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MX2013009742A - Vacuna de glicolipopeptidos a base de muc1 con adyuvante. - Google Patents

Vacuna de glicolipopeptidos a base de muc1 con adyuvante.

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Publication number
MX2013009742A
MX2013009742A MX2013009742A MX2013009742A MX2013009742A MX 2013009742 A MX2013009742 A MX 2013009742A MX 2013009742 A MX2013009742 A MX 2013009742A MX 2013009742 A MX2013009742 A MX 2013009742A MX 2013009742 A MX2013009742 A MX 2013009742A
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MX
Mexico
Prior art keywords
cancer
group
independently
seq
vaccine formulation
Prior art date
Application number
MX2013009742A
Other languages
English (en)
Inventor
Scott Peterson
Jeffrey Millard
Sandy Koppenol
Linda Pestano
Diana F Hausman
Robert L Kirkman
Original Assignee
Oncothyreon Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Oncothyreon Inc filed Critical Oncothyreon Inc
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Abstract

En el presente documento se proporcionan formulaciones de vacuna glicolipopeptídica liposomal que comprenden un adyuvante y un agente inmunógeno para inmunoterapia y/o tratamiento del cáncer.

Description

VACUNA DE GLICOLIPOPEPTIDOS A BASE DE MUCl CON ADYUVANTE REFERENCIA CRUZADA La presente solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de Estados Unidos N° 61/446,332, presentada el 24 de febrero de 2011 y la Solicitud Provisional de Estados Unidos N° 61/470,449, presentada el 31 de marzo de 2011, cada una de las cuales se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad.
LISTA DE SECUENCIAS La presente solicitud contiene una Lista de Secuencias que se ha presentado en formato ASCII a través de EFS-Web y se incorpora por la presente por referencia en su totalidad. Dicha copia en ASCII, creada el 23 de febrero de 2012, se denomina 34395PCT.txt y tiene un tamaño de 7.683 bytes .
ESTADO DE LA INVENCIÓN La inmunoterapia del cáncer dirige el sistema inmune para reconocer antigenos asociados a tumores y ataca a células cancerosas.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En el presente documento se proporcionan formulaciones de vacuna inmunogénica que potencian el sistema inmunológico para el tratamiento de tumores malignos. En algunas realizaciones, las formulaciones inmunoterapéuticas que se describen en el presente documento provocan respuestas de linfocitos B y/o linfocitos T específicos de antígenos. En algunas realizaciones, las formulaciones de vacuna que se describen en el presente documento comprenden antígenos sintéticos que provocan una respuesta inmune que reconoce antígenos asociados a tumores y ataca a las células cancerosas. Las formulaciones de vacuna inmunogénica que se describen .en el presente documento aumentan la eficacia de los regímenes existentes para tratamiento de cáncer.
En el presente documento se proporcionan formulaciones de vacuna liposomal que comprenden: (a) un péptido que comprende al menos dos copias de una repetición en tándem de núcleos: TSAPDTRPAPGSTAPPAHGV, (SEC ID NO: 1) o una secuencia idéntica al menos en un 85 % al SEC ID NO: 1, o permutaciones lineales de la misma; en que S y T están independientemente, en cada caso, opcionalmente sustituidos con epítopo de Te de hidratos de carbono asociados a cáncer; (b) un lipopéptido unido covalentemente a (a) que tiene la fórmula: H2N-(aal)* (aa2)* (aa3)-OH en que aal se selecciona independientemente, en cada caso, entre S, T, , R o C; aa2 se selecciona independientemente, en cada caso, entre S, T, K, R o C; aa3 se selecciona independientemente, en cada caso, entre L o G; * independientemente, en cada caso, representa un lípido unido covalentemente a un resto de aminoácido; (c) un adyuvante de Fórmula I: Fórmula I en que al menos uno de Rl, R2, R3, R5, R6, y R7 es un grupo fuertemente lipofilico seleccionado entre el grupo que consiste en WH^-X- H3C(CH2)lt— (CH=CHCH2)n-X— \~ (ü) en que X, XI, X2, y X3 son independientemente —CO— o — CH2-; Z es -NH- o -0; k, m, y r son independientemente un número entero de 0 a 30 incluido, n y q son independientemente un número entero de 0 a 6 incluido; en que Y4 es un espaciador seleccionado entre el grupo que consiste en —0-, —S—, y —NH— en que, al menos uno de Y1R1, Y2R2, Y3R3, Y5R5, Y6R6 e Y7R7 es un equivalente de fosfato monovalente (EFM), en que cada equivalente de fosfato monovalente es, independientemente, (a) —R'—C(0)OH en el que R' es un grupo alquilo sustituido o sin sustituir de 1-4 carbonos, o (b) se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en -0B(0H)0R, -0P ( 0) ( OH ) OR, -OS (0) (0) (OH) 0R, y -OP(=0) (OH)-0-P(=0) (OH)OR, en el que R es hidrógeno, o un grupo alquilo sustituido o sin sustituir de 1-4 carbonos, y si R es un grupo alquilo sustituido, las sustituciones son —OH o —NH2, en que R8 se selecciona entre el grupo que consiste en H, OH, 0R9, un resto que en combinación con Y8 forma un equivalente de fosfato monovalente como se ha definido anteriormente, y un grupo (i)-(viii) como se ha definido anteriormente; en que R9 es un grupo alquilo o acilo con una longitud de 1 a 10 carbonos; y en que el enlace glicosidico es a o ß; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; o un adyuvante de Fórmula II: ¾rmula II en que al menos uno de Rl, R2, R3, Rll, R12 y R13 es un grupo fuertemente lipofilico seleccionado entre el grupo que consiste en (i)-(viii) mencionados anteriormente; en que Y4 es un espaciador seleccionado entre el grupo que consiste en —O—, —S—, y —NH— y en que al menos uno de Y1R1, Y2R2, Y3R3, Y11R11, Y12R12 e Y13R13 es independientemente un equivalente de fosfato monovalente como se ha definido anteriormente; en que las siguientes limitaciones se aplican tanto a (I) como a (II) mencionados anteriormente: Yl, Y2, Y3, Y5, Y6, Y7, Yll, Y12 e Y13 son espaciadores seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en -0-, -S-, y -NH-; Rl, R2, R3, R5, R6, R7 , Rll, R12 y R13 son independientemente hidrógeno, un resto que con el grupo Y numerado comúnmente forma equivalente de fosfato monovalente como se ha definido anteriormente, o un grupo fuertemente lipofílico seleccionado entre el grupo que consiste en (i)-(viii) mencionados anteriormente; los grupos fuertemente lipofilicos de dicho compuesto proporcionan colectivamente al menos dos cadenas principales de carbono, y las cadenas principales de carbono de dichos grupos fuertemente lipofilicos proporcionan colectivamente al menos 30 átomos de carbono; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y (d) uno o más vehículos lípidos.
En algunas realizaciones, la formulación es un polvo liofilizado, una película fina seca o un polvo seco. En algunas realizaciones, la formulación es un polvo liofilizado. En algunas realizaciones, la formulación de vacuna es una suspensión en agua, una emulsión, o una suspensión en aceite. En algunas realizaciones, la formulación es una suspensión en agua. En algunas realizaciones, la formulación comprende adicionalmente terc-butanol .
En algunas realizaciones, la secuencia de repetición en tándem de núcleos tiene al menos un 90 % de homología con la secuencia en (a). En algunas realizaciones, la secuencia de repetición en tándem de núcleos tiene una homología de al menos un 95 % con la secuencia en (a).
En algunas realizaciones, el vehículo líguido se selecciona entre dimoristoíl fosfatidilglicerol (DMPG), dipalmitoíl fosfatidilcolina (DPPC), fosfatidilcolina (PC; lecitina), ácido fosfatídico (PA), fosfatidilglicerol (PG), fosfatidiletanolamina (PE), fos fatidilserina (PS). Otros fosfolípidos adecuados incluyen adicionalmente diestearoilfosfatidilcolina (DSPC) , dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) , dipalmitoilfosfatidiglicerol (DPPG) , diestearoilfosfatidiglicerol (DSPG), ácido dipalmitoíl fosfatídico (DPPA); ácido dimiristoilfosfatídico (DMPA), ácido diestearoil fos fatídico (DSPA), dipalmitoilfosfatidilserina (DPPS) , dimiristoilfosfatidilserina (DMPS) , diestearoilfosfatidilserina (DSPS) , dipalmitoilfosfatidietanolamina (DPPE) , dimiristoilfosfatidiletanolamina (DMPE), diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE), o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, o combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, el vehículo lípido se selecciona entre dimiristoíl fosfatidilglicerol (DMPG), dipalmitoíl fosfatidilcolina (DPPC), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o combinación del mismo .
En algunas realizaciones, las formulaciones comprenden adicionalmente colesterol.
En algunas realizaciones, el lipido unido covalentemente a un resto de aminoácido se selecciona independientemente, en cada caso, entre cadenas de miristoílo, palmitoílo, laurilo, estearoilo, decanoílo, y octanoílo, o una combinación de las mismas. En algunas realizaciones, el lípido unido covalentemente al resto de aminoácido es independientemente, en cada caso, una cadena de miristoílo.
En algunas realizaciones, (b) está unido al extremo carboxi de (a). En algunas realizaciones, (b) está unido al extremo amino de (a).
En algunas realizaciones, (a) + (b) y- (c) están en una relación de peso de (a) + (b): peso de (c) de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1. En algunas realizaciones, (a) + (b) y (c) están en una relación de peso de (a) + (b) : peso de (c) de aproximadamente 1:5 a aproximadamente 5:1. En algunas realizaciones, (a) + (b) y (c) están en una relación de peso de (a) + (b) : peso de (c) de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 2:1.
En algunas realizaciones, Te, independientemente en cada caso, se selecciona entre: y un hapteno T.
En algunas realizaciones, Te, independientemente en cada caso, se selecciona entre STF y un hapteno T.
En algunas realizaciones, el péptido está sustituido con al menos un Te de hidratos de carbono asociado con cáncer. En algunas realizaciones, el péptido está sustituido con al menos dos Te. En algunas realizaciones, el péptido está sustituido con al menos tres Te. En algunas realizaciones, el péptido está sustituido con al menos cuatro Te. En algunas realizaciones, el péptido está sustituido con al menos cinco Te. En algunas realizaciones, el péptido está sustituido con al menos cinco Te. En algunas realizaciones, el péptido está sustituido con al menos seis Te. En algunas realizaciones, el péptido está sustituido con al menos siete Te. En algunas realizaciones, el péptido está sustituido con al menos ocho Te. En algunas realizaciones, el péptido está sustituido con al menos nueve Te. En algunas realizaciones, el péptido está sustituido con al menos diez Te.
En algunas realizaciones, el adyuvante tiene la Fórmula I, o es una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunas realizaciones, el adyuvante tiene la Fórmula II, o es una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En algunas realizaciones, Y4 es —S—. En algunas realizaciones, , Y4 es —NH—. En algunas realizaciones, Y4 es — 0-.
En algunas realizaciones, al menos un grupo fuertemente lipofilico satisface (i) y para al menos uno de dichos grupos, k es un número entero de 4-30. En algunas realizaciones, al menos un grupo fuertemente lipofilico satisface (ii), y para al menos uno de dichos grupos, y 2k+3n es un número entero de 4-30. En algunas realizaciones, al menos un grupo fuertemente lipofilico satisface (iii), y para al menos uno de dichos grupos, y m+n+1 es 4-30. En algunas realizaciones, al menos un grupo fuertemente lipofilico satisface (iv), y para al menos uno de dichos grupos, m+n+1 es 4-30. En algunas realizaciones, al menos un grupo fuertemente lipofilico satisface (v) , y para al menos uno de dichos grupos-, m+n+k+l es 4-30. En algunas realizaciones, al menos un grupo fuertemente lipofilico satisface (vi), y para al menos uno de dichos grupos, k+m+2 es 4-30. En algunas realizaciones, al menos un grupo fuertemente lipofilico satisface (vii), y para al menos uno de dichos grupos, k+q+m+n es 4-30. En algunas realizaciones, al menos un grupo fuertemente lipofilico satisface (viii), y para al menos uno de dichos grupos, r+k+q+m+n es 5-30.
En algunas realizaciones, Yl, Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7 , Yll, Y12 e Y13 son independientemente —O— o —NH-. En algunas realizaciones, Yl, Y2, Y3, Y4, Y5, Y6 e Y7, son independientemente —O— o —NH—. En algunas realizaciones, Yl, Y2, Y3, Y4, Yll, Y12, Y13 son independientemente -O- o -NH-.
En algunas realizaciones, Y4 es —O—. En algunas realizaciones, cada equivalente de monofosfato es — OP (O) (OH) (OH) .
En algunas realizaciones, un adyuvante de Fórmula I es un compuesto, en que Y4 es -0-; Yl, Y2, y Y7 son -0-; Y3, Y5 e Y6 son independientemente —O— o —NH—; Rl, R3, R5 y R6 son independientemente hidrógeno o un grupo fuertemente · lipofilico seleccionado entre (i)-(viii); al menos uno de Rl, R3, R5., y R6 no es hidrógeno; R2 y R7 se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en H -P(0)(0H)2, -S03H, -P ( O) ( OH ) ( OCH2CH2NH2 ) , y -CH2COOH; y R8 se selecciona entre el grupo que consiste en H, OH, 0S03H, y 0R9, en que R9 es un grupo alquilo o acilo con una longitud de 1 a 10 carbonos.
En algunas realizaciones un adyuvante de Fórmula I es un compuesto, en que Y4 es -O-; Y2 e Y12 son -O-p; Yl, Y3, Yll, e Y13 se eligen independientemente entre el grupo que consiste en —O—, —NH— y —S—; Rl, R3, Rll, y R13 son independientemente hidrógeno, o un grupo fuertemente lipofilico seleccionado entre (i)- ( viii ) ; al menos uno de Rl, R3, R5, y R6 no es hidrógeno; y R2 y R12 se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en H, -P(0)(OH)2, —P ( O ) ( OH ) ( OCH2CH2NH2 ) , y -CH2COOH.
En algunas realizaciones, Rl, R3, R5 y R6 son independientemente hidrógeno, o un grupo fuertemente lipofilico seleccionado entre el grupo que consiste en (i)- (viii), al menos un Rl, R3, R5 y R6 no es hidrógeno, y R2 y R7 se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en H, -P(0) (0H)2, -S03H,-, —P(0) (OH) (OCH2CH2NH2) , y —CH2C00H; y R8 se selecciona entre el grupo que consiste en H, OH, OS03H, y 0R9 en que R9 es un grupo alquilo o acilo con una longitud de 1 a 10 carbonos.
En algunas realizaciones, Rl, R3, Rll, y R13 son independientemente hidrógeno, o un grupo fuertemente lipofílico seleccionado entre (i)-(viii); al menos uno de Rl, R3, R5, y R6 no es hidrógeno; y R2 y R12 se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en H, — P(0)(OH)2, —P(O) (OH) ( OCH2CH2NH2 ) , y -CH2COOH.
En algunas realizaciones de Fórmula I, cada equivalente de monofosfato es —OP (O) (OH) (OH) . En algunas realizaciones de Fórmula II, cada equivalente de monofosfato es — OP(O) (OH) (OH) .
En algunas realizaciones, los grupos fuertemente lipofilicos de dicho compuesto proporcionan colectivamente al menos tres cadenas principales de carbono, y en que las cadenas principales de carbono de dichos grupos fuertemente lipofilicos proporcionan colectivamente al menos 40 átomos de carbono, presentando dicho adyuvante actividad inmunoestimulante . En algunas realizaciones, los grupos fuertemente lipofilicos de dicho compuesto proporcionan colectivamente al menos cuatro cadenas principales de carbono y en que las cadenas principales de carbono proporcionan colectivamente al menos 50 átomos de carbono, presentando dicho adyuvante actividad inmunoestimulante. En algunas realizaciones, los grupos fuertemente lipofilicos proporcionan colectivamente seis cadenas principales de carbono. En algunas realizaciones, cada cadena principal de carbono se caracteriza por 10, 12, 14, 16, 18 o 20 átomos de carbono en dicha cadena.
En algunas realizaciones, al menos un grupo fuertemente lipofilico es una de las estructuras gue se exponen a continuación: En algunas realizaciones, el al menos un grupo fuertemente lipofilico comprende un enantiómero R. En algunas realizaciones, el al menos un grupo fuertemente lipofilico comprende un enantiómero S. En algunas realizaciones, el al menos un grupo fuertemente lipofilico es un racemato. En algunas realizaciones, el al menos un grupo fuertemente lipofilico comprende un diastereómero RR, RS, SR o SS. Se contempla que todos los racematos, enantiómeros o diastereomeros están dentro del alcance de las realizaciones que se presentan en el presente documento. En algunas realizaciones, el al menos un grupo fuertemente lipofilico es una de las estructuras que se exponen a continuación: 20 En algunas realizaciones, el al menos un grupc fuertemente lipofilico es una de las estructuras que se exponen a continuación: En algunas realizaciones, un adyuvante de Fórmula un análogo de lipido A de PET . En algunas realizaciones adyuvante de Fórmula I presenta la siguiente estructura: en que Rl, R3, R5 y R6 son independientemente hidrógeno o un grupo lipofílico seleccionado entre el grupo que consiste en H3C(C H2)k— X— }- en que X, XI, X2, y X3 son independientemente —CO— o — CH2 ,—; Z es — H— o -0-; k, m, y r son independientemente un número entero de 0 a 30 incluido, n y q son independientemente un número entero de 0 a 6 incluido; al menos uno de Rl, R3, R5 y R6 no es hidrógeno; R2 y R7 se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en H, -P(0)(OH)2, -S03H, —P(O) (OH) (OCH2CH2NH2) , y -CH2C00H; y R9 es H, o un grupo alquilo o acilo con una longitud de 1 a 10 carbonos.
En algunas realizaciones, Rl y R9 son hidrógeno; R2 es un hidrógeno o el grupo fosfono —P(0)(0H)2; R7 es el grupo fosfono —P(0)(OH)2; y R3, R5 y R6 son los mismos grupos acilo o diferentes de la estructura siguiente en que m y n se eligen independientemente entre un número entero entre 6 y 10 incluido.
En algunas realizaciones, R3, R5 y R6 son idénticos.
En algunas realizaciones, un adyuvante tiene una de las estructuras que se exponen a continuación: En algunas realizaciones, un adyuvante tiene la siguiente estructura En algunas realizaciones, un adyuvante tiene guíente estructura: en que R3, R5 y R6 son el mismo o diferentes grupo o grupos de sustitución de la siguiente estructura en que m y n se eligen independientemente entre un número entero de 6 a 10 incluido.
En alguna de las realizaciones anteriores, el adyuvante es una sal de trietilamina, una sal de trietanolamina o una sal de amonio. En alguna de las realizaciones anteriores, el adyuvante es una sal de trietilamina. En alguna de las realizaciones anteriores, el adyuvante es una sal de trietilamina de un análogo de lipido A de PET.
En alguna de las realizaciones que se han descrito anteriormente, a ' comprende H2N- TSAPDT ( Tn ) RPAPGS ( Tn-) T ( Tn ) APPAHGVTSAPDT ( Tn ) RPAPGS ( Tn ) T ( Tn ) APPA HGVS*S*L-OH (SEC ID NO: 2), en que Tn representa GalNAcDl.
En alguna de las realizaciones que se han descrito anteriormente, una formulación de vacuna liposomal comprende: (a) un péptido que comprende al menos dos copias de una repetición en tándem de núcleos: T (Te ) S ( Te ) APDT ( Te ) RPAPGS ( Te ) T ( Te ) APPAHGV, SEC ID NO: 18 o una secuencia idéntica al menos en un 85 % al SEC ID NO: 18, o permutaciones lineales de la misma; en que Te representa un epitopo de hidratos de carbono asociados a cáncer; (b) un lipopéptido unido covalentemente a (a) que tiene la fórmula: H2N-S*S*L-OH en que * independientemente, en cada caso, representa un lipido unido covalentemente a un resto de Serina.
En algunas realizaciones que se han descrito anteriormente, una formulación de vacuna comprende: (a) un péptido que comprende al menos dos copias de una repetición en tándem de núcleos: TSAPDT ( Te ) RPAPGS (Te ) (Te ) APPAHGV, SEC ID NO: 19 o una secuencia idéntica al menos en un 85 % al SEC ID NO: 19, o permutaciones lineales de la misma; en que Te representa un epitopo de hidratos de carbono asociados a cáncer; (b) un lipopéptido unido covalentemente a (a) que tiene la fórmula: H2N-S*S*L-OH en que * independientemente, en cada caso, representa un lipido unido covalentemente a un resto de Serina.
En algunas realizaciones, la formulación comprende entre 2-10 repeticiones en tándem de la secuencia de repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 18 o SEC ID NO: 19. En algunas realizaciones, la formulación comprende entre 2-5 repeticiones en tándem de la secuencia de repetición en tándem de núcleos del SEC ID NO: 18 o SEC ID NO: 19. En algunas realizaciones, la formulación comprende 2 repeticiones en tándem de la secuencia de repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 18 o SEC ID NO: 19.
En alguna de dichas realizaciones, la formulación es un polvo liofilizado, una película delgada seca o un polvo seco. En alguna de dichas realizaciones, la formulación es un polvo liofilizado. En alguna de dichas realizaciones, la formulación de vacuna es una suspensión en agua, una emulsión, o una suspensión en aceite. En algunas realizaciones, la formulación es una suspensión en agua. En alguna de dichas realizaciones, la formulación comprende adicionalmente terc-butanol .
En alguna de dichas realizaciones, la secuencia de repetición en tándem de núcleos tiene- una homología de al menos un 90 % con la secuencia de (a) como se describe en cualquiera de las realizaciones que se han descrito anteriormente o en el presente documento. En alguna de dichas realizaciones, la secuencia de repetición en tándem de núcleos tiene una homología de al menos un 95 % con la secuencia de (a) como se describe en cualquiera de las realizaciones que se han descrito anteriormente o en el presente documento.
En alguna de dichas realizaciones, el vehículo líquido se selecciona entre dimiristoíl fos fatidi lgl icerol (DMPG), dipalmitoíl fosfatidilcolina (DPPC), fosfatidilcolina (PC; lecitina), ácido fosfatidico (PA), fosfatidilglicerol (PG), fosfatidiletanolamina ( PE ) , fosfatidilserina (PS). Otros fosfolípidos adecuados adicionales incluyen diestearoilfosfatidilcolina (DSPC) , dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), dipalmitoilfosfatidiglicerol (DPPG) , diestearoilfosfatidiglicerol (DSPG), ácido dipalmitoil fos fatídico (DPPA); ácido dimiristoilfosfatídico ( DMPA) , ácido diestearoilfosfatídico (DSPA), dipalmitoilfosfatidilserina (DPPS), dimiristoilfosfatidilserina (DMPS) , diestearoilfosfatidilserina (DSPS) , dipalmitoilfosfatidietanolamina (DPPE) , dimiristoil fos fatidiletanolamina (DMPE) , diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE), o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, o combinación de los mismos.
En alguna de dichas realizaciones, el vehículo lípido se selecciona entre dimiristoil fosfatidilglicerol (DMPG), dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC), o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, o combinación de los mismos.
En alguna de dichas realizaciones, el lípido unido covalentemente a un resto de aminoácido se selecciona independientemente, en cada caso, entre cadenas de miristoilo, palmitoilo, laurilo, estearoilo, decanoílo, y octanoilo, o una combinación de los mismos.
En alguna de dichas realizaciones, la formulación comprende adicionalmente colesterol.
En alguna de dichas realizaciones, el lípido unido covalentemente al resto de Serina es independientemente, en cada caso, una cadena de miristoilo..
En alguna de dichas realizaciones, (b) está unido al extremo carboxi de (a). En alguna de dichas realizaciones, (b) está unido al extremo amino de (a).
En alguna de dichas realizaciones, (a) + (b) y (c) están en una relación de peso de (a) + (b) : peso de (c) de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1. En alguna de dichas realizaciones, (a) + (b) y (c) están en una relación de peso de (a) + (b) : peso de (c) de aproximadamente 1:5 a aproximadamente 5:1. En alguna de dichas realizaciones, (a) + (b) y (c) están en una relación de peso de (a) + (b) : peso de (c) de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 2:1.
En algunas realizaciones, Te es Tn, en que Tn representa GalNAcal .
En algunas realizaciones, en el presente documento se proporcionan formulaciones de vacuna liposomal que comprenden : (a) un glicolipopéptido de estructura: H2N- TSAPDT ( Tn ) RPAPGS ( n ) T ( n ) APPAHGVTSAPDT ( Tn ) RPAPGS ( Tn ) T ( n ) APPA HGVS*S*L-OH SEC ID NO: 2 en que Tn representa GalNAcDl; y * representa, independientemente en cada caso, un lípido C14 unido covalentemente a un resto de Serina; o, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y (c) un vehículo lipido.
En algunas realizaciones, el lípido C14 es una cadena d( miristoílo.
En algunas realizaciones, el adyuvante es , o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En algunas realizaciones, la sal farmacéuticamente aceptable es una sal de trietilamina .
En algunas realizaciones, el vehículo lípido se selecciona entre DMPG, DPPC o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o combinación del mismo. En algunas realizaciones, la formulación de vacuna liposomal comprende adicionalmente colesterol.
En cualquiera de las realizaciones que se han descrito anteriormente, la formulación comprende uno o más epitopos de MUC1. En cualquiera de las realizaciones que se han descrito anteriormente, los liposomas tienen un diámetro de distribución de población de un 90 % (d90) = aproximadamente 0,25 Dm. En cualquiera de las realizaciones que se han descrito anteriormente, los liposomas tienen un diámetro de distribución de población de un 90 % (d90) = aproximadamente 0,22 Dm. En cualquiera de las realizaciones que se han descrito anteriormente, los liposomas tienen un diámetro de distribución de población de un 90 % (d90) = aproximadamente 0,20 Dm.
En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan formulaciones de vacuna liposomal que comprenden : (a) un péptido que comprende al menos dos copias de una repetición en tándem de núcleos: TSAPDTRPAPGSTAPPAHGV, (SEC ID NO: 1) o una secuencia idéntica al menos en un 85 % al SEC ID NO: 1, o permutaciones lineales de la misma; en que S y T están independientemente, en cada caso, opcionalmente sustituidos con un epitopo Te de hidratos de carbono asociados a cáncer; (b) un lipopéptido unido covalentemente a (a) que tiene la fórmula: H2N-(aal)* (aa2)* (aa3)-OH en que aal se selecciona independientemente, en cada caso, entre S, T, , R o C; aa2 se selecciona independientemente, en cada caso, entre S, T, , R o C; aa3 se selecciona independientemente, en cada caso, entre L o G; * independientemente, en cada caso, representa un lipido unido covalentemente a un resto de aminoácido; (c) un adyuvante; y (d) uno o más vehículos lípidos.
En algunas realizaciones, el adyuvante se selecciona entre oligodesoxinucleótidos de CpG (ODN) , saponina, un agonista TLR-9, o un análogo de Lipido A, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, o combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, el análogo de Lipido A es un adyuvante de Fórmula I: órmula I en que al menos uno de Rl, R2, R3, R5, R6, y R7 es un grupo fuertemente lipofílico seleccionado entre el grupo que consiste en H3C(CH2)k— - · (0 H3C (C Hák— (C H =CH C ?2)p -X¦ en que X, XI, X2, y X3 son independientemente —CO— o — CH2-; Z es — H— o -0; k, m, y r son independientemente un número entero de 0 a 30 incluido, n y q son independientemente un número entero de 0 a 6 incluido; en que Y4 es un espaciador seleccionado entre el grupo que consiste en —0—, —S—, y —NH— en que, al menos uno de Y1R1, Y2R2, Y3R3, Y5R5, Y6R6 e Y7R7 equivalente de fosfato monovalente (EFM), en que cada equivalente de fosfato monovalente es, independientemente, (a) —R'—C(0)OH. en que R' es un grupo alquilo sustituido o sin sustituir de 1-4 carbonos, o (b) se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en -OB(OH)OR, -0P (0) (OH) OR, -OS (0) (0) (OH) OR, y -OP(=0) (0H)- -P(=0) (0H)0R, en que R es hidrógeno, o un grupo alquilo sustituido o sin sustituir de 1-4 carbonos, y si R es un grupo alquilo sustituido, las sustituciones son—OH o —NH2, en que R8 se selecciona entre el grupo que consiste en H, OH, 0R9, un resto que en combinación con Y8 forma un equivalente de fosfato monovalente como se ha definido anteriormente, y un grupo (i)-(viii) como se ha definido anteriormente; en que R9 es un grupo alquilo o acilo con una longitud de 1 a 10 carbonos; y en que el enlace glicosidico es a o ß; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; o un adyuvante de Fórmula II: Srmula II en que al menos uno de Rl, R2, R3, Rll, R12 y R13 un grupo fuertemente lipofílico seleccionado entre el grupo el grupo que consiste en (i)-(viii) mencionados anteriormente; en que Y4 es un espaciador seleccionado entre el grupo que consiste en —O—, —S—, y —NH— y en que al menos uno de Y1R1, Y2R2, Y3R3, Y11R11, Y12R12 e Y13R13 es independientemente un equivalente de fosfato monovalente como se ha definido anteriormente; en que las siguientes limitaciones se aplican tanto a (I) como a (II) mencionados anteriormente: Yl, Y2, Y3, ?5, ?6, XI, Y11, Y12 e Y13 son espaciadores seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en -0-, -S-, y -NH-; Rl, R2, R3, R5, R6, R7, Rll, R12 y R13 son independientemente hidrógeno, un resto que con el grupo Y numerado normalmente forma equivalente de fosfato monovalente como se ha definido anteriormente, o un grupo fuertemente lipofílico seleccionado entre el grupo que consiste en (i)-(viii) mencionados anteriormente; los grupos fuertemente lipofilicos de dicho compuesto proporcionan colectivamente al menos dos cadenas principales que carbono, y las cadenas principales de carbono de dichos grupos fuertemente lipofilicos proporcionan colectivamente al menos 30 átomos de carbono; o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos; En alguna de dichas realizaciones, la formulación es un polvo liofilizado, una película delgada seca o un polvo seco. En algunas realizaciones, la formulación es un polvo liofilizado. En alguna de dichas realizaciones, la formulación de vacuna es una suspensión en agua, una emulsión, o una suspensión en aceite. En algunas realizaciones, la formulación es una suspensión en agua. En alguna de dichas realizaciones, la formulación comprende adicionalmente terc-butanol .
En alguna de dichas realizaciones, la secuencia de repetición en tándem de núcleos tiene una homología de al menos un 90 % con la secuencia en (a) como se describe en cualquiera de las realizaciones que se han descrito anteriormente o en el presente documento. En alguna de dichas realizaciones, la secuencia de repetición en tándem de núcleos tiene una homología de al menos un 95 % con la secuencia en (a) como se describe en cualquiera de las realizaciones que se han descrito anteriormente o en el presente documento.
En alguna de dichas realizaciones, el vehículo lípido se selecciona entre dimiristoíl fosfatidilglicerol (DMPG), dipalmitoíl fosfatidilcolina (DPPC), fosfatidilcolina (PC; lecitina), ácido fosfatídico (PA), fosfatidilglicerol (PG), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilserina (PS). Otros fosfolípidos adecuados adicionales incluyen diestearoilfosfatidilcolina (DSPC) , dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), dipalmitoilfosfatidiglicerol (DPPG) , diestearoilfosfatidiglicerol (DSPG), ácido dipalmitoíl fos fatídico (DPPA); ácido dimiristoilfosfatídico (DMPA), ácido diestearoilfosfatídico (DSPA), dipalmitoilfosfatidilserina (DPPS) , dimiristoilfosfatidilserina (DMPS) , diestearoilfosfatidilserina (DSPS) , dipalmitoilfosfatidietanolamina (DPPE) , dimiristoilfosfatidiletanolamina (DMPE), diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE), o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, o combinación de los mismos.
En alguna de dichas realizaciones, el vehículo lipido se selecciona entre dimiristoil fosfatidilglicerol (DMPG), dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC), o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, o combinación de los mismos.
En alguna de dichas realizaciones, la formulación comprende adicionalmente colesterol.
En alguna de dichas realizaciones, el lipido unido covalentemente a un resto de aminoácido se selecciona independientemente, en cada caso, entre cadenas de miristoilo, palmitoílo, laurilo, estearoílo, decanoilo, y octanoilo, o una combinación de las mismas. En alguna de dichas realizaciones, el lipido unido covalentemente al resto de aminoácido es independientemente, en cada caso, una cadena de miristoilo.
En alguna de dichas realizaciones, (b) está unido al extremo carboxi de (a). En alguna de dichas realizaciones, (b) está unido al extremo amino de (a).
En alguna de dichas realizaciones, (a) + (b) y (c) están en una relación de peso de (a) + (b): peso (c) de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1. En alguna de dichas realizaciones, (a) + (b) y (c) están en una relación de peso de (a) + (b) : peso (c) de aproximadamente 1:5 a aproximadamente 5:1. En alguna de dichas realizaciones, (a) + (b) y (c) están en una relación de peso de (a) + (b) : peso (c) de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 2:1.
En alguna de dichas realizaciones, Te, independientemente en cada caso, se selecciona entre y un hapteno T.
En alguna de dichas realizaciones, Te es Tn. En alguna de dichas realizaciones, Te es Tn' . En alguna de dichas realizaciones, Te es STn. En alguna de dichas realizaciones, Te. es STn' . En alguna de dichas realizaciones, Te es TF. En alguna de dichas realizaciones, Te es TF' . En alguna de dichas realizaciones, Te es STF. En alguna de dichas realizaciones, Te es STF'. En alguna de dichas realizaciones, Te es Fia. En alguna de dichas realizaciones, Te es Fia' . En alguna de dichas realizaciones, Te es hapteno T. En alguna de dichas realizaciones, Te es hapteno T' . En alguna de dichas realizaciones, Te, independientemente en cada caso, se selecciona entre Tn, Tn' , STn y STn' . En alguna de dichas realizaciones, Te, independientemente en cada caso, se selecciona entre Tn y STn.
En alguna de dichas realizaciones, el adyuvante se selecciona entre un compuesto de Fórmula I, saponina, ODN de CpG, y un agonista TLR-9, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una combinación del mismo.
En alguna de dichas realizaciones, el adyuvante se selecciona entre saponina, ODN de CpG, y un agonista TLR-9, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una combinación del mismo .
En alguna de dichas realizaciones, una formulación de vacuna comprende (a) un péptido que comprende al menos dos copias de una repetición en tándem de núcleos: T (Te) S (Te ) APDT (Te) RPAPGS (Te )T (Te) APPAHGV, SEC ID NO: 18 o una secuencia idéntica al menos en un 85 % al SEC ID NO: 18, o permutaciones lineales de la misma; en que Te representa un epitopo de hidratos de carbono asociados a cáncer; (b) un lipopéptido unido covalentemente a (a) que tiene la fórmula: H2N-S*S*L-0H en que * independientemente, en cada caso, representa un lipido unido covalentemente a un resto de Serina.
En alguna de dichas realizaciones, una formulación de vacuna comprende: (a) un péptido que comprende al menos dos copias de una repetición en tándem de núcleos: TSAPDT ( Te ) RPAPGS (Te ) T (Te ) APPAHGV, SEC ID NO: 19 o una secuencia idéntica al menos en un 85 % al SEC ID NO: 19, o permutaciones lineales de la misma; en que Te representa un epitopo de hidratos de carbono asociados a cáncer; (b) un lipopéptido unido covalentemente a (a) que tiene la fórmula: H2N-S*S*L-OH en que * independientemente, en cada caso, representa un lipido unido covalentemente a un resto de Serina.
En alguna de dichas realizaciones, una formulación de vacuna liposomal comprende: (a) un glicolipopéptido de estructura: H2N- TSAPDT ( Tn ) RPAPGS ( Tn ) T ( Tn ) APPAHGVTSAPDT ( Tn ) RPAPGS ( Tn ) T ( Tn ) APPA HGVS*S*L-OH SEC ID NO: 2 en que Tn representa GalNAcDl; y * representa, independientemente en cada caso, un lipido C14 unido covalentemente a un resto de Serina.
En el presente documento se proporcionan métodos para tratar a un individuo que padece o que se sospecha que padece un cáncer que expresa un antigeno asociado a tumores de MUC1 que comprende administrar al individuo en necesidad de la misma, durante un periodo de tiempo, una formulación de vacuna liposomal que se ha descrito anteriormente.
En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de mama, cáncer de glándula parótida, cáncer gástrico, cáncer de esófago, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vesícula biliar, cáncer hepatocelular, cáncer de tiroides, cáncer de endometrio, mieloma múltiple, leucemia mielógena aguda, leucemia linfoblástica aguda/crónica, leucemia de células pilosas, linfoma folicular, mieloma múltiple, plasmacitoma, linfoma difuso de linfocitos B de células grandes, cáncer pancreático, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de ovarios, adenocarcinoma del pulmón, cáncer de pulmón de células escamosas, cáncer de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer renal, cáncer de vejiga urinaria, o cáncer del tracto urinario.
En algunas realizaciones, los métodos que se han descrito anteriormente comprenden adicionalmente la medida de una respuesta inmune en el individuo. En algunas realizaciones, la medida de la respuesta inmune en el individuo tratado comprende medir la proliferación de linfocitos T en el individuo.
En algunas realizaciones, el periodo de tiempo se selecciona entre al menos aproximadamente 5 días, al menos aproximadamente 1 semana, al menos aproximadamente 2 semanas, al menos aproximadamente 4 semanas, al menos aproximadamente 8 semanas, al menos aproximadamente 16 semanas, al menos aproximadamente 20 semanas, al menos aproximadamente 24 semanas, al menos aproximadamente 28 semanas, al menos aproximadamente 32 semanas, al menos aproximadamente 36 semanas, al menos aproximadamente 40 semanas, al menos aproximadamente 44 semanas, al menos aproximadamente 48 semanas, al menos aproximadamente 52 semanas, al menos aproximadamente 60 semanas, al menos aproximadamente 68 semanas, al menos aproximadamente 72 semanas, al menos aproximadamente 80 semanas, al menos aproximadamente 88 semanas, al menos aproximadamente 96 semanas y al menos aproximadamente 104 semanas.
En algunas realizaciones, la composición de vacuna se administra mediante una inyección intramuscular, intravenosa, subcutánea, intranodal, intratumoral , intraperitoneal o intradérmica . En algunas realizaciones, la composición de vacuna se administra mediante inyección subcutánea. En algunas realizaciones, la composición de vacuna se administra mediante una bomba. En algunas realizaciones, la composición de vacuna se administra mediante una bomba implantada (por ejemplo, a través de una bomba osmótica Alzet®) .
En algunas realizaciones, el individuo se trata con ciclofosfamida, daclizumab o imatinib antes del tratamiento con una formulación de vacuna que se ha descrito anteriormente.
En el presente documento también se proporcionan métodos para inducir y/o mantener una respuesta inmune celular y humoral en un individuo que comprende administrar a un individuo, durante un periodo de tiempo, una formulación de vacuna liposomal que se ha descrito anteriormente. En algunas realizaciones, los métodos que se han descrito anteriormente comprenden medir adicionalmente la proliferación de linfocitos T en el individuo. En otras realizaciones, los métodos que se han descrito anteriormente comprenden medir la producción de anticuerpos en el individuo.
En el presente documento también se proporcionan métodos para tratar una enfermedad, trastorno o afección asociados con MUC1 hipoglicosilada en un individuo que comprende administrar a un individuo que tiene MUC1 hipoglicosilada, durante un periodo de tiempo, una formulación de vacuna liposomal que se ha descrito anteriormente. En algunas realizaciones, MUC1 hipoglicosilada en el individuo está asociada con ün cáncer. En otras realizaciones, la formulación de vacuna liposomal que se ha descrito anteriormente induce y/o mantiene una respuesta inmune especifica a MUC1 hipoglicosilada en el individuo. En algunos casos, la respuesta inmune es una respuesta inmune celular. En otros casos, la respuesta inmune es una respuesta inmune humoral .
INCORPORACIÓN POR REFERENCIA Todas las publicaciones, patentes, y solicitudes de patentes que se mencionan en la presente memoria descriptiva se incorporan en el presente documento por referencia en la misma medida como si se indicara que cada publicación, patente, o solicitud de patente especifica e individualmente se incorpora por referencia.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las nuevas características de la invención se exponen en detalle en las reivindicaciones adjuntas. Una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente invención se obtendrá por referencia a la siguiente descripción detallada que expone las realizaciones ilustrativas, en que se usan los principios de la invención, y los dibujos que las acompañan de las cuales: La Figura 1 ilustra un proceso para síntesis de una formulación de vacuna liposomal.
La Figura 2 ilustra imágenes de liposomas formulados vitrificados por microscopía electrónica de transmisión (Figura 2A) y de vacuna liposomal reconstituida por microscopía de luz (Figura 2B) y microscopía electrónica por criofractura (Figura 2C) para una formulación de vacuna liposomal que se describe en el presente documento.
La Figura 3 ilustra la inducción ex vivo de IFNy en Linfocitos T CD8+ (Figura 3A) y CD4+ (Figura 3B) en ratones C57BL/6J inmunizados con una formulación de vacuna que se describe en el presente documento.
La Figura 4 ilustra una respuesta a la dosis de IgG unida a un antígeno MUC1 a partir de sueros de ratones inmunizados con una formulación de vacuna que se describe en el presente documento.
La Figura 5 ilustra una comparación de una formulación de una vacuna liposomal que se describe en el presente documento que comprende un SEC ID NO: 2 en comparación con una formulación de vacuna BLP25 (Vacuna A o Vac A) en la unión de IgG a un antígeno MUCl glicosilado (parte superior) y a un antigeno MUCl no glicosilado (parte inferior).
La Figura 6 ilustra la inducción ex vivo de IFNy de esplenocitos (Figura 6A) e inducción de anticuerpos IgG (Figuras 6B y 6C) en ratones transgénicos con MUCl humana inmunizados con una formulación de vacuna que se describe en el presente documento.
La Figura 7 ilustra el análisis mediante FACS de células B16-MUC1 y B16 (Figura 7A) o células epiteliales de Mama y de carcinoma de Mama (Figura 7B) con sueros de ratones vacunados con una formulación de vacuna que se describe en el presente documento .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Existen muchas terapias clínicamente útiles para el tratamiento del cáncer. En algunos casos, un inconveniente del tratamiento convencional del cáncer es que el tratamiento no es específico, afectando a células sanas así como a células cancerosas, dando como resultado efectos secundarios tóxicos .
La mucina MUC1 es una glicoproteina de alto peso molecular que se expresa en células normales asi como en células cancerosas. Sin embargo, la mucina asociada a tumores a menudo porta patrones alterados de glicosilación. En muchos cánceres, MUC1 está sobreexpresada y/o subglicosilada o glicosilada de forma anómala. La glicosilación anómala de MUC1 en tejidos cancerosos da como resultado una exposición de epitopos de péptidos del núcleo al sistema inmune. Estas características hacen a las mucinas asociadas a tumores antigénicamente distintas de las mucinas homologas de las células normales. Por consiguiente, en el presente documento se proporcionan formulaciones de vacuna inmunogénica que inducen una respuesta inmune celular y/o humoral que se dirige a antigenos MUC1 expresados en tejidos tumorales y/o cancerosos.
En algunas realizaciones, las formulaciones inmunogénicas que se describen en el presente documento provocan respuestas de linfocitos B y/o linfocitos T específicos de antígenos que reconocen antígenos asociados a tumores y atacan a las células cancerosas. En alguna de dichas realizaciones, las células cancerosas son atacadas selectivamente, reduciendo de este modo el potencial de efectos secundarios tóxicos. En otras realizaciones, las formulaciones inmunogénicas que se describen en el presente documento inducen la producción de anticuerpos por parte de los linfocitos B frente a antigenos de cáncer. Por consiguiente, un enfoque de inmunoterapia que comprende el uso de formulaciones de vacuna liposomal que se describen en el presente documento tiene el potencial de aumentar la eficacia de las terapias existentes contra el cáncer. En algunas realizaciones, la administración de las formulaciones de vacuna liposomal que se proporcionan en el presente documento aumenta la esperanza de vida y/o mejora la calidad de la vida de los individuos sometidos a tratamiento con las vacunas que se describen en el presente documento.
Mucinas MUCl Las mucinas son glicoproteinas caracterizadas por alto peso molecular (> 1.000.000 daltons) y glicosilacion extensa (a menudo más de un 80 %). El producto genético de MUCl humana se expresa fuertemente en muchas células cancerosas humanas que incluyen, y no se limitan a, mama, pancreáticas y determinadas células cancerosas de ovario. Aunque las mucinas con MUCl codificada expresadas en diversos cánceres contienen la misma secuencia de péptidos del núcleo de repetición en tándem, existen diferencias en la glicosilacion. Debido a la subglicosilación en células cancerosas, las moléculas de MUCl en las células cancerosas expresan epítopos que no se expresan en las células epiteliales normales. La mucina MUCl consiste en una proteína de membrana integral con dominios extracelulares, transmembrana y citoplasmáticos . Los componentes antigénicos de MUC1 residen en el dominio extracelular de MUC1 que comprende una glicoproteína que consiste en repeticiones en tándem de una unidad de aminoácido de 20 mer de SEC ID NO: 1 como se describe a continuación .
La secuencia de aminoácidos de MUC1 Humana está disponible en la base de datos SWISS-PROT como P15941. El número de repeticiones es polimórfico en un grado elevado. Varía de 21 a 125 en la población del norte de Europa. Los alelos más frecuentes contienen 41 y 85 repeticiones. Para MUC1 de Ratón, véase SWISS-PROT Q02496.
MUC1 es un antígeno polimórfico caracterizado por un número variable de repeticiones perfectas e imperfectas de la siguiente secuencia de 20 mer del núcleo: 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 (SEC ID NO: 1 ) El icosapéptido repetido en tándem explica el polimorfismo en tres posiciones, como se muestra entre corchetes: TSAP [D/E] [T/S] RPAPGSTAP [ P/A/Q/T] AHGV (SEC ID NO: 3). Los polimorfismos comunes son la doble mutación coordinada DT->ES y los reemplazos individuales P->A, P->Q y P->T. El reemplazo más frecuente DT>ES se produce hasta en un 50 % de las repeticiones.
Dentro del alcance de las realizaciones que se presentan en el presente documento se contemplan vacunas que comprenden glicolipopéptidos que comprenden al menos un epitopo de linfocitos B y/o T nativos de MUCl, o al menos un epitopo mutante básicamente idéntico a dicho epitopo nativo. En algunas realizaciones, los glicopéptidos comprenden opcionalmente secuencias adicionales de MUCl que no forman parte de un epitopo.
En algunas realizaciones, un glicopéptido adecuado para una formulación de vacuna liposomal que se describe en el presente documento comprende un epitopo de linfocitos B o un epitopo de linfocitos T de MUCl (que, en cada caso, puede ser un epitopo natural o un mutante permitido del mismo), o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, estos epitopos son idénticos, de superposición, o distintos. En algunas realizaciones, los epitopos de linfocitos T y B de un antigeno se superponen. Por ejemplo, en el caso de MUCl, SAPDTRP, SEC ID NO: 4 (es decir, los aminoácidos 2-8 de SEC ID NO:l) es un epitopo de linfocitos T, mientras que PDTRP, SEC ID NO: 5 (es decir, los aminoácidos 4-8 de SEC ID NO:l) es un epitopo de linfocitos B.
Los sitios de glicosilacion en un inmunógeno presente en una formulación de vacuna que se describe en el presente documento son opcionalmente uno o más de (1) sitios realmente glicosilados en la glicoproteina tumoral derivada de MUC1, (2) sitios que se pueden glicosilar pero que no están realmente glicosilados en esa glicoproteina tumoral, y/o (3) sitios extraños a una glicoproteina tumoral. Ninguno, uno, algunos o todos los sitios de glicosilacion normalmente glicosilados en la glicoproteina tumoral derivada de MUC1 están glicosilados en un inmunógeno presente en una formulación de vacuna que se proporciona en el presente documento .
Los inmunóqenos adecuados para formulaciones de vacuna que se describen en el presente documento comprenden dos o más copias de las secuencias de repetición completa que se han mencionado anteriormente o una permutación lineal de las mismas.
Cada epitopo de MUC1 en cuestión corresponde opcionalmente a uno o más epitopos de la región variable de repetición en tándem, o a un epitopo fuera de esa región. Los epitopos en la región de repetición en tándem incluyen, por ejemplo, PAPGS de SEC ID NO: 6 (es decir, los aminoácidos 7-12 de SEC ID NO:l), PPAHGVT, SEC ID NO: 7 (es decir, los aminoácidos 15-20, y 1 de SEC ID NO:l) y PDTRP, SEC IF NO; 8 (es decir, los aminoácidos 4-8 de SEC ID NO:l). La secuencia PDTRPAPGS de SEC ID NO: 9 (es decir, los aminoácidos 4-12 de SEC ID N0:1) incluye dos epitopos de superposición. La secuencia PDTRP de SEC ID NO: 10, forma la punta de una protuberancia saliente expuesta a solventes y que forma un giro beta de tipo II estable.
Dentro del alcance de las realizaciones que se presentan en el presente documento también se contemplan glicolipopéptidos que comprenden al menos una secuencia de 20 aminoácidos (una repetición en tándem de núcleos) que difiere únicamente en una o más sustituciones conservativas y/o una única sustitución no conservadora a partir de una repetición en tándem de MUC1, y comprende un epítopo de una región variable de repetición en tándem de MUC1 (idénticamente, o un mutante permitido).
En un subgrupo de estas realizaciones, el glicolipopéptido comprende una pluralidad de repeticiones en tándem de núcleos que no se superponen, tales como (para un total de 40 aminoácidos), tres (para un total de 60 aminoácidos), cuatro, cinco, seis, siete u ocho. Estas repeticiones en tándem de núcleos pueden ser, pero no es necesario que sean, idénticas entre si. En contraste, en la mucina MUC1 humana natural, el número de repeticiones por lo general es 21-125.
Dentro del alcance de las realizaciones que se presentan en el presente documento también se contemplan formulaciones de vacuna en que la porción de péptido del glicolipopéptido comprende opcionalmenté subsecuencias de aminoácidos adicionales. Dichas subsecuencias comprenden epitopos adicionales, que incluyen epitopos de la región de repetición en tándem variable de MUC1 (que está por debajo de una repetición en tándem de núcleo), epitopos de MUC1 desde fuera de esa región, o epitopos de otros antígenos de cáncer.
Por consiguiente, en el presente documento se proporcionan formulaciones de vacuna que comprenden glicolipopéptidos de MUC1. En algunas realizaciones, dichos glicolipopéptidos sintéticos de MUC1 comprenden una o más copias de un péptido de repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1 que imita a epitopos¦ de péptidos de MUC1 presentes en células cancerosas. En el presente documento, en algunas realizaciones, están los glicolipopéptidos de MUC1 que comprenden un péptido que comprende al menos dos copias de una repetición en tándem de núcleos: TSAPDTRPAPGSTAPPAHGV (SEC ID NO: 1) o una secuencia básicamente idéntica a SEC ID NO: 1, o permutación lineal de la misma; en que S y T están independientemente, en cada caso, opcionalmente sustituidos con un epitopo Te de hidratos de carbono asociados a cáncer.
Ya que existen múltiples repeticiones de esta secuencia, el punto de partida que se muestra es arbitrario, y las "permutaciones lineales" para la repeticiones en tándem varían. Por ejemplo, en . una realización, una unidad de repetición en tándem comienza en el aminoácido 19 de SEC ID NO: 1 y se cicla a través de toda la secuencia de péptidos de SEC ID NO: 1 para proporcionar una repetición en tándem de núcleos de secuencia GVTSAPDTRPAPGSTAPPAH (SEC ID NO: 11). En otras realizaciones a modo de ejemplo, una unidad de repetición en tándem comienza simplemente en el aminoácido 6 de SEC ID NO: 1 y se cicla a través de toda la secuencia de péptidos de SEC ID NO: 1 para proporcionar una repetición en tándem de núcleos de secuencia TRPAPGSTAPPAHGVTSAPD (SEC ID NO: 12). También se contempla que otras "permutaciones lineales" análogas están dentro del alcance de las realizaciones que se presentan en el presente documento.
En algunas realizaciones, una formulación liposomal que se describe en el presente documento comprende entre 1 y 30 copias de una repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1 o una secuencia básicamente idéntica a SEC ID NO: 1, o permutación lineal de la misma. En algunas realizaciones, una formulación liposomal que se describe en el presente documento comprende entre 1 y 20 copias de una repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1, una secuencia básicamente idéntica a SEC ID NO: 1, o permutación lineal de la misma. En algunas realizaciones, una formulación liposomal que se describe en el presente documento comprende entre 1 y 10 copias de una repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO 1, una secuencia básicamente idéntica a SEC ID NO: 1, o permutación lineal de la misma. En algunas realizaciones, una formulación liposomal que se describe en el presente documento comprende entre 1 y 5 copias de una repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1, una secuencia básicamente idéntica a SEC ID NO: 1, o permutación lineal de la misma. En algunas realizaciones, una formulación liposomal que se describe en el presente documento comprende 2 copias de una repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1, una secuencia básicamente idéntica a SEC ID NO: 1, o permutación lineal de la misma. En algunas realizaciones, una formulación liposomal que se describe en el presente documento comprende 3 copias de una repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1, una secuencia básicamente idéntica a SEC ID NO: 1, o permutación lineal de la misma. En algunas realizaciones, una formulación liposomal que se describe en el presente documento comprende 4copias de una repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1, una secuencia básicamente idéntica a SEC ID NO: 1, o permutación lineal de la misma. En algunas realizaciones, una formulación liposomal que se describe en el presente documento comprende 5 copias de una repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1, una secuencia básicamente idéntica a SEC ID NO: 1, o permutación lineal de la misma. En algunas realizaciones, una formulación liposomal que se describe en el presente documento comprende 6 copias de una repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1, una secuencia básicamente idéntica a SEC ID NO: 1, o permutación lineal de la misma. En algunas realizaciones, una formulación liposomal que se describe en el presente documento comprende 7 copias de una repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1, una secuencia básicamente idéntica a SEC ID NO: 1, o permutación lineal de la misma. En algunas realizaciones, una formulación liposomal que se describe en el presente documento comprende 8 copias de una repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1, una secuencia básicamente idéntica a SEC ID NO: 1, o permutación lineal de la misma. En algunas realizaciones, una formulación liposomal que se describe en el presente documento comprende 9 copias de una repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1, una secuencia básicamente idéntica a SEC ID NO: 1, o permutación lineal de la misma. En algunas realizaciones, una formulación liposomal que se describe en el presente documento comprende 10 copias de una repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1, una secuencia básicamente idéntica a SEC ID NO: 1, o permutación lineal de la misma. En cualquiera de las realizaciones anteriores, la una copia o más de una copias de repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1 están glicosiladas tal como se describe en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, "secuencia básicamente idéntica a SEC ID NO: 1" se refiere a que, en una realización, una secuencia es idéntica al menos en un 80 % a SEC ID NO: 1. En otras realizaciones, "secuencia básicamente idéntica a SEC ID NO: 1" se refiere a que, una secuencia es idéntica al menos en un 85 % a SEC ID NO: 1. En otras realizaciones, "secuencia básicamente idéntica a SEC ID NO: 1" se refiere a que, una secuencia es idéntica al menos en un 90 % a SEC ID NO: 1. En otras realizaciones, "secuencia básicamente idéntica a SEC ID NO: 1" se refiere a que, una secuencia es idéntica al menos en un 95 % a SEC ID NO: 1.
VARIANTES CON REPETICIÓN DE NÚCLEOS DE MUC1 En algunas realizaciones, la formulación de vacuna que se describe en el presente documento incorpora homólogos inmunológicamente activos o variantes de repeticiones del núcleo de MUC1 (por ejemplo, variantes de SEC ID NO: 1). Por consiguiente, las realizaciones que se presentan al presente documento .incluyen el uso de un péptido con repetición de núcleos de MUC1 que tiene una secuencia que es similar a, pero no idéntica a, la secuencia del aminoácido representada en el SEC ID NO: 1. Por lo tanto, también se contempla dentro del alcance de las realizaciones, que se proporciona en el presente documento, el uso de una repetición del núcleo de MUC1 que tiene una secuencia idéntica de un 99 %, un 98 %, un 97 %, un 96 %, un 95 , un 94 %, un 93 %, un 92 %, un 91 %, un 90 %, un 89 %, un 88 %, un 87 %, un 86 %, un 85 %, un 84 %, un 83 %, un 82 %, un 81 %, o un 80 % en comparación con la secuencia de SEC ID NO. 1, y que es inmunologicamente activa.
En algunas realizaciones, una proteina con repetición de núcleos de MUC1 está opcionalmente modificada para contener variaciones conservadoras con el fin de cambiar restos no críticos o restos en regiones no críticas. Los aminoácidos que no son críticos se identifican por métodos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio, cristalización, resonancia magnética nuclear, marcado por fotoafinidad, o mutagénesis mediante alanina (Cunningham y col., Science, 244: 1081-1085 (1989); Smith y col., J. Mol. Biol., 224: 899-904 (1992); de Vos y col., Science, 255: 306-312 (1992)). Las proteínas modificadas se ensayan para la actividad o para la capacidad de inducir una respuesta inmune a través de métodos tales como unión de proteasa al sustrato, escisión, actividad in vitro, o actividad in vivo.
En algunas realizaciones, una variante con repetición de núcleos de MUC1 incorpora sustituciones de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos que mejoran la estabilidad con repetición de núcleos de MUC1 o con un aminoácido hidrofóbico diferente que mejora la estabilidad con repetición de núcleos de MUC1 frente a la oxidación, o con un aminoácido diferente que mejora la estabilidad con repetición de núcleos de MUC1 frente a proteasas. Por lo tanto, una "variante" del polipéptido con repetición de núcleos de MUC1 difiere en la secuencia de aminoácidos de la secuencia representada en el SEC ID NO: 1 mediante una o más sustituciones, supresiones, inserciones, inversiones, truncamientos, modificaciones, o una combinación de los mismos. Dicha variante contiene opcionalmente sustituciones de aminoácidos que sustituyen un aminoácido dado con otro aminoácido de características similares. La sustituciones conservadoras incluyen, entre los aminoácidos alifáticos, intercambio de alanina, valina, leucina, e isoleucina; intercambio de los restos hidroxilo de serina y treonina, intercambio de los restos ácidos de aspartato y glutamato, sustitución entre los restos amida de asparagina y glutamina, intercambio de los restos básicos de lisina y arginina, y reemplazos entre los restos aromáticos de fenilalanina y tirosina. Véase Bowie y col., Science, 247: 1306-1310 (1990) .
La región de repetición en tándem de núcleos está opcionalmente modificada, tal como se describe en detalle a continuación, en formas en que la variante retiene la característica de activación de linfocitos T.
En algunas realizaciones, una variante de MUCl es un fragmento de la proteína MUCl. En algunas realizaciones, las variantes de MUCl incluyen fragmentos de MUCl resistentes a la escisión proteolítica o fragmentos de MUCl que contienen uno o más aminoácidos no naturales, tales como D-aminoácidos . Dichos derivados tendrían el beneficio de mayor vida media circulante, mientras que conservan la especificidad beneficiosa de los linfocitos T.
En otra realización, una variante de MUCl incluye una porción de la región de repetición en tándem extracelular de MUCl, con la secuencia de aminoácidos DTR, SEC ID NO: 13, (Asp-Thr-Arg) , DTRP, SEC ID NO: 14, (Asp-Thr-Arg-Pro ) , SAPDTRP, SEC ID NO.: 15, ( Ser-Ala-Pro-Asp-Thr-Arg-Pro ) , o TSAPDTRPA, SEC ID NO: 16. Otros derivados de MUCl consisten básicamente en una repetición de núcleos del péptido truncado de la mucina MUCl, por ejemplo, GVTSAPDTRPAPGSTA, SEC ID NO: 1 . Por supuesto que esta secuencia del núcleo truncada está permutada y/o alterada de otro modo tal como se ha descrito anteriormente .
MODIFICACIONES A LA REPETICIÓN DE NÚCLEOS DE MUCl Las variantes con repetición de núcleos de MUCl incluyen derivados o análogos en los que (i) un aminoácido está sustituido con un resto de aminoácido que no está codificado por el código genético, (ii) el polipéptido maduro está condensado con otro compuesto tal como polietilenglicol, o (iii) aminoácidos adicionales están condensados con el polipéptido de MUCl, tales como una secuencia directora o secretora o una secuencia para la purificación del polipéptido.
Modificaciones típicas incluyen, pero no se limitan a, acetilación, acilación, ribosilacion ADP de, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto de hemoglobina, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fos fatidilinositol , reticulación, ciclación, formación de enlaces disulfuro, demetilación, formación de entrecruzamientos covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, gamma carboxilación, glicosilación, formación de anclajes de GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición de aminoácidos mediada por ARN de transferencia a proteínas tal como arginilación, y ubiquitinación .
Se hacen modificaciones en cualquier parte en un polipéptido con repetición de núcleos de MUC1, que incluye la estructura principal del péptido, las cadenas laterales de aminoácidos, y los extremos amino o carboxilo. Determinadas modificaciones comunes del péptido que son útiles para la modificación de la repetición de núcleos de MUC1 incluyen glicosilación, unión a lípidos, sulfatación, gamma-carboxilación de restos de ácido glutámico, hidroxilación, bloqueo del grupo amino o carboxilo en un polipéptido, o ambos, mediante una modificación covalente, y ribosilación de ADP.
Además, uno o más aminoácidos de la secuencia de núcleos están alterados, de una manera conservadora de modo que se mantiene el requisito de actividad de activación de linfocitos T. Las sustituciones típicas se hacen entre los siguientes grupos de aminoácidos: (a) G, A, V, L e I; (b) G y P; (c) S, C, T, M; (d) F, Y, y W; (e) H, y R; y (f) D, E, N., y Q. Otras sustituciones incluyen los siguientes grupos: (i) S y T; (ii) P y G; a (iii) A, V, L e I.
Dentro del alcance de las realizaciones que se proporcionan en el presente documento también se contemplan modificaciones de polipéptido con repetición de núcleos en que el polipéptido se une a otro polipéptido con el que 7 O normalmente no se asocia (por ejemplo, proteína de fusión a Glutatión S-transferasa (GST), fusiones a beta-galactosidasa, fusiones a GAL de dos híbridos de levadura, fusiones a poli-His, fusiones a Ig y similares). Por lo tanto, un péptido con repetición de núcleos de MUC1 opcionalmente está unido de forma operativa, a su extremo N o C, a un polipéptido heterólogo que tiene una secuencia de aminoácidos que no es básicamente homologa a la repetición de núcleos de MUC1. "Unido operativamente" indica que tanto el péptido con repetición de núcleos de MUC1 como el polipéptido heterólogo están en la estructura. Dicha proteína de fusión altera (por ejemplo, potencia, amortigua) la capacidad de la repetición de núcleos de MUC1, o una variante funcional de la misma, de inducir una reacción inmunológica a partir de un sistema huésped.
EPÍTOPOS DE HIDRATOS DE CARBONO Los cánceres humanos presentan varios epítopos de hidratos de carbono. Éstos incluyen las cadenas de la serie lacto de tipo 1 y de tipo 2, cadenas ganglio asociadas a cáncer, y glicoesfingolípidos neutros. Ejemplos de las cadenas de de la serie lacto de Tipo 1 y de Tipo 2 incluyen, y no se limitan a: Lewis a, Lewis a dimérica, Lewis b, Lewls b/Lewis a, Lewis x, Lewis, y, Lewis a/Lewis x, Lewis x dimérico, Lewis y/Lewis x, trifucosil Lewis y, trifucosil Le is b, sialosil Lewis x, sialosilo Lewis y, sialosil Le is x dimérico, Tn, sialosil Tn, sialosil TF, TF y similares. Ejemplos de cadenas ganglio asociadas a cáncer incluyen y no se limitan a . GM3, GD3, GM2, GM4, GD2, GM1 , GD-la , GD-lb y similares. Esfingolipidos neutros incluyen globotriosa, globotetraosa, globopentaosa, isoglobotriosa , isoglobotetraosa , mucotriosa, mucotetraosa, lactotriosa, lactotetraosa, neolactotetraosa, gangliotriosa , gangliotetraosa, galabiosa, 9-0-acetil-GD3 y similares.
Otro grupo de dichos antigenos comprende las mucinas glicosiladas asociadas a tumores. Generalmente, las mucinas son glicoproteinas que se encuentran en la saliva, jugos gástricos, etc., que forman soluciones viscosas y que actúan como lubricantes o protectores en las superficies externas e internas del organismo. Los tejidos cancerosos producen mucinas anómalas que están relativamente menos glicosiladas y/o sobreexpresadas que sus homólogos normales. Debido a alteraciones funcionales de la maquinaria de glicosilación de proteínas en células cancerosas, las mucinas asociadas a tumores contienen por lo general glicanos cortos, incompletos. Por lo tanto, a modo de ejemplo, la mucina normal asociada a los glóbulos de grasa de la leche humana consiste principalmente en el glicano tetrasacárido, gal ß 1- 4 glcNAcpl-6 ( gal ß 1-3) gal NAC-OÍ y sus análogos sialilados.
Pero el hapteno Tn asociado a tumores consiste solamente en el resto de monosacárido, a-2-acetamido-3-desoxi-D-galactopiranosilo, y el hapteno T consiste solamente en el disacárido ß-D-galactopiranosil- ( 1-3 ) -a-acetamido-2-desoxi-D-galactopiranosilo . Otros haptenos de mucinas asociadas a tumores, tales como los haptenos sialil-Tn y el sialil-(2-6)T, incluyen haptenos a partir de la unión de restos terminales de sialilo a los glicanos cortos de Tn y T.
Los antigenos T y Tn se encuentran en forma inmunorreactiva en las membranas de la superficie externa de la mayoría de las células de carcinoma primario y sus metástasis (> 90 % de todos los carcinomas humanos). Como marcadores de cáncer, T y Tn permiten la detección inmunohistoquímica temprana y el pronóstico de la capacidad de invasión de determinados carcinomas. El grado de expresión de T y Tn con frecuencia se correlaciona con el grado de diferenciación de cánceres que incluyen determinados carcinomas .
Una diversidad de hidratos de carbono son adecuados para incorporación en un glicolipopéptido sintético inmunógeno presente en una formulación de vacuna liposomal que se describe en el presente documento. Diversos epítopos de hidratos de carbono se describen en Wong, Patente de Estados Unidos N° 6,013,779, que se incorpora en el presente documento por referencia para dicha divulgación. Los haptenos Tn, T, TF, sialil Tn y sialil (2—>6) T son ejemplos de epitopos de hidratos de carbono asociados a tumores que se expresan en un grado elevado en los cánceres humanos comunes; dichos epitopos de hidratos de carbono se conjugan con compuestos aminados y/o aminoácidos usando métodos adecuados.
En algunas realizaciones, los epitopos de hidratos de carbono adecuados para glicosilacion de una repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1 incluyen y no se limitan a: el hapteno T, y similares.
En la mucina MUCl humana natural de 20 mer, existen cinco sitios típicos de glicosilación unidos a 0 por repetición. En MUCl normal, una media de 2,6 de estos sitios están ocupados.
Dentro del alcance de la realizaciones que se presentan en el presente documento se contemplan formulaciones de vacuna que comprenden glicoproteínas de MUCl en que el número medio de aminoácidos glicosilados por repetición es inferior a, el mismo que, o mayor que el valor "natural". En alguna de dichas realizaciones, uno o más de los restos de Serina o Treonina de SEC ID NO: 1 están O-glicosilados.
Como se usa en el presente documento, un aminoácido o péptido glicosilado es uno cuya cadena lateral comprende al menos una unidad monomérica de hidratos de carbono. Opcionalmente, un aminoácido o péptido glicosilado incorpora un resto alifático y/o aromático. Un aminoácido o péptido glicosilado de forma sencilla es uno cuya cadena lateral consiste en un engarce seleccionado entre el grupo que consiste en -O-, -S-, y -NH-, y una o más unidades de hidratos de carbono. Un aminoácido o péptido glicosilado comprende unidades de monómeros seleccionados entre galactosa, mañosa, glucosa, N-acetilglucosamina , N-acetilgalactosamina, ácidos siálicos, fucosa, xilosa y similares. El número de unidades de azúcar varia, de aproximadamente 1 a 20; o de 1 a 10, o 1 de a 5, o 1-3 o 1-2. Si una cadena de oligosacáridos (es decir, una cadena de dos o más unidades de azúcar) está unida, la cadena es lineal o ramificada.
En una realización, un aminoácido o péptido glicosilado comprende restos -O-glicosilados y -N-glicosilados . La O-glicosilación es, por ejemplo, de aminoácidos que contienen hidroxi tales como serina o treonina. Tirosina, hidroxilisina, e hidroxiprolina también están opcionalmente O-glicosiladas . En otras realizaciones, un aminoácido o péptido glicosilado comprende restos N-glicosilados. La N-glicosilación es, por ejemplo, de cadenas laterales de aminoácidos que contienen amida, tales como Asn, o del extremo amino de una proteina. En un enlace N-glicosilado, el nitrógeno está opcionalmente sin sustituir (-NH-) o sustituido (-NZ-) . En otras realizaciones, un aminoácido o péptido glicosilado comprende restos S-glicosilados . La S-glicosilación es, por ejemplo, del grupo tiol de cisteína.
En consecuencia, en algunas realizaciones, las formulaciones de vacuna que se describen en el presente documento comprenden inmunógenos en que uno de los restos Serina o Treonina de SEC ID NO: 1 está glicosilado. En algunas realizaciones, las formulaciones de vacuna que se describen en el presente documento comprenden inmunogenos en que dos de los restos Serina o Treonina de SEC ID NO: 1 están glicosilados . En algunas realizaciones, las formulaciones de vacuna que se describen en el presente documento comprenden inmunogenos en que tres de los restos Serina o Treonina de SEC ID NO: 1 están glicosilados. En algunas realizaciones, las formulaciones de vacuna que se describen en el presente documento comprenden inmunogenos en que cuatro de los restos Serina o Treonina de SEC ID NO: 1 están glicosilados. En algunas realizaciones, las formulaciones de vacuna que se describen en el presente- documento comprenden inmunogenos en que cinco de los restos Serina o Treonina de SEC ID NO: 1 están glicosilados.
En algunas realizaciones, las formulaciones de vacuna que se describen en el presente documento comprenden dos o más copias de la secuencia de repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1. En alguna de dichas realizaciones, las ¦ formulaciones de vacuna que se describen en el presente documento comprenden inmunogenos que tienen dos o más copias de la secuencia de repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1 en que uno de los restos Serina o Treonina de SEC ID NO: 1 están glicosilados. En algunas realizaciones, las formulaciones de vacuna que se describen en el presente documento comprenden inmunogenos que tienen dos o más copias de la secuencia de repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1 en que los de los restos Serina o Treonina de SEC ID NO: 1 están glicosilados . En algunas realizaciones, las formulaciones de vacuna que se describen en el presente documento comprenden inmunógenos que tienen dos o más copias de la secuencia de repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1 en que tres de los restos Serina o Treonina del SEC ID NO: 1 están glicosilados. En algunas realizaciones, las formulaciones de vacuna que se describen en el presente documento comprenden inmunógenos que tienen dos o más copias de la secuencia de repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1 en que cuatro de los restos Serina o Treonina de SEC ID NO: 1 están glicosilados. En algunas realizaciones, las formulaciones de vacuna que se describen en el presente documento comprenden inmunógenos que tienen dos o más copias de la secuencia de repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1 en que cinco de los restos Serina o Treonina de SEC ID NO: 1 están glicosilados. En algunas realizaciones, las formulaciones de vacuna que se describen en el presente documento comprenden inmunógenos que tienen dos o más copias de la secuencia de repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1 en que seis de los restos Serina o Treonina de SEC ID NO: 1 están glicosilados. En algunas realizaciones, las formulaciones de vacuna que se describen en el presente documento comprenden inmunogenos que tienen dos o más copias de la secuencia de repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1 en que siete de los restos Serina o Treonina de SEC ID NO: 1 están glicosilados . En algunas realizaciones, las formulaciones de vacuna que se describen en el presente documento comprenden inmunogenos que tienen dos o más copias de la secuencia de repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1 en que ocho de los restos Serina o Treonina de SEC ID NO: 1 están glicosilados. En algunas realizaciones, las formulaciones de vacuna que se describen en el presente documento comprenden inmunogenos que tienen dos o más copias de la secuencia de repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1 en que nueve de los restos Serina o Treonina de SEC ID NO: 1 están glicosilados. En algunas realizaciones, las formulaciones de vacuna que se describen en el presente documento comprenden inmunogenos que tienen dos o más copias de la secuencia de repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1 en que 10 de los restos Serina o Treonina de SEC ID NO: 1 están glicosilados. Dependiendo del número de copias de la secuencia de repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1, restos adicionales de Serina o Treonina están opcionalmente glicosilados y se contempla que están dentro del alcance de la realizaciones se presentan en el presente documento.
En algunas realizaciones de inmunogenos que tienen dos o más copias de la secuencia de repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1, el patrón de glicosilacion de una secuencia dada de repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1 es el mismo para cada resto en la otra u otras repetición o repeticiones en tándem de núcleos. Por ejemplo, en un inmunógeno que tiene una repetición en tándem de núcleos que tiene glicosilación en los restos de Treonina y un resto de Serina, la otra repetición o repeticiones en tándem de núcleos tendrían la misma glicosilación en los restos correspondientes, es decir, dos restos de Treonina y un resto de Serina.
En algunas realizaciones de inmunogenos que tienen dos o más copias de la secuencia de repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1, el patrón de glicosilación de una secuencia de repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1 no es el mismo para cada resto en la otra u otras repeticiones en tándem de núcleos. Es decir, en algunas realizaciones una repetición en tándem de núcleos está glicosilada de forma diferente que la otra repetición o repeticiones en tándem de núcleos. Se contempla que estas diferencias incluyen diferentes apariciones de glicosilación (por ejemplo, 4 glicosilaciones en una primera repetición en tándem de núcleos y 2 glicosilaciones en una segunda repetición en tándem de núcleos), diferentes restos de aminoácidos para glicosilación y diferentes grupos glicosilo entre repeticiones en tándem de núcleos.
En cualquiera de las realizaciones anteriores, cada resto glicosilo presente en una secuencia de repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1, o SEC ID NO: 18, o SEC ID NO: 19, o cualquier otra secuencia de péptidos que se describe en el presente documento se selecciona independientemente en cada aparición. Por consiguiente, un péptido glicosilado en una formulación de vacuna que se describe en el presente documento comprende uno o más epitopos de hidratos de carbono (por ejemplo, restos glicosilo que se describen en el presente documento tales como epitopos de hidratos de carbono de Te asociados a cáncer) que son todos iguales, o diferentes, o cualquier combinación de diversos restos glicosilo (por ejemplo, restos de Te) .
En algunas realizaciones, las formulaciones de vacuna que se describen en el presente documento comprenden inmunógenos que tienen dos o más copias de la secuencia de repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1 en que Treonina-6, Serina-12 y Treonina-13 están glicosiladas para cada repetición en tándem de núcleos. En algunas realizaciones, las formulaciones de vacuna que se describen en el presente documento comprenden inmunógenos que tienen dos o más copias de la secuencia de repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1 que no tienen Serina-12 y Treonina-13 glicosiladas para una primera repetición en tándem de núcleos y Treonina-6 glicosilada para una segunda repetición en tándem de núcleos o adicional.
Lipidos En algunas realizaciones, una repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1 está unida covalentemente a uno o más aminoácidos lipidados. Como se usa en el presente documento, un "lipido" es un grupo palmitoilo, laurilo, miristoilo, estearoilo o decanoílo o, más generalmente, cualquier grupo acilo graso de cadena ramificada o lineal, monoinsaturado o poliinsaturado, saturado en C2-C30 que está unido a aminoácidos que poseen grupos funcionales oxígeno, nitrógeno, o azufre. Dichos aminoácidos incluyen, pero no se limitan a, treonina, serina, lisina, arginina, y cisteína.
Un "monolipopéptido" es un péptido al que sólo se une un lipido. De forma análoga, un "dilipopéptido" es un péptido que tiene dos lipidos unidos a uno o dos aminoácidos. Si los dos lipidos están unidos a dos restos de aminoácido, esos residuos están espaciados en cualquier número de aminoácidos separados. En casos en los que está unido más de un lipido, los lipidos son el mismo lipido o son diferentes lipidos. De forma análoga, si están unidos más de dos lipidos, dos o más de los lípidos son los mismos o todos los lípidos son distintos .
Por consiguiente, los péptidos lipidados que se proporcionan en el presente documento se incorporan en un liposoma porque la parte lipidica de ese péptido se integra espontáneamente en la bicapa lipidica' de un liposoma. Por lo tanto, en una realización, un lipopéptido se presenta sobre la "superficie" de un liposoma. En una realización alternativa, un péptido se encapsula dentro de un liposoma.
Un glicolipopéptido comprende uno o más aminoácidos glicosilados en que al menos uno de los aminoácidos glicosilados comprende un epitopo de hidratos de carbono asociados a enfermedades, tal como un epitopo de hidratos de carbono asociados a tumores, y uno o más aminoácidos lipidados.
En algunas realizaciones, un glicolipopéptido presente en una formulación de vacuna liposomal que se describe en el presente documento es un dilipopéptido glicosilado. En alguna de dichas realizaciones, el dilipopéptido unido a una repetición en tándem de núcleos glicosilados de SEC ID NO: 1 comprende la secuencia H2N- (aal ) * (aa2) * (aa3) -OH en que aal se selecciona independientemente, en cada caso, entre S, . T, K, R o C; aa2 se selecciona independientemente, en cada caso, entre S, T, , R o C; aa3 se selecciona independientemente, en cada caso, entre L o G; * independientemente, en cada caso, representa un lípido unido covalentemente a un resto de aminoácido.
Como se usa en el presente documento, el lípido representado por está unido covalentemente al aminoácido que precede al "*". De este modo *C*L representa una secuencia dilipidada en que los restos y C están unidos covalentemente a un lipido. Ejemplos de secuencias dilipidadas incluyen, y no se limitan a, S*S*L, S*S*G, S*K*L, T*S*L, R*S*L, C*T*G y similares. También se contempla que otras permutaciones análogas están dentro del alcance de las realizaciones que se presentan en el presente documento.
En alguna de dichas realizaciones, la secuencia dilipidada está unida al N terminal de una repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1. En alguna otra de dichas realizaciones, la secuencia dilipidada está unida al C terminal de una repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1.
En algunas realizaciones, un glicolipopéptido presente en una formulación de vacuna liposomal que se describe en el presente documento comprende, como su región C-terminal, la secuencia SSL, en la que ambas serinas están lipidadas .
Por consiguiente, en el presente documento se proporcionan formulaciones de vacuna que comprenden glicolipopéptidos de MUC1. En algunas realizaciones, dichos glicolipopéptidos sintéticos de MUC1 comprenden una o más copias de un péptido de repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1 que imitan a epitopos de péptidos de MUC1 presentes en células cancerosas.
En el presente documento, en algunas realizaciones, se proporcionan glicolipopéptidos de MUC1 que comprenden un péptido que comprende al menos dos copias de una repetición en tándem de núcleos: TSAPDTRPAPGSTAPPAHGV (SEC ID NO: 1) o una secuencia idéntica al menos en un 85 % a SEC ID NO: 1, o permutación lineal de la misma; en que S y T independientemente, en cada caso, están opcionalmente sustituidos con un epitopo Te de hidratos de carbono asociados a cáncer; y un lipopéptido unido covalentemente a (a) que tiene la fórmula : H2N-(aal) * (aa2) * (aa3) -OH en que aal se selecciona independientemente, en cada caso, entre S, T, K, R o C; aa2 se selecciona independientemente, en cada caso, entre S, T, K, R o C; aa3 se selecciona independientemente, en cada caso, entre L o G; * independientemente, en cada caso, representa un lipido unido covalentemente a un resto de aminoácido.
En el presente documento, en algunas realizaciones, se proporcionan glicolipopéptidos de MUCl que comprenden: (a) un péptido que comprende al menos dos copias de una repetición en tándem de núcleos: T (Te ) S ( Te ) APD ( Te ) RPAPGS ( Te ) T ( Te ) APPAHGV, SEC ID NO: 18 o una secuencia idéntica al menos en un 85 % a SEC ID NO: 18, o permutaciones lineales de la misma; en que Te representa un epitopo de hidratos de carbono asociados a cáncer; (b) un lipopéptido unido covalentemente a (a) que tiene la fórmula: H2N-S*S*L-0H en que * independientemente, en cada caso, representa un lipido unido covalentemente a un resto de Serina.
En el presente documento, en algunas realizaciones, se proporcionan glicolipopéptidos de MUC1 que comprenden un péptido que comprende al menos dos copias de una repetición en tándem de núcleos: TSAPDT ( Te ) RPAPGS ( Te )T (Te) APPAHGV (SEC ID NO: 19) o una secuencia idéntica al menos en un 85 % a SEC ID NO: 19, o permutación lineal de la misma; en que Te es un epitopo de hidratos de carbono asociados a cáncer; y un lipopéptido unido covalentemente a (a) que tiene la fórmula : H2N-(aal)* (aa2)* (aa3)-OH en que aal se selecciona independientemente, en cada caso, entre S, T, K, R o C; aa2 sé selecciona independientemente, en cada caso, entre S, T, , R o C; aa3 se selecciona independientemente, en cada caso, entre L o G; * independientemente, en cada caso, representa un lipido unido covalentemente a un resto de aminoácido; En realizaciones especificas, una formulación de vacuna liposomal que se describe en el presente documento es un glicolipopéptido sintético que contiene 43 aminoácidos, con dos copias de SEC ID NO: 1, y una secuencia tripeptidica dilipidada unida al extremo C como se muestra a continuación: TSAPDT ( Tn ) RPAPGS ( Tn ) T ( Tn ) APPAHGVTSAPDT ( Tn ) RPAPGS ( Tn ) T ( Tn ) APPAHGVS*S*L-OH (SEC ID NO: 2) en que Tn es GalNAcDl.
Existen seis restos de serina y treonina alfa-glicosilados tal como se observa mediante las denominaciones (Tn) . Tn es la abreviatura de N-acetilgalactosamina (GalNAc) unida mediante enlace alfa glicosidico (GalNAcDl). Existen dos restos de miristilserina C-terminales denominados S* que sirven para anclar el péptido en los liposomas del producto farmacológico y potenciar el reconocimiento inmune. Todos los aminoácidos son isómeros L naturales y las serinas y treoninas modificadas con GalNAc unidas a O todas están unidas por enlaces alfa glicosídicos . No hay cisteinas presentes en la secuencia y por lo tanto no hay potencial para estructura terciaria de enlace disulfuro en el péptido o entrecruzamiento entre péptidos.
En algunas realizaciones, una formulación de vacuna que se proporciona en el presente documento comprende una sal de SEC ID NO: 2. Ejemplos de dichas sales incluyen, y no se limitan a, sales de acetato, citrato, tartrato, mesilato, besilato, tosilato, maleato, fumarato, oxalato, triflato, trietilamina, diisopropiletilamina y similares. Ejemplos adicionales de dichas sales incluyen, y no se limitan a, clorhidrato, bromhidrato, fosfato, sulfato y similares. En otras realizaciones, una sal de SEC ID NO: 2 es una sal del ácido trifluoroacético . En realizaciones especificas, una sal de SEC ID NO: 2 es una sal de acetato que tiene la fórmula: C248H407N59O90 · X C2H302.
Adyuvantes Los glicolipopéptidos que comprenden repeticiones en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1 se administran opcionalmente en conjunto con un adyuvante para potenciar una respuesta específica a un antígeno. En una realización, adyuvantes a base de Lipidos, tales como Lipido A y derivados del mismo, son adecuados para uso con las formulaciones de vacuna de glicolipopéptidos que se describen en el presente documento. Monofosforil lipido A (MPLA) , por ejemplo, es un adyuvante que provoca una presentación aumentada de antigeno liposomal a Linfocitos T específicos. En otra realización, un muramil dipéptido (MDP) también es un adyuvante adecuado para uso en conjunto con las formulaciones de vacuna que se describen en el presente documento.
En una realización más, un adyuvante adecuado para uso con las formulaciones de vacuna liposomal que se proporcionan en el presente documento incluye citoquinas estimulantes, tales como interleuquina-2 (IL-2). En algunas realizaciones, IL-2 se formula de forma beneficiosa con liposomas. En algunas realizaciones, un adyuvante es un modulador de un receptor de tipo toll. Ejemplos de moduladores de receptores de tipo toll incluyen agonistas de TLR-9 y no se limitan a moduladores de moléculas pequeñas de receptores de tipo toll tales como Imiquimod. Otros ejemplos de adyuvantes que se usan en combinación con un adyuvante de Fórmula I o Fórmula II incluyen, y no se limitan a, saponina, ODN de CpG y similares .
También se contemplan imitadores sintéticos de Lipido A para uso con formulaciones de vacuna que se describen en el presente documento. En alguna de dichas realizaciones, un adyuvante es un compuesto de Fórmula I: Fórmula I en que al menos uno de Rl, R2, R3, R5, R6, y R7 es un grupo fuertemente lipofílico seleccionado entre el grupo el grupo que consiste en H3C(CH2)k X— \- (O H3C(CH2)k (CH=CHCH2)„-X f- (i¡) en que X, XI, X2, y X3 son independientemente —CO— o — CH2-; Z es —NH— o -0; k, m, y r son independientemente un número entero de 0 a 30 incluido, n y q son independientemente un número entero de 0 a 6 incluido; en que Y4 es un espaciador seleccionado entre el grupo que consiste en —0—, —S—, y —NH— en que, al menos uno de Y1R1, Y2R2, Y3R3, Y5R5, Y6R6 e Y7R7 es un equivalente de fosfato monovalente (EFM), en que cada equivalente de fosfato monovalente es, independientemente, (a) —R'—C(0)0H en que R' es un grupo alquilo sustituido o sin sustituir de 1-4 carbonos, o (b) se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en -0B(0H)0R, -OP(O) (OH)OR, -OS ( O) ( 0 ) ( OH ) OR, y -OP ( =0 ) { OH ) -O-P(=0) (OH)OR, en que R es hidrógeno, o un grupo alquilo sustituido o sin sustituir de 1-4 carbonos, y si R es un grupo alquilo sustituido, las sustituciones son—OH o —NH2, en que R8 se selecciona entre el grupo que consiste en H, OH, 0R9, un resto que en combinación con Y8 forma un equivalente de fosfato monovalente como se ha definido anteriormente, y un grupo (i)-(viii) como se ha definido anteriormente; en que R9 es un grupo alquilo o acilo con una longitud de 1 a 10 carbonos; y en que el enlace glicosídico es o ß; o un compuesto que es un compuesto- de Fórmula II Fórmula II en que al menos uno de Rl, R2, R3, Rll, R12 y R13 es un grupo fuertemente lipofílico seleccionado entre el grupo el grupo que consiste en (i)-(viii) mencionados anteriormente; en que Y4 es un espaciador seleccionado entre el grupo que consiste en —O—, —S—, y —NH— y en que al menos uno de Yl, Rl, Y2R2, Y3R3, Y11R11, Y12R12 e Y13R13 es independientemente un equivalente de fosfato monovalente como se ha definido anteriormente; en que las siguientes limitaciones se aplican tanto a (I) como a (II) mencionados anteriormente: Yl, Y2, Y3, Y5, Y6, Y7 , Yll, Y12 e Y13 son espaciadores independientemente seleccionados entre el grupo que consiste en —O—, -S-, y -NH-; Rl, R2, R3, R5, R6, R7 , Rll, R12 y R13 son independientemente hidrógeno, un resto que con el grupo Y numerado normalmente forma equivalente de fosfato monovalente como se ha definido anteriormente, o un grupo fuertemente lipofilico seleccionado entre el grupo que consiste en (i)-(viii) mencionados anteriormente. los grupos fuertemente lipofilicos de dicho compuesto proporcionan colectivamente al menos dos cadenas principales de carbono, y las cadenas principales de carbono de dichos grupos fuertemente lipofilicos proporcionan colectivamente al menos 30 átomos de carbono; o que el compuesto es una sal farmacéuticamente aceptable de I o II.
En algunas realizaciones, un adyuvante adecuado para una formulación de vacuna liposomal que se describe en el presente documento es un compuesto de Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo En algunas realizaciones, un adyuvante adecuado para una formulación de vacuna liposomal que se describe en el presente documento es un compuesto de Fórmula II, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En algunas realizaciones, Y4 es —O—. En algunas realizaciones, al menos un grupo fuertemente lipofilico satisface (i) y para al menos uno de dichos grupos, k es un número entero de 4-30. En algunas realizaciones, al menos un grupo fuertemente lipofilico satisface (ii), y para al menos uno de dichos grupos, y 2k+3n es un número entero de 4-30. En algunas realizaciones, al menos un grupo fuertemente lipofilico satisface (iii), y para al menos uno de dichos grupos, y m+n+1 es de 4-30. En algunas realizaciones, al menos un grupo fuertemente lipofilico satisface (iv), y para al menos uno de dichos grupos, m+n+1 es de 4-30. En algunas realizaciones, al menos un grupo fuertemente lipofilico satisface (v) , y para al menos uno de dichos grupos, m+n+k+1 es de 4-30. En algunas realizaciones, al menos un grupo fuertemente lipofilico satisface (vi), y para al menos uno de dichos grupos, k+m+2 es de 4-30. En algunas realizaciones, al menos un grupo fuertemente lipofilico satisface (vii), y para al menos uno de dichos grupos, k+q+m+n es de 4-30. En algunas realizaciones, al menos un grupo fuertemente lipofilico satisface (viii), y para al menos uno de dichos grupos, r+k+q+m+n es de 5-30.
En algunas realizaciones, Yl, Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7 , Yll, Y12 e Y13 son independientemente —O— o — H-. En algunas realizaciones, Yl, Y2, Y3, Y4, Y5, Y6 e Y7, consisten independientemente en —O— o —NH—. En algunas realizaciones, Yl, Y2, Y3, Y4, Yll, Y12, Y13 son independientemente -O- o - NH-.
En algunas realizaciones, cada equivalente de monofosfato es -0P (0) (OH) (OH) .
En algunas realizaciones, un adyuvante de Fórmula I es un compuesto en que Y4 es -0-; Yl, Y2, e Y7 son -O-; Y3, Y5 e Y6 son independientemente —O— o —NH—; Rl, R3, R5 y R6 son independientemente hidrógeno o un grupo fuertemente lipofílico seleccionado entre (i)-(viii); al menos uno de Rl, R3, R5, y R6 no es hidrógeno; R2 y R7 se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en H, -P(0) (OH)2, -S03H, -P (O) (OH) (OCH2CH2NH2 ) . y -CH2COOH; y R8 se selecciona entre el grupo que consiste en H, OH, OS03H, y OR9, en que R9 es un grupo alquilo o acilo con una longitud de 1 a 10 carbonos.
En algunas realizaciones de Fórmula I, Y4 es -0-; Y2 e Y12 son -O-; Yl, Y3, Yll, e Y13 se eligen independientemente entre el grupo que consiste en —O—, —NH— y —S—; Rl, R3, Rll, y R13 son independientemente hidrógeno, o un grupo fuertemente lipofílico seleccionado entre (i)- ( viii ) ; al menos uno de Rl, R3, R5, y R6 no es hidrógeno; y R2 y R12 se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en H, -P(0) (0H)2, -P (O) (OH) (OCH2CH2NH2 ) , y -CH2COOH.
En algunas realizaciones, Rl, R3, R5 y R6 son independientemente hidrógeno o un grupo fuertemente lipofilico seleccionado entre el grupo que consiste en (i)- (viii), al menos un Rl, R3, R5 y R6 no es hidrógeno, y R2 y R7 se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en H, -P(0)(OH)2, -S03H,-, -P (O) (OH) (OCH2CH2NH2 ) , y —CH2COOH; y R8 se selecciona entre el grupo que consiste en H, OH, OS03H, y OR9 en que R9 es un grupo alquilo o acilo con una longitud de 1 a 10 carbonos.
En algunas realizaciones, Rl, R3, Rll, y R13 son independientemente hidrógeno, o un grupo fuertemente lipofilico seleccionado entre (i)-(viii); al menos uno de Rl, R3, R5, y R6 no es hidrógeno; y R2 y R12 se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en H, — P(0)(OH)2, -P (O) (OH) (OCH2CH2NH2 ) , y -CH2COOH.
En algunas realizaciones, cada equivalente de monofosfato es -0P (0) (OH) (OH) .
En algunas realizaciones, los grupos fuertemente lipofilicos de compuestos que se han descrito anteriormente proporcionan colectivamente al menos tres cadenas principales de carbono, y en que las cadenas principales de carbono de dichos grupos fuertemente lipofilicos proporcionan colectivamente al menos 40 átomos de carbono, teniendo dicho compuesto actividad inmunoestimulante . En algunas realizaciones, los grupos fuertemente lipofilicos de compuestos que se han descrito anteriormente proporcionan colectivamente al menos cuatro cadenas principales de carbono y en que las cadenas principales de carbono proporcionan colectivamente al menos 50 átomos de carbono, teniendo dicho compuesto actividad inmunoestimulante.
En algunas realizaciones, los grupos fuertemente lipofilicos proporcionan colectivamente seis cadenas principales de carbono. En algunas realizaciones, cada cadena principal de carbono está caracterizada por 10, 12, 14, 16, 18 o 20 átomos de carbono en dicha cadena.
En algunas realizaciones, Y3 e Y5 son —NH— e Y6 es —O—. En algunas realizaciones, R3, R5 y R6 son grupos fuertemente lipofilicos de acuerdo con (v) , con valores elegidos independientemente para k, XI, m, n, y X2. En algunas realizaciones, k y m para R3, R5 y R6 son independientemente de 8-18. En algunas realizaciones, XI es —CO—, X2 es —CO— y n = 1. En algunas realizaciones, k y m son independientemente 8, 10, 12, 14, 16 o 18. En algunas realizaciones, k y m son 12. En algunas realizaciones, R8 es OH. En algunas realizaciones, Y7 es -O- y R7 es -P (=0) (OH) (OH) . En algunas realizaciones, Y2 es —O— y R2 es H. En algunas realizaciones, Y2 es -O- y R2 es -P ( =0) ( OH ) ( OH ) . En algunas realizaciones, R1-R3 son hidrógeno. En algunas realizaciones, Y1-Y3 son —O— y R1-R3 son hidrógeno. En algunas realizaciones, R1-R3 son hidrógeno, y dos de Y1-Y3 son —O— y el otro es —NH—. En algunas realizaciones, dos de R1-R3 son hidrógeno. En algunas realizaciones, dos de -Y1R1, -Y2R2, y -Y3R3 son -OH. En algunas realizaciones, uno de —Y1R1, —Y2R2, e Y3R3 es —OH y uno de -Y1R1, -Y2R2, e Y3R3 es -NH2.
En algunas realizaciones, uno de R1-R4 es hidrógeno. En algunas realizaciones, ninguno de R1-R3 es hidrógeno. En algunas realizaciones, uno de R1-R3 es un grupo fuertemente lipofílico. En algunas realizaciones, al menos dos de R1-R3 comprenden grupos fuertemente lipofilicos. En algunas realizaciones, dos de R1-R3 son grupos fuertemente lipofilicos. En algunas realizaciones, tres de R1-R4 son grupos fuertemente lipofilicos.
En algunas realizaciones, cada uno de los espaciadores Y1-Y4 e Y11-Y13 es —O—. En algunas realizaciones, tres de los espaciadores Y1-Y4 son —O— y el espaciador restante es —NH—.
En algunas realizaciones, un compuesto de Fórmula I o Fórmula II proporciona un equivalente de fosfato. En algunas realizaciones, un compuesto de Fórmula I o Fórmula II proporciona dos equivalentes de fosfato.
En algunas realizaciones, se aplica (b) y R es hidroxilo. En algunas realizaciones, se aplica (b) y dicho equivalente de fosfato comprende —OP (=0) (OH) 0—. En algunas realizaciones, se aplica (b) y R es un grupo alquilo sustituido o sin sustituir de 1-4 carbonos.
En algunas realizaciones, R es CH2CH2NH2, En algunas realizaciones, se aplica (a). En algunas realizaciones, R' es —CH2 —. En algunas realizaciones, el azúcar es un amino azúcar. En algunas realizaciones, el azúcar es una glucosamina.
En algunas realizaciones, al menos un equivalente de fosfato es Y5R5, Y6R6, Y7R7, o Y8R8. En algunas realizaciones, al menos un equivalente de fosfato está conectado a dicha unidad de azúcar. En algunas realizaciones, al menos un equivalente de fosfato es Y1R1, Y2R2 o Y3R3. En algunas realizaciones, al menos uno de R5-R8 comprende un grupo fuertemente lipofilico. En algunas realizaciones, dos o más de R5-R7 comprenden un grupo fuertemente lipofilico.
En algunas realizaciones, al menos un grupo fuertemente lipofilico comprende sólo una cadena principal de carbono. En algunas realizaciones, al menos un grupo fuertemente lipofilico comprende sólo dos cadenas principales de carbono.
En algunas realizaciones, al menos un grupo fuertemente lipofílico comprende sólo tres cadenas principales de carbono. En algunas realizaciones, grupos fuertemente lipofílicos proporcionan colectivamente tres cadenas principales de carbono. En algunas realizaciones, grupos fuertemente lipofilicos proporcionan colectivamente cuatro cadenas principales de carbono. En algunas realizaciones, grupos fuertemente lipofilicos proporcionan colectivamente cinco cadenas principales de carbono. En algunas realizaciones, grupos fuertemente lipofilicos proporcionan • colectivamente seis cadenas principales de carbono. En algunas realizaciones, grupos fuertemente lipofilicos proporcionan colectivamente siete cadenas principales de carbono. En algunas realizaciones, grupos fuertemente lipofilicos proporcionan colectivamente ocho cadenas principales de carbono.
En algunas realizaciones, cada cadena principal de carbono tiene de 10-20 carbonos. En algunas realizaciones, cada cadena principal de carbono tiene de 12-16 carbonos. En algunas realizaciones, las cadenas principales de carbono de los grupos fuertemente lipofilicos proporcionan colectivamente al menos 40 átomos de carbono. En algunas realizaciones, las cadenas principales de carbono de los grupos fuertemente lipofilicos proporcionan colectivamente al menos 50 átomos de carbono. En algunas realizaciones, las cadenas principales de carbono de los grupos fuertemente lipofilicos proporcionan colectivamente al menos 60 átomos de carbono. En algunas realizaciones, las cadenas principales de carbono de los grupos fuertemente lipofilicos proporcionan colectivamente al menos 70 átomos de carbono. En algunas realizaciones, las cadenas principales de carbono de los grupos fuertemente lipofilicos proporcionan colectivamente al menos 80 átomos de carbono. En algunas realizaciones, las cadenas principales de carbono de los grupos fuertemente lipofilicos proporcionan colectivamente al menos 90 átomos de carbono. En algunas realizaciones, las cadenas principales de carbono de los grupos fuertemente lipofilicos proporcionan colectivamente no más de 90 átomos de carbono. En algunas realizaciones, las cadenas .principales de carbono de los grupos fuertemente lipofilicos proporcionan colectivamente no más de 80 átomos de carbono. En algunas realizaciones, las cadenas principales de carbono de los grupos fuertemente lipofilicos proporcionan colectivamente no más de 70 átomos de carbono. En algunas realizaciones, las cadenas principales de carbono de los grupos fuertemente lipofilicos proporcionan colectivamente no más de 60 átomos de carbono.
En algunas realizaciones, al menos un grupo fuertemente lipofilico se selecciona entre el grupo que consiste en en que X es -CO- o -CH2-, k es un número entero de 4-30; en que n es un número entero de 0-6, k es un número entero de 0-30 y 2k+3n es 35 un número entero de 4-30; en que m y n son números enteros (de 0-6 para n y de 0-30 para m) , y m+n+1 es de 4-30; en en que XI y X2 son independientemente —CO— o —CH2— y m+n+k+1 es de 4-30; en que Z es —NH— o —O-, y k+m+2 es de 4-30; en que q es un número entero de 0-6, y k+q+m+n es de 4- en que XI, X2, y X3 son independientemente —CO— o —CH2 — C02—, r es un número entero de 0-6, y r+k+q+m+n es de 5-30.
En algunas realizaciones, todos los grupos fuertemente lipofilicos se seleccionan entre el grupo que consiste en estructuras (i) -(viii). En algunas realizaciones, al menos un grupo fuertemente lipofilico es la estructura (i). En algunas realizaciones, al menos un grupo fuertemente lipofilico es la estructura (?·) . En algunas realizaciones, al menos un grupo fuertemente lipofilico es la estructura (iii) . En algunas realizaciones, al menos un grupo fuertemente lipofilico es la estructura (iv) . En algunas realizaciones, al menos un grupo fuertemente lipofilico es la estructura (v) . En algunas realizaciones, al menos un grupo fuertemente lipofílico es la estructura (vi). En algunas realizaciones, al menos un grupo fuertemente lipofílico es la estructura (vii). En algunas realizaciones, al menos un grupo fuertemente lipofílico es la estructura (viii).
En algunas realizaciones, al menos un grupo fuertemente lipofílico es una de las estructuras que se exponen a continuación En algunas realizaciones, el al menos un grupo fuertemente lipofilico comprende un enantiómero R. En algunas realizaciones, el al menos un grupo fuertemente lipofilico comprende un enantiómero S. En algunas realizaciones, el al menos un grupo fuertemente lipofilico es un racemato. En algunas realizaciones, el al menos un grupo fuertemente lipofilico comprende un diastereómero RR, RS, y SR o SS. Se contempla que todos los racematos, en'antiómeros o diastereómeros están dentro del alcance de las realizaciones que se presentan en el presente documento. En algunas realizaciones, el al menos un grupo fuertemente lipofilico es una de las estructuras que se exponen a continuación: 106 En algunas realizaciones, el al menos un grupc fuertemente lipofílico es una de las estructuras que se exponen a continuación: En algunas realizaciones, cada grupo fuertemente lipofílico es independientemente una de las estructuras que se han expuesto anteriormente.
En algunas realizaciones, el adyuvante es un compuesto tal como se define a continuación: en que Rl, R3, R5 y R6 son independientemente hidrógeno o un grupo lipofílico seleccionado entre el grupo que consiste en H-,C(C H½)„ X - í¡) HsCtCHj),, fCH=CHCH2)n X |- OH 3C(C H=), en que X, XI, X2, y X3 son independientemente —CO— o — CH2 ,—; Z es -NH- o -O-; k, m, y r son independientemente un número entero de 0 a 30 incluido, n y q son independientemente un número entero de 0 a 6 incluido; al menos uno de Rl, R3, R5 y R6 no es hidrógeno; R2 y R7 se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en H, -P(0) (OH)2, -S03H, -P (O) (OH) (OCH2CH2NH2 ) , y -CH2COOH; y R9 es H, o un grupo alquilo o acilo de 1 a 10 carbonos de longitud.
En algunas realizaciones, Rl y R9 son hidrógeno; R2 es a hidrógeno o el grupo fosfono—P (O) (OH) 2; R7 es el grupo fosfono—P(O) (OH) 2; y R3, R5 y R6 son los mismos o diferentes grupos acilo de la siguiente estructura en que. m y n se eligen independientemente entre un número entero entre 6 y 10 incluido.
En algunas realizaciones, R3, R5 y R6 son idénticos. En algunas realizaciones, un adyuvante es En algunas realizaciones, un adyuvante tiene Lguiente estructura (Lípido A de PET) En algunas realizaciones, un adyuvante es: En algunas realizaciones un adyuvante tiene la siguiente estructura algunas realizaciones, un adyuvante es un compuesto definido por la siguiente estructura en que Y3, Y5 e Y6 son independientemente —O— o —NH—; Y10 se selecciona entre el grupo que consiste en —O—, — NH— y -S-; Rl, R3, R5 y R6 son independientemente hidrógeno o un grupo lipofilico seleccionado entre el grupo que consiste en H3C(C H2)k X— - en que X, XI, X2, y X3 son independientemente CO o CH2; Z es NH u 0; k, m, y r son independientemente un número entero de 0 a 30 incluido, n y q son independientemente un número entero de 0 a 6 incluido; y al menos uno de Rl, R3, R5 y R6 no es un átomo de hidrógeno; R2 se selecciona entre el grupo que consiste en H, — P(0)(OH)2, -S03H, -P (O) (OH) (OCH2CH2NH2 ) , y -CH2COOH; y RIO se selecciona entre el grupo que consiste en H, — P(0)(OH)2, -S03H, —P(O) (OH) ( OCH2CH2NH2 )— CH2COOH . y un grupo alquilo de 1 a 10 carbonos de longitud, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En algunas realizaciones, el adyuvante tiene la siguiente estructura en que R2 y RIO son independientemente hidrógeno o un grupo fos fono (—P ( 0) (OH) 2 ) , y al menos uno de ellos es el grupo fosfono; Y3 es -0- o —NH—, R3, R5, y R6 son independientemente hidrógeno o un grupo lipofilico seleccionado entre el grupo que consiste en H3 en que X, Xll, X2, y X3 son independientemente CO o CH2; Z es NH u O; k, m, y r son independientemente un número entero de 0 a 30 incluido, n y q son independientemente un número entero de 0 a 6 incluido; y al menos uno de R3, R5, y R6 no es hidrógeno.
En algunas realizaciones, el adyuvante tiene la siguiente estructura en que R3, R5 y R6 son el mismo o diferente grupo o grupos de sustitución de la siguiente estructura en que m y n se eligen independientemente entre un número entero entre 6 y 10 incluido.
En algunas realizaciones, el adyuvante tiene la siguiente estructura en que Y3 e Y13 son independientemente —O— o —NH—; R3 y R13 son el mismo grupo de . sustitución y son un grupo fuertemente lipofilico seleccionado entre el grupo que consiste en: H3C(CH2)k— X- (9 H3C(CH2)k— (CH=CHCH2)n en que X, XI, X2, y X, son independientemente CO o CH2; Z es NH y O; k, m, y r son independientemente un número entero de 0 a 30 incluido, n y q son independientemente un número entero de 0 a 6 incluido.
En algunas realizaciones, el adyuvante tiene la siguiente estructura En algunas realizaciones, los grupos fuertemente lipofilicos de dicho compuesto proporcionan colectivamente al menos tres cadenas principales de carbono, y en que las cadenas principales de carbono de dichos grupos fuertemente lipofilicos proporcionan colectivamente al menos 40 átomos de carbono. En algunas realizaciones, los grupos fuertemente lipofilicos de dicho compuesto proporcionan colectivamente al menos cuatro cadenas principales de carbono y en que las cadenas principales de carbono proporcionan colectivamente al menos 50 átomos de carbono. En algunas realizaciones, los grupos fuertemente lipofilicos de dicho compuesto proporcionan colectivamente al menos cuatro cadenas principales de carbono y en que las cadenas principales de carbono proporcionan colectivamente al menos 50 átomos de carbono .
En algunas realizaciones, un compuesto de Fórmula I o Fórmula II comprende una unidad de Pentaeritritol ( PET ) o un derivado de una unidad de PET. En alguna de dichas realizaciones, una unidad PET tiene la estructura: En algunas realizaciones, el Lípido A está modificado por apertura del anillo de una unidad de azúcar para proporcionar un grupo de PET; el grupo de PET está opcionalmente modificado (por ejemplo, para producir un derivado de éter, un derivado de amida, un derivado de éster y similares ) .
En algunas realizaciones, de Fórmula II, al menos dos cadenas principales de carbono están conectadas, sin ninguna unidad intermedia de PET, a la primera unidad de PET, y al menos dos cadenas principales de carbono están conectadas, sin ninguna unidad intermedia de PET, a la segunda unidad de PET. En algunas realizaciones, al menos dos cadenas principales de carbono están conectadas, sin ninguna unidad intermedia de PET, a la unidad de azúcar, y al menos dos cadenas principales de carbono están conectadas, sin ninguna unidad intermedia de azúcar, a la unidad de PET. En algunas realizaciones, los grupos fuertemente lipofilicos proporcionan colectivamente seis cadenas principales de carbono. En algunas realizaciones, los grupos fuertemente lipofilicos proporcionan colectivamente seis cadenas principales de carbono.
En algunas realizaciones, cada cadena principal de carbono está caracterizada por 10, 12, 14, 16, 18 o 20 átomos de carbono en dicha cadena. En- algunas realizaciones, cada cadena principal de carbono está caracterizada por 10, 12, 14, 16, 18 o 20 átomos de carbono en dicha cadena. En algunas realizaciones, cada cadena principal de carbono tiene 10, 12, 14, 16, 18 o 20 carbonos. En algunas realizaciones, cada cadena principal de carbono tiene 10, 12, 14, 16, 18 o 20 carbonos. En algunas realizaciones, cada cadena principal de carbono tiene 10, 12, 14, 16, 18 o 20 carbonos.
En algunas realizaciones, cualquier adyuvante que se ha descrito anteriormente tiene actividad antagonista de lipido A.
En algunas realizaciones, los adyuvantes que se han descrito anteriormente están presentes en forma de sales en las formulaciones de vacuna liposomal que se proporcionan en el presente documento. Ejemplos de dichas sales incluyen, y no se limitan a, sales de trietilamina o diisopropiletilamina, otras sales de amonio, sales de trietanolamina, acetato, citrato, tartrato, mesilato, besilato, tosilato, maleato, fumarato, oxalato, triflato, sales de clorhidrato, bromhidrato, fosfato, sulfato y similares. Otras de dichas sales incluyen, y no se limitan a, NaOH, OH, MqOH, CaOH, ZnOH, etilendiamina , etanolamina (2-aminoetanol ) , ÍH-Imidazol, dietilamina, piperazina, deanol, sales de colina y similares.
En realizaciones especificas, una formulación de vacuna liposomal que se describe en el presente documento comprende Lípido A de PET, es decir, un adyuvante fosfoglicolipido de pentaeritritol en la cadena 6 y C14-glucosamina-monofosfato . En realizaciones especificas, una formulación de vacuna liposomal que se describe en el presente documento comprende una sal de trietilamina de Lipido A de PET. El nombre IUPAC para sal de TEA de Lipido A de PET es hidrogenofosfato de trietilamonio y de ( 2R, 3S, 4R, 5R, 6R) -6- ( 3-hidroxi-2- ( hidroximetil ) -2- ( ( ( R) -3- ( tetradecanoiloxi ) tetradecanamido ) metil )propoxi ) -2- ( hidroximetil ) -5- ( (R)-3-( tetradecanoiloxi ) tetradecanamido ) -4- ( (R) -3- ( tetradecanoiloxi ) tetradecanoiloxi ) tetrahidro-2H-piran-3-ilo . Determinadas propiedades físicas del Lípido A de PET se muestran a continuación: Liposomas Las formulaciones de vacuna que se describen en el presente documento son formulaciones de vacuna liposomal. Los liposomas a modo de e emplo adecuados para su incorporación en las formulaciones incluyen, y no se limitan a, vesículas multilaminares (MLV) , vesículas oligolaminares (OLV) , vesículas unilaminares (UV) , vesículas unilaminares pequeñas (SUV), vesículas unilaminares de tamaño medio (MUV) , vesículas unilaminares grandes (LUV), vesículas unilaminares gigantes (GUV), vesículas multivesiculares (MW) , vesículas individuales u oligolaminares preparadas mediante el método de evaporación en fase inversa (REV), vesículas multilaminares preparadas mediante el método de evaporación en fase inversa (MLV-REV) , vesículas plurilaminares estables (SPLV), MLV congeladas y descongeladas (FATMLV), vesículas preparadas mediante métodos de extrusión (VET), vesículas preparadas mediante prensa Francesa (FPV), vesículas preparadas por fusión (FUV), vesículas de deshidratación-rehidratación (DRV), y burbujosomas (BSV). Técnicas para preparar liposomas son las que se describen, por ejemplo, en COLLOIDAL DRUG DELIVERY SYSTEMS, vol . 66 (J. Kreuter ed., Marcel Dekker, Inc. (1994)).
Dependiendo del método de preparación, los liposomas son unilaminares o multilaminares, y varían en tamaño con diámetros que varían de 0,02 Dm a mayor que aproximadamente 10 Dm.
Los liposomas se adsorben a muchos tipos de células y a continuación liberan un agente incorporado (por ejemplo, un grupo glicopéptido que comprende una o más copias de una repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1). En algunos casos, los liposomas se condensan con la célula diana, mediante la cual los contenidos de los liposomas se vacían a continuación en la célula diana. Como alternativa, un liposoma sufre endocitosis por células que son fagocíticas. La endocitosis va seguida de degradación intralisosomal de lípidos liposomales y liberación de los agentes encapsulados . Scherphof y col., Ann. N.Y Acad . Sci . , 446: 368 (1985).
Los liposomas que se proporcionan en el presente documento también comprenden vehículos lípidos. En algunas realizaciones los vehículos lípidos son fosfolípidos . Vehículos lípidos capaces de formar liposomas incluyen, pero no se limitan a, dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), fosfatidilcolina (PC; lecitina), ácido fosfatídico (PA), fosfatidilglicerol (PG), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilserina (PS). Otros fosfolípidos adecuados adicionales incluyen diestearoil fos fatidilcolina (DSPC), dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) , dipalmitoilfosfatidiglicerol (DPPG), diestearoilfosfatidiglicerol (DSPG) , dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG), ácido dipalmitoilfosfatídico (DPPA); ácido dimiristoilfosfatídico (DMPA), ácido diestearoilfosfatídico (DSPA), dipalmitoil fosfatidilserina (DPPS) , dimiristoilfosfatidilserina (DMPS) , diestearoilfosfatidilserina (DSPS) , dipalmitoil fosfatidietanolamina (DPPE) , dimiristoilfosfatidiletanolamina (DMPE) , diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE) y similares, o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, los liposomas comprenden adicionalmente un esterol (por ejemplo, colesterol) que modula la formación de liposomas. En algunas realizaciones, los vehículos lípidos son lípidos conocidos polares sin fosfato.
En algunas realizaciones, un liposoma que se describe en el presente documento comprende una o más copias de una repetición en tándem de núcleos glicosilados de SEC ID NO: 1 unidos a una secuencia de aminoácidos dilipidados. En algunas otras realizaciones, un liposoma que se describe en el presente documento comprende una o más copias de una repetición en tándem de núcleos glicosilados de SEC ID NO: 1 unidos a una secuencia de aminoácidos dilipidados, y además un adyuvante. En realizaciones adicionales más, un liposoma que se describe en el presente documento comprende una o más copias de una repetición en tándem de núcleos glicosilados de SEC ID NO: 1 unidos a una secuencia de aminoácidos dilipidados, un adyuvante y un vehículo lípido. En cualquiera de las realizaciones que se han mencionado anteriormente, un liposoma que se describe en el presente documento comprende una mezcla de adyuvantes (por ejemplo, un adyuvante de Fórmula I y ODN de CpG, agonistas sintéticos de TLR-9, saponina, o similares).
En realizaciones especificas, una formulación de vacuna que se describe en el presente documento se produce usando una etapa de mezcla simultánea en la que hay una mezcla controlada de fases orgánicas y acuosas. En algunas realizaciones, una fase orgánica comprende un disolvente orgánico. En algunas realizaciones, una fase orgánica comprende un disolvente orgánico y hasta aproximadamente un 20 % v/v de agua. En algunas realizaciones, una fase orgánica comprende un disolvente orgánico y hasta aproximadamente un 15 % v/v de agua. En algunas realizaciones, una fase orgánica comprende un disolvente orgánico y hasta aproximadamente un 10 % v/v de agua. En algunas realizaciones, una fase orgánica comprende un disolvente orgánico y hasta aproximadamente un 5 % de agua. En algunas realizaciones, una fase orgánica comprende un disolvente orgánico y menos de aproximadamente un 5 % v/v de agua. En alguna de dichas realizaciones, la presencia de agua en la fase orgánica permite una mejora disolución de un soluto (por ejemplo, un glicolipopéptido ) . En alguna de dichas realizaciones, la fase orgánica comprende un disolvente orgánico que es miscible con agua.
En algunas realizaciones, una fase acuosa opcionalmente comprende hasta aproximadamente un 20 % v/v de un disolvente orgánico. En algunas realizaciones, una fase acuosa opcionalmente comprende hasta aproximadamente un 15 % v/v de un disolvente orgánico. En algunas realizaciones, una fase acuosa opcionalmente comprende hasta aproximadamente un 10 % v/v de un disolvente orgánico. En algunas realizaciones, una fase acuosa opcionalmente comprende hasta aproximadamente un 5 % v/v de un disolvente orgánico.
A modo de ejemplo, los vehículos lípidos y glicolipopéptido (por ejemplo, un glicolipopéptido de SEC ID NO: 2) y adyuvante (por ejemplo, Lípido A de PET, sal de trietilamina de Lípido A de PET) están totalmente solubi 1 i zados en una fase orgánica que opcionalmente contiene hasta un 5 % v/v de agua (por ejemplo, t-BuOH que contiene hasta un 5 % v/v de agua). El tamaño de liposoma se controla a través del uso de mezcla simultánea de las dos fases usando una relación controlada de caudales. La relación de caudales de las fases acuosa a orgánica se mantiene constante a aproximadamente 3:1 para producir liposomas con una distribución de la población de aproximadamente un 90 % (d90) = 0,22 ym permitiendo la filtración a través de un filtro aséptico. En algunas realizaciones, los liposomas tienen una distribución de la población de aproximadamente un 90 % (d90) = 0,4 pm. En algunas realizaciones, los liposomas tienen una distribución de la población de aproximadamente un 90 % (d90) = 0,30 ym. En algunas realizaciones, los liposomas tienen una distribución de la población de aproximadamente un 90 % (d90) = 0,25 im. En algunas realizaciones, los liposomas tienen una distribución de la población de aproximadamente un 90 % (d90) = 0,20 µ?t?.
Determinados parámetros que están opcionalmente modificados en la preparación de liposomas incluyen la relación de mezcla acuosa/orgánica, temperaturas así como tasa de enfriamiento para obtener liposomas que son adecuados para su incorporación en las formulaciones de vacuna que se describen en el presente documento. La Figura 1 ilustra un procedimiento a modo de ejemplo para la fabricación de formulaciones de vacuna liposomal que se describen en el presente documento.
Relación de caudales entre solución lípída y agua Siempre que el inicio y la detención del flujo de fase acuosa y orgánica son simultáneos, la relación de caudal de solución de agua a orgánica determina la concentración de disolvente y, en consecuencia, el tamaño de liposoma. Cuanto mayor sea la concentración del disolvente, más grandes serán los liposomas formados. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la relación de caudal de agua a caudal de solución orgánica es al menos 2:1 (obteniéndose una concentración de disolvente orgánico no superior a aproximadamente un 33 %), al menos 3:1 (obteniéndose una concentración de disolvente orgánico no superior a aproximadamente un 25 %). En algunas realizaciones, la relación de caudal de agua a caudal de solución orgánica es al menos 5,67:1 (obteniéndose una concentración de disolvente orgánico no superior a aproximadamente un 15 %), La relación de caudal de agua a caudal de solución orgánica por lo general no es superior a 19: 1. En algunas realizaciones, la relación de caudal de agua a caudal de solución orgánica es entre aproximadamente 19:1 (consiguiendo una concentración de disolvente orgánico de aproximadamente un 5 % ) y 3 1/3:1 (consiguiendo una concentración de disolvente orgánico de aproximadamente un 30 %), entre aproximadamente 9:1 (consiguiendo una concentración de disolvente orgánico de aproximadamente un 10 %), y 5:1 (consiguiendo una concentración de disolvente orgánico de aproximadamente un 20 %), o entre aproximadamente 9:1 y 4:1 (consiguiendo una concentración de disolvente orgánico de aproximadamente un 25 %). A modo de ejemplo, una concentración de t-Butanol al 15 % v/v en agua se obtiene haciendo fluir 85 ml/min de agua a 15 ml/min de fase orgánica para proporcionar un tamaño de partícula del liposoma básicamente uniforme de d90. En cualquiera de las realizaciones que se ha mencionado anteriormente, una fase orgánica es cualquier fase orgánica que se describe en el presente documento.
Por consiguiente, el caudal se ajusta como sea práctico para un tamaño de liposoma dado deseado, siempre y cuando la relación se mantenga constante. Por lo tanto, por ejemplo, si se desea producir una preparación de liposomas en la que no más de aproximadamente un 99 % de los liposomas sean de un tamaño inferior a aproximadamente 200 nm, y la concentración de la concentración de solución orgánica sea aproximadamente un 20 %, entonces los caudales se ajustan, mientras que se mantiene una relación de caudal de agua a caudal de solución de lípidos de aproximadamente 4 a 1, de acuerdo con consideraciones prácticas tales como el tiempo práctico de mezcla y el volumen de las soluciones a usar.
Temperatura de los líquidos Los líquidos se calientan opcionalmente mientras que se mantienen en sus respectivos tanques de depósito, que se pueden aislar con camisas para reducir la pérdida de calor. La temperatura del líquido se mantiene entre aproximadamente 40 °C-45 °C, aproximadamente 45 °C-50 °C, aproximadamente 50 °C-55 °C, o aproximadamente 55 °C-60 °C. En algunas realizaciones, la temperatura del líquido se mantiene a aproximadamente 42 °C ± 2 °C, 44 °C ± 2 °C, 47 °C ± 2 °C, 50 °C ± 2 °C, 53 °C ± 2 °C, 55 °C ± 2 °C, 57 °C ± 2 °C, o 60 °C ± 2 °C. En algunas realizaciones , temperatura del liquido se mantiene a aproximadamente 53 °C ± 2 °C.
Enfriamiento En algunas realizaciones, el enfriamiento rápido, hecho posible mediante el uso de un intercambiador de calor inmediatamente después de la formación de liposomas, permite el control del tamaño del liposoma y elimina un obstáculo a la independencia del tamaño del lote y a la variabilidad en el tamaño del liposoma. Para mantener el tamaño del liposoma, la temperatura y el tiempo de enfriamiento no deberían superar aproximadamente 20 °C en 5 horas, por ejemplo enfriando de aproximadamente 55 °C a aproximadamente 35 °C en menos de 5 horas, o de aproximadamente 55 °C a aproximadamente 30 °C en menos de 2 horas, o de aproximadamente 55 °C a aproximadamente 30 °C en menos de 30 minutos. La mezcla se enfría opcionalmente a temperaturas más bajas si desea; sin embargo, la solución a granel se mantiene por encima de la temperatura de congelación.
Un aparato para fabricar liposomas que usan procedimientos que se han descrito anteriormente se describe en el documento de Estados Unidos con N° de Serie 13/140,786 (publicado como Solicitud de Pat . de Estados Unidos N° 2012/0034294), cuya divulgación se incorpora en el presente documento por referencia.
En una realización, un liófilo (es decir, una suspensión que comprende liposomas) obtenido a partir de la etapa de mezcla controlada que se ha descrito anteriormente se filtra de forma estéril, se transfiere a viales y se somete a secado por congelación para proporcionar una torta liofilizada o polvo que comprende liposomas. Dicha torta o polvo se reconstituye en solución salina (por ejemplo, solución salina estéril al 0,9 % p/v) antes de su administración a un individuo con necesidad de la misma. En otra realización, un liófilo (es decir, una suspensión que comprende liposomas) obtenido a partir de la etapa de mezcla controlada que se ha descrito anteriormente se filtra de forma estéril y se administra directamente a un individuo con necesidad del mismo. En otras realizaciones más, un liófilo (es decir, una suspensión que comprende liposomas) obtenido a partir de la etapa de mezcla controlada que se ha descrito anteriormente se filtra de forma estéril, se coloca en viales y se evapora y/o se concentra (por ejemplo, a presión reducida) para proporcionar a una película fina o polvo seco que a continuación se reconstituyen antes de la administración a un individuo con necesidad del mismo.
En algunas realizaciones un líquido usado para reconstitución de una película fina o polvo liposomal o torta liofilizada o sólido que se han descrito anteriormente es solución salina (por ejemplo, solución salina al 0,9 % p/v). En algunas realizaciones, un líquido usado para reconstitución de una película fina o polvo o torta liofilizada o sólido se han descrito anteriormente es cualquier otro diluyente parenteralmente aceptable (por ejemplo, D5W, solución de Ringers lactatada, solución de dextrosa y similares). En algunas realizaciones, un líquido usado para reconstitución de una película fina liposomal o polvo o torta liofilizada o sólido que se han descrito anteriormente es un aceite. En alguna de dichas realizaciones, se contempla dentro del alcance de las realizaciones que se presentan en el presente documento el uso de un aceite farmacéuticamente aceptable como diluyente para la preparación de formulaciones de vacuna de liberación sostenida. En alguna de dichas realizaciones, las formulaciones de vacuna que son suspensiones en aceite permiten la formación de un depósito de liberación sostenida (por ejemplo, un bolsillo subcutáneo o intramuscular de suspensión en aceite) después de la administración, permitiendo por lo tanto la liberación extendida. Ejemplos de dichos diluyentes usados para formular suspensiones en aceite que comprenden liposomas que se describen en el presente documento incluyen, y no se limitan a, aceite de semilla de soja, ácido oleico y sus derivados glicéridos, aceite de oliva, aceite de ricino, y similares. En alguna de dichas realizaciones, una formulación de vacuna liposomal que se proporciona en el presente documento es una emulsión. En alguna de dichas realizaciones, una formulación de vacuna liposomal que se proporciona en el presente documento es una suspensión en aceite.
En algunas realizaciones, una formulación de vacuna liposomal que se describe en el presente documento comprende una relación de peso a peso de péptido glicodilipidado (por ejemplo, SEC ID NO: 2) a adyuvante (por ejemplo, Lipido A de PET, Sal de TEA) de aproximadamente 10: 1 a aproximadamente 1:10. En algunas realizaciones, una formulación de vacuna liposomal que se describe en el presente documento comprende una relación de peso a peso de péptido glicolipidado (por ejemplo, SEC ID NO: 2) a adyuvante (por ejemplo, Lipido A de PET, Sal de TEA) de aproximadamente 8:1 a aproximadamente 1:8. En algunas realizaciones, una formulación de vacuna liposomal que se describe en el presente documento comprende una relación de peso a peso de péptido glicolipidado (por ejemplo, SEC ID NO: 2) a adyuvante (por ejemplo, Lipido A de PET, Sal de TEA) de aproximadamente 5: 1 a aproximadamente 1:5. En algunas realizaciones, una formulación de vacuna liposomal que se describe en el presente documento comprende una relación de peso a peso de péptido glicolipidado (por ejemplo, SEC ID NO: 2) a adyuvante (por ejemplo, Lípido A de PET, Sal de TEA) de aproximadamente 2: l a aproximadamente 1:2. En algunas realizaciones, una formulación de vacuna liposomal que se describe en el presente documento comprende una relación de peso a peso de péptido glicolipidado (por ejemplo, SEC ID NO: 2) a adyuvante (por ejemplo, Lipido A de PET, Sal de TEA) de 1:1. En algunas realización específicas, una formulación de vacuna liposomal que se describe en el presente documento comprende aproximadamente 300 Dg de péptido glicodilipidado (por ejemplo, SEC ID NO: 2) y aproximadamente 150 Dg de adyuvante (por ejemplo, Lípido A de PET, Sal de TEA). En algunas realizaciones, una formulación de vacuna liposomal que se describe en el presente documento comprende aproximadamente 600 Dg de péptido glicodilipidado (por ejemplo, SEC ID NO: 2) y aproximadamente 300 Dg de adyuvante (por ejemplo, Lípido A de PET, Sal de TEA). En algunas realizaciones, una formulación de vacuna liposomal que se describe en el presente documento comprende aproximadamente 900 . Dg péptido glicodilipidado (por ejemplo, SEC ID NO: 2) y aproximadamente 450 Dg de adyuvante (por ejemplo, Lípido A de PET, Sal de TEA). En algunas realizaciones, una formulación de vacuna liposomal que se describe en el presente documento comprende aproximadamente 1200 Dg péptido glicodilipidado (por ejemplo, SEC ID NO: 2) y aproximadamente 600 Dg de adyuvante (por ejemplo, Lipido A de PET, Sal de TEA) . En alguna de dichas realizaciones, la formulación liposomal es un polvo sólido liofilizado o torta que se reconstituyen solución salina (por ejemplo, solución salina estéril al 0,9 % p/v) para proporcionar la formulación de vacuna.
En el presente documento se contempla cualquier combinación de una o más copias de una repetición en tándem de núcleos glicosilados (SEC ID NO: 1), una secuencia de aminoácidos dilipidados, y uno o más adyuvantes, que se han descrito anteriormente para las diversas variables. A través de toda la memoria descriptiva, se proporcionan glicolipopéptidos , y composiciones y métodos para el uso de los mismos, y se eligen para proporcionar tratamiento adecuado para individuos con necesidad de los mismos.
MÉTODOS DE TRATAMIENTO En el presente documento, en algunas realizaciones, se proporcionan métodos para estimular el sistema inmune de un individuo en necesidad de los mismos que comprende la administración de una formulación de vacuna liposomal que se describe en el presente documento (por ejemplo, una formulación de glicolipopéptidos que comprende una o más copias de SEC ID NO: 1 y un adyuvante (por ejemplo, Lipido A de PET ) . En algunos casos, la administración de una formulación de vacuna liposomal que se describe en el presente documento induce y/o mantiene una respuesta celular. En otros casos, la administración de una formulación de vacuna liposomal que se describe en el presente documento induce y/o mantiene una respuesta humoral. En casos adicionales, la administración de una formulación de vacuna liposomal que se describe en el presente documento induce y/o mantiene una respuesta tanto humoral como celular.
En el presente documento también se proporcionan métodos para tratamiento del cáncer en un individuo en necesidad del mismo que comprende la administración de una formulación de vacuna liposomal que se describe en el presente documento. En alguna de dichas realizaciones, el individuo padece cáncer. En otras realizaciones, se sospecha que el individuo está padeciendo cáncer. En otras realizaciones más, el individuo está predispuesto al cáncer (por ejemplo, un individuo predispuesto a cáncer de mama). En determinadas realizaciones, el cáncer se selecciona entre el grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de pulmón, adenocarcinoma del pulmón, cáncer de pulmón de células escamosas, cáncer de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer cerebral, cáncer abdominal, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de esófago, cáncer parafaringeo, cáncer gastrointestinal, glioma, cáncer de hígado, cáncer oral, cáncer de lengua, neuroblastoma , osteosarcoma , cáncer de ovarios, cáncer renal, cáncer de vejiga urinaria, cáncer del tracto urinario, cáncer pancreático, retinoblastoma, cáncer cervical, cáncer de útero, tumor de Wilm, mieloma múltiple, cáncer de piel, linfoma, leucemia, cáncer de sangre, cáncer de tiroides, cáncer óseo, tumor adenoquístico, condrosarcoma, tumor de células del islote pancreático, tumor neuroendocrino, cáncer de próstata, cáncer de ovarios, glioblastoma, carcinoma endometrial, cáncer endometrial, leiomiosarcoma, cáncer de la vesícula biliar, cáncer hepatocelular, cáncer hematológico, mieloma múltiple, leucemia mielógena aguda, leucemia linfoblástica aguda/crónica, leucemia de células pilosas, linfoma folicular, mieloma múltiple, plasmacitoma , linfoma de Linfocitos B grandes difuso. En determinadas realizaciones, el cáncer es cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón, cáncer de colon o cáncer de próstata. En determinadas realizaciones, el cáncer es cáncer de pulmón de células no pequeñas. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer hematológico .
En algunas realizaciones, el cáncer está asociado con la expresión del antigeno MUCl que incluye, pero no se limita a, cánceres de mama, pulmón de células no pequeñas, ovarios, colorrectal, gástrico, próstata, pancreático, y de células renales. En algunas realizaciones, el cáncer está asociado con tumores sólidos. En determinados casos, los tumores sólidos están avanzados, por ejemplo, estadio 3 o 4. En algunos casos, los tumores son tumores de mama, tumores de pulmón de células no pequeñas, tumores de ovario, tumores colorrectales , tumores gástricos, tumores de próstata, tumores pancreáticos, y tumores de cáncer de células renales. En determinados casos, el tumor sólido está asociado histológicamente con la expresión del antigeno MUCl.
Como se usa en el presente documento, en algunas realizaciones, "tratamiento" o "que trata" o "tratado" se refiere a tratamiento terapéutico en que el objetivo es ralentizar (disminuir) una afección fisiológica, trastorno o enfermedad no deseada, u obtener resultados clínicos beneficiosos o deseados. Para los fines que se describen en el presente documento, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, alivio de síntomas; disminución de la extensión de la afección, trastorno o enfermedad; estabilización (es decir, no empeoramiento) del estado de la afección, trastorno por enfermedad; retraso del comienzo o ralentización de la progresión de la afección, trastorno o enfermedad; mejora del estado de la afección, trastorno o enfermedad; y remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o indetectable , o potenciación o mejora de la afección, trastorno o enfermedad. Tratamiento incluye provocar una respuesta clínicamente significativa sin niveles excesivos de efectos secundarios. Tratamiento también incluye prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. En otras realizaciones, tratamiento" o "que trata" o "tratado" se refiere a medidas profilácticas, en que el objetivo es retrasar la aparición de o reducir la gravedad fisiológica no deseada de la afección, trastorno o enfermedad, tal como, por ejemplo es una persona que está predispuesta a una enfermedad (por ejemplo, un individuo que porta un marcador genético de una enfermedad tal como cáncer de mama).
Los métodos de tratamiento que se describen en el presente documento tratan diversas etapas del cáncer que incluyen etapas que están localmente avanzadas, metastásicas y/o recurrentes. En la estadificación del cáncer, localmente avanzado se define generalmente como cáncer que se ha propagado de un área localizada a tejidos y/o ganglios linfáticos cercanos. En el sistema . de clasificación con números Romanos, localmente avanzado normalmente se clasifica en Estadio II o III. Cáncer que es metastásico es un estadio en el que el cáncer se disemina por todo cuerpo a tejidos y órganos distantes (estadio IV). Cáncer, denominado recurrente generalmente se define como el cáncer que ha vuelto a aparecer, normalmente después de un periodo de tiempo, después de estar en remisión o después de que un tumor se hay eliminado visiblemente. La reaparición puede ser local, es decir, que aparece en el mismo lugar que el original, o distante, es decir, que aparece en diferentes partes del organismo. En determinados casos, un cáncer tratable por terapias de combinación que se describen en el presente documento no es resecable, o no se puede eliminar mediante cirugía .
En alguna de dichas realizaciones, los métodos de tratamiento (por ejemplo, inmunoterapia ) que se describen en el presente documento proporcionan terapia accesoria a cualquier otra terapia contra el cáncer prescrita por un individuo. Por consiguiente, en algunas realizaciones, formulaciones de vacuna liposomal que se describen en el presente documento se administran en combinación con tratamiento con cualquier otro agente anticáncer que incluye, y no se limita a, metotrexato ( RHEUMATREX®, Ametopterina ) ciclofosfamida (CYTOXAN®), talidomida (THALIDOMID®) , acridina carboxamida, actimid®, actinomicina, 17-N-alilamino-17-demetoxigeldanamicina, aminopterina, amsacrina, antraciclina, agentes antineoplásicos , antineoplaston, 5-azacitidina, azatioprina, BL22, bendamustina , biricodar, bleomicina, bortezomib, briostatina, busulfán, caliculina, camptotecina , capecitabina, carboplatino, cetuximab, clorambucilo, cisplatino, cladribina, clofarabina, citarabina, dacarbazina, dasatinib, daunorubicina, decitabina, ácido dicloroacético, discodermolida , docetaxel, doxorubicina, epirubicina, epotilona, eribulina, estramustina, etopósido, exatecan, exisulind, ferruginol, floxuridina, fludarabina, fluorouracilo, fosfestrol, fotemustina, ganciclovir, gemcitabina, hidroxiurea, IT-101, idarrubicina , ifosfamida, imiquimod, irinotecan, irofulveno, ixabepilona, laniquidar, lapatinib, lenalidomida , lomustina, lurtotecan, mafosfamida, masoprocol, mecloretamina , melfalán, mercaptopurina, mitomicina, mitotano, mitoxantrona, nelarabina, nilotinib, oblimersén, oxaliplatino, PAC-1, paclitaxel, pemetrexed, pentostatino, pipobromán, pixantrona, plicamicina, procarbazina, inhibidores del proteasoma (por ejemplo, bortezomib) , raltitrexed, rebecamicina , revlimid®, rubitecán, SN-38, salinosporamida A, satraplatino, estreptozotocina , swainsonina, tariquidar, taxanos, tegafururacilo, temozolomida , testolactona, tioTEPA, tioguanina, topotecan, trabectedina , tretinoína, tetranitrato de triplatino, tris (2-cloroetil ) amina, troxacitabina, mostaza de uracilo, valrubicina, vinblastina, vincristina, vinorelbina, vorinostat, zosuquidar, o similares.
En realizaciones adicionales, los métodos de tratamiento (por ejemplo, inmunoterapia ) que se describen en el presente documento es decir, formulaciones de vacuna liposomal que se describen en el presente documento se administran en combinación con radioterapia (por ejemplo, rayos ?, rayos X, y/o la administración dirigida de radioisótopos a las células tumorales, microondas, radiación UV y similares. En realizaciones adicionales, los métodos de tratamiento (por ejemplo, inmunoterapia) que se describen en el presente documento es decir, formulaciones de vacuna liposomal que se describen en el presente documento se administran en combinación con terapia genética. Genes terapéuticos incluyen una versión antisentido de un inductor de proliferación celular (oncogen), un inhibidor de proliferación celular (supresor de tumores), o un inductor de muerte celular programada (gen pro-apoptótico ) . En algunas realizaciones, las terapias de combinación que se describen en el presente documento se administran con una cirugía (por ejemplo, resección).
En realizaciones adicionales, los métodos de tratamiento (por ejemplo, inmunoterapia) que se describen en el presente documento es decir, formulaciones de vacuna liposomal que se describen en el presente documento se administran en combinación con agentes antidiarreicos , agentes antieméticos, analgésicos, opioides y/o agentes antiinflamatorios no esteroideos.
En otras realizaciones, una formulación de vacuna liposomal que se describe en el presente documento (por ejemplo, una formulación que comprende el SEC ID NO: 2 y Sal de TEA de Lípido A de PET ) se administra a un individuo que ha sido tratado previamente con ciclofosfamida, o imitanib, o daclizumab y/o cualquier otro agente anticáncer. En otras realizaciones, una formulación de vacuna liposomal que se describe en el presente documento se administra a un individuo que no ha sido tratado previamente con ciclofos famida y/o cualquier otro agente anticáncer.
En alguna de las realizaciones anteriores, el tratamiento con una formulación de vacuna liposomal que se describe en el presente documento (por ejemplo, una formulación que comprende el SEC ID NO: 2) prolonga la esperanza de vida y/o aumenta las tasas de supervivencia de los individuos que padecen cáncer. En alguna de las realizaciones anteriores, el tratamiento con una formulación de vacuna liposomal que se describe en el presente documento (por ejemplo, una formulación que comprende el SEC ID NO: 2) mejora la calidad de vida de un individuo que padece cáncer (por ejemplo, un individuo que necesita una cantidad más baja de un fármaco anticáncer que produce efectos secundarios cuando el individuo está inmunizado con una formulación de vacuna que se describe en el presente documento).
En alguna de las realizaciones anteriores, el tratamiento con una formulación de vacuna liposomal que se describe en el presente documento (por ejemplo, una formulación que comprende el SEC ID NO: 2) induce y/o mantiene una respuesta inmune en un individuo. Respuestas inmunes incluyen respuestas humorales (es decir, la producción de anticuerpos), respuestas celulares (es decir, proliferación y estimulación de linfocitos T), o ambas. La medida de la activación y la duración de las respuestas celulares son por cualquier método conocido, por ejemplo, ensayos con linfocitos T citotóxicos (CTL). Las respuestas humorales también se miden por métodos conocidos que incluyen aislamiento y ¦ cuanti ficación de títulos de anticuerpos específicos a la vacuna liposomal tales como fracciones de anticuerpos IgG o IgM.
En el presente documento también se proporcionan métodos para tratar una enfermedad, trastorno o afección asociados con MUC1 glicosilada de forma anómala en un individuo que comprende administrar a un individuo que tiene MUC1 glicosilada de forma anómala una formulación de vacuna liposomal que se describe en el presente documento. En algunas realizaciones de los métodos que se describen en el presente documento, los métodos incluyen tratamiento de MUCl con patrones alterados de glicosilación que incluyen sub- o hipoglicosilación con respecto a homólogos normales de MUCl. En algunas realizaciones, los patrones alterados son de diferentes unidades de glicosilo (es decir, diferentes sacáridos) con respecto a homólogos normales de MUCl. En otras realizaciones más de los métodos que se describen en el presente documento, los métodos incluyen tratamiento de MUCl glicosilada de forma anómala que se debe a sobre- o hiperglicosilacion.
Enfermedades, afecciones y trastornos que presentan formas hipoglicosiladas de MUCl incluyen, pero no se limitan a, cánceres tales como los que se describen en el presente documento, lesiones y neoplasias precursoras de cánceres, por ejemplo, hiperplasia prostética o epitelial; pancreatitis; enfermedad inflamatoria del intestino; sucesos que inducen inflamación en tejidos que expresan MUCl, por ejemplo, lactancia y/o mastitis, cirugía pélvica, virus de las paperas, y tabaquismo; y otros fenotipos de tejidos inflamados tales como inflamación en el intestino y el colon. Las formas hiperglicosiladas de MUCl se encuentran en determinados cánceres que incluyen, pero no se limitan a, aarcinomas de células escamosas, Enfermedad de Bowen y algunos cánceres de mama.
Dosificaciones Cuando una formulación de vacuna liposomal que se describe en el presente documento, (por ejemplo, una formulación que comprende un glicolipopéptido que tiene una o más copias de un péptido de repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1), se está administrando a un individuo, un experto en la materia entiende que la dosificación depende de diversos factores, que incluyen, pero no se limitan a, el peso del individuo, tamaño del tumor, o progresión del tumor. Generalmente, como se usa en el presente documento, un individuo que recibe una formulación de vacuna que se describe en el presente documento (por ejemplo, una formulación que comprende el SEC ID NO: 2 y adyuvante de Lipido A de PET ) , es un organismo individual. En determinadas realizaciones, un individuo será un mamífero. Específicamente, un individuo es un ser humano, que incluye que sea un hombre o una mujer. En muchas realizaciones, el individuo será un paciente, o un individuo que espera o que está bajo atención médica y tratamiento.
Opcionalmente un individuo se administra con una dosis de aproximadamente 50 Dg, aproximadamente 100 Dg, aproximadamente 200 Dg, aproximadamente 300 Dg, aproximadamente 400 ?g, aproximadamente 500 ?g, aproximadamente 600 ?g, aproximadamente 700 ?g, aproximadamente 800 ?g, aproximadamente 900 ?g, aproximadamente 1.000 ?g, aproximadamente 1 .010 ?g, aproximadamente 1.020 ?g, aproximadamente 1 .030 ?g, aproximadamente 1.040 ?gf aproximadamente 1 .050 ?g, aproximadamente 1.060 ?g, aproximadamente 1 .070 ?g, aproximadamente 1.080 ?g, aproximadamente 1 .090 ?g, aproximadamente 1.100 Dg, 1.200 ?g, 1.300 Dg, 1. 400 Og, 1.500 Dg, 1.600 Dg, 1.700 Dg, 1.800 Dg, 1.900 Dg, o aproximadamente 2.000 Dg de una formulación de vacuna liposomal de glicolipopolipéptido a base de MUC1 que se describe en el presente documento (por ejemplo, una formulación que comprende el SEC ID NO: 2 y adyuvante de Lipido A de PE ) , en aplicaciones individuales o acumuladas. En realizaciones especificas, la dosis administrada al individuo es aproximadamente 1.000 Dg de la formulación de vacuna por semana .
Un individuo opcionalmente recibirá una dosis de la formulación de vacuna liposomal de glicolipopolipéptido a base de MUC1 que se describe en el presente documento (por ejemplo, una formulación que comprende el SEC ID NO: 2 y adyuvante de Lipido A de PET), por ejemplo, varias veces al día, cada día, cada dos dias, una vez a la semana, o cualquier otro régimen de dosificación adecuado. En una realización, la administración de rutina incluye administrar una dosis de una vacuna liposomal que se describe en el presente documento una vez a la semana durante un periodo de tiempo. Por supuesto, el régimen de dosificación comprende opcionalmente otras permutaciones de administración de péptido MUC1. Es. decir, a vacuna se administra una vez, dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces, seis veces, o más veces a la semana siguiendo el criterio del médico. En algunas realizaciones, los individuos serán administrados con al menos 5 dosis durante un período de tiempo. En otras realizaciones, los individuos serán administrados con una cantidad superior a o inferior a 5 dosis. Por lo tanto, en una realización, un individuo recibirá una dosis de aproximadamente 1.000 Dg del polipéptido glicolipidado de MUC1 cada semana. Como alternativa, el individuo recibirá dos dosis de 500 Dg, dos veces a la semana, o una dosis diaria de 100 Dg durante cinco días.
Estos ejemplos de dosificación no son limitantes y sólo se usan para ilustrar a modo de ejemplo regímenes de dosificación en particular para la administ ación de aproximadamente 1.000 Dg del polipéptido glicolipidado de MUC1. Por ejemplo, si la dosis apropiada para una situación dada es 1.000 Dg por semana, la dosis se desglosan opcionalmente en cualquier número de permutaciones, por ejemplo, cuatro inyecciones de 250 dg por semana. Esto también es válido si la dosis apropiada para una situación particular es mayor que o inferior a 1.000 Dg.
El periodo de tiempo que una formulación de vacuna liposomal de glicolipopolipéptido a base de MUC1 (por ejemplo, una formulación que comprende el SEC ID NO: 2 y adyuvante de Lipido A de PET), se administra al individuo es cualquier periodo adecuado según lo determine el estadio del cáncer, la historia médica del paciente y el criterio del médico tratante. Ejemplos de dichos periodos adecuados incluyen, pero no se limitan a, al menos aproximadamente 3 meses, al menos aproximadamente 4 meses, al menos aproximadamente 5 meses, al menos aproximadamente 6 meses, al menos aproximadamente 7 meses, al menos aproximadamente 8 meses, al menos aproximadamente 9 meses, al menos aproximadamente 10 meses, al menos aproximadamente 11 meses, al menos aproximadamente 12 meses, al menos aproximadamente 13 meses, al menos aproximadamente 14 meses, al menos aproximadamente 15 meses, al menos aproximadamente 16 meses, al menos aproximadamente 17 meses, al menos aproximadamente 18 meses, al menos aproximadamente 19 meses, al menos aproximadamente 20 meses, al menos aproximadamente 21 meses, al menos aproximadamente 22 meses, al menos aproximadamente 23 meses, o al menos aproximadamente 24 meses o superior. El periodo de tratamiento continúa opcionalmente durante más de 24 meses, si se desea, tal como durante 30 meses, 31 meses, 32 meses, 33 meses, 34 meses, 35 meses, 36 meses, o más de 36 meses .
En otra realización, el período de tiempo de dosificación de cualquiera de los métodos que se describen en el presente documento es durante al menos aproximadamente 2 semanas, al menos aproximadamente 4 semanas, al menos aproximadamente 8 semanas, al menos aproximadamente 16 semanas, al menos aproximadamente 17 semanas, al menos aproximadamente 18 semanas, al menos aproximadamente 19 semanas, al menos aproximadamente 20 semanas, al menos aproximadamente 24 semanas, al menos aproximadamente 28 semanas, al menos aproximadamente 32 semanas, al menos aproximadamente 36 semanas, al menos aproximadamente 40 semanas, al menos aproximadamente 44 semanas, al menos aproximadamente 48 semanas, al menos aproximadamente 52 semanas, al menos aproximadamente 60 semanas, al menos aproximadamente 68 semanas, al menos aproximadamente 72 semanas, al menos aproximadamente 80 semanas, al menos aproximadamente 88 semanas, al menos aproximadamente 96 semanas, o al menos aproximadamente 104 semanas.
Cualquier formulación de vacuna liposomal que se describe en- el presente documento (por ejemplo, una formulación que comprende el SEC ID NO: 2 y adyuvante de Lípido A de PET ) , se administra opcionalmente en diferentes fases de tratamiento. Por ejemplo, la formulación de vacuna liposomal de glicolipopolipéptido a base de MUC1 se administra tanto en una fase de tratamiento como en una fase de mantenimiento. En algunas realizaciones, la fase de tratamiento comprenderá administración de la formulación de la vacuna liposomal en dosificaciones semanales, mientras que la fase de mantenimiento es para periodos de tiempo más largos, tales como aproximadamente cada 6 semanas, aproximadamente cada 7 semanas, aproximadamente cada 8 semanas, aproximadamente cada 9 semanas, aproximadamente cada 10 semanas, aproximadamente cada 11 semanas, aproximadamente cada 12 semanas, o superior. En algunos casos, la dosificación administrada en la fase de tratamiento será mayor que la dosis administrada en la fase de mantenimiento. Sin embargo, las fases de tratamiento y mantenimiento están diseñadas para un individuo en particular de modo que el tiempo y las dosificaciones entre las fases de tratamiento y mantenimiento varían a partir de los ejemplos anteriores. Generalmente, la fase de mantenimiento comienza en cualquier momento que se considere apropiado. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la fase de tratamiento será de ocho semanas y la fase de mantenimiento se' mantendrá durante toda la vida del individuo. En otras realizaciones, sólo se realizará un tratamiento o una fase de mantenimiento.
En otras realizaciones más, una vacuna liposomal que se describe en el presente documento (por ejemplo, una formulación que comprende el SEC ID NO: 2 y adyuvante de Lípido A de PET), se administra profilácticamente. En estas realizaciones, la administración de la vacuna liposomal previene la aparición de cáncer en un individuo (por ejemplo, un individuo predispuesto genéticamente a desarrollar cáncer, tal como cáncer de mama.
El periodo de tiempo que un individuo debería permanecer con una formulación de vacuna que se describe en el presente documento está determinado por el médico que trata. En algunos casos, es ventajoso administrar la formulación de vacuna durante el resto de la vida de un individuo. En alguna de dichas realizaciones, una formulación de vacuna se administra en cuatro cuadrantes del organismo, por ejemplo, ganglios linfáticos cercanos, (por ejemplo, en cada axila), en cada nalga (por ejemplo, por vía subcutánea) y similares. En alguna de dichas realizaciones, una formulación de vacuna se administra mediante una bomba. En algunas realizaciones, se implanta una bomba y/o dispositivos de administración en un individuo para permitir la dosificación crónica. Ejemplos de bombas implantables incluyen, y no se limitan a, bombas osmóticas Alzet®.
Kits En el presente documento se proporcionan kits para dispensar las formulaciones de vacuna liposomal que se describen en el presente documento. Dichos kits comprenden un primer vial de producto farmacológico que comprende glicolipopéptido que comprende una o más copias de una repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1, y un adyuvante (Lipido A de PET, sal de trietilamina ) , y un segundo vial que contiene un liquido estéril adecuado tal como se describe en el presente documento para reconstitución. En algunas realizaciones.
Por ejemplo, en una realización, dichos kits comprenden un primer vial, es decir, un vial de producto farmacológico que contiene 300 g de glicolipopéptido que comprende una o más copias de una repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1, y 150 µq de adyuvante (Lipido A de PET, sal de trietilamina), que representa una carga de un 120 %. Este exceso pretende facilitar la retirada de la administración de la dosis especificada. El kit comprende adicionalmente un segundo vial que contiene hasta 1 mi de solución de cloruro sódico al 0,9 % para inyección. Después de reconstitución del producto farmacológico con 0,6 mi de solución de cloruro sódico para inyección (0,9 % p/v), un vial de producto farmacológico produce 0,5 mi para administración que corresponde a 250 pg de un glicolipopéptido que comprende una 0 más copias de una repetición en tándem de núcleos de SEC ID NO: 1. A modo de ejemplo, si la dosis es de 1 mg en total, se necesitan 4 viales por dosis.
DEFINICIONES ESPECÍFICAS "Cadenas principales de carbono" tal como se usan en el presente documento se refieren a cadenas de carbono que tienen por lo menos seis carbonos de longitud. Los átomos de carbono de una cadena de carbono pueden estar unidos a 3, 2, 1 o 0 hidrógenos. En una cadena de carbono principal, los carbonos --CH< y >C< normalmente son puntos de ramificación para la unión (con o sin un engarce) de otra cadena de carbono. En algunas realizaciones, pueden estar sustituidos con un grupo lateral, tal como amino o hidroxilo. Los átomos de carbono de cualquier cadena principal de carbono pueden incluir uno o más carbonos de carbonilo o tiocarbonilo, es decir, —C(=0)— o —C(=S)— .
"Grupos fuertemente lipofilicos" se refieren a un grupo lipofilico que comprende al menos cinco átomos distintos a hidrógeno, para los que el log P, como se predice con el algoritmo de Meylan, es mayor que 3. La lipofilia de grupos se puede determinar midiendo el coeficiente de reparto de la molécula HZ (en la que Z es la cadena lateral en cuestión) entre un solvente no polar (por ejemplo, etanol, dioxano, acetona, benceno, n-octanol ) y agua, a STP. La lipofilia se puede definir como el logaritmo de este coeficiente de reparto (log P) ; entonces será positivo para moléculas que prefieren el solvente no polar. Por lo tanto, un grupo lipofilico es uno para el que log P es mayor que cero.
El coeficiente de reparto (P) se define como la relación de las concentraciones en equilibrio de una sustancia disuelta en un sistema de dos fases que consiste en dos solventes muy inmiscibles. Uno de estos sistemas es n-octanol : agua; la fase de octanol contendrá aproximadamente un 20 % de agua y la fase acuosa aproximadamente un 0, 008 % de octanol. Por lo tanto, el coeficiente de reparto apropiado (Pow) es la relación de la concentración molar del soluto en octanol saturado con agua a su concentración molar en agua saturada con octanol. N-octanol es un sustituto útil para membranas biológicas ya que, al igual que muchos componentes de membrana, es anfifilico. (En lo sucesivo, la referencia a log P se referirá a log Pow, a menos que se indique lo contrario ) .
Para obtener más información sobre métodos para determinar Pow, véase Sangster, J. , Octanol-Water Partition Coefficients : Fundamentáis and Physical Chemistry (Abril 1997) (ISBN 0-471-9739). Para tabulaciones de coeficientes de reparto de octanol-agua, véanse los EPA "Chemicals in the Environment: OPPT Chemicals Fact Sheets" the USDA Pesticide Properties Datábase, Sangster, J.f "Octanol-Water Partition Coefficients of Simple Organic Compounds", J. Phys . Chem. Ref. Data, 18: 1111-1230 (1989); Verbruggen, E. M. J. , y col., " Physiochemical Properties of Higher Nonaromatic Hydrocarbons : Literature Study, " J. Phys. Chem. Ref. Data, 29: 1435-46 (2000). Se debería indicar que los valores de Pow recopilados para diferentes compuestos se pueden haber determinado mediante diferentes metodologías.
En el método de Meylan, el log Pow predicho se obtiene por adición de coeficientes ponderados para cada fragmento (el coeficiente sin procesar multiplicado por el número de copias de ese fragmento) a la constante 0,2290. Los fragmentos considerados incluyen --CH3 unido ali fáticamente (0, 5473), —CH2- (0,4911), —CH (0,3614), —OH (-1,4086), --NH2 (-1,4148), —C(=0)N (-0,5236), --SH (-0,0001), --NH-- (-1,4962), N=C (-0,0010), --0-- (-1,2566), --CHO (-0,9422), C tere unido de este modo a 3 + C (0,2676), C no H no tere (0, 9723), —C(=0)0— (-0, 9505), —C(=0)— (-1,5586), =CH o C< (0, 3836), #C (0,1334), —C(=0)N (-0,5236), —0—CO—C--N—CO (-0,5), —SO—0 (-9), —O—P (-0,0162); 0= P (-2,4239), --OH unido a fosfato (0,475); C aromático (0,2940), N aromático (anillo de 5 miembros) (-0,5262), —OH unido aromáticamente (-0, 4802 ) .
Para grupos fuertemente lipofilicos, el logP predicho por el algoritmo de Meylan es al menos 3. En otras realizaciones, para grupos fuertemente lipofilicos, el logP es al menos 4, es al menos 4, es al menos 5, es al menos 6, es al menos 7, es al menos 8, es al menos 9, es al menos 10, o más de 10.
Grupos fuertemente lipofilicos comprenden una o más cadenas de carbono, en algunas realizaciones, una o más cadenas principales de carbono. Grupos fuertemente lipofilicos incluyen lipidos simples (no ramificados, aciclicos), o un lipido complejo (ramificado y/o cíclico, que incluye parcialmente aromático).
En algunas realizaciones, el grupo fuertemente lipofílico comprenderá no más de 100 átomos distintos a hidrógeno, no más de 80 de dichos átomos, no más de 60 de dichos átomos, o no más de 40 de dichos átomos.
Como se ha indicado anteriormente, el grupo fuertemente lipofílico debe comprender al menos cinco átomos distintos a hidrógeno. En algunas realizaciones, comprende al menos seis, más preferentemente al menos 8, aún más preferentemente al menos 9, incluso preferentemente, comprende al menos 11 de dichos átomos, aún más preferentemente al menos 13 de dichos átomos, más preferentemente al menos 21 de dichos átomos.
En algunas realizaciones, el grupo fuertemente lipofílico tiene una composición elemental limitada a los elementos carbono, silicio, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno, azufre, y fósforo. En algunas realizaciones, la mayoría de los enlaces dentro de la cadena lateral gue no implican hidrógeno son enlaces carbono-carbono.
Dado que la presencia de oxígeno, nitrógeno, azufre y fósforo tiende a reducir la lipofilia, en el grupo fuertemente lipofílico, en algunas realizaciones, más de un 50 %, o más de un 75 %, de los átomos que no son hidrógeno son átomos de carbono.
Por la misma razón, el grupo fuertemente lipofílico, en algunas realizaciones, comprende al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, o al menos 10 átomos de carbono ..
Se puede encontrar referencia adicional a grupos fuertemente lipofílicos en la Patente de Estados Unidos N° 7,820,627, que se incorpora por referencia con respecto a su análisis y solicitud de grupos lipofílicos y fuertemente lipofílicos .
Ejemplos Ejemplo 1: Síntesis de una formulación de vacuna liposomal Glicolipopéptido de SEC ID NO: 2, (159 mg), Lipido A de PET (96 mg), DPPC (4,36 g) , DMPG Na (0,54 g) y Colesterol (2,60 g) se disolvieron en 117 gramos de t-butanol que contenia 5 mi de agua estéril para irrigación.
La solución calentada de t-butanol y el agua estéril calentada se bombean en motores separados que se ajustan a caudales deseables de modo que la relación de caudales de las fases acuosa a orgánica se mantiene constante a 5,9:1 para producir liposomas con una distribución de la población de un 90 % (d90) = 0,22 µp?, permitiendo la filtración a través de al menos un filtro aséptico. Usando el procedimiento que se describen en la Figura 1, se preparan viales que contienen sólido liofilizado. La siguiente fórmula del lote se usa para un lote a escala de 1 1 que representa 500 viales. La fórmula se usa en fracciones o múltiplos del tamaño del lote indicado .
#No en la formulación final. Agua y alcohol se retiran durante la liofilización.
La mezcla de liposomas se filtra y se liofiliza. El producto farmacológico liofilizado es un polvo estéril que, después de reconstrucción, produce una suspensión lechosa libre de partículas visibles. El sistema de cierre del envase se compone de un vial de vidrio de Tipo 1 de 5 mi con un tapón Flurotec® de 13 mm y un cierre hermético de aluminio de 13 mm. En realizaciones alternativas, el sistema de cierre del envase se compone de un vial de vidrio de Tipo 1 de 3 mi .
Cada vial proporciona una formulación liposomal liofilizada destinada a administración subcutánea después de reconstitución con solución de cloruro sódico para inyección (0, 9 % p/v) .
La formulación de vacuna liposomal anterior también se aumentó a escala a un lote a escala de 9 1. La fórmula del lote es como sigue a continuación: #No en la formulación final. Agua y alcohol se retiran durante la liofilización.
La Figura 2 representa imágenes a modo de ejemplo de la vacuna liposomal a partir de los procesos anteriores. La Figura 2A muestra una micrografia electrónica de transmisión de liposomas formulados, vitrificados de muestras de lotes. La Figura 2B representa la imagen de la vacuna liposomal reconstituida en solución salina bajo microscopía de luz. La Figura 2C presenta una imagen de críofractura de la vacuna liposomal reconstituida bajo microscopía electrónica.
Ejemplo 2: Inducción de IFNy en Linfocitos T CD4- y CD8+ mediante una formulación de vacuna liposomal del Ejemplo 1 Se inyectaron ratones hembra C57B1/6J con una formulación de vacuna liposomal del Ejemplo 1 en concentraciones de 5 Dg/ratón, 25 Dg/ratón o 100 Dg/ratón. Los controles incluían tratamiento con solución salina y tratamiento sólo con Lípido A de PET a 50 Dg/ratón. Después de la inmunización, se aislaron esplenocitos de los ratones C57B1/6 y se estimularon ex vivo durante 48 horas con un péptido MUC1 que tiene el SEC ID NO: 2, un péptido BP-1-109 de control negativo que tiene la sencuencia CTRPNNNTRKSIRIQRGPGRAFV IGKIGRMNQAS* S*L (SEC ID NO: 20, S* son serinas lipidadas), vehículo de solución salina o ningún tratamiento.
La Figura 3 presenta concentraciones de IFNy intracelular en linfocitos T CD4-/CD8+ (Figura 3A) o CD4+/CD8- (Figura 3B) estimulados ex vivo con los diversos antígenos. Los datos se presentan como un % de células IFNy positivas con relación a la población total de células CD4+ o CD8+. Los linfocitos T de ratones con tratamiento in vivo a las diversas concentraciones de una formulación de vacuna liposomal del Ejemplo 1 presentaron inducción estadísticamente significativa (p < 0,05) de IFNy cuando se estimularon con un péptido MUC1 ex vivo con respecto al tratamiento con solución salina.
Ejemplo 3: Modelo animal In vivo animal para ensayar respuesta humoral de la formulación de vacuna liposomal del Ejemplo 1 Se inyectaron ratones C57B1/6J con una formulación de vacuna liposomal del Ejemplo 1 en tres concentraciones diferentes de vacuna (5, 25 y 100 Dg) . Se usaron dosis de 50 ?g de Lipido A de PET y solución salina como control negativo. Se aislaron sueros de los ratones y posteriormente se diluyó en serie y se incubó sobre placas revestidas con antigeno MUCl que tenían el SEC ID NO: 2. Después de incubación, con sueros, las placas se lavaron y se añadió un anticuerpo específico IgG anti-ratón marcado. El anticuerpo se retiró por lavado y la IgG de ratón se midió mediante un lector de ELISA. El análisis por ELISA en la Figura 4 representa que los niveles de anticuerpos eran similares en todos los tres grupos de dosis, es decir, 5 Dg/ratón, 25 ?g/ratón, 100 Dg/ratón. En contraste, los animales tratados con solución salina y Lipido A de PET no mostraron respuesta al anticuerpo.
En un experimento similar, se inyectaron ratones con una formulación de vacuna liposomal del Ejemplo 1 o una vacuna MUCl no glicosilada (Vacuna A) . Un grupo sin tratamiento previo se usó como control negativo. Se aislaron sueros, se diluyó y se incubó con un péptido MUCl glicosilado que tenían el SEC ID NO: 2 o un péptido MUCl no glicosilado, STAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAKG, SEC ID NO: 21. La Figura 5 muestra la comparación de la unión de IgG al péptido glicosilado en los ratones tratados con la vacuna liposomal del Ejemplo 1 o ratones tratados con la Vacuna A (parte superior) con relación a la unión de IgG al péptido no glicosilado en los ratones tratados con la vacuna liposomal del Ejemplo 1 o ratones tratados con la Vacuna A (parte inferior) .
Ejemplo 4: Inducción de IFNy y anticuerpos de la formulación de vacuna liposomal del Ejemplo 1 en modelo animal de MUCl humana transgénica Ratones transgénicos (Tg) que expresan MUCl humana se derivaron acuerdo con Peat y col., Cáncer Res., 52: 1954-1960, 1992. Los ratones Tg MUCl expresaron un transgén de MUCl humana en un patrón o nivel similar a la expresión de MUCl endógena humana.
En los siguientes experimentos, ratones Tg con MUCl (N = 5/grupo) se (1) trataron previamente con ciclofosfamida (día -3) y se trataron con 5, 25, o 100 Dg de la formulación de vacuna liposomal del Ejemplo 1 semanalment.e durante ocho semanas, (2) se trataron con control de solución salina, o (3) 50 Dg de adyuvante de Lípido A de PET sólo. Al final de la sesión de tratamiento, los ratones se evaluaron para la respuesta de linfocitos T mediante inducción de IFNy y respuesta de anticuerpos por ELISA.
Inducción de IFNy: Esplenocitos combinados se aislaron a partir de cada uno de los grupos de ratones Tg con MUC1 tratados con solución salina, tratados con Lipido A de PET, y tratados con la formulación de vacuna liposomal y se estimularon ex vivo durante 48 horas con un péptido MUC1 que tenían el SEC ID NO: 2, un péptido BP-1-109 de control negativo con la secuencia CTRPNNNTRKSIRIQRGPGRAFVTIGKIGRMNQAS* S*L (SEC ID NO: 20, S* son serinas lipidadas) o vehículo. La expresión o la inducción de IFNy después del tratamiento ex vivo se midió en los sobrenadantes de cultivo celular usando tecnología Luminex (Figura 6A) . Los animales transgénicos inmunizados con la formulación de vacuna liposomal del Ejemplo 1 en todas las tres concentraciones mostraron respuesta a IFNy con respecto a la estimulación ex vivo con el péptido UC1 que tenían el SEC ID NO: 2.
Inducción de anticuerpos: Se recogieron sueros de los animales tratados anteriormente y se sometieron a análisis por ELISA con un péptido MUC1 que tenían el SEC ID NO: 2 similar a los ejemplos anteriores. La Figura 6B muestra los niveles totales de IgG de ratones vacunados con 5, 25 o 100 \iq de la formulación de vacuna liposomal del Ejemplo 1 o tratados con 50 iq de Lipido A de PET liposomal o solución salina. La Figura 6C muestra los isotipos de IgG a partir de los ratones vacunados con 25 ug de la formulación de vacuna liposomal del Ejemplo 1. Los datos representados en las Figuras 6B y 6C representan los niveles medios de IgG en suero de 5 ratones individuales.
Ejemplo 5: Formulación de vacuna liposomal del Ejemplo 1 y especificidad de anticuerpo para MUC1 Tumoral Humana Ratones C57B1/6J se vacunaron con 100 Dg de la formulación de vacuna liposomal del Ejemplo 1. Sueros a partir de los ratones tratados o animales sin tratar se usaron para análisis FACS de lineas celulares de melanoma de ratón B16 o B16-MUC1. Un anticuerpo SM3 anti-MUCl ( SCBT SC-53381) se usó como control positivo para MUC1 hipoglicosilada . La Figura 7A muestra que IgG de ratones inmunizados con la formulación de vacuna liposomal del Ejemplo 1 se une selectivamente a la MUC1 celular.
En un experimento similar, células epiteliales de mama humana y células de carcinoma de mama T47D se tiñeron usando suero de ratones transgénicos con MUC 1 humana con 100 Dg de la formulación de vacuna liposomal del Ejemplo 1 o 50 Dg de lipido A de PET . La tinción celular se detectó por citometria de flujo usando un anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con florescencia. La Figura 7B muestra que IgG a partir de ratones inmunizados con la formulación de vacuna liposomal del Ejemplo 1 discrimina entre MUC1 normal y tumoral. SM3 se usó de nuevo como un control positivo para MUCl hipoglicosilada y se usaron anticuerpos monoclonales B27.29 de MUCl y Células madre (Stem Cell Technologies) como controles positivos para MUCl normal totalmente glicosilada.
Ejemplo 6: El Efecto de una formulación de vacuna liposomal del Ejemplo 1 en Crecimiento tumoral Ratones C57B1/6 se trataron usando una programación bisemanal con vehículo de solución salina, 50 Dg de Lipido A de PET Liposomal o 5 Dg de la formulación de vacuna liposomal del Ejemplo 1 comenzando el día -42. En el Día 0, los ratones se estimularon con células tumorales B16-MUC1 2 x 106, B16 0,5 x 106, o MC38-MUC1 2 x 106 seguido de dos vacunas adicionales los días +3 y +17. El crecimiento tumoral se registró dos veces a la semana.
En el modelo de B16-MUC1, los animales tratados con la formulación de vacuna del Ejemplo 1 no presentaban tumores en el Día 44. 9/12 animales estaban libres de tumores en el grupo de la formulación de vacuna del E emplo 1 al final del estudio. En contraste, los grupos de solución salina y Lipido A de PET presentaban curvas similares de crecimiento tumoral. El volumen medio tumoral en estos dos grupos era aproximadamente de 200 mm3 hacia el Día 10. Hacia el Día 24, el volumen medio tumoral era aproximadamente de 1200 mm3 para los grupos de solución salina y Lipido A de PET.
En el modelo de MC38-MUC1, 3/12 animales estaban libres de tumor en el grupo de la formulación de vacuna del Ejemplo 1 al final del estudio. El crecimiento tumoral también disminuyó en comparación con los grupos de solución salina y Lipido A de PET. Hacia el Día 32, el volumen tumoral medio era aproximadamente de 120 mm3 para el grupo de la formulación de vacuna del Ejemplo 1 en comparación con aproximadamente 1200 mm3 para el grupo de Lipido A de PET y aproximadamente 1700 mm3 para el grupo de solución salina.
En el modelo de B16, en el que los tumores no presentaban MUC1, el crecimiento tumoral era similar entre todos los tres grupos.
Ejemplo 7: Prueba clínica para ensayar el efecto de la formulación de vacuna liposomal para inmunoterapia de cáncer de pulmón de células no pequeñas Se trata de un estudio aleatorio, controlado, de etiqueta descubierta potencial para ensayar la seguridad y la eficacia de la inmunoterapia específica activa a la vacuna liposomal del Ejemplo 1 para el tratamiento de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) en estadio IIIB o estadio IV. Para ser elegibles, los pacientes que entran en el ensayo tendrán que demostrar enfermedad estable o una respuesta clínica después del tratamiento de primera línea (sólo quimioterapia, o quimioterapia y radioterapia) y presentar un estado funcional de ECOG de 0, 1 o 2. Siguiendo un periodo de descanso de 3 semanas, los pacientes serán estratificados por estado de enfermedad (ya sea enfermedad locoregional en estadio IIIB o estadio IIIB con derrame pleural maligno y estadio IV), y se asignarán al azar a mejor tratamiento de apoyo (BSC) más inmunoterapia con vacuna, o sólo BSC.
Se administrarán ocho vacunas subcutáneas semanalmente con 1.000 Dg de vacuna de Liposomas del Ejemplo 1 a las semanas 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7.
Las medidas primarias de los resultados serán documentar el perfil de seguridad de la vacuna de liposomas del Ejemplo' 1, y comparar de la tasa de supervivencia de los pacientes en los dos grupos del ensayo. Las medidas secundarias de los resultados serán medir la respuesta inmune obtenida por la vacuna de liposomas del E emplo 1, y evaluar la calidad de vida de los pacientes sometidos a inmunoterapia .
Ejemplo 8: Prueba clínica para ensayar la dosis máxima tolerada y/o la dosificación recomendada de la formulación de vacuna liposomal en pacientes con tumores sólidos avanzados Este es un estudio de aumento de dosis en Fase I, de etiqueta descubierta para evaluar la seguridad y la inmunogenicidad de la vacunación con una dosis de repetición con la vacuna de liposomas del Ejemplo 1 en pacientes tratados previamente con tumores sólidos en el Estadio 3 o 4, con histologías que se han asociado con la expresión del antígeno MUCl que incluyen, pero no se limitan a: cánceres de mama, pulmón de células no pequeñas, ovarios, colorrectal, gástrico, próstata, pancreático, y células renales.
La parte 1 evalúa los niveles de aumento de dosis de la vacuna de liposomas del E emplo 1 administrada por vía subcutánea una vez cada dos semanas (Q2W) durante 8 semanas (para un total de 4 dosis) o una vez cada semana (QW) durante 8 semanas (para un total de - 8 dosis), y usa un diseño de aumento de dosis 3+3 para identificar la dosis máxima tolerada (DMT) y/o dosis recomendada (DR) para cada programación de dosificación, para evaluación adicional en la Parte 2 del estudio. La parte 2 evalúa la seguridad, inmunogenicidad, y actividad antitumoral potencial de la vacuna de liposomas del Ejemplo 1 administrada durante 8 semanas a las DMT/DR Q2W y QW en poblaciones base de 15 pacientes cada una. Después del periodo de administración de 8 semanas, los pacientes se evalúan para la seguridad, respuesta inmune y respuesta al tumor a la Semana 20.
La población del estudio incluye pacientes con tumores sólidos en Estadio 3 o 4 tratados previamente con histologías que están asociadas con la expresión de MUCl.
Criterios de inclusión: • 18-70 años de edad en el momento del consentimiento • Esperanza de vida de al menos 6 meses, de acuerdo con la opinión del investigador • Padecer cáncer de mama, de pulmón de células no pequeñas, de ovarios, colorrectal, gástrico, de próstata, pancreático, o de células renales histológicamente confirmado, u otro tipo de tumor • Presentar evidencia de enfermedad persistente, recurrente, o progresiva después de al menos un transcurso de terapia sistémica para la enfermedad localmente avanzada o metastásica, que incluye quimioterapia, terapia dirigida, o inmunoterapia • Enfermedad en estadio clínico 3 o 4 • ECOG 0 o 1 • Parámetros hematológicos , renales y hepáticos adecuados Criterios de exclusión: • Ha recibido tratamiento con cualquier agente sistémico de quimioterapia, radiación, o experimental dentro de las 4 semanas del estudio de dosificación con fármacos • Presenta una historia conocida de enfermedad autoinmune, arteritis, o vasculitis o enfermedad de inmunodeficiencia reconocida (por ejemplo, inmunodeficiencias celulares, hipogammaglobulinemia, o disgammaglobulinemia ) • Presenta cualquier afección médica preexistente que necesita terapia crónica con esteroides o con inmunosupresores • HIV, hepatitis B o hepatitis C positiva • Recepción de cualquier otra vacuna = 4 semanas antes de la inscripción en el estudio Modo de Administración: Todos los sujetos reciben una inyección intravenosa inicial de 250 mg/m2 de ciclofos famida en el Dia -3. La vacuna de liposomas del Ejemplo 1 se administra por via subcutánea, comenzando, en el Dia 1 por asignación de población base. Todos los pacientes reciben dosis de la vacuna de liposomas del Ejemplo 1 administradas como cuatro inyecciones separadas en cuatro sitios de inyección separados (una inyección, cada una en la parte superior del brazo o muslo, parte superior del brazo o muslo izquierdo, y parte inferior del abdomen derecho e izquierdo). La dosis de partida es de 250 Dg de la vacuna liposomal con 125 Dg de adyuvante de Lipido A de PET (relación de 2:1). Los niveles adicionales de dosis incluyen 500 y 1000 Dg de la vacuna liposomal en una relación de 2:1 con el adyuvante. Los niveles de dosis se seleccionan usando un diseño de duplicación de dosis. Un nivel intermedio de dosis, 750 Dg, se considera cuando la DMT es inferior a 1000 Dg.
En la evaluación y valoración de la Parte 2 de la administración de ocho semanas, las medidas de respuesta inmune incluyen títulos séricos de anticuerpos específicos de MUC-l usando ELISA específica para la vacuna liposomal del Ejemplo 1 y ensayos ELIPSOT específicos de MUC-l para IFN-gamma. Las medidas de respuesta también incluyen, pero no se limitan a: proporción de linfocitos T CD4 y CD8 circulantes, proporción de la población de células supresoras mieloides circulantes, niveles de citoquinas de linfocitos T, proporción relativa de anticuerpos IgG e IgM dirigidos contra la vacuna liposomal del Ejemplo 1, y niveles de citoquinas circulantes. La respuesta tumoral se evalúa tal como se define con los criterios RECIST 1.1.
Aunque se han mostrado y descrito realizaciones preferentes de la presente invención en el presente documento, será obvio para los expertos en la materia que dichas realizaciones se proporcionan solamente a modo de ejemplo. Ahora se les ocurrirán numerosas variaciones, cambios y sustituciones a los expertos en la materia sin apartarse de la invención. Se debería entender que en la práctica de la invención se pueden usar diversas alternativas a las realizaciones de la invención que se describen en el presente documento. Se pretende que las siguientes reivindicaciones definan el alcance de la invención y que los métodos y estructuras dentro del alcance de estas reivindicaciones y sus equivalentes sean cubiertas de este modo .

Claims (30)

NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito el presente invento, se; considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES
1.- Una formulación de vacuna liposomal que comprende : (a) un péptido que comprende al menos dos copias de una repetición en tándem de núcleos: TSAPDTRPAPGSTAPPAHGV, (SEC ID NO: 1) o una secuencia idéntica al menos en un 85 % a SEC ID NO: 1, o permutaciones lineales de la misma; caracterizada por que S y T están independientemente, en cada caso, opcionalmente sustituidos con un epitopo Te de hidratos de carbono asociados a cáncer; (b) un lipopéptido unido covalentemente a (a) que tiene la fórmula: H2N-(aal)* (aa2)* (aa3)-0H en que aal se selecciona independientemente, en cada caso, entre S, T, K, R o C; aa2 se selecciona independientemente, en cada caso, entre S, T, K, R o C; aa3 se selecciona independientemente, en cada caso, entre L o G; * independientemente, en cada caso, representa un lipido unido covalentemente a un resto de aminoácido; (c) un adyuvante de Fórmula I: Fórmula I en que al menos uno de Rl, R2, R3, R5, R6, y R7 es un grupo fuertemente lipofílico seleccionado entre el grupo el grupo que consiste en H3C (C H JK (CH =CHC X 1- (¡i) OH I H3C(CH2)m C (CHj)B X - Ciii) O HaCCCHi ,-, ? (CHJ,, X - (iv) en que X, XI, X2, y X3 son independientemente —CO— o — CH2-; Z es —NH— o -O; k, m, y r son independientemente un número entero de 0 a 30 incluido, n y q son independientemente un número entero de 0 a 6 incluido; en que Y4 es un espaciador seleccionado entre el grupo que consiste en —O—, —S—, y —NH— en que, al menos uno de Y1R1, Y2R2, Y3R3, Y5R5, Y6R6 e Y7R7 es un equivalente de fosfato monovalente (EFM), en que cada equivalente de fosfato monovalente es, independientemente, (a) —R'—C(0)OH en el que R' es un grupo alquilo sustituido o sin sustituir de 1-4 carbonos, o (b) se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en -OB(OH)OR, —OP ( O) ( OH ) OR, -OS (O) (O) (OH) OR, y -OP(=0) (OH)-O-P(=0) (OH)OR, en que R es hidrógeno, o un grupo alquilo sustituido o sin sustituir de 1-4 carbonos, y si R es un grupo alquilo sustituido , las sustituciones son—OH o —NH2, en que R8 se selecciona entre el grupo que consiste en H, OH, 0R9, un resto que en combinación con Y8 forma un equivalente de fosfato monovalente como se ha definido anteriormente, y un grupo (i)-(viii) como se ha definido anteriormente; en que R9 es un grupo alquilo o acilo longitud de 1 a 10 carbonos; y en que el enlace glicosídico es a o ß; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; un adyuvante de Fórmula II Fórmula II en que al menos uno de Rl, R2, R3, Rll, R12 y R13 es un grupo fuertemente lipofilico seleccionado entre el grupo el grupo que consiste en (i)-(viii) mencionados anteriormente; en que Y4 es un espaciador seleccionado entre el grupo que consiste en —O—, —S—, y —NH— y en que al menos uno de Y1R1, Y2R2, Y3R3, Y11R11, Y12R12 e Y13R13 es independientemente un equivalente de fosfato monovalente como se ha definido anteriormente; en que las siguientes limitaciones se aplican tanto a (I) como a (II) mencionados anteriormente: Yl, Y2, Y3, Y5, Y6, Y7 , Yll, Y12 e Y13 son espaciadores seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en -O-, -S-, y -NH-; Rl, R2, R3, R5, R6, R7 , Rll, R12 y R13 son independientemente hidrógeno, un resto que con el grupo Y numerado normalmente forma equivalente de fosfato monovalente como se ha definido anteriormente, o un grupo fuertemente lipofílico seleccionado entre el grupo que consiste en (i)-(viii) mencionados anteriormente; los grupos fuertemente lipofílicos de dicho compuesto proporcionan colectivamente al menos dos cadenas principales de carbono, y las cadenas principales de carbono de dichos grupos fuertemente lipofílicos proporcionan colectivamente al menos 30 átomos de carbono; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y (d) uno o más vehículos lípidos.
2.- La formulación de vacuna de la reivindicación 1, caracterizada por que el vehículo lípido se selecciona entre dimiristoíl fosfatidilglicerol (DMPG), dipalmitoíl fosfatidilcolina (DPPC), fosfatidilcolina (PC; lecitina), ácido fosfatídico (PA.), fosfatidilglicerol (PG), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilserina (PS), diestearoil fosfatidilcolina (DSPC) , dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) , dipalmitoilfosfatidiglicerol (DPPG) , diestearoilfosfatidiglicerol (DSPG), ácido dipalmitoilfosfatidico (DPPA); ácido dimiristoilfosfatídico (DMPA), ácido diestearoilfosfatidico (DSPA), dipalmitoilfosfatidilserina (DPPS) , dimiristoilfosfatidilserina (DMPS) , diestearoilfosfatidilserina (DSPS) , dipalmitoilfosfatidietanolamina (DPPE) , dimiristoilfosfatidiletanolamina (DMPE) y diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o combinación del mismo .
3.- La formulación de vacuna de la reivindicación 1, caracterizada por que el lipido unido covalentemente a un resto aminoácido se selecciona independientemente, en cada caso, entre cadenas de miristoilo, palmitoilo, laurilo, estearoilo, decanoílo, y octanoílo, o una combinación de las mismas .
4. - La formulación de vacuna de la reivindicación 1, caracterizada por que (b) está unido al extremo carboxi de (a) .
5.- La formulación de vacuna de la reivindicación 1, caracterizada por que (a) + (b) y (c) están en una relación de peso de (a) + (b):peso de (c) de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1.
6.- La formulación de vacuna de la reivindicación 1, caracterizada por que Te, independientemente en cada caso, se selecciona entre y un hapteno T.
7. - La formulación de vacuna de la reivindicación 1, caracterizada por que Y4 es -O-; Yl, Y2, e Y7 son -O-; Y3, Y5 e Y6 son independientemente —0— o —NH—; Rl, R3, R5 y R6 son independientemente hidrógeno o un grupo fuertemente lipofilico seleccionado entre (i)-(viii); al menos uno de Rl, R3, R5, y R6 no es hidrógeno; R2 y R7 se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en H, -P(0)(0H)2, -S03H, —P(0) (OH) (OCH2CH2NH2) y -CH2C00H; y R8 se selecciona entre el grupo que consiste en H, OH, 0S03H, y 0R9, en que R9 es un grupo alquilo o acilo con una longitud de 1 a 10 carbonos.
8. - La formulación de vacuna de la reivindicación 1, caracterizada por que al menos un grupo fuertemente
9.- La formulación de vacuna de la reivindicación 1, caracterizada por que el adyuvante tiene la siguiente estructura : en que Rl, R3, R5 y R6 son independientemente hidrógeno o un grupo lipofilico seleccionado entre el grupo que consiste en ¡) en que X, XI, X2, y X3 son independientemente —CO— o — CH2 ,—; Z es -NH- o -0-; k, m, y r son independientemente un número entero de 0 a 30 incluido, n y q son independientemente un número entero de 0 a 6 incluido ; menos uno de Rl, R3, R5 y R6 no es hidrógeno R2 y R7 se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en H, -P(0) (OH)2, -S03H, -P(0) (OH), (OCH2CH2NH2 ) , y -CH2COOH; y R9 es H, o un grupo alquilo o acilo con una longitud de 1 a 10 carbonos.
10.- La formulación de vacuna de la reivindicación 1, caracterizada por que el adyuvante estructuras que se exponen a continuación
11. - La formulación de vacuna de la reivindicación 1, caracterizada por que el péptido está sustituido con al menos 6 Te.
12. - La formulación de vacuna de la reivindicación 1, caracterizada por que el péptido comprende: H2N-TSAPDT (Tn) RPAPGS ( Tn ) T ( Tn ) APPAHGVTSAPDT ( Tn ) RPAPGS ( Tn ) T ( Tn ) APPA HGVS*S*L-OH (SEC ID NO: 2) en que Tn representa GalNAcDl .
13. - Una formulación de vacuna liposomal que comprende : (a) un glicolipopéptido de estructura: H2N- TSAPDT ( Tn ) RPAPGS ( Tn ) T ( Tn ) APPAHGVTSAPDT ( Tn ) RPAPGS ( Tn ) T ( Tn ) APPí HGVS*S*L-OH SEC ID NO: 2 en que Tn representa GalNAcDl; y * representa, independientemente en cada caso, un lípidc C14 unido covalentemente a un resto de Serina; (b) un adyuvante de estructura: o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y (c) un vehículo lípido.
14.- La composición de la reivindicación 13, caracterizada por que el lípido C14 es una cadena de miristoílo.
15.- La composición de la reivindicación 13, caracterizada por que el adyuvante es , o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
16. - El adyuvante de la reivindicación 13, caracterizado por que la sal farmacéuticamente aceptable es una sal de trietilamina .
17. - La composición de la reivindicación 13, caracterizada por que el vehículo lípido se selecciona entre DMPG, DPPC o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o combinación del mismo.
18. - La formulación de la reivindicación 13, que comprende adicionalmente colesterol.
19. - Uso de la formulación de vacuna liposomal de conformidad con la reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento útil para el tratamiento de cáncer que expresa un antigeno asociado a tumor por MUCl en un individuo que padece o que se sospecha que padece dicho cáncer.
20. - El uso de conformidad con la reivindicación 19, en donde el cáncer es cáncer de mama, cáncer de glándula parótida, cáncer gástrico, cáncer de esófago, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de la vesícula biliar, cáncer hepatocelular , cáncer de tiroides, cáncer de endometrio, mieloma múltiple, leucemia mielógena aguda, leucemia linfoblástica aguda/crónica, leucemia de células pilosas, linfoma folicular, mieloma múltiple, plasmacitoma , linfoma difuso de linfocitos B de células grandes, cáncer pancreático, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de ovarios, adenocarcinoma del pulmón, cáncer de pulmón de células escamosas, cáncer de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer renal, cáncer de vejiga urinaria, o cáncer del tracto urinario.
21. - El uso de conformidad con la reivindicación 19, en donde adicionalmente se mide una respuesta inmune en el individuo.
22. - El uso de conformidad con la reivindicación 21, en donde la medición de la respuesta inmune en el individuo tratado comprende medir la proliferación de linfocitos T en el individuo.
23.- El uso de conformidad con la reivindicación 21, en donde la medición de la respuesta inmune en el individuo tratado comprende medir la producción de anticuerpos en el individuo. 5
24.- El uso de conformidad con la reivindicación 19, en donde la composición de vacuna está adaptada para ser administrable mediante una inyección intramuscular, intravenosa, subcutánea, intranodal, intratumoral , intraperitoneal , intradérmica o mediante una bomba 10 implantada.
25.- El uso de conformidad con la reivindicación 19, en donde el individuo se trata con ciclofosfamida, daclizumab o imatinib antes del tratamiento con la formulación de vacuna de conformidad con la reivindicación 1. 15
26.- Uso de la formulación de vacuna liposomal de conformidad con la reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento útil para inducir y/o mantener una respuesta inmune celular y humoral en un individuo.
27. - El uso de conformidad con la reivindicación 20 26, en donde adicionalmente se mide la proliferación de linfocitos T en el individuo.
28. - El uso de conformidad con la reivindicación 26, en donde adicionalmente se mide la producción de anticuerpos en el individuo.
29. - Uso de la formulación de vacuna liposomal de conformidad con la reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento útil para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección asociados con MUCl hipoglicosilada en un individuo que tiene MUCl hipoglicosilada.
30. - El uso de conformidad con la reivindicación 29, en donde la MUCl hipoglicosilada en el individuo está asociada con un cáncer.
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