MX2013009781A

MX2013009781A - Proteinas monovalentes que se unen a antigenos.

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Publication number: MX2013009781A
Application number: MX2013009781A
Authority: MX
Inventors: Christian Klein; Birgit Bossenmaier; Hubert Kettenberger; Klaus-Peter Keunkele; Joerg Thomas Regula; Wolfgang Schaefer; Manfred Schwaiger; Claudio Sustmann
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 2011-02-28
Filing date: 2012-02-24
Publication date: 2013-09-26
Also published as: CN103403025A; KR101572338B1; KR20130135896A; US10611825B2; US20120237507A1; BR112013020338A2; WO2012116927A1; CN103403025B; AR085403A1; CA2824824A1; US20180037633A1; JP2014509199A; JP5768147B2; MX342034B; EP2681240B1; EP2681240A1; RU2013141078A

Abstract

La presente invención se refiere a proteínas monovalentes que se unen a antígenos con un intercambio de dominios CH1-CL, a métodos para su producción, a composiciones farmacéuticas que contienen tales anticuerpos y a usos de los mismos.

Description

PROTEINAS MONOVALENTES QUE SE UNEN A ANTIGENOS Campo de la Invención La presente invención se refiere a proteínas monovalentes que se unen a antígenos con un intercambio de dominios CH1-CL, a métodos para su producción, a composiciones farmacéuticas que contienen tales anticuerpos y a usos de los mismos.

Antecedentes de la Invención En las dos últimas décadas se han desarrollado y evaluado varios derivados de anticuerpo de ingeniería, ya sea mono- o multiespecíficos , ya sea mono- o multivalentes (véase p.ej. Holliger, P. y col., Nature Biotech. 23, 1126-1136, 2005; Fischer, N. y Léger, 0., Pathobiology 74, 3-14, 2007).

Dado que ciertos antígenos, p.ej. los de los anticuerpos monovalentes de c-Met, tienen diferentes propiedades, por ejemplo la pérdida de la función agonista o la internalización reducida del receptor después de la unión con el anticuerpo con respecto a sus correspondientes formas bivalentes, constituyen por lo tanto formatos atractivos para el uso terapéutico, p.ej. en el documento O 2005/063816 se describen fragmentos monovalentes de anticuerpo como agentes terapéuticos .

En US 2004/0033561 se describe un método para la generación de anticuerpos monovalentes basado en la co- Ref. 242410 expresión de una cadena de anticuerpo VH-CH1-CH2-CH3 con una cadena de anticuerpo VL-CL-CH2-CH3 ; sin embargo, un inconveniente de este método es la formación de un homodímero inactivo de unión de las cadenas VL-CL-CH2-CH3 , que se representa en la Figura 2. Debido a que tienen un peso molecular similar, estos productos secundarios homodímeros son difíciles de separar.

En WO 2007/048037 se describen también anticuerpos monovalentes basados en la co-expresión de una cadena de anticuerpo VH-CH1-CH2-CH3 con una cadena de anticuerpo VL-CL-CH2-CH3, pero que tienen un resto marcador unido a la cadena pesada para facilitar la purificación del heterodímero del producto secundario homodímero, que es difícil de separar.

En WO 2009/089004 se describe otra posibilidad de generar un anticuerpo heterodímero monovalente utilizando efectos electrostáticos de orientación.

En WO 2010/145792 se describen anticuerpos tetravalentes biespecífieos , en los que se reducen los productos secundarios mal encajados de peso similar, obteniéndose rendimientos elevados del anticuerpo biespecífico deseado.

Breve Descripción de la Invención La invención se refiere a una proteína monovalente que se une a un antígeno, que consta de: a) una cadena pesada modificada de un anticuerpo - - que se une específicamente a un antígeno, en la que dominio VH se ha reemplazado por el dominio VL de tal anticuerpo; y b) una cadena pesada modificada de tal anticuerpo, en la que el dominio CH1 se ha reemplazado por el dominio CL de tal anticuerpo.

En una modalidad de la invención, la proteína monovalente que se une al antígeno según la invención está caracterizada porque: el dominio CH3 de la cadena pesada modificada del anticuerpo de a) y el dominio CH3 de la cadena pesada modificada del anticuerpo de b) se une a la interfase formada por una interfase original entre los dominios CH3 del anticuerpo; tal interfase se altera para favorecer la formación de la proteína monovalente que se une al antígeno, tal alteración está caracterizada porque: i) se altera el dominio CH3 de una cadena pesada, de modo que dentro de la interfase original, el dominio CH3 de una cadena pesada que se une la interfase original del dominio CH3 de la otra cadena pesada dentro de la proteína monovalente que se une al antígeno se reemplaza un resto aminoácido por un resto aminoácido que tiene un mayor volumen de cadena lateral, con lo cual se genera una protuberancia dentro de la interfase del dominio CH3 de una cadena pesada, que puede posicionarse dentro de una cavidad de la interfase del dominio CH3 de la otra cadena pesada y ii) se altera el dominio CH3 de la otra cadena pesada, de modo que dentro de la interfase original del segundo dominio CH3 que se une a la interfase original del primer dominio CH3 de la proteína monovalente que se une al antígeno se reemplaza un resto aminoácido por un resto aminoácido que tiene un menor volumen de cadena lateral, con lo cual se genera una cavidad dentro de la interfase del segundo dominio CH3 , dentro de la cual puede alojarse una protuberancia de la interfase del primer dominio CH3.

En una modalidad de la invención, esta proteína monovalente que se une al antígeno según la invención es caracterizada porque tal resto aminoácido que tiene un mayor volumen de cadenas laterales se elige entre el grupo formado por la arginina (R) , fenilalanina (F) , tirosina (Y) , triptófano (W) y tal resto aminoácido que tiene un volumen menor de cadena lateral se elige entre el grupo formado por alanina (A) , serina (S) , treonina (T) , valina (V) .

En una modalidad de la invención, esta proteína monovalente que se une al antígeno según la invención está caracterizada demás porque: los dos dominios CH3 se han alterado con la introducción de la cisteína (C) como aminoácido en las posiciones correspondientes de cada dominio CH3, de modo que pueda formarse un puente disulfuro entre ambos dominios CH3.

En una modalidad, la proteína monovalente que se une al antígeno según la invención está caracterizada porque es del isotipo IgG humano.

En una modalidad, la proteína monovalente que se une al antígeno según la invención está caracterizada porque contiene a) una cadena pesada modificada que contiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1; y b) una cadena pesada modificada que contiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2; o a) una cadena pesada modificada que contiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 3; y b) una cadena pesada modificada que contiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 4; o a) una cadena pesada modificada que contiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 5; y b) una cadena pesada modificada que contiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 6 ; o a) una cadena pesada modificada que contiene la - - secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 7; y b) una cadena pesada modificada que contiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 8; o a) una cadena pesada modificada que contiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 9; y b) una cadena pesada modificada que contiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 10; o a) una cadena pesada modificada que contiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 11; y b) una cadena pesada modificada que contiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 12.

En un aspecto de la invención, la proteína monovalente que se une al antígeno según la invención está caracterizada porque las cadenas pesadas modificadas de a) y b) son del isotipo IgGl y la proteína que se une al antígeno está afucosilada con una cantidad de fucosa del 80% o menos (con preferencia del 65% al 5%) dentro de la cantidad total de oligosacáridos (azúcares) de Asn297.

La invención se refiere además a un método para obtener una proteína monovalente que se una a un antígeno según la invención, que consta de los pasos siguientes: a) transformar una célula hospedera con vectores que contengan moléculas de ácido nucleico que codifiquen a una proteína monovalente que se une a un antígeno según la invención, b) cultivar la célula hospedera en condiciones que permitan sintetizar tal proteína monovalente que se une a la molécula de antígeno; y c) recuperar tal proteína monovalente que se une a la molécula de antígeno de tal cultivo.

La invención se refiere además a un ácido nucleico que codifica a la proteína monovalente, que se une al antígeno según la invención.

La invención se refiere además- a vectores que contienen un ácido nucleico que codifica a la proteína monovalente que se une al antígeno según la invención.

La invención se refiere además a una célula hospedera, que contiene tales vectores.

La invención se refiere además a una composición, con preferencia una composición farmacéutica o de diagnóstico que contiene una proteína monovalente, que se une a un antígeno según la invención.

La invención se refiere además a una composición farmacéutica que contiene una proteína monovalente, que se une a un antígeno según la invención y por lo menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

La invención se refiere además a un método para el tratamiento de un paciente que necesite la terapia, caracterizado por administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína monovalente, que se una a un antígeno según la invención.

Las proteínas que se unen a antígenos según la invención se basan en el principio de una cadena VL-CH1-CH2-CH3 y VH-CL-CH2-CH3 solamente forma heterodímeros y no puede formar un producto secundario homodímero difícil de separar, de estructura y peso molecular similares. El efecto de esta modificación no consiste fundamentalmente en la reducción de productos secundarios, sino en que se forme un solo producto secundario que se transforme de producto secundario homodímero de tamaño similar en un tetrámero de peso molecular elevado (Figura 1C) . Después puede separarse fácilmente este tetrámero de peso molecular elevado por SEC o por otras técnicas de separación de pesos moleculares (MW, por sus siglas en inglés) .

El producto secundario dímero formado (Figura 1C) puede separarse fácilmente gracias a las diferencias de peso molecular (el peso molecular es aproximadamente el doble) y de estructura. Por consiguiente es posible la purificación sin introducir más modificaciones (p.ej. introducción de marcadores genéticos) .

Se ha encontrado además que las proteínas monovalentes que se unen a antígenos según la invención tienen características valiosas, por ejemplo las actividades biológicas o farmacológicas (p.ej. la ADCC, o actividad biológica antagonista así como la pérdida de actividades antagonistas). Pueden utilizarse p.ej. para el tratamiento de enfermedades, por ejemplo el cáncer. Las proteínas monovalentes que se unen a antígenos tienen además propiedades farmacocinéticas muy valiosas (p.ej. la vida media (denominada tl/2) o la AUC) .

Breve Descripción de las Figuras Figura 1A. Esquema de la proteína monovalente que se une al antígeno según la invención con intercambio de dominios CH1-CL en base a las cadenas VL-CH1-CH2-CH3 y VH-CL-CH2-CH3 (abreviado por MoAb) . Figura IB. Esquema de un MoAb según .la invención que incluye las hélices super-enrrolladas (knobs -into-holes) en los dominios CH3. Fig. 1C . Esquema de la proteína bivalente dímera que se une al antígeno (MoAb dímero que se forma como producto · secundario, que puede separarse fácilmente por tener una estructura y un peso molecular diferentes) .

Figuras 2A-2B. Esquema de Figura 2A, un anticuerpo monovalente de las cadenas VL-CL-CH2 -CH3 y de VH-CH1 -CH2 -CH3 (descrito p.ej. en US 2004/0033561) y Figura 2B, el producto secundario homodímero, de las cadenas VL-CL-CH2 -CH3 , inactivo para la unión, difícil de separar (descrito p.ej. en O 2007/048037) .

Figuras 3A-3B. Caracterización bioquímica del MoAb - - c-Met (c-Met 5D5 MoAb ("wt")). Figura 3A. La proteína que se une al antígeno, purificada de la proteína, se separa en una columna Superdex 200 26/60. Los picos individuales corresponden al MoAb (3) , MoAb dímero (2) y una fracción de agregado (1) . Figura 3B. Las fracciones de los picos (1, 2, 3) se reúnen y se someten a SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras. Los geles de poliacrilamida se tiñen con colorante azul de Coomassie.

Figura 4A-4C. Caracterización bioquímica de los MoAb IGFIR monovalentes (IGFIR AK18 MoAb ("wt")). Figura 4A. La proteína de fijación al antígeno, purificada de la proteína A, se separa en una columna Superdex 200 26/60. Los picos individuales corresponden al MoAb (2) y MoAb dímero (1) . Figura 4B. Se reúnen las fracciones de los picos (1,2) se someten a SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras. Los geles de poliacrilamida se tiñen con colorante azul de Coomassie. Figura 4C. Se investiga el peso molecular de las fracciones de los picos 1 y 2 por SEC-MALLS. Se identifica el pico 2 como proteína monovalente MoAb IGFIR que se une al antígeno.

Figuras 5A-5B. Caracterización bioquímica del MoAb Her3 (Her3 205 MoAb ("wt")). Figura 5A. El anticuerpo purificado de la proteína A se separa en una columna Superdex 200 26/60. Los picos individuales corresponden al MoAb (3), MoAb dímero (2) y una fracción de agregado (1) . Figura 5B . Se - reúnen las fracciones de los picos (1, 2, 3) y se someten a SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras . Los geles de poliacrilamida se tiñen con colorante azul de Coomassie.

Figuras 6A-6B. Caracterización bioquímica de MoAb Her3 con mutaciones KiH (Her3 205 MoAb KiH) . Figura 6A. La proteína que se une al antígeno, purificada de la proteína A se separa en una columna Superdex 200 26/60. Figura 6B. Se reúnen las fracciones de pico y se someten a SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras. Los geles de poliacrilamida se tiñen con colorante azul de Coomassie.

Figuras 7A-7B. Caracterización bioquímica de MoAb IGF1R con mutaciones KiH (IGF1R AK18 MoAb KiH) . Figura 7A. Se separa el anticuerpo purificado de la proteína A en una columna Superdex 200 26/60. Los picos individuales corresponden al MoAb (2) y MoAb dímero (1) . Figura 7B. Se reúnen las fracciones de pico (1,2) y se someten a SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras. Los geles de poliacrilamida se tiñen con colorante azul de Coomassie.

Figuras 8A-8B. Caracterización bioquímica de MoAb c-Met con mutaciones KiH (c-Met 5D5 MoAb KiH) . Figura 8A. Se separa el anticuerpo purificado de la proteína A en una columna Superdex 200 26/60. Figura 8B. Se reúnen las fracciones de pico y se someten a SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras. Los geles de poliacrilamida se tiñen con colorante azul de Coomassie.

Figura 9. Ensayo de fosforilación del receptor de c-Met en células A549. Las células A549 se estimulan con HGF en ausencia o presencia de antígenos que se unen al c-Met o de c-Met 5D5 MoAb ("wt")) . Los lisados celulares totales se someten a análisis de "immunoblot" . El asterisco indica una banda fosfo-c-Met entre dos bandas inespecíficas .

Figura 10. Unión celular de MoAb c-Met (c-Met 5D5 MoAb ("wt"))) a las células A549 con análisis citométrico de flujo. Se incuban las células A549 con concentraciones diluidas en serie de los anticuerpos indicados. Los anticuerpos fijados se visualizan con un anticuerpo asociado al fluoroforo secundarios que se une al Fe.

Figura 11. Representación esquemática del ensayo de resonancia del plasmón de superficie aplicada al análisis de la afinidad de fijación de la proteína monovalente IGF1R AK18 MoAb ("wt") que se une al antígeno.

Figura 12. Unión celular del MoAb IGF- IR (IGF1R AK18 MoAb ("wt")) a las células A549 por un análisis citométrico de flujo. Se incuban las células A549 con concentraciones diluidas en serie de los anticuerpos indicados. Se visualizan los anticuerpos fijados con un anticuerpo asociado al fluoroforo secundarios que se une al Fe.

Figura 13. Ensayos ADCC con IGF1R Mab original no obtenido por glicoingeniería (no-ge) y con IGF1R Mab original obtenido por glicoingeniería (ge) y proteína monovalente no obtenida por glicoingeniería IGFIR MoAb (IGFIR AK18 MoAb ("wt")) que se une al antígeno. Se incuban las células mononucleadas de la sangre periférica (PBMC) derivadas de un donante con células de cáncer de próstata (DU145) en presencia de IGFIR Mab no-ge original (= 1) , IGFIR Mab ge original (= 2) y proteína monovalente no-ge que se une al antígeno IGFIR MoAb (= 3) .

Figura 14. Se evalúa la internalización del IGF- IR después de la incubación con el anticuerpo IGF- IR IgGl original y la proteína monovalente IGFIR MoAb (IGFIR AK18 MoAb ("wt")) que se une al antígeno, los datos indican que la internalización del IGF- IR se reduce en términos de potencia e internalización absoluta cuando está unida la proteína monovalente que se une al antígeno IGFIR MoAb (IGFIR AK18 MoAb ("wt") ) .

Figura 15. Se evalúa la autofosforilación inducida por la IGF-1 del IGF-IR después de la incubación con el anticuerpo IGF- IR IgGl y la proteína monovalente IGFIR MoAb (IGFIR AK18 MoAb ("wt")) que se une al antígeno, los datos indican que la autofosforilación del IGF- IR inducida por la IGF-1 se reduce en términos de potencia cuando está unida la proteína monovalente que se une al antígeno IGFIR MoAb (IGFIR AK18 MoAb ("wt")) .

Figura 16. Se evalúa la tendencia a la agregación de la proteína monovalente IGFIR MoAb (IGFIR AK18 MoAb ("wt")) que se une al antígeno, con un ensayo DLS a lo largo del tiempo. Durante un período de cinco días no se detecta un incremento medible del radio hidrodinámico (Rh) de la fracción monómera aislada (ver Figura 4) .

Figura 17. Espectro EM-ESI de la proteína monovalente IGFIR MoAb (IGFIR AK18 MoAb ("wt")) que se une al antígeno, después de la desglicosilación y en condiciones no reductoras .

Figura 18. Espectro ESI-MS de la proteína monovalente IGFIR MoAb (IGFIR AK18 MoAb ("wt")) que se une al antígeno, después de la desglicosilación y reducción.

Descripción del listado de secuencias SEC ID NO: 1 C-Met 5D5 MoAb ("Wt") cadena pesada modificada a) VL- CH1-CH2 -CH3 SEC ID NO: 2 c-Met 5D5 MoAb ("wt") cadena pesada modificada b) VH- CL-CH2-CH3 SEC ID NO: 3 IGFIR AK18 MoAb ("wt") cadena pesada modificada a) VL- CH1-CH2-CH3 SEC ID NO: 4 IGFIR AK18 MoAb ("wt") cadena pesada modificada b) VH- CL-CH2 -CH3 SEC ID NO: 5 Her3 205 MoAb ("wt" ) - cadena pesada modificada a) VL-CH1-CH2 -CH3 SEC ID NO: 6 Her3 205 MoAb ("wt") - cadena pesada modificada b) VH-CL-CH2 -CH3 SEC ID NO: 7 c- et 5D5 MoAb KiH cadena pesada modificada a) VL-CH1-CH2 -CH3 pomo (botón) T366W, S354C SEC ID NO: 8 c-Met 5D5 MoAb KiH cadena pesada modificada b) VH-CL-CH2 -CH3 agujero (ojal) L368A, Y407V, T366S, Y349C SEC ID NO: 9 IGF1R AK18 MoAb KiH cadena pesada modificada a) VL-CH1-CH2 -CH3 pomo (knob) T366W, S354C SEC ID NO: 10 IGF1R AK18 MoAb KiH cadena pesada modificada b) VH-CL-CH2 -CH3 agujero (ojal) L368A, Y407V, T366S, Y349C SEC ID NO: 11 Her3 205 MoAb KiH cadena pesada modificada a) VL-CH1-CH2-CH3 pomo (knob) T366 , S354C SEC ID NO: 12 Her3 205 MoAb KiH cadena pesada modificada b) VH-CL-CH2 -CH3 agujero (ojal) L368A, Y407V, T366S, Y349C Descripción Detallada de la Invención La invención se refiere a una proteína monovalente que se une a un antígeno que consta de: a) una cadena pesada modificada de un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno, en la que el dominio VH se ha reemplazado por el dominio VL de tal anticuerpo; y b) una cadena pesada modificada de tal anticuerpo, en la que el dominio CH1 se ha reemplazado por el dominio CL de tal anticuerpo.

En modalidad, de la invención, los dominios CH3 de tal proteína monovalente que se une al antígeno según la invención pueden alterarse por la tecnología de las hélices super-enrrolladas (KiH, por sus siglas en inglés) que se ha descrito con detalle en diversas publicaciones, p.ej. en WO 96/027011, Ridgway, J.B., Protein Eng. 9, 617-621, 1996; Merchant, A.M. y col., Nat . Biotech. 16, 677-681, 1998. En este método se alteran las superficies de interacción de dos dominios CH3 para incrementar la heterodimerización de las dos cadenas pesadas que contienen estos dos dominios CH3. Cada uno de los dos dominios CH3 (de las dos cadenas pesadas) puede ser el "botón", mientras que el otro es el "ojal". El efecto de esta modificación es que se reduce significativamente el producto secundario tetrámero de peso molecular elevado.

La introducción de un puente disulfuro también estabiliza a los heterodímeros (Merchant, A.M. y col., Nature Biotech. 16, 677-681, 1998; Atwell, S. y col., J. Mol. Biol . 270, 26-35, 1997) y aumenta el rendimiento.

Por consiguiente, en un aspecto de la invención tal proteína monovalente que se une al antígeno está caracterizada además porque: el dominio CH3 de la cadena pesada del anticuerpo de. longitud completa de a) y el dominio CH3 de la cadena pesada modificada del anticuerpo de longitud completa de b) se ponen en contacto en cada caso con la interfase, que contiene una interfase original entre los dominios CH3 del anticuerpo; en el que tal interfase se ha alterado para fomentar la formación de la proteína monovalente que se une al antígeno, tal alteración está caracterizada porque: i) se altera el dominio CH3 de una cadena pesada, de modo que dentro de la interfase original el dominio CH3 de una cadena pesada que se pone en contacto con la interfase original del dominio CH3 de la otra cadena pesada dentro de la proteína monovalente que se une al antígeno, se reemplaza un resto aminoácido por un resto aminoácido que tiene un mayor volumen de cadena lateral, con lo cual se genera una protuberancia dentro de la interfase del dominio CH3 de una cadena pesada, que puede alojarse dentro de la cavidad de la interfase del dominio CH3 de la otra cadena pesada y ii) se altera el dominio CH3 de la otra cadena pesada de modo que dentro de la interfase original del segundo dominio CH3 que se une a la interfase original del primer dominio CH3 dentro de la proteína monovalente que se une al antígeno, se reemplaza un resto aminoácido por un resto aminoácido que tiene un menor volumen de cadena lateral, con lo cual se genera una cavidad dentro de la interfase del segundo dominio CH3 , dentro de la cual puede alojarse una protuberancia de la interfase del primer dominio CH3.

Con preferencia tal resto aminoácido que tiene un mayor volumen de cadenas laterales que se elige entre el grupo formado por la arginina (R) , fenilalanina (F) , tirosina (Y) , triptófano ( ) .

Con preferencia, tal resto aminoácido que tiene un menor volumen de cadenas laterales se elige entre el grupo formado por alanina (A) , serina (S) , treonina (T) , valina (V) .

En un aspecto de la invención, los dos dominios CH3 se han alterado además con la introducción de cisteína (C) como aminoácido en las posiciones correspondientes de cada dominio CH3 de modo que puede formarse un puente disulfuro entre los dos dominios CH3.

En una modalidad preferida, tal proteína monovalente que se une al antígeno contiene una mutación T366W en el dominio CH3 de la "cadena del botones" y las mutaciones T366S, L368A, Y407V en el dominio CH3 de la "cadena del ojal" . Puede utilizarse también un puente disulfuro adicional entre los dominios CH3 (Merchant, A.M. y col., Nature Biotech. 16, 677-681, 1998) p.ej. introduciendo una mutación Y349C en el dominio CH3 de la "cadena de botón" y una mutación E356C o una mutación S354C en el dominio CH3 de la "cadena de ojal" . Por tanto, en otra modalidad, tal proteína monovalente contiene las mutaciones Y349C, T366 en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones E356C, T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3 o tal proteína monovalente que se une al antígeno contiene las mutaciones Y349C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones S354C, T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3 (la mutación Y349C adicional en un dominio CH3 y la mutación adicional E356C o S354C el otro dominio CH3 forman un puente disulfuro entre las cadenas) (numeración siempre de acuerdo con el índice EU de Kabat) . Pero, de forma alternativa o adicional pueden aplicarse también otras tecnologías de hélice super-enrrollada (botones en ojales) descritas en el documento EP 1 870 459 Al. Un ejemplo preferido de tal proteína monovalente que se une al antígeno son las mutaciones R409D; K370E en el dominio CH3 de la "cadena de botón" y las mutaciones D399K; E357K en el dominio CH3 de la "cadena de ojal" (numeración siempre de acuerdo con el índice EU de Kabat) .

En otra modalidad, tal proteína monovalente que se une al antígeno contiene una mutación T366W en el dominio CH3 de la "cadena de botón" y las mutaciones T366S, L368A, Y407V en el dominio CH3 de la "cadena de ojal" y además la R409D; las mutaciones K370E en el dominio CH3 de la "cadena de botón" y la D399K; las mutaciones E357K en el dominio CH3 de la "cadena de ojal" .

En otra modalidad, tal proteína monovalente que se une al antígeno contiene las mutaciones Y349C, T366 en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones S354C, T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3 o tal proteína monovalente que se une al antígeno contiene las mutaciones Y349C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones S354C, T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3 y además las mutaciones 409D; K370E en el dominio CH3 de la "cadena de botón" y las mutaciones D399K; E357K en el dominio CH3 de la "cadena de ojal".

En una modalidad, la proteína monovalente que se une al antígeno según la invención está caracterizada porque contiene : a) una cadena pesada modificada que contiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1; y b) una cadena pesada modificada que contiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2.

En una modalidad, la proteína monovalente que se une al antígeno según la invención está caracterizada porque contiene a) una cadena pesada modificada que contiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 3; y b) una cadena pesada modificada que contiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 4.

En una modalidad, la proteína monovalente que se une al antígeno según la invención está caracterizada porque contiene a) una cadena pesada modificada que contiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 5; y b) una cadena pesada modificada que contiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 6.

En una modalidad, la proteína monovalente que se une al antígeno según la invención está caracterizada porque contiene a) una cadena pesada modificada que contiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 7; y b) una cadena pesada modificada que contiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 8.

En una modalidad, la proteína monovalente que se une al antígeno según la invención está caracterizada porque contiene a) una cadena pesada modificada que contiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 9; y b) una cadena pesada modificada que contiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 10.

En una modalidad, la proteína monovalente que se une al antígeno según la invención está caracterizada porque contiene a) una cadena pesada modificada, que contiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 11; y b) una cadena pesada modificada, que contiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 12.

El término "anticuerpo" se emplea aquí para indicar un anticuerpo de longitud completa que contiene dos cadenas pesadas de anticuerpo y dos cadenas ligeras de anticuerpo (véase las Figuras 1A-1C) . Una cadena pesada de anticuerpo de longitud completa es un polipéptido que contiene en la dirección del extremo N-terminal al extremo C-terminal de un dominio variable de cadena pesada (VH, por sus siglas en inglés) de anticuerpo/ un dominio constante 1 (CH1, por sus siglas en inglés) de cadena pesada de anticuerpo, una región bisagra (HR, por sus siglas en inglés) de anticuerpo, un dominio constante 2 (CH2, por sus siglas en inglés) de cadena pesada de anticuerpo y un dominio constante 3 (CH3) de cadena pesada de anticuerpo, abreviado por VH-CH1-HR-CH2 -CH3 ; y opcionalmente un dominio constante 4 (CH4, por sus siglas en inglés) de cadena pesada de anticuerpo, en el caso de un anticuerpo del subgrupo IgE. Con preferencia, la cadena pesada de anticuerpo de longitud completa es un polipéptido que en la dirección del extremo N-terminal al extremo C-terminal está formado por los dominios VH, CH1, HR, CH2 y CH3. La cadena ligera del anticuerpo de longitud completa es un polipéptido que en la dirección del extremo N-terminal al extremo C-terminal está formado por un dominio variable de cadena ligera (VL, por sus siglas en inglés) de anticuerpo y un dominio constante de cadena ligera de anticuerpo (CL) , abreviado por VL-CL. El dominio constante de cadena ligera (CL) de anticuerpo puede ser ? (kappa) o ? (lambda) . Las cadenas del anticuerpo están unidas entre mediante un puente disulfuro entre polipéptidos que une entre sí el dominio CL y el dominio CH1 (es decir, une la cadena ligera y la cadena pesada) y las regiones bisagra de las cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de anticuerpos típicos de longitud completa son los anticuerpos naturales del tipo IgG (p.ej. IgGl e IgG2, IgM, IgA, IgD e IgE.) Los anticuerpos de la invención pueden ser de una sola especie, p.ej. humanos, o pueden ser anticuerpos quimerizados o humanizados. Los anticuerpos de longitud completa de la invención contienen dos sitios de fijación sobre el antígeno, cada uno de ellos está formado por un par de VH y VL, cada uno de ellos se une específicamente al mismo antígeno (el primero) . De estos anticuerpos de longitud completa se derivan las proteínas monovalentes que se unen a antígenos de la invención modificando: a) la primera cadena pesada de tal anticuerpo reemplazando el dominio VH por el dominio VL de tal anticuerpo; y modificando b) la segunda cadena pesada de tal anticuerpo reemplazando el dominio CH1 por el dominio CL de tal anticuerpo. De este modo, la proteína monovalente resultante, que se une al antígeno, contiene dos cadenas pesadas modificadas y ninguna cadena ligera.

El extremo C-terminal de la cadena pesada o ligera de tal anticuerpo de longitud completa indica el último aminoácido del extremo C-terminal de la cadena pesada o ligera .

Los términos "sitio de unión" o "sitio de unión al antígeno" se emplean aquí para indicar la o las regiones de la proteína que se unen al antígeno según la invención, a las que actualmente está unido un ligando (p.ej. el antígeno o fragmento de antígeno) y que se deriva de la molécula del anticuerpo o de un fragmento de anticuerpo (p.ej. un fragmento Fab) . El sitio de unión al antígeno según la invención está formado por dominios variables de cadena pesada (VH) de anticuerpo y dominios variables de cadena ligera (VL) de anticuerpo.

Los sitios de unión al antígeno (es decir, los pares de VH/VL) que se unen específicamente al antígeno deseado pueden derivarse a) de anticuerpos conocidos del antígeno o b) de nuevos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo obtenidos de nuevo aplicando métodos de inmunización que emplean entre otros la proteína del antígeno o el ácido nucleico o fragmentos de ácido nucleico o por la selección llamada despliegue de fago (selección de proteínas que presentan determinados fagos en su superficie) .

Un sitio de una proteína monovalente de la invención para la fijación sobre antígeno puede contener seis - - regiones determinantes de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) , que contribuyen en grados variables a la afinidad del sitio de fijación para con el antígeno. Hay tres CDR de dominio variable de cadena pesada (CDRH1, CDRH2 y CDRH3) y tres CDR de dominio variable de cadena ligera (CDRL1 , CDRL2 y CDRL3) . La extensión de las CDR y de las regiones de armazón (FR) se determina comparándolas con una base de datos compilada de secuencias de aminoácidos, en las que estas regiones se hayan definido según la variabilidad entre las secuencias.

La especificidad de un anticuerpo indica el reconocimiento específico del anticuerpo con respecto a un epítopo concreto de un antígeno. Los anticuerpos naturales son, por ejemplo, monoespecífieos . Los anticuerpos biespecífieos son anticuerpos que tienen dos especificidades diferentes de unión con antígenos. Las proteínas monovalentes que se unen a antígenos según la invención son "monoespecíficas" y se unen de modo específico a un epítopo del antígeno en cuestión.

El término "valente" se emplea en esta solicitud para indicar la presencia de un número determinado de sitios de unión dentro de la molécula del anticuerpo. Un anticuerpo natural tiene por ejemplo dos sitios de unión y es bivalente. El término "proteína monovalente que se une al antígeno" indica un polipéptido que solamente contiene un sitio de unión con el antígeno.

Los anticuerpos de longitud completa de la invención contienen regiones constantes de inmunoglobulina de uno o más grupos de inmunoglobulina. Los grupos de inmunoglobulina incluyen a la IgG, IgM, IgA, IgD e IgE (o isotipos) y, en el caso de la IgG e IgA, sus subgrupos (o subtipos) . En modalidad, un anticuerpo de longitud completa de la invención y por tanto una proteína monovalente de la invención que se une a un antígeno tiene una estructura de dominios constantes de un anticuerpo del grupo IgG.

Los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" se emplean aquí para indicar una preparación de moléculas de anticuerpo que tienen una única composición de aminoácidos.

El término "anticuerpo quimérico" indica un anticuerpo que contiene una región variable, es decir, una región de fijación de una fuente o especie y por lo menos una porción de una región constante derivada de una especie o fuente diferente, obtenida normalmente por técnicas de ADN recombinante . Son preferidos los anticuerpos quiméricos que contienen una región variable murina y una región constante humana. Otras formas preferidas de "anticuerpos quiméricos" contempladas en la presente invención son aquellas, en las que la región constante se ha modificado o cambiado con respecto a la del anticuerpo original para generar las propiedades según la invención, en especial en lo que respecta a la unión con el Clq y/o la unión con el receptor de Fe (FcR) . Tales anticuerpos quiméricos se denominan también anticuerpos de clase cambiada. Los anticuerpos quiméricos son el producto de genes de inmunoglobulina expresados que contienen segmentos de ADN que codifican a las regiones variables de inmunoglobulina y segmentos de ADN que codifican a las regiones constantes de inmunoglobulina. Los métodos de obtención de anticuerpos quiméricos incluyen las técnicas convencionales de ADN recombinante y de transfección genética, que son bien conocidas en la técnica, véase p.ej. Morrison, S.L. y col., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855, 1984; US 5,202,238 y US 5,204,244.

El término "anticuerpo humanizado" indica anticuerpos en las que las regiones de estructura o "regiones determinantes de complementariedad" (CDR) se han modificado para que contengan la CDR de una inmunoglobulina de especificidad diferente con respecto a la de la inmunoglobulina original. En modalidad, se injerta una CDR murina en la región de estructura de un anticuerpo humano para obtener el "anticuerpo humanizado", véase p.ej. Riechmann, L. y col., Nature 332, 323-327, 1988; y Neuberger, M.S. y col., Nature 314, 268-270, 1985. Las CDR especialmente preferidas corresponden a las que representan secuencias que reconocen a los antígenos antes mencionados de los anticuerpos quiméricos. Otras formas de "anticuerpos humanizados" contemplados en la presente invención son aquellas, en las que la región constante se ha modificado o cambiado adicionalmente con respecto al anticuerpo original para generar propiedades según la invención, en especial en lo que respecta a la unión con el Clq y/o a la unión con el receptor de Fe (FcR) .

El término "anticuerpo humano" se emplea aquí para indicar anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de las secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos son bien conocidos en el estado de la técnica (van Dijk, M.A. y van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5, 368-374, 2001). Los anticuerpos humanos pueden obtenerse también en animales transgénicos (p.ej., ratones) que, después de la inmunización, son capaces de producir un repertorio completo o una selección de anticuerpos humanos en ausencia de producción endógena de inmunoglobulina. La transferencia de la disposición genética de la inmunoglobulina de la línea germinal humana a tales ratones mutantes de línea germinal puede traducirse en la producción de anticuerpos humanos después del contacto con el antígeno (ver, p.ej., Jakobovits, A. y col., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 90, 2551-2555, 1993; Jakobovits, A. y col., Nature 362, 255-258, 1993; Bruggemann, M. y col., Year Immunol . 7, 33-40, 1993). Los anticuerpos humanos pueden producirse también en bibliotecas de exposición de fagos (Hoogenboom, H.R. y inter, G., J. Mol. Biol. 227, 381-388, 1992; Marks , J.D. y col., J. Mol. Biol . 222, 581-597, 1991) . Se dispone también de las técnicas de Colé, A. y col. y Boerner, P. y col. para la obtención de anticuerpos monoclonales humanos (Colé, A. y col., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan L. Liss, p. 77, 1985; y Boerner, P. y col., J. Immunol . 147, 86-95, 1991). Tal como se ha mencionado antes para los anticuerpos quiméricos y humanizados según la invención, el término "anticuerpo humano" se emplea aquí para indicar los anticuerpos que se han modificado en la región constante para generar propiedades según la invención, en especial en lo que respecta a la unión al Clq y/o a la unión al FcR, p.ej. por "cambio de clase", es decir, cambio o mutación de partes del Fe (p.ej. de la IgGl a la IgG4 y/o mutación IgGl/IgG4).

El término "anticuerpo humano recombinante" se emplea aquí para indicar todos los anticuerpos humanos que se obtienen, expresan, crean o aislan por medios recombinantes , como son los anticuerpos aislados de una célula hospedera por ejemplo una célula NSO o CHO o de un animal (p.ej. un ratón) que sea transgénico en cuanto a los genes de la inmu-noglobulina humana o los anticuerpos expresados empleando un vector de expresión recombinante transfectado a una célula hospedera. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes en una forma reordenada. Los anticuerpos humanos recombinantes según la invención se han sometido a una hipermutación somática "in vivo" . Por tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL del anticuerpo recombinante son secuencias que, en cuanto derivadas de y relacionadas con las secuencias VH y VL de línea germinal humana, no pueden existir de modo natural en del repertorio de líneas germinales de anticuerpos humanos "in vivo" .

El "dominio variable" (dominio variable de una cadena ligera (VL) , región variable de una cadena pesada (VH) se emplea aquí para indicar cada uno de los pares de cadenas ligeras y pesadas que intervienen directamente en la fijación del anticuerpo sobre el antígeno. Los dominios de cadenas variables humanas, ligeras y pesadas, tienen la misma estructura general y cada dominio contiene cuatro regiones de armazón (FR) , cuyas secuencias están muy conservadas, conectadas por tres "regiones hipervariables" (o regiones determinantes de complementariedad, CDR) . Las regiones es-tructurales adoptan una conformación de lámina ß y las CDR pueden formar bucles que conecten la estructura de lámina ß. Las CDR de cada cadena se mantienen en su estructura tridimensional gracias a las regiones de estructura y junto con las CDR de la otra cadena forman el sitio de fijación sobre el antígeno. Las regiones CDR3 de cadena pesada y - - ligera del anticuerpo desempeñan un rol especialmente importante en la especificidad de unión/afinidad de los anticuerpos según la invención y por ello constituyen otro objeto de la invención.

Los términos "región hipervariable" o "porción de un anticuerpo que se une al antígeno" se emplean aquí para indicar los restos aminoácido de un anticuerpo que producen la unión con el antígeno. La región hipervariable contiene restos aminoácido de las "regiones determinantes de complementariedad" o "CDR" . Las regiones de "estructura" o "F " son aquellas regiones de dominio variable distintas de los restos de región hipervariable que se acaban definir. Por lo tanto, las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo abarcan desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal de los dominios FR1 , CDR1, FR2 , CDR2 , FR3 , CDR3 y FR4. Las CDR de cada cadena están separadas por los aminoácidos de estructura. En especial, la CDR3 de cadena pesada es la región que más contribuye a la fijación sobre el antígeno. Las regiones CDR y FR se determinan de acuerdo con la definición estándar de Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. , Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) .

Tal como se emplea aquí, el término "unión" o "fijación específica" indica la unión de la proteína monovalente que se une a un epítopo del antígeno en un ensayo "in vitro", con preferencia en un ensayo de resonancia de plasmón (BIAcore, GE-Healthcare Upsala, Suecia) con el antígeno de tipo silvestre purificado. La afinidad de la unión se define en términos ka (constante de velocidad de asociación del anticuerpo del complejo de anticuerpo/antígeno) , kD (constante de disociación) y KD (kD/ka) . La unión o fijación específica indica una afinidad de unión (KD) de 10-8 mol/1 o menos, con preferencia de 10-9 M a 10-13 mol/1.

La fijación de la proteína monovalente que se une al antígeno con el FCYRIII puede investigarse mediante un ensayo BIAcore (GE-Healthcare, Upsala, Suecia) . La afinidad de la unión se define mediante los términos ka (constante de velocidad de asociación del anticuerpo del complejo de anticuerpo/antígeno), kD (constante de disociación) y KD (kD/ka) .

El término "epítopo" incluye cualquier punto determinante de un polipéptido capaz de unirse específicamente con proteínas monovalentes que se fijan sobre antígenos. En ciertas modalidades, el determinante epítopo incluye a grupos de moléculas de superficie químicamente activos, como son los aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, fosforilo o sulfonilo y, en ciertas modalidades, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características específicas de carga. Un epítopo es una región de un antígeno que está unida a una proteína monovalente que se fija sobre un antígeno.

En ciertas modalidades, se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno sí reconoce con preferencia su antígeno diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas.

En otra modalidad, la proteína monovalente que se une al antígeno según la invención está caracterizada porque tal anticuerpo de longitud completa es del subgrupo IgGl humano, o del subgrupo IgGl humano, con las mutaciones L234A y L235A.

En otra modalidad, la proteína monovalente que se une al antígeno según la invención está caracterizada porque tal anticuerpo de longitud completa es del subgrupo IgG2 humano.

En otra modalidad, la proteína monovalente que se une al antígeno según la invención está caracterizada porque tal anticuerpo de longitud completa es del subgrupo IgG3 humano .

En otra modalidad, la proteína monovalente que se une al antígeno según la invención está caracterizada porque tal anticuerpo de longitud completa es del subgrupo IgG4 humano o del subgrupo IgG4 humano con las mutaciones adicionales S228P y L235E (también llamada IgG4 SPLE) .

El término "región constante" se emplea en la - - presente solicitud para indicar la suma de los dominios de un anticuerpo distintos a la región variable. La región constante no participa directamente en la fijación sobre un antígeno, pero posee varias funciones efectoras. En función de la secuencia de aminoácidos de la región constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos se dividen en los subgrupos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM y varios de ellos pueden dividirse a su vez en subgrupos, por ejemplo el IgGl, IgG2 , IgG3 e IgG4 , IgAl e IgA2. Las regiones constantes de cadena pesada que corresponden a los diferentes grupos de anticuerpos se denominan a, d, e, ? y µ, respectivamente. Las regiones constantes de cadena ligera (CL) , que pueden encontrarse en los cincos grupos de anticuerpo, se denominan ? (kappa) y ? (lambda) .

El término "región constante derivada de un origen humano" se emplea en la presente solicitud para indicar una región constante de cadena pesada de un anticuerpo humano de los subgrupos IgGl, IgG2 , IgG3 o IgG4 y/o una región constante de cadena ligera kappa o lambda. Tales regiones constantes son bien conocidas en el estado de la técnica y se han descrito p.ej. en Kabat, E.A., (véase . ej . Johnson, G. y Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28, 214-218, 2000; Kabat, E.A. y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 72, 2785-2788, 1975).

Los anticuerpos del subgrupo IgG4 presentan una unión reducida con el receptor de Fe (FcYRIIIa) , mientras que - - los anticuerpos de otros subgrupos IgG presentan una unión fuerte. Sin embargo, el Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (pérdida del hidrato de carbono de Fe), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 y His435 son restos, que si se alteran, proporcionan también una unión reducida con el receptor de Fe (Shields, R.L. y col., J. Biol . Chem. 276, 6591-6604, 2001/ Lund, J. y col., FASEB J. 9, 115-119, 1995; Morgan, A. y col., Immunology 86, 319-324, 1995; EP 0 307 434).

En una modalidad, un anticuerpo, de la invención tiene una unión reducida con el FcR si se compara con un anticuerpo IgGl y el anticuerpo original de longitud completa es en lo que respecta a la unión con el FcR del subgrupo IgG4 o del subgrupo IgGl o IgG2 con una mutación en S228, L234, L235 y/o D265, y/o contiene la mutación PVA236. En una modalidad, las mutaciones del anticuerpo original de longitud completa son la S228P, L234A, L235A, L235E y/o PVA236. En otra modalidad, las mutaciones del anticuerpo original de longitud completa son la S228P y L235E en la IgG4 y la L234A y L235A en la IgGl.

La región constante de un anticuerpo interviene directamente en la ADCC (citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo) y en la CDC (citotoxicidad dependiente de complemento) . La activación de complemento (CDC) se inicia uniendo el factor de complemento Clq a la región constante de la mayor parte de subgrupos de anticuerpos IgG. La influencia de un anticuerpo en el sistema de complemento depende ciertas condiciones, mientras que la fijación sobre el Clq se realiza gracias a sitios de fijación definidos existentes en la parte Fe. La fijación del anticuerpo sobre el Clq se consigue por interacciones definidas proteína-proteína en el sitio llamado de unión. Estos sitios de fijación de región constante son conocidos en la técnica y se han descrito p . ej . en Lukas, T.J. y col., J. Immunol . 127, 2555-2560, 1981; Brunhouse, R. y Cobra, J.J., Mol. Immunol. 16, 907-917, 1979; Burton, D.R. y col., Nature 288, 338-344, 1980; Thomason, J.E. y col . , Mol. Immunol. 37, 995-1004, 2000; Idusogie, E.E. y' col., J. Immunol. 164, 4178-4184, 2000; Hearer, M. y col., J. Virology 75, 12161-12168, 2001; Morgan, A. y col., Immunology 86, 319-324, 1995; EP 0 307 434. Tales sitios de fijación de región constante son p.ej. L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 y P329 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) .

El término "citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés) " indica la lisis de células diana humanas por acción de un anticuerpo según la invención en presencia de células efectoras. La ADCC se mide con preferencia mediante el tratamiento de una preparación de células que expresan a un antígeno con un anticuerpo según la invención en presencia de células efectoras, por ejemplo las - - PBMC recién aisladas o las células efectoras purificadas a partir de capas leucocitarias (buffy coats, por sus siglas en inglés) , como son los monocitos o las células asesinas naturales (NK) o una línea celular de NK de crecimiento per-manente .

De modo sorprendente se ha encontrado que una proteína según la invención que se une a un antígeno presenta mejores propiedades ADCC que su anticuerpo original de longitud completa. Estos mejores efectos ADCC se logran sin más modificación de la parte Fe, por ejemplo por glicoingeniería . El término "citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) " indica un proceso iniciado con la unión del factor de complemento Clq con la parte Fe de la mayor parte de subgrupos de anticuerpos IgG. La unión del Clq con un anticuerpo Clq se consigue por interacciones definidas proteína-proteína en el sitio llamado de unión. Estos sitios de fijación de región constante son conocidos en la técnica (ver más arriba) . Tales sitios de fijación de la parte Fe están caracterizados . ej . por los aminoácidos L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 y P329 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) . Los anticuerpos de los subgrupos IgGl , IgG2 e IgG3 normalmente presentan activación de complemento, incluida la unión al Clq y C3 , mientras que el IgG4 no activa el sistema de complemento y no se une al Clq y/o C3.

Las funciones efectoras de los anticuerpos monoclonales de mediación celular pueden intensificarse diseñando su componente oligosacárido del modo descrito por Umana, P. y col., Nature Biotechnol. 17, 176-180, 1999, y US 6,602,684. Los anticuerpos de tipo IgGl , que son los anticuerpos más utilizados en el ámbito terapéutico, son glicoproteínas que tienen un sitio de glicosilación unido a N conservado en Asn297 en cada dominio CH2. Los dos oligosacáridos biantenarios complejos unidos al Asn297 están sepultados entre los dominios CH2 , formando contactos extensivos con el esqueleto del polipéptido y su presencia es esencial para que el anticuerpo pueda mediar en las funciones efectoras, por ejemplo la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) (Lifely, M.R. y col., Glycobiology 5, 813-822, 1995; Jefferis, R. y col., Immunol . Rev. 163, 59-76, 1998; Wright, A. y Morrison, S.L., Trends Biotechnol. 15, 26-32, 1997) . Umana, P. y col. han puesto de manifiesto en Nature Biotechnol. 17, 176-180, 1999 y WO 99/54342 que la sobreexpresión de la ß ( 1 , 4 j -N-acetil-glucosaminiltransferasa III ("GnTIII"), una glucosiltransferasa que cataliza la formación de oligosacáridos biseccionados , en células de ovarios de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés) , aumenta significativamente la actividad ADCC de los anticuerpos "in vitro" . Las alteraciones de la composición del hidrato de carbono Asn297 o su eliminación afecta también su fijación sobre el FCYR y Clq (Umana, P. y col., Nature Biotechnol. 17, 176-180, 1999; Davies, J. y col., Biotechnol . Bioeng. 74, 288-294, 2001; Mimura, Y. y col., J. Biol . Chem. 276, 45539-45547, 2001; Radaev, S. y col., J. Biol. Chem. 276, 16478-16483, 2001; Shields, R.L. y col., J. Biol. Chem. 276, 6591-6604, 2001; Shields, R.L. y col., J. Biol. Chem. 277, 26733-26740, 2002; Simmons, L.C. y col., J. Immunol . Methods 263, 133-147, 2002) .

En un aspecto de la invención, la proteína monovalente que se une al antígeno según la invención está caracterizada porque las cadenas pesadas modificadas de a) y b) son del isotipo IgGl y la proteína que se une al antígeno es afucosilada con una cantidad de fucosa del 80% o menos de la cantidad total de oligosacáridos (azúcares) en Asn297.

En una modalidad, la proteína que se une al antígeno es afucosilada con una cantidad de fucosa del 65% al 5% de la cantidad total de oligosacáridos (azúcares) en Asn297.

El término "proteína afucosilada que se une al antígeno" indica proteínas de los isotipos IgGl o IgG3 (con preferencia del isotipo IgGl) que se une al antígeno, con un modelo alterado de glicosilación en la región Fe de Asn297, que tiene un nivel reducido de restos fucosa. La glicosilación de las IgGl o IgG3 humanas tiene lugar en Asn297 como glicosilación de oligosacárido complejo - - biantenario afucosilado en el núcleo, terminada con hasta dos restos Gal. Estas estructuras se denominan restos glicano G0, Gl (OÍ- 1,6- o OÍ-1,3-) o G2 , en función de la cantidad de restos Gal terminales (Raju, T.S., Bioprocess Int. 1, 44-53, 2003) . La glicosilación de tipo CHO de las partes Fe del anticuerpo se ha descrito p.ej. en Routier, F.H., Glycoconjugate J. 14, 201-207, 1997. Los anticuerpos que se expresan de modo recombinante en células hospedantes de CHO no glicomodi icadas normalmente se fucosilan en el Asn297 en una cantidad por lo menos del 85%. Se da por supuesto que el término anticuerpo afucosilado se emplea para indicar un anticuerpo que no contiene fucosa en su modelo de glicosilación. Se sabe en general que la posición típica del resto glicosilado en un anticuerpo es la asparagina de la posición 297 según el sistema de numeración EU ("Asn297") .

Por lo tanto, una proteína afucosilada según la invención que se une a un antígeno significa un anticuerpo de los isotipos IgGl o IgG3 (con preferencia del isotipo IgGl) , en la que la cantidad de fucosa es del 80% o menos (p.ej. del 80% al 1%) de la cantidad total de oligosacáridos (azúcares) en Asn297 (lo cual significa que por lo menos el 20% o más de los oligosacáridos de la región Fe en Asn297 están afucosilados) . En una modalidad, la cantidad de fucosa es del 65% o menos (p.ej. del 65% al 1%), en una modalidad del 65% al 5%, en una modalidad del 40% al 20% de los oligosacáridos - - de la región Fe en Asn297. Según la invención "la cantidad de fucosa" significa la cantidad de tal oligosacárido (fucosa) dentro de la cadena de oligosacárido (azúcar) en Asn297, referida a la suma de todos los oligosacáridos (azúcares) unidos al punto Asn297 (p.ej. estructuras complejas, híbridas y de alto contenido de mañosa) , medida por espectrometría de masas MALDI-TOF y calculada como valor promedio (véase el procedimiento detallado para determinar la cantidad de fucosa p.ej. en O 2008/077546). Además, en una modalidad, los oligosacáridos de la región Fe están bisectados . El anticuerpo afucosilado según la invención puede expresarse en una célula hospedera glicomodificada , diseñada para expresar por lo menos un ácido nucleico que codifique a un polipéptido que tenga actividad de GnTIII, en una cantidad suficiente para fucosilar parcialmente los oligosacáridos de la región Fe. En una modalidad, el polipéptido que tiene actividad GnTIII es un polipéptido de fusión. Como alternativa, la actividad al, 6-fucosiltransferasa de la célula hospedera puede reducirse o eliminarse de acuerdo con la patente US 6,946,292 para generar células hospedantes glicomodificadas . La cantidad de fucosilación de anticuerpo puede predeterminarse, p.ej. por las condiciones de fermentación (p.ej. el tiempo de fermentación) o por la combinación por lo menos de dos anticuerpos con diferentes cantidades de fucosilación. Estas proteínas afucosiladas , que se unen a un antígeno, y los correspondientes métodos de glicoingeniería se han descrito en WO 2005/044859, O 2004/ 065540, WO 2007/031875, Umana, P. y col., Nature Biotechnol . 17, 176-180, 1999, WO 99/154342, WO 2005/018572, WO 2006/ 116260, WO 2006/114700, WO 2005/011735, WO 2005/027966, WO 97/028267, US 2006/0134709, US 2005/0054048, US 2005/0152894, WO 2003/035835 o WO 2000/061739. Estas proteínas glicodiseñadas de la invención, que se unen a antígenos, tienen una mayor ADCC (si se comparan con las proteínas originales que se unen a antígenos) . Otros métodos de glucoingeniería que permiten obtener proteínas afucosiladas según la invención, que se unen a antígenos, se han descrito p.ej. en Niwa, R. y col., J. Immunol. Methods 306, 151-160, 2005; Shinkawa, T. y col., J. Biol. Chem. 278, 3466-2373, 2003; WO 03/055993 o US 2005/0249722.

Por consiguiente, un aspecto de la invención es una proteína afucosilada que se une a un antígeno según la invención, que es del isotipo IgGl o del isotipo IgG3 (con preferencia del isotipo IgGl) con una cantidad de fucosa del 60% o menos (p.ej. del 60% al 1%) de la cantidad total de oligosacáridos (azúcares) en Asn297, para el tratamiento del cáncer. Otro aspecto de la invención es el uso de un anticuerpo afucosilado anti-CD20 del isotipo IgGl o IgG3 (con preferencia del isotipo IgGl) que se une específicamente al CD20 con una cantidad de fucosa del 60% o menos de la - - cantidad total de oligosacáridos (azúcares) en Asn297, para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer. En una modalidad, la cantidad de fucosa se sitúa entre el 60% y el 20% de la cantidad total de oligosacáridos (azúcares) en Asn297. En una modalidad, la cantidad de fucosa se sitúa entre el 60% y el 40% de la cantidad total de oligosacáridos (azúcares) en Asn297. En una modalidad, la cantidad de fucosa se sitúa en el 0% de la cantidad total de oligosacáridos (azúcares) en Asn297.

El "sistema de numeración EU" o el "índice EU (según Kabat) " se emplea habitualmente para indicar la posición o un resto en una región constante de cadena pesada de la inmunoglobulina (p.ej., el índice EU se ha descrito en Kabat y col . , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. , Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) , que se incorpora explícitamente a la presente como referencia) .

La frase "cadenas azúcar poseen las características de los glicanos unidos a N fijados sobre la Asn297 de un anticuerpo que se expresa de modo recombinante en las células CHO" indica que la cadena azúcar unida a Asn2 7 del anticuerpo según la invención tiene la misma estructura y secuencia de restos azúcar, exceptuando el resto fucosa, que los que tiene el mismo anticuerpo expresado en células CHO sin modificar, p.ej. el descrito en WO 2006/103100.

- - El término "NGNA" se emplea en esta solicitud para indicar el resto azúcar ácido N-glicolilneuramínico.

El anticuerpo según la invención se produce por medios recombinantes . Es, pues, un aspecto de la presente invención un ácido nucleico que codifica al anticuerpo según la invención y otro aspecto es una célula que contiene tal ácido nucleico que codifica a un anticuerpo según la invención. Los métodos de producción recombinante son ampliamente conocidos en el estado de la técnica y consisten en la expresión de proteínas en células procariotas y eucariotas y el posterior aislamiento del anticuerpo y normalmente la purificación del mismo hasta una pureza farmacéuticamente aceptable. Para la expresión recién mencionada de los anticuerpos en una célula hospedera se insertan los ácidos nucleicos que codifican a las respectivas cadenas corta y larga modificadas en vectores de expresión por métodos estándar. La expresión se realiza en células hospedantes procariotas o eucariotas apropiadas, por ejemplo las células CHO, células NSO, células SP2/0, células HEK293, células COS , células PER.C6, levadura o células de E. coli, y se recupera el anticuerpo de las células (líquido sobrenadante o células después de la lisis) . Los métodos generales de producción recombinante de anticuerpos son bien conocidos en el estado de la técnica y se han descrito, por ejemplo, en artículos de revistas científicas, de autores - - como Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17, 183-202, 1999; Geisse, S. y col., Protein Expr. Purif. 8, 271-282, 1996; Kaufman, R., J. Mol. Biotechnol . 16, 151-160, 2000; Werner, R.G., Drug Res. 48, 870-880, 1998.

Las proteínas de la invención, que se unen a antígenos, se separan del medio de cultivo de modo conveniente por procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas , por ejemplo proteína A-sefarosa, cromatografía a través de hidroxilapatita, electroforesis a través de gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

El ADN y el AR que codifican a los anticuerpos monoclonales se aislan fácilmente y se secuencian aplicando procedimientos convencionales. Las células de hibridoma pueden servir como fuentes de tales ADN y ARN. Una vez aislado, el ADN puede insertarse en vectores de expresión, que se transfectan a células hospederas del tipo células HEK 293, células CHO o células de mieloma que de otro modo no producirían proteína de inmunoglobulina para realizar la síntesis de anticuerpos monoclonales recombinantes en las células hospederas.

Las variantes de secuencias de aminoácidos (o mutantes) del anticuerpo biespecífico se obtienen introduciendo los cambios apropiados de nucleótidos en el ADN del anticuerpo o por síntesis de nucleótidos. Sin embargo, estas modificaciones pueden realizarse solamente en un intervalo muy limitado, p.ej. del modo antes descrito. Por ejemplo, las modificaciones no alteran las características del anticuerpo antes mencionadas, por ejemplo el isotipo de IgG y la fijación sobre el antígeno, pero pueden mejorar el rendimiento de la producción recombinante , la estabilidad de la proteína o facilitar la purificación.

El término "célula hospedera" se emplea en la presente solicitud para indicar cualquier tipo de sistema celular que puede diseñarse para generar los anticuerpos según la presente invención. En una modalidad, las células HEK293 y las células CHO se emplean como células hospederas. Tal como se emplea aquí, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se emplean indistintamente y todas las denominaciones incluyen a la progenie. Por tanto, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula objeto primaria y los cultivos derivados de la misma con independencia del número de transferencias. Se da también por supuesto que toda la progenie puede que no sea exactamente idéntica en cuanto al contenido de ADN, debido a las mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la progenie variante que tiene la misma función o actividad biológica que se ha explorado en la célula transformada original .

La expresión en células NSO se ha descrito p.ej. en Barnes, L.M. y col., Cytotechnology 32, 109-123, 2000; Barnes, L.M. y col., Biotech. Bioeng. 73, 261-270, 2001. La expresión transitoria se ha descrito p.ej en Durocher, Y. y col., Nucí. Acids . Res. 30, E9, 2002. La clonación de los dominios variables se ha descrito en Orlandi, R. y col., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 86, 3833-3837, 1989; Cárter, P. y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89, 4285-4289, 1992; y Norderhaug, L. y col., J. Immunol . Methods 204, 77-87, 1997. Un sistema preferido de expresión transitoria (HEK 293) se ha descrito en Schlaeger, E.-J., y Christensen, K. , en Cytotech-nology 30, 71-83, 1999 y en Schlaeger, E.-J., en J. Immunol. Methods 194, 191-199, 1996.

Las secuencias de control idóneas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operador y un sitio de unión a un ribosoma. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, intensificadores y señales de poliadenilación.

Un ácido nucleico está "unido operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una pre-secuencia o líder secretorio está unido operativamente con un ADN de un polipéptido si se expresa como pre-prote na que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o intensificador está unido operativamente con una secuencia codificadora si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión de un ribosoma está unido operativamente con una secuencia - - codificadora si está posicionado de tal manera que facilita la traducción. En general, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que se van a unir son contiguas, y, en el caso de un líder secretorio, son contiguas y están dentro del marco de lectura. Sin embargo, los intensificadores no tienen que estar contiguos. La unión se realiza por ligación en sitios de restricción oportunos. Si no existen tales sitios, se emplearán adaptadores o engarces oligonucleótidos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

La purificación de proteínas de unión a antígeno monovalentes se realiza con el fin de eliminar componentes celulares u otros contaminantes, p.ej. otros ácidos nucleicos celulares o proteínas (p.ej. productos secundarios), por técnicas estándar, incluido el tratamiento alcalino/SDS , el contraste con CsCl, la cromatografía de columna, la electro-foresis a través de gel de agarosa y otros métodos bien conocidos de la técnica, véase Ausubel, F. y col., coord. , Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing y Wiley Interscience , Nueva York (1987). Los diferentes métodos se han consolidado y se emplean con frecuencia para la purificación de proteínas, por ejemplo la cromatografía de afinidad con proteínas microbianas (p.ej. cromatografía de afinidad de proteína A o proteína G) , cromatografía de intercambio iónico (p.ej. intercambio catiónico (resinas de - - carboximetilo) , intercambio aniónico (resinas de arainoetilo) y de intercambio mixto), la adsorción tiófila (p.ej. con beta-mercapto-etanol y otros ligandos SH) , la interacción hidrófoba o la cromatografía de adsorción aromática (p.ej. con fenil-sefarosa, resinas aza-arenófilas o con ácido m-aminofenil-borónico) , cromatografía de afinidad con quelatos metálicos (p.ej. con material de afinidad Ni (II) y Cu(II)), la cromatografía de exclusión de tamaños y los métodos electroforéticos (por ejemplo la electroforesis a través de gel, la electroforesis capilar) (Vijayalakshmi , M.A., Ap l . Biochem. Biotech. 75, 93-102, 1998) . Un ejemplo de purificación se describe en el ejemplo 1 y en las correspondientes figuras de 3A a 8B.

Un aspecto de la invención es una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo de la invención. Otro aspecto de la invención es el uso de un anticuerpo según la invención para la fabricación de una composición farmacéutica. Otro aspecto de la invención es un método para la fabricación de una composición farmacéutica que contenga un anticuerpo de la invención. En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición, p.ej. una composición farmacéutica, que contiene un anticuerpo según la presente invención, formulado con un vehículo farmacéutico.

Una modalidad de la invención es la proteína monovalente que se une al antígeno según la invención para el - - tratamiento del cáncer.

Otro aspecto de la invención es tal composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer.

Una modalidad de la invención es la proteína monovalente que se une al antígeno según la invención para el uso en el tratamiento del cáncer.

Otro aspecto de la invención es el uso de un anticuerpo según la invención para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer.

Otro aspecto de la invención es un método de tratamiento de un paciente que sufre un cáncer, que consiste en administrar un anticuerpo de la invención a un paciente que necesite tal tratamiento.

Tal como se emplea aquí, "vehículo farmacéutico" incluye a todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos , agentes isotónicos y retardantes de absorción y similares que sean fisiológicamente compatibles. Con preferencia, el vehículo es idóneo para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (p.ej. por inyección o infusión).

Una composición de la presente invención puede administrarse por una gran variedad de métodos ya conocidos de la técnica. Los expertos sabrán apreciar que la vía y/o el modo de administración pueden variar en función de los resultados deseados. Para administrar un compuesto de la invención por ciertas vías de administración, puede ser necesario revestir el compuesto con, o co-administrar el compuesto con, un material para impedir su inactivación. Por ejemplo, el compuesto puede administrarse a un sujeto en un vehículo apropiado, por ejemplo, liposomas, o un diluyente. Los diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen la solución salina y las soluciones acuosas reguladas en pH. Los vehículos farmacéuticos incluyen las soluciones o dispersiones acuosas estériles y los polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones estériles inyectables . El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas ya es conocido en la técnica .

Las frases "administración parenteral" y "administrado por vía parenteral" se emplea aquí para indicar los modos de administración diferentes de la administración enteral y tópica, normalmente por inyección e incluyen, sin limitación, la inyección intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital , intracardíaca, intradérmica, iritraperitoneal , transtraqueal , subcutánea, subcuticula , intra-articula , subcapsular, subaracnoidea , intraespinal , epidural e intraesternal y la infusión .

El término cáncer se emplea aquí para indicar - enfermedades proliferativas , por ejemplo linfornas, leucemias linfocíticas , cáncer de pulmón, cáncer de pulmón no de células pequeñas (NSCL, por sus siglas en inglés) , cáncer de pulmón de células bronquioloalveolares , cáncer óseo, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer de útero, cáncer de ovarios, cáncer de recto, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de útero, carcinoma de los tubos de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cérvix, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, enfermedad de Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de glándula tiroides, cáncer de glándula paratiroides , cáncer de cápsula suprarrenales, sarcoma de tejido blando, cáncer de uretra, cáncer de pene, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de ríñones o de uréter, carcinoma de células renales, carcinoma de pelvis renal, mesotelioma, cáncer hepatocelular, cáncer biliar, neoplasmas del sistema nervioso central (SNC) , tumores del eje espinal, glioma del tronco cerebral, glioblastoma multiforme, astrocitomas , schwanomas, ependimonas, meduloblastomas , meningiomas, carcinomas de células escamosas, adenoma pituitario y sarcoma de Ewings, incluidas las versiones refractarias de cualquiera de los cánceres recién mencionados o las combinaciones de uno o más de los cánceres anteriores.

Estas composiciones pueden contener también adyuvantes como son los conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos puede asegurarse tanto con procedimientos de esterilización, ver más arriba, como por la inclusión de varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol , fenol, ácido sórbico y similares. Puede ser también deseable la inclusión en las composiciones de agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, cloruro sódico y similares. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede conseguirse mediante la inclusión de agentes que retarden la absorción, como son el monoestearato de aluminio y la gelatina.

Con independencia de la vía de administración elegida, los compuestos de la presente invención, que pueden utilizarse en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmacéuticas de la presente invención, se formulan en formas de dosificación farmacéuticamente aceptables por métodos convencionales, que los expertos ya conocen.

Los niveles actuales de dosificación de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variarse con el fin de obtener una cantidad de ingrediente activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada en un paciente, una composición y un modo de administración concretos, sin ser tóxicos para el paciente. El nivel de dosificación elegido dependerá de un gran número de factores farmacocinéticos , incluida la actividad de las composiciones concretas de la presente invención que se empleen, la vía de administración, el tiempo de administración, la velocidad de excreción del compuesto concreto que se emplee, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales que se utilicen en combinación con las composiciones concretas empleadas, la edad, el sexo, el peso, el estado patológico, el estado general de salud y el historial médico previo del paciente a tratar así como los factores bien conocidos en las técnicas médicas .

La composición tiene que ser estéril y líquida en un grado tal que la composición pueda administrarse con una jeringuilla. Además del agua, el vehículo es con preferencia una solución salina regulada en pH isotónica.

La fluidez correcta puede mantenerse, por ejemplo, con el uso de recubrimiento, tal como la lecitina, manteniendo el tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y con el uso de agentes tensioactivos . En muchos casos es preferible incorporar a la composición agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, polialcoholes , tales como manitol o sorbitol y cloruro sódico.

Tal como se emplea aquí, las expresiones "célula", - - "línea celular" y "cultivo celular" se emplean indistintamente y todas las denominaciones incluyen a la progenie. Por tanto, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula objeto primaria y los cultivos derivados de la misma con independencia del número de transferencias. Se da también por supuesto que toda la progenie puede que no sea exactamente idéntica en cuanto al contenido de ADN, debido a las mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la progenie variante que tiene la misma función o actividad biológica que se ha explorado en la célula transformada original . Cuando se empleen denominaciones distintas, su sentido se desprenderá del contexto .

El término "transformación" se emplea aquí para indicar un proceso de transferencia de un vector/ácido nucleico a una célula hospedera. Si se emplean como células hospederas células sin barrera de pared celular formidable, la transfección se puede llevar a cabo p.ej. por el método de precipitación con fosfato cálcico descrito por Graham y van der Eb, A.J., Virology 52, 456-467, 1978. Sin embargo pueden emplearse también otros, métodos de introducción del ADN en las células, como son la inyección nuclear o la fusión de protoplastos . Si se emplean células procariotas o células que contienen construcciones sustanciales de pared celular, p.ej. un método de transfección el tratamiento con calcio empleando - - el cloruro cálcico, descrito por Cohén, F.N. y col., PNAS 69, 2110-2114, 1972.

Tal como se emplea aquí, "expresión" indica el proceso por el que un ácido nucleico se transcribe al AR m y/o el proceso por el que el ARNm transcrito (también llamado transcrito) se traduce seguidamente en péptidos, polipéptidos o proteínas. Los transcritos y los polipéptidos codificados se denominan colectivamente productos genéticos. Si el poli-nucleótido deriva del ADN genómico, la expresión en una célula eucariota puede incluir el empalme del ARNm.

Un "vector" es una molécula de ácido nucleico, en particular una molécula auto-replicante, que transfiere una molécula de ácido nucleico insertada a y/o entre células hospederas. El término incluye a los vectores que funcionan primariamente para la inserción de ADN o ARN en una célula (p.ej., integración cromosómica) , la replicación de vectores que funcionan primariamente para la replicación de ADN o ARN y vectores de expresión que funcionan para la transcripción y/o traducción del ADN o ARN. Se incluyen también los vectores que proporcionan más de una de las funciones descritas .

Un "vector de expresión" es un polinucleótido que, cuando se introduce en una célula hospedera apropiada, puede transcribirse y traducirse en un polipéptido. Un "sistema de expresión" se emplea normalmente para indicar una célula hospedera apropiada que consta de un vector de expresión que puede funcionar para generar un producto de expresión deseado .

Los siguientes ejemplos, listado de secuencias y figuras se presentan para facilitar la comprensión de la presente invención, cuyo verdadero alcance se define en las reivindicaciones adjuntas. Se da por supuesto que pueden introducirse modificaciones a los procedimientos definidos sin apartarse del espíritu de la invención.

Procedimientos experimentales ?. Materiales y Métodos: Técnicas de ADN recombinante Para manipular el ADN se aplican los métodos estándar descritos en Sambrook, J. y col., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989. Los reactivos de biología molecular se emplean de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Análisis de secuencias de ADN y de proteínas y gestión de los datos de las secuencias La información general respecto a las secuencias de nucleótido de las cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulinas humanas se encontrará en: Kabat, E.A. y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta ed. , NIH, publicación No. 91-3242. Los aminoácidos de las cadenas de anticuerpo se numeran y nombran según la numeración EU (Edelman, G.M. y col., PNAS 63, 78-85, 1969; Kabat, E.A. y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta ed. , publicación NIH No. 91-3242) . Para la creación de la secuencia, mapeo, análisis e ilustración se emplean el paquete informático GCG (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) , versión 10.2 y el programa Vector NTI Advance suite, versión 8.0 de Infomax.

Secuenciacion del ADN Se determinan las secuencias de ADN por secuenciacion de doble hebra realizada en SequiServe (Vaterstetten, Alemania) y Geneart AG (Regensburg, Alemania) .

Síntesis genética Los segmentos de genes deseados se preparan en Geneart AG (Regensburg, Alemania) a partir de oligonucleótidos sintéticos y productos de PCR por síntesis genética automatizada. Los segmentos de genes, que están flanqueados por sitios de rotura de endonucleasa de restricción singular se clonan en plásmidos pGA18 (ampR) . Se purifica el ADN plásmido a partir de las bacterias transformadas y la concentración se determina por espectroscopia UV. La secuencia de ADN de los fragmentos de genes subclonados se confirma por secuenciacion del ADN. Las secuencias de ADN que codifican a las dos cadenas de anticuerpo (VH-CL-CH2 -CH3 y VL-CH1 -CH2 -CH3 ) se preparan en forma de fragmentos completos por síntesis genética, flanqueados por los sitios de restricción 5'HpaI y 3'NaeI. Se sintetizan los segmentos genéticos que codifican a las hélices super-enrrolladas , que indican una cadena pesada de anticuerpo que lleva una mutación T366W en el dominio CH3 y una segunda cadena pesada de anticuerpo que lleva las mutaciones T366S, L368A y Y407V en el dominio CH3 , flanqueados con los sitios de restricción 5'-BclI y 3'-NaeI. De manera similar se preparan por síntesis genética secuencias de ADN de tipo hélice super-enrrollada , que codifican a la cadena pesada de anticuerpo, que lleva una mutación T366W en el dominio CH3 y una segunda cadena pesada de anticuerpo que lleva las mutaciones T366S, L368A y Y407V, flanqueados con los sitios de restricción Bell y Nael. Todos los constructos se diseñan con una secuencia de ADN del extremo 5' que codifica a un péptido líder, que se dirige a proteínas que se segregan en células eucariotas.

Construcción de plásmidos de expresión Se emplea un vector de expresión Roche para la construcción de todas las cadenas de anticuerpo. El vector se compone de los elementos siguientes: un origen de replicación, oriP, de virus de Epstein-Barr (EBV, por sus siglas en inglés) , - un origen de replicación del vector pUC18 que permite la replicación de este plásmido en E. coli, - - - un gen de beta-lactamasa que confiere resistente a la ampicilina en E. coli, el intensificador inmediato anterior y el promotor del citomegalovirus humano (HCMV) , - la secuencia de señal de poliadenilación de 1-inmunóglobulina humana ("poli A") y - sitios de restricción únicos Hpal, Bell y Nael. Los genes de inmunoglobulina del orden de VH-CL- CH2-CH3 y VL-CH1-CH2-CH3 así como los constructos de "hélices super-enrrolladas" se obtienen por síntesis genética y se clonan en plásmidos pGA18 (ampR) del modo descrito.. Los plásmidos pG18 (ampR) que llevan los segmentos de ADN sintetizado y el vector de expresión Roche se digieren con enzimas de restricción ya sea Hpal y Nael, ya sea Bell y Nael (Roche Molecular Biochemicals) y se someten a electroforesis a través de gel de agarosa . Después se ligan los segmentos de ADN codificador de cadena ligera y pesada al fragmento Hpal/Nael o al fragmento Bcll/Nael del vector de expresión Roche aislado obteniéndose los vectores de expresión finales. Se transforman los vectores de expresión finales en células de E. coli, se aisla el ADN de plásmido de expresión (Miniprep) y se somete a análisis con enzimas de restricción y a secuenciación del ADN. Se cultivan los clones correctos en 150 mi de medio LB-Amp, se aisla de nuevo el ADN plásmido (Maxiprep) y se confirma la integridad de secuencia por secuenciación del ADN.

Expresión transitoria de variantes de inmunoglobulina en células HEK293 Se expresan variantes de inmunoglobulina recombinante por transfeccion transitoria de células 293 -F de riñon embrionario humano empleando el sistema de expresión FreeStyle™ 293 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen, EE.UU.). Resumiendo, se cultivan en suspensión las células FreeStyle™ 293 -F en un medio de expresión FreeStyle™ 293 a 37 °C con un 8% de C02 y se siembran las células en medio fresco, con una densidad de 1-2 x 106 células viables/ml el día de la transfeccion. Se preparan complejos de ADN-293Íectina™ en medio Opti-MEM® I (Invitrogen, EE.UU.) empleando 325 µ? de la 293fectina™ (Invitrogen, Alemania) y 250 µg de ADN plásmido de cadena pesada y ligera en una proporción molar 1:1 para un volumen final de transfeccion de 250 mi. Se recogen por centrifugación a 14000 g durante 30 minutos los líquidos sobrenadantes de cultivo celular que contienen anticuerpos a los 7 días de la transfeccion y se filtran en un filtro estéril (0.22 µp\) . Se almacenan los líquidos sobrenadantes a -20°C hasta el momento de la purificación.

Como alternativa se generan los anticuerpos por transfeccion transitoria en células HEK293-EBNA. Se expresan los anticuerpos por co-transfeccion transitoria de los correspondientes plásmidos de expresión en células HEK293-EBNA (línea celular 293 de riñon embrionario humano, que expresan al antígeno nuclear del virus de Epstein-Barr; American Type Culture Collection, número depósito ATCC No. CRL-10852, lote 959 218) de crecimiento adherente, cultivadas en medio DMEM (medio Eagle modificado por Dulbecco, Gibco) suplementado con un 10% de FCS de IgG Ultra Bajo (suero fetal bovino, Gibco) , L-glutamina 2 mM de (Gibco) y 250 pg/ml de geneticina (Gibco) . Para la transfección se emplea el reactivo FuGENE™ 6 (Roche Molecular Biochemicals ) en una proporción de 4:1 entre el reactivo FuGENE™ (µ?) y el ADN (yg) (que se sitúa entre 3:1 y 6:1) . Las proteínas se expresan a partir de los plásmidos correspondientes en una proporción equimolar de plásmidos. El día 3 se alimentan las células con L-glutamina 4 mM, glucosa [Sigma] y NAA [Gibco] . Se recogen por centrifugación los líquidos sobrenadantes del cultivo celular que contienen los anticuerpos biespecífieos desde el día 5 al 11 después de la transfección y se almacenan a -20°C. Se encontrará información general sobre la expresión recombinante de inmunoglobulinas humanas, p.ej. en células HEK293, en: Meissner, P. y col., Biotechnol . Bioeng. 75, 197-203, 2001.

Purificación de anticuerpos Se purifican los anticuerpos de los líquidos sobrenadantes de los cultivos celulares por cromatografía de - - afinidad empleando la Proteína A-Sepharose (GE Healthcare, Suecia) y la cromatografía de exclusión de tamaños Superdex200. Resumiendo, se depositan los líquidos sobrenadantes de cultivos celulares filtrados en condiciones estériles sobre la parte superior de una columna HiTrap Proteína A HP (5 mi) equilibrada con regulador de pH PBS (10 mM de Na2HP04, 1 mM de KH2P04, 137 mM de NaCl y 2.7 mM de KC1, de pH = 7.4) . Se eliminan por lavado con regulador de pH de equilibrado las proteínas no fijadas. Se eluyen los anticuerpos y las variantes de anticuerpo con regulador de pH citrato 0.1 M, de pH 2.8, y se neutralizan las fracciones que contienen proteínas con 0.1 mi de regulador de pH Tris 1 M, de pH 8.5. Después se recogen las fracciones que contienen proteína eluida, se concentran en un dispositivo de filtro centrifugador Amicon Ultra (MWCO: 30 K, Millipore) hasta un volumen de 3 mi y se depositan en la parte superior de una columna de filtración a través de gel Superdex200 HiLoad 120 mi 16/60 ó 26/60 (GE Healthcare, Suecia) equilibrada con 20 mM de histidina, 140 mM de NaCl, de pH 6.0. Se recogen las fracciones que contienen anticuerpos biespecífieos y de control purificados, que tienen menos de un 5% de agregados de peso molecular elevado y se almacenan a -80°C en forma de partes alícuotas de 1.0 mg/ml .

Análisis de las proteínas purificadas Se determina la concentración de proteína de las muestras de proteína purificada midiendo la densidad óptica (OD, por sus siglas en inglés) a 280 nm, empleando el coeficiente de extinción molar calculado en base a la secuencia de aminoácidos. Se analizan la pureza y el peso molecular de los anticuerpos biespecífieos y los de control por SDS-PAGE en presencia y en ausencia de un agente reductor (5 mM de 1 , 4 -ditiotreitol ) y tinción con el colorante azul brillante Coomassie. Se emplea el sistema de gel NuPAGE® Pre-Cast (Invitrogen, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (geles de Tris-glicina del 4-12%) . Se analiza el contenido de agregados en las muestras de anticuerpos biespecíficos y de control . mediante SEC de alta eficacia empleando una columna analítica de exclusión de tamaños Superdex 200 (GE Healthcare, Suecia) en un regulador de pH de trabajo 200 mM de KH2P04, 250 mM de KC1 , de pH 7.0 a 25°C. Se inyectan 25 µg de proteína en la columna con un caudal de 0.5 ml/min y se someten a elución isocrática durante 50 minutos. Para los análisis de estabilidad se incuban concentraciones de 1 mg/ml de proteínas purificadas a 4°C y 40 °C durante 7 días y después se evalúan por SEC de alta eficacia (p.ej. análisis HP-SEC (proteína purificada) ) . Se verifica la integridad del esqueleto de aminoácidos de las cadenas larga y corta del anticuerpo biespecífico reducido por espectrometría de masas Q-TOF con nanoelectro-aspersión después de haber eliminado los N-glicanos por tratamiento - - enzimático con la péptido-N-glucosidasa F (Roche Molecular Biochemicals) .

Espectrometría de masas y SEC-MALLS Espectrometría de masas Se determina el peso total de anticuerpos desglicosilados y se confirma por espectrometría de masas con ionización de electro-aspersión (EM-ESI, por sus siglas en inglés) . Resumiendo, se desglicosilan 100 µg de anticuerpos purificados con 50 mU de N-glicosidasa F (PNGaseF, ProZyme) en KH2P04/K2HP04 100 mM, de pH 7, a 37°C durante 12-24 h, en una concentración de proteína de hasta 2 mg/ml y después se desalinizan por HPLC empleando una columna Sephadex G25 (GE Healthcare) . Se determina el peso de las cadenas pesadas y ligeras correspondientes por EM-ESI después de la desglicosilación y reducción. Resumiendo, se incuban 50 yg de anticuerpo en 115 µ? con 60 µ? de 1M TCEP y 50 µ? de 8 M clorhidrato de guanidina y después se desalinizan. Se determina el peso total y el peso de las cadenas pesadas y ligeras reducidas por EM-ESI en un sistema EM del tipo Q-Star Elite equipado con una fuente de tipo NanoMate. El intervalo de pesos registrado dependerá del peso molecular de las muestras. En general, para los anticuerpos reducidos el intervalo de pesos se sitúa entre 600 y 2000 m/z y para los anticuerpos no reducido o las moléculas biespecíficas entre 1000 y 3600 m/z.

- - SEC-MALLS Se realiza una SEC-MALLS (siglas en inglés para cromatografía de exclusión de tamaños con dispersión de luz láser multiangular) para determinar el peso molecular aproximado de las proteínas en solución. De acuerdo con la teoría de la dispersión de la luz, la MALLS permite la estimación del peso molecular de macromoléculas con independencia de su geometría molecular o de otros supuestos. La SEC-MALLS se basa en la separación de las proteínas de acuerdo con sus tamaños (radio hidrodinámico) por cromatografía SEC y después se emplean detectores sensibles a la concentración y a la dispersión de la luz. La SEC-MALLS permite normalmente realizar estimaciones de los pesos moleculares con una resolución que permite una discriminación clara entre monómeros, dímeros, trímeros, etc.,. con la condición de que la separación SEC sea suficiente.

En este trabajo se emplea el siguiente equipo instrumental: Dionax Ultímate 3000 HPLC; columna: Superose6 10/300 (GE Healthcare); eluyente: 1 x PBS; caudal: 0.25 ml/min; detectores: OptiLab REX (Wyatt Inc., Dernbach) , MiniDawn Treos (Wyatt Inc., Dernbach). Se calculan los pesos moleculares con el programa informático de Astra, versión 5.3.2.13. Se cargan cantidades de proteína entre 50 y 150 µg en la columna y como proteína de referencia se emplea la BSA (Sigma Aldrich) .

Dispersión de luz dinámica (DLS, por sus siglas en inglés) en el tiempo En una placa filtrante de 384 cavidades (tamaño de poro = 0.45 µ?t?) se filtran las muestras (30 µ?) de una concentración aprox. de 1 mg/ml en His/HisCl 20 mM, NaCl 140 mM, de pH 6.0, y se recogen en placas ópticas de 384 cavidades (Corning) y se recubren con 20 µ? de aceite de parafina (Sigma) . Se recogen los datos de dispersión dinámica de la luz de modo repetido durante un período de 5 días con un lector de placas del tipo DynaPro DLS (Wyatt) a una temperatura constante de 40 °C. Los datos se procesan con el programa informático Dynamics V6.10 (Wyatt).

Ensayo de fosforilación de la c-Met Se siembran 5xl05 células A549 por cavidad en una placa de 6 cavidades el día antes de la estimulación HGF en un medio RPMI con un 0.5% de FCS (suero fetal bovino) . Al día siguiente se reemplaza el medio de cultivo durante una hora por medio RPMI que contiene un 0.2% de BSA (siglas en inglés para albúmina de suero bovino) . Después se añaden 12.5 ug/ml del anticuerpo biespecífico al medio y se incuban las células durante 15 minutos, después se añade el HGF (R&D, 294 -HGN) durante 10 minutos más en una concentración final de 25 ng/ml. Se lavan las células una vez con PBS enfriado con hielo, que contiene vanadato sódico 1 mM, después se colocan sobre hielo y se lisan en una placa de cultivo celular con - - 100 µ? de regulador de H de lisis (50 mM de Tris-Cl de pH 7.5, 150 mM de NaCl , 1% de NP40, 0.5% DOC, aprotinina, 0.5 mM de PMSF, 1 mM de vanadato sódico) . Se transfieren los lisados celulares a .tubos eppendorf y se deja que la lisis progrese durante 30 minutos sobre hielo. Se determina la concentración de proteína aplicando el método BCA (Pierce) . Se separan 30-50 ug del lisado en un gel Bis-Tris NuPage 4-12% (Invitrogen) y se transfieren las proteínas del gel a una membrana de nitrocelulosa . Se bloquean las membranas durante una hora con TBS-T que contiene un 5% de BSA y revelan con un anticuerpo c-Met fosfo-específico dirigido contra Y1349 (Epitomics, 2319-1) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las inmunotransferencias ( immunoblots ) se exploran de nuevo con un anticuerpo que se fija sobre la c-Met no fosforilada (Santa Cruz, sc-161) .

Ensayo de fosforilación de la Her3 (ErbB3) Se siembran 2xl05 células MCF7 por cavidad en una placa de 12 cavidades, en un medio de cultivo completo (RPMI 1640, 10% de FCS) . Se dejan crecer las células hasta una confluencia del 90% durante dos días. Se reemplaza el medio por un medio de inanición que contiene un 0.5% de FCS. Al día siguiente se suplementan los anticuerpos en cuestión en las concentraciones indicadas 1 hora antes de la adición de 500 ng/ml de herregulina (R&D) . Después de la adición de la herregulina se cultivan las células durante 10 minutos más, - - se recolectan las células y se lisan. Se determina la concentración de proteína aplicando el método BCA (Pierce) . Se separan 30-50 µg de lisado en un gel 4-12% Bis-Tris NuPage (Invitrogen) y se transfieren las proteínas del gel a una membrana de nitrocelulosa . Se bloquean las membranas durante una hora con TBS-T que contiene un 5% de BSA y se revelan con un anticuerpo fosfo-específico Her3/ErbB3 que reconoce específicamente a la Tyrl289 (4791, Cell Signaling) .

FACS Se destacan y se cuentan las células A549. Se siembran 1.5xl05 células por cavidad de una placa de 96 cavidades cónicas. Se centrifugan las células (1500 rpm, 4°C, 5 min) y se incuban sobre hielo durante 30 min en 50 µ? de una serie de diluciones del correspondiente anticuerpo biespecífico en PBS con 2% de FCS (siglas en inglés para suero fetal bovino) . Se centrifugan de nuevo las células, se lavan una vez con 200 µ? de PBS que contienen un 2% de FCS y se someten a una segunda incubación de 30 min con un anticuerpo asociado a Alexa488 dirigido contra el Fe humano, que se diluye en PBS que contiene un 2% de FCS (Jackson Immunoresearch, 109116098). Se centrifugan las células, se lavan dos veces con 200 µ? de PBS que contiene un 2% de FCS, se suspenden de nuevo en una solución BD CellFix (BD Biosciences) y se incuban por lo menos durante 10 min sobre hielo. Se determina la fluorescencia media (mfi) de las - - células por citometría de flujo (FACS Canto, BD) . Se determina la mfi por lo menos por duplicado de dos tinciones independientes. Los espectros de citometría de flujo se procesan después con el programa informático FlowJo (TreeStar) . Se determina la fijación semi-máxima empleando el programa XLFit 4.0 (IDBS) y el modelo 205 de un sitio de dosis-respuesta .

Resonancia de plasmón de superficie Se analizan las propiedades de unión de anticuerpos monovalentes anti-IGF-lR con la tecnología de resonancia de plasmón de superficie (SPR, por sus siglas en inglés) empleando un instrumento Biacore (Biacore, GE-Healthcare , Upsala) . Este sistema se ha consolidado para el estudio de las interacciones moleculares. Permite el seguimiento continuo en tiempo real de las uniones de ligando- nalito y, de este modo, la determinación de las constantes de velocidad de asociación (ka) , constantes de velocidad de disociación (kD) y constantes de equilibrio (KD) en diversos planteamientos experimentales. La tecnología SPR se basa en la medición del índice de refracción junto a la superficie de un chip biosensor recubierto de oro. Los cambios de índice de refracción indican los cambios de peso en la superficie producidos por la interacción del ligando inmovilizado con el analito inyectado en solución. Si las moléculas se unen al ligando inmovilizado en la superficie, entonces el peso - - aumento, pero en el caso de disociación el peso disminuye. Para capturar el anticuerpo IgG anti -humano se inmoviliza en la superficie del chip biosensor CM5 empleando la química de condensación de amina. Se activan las células de flujo con una mezcla 1:1 de N-hidroxisuccinimida 0.1 M y 3-(N,N-dimetilamino) propil-N-etilcarbodiimida 0.1 M con un caudal de 5 µ?/min. Se inyecta el anticuerpo IgG anti -humano en acetato sódico de pH 5.0 en una concentración de 10 g/ml . Se trata una célula de flujo de control de referencia de igual manera, pero con reguladores de pH de vehículo solamente, en lugar del anticuerpo de captura. Se bloquean las superficies con la inyección de etanolamina 1 M/HC1 de pH 8.5. Se diluyen los anticuerpos IGF- IR en HBS-P y se inyectan. Todas las interacciones se realizan a 25 °C (temperatura estándar) . Se inyecta la solución de regeneración de cloruro magnésico 3 M durante 60 s con un caudal de 5 µ?/min para eliminar cualquier proteína unida mediante enlace no covalente después de cada ciclo de fijación. Se detectan las señales a razón de una señal por segundo. Se inyectan las muestras en concentraciones crecientes. En la Figura 17 se representa el formato de ensayo aplicado. Para reforzar las uniones monovalentes se elige una densidad de carga baja con una densidad de anticuerpo de captura y anticuerpo IGF-IR.

Para las mediciones de afinidad se inmoviliza el FcglIIa humano en un chip sensor CM-5 por captura del - - receptor marcado con His de un anticuerpo anti-His (Penta-His, Qiagen) que se ha anclado en la superficie por la química estándar de condensación de amina y bloqueo en un instrumento SPR (Biacore T100) . Después de la captura del FcgRIIIa se inyectan anticuerpos IGF1R 50 nM a 25 °C con un caudal de 5 µ?/min. Después se regenera el chip con un pulso de 60 s de una solución de glicina-HCl 10 mM, de pH 2.0.

Ensayo de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés) Determinación de funciones e.fectoras mediadas por anticuerpos anti-IGF-IR. Con el fin determinar la capacidad de generar anticuerpos que desencadenen mecanismos efectos inmunes se realizan estudios de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) . Para estudiar los efectos de los anticuerpos en la ADCC, se marcan las células que expresan el DU145 IGF-IR (1 x 106 células/ml) con 1 µ? por mi de solución BATDA (Perkin Elmer) durante 25 minutos a 37 °C en una incubadora celular. Después se lavan las células cuatro veces con 10 mi de RPMI -FM/penicilina-estreptomicina y se centrifugan durante 10 minutos a una velocidad de 200 x g. Antes del último paso de centrifugación se determinan los números de las células y se diluyen las células hasta lxlO5 células/ml en medio RPMI -FM/penicilina-estreptomicina del que se obtendrá el granulado de centrifugación. Se depositan las células a razón de 5,000 por cavidad en una placa de cavidades de fondo redondo, en un volumen de 50 µ?. Se añaden los anticuerpos HuMAb en una concentración final situada entre 25 y 0.1 g/ml en un volumen de 50 µ? de medio de cultivo por 50 µ? de suspensión celular. A continuación se añaden 50 µ? de células efectoras PBMC recién aisladas en una proporción E:T de 25:1. Se centrifugan las placas a 200 x g durante 1 minuto, después se incuban a 37 °C durante 2 horas. Después de la incubación se centrifugan las células a 200 x g durante 10 minutos, se recogen 20 µ? del líquido sobrenadante y se transfieren a una placa del tipo Optiplate 96-F. Se añaden 200 µ? de solución de europio (Perkin Elmer, a temperatura ambiente) y se incuban las placas durante 15 minutos sobre una plataforma agitadora. Se cuantifica la fluorescencia en un fluorímetro de resolución temporal (Víctor 3, Perkin Elmer) aplicando el método Eu-TDA de Perkin Elmer. La magnitud de la lisis celular por ADCC se expresa en forma de % de la liberación máxima de intensificador de fluorescencia TDA a partir de las células diana lisadas con detergente, corregida con la liberación espontánea de TDA de las células diana en cuestión.

Ensayo de internalización del IGF- IR La unión de los anticuerpos y de las proteínas de unión a antígenos según la invención al IGF-IR se traduce en la internalización y la degradación del receptor. El seguimiento de este proceso puede realizarse incubando las células HT29 CRC que expresan al IGF- IR con anticuerpos dirigidos contra el IGF- IR y después cuantificando con un ensayo ELISA los niveles restantes de la proteína IGF-1R en los lisados celulares.

A tal fin se incuban las células HT29 a razón de 1.5 x 104 células/cavidad en una MTP de 96 cavidades en médio RPMI con 10% de FCS a 37°C y un 5% de C02 durante una noche para que las células puedan adherirse. A la mañana siguiente se aspira el medio y se añaden 100 µ? de anticuerpo anti-IGF-IR diluido en medio RPMI + 10% de FCS en concentraciones que van de 10 nM a 2 pM en pasos de dilución 1:3. Se incuban las células con anticuerpo a 37°C durante 18 horas. Después se elimina de nuevo el medio y se añaden 120 µ? de regulador de pH de lisis MES (MES 25 mM de pH 6.5 + completo) .

Para el ensayo ELISA se introducen en las placas de poliestireno de 96 cavidades recubiertas con estreptavidina (Nunc) 100 µ? del MAK<hu IGF-lRa>hu-la- IgG-Bi (Ch.10) diluido 1:200 en BSA al 3% en PBST (concentración final: 2,4 µg/ml) y se incuban con agitación constante a temperatura ambiente durante 1 hora. Después se separa el contenido de la cavidad y se lava cada cavidad tres veces con 200 µ? de PBST. Se añaden a cada cavidad 100 µ? de la solución de lisado celular, se incuban de nuevo a temperatura ambiente durante 1 hora en una plataforma agitadora de placas y se lavan tres veces con 200 µ? de PBST. Se separa el líquido sobrenadante, - - se añaden 100 µ?/cavidad de PAK<human IGF-lRa>Ra-C20-IgG (Santa Cruz No. sc-713) diluido 1:750 en BSA al 3% en PBST, se incuban de igual modo y se lavan con los mismos intervalos antes descritos. Con el fin detectar el anticuerpo específico unido al IGF-1R se añaden 100 µ?/cavidad de un anticuerpo policlonal de conejo conjugado con peroxidasa de rábano rusticano (Señalización Celular, No. 7074) diluido 1:4000 en BSA al 3% en PBST. Pasada otra hora se separa de nuevo el anticuerpo no fijado por lavado a fondo, 6 veces, del modo antes descrito. Para cuantificar el anticuerpo unido se añaden 100 µ?/cavidad de 3 , 3 ' - 5 , 5 ' - tetra-metilbencidina (Roche, BM-Blue No. de cat . 11484281) y se incuban a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se interrumpe la reacción colorimétrica por adición de 25 µ?/cavidad de H2S04 1M y se mide la absorción de la luz en una longitud de onda de 450 nm. Se emplean las células no tratadas con anticuerpo como control para la regulación decreciente del 0%, y el regulador de pH de lisis como control de base.

Ensayo de autofosforilación del IGF-1R (estimulación del IGF-1) El impacto de los anticuerpos IGF- IR sobre el IGF-1R se traduce en la inhibición de la autofosforilación inducida por la IGF-1. Hemos investigado la inhibición de la autofosforilación del anticuerpo IGF- IR monovalente sin hélices super-enrrolladas y la hemos comparado con la del - - anticuerpo IgGl IGF-1R original. Para este fin se tratan las células 3T3-IGF-1R, una línea celular de fibroblastos murinos que sobreexpresan el IGF- IR humano, con IGF-1 recombinante humana 10 nM durante 10 minutos en presencia de diferentes concentraciones de anticuerpos IGF- IR monovalentes y bivalentes. Después de la lisis de las células se determinan los niveles de la proteína IGF- IR fosforilada mediante un ensayo ELISA específico del fosfo-IGF- IR, que combina un anticuerpo de captura específico del IGF- IR humano y un anticuerpo detección específico de la fosfo-tirosina .

Determinación de propiedades farmacocinéticas (PK, por sus siglas en inglés) : cinética de dosis individual en ratones Métodos Animales Ratones NMRI hembra, alimentados, de peso corporal: 23-32 g en el momento en el que se les administra el compuesto de la invención.

Método de estudio Para una dosis individual i.v. de 10 mg/kg se dividen los ratones en 3 grupos de 2-3 animales cada uno. Se extraen muestras de sangre del grupo 1 al cabo de 0.5, 168 y 672 horas, del grupo 2 al cabo de 24 y 336 horas y del grupo 3 al cabo de 48 y 504 horas de la dosificación.

Las muestras de sangre de 100 µ? se obtienen por punción retrobulbar. Se obtienen muestras de suero de por lo menos de 40 µ? a partir de la sangre después de 1 hora a temperatura ambiente por centrifugación (9300xg) a temperatura ambiente durante 2.5 min. Después de la centrifugación se congelan directamente las muestras de suero a -20°C hasta el momento del análisis.

Análisis Se determinan las concentraciones de anticuerpos humanos en suero de ratones con un ensayo inmunoabsorbente asociado a enzima (ELISA, por sus siglas en inglés) empleando suero de ratón al 1%. En un primer paso se depositan en las placas de microvaloración recubiertas con estreptavidina los anticuerpos monoclonales biotinilados dirigidos contra el FCY humano (mAb<hFcYPAN>IgG-Bi) . En el paso siguiente se añaden muestras de suero (en diversas diluciones) y los patrones de referencia, respectivamente, y se unen al mAb<hFcYPAN>IgG-Bi inmovilizado. A continuación se añade el anticuerpo monoclonal digoxigenilado contra el Fcy (mAb<hFcYPA >IgG-Dig) humano. Se detectan los anticuerpos humanos con el conjugado del anticuerpo anti -Dig-peroxidasa de rábano rusticano. Se emplea una solución de ABTS-como sustrato de la peroxidasa de rábano rusticano. La especificidad del anticuerpo de captura y detección, que no tiene reacción cruzada con la IgG de ratón, permite la determinación cuantitativa de los anticuerpos humanos en las muestras de suero de ratón.

- - Cálculos Se calculan los parámetros farmacocinéticos por análisis no compartimentado, empleando el programa informático de evaluación farmacocinética llamado WinNonlinTM, versión 5.2.1.

Tabla 1: Parámetros farmacocinéticos computados - - Para evaluar los anticuerpos humanos se emplean los siguientes parámetros farmacocinéticos : - La concentración inicial estimada para modelos de bolo i.v. (C0) .

La concentración máxima observada (Cmax) , existente en (Tmax) .

El tiempo de concentración máxima observada (Tmax) .

El área debajo de la curva de concentración/tiempo AUC(O-inf) se calcula por la regla trapezoidal lineal (con interpolación lineal), de tiempo 0 a infinito .

- La vida media terminal aparente (Tl/2) se deriva de la ecuación: Tl/2 = 1?2 / ?? .

- La eliminación corporal total (CL) se calcula en forma de dosis/AUC ( 0- inf . ) - El volumen de distribución en estado constante (Vss) , calculado como MRT ( 0 - inf . ) x CL (MRT ( 0- inf . ) , definido como AUMC ( 0 - inf . ) /AUC ( 0 - inf . ) .

B. Ejemplos Ejemplo 1 Generación de anticuerpo monovalente Hemos diseñado las proteínas monovalentes que se unen a antígenos contra el c-Met (SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 2; c-Met 5D5 MoA ("wt")), el IGF-1R (SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 4; IGF1R AK18 MoAb ( "wt" ) ) y el HER3 (SEC ID NO : 5 y SEC ID NO: 6; Her3 205 MoAb ( "wt" ) ) en base al principio de diseño representado en la Figura 1A. Además se diseñan los mismos anticuerpos monovalentes contra el c-Met (SEC ID NO: 7 y SEC ID NO: 8; c-Met 5D5 MoAb KiH) , IGF-1R (SEC ID NO: 9 y SEC ID NO: 10; IGF1R AK18 MoAb KiH) y HER3 (SEC ID NO: 11 y SEC ID NO: 12; Her3 205 MoAb KiH) incorporando mutaciones en las partes CH3 para apoyar la heterodimerización de la tecnología de hélices super-enrrolladas (KiH) (Merchant, A.M. y col., Nat. Biotechnol . 16, 677-681, 1998) . Todos los anticuerpos monovalentes se expresan de modo transitorio en células HEK293 del modo antes descrito y después se purifican por cromatografía de afinidad asociada a la proteína A y después por cromatografía de exclusión de tamaños.

Las figuras 3A-5B representan los cromatogramas de exclusión de tamaño de tres proteínas monovalentes diferentes, que se unen a antígenos, sin hélices super-enrrolladas, así como el correspondiente SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras.

Se confirma el tamaño de los diferentes tipos por SEC-MALLS (Figura 4C) y se confirma la identidad de las proteínas aisladas por espectrometría de masas. En su conjunto, estos datos indican que el entrecruzamiento CH1-CL permite una purificación fácil de un anticuerpo monovalente puro (pico 3 en las Figura 3A-3B, pico 2 en las Figura 4A-4C, pico 3 en las Figuras 5A-5B) sin necesidad de incluir hélices super-enrrolladas en la porción Fe para reforzar la heterodimerización. Este producto puede separarse en la línea de base por cromatografía de exclusión de tamaños de una forma dímera divalente de la proteína que se une al antígeno (MoAb-dímero) como producto secundario del modo representado en la Figura 1C, que precede al pico de la proteína monovalente que se une al antígeno. La mayoría de los puentes cisteína del constructo dímero divalente, que se entrecruza con el dímero, no están cerrados, lo cual conduce a la observación de que en condiciones no reductoras del ensayo SDS-PAGE se observa un producto principal en 100 kDa y no en 200 kDa como cabría esperar (pico 2 de las Figuras 3A-3B, pico 1 de las Figuras 4A-4C, pico 2 de las Figuras 5A-5B) . El pico adicional (pico 1 de las Figuras 3A-3B, pico 1 de la Figura 5) que puede observarse para el c-Met 5D5 MoAb ("wt") y Her3 205 MoAb ("wt") representa agregados de peso molecular más elevado. Esto está en contraposición con el anticuerpo monovalente descrito en WO/2007/048037 , cuya mezcla de anticuerpos monovalentes heterodímeros y homodímeros (Figuras 2A-2B) no puede separarse por medios convencionales.

Las figuras 5A-6B contienen los cromatogramas de la cromatografía de exclusión de tamaños de las tres proteínas monovalentes diferentes, que se unen a antígenos con hélices super-enrrolladas así como el correspondiente SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras .

Aplicando esta tecnología de hélices super-enrrolladas para la heterodimerización de Fe se pueden mejorar los rendimientos relativos de proteína monovalente heterodímera que se une al antígeno si se compara con el MoAb-dímero bivalente tal como se representa en las figuras 6A-8B.

Ejemplo 2 Fosforilación c-Met (Figura 9) Se ha descrito la c-Met como tirosina-cinasa de receptor oncogénica que, después de la desregulación, fomenta la transformación celular. En el pasado se han descrito anticuerpos dirigidos contra la c-Met. El MetMAb/OA- 5D5 (Genentech) es un anticuerpo de este tipo, que inhibe la activación de la c-Met dependiente de ligando. Dado que el anticuerpo bivalente es activador, se ha diseñado como constructo de un brazo, en el que se ha eliminado un brazo FAb para obtener un anticuerpo monovalente. Para demostrar una eficacia similar al OA-5D5 y la proteína monovalente c-Met MoAb que se une al antígeno (c-Met 5D5 MoAb ("wt")), se incuban células A549 con los anticuerpos correspondientes en ausencia o presencia del HGF, el único ligando conocido de la c-Met. A diferencia del MetMAb bivalente (MetMAb (biv. Ab) ) , ninguno de los anticuerpos tiene potencial activador en ausencia del HGF. Además, tal como cabía esperar, el c-Met MoAb (c-Met 5D5 MoAb ("wt")) es tan eficaz suprimiendo la fosforilación de receptor inducida por ligando como el OA-5D5. Un anticuerpo de control IgG humano inespecífico no influye en la fosforilación de receptor de c-Met dependiente del HGF.

Ejemplo 3 Fijación celular sobre líneas celulares que expresan la c-Met (Figura 10) Se demuestra la unión celular de la proteína monovalente c-Met MoAb (c-Met 5D5 MoAb ( "wt" ) ) que se une al antígeno en células A549. Se incuba una suspensión celular en concentraciones de una serie de diluciones triples (100 -0,0003 ug/ml) de los anticuerpos indicados. Los anticuerpos unidos se visualizan con un anticuerpo secundario asociado a Alexa488, que se une a la región constante de la inmunoglobulina humana. La intensidad de fluorescencia de las células individuales se mide en un citómetro de flujo del tipo FACS Canto (BD Biosciences) . No se observan diferencias de unión entre el c-Met MoAb y el OA-5D5, lo cual indica que el c-Met MoAb (c-Met 5D5 MoAb ("wt")) se une eficazmente a la c.-Met de la superficie de las células, unión semi -máxima OA-5D5 1.45 n c-Met MoAb 1.57 nM Ejemplo 4 Afinidad de unión con el IGF- IR (Figura 11) La unión del dominio extracelular del IGF- IR de la proteína monovalente IGF1R MoAb (IGF1R AK18 MoAb ("wt")) que se une al antígeno se compara con la unión del anticuerpo <IGF-1R> IgGl original por resonancia de plasmón de superficie (SPR) . En la Figura 17 se representa el esquema del ensayo SPR para determinar la afinidad monovalente. Los análisis (determinación por duplicado) indican que la afinidad de unión con el IGF- IR se conserva en el anticuerpo monovalente . k(act) k(desact) KD Mab (IGF-1R) 1.74E+06 6.63E-03 3.80E-09 MoAb (IGF-1R) 1.3E+06 2.9E-03 2.16E-09 - - MoAb (IGF-1R) 2.4E+06 3.3E-03 1.4E-09 Ejemplo 5 Unión celular a las líneas celulares que expresan el IGF-1R (Figura 12) La unión celular de la proteína monovalente IGF1R MoAb (IGF1R AK18 MoAb ("wt")) que se une al antígeno se demuestra en las células A549. Las células A549 en la fase de crecimiento logarítmico se despeja con Accutase (Sigma) y se emplean 2xl05 células para la incubación con cada anticuerpo individual. Se añade el MoAb en concentraciones de una serie de diluciones triples (100 - 0.0003 g/ml) . Los anticuerpos unidos se visualizan con un anticuerpo secundario asociado a Alexa488 (5 g/ml) , que se une a la región constante de la inmunoglobulina humana. Las células muertas se tiñen con 7-AAD (BD) y se excluyen del análisis. La intensidad de fluorescencia de las células individuales se mide en un citómetro de flujo del tipo FACS Canto (BD Biosciences) . Los datos indican que hay una diferencia en la unión semi -máxima con las células, debida al hecho de que el anticuerpo IGF-1R IgGl se puede unir con dos brazos al IGF- IR de las células y presenta un efecto de avidez, mientras que el anticuerpo monovalente solamente tiene un brazo para realizar la unión, unión semi -máxima IGF-1R (150kDa) 0.76 nM IGF-1R MoAb (100kDa)5.65 nM Ejemplo 6 Inducción de la ADCC (Figura 13) Pueden utilizarse las células mononucleadas de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) derivadas de donantes para medir el reclutamiento celular efecto causado por anticuerpo de glicoingeniería y anticuerpo no diseñados por glicoingeniería en células cancerosas. La lisis de las células cancerosas guarda relación con la citotoxicidad mediada por las células NK y es proporciona a la capacidad del anticuerpo para reclutar células NK. En este contexto especial se incuban células de cáncer de próstata DU145 en una proporción 1:25 (DU145:PBMC) con PBMC en ausencia o presencia de los anticuerpos correspondientes. Después de 2 horas se determina la lisis celular con el sistema BATDA/europio ya descrito previamente. La magnitud de la lisis celular por ADCC se expresa en forma de % de la liberación máxima de intensificador de fluorescencia TDA a partir de las células diana lisadas con detergente, corregida con la liberación espontánea de TDA de las células diana en cuestión. A pesar de la afinidad aparentemente más baja con respecto al IGF- IR en las células, los datos indican que la proteína monovalente no diseñada por glicoingeniería IGF1R MoAb (IGF1R AK18 MoAb (¾")), que se une al antígeno, es superior induciendo la ADCC en concentraciones elevadas, si se compara con el anticuerpo IGF-1R original, no diseñado por glicoingeniería . De modo sorprendente, la proteína monovalente no diseñada por glicoingeniería IGFIR MoAb (IGFIR AK18 MoAb ("wt")), que" se une al antígeno, es incluso superior induciendo la ADCC en concentraciones elevadas que el anticuerpo IGF-IR original de glicoingeniería, que presenta una caída en el ensayo de la ADCC que va a concentraciones elevadas. Las proteínas monovalentes (IGFIR AK18 MoAb ("wt")), que se unen al antígeno IGF-IR y que median la internalizacion reducida del IGF- IR e intensifican la ADCC debido a la internalizacion reducida (ver más abajo) y doblan la cantidad de partes Fe que se unen a los receptores FcRIIIa de las células efectoras, pueden constituir por tanto una estrategia prometedora de dirigirse contra el IGF-IR en las células cancerosas; igual que los anticuerpos no diseñados por glicoingeniería como los diseñados por glicoingeniería.

Ejemplo 7 Ensayo de internalizacion del IGF-IR (Figura 14) El direccionamiento de IGF-IR con anticuerpos IGF-IR originales bivalentes se traduce en la internalizacion de IGF-IR. Hemos investigado las propiedades de internalizacion de la proteína monovalente IGFIR MoAb (IGFIR A 18 MoAb ("wt")) que se une al antígeno. Los datos de la Figura 14 indican que la internalizacion del IGF-IR se reduce en términos de potencia y de internalizacion absoluta cuando está unida la proteína monovalente IGF1R MoAb (IGF1R AK18 MoAb ("wt")) que se une al antígeno.

El direccionamiento de IGF- IR de las células tumorales con anticuerpos IGF- IR bivalentes se traduce en la internalizacion y la degradación lisosómica del IGF- IR. Hemos investigado las propiedades de internalizacion de la proteína monovalente IGF1R MoAb (IGF1R AK18 MoAb ("wt")) que se une al antígeno. Para tal fin se tratan las células de cáncer de colon HT29 durante 18 horas con diferentes concentraciones de proteína monovalente IGF1R MoAb (IGF1R AK18 MoAb ("wt")) que se une al antígeno y con el anticuerpo IGF- IR bivalente original. Después de la lisis de las células, los niveles restantes de proteíña IGF- IR se determinan con un ensayo ELISA específico del IGF-1R.

Lós datos de la Figura 14 indican que la internalizacion del IGF- IR se reduce en términos de potencia y de internalizacion absoluta cuando está unida la proteína monovalente IGF1R MoAb (IGF1R AK18 MoAb ("wt")) que se une al antígeno. La internalizacion máxima se reduce del 83% (IgGl) al 48% (MoAb) , la concentración requerida para la inhibición semimáxima aumenta de 0.027 nM (IgGl) a 1.5 nM (MoAb).

Ejemplo 8 Autofosforilación del IGF-1R (estimulación del IGF-1) (Figura 15) El impacto de los anticuerpos IGF- IR sobre el IGF- - - 1R se traduce en la inhibición de la autofosforilación inducida por la IGF-1. Se ha investigado la inhibición de la autofosforilación de la proteína IGFIR MoAb (IGF1R AK18 MoAb ("wt")) que se une al antígeno y la hemos comparado con la del anticuerpo IgGl IGF-1R original. Para este fin se tratan las células 3T3-IGF-1R, una línea celular de fibroblastos murinos que sobreexpresan el IGF-IR humano, con IGF-1 recombinante humana 10 nM durante 10 minutos en presencia de diferentes concentraciones de la proteína IGF1R MoAb monovalente (IGF1R AK18 MoAb ("wt")), que se une al antígeno, y el anticuerpo IGF- IR bivalente original. Después de la lisis de las células se determinan los niveles de la proteína IGF- IR fosforilada mediante un ensayo ELISA específico del fosfo-IGF-lR, que combina un anticuerpo de captura específico del IGF- IR humano y un anticuerpo detección específico de la fosfo-tirosina .

Los datos de la Figura 15 indican que la proteína monovalente IGF1R MoAb (IGF1R AK18 MoAb ("wt")), que se une al antígeno, puede inhibir la autofosforilación inducida por la IGF-1, aunque en una concentración más elevada, debido a la unión monovalente de las células (falta del efecto avidez debido a que la unión es bivalente) . La concentración requerida para la inhibición semi -máxima aumenta de 1,44 nM (IgGl) a 27.9 nM (MoAb). Dado que la diferencia de los valores IC50 entre los anticuerpos monovalentes y los bivalentes es ligeramente menos pronunciada en la autofosforilación del IGF-1R (19 veces) si se compara con la regulación decreciente del IGF-1R (59 veces) , el impacto reducido de la unión monovalente en la regulación decreciente no puede explicarse solamente con la afinidad reducida con el IGF-1R.

Ejemplo 9 Estabilidad de proteína monovalente IGF- IR que se une al antígeno (Figura 16) Se estudia la estabilidad de la proteína monovalente IGF1R MoAb (IGF1R AK18 oAb ("wt") ) , que se une al antígeno, con la dispersión dinámica de la luz, ya descrita previamente. Resumiendo, se evalúa la tendencia a la agregación de la proteína monovalente IGF1R MoAb que se une al antígeno con un ensayo DLS de cierta duración a 40°C. Durante un período de cinco días no se detecta (ver Figura 16) un aumento medible del radio hidrodinámico (Rh) de la fracción de monómero aislada (ver Figura 10) .

E emplo 10 Determinación de propiedades farmacocinéticas (PK) Las propiedades farmacocinéticas de los anticuerpos monovalentes de la invención se determinan en ratones NMRI , hembra, alimentados, de peso corporal: 23-32 g en el momento de la administración del compuesto en un estudio PK de una sola dosis, tal como se ha descrito previamente (en la sección de los métodos) .

Las propiedades PK se recogen en la siguiente tabla e indican que la proteína monovalente IGFIR MoAb (IGFIR AK18 MoAb ("wt")) que se une al antígeno tiene mejores propiedades PK que el anticuerpo <IGF-1R> IgGl original.

Tabla 2 : Resumen de las propiedades Ejemplo 11 Ensayo EM-ESI del IGF- IR MoAb (Figuras 17 y 18) La proteína monovalente IGFIR MoAb (IGFIR AK18 MoAb ("wt")) que se une al antígeno se expresa de modo transitorio y se purifica por afinidad con la proteína A y por cromatografía de exclusión de tamaños (SEC) . Después de la SEC preparativa se eluye el anticuerpo arrojando dos picos separados (pico 1 y pico 2) , que se recogen. La SEC analítica de la fracción 2 (pico 2) corresponde a un peso molecular de 100 kDa que indica un monómero definido. La SEC-MALLS confirma el resultado inicial de la SEC e indica para la fracción 2 (monómero) a peso molecular de 99,5 kDa . El análisis por SDS-PAGE de esta fracción en condiciones desnaturalizadoras y reductoras indica una banda principal, con un peso molecular aparente de 50-60 kDa . En condiciones no reductoras, la fracción 2 (monómero) presenta una banda principal en torno a un peso molecular de 100 kDa.

Fracción 1 = 165 mi Fracción 2 = 190 mi Los espectros EM-ESI del MoAbs desglicosilado de la fracción 2 presentan una serie de picos que corresponden a un monómero que tiene un peso de 98151 Da.

Tabla 3 : Resumen de los datos EM de las mediciones EM-ESI no reductoras de la fracción 2.

Las mediciones EM en condiciones reductoras de la fracción 2 indican la secuencia y expresión correctas del constructo. Los datos EM de la fracción 2 indican dos cadenas pesadas diferentes, de un peso molecular de 47959 Da y 50211 Da, en cantidades aproximadamente iguales.

- - Tabla 4 : Resumen de los datos EM de las mediciones EM-ESI en condiciones reductoras de la fracción 2 Ejemplo 12 Producción de proteínas que se unen a antígenos, diseñadas por glicoingeniería Para la producción de la proteína de glicoingeniería que se une al antígeno se transfectan células HEK-EBNA empleando el método del fosfato cálcico, con cuatro plásmidos. Dos codifican las cadenas del anticuerpo, uno es para la expresión de un polipéptido GnTIII de fusión (un vector de expresión GnT-III) y uno es para la expresión de la manosidasa II (un vector de expresión de la manosidasa II de Golgi) en una proporción de 4:4:1:1, entre ellos. Se cultivan las células en forma de cultivos monocapa adherentes en matraces T empleando un medio de cultivo DMEM suplementado con un 10% de FCS y se transfectan cuando alcanzan un grado de confluencia entre el 50 y el 80%. Para la transfección de un matraz T150 se siembran 15 millones de células 24 horas antes de la transfección a 25 mi de un medio de cultivo DMEM suplementado con FCS (al 10% en V/V, concentración final) y se introducen las células en una incubadora a 37 °C con una atmósfera del 5% de C02 durante una noche. Para cada matraz T150 a transfectar se prepara una solución de ADN, CaCl2 y agua mezclando 94 µg de ADN vector plásmido total, dividido en partes iguales entre vectores de expresión de la cadena pesada y ligera, y agua hasta un volumen final de 469 µ? y 469 µ? de una solución 1M de CaCl2. A esta solución se le añaden 938 µ? de una solución de HEPES 50 mM, NaCl 280 mM, Na2HP04 1.5 mM de pH 7.05, se mezclan inmediatamente durante 10 s y se dejan en reposo a temperatura ambiente durante 20 s. Se diluye la suspensión con 10 mi de DMEM suplementado con un 2% de FCS y se introduce en el T150 en lugar del medio existente. Después se añaden otros 13 mi de medio de transíección . Se incuban las células a 37 °C, con un 5% de C02 durante un período de tiempo de 17 a 20 horas, después se reemplaza el medio por 25 mi de DMEM, con un 10% de FCS. Se recoge el medio de cultivo acondicionado aprox. 7 días después del reemplazo de medios por centrifugación a 210 x g durante 15 min, se filtra la solución en condiciones estériles (filtro de 0.22 µp?) , se añade azida sódica en una concentración final de 0.1% p/v y se guardan a 4°C.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Una proteína monovalente que se une a un antígeno caracterizada porque comprende: a) una cadena pesada modificada de un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno, en la que el dominio VH se ha reemplazado por el dominio VL de tal anticuerpo; y b) una cadena pesada modificada de tal anticuerpo, en la que el dominio CHl se ha reemplazado por el dominio CL de tal anticuerpo.

2. La proteína monovalente que se une al antígeno de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el dominio CH3 de la cadena pesada modificada del anticuerpo de a) y el dominio CH3 de la cadena pesada modificada del anticuerpo de b) se unen entre sí en una interfase, que está formada por la interfase original entre los dominios CH3 del anticuerpo; tal interfase está alterada para fomentar la formación de la proteína monovalente que se une al antígeno, tal alteración se describe porque: i) el dominio CH3 de una cadena pesada está alterado, de modo que dentro de la interfase original el dominio CH3 de una cadena pesada, que se une a la interfase original del dominio CH3 de la otra cadena pesada dentro de la proteína monovalente que se une al antígeno, se reemplaza un resto aminoácido por un resto aminoácido que tiene un mayor volumen de cadena lateral , con lo cual se genera una protuberancia dentro de la interfase del dominio CH3 de una cadena pesada que puede alojarse dentro de una cavidad de la interfase del dominio CH3 de la otra cadena pesada y ii) el dominio CH3 de la otra cadena pesada está alterado, de modo que dentro de la interfase original del segundo dominio CH3 , que se une a la interfase original del primer dominio CH3 de la proteína monovalente que se une al antígeno, se reemplaza un resto aminoácido por un resto aminoácido que tiene un menor volumen de cadena lateral, con lo cual se genera una cavidad en la interfase del segundo dominio CH3 , dentro de la cual puede alojarse una protuberancia de la interfase del primer dominio CH3.

3. La proteína monovalente que se une al antígeno de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque tal resto aminoácido que tiene un mayor volumen de cadenas laterales se elige entre el grupo formado por arginina (R) , fenilalanina (F) , tirosina (Y) , triptófano (W) y tal resto aminoácido que tiene un menor volumen de cadenas laterales se elige entre el grupo formado por alanina (A) , serina (S) , treonina (T) , valina (V) .

4. La proteína monovalente que se une al antígeno de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque los dos dominios CH3 están alterados además por la introducción de cisteína (C) como aminoácido en las posiciones correspondientes de cada dominio CH3 de modo que pueda formarse un puente disulfuro entre los dos dominios CH3.

5. La proteína monovalente que se une al antígeno de conformidad con las reivindicaciones de 1 a 4, caracterizada porque es del isotipo IgGl humano.

6. La proteína monovalente que se une al antígeno de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque contiene a) una cadena pesada modificada que contiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1; y b) una cadena pesada modi icada que contiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2; o bien a) una cadena pesada modificada que con iene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 3; y b) una cadena pesada modificada que contiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 4; o bien a) una cadena pesada modificada que contiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 5; y b) una cadena pesada modificada que contiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 6; o bien a) una cadena pesada modificada que contiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 7; y b) una cadena pesada modificada que contiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 8; o bien a) una cadena pesada modificada que contiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 9; y b) una cadena pesada modificada que contiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 10; o bien a) una cadena pesada modificada que contiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 11; y b) una cadena pesada modificada que contiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 12.

7. La proteína monovalente que se une al antígeno de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 ó 6, caracterizada porque las cadenas pesadas modificadas de a) y b) son del isotipo IgGl y la proteína, que se une al antígeno es afucosilada, con una cantidad de fucosa de 80% o menos de la cantidad total de oligosacáridos (azúcares) en Asn297, y es de isotipo IgGl humano.

8. Una composición farmacéutica de una proteína monovalente caracterizada porque se une a un antígeno de conformidad con las reivindicaciones 1 a 7.

9. Una composición farmacéutica caracterizada porque contiene una proteína monovalente que se une a un antígeno de conformidad con las reivindicaciones 1 a 7, y por lo menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

10. La proteína monovalente que se une al antígeno de conformidad con las reivindicaciones 1 a 7 para el usarse en el tratamiento del cáncer.

11. Uso de la proteína monovalente que se une al antígeno de conformidad con las reivindicaciones 1 a 7, para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer.

12. Un método para el tratamiento de un paciente que necesite la terapia, caracterizado porque comprende administrar al paciente una' cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína monovalente que se une a un antígeno de conformidad con las reivindicaciones 1 a 7.

13. Un método para la preparación de una proteína monovalente que se une a un antígeno de conformidad con las reivindicaciones de 1 a 7, caracterizado porque comprende de los pasos siguientes: a) transformar una célula hospedera con vectores que contengan moléculas de ácido nucleico que codifican a una proteína monovalente que se une a un antígeno de conformidad con las reivindicaciones 1 a 7, b) cultivar la célula hospedera en condiciones que permitan sintetizar tal proteína monovalente que se une a la molécula de antígeno; y c) recuperar tal proteína monovalente que se une a la molécula de antígeno de tal cultivo.

14. Ácido nucleico que codifica a la proteína monovalente caracterizado porque se une al antígeno de conformidad con las reivindicaciones 1 a 7.

15. Un vector caracterizado porque comprende un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 14.

16. Una célula hospedera caracterizada porque comprende el vector de conformidad con la reivindicación 15.