MX2012004992A - 2-amino-9-[4-(4-metoxi-fenoxi)-piperidin-1-il]-4-fenil-indeno [1,2-d] piridimin-5-ona y su uso como un antagonista del receptor de adenosina a2a altamente selectivo. - Google Patents

Abstract

Esta invención se relaciona con una nueva arilindenopirimidina, A, y sus usos terapéuticos y profilácticos; los trastornos que se tratan y/o previenen incluyen la enfermedad de Parkinson.(Ver Formula).

Description

2-AMINO-9-r4-(4-METOXI-FENOXn-PIPERIDIN-1 -IU-4-FENIL-INDENOn ,2- D1PIRIMIDIN-5-0NA Y SU USO COMO UN ANTAGONISTA DEL RECEPTOR DE ADENOSINA A2A ALTAMENTE SELECTIVO REFERENCIA CRUZADA CON SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reclama el beneficio de la presentación de la Solicitud Provisional de E.U.A. No.61/255,925 presentada el 29 de octubre, 2009. Las descripciones completas de las solicitudes de patente relacionadas antes mencionadas se incorporan a la presente como referencia para cualquier propósito.

CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona con una 2-amino-9-[4-(4-metox¡-fenoxi)-piperidin-1 -il]-4-fenil-indeno[1 ,2-d]pirimidin-5-ona y sus usos terapéuticos y profilácticos. Los trastornos que se tratan y/o previenen incluyen los trastornos neurodegenerativos y motores que se mejoran por la antagonización de los receptores de adenosina A2A- ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La adenosina es un nucleótido de purina producido por todas las células metabólicamente activas dentro del organismo. La adenosina ejerce sus efectos a través de cuatro subtipos de receptores de superficie celular (A1 , A2A, A2b y A3), que pertenecen a la superfamilia de receptores acoplados a la proteína G. Los subtipos A1 y A3 se acoplan a la proteína G inhibidora, mientras que A2A y A2b se acoplan a la proteína G estimuladora. Los receptores A2A se encuentran principalmente en el cerebro, tanto en las neuronas como en las células gliales (nivel más alto en el cuerpo estriado y núcleo accumbens, nivel moderado a alto en las regiones del tubérculo olfatorio, hipotálamo, hipocampo, etc.).

En los tejidos periféricos, los receptores A2A se encuentran en las plaquetas, neutrófilos, músculo liso vascular y endotelio. El cuerpo estriado es la región principal del cerebro para regular la actividad motora, especialmente a través de su inervación por parte de neuronas dopaminérgicas que se originan en la sustancia negra. El cuerpo estriado es el objetivo principal de degeneración de neuronas dopaminérgicas en pacientes con la enfermedad de Parkinson (PD, por sus siglas en inglés). Dentro del cuerpo estriado, los receptores A2A se localizan junto con los receptores de dopamina D2, lo que sugiere un sitio importante para la integración de la señalización de la adenosina y dopamina en el cerebro.

Los bloqueadores de los receptores de adenosina AZA, pueden proporcionar una nueva clase de agentes antiparkinsonianos (Impagnatiello, F.; Bastía, E.; Ongini, E.¡ Monopoli, A. Emerging Therapeutic Targets, 2000, 4, 635).

Los antagonistas del receptor A2A constituyen terapias potencialmente útiles para el tratamiento de adicciones. Los principales fármacos de abuso (opiáceos, cocaína, etanol, y similares) modulan directa o indirectamente los mecanismos de señalización de la dopamina en las neuronas, especialmente las que se encuentran en el núcleo accumbens, que contienen altos niveles de receptores de adenosina A2A. Se demostró que la dependencia aumenta con la vía de señalización de la adenosina, y que la administración de un antagonista del receptor A2A reduce el deseo de consumir sustancias adictivas ("The Critical Role of Adenosine A2A Receptors and Gi ß? Subunits in Alcoholism and Addiction: From Cell Biology to Behavior", de Ivan Diamond y Lina Yao, (The Cell Biology of Addiction, 2006, pp 291-316) y "Adaptations in Adenosine Signalíng in Drug Dependence: Therapeutic Implications", de Stefen P. Hack y Macdonald J. Christie, Critical Review in Neurobiology, Vol. 15, 235-274 (2003)). Véase también Alcoholism: Clinical and Experimental Research (2007), 31 (8), 1302-1307.

Se podría usar un antagonista del receptor A2A para tratar el trastorno de hiperactividad y déficit de atención (ADHD, por sus siglas en inglés), puesto que la cafeína (un antagonista no selectivo de la adenosina) puede ser útil para tratar el ADHD, y existen muchas interacciones entre la dopamina y la adenosina a nivel neuronal. "Clinical Genetics" (2000), 58(1 ), 31-40 y las referencias incluidas allí.

Puede usarse un antagonista de A2A selectivo para tratar la migraña aguda y profilácticamente. Los antagonistas selectivos de adenosina mostraron actividad en los modelos animales agudos y profilácticos para la migraña ("Effects of K-056, a novel selective adenosine A2A antagonist in animal models of migraine," by Kurokawa M. y otros, Abstract from Neuroscience 2009).

Los antagonistas del receptor A2A constituyen terapias potencialmente útiles para el tratamiento de la depresión. Los antagonistas A2A se conocen por inducir actividad en diversos modelos de depresión, incluidas las pruebas de natación forzada y de suspensión por la cola. La respuesta positiva es mediada por la transmisión dopaminérgica y se causa por una prolongación de la conducta orientada al escape más que por un efecto estimulante motor. Neurology (2003), 61 (supl. 6) S82-S87.

Los antagonistas del receptor A2A constituyen terapias potencialmente útiles para el tratamiento de la ansiedad. Se ha demostrado que los antagonistas A2A previenen respuestas emocionales/ansiosas in vivo. Neurobiology of Disease (2007), 28(2) 197-205.

Los antagonistas A2A se describieron en la patente de Estados Unidos núm. US 7,468,373 B2, y la solicitud de patente de Estados Unidos núm. US 2009/0054429 A1 , y las referencias en ellas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN El Compuesto A es un antagonista del receptor de adenosi potente de molécula pequeña.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Para muchos trastornos para los que el antagonismo del receptor A2A es terapéuticamente útil, la actividad del receptor A1 es indeseada y puede contribuir a los efectos secundarios o incluso oponerse al efecto beneficioso de la actividad primaria de A2A. Esta invención proporciona un compuesto que se encontró sorprendente e inesperadamente tiene selectividad por el receptor A2A- El compuesto de la presente invención tiene una actividad A2A /A1 en exceso de 3000/1 , cuando se esperaría que tuviera una relación de actividad A2A /A1 de 1/1. Así, se espera que el compuesto de la presente invención tenga una eficacia terapéutica mucho mayor y/o menos efectos secundarios.

La invención proporciona un compuesto A y solvatos, hidratos, tautómeros y sales farmacéuticamente aceptables de estos.

Esta invención proporciona, además, un método para tratar a un sujeto que tiene una afección que se mejora por la antagonización de los receptores de adenosina A2A; el método comprende administrar al sujeto una dosis terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica de la invención.

Esta invención proporciona, además, un método para prevenir un trastorno que se mejora por la antagonización de los receptores de adenosina A2A en un sujeto; el método comprende administrar al sujeto una dosis profilácticamente eficaz del compuesto de la reivindicación 1 , ya sea antes o después de un evento que se piensa causará un trastorno que se mejora por la antagonización de los receptores de adenosina A2A en el sujeto.

Los compuestos de la presente pueden estar aislados y usarse como bases libres. También pueden estar aislados y usarse como sales farmacéuticamente aceptables.

Algunos ejemplos de estas sales incluyen sales de los ácidos hidrobrómico, hidroiódico, hidroclorhidrico, perclorhidrico, sulfúrico, maleico, fumárico, mélico, tartárico, cítrico, adípico, benzoico, mandélico, metanosulfónico, hidroetanosulfónico, bencenosulfónico, oxálico, palmoico, 2 naftalensulfónico, p-toluensulfónico, ciclohexanosulfámico y sacárico.

Esta invención proporciona, además, una composición farmacéutica que comprende el compuesto de la presente y un portador farmacéuticamente aceptable.

Los portadores farmacéuticamente aceptables son del conocimiento de aquellos con experiencia en la materia e incluyen, pero no se limitan a, de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.1 M y, preferentemente, 0.05 M de fosfato o 0.8 % de suero salino. Estos portadores farmacéuticamente aceptables pueden ser soluciones acuosas o no acuosas, suspensiones y emulsiones. Algunos ejemplos de solventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen agua, etanol, soluciones alcohólicas/acuosas, glicerol, emulsiones o suspensiones, lo que incluye medios salinos y tampones. Los portadores por vía oral pueden ser elixires, jarabes, cápsulas, tabletas, y similares. El portador sólido típico es una sustancia inerte, tal como lactosa, almidón, glucosa, metilcelulosa, estearato de magnesio, fosfato dicalcio, manitol, y similares. Los portadores por vía parenteral incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa en solución de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, lactato de Ringer y aceites fijos. Los portadores por via intravenosa incluyen reabastecedores de nutrientes y fluidos, reabastecedores de electrolitos, tales como los basados en la dextrosa en solución de Ringer, y similares.

También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes, y similares. Todos los portadores se pueden mezclar según sea necesario con desintegrantes, diluyentes, agentes de granulación, lubricantes, aglutinantes, y similares por medio del uso de técnicas convencionales conocidas en la materia.

Esta invención proporciona adicionalmente un método para tratar a un sujeto que tiene un trastorno que se mejora por la antagonización de los receptores de adenosina A2A¡ el método comprende administrar al sujeto una dosis terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica de la invención.

En una modalidad el trastorno es un trastorno neurodegenerativo o motor. Algunos ejemplos de trastornos que se pueden tratar con la composición farmacéutica de la presente invención incluyen, sin limitarse a, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, atrofia sistémica múltiple, degeneración corticobasal, enfermedad de Alzheimer y demencia senil.

En una modalidad preferida el trastorno es la enfermedad de Parkinson.

Como se usa en la presente descripción, el término "sujeto" incluye, sin limitarse a, cualquier animal o animal modificado artificialmente que sufra un trastorno que se mejora por la antagonización de los receptores de adenosina A2A- En una modalidad preferida el sujeto es un ser humano.

La administración de la composición farmacéutica de la presente descripción puede efectuarse o llevarse a cabo por medio del uso de cualquiera de los diversos métodos conocidos por aquellos con conocimiento en la materia. Por ejemplo, los compuestos de la invención se pueden administrar por vía intravenosa, intramuscular, oral y subcutánea. En la modalidad preferida la composición farmacéutica de la presente se administra por vía oral. Además, la administración puede comprender suministrar al sujeto una pluralidad de dosis durante un período adecuado de tiempo. Estos regímenes de administración se pueden determinar de acuerdo con los métodos de rutina.

Como se usa en la presente descripción una "dosis terapéuticamente eficaz" de una composición farmacéutica es una cantidad suficiente para detener, revertir o reducir el avance de un trastorno. Una "dosis profilácticamente eficaz" de una composición farmacéutica es una cantidad suficiente para prevenir un trastorno, es decir, eliminar, mejorar o demorar el inicio del trastorno. En la materia se conocen los métodos para determinar las dosis terapéutica y profilácticamente eficaces para la composición farmacéutica de la invención. Por ejemplo, la dosis eficaz para administrar la composición farmacéutica a un ser humano se puede determinar matemáticamente a partir de los resultados de estudios practicados en animales.

En una modalidad, la dosis terapéutica o profilácticamente eficaz es una dosis suficiente para suministrar de aproximadamente 0.001 mg por kilo (mg/kg) de peso corporal a aproximadamente 200 mg/kg de peso corporal de la composición farmacéutica de la invención. En otra modalidad la dosis terapéutica o profilácticamente eficaz es una dosis suficiente para suministrar de aproximadamente 0.05 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal. Más específicamente, en una modalidad, las dosis por vía oral varían de aproximadamente 0.05 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg por día. En otra modalidad las dosis por vía oral varían de aproximadamente 0.05 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg por día y, en otra modalidad, de aproximadamente 0.05 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg por día. En aun otra modalidad, las dosis en infusión se encuentran en el intervalo de aproximadamente 1.0 pg/kg/min a aproximadamente 10 mg/kg/min de inhibidor, en mezcla con un portador farmacéutico durante un período en el intervalo de aproximadamente varios minutos a aproximadamente varios días. En otra modalidad para administrarse tópicamente, el compuesto de la invención se puede combinar con un portador farmacéutico en una relación fármaco-portador de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 0.1.

La invención proporciona, además, un método para tratar adicciones en mamíferos; el método comprende administrar una dosis terapéuticamente eficaz del compuesto de la Fórmula A.

La invención proporciona, además, un método para tratar el ADHD en mamíferos; el método comprende administrar una dosis terapéuticamente eficaz del compuesto de la Fórmula A.

La invención proporciona, además, un método para tratar la depresión en mamíferos; el método comprende administrar una dosis terapéuticamente eficaz del compuesto de la Fórmula A.

La invención proporciona, además, un método para tratar la ansiedad en mamíferos; el método comprende administrar una dosis terapéuticamente eficaz del compuesto de la Fórmula A.

La invención proporciona, además, un método para tratar la migraña en mamíferos; el método comprende administrar una dosis terapéuticamente eficaz de un compuesto de la Fórmula A.

Ejemplos: El compuesto A puede prepararse por métodos conocidos para los experimentados en la materia. El siguiente esquema de reacción se representa solamente como un ejemplo de la invención y de ningún modo significa limitar la invención.

Esquema 1 Guanidina NaOH EtOH, Reflujo El Esquema 1 ¡lustra la ruta sintética que conduce al compuesto A. Comenzando con 7-hidroxi indanona I y siguiendo el trayecto indicado por las flechas, la alquilación en condiciones básicas con 1-bromometil-4-metoxi-benceno (PMBBr) proporciona indanona II que se condensa en condiciones básicas con benzaldehido para proporcionar el bencilideno III. El bencilideno III reacciona después con guanidina (base libre) y da la amino pirimidina IV intermedia y se oxida directamente a la cetona V correspondiente al burbujear aire a través de la solución de N-metil pirrolidinona (NMP) básica. La desprotección puede llevarse a cabo al tratar V con ácido trifluoacético (TFA) en CH2CI2 para dar el fenol VI correspondiente. El fenol VI puede convertirse al triflato VII correspondiente por tratamiento con N-feniltriflimida en condiciones básicas en dimetilformamida (DMF). Finalmente, el triflato VII reacciona con las aminas de la fórmula HNR1R2 en NMP para proporcionar compuestos de la fórmula A.

Ejemplo A: 9-[4-(4-acetil-fenil)-piperazin-1 -il1-2-amino-4-fenil-indeno[1.2-dlpirimidin-5-ona Ejemplo A: Etapa a 7-4-metoxi-benciloxi)-indan-1-ona Se añadió 1-bromometil-4-metoxi-benceno (12.3 mi, 84.6 mmol) puro a una suspensión acuosa de acetona (300 mi) de 7-hidroxi-indan-1-ona (11 .9 g, 80.5 mmol) y K2C03 (22.3 g, 161 .0 mmol) y la mezcla resultante se sometió a reflujo. Después de 6 h la mezcla se enfrió, se filtró, y se lavó con acetona. El filtrado se concentró al vacío para proporcionar el compuesto del título que se usó sin purificación adicional.

Ejemplo A: Etapa b 2-bencilideno-7-(4-metoxi-benciloxi)-indan-1-ona Se añadió una solución acuosa (10 mi) de NaOH (3.1 g, 77.2 mmol) en forma de gotas a una solución de etanol (EtOH) (400 mi) de 7-4-metoxi-benciloxi)-indan-1-ona (5.0 g, 30.8 mmol) y benzaldehido (8.2 mi, 81.1 mmol). Se formó inmediatamente un precipitado. La suspensión acuosa obtenida se agitó vigorosamente por 1.5 horas. Se enfrió la suspensión acuosa en un baño de hielo, se filtró y lavó con EtOH frío. El sólido recogido se secó al vacío para dar el compuesto del título que se usó sin purificación adicional.

Ejemplo A: Etapa c 9-(4-metox¡-benciloxi)-4-fenil-5H-indeno[1 ,2-dlpirimidin-2-ilamina Se añadió NaOH ( 5.4 g, 386.0 mmol) en polvo a una solución de EtOH (300 mi) de clorhidrato de guanidina (36.9 g, 386.0 mmol). Después de 30 min, el cloruro de sodio se filtró y el filtrado se añadió a una suspensión de EtOH (200 mi) de 2-bencilideno-7-(4-metoxi-benciloxi)-indan-1-ona (27.4 g, 77.2 mmol). La mezcla resultante se calentó a reflujo durante la noche. La solución homogénea se enfrió en hielo por 30 minutos y se filtró para dar el compuesto del titulo el cual se usó sin purificación adicional.

Ejemplo A: Etapa d 2-amino-9-(4-metoxi-benciloxi)-4-fenil-indeno[1 ,2-d1pirimidin-5-ona Se añadió NaOH (860 mg, 21.5 mmol) a una solución de NMP (20 mi) de 9-(4-metoxi-benciloxi)-4-fenil-5H-indeno[1 ,2-d]pirimidin-2-ilamina (8.5 g, 21.5 mmol). La mezcla obtenida se calentó a 80 °C y se burbujeó aire a través de la solución. Después de 16 horas, la mezcla se enfrió hasta la temperatura ambiente, se añadió agua y el precipitado resultante se filtró y se lavó con agua y EtOH frío. El sólido se secó al vacio para dar el compuesto del título.

Ejemplo A: Etapa e 2-amino-9-hidroxi-4-fenil-indenof1 ,2-dlpir¡midin-5-ona Se añadió ácido trifluoacético (TFA) puro (37 mi) a una solución de CH2CI2 (50 mi) de 2-amino-9-(4-metoxi-benciloxi)-4-fenil-indeno[1 ,2-d]pirimidin-5-ona (6.8 g, 16.6 mmol). Después de 2 h, la mezcla se concentró al vacío. El material resultante se suspendió en agua y se añadió NaHC03 saturado acuoso. El precipitado resultante se filtró y se secó al vacio para dar el compuesto del título.

Ejemplo A: Etapa f Ester del ácido 2-am¡no-5-oxo-4-fenil-5H-indeno[1 ,2-d1pirimidin-9-il trifluoro-metanosulfónico Se añadió f-BuOK sólido (965 mg, 8.6 mmol) a una solución de D F (30 mi) de 2-amino-9-hidroxi-4-fen¡l-indeno[1 ,2-d]pirimidin-5-ona (2.1 g, 7.2 mmol). Después de 20 min, se añadió PhN(Tf)2 sólido (2.7 g, 7.6 mmol). Después de 4 h se añadió agua y el precipitado resultante se filtró y se lavó con agua. El sólido se disolvió en THF y se empac en seco en gel de sílice. La cromatografía de columna dio el compuesto del título.

Ejemplo A: Etapa g 2-amino-9-[4-(4-metoxi-fenoxi)-piperidin-1-ill-4-fenil-indeno[1 ,2-dlpirimidi Se añadió 4-(4-metoxi-fenox¡)-piper¡d¡na puro (39 mg, 0.19 mmol) a una solución de NMP (0.15 mi) de éster del ácido 2-amino-5-oxo-4-fenil-5H-indeno[1 ,2-d]pirimidin-9-il trifluoro-metanosulfónico (30 mg, 0.07 mmol) y diisopropiletilamina (0.14 mi, 0.81 mmol) y la mezcla se calentó hasta 130 °C. Después de 7 h, la mezcla se enfrió y se purificó directamente por medio de cromatografía de columna para proporcionar el compuesto del titulo. 1H NMR (300 MHz, CLOROFORMO-d) d = 8.02 (dd, J = 2.3, 7.5 Hz, 2 H), 7.50 - 7.55 (m, 3 H), 7.46 (d, J = 7.9 Hz, 1 H), 7.38 (d, J = 7.9 Hz, 1 H), 7.21 (d, J = 7.9 Hz, 1 H), 6.90 - 6.99 (m, 2 H), 6.80 - 6.90 (m, 2 H), 5.67 (br. s., 2 H), 4.43 (dt, J = 3.5, 7.6 Hz, 1 H), 3.80 (s, 3 H), 3.61 (ddd, J = 3.4, 7.0, 11.1 Hz, 2 H), 3.17 (ddd, J = 3.2, 8.4, 1 1.8 Hz, 2 H), 2.21 - 2.35 (m, 2 H), 2.05 - 2.21 (m, 2 H); MS (ES) m/z: 479 (M+H+).

Ensayos y actividad biológica Ensayo de unión de liqandos para el receptor de adenosina A?A El ensayo de unión de ligandos del receptor de adenosina A2A se realizó por medio del uso de una membrana plasmática de células HEK293 que contenía el receptor de adenosina A2A (PerkinElmer, RB-HA2A) y el radioligando [3H]CGS21680 (PerkinElmer, NET1021). El ensayo se realizó en una placa de polipropileno de 96 pocilios en un volumen total de 200 µ? por la adición secuencial de 20 µ? de membrana diluida 1 :20, 130 µ? de amortiguador de ensayo (50 mM Tris HCI, pH 7.4, 10 mM MgCI2 1 mM, EDTA) que contenia [3H] CGS21680, 50 µ? del compuesto diluido (4X) o vehículo de control en el amortiguador de ensayo. Se determinó la unión no específica con 80 mM de ÑECA. La reacción se realizó a temperatura ambiente por 2 horas antes del filtrado a través de una placa de filtro GF/C de 96 pocilios remojada previamente en Tris HCI 50 mM, pH 7.4 que contenía 0.3 % de polietilenimina. Después, las placas se lavaron 5 veces con Tris HCI 50 mM frío, pH 7.4, se secaron y sellaron en el fondo. Se añadió 30 µ? de fluido de microcentelleo en cada pocilio y la parte superior se selló. Las placas se contaron en un contador Packard Topcount para [3H). Se analizaron los datos en los programas Microsoft Excel y GraphPad Prism. (Varani, K.; Gessi, S.; Dalpiaz, A.; Borea, P.A. British Journal of Pharmacology, 1996, 17, 1693).

Ensayo funcional del receptor de adenosina A?A (A?AGAL2) Para comenzar el ensayo funcional se descongelaron células CHO-K1 criopreservadas que sobreexpresaban el receptor de adenosina A2A humana y contenían un gen reportero de la beta-galactosidasa inducible por cAMP, se centrifugaron, se eliminó el medio que contenía DMSO y, después, se sembraron con medio de cultivo fresco en placas tratadas con cultivo de tejido de 384 pocilios transparentes (BD núm. 353961) a una concentración de 10K células/pocilio. Antes del ensayo, estas placas se cultivaron por dos días a 37 °C, C02 al 5 %, 90 % de humedad relativa. El día del ensayo funcional se eliminaron los medios de cultivo y se reemplazaron con 45 µ? del medio del ensayo (Ham/F-12 Modified (Mediatech, núm. 10-080CV) suplementado con BSA al 0.1 %). Los compuestos de prueba se diluyeron y se crearon curvas de 11 puntos a una concentración de 1000x en 100 % de DMSO. Inmediatamente después de la adición del medio de ensayo a las placas de células, se adicionaron a las placas de células 50 ni de las curvas de control del antagonista o agonista del compuesto de prueba adecuado por medio del uso de un Cartesian Hummingbird. Las curvas del compuesto se dejaron incubar a temperatura ambiente en las placas de célula por aproximadamente 15 minutos antes de la adición de un reto con agonista ÑECA 15 nM (Sigma E2387) (volumen 5 µ?). Además, en cada placa se incluyó una curva de control de ÑECA, un control DMSO/medio y una sola dosis de Forskolin (Sigma F3917). Después de las adiciones, las placas de células se dejaron incubar a 37 °C, CO2 al 5 %, 90 % de humedad relativa por 5.5 - 6 horas. Después de la incubación, el medio se eliminó, y las placas de células se lavaron 1 x 50 µ? con DPBS sin Ca & Mg (Mediatech 21-031-CV). En los pocilios secos, 20 µ? del amortiguador de lisis reportero 1x (Promega E3971 (diluido en dhl^O de solución madre - 5x)) se añadió a cada pocilio y las placas se congelaron a -20 °C durante toda la noche. Para el ensayo colorimétrico de la enzima ß-galactosidasa, las placas se descongelaron a temperatura ambiente y se añadieron 20 µ? de amortiguador de ensayo 2X (Promega) en cada pocilio. Se dejó que el color se desarrollara a 37 °C, C02 al 5 %, 90 % de humedad relativa por 1 - 1.5 h o hasta que apareciera una señal razonable. La reacción colorimétrica se detuvo con la adición de 60 µ?/pocillo de carbonato sódico 1 M. Las placas se contaron a 405 nm en un Lector de microplaca SpectraMax (Molecular Devices). Los datos se analizaron en Microsoft Excel y las curvas de IC/EC50 se ajustaron con una macro estándar.

Ensayo funcional del receptor de adenosina A1 (A1GAL2) Para comenzar el ensayó funcional se descongelaron células CHO-K1 criopreservadas que sobreexpresaban el receptor de adenosina A1 humana y contenían un gen reportero de la beta-galactosidasa inducible por cAMP, se centrifugaron, se eliminó el medio que contenia DMSO y después se sembraron con medio de cultivo fresco en placas tratadas con cultivo de tejido de 384 pocilios transparentes (BD núm. 353961 ) a una concentración de 10K células/pocilio. Antes del ensayo, estas placas se cultivaron por dos días a 37 °C, C02 al 5 %, 90 % de humedad relativa. El día del ensayo funcional se eliminaron los medios de cultivo y se reemplazaron con 45 pl del medio del ensayo (Ham/F-12 Modified (Mediatech, núm. 10-080CV) suplementado con BSA al 0.1 %). Los compuestos de prueba se diluyeron y se crearon curvas de 11 puntos a una concentración de 1000x en 100 % de DIvISO. Inmediatamente después de la adición del medio de ensayo a las placas de células, se adicionaron a las placas de células 50 ni de las curvas de control del antagonista o agonista del compuesto de prueba adecuado por medio del uso de un Cartesian Hummingbird. Las curvas del compuesto se dejaron incubar a temperatura ambiente en las placas de células por aproximadamente 15 minutos antes de la adición del reto con agonista r-PIA 4 nM (Sigma P4532)/1 uM forescolina (Sigma F3917) (volumen 5 pl). Además, en cada placa se incluyó una curva de control de r-PIA en 1 uM Forskolin, un control DMSO/medio y una sola dosis de Forskolin. Después de las adiciones, las placas de células se dejaron incubar a 37 °C, CO2 al 5 %, 90 % de humedad relativa por 5.5 - 6 horas. Después de la incubación, el medio se eliminó, y las placas de células se lavaron 1x 50 pl con DPBS sin Ca & Mg (Mediatech 21-031 -CV). En los pocilios secos, 20 µ? del amortiguador de lisis 1x Repórter (Promega E3971 (diluido en dh^O de solución madre 5x)) se añadió a cada pocilio y las placas se congelaron a -20 °C durante toda la noche. Para el ensayo colorimétrico de la enzima ß-galactosidasa, las placas se descongelaron a temperatura ambiente y se añadieron 20 µ? de amortiguador de ensayo 2X (Promega) en cada pocilio. Se dejó que el color se desarrollara a 37 °C, C02 al 5 %, 90 % de humedad relativa por 1 - 1.5 h o hasta que apareciera una señal razonable. La reacción colorimétrica se detuvo con la adición de 60 µ?/pocillo de carbonato sódico 1 M. Las placas se contaron a 405 nm en un Lector de microplaca SpectraMax (Molecular Devices). Los datos se analizaron en Microsoft Excel y las curvas de IC/EC50 se ajustaron con una macro estándar.

Datos del ensayo de A?A EL compuesto de la Fórmula A mostró sorprendente inesperadamente selectividad por A2A por encima del antagonismo receptor A1.

Ejemplo A2AGal2( M) A1Gal2(pM) A1 A2A A 0.823 7.3 3173.91 Aunque la especificación anterior enseña los principios de la presente invención con ejemplos provistos para fines de ilustración, se entenderá que la práctica de la invención abarca todas las variaciones, adaptaciones o modificaciones usuales que entran dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones y sus equivalentes.

Todas las publicaciones descritas en la descripción anterior se incorporan en su totalidad como referencia en la presente descripción.

Claims (16)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un compuesto A que es: y solvatos, hidratos, tautómeros y sales farmacéuticamente aceptables de éstos.

2.- Una composición farmacéutica que comprende el compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 , y un portador farmacéuticamente aceptable.

3.- El uso del compuesto de la reivindicación 1 , para preparar un medicamento para tratar a un sujeto que tiene un trastorno que se mejora por la antagonización de los receptores de adenosina A2A en células adecuadas en el sujeto.

4.- El uso del compuesto de la reivindicación 1 , para preparar un medicamento para prevenir un trastorno que se mejora por la antagonización de los receptores de adenosina A2A en células adecuadas en un sujeto; en donde el medicamento está adaptado para ser administrable antes o después de un evento que se piensa causará un trastorno que se mejora por la antagonización de los receptores de adenosina A2A en las células adecuadas en el sujeto.

5. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 3, en donde el medicamento comprende una dosis terapéutica o profilácticamente eficaz de la composición farmacéutica de la reivindicación 2.

6. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 4, en donde el medicamento comprende una dosis terapéutica o profilácticamente eficaz de la composición farmacéutica de la reivindicación 2.

7. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 3, en donde el trastorno es un trastorno neurodegenerativo o un trastorno motor.

8. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 3, en donde el trastorno se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, atrofia sistémica múltiple, degeneración corticobasal, enfermedad de Alzheimer, o demencia senil.

9.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 4, en donde el trastorno es un trastorno neurodegenerativo o un trastorno motor.

10. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 4, en donde el trastorno se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, atrofia sistémica múltiple, degeneración corticobasal, enfermedad de Alzheimer, o demencia senil.

1 1 . - El uso como el que se reclama en la reivindicación 3, en donde el trastorno es la enfermedad de Parkinson.

12. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 3, en donde el trastorno es la adicción.

13. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 3, en donde el trastorno es la hiperactividad y el déficit de atención (ADHD).

14.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 3, en donde el trastorno es la depresión.

15. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 3, en donde el trastorno es la ansiedad.

16. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 3, en donde el trastorno es la migraña.