MX2010013509A - Metodo y dispositivo para la deteccion de la enfermedad cervical. - Google Patents

Abstract

La presente invención divulga un dispositivo de nuevos métodos para la detección de enfermedad cervical, incluyendo displasia cervical y el carcinoma cervical (que van desde carcinoma in situ hasta carcinoma invasivo del cuello uterino), en varias muestras de pacientes, al mismo tiempo. El dispositivo "multi-celdas" de la presente invención consiste en un sólido apoyo que presenta varias áreas de buena separación, cada uno sirve para acomodar una muestra de un paciente, llevando a evaluación simultanea diferentes muestras de diferentes pacientes, para su revisión y detección de la enfermedad cervical en un tamizaje, utilizando el método de la presente invención.

Description

MÉTODO Y DISPOSITIVO PARA LA DETECCIÓN DE LA ENFERMEDAD CERVICAL CAMPO DE LA INVENCIÓN El campo de la invención es la detección de la enfermedad cervical y su tamizaje, utilizando un dispositivo que renueva la metodología.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La presente invención describe un dispositivo de nuevos métodos para la detección de enfermedad cervical, incluyendo displasia cervical y el carcinoma cervical (que van desde carcinoma in situ hasta carcinoma invasivo del cuello uterino), en varias muestras de pacientes, al mismo tiempo.

El dispositivo "multi-celdas" de la presente invención consiste en un sólido apoyo que presenta varias áreas de buena separación, cada uno sirve para acomodar una muestra de un paciente, llevando a evaluación simultanea diferentes muestras de diferentes pacientes, para su revisión y detección de la enfermedad cervical en un tamizaje, utilizando el método de la presente invención.

La metodología de la presente invención, primero comprende las manchas Citológicas convencionales que aplica el dispositivo nuevo "multi-celdas", que incluye la tinción convencional con hematoxilina o Hematoxilina y eosina de (H & E) y la tinción de Papanicolau convencional.

Además, la metodología de la presente invención comprende determinar la expresión de al menos un biomarcador o la combinación de algunos biomarca.dores , en las células cervicales recogidos directamente del cérvix-uterino de una paciente o derivado de una muestra cervical de una paciente. Tales células cervicales pueden estar adheridas a las paredes del dispositivo "multi-celdas" o bien suspendidas en la celda .

Además, dicha determinación de expresión puede depender de la utilización de un anticuerpo o de la combinación de anticuerpos .

En particular, el método de la presente invención esta descrito en el presente documento mediante un anticuerpo, o la combinación de ellos. Dichos anticuerpos, o variantes y fragmentos de los mismos, son capaces de enlazar a biomarcadores que e sobre-expresan en el cáncer, incluyendo el carcinoma cervical y la displasia, en comparación con un control normal.

Además para practicar la metodología de la invención el dispositivo "multi-celdas" se presenta en un kit.

Por último, el dispositivo y la metodología de ¦ la presente invención puede practicarse con un procedimiento modo manual, o modificarse a un mecanismo semiautomático o totalmente automatizado de acuerdo con las habilidades que se conocen. En la medida, la metodología de la presente invención tiene su aplicación en la forma innovadora de la realización del tamizaje para detección y para el manejo de la enfermedad cervical.

Cabe señalar que la invención actual abarca el uso y la aplicación del dispositivo y métodos a cualquier fluido biológico, o que la suspensión de células sea extraídas de cualquier fluido biológico para muestra para la detección y el manejo detección de otras enfermedades y condiciones pertinentes para otros órganos, más allá de las enfermedades ginecológicas y cervicales.

Abreviaturas: cáncer de cuello uterino (CvC) .

La incidencia de cáncer cervical y su mortalidad.

El cáncer cérvico-uterino ocupa el segundo en el diagnóstico de malignidad y el tercer lugar como causa de muerte por cáncer en las mujeres en todo el mundo. Allí se tienen 555, 100 nuevos casos y 309,800 muertes calcularon en 2007, 83% de los cuales se ha producido en el mundo en desarrollo (American Cáncer Society, ACS Mundial de cáncer de hechos y cifras, 2007).

En los Estados Unidos en el año 2010, hubo un estimado 12,200 nuevos casos de cáncer cérvico-uterino invasivo y una estimación de 4.210 muertes por cáncer cérvico-uterino (American Cáncer Society, ACS Cáncer Facts & Cifras, 2010; Jemal A, et al., estadísticas de cáncer, 2010, CA cáncer J Clin 60:277-300, 2010) .

Desde su creación en 1957, la prueba de Papanicolaou se ha convertido en una prueba rutinaria para la detección de la enfermedad cérvico-uterina en los Estados Unidos. Como un resultado de esta prueba rutinaria de tamizaje exitosa, las tasas de incidencia de cáncer cérvico-uterino han disminuido en la población femenina afro-americana y en mujeres de raza blanca, las lesiones pre-invasivas del cérvix-uterino se detectan mucho más frecuentemente que el cáncer invasivo, y las tasas de mortalidad han disminuido asi en los últimos decenios .

Etiología del cáncer cérvico-uterino y patología. La infección con el virus del papiloma humano (VPH) es un factor etiológico principal para la etiología del cáncer cérvico-uterino. La magnitud de la Asociación de riesgo es mayor que el fumar para el cáncer de pulmón (Unger ER, E de Barr, virus del papiloma humano y cáncer de cuello uterino, en Emerg Infect Dis 10:2031-2032, 2004) . Entre los tipos de VPH 200 conocidos, HPV16/18 son las cepas más comúnmente asociado a cáncer cérvico-uterino, más que un riesgo mayor de 200 v eces que el resto de las cepas. (Castellsague X, et al., 1A1 rededor del mundo se ha considerado la infección del virus del papiloma humano (VPH) y sus co-factores como la etiología del adenocarcinoma cervical: Implicaciones para la detección y prevención, J Nati Cáncer Inst 5:303-315, 2006) .

Sin embargo la mayoría de las infecciones de VPH desaparece espontáneamente y sólo un pequeño porcentaje progresan hacia el NCI (neoplasia cervical intraepitelial) o CIS (carcinoma in situ) . Otros factores de riesgo que contribuyen a la producción de la enfermedad del cáncer cérvico-uterino puede ser la inmunosupresión, la multipariedad, el hábito tabáquico de fumar, y factores nutricionales , así como el uso prolongado de anticonceptivos orales (O S / Centro de información de ICO en VPH y cáncer cérvico-uterino, resumen de informe sobre VPH y estadísticas de cáncer cervical en Brasil, 2007; ACS, 2010) .

Cáncer de cuello uterino comprende dos tipos principales: el carcinoma de células escamosas (75%) y el adenocarcinoma (20%), que afectan a las células escamosas y las células glandulares del epitelio del cuello uterino respectivamente (OMS / ICO, 2007).

El sistema de Bethesda clasifica las lesiones cervicales precancerosas en : I) Células escamosas atipicas de significado indeterminado (ASCUS) II) LESIONES INTRAEPITELIALES ESCAMOSAS DE BAJO GRADO (LSIL) o neoplasia cervical intraepitelial (NC - I) , caracterizada por la displasia leve.

III) Lesiones escamosas intra epiteliales 1 de alto grado (HSIL) o neoplasia cervical intraepitelial, incluyendo el carcinoma in situ (NCI - II, NCI - III / CIS) caracterizado por displasia de moderada a severa.

Tenga en cuenta que LSIL/HSIL nomenclatura se refiere a lesiones cervicales detectadas por la prueba citológica, mientras que la nomenclatura NCI se refiere a la displasia determinada de acuerdo con el análisis histológico de la Biopsia de la muestra tomada de tejido cervical (WHO / ICO, 2007) .

CIN - I, rara vez o sea el (1%) evoluciona a cáncer y en su mayoría regresa a la normalidad, incluso sin ningún tratamiento; CIN - II conllevan un riesgo de progresión en cáncer del 16% por dos años y el 25% después de cinco años, si no se da ningún tratamiento. CIS (CARCINOMA IN SITU) es un cáncer cérvico-uterino confinado al cérvix uterino que evolucionará a cáncer cérvico-uterino invasivo (CCI) en un periodo de entre 10 y 12 años. La supervivencia relativa para los pacientes con cáncer cérvico-uterino en los E.U.A. de 1 año a 5 años es de 88% y 72% respectivamente, mientras que la tasa de supervivencia para los pacientes diagnosticados con cáncer cérvico-uterino localizado a 5-años es del 92% (ACS, 2010) .

La figura 1 ilustra las etapas de la enfermedad cervical .

Las lesiones precancerosas NCI pueden ser tratadas por electrocoagulación, crioterapia, ablación con Láser C02 o cirugía local (M de Campion, Enfermedad Pre-invasiva .

Publicado En: Prácticas de Oncología Ginecológica Tercera Edición. Eds: Berek JS, hacker NF, Lippincott, Williams & Wilkins, Filadelfia, Estados Unidos, pp 271-343, 2000; ACS, 2007). Los diferentes Tipos de cáncer cérvico-uterino invasivos son tratados con cirugía, radiación o ambos, así como también se puede usar 1 la quimioterapia en casos específicos y con previa selección.

Los síntomas, frecuentemente son sangrado vaginal anormal, este no se presenta hasta que se ha desarrollado el cáncer .

Detección de cáncer cérvico-uterino.

El examen Papanicolaou en países desarrollados, ha contribuido lugar a dudas, la disminución en la incidencia de morbilidad y mortalidad del cáncer cérvico-uterino, debido a la detección precoz de lesiones cervicales. La prueba de Papanicolaou es una tinción citológica de células cervicales recogida a través de un procedimiento sencillo que se realiza en el consultorio. Las células son se untan ya sea directamente en una laminilla, luego se fijan y se tiñen este es la preparación de la muestra para el clásico y (convencional Papanicolaou), o primero se enjuaga en una solución liquida de conservante para separar las células de la mucosa y eliminar los detritos celulares de la muestra, antes de preparar la laminilla (citología en base líquida, CBL) . En ambos casos, las laminillas son leídas y revisadas por un cito patólogo.

La Prueba de Papanicolaou se basa en lectura visual subjetiva de morfologías de la célula y se ha limitado su sensibilidad a un (50%) y alta susceptibilidad de una variabilidad en la apreciación de la muestra intra e interpersonal (Boulet GAV, et al., VPH virus del papiloma humano en la detección del cáncer cérvico-uterino : y el importante papel que juegan los biomarcadores , CANCER EPIDEMIOLOGÍA BIOMARCADORES PREV 17:810 - 817, 2008) .

Pueden leerse de 50.000 a 300.000 células por diapositiva, para poder encontrar células potencialmente anormales que son de 20-30, y a menudo se requiere de una doble lectura. Por lo tanto la Prueba de Papanicolaou. de personal altamente calificado y capacitado en laboratorios adecuados, para hacer las pruebas que requieren mucho trabajo y son muy costosas.

El desarrollo de la tecnología CBL (CITOLOGIA EN BASE LÍQUIDA) (ThinPrep, Cytyc Inc.; Camino Seguro, Tres caminos para el Procesamiento de imágenes, Inc.) ha proporcionado un método más estandarizado de toma de muestras, reduciendo así por > 50% el número de muestras celulares inadecuadas, al tiempo que permite la detección de más de 65 % LSIL en la población general que se realiza la prueba convencional del Papanicolaou . Además, con la preparación automatizada de la laminilla y los métodos de lectura automatizada han reducido la carga del análisis, así como la variabilidad intra e interpersonal para la evaluación de la muestra. No obstante, a la fecha, la prueba de Papanicolaou incluso en su formato de CBL (CITOLOGÍA EN BASE LÍQUIDA) sigue siendo una "lectura" en función del tamizaje para su detección, lo cual requiere de una infraestructura apropiada y recursos humanos entrenados y capacitados.

La relación etiológica entre el VPH y el cáncer cérvico-uterino ha sido explotada para el desarrollo de tecnologías moleculares para la identificación del virus y poder superar las limitaciones del estudio citológico en la detección cervical que se realiza en el tamizaje. La Prueba de amplificación de DNA de VPH se utiliza ahora para suplir las equivocaciones en las pruebas de Papanicolau, para clasificar a los pacientes de alto riesgo, abordarlas y enviarlas a una prueba citológica y como seguimiento después del tratamiento de NCI (Boulet, 2008) . Actualmente la prueba de VPH sirve como un punto final suplente para el tamizaje y la detección del cáncer cérvico-uterino . Sin embargo, también ha sido sugerido para el examen primario, particularmente en mujeres mayores de 30 años, seguido por una citología de detección si resultan ser VPH positivas (Smith RA, Cokkinides V, Eyre HJ. GUÍAS PARA LA DETECCIÓN TEMPRANA DEL CANCER, DE LA SOCIEDAD AMERICANA DEL CÁNCER, 2005. CA Cáncer J Clin 55:31 - 44, 2005) . VPH pruebas por amplificación de DNA se realiza en BASE LIQUIDA PARA CITOLOGÍA (LBC) ThinPrep muestras, como la tinción de Papanicolau.

.De acuerdo con las recomendaciones de la SAC (Smith, 2005), la detección del cáncer cérvico-uterino debe hacerse cada año con pruebas de Papanicolau convencionales o en base liquida para citología (LBC) . Si la prueba de Papanicolaou es anormal revela ASCUS, se realiza la prueba de VPH, y si es positiva, las mujeres se refieren a colposcopia. Si la prueba de Papanicolaou revela LSIL o HSIL, las pacientes inmediatamente se refieren a la colposcopia.

Colposcopia es el examen microscópico del cuello uterino a ácido acético o Tinción de Lugol para revelar las células anormales, que pueden ser a su vez remitidas a biopsia. Mujeres mayores de 30 años que han tenido tres resultados de la prueba de Papanicolau normales en pruebas seguidas, puede tener una revisión cada 2-3 años con la citología cervical por sí sola, o cada 3 años con una prueba de ADN del VPH además citología cervical. Las mujeres mayores de 70 años que han tenido tres o más PAP normal de pruebas consecutivas y ninguna prueba de Papanicolaou resultó anormal en los últimos 10 años, pueden dejar de realizarse las pruebas de detección (Smith, 2005) .

La inmuno marcación puede utilizarse para mejorar la precisión de la prueba de Papanicolaou, complementando la lectura con un criterio más objetivo basando la prueba citológica en la interacción antígeno-anticuerpo .

El antígeno Ki-67 es una proteína nuclear grande, que se expresa en la proliferación de las células (Goodson WH., et al. La relación funcional entre in vivo bromodeoxyuridine índice de etiquetado y índice de proliferación de Ki-67 en el cáncer de mama humanos, Breast Cáncer Res Treat 1998 mayo; 49 (2): 155-164; Scholzen T., et al. La proteína de Ki-67: de lo conocido y lo desconocido [revisión] , j . Celda Physiol 2000; 182:311-22). Ki-67 se expresa preferentemente durante las fases activas de todo el ciclo celular (G final 1 -, S, G 2 -y M-) , y está ausente en las células en reposo (G 0 - ) . En el diagnóstico anatomo-patológico, los anticuerpos a Ki-67 se utilizan para las tasas de proliferación de grado de tumores (Cattoretti g., et al. Anticuerpos monoclonales contra partes recombinantes del antígeno Ki-67 (MIBland MIB3) para detectar células que estén proliferando en las muestras procesadas en parafina fijada en formalina en micro-ondas. J Pathol de 1992; 168:357-63).

La inmunotinción de Ki-67 con el anticuerpo disponible comercialmente MIB-1 ha sido evaluado como una prueba adjunta para mejorar la precisión del diagnóstico de lesiones cervicales de intraepiteliales escamosas (LSIL o HSIL; Pirog et al .

La Precisión del diagnóstico de lesiones cervicales escamosas intraepiteliales de baja graduación se ha mejorado con inmunotinción con el MILB-1, Am J Surg Pathol 26:70-75, 2002). De hecho se informó que existe una considerable variación en el diagnóstico de LSIL entre la observación de la muestra y la inmunotinción .

La inmunotinción con MIB-1 ser más sensibles y especificas que las pruebas de VPH.

Ha sido demostrado que los mini-cromosomas de las proteínas de mantenimiento (MCM) y en particular MCM-2, MCM-5 y 7 de MCM, son útiles para la detección de la enfermedad cervical incluido la - Displasia y el cáncer (Williams et al., Proc Nati Acad Sci U.S. A. 95:14932-14937, 1998; Freeman et al., 5:2121 Clin Cáncer RES-2132, 1999), como se ha demostrado en frotis cervicales convencionales o por tinción inmunohistoquímica de tejidos cervicales. Resultados recientes mediante un modelo VPH-transgénico de ratón han demostrado que MCM-7 más bien parece ser un marcador de inmuno-química para una detección de alta calidad de la enfermedad cervical (freno et al., res de cáncer. 63: 8173-8180, 2003; Malinowski et al., Acta Cytol. 43: 696, 2004; 7, 632,498 De patentes de Estados Unidos Malinowski et al., 2009) .

Quinasa dependiente del inhibidor de la ciclina 2A (CDKN2A) , también conocido como pl6(INK4a) es un ciclo celular regulador de sobre-expresión en las lesiones preneoplastic cervicales albergan HPV16/18 y cáncer cérvico-uterino. La sobre-expresión de pl6(INK4a) es debido a la inactivación funcional de la proteína retinoblastoma Rb, por la proteína VPH E7. Por lo tanto la sobre-expresión de pl6(INK4a), está relacionada con la expresión activa de los genes de VPH, y es preferible a solo detectar la presencia del virus.

Por lo tanto se ha propuesto que - la sobre-expresión de pl6(INK4a) puede utilizarse como un marcador para detectar la infección persistente de VPH de alto riesgo y aumentar la calidad en la detección de lesiones epiteliales escamosas (HSIL; Klaes et al. Sobre-expresión de pl6(INK4a) y como un marcador especifico para displasias y células epiteliales neoplásicas del cérvix-uterino, Int J cáncer 92:276-284, 2001; Agoff et al., expresión de pl6(INK4a) se correlaciona con algún grado de neoplasia cervical: una comparación con Ki-67 expresión y detección de los tipos de VPH de alto riesgo, Mod Pathol 16:665-673, 2003; Von Knebel Doeberitz et al., 2004, 6,709,832 de patentes de Estados Unidos) .

La Detección por inmuno-histoquimica con el pl6(INK4a) en biopsias cervicales está en uso rutinario para discriminar entre la asociación o no de las lesiones al VPH (Redman R, et al., la utilidad de P16(Ink4a) en discriminar entre neoplasia cervical intraepitelial 1 y no neoplásica equivocas lesiones del cuello uterino, 132:795 Arch Pathol Lab Med-799, 2008) y como suplente marcador de alto riesgo de infección por VPH ( ulvany NJ, et al., utilidad de diagnóstico de pl6lNK4a: un reevaluación de su uso en biopsias cervicales. Patología 40:335-344, 2008) .

Además, se está evaluando la inmunotinción de las muestras de tejido cérvico-uterino con pl6lNK4a de ThinPrep por su habilidad para ayudar en la identificación de alto grado de las lesiones intraepitelial, evaluadas en las biopsias de seguimiento y las pruebas de ADN dé VPH de alto riesgo (Meyer et al., evaluación de pl6 INK4a expresión de ThinPrep cervicales especímenes con la pl6 CINtec INK4a ensayo, cáncer, 111:83-92, 2007; Doeberitz et al., 2007, 7,306,926 de patentes de Estados Unidos) .

Por último, un procedimiento basado en la prueba ELISA con pl6(INK4a) para la detección usando un lisado de proteínas de células exfoliativas , se ha reportado que se presenta una mayor sensibilidad y especificidad para las pruebas de Displasia y cáncer (Ding L, et al., prueba de ELISA para detectar la CDK2A de la ThinPrep (expresión de pl6(INK4a) en las células exfoliantes: es una nueva herramienta para la prueba de detección del cáncer cérvico-uterino, Mol Diagn Ther 12:395-400, 2008) .

En conclusión, el uso de anticuerpos contra biomarcadores específicos de cáncer cérvico-uterino y lesiones cervicales pre-neoplásicas pueden aumentar la precisión de la detección de la enfermedad cervical actual.

Hay un consenso en cuanto a las discrepancias de la interpretación que caen en el error con los observadores comunes, especialmente en la categoría de citología LSIL. De hecho inmunot inción con anticuerpos representa una "prueba objetiva" por lo tanto puede servir de complemento a la interpretación morfológica ofrecida por el patólogo. Los anticuerpos contra biomarcadores específicos, podrían ayudar en la interpretación para el diagnóstico de LSIL, por el aumento de la precisión del diagnóstico anatomo patológico basado en la citología.

Entre los biomarcadores circulantes, se han entontrado niveles en el suero de antigeno de carcinoma de células escamosas para poder ser relacionados con la etapa del tumor, el tamaño del tumor, el tumor residual después del tratamiento, o tumor recurrente o enfermedad progresiva y asi la supervivencia en el carcinoma cervical escamosa (KN de Gaarenstroom, Bonfrer JMG. NACB, Academia Nacional de bioquímica clínica: directrices para el uso de marcadores tumorales de cáncer de cuello uterino, 2007) . Antígeno de SCC es un grupo de glicoproteínas con peso molecular de ~ 45KDa, perteneciente a la familia de inhibidores de la proteasa serina. Hay de hecho dos genes, SSC1 y SSC2, ambos localizados en el cromosoma 18q21.3, para la codificación de la isoforma neutral y la ácida respectivamente. La forma neutral se detecta en las células epiteliales malignas y normales .

Considerando que la isoforma ácida se encuentra en las células tumorales y en los sueros de pacientes con carcinoma bien diferenciado de carcinoma de células escamosas (Kato H, et al., distribución heterogénea de ácidos TA-4 en el carcinoma de células escamosas cervical; demostración de inmunohistoquímica con anticuerpos monoclonales , 78:1246 japonés J Cáncer Res-1250, 1987) . SSC1 y SSC2 son casi idénticos, sólo difieren en sus asas reactivas. Hay pruebas de que los eventos que regulan los procesos proteoliticos, en ambos procesos el normal y los procesos patológicos, tienen aún distintas funciones biológicas (De Bruijn H A, et al., El valor clínico del antígeno de carcinoma de células escamosas en cáncer del cuello uterino, el Tumor Biol 19: 505-516, 1998) .

También se han encontrado niveles elevados de SCC en pacientes con carcinoma de células escamosas en otros órganos (vulva, vagina, cabeza y cuello, pulmón) así como en los pacientes con enfermedades benignas de piel (psoriasis, eczema), pulmón ( sarcoidosis ) , hígado y riñon.

Sin embargo, según las recomendaciones de NACB (Gaarenstroom, 2007), SCC no es un biomarcador lo suficientemente sensible para detectar el cáncer cérvico-uterino y su utilidad clínica en el pronóstico, pero en lo que respecta a la vigilancia de la respuesta al tratamiento se necesita más evaluación.

En conclusión, existe una necesidad de mejorar la precisión, el desarrollo de la metodología y el costo normal en la detección de enfermedad cervical. El dispositivo y la metodología de la presente invención tienen utilidad y se deben aplicar, en la detección de la enfermedad cervical como una novedad basada en la citología de alto rendimiento.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN: La presente invención nos revela un dispositivo y una metodología novedosa para la detección y el tamiza e de la enfermedad cervical en muestras cérvico-uterinas de pacientes .

El dispositivo "multi-celdas" de la presente invención consiste en un sólido apoyo con múltiples áreas circulares bien-separados para colocar cada muestra de un paciente, dando asi alojamiento a múltiples muestras de pacientes pudiendo asi realizar una evaluación simultánea de múltiples muestras de pacientes, para la detección y el tamizaje de la enfermedad cervical, utilizando la metodología de la presente invención .

La metodología de la presente invención, comprenden primero las manchas Citológicas convencionales que aplican al dispositivo innovador, de celdas o pocilios, incluyendo el método convencional de tinción con hematoxilina o Hematoxilina y eosina (H & E) y la tinción convencional del Papanicolau. Por lo tanto, el dispositivo y el método de la presente invención tiene aplicación de utilidad en la detección de alto rendimiento, la detección y el manejo de la enfermedad cervical, así como una variedad de otros ensayos basados en la celda y la citología.

La presente invención abarca la aplicación del dispositivo y la metodología de la presente invención en muestras de pacientes que provengan de cualquier fluido o biológico o tejido. En la medida en que la presente invención proporcione aplicaciones de utilidad en el análisis, detección, diagnóstico, manejo de enfermedades y más allá de detección de una variedad de enfermedades y afecciones de diferentes sitios y órganos más allá de enfermedades ginecológicas .

Muestras de células cervicales pre-neoplásicas, displásicas y maligna (Thin Prep) son raras.

Por lo tanto, en el campo preferido de la invención de la presente, se establece una condición experimental que copiando una muestra de paciente con cáncer cérvico-uterino del tamizaje, mezclando las células cervicales normales con las células de una linea de células de cáncer, crecen juntos en co-cultivo. En este ejemplo de co-cultivo que se muestra a continuación, se utilizó para ilustrar los métodos de la presente invención. El uso de la auténtica Thin Preps, la preparación más común en las muestras de tejido cérvico-' uterino que se utiliza actualmente para el tamizaje de detección y manejo del cáncer cervical y otros.

Todas las formas de muestras cervicales están comprendidas en la presente invención.

La presente invención también proporciona un método novedoso de inmunotinción de muestras de tejido cérvico-uterino de paciente con enfermedad cervical usando el "dispositivo multiceldas" , o "dispositivo de pocitos". En un ensayo se utilizó preferentemente la presente invención, y en el ensayo se usó una mezcla de células cervicales normales y células cervicales cancerosas para simular una muestra con tejido cervical, con un anticuerpo especifico, destinados a localizar un antigeno de superficie, localizado en la membrana celular, se utilizan para teñir las células de cáncer entre las células cervicales normales. La presente invención aprovecha las ventajas de utilizar anticuerpos monoclonales específicos para identificar algunas células de cáncer en una mezcla de células normales, lo que incrementa precisión del diagnóstico, sobre la evaluación visual la morfología de la célula por el patólogo .

También esta incluido en esta invención el uso de un anticuerpo o la combinación de anticuerpos contra un biomarcador o una combinación de biomarcadores que están asociados a lesiones pre-neoplásicas, neoplásicas o simplemente una displasia en las células cervicales. El uso de anticuerpos contra dichos biomarcadores mejoraría en gran medida la sensibilidad de detección de la prueba actual .

Por último la presente invención detalla un método novedoso para la detección de la enfermedad cervical y que se practica en una suspensión de células en una solución de detección. La suspensión de dichas células es una mezcla de células cervicales normales y células con cáncer cérvico uterino, como se describió anteriormente, una imitación de condición experimental una muestra del paciente con tejido cervical para la detección de la enfermedad cervical. La solución ThinPrep auténtica está comprendida la presente invención. En esta recreación del modelo, la tinción de la célula se realiza con un anticuerpo anti-Her2, que se localiza en la membrana celular de las células cancerosas del modelo utilizado. Sin embargo el anticuerpo o la combinación de anticuerpos contra biomarcadores o combinación de biomarcadores que están asociados a lesiones preneoplásicas, neoplásicas o displasias de las células cervicales son llevadas a cabo por la presente invención y aparte mejoraría en gran medida actual PAP sensibilidad de detección.

La incorporación de este última además ofrece la posibilidad de cuantificar la reacción especifica de antigeno-anticuerpo, a su vez facilitar y potencialmente automatizar todo el proceso de tamizaje del cáncer cérvico uterino. En el presente ejemplo se utiliza una reacción colorimétrica, pero son de otros ¦ sistemas de detección llevadas a cabo también usando la presente invención.

La Inmunomarcación basada en lectura colorimétrica de la reactividad de la célula representa una mejora precisa, rentable y fácil de usar con en una revisión visual para la evaluación de intensidades de tinción y morfologías celulares realizadas por el patólogo.

Además se proporcionan los kits para practicar la metodología de la invención.

Personas capacitadas en la técnica afirman que en la presente invención se incluyen los dispositivos y la metodología para realizar o practicar el procedimiento de forma manual, o se puede modificar la metodología para realizar el procedimiento de forma semiautomática, o también se puede realizar de forma totalmente automatizado.

En conclusión, la presente invención ofrece muchas mejoras y aplicaciones de utilidad, para los procedimientos del tamizaje del cáncer cérvico-uterinos más actuales: Único de alto rendimiento para realizar múltiples procedimientos simultáneamente Mayor precisión en la interpretación diagnóstica, comparando la evaluación morfológica de la célula, con la debida utilización anticuerpos específicos lo cual lo hace más rentable y de prestigió por mayor especificidad y sensibilidad .

La medición cuantitativa de la reacción antígeno-anticuerpo especifica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE FIGURAS Y TABLAS La Figura 1: Diseño del dispositivo muíti-celdas , se muestra el dispositivo multi-celdas de la presente invención. Prototipo es 90 x 130 x 1 mm. , presentando un numerado del (1-40) de las áreas circulares (o celdas) de 15 mm de diámetro. También están contenidos en la presente invención otros formatos, tales como, pero sin limitarse a: 6, 12, 24, 48, 96, 384-celdas o cualquier otro tamaño, siempre y cuando el diámetro sea compatible con la realización del ensayo y con el dispositivo en general los cuales pueden ser fácilmente montados y poderse leer bajo un microscopio.

La Figura 2A: Tinción de células cervicales normales con Hematoxilina , utilizando el dispositivo multiceldas . Muestras de Células cervicales normales de pacientes, es decir, 250 M 1 de un Thin Prep, se depositan en cada una de las celdas del dispositivo multi-celdas áreas circulares de 15 mm de diámetro del dispositivo multi-celdas. Por lo tanto varias muestras pueden evaluarse simultáneamente. Las células son secadas con aire en RT y se enjuagan con PBS . Para eliminar el exceso de los desechos de la célula, entonces las células ya están listas para cualquier procedimiento de tinción citológica. En el presente documento, se muestra la tinción hematoxilina para cuatro diferentes muestras (2A-2B) del dispositivo multi-celdas. El dispositivo se enjuaga con ddH20, y las muestras están cubiertas con unas gotas de solución de hematoxilina Mayer débil durante 1-2 minutos, luego lavar con solución de bluing a núcleos de color azul o grifo H20. El dispositivo se observa bajo microscopio con diferentes aumentos (figura 2A: 4 X; Figura 2B-2D : 10 X) . Los resultados muestran tinción citológica que puede correctamente ser interpretada en el dispositivo multi-celdas de alto rendimiento de la presente invención.

En la Figura 2?: Muestra de Células Cervicales Normales que está procesada en el dispositivo multi-celdas fijadas y teñidas con hematoxilina (aumento 4X) .

La Figura 2B: Muestra de Células Cervicales Normales que está procesada en el dispositivo multi-celdas fijadas y teñidas con hematoxilina (aumento 10X) La Figura 2C: Muestra de Células Cervicales Normales que está procesada en el dispositivo multi-celdas fijadas y teñidas con hematoxylin (aumento 10X) La Figura 2D: Muestra de Células Cervicales Normales que está procesada en el dispositivo multi-celdas fijadas y teñidas con hematoxilina (aumento 10X.) La Figura 3A: Inmunomarcación de una muestra que contiene una mezcla de células con cáncer cérvico-uterino y células cervicales normales, utilizando el dispositivo multi-celdas y anticuerpos comúnmente utilizados. Las células cervicales normales vienen de una muestra de un paciente sin cáncer o sea normal de una preparación en base liquida (Thin Prep) y se mezclan con BT474 células de cáncer de mama en un experimento donde se realiza un co-cultivo imitando una muestra de un paciente para detección del cáncer cérvico-uterino, tal como se describe en los ejemplos 2 y 3, con la metodología usada en la presente invención junto con el dispositivo multi-celdas. A continuación, se realiza una inmunotinción con anticuerpos específicos.

Específicamente, tenemos una cantidad constante de células cervicales normales depositadas en el dispositivo multi-celdas, mientras que solo colocamos algunas células con cáncer (es decir, suficiente cantidad para que sean visualizadas en un campo para el propósito del ejemplo), se colocan posteriormente y se cultiva para su crecimiento a 37 0 C. Para activar y hacer pruebas de reproducibilidad y tener las muestras por Duplicado, por triplicado o tener muestras por cuadruplicado. Las células se tratan inactivándose con peroxidasa antes de ser marcadas con anticuerpos. El anticuerpo monoclonal Her2 se agrega como anticuerpo principal en 1 M g/ml en PBS . Se incuba durante una hora a 37 ° C. Y para la detección se' utiliza un anticuerpo IgG anti-ratón (diluido a 1 µ g/ml en PBS) se agrega y se incuba otra hora a 37 0 C, después se liga a la estreptavidina que es una peroxidasa de rábano picante (también diluido a 1 µ g/ml en PBS se incuba durante otra hora a 37 ° C) . La reacción se desarrolla con la adición de sustrato DAB, produciendo una tinción color marrón y es detenida con PBS que contiene azida. El Dispositivo multi-celdas se evalúa con el microscopio a diferentes aumentos (figuras 3A-3E: 10 X; Las cifras de 3F-3 G: 40 X) .

La Figura 3A: Muestra que contiene una mezcla de células cérvico-uterinas humanas normales y células cérvico-uterinas humanas con cáncer (señaladas con una flecha roja) , que está procesada con la metodología y el dispositivo multi-celdas objeto de la presente invención, teñidas con hematoxilina y marcadas con anticuerpo anti-Her2 (aumento 10X) La Figura 3B: Muestra que contiene una mezcla de células cérvico-uterinas humanas normales y células cérvico-uterinas humanas con cáncer (señaladas con una flecha roja) , que está procesada con la metodología y el dispositivo multi-celdas objeto de la presente invención, teñidas con hematoxilina y marcadas con anticuerpo anti-Her2 (aumento 10X) La Figura 3C: Muestra que contiene una mezcla de células cérvico-uterinas humanas normales y células cérvico-uterinas humanas con cáncer (señaladas con una flecha roja) , que está procesada con la metodología y el dispositivo multi-celdas objeto de la presente invención, teñidas con hematoxilina y marcadas con anticuerpo anti-Her2 (aumento 10X) La Figura 3D : Muestra que contiene una mezcla de células cérvico-uterinas humanas normales y células cérvico-uterinas humanas con cáncer que está procesada con la metodología y el dispositivo multi-celdas objeto de la presente invención, teñidas con hematoxilina y marcadas con anticuerpo anti-Her2 (aumento 10X) La Figura 3E : Muestra que contiene una mezcla de células cérvico-uterinas humanas normales y células cérvico-uterinas humanas con cáncer (señaladas con una flecha roja) , que está procesada con la metodología y el dispositivo multi-celdas objeto de la presente invención, teñidas con hematoxilina y marcadas con anticuerpo anti-Her2 (aumento 10X) La Figure 3F: Muestra que contiene una mezcla de células cérvico-uterinas humanas normales y células cérvico-uterinas humanas con cáncer (señaladas con una flecha roja) , que está procesada con la metodología y el dispositivo multi-celdas objeto de la presente invención, teñidas con hematoxilina y marcadas con anticuerpo anti-Her2 (aumento 40X) La Figure 3G: Muestra que contiene una mezcla de células cérvico-uterinas humanas normales y células cérvico-uterinas humanas con cáncer (señaladas con una flecha roja) , que está procesada con la metodología y el dispositivo multi-celdas objeto de la presente invención, teñidas con hematoxilina y marcadas con anticuerpo anti-Her2 (aumento 40X) Los resultados muestran que el uso de anticuerpos mejora el reconocimiento de las células con cáncer, en comparación con la evaluación morfológica por si sola.

Tabla I: Inmunomarcación de células de cáncer entre las células cervicales normales en solución utilizando el método de ELISA que es el formato comúnmente utilizados en exámenes realizados con anticuerpos, Como en la figura 3 (ejemplos 2 y 3), las células de cáncer de mama se mezclan con las células cérvico-uterinas normales de un paciente de una muestra ThinPrep, excepto que en este caso se utilizan un determinado número de células cancerosas y van en aumento usando (200, 300, 400, 600, 800, 1200 células por celda) . Además, este experimento se lleva en el dispositivo multi-celdas, que es una placa con 96 celdas, en este formato facilita que las pruebas se puedan alternar con la inmunotinción, pudiéndose practicar ambas metodologías, este se practica con la célula en una suspensión en agua base, tal como se describe en detalle en el ejemplo 4. Inmunomarcación es tal y como se describe en la figura 3 con duplicado de las muestras, excepto que el sustrato usado para la detección es soluble, como TMB y la reacción antígeno-anticuerpo es evaluado por un colorímetro que es una placa lectora de 450 nm. Los controles incluyen una suspensión blanco sin células y una suspensión blanco con células pero sin ningún anticuerpo primario, Las lecturas de OD 1 y 0D2 son ejecutados en la pared de la celda donde está la muestra en suspensión de células enteras (que contiene un sedimento celular luminoso) , o bien solamente en el sobrenadante de la celda, respectivamente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la divulgación de una metodología y un dispositivo completamente nuevos para la detección y el manejo de la enfermedad cérvico-uterino en muestras cérvico-uterinas de pacientes.

Dispositivo multiceldas El dispositivo "multi-celdas" de la presente invención consiste en un sólido apoyo con múltiples áreas circulares separadas, con una muestra de paciente en cada una, llevando a cabo con este dispositivo y metodología un alojamiento múltiple para una evaluación simultanea de múltiples muestras de pacientes en el tamizaje para la detección de la enfermedad cérvico-uterina, utilizando la metodología de la presente invención.

En la medida, de la novedad del dispositivo es que permite realizar la evaluación de muestras cérvico- uterinas múltiples simultáneamente, en comparación y contrariamente al examen de Papanicolaou convencional o estándar de oro actual para preparar análisis, mediante el cual las muestras individuales se colocara en un portaobjetos de vidrio y teñido usando la tinción convencional de Papanicolau.

La figura 1 ilustra el prototipo del dispositivo multi-celdas de la presente invención con 40 numerando del (1-40) circular áreas (o celdas) de 15 mm de diámetro.

Esta invención abarca otros formatos son abarca, tales como, pero no se limita a: 6, 12, 24, 48, 96, 384 pozos. Se sabe que los trabajadores calificados en la técnica han ajustado el diámetro del dispositivo y el formato de la metodología (por ejemplo, el número de celdas), al ámbito de aplicación del ensayo, son cambios pertinentes basadas en la celda. Las modificaciones del dispositivo multi-celdas se realizaron para facilitar la lectura en el microscopio, el manejo o manipulación de la muestra para el ensayo, así como las modificaciones para que. el dispositivo multi-celdas sea compatible con cualquier instrumento o equipo que puede estar asociada con el uso y la aplicación del dispositivo, ya sea para la manipulación, cualitativa o con fines de medición cuantitativa .

El dispositivo multiceldas está hecho preferentemente de policarbonato, sin embargo, la presente invención también se puede hacer en otros materiales, tales como pero no limitado a: vidrio, acrilico, vidrio flexible, poliestireno, polipropileno, etc.. Las modificaciones en el material tienen que ver con la facilitación de la adsorción de proteínas, y para asegurar la compatibilidad con las soluciones orgánicas o acuosas del ' procedimiento, y otras modificaciones como sea el conocimiento de los trabajadores calificados en la técnica, están comprendidos en la presente invención .

El dispositivo multiceldas está recubierto con una capa de pintura delgada, por lo tanto, crea y delimita cada una de las áreas circulares que forman el dispositivo multiceldas, de tal manera que no se pueda producir ni cruzar ninguna contaminación entre las muestras. Al igual que la capa que cubre el dispositiva puede ser de diferente grosor, las áreas circulares (multiceldas) pueden estar delineadas por un aro de espesor y altura diferente, convirtiendo el área en un pozo de profundidad diferente.

La metodología de la presente invención permite el análisis simultáneo de muestras múltiples.

En esta medida, la metodología y dispositivo multiceldas objeto de la presente invención tiene aplicación de utilidad como un nuevo formato de alto rendimiento para una variedad de otras pruebas célula-base, incluyendo la citología convencional y la inmunotinción celular, que se realizan con frecuencia en laminillas de vidrio individuales. La metodología y el dispositivo multi-celdas objeto de la presente invención se puede utilizar preferentemente en la prueba de Papanicolaou cérvico-uterina de los programas nacionales de tamizaje.

Para los efectos de la presente invención, la muestra de células cervicales, pretende ser una muestra recogida directamente del cérvix-uterino de un paciente que incluye células, tejido o fluido corporal, utilizando cualquier dispositivo, para recolección de muestra el cual incluye pero no limita a brocha citológica, espátula, raspado o secreciones de un área o mediante un aguja para aspirar líquidos corporales. Las muestras cervicales también pueden provenir pero sin limitarse a tejidos humanos frescos o congelados, tejido fijado en parafina, la muestra de una biopsia, células cérvico-uterinas exfoliadas o muestras de moco cérvico-uterino .

Por otra parte para los efectos de la presente invención, entendemos que como muestras cervicales están comprendidas las células cérvico-uterinas, que provienen de muestras tomadas y suspendidas en base agua tales como, pero sin limitarse a, ThinPrep . RTM . Preparación (CYTYC, Inc.), o SurePath. RTM.

(TriPath Imaging, Inc.).

Además comprendidos en la presente invención son la suspensión de células cervicales usando otras soluciones conservadoras de citología en base- líquida, tales como la citología en base de alcohol u otras soluciones de otro tipo para pruebas de inmunohistoquímica, o células cervicales en suspensión en soluciones no conservadoras, como la solución salina de búfer de fosfato (PBS). Células cervicales recogidas por cualquier técnica mencionada u obtenida de cualquiera de las soluciones mencionadas anteriormente y, a continuación, se coloca en una celda diapositiva, que incluye una monocapa en cada celda, como se contempla en la presente invención.

En particular la inclusión presentes células cervicales incluidas en la metodología de la invención provienen de alícuotas de ThinPrep. Como alternativa, la alícuotas de ThinPrep se centrifugan, se lavan en PBS, se vuelven a segmentar a través de un centrifugado suave, finalmente en el siguiente paso se resuspenden en PBS.

Además también están comprendidas en la presente invención, cualquier otro fluido biológico que contenga células y que se pueda evaluar por tinción citológica, examen de microscopio, inmunotinción con algún anticuerpo específico o cualquier , combinación de anticuerpos. Estos fluidos biológicos incluyen pero no se limitan para: lavados bronquio-alveolares , esputo, frotis ginecológicos, fluidos de aspirado de pezón, orina, etc.. En muchos de los casos, estos fluidos biológicos están asociados con la detección de enfermedades y las condiciones de los sitios del órgano específico, por ejemplo, el lavado bronquio-alveolar para asma o cáncer de pulmón y/o cualquier enfermedad pulmonar, fluido aspirado del pezón para el cáncer de mama, sedimentos de orina después de un tacto rectal para el examen de cáncer de próstata, etc.. Comprendidos en la presente invención están las células derivadas pero no limitado a, tejidos humanos frescos o congelados, tejido fijado en parafina, .muestra de la biopsia, micro-cortes de tumor de tejidos etc.. Por lo tanto, la metodología y el dispositivo multiceldas de la presente invención tienen aplicaciones de utilidad en la detección y la posible detección de una variedad de enfermedades, más allá de Enfermedades ginecológicas y cérvico-uterinas .

Automatización, Como lo saben los expertos en la técnica, este dispositivo objeto de la presente invención, puede ser usado como una nueva metodología de alto rendimiento se puede utilizar en un formato manual, semiautomatizado o totalmente automatizado. La tinción clásica, que incluye la tinción de la prueba de Papanicolaou usada en el programa nacional de tamizaje para la detección de enfermedad cervical, asi como también procedimientos de inmunohistoquimica que se aplican a varias laminillas, ya han sido automatizados desde hace tiempo los equipos y procedimientos que permitan el manejo de un gran número de muestras múltiples por hora. Están comprendidos en la presente invención, sistemas, aparatos, métodos y modificaciones lo que permite el control automático del mismo y la programación de todas las tareas necesarias para aumentar el rendimiento de los procedimientos automatizados en el dispositivo multi-celdas, tales como pero no limitado a: muestra la deposición, soplando aire, lavados, tinciones en varios baños a intervalos específicos, Adición o eliminación de botellas de reactivo o contenedores de líquidos, mezcla de reactivos, aplicación de reactivos para el dispositivo multi-celdas, introduciendo con este un nuevo soporte sólido (es decir, el dispositivo mutli-celdas). con muestras adicionales, aumentando el rendimiento, tener un · apoyo sólido a lo largo de los procedimientos realizados, la captura de imágenes del dispositivo, medir reacciones colorimétricas, etc..

Automatización parcial o total de los procesos descritos en este documento son llevadas a cabo por la presente invención .

Las Tinciones Citológicas utilizando el dispositivo multi-celdas objeto de la presente invención.

En primer lugar, los métodos de la presente invención comprenden el uso del dispositivo multi-celdas en la tinción citológica convencional. De hecho, en una ejemplo que se prefiere usar la presente invención, se demuestra la aplicación del dispositivo multi-celdas en la' tinción hematoxilina clásica (Por ejemplo 1, figuras 2A-2D) .

Son células cervicales que provienen de una muestra de paciente normal en Thin Prep, depositado en una de las celdas o área circular del dispositivo multi-celdas. Varias muestras pueden ser teñidas simultáneamente y evaluadas visualmente bajo el microscopio. Por lo tanto el dispositivo multi-celdas tiene utilidad y aplicación para convertir en un formato de alto rendimiento a una variedad de otras pruebas células-base, incluyendo la detección de enfermedad cérvico-uterina en los programas nacionales de tamizaje.

En la realización de esta práctica, el dispositivo multi-celdas ha sido irradiado con rayos UV para habilitar datos adjuntos a la célula.

Los métodos para acoplar el alterna miento de las células, método que conocen los trabajadores calificados en la técnica (tales como, pero no se limita a polylysine, agentes de la Unión, tratamiento de plástico para la adsorción de la celda, etc.) son llevadas a cabo por la presente invención, dependiendo del material del que esté hecho el dispositivo multi-celdas objeto de la presente invención .

Los trabajadores calificados en la técnica saben, que el tamaño de las áreas circulares del dispositivo multi-celdas, debe ser razonablemente compatible con la cantidad de células que se quieren examinar. Por lo tanto, dependiendo del ámbito de la aplicación del experimento, entre visualización, detección o programa nacional de tamizaje, será elegida una muestra con un número determinado de células y el volumen que puede ser razonablemente alojado y se esparcen en la superficie bien de la celda del dispositivo multi-celdas seleccionado. Por ejemplo, un diámetro' de 15 mm bien puede acomodar alrededor de 300.000 células lo cual es el número que puede ser necesario para un diagnóstico preciso en la prueba de tamizaje de la prueba de Papanicolaou.

Después de depositar las células en el dispositivo multi-celdas, las células son secadas con en RT, o alternativamente expuestas en una cámara a una temperatura de 37-40 ° C, después se enjuagan con PBS . Las células se limpian de los excesos o desechos, con este procedimiento se observará un notorio deterioro del frotis para preparar la tinción de la muestra cervical. En un protocolo especifico, se realiza la tinción hematoxilina Ejemplo 1 (figuras 2A-2D) , colorear, por tanto, núcleos de células en azul y se realiza la evaluación visual bajo la óptica del microscopio.

Los resultados, como se muestra en las figuras 2A-2D, demostraron que la tinción citológica puede ser realizada con éxito en el formato de dispositivo multi-celdas de alto rendimiento de la presente invención.

Aplicación del dispositivo multi-celdas para la detección del cáncer cervical .

El dispositivo de la presente invención tiene utilidad y aplicación de alto rendimiento en la detección y en los programas nacionales de detección en tamizaje de la enfermedad cervical.

Porque las lesiones preneoplásicas , displásicas y cancerosas son raras en las muestras cervicales humanas, este protocolo particular de la presente invención recurre a una condición experimental imitando una muestra de algún paciente para la detección del cáncer cérvico-uterino, mezclando las células cervicales normales con las células de una linea de células de cáncer, crecen juntos durante la noche en un co-cultivo (ejemplo 2).

Como se describe en detalle en el ejemplo 2, tenemos células cervicales que provienen de una muestra de paciente normal preparada con Thin Prep, son depositadas en una sola área circular (celda) del dispositivo multiceldas y tratados como en el ejemplo 1 (es decir, secados con aire y enjuagarse con . PBS) . Posteriormente están las capas de células provenientes de una linea de células de cáncer en cada una de las áreas circulares individuales (celdas) del dispositivo multiceldas y son incubados ON a 37 0 C para esparcirse y adj untarlas .

Al dia siguiente, las células son fijadas con etanol al 95% para asegurar los datos adjuntos de células de cáncer y teñidas con hematoxilina . Múltiples muestras de pacientes cervicales pueden utilizarse simultáneamente en el dispositivo multiceldas, y los co-cultivos puede utilizar diferentes cantidades de las células cancerosas con respecto a las células normales.

En este protocolo especifico de la invención presente, pusimos una linea de células de cáncer de mama y se utiliza BT474, pero cualquier linea de células de cáncer puede utilizarse para este propósito. Los co-cultivos de algunas células de cáncer entre células cervicales normales rehaciendo las condiciones del ensayo de una muestra de paciente para la detección sistemática de cáncer cérvico uterino, donde unas pocas células anormales que deba reconocerse en un campo de las células normales.

Resultados de la evaluación de microscopio en la observación de las células de cáncer redonda o alargado (aqui las células epiteliales de un carcinoma ductal) que han crecido entre células cervicales escamosas, caracterizado por su gran forma poligonal y la basada en la tinción azul de los núcleos con hematoxilina . Debido a que en este ejemplo, células cervicales y las células cancerosas son ambos teñidas con Hematoxilina, sólo pueden ser distinguidos basándose en la morfología celular por sí sola. El diferencia en la forma celular entre las células cancerosas y células cervicales normales puede observarse en Cifras 3A-3 G infra. Por el contrario, en el siguiente protocolo (a saber, el ejemplo 3, figuras 3A- 3 G) , células cervicales se tiñen con hematoxilina, mientras que las células cancerosas se tiñen con un anticuerpo específico. Por lo tanto, se distinguen células cervicales y las células cancerosas basándose en la morfología de la célula y sobre la base de inmunotinción específica .

En este protocolo específico se realiza la tinción con hematoxilina. Sin embargo, la presente invención abarca tinción de células normales y anormales en el dispositivo de pocilios con cualquiera tinción citológica, incluyendo la tinción de Papanicolau que se utiliza en el tamizaje cervical. En la medida, el dispositivo y método de la presente invención encuentra aplicación de utilidad en la detección de la enfermedad cervical y en el tamizaje.

En conclusión, este protocolo especifico de la presente invención confirma que co-cultivo y la tinción con Hematoxilina de unas pocas células de cáncer entre las células cervicales normales puede habilitar la evaluación microscópica de las diferencias de morfología de la célula, sirviendo como un modelo experimental de una muestra de paciente para la detección del cáncer de cuello uterino.

El modelo de co-cultivo en este protocolo específico de la presente invención puede ser aplicado a las células de otros fluidos biológicos, excepto los frotis cervicales y Thin Prep, tales pero no se limita a: lavados bronquio-alveolares, esputo, aspirado de líquido del pezón, líquido cefalorraquídeo, líquido peritoneal, plasma, suero, semen, líquido prostético, etc.. En la medida, el dispositivo multiceldas puede ser aplicado con éxito para el examen de estos fluidos biológicos que pueden estar asociados con la detección de enfermedades y afecciones de diferentes en diferentes órganos, la ampliación de la aplicación útil del dispositivo multiceldas a las enfermedades y los programas de tamizaje vá más allá de las enfermedades ginecológicas. Como las mencionadas anteriormente, otras líneas de células de cáncer y las células tumorales pueden utilizarse conjuntamente con otros fluidos biológicos, por lo que la presente invención abarca varios otros modelos de cáncer o tamizaje y la selección de la enfermedad.

Inmunomarcación muestras cervical mediante dispositivo multiceldas y los anticuerpos utilizados en el tamizaje cervical, existe una necesidad de mejorar la precisión de la prueba de Papanicolaou . La inmunotinción con anticuerpos representa una más "prueba objetiva" que la lectura visual subjetiva de la morfología de las células.

En este documento el término "anticuerpos" se refiere a un recombinante policlonal, anticuerpo monoclonal, molécula de tamaño completo o un fragmento de anticuerpo, incluyendo pero no limitándose a FAB, scFv, fragmento de variable de cadena simple, affibodies, diabodies y cualquier otras fragmentos de anticuerpos que se fijan al sitio antigénico determinante de vinculación. El término "anticuerpos" es usado indistintamente en este documento para referirse a cualquiera de las especies más arriba. Por lo tanto, anticuerpos incluyen anticuerpos producidos in vitro así como anticuerpos generan en vivo en una especie de mamífero capaz de la respuesta inmune. Métodos para productos monoclonales, policlonales , anticuerpos recombinantes y sus fragmentos son conocidos por los expertos en la materia (Colligan et al, protocolos actualidades en en inmunología, Wiley Intersciences ; Kohler et al. 256:495 de la naturaleza-497 , 1975; Fago visualización de péptidos y proteínas: un manual de laboratorio, Kay b. b., j. j. & McCafferty de invierno, Eds, Academic Press, 1996) .

Por lo tanto, inmunotinción puede servir' de complemento a la interpretación morfológica ofrecidos por el patólogo. Anticuerpos contra biomarcadores específicos pueden ayudar en la interpretación diagnóstica de lesiones preneoplásicas y displásicas en la detección del cáncer cervical, incrementando la precisión de la anatomía patológica o diagnóstico basado en la citología.

Por lo tanto, en un protocolo de preferencia de la presente invención, es la inmunotinción simultánea de múltiples muestras cervicales que se realiza en el dispositivo multiceldas de la presente invención, utilizando anticuerpos comercialmente disponibles y usados (ejemplo 3f figuras 3A-3 G) . Los que entienden o sea los expertos de la técnica, saben que los antígenos blanco de los anticuerpos que se usan para el diagnóstico, pueden estar en diferentes localizaciones de la célula, es decir, núcleo, citoplasma o en la membrana, además pueden ayudar al patólogo en el diagnóstico que está basado en citología o histología por sí sola .

Esta incorporación nos lleva a las condiciones experimentales que se establecieron en el ejemplo 2, que son relativas a una mezcla de células cervicales normales simulando una muestra del paciente para la detección de células con cáncer cérvico-uterino, ya que las lesiones preneoplásicas, displásicas y cancerosas son raras en las muestras cervicales.

La mezcla de células se trata con etanol al 95% para garantizar que la célula se adhiera a la superficie del dispositivo multi-celdas durante el procedimiento, sin embargo otros protocolos conocidos en el estado de la técnica son llevados a cabo por la presente invención para garantizar los resultados.

En este protocolo específico, el dispositivo multiceldas permite la determinación simultánea de múltiples compuestos por un número constante de las células cervicales normales y un número creciente de las muestras de las células cancerosas. > En este ejemplo, la línea de células de cáncer de mama que se utilizó fue la BT474 , sin embargo, la presente invención abarca cualquier célula preneoplásica o en la línea neoplásica o células del tumor. Mezclas de las células, con diversas tasas de células con cáncer de y de células normales, son realizadas por triplicado para comprobar la reproducibilidad y tratamiento para la inmunotinción .

También se pueden preparar varias muestras del mismo paciente si se estudia con diferente anticuerpo y con diferentes patrones de tinción (ya sea nucleares, citoplasmática o de membrana) se utilizan para confirmar mejor el diagnóstico.

En el protocolo preferido de la presente invención, el anticuerpo principal que se utiliza es un anticuerpo monoclonal contra Her 2, que es una glicoproteína de membrana con actividad de tirosina-quinasa perteneciente a los receptores de factor de crecimiento epitelial sabido es que está sobre-expresado en algunos pacientes con cáncer de mama. Sin embargo, el método de la invención actual abarca los anticuerpos, definidos anteriormente y otros como (por ejemplo, el cultivo de células policlonales , monoclonal, sobrenadante, purificado o no, recombinante, etc.) . Y variante, contra cualquier antigeno en cualquier localización de la célula.

En los ejemplos que se detallan en el presente documento, el procedimiento de inmunotinción comprende el uso de una inmunoglobulina que es un anticuerpo anti ratón de bio-tinción que es usado como anticuerpo secundario seguido de estreptavidina ligado a una peroxidasa de rábano picante, seguido por último por la adición de un sustrato precipitante el DAB. Después de mostrar los núcleos de las células teñidos con hematoxilina los cuales se observan de color azul en el dispositivo multiceldas que se observa bajo el microscopio.

Otros procedimientos de inmunotinción, conocidos en el campo también se pueden realizar en el dispositivo multiceldas objeto de la presente invención.

Por ejemplo, protocolos que se basan en diferentes indicaciones y diferentes sistemas de detección, tales como fosfatasa-alcalina , biotina-estreptovidina, o fluoro-cromos , pueden también ser realizado con éxito dentro del ámbito de la aplicación de la presente invención. Por otra parte, mientras que células cervicales deben someterse a un pre-tratamiento de inactivación por una peroxidasa endógena, si se utiliza la tinción basada en la peroxidasa, el pre-tratamiento mencionado no es necesario cuando se utiliza sistema de imágenes basado en la fluorescencia, entonces el protocolo se modifica en consecuencia.

Las modificaciones alternativas conocidas por la experta en la materia son llevadas a cabo por la presente invención, tales como pero no limitado a lo siguiente: cualquier método para hacer antigenos que se unan más fácilmente a los anticuerpos también pueden utilizarse en la práctica de la invención, incluyendo el métodos de recuperación del antigeno, conocidos en la técnica, los protocolos alternativos de selección de sustrato y los métodos alternativos de tinción para bloquear biotina endógena o inespecifica vinculante (véase también) .

Acuerdo con el método de la presente invención y como se muestra en las figuras 3A-3 G, el dispositivo multi-celdas objeto de la presente invención, puede ser usado para discriminar unas pocas células de cáncer entre células normales en una población mixta, en una condición experimental simulando a una muestra cérvico-uterina para la detección de la prueba de Papanicolaou . De hecho las células del cáncer de mama se tiñe en marrón (DAB) por el anti-Her2, anticuerpo en un campo de las células cervicales escamosas, caracterizado por su forma poligonal y la Hematoxilina había teñida de núcleos azules.

Se destaca en el presente documento que, si bien el método de la presente invención es ejemplificado que comúnmente utiliza anticuerpos que son específicos de las células cancerosas, el uso de otros anticuerpos contra biomarcadores que son sobre-expresados o diferencialmente expresadas en las células con lesiones displásicas, preneoplásicas o células cervicales malignas, tales como anticuerpos contra pl6(INK4a), Ki-67, VPH, cualquier otra enfermedad infecciosa cérvico-uterina de cérvix-uterino, o los anticuerpos que reaccionan con células cérvicales en la enfermedad o en el estado normal, también es abarcado en la presente invención.

En conclusión, el método de la invención presente depende de un antigeno-anticuerpo objetivo la interacción para identificar células malignas en el espécimen de paciente. En la medida, el dispositivo y los métodos de la presente invención tiene utilidad y aplicación como para mejora el potencial del examen del Papanicolaou, y como un nuevo tamizaje cérvico-uterino de inmuno-citología de alto rendimiento .

La metodología de la Inmunotinción de las muestras de tejido cérvico-uterino mediante el formato célular tipo-ELISA. Otro método de la presente invención se refiere a un procedimiento de inmunotinción basado en una muestra de células humanas y un anticuerpo (o una combinación de ellos) en un formato de tipo de ELISA-multi-celdas .

Cuando la célula y el anticuerpo a la combinación de ellos que provienen de una suspensión es capaz de detectar displasia cervical, lesiones neoplásicas o preneoplásicas o sus modificaciones en una muestra de tejido cervical, el método de la presente invención tiene utilidad y aplicación en la detección de cáncer cervical y los programas nacionales de tamizaje.

Como se explicó anteriormente, dependiendo de la suspensión de células que se utiliza y el anticuerpo o se utiliza una combinación de anticuerpos, entonces, el método de la presente invención tiene aplicación de utilidad en la detección y el tamizaje de otras condiciones y enfermedades, más allá de las enfermedades ginecológicas, incluyendo cáncer de otros órganos.

En un protocolo preferente de la presente invención, el método de inmunotinción de la célula de la presente invención usando un formato de tipo de ELISA, se aplica para detectar las células cancerosas simultáneamente en múltiples muestras de tejido cérvico-uterino (ejemplo 4, cuadro 1) .

En la preferencia de este protocolo, el concepto de formato de dispositivo "multi-celdas" , que ha sido ampliamente descrito hasta ahora en la presente invención, se amplía para el tipo común de formato de ELISA (multi-celdas), tal como una placa de 96 celdas o su equivalente. Placas con un número diferente de celdas o pozos por placa pueden ser imaginados, incluyendo pero no limitándose a 6, 12, 24, 48, 96, placas de 384 celdas o pozos, lo que permite que sea rentable, fácil de usar y en pequeña escala al formato de alto rendimiento, ya que considerando este caso todos los procedimientos están comprendidos en la presente invención .

Además, se hace hincapié en este documento que, si bien el formato de 96 celdas o pozos podría ser el formato de alto rendimiento más común y fácil de usar, otras cantidades y tamaños pueden ser más compatibles con el numero de la cantidad requerida de células necesarias . para una detección cervical, como unas 300.000 células debe ser evaluados para prever un diagnóstico preciso. De hecho, se sabe que trabajadores calificados en la técnica para ajusfar bien el diámetro del formato del ensayo (por ejemplo, el número de células) al ámbito de aplicación del ensayo células-base correspondiente .

Mientras que una aplicación importante de la presente invención es el tamizaje de de alto rendimiento, la presente invención abarca también la aplicación de este ensayo de inmunotinción de una muestra de células proveniente de una versión diferente de suspensión, al igual que los ensayos de fluoximetria .

Tenga en cuenta que, mientras el dispositivo multiceldas de la presente invención descrita anteriormente implica una mezcla de células adherentes, el formato de tipo de ELISA-Multi-celdas , puede implicar una mezcla de células adherentes, asi como una mezcla de células en suspensión. Las células adherente hechas a través de diferentes métodos, incluyendo la fijación de alcohol o de secado con aire, pueden ser alojados en una variedad de placas de celdas o pozos, mientras que las células en suspensión preferentemente pueden tratarse en el fondo de la celda de la placa, y deben ser centrifugados en cada paso del procedimiento.

Tenga en cuenta que, como se describe más adelante, cuando se ocupan de las células provenientes de una suspensión, cada paso del procedimiento es seguido por un paso de centrifugación suave para garantizar que las células se adhieran a la parte inferior de la celda o pozo, como se detalla en el ejemplo .

El inmunotinción sigue los principios del ejemplo 3 (figuras 3A-3 G) , salvo por usando un número especifico de células de cáncer en la mezcla, reactividad de antigeno-anticuerpo puede ser cuantificado por lectura colorimétrica, en lugar de hacerlo por una lectura visual semicuantitativa basado en examen de microscopio.

La presente invención abarca cualquier modificación de una placa ELISA-tipo Multiceldas, relacionadas con el formato, ya sea el número, el tamaño y el material de soporte de la placa. Por otra parte comprendidos en la presente invención son modificaciones de apoyo que se estimen necesarias para ser compatibles con o bien para facilitar su lectura en el microscopio, para su manejo y manipulación, los lectores de inmunoanálisis , de manejo, de manipulación y cualquier otro instrumento o equipos que pueden ser asociadas a la utilización y aplicación de la presente invención ya sea para la manipulación, o para fines de medición cualitativa o cuantitativamente con fines de medición.

Por otra parte la invención presente . abarca cualquier modificación de la metodología y el dispositivo para poder desarrollar versiones para realizar los procedimientos manuales, procedimientos semiautomat izados y procedimientos totalmente automatizados. Los Procedimientos de automatización variarán en función de: La automatización del ensayo dependerá de si en el ensayo existen células adheridas o células suspendidas, y todas las modificaciones están comprendidas en la presente invención .

En este protocolo de la presente invención, se prefirió una cantidad constante de células cervicales y una muestra cérvico-uterina de paciente normal en (Thin Prep) se deposita en cada celda del dispositivo de tipo-ELISA multi-celda, formato que implica sembrar un número creciente de células de cáncer de mama de BT474, en un co-cultivo, y realizar un experimento simulando una muestra de paciente para la detección del CACU., tal como se describe en el ejemplo 2.

Las mezclas se preparan por triplicado para permitir la cuantificación .

Las células se tratan con H202 en para lograr una inactivación de la peroxidasa antes de teñir los anticuerpos, si es un método relacionado con el uso de la peroxidasa en el procedimiento de la tinción. A continuación, se lleva a cabo la inmunotincion con anticuerpos específicos.

El anticuerpo primario utilizados aquí con el propósito de este ejemplo es un anti-Her 2 (localizado en la membrana), seguido por anticuerpos secundarios conjugados con biotina y conjugado con peroxidasa streptavidine . Los complejos antígeno-anticuerpo se visualizan por la adición de un sustrato soluble, tal como, pero sin limitarse a tetra-metil-benzidine (TMB) . La Imunoreactividad está dirigida por la medición de la densidad óptica (OD) de la reacción colorimétrica a través de un lector de placa en la longitud de onda correspondiente.

Otros sistemas de inmunodetección son llevadas a cabo por la presente invención. Los resultados de este experimento figuran en la tabla 1 y nos muestran la inmunoreactividad, medida por la lectura, que aumenta directamente proporcional al número de células de cáncer en la celda revisada. El duplicado de las muestras se indicó para que el experimento se reproduzca.

El método de la presente invención ofrece algunas ventajas sobre la prueba de ELISA de tipo convencional. De hecho, en el procedimiento convencional de ELISA, los extractos de proteina de células son fijados por una capa en la placa de Multiceldas, en lugar de fijar las células intactas. Por lo tanto, los biomarcadores deben ser solubles para detectarse en un ensayo de ELISA. Por el contrario, si es soluble o no, no importa los biomarcadores se detectan en una célula intacta. La ventaja identificada anteriormente es particularmente importante, ya que tienen varias publicaciones que señalan la mala calidad de los extractos de proteínas derivadas de células cérvico-uterinas (Ding, 2008; Ge Y et otros, análisis proteómicos de alto grado que identifica células cervicales displásicas obtenido de las laminillas de la ThinPrep y el uso de láser para micro disección y fijarlo revisarlo con espectrometría de masas, J Proteome Res 6:4256-4268, 2007) .

El rendimiento pobre de los extractos de proteínas obtenidos de células cérvico-uterinos puede afectar la exactitud y reproducibilidad necesaria para un ensayo de ELISA convencional.

Es conocida en la técnica, que actualmente la detección visual en las muestras cérvico-uterinas presenta una significativa variabilidad en la observación entre diferentes observadores. En un estudio realizado anteriormente en la presente invención, es decir, la inmunotinción de las células en el dispositivo de formato multi-celdas, hemos demostrado que el uso de anticuerpos proporciona mayor precisión sobre la evaluación de la morfología celular por sí sola. En este proyecto específicamente, es decir, la inmunotinción de la célula utilizando un dispositivo con formato de tipo ELISA Multi-celda, se nos muestra con mayor facilidad que la inmunoreactividad puede ser cuantificada especialmente a través de una lectura colorimétrica y el ensayo es perfectamente reproducible .

En el contexto del tamizaje convencional de detección de enfermedad cérvico-uterina, donde se requieren significativos recursos humanos bien preparados y equipos, para lectura de colorimetría para la lectura de inmunotinción de células cérvico-uterinas es una nueva aplicación de utilidad de la presente invención.

Facilita la .evaluación de la muestra facilitando la lectura colorimétrica, ofreciendo eventualmente una alternativa a la evaluación del patólogo.

En conclusión, nos demuestran que las aplicaciones de la utilidad de la presente invención son: MANEJO SIMULTANEO DE VARIAS MUESTRAS INMUNOTINCIÓN QUE REPRESENTA UNA MEJORA SOBRE EL TAMIZAJE REALIZADO CON EL PAPANICOLAOU CONVENCIONAL PARA LA DETECCIÓN DE ENFERMEDADES CÉRVICO-UTERINAS, ASÍ COMO LA ACTUAL PRESENTACIÓN DE LA MUESTRA ThinPrep Además se proporcionan los kits para practicar los métodos de la invención.

EJEMPLOS Se utilizan las siguientes abreviaturas en todo. ddH20: AGUA doble bidestilada HR: hora; min: minutos; seg: segundos; rpm: rotación por minuto; RT: temperatura.

Ejemplo 1: La tinción de las muestras cérvico-uterinas con Hematoxilina con el dispositivo multi-células , se coloca una fracción de una muestra individual de thin PReP (i.e.250 µ 1 volumen , aproximadamente 50-100.000 células) se coloca en capas en una sola área circular (celda) del dispositivo multi-celdas . Por lo tanto pueden ser evaluadas simultáneamente múltiples muestras. El dispositivo ha sido previamente irradiado con rayos UV, lo cual nos permite colocar la muestra de las células. Sin embargo, se alternan los métodos para poder colocar más muestras de células dependiendo del material del que esté formado el dispositivo.

Las muestras son secada con aire RT o en una cámara a temperaturas de 37-40 C, a continuación se enjuagan las muestras con PBS. Lavando y quitando el exceso de desechos de las células, quedando asi las células listas para cualquier tinción citplógica.

En este ensayo especifico, se lleva a cabo tinción con hematoxilina. Para la tinción con hematoxilina en el dispositivo multi-celdas de pocilios se siguen los siguientes pasos : 1. - Enjuagarse con ddH20. 2. - Se cubre con unas gotas de solución débil de Mayer base hematoxilina para dispositivo multiceldas de 1-2 minutos se enjuaga dos veces en la llave con H20 o solución buffer (agua de la llave, o con solución de sodio o carbonato de litio para asegurar el pH alcalino) y se tiñe el núcleo de la célula de color azul y se enjuaga una vez con ddH20. Y se observa bajo el microscopio el dispositivo multiceldas utilizando diferentes amplificaciones (figuras 2A-2D) .

Ejemplo 2 : Co-cultivo y tinción hematoxilina de muestras de células cervicales de pacientes (a partir de una muestra proveniente de Thin Prep) y células de cáncer en las celdas del dispositivo multi-celdas, en un ensayo que nos imite la detección en el tamizaje Papanicolaou En primer lugar, se coloca un volumen de 250 µ? de una muestra individual de Thin Prep, previamente diagnosticada como normal, en capas en una sola área circular (celda) del dispositivo multiceldas. Las muestras son secadas con aire y luego se enjuagan con PBS y son teñidas con hematoxilina, como se describe en el ejemplo 1. La linea de células de cáncer de mama BT474 (ATCC # HTB-20) , las células epiteliales similares, es decir, de un carcinoma ductal de mama, y se utiliza en el experimento co-Cultivo que incluiría también células cérvico-uterinas de muestras de pacientes provenientes de una Thin Prep. Las líneas celulares fueron cultivadas en medio ATCC según una recomendación del proveedor, tripsinizado y que cuentan con un arreglo de procedimientos estándar.

Las células BT474 se depositan en cada área circular individuales (celda) del dispositivo multi-celdas y varias horas on a 37 ° C para esparcir y colocarlas en una estufa. Al día siguiente, las células cancerosas son fijadas con alcohol de 95 % y se tiñen con hematoxilina, como se describió anteriormente.

Resultados de la evaluación en la observación en el microscopio de las células de cáncer se observan alargadas, que han crecido entre grandes células poligonal escamosas células cérvico-uterinas , que se visualizan por sus núcleos teñidos de color azul. En este ejemplo, el cáncer y las células cérvico-uterinos normales se distinguen basándose en la morfología celular por sí sola. Estos resultados nos confirman que el co-cultivo de las células cérvico-uterinas normales y las células cancerosas se pueden utilizar como un modelo para realizar el examen de Papanicolaou .

Ejemplo 3: Inmunomarcación de muestra cérvico-uterina de pacientes realizada en el dispositivo multi-celdas usando anticuerpos monoclonales .

Este ejemplo describe cómo puede realizarse la inmunot inción en el dispositivo multi-celdas usando anticuerpos monoclonales disponibles comercialmente . En este ejemplo se demuestra la utilidad de inmunotinción como complemento de la evaluación microscópica de la morfología célular en el tamizaje de detección de enfermedad c.érvico-uterina .

Dado que en las muestras de tejido proveniente de Thin Prep las lesiones preneoplásicas , displásicas y cancerosas son raras, hemos recurrido a una condición experimental imitando una muestra de paciente para la detección del cáncer cérvico-uterino, es decir. Colocar una mezcla de las células cérvico-uterinas normales con las células de una linea célular con cáncer que se cultivan ON en co-cultivo, como está descrito en el ejemplo 2. En este modelo experimental, una cantidad constante de células cérvico-uterinas de paciente normal provenientes de una preparación de thin, diagnosticados previamente diagnosticadas (250 µ 1 volumen) se coloca en capas en cada área circular (celda) del dispositivo multi-celdas , se secan con aire en RT o en una cámara a temperaturas de 37-40 C a continuación, se enjuagan con PBS . Posteriormente, se agregan algunas células de cáncer (es decir, suficiente para ser visualizado en un campo con el fin de realizar el ejemplo) están en capas, por triplicado y cultivadas para su crecimiento ' a 37 0 C. Al día siguiente, las células son fijadas con etanol al 95%, sin embargo, en lugar de proceder a la tinción con hematoxilina como en el ejemplo 2 que es el ejemplo anterior, el dispositivo multi-celdas se prepara para el procedimiento de inmunotinción . En este ejemplo, se utilizaron células de cáncer de mama de la linea celular BT474 y fueron marcadas con anticuerpos monoclonales contra Her 2 (utilizando un volumen adecuado de 1 g/ml de la solución en PBE, suficiente para cubrir las células) . Tenga en cuenta que las células deben ser tratadas con H202, hasta inactivar la peroxidasa endógena, como se describe a detalle en el ejemplo 4 a continuación, si una peroxidasa base es utilizada en el sistema de detección. El anticuerpo primario se incuba durante 1 hora a 37 0 C. A continuación, para su detección, un anticuerpo IgG anti-ratón biotinilado es usado como anticuerpo secundario (laboratorio de Jackson) diluido a 1 g/ml en PBE se agrega a cada área del dispositivo multi-celdas y se incuban durante 1 hora a 37 0 C. El anticuerpo secundario es seguido por estreptavidina vinculada a una peroxidasa de rábano picante (Jackson Lab) diluido a 1 yg/ml en PBE sin azida y nuevamente se incuban durante 1 hora a 37 ° C.

La reacción es desarrollada por la incorporación del sustrato recién preparado de 3-3 ' diaminobenzidina de tetrahidroclorito (DAB a 5 mg/ml) . seguido de incubación en RT . Desarrollando un color que es checado bajo la óptica del microscopio y la reacción se detuvo con PBS que contiene azida de 0,05%. El conteo de la tinción con Hematoxilina se realiza contando los núcleos de las células teñidos con azul, y el dispositivo multi-celdas se observa bajo el microscopio.

En los controles necesarios para realizar este experimento se incluyen: a) Únicamente células cérvico-uterinas normales. b) Únicamente células de cáncer de mama c) una mezcla de células cérvico-uterinas normales y células de cáncer de mama sin procedimiento de inmunotinción . d) las células cancerosas solas marcadas o teñido con anticuerpos anti-Her2.

Figura 3A-3 G Estas figuras nos muestran como la inmunotinción nos permite una identificación especifica de las pocas células cancerosas que existen en un una muestra que tiene de fondo células cérvico-uterinas normales, en un protocolo experimental simulando una muestra para detección de enfermedad cérvico-uterina en el tamizaje a través de la Prueba de Papanicolaou, además de la observación de las diferencias de morfología celular por sí sola.

Ejemplo : La inmuno-marcación de la muestra cérvico-uterina del paciente en (Thin Prep) y las células de cáncer en la solución, utilizando el formato tipo-ELISA y los anticuerpos monoclonales utilizados comúnmente (figura 5).

En este ejemplo, el concepto del formato del dispositivo multiceldas se extiende a los formatos tipo-ELISA comúnmente conocidos, tal como una placa de fondo plano de 96 celdas o pocilios o su equivalente. De hecho, presentando diferentes placas con diferentes cantidades de celdas o pozos pueden ser previstos, como lo considere adecuado, es decir, 6, 12, 24, 48, 96, o bien placas de 384 celdas o pozas, permitiendo en el ejemple de pequeña escala su alto rendimiento, es un formato rentable de fácil uso, y se acomoda a las necesidades'. Además, se destaca en el presente documento que, si bien podría ser el formato de 96 celdas o pocilios, es el formato de alto rendimiento más común y fácil de usar. Otras cantidades y tamaños de las celdas o pozos pueden ser más compatibles con el número requerido de células necesarias para una detección de enfermedad cérvico-uterina, como hasta 300 . 000 células que tenga que ser evaluado para prever un diagnóstico preciso.

Por otra parte, mientras que el dispositivo de ensayo consiste en una mezcla de células que se adhieren bien, la placa con el formato con 96 celdas o pozos puede incluir una mezcla de células adherentes, asi como una mezcla de células en suspensión. -Tenga en cuenta que cuando se trabaja con células en suspensión, cada paso del procedimiento es seguido por un paso de centrifugación suave para garantizar que las células se colectan en el fondo de la celda o pozo.

Por último, en este ejemplo el inmunotinción sigue los principios del ejemplo 3 (figuras 3A-3 G) , excepto que pueda ser utilizado un número especifico de células de cáncer en la mezcla, la reactividad del complejo antigeno-anticuerpo puede ser cuantificada por medio de lectura colorimétrica, en lugar de hacerlo por un lectura visual semicuantitativa basada en el examen microscópico.

En este experimento, se utiliza una mezcla de células cérvico-uterinas normales y células de cáncer de mama, como se describió anteriormente en los ejemplos 2 y 3 , (figuras 3A-3 G) , en este protocolo experimental simulamos una muestra de de células cérvico-uterinas para la detección del cáncer cérvico-uterino . Y el procedimiento es el siguiente : En primer lugar, ponemos una cantidad constante de células cérvico-uterinas de paciente normal que provienen de una preparación de thin normal previamente diagnosticados ( 250 µ 1 volumen; aproximadamente 50- 100 . 000 células) se deposita en cada celda o pocilio de una placa de ulti-celdas, es decir, una placa con 96 celdas o pozos en aras de este ejemplo.

Las células que provienen de la preparación (Thin-Prep) , deben ser tratadas para inactivar peroxidasa endógena. Las placas que contiene muestras de células cérvico-uterinas se tratan con un volumen adecuado de solución de peróxido de hidrógeno de 1 % diluido en PBS (H 2 0 2 ; 100 a 300 SI / bien según el tamaño del aro, celda, pocilio) durante 30 minutos en RT con suave Agitación suave 400 rpm. Después de la inactivación de la peroxidasa endógena, las células se enjuagan tres veces con PBS que contiene 0.3 Tween 20 (PBST) , se centrifugan y se separa el sobrenadante.

En este punto, las células son secadas con aire seco en RT y, después se vuelven a enjuagar con PBS tal y como se describió anteriormente en los Ejemplos 1-3, posteriormente se tratan como células adherentes. Por otra parte son centrifugadas suavemente entre cada paso, si se da tratamiento como si fueran células en suspensión. Se colocan un número creciente de células de cáncer de mama de la linea celular BT474, las células de cáncer (cáncer de 200 a 1200 células / bien) es en capas, por duplicado y se cultiva a 37 0 C.

Al día siguiente, las células son fijadas en alcohol con 95% de etanol, si las muestras de células cérvico-uterinas ya han sido anteriormente secadas con aire seco, o si ya habían sido previamente centrifugadas. En este ejemplo también puede ser ejecutado con éxito, por capas con el mismo volumen de células cérvico-uterinas y con un número determinado de células con cáncer, seguidas por un tratamiento de inactivación de peroxidasa endógena. A continuación, las células son secadas con aire seco y lavadas con PBS, o simplemente se centrifuga, dependiendo del procedimiento (ya sea las células fijadas, o bien , las células que provienen de una preparación en suspensión) depende del que haya sido elegido .

Para bloquear la Biotina endógena de las células, estas son incubadas durante 30 minutos en RT con una solución de estreptavidina en PBE sin azida (10 SG/ml) , seguido de un enjuague de PBST. A continuación, las células son incubadas aún más con una solución de biotina (200 SG/ml) en PBE (PBS con 1% de BSA, 1 mM EDTA, NaN3 de 1,5 mM, pH7.4 ) y secadas. Las células se enjuaga tres veces con PBST, se centrifuga y se separa el sobrenadante.

Después de la mezcla de capas de células y la realización de la inactivación de la peroxidasa endógena se bloquea también la biotina, finalmente se realiza la inmunotinción en la placa.

Todos los pasos de incubación tienen una duración de 30 min y se realizan en RT a menos de 400 rpm, y asi son sacudidas por el resto del procedimiento.

Las placas son incubados de forma relevante con anticuerpos primarios de anti-Her-2 (50 Sl/aro, celda o pocilio y se puede utilizar una placa con 96 aros, celdas, o pocitos, o los que sean necesarios para incluir todas las células), se agrega una solución con una dilución apropiada en el búfer de PBE durante 30 minutos, en RT. Las células se lavan tres veces con PBST para quitar los anticuerpos primarios que no se fijaron (específicamente, los aros, celdas o pozitos son llenados con búfer, y las placas son centrifugadas durante 10 minutos a 1500 rpm y el sobrenadante se separa) .

Un anticuerpo secundario se conjuga con biotina (con el propósito de la invención de una biotina conjugada con un anticuerpo IgG anti ratón) , a continuación, se le agrega a cada aro, celda o pocito (50 SI de una solución de lSg/ml del anticuerpo secundario biotinilado en búfer PBE) y las células son incubadas como ya se describió con anterioridad (durante 30 min, en RT, a 400 rpm) . Las células se lavan tres veces con PSBT para eliminar el exceso de anticuerpo secundario como se describe anteriormente. Las células se giran hacia abajo durante 10 minutos a 1500 rpm, y cuidadosamente se aspira el sobrenadante, preferentemente con vacío .

Después se agrega a cada aro, celda o pocito un conjugado de peroxidasa con estreptavidina (50 SI un lSg/ml dilución en búfer PGBE sin azida) y las células son incubadas 30 min en RT y agitadas a 400 rpm agitación, como se describió anteriormente. Después de un lavado con PSBT y dos lavados con PBS, los complejos antígeno-anticuerpo se visualizan mediante la adición de una solución de de 50S1 de sustrato de TMB a cada uno de los aros, celdas o pocitos, después se incubación de 10-40 min en RT y se agitan a 400 rpm. Dentro de los 10 minutos siguientes aparecerá al interior un color azul con intensidad variable que dependerá de la cantidad de células por aro, celda o pocito y la concentración del antigeno. La reacción se detiene llenando cada aro, celda o pocito con H2S04, pasando la suspensión celular a un color amarillo, pudiéndose leer la inmunoreactividad de la placa en un lector colorimétrico de placas en 450 nm.

Los ejemplos presentados anteriormente simplemente pretenden ilustrar las diversas utilidades y aplicaciones de este invento. Por lo tanto se entiende que son posibles numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención a la luz de las enseñanzas anteriores y, por lo tanto, en el ámbito del anexo de reclamaciones, la presente invención puede ser practicada en contra de lo que particularmente se está publicando.

Todas las patentes y publicaciones que se incorporan en el presente documento para referencia en la misma medida como si cada publicación individual estuviera indicando específicamente e individualmente para incorporarse por referencia. Debe de darse por entendido que, a pesar de que la presente invención ha sido específicamente publicada o revelada por ejemplos específicos y escogidos incluyendo las funciones opcionales.

Las modificaciones y las variaciones de los conceptos divulgados en el presente documento se deberá recurrir por los expertos en la técnica ya que tales modificaciones y variaciones deberán considerase incluidas dentro del ámbito de este invento.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un método y dispositivo para facilitar el análisis simultáneo de varias muestras de material biológico humano para la detección, manejo o para los programas nacionales de detección de la enfermedad, que están contenidas en cada aro, celda o pocito, mediante el cual se analizan las células, de las muestras que pueden estar fijas o tratadas en solución, a través de la sola tinción citológica o bien por la tinción ' por medio de inmunohistoquímica, utilizando un anticuerpo o una combinación de ellos, a través de la medición cuantitativa o- semicuantitativa de una evaluación visual, y donde dicha metodología y dispositivo pueden ser practicadas en forma manual, semiautomática o completamente automatizada.

2. Un dispositivo para facilitar el análisis simultaneo de varios aros, celdas o pocitos que contienen las muestras de un material biológico humano para la detección, manejo o bien programas nacionales de detección.

3. El dispositivo según la reivindicación 2, caracterizado porque las muestras de material biológico humano en el que las células son fijadas en una preparación sólida .

4. El dispositivo según la reivindicación 3, caracterizado porque las células son teñidas con tinción citológica.

5. El dispositivo según la reivindicación 4, caracterizado porque los especímenes biológicos comprendan células cérvico-uterinas tratadas con Tinción de Papanicolau para la detección del cáncer cérvico-uterino.

6. El dispositivo según la reivindicación 2, caracterizado porque las modificaciones para automatizar la metodología y los procedimientos utilizando dicho dispositivo .

7. Un método de inmunohistoquimica que contiene una célula de un ser humano que proviene de una muestra que contiene material biológico que se analiza con un anticuerpo o combinación de anticuerpos y el dispositivo según la reivindicación 3.

8. Un método de inmunohistoquimica que contiene una célula que proviene de una muestra biológica se analiza con un anticuerpo o combinación de anticuerpos y la reacción antígeno-anticuerpo se mide en solución.

9. El método de la reivindicación 7 donde el espécimen biológico es una muestra cérvico-uterina .

10. El método de la reivindicación 8 donde el espécimen biológico es una muestra cérvico-uterina.

11. El método de la reivindicación 9, donde se lleva a cabo el método como complemento de los programas nacionales de tamizaje de Papanicolaou convencional o sea con tinción citológica para la detección del cáncer cérvico-uterino.

12. El método de la reivindicación 10 El método de la reivindicación donde se lleva a cabo el método como un complemento de tinción citológica del Papanicolaou convencional para detección del cáncer cérvico-uterino .

13. Un ki. para practicar los métodos de las reivindicaciones 12.