MX2012005409A - Aplicaciones terapeuticas y de diagnostico contra tripanosomosis. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a la identificación de secuencias de nucleótidos y de péptidos de un novedoso transportador de HDL localizado en la bolsa flagelar de parásitos de tripanosoma africano, y al uso de las mismas para el diagnóstico de antitripanosomosis, aplicaciones terapéuticas y de vacuna en seres humanos y en animales.

Description

APLICACIONES TERAPÉUTICAS Y DE DIAGNÓSTICO CONTRA TRIPANOSOMOSIS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la identificación de las secuencias de nucleótidos y de péptidos de una novedosa proteína de la bolsa flagelar específica de parásitos de tripanosoma africano y al uso de la misma para aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas y en particular como una vacuna para inmunizar animales humanos y/o no humanos como diana terapéutica en la lucha contra tripanosomosis o tripanosomiasis.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La tripanosomosis y la tripanosomiasis son causadas por varias especies de protozoos parásitos del género Trypanosoma, y tripanosomas africanos generalmente se refiere a tripanosomas que pertenecen al grupo Salivaría, que por sí mismo incluye tres subgéneros principales: Trypanozoon, Duttonella y Nannomonas.

Sólo el subgénero Trypanozoon comprende, además de especies infecciosas para animales, dos especies infecciosas para seres humanos en los que producen enfermedad del sueño. Los otros subgéneros incluyen especies que infectan animales salvajes y domésticos y que nunca son infecciosos para seres humanos, pero que pueden tener consecuencias indirectas significativas para la salud. El subgénero Trypanozoon consiste en tripanosomas polimórficos (formas largas y cortas o acortadas), con un flagelo libre opcional y un pequeño cinetoplasto en la posición subterminal (posterior). Las especies de este subgénero son Trypanosoma (T.) brucei, T. evansi y T. equiperdum. T. brucei incluye tres subespecies: T. b. brucei, T. b. gambiense y T. b. rhodesiense, que son bastante similares en términos morfológicos, antigénicos y bioquímicos y que se diferencian por su naturaleza infecciosa, su patogenicidad y su distribución geográfica. T. brucei y sus subespecies se transmiten por moscas tse-tse. T. evansi se transmite a ganado vacuno, caballos y camellos por moscas picadoras distintas de tse-tse (Tabanidae) en África, América del Sur y el sudeste asiático. T. equiperdum no tiene huésped invertebrado (transmisión sexual en caballos). Las dos últimas especies se extienden más allá de las áreas con moscas tse-tse y son cosmopolitas. Su morfología es similar a la de T. brucei, pero son monomórficas (sólo formas largas).

Los tripanosomas que pertenecen al subgénero Duttonella tienen forma de garrote, con una extremidad posterior redonda y ancha y un cuerpo que se estrecha hacia la extremidad anterior. El cinetoplasto es voluminoso, redondo y en la posición terminal la membrana ondulante está relativamente sin desarrollar, es estrecha y termina en un flagelo libre. T. vivax y T. uniforme, especies de parásitos de rumiantes salvajes y domésticos, pueden transmitirse mecánicamente o por moscas tse-tse en las que colonizan exclusivamente la probóscide y el proventrículo.

Los tripanosomas del subgénero Nannomonas son pequeños (8-24 µ??), y no tienen flagelo libre en ningún estadio de su desarrollo. El cinetoplasto de tamaño promedio está en la posición subterminal o marginal. La extremidad posterior es redonda y la membrana ondulante estrecha. Su patogenicidad en África es significativa para ganado vacuno, cerdos y perros. Su desarrollo en la mosca tse-tse tiene lugar exclusivamente en el estómago y la probóscide. Las especies principales son T. congolense y T. simiae. Estos tripanosomas son pequeños con una extremidad posterior redonda, un cinetoplasto en la posición marginal y una membrana ondulante estrecha. No tienen un flagelo libre.

Los rumiantes domésticos de África son principalmente infectados por tres especies de tripanosomas patogénicos, T. congolense, T. vivax y T. brucei, que son responsables de una patología llamada nagana. Otros animales se infectan por otras especies patogénicas de tripanosoma, T. evansi, que es responsable de una patología llamada surra. Los tripanosomas se caracterizan por una gran diversidad genética, que se refiere a su infectividad, virulencia, patogeniciad, transmisibilidad y sensibilidad a productos tripanocidas.

T. congolense es el principal agente de la tripanosomosis bovina en África, por su frecuencia y patogenicidad. También se adapta a diversas especies de animales no humanos y, por tanto, puede parasitizar indiferentemente bóvidos, suidos, óvidos, cápridos, équidos y cánidos.

T. brucei, y en particular la subespecie Trypanosoma brucei gambiense, es probablemente la más ampliamente conocida, ya que es responsable de la forma crónica de enfermedad del sueño en los seres humanos en África Occidental y Central. La subespecie Trypanosoma brucei brucei es un parásito de animales domésticos y salvajes en toda África, pero no es infecciosa para el ser humano debido al efecto lítico de la apolipoproteína L, presente en suero humano, en las formas de sangre de estos tripanosomas. La tercera subespecie es Trypanosoma brucei rhodesiense, que es el agente de la enfermedad del sueño en su forma aguda en África.

Además, la subespecie T. evansi se transmite a bóvidos, caballos y camellos y tiene repercusiones económicas significativas en África, en particular para la reproducción de ganado vacuno y búfalos.

Finalmente, T. vivax es un parásito principalmente de los ungulados en el África tropical y se transmite por moscas de los caballos y tábanos.

Los tripanosomas tienen un complejo ciclo de vida que incluye diversas formas morfológicas. Tienen en general un cuerpo fusiforme. Tienen un flagelo conectado al cuerpo por una membrana ondulante. Se reproducen asexualmente por fisión binaria. Durante una infección, la mosca tse-tse (Glossina sp.) inyecta en la dermis del huésped en el sitio de punción los metacíclicos infecciosos presentes en las partes de la boca. Los parásitos se multiplican en la dermis en el punto de inoculación. Se produce una reacción local relacionada con la multiplicación de parásitos en la dermis, y los parásitos dan lugar a formas de sangre. Este estadio puede durar de 1-3 semanas, por ejemplo, en el caso de 7. congolense. Entonces, los parásitos invaden la sangre, el sistema linfático, en particular los ganglios linfáticos, y diversos órganos tales como el hígado, bazo, corazón, ríñones y testículos, que luego presentan lesiones significativas. La tse-tse es infectada por ellos y se alimenta sobre animales parasitizados, y una vez infectada sigue siendo infecciosa durante toda su vida. En el caso de 7. brucei y 7. congolense, el tripanosoma hace que el insecto se someta a un complejo ciclo que implica desdiferenciación en el intestino en formas procíclicas no infecciosas. En las glándulas salivares o partes de la boca, los tripanosomas se transforman en formas de epimastigota adherentes que se multiplican activamente. Su diferenciación conduce al estadio infeccioso representado por formas metacíclicas, que no se dividen más.

El ciclo de 7. vivax no comprende estadio procíclico. Empieza con la unión de flagelos en las formas de sangre introducidas por tse-tse. Se diferencian en formas de epimastigota, que proliferan y luego se diferencian en metacíclicos infecciosos. La duración total del ciclo en la tse-tse es aproximadamente 5-10 días para 7. vivax, 18 días para 7. congolense y 30 días para 7. brucei.

Las fuentes de infección para animales domésticos son otros animales domésticos o animales salvajes que están enfermos o que son vehículos sanos. La existencia del reservorio procede del hecho de que ciertas especies son relativamente no receptivas a la infección, y relativamente insensibles a la enfermedad. Posibles vectores varían por especie de tripanosoma. 7. congolense y 7. brucei se transmiten exclusivamente por vectores biológicos tales como moscas tse-tse, pero 7. v/Vax también puede transmitirse por vectores mecánicos tales como moscas picadoras (tábanos o moscas del establo). 7. evansi se transmite exclusivamente por vectores mecánicos. La eficiencia de la transmisión depende de las tasas de infección por tse-tse e interacciones huésped-vector. Generalmente, los tripanosomas que son infecciosos para animales tienen tasas de infección mayores que los tripanosomas que infectan al ser humano, que contribuye a la muy amplia distribución de tripanosomosis animal.

El análisis de tripanosomas por microscopía electrónica muestra la existencia de una envuelta de aproximadamente 15 nm que cubre la totalidad del cuerpo de la célula del parásito. Esta envuelta sólo está presente sobre la superficie de la sangre y formas metacíclicas. Comprende esencialmente una glicoproteína de superficie variable (VSG) con otras proteínas de membrana en pequeñas cantidades. Las VSG forman una estructura muy densa que comprende una barrera física entre la membrana plasmática y el huésped. La estructura 3-D predice que sólo una pequeña parte de la proteína se expone sobre la superficie del parásito. Por tanto, la función principal de esta envuelta es enmascarar los antígenos de la membrana invariante del parásito presentando varios motivos inmunodominantes a las defensas inmunitarias del huésped. La envuelta protege adicionalmente las formas de sangre contra la lisis por activación de la vía alternativa del complemento.

Actualmente, el control de la enfermedad se basa principalmente en el control de vectores por el uso de insecticidas cuyo impacto medioambiental está lejos de ser despreciable. En términos de infección, el control de la tripanosomosis se basa exclusivamente en el uso de fármacos, debido a que estos parásitos escapan de las defensas inmunitarias del huésped expresando antígenos de superficie variables. Por tanto, este fenómeno de variación antigénica ha obstaculizado hasta la fecha todos los esfuerzos por desarrollar una vacuna antiparasitaria novedosa. Sólo están disponibles unas pocas moléculas con efecto limitado contra el agente patogénico, los tripanosomas, llamados tripanocidos. Estos tratamientos con quimioterapia tienen numerosas limitaciones. De hecho, el tratamiento de la tripanosomosis implica varios productos tripanocidas descubiertos la mayoría de ellos hace varias décadas. Todos estos productos tienen efectos secundarios significativos y han aparecido muchas cepas resistentes o multirresistentes a parásitos.

En términos de diagnósticos, faltan técnicas que sean rápidas, fidedignas, económicas y aplicables en el campo. Actualmente se usan diversas técnicas, pero también tienen muchas limitaciones. Los diagnósticos clínicos, que generalmente se limitan a la sospecha, se basan en la observación de síntomas que generalmente son relativamente inespecíficos. De hecho, infecciones por otros parásitos que pueden producir ciertos síntomas comparables son frecuentes en estas regiones. La detección, tanto directa como después del enriquecimiento, de tripanosomas en la sangre, linfa u otros fluidos se lleva a cabo por examen microscópico de la preparación (fresca o teñida con Giemsa), y aunque esta técnica hace posible confirmar tripanosomosis, es relativamente insensible. Técnicas moleculares tales como PCR son caras y requieren una inversión considerable en particular en el contexto de estudios epidemiológicos. Las técnicas serológicas se basan en lisados totales, son difíciles de normalizar y son sensibles, pero relativamente inespecíficas. Hasta la fecha no ha tenido éxito la búsqueda de antígenos específicos usando ELISA.

En este contexto, es una prioridad la búsqueda de novedosas dianas terapéuticas que permitan el desarrollo de una vacuna "antipatología" para reducir los efectos dañinos de parasitemia sobre el animal o moléculas de tripanocidas novedosas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN El solicitante ha identificado y caracterizado en T. congolense una proteína designada como FLP80, localizada al nivel de la bolsa flagelar y el compartimento endocítico temprano de formas de sangre del parásito. El principal campo de aplicación previsto es la lucha contra tripanosomosis y el uso de dicha proteína para fines biotecnológicos. De hecho, la novedosa proteína FLP80 es útil para la vacunación de tripanosomosis producida por tripanosomas africanos.

Según la invención, las secuencias de péptidos recientemente caracterizadas se usan para la producción de pruebas de diagnóstico y para la preparación de composiciones de vacuna y farmacéuticas. Dicha proteína, y cualquier fragmento de polipéptidos antigénicos de dicha proteína, son adicionalmente útiles para la producción de anticuerpos específicos de los parásitos, con el fin de diagnósticos o inmunización pasiva. Finalmente, FLP80 constituye una diana terapéutica de elección para el desarrollo de agentes tripanocidas o inhibidores competitivos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1 : representa la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína FLP80 de la bolsa flagelar; Figura 2: representa la secuencia de péptidos correspondiente a la proteína FLP80 de la bolsa flagelar; Figura 3A: representa un análisis de transferencia Western de la expresión de FLP80 durante el ciclo parasítico en formas procíclicas (PCF), formas de epimastigota (EMF) y formas de sangre (BSF) en relación con la expresión de tubulina (TUB) durante tres estadios parásitos; Figura 3B: representa un análisis de transferencia Western de FLP80 en formas de sangre (BSF) sin y después de tratamiento con una endoglicosidasa (PNGasa).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA LA INVENCIÓN Definiciones "Tripanosomas africanos" se refieren a protozoos parásitos del género Trypanosoma que pertenecen al grupo Salivaría, que por sí mismo incluye tres subgéneros principales: Trypanozoon, Duttonella y Nannomonas, tal como se ha definido anteriormente. Éstos se han descrito como tripanosomas africanos, pero sin embargo hoy en día se encuentran en Asia y América del sur, además de en el continente africano. Los tripanosomas africanos más comunes son Trypanosoma congolense, Trypanosoma v vax, Trypanosoma evansi y Trypanosoma brucei.

Los términos "tripanosomosis" y "tripanosomosis animal africana" (TAA) generalmente se refieren a infecciones de animales no humanos producidas por tripanosomas africanos, mientras que los términos "tripanosomiasis" o "tripanosomiasis africana" se usan para referirse a infecciones humanas, también producidas por tripanosomas africanos. Para fines de simplificación, los términos tripanosomosis y tripanosomiasis se usan indiferentemente en este documento.

Un objeto de la presente invención se refiere a una molécula de ADN o ARN que codifica una novedosa proteína de la bolsa flagelar, llamada FLP80, específica para tripanosomas africanos. Dicha molécula de ADN o ARN novedosa comprende al menos una secuencia de nucleótidos como se representa en la secuencia SEC ID N°: 1 , una secuencia complementaria, una secuencia antisentido o una secuencia equivalente a la secuencia de SEC ID N°: 1 , y en particular una secuencia que comprende una identidad de al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 93 %, 94 % o el 95 % con la secuencia entera SEC ID N°: 1 , o una secuencia de nucleótidos puede hibridarse con la secuencia de SEC ID N°: 1 bajo condiciones de hibridación rigurosas.

Condiciones de hibridación rigurosas se refiere a la hibridación a una temperatura de 65 °C durante la noche en una disolución que contiene el 0,1 % de SDS, el 0,7 % de leche desnatada en polvo y 6X SSC, seguido de lavados a temperatura ambiente en 2X SSC - 0,1 % de SDS y a 65 °C en 0,2X SSC - 0,1 % de SDS.

La invención también se refiere a fragmentos de ADN o ARN cuya secuencia de nucleótidos es idéntica, complementaria, antisentido o equivalente a la secuencia de SEC ID N°: 1 , y en particular fragmentos de ADN o ARN que tienen, para una secuencia de aproximadamente 30 a 100 nucleótidos contiguos, o aproximadamente 30 a 50, y preferentemente al menos 30 nucleótidos contiguos, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 % o al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 93 %, 94 % o el 95 % de homología con la secuencia SEC ID N°: 1 , o una secuencia de nucleótidos puede hibridarse con la secuencia SEC ID N°: 1 bajo condiciones de hibridación rigurosas.

Secuencia de nucleótidos se refiere a al menos una hebra de ADN o su hebra complementaria, o una hebra de ARN o su hebra codificante, o el ADN complementario correspondiente. La secuencia de ADN de SEC ID N°: 1 se corresponde con la secuencia de ARN mensajero, dado que la timina (T) en el ADN está sustituida con uracilo (U) en el ARN.

Según la invención, se dice que dos secuencias de nucleótidos son equivalentes entre sí como resultado de variabilidad natural, en particular mutación espontánea de las especies a partir de las que se identificaron, o variabilidad inducida, además de secuencias homologas, definiéndose la homología más adelante. La variabilidad se refiere a cualquier modificación espontánea o inducida de una secuencia, en particular por sustitución y/o inserción y/o deleción de nucleótidos y/o fragmentos de nucleótidos, y/o extensión y/o acortamiento de la secuencia en al menos un extremo, o variabilidad no natural que puede resultar de las técnicas de ingeniería genética usadas. Esta variabilidad puede expresarse por modificaciones de cualquier secuencia de partida, considerada como referencia, y puede expresarse por un grado de homología en relación con dichas secuencias de referencia.

La homología caracteriza el grado de identidad de dos fragmentos de nucleótidos (o péptidos) comparados; se mide por identidad en porcentaje, que en particular se determina por comparación directa de secuencias de nucleótidos (o péptidos) en relación con secuencias de nucleótidos (o péptidos) de referencia. La invención tiene como objeto una proteína de Trypanosoma congolense, llamada FLP80, con un peso molecular aparente de aproximadamente 40 kDa, además de los fragmentos de péptidos antigénicos o un equivalente inmunológico de dicha proteína. Se identificó en un extracto de proteínas de la membrana a partir de formas de sangre del parásito por análisis de espectrometría de masas. La secuencia de la proteína flagelar FLP80 comprende 41 1 aminoácidos, y se representa en la secuencia SEC ID N°: 2. El análisis de la secuencia muestra la presencia de un péptido señal y un dominio transmembrana en las posiciones 354 a 379. La secuencia es rica en cisteína, pero no está presente ningún motivo particular. Además, el solicitante ha mostrado que FLP80 se expresa diferencialmente durante el ciclo del tripanosoma. De hecho, como se muestra en la sección experimental, en el Ejemplo 2 más adelante, FLP80 no está delecionada en formas procíclicas (PCF), pero se detecta en formas de epimastigota (EMF) con un peso molecular de aproximadamente 60 kDa y en formas de sangre (BSF) con un peso molecular de 65 kDa. El tratamiento con endoglicosidasas muestra que la diferencia de tamaño entre el peso molecular observado en una transferencia Western y el peso molecular teórico es debido a glicosilación pesada de la proteína. Además, FLP80 es particularmente abundante en formas de sangre. Más precisamente, FLP80 está presente en 2,7-105 especímenes por célula. Su inmunolocalización en formas de sangre muestra que la proteína se encuentra en la bolsa flagelar y el compartimento endocítico (Ejemplo 3).

Esta proteína se expresa en formas de sangre del parásito y, por tanto, está presente durante toda la infección, que representa una ventaja en relación con candidatos a vacuna o diagnósticos desarrollados hasta la fecha que sólo se han demostrado en formas parásitas encontradas en el insecto. De hecho, no es cierto que tales candidatos se expresen durante la infección, mientras que la presencia del candidato en la sangre del huésped mamífero infectado es una condición previa necesaria para su uso en particular para el establecimiento de una prueba de diagnóstico.

Equivalente inmunológico se refiere a que cualquier polipéptido o péptido puede ser inmunológicamente reconocido por anticuerpos dirigidos contra FLP80.

La invención se refiere además a cualquier fragmento de FLP80, y más particularmente a cualquier fragmento de péptidos antigénicos específicamente reconocido por antisueros anti-tripanosoma africano.

Dicha proteína y fragmentos de proteína de la invención pueden comprender modificaciones, en particular modificaciones químicas que no alteran su inmunogenicidad. Los péptidos pueden obtenerse por síntesis química, lisis de FLP80 o por técnicas de recombinación genética.

Según un segundo aspecto, la presente invención se refiere a una estrategia antiparasitaria novedosa en la que FLP80 se usa como diana terapéutica. Más precisamente, esta estrategia antiparasitaria novedosa consiste en usar la novedosa proteína flagelar FLP80 como diana terapéutica para la internalización de un agente tripanocida o para inhibir el crecimiento o la multiplicación de parásitos infecciosos. Como FLP80 es altamente abundante en la membrana de la bolsa flagelar, de hecho constituye una diana terapéutica de elección para la internalización de moléculas tripanocidas en parásitos. La bolsa flagelar es el único sitio de intercambio entre el parásito y el entorno externo y no está envuelta, a diferencia del resto del cuerpo de la célula, con una envuelta densa e impenetrable de glicoproteínas de superficie variables (VSG). Hasta la fecha se han descrito muy pocas proteínas flagelares en tripanosomatidas y los únicos ejemplos conocidos están presentes en bajos números por célula. Esta proteína de la membrana, considerando su abundancia, probablemente cubre una gran porción de la bolsa flagelar y parece esencial para la supervivencia del parásito en el huésped mamífero infectado. Por consiguiente, en relación con las dianas terapéuticas consideradas hasta la fecha, FLP80 tiene numerosas ventajas en términos de abundancia, localización, función y especificidad, que hacen que sea posible prever una estrategia que tiene como objetivo bloquear esta función de proteínas. Según este aspecto de la presente invención se ha descubierto en particular que la proteína de membrana FLP80 se corresponde con un transportador activo de lipoproteínas de alta densidad (HDL). Más precisamente, el sustrato de FLP80 se identificó por cromatografía de afinidad con proteínas del suero de ratón como la fracción HDL (identificación de apolipoproteínas A1 y E por espectrometría de masas).

Por consiguiente, otro objeto de la presente invención se refiere a apolipoproteínas A1 o E, y en particular a un complejo terapéutico que comprende una apolipoproteína A1 o E complejada de una forma funcional con una molécula tóxica y que puede unirse al transportador de FLP80. El acoplamiento del ligando de la apolipoproteína FLP80 con una molécula terapéutica tóxica hace que sea posible internalizar y, por tanto, concentrar fuertemente tales moléculas tóxicas en el parásito por la interfase especial de la bolsa flagelar.

Además, el uso inventivo de FLP80 como transportador de moléculas tóxicas representa una ventaja en relación con una estrategia de vacuna a largo plazo tradicional. Como la concentración de moléculas tóxicas en y alrededor del agente infeccioso en cuestión es siempre un problema importante en cualquier tratamiento dado, la presencia de FLP80 en grandes números en el sitio especial de intercambio comprendido por la bolsa flagelar hace que sea posible concentrar muy en exceso una molécula tóxica y, por tanto, aumentar las posibilidades de éxito del tratamiento para limitar los riesgos de toxicidad para el huésped y para reducir los costes de tratamiento.

Entre los compuestos con actividad tripanocida y que pueden acoplarse con el ligando de apolipoproteína e internalizarse en el parásito por FLP80 puede hacerse mención de agentes tripanocidas tales como diamidina (pentamidina o mesilato de pentamidina, diminazeno o aceturato de diminazeno), derivados arsénicos tales como melarsoprol®, melarsomina, eflornitina (DMFO), arsobal, MelBdm, derivados de nitrofurano tales como nifurtimox (5-nitrofurano), análogos de ornitina (eflornithine® o difluorometilornitina), fenantridina (isometamidium o homidium®), una nafta-urea polisulfonada tal como suramin®, un agente maligno antitumoral tal como quinapiramina, sulfoximina de butionina (BSO), azaserina, 6-diazo-5-oxo-norleucina (DON) y/o acivicina.

Las moléculas tóxicas se acoplan de una manera funcional con el ligando de apolipoproteína de tal forma que permita (1) la unión del complejo de FLP80 con una afinidad del mismo orden que el ligando de apolipoproteína sin acoplar, y (2) la internalización y concentración del complejo de tripanocida en el parásito de tripanosoma.

Como un equivalente funcional del complejo de apolipoproteína-molécula tóxica puede usarse cualquier molécula que tenga una afinidad de unión por la proteína de la membrana FLP80 similar al sustrato de apolipoproteína. Puede hacerse mención, por ejemplo, de un anticuerpo tal como se describe más adelante dirigido específicamente contra FLP80 ligada a una molécula de tripanocida tóxica que puede producir, después de la unión a FLP80, la internalización de la molécula tóxica en el tripanosoma.

Por consiguiente, según la presente invención, el complejo de apolipoproteína-molécula tóxica o un equivalente funcional se usa como composición veterinaria contra tripanosomosis. Tales composiciones veterinarias tripanocidas comprenden el sustrato de apolipoproteína acoplado de una manera funcional con un agente tripanocida tal como se ha descrito anteriormente en una cantidad terapéuticamente suficiente para tratar y/o prevenir tripanosomosis africana en animales o seres humanos. Por tanto, los procedimientos de tratamiento con tripanosomosis comprenden la obtención de un sustrato del complejo de apolipoproteína o equivalente, el acoplamiento del sustrato a un agente tóxico o tripanocida y la administración del complejo de tripanocida así obtenido a un ser humano y/o un animal no humano que se ha infectado o que probablemente se infectará por tripanosomas africanos.

Los procedimientos para determinar la unión del sustrato de apolipoproteína o equivalente, y/o un complejo de tripanocida de la invención, sobre proteínas de la membrana tales como FLP80 son muy conocidos para el experto en la materia y pueden lograrse, por ejemplo, por medio de experimentos de inhibición competitiva entre el ligando de apolipoproteína A1 o E y el complejo de tripanocida o por la tecnología Biacore™ para estudiar la unión en tiempo real sin tener que marcar el sustrato o FLP80. Esta técnica usa un biosensor de resonancia de plasmones superficiales que detecta variaciones de masa sobre la superficie de un chip de sensor sobre el que se inmoviliza el ligando de apolipoproteína o el complejo se inmoviliza covalentemente o no covalentemente, y en el que FLP80 se inyecta por un sistema microfluídico en una corriente continua de tampón sobre la superficie del chip sensor. El análisis en tiempo real hace posible determinar la cinética de las constantes de asociación y disociación y deducir a partir de las mismas el valor de la constante de afinidad.

Por tanto, la internalización de los complejos de tripanocida puede medirse sobre líneas celulares que expresan FLP80 recombinante y tratarse con el complejo de tripanocida que comprende un sustrato de apolipoproteína radiomarcado acoplado de una manera funcional a un agente tóxico, y puede medirse la radiactividad asociada a las células.

Alternativamente, otro objeto de la presente invención se refiere a inhibidores competitivos de la unión del sustrato natural a proteína FLP80. Tales inhibidores competitivos son, por ejemplo, una apolipoproteína A1 o E truncada, es decir, que comprende el 10-80 % del tamaño de las apolipoproteínas A1 y E naturales. Los anticuerpos específicos del sitio de unión de FLP80 también pueden constituir inhibidores competitivos de la unión del sustrato natural sobre FLP80 y, por tanto, inhibir el crecimiento de y destruir los tripanosomas infecciosos.

La presente invención se refiere además a un procedimiento para cribar complejos de tripanocidas que pueden internalizarse por FLP80 en tripanosomas infecciosos y, por tanto, pueden destruir tripanosomas infecciosos. Alternativamente, la presente invención se refiere a un procedimiento para cribar inhibidores de FLP80 que puede inhibir el ciclo infeccioso de tripanosomas, su crecimiento o su multiplicación en el huésped animal no humano infectado. Los procedimientos de la invención comprenden una etapa de evaluación de la capacidad de dichas moléculas o agentes para ser internalizados y para concentrarse en los parásitos con el fin de inducir su destrucción y/o para inhibir la actividad o la función de FLP80 y/o para detener los ciclos infecciosos de los parásitos y/o para inducir una reducción de su multiplicación o su crecimiento.

Por tanto, el procedimiento de cribado de la invención comprende una prueba de inhibición del crecimiento/multiplicación de tripanosomas africanos. Los agentes tripanocidas cribados mediante el procedimiento tal como se ha definido anteriormente se caracterizan por su capacidad para inhibir o modular el crecimiento o multiplicación de tripanosomas africanos infecciosos.

Por consiguiente, también forman una parte integral de la invención las composiciones que comprenden agentes tripanocidas o inhibidores de FLP80 como terapias contra tripanosomosis, o para la preparación de una composición farmacéutica para tratar y/o prevenir la enfermedad, además de procedimientos para tratar y/o prevenir tripanosomosis que comprenden la administración de tales agentes tripanocidas, moléculas inhibidoras o composiciones.

Según un tercer aspecto, otro objeto de la presente invención reside en un cásete de expresión funcional, en particular en una célula de un organismo procariota o eucariota, que permite la expresión de ADN que codifica la totalidad o un fragmento de proteína FLP80. En particular, un fragmento de ADN tal como se ha definido anteriormente se coloca bajo el control de los elementos requeridos para su expresión. Por tanto, dicha proteína o fragmentos de proteína expresados son reconocidos por antisueros anti-tripanosoma africano.

Generalmente, cualquier célula de un organismo procariota o eucariota puede usarse en el contexto de la presente invención. Tales células son conocidas para el experto en la materia. Como ejemplos puede hacerse mención de células de un organismo eucariota tal como células de mamífero, en particular células de ovario de hámster chino (CHO), células de insecto o células fúngicas, en particular células unicelulares o de levadura, en particular de Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces y particularmente seleccionadas del grupo que comprende Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces malidevorans, Schizosaccharomyces sloofiae y Schizosaccharomyces octosporus. Similarmente, entre células de organismos procariotas puede hacerse mención, sin constituir ningún modo una limitación, de células de una cepa de Escherichia coli (E. coli) o células de enterobacterias. La célula puede ser natural o mutante. Las mutaciones se describen en la bibliografía disponible para el experto en la materia. Preferentemente se usa una célula de E. coli tal como, por ejemplo, BL21 (DE3).

El cásete de expresión de la invención está previsto para la producción, por ejemplo, en E. coli, de FLP80 o fragmentos de dicha proteína reconocidos por antisueros anti-tripanosoma africano. Tales antisueros proceden de animales que han contraído una infección reciente o antigua por 7. congolense, y que tienen inmunoglobulinas que reconocen específicamente FLP80. Por tanto, FLP80 puede reconocerse por otros anticuerpos tales como, por ejemplo, anticuerpos monoclonales o policlonales obtenidos por inmunización de especies variadas con la proteína natural anteriormente dicha, la proteína recombinante o los fragmentos o péptidos de los mismos.

La proteína flagelar FLP80 se refiere al antígeno de membrana de T. congolense producido en particular por las técnicas de recombinación genética descritas en la presente solicitud, o cualquier fragmento o mutante de dicho antígeno, con la condición de que sea ¡nmunológicamente reactiva con anticuerpos dirigidos contra la proteína FLP80 de dichos parásitos.

Ventajosamente, dichas proteínas tienen una secuencia de aminoácidos con un grado de homología de al menos el 70 %, al menos el 80 %, preferentemente al menos el 85 % o el 90 %, y lo más preferentemente al menos el 92 %, 93 %, 94 % o al menos el 95 % en relación con la secuencia SEC ID N°: 2. En la práctica, un equivalente tal puede obtenerse por deleción, sustitución y/o adición de uno o más aminoácidos de la proteína nativa o recombinante. Está dentro de los medios del experto en la materia llevar a cabo estas modificaciones por técnicas conocidas sin afectar el reconocimiento inmunológico.

En el contexto de la presente invención, FLP80 puede modificarse in vitro, en particular por deleción o adición de grupos químicos tales como fosfatos, azúcares o ácidos mirísticos, para mejorar su estabilidad o la presentación de uno o varios epítopes.

El cásete de expresión de la invención permite la producción de FLP80, que tiene la secuencia de aminoácidos que se ha especificado anteriormente, y fragmentos de dicha proteína, que pueden fusionarse ventajosamente con un elemento exógeno que puede contribuir a su estabilidad, purificación, producción o reconocimiento. La elección de un elemento exógeno tal está dentro de los medios del experto en la materia. Puede ser en particular un hapteno o un exógeno péptido.

El cásete de expresión de la invención comprende los elementos requeridos para la expresión de dicho fragmento de ADN en la célula en estudio. "Elementos requeridos para la expresión" se refiere a todos los elementos que permiten la transcripción del fragmento de ADN en ARN mensajero (ARNm), tal como las secuencias promotoras de la transcripción (por ejemplo, promotor del CMV) y secuencias terminadoras, además de elementos que permiten la traducción de ARNm en proteína.

La presente invención se extiende adicionalmente a vectores que comprenden un cásete de expresión de la invención. También puede ser un vector de plásmido que puede replicarse autónomamente y en particular multiplicarse. Puede ser un vector vírico y en particular un vector derivado de baculovirus, más particularmente previsto para la expresión en células de insecto, o un vector derivado de adenovirus para la expresión en células de mamífero.

La presente invención también se refiere a una célula de un organismo procariota o eucariota que comprende un cásete de expresión, tanto integrado en el genoma de la célula como insertado en un vector.

La presente invención también se refiere a un procedimiento para preparar FLP80, o fragmentos de dicha proteína, en el que: (i) una célula de un organismo procariota o eucariota que comprende el cásete de expresión de la invención se cultiva bajo condiciones adecuadas; y (ii) la proteína expresada por dicho organismo se recupera.

Según un cuarto aspecto, la invención se refiere a anticuerpos monoclonales o policlonales obtenidos por reacción inmunológica de un organismo animal no humano con un agente inmunogénico que comprende FLP80 natural o recombinante, y fragmentos de péptidos de la misma, tal como se ha definido anteriormente. Las técnicas de producción de anticuerpos son muy conocidas para el experto en la materia. Como ejemplos, los anticuerpos policlonales de la presente invención pueden generarse inyectando FLP80 o un fragmento de péptidos antigénicos de la misma en conejos o ratones con el fin de inmunizarlos. Los sueros policlonales de conejo o ratón así obtenidos se prueban para su reactividad por ELISA indirecto.

Según un quinto aspecto, la presente invención tiene como objeto una composición inmunoterapéutica activa, en particular una preparación de vacuna, que comprende FLP80 natural o recombinante, uno o más fragmentos de péptidos antigénicos de la misma, tal como se han definido anteriormente, y opcionalmente un excipiente y/o adyuvante adecuados.

Las composiciones de vacuna o veterinarias de la invención pretenden tratar y/o prevenir una infección por tripanosomas africanos en un animal humano y/o animal no humano.

Más particularmente, las composiciones de la invención pretenden tratar y/o prevenir la infección por T. congolense. La tripanosomosis africana, el 75 % de la cual es debida a T. congolense, produce en animales síndromes de gravedad variable que oscilan de infección aguda con mortalidad en 3 a 4 semanas a infección crónica que dura meses o incluso años. La progresión crónica, caracterizada por parasitemias intermitentes, es la más frecuente en ganado vacuno africano. La enfermedad empieza con una fase de hipertermia, y luego dos a tres semanas después de la picadura infectante el número de glóbulos rojos y los niveles de hemoglobina y hematocrito disminuyen, reflejando anemia, que es el principal síntoma de la tripanosomosis. Los animales crónicamente infectados consumen menos alimentos, se vuelven caquéxicos, su crecimiento se ralentiza y se observan efectos negativos sobre la reproducción. La anemia por tripanosomosis se establece en dos fases. Durante la fase inicial, la anemia va acompañada de parasitemia y resultados principalmente de hemolisis extravascular: los glóbulos rojos son destruidos por el sistema de fagocitos en el bazo, hígado, sangre en circulación y médula ósea. Eventualmente, la anemia produce disfunción de la médula ósea.

Dichas composiciones de vacuna veterinarias pueden proporcionarse en forma de una vacuna antigénica y, por tanto, comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de FLP80 natural o recombinante, o los fragmentos de péptidos antigénicos de la misma, tal como se ha descrito anteriormente.

Las composiciones de vacuna pueden proporcionarse en forma de vacunas de ADN y, por tanto, pueden comprender un cásete de expresión, un vector, una célula de un organismo procariota o eucariota tal como se ha definido anteriormente, pueden expresar FLP80, o los fragmentos de péptidos antigénicos de la misma, y/o una combinación de los mismos.

Las vacunas de la presente invención pueden ser vacunas monovalentes que comprenden una cantidad eficaz de FLP80 natural o recombinante, y/o los fragmentos de péptidos antigénicos de la misma y/o las secuencias de nucleótidos que codifican dichos péptidos o fragmentos de péptidos.

Dicha vacuna monovalente previene la infestación y, por tanto, la expresión de la enfermedad.

Si dicha vacuna no previene la infestación, sino sólo la expresión de la enfermedad, podría llamarse una vacuna "anti-enfermedad". En este caso, y dado que el diagnóstico diferencial con otras parasitosis de la sangre es actualmente no sistémico, el uso de vacunas multivalentes que combinan la llamada vacuna "antienfermedad" con antígenos de otros tripanosomas y/u otros agentes terapéuticos activos y/u otras vacunas comúnmente usadas en la prevención de enfermedades es particularmente ventajoso según la presente invención.

Por tanto, las vacunas de la presente invención pueden ser vacunas monovalentes que combinan una o más proteínas naturales o recombinantes y/o fragmentos de péptidos y/o secuencia de nucleótidos que codifica dichos péptidos y fragmentos de péptidos de una o más especies de tripanosoma, y preferentemente derivadas de una o más especies de tripanosoma similares o diferentes.

Dichos péptidos antigénicos derivados de tripanosoma, fragmentos o mezclas de péptidos antigénicos son, por ejemplo, sialidasas, trans-sialidasas, tubulinas, proteasas, lipasas o también otras proteínas flagelares.

Como ejemplos de trans-sialidasas que pueden incorporarse en vacunas multivalentes puede hacerse mención de las trans-sialidasas de T. cruzi, T. congolense, T. vivax, T. evansi, T. brucei, T. rhodesiense y/o T. gambiense. Ciertas trans-sialidasas de T. congolense, entre otras, se describen en la solicitud internacional WO2004/55176 o por Tiralongo E. y col. (JBC vol. 278, n° 26, pág. 23301-10, 2003). Más precisamente, puede hacerse mención de cadenas A y B de trans-sialidasa de T. cruzi como se han depositado en GenBank bajo los números Gl:29726491 , Gl:29726490, Gl:29726489 y Gl:29726488. También es ventajoso usar formas mutadas inactivas de trans-sialidasas. A este respecto puede hacerse mención de las trans-sialidasas de T. cruzi mutantes descritas en la solicitud internacional WO2007/107488, por ejemplo, que conservan menos del 20 % de su actividad enzimática de sialidasa y transferasa.

Como ejemplos de tubulinas derivadas de tripanosoma puede hacerse mención de alfa-tubulina de T. brucei (depositada en GenBank bajo el número de acceso AAA30262.1), beta-tubulina de T. brucei (depositada en GenBank bajo el número de acceso AAA30261.1), epsilon-tubulina de T. brucei (depositada en GenBank bajo el número de acceso EAN77544.1), epsilon-tubulina TREU927 de T. brucei (referenciada en NCBI bajo los números XP_822372.1 y XP_829157.1), delta-tubulina de T. brucei (depositada en GenBank bajo el número de acceso EAN80045.1), zeta-tubulina de T. brucei (referenciada en NCBI bajo el número XP_001218818.1 ) o las tubulinas de T. brucei descritas en la solicitud internacional WO2008/134643.

Como ejemplos de proteínas flagelares derivadas de tripanosoma puede hacerse mención de la proteína flagelar de T. brucei descrita en la solicitud internacional WO2002/19960 o la proteína flagelar de T. congolense descrita en la solicitud francesa del solicitante presentada el 13 de noviembre de 2009 bajo el número FR09/58035. Adicionalmente puede hacerse mención de la proteína flagelar TREU927 de T. brucei o proteínas similares a flagelares (referenciadas en NCBI bajo los números XP_847376.1 ; XP_847374.1 ; XP_847295.1 ; XP_843961.1 ; XP_847377.1), la proteína flagelar TB-44A de T. brucei (depositada en GenBank bajo el número de acceso AAZ13310.1), la proteína flagelar TB-24 de T. brucei (depositada en GenBank bajo el número de acceso AAZ13308.1) y la proteína flagelar de T. brucei depositada en GenBank bajo el número de acceso AAZ13311.1.

Como ejemplos de proteasas puede hacerse mención de cisteína proteasas de tripanosoma tales como congopaína o tripanopaína-Tc de T. congolense, rodesaína de T. rhodesiense y chagasina o cruzipaína de T. cruzi.

Las vacunas de la presente invención, tanto sin son monovalentes como multivalentes, pueden comprender adicionalmente adyuvantes con el fin de aumentar la respuesta antigénica. Los adyuvantes son muy conocidos para el experto en la materia. Como ejemplos de adyuvantes puede hacerse mención de vitamina E, geles de aluminio o sales tales como hidróxido de aluminio o fosfatos de aluminio, sales metálicas, saponinas, polímeros de ácido poliacrílico tales como Carbopol®, polímeros de bloque no iónicos, aminas de ácidos grasos tales como avridina y DDA, polímeros basados en dextrano tales como sulfato de dextrano y DEAE-dextrano, liposomas, inmunógenos bacterianos tales como LPS, peptigoglicanos o MDP.

Los animales no humanos que pueden tratarse incluyen, por ejemplo, bóvidos, óvidos, félidos, suidos, camélidos y/o cánidos.

Alternativamente, las vacunas pueden comprender una cantidad terapéutica eficaz de un anticuerpo monoclonal o policlonal como se describe más adelante.

Las vacunas multivalentes de la presente invención pueden contener adicionalmente antígenos de otras parasitosis de la sangre derivadas de, por ejemplo, protozoos tales como Theileria parva, T. annulata, Babesia bigemina ¡y B. divergens para tratar y/o prevenir tripanosomas y teileriosis, anaplasmosis y/o babesiosis. Éstos pueden combinarse adicionalmente con otras vacunas convencionales usadas para la profilaxis y/o el tratamiento de parasitosis en las áreas diana, concretamente contra glosopeda, clostridiosis, peste, fiebre catarral, pleuroneumonia contagiosa bovina (PNCB), pata negra, pasteurelosis y/o viruela ovina.

Las vacunas de la presente invención son particularmente útiles para tratar y/o prevenir patogénesis inducidas por tripanosomosis tales como anemia, degradaciones en la salud general, pérdida de peso y/o inmunosupresión en seres humanos o animales no humanos.

Las vacunas monovalentes o multivalentes también pueden administrarse en combinación con agentes antiparasitarios, agentes antiinfecciosos y/o agentes sintomáticos.

Los agentes antiparasitarios incluyen, por ejemplo, fármacos tripanocidas tales como diamidinas (pentamidina o mesilato de pentamidina, diminazeno o aceturato de diminazeno), derivados arsénicos tales como melarsoprol®, melarsomina, eflornitina (DMFO), arsobal, MelBdm, derivados de nitrofurano tales como nifurtimox (5-nitrofurano), análogos de ornitina (eflornithine® o difluorometilornitina), fenantridina (isometamidium o homidium®), una nafta-urea polisulfonada tal como suramin®, un agente contra tumores malignos tales como quinapiramina, butionina-sulfoximina (BSO), azaserina, 6-diazo-5-oxo-norleucina (DON) y/o acivicina. Si las vacunas se administran en combinación con agentes antiparasitarios, estos últimos se administran preferentemente antes y/o simultáneamente y/o después de las vacunas monovalentes o multivalentes descritas anteriormente. Otros agentes antiparasitarios no específicos para tripanosomas son muy conocidos en el campo, y se administran antes y/o simultáneamente y/o después de las vacunas de la invención. Entre éstos puede hacerse mención de avermectinas (ivermectina, abamectina, doramectina, eprinomectina y selamectina), piretrinas (deltametrina, etc.) y/o agentes antiparasitarios antihelmínticos (oxibendazol, piperazina, flubendazol).

Como ejemplos de agentes antiinfecciosos puede hacerse mención de antibióticos tales como ß-lactamas, fosfomicina, glicopéptidos o polipéptidos con actividad antibiótica, bacitracina, aminoglucósidos, macrólidos, lincosamidas, estreptograminas, tetraciclinas, fenicoles, ácido fusídico o quinolonas.

Agentes sintomáticos son, por ejemplo, agentes antianémicos tales como hierro, vitamina B12, ácido fótico o levofolinato de calcio; o agentes hepatoprotectores tales como complejos de flavonoides (silimarina, silibinina, etc.), cúrcuma, Desmodium adscendens y/o Chrysanthellum americanum (carbón).

Fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) pueden incluir, entre otros, oxicams (meloxicam, piroxicam y/o tenoxicam), derivados de salicilato (salicilato de metilo y lisina acetilada), ácidos 2-arilpropiónicos (profenos), derivados de indolsulfonamida, AINE de la COX-2 selectivos (celecoxib, etoricoxib, etc.), fenilbutazona, ácido niflúmico y/o ácidos fenámicos.

Según un sexto aspecto, la presente invención se refiere a sondas o cebadores específicos del tripanosoma africano, y el uso de los mismos en pruebas de diagnóstico.

El término "sonda" como se usa en la presente invención se refiere a ADN o ARN que comprende al menos una secuencia de nucleótidos que permite la hibridación con ácidos nucleicos con al menos una secuencia de nucleótidos tal como la representada en la secuencia SEC ID N°: 1 , una secuencia complementaria, una secuencia antisentido o una secuencia equivalente a dichas secuencias, y en particular una secuencia con cinco a 100 nucleótidos contiguos que tiene al menos el 50 %, preferentemente al menos el 60 %, al menos el 70 % o al menos el 85 % de homología con la secuencia SEC ID N°: 1 , o con un oligonucleótido sintético que permite tal hibridación, sin modificar o que comprende una o más bases modificadas tales como inosina, metil-5-desoxicitidina, desoxiuridina, dimetilamino-5- desoxiuridina, diamino-2,6-purina, bromo-5-desoxiuridina o cualquier otra base modificada. Similarmente, estas sondas pueden modificarse en el azúcar, concretamente la sustitución de al menos una desoxirribosa con una poliamida, o en el grupo fosfato, por ejemplo, su sustitución por esteres en particular seleccionados de difosfato, ésteres de dialquilo y de arilfosfonato y ésteres de fosforotioato.

Las sondas pueden ser mucho más cortas que la secuencia identificada en la secuencia SEC ID N°: 1. En la práctica, tales sondas comprenden al menos cinco nucleótidos, ventajosamente entre cinco y 50 nucleótidos, preferentemente aproximadamente 20 nucleótidos, que tienen una especificidad de hibridación en condiciones establecidas para formar un complejo de hibridación con el ADN o ARN que tiene una secuencia de nucleótidos como se ha definido previamente. Las sondas de la invención pueden usarse para fines de diagnóstico, como sondas de captura y/o de detección.

Los cebadores de la invención comprenden una secuencia de cinco a 30 nucleótidos consecutivos de la secuencia SEC ID N°: 1 , y tienen una especificidad de hibridación bajo condiciones predeterminadas parar iniciar la polimerización enzimática, por ejemplo, en una técnica de amplificación tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), en un procedimiento de extensión tal como secuenciación, en un procedimiento de transcripción inversa o similares.

Según un séptimo aspecto, la invención comprende la detección y/o la monitorización del reactivo, además de un procedimiento y kits para diagnosticar infecciones por T. congolense. Los reactivos de detección de tripanosoma o kits de diagnóstico comprenden como sustancia reactiva al menos un anticuerpo monoclonal o policlonal como se ha descrito anteriormente. Alternativamente, los reactivos de detección de tripanosoma o kit de diagnóstico comprenden una sonda y/o cebador para detectar y/o identificar tripanosomas africanos en una muestra biológica, en particular una sonda de captura y/o una sonda de detección, con una y/o la otra como se han definido anteriormente.

Según una realización preferida, la presente invención se refiere más particularmente a un procedimiento de inmunodetección e inmunolocalización de FLP80 durante el ciclo parasítico.

El reactivo usado para la inmunodetección e inmunolocalización puede unirse directamente o indirectamente a un soporte sólido adecuado. El soporte sólido puede estar en particular en forma de un cono, tubo, pocilio, perla o similares.

El término "soporte sólido" como se usa en este documento incluye todos los materiales sobre los que puede inmovilizarse un reactivo para su uso en pruebas de diagnóstico. Materiales naturales o sintéticos, químicamente modificados o no, pueden usarse como soportes sólidos, en particular polisacáridos tales como materiales basados en celulosa, por ejemplo, papel, derivados de celulosa tales como nitrocelulosa y acetato; polímeros tales como cloruro de vinilo, polietileno, poliestireno, poliacrilato o copolímeros tales como polímeros de cloruro de vinilo y propileno, polímeros de cloruro de vinilo y acetato de vinilo, copolímeros basados en estireno, fibras naturales tales como algodón y fibras sintéticas tales como nailon.

El reactivo puede unirse al soporte sólido directamente o indirectamente. Directamente, son posibles dos enfoques, tanto por adsorción del reactivo sobre el soporte sólido, es decir, por enlaces no covalentes (principalmente hidrógeno, van der Waals o enlaces iónicos), como por establecimiento de enlaces covalentes entre el reactivo y el soporte. Indirectamente, un compuesto "anti-reactivo" que puede interactuar con el reactivo con el fin de inmovilizar la unidad sobre el soporte sólido puede unirse de antemano (por adsorción o covalencia) con el soporte sólido. Como un ejemplo, puede hacerse mención de un anticuerpo anti-FLP80, basándose en la condición de que es inmunológicamente reactivo con una parte diferente de la proteína que la que participa en la reacción de reconocimiento de anticuerpos del suero; un sistema ligando-receptor, por ejemplo, injertando sobre la proteína FLP80 una molécula tal como una vitamina, e inmovilizando el receptor correspondiente sobre la fase sólida (por ejemplo, el sistema de biotina-estreptavidina). Los enfoques indirectos también incluyen el injerto preliminar o fusión por recombinación genética de una proteína, o un fragmento de dicha proteína, o un polipéptido, en un extremo de la proteína FLP80, e inmovilización de la última sobre el soporte sólido por adsorción pasiva o covalencia de la proteína o polipéptido injertado o fusionado.

Las sondas de captura pueden inmovilizarse sobre un soporte sólido por cualquier medio adecuado, es decir, directamente o indirectamente, por ejemplo, por covalencia o adsorción pasiva. Las sondas de detección se marcan por medio de una marca seleccionada de isótopos radiactivos, enzimas en particular seleccionadas de peroxidasa y fosfatasa alcalina, y aquellas que pueden hidrolizar un sustrato cromogénico, fluorogénico o luminiscente, cromóforos químicos, compuestos cromogénicos, fluorogénicos o luminiscentes, análogos de nucleótidos básicos y biotina.

Las sondas de la presente invención usadas para fines de diagnóstico pueden implementarse en cualquier técnica de hibridación conocida, y en particular las llamadas técnicas de "transferencia por puntos"; transferencia Southern; transferencia Northern, que es una técnica idéntica a la técnica de transferencia Southern, pero que usa ARN como diana; y la técnica de sándwich.

El procedimiento de inmunodetección y/o inmunolocalización de una infección por tripanosoma africano en una muestra biológica, tal como una muestra de sangre de un animal no humano, consiste en poner juntos dicha muestra con un reactivo tal como se ha definido anteriormente, en condiciones que permitan una posible reacción inmunológica, luego la detección de la presencia de un inmunocomplejo con dicho reactivo. Preferentemente, dicho procedimiento implementa un suero inmune que comprende anticuerpos policlonales obtenidos, por ejemplo, de ratones inmunizados por la proteína recombinante expresada en E. coli.

Según una realización preferencial, la presente invención tiene como objeto un procedimiento para diagnosticar tripanosomosis que comprende la detección de FLP80 como antígeno en circulación durante la infección, y la detección de la presencia de parásitos de tripanosoma en ganado vacuno encontrados en una región endémica con el fin de aplicar el tratamiento adecuado.

Como ejemplo no restrictivo puede hacerse mención de la técnica de detección de ELISA de una o múltiples etapas que consiste en hacer reaccionar un primer anticuerpo monoclonal o policlonal específico para el antígeno buscado, unido a un soporte sólido, con la muestra, y revelar la posible presencia de un inmunocomplejo así formado por un segundo anticuerpo marcado por cualquier marca adecuada conocida para el experto en la materia, en particular un isótopo radiactivo, una enzima, por ejemplo, peroxidasa o fosfatasa alcalina o similares, por las llamadas técnicas de competencia muy conocidas para el experto en la materia.

Finalmente, según este aspecto, la presente invención tiene como objeto un kit para uso veterinario para diagnosticar tripanosomosis en una muestra biológica que comprende una sonda o un cebador, o un anticuerpo tal como se ha descrito anteriormente, además de un reactivo para detectar una reacción inmunológica. Los kits de la presente invención comprenden al menos un compartimento para un envasado opcionalmente estéril que comprende una cantidad terapéutica eficaz de un reactivo tal como se ha descrito anteriormente, además de instrucciones referentes al protocolo para implementar los diagnósticos veterinarios de la invención.

EJEMPLOS Ejemplo 1 : Demostración de la expresión de FLP80 durante el ciclo parasítico 5-106 células de la cepa IL3000 de T. congolense para formas procíclicas (PCF), formas de epimastigota (EMF) y formas de sangre (BSF) se sometieron a análisis de transferencia Western con un antisuero dirigido contra FLP80 o tubulina (control de carga).

Como se muestra en la transferencia Western en la Figura 3, no se detectó señal en formas procíclicas, se detectó una señal correspondiente a un peso molecular de 60 kDa en formas de epimastigota y se detectó una señal todavía más fuerte correspondiente a un peso molecular de 65 kDa. Se detectó una señal constante en los tres estadios parásitos para tubulina.

Ejemplo 2: Inmunolocalización de FLP80 en formas de sangre de T. congolense Se marcaron formas de sangre de T. congolense con DAPI que tiñe ADN nuclear y mitocondrial (de cinetoplasto), un antisuero de FLP80 o lectina de tomate que tiñe la bolsa flagelar y el endosoma temprano. La imagen superpuesta muestra que la señal correspondiente a FLP80 sólo se colocaliza en la bolsa flagelar próxima al cinetoplasto con la de la lectina de tomate; el compartimento endocítico temprano sólo se marcó por lectina.

Ejemplo 3: Pruebas de vacunación con la proteína flagelar FLP80 Dos grupos de ganado vacuno se inyectaron subcutáneamente con la proteína antigénica FLP80 mezclada con dos tipos de adyuvantes, 1 mg/ml de Quil A (saponina) y AdjuPhos (fosfato de aluminio coloidal), volumen con respecto a volumen según un volumen final de 1 mi o sólo con la mezcla de adyuvante (control). Se administró una inyección cada tres semanas para un total de tres inyecciones de 100 pg, 50 \ig y 25 g de antígeno, respectivamente. Los animales se infectaron intradérmicamente con la cepa IL3000 de T. congolense tres semanas después de la última inyección en una relación de 1.000 parásitos por animal. Las muestras de sangre se tomaron diariamente hasta que todos los animales se reconocieron como infectados, determinándose la parasitemia por análisis de la capa leucocítica. Después se tomaron muestras de sangre semanales para monitorizar la parasitemia y anemia, y los animales se pesaron mensualmente. La cinética de la respuesta a la inmunización y a la infección se monitorizaron por ELISA en los diversos antígenos inmunizantes.

Ejemplo 4: Ejemplo de pruebas de diagnóstico en sangre de animal infectado Esta prueba se lleva a cabo detectando el antígeno FLP80 en circulación por el procedimiento de ELISA tipo sándwich. El anticuerpo de "captura" anti-FLP80 se adsorbe en los pocilios de una placa de 96 pocilios por incubación durante la noche a 4 °C de 1-10 pg/ml de anticuerpo de captura diluido en 100 µ? de tampón NaHC03 50 mM (pH 9,6). Entonces, la placa se vacía y se lava tres veces con 200 µ? por pocilio de disolución de PBS-Tween (Na2HP04 3,2 mM, KH2P04 0,5 mM, KCI 1 ,3 mM, NaCI 135 mM (pH 7,4), 0,05 % de Tween 20). A continuación, 100 µ? de disolución de bloqueo (0,2 % de gelatina en PBS-Tween) se añaden a cada pocilio y se incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas se vacían y luego se depositan 100 µ? de sueros de animal que van a probarse en los pocilios y se incuban durante 2 horas a 37 °C. Entonces, la placa se vacía y luego se lava tres veces con 200 µ? por pocilio de disolución de PBS-Tween. 100 µ? de una disolución que contiene el segundo anticuerpo acoplado a biotina (PBS-Tween que contiene 1-10 pg/ml de anticuerpo biotinilado) se añaden a cada pocilio y se incuban durante 1 hora a 37 °C. Entonces, la placa se vacía y luego se lava cuatro veces con 200 µ? por pocilio de disolución de PBS-Tween. 100 µ? de PBS-Tween que contienen estreptavidina acoplada a peroxidasa (Sigma) se añaden según las recomendaciones del fabricante. Entonces, la placa se vacía y luego se lava cuatro veces con 200 µ? por pocilio de disolución de PBS-Tween. Finalmente, la reacción se visualiza añadiendo sustrato de peroxidasa según las recomendaciones del fabricante (ejemplo de un sustrato revelador que puede usarse: ABTS (Sigma)). El resultado se lee usando un lector de placas o fluorímetro según las recomendaciones del fabricante.

El anticuerpo de captura usado puede ser tanto un suero policlonal inmunopurificado contra la proteína FLP80 de T. congolense como un anticuerpo monoclonal que reconoce un epítope presente en dicha proteína. El segundo anticuerpo es un anticuerpo monoclonal diferente del anticuerpo de captura que reconoce un epítope de FLP80 diferente.

Claims (31)

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ADN o ARN caracterizada porque comprende al menos una secuencia de nucleótidos aislada que codifica una proteína de la bolsa flagelar de tripanosomas africanos, caracterizada porque comprende la secuencia de nucleótidos tal como se representa en la secuencia SEC ID N°: 1 , una secuencia complementaria a la secuencia SEC ID N°: 1 , una secuencia que comprende una identidad de al menos el 85 % con respecto a la longitud entera de la secuencia SEC ID N°: 1 , un fragmento de dichas secuencias que comprende entre 30 y 100 nucleótidos, o una secuencia de nucleótidos que puede hibridarse con la secuencia SEC ID N°: 1 bajo condiciones de hibridación rigurosas.

2. Una proteína de tripanosomas africanos codificada por la secuencia de nucleótidos tal como se define en la reivindicación 1.

3. Una proteína caracterizada porque comprende la secuencia de péptidos tal como se representa en la secuencia SEC ID N°: 2, y que se designa como FLP80, o un fragmento de péptidos antigénicos de dicha proteína.

4. Una proteína de conformidad con la reivindicación 2 o la reivindicación 3 como diana terapéutica para el tratamiento y/o la prevención de tripanosomosis.

5. Un cásete de expresión funcional en una célula de origen procariota o eucariota caracterizada porque permite la expresión de una molécula de ADN tal como se define en la reivindicación 1.

6. Un cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque codifica una proteína de la bolsa flagelar de tripanosomas africanos que tiene una secuencia tal como se representa en la secuencia SEC ID N°: 2, o un fragmento de péptidos antigénicos de dicha secuencia.

7. Un vector recombinante caracterizado porque comprende un ácido nucleico tal como se define en la reivindicación 1 o un cásete de expresión tal como se define en la reivindicación 5 o en la reivindicación 6.

8. Un vector recombinante de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque dicho vector es de origen eucariota o procariota.

9. Una célula huésped recombinante que comprende un ácido nucleico tal como se define en la reivindicación 1 , un cásete de expresión tal como se define en la reivindicación 5 o en la reivindicación 6, o un vector recombinante tal como se define en la reivindicación 7 o en la reivindicación 8.

10. Una proteína de conformidad con la reivindicación 2 o la reivindicación 3, o un fragmento de péptidos antigénicos de dicha proteína, caracterizado porque dicha proteína o dicho fragmento presenta reactividad con los sueros de animales no humanos o seres humanos infectados por un tripanosoma africano.

11. Una vacuna para prevenir y/o tratar tripanosomosis y patogénesis inducidas por dicha tripanosomosis en animales no humanos, caracterizada porque comprende una cantidad eficaz de una o más proteínas tal como se definen en cualquiera de las reivindicaciones 2, 3 y 10.

12. Una vacuna para prevenir y/o tratar tripanosomiasis y patogénesis inducidas por dicha tripanosomiasis en seres humanos, caracterizada porque comprende una cantidad terapéutica eficaz de una o más proteínas tal como se definen en cualquiera de las reivindicaciones 2, 3 y 10.

13. Una vacuna de la reivindicación 1 1 o la reivindicación 12 para proteger contra infecciones por tripanosomas africanos seleccionados de Trypanosoma congolense, Trypanosoma vivax, Trypanosoma evansi y/o Trypanosoma brucei, y preferentemente contra infecciones por Trypanosoma congolense.

14. Una vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizada porque dichas patogénesis inducidas comprenden anemia, degradaciones en la salud general, pérdida de peso y/o inmunosupresión en animales humanos o en animales no humanos.

15. Una vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 , 13 ó 14, caracterizada porque dichos animales no humanos se seleccionan entre bóvidos, óvidos, félidos, suidos, camélidos y/o cánidos.

16. Una vacuna multivalente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 1 a 15, caracterizada porque comprende además uno o más péptidos antigénicos y/o fragmentos antigénicos y/o secuencias de nucleótidos que codifican dichos péptidos derivadas de una o más especies de tripanosoma africano.

17. Una vacuna multivalente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, caracterizada porque dichos péptidos y/o fragmentos y/o secuencias de nucleótidos se derivan de proteínas flagelares, sialidasas, trans- sialidasas, proteasas, lipasas y/o tubulinas.

18. Una vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17, caracterizada porque comprende además al menos un agente antiparasitario, al menos un agente antiinfeccioso y/o al menos un agente sintomático.

19. Una vacuna de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque el agente antiparasitario es un tripanocida y/o un agente antiparasitario no específico para tripanosomas.

20. Una vacuna de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque el agente antiinfeccioso se selecciona de ß-lactamas, fosfomicina, glicopéptidos o polipéptidos con actividad antibiótica, bacitracina, aminoglucósidos, macrólidos, lincosamidas, estreptograminas, tetraciclinas, fenicoles, ácido fusídico o quinolonas.

21. Una vacuna de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque el agente sintomático es un agente antianémico, un agente hepatoprotector y/o un fármaco antiinflamatorio no esteroideo.

22. Una vacuna de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque el agente antiparasitario y/o el agente antiinfectivo y/o el agente sintomático se administran antes y/o simultáneamente y/o después de dicha vacuna.

23. Una vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 1 22, caracterizada porque comprende además un adyuvante.

24. Una vacuna caracterizada porque comprende la vacuna tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 1 a 23 y una vacuna y/o o un antígeno dirigido contra teileriosis, anaplasmosis y/o babesiosis.

25. Una vacuna caracterizada porque comprende la vacuna tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 1 a 23 y una vacuna y/o o un antígeno dirigido contra glosopeda, clostridiosis, peste, fiebre catarral, pleuroneumonía contagiosa bovina (PNCB), pata negra, pasteurelosis y/o viruela ovina.

26. Un anticuerpo monoclonal o policlonal caracterizado porque se obtiene por reacción inmunológica de un organismo animal no humano con al menos una proteína o un fragmento de péptidos antigénicos tal como se definen en cualquiera de las reivindicaciones 2, 3 y 10.

27. Un reactivo para detectar tripanosomosis en una muestra biológica, caracterizado porque comprende un anticuerpo tal como se define en la reivindicación 26.

28. Un procedimiento para el diagnóstico in vitro de tripanosomosis en una muestra biológica de un animal no humano que puede resultar infectado por un tripanosoma africano, caracterizado porque dicha muestra y un reactivo tal como se define en la reivindicación 27 se ponen juntos en condiciones que permiten una posible reacción inmunológica, y en el que luego se detecta la presencia de un inmunocomplejo.

29. Un kit para diagnosticar tripanosomosis en una muestra biológica usada para la implementación del procedimiento tal como se define en la reivindicación 28, caracterizado porque comprende al menos un anticuerpo tal como se define en la reivindicación 26, un medio adecuado para la formación de un ¡nmunocomplejo con dicho anticuerpo y al menos un reactivo para detectar una reacción inmunológica.

30. Un procedimiento para cribar agentes tripanocidas o inhibidores que comprende poner juntos el agente previamente radiomarcado que va a probarse con líneas celulares que expresan la proteína FLP80 tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 2, 3 y 10 y la medición de la radiactividad asociada a dichas células.

31. Un inhibidor competitivo de la unión a proteína FLP80 que puede obtenerse mediante el procedimiento tal como se define en la reivindicación 30 para el tratamiento y/o la prevención de tripanosomosis, caracterizado porque dicho inhibidor comprende una apolipoproteína A o E1 truncada.