% de albúmina de suero bovino (BSA) (Sigma-biotin free) ] . Después del segundo lavado, se resuspendieron las células a razón de 1E07 células/80 µ? PBF y se agregaron 20 µ? de perlas de estraptavidina MACS® (Miltenyi Biotech, Auburn CA) cada 10E7 células a la suspensión de células. Las células y las perlas se incubaron a 4°C durante 15 minutos y se lavaron una vez con 2 mi de PBF cada 10E7 células.

El siguiente protocolo se utilizó para Ab4, Ab7, Ab9 y Abll: Se cargó previamente CGRP alfa humano biotinilado en las perlas de estreptavidina de la siguiente manera. Se mezclaron 75 microlitros de perlas de estrptavidina (Milteny Biotec, Auburn CA) con huCGRPD N-biotinilado (concentración final delOug/ml) y 300 ul PBF. Se incubó esta mezcla a 4°C durante 30 min y se retiró el CGRP alfa humano biotinilado no ligado utilizando una columna de separación MACS® (Miltenyi Biotec, con un enjuague de lml para retirar el material no ligado) . Luego se agotó el material, y luego se utilizó para resuspender las células a razón de más de lOOul cada 1E7 células, la mezcla luego se incubó a 4°C durante 30min y se lavó una vez con 10 mi de PBF.

Para ambos protocolos a) y b) se aplicó lo siguiente: después del lavado, las células, the cells se resuspendieron en 500µ1 de PBF y se separaron. Se enjuagó previamente una columna de MS MACS® (Miltenyi Biotec, Auburn CA) con 500 mi de PBF en un soporte magnético (Milteni) . La suspensión de células se aplicó a la columna a través de un prefiltro, y se recolectó la fracción no ligada. La columna se lavó con 2.5 mi de buffer PBF. La columna se retiró del soporte con imán y se colocó en un tubo eppendorf estéril de 1.5 mi. Se agregó 1 mi de buffer PBF en la parte superior de la columna, y se recolectaron las células seleccionadas positivas. El rendimiento y la viabilidad de la fracción de células positivas se determinó mediante tinción con trypan blue. La selección positiva tuvo un rendimiento promedio de 1% de la concentración de células de partida.

Se estableción un ensayo piloto de screening de células par obtener información sobre los niveles de sembrado para el cultivo. Se sembraron las placas a razón de 10, 25, 50, 100, o 200 células B enriquecidas/pocilio. Por otra parte, cada pocilio que contenia 50K de células/pocilio de células EL-4.B5 irradiadas (5,000 Rads) y un nivel aproximado de sobrenadante de células T de conejo activadas (Ver la Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense No. 20070269868) (en el rango de 1-5% dependiendo de la preparación) en un medio RPMI modificado de alta glucosa a un volumen final de 250 µ?/pocillo. Se incubaron los cultivos durante 5 a 7 días a 37 °C en 4% C02.

Ensayo de screening de cultivo de células B mediante reconocimiento del antigeno (ELISA) A fin de identificar los pocilios que producían anticuerpos anti-CGRP alfa humano, el mismo protocolo que el descrito para la determinación de títulos de las muestras de suero mediante reconocimiento del antígeno (ELISA) se utilizó con los siguientes cambios. Brevemente, se recubrieron placas recubiertas con neutravidin con una mezlca de CGRP alfa humano N- y C- biotinilados (50 µL por pocilio, l\iq/m cada uno) . Las muestras de sobrenadante de células B (50µL) se ensayaron sin previa dilución.

Identificación de la actividad functional en los sobrenadantes de células B utilizando la producción de cAMP promovida por CGRP Para determinar la actividad funcional contenida en los sobrenadantes de células B, un procedimiento similar al descrito para la determinación del título funcional de las muestras de suero se utilizó con las siguientes modificaciones. Brevemente, se usaron sobrenadantes de células B (20µL) en lugar de las muestras de suero policlonal diluidas .

Aislamiento de células B especificas para el antígeno Las placas que contenían los pocilios de interés se retiraron de -70 °C, y se recuperaron las células de cada pocilio utilizndo cinco lavados de 200 microlitros de medio (10% RPMI completo, 55µ? B E) por pocilio. Las células recuperadas se granularon mediante centrifugación y se retiró cuidadosamente el sobrenadante. Las células granuladas se resuspendieron en 100 µ? de medio. A fin de identificar las células que expresan el anticuerpo, se recubrieron perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina (M280 dynabeads, Invitrogen) con una combinación de CGRP alfa humano N- y C-biotiniladosD . Los lotes individuales de CGRP alfa humano biotiniladoD se optimizaron por dilución en serie. Luego se mezclaron 100 microlitros que contenían aproximadamente 4xl0E7 de perlas recubiertas con las células resuspendidas . A esta mezcla se agregaron 15 microlitros de H&L IgG-FITC anti conejo de cabra (Jackson Immunoresearch) diluidos a 1:100 en medio.

Se retiraron 20 microlitros de suspensión de células/perlas/ H&L anti conejo y se dispensaron gotas de 5 microlitros en un portaobjetos de vidrio de un pocilio previamente tratado con Sigmacote (Sigma) con un total de 35 a 40 gotas por portaobjetos. Una barrera impermeable de aceite de parafina (JT Baker) se utilizó para sumergir las gotas, y el portaobjetos se incubó durante 90 minutos a 37 °C en un incubador con 4% C02 en la oscuridad.

Las células B especificas que producen el anticuerpo pueden identificarse mediante el anillo fluorescente producido por la secreción del anticuerpo, el reconocimiento del agente biotinilado asociado a la perla, y la subsiguiente detección utilizndo un reactivo de detección de IgG fluorescente. Una vez que una célula de interés se retiró mediante un micromanipulador (Eppendorf) . La célula individual que sintetiza y exporta el anticuerpo se transfirió al tubo de microcentrifuga, se congeló utilizando hielo seco y se almacenó a -70°C.

Amplificación y determinación de las secuencias de anticuerpo obtenidas a partir de las células B especificas para el antigeno Las secuencias de anticuerpo se recuperaron utilizando un método basado en la combinación de RT-PCR para una célula B individual aislada. Se diseñaron cebadores que contenían las enzimas de restricción para templar en las regiones conservadas y constantes de los genes diana de inmunoglobulina (pesada y ligera), como, por ejemplo, secuencias de inmunoglobulina de conejo, y una recuperación de dos pasos por nested PCR se utilizó para amplificar la secuencia del anticuerpo. Se analizó para los amplicones de cada pocilio la recuperación y la integridad del tamaño. Los fragmentos resultantes luego se digirieron con AluI para obtener la huella de clonalidad de la secuencia. Las secuencias idénticas mostraron un patrón de fragmentación común en sus análisis electroforáticos . Los fragmentos de amplicón de cadena pesada y ligera originales luego se digirieron utilizando los sitios de restricción enzimática contenidos dentro de los cebadores PCR y se clonaron en un vector de expresión. El vector que contenia los fragmentos de DNA subclonados se amplificaron y se purificaron. Previo a la expresión, se verificaron las secuencias de las cadenas pesada y ligera sublonadas.

Producción recombinante de anticuerpo monoclonal de especificidad por el sustrato y/o propiedades funcionales deseadas Para determinar la especificidad por el antigeno y las propiedades funcionales de Iso anticuerpos recuperados a partir de ls células B especificas, se transfectaron los vectores que promueven la expresión de las secuencias deseadas de la cadena pesada y de la cadena ligera en células HEK-293.

Reconocimiento del antigeno de los anticuerpos recombinantes mediante ELISA Para caracterizar los anticuerpos recombinants expresados según su habilidad de unirse a CGRPD humano, se ensayaron soluciones que contenían anticuerpos mediante ELISA. Todas las incubaciones se realizaron a temperatura ambiente. Brevemente, placas Immulon IV (Thermo Scientific) se recubrieron con una solución que contenía CGRPD (lut/mL en PBS) durante 2 horas. Las placas recubiertas con CGRPD luego se lavaron tres veces en buffer de lavado (PBS, 0.05% Tween-20). Las placas luego se bloquearon utilizando una solución de bloqueo (PBS, 0.5% de gelatina de piel de pescado, 0.05% Tween-20) durante aproximadamente una hora. La solución de bloqueo luego se retiró y las placas se incubaron con una serie de dilución del anticuerpo que se ensayó durante aproximadamente una hora. Al final de esta incubación, la placa se lavó tres veces con buffer de lavado y luego se incubó con una segunda solución que contenía anticuerpos (fragmento F (ab')2 de affinipure conjugada a peroxidasa anti IgG humana de cabra, específicos para fragmento Fe (Jackson Immunoresearch) durante aproximadamente 45 minutos y se lavó tres veces. En ese momento se agregó una solución de sustrato (sustrato de TMB peroxidasa, BioFx) y se incubó durante 3 a 5 minutos en la oscuridad. La reacción se detuvo mediante el agregado de una solución que contenía HC1 (0.5M) y la placa se leyó a 450 nm en un lector de placas.

Resultados: Las Figuras 15-18 demuestran que anticuerpos anti CGRP Abl-Abl4 se unen a y reconocen CGRPD.

Caracterización funcional de anticuerpos recombinantes mediante la modulación de los niveles de cA P intracelular promovido por CGRP y reactividad cruzada con las ratas Para caracterizar el anticuerpo recombinante expresado según su habilidad para inhibir el ensayo del aumento en los niveles celulares de cAMP mediado por CGRPD, se utilizó un kit de ensayo electroquimioluminiscente (Meso Scale Discovery, MSD) . Brevemente, se realizaron diluciones en serie de las preparaciones de anticuerpos a ensayar en buffer de ensayo MSD (Hepes, MgC12, pH 7.3, lmg/mL blocker A, Meso Scale Discovery) en una placa de poliestireno de fondo redondo de 96 pocilios (Costar) . A esta placa, se agregó CGRP alfa humano (concentración final de 25ng/mL) diluido en buffer de ensayo MSD y se incubó durante una hora a 37 °C. se utilizaron los controles adecuados sugeridos por el fabricante del kit de ensayo. Se separaron las células de neuroepitelioma humano (SK-N-MC, ATCC) utilizando una solución de EDTA (5mM) y se lavaron utilizando medio de crecimiento (MEM, 10% FBS, antibiotics) con centrifugación. Se ajustó el número de células a 2 millones de células por mL en buffer de ensayo, y se agregó IBMX (3-Isobutyl-lMethylxanthine, 50mM Sigma) a una concentración final de 0.2mM justo antes de cargar las células en la placa de ensayo para cAMP. La solución de anticuerpo anti CGRP alfa humano se incubó durante una hora después de lo cual se transfirieron 20 microlitros de la solución que contenia las células a la placa de ensayo para cAMP. Todas las muestras ensayadas se ensayaron por duplicado con los conroles apropiados. Se agregaron 10 microlitros de células a los pocilios y la placa se incubó durante 30 minutos con agitación de balanceo. Mientras se incubaban las células con la solución de CGRP, se preparó la solución stop realizando una solución 1:200 de cAMP marcado con TAG (MSD) en buffer de lisis (MSD) . Para detener la incubación de células/CGRP, se agregaron 20 microlitros de solución stop a las células y la placa se incubó durante una hora con agitación de balanceo. El buffer de lectura (MSD) se diluyó cuatro veces con agua y se agregaronlOO microlitros a los pocilios en la placa. La placa luego se leyó utilizando un Sector Imager 2400 (MSD) y el software Prism se utilizó para el ajuste de los datos y la determinación de IC50.

Para ensayar la habilidad de los anticuerpos recombinante de actuar como agonista de CGRP humano ? se llevó a cabo un ensayo similar con la sustitución del agonista de CGRP (concentración final de CGRPD 10ng/mL) . La evaluación de los anticuerpos recombinants para reconocer e inhibir la generación de cAMP mediada por CGRP de rata se realizó utilizando CGRP de rata (concentración final de 5ng/mL) y la linea de células de rata L6 (ATCC) .

Resultados: Las Figuras 19-37 demuestran que anticuerpos anti CGRP Abl-Abl4 inhiben CGRPDDDCGRPQ, y el aumento de los niveles celulares de cAMP mediado por CGRP.

Ejemplo 2: Producción enzimática de fragmentos Fab Se llevaron a cabo digestiones de papaina utilizando papaina inmovilizada (Thermo/Pierce) según indicaciones del fabricante. Brevemente, se incubaron anticuerpos purificados en un buffer que contenia cisteina/HCl con papaina inmovilizada a 37 °C con agitación de balanceo leve. La digestión se monitoreó tomando una alícuota y analizándola mediante SDS-PAGE según la escisión de la cadena pesada. Para detener la reacción, la papaina inmovilizada se centrifugó y se lavó utilizando 50 niM Tris pH 7.5 y se filtró. El anticuerpo de longitud completa y los fragmentos Fe no digeridos se retiraron utilizando una columna abSelectSure (GE) .

Ejemplo 3 Expresión de células de levadura Construcción de vectores de expresión de Pichia pastoris para las cadenas pesada y ligera Los fragmentos humanizados de las cadenas ligera y pesada se sintetizaron comercialmente y se subclonaron en un vector de expresión pGAP. El vector de expresión pGAP utiliza el promotor GAP para promover la expresión de la secuencia líder de la cadena de inmunoglobulina y la albúmina de suero humano (HSA) . Por otra parte, este vector contiene elementos comunes como, por ejemplo, un origen de replicación bacteriano, y una copia del gen de resistencia a kanamycin que confiere resistencia al antibiótico G418 en P. pastoris. G418 proporciona un medio de selección de cepas que contienen el vector de expresión deseado integrado a su genoma.

Transformación de vectores de expresión en cepas huésped haploides metí y lys3 de Pichia pastoris Todos los métodos utilizados para la trasformación de cepas haploides de P. pastoris y la manipulación del ciclo sexual de P. pastoris se realizaron como se describe en los Pichia Protocols (Methods in Molecular Biology Higgings, DR, y Cregg, JM, Eds . 1998. Humana Press, Totowa, NJ) . Previo a la transformación, cada vector se linaelizó dentro de las secuencias promotoras GAP para dirigir la integración del vector en el locus del promotor GAP del genoma de P. pastoris. Las cepas haploides se transfectaron utilizando electroporación y se seleccionaron los transformantes exitosos en placas de agar G418 de YPDS (extracto de levadura, peptona dextrosa con sorbitol) . Se determinaron los números de copia de los genes de cadena pesada y ligera para las cepas haploides mediante análisis Southern blot. Las cepas haploides luego se aparearon y se seleccionaron según su habilidad para crecer en la ausencia de los aminoácidos marcadores (es decir, Lys y Met) . Los clones diploides resultantes luego se sometieron a un Southern blot final para confirmar los números de copia de los genes de cadena pesada y ligera. Un clon que expresaba el anticuerpo de interés se seleccionó utilizando biosensores de proteina A de interferometria de biocapa para monitorear la expresión (Octet, ForteBio) .

Ejemplo 4 Expresión de Ab3, Ab6 y Abl4 en Pichia pastoris Se obtuvieron tres cepas de Pichia para la expresión del anticuerpo de longitud completa. Para todas las cepas que expresan el anticuerpo de longitud completa, se crearon cepas haploides y subsiguientemente se aparearon. Una cepa haploide expresó la longitud completa de la secuencia de la cadena ligera y otra cepa haploide expresó la longitud completa de la secuencia de la cadena pesada. Cada cepa diploide se utilizó para generar un banco de células de investigación y se utilizó para la expresión en un bioreactor.

Primero se expandió un inoculo utilizando el banco de células de investigación utilizando un medio compuesto por los siguientes nutrientes (%p/v) : extracto de levadura 3%, dextrosa anhidra 4%, YNB 1.34%, Biotina 0.004% y 100 mM fosfato de potasio. Para generar el inoculo para los termentadores, el banco de células se expandió durante aproximadamente 24 horas en un incubador de balanceo a 30°C y 300 rpm. Luego se agregó 10% de un inoculo a recipientes Labfors con un volumen de trabajo de 2.5L conteniendo 1 L de medio de crecimiento estéril. El medio de crecimiento estaba compuesto de los siguientes nutrientes: sulfato de potasio 18.2 g/L, fosfato monobásico de amonio 36.4 g/L, fosfato dibásico de potasio 12.8 g/L, heptahidrato de sulfato de magnesio 3.72 g/L, dihidrato de citrato de sodio 10 g/L, glicerol 40 g/L, extracto de levadura 30 g/L, PTM1 metales traza 4.35 mL/L, y antiespumante 204 1.67 mL/L. La solución PTM1 de metales traza estaba compuesta de los siguientes componentes: pentahidrato de sulfato cúprico 6 g/L, yoduro de sodio 0.08 g/L, hidrato de sulfato de manganeso 3 g/L, dihidrato de molibdato de sodio 0.2 g/L, ácido bórico 0.02 g/L, cloruro de cobalto 0.5 g/L, cloruro de cinc 20 g/L, heptahidrato de sulfato ferroso 65 g/L, biotina 0.2 g/L, y ácido sulfúrico 5 mL/L.

Los parámetros de control del proceso del bioreactor se ajustaron de la manera siguiente: Agitación 1000 rpm, flujo de aire 1.35 litros estándar por minuto, temperatura 28°C y pH controlado a 6 utilizando hidróxido de amonio. No se proporcionó un suplemento de oxigeno.

Los cultivos de fermentación se cultivaron durante aproximadamente 12 a 16 horas hasta que el glicerol inicial se consumió tal como se observó por una pico en el oxigeno disuelto. Los cultivos se mantuvieron sin nutrientes durante aproximadamente tres horas después del pico de oxigeno disuelto. Después del periodo de falta de nutrientes, se agregó un bolus de etanol al reactor para alcanzar 1% etanol (p/v) . Los cultivos de fermentación se equilibraron durantel5 a 30 minutos. El agregado de alimentación se inició 30 minutos después del bolus de etanol y se fijó a una tasa constante de 1 mL/min durante 40 minutos, luego la bomba de alimentación se controló mediante un sensor de etanol que mantuvo la concentración de etanol a 1% durante el resto de la corrida utilizando una sonda sensora de etanol (Raven Biotech) . La alimentación estaba compuesta de los siguientes componentes: extracto de levadura 50 g/L, dextrosa 500 g/L, heptahidrato de sulfato de magnesio 3 g/L, y PTM1 metales traza 12 mL/L. Para la fermentación de Ab6 y Abl4, de longitud completa se agregó también a la alimentación dihidrato de citrato de sodio (0.5g/L). El tiempo total de fermentación fue aproximadamente 90 horas.

Ejemplo 5 Métodos para humanizar anticuerpos Los métodos para humanizar anticuerpos han sido descritos previamente en la Publicación de Patente Estadounidense No. 7935340, cuya divulgación es incorporada por referencia en la presente memoria en su totalidad. En algunos casos, es necesario determinar si se requieren residuos framework de conejo adicionaes para mantener la actividad. En algunos casos, los anticuerpos humanizados aún necesitan retener ciertos residuos framework de conejo para minimizar la pérdida de afinidad o actividad. En estos casos, es necesario cambiar aminoácidos de un framework simple o múltiple de las secuencias de lineas germinales humanas de vuelta a los aminoácidos de conejo originales a fin de poseer la actividad deseada. Estos cambios se determinaron experimentalmente a fin de identificar cuáles residuos de conejo son necesarios para preservar la afinidad y la actividad. Esto es ahora el extremo de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada y ligera humanizada.

Ejemplo 6 Inhibición de la unión de CGRP a su receptor celular Para caracterizar los anticuerpos recombinantes expresados según su habilidad para inhibir la unión de CGRP a su receptor celular, se llevó a cabo un ensayo de unión al radioligando como se describió anteriormente [Elshourbagy et al, Endocrinology 139:1678 (1998); Zimmerman et al, Peptides, 16:421 (1995)]. Se utilizaron preparaciones de membrana de de los recepotores de CGRP humano recombinante, receptores del tipo del receptor calcitonin y RAMP1 (Chemiscreen, illipore) . Se preincubaron diluciones de anticuerpo con CGRP alfa humano radiomarcado con 1251 (0.03nM) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se estimó la unión no especifica en la presencia de 0. luM CGRP alfa humano. Las membranas se filtraron y se lavaron. Los filtros luego se contaron para determinar CGRP alfa humano radiomarcado con 1251 ligado en forma especifica. Resultados: La Figura 38 demuestra que los anticuerpos anti CGRP Abl-Abl3 inhiben la unión de CGRP a su receptor celular.

Ejemplo 7 Inhibición de la vasodilatacion neurogénica mediante anticuerpos anti CGRP en ratas CGRP es un vasodilatador potente (Nature 313: 54-56 (1985) y Br J. Clin. Pharmacol . 26(6):691-5. (1988)). Un estudio farmacodinámico para medir la actividad antagonista del receptor de CGRP en forma no invasiva se utilizó a fin de caracterizar los anticuerpos anti CGRP. El modelo se basó en los cambios en el flujo sanguíneo dérmico utilizando imagenología Doppler de láser seguido de la aplicación tópica de una solución de capsaicina. La capsaicin activa el receptor de tipo 1 vaniloide potencial del receptor transitorio (TRPV-1), produciendo inflamación neurogénica y vasodilatación mediante la liberación local de mediadores vasoactivos incluyendo CGRP y la sustancia P (Br. J. Pharmacol. 110: 772-776 (1993)).

En el día previo a el ensayo de vasodilatación, se dosificaron los animales con el agente o control del ensayo via IP ( intraperitoneal ) . Después de la dosificación, los animales se rasuraron y depilaron en la región posterior inferior del lado dorsal, en un área de aproximadamente 2x6cm. Los animales fueron devueltos a sus jaulas durante la noche. En el día de la prueba, aproximadamente 24 horas después de la dosificación, los animales se anestesiaron con gas isoflurano y se colocaron en una almohadilla de calentamiento de temperatura controlada y se les colocó un cono nasal para la administración continua de isoflurano. Se utilizó imagenologia Doppler láser para la observación de la vasodilatación. Se dirigió un haz coherente de luz roja generado por un láser de helio-neón a 633 nm al ára rasurada, un rectángulo (2x6 cm) , y se detectó en modo de resolución media. Se obtuvo primero una lina base Doppler y se predeterminó la ubicación de colocación del anillo mediante la identificación de dos áreas similares de bajo flujo. Se colocaron dos anillos (~lcm de diámetro) en las regiones seleccionadas y se realizó la detección de la linea de base. Inmediatamente después de completer la detección, se aplicó lmg de capsaicina en 5 µ?? de una solución etanol : acetona (1:1) dentro de cada uno de los dos anillos. Se repitieron las detecciones Doppler a 2.5, 5, 7.5, 10, 12.5, 15, 17.5, 20, 22.5, 25, 27.5 y 30 minutos después de la aplicación de capsaicina. El cambio porcentual del flujo medio de la linea base dentro de cada uno de los dos anillos se gráfico como los resultado se la vasodilatación debida a capsaicina.

A fin de ensayar los anticuerpos recombinantes expresados según su habilidad para inhibir la unión de CGRP a su receptor celular, se llevó a cabo un ensayo de unión al radioligando tal como se describe arriba.

Resultados: Las Figuras 39 y 40 demuestran que los anticuerpos anti CGRP Ab3 y Ab6 disminuyeron la vasodilatación en este modelo después de la administración de capsaicina .

Ejemplo 8 Uso de anticuerpos anti CGRP para bloquear la diarrea inducida por CGRP en dos cepas de ratones (ratones transgénicos Nestin/RAMPl human y ratones C57BL/6J) El descubrimiento inicial de que los anticuerpos anti CGRP pueden utilizarse para prevenir o tratar la diarrea inducida por CGRP se basó en estudios del efecto de anticuerpos anti CGRP sobre la induced fotofobia o fotoaversión inducida por CGRP. Esto se realizó como una de las consecuencias de las migranias en la fotofobia, o la sensibilidad aumentada a la luz [Mulleners et al, Headache 41: 31-39 (2001); Recober et al, J. Neuroscience 29:8798:8804 (2009)]. Asimismo es conocido que los migraineurs, pero no los non-migraineurs, son sensibles al dolor de cabeza inducido por CGRP [reviewed in Neurology 22:241-246 (2009)]. CGRP se une a un receptor acoplado a la proteina G llamado CLR (receptor del tipo calcitonin) que funciona en forma concomitante con la proteina 1 que modifica la actividad del receptor (RAMPl) en la mediación de la unión a CGRP y la señalización. In vitro, la actividad de CGRP es aumentada en gran medida por la sobreexpresion de la subunidad de RAMPl del receptor de CGRP [(J. Neurosci. 27:2693-2703 (2007)]. Para estudiar la aversión a la luz en ratones, se desarrolló un modelo de ratones transgénicos nestin/ RAMPl humano [Recober et al, J. Neuroscience 29: 8798-8804 (2009); Russo et al, Mol. Cell. Pharmacol., 1:264-270 (2009)]. Estos ratones, al exponerse a los síntomas cuando CGRP se encuentra presente asociados con las migrañas en particular la aversión a la luz (ibid) . Este protocolo se detalla a continuación.

PROTOCOLO DE AVERSIÓN A LA LUZ Para evaluar la capacidad de anticuerpos anti CGRP para bloquear la fotofobia inducida por CGRP, se albergan a los ratones en condiciones estándar en grupos de 2 a 5 por jaula con un ciclo lumínico de 12 horas (se prenden las luces a 0500 CST/0600 CDT y se apagan a las 1700 CST/1800 CDT) con acceso ad libitum a agua y alimento. Los ratones utilizados en estos estudios comprenden colonias de ratones de genotipo Nestin/hRAMPl que contienen dos alelos transgénicos Tg (Nes-cre) lKln/J y Tg(RAMPl) y alelos (B6; SJL-Tg (Nes-cre) IKln Tg(RAMPl) . Nes-cre was introduced in these mice por una cruza involucrando a ratones obtenidos de The Jackson Laboratory (stock 003771) en un trasfondo genético B6.

Los ratones de control utilizados en el protocolo son compañeros de carnada que son o no-transgénicos, o transgénicos en un solo locus (que no expresan hRAMPl) y que contienen o bien el transgen nestin-cre o bien Cxl-GFP-hRAMPl. La colonia stock se mantiene mediante el backcrossing de ratones CXl-GFP-hRAMPl con compañeros de carnada no-transgénicos en la instalación con barreras. Para los estudios del comportamiento, la colonia se mantiene mediante el backcrossing de ratones transgénicos en un solo locus CXl-GFP-hRAMPl con ratones nestin-cre en instalaciones sin barrera. Todos los ratones se cuidan con procedimientos de cuidado animal aprobados por el Comité de Cuidado y Utilización Animal de la Universidad de Iowa y que además cumplen con los estándares fijados por los Institutos Nacionale de la Salud (NIH) .

Los materiales y equipamientos utilizados en este protocolo incluyen una Caja de Luz/Oscuridad y cámaras de ensayo que comprenden un campo abierto de Plexiglass (27 x 27 x 20,3 cm) y contienen matrices de 16 focos rojos (Med Associates Inc., St. Albans, VT) . La caja de luz/oscuridad se encuentra dividida en dos zonas de igual tamaño por un injerto oscuro que es opaco a la luz visible. Hay una apertura (5.2 x 6.8 cm) en el injerto oscuro que permite al ratón moverse libremente entre las dos zonas. Esta cámara de ensayo se coloca dentro de un cubículo (56 x 38 x 36 cm) que atenúa los ruidos y provisto de un ventilador (Med Associates Inc.). Hay seis cámaras comprendidas en el sistema integral que se encuentra integrado con una computadora que posee software para registrar y colectar los datos (Med Associates Inc.). El software que ha sido utilizado para monitorear los Resultados es Activity Monitor v 6.02 (Med Associates Inc.). Las configuraciones del software usadas para registrar los datos comprenden: Resolución (ms) : 50, Tamaño de Box: 3, Demora del Detenimiento (ms) : 500, Disparador Ambulatorio: 3, Tipo de Sesión: C, Tiempo de Sesión (min) : 20, Intervalo de Bloque (sec) : 300, y Archivo Comprimido: DEFAULT.ZIP.

En el protocolo la fuente de luz en cada cámara es un panel LED instalado en el techo del cubículo que atenúa el ruido.

El panel LED contiene 36 focos LED colimados de 1 watt (5500k Daylight hite) (LEDwholesalers, Burlingame, CA) . Para controlar la intensidad de la luz, cada panel LED se encuentra conectada a un impulsor LED regulable (LINEARdrive; eldoLED America Inc., San José, CA) llevando a un rango potencial de intensidad de luz desde -300 a 27, 000 lux. La intensidad de luz estándar es ~1000-1200 lux a menos que se estipule otra cosa.

The injectors used are hand-made by inserting a stripped 30 gauge x ½" needle into non-radiopaque polyethylene tubing (inner diameter.38 mm; outer diameter 1.09 mm) . Using the tubing described above, a stopper (~lcm in length) se coloca over the needle leaving aproximadamente 2.5 mm de the bevel uncovered. These injectors are connected to a 10 µL Hamilton syringe .

Los ratones are injected ICV con rat a-CGRP (Sigma) diluted in Dulbecco phosphate-buffered saline (D-PBS) (Hyclone) . The total dose delivery is 0.5 nmol . Por ejemplo, 250 o 500 µg CGRP is diluted in 250 o 500 pL sterile PBS for a final concentration de 1 g/ L. The CGRP se almacena a-20°C y aliquots are freeze-thawed at most one time. The PBS se almacena a 4°C.

Los ratones are administered an exemplary anticuerpo anti CGRP disclosed herein (Ab3) which se almacena a 4°C previo a administration . En este protocolo previo a la administración de the anticuerpo es decir, aproximadamente 24 horas previo a testing, los ratones are weighed y then receive a systemic ( intraperitoneal (ip) ) injection de either: vehicle, control anticuerpo (anti-digoxin anticuerpo) , o CGRP-binding anticuerpo at una dosis de 30 mg/kg. Los ratones are asimismo screened to detect any abnormal physical conditions that could affect the assay como, por ejemplo, a missing eye, cataracts, o other abnormalities como, por ejemplo, grooming, etc. The day after anticuerpo administration, mice are transported in cages from animal housing on a cart y then los ratones are placed in the behavior room for acclimation al menos 1 hora previo a any injection o testing. Any coverings required for transport are removed from the cages y normal light conditions (standard overhead fluorescent lighting) are turned on during acclimation y remain on for the remainder de the procedure . Por otra parte, all equipment that produces sound including anesthetic devices, light/dark chambers, y LED panels are turned on during acclimation y remain hasta que testing is complete. Típicamente there is minimal human presence in the room during acclimation.

After acclimation each mouse se coloca in an induction chamber y administered 3.5% isoflurane. After the mouse is anesthetized, it is transferred to a nose cone maintaining 3.5% isoflurane administration, so that it remains anesthetized during injection. Thereafter drug administration is effected using the injector by direct injection into the right lateral ventricle through the intact scalp aiming at 1 mm posterior to bregma y 1 mm right from the midline.

Típicamente for consistency all the injections are performed by la misma person after a period de training yielding a success rate de >90% as demonstrated by injections de dye into the ventricles. The drugs injected are either 2.0 µ?. vehicle (D-PBS) \ih o 2.0 µg CGRP in 2.0 µ?, vehicle (1 µg/µL) administered as a direct inyección intracerebroventricular into the right lateral ventricle de the brain through the intact scalp aiming at 1 mm posterior to bregma y 1 mm right from the midline as described before [Recober et al, J. Neuroscience 29: 8798-8804 (2009)] After all 2.0 pL is delivered, the needle remains in place for 10 sec y then removed. The time de injection is then recorded.

After injection los ratones are allowed to recover for 30 minutos previo a testing in an empty, uncovered cage containing a paper towel for bedding. During recovery, the following is recorded: diarrea, excessive urination, bleeding post-injection, abnormal behavior como, por ejemplo, lack de movement, seizures, etc. Based on these observations it is determined whether la administración del anticuerpo anti CGRP has an effect (preventative o palliative) on la diarrea inducida por CGRP in the ratones transgénicos which are administered anticuerpo y later administered CGRP ICV en relación a the ratones transgénicos which are only administered CGRP y the control (vehicle o control anticuerpo in vehicle) . anticuerpos which inhibit CGRP induced diarrea en este protocolo se identifican as being potentially useful in tratar o prevenir acute o diarrea crónica, particularly diarrea que se relaciona con niveles elevados de CGRP.

After a 30 minuto recovery the light protocol testing is effected. Each mouse se coloca along the back wall (furthest from the opening entre the dos zones) in the light zone aproximadamente in the center. This triggers the recording to begin. Up to six mice are tested at one time (one mouse per chamber) . During testing the shelf con the chamber is pushed back into the cabinet y the doors closed. The software records mouse movement for 20 minutos. After the recording is completed, each mouse is removed y placed back in home cage for transport back to animal housing.

Resultados Utilizando este protocolo un anticuerpo anti CGRP desarrollado por Alder Biopharmaceuticals identificado en la presente memoria como Ab3 demostró derivar en que los ratones transgénicos pasaran una cantidad de tiempo estadísticamente significativa en la luz. (Estos resultados no se muestran dado que se relacionan con una invención deiferente que se divulga en la Solicitud de Patente Provisoria No. 61/496,860 (Expediente de Abogado No. 67858.760000) presentada el 14 de junio de 2011 y U.S. Ser. No. (Expediente de Abogado No. 67858.730303) presentado en la misma fecha que esta solicitud, y cuya solicitud se incorpora por referencia en la presente memoria) .

Un hecho relevante en cuanto a la presente invención es que se descubrió durante estos experimentos que los ratones que se trataron con el mismo anticuerpo anti CGRP (Ab3) de Alder tampoco exhiben diarrea asociada a CGRP. Mientras que la administración de CGRP dio lugar a diarrea en la mayoría de los ratones transgénicos utilizados en los estudios de fotoaversión a los que no se administró el anticuerpo anti CGRP, no se observó diarrea en los mismos ratones transgénicos que recibieron la administración de CGRP y a los que luego se administró Ab3 en forma sistémica ( intraperitoneally) .

Estos resultados se muestran en la Figura 41. Más específicamente, la Figura 41 contiene los resultado de experimentos donde los efectos de CGRP inyectado vía intracerebroventricular (ICV) en ratones transgénicos Nestin/hRampl . Los datos muestran que CGRP de rata inyectado vía ICV indujo la diarrea en los ratones Nestin/hRAMPl tg y que la inyeción intraperitoneal de Ab3 (30mgs/kg, ~24 hrs. previo al desafio con CGRP) inhibe la diarrea inducida por CGRP inyectado vía intra cerebroventricular (ICV) en los ratones Nestin/hRAMPl tg.

Puede observarse a partir de la Figura que la totalidad de los ratones transgénicos Nestin/hRampl que no recibieron CGRP (ratones a los que se administró sólo vehículo IP y vehículo ICV) no desarrollaron diarrea. En estos estudios los ratones transgénicos RAMPl C57/BL6J recibieron CGRP(alpha) de rata. En contraste, la mayoría de los mismos ratones transgénicos que recibieron CGRP de rata por administración ICV y a los cuales luego se administraron los controles (ya sea el anticuerpo de control el el vehículo IP o una combinación de los vehículos IP y ICV) desarrollaron diarrea (se observo respectivamente en 90% o alrededor de 80% de los ratones que recibieron CGRP y los controles de anticuerpo o vehículo) Es importante observar que los datos en la Figura 41 muestran que la totalidad de los ratones transgénicos que recibieron en anticuerpo de Alder Ab3 y CGRP no desarrollaron diarrea. Por otra parte, se llevaron a cabo experimentos en ratones no transgénicos (ratones C57BL/6J) . En contraste con los estudios anteriores en los que se utilizaron los ratones Nestin/hRAMPl, se administró CGRP humano (?) a la cepa C57/BL6J. Estos experimentos dieron lugar a resultados similares, es decir, el anticuerpo anti CGRP prvino la diarrea asociada a CGRP en estos animales. Estos resultados en forma conjunta sugieren que los anticuerpos que específicamente se unen a CGRP (y posiblemente otros polipéptidos que inhiben la interacción CGRP/ receptor de CGRP) pueden utilizarse para inhibir la diarrea asociada a CGRP en diferentes individuos, y para tratar las condiciones o tratamientos que involucran un exceso en los niveles de CGRP como, por ejemplo, aquellas/os que se describen en la presente memoria.

Las Figuras 42-44 contienen los resultado de experimentos similares con CGRP llevados a cabo en ratones no transgénicos (ratones C57BL/6J). Estos resultados muestran que el mismo anticuerpo anti CGRP (Ab3) previno la diarrea en los ratones C57BL/6J que recibieron CGRP humano. En contraste, la mayoría de los ratones C57BL/6J que recibieron el CGRP humano (?? y los mismos controles desarrollaron diarrea.

Específicamente, La Figura 42 contiene los resultados de los experimentos que demuestran que la inyección intracerebroventricular de CGRP humano (similar al CGRP de rata) induce la diarrea en forma dosis dependiente en ratones C57BL/6J. Los datos asimismo muestran que alrededor de 80% de los ratones C57BL/6J a los que se administró 2.0 pg de CGRP humano mediante inyección intracerebroventricular desarrollaron diarrea mientras que ninguno de los ratones que recibieron el control o una cantidad disminuida de CGRP humano (0.4 µg) desarrolaron diarrea.

La Figura 43 muestra los resultados de experimentos adicionales que muestran que inyección intraperitoneal de Ab3 (30mgs/kg ip, -24 hrs . previo al desafio con CGRP) inhibe la diarrea inducida por CGRP inyectado via ICV en ratones C57/BL6J. En contraste la administración del anticuerpo o vehículo de control no tuvo efecto alguno sobre la diarrea inducida por CGRP inyectado via ICV.

La Figura 44 muestra los resultados de experimentos adicionales que muestran que Ab3 (30mgs/kg inyección intraperitoneal ~24 hrs. previo al desafío con CGRP humano) inhibe la diarrea inducida por CGRP inyectao via IP en ratones C57/BL6J. En contraste la administración del anticuerpo de control contenido en el mismo vehículo que Ab3 no tuvo efecto alguno sobre la diarrea inducida por CGRP.

Estos resultados obtenidos para cepas de ratones diferentes demuestran convincentemente que la administración de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti CGRP humano puede prevenir o mejorar la diarrea, especialmente en condiciones asociadas con niveles elevados de CGRP. Estos resultados asimismo indican que existe un efecto profiláctico similar cuando se administra CGRP mediante 2 formas diferentes (inyección intraperitoneal o intracerebroventricular ) y es que especifico para especies diferentes. Conforme a ello el anticuerpo anti CGRP aparentemente es capaz de unirse en forma efectiva a CGRP y prevenir sus efectos adversos de diarrea sin importar si se administa en un sistema o en forma local mediante inyección intracerebroventricular.

Por otra parte, los resultados muestran que los ensayos en roedores a los que se administra CGRP pueden utilizarse para evaluar si puede utilizarse un anticuerpo anti CGRP u otro inhibidor del polipéptido CGRP/ receptor de CGRP candidato para inhibir o tratar trastornos gastrointestinales u otras condiciones que se caracterizan por un exceso de CGRP que involucran aberraciones en los movimientos del intestino, balance de electrolitos y/o excreción de fluidos, y en particular diarrea. Estas condiciones incluyen a modo ej emplificativo enfermedad inflamatoria del intestino, diarrea bacteriana o viral, trastornos funcionales del intestino seleccionado a partir de un grupo que consiste de reflujo gastro-esofágico, dispepsia, síndrome del intestino irritable, síndrome de dolor abdominal funcional, diverticulosis, diverticulitis y, enfermedad de Crohn, ileítis, colitis colagenosa, colitis linfocítica, y colitis ulcerosa y cánceres y tratamientos de cáncer asociados con la diarrea, por ejemplo, carcinoma medular de la tiroides o cáncer colorrectal y otras condiciones identificadas anteriormente .

Ejemplo 9 Efecto de la administración de anticuerpo anti CGRP sobre la evacuación del colon Se llevaron a cabo experimentos en ratones C57BL/6 para evaluar la eficacia potencial de la administración de anticuerpo anti CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea y trastornos gastrointestinales relacionados. En relación a los experimentos en los que se utilizaban ratones C57BL/6J en el Ejemplo 8, se usó una dosis mayor de CGRP y una dosis menor de anticuerpo; aún asi, Ab3 y Ab6 fueron efectivos en disminuir la incidencia de diarrea.

Métodos Se alojaron ratones C57BL/6 macho (Harían Laboratories) a las 6-8 semanas de edad en forma individual en jaulas convencionales de policarbonato o en jaulas microailadas de policarbonato claras o amarillas con el lecho de contacto irradiado y certificado y aclimatadas a las instalaciones durante al menos 24 horas. Se suministró alimento y agua ad libitum. Se configuraron los controles ambientales para mantener la temperature en el rango de 18 a 26 °C (64 a 79 grados F) con una humedad relativa 30% a 70%. Se mantuvo un ciclo de luz/oscuridad de 12:12 horas.

Los animales se distribuyeron al azar en cuatro grupos de tratamiento (diez animales en cada uno) , basándose en el peso corporal al día siguiente a su recepción. Se revisaron las medias de los pesos corporales para cada grupo a fin de asegurar que los valores medios y las desviaciones estándar satisfacían el supuesto de homogeinicidad.

En el día 1, se administró a los grupos de tratamiento 1 y 2 el anticuerpo de control negativo (del mismo isotipo que los anticuerpos anti CGRP) los grupos 3 y 4 recibieron los anticuerpos Ab3 y Ab6, respectivamente (todos los anticuerpos se administraron vía i.p. a razón de 10 mg/kg, y un volumen por dosis de 2.63 mL/kg) .

En el día 2, los grupos de tratamiento 2, 3, y 4 recibieron CGRP (0.05 mg/kg, volumen de la dosis 3.33 mL/kg) i.p. y group 1 recibió an equal volumen de la dosis de PBS i.p.. Los animáis were then placed on a piece de Absorbent paper inside a cage sepárate from their home cage immediately post dose. The trozo de papel was weighed previo a placing it in the bottom de the cage y the weight was recorded. Each animal' s bowel movements were monitored for 30 minutos post CGRP dose. Observations were made as incidence y total weight de diarrea (that which sticks to el papel) . A positive incidence de diarrea was recorded if a loóse stool was present. Gross fecal weight was determined by lifting el papel out de the cage by grasping the long side y lifting while holding el papel at aproximadamente a 45 degree angle, y shaking lightly. Any stools that rolled off se consideraron normal, anything that stuck to el papel was considered diarrea. The trozo de papel con any stools attached was then placed on the scale y weighed.

Resul tados Después de la administración de CGRP, se evaluaron los efectos de los dos anticuerpos anti CGRP diferentes sobre la afección gastrointestinal, en este caso diarrea, durante un periodo de observación de 30 minutos y se compararon con los dos grupos de control. Como se muestra en la Figura 45, 80% de los animales de control positivo (los que recibieron CGRP y el anticuerpo de control negativo) exhibieron diarrea, en comparación a tan sólo 60% y 40% de los animales que recibieron Ab6 y Ab3. Ninguno de los animales de control negativo exhibió diarrea. Por otra parte, el peso bruto de las heces en los animales que recibieron el anticuerpo anti CGRP fue significativamente menor que los animales de control (Figura 46) . Asimismo, la consistencia de las heces en los animales que recibieron el anticuerpo de control era mucho más fluida (aguada) en relación a los animales que recibieron los anticuerpos anti CGRP, otra indicación de que el anticuerpo anti CGRP ayudó a restaurar la función gastrointestinal normal y específicamente la evacuación normal del colon.

Estos resultados asimismo confirman que un anticuerpo anti CGRP puede ser efectivo para prevenir o tratar la diarrea y las condiciones relacionadas.

Ejemplo 10 Efecto de la administración de anticuerpo anti CGRP sobre la evacuación del colon Se llevó a cabo un experimento adicional en ratones C57 BL/ 6 para evaluar la eficacia potencial de la administración de anticuerpo anti CGRP para el tratamiento o prevención de diarrea y trastornos gastrointestinales relacionados. Se usó una dosis mayor de anticuerpos anti CGRP que la que se utilizó en el Ejemplo 9 y el efecto sobre la incidencia de diarrea y sobre el peso bruto de las heces fue más pronunciado .

Métodos Se indujo la diarrhea en forma experimental en ratones C57BL/ 6 , con diez ratones en cada uno de cuatro grupos de tratamiento como en el Ejemplo 9, excepto que la dosis de cada anticuerpo fue tres veces mayor (30 mg/kg, volumen de la dosis 7.89 mL/kg), y el volumen de la dosis de CGRP fue tres veces mayor aunque la dosis de CGRP fue la misma (0.05 mg/kg, volumen de la dosis 10 mL/kg) . El grupo 1 (control negativo) recibió el anticuerpo de control negativo en el dia 1 y PBS en el día 2. Los grupos 2, 3, y 4 recibieron el anticuerpo de control, Ab3, y Ab6, respectivamente, en el día 1, y CGRP en el día 2. Se administraron anticuerpos y CGRP vía i.p..

Resultados Después de la administración de CGRP, se evaluaron los efectos de los dos anticuerpos anti CGRP diferentes sobre la afección gastrointestinal, en este caso diarrea, durante un período de observación de 30 minutos y se compararon con los dos grupos de. Como se muestra en la Figura 47, 80% de los animales de control positivo (los que recibieron CGRP y el anticuerpo de control negativo) exhibieron diarrea, en comparación a tan sólo 40% y 20% de los animales que recibieron Ab6 y Ab3. Ninguno de los animales de control negativo exhibió diarrea. Por otra parte, el peso bruto promedio de las heces en los animales que recibieron los anticuerpos anti CGRP fue significativamente menor que los animales de control (Figura 48). Asimismo, la consistencia de las heces en los animales que recibieron el anticuerpo de control era mucho más fluida (aguada) en relación a los animales que recibieron los anticuerpos anti CGRP, otra indicación de que el anticuerpo anti CGRP ayudó a restaurar la función gastrointestinal normal y específicamente la evacuación normal del colon.

Estos resultados asimismo confirman que un anticuerpo anti CGRP puede ser efectivo para prevenir o tratar la diarrea y las condiciones relacionadas.

Claims (77)

REIVINDICACIONES

1) . Un método para inhibir, prevenir o tratar diarrea o disentería y/o mantener los niveles adicuados de electrolitos y fluidos en el colon de un sujeto que posee una condición asociada con la diarrea o disentería el cual comprende administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo anti CGRP o fragmento de anticuerpo anti CGRP o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti receptor de CGRP.

2) El método conforme a la reivindicación 1, donde la diarrea o disentería está asociada con un aumento de CGRP.

3) . El método conforme a la reivindicación 1 o 2, donde la diarrea is diarrea aguda o diarrea crónica.

4) El método conforme a la reivindicación 1 o 2, donde la diarrea comprende diarrea osmótica, diarrea secretora, diarrea de motilidad, diarrea exudativa, y/o diarrea inflamatoria .

5) . El método conforme a la reivindicación 1 o 2, donde la diarrea es causada por una condición crónica o aguda a seleccionar a partir de trastorno functional del intestine, síondrome del intestino irritable, enfermedad celíaca, enfermedad pancreática, pancreatitis, diabetes tipo 1 o tipo 2, fibrosis quística, enfermedad de Crohn, neuropatía diabéitca, menstruación, hipertiroidismo, desbalance hormonal, enteritis, una enfermedad inflamatoria del intestino, colitis microscópica, enfermedad del intestino isquémico, colitis ulcerosa, mucositis o tuberculosis.

6) . El método conforme a la reivindicación 1 o 2, donde la condición asociada a la diarrea es una diarrea inducida por bacterias, parásitos o virus.

7) El método conforme a la reivindicación 1 o 2, donde la condición que deriva en la diarrea es un parásito seleccionado a partir de Entaamoeba histolytica, Giardia, u otro protozoarxo.

8) El método conforme a la reivindicación 1 o 2, donde la condición que deriva en la diarrea es una bacteria seleccionada a partir de E coli, Shigella, Entaamoeba histolytica, Salmonella, Campylobacter, o Clostridium difficile .

9) El método conforme a la reivindicación 1 o 2, donde la condición que deriva en la diarrea es un virus seleccionado a partir de rotavirus, RSV, HIV, norvovirus, adenovirus, y astrovirus .

10) El método conforme a la reivindicación 1 o 2, donde la condición que deriva en la diarrea es envenenamiento alimentario .

11) . El método conforme a la reivindicación 1 o 2, donde la condición asociada a la diarrea es un trastorno funcional del intestino seleccionado a partir del grupo que consiste en reflujo gastroesofágico, dispepsia, síndrome del intestino irritable, síndrome funcional de dolor abdominal, mala absorción del ácido biliar, y diverticulitis .

12) . El método conforme a la reivindicación 1 o 2, donde la condición asociada con la diarrea es una enfermedad inflamatoria del intestino que se selecciona a partir del conjunto que consiste en enfermedad de Crohn, ileitis, colitis colagenosa, colitis linfocítica, y colitis ulcerosa.

13) . El método conforme a la reivindicación 1 o 2, donde la condición asociada a la diarrea es un cáncer o un tratamiento del cáncer asociado con la diarrea.

14) . El método conforme a la reivindicación 13 donde el cáncer es carcinoma medular de la tiroides, turores que secretan hormonas, cáncer renal, cáncer de hígado, o cáncer colorectal .

15) . El método conforme a la reivindicación 13 donde el tratamiento del cáncer asociado con la diarrea se selecciona a partir de quimioterapia, terapia de citoquinas y radiación o una combinación de ellas.

16) El método conforme a la reivindicación 13 o 15, donde dicho tratamiento ocasiona mucositis o daño en el borde en cepillo del intestino.

17) . El método conforme a la reivindicación 15, donde la quimioterapia incluye un compuesto de platino.

18) . El método conforme a la reivindicación 1 o 2, donde la condición asociada a la diarrea es un fármcaco, quimioterapia, un inmunorrégimen, terapia celular, y/o terapia de radiación.

19) . El método conforme a la reivindicación 18, donde el fármaco asociado con la diarrea es un antibiótico, agente analgésico como un NSAID o compuesto opiáceo, antidepresivo, u hormona.

20) . El método conforme a la reivindicación 1 o 2, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se administra como monoterapia .

21) . El método conforme a la reivindicación 1 o 2, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se administra con otro agente para el tratamiento de la diarrea.

22) El método conforme a la reivindicación 21, donde el otro agente es un agente antimotilidad tal como loperamida, un compuesto de bismuto, codeina, un compuesto de cinc, secuestrante del ácido biliar tal como colestriamina, colestipol, o colesevelam, solución de electrolitos o probióticoi .

23) . El método conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1-22 donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti CGRP humano que se une en forma especifica a éste o a un epitopo(s) lineal o conformacional superpuesto y/o compite por la unión al mismo o a un epitopo(s) lineal o conformacional superpuesto sobre un polipéptido CGRP intacto o fragmento del mismo como un anticuerpo anti-CGRP humano seleccionado a partir de Abl, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, AblO, Abll, Abl2, Abl3 o Abl4.

24) . El método conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1-23 donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une en forma especifica al mismo o a un epitopo(s) lineal o conformacional superpuesto y/o compite por la unión al mismo o a un epitopo(s) lineal o conformacional superpuesto sobre un polipéptido CGRP o fragmento del mismo como Ab3, Ab6, Abl3 o Abl4.

25) . El método conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1-24 donde el fragmento de anticuerpo se selecciona a partir de un fragmento Fab, un fragmento Fab' , o un fragmento F(ab')2.

26) . El método conforme a la reivindicación 25, donde fragmento es un fragmento Fab.

27) El método conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1-26, donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti CGRP humano comprende 1, 2, 3, 4, 5 o las 6 CDRs idénticas a las contenidas en un anticuerpo anti-CGRP humano seleccionado a partir de Abl, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, AblO, Abll, Abl2, Abl3 o Abl4.

28) El método conforme a la reivindicación 27, donde al menos 2 de las CDRs son idénticas a las que contiene un anticuerpo seleccionado a partir de Abl, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, AblO, Abll, Abl2, Abl3 o Abl4.

29) El método conforme a la reivindicación 27, donde al menos 3 de las CDRs son idénticas a las que contiene un anticuerpo seleccionado a partir de Abl, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, AblO, Abll, Abl2, Abl3 o Abl4.

30) El método conforme a la reivindicación 27, donde al menos 4 de las CDRs son idénticas a las que contiene un anticuerpo seleccionado a partir de Abl, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, AblO, Abll, Abl2, Abl3 o Abl4.

31) El método conforme a la reivindicación 27, donde al menos 5 de las CDRs son idénticas a las que contiene un anticuerpo seleccionado a partir de Abl, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, AblO, Abll, Abl2, Abl3 o Abl4.

32) El método conforme a la reivindicación 27, donde las 6 CDRs son idénticas a las que contiene un anticuerpo seleccionado a partir de Abl, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, AblO, Abll, Abl2, Abl3 o Abl4.

33) . El método conforme una cualquiera de las reivindicaciones 1-32 donde anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una regi variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de CDR 1 SEQ ID NO: 25, la secuencia de CDR 2 SEQ ID NO: 26, y la secuencia de CDR 3 SEQ ID NO:27, y/o una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de CDR 1 SEQ ID NO: 28, la secuencia de CDR 2 SEQ ID NO:29, y la secuencia de CDR 3 SEQ ID NO: 30.

34) . El método conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1-32 donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de CDR 1 SEQ ID NO: 55, la secuencia de CDR 2 SEQ ID NO: 56, y la secuencia de CDR 3 SEQ ID NO: 57, y/o una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de CDR 1 SEQ ID NO: 58, la secuencia de CDR 2 SEQ ID NO:59, y la secuencia de CDR 3 SEQ ID NO: 60.

35) . El método conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1-32 donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende al menos 2 regiones determinantes de la comprementariedad (CDRs) en cada una de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada las cuales son idénticas a las que contiene un anticuerpo anti CGRP humano seleccionado a partir de Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, o Ab6, Abl3 o Abl4

36) . El método conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1-32 donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende al menos 3, 4, 5 o 6 regiones determinantes de la comprementariedad (CDRs) en cada una de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada las cuales son idénticas a las contenidas en Ab3, Ab6, Abl3 o Abl4.

37) . El método conforme una cualquiera de las reivindicaciones 1-36 donde anticuerpo o fragmento de anticuerpo no está glicosilado o no posee N-glicosilación o si está glicosilado sólo contiene residuos de mañosa.

38) . El método conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1-37 donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo contiene una región Fe que se ha modificado de modo de alterar la función efectora, vida media, proteólisis, y/o glicosilación .

39) . El método conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1-38 donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo humanizado de cadena sencilla o un anticuerpo quimérico.

40) . El método conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1-39 donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une en forma específica a células humanas que expresan CGRP y/o a las moléculas circulantes de CGRP soluble in vivo.

41) . El método conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1-40 donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una secuencia polipeptídica de la región variable de la cadena pesada a seleccionar de: SEQ ID NO: 3, 13, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123, o 133, o una variante de ellas al menos 90% idéntica a las mismas; y asimismo comprende una secuencia polipeptídica de la región variable de la cadena ligera a seleccionar de: SEQ ID NO: 1, 11, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121 o 131, o una variante de ellas al menos 90% idéntica a las mismas, donde uno o más de los residuos framework (FR) o CDR en dicho polipéptido VH o VL se ha sustituido con otro residuo aminoácido que da lugar a un anticuerpo anti CGRP que se une en forma específica a CGRP.

42) . El método conforme a la reivindicación 41 donde uno o más de dichos residuos FR están sustituidos con un aminoácido que se encuentra presente en el sitio correspondiente en un anticuerpo anti CGRP parental de conejo a partir del cual se han derivado las regiones determinantes de la comprementariedad (CDRs) contenidas en dichos polipéptidos VH o VL o una sustitución de aminoácidos conservadora.

43) . El método conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1-42, donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es humanizado.

44) . El método conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1-42, donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es quimérico.

45) . El método conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1-39, donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende un anticuerpo de cadena sencilla.

46.). El método conforme a la reivindicación 44, donde dicho anticuero quimérico comprende un Fc humano.

47) . El método conforme a la reivindicación 46, donde dicho Fc humano se deriva a partir de IgGl, IgG2, IgG3, o IgG .

48) . El método conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1-47 donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo inhibe la asociación de CGRP con CGRP-R y/o multimeros de éste, una o más proteínas adicionales en un complejo CGRP-CGRP-R, y/o antagoniza sus efectos biológicos.

49) . El método conforme a la reivindicación 41 donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una secuencia polipeptídica que posee una homología de al menos 90% o mayor con cualquiera de las secuencias polipeptídicas que se especifican en la presente memoria.

50) . El método conforme a la reivindicación 41 donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una secuencia polipeptídica que posee una homología de al menos 95% o mayor con cualquiera de las secuencias polipeptídica que se especifican en la presente memoria.

51) . El método conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1-50, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti CGRP se une a CGRP con una velocidad de corte (Ko£f) menor que o igual a 10"4 S"1, 5xl0"5 S"1, 10"5 S"1, 5xl0"6 S"1, 10"6 S"1, 5xl0"7 S"1, o 10"7 S"1.

52) . El método conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1-51 donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo inhibe la producción de CGRP con CGRP-R y/o multímeros de éste, y la producción de CGRP con CGRP-R y una o más proteínas adicionales en un complejo.

53) . El método conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1-52 donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti CGRP humano se une a éste o a un epítopo de CGRP como un anticuerpo anti CGRP seleccionado a partir de Abl, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, AblO, Abll, Abl2, Abl3 o Abl4.

54) . El método conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1-53 donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti CGRP humano comprende una o más de las CDRs contenidas en las secuencias polipeptídicas de la región variable de la cadena pesada a seleccionar de: SEQ ID NO: 3, 13, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123, o 133 y/o una o más de las CDRs contenidas en las secuencias polipeptídicas de la región variable de la cadena ligera a seleccionar de: SEQ ID NO: 1, 11, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121 o 131.

55) . El método conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1-54 donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se administra por vía intramuscular, por via subcutánea, intravenosa, rectal, mediante infusión, por via oral, transdérmica o por inhalación.

56) . El método conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1-54 donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se administra por via intravenosa.

57) . El método conforme a la reivindicación 1 o 2, donde the diarrea asociada a CGRP se selecciona a partir de diarrea associated con asociada con síndrome de intestino irritable, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, ileitis, colitis ulcerosa, el cólera, enfermedad pancreática, intolerancia a la lactosa, la malabsorción de fructosa, malabsorción, sobredosis o sobreingestión de magnesio, sobresodisis o sobreingestión de vitamina C, sobredosis o sobreingestión de sorbitol, intoxicación alimentaria, infección por E. coli, deficiencia enzimática, anormalidad de mucosa, enfermedad celíaca, intolerancia al gluten, anemia perniciosa, alergia a los alimentos, intolerancia a los alimentos, síndrome de intestino corto, fibrosis por radiación, diarrea asociada con la quimioterapia, tratamiento con orlistat, fibrosis quística, pancreatitis, ingestión crónica de etanol, enfermedad intestinal isquémica, colitis microscópica, malabsorción de sales biliares (diarrea de ácido biliar primaria) , niveles elevados o la secreción de serotonina, diarrea infantil.

58) . El método conforme a la reivindicación 1 o 2, donde el tratamiento further incluye la administración de otro agente o régimen terapéutico a seleccionar a partir de the group consisting of: antibiotics, antivirals, absorbents, anti-motility medications, bismuth compounds, bismuth subsalicylate, bile acid sequestrants , probiotics, digestive enzymes, lactase, zinc, oral rehydration therapy, y any combination thereof.

59) . El método conforme a la reivindicación 58, donde said anti-motility agents se seleccionan a partir del grupo que consiste en loperamida (Imodium), difenoxilato con atropina (Lomotil) , opiáceos, paregórico tintura de opio, codeina y morfina .

60) El método conforme a la reivindicación 58, donde dichos secuestrantes del ácido biliar se seleccionan a partir del grupo que consiste en: colestiramina, colestipol y colesevelam.

61) . El método conforme a la reivindicación 1 o 2, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti CGRP humano que posee especificidad de unión por CGRP comprende secuencias polipeptidicas de la CDRl, CDR2, y CDR3 de la región variable de la cadena ligera y secuencias polipeptidicas de la CDRl, CDR2, y CDR3 de la región variable de la cadena pesada seleccionadas a partir de las siguientes:

62) . El método conforme a la reivindicación 61, donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un scFv, camelcuerpo, nanocuerpo, IgNAR (anticuerpos de cadena sencilla derivados de tiburones), fragmento Fab, Fab ' , o F(ab')2.

63) . El método conforme a la reivindicación 61, donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti CGRP humano es un gmento Fab

64). El método conforme a la reivindicación 61, donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una secuencia polipeptidica de la región variable de la cadena ligera y una secuencia polipeptidica de la región variable de la cadena pesada seleccionadas a partir de las siguientes:

65) . El método conforme a la reivindicación 61, donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una secuencia polipeptidica de la cadena ligera y una secuencia polipeptidica de la cadena pesada seleccionadas a partir de las siguientes:

66) . El método conforme a la reivindicación 61, donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una región variable de la cadena ligera y las secuencias polipeptidicas de la región variable de la cadena pesada son, cada una, al menos 90% idénticas a una de las secuencias polipeptidicas de la región variable de la cadena ligera SEQ ID NOS: 1, 11, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, o 131, y una de las secuencias polipeptidicas de la región variable de la cadena pesada SEQ ID NOS: 3, 13, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123 o 133, respectivamente.

67) . El método conforme a la reivindicación 61, donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es quimérico o humanizado.

68) . El método conforme a la reivindicación 61, donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti CGRP humano se encuentra enteramente desglicosilado o no posee N-glicosilación o comprende sólo residuos de mañosa.

69) . El método conforme a la reivindicación 61, donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti CGRP humano comprende es un dominio constante humano.

70) . El método conforme a la reivindicación 61, donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti CGRP humano es un anticuerpo IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4.

71) . El método conforme a la reivindicación 61, donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti CGRP humano contiene una región Fe que se ha modificado de modo de alterar al menos uno de la función efectora, vida media, proteólisis, y/o glicosilación.

72) . El método conforme a la reivindicación 61, donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti CGRP humano posee una región Fe que contiene una mutación que altera o elimina la glicosilación o elimina la N-glicosilación .

73). El método conforme a la reivindicación 61, donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti CGRP humano está directa o indirectamente ligado a un marcador o agente terapéutico detectable.

74) . El método conforme a la reivindicación 61, donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti CGRP humano comprende asimismo una porción efectora.

75) . El método conforme a la reivindicación 74, donde dicha parte efectora es una porción o grupo funcional detectable.

76) . El método conforme a la reivindicación 75, donde dicha parte efectora es una tinta fluorescente, una enzima, un sustrato, un material bioluminiscente, un material radiactivo, o un material quimioluminiscente .

77). El método conforme a la reivindicación 75, donde dicho grupo funcional es streptavidina, avidina, biotina, una citotoxina, un agente citotóxico, o un material radiactivo.