DE10258400A1

DE10258400A1 - Trans-Sialidasen aus Trypanosoma congolense

Info

Publication number: DE10258400A1
Application number: DE10258400A
Authority: DE
Inventors: Roland Dr. Schauer; Evelin Dr. Tiralongo; Günther Dr. Boehm; Bernd Dr. Stahl; Silke Dr. Schrader
Original assignee: Nutricia NV
Current assignee: Nutricia NV
Priority date: 2002-12-13
Filing date: 2002-12-13
Publication date: 2004-06-24
Also published as: JP2006509515A; AU2003294833A8; US7655784B2; WO2004055176A2; CA2509070A1; WO2004055176A3; US20070004656A1; EP1570054A2; CN1726279A; RU2393222C2; RU2005122020A; AU2003294833A1

Abstract

Die Erfindung betrifft neuartige Enzyme, die Sialinsäuren von einem Donormolekül auf ein Akzeptormolekül übertragen (Trans-Sialidasen). Die Enzyme wurden aus dem Einzeller Trypanosoma congolense isoliert. Weiterhin betrifft die Erfindung funktionale Äquivalente dieser Enzyme; die für diese Enzyme und deren funktionalen Äquivalente kodierenden Nukleinsäuresequenzen und Aminosäuresequenzen; Expressionskonstrukte und Vektoren, welche diese Sequenzen enthalten; rekombinante Mikroorganismen, welche eine erfindungsgemäße kodierende Nukleinsäuresequenz tragen; Verfahren zur rekombinanten Herstellung erfindungsgemäßer Enzyme; Verfahren zur Isolierung erfindungsgemäßer Enzyme aus Trypanosoma congolense; Verfahren zur enzymatischen Sialisierung von Akzeptormolekülen unter Verwendung erfindungsgemäßer Enzyme; Effektoren der erfindungsgemäßen Trans-Sialidasen; die Verwendung erfindungsgemäßer Nukleinsäuresequenzen, Aminosäuresequenzen, Enzyme, Effektoren oder Sialysierungsprodukte zur Herstellung von Impfstoffen, Medikamenten, Nahrungs- oder Nahrungsergänzungsmitteln sowie die erfindungsgemäß hergestellten Mittel selbst.

Description

Die Erfindung betrifft neuartige Enzyme, die Sialinsäuren von einem Donormolekül (z. B. Oligosaccharide, Polysialinsäuren, glykosylierte Proteine, glykosylierte Peptide, glykosylierte Lipide (z.B. Ganglioside) und andere glykosylierte nieder- und hochmolekulare Moleküle) auf ein Akzeptormolekül (z.B. Oligo- und Polysaccharide, glykosylierte Proteine, glykosylierte Peptide, glykosylierte Lipide und andere glykosylierte nieder und hochmolekulare Moleküle) übertragen (Trans-Sialidasen). Die Enzyme wurden aus dem Einzeller Trypanosoma congolense isoliert.
Weiterhin betrifft die Erfindung funktionale Äquivalente dieser Enzyme; die für diese Enzyme und deren funktionalen Äquivalente kodierenden Nukleinsäuresequenzen; Expressionskonstrukte und Vektoren, welche diese Sequenzen enthalten; rekombinante Mikroorganismen, welche eine erfindungsgemäße kodierende Nukleinsäuresequenz tragen; Verfahren zur rekombinanten Herstellung erfindungsgemäßer Enzyme; Verfahren zur Isolierung erfindungsgemäßer Enzyme aus Trypanosoma congolense; Verfahren zur enzymatischen Sialisierung von Akzeptormolekülen unter Verwendung erfindungsgemäßer Enzyme; Effektoren der erfindungsgemäßen Trans-Sialidasen; die Verwendung erfindungsgemäßer Nukleinsäuresequenzen, Enzyme, Effektoren oder Sialysierungsprodukte zur Herstellung von Impfstoffen, Medikamenten, Nahrungs- oder Nahrungsergänzungsmittel; sowie die erfindungsgemäß hergestellten Mittel selbst.

Trans-Sialidasen können Sialinsäuren, bevorzugt alpha-2,3-gebundene Sialinsäuren, von einem Donormolekül auf ein Akzeptormolekül übertragen, wobei wiederum alpha-2,3-glykosidische Bindungen, bevorzugt an einem ß-terminalen Galaktoserest, ausgebildet werden.

Unter dem Begriff Sialinsäuren werden alle N- und O- Derivate der Neuraminsäure zu sammengefasst (Blix et al., 1957). Die Neuraminsäure (5-Amino-3,5-didesoxy-D-glycero-D-galacto-nonulo-pyranosonsäure) ist ein Aminozucker mit einem Rückgrat aus neun Kohlenstoffatomen, der durch die Carboxylgruppe am C-Atom 2 einen stark sauren pK-Wert von 2,2 erhält und daher unter physiologischen Bedingungen negativ geladen ist. Die unsubstituierte Form ist sehr instabil und kommt in der Natur in freier Form nicht vor (Schauer, 1982). Allerdings sind inzwischen mehr als 40 natürliche Derivate der Neuraminsäure bekannt (Schauer und Kamerling, 1997). Die beiden häufigsten in der Natur vorkommenden Sialinsäuren sind die N-Acetylneuraminsäure (Neu5Ac), der Vorläufer aller glykosidisch gebundenen Sialinsäuren (Schauer, 1991) und die N-Glykolylneuraminsäure (Neu5Gc), die durch Hydroxylierung der Methylgruppe des N-Acetylrestes von CMP-Neu5Ac entsteht (Shaw und Schauer, 1988). Die Hydroxylgruppen dieser beiden Sialinsäuren können durch Acetyl-, Lactyl-, Methyl-, Sulfat- und Phosphatreste in unterschiedlicher Kombination substituiert sein, was zu der großen strukturellen Vielfalt der Sialinsäuren führt (Schauer, 1991; Schauer und Kamerling, 1997).

Der größte Teil der natürlich vorkommenden Sialinsäuren liegt gebunden als Bestandteil von Oligosacchariden, Polysacchariden und insbesondere Glykokonjugaten vor (Schauer, 1982). Es sind aber auch schon Polysialinsäuren aus transgener mikrobieller Produktion bekannt. Sialylierte Glykokonjugate kommen vor allem in der äußeren Membran der Zellen vor, sind jedoch auch wichtige Bestandteile des Serums und von mukösen Schleimen (Traving und Schauer, 1998). Die Sialinsäuren schützen Glykoproteine und Zellen vor dem Angriff durch Proteasen und anderen Enzymen und damit vor dem Abbau (Reuter et al., 1988). Die sialinsäurehaltigen Schleimhäute des Magen-Darmtraktes bilden nicht nur einen wirksamen Schutz vor den Verdauungsenzymen, sondern schützen die darunter liegenden Gewebe auch vor dem Eindringen pathogener Bakterien (Kelm und Schauer, 1997).

Eine sehr wichtige Funktion üben Sialinsäuren bei molekularen und zellulären Erkennungsprozessen aus. Dabei maskieren sie Rezeptoren und verhindern so Interaktionen zwischen Rezeptoren und Liganden (Schauer, 1985; Kelm und Schauer, 1997). So schützen Sialinsäuren z.B. Serumglykoproteine und Erythrozyten vor Abbau und Phagozytose, indem sie darunterliegende Galaktosereste maskieren. Werden die endstän digen Sialinsäuren abgespalten, können die subterminalen Galaktosereste durch Lektine auf Hepatozyten bzw. Phagozyten gebunden werden und es kommt zur Endozytose der Serumproteine bzw. Erythrozyten. Ein weiteres Beispiel ist der Schutz körpereigener Gewebe, aber auch vieler hochsialylierter Tumore vor der Erkennung durch das Immunsystem (Pilatte et al., 1993). Geht die schützende Sialinsäureschicht verloren, kann es zu Autoimmunreaktionen kommen.

Sialinsäuren dienen auch als Erkennungsstellen für körpereigene Zellen und Hormone und spielen so eine wichtige Rolle bei zellulären Interaktionen (Keim und Schauer, 1997). Bei Entzündungen etwa exprimieren Endothelzellen auf ihrer Oberfläche Selektine, die bestimmte sialylierte Strukturen (z.B. Sialyl-Lewis X ) auf Leukozyten erkennen, so dass diese an die Endothelzellen binden und in das Gewebe eindringen können (Lasky, 1995). Außerdem wird die Aktivierung der T-Zellen der humoralen Immunabwehr durch die Wirkung von Trans-Sialidasen beeinflusst (Gao et al., 2001). Sialoadhäsine (Siglecs) wie das Myelin-assoziierte Glykoprotein (MAG) binden ebenfalls hochspezifisch an sialylierte Glykane (Keim et al., 1996; Crocker et al., 1998). Das Myelinassoziierte Glykoprotein ist im Nervensystem unter anderem an der Myelinisierung und an der Regulation des axonalen Wachstums beteiligt. Somit ist es nicht verwunderlich, dass jüngst festgestellt wurde, dass Trans-Sialidasen durch die Übertragung von Sialinsäuren an der Differenzierung von Nervenzellen und Gliazellen beteiligt sind (Chuenkova et al., 2001). CD-22 ist ein weiterer Sialinsäure-bindender Rezeptor, der auf Lymphozyten vorkommt und das "Zwiegespräch" von T- und B-Lymphozyten ermöglicht. Die Familie der Siglecs besteht mittlerweise aus über 10 molekularbiologisch charakterisierten Vertretern.

Sialinsäuren sind jedoch nicht nur bei körpereigenen Erkennungsprozessen wichtig, sondern stellen auch Rezeptoren für einige Bakterien, Viren und Toxine dar. So erfolgt z.B. die Bindung des Tetanus-Toxins an Ganglioside von Nervensynapsen über Sialinsäuren (Schauer et al., 1995). Die Sialinsäure-spezifische Adhäsion über mikrobielle Lektine (Sharon und Lis, 1997) ist oft ein kritischer Schritt bei Infektionskrankheiten, etwa bei der durch einige E. coli-Stämme hervorgerufenen Neugeborenen-Meningitis oder bei Infektionen der Magenschleimhaut durch Helicobacter pylori. Vor allem die Grippeerreger Influenza A und B Viren docken über Sialinsäure an die zu infizierenden Zellen an (Schauer, 2000).

Modifikationen der Sialinsäuren, insbesondere die O-Acetylierung, besitzen eine große Bedeutung bei der Regulation der molekularen und zellulären Erkennung (Schauer, 1991). So binden Influenza C-Viren spezifisch an 9-O-acetylierte Sialinsäuren auf Bronchialepithelien (Herrler et al., 1985), während die O-Acetylierung eine Bindung von Influenza A- und B-Viren verhindert (Riga et al., 1985). Vor allem aber ist die O-Acetylierung von Sialinsäuren sehr wichtig für die Morphogenese und Entwicklung verschiedener Gewebe (Varki et al., 1991). Bei neuroektodermalen Tumoren ist sie erhöht (Hubt et al., 2000; Fahr und Schauer, 2001) und bei Dickdarmkrebs erniedrigt (Corfield et al., 1999). Sialinsäuren sind essentielle Modulatoren des biologischen Verhaltens von Tumoren (Schauer, 2000).

Eigurenbesehreibung

Bild 1 zeigt einen Vergleich der von Aminosäureteilsequenzen der erfindungsgemäßen Trans-Sialidasen TS1 und TS2. Identische Aminosäuren in beiden Sequenzen sind dunkel markiert. Die Übereinstimmung (Identität) der beiden Teilsequenzen beträgt nur etwa 50%.

Bild 2 zeigt die verschiedenen Reaktionsweisen von Sialidase, Sialyltransferasen und Trans-Sialidasen

Bild 3 zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenz der Sialidase aus Trypanosoma rangeli (T. r. S), der Trans-Sialidase von Trypanosoma cruzi (T. cr. TS) und der Trans-Sialidase von Trypanosoma brucei brucei (T. b. br. TS) mit Teilsequenzen der beiden erfindungsgemäßen Trans-Sialidasen aus Trypanosoma congolense (T. con. TS1 und T. con. TS2). Aminosäuren, die in allen Sequenzen identisch sind, sind weiß auf dunkelgrauem Hintergrund dargestellt. Aminosäuren, die in mindestens 4 von den 5 Sequenzen identisch sind, sind schwarz auf Dunkelgrau gedruckt, während Aminosäuren, die in mindestens 3 der 5 Sequenzen übereinstimmen mit hellerem Grau hinterlegt sind.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, neuartige Mittel bereitzustellen, mit deren Hilfe Sialinsäure-gesteuerte biologische oder patho-biologische Prozesse beeinflussbar sind.

Obige Aufgabe konnte überraschenderweise gelöst werden durch Bereitstellung neuartiger Enzyme mit Trans-Sialidase-Aktivität und der kodierenden Sequenzen davon aus Trypanosoma congolense.

Ein erster Gegenstand der Erfindung betrifft Polynukleotide, welche für Proteine mit Trans-Sialidase-Aktivität kodieren und aus Trypanosoma congolense isolierbar sind, wobei diese Proteine vorzugsweise den Transfer von Sialinsäure von einem Donor auf ein Akzeptormolekül katalysieren.

Bevorzugte Polynukleotide umfassen wenigstens eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder 3, oder stellen Fragmente davon dar, welche wenigstens 15 zusammenhängende Nukleotidreste umfassen. Gegenstand der Erfindung sind auch die dazu komplementären Polynukleotide und Fragmente; und die von diesen Polynukleotiden durch Entartung des genetischen Codes abgeleiteten Nukleotidsequenzen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Oligonukleotide, welche mit einem erfindungsgemäßen Polynukleotid, insbesondere unter stringenten Bedingungen, hybridisieren.

Gegenstand der Erfindung sind auch Polynukleotide, welche mit einem Oligonukleotid gemäß obiger Definition, insbesondere unter stringenten Bedingungen, hybridisieren und für ein Genprodukt aus Mikroorganismen der Gattung Trypanosoma kodieren.

Gegenstand der Endung sind auch Polypeptide, welche von einem Polynukleotid kodiert werden, das eine Nukleinsäuresequenz gemäß obiger Definition umfasst; oder welche eine Aminosäuresequenz aufweisen, die wenigstens 10 zusammenhängende Aminosäuren gemäß SEQ ID NO: 2 oder 4 umfasst; sowie funktionale Äquivalente da von, welche Trans-Sialidase-Aktivität besitzen.

Gegenstand der Erfindung sind insbesondere Trans-Sialidasen oder funktionale Äquivalente davon mit Trans-Sialidase-Aktivität, gekennzeichnet durch eine der folgenden Aminosäureteilsequenzen:
TDTVAKYSTDGGRTWKREVIIPNGR (Pos. 1 bis 25 gemäß SEQ ID NO: 2)
FRIPSLVEIDGVLIATFDTRYLRASDSSLI (Pos. 1 bis 30 gemäß SEQ ID NO: 4).

Eine bevorzugte Trans-Sialidase 1 (TS1) ist durch wenigstens eines der folgenden Charakteristika gekennzeichnet:

Eine weitere bevorzugte Trans-Sialidase 2 (TS2), ist durch wenigstens eines der folgenden Charakteristika gekennzeichnet:

Die oben beschriebenen erfindungsgemäßen Polynukleotide und Polypeptide, insbesondere kodierenden Nukleinsäuresequenzen und Aminosäuresequenzen sind aus dem Organismus Trypanosoma congolense ableitbar. Sie sind aber auch unter Anwendung synthetischer, insbesondere chemischer, biochemischer, enzymatischer, gentechnologischer und transgener Methoden zugänglich.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin funktionale Äquivalente erfindungsgemäßer Trans-Sialidasen.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Expressionskassetten, umfassend in operativer Verknüpfung mit wenigstens einer regulativen Nukleinsäuresequenz eine Nukleinsäuresequenz gemäß obiger Definition. Weiterhin umfasst die Erfindung auch rekombinante Vektoren, enthaltend wenigstens eine dieser Expressionskassetten.

Gegenstand der Erfindung sind außerdem prokaryotische oder eukaryotische Wirte, transformiert mit wenigstens einem Vektor gemäß obiger Definition.

Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung einer Expressionskassette, eines Vektors oder eines Wirts gemäß obiger Definition zur rekombinanten Herstellung eines Proteins mit Trans-Sialidase-Aktivität.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur enzymatischen Sialisierung eines Akzeptormoleküls, dadurch gekennzeichnet, dass man das Akzeptormolekül mit einem Sialinsäurereste enthaltenden Donor in Gegenwart einer Trans-Sialidase gemäß obiger Definition inkubiert und den sialylierten Akzeptor isoliert.

Derartige Verfahren sind durch wenigsten eine weitere der folgenden Eigenschaften charakterisiert:

a) der Donor ist ausgewählt unter an Oligosaccharide, Polysaccharide, Polysialinsäuren, Glykoproteine und Glykolipide gebundene Sialinsäuren, wie insbesondere Lactoferrine, glykolisierte Molkenproteine und Caseine und Fragmente davon;
b) der Akzeptor ist ausgewählt unter β-Galaktose enthaltenden Polymeren, wie β-Galaktooligosacchariden, Laktitol, Laktobionsäure, Methyl-ß-lactosid, Acetyllaktosaminen, Galaktopyranosiden, Trans-Galaktooligosacchariden, Polygalaktose und anderen Glykokonjugaten mit endständig gebundener β(1-3) oder β(1-4)-Galaktose; oder Galaktose.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung einer erfindungsgemäßen Trans-Sialidase, einer dafür kodierenden Nukleinsäuresequenz oder eines erfindungsgemäß hergestellten Sialisierungsprodukts zur Herstellung eines Medikaments, Nahrungsmittels oder Nahrungsergänzungsmittels oder einer Nahrungsmittelzusatzes zur Prävention oder Behandlung Sialinsäure-gesteuerter parasitärer, bakterieller oder viraler Infektionen; zur Behandlung von Tumorerkrankungen; zur Behandlung von Erkrankungen, welche mit einer Entwicklungsstörung des Gewebes assoziiert sind; zur Behandlung von Erkrankungen des Immunsystems; zur Behandlung von Autoimmunreaktionen; zur Behandlung von Erkrankungen mit gestörter Zellkommunikation; und/oder zur Behandlung von Entzündungen.

Insbesondere ist Gegenstand der Erfindung die Verwendung einer erfindungsgemäßen Trans-Sialidase gemäß obiger Definiton, zur Entwicklung eines Trypanosomiasis-Impfstoffs oder zur Entwicklung von Enzyminhibitoren zur Behandlung oder Prävention von Trypanosoma-Infektionen.

Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung einer Trans-Sialidase, einer dafür kodierenden Nukleinsäuresequenz oder eines erfindungsgemäß hergestellten sialylierten Produkts zur Herstellung eines Medikaments, Nahrungsergänzungsmittels oder Nahrungsmittels zum Schutz körpereigener Zellen oder Gewebe oder Glykoproteine vor enzymatischer Einwirkung.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung einer Trans-Sialidase, einer dafür kodierenden Nukleinsäuresequenz oder eines erfindungsgemäß hergestellten sialylierten Produkts zur Herstellung eines Medikaments, Nahrungsergänzungsmittels oder Nahrungsmittels zu Beeinflussung der Entwicklung und/oder Morphogenese von Körpergeweben.

Weiterhin betrifft die Erfindung Effektoren der Trans-Sialidase-Aktivität einer Trans-Sialidase, ausgewählt unter

a) Polypeptid-Liganden, welche mit einer Trans-Sialidase gemäß obiger Definition Wechselwirken;
b) niedermolekularen Effektoren, welche die biologische Aktivität einer Trans-Sialidase gemäß obiger Definition modulieren; und
c) Antisense-Nukleinsäuresequenzen zu einer Nukleinsäuresequenz gemäß obiger Definition.

Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung eines solchen Effektors zur Herstellung eines Medikaments, Nahrungsergänzungsmittels oder Nahrungsmittels zur Behandlung oder Prävention von mit Trans-Sialidase-Aktivität assoziierten Erkrankungen.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Isolierung eines Enzyms mit Trans-Sialidase-Ayktivität, wobei man

a) Trypanosoma congolense in einem Medium kultiviert, und
b) das gewünschte Produkt aus dem Kulturüberstand durch Ionenaustauschchromatographie mit Hilfe eines Salzgradienten, gegebenenfalls gefolgt von Isoelektrischer Fokussierung, Gelfiltration, Affinitätschromatographie und/oder Proteinfällung, isoliert.

Schließlich berifft die Erfindung pharmazeutisches oder gentherapeutisches Mittel, enthaltend in einem pharmazeutisch oder gentherapeutisch verträglichen Träger wenigsten einen Effektor gemäß obiger Definition

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

i) Bedeutung der Erfindung

Die Bedeutung der vorliegenden Erfindung ergibt sich aus der mit dieser Erfindung nun möglichen Beeinflussung der Sialinsäure-gesteuerten parasitären, bakteriellen und viralen Infektionsmechanismen, der Beeinflussung der Zellkommunikation und des Immunsystems und der Veränderung der Regulations- und Entwicklungsmechnismen menschlicher und tierischer Gewebe sowie von Tumoren. Dies wird durch die gezielte Übertragung von Sialinsäuren auf biologisch relevante Glykostrukturen (Glykane, Glykanderivate und Glykokonjugate) mittels der hierin beschriebenen Trans-Sialidasen erreicht.

Aus der Übertragung der Sialinsäuren auf ausgewählte Trägerstrukturen ergeben sich beispielsweise Produkte zur Veränderung von Entzündungsreaktionen, Veränderung zellulärer Interaktionen im menschlichen und tierischen Körper, Schutz körpereigener Gewebe vor Angriffen des eigenen Immunsystems (Autoimmunreaktionen), „Enttarnung" von Krebszellen im Körper eines Patienten, damit sie vom körpereigenen Immunsystem wieder bekämpft werden (Krebstherapie und Krebsprävention), Bekämpfung des Eindringens pathogener Bakterien in den menschlichen und tierischen Körper, Prävention und Bekämpfung von viralen Infektionen, Bekämpfung von Infektionen der Magenschleimhaut durch Helicobacter pylori, Bekämpfung der durch Bakterien und Viren hervorgerufenen Neugeborenen-Meningitis, Präventive und therapeutische Beeinflussung von Rezeptoren von eukaryontischen und prokaryontischen pathogenen Organismen, Bakterien, Viren und Toxinen zur Vermeidung derer Wirkungsenffaltung im menschlichen und tierischen Körper, Inhibition der Bindung des Cholera-Toxins an menschliche und tierische Schleimhäute des Verdauungstraktes, Entwicklung eines Impfstoffes gegen Trypanosomiasis, Entwicklung von Enzyminhibitoren zur Bekämpfung (Therapie) von Trypanosoma Infektionen, Beeinflussung molekularer und zellulärer Erkennungsprozesse im menschlichen und tierischen Körper, Schutz von Glykoproteinen und Zellen vor dem Angriff durch Proteasen und andere Enzyme, unter anderem auch zum Schutz des Abbaus der Moleküle durch Enzyme des menschlichen und tierischen Verdauungstraktes, Beeinflussung der Entwicklung von Körpergeweben und Beeinflussung der Morphogenese von Körpergeweben.

Die erfindungsgemäßen Trans-Sialidasen sind durch folgende DNS- und Aminosäure-Teilsequenzen sowie durch andere DNS-Sequenze-Homologe, z.B. mit einer mehr als 60 prozentigen Übereinstimmung (Identität) zu diesen Teilsequenzen, charakterisiert.

ii) Sequenzangaben zu bevorzugten Trans-Sialidasen

(1) Informationen für die Sequenz des Enzyms TS1:

Merkmale der DNS der Teilsequenz von TS1:

Länge: 1491 Basenpaare
Typ: Nukleinsäure
Strangform: doppelt
Ursprung: Trypanosoma congolense

DNS Teilsequenz des Enzyms TS1 (SEQ ID NO: 1):

Aminosäureteilsequenz des Enzyms TS1 (SEQ ID NO: 2):

(2) Informationen für die Sequenz des Enzyms TS2:

Merkmale der DNS der Teilsequenz von TS2: Länge: 831 Basenpaare

Typ: Nukleinsäure
Strangform: doppelt
Ursprung: Trypanosoma congolense

DNS Teilsequenz des Enzyms TS2 (SEQ ID NO: 3):

Aminosäureteilsequenz des Enzyms TS2 (SEQ ID NO: 4):

Die Teilsequenzen der Aminosäuren von Enzym TS1 und Enzym TS2 haben eine Übereinstimmung (Identiät) von nur ca. 50%. Die Teilsequenzen charakterisieren daher eindeutig zwei verschiedene Stoffe (siehe Bild 1).

iii) Beschreibung der Eigenschaften der neu gefundenen Enzyme TS1 und TS2

a) Physikalisch/chemische Eigenschaften der Stoffe

Tabelle 1: Basisdaten der beiden Trans-Sialidasen TS1 und TS2

b) Biologische Eigenschaften der Stoffe

Die beiden hier beanspruchten Stoffe sind zwei Enzyme, die Sialinsäuren von einem Donormolekül auf ein Akzeptormolekül übertragen.

Als Donoren fungieren bei beiden Enzymen an Glykane, z.B. an Oligosaccharide, Polysaccharide, Polysialinsäuren, Glykoproteine und Glykolipide, gebundene Sialinsäuren. Unter den Glykoproteinen sind insbesondere Lactoferrine (aus Mensch, Kuh, Ziege, Schaf, Pferd, Kamel und anderen Tieren), glykolisierte Molkenproteine (aus Mensch, Kuh, Ziege, Schaf, Pferd, Kamel und anderen Tieren) und Caseine (aus Mensch, Kuh, Ziege, Schaf, Pferd, Kamel und anderen Tieren) sowie andere glykolisierte Proteine humanen, tierischen und pflanzlichen Ursprungs sowie Teilen davon, wie z.B. Teilstücke aus Caseinen (aus Mensch, Kuh, Ziege, Schaf, Pferd, Kamel und anderen Tieren) wie beispielsweise das Glykomakropeptid aus den Caseinen dieser Tiere gute Donoren für Sialinsäuren, die von den Enzymen übertragen werden können. Ganglioside können ebenfalls als Donoren eingesetzt werden.

Beide Trans-Sialidasen haben eine gute Akzeptorspezifität für Galaktooligosaccharide, insbesondere für beta-Galakto-Oligosaccharide, wie z.B. Vivinal GOS von der Firma Borculo Domo Ingredients (BDI) und Oligomate 55 von der Firma Yakult. Außerdem können Laktitol, Laktobionsäure, Methyl-β-lactosid, Acetyllaktosamine, Galaktopyranoside, Trans-Galaktooligosaccharide, Polygalaktosen und andere Glykokonjugate mit endständig gebundener β(1-3) oder β(1-4)-Galaktose als Akzeptoren fungieren. Eine Methylierung des Galaktoserestes führt zu einer Verminderung der Akzeptorfunktion. Die Methylierung eines Glukoserestes (z.B. bei der Laktose) hat einen geringen Einfluss auf die Akzeptorfunktion. Das Monosaccharid Galaktose dient ebenfalls als Akzeptor, wenn auch mit geringerer Spezifität.

Das Enzym TS1 zeigt eine etwa doppelt so effiziente Übertragung der Sialinsäuren auf die entsprechenden Akzeptoren wie das Enzym TS2. Die Substrate können frei, d.h. löslich, oder auch Zellmembran-gebunden sein.

Die Übertragung von alpha-2,3-gebundenen endständigen Sialinsäuren auf beta-1,4-gebundene endständige Galaktosereste ist auch von den Trans-Sialidasen von Typanosoma cruzi (Schenkman et al.,1991; Vandekerckhove et al., 1992; Scudder et al., 1993) und Trypanosoma brucei (Engstler et al., 1992, 1993, 1995) bekannt. Aufgrund unterschiedlicher DNS- und Aminosäuresequenzen unterscheiden sich TS1 und TS2 jedoch von den bereits bekannten Enzymen. TS1 und TS2 sind damit eindeutig als neue Stoffe (Trans-Sialidasen) charakterisiert. Zur weiteren Abgrenzung siehe den nächsten Absatz.

iv) Abgrenzung der Erfindung zu anderen Trans-Sialidasen, Sialidasen und Sialyltransferasen

Das erste Mal beschrieben wurde ein Enzym „Trans-Sialidase" in der amerikanischen Trypanosomenart Trypanosoma cruz (Schenkmann et al., 1991). Wenig später konnte das Enzym ebenfalls in den afrikanischen Arten Trypanosoma brucei gambiense, Trypanosoma brucei rhodesiense und Trypanosoma brucei brucei nachgewiesen werden (Engstler et al,. 1993, Pontes de Carvalho et al., 1993, Engstler et al., 1995). Weiterhin wurde Trans-Sialidase in Endotrypanum Arten (Parasiten, die das Faultier befallen) (Medina-Acosta et al., 1994), in Corynebacterium diphtheriae (Mattos-Guaraldi et al., 1998) und im menschlichen Plasma (Tertov et al. 2001) detektiert. Bereits lange vor den Nachweis der Trans-Sialidasen waren die sogenannten Sialidasen bekannt. Dies sind Glykohydrolasen, die Sialinsäuren von einem Donormolekül ausschließlich auf Wasser übertragen, die Sialinsäuren also von Oligosacchariden und Glykokonjugaten abhydrolysieren.

Weiterhin können bestimmte Enzyme mit Cytidin-Monophosphat (CMP)-aktivierte Sialinsäuren auf andere Zuckerreste, meist Galaktose und N-Acetylgalaktosamin, übertragen. Diese Enzyme nennt man Sialyltransferasen (siehe Bild 2).

Die hier beanspruchten Trans-Sialidasen übertragen Sialinsäuren nicht ausschließlich von einem Donormolekül auf Wasser, wie dies die reinen Sialidasen tun. Fehlt jedoch ein geeigneter Akzeptor, hydrolysieren die hier beanspruchten Trans-Sialidasen die Sialinsäuren ebenso wie die einfachen Sialidasen. Die hier beanspruchten Trans-Sialidasen benötigen auch keine aktivierten Sialinsäuren für ihre Übertragungsreaktion wie die zuvor erwähnten Sialyltransferasen. Die Trans-Sialidasen haben auch eine breitere Donor- und Akzeptorspezifität als die Sialyltransferasen und sind deshalb besonders vielseitig einsetzbar. Die hier beanspruchten Trans-Sialidasen sind damit für die industrielle Verwertung vorteilhafter als die reinen Sialidasen und Sialyltransferasen.

Bisher sind nur die DNS- und Aminosäuresequenzen der Trans-Sialidasen von Trypanosoma cruzi und Trypanosoma brucei brucei bekannt, sowie die DNS- und Aminosäuresequenz einer reinen Sialidase aus Trypanosoma rangeli. Das hier beanspruchte Enzym TS1 hat zu der entsprechenden Aminosäureteilsequenz der Trans-Sialidase aus Trypanosoma brucei brucei eine Übereinstimmung (Identität) von unter 60% und zu der entsprechenden Teilsequenz von Trypanosoma cruzi eine Übereinstimmung von unter 50%. Das hier beanspruchte Enzym TS2 hat zu der entsprechenden Aminosäureteilsequenz der Trans-Sialidase aus Trypanosoma brucei brucei eine Übereinstimmung (Identität) von unter 50% und zu der entsprechenden Teilsequenz von Trypanosoma cruzi eine Übereinstimmung von ebenfalls unter 50% (siehe Bild 3). Des Weiteren ist bekannt, dass die Übereinstimmung der Aminosäuren zwischen den Trans-Sialidasen von Trypanosomen und den bekannten Sialidasen und Trans-Sialidasen von Bakterien und Viren nur 20% bis 30% beträgt (Chuenkova et al., 1999, Montagna et al., 2002).

Bei den hier beschriebenen Enzymen handelt es sich somit um neu charakterisierte Stoffe (Enzyme), deren Übereinstimmung (Identität) zu den entsprechenden DNS- und Aminosäuresequenzen anderer bekannter Enzyme ähnlicher Funktion unter 60% beträgt.

v) Weitere Erläuterungen zur vorliegenden Erfindung

a) Polypeptide und funktionale Äquivalente

„Polypeptide" im Sinne der Erfindung umfassen charakteristische Teilfragmente der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen, ebenso wie Aminosäuresequenzen der erfindungsgemäßen Enzyme und der funktionalen Äquivalente davon.

Erfindungsgemäß mit umfasst sind somit ebenfalls „funktionale Äquivalente" oder „Homologe" der konkret offenbarten neuen Polypeptide bzw. Enzyme.

„Funktionale Äquivalente" oder Analoga der konkret offenbarten Polypeptide sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung davon verschiedene Polypeptide, welche weiterhin die gewünschte biologische Aktivität gemäß obiger Definition (wie z.B. Substratspezifität) besitzen.

Unter "funktionalen Äquivalenten" versteht man erfindungsgemäß insbesondere Mutanten, welche in wenigstens einer der oben genannten Sequenzpositionen eine andere als die konkret genannte Aminosäure aufweisen aber trotzdem eine der hierin genannten biologische Aktivität besitzen. "Funktionale Äquivalente" umfassen somit die durch eine oder mehrere Aminosäure-Additionen, -Substituenten, -Deletionen und/oder -Inversionen erhältlichen Mutanten, wobei die genannten Veränderungen in jeglicher Sequenzposition auftreten können, solange sie zu einer Mutante mit dem erfindungsgemäßen Eigenschaftsprofil führen. Funktionale Äquivalenz ist insbesondere auch dann gegeben, wenn die Reaktivitätsmuster zwischen Mutante und unverändertem Polypeptid qualitativ übereinstimmen, d.h. beispielsweise gleiche Substrate mit unterschiedlicher Geschwindigkeit umgesetzt werden.

„Funktionale Äquivalente" im obigen Sinne sind auch Präkursoren der beschriebenen Polypeptide sowie funktionale Derivate und Salze der Polypeptide. Unter dem Ausdruck „Salze" versteht man sowohl Salze von Carboxylgruppen als auch Säureadditionssalze von Aminogruppen der erfindungsgemäßen Proteinmoleküle. Salze von Carboxylgrup pen können in an sich bekannter Weise hergestellt werden und umfassen anorganische Salze, wie zum Beispiel Natrium-, Calcium-, Ammonium-, Eisen- und Zinksalze, sowie Salze mit organischen Basen, wie zum Beispiel Aminen, wie Triethanolamin, Arginin, Lysin, Piperidin und dergleichen. Säureadditionssalze, wie zum Beispiel Salze mit Mineralsäuren, wie Salzsäure oder Schwefelsäure und Salze mit organischen Säuren, wie Essigsäure und Oxalsäure sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

„Funktionale Derivate" erfindungsgemäßer Polypeptide können an funktionellen Aminosäure-Seitengruppen oder an deren N- oder C-terminalen Ende mit Hilfe bekannter Techniken ebenfalls hergestellt werden. Derartige Derivate umfassen beispielsweise aliphatische Ester von Carbonsäuregruppen, Amide von Carbonsäuregruppen, erhältlich durch Umsetzung mit Ammoniak oder mit einem primären oder sekundären Amin; N-Acylderivate freier Aminogruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen; oder O-Acylderivate freier Hydroxygruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen.

"Funktionale Äquivalente" umfassen natürlich auch Polypeptide welche aus anderen Organismen zugänglich sind sowie natürlich vorkommende Varianten. Beispielsweise lassen sich durch Sequenzvergleich Bereiche homologer Sequenzregionen festlegen und in Anlehnung an die konkreten Vorgaben der Erfindung äquivalente Enzyme ermitteln.

„Funktionale Äquivalente" umfassen ebenfalls Fragmente, vorzugsweise einzelne Domänen oder Sequenzmotive, der erfindungsgemäßen Polypeptide, welche z.B. die gewünschte biologische Funktion aufweisen.

„Funktionale Äquivalente" sind außerdem Fusionsproteine, welche ein der oben genannten Polypeptidsequenzen oder davon abgeleitete funktionale Äquivalente und wenigstens eine weitere, davon funktionell verschiedene, heterologe Sequenz in funktioneller N- oder C-terminaler Verknüpfung (d.h. ohne gegenseitigen wesentliche funktionelle Beeinträchtigung der Fusionsproteinteile) aufweisen. Nichtlimitiernde Beispiele für derartige heterologe Sequenzen sind z.B. Signalpeptide, Enzyme, Immunoglobuline, Oberflächenantigene, Rezeptoren oder Rezeptorliganden.

„Funktionale Äquivalente" erfindungsgemäßer Trans-Sialidasen sind insbesondere Enzyme, deren Aminosäuresequenzen oder -teilsequenzen zur korrespondierenden Aminosäuresequenz oder -teilsequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder 4 eine Sequenzidentität (Sequenzhomologie) von wenigsten 60% insbesondere wenigstens 65% oder wenigstens 70%, wie z.B. 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% oder 99%, berechnet nach dem Algorithmus von Pearson und Lipman, Proc. Natl. Acad, Sci. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448, aufweisen.

Im Falle einer möglichen Proteinglykosylierung umfassen erfindungsgemäße Äquivalente Proteine des oben bezeichneten Typs in deglykosylierter bzw. glykosylierter Form sowie durch Veränderung des Glykosylierungsmusters erhältliche abgewandelte Formen.

Homologe der erfindungsgemäßen Proteine oder Polypeptide können durch Mutagenese erzeugt werden, z.B. durch Punktmutation, Verlängerung oder Verkürzung des Proteins. Der Begriff "Homolog", wie er hier verwendet wird, betrifft auch eine variante Form des Proteins, die als Agonist oder Antagonist der Protein-Aktivität wirkt.

Homologe der erfindungsgemäßen Proteine können durch Screening kombinatorischer Banken von Mutanten, wie z.B. Verkürzungsmutanten, identifiziert werden. Beispielsweise kann eine variegierte Bank von Protein-Varianten durch kombinatorische Mutagenese auf Nukleinsäureebene erzeugt werden, wie z.B. durch enzymatisches Ligieren eines Gemisches synthetischer Oligonukleotide. Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, die zur Herstellung von Banken potentieller Homologer aus einer degenerierten Oligonukleotidsequenz verwendet werden können. Die chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz kann in einem DNA-Syntheseautomaten durchgeführt werden, und das synthetische Gen kann dann in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden. Die Verwendung eines degenerierten Gensatzes ermöglicht die Bereitstellung sämtlicher Sequenzen in einem Gemisch, die den gewünschten Satz an potentiellen Proteinsequenzen codieren. Verfahren zur Synthese degenerierter Oligonukleotide sind dem Fachmann bekannt (Z.B. Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al., (1984) Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11: 477).

b) Polynukleotide

„Polynukleotide" im Sinne der vorliegender Erfindung umfassen charakteristische Teilfragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen die für Aminosäureteilsequenzen erfindungsgemäßer Enzyme kodieren, ebenso wie Nukleisäuresequenzen die für Enzyme und deren funktionale Äquivalente kodieren. Polynukleotide umfassen vorzugsweise mehr als etwa 20 insbesondere mehr als etwa 30, wie z.B. mehr als etwa 45 oder mehr als etwa 60 Nukleinsäurereste.

„Oligonukleotide" umfassen insbesondere eine Sequenz von weniger als etwa 60, vorzugsweise weniger als etwa 45, insbesondere weniger als etwa 30 oder weniger als etwa 20 Nukleinsäuresten.

Alle hierin erwähnten „Nukleinsäuresequenzen" sind in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen, wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seiten 896–897) erfolgen. Die Anlagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mit Hilfe des Klenow-Fragmentes der DNA-Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.

Gegenstand der Erfindung sind auch Nukleinsäuresequenzen (einzel- und doppelsträngige DNA- und RNA-Sequenzen, wie z.B. cDNA und mRNA), kodierend für eines der obigen Polypeptide und deren funktionalen Äquivalenten, welche z.B. auch unter Verwendung künstlicher Nukleotidanaloga zugänglich sind.

Die Erfindung betrifft sowohl isolierte Nukleinsäuremoleküle, welche für erfindungsgemäße Polypeptide bzw. Proteine oder biologisch aktive Abschnitte davon kodieren, sowie Nukleinsäurefragmente, die z.B. zur Verwendung als Hybridisierungssonden oder Primer zur Identifizierung oder Amplifizierung von erfindungsgemäßer kodierenden Nukleinsäuren verwendet werden können.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können zudem untranslatierte Sequenzen vom 3'- und/oder 5'-Ende des kodierenden Genbereichs enthalten

Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül wird von anderen Nukleinsäuremolekülen abgetrennt, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure zugegen sind und kann überdies im wesentlichen frei von anderem zellulären Material oder Kulturmedium sein, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt wird, oder frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien sein, wenn es chemisch synthetisiert wird.

Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül kann mittels molekularbiologischer Standardtechniken und der erfindungsgemäß bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden. Beispielsweise kann cDNA aus einer geeigneten cDNA-Bank isoliert werden, indem eine der konkret offenbarten vollständigen Sequenzen oder ein Abschnitt davon als Hybridisierungssonde und Standard-Hybridisierungstechniken (wie z.B. beschrieben in Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) verwendet werden. Überdies läßt sich ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine der offenbarten Sequenzen oder ein Abschnitt davon, durch Polymerasekettenreaktion isolieren, wobei die Oligonukleotidprimer, die auf der Basis dieser Sequenz erstellt wurden, verwendet werden. Die so amplifizierte Nukleinsäure kann in einen geeigneten Vektor kloniert werden und durch DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide, können ferner durch Standard-Syntheseverfahren, z.B. mit einem automatischen DNA-Synthesegerät, hergestellt werden.

Die Erfindung umfasst weiterhin die zu den konkret beschriebenen Nukleotidsequenzen „komplementären" Nukleinsäuremoleküle oder einen Abschnitt davon.

Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen ermöglichen die Erzeugung von Sonden und Primern, die zur Identifizierung und/oder Klonierung von homologen Sequenzen in anderen Zelltypen und Organismen verwendbar sind. Solche Sonden bzw. Primer umfassen gewöhnlich einen Nukleotidsequenzbereich, der unter stringenten Bedingungen an mindestens etwa 12, vorzugsweise mindestens etwa 25, wie z.B. etwa 40, 50 oder 75 aufeinanderfolgende Nukleotide eines Sense-Stranges einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder eines entsprechenden Antisense-Stranges hybridisiert.

Weitere erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen sind abgeleitet von SEQ ID NO: 1 und 3 und unterscheiden sich davon durch Addition, Substitution, Insertion oder Deletion einzelner oder mehrerer Nukleotide, kodieren aber weiterhin für Polypeptide mit dem gewünschten Eigenschaftsprofil.

Erfindungsgemäß umfasst sind auch solche Nukleinsäuresequenzen, die sogenannte stumme Mutationen umfassen oder entsprechend der Codon-Nutzung eins speziellen Ursprungs- oder Wirtsorganismus, im Vergleich zu einer konkret genannten Sequenz verändert sind, ebenso wie natürlich vorkommende Varianten, wie z.B. Spleißvarianten oder Allelvarianten, davon. Gegenstand sind ebenso durch konservative Nukleotidsubstutionen (d.h. die betreffende Aminosäure wird durch eine Aminosäure gleicher Ladung, Größe, Polarität und/oder Löslichkeit ersetzt) erhältliche Sequenzen.

Gegenstand der Erfindung sind auch die durch Sequenzpolymorphismen von den konkret offenbarten Nukleinsäuren abgeleiteten Moleküle. Diese genetischen Polymorphismen können zwischen Individuen innerhalb einer Population aufgrund der natürlichen Variation existieren. Diese natürlichen Variationen bewirken üblicherweise eine Varianz von 1 bis 5% in der Nukleotidsequenz eines Gens.

Weiterhin umfasst die Erfindung auch Nukleinsäuresequenzen, welchen mit oben genannten kodierenden Sequenzen hybridisieren oder dazu komplementär sind. Diese Polynukleotide lassen sich bei Durchmusterung von genomischen oder cDNA-Banken auffinden und gegebenenfalls daraus mit geeigneten Primern mittels PCR vermehren und anschließend beispielsweise mit geeigneten Sonden isolieren. Eine weitere Mög lichkeit bietet die Transformation geeigneter Mikroorganismen mit erfindungsgemäßen Polynukleotiden oder Vektoren, die Vermehrung der Mikroorganismen und damit der Polynukleotide und deren anschließende Isolierung. Darüber hinaus können erfindungsgemäße Polynukleotide auch auf chemischem Wege synthetisiert werden.

Unter der Eigenschaft, an Polynukleotide „hybridisieren" zu können, versteht man die Fähigkeit eines Poly- oder Oligonukleotids unter stringenten Bedingungen an eine nahezu komplementäre Sequenz zu binden, während unter diesen Bedingungen unspezifische Bindungen zwischen nicht-komplementären Partnern unterbleiben. Dazu sollten die Sequenzen zu 70–100%, vorzugsweise zu 90–100%, komplementär sein. Die Eigenschaft komplementärer Sequenzen, spezifisch aneinander binden zu können, macht man sich beispielsweise in der Northern- oder Southern-Blot-Technik oder bei der Primerbindung in PCR oder RT-PCR zunutze. Üblicherweise werden dazu Oligonukleotide ab einer Länge von 30 Basenpaaren eingesetzt.

Unter "stringenten" Bedingungen versteht man, wenn beispielsweise nach dem Southern bzw. Northern Blot die DNA bzw. RNA Fragmente auf den Membranen mit einer Sonde unter spezifischen Bedingungen, das heißt, bei einer Temperatur von 60–70°C, (38–42°C bei 50% Hybridisierungslösungen die 50% Formamid enthalten) hybridisiert. Weiterhin sind die Bedingungen dann spezifisch bzw. stringent, wenn die im Anschluss an die Hybridisierung durchgeführten Waschschritte zur Elution unspezifisch hybridisierter DNA bzw. RNA-Sonden ebenfalls spezifisch durchgeführt werden. Bei spezifischen Waschschritten handelt es sich üblichenrweise um das zweimalige Waschen bei 20–25 °C für 5–10min. mit 2 × SSC-Puffer, der 0,1% SDS (Natriumdodecylsulfat) enthält und anschließendem zweimaligen Waschen mit Puffer niedrigerer Ionenstärke (z.B. 0,1 × SSC mit 0,1% SDS) bei höherer Temperatur (z.B. 64°C). [20 × SSC: 3M NaCl, 0,3M Na-Citrat, pH 7,0]. Dabei bleiben nur in hohem Maße komplementäre Nukleinsäuren aneinander gebunden. Die Einstellung stringenter Bedingungen ist dem Fachmann bekannt und ist z.B. in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1–6.3.6. beschrieben.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft "Antisense-"Nukleinsäuren. Diese umfassen eine Nukleotidsequenz, die zu einer kodierenden "Sense-"Nukleinsäure, komplementär ist. Die Antisense-Nukleinsäure kann zum gesamten kodierenden Strang oder nur zu einem Abschnitt davon komplementär sein. Bei einer weiteren Ausführungsform ist das Antisense-Nukleinsäuremolekül antisense zu einem nicht-kodierenden Bereich des kodierenden Stranges einer Nukleotidsequenz. Der Begriff "nicht-kodierender Bereich" betrifft die als 5'- und 3'-untranslatierte Bereiche bezeichneten Sequenzabschnitte.

Ein Antisense-Oligonukleotid kann z.B. etwa 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Nukleotide lang sein. Eine erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäure kann durch chemische Synthese und enzymatische Ligationsreaktionen mittels im Fachgebiet bekannter Verfahren konstruiert werden. Eine Antisense-Nukleinsäure kann chemisch synthetisiert werden, wobei natürlich vorkommende Nukleotide oder verschieden modifizierte Nukleotide verwendet werden, die so gestaltet sind, daß sie die biologische Stabilität der Moleküle erhöhen, oder die physikalische Stabilität des Duplexes erhöhen, der zwischen der Antisense- und Sense-Nukleinsäure entstanden ist. Beispielsweise können Phosphorthioat-Derivate und acridinsubstituierte Nukleotide verwendet werden. Beispiele modifizierter Nukleotide, die zur Erzeugung der Antisense-Nukleinsäure verwendet werden können, sind z.B. 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-loduracil, Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, und dergleichen.

Die erfindungsgemäßen Antisense-Nukleinsäuremoleküle werden üblicherweise an eine Zelle verabreicht oder in situ erzeugt, so daß sie mit der zellulären mRNA und/oder einer kodierenden DNA hybridisieren oder daran binden, so daß die Expression des Proteins, z.B. durch Hemmung der Transkription und/oder Translation, gehemmt wird.

Die Begriffe "exprimieren" bzw. 'Verstärkung" oder „Überexpression" beschreiben im Kontext der Erfindung die Produktion bzw. Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden. Dazu kann man beispielsweise ein Gen in einen Organismus einbringen, ein vorhandenes Gen durch ein anderes Gen ersetzen, die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöhen, einen starken Promotor verwenden oder ein Gen verwenden, das für ein entsprechendes Enzym mit einer hohen Aktivität kodiert und man kann gegebenenfalls diese Maßnahmen kombinieren.

Die Begriffe „abschwächen" und „verringern" beschreiben im Kontext der Erfindung die Abschwächung oder Verringerung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden. Dazu kann man beispielsweise ein Gen in einem Organismus deletieren, ein vorhandenes Gen durch ein anderes Gen ersetzen, die Kopienzahl eines Transkriptes des Gens bzw. der Gene erniedrigen, einen schwachen Promotor verwenden oder ein Gen verwenden, das für ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigeren Aktivität kodiert und man kann gegebenenfalls diese Maßnahmen kombinieren.

c) Expressionskonstrukte und Vektoren:

Gegenstand der Erfindung sind außerdem Expressionskonstrukte, enthaltend unter der genetischen Kontrolle regulativer Nukleinsäuresequenzen eine für ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz; sowie Vektoren, umfassend wenigstens eines dieser Expressionskonstrukte. Vorzugsweise umfassen solche erfindungsgemäßen Konstrukte 5'-stromaufwärts von der jeweiligen kodierenden Sequenz einen Promotor und 3'-stromabwärts eine Terminatorsequenz sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils operativ verknüpft mit der kodierenden Sequenz.

Unter einer „operativen Verknüpfung" versteht man die sequentielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und gegebenenfalls weiterer regulativer Elemente derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Beispiele für operativ verknüpfbare Sequenzen sind Targeting-Sequenzen sowie Enhancer, Polyadenylierungssignale und dergleichen. Weitere regulative Elemente umfassen selektierbare Marken, Amplifikationssignale, Replikationsursprünge und dergleichen. Geeignete regulatorische Sequenzen sind z.B. beschrieben in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).

Zusätzlich zu den artifiziellen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulationssequenz vor dem eigentlichen Strukturgen noch vorhanden sein. Durch genetische Veränderung kann diese natürliche Regulation gegebenenfalls ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht oder erniedrigt werden. Das Genkonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es werden keine zusätzlichen Regulationssignale vor das Strukturgen insertiert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wird nicht entfernt. Statt dessen wird die natürliche Regulationssequenz so mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert oder verringert wird. Die Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.

Beispiele für brauchbare Promotoren sind: cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, laclq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, lambda-PR- oder im lambda-PL-Promotor, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden; sowie die gram-positiven Promotoren amy und SPO2, die Hefepromotoren ADC1, MFalpha , AC, P-60, CYC1, GAPDH oder die Pflanzenpromotoren CaMV/35S, SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, not oder der Ubiquitin- oder Phaseolin-Promotor. Besonders bevorzugt ist die Verwendung induzierbarer Promotoren, wie z.B. licht- und insbesondere temperaturinduztierbarer Promotoren, wie der P_rP_l-Promotor. Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen verwendet werden. Darüber hinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.

Die genannten regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Nukleinsäuresequenzen und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.

Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Expression positiv beeinflussen und dadurch erhöhen oder erniedrigen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.

Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten kodierenden Nukleotidsequenz sowie einem Terminator- oder Polyadenylierungssignal. Dazu verwendet man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind.

Das rekombinante Nukleinsäurekonstrukt bzw. Genkonstrukt wird zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen wirtsspezifischen Vektor insertiert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht.

"Vektoren" sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus "Cloning Vectors" (Pouwels P.H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) entnommen werden. Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, wie beispielsweise Phagen, Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus und Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Cosmide, und lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden.

Als Beispiele für geeignete Expressionsvektoren können genannt werden: Übliche Fusionsexpressionsvektoren, wie pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. und Johnson, K.S. (1988) Gene 67: 31–40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT 5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), bei denen Glutathion-S-Transferase (GST), Maltose E-bindendes Protein bzw. Protein A an das rekombinante Zielprotein fusioniert wird.

Nicht-Fusionsprotein-Expressionsvektoren wie pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69: 301-315) und pET 11 d (Studier et al. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990)60–89).

Hefe-Expressionsvektor zur Expression in der Hefe S. cerevisiae , wie pYepSec1 (Baldari et al., (1987) Embo J. 6: 229–234), pMFa (Kurjan und Herskowitz (1982) Cell 30: 933–943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54: 113–123) sowie pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektoren und Verfahren zur Konstruktion von Vektoren, die sich zur Verwendung in anderen Pilzen, wie filamentösen Pilzen, eignen, umfassen diejenigen, die eingehend beschrieben sind in: van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy et al., Hrsg., S. 1–28, Cambridge University Press: Cambridge.

Baculovirus-Vektoren, die zur Expression von Proteinen in gezüchteten Insektenzellen (bspw. Sf9-Zellen) verfügbar sind, umfassen die pAc-Reihe (Smith et al., (1983) Mol. Cell Biol.. 3: 2156–2165) und die pVL-Reihe (Lucklow und Summers (1989) Virology 170: 31–39).

Pflanzen-Expressionsvektoren, wie solche, die eingehend beschrieben sind in: Becker, D., Kemper, E., Schell, J. und Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20: 1195–1197; und Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acids Res. 12: 8711–8721.

Säugetier-Expressionsvektoren, wie pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329: 840) und pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6: 187–195).

Weitere geeignete Expressionssysteme für prokaryontische und eukaryotische Zellen sind in Kapitel 16 und 17 von Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T., Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben.

d) Rekombinante Mikroorganismen:

Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vektoren sind rekombinante Mikroorganismen herstellbar, welche beispielsweise mit wenigstens einem erfindungsgemäßen Vektor trans formiert sind und zur Produktion der erfindungsgemäßen Polypeptide eingesetzt werden können. Vorteilhafterweise werden die oben beschriebenen erfindungsgemäßen rekombinanten Konstrukte in ein geeignetes Wirtssystem eingebracht und exprimiert. Dabei werden vorzugsweise dem Fachmann bekannte geläufige Klonierungs- und Transfektionsmethoden, wie beispielsweise Co-Präzipitation, Protoplastenfusion, Elektroporation, retrovirale Transfektion und dergleichen, verwendet, um die genannten Nukleinsäuren im jeweiligen Expressionssystem zur Expression zu bringen. Geeignete Systeme werden beispielsweise in Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997, oder Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben.

Erfindungsgemäß sind auch homolog rekombinierte Mikroorganismen herstellbar. Dazu wird ein Vektor hergestellt, der zumindest einen Abschnitt eines erfindungsgemäßen Gens oder einer kodierenden Sequenz enthält, worin gegebenenfalls wenigstens eine Aminosäure-Deletion, -Addition oder -Substitution eingebracht worden ist, um die erfindungsgemäße Sequenz zu verändern, z.B. funktionell zu disrumpieren ("Knockout"-Vektor). Die eingebrachte Sequenz kann z.B. auch ein Homologes aus einem verwandten Mikroorganismus sein oder aus einer Säugetier-, Hefe- oder Insektenquelle abgeleitet sein. Der zur homologen Rekombination verwendete Vektor kann alternativ derart ausgestaltet sein, daß das endogene Gen bei homologer Rekombination mutiert oder anderweitig verändert ist, jedoch noch das funktionelle Protein codiert (z.B. kann der stromaufwärts gelegene regulatorische Bereich derart verändert sein, daß dadurch die Expression des endogenen Proteins verändert wird). Der veränderte Abschnitt des erfindungsgemäßen Gens ist im homologen Rekombinationsvektor. Die Konstruktion geeigneter Vektoren zur homologen Rekombination ist z.B. beschrieben in Thomas, K.R. und Capecchi, M.R. (1987) Cell 51: 503.

Als Wirtsorganismen sind prinzipiell alle Organismen geeignet, die eine Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, ihrer Allelvarianten, ihrer funktionellen Äquivalente oder Derivate ermöglichen. Unter Wirtsorganismen sind beispielsweise Bakterien, Pilze, Hefen, pflanzliche oder tierische Zellen zu verstehen. Bevorzugte Organismen sind Bakterien, wie solche der Gattungen Escherichia, wie z.B. Escherichia coli, Streptomy ces, Bacillus oder Pseudomonas, eukaryotische Mikroorganismen, wie Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus, höhere eukaryotische Zellen aus Tieren oder Pflanzen, beispielsweise Sf9 oder CHO-Zellen.

Die Selektion erfolgreich transformierter Organismen kann durch Markergene erfolgen, die ebenfalls im Vektor oder in der Expressionskassette enthalten sind. Beispiele für solche Markergene sind Gene für Antibiotikaresistenz und für Enzyme, die eine farbgebende Reaktion katalysieren, die ein Anfärben der transformierten Zelle bewirkt. Diese können dann mittels automatischer Zellsortierung selektiert werden. Erfolgreich mit einem Vektor transformierte Mikroorganismen, die ein entsprechendes Antibiotikaresistenzgen (z.B. G418 oder Hygromycin) tragen, lassen sich durch entsprechende Antibiotika-enthaltende Medien oder Nährböden selektieren. Markerproteine, die an der Zelloberfläche präsentiert werden, können zur Selektion mittels Affinitätschromatographie genutzt werden.

Die Kombination aus den Wirtsorganismen und den zu den Organismen passenden Vektoren, wie Plasmide, Viren oder Phagen, wie beispielsweise Plasmide mit dem RNA-Polymerase/Promoter-System, die Phagen 8 oder 7 oder andere temperente Phagen oder Transposons und/oder weiteren vorteilhaften regulatorischen Sequenzen bildet ein Expressionssystem. Beispielsweise ist unter dem Begriff "Expressionssystem" die Kombination aus Säugetierzellen, wie CHO-Zellen, und Vektoren, wie pcDNA3neo-Vektor, die für Säugetierzellen geeignet sind, zu verstehen.

Gewünschtenfalls kann das Genprodukt auch in transgenen Organismen, wie transgenen Tieren, insbesondere Mäusen, Schafen oder transgenen Pflanzen zur Expression, gebracht werden.

e) Rekombinante Herstellung der Polypeptide:

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Verfahren zur rekombinanten Herstellung einer erfindungsgemäßen Polypeptide oder funktioneller, biologisch aktiver Fragmente davon, wobei man einen Polypeptide-produzierenden Mikroorganismus kultiviert, gegebenenfalls die Expression der Polypeptide induziert und diese aus der Kultur isoliert.

Die Polypeptide können so auch in großtechnischem Maßstab produziert werden, falls dies erwünscht ist.

Der rekombinante Mikroorganismus kann nach bekannten Verfahren kultiviert und fermentiert werden. Bakterien können beispielsweise in TB- oder LB-Medium und bei einer Temperatur von 20 bis 40°C und einem pH-Wert von 6 bis 9 vermehrt werden. Im Einzelnen werden geeignete Kultivierungsbedingungen beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) beschrieben.

Die Zellen werden dann, falls die Polypeptide nicht in das Kulturmedium sezerniert werden, aufgeschlossen und das Produkt nach bekannten Proteinisolierungsverfahren aus dem Lysat gewonnen. Die Zellen können wahlweise durch hochfrequenten Ultraschall, durch hohen Druck, wie z.B. in einer French-Druckzelle, durch Osmolyse, durch Einwirkung von Detergenzien, lytischen Enzymen oder organischen Lösungsmitteln, durch Homogenisatoren oder durch Kombination mehrerer der aufgeführten Verfahren aufgeschlossen werden.

Eine Aufreinigung der Polypeptide kann mit bekannten, chromatographischen Verfahren erzielt werden, wie Molekularsieb-Chromatographie (Gelfiltration), wie Q-Sepharose-Chromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie und hydrophobe Chromatographie, sowie mit anderen üblichen Verfahren wie Ultrafiltration, Kristallisation, Aussalzen, Dialyse und nativer Gelelektrophorese. Geeignete Verfahren werden beispielsweise in Cooper, F.G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York oder in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin beschrieben. Analoges gilt für nicht-rekominant hergestellte Polypeptide.

Besonders vorteilhaft ist es, zur Isolierung des rekombinanten Proteins Vektorsysteme oder Oligonukleotide zu verwenden, die die cDNA um bestimmte Nukleotidsequenzen verlängern und damit für veränderte Polypeptide oder Fusionsproteine kodieren, die z.B. einer einfacheren Reinigung dienen. Derartige geeignete Modifikationen sind beispielsweise als Anker fungierende sogenannte "Tags", wie z.B. die als Hexa-Histidin- Anker bekannte Modifikation oder Epitope, die als Antigene von Antikörpern erkannt werden können (beschrieben zum Beispiel in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Press). Diese Anker können zur Anheftung der Proteine an einen festen Träger, wie z.B. einer Polymermatrix, dienen, die beispielsweise in einer Chromatographiesäule eingefüllt sein kann, oder an einer Mikrotiterplatte oder an einem sonstigen Träger verwendet werden kann.

Gleichzeitig können diese Anker auch zur Erkennung der Proteine verwendet werden. Zur Erkennung der Proteine können außerdem übliche Marker, wie Fluoreszenzfarbstoffe, Enzymmarker, die nach Reaktion mit einem Substrat ein detektierbares Reaktionsprodukt bilden, oder radioaktive Marker, allein oder in Kombination mit den Ankern zur Derivatisierung der Proteine verwendet werden.

f) Reinigung des gewünschten Sialisierungsproduktes aus der Kultur

Die Gewinnung des gewünschten Produktes aus dem Mikrooganismus oder aus dem Kulturüberstand kann durch verschiedene, im Fachgebiet bekannte Verfahren erfolgen. Wird das gewünschte Produkt von den Zellen nicht sezerniert, können die Zellen aus der Kultur durch langsame Zentrifugation geerntet werden, die Zellen können durch Standard-Techniken, wie mechanische Kraft oder Ultraschallbehandlung, lysiert werden. Die Zelltrümmer werden durch Zentrifugation entfernt, und die Überstandsfraktion, die die löslichen Proteine enthält, wird zurweiteren Reinigung dergewünschten Verbindung erhalten. Wird das Produkt von den Zellen sezerniert, werden die Zellen durch langsame Zentrifugation aus der Kultur entfernt, und die Überstandsfraktion wird zur weiteren Reinigung behalten.

Die Überstandsfraktion aus beiden Reinigungsverfahren kann einer Chromatographie mit einem geeigneten Harz unterworfen werden, wobei das gewünschte Molekül mit höherer Selektivität als die Verunreinigungen entweder auf dem Chromatographieharz zurückgehalten wird oder dieses passiert. Diese Chromatographieschritte können nötigenfalls wiederholt werden, wobei die gleichen oder andere Chromatographieharze verwendet werden. Der Fachmann ist in der Auswahl der geeigneten Chromatographieharze und ihrer wirksamsten Anwendung für ein bestimmtes zu reinigendes Molekül bewandert. Das gereinigte Produkt kann durch Filtration oder Ultrafiltration konzentriert und bei einer Temperatur aufbewahrt werden, bei der die Stabilität des Produktes maximal ist.

Im Stand der Technik sind viele Reinigungsverfahren bekannt. Diese Reinigungstechniken sind z.B. beschrieben in Bailey, J.E. & Ollis, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill: New York (1986).

Die Identität und Reinheit der isolierten Verbindungen kann durch Techniken des Standes der Technik bestimmt werden. Diese umfassen Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC), spektroskopische Verfahren, Färbeverfahren, Dünnschichtchromatographie, NIRS, Enzymtest oder mikrobiologische Tests. Diese Analyseverfahren sind z.B. zusammengefaßt in: Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60: 133–140; Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11 27–32; und Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19: 67–70. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Bd. A27, VCH: Weinheim, S. 89–90, S. 521–540, S. 540–547, S. 559–566, 575–581 und S. 581–587; Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17.

Folgende nichtlimitierende Beispiele beschreiben spezielle Ausführungsformen der Erfindung.

Allgemeines:
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungsschritte wie z.B. Restriktionsspaltungen, Agarose Gelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von Zellen, Anzucht von Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter DNA wurden wie bei Sambrook et al. (1989) a.a.O. beschrieben durchgeführt.
Beispiel 1: Isolation der Enzyme aus Kulturen von Trypanosoma congolense
Die prozyklischen Formen von Trypanosoma congolense (hinterlegt beim Schweizer Tropeninstitut Basel (STIB) als Stamm Nr. 249) können bei 27°C ohne CO₂ in SM/SDM 79 Medium, welches 10% fötales Kälberserum und Hemin enthält, angezüchtet werden. Nach drei bis vier Tagen ist die Zellzahl von 1 × 10⁶ auf ca. 7 × 10⁶/ml angewachsen und der Kulturüberstand wird durch Zentrifugation abgetrennt, filtriert und durch Ultrafiltration konzentriert. In dem so gewonnenen Kulturüberstand können 84% der Enzymaktivität festgestellt werden, während noch 16% der Enzyaktivität gebunden an das Zellpellet detektiert werden können. Die konzentrierten Kulturüberstände werden direkt als Enzymkonzentrat für die Trans-Sialidase Reaktionen eingesetzt. Die gewünschten sialisierten Moleküle werden nach der Reaktion aus dem Kulturüberstand isoliert.
Beispiel 2: Reinigung der Enzyme
Zur Isolierung reiner Enzyme wird der konzentrierte Kulturüberstand auf eine Ionenaustauschsäule (Q Sepharose) gegeben. Die Säule wird nach dem Waschen mit einem Salzgradienten eluiert. TS2 eluiert mit einer Salzkonzentration bis 0,2M, TS1 mit einem Salzgradienten ab 0,2M. Nach der Elution werden die beiden Enzyme getrennt mittels Isoelektrischer Fokussierung, Gelfiltration (Sephades G150 SF), Affinitätschromatographie oder Proteinfällung bis zur apparenten Homogenität aufgereinigt.
Beispiel 3: Bestimmung der Enzymaktivität
Zur Bestimmung der Transferaktivität der Trans-Sialidase werden 25 μl Enzymlösung in 50 mM BisTris Puffer, pH 7,0, zusammen mit 1 mM NeuSAc-α(2-3)lactose als Donor und 0,5 mM 4-Methylumbelliferylgalactosid als Akzeptor in einem Endvolumen von 50 μl bei 37°C für 2h inkubiert. Die Inkubation wird durch Zugabe von 1 ml eiskaltem Wasser abgestoppt. Anschliessend wird der Reaktionsansatz auf vorher mit 0,3 ml Q Sepharose FF (Acetatform) gefüllte und mit Wasser preequillibrierte Säulen gegeben. Nach dem Auswaschen des Akzeptors mit Wasser und dem Verwerten des Todvolumens (200 μl 1N HCl), wird das sialylierte Produkt mit 1N HCl eluiert (700 μl). Nach saurer Hydrolyse des Produktes bei 95°C für 45 min und Abkühlung auf Eis, wird die Probe mit 250–290 μl 2N NaOH und 300 μl 1 M Glycin/NaOH Puffer pH 10,0 neutralisiert. Die Fluoreszenz des freigesetzten Methylumbelliferons wird in schwarzen 96-well-plates (Microfluor, Dynex, U.S.A.) bei einer Anregungswellenlänge von 365 nm und einer Emissionswellenlänge von 450 nm gemessen. Die Aktivität des Enzyms entspricht der Intensität der gemessenen Fluoreszenz und kann an einer zuvor erstellten Eichkurve abgelesen werden (Methode nach Engstler et al. 1992).
Beispiel 4: Herstellung transgener Produktionsorganismen (Bakterien, Hefen, Pilzen, Pflanzen) für die Enzyme
Die hier erstmals beschriebenen DNS-Teilsequenzen von TS1 und TS2 ermöglichen mittels routinemäßig angewandten Standardtechniken die vollständige DNS-Sequenzen der Enzyme zu erstellen (insbesondere, da die hier vorgestellten DNS-Sequenzen keine nicht codierenden Introns enthalten). Die entsprechenden Standardtechniken sind z.B. die „Polymerase-Chain-Reaction" Technik (PCR-Technik), „Southern-Blott" über die genomische DNS oder cDNS und mRNA-Techniken, die mit Hilfe von kommerziell erhältlichen Kits beispielsweise von den Firmen Invitrogen oder Clontech durchgeführt werden können. Die Techniken sind dem Fachmann bekannt und sind unter anderem beschrieben in: Ausubel et al: Current Protocols in Molecular Biology, Edition 1989 und 2001. Die vollständige DNS der jeweiligen Enzyme oder funktionelle Teilsequenzen daraus werden mittels standard Transformationstechniken (Ausubel et al.) in die gewünschten Produktionsorganismen eingebracht. Die transgenen Organismen produzieren TS1 und TS2 und können aus den transgenen Organismen und/oder deren Kulturüberständen isoliert werden. Als Empfängerorganismen der DNS, die TS1 oder TS2 kodiert, kommen prokaryontische Bakterien, eukaryontische Mikroorganismen, Hefen und andere Pilze, eukaryontische Zellkulturen, Algen, Pflanzen, Samen, Tiere, Teile von Tieren, Gewebe, Hybridome, transgene Organismen und genbiologische, gentherapeutische und transgene Rekombinanten sowie davon abgeleitete Organismen, Organe, Gewebe und Zellen zum Einsatz. Die hier beanspruchten Enzyme können aus den entsprechenden Ganzen oder Teilen von transgenen Organismen, aus ihren Kul turüberständen, aus Organen, Gewebe, Zellen, biologische Flüssigkeiten, Exsudaten, Eiern, Blut, Lymphe, Milch, Pflanzen, Algen und Samen sowie aus Teilen davon isoliert werden.
Beispiel 5: Reaktionsbeispiel der Enzyme
6kg von Glycomakropeptid (GMP) werden zusammen mit 1 kg Galaktooligosaccharide mit einer Kettenlänge von 6–10 Zucker in handelsüblichem 50 mM Bis Tris Puffer pH 7,0 (z. B. von des Firma Merk, Darmstadt) gelöst. Die Lösung wird mit 1 Liter des Trans-Sialidase enthaltenden Kulturüberstandes von Trypanosoma congolense versetzt und bei 37°C 3 Stunden lang inkubiert. Nach diesem Zeitraum hat die Trans-Sialidase Sialinsäuren von dem GMP auf die Galaktooligosaccharide übertragen. Die sialisierten Produkte können mit Hilfe üblicher chromatographischer Methoden (Ausubel et al.) oder Filtertechniken abgetrennt und gereinigt werden und stehen in reinem Zustand für Produktformulierungen zur Verfügung.
Glycomakropeptid (GMP) ist ein Abfallprodukt der Käseherstellung aus Kuhmilch. Nach Fällung des Caseins für die Käsezubereitung kann es aus der verbleibenden Molke mittels Filtertechniken isoliert werden.
Galaktooligosaccharide werden hergestellt, indem Laktose mittels des im Handel erhältlichen Enzyms beta-Galaktosidase umgesetzt wird. Bei dieser Umsetzung spaltet beta-Galaktosidase einerseits die Laktose in seine monomeren Zucker. Andererseits entstehen bei dieser Umsetzung in einer Nebenreaktion auch längerkettige Galaktooligosaccharide, die abgetrennt werden können und dann als Akzeptoren für die Trans-Sialidase Reaktion zur Verfügung stehen.
Beispiel 6: Verwendung der Enzyme
Die beiden isolierten Enzyme können beispielsweise zur Sialylierung von beta-Galaktose enthaltene Polymere (wie Gum arabicum etc.) und insbesondere für Poylactosamine und Galactane sowie für Galactooligosaccharide (GOS), insbesondere für beta-Galakto-Oligosaccharide, wie z.B. Vivinal GOS von der Firma Borculo Domo Ingredients (BDI) und Oligomate 55 von der Firma Yakult eingesetzt werden.
Diese polymeren Galaktose-Zucker und neu gebildete Galaktooligosaccharide (Herstellung wie in Beispiel 5 beschrieben) können mit Hilfe der in diesem Patent beanspruchten Trans-Sialidasen sialyliert werden. Als Donoren für die Sialinsäuren können alle oben erwähnten Donoren und insbesondere das Glykomakropeptid aus Caseinen (von Mensch, Kuh, Ziege, Schaf, Pferd, Kamel und anderen Tieren) zum Einsatz kommen. Sialisierte Zuckerstrukturen weisen eine erhöhte Ähnlichkeit zu sauren Zuckern auf, die auch im menschlichen Körper gefunden werden können und dort vielfältige Aufgaben haben.
Literatur
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SEQUENCE LISTING

Claims

Polynukleotid, welches für ein Protein mit Trans-Sialidase-Aktivität kodiert und aus Trypanosoma congolense isolierbar ist.
Polynukleotid nach Anspruch 1, welches für ein Protein mit Trans-Sialidase-Aktivität kodiert, das den Transfer von Sialinsäure von einem Donor auf ein Akzeptormolekül katalysiert.
Polynukleotid, nach Anspruch 1 oder 2, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder 3, oder Fragmente davon, welche wenigstens 15 zusammenhängende Nukleotidreste umfassen; die dazu komplementären Polynukleotide und Fragmente; und die von diesen Polynukleotiden durch Entartung des genetischen Codes abgeleiteten Nukleotidsequenzen.
Oligonukleotid, welches mit einem Polynukleotid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, insbesondere unter stringenten Bedingungen, hybridisiert.
Polynukleotid, welches mit einem Oligonukleotid nach Anspruch 4, insbesondere unter stringenten Bedingungen, hybridisiert und für ein Genprodukt aus Mikroorganismen der Gattung Trypanosoma kodiert.
Polypeptid, welches von einem Polynukleotid kodiert wird, das eine Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 5 umfasst; oder welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die wenigstens 10 zusammenhängende Aminosäuren gemäß SEQ ID NO: 2 oder 4 umfasst; sowie funktionale Äquivalente davon, welche Trans-Sialidase-Aktivität besitzen.
Trans-Sialidase oder funktionale Äquivalente davon mit Trans-Sialidase-Aktivität, gekennzeichnet durch eine der folgenden Aminosäureteilsequenzen: TDTVAKYSTDGGRTWKREVIIPNGR (Pos. 1 bis 25 gemäß SEQ ID NO:2) FRIPSLVEIDGVLIATFDTRYLRASDSSLI (Pos. 1 bis 30 gemäß SEQ ID NO:4).
Trans-Sialidase 1 (TS1) gekennzeichnet durch wenigstens eines der folgenden Charakteristika:
Trans-Sialidase 2 (TS2), gekennzeichnet durch wenigstens eines der folgenden Charakteristika:
Stoff nach einem der Ansprüche 1 bis 9, abgeleitet aus dem Organismus Trypanosoma congolense.
Stoffe nach einem der Ansprüche 1 bis 9, hergestellt unter Anwendung synthetischer, insbesondere chemischer, biochemischer, enzymatischer, gentechnologischer und transgener Methoden.
Funktionales Äquivalent einer Trans-Sialidase nach einem der Ansprüche 8 und 9, deren Aminosäuresequenz oder -teilsequenz zur korrespondierenden Aminosäuresequenz oder -teilsequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder 4 eine Sequenzidentität von wenigsten 50% oder wenigstens 60%, insbesondere wenigstens 65% oder wenigstens 70%, wie z.B. 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% oder 99%, berechnet nach dem Algorithmus von Pearson und Lipman, Proc. Natl. Acad, Sci. (USA) 85(8), 1988, 2444–2448, aufweist; oder das eine oder mehrere Deletionen, Additionen, Substitutionen oder Inversionen einzelner oder mehrerer Aminosäurereste enthält oder ein verändertes Glykosylierungsmuster zeigt; wobei die Befähigung zur Katalyse der Übertragung von Sialinsäuren von einem Donor auf einen Akzeptor erhalten bleibt.
Expressionskassette, umfassend in operativer Verknüpfung mit wenigstens einer regulativen Nukleinsäuresequenz eine Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
Rekombinanter Vektor, umfassend wenigstens eine Expressionskassette nach Anspruch 13.
Prokaryotischer oder eukaryotischer Wirt, transformiert mit wenigstens einem Vektor nach Anspruch 14.
Verwendung einer Expressionskassette nach Anspruch 13, eines Vektors nach Anspruch 14 oder eines Wirts nach Anspruch 15 zur rekombinanten Herstellung eines Proteins mit Trans-Sialidase-Aktivität.
Verfahren zur enzymatischen Sialisierung eines Akzeptormoleküls, dadurch gekennzeichnet, dass man das Akzeptormolekül mit einem Sialinsäurereste enthaltenden Donor in Gegenwart eines Enzyms nach einem der Ansprüche 6 bis 12 inkubiert und den sialylierten Akzeptor isoliert.
Verfahren nach Anspruch 17, gekennzeichnet durch wenigsten eine weitere der folgenden Eigenschaften: a) der Donor ist ausgewählt unter an Oligosaccharide, Polysaccharide, Polysialinsäuren, Glykoproteine und Glykolipide gebundene Sialinsäuren, wie insbesondere Lactoferrine, glykolisierte Molkenproteine und Caseine und Fragmente davon; b) der Akzeptor ist ausgewählt unter ß-Galaktose enthaltenden Polymeren, wie β-Galaktooligosacchariden, Laktitol, Laktobionsäure, Methyl-β-lactosid, Acetyllaktosaminen, Galaktopyranosiden, Trans-Galaktooligosacchariden, Polygalaktose und anderen Glykokonjugaten mit endständig gebundener β(1–3) oder β(1–4)-Galaktose oder Galaktose.
Verwendung einer Trans-Sialidase nach einem der Ansprüche 6 bis 12, einer dafür kodierenden Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder eines nach einem der Ansprüche 18 und 19 hergestellten Sialisierungsprodukts zur Herstellung eines Medikaments, Nahrungsmittels oder Nahrungsergänzungsmittels oder einer Nahrungsmittelzutat zur Prävention oder Behandlung Sialinsäure-gesteuerter parasitärer, bakterieller oder viraler Infektionen; zur Behandlung von Tumorerkrankungen; zur Behandlung von Erkrankungen, welche mit einer Entwicklungsstörung des Gewebes assoziiert sind; zur Behandlung von Erkrankungen des Immunsystems; zur Behandlung von Autoimmunreaktionen; zur Behandlung von Erkrankungen mit gestörter Zellkommunikation; oder zur Behandlung von Entzündungen.
Verwendung einer Trans-Sialidase nach einem der Ansprüche 6 bis 12, zur Entwicklung eines Trypanosomiasis-Impfstoffs oder zur Entwicklung von Enzyminhibitoren zur Behandlung oder Prävention von Trypanosoma-Infektionen.
Verwendung einer Trans-Sialidase nach einem der Ansprüche 6 bis 12, einer dafür kodierenden Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder eines nach einem der Ansprüche 18 und 19 hergestellten sialylierten Produkts zur Herstellung eines Medikaments, Nahrungsergänzungsmittels oder Nahrungsmittels zur Schutz körpereigener Zellen oder Gewebe oder Glykoproteine vor enzymatischer Einwirkung.
Verwendung einer Trans-Sialidase nach einem der Ansprüche 6 bis 12, einer dafür kodierenden Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder eines nach einem der Ansprüche 17 und 18 hergestellten sialylierten Produkts zur Herstellung eines Medikaments, Nahrungsergänzungsmittels oder Nahrungsmittels zu Beeinflussung der Entwicklung und/oder Morphogenese von Körpergeweben.
Effektor der Trans-Sialidase-Aktivität einer Trans-Sialidase nach einem der Ansprüche 6 bis 12, ausgewählt unter a) Polypeptid-Liganden, welche mit einer Trans-Sialidase nach einem der Ansprüche 6 bis 12 wechselwirken; b) niedermolekularen Effektoren, welche die biologische Aktivität einer Trans-Sialidase nach einem der Ansprüche 6 bis 12 modulieren; und c) Antisense-Nukleinsäuresequenzen zu einer Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
Verwendung eines Effektors nach Anspruch 23 zur Herstellung eines pharmazeutisches oder gentherapeutisches Mittels, Nahrungsergänzungsmittels oder Nahrungsmittels zur Behandlung oder Prävention von mit Trans-Sialidase-Aktivität assoziierten Erkrankungen.
Verfahren zur Isolierung eines Enzyms mit Trans-Sialidase-Ayktivität, wobei man a) Trypanosoma congolense in einem Medium kultiviert, b) und das gewünschte Produkt aus dem Kulturüberstand durch Ionenaustauschchromatographie mit Hilfe eines Salzgradienten, gegebenenfalls gefolgt von Isoelektrischer Fokussierung, Gelfiltration, Affinitätschromatographie und/oder Proteinfällung, isoliert.
Pharmazeutisches oder gentherapeutisches Mittel, enthaltend in einem pharmazeutisch oder gentherapeutisch verträglichen Träger wenigsten einen Effektor nach Anspruch 23.