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CN111295200B - 作为疫苗中的佐剂的包含合成的神经节苷脂gm3变体的纳米颗粒 - Google Patents

作为疫苗中的佐剂的包含合成的神经节苷脂gm3变体的纳米颗粒 Download PDF

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Abstract

本发明描述了用于获得基于不同的合成的神经节苷脂GM3变体的纳米颗粒佐剂的方式。取决于在合成的GM3的神经酰胺中存在的脂肪酸的精细结构，可以获得用于特异性地和专门地刺激针对所伴随的抗原的体液或细胞免疫应答的佐剂。特别地，本发明提供了免疫原性疫苗组合物，其包含肽、多肽或蛋白质和上面提及的纳米颗粒，所述纳米颗粒通过将细菌脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)的外膜复合物(OMC)的疏水蛋白质与完全合成的神经节苷脂GM3变体一起进行分散来形成。

Description

作为疫苗中的佐剂的包含合成的神经节苷脂GM3变体的纳米 颗粒
技术领域
本发明涉及免疫纳米技术和免疫肿瘤学的领域，尤其涉及用于治疗具有癌症和/或由致癌病毒引起的慢性感染的个体的治疗性疫苗。特别地，本发明描述了专门用于特异性地在这些患者中刺激细胞或体液免疫效应子的纳米颗粒佐剂，和此外还提供了相应的疫苗组合物。
现有技术
在几十年的失败的临床试验结果之后，癌症治疗性疫苗的领域未能实现成为有益于患者的有效且低毒性的治疗这一希望。最近的用免疫检查点抑制剂抗体(Abs)获得的临床成功鼓励了在免疫肿瘤学中的商业和科学兴趣，包括癌症疫苗。从这个观点看，这些治疗性疫苗的失败可能归因于诸如下列的因素：抗原的不正确的选择、相对无效的载体/佐剂的使用和分开形式(即没有与允许纠正由肿瘤微环境所施加的负面效应的其他免疫调节剂相组合)的所述疫苗的使用(Branca M.A.等人,(2016)Nat Biotech 34(10):1019-24)。
传统上，癌症疫苗在其制剂中使用被分类为自身肿瘤相关抗原的蛋白质，所述自身肿瘤相关抗原尽管在肿瘤细胞中异常地表达，但也存在于正常组织中。这些疫苗的临床有效性的坚实证据的缺乏可能部分地归因于中枢性耐受过程，通过该过程发生具有有着针对大多数的这些自身抗原的高亲和力的受体的T细胞的消除(Tran E.等人,(2017)NatImmunol 18(3):255-62)。因此，基于该类型的抗原的癌症疫苗的成功将会依赖于新型专门佐剂的使用，所述新型专门佐剂能够增强效应T细胞的特异性应答(其在开始时相对微弱)，以致天然地将肿瘤转变为新抗原的来源。这使得能够调动多特异性的和个性化的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的强大作用，其能够根除恶性损伤。
最近，现有技术反映了在评价用于设计成功的癌症疫苗的抗原中的改变，其在于选择肿瘤新抗原。这些新抗原的一个有吸引力的来源产生自个体肿瘤突变的个性化检测。该类型的抗原的另一个更受限的来源来自致癌病毒蛋白质的序列。虽然这些经突变的肽的优点可能是对于免疫系统来说是新的(不存在于正常组织中)并因此是更具免疫原性的，但是用这些新抗原设计的新疫苗的成功还将会依赖于新型佐剂，所述新型佐剂能够使CTL应答最大化(其中通过允许其在正确成熟的情形下被抗原呈递细胞(APC)呈递的局部持续性来寻求抗原的最佳可得性)，和另外还纠正肿瘤微环境的免疫抑制效应。另外，真正的新表位的鉴定在实践中是无效的行为。测序研究鉴定出在个体肿瘤中的数千个的体细胞突变并且生物信息学程序预测出数百个的能够结合特异性MHC的肽。但是当分离出它们并且通过质谱法进行研究时，这些新表位中的绝大多数在真实的肿瘤中并不存在，并且甚至更糟，仅很少一些能够刺激CTL应答。这意味着，现行的用于预测和验证新表位的方法学远不能常规地用于使个性化免疫疗法进入临床实践(Editorial,(2017)Nat Biotech 35(2):97)。
在所有类型的疫苗中，合适的佐剂的选择是取得所希望的成功的关键要素。癌症治疗性疫苗的基本目标是诱导B淋巴细胞、T淋巴细胞和先天免疫介体的激活和增殖，以致出现能够识别和破坏肿瘤细胞的体液和细胞免疫效应子，从而导致存活率和患者生活质量的提高。在这个意义下，理想的佐剂应当首先优化抗原对于APC的可得性。其次，应当取得这些APC的有效刺激以便其表达必需的共刺激信号并且分泌特异性的细胞因子和趋化因子。第三，应当能够调节TME以便中和免疫抑制效应。现今，在实践中还不存在具有所有这些特征的佐剂。
如Khong H.等人(Khong H.等人,(2016)J Immunother Cancer 4:56)所解释的，在被证明最令人感兴趣的用于癌症疫苗的佐剂变体之中的是微颗粒和纳米颗粒，这是由于其可以具有一些所希望的特性，尤其是还作为疫苗载体起作用。可以对这些颗粒制备物进行设计，以致可以有效地将所伴随的抗原引导至特异性APC，通过调节颗粒大小、刚度和净电荷。具有在500-2000nm的范围内的直径的颗粒疫苗在注射位点处优先被APC捕获并移动至淋巴结(LN)，而在20和200nm之间的颗粒被动地引流至LN，在那里它们被常驻的APC获取。最常用于这些目的的微颗粒和纳米颗粒是脂质体、脂蛋白体、合成聚合物和天然聚合物。这些系统中的每一个系统的优点和限制已经详细地描述在现有技术中。
与本发明特别相关的是Xu F.等人(Xu F.等人,(2016)ACS Nano第10卷:1189-1200)的关于在其组成中包含神经节苷脂GM3的合成纳米颗粒佐剂的描述。该佐剂通过用其中插入了神经节苷脂GM3的脂质膜包被直径为40至80nm的金纳米颗粒来获得。以该方式可以有利地利用糖脂-受体特异性相互作用的原理以进行定向，特别是唾液酰基乳糖与Siglec1(CD169)(其是在激活的树突细胞(DC)上过表达的标志物，所述激活的树突细胞是在LN中与CD4+T细胞的突触的主角)的相互作用。虽然这些包覆有GM3的纳米颗粒在体内选择性地积累在腘LN中存在的CD169+DC中，但在用参考抗原的免疫接种实验中不存在其作为佐剂的可能性的证据，和在肿瘤模型中也不存在任何功效证据。另一方面，该原理仅在直径范围具为40至80nm的纳米颗粒中起作用。
Molina等人在专利US 7,776,346中描述了用于通过将非常小尺寸的脂蛋白体(VSSP)与确定的免疫原性差的抗原相联合来制备有效的免疫原的方式，所述非常小尺寸的脂蛋白体通过细菌脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)的外膜蛋白质复合物(OMPC)与神经节苷脂GM3的疏水缀合来形成，这可以被认为最接近本发明的技术解决方案。而Rodríguez等人在US 6,149,921中已经详细地描述了用于获得这些VSSP的方式，其中强调用于获得这些脂蛋白体的神经节苷脂GM3应当从生物学来源，主要从由于单克隆抗体的工业生产而产生的杂交瘤块来获得。同样地，Estévez等人(Estévez等人,(2000)Vaccine第18卷:90-197)教导，也可以通过采用从犬红细胞开始获得的GM3来产生这些VSSP。在现有技术中已知，如例如Lee H等人(Lee H等人,(2011)Int J Mass Spectr第305卷:138-150)所教导的，从任何天然来源获得的神经节苷脂GM3由各种不同分子种类的可变混合物组成，其中寡糖的组成是固定的但神经酰胺是多变的，出现各种不同类型的脂肪酸。除了使用动物或肿瘤起源的成分来产生药用制备物的不方便之外，采用生物学起源的GM3还适度地妨碍获得具有所需的高度可重现的特征的VSSP。
关于本发明，合乎情理的是确立，没有任何以前的技术解决方案或科学出版物描述了通过使用具有在化学上确定的结构的完全合成的各种不同GM3的制备过程而获得的VSSP变体，其具有令人惊奇的特性，即其作为治疗性疫苗的佐剂的专门用途最终取决于在其获得中所使用的在分子上均质的神经节苷脂GM3，并且由于所述专门化而提供了相对于用来自生物学来源的GM3所产生的VSSP而言具有有利特性的佐剂。因此，本发明的新颖性在于提供了两种新的VSSP类型的纳米颗粒佐剂。其中之一采用其神经酰胺包含硬脂酸的完成合成的神经节苷脂GM3，GM3(18:0)，并且其主要对于诱导强有力的针对所伴随的抗原的抗体应答来说是有用的。另一种佐剂通过采用其神经酰胺包含油酸的完成合成的神经节苷脂GM3来获得，GM3(18:1)，并且其在诱导CTL细胞的特异性效应子应答中是特别有效的。
发明简述
在一个实施方案中，本发明的目标为佐剂，其包含纳米颗粒，所述纳米颗粒通过将完全合成的神经节苷脂GM3变体与细菌脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜复合物的疏水蛋白质相联合来形成；特别地，这些佐剂在神经节苷脂GM3的神经酰胺中具有硬脂酸或油酸。
在第二个方面，本发明涉及疫苗组合物，其包含上面提及的纳米颗粒佐剂，和作为抗原的肽、多肽或蛋白质，和任选地其他佐剂(其可以为氧化铝或油性佐剂，但不限制于这些)。特别地，构成这些疫苗组合物的一部分的抗原为生长因子受体的细胞外结构域或其部分，例如单独的或相组合的HER1、HER2或HER3；或者从激素GnRH开始产生的肽PyrGnRHm1-TT。所述疫苗组合物可以在制备用于治疗癌症或由致癌病毒引起的慢性病毒感染的药物中进行使用。
在一个特别的实施方案中，本发明涉及包含作为本发明目标的纳米颗粒佐剂(单独的或相组合的)的疫苗组合物用于刺激患者的抗原特异性体液或细胞免疫应答的用途。
另外，本发明的目标为用于向有此需要的受试者施用本发明的疫苗组合物的治疗方法，通过皮下(SC)、真皮内、肌内、肿瘤内途径或者通过直接施加在粘膜上，以每十五天一次的频次持续至少总共五个诱导剂量，和随后以月维持剂量持续至少六个月。可以同时地、分阶段地或交替地施用所述组合物。
发明详述
疫苗组合物
在本发明中所采用的疫苗组合物通过将纳米颗粒佐剂与作为抗原的肽、多肽或蛋白质(特别是生长因子受体的完整细胞外结构域或其部分；在随肿瘤进展的确定阶段中相关的激素，例如GnRH，但不限于这些)相联合来形成，所述纳米颗粒佐剂通过将细菌脑膜炎奈瑟氏球菌的OMPC的疏水蛋白质与完全合成的神经节苷脂GM3变体一起进行分散来形成。
构成本发明VSSP的一部分的神经节苷脂GM3的神经酰胺所包含的脂肪酸的类型将会取决于疫苗的目的：在希望有助于抗体应答的情况下，使用硬脂酸(GM3 18:0)；而如果希望CTL应答，则采用油酸(GM3 18:1)。还可能的是，通过适当地将用这两种疫苗制剂进行的免疫接种相组合，在宿主中诱导针对相同抗原的抗体和CTL双重应答。包含GM3(18:0)的VSSP和具有GM3(18:1)的VSSP均可以单独地或者以构成与其他试剂(例如氧化铝或油性佐剂，但不仅限于后者这些)相组合的佐剂的一部分的方式来进行使用。
相比于采用从天然来源获得的神经节苷脂作为佐剂的疫苗制剂而言，使用GM3(18:0)作为佐剂的本发明的疫苗组合物在体液应答、肿瘤系的识别、肿瘤细胞中受体激活的抑制以及这些细胞生存力的降低方面诱导更高的质量。
相比于采用从天然来源获得的神经节苷脂作为佐剂的疫苗制剂而言，使用GM3(18:1)作为佐剂的本发明的疫苗组合物在CTL应答方面诱导更高的质量。
治疗性应用和治疗方法
本发明提供了疫苗组合物，其专门用于诱导针对生长因子受体家族的抗体应答或CTL应答，这是在免疫肿瘤学中对于该目的抗原系统来说特别有用的解决方案，其中已知，抗体应答和特异性CTL应答都是有效的，但是在单一疫苗制剂中和用单一施用方案难以进行优化。
引入专门用于产生高滴度的针对在随肿瘤进展的确定阶段中相关的激素(特别是GnRH，虽然并不限于该激素)的中和抗体的疫苗制剂也是本发明的目的。
本发明的另一个目标为提供治疗性疫苗组合物，其能够在所有罹患癌症或由致癌病毒引起的慢性病毒感染的免疫妥协患者上产生强有力的特异性抗体应答或CTL应答。
本发明的疫苗组合物可以通过SC、真皮内、肌内、肿瘤内途径或者通过直接施加在粘膜上来引入到患者中。
在可以用作为本发明目标的疫苗组合物进行治疗的癌症类型之中，包括上皮起源的癌。更特别地，在这些癌症的例子之中，包括鳞状上皮细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌)、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、头颈癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫癌、乳腺癌、前列腺癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、阴道癌、甲状腺癌、肛门癌和阴茎癌。
在本发明的疫苗组合物中生长因子受体的细胞外结构域或其部分的待在人中进行使用的剂量范围为200μg至1mg，优选地400μg至900μg。在本发明的疫苗组合物中GnRH的待使用的剂量范围为500μg至3mg，优选地1mg至2.5mg。以在100μg和1mg之间，优选地在200μg和600μg之间的范围(根据OMPC的含量)施用所述VSSP。
所述组合物在受试者中以下述方式来进行施用：以每十五天一次的频次持续至少总共五个诱导剂量，和随后以月维持剂量持续至少六个月。如果希望在宿主中诱导针对相同抗原的抗体和CTL双重应答，那么可以同时地、分阶段地或交替地将用这两种疫苗制剂进行的免疫接种相组合。
纳米颗粒佐剂VSSP GM3(18:0)的获得
首先，在具有搅拌的反应器中，将脑膜炎奈瑟氏球菌的OMPC在包含脱氧胆酸钠(10-40mM)和十二烷基硫酸钠(1-10mM)的混合物的Tris-HCL缓冲液溶液中分散1至36小时的时间段。接着，添加质量为所添加的OMPC质量的0.1至3倍的合成的神经节苷脂(GM318:0)，并且延长搅拌。然后，通过超滤或透析系统来去除去污剂。将经超滤的剩余溶液进行浓缩以将其浓度调节至0.1至1mg/ml的OMPC的所希望的剂量，并且通过在孔径为0.2μm的无菌胶囊中实施过滤来进行灭菌。
纳米颗粒佐剂VSSP GM3(18:1)的获得
首先，在具有搅拌的反应器中，将脑膜炎奈瑟氏球菌的OMPC在包含脱氧胆酸钠(10-40mM)和十二烷基硫酸钠(1-10mM)的混合物的Tris-HCL缓冲液溶液中分散1至36小时的时间段。接着，添加质量为所添加的OMPC质量的0.1至3倍的合成的神经节苷脂(GM318:1)，并且延长搅拌。然后，通过超滤或透析系统来去除去污剂。将经超滤的剩余溶液进行浓缩以将其浓度调节至0.1至1mg/ml的OMPC的所希望的剂量，并且通过在孔径为0.2μm的无菌胶囊中实施过滤来进行灭菌。
具有VSSP GM3(18:0)的HER1、HER1+HER2和HER3的疫苗组合物的制备
包含作为生长因子受体的HER1或HER1+HER2或HER3和作为佐剂的VSSP GM3(18:0)并且其目的为实现诱导强有力的特异性体液免疫应答的在本发明中的优选的疫苗组合物可以以下述方式来进行制备：在注射之前在患者的床位旁将以溶液或冻干物的抗原HER1或HER1+HER2或HER3的独个小瓶的内容物与保存于4至20℃的VSSP GM3(18:0)分开地混合10-30分钟，以致抗原的质量和VSSP GM3(18:0)的质量的最终比例(根据OMPC的含量)在300μg至2mg的范围内。
具有VSSP GM3(18:1)的HER1、HER1+HER2和HER3的疫苗组合物的制备
包含作为生长因子受体的HER1或HER1+HER2或HER3和作为佐剂的VSSP GM3(18:1)并且其目的为实现诱导强有力的特异性细胞免疫应答的在本发明中的优选的疫苗组合物可以以下述方式来进行制备：在注射之前在患者的床位旁将以溶液或冻干物的抗原HER1或HER1+HER2或HER3的独个小瓶的内容物与保存于4至20℃的VSSP GM3(18:1)分开地混合10-30分钟，以致抗原的质量和VSSP GM3(18:1)的质量的最终比例(根据OMPC的含量)在300μg至2mg的范围内。
GnRHm1-TT VSSP GM3(18:0)的疫苗组合物的制备
通过在生物合成过程中用L-脯氨酸置换在天然GnRH的序列(EHWSYGLRPG)中其通常所占据的第六个位置的氨基酸L-甘氨酸来产生肽GnRHm1-TT(EHWSYPLRPG)。为了完成其构建，在适宜的合成过程中添加破伤风类毒素的表位QYIKANSKFIGITEL(Junco J.A.等人,(2007)Vaccine 25:8460-68)，按照固相方法(Hougten等人,(1986)Biotecniques 4:522-6)；为了本发明的目的，从现在起，将称所述肽为PyrGnRHm1-TT。
包含PyrGnRHm1-TT和作为佐剂的VSSP GM3(18:0)并且其目的为实现诱导强有力的特异性体液免疫应答的在本发明中的优选的疫苗组合物可以以下述方式来进行制备：在注射之前在患者的床位旁将以溶液或冻干物的抗原PyrGnRHm1-TT的独个小瓶的内容物与保存于4至20℃的VSSP GM3(18:0)分开地混合10-30分钟，以致抗原的质量和VSSP GM3(18:0)的质量的最终比例(根据OMPC的含量)在600μg至4mg的范围内。
附图简述
图1.在携带MCA203肿瘤并且用包含各种不同的GM3分子种类的VSSP纳米颗粒进行治疗的小鼠的脾中CD11b+GR1+细胞的积累，其通过流式细胞术来进行测量。
图2.在用OVA/VSSP GM3(18:1)、OVA/VSSP GM3(18:0)和OVA/天然VSSP进行免疫接种的小鼠中体内诱导的抗原特异性CTL应答，其通过流式细胞术来进行测量。
图3.在用OVA和包含各种不同的GM3分子种类的VSSP佐剂纳米颗粒的疫苗进行治疗的EG7模型中的抗肿瘤效应。该图显示了在实验的第20天，每个组的肿瘤体积的独个值及其平均值。虚线表示这样的值，在所述值之下认为肿瘤未进展。在右边显示了在每个组中由于治疗而没有肿瘤进展的动物的频率。
图4.通过佐以VSSP GM3(18:0)的HER3疫苗制备物所诱导的IgG抗体的滴度，其通过ELISA来进行测量。
图5a.通过佐以VSSP GM3(18:0)的HER1+HER2二价疫苗制备物所诱导的针对HER1和HER2的特异性抗体的滴度与佐以天然VSSP的情形的比较，其通过ELISA来进行测量。
图5b.通过佐以VSSP GM3(18:0)的HER1+HER2二价疫苗制备物所诱导的针对ECD-HER2的亚结构域的特异性抗体的滴度与佐以天然VSSP的情形的比较，其通过ELISA来进行测量。
图6.由通过佐以VSSP GM3(18:0)的HER1+HER2二价疫苗制备物所诱导的抗体对于HER1+/HER2+肿瘤系的识别与佐以天然VSSP的情形的比较，其通过流式细胞术来进行测量。
图7.通过佐以VSSP GM3(18:0)的HER1+HER2二价疫苗制备物所诱导的抗体对于H125 HER1+/HER2+肿瘤系的生存力的效应与佐以天然VSSP的情形的比较，其通过MTT比色测定法来进行测量。
图8.由通过佐以VSSP GM3(18:0)的HER1疫苗制备物所诱导的抗体对于MDA-MB468(HER1+)肿瘤系的识别与佐以天然VSSP的情形的比较，其通过流式细胞术来进行测量。
图9.由通过佐以VSSP GM3(18:0)的HER1疫苗制备物所诱导的抗体对于HER1激活的抑制与佐以天然VSSP的情形的比较，其通过Western印迹法来进行测量。
图10.用肽PyrGnRHm1-TT(具有和没有VSSP GM3(18:0))进行的免疫接种对于哥本哈根大鼠前列腺的重量的效应。
图11.在植入了Dunning R3327-H肿瘤系的哥本哈根大鼠中肿瘤生长速率的评价。
实施例
实施例1.在携带MCA203肿瘤的小鼠中施用VSSP GM3(18:1)不增加脾中CD11b+GR1+细胞的数目
在第0天用1×106个MCA203细胞通过SC途径接种四组雌性C57BL/6小鼠(3只动物/组)。然后，在第11、12和18天通过SC途径向这些组中的三组的小鼠注射天然VSSP、VSSP GM3(18:1)和VSSP GM3(18:0)(200μg的OMPC)，留下第四组作为未治疗的对照，向其施用磷酸盐缓冲液。在第22天，处死动物并独个地处理取出的脾以通过流式细胞术来测定CD11b+Gr1+细胞的数目。可以看出(图1)，如在用VSSP GM3(18:1)进行治疗的动物中，这些脾细胞的数量的平均值相对于在对照组动物中由肿瘤所诱导的数量的平均值而言没有增加。相反，这些CD11b+Gr1+细胞的数量的平均值在注射了天然VSSP和VSSP GM3(18:0)的动物的脾中显著增加(相同字母，p>0.05；不同字母，p<0.05，ANOVA和Tukey检验)。
实施例2.相比于用OVA/天然VSSP和OVA/VSSP GM3(18:0)进行疫苗接种而言，用OVA/VSSP GM3(18:1)进行疫苗接种诱导多至三倍的CD8+T细胞的特异性细胞毒性
通过使用天然VSSP、VSSP GM3(18:1)或VSSP GM3(18:0)的纳米颗粒作为佐剂，在用抗原OVA的三种不同制剂进行免疫接种的雌性C57BL/6小鼠(3只动物/组)中以比较的方式评价了体内抗原特异性CTL应答。在第0、1和7天通过SC途径施用疫苗(200μg的OMPC)。平行地，从幼稚动物获得脾细胞，其用CFSE进行差异标记(在37℃下5分钟)。在用肽SIINFEKL对其进行脉冲处理(1μΜ；在37℃和5％CO2下90分钟)后将高度经标记(5μΜ)的细胞用作靶细胞，而将低度经标记(0.33μΜ)的细胞用作没有肽负荷的对照。在最后一次免疫接种后，进行洗涤以去除游离的肽，并且以相等的比例混合两种类型的脾细胞并注射到经疫苗接种的动物中。在16个小时过后，取出经疫苗接种的小鼠的腹股沟淋巴结并且通过流式细胞术来测量相应于所述两种荧光强度的全部事件。根据下式来计算特异性裂解的百分比：100-[(CFSE高/CFSE低)x 100]。如在图2中所示，疫苗OVA/VSSP GM3(18:1)诱导接近60％的特异性裂解，这是几乎三倍于用OVA/天然VSSP和OVA/VSSP GM3(18:0)这些疫苗所达到的值的值。
实施例3.癌症治疗性疫苗中采用VSSP GM3(18:1)佐剂纳米颗粒具有比采用天然VSSP的情形更大的抗肿瘤效应
在第0天用3×105个EG.7(经遗传修饰以表达OVA作为肿瘤新抗原的EL4胸腺瘤的变体)细胞通过SC途径接种三组雌性C57BL/6小鼠(10只动物/组)。然后，在第4、5和11天用佐以天然VSSP的两种不同的OVA疫苗制剂(50μg/剂)和佐以VSSP GM3(18:1)的第二制剂(200μg/剂)进行三次相继的SC免疫接种。第三组的小鼠以相同的频次用磷酸盐缓冲液进行注射并且用作该实验的对照。从肿瘤接种7天开始，每周测量肿瘤体积(TV)2次。当肿瘤显示出坏死时或者当肿瘤大小超过17mm的直径时，处死动物。在该实验的第20天(图3)，看到治疗性疫苗OVA/VSSP GM3(18:1)相对于制剂OVA/天然VSSP而言的优势(TV的平均值：VSSPGM3(18:1)，560mm3；天然VSSP，740mm3；对照，1640mm3)(p＝0.037，ANOVA和Tukey检验)。更重要的是，看到如在用制备物OVA/VSSP GM3(18:1)进行治疗的组中，50％的动物未在攻击模型例如EG7中显示出肿瘤进展(对照组中100％的动物具有进展)。在用OVA/天然VSSP进行疫苗接种的动物中，仅20％实现避免了进展(p＝0.012，卡方检验)。
实施例4.通过疫苗制备物HER3/VSSP GM3(18:0)来诱导高滴度的关于HER3的特异性抗体
用包含与200μg VSSP GM3(18:0)相混合的200μg ECD-HER3的疫苗制备物通过SC途径免疫接种BALB/c品系的小鼠(n＝5)。所述免疫接种在第0、14、28和42天进行。在第35天(第1次抽血)和第56天(第2次抽血)抽取血液以处理血清，并且通过ELISA来测定针对ECD-HER3的特异性抗体的滴度。为此，将平板用10μg/mL的ECD-HER3进行包被，并且在37℃下进行温育。在相应的封闭后，添加血清稀释物(1/100、1/1000、1/5000、1/10000)。通过使用抗鼠类IgG抗体/过氧化物酶的缀合物(Sigma)和所述酶的相应的底物来使反应可视化。
经免疫接种的小鼠发展出IgG同种型的特异性抗体，其达到了直至1/5000的滴度(图4)。该结果证明了VSSP GM3(18:0)激活针对免疫原性非常差的抗原例如自体肿瘤抗原的免疫系统的体液分支的潜力。
实施例5.相对于佐以天然VSSP的情形而言，佐以VSSP GM3(18:0)的HER1+HER2二价疫苗制备物诱导更高滴度的特异性IgG抗体
用包含佐以200μg天然VSSP(组1)或200μg VSSP GM3(18:0)(组2)的100μg ECD-HER1和100μg ECD-HER2的混合物的疫苗制备物免疫接种BALB/c品系的小鼠(n＝5)。所述免疫接种在第0、14和28天通过SC途径进行。在第35天抽取血液以处理血清。通过ELISA技术来测定针对HER1和HER2的ECD的特异性抗体的滴度。为此，将平板用5μg/mL的ECD-HER1或5μg/mL的ECD-HER2进行包被，并且在37℃下进行温育。在相应的封闭后，添加血清稀释物(1/100、1/1000、1/10000、1/50000、1/100000)。通过使用抗鼠类IgG/碱性磷酸酶的缀合物(Sigma)和所述酶的相应的底物来使反应可视化。使用免疫前血清作为阴性对照。
所有经免疫接种的小鼠都发展出IgG同种型的特异性抗体。关于ECD-HER1的特异性抗体的滴度在其中所使用的佐剂为VSSP GM3(18:0)的组2中是更高的，相对于在其中佐剂为天然VSSP的组1中发展出的抗体的滴度而言(图5a)。另一方面，尽管关于针对ECD-HER2的特异性抗体，在组1和2中所诱导的抗体的滴度之间未获得显著差异，但是在其中疫苗制备物使用VSSP GM3(18:0)作为佐剂的组2中的滴度具有增加的趋势。鉴于在ECD-HER2的识别中所观察到的趋势，进行从针对在丝状噬菌体上表达的ECD-HER2的亚结构域(亚结构域I、II、III和IV)的免疫血清开始纯化出的多克隆抗体(PcAb)的滴定。为此，将ELISA平板用10μg/mL的PcAb进行包被，并且在37℃下进行温育。然后，添加表达HER2的不同亚结构域的噬菌体样品，并且用与过氧化物酶相缀合的抗噬菌体抗体(GE-Healthcare)来使比色信号显现。在图5b中可以看出，来自其中采用VSSP GM3(18:0)作为佐剂的动物的PcAb具有比来自其中采用天然VSSP作为佐剂的动物的抗体更高的针对ECD-HER2的亚结构域I、III和IV的反应性。
实施例6.相对于佐以天然VSSP的情形而言，由通过佐以VSSP GM3(18:0)的HER1+HER2二价疫苗制备物所诱导的抗体对于HER1+/HER2+肿瘤系的更大的识别
用包含佐以200μg天然VSSP或佐以200μg VSSP GM3(18:0)的100μg ECD-HER1和100μg ECD-HER2的混合物的疫苗制备物通过SC途径免疫接种BALB/c品系的小鼠(n＝5)。所述免疫接种在第0、14和28天进行，并且使用相应于第35天的血清来评价对于表达HER1和HER2的肿瘤系的识别。所使用的系为：阴道上皮癌A431(ATCC-CRL 1555)、非小细胞肺癌H125(ATCC-CRC 5801)和乳腺癌SKBR3(ATCC-HTB 30)。通过流式细胞术来进行测量。为此，用在磷酸盐缓冲盐水溶液中的2％胎牛血清封闭每个细胞系的105个细胞，然后将其与每个治疗组的血清混合物的1/200稀释物一起进行温育。通过使用抗鼠类IgG抗体/异硫氰酸荧光素(FITC)的缀合物(Sigma)并且通过在流式细胞仪中获取至少5000个细胞来使特异性抗体与肿瘤细胞中的受体HER1和HER2的结合可视化。作为阴性对照，对于每个所评价的组使用免疫前血清的混合物。通过佐以VSSP GM3(18:0)的疫苗制备物所诱导的血清以更高的强度识别所评价的肿瘤系的细胞(图6)。
实施例7.相对于佐以天然VSSP的情形而言，通过佐以VSSP GM3(18:0)的HER1+HER2二价疫苗制备物所诱导的抗体引起H125肿瘤系的生存力的更大降低
将105个H125系的细胞与来自BALB/c小鼠的经1/20稀释的血清混合物一起温育72小时，所述BALB/c小鼠每十五天用三个剂量的佐以VSSP GM3(18:0)或天然VSSP的100μgECD-HER1和100μg ECD-HER2的混合物的二价疫苗制备物进行免疫接种。作为阴性对照，使用以与免疫血清相同的稀释度的免疫前血清的混合物。作为阳性对照，使用10μΜ的酪氨酸激酶抑制剂AG1478。免疫血清对于细胞生存力的效应的测定通过MTT比色测定法来进行，并且吸光度的读取在540nm和630nm下进行。细胞生存力通过下式来确定：
图7显示，相对于佐以天然VSSP的疫苗制备物而言，通过佐以VSSP GM3(18:0)的疫苗制备物所诱导的血清使细胞生存力显著降低。
实施例8.相对于佐以天然VSSP的情形而言，由通过佐以VSSP GM3(18:0)的HER1疫苗制备物所诱导的抗体对于HER1+肿瘤系的更大的识别
用包含佐以400μg天然VSSP或佐以400μg VSSP GM3(18:0)的200μg ECD-HER1的疫苗制备物通过SC途径免疫接种C57BL/6品系的小鼠(n＝5)。所述免疫接种在第0、14、28和42天进行，并且使用相应于第56天的血清来评价对于在其膜中具有HER1的高表达的MDA-MB468乳腺癌系(ATCC-HTB 132)的识别。通过流式细胞术技术来进行测量。为此，用在磷酸盐缓冲盐水溶液中的2％胎牛血清封闭所述细胞系的105个细胞，然后将其与每个治疗组的血清混合物的1/100稀释物一起进行温育。通过使用抗鼠类IgG抗体/FITC的缀合物(Sigma)并且通过在流式细胞仪中获取至少5000个细胞来使特异性抗体与肿瘤细胞中的受体HER1的结合可视化。作为阴性对照，对于每个所评价的组使用免疫前血清的混合物。通过佐以VSSP GM3(18:0)的疫苗制备物所诱导的血清以更高的强度识别所评价的肿瘤系的细胞(图8)。
实施例9.相对于佐以天然VSSP的情形而言，通过佐以VSSP GM3(18:0)的HER1疫苗制备物所诱导的抗体更大地抑制HER1的激活
采用C57BL/6品系的小鼠，其被分为四个组(n＝5)并且用下面的疫苗制备物通过SC途径进行免疫接种：
组1：佐以200μg天然VSSP的200μg ECD-HER1；
组2：佐以200μg VSSP GM3(18:0)的200μg ECD-HER1；
组3：佐以400μg天然VSSP的200μg ECD-HER1；
组4：佐以400μg VSSP GM3(18:0)的200μg ECD-HER1。
所述免疫接种在第0、14、28和42天进行，并且使用相应于第56天的血清来评价所产生的抗体在EGF存在下抑制HER1的磷酸化的能力。为此，将H292肺癌系的细胞(CRL 1848)与稀释度为1/100的血清混合物一起温育2小时。然后，用100ng/mL的EGF刺激细胞10分钟以诱导HER1的激活。通过Western印迹技术来测量所述血清对于HER1的磷酸化的效应，其中使用特异性抗体来检测经磷酸化的HER1和β-肌动蛋白。作为HER1的激活的对照，使用用EGF进行处理的细胞。作为HER1的抑制的阴性对照，采用稀释度为1/100的免疫前血清的混合物，和作为抑制的阳性对照，使用10μΜ的酪氨酸激酶抑制剂AG1478。使用所获得的照片来进行光密度测定法，其使得能够对数据进行标准化。
用使用VSSP GM3(18:0)作为佐剂的疫苗制备物进行免疫接种的组的血清比采用天然VSSP作为佐剂的组的血清更强地在磷酸化方面抑制受体HER1的激活，不论是以200μg的剂量还是以400μg的剂量，其中在400μg的剂量下该抑制更明显(图9)。该结果证明了包含VSSP GM3(18:0)作为佐剂的疫苗制备物在所诱导的体液免疫应答的质量方面的优越性。
实施例10.哥本哈根大鼠中疫苗制剂PyrGnRHm1-TT/VSSP GM3(18:0)对于前列腺的效应
使用8-12周龄的雄性哥本哈根大鼠。将动物分为3个组，每组10只动物。
组1：安慰剂(Montanide ISA 51VG/VSSP GM3 18:0)；
组2：用PyrGnRHm1-TT/Montanide ISA 51VG进行免疫接种；
组3：用PyrGnRHm1-TT/Montanide ISA 51VG/VSSP GM3 18:0进行免疫接种。
为了制备免疫原，将肽PyrGnRHm1-TT重悬浮在蒸馏水和VSSP中直至达到750μg的肽和120μg的VSSP/250μL的最终浓度。然后，将该混合物用Montanide ISA 51VG以50:50(v/v)按比例地进行配制。动物以每十五天一次的频次接受4次免疫接种。
相比于安慰剂而言，用在Montanide ISA 51VG中乳化的肽PyrGnRHm1-TT进行免疫接种产生前列腺大小的显著减小(p<0.05)。然而，当将肽PyrGnRHm1-TT用VSSP进行乳化时，该差异大得多(p<0.01)(图10)。
实施例11.通过采用肽PyrGnRHm1-TT在Dunning R3327-H模型中诱导抗肿瘤应答
用Dunning R3327-H鼠类肿瘤模型的肿瘤碎块(2×2×2mm)在右后肢的远端区中以SC方式对成年哥本哈根大鼠进行移植。将动物分为接受不同处理的四个组：
组1：安慰剂：Montanide ISA 51VG/VSSP GM3 18:0；
组2：去势的；
组3：用肽PyrGnRHm1-TT/Montanide ISA 51VG进行免疫接种；
组4：用肽PyrGnRHm1–TT/Montanide ISA 51VG/VSSP GM318:0进行免疫接种。
当肿瘤达到大约10mm的直径时，开始对于每个组按照相应的处理进行免疫接种。进行总共7次免疫接种，每15天一次。
在图11中，在安慰剂组(组1)中观察到急剧的肿瘤生长，这不同于去势组和免疫接种组(组2、3和4)，其中看到肿瘤生长的明显抑制(p<0.01)。该差异在用VSSP GM3 18:0乳化的变体PyrGnRHm1-TT中变得更为显著(p＝0.005)。

Claims (5)

1.佐剂，其包含纳米颗粒，所述纳米颗粒通过将细菌脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)的外膜复合物的疏水蛋白质与完全合成的神经节苷脂GM3变体一起进行分散来形成，其中在所述神经节苷脂GM3的神经酰胺中存在的脂肪酸为硬脂酸(18:0)或油酸(18:1)。
2.疫苗组合物，其包含权利要求1的佐剂，和从包括下列各项的组中选择的抗原：
-单独的或相组合的HER1、HER2或HER3；和
-肽PyrGnRHm1-TT。
3.权利要求2的疫苗组合物，其包含从包括下列各项的组中选择的其他佐剂：
-氧化铝，和
-油性佐剂。
4.根据权利要求2-3中任一项的疫苗组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗表达HER1、HER2、HER3和/或肽PyrGnRHm1-TT的癌症。
5.根据权利要求2的疫苗组合物在制备用于刺激抗原特异性体液免疫应答的药物中的用途，其中在所述神经节苷脂GM3的神经酰胺中存在的脂肪酸为硬脂酸(18:0)。
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