MX2012007121A

MX2012007121A - Uso combinado de proteinas cry1ca y cry1fapara el manejo de resistencia de insectos.

Info

Publication number: MX2012007121A
Application number: MX2012007121A
Authority: MX
Inventors: Thomas Meade; Joel J Sheets; Kenneth Narva; Nicholas P Storer; Aaron T Woosley; Stephanie L Burton
Original assignee: Dow Agrosciences Llc
Priority date: 2009-12-16
Filing date: 2010-12-16
Publication date: 2012-10-09
Also published as: BR112012014801A8; CL2012001626A1; DK2512222T3; PL2512222T3; IL220341A0; US9567602B2; PH12012501424A1; BR112012014801A2; KR20120096571A; MX354904B; US20120317681A1; BR112012014801B1; ES2663283T3; AU2010330917A1; CN102821596B; EP2512222B1; RS57105B1; CN102821596A; WO2011075588A1; AU2010330917B2

Abstract

La presente invención incluye métodos y plantas para controlar insectos lepidópteros, comprendiendo dichas plantas una proteína insecticida Cry1Fa y una proteína insecticida Cry1Ca, en combinación, para retardar o prevenir el desarrollo de resistencia por el o los insectos.

Description

USO COMBINADO DE PROTEÍNAS CRY1CA Y CRY1 FA PARA EL MANEJO DE LA RESISTENCIA DE INSECTOS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los seres humanos cultivan maíz para aplicaciones alimenticias y energéticas. Los seres humanos también cultivan muchos otros cultivos, incluyendo soja y algodón. Los insectos comen y dañan las plantas y de ese modo los esfuerzos humanos son socavados. Se gastan miles de millones de dólares por año para controlar las pestes de insectos y se pierden miles de millones adicionales por el daño que causan. Los insecticidas químicos orgánicos sintéticos han sido las herramientas principales empleadas para controlar pestes de insectos pero los insecticidas biológicos, tales como las proteínas insecticidas derivadas de Bacillus thuringiensis (Bt), han jugado un rol importante en algunas áreas. La capacidad de producir plantas resistentes a insectos a través de la transformación con genes de proteínas insecticidas Bt ha revolucionado la agricultura moderna y ha resaltado la importancia y el valor de las proteínas insecticidas y sus genes.

Se han empleado diversas proteínas Bt para crear las plantas transgénicas resistentes a insectos que han sido exitosamente registradas y comercializadas hasta la fecha. Estas incluyen CryIAb, CryIAc, CryI F y Cry3Bb en maíz, CryIAc y Cry2Ab en algodón, y Cry3A en papa.

Los productos comerciales que expresan estas proteínas expresan una única proteína excepto en los casos donde el espectro insecticida combinado de 2 proteínas es deseado (por ej., CrylAb y Cry3Bb en maíz combinado para proporcionar resistencia a pestes lepidópteras y gusano de la raíz, respectivamente) o donde la acción independiente de las proteínas las hace útiles como una herramienta para retardar el desarrollo de resistencia en poblaciones de insectos susceptibles (por ej., CrylAc y Cry2Ab en algodón combinado para proporcionar manejo de resistencia para el gusano del brote del tabaco).

Es decir, algunas de las cualidades de las plantas transgénicas resistentes a insectos que han conducido a una rápida y global adopción de esta tecnología también dan origen a la preocupación de que las poblaciones de pestes desarrollarán resistencia a las proteínas insecticidas producidas por estas plantas. Se han sugerido diversas estrategias para preservar la utilidad de características de resistencia a insectos basadas en Bt las cuales incluyen implementar proteínas a una dosis elevada en combinación con un refugio, y alternación con, o uso conjunto de, diferentes toxinas (McGaughey et al. (1998), "B.t. Resistance Management," Nature Biotechnol. 16:144-146).

Las proteínas seleccionadas para utilizar en una pila de IRM (siglas correspondientes a Manejo de Resistencia a Insectos) necesitan ejercer su efecto insecticida independientemente de modo que la resistencia desarrollada a una proteína no confiera resistencia a la segunda proteína (es decir, no hay resistencia cruzada a las proteínas). Si, por ejemplo, una población de pestes seleccionada para resistencia a la "Proteína A" es sensible a la "Proteína B", uno concluiría que no existe resistencia cruzada y que una combinación de Proteína A y Proteína B sería eficaz para retardar la resistencia a la Proteína A sola.

En ausencia de poblaciones de insectos resistentes, se pueden realizar evaluaciones basadas en otras características que se presume que están relacionadas con el mecanismo de acción y potencial de resistencia cruzada. La utilidad de la unión mediada por el receptor en la identificación de proteínas insecticidas que probablemente no exhiban resistencia cruzada ha sido sugerida (van Mellaert et al. 1999). El pronosticador clave de la falta de resistencia cruzada inherente a este método es que las proteínas insecticidas no compiten por receptores en una especie de insecto sensible.

En el caso en que dos toxinas Bt compitan por el mismo receptor, entonces si ese receptor muta en ese insecto de modo que una de las toxinas no se una más a ese receptor y por ende ya no sea insecticida contra el insecto, podría darse el caso que el insecto también será resistente a la segunda toxina (que está unida competitivamente al mismo receptor). Es decir, se dice que el insecto es resistente en forma cruzada a ambas toxinas Bt. Sin embargo, si dos toxinas se unen a dos receptores diferentes, esto podría ser un indicio de que el insecto no sería simultáneamente resistente a esas dos toxinas.

CryI Fa es útil para controlar muchas especies de pestes lepidópteras incluyendo al taladrador del maíz europeo (ECB; Ostrinia nubilalis (Hübner)) y el gusano cogollero (FAW siglas correspondientes a "fall armyworm"; Spodoptera frugiperda), y es activa contra el taladrador de la caña de azúcar (SCB; Diatraea saccharalis).

La proteína CryI Fa, como es producida en plantas de maíz que contienen el evento TC 507, es responsable de una característica de resistencia a insectos líder en la industria para el control de FAW. CryI Fa es adicionalmente empleada en los productos Herculex®, SmartStax™, y WideStrike™.

La capacidad de conducir estudios de unión al receptor (competitivos u homólogos) utilizando la proteína CryI Fa es limitada debido a que la técnica más común disponible para proteínas de etiqueta para la detección en ensayos de unión al receptor inactiva la actividad insecticida de la proteína CryI Fa.

Toxinas Cry adicionales son enlistadas en el sitio web del comité de nomenclaturas B.t. oficial (Crickmore et al:, lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/). Ver el Apéndice A, adjunto. Existen actualmente casi 60 grupos principales de toxinas "Cry" (Cry1-Cry59), con toxinas Cyt adicionales y toxinas VIP y similares. Muchos de cada grupo numérico tienen subgrupos en letra mayúscula, y los subgrupos en letra mayúscula tienen sub-subgrupos en letra minúscula. (Cry1 tiene A-L, y CryIA tiene a-i, por ejemplo).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en parte al sorprendente descubrimiento de que una población de gusano cogollero {Spodoptera frugiperda; FAW) seleccionada para resistencia a la actividad insecticida de la proteína CryI Fa no es resistente a la actividad insecticida de la proteína CryI Ca. Como el experto en la técnica reconocerá con el beneficio de esta descripción, las plantas que expresan estas dos proteínas insecticidas, o sus porciones insecticidas, serán útiles para retardar o prevenir el desarrollo de resistencia a cualquiera de estas proteínas insecticidas por sí solas.

La presente invención es también respaldada por el descubrimiento de que CryI Fa y CryI Ca no compiten entre sí por la unión a receptores intestinales de FAW (o de Diatraea saccharalis (taladrador de la caña de azúcar; SCB (siglas correspondientes a "sugarcane borer")).

La presente invención se refiere además en parte a pilas triples o "pirámides" de tres (o más) toxinas, siendo las toxinas CryI Fa y Cryl C el par de base. Una pirámide preferida proporciona por lo menos dos proteínas que proporcionan actividad resistente no cruzada contra dos pestes - FAW y el ECB (taladrador del maíz europeo (European corn borer); Ostrinia nubilalis): CryI Fa más CryICa más una o más toxinas anti-ECB tal como CryIAb. En algunas modalidades de pirámide preferidas, las toxinas seleccionadas tienen tres modalidades de acción separadas contra el FAW. Las combinaciones preferidas de pirámides son CryI Fa más CryI Ca más otra toxina/gen seleccionado del grupo formado por Vip3Ab, Cryl D, Cry Be, y Cry E. Las plantas (y área en acres plantada con dichas plantas) que producen estas tres toxinas son incluidas dentro del alcance de la presente invención. También pueden agregarse toxinas/ genes adicionales, pero estas pilas triples particulares proporcionarían, de acuerdo con la presente invención, en forma ventajosa y sorprendente, tres modalidades de acción contra el FAW. Esto puede ayudar a reducir o eliminar el requerimiento de áreas en acres de refugio. La presente invención se refiere además, en general, al uso de tres proteínas insecticidas (proteínas Cry en algunas modalidades preferidas) que no compiten entre sí contra una peste objetivo única.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS SEQ ID NO:1 CryI Ca núcleo/proteína quimérica de protoxina CryIAb 1164 aa (DIG-152) (versión pMYC2547) SEQ ID NO:2 segunda proteína quimérica de protoxina CryICa núcleo/CryIAb 1 164 aa (DIG-109) (versión en maíz) SEQ ID NO:3 CDS optimizada para maíz que codifica DIG-109 3492 pb BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1 : Valoraciones del daño por alimentación de trozos de hojas de maíz desafiados in vitro con larvas neonatas de gusano cogollero (FAW) y gusano cogollero resistente a Cryl F (rFAW). Plantas TO transgénicas seleccionadas después de transformación con pDAS5162 fueron divididas en dos grupos mediante exploración con inmunotransferencia utilizando anticuerpo DIG152RPC1 : plantas que no producen DIG-109 (en el lado izquierdo de la Figura), y aquéllas que tienen niveles detectables de DIG-109 (en el centro de la Figura). Las plantas positivas en DIG-109 son puntuadas por el nivel de expresión (de izquierda a derecha; de más bajo a más alto). El análisis HP para DSM2 fue completado en 36 líneas transformadas con pDAS5162. Un evento de integración simple, definido como 1-2 copias del gen, fue detectado en 95% de las muestras. Los resultados de bioensayos de plantas Control Positivas y Negativas se muestran en el lado derecho de la Figura.

Figura 2: Competición por la unión a BBMV por la toxina de núcleo CryI Fa, toxina de núcleo CryICa, y toxina de núcleo CryICa etiquetada con 1251.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Según lo informado en esta invención, la toxina CryI Ca producida en maíz transgénico y en otras plantas (algodón y soja, por ejemplo) es muy eficaz para controlar al gusano cogollero (FAW; Spodoptera frugiperda) que ha desarrollado resistencia a la actividad de CryI Fa. Por lo tanto, la presente invención se refiere, en parte, al sorprendente descubrimiento de que el gusano cogollero resistente a CryI Fa es susceptible (es decir, no es resistente en forma cruzada) a CryI Ca.

La presente invención se refiere también, en parte, al sorprendente descubrimiento de que la toxina CryI Ca es eficaz para proteger a las plantas (tales como plantas de maíz) del daño causado por el gusano cogollero resistente a CryI Fa. Para una descripción de esta peste, véase, por ej., Tabashnik, PNAS (2008), vol. 105 no. 49, 19029-19030.

La presente invención incluye el uso de la toxina CryI Ca para proteger al maíz y a otras especies de plantas importantes para la economía del daño y pérdida de producción causados por la alimentación del gusano cogollero o a poblaciones de gusanos cogolleros que han desarrollado resistencia a CryI Fa.

La presente invención por ende enseña una pila de IRM para prevenir o mitigar contra el desarrollo de resistencia por el gusano cogollero a CryI Fa y/o CryI Ca.

La presente invención proporciona composiciones para controlar pestes lepidópteras que comprenden células que producen una proteína que contiene la toxina de núcleo CryI Fa y una proteína que contiene la toxina de núcleo CryI Ca.

La invención comprende además un huésped transformado para producir tanto una proteína que contiene la toxina de núcleo CryI Fa como una proteína que contiene toxina de núcleo CryI Ca, donde dicho huésped es un microorganismo o una célula vegetal. El o los presentes polinucleótidos están preferentemente en una construcción genética bajo el control (operativamente ligado a / que comprende) de un promotor no BacHIus-thuringiensis. Los presentes polinucleótidos pueden comprender el uso de codones para una mayor expresión en una planta.

Se pretende adicionalmente que la invención proporcione un método para controlar pestes lepidópteras que comprende poner en contacto a dichas pestes o al medioambiente de dichas pestes con una cantidad eficaz de una composición que contiene una proteína que contiene la toxina de núcleo CryI Fa y que contiene además una proteína que contiene la toxina de núcleo CryI Ca.

Una modalidad de la invención comprende una planta de maíz (y otras plantas - algodón y soja, por ejemplo) que comprende un gen expresable en plantas que codifica una proteína que contiene la toxina de núcleo CryI Ca y un gen expresable en plantas que codifica una proteína que contiene la toxina de núcleo CryI Fa, y la semilla de ese tipo de planta.

Una modalidad adicional de la invención comprende una planta de maíz (y otras plantas - algodón y soja, por ejemplo) donde un gen expresable en plantas que codifica una proteína que contiene la toxina de núcleo CryI Ca y un gen expresable en plantas que codifica una proteína que contiene la toxina de núcleo CryI Fa han sido introducidos en dicha planta de maíz, y semilla de dicha planta.

(Para una revisión de CryI C como un bioinsecticida potencial en plantas, véase Avisar et al. 2009). Avisar D, Eilenberg H, Keller M, Reznik N, Segal M, Sneh B, Zilberstein A (2009) The Bacillus thuringiensis delta-endotoxin CryIC as a potential bioinsecticide in plants. Plant Science 176:315-324.) Receptores de insectos.

Según lo descrito en los Ejemplos, los estudios de unión a receptores competitivos que utilizan la proteína que contiene una toxina de núcleo CryICa radioetiquetada muestran que la proteína que contiene una toxina de núcleo CryI Fa no compite por el sitio de unión de afinidad elevada presente en tejidos de insecto FAW a los cuales CryICa se une. Estos resultados indican que la combinación de proteínas CryI Fa y CryICa es un medio eficaz para mitigar el desarrollo de resistencia en poblaciones de FAW a CryI Fa (e igualmente, el desarrollo de resistencia a CryI Ca), y probablemente aumentaría el nivel de resistencia a esta peste en plantas de maíz que expresan ambas proteínas.

Por consiguiente, basado en parte en los datos descritos anteriormente y en otra parte de la presente invención, se cree que la coproducción (apilamiento) de las proteínas CryICa y CryI Fa puede utilizarse para producir una pila de IRM a dosis elevada para el FAW. Otras proteínas pueden ser agregadas a esta combinación para expandir el espectro de control de insectos. Por ejemplo, en el maíz, la adición de CryIAb crearía una pirámide de IRM para el control del taladrador del maíz europeo.

Otra opción de implementación sería utilizar una o ambas proteínas CryI Fa y CryICa en combinación con la proteína CryIAb para mitigar el desarrollo de resistencia. Por consiguiente, otra opción de implementación de la presente invención sería utilizar una o ambas proteínas CryI Fa y CryI Ca en regiones de desarrollo de cultivos donde la implementación de la proteína CryIAb se ha vuelto ineficaz para controlar al taladrador de la caña de azúcar debido al desarrollo de poblaciones resistentes. Por lo tanto, una combinación de "apilamiento triple" o "pirámide" preferida para utilizar de acuerdo con la presente invención es CryI F más CryI C más CryIAb.

La presente invención se refiere también, en parte, a apilamientos triples o "pirámides" de tres (o más) toxinas, siendo las toxinas CryI Fa y CryI C el par de base preferido. Una pirámide preferida proporciona por lo menos dos proteínas que proporcionan actividad de resistencia no cruzada contra dos pestes, el FAW y el ECB ("European com borer"; Ostrinia nubilalis): CryI Fa más CryI Da más una o más toxinas de ECB tales como CryIAb (ver US 2008 031 1096), como CryI F es activo contra ambos insectos. Otras toxinas del ECB incluyen CryI Be (ver USSN 61/284,290; presentada el 16 de diciembre, 2009), Cryl l (ver USSN 61/284,278; presentada el 16 de diciembre, 2009), Cry2Aa (ver USSN 61/284,278; presentada el 16 de diciembre, 2009) y DIG-3 (ver US 2010 00269223). En algunas modalidades preferidas de pirámides, las toxinas seleccionadas tienen tres modos de acción separadas contra el FAW; estas combinaciones preferidas de pirámides son CryI Fa más CryI Ca más otra toxina/gen seleccionada del grupo formado por Vip3Ab, Cry D (ver USSN 61/284,252; presentada el 16 de diciembre, 2009), CryI Be, y CryI E (ver USSN 61/284,278; presentada el 16 de diciembre, 2009). Las plantas (y área en acres plantada con dichas plantas) que producen estas tres toxinas son incluidas dentro del alcance de la presente invención. También pueden agregarse toxinas/genes adicionales, pero estos apilamientos triples particulares proporcionarían, de acuerdo con la presente invención, en forma ventajosa y sorprendente tres modos de acción contra el FAW. Esto puede ayudar a reducir o eliminar el requerimiento de área en acres de refugio. Un campo plantado de ese modo de más de 40468,564 m2 (10 acres) es así incluido dentro de la presente invención.

Otras toxinas Vip3, por ejemplo, están enlistadas en el Apéndice A adjunto. Esos números del GENBANK también pueden emplearse para obtener las secuencias para cualquiera de los genes y proteínas descritos o mencionados en la presente.

La Patente Estadounidense N° 5, 188,960 y Patente Estadounidense N° 5,827,514 describen proteínas que contienen la toxina de núcleo CryI Fa adecuadas para utilizar en la práctica de la presente invención. Patente Estadounidense N° 6,218,188 describe secuencias de ADN optimizadas para plantas que codifican proteínas que contienen la toxina de núcleo Cry1 Fa que son adecuadas para utilizar en la presente invención.

Las combinaciones de las toxinas descritas en la presente invención pueden ser utilizadas para controlar pestes lepidópteras. Los lepidópteros adultos, por ejemplo, las mariposas y las polillas, se alimentan (aminoácidos 1 a 601 ) y una protoxina heteróloga (aminoácidos 602 hasta el término C). En una modalidad preferida, la porción de una toxina quimérica que comprende la protoxina es derivada de una toxina de proteína CryIAb. Como un segundo Ejemplo, una segunda toxina quimérica de la presente invención, según lo descrito en SEC ID NO:1 tiene la porción de toxina de núcleo completa de CryI Ca (aminoácidos 1 a 619) y una protoxina heteróloga (aminoácidos 620 hasta el término C). En una modalidad preferida, la porción de una toxina quimérica que comprende la protoxina es derivada de una toxina proteica CryIAb.

Un experto en la técnica apreciará que las toxinas Bt, incluso dentro de una cierta clase tal como Cryl F, varían en cierto grado en longitud y la ubicación precisa de la transición desde la porción de toxina de núcleo hasta la porción de protoxina. Típicamente, las toxinas CryI Ca y CryI Fa tienen una longitud de aproximadamente 1 150 a aproximadamente 1200 aminoácidos. La transición desde una porción de toxina de núcleo hasta una porción de protoxina típicamente se producirá entre aproximadamente 50% y aproximadamente 60% de la toxina de longitud completa. La toxina quimérica de la presente invención incluirá la extensión completa de esta porción de toxina de núcleo N-terminal. Por lo tanto, la toxina quimérica comprenderá por lo menos aproximadamente 50% de la longitud completa de la proteína de toxina Bt CryI Fa o por lo menos aproximadamente 50% de la longitud completa de la proteína de toxina Bt CryI Ca. Esto será típicamente por lo menos aproximadamente 590 aminoácidos. Con respecto a la porción de protoxina, la extensión completa de la porción de protoxina CryIAb se extiende desde el extremo de la porción de toxina de núcleo hasta el término C de la molécula.

Genes y toxinas Los genes y toxinas útiles de acuerdo con la presente invención incluyen no solo las secuencias de longitud completa descritas sino además los fragmentos de estas secuencias, variantes, mutantes y proteínas de fusión los cuales retienen la actividad pesticida característica de las toxinas específicamente ejemplificadas en esta invención. Como se utiliza en esta invención, los términos "variantes" o "variaciones" de genes se refieren a secuencias de nucleótidos las cuales codifican las mismas toxinas o las cuales codifican toxinas equivalentes que tienen actividad pesticida. Como se emplea en esta invención, el término "toxinas equivalentes" se refiere a toxinas que tienen la misma o esencialmente la misma actividad biológica contra las pestes objetivo que las toxinas reivindicadas.

Como se emplea en esta invención, los límites representan aproximadamente 95% (Cryl Fa's y 1 Ca's), 78% (CryI F's y CryI C's), y 45% (Cryl 's) de identidad de secuencia, según "Revisión of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins," N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, y D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol 62: 807-813. Estos cortes también pueden ser aplicados a las toxinas núcleo solamente (para las toxinas Cry1 F y Cry1 C).

Debería ser evidente para un experto en la técnica que los genes que codifican toxinas activas pueden ser identificados y obtenidos a través de diversos medios. Los genes o porciones de genes específicos ejemplificados en esta invención pueden obtenerse a partir de los aislados depositados en un depósito de cultivos. Estos genes, o porciones o variantes de los mismos, también pueden ser construidos sintéticamente, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador de genes. Las variaciones de genes pueden ser fácilmente construidas utilizando técnicas convencionales para realizar mutaciones de puntos. También, los fragmentos de estos genes pueden ser realizados utilizando exonucleasas o endonucleasas comercialmente disponibles de acuerdo con procedimientos convencionales. Por ejemplo, pueden emplearse enzimas tales como Bal31 o mutagénesis dirigida al sitio para cortar sistemáticamente nucleótidos desde los extremos de estos genes. Los genes que codifican los fragmentos activos también pueden ser obtenidos utilizando una variedad de enzimas de restricción. Pueden emplearse proteasas para obtener directamente fragmentos activos de estas toxinas proteicas.

Los fragmentos y equivalentes los cuales retienen la actividad pesticida de las toxinas ejemplificadas estarían dentro del alcance de la presente invención. Asi mismo, debido a la redundancia del código genético, una variedad de secuencias de ADN diferentes puede codificar las secuencias de aminoácidos descritas en esta invención. El experto en la técnica sabrá crear estas secuencias de ADN alternativas que codifican las mismas, o esencialmente las mismas, toxinas. Estas secuencias de ADN variantes están dentro del alcance de la presente invención. Como se emplea en esta invención, la referencia a "esencialmente la misma" secuencia se refiere a secuencias las cuales tienen sustituciones, deleciones, adiciones o inserciones de aminoácidos las cuales no afectan materialmente la actividad pesticida. Los fragmentos de genes que codifican proteínas que retienen la actividad pesticida son también incluidos en esta definición.

Un método adicional para identificar los genes que codifican las toxinas y porciones de genes útiles de acuerdo con la presente invención es a través del uso de sondas de oligonucleótidos. Estas sondas son secuencias nucleotídicas detectables. Estas secuencias pueden ser detectables en virtud de una etiqueta apropiada o pueden hacerse inherentemente fluorescentes según lo descrito en la Solicitud Internacional No. WO93/16094. Como es bien sabido en la técnica, si la molécula sonda y la muestra de ácido nucleico se hibridan formando una unión fuerte entre las dos moléculas, se puede presumir razonablemente que la sonda y la muestra tienen homología sustancial. Preferentemente, la hibridación se lleva a cabo bajo condiciones severas mediante técnicas bien conocidas en la técnica, según lo descrito, por ejemplo, en Keller, G. H., M. M. Manak (1987) ADN Probes, Stockton Press, Nueva York, N.Y., pp. 169-170. Algunos ejemplos de concentraciones de sales y combinaciones de temperaturas son los siguientes (en orden de severidad en aumento): 2X SSPE o SSC a temperatura ambiente; 1X SSPE o SSC a 42° C; 0.1X SSPE o SSC a 42° C; 0.1X SSPE o SSC a 65° C. La detección de la sonda proporciona un medio para determinar en forma conocida si se ha producido la hibridación. Ese tipo de análisis de sonda proporciona un método rápido para identificar genes que codifican toxinas de la presente invención. Los segmentos nucleotídicos los cuales son empleados como sondas de acuerdo con la invención pueden ser sintetizados utilizando un sintetizador de ADN y procedimientos convencionales. Estas secuencias de nucleótidos también pueden ser empleadas como iniciadores de PCR para amplificar genes de la presente invención.

Toxinas variantes Ciertas toxinas de la presente invención han sido específicamente ejemplificadas en esta invención. Puesto que estas toxinas son meramente ejemplares de las toxinas de la presente invención, debería ser fácilmente evidente que la presente invención comprende toxinas variantes o equivalentes (y secuencias nucleotídicas que codifican toxinas equivalentes) que tienen la misma actividad pesticida o similar de la toxina ejemplificada. Las toxinas equivalentes tendrán homología de aminoácidos con una toxina ejemplificada. Esta homología de aminoácidos será típicamente superior a 75%, preferentemente será superior a 90%, y más preferentemente será superior a 95%. La homología de aminoácidos será la más alta en regiones críticas de la toxina que representan la actividad biológica o que están involucradas en la determinación de la configuración tridimensional la cual finalmente es responsable de la actividad biológica. Con respecto a esto, ciertas sustituciones de aminoácidos son aceptables y pueden ser esperadas si estas sustituciones están en regiones las cuales no son críticas para la actividad o son sustituciones de aminoácidos conservadores que no afectan a la configuración tridimensional de la molécula. Por ejemplo, los aminoácidos pueden ser colocados en las siguientes clases: no polares, polares no cargados, básicos y ácidos. Las sustituciones conservadoras por las cuales un aminoácido de una clase es reemplazado por otro aminoácido del mismo tipo caen dentro del alcance de la presente invención siempre y cuando la sustitución no altere materialmente la actividad biológica del compuesto. El cuadro 1 proporciona un listado de ejemplos de aminoácidos que pertenecen a cada clase.

CUADRO 1 En algunos casos, también pueden realizarse sustituciones no conservadoras. El factor crítico es que estas sustituciones no deben disminuir significativamente de la actividad biológica de la toxina.

Huéspedes recombinantes Los genes que codifican las toxinas de la presente invención pueden ser introducidos en una amplia variedad de huéspedes microbianos o vegetales. La expresión del gen de toxina da como resultado, directa o indirectamente, la producción intracelular y mantenimiento del pesticida. La transferencia de conjugación y transferencia recombinante pueden emplearse para crear una cepa de Bt que exprese ambas toxinas de la presente invención. Otros organismos huéspedes también pueden ser transformados con uno o ambos genes de toxinas luego emplearse para lograr el efecto sinérgico. Con huéspedes microbianos adecuados, por ej., Pseudomonas, los microbios pueden ser aplicados al sitio de la peste, donde proliferarán y serán ingeridos. El resultado es el control de la peste. Alternativamente, el microbio que alberga el gen de toxina puede ser tratado bajo condiciones que prolongan la actividad de la toxina y estabilizan la célula. La célula tratada, la cual retiene la actividad tóxica, luego puede ser aplicada al medio ambiente de la peste objetivo.

Donde el gen de toxina Bt es introducido por medio de un vector adecuado en un huésped microbiano, y dicho huésped es aplicado al medio ambiente en un estado viviente, es esencial que ciertos microbios huéspedes sean empleados. Los huéspedes de microorganismos son seleccionados los cuales se sabe que ocupan la "fitosfera" (filoplano, filosfera, rizosfera y/o rizoplano) de uno o más cultivos de interés. Estos microorganismos son seleccionados de modo que sean capaces de competir exitosamente en el medioambiente en particular (cultivo y otros hábitats de insectos) con los microorganismos del tipo salvaje, proporcionan un mantenimiento y expresión estables del gen que expresa el pesticida polipeptídico, y, deseablemente, proporcionan una protección mejorada del pesticida de la degradación e inactivación de medio ambiente.

Se conoce una gran cantidad de microorganismos que habitan el filoplano (la superficie de las hojas de las plantas) y/o la rizosfera (el suelo que rodea las raíces de las plantas) de una amplia variedad de cultivos importantes. Estos microorganismos incluyen bacterias, algas, y hongos. De interés particular son microorganismos, tales como bacterias, por ej., los géneros Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobactenum, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, y Alcaligenes; hongos particularmente levadura, por ej., los géneros Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula, y Aureobasidium. De particular interés son especies bacterianas de fitosfera tales como Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobactenium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, y Azotobacter vinlandii; y especies de levadura de fitosfera tales como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae, y Aureobasidium pollulans. De particular interés son los microorganismos pigmentados.

Se encuentra disponible una amplia variedad de métodos para introducir un gen Bt que codifica una toxina en un microorganismo huésped bajo condiciones las cuales permiten un mantenimiento y expresión estables del gen. Estos métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica y son descritos, por ejemplo, en la Patente Estadounidense No. 5135867, la cual es incorporada a la presente como referencia.

Tratamiento de células Células de Bacülus thuringiensis o recombinantes que expresan las toxinas Bt pueden ser tratadas para prolongar la actividad de toxina y estabilizar la célula. La microcápsula pesticida que es formada comprende la toxina Bt o toxinas dentro de una estructura celular que ha sido estabilizada y protegerá la toxina cuando la microcápsula es aplicada al medioambiente de la peste objetivo. Las células huéspedes adecuadas pueden incluir ya sea procariotas o eucariotas, estando normalmente limitadas a aquellas células las cuales no producen sustancias tóxicas para organismos superiores, tales como los mamíferos. Sin embargo, se podrían utilizar organismos los cuales producen sustancias tóxicas para organismos superiores, donde las sustancias tóxicas son inestables o el nivel de aplicación es suficientemente bajo como para evitar cualquier posibilidad de toxicidad para un huésped mamífero. Como huéspedes, de particular interés serán las procariotas y las eucariotas inferiores, tales como hongos.

La célula estará generalmente intacta y estará sustancialmente en la forma proliferativa cuando es tratada, más que en una forma de espora, si bien en algunos casos pueden emplearse esporas.

El tratamiento de la célula microbiana, por ej., un microbio que contiene el gen o genes de toxina B.t., puede ser por medios químicos o físicos, o mediante una combinación de medios químicos y/o físicos, siempre y cuando la técnica no afecte perjudicialmente las propiedades de la toxina, no disminuya la capacidad celular para proteger a la toxina. Los ejemplos de reactivos químicos son agentes halogenantes, particularmente halógenos de no. atómico 17-80. Más particularmente, se puede emplear yodo bajo condiciones leves y durante un tiempo suficiente para lograr los resultados deseados. Otras técnicas adecuadas incluyen el tratamiento con aldehidos, tales como glutaraldehído; agentes anti-infección, tales como cloruro de "Zephiran" y cloruro de cetilpiridinio; alcoholes, tales como isopropilo y etanol; diversos fijadores histológicos, tales como yodo Lugol, fijador Bouin's, diversos ácidos y fijador de Helly (Ver: Humason, Gretchen L., Animal Tissue Techniques, W. H. Freeman and Company, 1967); o una combinación de agentes físicos (calor) y químicos que preservan y prolongan la actividad de la toxina producida en la célula cuando la célula es administrada al medioambiente del huésped. Los ejemplos de medios físicos son radiación de longitud de onda corta tal como radiación gamma y radiación X, congelamiento, irradiación de UV, liofilización y similares. Los métodos para el tratamiento de células microbianas son descritos en las Pat. Estadounidenses Nos. 4,695,455 y 4,695,462, las cuales son incorporadas a la presente como referencia.

Las células generalmente tendrán mayor estabilidad estructural lo cual aumentará la resistencia a las condiciones medioambientales. Donde el pesticida está en una proforma, el método de tratamiento celular debería ser seleccionado de modo de no inhibir el procesamiento de la proforma a la forma madura del pesticida por el patógeno de la peste objetivo. Por ejemplo, el formaldehído entrecruzará proteínas y podría inhibir el procesamiento de la proforma de un pesticida polipeptídico. El método de tratamiento debería retener por lo menos una porción sustancial de la biodisponibilidad o bioactividad de la toxina.

Las características de interés particular en la selección de una célula huésped para propósitos de producción incluyen la facilidad para introducir el gen o genes B.t. en el huésped, disponibilidad de sistemas de expresión, eficacia de expresión, estabilidad del pesticida en el huésped, y la presencia de capacidades genéticas auxiliares. Las características de interés para utilizar como una microcápsula pesticida incluyen cualidades protectoras para el pesticida, tales como paredes celulares espesas, pigmentación y empaquetadura intracelular o formación de cuerpos de inclusión; supervivencia en medioambientes acuosos; falta de toxicidad para mamíferos; capacidad de atracción de pestes para ingestión; facilidad para matar y de fijación sin daño a la toxina; y similares. Otras consideraciones incluyen facilidad de formulación y manipuleo, economía, estabilidad en almacenamiento y similares.

Crecimiento de células. El huésped celular que contiene el gen o genes insecticidas de B.t. puede ser cultivado en un medio nutriente conveniente, donde el constructo de ADN proporciona una ventaja selectiva, proporcionando un medio selectivo de modo que sustancialmente todas o todas las células retengan el gen de B.t. Luego, estas células pueden ser recolectadas de conformidad con modos convencionales. Alternativamente, las células pueden ser tratadas con anterioridad a la recolección.

Las células de B.t. que producen las toxinas de la invención pueden ser cultivadas utilizando medios de la técnica convencionales y técnicas de fermentación. Luego de la compleción del ciclo de fermentación, las bacterias pueden ser recolectadas separando, en primer lugar, las esporas de B.t. y los cristales del caldo de fermentación por medios bien conocidos en la técnica. Las esporas y cristales de B.t. recuperados pueden ser formulados en un polvo humectable, concentrado líquido, gránulos u otras formulaciones mediante la adición de agentes tensoactivos, dispersantes, portadores inertes y otros componentes para facilitar el manipuleo y aplicación para pestes objetivos en particular. Estas formulaciones y procedimientos de aplicación, son todos bien conocidos en la técnica.

Formulaciones Los gránulos de sebo formulados que contienen un atrayente y esporas, cristales y toxinas de los aislados de B.t., o microbios recombinantes que comprenden los genes obtenibles de los aislados de B.t. descritos en esta invención, pueden ser aplicados al suelo. El producto formulado también puede ser aplicado como un tratamiento de la raíz o de recubrimiento de la semilla o tratamiento de la planta en su totalidad en etapas posteriores del ciclo de cultivo. Pueden emplearse tratamientos de la planta y del suelo de las células de B.t. como polvos humectables, gránulos o polvillos, mezclando con diversos materiales inertes, tales como minerales inorgánicos (filosilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos, y similares) o materiales botánicos (mazorcas de maíz en polvo, cáscaras de arroz, cáscaras de nuez, y similares). Las formulaciones pueden incluir adyuvantes de dispersión-pegajosidad, agentes estabilizantes, otros aditivos pesticidas o agentes tensoactivos. Las formulaciones líquidas pueden ser de base acuosa o no acuosa, y empleadas como espumas, geles, suspensiones, concentrados emulsionables o similares. Los ingredientes pueden incluir agentes reológicos, agentes tensoactivos, emulsionantes, dispersantes o polímeros.

Como un experto en la técnica podría apreciar, la concentración pesticida variará ampliamente dependiendo de la naturaleza de la formulación en particular, especialmente si es un concentrado o si es para utilizar directamente. El pesticida estará presente en por lo menos 1 % en peso y puede ser 100% en peso. Las formulaciones secas tendrán entre aproximadamente 1-95% en peso del pesticida mientras que las formulaciones líquidas generalmente serán entre aproximadamente 1-60% en peso de los sólidos en la fase líquida. Las formulaciones generalmente tendrán entre aproximadamente 02 y aproximadamente 104 células/mg. Estas formulaciones serán administradas a aproximadamente 50 mg (líquidas o secas) hasta 1 kg o más por hectárea.

Las formulaciones pueden ser aplicadas al medio ambiente de la peste lepidóptera, por ej., al follaje o al suelo, por pulverización, espolvoreado, rociado o similar.

Transformación de plantas Un huésped recombinante preferido para la producción de las proteínas insecticidas de la presente invención es una planta transformada. Los genes que codifican las proteínas de toxina Bt, según lo descrito en esta invención, pueden ser insertados en células de plantas utilizando una variedad de técnicas las cuales son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, una gran cantidad de vectores de clonación que comprenden un sistema de replicación en Escheríchia coli y un marcador que permite la selección de las células transformadas está disponible para la preparación para la inserción de genes extraños en plantas superiores. Los vectores comprenden, por ejemplo, pBR322, serie pUC, serie M13mp, pACYC184, inter alia. Por consiguiente, el fragmento de ADN que tiene la secuencia que codifica la proteína de toxina Bt puede ser insertado en el vector en un sitio de restricción adecuado. El plásmido resultante es empleado para la transformación en E. coli. Las células de E. coli son cultivadas en un medio nutriente adecuado, luego recolectadas y lisadas. El plásmido es recuperado. Se llevan a cabo en general análisis de secuencias, análisis de restricción, electroforesis y otros métodos de biología molecular-bioquímicos como métodos de análisis.

Después de cada manipulación, la secuencia de ADN empleada puede ser disociada y unida a la siguiente secuencia de ADN. Cada secuencia de plásmido puede ser clonada en los mismos u otros plásmidos. Dependiendo del método de inserción de genes deseados en la planta, otras secuencias de ADN pueden ser necesarias. Si, por ejemplo, el plásmido Ti o Ri es empleado para la transformación de la célula vegetal, luego por lo menos el borde derecho, pero a menudo el borde derecho y el borde izquierdo del T-ADN del plásmido Ti o Ri, debe unirse como la región flanqueante de los genes que se van a insertar. El uso de T-ADN para la transformación de células vegetales ha sido intensamente investigado y suficientemente descrito en EP 120 516, Lee y Gelvin (2008), Hoekema (1985), Fraley er a/., (1986), y An et al., (1985), y está bien establecido en la técnica.

Una vez que el ADN insertado ha sido integrado en el genoma de la planta, es relativamente estable. El vector de transformación normalmente contiene un marcador seleccionable que confiere sobre las células vegetales transformadas resistencia a un biocida o un antibiótico, tales como Bialaphos, Kanamycin, G418, Bleomycin, o Hygromycin, entre otros. El marcador individualmente empleado debería permitir concordantemente la selección de células transformadas más que de células que no contienen el ADN insertado.

Se encuentra disponible una gran cantidad de técnicas para insertar ADN en una célula huésped de planta. Dichas técnicas incluyen transformación con T-ADN utilizando Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como agente de transformación, fusión, inyección, biotística (bombardeo de micropartículas), o electroporación así como también otros métodos posibles. Si se emplean agrobacterias para la transformación, el ADN que se va a insertar debe ser clonado en plásmidos especiales, básicamente ya sea en un vector intermedio o en un vector binario. Los vectores intermedios pueden estar integrados en el plásmido Ti o Ri mediante recombinación homologa debido a secuencias que son homologas a secuencias en el T-ADN. El plásmido Ti o Ri también comprende la región vir necesaria para la transferencia del T-ADN. Los vectores intermedios no pueden replicarse por sí mismos en Agrobacterias. El vector intermedio puede ser transferido en Agrobacterium tumefaciens por medio de un plásmido ayudante (conjugación). Los vectores binarios pueden replicarse por sí mismos tanto en E. coli como en Agrobacterias. Los mismos comprenden un gen marcador de selección y un ligante o poliligante el cual está enmarcado por las regiones bordes de T-ADN Derecha e Izquierda. Se pueden transformar directamente en Agrobacterias (Holsters et al., 1978). La Agrobacteria empleada como célula huésped debe comprender un plásmido que porta una región vir. La región vir es necesaria para la transferencia del T-ADN en la célula vegetal. Puede contener T-ADN adicional. La bacteria así transformada es empleada para la transformación de células vegetales. Los explantos vegetales pueden ser ventajosamente cultivados con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes para la transferencia del ADN en la célula vegetal. Luego, las plantas enteras pueden ser regeneradas a partir del material vegetal infectado (por ejemplo, pedazos de hoja, segmentos de tallo, raíces, pero también protoplastos o células cultivadas en suspensión) en un medio adecuado, el cual puede contener antibióticos o biocidas para selección. Las plantas así obtenidas pueden ser luego analizadas para determinar la presencia del ADN insertado. No se realizan demandas especiales de los plásmidos en el caso de inyección y electroporación. Es posible utilizar plásmidos comunes, tales como, por ejemplo, derivados de pUC.

Las células transformadas crecen dentro de las plantas en la forma usual. Pueden formar células germinales y transmitir la o las características transformadas a las plantas progenies. Dichas plantas pueden ser cultivadas en la forma normal y cruzadas con plantas que tienen los mismos factores hereditarios transformados u otros factores hereditarios. Los individuos híbridos resultantes tienen las propiedades fenotípicas correspondientes.

En una modalidad preferida de la presente invención, las plantas serán transformadas con genes donde el uso de codones ha sido optimizado para plantas. Ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5380831 , la cual se incorpora a la presente como referencia. Si bien algunas toxinas truncadas son ejemplificadas en esta invención, es bien conocido en la técnica de Bt que las toxinas del tipo de 130 kDa (longitud completa) tienen una mitad N-terminal que es la toxina de núcleo, y una mitad C-terminal que es la "cola" de protoxina. Por lo tanto, se pueden emplear "colas" apropiadas con toxinas truncas / núcleo de la presente invención. Ver, por ej., Patente de E.U.A. No. 6218188 y Patente de E.U.A. No. 6673990. Por añadidura, en la técnica se conocen métodos para crear genes de Bt sintéticos para utilizar en plantas (Stewart y Burgin, 2007). Un ejemplo no limitativo de una planta transformada preferida es una planta de maíz fértil que comprende un gen expresable en plantas que codifica una proteína CryI Fa, y que comprende además un segundo gen expresable en plantas que codifica una proteína CryI Ca.

La transferencia (o introgresión) de la o las características determinadas por CryI Fa y CryI Ca en líneas de maíz innatas puede ser lograda por cría por selección recurrente, por ejemplo por retrocruzamiento. En este caso, un progenitor recurrente deseado es cruzado, en primer lugar, a un consanguíneo donante (el progenitor no recurrente) que porta el o los genes apropiados para las características determinadas CryI F y CryI C. La progenie de esta cruza es luego apareada de vuelta al progenitor recurrente seguido por selección en la progenie resultante para la o las características deseadas para ser transferidas del progenitor no recurrente. Luego de tres, preferentemente cuatro, más preferentemente cinco o más generaciones de retrocruzamientos con el progenitor recurrente con selección para la o las características deseadas, la progenie será heterocigótica para sitios que controlan la o las características que se están transfiriendo, pero será como el progenitor recurrente para la mayoría o casi la totalidad de otros genes (ver, por ejemplo, Poehlman & Sleper (1995) Breeding Field Crops, 4th Ed., 172- 175; Fehr (1987) Principies of Cultivar Development, Vol. 1 : Theory and Technique, 360-376).

Estrategias de Manejo de Resistencia a Insectos (IRM) Roush et al., por ejemplo, describe estrategias de dos toxinas, también denominadas "piramidación" o "apilamiento" para el manejo de cultivos transgénicos insecticidas. (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353, 1777-1786).

En su página en Internet, the United States Environmental Protection Agency (la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos) (epa.gov/oppbppd1/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm) publica los siguientes requerimientos para proporcionar refugios no transgénicos (es decir, no B.t.) (una sección o bloque de cultivos / maíz no Bt) para utilizar con cultivos transgénicos que producen una única proteína Bt activa contra pestes objetivo.

"Los requerimientos estructurados específicos para productos de maíz Bt (CryIAb o CryI F) protegidos contra el taladrador del maíz son los siguientes: Refugios estructurados: 20% refugio de maíz Bt no lepidóptero en Cinturón del Maíz; 50% refugio Bt no Lepidóptero en Cinturón del Algodón Bloques Internos (es decir, dentro del campo de bt) Externos (es decir, campos separados dentro de 804.6 metros (½ milla) (402.33 metros (¼ de milla) si es posible) del campo de Bt para aumentar al máximo el apareamiento al azar) Bandas En campo Las bandas deben ser por lo menos 4 hileras de ancho (preferentemente 6 hileras) para reducir lo efectos del movimiento larvario" Por añadidura, la National Corn Growers Association (Asociación Nacional de Cultivadores de Maíz), en su sitio en Internet: (ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn) también proporciona pautas similares con respecto a los requerimientos de refugios. Por ejemplo: "Requerimientos del IRM de Taladrador del Maíz: -Plantar por lo menos 20% de sus acres de maíz a híbridos de refugio -En regiones productoras de algodón, el refugio debe ser 50% -Debe plantarse dentro de la ½ milla (804.6 metros) de los híbridos de refugio -El refugio puede ser plantado como bandas dentro del campo de Bt; las bandas de refugio deben ser por lo menos 4 hileras de ancho -El refugio puede ser tratado con pesticidas convencionales solamente si son alcanzados los umbrales económicos para el insecto objetivo -No pueden utilizarse insecticidas atomizables a base de Bt sobre el maíz del refugio -Debe plantarse un refugio apropiado en cada granja con maíz Bt" Según lo manifestado por Roush ef al. (en las páginas 1780 y 1784 columna derecha, por ejemplo), el apilamiento o piramidación de dos proteínas diferentes cada una eficaz contra las pestes objetivos y con poca o ninguna resistencia cruzada puede permitir el uso de un refugio más pequeño. Roush sugiere que para un apilamiento exitoso, un tamaño de refugio de menos de 10% de refugio, puede proporcionar un manejo de resistencia comparable con aproximadamente 50% de refugio para una única característica (no piramidada). Para productos de maíz Bt piramidados actualmente disponibles, la Agencia Estadounidense de Protección al Medioambiente (U.S. Environmental Protection Agency) requiere significativamente menos (generalmente 5%) de refugio estructurado de maíz no Bt plantado que para productos de una sola característica (generalmente 20%).

Existen diversas maneras de proporcionar los efectos de IRM (Manejo de Resistencia a Insectos) de un refugio, incluyendo diversos diseños de plantado geométrico en los campos (según lo mencionado anteriormente) y mezclas de semillas en bolsa, según lo descrito adicionalmente por Roush ef al. (supra), y en la Patente de E.U.A. N° 6,551 ,962.

Los porcentajes proporcionados, o relaciones similares de refugios, pueden emplearse para los apilamientos o pirámides dobles o triples en cuestión. Para apilamientos triples con tres modalidades de acción contra una sola peste objetivo, una meta sería cero refugio (o menos del 5% de refugio, por ejemplo). Esto es particularmente cierto para áreas en acres comerciales - de más de 40468.564 metros cuadrados (10 acres) por ejemplo.

Todas las patentes, solicitudes de patentes, solicitudes provisorias y publicaciones a las que se hace referencia o que son citadas en esta invención son incorporadas por referencia en su totalidad en la medida en que no sean inconsistentes con las enseñanzas explícitas de esta memoria descriptiva.

Lo que sigue son ejemplos que ilustran procedimientos para poner en práctica la invención. Estos ejemplos no deberían ser interpretados como limitativos. Todos los porcentajes son en peso y todas las proporciones de las mezclas de solventes son en volumen a menos que se indique lo contrario. Todas las temperaturas están en grados Celsius.

A menos que se indique o se infiera específicamente lo contrario, los términos "un", "una", y "la", "el" significan "por lo menos uno" como se utiliza en esta invención.

EJEMPLO 1 Diseño de toxinas núcleo CrylCa quiméricas y protoxinas CrylAb Toxinas Quiméricas Las proteínas quiméricas que utilizan el dominio de toxina de núcleo de una toxina Cry fusionada al segmento de protoxina de otra toxina Cr han sido previamente reportadas, por ejemplo, en la Patente de E.U.A. No. 5593881 y en la Patente de E.U.A No. 5932209. Una secuencia de proteína de delta endotoxina Cry1 Ca3 es depositada como GenBank Acceso Número AAA22343 bajo una terminología obsoleta de CrylC(b).

Las variantes de proteínas quiméricas CrylCa de esta invención incluyen toxinas quiméricas que comprenden un segmento de toxina de núcleo N-terminal derivado de una toxina insecticida Cry1 Ca3 fusionada a un segmento de protoxina de delta endotoxina heterólogo en algún punto pasando el extremo del segmento de la toxina de núcleo. La transición de la toxina de núcleo al segmento de protoxina heterólogo puede ocurrir en aproximadamente la unión de la toxina de núcleo/ protoxina nativa o, en la alternativa, una porción de la protoxina nativa (que se extiende pasando el segmento de la toxina de núcleo) puede ser retenida, con la transición a la protoxina heteróloga que ocurre corriente abajo. En una forma de variante, los segmentos de toxina de núcleo y protoxina pueden comprender exactamente la secuencia de aminoácidos de las toxinas nativas de las cuales derivan, o pueden incluir adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos que no disminuyen y pueden aumentar, la función biológica de los segmentos cuando se fusionan entre sí.

Por ejemplo, una toxina quimérica de la presente invención comprende un segmento de toxina de núcleo derivado de Cry1 Ca3 y una protoxina heteróloga. En una modalidad preferida de la invención, el segmento de toxina de núcleo derivado de Cry1 Ca3 (619 aminoácidos) es fusionado a un segmento heterólogo que comprende un segmento de protoxina derivado de una delta-endotoxina CryIAb (545 aminoácidos). La secuencia de 1 164 aminoácidos de la proteína quimérica, en esta invención denominada DIG-152, es descrita como SEC ID NO:1. Una segunda modalidad preferida de la invención comprende una proteína quimérica en la cual el segmento de toxina de núcleo CryI Ca (619 aminoácidos) está unido a un segundo segmento de protoxina de 545 aminoácidos derivado de CryIAb. La secuencia de 1 164 aminoácidos de la segunda proteína quimérica, denominada DIG-109, es descrita como SEC ID NO:2 (versión optimizada del maíz). Debe entenderse que otras fusiones quiméricas que comprenden las variantes de toxina de núcleo CryI Ca y protoxinas derivadas de CryIAb están dentro del alcance de esta invención.

Se señala que las proteínas quiméricas DIG-152 y DIG-109 son equivalentes esencialmente funcionales entre sí, difiriendo en secuencia solamente en una sola posición (aminoácido 620, que une el segmento de toxina de núcleo CryI Ca al segmento de protoxina CryIAb).

EJEMPLO 2 Construcción de plásmidos de expresión que codifican proteínas núcleo CrvICa/ protoxina CrvIAb quiméricas y expresión en Pseudomonas Se emplearon métodos de clonación convencionales (como se describe en, por ejemplo, Sambrook et al., (1989) y Ausubel et al., (1995), y sus actualizaciones) en la construcción de constructos de expresión de Pseudomonas fluorescens (Pf) pMYC2547 modificados por técnicas de ingeniería genética para producir una proteína quimérica DIG-152 de longitud completa (según lo descrito en SEC ID NO:1). Se llevó a cabo la producción de proteínas en la cepa de Pseudomonas fluorescens MB214 (un derivado de la cepa MB101 ; P. fluorescens biovar I), que tiene una inserción de un operón lac modificado según lo descrito en la Patente de E.U.A. No. 5169760. La estrategia básica de clonación abarcó la subclonación de un fragmento de ADN que codifica DIG-152 en vectores plásmidos, por lo cual se coloca bajo el control de expresión del promotor Ptac y del terminador rrnBT1T2 del plásmido pKK223-3 (PL Pharmacia, Milwaukee, Wl). Un plásmido de ese tipo fue denominado pMYC2547, y el aislado MB214 que alberga este plásmido es denominado Dpf108.

Análisis de Crecimiento y Expresión en Frascos de Agitación La producción de proteína DIG-152 para caracterización y bioensayo de insectos se logró mediante la cepa de P. fluorescens Dpf108 cultivada en frasco de agitación. Se llevó a cabo la producción de la proteína DIG-152 impulsada por el promotor Ptac según lo descrito previamente en la Patente de E.U.A. No. 5527883. Los detalles de las manipulaciones microbiológicas están disponibles en Squires et al., (2004), Solicitud de Patente de E.U.A. 20060008877, Solicitud de Patente de E.U.A. 20080193974, y Solicitud de Patente de E.U.A. 20080058262, incorporadas a la presente por referencia. La expresión fue inducida por la adición de isopropil-P-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) después de una incubación inicial de 24 horas a 30° con agitación. Se sacaron muestras de los cultivos en el momento de la inducción y en diversos momentos pos inducción. Se midió la densidad celular por densidad óptica a 600 nm (OD60o).

Fraccionamiento Celular y Análisis SDS-PAGE de Muestras en Frascos de Agitación En cada momento del muestreo, se ajustó la densidad celular de las muestras hasta ??ß?? = 20 y alícuotas de 1 mL se centrifugaron a 14000 x g durante cinco minutos. Los pellets celulares se congelaron a -80°. Las fracciones solubles e insolubles de muestras de pellets celulares en frascos de agitación congeladas fueron generadas utilizando EasyLyse™ Bacterial Protein Extraction Solution (EPICENTRE® Biotechnologies, Madison, Wl). Cada pellet celular fue resuspendido en 1 mL de solución EasyLyse™ y adicionalmente diluido en regulador de pH de lisis 1 :4 y se incubó con agitación a temperatura ambiente durante 30 minutos. El lisado se centrifugó a 14,000 rpm durante 20 minutos a 4o y el sobrenadante se recuperó como la fracción soluble. El pellet (fracción insoluble) fue luego resuspendido en un volumen igual de solución salina de pH regulado con fosfato (PBS; Na2HP0 1 1.9 mM, NaCI 137 mM, KCI 2.7 mM, pH 7,4).

Las muestras se mezclaron 1 :1 con regulador de pH de muestra 2X Laemmli que contenía ß-mercaptoetanol (Sambrook et al., supra.) y se hirvieron durante 5 minutos previamente a la carga sobre geles Criterion XT Bis-Tris 12% (Bio-Rad Inc., Hercules, CA). Se llevó a cabo electroforesis en la regulador de pH XT MOPS recomendado. Los geles fueron manchados con Coloración Bio-Safe Coomassie Stain de acuerdo con el protocolo del fabricante (Bio-Rad) y se tomaron imágenes utilizando el sistema de Imágenes de Alpha Innotech (San Leandro, CA).

Preparación de cuerpos de inclusión Se llevaron a cabo preparaciones de cuerpos de inclusión (Cl) de proteína DIG-152 en células de fermentaciones de P. fluorescens que produjeron proteína insecticida Bt insoluble, según lo demostrado por SDS-PAGE y MALDI-MS (Desorción por Láser Asistida por Matriz/ Espectrometría de Masas de Ionización). Se descongelaron pellets de fermentaciones de P. fluorescens en un baño de agua a 37°. Las células se resuspendieron hasta 25% p/v en regulador de pH de lisis [Tris 50 mM, pH 7.5, NaCI 200 mM, sal disódica de EDTA (ácido etilendiamina tetraacético) 20 mM, 1 % Tritón X-100, y Ditiotreitol (DTT) 5 mM; 5 mL/L de cóctel de inhibidor de proteasa bacteriano (Catálogo # P8465; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) se agregaron justo antes del uso]. Las células se suspendieron utilizando un homogenizador manual a la configuración más baja (Tissue Tearor, BioSpec Products, Inc., Bartlesville, OK). La lisozima (25 mg de Sigma L7651 , de la clara de huevo de gallina) se agregó a la suspensión celular mezclando con una espátula de metal, y la suspensión se incubó a temperatura ambiente durante una hora. La suspensión se enfrió sobre hielo durante 15 minutos, luego se sónico utilizando un aparato de sonicación Branson Sonifier 250 (dos sesiones de 1 minuto, a 50% ciclo de tarea, 30% salida). Se controló la lisis celular por microscopía. Se agregaron 25 mg adicionales de lisozima en caso necesario, y se repitieron la incubación y la sonicación. Luego de la confirmación de la lisis celular por microscopía, el lisado se centrifugó a 11.500 x g durante 25 minutos (4o) para formar el pellet de Cl, y se descartó el sobrenadante. El pellet de Cl se resuspendió con regulador de pH de lisis de 100 mL, se homogenizó con el mezclador manual y se centrifugó como se describió anteriormente. El pellet de Cl se lavó repetidamente por resuspensión (en regulador de pH de lisis 50 mL), homogenización, sonicación, y centrifugación hasta que el sobrenadante se tornó incoloro y el pellet de Cl adquirió firmeza y un color blancuzco. Para el lavado final, el pellet de Cl se resuspendió en agua destilada filtrada estéril (0.22 pm) que contenía EDTA 2 mM y se centrifugó. El pellet final se resuspendió en agua destilada filtrada estéril que contenía EDTA 2 mM y se almacenó en alícuotas de 1 mL a -80°.

El análisis SDS-PAGE y cuantificación de proteína en preparaciones de Cl se realizó por descongelación de una alícuota de 1 mL de pellet de Cl y diluyendo 1 :20 con agua destilada filtrada estéril. Luego, la muestra diluida se hirvió con regulador de pH de muestra reductor 4X [Tris 250 mM, pH 6.8, 40% de glicerol (v/v), 0.4% Azul de Bromofenol (p/v), 8% SDS (p/v) y 8% de ß-mercaptoetanol (v/v)] y se cargó sobre un gel Novex® 4-20% Tris-Glicina, 12+2 pocilios (Invitrogen) corrido con regulador de pH 1X Tris/Glicina/SDS (BioRad). El gel se corrió durante 60 min. a 200 voltios luego se manchó con Azul Coomassie (50% G-250/50% R-250 en 45% metanol, 10% de ácido acético), y se destiñó con ácido acético al 7%, metanol al 5% en agua destilada. Se realizó la cuantificación de bandas objetivo comparando valores densitométricos para las bandas contra muestras convencionales de Seroalbúmina Bovina (BSA, por sus siglas en inglés) corridas en el mismo gel para generar una curva estándar.

Solubilización de Cuerpos de Inclusión Seis ml_ de suspensión de cuerpo de inclusión DIG-152 del clon Pf DPf108 se centrifugaron en la configuración más alta de una microcentriguradora modelo Eppendorf 5415C (aproximadamente 14,000 x g) para peletizar las inclusiones. El sobrenadante del regulador de pH de almacenamiento se extrajo y reemplazó con 25 ml_ de regulador de pH de carbonato sódico 100 mM, pH1 1 , en un tubo cónico de 50 ml_. Las inclusiones se resuspendieron utilizando una pipeta y se sometieron a vórtice para mezclar completamente. El tubo se colocó en una plataforma de agitación suave a 4o durante toda la noche para extraer la proteína objetivo. El extracto se centrifugó a 30,000 x g durante 30 min a 4o, y el sobrenadante resultante se concentró 5 veces utilizando un dispositivo de filtro centrífugo de celulosa regenerado Amicon Ultra-15 (30,000 Molecular Weight Cutoff; Millipore). Luego, el regulador de pH de muestra se cambió a CAPS [ácido 3-(ciclohexamino)l-propansulfónico] 10 mM pH 10 utilizando columnas PD-10 descartables (GE Healthcare, Piscataway, NJ).

Solubilización y activación de tripsina de proteína de Cuerpos de Inclusión En algunos casos, se centrifugó la suspensión de cuerpo de inclusión DIG-152 del clon Pf DPÍ108 en la configuración más alta de una microcentrífuga modelo 5415C de Eppendorf (aproximadamente 14,000 x g) para peletizar las inclusiones. El sobrenadante de regulador de pH de almacenamiento se extrajo y reemplazó con CAPS 100 mM, pH 1 1 para proporcionar una concentración proteica de aproximadamente 50 mg/mL. El tubo se agitó a temperatura ambiente durante tres horas para solubilizar completamente la proteína. Se agregó tripsina a una cantidad igual a 5% hasta 10% (p:p, en base al peso inicial del polvo IB) y se logró la digestión mediante incubación agitando durante la noche a 4o o agitando de 90-120 minutos a temperatura ambiente. Se extrajo el material insoluble mediante centrifugación a 10,000 x g durante 15 minutos, y el sobrenadante se aplicó a una columna de intercambio aniónico MonoQ (10 mm por 10 cm). La proteína DIG-152 activada se eluyó (según lo determinado por SDS-PAGE, ver más abajo) mediante un gradiente de NaCI 0% a 100% 1 M durante 25 volúmenes de columna. Las fracciones que contenían la proteína activada se agruparon y, cuando resultó necesario, se concentraron hasta menos de 10 mL utilizando un dispositivo de filtro centrífugo de celulosa regenerado Amicon Ultra-15 según lo mencionado anteriormente. Luego, el material se pasó a través de una columna Superdex 200 (16 mm por 60 cm) en regulador de pH que contenía NaCI 100 mM. 10% glicerol, 0.5% Tween-20 y EDTA 1 mM. Se determinó por análisis de SDS-PAGE que la proteína activada (enzimáticamente truncada) eluye a 65 hasta 70 mL. Las fracciones que contenían la proteína activada se agruparon y concentraron utilizando el concentrador centrífugo según lo mencionado anteriormente.

Electroforesis en gel Las preparaciones proteicas concentradas se prepararon para electroforesis diluyendo 1 :50 en regulador de pH de muestra NuPAGE® LDS (Invitrogen) que contenía DTT 5 mM como un agente reductor y se calentaron a 95° durante 4 minutos. La muestra se cargó en sendas por duplicado de un gel 4-12% NuPAGE® a lo largo de cinco patrones de BSA que oscilan entre 0.2 pg y 2 pg/senda (para generación de curvas estándares). Se aplicó voltaje a 200 V utilizando regulador de pH de corrida MOPS SDS (Invitrogen) hasta que el tinte de rastreo alcanzó el fondo del gel. El gen se manchó con 0.2% Coomassie Blue G-250 en 45% de metanol, ácido acético al 10%, y se desmanchó, primero brevemente con 45% metanol, ácido acético al 10%, y luego a longitud con ácido acético al 7%, metanol al 5% hasta que el fondo se aclaró. Luego del desmanchado, el gel se barrió con un BioRad Fluor-S Multilmager. Se empleó un programa informático instrument's Quantity One Software v.4.5.2 para obtener volúmenes de fondo sustraído de las bandas proteicas manchadas y para generar la curva estándar de BSA que se empleó para calcular la concentración de la proteína DIG-152 quimérica en la solución inicial.

EJEMPLO 3 Actividad insecticida de proteína DIG-152 producida en Pseudomonas fluorescens La actividad insecticida de la proteína DIG-152 fue demostrada en larvas del gusano cogollero (FAW, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith)) y sobre larvas de FAE resistente a Cry1 F (rFAW).

Preparación de muestras y bioensayos Las preparaciones de los cuerpos de inclusión (proteína nativa de longitud completa o proteína activada con tripsina) fueron transferidas a regulador de pH de pH 10 CAPS 10 mM mediante métodos de intercambio tales como diálisis o columnas PD-10. Luego, las muestras se diluyeron apropiadamente en CAPS 10 mM pH 10, y todos los bioensayos contenían un tratamiento de control que consistía en esta regulador de pH, lo cual sirvió como un control de fondo ("background check") para mortalidad o inhibición del crecimiento.

Se estimaron las concentraciones proteicas en regulador de pH de bioensayo mediante electroforesis en gel utilizando BSA para crear una curva estándar para densitometría en gel, la cual se midió utilizando un sistema de imágenes BioRad según lo mencionado anteriormente. Las proteínas en la matriz de gel se mancharon con mancha a base de Azul Coomassie y se desmancharon antes de la lectura.

Las proteínas purificadas se analizaron para determinar la actividad insecticida en bioensayos conducidos con larvas de lepidópteros neonatos en dieta para insectos artificial. Las larvas de FAW se criaron de huevos obtenidos de una colonia mantenida por un insectario comercial (Benzon Research Inc., Carlisle, PA). Las larvas de rFAW se criaron de huevos recolectados de una colonia no comercial (Dow AgroSciences, Indianápolis, IN).

Los bioensayos se llevaron a cabo en bandejas de plástico de 128 pocilios diseñadas específicamente para bioensayos de insectos (C-D International, Pitman, NJ). Cada pocilio contenía 1.0 mL de dieta para lepidópteros de multiespecies (Southland Products, Lake Village, AR). Una alícuota de 40 pL de muestra proteica fue administrada mediante pipeta sobre la superficie de la dieta de 1.5 cm2 de cada pocilio (es decir 26.7 pL/cm2). Las concentraciones de la dieta se calcularon como la cantidad (ng) de proteína DIG-152 por centímetro cuadrado de área superficial en el pocilio. Las bandejas tratadas se mantuvieron en una campana de extracción de vapores hasta que el líquido sobre la superficie de la dieta se había evaporado o fue absorbido en la dieta.

Dentro de unas pocas horas de eclosón, se recogieron larvas individuales con un cepillo de pelo de camello humedecido y se depositaron sobre la dieta tratada, una larva por pocilio. Luego, los pocilios infestados se sellaron con láminas adhesivas de plástico transparente, se ventilaron para permitir el intercambio de gases (C-D International). Las bandejas de bioensayo se mantuvieron bajo condiciones medioambientales controladas [28°, aproximadamente 40% de Humedad Relativa (HR), 16 h:8 h (luz: oscuridad)] durante 5 días, después de ese tiempo, se registraron la cantidad total de insectos expuestos a cada muestra proteica, la cantidad de insectos muertos y el peso de los insectos sobrevivientes. Se calcularon el porcentaje de mortalidad y el porcentaje de inhibición del crecimiento para cada tratamiento. Se calculó el porcentaje de inhibición del crecimiento (IC) de la siguiente manera: %IC = [1 - (TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)] x 100 donde TWIT es el Peso Total de Insectos en el Tratamiento (por sus siglas en inglés "Total Weight of Insects in the Treatment), TNIT es la Cantidad Total de Insectos en el Tratamiento (por sus siglas en inglés "Total Number of jnsects in the Treatment") TWIBC es el Peso Total de Insectos en el Control de Fondo (por sus siglas en inglés "Total Weight of Insects in the Background Check") (control Regulador de pH), y TNIBC es la Cantidad Total de Insectos en el Control de Fondo (por sus siglas en inglés "Total Number of insects in the Background_Check") (Control regulador de pH).

La IC50 se determinó como siendo la concentración de proteína DIG-152 quimérica en la dieta a la cual el valor del % de IC era de 50. La CL50 (50% de la Concentración Letal) se registró como la concentración de proteína DIG-152 en la dieta a la cual 50% de los insectos de ensayo fueron eliminados. Se realizó un análisis estadístico (ANOVA de una vía) utilizando el programa informático JMP (SAS, Cary, NC).

El cuadro 2 presenta los resultados de bioensayos de ingestión de proteína DIG-152 en larvas de insectos de gusano cogollero.

CUADRO 2 Valores de ICso v CL50 (en nq/cm2) calculados de la superficie de la dieta de insectos cargada con proteína DIG-152 Una característica de la proteína DIG-152 de la presente invención es que el crecimiento de larvas neonatos de gusano cogollero (Spodoptera frugiperda) es inhibido luego de la ingestión de la proteína DIG-152. Por añadidura, las larvas de gusano cogollero que son resistentes a la intoxicación por CryI Fa son tan susceptibles a la actividad de DIG-152 como lo son las larvas de gusano cogollero del tipo salvaje. La importancia de la susceptibilidad de estos insectos resistentes a CryI Fa a Cryl Ca es descrita en forma más detallada en los que antecede.

EJEMPLO 4 Diseño de una secuencia codón- optimizada de maíz que codifica la proteína DIG-109 Un experto en la técnica de la biología molecular en plantas comprenderá que pueden diseñarse múltiples secuencias de ADN para codificar una sola secuencia de aminoácidos. Un medio común para aumentar la expresión de una región codificante para una proteína de interés consiste en diseñar la región codificante de modo que sus composiciones codónica se asemeje a la composición codónica global del huésped en el cual el gen está destinado a ser expresado. Una guía con respecto al diseño y producción de genes sintéticos puede ser encontrada en, por ejemplo, WO 1997/13402 y en la Patente Estadounidense No. 5380831.

Una secuencia de ADN que tiene una preferencia codónica de maíz fue diseñada y sintetizada para producir la proteína insecticida quimérica DIG-109 en plantas monocotiledóneas transgénicas. Se calculó una tabla de uso de codones para maíz (Zea mays L.) de 706 secuencias codificantes de proteína obtenidas de secuencias depositadas en GenBank (world wide web: ncbi.nlm.nih.gov). Se calculó un conjunto codónico de maíz promedio ponderado después de omitir cualquier codón redundante empleado menos de aproximadamente 10% de los usos de codones totales para ese aminoácido. La representación del Promedio Ponderado para cada codón se calculó utilizando la fórmula: % Promedio Ponderado de C1 = 1/(%C1 + %C2 + %C3 + etc.) x %C1 x 100 donde C1 es el codón en cuestión y %C2, %C3, etc. representan los valores de uso % promedios de los codones sinónimos remanentes.

Para derivar una secuencia de ADN codón- optimizada del maíz que codifica la proteína DIG-109 de 1 164 aminoácidos de SEC ID NO:2, se realizaron sustituciones codónicas a la secuencia de ADN cryICa nativa' que codifica el segmento de toxina de núcleo CryI Ca de modo que la secuencia de ADN resultante tuviera la composición codónica general de el cuadro de preferencias codónicas optimizados para maíz. De manera similar, se realizaron las sustituciones codónicas a la secuencia de ADN cryIAb nativa que codifica el segmento de protoxina CryIAb de modo que la secuencia de ADN resultante tuviera la composición codónica general de el cuadro de preferencias de codones optimizados para maíz. Se realizaron refinamientos adicionales a las secuencias para eliminar sitios de reconocimiento de enzimas de restricción no deseables, sitios de corte y empalme de intrones vegetales potenciales, corridas largas de residuos A T o C/G, y otros motivos que podrían interferir con la estabilidad de ARN, transcripción o traducción de la región codificante en células vegetales. Se realizaron otros cambios para introducir sitios de reconocimiento de enzimas de restricción deseados y para eliminar Marcos de Lectura Abierta internos largos (marcos diferentes a +1). Estos cambios fueron todos realizados dentro de las restricciones de retener aproximadamente la composición de codones con preferencia hacia el maíz. Una secuencia codón- optimizada de maíz completa (que codifica la proteína DIG-109) es descrita como SEC ID NO:3. La síntesis del fragmento de ADN fue realizada por un proveedor comercial (ADN2.0, Menlo Park, CA).

EJEMPLO 5 Construcción de vectores de transformación de plantas que contienen genes expresables en plantas que codifican proteínas DIG-109 El sistema superbinario de Agrobacterium (Japan Tobacco, Tokio, JP) es empleado convenientemente para la transformación de huéspedes vegetales monocotiledóneos. El sistema superbinario emplea el plásmido vector lanzadera pSB11 el cual contiene las secuencias para la repetición de borde de T-ADN derecho (RB) y la repetición de borde de T-ADN Izquierdo (LB) separados por múltiples sitios de clonación. Un derivado de pSB1 1 (denominado pDAB7691 ) fue preparado mediante métodos de clonación de ADN convencionales. El plásmido pDAB7691 contiene la secuencia codificante de DIG-109 maíz- optimizada (CDS; es decir, SEC ID NO:3) bajo el control transcripcional del promotor de ubiquitinal del maíz con intrón 1 asociado (Patente de E.U.A N° 5510474) y la Región No Traducida en 3' Per5 de maíz (3* UTR) (Patente de E.U.A N° 7179902). Adicionalmente, pDAB7691 contiene un gen marcador seleccionable vegetal que comprende el DSM2 CDS de Dow AgroSciences (WO 2008/070845 A2) bajo el control transcripcional del promotor actinal de arroz con intrón 1 asociado (Patente de E.U.A. N° 5641876) y UTR 3' de Lipasa del maíz (Patente de E.U.A. N° 7179902). La disposición física de los componentes de la región T de pDAB7691 es ilustrada convenientemente como: RB>promotor Ubi1 de maíz: DIG-109 CDS: Per5 3'UTR de maíz>promotor Act1 del arroz: DSM2 CDS: Lip 3'UTR del maíz>LB Un segundo derivado de pSB11 (denominado pDAB100276) fue preparado mediante métodos de clonación de ADN convencionales. El plásmido pDAB100276 contiene la secuencia codificante de DIG-109 maíz-optimizada (CDS; es decir, SEC ID NO:3) bajo el control transcripcional del promotor ubiquitina 1 del maíz con intrón 1 asociado y la Per5 3' UTR del maíz. Por añadidura, pDAB100276 contiene un gen marcador seleccionable vegetal que comprende la CDS AAD1 de Dow AgroSciences (Solicitud de Patente de E.U.A. No. 20090093366), bajo el control transcripcional del promotor de ubiquitina 1 del maíz con intrón 1 asociado y la UTR 3' de Lipasa del maíz. La disposición física de los componentes de la región T de pDAB100276 es ilustrada convenientemente como: RB>promotor Ubi1 del maíz: DIG-109 CDS: Per5 3' UTR del maíz> promotor Ubi1 del maíz: AAD-1 CDS: Lip 3' UTR del maíz >LB Para preparar para la transformación de Agrobacterium, se cultivaron células de la cepa de clonación de Escherichia coli DH5a que albergan el plásmido pDAB7691 o el plásmido pDAB100276 a 37° durante toda la noche en medio de agar LB (g/L. Bacto Triptona, 10; Bacto Extracto de Levadura, 5; NaCI, 10; agar, 15) que contenía Espectinomicina (100 pg/mL). Se cultivaron células de la cepa DH5a que contenían el plásmido movilizante conjugal pRK2013 en agar LB que contenía Kanamicina (50 pg/mL). Luego de la incubación, las placas se colocaron a 4° a la espera de la disponibilidad de la cepa de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 que contenía el plásmido pSB1.

EJEMPLO 6 Transformación de Agrobacterium para generación de vectores superbinarios El sistema superbinario de Agrobacterium, el cual emplea la cepa de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 que contiene el plásmido pSB1 , es empleado convenientemente para la transformación de huéspedes de plantas monocotiledóneas. Las metodologías para construir y validar vectores superbinarios son bien establecidas según lo proporcionado en el Manual Operativo para pSB1 (Japan Tobacco). Se emplearon métodos de microbiología y biología molecular convencionales para generar y validar el plásmido superbinario pDAS5162, el cual es un plásmido cointegrador que comprende a los plásmidos pSB1 y pDAB7691 , y el plásmido superbinario pDAS5848, el cual es un plásmido cointegrador que comprende a los plásmidos pSB1 y pDAB 100276.

EJEMPLO 7 Producción de proteína DIG-109 en plantas de maíz Transformación Mediada por Agrobacterium de Maíz Se plantaron semillas de una cruza F1 Hi-ll (Armstrong et al., 1991) en macetas de 18.9270589 litros (5 galones) que contenían una mezcla de medio de cultivo sin tierra 95% Metro-Mix 360 (Sun Gro Horticulture, Bellevue, WA) y 5% de arcilla/arcilla del suelo. Las plantas se cultivaron en un invernadero utilizando una combinación de sodio a presión elevada y lámparas de haluro de metal con un fotoperíodo de 16 horas de luz: 8 horas de oscuridad. Se realizaron polinizaciones de hermanos controladas para obtener embriones F2 inmaduros para transformación. Se recolectaron mazorcas de maíz a aproximadamente 8-10 días pos-polinización cuando los embriones inmaduros tenían un tamaño entre 1 .0 mm y 2.0 mm.

Infección y cocultivo Las mazorcas de maíz fueron descascaradas y la superficie fue esterilizada por frotación con jabón líquido, sumergiendo en blanqueador comercial 20% (que contenía hipoclorito sódico al 5%) durante aproximadamente 20 minutos, luego enjuagando tres veces con agua estéril.

Una suspensión de células de Agrobacteríum tumefaciens que contenían pDAS5162, un vector superbinario que alberga a un gen que codifica la proteína DIG-109 y que contenía el gen marcador seleccionare de planta DSM2, se preparó transfiriendo 1 o 2 lazos de bacterias [cultivadas durante 2-3 días a 28° en medio sólido YEP (g/L: Bacto Extracto de Levadura, 10; Bacto Peptona, 10; NaCI, 5; agar, 15) que contenía 100 mg/L de Espectinomicina, 10 mg/L de Tetraciclina, y 250 mg/L de Estreptomicina] en 5 mL de medio líquido de infección [Medio Basal LS (Linsmaier y Skoog, 1965), vitaminas N6 (Chu et al., 1975), 1.5 mg/L de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), 68.5 g/L de sacarosa, 36.0 g/L de glucosa, L-prolina 6 mM, pH 5.2] que contenía 100 µ? de acetosiringona.

Alternativamente, una suspensión de células de Agrobacteríum tumefaciens que contenían pDAS5848, un vector superbinario que alberga un gen que codifica la proteína DIG-109 y que contiene el gen marcador seleccionable de planta AAD-1 , se preparó transfiriendo 1 o 2 lazos de bacterias cultivadas según lo descrito anteriormente en 5 mL de medio líquido de infección que contenía 100 a 200 µ? de acetosiringona.

En ambos casos, la solución se sometió a vórtice hasta que se logró una suspensión uniforme, y la concentración se ajustó hasta una densidad final de 200 unidades Klett utilizando un colorímetro Klett-Summerson con un filtró púrpura (para transformaciones de pDAS5162), o hasta una densidad óptica de 1.2 a 550 nm (para transformaciones de pDAS5848). Los embriones inmaduros fueron aislados directamente en un tubo de microcentrífuga que contenía 2 mL del medio de infección. El medio se extrajo y se reemplazó con 1 mL de la solución de Agrobacterium y la solución de /\grobacter/um/embr¡ones se incubó durante 5 a 10 minutos a temperatura ambiente. Luego, los embriones fueron transferidos a medio de cocultivo [Medio Basal LS, vitaminas N6, 1.5 mg/L de 2,4-D, 30.0 g/L de sacarosa, L-prolina 6 mM, 0.85 mg/L de AgN03, 2.8 g/L de goma Gelan (PhytoTechnology Laboratories, Lenexa, KS), pH 5.8] que contenía 100 µ? de acetosiringona (para transformantes de pDAS5162) o que contenía 100 a 200 µ? de acetosiringona (para transformantes pDAS5848), y cocultivados durante 3-4 días a 20° en la oscuridad.

Luego del cocultivo, los embriones fueron transferidos a medio de reposo que contenía sales de MS y vitaminas, L-prolina 6 mM, 100 mg/L de mio-inositol, 500 mg/L de MES, 30 g/L de sacarosa, 1.5 mg/L de 2,4-D, 0.85 mg/L de AgN03, 250 mg/L de Cefotaxime, 2.8 g/L de goma gelan, pH 5.8. Aproximadamente 7 días después, los embriones fueron transferidos al mismo medio suplementado con 3 mg/L de Bialaphos (para transformantes pDAS5162) o suplementados con 100 nM de haloxifop (para transformantes pDAS5848) (medio de selección). Los aislados transformados fueron identificados después de aproximadamente 8 semanas y se aumentaron de tamaño transfiriéndolos a medio de selección frasco en intervalos de 2 semanas para regeneración y análisis.

Regeneración y producción de semillas Para la regeneración, los cultivos fueron transferidos a medio de inducción "28" (sales MS y vitaminas, 30 g/L de sacarosa, 5 mg/L de Bencilaminopurina, 0.25 mg/L 2, 4-D, 250 mg/L de Cefotaxime, 2.5 g/L de goma gelan, pH 5.7) suplementado con 3 mg/L de Bialaphos (para transformantes pDAS5162) o suplementado con 100 n de haloxifop (para transformantes pDAS5848). La incubación fue durante 1 semana bajo condiciones de luz baja (14 pErrfV1), luego 1 semana bajo condiciones de luz alta (aproximadamente 89 Em' ). Los tejidos fueron posteriormente transferidos a medio de regeneración "36" (igual que el medio de inducción excepto que carece de los reguladores del crecimiento de plantas). Cuando las plántulas tuvieron un largo de 3-5 cm, se transfirieron a tubos de vidrio para cultivo que contenían medio SHGA [(Schenk y Hildebrandt (1972) sales y vitaminas; PhytoTechnologies Labr.), 1.0 g/L de mio-inositol, 10 g/L de sacarosa y 2.0 g/L de goma gelan, pH 5.8] para permitir el crecimiento adicional y desarrollo del brote y las raíces. Las plantas fueron trasplantadas a la misma mezcla de suelo según lo descrito anteriormente y cultivadas para floración en el invernadero. Se llevaron a cabo polinizaciones controladas para la producción de semillas.

Los expertos en la técnica de la transformación del maíz comprenderán que otros métodos están disponibles para la transformación del maíz y para la selección de plantas transformadas cuando se emplean otros genes marcadores seleccionables expresables de plantas (por ej. genes de tolerancia a herbicida).

EJEMPLO 8 Análisis bioquímico y bioensayos de insectos de plantas de maíz productoras de proteína DIG-109 La producción de proteína DIG-109 en plantas de maíz transgénicas se examinó en proteínas extraídas de hojas de plantas jóvenes (generación TO). Dos discos e hojas de maíz de 6 mm de diámetro se colocaron en un tubo de muestra de una caja de tubos agrupados de 96 pocilios de profundidad (Costar Cat# 3957) y se congelaron a -80° hasta el día del análisis. En ese momento, se agregaron dos BB's Daisy™ recubiertos con zinc de 4.5 mm a cada tubo (congelado), junto con 200 L de regulador de pH de extracción compuesto por PBS (Solución Salina Tamponada con Fosfato; Fisher Cat# BP665-1) más 0.05% de Tween 20. Cada tubo se tapó y la caja se colocó en un molino de perlas (Pulverizador 4-96 de Kleco™; García Manufacturing, Visalia, CA) a la configuración máxima durante tres minutos. Las muestras pulverizadas se centrifugaron durante 5 minutos a 2,500 x g y el sobrenadante que contenía proteínas solubles se empleó en los inmunoensayos.

Los análisis de inmunoblot de proteínas de hojas de maíz extraídas revelaron que el anticuerpo policlonal DIG152RPC1 (preparado de conejos inmunizados con la proteína que contiene una toxina de núcleo Cry Ca activada con tripsina) no reacciona en forma cruzada con proteínas extraídas de hojas de plantas no transgénicas. En extractos de plantas transformadas con pDAS5162, se detectaron diversas especies proteicas por el anticuerpo DIG152PRC1 .

Es evidente que, si bien el transgén introducido en el maíz por medio de transformación con pDAS5162 codifica la proteína DIG-109 de longitud completa, la actividad proteolítica dentro de las células de maíz procesa la proteína naciente hasta una abundancia de especies de peso molecular más pequeño.

La toxicidad de insectos de las hojas recolectadas de plantas de maíz transgénico independientemente aisladas transformadas con el constructo pDAS5162 se analizó in vitro utilizando larvas neonatas de de gusano cogollero (FAW, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith)) y larvas de gusano cogollero (FAW) resistente a CryI F (rFAW). Se obtuvieron huevos de gusano cogollero (FAW) de un insectario comercial (Benzon), y los huevos rFAW provenían de una población no comercial (Dow AgroSciences). Se tomaron muestras de segmentos de hojas para bioensayos de insectos de plantas T0 cultivadas en invernadero aproximadamente 2 semanas después de que las plantas fueran trasplantadas desde el laboratorio en el invernadero. Se colocaron dos trozos de hojas de cada planta (cada una de aproximadamente 0.000645 m2 (1 pulgada cuadrada)) en pocilios separados de una bandeja de 32 pocilios (CD International) encima de aproximadamente 3 ml_ de agar al 2% solidificado. Los huevos se incubaron sobre dieta de lepidópteros de múltiples especies (Southland Products) y las larvas neonatas se seleccionaron cuando tenían menos de 24 horas de edad. Se colocaron cuidadosamente aproximadamente 10 larvas por segmento de hoja en cada pocilio utilizando un pincel para pintar de pelo de camello. Las bandejas infestadas se sellaron con las tapas perforadas suministradas con las bandejas, luego se mantuvieron a 28°, 40% HR, 16 horas luz: 8 horas de oscuridad durante tres días. El porcentaje de daño (% DAM (por sus siglas en inglés) para cada trozo de hoja se registró a la conclusión del ensayo. Se promediaron las puntuaciones del daño y se emplearon para determinar cuales plantas tenían el menor daño de cada tipo de insecto analizado. Los ensayos fueron replicados varias veces para todos los insectos.

Los datos fueron analizados utilizando el programa informático estadístico JMP (SAS, Cary, NC), promediando las puntuaciones de % de DAM para cada planta, para cada tipo de insecto. El modelo "Fit Y por X" fue empleado para análisis ANOVA de una vía. Se empleó separación de medios Tukey-Kramer según lo necesario para analizar diferencias significativas entre las puntuaciones de % de daño (DAM) medias para cada tratamiento. Se realizaron comparaciones a las puntuaciones de % de DAM obtenidas de plantas control de edad similar. Las plantas controles positivas fueron cultivadas de semillas del híbrido comercial Herculex I™, que produce la toxina de B.t. CryI Fa. Los controles negativos (es decir, plantas no transformadas) fueron representados por las líneas Hi II y B104, y una isolínea Herculex I™ (un progenitor que no contiene Cry del híbrido Herculex I™).

Figura 1 sintetiza los resultados obtenidos en dichas pruebas de bioensayos de insectos. Es un hallazgo sorprendente el hecho de que existe una correlación positiva entre la producción de DIG-109 en las hojas transgénicas y la puntuación de %DAM. Para FAW, F = 35.3; d.f. = 1 , 33; P < 0.0001 ; r2 = 0.52, y para rFAW, F = 25.3; d.f. = 1 , 33; P < 0,0001 ; r2 = 0.43. Un hallazgo adicional sorprendente y novedoso es que las larvas de gusano cogollero que son resistentes a intoxicación por la toxina B.t. CryI Fa son aun inhibidas de alimentarse por la toxina B.t. DIG-109.

Se entiende que otras pestes de insectos de maíz pueden ser analizadas en forma similar. Estas pestes incluyen, aunque sin limitarse a: Agromyza parvicornis (minador de las hojas del maíz (com blot leafminer)), Agrotis Ípsilon (gusano cortador negro (black cutworm)), Anticarsia gemmatalís (oruga del frijol terciopelo (velvetbean Caterpillar)), Diatraea grandiosella (taladrador del maíz del suroeste (southwestern corn borer)), Diatraea saccharalis (taladrador de la caña de azúcar (sugarcane borer)), Elasmopalpus lignosellus (taladrador del tallo del trigo (lesser cornstalk borer)), Helicoverpa zea (gusano de la mazorca del maíz (corn earworm)), Heliothis virescens, (gusano del tabaco (tobáceo budworm)), Ostrinia nubilalis (taladrador europeo del maíz (European corn borer)), O. nubilalis, Plutella xylostella resistente a CryI F (polilla espalda de diamante (diamondback moth)), P. xylostella Cry1-resistente, Spodoptera exigua (gusano de la remolacha (beet armyworm)), y Trichoplusia ni (gusano medidor de la col (cabbage looper)).

Las plantas de maíz transgénicas transformadas con pDAS5848 (generación TO) también fueron examinadas mediante bioensayos de insectos y mediante inmunoanálisis. La cantidad de proteína DIG-109 en extractos de hojas se cuantificó utilizando un kit de detección de ELISA CryI C disponible en el mercado (Envirologix™, Portland, MA; Cat# AP007), y el nivel de proteína DIG-109 se expresó como partes por millón (ppm; 1 ppm representa 1 ng de proteína DIG-109 por cada mg de proteína soluble total en el extracto).

El daño por alimentación por el gusano cogollero (FAW) y gusano cogollero resistente a CryI F (rFAW) se codificó de la siguiente manera: 0 = ningún daño o unas pocas marcas por alimentación de hueco de aguja (pinhole), 1 = 25% a 50% de hoja comida, y 2 = la mayor parte de la hoja consumida o ya no queda nada de la hoja. Una planta protegida es aquella cuya puntuación del daño es 0,67 o inferior.

Los datos de el cuadro 3 muestran que existe una correlación positiva entre la presencia de especie de proteína DIG-109 detectada por ELISA en las plantas TO y control de daño por alimentación realizado por larvas de gusano cogollero en bioensayos in vitro. La planta con el nivel más alto detectado de proteína DIG-109 (planta 5848-005.4) tenía la puntuación más baja de daño por alimentación de hoja. Las hojas de plantas con niveles inferiores de proteína DIG-109 detectable en el rango de 190 a 230 ppm también sufrieron menos daño por alimentación de lo visto con hojas de las plantas controles negativas (es decir, controles no transformados B104 y Hi II), que tenían puntuaciones promedio de daño de 1.7 y 1.8. En todas las hojas pDAS5848 examinadas, la especie de proteína DIG-109 predominante detectada comprendería un doblete de péptidos de tamaño aproximado 60kDa y 55kDa.

CUADRO 3 Niveles de proteína DIG-109 en extractos de hojas de maíz transgénicas transformadas con pDAS5848 y reducción del daño por alimentación del gusano cogollero de la media Por lo tanto, una característica de la presente invención es que la proteína DIG-109, cuando es producida en plantas de maíz, torna a las plantas resistentes al daño por alimentación por larvas de gusano cogollero y larvas de gusano cogollero resistente a CryI F.

EJEMPLO 9 Experimentos de unión competitiva de proteínas de toxina de núcleo CryIFa y CryICa con vesículas de membrana de borde de cepillo aisladas de Spodoptera frugiperda Los siguientes Ejemplos evalúan la unión de competición de proteínas de toxina de núcleo Cry1 a receptores putativos en tejidos de intestino de insecto. Se ha demostrado que la proteína que contiene una toxina de núcleo CryI Ca etiquetada con 1251 se une con alta afinidad a Vesículas de Membrana Borde de Cepillo (VMBC) preparadas de Spodoptera frugiperda (gusano cogollero) y que la proteína que contiene una toxina de núcleo Cry Fa no compite con esta unión.

Purificación de Proteínas Crv Un gen que codifica una proteína quimérica que comprende la toxina de núcleo CryICa y la protoxina CryIAb se expresó en la cepa de expresión de Pseudomonas fluorescens según lo descrito en el Ejemplo 2. De manera similar, un gen que codifica una proteína quimérica, que comprende la toxina de núcleo CryI Fa (603 aminoácidos) y la protoxina CryIAb (545 aminoácidos) se expresó en el sistema Pf. Las proteínas fueron mediante los métodos del Ejemplo 2, y se llevó a cabo una digestión con tripsina para producir toxinas núcleo activadas a partir de las proteínas de longitud completa y los productos se purificaron mediante los métodos del Ejemplo 2.

Las preparaciones de las proteínas procesadas con tripsina (toxina de núcleo activada) eran >95% puras y tenían un peso molecular de aproximadamente 65 kDa según lo determinado experimentalmente por SDS-PAGE.

Se emplearon métodos convencionales de cuantificación proteica y SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida según lo enseñado, por ejemplo, en Sambrook et al. (1989) y Ausubel et al. (1995), y sus actualizaciones.

Preparación v Fraccionamiento de VMBC Solubilizadas Larvas de Spodoptera frugiperda en último estadio se ayunaron durante toda la noche y luego se disecaron después de enfriamiento sobre hielo durante 15 minutos. El tejido de intestino medio fue extraído de la cavidad corporal, dejando atrás el intestino posterior unido al integumento. El intestino medio se colocó en un volumen 9X de regulador de pH de homogenización enfriado con hielo (manitol 300 mM, EGTA 5 mM, base Tris 17 mM, pH 7.5), suplementado con Cóctel Inhibidor de Proteasa (Sigma-Aldrich P-2714) diluido según lo recomendado por el proveedor. El tejido fue homogenizado con 15 golpes de un homogenizador de tejido de vidrio. Las VMBC fueron preparadas mediante el método de precipitación con MgCI2 de Wolfersberger (1993). Brevemente, se mezcló un volumen igual de una solución de MgCI2 24 mM en manitol 300 mM con el homogenado de intestino medio, se agitó durante 5 minutos y se dejó en reposo sobre hielo durante 15 min. La solución se centrifugó a 2,500 x g durante 15 min a 4°. El sobrenadante se guardó y el pellet se suspendió en el volumen original de regulador de pH de homogenización diluido 0.5X y se centrifugó nuevamente. Los dos sobrenadantes se combinaron y centrifugaron a 27.000 x g durante 30 min a 4o para formar la fracción de VMBC. El pellet se suspendió en Regulador de pH de Almacenamiento de VMBC (HEPES 10 mM, KC1 130 mM, 10% glicerol, pH 7.4) hasta una concentración proteica de aproximadamente 3 mg/mL. La concentración proteica se determinó utilizando Seroalbúmina Bovina (BSA, por sus siglas en inglés) como el patrón. Se realizó la determinación de la fosfatasa alcalina (una enzima marcadora para la fracción de VMBC) con anterioridad al congelamiento de las muestras utilizando el Kit de Ensayo de Fosfatasa Alcalina QuantiChrom™ DALP-250 Alkaline Phosphatase Assay Kit (Gentaur Molecular Products, Kampenhout, BE) siguiendo las instrucciones del fabricante. La actividad específica de esta enzima típicamente aumentó 7 veces en comparación con aquella encontrada en la fracción de homogenado de intestino medio de partida. Las VMBC se distribuyeron en muestras de 250 pL, se congelaron con congelamiento flash en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°.

Electroforesis El análisis de proteínas por SDS-PAGE se llevó a cabo bajo condiciones reductoras (es decir, en 5% de ß-mercaptoetanol, BME) y desnaturalizantes (es decir, calentamiento durante 5 minutos a 90° en presencia de 2% SDS). Las proteínas se cargaron en pocilios de un gel de Tris-Glicina poliacrilamida al 4% hasta 20% (BioRad; Hercules, CA) y se separaron a 200 voltios durante 60 minutos. Las bandas proteicas fueron detectadas por tinción con Azul Brillante Coomassie R-250 (BioRad) durante una hora, y de desmancharon con una solución de 5% metanol en ácido acético al 7%. Se tomaron imágenes de los geles y se analizaron utilizando un BioRad Fluro-S Multi Imager™. Se determinaron los pesos moleculares relativos de las bandas proteicas por comparación con las movilidades de proteínas de pesos moleculares conocidos observadas en una muestra de Escalera de Proteínas BenchMark™ Protein Ladder (Life Technologies, Rockville, MD) cargada en un pocilio del gel.

Yodación de proteína que contiene una toxina de núcleo CrvI Ca La proteína que contiene una toxina de núcleo CryI Ca purificada se trató con yodo utilizando Perlas de Yodación Pierce lodination Beads (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). Brevemente, se lavaron dos Perlas de Yodación dos veces con 500 pL de PBS (fosfato sódico 20 mM, NaCI 0.15 M, pH 7.5), y se colocaron en un tubo de centrifugación de 1.5 mL con 00 pL de PBS. Se agregó 0.5 mCi de yoduro sódico rotulado con 1251, los componentes se dejaron reaccionar durante 5 minutos a temperatura ambiente, luego se agregó 1 pg de proteína que contiene toxina de núcleo CryI Ca a la solución y se dejó reaccionar durante 3 a 5 minutos más. La reacción fue terminada por pipeteo de la solución desde las Perlas de Yodación y aplicándola a una solución giratoria Zeba™ (Invitrogen) equilibrada en CAPS 50 mM, pH 10.0, DTT 1 mM (ditiotreitol), EDTA 1 mM, y 5% glicerol. Las Perlas de Yodación se lavaron dos veces con 10 pL de PBS y la solución de lavado fue también aplicada a la columna de desalinización Zeba™. La solución radiactiva fue eluida a través de la columna de centrifugación por centrifugación a 1 ,000 x g durante 2 min. Luego la proteína que contenía toxina de núcleo CryI Ca radioetiquetada con 1251 se dializó contra CAPS 50 mM, pH 10.0, DTT 1 mM, EDTA 1 mM, y 5% glicerol.

Imágenes Se determinó la radio-pureza de la proteína de toxina de núcleo CryI Ca tratada con yodo mediante SDS-PAGE y fosforimágenes. Brevemente, se secaron geles de SDS-PAGE utilizando un aparato de secado de geles BioRad siguiendo las instrucciones del fabricante. Se tomaron imágenes de los geles secados envolviéndolos en película Mylar (espesor de 12 ym) y exponiéndolos bajo una pantalla de fósforo de almacenamiento Molecular Dynamics (35 cm x 43 cm) durante 1 hora. Las placas se desarrollaron utilizando un aparato de fosforimágenes Molecular Dynamics Storm 820 y la imagen se analizó utilizando el programa informático ImageQuant™.

EJEMPLO 10 Unión de proteína de toxina de núcleo Cry1 etiquetada con 1251 a VMBC de Spodoptera frupiperda Se generó una curva de saturación utilizando proteína que contiene toxina de núcleo CryIAc radioetiquetada con 1251 para determinar la cantidad óptima de proteína de VMBC para utilizar en los ensayos de unión con proteínas que contienen toxina de núcleo CryI Ca y CryI Fa. Se incubó 0.5 nM de proteína que contiene toxina de núcleo CryIAc radioetiquetada con 1251 durante 1 hora a 28° en regulador de pH de unión (NaHP04 8 mM, KH2P04 2 mM, NaCI 150 mM, 0.1 % BSA, pH 7,4) con cantidades de proteína de VMBC que oscilan entre 0 g/mL y 500 pg/mL (volumen total de 0.5 ml_). La proteína de toxina de núcleo CryIAc etiquetada con 1251 unida a las proteínas VMBC se separó de la fracción no unida por muestreo de 150 pL de la mezcla de reacción por triplicado en tubos de centrifugación de 1.5 mL y centrifugación de las muestras a 14.000 x g durante 8 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se extrajo suavemente y el pellet se lavó tres veces con regulador de pH de unión enfriado con hielo. El fondo el tubo de centrifugación que contenía el pellet se cortó, se colocó en un tubo de cultivo de vidrio de 13 x 75 mm y las muestras se contaron durante 5 minutos cada una en el contador gamma. CPM ("counts per minute" recuentos por minuto) obtenidos menos CPM de fondo (reacción sin proteína de VMBC) se trazó contra la concentración de proteína de VMBC. De acuerdo con otros resultados también, se determinó la concentración óptima de proteína VMBC para utilizar en los ensayos de unión que era 150 pg/mL.

EJEMPLO 11 Ensayos de unión competitiva a VMBC de S. fruqiperda con proteínas de toxina de núcleo de CryICa y Cryl Fa Se llevaron a cabo ensayos de unión de competición homologa y heteróloga utilizando 150 g/mL de proteína VMBC y 0.5 nM de la proteína de toxina de núcleo CryI Ca radioetiquetada con 1251. Las concentraciones de la proteína de toxina de núcleo Cryl Fa no radioetiquetada competitiva agregadas a la mezcla de reacción oscilaron entre 0.045 nM y 1000 nM y se agregaron al mismo tiempo que la proteína de toxina de núcleo CryI Ca radiactiva, para asegurar la verdadera competición por la unión. Se llevaron a cabo incubaciones durante 1 hora a 28° y se midió la cantidad de proteína de toxina de núcleo CryI Ca etiquetada con 1251 unida a la VMBC (unión específica) según lo descrito anteriormente. La unión no específica fue representada por los recuentos obtenidos en presencia de 1 ,000 nM de proteína de toxina de núcleo CryI Ca no radioetiquetada. Se consideró que un cien por ciento de unión total era la cantidad de unión en ausencia de cualquier proteína de toxina de núcleo Cryl Fa competidora.

Los ensayos de unión al receptor que utilizan proteína de toxina de núcleo CryICa etiquetada con 1251 determinaron la capacidad de la proteína de toxina de núcleo CryI Fa de desplazar a este ligando radioetiquetado de su sitio de unión en VMBC de S. frugiperda. Los resultados (Figura 2) muestran que la proteína de toxina de núcleo CryI Fa no desplazó proteína de toxina de núcleo CryI Ca etiquetada con 1251 de su proteína o proteínas receptoras en concentraciones tan elevadas como 300 nM (600 veces la concentración del ligando de unión radiactivo). Según lo esperado, la proteína de toxina de núcleo CryI Ca sin etiquetar era capaz de desplazar a la proteína de toxina de núcleo CryI Ca radioetiquetada de su proteína o proteínas de unión, exhibiendo una curva de respuesta a la dosis sigmoidal produciéndose 50% del desplazamiento a 5 nM.

Por lo tanto, se indica que la proteína de toxina de núcleo CryI Ca interactúa con un sitio de unión en VMBC de S. frugiperda que no une la proteína de toxina de núcleo CryI Fa.

Ver Figura 2: Competición por la unión a VMBC de Spodoptera frugiperda por la toxina de núcleo CryI Fa, la toxina de núcleo CryI Ca, y toxina de núcleo CryI Ca etiquetada con 1251.

EJEMPLO 12 Unión competitiva de proteína de toxina de núcleo CryICa y proteína de toxina de núcleo CryIFa etiquetada con biotina a VMBC de Diatraea saccharalis Los siguientes Ejemplos evalúan la unión competitiva de proteínas de toxina de núcleo Cry1 a receptores putativos en tejidos de intestino de insecto. Se muestra que la proteína de toxina de núcleo CryI Fa etiquetada con biotina se une con alta afinidad a Vesículas de Membrana Borde de Cepillo (VMBC) preparadas a partir de Diatraea saccharalis (taladrador de la caña de azúcar) y que la proteína de toxina de núcleo CryI Ca no compite con esta unión.

Preparación y Fraccionamiento de VMBC Solubilizadas Larvas de D. saccharalis en último estadio se ayunaron durante toda la noche y luego se disecaron después de enfriamiento sobre hielo durante 15 minutos. Se hicieron preparaciones de VMBC siguiendo los métodos descritos en el Ejemplo 10.

Los resultados de los ensayos de unión por competición utilizando proteína de toxina de núcleo CryI Fa etiquetada con 1251 pueden tener relevancia biológica limitada, puesto que la yodación de la proteína CryI Fa torna a la proteína inactiva en bioensayos de alimentación de insectos. En contraste, se ha descubierto que la proteína de toxina de núcleo CryI Fa biotinilada retiene su toxicidad contra insectos. Por añadidura, es posible medir la interacción de esta proteína (biotinilada) con receptores en presencia de proteínas de toxina de núcleo Cry (de competitición) no biotiniladas. Ese tipo de experimento de competición puede detectar la unión de la proteína de toxina de núcleo CryI Fa etiquetada con biotina a receptores en VMBC de D. saccharalis después de electroforesis de las proteínas de VMBC y transferencia de la muestra entera a una membrana de PVDF (fluoruro de polivinilideno). Avidina conjugada a peroxidasa de rábano picante, en combinación con un reactivo de luminiscencia química mejorado, se emplea para visualizar la proteína de toxina de núcleo CryI Fa etiquetada con biotina.

La proteína de toxina de núcleo CryI Fa fue etiquetada con biotina utilizando un Kit de Biotinilación Pierce EZ-Link® Sulfo-NHS-LC (Thermo Fisher Scientific). Brevemente, se agregaron 40 µ?_ de Sulfo-NHS-LC-biotina (10 mg/mL en Sulfóxido de Dimetilo) a 500 µ?_ de proteína de toxina de núcleo CryI Fa (2.0 mg/mL) en regulador de pH de fosfato sódico 0.1 M, pH 7.2. La reacción se incubó a 4o durante toda la noche, luego se extrajo Sulfo-NHS-LC-biotina sin reaccionar utilizando una columna de desalinización Zeba™. Se midió la incorporación de biotina en proteína de toxina de núcleo CryI Fa utilizando el ensayo de desplazamiento de Pierce HABA-avidina (Thermo Fisher Scientific) según lo descrito por el fabricante.

La proteína de toxina de núcleo CryI Fa etiquetada con biotina (2.5 nM) se incubó durante 1 hr. a 28° con 0.2 mg de VMBC preparadas a partir de D. saccharalis [en un volumen total de 1.0 mL] en presencia o ausencia de un exceso de 500 veces de proteínas de toxina de núcleo Cry1 Fa o CryI Ca sin etiquetar. Se extrajo la proteína de toxina de núcleo CryI Fa etiquetada con biotina no unida por centrifugación a 16,000 x g durante 10 min y el pellet resultante se lavó 3 veces con regulador de pH de unión enfriado con hielo. El pellet se suspendió en 15 pL de regulador de pH de muestra 4X Laemmli, se sometió a vórtice y se sónico para asegurar la completa solubilización y se calentó hasta 90° durante 3 min. La muestra entera se cargó sobre un gel de Tris glicina al 4% hasta 20%, se separó por SDS-PAGE, y se electro transfirió sobre membrana de PVDF según lo recomendado por las instrucciones del proveedor (BioRad). 1 ,000 ng de proteína de toxina de núcleo CryI Fa y proteína de toxina de núcleo CryI Ca también se corrieron en el gel como controles negativos. La proteína de toxina de núcleo CryI Fa etiquetada con biotina fue visualizada con peroxidasa de rábano picante conjugada a avidina a una dilución 1 :15,000 con quimioluminiscencia aumentada utilizando una mezcla 1 :1 de Solución de Peróxido SuperSignal® West Pico Peroxide Solution con Solución Potenciadora Luminal Enhancer Solution (Thermo Fisher Scientific, números de catálogo 1859674 y 1859675). Se registraron las bandas utilizando un Biorad Fluor-S Multilmager con programa informático Quantity One v.4.5.2.

Los resultados demostraron la detección de proteína de toxina de núcleo Cry1 Fa etiquetada con biotina unida a receptores en VMBC de D. saccharalis, y mostraron además que la proteína de toxina de núcleo Cry1 Fa no biotinilada a una concentración en exceso de 500 veces desplazó completamente la proteína de toxina de núcleo CryI Fa biotinilada unida de su receptor o receptores. En contraste, una concentración en exceso de 500 veces de proteína de toxina de núcleo CryI Ca no fue capaz de desplazar la proteína de toxina de núcleo CryI Fa biotinilada unida, indicando que la proteína de toxina de núcleo CryI Ca no compite por los sitio(s) de unión de la proteína de toxina de núcleo CryI Fa en VMBC de D. saccharalis. Por lo tanto se indica que, de modo análogo a los resultados obtenidos con VMBC de S. frugiperda, la proteína de toxina de núcleo Cry1 Fa y la proteína de toxina de núcleo CryICa se unen a sitios de unión separados en VMBC de D. saccharalis.

Referencias Finney, D.J. 1971. Probit analysis. Cambridge University Press, Inglaterra.

Hua, G., L. Masson, J. L. Jurat-Fuentes, G. Schwab, y M. J.

Adang. Binding analyses of Bacillus thuringiensis Cry d-endotoxins using brush border membrane vesicles of Ostrinia nubilalis. Applied and Environmental Microbiology 67[2], 872-879. 2001.

LeOra Software. 1987. POLO-PC. A user's guide to probit and logit analysis. Berkeley, CA.

McGaughey, W. H., F. Gould, y W. Gelernter. Bt resistance management. Nature Biotechnology 16[2], 144-146. 1998 Marcon, P.R.G.C., L.J. Young, K. Steffey, y B.D. Siegfried. 1999. Baseline susceptibility of the European com borer, Ostrinia nubilalis (Hübner) (Lepidoptera: Pyralidae) to Bacillus thuringiensis toxins. J. Econ. Entomol. 92 (2): 280-285.

Robertson, L.J. y H.K. Preisler. 1992. Pesticide bioassays with arthropods. CRC Press, Boca Ranton, FL.

SAS Institute Inc. 1988. SAS procedures guide, Reléase 6.03 edition. SAS Institute Inc, Cary, NC.

Stone, B.F. 1968. A formula for determining degree of dominance in cases of monofactorial inheritance of resistance to chemicals. Bull. WHO 38:325-329.

Van Mellaert, H., J. Botterman, J. Van Rie, y H. Jóos. Transgenic plants for the prevention of development of insects resistant to Bacillus thuringiensis toxins. (Plant Genetic Systems N.V., Belg. 89-401499[400246], 57-19901205. EP. 5-31-1989 Apéndice A Lista completa de delta-endotoxinas - del sitio web de Crickmore et al. (citado en la solicitud) desde el 14 de diciembre, 2009 En el sitio web, nombrar links a entrada NCBI (si están disponibles) Nombre No. Cuenta Autores Año Cepa fuente Comentario Crv1Aa1 AAA22353 Schnepf et al 1985 Bt kurstaki HD1 Crv1 Aa2 AAA22552 Shibano et al 1985 Bt sotto Crv1Aa3 BAA00257 Shimizu et al 1988 Bt aizawai IPL7 Cry1Aa4 CAA31886 Masson et al 1989 Bt entomocidus Crv1Aa5 BAA04468 Udayasuriyan et al 1994 Bt Fu-2-7 Crv1Aa6 AAA86265 Masson et al 1994 Bt kurstaki NRD-12 Cry1Aa7 AAD46139 Osman et al 1999 Bt C12 Secuencia de Crv1 Aa8 126149 Liu 1996 ADN solamente Crv1 Aa9 BAA77213 Nagamatsu et al 1999 Bt dendrolimus T84A1 Crv1Aa10 AAD55382 Hou and Chen 1999 Bt kurstaki HD-1-02 Crv1Aa1 1 CAA70856 Tounsi et al 1999 Bt kurstaki Crv1Aa12 AAP80146 Yao et al 2001 Bt Ly30 Crv1Aa13 AAM44305 Zhong et al 2002 Bt sotto Crv1Aa14 AAP40639 Ren et al 2002 sin publicar Crv1Aa15 AAY66993 Sauka et al 2005 Bt lNTA Mol-12 Crv1Ab1 AAA22330 Wabiko et al 1986 Bt berliner 1715 Crv1Ab2 AAA22613 Thorne et al 1986 Bt kurstaki Crv1Ab3 AAA22561 Geiser et al 1986 Bt kurstaki HD1 Crv1Ab4 BAA00071 Kondo et al 1987 Bt kurstaki HD1 Crv1Ab5 CAA28405 Hofte et al 1986 Bt berliner 1715 Crv1Ab6 AAA22420 Hefford et al 1987 Bt kurstaki NRD-12 Crv1Ab7 CAA31620 Haider & Ellar 1988 Bt aizawai IC1 Crv1Ab8 AAA22551 Oeda et al 1987 Bt aizawai IPL7 Crv1Ab9 CAA38701 Chak & Jen 1993 Bt aizawai HD133 Crv1Ab10 A29125 Fischhoff et al 1987 Bt kurstaki HD1 secuencia de Crv1Ab1 1 112419 Ely & Tippett 1995 Bt A20 ADN solamente Crv1Ab12 AAC64003 Silva-Werneck et al 1998 Bt kurstaki S93 Crv1Ab13 AAN 76494 Tan et al 2002 Bt c005 Meza-Basso 8 Crv1Ab14 AAG16877 ' 2000 Bt chileno nativo Theoduloz Crv1 Ab15 AAO13302 Li et al 2001 Bt B-Hm-16 Crv1Ab16 AAK55546 Yu et al 2002 Bt AC-1 1 Crv1 Ab17 AAT46 15 Huang et al 2004 Bt WB9 Crv1 Ab18 AAQ88259 Stobdan et al 2004 Bt Crv1Ab19 AAW31761 Zhong et al 2005 Bt X-2 Crv1Ab20 ABB72460 Liu et al 2006 BtC008 Crv1Ab21 ABS18384 Swiecicka et al 2007 Bt IS5056 Crv1Ab22 ABW87320 Wu and Feng 2008 BtS2491Ab CrylAb- AAK14336 Nagarathinam et al 2001 Bt kunthala RX24 similar CrylAb- AAK14337 Nagarathinam et al 2001 Bt kunthala RX28 similar Cryl Ab- AAK14338 Nagarathinam et al 2001 Bt kunthala RX27 similar CrylAb- secuencia ABG88858 Lin et al 2006 Bt Iy4a3 similar insuficiente CrylAd AAA22331 Adang et al 1985 Bt kurstaki HD73 Cry1Ac2 AAA22338 Von Tersch et al 1991 Bt kenyae Crv1Ac3 CAA38098 Dardenne et al 1990 Bt BTS89A Cry1 Ac4 AAA73077 Feitelson 1991 Bt kurstaki PS85A1 Bt kurstaki Crv1Ac5 AAA22339 Feitelson 1992 PS81 GG Crv1Ac6 AAA86266 Masson et al 1994 Bt kurstaki NRD-12 Cry1 Ac7 AAB46989 Herrera et al 1994 Bt kurstaki HD73 Crv1Ac8 AAC44841 Ornólo et al 1997 Bt kurstaki HD73 Cry1Ac9 AAB49768 Gleave et al 1992 Bt DSIR732 Bt kurstaki YBT- Cry1Ac10 CAA05505 Sun 1997 1520 akhdoom Cry1Ac1 1 CAA 10270 & 1998 Riazuddin Crv1Ac12 112418 Ely & Tippett 1995 Bt A20 secuencia de ADN solamente Crv1Ac13 AAD38701 Qiao et al 1999 Bt kurstaki HD1 Crv1Ac14 AAQ06607 Yao et al 2002 Bt Ly30 Crv1Ac15 AAN07788 Tzeng et al 2001 Bt de Taiwan Crv1Ac16 AAU87037 Zhao et al 2005 Bt H3 Crv1Ac17 AAX18704 Hire et al 2005 Bt kenyae HD549 Cry1Ac18 AAY88347 Kaur & Allam 2005 Bt SK-729 Crv1Ac19 ABD37053 Gao et al 2005 Bt C-33 Cry1Ac20 ABB89046 Tan et al 2005 Crv1Ac21 AAY66992 Sauka et al 2005 INTA Mol- 12 Crv1Ac22 ABZ01836 Zhang & Fang 2008 Bt W015-1 Crv1Ac23 CAQ30431 ashyap et al 2008 Bt Crv1Ac24 ABL01535 Arango et al 2008 Bt 146-158-01 Cry1Ac25 FJ513324 Guan Peng et al 2008 Bt Tm37-6 Sin enlace NCBI Julio 09 Cry1Ac26 FJ617446 Guan Peng et al 2009 Bt Tm41-4 Sin enlace NCBI Julio 09 Cry1Ac27 FJ617447 Guan Peng et al 2009 Bt Tm44-1 B Sin enlaceNCBI Julio 09 Cry1Ac28 ACM90319 Li et al 2009 Bt Q-12 Crv1Ad1 AAA22340 Feitelson 1993 Bt aiza ai PS81 I Crv1Ad2 CAA01880 Anonymous 1995 Bt PS81 RR1 Crv1Ae1 AAA22410 Lee & Aronson 1991 Bt alesti Crv1Af1 AAB82749 Kang et al 1997 Bt NT0423 Cry1Aq1 AAD46137 Mustafa 1999 Crv1Ah1 AAQ 14326 Tan et al 2000 Crv1Ah2 ABB76664 Qi et al 2005 Bt alesti Cry1Ai1 AA039719 Wang et al 2002 CrylA-similar AAK14339 Nagarathinam et al 2001 Bt kunthala nags3 secuencia incierta Cry1 Ba1 CAA29898 Brizzard & Whiteley 1988 Bt thuringiensis HD2 Crv1 Ba2 CAA65003 Soetaert 1996 Bt entomocidus HD110 Crv1 Ba3 AAK63251 Zhang et al 2001 Crv1 Ba4 AAK51084 Nathan et al 2001 Bt entomocidus HD9 Crv1 Ba5 ABO20894 Song et al 2007 Bt sfw-12 Crv1 Ba6 ABL60921 Martins et al 2006 Bt S601 Crv1 Bb1 AAA22344 Donovan et al 1994 Bt EG5847 Crv1 Bc1 CAA86568 Bishop et al 1994 Bt morrisoni Crv1 Bd1 AAD10292 Kuo et al Bt wuhanensis 2000 Crv1Bd2 AAM93496 Isakova et al 2002 Bt834 Crv1Be1 AAC32850 Payne et al 1998 Bt PS158C2 Crv1Be2 AAQ52387 Baum et al 2003 Sin enlace NCBI Cry1Be3 FJ716102 Xiaodong Sun et al 2009 Bt Julio 09 Crv1Bf1 CAC50778 Arnaut et al 2001 Crv1Bf2 AAQ52380 Baum et al 2003 Crv1Bq1 AAO39720 Wang et al 2002 Crv1Ca1 CAA30396 Honee et al 1988 Bt entomocidus 60.5 Cry1Ca2 CAA31951 Sanchis et al 1989 Bt aizawai 7.29 Crv1Ca3 AAA22343 Feitelson 1993 Btaizawai PS81I Crv1Ca4 CAA01886 Van Mellaert et al 1990 Bt entomocidus HD110 Crv1Ca5 CAA65457 Strizhov 1996 Bt aizawai 7.29 Crv1Ca6 AAF37224 Yu et al 2000 Bt AF-2 Crv1Ca7 AAG50438 Aixing et al 2000 Bt J8 Cry1Ca8 AAM00264 Chen et al 2001 Bt c002 Crv1Ca9 AAL79362 Kao et al 2003 BtG10-01A Crv1Ca10 AAN 16462 Lin et al 2003 Bt E05-20a Crv1Ca11 AAX53094 Cai et al 2005 Bt C-33 Secuencia de Crv1Cb1 M97880 Kalman et al 1993 Bt galleriae HD29 ADN solamente Crv1Cb2 AAG35409 Song et al 2000 Bt c001 Crv1Cb3 ACD50894 Huang et al 2008 Bt087 CrvlCb- Thammasittirong et secuencia AAX63901 612005 Bt TA476-1 similar al insuficiente Crv1Da1 CAA38099 Hofte et al 1990 Bt aizawai HD68 Secuencia de Crv1Da2 176415 Payne & Sick 1997 ADN solamente Crv1Db1 CAA80234 Lambert 1993 Bt BTS00349A Crv1Db2 AAK48937 Li et al 2001 Bt B-Pr-88 CrvlDd ABK35074 Lertwiriyawong et al 2006 Bt JC291 Crv1Ea1 CAA37933 Visser et al 1990 Bt kenyae 4F1 Crv1Ea2 CAA39609 Bosse et al 1990 Bt kenyae Crv1Ea3 AAA22345 Feitelson 1991 Bt kenyae PS81F Barboza-Corona et Crv1Ea4 AAD04732 ei1998 Bt kenyae LBIT-147 al Secuencia de Crv1Ea5 A15535 Botterman et al 1994 ADN solamente Crv1Ea6 AAL50330 Sun et al 1999 Bt YBT-032 Crv1Ea7 AAW72936 Huehne et al 2005 Bt JC190 Crv1Ea8 ABX11258 Huang et al 2007 Bt HZM2 Crv1Eb1 AAA22346 Feitelson 1993 Btaizawai PS81A2 Crv1Fa1 AAA22348 Chambers et al 1991 Bt aizawai EG6346 Crv1Fa2 AAA22347 Feitelson 1993 Btaizawai PS81I Crv1Fb1 CAA80235 Lambert 1993 Bt BTS00349A Crv1Fb2 BAA25298 asuda & Asano 1998 Bt morrisoni INA67 Crv1Fb3 AAF21767 Song et al 1998 Bt morrisoni Crv1Fb4 AAC 10641 Payne et al 1997 Crv1Fb5 AA013295 Li et al 2001 Bt B-Pr-88 Crv1Fb6 ACD50892 Huang et al 2008 Bt 012 Crv1Fb7 ACD50893 Huang et al 2008 Bt 087 Crv1Ga1 CAA80233 Lambert 1993 Bt BTS0349A Crv1Ga2 CAA70506 Shevelev et al 1997 Bt wuhanensis Crv1Gb1 AAD10291 Kuo & C ak 1999 Bt wuhanensis HD525 Crv1Gb2 AA013756 Li et al 2000 Bt B-Pr-88 CrylGc AAQ52381 Baum et al 2003 Cry1 Ha1 CAA80236 Lambert 1993 Bt BTS02069AA Crv1 Hb1 AAA79694 Koo et al 1995 Bt morrisoni BF190 CrylH- similar AAF01213 Srifah et al 1999 BUC291 secuencia insuficiente Crv1la1 CAA44633 Tailor et al 1992 Bt kurstaki Crv1la2 AAA22354 Gleave et al 1993 Bt kurstaki Cry1 la3 AAC36999 Shin et al 1995 Bt kurstaki HD1 Crv1la4 AAB00958 Kostichka et al 1996 Bt AB88 Crv1la5 CAA70124 Selvapandiyan 1996 Bt 61 Crv1la6 AAC26910 Zhong et al 1998 Bt kurstaki S101 Cry1 la7 AAM73516 Porcar et al 2000 Bt Crv1la8 AAK66742 Song et al 2001 Crv1la9 AAQ08616 Yao et al 2002 Bt Ly30 Crv1la10 AAP86782 Espindola et al 2003 Bt thuringiensis Crv1la11 CAC85964 Tounsi et al 2003 Bt kurstaki BNS3 Crv1la12 AAV53390 Grossi de Sa et al 2005 Bt Crv1la13 ABF83202 Martins et al 2006 Bt Crv1 la14 ACG63871 Liu & Guo 2008 Bt11 Cry1 la15 FJ617445 Guan Peng et al 2009 Bt E-1 B Sin enlace NCBI Julio 2009 Cry1la16 FJ617448 Guan Peng et al 2009 Bt E-1A Sin enlace NCBI Julio 2009 Crv1lb1 AAA82114 Shin et al 1995 Bt entomocidus BP465 Crv1lb2 ABW88019 Guan et al 2007 Bt PP61 Cr l 3 ACD75515 Liu & Guo 2008 Bt GS8 Crv1lc1 AAC62933 Osman et al 1998 Bt C18 Crv1lc2 AAE71691 Osman et al 2001 Crv1ld1 AAD44366 Choi 2000 Crv1le1 AAG43526 Song et al 2000 Bt BTC007 Crv1lf1 AAQ52382 Baum et al 2003 similar AAC31094 Payne et al 1998 secuencia CrvH- insuficiente similar ABG88859 Lin & Fang 2006 Bt Iy4a3 secuencia CrvUal AAA22341 insuficiente Donovan 1994 Bt EG5847 CrvUbl AAA98959 Von Tersc & González 1994 Bt EG5092 CrvUd AAC31092 Payne et al 1998 Crv1Jc2 AAQ52372 Baum et al 2003 CrvUdl CAC50779 Arnaut et al 2001 Bt Crv1 Ka1 AAB00376 Koo et al 1995 Crv1 La1 Bt morrisoni BF190 AAS60191 Je et al 2004 Crv1- Bt kurstaki K1 similar AAC31091 Payne et al 1998 secuencia Crv2Aa1 AAA22335 insuficiente Donovan et al 1989 Bt kurstaki Crv2Aa2 AAA83516 Widner & Whiteley 1989 Bt kurstaki HD1 Crv2Aa3 D86064 Sasaki et al 1997 Bt sotto Secuencia de Crv2Aa4 AAC04867 ADN solamente Misra et al 1998 Bt kenyae HD549 Crv2Aa5 CAA10671 Yu & Pang 1999 Bt SL39 Crv2Aa6 CAA 10672 Yu & Pang 1999 Bt YZ71 Crv2Aa7 CAA10670 Yu & Pang 1999 Bt CY29 Cry2Aa8 AA013734 Wei et al 2000 Bt Dongbei 66 Crv2Aa9 AA013750 Zhang et al 2000 Crv2Aa10 AAQ04263 Yao et al 2001 Crv2Aa11 AAQ52384 Baum et al 2003 Crv2Aa12 ABI83671 Tan et al 2006 Bt Rpp39 Crv2Aa13 ABL01536 Arango et al 2008 Bt 1 6-158-01 Crv2Aa14 ACF04939 Hire et al 2008 Bt HD-550 Crv2Ab1 AAA22342 Widner & Whiteley 1989 Bt kurstaki HD1 Crv2Ab2 CAA39075 Dankocsik et al 1990 Bt kurstaki HD1 Crv2Ab3 AAG36762 Chen et al 1999 Bt BTC002 Crv2Ab4 AA013296 Li et al 2001 Bt B-Pr-88 Crv2Ab5 AAQ04609 Yao et al 2001 Bt Iy30 Crv2Ab6 MP59457 Wang et al 2003 Bt WZ-7 Crv2Ab7 AA266347 Udayasuriyan et al 2005 Bt 14-1 Crv2Ab8 ABC95996 Huang et al 2006 Bt WB2 Crv2Ab<3 ABC74968 Zhang et al 2005 Bt LLB6 Crv2Ab10 EF157306 Lin et al 2006 Bt LyD Crv2Ab11 CAM84575 Saleem et al 2007 Bt CMBL-BT1 Crv2Ab12 ABM21764 Lin et al 2007 Bt LyD Crv2Ab13 ACG76120 Zhu et al 2008 Bt ywc5-4 Crv2Ab14 ACG76121 Zhu et al 2008 Bt Bts Crv2Ac1 CAA40536 Aronson 1991 Bt Shanghai S1 Crv2Ac2 AAG35410 Song et al 2000 Crv2Ac3 AAQ52385 Baum et al 2003 Crv2Ac4 ABC95997 Huang et al 2006 Bt WB9 Crv2Ac5 ABC74969 Zhang et al 2005 Crv2Ac6 ABC74793 Xia et al 2006 Bt wuhanensis Crv2Ac7 CAL18690 Saleem et al 2008 Bt SBSBT-1 Crv2Ac8 CA 09325 Saleem et al 2007 Bt CMBL-BT1 Crv2Ac9 CAM09326 Saleem et al 2007 Bt CMBL-BT2 Crv2Ac10 ABN15104 Bai et al 2007 Bt QCL-1 Crv2Ac11 CAM83895 Saleem et al 2007 Bt HD29 Crv2Ac12 CAM83896 Saleem et al 2007 Bt CMBL-BT3 Crv2Ad1 AAF09583 Choi et al 1999 Bt BR30 Crv2Ad2 ABC86927 Huang et al 2006 Bt WB10 Crv2Ad3 CA 29504 Saleem et al 2006 Bt 5_2AcT(1 ) Crv2Ad4 CAM32331 Saleem et al 2007 Bt CMBL-BT2 Crv2Ad5 CA078739 Saleem et al 2007 Bt HD29 Crv2Ae1 AAQ52362 Baum et al 2003 Crv2Af1 ABO30519 Beard et al 2007 Bt C81 Crv2Aq ACH91610 Z u et al 2008 Bt JF19-2 Cry2Ah EU939453 Zhang et al 2008 Bt Sin enlace NCBI Julio 09 Crv2Ah2 ACL80665 Zhang et al 2009 Bt BRC-ZQL3 Cry2Ai FJ788388 Udayasuriyan et al 2009 Bt Sin enlace NCBI Julio 09 Crv3Aa1 AAA22336 Herrnstadt et al 1987 Bt san diego Crv3Aa2 AAA22541 Sekar et al 1987 Bt tenebrionis Crv3Aa3 CAA68482 Hofte et al 1987 Crv3Aa4 AAA22542 McPherson et al 1988 Bt tenebrionis Crv3Aa5 AAA50255 Donovan et al Bt morrisoni 1988 EG2158 Crv3Aa6 AAC43266 Adams et al 1994 Bt tenebrionis Crv3Aa7 CAB4141 1 Zhang et al 1999 Bt 22 Crv3Aa8 AAS79487 Gao and Caí 2004 Bt YM-03 Crv3Aa9 AAW05659 Bulla and Candas 2004 Bt UTD-001 Crv3Aa10 AAU29411 Chen et al 2004 Bt 886 Crv3Aa1 1 AAW82872 Kurt et al 2005 Bt tenebrionis Mm2 Crv3Aa12 ABY49136 Sezen et al 2008 Bt tenebrionis Crv3Ba1 CAA34983 Sick et al 1990 Bt tolwort i 43F Crv3Ba2 CAA00645 Peferoen et al 1990 Bt PGSI208 Crv3Bb1 AAA22334 Donovan et al 1992 Bt EG4961 Crv3Bb2 AAA74198 Donovan et al 1995 Bt EG51 4 Crv3Bb3 1 5475 Peferoen et al 1995 Secuencia de ADN solamente Cry3Ca1 CAA42469 Lambert et al 1992 Bt kurstaki Btl109P Crv4Aa1 CAA68485 Ward & Ellar 1987 Bt israelensis Crv4Aa2 BAA00179 Sen et al 1988 Bt israelensis HD522 Crv4Aa3 CAD30148 Berry et al 2002 Bt israelensis Crv4A- AAY96321 secuencia similar Mahalakshmi et al 2005 Bt LDC-9 insuficiente Crv4Ba1 CAA30312 Chungjatpornchai et al 1988 Bt israelensis 4Q2 72 Cry4Ba2 CAA30114 Tungpradubkul et al 1988 Bt israelensis Cry4Ba3 AAA22337 Yamamoto et al 1988 Bt israelensis Cry4Ba4 BAA00 78 Sen et al 1988 Bt israelensis HD522 Crv4Ba5 CAD30095 Berry et al 2002 Bt israelensis Cry4Ba- similar ABC47686 Mahalakshmi et al 2005 Bt LDC-9 secuencia insuficiente Cry4Ca1 EU646202 Shu et al 2008 Sin enlace NCBI Julio 09 Cry4Cb1 FJ403208 Jun & Furong 2008 B. HS18-1 Sin enlace NCBI Julio 09 Cry4Cb2 FJ597622 Jun & Furong 2008 Bt Ywc2-8 Sin enlace NCBI Julio 09 Cry4Cc1 FJ403207 Jun & Furong 2008 Bt MC28 Sin enlace NCBI Julio 09 Cry5Aa1 AAA67694 Narva et al 1994 Bt darmstadiensis PS17 Crv5Ab1 AAA67693 Narva et al 1991 Bt darmstadiensis PS17 Crv5Ac1 I34543 Payne et al 1997 Secuencia de ADN solamente Crv5Ad1 ABQ82087 Lenane et al 2007 Bt L366 Crv5Ba1 AAA68598 Foncerrada & Narva 1997 Bt PS86Q3 Crv5Ba2 ABW88932 Guo et al 2008 YBT 1518 Crv6Aa1 AAA22357 Narva et al 1993 Bt PS52A1 Crv6Aa2 AAM46849 Bai et al 2001 YBT 1518 Cry6Aa3 ABH03377 Jia et al 2006 Bt 96418 Cry6Ba1 AAA22358 Narva et al 1991 Bt PS69D1 Cry7Aa1 AAA22351 Lambert et al 1992 Bt galleriae PGSI245 Crv7Ab1 AAA21 20 Narva & Fu 1994 Bt dakota HD511 Crv7Ab2 AAA21121 Narva & Fu 994 Bt kumamotoensis 867 Cry7Ab3 ABX24522 Song et al 2008 Bt WZ-9 Cry7Ab4 EU380678 Shu et al 2008 Bt Sin enlace NCBI Julio 09 Crv7Ab5 ABX79555 Aguirre-Arzola et al 2008 Bt monterrey GM-33 Crv7Ab6 ACI44005 Deng et al 2008 Bt HQ122 Cry7Ab7 FJ940776 Wang et al 2009 Sin enlace NCBI Sept 09 Cry7Ab8 GU145299 Feng Jing 2009 Sin enlace NCBI Nov 09 Crv7Ba1 ABB70817 Zhang et al 2006 Bt huazhongensis Crv7Ca1 ABR67863 Gao et al 2007 Bt BTH-13 Crv7Da1 ACQ99547 Yi et al 2009 Bt LH-2 Crv8Aa1 AAA21 1 17 Narva & Fu 1992 Bt kumamotoensis Cry8Ab1 EU044830 Cheng et al 2007 Bt B-JJX Sin enlace NCBI Julio 09 Crv8Ba1 AAA21 118 Narva & Fu 1993 Bt kumamotoensis Crv8Bb1 CAD57542 Abad et al 2002 Crv8Bc1 CAD57543 Abad et al 2002 Crv8Ca1 AAA21 1 19 Sato et al. 1995 Bt japonensis Buibui Crv8Ca2 AAR98783 Shu et al 2004 Bt HBF-1 Cry8Ca3 EU625349 Du et al 2008 Sin enlace NCBI Bt FTL-23 Julio 09 Crv8Da1 BAC07226 Asano et al 2002 Bt galleriae Crv8Da2 BD133574 Asano et al 2002 Bt Secuencia de ADN solamente Crv8Da3 BD133575 Asano et al 2002 Secuencia de Bt ADN solamente Crv8Db1 BAF93483 Yamaguchi et al 2007 Bt BBT2-5 Crv8Ea1 AAQ73470 Fuping et al 2003 Bt 185 Cry8Ea2 EU047597 Liu et al 2007 Bt B-DLL Sin enlace NCBI Julio 09 Crv8Fa1 AAT48690 Shu et al 2004 también Bt 185 AAW81032 Crv8Ga1 AAT46073 Shu et al 2004 Bt HBF-18 Crv8Ga2 ABC42043 Yan et al 2008 Bt 145 Cry8Ga3 FJ 198072 Xiaodong et al 2008 Sin enlace NCBI Bt FCD114 Julio 09 Cry8Ha1 EF465532 Fuping et al 2006 Sin enlace NCBI Bt 185 Julio 09 Cry8la1 EU381044 Yan et al 2008 Sin enlace NCBI Bt su4 Julio 09 Cry8Ja1 EU625348 Du et al 2008 Sin enlace NCBI Bt FPT-2 Julio 09 Cry8Ka1 FJ422558 Quezado et al 2008 Sin enlace NCBI Julio 09 Crv8Ka2 ACN87262 Noguera & Ibarra 2009 Bt kenyae Cry8- FJ770571 Secuencia de similar Noguera & Ibarra 2009 Bt canadensis ADN solamente Crv8- ABS53003 Mangena et al similar 2007 Bt Crv9Aa1 CAA41122 Shevelev et al 1991 Bt galleriae Crv9Aa2 CAA41425 Gleave et al 1992 Bt DSIR517 Cry9Aa3 GQ249293 Su et al 2009 Sin enlace NCBI Bt SC5(D2) Julio 09 Cry9Aa4 GQ249294 Su et al 2009 Sin enlace NCBI Bt T03C001 Julio 09 Crv9Aa AAQ52376 Baum et al secuencia similar 2003 incompleta Crv9Ba1 CAA52927 Shevelev et al 1993 Bt galleriae Crv9Bb1 AAV28716 Silva-Werneck et al 2004 Bt japonensis Crv9Ca1 CAA85764 Lambert et al 1996 Bt tolworthi Crv9Ca2 AAQ52375 Baum et al 2003 Crv9Da1 BAA19948 Asano 1997 Bt japonensis 141 Crv9Da2 AAB97923 Wasano & Ohba 1998 Bt japonensis Cry9Da3 GQ249295 Su et al 2009 Sin enlace NCBI Bt T03B001 Julio 09 Cry9Da4 GQ249297 Su et al 2009 Sin enlace NCBI Bt T03B001 Julio 09 Crv9Db1 AAX78439 Flannagan & Abad 2005 Bt kurstaki DP1019 Crv9Ea1 BAA34908 idoh & Oyama 1998 Bt aizawai SSK-10 Crv9Ea2 AAO12908 Li et al 2001 Bt B-Hm-16 CrY9Ea3 ABM21765 Lin et al 2006 Bt lyA Crv9Ea4 ACE88267 Zhu et al 2008 Bt ywc5-4 Crv9Ea5 ACF04743 Zhu et al 2008 Bts Crv9Ea6 ACG63872 Liu & Guo 2008 Bt 1 1 Cry9Ea7 FJ380927 Sun et al 2008 Sin enlace NCBI Julio 09 Cry9Ea8 GQ249292 Su et al Sin enlace NCBI 2009 GQ249292 Julio 09 Crv9Eb1 CAC50780 Arnaut et al 2001 Cry9Eb2 GQ249298 Su et al 2009 Sin enlace NCBI Bt T03B001 Julio 09 Crv9Ec1 AAC63366 Wasano et al 2003 Bt galleriae Crv9Ed1 AAX78440 Flannagan & Abad 2005 Bt kurstaki DP1019 Cry9Ee1 GQ249296 Su et al 2009 Sin enlace NCBI Bt T03B001 Ago 09 Cry9- AAC63366 Wasano et al similar 1998 secuencia Bt galleriae insuficiente Crv10Aa1 AAA22614 Thorne et al 1986 Bt israelensis Crv10Aa2 E00614 Aran & Toomasu Bt israelensis ONR- 1996 ¦Secuencia de 60A ADN solamente Crv10Aa3 CAD30098 Berry et al 2002 Bt israelensis CrvlOA- DQ167578 Mahalakshmi et al secuencia similar 2006 Bt LDC-9 incompleta Crv11Aa1 AAA22352 Donovan et al 1988 Bt israelensis Crv11 Aa2 AAA2261 1 Adams et al 1989 Bt israelensis Crv1 1 Aa3 CAD30081 Berry et al 2002 Bt israelensis Crv1 1Aa- DQ166531 Mahalakshmi et al secuencia similar 2007 Bt LDC-9 incompleta Crv1 1 Ba1 CAA60504 Delecluse et al 1995 Bt jegathesan 367 Crv11 Bb1 AAC97162 Orduz et al 1998 Bt medellin Crv12Aa1 AAA22355 Narva et al 1991 Bt PS33F2 Crv13Aa1 AAA22356 Narva et al 1992 Bt PS63B Crv14Aa1 AAA21516 Narva et al 1994 Bt sotto PS80JJ1 Crv15Aa1 AAA22333 Brown & Whiteley 1992 Bt thompsoni Crv16Aa1 CAA63860 Barloy et al 1996 Cb malaysia CH18 Crv17Aa1 CAA67841 Barloy et al 1998 Cb malaysia CH18 Crv18Aa1 CAA67506 Z ang et al Paenibacillus 1997 popilliae Cry18Ba1 AAF89667 Patel et al 1999 Paenibacillus popilliae Crv18Ca1 AAF89668 Patel et al Paenibacillus 1999 nonilliap Crv19Aa1 CAA68875 Rosso & Delecluse 1996 Bt jegathesan 367 Crv19Ba1 BAA32397 Hwang et al 1998 Bt higo Crv20Aa1 AAB93476 Lee & Gilí 1997 Bt fukuokaensis Crv20Ba1 ACS93601 Noguera & Ibarra 2009 Bt higo LBIT-976 Cry20- similar GQ144333 Y¡ et al 2009 Bt Y-5 Secuencia de 11 1 11 1 ADN solamente Crv21Aa1 I32932 Payne et al 1996 Secuencia de ADN solamente Crv21Aa2 I66477 Feitelson 1997 Secuencia de ADN solamente Crv21 Ba1 BAC06484 Sato & Asano 2002 Bt roskildiensis Crv22Aa1 134547 Payne et al 1997 Secuencia de ADN solamente Crv22.Aa2 CAD43579 Isaac et al 2002 Bt Crv22Aa3 ACD9321 1 Du et al 2008 Bt FZ-4 Crv22Ab1 AAK50456 Baum et al 2000 Bt EG4140 Crv22Ab2 CAD43577 Isaac et al 2002 Bt Crv22Ba1 CAD43578 Isaac et al 2002 Bt Crv23Aa1 AAF76375 Donovan et al 2000 Bt Binaria con Cry37Aa1 Crv24Aa1 AAC61891 Kawalek and Gilí 1998 Bt jegathesan Crv24Ba1 BAD32657 Ohgushi et al 2004 Bt sotto Crv24Ca1 CAJ43600 Beron & Salerno 2005 Bt FCC-41 Crv25Aa1 AAC61892 Kawalek and Gilí 1998 Bt jegathesan Crv26Aa1 AAD25075 Wojciechowska et al 1999 Bt finitimus B-1166 Crv27Aa1 BAA82796 Saitoh 1999 Bt higo Crv28Aa1 AAD24189 Wojciechowska et al 1999 Bt finitimus B-1161 Crv28Aa2 AAG00235 oore and Debro 2000 Bt finitimus Crv29Aa1 CAC80985 Delecluse et al 2000 Bt medellin Crv30Aa1 CAC80986 Delecluse et al 2000 Bt medellin Crv30Ba1 BAD00052 Ito et al 2003 Bt entomocidus Crv30Ca1 BAD67157 Ohgushi et al 2004 Bt sotto Crv30Ca2 ACU24781 Sun and Park 2009 Btjegathesan 367 Cry30Da1 EF095955 Shu et al 2006 Bt Y41 Ningún link NCBI Julio 09 Crv30Db1 BAE80088 Kis ida et al 2006 Bt aizawai BUN1-1' Crv30Ea1 ACC95445 Fang et al 2007 Bt S2160-1 Cry30Ea2 FJ499389 Jun et al 2008 Bt Ywc2-8 Ningún link NCBI Julio 09 Crv30Fa1 ACI22625 Tan et al 2008 Bt MC28 Crv30Ga1 ACG60020 Zhu et al 2008 BÍ HS18-1 Crv31Aa1 BAB11757 Saitoh & Mizuki 2000 Bt 84-HS-1-1 1 Crv31Aa2 AAL87458 Jung and Cote 2000 Bt M15 Crv31Aa3 BAE79808 Uemori et al 2006 Bt B0195 Crv31Aa4 BAF32571 Yasutake et al 2006 Bt 79-25 Crv31Aa5 BAF32572 Yasutake et al 2006 Bt 92-10 Crv31Ab1 BAE79809 Uemori et al 2006 Bt B0195 Crv31Ab2 BAF32570 Yasutake et al 2006 Bt 31-5 Crv31Ac1 BAF34368 Yasutake et al 2006 Bt 87-29 Cry32Aa1 AAG36711 Balasubramanian et al 2001 Bt yunnanensis Crv32Ba1 BAB78601 Takebe et al 2001 Bt Crv32Ca1 BAB78602 Takebe et al 2001 Bt Crv32Da1 BAB78603 Takebe et al 2001 Bt Crv33Aa1 AAL26871 Kim et al 2001 Bt dakota Crv34Aa1 AAG50341 Ellis et al 2001 Bt PS80JJ1 Binaria con Cry35Aa1 Crv34Aa2 AA 64560 Rupar et al 2001 Bt EG5899 Binaria con Cry35Aa2 Crv34Aa3 AAT29032 Schnepf et al 2004 Bt PS69Q Binaria con Cry35Aa3 Crv34Aa4 AAT29030 Schnepf et al 2004 Bt PS185GG Binaria con Cry35Aa4 Crv34Ab1 AAG41671 Moellenbeck et al 2001 Bt PS149B1 Binaria con Cry35Ab1 Crv34Ac1 AAG50118 Ellis et al 2001 Bt PS167H2 Binaria con Cry35Ac1 Crv34Ac2 AAK64562 Rupar et al 2001 Bt EG9444 Binaria con Cry35Ab2 Crv34Ac3 AAT29029 Schnepf et al 2004 Bt KR1369 Binaria con Cry35Ab3 Crv34Ba1 AAK64565 Rupar et al 2001 Bt EG4851 Binaria con Cry35Ba1 Crv34Ba2 AAT29033 Schnepf et al 2004 Bt PS201 L3 Binaria con Cry35Ba2 Crv34Ba3 AAT29031 Schnepf et al 2004 Bt PS201HH2 Binaria con Cry35Ba3 Crv35Aa1 AAG50342 Ellis et al 2001 Bt PS80JJ1 Binaria con Cry34Aa1 Crv35Aa2 AAK64561 Rupar et al 2001 Binaria Bt EG5899 con Cry34Aa2 Crv35Aa3 AAT29028 Schnepf et al 2004 Bt PS69Q Binaria con Cry34Aa3 Crv35Aa4 AAT29025 Schnepf et al 2004 Bt PS185GG Binaria con Cry34Aa4 Crv35Ab1 AAG 1672 oellenbeck et al 2001 Bt PS149B1 Binaria con Cry34Ab1 Crv35Ab2 AAK64563 Rupar et al 2001 Bt EG9444 Binaria con Cry34Ac2 Crv35Ab3 AY536891 AAT29024 2004 Bt KR1369 Binaria con Cry34Ab3 Crv35Ac1 AAG50117 E!lis et al 2001 Bt PS167H2 Binaria con Cry34Ac1 Crv35Ba1 AAK64566 Rupar et al 2001 Bt EG4851 Binaria con Cry34Ba1 Crv35Ba2 AAT29027 Schnepf et al 2004 Bt PS201L3 Binaria con Cry34Ba2 Crv35Ba3 AAT29026 Schnepf et al 2004 Bt PS201 HH2 Binaria con Cry34Ba3 Crv36Aa1 AAK64558 Rupar et al 2001 Bt Crv37Aa1 AAF76376 Donovan et al 2000 Bt Binaria con Cry23Aa Crv38Aa1 AAK64559 Rupar et al 2000 Bt Crv39Aa1 BAB72016 Ito et al 2001 Bt aizawai Crv40Aa1 BAB72018 Ito et al 2001 Bt aizawai Crv40Ba1 BAC77648 Ito et al 2003 Bun1-14 Cry40Ca1 EU381045 Shu et al 2008 Bt Y41 Ningún link a NCBI Julio 09 Crv40Da1 ACF15199 Zhang et al 2008 Bt S2096-2 Crv41Aa1 BAD35157 Yamashita et al 2003 Bt A1462 Crv41Ab1 BAD35163 Yamashita et al 2003 Bt A1462 Crv42Aa1 BAD35166 Yamashita et al 2003 Bt A1462 Crv43Aa1 BAD 15301 Yokoyama y Tanaka 2003 P. lentimorbus semadara Crv43Aa2 BAD95 74 Nozawa 2004 P. popilliae popilliae Crv43Ba1 BAD15303 Yokoyama y Tanaka 2003 P. lentimorbus semadara Crv43-like BAD15305 Yokoyama y Tanaka P. lentimorbus 2003 semadara Crv44Aa BAD08532 Ito et al 2004 Bt entomocidus INA288 Crv45Aa BAD22577 Okumura et al 2004 Bt 89-T-34-22 Crv46Aa BAC79010 Ito et al 2004 Bt dakota Cry46Aa2 BAG68906 Ishikawa et al 2008 Bt A1470 Crv46Ab BAD35170 Yamagiwa et al 2004 Bt Crv47Aa AAY24695 Kongsuwan et al 2005 Bt CAA890 Crv48Aa CAJ18351 Jones y Berry 2005 Bs IAB59 binaria con 49Aa Cry48Aa2 CAJ86545 Jones y Berry 2006 Bs 47-6 B binaria con 49Aa2 Cry48Aa3 CAJ86546 Jones y Berry 2006 Bs NHA15b binaria con 49Aa3 Crv48Ab CAJ86548 Jones y Berry 2006 Bs LP1G binaria con 49Ab1 Crv48Ab2 CAJ86549 Jones y Berry 2006 BS 2173 binaria con 49Aa4 Crv49Aa CAH56541 Jones y Berry 2005 Bs IAB59 binaria con 48Aa Crv49Aa2 CAJ86541 Jones y Berry 2006 Bs 47-6B binaria con 48Aa2 Cry49Aa3 CAJ86543 Jones y Berry 2006 BsNHA15b binaria con 48Aa3 Crv49Aa4 CAJ86544 Jones y Berry 2006 Bs 2173 binaria con 48Ab2 Crv49Ab1 CAJ86542 Jones y Berry 2006 Bs LP1G binaria con 48Ab1 Cry50Aa1 BAE86999 Ohgushi et al 2006 Bt sotto Crv51Aa1 AB114444 eng et al 2006 Bt F14-1 Cry52Aa1 EF613489 Song et al 2007 Bt Y41 Ningún link a NCBI Julio 09 Cry52Ba1 FJ 361760 Jun et al 2008 Bt BM59-2 Ningún link a NCBI Julio 09 Cry53Aa1 EF633476 Song et al 2007 Bt Y41 Ningún link a NCBI Julio 09 Cry53Ab1 FJ361759 Jun et al 2008 Bt MC28 Ningún link a NCBI Julio 09 Crv54Aa1 ACA52194 Tan et al 2009 Bt C28 Crv55Aa1 ABW88931 Guo et al 2008 YBT 1518 Crv55Aa2 AAE33526 Bradfisch et al 2000 BT Y41 Cry56Aa1 FJ597621 Jun & Furong 2008 Bt Ywc2-8 Ningún link a NCBI Julio 09 Cry56Aa2 GQ483512 Guan Peng et al 2009 Bt G7-1 Ningún link a NCBI Ago 09 Crv57Aa1 ANC87261 Noguera & Ibarra 2009 Bt kim Crv58Aa1 ANC87260 Noguera & Ibarra 2009 Bt entomocidus Crv59Aa1 ACR43758 Noguera & Ibarra 2009 Bt kim LBIT-980 'PNAS 93. 5389- Vip3Aa1 ¡Vip3Aa JAAC37036 Estruch et al 996 AB88 Í5394 ¾Á¥"93T5389- Vip3Aa2 ¡Vip3Ab IAAC37037 Estruch et al 11996 AB424 5394 Vip3Aa3 V¡p3Aa4 W09818932 US 6656908 Dic Vip3Aa5 ¡PS81 F Sup ¡AAR81080 Feitelson et al 1998 Bt PS81 F (A2.A3) 7 2003 Mayo 1998 W09818932 US 6656908 Dic V¡p3Aa6 |Jav90 Sup !AAR81081 Feitelson et al ¡1998 Bt (A2.A3) 7 2003 Mayo 1998 Vip3Aa7 " ¡Vip83 IAAK95326 Caí et al :2001 sin publicar Bt YBT-833 Loguercio et Vip3Aa8 ;Vip3A ÍAAK97481 12001 sin publicar Bt HD125 al Selvapandiya Vip3Aa9 :VipS ICAA76665 2001 sin publicar Bt A13 n et al !Protein Exor.

Vip3Aa10 ;Vip3V ¡AAN60738 Doss et al ¡2002 Bt iPurif. 26. 82-88 Vip3Áa11 ;Vip3A ÍAAR36859 Liu et al 2003 •sin publicar Bt C9 |V¡p3AaÍ2 |Vip3A-WB5 fÁAM22456 Wu and Guan '2003""" ¡sin publicar Bt :Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao V¡p3Aa13 ¡Vip3A ¡AAL69542 Chen et al 2002 Bt S184 18, 687-692 Polumetla et Vip3Aa14 jVip ÍAAQ 12340 2003 sin publicar ¡Bt tolworthi al . ¡ VÍp3Áa15 ÍVip3A |ÁAP5Í 131 (Wu et al 2004 [sin publicar ¡Bt WBSO Vip3Aa19 V¡p3ALD " ¡DQ241674 Liu et al 2006 sin publicar Bt AL Vip3Aa19 Vip3A-1 ¡DQ539887 Hart et al (2006 sin publicar Vip3Aa20 Vip3A-2 ¡DQ539888 Hart et al 2006 Jsin publicar Vip3Aa21 Vip |ABD84410 ¡Panbangred Í2006 |sin publicar Bt aizawai Vip3Aa22 Vip3Á-LSÍ AAY4 27 Lu et al Í2005" sin publicar BtTsi Vip3Aa23 Vip3A-LS8 AAY41428 :Lu et al ¡2005 sin publicar ' Bt LS8 Vip3Aa24 ??? 880913 ¡Song et al 2007 ¡sin publicar ¡Bt WZ-7 Vip3Aa25 EF608501 iHsieh et al |2007 sin publicar Vip3Aa26 EU294496 iShen and Guo 2007 ¡sin publicar 'Bt TF9 Vip3Aa27 ÍEU332167 Shen and Guo 2007 ¡sin publicar Bt 16 Vip3Aa28 FJ4948 7 Xiumei Yu Í2008 Isín publicar :Bt JF23-8 Vip3Aa29 ,?J62667 Xieumei et al ¡2009 sin publicar Bt JF21-1 Vip3Aa30 ¡FJ626675 Xieumei et al ¡2009 isin publicar MD2-1 Vip3Aa31 FJ626676 Xieumei et al "¡20Ó9 sin publicar JF21-1 Vip3Ab2 Vip3D G???88247~ Feng y Shen 2006 ¡sin publicar Bt solicitud Vip3Ac1 PS49C Narva et al estadounidense 120040128716 solicitud Vip3Ad1 PS158C2 Narva et al estadounidense 120040128716 Vip3Ad2 ¡ISP3B |CAI43276 ,Van Rie et al ¡2005 ¡sin publicar ¡Bt Vip3Ae1 ISP3C ÍCAI43277 'Van Rie et al 2005 'sin publicar ¡Bt Vip3Af1 SP3A ¡CAI43275 ¡Van Rie et al ¡2005 ¡sin publicar Vip3Af2 Vip3C~ ÍADÑ08753 rSyngentV " "lWO 03/075655" Vip3Ag1 Vip3B ADN08758 ¡Syngenta i. ¡WO 02/078437 Vip3Ag2 [F J5568O3 ¡ Audtho et al ¡2u08 ¡Bt Vip3Ah1 Vip3S ¡DQ832323 Li and Shen ;2006 sin publicar Bt Vip3Ba1 AAV70653 ¡Rang et al ¡2004 ¡sin publicar

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. Una planta transgénica que comprende ADN que codifica una proteína insecticida CryIC y ADN que codifica una proteína insecticida CryI F.

2. Una semilla de una planta de la reivindicación 1.

3. Una planta de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el ADN que codifica una proteína insecticida CryIC y el ADN que codifica una proteína insecticida CryI F han sido transferidos a dicha planta.

4. Una semilla de una planta de la reivindicación 3.

5. Un campo de plantas que comprende plantas de refugio no Bt y una pluralidad de plantas de la reivindicación 1 , donde dichas plantas de refugio comprenden menos de 40% de todas las plantas de cultivo en dicho campo.

6. El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas del refugio comprenden menos de 30% de todas las plantas de cultivo en dicho campo.

7. El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas del refugio comprenden menos de 20% de todas las plantas de cultivo en dicho campo.

8. El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas del refugio comprenden menos de 0% de todas las plantas de cultivo en dicho campo.

9. El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas del refugio comprenden menos de 5% de todas las plantas de cultivo en dicho campo.

10. El campo de plantas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dichas plantas del refugio están en bloques o bandas.

1 1. Una mezcla de semillas que comprende las semillas del refugio de plantas de refugio no Bt, y una pluralidad de semillas de la reivindicación 4, en donde dichas semillas de refugio comprenden menos de 40% de todas las semillas en la mezcla.

12. La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizada además porque dichas semillas de refugio comprenden menos de 30% de todas las semillas en la mezcla.

13. La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizada además porque dichas semillas de refugio comprenden menos de 20% de todas las semillas en la mezcla.

14. La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizada además porque dichas semillas de refugio comprenden menos de 10% de todas las semillas en la mezcla.

15. La mezcla de semillas de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dichas semillas de refugio comprenden menos de 5% de todas las semillas en la mezcla.

16. Un método de manejo de desarrollo de resistencia a una toxina Cry por un insecto, comprendiendo dicho método en plantar semillas para producir un campo de plantas de la reivindicación 5.

17. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha planta comprende adicionalmente ADN que codifica una proteína que contiene toxina de núcleo CryIAb.

18. Un campo de plantas que comprende plantas de refugio no Bt y una pluralidad de plantas transgénicas de la reivindicación 17, en donde dichas plantas del refugio comprenden menos de aproximadamente 20% de todas las plantas de cultivo en dicho campo.

19. Un campo de plantas que comprende una pluralidad de plantas de la reivindicación 17, en donde dicho campo comprende menos de aproximadamente 10% de plantas de refugio.

20. Un método de manejo del desarrollo de resistencia a una toxina Cry por un insecto, comprendiendo dicho método en plantar semillas para producir un campo de plantas de la reivindicación 19.

21. Una composición para controlar pestes de lepidópteros que comprende células que expresan cantidades eficaces tanto de una proteína que contiene toxina de núcleo CryI F como de una proteína que contiene toxina de núcleo CryI C.

22. Una composición de conformidad con la reivindicación 21 , cacarcterizada además porque comprende un huésped transformado para expresar tanto una proteína que contiene toxina de núcleo CryI F como una proteína que contiene toxina de núcleo CryI C, en donde dicho huésped es un microorganismo o una célula vegetal.

23. Un método para controlar pestes de lepidópteros que comprende presentar a dichas pestes o al medio ambiente de dichas pestes una cantidad eficaz de una composición de la reivindicación 21.

24. Una planta transgénica que produce tres proteínas Cry insecticidas que son insecticidas para el mismo insecto objetivo, teniendo dicho insecto potencial para desarrollar resistencia a cualquiera de dichas proteínas Cry, y en donde cada una de dichas proteínas Cry se une a un receptor diferente del intestino en dicho insecto objetivo.

25. La planta de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada además porque dicho insecto es el gusano cogollero.

26. Una planta transgénica que produce una proteína CryI Fa más una proteína CryI Ca más una tercera proteína seleccionada del grupo formado por las proteínas Vip3A, Cry1 D, Cry1 Be, y Cry1 E.

27. Un método para el manejo del desarrollo de resistencia a una toxina Cry por un insecto, comprendiendo dicho método plantar semillas para producir un campo de plantas de la reivindicación 26.

28. Un campo de plantas que comprende plantas de refugio no de Bt y una pluralidad de plantas de la reivindicación 26, en donde dichas plantas del refugio comprenden menos de aproximadamente 10% de todas las plantas de cultivo en dicho campo.

29. El campo de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque dicho campo comprende menos de aproximadamente 5% de plantas de refugio.

30. Un método para el manejo del desarrollo de resistencia a una toxina Cry por un insecto, comprendiendo dicho método plantar semillas para producir un campo de plantas de la reivindicación 28 o 29.

31. Una mezcla de semillas que comprende semillas de refugio de plantas de refugio no de Bt, y una pluralidad de semillas de una planta de la reivindicación 26, en donde dichas semillas de refugio comprenden menos del 10% de todas las semillas en la mezcla.

32. El campo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5, 18, y 28, caracterizado además porque dichas plantas ocupan más de 40468.564 m2 (10 acres).

33. La planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 17, 24, y 26, caracterizada además porque dicha planta se selecciona del grupo formado por maíz, soja y algodón.

34. La planta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 17, 24, y 26, caracterizada además porque dicha planta es una planta de maíz.

35.- Una célula de planta de una planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 17, 24, 26, 33 y 33, en donde dicha célula de planta comprende dicho ADN que codifica dicha proteina insecticida Cryl c y dicho ADN que codifica dicha proteína insecticida CryI F, en donde dicha proteína insecticida Cryl F es al menos 99% idéntica a la SEQ ID NO:4, y dicha proteína insecticida Cry 1C es al menos 99% idéntica a la SEQ ID NO:5.

36.- La planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ,2, 17, 24, 26, 33 y 34, caracterizada ademásporque dicha proteína insecticida CrylF comprende la SEQ ID NO:4, y dicha proteína insecticida CryIC comprende la SEQ ID NO:5.