CN118903397A - GloboH六糖、linker化合物、蛋白偶联物及免疫原性组合物在治疗或抑制上皮性肿瘤中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了GloboH六糖、linker化合物、蛋白偶联物及免疫原性组合物在治疗或抑制上皮性肿瘤中的应用，涉及医药生物技术领域。本发明提供的GloboH六糖可通过linker而与载体蛋白复合，用于制备治疗癌症或抑制上皮性肿瘤生长的药物或疫苗。蛋白偶联物与佐剂组合后能制备相应的免疫原性组合物，诱导受试者体内能产生较高的体液免疫和细胞免疫效果，能在受试者体内诱导产生较高的IgG、IgM、IgG抗体亚型的抗体滴度。因此，本发明提供的GloboH六糖、linker化合物、蛋白偶联物在制备抑制上皮性肿瘤的药物或疫苗中具有良好的应用前景，免疫原性组合物在制备抑制上皮性肿瘤的疫苗中也具有良好的应用前景。

Description

GloboH六糖、linker化合物、蛋白偶联物及免疫原性组合物在 治疗或抑制上皮性肿瘤中的应用

技术领域

本发明涉及医药生物技术领域，具体而言，涉及GloboH六糖、linker化合物、蛋白偶联物及免疫原性组合物在治疗或抑制上皮性肿瘤中的应用。

背景技术

肿瘤糖基化异常是癌症生物学中的一个重要标志，肿瘤相关糖抗原（Tumor-Associated Carbohydrate Antigens, TACAs）在肿瘤细胞表面的过度表达与在正常细胞中的无/低表达形成显著对比，相关糖抗原研究也是目前肿瘤治疗性抗体和治疗疫苗焦点。TACA球状丝氨酸聚糖（Globo H）是一种结构复杂的六糖化合物，Globo H抗原在各种上皮细胞肿瘤（如乳腺、卵巢、结肠、胃、胰腺和肺癌）上过表达，正常细胞极低表达。其主要通过肿瘤免疫抑制、微血管生成及肿瘤蛋白激酶几方面实现促癌作用。这些发现使得Globo H，一种六糖抗原表位，成为引人注目的肿瘤标记物以及癌症疫苗研发的可行标靶。

开发针对Globo H的治疗疫苗或药物通过激活人体免疫系统，尤其是激活针对Globo H的特异性抗体和细胞免疫反应，有望阻断这些促癌机制。由于肿瘤相关糖抗原分子量较小，缺乏尺寸效应和簇效应，具备强免疫原性，只能刺激B细胞产生低亲和的IgM抗体，没有免疫记忆，因此需要与载体蛋白偶联形成糖缀合物，以诱导机体产生持久且可增强的IgG抗体。

而糖-蛋白偶联策略对于最终的治疗疫苗效果极为关键，现有Globo H采用下述的糖-蛋白偶联策略：1）还原胺化方法：反应条件苛刻，改变了抗原基础结构，伴随过度还原及其他副反应[1]；2）硫加成方法：含硫键在体内环境不稳定，易被还原或氧化，影响偶联产品的长期稳定性[2]；3）二硫键方法：二硫键强还原性，在体内有断裂的风险[3]；4）环加成方法：环状linker单元可能存在免疫原性问题[4]。现有技术存在糖-蛋白结合效率低，容易产生其他副反应或者免疫副作用，限制了现有GloboH疫苗的免疫效果。

鉴于此，特提出本发明。

参考文献：

[1] Gildersleeve, J., Oyelaran, O., Simpson, J.,&Allred, B. E.(2008). Improved procedure for direct coupling of carbohydrates to proteinsvia reductive amination. Bioconjugate Chemistry, 19(7), 1485-1490.

[2] Smith, A. M.,&Brown, S. P. (2015). Thiol-Mediated Conjugation ofSugars to Proteins. Bioconjugate Chemistry, 26(3), 531-540.

[3] Sadowsky, J., Pillow, T. H., Chen, J., Fan, F., He, C., Wang, Y.,...&Wai, J. (2017). Development of Efficient Chemistry to Generate Site-Specific Disulfide-Linked Protein- and Peptide-Payload Conjugates:Application to THIOMAB Antibody-Drug Conjugates. Bioconjugate Chemistry, 28(8), 2086-2098.

[4] Bruins, J. J., Blanco-Ania, D., van der Doef, V., van Delft, F.V.,&Albada, B. (2018). Orthogonal, dual protein labelling by tandemcycloaddition of strained alkenes and alkynes to ortho-quinones and azides.Chemical Communications, 54(53), 7338-7341.

发明内容

本发明的目的在于提供GloboH六糖、linker化合物、蛋白偶联物及免疫原性组合物在治疗或抑制上皮性肿瘤中的应用以解决上述技术问题。

第一方面，本发明提供了一种式I所示的化合物或其立体异构体、溶剂化物、水合物、前药、稳定的同位素衍生物及药学上可接受的盐在制备用于治疗或抑制上皮性肿瘤生长的药物或疫苗中的应用，

。

第二方面，本发明提供了一种linker化合物在制备用于治疗或抑制上皮性肿瘤生长的药物或疫苗中的应用，linker化合物包括双活化酯linker和式I所示的化合物或其立体异构体、溶剂化物、水合物、前药、稳定的同位素衍生物及药学上可接受的盐，双活化酯linker与式I所示的化合物的氨基酰胺缩合；

。

第三方面，本发明提供了一种蛋白偶联物在制备用于治疗或抑制上皮性肿瘤生长的药物或疫苗中的应用，蛋白偶联物，其包括载体蛋白和上述的linker化合物，载体蛋白与linker化合物通过酰胺缩合。

第四方面，本发明提供了一种免疫原性组合物，其包括上述的蛋白偶联物和佐剂。

第五方面，本发明提供了上述的免疫原性组合物在制备用于治疗或抑制上皮性肿瘤生长的药物中的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明基于酰胺缩合的方式进行的糖-蛋白偶联，具备副反应小、生物兼容性强、不产生额外免疫原性的技术优势。GloboH六糖可以通过连接子（linker）而与载体蛋白复合，用于制备治疗癌症或抑制上皮性肿瘤生长的药物或疫苗。通过与佐剂搭配，制备相应的免疫原性组合物，通过免疫检测，受试者体内能产生较高的体液免疫和细胞免疫效果，能在受试者体内诱导产生较高的IgG、IgM、IgG抗体亚型的抗体滴度。本发明提供的免疫原性组合物免疫受试者后，产生的抗体对肿瘤细胞具有特异性结合效果，特异性抗体引发的CDC反应对肿瘤细胞具有强杀伤效果。因此，本发明提供的GloboH六糖、linker化合物、蛋白偶联物在制备抑制上皮性肿瘤的药物或疫苗中具有良好的应用前景。蛋白偶联物与佐剂配合后的免疫原性组合物在制备抑制上皮性肿瘤的疫苗中也具有良好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为注射不同佐剂组合的GloboH疫苗各组小鼠体重统计结果图；

图2为注射不同佐剂组合的GloboH疫苗小鼠血清IgG抗体滴度统计结果图；

图3为注射不同佐剂组合的GloboH疫苗小鼠血清IgM抗体滴度统计结果图；

图4为注射不同佐剂组合的GloboH疫苗小鼠血清IgG亚型的抗体滴度统计结果图；

图5为注射不同佐剂组合的GloboH疫苗小鼠血清抗体对肿瘤细胞特异性结合效果图；

图6为注射不同佐剂组合的GloboH疫苗小鼠血清抗体对MCF-7和B16F10的CDC反应统计结果图；

图7为本发明实施例提供的式I所示化合物的核磁氢谱；

图8为本发明实施例提供的式I所示化合物的核磁碳谱；

图9为本发明实施例提供的Globo H-CRM197的MALDI-TOF的谱图；

图10为实施例2制备的蛋白偶联物（GloboH-BSA）的MALDI-TOF的谱图。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols inMolecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

第一方面，本发明提供了一种式I所示的化合物或其立体异构体、溶剂化物、水合物、前药、稳定的同位素衍生物及药学上可接受的盐在制备用于治疗或抑制上皮性肿瘤生长的药物或疫苗中的应用，

。

GloboH六糖可以通过连接子（linker）而与载体蛋白复合，用于制备治疗癌症或抑制上皮性肿瘤生长的药物或疫苗。通过与佐剂搭配，制备相应的免疫原性组合物，通过免疫检测，受试者体内能产生较高的体液免疫和细胞免疫效果，能在受试者体内诱导产生较高的IgG、IgM、IgG抗体亚型的抗体滴度。高抗体滴度的产生有助于提高肿瘤抑制效果。

上述药物或疫苗的形态包括不限于：固体、液体或半固体。

在本发明应用较佳的实施方式中，上皮性肿瘤选自乳头状瘤、胃肠癌、子宫癌、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、腺癌、乳腺癌、腺瘤和鳞癌中的至少一种。

胃肠癌选自食道癌、胆囊癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、小肠癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌和肛门癌。结直肠肿瘤包括息肉样型、狭窄型和溃疡型中的一种或多种。

在一种可选的实施方式中，腺癌包括不限于肺腺癌、甲状腺癌、涎腺癌、胰腺癌或前列腺癌。

在一种可选的实施方式中，腺瘤包括不限于囊腺瘤、纤维腺瘤、多形性腺瘤或息肉状腺瘤。

在一种可选的实施方式中，乳腺癌包括不限于乳腺上皮癌；

优选地，所述乳腺癌为乳腺导管癌或乳腺小叶癌。

乳腺癌，优选II期至IV期和/或不良分化的侵袭性导管癌、粉刺癌以及髓样癌(优选2级)。

卵巢癌，浆液性和粘液性癌(优选地Ic期至IIIb期)、颗粒细胞肿瘤、表面上皮-间质肿瘤(腺癌)、囊腺癌以及子宫内膜样肿瘤。

子宫癌，优选地包括子宫内膜样腺癌(优选地I期至IIIc期)。

膀胱癌，优选地包括移行细胞癌(优选地II期至IV期)。

肺癌，优选地包括小细胞肺癌(优选地I期至IIIb期)、非小细胞肺癌(优选地不良至中度分化的鳞状和腺癌)以及大细胞肺癌。

鳞癌为口腔鳞癌、咽鳞癌、喉癌、食道鳞癌（例如食管鳞癌）、唇的鳞状细胞癌、子宫鳞癌、阴道鳞癌和皮肤鳞癌中的一种或多种。

口腔鳞状上皮细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)又称口腔鳞癌。口腔鳞癌例如包括不限于舌鳞癌。

在其他实施方式中，上述鳞癌也可以是支气管、膀胱、肾盂等部位通过鳞状上皮化生而形成的鳞状细胞癌。

在本发明应用较佳的实施方式中，药物或疫苗用于诱导如下至少一种抗体的产生：

IgM抗体和IgG抗体。药物或疫苗可以诱导受试者产生较强的体液免疫和细胞免疫反应。

药物用于诱导如下抗体中的至少一种抗体产生：IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。如IgG2a在受试者体内能够引起较强的CDC和ADCC反应，IgG1能够在受试者体内诱导更强的CDC、ADCC和ADCP反应。

第二方面，本发明提供了一种linker化合物在制备用于治疗或抑制上皮性肿瘤生长的药物或疫苗中的应用，linker化合物包括双活化酯linker和式I所示的化合物或其立体异构体、溶剂化物、水合物、前药、稳定的同位素衍生物及药学上可接受的盐，双活化酯linker与式I所示的化合物的氨基酰胺缩合；

。

在本发明应用较佳的实施方式中，双活化酯linker选自下述结构式所示化合物：

。

linker化合物选自下述结构式所示化合物：

。

第三方面，本发明提供了一种蛋白偶联物在制备用于治疗或抑制上皮性肿瘤生长的药物或疫苗中的应用，蛋白偶联物，其包括载体蛋白和上述中的linker化合物，载体蛋白与linker化合物通过酰胺缩合。

在本发明应用较佳的实施方式中，载体蛋白是白喉毒素交叉反应性材料197、白喉类毒素、破伤风类毒素或牛血清白蛋白。

在本发明应用较佳的实施方式中，蛋白偶联物的结构式如下所示：

。

第四方面，本发明提供了一种免疫原性组合物，其包括上述中的蛋白偶联物和佐剂。本发明提供的免疫原性组合物免疫受试者后，产生的抗体对肿瘤细胞具有特异性结合效果，特异性抗体引发的CDC反应对肿瘤细胞具有强杀伤效果。因此，本发明提供的GloboH六糖、linker化合物、蛋白偶联物在制备抑制上皮性肿瘤的药物或疫苗中具有良好的应用前景。蛋白偶联物与佐剂配合后的免疫原性组合物在制备抑制上皮性肿瘤的疫苗中也具有良好的应用前景。

免疫原性组合物是指能引起免疫应答的性能的物质，即包括抗原的免疫原性组合物能刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分化，最终产生免疫效应物质抗体和致敏淋巴细胞的特性。

在本发明应用较佳的实施方式中，佐剂选自Toll样受体激动剂、RIG-I样受体激动剂、NOD样受体激动剂、C-型凝集素受体、STING激动剂、细菌毒素及其衍生物、皂苷类、细胞因子和其他佐剂中的至少一种；其他佐剂选自热激蛋白、A151、GTP-GDP、氟化钠、烷基聚丙烯酯多聚体、二甲基双十八烷基季胺溴化物、脂质体、铝佐剂、MF59、AS03、α-GalCer、脂多糖和RC-529佐剂的至少一种。

脂质体是体外制备的可变大小囊泡，由球形脂质双层和含水内室构成。作为现代囊泡抗原递送方法，脂质体克服了传统抗原递送方法的局限，可延长疫苗释放时间。脂质体通常由各种两性磷脂组成，如磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂，它们可以与其他脂质（如胆固醇）结合以稳定膜，也可以通过带有负电荷或正电荷的脂质来调节脂质体的结构和表面性质。作为疫苗载体，脂质体具有多重优势，包括抑制抗原降解、运输亲水性和亲脂性抗原、调控抗原释放、改善抗原特异性免疫反应，以及增强细胞摄取。

在一种可选的实施方式中，Toll样受体激动剂选自CpG-ODN、CpG 1018、肽聚糖、脂磷壁酸、MPL、MPLA、3-O-脱酰基单磷酰脂质A、咪喹莫特、瑞喹莫特、细菌鞭毛蛋白、MEDI9197和Poly I:C中的至少一种。此外，Toll样受体激动剂包括不限于TLR1，TLR2，TLR4，TLR5和TLR9的激动剂。

3D-MPL：3-O-脱酰基单磷酰脂质A(3D-MPL)也称为3-脱-O-酰基单磷酰脂质A或3-O- 脱酰基-4’-单磷酰脂质A。该名称表明单磷酰脂质A中还原端葡糖胺的3位脱酰基。其由明尼苏达沙门菌(Salmonellaminnesota)的无庚糖(heptoseless)突变体制备，化学结构类似于脂质A但缺乏酸不稳定的磷酰基和碱不稳定的酰基。它能激活单核细胞/巨噬细胞谱系细胞，刺激释放几种细胞因子，包括IL-1、IL-2、TNF-α和GM-CSF。

CpG 1018佐剂是一种TLR9激动剂，既能够刺激B细，促进体液免疫；同时也能刺激树突状细胞活化，进而刺激特异性T细胞、产生记忆细胞。

CpG ODN佐剂，即 CpG 寡核苷酸(CpG oligodeoxynucleotides, CpG ODN) 是指一类以未甲基化 CG 二核苷酸为核心的寡聚核苷酸序列，CpG ODN可以激活 TLR9 受体，是一种有潜力的疫苗佐剂，能够增强疫苗的免疫反应强度、广度和持久性。CpG ODN佐剂包括不限于A、B、C 三类，即CpG-A ODN、CpG-B ODN和CpG-C ODN；包括不限于ODN 2216、ODN2006、ODN 2395。

多聚体CpG-A ODN主要定位于早期溶酶体，在浆细胞样树突状细胞中，它们导致IFN-α的强烈诱导。单体CpG-B ODNs集中在晚期内体区室，可以促进浆细胞样树突状细胞和B细胞的细胞成熟。CpG-C ODN定位于两个区室，诱导IFN-α的产生和细胞成熟。影响含CpG序列生物效应的其他结构修饰包括通过非核苷化学连接体连接两个或多个短的硫代磷酸酯骨架CpG ODN，以产生线性嵌合免疫调节化合物和/或含CpG纳米颗粒化合物的制剂。

RIG-I样受体激动剂选自3pRNA和短的双链RNA中的至少一种；

NOD样受体激动剂选自胞壁酰二肽和N一乙酰葡萄糖胺中的至少一种；

C-型凝集素受体选自β-葡聚糖和海藻糖二硼酸盐中的至少一种；

STING激动剂选自cGAMP、c-di-AMP和c-di-GMP中的至少一种；cGAMP包括不限于3’-3’cGAMP和2’-3’cGAMP。

细菌毒素及其衍生物选自霍乱毒素及其亚单元和大肠杆菌不耐热肠毒素及其亚单元中的至少一种；

皂苷类选自QS21、番茄苷和Quil-A中的至少一种；

细胞因子选自GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-34、IL-6、IFN-γ、Flt-3和淋巴细胞趋化因子中的至少一种。

霍乱毒素亚单元选自CTB和/或CTA，大肠杆菌不耐热肠毒素亚单元选自LTB。

铝佐剂为明矾、氢氧化铝、磷酸铝。

脂多糖为两性离子多糖佐剂。

佐剂为QS21和3D-MPL的组合佐剂；或，QS21和S34的组合佐剂。经过筛选，发明人发现，QS21+3D-MPL的佐剂组合能够在能在人体内诱导较高的IgG2a和IgG3，进而诱导较强的抗肿瘤免疫反应。QS21+S34能在人体等受试者体内诱导更优的总IgG抗体滴度和IgM滴度，较高的总IgG抗体滴度有助于在受试者体内诱导更强的CDC、ADCC和ADCP反应，进而发挥较高的抗肿瘤活性。

第五方面，本发明提供了免疫原性组合物在制备用于治疗或抑制上皮性肿瘤生长的药物中的应用。

上述药物还包括药学上可接受的载体。

其他药学上可接受的载体选自淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、乳糖、乳糖淀粉复合物、乳糖纤维素复合物、甘露醇、甘露醇淀粉复合物、山梨醇、聚维酮、共聚维酮、羟丙甲纤维素、羟丙基纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、硬脂酸镁、硬脂富马酸钠、滑石粉、硬脂酸中的一种或者多种。

在一种可选的实施方式中，上述药物为液体药物制剂（如作为注射剂的一种），例如溶液、悬浮液和凝胶通常含有液体载体，例如水和/或药学上可接受的有机溶剂。此外，此类液体制剂还可包含pH调节剂、乳化剂或分散剂、缓冲剂、防腐剂、润湿剂、胶凝剂(例如甲基纤维素)，例如如上所定义的。药物可以是等渗的，即，它们可具有与血液相同的渗透压。药物的等渗性可通过使用氯化钠和其他药学上可接受的试剂来调节，这些试剂例如葡萄糖、麦芽糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇和其他无机或有机可溶性物质。液体组合物的粘度可通过药学上可接受的增稠剂例如甲基纤维素来调节。其他合适的增稠剂包括例如黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆等。增稠剂的优选浓度取决于所选择的试剂。

在本发明应用较佳的实施方式中，药物的剂型选自片剂、丸剂、粉剂、混悬剂、凝胶、乳液、颗粒剂、胶囊、注射剂和喷雾剂中的任意一种。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种式I所示化合物，其结构式如下所示：

。

本实施例还提供上述式I所示化合物的制备方法，包括：

（1）合成化合物A：

参照下述合成路径进行合成：

将对甲基苯基硫-β-D-吡喃半乳糖苷溶于二氯甲烷/吡啶（1:1，v/v）中，加入1.05当量二叔丁基硅基双（三氟甲烷磺酸），室温下搅拌3小时。冷却至-20℃，加入1.05当量氯甲酸-9-芴基甲酯，搅拌1小时。再加入1.2当量的苯甲酰氯，室温下搅拌1小时。反应结束后，加入甲醇淬灭并浓缩。将残留物溶解在乙酸乙酯中，用1M盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，用硅胶柱层析纯化（洗脱液：石油醚与乙酸乙酯），最终以89%的收率得到化合物A。

化合物A表征数据如下：¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ 8.10 (dd, J = 8.4, 1.4Hz, 1H), 7.76 – 7.69 (m, 1H), 7.60 – 7.56 (m, 1H), 7.54 (dd, J = 7.4, 1.1 Hz,1H), 7.50 – 7.44 (m, 2H), 7.41 – 7.32 (m, 4H), 7.25 – 7.21 (m, 1H), 7.11 (td,J = 7.5, 1.1 Hz, 1H), 7.08 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 5.85 (t, J = 10.0 Hz, 1H),4.91 (dd, J = 9.8, 3.1 Hz, 1H), 4.87 – 4.80 (m, 2H), 4.36 – 4.26 (m, 4H),4.19 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 3.56 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 2.33 (s, 3H), 1.19 (s,9H), 1.05 (s, 9H)。¹³C NMR (150MHz, CDCl₃) δ 165.42, 154.55, 143.40, 143.17,141.25, 138.25, 133.40, 133.26, 130.08, 130.07, 129.78, 129.73, 128.56,127.90, 127.26, 127.23, 125.34, 125.29, 120.03, 88.00, 78.49, 74.96, 70.53,70.46, 68.26, 67.16, 46.56, 27.66, 27.65, 23.42, 21.24, 20.84. HRMS (ESI): [M+Na]⁺calcd for C₄₃H₄₈O₈SSiNa, 775.2731; found, 775.2732。

（2）合成下述结构式所示化合物B：

，将化合物A溶于DMF中，加入1.5当量苯甲醛二甲基缩醛和0.3当量樟脑磺酸，40℃下搅拌过夜后加入三乙胺淬灭并浓缩。将残留物溶于DMF中，0℃下分别加入5.5当量溴苄和5.5当量钠氢，室温搅拌3小时。反应结束后加入甲醇淬灭并浓缩，用硅胶柱层析纯化（洗脱液：甲苯与丙酮），以78%的收率得到化合物B。

化合物B的表征数据如下：¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ 7.57 – 7.54 (m, 2H),7.51 – 7.47 (m, 2H), 7.42 – 7.38 (m, 4H), 7.38 – 7.29 (m, 16H), 7.27 – 7.24(m, 3H), 7.22 – 7.19 (m, 3H), 5.49 (s, 1H), 5.21 (d, J = 10.6 Hz, 1H), 4.96(d, J = 11.0 Hz, 1H), 4.88 (d, J = 11.2 Hz, 1H), 4.82 (d, J = 10.7 Hz, 1H),4.79 (dd, J = 11.2, 2.6 Hz, 2H), 4.76 – 4.74 (m, 2H), 4.57 (d, J = 12.0 Hz,1H), 4.51 – 4.47 (m, 2H), 4.36 (d, J = 12.1 Hz, 1H), 4.24 (dd, J = 12.3, 1.5Hz, 1H), 4.08 – 4.04 (m, 2H), 4.01 (t, J = 9.3 Hz, 1H), 3.91 (dd, J = 10.9,4.1 Hz, 1H), 3.87 (dd, J = 12.4, 1.9 Hz, 1H), 3.83 – 3.78 (m, 2H), 3.76 –3.70 (m, 3H), 3.68 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 3.66 – 3.63 (m, 2H), 3.48 (dd, J =9.2, 7.8 Hz, 1H), 3.46 – 3.38 (m, 2H), 3.34 – 3.25 (m, 2H), 2.96 (d, J = 1.3Hz, 1H)。¹³C NMR (150 MHz, CDCl₃) δ 139.07, 138.95, 138.93, 138.61, 138.52,138.21, 128.94, 128.69, 128.46, 128.35, 128.32, 128.29, 128.20, 128.18,128.03, 127.86, 127.79, 127.70, 127.58, 127.54, 127.48, 127.35, 126.65,103.92, 102.94, 101.44, 83.07, 81.83, 79.76, 78.91, 77.66, 75.86, 75.39,75.18, 74.90, 73.75, 73.07, 71.71, 70.58, 70.05, 69.15, 69.05, 68.39, 66.44,50.77。HRMS (ESI): [M+NH₄]⁺calcd for C₅₈H₆₇N₄O₁₂, 1011.4750; found, 1011.4748。

（3）合成下述结构式所示化合物C：

，将化合物B溶于四氢呋喃中，加入4当量硼烷-三甲胺络合物，冰浴下加入6当量三氯化铝和2当量水，室温下搅拌3小时。反应结束后加入乙酸乙酯稀释，用1M 盐酸溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，用硅胶柱层析纯化（洗脱液：甲苯与丙酮），以79%的收率得到化合物C。

化合物C的表征数据如下：¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ 7.44 – 7.40 (m, 2H),7.39 – 7.22 (m, 28H), 5.01 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 4.94 (d, J = 11.1 Hz, 1H),4.83 – 4.75 (m, 4H), 4.74 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 4.69 (d, J = 11.8 Hz, 1H),4.58 (d, J = 12.1 Hz, 1H), 4.50 – 4.45 (m, 3H), 4.44 – 4.39 (m, 2H), 4.07 –4.03 (m, 2H), 4.00 (t, J = 9.4 Hz, 1H), 3.85 – 3.78 (m, 2H), 3.76 – 3.71 (m,3H), 3.71 – 3.67 (m, 2H), 3.66 – 3.59 (m, 4H), 3.51 (dd, J = 9.7, 5.3 Hz,1H), 3.45 (dd, J = 9.2, 7.8 Hz, 1H), 3.43 – 3.38 (m, 2H), 3.37 – 3.33 (m,1H), 3.33 – 3.26 (m, 2H)。¹³C NMR (150 MHz, CDCl₃) δ 139.19, 138.87, 138.71,138.37, 138.28, 138.02, 128.54, 128.44, 128.35, 128.34, 128.18, 128.12,128.01, 127.93, 127.88, 127.84, 127.73, 127.71, 127.68, 127.61, 127.58,127.56, 127.31, 103.88, 102.60, 82.89, 81.76, 81.19, 79.46, 76.59, 75.41,75.32, 75.16, 74.83, 73.58, 73.21, 72.87, 72.09, 70.56, 70.03, 69.11, 68.54,68.35, 66.23, 50.76; HRMS (ESI): [M+Na]⁺calcd for C₅₈H₆₅N₃O₁₂Na, 1018.4460;found, 1018.4463。

（4）合成化合物D；

参照下述合成路径进行合成：

，将1.5当量化合物A供体和1当量化合物C受体溶于甲苯中，加入分子筛搅拌30分钟，冷却至0℃下加入3当量N-碘代丁二酰亚胺和0.5当量叔丁基二甲硅基三氟甲磺酸酯，低温下搅拌5小时后加入少量吡啶和甲醇淬灭，再加入10V三乙胺，室温搅拌3小时。反应结束后过滤，浓缩，用硅胶柱层析纯化（洗脱液：丙酮与石油醚），以83%的收率得到化合物D。

化合物D的表征数据如下：¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ 8.02 – 7.99 (m, 2H),7.43 – 7.39 (m, 1H), 7.31 – 7.22 (m, 18H), 7.22 – 7.13 (m, 12H), 7.04 – 6.99(m, 2H), 5.43 (dd, J = 10.3, 3.5 Hz, 1H), 5.17 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 4.90 (d,J = 11.0 Hz, 1H), 4.86 (d, J = 12.3 Hz, 1H), 4.82 – 4.75 (m, 2H), 4.72 – 4.66(m, 3H), 4.59 (d, J = 12.2 Hz, 1H), 4.48 (d, J = 12.1 Hz, 1H), 4.42 (d, J =7.7 Hz, 1H), 4.40 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 4.38 (dd, J = 3.4, 1.2 Hz, 1H), 4.33(d, J = 12.1 Hz, 1H), 4.21 – 4.20 (m, 1H), 4.14 (dd, J = 10.3, 3.4 Hz, 1H),4.06 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 4.04 – 3.97 (m, 3H), 3.92 (t, J = 9.2 Hz, 1H), 3.78– 3.69 (m, 5H), 3.68 – 3.64 (m, 3H), 3.60 – 3.56 (m, 4H), 3.56 – 3.52 (m,2H), 3.41 (dd, J = 9.0, 7.7 Hz, 1H), 3.37 – 3.32 (m, 1H), 3.26 – 3.22 (m,3H), 3.22 – 3.17 (m, 2H), 1.09 (s, 9H), 1.00 (s, 9H);¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃)δ 167.00, 139.12, 138.80, 138.52, 138.40, 138.14, 138.09, 137.57, 133.21,130.19, 129.94, 129.73, 128.62, 128.52, 128.50, 128.47, 128.36, 128.31,128.27, 128.21, 128.17, 128.14, 128.09, 128.06, 128.03, 127.94, 127.87,127.83, 127.78, 127.72, 127.68, 127.62, 127.59, 127.43, 127.25, 127.12,103.84, 102.98, 98.31, 81.92, 81.86, 80.88, 79.06, 77.36, 76.99, 75.07,74.96, 74.79, 74.72, 74.35, 74.04, 73.42, 73.24, 73.20, 73.06, 72.97, 72.53,71.91, 70.59, 70.05, 69.17, 69.11, 68.65, 68.51, 68.45, 67.41, 66.90, 66.76,50.78, 27.62, 27.47, 23.41, 20.90; HRMS (ESI): [M+Na]⁺calcd for C₇₉H₉₅N₃O₁₈SiNa,1424.6272; found, 1424.6267。

（5）合成化合物E：

参照下述合成路径进行合成：

，将1.5当量三氯亚胺酯供体和1当量硫代糖苷受体溶于二氯甲烷/甲苯（1:1，v/v）中，加入分子筛搅拌30分钟，冷却至0℃下加入0.3当量三氟甲磺酸。低温下搅拌3小时。反应结束后加入三乙胺淬灭，过滤，浓缩，用硅胶柱层析纯化（洗脱液：丙酮与石油醚），以76%的收率得到化合物E。

化合物E的表征数据如下：¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ 7.57 – 7.53 (m, 2H),7.44 – 7.34 (m, 3H), 7.16 – 7.12 (m, 1H), 7.09 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 5.52 (s,1H), 5.48 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 5.36 (dd, J = 3.6, 1.2 Hz, 1H), 5.20 (dd, J =10.4, 7.9 Hz, 1H), 5.07 (d, J = 10.1 Hz, 1H), 4.96 (dd, J = 10.4, 3.5 Hz,1H), 4.79 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.75 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 4.70 (d, J = 12.0Hz, 1H), 4.45 (dd, J = 10.8, 3.3 Hz, 1H), 4.30 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 4.19 –4.08 (m, 3H), 3.93 (dd, J = 12.2, 1.6 Hz, 1H), 3.89 – 3.83 (m, 1H), 3.74 –3.64 (m, 1H), 3.32 (s, 1H), 2.56 (s, 6H), 2.15 (s, 3H), 2.07 (s, 3H), 2.05(s, 3H), 1.97 (s, 3H);¹³C NMR (150 MHz, CDCl₃) δ 169.88, 169.81, 169.60,168.85, 153.29, 144.08, 137.50, 129.97, 128.57, 128.53, 127.77, 127.68,125.85, 100.99, 100.26, 94.70, 85.59, 75.90, 75.61, 74.09, 70.44, 70.37,69.07, 68.87, 68.43, 66.56, 61.11, 52.82, 22.13, 20.30, 20.26, 20.24, 20.08.HRMS (ESI): [M+Na]⁺calcd for C₃₈H₄₄Cl₃NO₁₅SNa, 914.1389; found, 914.1385。

（6）合成化合物F：

参照下述合成路径进行合成：

，将1.5当量化合物E供体和1当量化合物D受体溶于二氯甲烷/甲苯（1:1，v/v）中，加入分子筛搅拌30分钟，冷却至-50℃，加入3当量N-碘代丁二酰亚胺和0.3当量三氟甲磺酸，在-50℃下搅拌3小时。反应结束后加入三乙胺淬灭，过滤，浓缩，用硅胶柱层析纯化（洗脱液：丙酮与石油醚），以76%的收率得到化合物F。

化合物F的表征数据如下：¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 8.25 – 8.19 (m, 2H),7.59 – 7.54 (m, 1H), 7.51 – 7.46 (m, 5H), 7.40 – 7.23 (m, 32H), 7.22 – 7.17(m, 6H), 7.06 – 7.01 (m, 2H), 5.76 (dd, J = 10.7, 3.7 Hz, 1H), 5.48 (s, 1H),5.33 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 5.29 – 5.22 (m, 2H), 5.13 (dd, J = 10.4, 7.9 Hz,1H), 5.00 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 4.96 (d, J = 11.1 Hz, 1H), 4.88 (d, J = 12.1Hz, 1H), 4.86 – 4.79 (m, 3H), 4.78 – 4.70 (m, 5H), 4.65 – 4.57 (m, 4H), 4.49(d, J = 12.1 Hz, 1H), 4.44 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.41 (d, J = 7.6 Hz, 1H),4.38 – 4.28 (m, 5H), 4.26 (s, 1H), 4.19 – 4.11 (m, 4H), 4.11 – 4.07 (m, 2H),4.05 – 4.00 (m, 2H), 3.99 – 3.91 (m, 3H), 3.91 – 3.85 (m, 4H), 3.85 – 3.80(m, 2H), 3.80 – 3.74 (m, 2H), 3.74 – 3.67 (m, 5H), 3.67 – 3.64 (m, 1H), 3.64– 3.61 (m, 2H), 3.54 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 3.48 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 3.46 –3.40 (m, 2H), 3.37 – 3.31 (m, 2H), 3.31 – 3.25 (m, 4H), 3.16 (dd, J = 8.7,5.5 Hz, 1H), 3.06 (dd, J = 9.1, 5.4 Hz, 1H), 2.84 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 2.15(s, 3H), 2.06 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 1.95 (s, 3H), 1.14 (s, 9H), 0.97 (s,9H);¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃) δ 170.38, 170.35, 170.02, 169.42, 165.92, 153.40,139.25, 138.71, 138.65, 138.26, 138.08, 138.02, 137.54, 133.53, 130.61,129.80, 128.93, 128.84, 128.42, 128.33, 128.29, 128.26, 128.21, 128.15,128.07, 128.03, 127.83, 127.80, 127.68, 127.60, 127.53, 127.51, 127.46,127.20, 126.50, 103.75, 102.69, 101.75, 100.80, 99.55, 98.31, 95.45, 82.00,80.89, 80.66, 79.45, 77.36, 76.02, 75.85, 75.02, 74.84, 74.56, 74.32, 73.63,73.12, 72.97, 72.84, 72.31, 70.88, 70.68, 70.54, 69.99, 69.86, 69.02, 68.64,67.76, 67.00, 65.86, 61.38, 54.36, 50.72, 27.54, 23.33, 20.89, 20.80, 20.76,20.56; HRMS (ESI): [M+Na]⁺calcd for C₁₀₉H₁₂₉Cl₃N₄O₃₃SiNa, 2177.7266; found,2177.7250。

（7）合成化合物G：

参照下述合成路径进行合成：

，将化合物F溶于四氢呋喃/氢氟酸吡啶（2:1，v/v）中，室温下搅拌过夜后加入乙醚稀释，分别用硫酸铜溶液、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩。将残留物溶于四氢呋喃/1M氢氧化钠溶液（3:1，v/v）中,室温搅拌过夜后，用氢型树脂调节至中性，过滤，萃取，浓缩。将残留物溶于甲醇/三乙胺/乙酸酐（12:2:1，v/v/v）中，室温搅拌3小时后过滤，浓缩。将残留物溶于在正丁醇/水（1∶1，v/v）中，加入钯碳，氢化脱苄基。反应结束后过滤，浓缩，用排阻色谱法纯化（BioGel P-2，45−90μm，洗脱液：0.1M碳酸氢铵溶液），合并含有产物的洗脱液冻干，得到化合物G（79%）。

化合物G的表征数据如下：¹H NMR (600 MHz, D₂O) δ 4.90 (d, J = 4.0 Hz,1H), 4.68 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.53 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 4.50 (d, J = 7.8 Hz,1H), 4.44 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.37 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 4.24 – 4.23 (m, 1H),4.17 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 4.10 – 4.06 (m, 2H), 4.05 – 4.01 (m, 2H), 4.01 –3.94 (m, 2H), 3.93 – 3.87 (m, 4H), 3.87 – 3.80 (m, 4H), 3.80 – 3.72 (m, 11H),3.71 – 3.66 (m, 4H), 3.66 – 3.62 (m, 3H), 3.62 – 3.55 (m, 4H), 3.51 (dd, J =9.9, 7.7 Hz, 1H), 3.35 – 3.30 (m, 1H), 3.21 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 2.01 (s,3H);¹³C NMR (150 MHz, D₂O) δ 174.65, 104.34, 102.82, 102.43, 101.55, 99.90,79.08, 78.18, 76.68, 74.99, 74.51, 74.34, 74.12, 73.99, 72.40, 71.95, 70.37,70.09, 69.77, 69.11, 68.45, 68.07, 67.49, 67.10, 65.91, 60.51, 60.46, 59.85,59.47, 51.00, 38.59, 21.77。

（8）合成式I所示化合物：

将1当量化合物G、1.5当量二磷酸鸟苷-L-岩藻糖（GDP-Fuc）和2当量氯化镁溶于0.1M Tris-HCl缓冲液中，加入碱性磷酸酶（CIAP，1 U/µL）和岩藻糖基转移酶（α1,2FucT ，1mg/mL），将混合物在37℃下孵育16小时后通过质谱监测反应进度。反应完全后离心，用排阻色谱法纯化（BioGel P-2，45−90μm，洗脱液：0.1M碳酸氢铵溶液），合并含有产物的洗脱液冻干，得到化合物I(87%）。

综上，总体的合成路线图参照如下所示：

其中Step 1对应上述步骤（4），Step2对应上述步骤（6），Step3对应上述步骤（7），Step4对应上述步骤（8）。

式I所示化合物的表征谱图参见图7和图8，表征数据：¹H NMR (600 MHz, D₂O) δ5.21 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 4.87 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.60 (d, J = 7.7 Hz, 1H),4.54 – 4.51 (m, 2H), 4.50 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.37 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 4.24– 4.19 (m, 2H), 4.09 – 4.05 (m, 2H), 4.01 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 4.00 – 3.95(m, 3H), 3.95 – 3.91 (m, 2H), 3.90 – 3.84 (m, 4H), 3.84 – 3.81 (m, 3H), 3.81– 3.80 (m, 1H), 3.79 – 3.71 (m, 12H), 3.70 – 3.66 (m, 4H), 3.66 – 3.60 (m,6H), 3.60 – 3.55 (m, 2H), 3.32 (t, J = 8.5 Hz, 1H), 3.16 (t, J = 5.1 Hz, 2H),2.03 (s, 3H), 1.20 (d, J = 6.6 Hz, 3H);¹³C NMR (150 MHz, D₂O) δ 174.28,103.96, 103.30, 102.02, 100.41, 99.26, 78.65, 78.22, 77.11, 76.32, 76.08,75.48, 75.04, 74.79, 74.59, 74.44, 73.54, 72.87, 72.06, 71.82, 70.81, 70.10,69.55, 69.48, 69.16, 69.08, 68.90, 68.45, 67.99, 67.80, 66.91, 66.76, 60.92,60.32, 59.94, 51.61, 39.11, 23.21, 22.20, 15.28。

本实施例提供一种蛋白偶联物（GloboH+CRM₁₉₇）的制备方法，包括：参照下述合成路径进行合成：

，将式I 3mg(一当量)， 三当量 PNP活化双酯，在十倍量三乙胺中室温搅拌2小时，TLC显示反应结束，浓缩反应液，C18反向色谱柱层析，得到Globo H-linker (式II)也就是linker化合物，收率~95%。

将带Globo H-linker (式II)（3 mg）和CRM197（2 mg）溶于PBS 缓冲液中（320 μL，100 mM，pH 7.4），室温孵育16小时，反应液用0.5 mL离心式过滤膜进行纯化（Amicon®Ultra-0.5 10 Kd），洗脱剂：超纯水 300 μL × 3，离心条件：12000 r × 5 min。

根据MALDI-TOF分析（图9），CRM197在m/z 58710.416出峰，Globo H-CRM197最高峰值位m/z 63669.512，通过计算可知，每个载体蛋白CRM197平均负载4.1个寡糖单元。

实施例2

本实施例提供一种蛋白偶联物（GloboH-BSA）的制备方法，将带Globo H-linker(式II)（3 mg）和BSA（2 mg）溶于PBS 缓冲液中（320 μL，100 mM，pH 7.4），室温孵育16小时，反应液用0.5 mL离心式过滤膜进行纯化（Amicon® Ultra-0.5 10 Kd），洗脱剂：超纯水300 μL × 3，离心条件：12000 r × 5 min，形成GloboH-BSA糖蛋白。根据MALDI-TOF分析（图10），BSA在m/z 66889.351出峰，Globo H-BSA最高峰值位m/z 81603.957，通过计算可知，每个BSA 上Globo H 六糖的平均个数: n=(81603.957-66889.351)/1212.47=12.14 ≈12。

实施例3

本实施例提供了不同佐剂组合的制备方法，具体步骤如下：

1.空白脂质体的制备：

将0.2 g DOPC溶解于0.5mL氯仿中溶清；（2）将0.05 g胆固醇溶解于0.5 mL氯仿中溶清。然后将上述两种溶液合并，采用可调斡旋混匀仪斡旋均匀；通过旋转蒸发器于40℃水浴温度，60 rpm转速，0.04 MPa真空压力下旋蒸成一薄膜；将10mM PBS的pH调至6.8，调节好后于40℃条件下预热，取50 mL PBS加入到旋蒸后的薄膜中，斡旋振荡均匀；再将混合均匀的溶液用高剪切分散机在12000rpm条件下剪切5-10分钟，通过粒度分析仪器控制剪切时间；再将以上样品在高压均质机分散，压力15000psi-20000psi条件下均质即得纳米脂质体溶液，通过粒度仪器检测合格后，先后通过0.45μm和0.22μm针孔滤膜过滤后即得脂质体注射液。

2.AL佐剂的制备：

配置1mol/L氢氧化钠溶液100mL，0.21%硫酸铝钾溶液4100mL，0.005mol/L PBS溶液3800mL，将三者混入容器中，沉降过夜，除去上清，重新补入缓冲液重悬，再次沉降，反复操作5次，最终用缓冲液定容到8L，分装备用；

3.S34脂质体或3D-MPL脂质体的制备

将0.2g DOPC溶解于0.5mL氯仿中溶清，（2）将0.05g胆固醇溶解于0.5mL氯仿中溶清，（3）将2mg S34或10mg的3D-MPL溶解于1mL氯仿中溶清。然后将上述三种溶液合并，斡旋均匀；通过旋转蒸发器于40℃水浴温度，60rpm转速，0.04MPa真空压力下旋蒸成薄膜；将PBS的pH调至6.8，调节好后于40℃条件下预热，取50mL PBS加入到旋蒸后的薄膜中，斡旋振荡均匀；再将混合均匀的溶液用高剪切分散机在12000rpm条件下剪切5-10分钟，通过粒度分析仪器控制剪切时间；再将以上样品在高压均质机分散，压力15000psi-20000psi条件下均质即得纳米脂质体溶液，通过粒度仪器检测合格后，通过0.45微米，0.22微米针孔滤膜过滤后即得脂质体注射液；

4.QS21佐剂的制备：

将1g DOPC溶解于5mL去离子水中溶清，即得QS21佐剂溶液。

实施例4

不同佐剂组合的Globo H疫苗对小鼠体重的影响。

实验方法：

采用了6~8周龄SPF雌性Balb/C小鼠，按照表1对小鼠进行分组，共分为8组，每组10只。注射前将佐剂与疫苗涡旋30s混匀，按照1、14、28天的程序，采用背部皮下的给药方式进行免疫，过程中记录体重。具体注射的疫苗（或免疫原性组合物）剂量如下：

组1注射5μg/抗原（Globo H-CRM197）+35μL脂质体溶液； 组2注射5μg抗原（GloboH-CRM197）+100μg Al佐剂（氢氧化铝）；组3注射5μg抗原（Globo H-CRM197）+10μg 3D-MPL佐剂； 组4注射5μg抗原（Globo H-CRM197）+10μg QS-21佐剂；组5注射5μg抗原（Globo H-CRM197）+2μg S34佐剂；组6注射5μg抗原（Globo H-CRM197）+2μg S34佐剂+10μg QS-21佐剂；组7注射5μg抗原（Globo H-CRM197）+10μg 3D-MPL佐剂+10μg QS-21佐剂；组8注射5μg抗原（Globo H-CRM197）+2μg S34佐剂+10μg QS-21佐剂。

表1. 不同佐剂组合的GloboH疫苗分组

实验结果：

从图1结果中可以看出，8组小鼠的体重无明显区别，三次免疫后小鼠体重随周龄增大略有升高，且不同的Globo H疫苗对小鼠体重无明显影响，这一结果表明了Globo H抗原搭配不同佐剂使用的安全性均比较好。

实施例5

不同佐剂组合的GloboH疫苗对小鼠IgG抗体滴度的影响。

实验方法：

采用了6~8周龄SPF雌性Balb/C小鼠，每组10只，按照实施例3中程序进行分组和免疫。分别在第14、28、42天进行小鼠眼眶取血，用ELISA法检测不同组小鼠血清中IgG抗体的含量。ELISA检测方法如下：首先根据实施例2中蛋白偶联物（GloboH-BSA）的制备方法制备GloboH-BSA糖蛋白，用来包被酶标板检测血清中抗GloboH抗体，用以排除产生的抗体是针对CRM97而非GloboH的情况。将GloboH-BSA抗原用PBS稀释至1ug/mL，按照100μL/well进行包被，4℃孵育过夜。用PBST洗涤三次，250μL/well，然后加入用PBS配置的2%的BSA溶液，室温孵育2小时。将待测血清用稀释液（1% BSA/PBST）按比例稀释。倒掉封闭液，加入稀释好的待测血清，室温孵育两小时。用PBST洗涤三次，加入稀释好的HRP标记的二抗（ abcam，货号31430），100μL/well，室温孵育1小时。用PBST洗涤五次，加入TMB显色液100μL/well，室温避光孵育10-15分钟。加入1M HCl，100μL/well。15分钟内读取OD₄₅₀值。

实验数据均取均数±标准差，用SPSS Statistics软件进行统计学分析，两组均数比较用t检验，多组均数比较用单因素方差分析，ns表示不具有显著性差异，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

实验结果：

结果如图2，在经过3针免疫后，除组1外，各组的抗体滴度均高于2针免疫，说明3针免疫后，抗体产生效果最好。此外，组6 GloboH+QS21+S34组IgG抗体滴度最高，说明QS21+S34的佐剂组合产生总IgG抗体的效果较好。

实施例6

不同佐剂组合的GloboH疫苗对小鼠IgM抗体滴度的影响。

实验方法：

采用了6~8周龄SPF雌性Balb/C小鼠，每组10只，按照实施例4中程序进行分组和免疫。在第3次免疫后的第13天分别对不同组小鼠进行眼眶取血，用ELISA法检测不同组小鼠血清中IgM抗体的含量。按照实施例5的实验方法进行ELISA检测和统计学分析，区别仅在于检测的抗体亚型不同（抗体来自生工生物， D110103-0001），其余检测步骤完全一致。

结果如图3，在几种复合佐剂中QS21+S34的佐剂组合产生IgM抗体的效果最好。除QS21+S34的复合佐剂外，QS21在单一佐剂中诱导产生IgM的效果最佳。

实施例7

不同佐剂组合的GloboH疫苗对小鼠IgG亚型的影响。

实验方法：

采用了6~8周龄SPF雌性Balb/C小鼠，每组10只，按照实施例4中程序进行分组和免疫。在第3次免疫后的第13天分别对不同组小鼠进行眼眶取血，用ELISA法检测不同组小鼠血清中IgG1（抗体来自Invitrogene，PA1-74421），IgG2a（抗体来自Invitrogene，A10685） ，IgG2b（抗体来自Invitrogene，M32407）和IgG3（抗体来自Invitrogene，M32607）抗体的含量。按照实施例5的实验方法进行ELISA检测和统计学分析，区别仅在于检测的抗体亚型不同，其余检测步骤完全一致。

实验结果：

结果如图4，组6 GloboH QS21+S34组产生的IgG1（图4中的a图）要高于组7 GloboHQS21+3D-MPL、组8 GloboH S34+3D-MPL、组4 GloboH QS21和组5 GloboH S34，说明QS21+S34佐剂系统能够在人体内诱导更强的CDC、ADCC和ADCP反应。而组7 GloboH QS21+3D-MPL组产生的IgG2a（图4中的b图）和IgG3（图4中的d图）明显高于组6 GloboH QS21+S34、组8GloboH S34+3D-MPL、组4 GloboH QS21和组3 GloboH 3D-MPL，IgG2a在小鼠体内能够引起较强的CDC和ADCC反应，说明 QS21+3D-MPL能够在小鼠体内引起较强的细胞免疫反应。组6GloboH QS21+S34产生的IgG2b（图4中的c图）略高于组7 QS21+3D-MPL，虽然IgG2b在小鼠体内能够诱导CDC反应，但效果远不如IgG2a强，因此再次说明小鼠体内组7 QS21+3D-MPL能够引起较强的CDC和ADCC反应。

实施例8

本实施例测试不同佐剂组合的GloboH疫苗产生的抗体对MCF7乳腺癌细胞特异性结合的能力。

实验方法：

采用了6~8周龄SPF雌性Balb/C小鼠，每组10只，按照实施例4中程序进行分组和免疫。在第3次免疫后的第7天分别对不同组小鼠进行眼眶取血。按照实施例5进行统计学分析。

MCF-7乳腺癌细胞是一种高表达GloboH抗原的肿瘤细胞，而B16F10黑色素瘤细胞是一种低表达GloboH抗原的肿瘤细胞作为阴性对照，两种细胞均来自American typeculture collection，收集对数期生长MCF-7和B16F10细胞，350~500g离心5分钟，1×PBS洗涤两遍，弃掉上清。350~500g离心5分钟，弃掉上清。用1×PBS洗涤，离心350~500g，5分钟，弃掉上清，重复三次。用2%的BSA重悬细胞，每100uL封闭液中含有1×10⁶个细胞，4℃避，光封闭30~60分钟。350~500g离心5分钟，弃掉上清。用1×PBS洗涤，离心350~500g，5分钟，弃掉上清，加入1×PBS重悬细胞，每100uL封闭液中含有1×106个细胞。根据抗体推荐浓度加入适量一抗（不同佐剂组合组小鼠血清1：20稀释），4℃避光孵育45分钟~1小时。用1×PBS洗涤，离心350~500g，5分钟，弃掉上清，重复一次。用荧光标记的二抗重悬细胞，根据抗体要求选择合适的稀释倍数，4℃避光孵育45分钟~1小时。350~500g离心5分钟，弃掉上清。用1×PBS洗涤，离心350~500g，5分钟，弃掉上清。用PBS重悬细胞，体积约200~500uL，流式细胞仪分析。此方法为检测各组小鼠血清抗体中能够与MCF-7细胞特异性结合的抗体量的多少，以此评价不同GloboH疫苗诱导肿瘤特异性免疫反应的强弱。

实验结果：

将经过3针免疫后第7天的小鼠血清与高表达GloboH的MCF-7乳腺癌细胞共孵育，再经荧光二抗标记后，通过流式细胞仪检测血清中的特异性抗体与MCF-7细胞的结合情况。以B16F10细胞作为阴性对照，结果表明（图5），组7 GloboH QS21+3D-MPL组的小鼠血清抗体与MCF-7细胞结合效果最好，说明QS21+3D-MPL诱导的抗体对MCF-7乳腺癌细胞的特异性杀伤能力最强，即抗肿瘤效果最好。

实施例9

不同佐剂组合的GloboH疫苗诱导小鼠CDC反应的效果。

实验方法：

采用了6~8周龄SPF雌性Balb/C小鼠，每组10只，按照实施例4中程序进行分组和免疫。在第3次免疫后的第13天分别对不同组小鼠进行眼眶取血。按照实施例5进行统计学分析。

MCF-7细胞经胰酶消化后，用DMEM完全培养基重悬至4×10⁵个/mL；移取100 μL细胞悬液至96孔板，过夜培养，使细胞完全贴壁；弃置旧的培养基，将各组小鼠的血清样品用DMEM完全培养基稀释，稀释成5%的血清样品，分别加入到96孔板的对应孔中。对照组加入相同体积的DMEM完全培养基，共同孵育24小时。用DMEM完全培养基轻柔洗涤两次，每次100 μL；加入100 μL 2%的乳兔补体（Cedarlane，CL3441-R）（DMEM完全培养基稀释），37℃孵育6h；使用CCK8试剂盒（碧云天，C0038）显色，在酶标仪上检测结果（450 nm），此方法为检测各组小鼠血清抗体对补体介导的细胞杀伤作用有何区别。

计算：

CDC%=100*（1-（Ae-Amax）/(Amin-Amax)）

其中Ae代表实验组孔在450 nm的吸收值，Amax代表最大杀伤组孔在450 nm的吸收值，Amin代表最小杀伤组孔在450 nm的吸收值。

实验结果：

在第3针免疫后第13天，取小鼠血清，检测血清中特异性抗体的CDC反应对MCF-7细胞的杀伤能力，结果发现组7 Globo H QS21+3D-MPL组的MCF-7细胞存活数量最低（图6），说明其诱导的CDC反应最强，这与GloboH QS21+3D-MPL能够诱导产生大量的IgG2a和IgG3结果一致。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种式I所示的化合物或其立体异构体、溶剂化物、水合物、前药、稳定的同位素衍生物及药学上可接受的盐在制备用于治疗或抑制上皮性肿瘤生长的药物或疫苗中的应用，其特征在于，

。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述上皮性肿瘤选自乳头状瘤、胃肠癌、子宫癌、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、腺癌、乳腺癌、腺瘤和鳞癌中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物或疫苗用于诱导如下至少一种抗体的产生：

IgM抗体和IgG抗体。

4.一种linker化合物在制备用于治疗或抑制上皮性肿瘤生长的药物或疫苗中的应用，其特征在于，所述linker化合物包括双活化酯linker和式I所示的化合物或其立体异构体、溶剂化物、水合物、前药、稳定的同位素衍生物及药学上可接受的盐，所述双活化酯linker与式I所示的化合物的氨基酰胺缩合；

。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述双活化酯linker选自下述结构式所示化合物：

；

所述linker化合物选自下述结构式所示化合物：

。

6.一种蛋白偶联物在制备用于治疗或抑制上皮性肿瘤生长的药物或疫苗中的应用，其特征在于，

所述蛋白偶联物，其包括载体蛋白和权利要求4-5任一项中所述的linker化合物，所述载体蛋白与所述linker化合物通过酰胺缩合。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述载体蛋白是白喉毒素交叉反应性材料197、白喉类毒素、破伤风类毒素或牛血清白蛋白。

8.一种免疫原性组合物，其特征在于，其包括权利要求6-7任一项中所述的蛋白偶联物和佐剂。

9.根据权利要求8所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述佐剂选自Toll样受体激动剂、RIG-I样受体激动剂、NOD样受体激动剂、C-型凝集素受体、STING激动剂、细菌毒素及其衍生物、皂苷类、细胞因子和其他佐剂中的至少一种；所述其他佐剂选自热激蛋白、A151、GTP-GDP、氟化钠、烷基聚丙烯酯多聚体、二甲基双十八烷基季胺溴化物、脂质体、铝佐剂、MF59、AS03、α-GalCer、脂多糖和RC-529佐剂的至少一种。

10.如权利要求8-9任一项所述的免疫原性组合物在制备用于治疗或抑制上皮性肿瘤生长的药物中的应用。