MX2012007128A - Uso de cry1ab en combinación con cry1be para el manejo de insectos resistentes. - Google Patents
Uso de cry1ab en combinación con cry1be para el manejo de insectos resistentes.Info
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Abstract
La presente invención incluye métodos y plantas para controlar los insectos perforador del maíz europeo y/o gusano cogollero del otoño, plantas que comprenden una proteína insecticida Cry1Ab y una proteína insecticida Cry1Be, y combinaciones variadas de otras proteínas que comprenden este par de proteínas, para retrasar o prevenir el desarrollo de la resistencia en los insectos.
Description
USO DE CRY1AB EN COMBINACIÓN CON CRY1 BE
PARA EL MANEJO DE INSECTOS RESISTENTES
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El ser humano cultiva maíz con fines alimentarios y energéticos. El ser humano cultiva además muchas otras plantas, incluso soja y algodón. Los insectos comen plantas y las dañan, lo que perjudica notablemente estas actividades humanas. Cada año se invierten miles de millones de dólares en el control de plagas de insectos y otros tantos miles de millones se pierden por el daño que causan. Los insecticidas orgánicos químicos sintéticos han sido las herramientas fundamentales utilizadas para controlar plagas de insectos pero los insecticidas biológicos, tales como las proteínas insecticidas derivadas de Bacillus thuringiensis (Bt), han resultado ser de una verdadera eficacia en algunas áreas. La capacidad de producir plantas resistentes a los insectos a través de la transformación con genes de proteínas insecticidas de Bt ha revolucionado la agricultura moderna y ha aumentado la importancia y el valor de las proteínas insecticidas y sus genes.
Se han empleado diversas proteínas de Bt para crear las plantas transgénicas resistentes a los insectos que se han registrado y comercializado con éxito hasta la fecha. Entre estas se incluyen CryIAb, CryIAc, Cry F y Cry3Bb en el maíz, CryIAc y Cry2Ab en el algodón, y Cry3A en la papa.
Los productos comerciales que incluyen estas proteínas
expresan una única proteína excepto en aquellos casos en los que se desea el espectro insecticida combinado de 2 proteínas (p. ej. se combinan CryIAb y Cry3Bb en el maíz para proveer resistencia a las plagas de lepidópteros y gusanos de las raíces, respectivamente) o en los que la acción independiente de las proteínas las convierte en herramientas útiles para retrasar el desarrollo de resistencia en poblaciones de insectos sensibles (p. ej. CryIAc y Cry2Ab en algodón combinadas para manejar la resistencia de la oruga del capullo del tabaco). Véase también la Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense No. 2009/0313717, que se refiere a una proteína Cry2 más una Vip3Aa, CryI F o CryIA para el control de Helicoverpa zea o armigerain. El documento WO 2009/132850 se refiere a CryI F o CryIA y Vip3Aa para controlar Spodoptera frugiperda. La Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense No. 2008/031 1096 se refiere en parte a CryIAb para controlar el perforador del maíz europeo (ECB; Ostrinia nubilalis (Hübner)) que es resistente a CryI F.
En otras palabras, algunas de las cualidades de las plantas transgénicas resistentes a los insectos que permitieron la adopción rápida y generalizada de esta tecnología también son las que dan motivo para pensar en que las poblaciones de plagas desarrollarán resistencia a las proteínas insecticidas que estas plantas producen. Se han propuesto varias estrategias para preservar la utilidad de las características de resistencia a los insectos basadas en Bt, entre las que se incluye la provisión de proteínas en altas dosis combinadas con un refugio, y su alternancia o despliegue paralelo con distintas toxinas (McGaughey et al. (1998), "Bt Resistance Management", Nature Biotechnol. 16:144-146).
Es necesario que las proteínas escogidas para utilizar en un apilamiento para el manejo de la resistencia en los insectos ("IRM" por sus siglas en inglés) ejerzan su efecto insecticida de modo independiente para que la resistencia que se desarrolle contra una proteína no confiera resistencia a la segunda proteína (es decir, no se produzca resistencia cruzada a las proteínas). Si, por ejemplo, una población de plagas seleccionada por su resistencia a la "proteína A" es sensible a la "proteína B", la conclusión sería que no se produciría resistencia cruzada y que una combinación de proteína A y proteína B resultaría eficaz para retardar la resistencia a la proteína A por sí sola.
En ausencia de poblaciones de insectos resistentes, se pueden realizar evaluaciones sobre la base de otras características que se crean relacionadas con el mecanismo de acción y resistencia cruzada potencial. La utilidad de las uniones mediadas por receptores para identificar proteínas insecticidas con la capacidad de no presentar resistencia cruzada ha sido sugerida (van Mellaert et al. 1999). El predictor clave de la ausencia de resistencia cruzada inherente en este método es que las proteínas insecticidas no compiten por los receptores en una especie de insectos que tenga sensibilidad.
En el caso de que dos toxinas Bt compitan por el mismo receptor en un insecto, si dicho receptor sufre una mutación en tal insecto de manera que una de las toxinas no se une más a ese receptor, y por ello no existe más insecticida contra el insecto, podría ocurrir que el insecto también resulte resistente a la segunda toxina (que se unió de modo competitivo al mismo receptor). En otras palabras, el insecto posee resistencia cruzada contra ambas toxinas de Bt. Sin embargo, si dos toxinas se unen a dos receptores diferentes, esto podría ser un indicio de que el insecto no podría ser resistente a esas dos toxinas en forma simultánea.
Por ejemplo, la proteína CryI Fa es útil para controlar muchas especies de plagas de lepidópteros entre las que se incluyen el ECB y el gusano cogollero del otoño (FAW; Spodoptera frugiperda), y es activa contra el perforador de la caña de azúcar (SCB (sugarcane borer); Diatraea saccharalis). La proteína CryI Fa, tal como se la produce en plantas de maíz transgénicas que contienen el evento TC1507, es la responsable de la gran importancia industrial que tiene un rasgo de la resistencia de un insecto para el control del FAW. La CryI Fa también es parte de los productos Herculex®, SmartStax™ y WideStrike™.
La posibilidad de realizar estudios sobre la unión de los receptores (competitivos u homólogos) mediante la utilización de la proteína CryI Fa tiene limitaciones porque la técnica más común de la que se dispone para etiquetar proteínas con capacidad de detección en los ensayos de unión de receptores tiende a desactivar la actividad insecticida de la proteína CryI Fa.
Otras toxinas Cry adicionales están enumeradas en el sitio web
del comité de nomenclatura oficial de Bt (Crickmore et al.; lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/). En la actualidad hay casi 60 grupos principales de toxinas "Cry" (Cry1 -Cry59), con otras toxinas Cyt y toxinas VIP y similares. En cada grupo numérico, muchos tienen subgrupos con letras mayúsculas, y los subgrupos con letras mayúsculas tienen a su vez subgrupos con letras minúsculas. (Cry1 tiene A-L, y CryIA tiene a-i, por ejemplo).
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere en parte al sorprendente descubrimiento de que Cry Ab y Cryl Be no compiten por la unión a sitios en las preparaciones de membranas celulares del intestino del perforador del maíz europeo (ECB; Ostrinia nubilalis (Hübner)) o del gusano cogollero del otoño (FAW; Spodoptera frugiperda). Como podrá observar el experto en la técnica a la luz de lo divulgado en el presente documento, las plantas que producen estas dos proteínas (que incluyen porciones insecticidas de las proteínas de longitud completa) pueden retardar o prevenir el desarrollo de la resistencia a cualquiera de estas proteínas insecticidas cuando están separadas. El maíz y la soja son algunas de las plantas preferidas. El ECB es el insecto diana preferido para el par de toxinas de la invención.
Por consiguiente, la presente invención se refiere en parte al uso de una proteína CrylAb en combinación con una proteína Cryl Be. Las
plantas (y los acres cultivados con tales plantas) que producen estas dos proteínas están comprendidas en el alcance de la presente invención.
La presente invención también se refiere en parte a apilamientos triples o "pirámides" de tres (o más) toxinas, en los que CryIAb y CryI Be son el par base. En algunas modalidades preferidas de pirámides, la combinación de las toxinas escogidas proporciona tres sitios de acción contra el ECB. Algunas combinaciones preferidas de pirámides de "tres sitios de acción" incluyen el par base principal de proteínas más Cry2A, Cryl l y DIG-3 como tercera proteína dirigida al ECB. Estos apilamientos triples particulares estarían en condiciones de proveer, de acuerdo con la presente invención y de manera ventajosa y sorprendente, tres sitios de acción contra el ECB. Esto serviría para reducir o eliminar el requisito de acreaje (superficie) de refugios.
Aunque la presente invención que se describe aquí se refiere a un par base de toxinas, CryIAb y CryI Be, que, cada una sola o en una "pirámide" de tres o más toxinas, proporcionan resistencia a los insectos en el maíz contra el ECB, debe entenderse que las combinaciones de CryIAb y CryI Be descriptas aquí también pueden usarse con proteínas adicionales dirigidas al FAW tanto en la soja como en el maíz.
De acuerdo con la presente invención, también se pueden agregar toxinas/genes adicionales. Por ejemplo, si Cry Fa está apilada con el par de proteínas principal (tanto Cryi Fa como CryI Be son ambas activas contra el FAW y el ECB), el agregado de una proteína adicional a este apilamiento triple en el que la cuarta proteína añadida va dirigida a ECB,
aportaría tres sitios de acción contra el FAW y tres sitios de acción contra el ECB. Esta proteína añadida (la cuarta proteína dirigida al FAW) podría escogerse del grupo integrado por CryI Fa, Vip3Ab o CryI E. El resultado de esto sería un apilamiento de cuatro proteínas con tres sitios de acción contra dos insectos (ECB y FAW).
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS CUADROS
Cuadro 1 : provee ejemplos de aminoácidos que pertenecen a las cuatro clases de aminoácidos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1 : es un gráfico que ilustra el porcentaje de unión de Cry1 Ab marcada contra Cry1 Be para BBMV del ECB.
Figura 2: es un gráfico que ilustra el porcentaje de unión de CrylAb marcada contra CryI Be con BBMV del FAW.
Figura 3: es un gráfico que ilustra el porcentaje de unión de Cry1 Be marcada contra CrylAb para BBMV del FAW.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere en parte al sorprendente descubrimiento de que CryIAb y CryI Be no compiten entre sí por los sitios de unión en el intestino del perforador del maíz europeo (ECB; Ostrinia nubilalis (Hübner)) o de los gusanos cogolleros del otoño (FAW; Spodoptera frugiperda). Por consiguiente, se puede usar una proteína CryIAb en combinación con una proteína CryI Be en maíz transgénico (y otras plantas; p. ej., algodón y soja, por ejemplo) para retrasar o prevenir el desarrollo de la resistencia a alguna de estas proteínas por sí solas en el ECB. El par de proteínas principal puede ser eficaz para proteger plantas (tales como plantas de maíz) contra los daños ocasionados por el ECB resistente a Cry. Esto quiere decir que uno de los usos de la presente invención es el de proteger el maíz y otras especies vegetales de importancia económica contra los daños y la pérdida de rendimiento que provocan las poblaciones del ECB que podrían desarrollar resistencia a CryIAb o CryI Be.
La presente invención enseña, por lo tanto, un apilamiento para el manejo de la resistencia en los insectos (IRM) que comprende CryIAb y CryI Be para prevenir o mitigar el desarrollo de la resistencia por parte de ECB a alguna de estas proteínas o a ambas.
Asimismo, aunque la invención que se presenta en esta memoria descriptiva ilustra una apilamiento para IRM que comprende CryIAb y CryI Be para prevenir la resistencia del ECB a alguna de estas proteínas, o a ambas, queda dentro del alcance de la invención divulgada aquí que una de CryIAb y Cry Be, o ambas, pueden adaptarse, solas o en combinación, para prevenir la resistencia del FAW a alguna de estas proteínas, o a ambas.
La presente invención proporciona composiciones para controlar plagas de lepidópteros que comprenden células que producen una proteína que contiene una toxina nuclear CryIAb y una proteina que contiene una toxina nuclear Cryi Be.
La invención comprende además un hospedante transformado para producir tanto una proteína insecticida CryIAb como una proteina insecticida Cryi Be, en donde dicho hospedante es un microorganismo o una célula vegetal. El/los polinucleótido/s del caso se encuentran preferiblemente en una construcción genética controlada por uno o varios promotores que no son de Bacillus-thuringiensis. Los polinucleótidos del caso pueden comprender el uso de codones para incrementar su expresión en una planta.
Otra meta adicional de la invención es proporcionar un método para controlar plagas de lepidópteros que comprende poner en contacto a dichas plagas o al ambiente de dichas plagas con una cantidad eficaz de una composición que comprende una proteína insecticida CryIAb y que contiene además una proteína insecticida Cryi Be.
Una modalidad de la invención comprende una planta de maíz que comprende un gen expresable en una planta que codifica una proteína insecticida Cryi Be y un gen expresable en una planta que codifica una proteína insecticida CryIAb, y las semillas de dicha planta.
Otra modalidad de la invención comprende una planta de maíz en la que se han introgresado un gen expresable en una planta que codifica una proteína insecticida CryIAb y un gen expresable en una planta que codifica una proteína insecticida CryIDa, y las semillas de dicha planta.
Como se describe en los Ejemplos, los estudios sobre la unión competitiva de receptores empleando proteínas CryIAb y CryI Be radiomarcadas muestran que la proteína CryI Be no compite por la unión en los tejidos del ECB o FAW a los que sí se une la CryIAb. Estos resultados también indican que la combinación de proteínas CryIAb y CryI Be puede ser un medio eficaz para mitigar el desarrollo de la resistencia en poblaciones de FAW a alguna de estas proteínas. Por consiguiente, tomando como base una parte de los datos descriptos en la presente invención, se considera que la coproducción (apilamiento) de las proteínas CryI Be y CryIAb puede ser utilizada para producir un apilamiento de IRM en altas dosis para el ECB.
A este par se le pueden agregar otras proteínas. Por ejemplo, la presente invención también se refiere en parte a apilamientos triples o "pirámides" de tres (o más) toxinas, donde CryIAb y CryI Be son el par base. En algunas modalidades preferidas de pirámides, las toxinas escogidas tienen tres sitios de acción separados contra el FAW. Algunas combinaciones preferidas de pirámides de "tres sitios de acción" incluyen el par base principal de proteínas más CryI Fa, Vip3Ab, CryI C, CryID o Cry E como tercera proteína destinada al FAW. Estos apilamientos triples particulares proporcionarían, de acuerdo con la presente invención y de manera ventajosa y sorprendente, tres sitios de acción contra el FAW. Esto serviría para reducir o eliminar el requisito del acreaje (superficie) de refugios. La expresión "sitios de acción separados" se refiere a que ninguna de las proteínas indicadas no provocan resistencia cruzada entre sí.
Asimismo se pueden añadir otras toxinas/genes de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, si CryI Fa está apilada con el par de proteínas principal (tanto CryI Fa como CryI Be son ambas activas contra el FAW además del perforador del maíz europeo (ECB)), el agregado de una proteína adicional a este apilamiento triple en el que la cuarta proteína añadida va dirigida a ECB, aportaría tres sitios de acción contra el FAW, y tres sitios de acción contra el ECB. Estas proteínas añadidas (la cuarta proteína) podrían escogerse del grupo integrado por Cry2A, Cryl l, DIG-3 (véase la Solicitud de Patente Estadounidense N.° de Acta 61/284,278 (presentada el 16 de diciembre de 2009) y US 2010 00269223). El resultado de esto sería un apilamiento de cuatro proteínas con tres sitios de acción contra dos insectos (ECB y FAW).
Por consiguiente, una opción de provisión es usar el par de proteínas principal en combinación con una tercera toxina/gen, y usar este apilamiento triple para mitigar el desarrollo de resistencia en el ECB y/o el FAW a cualquiera de estas toxinas. Por consiguiente, la presente invención también se refiere en parte a apílamientos triples o "pirámides" de tres (o más) toxinas. En algunas modalidades de pirámides preferidas, las toxinas escogidas tienen tres sitios de acción separados contra el ECB y/o el FAW.
Entre las opciones de provisión de la presente invención se incluye el uso de dos, tres, o más proteínas de las proteínas propuestas en aquellas regiones agrícolas en las que el ECB y/o el FAW pueden desarrollar poblaciones resistentes.
Tómese como guía respecto de la utilización de CryI Fa y
CryI Be (para controlar el ECB y/o el FAW), la Solicitud de Patente Estadounidense N.° de Acta 61/284,290 (presentada el 16 de diciembre de 2009). Sabiendo que CryI Fa es activa contra el ECB (y el FAW), CryIAb más CryI Be más CryI Fa proporcionarían, de acuerdo con la presente invención y de manera ventajosa y sorprendente, tres sitios de acción contra el ECB. Esto serviría para reducir o eliminar el requisito de acreaje (superficie) de refugios.
La CryI Fa es parte de los productos Herculex®, SmartStax™ y WidesStrike™. El par de genes propuesto (CryIAb y CryI Be) podrían combinarse, por ejemplo, en un producto con CryI Fa tal como Herculex®, SmartStax™ y WideStrike™. Por consiguiente, el par de proteínas principal podría resultar fundamental para reducir la presión a la hora de seleccionar estas y otras proteínas. El par de proteínas principal podría usarse entonces en las tres combinaciones de genes para el maíz y otras plantas (algodón y soja, por ejemplo).
Tal como ya se mencionó, podrían añadirse también otras toxinas/genes adicionales de acuerdo con la presente invención. Cuando el objetivo es el ECB, se pueden emplear Cry2A, Cryl l y/o DIG-3. Consúltese la Solicitud de Patente Estadounidense N.° de Acta 61/284,278 (presentada el
16 de diciembre de 2009) y el documento US2010 00269223. En cuanto a la combinación de CryI F y CryIAb (para controlar el ECB), téngase presente la Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense No. 2008/031 096.
Las plantas (y los acres cultivados con tales plantas) que producen cualquiera de las combinaciones de proteínas propuestas están comprendidas en el alcance de la presente invención. También pueden incorporarse otras toxinas/genes adicionales, pero los apilamientos particulares que se han analizado proporcionan, de manera ventajosa y sorprendente, múltiples sitios de acción contra el ECB y/o el FAW. Esto serviría para reducir o eliminar el requisito de acreaje (superficie) de refugios. En la presente invención se incluye, por lo tanto, un terreno cultivado de la manera expuesta con una extensión de más de diez acres.
Asimismo se puede hacer uso del GENBANK para obtener las secuencias para cualquiera de los genes y las proteínas descriptas en la presente invención. En este sentido, véase el Apéndice A que se presenta más adelante. Las patentes de invención también pueden usarse. Por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 5,188,960 y la Patente Estadounidense No. 5,827,514 describen proteínas que contienen toxinas nucleares CryI Fa adecuadas para usar cuando se lleva a la práctica la presente invención. La Patente Estadounidense No. 6,218,188 describe secuencias de ADN optimizadas para plantas y que codifican proteínas que contienen una toxina nuclear CryI Fa que son adecuadas para usar en la presente invención.
Las combinaciones de proteínas descriptas en el presente documento pueden utilizarse para controlar plagas de lepidópteros. Los lepidópteros adultos, por ejemplo, mariposas y polillas, se alimentan básicamente del néctar de las flores y constituyen agentes importantes de la polinización. Casi todas las larvas, es decir, orugas, de lepidópteros se alimentan de plantas, y muchos de estos son plagas tremendas. Las orugas se alimentan por afuera o por dentro del follaje o en las raíces o en el tallo de una planta, privando a la planta de nutrientes y frecuentemente terminan destruyendo la estructura de soporte físico de la planta. Asimismo, las orugas se alimentan de frutos, telas y granos y harinas almacenados, cosa que impide la venta de estos productos o disminuye considerablemente su valor. Tal como se emplea en este contexto, la referencia a plagas de lepidópteros comprende diversas etapas vitales de la plaga, incluso sus estados larvales.
Algunas toxinas quiméricas de la presente invención comprenden una porción de toxina nuclear N-terminal completa de una toxina de Bt y, en un punto más allá del extremo de la porción de toxina nuclear, la proteina presenta una transición a una secuencia de protoxina heteróloga. La porción de toxina N-terminal con actividad insecticida de una toxina de Bt lleva el nombre de toxina "nuclear". La transición desde el segmento de toxina nuclear hasta el segmento de protoxina heteróloga puede producirse aproximadamente en la unión toxina/protoxina o, como alternativa, se puede retener una porción de la protoxina nativa (que se extiende más allá de la porción de toxina nuclear), y que la transición hasta la porción de protoxina heteróloga se produzca corriente abajo.
Como ejemplo, una toxina quimérica de la presente invención, es una porción de toxina nuclear completa de CryIAb (aproximadamente aminoácidos 1 a 601 ) y/o una protoxina heteróloga (aproximadamente aminoácidos 602 hasta el término C). En una modalidad preferida, la porción de una toxina quimérica que comprende la protoxina deriva de una toxina de proteína CryIAb. En una modalidad preferida, la porción de una toxina quimérica que comprende la protoxina deriva de una toxina de proteína CryIAb.
La persona experimentada en la técnica observará que las toxinas de Bt, incluso dentro de una determinada clase tal como CryI Be, varían en cierto grado en cuanto a su longitud y la ubicación precisa de la transición desde la porción de toxina nuclear hasta la porción de protoxina. Normalmente, las toxinas CryI Be son de aproximadamente 1 1 50 a aproximadamente 1200 aminoácidos de longitud. La transición desde la porción de toxina nuclear hasta la porción de protoxina ocurrirá normalmente entre aproximadamente 50% y aproximadamente 60% de la toxina de longitud completa. La toxina quimérica de la presente invención incluirá la expansión total de esta porción de toxina nuclear N-terminal. Por consiguiente, la toxina quimérica comprenderá por lo menos aproximadamente 50% de la longitud completa de la proteína CryI Be. Esto será normalmente de por lo menos aproximadamente 590 aminoácidos. Con respecto a la porción de protoxina, la expansión completa de la porción de protoxina de CryIAb se extiende desde el extremo de la porción de toxina nuclear hasta el término C de la molécula.
Genes y toxinas
Los genes y toxinas útiles de acuerdo con la presente invención incluyen no solo las secuencias de longitud completa divulgadas sino además los fragmentos de estas secuencias, variantes, mutantes, y proteínas de fusión que retienen la actividad pesticida característica de las toxinas que se ejemplifican específicamente en este documento. Tal como se emplea en este contexto, los términos "variantes" o "variaciones" de genes se refieren a secuencias de nucleótidos que codifican las mismas toxinas o que codifican toxinas equivalentes con actividad pesticida. Tal como se emplea en este contexto, la expresión "toxinas equivalentes" se refiere a toxinas que tienen la misma actividad biológica, o esencialmente la misma, que las toxinas reivindicadas contra las plagas diana.
Tal como se emplea en este contexto, los límites representan aproximadamente 95% de identidad de secuencia (de las CryIAb y CryI Be), 78% (de las CryIA y CryI B), y 45% (de las Cry1), según "Revisión of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins", N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, y D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol 62: 807-813. Estos recortes también pueden aplicarse a las toxinas nucleares por si solas.
La persona experimentada en la técnica verá con facilidad que
los genes que codifican toxinas activas pueden identificarse y obtenerse por diversos medios. Los genes o porciones de genes específicos que se dan como ejemplos en la presente invención pueden obtenerse a partir de los aislados depositados en un depositario de cultivos. Estos genes, o porciones o variantes de estos, también pueden construirse en forma sintética, por ejemplo, por medio de un sintetizador génico. Las variaciones de genes pueden construirse sin dificultades utilizando técnicas estándares para preparar mutaciones puntuales. Por otra parte, se pueden fabricar fragmentos de estos genes empleando exonucleasas o endonucleasas de circulación comercial siguiendo procedimientos convencionales. Por ejemplo, se pueden usar enzimas tales como Bal31 o mutagénesis dirigida al sitio para recortar sistemáticamente nucleótidos de los extremos de estos genes. Los genes que codifican fragmentos activos pueden obtenerse además usando una variedad de enzimas de restricción. Se pueden usar proteasas para obtener directamente fragmentos activos de estas toxinas de proteínas.
Los fragmentos y equivalentes que retienen la actividad pesticida de las toxinas ejemplificadas están comprendidos en el alcance de la presente invención. Además, debido a la redundancia del código genético, una variedad de diferentes secuencias de ADN puede codificar las secuencias de aminoácidos divulgadas aquí. La persona con experiencia en la técnica sabe muy bien cómo crear estas secuencias de ADN alternativas que codifican las mismas toxinas, o esencialmente las mismas. Estas secuencias de ADN variantes están comprendidas en el alcance de la presente invención. Tal como se emplea en este contexto, la referencia a "esencialmente la misma" secuencia se refiere a secuencias que tienen sustituciones, deleciones, adiciones o inserciones de aminoácidos que no afectan la actividad pesticida en concreto. Los fragmentos de genes que codifican proteínas que retienen la actividad pesticida también están incluidos en esta definición.
Otro método para identificar los genes que codifican las toxinas y porciones de genes que resultan útiles de acuerdo con la presente invención es el que implica el uso de sondas de oligonucleótidos. Estas sondas son secuencias de nucleótidos detectables. Estas secuencias pueden ser detectadas gracias a una marca apropiada o pueden elaborarse inherentemente como fluorescentes tal cual se describe en la Solicitud Internacional No. WO93/16094. Como se sabe muy bien en la técnica correspondiente, si la molécula de sonda y la muestra de ácido nucleico se hibridan mediante la formación de un enlace fuerte entre las dos moléculas, hay buenas razones para pensar que la sonda y la muestra tienen una sustancial homología. Preferiblemente, la hibridación se lleva a cabo en condiciones estríngentes por medio de técnicas que se conocen bien en esta ciencia, como se describe, por ejemplo, en Keller, G. H., M. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, Nueva York, N.Y., pp. 169-170. Algunos ejemplos de concentraciones salinas y combinaciones de temperatura son las siguientes (en orden creciente de estringencia): 2X SSPE o SSC a temperatura ambiente; 1X SSPE o SSC a 42°C; 0.1X SSPE o SSC a 42°C; 0.1X SSPE o SSC a 65°C. La detección de la sonda constituye un medio para determinar de manera conocida si se ha producido la hibridación. Dicho análisis de las sondas proporciona un método rápido para identificar genes que codifican toxinas de la presente invención. Los segmentos de nucleótidos que se usan como sondas de acuerdo con la invención pueden sintetizarse con un sintetizador de ADN y procedimientos convencionales. Estas secuencias de nucleótidos también pueden usarse como iniciadores de PCR para amplificar genes de la presente invención.
Toxinas variantes
Algunas toxinas de la presente invención han sido ejemplificadas específicamente aquí. Dado que estas toxinas son meros ejemplos de las toxinas de la presente invención, queda obviamente clarificado que la presente invención comprende toxinas variantes o equivalentes (y secuencias de nucleótidos que codifican toxinas equivalentes) que tienen la misma actividad pesticida, o similar, que la toxina ejemplificada. Las toxinas equivalentes tendrán una homología de aminoácidos con una de las toxinas ejemplificadas. Esta homología de aminoácidos será normalmente superior al 75%, preferiblemente superior al 90%, y mucho más preferiblemente superior al 95%. La homología de aminoácidos más elevada aparecerá en las regiones criticas de la toxina, que son las responsables de la actividad biológica o que están involucradas en la determinación de su configuración tridimensional, que es en definitiva la que comanda la actividad biológica. En este sentido, son aceptables algunas sustituciones de aminoácidos y pueden presentarse si estas sustituciones ocurren en regiones que no son criticas para la actividad o son sustituciones conservativas de aminoácidos que no afectan la configuración tridimensional de la molécula. Por ejemplo, los aminoácidos pueden ubicarse en las siguientes clases: no polares, polares sin carga, básicos y acidicos. Las sustituciones conservativas por las que un aminoácido de una clase es reemplazado por otro aminoácido del mismo tipo están comprendidas en el alcance de la presente invención siempre y cuando la sustitución no altere de manera concreta la actividad biológica del compuesto. A continuación se presenta una lista de ejemplos de aminoácidos de cada clase.
CUADRO 1
Ejemplos de aminoácidos que pertenecen a las cuatro clases de
aminoácidos
En algunos ejemplos, también son posibles las sustituciones no conservativas. El factor crítico es que estas sustituciones no deben disminuir de manera notable la actividad biológica de la toxina.
Hospedantes recombinantes
Los genes que codifican las toxinas de la presente invención pueden introducirse en una gran variedad de hospedantes microbianos o vegetales. La expresión del gen de la toxina da como resultado, directa o indirectamente, la producción y el mantenimiento intracelulares del pesticida. Se pueden usar la transferencia conjunta y la transferencia recombinante para crear una cepa de Bt que expresa ambas toxinas de la presente invención. También se pueden transformar otros organismos hospedantes con uno de los genes de la toxina, o ambos, que luego se usan para obtener el efecto sinérgico. Con hospedantes microbianos adecuados, p. ej., Pseudomonas, los microbios pueden aplicarse al situs de la plaga, en donde proliferarán y serán ingeridos. El resultado es el control de la plaga. Como alternativa, el microbio que hospeda al gen de la toxina puede ser tratado en condiciones que prolongan la actividad de la toxina y estabilizan la célula. La célula tratada, que retiene la actividad tóxica, puede ser aplicada entonces al ambiente de la plaga diana.
Cuando el gen de la toxina de Bt es introducido por un vector adecuado en un hospedante microbiano, y dicho hospedante todavía está vivo cuando se lo suministra al ambiente, es fundamental utilizar determinados microbios hospedantes. Se seleccionan aquellos microorganismos hospedantes conocidos por ocupar la "fitoesfera" (filoplano, filoesfera, rizoesfera, y/o rizoplano) de uno o más cultivos de interés. Estos microorganismos se escogen por su capacidad para competir de manera
eficaz en el ambiente particular (cultivo y otros hábitats de los insectos) con los microorganismos de tipo salvaje, proporcionar un mantenimiento y expresión estable del gen que expresa el pesticida polipeptídico y, sobre todo, proveer una mejor protección del pesticida respecto de la degradación e inactivación que puede producir el ambiente.
Existe una gran cantidad de microorganismos que, se sabe, habitan el filoplano (la superficie de las hojas de las plantas) y/o la rizoesfera (el suelo que rodea a las raíces de las plantas) de una amplia variedad de cultivos de importancia. Estos microorganismos incluyen bacterias, algas y hongos. En especial, interesan los microorganismos, tales como bacterias, p. ej., los géneros Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobactenum, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, y Alcaligenes; hongos, especialmente levaduras, p. ej., los géneros Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula, y Aureobasidium. Especialmente interesantes son las especies bacterianas de la fitoesfera como las Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobactenium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, y Azotobacter vinlandii; y las especies de levaduras de la fitoesfera tales como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae, y Aureobasidium pol/ulans. Especialmente interesantes son los microorganismos pigmentados.
Se dispone de una amplia gama de métodos para introducir un gen de Bt que codifica una toxina en un microorganismo hospedante en condiciones que permiten el mantenimiento y la expresión estables del gen. Estos métodos son del conocimiento general de los expertos en la técnica y están descriptos, por ejemplo, en la Patente Estadounidense No. 5, 135,867, que se incorpora como referencia al presente documento.
Tratamiento de células
Las células de Bacillus thuríngiensis o recombinantes que expresan las toxinas de Bt pueden ser tratados con el fin de prolongar la actividad de la toxina y estabilizar la célula. La microcápsula de pesticida que se forma comprende la toxina o las toxinas de Bt dentro de una estructura celular que ha sido estabilizada y que protegerá a la toxina cuando se aplique la microcápsula al ambiente de la plaga diana. Las células hospedantes adecuadas pueden incluir procariotas o eucariotas, todo esto limitado normalmente a aquellas células que no producen sustancias tóxicas para los organismos superiores, tales como mamíferos. Sin embargo, los organismos que producen sustancias que son tóxicas para los organismos superiores podrían emplearse en aquellos casos en que las sustancias tóxicas son inestables o en que el nivel de aplicación es lo suficientemente bajo como para evitar hasta la más mínima posibilidad de que un hospedante mamífero
se intoxique. En calidad de hospedantes, interesan particularmente los procariotas y los eucariotas inferiores, tales como hongos.
Para el tratamiento, la célula estará, en general, intacta y sustancialmente en su forma proliferativa, más que en su forma de espora, aunque en algunos ejemplos se pueden emplear esporas.
El tratamiento de la célula microbiana, p. ej., un microbio que contiene el gen o los genes de la toxina de Bt , puede hacerse por medios químicos o físicos, o mediante una combinación de medios químicos y/o físicos, en tanto la técnica no perjudique las propiedades de la toxina ni disminuya la capacidad de la célula para proteger a la toxina. Ejemplos de reactivos químicos son los agentes halogenantes, especialmente halógenos de N.° atómico 17-80. Más especialmente, puede emplearse yodo en condiciones moderadas y durante un tiempo suficiente para conseguir los resultados buscados. Otras técnicas adecuadas incluyen tratamiento con aldehidos, tales como glutaraldehído; antiinfecciosos, tales como cloruro de zefirano y cloruro de cetilpiridinio; alcoholes, tales como isopropilo y etanol; diversos fijadores histológicos, tales como yodo de Lugol, fijador de Bouin, ácidos varios y fijador de Helly (véase: Humason, Gretchen L, Animal Tissue Techniques, W. H. Freeman and Company, 1967); o una combinación de agentes físicos (calor) y químicos que preservan y prolongan la actividad de la toxina producida en la célula cuando la célula es administrada al ambiente del hospedante. Ejemplos de medios físicos son la radiación de longitudes de onda cortas tales como la radiación con rayos gamma y la radiación con rayos X, congelamiento, irradiación UV, liofilización, y similares. Métodos para el tratamiento de células microbianas aparecen divulgados en las Patentes Estadounidenses N.° 4,695,455 y 4,695,462, que se incorporan al presente documento como referencia.
Las células tendrán, en general, una estabilidad estructural superior, lo cual mejorará la resistencia a las condiciones ambientales. Cuando el pesticida está en una proforma, el método de tratamiento para la célula debe escogerse teniendo en cuenta que el patógeno de la plaga diana no inhiba el procesamiento de la proforma a la forma madura del pesticida. Por ejemplo, el formaldehído suele entrecruzar las proteínas y podría inhibir el procesamiento de la proforma de un pesticida polipeptídico. El método de tratamiento debería retener por lo menos una porción considerable de la biodisponibilidad o bioactividad de la toxina.
Entre las características que interesan en particular para realizar la selección de una célula hospedante con fines de producción se incluyen la facilidad para introducir el gen o los genes de Bt en el hospedante, la disponibilidad de sistemas de expresión, la eficacia de la expresión, la estabilidad del pesticida en el hospedante, y la presencia de otras capacidades genéticas auxiliares. Las características que interesan para el uso como microcápsula pesticida incluyen cualidades protectoras del pesticida, tales como paredes celulares gruesas, pigmentación, y empacamiento intracelular o formación de cuerpos de inclusión; supervivencia en ambientes acuosos; atoxicidad para los mamíferos; calidad de atracción para que las plagas lo ingieran; facilidad para matar y fijarse sin daño a la toxina; y similares. Otras consideraciones incluyen la facilidad de formulación y manipulación, la economía, la estabilidad en almacenamiento y otras.
Crecimiento celular
El hospedante celular que contiene el gen o los genes insecticidas del Bt pueden desarrollarse en cualquier medio de nutrición conveniente, en donde la construcción de ADN proporciona una ventaja selectiva, proveyendo un medio selectivo que permita que casi todas, o todas, las células retengan el gen de Bt Estas células se pueden cosechar entonces siguiendo medios convencionales. Como alternativa, las células pueden recibir tratamiento antes de la cosecha.
Las células de Bt que producen las toxinas de la invención pueden cultivarse empleando medios y técnicas de fermentación de uso común en este campo científico. Una vez completado el ciclo de fermentación, las bacterias pueden ser cosechadas separando en primer término las esporas y los cristales de Bt del caldo de fermentación utilizando medios conocidos en la técnica. Las esporas y cristales de Bt recuperados pueden formularse en un polvo humectable, un concentrado líquido, gránulos u otras formulaciones añadiendo surfactantes, dispersantes, portadores inertes, y otros componentes que faciliten la manipulación y la aplicación de cada plaga diana particular. Estas formulaciones y procedimientos de aplicación son muy bien conocidos en la técnica.
Formulaciones
Los gránulos cebados formulados que contienen un atrayente y esporas, cristales y toxinas de los aislados de Bt, o microbios recombinantes que comprenden los genes que se pueden obtener de los aislados de Bt divulgados en la presente, pueden ser aplicados en el suelo. El producto formulado también puede aplicarse como revestimiento de semillas o tratamiento de las raíces o tratamiento total de la planta en etapas posteriores del ciclo del cultivo. El tratamiento de las células de Bt en plantas y en el suelo puede realizarse en forma de polvos humectables, gránulos o polvillos, haciendo una mezcla con diversos materiales inertes, tales como minerales inorgánicos (filosilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos, y similares) o materiales botánicos (marlos en polvo, cáscaras de arroz, cáscaras de nuez, y similares). Las formulaciones pueden incluir adyuvantes extendedores-adherentes, agentes de estabilización, otros aditivos pesticidas, o surfactantes. Las formulaciones líquidas pueden ser de base acuosa o no acuosa y utilizarse en forma de espumas, geles, suspensiones, concentrados emulsionables, o similares. Los ingredientes pueden incluir agentes reológicos, surfactantes, emulsionantes, dispersantes o polímeros.
Como podrá apreciar el experto en la técnica, la concentración pesticida variará en gran medida según la naturaleza de la formulación específica, especialmente si se trata de un concentrado o si se ha de usar directamente. La cantidad de pesticida será de por lo menos 1% por peso y puede ser de 100% por peso. Las formulaciones deshidratadas tendrán de
aproximadamente 1 -95% por peso del pesticida mientras que las formulaciones líquidas tendrán en general desde aproximadamente 1-60% por peso de los sólidos en la fase líquida. Las formulaciones tendrán por lo común desde aproximadamente 102 hasta aproximadamente 104 células/mg. Estas formulaciones serán administradas a razón de aproximadamente 50 mg (peso líquido o deshidratado) hasta 1 kg o más por hectárea.
Las formulaciones pueden aplicarse al ambiente de la plaga de lepidópteros, p. ej., follaje o suelo, por medio de pulverización, espolvoreo, rociamiento, o similares.
Transformación de la planta
Un hospedante recombinante preferido para la producción de las proteínas insecticidas de la presente invención es una planta transformada. Los genes que codifican las proteínas de las toxinas de Bt, tal como se divulga en la presente, pueden insertarse en las células vegetales por medio de una variedad de técnicas de uso difundido en el arte. Por ejemplo, se dispone de un gran número de vectores de clonación que comprenden un sistema de replicación en Escherichia coli y un marcador que permite la selección de las células transformadas para una preparación destinada a la inserción de genes foráneos en plantas de orden superior. Los vectores comprenden, por ejemplo, pBR322, series pUC, series M13mp, pACYC 84, entre otros. Por consiguiente, el fragmento de ADN que posee la secuencia que codifica la proteína de las toxinas de Bt puede ser insertado en el vector en un sitio de restricción adecuado. El plásmido resultante es utilizado para la transformación en E. coli. Las células de E. coli son cultivadas en un medio de nutrición adecuado, luego son cosechadas y lisadas. El plásmido es recuperado. Por lo general, se realizan análisis de las secuencias, análisis de restricción, electroforesis, y otros métodos biológicos bioquímicos-moleculares como métodos de análisis. Después de cada manipulación, la secuencia de ADN usada puede escindirse y unirse a la secuencia de ADN siguiente. Cada secuencia de plásmido puede clonarse en el mismo plásmido, o en otros. Según cuál sea el método que se use para insertar los genes deseados en la planta, se pueden necesitar otras secuencias de ADN. Si, por ejemplo, se usa el plásmido Ti o Ri para la transformación de la célula vegetal, entonces por lo menos el borde derecho, aunque muchas veces tanto el derecho como el izquierdo, del ADN-T del plásmido Ti o Ri, debe unirse como región flanqueadora de los genes que se han de insertar. El uso de ADN-T para la transformación de células vegetales ha sido intensamente investigado y está suficientemente descripto en el documento de patente EP 120 516, Lee y Gelvin (2008), Hoekema (1985), Fraley et al., (1986), y An et al., (1985), y está bien desarrollado en la técnica.
Una vez que el ADN insertado se ha integrado al genoma de la planta, es relativamente estable. El vector de transformación contiene normalmente un marcador seleccionare que confiere a las células vegetales transformadas resistencia a un biocida o un antibiótico, tales como Bialafós, Kanamicina, G418, Bleomicina o Higromicina, entre otros. El marcador
específicamente empleado debería, por consiguiente, permitir la selección de las células transformadas en lugar de las células que no contienen el ADN insertado.
Se dispone de una gran cantidad de técnicas para insertar ADN en una célula hospedante de una planta. Dichas técnicas incluyen transformación con ADN-T que emplea Agrobacteríum tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como agente de transformación, fusión, inyección, biolística (bombardeo de microparticulas), o electroporación además de otros métodos posibles. Si se usan Agrobacterias para la transformación, el ADN que se ha de insertar debe ser clonado en plásmidos especiales, a saber en un vector intermediario o en un vector binario. Los vectores intermediarios pueden ser integrados en el plásmido Ti o Ri por recombinación homologa gracias a secuencias que son homologas a las secuencias del ADN-T. El plásmido Ti o Ri también comprende la región vir que es necesaria para la transferencia del ADN-T. Los vectores intermediarios no pueden replicarse a si mismos en las Agrobacterias. El vector intermediario puede transferirse a Agrobacterium tumefaciens por medio de un plásmido ayudante (conjugación). Los vectores binarios pueden replicarse a sí mismos tanto en E. coli como en Agrobacterias. Comprenden un gen marcador de selección y un conector o policonector que están enmarcados por las regiones del borde derecho y del borde izquierdo del ADN-T. Pueden transformarse directamente en Agrobacterias (Holsters et al., 1978). El Agrobacteríum que se usa como célula hospedante debe comprender un plásmido que porta una región vir. La región vir es necesaria para la transferencia del ADN-T en la célula vegetal. Puede haber más contenido de ADN-T. La bacteria transformada de esta forma se usa para la transformación de células vegetales. Pueden cultivarse explantas de manera ventajosa con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes para la transferencia del ADN en la célula vegetal. A partir del material vegetal infectado (por ejemplo, pedazos de hoja, segmentos de tallo, raices, además de protoplastos o células cultivadas en suspensión) se pueden regenerar entonces plantas completas, en un medio adecuado, que puede contener antibióticos o biocidas para la selección. Las plantas obtenidas así pueden someterse a evaluaciones para constatar la presencia del ADN insertado. No hay requisitos especiales respecto de los plásmidos en el caso de inyección y electroporación. Es posible la utilización de plásmidos comunes, como por ejemplo, derivados de pUC.
Las células transformadas crecen dentro de las plantas de la manera usual. Ellas pueden formar células germinales y transmitir el rasgo, o los rasgos, transformados a las plantas de la progenie. Estas plantas pueden cultivarse de la manera usual y cruzarse con plantas que tienen los mismos factores hereditarios transformados u otros factores hereditarios. Los individuos híbridos resultantes tienen las propiedades fenotípicas correspondientes.
En una modalidad preferida de la presente invención, las plantas serán transformadas con genes en donde el uso de codones ha sido optimizado para plantas. Véase, por ejemplo, la Patente Estadounidense N.° 5,380,831 , que se incorpora asi como referencia. Si bien en la presente invención se dan como ejemplos algunas toxinas truncadas, es harto conocido en la técnica del Bt que las toxinas (de longitud completa) del tipo 130 kDa tienen una mitad N-terminal que es la toxina nuclear, y una mitad C-terminal que es la "cola" de la protoxina. Por consiguiente, las "colas" apropiadas pueden ser usadas con toxinas truncadas / nucleares de la presente invención. Véanse, por ejemplo, la Patente Estadounidense N.° 6,218,188 y la Patente Estadounidense N.° 6,673,990. Por otra parte, en la técnica se conocen los métodos para crear genes sintéticos de Bt que se pueden usar en plantas (Stewart y Burgin, 2007). Un ejemplo no limitativo de una planta transformada preferida es una planta de maíz fértil que comprende un gen expresable en plantas que codifica una proteina CrylAb, y que además comprende un segundo gen expresable en plantas que codifica una proteína CryI Be.
La transferencia (o introgresión) del rasgo, o de los rasgos, determinados por CrylAb y CryI Be en lineas de maíz endocriadas puede conseguirse aplicando multiplicación por selección recurrente, por ejemplo retrocruzamiento. En este caso, se cruza en primer término un progenitor recurrente deseado con un donante endocriado (el progenitor no recurrente) que porta el gen, o los genes, apropiados para los rasgos determinados por CryIA y CryI Be. La progenie de este cruzamiento se retrocruza con el progenitor recurrente y se efectúa a continuación una selección en la progenie resultante en búsqueda del rasgo, o de los rasgos, que se desean transferir desde el progenitor no recurrente. Después de tres, preferiblemente cuatro, más preferiblemente cinco o más generaciones de retrocruzamiento con el progenitor recurrente acompañado de selección del rasgo, o de los rasgos, deseados, la progenie será heterocigota de los loci que controlan el rasgo, o los rasgos, que se están transfiriendo, pero serán iguales al progenitor recurrente en la mayor parte, o en casi todos, los otros genes (véase, por ejemplo, Poehlman & Sleper (1995) Breeding Field Crops, 4.a Ed., 172-175; Fehr (1987) Principies of Cultivar Development, Vol. 1 : Theory and Technique, 360-376).
Estrategias para el manejo de la resistencia en insectos (IRM)
Roush et al., por ejemplo, definen estrategias de dos toxinas, lo que también se llama "pirámides" o "apilamiento", para el manejo de cultivos transgénicos insecticidas. (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353, 1777-1786).
En su sitio web, la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (United States Environmental Protection Agency) (epa.gov/oppbppd1/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm) publica los siguientes requisitos para proveer refugios (una sección de cultivos / maíz no Bf) no transgénicos (es decir, no Bt ) para utilizar en cultivos transgénicos que producen una proteina Bt única activa contra plagas diana.
"Los requisitos estructurados específicos para los productos del maíz Bt (CryIAb o CryI F) protegidos contra el perforador del maíz son los
siguientes:
Refugios estructurados
20% de refugio de maíz Bt no Lepidóptero en el Cinturón Maicero;
50% de refugio Bt no Lepidóptero en el Cinturón Algodonero
Bloques
Internos (es decir, dentro del campo Bt)
Externos (es decir, campos separados por ½ milla (-0.805 km) (Ví de milla (-0.402 km) si es posible) del campo Bt para maximizar la multiplicación aleatoria)
Franjas dentro del campo
Las franjas deben ser de por lo menos 4 hileras de ancho
(preferiblemente 6 hileras) para reducir los efectos del desplazamiento de las larvas"
Por otra parte, la Asociación Nacional de Agricultores Maiceros (National Corn Growers Association), en su sitio web: (ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn) también proporciona lineamientos similares con respecto a los requisitos para los refugios. Por ejemplo:
"Requisitos para el IRM del perforador del maiz:
-Plantar por lo menos 20% de de los acres de maíz para refugiar a los híbridos
-En las regiones productoras de algodón, el refugio debe ser de
50%
-Debe plantarse como máximo a 1/2 milla (-0.805 km) de los híbridos del refugio
-El refugio puede plantarse en franjas dentro del campo Bt¡ las franjas de refugio deben ser de por lo menos 4 hileras de ancho
-El refugio debe ser tratado con pesticidas convencionales sólo si se alcanzan los umbrales redituables para el insecto diana
-No pueden emplearse insecticidas pulverizables a base de Bt en el maíz de refugio
-Debe plantarse refugio apropiado en cada granja con maíz Bt"
Como lo establecen Roush et al. (en las páginas 1780 y 1784, columna de la derecha, por ejemplo), el apilamiento o las pirámides de dos proteínas diferentes cada una de las cuales es eficaz contra las plagas diana y con poca o nula resistencia cruzada pueden permitir el uso de un refugio más pequeño. Roush sugiere que para conseguir un apilamiento eficaz, un tamaño de refugio inferior al 10% del refugio puede proveer un manejo de la resistencia comparable a aproximadamente 50% del refugio para un rasgo único (no piramidal). Para los productos de maíz Bt piramidales actuales, la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos exige que se plante muchísimo menos (5% en general) de refugio estructurado de maíz no Bt que para los productos con rasgos únicos (generalmente 20%).
Existen diversas maneras de obtener los efectos del IRM de un refugio, que incluyen patrones variados de plantación geométrica en los campos (como se mencionó más arriba) y mezclas de semillas embolsadas, otro punto también analizado por Roush et al. (más arriba), y la Patente Estadounidense N.° 6,551 ,962.
Los porcentajes precedentes, o las proporciones de refugio similares, pueden usarse para los apilamientos o pirámides dobles o triples de la presente. En el caso de los apilamientos triples con tres sitios de acción contra una plaga diana única, un objetivo sería el refugio cero (o menos del 5% de refugio, por ejemplo). Esto resulta especialmente relevante para lo que es el acreaje (superficie) comercial, es decir, de más de 10 acres (~4.047 ha) por ejemplo.
Todas las patentes, solicitudes de patente, solicitudes provisionales y publicaciones a las que se ha hecho referencia o que han sido citadas en el presente documento quedan incorporadas como referencia en su totalidad hasta el punto en que no resulten contradictorias respecto de lo que se explica específicamente en esta memoria descriptiva.
A menos que se lo indique o que quede implícito específicamente, los términos "un", "una", "el" y "la" significan "por lo menos uno/una" tal como se los emplea en este contexto.
A continuación se presentan ejemplos que ilustran los procedimientos para llevar a la práctica la invención. Estos ejemplos no deben tomarse como limitantes en ningún sentido. Todos los porcentajes están por peso y todas las proporciones de las mezclas de solventes están por volumen a menos que se aclare lo contrario. Todas las temperaturas están en grados Celsius.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1
Etiquetación de proteínas Cry con 25l
Yodación de toxinas Cry
Se yodaron toxinas truncadas y purificadas Cry empleando lodo-Beads (perlas de yodo) o lodo-gen (gen de yodo) (Pierce). En pocas palabras, se lavaron dos perlas de yodo dos veces con 500 µ? de solución salina con tampón de fosfato, PBS (fosfato de sodio 20 mM, NaCI 0.15 M, pH 7.5), y se colocaron en un tubo de centrífuga de 1.5 mi detrás de un escudo de plomo. A esto se le añadieron 100 µ? de PBS. En una campana y empleando técnicas de manipulación de radiactividad apropiadas, se añadió 0.5 mCi Na125l (17.4 Ci/mg, Lote 0 14, Amersham) a la solución de PBS con las perlas de yodo. Se permitió que los componentes reaccionaran durante 5 minutos a temperatura ambiente, luego se incorporaron 2-25 ig de proteína Cry truncada de alta pureza a la solución y se dejó reaccionar durante otros 3-5 minutos. La reacción finalizó al retirar la solución de las perlas de yodo y aplicarla a una columna de rotación desalinizadora Zeba de 0.5 mi (InVitrogen) equilibrada en PBS. La perla de yodo fue lavada dos veces con 10 µ? de PBS en cada ocasión y la solución de lavado también fue aplicada a la columna desalinizadora. La solución radiactiva fue eluida por la columna desalinizadora centrifugando a 1000 x g durante 2 min. En el caso de CryI Da, se usó el método basado en el gen de yodo para realizar el procedimiento de radiomarcado. Con este procedimiento, primeramente se despojó a la toxina cry en tampón de fosfato 100 mM (pH 8) de lipopolisacáridos (LPS) pasándola a través de una pequeña columna de polimixina de 0.5 mi varias veces. Al tubo de gen de yodo (Pierce Chem. Co.) se le añadieron 20 pg de la toxina CryI Da sin LPS, luego 0.5 mCi de Na125l. La mezcla de reacción se agitó durante 15 min a 25°C. La solución fue retirada del tubo, y se agregaron 50 pl de Nal 0.2M sin radiomarca para desactivar la reacción. La proteína fue dializada contra PBS con 3 cambios de tampón para eliminar todo 25l que no se hubiere fijado.
La radiopureza de las proteínas Cry yodadas fue determinada por SDS-PAGE, imágenes en fósforo y recuento gamma. En pocas palabras, se separaron 2 µ? de la proteína radiactiva por SDS-PAGE. Después de la separación, se secaron los geles utilizando un equipo de secado en gel BioRad respetando las instrucciones del fabricante. Se tomaron imágenes de los geles secados envolviéndolos en película Mylar (12 µ?t? de espesor), y exponiéndolos bajo una pantalla de fósforo de almacenamiento provisto por Molecular Dynamics (35 cm x 43 cm), durante 1 hora. Las placas fueron desarrolladas mediante el uso de un tomador de imágenes en fósforo Storm
820 de Molecular Dynamics y las imágenes fueron analizadas por Software ImageQuant™. La banda radiactiva junto con las áreas inmediatamente superiores e inferiores de la banda fueron recortadas del gel con una hojita de afeitar y el recuento se hizo con un contador de rayos gamma. Sólo se detectó radiactividad en la banda de la proteína Cry y en las áreas por debajo de la banda. No se detectó radiactividad por encima de la banda, lo cual indica que todos los contaminantes radiactivos estaban compuestos por componentes de proteína más pequeños que la proteína Cry truncada. Estos componentes representan con toda probabilidad los productos de la degradación.
EJEMPLO 2
Protocolo de preparación de BBMV
Preparación y fraccionamiento de BBMV solubilizadas Larvas de Spodoptera frugiperda, Ostrinia nubilalis o Heleothis. zea en su último instar fueron sometidas a ayuno durante una noche y a la mañana siguiente fueron diseccionadas después de enfriamiento sobre hielo durante 15 minutos. Se extrajo el tejido del intestino medio de la cavidad corporal y se desechó el intestino posterior ligado al integumento. El intestino medio fue colocado en un volumen 9X de tampón de homogenización helado (manitol 300 mM, EGTA 5 mM, tris, base 17 mM, pH 7.5), suplementado con
Cóctel Inhibidor de Proteasa1 (Sigma P-2714) diluido en la forma recomendada por el proveedor. El tejido fue homogeneizado con 15 golpes de un homogenizador de vidrio para tejidos. Las BBMV fueron preparadas por el método de precipitación en MgC de Wolfersberger (1993). En pocas palabras, se mezcló un volumen igual de una solución de MgCI2 24 mM en manitol 300 mM con el homogenado de intestino medio, se agitó durante 5 minutos y se dejó reposar sobre hielo durante 15 min. La solución fue centrifugada a 2500 x g durante 5 min a 4°C. Se recuperó el sobrenadante y el pellet se suspendió en el volumen original de tampón de homogenización diluido 0.5X y se volvió a centrifugar. Los dos sobrenadantes fueron combinados, centrifugados a 27 000 x g durante 30 min a 4°C para formar la fracción de BBMV. El pellet fue suspendido en 10 mi de tampón de homogenización y suministrado a inhibidores de proteasa y se volvió a centrifugar a 27 000 x g durante 30 min a 4°C para lavar las BBMV. El pellet resultante fue suspendido en tampón de almacenamiento de BBMV (HEPES 10 mM, KCI 130 mM, 10% de glicerol, pH 7.4) hasta una concentración de aproximadamente 3 mg/ml de proteína. La concentración de proteína fue determinada aplicando el método Bradford (1976) con albúmina de suero bovino (BSA) como estándar. La determinación de la fosfatasa alcalina se hizo antes de congelar las muestras mediante el ensayo Sigma respetando las instrucciones del fabricante. La actividad específica de esta enzima marcadora
1 La cocentración final de los componentes cóctel (en µ?) son AEBSF (500), EDTA (250 mM), Bestatina (32), E-64 (0.35), Leupeptina (0.25) y Aprotinina (0.075).
en la fracción de BBMV aumentó en general 7 veces con respecto a la que se encontró en la fracción de homogenado de intestino medio. Se hicieron alícuotas de las BBMV en muestras de 250 µ?, se las congeló inmediatamente en N2 líquido y se las almacenó a -80°C.
EJEMPLO 3
Método para medir la unión de proteínas Cry marcadas con 25l a
proteínas de BBMV
Unión de proteínas Cry marcadas con 125l a BBMV
Para determinar la cantidad óptima de proteína de BBMV que se debe usar en los ensayos de fijación, se generó una curva de saturación. La proteína Cry radiomarcada con 125l (0.5 nM) fue incubada durante 1 hora a 28°C con distintas cantidades de proteína de BBMV, que iban de 0 a 500 pg/ml en tampón de unión (NaHP04 8 mM, KH2P04 2 mM, NaCI 150 mM, 0.1 % de albúmina de suero bovino, pH 7.4). El volumen total fue de 0.5 mi. La proteína Cry con 125l que se había fijado se separó de la que no se había fijado tomando muestras de 150 µ? de la mezcla de reacción por triplicado de un tubo de 1.5 mi de centrífuga y colocándolas en un tubo de 500 µ? de centrífuga y centrifugando las muestras a 14 000 x g durante 6 minutos a temperatura ambiente. Se retiró el sobrenadante con cuidado, y se lavó el pellet también con cuidado tres veces con tampón de unión helado. El fondo de la centrífuga que contenía el pellet fue recortado y colocado en un tubo de cultivo de vidrio de 13 x 75 mm. Las muestras fueron contadas durante 5 minutos cada vez en el contador gamma. Los recuentos contenidos en la muestra fueron restados de los recuentos antecedentes (reacción sin proteínas) y se elaboró una gráfica contra la concentración de proteína de BBMV. Se determinó que la cantidad óptima de proteína que se debe usar es de 0.15 mg/ml de proteína de BBMV.
Para determinar la cinética de la unión, se generó una curva de saturación. En pocas palabras, se incubaron BBMV (150 pg/ml) durante 1 hora a 28°C con concentraciones crecientes de toxina Cry con 25l, que iban de 0.01 a 10 nM. La fijación total fue determinada tomando muestras de 150 µ? de cada concentración por triplicado, centrifugando la muestra y haciendo el recuento como se describió más arriba. La unión no específica fue determinada de la misma manera, agregando 1000 nM de la toxina Cry no radiactiva tripsinizada homologa añadida a la mezcla de reacción para saturar todos los sitios de unión inespecifica de receptores. La unión específica fue calculada como la diferencia entre la unión total y la unión no específica.
Los ensayos de unión competitiva homologa y heteróloga fueron realizados con 150 pg/ml de proteína de BBMV y 0.5 nM de la proteína Cry radiomarcada con 125l. La concentración de la toxina Cry competitiva sin radiomarca añadida a la mezcla de reacción iba de 0.045 a 1000 nM y fue añadida al mismo tiempo que el ligando radiactivo, para garantizar una verdadera competencia de unión. Las incubaciones se realizaron durante 1 hora a 28°C y se midió la cantidad de proteína Cry con 125l fijada a su toxina receptora como se describió anteriormente restando la unión no específica. Se determinó el cien por ciento de unión total en ausencia de ligando competidor. Los resultados fueron llevados a una gráfica semilogarítmica como porcentaje de la unión específica total contra la concentración del ligando competitivo añadido.
EJEMPLO 4
Síntesis de los resultados
La Figura 1 muestra el porcentaje de unión específica de
CryIAb marcada con 125l (0.5 nM) en las BBMV del ECB contra la competencia de CryIAb homologa no marcada (?) y CryI Be heteróloga (·). La curva del desplazamiento de la competencia homologa por parte de CryIAb da como resultado una curva de forma sigmoide que muestra el 50% de desplazamiento del radioligando a aproximadamente 0.5 nM de CryIAb. CryIBe también desplaza a CryI Be marcada con 125l de su sitio de unión pero requiere aproximadamente 40 nM de concentración (80 veces más que la requerida por CryIAb), para desplazar el 50% de la CryIAb marcada con 125l de su sitio de unión.
La Figura 2 muestra el porcentaje de unión especifica de
CryIAb marcada con 125l (0.5 nM) en las BBMV del FAW contra la competencia de CryIAb homologa no marcada (?) y CryI Be heteróloga (·). La curva del desplazamiento de la competencia homologa por parte de
CrylAb da como resultado una curva de forma sigmoide que muestra el 50% de desplazamiento del radioligando a aproximadamente 0.3 nM de CrylAb. Cryl Be desplaza a CrylAb marcada con 125l en un 50% a una concentración de aproximadamente 300 nM, o aproximadamente 1000 veces más que la requerida por CrylAb. Las barras de error representan el rango de valores obtenido de las determinaciones por duplicado.
La Figura 3 muestra el porcentaje de unión específica de CrylBe marcada con 125l (0.5 nM) en las BBMV del FAW contra la competencia de la Cryl Be homologa no marcada (·) y la CrylAb heteróloga (?). La curva del desplazamiento de la competencia homologa por parte de Cryl Be da como resultado una curva de forma sigmoide que muestra el 50% de desplazamiento del radioligando a aproximadamente 2 nM de Cryl Be. CrylAb a una concentración de 1000 nM (2000 veces más que el desplazamiento de Cryl Be marcada con 125l) da como resultado aproximadamente el 50% de desplazamiento. La afinidad de CrylAb para competir por la unión de Cryl Be es aproximadamente 500 veces menor. Las barras de error representan el rango de valores obtenidos de las determinaciones efectuadas por triplicado.
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APENDICE A
Lista de endotoxinas delta - del sitio web de Crickmore et al. (citado en
la memoria descriptiva de la presente solicitud) Número de acceso es de la entrada en NCBI
Nombre N.° de acc. Autores Año Cepa original Comentario
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Crv1Aa2 AAA22552 Shibano et al 1985 Bt sotto
Crv1Aa3 BAA00257 Shimizu et al 1988 Bt aizawai IPL7
Crv1Aa4 CAA31886 Masson et al 1989 Bt entomocidus
Crv1Aa5 BAA04468 Udayasuriyan et al 1994 Bt Fu-2-7
Bt kurstaki NRD- Crv1Aa6 AAA86265 Masson et al 1994
12
Crv1Aa7 AAD46139 Osman et al 1999 Bt C12
Liu Secuencia de ADN
Crv1Aa8 126149 1996
solamente
Bt dendrolimus
Cry1Aa9 BAA77213 Nagamatsu et al 1999
T84A1
Bt kurstaki HD-1- Crv1Aa10 AAD55382 Hou and Chen 1999
02
Crv1Aa1 1 CAA70856 Tounsi et al 1999 Bt kurstaki
Crv1Aa12 AAP80146 Yao et al 2001 Bt Ly30
Crv1Aa13 AAM44305 Zhong et al 2002 Bt sotto
Cry1Aa14 AAP40639 en et al 2002 Sin publicar
Crv1Aa15 AAY66993 Sauka et al 2005 Bt INTA Mol-12
Cry1Ab1 AAA22330 Wabiko et al 1986 Bt berliner 1715
Crv1Ab2 AAA22613 Thorne et al 1986 Bt kurstaki
Crv1Ab3 AAA22561 Geiser et al 1986 Bt kurstaki HD1
Cry1Ab4 BAA00071 Kondo et al 1987 Bt kurstaki HD1
Crv1Ab5 CAA28405 Hofte et al 1986 Bt berliner 1715
Bt kurstaki NRD- Crv1Ab6 AAA22420 Hefford et al 1987
12
Cry1Ab7 CAA31620 Haider & Ellar 1988 Bt aizawai IC1
Cry1Ab8 AAA22551 Oeda et al 1987 Bt aizawai IPL7
Bt aizawai
Crv1Ab9 CAA38701 Chak & Jen 1993
HD133
Crv1Ab1 Q A29125 Fischhoff et al 1987 Bt kurstaki HD1
Crv1Ab 1 112419 Secuencia de ADN
Ely & Tippett 1995 Bt A20
solamente
Cry1Ab12 AAC64003 Silva-Werneck et al 1998 Bt kurstaki S93
Crv1Ab13 AAN76494 Tan et al 2002 Bt c005
Meza-Basso &
Crv1 Ab14 AAG16877 2000 Native Chilean Bt
Theoduloz
Crv1Ab15 AAO13302 Li et al 2001 Bt B-Hm-16
Crv1Ab16 AAK55546 Yu et al 2002 Bt AC-11
Cry1Ab17 AAT46415 Huang et al 2004 Bt WB9
Cry1Ab18 AAQ88259 Stobdan et al 2004 Bt
Crv1Ab19 AAW31761 Zhong et al 2005 Bt X-2
Crv1Ab20 ABB72460 Liu et al 2006 BtC008
Crv1Ab21 ABS18384 Swiecicka et al 2007 Bt IS5056
Crv1Ab22 ABW87320 Wu and Feng 2008 BtS2491Ab
CrylAb- AAK14336 Nagarathinam et al 2001 Bt kunthala RX24 Secuencia incierta similar
CrylAb- AAK14337 Nagarathinam et al 2001 Bt kunthala RX28 Secuencia incierta similar
CrylAb- AAK14338 Nagarathinam et al 2001 Bt kunthala RX27 Secuencia incierta similar
CrylAb- Secuencia
ABG88858 Lin et al 2006 Bt Iy4a3
similar insuficiente
CrylAd AAA22331 Adang et al 1985 Bt kurstaki HD73
Crv1Ac2 AAA22338 Von Tersch et al 1991 Bt kenyae
Crv1Ac3 CAA38098 Dardenne et al 1990 Bt BTS89A
Bt kurstaki
Cry1Ac4 AAA73077 Feitelson 1991
PS85A1
Bt kurstaki
Cry1Ac5 AAA22339 Feitelson 1992
PS81 GG
Bt kurstaki NRD- Cry1Ac6 AAA86266 Masson et al 1994
12
Crv1Ac7 AAB46989 Herrera et al 1994 Bt kurstaki HD73
Cry1Ac8 AAC44841 Ornólo et al 1997 Bt kurstaki HD73
Cry1Ac9 AAB49768 Gleave et al 1992 Bt DSIR732
Bt kurstaki YBT- CrvIAd O CAA05505 Sun 1997
1520
Makhdoom &
Crv1Ac11 CAA10270 1998
Riazuddin
Secuencia de ADN
Crv1Ac12 112418 Ely & Tippett 1995 Bt A20
solamente
Crv1Ac13 AAD38701 Qiao et al 1999 Bt kurstaki HD1
Crv1Ac14 AAQ06607 Yao et al 2002 Bt Ly30
Crv1Ac15 AAN07788 Tzeng et al 2001 Bt de Taiwán
Crv1Ac16 AAU87037 Zhao et al 2005 Bt H3
Crv1Ac17 AAX18704 Hire et al 2005 Bt kenyae HD549
Crv1Ac18 AAY88347 Kaur & Allam 2005 Bt SK-729
Crv1Ac19 ABD37053 Gao et al 2005 Bt C-33
Cn/1Ac20 ABB89046 Tan et al 2005
Crv1Ac21 AAY66992 Sauka et al 2005 INTA Mol-12
Crv1Ac22 ABZ01836 Zhang & Fang 2008 Bt W015-1
Crv1Ac23 CAQ30431 Kashyap et al 2008 Bt
Crv1 Ac24 ABL01535 Arango et al 2008 Bt 146-158-01
Sin vínculo al NCBI
Cry1 Ac25 FJ513324 Guan Peng et al 2008 Bt Tm37-6
julio 2009
Sin vinculo al NCBI
Cry1Ac26 FJ617446 Guan Peng et al 2009 BtTm41-4
julio 2009
Sin vinculo al NCBI Cry1Ac27 FJ617447 Guan Peng et al 2009 Bt Tm44-1B
julio 2009
Crv1Ac28 ACM90319 Lietal 2009 Bt Q-12
CrvIAcM AAA22340 Feitelson 1993 Btaizawai PS81I
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Cry1Ae1 AAA22410 Lee & Aronson 1991 Bt alesti
Crv1Af1 AAB82749 Kang et al 1997 Bt NT0423
Crv1Aq1 AAD46137 Mustafa 1999
Crv1Ah1 AAQ14326 Tan etal 2000
Crv1Ah2 ABB76664 Qi et al 2005 Bt alesti
Crv1Ai1 AA039719 Wang etal 2002
CrvIA- Bt kunthala
AAK14339 Nagarathinam et al
similar Secuencia incierta nags3
Bt thuringiensis
CAA29898 Brizzard & Whiteley 1988
HD2
Crv1Ba2 Bt entomocidus
CAA65003 Soetaert 1996
HD110
Crv1Ba3 AAK63251 Zhang et al 2001
Bt entomocidus
Cry1Ba4 AAK51084 Nathan et al 2001
HD9
Cry1Ba5 ABO20894 Song et al 2007 Bt sfw-12
Cry1Ba6 ABL60921 Martins et al 2006 Bt S601
Cry1Bb1 AAA22344 Donovan et al 1994 Bt EG5847
CrvIBd CAA86568 Bishop et al 1994 Bt morrisoni
Bt wuhanensis
Crv1Bd1 AAD10292 Kuoetal 2000
HD525
Crv1Bd2 AAM93496 Isakova et al 2002 Bt834
Crv1Be1 AAC32850 Payne et al 1998 Bt PS158C2
Crv1Be2 AAQ52387 Baum et al 2003
Sin vinculo al NCBI
Cry1Be3 FJ716102 Xiaodong Sun et al 2009
julio 2009
Cry1Bf1 CAC50778 Arnaut et al 2001
Crv1Bf2 AAQ52380 Baum et al 2003
Crv1Bg1 AAO39720 Wang et al 2002
Bt entomocidus
Crv1Ca1 CAA30396 Honee et al 1988
60.5
Cry1Ca2 CAA31951 Sanchis et al 1989 Bt aizawai 7.29
Cry1Ca3 AAA22343 Feitelson 1993 Bt aizawai PS81I
Bt entomocidus
Crv1Ca4 CAA01886 Van Mellaert etal 1990
HD110
Cry1Ca5 CAA65457 Strizhov 1996 Bt aizawai 7.29
Cry1Ca6 AAF37224 Yu et al 2000 Bt AF-2
Cry1Ca7 AAG50438 Aixing et al 2000 Bt J8
Cry1Ca8 AA 00264 Chen et al 2001 Bt c002
Crv1Ca9 AAL79362 Kaoetal 2003 BtG10-01A
Cry1Ca10 AAN16462 Lin et al 2003 Bt E05-20a
Crv1Ca11 AAX53094 Caietal 2005 Bt C-33
Crv1Cb1 M97880 Kalman et al 1993 Bt galleriae HD29 Secuencia de ADN solamente
Crv1Cb2 AAG35409 Song et al 2000 Bt c001
Crv1Cb3 ACD50894 Huangetal 2008 Bt 087
CrylCb- AAX63901 Thammasittirong et
similar al 2005 BtTA 76-1 Secuencia
insuficiente
Cry1Da1 CAA38099 Hofte et al 1990 Bt aizawai HD68
Cry1Da2 176415 Payne & Sick 1997 Secuencia de ADN solamente
Crv1Db1 CAA80234 Lambert 1993 Bt BTS00349A
Crv1Db2 AAK48937 Li et al 2001 Bt B-Pr-88
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Crv1Ea1 CAA37933 Visser et al 1990 Bt kenyae 4F1
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Crv1Eb1 AAA22346 Feitelson Bt aizawai
1993
PS81A2
Crv1Fa1 AAA22348 Chambers et al Bt aizawai
EG6346
Crv1Fa2 AAA22347 Feitelson 1993 Bt aizawai PS81I
Cry1Fb1 CAA80235 Lambert 1993 Bt BTS00349A
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INA67
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Cry Fb7 ACD50893 Huang et al 2008 Bt 087
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Cry1 Hb1 AAA79694 Koo et al 1995
BF190
Cryl H- AAF01213 Srifah et al Secuencia
1999 BUC291
similar insuficiente
Cryl Ia1 CAA44633 Tailor et al 1992 Bt kurstaki
Cn 1 Ia2 AAA22354 Gleave et al 1993 Bt kurstaki
Cryl Ia3 AAC36999 Shin et al 1995 Bt kurstaki HD1
Cryl Ia4 AAB00958 Kostichka et al 1996 Bt AB88
Ciy1 Ia5 CAA70124 Selvapandiyan 1996 Bt 61
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Cryl aa1166 FJ617448 Guan Peng et al 2009 Bt E-1 A
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Cryl b1 AAA82114 Shin et al 1995
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Cryl - Secuencia
ABG88859 Lin & Fang 2006 Bt Iy4a3
similar insuficiente
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Crv2Aa1 1 AAQ52384 Baum et al 2003
Cry2Aa12 ABI83671 Tan et al 2006 Bt Rpp39
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Crv2Ab3 AAG36762 Chen et al 1999 Bt BTC002
Crv2Ab4 AA013296 Li et al 2001 Bt B-Pr-88
Cry2Ab5 AAQ04609 Yao et al 2001 Bt Iy30
Crv2Ab6 AAP59457 Wang et al 2003 Bt WZ-7
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Cry2Ab10 EF157306 Lin et al 2006 Bt LyD
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Crv2Ac1 CAA40536 Aronson 1991 Bt Shanghai S1
Crv2Ac2 AAG35410 Song et al 2000
Crv2Ac3 AAQ52385 Baum et al 2003
Crv2Ac4 ABC95997 Huang et al 2006 Bt WB9
Cry2Ac5 ABC74969 Zhang et al 2005
Cry2Ac6 ABC74793 Xia et al 2006 Bt uhanensis
Crv2Ac7 CAL 18690 Saleem et al 2008 Bt SBSBT-1
Crv2Ac8 CAM09325 Saleem et al 2007 Bt CMBL-BT1
Crv2Ac9 CAM09326 Saleem et al 2007 Bt CMBL-BT2
Cry2Ac10 ABN15104 Bai et al 2007 Bt QCL-1
Cry2Ac1 1 CAM83895 Saleem et al 2007 Bt HD29
Crv2Ac12 CAM83896 Saleem et al 2007 Bt CMBL-BT3
Cry2Ad1 AAF09583 Choi et al 1999 Bt BR30
Crv2Ad2 ABC86927 Huang et al 2006 Bt WB10
Crv2Ad3 CAK29504 Saleem et al 2006 Bt 5_2AcT(1 )
Crv2Ad4 CAM32331 Saleem et al 2007 Bt CMBL-BT2
Crv2Ad5 CA078739 Saleem et al 2007 Bt HD29
Cry2Ae1 AAQ52362 Baum et al 2003
Crv2Af1 ABO30519 Beard et al 2007 Bt C81
Crv2Aq ACH91610 Zhu et al 2008 Bt JF19-2
Sin vínculo al NCBI
Cry2Ah EU939453 Zhang et al 2008 Bt
julio 2009
Crv2Ah2 ACL80665 Zhang et al 2009 Bt BRC-ZQL3
Sin vinculo al NCBI
Cry2A¡ FJ788388 Udayasuhyan et al 2009 Bt
julio 2009
Crv3Aa1 AAA22336 Herrnstadt et al 1987 Bt san diego
Crv3Aa2 AAA22541 Sekar et al 1987 Bt tenebrionis
Cry3Aa3 CAA68482 Hofte et al 1987
Crv3Aa4 AAA22542 McPherson et al 1988 Bt tenebrionis
Bt morrisoni
Cry3Aa5 AAA50255 Donovan et al 1988
EG2158
Cry3Aa6 AAC43266 Adams et al 1994 Bt tenebrionis
Cry3Aa7 CAB41411 Zhang et al 1999 Bt 22
Cry3Aa8 AAS79487 Gao and Cai 2004 Bt YM-03
Crv3Aa9 AAW05659 Bulla and Candas 2004 Bt UTD-001
Cry3Aa10 AAU2941 1 Chen et al 2004 Bt 886
Bt tenebrionis
Crv3Aa1 1 AAW82872 Kurt et al 2005
Mm2
Cry3Aa12 ABY49136 Sezen et al 2008 Bt tenebrionis
Crv3Ba1 CAA34983 Sick et al 1990 Bt tolworthi 43F
Cry3Ba2 CAA00645 Peferoen et al 1990 Bt PGSI208
Crv3Bb1 AAA22334 Donovan et al 1992 Bt EG4961
Crv3Bb2 AAA7 198 Donovan et al 1995 Bt EG5144
Secuencia de ADN
Crv3Bb3 115475 Peferoen et al 1995
solamente
Bt kurstaki
Cry3Ca1 CAA42469 Lambert et al 1992
Btl109P
Cry4Aa1 CAA68485 Ward & Ellar 1987 Bt israelensis
Bt israelensis
Cry4Aa2 BAA00179 Sen et al 1988
HD522
Cry4Aa3 CAD30148 Berry et al 2002 Bt israelensis
Crv4A- Secuencia
AAY96321 Mahalakshmi et al 2005 Bt LDC-9
similar insuficiente
Chungjatpornchai et Bt israelensis
Cry4Ba1 CAA30312 1988
al 4Q2-72
Cry4Ba2 CAA301 14 Tungpradubkul et al 1988 Bt israelensis
Cry4Ba3 AAA22337 Yamamoto et al 1988 Bt israelensis
Crv Ba4 BAA00178 Sen et al 1988 Bt ¡sraelensis
HD522
Crv4Ba5 CAD30095 Berry et al 2002 Bt israelensis
Crv4Ba- similar ABC47686 Mahalakshmi et al 2005 Bt LDC-9 Secuencia
insuficiente
Cry4Ca1 EU646202 Shu et al 2008 Sin vínculo al NCBI julio 2009
Cry4Cb1 FJ403208 Jun & Furong 2008 Bt HS18-1 Sin vínculo al NCBI julio 2009
Cry4Cb2 FJ597622 Jun & Furong 2008 Sin vinculo al NCBI
Bt Ywc2-8
julio 2009
Cry4Cc1 FJ403207 Jun & Furong 2008 Bt MC28 Sin vínculo al NCBI julio 2009
Bt
Cry5Aa1 AAA67694 Narva et al 1994 darmstadiensis
PS17
Bt
Crv5Ab1 AAA67693 Narva et al 1991 darmstadiensis
PS17
Crv5Ac1 I34543 Payne et al 1997 Secuencia de ADN solamente
Crv5Ad1 ABQ82087 Lenane et al 2007 Bt L366
Crv5Ba1 AAA68598 Foncerrada & Narva 1997 Bt PS86Q3
Crv5Ba2 ABW88932 Guo et al 2008 YBT 1518
Crv6Aa1 AAA22357 Narva et al 1993 Bt PS52A1
Crv6Aa2 AAM46849 Bai et al 2001 YBT 1518
Crv6Aa3 ABH03377 Jia et al 2006 Bt 96418
Crv6Ba1 AAA22358 Narva et al 1991 Bt PS69D1
Crv7Aa1 AAA22351 Lambert et al Bt galleriae
1992
PGSI245
Crv7Ab1 AAA21 120 Narva & Fu 1994 Bt dakota HD511
Bt
Crv7Ab2 AAA21121 Narva & Fu 1994 kumamotoensis
867
Crv7Ab3 ABX24522 Song et al 2008 Bt WZ-9
Cry7Ab4 EU380678 Shu et al 2008 Bt Sin vinculo al NCBI julio 2009
Crv7Ab5 ABX79555 Aguirre-Arzola et al Bt monterrey
2008
GM-33
Crv7Ab6 ACI44005 Deng et al 2008 Bt HQ122
Cry7Ab7 FJ940776 Wang et al 2009 Sin vínculo al NCBI septiembre 2009
Cry7Ab8 GU145299 Feng Jing 2009 Sin vinculo al NCBI noviembre 2009
Crv7Ba1 ABB70817 Zhang et al Bt
2006
huazhongensis
Crv7Ca1 ABR67863 Gao et al 2007 Bt ???-13
Crv7Da1 ACQ99547 Yi et al 2009 Bt LH-2
Bt
Crv8Aa1 AAA21 1 17 Narva & Fu 1992
kumamotoensis
Sin vínculo al NCBI
Cry8Ab1 EU044830 Cheng et al 2007 Bt B-JJX
julio 2009
Bt
Crv8Ba1 AAA21 1 18 Narva & Fu 1993
kumamotoensis
Crv8Bb1 CAD57542 Abad et al 2002
Crv8Bc1 CAD57543 Abad et al 2002
Bt japonensis
Crv8Ca1 AAA21 119 Sato et al. 1995
Buibui
Crv8Ca2 AAR98783 Shu et al 2004 Bt HBF-1
Sin vinculo al NCBI
Cry8Ca3 EU625349 Du et al 2008 Bt FTL-23
julio 2009
Crv8Da1 BAC07226 Asano et al 2002 Bt galleriae
Secuencia de ADN
Crv8Da2 BD133574 Asano et al 2002 Bt
solamente
Secuencia de ADN
Crv8Da3 BD133575 Asano et al 2002 Bt
solamente
Crv8Db1 BAF93483 Yamaguchi et al 2007 Bt BBT2-5
Crv8Ea1 AAQ73470 Fuping et al 2003 Bt 185
Sin vinculo al NCBI
Cry8Ea2 EU047597 Liu et al 2007 Bt B-DLL
julio 2009
También
Crv8Fa1 AAT48690 Shu et al 2004 Bt 185
AAW81032
Crv8Ga1 AAT46073 Shu et al 2004 Bt HBF-18
Crv8Ga2 ABC42043 Yan et al 2008 Bt 145
Sin vinculo al NCBI
Cry8Ga3 FJ198072 Xiaodong et al · 2008 Bt FCD1 14
julio 2009
Sin vínculo al NCBI
Cry8Ha1 EF465532 Fuping et al 2006 Bt 185
julio 2009
Sin vínculo al NCBI
Cry8la1 EU381044 Yan et al 2008 Bt su4 °
julio 2009
Sin vínculo al NCBI
Cry8Ja1 EU625348 Du et al 2008 Bt FPT-2
julio 2009
Sin vínculo al NCBI
Cry8Ka1 FJ422558 Quezado et al 2008
julio 2009
Crv8Ka2 ACN87262 Noguera & Ibarra 2009 Bt kenyae
Crv8- Secuencia de ADN
FJ770571 Noguera & Ibarra 2009 Bt canadensis
similar solamente
Crv8- ABS53003 Mangena et al 2007 Bt
similar
Crv9Aa1 CAA41 122 Shevelev et al 1991 Bt galleriae
Crv9Aa2 CAA41425 Gleave et al 1992 Bt DSIR517
Sin vínculo al NCBI
Cry9Aa3 GQ249293 Su et al 2009 Bt SC5(D2)
julio 2009
Sin vínculo al NCBI
Cry9Aa4 GQ249294 Su et al 2009 Bt T03C001
julio 2009
Crv9Aa Secuencia
AAQ52376 Baum et al 2003
similar incompleta
Crv9Ba1 CAA52927 Shevelev et al 1993 Bt galleriae
Crv9Bb1 AAV28716 Silva-Werneck et al 2004 Bt japonensis
Crv9Ca1 CAA85764 Lamber et al 1996 Bt tolworthi
Cn 9Ca2 AAQ52375 Baum et al 2003
Bt japonensis
Crv9Da1 BAA19948 Asano 1997
N141
Crv9Da2 AAB97923 Wasano & Ohba 1998 Bt japonensis
Sin vínculo al NCBI
Cry9Da3 GQ249295 Su et al 2009 Bt T03B001
julio 2009
Sin vinculo al NCBI
Cry9Da4 GQ249297 Su et al 2009 Bt T03B001
julio 2009
Bt kurstaki
Crv9Db1 AAX78439 Flannagan & Abad 2005
DP1019
Bt aizawai SSK- Crv9Ea1 BAA34908 Midoh & Oyama 1998
10
Crv9Ea2 AAO12908 Li et al 2001 Bt B-Hm-16
Crv9Ea3 ABM21765 Lin et al 2006 Bt lyA
Crv9Ea4 ACE88267 Zhu et al 2008 Bt ywc5-4
Crv9Ea5 ACF04743 Zhu et al 2008 Bts
Crv9Ea6 ACG63872 Liu & Guo 2008 Bt 11
Sin vinculo al NCBI
Cry9Ea7 FJ380927 Sun et al 2008
julio 2009
Sin vinculo al NCBI
Cry9Ea8 GQ249292 Su et al 2009 GQ249292
julio 2009
Crv9Eb1 CAC50780 Arnaut et al 2001
Sin vinculo al NCBI
Cry9Eb2 GQ249298 Su et al 2009 Bt T03B001
julio 2009
Crv9Ec1 AAC63366 Wasano et al 2003 Bt galleriae
Bt kurstaki
Crv9Ed1 AAX78440 Flannagan & Abad 2005
DP1019
Sin vinculo al NCBI
Cry9Ee1 GQ249296 Su et al 2009 Bt T03B001
agosto 2009
Cry9- Secuencia
AAC63366 Wasano et al 1998 Bt galleriae
similar insuficiente
Crv10Aa1 AAA22614 Thorne et al 1986 Bt israelensis
Bt israelensis Secuencia de ADN
Crv10Aa2 E00614 Aran & Toomasu 1996
ONR-60A solamente
Crv10Aa3 CAD30098 Berry et al 2002 Bt israelensis
Crvl OA- Secuencia
DQ167578 Mahalakshmi et al 2006 Bt LDC-9
similar incompleta
Crv1 1Aa1 AAA22352 Donovan et al 1988 Bt israelensis
Crv1 1Aa2 AAA2261 1 Adams et al 1989 Bt israelensis
Crv1 1Aa3 CAD30081 Berry et al 2002 Bt israelensis
Crv1 1Aa- DQ 166531 Mahalakshmi et al 2007 Secuencia
Bt LDC-9
similar incompleta
Bt jegathesan
Cry1 1 Ba1 CAA60504 Delecluse et al 1995
367
Cry1 1 Bb1 AAC97162 Orduz et al 1998 Bt medellin
Crv12Aa1 AAA22355 Narva et al 1991 Bt PS33F2
Crv13Aa1 AAA22356 Narva et al 1992 Bt PS63B
Crv14Aa1 AAA21516 Narva et al 1994 Bt sotto PS80JJ1
Crv15Aa1 AAA22333 Brown & Whiteley 1992 Bt thompsoni
Crv16Aa1 Cb malaysia
CAA63860 Barloy et al 1996
CH18
Cb malaysia
Crv17Aa1 CAA67841 Barloy et al 1998
CH18
Cry18Aa1 Paenibacillus
CAA67506 Zhang et al 1997
popilliae
Paenibacillus
Crv18Ba1 AAF89667 Patel et al 1999
popilliae
Paenibacillus
Crv18Ca1 AAF89668 Patel et al 1999
popilliae
Bt jegathesan
Crv19Aa1 CAA68875 Rosso & Delecluse 1996
367
Crv19Ba1 BAA32397 Hwang et al 1998 Bt higo
Cry20Aa1 AAB93476 Lee & Gilí 1997 Bt fukuokaensis
Crv20Ba1 ACS93601 Noguera & Ibarra 2009 Bt higo LBIT-976
Crv20- Secuencia de ADN
GQ144333 Yi et al 2009 Bt Y-5
similar solamente
Crv21 Aa1 I32932 Secuencia de ADN
Payne et al 1996
solamente
Crv21Aa2 I66477 Secuencia de ADN
Feitelson 1997
solamente
Crv21 Ba1 BAC06484 Sato & Asano 2002 Bt roskildiensis
Cry22Aa1 134547 Secuencia de ADN
Payne et al 1997
solamente
Crv22Aa2 CAD43579 Isaac et al 2002 Bt
Cry22Aa3 ACD9321 1 Du et al 2008 Bt FZ-4
Crv22Ab1 AAK50456 Baum et al 2000 Bt EG4140
Cry22Ab2 CAD43577 Isaac et al 2002 Bt
Crv22Ba1 CAD43578 Isaac et al 2002 Bt
Binaria con
Crv23Aa1 AAF76375 Donovan et al 2000 Bt
Cry37Aa1
Crv24Aa1 AAC61891 Kawalek and Gilí 1998 Bt jegathesan
Crv24Ba1 BAD32657 Ohgushi et al 2004 Bt sotto
Cry24Ca1 CAJ43600 Beron & Salerno 2005 Bt FCC-41
Cry25Aa1 AAC61892 Kawalek and Gilí 1998 Bt jegathesan
Wojciechowska et Bt finitimus B- Crv26Aa1 AAD25075 1999
al 1166
Crv27Aa1 BAA82796 Saitoh 1999 Bt higo
Cry28Aa1 AAD24189 Wojciechowska et al 1999 Bt finitimus B- 1161
Crv28Aa2 AAG00235 Moore and Debro 2000 Bt finitimus
Cry29Aa1 CAC80985 Delecluse et al 2000 Bt medellin
Crv30Aa1 CAC80986 Delecluse et al 2000 Bt medellin
Crv30Ba1 BAD00052 Ito et al 2003 Bt entomocidus
Crv30Ca1 BAD67157 Ohgushi et al 2004 Bt sotto
Crv30Ca2 ACU24781 Sun and Park Bt jegathesan
2009
367
Cry30Da1 EF095955 Shu et al 2006 Bt Y41 Sin vínculo al NCBI julio 2009
Crv30Db1 BAE80088 Kishida et al Bt aizawai BUN1 - 2006
14
Crv30Ea1 ACC95445 Fang et al 2007 Bt S2160-1
Cry30Ea2 FJ499389 Jun et al 2008 Bt Ywc2-8 Sin vínculo al NCBI julio 2009
Crv30Fa1 ACI22625 Tan et al 2008 Bt MC28
Cry30Ga1 ACG60020 Zhu et al 2008 Bt HS18-1
Crv31Aa1 BAB 1 1757 Saitoh & izuki 2000 Bt 84-HS-1 -1 1
Cry31Aa2 AAL87458 Jung and Cote 2000 Bt 15
Cry31Aa3 BAE79808 Uemori et al 2006 Bt B0195
Cry3 Aa4 BAF32571 Yasutake et al 2006 Bt 79-25
Crv31Aa5 BAF32572 Yasutake et al 2006 Bt 92-10
Crv31Ab1 BAE79809 Uemori et al 2006 Bt B0195
Crv31Ab2 BAF32570 Yasutake et al 2006 Bt 31-5
Crv31Ac1 BAF34368 Yasutake et al 2006 Bt 87-29
Balasubramanian et
Crv32Aa1 AAG3671 1
al 2001 Bt yunnanensis
Crv32Ba1 BAB78601 Takebe et al 2001 Bt
Crv32Ca1 BAB78602 Takebe et al 2001 Bt
Crv32Da1 BAB78603 Takebe et al 2001 Bt
Cry33Aa1 AAL26871 Kim et al 2001 Bt dakota
Crv34Aa1 AAG50341 Ellis et al 2001 Binaria con
Bt PS80JJ1
Cry35Aa1
Crv34Aa2 AAK64560 Rupar et al 2001 Binaria con
Bt EG5899
Cry35Aa2
Crv34Aa3 AAT29032 Schnepf et al 2004 Binaria con
Bt PS69Q
Cry35Aa3
Crv34Aa4 AAT29030 Schnepf et al 2004 Binaria con
Bt PS185GG
Cry35Aa4
Crv34Ab1 AAG41671 Moellenbeck et al 2001 Binaria con
Bt PS149B1
Cry35Ab1
Crv34Ac1 AAG50118 Ellis et al 2001 Binaria con
Bt PS167H2
Cry35Ac1
Crv34Ac2 AAK64562 ! Rupar et al 2001 Bt EG9444 Binaria con
Cry35Ab2
Crv34Ac3 AAT29029 i Schnepf et al 2004 Binaria con
Bt KR1369
Cry35Ab3
Crv34Ba1 AAK64565 > Rupar et al 2001 Bt EG4851 Binaria con
Cry35Ba1
Crv34Ba2 AAT29033 Schnepf et al 2004 Binaria con
Bt PS201 L3
Cry35Ba2
Crv34Ba3 AAT29031 Schnepf et al 2004 Binaria con
Bt PS201 HH2
Cry35Ba3
Crv35Aa1 AAG50342 ! Ellis et al 2001 Bt PS80JJ1 Binaria con
Cry34Aa1
Crv35Aa2 AAK64561 Rupar et al 2001 Bt EG5899 Binaria con
Cry34Aa2
Crv35Aa3 AAT29028 Schnepf et al 2004 Bt PS69Q Binaria con
Cry34Aa3
Crv35Aa4 AAT29025 Schnepf et al 2004 Binaria con
Bt PS185GG
Cry34Aa4
Crv35Ab1 AAG41672 Moe!lenbeck et al 2001 Binaria con
Bt PS149B1
Cry34Ab1
Crv35Ab2 AAK64563 Rupar et al 2001 Bt EG9444 Binaria con
Cry34Ac2
Crv35Ab3 AY536891 AAT29024 2004 Binaria con
Bt KR1369
Cry34Ab3
Crv35Ac1 AAG50117 Ellis et al 2001 Bt PS167H2 Binaria con
Cry34Ac1
Crv35Ba1 AAK64566 Rupar et al 2001 Binaria con
Bt EG4851
Cry34Ba1
Crv35Ba2 AAT29027 Schnepf et al 2004 Binaria con
Bt PS201 L3
Cry34Ba2
Crv35Ba3 AAT29026 Schnepf et al 2004 Binaria con
Bt PS201 HH2
Cry34Ba3
Crv36Aa 1 AAK64558 Rupar et al 2001 Bt
Crv37Aa 1 AAF76376 Donovan et al 2000 Bt Binaria con
Cry23Aa
Crv38Aa 1 AAK64559 Rupar et al 2000 Bt
Crv39Aa 1 BAB72016 Ito et a! 2001 Bt aizawai
Crv40Aa1 BAB72018 Ito et al 2001 Bt aizawai
Crv40Ba1 BAC77648 Ito et al 2003 Bun1 -14
Cry40Ca 1 EU381045 Shu et al 2008 Bt Y41 Sin vínculo a! NCBI julio 2009
Cry40Da1 ACF15199 Zhang et al 2008 Bt S2096-2
Crv41Aa1 BAD35157 Yamashita et al 2003 Bt A1462
Crv41 Ab1 BAD35163 Yamashita et al 2003 Bt A 1462
Crv42Aa1 BAD35166 Yamashita et al 2003 Bt A1462
Crv43Aa1 Yokoyama and
BAD15301 2003 P. lentimorbus
Tanaka semadara
Crv43Aa2 BAD95474 Nozawa 2004 P. popilliae
popilliae
Cry43Ba1 BAD15303 °kovama and
Tanaka 2003 P. lentimorbus
semadara
Cry43- BAD15305 Yoko ama and
similar 2003 P. lentimorbus
Tanaka semadara
Crv44Aa BAD08532 Ito et al 2004 Bt entomocidus
INA288
Crv45Aa BAD22577 Okumura et al 2004 Bt 89-T-34-22
Crv46Aa BAC79010 Ito et al 2004 Bt dakota
Cry46Aa2 BAG68906 Ishikawa et al 2008 Bt A1470
Crv46Ab BAD35170 Yamagiwa et al 2004 Bt
Cry47Aa AAY24695 Kongsuwan et al 2005 Bt CAA890
Cry48Aa CAJ 18351 Jones and Berry 2005 Bs IAB59 Binaria con 9Aa
Cry48Aa2 CAJ86545 Jones and Berry 2006 Bs 47-6B Binaria con 49Aa2
Cry48Aa3 CAJ86546 Jones and Berry 2006 Bs NHA15b Binaria con 49Aa3
Cry48Ab CAJ86548 Jones and Berry 2006 Bs LP1G Binaria con 49Ab1
Crv48Ab2 CAJ86549 Jones and Berry 2006 Bs 2173 Binaria con 49Aa4
Cry49Aa CAH56541 Jones and Berry 2005 Bs IAB59 Binaria con 48Aa
Cry49Aa2 CAJ86541 Jones and Berry 2006 Bs 47-6B Binaria con 48Aa2
Cry49Aa3 CAJ86543 Jones and Berry 2006 BsNHA15b Binaria con 48Aa3
Cry49Aa4 CAJ86544 Jones and Berry 2006 Bs 2173 Binaria con 48Ab2
Cry49Ab1 CAJ86542 Jones and Berry 2006 Bs LP1G Binaria con 48Ab1
Cry50Aa BAE86999 Ohgushi et al 2006 Bt sotto
Cry51Aa1 ABI14444 eng et al 2006 Bt F14-1
Cry52Aa1 EF613489 Song et al 2007 Bt Y41 Sin vinculo al NCBI julio 2009
Cry52Ba1 FJ361760 Jun et al 2008 Bt BM59-2 Sin vínculo al NCBI julio 2009
Cry53Aa1 EF633476 Song et al 2007 Bt Y41 Sin vinculo al NCBI julio 2009
Cry53Ab1 FJ361759 Jun et al 2008 Bt C28 Sin vínculo al NCBI julio 2009
Crv54Aa1 ACA52194 Tan et al 2009 Bt C28
Cry55Aa1 ABW88931 Guo et al 2008 YBT 1518
Crv55Aa2 AAE33526 Bradfisch et al 2000 BT Y41
Cry56Aa1 FJ597621 Jun & Furong 2008 Bt Ywc2-8 Sin vínculo al NCBI julio 2009
Cry56Aa2 GQ483512 Guan Peng et al 2009 Bt G7-1 Sin vínculo al NCBI agosto 2009
Cry57Aa1 ANC87261 Noguera & Ibarra 2009 Bt kim
Cry58Aa1 ANC87260 Noguera & Ibarra 2009 Bt entomocidus
Crv59Aa1 ACR43758 Noguera & Ibarra 2009 Bt kim LBIT-980
Claims (23)
1 . Una planta transgénica que comprende ADN que codifica una proteína insecticida CryIAb y ADN que codifica una proteína insecticida CryI Be.
2. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha planta comprende adicionalmente ADN que codifica una tercera proteína insecticida, tercera proteína que se selecciona del grupo integrado por Cry2A, Cry l y DIG-3.
3. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque dicha planta comprende adicionalmente ADN que codifica una proteína CryI Fa insecticida, y ADN que codifica una cuarta proteína insecticida seleccionada del grupo integrado por CryI Fa, Vip3Ab, CryI Ca y CryI E
4. Semillas de una planta de cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
5. Un campo de plantas que comprende plantas refugio no Bt y una pluralidad de plantas de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dichas plantas de refugio comprenden menos del 40% de todas las plantas cultivadas en dicho campo.
6. El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio comprenden menos del 30% de todas las plantas cultivadas en dicho campo.
7. El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio comprenden menos del 20% de todas las plantas cultivadas en dicho campo.
8. El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio comprenden menos del 10% de todas las plantas cultivadas en dicho campo.
9. El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio comprenden menos del 5% de todas las plantas cultivadas en dicho campo.
10. El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas de refugio están dispuestas en bloques o en franjas.
1 1. Una mezcla de semillas que comprende semillas refugio de plantas refugio no Bt, y una pluralidad de semillas de la reivindicación 4, en donde dichas semillas de refugio comprenden menos del 40% de todas las semillas de la mezcla.
12. La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizada además porque dichas semillas de refugio comprenden menos del 30% de todas las semillas de la mezcla.
13. La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dichas semillas de refugio comprenden menos del 20% de todas las semillas de la mezcla.
14. La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizada además porque dichas semillas de refugio comprenden menos del 10% de todas las semillas de la mezcla.
15. La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizada además porque dichas semillas de refugio comprenden menos del 5% de todas las semillas de la mezcla.
16. Un método para manejar el desarrollo de la resistencia a una toxina Cry en un insecto, método que comprende plantar semillas para producir un campo de plantas de cualquiera de las reivindicaciones 5-10.
17. Un campo de cualquiera de las reivindicaciones 5-10, en donde dichas plantas ocupan más de 10 acres (~4.047 ha).
18. Una planta de cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en donde dicha planta es seleccionada del grupo integrado por maíz, soja y algodón.
19. La planta de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada además porque dicha planta es una planta de maíz.
20. Una célula vegetal de una planta de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicha célula vegetal comprende dicho ADN que codifica dicha proteína insecticida CryI Be y dicho ADN que codifica dicha proteína insecticida CryIAb, en donde dicha proteína insecticida CryI Be es por lo menos 99% idéntica con la SEQ ID NO:1 , y dicha proteína insecticida CryIAb es por lo menos 99% idéntica con la SEQ ID NO:2.
21. Una planta de cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en dode dicha proteína insecticida CryI Be comprende SEQ ID NO: 1 y dicha proteína insecticida CryIAb comprende SEQ ID NO:2.
22. Un método para producir la célula vegetal de la reivindicación 20.
23. Un método para controla un insecto perforador del maíz europeo al poner en contacto dicho insecto con una proteína insecticida CryI Be y una proteína insecticida CryIAb.
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