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MX2013006330A - Conjugados de molecula pequeña para suministro intracelular de acidos nucleicos. - Google Patents

Conjugados de molecula pequeña para suministro intracelular de acidos nucleicos.

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Publication number
MX2013006330A
MX2013006330A MX2013006330A MX2013006330A MX2013006330A MX 2013006330 A MX2013006330 A MX 2013006330A MX 2013006330 A MX2013006330 A MX 2013006330A MX 2013006330 A MX2013006330 A MX 2013006330A MX 2013006330 A MX2013006330 A MX 2013006330A
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MX
Mexico
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phenyl
sirna
nucleotide
formula
amino
Prior art date
Application number
MX2013006330A
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English (en)
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MX342609B (es
Inventor
David L Lewis
Eric A Kitas
David B Rozema
Peter Mohr
Kerstin Jahn-Hofmann
Philipp Hadwiger
Torsten Hoffmann
Hans Martin Mueller
Guenther Ott
Ingo Roehl
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of MX2013006330A publication Critical patent/MX2013006330A/es
Publication of MX342609B publication Critical patent/MX342609B/es

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Abstract

Se proporcionan el uso de compuestos para el suministro de ácidos nucleicos, así como conjugados de estos compuestos con ácidos nucleicos, en particular siARNs. También se describe siARN estabilizados que son útiles cuando se unen covalentemente al compuesto y son co-administrados con un polímero de suministro para lograr supresión de ARNm in vivo. En particular, la invención proporciona el uso de un compuesto de la fórmula (I) para el suministro de ácidos nucleicos, en donde: Y es un grupo enlazador seleccionado de - (CH2)3 O C(O) -N- (CH2CH2-O)p-CH2CH2 R1 es -alquilo (C1-6); -(CH2)-naftilo; o -(CH2)m-fenilo, fenilo que es no sustituido o hasta cuatro veces sustituido con un sustituyente seleccionado independientemente de: -NO2, -CN, Halógeno, -O- (CH2)-fenilo, -O-(C1-6)alquilo, o -C(O)-NH2 R2 es hidrógeno; -(CH2)k-N-C(Ph)3, anillos fenilo que son no sustituidos o sustituidos independientemente con -O-(C1-4)alquilo; -(CH2)k - C(O)-NH2 -(CH2)k-fenilo; -alquilo de (C1-6), el cual es no sustituido o sustituido una vez con -S-CH3 R3 es -NH-fenilo, grupo fenilo que es sustituido además con un sustituyente seleccionado independientemente de -(CH2) -OH; o -(CH2) -O-C(O)O- (4-nitro-fenilo) ; k es 1, 2, 3, 4, 5, 6; m es 1, 2, 3 ó 4; n es 0 ó 1; y p es un entero de la 20.

Description

CONJUGADOS DE MOLECULA PEQUEÑA PARA SUMINISTRO INTRACÉLULAR DE ACIDOS NUCLEICOS Campo de la Invención La presente invención se refiere al uso de novedosos conjugados de molécula pequeña para el ' suministro de ácidos nucleicos, tales como siAR . El suministro de ácidos nucleicos a una célula viva está altamente restringido por el complejo sistema de membrana de la célula.
Antecedentes de la Invención Un medio que se ha usado para suministrar ácidos nucleicos in vivo ha sido fijar el ácido nucleico ya" sea a una molécula de dirección pequeña o a una molécula hidrófoba tal como un líquido o esterol . Aunque cierto suministro y actividad han sido observados con ! estos conjugados cuando se administran a roedores, la1 dosis necesaria ha sido prohibitivamente grande, traduciéndose comúnmente en efectos de toxicidad no deseados¦ in ivo y altos costos y régimen de tratamiento impracticable cuando se traduce a humanos. En la presente se proporciona el uso de compuestos de molécula pequeña para el suministro de ácidos nucleicos, tales como siARN. Cuando los compuestos de molécula pequeña se conjugan al ácido nucleico, median el suministro exitoso del ácido nucleico al interior de una célula. Se ha encontrado sorprendentemente que dosis ef. 241163 reducidas significativamente del ácido nucleico son ahora suficientes para un suministro exitoso cuando se usan los compuestos novedosos provistos en la presenté. De esta manera, el uso de los compuestos proporciona una i herramienta poderosa para el suministro de ácidos nucleicos con toxicidad ín vivo limitada considerablemente .
Breve Descripción de la Invención En una modalidad, la presente inverjcion' está dirigida al uso de compuestos de la fórmula , (J), para el suministro de ácidos nucleicos, en donde Y es un grupo enlazador seleccionado de -(;CH2)3- o -C(0) -N- (CH2-CH2-0)p-CH2-CH2-; : R1 es -alquilo (Cl-6) ; - (CH2) -naftilo; o , - (CH2) m-fenilo, fenilo que es no sustituido o" hasta cuatro veces sustituido con un sustituyente seleccionado independientemente de 1 -N02, - C , '' '.' Halógeno, -O- (CH2) -fenilo, -O- (Cl-6) alquilo, o -C(0)-NH2; R2 es hidrógeno; - (CH2) k-N-C (Ph) 3 , anillos fenilo que son no sustituidos o sustituidos independientemente con -O- (Cl-4) alquilo; - (CH2)k -C(0) -NH2; - (CH2)k-fenilo; -alquilo de (Cl-6), el cual es no sustituido o sustituido una vez con -S-CH3; R3 es -NH-fenilo, grupo fenilo que es sustituido además con un sustituyente seleccionado independientemente de - (CH2) -OH; o - (CH2) -0-C(0) -O- (4-nitro-fenilo) ; k es 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 ; m es 1 , 2 , 3 ó 4 ; n es 0 ó 1 ; y p es un entero de 1 a 20.
En otra modalidad, se proporciona el usó de los compuestos de la fórmula (I) con la conformación específica como la mostrada en la fórmula (la) para el suministro de ácidos nucleicos, en donde todos los sustituyentes R1, R2, R3 y", Y así como las variables k, m, n y p tienen el significado indicado arriba .
En otra modalidad más, la presente invención está dirigida al uso de compuestos de la fórmula (I) o (Iá) para el suministro de ácidos nucleicos, en donde Y es -(CH2)3-; y todos los grupos sustituyentes restantes tienen el significado indicado arriba.
En otra modalidad más, la presente invención está dirigida al uso de compuestos de la fórmula (I) o;;(Iai) para el suministro de ácidos nucleicos, en donde Y es. -G(0)-N-(CH2-CH2-0) P-CH2-CH2- ; y todos los grupos sustituyentes tienen el significado indicado arriba.
En otra modalidad más, se proporciona el uso de los compuestos de las fórmulas (I) o (la) en el suministro de ácidos nucleicos, en donde Y es - (CH2)3-; R2 es - (CH2) k- -C (Ph) 3- , anillos fenilo que son no sustituidos o sustituidos independientemente con -O-alquilo de (Cl-4) ; y '. '. ! R3 es -NH-fenilo, grupo fenilo que sé sustituye además con - (CH2) -0-C(0) -0- (4-nitro-fenilo) ; n es 0; y R1 y k tienen los significados indicados arriba.
En otra modalidad más, se proporciona el uso de compuestos de las fórmulas (I) o (la) en el suministro de ácidos nucleicos, en donde Y es -C(0) -N- (CH2-CH2-0)p-CH2-CH2-; R2 es - (CH2) k-N-C (Ph) 3 , anillos fenilo que son no sustituidos o sustituidos independientemente con -0-alquilo de (Cl-4) ; y R3 es -NH-feniló, grupo fenilo que se sustituye además con - (CH2) -O-C(O) -O- (4-nitro-fenilo) ; n es 0 ; y ' R1, k y p tienen los significados indicados arriba. El término "alquilo de (Cl-6)" según se usa ; en la presente, significa un hidrocarburo saturado ílineal o ramificado que contiene de 1 a 6 átomos de carbono., Los grupos alquilo de Cl-6 que se prefieren incluyen metilo, etilo, propilo, iso-propilo, butilo, 2-butilo y similares.
El término "halógeno" según se usa en la¡ presente significa flúor, cloro, bromo o yodo, prefiriéndose flúor y cloro.
Los compuestos para usarse en el suministro de ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, ueden obtenerse generalmente usando métodos conocidos por la persona de capacidad ordinaria en la técnica de química orgánica o medicinal. Asimismo, se entiende que la porción colesterol puede ser reemplazada por otros compuestos natural o químicamente sintetizados de la clase esteroidé (por ejemplo, ácido colánico, ácido litocólico, etc.) u„ otras moléculas pequeñas (por ejemplo, vitaminas) que se conozcan como efectivos en el suministro de ácido nucleico tales como tocoferol (Molecular therapy, 2008, 16, 734).
Para el suministro exitoso de los ácidos nucleicos, los compuestos de la fórmula (I) o (la) se 1 fijan covalentemente a los ácidos nucleicos. De preferencia, el enlace covalente se crea por la reacción de un; grupo funcional adecuado, tal como es decir, un grupo amina primario, en el ácido nucleico con el grupo carbonilo activado en la porción -0-C(0)-0- de R3 como se definió anteriormente en la presente. En consecuencia, se proporciona en la presente un conjugado que comprende los compuestos de la fórmula (I) o (la) y un ácido nucleico.
El término "ácido nucleico" según se usa en la presente se refiere a cualquier forma de ADN, incluyendo ADNc, o AR , o un fragmento del mismo, nucleótido, nucleósido, oligonucleótidos (incluyendo oligonucleótidos antisentido, ALN y siARN) , que causa un efecto biológico cuando se administra in vivo a un animal, incluyendo pero no limitado a aves y mamíferos, incluyendo humanos. Lo$ ácidos nucleicos que se prefiere usar en la presente son siARNs.
El conjugado que comprende los compuestos fijados covalentemente a un ácido nucleico muestra una, capacidad mejorada para ser absorbido por células en comparación con el ácido nucleico solo. Una vez que el conjugado se suministra a la célula y viaja al lisosoma, el ácido nucleico correspondiente es liberado por corte enzimático. Este, corte tiene lugar de preferencia cuando un motivo di-péptido, que consiste preferiblemente de la secuencia a- , o ß- (fenil) alanina y lisina como está presente en los compuestos de la fórmula (I) o (la) se incorpora en el conjugado (véase esquema de reacción 1) . De manera muy preferible él conjugado contiene el motivo de di-péptido y un separador tal omo el separador de carbamato de p-aminobencilo (Bioconjugate Chem. 2002,13,855) que se fragmenta espontáneamente una vez ;que el enlace de amida C-terminal del motivo di-péptido es Cortado como se ejemplifica para moléculas de siARN en el ésquema de reacción 2. En consecuencia, los conjugados que comprenden compuestos de la fórmula (I) o (la) también se conocen' como conjugados de colesterol que contienen dipéptidos. El; corte enzimático del ácido nucleico a partir de: los conjugados de colesterol que contienen dipéptidos de esta invención se cataliza por proteasas innatas de la célula. Un ejemplo de una proteasa innata c^paz de cortar el motivo di-péptido presente en, los compuestos de la fórmula (I) o (la) es catept$,ina B. La catepsina B es una cisteína proteasa ubicua conocida ubicada en los lisosomas de células de mamífero (Bioconj ugate Chem. 2002,13,855; J. " Med. ¦» n Chem. 2005,48,1344 ; Nat . Biotechnology 2003,21 /778) . Así, el motivo di-péptido descrito arriba ée conoce también como motivo di-péptido cortable por cateps ina . ' La presente invención proporciona pbr lo tanto también un método para el suministro de un ácido nucleico al interior de células, en donde el ácido nucleico puede ser cortado posteriormente del conjugado para revelar una actividad terapéutica;.
En una modalidad más de la presente invención, se proporciona el uso de un conjµgado de los compuestos de la fórmula (I) o (la) '/unido covalentemente a un siARN para suministro int race luí ar .
Los conjugados de la fórmula (I) 1 o (la) unidos covalentemente a un ácido nucleico se designan aquí como fórmula (II) o (lia) , respectivamente. 1 Esquema de reacción 1 Motivo de di-péptido con porción de R1-(fenil)alanina porción dé R2-lisina corte enzimáticb con sustancia biológicamente activa unida en R3 Por lo tanto, en una modalidad más, lá presente invención proporciona un compuesto de la fórmula en donde Ra es - (CH2)ki-NH2; : R1 y k tienen los significados indicados! para la fórmula (I) arriba.
En una modalidad más específica, la ; ' présente invención proporciona compuestos de la fórmula ácido nucleico (na) en donde Ra es - (CH2)k-NH2; R1 y k tienen los significados indicados para la fórmula (I) arriba.
En una modalidad preferida, el ácido nucleico en la fórmula (II) o (lia) es un siARN.
Los compuestos de la fórmula (II) o (lia) pueden tener propiedades valiosas en terapia. Por lo tanto, én una modalidad más, se proporcionan los compuestos de ía fórmula (II) o (Ha) para usarse como medicamentos. | Otra modalidad de la invención es una composición farmacéutica que comprende los conjugados de los compuestos de la fórmula (I) o (la) unidos covalentemente á, un; .ácido nucleico .
En otra modalidad más de la invención se proporciona una composición farmacéutica que comprendé los compuestos de la fórmula (Ha) junto con excipientes farmacéuticamente aceptables.
Las siguientes modalidades son ejemplos,! de conjugados de los compuestos de la fórmula (I) o (la)' unidos covalentemente a siARN. Se entiende que estas modalidades también pueden aplicarse a otros tipos de ácidos nucleicos como los definidos arriba. 1 La fijación covalente del siARN a los compuestos de la fórmula (I) o (la) se logra mediante la reacción! de un grupo nucleofílico adecuado, es decir, un grupo amina primario, en el siARN con el grupo -C(0)- activado en' R3 de los compuestos de la fórmula (I) o (la) . La activación de ese grupo -C(0)- se obtiene por un p-nitrofenoxi carbonates como se muestra en el siguiente esquema de reacción 2.
Esquema de reacción 2 Porción de colesterol \ El carbonato activado con p-nitrofenilo puede por ejemplo ser hecho reaccionar con el siARN equipado con un nucleófilo adecuado tal como la amina primaria dé un enlazador hexilamino para generar un enlace de carbámato ' ara producir el conjugado del siARN covalente. Una vez que el siARN es absorbido intracelularmente y transferido al lisosoma, los compuestos de la fórmula (I) o (Ilá) en donde la sustancia biológica activa es un siARN son cortados por la il actividad proteasa que libera el siARN mediante uha reacción de 1 , 6-eliminación como también se muestra en el esquema de reacción 3. La porción colesterol del conjugado de los compuestos de la fórmula (II) o (Ha) modifica las propiedades PK de siARN de tal manera que la administración sistémica haga posible el silenciamiento génico in vivo.
En una modalidad los compuestos de la fórmula (II) o (lía) en donde el ácido nucleico es siARN se co-ádministran con un polímero de suministro. Los polímeros de suministro proporcionan un medio para romper membranas celulares y mediar liberación endosómica. En otra modalidad, él polímero de suministro y el conjugado de siARN de la invención: no se fijan covalentemente y se sintetiza por separado y pueden ser suministrados en recipientes separados o en: un solo recipiente. Polímeros de suministro para oligonucleótidos tales como siARN se conocen bien en la técnica.
Por ejemplo, Rozema et al., en la publicación de patente de E.U.A. 20040162260 demostró un medio para regular de manera reversible la actividad de ruptura de membrana de una poliamina activa en membrana. La regulación reversible proporcionó un medio para limitar la actividád ja los endosomas de células objetivo, limitando así la toxicidad. Su método se basaba en la reacción de aminas en la poliamina con i anhídrido 2 -propiónico-3 -metilmaleico . Esta modificación i convirtió al policatión en un polianión mediante conversión de aminas primarias en grupos que contienen c rboxilo e inhibió reversiblemente la actividad de membrana de la poliamida.
Esquema de reacción 3 proteólisis 1 ,6-eliminación ... vSÍARN Para hacer posible el co-suminist o del , ,ácido nucleico con el vehículo de suministro, el ácido nucleico se enlazó covalentemente al polímero de suministró. En la solicitud de patente de E.U.A. provisional 61/307490 se describe una nueva generación de polímeros de suministro. Ahí, se proporciona una poliamina activa membraná" que - I comprende un terpolímero anfifático formado mediante polimerización aleatoria de monómeros que contienen amina, monómeros hidrófobos inferiores y monómeros hidrófobos superiores. Esta nueva generación de polímeros de suministro eliminó la necesidad de que polinucleótido y polímero se asocien ya sea por enlace covalente o por interacción carga-carga .
Ejemplos no limitativos de polímeros de suministro usados para co-administración con los conjugados dé siARN de la presente invención son poliaminas activas en membrana y éter polivinílico (PBAVE) , poli -conjugados dinámicos (DPC; Rozema et al. 2007) y DPCs mejorados como los descritos en la solicitud de patente de E.U.A. provisional 61/307490.
En una modalidad más, se proporciona un nuevo patrón de modificación de siARN químico para suministro in vivo funcional. Este nuevo patrón de modificación de" siARN químico es especialmente útil con vehículos de suministro que presentan una retención endosómica/lisosómica relativamente fuerte .
Se encontró que la estabilización de siARN contra degradación por nucleasas ubicadas en , forma endosómica/lisosómica tales como DNAsa II mejora fuertemente la supresión de objetivos. Esta estabilización puede afectar directamente la cantidad de siARN liberada en el citoplasma cuando la maquinaria de ARNi celular sea ubicada. Sólo la porción de siAR disponible en el citoplasma es capaz de desencadenar el efecto de AR i . ,' I Además de características farmaeocinéticas deficientes, las moléculas de siARN son susceptibles a nucleasas en el ambiente biológico cuando se administran tal cuales en la circulación sin un vehículo de suministro protector. En consecuencia, muchas moléculas de; si¾ÍRN se degradan rápidamente ya sea extracelularmente en el te ido y torrente sanguíneo o después de absorción intracelular (por ejemplo, en el endosoma) . , ¦ ' Una nucleasa bien conocida que se ubica en el compartimiento endosómico/lisosómico es DNasa II. Esta enzima es activa a pH debajo de 6-6.5 con actividad máxima en el intervalo de pH de 4.5-5, reflejando condiciones presentes en el ambiente acidificado del compartimiento endosómico/lisosómico. Las siguientes vías de degradación de ARN inducidas por DNasa II fueron identificadas in vitro y se describen en esta invención: A. Hebras de ARN que contienen al merios un nucleótido 2 '-0H se degradan rápidamente mediante un intermedio de fósforo pentavalente cíclico, llevando a fosfatos 2' -3' cíclicos en el producto de corté 5' . La formación del intermedio pentavalente puede inhibirse por nucleótidos que carezcan de un grupo 2 '-0H tales, cotilo 2'-desoxi, 2'-0-metilo (2'-0Me) o 2 ' -desoxi-2 ' -fluoro '(¡2 ' -F) .
B. Además, ARN se degrada en unas vía 5'-exonucleolítica independiente de la modificación 2' en los nucleótidos 5 ' -terminales . Esta vía de degradación puede ser inhibida por porciones no nucleótidas 5 ' -terminales, tales como, por ejemplo, colesterol, enlazador de aminoaíquiljo o un fosforotioato en el primer enlace entré nucleótidos.
C. Un fosfato 5' también protege y hace más,| en la i ¦ i! cinética de corte exonucleolítico, pero no puede bloquear completamente esta vía. Esto es muy probablemente debido al corte del 5' -fosfato por fosfatasas o a una actividad fosfatasa inherente de la preparación de enzima DNasa II usada en el ensayo de estabilidad in vitro.
D. La mejor protección se logró ? con ¦ 1 oligonucleótidos que carecían de cualquier nucleótido' 2' -OH dentro de la hebra, iniciando con un nucleótido 2'-0 e en el extremo 5' conectado por un enlace de fosforotioato OPTO) al segundo nucleótido. Otros nucleótidos terminales que carecen de un grupo 2 '-0H también protegen contra la degradación 5'-exo, pero a un menor grado en comparación con la modificación con 2' -OMc .
Por consiguiente, los inventores de la presente invención encontraron que moléculas de siARN pueden ser estabilizadas significativamente cuando se use el siguiente diseño, en donde se proporciona un oligonucleótido óon una hebra antisentido con el patrón de modificación: 5' - (w) - (Zl) - (Z2 ) - (Z3 ) na-3 ' y una hebra en sentido con el patrón de modificación 5 ' - ( Z3 ) ns-3 ' , en donde w es independientemente un 5 '-fosfato o 5'-fosfotioato o H, Zl es independientemente un nucleósido 2'-modificado Z2 es independientemente un 2'-desoxi nucleósido o nucleósido 2 ' -fluoro-modificado, Z3 es independientemente un nucleósido 2'-modificado, na es 8-23 y ns es 8-25.
En una modalidad preferida se proporciona un oligonucleótido con una hebra antisentido con el patrón de modificación: 5 ' - (w) - (Zl) - (Z2) - (Z3) na-3' y una hembra en sentido con el patrón de modificación 5 ' - (Z3 ) ns-3 ' , en 'donde Zl es un nucleósido 2 '- luoro-modificado o un 2désoxi-nucleósido y todos los sustituyentes restantes así como las variables na y ns tienen el significado indicado arriba.
En una modalidad preferida se proporciona un oligonucleótido con una hebra en antisentido con el, patrón de modificación: 5 ' - (ws) - (Zl) - (Z2) - (Z3) na-3 ' y una ' [ hebra en sentido con el patrón de modificación 5 ' - (Z3) ns-3 ' / ' en' donde Z3 es un nucleósido modificado con 2 ' -O-metilo, un nucleósido modificado con 2'-fluoro o un 2desoxi-nucleósido y 'todos los sustituyentes restantes así como las variables na y: na tienen el significado indicado arriba. , En una modalidad preferida se proporciona un oligonucleótido con una hebra en antisentido con el patrón de modificación: 5 ' - ( s) - (Zl) -(Z2) - (Z3) na-3 ' y una hebra en sentido con el patrón de modificación 5 ' - (Z3) n3-3 ' > en' donde Zl es un nucleósido 2 ' - fluoro-modificado o un 2'-desoxi-nucleósido y Z3 es un nucleósido modificado con 2'-0-metilo, un nucleósido modificado con 2'-fluoro o un 2desoxi-nucleósido y todos los sustituyentes restantes así cgmo las variables na y ns tienen el significado indicado arriba. * Los nucleósidos en la secuencia de ácido nucleico del oligonucleótido con el patrón de modificación novedoso pueden ser ya sea enlazados por 5' -5' fosfodiéster s 0,5' -3' fosforotioatos . ' Según se usa en la presente, la hebra en "antisentido" es la hebra de siARN que es complementaria al ARNm objetivo y que se unirá al ARm una vez que el siARN sea desenrollado. ¦< La hebra en sentido del siARN que comprende el patrón de modificación novedoso es complementaria a la hebra en antisentido. ; El siARN que comprende el novedoso patrón de modificación probó ser particularmente adecuado cuando se fijó covalentemente a un polímero de suministro, como se ejemplifica por Tozema et al. (Dynamic PolyConjugates (DPC; Rozema et al. 2007). La potencia y duración de efecto .pueden i incrementarse significativamente empleando la estrategia de modificación con siARN delineada en esta invención. ¦ i En otra modalidad, el siARN que comprendé el patrón de modificación novedoso es especialmente útil cuáiido se conjuga a moléculas pequeñas que alteran las propiedades farmacocinéticas de siARN tales como colesterol o los compuestos de la fórmula (I) y (la) provistos en la presente. En una modalidad, se proporciona un conjugado de una molécula pequeña y un oligonucleótido, en donde el oligonucleótido tiene el siguiente patrón de modificación: La hebra en antisentido con el patrón de modificación: 5 ' - (ws ) - (Zl) - (Z2 ) - (Z3)na-3' y una hebra en sentido con el patrón de modificación 5'-(Z3)ns-, en donde los sustituyentes agí, como las variables na y ns tienen el significado indicado árjriba . En una modalidad la molécula pequeña es colesterol. En1 otra modalidad la molécula pequeña es un compuesto de la fórmula (I) o (la), dando como resultado compuestos de la fórmula (II) o (Ha) .
De preferencia, los conjugados de moléculas de siARN son co-administrados con un polímero de suministro. Los polímeros de suministro adecuados se describieron arriba.
En una modalidad, el siARN que comprende el patrón de modificación novedoso es especialmente útil cuando se conjuga a un ligando que se sabe se une a un receptor específico que internaliza al conjugado dentro de una célula. Particularmente, el receptor de asialogl icoprqteína (ASGPR) expresado en hepatocitos es un receptor' bien ¦ 1 conocido que hace posible la depuración ( endoc itos i s y degradación lisosómica) de proteínas desgalilladas de la circulación. Se ha mostrado que la N-acetil-D-galac tosamina tiene una alta afinidad de unión por el receptor, especialmente cuando se presenta en forma multivalente y cuando los residuos de galactosa son separados adecuadamente (J Biol Bhem, 2001, ! 276, 37577) . Para utilizar este receptor de alta capacidad para endocitos mediada por receptor del ácido nucleico, el ligando sintético mostrado abajo se preparó para ser fijado covalentemente a las moléculas de siARN que comprenden el patrón de modificación novedoso. Ya que este tipo de endocitosis lleva a degradación lisosómica del material internalizado el siARN debe prepararse de tal manera que sea estable en el lisosoma, lo .cual ahora es resuelto por el novedoso patrón de modificación delineado arriba.
Asimismo, se entiende que el ligando de dirección mostrado en la fórmula III conjugado a un ácido nucleico tal como siARN como .se muestra en la fórmula IV puede ser reemplazado por otros compuestos naturales o sintetizados químicamente (antagonistas o agonistas) que presenten una alta afinidad de un'ión a receptores expresados en superficie celular. Ejemplos incluyen folato como ligando del receptor de folato expresado en una variedad de células cancerosas (Ann. N.Y. Acad. Sci., 2009, 1175, 32) o moléculas de unión a PS A (Nature Biotech, 2006, 24, 1005; Mol Pharm, 2009, 6, 780) .
El ligando para el ASGPR es unido mediante un enlace de amida al ácido nucleico. La formación de enlaces de amida puede establecerse con la ayuda de química de N- hidroxi - succ inimida (NHS) . El ligando empleado en la reacción de conjugación se muestra abajo (fórmula III) . Para interacción con la ASGPR los grupbs O-acetato en los residuos de azúcar tienen que ser eliminados como se muestra en la (fórmula IV) para siAR .
(IV) En una modalidad de la invención, se proporciona un conjugado de un compuesto de la fórmula IV y un oligonucleótido, en donde el oligonucleótido tiene el siguiente patrón de modificación: La hebra antisentido con el patrón de modificación 5 ' - (w) - (Zl) - (Z2 ) - (Z3 ) na-3 ' y una >hebra en sentido con el patrón de modificación 5'-(Z3)ns-, en donde los sustituyentes así como las variables na y ns tienen el significado indicado arriba. El conjugado también se ;conoce como un conjugado de GalNAc palmitoilo. Preferiblemente, el conjugado de GalNAc palmitoilo es co-administradó don un polímero de suministro. Polímeros de suministro adecuados se describieron arriba.
Se encontró que para estos patrones de modificación los esteres cortables probaron ser adecuados en comparación con ligandoo de molécula pequeña enlazados estableménté . Los posibles enlazadores cortables son un motivo di-péptidp como el ejemplificado en el esquema de reacción 1 o uri enlazador de ARN cortable que comprenden nucleótidos que contienen 2'-OH. El enlazador de ARN cortable es especialmente útil en relación con las moléculas de siARN que tienen el novedoso patrón de modificación (siARN completamente 2 ' -modif cado) descritas arriba. , En principio, un sitio de corte con nucléasa , puede ser introducido por salientes 3' o 5' que contengan al menos un nucleótido 2' -OH ya sea en la hebra en sentido o antisentido. La especie de siARN activa final se genera por procesamiento de nucleasa intracelular . Asimismo, el uso de sitios de corte definidos implementados por 2 '-OH nucleótidos dentro de la región de pares de bases es posible. Ésto puede hacerse usando al menos un nucleótido 2 '-OH complementario a la hebra opuesta o mediante la introducción de ya séa al menos un nucleótido 2' -OH no coincidido o un pasádor/bulto que contenga al menos un nucleótido 2' -OH.
En contraste con otras químicas enlazadoras cortables, el uso de sitios de corte definidos mediante la introducción de nucleótidos 2' -OH llevó a aun enfoque de conjugación más versátil. Al introducir sitios : ;de : corte selectivos sobre una o ambas hebras del siARN ya sea en el extremo 3' y/o el 5' o dentro de la estructura dúplex, es posible una conjugación múltiple.
En consecuencia, en una modalidad, se proporciona un conjugado de molécula pequeña y un oligonucleótido en donde : 1 a) la molécula pequeña comprende un enlazádor de nucleótido que comprende 1-10, de preferencia 1-5, muy preferiblemente 1-3 nucleótidos 2??; b) el oligonucleótido tiene el siguiente , patrón de - i modificación: la hebra en antisentido con el patrón de modificación 5' - (w) - (Zl) - (Z2) - (Z3)na-3' y una hebra en sentido con el patrón de modificación 5'-(Z3)ns-, en donde los sustituyentes así como las variables na y ns tienen el significado indicado arriba; y c) el oligonucleótido se fija covalentementze por medio del enlazádor de nucleótido a la molécula pequeña.
El enlazádor de nucleótido es cortado, por ejemplo, en el endosoma por nucleasas intracelulares tales como DNAsa II después de la internalización del conjugado, liberando así el siARN. , Preferiblemente, el conjugado es co-administrado con un polímero de suministro. Los polímeros de suministro adecuados se describen arriba.
En otra modalidad de la invención se proporciona un compuesto de la fórmula (V) . Este compuesto comprende, una porción de colesterol, y un enlazádor de nucleótidos, que comprende 1-10, de preferencia 1-5, muy preferiblemente, 1-3 nucleótidos 2' -OH. Este enlazador de nucleótidos es útil para fijación covalente de un oligonucleótido tal como un siARN al compuesto de la fórmula (V) . De preferéncia, el oligonucleótido tiene el novedoso patrón de modi icación indicado arriba. Por consiguiente, en otra modalidad se proporciona un conjugado de la fórmula (V) y un oligonucleótido, en donde el oligonucleótido es unido covalentemente al enlazador de nucleótido del compuesto de la fórmula (V) .
El enlazador de nucleótido es cortado por nucleasas intracelulares tales como DNAsa II después! dé la internalización del conjugado de un compuesto de la fórmula (V) y un oligonucleótido en el endosoma, liberando así el SiARN.
R = enlazador de nucleótido (V) De preferencia, el conjugado de un compuesto '.de la fórmula (V) y un oligonucleótido es co-administrádo con un polímero de suministro. Los polímeros de suministró adecuados se describen arriba. ¡ En otra modalidad, el polímero de suministro y el conjugado de un compuesto de la fórmula (V) y un oligonucleótido de la invención no se fijan covalentemente y se sintetizan por separado y pueden ser suministrados en recipientes separados o en un solo recipiente.
Definiciones El término "molécula pequeña" según se usa en la presente, se refiere a moléculas orgánicas o inorgánicas ya sea sintetizadas o encontradas en la naturaleza, que generalmente tienen un peso molecular de menos de 10,000 gramos por mol, opcionalmente menos de 5,000 gramos por (mol y opcionalmente menos de 2,000 gramos por mol.
El término "péptido" según se usa aquí se refiere a un compuesto polimérico producido por una formación de enlaces de amida entre un grupo alfa-carboxilo de uh Ds ,o L-aminoácido y un grupo alfa-amino de otro D- o L-aminoácido . El término "proteína" según se usa en la presente sé refiere a polipéptidos de secuencia específica de ; más ; de ! aproximadamente 50 residuos.
El término "motivo de di-péptido" según se usa en la presente se refiere a cualquier motivo que comprende un enlace de amida formado ya sea por el grupo D- o L-alfa o beta amino de un primer aminoácido con el grupo alfa-carboxilo de un segundo D- o L-aminoácido .
Según se usa en la presente, el t(érmino "aminoácido" se refiere a cualquier molécula qué contenga grupos funcionales tanto amina como carboxilo.1 Así, el término "aminoácido" se refiere a aminoácidos tanto naturales como no naturales y sintéticos. Cualquier aminoácido natural usado en la presente invención se conoce en la presente por sus abreviaturas comunes .
El término "ligando" según se usa en la presente se refiere a una porción que es capaz de unirse covalentemente o químicamente de otra manera a un ácido nucleico. Él término "un ligando" en el contexto de la invención es de preferencia : 1 un compuesto de la fórmula (I) o (la) unido covalentemente a un ácido nucleico.
El término "ácido nucleico" según se usa > en la presente significa un oligómero o polímero compuesto de nucleótidos, por ejemplo, desoxirribonucleótidqs o ribonucleótidos , o compuestos producidos sintéticamente ' (por ejemplo, PNA como el descrito en la patente de E.U.A.! No. 5,948,902 y las referencias citadas ahí) que pueden, hibridar con ácidos nucleidos de origen natural de una manera específica de secuencia análoga a aquella de dos ácidos nucleicos de origen natural, por ejemplo, pueden participar en interacciones de apareo de bases de Watson-Crick' . Los ácidos nucleicos que no son de origen natural son oligómeros o polímeros que contienen secuencias de nucleobases q e¡ no se presentan en la naturaleza, o especies que contienen equivalentes funcionales de nucleobases de origen natural, azúcares o enlaces entre azúcares, tales como ácidos nucleicos péptidos (PNA, por sus siglas en inglés), ácidos nucleicos de treosa (TNA, por sus siglas en inglés) , ácidos nucleicos trabados (LNA, por sus siglas en inglés) o "ácidos nucleicos de glicerol (GNA, por sus siglas en inglés) . Este término incluye oligómeros que contiene las nucleobases de ácido nucleico de origen natural adenina (A) , guanina (G) , timina (T) , citosina (C) y uracilo (U) , así como oligómeros que contienen análogos de base o nucleobases modificadas. Los ácidos nucleicos pueden derivarse de una variedad de fuentes naturales tales como moléculas de ADN y AR virales, bacterianas y eucarióticas . Otros ácidos nucleicos pueden derivarse de fuentes sintéticas, e incluyen cualquiera de los oligonucleótidos múltiples que están siendo fabricados para usarse como reactivos de investigación, agentes' de diagnóstico o agentes terapéuticos potenciales y definidos. El término incluye oligómeros que comprenden un ácido nucleico de hebra individual o un ácido nucleico de : doble hebra .
El término "2 ' -modificado" según se usa $n la presente se refiere a un ß-D-ribonucleósido o ;' ß-D-ribonucleótido que comprende nucleobases de orig n natural que tienen el grupo 2 '-0H reemplazado por H, F, 0-CÍH3 u| otros sustituyentes conocidos en la técnica.
El término "nucleótido 2' -OH" según se usa en la presente se refiere a un ß-D-ribonucleótido que comprende nucleobases de origen natural que tienen un grupo 2' -OH.
El término "5' -fosfato" según se usa en la presente se refiere a la fórmula -0-P(=0) (OH) OH. En otro aspecto el fosfato es modificado de tal manera que uno de los grupqs O u OH sea reemplazado por S y se llama en la presente "5'-fosfotioato" .
El término "fosforotioato" según se usa ,.en la presente, se refiere a un enlace entre nucleótidos en el, cual uno de los oxígenos no de puenteo es reemplazado por azufre.
El término "polímero de suministro" según se Usa en la presente se refiere a polímeros adecuados1 paira el suministro funcional de un ácido nucleico. En el contexto de la presente invención, el polímero de suministro es ya sea unido covalentemente a o co-administrado con la sustancia biológicamente conjugada a los compuestos descritos en las presente y media escape endosómico después dé su internalización en la célula y absorción en el endósoma . El término "polímero" en este contexto significa cualquier compuesto que está formado de dos o más unidades moñoméricas enlazadas covalentemente entre sí, en donde las 'unidades monoméricas pueden ser iguales o diferentes, de tal forma que el polímero pueda ser un homopolímero o un heteropolímero . Polímeros representativos incluyen péptidos, polisacáridos , ácidos nucleicos y similares, en donde los polímeros .pueden ser de origen natural o sintéticos. Ejemplos no limitativos de polímeros de suministro son por ejemplo revisados en I INTERNATIONAL JOURNAL OF PHARMACEUTICAL RESEARCH, AND DEVELOPTMENT, octubre 2010/volumen 2/edición 8/artículp No. 2. Ejemplos no limitativos de polímeros de suministro útiles para el suministro de ácidos nucleicos se describen en las solicitudes europeas 10165502.5 y 10191030.5, publicación de PCT O 2008/0022309 y solicitud de E.U.A. provisional 61/307490 y referencias citadas ahí; los cuales se incluyen todos por referencia.
Según se usa en la presente, "composición farmacéutica" incluye los conjugados de la invención, un portador o diluyente farmacéutico y cualquier otro medio o agente necesario para formulación.
Según se usa en la presente un "portador farmacéutico" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos , agentes isotónicos y de retraso de absorción y similares que sean fisiológicamente compatibles. De preferencia, el portador es adecuado para administración intravenosa, int amuscular, subcutánea, parenteral , espijñal o epidérmica (por ejemplo, mediante inyección o infusión) .
Un conjugado de la presente invención J puede administrarse mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Como se apreciará por el experto en la técnica, la ruta y/o modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. Para administrar un conjugado de la invención por ciertas rutas de administración, puede ser necesario recubrir el conjugado con, o co-administrar al conjugado con, un material para evitar su inactiváción. Por ejemplo, el conjugado puede ser administrado a un sujeto en un portador o un diluyente adecuado. Los diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen solución salina y soluciones reguladoras de pH acuosas. Los portadores farmacéuticos incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles 'El 'Uso de estos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce en la técnica. !' Las frases "administración parenteral" y "administrado parenteralmente" según se usan aquí significan modos de administración que no son administración éntéral y tópica, normalmente por inyección, e incluyen, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial , intratecal, intracapsular, intraorbital , intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal , transtraqueal , subcutánea, subcuticular, intraarticular, sübcapsular, subaracnoide, intraespinal , epidural e intraesternal .
Estos portadores también pueden contener adyuvantes tales como conservadores, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes de dispersión. La prevención de la presencia de microorganismos puede asegurarse tantó por procedimientos de esterilización, véase arriba, como ,por la inclusión de varios agentes antibacterianos y antifúhgicos , por ejemplo, parabeno, clorobutanol , fenol, ácido sórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio y similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada; de la forma farmacéutica inyectable puede propiciarse mediante la inclusión de agentes que retrasen la absorción tales ( como monostearato de aluminio y gelatina.
No obstante la ruta de administración seleccionada, los conjugados de la presente invención, los cuales se -pueden usar en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmacéuticas de la presente invención, se formulan : en formas de dosis farmacéuticamente aceptables mediante métodos convencionales conocidos por aquellos expertos en la técnica.
Los niveles de dosificación reales dé los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variarse para obtener » asíí una cantidad del ingrediente activo que sea efectiva para lograr 1 la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración particular, sin que sea tóxico para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad ] de las composiciones particulares de la presente invención empleadas, la ruta de administración, el tiempo de administración, la velocidad de excreción del 'compuesto particular que esté siendo empleado, la duración, del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, condición, salud general e historial médico anterior del paciente que esté siendo tratado, y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.
La composición farmacéutica debe ser estéril y fluida al grado de que la composición pueda ser suministrada por una jeringa. Además de agua, el portador es de preferencia una solución salina de pH regulado isotónica.
La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitiná, por el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos . En muchos casos, es preferible incluir agentes isotónicos, por .ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol o sorbitol y cloruro de sodio en la composición.
Breve Descripción de las Figuras ¦ La figura 1 muestra la co-administración de conjugados de siARN que comprenden los compuestos de la fórmula (I) o (la) y un polímero de suministro in vivo.
La figura 2 muestra la co-administración de conjugados de siARN que comprenden los compuestos de la fórmula (I) o (la) y un polímero de suministro in vivo.
La figura 3 muestra la co-administíación de conjugados de siARN que comprenden los compuestos de la fórmula (I) o (la) y un polímero de suministro in vivo.
La figura 4 muestra la co-administración de conjugados de siARN que comprenden los compuestos de la fórmula (I) o (la) y un polímero de suministro in vivo. ' La figura 5a muestra silenciamiento génico mediado por hebra en antisentido con moléculas de siARN completamente 2 ' -modificadas . Células C0S7 fueron co-transfectadas con moléculas de siARN dirigidas a EGFP a 3 nM y psiCHECK2 -?? . La actividad de supresión de las moléculas de siARN se evaluó al medir la actividad de luciferasa de renilla contra luciérnaga de la construcción reportera. Las moléculas de siARN fueron clasificadas por actividad de supresión de moléculas de siARN de referencia (2-19-2) no modificadas.
La figura 5b muestra silenciamiento génicó mediado por hebra en sentido con moléculas de siARN completamente 2'-modificadas. Células COS7 fueron co-transfectadas ; con I moléculas de siARN dirigidas a EGFP a 3 nM y psiCHECK2 -ST . La actividad de supresión de las moléculas de siARN se evaluó al medir la expresión de luciferasa a partir de la construcción reportera. Las moléculas de siARN fueron clasif cadas por actividad supresora de moléculas de siARN de refeirenc!a (2-19-2) no modificadas.
La figura 6a muestra la reducción de la actividad de FVII en suero en primates no humanos después de inyección intravenosa de varias moléculas de siARN 2'-modificadas unidas covaleñtemente a un polímero de J suministro.
La figura 6b muestra el desarrollo del tiempo de protrombina en primates no humanos después de tratamiento con moléculas de siARN 2 ' -modificadas conjugadas covaleñtemente a un polímero de suministro.
Descripción Detallada de la Invención · Ej emplos Los siguientes ejemplos están diseñados; como ejemplos de referencia únicamente, para de esta 'manera ilustrar la síntesis de los compuestos para usarse en el suministro de ácidos nucleicos. No se intenta que formen parte de la invención.
Ejemplo 1 Etapa 1: 3- [ (3S, 8S, 9S, 10R, 13R, 14S, 17R) -17- ( (R) -1,5-dimetil-hexil) -10 , 13-dimetil- 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17-tetradecahidro-lH-ciclopenta [a] fenantren-3-iloxi] -propilamina .
Quiral La amina del título se preparó a partir de su precursor de bencilo de acuerdo con un protocolo de la literatura [Lollo et al. WO2001/070415] .
Etapa 2: ácido N- {3- [ (3S, 8S, 9S, 10R, 13R, 14S, 17R) -17- ( (R) -1, 5-dimetil-hexil) -10, 13-dimetil- 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-tetradecahidro- 1H-ciclopenta [a] fenantren-3-iloxi] -propil} -succinámicol En un matraz de fondo redondo de 2 litros; 3 ( (3S, 8S, 9S, 10R, 13R, 14S, 17R) - 10 , 13 -dimetil - 17 - ( (R) -6 -metilheptan-2-il) - 2 , 3 , 4 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 1,7- ,, tetradecahidro-lH-ciclopenta [a] fenantren-3-iloxi) propan-1-amina (21.15 g, 47.7 mmol , Eq : 1.00) y base de Hueiiig (12.3 g, 16.6 mi, 95.3 mmol, Eq: 2.00) se combinaron con AcOEt; J(845 mi) para dar una solución incolora. Se añadió dihidrofuran-2,5-diona (4.77 g, 47.7 mmol, Eq: 1.00) en THF (42 :ml) ;y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche => suspensión blanca. Todos los materiales volátiles fueron removidos i.v., el residuo se disolvió en CH2G12, la i ? capa orgánica se lavó con NH4C1 y salmuera, se secó ,1 sobre Na2S04 y se evaporó hasta la sequedad. El producto crudo se disolvió en CH3CN/H20 y se liofilizó para producir 29.8 g del compuesto del titulo como un polvo esponjoso.
MS (ISP) : (M-H) 542.5.
Etapa 3 : NI- ( (3S, 8S, 9S, 10R, 13R, 14S, 17R) -10, 13-dimetil-17- ( (R) -6 -metilheptan-2 - il ) - 2, 3,4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-tetradecahidro-lH- ' ciclopenta [a] fenantren-3-iloxi) propil) -N4- ( (S) -1- ( (=) - 1- '( - (hidroximetil ) fenilamino) -6- ( (4-metoxifenil) difenilmetilamino) -l-oxohexan-2-ilamino) -3- (4-nitrofenil) -l-oxopropan-2-il) succinimida.
En un matraz de fondo redondo de 10 mL, el ácido 4- (3- ( (3S, 8S, 9S, 10R, 13R, 14S, 17R) -10, 13-dimetil-17- ( (R) -6- ' ' metilheptan-2-il) -2, 3,4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-tetradecahidro- ??-ciclopenta [a] fenantren-3-iloxi ) propilamino) -4 -oxobutanoico preparado anteriormente (106 mg, 184 µp??? , Eq: 1.00), (S) -2- ( (S) -2 -amino-†3- (4- ? nitrofenil ) propanamido) -N- (4- (hidroximetil ) fenil) -6*- ( (4^ metoxifenil ) difenilraetilamino) hexanamida (132 mg, 184 j µp??? , Eq: 1.00), HOAt (25.0 mg, 184 mol, Eq: 1.00) y clorhidrato de EDC (35.3 mg, 184 µp???, Eq: 1.00) fueron mezclados juntos en CH2C12 (1.8 mi) para dar una solución amarilla. Base de Huenig (47.5 mg, 64.2 µ?, 368 µt???, Eq: 2.00) se añadió y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La TLC indicó el consumo del material de partida. Todos los materiales volátiles se removieron i.v., y el producto crudo se purificó mediante cromatografía por vaporización Si02/7% de MeOH/0.1% de Net3 en CH2C12 para producir 128 mg del compuesto del título como un sólido amarillo claro.
MS : masa esperada: 1240.7552, masa encontrada: 1240.7518.
En un matraz de fondo redondo de 10 mL, ,la l-(3- ( (3S, 8S, 9S, 10R, 13R, 14S, 17R) -10, 13 -dimetil - 17 - ( (R) -6-metilheptan-2-il) -2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-tetradecahidro- ? lH-ciclopenta [a] fenantren-3-iloxi)propil) -N4- ( (S) -1- ( (S) -1- (4- ( (hidroximetil) fenilamino) -6- ( (4-metoxifenil) difenilmetilamino) -1† oxohexan-2-ilamino) -3- (4-nitrofaiil) -l-oxopropan-2-il) succitiamid preparada arriba (126 mg, 101 umol, Eq: 1.00) y base de Huenig (39.3 mg, 53.2 µ?, 304 umol, Eq: 3.00) se combinaron con CH2C12 (lr4 mi) y DMF (1.0 mi) para dar una suspensión amarilla; carbonato de bis (4-riitrofenilo) (46.3 mg, 152 umoles, Eq: 1.50) fue añadido y la reacción se dejó proceder durante la noche. La mezcla se vertió en hielo triturado, se extrajo 2x con AcOEt, se lavó con H20, se secó- sobre Na2S04, y se evaporó hasta la sequedad. Después de la trituración con -10 mi de éter dietílico, 99 mg del producto del título se obtuvieron como un sólido blanquecino.
MS: Masa esperada: 1405.7614, masa encontrada: 1405.7518.
El bloque de construcción de dipéptido necesario para la etapa 3 se preparó como sigue: Etapa a: ácido (S) -2- [ (S) -2- (9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino) -3- (4 -nitro- fenil ) -propionilamino] -6-{ [ (4-metoxi-fenil) -difenil-metil] -amino} -hexanoico En un matraz de fondo redondo de 25 mL, ácido 2-amino-6- ( (4 -metoxifenil) difenilmetil -amino) hexanoico i (Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855-869, 968 mg, 2.31immóí, Eq: 1.00) se disolvió en CH2C12 (20 mi) para dar una solución amarilla claro. Se añadieron base de Huenig (897 mg, 1.21 mi, 6.94 mmol, Eq: 3.00) y trimetilclorosilano (528 mg, é2,l µ?, 4.86 mmol, Eq: 2.10) y la mezcla de reacción se agitó durante 15 minutos .
En un segundo matraz de fondo redondo de 50 mL, ácido (S) -2- ( ( (9H-fluoren-9-il) metoxi) carbonilamino) -3- (4-nitrofenil ) propanoico (1 g, 2.31 mmol, Eq: 1.00) se disolvió en DMF (20 mi) para dar una solución incolora. Se añadieron base de Huenig (359 mg, 485 DI, 2.78 mmol, Eq: 1.20) y\ TPTU [125700-71-2] (687 mg, 2.31 mmol, Eq: 1.00) y la mezqla de reacción se agitó durante 20 minutos. La solución dfel primer matraz que contenía la monosililamina de éste silílico correspondiente se añadió y la reacción se agitó durante otras 3 horas. La mezcla se vertió sobre hielo triturado/NHCl , se extrajo 2 x con AcOEt, se lavó con ;H20 y salmuera, se secó sobre Na2S04, y se evaporó hasta la sequedad. La cromatografía por vaporización con Si02/ip% de MeOH/0.1% de Net3 en CH2C12 dio 1.38 g del compuésto , del título como una espuma parduzca.
MS (ISP) : (M+H) 833.5, (M+Na) 855.4.
Etapa b: éster 9H-fluoren-9-ilmetílico de ácido [ (S) -1- ( (S) -1- (4 -hidroximetil -fenilacarbamoil ) -5- { [ (4-metoxi-fenil) -difenil-metil] -amino} -pentilcarbamoil ) -2- (4-nitro-fenil) -etil] -carbáraico En un matraz en forma de pera de 250 mL, el ácido (S) -2- ( (S) -2- ( ( (9H-fluoren-9-il) metoxi) carbonilamino) -3- (4-nitrofenil) propanamido) -6- ( (4-metoxifenil) difenil-metilamino) hexanoico sintetizado arriba (1.38 g, 1.66 mmol, Eq: 1.00), (4 -aminofenil ) metanol (204 mg, 1.66 mmol,1 Eq: 1.00), HOAt (226 mg, 1.66 mmol, Eq : 1.00) y clorhidrato de EDC (318 mg, 1.66 mmol, Eq: 1.00) se disolvieron en CH2C12 (16.6 mi) para dar una solución amarilla. Se añadió base de Huenic (428 mg, 579 µ?, 3.31 mmol, Eq: 2.00) y la reacción se dejó proceder durante la noche. La mezcla se vertió sobre hielo triturado/NH4Cl ( H ~7) , se extrajo 2 x con AcOEt, se lavó con H20, se secó sobre Na2S04 y se evaporó hastzá la sequedad. El producto crudo se trituró con éter dietíli'cp (1 x 50 mL) ; el sólido resultante se filtró y se secó .· para producir 1.214 g del compuesto del título como un sólido" café claro.
MS (ISP) : (M+H) 938.7.
Etapa c: (4-hidroximetil-fenil) -amida de ácido (S) 2- [ (S) -2-amino-3- (4-nitro-fenil) -propionilamino] -6- { [ (4-metoxi-fenil) -difenil-metil] -amino} -hexanoico En un matraz de fondo redondo de 50 mL, el éster 9H-fluoren-9-ilmetílico de ácido [ (S) -1- ( (S) -1- (4-hidroximetil-fenilcarbamoil) -5- { [ (4-metoxi-fenil) -difenil-metil] -amino} -pentilcarbamoil ) -2- (4-nitro-fenil) -etil] -carbámico preparado anteriormente (1.214 g, 1.29 mmol Eq: 1.001) se combinó con THF (19 mi) para dar una solución ::café . A 0°C, se añadió dietilamina (1.77 g, 2.49 mi, 24.2 mmol, Eq: 18.70) . La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas cuando la MS indicó la desaparición del material de partida. Todos los volátiles se evaporaron i.v.; la siguiente cromatografía por vaporización SiO2/0.1% de Net3 en CH2C.12 => 10% de MeOH/0.1% Net3 en CH2C12, seguida por , una cromatografía por vaporización SI02/5% de MeOH/0.1% Net3 en CH2C12 dio 502 mg del compuesto del título como una espuma t café claro.
Ejemplo 2 O-Bencil-N- [4- ( {3- [ (3beta) -colest-5-en-3-iloxi] propil } amino) -4 -oxobutanoil] -L-tirosil-N-6 - [ (4-metoxifenil) (difenil) metil] -N- [4- ( { [ (4-nitrofenoxi) carbonil] oxijmetil) fenil] -L-lisinamida Quiral Se preparó en analogía al ejemplo 1, pero usando en la etapa 3 (4-hidroximetil-fenil) -amida de ácido (S;) -2- ''[ (S) -2-amino-3- (4-benciloxi-fenil) -propionilamino] -6- { [ (4-metoxi-fenil) -difenil -metil] -amino} -hexanoico en lugar de (S) -2-( (S) -2-amino-3- (4 -nitrofenil ) propanamido) -N- (4-(hidroximetil) fenil) -6- ( (4-metoxifenil) difenil-metilamino) hexanamida como socio de acoplamiento. El primero se preparó a partir de ácido (S) -2- ( ( (9H-fíuoren-9-il) metoxi) carbonilamino) -3- (4- (benciloxi) fenil) ropanoico como se describió arriba en las etapas a] -c] .
S: Masa esperada: 1466.8182, masa encontrada 1466.8136.
Ejemplo 3 N- [4- ( {3- [ (3Beta) -colest-5-en-3-iloxi] propil } amino) -4- oxobutanoil] -4-ciano-L-fenilalanil-N-6- [ (4*- metoxifenil) (difenil ) metil] -N- [4- ( { [ (4- nitrofenoxi) carbonil] oxi}metil) fenil] -L-lisinamida Quiral Se preparó en analogía al ejemplo 1, pero usando en la etapa 3 (4-hidroximetil-fenil) -amida de ácido (S) -2 [ (S) -2-amino-3- (4-ciano-fenil) -propionilamino] -6- { [ (4-metoxi-fenil) -difenil-metil] -amino} -hexanoico en lugar dé (S) -2-( (S) -2-amino-3- (4-nitrofenil) -propoanamido) -N- (4-(hidroximetil ) fenil) -6- ( (4-metoxifenil) difenil- metilamino) hexanamida como socio de acoplamiento. La primera se preparó a partir de ácido (S) -2- ( ( (9H-fluoren-9-il) metoxi) carbonilamino) -3- (4-cianofenil) propanoico cómo se describió arriba en las etapas a] -c] .
MS : Masa esperada: 1385.7716, masa encontrada: 1385.7696.
Ejemplo 4 3 , 4-Dicloro-N- [4 - ( {3 - [ (3beta) -colet-5-en-3-j iloxi] propil )amino) -4 -oxobutanoil] -L-fenilalanil-N-6- [ (4 - metoxifenil) (difenil ) metil] -N- [4- ( ( [Ñ(4- nitrofenoxi) carbonil] oxijmetil) fenil] -L-lisinamida, Quiral Se preparó en analogía al ejemplo 1, pero usando en la etapa 3 (4-hidroximetil-fenil) -amida de ácido (S);- 2-;;[,;(S) -2-amino-3- (3 , 4 -dicloro-fenil) -porpionilamino] -6- { [ (4-metoxi-fenil) -difenil -metil] -amino} -hexanoico en lugar de (S) -2- ( (S) -2-amino-3- (4 -nitrofenil) propanamido) -N- (4- (hidroximetil) fenil) -6- ( (4 -metoxifenil ) difenil- ¦ ! metilamino) hexanamida como socio de acoplamiento. La primera ' -I se preparó a partir de ácido (S) -2- ( ( (9H-fluoren-9-il) metoxi) carbonilamino) -3- (3 , 4 -diclorofenil ) propanoicó en las etapas a] -c] .
MS: Masa esperada: 1428.6984, masa encontrada : 1428.695.
Ejemplo 5 4-Cloro-N- [4- ( { 8- [ (3beta) -colest-5-en-3-iloxi] pro il } afnino) - 4-oxobutanoil] -L-fenilalanil-N-6- [ (4- metoxifenil) (difenil) metil] -N- [4- ({ [ (4- nitrofenoxi) carbonil] oxi)metil) fenil] -L-lisinamid " Se preparó en analogía al ejemplo 1, pero usando en la etapa 3 (S) -2- ( (S) -2-amino-3- (4-clorofenil) propanamido) -N- (4-(hidroximetil) fenil) -6- ( (4-metoxifenil) difenil-metilamino) hexanamida en lugar de (S) -2- ( (S) -2-amino-3- (4-nitrofgenil) -propanamido) -N- (4- (hidroximetil) fenil) -6- ( (4-metoxifenil) difenil-metilamino) hexanamida como socio , de acoplamiento. La primera se preparó a partir de ácido (S) -2- ( ( (9H-fluoren-9-il)metoxi) -carbonilamino) -3- (4-clorofenil)propanoiéo como se describió arriba en las etapas a] -c] .
MS : Masa esperada: 1394.7373, masa encontrada: 1394.7342.
Ejemplo 6 Carbonato de 4- { [ (2S) -2- { [ (2S) -2- [ (4- { [3- ( { (3S, 8S, 9S, 10R( 13R, 14S, 17R) - 10 , 13 -dimetil- 17 - [ (2R)>-6- metilheptan-2-il] -2,3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ,17- tetradecahidro- lH-ciclopenta [a] fenantren-3^ iljoxi) propil] amino) -4-oxobutanoil) amino] -3- (naftalen-1- il) ropanoil] amino] -6- { [ (4- metoxifenil ) (difenil) metil] aminojhexanoil] amino}bénci1-4 - nitrofenilo (nombre no preferido) Se preparó en analogía al ejemplo 1, pero usando en la etapa 3 (4-hidroximetil-fenil) -amida de ácido (S) -2- '( (S) -2 -amino-3 -naftalen- 1- il-propionilamino) -6- { [ (4 -meto i- fénil ) difenil-metil] -amino} -hexanoico en lugar de (S) ¡-2- ,( ,(S) -2-amino-3- (4-nitroftenil) -propanamido) -N- (4- '< 1 | (hidroximetil) fenil) -6- ( (4 -metoifenil) difenil-metilamino) hexanamida como socio de acoplamiento. se preparó a partir de ácido (S) -2- ( ( (9H-fluó en-9-il) metoxi) carbonilamino) -3- (naftalen-1-il) se describió arriba en las etapas a[-c] . i| MS : Masa esperada: 1410.792, masa éncorítSrada : 1410.7918. í '' ; Ejemplo 7 . ;; nitrofenoxi) carbonil] oxi}metil) fenil] -L- lisinamida i Se preparó en analogía al ejemplo 1, pero usando en la etapa 3 (4 -hidroximetil- fenil) -amida de ácido (s!) -2Í- ;[(S) i 2 -amino-3 - (4 -fluoro-fenil) -pro ionilamino] -6- { [ (4 -métox -fenil) -difenil-metil] -amino} -hexanoico en lugar de (S)-2-( (S) -2-amino-3- (4 -nitrofenil ) -propanamido) -N- (4-(hidroximetil ) fenil) -6- ( (4 -metoxifenil ) difenil -metilamino) -hexanamida como socio de acoplamiento. La primera se preparó a partir de ácido (S) -2- ( ( (9H-fluoren-9-il) metoxi) carbonilamino) -3- (4-fluorofenil) propanoicd como se describió arriba en las etapas a] -c] .
MS : Masa esperada: 1378.7669, masa encontrada: 1378.7609.
Ejemplo 8 N- [4- ( {3 - [ (3Beta) -colest-5-en-3-iloxi] ropil } amirio) -4- oxobutanoil] -2-fluoro-L-fenilalanil-N-6- [ (4- metoxifenil) (difenil) metil] -N- [4- ( { [ (4- nitrofenoxi) carbonil] oxijmetil) fenil] -L-lisinamida preparó en analogía al ejemplo 1, pero usando en la etapa 3 (4 -hdroximetil- fenil) -amida de ácido (S) -2- [ (S) -2-amino-3-(2 -f luoro-fenil) -propionilamino] -6-{ [ (4-metoxi-fenil) -difenil-metil] -amino} -hexanoico en lugar de (S) -2- ( (S) -2-amino-3- (4-riitrofenil) - 'i propanamido) -N- (4- (hidroximetil) fenil) -6- ( (4-metoxifenil) difenil-i metilamino) -hexanamida como socio de acoplamiento. La primera se preparó a partir de ácido (S) -2- ( ( (9H-fluoren-9-il)metoxi) carbonilamino) -3- (2-f luorofenil)propanoico como se describió i arriba en las etapas a] -c] .
MS: Masa esperada: 1378.7669, masa encontrada: 1378.7689.
Ejemplo 9 N- [4- ( (3- [ (3Beta) -colest-5-en-3-iloxi] ropil } amino) -4- oxobutanoil] -3-f luoro-L-f enilalanil-N-6- [ (4- metoxifenil) (dif enil) metil] -N- [4- ( { [ (4- nitrofenoxi) carbonil].oxi}metil) fenil] -L-lisinamida, Quiral Se preparó en analogía al ejemplo 1, pero usando en la etapa 3 (4 -hdroximetil- fenil) -amida de ácido (S) -2- [ (S) -2-amino-3-(3-f luoro-fenil) -propionilamino] -6-{ [ (4-metoxi-fenil) -difenilmetil] - amino} -hexanoico en lugar de (S) -2- ( (S) -2-amino-3- (4-nitrofenil) -propanamido) -N- (4- (hidroximetil) fenil) -6- ( (4 -metoxifenil) dif enil-metilamino) -hexanamida como socio de acoplamiento. La primera se preparó a partir de ácido (S) -2- ( ( (9H-fluóren-9-il)metoxi) carbonilamino) -3- (3-f luorofenil)propanoico como se describió arriba en las etapas a] -c] .
MS: Masa esperada: 1378.7669, masa encontrada: 1378.7689.
Ejemplo 10 Etapa 1: NI- ( 3 - ( ( 3S , 8S , 9S, 10R, 13R, 14S , 17R) -10, 13- Dimetil-17- ( (R) -6-metilheptan-2-il) - 2, 3, ,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16 , 17- tetradecahidro- 1H-ciclopenta [a] f enantren-3-iloxi) ropil) -N4- ( (S) -1- (4-f luorofenil) -4- ( (S) -1- (4 -hidroximetil ) fenilamino) -6- ( (4-metoxifenil) dif enilmetilamino) -l-oxohexan-2-ilamino) -4-oxobutan-2 - il ) succinimida .
En un matraz de fondo redondo de 10 mi, el cido 4- (3- ( (3S, 8S, 9S, 10R, 13R, 14S, 17R) - 10 , 13 -Dimet il - 17 - ,( (R) -6 metilheptan-2-il) -2, 3,4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 , 11 - tetradecahidro- ??-ciclopenta [a] fenantren-3-iloxi ) ropilamino) -4 -oxobutanoico preparado anteriormente (109 mg, 188 µ????eß, Eq : 1.00), (4 -hidroximetil - fenil ) -amida de ácido (S ) - 2 - [ ( S) - 3 -amino-4 - ( 4 - fluórofenil ) -butirilamino] -6- { [ (4 -metoxi - fenil ) -difenil ) meti1] ^amirio} -hexanoico (132 mg, 188 umoles, Eq : 1.00), HOAt (25.6 mg, 188 moles, Eq: 1.00) y clorhidrato de EDC (36.1 mg, 188 pmoles, Eq : 1.00) se mezclaron juntos en CH2C12 (2 mi) para dar una solución amarilla. Se añadió base de Hüenig (48.7 mg, 64.1 µ? , 377 µ?t????T, Eq : 2.00) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche; La¡ TLC indicó el consumo del material de partida. Todos los materiales volátiles fueron removidos I.V., y el producto crudo se purificó mediante cromatografía por vaporización '¦ i con Si02/5% de MeOH/0.1% de Net3 en CH2C12 para producir 197 mg del compuesto del título como un sólido blanquecino.
MS : Masa esperada: 1227.7763, masa encontrada: 1227.7714.
Etapa 2: carbonato de 4- ( (S) -2- ( (S) -3- (4- (3- ( (3S, 8S, 9S, 10R, 13R, 14S, 17R) -10 , 13 -dimetil-17- ( (R) -6-metilheptan-2-il) -2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ,15, 16, 17-tetradecahidro-lH-ciclopenta [a] fenantren-3-iloxi) fenántren-3-iloxi) propilamino) -4-oxobutanamido) -4- (4- ¦ fluorofenil ) butanamido) -6 - En un matraz de fondo redondo de 10 mL, la NI- (3- ( (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R) -10, 13-dimetil-17- ( (R) -6-metilheptán-2;-il) -2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-IH-ciclopenta [a] fenantren-3-iloxi)propil) -N4- ( (S) -1- (4-fluorofenil) -4-( (S) -1- (4- (hidroximetil) fenilamino) -6- ( (4-metoxifenil)difenilmetilamino) -l-oxohexan-2-ilamino) -4-oxobutan-2-il) succinimida preparada anteriormente (196 mg, 160 umol, Eq: 1.?0) y base de Huenig (61.9 mg, 81.4 µ?, 479 umol, Eq: 3.00) se combinaron con CH2C12 (1.6 mi) y DMF (0.8 mi) para dar una suspensión amarilla; se añadió carbonato de bis (4-nitrofenilo) (72.8 mg, 239 umoles, Eq: :1.50) y la reacción se dejó proceder a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla se vertió en hielo triturado/ H4Cl ( H ~6) , se extraj<? 2 x con AcOEt, se lavó con H20 y salmuera, y se secó sobre Na2S04 y se evaporó hasta la sequedad. Después de la trituración con AcOEt/heptano se obtuvieron 123 mg del compuesto del título como un sólido amarillo claro.
MS: Masa esperada: 1392.7825, masa encontrada: 1392.7819. 1 1 El bloque de construcción dipeptídico necesario para la etapa 1 se preparó como sigue: Etapa a: ácido (S) -2- [ (S) -3- (9tf-flütíren-9-ilmetoxicarbonilamino) -4- (4-fluoro-fenil) -butirilamino] -6-{ [ (4-metoxi-fenil) -difenil-metil) ] -amino} -hexanoico En un matraz de fondo redondo de 25 mL, ácido (S)-2-amino-6- ( (4-metoxifenil) difenilmetil-amino)hexanoico (Bioconjugate : Chem. 2002, 13, 855-869, 1040 mg, 2.48 mmol, Eq: 1.00) se disolvió en CH2C12 (12.5 mi) para dar una solución amarillo pálido. Se añadieron b^se de Huenig (961 mg, 1.27 mi, 7.44 mmol, Eq: 3.00) y trimetilclorosilano (566 mg, 621 ul, 5.21 mmol, Eq: 2.10) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 20 minutos.
En un segundo matraz de fondo redondo de 50 mL, ácido (S) -3- ( ( (9H-fluoren-9-il)metoxi) carbonil-amino) -4- (4-fluorofenil)butanoico ¦? (1040 mg, 2.48 mmol, Eq: 1.00) se disolvió en DMF (12.5 mi) pára dar una solución incolora. Se añadieron base de Huenig (385 mg, 506 µ?, 2.98 mmol, Eq: 1.20) y TPTU [125700-71-2] (737 mg, 2.48 mmol, Eq: 1.00) y la mezcla de reacción se agitó durante 15 minutos. La solución del primer matraz que contenía la monosilamina de éster silílico correspondiente se añadió y la reacción se agitó durante otras 3, horas a temperatura ambiente. La mezcla se vertió en hielo tritürado/N¾Cl , se extrajo 2x con AcOEt, se lavó con H20 y salmuera, se secó sobre Na2S04 y se evaporó hasta la sequedad. La cromatografía por vaporización con Si02/5% de MeOH/0.1% de Net3 en CH2C12 dio 2.10 g del compuesto del título como una espuma amarilla.
MS (ISP) : (M+H) 820.6.
Etapa b: éster 9H-f luoren-9- ilmetílico de acido [ (S) -2- (4-f luoro-fenil) -1- [ ( (S) -1- (4 -hidroximetil- f enilcarbamoil ) -5- { [ (4 -metoxi-f enil) -dif enil -metil] -amino - pentilcarbamoil ) -metil] -et il } -carbámico Quiral En un matraz en forma de pera de 250 mL, :el éster 9H-f luoren-9-ilmetílico de ácido [ (S ) -2 - (4 - f luoro- f nií ) - 1 - [ ( (S) -1- (4-hidroximetil-fenilcarbamoil) -5- { [ (4-metoxi-fénil) -difenil-metil] -amino} -pentilcarbamoil) -metil] -etil} ^carb'ámico sintetizado arriba (2.10 g, 2.56 mmol) , Eq: 1.00), (4-aminofenil) metanol (315 mg, 2.55 mmol, Eq: 1.00), HOÁt (349 mg, 2.56 mmol, Eq: 1.00) y clorhidrato de EDC (491 mg, 2.56 mmol, Eq: 1.00) se disolvieron en CH2C12 (12.5 mi) . Se añadió base de Huenig (662 mg, 871 µ?, 5.21 mmol, Eq : 2.00) y la reacción se dejó proceder durante la noche. La mezcla se vertió en hielo triturado/NH4Cl (pH ~7) , se extrajo córi 2 x con AcOEt, se lavó con H20 y salmuera, se secó sobre Na2S04, y se evaporó hasta la sequedad. El producto crudo se trituró con éter dietílico (1 x 50 mi) ; el sólido resultante se filtró y se secó para producir 0.796 g del compuestd del título como un sólido café claro.
MS (ISP) : (M+H) 925.6.
Etapa c: 4- (hidroximetil) -fenil) -amida de ácido (S) -2- [ (S) -3 -amino- 4- (4-fluoro-fenil) -butirilamino] -6- { (4-metoxi-fenil) -difenil-metil] -amino} -hexanoico Quiral En un matraz de fondo redondo de 50 mL, .él éster 9H- f luoren- 9 - i lmet í 1 ico de ácido { ( S ) - 2 - ( 4 - f lüoro -fenil) -1- [ ( (S) -1- ( 4 - hidroxime t i 1 - f eni 1 carbamoi 1 ) - 5 - { [ (4-metoxi-f enil) -difenil-metil] - amino] -petnilcarbamoil) raetil] -etil } -carbámico (793 mg, 857 mol, Eq: 1.001) se combinó con THF (12 mi) para dar una solución parduzca. A 0°C, se añadió dieitilamina (1.13 g, 1.59 mi, 15.4 mmol, Eq: 18) . La reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla se vertió sobre hielo tri turado/NH3Cl (pH ~7) , se extrajo 2 x con AcOEt, se lavó con H20 y salmuera, se secó sobre Na2S04 y se evaporó hasta la sequedad. La cromatografía por vaporización' con SiO2/l0% de MeOH/0.1% de Net3 en CH2C12 produjo 500 ? mg del compuesto del título como un sólido blanquee ino .
MS : Masa esperada: 702.3581, masa encontrada: 702.3578.
Ejemplo 11 Carbonato de 4 - ( ( S ) - 2 - ( ( S ) - 3 - ( 4 - ( 3 - ( (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R) -10, 13 - dime ti 1 - 17 - ( ( ) -6- raet ilheptan- 2 - il ) - 2,3,4,7,8, 9,10,11,12,13, 14,15,16,17 - te t radecahidro - lH-ciclopenta [a] fenantren-3-iloxi) prop i lamino ) - 4- oxobu tanamido ) - 4 - f eni lbu t anamido ) -6- ( ( 4 -' metoxif enil) di feni lme ti lamino ) hexanamido) bencil -4 nitrofeni lo Se preparó en analogía al Ejemplo 10, pero usando en etapa 1 ( S ) - 2 - ( ( S ) - 3 - amirio - 4 - feni lbutanamido ) - N - (4- (hidroximetil ) fenil) -6- ( (4-;. metoxifenil) difenil -metilamino) hexanamida en lugar de (4-hidroximetil-fenil) -amida de ácido ( S ) - 2 - [ ( S ) - 3 - amino-4- ( 4 - f luoro- fenil ) -but irilamino] -6{ [ (4-metoxi- feni 1 ) - di f eni 1 -met i 1 ] - mino } -hexanoico como socio de acoplamiento. El anterior se preparó a partir de ácido (S) -3- ( ( (9H-fluoren-9-il) metoxi) carboni lamino ) - 4 - fenilbutanoico como se describió arriba en. las etapas a] — c] .
EM : masa esperada: 1374.792, masa encontrada : 1374.7877. ' ' Ejemplo 12 4-Nitrofenil carbonato de 4- ( {N-2~- [ (3S) -4- (4 -clorofenil ) -3- { [4- ( {3- [ (3beta) -colest-5-en-3-iloxi] propil}amino!) -4r . 1 oxobutanoil] aminojbutanoil] -N-6~- [ (4- metoxifenil) (difenil) metil] -L-lisil}amino) bencilo ? Se preparó en analogía al Ejemplo 10, pero usando en etapa 1 (S) -2- ( (S) -3-amino-4- (4 -clorofenil ) butanámidd) -N-(4- (hidroximetil ) fenil) -6- ( (4 -metoxifenil ) -difenilmetilamino) hexanamida en lugar de (4 -hidroximetil -fenil) -amida de ácido (S) -2 - [ (S) -3 -amino- - (4 -fluoró-féhil ) -butirilamino] -6- { [ (4-metoxi-fenil) -difenil-metil] -amiho} -hexanoico como socio de acoplamiento. El anterior se préparó a partir de ácido (S) -3- ( ( (9H-fluorén-9-il) metoxi) carbonilamino) -4- (4 -clorofenil) -butanoico como se describió arriba en las etapas a] — c] .
EM (ISP) : (M+H) 1409.9.
Ejemplo 13 N- [4- ( {3 - [ (3Beta) -colest-5-en-3-iloxi] propil } amino) -4- oxobutanoil] -0-metil-L-tirosil-N~-6- [ (4- metoxifenil) (difenil) metil] -N- [4- ({ [ (4-nitrofenoxi) carbonil] oxijmetil) fenil] -L-lisinamida i Se preparó en analogía al Ejemplo 1, pero usando en etapa 3 (S) -2 -( (S) -2-amino-3 - (4 -metoxifenil ) propanámido) -N-(4- (hidroximetil ) fenil) -6- ( (4 -metoxifenil ) - ' difenilmetilamino) hexanamida en lugar de (S) -2- ( (S)-¡2-a;mino-3- (4 -nitrofenil ) -propanámido) -N- (4- (hidroximetil ) fenil) -6-( (4-metoxifenil) difenil-metilamino) hexanamida como socio de acoplamiento. El anterior se preparó a partir de ácido (S)-2-( ( ( 9H- fluoren-9- il ) metoxi) carbonilamino) -3 - (4-metoxifenil) propanoico como se describió arriba en las etapas a] — c] del ejemplo 1.
EM (ISP) : (M+H) 1391.9.
Ejemplo 14 N- [4- ( {3 - [ (3 -Beta) -colest-5 -en-3 -iloxi] ropil }amino) -4- oxobutanoil] -D-fenilalanil~ -N-6 - [ (4- metoxifenil) (difenil) metil] -N- [4- ({ [ (4- nitrofenoxi) carbonil] oxijmetil) fenil] D-lisinamida Se preparó en analogía al Ejemplo 1, pero sando en etapa 3 (R) -2- ( (R) -2-amino-3-fenil-propanamido) - - (4- ( hidroxime t i 1 ) feni 1 ) - 6 - ( ( 4 -metoxifenil) difenilmetilamino) -hexanamida en lugar de (S) -2- ( (S) -2-amino-3- ( 4 - ni trofeni 1 ) -propanamidó ) - -(4 - (hidroximetil) fenil) - 6 - ( (4 - metoxi feni 1) difenil-" met i lamino ) hexanamida como socio de acoplamiento. Este bloque de construcción se sintetizó a partir de ácido (R) -2- ( ( (9H-fluoren-9-il)metoxi) carbóni 1 ami o ) -6 -aminohexanoico y ácido ( R ) - 2 - amino - 6 - ( ( 4 -metoxifenil) difenilmetil amino ) hexanoi co ( véase Bioconjugate Chem . 2002, 13, 885-869) cómo se describió arriba en las etapas a] — c] .
EM : masa esperada: 1360.7763, masa encontrada: 1360.7774.
Ejem lo 15 Carbonato de 4 - ( { - 2 ~ - [ ( 3 S ) - 3 - ( [ 4 - ( ( 3 - [ ( 3 - Beta colest-5-en-3-iloxi] ropi 1 } amino ) - 4 - oxobutanoi 1 ] aminoj 4 - ( 4 - c ianof enil ) butano i 1 ] -N- 6 ~ - [ ( 4 metoxifenil) ( di fenil ) met i 1 ] - L- 1 is i 1 } amino) ', de 4 - nitrofenil bencilo Se preparó en analogía al Ejemplo 10, pero usando en etapa 1 ( S ) - 2 - ( ( S ) - 3 - amino - 4 - ( 4 -cianofenil ) butanamido) -N- (4- ( hidroxime t i 1 ) fenil) -6- ( ( 4 - me oxi feni 1 ) di feni 1 -met i 1 amino ) hexanamida en lugar de (4 - hidroximetil - fenil) amida de ácido, (Si),-2- [ (S) -3-amino-4- (4-f luoro-fenil) - butiril amino] -6 { [ (4-metoxi - feni 1 ) - di feni 1 -met i 1 ] - amino } - hexano i co como socio de acoplamiento. El anterior se preparo a partir de ácido ( S ) - 3 - ( ( ( 9H - f luóren- 9 -i 1 ) meto i ) carbóni 1 amino ) - 4- (4-cianofenil) butanoico;1 como se describió arriba en las etapas a] — c] .
EM: masa esperada: 1399.7872, masa encontrada: 1399.7857.
Ejemplo 16 N- [4- ({3 - [ (3beta) -colest-5-en-3- i lo i ] ro i 1 } j amlno ) - 4 - oxobutanoi 1 ] -L-fenilalanil-N-6 - [ ( 4 - 1 metoxif enil) (difenil)metil] -N- [4- (( [ (4 - nitrofenoxi) ca bóni 1 ] oxi }metil) fenil] L-lis inamida Etapa 1 : (4-Hidroximetil-fenil) -amida de ácido (S) -2- ( (S) amino-3-fenil-propionilamino) -6- { [ (4-metoxi-fenil) -difenil metil] -amino} -hexanoico El bloque de construcción (4 -hidroximetil fenil )¦ amida de ácido (S) -2- ( (S) -2-amino-3-fenil-propionilamino) -6-{ [ (4-metoxi-fenil) difenil-me il] -amino} -hexanoico se preparó en analogía al procedimiento descrito en Bioconjugáte Chem., Vol. 13, No.4, 2002, 855-869 EM (ISP) : (M+H) 671.5 Etapa 2 : NI- (3- ( (3S, 8S, 9S, 10R, 13R, 14S, 17R) -10 , 13-dimetil-17-( (R) -6-metilheptan-2-il) -2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro- lH-ciclopenta [a] fenantren-3 - iloxi ) propil) ^N4 - ( (S) -1- ( (S) -1- (4- (hidroximetil) fenilamino) -6- ( (4-metoxifenil) difenilmetilamino) -l-oxohexan-2-ilamino) -l-óxo-3-fenilpropan-2-il) succinamida TPTU [125700-71-2] (233 mg, 784 µp??? , Eq : 1.00) se añadió a una solución de ácido N-{3- [ (3S, 8S, 9S, 10R, 13R, 14S, 17R) -17- ( (R) - 1 , 5 -dimetil -hexil ) -10, 13-dimetil-2 , 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-tetradecahidró-??-ciclopenta [a] fenantren- 3 - iloxi] -propil }- succinámicó (jvéase ejemplo 1, etapa 2) (426 mg, 0.784 mmol, Eq: 1.00) y, base de Huenig (304 mg, 411 µ? , 2.35 mmol , Eq: 3) en DMF (1Q ml). Después de 3 minutos (4-hidroximetil-fenil) -amida de .ácido (S) -2- ( (S) -2-amino-3-fenil-propionilamino) -6- { [ (4-métoxi-fenil) -difenil-metil] -amino} -hexanoico (etapa 1) se añadió TLC a t = 1 h mostró que la reacción estaba completa. El solvente se removió bajo presión, reducida. El residuo restante se absorbió en acetato de etilo y se extra ó con solución mitad saturada de NaHC03 (1 X), solución de ftalato ácido de potasio 0.05M (2 X), agua (1 X) y salmuera (1 X). El extracto orgánico se secó sobre MgS04 y se concentró, bajo presión reducida. El material crudo se purificó mediante cromatografía de vaporización instantánea para obtener el ¦I producto del título (682 mg, 513, µp???) como un sólido, café claro.
EM (ISP) : (M+H) 1196.8 Etapa 3 : La base de Hünig (465 mg, 629 µ? , 3.6 mmol, Eq: 6) se añadió a una solución del alcohol previo (718 mg, 1600 mot , Eq: 1.00) y carbonato de bis (4 -nitrofenil) (548 mg, Í.8 ;mmol, Eq: 3) en THF (20 ml) . La solución amarilla se agitó durante la noche a temperatura ambiente. El solvente se removió bajo presión reducida. El residuo restante se trituró con éter dietílico. El sólido se recolectó mediante filtración, se lavó con éter y se secó bajo presión reducida para obtener el compuesto del título (800 mg, 529 µp???) como un sólido, café claro .
EM (ISP) : (M+H) 1361.9 Ejemplo 17 Etapa 1 : ácido [ (S) -2- (9H-Fluoren-9 ilmetoxicarbonilamino) -3 -fenil-propionilamino] -hexanoico1 L-Fmoc-Phe-OSu disponible comercialmente (0.969 g, 2.00 mmol, Eq: 1.00) se suspendió en una mezcla 1:1 y/y de 1 , 2 -dimetoxietano y agua (17 mi) y se trató a 0°C con L-norleucina (0.275 g, 2.10 mmol, Eq: 1.05) y NaHC03 (0.185 g, 2.20 mmol, Eq: 1.10) . El baño de enfriamiento se removió y la reacción se dejó proceder a temperatura ambiente durante 14 h. La mezcla se vertió en hielo triturado / ácido cítrico (pH —3), se extrajo 2x con acetato de etilo, se lavó con H20 y salmuera, se secó sobre Na2S04, y se evaporó hasta la sequedad. La cromatografía por vaporización instantánea , Si02 / AcOEt produjo 0.870 mg del compuesto del título como sólido blanco.
EM (ISP) : (M+H) 501.2.
Etapa 2: Ester 9H-fluoren-9-ilmetilíco de ácido { (S) -1- [ (S) -1- (4-Hidroximetil-fenilcarbamoil) - pentilcarbamoil] -2-fenil-etil }carbám En una matraz con forma de pera, el ácido (S)-2- [ (S) -2- (9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino) -3-fenil-propionilamino] -hexanoico arriba sintetizado (10.72 g, 21 mmol, Eq: 1.00), (4 -aminofenil ) metanol (2.717 g, 22 mmol, Eq: 1.03), y 2-etoxi-l-etoxicarbonil-l, 2dihidroquinolina (EEDQ) (7.994 g, 32 mmol, Eq: 1.50) se disolvieron en CH2C12 (320 mi) y se agitaron durante la noche bajo un globo de Ar. La mezcla se vertió en hielo triturado / NH4C1, se extrajo 2 x con AcOEt, se lavó con H20, se secó sobre Na2S04 , y el volumen se redujo a 300 mi. El precipitado se filtró y se secó '; para . dar 5.25 g del compuesto del título como sólido café claró.
E (ISP) : (M+H) 606.3. : Etapa 3: (4 -hidroximetilfenil ) -amida de ácido (S) -2- ( (S) -2-Amino-3-fenil-propionilamino) -hexanoico En un matraz de fondo redondo, el éster 9H-fluoren-9-ilraetílico de ácido { (S) -1- [ (S) -1- (4-hidroximetilfenilcarbamoil) -pentilcarbamoil] -2-fenil-etil } -carbámico preparado arriba (4.738 g, 7.822 mmol , Eq: 1.0) se disolvió en CH2C12 (28 mi). A 0o, dietilamina (28 mi, 19.80 g, 271 mmol, Eq: 35) se añadió y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Todo el material volátil se evaporó i. V.; se efectuó cromatografía por vaporización instantánea ¦ 1 5 Si02 / CH2C12 / 10% MeOH, seguida de cristalización de AcOEt, produjo 2.116 g del compuesto del título como cristales café claro.
EM (ISP) : (M+H) 38 .2. 1 ; Etapa 4 NI- (3- ( (35, 8S, 9S, 10R, 13R, 14S, 17R) -10 , 13 -dimetil - 17- ( (R) -6-metilheptan-2-il) -2, 3,4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-tetradecahidro- lH-ciclopenta [a] fenantren-3-iloxi) propíl) -N4-( (S) -1- ( (S) -1- (4- (hidroximetil) fenilamino) -l-oxohexan-2-ilamino) -l-oxo-3-fenilpropan-2-il) succinamida Se preparó inmediatamente en analogía al Ejemplo 16 etapa 2 EM (ISP): (M+H) 909.7 (M+Na) 931.8.
Etapa 5 N- [4 - ( {3 - [ (3beta) -colest-5-en-3-iloxi] propil }amino) -4 -oxobutanoil] -L- fenilalanil -N- [4"('{ [(4- nitrofenoxi) carbonil] oxijmetil) fenil] -L-norleucinamida Se preparó inmediatamente en analogía al Ejemplo 16 etapa 3.
EM masa esperada: 1073.6453, masa encontrada 1073.642 Ejemplo 18 N- [4 - ({3 - [ (3beta) -colest- 5-en-3 - iloxi] ropil } aminó) -4 - oxobutanoil] -L-alanil-N- [4- ( { [ (4nitrofenoxi) carbonil] oxi }metil) fenil] glicinamidá Etapa 1 : Adición de alcohol FMOC-4-aminobencílico a la resina 2 -clorotritilo Resina de cloruro de 2 -clorotritilo (Novabiocem Ól- 64-0114, 100-200 mallas), 1%DVB (18 g, 21.6 mmol, Eq: '1.00) se aumentó en DCM/DMF=l/l (300 mL) durante diez minutos. La resina se drenó y una solución de alcohol FMOC-4-aminobencílico (14.9 g, 43.2 mmol, Eq: 2) y piridina (6.83 g, 6.99 mi, 86.4 mmol, Eq: 4) en DCM/DMF=l/l (300 mL) se añadió. La mezcla se agitó durante la noche. La resina se drenó, y se tapó con una solución de base de Hünig al 10% en metanol (300 mL) . La resina se lavó con DMF y DCM y se secó durante la noche con HV para obtener 21.7 g de resina. < Determinación de la carga resultó en 0.41 mmol/g.
Etapa 2 : NI- (3- ( (35, 8S, 9S, 10R, 13R, 14S, 17R) - 10 , 13 -dimeti'l - 17-( (R) -6-metilheptan-2-il) -2 , 3 , 4 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17-tetradecahidro- ??-ciclopenta [a] fenantren-3-iloxi) propil) -N4-( (S) -1- (2- (4- (hidroximetil ) fenilamino) -2-oxoetilamino) -Ir oxopropan-2 il ) succinamida La resina de la etapa 1 (1 g, 410 µp??? , Eq: 1.00) se prelavó con DMF (2 X) y se trató con piperidina D -l/4 (10 mL) durante 5 y 10 minutos. La resina se lavó alternativamente con DMF e IPA (3 X 10 mL) . Una solución de Fmoc-Gly-OH (488 mg, 1.64 mmol , Eq: 4), TPTU (487 mg,j 1.64 mmol, Eq: 4) y base de Huenig (636 mg, 859 µ?, 4.92 mmol, Eq: 12) en DMF (10 mL) se agitó durante 5 minutos y después se agitó con la resina por una hora. La resina se lavó alternativamente con DMF y alcohol isopropílico (3X) .
Los cortes de Fmoc siguientes y acoplamientos de Fmoc-Ala-OH subsecuentes (511 mg, 1.64 mmol, Éq : 4) y ácido N-{3-[(35,85,95,10R,13R,14S,17R)-17-((R)-l,5-Dimetil-hexil ) - 10 , 13 -dimetil -2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 -tetradecahidro- 1H-ciclopenta [a] fenantren-3-iloxi] -propil } -succinámicó (ejemplo 1, etapa 2) (892 mg, 1.64 mmol, Eq : 4) se llevó a cabo en consecuencia. La resina de péptido seca se agitó durante aproximadamente 2 X 30 min en TFA 1%/DCM (2 X 20 mL) . La mezcla de reacción se filtró y la resina se . lavó con DCM. Los filtrados se agruparon y los solventes se evaporaron al vacío. El material crudo se trituró con éter dietílico (2 x) . Después de purificación mediante cromatografía de vaporización instantánea, el producto ( 84 mg, 97.3 µp???) se obtuvo como un sólido blanco.
EM masa esperada : 776.5452 , masa encontrada 776. $455 Etapa 3 : El alcohol NI- (3 - ( (35 , 8S, 9S, 10R, 13R, 14S , 17R) -10, 13-dimetil-17- ( (R) - 6met i lhe tan - 2 - i 1 ) -2,3,4,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 - tet radecahidro- 1H- ;' ; c ic lo enta [a] fenantren-3- i lo i )propil) -N4- ( ( S ) - 1 - ( 2 -(4- ( hidroximet i 1 ) fenilamino) - 2 - oxoet i lamino ) -1-oxopropan- 2 - i 1 ) succ inamida [RO 5545270 ] arriba prepárado (70 mg, 90.1 µp??? , Eq : 1.00) y carbonato de bis(4-nitrofenilo) (137 mg , 450 µt???, Eq : 5) bajo Argón a temperatura ambiente se disolvieron en DMF (4 mi) y se trataron con base de Huenig (34.9 mg , 47.2 µ1> 270 mot , Eq : 3) . y la mezcla se dejó reaccionar durante la noche. El solvente se removió al vacío. El sólido resultante se trituró con éter dietílico. El sólido se recolectó mediante filtración y se lavó con éter dietílico. El producto se secó al vacío para obtener el compuesto del título (84 mg , 80.2 µ????) como un sólido café claro.
EM masa esperada : 941.5514 , masa encontrada 941.5518 Ejemplo 19 N- [4- ( {3- [ (3beta) -colest-5-en-3-iloxi] propil } amino) -4÷ oxobutanoil] -L-leucil-N- [4- ( { [ (4- nitrofenoxi) carbonil] oxi}metil) fenil] -L-metioninamida Adición de alcohol FM0C-4-aminobencílico ; a : la resina 2 -clorotritilo Se preparó en analogía al Ejemplo 18, etapa 1.
Etapa 2 NI- (3 - ( (35, 8S, 9S, 10R, 13R, 14S, 17R) -10, 13 -dimetil -17-( (R) - 6 -met ilheptan- 2 - il ) -2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tet adecahidro-lH-ciclopenta [a] fenantren-3-iloxi) rop i 1 ) -N4 - ( ( S ) ÷1-( (S) -1- (4- (hidroximetil) fenilamino) -4- (metiltio) - I -oxobutan- 2 - i lamino ) - 4 -met i 1 - 1 - oxopentan- 2 -i 1 ) succ inamida .' ' Se preparó en analogía al Ejemplo 18 > etapa 2, usando Fmoc-Met-OH (609 mg, 1.64 mmol, Eq : 4) y Fmoc-Leu-OH (580 mg , 1.64 mmol, Eq: 4) como aminoácidos.
El producto ( 208 mg , 210 µp\?1) se obtuvo cómo un sólido amarillo claro.
EM (ISP) : (M+H) 893.6183 Etapa 3 Se preparó en analogía al Ejemplo 18, etapa 3. Después de la purificación sobre gel de sílice, el compuesto del título (161 mg, 137 praol) se obtuvo como sólido café claro.
EM masa esperada : 105 .617 , masa encontrada 1057.6184 Ejemplo 20 N- [4 - ({3 - [ ( 3beta ) - colest-5-en-3 - i lo i ] ropi 1 } amin'o ) - 4 -oxobutanoil] -L-leucil-N-1- - [4 - ({ [ (4- nit rof enoxi ) carbóni 1 ] oxi }met il ) feni 1 ] - L- aspa tamida Etapa 1 : Adición de alcohol FMOC - 4 - aminobenc í 1 i co a la resina 2 - c lorotrit i lo se llevó a cabo en analogía al Ejemplo ; 18, etapa 1.
Etapa 2 (S)-2-((S)-2-(4-(3- ( (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R) -10, 13 - dimet i 1 - 17 - ( (R) -6- met i lhept an- 2 - il ) - 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17 - tet radecanid o - lH-ciclopenta [a] fenantren-3-iloxi) propil amino ) - 4 - oxobutanamido) - 4 - met i lpent anamido ) -NI- (4- ( hidroximet i 1 ) fenil) succinamida Se preparó en analogía al Ejemplo 18, etapa 2, usando Fmoc-Asn-OH (581 mg , 1.64 mmol , Eq : 4) y Fmoc-Leu-OH (580 mg , 1.64 mmol, Eq: 4) "como aminoác idos .
El producto (87 mg , 89.4 µp???) se obtuvo :como un sólido amarillo claro.
EM masa esperada : 875.6136 , masa encontrada 875.6133 : Etapa 3 El compuesto del título se preparó 1 en analogía al Ejemplo 18, etapa 3. Después de la purificación sobre gel de sílice (87 mg, 89.4: µt??? el compuesto del título se obtuvo como sólido café claro.
EM masa esperada: 1040.6198, masa encontrada 1040.6188 Ejemplo 21 N- [4- ({3 - [(3beta) -colest-5-en-3-iloxi] propil} amino ) - 4 -oxobutanoil] -L-alanil-N-l~- [4- (( [ (4- nitrofenoxi) carbonil] oxi }metil) fenil] -L-aspartamida Etapa 1 : Adición de alcohol FMOC - 4 - aminobenc í 1 i co a la resina 2 - c lorotri t i 1o \ se llevó a cabo en analogía al Ejemplo ' 18, etapa 1.
Etapa 2 (S) -2- ( (S) -2- (4- (3-( (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R) -10,13-dimetil-17- ( (R) - 6 met i lheptan- 2 - i 1 ) - 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17 - tet adecahidro¦ lH-ciclopenta[a] fenantren-3-i lo i ) rop i 1 amino ) - 4 oxobutanamido) propanamido) -Nl- (4-(hidroximetil) fenil) succinamida Se preparó en analogía al Ejemplo 18, etapa 2, usando Fmoc-Asn-OH (581 mg, 1.64 mmol , Eq : 4) y Fmoc-Ala-OH (511 mg, 1.64 mmol, Eq: 4) como aminoácido.
El producto (140 mg, 159 µp???) se obtuvo como sólido amarillo claro. EM (ISP) : (M+H) 834.8 (M+Na) 856.7 Etapa 3 El compuesto del título se preparó en analogía al Ejemplo 18, etapa 3. Después de la purificación sobre gel de sílice (169 mg, 152 µ????) se obtuvo como sólido café claro.
EM masa esperada : 998.5729, masa encontrada 998.5739 Ejemplo 22 N-2-- [4 - ({3 - [ (3beta) -colest-5 -en-3 -iloxi] ropil }amino) -4 - oxobutanoil] -L-asparaginil -N- [4 ( { [ (4- nitrofenoxi ) carbonil] oxi }metil ) fenil] glicinamidá Etapa 1 : Adición de alcohol FMOC-4 -aminobencílico resina 2 -clorotritilo Se llevó a cabo en analogía al Ejemplo 18, etapa 1 Etapa 2 (S) -2- (4- (3- ( (3S, 8S, 9S, 10R, 13R, 14S , 17R) -10 ; 13 -dimetil-17- ( (R) -6-metilheptan-2-il) - 2,3, 4, 7, 8,9, 10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-tetradecahidro-lH-ciclopenta [a] fenantren-3-iloxi) propilamino) -4 -oxobutanamido) NI- (2- (4- (hidroximetil) fenilamino) -2-oxoetil) succinamida Se preparó en analogía al Ejemplo 18, etapa 2, usando Fmoc-Gly-OH (488 mg, 1.64 mmol, Eq: 4) y Fmoc-Ajsn-OH (581 mg, 1.64 mmol, Eq: 4) como aminoácidos.
El producto (140 mg, 162 µp???) se obtuvo como sólido blanco.
EM masa esperada : 819.551 , masa encontrada 819.5503 Etapa 3 : El compuesto del título se obtuvo en analogía al Ejemplo 18, etapa 3 (176 mg, 161 µtt???) como sólido café claro.
EM masa esperada: 984.5572, masa encontrada 984.5489 Ejemplo 23 N- [4 - ({3 - [(3beta) -colest-5-en-3- i lo i ] propi 1 } amiho ) 4-oxobutanoil] - L- fenilalanil-N- [4 ({ [ ( 4 nitrofenoxi) carbonil] oxi }metil) fenil] gli c iríami da Etapa 1 : , Adición de alcohol FMOC - 4 - aminobenc í 1 i co á la resina 2 -clorotritilo Se llevó a cabo en analogía al Ejemplo 18, etapa 1.
Etapa 2 : NI- (3 - ( ( 35 , 8S , 9S , 10R, 13R, 14S , 17R) -10 , 13 -dimet i 1 - 17 - ( (R) - 6 -met ilheptan- 2 - il ) - : 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro- ; ??-ciclopenta [a] fenantren-3-iloxi)propil) -N4- ( (S) - 1 -( 2 - ( 4 - ( hidroximet il) fenilamino) - 2- oxoetilamino) -:l - ';¦ oxo -3-fenilpropan-2-il) succinamida Se preparó en analogía al Ejemplo 18, etapa 2, usando Fmoc-Gly-OH (488 mg, 1.64 mmol, Eq: 4) y Fmoc-Phe-OH (635 mg, 1.64 mmol, Eq: 4) como aminoácidos.
El producto (259 mg, 288 µ????) se obtuvo como sólido blanco. ? EM masa esperada : 852.5765 , masa encontrada 852.5754 Etapa 3 El compuesto del título se obtuvo en analogía al Ejemplo 18, etapa 3. (280 mg, 247 µ????) como sólido café claro.
EM masa esperada: 1017.5827, masa encontrada 1017.5775. '. ' Ejemplo 24 N- [4- ( {3 - [ (3beta) -colest-5-en-3-iloxi] propil } aminó) -4 oxobutanoil] -L-leucil-N- [4- ( { [ (4nitrofenoxi) carbonil] oxi }metil) fenil] glicinam'ida Etapa 1 : Adición de FMOC-4 -aminobencilalcohol a la resina" 2-clorotritilo Se llevó a cabo en analogía al Ejemplo 18, etapa 1 Etapa 2 NI- (3- ( (3S, 8S, 9S, 10R, 13R, 14S, 17R) - 10 , 13 -dimetil - 17-( (R) -6-metilheptan-2-il) -2 , 3 , 4 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14, 15, 16, 17-tetradecahidro- lH-ciclopenta [a] fenantren-3-iloxi) prop'il) -N4-( (S) -1- (2- (4- (hidroximetil) fenilamino) -2-oxoetilamino) -4-me i1 - loxopentan- 2 - i1 ) succinamida Se preparó en analogía al Ejemplo 18, etapa . 2, usando Fmoc-Gly-OH (488 mg, 1.64 mmol , Eq: 4) y Fmoc-Leu-OH (580 mg, 1.64 mmol, Eq: 4) como aminoácidos.
El producto (240 mg, 278 µ????) se obtuvo comq: un sólido amarillo claro.
EM masa esperada: 818.5921, masa encontrada 818.5921 Etapa 3 ' ' '..
El compuesto del título Se preparó en analogía , ál Ejemplo 18, etapa 3. Después de la purificación sobre gel de sílice, esto (194 mg, 177 µ????) se obtuvo como sólido amarillo claro.
EM masa esperada: 983.5983 masa encontrada 983.6004 Ejemplo 25 N- [4- ({3- [ (3beta) -colest-5-en-3-iloxi] propil )amiiio) -4- oxobutanoil] -L-leucil-N- [4- ( { [ (4- nitrofenoxi) carbonil] oxijmetil) fenil] -L-fenilalaninamida Etapa 1 : Adición de FMOC-4 -aminobencilalcohol a la resina 2-clorotritilo Se 18, etapa 1 Etapa 2 Nl-(3-( (35,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimetil-17- ( (R) -6-metilheptan-2-il) -2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17 - te t radecahidro - , ??-ciclopenta [a] fenantren-3- i loxi ) prop il) -N4 - ( (S) -1·-( (S) -1- (4- (hidroximetil) fenilamino) -1- oxo -feni lpropan- 2 - i lamino ) -4-metil-l- oxopentan il) succinamida Se preparó en analogía al Ejemplo 18, etapa 2, usando Fmoc-Phe-OH (635 mg , 1.64 mmol , Eq: 4) y Fmoc-Leu-OH (580 mg , 1.64 mmol, Eq: 4) como aminoácidos . ,, El producto (153 mg , 151 µ????) se obtuvo como sólido amarillo claro.
EM masa esperada: 908.6391 masa encontrada 908.637.
Etapa 3 : El compuesto del título se preparó en analogía al Ejemplo 18, etapa 3. Después de la purificación sobre gel de sílice, esto (117 mg, 98 µp???) se obtuvo como sólido blanco.
EM masa esperada : 1073.6453 masa encontrada 1073.646.
Ejemplo 26 N - [4- ({3- [ (3beta) -colest-5-en-3-iloxi]propil} ami o) - 4 - oxobut ano i 1 ] -L-fenilalanil-N- [4 ({ [ ( 4 - nit rof enoxi ) carbón il] o i} me til) fenil] - L- fenilalaninamida Etapa 1 : Adición de FMOC - 4 - aminobenc i la lcohol resina 2 - c loro t r i i lo Se llevó a cabo en analogía al Ejemplo1 etapa 1.
Etapa 2 Nl- (3- ( (35,8S, 9S,10R,13R,14S,17R) -10,13-dimetil-17- ( (R) - 6 -met ilheptan- 2 - il ) - 2,3,4,7,8, 9,10,11,12, 13,14,15,16, 17 - t e t radecah i.dro 1H- c i c 1 opent a [a] fenantren-3-i loxi )propil) -N4- ( (S) -1 ( (S) -1- (4 - (hidroximetil) fenilamino) -l-oxo-3-f en i lpropan- 2-ilamino) -l-oxo-3-feni lpropan - 2 - il) succinamida Se preparó en analogía al Ejemplo 18, etapa 2, con Fmoc-Phe-OH (635 mg, 1.64 mmol , Eq: 4) como aminoácido.
El producto (240 mg, 204 µp???) se obtuvo como sólido amarillo claro.
EM masa esperada: 942.6234 masa encontrada 942.6218 Etapa 3: El compuesto del título se preparó de forma análoga al ejemplo 18, etapa 3. Después de la purificación sobre gel de sílice, esto (190 mg, 154 µ?t???) se obtuvo como sólido blanco . ' ¦', EM masa esperada: 1107.6296 masa encontrada 1107.6287 Ejemplo 27 N- [4 - ((3 - [ (3beta) -colest-5-en-3- i loxi ] rop il } amino) - 4-oxobutanoil] -L-leucil-N- [4- ({ [(4- ni t rofenoxi ) carbóni 1 ] oxi ) met i 1 ) fenil] - L - leucinamída Etapa 1 : Adición de alcohol FMOC - 4 - aminobenc í 1 i co a-la resina 2 - c lorotri t i lo Se llevó a cabo en forma análoga al ejemplo 18 , etapa 1.
Etapa 2 NI- ( 3 - ( ( 35 , 8S , 9S , 10R, 13R, 14S , 17R) - 10 , 13 -dimetil-17- ( (R) - 6 -met i lheptan - 2 - il ) - 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17 - tet radecahidrp -lH-ciclopenta [a] fenantren-3-iloxi) ropil) -N4- ( (S) - 1 -( ( S ) - 1 - ( 4 - (hidroximet il ) fe i lamino ) - 4 -met i 1 - 1 -oxopentan- 2 - i 1 amino ) - 4 -met i 1 - 1 - oxopentan - 2 -i 1 ) succ inamida : Se preparó en analogía al Ejemplo 18, etapa 2, con Fmoc-Leu-OH (1.59 g, 4.5 mmol , Eq : 3) como aminoácido.
El producto (254 mg, 284 µp???) se obtuvo como sólido blanco.
EM masa esperada : 874.6547 masa encontrada 874.6527 Etapa 3 El compuesto del título se preparó en analogía al Ejemplo 18, etapa 3. Después de la purificación sobre gel de sílice esto se obtuvo como sólido blanco (178 mg, 168 µp???) .
EM masa esperada : 1039.6609 masa encontrada 1039.6588 Ejemplo 28 N- [4 - ( { 3 - [ (3beta) -colest-5-en-3-iloxi] propil ) amirio) -4 - oxobutanoil] -L-alanil-N- [4 - ( { [ (4- nitrofenoxi) carbonil] oxijmetil) fenil] -L-alaninamida Etapa 1 Ester 9H- f luoren- 9 - i lmet í 1 ico de ácido {(S) 1- [ (S) -1- ( 4 - hidroximet i 1 - feni lcarbamoi 1 ) -et i lcarbamoi 1 ] - et i 1 } - carbámico Una solución de Fmoc -Ala -Al a - OH (1 g, ^.61 mmol, Eq: 1.00) y ( 4 - aminofeni 1 ) metanol (483 mg , 3.92 mmol, Eq: 1.5) en THE (20 mi) se trató con ÉEDQ ' (970 mg, 3.92 mmol, Eq: 1.5) . La solución se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla se diluyó con 2-propanol al 10%/acetato de etilo (100 rnL) y la solución se lavó con KHS04 5%/K2S04 10% (2 X), -agua (IX) y salmuera (IX) , se secó sobre Mg504 y se evaporó al vacío. El residuo se sometió a sonificación en éter dietílico durante varios minutos y el sólido se recolectó mediante filtración para obtener el producto (1.27 g, 1.2 mmol) como sólido café claro.
EM (ISP) : (M+H) 488.3 Etapa 2 : ( S ) - 2 -Amino-N- [ (S) -1- (4-hidroximetil-fenilcarbamoil ) -etil] -propionamida El compuesto se preparó en analogía al Ejemplo 1 etapa c para obtener el producto (245 mg, 877 µp???) tomo sólido amarillo claro.
EM (ISP): (M+H) 266.3, (M+Na) 288.2 (2M+H) 531.3 Etapa 3 : NI- (3- ( (35,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimetil-17-((R)-6-metilheptan-2-il)2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 16,17-tetradecahidro-lH-ciclopenta [a] fenantren-3-iloxi) ropil) -N4-((S)-l-((S)-l-(4-( hidroximet i 1 ) fenilamino) - 1 -oxopropan- 2 - ilaminó) -1 oxopropan- 2 - il ) suc c inamida El compuesto se preparó en analogía, , al Ejemplo 16 etapa 2 (165 mg , 198 µp???) como sólido café claro .
EM masa esperada: 790.5608, masa encontrada 790.5587 Etapa 4 El compuesto del título Se preparó en analogía al Ejemplo 18, etapa 3. Después de la purificación sobre; gel de sílice esto se obtuvo como sólido blanco (99 mg, 98.4÷µ????1) .
EM masa esperada: 955.567, masa encontrada 955.5651 Ejemplo 29 N- [4 - ({3 - [ (3beta) -colest-5-en-3-iloxi]propil}amino);-4- oxobutanoil] -L-isoleucil nitrofenoxi) carbonil] oxi }metil) fenil] -L-aspartámida Etapa 1 Ácido - [ (2S, 3S) -2- (9H-Fluorén-9-ilmetoxicarbonilamino) -3 -metil-pentanoilamino] succinámÍQO¡ Resina de cloruro de 2 -clorotritilo (5 g, 7.5 mmol, Eq: 1.00) se aumentó en DCM y después se trató con. una solución de Fmoc-Asn (Trt) -OH (8.95 g, 15.0 mmol, . Eq : ;2) y base de Huenig (3.88 g, 5.1 mi, 30.0 mmol, Eq: 4) en DCM durante la noche. La resina se lavó con DCM y se tapó con una solución de base de Huenig al 10% en metanol . Se acopló Ftnoc-Ile-OH (5.3 g, 15.0 mmol, Eq: 2) con TPTU (4.46 g, 15.0 mmol, Eq: 2) y base de Huenig (3.88 g, 5.1 mi, 30.0 mmol, Éq: 4',) , de acuerdo con la síntesis de péptido de fase sólida estándar. El producto se cortó de la resina con un coctel de TFA/Agua/triisopropilsilano (95/2.5/2.5 v/v/v) durante dos horas a temperatura ambiente. La resina se filtro y'y el filtrado se concentró bajo presión reducida hasta un volumen pequeño. Después de trituración con éter dietílico, el producto se filtró y se secó al vacío para obtener el producto (2.85 g, 5.79 mmol) como sólido blanco.
EM masa esperada: 467.2056, masa encontrada 467.2056 Etapa 2 Ester 9H-fluoren-9-ilmetílico de ácido {(1S,2S)-1- [2-carbamoil-l- ( (5) -4-hidroximetil-fenilcarbamoil) -etilcarbamoil] -2-metil-butil} -carbámico El compuesto se preparó en analogía al Ejemplo 28 etapa 1 (620 mg, 336 µp???) como sólido amarillo claro.
Etapa 3 (S) -2- ( (2S, 3S) -2-Amino-3-metil-pentanoilamiño) (4 -hidroximetil- fenil ) succinamida El compuesto se preparó en analogía al Ejemplo 1 etapa c (100 mg , 228 µ????) como -sólido amarillo claro.
Etapa 4 (S)-2-((2S,3S)-2-(4-(3- ( (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R) -10, 13 - dimet i 1 - 17 - metilheptan-2-il)- 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17 - te t radecana drp;-??-ciclopenta [a] fenantren-3-iloxi) prop i lamino ) j- 4 -oxobutanamido ) - 3 - met i lpent anamido ) -NI - ( 4 - ¦ '¦ ¡' '! ' ? " J (hidroximetil) fenil) succinamida ; '! '! El compuesto se preparó en analogía al Éjemplp ie etapa 2 (89 mg, 91.4 µ????) como sólido amarillo claro.! ;; i i Etapa 5 El compuesto de la etapa previa se hizo reaccionar para el compuesto del título en forma análoga al ej eiriplo',; 18 , etapa 3. Después de la purificación sobre gel de sílide, ¡ssto (42 mg, 36.3 µ????) se obtuvo como un sólido café clar.óí EM masa esperada: 1040.6198, masa encontrada 1040.6177 ;¡ , Ejemplo 30 1 N- [4 - ({3 - [ (3beta) -colest-5-en-3 - iloxi] ropil } amino ) - 4 - oxobutanoi 1 ] - L - feni lal ani 1 -N- 6 - [ (4- : '<¦ · metoxifenil) (difenil) metil] -N- [4- ( { [ (4- i': ' ni t rofenoxi ) carboni 1 ] oxi } met i 1) fenil]D-li sinamida El compuesto se preparó en analogía al Ejemplo 16 etapa 1, empezando con Fmoc-D-Lys (Boc) OH, (158 mg, 116 u'mol) como sólido café claro. ! EM (ISP) : (M+H) 1362.8 (M+Na) 1383.8 Ejemplo 31 N- {15- [ (3beta) -colest- 5-en-3 - iloxi ) -4 , 15-dioxo-8, 11-dioxa- 5 , 14 -diazapentadecan-l-oil } -L-fenilalanil -N-6~- [ (4 - ',. metoxifenil) (difenil) metil] -N- [4- ( { [ (4- nitrofenoxi) carbonil] oxi}metil) fenil] -L- lisinamida El compuesto del título se preparó análogo al ejemplo 16 usando un derivado de colesterol -oligo-PEG eri la etapa 2 de la síntesis.
EM (ISP) : (M+H) 1479.8 El intermediario de colesterol -PEG necesario ácido N- [2 - (2- {2 - [3S, 8S, 9S, 10R, 13R, 14S, 17R) -17- ( (R) - 1 , 5 -dime il hexil) -10, 13-dimetil- 2, 3 ,4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17 tetradecahidro-lH-ciclopenta [a] fenantren-3-iloxicarbonilamino] -etoxi } -etoxi) -etil] -succinámico para la etapa 2 se preparó como sigue: Etapa a: éster (3S, 8S, 9S, 10R, 13R, 14S, 17R) - 17 ( (R) 1 , 5-dimetil -hexil) -10 , 13 -dimetil - 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-tetradecahidro-lH-ciclopenta [a] fenantren-3-ilo de ácido { 2 - [2 - ( 2 -Amino-etoxi ) -etoxi] -etil} -carbámico Una solución de cloroformato de colesterilo (i; g, 2.23 mmol) en 25 mL diclorometano se añadió por goteo bajo agitación a una solución de 2 , 21 - (etilenedioxi)bis- (etilamina) (495 mg, 3.34 mmol) en 75 mL diclorometano. La reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente.' La reacción se diluyó con diclorometano y se extrajo con agua. El extracto orgánico se secó sobre MgS04 anhidro '. se deshidrató, filtró y evaporó. Después de la purificación sobre gel de sílice modificado con amino (elyuente: MeCl;2-> MeC12/MeOH=975 : 25 v/v) el producto (615 mg) se obtuvo como, un sólido ceroso blanco.
EM (ISP) : (M+H) Etapa ácido N-[2- (2-{2- [ (3S, 8S, 9S, 10R, 13R, 14S, 17R) -17- ( (R) -1 , 5 -Dimetil -hexil ) -10, 13-dimetil-2 , 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-tetradecáhidro-lH-ciclopenta [a] fenantren-3-iloxicarbonilamino] -etoxi } -etoxi) -etil] -succinámico La amina de la etapa a (480 mg, 0.856 mmól) y trietilamin (0.13 mL, 0.94 mmol) se disolvieron en 5 mL diclorometano . Después de añadir anhídrido succínico ( 90¡mg, 0.9 mmol) la solución se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La revisión TLC mostró aún material de partida. Se añadió más anhídrido succínico (20 mg, 0.2 mmol) . Después' de agitar la reacción durante otras 3 horas a temperatura ambiente, se diluyó con diclorometano y se lavó con', una mezcla de KHS04 al 5%/ K2S04 al 10%. El extracto orgánico se secó sobre gS04 anhidro se deshidrató, filtró y evaporó ,, al vacío para obtener el ácido deseado (490 mg, 0.667 mmol) .....
EM (ISP) : (M+H) 661.5 Ejemplo 32 N- [30- [ (3beta) -colest-5-en-3-iloxi } -4 , 30-dioxo-, ; ;; ', 8, 11, 14 ,17, 20, 23, 26-heptaoxa-5 , 29-diazatriacontan-l-oiL} -L- fenilalanil-N-6~- [ (4 -metoxifenil) (difenil) metil] [4- ( { [ (4nitrofenoxi) carbonil] oxi} metil ) fenil] -L- lisinamida El compuesto del título Se preparó análogo al ejemplo 16 usando un derivado de colesterol-PEG en la etapa 2 de la síntesis.
EM (ISP) : (M+H) 1699.9 El intermediario de cholesterol - PEG necesario 1 ácido 1- [ (3beta) -colest-5-en-3 -iloxi] -1, 27-dioxo5, 8 , 11 , 14 , 17 , 20 , 23-heptaoxa-2 , 26-diazatriacontan-30-oico para la etapa 2 se preparó como sigue: Etapa a: [25- ( { (3S , 8S , 9S , 10R, 13R, 14S , 17R) - 10 , 13 -dimetil-17- [ (2R) -6-metilheptan-2-il] - 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-tetradecahidro-lH-ciclopenta [a] fenantren-3il}oxi) -25-oxo-3, 6, 9, 12, 15, 18, 21-heptaoxa-24-azapentacos-l-il] carbamato de tert-butilo ': Cloroformiato de colesterilo (476 mg, 1.06 mmol) y trietilamina (155 uL, 1.113 mmol) se disolvieron en .5 mL de diclorometano . Después una solución de alfa-amino-omega-boc-aminoocta (etilenglicol) (497 mg, 1.06 mmol) se disolvió en 1 mL de diclorometano se añadió. La solución se agitó durante la noche a temperatura ambiente y se diluyó con diclorómetaño y se extrajo con una mezcla acuosa de KHS04 al 5%/K2SÓ4 al 10%. El extracto orgánico se secó sobre MgS04 anhidro, se filtró y se evaporó al vacío. Después de la purificación sobre gel de sílice (eluyenté: MeCl2/MeOH=975 : 25-> 95:5 v/v) el producto (530 mg, 0.571 mmol) se obtuvo como un aceite incoloro .
EM (ISP) : ( +NH4) 898.7 Etapa b : ácido 1- [ (3beta) -colest-5-en-3-ildxi] - 1, 27-dioxo-5, 8, 11, 14, 17, 20, 23 -heptaoxa-2 , 26 -diazatriacontan- El derivado Boc previo (450 mg, 0.511 mmol) se disolvió en 4M HC1 en dioxano (10.2 mL, 40.9 mmol) . La solución se agitó a temperatura ambiente durante 40 min. El solvente se removió al vacío y el sólido blanco restante se disolvió en 5 mL de diclorometano y se trató con trietilamina (32 uL, 0.229 mmol) y anhídrido succínico (11.5 mg, 0.114 mmol) durante la noche. Se añadió más anhídrido succínico' (11 mg, 0.11 mmol, 0.2 equiv.) y después de 60 min, se diluyó la reacción con diclorometano y se lavó con rgulador de pH ' de KHS04 al 5%/K2S04 al 10%. El extracto orgánico se secó sobre MgS04 anhidro, se filtró y se evaporó para obtener 390 mg del producto deseado.
EM (ISP) : (M+H) 881.7 Ejemplo 33 N- (66- [ (3beta) -colest-5-en-3 -iloxi] -4 , 66-diox'o- 8, 11, 14, 17, 20, 23,26, 29, 32,35, 38,41,44,47, 50, 53, 56/ 59, 6,!,2- nonadecaoxa-5 , 65 -diazahexahexacontan- 1-oil } -L- fenilalanil-N- 6~- [ (4-metoxifenil) (difenil) metil] -N- [4- ( { [ (4- nitrofenoxi) carbonil] oxijmetil) fenil] -lisinamida El compuesto del título se preparó análogo al ejemplo 16 usando un derivado de colé s terol - PEG en la etapa 2 de la síntesis.
EM (ISP) : (M+H) 2228.1 El intermediario de cholesterol - PEG necesario ácido 1 - [ ( bet a ) - col est - 5 - en- 3 - i loxi ] - 1 , 63 - dioxo - . 5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,5 9 - nonadecaox - 2 , 62 - di azahexahexacontan - 66 - oico ; Para la etapa 2 se preparó como sigue: Etapa aj_ (59-amino- 3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57 nonadecaoxanonapentacont- 1-il) carbamato de (3beta) -colest-5- Alfa, omega-bis-amino 20 (etilenglicol ) (538 mg, 0.6 mmol) y trietilamina (92 uL, 0.66 mmol) se disolvieron en 15 mL de diclorometano seco. Una solución de cloroformiato de colesterilo (270 mg, 0.6 mmol) en 2 mL de diclorometano seco se añadió por goteo a temperatura ambiente. La solución se agitó durante la noche, después se concentró al vacío hasta un volumen pequeño y se purificó directamente sobre gel de sílice (eluyent: MeC12/MeOH=95 : 5- > 9:4-> 4:1 v/v) para obtener' el producto (350 mg, 0.254 mmol) como un sólido ceroso.
EM (ISP) : (M+H) 1309.9 Etapa b : ácido 1- [ (3beta) -colest-5-en-3-iloxi] -1, 63-dioxo-5, 8, 11, 14, 17, 20, 23 , 26, 29, 32 , 35, 38, 41, 44, 47 50, 53, 56, 59-nonadecaoxa-2 , 62-diazahexahexacontan-66-oico La amina de la etapa a (329 mg, 0.251 mmol), anhídrido succínico (26.4 mg, 0.264 mmol) y trietilamina. (40 uL, 0.286 mmol) se disolvieron en 5 mL de diclorometano seco. Después de añadir más trietilamina (40 uL, 0.286 mmol),, la solución (pH>8) se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La reacción se diluyó con diclorometano y se, lavó dos veces con una mezcla acuosa de KHS04 al 5%/K2S04 alJ 10%. El extracto orgánico se secó sobre MgS04 anhidro, se filtró y se evaporó para obtener el producto (260 mg, 0.175 mmol) 1 como un sólido ceroso incoloro.
EM (ISP) : (M+NH4) 1408.9 t Los siguientes ejemplos de trabajo ilustran la invención : Ejemplo 34 Procedimiento general para la preparación de conjugados de ARN Materiales Se compraron sulfóxido de dimetilo (DMSO) , ,N-diisopropiletilamina (DIPEA) y solución de acetato de sodio (3 M, pH 5.2) de Sigma Aldric Chemie GmbH (Traüfkircen, Alemania) .
Se compraron acetato de trietilamonio (TEAA) > (2.0 , pH 7.0) y acetonitrilo (ACN, calidad HPLC) para RP-HPLC de Biosolve (Valkenswaard, Países Bajos) .
Se compró etanol (EtOH, p.a.) de Merck (Darmstádt, Alemania) . Se usó agua purificada de un sistema Optilab HF (Membra Puré, Alemania) .
Se compró columna RPC recurso de 3 mL (10 x ,0, ,64 cm; 15 pm tamaño de partícula) de GE Healthcare (Ffeiburg, Alemania) .
Se llevó a cabo purificación HPLC usando un sistema AKTA Explorer 100 (GE Healthcare) .
Síntesis de ARN modificado con amino AR equipado con un aminoenlazador en el extreme 5' de la cepa de sentido se produjo por química fosforamidita estándar en fase sólida a una escala de 1215 µp??? usando un AKTA Oligopilot 100 (GE Healthcare, Freiburg, Alemania) y vidrio de poro controlado como soporte sólido (Prime Synthesis, Aston, PA, EUA) . ARN que contiene nucleótidos de 21 -O-metilo se generaron usando las fosforamiditas correspondientes, fosforamiditas 2 ' -O-metilo y amidita de TFAhexilaminoenlazador (Sigma-Aldric , SAFC, Hamburgo, Alemania) . Corte y desprotección así como la purificación se logró por métodos conocidos en el campo (Wincott F., et al, NAR 1995, 23,14, 2677-84) .
El ARN modificado con amino se caracterizó por HPLC de intercambio de aniones (pureza: 96.1%) y se confirmó la identidad por ESI-EM ( [M+H] 1+ calculado: 6937.4; [M+H] 1+ medido: 6939.0.
Secuencia: 5 '- (NH2C6 ) GGAAUCuuAuAuuuGAUCcAsA- 3 ' ; u, c: nucleótidos de 21 -O-metilo de nucleótidos de ARN correspondientes, s: fosfortioato .
Procedimiento de conjugación experimental general Los compuestos de los títulos de los ejemplos 1-33 se acoplaron mediante ARN modificado con amino de acuerdó con el siguiente procedimiento: ARN equipado con aminoenlazador C6 en el extremo 5' (16.5 mg, 1 equivalente) se disolvió en 500 µ?? de DMSO y 150 µ!?1? de agua. El derivado de p-Nitrofenilcarbonatp (10 equivalentes) se disolvió en 1 mL de DMSO se añaden seguidos de 8 µ?- de DIPEA. La mezcla de reacción se agitó a 35°C en la oscuridad y se monitoreó usando RP-HPLC (RPC recurso 3 mL, regulador de pH: A: 0.1M TEAA en agua, B: 0.1M TEAA $n 95% ACN, gradiente: 3% B a 100% B en 20 CV) . Un vez que la reacción se ha ido hasta su finalización el conjugado de ARN se precipita usando acetato sódico (3 M) en EtOH a -20 0 C. Para ejemplos que carecen de un grupo protector de MMT en el motivo dipéptido los conjugados correspondientes se purifican usando las condiciones descritas anteriormente. Las fracciones puras se combinaron y el material se precipita usando acetato de sodio / EtOH para dar el conjugado de ARN deseado.
Los conjugados de ARN que contienen un grupo protector de MMT en la secuencia de dipéptido se procesan adicionalmente de acuerdo con el procedimiento dado a continuación.
Procedimiento general para corte de MMT El sedimento de conjugado de ARN crudo se disuelve en 500 uL de agua y 1.5 mL de regulador de pH de acétalo de sodio (3 M, pH 5.2 ó 0.1 M, pH 4.0). La solución se agita durante 2 días a 30°C. La solución se agita durante 2 días a 30°C. La mezcla de reacción se monitorea usando RP-HPLC (RPC ? de recurso 3 mL, regulador de pH: A: 0.1 M TEAA en agua, B: TEAA 0.1M en 95% ACN, gradiente: 3% de B a 100% B en 2?! CV) . Después del corte completo del grupo protector MMT el conjugado de ARN se purifica directamente usando* las condiciones recién mencionadas arriba. Se agrupan fracciones ? puras y el conjugado deseado se precipita usando acetato de sodio/EtOH.
Como un control, un conjugado de ARN que carece del motivo de dipéptido fue sintetizado. Para este propósito se fijó colesterol al extremo 5' por medio de un enlá¿ador ,1 descrito en la literatura (Nature Biotech, 2007, 25, 1149) . Este conjugado se conoce como "no cortable" .
Todos los conjugados de ARN fueron analizados mediante RP HPLC para pureza y la identidad se confirmó por ESI MS (modo negativo) . Brevemente, RP-HPLC se llevó a cabo en un sistema Dionex Ultímate (Dionex, Idstéin, Alemania) equipado con una columna XBridge Cis (2.5 x 50 mm, 2.5 µ?? de tamaño de partícula, aters, Eschborn, Alemania) a 65 °C de temperatura de columna. Elución' por gradientes se llevó a cabo usando 100 raM de hexaf luoroi.sopropanol (HFIP) y 16 raM de trietilamin^ en metanol al 1% como eluyente A y en metanol al 95% como eluyente B (1% de B a 18% de B en 30 minutos) La detección UV se registró a 260 nm. Para el análisis espectrométrico de masas un sistema ThermoFinnigan : LCQ DecaXP ESI-MS con fuente de microaspersión y detector de trampa iónica se acopló en línea al sistema HPLC. ' Ejemplos de compuestos específicos de la fórmula (lia) se describen en la tabla 1. Los compuestos resultantes son llamados "conjugados de siARN que contienen colesterol di-péptidos, en donde los conjugados de siARN de colesterol que contienen di-péptidos específicos se conocen además como "compuesto del título del ejemplo X- (NHC6 )-( secuencia de siARN)" y "siARN con compuesto del título del ejemplo X".' Preparación de siARN Secuencia antisentido: 5'-uuGGAUc AAuAuAAGAuUCcsCSU- 3 ' u, c: nucleótidos de 2'-0-metilo de nucleótidos de ARN correspondientes, s: fosforotioato Los conjugados de siARN de colesterol que contienen dipéptidos dirigidos contra la apoliproteína B de ARNm fueron generados al mezclar una solución equimolar de hebras complementarias en regulador de pH de fijación (20 irt de fosfato de sodio, pH 6.8; 100 mM de cloruro de sodio), calentados en un baño de agua a 80-85°C durante 3 minutds y enfriados a la temperatura ambiente durante un periodo dé!3-4 horas. La formación de dúplex se confirmó mediante electroforesis en gel negativa. ;, ; Todos los conjugados de siARN de colesterol que contienen dipéptidos preparados se listan en la tabla: 2.
Tabla 1 Conjugados de siARN de colesterol que contienen dipéptidos •I (5' -3') y datos analítios. Simbología: las letras en minúsculas' a, c, g, u, son nucleótido de 2'-0-metilo; los enlaces de fosforotioato A son simbolizados con una letra en minúsculas "s" (NHC6) es el enla¾a .or de aminohexilo incorporado en el extremo 5' de la hebra en sentido.
Tabla 2 Conjugados de siARN de colesterol que contiene dipéptido. última entrada (para de SBQ ID NO 266/154) representa un conjugado de siARN que carece del motivo dipéptido. Simbología: las letras en minúsculas a, c, g, u, son nucleótido de 2'-0-metilo; los enlaces de fosforotioato A son simbolizados con una letra en minúsculas; "s" (NHC6) es el enlazador de aminohexilo incorporado en el extremo 5' de la" hebra en sentido.
Ejemplo 35 Experimentos in vivo Co-administración de conjugados de siARN ; de colesterol que contienen dipéptidos y suministro de polímero in vivo Ratones de seis a ocho semanas de edad (cepa C57BL/6 o ICR, -18-20 g cada uno) fueron obtenidos dé Harían Sprague Da ley ( Indianapolis IN) . Los ratones fueron alojados al menos 2 días antes de la inyección. La alimentación se llevó a cabo ad libitum con Harían Tecklad Rodent Diet (Harlan> Madison, I) .
Los ratones (n=3 por grupo) fueron inyectados . con una mezcla de una solución de 0.2 mL de polím ro 1 de suministro y 0.2 mL de conjugados de siARN de colesterol que contienen dipéptidos. La dosis inyectada fue, a menos que: se indique lo contrario, 15 mg/kg para el polímero de suministro y 0.1 mg/kg con respecto a los conjugados de siARN de colesterol que contienen dipéptidos. Las soluciones fueron inyectadas mediante infusión en la vena de la cola. 48 Horas después de de la inyección los niveles de ApoB en suero se midieron con relación a los animales tratados con glucosa isotónica de acuerdo con el siguiente procedimiento.
Determinación de niveles de ApoB en suero Los ratones fueron ayunados durante 4 horas ; antes de la recolección de suero por sangrado submandibülar. Los niveles de proteína ApoB en suero se determinaron mediante métodos de ELISA en emparedado estándares. Brevemente, un anticuerpo ApoB anti-ratón de cabra policlonal y, un anticuerpo ApoB anti-ratón de conejo (Biodesign International) se usaron como anticuerpos de captura y detección respectivamente. Un anticuerpo IgG anti-cónejo de cabra conjugado a HRP (Sigma) fue aplicado posteriormente para unir el complejo ApoB/anticuerpo . La absorbancia" de tetrametil-benzidina (TMB, Sigma) y el desarrollo colorimétrico se midió después por un lector de microplaca Tecan Safire2 (Austria, Europa) a450 nm.
En la figura 1 varios conjugados de isARN de colesterol que contienen dipéptidos fueron referenciados contra el mismo siARN conjugado a colesterol pero que' carecía del motivo cortable elaborado anteriormente en esta sección. El efecto de este conjugado de siARN (SEQ ID NO par 266/164, "control no cortable") en los niveles de ApoB en suero se estableció en 1 para poder evaluar la influencia de los conjugados que contienen dipeptidos con relación al control no cortable. Al sustituir el motivo Phe-Lys usado inicialmente (siARN con compuesto del título del ejemplo 16) con los D-aminoácidos correspondientes (siARN con compuesto del título del ejemplo 14) o al sólo reemplazar el Lys con el enantiómero no natural (siARN con compuesto del título del ejemplo 30) se produjo una reducción de ApóB menos pronunciada o equivalente a la del siARN de control no cortable. El reemplazo de Lys por gly (siARN con compuesto del título del ejemplo 23) o Phe por p-metoxifenilalánina (siARN con compuesto del título del ejemplo 13) redujo la potencia en comparación con siARn con compuesto del título del ejemplo 16. Otros motivos de dipéptidos que contenían conjugados de siARN mostraron ser tan eficaces como el conjugado que contenía Phe-Lys original.
La figura 2 resume conjugados de siAR de colesterol que contienen dipéptidos que fueron tan eficaces o tuvieron eficacia mejorada en comparación con siAR con compuesto del título del ejemplo 16 que consisten, en el motivo Phe-Lys. Todos estos conjugados fueron significativamente más activos en comparación con el conjugado de siARN de colesterol "no cortable" SEQ ID NO par 266/154. Los conjugados de siARN de colesterol que contienen dipéptidos de mejor actuación tuvieron un anillo de fenilo modificado con flúor en el motivo Phy-Lys (siAR con compuesto del título del ejemplo 8, siARN con compuesto del título del ejemplo 9) o tuvieron la fenilalanina sustituida con beta-fenilalanina (siARN con compuesto del título del ejemplo 11) o un derivado de la misma (siARN con compuesto del título del ejemplo 10) .
Ya que los conjugados de siARN de colesterol que contienen dipéptidos con motivos de dipéptidos que consisten en D-aminoácidos actúan igual al conjugado de control no cortable, es concebible que las demás secuencias de dipéptidos sean de hecho cortadas por una actividad proteasa in vivo. Sin embargo, dada la amplia aceptación de diferentes aminoácidos y derivados de los mismos es probable que más de una enzima esté participando en la reacción de corte como se sugiere en la literatura (Bioconjugate Chem. 2002 , 13 ,"Q55) .
Como se muestra en la figura 3, la incorporación de un motivo de dipéptido cortable con catepsina (en este caso Phe-Lys, siARN con compuesto del título del ejemplo 16) entre el siARN y el colesterol de ligando de molécula pequeña impulsa la potencia del conjugado de siARN en comparación con el conjugado de siARN de colesterol recto (SEQ ID . ',?? ... par 266/154) . Separación adicional del ligando de colesterol, a partir del motivo de dipéptido por medio de enlazadores" a base de PEG reduce la potencia proporcional a la longitud 'del enlazador de PEG.
En la figura 4 la dosis de polímero se mantuvo ? constante a 15 mg/kg. La dosis de siARN se tituló y el efecto en el contenido de ApoB en suero fue medido. Los conjugados de siARN de colesterol que contienen dipéptidos que contienen el motivo Phe-Lys (F-K) fueron significativamente más potentes en comparación con el conjugado de control" que carecía de la secuencia de dipéptidos.
Ejemplo 36 Síntesis de oligorribonucleótidos 2 ' -modificados Los oligorribonucleótidos fueron sintetizados de acuerdo con la tecnología de fosforamidita en fase sólida. Dependiendo de la escala ya sea un sintetizador ; ABI·> 394 (Applied Biosystems) o un oligopilot 100 AKTA (GE Healthcare, Freiburg, Alemania) fueron usados. Las síntesis se llevaron a cabo en un soporte sólido hecho de vidrio de poro controlado (CPG, 520A, con una carga de 75 mol/g, obtenido de Prime Synthesis, Aston, PA, E.U.A.). Todas las fosforamiditas! de ARN 2 ' -modificadas así como reactivos auxiliares se compraron de SAFC (Hamburgo, Alemania) . Específicamente, las siguientes 2'-0-metil fosforamiditas fueron usadas: (5 -0-dimetoxitritil-N- (benzoil) -2 ' -O-metil-adenosin-3 ' -O- (2-cianoetil-N, N-diisopropilamino) fosforamidita, 5' -0-dimetoxitritil-iV4- (acetil) -2' -O-metil-citidin-3 ' -O- (2-cianoetil-iV, iV-diisopropilamino) fosforamidita, (5;' - O-dimetoxitritil-N2- (isobutiril) -2' -0-metil-guanosin-3 ' -0- (2-cianoetil-N, N-diisopropilamino) fosforamidita, y 5'-0-dimetoxitritil-2 ' -0-metil-uridin-3 ' -0- (2-cianoetil-N, N-diisopropilamino) fosforamidita . Las 2' -desoxi-2' -fluoro-fosforamiditas portaban los mismos grupos protectores que las 2'-0-metil ARN amiditas. Todas las amiditas fueron disueltas en acetonitrilo anhidro (100 mM) y se añadieron tamices moleculares (3Á) . Para generar el 5' -fosfato, se usó la 2- [2-(4,4' -dimetoxitritiloxi) etilsulfonil] etil- ( 2 -cianoetil ) - N, N-diisopropil) -fosforamidita de Glen Research (Sterling, Virginia, E.U.A.). Para poder introducir el amino nlazador C-6 en el extremo 5' de los oligómeros, se empleó la 6-( trifluoroacetilamino) -hexil- (2-cianoetil) - (N, N-diisopropil) -fosforamidita de Thermo Fisher Scientific (Milwaukee, Wisconsin, E.U.A.)- Las modificaciones 5' fueron introducidas sin ninguna modificación del ciclo de síntesis. Se usó 5-etiltiotetrazol (ETT, 500 mM en acetonitrilo) como , isolución activadora. Los tiempos de acoplamiento fueron 6 · minutos . Para introducir enlaces de fosforotioato se empleó; una solución 50 mM de 3 - ( (dimetilamino-metiliden) amino) -3H- 1 ¿ 2 , 4 -ditiazol-3 - tiona (DDT, obtenida de AM Chemicals, Occeanside, CA, E.U.A.) en acetonitrilo/piridina anhidra (1:1 v/v) .
Ejemplo 37 Corte y desprotección de oligómero unido en soporte Después de la finalización de la síntesis ' en fase sólida, el soporte sólido seco se transfirió a un tubo de 15 mL y se trató con amoniaco acuoso concentrado , (Aldrich) durante 18 horas a 40 °C. Después de la centrifugación el sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y el CPG sé; lavó con amoniaco acuoso. Las soluciones combinadas fueron evaporadas y el residuo sólido se reconstituyó en iregulador de pH A (véase abajo) .
Ejemplo 38 Purificación de oligorribonucleótidos Oligómeros crudos fueron purificados mediante HPLC de intercambio aniónico usando una columna empacada con Source Q15 (GE Helthcare) y un sistema AKTA Explorer (GE Helthcare) . El regulador de pH A fue 10 mM de perclorato de sodio, 20 mM de tris, 1 mM de EDTA, pH J 7.4 (Fluka, Buchs, Suiza) y el regulador de pH B fue igual al regulador de pH A con excepción de 500 mM de perclorato de sodio. Se empleó un gradiente de 22% de B a 42% de B dentro de 32 volúmenes de columna (CV, por sus siglas en inglés) . Se registraron los trazos de UV a 280 nm . Tracciones adecuadas fueron agrupadas y precipitadas; con NaOAc 3M, pH = 5.2 y 70% de etanol . Finalmente, > el sedimento se lavó con 70% de etanol.
Ejemplo 39 Fijación de oligorribonucleótidos para generar siARN , Hebras complementarias fueron mezcladas al combinar soluciones de ARN equimolares. La mezcla se liofilizó y reconstituyó con un volumen adecuado de regulador de pH de fijación (100 mM de NaCl, 20 mM de fosfato de sodio, pH 6.8) para lograr la concentración deseada. Esta solución se puso en un baño dé agua a 85°C que se enfrió a temperatura ambiente dentro de 3 horas .
Ejemplo 40 Actividad in vitro de moléculas de siARN libres de residuos 2 ' -OH Para investigar si las moléculas de siA Ñ que carecían de cualquiera residuos 2' -OH mostraban potente actividad de supresión in vitro, probamos un pane de moléculas de siARN dirigidas a ARNm de EGFP con diferentes químicas de 2 ' -modificación (SEQ ID pares 31/32 a 149/150, y véase tabla 3 para ejemplos) . Las moléculas de siARN fueron tamizadas para actividad en sentido y ant,isehtido con el Dual-Glo® Luciferase Assay System (Promega) úsand el vector psiCHECK2 (Promega) en células COS7' (DSMZ, Braunschweig, Alemania, No. de registro ACC-60) . Para abordar la actividad de silenciamiento conferida; por. la hebra en sentido y antisentido clonamos cada secuencia del sitio objetivo de 19 meros correspondiente cómo una construcción psiCHECK2 separada (psiCHECK2 -AT para actividad antisentido, psiCHECK2-ST para actividad,, , en sentido) en la región de clonación múltiple ubicada 3' hacia el codón de paro de traducción de la luciferasa de ¡i Renilla sintética. Usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemania, No. de registro 11668-019); las células C0S7 fueron co-transíectadas con construcción de vector y 3 nM del siARN correspondiente complementario al sitio objetivo clonado. Silenciamiento mediado por siARN exitoso se determinó 24 horas después de la trahsfección ? mediante la actividad de la luciferasa de Ranilla normalizada a niveles de luciferasa de luciérnaga ¡para tomar la eficiencia de transfección en cuenta (véase figura 5a para actividad antisentido y figura 5b para actividad en sentido) .
Tabla 3: Ejemplos de secuencias de siAR y modificaciones químicas usadas para la determinación de la actividad de supresión in vitro dependiente de las modificaciones 2'. Los dúplex de referencia y ejemplos seleccionados de variantes de modificación correspondientes usados en este estudio. Xf Indica una modificación 2'-fluoro del nucleótido X, letras minúsculas indican: una modificación con 2'-0-metilo, las letras subrayadas indican un nucleótido de ADN, todas las demás letras mayúsculas indican ribonucleótidos . La letra "p" indica un 5 '-fosfato.
Dúplexes de ARN unmod 5'- UGCCCAUCCUGGUCGAGCUTT -3' 3'- TTACGGGUAGGACCAGCUCGAp -5 ' F/OMe 5'- UfgCfcCfaUfcCfuGfgUfcGfaGfcUfTsT -3' 3'- TsTaCfgGfgUfaGfgAfcCfaGfcUfcGfap -5' F/DNA 5'- UfGCfCCfAUfCCfUGfGUfCGfAGfCUfTsT -3' 3'- TsTACfGGfGUfAGfGAfCCfAGfCUfCGfAp -5' DNA/OMe 5 '- UgCcCaUcCuGgUcGaGcUTsT -3' 3'- TsTaCgGgUaGgAcCaGcUcGap -5' encontró que las 5 moléculas de siA modificadas más potentes (>60% de supresión) fueron diseñadas en un patrón 2 ' - fluoro/2 ' -O-metilos (2'F/2'-OMe) alternante. Mientras que confiere la actividad antisentido, esta química eliminó completamente la actividad de las hebras en sentido correspondientes, como lo demuestra la falta o mínima cantidad de actividad luciferasa de renilla para todas las variantes 2'F/2'-0Me.
Concluimos que este patrón 2'F/2'-OMe promueve la actividad de hebra antisentido deseada de siARN mientras que los efectos fuera de objetivo no deseados que provienen de la hebra en sentido son completamente suprimidos.
Ejemplo 41 Detección de sitios sensibles a DNasa II mediante ensayo in vitro Un método de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC, por sus siglas en inglés) en fase inversa (RP, por sus siglas en inglés) por apareo iónico (IP, por sus siglas en inglés) acoplado a un método a base de HPL ^AEX, por sus siglas en inglés) de espectrometría de masas (MS, por sus siglas en inglés) por ionización por electróaspersión (ESI, por sus siglas en inglés) o de intercambio aniónico se estableció para probar la estabilidad in vitro de 'moléculas de ARN de una sola y de doble hebra seleccionadas.
Descripción del método: Para análisis de estabilidad una solución 10 µ? ya sea de ARN de una sola hebra o de doble hebra se incubó a 37 °C en 5 mM de solución reguladora de pH de acetato de sodio (pH 4.5) que contenía 0.8 u 8 unidades de DNasa II (de bazo de bovino, tipo V, Sigma Aldrich) . La reacción de incubación se detuvo al añadir una solución 100 mM de acetato de trietilamino ("fEAA) , desplazando el pH a 7 e inactivando la enzima DNasa II. El análisis se hizo ya sea mediante LC/MS combinada con detección UV o por AEX-HPLC con detección UV. Los trazos de detección UV a 260 nm fueron usados para análisis cuantitativo, los datos de MS sirvieron para identificación de sitios de corte dentro de la -secuencia de ARN. " A. IP-RP-HPLC Se hizo empleando una columna Waters XBridge Ci8 (2.5 x 50 mm, 2.5 µp? de tamaño de partícula) a 65°C de temperatura de columna. La elución por gradiente se llevó a cabo usando 100 mM de hexafluoroisopropanol (HFÍP) y 16 mM de trietilamina en 1% de metanol como eluyente A y composición A en 95% de metanol como eluyente B. Se , empleó un gradiente de 1% de B a 18% de B en 30 minutos.
B. AEX-HPLC Se llevó a cabo en una columna Dicnex DMA. i Pac200 (4 x 250 mm) a 50°C usando un regulador de pH de fosfato120 mM que contenía 10% de ACN a pH = 11. El eluyente B contenía NaBr! 1M en eluyente A. Se empleó un gradiente de 25 a 62% de B en 18 minutos! Tabla 4 Dúplex y las hebras intactas restantes evaluadas para su estabilidad contra DNasa II. Simbología: letras en minúsculas a¿ c, g, u, son nucleótidos de 2'-0-metilo; letras en mayúscula A, C¡ G, U seguidas por "f" indica un nucleótido 2' -fluoro. La letra minúscula "p" indica un 5-fosfato. (invdT) representa una desoxitimidina inyertida (3, 3' -enlazada) . Los enlaces de fosforotioato A son simbolizadbs con una "s". dT Es desoxitimidina. ( HC6) Es el enlazador de aminohéxilo incorporado en el extremo 5' de la hebra en sentido. " Conclusiones: A. Hebras de ARN que contenían al menos un nucleótido 2' -OH (por ejemplo, ambas hebras de SEQ ID NO par 157/158) fueron degradadas rápidamente mediante un intermedio pentavalente cíclico, llevando a fosfatos cíclicos 2 '-3' en el producto de corte 5'. La formación del intermedio pentavalente puede inhibirse usando nucleótidos que carezcan de un grupo 2'-0H, como por ejemplo 2'-desoxi, 2'-0Me o 2' -F.
B. Además, ARN se degrada mediante una1 vía' 5'-exonucleolítica, que es independiente de la modificación 2' en los nucleótidos 5 ' -terminales . Esta vía de degradación puede ser inhibida usando porciones no nucleótidas 5'-terminales, como por ejemplo un aminoenlazador C6 , ,(por ejemplo, SEQ ID NO: 160 en SEQ ID NO par 160/159 o SEQ ID NO 165 en SEQ ID NO par 165/166) o un fosforotioato en el primer enlace entre nucleótidos (por ejemplo, SEQ ID NO 160 en SEQ ID NO par 160/159) .
C. Un grupo 5' -fosfato hace más lenta la Cinética de corte exonucleolítica, pero no puede bloquear completamente la degradación que inicia en este extremo (por ejemplo SEQ ID NO 160 en SEQ ID NO par 160/159) . Esto es' más probablemente debido al corte del 5 '-fosfato ya sea v or fosfatasas o por una actividad fosfatasa inherente de, „ la enzima DNasa II.
D. La mejor protección para hebras de ARN se logró con oligonucleótidos que no contenían 2 '-0H nucleótido, iniciando con un 2'-0Me nucleótido en el extremo 5' conectado por un enlace de fosforotioato al segundo nucleótido' (por ejemplo, SEQ ID NO 173 en SEQ ID NO par 173/174) . Otros ¦I nucleótidos no 2' -OH terminales también protegen contra la 5' -exo degradación pero en un menor grado en comparación con la modificación 2'-0Me (refiérase a tabla 9) .
Ejemplo 42 Actividad de supresión in vivo de moléculas de siARN libres de residuos 2' -OH Se llevaron a cabo experimentos in vivo coil ratones inyectados con moléculas de siARN de dirección a factor' VII ? (FVII) (SEQ ID NO pares 179/166 y 180/168, véase tabla 5:)' coadministradas con DPC-GalNac.
Tabla 5a Secuencias de moléculas de siARN para experimento in vivo. Simbología: las letras en minúsculas ac, c, g, u, son nucleótidos de 2 ' -O-metilo ; las letras en mayúsculas A, C, G, U seguidas por "f" indican un nucleótido 2'-fluoró,. La "p" indica un 5' -fosfato. (invdT) Representa una desoxitimidina invertida (enlazada 3' -3'). Enlaces... de fosforotioato A son simbolizados con una "s" . ; , dT...„ Es desoxitimidina (NHC6) es el enlazador de aminohexilo incorporado en el extremo 5' de la misma hebra. GalNAc ' se refiere a la estructura en la fórmula (IV) . · Un siAR De FVII con un patrón 2 ' -OMe/2 ' -F alternante o hebra en sentido y antisentido se generó con un nucleótido 2'-OMe 5' -terminal en la hebra antisentido y una hebra 2'-F 5 ' -terminal en la en sentido. Ambas hebras son protegidas por un inv(dT) en la saliente 3' -terminal. La hebra antisentido portaba un grupo 5' -fosfato para mantener la actividad del siARN. Al extremo 5' de la hebra en sentido se le conjugó un ligando de GalNAc-palmitoilo para hacer posible la dirección a hepatocitos por el receptor de hacialiloglicoprotéina expresada en estas células. siARN: (2.5 mg/kg) Fue co-administrado con polímero de suministro de PBAVE dirigido a GalNAc (15 mg/kg) en ratones.
Mediciones de AR m de FVII fueron hechas pará homogenados de hígado usando QuantiGene 1.0 branched DNA (bADN) Assay Kit (Panomics, Fremont, Calif., E . U.A. , ¡ No i de catálogo QG0004) .
Después de la necropsia 1-2 g de tejido hepático se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido. El tejido congelado se hizo polvo con mortero y mano en hielo seco. Se transfirieron 15-25 mg de tejido a un tubo de reacción de 1.5 mL enfriado, 1 mL de mezcla de lisis 1:3 prediluida en, agua MillIQ y 3.3 µ?? de proteinasa K (50 ]ig/]ih) se añadieron" y el tejido se liso durante varios segundos de sonicación ultrasónica en polvo a 30-50% (HD2070, Bandelin, Berlín, Alemania) . Los lisados fueron almacenados a -80°C hasta el análisis. Para el análisis de ARNm el lisado se descongeló y digirió con proteinasa K durante 15 minutos a 1,000 rpm ''en un termomezclador a 65°C (Thermomixer confort, Eppendorf, Hamburgo, Alemania) . Los niveles de ARNm de FVII y GAPDH se determinaron usando reactivos QuantiGene 1.0 bDNA Assay, Kit de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.. La expresión de ARNm de FVII se analizó usando 20 µL de lisado y un conjunto de sondas de FVII de ratón. La expresión ARNm de GAPDH se analizó usando 40 iL de lisado y conjuntos dé sondas de rattus norwegicus que mostraron reaccionar eh forma cruzada con ratones (secuencias de conjuntos de sondas véase arriba) . Como lectura de ensayo la señal ¦ de quimioluminiscencia al final del ensayo se midió en un contador de luminiscencia Víctor 2 Light (Perkin. Elmer, iesbaden, Alemania) como unidades de luz relativas (RLU, por sus siglas en inglés) . La señal para ARNm de FVII se dividió entre la señal para ARNm de GAPDH para los mismos valores de lisados que los reportados para la expresión de ARNm de FVII normalizada a GAPDH.
Los resultados demuestran una supresión de ARNm de FVII de 79% 48 horas después de la dosificación luego de la administración del par de SEQ ID NO 179/166. En contiraste, el siARN que porta 2 '-0H nucleótido SEQ ID NO par 180/168 no mostró supresión significativa (< 25%) , como se muestra en la tabla 5.
Tabla 5b Resultados de estudios de supresión in vivo Ejemplo 43 Distribución tisular de moléculas de siARN que careúen de residuos 2 ' -OH La concentración de siARN en las muestras de tejido hepático se determinó usando un método de detección de oligonucleótidos privado como el descrito en WO2010043512.
Brevemente, la cuantif icación de siARN se basa en la hibridación de una sonda de PNA marcada fluorescentemente (Atto-425) (Atto425-O0- GCAAAGGCGTGCCAACT , complementaria a la , hebra antisentido del dúplex de siARN, seguida. por separación a base de AEX-HPLC. La cuantif icación se hizo mediante detección por fluorescencia contra' una curva de calibración externa que se generó a partir de una serie de diluciones de los dos siARN de FVII usados en el experimento in vivo (véase ejemplo 42) . Para niveles en plasma de entre 0.2 a 2 i y para tejido ~ 1 mg de alícuotas fueron inyectadas en el sistema de HPLC .
El análisis de tejido hepático del siARN estabilizado que carecía del nucleótido 2' -OH mostró altas concentraciones de hebra antisentido intacta' en el hígado en el intervalo de ug/g, pero -95% estuvo presente en la forma inactiva 5 ' - des fos fpri 1 ada (véase tabla 6) . El ARN resultante con ' un nucleótido 2'-OMe terminal no es propenso a refosforilacióri en el citoplasma por la fosfocinasa hClpl (véase abajo) . En contraste, la hebra antisentido del ARNsi ; que contiene 2 '-OH se degradó completamente en el tejido dentro de las primeras 6 horas luego de la dosificación.
Tabla 6 Análisis de tejido hepático de siARN estabilizado que i no contiene 2 '-0H Ejemplo 44 Actividad de supresión in vitro de moléculas de siARN con extremos 5' optimizados Un tamiz in vitro adicional para moléculas de siARN de FVII se llevó a cabo para identificar moléculas de siARN que pudieran estar (re-) fosforiladas intracelularmente en el extremo 5' del antisentido para, dar como resultado las especies ARNi competentes . Todas : las moléculas de siARN de este tamiz se muestran en la tabla' 7. El patrón de modificación 2'-OMe/2'-F alternante ' fue idéntico al diseño de la primera generación (si ningún residuo 2' -OH) con excepción de varias modificaciones en los primeros dos nucleótidos en el extremo 5' de l hebra antisentido. Los dos nucleótidos 5 ' -terminales de la hebra antisentido fueron generados como nucleótidos modificados como 2'-F o 2'-desoxi en varias combinaciones con y sin un 5 '-fosfato o 5 ' -fosfotioato adicional. Todas las moléculas de siARN fueron tamizadas en respuesta a dosis (24 "nM a 0.00037 nM en diluciones de 4 veces) para actividad de supresión después de la transfeccion de hepatocitos de ratón primarios (30,000 células por pocilios; formato de placa de 96 pocilios) usando Lipofectamine 2000 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Dos moléculas de siARN fueron comparables activas al dúplex progenitor (SQ ID NO par 182/168); siARNs comparables activas: SÉQ 'ÍD NO pares 181/186 y 181/185) en términos de valores iC50, ! una con un grupo 2'-F 5 '-terminal y un grupo fosfato y uná. con dos 2'-desoxi nucleótido 5 ' -terminalales y un 5'-fosforotioato (véase tabla 7 para valores IC50) . Ambas de ellas fueron alrededor de 5-6 veces más activas en comparación con el siARN (SEQ ID NO par 181/166) usado en el primer experimento con animales con el nucléotidó 2'-OMe terminal .
Ejemplo 45 5 -Fosforilación in vitro de moléculas de siARN con extremos 5' optimizados Todas las moléculas de siARN sin un 5' -fosfato o 5 '- fosforotioato listadas en la tabla 7 fueron evaluadas para fosforilación mediante hClpl en extracto dé células HeLa S100.
La 5 ' -fosforilación se analizó a partir de extractos de S100 HeLa como se describe por Weitzer y Martínez (S. Weitzer and J. Martínez. hClpl : a novel kinase revitalizes RNA metabolism. Cell Cycle 6 (17) : 2133-2137, 2007) . Directamente después de la incubación de 1 µ? de moléculas de siARN en el extracto de S100 HeLa que contenía 5 mM de ATP, la solución se analizó ya sea por IP-RP-HPLC o AEX-HPLC bajo condiciones de desnaturalización mediante inyección de una solución de muestra de 5 pL : A. IP-RP-HPLC Se hizo empleando una columna Wáters XBridge C18 (2.5 x 50 mm, 2.5 µp? de tamaño de partícula) a l 65° C de temperatura de columna. La elución por gradiente se ' II llevó a cabo usando 100 mM de hexafloroisopropanol (HFIP) y 16 mM de trietilamina en 1% de metanol como eluyenté A y composición A en 95% de metanol como eluyenté B". Un gradiente de 1% de B a 18% en 30 minutos fue empleado. ; B. AEX-HPLC Se llevó a cabo en una columna Dionex DNA Pac200 (4 x 250 mm) a 50°C usando 20 mM de regulador de pH de fosfato que contenía 10% de ACN a pH=ll. Se empleó eluyenté B que contenía NaBr 1M en eluyenté A. Se empleó un gradiente de 25 a 62% de B en 18 minutos.
La relación de 5 '- fosforilación se calcula para cada hebra de un siARN a partir del trazo UV a 260 nm usando la siguiente ecuación (PA es área máxima) : ' % (5' -fosforilación) = 100* PA [hebra 5' -fosforilada] / (PA [hebra 5' -fosfotilada] + PA [hebra progenitora] ) En la tabla 8 se muestra que la hebra antisentido de un siARN no puede ser 5 ' -fosforilada, cuando un riucleótido 2'-OMe se ubica en el extremo 5' (SEQ ID NO par 181/196 y SEQ ID NO par 181/195) . E contraste, la hebra antiséntido es susceptible a 5 ' -fosforilación, cuando un 2'-F, 2' -descocí o 2 '-0H nucleótido se incorpore en el extremo 5' (SEQ ID NO par 181/915, SEQ ID NO par 181/912, SEQ ID NO par 181/197, $EQ ID NO par 181/199 y SEQ ID NO par 182/168) . Las dos moléculas de siARN que fueron comparablemente activas en el ensayo in vitro al par SEQ ID NO 182/168 (SEQ ID NO par 181/186 y 181/185), son susceptibles a 5 ' -fosforilación una vez que el grupo 5' -fosfato/5' -PTO introducidos sintéticamente, , es cortado in vivo, por ejemplo, por fosfatasas.
Tabla 8 Porcentaje de hebra 5 '- fosforilada después de 4 horas de incubación en extracto de células S100 HeLa . Simbología: a, c, g, u, son nucleótidos de 2 ' -O-metilo letras en mayúscula A, C, G, U seguidas por "f" indica, un nucleótido 2' -fluoro. La letra minúscula "p" indica un 5-fosfato. (invdT) representa una desoxi t imidina i vert ida (3,3' -enlazada) . Los enlaces 1 de f osf orot ioato A son simbolizados con una "s" . dT Es desoxi timidina .
E emplo 46 Estabilidad en DNAsa II in vitro de moléculas de siÁRN con extremos 5' optimizados ( Todas las hebras antisentido fueron tamizadas para estabilidad en DNAsa II como se describió e';n> el ejemplo 41. Las dos hebras antisentido presentes en las moléculas de siARN que fueron comparabl emente activas con el dúplex progenitor (EQ ID NO 18^6 y SEQ ID NO par 185 uno con un 2' -F 5' -terminal y un grupo fosfato y uno con dos 2 ' -desoxi nucleótidos 5'-terminales y un 5 ' - f osf orot ioato son estables' h^eia el corte con DNAsa II (> 70% de hebra intacta después Tabla 9 Estabilidad in vitro de moleclas de siARN hacia DNasa ! II después de 20 horas de incubación Ejemplo 47 Actividad de supresión in vivo de moléculas de siARN con extremos 5' optimizados Para evaluar si la mejora in vitro por los extremos 5' optimizados se transfiere a la situación in vivo,' llevamos a cabo experimentos en ratón adicionales con conjugados GalNAc-palmitoilo de moléculas de siARN seleccionadas (véase tabla 10) . Moléculas de siARN fueron administradas ségúñ ' las condiciones idénticas a las descritas para el primer experimento en ratones (ejemplo 42, esta solicitud de patente) . Para la medición de los niveles de FVII, muestras en plasma de ratones fueron preparadas al tomar sangre (9 volúmenes) por sangrado submandibular en tubos microcentrif ugos que contenían 0.109 mol/L de anticóágulante de citrato de sodio (1 volumen) siguiendo procedimientos estándares. La actividad de FVII en plasma se midió con un i método cromogénico usando un kit BIOPHEN VIí (Hyphen BioMed/Aniar , Masón, OH) siguiendo las recomendaciones del ? fabricante. La absorbancia del desarrollo colorimétrieo se midió usando un lector de microplaca Tecan Safire 2 a 405 nm.
Las moléculas de siARN bajo investigación mostraron actividad in vivo, correlacionándose completamente con los resultados del tamizado in vitro. La actividad FVII en suero se redujo en más de 80% para ambas moléculas de siARN 48 horas después de la dosificación, en comparación co 49% usando el diseño de siARN de primera generación (véase "Éabla 10) . Este resultado subraya claramente la importancia de un nucleótido 5' -terminal en la hebra antisentido que puede! ser efectivamente fosforilado, en caso de que las fosfatases corten in vivo el grupo 5' -fosfato o 5 '- fosfotioato generado sintéticamente. En caso de un nucleótido 2'-OMe 5 '-terminal como el usado en el diseño inicial o descrito er la literatura como un diseño de siARN más potente con ba'se eñ la comparación in vitro con moléculas de siARN canónicas, el corte del fosfato sintético in vivo llevaría a uña fuerte reducción en la potencia del siARN correspondiente.
Tabla 10 Actividad de supresión in vivo de moléculas 'de siARN con extremos 5' optimizados. Simbología: Simbología: a, c, g, u'> son nucleótidos de 2' -O-metilo; letras en mayúscula A, C, G, U seguidas por "f" indica un nucleótido 2'-fluoro. La letra minúscula "p" indica' un 5-fosfato. (invdT) representa una desoxitimidina invertida .(3,3'-enlazada) . los enlaces de fosforotioato A son simbolizados con una letra en minúsculas "s" ( HC6) es el enlazador de kminohexilo incorporado en el extremo 5' de la hebra en sentido. GalNAc Se refiere a la estructura en la fórmula (IV) .
Ejemplo 48 Actividad de supresión in vitro de moléculas siARN con extremos 3' optimizados Para incrementar más la actividad de las moléculas de siARN estables en DNasa II se llevó a cabo un estudio SAR de la saliente 3' . Varias combinaciones de invdT, dTinvdT o dTsdT ya sea en la saliente 3' de la hebra en sentido o antisentido se aplicaron a moléculas de siARN de dirección a Ahal y EGFP (véanse tablas 11 y 12, respectivamente) y se compararon por pares para la composición en ambos extremos 3' en las moléculas de siARN más potentes. Todas las moléculas de siARN fueron tamizádas en respuesta a dosis (24 nM a 0.00037 nM en diluciones ;de 4 veces) para actividad de supresión después de la tránsfección de hepatocitos de ratón primarios (30,000 células/pocilio; formato de placa de 96 pocilios) usando Lipofectamine 2?|?? de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Tabla 11 Actividad de supresión in vi tro de moléculas de siARN ,,de dirección a EGFP con diferentes extremos 3' Tabla 12 - Actividad de supresión in vi ro de moléculas de siÁRN de dirección a Ahal con diferentes extremos 3': Se encontró que las moléculas de siARN con dos salientes dTsdT de nucleótidos en la hebra añtise tido actuaron siempre mejor que aquellas con una sola saliente invdT en el extremo 3' del antisentido (mientras qué las hebras en sentido fueron iguales) . Fue además benéfica la combinación de una hebra en sentido modificada con una sola saliente invdT como la saliente 3' .
Ejemplo 49 Actividad de supresión in vivo de moléculas de siARN en primates no humanos Preparación de DPCs y dosificación DPCs fueron preparadas al fijar covalenteriiente polímero "149 RAFT" al factor VII de coagulación de dirección a siARN indicado (siF7) a la relación 4:1 p:p (polímero : siARN) a través de un enlace con disulfuro y luego modificando el conjugado polímero- siARN con una mezcla '2:1 p:p de CDM-PEG : CDM-NAG a una relación 7x p:p (CDM : políme;rp) . Monos macacos fueron dosificados con 1 mg/kg de DPC (pesoy del polímero) y 0.25 mg/kg del siARN indicado. Un animal ¡recibió DPC que contenía siF7 SEQ ID NO par 151/152, dos animales recibieron DPC que contenía siF7 SEQ ID NO para 253/254) ; #1 y #2), y dos animales recibían DPC que contenía SEQ ID NO par 251/255, #1 y #2). Los valores F7 fueron normalizados- al promedio de los dos valores pre-dosis. Animales que recibían DPCs que contenían SEQ ID NO par 253/254 o SEQ ID ÑO par 251/255 tuvieron mayores niveles de supresión de F7 y PT más larga que el animal que recibió SEQ ID NO par 251/252.
Procedimiento de inyección de DPC Para cada procedimiento de inyección, a los animales se les dio una inyección de IM que contenía una combinación de cetamina (hasta 7 mg/kg) y dexmédetomidina (hasta 0.03 mg/kg) y se movieron a una habitación de procedimiento. En el cuarto de procedimiento, los animales fueron puestos a una almohadilla de calentamiento fórrada de agua y el sitio de inyección se rasuró y se preparó con un antiséptico. Se insertó un catéter intravenoso (calibre. ,20 a 22) en una vena sistémica (cefálica o safena inferior) y la solución de DPC se infundió (2 ml/kg) lentamente durante 1 a 2 minutos. Se usó un oxímetro propulsos para monitbrear el ritmo cardiaco y saturación de oxígeno durante! e inmediatamente después del procedimiento de inyección .', Cada procedimiento de inyección tardó aproximadamente 20 minutos en llevarse a cabo. Después de la inyección el catéter se retiró y se aplicó presión suave al sitio de venipunción^ Los animales fueron regresados a sus jaulas y se les dio: una inyección IM del fármaco de inversión atipamezol (aniisedan) (0.10 a 0.15 mg/kg) . Los animales fueron monitoreados hasta que volvieran a obtener actividad normal.
Procedimiento de toma de sangre Se obtuvieron tomas de sangre (1-5 mi) para la medición de la inhibición génica (actividad F7 , .tiempo de coagulación) , químicas sanguíneas y marcadores para · daño hepático (CBC, panel de química, ALT, citocinas, complemento) . Para estos procedimientos de toma de sangre, a los animales se les dio una inyección IM que contenía una combinación de cetamina (hasta 7 mg/kg) y dexmedetomidina (hasta 0.03 mg/kg) . Una vez sedados, los animales fueron movidos a una tabla de procedimiento portátil y una aguja y jeringa calibre 22 se usaron para tomar sangre de la' Vena femoral. Inmediatamente después de la toma de sangre, se aplicó presión al sitio de venipunción y la sangre se dividió en los tubos de muestra adecuados para cada prueba de; sangre. A los animales se les dio una inyección IM del fármaco de reversión aptipamezol (antisedan) (0.10 a 0.15 mg/kg) y regresaron a su jaula. No más de 20% de volumen de sangre total se extrajo en cualquier periodo 30 días (volumen, de sangre estimado = 60 ml/kg) . Cada procedimiento de toma' de sangre tardó aproximadamente 10 minutos al llevarse a cabo.
Mediciones de la actividad de factor VII (F,7) Muestras de sangre de primates no humanos, se prepararon al llenar tubos separados de suero con sangre entera y dejar que la sangre se coagulara a temperatura ambiente durante al menos 20 minutos. Después de la coagulación, los tubos de sangre fueron centrifugados durante 3 minutos a 9,000 rpm, se hicieron alícuotas en tubos Eppendorf y se almacenaron a -20°C hasta el ensayo. La actividad F7 en suero se midió con un método cromogénico usando un kit BIOPHEN VII (Hyphen BioMed/Aniara, Masón', OH) siguiendo las recomendaciones del fabricante. La absorbancia del desarrollo colorimétrico se midió usando un lector de microplaca Tecan Safire 2 a 405 nm.
Pruebas de coagulación (protiempo, protiempo parcial y fibrinógeno) Muestras de sangre de primates no humanso se prepararon al llenar completamente tubos de citrato de sodio (BD Vacutainer) con sangre entera y mezclando suavemente para evitar formación de coágulos . Los tubos se transportaron a un laboratorio de prueba clínico dentro de 1 hora y se llevaron a cabo ensayos de coagulación a las 4 horas a partir ! del tiempo de toma.
Tabla 13 Moléculas de dsARN de FVII usadas para expériménto NHP : Simbología: Simbología: Simbología: a, c, g, u,n son nucleótidos de 2 ' -0-metilo; letras en mayúscula A, ' C, G', U seguidas por "f" indica un nucleótido 2'-fluoro. La letra minúscula "p" indica un 5- fosfato. (invdT) representa una desoxitimidina invertida ( 3 , 3 ' -enlazada) . Los enlaces , de fosforotioato A son simbolizados con una letra en minúsculas "s" . dT Es desoxitimidina, NH2C6 es el enlazador amino exilo incorporado en el extremo 5' de la hebra en sentido .
El cambio de la saliente (invdT)-3' de un solo nucleótido en ambas hebras por un diseño de siARN asimétrico con una saliente 3'-(invdT) en la hebra en sentido y una saliente dTsdT en la hebra antisentido, pero de otra manera el patrón de modificación constante llevó a una reducción de F7 en suero más pronunciada y una duración significativamente prolongada de este efecto en primates no humanos (véase figura 6a) . Esta observación es soportada por una consecuencia biológica esperada, en particular un efecto más pronunciado en el' tiempo de protrombina correspondiente al grado de reducción de factor VII (véase figura 6b) .
Ejemplo 50 Actividad de supresión in vivo de moléculas de siARN con enlazadores de ARN cortables En la tabla 14, la eficacia in vivo con base e,n la inhibición de proteína FVII en suero se comparó usando conjugado de siARN a colesterol o GalNAc-palmitoilo en el mismo contexto de secuencia que en ratones. El experimento vivo se llevó a cabo como se describió en el ejemplo 42;. La inhibición de FVII fue fuertemente reducida para ' las moléculas de siARN conjugadas a colesterol que no , contenían 2 '-0H en comparación con las contrapartes conjugadas a GalNAc-palmitoilo (SEQ ID NO par 179/166 vs . 179/190, SEQ ID NO par 257/264 vs . SEQ ID NO par 179/262, SEQ ÍD NO par 257/263 vs. SEQ ID NO par 179/163 y SEQ ID NO par 257/166 vs . (SEQ ID NO par 179/166) . En contraste, para una siARN que contenía 2 '-OH el conjugado de colesterol llevó a una inhibición de FVII más alta en comparación con el derivado de GalNAc-palmitoilo (SEQ ID NO par 180/168 vs . SEQ ÍD NO par 258/168) .
Los ligandos de molécula pequeña GalNAc-palmitoilo y colesterol usados en el experimento in vivo descbrito son conectados a siARN por medio de un enlazador no cortable al extremo 5' de la hebra en sentido. En el caso de la he¾>,ra en sentido que exhiba 2' -OH nucléotidos el ligando puede' ser cortado por nucleasas (por ejemplo, DNasa IÍ en el compartimiento endosómico o lisosómico) . La reacción de corte libera el siARN libre que es luego liberado en el citoplasma por la actividad de alteración endosómica del polímero de suministro.
Para moléculas de siARN que carecen dé un nucleótido 2 '-OH en la hebra en sentido, los ligandos se conectan establemente al dúplex, ya que ningún mecanismo enzimático (nucleasa/proteasa/esterasa, etc.) o químico desencadena el corte de ligando. Por lo tanto; siARN conjugado a colesterol completamente estable puede ser i j atrapado en membranas celulares debido a; la interacción de membrana del ligando de colesterol lipófilo. Concentraciones todavía más altas del siARN en el tejido no son suficientes para liberación efectiva del siARN en el citoplasma. En contraste, el siARN conjugado a GalNAc -palmito i lo menos lipófilo puede liberarse en el citoplasma, debido a una interacción menos pronunciada con membranas celulares. Por esta razón, conjugado de siARN a GalNAc-palmitoí lo no cortable y estable es más eficaz en comparación con un colesterol conjugado al mismo siARN.
El desarrollo de construcciones enlázadoras cortables ayudaría a derivar el aspecto ., , de atrapamiento en membrana de siARN conjugado1 a colesterol establemente. Usando química enlazadora de disulfuro como se describió como una posibilidad atractiva para introducir un sitio de corte definido. Sin embargo, el corte está restringido a 'retjj'cir organelos dentro de la célula ( PNAS , 2006 103, 13872) . Ya que se espera que el corte sea lento eji el compartimiento endosómico/ isosómico , la mayoría del siARN conjugado a colé sterol - di sul furo aún puede ser atrapado en membranas como se describió paira los conjugados de colesterol no cortables.
Tabla 14 Además de la bien establecida química de erilazador cortable por disulfuro otra posibilidad es la generación de sitios de corte definidos usando nucleótidos 2' -OH en ciertas posiciones. La introducción de nucleótidos 2' -OH en posiciones selectivas es un nuevo enfoque para lograr: «el corte de los conjugados a partir de hebras de ARN. 'líos nucleótidos 2' -OH pueden ya sea ser implementados al añadir salientes de una sola hebra con por lo menos un nucleótido 2 '-0H en el extremo 3' o 5' de la hebra de ARN o usando nucleótidos 2' -OH dentro de la región dúplex de un siARN. La actividad enzimática de nucleasas presentes en' el endosoma/lisosoma corta selectivamente en estas pósic.ipnes. En un primer diseño el colesterol se conectó a la hebra en sentido por medio de una saliente de una sola hebra que contenía 3 nucleótidos 2 '-0H (AUC) en el extremo 5' .
Moléculas de siARN conjugadas a colesterol que compraban varias químicas enlazadoras cortables se muestran en la tabla 15. Todas las moléculas de siARN tienen el contexto de secuencia idéntico, sólo se alteró la química enlazadora. Colesterol se conectó a la hebra en seiitid , por medio de saliente de una sola hebra comprendida de tres nucleótidos 2' -OH (AUC) al extremo 5' terminal. Cuando se. coadministraron con un polímero de suministro este siARN (SEQ ID NO par 260/263) llevó a 77% de submodulación de FVII en suero en ratones, en comparación con sólo 60% cuando se usa el siARN idéntico con un colesterol unido establemente. El mismo siARN con un colesterol conjugado por medio de un enlazador de acuerdo con la fórmula la al extremo 5' terminal de la hebra en sentido (SEQ ID NO par 261/263) llevó a 93% de reducción de la actividad de FVII en suero. Todos los resultados se lograron mediante co-administración de 15 mg/kg de un polímero de suministro con 2.5 mg/kg de siARN conjugado a ¡i colesterol en ratones.
Estos resultados indican que el uso de un, enlazador ¦ J cortable mejora la potencia in vivo de moléculas de: siÁRN que no contienen nucleótido 2' -OH. El enlazador cortablé puede ya sea comprender nucleotidos que contengan 2' -OH, un motivo de corte dipéptido o una química enlazadora de disulfuro. Todas las construcciones enlazadoras cortables mejoran la potencia in vivo en un escenario de co-administración de moléculas de siARN conjugadas a colesterol con un polímero de suministro i de liberación endosómica lenta.
Tabla 15 Comparación in vivo de varias químicas enlazadoras para moléculas de siARN conjugadas a colesterol Ejemplo 51 Estabilidad en suero in vi tro de moléculas de siARN con enlazadores cortables La estabilidad del enlazador cortable se evaluó en un ensayo de estabilidad in vitro. Las hebras en sentido conjugadas a colesterol fueron incubadas en 90% de suero de ratón a 37°C durante varios puntos de tiempo. La reacción de incubación se detuvo mediante la adición de proteinasá K en un regulador de pH que contenía dodecilsulfato de sodio (SDS) . El tratamiento degrada todas las proteínas y enzimas i sin interferir con la integridad de la hebra de ARN. 25 ÍiL De esta solución se inyectaron directamente en un sistema « AEX-HPLC conectado a un detector UV a 260 nm. AEX-HPLC Se llevó a cabo en una columna Dionex DNA Pac200 (4x250 mm) a 75°C usando un regulador de pH Tris 20 mM que contenía 50% de ACN a pH=8. 800 nM De NaBr en eluyente B sirve como sal eluyénte. Se empleó un gradiente de 25 a 62% de B en 18 minutos.
El ARN de una sola hebra que contiene colesterol eluye de la columna de HPLC como un pico ancho a 260 ' nm . Después del corte del colesterol, agudos picos simétricos se observan en tiempo de retención más bajo. La velocidad de corte de colesterol se determinó por la siguiente ecuación (PA = área pico) : % (ARN libre) = 100% PA [ARN libre] / ( PA [AR libre]+PA [conjugado de cole$terol ARN] Se mostró in vitro, que la saliente (AUC) de nucleótido 3nt se corta cuantitativamente en menos dé 1 hora en 90% de suero de ratón. El corte se presenta 3' hacia los dos nucleótidos de piridina en la saliente, llevando aP dos ;l metabolitos de corte distintos (las áreas pico dé los metabolitos fueron resumidas para evaluación de datos,) . En contraste, el enlazador que contenía dipép ido se pone con la fórmula la, el disulfuro y el colesterol enlazado establemente son completamente estables en suero de ratón.
Ejemplo 52 1 Distribución tisular de moléculas de siARN con enlazadores cortables 1 " ,1 Estos resultados indican que el uso de un enlazador cortable mejora la potencia in vivo de moléculas de siARN que no contienen nucleótido 2' -OH. El enlazador cortable puede estar ya sea comprendido de nucleótidos que contienen 2/ -OH, un motivo de corte dipéptido o una química enlazadora de disulfuro. Todas las construcciones de enlazadores cortables mejoran la potencia in vivo en un escenario dé coadministración de una molécula de siARN conjugada a colesterol con un polímero de suministro de liberación endosómica lenta.
Brevemente, la cuantificación de siARN se basa¦ en la hibridación de una sonda PNA marcada fluorescentemente (Atto-425) (Atto425-00-TGAGTTGGCACGCCTTT obtenida de Panagene;. Inc, Corea) complementada a la hebra en sentido del dúplex: de SiARN, seguida por separación a base de AEX-HPLC. La cuantificación se hizo mediante detección por fluorescencia contra una curva de calibración externa que se generó a partir de una serie de diluciones de las moléculas de siAR FVII usadas en el experimento in vivo (véase ejemplo 42) . Para muestras de plasma de entre 0.2 a 2 ]i y para alícuotas de tejido de alrededor de 1 mg se inyectaron en el sistema HPLC.
En la tabla 16 se muestran los resultados del análisis de tejido hepático. Cuando se analiza el contenido de siARN fue encontrado, que la hebra antisentido está presente en tejido hepático es cortada cuantitativamente de colesterol cuando se usa ya sea el motivo enlazador dipéptido o la saliente 5' de 3 nt con la secuencia AUC enlazadora no modificada. En contraste, sólo 15% del siARN enlazado a disulfuro que está presente en el hígado es cortado de colesterol dentro de las primeras 48 horas luego det la dosificación y nada del colesterol establemente ünido se corta del siARN.
Cuando se comparan las cantidades absolutas ! de siARN libre de colesterol en tejido hepático cantidades similares se encontraron para el enlazador de disulfu'ro y para el enlazador AUC de ARN, adecuadamente correlacionándose con la actividad en suero de FVII igual 48 horas después'; de la dosificación. La actividad FVII más baja lograda con el siARN de colesterol enlazado a dipéptidos se correlaciona fuertemente con la cantidad absoluta más alta del siARN libre de colesterol cortado.
La cantidad total de conjugados de siARN de colesterol equipado con un enlazador (AUC) en lai hebra en sentido suministrada al hígado es ~ 6 veces más baja en comparación con el colesterol establemente o unido a disulfuro y ~3 veces más baja en comparación con ei siARN de colesterol conjugado a dipéptido. La presencia; t isular reducida puede atribuirse al hecho de que el enlazador AUC no i sólo es un substrato para nucleasas intracelulares , sino también para nucleasas presentes en circulación como se muestra en incubación in vitro con suero de ratón . Cuando el ligando de colesterol se corta del siARN ya en circulación, el siARN resultante es propenso a la depuración renal y es rápidamente excretado en la orina sin suministro en tejido.
Tabla 16 Ejemplo 53 Actividad de supresión in vivo de moléculas de si AR con enlazadores de ARN cortables El experimento in vivo se llevó a cabo como se describió en el ejemplo 30 en ratones usando conjugados de siARN a colesterol- En el ejemplo 50 el colesterol se conectó a la hebra en sentido por medio de una saliente de una sola hebra que contenía tres nucleótidos! 2'-0H (AUC) en el extremo 5' terminal (SEQ ID NO par 260/263) , que mostró baja estabilidad en suero como se describió en el ejemplo 51. Esto llevó a una concentración tisular claramente reducida en comparación con las químicas enlazadoras estables en suero como las descritas' en el ejemplo 52. La combinación de sólo uno o dos nucleótidos 12' -OH seleccionados junto con nucleótidos 2'-OMe dentro del enlazador llevó a una estabilidad en suero más alta, pero mantiene sensibilidad contra nucleasas presentes en el endosoma/lisosoma. La actividad enzimática de nucleasas presentes en el endosoma/lisosoma corta selectivamente en las posiciones de los nucleótidos 2'-0H. ' Las moléculas de siARN conjugadas a colesterol que comparan varios motivos enlazadores de nucleótidos cortables se resumen ,en la tabla 17. Todas las moléculas de siARN tienen el contexto de: secüéncia idéntico, sólo la química enlazadora fue alterada. Colesterol se conectó al extremo 5' terminal de la hebra en sentid por medio de saliente de una sola hebra comprendida de 3 a 4 nucleótidos a los nucleótidos con números variables 2 ' -OH y 2' -OMe. Cuando se coadministró con un polímero de suministro todas las moléculas de siARN llevaron a una submodulación de FVTI en suero en ratones. El siARN (SEQ ID NO par 276/282) llevó a 87% de reducción de actividad de FVIÍ en suero 48 horas y 95% 168 horas después de la dosificación. El siARN (SEQ ID NO par 277/282) llevó a una reducción de actividad FVIÍ del 79% en suero 48 horas y 97% 168 horas después de la dosif icaciorl. Todos los resultados se lograron mediante co-administración de 15 mg/kg " de un polímero de suministro con 2.5 mg/kg del siARN conjugado a colesterol en ratones. .
Tabla 17 Comparación in vivo de varios motivos enlazadores de nucleótidos para moléculas de siARN conjugadas a colesterol Estos resultados indican que el uso de un enlazador nucleótido que es estable en suero y portable i en endosoma/lisosoma mejora más la potencia in vivo de moléculas de siARN en comparación con moléculas de siARN con 1 un enlazador lábil en suero. Todas las construcciones enlazadoras cortables mejoran la potencia in vivó] eri! ! un escenario de co-administración de moléculas de siARN conjugadas a colesterol con un polímero de suministro de lenta liberación endosómica.
En las siguientes tablas se resumen las moléculas de siAR usadas en los ejemplos.
Tabla 18 Secuencias centrales Tabla 19 Mapeo de secuencias centrales y secuencia modificada I Se hace constar que con relación a esta fecha,, el mejor método conocido por la solicitante para llevar; a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (22)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como anbecedjs, se reclama como propiedad lo contenido en las siguijjentes reivindicaciones : ! li Ij
1. Uso de un compuesto de la fórmula ¡¡ i (O, para el suministro de ácidos nucleicos, en donde Y es un grupo enlazador seleccionado de - (<G?2):?" ° C(O) -N- (CH2-CH2-0)p-CH2-CH2-; I ! ¦! R1 es -alquilo (Cl-6) ; - (CH2) -naftilo; o ' - (CH2) m-fenilo, fenilo que es no sustituido oi'hasta cuatro veces sustituido con un sustituyente seleccionado independientemente de i -N02, -CN, Halógeno, -O- (CH2) -fenilo, -O- (Cl-6) alquilo, o -C(0)-N¾; R2 es hidrógeno; - (CH2)k:-N-C(Ph) 3/ anillos fenilo que son no sustituidos o sustituidos independientemente con -0- (Cl-4) alquilo; -(CH2)k -C(0)-NH2; - (CH2)k- fenilo ; -alquilo de (Cl-6) , el cual es no sustituido o , sustituido i una vez con -S-CH3; R3 es -NH-fenilo, grupo fenilo que es sustituido i además con un sustituyente seleccionado independientemente de - (CH2) -OH; o - (CH2) -0-C(0) -O- (4-nitro-f enilo) ; k es 1, 2, 3, 4, 5, 6 ; m es 1 , 2 , 3 ó 4 ; n es 0 ó 1; y p es un entero de 1 a 20.
2. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el compuesto de la fórmula (I) tiene la conf ornación como la mostrada en la fórmula (la)
3. El uso de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, en donde Y de los compuestos de la fórmula (I) o (la) es - (CH2)3-.
4. El uso de conformidad con la reivindicación 3, en donde el sustituyente de los compuestos de la fórmula (I) o (la) ; Y es - (CH2) 3- ; R2 es - (CH2) k-N-C (Ph) 3- , anillos fenilo que son no sustituidos o sustituidos independientemente con -^0- alquilo de (Cl-4) ; y ; R3 es -NH-fenilo, grupo fenilo que se sustituye además con - (CH2) -O-C (0) -0- (4 -nitro-fenilo) ; n es 0 ; y R1 y k tienen los significados indicados arriba,
5. El uso de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, en donde el sustituyente Y de los compuestos de la fórmula (I) o (la) es -C (0) -N- (CH2-CH2-0) p-CH2-CH2- .
6. El uso de conformidad con la reivindicación 5, en donde el sustituyente de los compuestos de la fórmula (I) o (la) Y es -C(0) -N- (CH -CH2-0) p-CH2-CH2- ; R2 es - (CH2) k-N-C (Ph) 3, anillos fenilo qué son no sustituidos o sustituidos independientemente con -Q-alquilo de (Cl-4) ; y R3 es -NH-fenilo, grupo fenilo que se sustituye además con - (CH2) -O-C(O) -O- (4-nitro-fenilo) ; n es O ; y R1, k y p tienen los significados indicados arriba.
7. El uso de conformidad con cualquiera dé las reivindicaciones 1 a 6, en donde el compuesto está unido covalentemente al ácido nucleico.
8. Un compuesto caracterizado porque tiene la fórmula (II) en donde Ra es - (CH2)ki-NH2; R1 y k tienen los significados indicados para la fórmula (I) arriba.
9. El compuesto de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque tiene la conformación como la mostrada en la fórmula (lia) ácido nucleico (na) en donde Ra es - (CH2)k-NH2; R1 y k tienen los significados indicados para la fórmula (I) arriba.
10. El compuesto de conformidad con,, la reivindicación 8 ó 9, caracterizado porque el ácido nucleico es un oligonucleótido que comprende una hebra en antisentido con el patrón de modificación 5' - (w) - (Zl) - (Z2) - (Z3)na-3' y una hebra en sentido con el patrón de modificación 5' - (?3)?3-3' , en donde w es independientemente un 5 '-fosfató ó* 5'-fosfotioato o H, Zl es independientemente un nucleótido 2'-modificado Z2 es independientemente un 2'-desoxi nucleótido o nucleótido 2' -fluoro-modificado, Z3 es independientemente un nucleótido , 2'-modificado, na es 8-23 y ns es 8-25.
11. El compuesto de conformidad con cualquieKa de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque ; el : cido nucleico es un siAR .
12. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque , el .ácido nucleico se administra con un polímero de suministro.
13. Una composición farmacéutica caracterizado porque comprende el compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
14. Un oligonucleótido caracterizado porque comprende una hebra en antisentido con el patrón de ¦i modificación 5' - (w) - (Zl) - (Z2) - (Z3)na-3' y una hebra en sentido con el patrón de modifideación 5' - (?3)?3-3' , en donde w es independientemente un 5' -fosfató o1 5'-fosfotioato o H, Zl es independientemente un nucleótido 2'-modificado Z2 es independientemente un 2'-desoxi nucleótido o nucleótido 2' -fluoro-modificado, Z3 es independientemente un nucleótido i 2'-modificado, na es 8-23 y ns es 8-25. ' ; '¦' '
15. El oligonucleótido de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque Zl es un nucleótido 2 ' -fluoro-modificado o un 2 ' desoxi-nucleótido y todos los sustituyentes restantes así como las variables na y: ng tienen el significado indicado arriba.
16. El oligonucleótido de conformidad"» con cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15, caracterizado porque Z3 es un nucleótido modificado con 2 ' -O-metil , un 169 nucleótido modificado con 2'-fluoro o un 2 ' desoxi-fmcléótido y todos los sustituyentes restantes así como las variables na y n3 tienen el significado indicado arriba.
17. El oligonucleótido de conformidad , con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, caracterizado porque está enlazado covalentemente a un polímero de suministro.
18. Un conjugado caracterizado porque comprende el oligonucleótido de conformidad con cualquiera las reivindicaciones 14 a 17, y colesterol .
19. Un conjugado caracterizado porque comprende el oligonucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, y un compuesto de la fórmula i siARN (|v)
20. Un conjugado de una molécula pequeña - y el oligonucleótido de conformidad con cualquiera dé las reivindicaciones 14 a 17, caracterizado porque la mql.écula ? 170 pequeña comprende un enlazador de nucleótidos que comprende 1-10 2 ??-nucleótidos ; y el oligonucleótido está unido covalentemente al enlazador de nucleótidos de la molécula pequeña.
21. El conjugado de conformidad con la i ' :' reivindicación 20, caracterizado porque la molécula pequeña 1 es colesterol o un compuesto de la fórmula > en donde R es un enlazador de nucleótidos que comprende 1-10 2 ??-nucleótidos .
22. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el oligonucleótido de conformidad ¡ con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, o el conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21.
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