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MX2012012262A - Proceso para preparar una composicion de inmunoglobulina. - Google Patents

Proceso para preparar una composicion de inmunoglobulina.

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MX2012012262A
MX2012012262A MX2012012262A MX2012012262A MX2012012262A MX 2012012262 A MX2012012262 A MX 2012012262A MX 2012012262 A MX2012012262 A MX 2012012262A MX 2012012262 A MX2012012262 A MX 2012012262A MX 2012012262 A MX2012012262 A MX 2012012262A
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MX
Mexico
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igm
solution
process according
antibody preparation
preparation
Prior art date
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MX2012012262A
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MX337060B (es
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Wolfgang Moeller
Dieter Rudnick
Oliver Maneg
Michael Rodemer
Herbert Dichtelmueller
Eckhard Flechsig
Original Assignee
Biotest Ag
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Publication date
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Application filed by Biotest Ag filed Critical Biotest Ag
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Publication of MX337060B publication Critical patent/MX337060B/es

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Abstract

Se proporciona un proceso para la preparación de una composición de inmunoglobulina a partir de una fracción de plasma que comprende inmunoglobulinas, y preparaciones de anticuerpo preparados utilizando el proceso.

Description

PROCESO PARA PREPARAR UNA COMPOSICIÓN DE INMUNOGLOBULINA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un proceso para la preparación de una composición de inmunoglobulina segura para virus, y preparaciones de anticuerpos y composiciones farmacéuticas que pueden prepararse utilizando el proceso.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las composiciones de inmunoglobulina preparadas a partir de plasma humano y adecuadas para administración intravenosa, se conocen en la especialidad y por varias décadas han jugado un papel importante en el tratamiento de un amplio rango de enfermedades. Se emplean inmunoglobulinas , por ejemplo para el tratamiento de infecciones en humanos y pueden asignarse a diversas clases con diversas propiedades bioquímicas y fisiológicas. La inmunoglobulina G participa en defender contra antígenos virales, mientras que IgM es predominantemente activo en respuestas inmunes a antitoxinas y antibacteriales.
Las soluciones de inmunoglobulina comprenden IgG, IgA e IgM en diversos porcentajes, con diferentes preparaciones que tienen diferentes aplicaciones de tratamiento, por ejemplo preparaciones con un superior porcentaje de IgM se emplean en la profilaxis o tratamiento de infecciones bacterianas. En contraste a preparaciones IgG, los anticuerpos IgM fácilmente se agregan en solución. Las preparaciones de IgM son difíciles de estabilizar especialmente si se enriquecen en comparación con concentraciones en plasma y almacenan en solución líquida.
Las soluciones de inmunoglobulina usualmente se preparan a partir de fracciones de suero o plasma de sangre, por ejemplo fracciones Cohn. Estas fracciones después se someten a una cantidad de etapas de purificación para retirar contaminantes incluyendo virus, proteínas desnaturalizadas, proteasas y lípidos. Plasma humano para fraccionación se recolecta de miles de donadores y pueden contener virus patogénicos a pesar de una completa o detallada prueba de plasma fuente. Por lo tanto, etapas de proceso para inactivar o retirar virus son esenciales para lograr productos seguros para uso en medicina. Se conocen en la especialidad varias técnicas para inactivación/eliminación de virus, por ejemplo tratamientos químicos, irradiación con luz UVC o filtración de nanómetros, que se realizan a fin de asegurar una seguridad total de virus. Sin embargo, estas etapas pueden tener un impacto negativo en la actividad de las inmunoglobulinas por ejemplo tiempos de irradiación prolongados con UVC pueden reducir el rendimiento de IgM inactivas y activas que se obtienen en la solución de inmunoglobulina final.
La capacidad de inactivación o eliminación de virus de las etapas de proceso se valida utilizando modelos a escala de laboratorio del proceso de producción y por cada etapa se determina un factor de inactivación o eliminación. Un aumento del factor de inactivación/eliminación agrega seguridad adicional viral al producto farmacéutico. Las guias actuales de las autoridades regulatorias requieren cuando menos dos etapas efectivas para virus con envolvente y sin envolvente en la fabricación de productos farmacéuticos derivados del plasma .
Además de virus que estén potencialmente presentes, también es necesario retirar otros contaminantes como proteasas, agregados de proteínas e inmunoglobulinas desnaturalizadas para lograr un producto bien tolerado. Inmunoglobulinas desnaturalizadas en especial son un riesgo potencial para los pacientes debido a que tienen una gran capacidad para activar complemento en forma no específica, lo que lleva a severos efectos secundarios en pacientes que reciben estas inmunoglobulinas desnaturalizadas. Está actividad anticomplementaría (ACA) se mide por una prueba estandardizada descrita en la Farmacopea Europea.
La eliminación de todos estos contaminantes es esencial (1) para que el producto sea tolerado por el paciente después de administración intravenosa, (2) para asegurar que el producto cumple con guías de bio-seguridad respecto a contaminación viral, (3) para permitir que el producto sea estable durante almacenamiento a largo plazo y (4) para generar la composición farmacéutica/mezcla de compuestos deseada.
La purificación inicial de soluciones de IgM humana se ha llevado a cabo por clásicos métodos de fraccionación de plasma Cohn o su modificación bien conocida (por ejemplo Cohn/Oncley, istler/Nitschmann) . Utilizando procesos de precipitación con etanol en frío la fracción de IgM se recupera en la fracción III o fracción I/III (también denominada B o B+I). Partiendo de la fracción III o I/III se han descrito métodos para purificación de soluciones de proteínas enriquecidas en IgM. EP0013901 describe un método de purificación que parte de la fracción III, incluyendo etapas que utilizan ácido octanóico, ß-Propiolactona y una etapa de adsorción utilizando una resina de intercambio aniónico. Este método se emplea para producir Pentaglobin® - a la fecha, el único producto IgM intravenoso comercialmente disponible. EP0352500 describes la preparación de un concentrado de IgM para aplicación intravenosa con una actividad anti-complementaría reducida al utilizar cromatografía de intercambio aniónico, ?-Propiolactona, radiación de luz UVC y una etapa de incubación a temperatura incrementada (40°C a 60°C) . ?-propiolactona es un producto químico bien conocido empleado en etapas de esterilización para inactivar virus que estén potencialmente presentes. Ya que ?-propiolactona es una sustancia muy reactiva, que provoca la modificación químicas de proteínas, también hay pérdida substancial de las actividades anti-virales y antibacterianas de las inmunoglobulinas . La preparación elaborada por este método fue estable en solución líquida por un tiempo limitado debido a la modificación química. La concentración de IgM tuvo sobre 50% del contenido total de inmunoglobulina .
La preparación de soluciones de proteína enriquecidas en IgM sin modificación química por ß -propiolactona se ha descrito en EP0413187 (Biotest) y EP0413188 (Biotest) . Estos métodos involucran someter una solución de proteínas conveniente, a tratamiento con ácido octanóico y cromatografía de intercambio aniónico, partiendo de la fracción Cohn III o II/III. En la patente EP0413187 (Biotest) el tratamiento de ácido octanóico se lleva a cabo al agitar por 15 min, a fin de retirar lípidos presentes en la fracción Cohn III.
Ya que grandes cantidades de inmunoglobulinas se administran intravenosamente a pacientes, debe lograrse una preparación farmacéutica tolerable. Preparaciones de IgM se han descrito como difíciles de preparar para aplicación intravenosa. IgM por naturaleza es un activador vigoroso de complementos después de enlace de antigeno. Por lo tanto, actividad anticomplementaria no especifica de moléculas de IgM desnaturalizadas es bastante más peligrosa para pacientes que moléculas IgG desnaturalizadas. La preparación de acuerdo con EP0413187 tiene una baja actividad anticomplementaria, entre 0.6 y 0.8 CH50/mg de proteina, pero debe estabilizarse e inactivarse de virus por ?-propiolactona . Baja actividad anticomplementaria se considera como < 1 CH50/mg de proteina de acuerdo con la monografía de EP para inmunoglobulina .
EP0413188B1 (Biotest) describe la elaboración de una preparación enriquecida con IgM para administración intravenosa al utilizar una cromatografía de intercambio de aniones a fin de reducir la actividad anti-complementaría . Adicionalmente, un tratamiento a pH 4 - 4.5 de 40 a 60°C, de preferencia entre 50 y 54°C, se describió para reducir la actividad anticomplementaría . Esta preparación tuvo que liofilizarse para asegurar estabilidad de la preparación por varios meses. Estabilidad a largo plazo como una solución líquida no pudo mostrarse.
Otro método describe el uso de tratamiento con ligero calentamiento de preparaciones de IgM a 40 a 62°C, de preferencia 45 a 55°C, a pH 4.0 a 5.0 (EP 0450412, Miles) para reducir la activación de complemento no específica. En esta solicitud de patente, se agrega ácido octanóico a una suspensión de fracción Cohn III a fin de retirar activador precalicreina y lipoproteinas por centrifugación. Sin embargo, este tratamiento llevo a perdida parcial de determinantes antigénicos de IgM. Esto puede aumentar el riesgo de generar neo-antigenos, lo que lleva a una inmunogenicidad incrementada en humanos o la perdida de actividad.
La preparación de una solución de proteina que contiene IgM para aplicación intravenosa al utilizar un tratamiento de proteasa (por ejemplo con pepsina) después de una etapa de precipitación de ácido octanóico se ha descrito en EP0835880 (US 6136312, ZLB). E1 tratamiento de proteasa lleva a fragmentación parcial de la molécula de inmunoglobulina que deteriora la actividad funcional completa de las partes Fab y Fe. Por lo tanto inmunoglobulinas tratadas con proteasa no puede considerarse como modificada. También, este método de preparación lleva a aproximadamente fragmentos de 5% con un peso molecular de <100kD.
Los métodos descritos para llevar a cabo el tratamiento con ácido octanóico (EP0413187 y EP0835880) tienen la desventaja de que el tratamiento con ácido octanóico no es efectivo respecto a eliminación e inactivación de virus sin envolvente, y no retira substancialmente toda la actividad proteolitica.
En EP 0345543 (Bayer, Miles) se describe una preparación de IgM altamente concentrada con al menos 33% de IgM para uso terapéutico, la preparación está substancialmente libre de títulos de isoaglutinina. En esta solicitud de patente, se lleva a cabo una precipitación de ácido octanóico, al agregar el ácido octanóico y las isoaglutininas se retiran por cromatografía de afinidad Synsorb. La preparación final debe de secarse por congelamiento .
Aunque la elaboración de una preparación que contiene IgM con baja actividad anticomplementaría es posible, si las inmunoglobulinas se modifican química o enzimáticamente y/o purifican adicionalmente por cromatografía y/o someten a un ligero tratamiento térmico.
Sin embargo, los métodos de la técnica previa que llevan a una preparación de inmunoglobulina no modificada no son capaces de lograr la capacidad de inactivación de virus para todos los virus que estén potencialmente presentes. Aunque varios métodos, tales como tratamiento con solvente/detergente, tratamiento con ácido octanóico, filtración de nanómetros y tratamiento térmico, son efectivos para inactivar o retirar virus envueltos, solo hay unos cuantos métodos conocidos que inactivan o retiran virus no envueltos, por ejemplo Parvo virus. Estos virus no envueltos, en su mayoría son muy pequeños, usualmente pasan a través de filtros de nanómetros con tamaños de poros sobre 20 nm. Este tamaño de poros es muy pequeño para moléculas IgM que tiene un diámetro de hasta 30 nm. Virus no envueltos son efectivamente inactivados por productos químicos como ß-propiolactona que sin embargo, también llevan a una inmunoglobulina modificada con funciones alteradas. Otro tratamiento efectivo es radiación ÜVC (EP1842561, CAF-DCF) . Sin embargo, conocidos tratamientos con solvente/detergente, tratamiento con ácido octanóico y ligero tratamiento térmico, no tienen efecto substancial en virus no envueltos.
Por lo tanto, todas las preparaciones que contienen IgM químicamente no modificadas, que se preparan por los métodos de la técnica previa, y que tienen baja actividad anticomplementaría, no son seguras para uso humano respecto a virus no envueltos por ejemplo Parvovirus.
En resumen los métodos de la técnica previa que aislan una preparación que contiene IgM tolerable intravenosa tienen ciertas desventajas, tales como la incapacidad para inactivar o retirar efectivamente virus no envueltos y la capacidad limitada por retirar actividad proteolítica mientras que mantienen IgM con alto rendimiento en solución. (Actividad proteolítica se refiere a la suma de proteasas presentes en la preparación) . Ya que una preparación de proteina liquida debe ser almacenable por largos periodos (por ejemplo 2 años), debe omitirse la actividad de proteasa residual, ya que estas actividades pueden llevar a degradación de la preparación farmacéutica.
De esta manera, el objetivo de la presente invención es resolver estas desventajas.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN En un primer aspecto, la presente invención proporciona un proceso para la preparación de una composición de inmunoglobulina IgM, a partir de una fracción de plasma que comprende inmunoglobulinas , el proceso comprende : (a) proporcionar una fracción de plasma como una solución que contiene las inmunoglobulinas; b) mezclar un ácido carboxilico C7 a Cg con la solución y tratar la solución mezclada con un agitador de vibración para precipitar las proteínas contaminantes; y (c) separar las proteínas precipitadas de la solución para dar por resultado la composición de inmunoglobulina que contiene IgM.
Los presentes solicitantes han encontrado de manera sorprendente que el uso de un agitador de vibración durante la etapa en donde la solución de inmunoglobulina se mezcla con el ácido carboxilico, es extremadamente ventajosa. Esta etapa de método proporciona una eliminación más eficiente de proteínas indeseadas (incluyendo proteasas) y produce un producto intermediario que es más adecuado para etapas de procesamiento corriente abajo utilizadas para producir un medicamento de inmunoglobulina ; el producto intermedio permite que estas etapas de procesamiento corriente abajo sean más eficientes. En particular, la composición que contiene inmunoglobulina IgM obtenida de la etapa (c) puede combinarse con etapas de tratamiento adicionales, tales como tratamiento con condiciones ligeramente acidas y tratamiento con radicación UVC, para producir una preparación de anticuerpo o producto de inmunoglobulina que contiene IgM que es adecuado para administración intravenosa y que tiene las siguientes propiedades ventajosas: (i) está químicamente modificado; (ii) es seguro para virus (iii) tiene baja actividad proteolítica (y por lo tanto es estable durante almacenamiento a largo plazo); (iv) tiene baja actividad anti-complementaría ; y (v) retiene un alto nivel de IgM nativa y activa. El nivel de seguridad de virus logrado con los métodos aquí descritos no se ha obtenido previamente. Además, el uso del método de la presente invención logra una preparación de anticuerpo o producto de inmunoglobulina que contiene IgM con combinaciones de estas características que previamente no se han obtenido.
En particular, las etapas de método de la presente invención llevan a una superior inactivación y eliminación de partículas de virus, en especial virus muy resistentes sin envolvente tales como Parvovirus, que usualmente no son muy susceptibles a tratamiento con ácido octanóico. Además, se logra una eliminación mejorada de actividad proteolítica en comparación con agitación convencional. Estas características se logran mientras que se mantiene un alto rendimiento de IgM que químicamente no está modificada. Este hallazgo contrasta con la vista convencional que el tratamiento con ácido octanóico no es una etapa efectiva contra virus no envueltos y debe lograrse mejorada seguridad viral a través de inactivación de virus, por métodos más agresivos tales como tratamiento ß -Propiolactona . También era bien conocido que incrementar por ejemplo la concentración de ácido octanóico para retirar completamente actividad proteolítica resulta en una pérdida masiva de IgM.
Los resultados de la presente invención se logran a través del uso de dispositivos de mezclado utilizando un modo de vibración en combinación con tratamiento de ácido octanóico. Esto es particularmente sorprendente ya que se conoce que IgM es muy susceptible a esfuerzo cortante, lo que puede llevar a una actividad anticomplementaria elevada indeseable. De acuerdo con esto, no se considerará utilizar un mezclador vibratorio para preparar una composición de IgM y se espera este impacto favorable cuando se utiliza un mezclado vibratorio durante procesamiento de una solución que contiene IgM.
Además, con el método de la presente invención, la separación lograda por la etapa (c) , tal como clarificación por filtración de la solución de tratamiento de ácido octanóico que resulta de la etapa (b) , se mejora cuando se emplea un dispositivo de mezclado con vibración. La separación se logra más fácilmente, reduciendo tiempo de procesamiento y costos de fabricación, y la etapa (c) lleva a una solución limpia que crea ventajas para procesamiento corriente abajo. Soluciones convencionales, que se logran al filtrar los resultados de soluciones que contienen IgM tratadas con ácido octanóico que se han agitado, son opalescentes u opacas.
La composición que contiene IgM resultante obtenida de la etapa (c) de preferencia se somete a tratamiento con condiciones ligeramente ácidas (por ejemplo pH 4) y una etapa de radiación de UVC para mejorar adicionalmente la seguridad de virus y estabilizar el producto final. Debido a la clarificación mejorada de la composición de inmunoglobulina que contiene IgM obtenida de la etapa (c) , es posible reducir el tiempo de radiación necesario con UVC para lograr una inactivación de virus no envueltos de más de 3 o 4 logi0. Esto resulta en un rendimiento superior de IgM nativa y activa durante tratamiento con UVC.
De manera sorprendente, estas etapas llevan a una solución que contiene IgM química y enzimáticamente no modificada, que tiene superiores rendimientos de IgM, nativa y activa, tiene baja actividad anticomplementaria y baja actividad proteolítica y tiene alta actividad antibacteriana y antiviral, con sobresaliente seguridad de virus referente a virus envueltos y no envueltos; una característica clave para productos farmacéuticos que son para administración intravenosa. Aún más, una solución que contiene IgM tratada que tiene mejorada estabilidad a. largo plazo, es muy estable en solución líquida por más de 12 meses a 2 - 8°C.
De acuerdo con esto, en un aspecto adicional la presente invención proporciona una preparación de anticuerpo que se obtiene utilizando el proceso de la presente invención anteriormente establecido y una preparación de anticuerpo que comprende IgM y tiene una actividad proteolítica menor a 8 U/1. En particular, la preparación de anticuerpo es adecuada para administración intravenosa en humanos y comprende IgG, IgA y IgM, en donde al menos 5% del total de inmunoglobulinas son IgM.
Aún más, la presente invención proporciona preparación anticuerpo de la presente invención para utilizar en medicina. En una modalidad, la preparación de anticuerpo es para utilizar en el tratamiento de desórdenes inmunológicos e infecciones bacterianas.
Un aspecto adicional de la presente invención proporciona un método de tratamiento que comprende administrar a un paciente la preparación de anticuerpo de la presente invención.
La presente invención ahora se describirá con mayor detalle de manera de ejemplo solamente, con referencia a las figuras acompañantes.
La FIGURA 1 proporciona una vista general de una modalidad de la invención, en donde se muestran las etapas pueden utilizarse para formar una preparación de anticuerpo adecuada para administración intravenosa. La etapa de tratamiento de ácido octanóico que emplea un dispositivo vibromezclador, el tratamiento a pH 4 y el tratamiento de UVC, se resaltan. El material de partida se genera a partir de un proceso de precipitación con etanol frío estándar de plasma humano.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se describió anteriormente, la presente invención proporciona un proceso para la preparación de una composición de inmunoglobulina que contiene IgM, a partir de una fracción de plasma que comprende inmunoglobulinas . Fracciones de plasma adecuadas para la preparación de composiciones de inmunoglobulina farmacéuticas y métodos para su producción, se conocen bien en la técnica. En particular, cuando las composiciones de inmunoglobulina farmacéuticas son para administración a humanos, la fracción de plasma se obtiene de plasma humano. La fracción de plasma de preferencia es una fracción de plasma precipitado y más preferiblemente una fracción de plasma precipitado que se obtiene por el proceso de fraccionación Cohn o sus modificaciones bien conocidas (por ejemplo, Kistler-Nitschmann) . Más preferiblemente, la fracción es fracción I/III o fracción III (también conocida como fracción B+I o fracción B) de fraccionación con etanol frió. Se prefiere que las inmunoglobulinas de la fracción de plasma comprendan al menos 5% IgM.
La etapa (a) comprende proporcionar una fracción de plasma como una solución que contiene las inmunoglobulinas. En muchos casos, la fracción de plasma que contiene las inmunoglobulinas estará en forma sólida o semisólida. De esta manera, el objetivo de esta etapa es asegurar o llevar la proteina de la fracción de plasma a solución, tal que esté en un estado conveniente para mezclar con el ácido carboxilico en la etapa (b) . Esta etapa puede comprender mezclar la fracción de plasma con un amortiguador conveniente. De preferencia, el amortiguador es de baja molaridad (es decir menos de 1 M) y tiene un pH de entre 4.5 y 5.5, por ejemplo amortiguador acetato de sodio 0.1 M pH 5.05+0.1. El mezclado puede completarse utilizando un mezclador de aspas o un agitador con vibración .
En la etapa (b) , la solución formada en la etapa (a) se mezcla utilizando un agitador con vibración con un ácido carboxilico C7 a Cg para precipitar proteínas contaminantes (por ejemplo proteasas, virus, etc.). El ácido carboxilico puede ramificarse y/o puede incluir sustituyentes que no alteran sustancialmente el efecto de la etapa (b) . El ácido carboxilico de preferencia es ácido octanóico. El ácido de preferencia se agrega a una concentración de al menos 0.075 kg/kg de la fracción de plasma, hasta una concentración de 0.2 kg/kg. Más preferiblemente, el ácido se agrega a 0.8 a 0.15 kg/kg de fracción de plasma y más preferiblemente entre 0.09 kg/kg y 0.13 kg/kg. Ácido de cualquier molaridad conveniente puede emplearse para proporcionar la concentración correcta.
Cualquier tipo de agitador con vibración comercialmente disponible adecuado para utilizar en la industria química/farmacéutica, podrá emplearse. Ejemplos de agitadores con vibración convenientes están disponibles de Graber + Pfenninger GmbH. En particular, el vibromezclador "Labormodell Typ 1" puede emplearse para experimentos a escala de laboratorio y el " Industriemixer Typ 4" puede emplearse para preparaciones a escala de producción. Los mezcladores con vibración pueden emplearse de acuerdo con las instrucciones del fabricante y en particular en ajustes o parámetros que se describen por los fabricantes como adecuados para mezclar soluciones que contienen proteínas. Por ejemplo, los mezcladores con vibración usualmente pueden operarse a menos de 100 Hz con una amplitud menor a 10 mm, por ejemplo el mezclado con vibración que utiliza el "Labormodell Typ 1" a escala de laboratorio, se llevó a cabo por los presentes inventores a 50 Hz, cuando se emplea un suministro de energía de 230 V. La amplitud de vibración del proceso de mezclado se varió entre 0 y 3 mm, y para la preparación de IgM de preferencia 3 mm se empleó. Placas agitadoras con un diámetro de entre 23 mm y 65 mm se emplearon para experimentos a escala de laboratorio. Para escala de producción, se empleó un diámetro de placa agitadora de 395 mm (diámetros de orificios de 13.5 mm y 16 mm) .
En la etapa (b) el pH de la solución mezclada de preferencia está entre 4.5 a 5.5, y más preferiblemente entre pH 4.8 y pH 5.3. La etapa puede llevarse a cabo en amortiguador acetato de sodio y por ejemplo con amortiguador acetato de sodio aproximadamente 0.1 M. La temperatura en la cual la etapa (b) se realiza de preferencia está entre 10°C y 35°C, y más preferiblemente 14 a 30 °C.
El tiempo de mezclado que utiliza el agitador con vibración no está limitado particularmente pero de preferencia es al menos 30 minutos y no más que 3 horas, y más preferible de 40 - 110 minutos. Tiempos de incubación menores a 30 minutos pueden reducir el nivel de inactivación de virus.
En una modalidad de la etapa (b) , se mezcla fosfato tricálcico con la solución en la etapa (b) . De preferencia, esto se agrega a 0.01 a 0.02 kg/kg de fracción de plasma (ya que está en forma sólida o semisólida) . El fosfato tricálcico puede agregarse simultáneamente por separado o secuencialmente al ácido carboxilico. En una modalidad preferida el fosfato tricálcico se agrega al menos 20 minutos después del ácido carboxilico.
En la etapa (c) las proteínas contaminantes precipitadas en la etapa (b) se separan de la solución para dar por resultado la composición de inmunoglobulina que contiene IgM (es decir una solución que contiene inmunoglobulina) . Esta etapa de separación no está limitada particularmente pero puede realizarse por cualquier método conveniente conocido en la especialidad. Sin embargo, la etapa de separación de preferencia se realiza utilizando filtración y más preferiblemente ultrafiltración y el resultado de la etapa (c) por lo tanto es una solución filtrada .
Como se describió anteriormente, el método de la presente invención es ventajoso en términos de fabricación ya que parece provocar una precipitación más eficiente de proteínas contaminantes y como resultado, la etapa (c) es más fácil de realizar. Cuando la mezcla que resulta de la etapa (b) se separa, se logra una solución transparentemente clara, es decir la composición de inmunoglobulina que contiene IgM. La filtración por lo tanto es más rápida y más fácil.
Adicionales etapas de proceso se requieren para convertir la composición de inmunoglobulina que contiene IgM obtenida de la etapa (c) en una preparación de inmunoglobulina adecuada para administración intravenosa.
De acuerdo con esto, en una modalidad preferida, el proceso de la presente invención comprende las etapas adicionales de tratar la composición de inmunoglobulina que contiene IgM obtenida de la etapa (c) con ligeras condiciones ácidas y además someter la composición tratada con ácido, a radiación UVC.
Para tratamiento con condiciones ligeramente ácidas, la composición de inmunoglobulina que contiene IgM obtenida de la etapa (c) se incuba entre pH 3.5 a pH 4.5, y de preferencia entre pH 3.8 y pH 4.2, para formar una solución incubada. Las condiciones ligeramente ácidas pueden crearse al agregar un ácido conveniente a la composición de inmunoglobulina que contiene IgM, por ejemplo el pH puede ajustarse al agregar HCl 0.2 M.
Esta etapa de incubación de preferencia se lleva a cabo entre 32 y 42 °C, y más preferiblemente entre 35 y 39°C. El tiempo de incubación de preferencia es al menos 2 horas y no mayor que 24 horas y más preferiblemente al menos 9 horas pero no mayor que 16 horas.
En la etapa de radiación, la solución incubada que se obtiene del tratamiento con ácido débil descrito anteriormente se trata con luz UVC para formar una solución irradiada con UVC. Esta etapa puede realizarse utilizando dispositivos que están comercialmente disponibles tales como el dispositivo UVivatec© (Bayer Technology Services). Se prefiere que la solución incubada se trate a 254 ± 10 nm entre 200 y 500 J/m2, más particularmente entre 200 y 300 J/m2, a fin de inactivar adicionalmente virus y proteasas que están potencialmente presentes. Se nota que el tratamiento con UVC bajo ligeras condiciones que normalmente se requerirían es solo posible con el filtrado libre de agua que se obtiene por la presente invención después del tratamiento con ácido octanóico con vibromezclado . Soluciones más opalescentes u opacas normalmente recibidas por las técnicas de agitación estándar requerirán más prolongados tiempos de radiación, lo que lleva a más desnaturalización de la actividad IgM y menores proporciones de inactivación de virus.
Además del tratamiento con ácido débil y la radiación UVC, las etapas adicionales para lograr una preparación de inmunoglobulina para administración intravenosa, pueden opcionalmente también comprender una o más etapas de filtración. En una modalidad, la solución de proteínas que se procesa puede ser adsorbida en DEAE-Sephadex y después separada de Sephadex por filtración profunda. Por ejemplo, además puede someterse a adsorción por lotes con 75 mg por kg de proteína DEAE Sephadex a pH 5.8, a fin de retirar la proteína acompañante indeseada Ceruloplasmina .
En una modalidad particularmente preferida, la solución incubada que se obtiene del tratamiento con ácido débil se somete a adsorción en DEAE-Sephadex y después separa de Sephadex por filtración profunda antes de tratarse con radiación UVC.
En otra modalidad, la solución de inmunoglobulina que se procesa puede filtrarse a través de un filtro de nanómetros. Filtros con tamaño de poros de 75 ± 5 nm a 35 ± 5 nm o filtros que tienen un tamaño de poros nominal de 75 a 35 nm (por ejemplo Pall Ultipor DV50), pueden emplearse en diversas etapas durante el proceso. (Un tamaño de poros nominal por ejemplo de 50 nm significa una velocidad de retención de > 4 loglO para virus con tamaño de 50 nm o más grande). En una modalidad preferida, la solución obtenida de la etapa DEAE-Sephadex descrita en el párrafo anterior se pasa a través de un filtro de 0.2 µt antes de radiación UVC. En una modalidad preferida adicional, la solución de inmunoglobulina que se obtiene después de radiación UVC se somete a nanofiltración, de preferencia a través de un filtro que tiene un tamaño de poros 40 a 50 nm. Se prefiere que esta etapa deba llevarse a cabo bajo condiciones estériles .
La preparación de anticuerpo final (es decir la solución de inmunoglobulina que contiene IgM procesada) obtenida del proceso definido anteriormente puede llenarse directamente en un recipiente bajo condiciones estériles. En forma alterna, la preparación de anticuerpo puede formularse con un agente estabilizante, tal como glicina. En particular, la preparación puede formularse en un amortiguador que contiene glicina a un pH entre 4 y 5.5, y de preferencia entre 4.1 a 4.5. La preparación de anticuerpo también puede diluirse a una concentración de proteínas entre 40 y 80 g/L y de preferencia entre 55 y 70 g/L.
De preferencia, el proceso de la presente invención no comprende una etapa que involucra una o más modificaciones químicas de los anticuerpos en la preparación, modificación enzimática de los anticuerpos o tratamiento térmico de los anticuerpos (por ejemplo tratamiento de los anticuerpos a una temperatura de 40°C o más por 10 minutos o más) . En forma más particular, el proceso de la presente invención no incluye una etapa de contacto de los anticuerpos con ß-propiolactona y/o pepsina .
La presente invención además proporciona una preparación de inmunoglobulina o preparación de anticuerpos, que se obtiene por el proceso anteriormente descrito. La preparación de inmunoglobulina es policlonal y puede comprender al menos IgM al 5%, de preferencia al menos IgM al 15% y más preferiblemente al menos IgM al 20%. Las otras inmunoglobul inas son IgG y IgA. De preferencia, la preparación de inmunoglobulina comprende entre IgM al 5 y 30% (más preferible entre aproximadamente 15 y 30%), entre IgA al 5 y 30% (más preferiblemente entre 15 y 30%) y entre IgG al 40 y 70% (más preferiblemente entre 45 y 70%) . En el producto más preferido, el contenido de IgG es aproximadamente 50% y el contenido de IgM y IgA cada uno es de aproximadamente 25%. Los valores significan el por cierto de por ejemplo IgM de la suma de IgG+IgA+IgM. Sin embargo, también es posible enriquecer IgM adicionalmente por métodos bien conocidos, por ejemplo cromatografía de intercambio de aniones. Los valores pueden determinarse por nefelometría o por inmunoprecipitación de acuerdo con Ph. Eur. (actual Edición (2010) 2.9.17).
En particular, las inmunoglobulinas en la preparación de inmunoglobulinas no se modifican químicamente. La preparación de inmunoglobulinas no se ha tratado durante su proceso de producción con un producto químico tal como ß-propiolactona para esterilizar el producto. Similarmente, la preparación no se ha tratado con una proteasa agregada, tal como pepsina, para esterilizar el producto. Como tal, las inmunoglobulinas están substancialmente en forma nativa.
La preparación de anticuerpo tiene una menor actividad proteolítica que las preparaciones de anticuerpo descritas . en la técnica previa. En particular, no se detecta actividad proteolítica en la preparación cuando se almacena entre 2 a 8 grados C. La actividad proteolítica puede medirse por métodos de prueba estandarizados conocidos en la técnica, tal como utilizar el substrato cromogénico que se describe a continuación en el ejemplo 6. En estos métodos se estima la actividad proteolítica al mezclar un substrato cromogénico (en particular aquellos sensibles a cuando menos una serina proteasa) y una muestra de la preparación de anticuerpo (usualmente diluida en amortiguador para cumplir o satisfacer el intervalo lineal del ensayo) a 37 grados C y supervisar las cinéticas de absorción utilizando un espectrofotómetro . La actividad proteolítica de la muestra se calcula a partir de la diferencia de absorción inicial (AAbs/min) al utilizar la ecuación C (U/L) S x AAbs/min x F (C = actividad proteolítica; S = factor de conversión referente al cambio de adsorción específico del substrato cromogénico; y F = factor de dilución) . El uso del substrato es de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
La actividad proteolítica puede en particular estimarse por las siguientes etapas: (a) 25 mg del substrato S-2288 (Chromogenix) se disuelven en 7.2 mi de agua-para-inyección; (b) una muestra de la preparación de anticuerpo se diluye amortiguador (100 mM Tris.HCl pH 8.4, NaCl 106 mM) para cumplir con el intervalo lineal del ensayo y la temperatura se ajusta a 37 grados C; (c) iguales cantidades (por ej . 200 µ?) de la preparación de anticuerpo diluida y el substrato disuelto se mezclan; (d) las cinéticas de absorción se miden a 405 nm por 1 a 3 minutos a 37 grados C utilizando un espectrofotómetro; (e) la actividad proteolítica de la muestra se calcula a partir de la diferencia de absorción inicial (AAbs/min) al utilizar la ecuación C (U/L) = 313 x AAbs/min x F (C = actividad proteolitica , F = factor de dilución) .
El limite de cuantificación de este método es 8 U/1, y utilizando una muestra de la preparación de anticuerpo de la presente invención la actividad proteolitica es indetectable . Como tal, el nivel de actividad proteolitica en el producto final de la presente invención es inferior a 8 U/1.
Como con preparaciones conocidas en la técnica, la preparación de anticuerpo de la presente invención puede almacenarse a 5±3 grados C. Sin embargo, debido a la purificación eficiente con el método de la presente invención, la estabilidad de la preparación de anticuerpo es extremadamente buena. El producto final es estable en forma liquida por al menos 3 meses, de preferencia al menos 6 meses y más preferible al menos dos años de 2 a 8 grados C, lo que significa que no hay fragmentación o polimerización de IgM sobre 5% medido en HPSEC, no hay incremento de actividad proteolitica, no hay disminución de actividad de anticuerpos IgM contra Escherichia coli y actividad de anticuerpos IgM contra Pneumococcus sacárido mayor a 25% y no hay aumento en actividad de anticomplemento mayor a 25%, que permanece inferior a 1 CH50/mg de proteina. Aún más, el producto final producido por el método de la presente invención es estable en forma liquida por al menos 3 meses, de preferencia al menos 6 meses y más preferible al menos un año a temperatura ambiente (entre 23 y 27°C) como se estima por el mismo criterio .
El proceso de la presente invención además proporciona un nivel superior de eliminación de virus que los procesos de la técnica previa resultando en una preparación de anticuerpo que es más segura que las preparaciones de anticuerpo de la técnica previa, particularmente con respecto a virus no envueltos activos como por ejemplo, parvovirus. El método de la presente invención es capaz de retirar/inactivar virus, y en particular virus no envueltos, en más de 3 logio, de preferencia más de 4 logio, y más preferiblemente más de 5 logio- Esto resulta en una preparación de anticuerpo que está substancialmente libre de virus, y en particular substancialmente libre de virus no envueltos (es decir libre de virus) . Aún más, el método de la presente invención es capaz de lograr este nivel de eliminación/inactivación de partículas virales sin un impacto significante en la cantidad de IgM activa o en la actividad anticomplementaria de la preparación de anticuerpo. De acuerdo con esto, se obtienen preparaciones de anticuerpos que son libres de virus respecto a virus envueltos y no envueltos, que contienen al menos 15%, más preferiblemente al menos un nivel de 20% de IgM y que tiene actividad anticomplementaria de =1 CH 50/mg proteina.
La preparación de anticuerpo de la presente invención es adecuada para utilizar en medicina y puede emplearse en el tratamiento de desórdenes inmunológicos e infecciones, particularmente desórdenes de deficiencia de IgM e infecciones bacterianas. Preparación de inmunoglobulina polivalente enriquecida con IgM humano para administración intravenosa, que puede prepararse por el proceso de la presente invención, contiene superiores títulos de anticuerpo contra bacterias Gram-negativas y Gram-positivas clínicamente relevantes así como superiores títulos de anticuerpo contra endotoxinas de bacterias Gram-negativas y exotoxinas de bacterias Gram-negativas y Gram-positivas, en comparación con preparaciones de inmunoglobulina G polivalente.
En particular, las preparaciones de anticuerpo de la presente invención son adecuadas para administración intravenosa a pacientes, y en particular son adecuadas para inyección intravenosa en humanos.
La invención también proporciona un método de tratamiento de un paciente que comprende una etapa de administrar la preparación de anticuerpo de la presente invención al paciente. En particular, el paciente puede sufrir de un desorden inmunológico o una infección bacteriana.
La presente invención ahora se describirá adicionalmente solo a manera de ejemplo.
Descripción del método de prueba para determinación de la actividad anti-complementaria El ensayo para determinar la actividad anticomplementaria se llevó a cabo de acuerdo con el método descrito en la Farmacopea Europea (European Pharmacopoeia) (método 2.6.17, Ph. Eur. 6. Edición, 2008).
Eritrocitos de oreja previamente tratados con hemolisina se someten a hemolisis por complemento. Por anticuerpos de enlace de complemento en la muestra se suprime la hemolisis. La cantidad de complemento se determina, que se liga (inactivo) por 1 mg de inmunoglobulina .
Una cierta cantidad de inmunoglobulina (10 mg) se mezcla con complemento de conejillo de Indias y el complemento libre se titula. La actividad anticomplementaria se expresa un complemento usado respecto al complemento usado de una solución de referencia. La unidad hemolitica de la actividad de complemento (CH50) es la cantidad de complemento que lleva a hemolisis de 2.5 x 108 eritrocitos preparados en forma óptima de una cantidad total de 5 x 108 eritrocitos en condiciones de amortiguador óptimas .
Eritrocitos preparados en forma óptima (8 mi de eritrocitos estabilizados de ovejas, lavados tres veces con amortiguador barbital-gelatina, finalmente 1 mi de sedimento eritrocito se suspenden en 24 mi de amortiguador-barbital-gelatina) se preparan al mezclar 20 mi de suspensión de eritrocitos con 20 mi de hemolisina (ajustada a 2 MHE/ml - unidad hemolitica mínima) e incubación por 15 minutos a 37 grados C.
Un equivalente de 10 mg de inmunoglobulina se diluye en amortiguador-barbital-gelatina (1 g de gelatina en 1 L de amortiguador barbital de pH 7.3, solución de amortiguador-barbital 5-veces: 83 g de cloruro de sodio, 10.192 g de barbital sodio en 2 litros de agua, pH 7.3) . A un volumen final de 1 mi se agregan 200 µ? de complemento 100 CH50 / mi. Los tubos de ensayo se incuban bajo agitación por 1 h a 37 grados C. Las muestras se diluyen y titulan contra eritrocitos preparados en forma óptima. Después de una incubación por 1 h a 37 grados C las muestras se centrifugan y la densidad óptica se determina utilizando un espectrofotómetro a una longitud de onda de 541 nm.
Ejemplo 1 - Elaboración de una preparación enriquecida IgM a partir de la fracción I/III 180 kg de Fracción Cohn I/III, que se origina de fraccionación con etanol frío de plasma humano, se suspenden en 720 L de amortiguador de acetato de sodio 0.1 M pH 5.05 y mezclan por 15 - 30 minutos después de que la temperatura de la suspensión se alcanza (22 ± 4 grados C) .
La solución se trata al agregar 19.8 kg de ácido octanóico (0.110 kg por kg de pasta I/III empleada) a temperatura ambiente y la solución de proteina se mezcla adicionalmente por 80 minutos, utilizando un mezclador vibratorio (Vibromixer®, tamaño 4, Graber+Pfenniger GmbH, Vibromezclador ajustado a un nivel 2 - 3) . El ácido octanóico se agrega lentamente durante 30 min.
Aproximadamente 3 kg de fosfato tri-calcio (Ca3P04)2) se agregan y la solución de proteina se mezcla adicionalmente por al menos 15 min. El precipitado se retira por filtración clarificante utilizando un filtro prensa. Una filtración de 0.2 \im adicional se lleva a cabo y la solución de proteina se somete a ultrafiltración con membranas 10 kD. La solución de proteina se diafiltra contra solución de NaCl 0.04 y posteriormente se ajusta a una concentración de proteina de 40 g/L.
La solución de proteina se trata a pH 4.0 ± 0.1 después de dilución 1+1 con agua para inyección. Ajuste de pH se lleva a cabo al utilizar HC1 1 M y la solución de proteina se incuba por 9 h a 37 grados C ± 2 grados C. Después de la incubación a pH 4, la solución de proteina se ajusta a pH 5.8, utilizando NaOH 1M. La solución de proteina resultante se purifica adicionalmente al agregar DEAE Sephadex en un modo por lotes (75 g de DEAE Sephadex por kg de proteina) . La solución de proteína se incuba bajo agitación por > 60 min a temperatura ambiente. DEAE Sephadex se retira por filtración clarificante. La solución de proteína se somete a una filtración de 0.2 µ??.
La solución de proteína se filtra a través de un filtro de 0.1 µp? y un filtro Pall, Ultipor VF DV50, de 50.8 cm (20"). El filtrado se procesa adicionalmente por tratamiento con luz QVC a 254 nm, utilizando un dispositivo de proceso UVivatec® de flujo pasante (Bayer Technology Services / Sartorius Stedim) a una dosis de UVC de 240 J/m2. La velocidad de flujo a través del reactor UVC se calcula utilizando las instrucciones del fabricante. La solución de proteína irradiada se concentra a una concentración de proteina de 50 - 70 g/1 por ultrafiltración y se somete a diafiltración (membrana de 10 kD, utilizando amortiguador glicina 0.32 M pH 4.3). El producto final se pasa a través de un filtro de 0.2 µp? y se almacena de 2 a 8 grados C.
Ejemplo 2 - Investigación de Condiciones en Etapa de Tratamiento de Acido Octanóico Para el tratamiento de ácido octanóico, se probaron los siguientes intervalos experimentales, también en combinación entre sí utilizando el método descrito en el Ejemplo 1 (no se muestran resultados) .
- Cantidad de ácido octanóico: 0.09 kg/kg a 0.13 kg/kg (Cantidad de ácido octanóico por kg de fracción usada I/III) (ácido octanóico 120 a 180 mM) - pH de tratamiento de ácido octanóico entre pH 4.8 y 5.3 Intervalo de temperatura de la reacción: 14 grados C a 30 grados C Tiempo de incubación: 40 a 110 min Todas las condiciones probadas llevan a intermediarios que son fáciles de clarificar para mayor procesamiento y con una reducción extensa en actividad proteolitica de varios miles de U/L en fracción de Cohn I/III) . Estos intermediarios resultan en un producto final con una actividad proteolitica inferior a 8 U/1 (calculado como se describe a continuación en el Ejemplo 6) que es el limite de cuantificación .
Ejemplo 3 - Reducción de Virus a Través del Uso de Vibromezclador - Determinación de factores de eliminación de virus para el tratamiento de ácido octanóico con y sin uso de un vibromezclador. 250 mi de facción suspendida I/III se homogeneizaron por 30 min a pH 5.05 y 22°C. A la suspensión se le agregaron 2.6 mi de la solución de material de virus. Se agregó ácido octanóico (110 g/kg) y homogeneizo por 60 min utilizando un vibromezclador. En un experimento paralelo, la misma mezcla se homogeneizó con agitación estándar. Después de 60 min, se agregó fosfato tri-calcio (0.15 g/kg ácido octanóico) y la suspensión se agitó por 15 min. La suspensión se liberó por filtración profunda utilizando un disco de filtro. El disco de filtro se enjuagó previamente con 70 - 80 mi de amortiguador. Después de filtración, el filtro se enjuagó con 80 mi de amortiguador. Filtrado y lavado se recolectaron y una muestra se tomó para titulación de virus.
Títulos de virus de las muestras tomadas antes de adición de ácido octanóico y después de filtración se determinan en celdas indicadoras apropiadas para SV40, Reo y PPV (CV-1, CCL.7.1 y PK13) . Finalmente, el factor de eliminación se calculó cumpliendo las guías actuales para estudios de validación de virus.
En estudios de validación de virus, virus no envueltos tales como SV40 y Reo se retiraron efectivamente en el orden de más de 4 logio y más de 5 logio, respectivamente. Aún más, PPV se retiró por más de 3 logio-Estos valores son más de 10 veces y hasta 1000 veces superiores que con el mismo tratamiento de ácido octanóico bajo condiciones de agitación estándar sin vibromezclado.
Tabla 1 : Comparación de factores de reducción de virus (logio) para el tratamiento con ácido octanóico con y sin el uso de un vibromezclador .
Ejemplo 4 - Evaluación de tratamiento UVC El intervalo óptimo para dosis de radiación UVC se ha evaluado. Hay un balance entre la dosis necesaria mínima para lograr al menos 4 logio de inactivación para virus no envueltos y la dosis máxima tolerable para evitar desnaturalización de las moléculas IgM, lo que lleva a una función Fab alterada para ligar antígenos y función Fe alterada que influencia activación de complemento. En el intervalo de 200 a 400 J/m2 se puede observar solo un ligero incremento de agregados de inmunoglobulina y sin impactos significante en contenido de fragmento.
Para los experimentos, la densidad óptica (OD = Optical Density) de la solución de proteina original, se utiliza para calcular el gasto de flujo en el sistema UVivatec lab con la hoja de Excel suministrada por el vendedor de BTS (cliente Master Calculation Sheet UVivatec Lab II Versión 3.0). El gasto de flujo se calcula al tomar en cuenta el desempeño de la lámpara, el punto de ajuste del sensor de lámpara de señal UV y la dosis de irradiación UVC deseada.
Solución que contiene IgM con un contenido de proteina de aproximadamente 55 g/1 (Lote 86GB005BE07) se bombea a un gasto de flujo de 5.8 1/h a través del sistema UVivatec a fin de lograr una dosis de 200 J/m2 para un solo flujo pasante. Una dosis de 300 J/m2 se logra al bombear la solución de proteina a un gasto de flujo de 3.9 L/m2 a través del sistema. 400 J/m2 se logró al bombear la solución de proteina a un gasto de flujo de 2.9 L/m2 a través del sistema.
Tabla 2 : Resultados analíticos para las determinaciones de actividad y titulo antes y después de tratamiento con UVC en el producto final concentrado Continúa No pudo observarse diferencia significante para contenido de inmunoglobulina, actividad proteolitica o ACA en el intervalo de 200 a 400 J/m2. El intervalo preferido para la dosis se ajustó entre 200 y 300 J/m2 debido a que 200 J/m2 es bien conocido que inactiva virus no envueltos y a 300 J/m2 no pudo verse impacto significante en formación de agregados y títulos de anticuerpos. La dosis preferida es 225 J/m2.
Solución que contiene IgM diluida con un contenido de proteína de 8 a 12 g/1 (Lote 86BB059BE07) se bombeó a un gasto de flujo de 5.8 l/h a través del sistema UVivatech a fin de lograr una dosis entre 200 y 300 J/m2 para un solo flujo pasante.
Tabla 3: Resultados analíticos para soluciones IgM antes y después de irradiación UVC a diferentes dosis de UVC Continúa La distribución entre las clases de inmunoglobulina permanece sin afectar por la radiación UV dentro de este procedimiento de intervalo de dosis. El patrón de distribución de peso molecular analizado por HPSEC tampoco se cambia. El nivel de pureza analizado por CZE permanece sin cambio. Actividad proteolitica (PA = Proteolytic Activity) , activación de precalicreina ( PKA = Prekallikrein Activator) y actividad anticomplementaria (ACA = Anti-Complementary Activity) están sin cambio. También, la actividad antibacteriana medida por método Elisa no se altera significativamente para todas las clases de inmunoglobulina.
Las alícuotas - irradiadas con crecientes intensidades de UV - se procesaron adicionalmente hasta producto final y sometido el mismo panel de pruebas analíticas. No hubo diferencia significante observable en los productos finales. Todos los títulos de anticuerpos probados siempre están en el intervalo de 100 + 10% de la preparación de control sin tratamiento UVC .
Ejemplo 5 - Reducción de Virus Total a Través del Uso de Tratamiento de Vibromezclador/pH4 y Tratamiento UVC - Determinación de Factores de Eliminación de Virus La validación de inactivación/eliminación de virus de las tres etapas de tratamiento de ácido octanóico con vibromezclado, tratamiento con pH4 y tratamiento UVC (215 J/m2) se realizó utilizando los siguientes virus modelo: Virus de Diarrea Viral Bovina (BVDV = Bovine Viral Diarrhea Virus) como virus modelo para Virus de Hepatitis C, Virus de Pseudorabia (PRV = Pseudorabies Virus) y virus modelo para Virus de Herpes Humano, virus de Inmunodeficiencia Humana (HIV-1) , Virus de Arteritis Equina (EAV = Equine Arteritis Virus) como virus modelo para corona virus, Virus Sindbis (SinV) como virus modelo para virus Flavi, Virus de Encefalomielitis Murina (MEV = Murine Encephalomyelitis Virus) como virus modelo para Virus de Hepatitis A, Reovirus (Reo) como virus modelo para otros virus no envueltos, Parvovirus Porcino (PPV = Porcine Parvovirus) como virus modelo para Parvovirus humano B19.
Los resultados de estos estudios con las tres etapas de tratamiento de ácido octanóico, tratamiento pH 4 y tratamiento UVC se citan en la siguiente Tabla 2.
Tabla 4 : Reducción de virus total por el proceso de producción IgM Continúa a Factor de reducción sin datos para validación de la etapa de irradiación UVC La nanofiltración opcional con filtros con un tamaño de poros nominal de aproximadamente 50 nm, agrega seguridad adicional al incrementar la reducción total hasta más de 17 logio dependiendo del tamaño del virus. Por ejemplo, >17.5 logio después se alcanza para HIV-1 mientras que PPV no se retira más por nanofiltración .
Por lo tanto, el procedimiento de purificación de acuerdo con la invención lleva a una preparación IgM segura de virus sobresaliente hasta ahora con esta preparación que contiene IgM de velocidades de reducción/inactivación de virus no alcanzada, mayores a 8 logio. Esto es especialmente importante para los virus no envueltos como MEV, Reo y PPV que en general son más resistentes contra procedimientos de eliminación e inactivación de virus debido a su tamaño pequeño y la falta de un envolvente de lipidos.
Ejemplo 6: Determinación de actividad proteolitica residual para el tratamiento con ácido octanóico con y sin el uso de un vibromezclador .
El tratamiento con ácido octanóico se realizó como en el ejemplo 1 y en un experimento paralelo sin un vibromezclador pero con agitación estándar vigorosa con un agitador de aspas. La actividad proteolitica en muestras después de tratamiento con ácido octanóico/fosfato tricálcico y ultra/filtración se determinó utilizando el sustrato cromogénico S-2288 (Chromogenix) , siguiendo las instrucciones de los fabricantes. 25 mg del sustrato S-2288 (Chromogenix) se disuelven en 7.2 mi de agua-para-inyección. Muestra se diluyen en un amortiguador (Tris 100 mM /HC1 pH 8.4, NaCl 106 mM) para cumplir con el intervalo de ensayo lineal, por ejemplo 200 µ? de amortiguador se mezclan con 200 µ? de muestra (mezclado y ajuste de temperatura a 37 °C) y 200 µ? de solución de sustrato cromogénico. Las cinéticas de absorción se miden a 405 nm (1-3 min) a 37°C, utilizando un espectrofotómetro . La actividad proteolitica de la muestra se calcula a partir de la diferencia de absorción inicial (AAbs/min) al utilizar la ecuación C (U/L) = 313 * AAbs/min * F (C = actividad proteolitica, F = factor de dilución) Tabla 5 : Reducción de actividad proteolitica por tratamiento con ácido octanóico El filtrado después de tratamiento con ácido octanóico fue limpio cuando se empleó vibromezclado. En el experimento de comparación, el filtrado después de tratamiento con ácido octanóico con agitador de aspas fue muy opaco y difícil de filtrar.
Ejemplo 7 : Títulos antibacterianos en una preparación IgM de acuerdo con la invención Para comparación con la única preparación que contiene IgM tolerable intravenosa comercialmente disponible, Pentaglobina, las actividades antibacterianas se analizaron en tres lotes de este fármaco bien establecido y comparan con una preparación de acuerdo con la invención. La determinación de anticuerpos de la clase IgA o IgM en la preparación de IgM contra antigenos antibacterianos o antifungales se llevó a cabo por ELISA. Placas de microtitulación se revistieron con un antigeno correspondiente e incubaron con un estándar o la preparación IgM. Anticuerpos ligados al antigeno se detectaron con un conjugado IgA antihumano o IgM antihumano. La detección se llevó a cabo al utilizar un sustrato de enzima. El cambio de color resultante corresponde a la cantidad de anticuerpos presentes en la preparación IgM.
Tabla 6 Comparación de actividad de enlace antibacteriano de IgM en una preparación de acuerdo con la invención y Pentaglobina comercialmente disponible Tabla 7 Comparación de actividad de enlace antibacteriano de IgA en una preparación de acuerdo con la invención y Pentaglobina comercialmente disponible Las actividades mediadas por IgM y IgA en la nueva preparación típicamente fueron al menos 1.5 veces tan altas como en Pentaglobina, que puede explicarse por el hecho de IgM y IgA en Pentaglobina se modifica químicamente con ß-Propiolactona . Esta etapa se reemplaza por los procedimientos más suaves de acuerdo con esta invención.
En total, estos datos demuestran que la región de enlace de la molécula IgM en la preparación final es activa en forma funcionalmente completa.
Ejemplo 8 Estudios de estabilidad en almacenamiento con producto IgM liquido Producto de acuerdo con el ejemplo 1 sin tratamiento UVC se almacenó en ampolletas de vidrio de 10 o 100 mi (volumen de relleno 5 mi o 50 mi) a 2 - 8°C y analizan para todos los parámetros de acuerdo con la especificación. Los resultados se muestran en la Tabla 8. Parámetros que son relevantes para mostrar estabilidad son el agregado y contenido de fragmento medido con cromatografía de exclusión de tamaño de alto desempeño (HPSEC = High Performance Size Exclusión Chromatography) , actividad proteolítica (PA) y actividad anticomplementaria (ACA) . Estos parámetros son críticos para tolerabilidad intravenosa y probablemente cambien durante almacenamiento a largo plazo. A 2 - 8°C no hubo cambio significante de estos parámetros. Incluso en almacenamiento a temperatura ambiente (23 - 27°C) estos valores permanecieron dentro de especificación, aunque hay un ligero incremento de fragmentos después de 24 meses a temperatura ambiente. Otros parámetros como coloración, opalescencia, valor de pH también se determinaron y permanecieron sin cambios sobre todo el periodo de estudio. Títulos de IgM y IgA contra diversas bacterias permanecen estables durante 2 años a 2 -8°C.
Producto de acuerdo con el ejemplo 1 con tratamiento UVC también se almacenó en ampolletas de vidrio de 10 o 100 mi (volumen de relleno 5 mi o 50 mi) a 2 - 8°C y temperatura ambiente y analizaron para todos los parámetros de acuerdo con la especificación. Los resultados se muestran en la Tabla 9. En este estudio de estabilidad continuo, la fecha de 12 meses actualmente disponible muestra el mismo perfil de estabilidad del producto sin tratamiento de UVC que permite extrapolación a una estabilidad a 24 meses.
Tabla 8 Estabilidad del lote A586067 probado a 2-8°C posición acostado. Tamaño de relleno: 5 mi Continúa n.t. = no probado Tabla 9 Estabilidad de lote ?586057 probado a 2 - 8°C posición acostada. Tamaño de relleno: 50 mi Continúa Ejemplo 9 Experimentos in vivo con producto IgM Para confirmar seguridad y tolerabilidad, los efectos de la preparación IgM en presión sanguínea arterial después de repetidas infusiones intravenosas sobre 5 días se estudiaron en 8 monos macaco cangrejeros conscientes. Una dosis de 190 mg/IgM/kg/día de la preparación IgM elaborada de acuerdo con los métodos descritos aquí, se administró. Pentaglobina, la preparación que contiene IgM tolerable intravenosa comercialmente disponible, se administró a algunos monos, como una sustancia de comparación. Pentaglobina se administró de manera tal que la misma dosis de IgM se administra. Una dosis de control de NaCl al 0.9% se administra a los animales en ocasiones antes de administración de las preparaciones de inmunoglobulina . La presión sanguínea se determinó después de inyección para determinar si la administración se asoció con un nivel intolerable de activación de complemento no especifica .
La administración de la preparación IgM (15 ml/kg/día) sólo tuvo efectos menores en presión sanguínea arterial (promedio, sistólica y diastólica) . Las diferencias hasta 4 horas después de toda infusión comparado con valores previamente probados no excede 4 mm de Hg. Estas diferencias pueden ser consideradas no biológicamente relevantes.
Los niveles C3a se determinaron en muestras de plasma que se toman después de inyección como un marcador para activación no específica de la ruta de complemento. Los niveles C3a [ng/ml] sólo fueron ligeramente incrementados por la administración de la preparación de IgM (15 mL/kgBW) y fueron incluso menores que con la preparación de referencia comercialmente disponible de Pentaglobina a cantidades iguales de IgM. Muestras de sangre se tomaron aproximadamente 6 horas después de tratamiento .
Tabla 10a Niveles de C3a [ng/ml] después de administración de la preparación IgM No se pudieron atribuir hallazgos toxicológicos sustanciales a la preparación de IgM, y no hubo alteraciones relevantes que no se observaron con Pentaglobina . Ya que la seguridad de Pentaglobina está bien establecida en la práctica clínica de muchos años, es razonable concluir que estas alteraciones no tienen ninguna relevancia clínica.
Tabla 10b Niveles de C3a [ng/ml] después de administración de la preparación de referencia a Pentaglobina Las buenas tolerabilidad y seguridad de la preparación de Ig también se verifican en estudio Fase I humano en 24 voluntarios sanos hombres y mujeres. Presión sanguínea sistólica en las primeras 4 horas después de administración en el promedio disminuyó sólo aproximadamente 9 % (11.9 mm Hg) después de infusión de 91 a 274 mg de la preparación IgM por g BW/d a 0.5 ml/min.
Esto fue en el mismo intervalo como el placebo de solución de NaCl de 0.9% (9.4%, 11.7 mm Hg) .
No se registraron eventos adversos serios y todos los eventos adversos no serios fueron auto-limitantes. Además, no hubo evidencia por la transmisión de un agente infeccioso, como se muestra por determinaciones PCT .
Se nota que la utilidad de los estudios de eficacia en modelos de animales de enfermedades relevantes está limitada debido a la inmunogenicidad y anticuerpos Gal reformados en preparaciones de IgM que se obtienen de plasma humano. Sin embargo, dado el conocimiento de la técnica previa respecto al uso de Pentaglobina en el tratamiento de enfermedad y los títulos de anticuerpo antibacterianos de la preparación IgM preparados por el método de la presente invención (como se muestra en el Ejemplo 7) puede concluirse que la preparación IgM tiene eficacia clínica .

Claims (37)

REIVINDICACIONES
1. Un proceso para la preparación de una composición de inmunoglobulina que contiene IgM a partir de una fracción de plasma que comprende inmunoglobulinas , el proceso se caracteriza porque comprende: (a) proporcionar una fracción de plasma como una solución que contiene las inmunoglobulinas; (b) mezclar un ácido carboxilico C7 a Cg con la solución y tratar la solución mezclada con un agitador con vibración para precipitar las proteínas contaminantes; y (c) separar las proteínas precipitadas de la solución para dar por resultado la composición de inmunoglobulina que contiene IgM.
2. Un proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa (b) , la concentración del ácido carboxilico C7 a C9 es cuando menos 0.075 kg/kg de fracción de plasma.
3. Un proceso de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque en la etapa (b) el pH de la solución mezclada está entre 4.5 a 5.5.
4. Un proceso de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque en la etapa (b) la temperatura de la solución mezclada es 10 grados C a 35 grados C.
5. Un proceso de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque en la etapa (b) , el ácido carboxilico C7 a Cg se incuba con la solución que contiene inmunoglobulinas por al menos 30 minutos.
6. Un proceso de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque el ácido carboxilico C? a Cg es ácido octanóico.
7. Un proceso de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque las inmunoglobulinas de la fracción de plasma comprenden al menos 5% de IgM.
8. Un proceso de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque la fracción de plasma es una precipitación de la fracción Cohn I/III o la fracción Kistler/Nitschmann B o B+I.
9. Un proceso de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque la etapa (c) comprende ultrafiltración y la composición de inmunoglobulina comprende una solución filtrada.
10. Un proceso de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque además comprende una etapa de incubar la composición de inmunoglobulina que contiene IgM de la etapa (c) entre pH 3.5 y pH 4.5 para formar una solución incubada.
11. Un proceso de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la etapa de incubar la composición de inmunoglobulina que contiene IgM de la etapa (c) , se conduce entre 32 y 42 grados C.
12. Un proceso de conformidad con la reivindicación 10 u 11, caracterizado porque además comprende las etapas de someter la solución incubada a adsorción en DEAE-Sephadex y separar DEAE Sephadex de la solución por filtración profunda.
13. Un proceso de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque además comprende la etapa de someter el filtrado de la filtración profunda a nanofiltración .
14. Un proceso de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la nanofiltración se conduce con un filtro con un tamaño de poros nominal de 35 a 75 nm y de preferencia un tamaño de poros nominal de 40 a 50 nm.
15. Un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, caracterizado porque además comprende la etapa de tratar la solución incubada de la reivindicación 10 o la reivindicación 11 o el filtrado de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 con irradiación UVC, para formar una solución irradiada UVC .
16. Un proceso de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la solución incubada o el filtrado se trata con irradiación UVC a 200 a 500 J/m2, y de preferencia a 200 a 300 J/m2.
17. Un proceso de conformidad con la reivindicación 15 ó 16, caracterizado porque además comprende la etapa de filtrar la solución irradiada con UVC bajo condiciones estériles para producir una preparación de anticuerpos adecuada para administración intravenosa.
18. Un proceso de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque formula la preparación de anticuerpos en un amortiguador que contiene glicina a un pH entre pH 4 y 5.5.
19. Un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, caracterizado porque además comprende una etapa de llenar un recipiente con la solución irradiada UVC de las reivindicaciones 15 ó 16 o la preparación de anticuerpo de las reivindicaciones 17 ó 18 bajo condiciones estériles.
20. Un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, caracterizado porque la solución irradiada UVC de las reivindicaciones 15 ó 16 o la preparación de anticuerpo de las reivindicaciones 17 ó 18 tiene una actividad proteolitica menor a 8 U/1.
21. Un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, caracterizado porque proporciona una eliminación mayor a 3 logio de virus no-envueltos .
22. Una preparación de anticuerpo que comprende inmunoglobulinas que se obtienen por el proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21.
23. Una preparación de anticuerpo adecuada para administración intravenosa en humanos, que comprenden inmunoglobulinas IgG, IgA y IgM, que tienen actividad proteolitica menor a 8 U/1, y en donde al menos 5% del total de las inmunoglobulinas son IgM.
24. Una preparación de anticuerpo que comprende IgM de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque es estable por al menos 2 años cuando se almacena de 2 a 8 grados C.
25. Una preparación de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 22 a 24, caracterizada porque la preparación comprende al menos 15% de IgM.
26. Una preparación de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque la preparación comprende cuando menos 20% de IgM
27. Una preparación de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque la preparación comprende 20% a 30% de IgM.
28. Una preparación de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 27, caracterizada porque además comprende un agente estabilizante .
29. Una preparación de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque el agente estabilizante es glicina.
30. Una preparación de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 29, caracterizada porque las inmunoglobulinas no se modifican químicamente .
31. Una composición de inmunoglobulina que contiene IgM que se obtiene por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
32. Una preparación de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 30 para uso en medicina .
33. Una preparación de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque se utiliza en el tratamiento de desórdenes inmunológicos e infecciones bacterianas .
34. Una preparación de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque el desorden inmunológico es un desorden deficiente en IgM.
35. Uso de una preparación de anticuerpos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 30 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de desórdenes inmunológicos e infecciones bacterianas.
36. Un método de tratamiento de un paciente que comprende administrar una preparación de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 30.
37. Un método de tratamiento de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el paciente sufre de un desorden inmunológico o una infección bacteriana.
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