MX2012012263A - Preparaciones de anticuerpos. - Google Patents
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Abstract
Se proporciona una preparación de anticuerpos adecuada para administración intravenosa en humanos, que comprende IgG, IgA y al menos anticuerpos IgM al 5% en peso de la cantidad total de anticuerpos, en donde la preparación se elabora a partir de plasma humano, en donde la preparación de anticuerpos tiene actividad de activación de complemento específica y en donde en un ensayo in vitro con suero humano adecuado para determinar la capacidad de la preparación de anticuerpos para activar complemento en forma no específica la preparación de anticuerpos sustancialmente no genera C5a y/o sustancialmente no genera C3a. Además se proporcionan usos médicos de la preparación de anticuerpo.
Description
PREPARACIONES DE ANTICUERPO
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a una preparación de anticuerpos (inmunoglobulina) que comprende IgM, que tiene especifica actividad de activación de complemento pero baja capacidad de activación de complemento no especifica. La presente invención también se refiere al uso de la preparación de anticuerpos en medicina .
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las composiciones de inmunoglobulina preparadas a partir de plasma humano y adecuadas para administración intravenosa, se conocen en la especialidad y por varias décadas han jugado un papel importante en el tratamiento de un amplio rango de enfermedades. Se emplean inmunoglobulinas , por ejemplo para el tratamiento de infecciones en humanos y pueden asignarse a diversas clases con diversas propiedades bioquímicas y fisiológicas. La inmunoglobulina G participa en defender contra antígenos virales, mientras que IgM es predominantemente activo en respuestas inmunes a antitoxinas y antibacteriales.
Las soluciones de inmunoglobulina comprenden IgG, IgA e IgM en diversos porcentajes, con diferentes preparaciones que tienen diferentes aplicaciones de tratamiento, por ejemplo preparaciones con un superior porcentaje de IgM se emplean en la profilaxis o tratamiento de infecciones bacterianas.
Las soluciones de inmunoglobulina usualmente se preparan a partir de fracciones de suero o plasma de sangre, por ejemplo fracciones Cohn. Estas fracciones después se someten a una cantidad de etapas de purificación para retirar contaminantes incluyendo virus, proteínas desnaturalizadas, proteasas y lípidos.
Plasma humano para fraccionación se recolecta de miles de donadores y pueden contener virus patogénicos a pesar de una completa o detallada prueba de plasma fuente. Por lo tanto, etapas de proceso para inactivar o retirar virus son esenciales para lograr productos seguros para uso en medicina. Se conocen en la especialidad varias técnicas para inactivación/eliminación de virus, por ejemplo tratamientos químicos, irradiación con luz UVC o filtración de nanómetros, que se realizan a fin de asegurar una seguridad total de virus.
La capacidad de inactivación o eliminación de virus de las etapas de proceso se valida utilizando modelos a escala de laboratorio del proceso de producción y por cada etapa se determina un factor de inactivación o eliminación. Un aumento del factor de inactivación/eliminación agrega seguridad adicional viral al producto farmacéutico. Las guías actuales de las autoridades regulatorias requieren cuando menos dos etapas efectivas para virus con envolvente y sin envolvente en la fabricación de productos farmacéuticos derivados del plasma .
Aunque varios métodos tales como tratamiento con solvente/detergente, tratamiento con ácido octanóico, filtración de nanómetros y tratamiento térmico, son efectivos para inactivar o eliminar virus envueltos, hay sólo unos cuantos métodos conocidos para inactivar o retirar virus no envueltos, por ejemplo parvovirus. Estos virus no envueltos primordialmente son muy pequeños, usualmente pasan a través de filtros de nanómetros, con tamaños de poros sobre 20 nm. Este tamaño de poros es muy pequeño para moléculas de IgM que tienen un diámetro de hasta 30 nm. Virus no envueltos se inactivan efectivamente por productos químicos como ß-propiolactona, que sin embargo también lleva a una inmunoglobulina modificada con funciones afectadas. Otro tratamiento efectivo de radiación UVC (EP 1842561, CAF-DCF) . Sin embargo, tratamientos con solvente/detergente conocidos, tratamiento con ácido octanóico y tratamiento con ligero calor no tienen efecto sustancial en virus no envueltos.
Como se mencionó anteriormente, además de virus, que potencialmente están presentes, también es necesario retirar otros contaminantes como lípidos, proteasas, agregados de proteínas e inmunoglobulinas desnaturalizadas. La eliminación de todos estos contaminantes es esencial (1) para asegurar que el producto cumpla con las guías de bio -seguridad respecto a contaminación viral, (2) para que el producto sea tolerado por el paciente después de administración intravenosa, (3) para permitir que el producto sea estable durante almacenamiento a largo plazo (cualquier actividad proteolítica residual puede llevar a degradación del producto en almacenamiento a largo plazo, por ejemplo 2 años), y (4) para generar la composición farmacéutica/mezcla de compuesto deseado.
Al mismo tiempo, sin embargo es esencial que las etapas de purificación para retirar los contaminantes, no interfieran con las moléculas de inmunoglobulina , de manera tal que hasta donde sea posible éstas retengan su actividad biológica normal y se retengan con alto rendimiento en solución. Este balance es difícil de lograr ya que muchas etapas de purificación conocidas también pueden tener un impacto negativo en la actividad de las inmunoglobulinas, y en particular en IgM; por ejemplo, tiempos de radiación extendidos con UVC pueden reducir el rendimiento de IgM nativas y activas que se obtienen en solución de inmunoglobulina final. No sólo esto lleva a una reducción en eficacia de la solución de inmunoglobulina final sino también puede provocar que la solución sea menos bien tolerada ín vivo.
Agregados e inmunoglobulinas desnaturalizadas, de los cuales la cantidad puede incrementarse por ciertas etapas de purificación, en especial son un riesgo potencial para los pacientes debido a que tienen alta capacidad para activar complemento en forma no especifica, lo que lleva a los severos efectos secundarios en pacientes que reciben estas inmunoglobulinas desnaturalizadas. Activación de complemento no especifica se refiere al inicio de la cascada de complemento en la ausencia de complejos de anticuerpo-antigeno específicos. Activación de complemento no específica deberá evitarse estrictamente ya que puede provocar efectos secundarios indeseables tales como hipotensión, rubor, dolor de cabeza, fiebre, calosfríos, náusea, vómito, dolor muscular, disnea y taquicardia. Activación de complemento específica por otra parte, es conveniente ya que ocurre sólo después de que las inmunoglobulinas se han ligado a sus antígenos específicos.
Se mide activación de complemento no específica como la actividad anticomplementaria (ACA) así denominada, por una prueba estándar descrita en la Farmacopea Europea.
El papel del sistema de complemento en la defensa inmune de patógenos es bien conocido. El sistema de complemento consiste de aproximadamente 20 proteínas, que se activan secuencialmente . La ruta de complemento clásica típicamente requiere un complejo de anticuerpo antígeno específico para activación, mientras que la ruta alterna puede activarse por antígenos sin la presencia de anticuerpos. La ruta clásica y alterna de activación de complemento toda genera una proteasa C3-convertasa . La C3-convertasa disocia y activa el componente C3, creando C3a y C3b, y provocando una cascada de adicionales eventos de disociación y activación sobre C5 convertasa a C5a y C5b. C5b inicia la ruta de ataque de membrana, lo que resulta en el complejo de ataque de membrana, que consiste de C5b, C6, C7, C8, y C9 polimérico. Éste es el producto final citolítico de la cascada de complemento que forma un canal de transmembrana, que provoca lisis osmótica de las células objetivo como bacterias.
Activación de complemento adicionalmente resulta en la formación de anafilatoxinas , incluyendo la proteína biológicamente activa C5a. Esta anafilatoxina es un agente quimiotáctico potente para células inmunes e inflamatorias e induce activación celular y provoca la liberación de instamina de mastocitos . En situaciones de activación de complemento no específica y/o descontrolada o excesiva, la sobreproducción de C5a puede provocar efectos nocivos en los pacientes.
C5a es un quimioatrayente de leucocitos efectivo, que provoca la acumulación de glóbulos blancos, en especial neutrófilo granulocitos, en sitios de activación de complemento. C5a activa glóbulos blancos y es un mediador inflamatorio poderoso. Mientras que estas funciones son benéficas durante reacciones de complejo antigeno anticuerpo especificas, toda generación no especifica de C5a deberá evitarse debido a los efectos secundarios potenciales .
Activación de complemento no especifica es un aspecto particular de preparaciones de inmunoglobulina IgM (es decir aquellas que comprenden al menos 5% de IgM) , como en contraste a preparaciones IgG, los anticuerpos IgM se agregan fácilmente en solución. Las preparaciones IgM son difíciles de estabilizar, en especial si se enriquecen en comparación con concentraciones en plasma y almacenan en solución líquida. También se conoce que IgM es un activador vigoroso de complemento; una sola molécula ligada a un antígeno puede activar complemento. Esto es en contraste con IgG, en donde dos o más moléculas de IgG deben ligarse a un antígeno en cerrada asociación entre sí para activar complemento .
Aún más, las indicaciones principales tratadas por IgM que contienen preparaciones de inmunoglobulina son infecciones bacterianas y sepsis. Todos estos pacientes ya sufren de hipotensión, una generación no deseada adicional de activación de complemento no específica y C5a llevará a un empeoramiento clínico de la condición del paciente. De acuerdo con esto, preparaciones de IgM se han descrito como difíciles de preparar para aplicación intravenosa.
Hay varios métodos descritos en la técnica para la producción de preparaciones de inmunoglobulina que contienen IgM de plasma humano.
La purificación inicial de soluciones de IgM humana se ha llevado a cabo por clásicos métodos de fraccionación de plasma Cohn o su modificación bien conocida (por ejemplo Cohn/Oncley, Kistler/Nitschmann) . Utilizando procesos de precipitación con etanol en frío la fracción de IgM se recupera en la fracción III o fracción I/III (también denominada B o B+I) . Partiendo de la fracción III o I/III se han descrito métodos para purificación de soluciones de proteínas enriquecidas en IgM. EP0013901 describe un método de purificación que parte de la fracción III, incluyendo etapas que utilizan ácido octanóico, tratamiento con ß-Propiolactona y una etapa de adsorción utilizando una resina de intercambio aniónico. Este método se emplea para producir Pentaglobin® - a la fecha, el único producto IgM intravenoso comercialmente disponible. La ß-propiolactona es un producto químico bien conocido empleado en etapas de esterilización para inactivar virus que estén potencialmente presentes. Ya que ß-propiolactona es una sustancia muy reactiva, que provoca la modificación químicas de proteínas, también hay pérdida substancial de las actividades anti-virales y antibacterianas de las inmunoglobulinas . Por otra parte, esta modificación química resulta en una actividad anticomplementaria reducida en comparación con una inmunoglobulina químicamente modificada. EP0352500 describes la preparación de un concentrado de IgM para aplicación intravenosa con una actividad anti-complementaría reducida al utilizar cromatografía de intercambio aniónico, /?-Propiolactona, radiación de luz UVC y una etapa de incubación a temperatura incrementada (40°C a 60°C) . La preparación elaborada por este método fue estable en solución líquida por un tiempo limitado debido a la modificación química. La concentración de IgM tuvo sobre 50% del contenido total de inmunoglobulina.
La preparación de soluciones de proteína enriquecidas en IgM sin modificación química por ß-propiolactona se ha descrito en EP0413187 (Biotest) y EP0413188 (Biotest). Estos métodos involucran someter una solución de proteínas conveniente, a tratamiento con ácido octanóico y cromatografía de intercambio aniónico, partiendo de la fracción Cohn III o II/III. En la patente EP0413187 (Biotest) el tratamiento de ácido octanóico se lleva a cabo al agitar por 15 min, a fin de retirar lípidos presentes en la fracción Cohn III.
La preparación de acuerdo con EP0413187 tiene una baja actividad anticomplementaria, entre 0.6 y 0.8 CH50/mg de proteina, pero debe estabilizarse e inactivarse de virus por ?-propiolactona . Baja actividad anticomplementaria se considera como < 1 CH50/mg de proteina de acuerdo con la monografía de EP para inmunoglobulina .
EP0413188B1 (Biotest) describe la elaboración de una preparación enriquecida con IgM para administración intravenosa al utilizar una cromatografía de intercambio de aniones a fin de reducir la actividad anti-complementaría . Adicionalmente, un tratamiento a pH 4 - 4.5 de 0 a 60°C, de preferencia entre 50 y 54 °C, se describió para reducir la actividad anticomplementaría . Esta preparación tuvo que liofilizarse para asegurar estabilidad de la preparación por varios meses. Estabilidad a largo plazo como una solución líquida no pudo mostrarse.
M. Wickerhauser et al. "Large Scale Preparation of Macroglobulin", Vox Sang 23, 1 19-125 (1972) mostró que las preparaciones de IgM aisladas por precipitación de PEG tuvieron alta actividad anticomplementaria (ACA) por prueba de fijación de complemento estándar y esta actividad ACA se reduce 10 veces por incubación de la preparación IgM a pH 4.0 a 37 °C por 8 horas seguido por reajuste a pH neutro. No se demostró si esta reducción de 10 veces es suficiente para asegurar tolerabilidad intravenosa. Los autores no estiman el potencial activador de complemento especifico de su concentrado IgM ni estiman la seguridad en ningún modelo de animal o humano.
Otro método describe el uso de tratamiento con ligero calentamiento de preparaciones de IgM a 40 a 62 °C, de preferencia 45 a 55°C, a pH 4.0 a 5.0 (EP 0450412, Miles) para reducir la activación de complemento no especifica. En esta solicitud de patente, se agrega ácido octanóico a una suspensión de fracción Cohn III a fin de retirar activador precalicreina y lipoproteinas por centrifugación. Sin embargo, este tratamiento con ligero calor llevó a pérdida parcial de determinantes antigénicos de IgM. Esto puede aumentar el riesgo de generar neo-antigenos, lo que lleva a una inmunogenicidad incrementada en humanos o la perdida de actividad.
La preparación de una solución de proteina que contiene IgM para aplicación intravenosa al utilizar un tratamiento de proteasa (por ejemplo con pepsina) después de una etapa de precipitación de ácido octanóico se ha descrito en EP0835880 (US 6136312, ZLB) . El tratamiento de proteasa lleva a fragmentación parcial de la molécula de inmunoglobulina que deteriora la actividad funcional completa de las partes Fab y Fe. Por lo tanto inmunoglobulinas tratadas con proteasa no puede considerarse como modificada. También, este método de preparación lleva a aproximadamente fragmentos de 5% con un peso molecular de <100kD.
Los métodos descritos para llevar a cabo el tratamiento con ácido octanóico (EP0413187 y EP0835880) tienen la desventaja de que el tratamiento con ácido octanóico no es efectivo respecto a eliminación e inactivación de virus sin envolvente, y no retira substancialmente toda la actividad proteolitica . En EP
0345543 (Bayer, Miles) se describe una preparación de IgM altamente concentrada con al menos 33% de IgM para uso terapéutico, la preparación está substancialmente libre de títulos de isoaglutinina . En esta solicitud de patente, se lleva a cabo una precipitación de ácido octanóico, al agregar el ácido octanóico y las isoaglutininas se retiran por cromatografía de afinidad Synsorb. La preparación final debe de secarse por congelamiento.
Aunque la elaboración de una preparación que contiene IgM con baja actividad anticomplementaría es posible, si las inmunoglobulinas se modifican química o enzimáticamente y/o purifican adicionalmente por cromatografía y/o someten a un ligero tratamiento térmico. Sin embargo, estos métodos tienen sus desventajas en la falta de eliminación de virus/inactivación de virus (y por lo tanto seguridad de virus), reducción en la cantidad de moléculas de inmunoglobulina en forma nativa y/o actividad anticomplementaria residual. Como tal, todavía hay necesidad por proporcionar preparaciones de inmunoglobulina que contienen IgM mejoradas adecuadas para administración intravenosa en humanos.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
En un primer aspecto, la presente invención proporciona una preparación de anticuerpos adecuada para administración intravenosa en humanos que comprende IgG, IgA y al menos anticuerpos IgM al 5% en peso de la cantidad total de anticuerpos, en donde la preparación se elabora a partir de plasma humano, en donde la preparación de anticuerpos tiene actividad de activación de complemento específica y en donde en un ensayo in vitro con suero humano adecuado para determinar la capacidad de la preparación de anticuerpos para activar complemento en forma no específica, la preparación de anticuerpos genera sustancialmente nada de C5a y/o sustancialmente nada de C3a.
Los presentes solicitantes han encontrado de manera sorprendente que la producción de una preparación de anticuerpos IgM de suero humano es posible que tiene actividad de activación de complemento específica y sustancialmente nada de actividad de complemento no específica. Este producto es ventajoso ya que mantiene eficacia de producto mientras que reduce efectos secundarios indeseados tales como hipotensión, asociados con activación de complemento no especifica después de administración intravenosa.
Un aspecto adicional de la presente invención proporciona un método para producir la preparación de anticuerpos de la presente invención a partir de plasma humano que comprende las etapas de:
(a) preparar a partir de plasma humano una fracción de plasma como una solución que contiene las inmunoglobulinas ;
b) mezclar un ácido carboxilico C7 a C9 con la solución y tratar la solución mezclada con un agitador de vibración para precipitar las proteinas contaminantes;
(c) separar las proteínas precipitadas de la solución para dar por resultado la composición de inmunoglobulina que contiene IgM;
(d) incubar la composición de inmunoglobulina que contiene IgM entre pH 3.5 y pH 4.5, para formar una solución incubada;
(e) irradiar la solución incubada con UVC para formar una solución irradiada con UVC; y
(f) filtrar la solución irradiada de UVC bajo condiciones estériles, para formar la preparación de anticuerpos adecuada para administración intravenosa en humanos.
Los presentes solicitantes han encontrado de manera sorprendente que el uso de un agitador de vibración durante la etapa en donde la solución de inmunoglobulina se mezcla con el ácido carboxilico, es extremadamente ventajosa. Esta etapa de método proporciona una eliminación más eficiente de proteínas indeseadas (incluyendo proteasas) y produce un producto intermediario que es más adecuado para etapas de procesamiento corriente abajo utilizadas para producir un medicamento de inmunoglobulina; el producto intermedio permite que estas etapas de procesamiento corriente abajo sean más eficientes. De acuerdo con esto, las etapas de procesamiento corriente abajo pueden ser menos severas ayudando a lograr la preparación de anticuerpos de la presente invención, que es capaz de activación de complemento específica y sustancialmente sin activación de complemento no específica .
En particular, la composición que contiene inmunoglobulina IgM obtenida de la etapa (c) puede ¦ combinarse con etapas de tratamiento adicionales, tales como tratamiento con condiciones ligeramente acidas y tratamiento con radicación UVC, para producir una preparación de anticuerpos o producto de inmunoglobulina que contiene IgM que es adecuado para administración intravenosa y que tiene las siguientes propiedades ventajosas tiene baja actividad proteolitica, retiene un alto nivel de IgM nativa y activa y está libre de virus y de esta manera es conveniente para administración intravenosa en humanos. El nivel de seguridad de virus logrado con los métodos aquí descritos no se ha obtenido previamente. Ventajas adicionales son tener baja actividad proteolitica (y por lo tanto estables durante almacenamiento a largo plazo) y químicamente no modificadas .
Aún más, la presente invención proporciona preparación anticuerpo de la presente invención para utilizar en medicina. En una modalidad, la preparación de anticuerpos es para utilizar en el tratamiento de desórdenes inmunológicos e infecciones bacterianas.
Un aspecto adicional de la presente invención proporciona un método de tratamiento que comprende administrar a un paciente la preparación de anticuerpos de la presente invención.
La presente invención ahora se describirá con mayor detalle de manera de ejemplo solamente, con referencia a las figuras- acompañantes.
La FIGURA 1 proporciona una vista general de una modalidad de la invención, en donde se muestran las etapas pueden utilizarse para formar una preparación de anticuerpos adecuada para administración intravenosa de acuerdo con la presente invención. La etapa del tratamiento con ácido octanóico que emplea un dispositivo vibromezclador, el tratamiento a pH 4 y el tratamiento UVC se resaltan. El material de partida se genera a partir de un proceso de precipitación con etanol en frió estándar de plasma humano.
La Figura 2 proporciona una gráfica que muestra concentraciones C5a promedio dependientes del tiempo que se encuentran en suero humano después de incubación con preparaciones IgM.
La Figura 3 proporciona una gráfica que muestra concentraciones C3a promedio dependientes del tiempo que se encuentran en suero humano después de incubación con preparaciones de IgM.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Preparación de anticuerpos
Como se describió anteriormente, la presente invención proporciona una preparación de anticuerpos adecuada para administración intravenosa en humanos gue comprende IgG, IgA y al menos anticuerpos IgM al 5% en peso de la cantidad total de anticuerpos, en donde la preparación se elabora a partir de plasma humano, en donde la preparación de anticuerpos tiene actividad de activación de complemento especifica y en donde en un ensayo in vitro con suero humano adecuado para determinar la capacidad de la preparación de anticuerpos para activar complemento en forma no especifica, la preparación de anticuerpos genera sustancialmente nada de C5a y/o sustancialmente nada de C3a.
La preparación de anticuerpos de la presente invención comprende proteínas de plasma humano de las cuales al menos 90%, de preferencia al menos 95% están constituidas de inmunoglobulinas (anticuerpos policlonales ) . En particular, la preparación comprende las inmunoglobulinas IgG, IgA y IgM en donde al menos 5% de las inmunoglobulinas son IgM. La cantidad de inmunoglobulinas IgG, IgA y IgM puede determinarse por nefelometría o por inmunoprecipitación de acuerdo con Ph. Eur. 2.7. 1.
En forma más preferible, la preparación de anticuerpos comprende cuando menos 10% de Ig y más preferible al menos 15% de IgM. En relación a IgG y IgA, de preferencia la preparación de anticuerpos comprende más de 5% IgA y/o más de 40% de IgG. Todos los porcentajes son porcentajes de la cantidad total de anticuerpos (por ejemplo, g de IgM / (g de IgG + g de IgA + g de IgM) x 100) .
Se conocen en la técnica métodos para determinar que la preparación de anticuerpos tiene actividad de activación de complemento específica (es decir la capacidad por activar la cascada de complemento en la presencia de antigeno) a través de estimar la actividad funcional de la parte Fe de la molécula de inmunoglobulina . En particular, se describe un método conveniente por el actual método de Eur. Ph. de acuerdo con las Guías Europeas ICH S6 (CPMP/ICH/302/95) que utilizan el antígeno Rubéola. Mayores detalles respecto a activación de complemento específica se proporcionan a continuación con referencia a la actividad biológica .
La preparación de anticuerpos no provoca sustancialmente activación de complemento no específica (es decir activación de la cascada de complemento por inmunoglobulinas en la ausencia de antígeno) en ensayos in vitro adecuados para determinar activación de complemento no específica en suero humano normal (es decir suero de humanos sanos) . En particular, el ensayo puede determinar la cantidad de C5a y/o C3a generados en el ensayo en la ausencia de antígeno. Como se notó anteriormente, la activación de complemento resulta en la producción de C5a y C3a. Ya que ambas de estas proteínas están involucradas en la ruta terminal del sistema de complemento (en vez de en cualquiera de la ruta clásica/lectina o la ruta alterna) son particularmente útiles para determinar la activación de complemento .
La preparación de anticuerpos sustancialmente no genera C5a y/o sustancialmente no genera C3a cuando se utiliza en un ensayo in vitro apropiado con suero humano en la ausencia de antigeno. En una modalidad preferida, la preparación de anticuerpos ajustada a una concentración IgM de 1.72 mg/ml, genera menos de 200 ng/ml de C5a después de 60 minutos del ensayo y/o la preparación de anticuerpos ajustada a una concentración IgM de 1.72 mg/ml genera menos de 6000 ng/ml de C3a después de 60 minutos del ensayo.
En forma alterna o además, la cantidad de C5a y/o C3a generada por la preparación de anticuerpos en el ensayo es la misma que la cantidad de C5a y/o C3a generada en el mismo ensayo por suero humano sólo + 70%. De preferencia esto es después de 60 minutos del ensayo.
Ensayos convenientes se conocen en la técnica. En una modalidad preferida, el ensayo comprende las etapas de: (a) agregar una cantidad de la preparación de anticuerpos a 100 µ? de suero humano para crear una mezcla de reacción que contiene 1.72 mg/ml de IgM e incubar la mezcla de reacción por 60 minutos a 37 °C, con agitación constante;
(b) preparar un conjunto de diluciones de la mezcla de reacción, adecuadas para un ELISA;
(c) realizar un ELISA emparedado en el conjunto de diluciones de la mezcla de reacción utilizando un anticuerpo primario y un secundario a C5a o C3a y una sustancia cromogénica, en donde el anticuerpo secundario se conjuga con una enzima y la sustancia cromogénica es el sustrato de la enzima; y
(d) determinar la cantidad de C5a o C3a en la mezcla de reacción con base en un cambio de color que se obtiene como resultado de poner en contacto la sustancia cromogénica con la enzima ligada a C5a o C3a mediante el anticuerpo secundario .
En el ELISA, el conjunto de diluciones se pone en contacto con pozos de una placa de ensayo revestida con el anticuerpo primario. Después de incubación, los pozos son lavados para retirar la muestra de dilución. El segundo anticuerpo después se incuba y liga a cualquier C3a/C5a ligado al anticuerpo primario en los pozos, ya que tiene un epitopo diferente en C3a/C5a al anticuerpo primario. Después de adicional lavado para retirar anticuerpo secundario no ligado, el cromógeno se incuba y reacciona con la enzima conjugada al segundo anticuerpo. El cambio de color resultante puede medirse por determinaciones de densidad óptica con un fotómetro, que es proporcional a la concentración de C5a/C3a presente en el juego de diluciones.
En particular, la cantidad de la preparación de anticuerpos agregada en la etapa (a) , es apropiada para crear una concentración de 1.72 mg/ml de Ig en la mezcla de reacción. Las etapas (c) y (d) pueden comprender: (i) aplicar el juego de diluciones de la mezcla de reacción a los pozos de una placa de ensayo que se reviste con un anticuerpo primario a C3a/C5a (es decir "el anticuerpo de captura"); (ii) incubar la placa para permitir que cualquier C3a/C5a ligue al anticuerpo primario; (iii) lavar la placa para retirar cualquier material en las diluciones no ligadas al anticuerpo primario; (iv) aplicar un anticuerpo ligado a enzima secundaria (el anticuerpo de detección) que también liga a C3a/C5a; (v) incubar la placa para permitir cualquier anticuerpo secundario que ligue a C3a/C5a; (vi) lavar la placa para retirar anticuerpo secundario no ligado; (vii) aplicar un producto químico que se convierte por la enzima en una señal de color; y (viii) medir la absorbancia de los pozos de la placa para determinar la presencia y cantidad de C3a/C5a.
El ELISA emparedado se realiza de acuerdo con los métodos conocidos en la especialidad y/o con equipos comercialmente disponibles de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. De manera conveniente y particularmente de preferencia, equipos de ensayo de inmunoabsorción ligados a enzima (ELISA = Enzyme Linked Immunosorbent Assay) comercialmente disponibles son Quidel Micro Vue C5a Plus EIA Kit; A025, y Quidel Micro Vue C3a Plus EIA Kit; A032.
En una modalidad adicional de la presente invención, la preparación de anticuerpos comprende menos de 2% de agregados de 1200 kDa o superior, de preferencia menos de 1.5%. Esto se refiere al por ciento del contenido de inmunoglobulina . La cantidad de agregados puede determinarse por cromatografía de exclusión de tamaño de alto desempeño (HPSEC = High Performance Size Exclusión Chromatography) . Esto puede realizarse por métodos conocidos en la técnica.
En forma alterna, o además de la habilidad de la preparación de anticuerpos para generar sustancialmente ninguna activación de complemento no específica, puede definirse como la actividad anticomplementaria de la preparación que es menor que 1.0 CH50/mg de proteína más preferiblemente menor que 0.75 CH50/mg de proteína. El ensayo para determinar la actividad anticomplementaria en esta escala puede llevarse a cabo de acuerdo con el método descrito en la Farmacopea Europea (método 2.6.17, Ph. Eur. 6. Edition, 2008). Mayores detalles de este ensayo se proporcionan en la sección de ensayos a continuación.
En una modalidad preferida, la preparación de anticuerpos se ha elaborado a partir de suero humano en la ausencia de una etapa que involucra modificación química o enzimática de los anticuerpos, es decir el proceso de producción de la preparación de anticuerpos a partir de suero humano no comprende una etapa de poner en contacto los anticuerpos con un reactivo que provocará su modificación enzimática o química. En particular, el proceso no comprende poner en contacto los anticuerpos con ß-propiolactona, lo que provoca modificación química de los anticuerpos o comprende poner en contacto los anticuerpos con pepsina, lo que provocará disociación enzimática de los anticuerpos .
En forma alterna, o además, la preparación de anticuerpos se ha elaborado a partir de suero humano en la ausencia de una etapa que involucra calentar los anticuerpos a una temperatura de 40 °C o más por 10 minutos o más. En particular, se conoce que las etapas de calentamiento pueden desnaturalizar las inmunoglobulinas y provocar agregación de inmunoglobulinas.
Además de preferencia la preparación de anticuerpos se elabora por un proceso que es capaz de más de 3 logio, de preferencia más de 4 logio, y más preferible más de 5 logio, eliminación de virus no envueltos, haciendo de esta manera que la preparación de anticuerpos sea libre de virus. La preparación del anticuerpos por lo tanto es más segura que las preparaciones de anticuerpos de la técnica previa, en particular respecto a virus no envueltos activos como por ejemplo parvovirus. Esto resulta en una preparación de anticuerpos que está sustancialmente libre de virus y en particular libre de virus no envueltos. Aún más, el método de la presente invención es capaz de lograr este nivel de inactivación/eliminación de partículas virales sin un impacto significante en la cantidad de IgM activos o en la actividad anticomplementaria de la preparación de anticuerpos.
En particular, la preparación de anticuerpos puede elaborarse a partir de plasma humano por un proceso que comprende las etapas de:
(a) preparar a partir del plasma humano una fracción de plasma como una solución que contiene inmunoglobulinas;
(b) mezclar un ácido carboxílico C7 a C9 con la solución y tratar la solución mixta con un agitador de vibración para precipitar proteínas contaminantes;
(c) separar las proteínas precipitadas de la solución para dar por resultado las composiciones de inmunoglobulina que contienen IgM;
(d) incubar la composición de inmunoglobulina que contiene IgM entre pH 3.5 y pH 4.5, para formar una solución incubada;
(e) irradiar la solución incubada con UVC para formar una solución irradiada con UVC; y
(f) filtrar la solución irradiada con UVC bajo condiciones estériles para formar la preparación de anticuerpos adecuada administración intravenosa en humanos.
Se prefiere que el proceso además comprenda someter a nanofiltración la solución incubada que se obtiene de la etapa (d) , antes de irradiación en la etapa (e) . Mayores detalles y aspectos preferidos del método de producción se describen en la siguiente sección.
En una modalidad preferida adicional de la invención, la preparación de anticuerpos es capaz de administración a monos macacos cangrejeros a 115 mg de IgM/kg de peso corporal/hora en la ausencia de 10% o mayor reducción en presión arterial del nivel de tratamiento previo. Como se notó anteriormente, activación de complemento no especifica provoca hipotensión y por lo tanto la falta de un cambio significante en presión arterial indica que sustancialmente no ocurre activación no especifica de complemento en monos sanos, in vivo. La presión arterial puede medirse al insertar un catéter de presión en la aorta abdominal inferior por la arteria femoral derecha.
En una modalidad preferida, la preparación de anticuerpos también comprende anticuerpos contra uno o más de Pneumococcus sacárido, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Candida albicans, y Chlamydia.
En una modalidad preferida adicional al menos 90% de los anticuerpos en la preparación de anticuerpos son biológicamente activos. El término biológicamente activo significa que los anticuerpos en la preparación están en forma nativa y en particular son capaces de activación de la cascada de complemento como resultado de enlace especifico a un antigeno. La actividad biológica de una preparación de anticuerpos puede estimarse con base en ensayos para determinar la actividad de enlace/titulo de anticuerpo y función/integridad de Fe que se conoce en la técnica. En particular, en un antigeno de rubéola in vitro adecuado para determinar la función Fe la actividad de la parte Fe de los anticuerpos de la preparación de anticuerpos es la misma que la de una preparación de referencia biológica + 10%, más preferiblemente ± 5%.
Preparaciones de referencia biológica se utilizan por la comunidad para el cuidado de salud y médica internacional y ayudan a asegurar consistencia en productos médicos. Como tales, preparaciones de referencia biológicas convenientes para el ensayo se conocen y están disponibles en la especialidad (por ejemplo la Preparación de Referencia Biológica de Inmunoglobulina (Lote Número 3) . En particular, el ensayo puede realizarse de acuerdo con la prueba de la Farmacopea Europea reconocida internacionalmente 2.7.9 para Función Fe de Inmunoglobulina (actual edición abril 2011) que utiliza la Preparación de Referencia Biológica de Inmunoglobulina Humana (Lote Número 3) como un control contra el cual el por ciento de actividad de la preparación de anticuerpos se determina.
Esta prueba comprende las etapas de (i) cargar glóbulos rojos humanos de grupo 0 teñidos con antigeno de virus rubéola para crear glóbulos sanguíneos revestidos con antígeno; (ii) incubar una cantidad de la preparación de anticuerpos con los glóbulos; agregar complemento de conejillo de Indias para empezar lisis iniciada por complemento de los glóbulos; (iii) medir la cinética de hemolisis por cambios de absorbancia dependiente de tiempo a 541 nm; (iv) evaluar la función de los anticuerpos de la preparación de anticuerpos utilizando cambio máximo de absorbancia por tiempo.
La preparación de anticuerpos de preferencia también tiene una menor actividad proteolitica que las preparaciones de anticuerpos descritas en la técnica previa. En particular, no es detectable actividad proteolitica en la preparación cuando se almacena entre 2 a 8°C. La actividad proteolitica puede medirse por métodos de prueba estandarizados conocidos en la especialidad, tal como el que utiliza el sustrato cromogénico que se describe en la sección de ensayo a continuación y en el Ejemplo 6.
La preparación de anticuerpos de la presente invención además puede comprender un agente estabilizante tal como glicina.
Como con las preparaciones conocidas en la técnica, la preparación de anticuerpos de la presente invención puede almacenarse a 5±3°C. Sin embargo, debido a la purificación eficiente con el método de la presente invención, la estabilidad de la preparación de anticuerpos es extremadamente buena. El producto final es estable en forma líquida por al menos 3 meses, de preferencia al menos 6 meses y más preferible al menos 2 años a 2 a 8°C, lo que significa que no hay fragmentación o polimerización de IgM sobre 1.5% medido en HPSEC, sin incremento de actividad proteolítica, sin decremento en actividad de anticuerpo IgM contra Escherichia coli y actividad de anticuerpo IgM contra Pneumococcus saccharide mayor a 25% y sin incremento en actividad anticomplementaria mayor a 25%, permaneciendo inferior a 1 CH50/mg de proteína. Aún más, el producto final producido por el método de la presente invención es estable en forma líquida por al menos 3 meses, de preferencia al menos 6 meses y es más preferible al menos 1 año a temperatura ambiente (entre 23 y 27 °C) como se estima por el mismo criterio.
Método de producción de preparación de anticuerpos
Como describió anteriormente, la presente invención proporciona la elaboración de una preparación de anticuerpos que contiene IgM a partir de una fracción de plasma que comprende inmunoglobulinas . En particular, la presente invención proporciona un método para producir la preparación de anticuerpos descrita aquí a partir de plasma humano que comprende las etapas de:
(a) preparar a partir de plasma humano, una fracción de plasma como una solución que contiene inmunoglobulinas;
(b) mezclar un ácido carboxilico C7 a Cg con la solución y tratar la solución mixta con un agitador de vibración para precipitar proteínas contaminantes;
(c) separar las proteínas precipitadas de la solución para dar por resultado la composición de inmunoglobulina que contiene IgM;
(d) incubar la composición de inmunoglobulina que contiene IgM entre pH3.5 y pH 4.5, para formar una solución incubada ;
(e) irradiar la solución incubada con UVC para formar una solución irradiada con UVC; y
(f) filtrar la solución irradiada con UVC bajo condiciones estériles para formar la preparación de anticuerpos adecuada para administración intravenosa en humanos.
Fracciones de plasma adecuadas para preparación de composiciones de inmunoglobulinas farmacéuticas y métodos para su producción son bien conocidas en la ¦ técnica. La fracción de plasma de preferencia es una fracción de plasma precipitada y más preferible una fracción de plasma precipitada que se obtiene por el proceso de Cohn, fraccionación o sus modificaciones bien conocidas (por ejemplo Kistler-Nitschmann) . Más preferiblemente, la fracción es la fracción I/III o la fracción III (también conocida como fracción B+I o fracción B) de fraccionación con etanol frió. Se prefiere que las inmunoglobulinas de la fracción del plasma comprendan al menos 5% IgM.
La etapa (a) comprende proporcionar una fracción de plasma como una solución que contiene las inmunoglobulinas. En muchos casos, la fracción de plasma que contiene las inmunoglobulinas estará en forma sólida o semisólida. De esta manera, el objetivo de esta etapa es asegurar o llevar la proteina de la fracción de plasma en solución tal que esté en un estado conveniente para mezclar con el ácido carboxilico en la etapa (b) . Esta etapa puede comprender mezclar la fracción de plasma con un amortiguador conveniente. De preferencia, el amortiguador es de baja molaridad (es decir menor que 1 M) y tiene un pH entre 4.5 y 5.5, por ejemplo amortiguador acetato de sodio 0.1 M pH 5.05±0.1. El mezclado puede completarse utilizando en un mezclador de aspas o un agitador vibratorio.
En la etapa (b) la solución formada en la etapa (a) se mezcla con un agitador de vibración con un ácido carboxilico C7 a Cg para precipitar las proteínas contaminantes (por ejemplo proteasas, virus, etc.) . El ácido carboxilico puede ser ramificado y/o puede incluir sustituyentes que no alteran sustancialmente el efecto de la etapa (b) . El ácido carboxilico de preferencia es ácido octanóico. El ácido carboxilico de preferencia se agrega a una concentración de al menos 0.075 kg/kg de fracción de plasma, hasta una concentración de 0.2 kg/kg. Más preferiblemente, el ácido carboxilico agregado es 0.8 a 0.15 kg/kg de fracción de plasma y más preferiblemente entre 0.09 kg/kg y 0.13 kg/kg. Ácido de cualquier molaridad conveniente puede emplearse para proporcionar la concentración correcta.
Cualquier tipo de agitador de vibración comercialmente disponible, adecuado para utilizar en la industria química/farmacéutica, podrá emplearse. Ejemplos de agitadores de vibración convenientes están disponibles de Graber + Pfenninger GmbH. En particular, el vibromezclador "Labormodell Typ 1" puede ser empleado para experimentos a escala de laboratorio y el "Industriemixer Typ 4" puede emplearse para preparaciones a escala de producción. Los mezcladores vibratorios pueden emplearse de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes y en particular a ajustes que se describen por los fabricantes como adecuados para mezclar soluciones que contienen proteínas. Por ejemplo, los mezcladores vibratorios pueden usualmente ser operados a menos de 100 Hz con una amplitud menor a 10 mm, por ejemplo el mezclado de vibración utilizando el "Labormodell Typ 1" a una escala de laboratorio se llevó a cabo por los presentes inventores a 50 Hz, cuando se emplea una fuente de energía de 230 V. La amplitud de vibración del proceso de mezclado se varió entre 0 y 3 mm, y para la preparación IgM de preferencia 3 mm se empleó. Placas agitadoras con un diámetro entre 23 mm y 65 mm se emplearon para experimentos a escala de laboratorio. Para escala de producción, se empleó un diámetro de placa agitadora de 395 mm (diámetros de orificio de 13.5 mm y 16 mm) .
En la etapa (b) el pH de la solución mixta de preferencia entre 4.5 a 5.5, y más preferible entre pH 4.8 y pH 5.3. La etapa pude llevarse a cabo en amortiguador acetato de sodio, y por ejemplo con amortiguador acetato de sodio aproximadamente 0.1 M. La temperatura en la cual la etapa (b) se realiza de preferencia entre 10°C y 35°C, y más preferible 14 a 30°C.
El tiempo de mezclado utilizando el agitador vibratorio no se limita particularmente pero de preferencia es al menos 30 minutos y no más que 3 horas, y más preferible de 40 - 1 10 minutos. Tiempos de incubación menores a 30 minutos pueden reducir el nivel de inactivación del virus.
En una modalidad de la etapa (b) se mezcla fosfato tri-cálcico con la solución en la etapa (b) . De preferencia, esto se agrega a 0.01 a 0.02 kg/kg de fracción de plasma (como está en forma sólida o semi-sólida) . El fosfato tri-cálcico puede agregarse en forma simultánea, separada o secuencial al ácido carboxilico. En una modalidad preferida, el fosfato tri-cálcico se agrega al menos 20 minutos después del ácido carboxilico.
En la etapa (c) las proteínas contaminantes precipitadas en la etapa (b) se separan de la solución para dar por resultado la composición de inmunoglobulina que contiene IgM (es decir una solución que contiene inmunoglobulina) . Esta etapa de separar no se limita particularmente pero puede realizarse por cualquier método conveniente conocido en la técnica. Sin embargo, la etapa de separación de preferencia se realiza utilizando filtración, y más preferible ultrafiltración, y el resultado de la etapa (c) por lo tanto es una solución filtrada .
Como se describió anteriormente, el método de la presente invención es ventajoso en términos de fabricación ya que parece provocar una precipitación más eficiente de proteínas contaminantes y como resultado, la etapa (c) es más fácil de realizar. Cuando la mezcla que resulta de la etapa (b) se separa, una solución transparente clara, es decir la composición de inmunoglobulina que contiene IgM se logra. La filtración por lo tanto es más rápida y más fácil.
Adicionales etapas de proceso (d) a (f) se requieren para convertir la composición de inmunoglobulina que contiene IgM que se obtiene de la etapa (c) en una preparación de anticuerpo adecuada para administración intravenosa.
La etapa (d) comprende tratar la composición de inmunoglobulina que contiene IgM que se obtiene de la etapa (c) con condiciones levemente ácidas, etapa (e) comprende someter la composición tratada con ácido a radiación UVC para formar una solución irradiada UVC, y la etapa (f) comprende filtrar la solución irradiada con UVC bajo condiciones estériles para formar la preparación de anticuerpo adecuada para administración intravenosa en humanos .
Para el tratamiento con condiciones ligeramente ácidas, la composición de inmunoglobulina que contiene IgM obtenida de la etapa (c) se incuba entre pH 3.5 a pH 4.5, y de preferencia entre pH 3.8 y pH 4.2, para formar una solución incubada. Las condiciones ligeramente ácidas pueden ser creadas al agregar un ácido conveniente a la composición de inmunoglobulina que contiene IgM, por ejemplo el pH puede ajustarse al agregar HCl 0.2 M.
Esta etapa de incubación de preferencia se lleva a cabo entre 32 y 42°C, y más preferible entre 35 y 39°C. El tiempo de incubación de preferencia es al menos 2 horas y no mayor que 24 horas, y más preferiblemente al menos 9 horas pero no mayor que 16 horas.
En la etapa de irradiación, la solución incubada que se obtiene del tratamiento de ácido débil descrito anteriormente, se trata con luz UVC para formar una solución UVC irradiada. Esta etapa puede realizarse utilizando dispositivos que están comercialmente disponibles, tales como el dispositivo UVivatec® (Bayer Technology Services) . Se prefiere que la solución incubada se trate a 254 ± 10 nm entre 200 y 500 J/m2, más particularmente entre 200 y 300 J/m2, a fin de inactivar adicionalmente virus y proteasas que estén potencialmente presentes. Se nota que el tratamiento con UVC bajo condiciones leves que el normalmente requerido solo es posible con el filtrado claro de agua que se obtiene por la presente invención después del tratamiento con ácido octanoico con vibromezclado . Soluciones más opalescentes u opacas normalmente recibidas por técnicas de agitación estándar requerirán más prolongados tiempos de irradiación que llevarían a más desnaturalización de la actividad IgM y menores velocidades de inactivación de virus.
En la etapa (f) la solución irradiada se filtra bajo condiciones estériles para formar la preparación de anticuerpo adecuada para administración intravenosa en humanos. De preferencia, la filtración es nanofiltración, más preferible a través de un filtro que tiene un tamaño de poros de 40 a 50 nm.
Además del tratamiento con ácido débil, la radiación UVC y la etapa de filtración, etapas adicionales para lograr una preparación de inmunoglobulina para administración intravenosa pueden también comprender opcionalmente una o más adicionales etapas de filtración. En una modalidad, la solución de proteina que se procesa puede ser adsorbida en DEAE-Sephadex y después separada de Sephadex por filtración profunda o intensa. Por ejemplo, además puede someterse a una adsorción de lote con 75 mg por kg de proteina DEAE Sephadex a pH 5.8, a fin de retirar la proteina acompañante indeseada Ceruloplasmina .
En una modalidad particularmente preferida, la solución incubada obtenida del tratamiento con ácido débil se somete a adsorción en DEAE-Sephadex y después se separa de Sephadex por filtración profunda, antes de tratarse por radiación UVC.
En otra modalidad, la solución de inmunoglobulina que se procesa puede ser filtrada a través de un filtro de nanómetros. Filtros de 75 + 5 nm a 35 ± 5 nm en tamaño de poro, o filtros que tienen un tamaño de poros nominal de 75 a 35 nm (por ejemplo Pall Ultipor DV50) , pueden emplearse en diversas etapas durante el proceso. (Un tamaño de poros nominal de 50 nm significa velocidad de retención de > 4 logl 0 para virus con tamaño de 50 nm o más grande) . En una modalidad preferida, la solución obtenida de la etapa DEAE-Sephadex descrita en el párrafo anterior se pasa a través de un filtro de 0.2 µp? antes de radiación UVC.
La preparación de anticuerpo final (es decir la solución de inmunoglobulina que contiene IgM procesada) obtenida del proceso definido anteriormente, puede llenarse directamente en un recipiente bajo condiciones estériles. En forma alterna, la preparación de anticuerpo puede formularse en un amortiguador que contiene glicina a un pH entre 4 y 5.5, y de preferencia entre 4.1 a 4.5. La preparación de anticuerpo también puede diluirse a una concentración de proteina entre 40 y 80 g/L y de preferencia entre 55 y 70 g/L. Se nota que también es posible enriquecer el contenido IgM de la preparación de anticuerpo por métodos bien conocidos, como por ejemplo cromatografía de intercambio de aniones.
Como se indicó previamente, el método descrito con anterioridad lleva a una superior inactivación y eliminación de partículas de virus, en especial muy resistentes, no envueltos tales como parvovirus, que usualmente no son muy susceptibles a tratamiento con ácido octanoico. Además, una eliminación mejorada de actividad proteolítica se logra en comparación con agitación convencional. Estas características se logran mientras que se mantiene un alto rendimiento de IgM que químicamente no está modificada. Este hallazgo hace contraste con la visión convencional de que el tratamiento con ácido octanoico no es una etapa efectiva contra virus no envueltos y seguridad viral mejorada debe lograrse a través de inactivación de virus por métodos más agresivos tales como tratamiento con ß-Propiolactona . También era bien conocido que incrementar por ejemplo la concentración de ácido octanoico para retirar completamente la actividad proteolítica resulta en una pérdida masiva de IgM.
Los resultados del método se logran a través del uso de dispositivos de mezclado utilizando un modo de vibración en combinación con el tratamiento de ácido octanoico. Esto es particularmente sorprendente ya que se conoce que IgM es muy susceptible a esfuerzo cortante, lo que puede llevarse a una actividad anticomplementaria alta. De acuerdo con esto, no se considerarla utilizar un mezclador vibratorio para preparar una composición de IgM y no se esperaría este impacto favorable cuando se utiliza un mezclado vibratorio durante procesamiento de una solución que contiene IgM.
Además con el método, la separación lograda por la etapa (c), tal como clarificación por filtración de la solución tratada con ácido octanoico que resulta de la etapa (b) , se mejora cuando se utiliza un dispositivo de mezclado vibratorio. La separación se logra más fácilmente, reduciendo el tiempo de procesamiento y los costos de fabricación, y la etapa (c) lleva a una solución limpia que crea ventajas para procesamiento corriente abajo. Soluciones convencionales, que se logran al filtrar los resultados de soluciones que contienen IgM tratadas con ácido octanoico que se han agitado, son opalescentes u opacas .
La composición que contiene IgM resultante obtenida de la etapa (c) de preferencia se somete a tratamiento con condiciones ligeramente ácidas (por ejemplo pH 4) y una etapa de radiación UVC para mejorar adicionalmente la seguridad de virus y estabilizar el producto final. Debido a la clarificación mejorada de la composición de inmunoglobulina que contiene IgM obtenida de la etapa (c) , es posible reducir el tiempo de radiación necesario con UVC para lograr inactivación de virus de los virus no envueltos con más de 3 o 4 logio. Esto resulta en un superior rendimiento de IgM nativa y activa durante tratamiento con UVC.
De manera sorprendente, estas etapas llevan a una solución que contiene IgM no modificada en forma enzimática y química, que tiene superiores rendimientos de IgM nativa y activa, tiene baja actividad anticomplementaria y baja actividad protéolítica y tiene una elevada actividad antibacteriana y antiviral, con una seguridad sobresaliente de virus referente a virus envueltos y no envueltos; una característica clave para productos farmacéuticos que son para administración intravenosa. Aún más, una solución que contiene IgM tratada, tiene mejorada estabilidad a largo plazo es muy estable en solución líquida por má de 12 meses a 2 - 8°C.
Uso Médico
La preparación de anticuerpos de la presente invención es adecuada para utilizar en medicina y puede ser empleada en el tratamiento de desórdenes inmunológicos e infecciones, particularmente desorden de deficiencia de IgM e infecciones bacterianas. Preparación de inmunoglobulina polivalente enriquecida con IgM humana para administración intravenosa contiene superiores títulos de anticuerpo contra bacterias Gram-negativas y Gram-positivas clínicamente relevantes, así como superiores títulos de anticuerpo contra endotoxinas de bacterias Gram-negativas y exotoxinas de bacterias Gram-negativas y Gram-positivas en comparación con preparaciones de inmunoglobulina G polivalentes .
En particular, las preparaciones de anticuerpo de la presente invención son adecuadas para administración intravenosa a pacientes.
La invención también proporciona un método de tratamiento de un paciente que comprende una etapa de administrar la preparación de anticuerpo de la presente invención a un paciente. En particular, el paciente puede sufrir de un desorden inmunológico o una infección bacteriana. En una modalidad preferida, las preparaciones de anticuerpo se administran en forma intravenosa.
La presente invención ahora se describirá adicionalmente solo a manera de ejemplo.
EJEMPLOS
Métodos de Ensayo
Distribución de tamaño molecular por II PLC para Concentrado de Ig
El método siguiente puede utilizarse para determinar el % de agregados en una preparación de anticuerpo (como se emplea en el Ejemplo 8).
Solución de Prueba: Se inyectan muestras sin diluir a aproximadamente 50 g/L con un volumen de inyección de 10 µ?? (aproximadamente 500 iq de carga de proteina) .
Solución de referencia: inmunoglobulina humana (e.g. Intratect, Biotest AG)
Solución estándar: estándar de filtración de gel Bio-Rad (Art.-No. 151-1901)
Columna :
— tamaño: 1 = 30 mm, 0 = 7.8 mm,
— fase estacionaria: Tosoh Bioscience TSK-Gel G4000 SWXL, adecuada para fraccionar proteínas globulares con masas moleculares relativas en el intervalo de 20 000 a 7 x 106 Da.
Fase móvil: se disuelven 4.873 g de hidrógeno de fosfato dihidrato disodio, 1.741 g de dihidrógeno fosfato monohidrato de sodio, 11.688 g de cloruro de sodio y 50 mg de azida de sodio en 1 litro de agua.
Gasto de flujo: 0.5 ml/min
Detección: espectrofotómetro a 280 nm. En el cromatograma que se obtiene con la solución de referencia, el cromatograma se integra de acuerdo con el siguiente esquema y los picos se identifican:
• Polímero (> 1200 kD) , 10 - 13 min
• IgM (1200 - 750 kD) , 13 - 19 min
• Dímero / IgA (750 - 350 kD) , 19 -20 min
• IgG (350 - 100 kD) , 20 - 26 min
• Fragmentos (< 100 kD) , 26 - 40 min
• Fragmentos (< 100 kD) , 26 - 40 min
Determinación de activación de complemento no específico
Eritrocitos de oveja tratados previamente con hemolisina se hemolisan por complemento. Por anticuerpos de enlace de complemento en la muestra se suprime la hemolisis. La cantidad de complemento se determina, que se liga (inactiva) por 1 mg de inmunoglobulina.
Una cierta cantidad de inmunoglobulina (10 mg) se mezcla con complemento de conejillo de Indias y el complemento libre se titula. La actividad anticomplementaria expresa un complemento usado respecto al complemento usado de una solución de referencia. La unidad hemolitica de actividad de complemento (CH50) es la cantidad de complemento que lleva a hemolisis de 2.5 x 108 eritrocitos preparados en forma óptima de una cantidad total de 5 x 108 eritrocitos en condiciones de amortiguado óptimo .
Eritrocitos preparados en forma óptima (8 mi de eritrocitos estabilizados de ovejas, lavados tres veces con amortiguador-gelatina-barbital, finalmente 1 mi de sedimento de eritrocitos se suspenden en 24 mi de amortiguador-gelatina-barbital) se preparan al mezclar 20 mi de suspensión de eritrocitos con 20 mi de hemolisina (ajustado a 2 MHE/ml - unidad hemolitica mínima) e incubación por 15 min a 37 °C.
Un equivalente de 10 mg de inmunoglobulina se diluye en un amortiguador de gelatina-barbital (1 g gelatina en 1 L de amortiguador barbital pH 7.3, solución de amortiguador barbital 5-veces: 83 g cloruro de sodio, 10.192 g barbital sodio en 2 litros de agua, pH 7.3). A un volumen final de 1 mi 200 µ? de complemento 100 CH5o / mi se agregan. Los tubos de ensayo se incuban con agitación por 1 h a 37°C. Las muestras se diluyen y titulan contra eritrocitos preparados en forma óptima. Después de una incubación por 1 h a 37 °C, las muestras se centrifuga y la densidad óptica se determina al utilizar un espectrofotómetro a una longitud de onda de 541 nm.
Determinación de actividad proteolitica
La actividad proteolitica puede medirse por métodos de prueba estandarizados conocidos en la técnica, tal como utilizar el substrato cromogénico que se describe a continuación en el ejemplo 6. En estos métodos se estima la actividad proteolitica al mezclar un substrato cromogénico (en particular aquellos sensibles a cuando menos una serina proteasa) y una muestra de la preparación de anticuerpo (usualmente diluida en amortiguador para cumplir o satisfacer el intervalo lineal del ensayo) a 37 grados C y supervisar las cinéticas de absorción utilizando un espectrofotómetro . La actividad proteolitica de la muestra se calcula a partir de la diferencia de absorción inicial (AAbs/min) al utilizar la ecuación C (U/L) = S x AAbs/min x F (C = actividad proteolitica; S = factor de conversión referente al cambio de adsorción especifico del substrato cromogénico; y F = factor de dilución) . El uso del substrato es de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
La actividad proteolitica puede en particular estimarse por las siguientes etapas:
(a) 25 mg del substrato S-2288 (Chromogenix) se disuelven en 7.2 mi de agua-para-inyección;
(b) una muestra de la preparación de anticuerpo se diluye amortiguador (100 mM Tris.HCl pH 8.4, NaCl 106 mM) para cumplir con el intervalo lineal del ensayo y la temperatura se ajusta a 37 grados C;
(c) iguales cantidades (e.g. 200 µ?) de la preparación de anticuerpo diluida y el substrato disuelto se mezclan;
(d) las cinéticas de absorción se miden a 405 nm por 1 a 3 minutos a 37 grados C utilizando un espectrofotómetro;
(e) la actividad proteolitica de la muestra se calcula a partir de la diferencia de absorción inicial (AAbs/min) al utilizar la ecuación C (U/L) = 313 x AAbs/min x F (C = actividad proteolitica, F = factor de dilución) .
El limite de cuantificación de este método es 8
U/1, y utilizando una muestra de la preparación de anticuerpo de la presente invención la actividad proteolitica es indetectable . Como tal, el nivel de actividad proteolitica en el producto final de la presente invención es inferior a 8 U/1.
Como con preparaciones conocidas en la técnica, la preparación de anticuerpo de la presente invención puede almacenarse a 5±3 grados C. Sin embargo, debido a la purificación eficiente con el método de la presente invención, la estabilidad de la preparación de anticuerpo es extremadamente buena. El producto final es estable en forma liquida por al menos 3 meses, de preferencia al menos 6 meses y más preferible al menos dos años de 2 a 8 grados C, lo que significa que no hay fragmentación o polimerización de IgM sobre 5% medido en HPSEC, no hay incremento de actividad proteolitica, no hay disminución de actividad de anticuerpos IgM contra Escherichia coli y actividad de anticuerpos IgM contra Pneumococcus sacárido mayor a 25% y no hay aumento en actividad de anticomplemento mayor a 25%, que permanece inferior a 1 CH50/mg de proteina. Aún más, el producto final producido por el método de la presente invención es estable en forma liquida por al menos 3 meses, de preferencia al menos 6 meses y más preferible al menos un año a temperatura ambiente (entre 23 y 27°C) como se estima por el mismo criterio .
El proceso de la presente invención además proporciona un nivel superior de eliminación de virus que los procesos de la técnica previa resultando en una preparación de anticuerpo que es más segura que las preparaciones de anticuerpo de la técnica previa, particularmente con respecto a virus no envueltos activos como por ejemplo, parvovirus. El método de la presente invención es capaz de retirar/inactivar virus, y en particular virus no envueltos, en más de 3 logio, de preferencia más de 4 logio, y más preferiblemente más de 5 logio. Esto resulta en una preparación de anticuerpo que está substancialmente libre de virus, y en particular substancialmente libre de virus no envueltos (es decir libre de virus) . Aún más, el método de la presente invención es capaz de lograr este nivel de eliminación/inactivación de partículas virales sin un impacto significante en la cantidad de Ig activa o en la actividad anticomplementaria de la preparación de anticuerpo. De acuerdo con esto, se obtienen preparaciones de anticuerpos que son libres de virus respecto a virus envueltos y no envueltos, que contienen al menos 15%, más preferiblemente al menos un nivel de 20% de IgM y que tiene actividad anticomplementaria de =1 CH 50/mg proteina.
La preparación de anticuerpo de la presente invención es adecuada para utilizar en medicina y puede emplearse en el tratamiento de desórdenes inmunológicos e infecciones, particularmente desórdenes de deficiencia de IgM e infecciones bacterianas. Preparación de inmunoglobulina polivalente enriquecida con IgM humano para administración intravenosa, que puede prepararse por el proceso de la presente invención, contiene superiores títulos de anticuerpo contra bacterias Gram-negativas y Gram-positivas clínicamente relevantes así como superiores títulos de anticuerpo contra endotoxinas de bacterias Gram-negativas y exotoxinas de bacterias Gram-negativas y Gram-positivas, en comparación con preparaciones de inmunoglobulina G polivalente.
En particular, las preparaciones de anticuerpo de la presente invención son adecuadas para administración intravenosa a pacientes, y en particular son adecuadas para inyección intravenosa en humanos.
La invención también proporciona un método de tratamiento de un paciente que comprende una etapa de administrar la preparación de anticuerpo de la presente invención al paciente. En particular, el paciente puede sufrir de un desorden inmunológico o una infección bacteriana.
La presente invención ahora se describirá adicionalmente solo a manera de ejemplo.
Descripción del método de prueba para determinación de la actividad anti-complementaria
El ensayo para determinar la actividad anticomplementaria se llevó a cabo de acuerdo con el método descrito en la Farmacopea Europea (European Pharmacopoeia ) (método 2.6.17, Ph. Eur. 6. Edición, 2008).
Eritrocitos de oreja previamente tratados con hemolisina se someten a hemolisis por complemento. Por anticuerpos de enlace de complemento en la muestra se suprime la hemolisis. La cantidad de complemento se determina, que se liga (inactiva) por 1 mg de inmunoglobulina .
Una cierta cantidad de inmunoglobulina (10 mg) se mezcla con complemento de conejillo de Indias y el complemento libre se titula. La actividad anticomplementaria se expresa un complemento usado respecto al complemento usado de una solución de referencia. La unidad hemolitica de la actividad de complemento (CH50) es la cantidad de complemento que lleva a hemolisis de 2.5 x 108 eritrocitos preparados en forma óptima de una cantidad total de 5 x 108 eritrocitos en condiciones de amortiguador óptimas .
Eritrocitos preparados en forma óptima (8 mi de eritrocitos estabilizados de ovejas, lavados tres veces con amortiguador barbital-gelatina, finalmente 1 mi de sedimento eritrocito se suspenden en 24 mi de amortiguador-barbital-gelatina) se preparan al mezclar 20 mi de suspensión de eritrocitos con 20 mi de hemolisina (ajustada a 2 MHE/ml - unidad hemolitica mínima) e incubación por 15 minutos a 37 grados C.
Un equivalente de 10 mg de inmunoglobulina se diluye en amortiguador-barbital-gelatina (1 g de gelatina en 1 L de amortiguador barbital de pH 7.3, solución de amortiguador-barbital 5-veces: 83 g de cloruro de sodio, 10.192 g de barbital sodio en 2 litros de agua, pH 7.3) . A un volumen final de 1 mi se agregan 200 µ? de complemento 100 CH50 / mi. Los tubos de ensayo se incuban bajo agitación por 1 h a 37 grados C. Las muestras se diluyen y titulan contra eritrocitos preparados en forma óptima. Después de una incubación por 1 h a 37 grados C las muestras se centrifugan y la densidad óptica se determina utilizando un espectrofotómetro a una longitud de onda de 541 nm.
Ejemplo 1 - Elaboración de una preparación enriquecida IgM a partir de la fracción I/III
180 kg de Fracción Cohn I/III, que se origina de f accionación con etanol frío de plasma humano, se suspenden en 720 L de amortiguador de acetato de sodio 0.1 M pH 5.05 y mezclan por 15 - 30 minutos después de que la temperatura de la suspensión se alcanza (22 + 4 grados C) .
La solución se trata al agregar 19.8 kg de ácido octanóico (0.110 kg por kg de pasta I/III empleada) a temperatura ambiente y la solución de proteína se mezcla adicionalmente por 80 minutos, utilizando un mezclador vibratorio (Vibromixer®, tamaño 4, Graber+Pfenniger GmbH, Vibromezclador ajustado a un nivel 2 - 3) . El ácido octanóico se agrega lentamente durante 30 min.
Aproximadamente 3 kg de fosfato tri-calcio (Ca3P04) 2 ) se agregan y la solución de proteina se mezcla adicionalmente por al menos 15 min. El precipitado se retira por filtración clarificante utilizando un filtro prensa. Una filtración de 0.2 µp? adicional se lleva a cabo y la solución de proteina se somete a ultrafiltración con membranas 10 kD. La solución de proteina se diafiltra contra solución de NaCl 0.04 M y posteriormente se ajusta a una concentración de proteina de 40 g/L.
La solución de proteina se trata a pH 4.0 + 0.1 después de dilución 1+1 con agua para inyección. Ajuste de pH se lleva a cabo al utilizar HC1 1 M y la solución de proteina se incuba por 9 h a 37 grados C ± 2 grados C. Después de la incubación a pH 4 , la solución de proteina se ajusta a pH 5.8, utilizando NaOH 1M. La solución de proteina resultante se purifica adicionalmente al agregar DEAE Sephadex en un modo por lotes (75 g de DEAE Sephadex por kg de proteina) . La solución de proteina se incuba bajo agitación por > 60 min a temperatura ambiente. DEAE Sephadex se retira por filtración clarificante. La solución de proteina se somete a una filtración de 0.2 µ?t?.
La solución de proteina se filtra a través de un filtro de 0.1 m y un filtro Pall, Ultipor VF DV50, de 50.8 cm (20"). El filtrado se procesa adicionalmente por tratamiento con luz UVC a 254 nm, utilizando un dispositivo de proceso UVivatec® de flujo pasante (Bayer Technology Services / Sartorius Stedim) a una dosis de UVC de 240 J/m2. La velocidad de flujo a través del reactor UVC se calcula utilizando las instrucciones del fabricante. La solución de proteina irradiada se concentra a una concentración de proteina de 50 - 70 g/1 por ultrafiltración y se somete a diafiltración (membrana de 10 kD, utilizando amortiguador glicina 0.32 M pH 4.3). El producto final se pasa a través de un filtro de 0.2 pía y se almacena de 2 a 8 grados C.
Ejemplo 2 - Investigación de Condiciones en Etapa de Tratamiento de Ácido Octanóico
Para el tratamiento de ácido octanóico, se probaron los siguientes intervalos experimentales, también en combinación entre si utilizando el método descrito en el Ejemplo 1 (no se muestran resultados) .
- Cantidad de ácido octanóico: 0.09 kg/kg a 0.13 kg/kg (Cantidad de ácido octanóico por kg de fracción usada I/III) (ácido octanóico 120 a 180 mM)
- pH de tratamiento de ácido octanóico entre pH 4.8 y 5.3
Intervalo de temperatura de la reacción: 14 grados C a 30 grados C
- Tiempo de incubación: 40 a 110 min
Todas las condiciones probadas llevan a intermediarios que son fáciles de clarificar para mayor procesamiento y con una reducción extensa en actividad proteolítica de varios miles de U/L en fracción de Cohn I/III) . Estos intermediarios resultan en un producto final con una actividad proteolítica inferior a 8 U/1 (calculado como se describe a continuación en el Ejemplo 6) que es el límite de cuantificación .
Ejemplo 3 - Reducción de Virus a Través del Uso de Vibromezclador - Determinación de factores de eliminación de virus para el tratamiento de ácido octanóico con y sin uso de un vibromezclador.
250 mi de facción suspendida I/III se homogeneizaron por 30 min a pH 5.05 y 22°C. A la suspensión se le agregaron 2.6 mi de la solución de material de virus. Se agregó ácido octanóico (110 g/kg) y homogeneizo por 60 min utilizando un vibromezclador. En un experimento paralelo, la misma mezcla se homogeneizo con agitación estándar. Después de 60 min, se agregó fosfato tri-calcio (0.15 g/kg ácido octanóico) y la suspensión se agitó por 15 min. La suspensión se liberó por filtración profunda utilizando un disco de filtro. El disco de filtro se enjuagó previamente con 70 - 80 mi de amortiguador. Después de filtración, el filtro se enjuagó con 80 mi de amortiguador. Filtrado y lavado se recolectaron y una muestra se tomó para titulación de virus.
Títulos de virus de las muestras tomadas antes de adición de ácido octanóico y después de filtración se determinan en celdas indicadoras apropiadas para SV40, Reo y PPV (CV-1, CCL.7.1 y PK13) . Finalmente, el factor de eliminación se calculó cumpliendo las guias actuales para estudios de validación de virus.
En estudios de validación de virus, virus no envueltos tales como SV40 y Reo se retiraron efectivamente en el orden de más de 4 logio y más de 5 logio, respectivamente. Aún más, PPV se retiró por más de 3 logio. Estos valores son más de 10 veces y hasta 1000 veces superiores que con el mismo tratamiento de ácido octanóico bajo condiciones de agitación estándar sin vibromezclado . Tabla 1 : Comparación de factores de reducción de virus (logio) para el tratamiento con ácido octanóico con y sin el uso de un vibrómezclador .
Ejemplo 4 - Evaluación de tratamiento UVC
El intervalo óptimo para dosis de radiación UVC se ha evaluado. Hay un balance entre la dosis necesaria mínima para lograr al menos 4 logio de inactivación para virus no envueltos y la dosis máxima tolerable para evitar desnaturalización de las moléculas IgM, lo que lleva a una función Fab alterada para ligar antígenos y función Fe alterada que influencia activación de complemento. En el intervalo de 200 a 400 J/m2 se puede observar solo un ligero incremento de agregados de inmunoglobulina y sin impactos significante en contenido de fragmento.
Para los experimentos, la densidad óptica (OD = Optical Density) de la solución de proteína original, se utiliza para calcular el gasto de flujo en el sistema UVivatec lab con la hoja de Excel suministrada por el vendedor de BTS (cliente Master Calculation Sheet UVivatec Lab II Versión 3.0). El gasto de flujo se calcula al tomar en cuenta el desempeño de la lámpara, el punto de ajuste del sensor de lámpara de señal UV y la dosis de irradiación UVC deseada.
Solución que contiene IgM con un contenido de proteína de aproximadamente 55 g/l (Lote 86GB005BE07) se bombea a un gasto de flujo de 5.8 1/h a través del sistema UVivatec a fin de lograr una dosis de 200 J/m2 para un solo flujo pasante. Una dosis de 300 J/m2 se logra al bombear la solución de proteína a un gasto de flujo de 3.9 L/m2 a través del sistema. 400 J/m2 se logró al bombear la solución de proteína a un gasto de flujo de 2.9 L/m2 través del sistema.
Tabla 2 : Resultados analíticos para las determinaciones actividad y titulo antes y después de tratamiento con en el producto final concentrado
Continúa
No pudo observarse diferencia significante para contenido de inmunoglobulina, actividad proteolítica o ACA en el intervalo de 200 a 400 J/m2. El intervalo preferido para la dosis se ajustó entre 200 y 300 J/m2 debido a que 200 J/m2 es bien conocido que inactiva virus no envueltos y a 300 J/m2 no pudo verse impacto significante en formación de agregados y títulos de anticuerpos. La dosis preferida es 225 J/m2.
Solución que contiene IgM diluida con un contenido de proteína de 8 a 12 g/1 (Lote 86BB059BE07) se bombeó a un gasto de flujo de 5.8 1/h a través del sistema UVivatech a fin de lograr una dosis entre 200 y 300 J/m2 para un solo flujo pasante.
Tabla 3 : Resultados analíticos para soluciones
IgM antes y después de irradiación UVC a diferentes dosis de UVC
Continúa
distribución entre las clases de inmunoglobulina permanece sin afectar por la radiación UV dentro de este procedimiento de intervalo de dosis. El patrón de distribución de peso molecular analizado por HPSEC tampoco se cambia. El nivel de pureza analizado por CZE permanece sin cambio. Actividad proteolitica (PA = Proteolytic Activity) , activación de precalicreina (PKA = Prekallikrein Activator) y actividad anticomplementaria (ACA = Anti-Complementary Activity) están sin cambio. También, la actividad antibacteriana medida por método Elisa no se altera significativamente para todas las clases de inmunoglobulina .
Las alícuotas - irradiadas con crecientes intensidades de UV - se procesaron adicionalmente hasta producto final y sometido el mismo panel de pruebas analíticas. No hubo diferencia significante observable en los productos finales. Todos los títulos de anticuerpos probados siempre están en el intervalo de 100 + 10% de la preparación de control sin tratamiento UVC.
Ejemplo 5 - Reducción de Virus Total a Través del Uso de Tratamiento de Vibromezclador/pH4 y Tratamiento UVC Determinación de Factores de Eliminación de Virus
La validación de inactivación/eliminación de virus de las tres etapas de tratamiento de ácido octanóico con vibromezclado, tratamiento con pH4 y tratamiento UVC (215 J/m2 ) se realizó utilizando los siguientes virus modelo: Virus de Diarrea Viral Bovina (BVDV = Bovine Viral Diarrhea Virus) como virus modelo para Virus de Hepatitis C, Virus de Pseudorabia (PRV = Pseudorabies Virus) y virus modelo para Virus de Herpes Humano, virus de Inmunodeficiencia Humana (HIV-1), Virus de Arteritis Equina (EAV = Equine Arteritis Virus) como virus modelo para corona virus, Virus Sindbis (SinV) como virus modelo para virus Flavi, Virus de Encefalomielitis urina (MEV = Murine Encephalomyelitis Virus) como virus modelo para Virus de Hepatitis A, Reovirus (Reo) como virus modelo para otros virus no envueltos, Parvovirus Porcino (PPV = Porcine Parvovirus) como virus modelo para Parvovirus humano B19.
Los resultados de estos estudios con las tres etapas de tratamiento de ácido octanóico, tratamiento pH y tratamiento UVC se citan en la siguiente Tabla 2.
Tabla : Reducción de virus total por el proceso producción IgM
Continúa
a Factor de reducción sin datos para validación de la etapa de irradiación UVC
La nanofiltración opcional con filtros con un tamaño de poros nominal de aproximadamente 50 nm, agrega seguridad adicional al incrementar la reducción total hasta más de 17 logio dependiendo del tamaño del virus. Por ejemplo, >17.5 logio después se alcanza para HIV-1 mientras que PPV no se retira más por nanofiltración .
Por lo tanto, el procedimiento de purificación de acuerdo con la invención lleva a una preparación IgM segura de virus sobresaliente hasta ahora con esta preparación que contiene IgM de velocidades de reducción/inactivación de virus no alcanzada, mayores a 8 logio. Esto es especialmente importante para los virus no envueltos como MEV, Reo y PPV que en general son más resistentes contra procedimientos de eliminación e inactivación de virus debido a su tamaño pequeño y la falta de un envolvente de lipidos.
Ejemplo 6: De-terminación de actividad proteolitica residual para el tratamiento con ácido octanóico con y sin el uso de un vibromezclador .
El tratamiento con ácido octanóico se realizó como en el ejemplo 1 y en un experimento paralelo sin un vibromezclador pero con agitación estándar vigorosa con un agitador de aspas. La actividad proteolitica en muestras después de tratamiento con ácido octanóico/fosfato tricálcico y ultra/filtración se determinó utilizando el sustrato cromogénico S-2288 ( Chromogenix ) , siguiendo las instrucciones de los fabricantes.
25 mg del sustrato S-2288 (Chromogenix) se disuelven en 7.2 mi de agua-para-inyección. Muestra se diluyen en un amortiguador (Tris 100 mM /HCl pH 8.4, NaCl 106 mM) para cumplir con el intervalo de ensayo lineal, por ejemplo 200 µ? de amortiguador se mezclan con 200 µ? de muestra (mezclado y ajuste de temperatura a 37°C) y 200 µ? de solución de sustrato cromogénico. Las cinéticas de absorción se miden a 405 nm (1-3 min) a 37°C, utilizando un espectrofotómetro . La actividad proteolitica de la muestra se calcula a partir de la diferencia de absorción inicial (AAbs/min) al utilizar la ecuación C (U/L) = 313 * AAbs/min * F (C = actividad proteolitica, F = factor de dilución)
Tabla 5 : Reducción de actividad proteolitica por tratamiento con ácido octanóico
Tratamiento con Tratamiento con ácido octanóico ácido octanóico sin con un vibromezclado vibromezclado
Material de 5630 5630
partida (U/1)
Actividad
proteolitica
residual promedio 42 < 8 (LOD)
después de
tratamiento con
ácido octanóico
(U/L)
El filtrado después de tratamiento con ácido octanóico fue limpio cuando se empleó vibromezclado. En el experimento de comparación, el filtrado después de tratamiento con ácido octanóico con agitador de aspas fue muy opaco y difícil de filtrar.
Ejemplo 7 : Títulos antibacterianos en una preparación IgM de acuerdo con la invención
Para comparación con la única preparación que contiene IgM tolerable intravenosa comercialmente disponible, Pentaglobina, las actividades antibacterianas se analizaron en tres lotes de este fármaco bien establecido y comparan con una preparación de acuerdo con la invención. La determinación de anticuerpos de la clase IgA o IgM en la preparación de IgM contra antígenos antibacterianos o antifungales se llevó a cabo por ELISA. Placas de microtitulación se revistieron con un antígeno correspondiente e incubaron con un estándar o la preparación IgM. Anticuerpos ligados al antigeno se detectaron con un conjugado IgA antihumano o IgM antihumano. La detección se llevó a cabo al utilizar un sustrato de enzima. El cambio de color resultante corresponde a la cantidad de anticuerpos presentes en la preparación IgM.
Tabla 6 Comparación de actividad de enlace antibacteriano de IgM en una preparación de acuerdo con la invención y Pentaglobina comercialmente disponible
Tabla 7 Comparación de actividad de enlace antibacteriano de IgA en una preparación de acuerdo con la invención y Pentaglobina comercialmente disponible
Las actividades mediadas por IgM y IgA en la nueva preparación típicamente fueron al menos 1.5 veces tan altas como en Pentaglobina, que puede explicarse por el hecho de IgM y IgA en Pentaglobina se modifica químicamente con ß-Propiolactona . Esta etapa se reemplaza por los procedimientos más suaves de acuerdo con esta invención.
En total, estos datos demuestran que la región de enlace de la molécula IgM en la preparación final es activa en forma funcionalmente completa.
Ejemplo 8 Estudios de estabilidad en almacenamiento con producto IgM liquido
Producto de acuerdo con el ejemplo 1 sin tratamiento UVC se almacenó en ampolletas de vidrio de 10 o 100 mi (volumen de relleno 5 mi o 50 mi) a 2 - 8°C y analizan para todos los parámetros de acuerdo con la especificación. Los resultados se muestran en la Tabla 8. Parámetros que son relevantes para mostrar estabilidad son el agregado y contenido de fragmento medido con cromatografía de exclusión de tamaño de alto desempeño (HPSEC = High Performance Size Exclusión Chromatography) , actividad proteolítica (??) y actividad anticomplementaria (ACA). Estos parámetros son. críticos para tolerabilidad intravenosa y probablemente cambien durante almacenamiento a largo plazo. A 2 - 8°C no hubo cambio significante de estos parámetros. Incluso en almacenamiento a temperatura ambiente (23 - 27°C) estos valores permanecieron dentro de especificación, aunque hay un ligero incremento de fragmentos después de 24 meses a temperatura ambiente. Otros parámetros como coloración, opalescencia, valor de pH también se determinaron y permanecieron sin cambios sobre todo el periodo de estudio. Títulos de IgM y IgA contra diversas bacterias permanecen estables durante 2 años a 2 -8°C.
Producto de acuerdo con el ejemplo 1 con tratamiento UVC también se almacenó en ampolletas de vidrio de 10 o 100 mi (volumen de relleno 5 mi o 50 mi) a 2 - 8°C y temperatura ambiente y analizaron para todos los parámetros de acuerdo con la especificación. Los resultados se muestran en la Tabla 9. En este estudio de estabilidad continuo, la fecha de 12 meses actualmente disponible muestra el mismo perfil de estabilidad del producto sin tratamiento de UVC que permite extrapolación a una estabilidad a 24 meses.
Tabla 8 Estabilidad del lote ?586067 probado a 2-8°C posición acostado. Tamaño de relleno: 5 mi
Continúa
n.t. = no probado
Tabla 9 Estabilidad de lote A586057 probado a 2 - 8o C posición acostada. Tamaño de relleno: 50 mi
Continúa
Ejemplo 9 Activación de complemento no específico in vitro con el producto IgM
Ejemplo 9A - Determinación de C5a niveles
Análisis del potencial de la preparación IgM para activar complemento in vitro en forma no específica se realiza utilizando factor C5a como un marcador para activación de la ruta de complemento terminal. Para este propósito se incuba suero humano con los productos de inmunoglobulina o amortiguador por 120 min. Se tomaron muestras después de 0, 5, 15, 60 y 120 minutos de incubación. Para demostrar función apropiada del sistema in vitro se mostró inhibición completa así como completa activación del sistema de complemento. La concentración de factor de complemento se mide por determinaciones de densidad óptica con un fotómetro que utiliza un equipo de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA = Enzyme Linked Immunosorbent Assay) comercialmente disponible (Quidel MicroVue C5a Plus EIA Kit; A025) .
Se descongeló rápidamente a 37 °C suero humano (Quidel NHS; A113) e inmediatamente se puso en hielo. Cada muestra sencilla consistió de un lote de reacción que contiene suero (100 µ?) . Primero se transfirieron con pipeta aditivos seguido por la adición de suero humano para empezar la reacción en todo lote de reacción.
Suero humano sin aditivos sirvió como un blanco y mostró activación de complemento de linea base debido a la configuración experimental. La adición de IgG agregado con calor (HAAG Quidel; Al 14; 1.3 µ?) sirvió como un fuerte activador de complemento de suero humano para demostrar la respuesta del sistema in vitro. EDTA (concentración final 10 mM) se agrega a suero humano para inhibir completamente activación de complemento sobre todo el tiempo de reacción y tratamiento experimental. Preparación de IgM. Pentaglobina (de acuerdo con EP0013901) y una preparación IgM de acuerdo con EP0413187 se ajustan a una concentración de IgM de 1.72 mg/ml en cada reacción. Se emplearon como controles negativos el volumen respectivo de amortiguador de formulación.
Todas las reacciones de detuvieron después de incubación por 0, 5, 15, 60 y 120 minutos a 37°C bajo agitación constante por adición de solución estabilizante (analizador de muestra Quidel A9576; 140 µ?) . Subsecuente dilución de muestra y análisis ELISA se realizan siguiendo el protocolo del fabricante. El experimento se realizó en dos replicar independientes y se calcularon los valores promedio. Los resultados se muestran en la Tabla 10 y la Figura 2.
La adición de activador (IgG agregado con calor) llevo a un fuerte incremento de C5a dentro de 15 minutos, indicando una respuesta sensible del sistema in vitro para detectar activación de complemento. La adición de EDTA como inhibidor resulto en valores sin cambio sobre todo el tiempo de incubación que muestra que la activación de complemento es especifica y no un artefacto debido a manejo o preparación de muestra. La incubación de suero humano a 37°C y exposición a superficies artificiales induce una ligera activación de complemento documentada como valor blanco .
La preparación de referencia IgM de acuerdo con EP0413187 resultó en activación de complemento hasta más de 1000 ng/ml después de 60 Minutos (tabla 10). La preparación de referencia modificada químicamente, disponible en el comercio, pentaglobina (EPOO 13901) todavía mostró la mitad del potencial de activación de complemento al producto EP0413187.
La concentración de C5a en suero tratado con la preparación IgM de acuerdo con esta invención es comparable con la concentración de C5a medida en suero sin aditivos (blanco) o en suero tratado con los amortiguadores de formulación (Glicina 300 mM, pH 4.3 o NaCl 0.45% /Glucosa 2.5%, pH 6.8). De esta manera las inmunoglobulinas en la preparación IgM de acuerdo con esta invención substancialmente no activan en forma no específica complemento en suero humano en el sistema de prueba in vi tro.
Tabla 10 Concentración promedio de C5a detectada en suero humano tratado con inmunoglobulinas que contienen IgM
Continúa
Ejemplo 9B Determinación de niveles C3a Análisis del potencial de la preparación IgM para activar complemento in vi tro en forma no específica se realiza utilizando el factor C3a como un marcador para activación de la ruta de complemento. Para este propósito se incuba suero humano con los productos de inmunoglobulina o amortiguador por 120 minutos. Muestras se toman después de 0, 5, 15, 60 y 120 minutos de incubación. A fin de demostrar función apropiada del sistema in vitro, se mostró inhibición completa al igual que activación completa del sistema de complemento. La concentración de factor de complemento se midió mediante determinaciones de densidad óptica con un fotómetro utilizando un equipo de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA) comercialmente disponible (Quidel Micro Vue C3a Plus EIA Kit; A032) .
Suero humano (Quidel NHS; A113) se descongeló rápidamente a 37 °C e inmediatamente se puso en hielo. Cada muestra sencilla consistió de un lote de reacción que contiene suero (100 µ?) . Aditivos primero fueron transferidos con pipeta, seguido por la adición de suero humano para iniciar la reacción en todo lote de reacción.
Suero humano sin los aditivos sirvió como un blanco y mostró activación de complemento de línea base debido a la configuración experimental. Adición del factor de veneno de cobra VF Quidel; A600; 20 U/ml) sirvió como un fuerte activador de complemento de suero humano para demostrar la respuesta del sistema ín vitro. EDTA (concentración final 10 mM) se agrega a suero humano a fin de inhibir completamente la activación de complemento sobre todo el tiempo de reacción y tratamiento experimental. Preparación IgM y Pentaglobina (de acuerdo con EP0013901) se ajustaron a una concentración de IgM de 1.72 mg/ml en cada reacción. Como controles negativos, se empleó el volumen respectivo del amortiguador de formulación.
Todas las reacciones se detuvieron después de incubación por 0, 5, 15, 60 y 120 minutos a 37°C bajo agitación constante al agregar solución estabilizante (estabilizador de muestra Quidel A9576; 140 µ?) . Subsecuente dilución de muestra análisis y ELISA se realizan siguiendo el protocolo de los fabricantes. El experimento se realizo en dos réplicas independientes y se calcularon valores promedio. Los resultados se muestran en la Tabla 11 y Figura 3.
** La adición de activador (CVF) lleva a un fuerte incremento de C3a dentro de 15 minutos indicando una respuesta sensible de el sistema in vitro para detectar activación de complemento. La adición de EDTA como inhibidor resultó en valores sin cambios sobre todo el tiempo de incubación que muestra que la activación de complemento no es un artefacto debido al manejo o preparación de la muestra. Incubación de suero humano a 37°C y exposición a superficies artificiales induce una activación de complemento ligera documentada con valores blanco .
La preparación de referencia químicamente modificada y comercialmente disponible Pentaglobina (EP0013901) mostró un potencial de activación C3 tres veces en superior en comparación con blanco.
La concentración de C3a en suero tratado con la preparación IgM de acuerdo con esta invención es comparable a la concentración C3a medida en suero sin aditivos (blanco) o en suero tratado con los amortiguadores de formulación (Glicina 300 mM, pH 4.3 o NaCl 0.45%/Glucosa 2.5%, pH 6.8). De esta manera las inmunoglobulinas en la preparación IgM de acuerdo con esta invención substancialmente no activan en forma no específica complemento en cantidades notables en suero humano en el sistema de prueba in vitro.
Tabla 11 Concentración promedio de C3a detectado en suero humano tratado con inmunoglobulinas que contienen IgM
Con inúa
Ejemplo 10 Experimentos in vivo con producto IgM
Para confirmar seguridad y tolerabilidad en los efectos de la preparación IgM en presión sanguínea arterial después de repetidas infusiones intravenosas sobre 5 días, se obtuvieron en 8 monos macacos cangrejeros consientes.
Una dosis de 190 mg/IgM/kg/día de la preparación IgM preparada de acuerdo con los métodos aquí descritos, se administró. Pentaglobina, la preparación que contiene IgM tolerable intravenosa comercialmente disponible se administró a ciertos monos como una sustancia de comparación .
Se administró Pentaglobina de manera tal que se suministra la misma dosis de IgM. La presión sanguínea se determinó siguiendo inyección para determinar si la administración se asoció con un nivel intolerable de activación de complemento no específico. Una dosis de control de NaCl 0.9% se administra a los animales varias horas antes de la administración de las preparaciones de inmunoglobulina . La presión sanguínea se determinó al insertar un catéter de presión en la aorta abdominal inferior mediante la arteria femoral derecha. Se transmiten resultados por telemetría.
La administración de la preparación Ig (15 ml/kg/dia) tuvo sólo menores efectos en presión sanguínea arterial (promedio, sistólica y diastólica) . Las diferencias hasta 4 horas después de cada infusión en comparación con valores previos a prueba no excede 4 mm de Hg. Estas diferencias pueden considerarse que no son biológicamente relevantes.
Tabla 12a Niveles de C3a [ng/ml] después de administración de la preparación IgM
Tabla 12a Niveles de C3a [ng/ml] después de la administración de la preparación de referencia Pentaglobina
Niveles de C3a se determinaron en muestras de plasma que se toman después de inyección como un marcador para activación no especifica de la ruta de complemento. Niveles C3a [ng/ml] se incrementaron sólo ligeramente por la administración de la preparación IgM (15 mL/kg de BW) y fueron incluso menores que con la preparación de referencia comercialmente - disponible Pentagl bina en cantidades iguales de IgM. Muestras de sangre se realizaron aproximadamente 6 horas después de tratamiento.
No se pudieron adjudicar hallazgos toxicológicos sustanciales atribuidos a la preparación de IgM, y no hubo alteraciones relevantes que no se observarán con Pentaglobina . Ya que la seguridad de Pentaglobina está bien establecida en la práctica clínica de muchos años, es razonable concluir que estas alteraciones no tienen ninguna relevancia clínica.
La buena tolerabilidad y seguridad de la preparación IgM también se verificó en un estudio Fase I en humanos, en 24 voluntarios sanos masculinos y femeninos. La presión sanguínea sistólica en las primeras 4 horas después de administración en promedio disminuyó sólo aproximadamente 9% (11.9 mm de Hg) después de infusión de 91 a 274 mg de la preparación IgM por kg de BW/d a 0.5 ml/min .
Este estuvo en el mismo intervalo como el placebo de solución de NaCl 0.9% (9.4%, 11.7 mm de Hg) .
No se registraron eventos adversos serios y todos los eventos adversos no serios fueron autolimitantes . Además, no hubo evidencia de la transformación de un agente infeccioso como se muestra por determinaciones del PCT .
Se nota que la utilidad de estudios de eficacia en modelos de animales- de enfermedades relevantes está limitada debido a la inmunogenicidad y anticuerpos Gal preformados en preparaciones IgM que se obtienen de plasma humano. Sin embargo, dado el conocimiento en la técnica previa respecto al uso de Pentaglobina en el tratamiento de enfermedad y los títulos de anticuerpos antibacterianos de la preparación IgM preparada por el método de la presente invención (como se demuestra en el Ejemplo 7) puede concluirse que la preparación de IgM tiene eficacia clínica .
Ejemplo 11 Integridad funcional de la parte Fe de la preparación de anticuerpo
Integridad funcional de la parte Fe de los anticuerpos en la preparación de anticuerpo preparada de acuerdo con el método aquí descrito, se analizó utilizando el método de la Farmacopea Europea (Ph. Eur.) actual (2.7.9 Prueba para función Fe de Inmunoglobulinas Edición de Farmacopea Europea actual abril 2011) de acuerdo con las Guias Europeas ICH S6 (CPMP/IC1 1/302/95) (Nota para Guía en evaluación de seguridad preclínica de productos farmacéuticos derivados de biotecnología) para preparaciones de IgG. La monografía de la Farmacopea Europea para inmunoglobulinas (01/2005:20709) propone una prueba basada en antígeno de rubéola para función Fe de inmunoglobulinas .
En particular, glóbulos rojos humanos del grupo O teñidos se cargaron con antígeno de virus de rubéola. Volúmenes específicos de las preparaciones de anticuerpo se incubaron con células de sangre revestidas con antígeno. La lisis iniciada por complemento de las células de sangre se inicia al agregar complemento de conejillo de Indias. Las cinéticas de hemolisis subsecuentes se miden mediante cambios dependientes del tiempo de absorbancia a 541 nm. La evaluación se llevó a cabo utilizando el cambio máximo de absorbancia por tiempo. Preparación de Referencia Biológica de Inmunoglobulina Humana; Lote BRP Número 3 se empleó como la comparación.
La actividad de la parte Fe de la molécula de anticuerpo se determina en 7 lotes de la preparación de anticuerpo que contiene IgM y en todos los lotes estuvo entre 96.5 y 103.3% en comparación con la preparación de referencia biológica (BRP = Biological Reference Preparation) , proporcionando de esta manera la funcionalidad de la preparación de anticuerpo que contiene IgM.
Claims (31)
1. Una preparación de anticuerpos adecuada para administración intravenosa en humanos que comprende IgG, IgA y al menos anticuerpos IgM al 5% en peso de la cantidad total de los anticuerpos, en donde la preparación se elabora a partir de plasma humano, en donde la preparación de anticuerpos tiene actividad de activación de complemento especifica y donde en un ensayo in vitro con suero humano adecuado para determinar la capacidad de la preparación de anticuerpos para activar complemento en forma no especifica, la preparación de anticuerpos genera sustancialmente nada de C5a y/o sustancialmente nada de C3a.
2. Una preparación de anticuerpos de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque además comprende más de IgA al 5% y más de IgG al 40% en peso de la cantidad total de anticuerpos.
3. Una preparación de anticuerpos de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque comprende al menos IgM al 10% en peso de la cantidad total de anticuerpos .
4. Una preparación de anticuerpos de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque comprende al menos IgM al 15% en peso de la cantidad total de anticuerpos.
5. Una preparación de anticuerpos de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque la preparación de anticuerpos ajustada a una concentración IgM de 1.72 mg/ml genera menos de 200 ng/ml de C5a después de 60 minutos del ensayo.
6. Una preparación de anticuerpos de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque la preparación de anticuerpos ajustada a una concentración IgM de 1.72 mg/ml, genera menos de 6000 ng/ml de C3a después de 60 minutos del ensayo.
7. Una preparación de anticuerpos de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque el ensayo en suero in vi tro de la preparación de anticuerpos con suero humano, genera la misma cantidad de C5a y/o C3a que suero humano sólo ± 70%.
8. Una preparación de anticuerpos de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque el ensayo de suero in vitro para determinar que la preparación de anticuerpos sustancialmente no genera C5a, comprende las etapas de: (a) agregar una cantidad de la preparación de anticuerpos a 100 µ? de suero humano para crear una mezcla de reacción que contiene 1.72 mg/ml de IgM e incubar la mezcla de reacción por 60 minutos a 37 °C con agitación constante; (b) preparar un conjunto de diluciones de mezcla de reacción adecuadas para ELISA; (c) realizar un ELISA emparedado en el conjunto de diluciones de la mezcla de reacción utilizando un anticuerpo primario y uno secundario a C5a y una sustancia cromogénica, en donde el anticuerpo secundario se conjuga a una enzima y la sustancia cromogénica es el sustrato de la enzima; y (d) determinar la cantidad de C5a en la mezcla de reacción con base en un cambio de color que se obtiene como resultado de poner en contacto la sustancia cromogénica con la enzima ligada a C5a mediante el anticuerpo secundario.
9. Una preparación de anticuerpos de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque el ensayo de suero in vitro para determinar que la preparación de anticuerpos sustancialmente no genera C3a, comprende las etapas de: (a) agregar una cantidad de la preparación de anticuerpos a 100 µ? de suero humano para crear una mezcla de reacción que contiene 1.72 mg/ml de IgM e incubar la mezcla de reacción por 60 minutos a 37 °C con agitación constante; (b) preparar un conjunto de diluciones de la mezcla de reacción adecuados para ELISA; (c) realizar un ELISA emparedado en el conjunto de diluciones de la mezcla de reacción utilizando un anticuerpo primario y uno secundario a C3a y una sustancia cromogénica, en donde el anticuerpo secundario se conjuga a una enzima y la sustancia cromogénica es el sustrato del enzima; y (d) determinar la cantidad de C3a en la mezcla de reacción con base en un cambio de color que se obtiene como resultado de poner en contacto la sustancia cromogénica con la enzima ligada a C3a mediante el anticuerpo secundario.
10. Una preparación de anticuerpos de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque comprende menos de 2% de agregados de 1200 kDa o superior .
11. Una preparación de anticuerpos de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque comprende menos de 1.5% de agregados de 1200 kDa o superior.
12. Una preparación de anticuerpos de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque la actividad anticomplementaria de la preparación es menor a 1.0 CH50/mg de proteína.
13. Una preparación de anticuerpos de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la actividad anticomplementaria es menor que 0.75 CH50/mg de proteína.
14. Una preparación de anticuerpos de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque comprende un contenido de inmunoglobulina mayor a 95% del contenido total de proteína.
15. Una preparación de anticuerpos de conformidad con cualquier reivindicación precedente, preparada a partir de suero humano en la ausencia de una etapa de tratamiento térmico a una temperatura de 40°C o superior por más de 10 minutos .
16. Una preparación de anticuerpos de conformidad con cualquier reivindicación precedente preparada de suero humano en la ausencia de una etapa que involucra modificación química o enzimática de los anticuerpos.
17. Una preparación de anticuerpos de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque la etapa de modificación química es una etapa de poner en contacto los anticuerpos con ß-propiolactona .
18. Una preparación de anticuerpos de conformidad con cualquier reivindicación precedente, preparada por un proceso que es capaz de más de eliminación 3 logio de virus no envueltos.
19. Una preparación de anticuerpos de conformidad con cualquier reivindicación precedente, preparada a partir de plasma humano por un proceso que comprende las etapas de: (a) preparar a partir del plasma humano, una fracción de plasma como una solución que contiene inmunoglobulinas ; (b) mezclar un ácido carboxílico C5 a C7 con la solución y tratar la solución mixta con un agitador de vibración para precipitar proteínas contaminantes; (c) separar las proteínas precipitadas de la solución para dar por resultado la composición de inmunoglobulina que contiene IgM; (d) incubar la composición de inmunoglobulina que contiene IgM entre pH 3.5 y pH 4.5, para formar una solución incubada; (e) irradiar la solución incubada con UVC para formar una solución irradiada con UVC; y (f) filtrar la solución irradiada con UVC bajo condiciones estériles para formar la preparación de anticuerpos adecuada para administración intravenosa en humanos.
20. Una preparación de anticuerpos de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque el proceso de más comprende someter la solución incubada que se obtiene de la etapa (d) a nanofiltración antes de irradiación en la etapa (e) .
21. Una preparación de anticuerpos de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque la preparación de anticuerpos es capaz de administración a monos macacos cangrejeros a 115 mg de IgM/kgBW/hr en la ausencia de más de 10% de reducción en presión arterial del nivel de tratamiento previo.
22. Una preparación de anticuerpos de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque al menos 90% de los anticuerpos en la preparación son biológicamente activos.
23. Una preparación de anticuerpos de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque en un ensayo basado en antigeno de rubéola in vitro adecuado para determinar la función Fe, la actividad de la parte Fe de los anticuerpos de la preparación de anticuerpos es la misma que la de la preparación de referencia biológica ±10%.
24. Un método para producir una preparación de anticuerpos de conformidad con cualquier reivindicación precedente, a partir de plasma humano, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) preparar a partir de plasma humano una fracción de plasma como una solución que contiene inmunoglobulinas; (b) mezclar un ácido carboxilico C7 a C9 con la solución y tratar la solución mixta con un agitador de vibración para precipitar proteínas contaminantes; (c) separar las proteínas precipitadas de la solución para dar por resultado la composición de inmunoglobulina que contiene IgM; (d) incubar la composición de inmunoglobulina que contiene IgM entre pH 3.5 y pH 4.5, para formar una solución incubada ; (e) irradiar la solución incubada con UVC para formar una solución irradiada con UVC; y (f) filtrar la solución irradiada con UVC bajo condiciones estériles, para formar la preparación de anticuerpos adecuada para administración intravenosa en humanos.
25. Una preparación de anticuerpos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, para utilizar en medicina.
26. Una preparación de anticuerpos de conformidad con la reivindicación 25, para utilizar en el tratamiento de desórdenes inmunológicos o una infección bacteriana.
27. Una preparación de anticuerpos de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque el desorden inmunológico es un desorden de deficiencia de Ig .
28. Uso de una preparación de anticuerpos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un desorden inmunológico o infecciones bacterianas.
29. Un método para tratamiento de un paciente que comprende administrar una preparación de anticuerpos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23.
30. Un método de tratamiento de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el paciente sufre de un desorden inmunológico o una infección bacteriana .
31. Un método de tratamiento de conformidad con las reivindicaciones 29 y 30, caracterizado porque la preparación de anticuerpos se administra a un paciente, en forma intravenosa.
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