MX2008011632A - Vacuna novedosa contra infeccion de trypanosoma cruzi. - Google Patents
Vacuna novedosa contra infeccion de trypanosoma cruzi.Info
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Abstract
La presente invención se refiere a una vacuna novedosa contra infección de Tripanosoma cruzi, útil en la prevención y/o tratamiento de la enfermedad de Chagas. Más específicamente, la presente invención se refiere a una enzima trans-sialidasa, mutante, recombinante, que puede utilizarse como vacuna eficaz sin efectos adversos.
Description
VACUNA NOVEDOSA CONTRA INFECCIÓN DE TRYPANOSOMA CRUZI
La presente invención se refiere a una vacuna novedosa contra infección de Trypanosoma cruzi, útil en la prevención y/o tratamiento de la enfermedad de Chagas. Más específicamente, la presente invención se refiere a una enzima trans-sialidasa mutante, recombinante que puede utilizarse como una vacuna eficiente, sin efectos colaterales, con lo cual la vacuna esta protegiendo contra la parasitemia y contra el daño del tejido causado por los parásitos.
Una de las enfermedades más comunes en Sudamérica y América central es la enfermedad de Chagas o tripanosomiasis americana. Esta enfermedad es causada por el parásito flagelado Trypanosoma cruzi y se propaga por el insecto chupador de sangre Triatoma infestans . Una vez que el parásito llega a la herida creada por la mordedura del insecto, se propaga a través del cuerpo e invade las células hospederas. Dentro de una célula hospedera, el parásito se transforma en un amastigoto no infeccioso que puede multiplicarse muy rápido. Cuando la cantidad de parásitos dentro de la célula representa aproximadamente 500, los parásitos se transforman de nuevo en la etapa tripomastigoto infecciosa. Poco después, las células
estallan, dejando los parásitos libres en la sangre desde donde estos pueden infectar nuevas células. La enfermedad tiene tres fases. La primera fase es la fase aguda, la cual ocurre justo después de la infección y tiene solo síntomas leves. La segunda fase es la fase latente, la cual puede tener una duración de 3-10 años y es asintomática . La tercera fase es la fase crónica, durante la cual todos los tejidos infectados están deteriorándose debido a la lisis celular a gran escala que finalmente conduce a la muerte del paciente. 70% de los pacientes chagásicos mueren de un ataque cardiaco causado por daño cardiaco grave.
El mecanismo molecular por el cual el parásito infecta las células hospederas es muy complejo y ha sido el tema de muchos proyectos de investigación a lo largo' de los años. Esta investigación ha demostrado que G. cruzi expresa una enzima única que transfiere ácido siálico la cual es capaz de disociar o fragmentar ácidos siálicos con uniones a-2,3 y transferirlos a los residuos de ß-1 , 4-galactosa terminales: la trans-sialidasa (TS) . La enzima se ancla en la membrana celular del parásito mediante un ancla GPI, pero también enviado a la sangre después de la fragmentación por una enzima lipasa del parásito. La trans-sialidasa desempeña una función
importante en el ciclo de infección de T. cruzi puesto que hace posible la invasión de las células hospederas. Los experimentos han demostrado que cuando se inhibe la actividad trans-sialidasa (por ejemplo utilizando lineas de células mutantes que no tienen ácido siálico sobre su superficie (Ciavaglia y col., 1993; Ming y col., 1993 y Schenkman y col., 1993) o bloqueando las moléculas aceptoras en la superficie del parásito (Yoshida y col., 1989; 1991 y Ruiz y col., 1993) la invasión de las células- hospederas por el parásito es inhibida. Además, la trans-sialidasa también desempeña una función en el mecanismo de defensa del parásito contra el sistema inmunitario del hospedero porque se utiliza para cubrir la superficie del parásito con moléculas de ácido siálico que dificulta que el sistema inmunitario del hospedero detecte el parásito.
Debido a que la enzima trans-sialidasa es de una función tan importante en el ciclo de infección y defensa, el parásito desarrollo diversos métodos para proteger la enzima contra el sistema inmunitario del hospedero. Primero, el parásito expresa más de 200 diferentes trans-sialidasas de las cuales solo aproximadamente 15 son activas (El-sayed y col., 2005). Este hecho hace muy difícil para el sistema inmunitario
la inhibición de la invasión de las células hospederas por el parásito en un ciclo de infección normal, especialmente porque los parásitos y sus trans-sialidasas reciben solo un breve tiempo en el torrente sanguíneo antes de que estos entren en una célula hospedera donde son protegidos del sistema inmunitario. Además, las trans-sialidasas tienen una cola inmunodominante muy larga de repeticiones SAPA las cuales actúan como una desviación para el sistema inmunitario, alejando exitosamente los anticuerpos del sitio catalítico importante de la enzima.
En la actualidad existen dos fármacos que se utilizan para contra restar la enfermedad: Benznidazol y Nifurtimox. Se sabe muy poco sobre su mecanismo, pero se sabe que ellos inducen estrés oxidativo en las células. Ambos productos no diferencian entre parásitos y células hospederas, dando como resultado efectos colaterales graves para el paciente. Debido a estos efectos colaterales y porque estos tienen una eficiencia muy limitada en pacientes crónicos, estos medicamentos solo tienen un uso limitado.
La vacunación podría solucionar estos problemas. Una vacuna probablemente sería mucho más eficaz en el
tratamiento de pacientes crónicos que la medicación existente y tendría la ventaja de tener un efecto preventivo también. GB2000968 describe una vacuna a base de tripanosoma muerto. No obstante, los tripomastigotos son difíciles de cultivar en alta densidad, y la capacidad inmunogénica de la vacuna es baja. Algunas otras solicitudes de patente han descrito una fracción microsomal (EP0003529) , una fracción de glucoproteína (US4298596) o un péptido (WO 9316199) derivado de G. Cruzi como vacuna posible. No obstante, ninguna de estas vacunas probó ser suficientemente eficiente.
Debido a su función primordial en la infección y debido al hecho de que la enzima esta bien expuesta sobre la superficie celular y presente como molécula libre en la sangre, y por tanto, una buena diana para los anticuerpos, la trans-sialidasa puede ser un buen candidato antigénico para la producción de una vacuna contra la .enfermedad de Chagas . No se espera que una vacuna basada en la enzima trans-sialidasa tenga efectos colaterales importantes porque no hay homólogos de la trans-sialidasa en humanos lo cual significa que todos los anticuerpos que se generen serían específicos del parásito. Algunos autores han descrito la vacunación basada en el suministro de DNA que codifica trans-
sialidasa (Costa y col., 1998; Vasconcelos y col., 2004), posiblemente en combinación con IL-12 (katae y col., 2002) . En el estudio de la vacunación con DNA de trans-sialidasa de Pereira-chioccola y col., (1999), se utilizo como control trans-sialidasa recombinante . Esta trans-sialidasa recombinante demostró desencadenar anticuerpos inactivadotes de trans-sialidasa y podría reducir la parasitemia inducida por el tripomastigoto en ratones. No obstante, la trans-sialidasa es ineficiente como antígeno debido a la cola inmunodominante . Por tanto, el uso de la enzima del parásito activa tipo nativo en la vacunación no es apropiada, en vista de que las elevadas dosis de la trans-sialidasa recombinante necesarias podrían inducir efectos colaterales, especialmente porque se demostró que la trans-sialidasa activa puede activar receptores neuronales (Woronowicz y col., 2004). US 2005158347 describe una vacuna multicomponentes contra T. Cruzi que contiene trans-sialidasa o un polinucleótido que codifica trans-sialidasa. No obstante, los inconvenientes relacionados con el uso de trans-sialidasa, como se mencionan antes, también son válidos para esta vacuna multicomponentes .
Sorprendentemente nosotros encontramos que los mutantes con actividad enzimática limitada o sin
actividad enzimática pueden utilizarse satisfactoriamente como vacuna. Esto es inesperado, en vista de que uno no esperaría que los anticuerpos contra estos mutantes inactivos todavía sean capaces de inactivar la actividad enzimática de la trans-sialidasa tipo nativo y/o inhibir el ciclo de infección. Incluso más sorprendentemente, nosotros fuimos capaces de hacer la vacuna más eficiente manipulando la trans-sialidasa (TS) en tal forma que la cola inmunodominante de las repeticiones SAPA ya no estuviera presente. La enzima trans-sialidasa mutante manipulada puede utilizarse como una vacuna eficiente contra la enfermedad de Chagas en ratones. Más sorprendentemente, la forma trans-sialidasa mutante (Mut TS) protege los animales inmunizados contra daño de tejido en el músculo cardiaco y esquelético (miocarditis) y miositis) y contra esplenomegalia, mientras que los animales inmunizados con trans-sialidasa tipo nativa todavía son afectados.
Un primer aspecto de la invención es el uso de una proteína mutante trans-sialidasa de tripanosoma, enzimáticamente inactiva como medicina. La proteína mutante trans-sialidasa enzimáticamente inactiva como se utiliza en la presente significa que la actividad sialidasa restante y/o la actividad transferasa es menor
que 20% de la actividad tipo nativa, preferentemente menos de 10% de la actividad tipo nativa, incluso más preferentemente menos de 5% de la actividad tipo nativa. La actividad sialidasa y transferasa se cuantifican por separado, como se describe en los materiales y métodos de los ejemplos. Preferentemente, el tripanosoma es T. Cruzi preferentemente, la trans-sialidasa mutante es una trans-sialidasa recombinante . Preferentemente, la trans-sialidasa mutante carece de la cola de repeticiones SAP inmunodominante . Incluso más preferentemente, la trans-sialidasa mutante comprende la ID SEC No.: 1, más preferentemente la trans-sialidasa mutante consiste en la ID SEC No.: 1. Una modalidad preferida es un mutante enzimáticamente inactivo de acuerdo con la invención, del cual el perfil de glucosilación es diferente del perfil de glucosilación de los tripanosomas tipo nativo. Como un ejemplo no limitativo, tal perfil de glucosilación diferente puede obtenerse por la producción de la enzima mutante como una enzima mutante recombinante en una célula hospedera que no sea de mamífero, preferentemente una célula de levadura, incluso más preferentemente una levadura Pichia, más preferentemente Pichia pastori GS115 o cualquier cepa Pichia pastori es manipulada que se obtenga de la cepa GS115. Preferentemente, el mutante enzimáticamente inactivo muestra un perfil N-glicano que
existe predominantemente de M8GlcNAc2. Predominantemente, cuando se utiliza en la presente, significa que el pico más importante en el análisis de N-glicano consiste en la fracción M8GlcNAc2.
Otro aspecto ' de la invención es el uso de una proteina mutante trans-sialidasa de Trypanosoma enzimáticamente inactiva para la preparación de una vacuna. Como una opción, la trans-sialidasa de Trypanosoma, enzimáticamente inactiva puede ser mezclada con otros antigenos apropiados. Como una opción, adyuvantes y/o citocinas pueden adicionarse a la vacuna para mejorar la respuesta inmune. Como un ejemplo no limitativo, un adyuvante apropiado ha sido descrito en WO 0160404, las citocinas apropiadas son, como un ejemplo no limitativo, interleucina-6 e interleucina-12.
Preferentemente, el tripanosoma es Trypanosoma cruzi y la vacuna se utiliza en el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de la enfermedad de Chagas. Preferentemente, la trans-sialidasa mutante es una trans-sialidasa recombinante . Preferentemente, la trans-sialidasa mutante carece de la cola de repeticiones SAPA inmunodominante . Incluso más preferentemente, la trans-sialidasa mutante comprende la ID SEC NO: 1, más preferentemente, la trans-sialidasa mutante consiste en la ID SEC No.: 1. Una
modalidad preferida es un mutante enzimáticamente inactivo de acuerdo con la invención, del cual el perfil de glucosilación es diferente del perfil de glucosilación en los tripanosomas tipo nativo.
Otro aspecto de la invención es una composición farmacéutica que contiene una proteina mutante trans-sialidasa de tripanosoma enzimáticamente inactiva como vacuna. Preferentemente, el tripanosoma es Trypanosoma cruzi y la vacuna se utiliza en el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de la enfermedad de Chagas . Preferentemente, la trans-sialidasa mutante es una trans-sialidasa recombinante . Preferentemente la trans-sialidasa mutante carece de la cola de repeticiones SAPA inmunodominante . Incluso más preferentemente, la trans-sialidasa mutante comprende la ID SEC No.: 1, más preferentemente, la trans-sialidasa mutante consiste en la ID SEC Np.: 1. Una modalidad preferida es un mutante enzimáticamente inactivo de acuerdo con la invención, del cual el perfil de glucosilación es diferente del perfil de glucosilación de los tripanosomas tipo nativo.
Todavía otro aspecto, es el uso de una proteína mutante trans-sialidasa de tripanosoma, enzimáticamente inactiva de acuerdo con la invención, para proteger
mamíferos (incluidos los humanos) contra miocarditis y/o miositis y/o esplenomegalia causada por infección de Trypanosoma cruzi. Preferentemente, la trans-sialidasa mutante carece de la cola de repetición SAPA inmunodominante . Incluso más preferentemente, la trans-sialidasa mutante comprende la ID SEC No.: 1, más preferentemente, la trans-sialidasa mutante consiste en la ID SEC NO: 1. Una modalidad preferida es un mutante enzimáticamente inactivo de acuerdo con la invención, del cual el perfil de glucosilación es diferente del perfil de glucosilación de los tripanosomas tipo nativo.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1: el plásmido pPICZTSjE que contiene el gen de transialidasa . AOX1 P= promotor AOX1 inducible con metanol, preMF= factor de acoplamiento de levadura (señal de secreción) ,
TS = gen de trans-sialidasa, E-tag = etiqueta de afinidad, fd g3) = DNA bacteriano sin función, AOX1 T= secuencia terminadora de AOX1, TEF1 P= promotor de levadura, EM7 P-Promotor bacteriano, Sh ble = marcador de resistencia de zeocina, CYC1 T= secuencia terminadora del citocromo C, ori = origen de replicación.
Figura 2: combinación de los datos del ensayo de fluorescencia con los datos ELISA como método de tamizaj e . A = placa con fondo transparente, de 96 pozos visualizada con el Lumilmager®. La fluorescencia es una medida de la cantidad de actividad trans-sialidasa en el medio de inducción de cada transformante. B = ELISA en placa de unión a proteina de 96 pozos. La trans-sialidasa de tamaño completo en el medio de inducción de cada transformante fue detectada con un anticuerpo anti-E-tag dirigido contra el E-tag C-terminal.
Figura 3: glucoperfiles de trans-sialidasa que fueron producidos en Pichia pastoris GS115 (WT) y Pichia pastoris Glycoswitch M8 (0CH1) La trans-sialidasa recombinante fue producida en pichi pastoris GS115 y en Pichia pastoris GS115 Glycoswitch M8, una cepa en la cual la hiperglucosilación ha sido desconectada a través del knock-out de la actividad OCH1. Los N-glucanos de la trans-sialidasas secretadas fueron analizados con la tecnología DSA-FACE. Los N-glucanos en la trans-sialidasa producida en Pichia pastoris GS115 Glycoswitch M8 son predominantemente M8GlcNAc2.
Figura 4: Actividad sialidasa de la trans-sialidasa imitante . La actividad siliadisa de la trans-sialidasa mutante que se utilizo en este proyecto fue determinada midiendo la cantidad de metilumbeliferona libre en la mezcla de reacción después de la reacción de la enzima con el sustrato ácido 4-metilumbeliferil-N-acetilneuraminico . La medición de la cantidad de fluorescencia se hizo con un lector de placa de múltiples pozos CYTOFLUOR® serie 4000 (PerSeptive Biosystems) .
Figura 5: actividad transferasa de la trans-sialidasa mutante 1 = escalera de dextrano, 2 = control, 3 = TS mutante, 4 = TS activa, 5 = Perfil glucano estándar R asa B. La actividad transferasa de la trans-sialidasa mutante que se utilizo en este proyecto se determinó analizando la cantidad de glucanos NA2FB sialilados (biantenario asíalo-, galactosilado, sustituido en el núcleo con fucosa y con GlcNAc bisecante) con la tecnología DSA-FACE.
Figura 6: mortalidad de los animales experimentales Presentación gráfica del número de animales supervivientes en diferentes puntos de tiempo después de la infección con parásitos T. Cruzi.
Prueba Log rank (prueba estadística para la igualdad de las distribuciones de los supervivientes) : Diferencias entre todos los grupos: P< 0.00001 Diferencias entre G1-G2-G6: P< 0.8404 Diferencias entre G3-G4-G5-G7: P< 0.5201
Figura 7: parasitemia en los animales experimentales La cantidad de parásitos en la sangre de los ratones fue verificada en los días 14 y 21 después de la infección. Los parásitos de 5 µL de sangre que fueron obtenidos de la cola del ratón fueron contados con una cámara de Neubauer. Los resultados se expresan como número de parásitos/50 campos microscópicos (400x) .
Prueba de Kruskal Wallis: Día 14 pi Diferencias entre todos los grupos: p< 0.0001 Diferencias entré G1-G2-G6: P< 0.553 Diferencias entre G3-G4-G5-G7: P< 0.224
Día 21 pi Diferencias entre todos los grupos: p< 0.0001 Diferencias entre G1-G2-G6: P< 0.266 Diferencias entre G3-G4-G5-G7: P< 0.073
Figura 8: peso de los animales experimentales Presentación gráfica del peso corporal de los animales el cual se determino cada semana.
Figura 9: resultados representativos del análisis histopatológico en ratones inmunizados y no inmunizados.
Ratones BALB/c fueron inyectados con 100 formas del torrente sanguíneo y los órganos fueron recolectados 60 días pi. Las secciones incrustadas en parafina fueron teñidas con hematoxilina y eosina y examinadas con un microscopio óptico en las siguientes amplificaciones: x200 y x400 (B, C, E, F, H, I), x400 (G) o x400 y x600 (A, D) . Ver el texto para los detalles de la preparación y descripción de la morfología.
Figura 10: cambios del peso del bazo en ratones inmunizados y desafiados con TSs. El peso del órgano se presenta como sigue: [(g) /peso corporal total (g) ] . Los resultados representan la media ± SD después de 60 días posteriores a la infección. Los valores que se presentan corresponden a uno (OVA) de tres ratones no inmunizados e infectados y uno de seis grupos control no inmunizados y no infectados (resultados similares) .
Figura 11: niveles de anticuerpos anti-TS a lo largo de la infección de G. Cruzi. Valores individuales y mediada (barras horizontales) de cada grupo. Los grupos WT, 0CH1 o Mut TS infectados tuvieron una tendencia al presentar mayores niveles de anticuerpos TS específicos que los ratones OVA infectados. (p< 0.0001). Los anticuerpos TS específicos mostraron diferencias significativas entre OVA más otros grupos control contra ratones WT, OCH1 y Mut TS inmunizados y no infectados, en todos los puntos de tiempo .
Figura 12: niveles circulantes de anticuerpos anti-SAPA durante la infección con T. Cruzi. Valores individuales y mediana (barras horizontales) de cada grupo. Después de 28 días pi, los grupos OVA, WT y OCH1 infectados tuvieron cantidades significativamente mayores de anticuerpos anti-SAPA específicos que los ratones MUT TS infectados (p< 0.0001). En los ratones control, los resultados representan uno (OVA) de tres grupos no inmunizados e infectados (resultados similares) . En el día -1 pi, los anticuerpos anti-SAPA específicos fueron no detectables en todos los grupos. En el día +14 pi los resultados fueron semejantes al día 28
EJEMPLOS
Materiales y métodos para los ejemplos
Mutagénesis aleatoria del gen de trans-sialidasa El gen de trans-sialidasa que fue clonado en nuestro laboratorio y que carece de la parte que codifica para las repeticiones inmunodominantes (Laroy y col., 2000) fue mutado utilizando una técnica de mutagénesis basada en PCR en el plásmido pPICZTSjE. En este método se crearon mutaciones aleatorias en el gen por la Taq DNA polimerasa propensa a error. La frecuencia de los errores se aumenta utilizando concentraciones desiguales de los dNTP (0.2 mM dATP y dGTP/1 mM dCTP y dTTP) y por adición de 0.1 mM de Mn2+ a la mezcla de reacción.
Transformación de pichia pastoris Los fragmentos de PCR mutados fueron ligados en el vector pPICZTSjE original y los plásmidos fueron transformados a la levadura pichia pastoris metilotrófica . Antes de la transformación los plásmidos fueron linealizados por una digestión de restricción Sacl para facilitar la inserción en el genoma de la levadura. La transformación del DNA plásmido a Pichia pastoris GS115 (his4) se hizo por electroporación de acuerdo con
las instrucciones del fabricante (Invitrogen) . La selección se hizo en placas YPDS que contenían el antibiótico zeocina (100 µg/mL) . Con un robot recolector de colonias Flexys (Genomic solutions) todos los transformantes fueron puestos en los pozos individuales de las placas de 96 pozos las cuales fueron prellenadas con medio YPD. Las células fueron crecidas durante 24 horas a 30°C y luego fueron estampadas sobre placas YPD sólidas para el stockage y análisis futuro.
Tamizaje de los transformantes para clones que expresan trans-sialidasa inactiva Los transformantes fueron crecidos en 150 µ? de medio BMGY en placas de 96 pozos. Después de 24 horas, la expresión de trans-sialidasa fue inducida cambiando el medio BMGY a medio mínimo (búfer de fosfatos 100 mM, pH 7 + 1.34% de YNB + 1% CSM + 1% metanol). Se permitió la expresión durante 28 horas y se adicionó 1% de metanol cada 12 horas. 5 µL de medio de inducción de cada transformante se utilizó para el ensayo enzimático. Para analizar la actividad enzimática de las trans-sialidasas expresadas se utilizo un ensayo de fluorescencia. La mezcla de reacción que se puso en cada pozo de una placa de 96 pozos consistió en lactosa-AMAC 20 µ?, sialil lactosa 0.4 mM, Hepes 20 mM, pH 7.2 y 10% de medio de
inducción (volumen de reacción total es 50 µ?.. Después de una hora de incubación a 37°C, la reacción se interrumpió adicionando 150 µ]!. de H20. La recolección de las moléculas sialiladas se hizo con resina intercambiadora de aniones (QAE-sephadex, SIGMA) en una placa de filtración de 96 pozos (Millipore) . Antes de adicionar las muestras, la resina es prehumedecida con 200 µ?? de H20 y el liquido se retira por centrifugación a 1000 rpm. Después de 4 lavados con 2000 µL de H20, las moléculas sialiladas se eluyen en una placa de fondo transparente, de 96 pozos con 150 S, de acetato de amonio 1 M. La fluorescencia se mide con el Lumilmager® (Boehringer) a 520 nm. Para separar los clones verdaderos que expresan trans-sialidasa inactiva de los clones que expresan solo una parte de la trans-sialidasa (debido al codón de terminación que se creo por la mutagénesis) , los datos del ensayo de fluorescencia fueron combinados con los datos de un ELISA que se hizo de acuerdo con los protocolos normales. Para el ELISA, 5 µL de medio de inducción de cada transformante se utilizo y se detecto la trans-sialidasa con anticuerpo anti-E-tag seguido por un anticuerpo secundario acoplado a peroxidasa. La quimioluminiscencia se midió con el Lumilimager® (Boehringer) .
Purificación de trans-sialidasa Para la purificación, la cepa Pichia pastoris, la cual expresa la trans-sialidasa, fue crecida en 600 mL de BMGY. A A60o de inducción 15 se comenzó en 600 mL de BMMY. La expresión se dejó durante 28 horas y se adicionó 1% de metanol cada 12 horas. El medio de expresión fue recolectado y filtrado (filtro de 0.45 um, Millipore) . Para evitar la degradación de la proteina, los inhibidores de proteasa fueron adicionados (1 tableta de Complete Proteasa inhibitor Cocktail, Roche) . El medio de cultivo fue aplicado a una columna anti-E-tag previamente empacada, de 5 mL (Pharmacia Biotech) equilibrada con búfer de unión (fosfato 0.2 M, 0.05% de NaN3, pH 7) a una velocidad de flujo de 2 ml/min utilizando un sistema FPLC (Pharmacia Biotech) . Después de esto, la columna fue lavada intensamente con búfer de unión. La trans-sialidasa fue eluida con glicina 1 M, pH 3. Las fracciones de 2,7 mL fueron recolectadas en los tubos que contenían 0.3 mL de búfer de neutralización (tris-HCl 1M pH 8.8). Las fracciones fueron analizadas para ver la presencia de trans-sialidasa por SDS-PAGE. La concentración de la proteína se determino con el método de Bradford (Bradford M.M., 1976). El rendimiento promedio de la trans-sialidasa fue aproximadamente 1 mg/litro del medio de expresión.
Análisis detallado de la actividad enzimática de la trans-sialidasa muíante La trans-sialidasa que fue seleccionada para uso en este proyecto fue analizada con mayor detalle: se cuantifico la actividad sialidasa y la actividad transferasa .
Se midió la actividad transferasa en Hepes 20 mM, pH 7.2, N-acetilneuraminil lactosa 20 µ? y estructuras de azúcar NA2FB etiquetadas con APTS 220 nM (biantenaria asíalo-, galactosilada, sustituida en el núcleo con fucosa y con GlcNAc bisecante) en un volumen de reacción total de 50 µL. Las estructuras de azúcar NA2FB fueron etiquetadas y purificadas de acuerdo con el protocolo como se describe anteriormente (Callewaert y col., 2001). 50 mg de la enzima purificada se adicionaron y la reacción se incubo a 25°C durante 30 minutos. La reacción se detuvo adicionando 150 µL de agua y colocando los tubos a -20°C. La mezcla de reacción fue luego secada por evaporación en vacío y reconstituida en 5 µL de agua. Para el análisis de las estructuras glucano utilizamos la tecnología DSA-FACE como se describió anteriormente (Callewaert y col., 2001). La actividad sialidasa de la enzima se midió en Tris-HCl 20 mM, pH 7.6, NaCl 30 mM y ácido 4-metilumbeliferil-N-acetilneuramínico (MUNANA) 0.2
mM en un volumen final de 50 µ?_ a una temperatura de 25°C. Para el ensayo se utilizó 1 ? de la trans-sialidasa purificada. Después de 15 minutos de incubación la reacción se interrumpió adicionando 150 µL de carbono 0.2 M y se midió la fluorescencia de la 4-metilumbeliferona libre con un aparato lector de placas de múltiples pozos CYTOFLUOR® serie 4000 (PerSeptive Biosystems) .
Ratones y parásitos Ratones BALB/c machos, adultos (de 13-14 semanas de nacidos) de las instalaciones para animales de la Escuela Veterinaria de La Plata-Universidad Nacional de La Plata, fueron los utilizados. Durante el experimento los ratones fueron mantenidos en las instalaciones para animales en la escuela de medicina de Rosario. Los animales tuvieron acceso a alimento y agua a voluntad y fueron mantenidos en condiciones de temperatura constante (22-24°C) , con un periodo de luz de 12 horas. Los tripomastigotos de la cepa Tulahuén de Trypanosoma cruzi (Te) fueron obtenidos de la sangre de ratones infectados. La muestras heparinizada fue diluida en solución fisiológica (PS) y los parásitos fueron contados utilizando una cámara de Neubauer .
Inmunizaciones Tres inmunizaciones —separadas por 14 días— han sido hechas con cada proteína. Para la primera inmunización se utilizo el Adyuvante completo de Freund (Adj ) , para las siguientes inmunizaciones se utilizo el Adyuvante Incompleto de Freund (Adj) (SIGMA) .
OCÜl, 30 µg por vía subcutánea. Vf 0.1 mL/ratón: 50% TS + vehículo (búfer = 75% glicina 1 M, pH 3 + 25% fosfato 0.2 M pH 7) , +50% Adj . WT, 30 µg por vía subcutánea; el resto ídem. Mut, 30 µg por vía subcutánea; el resto ídem. Alb, ovalbumina (SIGMA) se utilizo como proteína irrelevante para los grupos control (indicado como OVA) .
Diseño experimental Gl vehículo + Te (n=10) G2 Adj + vehículo + Te (n=10) G3 Adj + WT + Te (n=10) G4 Adj + OCH1 + Te (n=10) G5 Adj + Mut + Te (n=10) G6 Adj + Alb + vehículo (n=10) G7 Adj + OCH1 (dos dosis) + Te (n=10) G8 vehículo + PS (n=5) G9 Adj + vehículo + PS (n=5)
G10 Adj + WT + PS (n=5) Gil Adj + OCH1 + PS (n=5) G12 Adj + Mut + PS (n=5) G13 Adj + Alb + vehículo + PS (n=5) G14 Adj + (dos dosis) + PS (n=5)
Desafió con Trypanosoma cruzi 14 días después de la última inmunización los ratones fueron desafiados con 100 tripomastigotos por ratón por vía subcutánea. Los grupos 8-14 recibieron PS.
La infección aguda in vivo fue monitorizada evaluando la supervivencia, peso de los animales y parasistemia .
Estudio histopatológico Los órganos (corazón, timo, bazo, músculo estriado e hígado) fueron recolectados y pesados a los 60 días después de la infección, se lavaron en PBS y se fijaron en 10% de formalina amortiguada durante 24 h. Secciones contiguas de 5 |im fueron montadas y teñidas con hematoxilina-eosina y tricromo de Massons siguiendo los procedimientos normalizados.
El parasitismo de tejido e inflamación fueron evaluados de acuerdo con el grado de inflamación como se describió anteriormente por Roggero y col., (2002).
Ejemplo 1: mutagénesis aleatoria del gen de trans-sialidasa Utilizando una técnica de mutagénesis basada en PCR en el plásmido pPICZTSjE (figura 1) pudimos crear mutaciones en el gen de trans-sialidasa . El método se baso en el uso de la Taq DNA polimerasa propensa a error. Utilizando altas cantidades de esta enzima en la reacción y adicionando cantidades desiguales de los dNTP y Mn2+ a la mezcla de PCR, se aumentó la frecuencia de estos errores. La técnica fue optimizada para asegurar que en promedio hubiera solo una mutación por producto de la PCR. El gen de trans-sialidasa mutado fue ligado en el vector pPICZTSjE original donde se reemplazo el gen original .
Los plásmidos que llevaban el gen de trans-sialidasa mutado fueron transformados a la levadura metilotrófica Pichia pastoris y los transformantes fueron puestos en placas de 96 pozos mediante un robot recolector de colonias flexys (Genomic Solutions) . La recolección de los transformantes fue entonces cribada
para clones que expresan una trans-sialidasa inactiva con un ensayo de fluorescencia el cual utilizó una molécula aceptora etiquetada fluorescentemente ( lactosa-AMAC) y una alta cantidad de moléculas donadoras de ácido siálico (sialil lactosa) . Después de la reacción con la trans-sialidasa en el medio de inducción de los transformantes, las moléculas sialiladas fueron recolectadas con resina de intercambio aniónico en una placa de filtración de 96 pozos y eluidas en una placa de 96 pozos de fondo transparente. La cantidad de sialil lactosa-AMAC pudo entonces ser medida con un Lumilmager® (Boehringer) y fue una medida para la actividad de la trans-sialidasa expresada por diferentes transformantes. Para excluir los transformantes que solo expresaron una trans-sialidasa parcial debido a la inserción de un codón de terminación temprano por la mutagénesis, los datos del ensayo de fluorescencia fueron combinados con los datos de un ELISA en los cuales utilizamos un anticuerpo contra la E-tag-C terminal (Figura 2) . De esta forma varios transformantes pudieron ser identificados los cuales expresaron una trans-sialidasa con muy poca o ninguna actividad enzimática.
Ejemplo 2: purificación de la trans-sialidasa recombinante Debido a la presencia de una E-tag en extremo C-terminal de la trans-sialidasa, la enzima pudo ser purificada a casi homogeneidad con un solo paso utilizando cromatografía de afinidad. Tres formas diferentes de la trans-sialidasa fueron purificadas para este proyecto: la trans-sialidasa activa que fue clonada en nuestro laboratorio y fue expresada en la cepa Pichia pastoris GS115 (his4) (Laroy y col., 2000) {WT) , la misma enzima pero expresada en la cepa Pichia pastoris GS115 (his4) Glycoswitch M8, una cepa de levadura en la cual la hiperglucosilación ha sido cerrada a través del knock-out de la actividad 0CH1 (Vervecken y col., 2004) (OCH1) (Figura 3) y una trans-sialidasa mutante la cual fue seleccionada a partir de la recolección de los mutantes que creamos a través de mutagénesis aleatoria y que fue expresada en la cepa Pichia pastoris GS115 (his4) {Mut) . Todas las trans-sialidasas que fueron utilizadas en este proyecto carecían de la cola de repeticiones SAPA inmunodominante que este presente en casi todas las trans-sialidasas derivadas del propio parásito. La actividad enzimática del mutante que fue seleccionado para utilizarse en este proyecto ha sido analizada con mayor detalle. La actividad sialidasa y la actividad
transferasa fueron medidas con ensayos de alta sensibilidad. Los datos demostraron que el mutante utilizado en este proyecto solo tuvo aproximadamente 3-6% de actividad sialidasa (Figura 4) y 4.5% de actividad transferasa (Figura 5) . Este mutante fue seleccionado porque demostró ninguna actividad en el ensayo de fluorescencia y demostró una muy buena expresión en el ensayo ELISA.
Para caracterizar más las consecuencias sistémicas de las inmunizaciones TSs y los posibles cambios en las propiedades cinéticas de la proteina OCH1, se llevó a cabo un experimento in vivo. Las proteínas TSs fueron administradas en forma subcutánea en ratones y su concentración se monitorizó en muestras de sangre tomadas en diferentes tiempos después de la inyección. Al mismo tiempo se corrió un análisis histopatológico . Durante todo el transcurso del experimento no se observaron alteraciones de tejido. Es decir, atrofia del timo) . Ningún valor detectable fue registrado en las mediciones llevadas a cabo en los días 1, 3, 4 después de la inyección. Después de 15, 20 y 30 días después del inoculo, las tres TS recombinantes mostraron niveles circulantes semejantes. Los datos cinéticos además fueron confirmados por análisis
Western blots de las muestras de suero empleando un anticuerpo anti-E-tag monoclonal.
En forma colectiva, se puede concluir que las proteínas recombinantes que se utilizan en la presente no indujeron alteraciones histopatológicas por sí mismas, en ninguno de los órganos estudiados. Sin embargo, debe señalarse que el tejido relevante para wt TS es el sistema nervioso donde tal vez se pueda encontrar actividad neurodiferenciadoras . Además, la proteína recombinante OCH1 TS, la cual carece del motivo de hiperglucosilación, no cambio su concentración y estabilización en sangre con respecto a WT y MUT.
Ejemplo 3: experimentos de vacunación 14 grupos de ratones fueron utilizados para estos experimentos y cada grupo recibió un tratamiento diferente. Los grupos 1-7 fueron desafiados con parásitos Trypanosoma cruzi 14 días después de la última inmunización, mientras que los grupos 8-14 funcionaron como un testigo o control y recibieron solución fisiológica (PS) . Los grupos 1-7 consistieron en 10 ratones cada uno, mientras que los grupos 8-14 consistieron en 5 ratones cada uno. La infección aguda en los animales fue monitorizada evaluando la supervivencia,
el peso de los animales y la parasitemia. La supervivencia fue verificada por un control de mortalidad diario y el peso de los animales fue registrado cada semana. Las parasitemias fueron estudiadas por observación microscópica directa en condiciones normales. A los 14 y 21 días después de la infección, 5 µ? de sangre obtenida de la cola de ratones infectados fue analizada; los resultados fueron expresados como número de parásitos/50 campos microscópicos (400 x) . Los resultados muestran que hubo 80-100% de supervivencia en los animales que fueron vacunados con trans-sialidasa . Por el contrario, los animales que no fueron vacunados con trans-sialidasa solo mostraron una supervivencia de 20%. La trans-sialidasa mutante fue incluso más eficiente que la trans-sialidasa activa en estos experimentos (Figura 6) . Cuando la parasitemia fue verificada en los diferentes grupos, se demostró que en animales no vacunados el número de parásitos en la sangre fue alto, mientras que en animales que fueron vacunados con la trans-sialidasa, el número de parásitos en la sangre fue muy bajo (Figura 7) . Cuando se observa el número de parásitos en la sangre se demostró que la trans-sialidasa mutante tuvo un mejor efecto que la trans-sialidasa activa. Asi mismo, la trans-sialidasa activa que fue expresada en una cepa de levadura en la cual se había
detenido la hiperglucosilación mostró un mejor efecto que la trans-sialidasa activa que fue expresada en una cepa de levaduras que todavía podía sintetizar proteínas hiperglucosiladas . Esto se puede explicar por el hecho de que la trans-sialidasa que fue expresada en la cepa de levadura con una hiperglucosilación defectuosa probablemente se aclarara con menor rapidez del cuerpo del ratón. Lo cual implica que tendrá un efecto más duradero en el torrente sanguíneo del ratón. Una explicación alternativa para esto podría ser el hecho de que la parte de la proteína de las glucoproteínas es mucho mejor accesible para anticuerpos en la cepa en la que la hiperglucosilación ha sido cerrada, debido a los glucanos más pequeños en estas glucoproteínas. Cuando se verifico el peso de los animales, se demostró que los animales que fueron vacunados con trans-sialidasa tuvieron un peso normal, mientras que se observo una disminución significativa en el peso de los animales infectados no vacunados (Figura 8) .
Ejemplo 4 : inmunonización Mut (pero no OCH1) induce protección contra daño de tejido en Infección con T. Cruzl experimental Los resultados presentes, así como algunos estudios publicados demuestran que la inmunización con diferentes
proteínas de T. Cruzi (o su gen por inmunización genética) pueden mejorar la supervivencia de ratones infectados con T. Cruzi. No obstante, en ninguno de estos estudios anteriores las inmunizaciones previenen alta proporción de daño de tejido en los animales infectados. Para este análisis, secciones de corazón, timo, bazo, músculo estriado e hígado de ratones inmunizados y desafiados con T. Cruzi fueron evaluados a 60 días después de la infección (etapa tardía de la infección) para revisar carga de parásitos en tejido e inflamación. La persistencia de parásitos y por tanto severidad de la enfermedad en este modo de ratón de infección con T. Cruzi es más alta en el corazón y músculo esquelético, y así estos tejidos fueron el foco primario de atención. Independientemente de las condiciones de la inmunización, todos los grupos de ratones no presentaron nido de amastigotos en los músculos esqueléticos y corazón (Figura 9 B, C, E, F, H, I y Tabla 1) . En comparación, los animales no inmunizados presentaron niveles moderados a altos de parasitismo en tejido.
Debe observarse que, en ratones inmunizados con Mut, el grado de inflamación y daño de tejido acompañante en el corazón y músculo esquelético fue notablemente reducido o prácticamente ausente después de la infección
(Figura 9 C, F, I) . Por el contrario, ratones inmunizados con WT u OCHl mostraron mejora parcial de sus lesiones de músculo y miocardio (Figura 9 B, E, H) . Aunque la mayoría de los animales control (60-90%) murieron, los pocos supervivientes mostraron extensa inflamación de músculo esquelético y necrosis de tejido, los sellos distintivos de la enfermedad de Chagas. Por último, como se puede observar en la Tabla II, ninguna lesión inflamatoria fue registrada en ratones no infectados, independientemente de la administración de las proteínas.
La esplenomegalia e infadenopatía relacionadas con la activación de células policlonales B y T son características comunes de la infección de T. Cruzi (Olivieri y col., 2002). Así mismo, el bazo es un órgano comprometido común en diferentes modelos animales de enfermedad de Chagas (Lima y col., 2001) . Por esta razón, el peso del bazo de ratones inmunizados y control en el día 60 después del desafío con T. Cruzi fue analizado (Figura 10) . Ratones BALB/c no inmunizados e infectados presentaron esplenomegalia importante. Los grupos tratados con WT y OCHl desarrollaron esplenomegalia moderada simultáneamente con la presencia de miocarditis o miositis. En estos animales, el estudio histológico reveló hiperplasia de los folículos linfáticos, con
necrosis o focal en los centros germinales y pulpa roja en ausencia de los parásitos. Por el contrario, ninguna alteración histológica o en el peso del bazo se encontró en ratones inmunizados con Mut, produciendo datos muy semejantes a los controles no infectados.
Los grupos infectados pero no tratados presentaron infiltrados focales de hígado de macrófagos que contenían amastigotos, bien preservados o en desintegración, con alguna necrosis de hepatocitos en las áreas focales.
Ejemplo 5: Inmunización con todas las proteínas recombinantes simula respuesta de anticuerpos anti-TS sistémicos pero los animales infectados, vacunados con Mit no inducen respuesta humoral anti-SAPA específica Se hizo un estudio cinético de la respuesta anti-TS IgG específicas de ratones inmunizados y control en el día -1, +14, +28 y +60 antes y después del desafío con G. Cruzi. Elevados títulos en suero de los anti-TSs IgGs fueron encontrados en todos los grupos inmunizados y/o infectados en todas las evaluaciones de los puntos de tiempo (Figura 11). Solo en el día +60 posterior a la infección estuvieron presentes títulos bajos a moderados del anti-TS IgG en los animales control infectados (grupos OVA+Tc, Adj+Tc y vehículo + Te) . Como se
esperaba, no hubo respuestas específicas a todos los TSs en sueros de ratones control no inmunizados/no infectados. Por tanto, las inmunizaciones con TSs pueden estimular una fuerte respuesta de anticuerpo IgG específico, independientemente de la proteína recombinante que se administre.
Debido a que todas las TSs recombinantes utilizadas en este estudio carecían de la cola de repeticiones SAPA inmunodominante, las respuestas inmunes dirigidas contra este dominio repetitivo resultaron del desafío del parásito, independientemente de la proteína TS inoculada. Los ratones fueron vacunados como se describe en Materiales y Métodos y luego se ensayaron 14, 28 y 60 días después de la infección con T. Cruzi para la presencia de la respuesta del anticuerpo anti-SAPA IgG específico (Figura 11) . Niveles moderados (días 14 y 28) y altos (día 60) de anticuerpos específicos de anti-SAPA fueron detectados en los sueros de ratones inmunizados con proteínas WT o OCH1 y en ratones no inmunizados pero infectados (grupo OVA + Te) . Sorprendentemente, los recipiendarios de la proteína Mut no revelaron anticuerpos anti-SAPA (p< 0.001) . Lo cual es una indicación de un control eficiente de la infección. Por ultimo, los anticuerpos específicos anti-SAPA no fueron detectables en
sueros recolectados antes de la infección con T. Cruzi. La presencia de los anticuerpos anti-SAPA circulantes fue correlacionada con un curso empeorado de infección. En vista de que los anticuerpos anti-SAPA no son protectores, la ausencia de anticuerpos anti-SAPA es una ventaja clara en vista de que está evitando la distracción del sistema inmunitario, y creando una respuesta inmunitaria eficaz hacia el sitio catalítico importante de la enzima. En realidad, los ratones inmunizados con la proteína Mut TS no solo sobrevivieron a la infección con T. Cruzi sino también controlaron la carga parasitaria en sangre y tejido presentando al mismo tiempo una reducción drástica en la inflamación y necrosis del músculo esquelético y cardiaco, durante la fase tardía de la infección. Estos resultados indican que el control inmunológico eficaz de la carga del parásito durante las fases aguda y crónica de la infección, como se obtiene con la vacuna Mut TS, da como resultado carga de parásito reducida en tejido y disminuciones asociadas en la intensidad de la enfermedad. A partir de estos resultados es evidente que la gravedad de la lesión de tejido en infección con T. Cruzi se vincula estrechamente al éxito relativo para limitar los niveles de parásitos y que tal limitación exitosa, como se comprobó por el nivel de anticuerpos anti-SAPA, solo se obtiene con la vacuna Mut TS .
Tabla 1
Miositis No infectados Infectados WT OCH1 Mut OVA T OCH1 Mut OVA
Ratones con 0/5 0/5 0/5 0/5 6/9 5/9 1/10 4/4 FM/total De tamaño 1 2 1 pequeño De tamaño 2 2 1 mediano De tamaño 3 1 3 grande Nidos de — — — ++++ amastigotos Miocarditis No infectados Infectados T OCH1 Mut OVA WT OCH1 Mut OVA
Ratones con 0/5 0/5 0/5 0/5 5/9 3/9 0/10 4/4 FM/total De tamaño 2 2 1 pequeño De tamaño 3 1 3 medio De tamaño grande Nidos de — — — ++++ amastigotos
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Claims (13)
1. El uso una proteína mutante trans-sialidasa de tripanosoma, imáticamente inactiva como medicina.
2. El uso de una proteína mutante trans-sialidasa de tripanosoma, enzimáticamente inactiva para la preparación de una vacuna .
3. El uso de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, con el cual la trans-sialidasa mutante es una trans-sialidasa mutante recombinante .
4. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, con el cual la trans-sialidasa mutante por medio del cual la trans-sialidasa mutante carece de la cola de repeticiones SAPA inmunodominante .
5. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, mediante el cual la trans-sialidasa comprende la ID SEC NO:l.
6. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, mediante el cual la trans-sialidasa mutante tiene un patrón de glucosilación modificado en comparación con la trans-sialidasa de tipo nativo .
7. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-6, mediante el cual la vacuna se utiliza en en el tratamiento profiláctico y/o terapéutica de enfermedad de Chagas.
8. El uso de una proteina mutante trans-sialidasa de tripanosoma, enzimáticamente inactiva para proteger mamíferos contra miocarditis y/o miositis y/o esplenomegalia causada por infección con Trypanosoma cruzi.
9. Una composición farmacéutica que contiene una proteína mutante trans-sialidasa de tripanosoma, enzimáticamente inactiva.
10. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 9, mediante la cual la trans-sialidasa es una trans-sialidasa recombinante .
11. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 9 ó 10, mediante la cual la trans-sialidasa es una trans-sialidasa que carece de la cola de repeticiones SAPA inmunodominante .
12. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 11, mediante la cual la trans-sialidasa comprende la ID SEC NO: 1.
13. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9-12, mediante la cual la trans-sialidasa tiene un patrón de glucosilación modificado en comparación con la trans-sialidasa tipo nativo.
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