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MX2012002014A - Inmunoconjugados dirigidos. - Google Patents

Inmunoconjugados dirigidos.

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Publication number
MX2012002014A
MX2012002014A MX2012002014A MX2012002014A MX2012002014A MX 2012002014 A MX2012002014 A MX 2012002014A MX 2012002014 A MX2012002014 A MX 2012002014A MX 2012002014 A MX2012002014 A MX 2012002014A MX 2012002014 A MX2012002014 A MX 2012002014A
Authority
MX
Mexico
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seq
immunoconjugate
sequence
group
immunoconjugate according
Prior art date
Application number
MX2012002014A
Other languages
English (en)
Inventor
Ralf Hosse
Ekkehard Moessner
Michela Silacci-Melkko
Pablo Umana
Original Assignee
Roche Glycart Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=43033282&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=MX2012002014(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Roche Glycart Ag filed Critical Roche Glycart Ag
Publication of MX2012002014A publication Critical patent/MX2012002014A/es

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Abstract

La presente invención se refiere a inmunoconjugados. En realizaciones particulares, la presente invención se refiere a inmunoconjugados que comprenden por lo menos un grupo efector de una cadena y dos o más grupos de unión a antígeno. Además, la presente invención se refiere a moléculas de ácidos nucleicos codificantes de dichos inmunoconjugados, vectores y células huésped que comprenden dichas moléculas de ácidos nucleicos. La invención se refiere además a métodos para producir los inmunoconjugados de la invención, y a métodos de utilización de dichos inmunoconjugados en el tratamiento de enfermedades.

Description

Inmunoconjugados dirigidos ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la invención La presente invención se refiere de manera general a inmunoconjugados específicos de antígeno para administrar selectivamente grupos efectores que incluyen sobre la actividad celular. Además, la presente invención se refiere a moléculas de ácidos nucleicos codificantes de dichos inmunoconjugados, y a vectores y células huésped que comprenden dichas moléculas de ácidos nucleicos. La invención se refiere además a métodos para producir los inmunoconjugados de la invención, y a métodos de utilizados de dichos inmunoconjugados en el tratamiento de enfermedades.
Antecedentes de la técnica La destrucción selectiva de una célula individual o de un tipo celular específico con frecuencia resulta deseable en una diversidad de contextos clínicos. Por ejemplo, es un objetivo primario de la terapia del cáncer destruir específicamente células tumorales, dejando intactas y sin daños las células y tejidos sanos. Una multitud de rutas de transducción de señales en la célula se encuentran ligadas a la supervivencia y/o muerte de la célula. Por consiguiente, la administración directa de un factor de la vía implicado en la supervivencia o muerte celulares se utiliza para el mantenimiento o destrucción de la célula.
Las citoquinas son moléculas de señalización celular que participan en la regulación del sistema inmunológico . Al utilizarse en la terapia del cáncer, las citoquinas pueden actuar como agentes inmunomoduladores que presentan efectos antitumorales y que pueden incrementar la inmunogenicidad de algunos tipos de tumores. Sin embargo, la rápida eliminación de la sangre y la falta de especificidad tumoral requieren la administración sistémica de . dosis elevadas de la citoquina con el fin de conseguir una concentración de la citoquina en el sitio tumoral que resulte suficiente para activar una respuesta inmunológica . o para presentar un efecto antitumoral. Estos niveles elevados de citoquina sistémica pueden conducir a toxicidad severa y a reacciones adversas. Una manera de administrar un factor de ruta de transducción de señales, tal como una citoquina, en un sitio especifico in vivo (por ejemplo un tumor o microambiente tumoral) es conjugar el factor a una inmunoglobulina especifica para el sitio. Las primeras estrategias destinadas a administrar factores de la ruta de transducción de señales, tales como citoquinas, en un sitio especifico in vivo incluían cadenas pesadas de inmunoglobulina conjugadas con diversas citoquinas, incluyendo linfotoxina, factor OÍ de necrosis tumoral (TNF- ) , interleuquina-2 (IL-2) y factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) . Las cadenas pesadas de inmunoglobulina se conjugaron químicamente a una citoquina o el conjugado de inmunoglobulina-citoquina se expresó en forma de una proteina de fusión (ver Nakamura K. y Kubo A. , Cáncer Supplement 80:2650-2655, 1997; Jun L. et al., Chin. ed. J. 113:151-153, 2000; y Becker J.C. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:7826-7831, 1996). Los investigadores han observado que, no sólo eran capaces de dirigir citoquinas a sitios específicos in vivo, sino que también podían aprovechar el hecho de que los anticuerpos monoclonales presentan vidas medias en suero más largas que la mayoría de las demás proteínas. Debido a la toxicidad sistémica asociada a las dosis altas de determinadas citoquinas no conjugadas, es decir IL-2, la capacidad de una proteína de fusión de inmunoglobulina-citoquina de maximizar las actividades inmunoestimuladoras en el sitio de un tumor, manteniendo al mínimo los efectos sistémicos secundarios, a una dosis menor, llevó a los investigadores a creer que los inmunoconjugados de inmunoglobulina-citoquina eran agentes terapéuticos óptimos. Sin embargo, una de las principales limitaciones a la utilidad clínica de las inmunoglobulinas como agentes de administración es su incorporación inadecuada y pobre distribución en los tumores, parcialmente debido al gran tamaño de la molécula de inmunoglobulina (ver Xiang J. et al.,. Immunol. Cell Biol. 72:275-285, 1994). Además, se ha sugerido que los inmunoconjugados de inmunoglobulina-citoquina pueden activar el complemento e interactuar con receptores Fe. Esta característica inherente a las inmunoglobulinas se ha percibido desfavorablemente debido a que los inmunoconjugados terapéuticos pueden dirigirse a células que expresan receptores Fe y no a las células preferentes portadoras de antígenos.
Un enfoque para superar dichos problemas es la utilización de fragmentos de inmunoglobulina manipulados. Numerosos estudios han detallado las características de los inmunocon ugados de fragmento de inmunoglobulina-citoquina (ver Savage P. et al., Br. J. Cáncer 67:304-310, 1993; Harvill E.T. y Morrison S.L., Immunotechnol . 1:95-105, 1995, y Yang J. et al., Mol. Immunol. 32:873-881, 1995). En general, existen dos constructos comunes de proteína de fusión de fragmento de inmunoglobulina-citoquina: F(ab' )2~ citoquina expresado en células de mamífero y scFv-citoquina expresado en Escherichia coli (ver Xiang J. , Hum. Antibodies 9:23-36, 1999). Tanto la reactividad de unión a tumor de la molécula parental de inmunoglobulina como la actividad funcional de la citoquina se mantienen en la mayoría de dichos tipos de inmunoconj ugado . Algunos estudios preclínicos recientes han demostrado que dichas proteínas de fusión son capaces de dirigir citoquinas a tumores que expresan el antígeno asociado a tumor in vivo, y de inhibir tumores tanto primarios como metastásicos en un modelo animal inmunológicamente competente.
Entre los ejemplos de inmunoconj ugados de fragmento de inmunoglobulina-citoquina se incluyen el inmunoconjugado scFv-IL-2, tal como se proporciona en la publicación de patente PCT n° WO 2001/062298 A2, el inmunoconj ugado de fragmento de cadena pesada de inmunoglobulina-GM-CSF, tal como se proporciona en la patente US n° 5.650.150, el inmunoconjugado proporcionado en la publicación de patente PCT n° WO 2006/119897 A2, en el que la primera subunidad de scFv-IL-12 comparte únicamente uno o más enlaces disulfuro con la segunda subunidad de IL-12-scFv, y el inmunoconj ugado tal como se describe en la publicación de patente PCT n° WO 99/29732 A2, en el que el fragmento de cadena pesada de Ig-IL-12 primera subunidad comparte únicamente uno o más enlaces disulfuro con la segunda subunidad de fragmento de cadena pesada de Ig-IL-12. Aunque estos inmunocon ugados de segunda generación presentan algunas propiedades mejoradas en comparación con los conjugados de inmunoglobulina-citoquina de primera generación, el desarrollo de más y más seguros agentes terapéuticos específicos resulta deseable para una mayor eficacia contra las células tumorales y una reducción del número y severidad de los efectos secundarios de estos productos (por ejemplo toxicidad, destrucción de células no tumorales, etc.). Además, resulta deseable identificar maneras de estabilizar adicionalmente los inmunoconj ugados manteniendo niveles .de actividad terapéutica aceptables.
La presente invención proporciona inmunoconjugados que muestran una eficacia mejorada, una especificidad de acción elevada, toxicidad reducida, y estabilidad mejora en sangre en comparación con los inmunoconjugados conocidos.
BREVE DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN Un aspecto de la presente invención se refiere a inmunoconjugados que muestran una eficacia mejorada, . una elevada especificidad de acción, toxicidad reducida y estabilidad mejorada en comparación con los inmunoconj ugados conocidos. Los inmunoconjugdos de la presente invención pueden utilizarse para administrar selectivamente grupos efectores a un sitio diana in vivo. En otra realización, el inmunoconj ugado administra una citoquina en un sitio diana, en el que la citoquina puede ejercer un efecto biológico localizado, tal como una respuesta inflamatoria local, la estimulación del crecimiento de las células T y la activación de las mismas, y/o la activación de células B y/o NK.
Un aspecto de la presente ivnención se refiere a un inmunoconj ugado que comprende por lo menos un primer grupo efector y por lo menos un primer y un segundo grupos de unión seleccionados independientemente de entre el grupo que consiste de un Fv y un Fab, en el que un primer grupo efector comparte un enlace peptidico amino-terminal o carboxi-terminal con un primer grupo de unión a antigeno y un segundo grupo de unión a antigeno comparte un enlace peptidico amino-terminal o carboxi-terminal con: i) el primer grupo efector, o ii) el primer grupo de unión a antigeno.
Otro aspecto de la presente invención es un inmunocon ugado que comprende por lo menos un primer grupo efector de una cadena unido en su aminoácido amino-terminal a una o más moléculas de scFv, yen el que el primer grupo efector de una cadena se encuentra unido en sus aminoácidos carboxi-terminales a una o más moléculas de scFv.
Otro aspecto de la presente invención es un inmunoconj ugado que comprende por lo menos un primer grupo efector de una cadena y primer y segundo grupos de unión a antigeno, en los que cada uno de entre el primer y el segundo grupos de unión a antigeno comprende una molécula de scFv unida en su aminoácido carboxi-terminal a una región constante que comprende un dominio constante de inmunoglobulina seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste de: CH1 de IgG, Ckappa de IgG y CH4 de IgE, y en el que el primer grupo de unión a antigeno se encuentra unido en el aminoácido carboxi-terminal de su región constante al aminoácido amino-terminal de uno de los grupos efectores, y en el que el primer y segundo grupos de unión a antigeno se encuentran unidos covalentemente mediante por lo menos un enlace disulfuro.
Otro aspecto de la presente invención es un inmunoconj ugado que comprende por lo menos un primer grupo efector de una cadena y un primer y segundo grupos de unión a antigeno, en los que cada uno de entre el primer y el segundo grupos de unión a antigeno comprende una molécula de scFv unida en su extremo carboxi-terminal a un dominio CH3 de IgGl, y en los que el primer grupo de unión a antigeno se encuentra unido en su aminoácido carboxi-terminal al aminoácido amino-terminal de uno de los grupos efectores, y en los que el primer y el segundo grupos de unión a antigeno se encuentran unidos covalentemente mediante por lo menos un enlace disulfuro.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un inmunoconjugado que comprender- un primer y un segundo grupo efector de una cadena y un primer y un segundo grupo de unión a antigeno, en los que cada uno de los grupos de unión a antigeno comprende una molécula Fab unida por el aminoácido carboxi-terminal de cadena pesada o ligera a un dominio CH3 de IgGl, y en el que cada uno de los dominios CH3 de IgGl se encuentra unido por su aminoácido carboxi-terminal al aminoácido amino-terminal de uno de los grupos efectores, y en el que el primer y el segundo grupos de unión a antigeno se encuentran unidos covalentemente mediante por lo menos un enlace disulfuro.
En una realización, el inmunoconjugado comprende la secuencia polipeptidica SEC ID n° 95. En otra realización, el inmunoconjugado comprende la secuencia polipeptidica SEC ID n° 104. En otra realización, el inmunoconjugado comprende la secuencia polipeptidica SEC ID n° 105. En otra realización, el inmunoconj ugado comprende la secuencia polipeptidica SEC ID n° 106. En otra realización, el inmunoconj ugado comprende la secuencia polipeptidica SEC ID n° 107. En otra realización, el inmunoconjugado comprende la secuencia polipeptidica SEC ID n° 96. En una realización adicional, el inmunoconjugado comprende la secuencia polipeptidica SEC ID n° 96 y una secuencia polipeptidica seleccionada de entre el grupo que consiste de las secuencias SEC ID n° 95 y 104 a 107. En otra realización, el inmunconjugado comprende un polipéptido que presenta una secuencia que es . por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de las secuencias SEC ID n° 95, 96 y 104 a 107.
En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptidica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia SEC ID n° 108. En otra realización, el inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptidica que se encuentra codificada por la secuencia polinucleótida SEC ID n° 108. En una realización, el inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptidica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia SEC ID n° 117. En otra realización, el inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptidica que se encuentra codificada por la secuencia polinucleótida SEC ID n° 117. En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptidica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia SEC ID n° 118. En otra realización, el inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptidica que se' encuentra codificada por la secuencia polinucleótida SEC ID n° 118. En una realización, el inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptidica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia SEC ID n° 119. En otra realización, el inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptidica que se encuentra codificada por la ¦ secuencia polinucleótida SEC ID n° 119. En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptidica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia SEC ID n° 120. En otra realización, el inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptidica que se encuentra codificada por la secuencia polinucleótida SEC ID n° 120. En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptidica 1 codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia SEC ID n° 109. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptidica que se encuentra codificada por la secuencia polinucleótida SEC ID n° 109.
En una realización, el inmunoconjugado comprende una región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 13 ó n° 15. En otra realización, el inmunoconj ugado comprende una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 9 ó n° 11. En una realización adicional, el inmunoconj ugado comprende una región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 13 ó n° 15, y una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 9 ó n° 11.
En una realización, el inmunoconj ugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia SEC ID n° 14 ó n° 16. En otra realización, el inmunoconj ugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que se encuentra codificada por la secuencia polinucleótida SEC ID n° 14 ó n° 16. En una realización, el inmunoconj ugado comprende una secuencia de región variable de cadena ligera codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia SEC ID n° 10 ó n° 12. En otra realización, el inmunoconj ugado comprende una secuencia de región variable de cadena ligera que se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida SEC ID n° 10 ó n° 12.
En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptidica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 99. En otra realización, el inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptidica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 100 ó n° 215. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptidica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 101 ó SEC ID n° 235. En una realización adicional, el inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptidica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 100, y una secuencia polipeptidica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 101. En una realización adicional, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptidica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 215, y una secuencia polipeptidica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 235.
En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptidica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia SEC ID n° 112. En otra realización, el inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptidica que se encuentra codificada por la secuencia polinucleótida SEC ID n° 112. En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptidica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia SEC ID n° 113 ó n° 216. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptidica que se encuentra codificada por la secuencia polinucleótida SEC ID n° 113 ó n° 216. En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptidica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia SEC ID n° 114 ó n° 236. En otra realización, el inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptidica que se encuentra codificada por la secuencia polinucleótida SEC ID n° 114 ó n° 236.
En una realización, el inmunoconj ugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID n° 7, SEC ID n° 179, SEC ID n° 183, SEC ID n° 187, SEC ID n° 191, SEC ID n° 195, SEC ID n° 199, SEC ID n° , 203 y SEC ID n° 207. En otra realización, el inmunocon ugado comprende una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID n° 3, SEC ID n° 5, SEC ID n° 177, SEC ID n° 181, SEC ID n° 185, SEC ID-n° 189, SEC ID n° 193/ SEC ID n° 197, SEC ID n° 201 y SEC ID n° 205. En una realización adicional, el inmunoconj ugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID n° 7, SEC ID n° 179, SEC ID n° 183, SEC ID n° 187, SEC ID n° 191, SEC ID n° 195, SEC ID n° 199, SEC ID n° 203 y SEC ID n° 207 y una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID n° 3, SEC ID n° 5, SEC ID n° 177, SEC ID n° 181, SEC ID n° 185, SEC ID n° 189, SEC ID n° 193, SEC ID n° 197, SEC ID n° 201 y SEC ID n° 205.
En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID n° .8, SEC ID n° 180, SEC ID n° 184, SEC ID n° 188, SEC ID n° 192, SEC ID n° 196, SEC ID n° 200, SEC ID n° 204 y SEC ID n° 208. En otra realización, el •inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID n° 8, SEC ID n° 180, SEC ID n° 184, SEC ID n° 188, SEC ID n° 192, SEC ID n° 196, SEC ID n° 200, SEC ID n° 204 y SEC ID n° 208. En una realización, el inmunoconj ugado comprende una secuencia de región variable de cadena ligera codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID n° 4, SEC ID n° 6, SEC ID n° 178, SEC ID n° 182, SEC ID n° 186, SEC ID n° 190, SEC ID n° 194, SEC ID n° 198, SEC ID n° 202 y SEC ID n° 206. En otra realización, el inmunoconj ugado comprende una secuencia de región variable de cadena ligera que se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID n° 4, SEC ID n° 6, SEC ID n° 178, SEC ID n° 182, SEC ID n° 186, SEC ID n° 190, SEC ID n° 194,. SEC ID n° 198, SEC ID n° 202 y SEC ID n° 206.
En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptidica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID n° 239, SEC ID n° 241 y SEC ID n° 243. En otra realización, el conjugado comprende una secuencia polipeptidica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID n° 245, SEC ID n° 247 y SEC ID n° 249. En una realización adicional, el inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptidica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID n° 239, SEC ID n° 241 y SEC ID n° 243, y una secuencia polipeptidica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID n° 245, SEC ID n° 247 y SEC ID n° 249. En una realización, el inmunoconjugado . comprende una secuencia polipeptidica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID n° 240, SEC ID n° 242 y SEC ID n° 244. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptidica que se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID n° 240, SEC ID n° 242 y SEC ID n° 244. En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptidica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID n° 246, SEC ID n° 248 y SEC ID n° 250. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptidica que se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID n° 246, SEC ID n° 248 y SEC ID n° 250. En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 1 ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID n° 21, SEC ID n° 25, SEC ID n° 27, SEC ID n° 31, SEC ID n° 35, SEC ID n° 39, SEC ID n° 43, SEC ID n° 47, SEC ID n° 51, SEC ID n° 69, SEC ID n° 73, SEC ID n° 77, SEC ID n° 81, SEC ID n° 85, SEC ID n° 89, SEC ID n° 93, SEC ID n° 123, SEC ID n° 127, SEC ID n° 131, SEC ID n°¾ 135, SEC ID n° 139, SEC ID n° 143, SEC ID n° 147, SEC ID n° 151, SEC ID n° 155, SEC ID n° 159, SEC ID n° 163, SEC ID n° 167, SEC ID n° 171 y SEC ID n° 175. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID n° 17, SEC ID n° 19, SEC ID n° 23, SEC ID n° 29, SEC ID n° 33, SEC ID n° 37, SEC ID n° 41, SEC ID n° 45, SEC ID n° 49, SEC ID n° 67, SEC ID n° 71, SEC ID n° 75, SEC ID n° 79, SEC ID n° 83, SEC ID n° 87, SEC ID n° 91, SEC ID n° 121, SEC ID n° 125, SEC ID n° 129, SEC ID n° 133, SEC ID n° 137, SEC ID n° 141, SEC ID n° 145, SEC ID n° 149, SEC ID n° 153, SEC ID n° 157, SEC ID n° 161, SEC ID n° 165, SEC ID n° 169 y SEC ID n° 173. En una realización adicional, el inmunoconj ugado comprende una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID n° 21, SEC ID n° 25, SEC ID n° 27, SEC ID n° 31, SEC ID n° 35, SEC ID n° 39, SEC ID n° 43, SEC ID n° 47, SEC ID n° 51, SEC ID n° 69, SEC ID n° 73, SEC ID n° 77, SEC ID n° 81, SEC ID n° 5 85, SEC ID n° 89, SEC ID n° 93, SEC ID n° 123, SEC ID n° 127, SEC ID n° 131, SEC ID n° 135, SEC ID n° 139, SEC ID n° 143, SEC ID n° 147, SEC ID n° 151, SEC ID n° 155, SEC ID n° 159, SEC ID n° 163, SEC ID n° 167, «SEC ID n° 171 y SEC ID n° 175, y una secuencia de región variable de cadena -^Q ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID n° 17, SEC ID n° 19, SEC ID n° 23, SEC ID n° 29, SEC ID n° 33, SEC ID n° 37, SEC ID n° 41, SEC ID n° 45, SEC ID n° 49, SEC ID n° 67, SEC ID n° 71, SEC ID n° 75, SEC ID n° o 79, SEC ID n° 83, SEC ID n° 87, SEC ID n° 91, SEC ID n° 121, SEC ID n° 125, SEC ID n° 129, SEC ID n° 133, SEC ID n° 137, SEC ID n° 141, SEC ID n° 145, SEC ID n° 149, SEC ID n° 153, SEC ID n° 157, SEC ID n° 161, SEC ID n° 165, 20 SEC ID n° 169 y SEC ID n° 173.
En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 25 98% ó 99% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID n° 22, SEC ID n° 26, SEC ID n° 28, SEC ID n° 32, SEC ID n° 36, SEC ID n° 40, SEC ID n° 44, SEC ID'n° 48, SEC ID n° 52, SEC ID n° 70, SEC ID n° 74, SEC ID n° 78, SEC ID n° 82, SEC ID n° 86, SEC ID n° 90, SEC ID n° 94, SEC ID n° 124, SEC ID n° 128, SEC ID n° 132, SEC ID n° 136, SEC ID n° 140, SEC ID n° 144, SEC ID n° 148, SEC ID n° 152, SEC ID n° 156, SEC ID n° 160, SEC ID n° 164, SEC ID n° 168, SEC ID n° 172 y SEC ID n° 176. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID n° 22, SEC ID n° 26, SEC ID n° 28, SEC ID n° 32, SEC ID n° 36, SEC ID n° 40, SEC ID n° 44, SEC ID n° 48, SEC ID n° 52, SEC ID n° 70, SEC ID n° 74, SEC ID n° 78, SEC ID n° 82, SEC ID n° 86, SEC ID n° 90, SEC ID n° 94, SEC ID n° 124, SEC ID n° 128, SEC ID n° 132, SEC ID n° 136, SEC ID n° 140, SEC ID n° 144, SEC ID n° 148, SEC ID n° 152, SEC ID n° 156, SEC ID n° 160, SEC ID n° 164, SEC ID n° 168, SEC ID n° 172 y SEC ID n° 176. En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena ligera que se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%,· 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID n° 18, SEC ID n° 20, SEC ID n° 24, SEC ID n° 30, SEC ID n° 34, SEC ID n° 38, SEC ID n° 42, SEC ID n° 46, SEC ID n° 50, SEC ID n° 68, SEC ID n° 72, SEC ID n° 76, SEC ID n° 80, SEC ID n° 84, SEC ID n° 88, SEC ID n° 92, SEC ID n° 122, SEC ID n° 126, SEC ID n° 130, SEC ID n° 134, SEC ID n° 138, SEC ID n° 142, SEC ID n° 146, SEC ID n° 150, SEC ID n° 154, SEC ID n° 158, SEC ID n° 162, SEC ID n° 166, SEC ID n° 170 y SEC ID n° 174. En otra realización, el inmunoconj ugado comprende una secuencia de región variable de cadena ligera que se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID n° 18, SEC ID n° 20, SEC ID n° 24, SEC ID n° 30, SEC ID n° 34, SEC ID n° 38, SEC ID n° 42, SEC ID n° 46, SEC ID n° 50, SEC ID n° 68, SEC ID n° 72, SEC ID n° 76, SEC ID n° 80, SEC ID n° 84, SEC ID n° 88, SEC ID n° 92, SEC ID n° 122, SEC ID n° 126, SEC ID n° 130, SEC ID n° 134, SEC ID n° 138, SEC ID n° 142, SEC ID n° 146, SEC ID n° 150, SEC ID n° 154, SEC ID n° 158, SEC ID n° 162, SEC ID n° 166, SEC ID n° 170 y SEC ID n° 174.
En una realización, el inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptidica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID n° 209, SEC ID n° 211, SEC ID n° 213, SEC ID n° 217, SEC ID n° 219, SEC ID n° 221, SEC ID n° 223, SEC ID n° 225 y SEC ID n° 227. En otra realización, el inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptidica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de las secuencias SEC ID n° 229, SEC ID n° 231, SEC ID n° 233 y SEC ID n° 237. En una realización adicional, el inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptidica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de las secuencias SEC ID n° 211, SEC ID n° 219 y SEC ID n° 221, y una secuencia polipeptidica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 231. En una realización adicional, el inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptidica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de las secuencias SEC ID n° 209, SEC ID n° 223, SEC ID n° 225 y SEC ID n° 227, y una secuencia polipeptidica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 229. En una realización adicional, el inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptidica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 213, y una secuencia polipeptidica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 233. En una realización adicional, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptidica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 217, y una secuencia polipeptidica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 237.
En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptidica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID n° 210, SEC ID n° 212, SEC ID n° 214, SEC ID n° 218, SEC ID n° 220, SEC ID n° 222, SEC ID n° 224, SEC ID n° 226 y SEC ID n° 228. En otra realización, el inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptidica que se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID n° 210, SEC ID n° 212, SEC ID n° 214, SEC ID n° 218, SEC ID ñ° 220, SEC ID n° 222, SEC ID n° 224, SEC ID n° 226 y SEC ID n° 228. En una realización, el inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptidica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de 4 secuencias SEC ID n° 230, SEC ID n° 232, SEC ID n° 234 y SEC ID n° 238. En otra realización, el inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptidica que se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID n° 230, SEC ID n° 232, SEC ID n° 234 y SEC ID n° 238.
En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 257 ó SEC ID n° 261. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 259 ó SEC ID n° 271. En una realización adicional, el inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 257 ó SEC ID n° 261, y una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 259 ó n° 271.
En una realización, el inmunoconjugado comprende uan secuencia de región variable de cadena pesada codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia SEC ID n° 258 ó SEC ID n° 262. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que se encuentra codificada por la secuencia polinucleótida SEC ID n° 258 ó SEC ID n° 262. En una realización, el inmunoconj ugado comprende una secuencia de región variable de cadena ligera codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia SEC ID n° 260 ó n° 272. En otra realización, el inmunocon ugado comprende una secuencia de región variable de cadena ligera que se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida SEC ID n° 260 ó n° 272. En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptidica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 251 ó SEC ID n° 255. En otra realización, el inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptidica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 253 ó SEC ID n° 265. En una realización adicional, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptidica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 251 ó SEC ID n° 255, y una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 253 ó n° 265.
En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia SEC ID n° 252 ó SEC ID n° 256. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que se encuentra codificada por la secuencia polinucleótida SEC ID n° 252 ó SEC ID n° 256. En una realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia SEC ID n° 254 ó n° 266. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica que se encuentra codificada por la secuencia polinucleótida SEC ID n° 254 ó n° 266.
En otra realización, el inmunoconjugado comprende por lo menos un grupo efector, en el que el grupo efector es una citoquina. En una realización específica, el grupo efector es una citoquina seleccionada de entre el grupo que consiste de: interleuquina-2 (IL-2), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) , interferón- (INF-a), interleuquina-12 (IL-12) , interleuquina-8 (IL-8), proteína inflamatoria de macrofagos la (MIP-la) , proteína inflamatoria de macrofagos lbeta (???-lbeta) y factor a de crecimiento transformante (TGF-a) . En otra realización, por lo menos un grupo de unión a antígeno es específico de uno de los determinantes antigénicos siguientes: el dominio extra B de la fibronectina (EDB) , el dominio Al de la tenascina (TNC-Al) , el dominio A2 de la tenascina (TNC-A2), la proteína activada por fibroblastos (FAP) y el proteoglicano condroitín sulfato del melanoma (MCSP) .
En otra realización, el inmunoconjugado de la unión se une a un receptor de grupo efector gue presenta una constante de disociación (KD) que es por lo menos aproximadamente 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 ó 10 veces mayor que para un grupo efector de control. En otra realización, el inmunoconjugado inhibe un incremento del volumen tumoral in vivo en por lo menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% o más al final del periodo de administración. En otra realización, el inmunoconjugado prolonga la supervivencia de mamíferos que presentan tumores malignos en por lo menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% al administrarse en un mamífero que necesita del mismo, respecto a un grupo efectorde control o un grupo efector en una molécula de inmunoconjugado "diacuerpo".
Otro aspecto de la presente invención se refiere a polinucleótidos aislados codificantes de inmunoconjugados de la invención o fragmentos de los mismos. Otro aspecto de la presente invención se refiere a un vector de expresión que comprende un cásete de expresión que comprende las secuencias polinucleótidas de la invención.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a células huésped que expresan los inmunoconjugados de la invención o fragmentos de los mismos.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a métodos para producir los inmunocon ugados de la invención o fragmentos de los mismos, en donde el método comprende cultivar células huésped transformadas con vectores de expresión codificantes de los inmunoconjugados de la invención o fragmentos de los mismos bajo condiciones adecuadas para la expresión de los mismos.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a métodos para estimular la proliferación y la diferenciación en un linfocito T activado, que comprenden poner en contacto un linfocito T activado con una cantidad eficaz de los inmunoconjugados de la invención.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a métodos para estimular la proliferación y la diferenciación en un linfocito B activado, que comprenden poner en contacto un linfocito B activado con una cantidad eficaz de los inmunoconj ugados de la invención.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a métodos para estimular la proliferación y la diferenciación en una célula asesina natural (NK) , que comprenden poner en contacto una célula NK con una cantidad eficaz de los inmunoconjugados de la invención.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a métodos para estimular, la proliferación y la diferenciación en un granulocito, un monocito o una célula dendrítica, que comprende poner en contacto un granulocito, un monocito o una célula dendrítica con una cantidad eficaz de los inmunoconjugados de la invención.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a métodos para estimular la diferenciación de los linfocitos T citotóxicos (CTL) , que comprenden poner . en contacto un linfocito T con una cantidad eficaz de los inmunoconj ugados de la invención.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a métodos para inhibir la replicación vírica, que comprenden poner en contacto una célula infectada por virus con una cantidad eficaz de los inmunoconjugados de la invención.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a métodos para regular positivamente la expresión del complejo mayor de histocompatibilidad 1 (MHC 1) , que comprenden poner en contacto una célula diana con una cantidad eficaz de los inmunoconjugados de la invención.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a métodos para inducir la muerte celular, que comprenden administrar en una célula diana una cantidad eficaz de los inmunoconjugados de la invención.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a métodos para inducir la quimiotaxis en una célula diana, que comprenden administrar en una célula diana una cantidad eficaz del inmunoconjugado de la invención.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para tratar una enfermedad en un individuo, que comprende las etapas de administrar en un individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende el inmunoconjugado de la invención y un portador farmacéutico.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS/FIGURAS FIGURA 1. Vista general esquemática de los diversos formatos de fusión de inmunoconjugados . Todos los constructos en la FIGURA 1 comprenden dos fragmentos scFv de anticuerpo (en el grupo de unión a antigeno) y una o dos moléculas de citoquina (como grupos efectores) conectados al mismo. Los paneles A a E muestran diferentes conectividades y estequiometrias de los grupos de unión a antigeno y grupos efectores. El panel A) ilustra una fusión "diacuerpo" de IL-2. El "diacuerpo" ensambla no covalentemente dos cadenas polipeptidicas idénticas. El panel B muestra un inmunoconjugado que comprende una cadena pesada de una molécula Fab fusionada en su extremo carboxi-terminal con una citoquina que, a su vez, se fusiona en su extremo carboxi-terminal con una segunda cadena pesada de Fab. Se coexpresa una cadena ligera con el polipéptido cadena pesada de Fab-citoquina-cadena pesada de Fab para formar el inmunoconj ugado . Alternativamente, las dos cadenas ligeras pueden fusionarse con la citoquina, y coexpresarse las cadenas pesadas. En el panel C, las dos cadenas pesadas de Fab se fusionan directamente entre si. La citoquina comparte un enlace peptidico amino-terminal con la cadena pesada del segundo grupo de unión a antigeno. Los dos formatos moleculares de los paneles B y C pueden modificarse de manera que la cadena de Fab se sustituya por un fragmento scFv, tal como en los paneles D y E.
FIGURA 2. Vista general esquemática de inmunoconj ugados adicionales que comprenden dos grupos de unión a antigeno y por lo menos uno o más grupos efectores. El panel A muestra una molécula Fab fusionada mediante su extremo carboxi-terminal a un dominio CH3 de IgG. Con el fin de conseguir la homodimerización del grupo de unión covalente a antigeno, puede introducirse un enlace disulfuro artificial en el extremo carboxi-terminal del dominio CH3 de IgG (inmunoconj ugado a la derecha dentro del panel A) . El dominio CH3 de IgGl mostrado en el panel A puede sustituirse por un dominio CH4 de IgE. Los grupos Fab en el panel A se sustituyen por fragmentos scFv en el panel B. Para el inmunoconj ugado del panel C, se fusionó la bisagra natural de IgG C-terminalmente con las moléculas Fab. Debido a que la región carboxi-terminal de la bisagra podría imponer algunas restricciones geométricas al ensamblaje de los dominios constantes que se encuentran fusionados C-terminalmente con la región bisagra de IgG, puede introducirse un línker artifical entre la región carboxi-terminal de la bisagra y el extremo amino-terminal del dominio CH3 de IgG. La región bisagra también puede introducirse entre un fragmento scFv y un dominio constante de inmunoglobulina, tal como se muestra en el' panel D. En los paneles A a D, se utiliza un dominio CH3 de IgGl o CH4 de IgE para homodimerizar los constructos. El panel E ilustra un inmunocnojugado en el que se consigue la dimerización mediante una interacción de heterodimerización CH1/Ckappa- El inmunoconj ugado del panel D puede presentar una o dos citoquinas en cada inmunoconj ugado . La FIGURA 3 presenta los resultados de un experimento de eficacia con dos formatos moleculares de inmunoconj ugado de interleuquina 2 diferentes específicos del estroma tumoral. Se inyectó subcutáneamente teratocarcinoma F9 en ratones 129SvEv y se midió el tamaño tumoral utilizando un calibrador. Se comparó la molécula "diacuerpo-IL-2 a dos concentraciones diferentes con el inmunoconj ugado Fab-interleuquina-2-Fab ( Fab-IL2-Fab) , en donde las concentraciones reflejan un número similar de moléculas de inmunoconj ugado . El inmunoconjugado Fab-IL2-Fab se denomina "Fab-L19", el control de interleuquina-2 no conjugado se denomina "rIL-2 no con .", la molécula de "diacuerpo"-IL-2 se denomina "diacuerpo" en la FIGURA 3. Se utilizó el anticuerpo L19, dirigido contra el dominio extra B de la fibronectina (EDB) , para generar los grupos de unión a antigeno en los inmunoconj ugados tanto de diacuerpo como Fab-L19. La cantidad de inmunoconjugado inyectada en cada ratón (en µg) se indica en la leyenda de la figura.
La FIGURA 4 presenta los resultados de un experimento de supervivencia con dos formatos moleculares de inmunoconjugado de interleuquina-2 diferentes específicos del estroma tumoral. Se inyectó intraesplénicamene la línea celular de tumor gástrico humano LS174T en ratones SCID-beige. El inmunoconj ugado Fab-IL2-Fab se denomina "Fab-L19", el control de interleuquina-2 no conjugada se denomina "rIL-2 no conj.", la molécula de "diacuerpo"-IL-2 se denomina "diacuerpo" en la FIGURA 4. Se utilizó el anticuerpo anti-EDB, L19, para generar los grupos . de unión a antígeno en los inmunoconjugados tanto de diacuerpo como Fab-L19. La cantidad de inmunoconj ugado inyectada en cada ratón (en µq) se indica en la leyenda de la figura, y refleja el mismo número de moléculas de inmunoconjugado.
La FIGURA 5 muestra las imágenes inmunohistoquímicás de tejido uterino humano a magnificaciones de 100X y 400X. La región variable 2B10 generada mediante los métodos descritos en el Ejemplo 3 se une al dominio A2 de la tenascina humana (TNC-A2). La región variable 2B10 en un fragmento Fab se ufisonó con un fragmento FLAG (SHD2B10-FLAG) . Se prepararon muestras de tejido uterino humano sano y canceroso para la tinción, inmunohistoquimica . A continuación, las muestras se incubaron con el fragmento Fab SHD2B10-FLAG . A continuación, las muestras se lavaron y se incubaron con un anticuerpo fluorescente especifico para el epitopo FLAG. Las muestras de tejido canceroso mostraban niveles de expresión más altos de TNC-A2 que las muestras de tejido sano.
La FIGURA 6 muestra los niveles de expresión de TNC-A2 en diversas muestras de tejido humano en términos de % de área superficial inmunofluorescente . Se incubaron diversas muestras de tejido humano procedentes de individuos sanos y de pacientes de cáncer con fragmento Fab SHD2B10-FLAG tal como se describe en la FIGURA 5.
La FIGURA 7 muestra los niveles de expresión de prote na activada por fibroblastos (FAP) en diversas muestras de tejido humano en términos de % de área superficial inmunofluorescente . Se incubaron diversas muestras de tejido humano procedentes de individuos sanos y de pacientes de cáncer con un anticuerpo comercial contra FAP (Abcam) . La parte superior de cada columna en el gráfico representa la expresión tumoral de FAP, mientras que la parte inferior de cada columna en el gráfico representa la expresión normal de FAP.
La FIGURA 8 presenta datos de BIACORE que muestran la afinidad de un anticuerpo de IgG conocido, L19, para EDB.
La FIGURA 9 presenta datos de BIACORE que muestran la afinidad de un inmunoconj ugado Fab-IL-2-Fab especifico para EDB. Los fragmentos Fab en el inmunoconj ugado se derivaron del anticuerpo L19.
La FIGURA 10 presenta datos de BIACORE que muestran la afinidad de una proteina de fusión "diacuerpo"-IL2 especifica para EDB. El fragmento scFv de diacuerpo se derivó a partir del anticuerpo L19. La proteina de fusión "diacuerpo"-IL2 incluye un linker de 8 aminoácidos situada entre el fragmento scFv y la molécula de IL-2.
La FIGURA 11 presenta datos de BIACORE que muestran la afinidad de una proteina de fusión "diacuerpo"-IL2 especifica para EDB. El fragmento scFv de diacuerpo se derivó a partir del anticuerpo L19. La proteina de fusión "diacuerpo"-IL2 incluye un linker de 12 aminoácidos entre el fragmento scFv y la molécula de IL-2.
La FIGURA 12 presenta datos de BIACORE que muestran la afinidad de un anticuerpo IgG conocido, F16, para el dominio Al inmovilizado de la tenascina (TNC-A1) . La FIGURA 12 también presenta datos de BIACORE que muestran la afinidad de un fragmento Fab del anticuerpo F16 para TNC-A1. Se indican en la figura las constantes de disociación (KD) calculadas para las moléculas IgG y Fab de F16.
La FIGURA 13 presenta los datos de BIACORE que muestran la afinidad de IL-2 para el receptor de IL-2 inmovilizado. Se 5 consiguió heterodimerizar las cadenas beta y gamma de IL-2R mediante la fusión de las cadenas respectivas con las variantes "botón en ojal" de la parte Fe de una IgGl humana, tal como se describe en. Merchant A.M. et al., Nat. Biotech. 16:677-681, 1998. Se indica en la figura el valor de KD -^Q calculado a partir de los datos de BIACORE.
La FIGURA 14 presenta datos de BIACORE que muestran la afinidad de una proteina de fusión "diacuerpo"-IL-2 para TNC- Al y el receptor de IL-2. La molécula de scFv en el diacuerpo se deriva del anticuerpo F16. Los valores de KD _. calculados a partir de los datos de BIACORE se indican en la figura.
La FIGURA 15 presenta los datos de BIACORE muestran la afinidad de un inmunoconjugado Fab-IL-2-Fab para TNC-Al y el receptor de IL-2. Las moléculas Fab en el inmunoconjugado se 20 derivaron del anticuerpo F16. Los valores de KD calculados a partir de los datos de BIACORE se indican en la figura.
La FIGURA 16 presenta los datos de BIACORE que muestran la afinidad de un inmunoconjugado scFv-IL-2-scFv para TNC-Al y el receptor de IL-2. Las moléculas de scFv en el 25 inmunoconjugado se derivaron a partir del anticuerpo F16.
Los valores de KD calculados a partir de los datos de BIACORE se indican en la figura.
La FIGURA 17 es una tabla resumen de los valores de KD obtenidos de los estudios BIACORE presentados en las figuras 12 a 16.
La FIGURA 18 presenta los resultados de un experimento de eficacia que compara la molécula de "diacuerpo"-IL-2 con diana en el dominio EDB de la fibronectina con el inmunoconj ugado Fab-interleuquina-2-Fab (denominado "Fab-SH2B10", que comprende las regiones variables de cadenas pesada y ligera de secuencias SEC ID n° 3 y 7, respectivamente) con diana en el dominio A2 de la tenascina C. El control de interleuquina-2 no conjugada se denomina vrIL-2 no conj.", la molécula de "diacuerpo"-IL-2 se denomina "diacuerpo L12" en la FIGURA 18. Se utilizó el anticuerpo anti-EDB, L19, para generar el grupo de unión a antigeno en el inmunoconjugado de diacuerpo. Se inyectó subcutáneamente la linea celular de teratocarcinoma F9 en ratones inmunocompetentes de la cepa 129. La cantidad de inmunoconj ugado inyectada en cada ratón . (en µg) se indica en la leyenda de la figura. El tratamiento se inició el día 6 y se realizaron 5 inyecciones en total hasta el día 11 del experimento .
La FIGURA 19 muestra la inducción de la proliferación de las células NK-92 por parte de los inmunoconjugados anti-FAP, anti-tenascina C y Fab-IL2-Fab (generados utilizando las secuencias de VH y de VL de los constructos 3F2, 3D9, 4B3 (anti-FAP) , 2F11 y 2B10 (anti-tenascina C) ) en comparación con la IL-2 humana no conjugada. Se midió la proliferación celular utilizando el sistema CellTiter Glo tras dos días de incubación .
La FIGURA 20A-B presenta los resultados de un ensayo ELISA que mide la inducción de la producción de IFN-gamma por parte de diversos inmunoconjugados que contienen interleuquina-12 en comparación con citoquinas no conjugadas, o con inmunoconj ugados que contienen los dominios p35 y p40 de IL-12 en moléculas separadas. El panel A muestra los resultados en placas recubiertas de fibronectina . El panel B muestra los resultados en solución.
La FIGURA 21 muestran los análisis cinéticos basados en resonancia de plasmón superficial (SPR) de fragmentos Fab anti-FAP de afinidad madurada. Se presentan conjuntos de datos cinéticos procesados para la unión del clon 19G1 a FAP (A) humano (hu) y a FAP (B) murino (mu) , para la unión del clon 20G8 a FAP hu (C) , a FAP mu (D) y de unión del clon 4B9 a FAP hu (E) y a FAP mu (F) . Las lineas suavizadas representan un ajuste global de los datos a un modelo de interacción 1:1.
La FIGURA 22 muestra análisis cinéticos basados en SPR de fragmentos Fab anti-FAP de afinidad madurada. Se presentan conjuntos de datos cinéticos procesados para la unión del clon 5B8 a FAP hu (A) y a FAP mu (B) , para la unión del clon 5F1 a FAP hu (C) , a FAP mu (D) y para la unión del clon 14B3 a FAP hu (E) y a FAP mu (F) . Las lineas suavizadas representan un ajuste global de los datos a un modelo de interacción 1:1.
La FIGURA 23 muestra análisis cinéticos basados en SPR de fragmentos Fab anti-FAP de afinidad madurada. Se presentan datos cinéticos procesados para la unión del clon 16F1 a FAP hu (A) y a FAP mu (B) , de unión del clon 16F8 a FAP hu (C) , a FAP mu (D) y de unión del clon 03C9 a FAP hu (E) y a FAP mu (F) . Las lineas suavizadas representan un ajuste global de los datos a un modelo de interacción 1:1.
La FIGURA 24 muestra análisis cinéticos basados en SPR de fragmentos Fab anti-FAP de afinidad madurada. Se presentan datos cinéticos procesados para la unión del clon 02D7 a FAP hu (A) y a FAP mu (B) , de la unión del clon 28H1 a FAP hu (C) , a FAP mu (D) , ¦ a FAP cyno (E) y para la unión del clon 22A3 a FAP hu (F), a FAP mu (G) y a FAP de Cynomolgus (cyno) (H) . Las lineas suavizadas representan un ajuste global de los datos a un modelo de interacción 1:1.
La FIGURA 25 muestra análisis cinéticos basados en SPR de fragmentos Fab anti-FAP de afinidad madurada. Se presentan datos cinéticos procesados para la unión del clon 29B11 a FAP hu (A), a FAP mu (B) , a FAP cyno (C) y para la unión del clon 23C10 a FAP hu (D) , a FAP mu (E) y a FAP cyno (F). Las lineas suavizadas representan un ajuste global de los datos a un modelo de interacción 1:1.
La FIGURA 26 muestra análisis cinéticos basados en SPR de 5 fragmentos Fab anti-TNC A2 de afinidad madura que se unen a TNC A2 humana (hu) . Se presentan datos cinéticos procesados para los clones 2B10_C3B6 (A), 2B10_6A12 (B), 2B10_C3A6 (C) , 2Bl0_O7D8 (D), 2B10_OlF7 (E) y 2B10_6H10 (F). Las lineas suavizadas representan un ajuste global de los datos a un -J^Q modelo de interacción 1:1.
La FIGURA 27 proporciona una vista general de las tres etapas de purificación llevadas a cabo para la purificación de Fab- IL2-Fab basado en 3F2.
La FIGURA 28A-D muestra los resultados de la purificación de Fab-IL2-Fab (A y B) basada en 3F2 y los resultados de la 5 purificación de Fab-IL2-Fab (C y D) basada en 4G8. (A, C) SDS-PAGE Bis-Tris al 4-12% y Tris-acetato al 3-8% de fracciones del procedimiento de purificación y del producto final. (B, D) Cromatografía analítica de exclusión por tamaño 20 tras las tres etapas de purificación aplicadas.
La FIGURA 29 muestra los resultados de la purificación del inmunoconjugado Fab-IL2-Fab 2B10. (A) SDS-PAGE Bis-Tris al 4- 12% de fracciones obtenidas durante el procedimiento de purificación y del producto final. B) Cromatografía analítica 25 de exclusión por tamaño tras las tres etapas de purificación aplicadas .
La FIGURA 30 muestra la evaluación de estabilidad del Fab-IL2-Fab basado en L19 anti-EDB de fibronectina . Se formuló Fab-IL2-Fab L19 en HC1 de histidina 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0 a una concentración de 6,3 mg/ml y se almacenó durante 4 semanas a temperatura ambiente y a 4°C. Se analizaron muestras cada semana para: (A) la concentración, mediante espectroscopia de UV (tras la centrifugación para peletizar cualquier material potencialmente precipitado) , y (B) contenido agregado mediante cromatografía analítica de exclusión por tamaños.
La FIGURA 31 muestra los análisis cinéticos basados en SPR de inmunoconjugados Fab-IL2-Fab 3F2 con diana en FAP para FAP humana, murina y de Cynomolgus (cyno) y receptor ß/? de IL-2 humana (IL2R bg) según determinación mediante resonancia de plasmón superficial. Las líneas suavizadas representan un ajuste global de los datos a un modelo de interacción 1:1. La FIGURA 32 muestra análisis cinéticos basados en SPR de inmunoconjugados Fab-IL2-Fab 4G8 con diana en FAP para FAP humana, murina y de Cynomolgus (cyno) según determinación mediante resonancia de plasmón superficial. Las líneas suavizadas representan un ajuste global de los datos a un modelo de interacción 1:1.
La FIGURA 33 muestra los análisis cinéticos basados en SPR de constructos Fab-IL2-Fab 4G8 con diana en FAP para las cadenas ß/? and á del receptor de IL-2 murino, según determinación mediante resonancia de plasmón superficial. Las lineas suavizadas representan un ajuste global de los datos a un modelo de reacción de dos estados.
La FIGURA 34 muestra análisis cinéticos basados en SPR de constructos Fab-IL2-Fab 3D9 con diana en FAP para FAP humana, murina y de Cynomolgus (cyno) y receptor ß/? de IL-2 humana (IL2R bg) según determinación mediante resonancia de plasmón superficial. Las lineas continuas representan un ajuste global de los datos a un modelo de interacción 1:1.
La FIGURA 35 muestra análisis cinéticos basados en SPR de constructos Fab-IL2-Fab 2B10 con diana en TNC A2 para las proteínas de fusión TNC A2 quiméricas humanas, murinas y de Cynomolgus (cyno) y receptor ß/? de IL-2 humana (IL2R bg) según determinación mediante resonancia de plasmón superficial. Las líneas continuas representan un ajuste global de los datos a un modelo de interacción 1:1.
La FIGURA 36 ilustra la eficacia de los inmunoconjugados Fab-IL2-Fab IL-2 dirigidos que reconocen TNC A2 (2B10) o FAP (3F2 y 4G8) en la inducción de la proliferación de las células NK92 en comparación con IL-2 (proleuquina) y con el diacuerpo L19 que reconoce la EDB de la fibronectina . El eje x se normaliza respecto al número de moléculas de IL-2, debido a que el diacuerpo presenta dos grupos efectores de IL-2, mientras que los constructos Fab-IL2-Fab contienen únicamente un grupo efector IL-2. Se midió la proliferación celular utilizando el sistema CellTiter Glo tras dos días de incubación .
La FIGURA 37 muestra la inducción de la fosforilación de STAT5 como consecuencia de la señalización del receptor de IL-2 mediada por IL-2 tras la incubación con un inmunoconjugado Fab-IL2-Fab de IL-2 basado en 4G8 con diana en FAB que reconoce FAP en diferentes poblaciones de células efectoras, incluyendo: (A) células NK CD56+, (B) células T ayudante CD4+CD25~CD127+, (C) células T citotóxicas CD3+, CD8+, y (D) células T reguladoras CD4+CD25+FOXP3+ (Tregs) procedentes de PBMCs humanas en solución.
La FIGURA 38 ilustra la eficacia de inmunoconjugados Fab-IL2-Fab de IL-2 dirigidos que reconocen TNC Al (2F11) , TNC A2 (2B10) o FAP (3F2, 4B3 y 3D9) en la inducción de la liberación de IFN-gamma y la proliferación de células NK92 en comparación con IL-2, en el caso de que los inmunoconjugados se encuentren presentes en solución o inmovilizados mediante FAP o TNC A2 recubierto sobre placas de microtitulacion.
La FIGURA 39 presenta los resultados de un experimento de supervivencia con dos formatos moleculares de inmunoconj ugado de IL-2 específicos para el estroma tumoral. Se inyectó intraesplénicamente en ratones SCID la línea celular de tumor de colon humano LS174T. El inmunoconj ugado Fab-IL2-Fab 2B10 con diana en TNC A2 se denomina "SH2B10", el control de IL-2 no conjugado se denomina "proleuquina", la molécula de diacuerpo de IL-2 con diana en EDB de fibronectina se denoina "diacuerpo". La cantidad de inmunoconj ugado inyectada en cada ratón (en µg) se indica en la leyenda de la figura, y refleja el mismo número de moléculas de inmunoconj ugado .
La FIGURA 40 presenta los resultados de un experimento de supervivencia con dos formatos moleculares de inmunoconj ugado de IL-2 específicos para el estroma tumoral . Se inyectó intrarrenalmente en ratones SCID la línea celular renal humana ACHN. Los inmunoconj ugados Fab-IL2-Fab 3F2 o 4G8 con diana en FAP se denominan "FAP-3F2" y "FAP-4G8-", el control de IL-2- no conjugado se denomina "proleuquina", la molécula de diacuerpo de IL-2 con diana en EDB de fibronectina se denomina "diacuerpo". La cantidad de inmunoconj ugados inyectada en cada ratón (en g) se indica en la leyenda de la figura, y refleja el mismo número de moléculas de inmunoconj ugado .
La FIGURA 41 presenta los resultados de un experimento de supervivencia con dos formatos moleculares de inmunoconj ugado de IL-2 específicos para el estroma tumoral. Se inyectó i.v. en ratones SCID la línea celular de NSCLC humana A549. El inmunoconj ugado Fab-IL2-Fab 2B10 con diana en TNC A2 se denomina "2B10", la molécula de diacuerpo de IL-2 con diana en EDB de fibronectina se denomina "diacuerpo". La cantidad de inmunoconj ugado inyectada en cada ratón (en µg) se indica en la leyenda de la figura, y refleja el mismo número de moléculas de inmunoconj ugado .
La FIGURA 42 presenta (A) una vista general del procedimiento de purificación del inmunoconjugado Fab-GM-CSF-Fab con L19 (ligante del ectodominio B de fibronectina) como Fab, y (B) una SDS-PAGE (reducida, no reducida) del inmunoconj ugado Fab-GM-CSF-Fab purificado.
La FIGURA 43 presenta los resultados de un ensayo de proliferación dependiente de GM-CSF que compara el efecto de GM-CSF y el inmunoconjugado Fab-GM-CSF-Fab con L19 (ligante del ectodominio B de la fibronectina) como Fab sobre células TF-1.
La FIGURA 44 presenta (A) una vista general del procedimiento de purificación del inmunoconjugado Fab-IL12-Fab con 4G8 (ligante de FAP) como Fab, y (B) una SDS-PAGE (reducida, no reducida) del inmunoconjugado Fab-IL12-Fab purificado.
La FIGURA 45 presenta los resultados de un ensayo de la liberación de IFN-gamma inducida por IL-12, comparando el efecto de IL-12 y el inmunoconjugado Fab-IL12-Fab purificado con 4G8 (ligante de FAP) como Fab, utilizando PBMCs aisladas a partir de sangre humana fresca procedente de un donante sano .
La FIGURA 46 presenta (A) una vista general del procedimiento de purificación del inmunoconj ugado Fab-IFN 2-Fab con L19 (ligante del ectodominio B de la fibronectina) como Fab, y (B) una SDS-PAGE (reducida, no reducida) del inmunoconj ugado Fab-IFNa2-Fab purificado.
La FIGURA 47 presenta los resultados de un ensayo de la inhibición inducida por IFN-gamma de la proliferación de (A) células T de Jurkat, y (B) células tumorales A549, comparando el efecto de IFN-gamma (Roferon A, Roche) y del inmunoconj ugado Fab-IFNa2-Fab purificado con L19 (ligante de ectodominio B de la fibronectina) como Fab.
La FIGURA 48 muestra (A) los perfiles de elución de la purificación del Fab-IL2-Fab basado en HLG con diana en MCSP, y (B) los resultados de la caracterización analítica del mismo Fab-IL2-Fab mediante SDS-PAGE (minigel Bis-Tris Novex NuPAGE, Invitrogen; tampón de corrido OPS, reducido y no reducido) .
La FIGURA 49 presenta los resultados de un ensayo de la liberación de IFN-gamma inducida por IL-2 comparando el efecto del inmunoconj ugado Fab-IL12-Fab purificado con 4G8 (ligante de FAP) como Fab, y el inmunoconj ugado Fab-IL12-Fab purificado con MHLG KV9 (ligante de MCSP) como Fab, utilizando células NK92 privadas de IL-2.
La FIGURA 50 presenta (A) una vista general del procedimiento de purificación del inmunoconj ugado Fab-IL2-Fab 2B10 con 2B10 (ligante de TNC A2) como Fab, y (B) una SDS-PAGE (reducida, no reducida) del inmunoconj ugado Fab-IL2-Fab 2B10 purificado.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Definiciones A menos que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria de manera general presentan el mismo significado entendido comúnmente por el experto ordinario en la materia. Generalmente, la nomenclatura utilizada en la presente memoria y los procedimientos de laboratorio de cultivo celular, genética molecular, química de ácidos nucleicos e hibridación descritos posteriormente son aquellos bien conocidos y utilizados comúnmente en la técnica. Las técnicas y procedimientos estándares se llevan a cabo generalmente según métodos convencionales de la técnica y diversas referencias generales (ver de manera general Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold' Spring Harbor, N.Y., que se incorpora como referencia en la presente memoria) , que se proporcionan durante la totalidad del presente documento.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "inmunoconjugado" se refiere a una molécula de polipéptido que incluye por lo menos un grupo efector y por lo menos un grupo de unión a antígeno. En una realización, el inmunoconjugado comprende por lo menos un grupo efector de una cadena y por lo menos dos grupos de unión a antígeno. La molécula de unión a antigeno puede unirse al grupo efector mediante una diversidad de interacciones en una diversidad de configuraciones tal como se describe en la presente memoria. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "grupo efector" se refiere a un polipéptido, por ejemplo mediante transducción de señales u otras rutas celulares. Por consiguiente, el grupo efector de la invención puede asociarse a la señalización mediada por receptores que transmite una señal desde el exterior de la membrana celular para modular una respuesta en una célula que porta uno o más receptores del grupo efector. En una realización, un grupo efector puede inducir una respuesta citotóxica en células que portan uno o más receptores del grupo efector. En otra realización, un grupo efector puede inducir una respuesta proliferativa en células que portan uno o más receptores del grupo efector. En otra realización, un grupo efector puede inducir la diferenciación en células que portan receptores del grupo efector. En otra realización, un grupo efector puede alterar la expresión (es decir, regular positiva o negativamente) de una proteina celular endógena en células que portan receptores del grupo efector. Entre los ejemplos no limitativos de grupos efectores se incluyen citoquinas, factores de crecimiento, hormonas, enzimas, sustratos y cofactores. El grupo efector puede asociarse a un grupo de unión a antigeno en una diversidad de configuraciones para formar un inmunocon ugado .
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "citoquina" se refiere a una molécula que media y/o regula una función o proceso biológico o celular (por ejemplo la inmunidad, la inflamación y la hematopoyesis). El término "citoquina" ' tal como se utiliza en la presente memoria incluye "linfoquinas" , "quimoquinas" , "monoquinas" e "interleuquinas" . Entre los ejemplos de citoquinas útiles se incluyen, aunque sin limitación, GM-CSF, IL-la, IL-?ß, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IFN-á, IFN-ß, IFN-?, ???-?a, ???-?ß, TGF-ß, TNF- y TNF-ß .
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "de una cadena" se refiere a una molécula que comprende monómeros aminoácidos conectados linealmente mediante enlaces peptidicos. En una realización, el grupo efector es un grupo efector de una cadena. Entre los ejemplos no limitativos de grupos efectores de una cadena se incluyen citoquinas, factores de crecimiento, hormonas, enzimas, sustratos y cofactores. En el caso de que el grupo efector sea una citoquina y la citoquina de interés se encuentre normalmente en forma de multimero en la naturaleza, cada subunidad de la citoquina multimérica se encuentra secuencialmente codificada por la cadena única del grupo efector. Por consiguiente, entre los ejemplos no limitativos de grupos efectores de una cadena que resultan útiles se incluyen GM-CSF, IL-la, IL-?ß, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IFN-á, IFN-ß, IFN-?, ???-?a, ???-?ß, TGF-ß, TNF-OÍ y TNF-ß.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "grupo efector de control" se refiere a un grupo efector no conjugado. Por ejemplo, al comparar un inmunoconjugado de IL-2 de la presente invención con un grupo efector de control, el grupo efector de control es IL-2 no conjugada libre. De manera similar, por ejemplo, al comparar un inmunoconjugado de IL-2 de la presente invención con un grupo efector de control, éste es IL-2 no conjugado libre (por ejemplo presente en forma de proteina heterodimérica en la que las subunidades p40 y p35 comparten únicamente uno o más enlaces disulfuro) .
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "receptor de grupo efector" se refiere a una molécula de polipéptido capaz de unirse específicamente a un grupo efector. Por ejemplo, en el caso de que IL-2 sea el grupo efector, el receptor del grupo efector que se une a una IL-2 (por ejemplo un inmunoconj ugado que comprenda IL-2) es el receptor de IL-2. De manera similar, por ejemplo, en el caso de que IL-12 sea el grupo efector de un inmunoconjugado, el receptor del grupo efector es el receptor de IL-12. En el caso de un grupo efector que se una específicamente a más de un receptor, todos los receptores que se unen específicamente al grupo efector son "receptores de grupo efector" para dicho grupo efector.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "grupo de unión a antigeno" se refiere a una molécula de polipéptido que se une específicamente a un determinante antigénico. En una realización, un grupo de unión a antígeno es capaz de dirigir la entidad a la que se encuentra unido (por ejemplo un grupo efector o un segundo grupo de unión a antígeno) a un sitio diana, por ejemplo a un tipo específico de célula tumoral o estroma tumoral que porta el determinante antigénico. Entre los grupos de unión a antígeno se incluyen anticuerpos y fragmentos de los mismos, tal como se define adicionalmente en la presente memoria. La expresión "se une específicamente" se refiere a que la unión es selectiva para el antígeno y puede discriminarse de interacciones no deseadas o no específicas. En una' realización, el inmunoconj ugado comprende por lo menos un, típicamente dos o más, grupos de unión a antígeno con regiones constantes, tal como se define adicionalmente en la presente memoria y es conocido de la técnica. Entre las regiones constantes de cadena pesada que resultan útiles se incluyen cualquiera de los cinco isotipos: á, a, á, ?, or i . Entre las regiones constantes de cadena ligera que resultan útiles se incluyen cualquiera de los dos isotipos: é y é.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "determinante antigénico" es sinónima de "antígeno" y "epítopo", y se refiere a un sitio (por ejemplo un tramo contiguo de aminoácidos o una configuración conformacional constituida de diferentes regiones de aminoácidos no contiguos) en una macromolécula polipeptidica a la que se une un grupo de unión a antigeno, formando un complejo de grupo de unión a antigeno-antigeno.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "grupo de unión a antigeno de control" se refiere a un grupo de unión a antigeno tal como existiría libre de otros grupos de unión a antígeno y grupos efectores. Por ejemplo, al comparar un inmunoconjugado Fab-IL2-Fab de la invención con un grupo de unión a antígeno de control, el grupo de unión a antígeno de control es Fab libre, en el que el inmunoconjugado Fab-IL2-Fab y la molécula Fab libre pueden unirse ambas específicamente al mismo determinante antigénico .
Tal como se utiliza en la presente memoria, los términos "primer" y "segundo" con respecto a los grupos de unión a antígeno, grupos efectores, etc., se utilizan por conveniencia para distinguir en qué casos se encuentra presente más de uno de cada tipo de grupo. La utilización de dichas expresiones no pretende proporcionar un orden específico u orientación del inmunoconjugado a menos que ello se indique explícitamente.
En el caso de que existan dos o más defiiciones de una expresión que se utilice y/o se encuentre aceptada en la técnica, la definición del término utilizada en la presente memoria pretenderá incluir la totalidad de dichos sigificados, a menos que se indique explícitamente lo contrario. Un ejemplo específico es la utilización de la expresión "región determinante de complementariedad" ("CDR") para referirse a los sitios de unión a antígeno no contiguos presentes dentro de la región variable de polipéptidos tanto pesados como ligeros. Esta región particular ha sido descrita por Kabat et al., U.S. Dept . of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 1986, y por Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987, incorporándose como referencia en la presente memoria, en las que las definiciones incluyen residuos aminoácidos solapantes o subconjuntos de aminoácidos al compararlas entre sí. Sin embargo, la aplicación de cualquiera de las definiciones para referirse a una CDR de un anticuerpo o variantes de la misma pretende encontrarse comprendida dentro del alcance de la expresión según se define y se utiliza en la presente memoria. Los residuos aminoácidos apropiados que comprenden las CDRs tal como se definen en cada uan de las referencias citadas se proporcionan a continuación, en la Tabla 1, a modo comparativo. El número exacto de residuos que comprende una CDR particular varía dependiendo de la secuencia y tamaño de la CDR. El experto en la materia podrá determinar rutinariamente qué residuos comprende una CDR particular dada la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo .
TABLA 1. Definiciones de CDR1 1La numeración de todas las definiciones de CDR en la Tabla 1 sigue las convenciones de numeración proporcionadas por Kabat et al. (ver posteriormente). ' 2 "AbM" con una "b" minúscula, tal como se utiliza en la Tabla 1, se refiere a las CDRs según la definición del programa informático de modelado de anticuerpos "AbM" de Oxford Molecular.
Kabat et al. también han definido un sistema de numeración para las secuencias de dominio variable que resulta aplicable a cualquier anticuerpo. El experto ordinario en la materia podrá asignar inequívocamente este sistema de "numeración de Kabat" a cualquier secuencia de dominio variable sin basarse en ningún dato experimental más allá de la secuencia misma. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "numeración de Kabat" se refiere al sistema de numeración proporcionado por Kabat et al., U.S. Dept . of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 1983. A menos que se indique lo contrario, las referencias a la numeración de posiciones especificas de residuos aminoácidos en un grupo de unión a antigeno de la invención siguen el sistema de numeración de Kabat. Las secuencias polipeptidicas del listado de secuencias (es decir, los números de secuencia SEC ID n° 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 96, 97, etc.) no se han numerado según el sistema de numeración de Kabat. Sin embargo, se encuentra perfectamente comprendido dentro de los conocimientos del experto ordinario en la materia convertir la numeración de las secuencias del listado de secuencias a la numeración de Kabat .
Inmunoconjugados Los inmunoconj ugados son moléculas de polipéptido que comprenden por lo menos un grupo efector y por lo menos un grupo de unión a antigeno. En una realización, el grupo efector es un grupo efector de una cadena. En una realización, el inmunocon ugado comprende por lo menos dos grupos de unión a antigeno. Entre los grupos de unión a antigeno y grupos efectores del inmunoconj ugado se incluyen aquellos indicados en detalle en la presente memoria y posteriormente, y en las figuras adjuntas. El grupo de unión a antigeno del inmunoconj ugado puede dirigirse contra una diversidad de moléculas diana (por ejemplo un determinante antigénico sobre una molécula de proteina expresada sobre una célula tumoral o estroma tumoral) . Se proporcionan en la presente memoria ejemplos no limitativos de grupos de unión a antigeno. En una realización, el grupo o grupos de unión a antigeno se dirigen contra un determinante antigénico de uno o más de los polipéptidos representados en la Tabla 5, posteriormente en la presente memoria. Los inmunoconj ugados de la invención típicamente muestran una o más de las propiedades siguientes: elevada especificidad de acción, toxicidad reducida y/o estabilidad mejorada, particularmente en comparación con los inmunoconjugados conocidos de diferentes configuraciones que presentan como diana los mismos determinantes antigénicos y que portan los mismos grupos efectores.
En una ralización, el inmunoconj ugado comprende por lo menos un primer grupo efector y por lo menos un primer y segundo grupos de unión a antígeno. En una realización preferente, el primer grupo efector es un grupo efector de una cadena.
En una realización preferente, el primer y segundo grupos de unión a antigeno se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste de un Fv y un Fab. En una realización especifica, el primer grupo efector comparte un enlace peptidico amino-terminal o carboxi-terminal con un primer grupo de unión a antigeno, y un segundo grupo de unión a antigeno comparte un enlace peptidico amino-terminal o carboxi-terminal con: i) el primer grupo efector, o ii) el primer grupo de unión a antigeno. En otra realización, el inmunoconjugado consiste esencialmente de un primer grupo efector de una cadena y primer y segundo grupos de unión a antigeno .
En una realización, un primer grupo efector comparte un enlace peptidico carboxi-terminal con un primer grupo de unión a antigeno y comparte además un enlace peptidico amino-terminal con un segundo grupo de unión a antigeno. En otra realización, un primer grupo de unión a antigeno comparte un enlace peptidico carboxi-terminal con un primer grupo efector, preferentemente un grupo efector de una cadena, y comparte además un enlace peptidico amino-terminal con un segundo grupo de unión a antigeno. En otra realización, un primer grupo de unión a antigeno comparte un enlace peptidico amino-terminal con un primer grupo efector, preferentemente un grupo efector de una cadena, y comparte además un péptido carboxi-terminal con un segundo grupo de unión a antigeno.
En una realización, un grupo efector,. preferentemente un grupo efector de una cadena, comparte un enlace peptidico carboxi-terminal con una primera región variable de cadena pesada, y comparte además un enlace peptidico amino-terminal con una segunda región variable de cadena pesada. En otra realización, un grupo efector, preferentemente un grupo efector de una cadena, comparte un enlace peptidico carboxi-terminal con una primera región variable de cadena ligera y comparte además un péptido amino-terminal con una segunda región variable de cadena ligera. En otra realización, se une una primera región variable de cadena pesada o ligera mediante un enlace peptidico carboxi-terminal a un primer grupo efector, preferentemente un grupo efector de uan cadena, y se une adicionalmente mediante un enlace peptidico amino-terminal a una segunda región variable de cadena pesada o ligera. En otra realización, se une una primera región variable de cadena pesada o ligera mediante un enlace peptidico amino-terminal a un primer grupo efector, preferentemente un grupo efector de una cadena, y se une adicionalmente mediante un enlace peptidico carboxi-terminal a una segunda región variable de cadena pesada o ligera.
En una realización, un grupo efector, preferentemente un grupo efector de una cadena, comparte un enlace peptidico carboxi-terminal con una cadena pesada o ligera de un primer Fab y comparte además un enlace peptidico amino-terminal con una cadena pesada o ligera de un segundo Fab. En otra realización, una cadena pesada o ligera de un primer . Fab comparte un enlace peptidico carboxi-terminal con un primer grupo efector de una cadena y comparte además un enlace peptidico amino-terminal con una cadena pesada o ligera de un segundo Fab. En otras realizaciones, una cadena pesada o ligera de un primer Fab comparte un enlace peptidico amino-terminal con un primer grupo efector de una cadena y comparte además un enlace peptidico carboxi-terminal con una cadena pesada o ligera de un segundo Fab.
En una realización, el inmunocon ugado comprende por lo menos un primer grupo efector que comparte un enlace peptidico amino-terminal con una o más moléculas scFv y en el que el primer grupo efector comparte un enlace peptidico carboxi-terminal con una o más moléculas scFv. En una realización preferente, el grupo efector es un grupo efector de una cadena .
En otra realización, el inmunoconj ugado comprende por lo menos un primer grupo efector, preferentemente un grupo efector de una cadena, y primer y segundo grupos de unión a antigeno, en los que cada uno de los grupos de unión a antigeno incluye una molécula scFv unida en su aminoácido carboxi-terminal a una región constante que incluye un dominio constante de inmunoglobulina, y en los que el primer grupo de unión a antígeno se encuentra unido en su aminoácido carboxi-terminal de región constante al aminoácido amino-terminal del primer grupo efector, y en los que el primer y segundo grupos de unión a antigeno se encuentran covalentemente unidos mediante por lo menos un enlace disulfuro. En una realización preferente, la región constante se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste de los dominios CH1 de IgG, CH2 de IgG, CH3 de IgG, Ckappa de IgG, Ciambda de IgG y CH4 de IgE. En una realización, el dominio de inmunoglobulina del primer grupo de unión a antigeno se encuentra covalentemente unido al dominio de inmunoglobulina del segundo grupo de unión a antigeno mediante un enlace disulfuro. En una realización, por lo menos un enlace disulfuro se localiza en el lado carboxi-terminal de los dominios de inmunoglobulina del primer y segundo grupos de unión a antigeno. En otra realización, por lo menos un enlace disulfuro se localiza en el lado amino-terminal de los dominios de inmunoglobulina del primer y segundo grupos de unión a antigeno. En otra realización, por. lo menos dos enlaces disulfuro se localizan en el lado amino-terminal de los dominios de inmunoglobulina del primer y segundo grupos de unión a antigeno.
En una realización especifica, el inmunoconj ugado comprende primer y segundo grupos de unión a antigeno, comprendiendo, cada uno, una molécula scFv unida en su aminoácido carboxi-terminal a una región constante que comprende un dominio CH1 de IgG, en el ' que el primer grupo de unión a antigeno se encuentra unido en su aminoácido carboxi-terminal de región constante al aminoácido amino-terminal del primer grupo efector, preferentemente un grupo efector de una cadena, y en el que el primer y segundo grupos de unión a antigeno se encuentran covalentemente unidos mediante por lo menos un enlace disulfuro. El segundo grupo de unión a antigeno del inmunoconj ugado puede unirse además en su aminoácido carboxi-terminal al aminoácido amino-terminal de un segundo grupo efector. En una realización, el segundo grupo efector es un grupo efector de una cadena.
En una realización especifica, el inmunoconj ugado comprende primer y segundo grupos de unión a antigeno, comprendiendo, cada uno, una molécula scFv unida en su aminoácido carboxi-terminal a una región constante que comprende un dominio Ckappa de IgG, en el que el primer grupo de unión a antigeno se une en su aminoácido carboxi-terminal de región constante al aminoácido amino-terminal del primer grupo efector, preferentemente un grupo efector de una cadena, y en el que el primer y segundo grupos de unión a antigeno se encuentran unidos covalentemente mediante por lo menos un enlace disulfuro. El segundo grupo de unión a antigeno del inmunoconj ugado puede unirse además en su aminoácido carboxi-terminal al aminoácido amino-terminal de un segundo grupo efector. En una realización, el segundo grupo efector es un grupo efector de una cadena.
En otra realización especifica, el inmunocon ugado comprende primer y segundo grupos de unión a antigeno, comprendiendo, cada uno, una molécula scFv unida en su aminoácido carboxi-terminal a una región constante que comprende un dominio CH4 de IgE, en el que el primer grupo de unión a antigeno se une en su aminoácido carboxi-terminal de región constante al aminoácido amino-terminal del primer grupo efector, preferentemente un grupo efector de uan cadena, y en el que el primer y segundo grupos de unión a antigeno se encuentran covalentementé unidos mediante por lo menos un enlace disulfuro. El segundo grupo de unión a antigeno del inmunoconjugado puede unirse además en su aminoácido carboxi-terminal al aminoácido amino-terminal de un segundo grupo efector. En una realización, el segundo grupo efector es un grupo efector de una cadena.
En otra realización especifica, el inmunoconj ugado comprende primer y segundo grupos de unión a antigeno, comprendiendo, cada uno, una molécula scFv unida en su aminoácido carboxi-terminal a un dominio CH3 de IgE, en el que el primer grupo de unión a antigeno se une en su aminoácido carboxi-terminal al aminoácido amino-terminal del primer grupo efector, preferentemente un grupo efector de una cadena, y en el que el primer y segundo grupos de unión a antigeno se encuentra unidos covalentementé mediante por lo menos un enlace disulfuro. El segundo grupo de unión a antigeno del inmunoconj ugado puede unirse además en su aminoácido carboxi-terminal al aminoácido amino-terminal de un segundo grupo efector. En una realización, el segundo grupo efector es un grupo efector de una cadena.
En otra realización, el inmunoconj ugado comprende primer y segundo grupos efectores, y primer y segundo grupos de unión a antígeno, en los que cada uno de los grupos de unión a antigeno comprenden una molécula Fab unida en su aminoácido carboxi-terminal de cadena pesada o ligera a un dominio CH3 de IgGl, y en los que cada uno de los dominios CH3 de IgGl se encuentra unido a su aminoácido carboxi-terminal respectivo en el aminoácido amino-terminal de uno de los grupos efectores, y en los que el primer y segundo grupos de unión a antigeno se encuentran covalentemente unidos mediante por lo menos un enlace disulfuro. En una realización preferente, el primer y/o segundo grupos efectores es un grupo efector de una cadena. En una realización adicional, los dominios CH3 de IgGl de los grupos de unión a antigeno pueden unirse mediante enlaces disulfuro. En otra realización, por lo menos un enlace disulfuro se localiza en el lado carboxi-terminal de los dominios CH3 de IgGl del primer y segundo grupos de unión a antigeno. En otra realización, por lo menos un enlace disulfuro se localiza en el lado amino-terminal de los dominios CH3 de IgGl del primer y segundo grupos de unión a antigeno. En otra realización, por lo menos dos enlaces disulfuro se localizan en el lado amino-terminal de los dominios CH3 de IgGl del primer y segundo grupos de unión a antigeno.
En otra realización, el inmunoconj ugado comprende uno o más sitios de corte proteolitico localizados entre grupos efectores y grupos de unión a antigeno.
Los componentes del inmunoconjugado (por ejemplo grupos de unión a antigeno y/o grupos efectores) pueden unirse directamente o mediante diversos linkers (por ejemplo linkers péptidos que comprenden uno o más aminoácidos, típicamente aproximadamente 2 a 10 aminoácidos) que se indican en la presente' memoria o que son conocidos de la técnica.
En una realización particular, el inmunoconjugado presenta una estabilidad mejorada en solución, particularmente en comparación con preparaciones de inmunoconjugado conocidas. En una realización, el inmunoconj ugado se une a un determinante antigénico con una constante de disociación (KD) que es por lo menos aproximadamente, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 25 veces inferior a la de un grupo de unión a antígeno de control. En una realización más específica, el inmunoconj ugado se une a un determinante antigénico con una KD que es aproximadamente 10 veces inferior a la de un grupo de unión a antígeno de control. En una realización, el inmunoconj ugado se une a un determinante antigénico con una KD que es inferior a aproximadamente 10 nM, inferior a aproximadamente 1 nM, o inferior a aproximadamente 0,1 nM. En otra realización, el inmunoconj ugado presenta un perfil de seguridad superior en comparación con preparaciones de inmunoconj ugado conocidas. El inmunoconj ugado preferentemente induce menos efectos secundarios y menos severos, tales como toxicidad, destrucción de células no tumorales, etc. La reducción de los efectos secundarios puede atribuirse a una afinidad de unión reducida de los inmunoconj ugados de la invención para los receptores de grupo efector. En una realización, el inmunoconj ugado se une a un receptor de grupo efector con una KD que es por lo menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 25 veces superior a la de un grupo efector de control. En una realización más especifica, el inmunoconj ugado se une a un receptor de grupo efector con una KD que es aproximadamente 2 veces superior a la de un grupo efector de control. En otra realización, el inmunoconj ugado se une a un receptor de grupo efector con una KD que es aproximadamente 10 veces superior a la de un grupo efector de control. En otra realización, el inmunoconj ugado se une a un receptor de grupo efector con una KD que es por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 veces superior a la de un grupo efector correspondiente en una molécula de inmunoconj ugado "diacuerpo". En otra realización, el inmunoconj ugado se une a un receptor de grupo efector con una constante de disociación, KD, que es aproximadamente 10 veces superior a la de un grupo efector correspondiente en un inmunoconjugado "diacuerpo" .
En otra realización, el inmunoconjugado presenta una eficacia superior, particularmente en comparación con preparaciones de inmunoconjugado conocidas. En una realización, el inmunoconj ugado es más capaz de inhibir incrementos de volumen tumoral in vivo y/o más capaz de prolongar la supervivencia en mamíferos que presentan tumores malignos. En una realización, el inmunoconj ugado inhibe un incremento del volumen tumoral in vivo en por lo menos aproximadamente 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ó 100% alcanzado el final del periodo de administración, de aproximadamente por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, '6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 dias. En una realización, el inmunoconj ugado inhibe un incremento del volumen tumoral in vivo en por lo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70% ó 75% alcanzado el final de un periodo de administración de 13 días. En otra realización, el inmunoconj ugado prolonga la supervivencia de mamíferos que presentan tumores malignos en por lo menos aproximadamente %, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ó 95% al administrarse en un mamífero que lo necesita, en comparación con un grupo efector de control. En otra realización, el inmunoconjugado prolonga la supervivencia de mamíferos que presentan tumores malignos en por lo menos 30%, 32% ó 35% al administrarlo en un mamífero que lo necesita, en comparación con un grupo efector de control. En otra realización, el inmunoconjugado prolonga la supervivencia de mamíferos que presentan tumores malignos en aproximadamente 30% al administrarlo en un mamífero que lo necesita, en comparación con un grupo efector de control. En otra realización, el inmunoconjugado prolonga la supervivencia de mamíferos que presentan tumores malignos en por lo menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ó 95% al administrarlo en un mamífero que lo necesita, en comparación con un grupo efector en una molécula de inmunoconj ugado "diacuerpo". En otra realización, el inmunoconjugado prolonga la supervivencia de mamíferos que presentan tumores malignos en por lo menos 30%, 32% ó 35% al administrarlo en un mamífero que lo necesita, en comparación con un grupo efector en una molécula de inmunoconjugado "diacuerpo". En otra realización, el inmunoconjugado prolonga la supervivencia de mamíferos que presentan tumores malignos en aproximadamente 30% al administrarlo en un mamífero que lo necesita, en comparación con un grupo efector en una molécula de inmunoconjugado "diacuerpo". En otra realización, el inmunoconjugado prolonga la supervivencia de mamíferos que presentan tumores malignos en por lo menos 5%, 10% ó 15% en comparación con un grupo efectar de control o de un grupo efector en una molécula de inmunocon ugado "diacuerpo".
Grupos de unión a antigeno El grupo de unión a antígeno del inmunoconj ugado de la invención es generalmente una molécula de polipéptido que se une a un determinante antigénico específico y es capaz de dirigir la entidad a la que se une (por ejemplo un grupo efector o un segundo grupo de unión a antígeno) a un sitio diana, por ejemplo a un tipo específico de célula tumoral o estroma tumoral que porta el determinante antigénico. El inmunoconj ugado puede unirse a determinantes antigénicos presentes, por ejemplo, sobre las superficies de las células tumorales, sobre las superficies de las células infectadas por virus, sobre las superficies de otras células enfermas, libres en suero sanguíneo, y/o en la matriz extracelular (ECM) .
Entre los ejemplos no limitativos se incluyen MAGE, MART-1/Melan-A, gplOO, dipeptidil peptidasa IV (DPPIV), proteína de unión a adenosina desaminasa (AD Abp) , ciclofilina b, antígeno asociado a cáncer colorrectal (CRC) -C017-1A/GA733, antígeno carcinoembrionario (CEA) y sus epítopos inmunogénicos CAP-1 y CAP-2, etv6, amll, antigeno especifico de próstata (PSA) y sus epitopos inmunogénicos PSA-1, PSA-2 y PSA-3, ¦ antigeno membranal especifico de próstata (PSMA), receptor de células T/cadena CD3-zeta, familia MAGE de 5 antigenos tumorales (por ejemplo MAGE-A1, MAGE-A2 , MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, AGE-A8 , MAGE-A9 , AGE- A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE- B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4 ) , MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-C5) , familia GAGE de antigenos tumorales (por ejemplo 10 GAGE-1, GAGE-2 , GAGE-3 , GAGE-4 , GAGE-5 , GAGE-6, GAGE-7 , GAGE- 8, GAGE-9) , BAGE, RAGE, LAGE-1 , NAG, GnT-V, UM-1, CDK4, tirosinasa, p53, familia MUC, HER2/neu, p21ras, RCAS1, á- fetoproteina, E-cadherina, á-catenina, ß-catenina y ?- catenina, pl20ctn, gplOO Pmelll7, PRAME, NY-ESO-1, cdc27, _. proteina de la poliposis adenomatosa coli (APC) , fodrina, b conexina 37, idiotipo Ig, pl5, gp75, gangliósidos Gm2 y GD2, productos víricos, tales como las proteínas del virus del papiloma humano, familia Smad de antígenos tumorales, lmp-1, PIA, antígeno 1 nuclear codificado por el EBV (EBNA) , 20 glucógeno fosforilasa cerebral, SSX-1, SSX-2 (HOM-MEL-40) , SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1 y CT-7 y c-erbB-2.
Entre los ejemplos no limitativos de antígenos víricos se incluyen la hemaglutinina del virus influenza, LMP-1 del virus de Epstein-Barr, la glucoproteína E2 del virus de la 25 hepatitis C, gpl60 del VIH y gpl20 del VIH.
Entre los ejemplos no limitativos de los antigenos de ECM se incluyen sindecan, heparanasa, integrinas, osteopontina, link, cadherinas, laminiria, EGF de tipo laminina, lectina, fibronectina, notch, tenascina y matrixina.
Los inmunoconj ugados de la invención pueden unirse a los ejemplos no limitativos específicos siguientes de antigenos de superficie celular: FAP, Her2, EGFR, CD2 (antigeno de superficie de células T) , CD3 (heteromultímero asociado al TCR) , CD22 (receptor de células B) , CD23 (receptor de IgE de baja afinidad) , CD25 (receptor á del receptor de IL-2) , CD30 (receptor de citoquina) , CD33 (antigeno de superficie de célula mieloide) , CD40 (receptor del factor de necrosis tumoral), IL-6R (receptor de IL6) , CD20, MCSP y PDGFfrR (receptor ß del factor de crecimiento derivado de plaquetas) . En una realización, el inmunoconj ugado de la invención comprende dos o más grupos de unión a antigeno, en los que cada uno de dichos grupos de unión a antigeno se une específicamente al mismo determinante antigénico. En otra realización, el inmunoconj ugado de la invención comprende dos o más grupos de unión a antígeno, en los que cada uno de dichos grupos de unión a antígeno se une específicamente a diferentes determinantes antigénicos.
El grupo de unión a antígeno puede ser cualquier tipo de anticuerpo o fragmento del mismo que conserve la unión específica a un determinante antigénico. Entre los fragmentos de anticuerpo se incluyen, aunque sin limitación, fragmentos de VH, fragmentos de VL, fragmentos Fab, fragmentos F(ab' )2, fragmentos scFv, fragmentos Fv, minicuerpos, diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos (ver, por ejemplo, Hudson y Souriau, Nature Med. 9: 129-134, 2003).
En una realización, el inmunoconj ugado comprende por lo menos un grupo de unión a antígeno, típicamente dos o más, que son específicos para el dominio extra B de la fibronectina (EDB) . En otra realización, el inmunoconj ugado comprende por lo menos un grupo de unión a antígeno, típicamente dos o más, que pueden competir con el anticuerpo monoclonal L19 para la unión a un epítopo de EDB (ver, por ejemplo, la publicación de patente PCT n° WO 2007/128563 Al (incorporada como referencia en la presente memoria en su totalidad) ) . En todavía otra realización, el inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una primera cadena pesada de Fab derivada del anticuerpo monoclonal L19 comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una molécula de IL-2 que, a su vez, comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una segunda cadena pesada de Fab derivada del anticuerpo monoclonal L19. En todavía otra realización, el inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una primera cadena pesada de Fab derivada del anticuerpo monoclonal L19 comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una molécula de IL-12 que, a su vez, comparte un enlace peptidico carboxi-terminal con una segunda cadena pesada de Fab derivada del anticuerpo monoclonal L19. En todavía otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una primera cadena pesada de Fab derivada del anticuerpo monoclonal L19 comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una molécula de IFN á que, a su vez, comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una segunda cadena pesada de Fab derivada del anticuerpo monoclonal L19. . En todavía otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una primera cadena pesada de Fab derivada del anticuerpo monoclonal L19 comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una molécula de GM-CSF que, a su vez, comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una segunda cadena pesada de Fab derivada del anticuerpo monoclonal L19. En una realización adicional, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que un primer scFv derivado del anticuerpo monoclonal L19 comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una molécula de IL-2 que, a su vez, comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con un segundo scFv derivado del anticuerpo monoclonal L19. En una realización más específica, el inmunoconjugado comprende la secuencia polipeptídica SEC ID n° 95 ó una variante de la misma que conserva funcionalidad. En otra realización, el inmunoconjugado comprende una cadena ligera de Fab derivada del anticuerpo monoclonal L19. En una realización más especifica, el inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptidica que es por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 96 ó una variante de la misma que conserva funcionalidad. En todavía otra realización, el inmunoconj ugado comprende dos secuencias polipeptídicas que son por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 95 y SEC ID n° 96 ó variantes de la misma que conservan funcionalidad. En una realización más específica, el inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptidica que es por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 104 ó una variante de la misma' que conserva funcionalidad. En todavía otra realización, el inmunoconj ugado comprende dos secuencias polipeptídicas que son por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 104 y SEC ID n° 96 ó variantes de la misma que conservan funcionalidad. En una realización más específica, el inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptidica que es por lo menos 80%, 85%_, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 105 ó una variante de la misma que conserva funcionalidad. En todavía otra realización, el inmunoconj ugado comprende dos secuencias polipeptídicas que son por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 105 y SEC ID n° 96 ó variantes de la misma que conservan funcionalidad. En una realización más especifica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptidica que es por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 106 ó una variante de la misma que conserva funcionalidad. En todavía otra realización, el inmunoconjugado comprende dos secuencias polipeptídicas que son por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó' 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 106 y SEC ID n° 96 ó variantes de la misma que conservan funcionalidad. En una realización más específica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptidica que es por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 107 ó una variante de la misma que conserva funcionalidad. En todavía otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptidica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 107 y SEC ID n° 96 ó variantes de la misma que conservan funcionalidad. En otra realización específica, los polipéptidos se encuentran unidos covalentemente, por ejemplo mediante un enlace disulfuro.
En una realización, el inmunoconjugado de la invención comprende por lo menos un grupo de unión a antigeno, típicamente dos o más, que son específicos para el dominio Al de la tenascina (TNC-A1) . En otra realización, el inmunoconj ugado comprende por lo menos un grupo de unión a antígeno, típicamente dos o más, que pueden competir con el anticuerpo monoclonal F16 para la unión a un epítopo de TNC-Al (ver, por ejemplo, la publicación de patente PCT n° WO 2007/128563 Al (incorporada en la presente memoria como referencia en su totalidad) ) . En una realización, el inmunoconjugado comprende por lo menos un grupo de unión a antígeno, típicamente dos o más que son específicos para el dominio Al y/o A4 de la tenascina (TNC-A1 o TNC-A4 o TNC-A1/A4). En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que un primera cadena pesada de Fab específica para el dominio Al de la tenascina comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una molécula de IL-2, una molécula de IL-12, una molécula de IFN-a o una molécula de GM-CSF, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una segunda cadena pesada de Fab específica para el dominio Al de la tenascina. En todavía otra realización, el inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una primera cadena pesada de Fab específica para el dominio Al de la tenascina comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una molécula de IL-2 que, a su vez, comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una segunda cadena pesada de Fab específica para el dominio Al de la tenascina. En una realización adicional, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que un primer scFv específica para el dominio Al de la tenascina comparte un enlace peptidico carboxi-terminal con una molécula de IL-2 que, a su vez, comparte un enlace peptidico carboxi-terminal con un segundo scFv específico para el dominio Al de la tenascina. En una realización específica, los grupos de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 13 ó a la secuencia SEC ID n° 15, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En otra realización específica, los grupos de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 9 ó a la secuencia SEC ID n° 11, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En una realización más específica, los grupos de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 13 ó a la secuencia SEC ID n° 15 ó variantes de las mismas que conservan funcionalidad, y una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 9 ó a la secuencia SEC ID n° 11 ó variantes de la misma que conservan funcionalidad. En otra realización específica, la secuencia de región variable de cadena pesada de los grupos de unión a antígeno del inmunoconjugado se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia SEC ID n° 14 ó a la secuencia SEC ID n° 16. En todavía otra realización específica, la secuencia de región variable de cadena pesada de los grupos de unión a antígeno del inmunoconjugado se encuentra codificada por la secuencia polinucleótida de la secuencia SEC ID n° 14 ó a la secuencia SEC ID n° 16. En otra realización específica, la secuencia de región variable de cadena ligera de los grupos de unión a antígeno del inmunoconj ugado se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia SEC ID n° 10 ó a la secuencia SEC ID n° 12. En todavía otra realización específica, la secuencia de región variable de cadena ligera de los grupos de unión a antígeno del inmunoconjugado se encuentra codificada . por la secuencia polinucleótida de la secuencia SEC ID n° 10 ó a la secuencia SEC ID n° 12. En una realización específica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptidica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 99 ó variantes de la misma que conservan funcionalidad. En otra realización especifica, el inmunoconjugado de la invención comprende una secuencia polipeptidica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 100 ó a la secuencia SEC ID n° 215, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En todavía otra realización especifica, el inmunoconjugado de la invención comprende una secuencia polipeptidica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 101 ó a la secuencia SEC ID n° 235 ó variantes de la misma que conservan funcionalidad. En una realización más especifica, el inmunoconj ugado de la presente invención comprende dos secuencias polipeptidicas que son por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 100 y SEC ID n° 101 ó variantes de la misma que conservan funcionalidad. En otra realización especifica, el inmunoconjugado de la presente invención comprende dos secuencias polipeptidicas que son por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 215 y SEC ID n° 235 ó variantes de la misma que conservan funcionalidad. En una realización especifica, el inmunocon ugado comprende una secuencia polipeptidica codificada por una secuencia polinucleótida .que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia SEC ID n° 112. En otra realización especifica, el inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptidica codificada por la secuencia polinucleótida de secuencia SEC ID n° 112. En otra realización especifica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptidica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia SEC ID n° 113 ó a la secuencia SEC ID n° 216. En todavía otra realización específica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptidica codificada por la secuencia polinucleótida de secuencia. SEC ID n° 113 ó a la secuencia SEC ID n° 216. En otra realización específica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptidica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia SEC ID n° 114 ó a la secuencia SEC ID n° 236. En todavía otra realización, el inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptidica codificada por la secuencia polinucleótida de la secuencia SEC ID n° 114 ó a la secuencia SEC ID n° 236.
En una realización, el inmunoconjugado comprende por lo menos un grupo de unión a antigeno, típicamente dos o más que son específicos para el dominio A2 de la tenascina (TNC-A2). En otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una primera cadena pesada de Fab específica para el dominio A2 de la tenascina comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una molécula de IL-2, una molécula de IL-2, una molécula de IFN j¾ o una molécula de GM-CSF, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una segunda cadena pesada de Fab específica para el dominio A2 de la tenascina. En todavía otra realización, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una primera cadena pesada de Fab específica para el dominio A2 de la tenascina comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una molécula de IL-2, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una segunda cadena pesada de Fab específica para el dominio A2 de la tenascina. En una realización específica, los grupos de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID n° 7, SEC ID n° 179, SEC ID n° 183, SEC ID n° 187, SEC ID n° 191, SEC ID n° 195, SEC ID n° 199, SEC ID n° 203 y SEC ID n° 207, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En otra realización específica, los grupos de unión a antigeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de las secuencias SEC ID n° 3, SEC ID n° 5, SEC ID n° 177, SEC ID n° 181, SEC ID n° 185, SEC ID n° 189, SEC ID n° 193, SEC ID n° 197, SEC ID n° 201 y SEC ID n° 205, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En una realización más especifica, los grupos de unión a antigeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID n° 7, SEC ID n° 179, SEC ID n° 183, SEC ID n° 187, SEC ID n° 191, SEC ID n° 195, SEC ID n° 199, SEC ID n° 203 y SEC ID n° 207, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad, y una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de las secuencias SEC ID n° 3, SEC ID n° 5, SEC ID n° 177, SEC ID n° 181, SEC ID n° 185, SEC ID n° 189, SEC ID n° 193, SEC ID n° 197, SEC ID n° 201 y SEC ID n° 205, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En otra realización especifica, la secuencia de región variable de cadena pesada de los grupos de unión a antigeno del inmunoconj ugado se encuentra codificada por 'una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ó 99% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID n° 8, SEC ID n° 180, SEC ID n° 184, SEC ID n° 188, SEC ID n° 192, SEC ID n° 196, SEC ID n° 200, SEC ID n° 204 y SEC ID n° 208. En todavía otra realización específica, la secuencia de región variable de cadena pesada de los grupos de unión a antígeno del inmunoconj ugado se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida seleccionada de entre el grupo de las secuencias SEC ID n° 8, SEC ID n° 180, SEC ID n° 184, SEC ID n° 188, SEC ID n° 192, SEC ID n° 196, SEC ID n° 200, SEC ID n° 204 y SEC ID n° 208. En otra realización específica, la secuencia de región variable de cadena ligera de los grupos de unión a antígeno del inmunoconj ugado se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID n° 4, SEC ID n° 6, SEC ID n° 178, SEC ID n° 182, SEC ID n° 186, SEC ID n° 190, SEC ID n° G94, SEC ID n° 198, SEC ID n° 202 y SEC ID n° 206. En todavía otra realización específica, la secuencia de región variable de cadena ligera de los grupos de unión a antígeno del inmunoconj ugado se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID n° 4, SEC ID n° 6, SEC ID n° 178, SEC ID n° 182, SEC ID n° 186, SEC ID n° 190, SEC ID n° 194, SEC ID n° 198, SEC ID n° 202 y SEC ID n° 206. En una realización especifica, el inmunoconjugado de la invención comprende una secuencia polipeptidica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID n° 239, SEC ID n° 241 y SEC ID n° 243, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En otra realización especifica, el inmunoconjugado de la invención comprende una secuencia polipeptidica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de las secuencias SEC ID n° 245, SEC ID n° 247 y la secuencia SEC ID n° 249, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En una realización más especifica, el inmunoconjugado de la presente invención comprende una secuencia polipeptidica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID n° 239, SEC ID n° 241 y SEC ID n° 243 ó variantes de las mismas que conservan funcionalidad, y una secuencia polipeptidica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID n° 245, SEC ID n° 247 y SEC ID n° 249 ó variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En otra realización especifica, el inmunoconjugado de la presente invención comprende dos secuencias polipeptidicas que son por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 239 y la secuencia SEC ID n° 247 ó a la secuencia SEC ID n° 249, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En todavía otra realización específica, el inmunoconj ugado de la presente invención comprende dos secuencias polipeptidicas que son por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idénticas a la secuencia SEC ID n° 241 y a la secuencia SEC ID n° 245 ó a la secuencia SEC ID n° 247, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En otra realización específica, el inmunoconj ugado de la presente invención comprende dos secuencias polipeptidicas que son por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 243 y SEC ID n° 245, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En una realización específica, el inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID n° 240, SEC ID n° 242 y SEC ID n° 244.
En otra realización específica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleótida seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID n° 240, SEC ID n° 242 y SEC ID n° 244. En otra realización específica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de las secuencias SEC ID n° 246, SEC ID n° 248 y SEC ID n° 250. En todavía otra realización específcia, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleótida seleccionada de entre el grupo de las secuencias SEC ID n° 246, SEC ID n° 248 y SEC ID n° 250. En una realización, el inmunoconj ugado comprende por lo menos un grupo de unión a antígeno, típicamente dos o más que son específicos para la proteína activada por fibroblastos (FAP) . En otra realización, el inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una primera cadena pesada de Fab específica para FAP comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una molécula de IL-2, una molécula de IL-12, una molécula de IFN-a o una molécula de GM-CSF, que a su vez comparten un enlace peptídico carboxi-terminal con una segunda cadena pesada de Fab específica para FAP. En todavía otra realización, el inmunocon ugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una primera cadena pesada de Fab específica para FAP comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una molécula de IL-2, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una segunda cadena pesada de Fab específica para FAP. En otra realización, el inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una primera cadena pesada de Fab específica para FAP comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una molécula de IL-12, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una segunda cadena pesada de Fab específica para FAP. En una realización específica, los grupos de unión a antígeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de las secuencias SEC ID n° 21, SEC ID n° 25, SEC ID n° 27, SEC ID n° 31, SEC ID n° 35, SEC ID n° 39, SEC ID n° 43, SEC ID n° 47, SEC ID n° 51, SEC ID n° 69, SEC ID n° 73, SEC ID n° 77, SEC ID n° 81, SEC ID n° 85, SEC ID n° 89, SEC ID n° 93, SEC ID n° 123, SEC ID n° 127, SEC ID n° 131, SEC ID n° 135, SEC ID n° 139, SEC ID n° 143, SEC ID n° 147, SEC ID n° 151, SEC ID n° 155, SEC ID n° 159, SEC ID n° 163, SEC ID n° 167, SEC ID n° 171 y SEC ID n° 175, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En otra realización específica, los grupos de unión a antigeno del inmunoconj ugado comprenden una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de las secuencias: SEC ID n° 17, SEC ID n° 19, SEC ID n° 23, SEC ID n° 29, SEC ID n° 33, SEC ID n° 37, SEC ID n° 41, SEC ID n° 45, SEC ID n° 49, SEC ID n° 67, SEC ID n° 71, SEC ID n° 75, SEC ID n° 79, SEC ID n° 83, SEC ID n° 87, SEC ID n° 91, SEC ID n° 121, SEC ID n° 125, SEC ID n° 129, SEC ID n° 133, SEC ID n° 137, SEC ID n° 141, SEC ID n° 145, SEC ID n° 149, SEC ID n° 153, SEC ID n° 157, SEC ID n° 161, SEC ID n° 165, SEC ID n° 169 y SEC ID n° 173, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En una realización más especifica, los grupos de unión a antigeno del inmunocon ugado comprenden una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de las secuencias SEC ID n° 21, SEC ID n° 25, SEC ID n° 27, SEC ID n° 31, SEC ID n° 35, SEC ID n° 39, SEC ID n° 43, SEC ID n° 47, SEC ID n° 51, SEC ID n° 69, SEC ID n° 73, SEC ID n° 77, SEC ID n° 81, SEC ID n° 85, SEC ID n° 89, SEC ID n° í 33, SEC ID n° 123, SEC ID n° 127, SEC ID n° 131 , SEC ID n° 135, SEC ID n° 139, SEC ID n° 143, SEC ID n° 147, SEC ID n° 151, SEC ID n° 155, SEC ID n° 159, SEC ID n° 163, SEC ID n° 167, SEC ID n° 171 y SEC ID n° 175, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad, y una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de las secuencias: SEC ID n° 17, SEC ID n° 19, SEC ID n° 23, SEC ID n° 29, SEC ID n° 33, SEC ID n° 37, SEC ID n° 41, SEC ID n° 45, SEC ID n° 49, SEC ID n° 67, SEC ID n° 71, SEC ID n° 75, SEC ID n° 79, SEC ID n° 83, SEC ID n° 87, SEC ID n° 91, SEC ID n° 121, SEC ID n° 125, SEC ID n° 129, SEC ID n° 133, SEC ID n° 137, SEC ID n° 141, SEC ID n° 145, SEC ID n° 149, SEC ID n° 153, SEC ID n° 157, SEC ID n° 161, SEC ID n° 165, SEC ID n° 169 y SEC ID n° 173, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En otra realización especifica, la secuencia de región variable de cadena pesada de los grupos de unión a antigeno del inmunocon ugado se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de las secuencias: SEC ID n° 22, SEC ID n° 26, SEC ID n° 28, SEC ID n° 32, SEC ID n° 36, SEC ID n° 40, SEC ID n° 44, SEC ID n° 48, SEC ID n° 52, SEC ID n° 70, SEC ID n° 74, SEC ID n° 78, SEC ID n° 82, SEC ID n° 86, SEC ID n° 90, SEC ID n° 94, SEC ID n° 124, SEC ID n° 128, SEC ID n° 132, SEC ID n° 136, SEC ID n° 140, SEC ID n° 144, SEC ID n° 148, SEC ID n° 152, SEC ID n° 156, SEC ID n° 160, SEC ID n° 164, SEC ID n° 168, SEC ID n° 172 y SEC ID n° 176. En todavía otra realización especifica, la secuencia de región variable de cadena pesada de los grupos de unión a antígeno del inmunoconjugado se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida seleccionada de entre el grupo gue consiste de las secuencias: SEC ID n° 22, SEC ID n° 26, SEC ID n° 28, SEC ID n° 32, SEC ID n° 36, SEC ID n° 40, SEC ID n° 44, SEC ID n° 48, SEC ID n° 52, SEC ID n° 70, SEC ID n° 74, SEC ID n° 78, SEC ID n° 82, SEC ID n° 86, SEC ID n° 90, SEC ID n° 94, SEC ID n° 124, SEC ID n° 128, SEC ID n° 132, SEC ID n° 136, SEC ID n° 140, SEC ID n° 144, SEC ID n° 148, SEC ID n° 152, SEC ID n° 156, SEC ID n° 160, SEC ID n° 164, SEC ID n° 168, SEC ID n° 172 y SEC ID n° 176. En otra realización específica, la secuencia de región variable de cadena ligera de los grupos de unión a antígeno del inmunoconjugado se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de las secuencias: SEC ID n° 18, SEC ID n° 20, SEC ID n° 24, SEC ID n° 30, SEC ID n° 34, SEC ID n° 38, SEC ID n° 42, SEC ID n° 46, SEC ID n° 50, SEC ID n° 68, SEC ID n° 72, SEC ID n° 76, SEC ID n° 80, SEC ID n° 84, SEC ID n° 88, SEC ID n° 92, SEC ID n° 122, SEC ID n° 126, SEC ID n° 130, SEC ID n° 134, SEC ID n° 138, SEC ID n° 142, SEC ID n° 146, SEC ID n° 150, SEC ID n° 154, SEC ID n° 158, SEC ID n° 162, SEC ID n° 166, SEC ID n° 170 y SEC ID n° 174. En todavía otra realización específica, la secuencia de región variable de cadena ligera de los grupos de unión a antígeno del inmunoconj ugado se encuentra codifciada por una secuencia polinucleótida seleccionada de entre el grupo que consiste de las secuencias: SEC ID n° 18, SEC ID n° 20, SEC ID n° 24, SEC ID n° 30, SEC ID n° 34, SEC ID n° 38, SEC ID n° .42, SEC ID n° 46, SEC ID n° 50, SEC ID n° 68, SEC ID n° 72, SEC ID n° 76, SEC ID n° 80, SEC ID n° 84, SEC ID n° 88, SEC ID n° 92, SEC ID n° 122, SEC ID n° 126, SEC ID n° 130, SEC ID n° 134, SEC ID n° 138, SEC ID n° 142, SEC ID n° 146, SEC ID n° 150, SEC ID n° 154, SEC ID n° 158, SEC ID n° 162, SEC ID n° 166, SEC ID n° 170 y SEC ID n° 174. En otra realización específica, el inmunoconjugado de la invención comprende una secuencia polipe'ptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 209, SEC ID n° 211, SEC ID n° 213, SEC ID n° 217, SEC ID n° 219, SEC ID n° 221, SEC ID n° 223, SEC ID n° 225 y SEC ID n° 227, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En todavía otra realización específica, el inmunoconj ugado de la invención comprende una secuencia polipeptidica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID n° 229, SEC ID n° 231, SEC ID n° 233 y SEC ID n° 237, o variantes de las mismas qué conservan funcionalidad. En una realización más especifica, el inmunoconjugado de la presente invención comprende una secuencia polipeptidica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID n° 211, SEC ID n° 219 y SEC ID n° 221, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad, y una secuencia polipeptidica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 231 o a variantes de la misma que conservan funcionalidad. En otra realización especifica, el inmunoconjugado de la presente invención comprende una secuencia polipeptidica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID n° 209, SEC ID n° 223, SEC ID n° 225 y SEC ID n° 227 ó variantes de las mismas que conservan funcionalidad, y una secuencia polipeptidica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 229 o a variantes de la misma que conservan funcionalidad. .En una realización específica adicional, el inmunoconjugado de la presente invención comprende dos secuencias polipeptídicas que son por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idénticas a las secuencias SEC ID n° 213 y SEC ID n° 233, o a variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En todavía otra realización específica, el inmunoconjugado de la presente invención comprende dos secuencias polipeptídicas que son por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idénticas a las secuencias SEC ID n° 217 y SEC ID n° 237 o a variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En todavía otra realización específica, el inmunoconjugado de la presente invención comprende dos secuencias polipeptídicas que son por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idénticas a las secuencias SEC ID n° 221 y SEC ID n° 231 o a variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En todavía otra realización específica, el inmunoconj ugado de la presente invención comprende dos secuencias polipeptídicas que son por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%,.95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idénticas a las secuencias SEC ID n° 223 y SEC ID n° 229 o a variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En todavía otra realización específica, el inmunoconj ugado de la presente invención comprende dos secuencias polipeptídicas que son por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idénticas a las secuencias SEC ID n° 225 y SEC ID n° 229 o a variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En todavía otra realización específica, el inmunoconjugado de la presente invención comprende dos secuencias polipeptídicas que son por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idénticas a las secuencias SEC ID n° 227 y SEC ID n° 229 o a variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En otra realización específica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID n° 210, SEC ID n° 212, SEC ID n° 214, SEC ID n° 218, SEC ID n° 220, SEC ID n° 222, SEC ID n° 224, SEC ID n° 226 y SEC ID n° 228. En todavía otra realización específica, el inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleótida seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID n° 210, SEC ID n° 212, SEC ID n° 214, SEC ID n° 218, SEC ID n° 220, SEC ID n° 222, SEC ID n° 224, SEC ID n° 226 y SEC ID n° 228. En otra realización específica, el inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID n° 230, SEC ID n° 232, SEC ID n° 234 y SEC ID n° 238. En todavía otra realización específica, el inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleótida seleccionada de entre el grupo de secuencias SEC ID n° 230, SEC ID n° 232, SEC ID n° 234 y SEC ID n° 238. En una realización, el inmunoconj ugado comprende por lo menos un grupo de unión a antígeno, típicamente dos o más que son específicos del proteoglicano condroitín sulfato del melanoma (MCSP) . En otra realización, el inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una primera cadena pesada de Fab específica para MCSP comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una molécula de IL-2, una molécula de IL-12, una molécula de IFN a o una molécula de GM-CSF, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una segunda cadena pesada de Fab específica para MCSP. En todavía otra realización, el inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptídica en la que una primera cadena pesada de Fab específica para MCSP comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una molécula de IL-2, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxi-terminal con una segunda cadena pesada de Fab específica para MCSP. En una realización específica, los grupos de unión a antígeno del inmunoconj ugado comprenden una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 257 o a la secuencia SEC ID n° 261 o a variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En otra realización especifica, los grupos de unión a antigeno del inmunoconjugado comprenden una sec encia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 259 o a la secuencia SEC ID n° 271 o a variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En una realización más especifica, los grupos de unión a antigeno del inmunoconj ugado comprenden una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 257 o a la secuencia SEC ID n° 261, o a variantes de las mismas que conservan funcionalidad, y una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%,· 99% ó 100% idéntica a' la secuencia SEC ID n° 259 o a la secuencia SEC ID n° 271, o a variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En una realización más especifica, los grupos de unión a antigeno del inmunoconjugado comprenden una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 257, y una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, .90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 261, y una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 259. En otra realización especifica, la secuencia de región variable de cadena pesada de los grupos de unión a antigeno del inmunoconjugado se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia SEC ID n° 258 ó a la secuencia SEC ID n° 262. En otra realización especifica, la secuencia de región variable de cadena ligera de los grupos de unión a antigeno del inmunoconjugado se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la. secuencia SEC ID n° 260 o a la secuencia SEC ID n° 272. En todavía otra realización específica, la secuencia de región variable de cadena ligera de los grupos de unión a antígeno del inmunoconjugado se encuentra codificada por la secuencia polinucleótida SEC ID n° 260 o SEC ID n° 272. En una realización específica, el inmunoconjugado de la invención comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 251 o a la secuencia SEC ID n° 255, o a variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En otra realización específica, el inmunoconjugado de la invención comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 253 o a la secuencia SEC ID n° 265, o a variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En una realización más específica, el inmunoconjugado de la presente invención comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 251 o a la secuencia SEC ID n° 255 ¦ o. a variantes de las mismas que conservan funcionalidad, y una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 253 o a la secuencia SEC ID n° 265, o a variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En otra realización específica, el inmunoconjugado de la presente invención comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 251 o a variantes de la misma que conservan funcionalidad, y una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 253 o a variantes de la misma que conservan funcionalidad. En otra realización específica, el inmunoconjugado de la presente invención comprende una secuencia polipeptidica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 255 o a variantes de la misma que conservan funcionalidad, y una secuencia polipeptidica que es por lo menos aproximadamente 80%,· 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 253 o a variantes de la misma que conservan funcionalidad. En otra realización especifica, el inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptidica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia SEC ID n° 252 o a la secuencia SEC ID n° 256. En todavía otra realización específica, el inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptidica codificada por la secuencia polinucleótida SEC ID n° 252 o SEC ID n° 256. En otra realización específica, el inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptidica codificada por una secuencia polinucleótida que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia SEC ID n° 254 o a la secuencia SEC ID n° 266. En todavía otra realización específica, el inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptidica codificada por la secuencia polinucleótida SEC ID n° 254 o SEC ID n° 266.
En una realización, los grupos de unión a antígeno comprenden por lo menos una región variable capaz de unirse a un determinante antigénico. Las regiones variables no limitativas que resultan útiles en la presente invenicón pueden ser de origen murino, de primate o humano. Las regiones variables humanas pueden derivarse de anticuerpos monoclonales humanos preparados mediante el método del hibrldoma. Las lineas celulares de mieloma humano y de heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos han sido descritas, por ejemplo, por Kozbor et al., J. Immunol. 133:3001-3005, 1984, y Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, páginas 51 a 63 ( arcel Dekker Inc., New York, 1987). Las regiones variables humanas también pueden ser producidas por animales transgénicos (por ejemplo ratones) que son capaces, tras la inmunización, de producir un repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de producción endógena de inmunoglobulinas . Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigótica del gen de la región de unión (JH) de cadena pesada de anticuerpo en ratones quiméricos y mutantes de linea germinal resulta en la inhibición total de la producción endógena de anticuerpos. La transferencia de la serie génica de inmunoglobulinas de linea germinal humana en dichos ratones mutantes de la linea germinal resultará en la producción de anticuerpos humanos tras el reto antigénico (ver, por ejemplo, Jakobovits et al., Nature 362:255-258, 1993).
Alternativamente, puede utilizarse la expresión fágica para producir anticuerpos humanos y regiones variables humanas in vitro a partir de repertorios génicos de dominio variable (V) de inmunoglobulina, por ejemplo de donantes no inmunizados (McCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990). En un ejemplo de esta técnica, se clonan genes de dominio V de anticuerpo dentro del marco de un gen de proteina de cubierta mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y se expresa en forma de fragmentos funcionales de anticuerpo sobre la superficie de la partícula fágica.
Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de una cadena del genoma fágico, las selecciones basadas en las propiedades funcionales de los fragmentos de anticuerpo/anticuerpo también resultan en la selección del gen codificante de los fragmentos anticuerpo/anticuerpo que muestran dichas propiedades. De esta manera, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. La expresión fágica puede llevarse a cabo en una diversidad de formatos. Para una revisión de los formatos de expresión fágica, ver Hoogenboom et al., Nucleic Acids Res. 19:4133-4137 (1991). Pueden utilizarse varias fuentes de segmentos del gen V para la expresión fágica. Clackson et al. aislaron una serie diversa de anticuerpos anti-oxazolona a partir de una biblioteca combinatorial aleatoria pequeña de genes V derivada de los bazos de ratones inmunizados (ver Clackson et al., Nature 352:624-628, 1991). Puede construirse un repertorio de genes V a partir de donantes humanos no inmunizados y pueden aislarse anticuerpos contra una serie diversa de antigenos (incluyendo autoantigenos ) esencialmente según las técnicas descritas por arks et al., J. Mol. Bio. 222:581-597, 1991. En una respuesta inmunológica natural, los genes de anticuerpo acumulan mutaciones a una tasa elevada (hipermutación somática) . Algunos de los cambios introducidos proporcionan una afinidad más alta, y las células B que expresan inmunoglobulinas superficiales de alta afinidad se replicarán y diferenciarán preferentemente durante el reto de antigenos posterior. Éste .proceso natural puede ser imitado mediante la utilización de la técnica conocida como "reorganización de cadenas". (ver Marks et al., Biotech. 10:779-783 (1992). En este método, la afinidad de los anticuerpos humanos "primarios" o de regiones variables obtenidas mediante expresión fágica puede mejorarse mediante la sustitución secuencial de los genes de región V de las cadenas pesada y ligera por repertorios.de variantes naturales (repertorios) de genes de dominio V obtenidos de donantes no inmunizados. Esta técnica permite la producción de anticuerpos y regiones variables con afinidades en el intervalo de nM. Una estrategia para preparar repertorios fágicos muy grandes de anticuerpos ha sido descxrita por 1 Waterhouse et al., Nucí. Acids Res. 21:2265-2266, 1993, y el aislamiento de un anticuerpo humano de alta afinidad directamente a partir de dicha biblioteca fágica grande se informa en Griffith et al., J. Cell. Bio. 120:885-896, 1993. También puede utilizarse la reorganización génica para derivar anticuerpos humanos y regiones variables de anticuerpos de roedor, en los que el anticuerpo o región variable humana presenta afinidades y especificidades similares a las del anticuerpo o región variable de roedor de partida. Según este método, que también se denomina "modificación de epitopos", el gen de dominio V de la cadena pesada o ligera de anticuerpos de roedor obtenido mediante técnicas de expresión fágica se sustituye por un repertorio de genes de dominio V humanos, creando quimeras roedor-humano. La selección con antigeno resulta en el aislamiento de regiones variables humanas capaces de restaurar el sitio de unión a antigeno funcional, es decir, el epitopo gobierna (modifica) la elección de pareja. Al repetir el procedimiento para sustituir el dominio V de roedor restante, se obtiene un anticuerpo humano (ver la publicación de patente PCT n° WO 93/06213) . Al contrario que la humanización tradicional de anticuerpos de roedor, la técnica de modificación de epitopos proporciona anticuerpos o regiones variables completamente humanos, que no presentan marco o residuos CDR de origen roedor.
Entre las regiones variables que pueden utilizarse también se incluyen secuencias de región variable murina que han sido primatizadas o humanizadas, o secuencias de región variable de primate que han sido humanizadas. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "humanizado" se refiere a una secuencia de región variable de grupo de unión a antigeno derivada de un anticuerpo no humano, por ejemplo un anticuerpo murino, que conserva o que conserva sustancialmente las propiedades de unión a antigeno de la molécula parental, pero que es menos inmunogénica en seres humanos. Lo anterior puede llevarse a cabo mediante diversos métodos, incluyendo: (a) injertación de únicamente CDRs no humanas en regiones marco humanas con o sin conservación de los residuos de marco críticos (por ejemplo, aquellos que resultan importantes para conservar una buena afinidad de unión a antígeno o funciones de anticuerpo) , y (b) "enmascaramiento" de las regiones variables no humanas con una sección de tipo humano mediante sustitución de los residuos superficiales. Dichos métodos se dan a conocer en Jones et al., orrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 81:6851-6855, 1984; Morrison y Oi, Adv. Immunol . 44:65-92, 1988; Verhoeyen et-al., Science 239:1534-1536, 1988; Padlan, Molec. Immun. 28:489-498, 1991; Padlan, Molec. Immun. 31 (3) : 169-217, 1994, la totalidad de las cuales se incorpora como referencia en su totalidad en la presente memoria.
Existen de manera general 3 regiones determinantes de complementariedad, o CDRs (CDR1, CDR2 y CDR3) en cada una de las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera de un anticuerpo, que se encuentran flanqueadas por cuatro subregiones de marco (es decir, FR1, FR2, FR3 y FR ) en cada uno de los dominios variables de cadena pesada y de cadena ligera de un anticuerpo. FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR . Puede encontrarse un comentario sobre los anticuerpos con regiones variables humanizadas en, ínter alia, la patente US n° 5.632.927, y en la solicitud publicada de patente US n° 2003/0175269, ambas incorporadas como referencia en su totalidad en la presente memoria.
De manera similar, tal como se utiliza en la presente memoria, el término "primatizado" se utiliza para referirse a una región variable de grupo de unión a antígeno derivada de un anticuerpo no de primate, por ejemplo un anticuerpo murino, que conserva, o que conserva sustancialmente, las propiedades de unión a antígeno de la molécula parental, pero que es menos inmunogénica en primates.
La elección de dominios variables humanos, tanto pesados como ligeros, durante la preparación de grupos de unión a antígeno humanizados resulta muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el método denominado de "ajuste óptimo", la secuencia de la región variable de un grupo de unión a antígeno de roedor se criba frente a la ¦biblioteca completa de secuencias de región variable humanas conocidas. La secuencia humana más similar a la del roedor seguidamente se acepta como la región marco humana (FR) para el grupo de unión a antigeno humanizado (Sims et al., J. Immunol. 151:2296, 1993; Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901, 1987). Otro método para seleccionar la secuencia de marco humana es comparar la secuencia de cada subregión individiual del marco de roedor completo (es decir, FRl, FR2, FR3 y FR4 ) o alguna combinación de las subregiones individuales (por ejemplo FRl y FR2 ) frente a una biblioteca de secuencias de región variable humanas que corresponden a dicha subregión de marco (por ejemplo según se determina mediante la numeración de Kabat) y seleccionar la secuencia humana para cada subregión o combinación que sea más similar a la del roedor (publicación de solicitud de patente US n° 2003/0040606A1) . Otro método utiliza una región de marco particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. Puede utilizarse el mismo marco para varios grupos de unión a antigeno humanizados diferentes (Cárter et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 89:4285, 1992; Presta et al., J. Immunol. 151:2623, 1993).
Generalmente, los grupos de unión a antigeno del inmunoconj ugado de la invención conservan una elevada afinidad para determinantes antigénicos específicos u otras propiedades biológicas favorables. Por consiguiente, se preparan regiones variables humanizadas mediante el análisis de las secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulina se encuentran comúnmente disponibles y resultarán familiares para el experto en la materia. Se encuentran disponibles programas informáticos que ilustran y muestran estructuras tridimensionales probables de la conformación de secuencias de región variable de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas visualizaciones permite analizar el papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de región variable de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influyen sobre la capacidad de la secuencia de región variable candidata para la unión a su antigeno. De esta manera, pueden seleccionarse y combinarse residuos de FR procedentes del receptor e importar secuencias de manera que se consiga la característica deseadadel grupo de unión a antígeno, tal como una afinidad incrementada para el antígeno o antigenos diana. En general, los residuos de la región hipervariable se encuentran directa y más sustancialmente implicados en la influencia sobre la unión a antígeno.
En otra realización, las moléculas de unión a antígeno de la presente invención se manipulan para que presenten una afinidad de unión incrementada de acuerdo con, por ejemplo, los métodos dados a conocer en la solicitud publicada de patente US n° 2004/0132066, el contenido completo de la cual se incorpora como referencia en la presente memoria. La capacidad del inmunoconjugado de la invención de unirse a un receptor de grupo efector o a un determinante antigénico espcifico puede medirse mediante un ensayo de inmunosorción ligada a enzima (ELISA) u otra técnica que resulte familiar al experto en la materia, por ejemplo la técnica de resonancia del plasmón superficial (analizada en un sistema BIACORE T100) (Liljeblad et al., Glyco. J. 17:323-329, 2000) y ensayos de unión tradicionales (Heeley R.P., Endocr. Res. 28:217-229, 2002) .
Grupos efectores Los grupos efectores para la utilización en la invención generalmente son polipéptidos que influyen sobre la actividad celular, por ejemplo mediante rutas de transducción de señales. Por consiguiente, el grupo efector del inmunocon ugado de la invención puede asociarse a la señalización mediada por receptor que transmite una señal desde el exterior de la membrana celular para modular una respuesta dentro de la célula. Por ejemplo, un grupo efector del inmunoconj ugado puede ser una citoquina. En una realización particular, el grupo efector es un grupo efector de una cadena tal como se define en la presente memoria. En una realización, uno o más grupos efectores, típicamente grupos efectores de una cadena, de los inmunoconjugados de la invención son citoquinas seleccionadas de entre el grupo que consiste de: IL-2, GM-CSF, IFN-a e IL-12. En otra realización, uno o más grupos efectores de una cadena de los inmunoconjugados son citoquinas seleccionadas de entre el grupo que consiste de': IL-8, ???-? , ???-?ß, and TGF-ß.
En una realización, el grupo efector, preferentemente un grupo efector de una cadena, del inmunoconjugado es IL-2. En una realización específica, el grupo efector de IL-2 puede inducir una o más respuestas celulares seleccionadas de entre el grupo que consiste de: la proliferación de linfocitos T activados, la diferenciación de linfocitos T activados, la actividad de células T citotóxicas (CTL) , la proliferación de células B activadas, la diferenciación de células B activadas, la proliferación de células asesinas naturales (NK) , la diferenciación de células NK, y la citotoxicidad antitumoral de NK/linfocitos asesinos activados (LAK) . En una realización, el grupo efector, preferentemente un grupo efector de una cadena, del inmunoconjugado es GM-CSF. En una realización específica, el grupo efector GM-CSF puede inducir la proliferación y/o diferenciación de granulocitos , monocitos o células dendríticas. En una realización, el grupo efector, preferentemente un grupo efector de una cadena, del inmunoconjugado IFN-OÍ. En una realización específica, el grupo efector de IFN-á puede inducir una o más respuestas celulares seleccionadas de entre el grupo que consiste de: la inhibición de la replicación vírica en una célula infectada por virus, y la regulación positiva de la expresión del complejo de histocompatibilidad mayor I (MHC I) . En otra realización específica, el grupo efector de IFN puede inhibir la proliferación de las células tumorales. En una realización, el grupo efector, preferentemente un grupo efector de una cadena, del inmunoconj ugado es IL-12. En una realización específica, el grupo efector de IL-12 puede inducir una o más respuestas celulares seleccionadas de entre el grupo que consiste de: la proliferación de células NK, la diferenciación de las células NK, la proliferación de las células T y la diferenciación de las células T. En una realización, el grupo efector, preferentemente un grupo efector de una cadena, del inmunoconj ugado es IL-8. En una realización específica, el grupo efector IL-8 puede inducir la quimotaxis en neutrófilos. En una realización, el grupo efector, preferentemente un grupo efector de una cadena, del inmunoconjugado, es ???-?a. En una realización específica, el grupo efector ???-? puede inducir la quimiotaxis en monocitos y en linfocitos T. En una realización, el grupo efector, preferentemente un grupo efector de una cadena, del inmunoconjugado es MIP-?ß. En una realización específica, el grupo efector ??-1ß puede inducir la quimiotaxis de monocitos y de linfocitos T. En una realización, el grupo efector, preferentemente un grupo efector de una cadena, del inmunoconjugado es TGF-ß. En una realización especifica, el grupo efector de TGF-ß puede inducir una o más respuestas celulares seleccionadas de entre el grupo que consiste de: la quimiotaxis de monocitos, la quimiotaxis de macrófagos, la regulación positiva de la expresión de IL-1 en macrófagos activados y la regulación positiva de la expresión de IgA en células B activadas.
Polipéptidos y polinucleótidos de inmunoconjugado Los inmunoconjugados de la" invención comprenden polipéptidos y fragmentos de los mismos. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "polipéptido" pretende comprender un "polipéptido" singular además de una pluralidad de "polipéptidos", y se refiere a una molécula compuesta de monómeros (aminoácidos) unidos linealmente mediante enlaces amida (también conocidos como enlaces peptidicos) . El término "polipéptido" se refiere a cualquier cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, y no se refiere a una longitud especifica del producto. De esta manera, dentro de la definición de "polipéptido" se incluyen péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos, "proteína", "cadena de aminoácidos" o cualquier otra expresión utilizada para referirse a una cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, y el término "polipéptido" puede utilizarse en lugar de, o intercambiablemente con cualquiera de dichos términos. El término "polipéptido" también pretender referirse a los productos de las modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, incluyendo, aunque sin limitación, la glucosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización con grupos protectores/bloqueantes, corte proteolitico o modificación con aminoácidos naturales. Puede derivarse un polipéptido de una fuente biológica natural o producirse mediante tecnología recombinante, aunque no se traduce necesariamente a partir de una secuencia de ácidos nucleicos designada. Puede generarse de cualquier manera, incluyendo mediante síntesis química.
Un polipéptido de la invención puede presentar un tamaño de aproximadamente 3 ó más, 5 ó más, 10 ó más, 20 ó más, 25 ó más, 50 ó más, 75 ó más, 100 ó más, 200 ó más, 500 ó más, 1.000 ó más, ó 2.000 ó más aminoácidos. Los polipéptidos pueden presentar una estructura tridimensional definida, aunque no presentan necesariamente dicha estructura. Se hace referencia a los polipéptidos con una estructura tridimensional definida como plegados, y a los polipéptidos que no presentan una estructura tridimensional definida, sino que pueden adoptar un gran número de conformaciones diferentes, como no plegados.
Un polipéptido o variante del mismo "aislado", o derivado del mismo, pretende referirse a un polipéptido que no se encuentra en su ambiente natural. No resulta necesario un nivel particular de purificación. Por ejemplo, puede extraerse un polipéptido aislado de su ambiente nativo o natural. Los polipéptidos producidos recombinantemente y las proteínas expresadas en células huésped se consideran aislados para los fines de la invención, al igual que los polipéptidos nativos o recombinantes que han sido separados, fraccionados o parcial o sustancialmente purificados mediante cualquier técnica adecuada.
También se encuentran incluidos como polipéptidos de la presente invención los derivados, análogos o variantes de los polipéptidos anteriormente indicados, y cualquier combinación de los mismos. Los términos "variante", "derivado" y "análogo" en referencia a los polipéptidos de la presente invención incluyen cualquier polipéptido que conserve por lo menos algunas de las propiedades biológicas, antigénicas o inmunogénicas del polipéptido nativo correspondiente. Entre las variantes de polipéptidos de la presente invención se incluyen polipéptidos que presentan secuencias alteradas de aminoácidos debido a sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos. Las variantes pueden ser naturales o no naturales. Pueden producirse variantes no naturales utilizando técnicas de mutagénesis conocidas de la técnica.
Los polipéptidos variantes pueden comprender sustituciones, deleciones o adicionaes de aminoácidos conservadoras o no conservadoras. Los derivados de los polipéptidos de la presente invención son polipéptidos que han sido alterados de manera que muestren características adicionales no presentes en el polipéptido nativo. Entre los ejemplos se incluyen proteínas de fusión. También puede hacerse referencia en la presente memoria a los polipéptidos variantes como "análogos de polipéptidos". Tal como se utiliza en la presente memoria, un "derivado" de un polipéptido se refiere a un polipéptido objeto que presenta uno o más residuos químicamente derivatizados mediante reacción de un grupo lateral funcional. También se encuentran comprendidos en el término "derivados" aquellos péptidos que contienen uno o más derivados de aminoácidos naturales de entre los veinte aminoácidos estándares. Por ejemplo, la 4-hidroxiprolina puede sustituirse por prolina; la 5-hidroxilisina puede sustituirse por lisina; la 3-metilhistidina puede sustituirse por histidina; la homoserina puede sustituirse por serina; y la ornitina puede sustituirse por lisina.
Alternativamente, pueden sintetizarse variantes recombinantes codificantes dichos polipéptidos o polipéptidos similares o seleccionarse mediante la utilización de la "redundancia" del código genético. Pueden introducirse diversas sustituciones de codones, tales como . cambios silenciosos que producen diversos sitios de restricción, para optimizar la clonación en un vector plásmido o vírico en un sistema procariótico o eucariótico particular. Las mutaciones en la secuencia polinucleótida puede reflejarse en el polipéptido o en dominios de otros péptidos añadidos al polipéptido para modificar las propiedades de cualquier parte del polipéptido, para cambiar características tales como las afinidades de unión a ligando, las afinidades entre cadenas o la tasa de degradación/renovación .
Preferentemente, las "sustituciones" de aminoácidos son el resultado de sustituir un aminoácido por otro aminoácido que presenta propiedades estructurales y/o químicas similares, es decir, sustituciones conservadoras de aminoácidos. Pueden realizarse sustituciones "conservadoras" de aminoácidos basándose en la similitud de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o naturaleza anfipática de los residuos implicados. Por ejemplo, entre los aminoácidos no polares (hidrofóbicos ) se incluyen alanina, leucina, isoleucina, . valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina; entre los aminoácidos neutros polares se incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina; entre los aminoácidos de carga positiva (básicos) se incluyen arginina, lisina e histidina; entre los aminoácidos de carga negativa (ácidos) se incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Las "inserciones" o "deleciones" preferentemente se encuentran comprendidas en el intervalo de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 20 aminoácidos, más preferentemente entre 1 y 10 aminoácidos. La variación permitida puede determinarse experimentalmente mediante la realización sistemática de inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos en una molécula de pólipéptido utilizando técnicas de ADN recombinante y sometiendo a ensayo las variantes recombinantes resultantes para la actividad.
Por un pólipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos por lo menos, por ejemplo, 95% "idéntica" a una secuencia-pregunta de aminoácidos de la presente invención, se pretende hacer referencia a que la secuencia de aminoácidos del pólipéptido objeto es idéntica a la secuencia-pregunta, excepto en que la secuencia del pólipéptido objeto puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia-pregunta de aminoácidos. En otras palabras, para obtener un pólipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos, por lo menos 95% idéntica a una secuencia-pregunta de aminoácidos, hasta 5% de los residuos aminoácidos en la secuencia objeto pueden insertarse, delecionarse o sustituirse con otro aminoácido. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden estar presentes en las posiciones amino-terminales o carboxi-terminales de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier posición entre dichas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre residuos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.
En la práctica, puede determinarse convencionalmente si cualquier polipéptido particular es por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%., 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a un polipéptido de referencia utilizando programas informáticos conocidos. Un método preferente para determinar la correspondencia global óptima entre una secuencia-pregunta (una secuencia de la presente invención) y una secuencia objeto, también denominado alineación de secuencia global, puede determinarse utilizando el programa informático FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al., Comp. Appl . Biosci. 6:237-245, 1990. En una alineación de secuencia, las secuencias de pregunta y objeto son ambas secuencias de nucleótidos o son ambas secuencias de aminoácidos. El resultado de dicha alineación global de secuencias se expresa en porcentaje de identidad. Son parámetros preferentes utilizados en una alineación de aminoácidos FASTDB: Matriz=PA 0, k-tuplo=2, penalización de no correspondencia^ , penalización de unión=20, longitud del grupo de aleatorización=0 , puntuación de corte=l, tamaño de ventana=longitud de secuencia, penalización de hueco=5, penalización de tamaño=0,05, tamaño de ventana=500 ó la longitud de la secuencia objeto de aminoácidos, la más corta de entre los dos valores.
En el caso de que la secuencia objeto sea más corta que la secuencia-pregunta debido a deleciones N-terminales o C-terminales, no debido a deleciones internas, debe realizarse una corrección manual de los resultados. Lo anterior se debe a que el programa FASTDB no incluye truncaciones N-términales y C-terminales de la secuencia objeto al calcular el porcentaje de identidad global. Para las secuencias objeto truncadas en los extremos N-terminales y C-terminales, respecto a la secuencia-pregunta, el porcentaje de identidad se corrige mediante el cálculo del número de residuos de la secuencia-pregunta que son N-terminales y C-terminales respecto a la secuencia objeto, no correspondientes/desalineadas con un residuo objeto correspondiente, como porcentaje del número total de bases de la secuencia-pregunta. Se determina si un residuo es correspondiente/alineado a partir de los resultados de la alineación de secuencias FASTDB. A continuación, este porcentaje se resta del porcentaje de identidad, calculado mediante el programa FASTDB anteriormente indicado utilizando los parámetros especificados, para alcanzar un puntuación final de porcentaje de identidad. Esta puntuación final de porcentaje de identidad es la utilizada para los fines de la presente invención. Únicamente los residuos en los extremos N-terminal y C-terminal de la secuencia objeto no correspondientes/desalineados respecto a la secuencia-pregunta, se consideran para los fines de ajustar manualmente la puntuación de porcentaje de identidad. Es decir, únicamente las posiciones de los residuos de la secuencia-pregunta situados más allá de los residuos N-terminales y C-terminales más distantes de la secuencia objeto.
Por ejemplo, se alinea una secuencia objeto de 90 residuos aminoácidos con una secuencia-pregunta de 100 residuos para determinar el porcentaje de identidad. La deleción se produce en el extremo N-terminal de la secuencia objeto y, por lo tanto, la alineación de FASTDB no muestra una correspondencia/alineación de los primeros 10 residuos en el extremo N-terminal. Los 10 residuos no apareados representan 10% de la secuencia (número de residuos en los extremos N-terminal y C-terminal no correspondientes/número total de residuos de la secuencia-pregunta) , de manera que se resta 10% de la puntuación de porcentaje de identidad calculado por el programa FASTDB. En el caso de que los 90 residuos restantes fueran perfectamente correspondientes, el porcentaje final de identidad seria 90%. En otro ejemplo, se compara una secuencia objeto de 90 residuos con una secuencia-pregunta de 100 residuos. En este caso las deleciones son deleciones internas, de manera que no hay residuos en los extremos N-terminal o C-terminal de la secuencia objeto que no sean correspondientes/alineadas con la secuencia-pregunta. En este caso, el porcentaje de identidad calculado por FASTDB no se corrige manualmente. Nuevamente, únicamente se 'corrigen manualmente las posiciones de residuos más allá de los extremos N-terminal y C-terminal de la secuencia-pregunta, según muestra la alineación de FASTDB, que no son correspondientes/alineados con la secuencia-pregunta. No debe realizarse ninguna otra corrección manual para los fines de la presente invención. Entre los polipéptidos de la invención se incluyen aquellos que son por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idénticos a las secuencias proporcionadas en las Tablas 3 y 4, posteriormente, incluyendo los fragmentos funcionales o variantes de los mismos. La invención también comprende polipéptidos que comprenden secuencias de las Tablas 3 ó 4 con sustituciones conservadoras de aminoácidos.
Los polipéptidos de la invención pueden encontrarse codificados por un único polinucleótido . , Alternativamente, pueden encontrarse codificados por múltiples (por ejemplo dos o más) polinucleótidos, de manera que se coexpresan los polipéptidos. Los polipéptidos que se coexpresan a partir de múltiples polinucleótidos pueden asociarse mediante, por ejemplo, enlaces disulfuro u otros medios para formar un inmunoconj ugado funcional. Por ejemplo, la parte de cadena pesada del grupo de unión a antigeno puede encontrarse codificado por un polinucleótido separado de la parte del inmunoconj ugado que comprende la parte de cadena ligera del grupo de unión a antigeno y el grupo efector. En el caso de que se coexpresen, los polipéptidos de cadena pesada se asociarán con los polipéptidos de cadena ligera para formar el grupo de unión a antigeno. Alternativamente, en otro ejemplo, la parte de cadena ligera del grupo de unión a antigeno podría encontrarse codificado por un polinucleótido separado procedente de la parte del inmunoconj ugado que comprende la parte de cadena ligera del grupo de unión a antígeno y el grupo efector.
Los inmunoconj ugados de la presente invención y los fragmentos de los mismos generalmente se encuentran codificados por polinucleótidos . El término "polinucleótido" pretende comprender un único ácido nucleico, así como una pluralidad de ácidos nucleicos, y se refiere a una molécula o constructo de ácido nucleico aislado, por ejemplo ARN mensajero (ARNm) , ARN derivado de un virus o ADN de plásmido (ADNp) . Un polinucleótido puede comprender un enlace fosfodiéster convencional o un enlace no convencional (por ejemplo un enlace amida, tal como el presente en los ácidos nucleicos de péptidos (APN) ) . La expresión "ácidos nucleicos" se refiere a uno o más segmentos de ácidos nucleicos cualesquiera, por ejemplo fragmentos de ADN o de ARN, presentes en un polinucléotido . El término "aislado" 1 referido a un ácido nucleico o polinucleótido se refiere a una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN, que ha sido extraída de su ambiente nativo. Por ejemplo, un polinucleótido recombinante codificante de un polipéptido terapéutico contenido en un vector se considera aislado para los fines de la presente invención. Entre los ejemplos adicionales de un polinucleótido aislado se incluyen los polinucleótidos recombinantes mantenidos en células huésped heterólogas o los polinucleótidos purificados (parcial o sustancialmente) en solución. Entre las moléculas de ARN aisladas se incluyen los transcritos de ARN in vivo o in vitro de la presente invención, así como las formas de cadena positiva y negativa, y las formas de doble cadena, de vectores pestivirus dados a conocer en la presente memoria. Entre los polinucleótidos o ácidos nucleicos aislados según la presente invención se incluyen además dichas moléculas producidas sintéticamente. Además, un polinucleótido o un ácido nucleico puede ser, o puede incluir un elemento regulador, tal como un promotor, un sitio de unión ribosómica o un terminador de transcripción.
Tal como se utiliza en la presente memoria, una "región codificante" es una parte de un ácido nucleico que consiste de codones traducidos en aminoácidos. Aunque un "codón de parada" (TAG, TGA o TAA) no se traduce en un aminoácido, puede considerarse parte de una región codificante, en caso de encontrarse presente, mientras que cualquier secuencia flanqueante, por ejemplo promotores, sitios de unión ribosómica, terminadores de transcripción, intrones, regiones 5' y 3' no traducidas y similares, no son parte de una región codificante. Pueden encontrarse presentes dos o más regiones codificantes de la presente invención en un solo constructo polinucleótido, por ejemplo en un solo vector, o en constructos polinucléotidos separados, por ejemplo en vectores separados (diferentes). Además, cualquier vector puede contener una única región codificante, o puede comprender dos o más regiones codificantes, por ejemplo un vector de la presente invención puede codificar una o más poliproteinas , que se separan post-traduccionalmente o cotraduccionalmente en las proteínas finales mediante corte proteolítico . Además, un vector, polinucleótido o ácido nucleico de la invención puede codificar regiones codificantes heterólogas, fusionadas o no fusionadas a un primer o segundo ácido nucleico codificante del inmunoconj ugado de la invención, o variante o derivado del mismo. Entre las regiones codificantes heterólogas se incluyen, aunque sin limitación, elementos especializados o motivos, tales como un péptido de señal secretoria o un dominio funcional heterólogo.
En determinadas realizaciones, el polinucleótido o ácido nucleico es ADN. En el caso de ADN, un polinucleótido que comprende un ácido nucleico, que codifica un polipéptido, normalmente puede incluir un promotor y/o otros elementos de control de la transcripción o de la traducción operablemente asociados a una o más regiones codificantes. Una asociación operable se produce en el caso de que una región codificante de un producto génico, por ejemplo un polipéptido, se asocie a una o más secuencias reguladoras de manera que sitúa la expresión del producto génico bajo la influencia o el control de la secuencia o secuencias reguladoras. Dos fragmentos de ADN (tales como una región codificante de polipéptido y un promotor asociado a la misma) se encuentran "operablemente asociados" en el caso de que la inducción de la función del promotor resulte en la transcripción de ARNm codificante del producto génico deseado y en el caso de que la naturaleza del enlace entre los dos fragmentos de ADN no interfiera con la capacidad de las secuencias reguladoras de la expresión de dirigir la expresión del producto génico o de interferir con la capacidad del molde de ADN de ser transcrito. De esta manera, una región promotora se encontraría operablemente asociada a un ácido nucleico codificante de un polipéptido en el caso de que el promotor fuera capaz de inducir la transcripción de dicho ácido nucleico. El promotor puede¦ ser un promotor específico de un tipo de célula que dirige una transcripción sustancial del ADN únicamente en células predeterminadas. Otros elementos de control de la transcripción, aparte de un promotor, por ejemplo intensificadores, operadores, represores y señales de terminación de la transcripción, pueden asociarse operablemente al polinucleótido para dirigir la transcripción especifica de un tipo celular. Los promotores y otras regiones de control de la transcripción que resultan adecuados se dan a conocer en la presente memoria.
Una diversidad de regiones de control de la transcripción es conocida por el experto en la materia. Entre ellas se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, regiones de control de la transcripción que funcionan en células de vertebrado, tales como, aunque sin limitarse a ellos, segmentos de promotor e intensificador procedentes de citomegalovirus (por ejemplo el promotor temprano inmediato, conjuntamente con el intrón A) , el virus 40 del simio (por ejemplo el promotor temprano) y los retrovirus (tales como, por ejemplo, el virus del sarcoma de Rous) . Entre otras regiones de control de la transcripción se incluyen aquéllas derivadas de genes de vertebrado, tales como actina, proteína de choque térmico, hormona de crecimiento bovina y ß-globina de conejo, asi como otras secuencias capaces de controlar la expresión génica en las células eucarióticas . Entre las regiones de control de la transcripción adecuadas adicionales se incluyen los promotores e intensificadores específicos de un tejido, así como los promotores inducibles por linfoquinas (por ejemplo los promotores inducibles por interferones o por interleuquinas) .
De manera similar, el experto ordinario en la materia conocerá una diversidad de elementos de control de la transcripción. Entre ellos se incluyen, aunque sin limitación, sitios de unión ribosómica, codones de inicio y terminación de la traducción, y elementos derivados de sistemas víricos (particularmente un sitio interno de entrada ribosómica, o IRES, también denominado secuencia CITE) .
En otras realizaciones, . un polinucleótido de la presente invención es ARN, por ejemplo en forma de ARN mensajero (ARNm) . El ARN de la presente invención puede ser de una cadena o de doble cadena.
Las regiones codificantes polinucleótidas y de ' ácidos nucleicos de la presente invención pueden encontrarse asociadas a regiones codificantes adicionales que codifican péptidos secretorios o de señal, que dirigen la secreción de un polipéptido codificado por un polinucleótido de la presente invención. Según la hipótesis de la señal, las proteínas secretadas por las células de mamífero presentan un péptido de señal o secuencia líder secretoria que resulta cortada de la proteína madura tras iniciarse la exportación de la cadena proteica en crecimiento a través del retículo endoplasmático rugoso. El experto ordinario en la materia conocerá que los polipéptidos secretados por las células de vertebrado generalmente presentan un péptido de señal fusionado al extremo N-terminal del polipéptido, que resulta cortado del polipéptido completo o "de longitud completa" para producir una forma secretada o "madura" del polipéptido. En determinadas realizaciones, se utiliza el péptido de señal nativo, por ejemplo una cadena ligera de inmunoglobulina o péptido de señal de cadena ligera, o un derivado funcional de dicha secuencia que conserve la capacidad de dirigir la secreción del polipéptido operablemente asociado al mismo. Alternativamente, puede utilizarse un péptido de señal de mamífero heterólogo, o un derivado funcional del mismo. Por ejemplo, la secuencia líder de tipo salvaje puede sustituirse por la secuencia líder del activador del plasminogeno tisular humano (TPA) o de la ß-glucuronidase de ratón.
La expresión "cásete de expresión" se refiere a un polinucleótido generado recombinantemente o sintéticamente, con una serie de elementos ácido nucleico especificados que permiten la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula diana. El cásete de expresión recombinante puede incorporarse en un plásmido, cromosoma, ADN mitocondrial, ADN de plástido, virus o fragmento de ácido nucleico. Típicamente, la parte de cásete de expresión recombinante de un vector de expresión incluye, entre otras secuencias, una secuencia de ácidos nucleicos que debe transcribirse y un promotor. En una realización, el cásete de expresión de la invención comprende secuencias polinucleótidas que codifican inmunoconjugados de la invención o fragmentos de los mismos. La expresión "vector de expresión" es sinónima de "constructo de expresión" y se refiere a una molécula de ADN que se utiliza para introducir y dirigir la expresión de un gen especifico al que se encuentra operablemente asociada en una célula diana. El vector de expresión de la presente invención comprende un cásete de expresión. Los vectores de expresión permiten la transcripción de grandes cantidades de ARNm estable. Una vez el vector de expresión se encuentra en el interior de la célula diana, la molécula de ácido ribonucleico o la proteína que se encuentra codificada por el gen es producida por la maquinaria celular de transcripción y/o traducción. En una realización, el vector de expresión de la invención comprende un cásete de expresión que comprende secuencias polinucleótidas que codifican inmunoconj ugados de la invención o fragmentos de los mismos. El término "artificial" se refiere a una composición sintética o no derivada de la célula huésped, por ejemplo un oligonucleotido sintetizado químicamente.
Por un ácido nucleico o polinucleótido que presenta una secuencia de nucleótidos por lo menos, por ejemplo, 95% "idéntica" a una' secuencia de nucleótidos de referencia de la presente invención se hace referencia a que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido is idéntica a la secuencia de referencia excepto en que la secuencia de polinucleótidos puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que presente una secuencia de nucleótidos por lo menos 95% idéntica a una secuencia de nucleótidos de referencia, hasta 5% de los nucleótidos en la secuencia de referencia pueden delecionarse o sustituirse por otro nucleótido, o puede insertarse en la secuencia de referencia un número de nucleótidos de hasta 5% del total de nucleótidos de la secuencia de referencia.
En la práctica, puede determinarse convencionalmente si cualquier molécula de ácido nucleico o polipéptido particular es por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia de nucleótidos o de polipéptido de la presente invención utilizando programas informáticos conocidos. Un método preferente para determinar la correspondencia global óptima entre una secuencia-pregunta (una secuencia de la presente invención) y una secuencia objeto, también denominado alineación de secuencia global, puede determinarse utilizando el programa informático FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al., Comp. Appl. Biosci. 6:237-245, 1990. En una alineación de secuencias, las secuencias de pregunta y objeto son ambas secuencias de ADN . Puede compararse una secuencia de ARN mediante la conversión de los Us en Ts. El resultado de dicha alineación global de secuencias se expresa en porcentaje de identidad. Los parámetros preferentes utilizados en una alineación FASTDB de secuencias de ADN para calcular el porcentaje de identidad son: Matriz=unitaria, k-tuplo=4, penalización de no correspondencia^, penalización de unión=30, longitud del grupo de aleatorización=0 , puntuación de corte=l, penalización de hueco=5, penalización de tamaño de hueco=0,05, tamaño de ventana=500 ó la longitud de la secuencia objeto de aminoácidos, la más corta de entre los dos valores.
En el caso de que la secuencia objeto sea más corta que la secuencia-pregunta debido a deleciones 5' ó 3' , no debido a deleciones internas, debe realizarse una corrección manual de los resultados. Lo anterior se debe a que el programa FASTDB no incluye truncaciones 5' y 3' de la secuencia objeto al calcular el porcentaje de identidad global. Para las secuencias objeto truncadas en los extremos 5' ó 3' , respecto a la secuencia-pregunta, el porcentaje de identidad se corrige mediante el cálculo del número de residuos de la secuencia-pregunta que se encuentran 5' y 3' respecto a la secuencia objeto, que no son correspondientes/desalineadas, como porcentaje del número total de bases de la secuencia-pregunta. Se determina si un nucleótido es correspondiente/alineado a partir de los resultados de la alineación de secuencias FASTDB. A continuación, este porcentaje se resta del porcentaje de identidad, calculado mediante el programa FASTDB anteriormente indicado utilizando los parámetros especificados, para alcanzar un puntuación final de porcentaje de identidad. Esta puntuación corregida es la utilizada para los fines de la presente invención. Únicamente las bases más allá de las bases 5' y 3' de la secuencia objeto, según muestra la alineación de FASTDB, que son no correspondientes/desalineados respecto a la secuencia-pregunta, son utilizadas para el cálculo para los fines de ajustar manualmente la puntuación de porcentaje de identidad. Por ejemplo, se alinea una secuencia objeto de 90 bases con una secuencia-pregunta de 100 bases para determinar el porcentaje de identidad. Las deleciones se producen en el extremo 5' de la secuencia objeto y, por lo tanto, la alineación de FASTDB no muestra una correspondencia/alineación de las primeras 10 bases en el extremo 5' . Las 10 bases no apareadas representan 10% de la secuencia (número de bases en los extremos 5' y 3' no correspondientes/número total de bases de la secuencia-pregunta) , de manera que se resta 10% de la puntuación de porcentaje de identidad calculada por el programa FASTDB. En el caso de que las 90 bases restantes fueran perfectamente correspondientes, el porcentaje final de identidad seria 90%. En otro ejemplo, se compara una secuencia objeto de 90 bases con una secuencia-pregunta de 100 bases. En este caso las deleciones son deleciones internas, de manera que no hay residuos en los extremos 5' ó 3' de la secuencia objeto que no sean correspondientes/alineadas con la secuencia-pregunta. En este caso, el porcentaje de identidad calculado por FASTDB no se corrige manualmente. Nuevamente, únicamente las bases 5' y 3' de la secuencia objeto que no son correspondientes/alineadas con la secuencia-pregunta se corrigen manualmente. No debe realizarse ninguna otra corrección manual para los fines de la presente invención. Entre los polinucleótidos de la invención se incluyen aquellos que son por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idénticos a las secuencias proporcionadas en las Tablas 6 y 8, posteriormente, incluyendo los fragmentos funcionales o variantes de los mismos. Los polinucleótidos pueden expresarse en forma de un único polinucleótido que codifique el inmunoconjugado completo, o en forma de múltiples (por ejemplo dos o más) polinucleótidos que se coexpresen. Los polipéptidos codificados por polinucleótidos que se coexpresan pueden asociarse mediante, por ejemplo, enlaces disulfuro u otros medios para formar un inmunoconj ugado funcional. Por ejemplo, la parte de cadena pesada del grupo de unión a antigeno puede encontrarse codificada por un polinucleótido separado de la parte del inmunoconjugado que comprende la parte de cadena ligera del grupo de unión a antigeno y el 1 grupo efector. ¦ En el' caso de que se coexpresen, los polipéptidos de cadena pesada se asociarán con los polipéptidos de cadena ligera para formar el grupo de unión a antigeno. Alternativamente, en otro ejemplo, la parte de cadena ligera del grupo de unión a antigeno podría encontrarse codificado . por un polinucleótido separado procedente de la parte del inmunoconjugado que comprende la parte de cadena ligera del grupo de unión a antígeno y el grupo efector.
En una realización específica, un polinucleótido aislado de la invención codifica un fragmento de un inmunoconjugado que comprende por lo menos un grupo efector, preferentemente un grupo efector de una cadena, y por lo menos un, preferentemente dos o más, grupos de unión a antígeno, en el que un primer grupo efector comparte un enlace peptídico amino-terminal o carboxi-terminal con un primer grupo de unión a antígeno y un segundo grupo de unión a antígeno comparte un enlace peptídico amino-terminal o carboxi-terminal con el primer grupo efector o el primer grupo de unión a antígeno. En una realización preferente, los grupos de unión a antígeno se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste de Fv y Fab. En otra realización específica, el polinucleótido codifica las cadenas pesadas de dos de los grupos de unión a antígeno y uno de los grupos efectores. En otra realización específica, el polinucleótido codifica las cadenas ligeras de dos de los grupos de unión a antigeno y uno de los grupos efectores. En otra realización especifica, el polinucleotido codifica una cadena ligera de uno de los grupos de unión a antigeno, una cadena pesada de un segundo grupo de unión a antigeno y uno de los grupos efectores .
En otra realización especifica, un polinucleotido aislado de la invención codifica un fragmento de un inmunoconjugado, en el que el polinucleotido codifica las cadenas pesadas de dos moléculas de Fab y un grupo efector, preferentemente un grupo efector de una cadena. En otra realización especifica, un polinucleotido aislado de la invención codifica un fragmento de un inmunoconjugado, en el que el polinucleotido codifica las cadenas ligeras de dos moléculas de Fab y un grupo efector, preferentemente un grupo efector de una cadena. En otra realización especifica, un polinucleotido aislado de la invención codifica un fragmento de un inmunoconjugado, en el que el polinucleotido codifica la cadena pesada de una molécula de Fab, la cadena ligera de la segunda molécula de Fab -y un grupo efector, preferentemente un grupo efector de una cadena .
En una realización, un polinucleotido aislado de la invención codifica un inmunoconjugado que comprende por lo menos un grupo efector, preferentemente un grupo efector de una cadena, unido en sus aminoácidos amino-terminales o carboxi-terminales a una o más moléculas de scFv.
En una realización, un polinucleótido aislado de la invención codifica un fragmento de inmunocon ugado que comprende por lo menos un grupo efector, preferentemente un grupo efector de una cadena y por lo menos un primer y un segundo grupos de unión a antigeno, en los que cada uno de los grupos de unión a antigeno comprende una molécula de scFv unida en su aminoácido carboxi-terminal a una región constante que comprende un dominio constante de inmunoglobulina seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste de CH1 de IgGl, Ckappa de IgG y CH4 de IgE, y en los que uno de los grupos de unión a antigeno se une en su aminoácido carboxi-terminal de región constante al aminoácido amino-terminal de uno de los grupos efectores, y en los que el primer y segundo grupos de unión a antigeno se unen covalentemente mediante un enlace disulfuro. En una realización adicional, el polinucleótido de la invención codifica uno de los grupos de unión a antigeno y un grupo efector, preferentemente un grupo efector de una cadena.
En una realización, un po-linucleótido aislado de la invención codifica un fragmento de inmunoconj ugado que comprende primer y segundo grupos efectores y dos grupos de unión a antigeno, en el que cada uno de los grupos de unión a antigeno comprende una molécula de scFv unida en su aminoácido carboxi-terminal a una región constante que comprende un dominio constante de inmunoglobulina, y en el que uno de los grupos de unión a antigeno se une en su aminoácido carboxi-terminal de región constante al aminoácido amino-terminal de uno de los grupos efectores, y en el que el segundo grupo de unión a antigeno se une en su aminoácido carboxi-terminal de región constante al aminoácido amino-terminal del segundo grupo efector, y en el que el primer y seugndo grupos de unión a antigeno se unen covalentemente mediante un enlace disulfuro. En una realización preferente, el primer y/o segundo grupos efectores son grupos efectores de una cadena. En una realización preferente, el dominio constante se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste de CH1 de IgGl, CkapPa de IgG y CH4 de IgE. En una realización adicional, el polinucleótido de la invención codifica uno de los grupos de unión a antigeno y uno de los grupos efectores. En una realización, un polinucleótido aislado de la invención codifica un fragmento de inmunoconj ugado que comprende por lo menos un grupo efector, preferentemente un grupo efector de una cadena y por lo menos un primer y un segundo grupos de unión a antigeno, en los que cada uno de los grupos de unión a antigeno comprende una molécula de scFv unida en su aminoácido carboxi-terminal a un dominio CH3 de IgG, y en los que uno de los grupos de unión a antigeno se une en su aminoácido carboxi-terminal al aminoácido amino-terminal de uno de los grupos efectores, y en los que el primer y segundo grupos de unión a antigeno se unen covalentemente mediante un enlace disulfuro. En una realización adicional, el polinucleótido de la invención codifica uno de los grupos de unión a antigeno y un grupo efector, preferentemente un grupo efector de una cadena.
En una realización, un polinucleótido aislado de la invención codifica un fragmento de inmunoconjugado que comprende dos grupos efectores y dos grupos de unión a antigeno, en el que cada uno de los grupos de unión a antigeno comprende una molécula de scFv unida en su aminoácido carboxi-terminal a un dominio CH3 de IgG, y en el que uno de los grupos de unión se une en su aminoácido carboxi-terminal al aminoácido amino-terminal de uno de los grupos efectores, y en el que el segundo grupo de unión a antigeno se une en su aminoácido carboxi-terminal al aminoácido amino-terminal del segundo grupo efector, y en el que el primer y seugndo grupos de unión a antigeno se unen covalentemente mediante un enlace disulfuro. En una realización preferente, el primer y/o segundo grupos efectores son grupos efectores de una cadena. En una realización adicional, el polinucleótido de la invención codifica uno de los grupos de unión a antigeno y uno de los grupos efectores, preferentemente un grupo efector de una cadena.
En una realización, un polinucleótido aislado de la invención codifica un fragmento de inmunoconj ugado que comprende dos grupos efectores y dos grupos de unión a antígeno, en el que cada uno de los grupos de unión a antigeno comprende una molécula de Fab unida en su aminoácido carboxi-terminal de cadena pesada o ligera a un dominio CH3 de IgGl, y en el que cada uno de los dominios CH3 de IgGl se une en su aminoácido, carboxi-terminal al aminoácido amino-terminal de uno de los grupos efectores, y en el que el primer y segundo grupos de unión a antigeno se unen covalentemente mediante un enlace disulfuro. En una realización preferente, el primer y/o segundo grupos efectores son grupos efectores de una cadena. En una realización adicional, el polinucleótido de la invención comprende una secuencia codificante de la región variable de cadena pesada de uno de los grupos de unión a antigeno y uno de dichos grupos efectores, preferentemente un grupo de una cadena. En todavía otra realización, el polinucleótido de la invención comprende una secuencia codificante de la región variable de cadena ligera de uno de los grupos de unión a antígeno y uno de los grupos efectores, preferentemente un grupo efector de una cadena.
En otra realización, la presente invención se refiere a un polinucleótido aislado codificante de un inmunoconj ugado o fragmento del mismo, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica una secuencia de región variable tal como se muestra en la Tabla 3, posteriormente. En otra realización, la presente invención se refiere a un polinucleótido aislado codificante de un inmunoconjugado o fragmento del mismo, en el que el polinucleótido comprende una secuencia que codifica una secuencia polipeptidica tal como se muestra en la Tabla 4. En otra realización, la invención se refiere además a un ácido nucleico aislado codificante de un inmunoconjugado o fragmento del mismo, en el que el ácido nucleico comprende una secuencia que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia de nucleótidos mostrada en las Tablas 6 y 8, posteriormente. En otra realización, la invención se refiere a un ácido nucleico aislado codificante de un inmunoconjugado o fragmento del mismo, en el que el ácido nucleico comprende una secuencia de ácidos nucleicos mostrada en las Tablas 6 y 8. En otra realización, la invención se refiere a un ácido nucleico aislado codificante de un inmunoconjugado o fragmento del mismo, en el que el ácido nucleico comprende una secuencia que codifica una secuencia de región variable que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos en la Tabla 3. En otra realización, la invención se refiere a un ácido nucleico aislado codificante de un inmunoconjugado o fragmento del mismo, en el que el ácido nucleico comprende una secuencia que codifica una secuencia polipeptidica que es por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos en la Tabla . La invención comprende un ácido nucleico aislado codificante de un inmunoconj ugado o fragmento del mismo, en el que el ácido nucleico comprende una secuencia que codifica las secuencias de región variable de la Tabla 3 con sustituciones conservadoras de aminoácidos. La invención también comprende un ácido nucleico aislado codificante de un inmunoconj ugado de la invención o fragmento del mismo, en el que el ácido nucleico comprende una secuencia que codifica las secuencias polipeptidicas de la Tabla 4 con sustituciones conservadoras de aminoácidos.
TABLA 2: TABLA 3: Constructo SECUENCIA POLIPEPTÍDICA SEC ID n° EWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ NSLRAED TAVYYCAKGWLGNFDYWGQGTLVTVSS 2C6; VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAP 41 RLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ QGQQI PPTFGQGTKVEIK 2C6; VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSSYAMSWVRQAPGKGL 43 EWVSAISGSAGYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCAKGWFGNFDYWGQGTLVTVSS 5H5 vL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAP 45 RLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ QGNQIPPTFGQGTKVEIK 5H5; VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRRSPGKGL 47 EWVSAISGGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDT AVYYCAKGWFTPFDYWGQGTLVTVSS 2C4; vL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSNYLAWYQQKPGQAP 49 RLLIYGASIRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ QGNQIPPTFGQGTKVEIK 2C4; VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL 51 EWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCAKGWFTPFDYWGQGTLVTVSS 2D9; VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAP 67 RLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ QGNQIPPTFGQGTKVEIK 2D9; VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMS VRQAPGKGL 69 Constructo SECUENCIA POLIPEPTÍDICA SEC ID n° EWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCAKGWFTPFDYWGQGTLVTVSS 4B8; VL ' EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAP 71 RLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ QGQVIPPTFGQGTKVEIK 4B8; vH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL 73 EWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCAKGWLGNFDYWGQGTLVTVSS 7A1; vL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAP 75 RLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ QGQQIPPTFGQGTKVEIK 7A1; VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL 77 EWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ NSLRAED TAVYYCAKGWFGNFDYWGQGTLVTVSS 13C2; vL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLA YQQKPGQAP 79 RLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ QGQLIPPTFGQGTKVEIK 13C2; VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL 81 E VSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCAKGWLGPFDYWGQGTLVTVSS 13E8; vL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAP 83 RLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ QGLNIPSTFGQGTKVEIK 13E8 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL 85 Cons ructo SECUENCIA POLIPEPTÍDICA SEC ID n° E VSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCAKGWLGPFDYWGQGTLVTVSS 14C10; vL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAP 87 RLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ QGHII PPTFGQGTKVEIK 14C10; vH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL 89 EWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCAKAWMGPFDYWGQGTLVTVSS .17A11; vL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAP 91 RLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ QGLNIPSTFGQGTKVEIK 17A11; vH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL • 93 EWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCAKGWLGPFDYWGQGTLVT SS 19G1; vL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAP 121 RLLINVGSRRATGI PDRFSGSGSG DFTLTISRLEPEDFAVYYCQ QGIMLPPTFGQGTKVEIK 19G1; vH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL 123 EWVSAIISSGGLTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSS 20G8; vL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAP 125 · RLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ QGIMLPPTFGQGTKVEIK 20G8; vH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL 127 Constructo SECUENCIA POLIPEPTÍDICA SEC ID n° EWVSAIIGSGSRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSS 4B9; vL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAP 129 RLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ QGIMLPPTFGQGTKVEIK 4B9; VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL 131 EWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSS 5B8; vL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAP 133 RLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ QGIMLPPTFGQGTKVEIK 5B8 vH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL 135 EWVSAIWGGGRSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSS 5F1; vL EI LTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAP 137 RLLI VGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ QGIMLPPTFGQGTKVEIK 5F1; vH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL 139 EWVSAIISSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSS 14B3; vL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAP 141 RLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ QGIMLPPTFGQGTKVEIK 14B3; vH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL 143 Construc o SECUENCIA POLIPEPTÍDICA SEC ID n° EWVSAILASGAITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ NSLRAED TAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSS 16F1; vL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAP 145 RLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ QGIMLPPTFGQGTKVEIK 16F1; vH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL 147.
E VSGIIGSGGITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSS 16F8; vL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAP 149 RLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ QGIMLPPTFGQGTKVEIK 16F8; vH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL 151 EWVSAILGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSS 03C9; vL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAP 153 RLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ QGIMLPPTFGQGTKVEIK 03C9; v„ EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFA SWVRQSPGKGL 155 EWVSAIIGSGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSS 02D7 ; vL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAP 157 RLLINVGSRRATGTPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ QAIMLPPTFGQGTKVEIK 02D7; vH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL 159 Constructo SECUENCIA POLIPEPTÍDICA SEC ID n° EWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSS 28H1; vL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSRSYLAWYQQKPGQAP 161 RLLI IGASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ QGQVIPPTFGQGTKVEIK 28H1; VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMS VRQAPGKGL 163 E VSAIWASGEQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDT AVYYCAKGWLGNFDYWGQGTLVTVSS 22A3 vL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAP 165 RLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ QGIMLPPTFGQGTKVEIK 22A3; VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL 167 EWVSAIIGSGSITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSS 29B11; vL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAP 169 RLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ QGIMLPPTFGQGTKVEIK 29B11; v„ EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL 171 EWVSAIIGSGGITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ NSLRAED TAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSS 23C10; vL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSRSYLAWYQQKPGQAP 173 RLLIIGASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ QGQVIPPTFGQGTKVEIK 23C10; vH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSAMSWVRQAPGKGL 175 Cons ructo SECUENCIA POLIPEPTÍDICA SEC ID n° ; v„ E MGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED TAVYYCARLYGYAYYGAFDYWGQGTTVTVSS 2B10 _D1A2_ VD DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPK 193 ; vL RLIYDAYSLQSGVPSRFSGGGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQ NGLQPATFGQGTKVEIK 2B10 _D1A2_ VD QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGL 195 ; vH EWMGG11PIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED TAVYYCARLYGYAYYGAFDYWGQGTTVTVSS 2B10_ _07D8; vL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRNVLGWYQQKPGKAPK 197 RLIYDVSSLQSGVPSRFSGGGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQ NGLQPATFGQGTKVEIK 2B10_ 07D8; vH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGL 199 E MGGIIPIFGTA YAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED TAVYYCARLYGYAYYGAFDYWGQGTTVTVSS 2B10_ _01F7; DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNVLGWYQQKPGKAPK 201 RLIYDASSLQSGVPSRFSGGGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQ NGLQPATFGQGTKVEIK 2B10_ _01F7; vH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGL 203 EWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED TAVYYCARLYGYAYYGAFDYWGQGTTVTVSS 2B10_ _6H10; vL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNVLGWYQQKPGKAPK 205 RLIQAATSLQSGVPSRFSGGGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQ NGLQPATFGQGTKVEIK 2B10_ 6H10; vH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGL 207 TABLA 5: TABLA 6: Constructo SECUENCIA POLINUCLEÓTIDA SEC ID n° 2B10; vL GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTC 4 GGAGACCGGGTCACCATCACCTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGA AATGATTTAGGGTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCTAAG CGCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAGAGTGGCGTCCCATCA AGGTTCAGCGGCGGTGGATCCGGGACAGAGTTCACTCTCACCATC AGCAGCTTGCAGCCTGAAGATTTTGCCACCTATTACTGCTTGCAG AATGGTCTGCAGCCCGCGACGTTTGGCCAGGGCACCAAAGTCGAG ATCAAG B10 (GS) ; vL GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTC 6 GGAGACCGGGTCACCATCACCTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGA AATGATTTAGGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCTAAG CGCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAGAGTGGCGTCCCATCA AGGTTCAGCGGCAGTGGATCCGGGACAGAGTTCACTCTCACCATC AGCAGCTTGCAGCCTGAAGATTTTGCCACCTATTACTGCTTGCAG AATGGTCTGCAGCCCGCGACGTTTGGCCAGGGCACCAAAGTCGAG ATCAAG 2B10; VH CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGG 8 TCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCCGGAGGCACATTCAGC AGCTACGCTATAAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTC GAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGTACAGCAAACTAC GCACAGAAGTTCCAGGGCAGGGTCACCATTACTGCAGACAAATCC ACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGAC ACCGCCGTGTATTACTGTGCGAGACTGTACGGTTACGCTTACTAC 1 Constructo SECUENCIA POLINUCLEÓTIDA SEC ID n° ACCGCCGTGTATTACTGTGCGAGACTGTACGGTTACGCTTACTAC GGTGCTTTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACCGTGACCGTCTCC TCA 2B10 _6A12; vL GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTC 182 GGAGACCGGGTCACCATCACCTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGA AATGATTTAGGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCTAAG CGCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAGAGTGGCGTCCCATCA AGGTTCAGCGGCAGTGGATCCGGGACAGAGTTCACTCTCACCATC AGCAGCTTGCAGCCTGAAGATTTTGCCACCTATTACTGCTTGCAG AATGGTCTGCAGCCCGCGACGTTTGGCCAGGGCACCAAAGTCGAG ATCAAG 2B10 _6A12; vH CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGG 184 TCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCCGGAGGCACATTCAGC AGCTATGCTATAAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTC GAGTGGATGGGAGTGATCATCCCTATCCTTGGTACCGCAAACTAC GCACAGAAGTTCCAGGGCAGGGTCACCATTACTGCAGACAAATCC ACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGAC ACCGCCGTGTATTACTGTGCGAGACTGTACGGTTACGCTTACTAC GGTGCTTTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACCGTGACCGTCTCC TCA 2B10 _C3 6 vL GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCTCCCTGTCTGCATCTGTC 186 GGAGACCGGGTCACCATCACCTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTCGT AATGTTTTAGGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCTAAG CGCCTGATCTATGATTCGTCCAGTTTGCAGAGTGGCGTCCCATCA Constructo SECUENCIA POLINUCLEÓTIDA SEC ID n° B10_ _01F7; v„ CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGG 204 TCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCCGGAGGCACATTCAGC AGCTACGCTATAAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTC GAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGTACAGCAAACTAC GCACAGAAGTTCCAGGGCAGGGTCACCATTACTGCAGACAAATCC ACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGAC ACCGCCGTGTATTACTGTGCGAGACTGTACGGTTACGCTTACTAC GGTGCTTTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACCGTGACCGTCTCC TCA B10 _6H10 vL GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTC 206 GGAGACCGGGTCACCATCACCTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTCGT AATGTTTTAGGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCTAAG CGCCTGATCCAGGCTGCTACCAGTTTGCAGAGTGGCGTCCCATCA AGGTTCAGCGGCGGTGGATCCGGGACAGAGTTCACTCTCACCATC AGCAGCTTGCAGCCTGAAGATTTTGCCACCTATTACTGCTTGCAG AATGGTCTGCAGCCCGCGACGTTTGGCCAGGGCACCAAAGTCGAG ATCAAG B10 _6H10; VH CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGG 208 TCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCCGGAGGCACATTCAGC AGCTACGCTATAAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTC GAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGTACAGCAAACTAC GCACAGAAGTTCCAGGGCAGGGTCACCATTACTGCAGACAAATCC ACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGAC ACCGCCGTGTATTACTGTGCGAGACTGTACGGTTACGCTTACTAC Construc o SECUENCIA POLINUCLEÓTIDA SEC ID n° GATTCCAAGAACACGCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGACC GAGGATACGGCCGTGTATTACTGTACCACATACGGCAACTACGTT GGGCACTACTTCGACCACTGGGGCCAAGGGACCACCGTCACCGTC TCCAGT ¦ V1 VL GATATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTTCCTGTCTGCATCTGTGGG 270 CGACCGGGTCACCATCACCTGCAGGGCCAGTCAGAATGTGGATACTA ACTTAGCTTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCACCTAAGCTCCTG ATCTATTCGGCATCCTACCGTTACACTGGCGTCCCATCAAGGTTCAG CGGCAGTGGATCCGGGACAGAGTTCACTCTCACAATCTCAAGCCTGC AACCTGAAGATTTCGCAACTTACTACTGTCAACAGTACAATAGTTAC CCTCTGACGTTCGGCGGAGGTACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGT G KV7; VL GATATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTTCCTGTCTGCATCTGTG 272 GGCGACCGGGTCACCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGAT ACTAACGTGGCTTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCACCTAAG CCTCTGATCTATTCGGCATCCTACCGGTACACTGGCGTCCCATCA AGGTTCAGCGGCAGTGGATCCGGGACAGAGTTCACTCTCACAATC TCAAGCCTGCAACCTGAAGATTTCGCAACTTACTACTGTCAACAG TACAATAGTTACCCTCTGACGTTCGGCGGAGGTACCAAGGTGGAG · ATCAAGCGTACGGTG TABLA 7: Constructo SECUENCIA POLINUCLEÓTIDA SEC ID n° 09 TABLA 8: 4 4 25 Células huésped Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "célula huésped" se refiere a cualquier tipo de sistema celular que puede manipularse para generar los inmunoconj ugados de la invención o fragmentos de los mismos. En una realización, la célula huésped se manipula para permitir la producción de un fragmento de inmunoconjugado . Entre las células huésped se incluyen las células en cultivo, por ejemplo las células en cultivo de mamífero, tales comó células CHO, HEK, BH, NSO, Sp2/0, de mieloma YO, de mieloma de ratón P3X63, PER, PER.C6 o células de hibridoma, células de levadura, de insecto, bacterianas y vegetales, entre otras, aunque también células comprendidas en un animal transgénico, planta transgénica o tejido vegetal o animal en cultivo. En una realización, la célula huésped de la invención comprende un vector de expresión que comprende secuencias polinucleótidas que codifican inmunoconj ugados de la invención o fragmentos de los mismos. Las células huésped de la invención pueden ser eucarióticas o procarióticas.
Purificación de polipéptidos de inmunoconjugado y fragmentos de los mismos Los inmunoconj ugados de la invención o fragmentos de los mismos pueden purificarse mediante técnicas conocidas, tales como la cromatografía líquida de alto rendimiento, la cromatografía de intercambio iónico, la electroforesis en gel, la cromatografía de afinidad, la cromatografía de exclusión por tamaño y similares. Las condiciones reales utilizadas para purificar una proteína particular dependerán, en parte, de factores tales como la carga neta, la hidrofobicidad, la hidrofilicidad, etc., y resultarán evidentes para el experto en la materia.
Para la purificación mediante cromatografía de afinidad, puede utilizarse una matriz con proteína A o con proteína G. Alternativamente, para la purificación mediante cromatografía de afinidad, puede utilizarse cualquier anticuerpo que se una específicamente al grupo efector de una cadena del inmunoconjugado. Para la producción de anticuerpos, diversos animales huésped, incluyendo, aunque sin limitación, conejos, ratones, ratas, etc., pueden inmunizarse mediante inyección con un inmunoconjugado de la invención o un fragmento del mismo. El inmunocon ugado puede unirse a un portador adecuado, tal como albúmina de suero bovino (BSA) , por medio de un grupo funcional de cadena lateral o línkers unidos a un grupo funcional de cadena lateral. Pueden utilizarse diversos adyuvantes para incrementar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie del huésped, incluyendo, aunque sin limitación, adyuvante de Freund (completo e incompleto) , geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias activas en superficie tales como lisolecitina , polioles plurónicds, polianiones, péptidos, emulsiones aceitosas, hemocianina de lapa americana, dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente útiles, tales como BCG (bacilos Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Por consiguiente, una realización incluye un método para producir los inmunoconjugados de la invención mediante el cultivo de una célula huésped que comprende un vector de expresión que comprende secuencias polinucleótidas que codifican inmunoconjugados de la invención o fragmentos de los mismos bajo condiciones adecuadas para la expresión de los mismos.
Métodos de utilización de inmunoconjugados Los inmunoconjugados de la invención resultan útiles para dirigir determinantes antigénicos específicos y para inducir diversas respuestas celulares en células diana y reclutadas. El inmunoconj ugado de la invención también resulta útil como reactivo diagnóstico. La unión de un inmunoconj ugado a un determinante antigénico puede detectarse fácilmente mediante la utilización de un anticuerpo secundario específico para el grupo efector. En una realización, el anticuerpo secundario y el inmunoconjugado facilitan la detección de la unión del inmunoconj ugado a un determinante antigénico localizado sobre una célula o superficie de un tejido.
En algunas realizaciones, se administra a una célula una cantidad eficaz de los inmunoconjugados de la invención. En otras realizaciones, se administra en un individuo una cantidad terapéuticamente eficaz del inmunoconjugado de la invención para el tratamiento de una enfermedad. La expresión "cantidad eficaz" tal como se utiliza en la presente memoria se define como la cantidad del inmunoconjugado de la invención que resulta necesaria para provocar un cambio fisiológico en la célula o tejido en el que se administra. La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" tal como¦ se utiliza en la presente memoria se define como la cantidad del inmunoconj ugado de la invención que elimina, reduce, retrasa, minimiza o evita efectos adversos de una enfermedad.
Los inmunoconj ugados de la invención pueden administrarse en un sujeto per se o en forma de una composición farmacéutica. En una realización, la enfermedad es un trastorno proliferativo, tal como cáncer. Entre los ejemplos no limitativos de trastornos proliferativos, tales como cánceres, se incluyen cáncer de vejiga, cáncer de cerebro, cáncer de cabeza y cuello, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer uterino, cáncer cervical, cáncer endometrial, cáncer esofágico, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer gástrico, cáncer de próstata, cáncer de sangre, cáncer de piel, carcinoma de células escamosas, cáncer de huesos y cáncer de riñon. Entre otros trastornos de la proliferación celular que pueden tratarse utilizando un inmunoconjugado de la presente invención se incluyen, .aunque sin limitación, neoplasmas localizados en: abdomen, hueso, mama, sistema digestivo, hígado, páncreas, peritoneo, glándulas endocrinas (adrenal, paratiroide, pituitaria, testículos, ovario, timo, tiroides), ojo, cabeza y cuello, sistema nervioso (central y periférico), sistema linfático, pelvis, piel, tejidos blandos, bazo, región torácica y sistema urogenital. También se encuentran incluidas las condiciones o lesiones precancerosas y las metástasis de cáncer. De manera similar, otros trastornos de la proliferación celular también pueden tratarse mediante los inmunoconjugados de la presente invención. Entre los ejemplos de dichos trastornos de la proliferación celular se incluyen, aunque sin limitación: hipergammaglobulinemia, trastornos linfoproliferativos , paraproteinemias, púrpura, sarcoidosis, síndrome de Sezary, macroglobulinemia de Waldenstron, enfermedad de Gaucher, histiocitosis y cualquier otra enfermedad de la proliferación celular, aparte de neoplasia, localizada en un sistema orgánico indicado anteriormente. En otra realización, la enfermedad se relaciona con la autoinmunidad, el rechazo del trasplante, las respuestas inmunológicas post-traumáticas y las enfermedades infecciosas (por ejemplo VIH) . Más específicamente, los inmunoconj ugados pueden utilizarse para eliminar células implicadas en trastornos mediados por células inmunológicas , incluyendo linfoma, autoinmunidad, rechazo del trasplante, enfermedad de injerto contra huésped, isquemia e ictus. El experto en la materia reconocerá fácilmente que en muchos casos los inmunoconjugados podrían no proporcionar la curación sino únicamente un beneficio parcial. En algunas realizaciones, un cambio fisiológico que presente cierto beneficio también se considera terapéuticamente beneficioso. De esta manera, en algunas realizaciones, una cantidad de inmunoconjugado que proporcione un cambio fisiológico se considera una "cantidad eficaz" o una "cantidad terapéuticamente eficaz".
El sujeto, paciente o individuo que necesita tratamiento típicamente es un mamífero, más específicamente un ser humano .
Composiciones, formulaciones, dosis y vias de administración Las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden una cantidad eficaz de uno o más inmunoconj ugados disueltos o dispersados en un portador farmacéuticamente aceptable. La expresión "farmacéutica o farmacológicamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica u otra desfavorable al administrarse en un animal, tal como, por ejemplo, un ser humano, según resulte apropiado. La preparación de una composición farmacéutica que contenga por lo menos un inmunocon ugado y opcionalmente un ingrediente activo adicional resultará conocida para el experto en la materia a la luz de la presente exposición, tal como se ejemplifica en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición, Mack Printing Company, 1990, incorporada como referencia en la presente memoria. Además, para la administración animal (por ejemplo humana) , se entenderá que las preparaciones deben cumplir los estándares de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza requeridos por la FDA Office of Biological Standards o autoridades correspondientes en otros países.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "portador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y la totalidad de los solventes, tampones, medios de dispersión, recubrimientos, surfactantes , antioxidantes, conservantes (por ejemplo agentes antibacterianos, agentes antifúngicos ) , agentes isotónicos, agentes retardantes de la absorción, sales, conservantes, fármacos, estabilizantes de fármacos, geles, ligantes, excipientes, agentes de desintegración, lubricantes, agentes edulcorantes, agentes saborizantes , pigmentos, tales como materiales y combinaciones de los mismos, tal como conocerá el experto ordinario en la materia (ver, por ejemplo, Remington' s Pharmaceutical Sciences, 18a edición, Mack Printing Company, 1990, páginas 1289 a 1329, incorporada como referencia en la presente memoria) . Excepto en la medida en que cualquier portador convencional resulte incompatible con el ingrediente activo, se encuentra contemplada su utilización en las composiciones terapéuticas o farmacéuticas.
Los inmunoconjugados pueden comprender diferentes tipos de portador dependiendo de si debe administrarse en forma sólida, liquida o aerosol, y de si debe ser estéril para vias de administración tales como la inyección. La presente invención puede administrarse por via intravenosa, intradérmica, intraarterial, interaperitoneal, intralesional, intracraneal, intraarticular, intraprostática, intraesplénica, intrarrenal, intrapleural, intratraqueal , intranasal, intravítrea, intravaginal , intrarrectal, tópica, intratumoral , intramuscular, intraperitoneal , subcutánea, subconj untival , intravesicular, mucosal, intrápericárdica, intraumbilical , intraocular, oral, tópica, local, por inhalación (por ejemplo inhalación de aerosol) , inyección, infusión, infusión continua, perfusión localizada bañando las células diana directamente, mediante un catéter, mediante un lavado, en cremas, en composiciones de lipidos (por ejemplo liposomas) o mediante cualquier método o combinación de los anteriores conocida por el experto ordinario en la materia (ver, por ejemplo, Remington' s Pharmaceutical Sciences, 18a edición, Mack Printing Company, 1990, incorporada como referencia en la presente memoria) . La administración parenteral, en particular la inyección intravenosa, se utiliza más comúnmente para administrar moléculas de polipéptido, tales como los inmunoconj ugados de la invención. La cantidad real de dosis de una composición de la presente invención administrada en un sujeto puede determinarse a partir de factores físicos y fisiológicos, tales como el peso corporal, la severidad de la condición, el tipo de enfermedad bajo tratamiento, las intervenciones terapéuticas previas o concurrentes, la idiopatía del paciente y la via de administración. El responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la concentración del ingrediente o ingredientes activos en una composición y la dosis o dosis apropiadas para el sujeto individual.
En determinadas realizaciones, las composiciones farmacéuticas pueden comprender, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 0,1% del inmunoconj ugado de la invención. En otras realizaciones, los inmunoconj ugados pueden comprender entre aproximadamente 2% y aproximadamente 75% del peso de la unidad, o entre aproximadamente 25% y aproximadamente 60%, por ejemplo, y cualquier intervalo derivable dentro de dichos intervalos. En otros ejemplos no limitativos, una dosis también puede comprender entre aproximadamente 1 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 5 microgramos/kg peso corporal , aproximadamente 10 microgramos/kg peso corporal, aproximadamente 50 microgramos/kg peso corporal, aproximadamente 100 microgramos/kg peso corporal , aproximadamente 200 microgramos/kg peso corporal , aproximadamente 350 microgramos/kg peso corporal , aproximadamente 500 microgramos/kg peso corporal, aproximadamente 1 miligramo/kg peso corporal, aproximadamente 5 miligramos/kg peso corporal, aproximadamente 10 miligramos/kg peso corporal, aproximadamente 50 miligramos/kg peso corporal, aproximadamente 100 miligramos/kg peso corporal , aproximadamente 200 miligramos/kg peso corporal, aproximadamente 350 miligramo/kg peso corporal, aproximadamente 500 miligramos/kg peso corporal y aproximadamente 1.000 miligramos/kg peso corporal, o más en cada administración, y cualquier intervalo derivable dentro de dichos intervalos. En ejemplos no limitativos de un intervalo derivable a partir de los números indicados en la presente memoria, puede administrarse un intervalo de entre aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, entre aproximadamente 5 microgramos/kg de peso corporal y aproximadamente 500 miligramos/kg de peso corporal, etc., basados en los números indicados anteriormente.
En cualquier caso, la composición puede comprender diversos antioxidantes para retardar la oxidación de uno o más componentes. Además, la prevención de la acción de los microorganismos puede realizarse mediante conservantes, tales como diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, incluyendo, anque sin limitación, parabenes (por ejemplo metilparabenes, propilparabenes) , clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal o combinaciones de los mismos.
Los inmunoconjugados pueden formularse en una composición en forma de base libre, neutra o de sal. Entre las sales farmacéuticamente aceptables se incluyen las sales de adición de ácido, por ejemplo aquéllas formadas con los grupos amino libres de una composición proteica, o que se forman con ácidos inorgánicos, tales como, por ejemplo, ácidos hidroclóricos o fosfóricos, o ácidos orgánicos tales como los ácidos acético, oxálico, tartárico o mandélico. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivarse a partir de bases inorgánicas, tales como, por ejemplo, los hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o hierro, o de bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina o procaina.
En realizaciones en las que la composición se encuentra en una forma liquida, un portador puede ser un solvente o medio de dispersión que comprende, aunque sin limitación, agua, etanol, poliol (por ejemplo glicerol, propilenglicol , polietilenglicol líquido, etc.), lípidos (por ejemplo triglicéridos , aceites vegetales, liposomas) y combinaciones de los mismos. Puede mantenerse la fluidez apropiada, por ejemplo, mediante la utilización de un recubrimiento, tal como lecitina; mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido mediante dispersión en portadores tales como, por ejemplo, poliol líquido o lípidos; mediante la utilización de surfactantes, tales como, por ejemplo, hidroxipropilcelulosa; o combinaciones de dichos métodos. En muchos casos, resulta preferible incluir agentes isotónicos, tales como, por ejemplo, azúcares, cloruro sódico o combinaciones de los mismos, y/o agentes tamponadores para mantener los valores de pH fisiológicamente aceptables.
En otras realizaciones, pueden utilizarse gotas oculares, soluciones nasales o sprays, aerosoles o inhalantes en la presente invención. Dichas composiciones generalmente se diseñan para que resulten compatibles con el tipo de tejido diana. En un ejemplo no limitativo, las soluciones nasales habitualmente son soluciones acuosas diseñadas para administrarse en las vías nasales en gotas o sprays. Las soluciones nasales se preparan de manera que resulten similares en muchos aspectos a las secreciones nasales, de manera que se mantenga la acción ciliar normal. De esta manera, en algunas realizaciones, las soluciones acuosas nasales habitualmente son isotónicas o ligeramente tamponadas para mantener un pH de entre aproximadamente 5,5 y aproximadamente 6,5. Además, pueden incluirse en la formulación conservantes antimicrobianos, similares a los utilizados en preparaciones oftálmicas, fármacos o estabilizadores de fármaco apropiados, en caso de resultar necesarios. Por ejemplo, son conocidas diversas preparaciones nasales comerciales y entre ellas se incluyen fármacos tales como antibióticos o antihistaminicos .
En determinadas realizaciones, el inmunoconj ugado se prepara para la administración mediante dichas vías como ingestión oral. En estas realizaciones, la composición sólida puede comprender, por ejemplo, soluciones, suspensiones, emulsiones, tabletas, pildoras, cápsulas (por ejemplo cápsulas de gelatina de cáscara dura o blanda) , formulaciones de liberación sostenida, composiciones bucales, trociscos, elixires, suspensiones, jarabes, obleas o combinaciones de los mismos. Pueden incorporarse composiciones orales directamente con los alimentos de la dieta. Los portadores preferentes para la administración oral comprenden diluyentes inertes, portadores comestibles asimilables o combinaciones de los mismos. En otros aspectos de la invención, la composición oral puede prepararse en forma de jarabe o elixir. Un jarabe o elixir puede comprender, por ejemplo, por lo menos un agente activo, un agente edulcorante, un conservante, un agente saborizante, un pigmento, un conservante, o combinaciones de los mismos.
En determinadas realizaciones, una composición oral puede comprender uno o más ligantes, excipientes, agentes de desintegración, lubricantes, agentes saborizantes y combinaciones de los mismos. En determinadas realizaciones, una composición puede comprender uno o más de los siguientes: un ligante, tal como, por ejemplo, goma tragacanto, acacia, almidón de maíz, gelatina o combinaciones de los mismos; un excipiente, tal como, por ejemplo, fosfato de dicalcio, manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio o combinaciones de los mismos; un agente desintegrante, tal como, por ejemplo, almidón de maiz, almidón de patata, ácido algínico o combinaciones de los mismos; un lubricante, tal como, por ejemplo, estearato de magnesio; un agente edulcorante, tal como, por ejemplo, sacarosa, lactosa, sacarina o combinaciones de los mismos; un agente saborizante, tal como, por ejemplo, menta, aceite de gaulteria (wintergreen) , saborizante de cereza, saborizante de naranja, etc., o combinaciones de los mismos. En el caso de que la forma de dosificación unitaria sea una cápsula, puede contener, además de materiales del tipo anteriormente indicado, portadores tales como un portador liquido. Pueden encontrarse presentes diversos otros materiales como recubrimientos, o para modificar de otro modo la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, las tabletas, pildoras o cápsulas pueden recubrirse con shellac, azúcar o ambos.
Entre las formulaciones adicionales que resultan adecuadas para otros modos de administración se incluyen los supositorios. Los supositorios son formas de dosificación sólidas de diversos pesos y formas, habitualmente medicados, para la inserción en el recto, la vagina o la uretra. Tras la inserción, los supositorios se ablandan, se funden o se disuelven en los líquidos de la cavidad. En general, para los supositorios, entre los portadores tradicionales pueden incluirse, por ejemplo, polialquilenglicoles, triglicéridos o combinaciones de los mismos. En determinadas realizaciones, los supositorios pueden formarse a partir de mezclas que contengan, por ejemplo, el ingrediente activo en el intervalo de entre aproximadamente 0,5% y aproximadamente 10%, y preferentemente de entre aproximadamente 1% y aproximadamente 2%.
Se prepararn soluciones inyectables estériles mediante la incorporación de los inmunoconj ugados de la invención en la cantidad requerida en el solvente apropiado con diversos de los demás ingredientes indicados anteriormente, según resulte necesario, seguido de la esterilización mediante filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan mediante la incorporación de los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y/o los demás ingredientes. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones, suspensiones o emulsiones inyectables estériles, los métodos preferentes de preparación son el secado al vacio o las técnicas de liofilización que proporcionan polvos del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de un medio liquido del mismo previamente esterilizado mediante filtración. El medio liquido debería tamponarse convenientemente en caso necesario y en primer lugar convertir en isotónico el diluyente líquido previamente a la inyección utilizando suficiente solución salina o glucosa. La preparación de composiciones altamente concentradas para la inyección directa también se encuentra contemplada, en la que se contempla la utilización de DMSO como solvente para resultar en la penetración extremadamente rápida, administrando concentraciones elevadas de los agentes activos en un área reducida.
La composición debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento, y conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. Se apreciará que la contaminación por endotoxinas debe mantenerse como mínimo a un nivel seguro, por ejemplo menos de 0,5 ng/mg de proteína.
En realizaciones particulares, la absorción prolongada de una composición inyectable puede llevarse a cabo mediante la utilización en las composiciones de agentes retardantes de la absorción, tales como, por ejemplo, monoestearato de aluminio, gelatina o combinaciones de los mismos.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden los inmunoconj ugados de la invención pueden prepararse mediante procedimientos de mezcla convencional, disolución, granulado, preparación de grageas, levigación, emulsionación, encapsulado, atrapamiento o liofilización . Las composiciones farmacéuticas pueden formularse de manera convencional utilizando uno o más portadores, diluyentes, excipientes o auxiliares fisiológicamente aceptables que faciliten el procesamiento de las proteínas en preparaciones que puedan utilizarse farmacéuticamente. La formulación apropiada depende de la vía de administración seleccionada.
Para la administración tópica, los inmunoconjugados de la invención pueden formularse en forma de soluciones, geles, pomadas, cremas, suspensiones, etc., que son bien conocidas de la técnica.
Entre las formulaciones sistémicas se incluyen aquéllas diseñadas para la administración mediante inyección, por ejemplo la administración subcutánea, la inyección intravenosa, intramuscular, intratecal o intraperitoneal, así como aquéllas diseñadas para la administración transdérmica, transmucosal, por inhalación, oral o pulmonar.
Para la inyección, los inmunoconjugados de la invención pueden formularse en soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles, tales como solución de Hank, solución de Ringer o tampón salino fisiológico. La solución puede contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, estabilizadores y/o dispersantes.
Alternativamente, los inmunocon ugados pueden presentarse en forma de polvos para la constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo agua estéril libre de pirógenos, antes de su utilización.
Para la administración transmucosal , se utilizan en la formulación penetrantes apropiados a la barrera que debe permearse. Dichos penetrantes son generalmente conocidos de la técnica.
Para la administración oral, los inmunoconj ugados pueden formularse fácilmente mediante combinación de los inmunoconj ugados con portadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos de la técnica. Dichos portadores permiten permiten formular los inmunoconj ugados de la invención como tabletas, pildoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, mezclas en suspensión, suspensiones y similares, para la ingestión oral del paciente que debe tratarse. Para formulaciones sólidas orales tales como, por ejemplo, polvos, cápsulas y tabletas, entre los excipientes adecuados se incluyen rellenos, tales como azúcares, por ejemplo lactosa, sacarosa, manitol y sorbitol; preparaciones dé celulosa, tales como almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina,. goma tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y/o polivinilpirrolidona (PVP) ; agentes de granulación y agentes de unión. Si se desea, pueden añadirse agentes desintegrantes, tales como polivinilpirrolidona reticulada, ágar o ácido alginico, o una sal del mismo, tal como alginato sódico.
Si se desea, las formas de dosificación sólida pueden recubrirse con azúcar o con un recubrimiento entérico utilizando técnicas estándares.
Para las preparaciones liquidas orales tales como, por ejemplo, suspensiones, elixires y soluciones, entre los portadores, excipientes o diluyentes adecuados se incluyen agua, glicoles, aceites, alcoholes, etc. Además, pueden añadirse agentes saborizantes, conservantes, agentes colorantes y similares.
Para la administración bucal, los inmunoconj ugados pueden presentar la forma de tabletas, pastillas, etc., formuladas de manera convencional.
Para la administración mediante inhalación, los inmunoconj ugados para la utilización según la invención se administran convenientemente en forma de un spray de aerosol a partir de paquetes presurizados o un nebulizador utilizando un propelente adecuado, por ejemplo diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la dosis unitaria puede determinarse proporcionando una válvula para administrar una cantidad medida. Pueden formularse cápsulas y cartuchos de gelatina para la utilización en un inhalador o insuflador que contenga una mezcla de polvos del inmunoconj ugado y una base de polvos adecuada, tal como lactosa o almidón.
Los inmunoconjugados también pueden formularse en composiciones rectales o vaginales, tales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo que contengan bases convencionales para supositorio, tales como manteca de cacao u otros glicéridos.
Además de las formulaciones anteriormente indicadas, los inmunoconjugados también pueden formularse como una preparación de depósito. Dichas formulaciones de acción prolongada pueden administrarse mediante implantación (por ejemplo subcutánea o intramuscularmente) o mediante inyección intramuscular. De esta manera, por ejemplo, los inmunoconjugados pueden formularse con materiales poliméricos o hidrofóbicos adecuados (por ejemplo en forma de una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados limitadamente solubles, por ejemplo como sal limitadamente soluble.
Alternativamente, pueden utilizarse otros sistemas de administración farmacéutica. Los liposomas y las emulsiones son ejemplos bien conocidos de vehículos de administración que pueden utilizarse para administrar inmunoconjugados de la invención. Pueden utilizarse determinados solventes orgánicos, tales como el dimetilsulfóxido, aunque habitualmente al coste de una mayor toxicidad. Además, los inmunoconj ugados pueden administrarse utilizando un sistema de liberación sostenida, tal como matrices semipermeables de polímeros sólidos que contengan el agente terapéutico. Se han establecido diversos materiales de liberación sostenida y son bien conocidos del experto en la materia. Las cápsulas de liberación sostenida pueden liberar los inmunocon ugados , dependiendo de su naturaleza química, durante unas cuantas semanas hasta más de 100 días. Dependiendo de la naturaleza química y estabilidad biológica de los inmunoconjugados, pueden utilizarse estrategias adicionales para la estabilización de los inmunoconj ugados .
Debido a que los inmunoconj ugados de la invención pueden contener cadenas laterales o extremos cargados, pueden incluirse en cualquiera de las formulaciones anteriormente indicadas en forma de ácidos o bases libres, o en forma de sales farmacéuticamente aceptables. Las sales farmacéuticamente aceptables son aquellas sales que conservan sustancialmente la actividad biológica de las bases libres y que se preparan mediante la reacción con ácidos inorgánicos.
Las sales farmacéuticas tienden a ser más solubles en solventes acuosos y otros solventes próticos que las formas de base libre correspondientes.
Los inmunocon ugados de la invención generalmente se utilizan en una · cantidad eficaz para conseguir el propósito pretendido. Para la utilización en el tratamiento o prevención de una condición de enfermedad, los inmunoconj ugados de la invención, o composiciones farmacéuticas de los mismos, se administran o se aplican en una cantidad terapéuticamente eficaz. Una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad eficaz para mejorar o prevenir los síntomas, o para prolongar la supervivencia del paciente bajo tratamiento. La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz se encuentran perfectamente dentro de las capacidades del experto en la materia, especialmente a la luz de la exposición detallada proporcionada en la presente memoria .
Para la administración sistémica, puede estimarse inicialmente a partir de ensayos in vitro una dosis terapéuticamente eficaz. Por ejemplo, puede formularse una dosis en modelos animales para conseguir un intervalo de concentraciones circulantes que incluya la IC50 según se determine en el cultivo celular. Puede utilizarse dicha información para determinar más exactamente dosis útiles en el ser humano.
También pueden estimarse dosis iniciales a partir de datos in vivo, por ejemplo modelos animales, utilizando técnicas que son bien conocidas de la técnica. El experto ordinario en la materia podría optimizar fácilmente la administración en seres humanos basándose en datos animales.
La cantidad e intervalo de las dosis puede ajustarse individualmente para proporcionar niveles plasmáticos de los inmunoconjugados que resulten suficientes para mantener el efecto terapéutico. Las dosis habituales para el paciente para la administración mediante inyección se encuentran comprendidas en el intervalo de entre aproximadamente 0,1 y 50 mg/kg/día, típicamente entre aproximadamente 0,5 y 1 mg/kg/día. Pueden conseguirse niveles séricos terapéuticamente eficaces mediante la administración de múltiples dosis cada día.
En los casos de la administración local o la incorporación selectiva, la concentración local eficaz de los inmunoconj ugados podría no estar relacionada con la concentración plasmática. El experto en la materia podrá optimizar las dosis locales terapéuticamente eficaces sin necesidad de experimentación indebida.
La cantidad de inmunoconjugado administrada dependerá evidentemente del sujeto tratado, del peso del sujeto, de la severidad de la enfermedad, del modo de administración y del criterio del médico responsable.
La terapia puede repetirse intermitentemente mientras resulten detectables síntomas, o incluso cuando ya no resulten detectables. La terapia puede proporcionarse sola o en combinación con otros fármacos. En el caso de los trastornos autoinmunológicos , entre los fármacos que pueden utilizarse en combinación con inmunocon ugados de la invención se incluyen, aunque sin limitación, los agentes antiinflamatorios esteroideos y no esteroideos.
Toxicidad Una dosis terapéuticamente eficaz de los inmunoconjugados indicados en la presente memoria generalmente proporcionará un beneficio terapéutico sin provocar toxicidad sustancial. La toxicidad de los inmunoconjugados puede determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándares en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo determinando la LD50 (la dosis letal para el 50% de la población) o la LD100 (la dosis letal para el 100% de la población) . La proporción de dosis entre el efecto tóxico y el efecto terapéutico es el índice terapéutico. En una realización, el inmunoconjugado muestra un elevado índice terapéutico. Los datos obtenidos de dichos ensayos de cultivo celular y estudios animales pueden utilizarse para formular un intervalo de dosis que no resulte tóxico, por ejemplo para la utilización en el ser humano. La dosis de los inmunoconjugados indicada en la presente memoria preferentemente se encuentra comprendida dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluye la dosis eficaz con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de dicho intervalo dependiendo de la forma de dosificación y vía de administración utilizadas. La formulación, vía de administración y dosis exactas pueden ser seleccionadas por el médico individual en vista de la condición del paciente (ver, por ejemplo, Fingí et al., 1975, en: The Pharmacological Basis of Therapeutics , capitulo 1, página 1 (incorporada como referencia en su totalidad en la presente memoria) .
Otros agentes y tratamientos Se contempla que puedan utilizarse otros agentes en combinación con la presente invención para mejorar la eficacia terapéutica del tratamiento. Entre dichos agentes adicionales se incluyen agentes inmunomoduladores, agentes que afectan a la regulación positiva de los receptores de superficie celular y las uniones GAP, agentes citostáticos y de diferenciación, inhibidores de la adhesión celular, o agentes que incrementan la sensibilidad de las células hiperproliferativas a los inductores apoptóticos. Entre los agentes inmunomoduladores se incluyen el factor de necrosis tumoral, los interferones a, beta y gamma, IL-2 y otras citoquinas, F42K y otros análogos de citoquina, o MIP-1, IP-1 ß, CP-1, RANTES y otras quimoquinas . Se contempla adicionalmente que la regulación positiva de los receptores de superficie celular o sus ligandos, tales como el ligando Fas/Fas, DR4 o DR5/TRAIL podría potenciar las capacidades inductoras de la apoptosis de la presente invención mediante el establecimiento de un efecto autocrino o paracrino sobre las células hiperproliferativas . Los incrementos de la señalización intercelular mediante la elevación del número de uniones GAP podría incrementar los efectos antihiperproliferativos sobre la población celular hiperproliferativa vecina. En otras realizaciones, pueden utilizarse agentes citostáticos o de diferenciación en combinación con la presente invención para mejorar la eficacia antihiperproliferativa de los tratamientos. Se contemplan inhibidores de la adhesión celular para mejorar la eficacia de la presente invención. Son ejemplos de inhibidores de la adhesión celular, los inhibidores de quinasa de adhesión focal (FAKs) y la lovastatina. Se contempla además que otros agentes que incrementan la sensibilidad de una célula hiperproliferativa a la apoptosis, tales como el anticuerpo C225, puedan utilizarse en combinación con la presente invención para mejorar la eficacia del tratamiento.
También puede utilizarse la terapia hormonal conjuntamente con la presente invención o en combinación con cualquier otra terapia del cáncer descrita anteriormente. Pueden utilizarse hormonas en el tratamiento de determinados cánceres, tales como el cáncer de mama, de próstata, de ovario o cervical para reducir el nivel o bloquear los efectos de determinadas hormonas, tales como la testosterona o el estrógeno. Este tratamiento con frecuencia se utiliza en combinación con por lo menos otra terapia del cáncer como opción de tratamiento o para reducir el riesgo de metástasis.
También pueden administrarse los inmunoconj ugados de la invención conjuntamente con quimioterapia, terapia de radiación u otras inmunoterapias . Pueden seleccionarse agentes anticáncer par adicha terapia de combinación, por ejemplo,. de entre los grupos de disruptores de los microtúbulos (por ejemplo alcaloides vinca, tales como vinblastina o vincristina, taxanos tales como docetaxel o paclitaxel, epotilones, tales como ixabepilón) , antimetabolitos (por ejemplo antifolatos, tales como metotrexato o aminopterina, antipurinas, tales como fludarabina, 6-mercaptopurina o 6-tioguanina, antipirimidinas tales como 5-fluorouracilo, capecitabina o gemcitabina, hidroxiurea) , inhibidores de la topoisomerasa (por ejemplo camptotecina, irinotecán, topotecán, o podofilotoxinas, tales como etopósido) , intercalantes de ADN (por ejemplo doxorubicina, daunorubicina, actinomicina, bleomicina) , agentes alquilantes (por ejemplo ciclofosfamida, clorambucilo, nitrosoureas tales como carmustina o nimustina, estreptozocina, busulfán, cisplatino, oxaliplatino, trietilenmelamina, dacarbazina) , terapias hormonales (por ejemplo glucocorticoides, inhibidores de la aromatasa, tales como tamoxifeno, antiandrógenos tales como flutamida, análogos de hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) tales como leuprólido) , antibióticos, inhibidores de quinasa (por ejemplo erlotinib, gefitinib, imatinib) , antagonistas de receptor (por ejemplo anticuerpo con diana en receptores de superficie celular que es conocido que estimulan la carcinogénesis y el crecimiento tumoral), inhibidores enzimáticos (por ejemplo inhibidores de la quinasa dependiente de ciclina (CDK) , enzimas reductores de aminoácidos (por ejemplo asparagina) , leucovorina, retinoides, activadores de la apoptosis de células tumorales y agentes antiangiogénicos .
EJEMPLOS Ejemplo 1 En la primera administración de citoquinas mediada por anticuerpos, realizada por Harvill E.T. y Morrison S.L., Immunotech. 1(2): 95-105, 1995, los constructos presentaban dos grupos de unión a antigeno para el direccionamiento a antigenos tumorales, y dos grupos de citoquina para inducir la activación de los linfocitos (una molécula de IL-2 fusionada a cada uno de los extremos C-terminales de cadena pesada de IgG3) . La afinidad de la citoquina es generalmente elevada para su receptor. Una molécula que portase dos unidades de citoquina podría presentar una afinidad todavía más alta para los receptores de citoquina debido a efectos de avidez (o multivalencia) . Este tipo de molécula podría, por lo tanto, activar fácilmente los linfocitos en el flujo sanguíneo, . incluso antes de que tuviese lugar el direccionamiento al tumor. Este efecto no resultaría deseable para el paciente. En contraste, una molécula de inmunoconjugado que portase únicamente un grupo de citoquina y dos o más dominios de direccionamiento sería menos probable que activase los linfocitos en la circulación y podría dirigir la molécula de inmunoconjugado completa al tumor, mientras que la activación de los linfocitos tendría lugar a una velocidad menor. Por lo tanto, se construyeron moléculas tales como las ilustradas en las figuras 1 y 2, con interleuquina-2 (IL-2) como citoquina modelo. Todas las moléculas generadas eran bivalentes para el antígeno tumoral, y eran bivalentes o monovalentes para la citoquina IL-2 tal como se indica en los dibujos. Las afinidades para el antígeno se compararon para dos formatos de inmunoconj ugado diferentes utilizando el anticuerpo L19 como ejemplo. Como referencia, dicho anticuerpo se clonó en el formato IgGl humano, en el formato de diacuerpo (figura 1A) y en la fusión Fab-IL2-Fab (figura IB) . Se sometió- a ensayo una variable en el formato de diacuerpo, de manera que el péptido linker entre VH y VL presentase una longitud de ocho o doce aminoácidos. El antigeno purificado dominio extra B de la fibronectina (EDB) se inmovilizó en un chip BIACORE, y se utilizó el constructo de fusión de anticuerpo como el analito soluble para la determinación de la afinidad. Las figuras 8 a 11 muestran los resultados de este experimento. Se consideró que IgG era el caso ideal de un suceso de unión bivalente. En este caso se observó una constante de afinidad de 260 pM. El constructo de fusión Fab-IL2-Fab presentaba una afinidad de 310 pM, que es esencialmente idéntica a la de IgG. Las dos variantes del diacuerpo (mostradas en las figuras 10 y 11) presentaban afinidades medidas de 270 pM y 360 pM, respectivamente. Por lo tanto, todos dichos constructos presentaban afinidades similares hacia el antigeno. La afinidad hacia el antigeno y el receptor de IL-2 se observaron utilizando constructos similares basados en la secuencia del anticuerpo F16 (Brack S.S. efc al.r Clin. Canc. Res. 12 (10) : 3200-3208, 2006). La figura 12 muestra los sensogramas de BIACORE de la IgG de F16 y su fragmento Fab monovalente correspondiente, al inmovilizar el dominio TNC-A1 sobre el chip BIACORE. Bajo estas condiciones experimentales particulares, la molécula de IgG mostró una constante de afinidad de 2,6 nM, y las moléculas de Fab mostraron una constante de afinidad de 50 nM. En este caso, el incremento 2 5 de afinidad atribuido a la bivalencia fue un factor de 20. Los inmunoconj ugados de diacuerpo, Fab-IL2-Fab y scFv-IL2-scFv mostraron afinidades hacia el antigeno de 5 nM, 4,8 nM y 12 nM, respectivamente. . Todos dichos constructos, por lo tanto, presentaban afinidades hacia el antigeno más estrechamente similares al carácter bivalente de una molécula IgG que el comportamiento monovalente del fragmento Fab.
Las diferencias fueron más pronunciadas al observar las afinidades para el receptor de IL-2. Para estudiar la afinidad de unión al receptor de IL-2, se generó una herramienta que permitía la expresión de un receptor de IL-2 heterodimérico; se fusionó la cadena ß del receptor de IL-2 a una molécula de Fe que . se manipuló para heterodimerizar (Fe (botón)) utilizando la tecnología de "botón-en-oj al" (Merchant A.M. et al., Nat . Biotech. 16:677-681, 1998). A continuación, se fusionó la cadena gamma del receptor de IL-2 a la variante Fe (ojal), que se heterodimerizó con Fe (botón). Esta proteína de fusión de Fe heterodimérica seguidamente se utilizó como sustrato para analizar la interacción IL-2/receptor de IL-2. La figura 13 muestra el sensograma de BIACOERE de la IL-2 disponible comercialmente (proleuquina ) , como analito, con el receptor de IL-2 inmovilizado. La afinidad medida, de -0,5 nM, está de acuerdo con los valores anteriormente publicados. Se resumen en la figura 17 las afinidades de los diversos constructos hacia el receptor de IL-2. Se observó un resultado importante: la diferencia entre el diacuerpo (F16 dia-IL2), que es bivalente con respecto a la citoquina, y la molécula Fab-IL2-Fab, que porta únicamente un grupo IL-2. La afinidad de unión del receptor de IL-2 del diacuerpo (0,8 nM) era similar a la de la IL-2 no conjugada (proleuquina) (0,5 nM) a pesar de que el diacuerpo era bivalente y la IL-2 era monovalente. La fusión Fab-IL2-Fab presentaba una afinidad de unión del receptor de IL-2 reducida prácticamente en un factor de 10 en comparación con el diacuerpo, lo que se reflejaba en una capacidad reducida para inducir la proliferación de las células NK92, tal como se muestra en la figura 19.
Ejemplo 2 Construcción de bibliotecas genéricas de Fab Se construyeron bibliotecas genéricas de anticuerpos en el formato Fab basándose en los genes de la linea germinal humana utilizando los emparejamientos de dominio V siguientes: Cadena ligera kappa Vk3_20 con cadena pesada VH3_23 para la biblioteca DP47-3 y cadena ligera kappa Vkl_17 con cadena pesada de VH1_69 para la biblioteca DP88-3. Ver la Tabla 2. Se aleatorizaron ambas bibliotecas en la CDR3 de la cadena ligera (L3) y la CDR3 de la cadena pesada (H3) y se ensamblaron a partir de 3 fragmentos por biblioteca mediante procesamiento mediante PCR de extensión solapante (SOE) . El fragmento 1 comprende el extremo 5' del gen de anticuerpo, incluyendo L3 aleatorizado; el fragmento 2 es un fragmento constante central que abarca desde L3 a H3, mientras que el fragmento 3 comprende H3 aleatorizado y la parte 3' del gen de anticuerpo.
Se utilizaron las combinaciones de cebadores siguientes para generar fragmentos de biblioteca para la biblioteca DP47-3: fragmento 1 (LMB3 - LibLlb_new) , fragmento 2 (MS63 - S64), fragmento 3 (Lib2H - fdseqlong) . Ver la Tabla 9. Se utilizaron las combinaciones de cebadores siguientes para generar fragmentos de biblioteca para la biblioteca DP88-3: fragmento 1 (LMB3 - RJH_LIB3), fragmento 2 (RJH31 - RJH32), fragmento 3 (LIB88 2 - fdseqlong). Ver la Tabla 10.
TABLA 9: TABLA 10: El protocolo de PCR para la producción de fragmentos de biblioteca incluía: 5 minutos de desnaturalización inicial a 94°C; 25 ciclos de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 58°C y 1 minuto a 72°C; y alargamiento terminal durante 10 minutos a 72°C. Para la PCR de ensamblaje, como molde se utilizaron proporciones equimolares de los 3 fragmentos. El protocolo de PCR de ensamblaje incluía: 3 minutos de desnaturalización inicial a 94°C; y 5 ciclos de 30 segundos a 94°C, 1 minuto a 58°C, y 2 minutos a 72°C. En esta etapa, se añadieron los cebadores complementarios para secuenciar los fragmentos exteriores 1-3 y se llevaron a cabo 20 ciclos adicionales antes de un alargamiento terminal durante 10 minutos a 72°C.
Tras el ensamblaje de cantidades suficientes de constructos Fab aleatorizados de longitud completa, se digirieron los constructos de Fab con Ncol/Notl para la biblioteca DP47-3, y con Ncol/Nhel para la biblioteca DP88-3 en paralelo a vector fagémido aceptor tratado de manera similar. Para la biblioteca DP47-3, se ligaron 22,8 pg de biblioteca de Fab con 16,2 µq de vector fagémido. Para la biblioteca DP88-3, se ligaron 30,6 iq de biblioteca de Fab con 30,6 pg de vector fagémido .
Se utilizaron las ligaciones purificadas para 68 transformaciones para la biblioteca DP47-3, y 64 transformaciones para la biblioteca DP88-3, respectivamente, para obtener tamaños finales de biblioteca de 4,2xl010 para DP47-3 y 3,3xl09 para DP88-3.
Las partículas fagémidas que expresaban las bibliotecas de Fab se rescataron y se purificaron con PEG/NaCl para las selecciones .
Ejemplo 3 Selección de clon 2B10 anti-TNC A2 Las selecciones se llevaron a cabo contra TNC-A2 humano expresado en E. coli que se subclonó 5' de una etiqueta avi y una etiqueta de 6xhis. Ver la secuencia SEC ID n° 57 en la Tabla 5. El antígeno se biotiniló in vivo tras la expresión. Se llevaron a cabo selecciones en solucón según el protocolo siguiente: (i) unión de ~ 1012 partículas fagémicas de la biblioteca DP88-3 y 100 nM de TNC A2 humano biotinilado durante 0,5 horas en un volumen total de 1 mi, (ii) captura de TNC-A2 humano biotinilado y fago unido mediante la adición de 5,4xl07 perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina durante 10 minutos; (iii) lavado de las perlas utilizando 5x 1 mi de PBS/Tween 20 y 5x 1 mi de PBS, (iv) elución de las partículas fágicas mediante la adición de 1 mi de TEA 100 mM (trietilamina) durante 10 minutos y neutralización mediante la adición de 500 iL de Tris 1M/HC1, pH 7,4, y (v) reinfección de células TG1 de E. coli en fase logarítmica, infección con fago ayudante VCSM13 y precipitación posterior con PEG/NaCl de partículas fagémicas que se utilizarán en rondas de selección posteriores.
Las selecciones se llevaron a cabo en 3 rondas utilizando una concentración constante de antígeno de 100 nM. En la ronda 2, se llevó a cabo la captura de complejos de antígeno : fago en placas con neutravidina en lugar de sobre perlas con estreptavidina. Se identificaron los ligantes específicos mediante ELISA de la manera siguiente, utilizando: Se recubrió cada pocilio de placas con neutravidina utilizando 100 il de 100 nM de TNC-A2 humano biotinilado.
Se añadieron sobrenadantes bacterianos que contenían Faby se detectaron los Fabs ligantes mediante sus etiquetas Flag mediante la utilización de un anticuerpo secundario anti-Flag/HRP. Tras la identificación, el clon 2B10 se expresó bacterianamente en un volumen de cultivo de 0,5 litros, se purificó mediante afinidad y se caracterizó adicionalmente mediante análisis de SPR utilizando BIACORE T100. Ver las secuencias SEC ID n° 3 y 7 de la Tabla 3.
Ejemplo 4 Selección de clon 2F11 anti-TCN A1/A4 Las selecciones se llevaron a cabo contra TNC-A1 humano expresado en E. coli que se subclonó 5' de una etiqueta avi y de una etiqueta de 6xhis. Ver la secuencia SEC ID n° 59 en la Tabla 5. El antigeno se biotiniló in vivo tras la expresión. Se llevaron a cabo selecciones en solución según el protocolo siguiente: (i) unión de ~ 1012 partículas fagémicas de la biblioteca DP47-3 y 100 n de TNC Al humano biotinilado durante 0,5 horas en un volumen total de 1 mi, (ii) captura de TNC-A1 humano biotinilado y fago unido mediante la adición de 5,4xl07 perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina durante 10 minutos; (iii) lavado de las perlas utilizando 5x 1 mi de PBS/Tween 20 y 5x 1 mi de PBS, (iv) elución de las partículas fágicas mediante la adición de 1 mi de TEA 100 m ( trietilamina) durante 10 minutos y neutralización mediante la adición de 500 iL de Tris 1M/HC1, pH 7,4, y (v) reinfección de células TG1 de E. coli en fase logarítmica, infección con fago ayudante VCSM13 y precipitación posterior con PEG/NaCl de partículas fagémicas que se utilizarán en rondas de selección posteriores.
Las selecciones se llevaron a cabo en 3 rondas utilizando una concentración constante de antigeno de 100 nM. En la ronda 2, se llevó a cabo la captura de complejos de antigeno : fago en placas con neutravidina en lugar de sobre perlas con estreptavidina .
Todas las reacciones de unión se suplementaron con 100 nM de dominio constante CH3 de IgG humana no biotinilada que comprendía una etiqueta avi y una etiqueta de 6xhis carboxi-terminales para competir para los clones no deseados que reconocen las etiquetas del antígeno.
En una primera etapa de cribado, se identificaron ligantes específicos mediante ELISA de la manera siguiente: Se recubrió cada placa de neutravidina con 100 il de TNC-A1 humano biotinilado 100 nM. Se añadieron sobrenadantes bacterianos que contenían Fab y se detectaron los Fabs que se unían específicamente a TNC-A1 humano a partir de sus etiquetas Flag mediante la utilización de un anticuerpo secundario anti-Flag/HRP.
En una segunda etapa de cribado, se repitió la ELISA anteriormente indicado utilizando también TNC-A1 murino, TNC A4 humano y TNC A4 mu como antígenos con el fin de determinar la reactividad cruzada. Todos los antígenos comprendían las mismas etiquetas avi y 6xhis en su extremo C-terminal y se encontraban biotiniladas in vivo. Ver las secuencias SEC ID n° 50 y 61 de la Tabla 5.
Tras la identificación, . el clon 2F11 se expresó bacterianamente en un volumen de cultivo de 0,5 litros, se purificó mediante afinidad y se caracterizó adicionalmente mediante análisis de SPR utilizando BIACORE T100. Ver las secuencias SEC ID n° 9 y 13 de la Tabla 3.
Ejemplo 5 Selección de clones anti-FAP (selecciones primarias) Las selecciones se llevaron a cabo contra el ectodominio de la proteína activadora de fibroblastos (FAP) humana o murina, que se clonaron cadena arriba de una polilisina y de un.a etiqueta 6xhis. Ver las secuencias SEC ID n° 53 y 55 de la Tabla 5. Antes de las selecciones, se recubrieron inmunotubos con los antígenos a una concentración de 10 g/ml or 5 g/ml, dependiendo de la ronda de selección. Se llevaron a cabo selecciones en solución según el protocolo siguiente: (i) unión de ~ 1012 partículas fagémidas de la biblioteca DP47-3 a FAP humano o murino inmovilizado durante 2 horas, ii) lavado de los inmunotubos utilizando 5 x 5 mi de PBS/Tween20 y 5 x 5 mi de PBS, (iii) elución de las partículas fágicas mediante la adición de 1 mi de TEA 100 mM ( trietilamina) durante 10 minutos y neutralización mediante la adición de 500 iL de Tris 1 M/HC1, pH 74, y (iv) reinfección de células de E. coli TG1 en fase logarítmica con fago ayudante VCSM13 y precipitación posterior con PEG/NaCl de las partículas fagémicas que se utilizarán en rondas de selección posteriores .
Las selecciones se llevaron a cabo en tres o cuatro rondas utilizando concentraciones decrecientes de antigeno de FAP humano y, en algunos casos, utilizando FAP murino a una concentración de 5. g/ml en la ronda de selección final. Se definieron los ligantes específicos como señales 5 x más altas que el fondo y se identificaron mediante ELISA. Se recubrieron placas maxisorp de NUNC con 10 ug/ml de FAP humano o murino, seguido de la adición de sobrenadantes bacterianos que contenían Fab y la detección de Fabs de unión específica mediante sus etiquetas Flagm ediante la utilización de un anticuerpo secundario anti-Flag/HRP .
Se expresaron bacterianamente los clones positivos en ELISA, como . cultivos de 1 mi en formato de 96 pocilios y los sobrenadantes se sometieron a un experimento de cribado cinético utilizando BIACORE T100.
Ejemplo 6 Construcción de bibliotecas de maduración de afinidad anti-FAP Se construyeron tres bibliotecas de maduración de afinidad basadas en anticuerpos preseleccionados de las selecciones primarias de anti-FAP. Más exactamente, se basaron en: (i) el clon 2D9 anti-FAP humana (biblioteca a.m.FAP2D9) (ver las secuencias SEC ID n° 67 y 69 de la Tabla 3), (ii) clon 4B8 anti-FAP murina (biblioteca a.m.FAP4B8) (ver las secuencias SEC ID n° 71 y 73 de la Tabla 3), e (iii) clones reactivos cruzadamente 7A1, 13B2, 13C2, 13E8, 14C10 y 17A11 (biblioteca a.m.FAPpool) (ver las secuencias SEC ID n° 75 y 77 de la Tabla 3, correspondiente a las secuencias de región variable de 7Al; secuencias SEC ID n° 79 y 81 de la Tabla 3, correspondientes a las secuencias de región variable de 13C2; secuencias SEC ID n° 83 y 85, correspondientes a las secuencias de región variable de 13E8; secuencias SEC ID n° 87 y 89, correspondientes a las secuencias de región variable de 14C10; secuencias SEC ID n° 91 y 93, correspondientes a las secuencias de región variable de 17A11) .
Cada una de estas bibliotecas consiste de dos sub-bibliotecas, aleatorizadas en CDRl y CDR2 de la cadena ligera (L1/L2) o en CDRl y CDR2 de la cadena pesada (H1/H2), respectivamente. Se agruparon estas sub-bibliotecas tras la transformación. Se construyó cada una de dichas sub-bibliotecas mediante cuatro etapas posteriores de amplificación y ensamblaje.
Para las bibliotecas de L1/L2, el protocolo de amplificación y ensamblaje incluía: (i) amplificación del fragmento 1 (LMB3 - DPK22_CDRl_rand_ba_opt) y fragmento 2 ( DPK22_CDRl_fo -DPK22_Ck_BsiWI_ba) , (ii) ensamblaje de los fragmentos 1 y 2 utilizando los cebadores exteriorse LMB3 y DPK22_Ck_BsiWI_ba para crear el molde para el fragmento 3, (iii) amplificación del fragmento 3 (LMB3 - DPK22_CDR2_rand_ba) y fragmento 4 (DPK22_CDR2_fo - DPK22_Ck_BsiWI_ba) , y (iv) ensamblaje final de los fragmentos 3 y 4 utilizando los mismos cebadores exteriores que los utilizados anteriormente. Ver la Tabla 1 para las secuencias de los cebadores.
TABLA 11: En negrita: 60% base original y 40% aleatorización como M Subrayado: 60% base original y 40% aleatorización como M Para las bibliotecas de H1/H2, el protocolo de amplificación y ensamblaje incluía: (i) amplificación del fragmento 1 (RJH53 - DP47_CDRl_rand_ba_opt) y fragmento 2 (DP47_CDRl_fo -MS5) , (ii) ensamblaje de los fragmentos 1 y 2 utilizando los cebadores exteriores RJH53 y MS52 para crear el molde para el fragmento 3, (iii) amplificación del fragmento 3 (RJH53 -DP47_CDR2_rand_ba) y fragmento 4 (DP47jCDR2_fo - S52) , y (iv) ensamblaje final · de los fragmentos 3 y 4 utilizando los mismos cebadores exteriores que los utilizados anteriormente. Ver la Tabla 12 para las secuencias de los cebadores.
TABLA 12: En negrita: 60% base original y 40% aleatorización como M Subrayado: 60% base original y 40% aleatorización como M Los productos ensamblados finales se digirieron con NcoI/BsiVII para las sub-bibliotecas de L1/L2 de a.m.FAP2D9 y a.m.FAP4B8, con Muñí y Nhel para las sub-bibliotecas de H1/H2 de a.m.FAP2D9 y a.m.FAP4B8, asi como con NcoI/BamHI para la biblioteca de L1/L2 de a.m.FAPpool y con BspEI/ PstI para las 3 8 bibliotecas de H1/H2 de a.m.FAPpool, respectivamente, en paralelo a vectores aceptores tratados de manera similar basados en preparaciones de plásmidos de los clones 2D9, 4B8 o una mezcla equimolar de los clones 7A1, 13B2, 13C2, 13E8, 14C10 y 17A11, respectivamente. Se ligaron las cantidades siguientes de dominios V (parciales) aleatorizados y el vector o vectores aceptores digeridos se ligaron para las bibliotecas respectivas (ug dominio V/pg vector) : sub-biblioteca de L1/L2 a.m.FAP2D9 (5,7/21,5), sub-biblioteca de H1/H2 a.m.FAP2D9 (4,1/15,5), sub-biblioteca de L1/L2 a.m.FAP4B8 (6,5/24,5), sub-biblioteca de H1/H2 a.m.FAP4B8 (5,7/21,5), sub-biblioteca de L1/L2 a.m.FAPpool (4,4/20), sub-biblioteca de H1/H2 a.m.FAPpool (3,4/15,5).
Las ligaciones purificadas de las sub-bibliotecas de L1/L2 y de H1/H2 se agruparon y se utilizaron para 60 transformaciones de cada una de las 3 bibliotecas de maduración de afinidad, para obtener tamaños finales de biblioteca de 6,2 x 109 para a.m.FAP2D9, 9,9 x 109 para a.m.FAP4B8 y 2,2 x 109 para a.m.FAPpool.
Las partículas fagémidas que expresaban las bibliotecas de Fab se rescataron y se purificaron con PEG/NaCl para selecciones secundarias.
Ejemplo 7 Selección de clones anti-FAP de afinidad madurada Las selecciones se llevaron a cabo contra el ectodominio de la proteína activadora de fibroblastos (FAP) humana o murina, que se clonaron 5' de una polilisina y de una etiqueta 6xhis.
Ver las secuencias SEC ID n° 53 y 55 de la Tabla 5. Antes de las selecciones, se recubrieron inmunotubos con los antígenos a una concentración de 10 µ?/???, 5 ug/ml ó 0,2 µg/mL, dependiendo de la biblioteca y de la ronda de selección. Se llevaron a cabo selecciones en solución según el protocolo siguiente: (i) unión de ~ 1012 partículas fagémidas de la biblioteca a.m.FAP2D9, a.m.FAP4B8 o a.m.FAPpool a FAP humano o murino inmovilizado durante 2 horas, ii) lavado de los inmunotubos utilizando 10 a 20 x 5 mi de PBS/Tween20 y 10 a 20 x 5 mi de PBS (dependiendo de la biblioteca y de la ronda de selección), (iii) elución de las partículas fágicas mediante la adición de 1 mi de TEA 100 mM (trietilamina) durante 10 minutos y neutralización mediante la adición de 500 iL de Tris 1 M/HC1, pH 7,4, y (iv) reinfección de células de E. coli TG1 en fase logarítmica, infección con fago ayudante VCSM13 y precipitación posterior con PEG/NaCl de las partículas fagémicas que se utilizarán en rondas de selección posteriores.
Las selecciones se llevaron a cabo en 2 rondas y se ajustaron las condiciones a cada una de las 3 bibliotecas individualmente. En detalle, los parámetros de selección fueron: a.m.FAP2D9 (5 µg /mL de FAP humana y 20 lavados en total para la ronda 1, 1 pg /mL de FAP humana y 30 lavados en total para la ronda 2), a.m.FAP4B8 (1 /mL FAP murina y 30 lavados en total para la ronda 1, 0,2 g /mL FAP humana y 40 lavados en total para la ronda 2) y a.m.FAPpool (5 µg /mL FAP humana y 30 lavados en total para la ronda 1, 5 pg /mL FAP murina y 30 lavados en total para la ronda 2) . Se definieron los ligantes específicos como señales 5 x más altas que el fondo y se identificaron mediante ELISA. Se recubrieron placas maxisorp de NUNC con 1 ó 0,2 g/ml de FAP humano o murino, seguido de la adición de sobrenadantes bacterianos que contenían Fab y la detección de Fabs de unión específica a partir de sus etiquetas Flag mediante la utilización de un anticuerpo secundario anti-Flag/HRP .
Se expresaron bacterianamente los clones positivos en ELISA, como cultivos de 1 mi en formato de 96 pocilios y . los sobrenadantes se sometieron a un experimento de cribado cinético utilizando BIACORE T100.
Ejemplo 8 Estudios de eficacia en diferentes formatos de IL-2 dirigida Se llevó a cabo un experimento de eficacia utilizando dos formatos moleculares diferentes de inmunoconjugado de interleuquina 2 específico para el estroma tumoral. Se inyectó subcutáneamente el teratocarcinoma F9 en ratones 129SvEv y se midió el tamaño tumoral utilizando un calibrador. Se comparó la molécula de "diacuerpo"-IL-2 a dos concentraciones diferentes con el inmunoconjugado Fab-interleuquina-2-Fab ( Fab-IL2-Fab) , en el que las concentraciones reflejaban un número similar de moléculas de inmunoconjugado. Se muestran los resultados en la figura 3. El inmunoconjugado Fab-IL2-Fab muestra una inhibición significativa del crecimiento tumoral y es mejor que el formato de diacuerpo a las dos concentraciones diferentes y mejor que los controles.
También se examinó la supervivencia de ratones tratados con dos formatos moleculares de inmunoconjugado de interleuquina-2 diferentes específicos para estroma tumoral. Se inyectó intraesplénicamente la linea celularr de tumor gástrico humano LS1"74T en ratones SCID-beige. Se comparó la molécula de "diacuerpo"-IL-2 a dos concentraciones diferentes con el inmunoconjugado Fab-IL-2-Fab, en el que las concentraciones reflejaban un número similar de moléculas de inmunoconjugado. Se muestran los resultados en la figura 4. El formato Fab-IL-2-Fab resultó en un porcentaje de supervivencia más alto en comparación con el formato de diacuerpo y los controles.
Ejemplo 9 Técnicas de ADN recombinante Se utilizaron métodos estándares para manipular el ADN, tales como los descritos en Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Los reactivos biológicos moleculares se utilizaron siguiendo las instrucciones del fabricante.
Se proporciona información general sobre secuencias de nucleótidos de cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulinas humanas en: Kabat E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, publicación de NIH n° 91-3242, 1991.
Secuenciación de ADN Se determinaron las secuencias de ADN mediante secuenciación de la doble cadena.
Síntesis génica Los segmentos génicos deseados fueron preparados por Geneart AG (Regensburg, Alemania) a partir de oligonucleótidos sintéticos y productos de PCR mediante síntesis génica automática. Los segmentos génico flanqueados por sitios únicos de corte por endonucleasa de restricción se clonaron en plásmidos pGA18 (ampR) . El plásmido de ADN se purificó a 1 partir de bacterias transformadas y la concentración se determinó mediante espectroscopia de UV. La secuencia del ADN de los fragmentos génicos subclonados se confirmó mediante secuenciación de ADN. Se diseñaron segmentos génicos con sitios de restricción adecuados para permitir la subclonacion en los vectores de expresión respectivos. Todos los constructos se' diseñaron con una secuencia 5' -terminal de ADN codificante de un péptido líder que presenta como diana proteínas para la secreción en células eucarióticas . Las Tablas 13 y 14 proporcionan péptidos líder ejemplares, y secuencias polinucleótidas codificantes de los mismos, respectivamente.
TABLA 13: Secuencias líder para la secreción: Secuencias polipeptídicas .
TABLA 14: Secuencias líder para la secreción : Polynucleotide Sequences .
Preparación de inmunoconjugados Se subclonaron las secuencias de ADN resultantes en vectores de expresión de mamífero (una para la cadena ligera y una para la proteína de fusión de cadena pesada) bajo el control del promotor PSV y cadena arriba de un sitio poliA sintético, incluyendo cada vector una secuencia OriP del EBV. Se produjeron inmunoconjugados tal como se aplican en los ejemplos mediante la cotransfección de células HEK293-EBNA en crecimiento exponencial con los vectores de expresión de mamífero utilizando una transfección con fosfato de calcio. Alternativamente, se transfectaron células HEK293 cultivadas en suspensión con polietilenimina (PEI) con los vectores de expresión, o se utilizaron grupos de células CHO establemente transfectadas . Aunque los constructos Fab-IL2-Fab con diana en FAP basados en 3F2 y 4G8 pueden purificarse mediante cromatografía de afinidad utilizando una matriz de proteína A, deben purificarse mediante cromatografía de afinidad en una matriz de proteína G, constructos Fab-IL2-Fab con diana en TNC A2 basados en 2B10.
Brevemente, se purificó Fab-IL2-Fab 2B10 con diana en TNC A2 a partir de sobrenadantes mediante una etapa de afinidad (proteína G) seguido de cromatografía de exclusión por tamaños (Superdex 200, GE Healthcare). Se equilibró la columna de proteína G en fosfato sódico 20 mM, citrato sódico 20 mM, pH 7,5, se cargó el sobrenadante y se lavó la columna con fosfato sódico 20 mM, citrato sódico 20 mM, pH 7,5. Se eluyó Fab-IL2-Fab con ácido fórmico 8,8 mM, pH 3. Las fracciones eluídas se agruparon y se purificaron mediante cromatografía por exclusión por tamaños en el tampón de formulación final. Fosfato de potasio 25 mM, cloruro sódico 125 mM, glicina 100 mM, pH 6,7. La figura 50 muestra los resultados ejemplares de la purificación y la analítica.
Se purificó Fab-IL2-Fab 3F2 o Fab-IL2-Fab 4G8 con diana FAP mediante un método similar compuesto de una etapa de afinidad (proteína A) , seguido de cromatografía por exclusión de tamaños (Superdex 200, GE Healthcare) . Se equilibró la columna de proteina A en fosfato sódico 20 mM, citrato sódico 20 mM, pH 7,5, se cargó el sobrenadante, y la columna se lavó con fosfato sódico 20 mM, citrato sódico 20 mM, cloruro sódico 500 mM, pH 7,5, seguido de un lavado con fosfato sódico 13,3 mM, citrato sódico 20 mM, cloruro sódico 500 mM, pH 5,45. Opcionalmente se llevó a cabo un tercer lavado con MES 10 mM, cloruro sódico 50 mM, pH 5. Se eluyó Fab-IL2-Fab con citrato sódico 20 mM, cloruro sódico 100 mM y glicina 100 mM, pH 3. Las fracciones eluidas se agruparon y se purificaron mediante cromatografía por exclusión por tamaños en el tampón de formulación final. Fosfato de potasio 25 mM, cloruro sódico 125 mM, glicina 100 mM, pH 6,7.
Ejemplo 10 Construcción de bibliotecas adicionales de maduración de afinidad anti-FAP (basadas en los clones 3F2 , 3D9, 468, 4B3 y 2C6) Se construyeron cuatro bibliotecas adicionales de maduración de afinidad basándose en anticuerpos preseleccionados de reactividad cruzada procedentes de la primera campaña de maduración de afinidad de anticuerpos anti-FAP, es decir los clones 3F2, 3D9, 4G8, 4B3 y 2C6 (ver las secuencias SEC ID n° 17 y 21 de la Tabla 3, correspondientes a las secuencias de región variable de 3F2; secuencias SEC ID n° 23 y 25 de la Tabla 3, correspondientes a las secuencias de región variable de 3D9; secuencias SEC ID n° 33 y 35 de la Tabla 3, correspondientes a las secuencias de región variable de 4B3; secuencias SEC ID n° 41 y 43 de la Tabla 3, correspondientes a las secuencias de región variable de 2C6) . Más exactamente, las cuatro bibliotecas se basaban en: 1) clones anti-FAP 3F2, 4G8 y 4B3 (biblioteca de VH, aleatorizada en las CDRs 1 y 2 de la cadena pesada variable, es decir, la biblioteca de H1/H2), .2) los clones anti-FAP 3D9 y 2C6 (biblioteca de VL, aleatorizada en las CDRs 1 y 2 de la cadena ligera variable, es decir, la biblioteca de L1/L2), 3) clon anti-FAP 3F2 (biblioteca de L3 con aleatorización suave en la CDR3 de la cadena ligera, es decir, la biblioteca de L3) , y 4) clon anti-FAP 3F2 (biblioteca de H3 con aleatorización suave en la CDR3 de la cadena pesada, es decir, la biblioteca de H3) . Se construyeron las dos primeras bibliotecas exactamente de la misma manera que se indica de manera general para la primera campaña de maduración de la afinidad de los anticuerpos anti-FAP, para las bibliotecas de L1/L2 y H1/H2, respectivamente. En contraste, para las bibliotecas de maduración de la afinidad de L3 y de H3 basadas en el clon 3F2, se utilizaron dos nuevos cebadores para introducir aleatorización suave en L3 AM_3F2_DPK22_L3_ba: CACTTTGGTCCCCTGGCCGAACGT CGGGGGAAGCA TAATACCCTGCTGACAGTAATACACTGC, con la bases subrayadas siendo 60% una base dada y 40% una mezcla N (mezcla de los cuatro nucleótidos: A, C, G y T) y H3 (AM_3F2_DP47_H3_fo : GGCCGTATATTACTGTGCG ??? GGG TGG TTT GGT GGT TTT AAC TACTGGGGCCAAGGAAC, con las bases subrayadas siendo 60% una base dada y 40% una mezcla N, siendo las bases en cursiva 60% 5 una base dada y 40% G, y siendo las bases en cursiva subrayadas 60% una base dada y 40% una mezcla K (mezcla de los dos nucleótidos G y T) del clon parental. Los tamaños de biblioteca eran los siguientes: biblioteca de H1/H2 (1,13 ? 1010) , biblioteca de L1/L2 (5,6 109) , biblioteca de L3 (2,3 i n ? 1010) y biblioteca de H3 (2,64 ? 1010) .
Ejemplo 11 Selección de clones anti-FAP de afinidad madurada _ Las selecciones se llevaron a cabo contra el ectodominio de o la proteina activadora de fibroblastos (FAP) humana o murina, que se clonaron cadena arriba de una 6x-lisina y de una etiqueta 6xhis (ver las secuencias SEC ID n° 53 y 55 de la Tabla 5) . Antes de las selecciones, se recubrieron 20 inmunotubos con los antigenos a una concentración de 1 pg/ml, 0,2 pg/ml ó 0,02 g/mL, dependiendo de la biblioteca y de la ronda de selección. Las selecciones y los cribados basados en ELISA se llevaron a cabo tal como se ha descrito para la primera campaña de maduración de la afinidad de los 25 anticuerpos anti-FAP. Se llevaron a cabo los cribados secundarios utilizando un biosensor ProteOn XPR36 (Biorad) y se determinaron las constantes de tasa cinética y las afinidades mediante el análisis de preparaciones de Fab purificadas a partir de la afinidad en el mismo instrumento. Se identificaron los clones de afinidad madurada siguientes: 19G1 (ver las secuencias SEC ID n° ¦ 121 y 123 de la Tabla 3), 20G8 (ver las secuencias SEC ID n° 125 y 127 de la Tabla 3), 4B9 (ver las secuencias SEC ID n° 129 y 131 de la Tabla 3) , 5B8 (ver las secuencias SEC ID n° 133 y 135 de la Tabla 3) , 5F1 (ver las secuencias SEC ID n°" 137 y 139 de la Tabla 3), 14B3 (ver las secuencias SEC ID n° 141 y 143 de la Tabla 3) , 16F1 (ver las secuencias SEC ID n° 145 y 147 de la Tabla 3), 16F8 (ver las secuencias SEC ID n° 149 y 151 de la Tabla 3), 03C9 (ver las secuencias SEC ID n° 153 y 155 de la Tabla 3), 22A3 (ver las secuencias SEC ID n° 165 y 167 de la Tabla 3), 29B11 (ver las secuencias SEC ID n° 169 y 171 de la Tabla 3) (todos estos clones se seleccionaron de la biblioteca de H1/H2 y se derivaron del clon parental 3F2), 02D7 (ver las secuencias SEC ID n° 157 y 159 de la Tabla 3) (seleccionadas de la biblioteca de L3 basada en el clon parental 3F2) y 28H1 (ver las secuencias SEC ID n° 161 y 163 de la Tabla 3) , y 23C10 (ver las secuencias SEC ID n° 173 y 175 de la Tabla 3) (estos dos clones se seleccionaron de la biblioteca de H1/H2 y se derivaron del clon parental 4G8) .
Las figuras 21 a 25 muestran los sensogramas de la resonancia de plasmón superficial de los Fabs de afinidad madurada seleccionados contra FAP, ¦ y la Tabla 15 proporciona las afinidades respectivas. Los Fabs seleccionados abarcan un intervalo de afinidades alto, en el intervalo de pM a nM, y presentan reactividad cruzada para la FAP humana (hu) y murina (mu) , asi como la FAP de Cynomolgus (cyno) según se determinó para clones seleccionados. Los Fabs anti-FAP de afinidad madurada se convirtieron en el formato Fab-IL2-Fab y en anticuerpos IgG ¦ para el análisis de especificidad. Se demostró la especificidad de unión por la falta de unión a DPPIV como homólogo cercano de FAP, expresado sobre células HEK293 o CHO.
TABLA 15: Sumario de las constantes cinéticas de equilibrio (KD) de anticuerpo anti-FAP de afinidad madurada en forma de fragmentos Fab (unión monovalente) .
Ejemplo 12 Construcción de bibliotecas de maduración de afinidad de anti-T C A2 (basadas en el clon 2B10) Se construyó una biblioteca de maduración de afinidad basándose en el anticuerpo preseleccionado de las selecciones primarias de TNC A2. Más exactamente, se basó en el clon parental 2B10 y consistía de dos sub-bibliotecas : 1) sub-biblioteca de VL, aleatorizado en CDR1 y CDR2 de la cadena ligera (L1/L2) , y 2) sub-biblioteca de VH, aleatorizada en CDR1 y CDR2 de la cadena pesada (H1/H2) . Se agruparon estas sub-bibliotecas tras la transformación. Se construyó cada una de dichas sub-bibliotecas mediante cuatro etapas posteriores de amplificación y ensamblaje. Para las bibliotecas de L1/L2: 1) amplificación del fragmento 1 (LMB3 - AM_VklA30_Ll_ba) y del fragmento 2 (RJH50 (VklA30_Ll/L2_fo) - RJH51 (VklA30_Bsi I_ba) ) , 2) ensamblaje de los fragmentos 1 y 2 utilizando los cebadores exteriores LMB3 y RJH51 (VklA30_BsiWI_ba) para crear el molde para 3) amplificación del fragmento 3 (LMB3 - AM_VklA30_L2_ba) y el fragmento 4 (RJH52 (VklA30_L2/L3) - RJH51 (VklA30_BsiWI_ba) ) , y 4) ensamblaje final de los fragmentos 3 y 4 utilizando los mismos cebadores exteriores que los indicados anteriormente. Para las bibliotecas de H1/H2: 1) amplificación del fragmento 1 (RJH53 - AM_DP88_Hl_ba_opt) y del fragmento 2 (RJH54 (DP88_Hl/H2_fo) - MS52), 2) ensamblaje de los fragmentos 1 y 2 utilizando los cebadores exteriores RJH53 y MS52 para crear el molde para 3) amplificación del fragmento 3 (RJH53 AM_DP88_H2_ba) y el fragmento 4 (RJH55 (DP88_H2H3_fo) -MS52) , y 4) ensamblaje final de los fragmentos 3 y 4 utilizando los mismos cebadores exteriores que los indicados anteriormente. Los productos finales del ensamblaje se digirieron con Ncol /BsiVII para las sub-bibliotecas de VL y Muñí y Nhel para las sub-bibliotecas de VH, y se clonaron en vectores aceptores digeridos de manera similar. El tamaño de la biblioteca resultó en 1,16 x 1010 clones independientes.
TABLA 16 Cebadores utilizados en las bibliotecas de maduración de 4 RJH55 TACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGGGTCAC (DP88 H2H3 fo) Subrayado: 60% base original y 40% aleatorización como V En negrita: 60% base original y 40% aleatorización como N Ejemplo 13 Selección de clones anti-TNC A2 de afinidad madurada Se llevaron a cabo selecciones contra TNC A2 humana expresada en E. coli que se clonó cadena arriba de una etiqueta avi y una etiqueta 6xhis (ver la secuencia SEC ID n° 57 de la Tabla 5) . Se biotiniló el antigeno in vivo tras la expresión. Se llevaron a cabo selecciones en solución tal como se describe para las selecciones primarias de TNC A2 utilizando concentraciones decrecientes de TNC A2 humana comprendidas entre 100 y 2 nM. Tras la identificación de clones de afinidad madura mediante ELIAS, se llevaron a cabo cribados secundarios utilizando un biosensor ProteOn XPR36 (Biorad) y se determinaron las constantes de tasa cinética y las afinidades mediante el análisis de preparaciones de Fab purificadas a partir de la afinidad en el mismo instrumento. Se identificaron los clones de afinidad madurada siguientes: 2B10_01F7 (ver las secuencias SEC ID n° 201 y 203 de la Tabla 3), 2B10_6H10 (ver las secuencias SEC ID n° 205 y 207 de la Tabla 3) , 2B10 C3A6 (ver las secuencias SEC ID n° 185 y 187 de la Tabla 3), 2B10_D1A2 (ver las secuencias SEC ID n° 189 y 191 de la Tabla 3), 2B10_O7D8 (ver las secuencias SEC ID n° 197 y 199 de la Tabla 3) (la totalidad de ellas se derivan de la sub-biblioteca de VL) , asi como 2B10_C3B6 (ver las secuencias SEC ID n° 177 y 179 de la Tabla 3), 2B10_6A12 (ver las secuencias SEC ID n° 181 y 183 de la Tabla 3) (estos dos clones se derivaron de la sub-biblioteca de VH) . Además, para el clon 2B10_D1A2, se generó un mutante V32D (ver las secuencias SEC ID n° 193 y 195 de la Tabla 3) (numeración según Kabat) .
La figura 26 muestra los sensogramas de la resonancia de plasmón superficial de los Fabs de afinidad madurada seleccionados contra TNC A2, y la Tabla 18 proporciona las afinidades respectivas. Las Fabs seleccionadas abarcan un intervalo de afinidad elevada en el rango de las pM.
TABLA 18: Sumario de las constantes cinéticas de equilibrio (KD) de anticuerpos anti-TNC A2 de afinidad madurada en forma de fragmentos Fab (unión monovalente) .
Ejemplo 14 Purificación de constructos Fab-IL2-Fab basados en 2B10, 3F2 y 4G8 Se desarrolló otro método de purificación (además del indicado en el Ejemplo 9) para los constructos Fab-IL2-Fab basados en 2B10, 3F2 y 4G8. Aunque los constructos Fab-IL2-Fab basados en 3F2 y 4G8 pueden purificarse mediante cromatografía de afinidad utilizando una matriz de proteína A (por ejemplo MabSelect Sure) , los constructos Fab-IL2-Fab basados en 2B10 deben purificarse mediante cromatografía de afinidad en una matriz de proteína G. El procedimiento de purificación se basa en las cuatro etapas siguientes: 1. Cromatografía de afinidad con MabSelect Sure o proteína G 2. Mantenimiento de pH bajo para la inactivación retrovírica 3. Cromatografía de intercambio aniónico - cromatografía CaptoQ, para eliminar el ADN 4. Cromatografía de intercambio catiónico - cromatografía de SP sefarosa FF, para eliminar los agregados Para la eliminación de agregados en cromatografía a pequeña escala, alternativamente puede utilizarse la cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Superdex 200 (GE Healthcare) .
Se proporciona un ejemplo del procedimiento de purificación posteriormente para Fab-IL2-Fab basado en 3F2. En una primera etapa, se ajustó a pH 7 el sobrenadante procedente de células HEK293 transíectadas transitoriamente con PEI en medio Freestyle (Invitrogen) y se aplicó a una columna MabSelect de proteína A (GE Healthcare) , se lavó con . NaP04 100 mM, NaCl 250 mM, pH 7, y se eluyó con formiato sódico 8,8 mM, pH 3. Se intercambiaron fracciones seleccionadas en tampón de lavado y se aplicaron a una columna CaptoQ (GE Healthcare) , se lavaron con NaP04 10 mM-, NaCl 40 mM, pH 6,5, y se eluyeron con NaCl 2 M. Se ajustó el eluído a pH 5 y se aplicó a una columna SP Sefarosa FF (GE Healthcare) , se lavó con acetato sódico 25 mM, NaCl 25 mM, pH 5, y se eluyó con acetato sódico 25 mM, NaCl 300 mM, pH 5. Las fracciones se intercambiaron en el tampón de formulación final. La figura 27 muestra una vista general del procedimiento de purificación.
El Fab-IL2-Fab basado en 3F2 purificado era puro tras la purificación (figura 28A) y no contenía agregados (figura 28B) . El procedimiento de purificación descrito se aplicó a un Fab-IL2-Fab basado en 4G8. El Fab-IL2-Fab basado en 4G8 se comportaba de manera similar al -Fab-IL2-Fab basado en 3F2. El material purificado era puro tras la purificación y no contenia agregados (figura 28, C-D) .
Se llevó a cabo la purificación paira el formato Fab-IL2-Fab con 2B10 (ligante de TNC A2) como fragmento Fab. En una primera etapa, se ajustó a pH 7 el sobrenadante procedente de células HEK293 transfectadas transitoriamente con PEI en medio Freestyle (Invitrogen) y se aplicó a una columna de proteina G (GE Healthcare) , se lavó con NaP04 100 mM, NaCl 250 mM, pH 7 , y se eluyó con formiato sódico 8,8 mM, pH 3. Se intercambiaron fracciones seleccionadas en tampón de lavado y se aplicaron a una columna CaptoQ (GE Healthcare) , se lavaron con NaP04 10 mM, NaCl 40 mM, pH 6,5, y se eluyeron con NaCl 2 M. Se ajustó el eluido a pH 5 y se aplicó a una columna SP Sefarosa FF (GE Healthcare) , se lavó con acetato sódico 25 mM, NaCl 25 mM, pH 5, y se eluyó con acetato sódico 25 mM, NaCl 300 mM, pH 5. Las fracciones se intercambiaron en el tampón de formulación final.
La figura 29 muestra los resultados de: (A) la caracterización analítica del producto mediante SDS-PAGE (minigel Bis-Tris Novex NuPAGE, Invitrogen, tampón de corrido MOPS, reducido y no reducido) , y (B) cromatografía analítica de exclusión por tamaño del producto tras cada una de las tres etapas de purificación. Se detectó 2,3% de agregados en el producto final.
Ejemplo 15 Ensayo de estabilidad Se llevó a cabo el ensayo de estabilidad para el formato Fab-IL2-Fab con el ligante B19 del ectodominio B de la fibronectina como fragmento Fab. Para los ensayos de estabilidad, se purificó el constructo Fab-IL2-Fab mediante cromatografía de afinidad de proteína A con una etapa de elución a pH 3, seguido de la cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Superdex 200 (GE Healthcare) tal como se ha descrito. Se sometieron a ensayo tres tampones diferentes y se identificó HC1 de histidina 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0 como tampón adecuado. A continuación, se formuló Fab-IL2-Fab L19 en HC1 de histidina 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0, a una concentración de 6,3 mg/ml y se almacenaron durante cuatro semanas a temperatura ambiente y a 4°C. La figura 30 muestra datos de estabilidad ejemplares: Se analizaron sondas cada semana para la concentración mediante espectroscopia de UV (figura 30A) (tras la centrif gación para peletizar el material potencialmente precipitado) y para el contenido de agregados mediante cromatografía analítica de exclusión por tamaño en una columna Superdex 200 (figura 30B) . Los resultados muestran que no se produjo agregación ni degradación al almacenar el constructo a 4°C o a temperatura ambiente durante 28 días, asi como tras un ciclo de congelación/descongelación a una concentración de 6 mg/ml . Estos datos demuestran que el formato Fab-IL2-Fab es altamente estable y que se comporta de manera comparable a los anticuerpos IgG.
Ejemplo 16 Afinidades de unión de Fab-IL2-Fab con diana en FAP mediante resonancia de plasmón superficial (Biacore) Se determinaron las afinidades de unión de los tres constructos Fab-IL2-Fab con diana en FAP: Fab-IL2-Fab 3F2, Fab-IL2-Fab 4G8 y Fab-1L2-Fab 3D9, mediante resonancia de plasmón superficial.
Para la determinación de la unión de FAP, se capturó FAP mediante un anticuerpo anti-His inmovilizado (Penta His, Qiagen n° 34660) y se utilizaron los constructos como analitos. La temperatura del análisis era 25°C y los constructos Fab-IL2-Fab se diluyeron 1:5 de 10 nM a 3,2 pM. Se aplicaron los parámetros de medición siguientes: Tiempo de asociación: 180 s, disociación: 900.s, caudal: 90 il/min. Se regeneró el chip con glicina 10 mM, pH 2 durante 60 segundos. Las curvas se ajustaron al modelo 1:1 para obtener los valores de KD (Rmax local, RI=0) .
Para determinar la afinidad para cadenas de receptor de IL-2 (IL-2R), se inmovilizaron las cadenas ß y ? (b/g, constructo botón en ojal) o la cadena á (a) de IL-2R se inmovilizaron sobre el chip y se utilizaron los constructos Fab-IL2-Fab como analitos. Temperatura del análisis: 25°C. Los constructos Fab-IL2-Fab 3F2 y 3D9 se diluyeron 1:2 de 25 nM a 0,78 nM y se aplicaron los parámetros de medición siguientes: Tiempo de asociación: 100 s, disociación: 180 s, caudal: 90 il/min. Se realizó la regeneración con glicina 10 mM, pH 1,5, durante 20 segundos. Los constructos Fab-IL2-Fab 4G8 se diluyeron de 100 nM a 3,125 nM y se aplicaron los parámetros de medición siguientes: Tiempo de asociación: 180 s, disociación: 180 s, caudal: 40 il/min. Regeneración con MgCl2 '3 M durante 30 segundos.
La Tabla 19 proporciona un resumen de las afinidades de unión de los inmunconjugados Fab-IL2-Fab 3F2, 4G8 y 3D9. Los valores picomolares de afinidad alcanzan el limite de detección del Biacore. Las figuras 31 a 34 muestran los sensogramas de Biacore y afinidades respectivas.
TABLA 19: Resumen de las constantes de equilibrio cinético (KD) de constructos Fab-IL2-Fab con diana, en FAP para FAP de diferentes especies , y receptor de IL-2 según determinación mediante resonancia de plasmón superficial Ejemplo 17 Afinidades de unión de Fab-IL2-Fab con diana en TNC A2 mediante resonancia de plasmón superficial (Biacore) Para la determinación de la unión de TNC A2 a los antigenos biotinilados (dominios fn5-Al-A2-A3 de TNC, fusionados entre si, expresados en E. coli. Mientras que los dominios fn5 y A3 en todos los casos son de origen humano, los dominios Al y A2 son humanos, murinos o Cynomolgus) se inmovilizaron sobre un chip con estreptavidina y se utilizaron los constructos de inmunoconjugado como analitos. Temperatura del análisis: 25°C. Los constructos Fab-IL2-Fab se diluyeron 1:2 de 25 nM a 0,39 nM y se aplicaron los parámetros de medición siguientes: Tiempo de asociación: 180 s, disociación: 180 s, caudal: 50 il/min. Se regeneró el chip con glicina 10 mM, pH 1,5 durante 60 segundos. Las curvas se ajustaron al modelo 1:1 para obtener los valores de KD. A modo de control negativo, se aplicaron los dominios 1 a 8 de TNC producidos en células HEK (HEK TNC 1 a 8) .
Para determinar la afinidad para las cadenas ß and ? de receptor de IL-2 (IL-2R) (b/g; constructo de botón en ojal), se inmovilizó el constructo IL-2R sobre el chip y se utilizaron los inmunoconjugados Fab-IL2-Fab como analitos. Temperatura del análisis: 25°C. Los inmunoconjugados Fab-IL2-Fab se diluyeron 1:2 de 25 nM a 0,78 nM y se aplicaron los parámetros de medición siguientes: Tiempo de asociación: 100 s, disociación: 180 s, caudal: 90 il/min. Se realizó la regeneración con glicina 10 mM, pH 1,5, durante 20 segundos. Los constructos Fab-IL2-Fab se diluyeron de 100 nM a 3,125 nM y se aplicaron los parámetros de medición siguientes: Tiempo de asociación: 180 s, disociación: 180 s, caudal: 40 il/min. Regeneración con MgC12 3 M durante 30 segundos. La Tabla 20 proporciona un resumen de las afinidades de unión para el inmunoconjugado Fab-IL2-Fab 2B10, la figura 35 muestra los sensogramas Biacore y afinidades respectivas.
TABLA 20: Resumen de las constantes de equilibrio cinético (KD) de constructos Fab-IL2-Fab con diana en TNC A2 para TNC A2 de diferentes especies , y receptor-ß/? de IL-2 según determinación mediante resonancia de plasmón superficial Ejemplo 18 Ensayos de actividad biológica con inmunoconjugados Fab- IL2-Fab de IL2 dirigidos Se investigó la actividad biológica de inmunoconj ugados Fab-IL2-Fab de IL-2 dirigidos en varios ensayos celulares en comparación con IL-2 (proleuquina ) ·.
Inducción de la proliferación de las células NK92 Se investigaron moléculas Fab-IL2-Fab de IL-2 dirigidas que reconocían TNC A2 (2B10) o FAP (3F2 y 4G8) para su potencial de inducir la proliferación de células NK92 en comparación con IL-2 (proleuquina) y el diacuerpo L19 de IL-2 que reconoce la EDB de la fibronectina .
Se recubrieron los pocilios de una placa ELISA de 96 pocilios de fondo plano con 2 µg/ml de tenascina humana, FAP o fibronectina durante la noche a 4°C. Tras bloquear la placa, se titularon los constructos Fab-IL2-Fab o el diacuerpo en la placa y se incubaron durante 90 minutos a temperatura ambiente (RT) para la unión. Tras un lavado intensivo para eliminar los constructos no unidos, se añadieron células NK92 privadas de IL-2 (10.000 células/pocilio). A modo de control positivo se añadió proleuquina en solución a algunos de los pocilios. Las células se incubaron durante 2 días a 37°C en un incubador humidificado (con 5% de C02) antes de lisar las células para determinar la proliferación mediante la medición del ATP utilizando el kit CellTiter Glo (Promega) .
Los resultados en la figura 36 muestran que todos los constructos Fab-IL2-Fab fueron capaces de activar la señalización de IL-2R sobre las células NK92 y de estimular su proliferación. Debido a la afinidad de unión reducida para el heterodimero IL-2R ß/? requerida para la señalización, se redujo la potencia de la inducción del crecimiento celular en un factor de aproximadamente 10 ó más en comparación con la IL-2 (proleuquina) . Sin embargo, la eficacia global a dosis más altas se conservó y era comparable a la de la IL-2 (proleuquina) .
Inducción de la fosforilación de STAT5 En otro experimento los presentes inventores sometieron a ensayo la inducción de la fosforilación de STAT5 como consecuencia de la señalización de IL-2R mediada por IL-2 tras la incubación con una molécula de Fab-IL2-Fab de IL-2 que reconocía FAP (basada en 4G8) sobre diferentes poblaciones de células efectoras, incluyendo: A) células NK CD56+, B) células T ayudante CD4+CD25~CD127+, C) células T citotóxicas CD3+CD8+, y D) células T reguladoras (Tregs) CD4+CD25+FOXP3+ de. PBMCs humanas en solución.
Se trataron PBMCs aisladas a partir de sangre de donantes sanos, durante 20 minutos con diferentes concentraciones de proleuquina o Fab-IL2-Fab antes de fij ar/permeabilizar las mismas y teñilas con anticuerpo anti-PhosphoSTAT5 (Becton Dickinson) según las instrucciones del suministrador. Tras la tinción intracelular de STAT5 fosforilado, asi como FOXP3, se tiñeron marcadores de superficie (CD3, CD4, CD8, CD56 y CD127) para la determinación de las diferentes subpoblaciones mediante citometria de flujo (FACS Canto II) .
Los resultados en la figura 37 confirman los resultados de la figura 36 y muestran que el constructo Fab-IL2-Fab 4G8 era capaz de activar la señalización de IL-2R en diversas células efectoras positivas para IL-2R y de inducir la señalización cadena abajo de IL-2R y la fosforilación de STAT5. Debido a la afinidad de unión reducida para el heterodimero IL-2R ß/? requerida para la señalización, se redujo la potencia de la inducción de la fosforilación de STAT5 en un factor de aproximadamente 10 ó más en comparación con la IL-2 (proleuquina) . Sin embargo, la eficacia global a dosis más altas se conservó y era comparable a la de la IL-2 (proleuquina) .
Liberación de IF -? e inducción de la proliferación en solución y tras la inmovilización En otro experimento, los presentes inventores pretendían imitar la situación producida en un tumor en el que se encuentra unido inmunoconj ugado de IL-2 dirigido e inmovilizado sobre las células tumorales o el estroma tumoral y puede activar las células efectoras. Con el fin de llevar a cabo lo anterior, los presentes inventores llevaron a cabo un ensayo de liberación de IFN- ? con células NK92, así como un ensayo de proliferación con los inmunoconjugados en solución, o recubrieron placas de microtitulación con antígeno TNC o FAP de manera que los inmunoconj ugados de IL-2 dirigidos se encontrasen inmovilizados tras la unión a TNC o FAP.
Se recubrieron los pocilios de una placa ELISA de 96 pocilios de fondo plano con 2 pg/ml de tenascina humana o FAP durante la noche a 4°C. Tras bloquear la placa, se titularon los constructos Fab-IL2-Fab en la placa y se incubaron durante 90 minutos a temperatura ambiente (RT) para la unión. Tras un lavado intensivo para eliminar los constructos no unidos, se añadieron células NK92 privadas de IL-2 (10.000 células/pocilio) . A modo de control positivo se añadió proleuquina en solución a algunos de los pocilios. Para determinar la proliferación de las ' células, éstas se incubaron durante 2 días a 37 °C en un incubador humidificado (con 5% de C02) antes de lisar las células para determinar la proliferación mediante la medición del ATP utilizando el kit CellTiter Glo (Promega) . Se midió la liberación de IFN-? en un enfoque separado tras 24 horas de incubación con Fab-IL2-Fab en el sobrenadante de las células con el kit ELISA de IFN-? humano de Becton Dickinson.
Los resultados confirmaron que todos los constructos Fab-IL2-Fab con diana en FAP, TNC Al o TNC A2 eran capaces de activar la señalización de IL-2R sobre células NK92 y de inducir la proliferación (figura 38A) de las células, asi como la secreción de IFN-? (figura 38C) en caso de encontrarse presente en solución. Debido a la afinidad de unión reducida para el heterodimero IL-2R ß/? requerida para la señalización, se redujo la potencia de la inducción de la liberación de IFN-? en un factor de aproximadamente 10 ó más en comparación con la IL-2 (proleuquina) . Sin embargo, la eficacia global a dosis más altas se conservó y era comparable a la de la IL-2 (proleuquina) . En el caso de que las placas de microtitulación se recubriesen con FAP o TNC, y los constructos se inmovilizasen sobre la placa, todos los constructos Fab-IL2-Fab con diana en FAP, TNC Al o TNC A2 todavía eran capaces de activar la señalización de IL-2R sobre las células NK92 y de inducir el crecimiento celular (figura 38B) y la liberación de IFN- ? (figura 38D) . En comparación con el ensayo realizado en solución, la diferencia de eficacia entre la IL-2 no recubierta .(proleuquina) y los constructos Fab-IL2-Fab inmovilizados era un orden de magnitud más alta; sin embargo, la eficacia global a dosis más altas se conservó y era comparable a la de IL-2 (proleuquina) .
Estos datos apoyan fuertemente el concepto de generar los inmunoconjugados dirigidos con baja exposición sistémica, pero que se acumulen en el sitio de la enfermedad, donde median en su función.
En el ejemplo siguiente, los presentes inventores investigador si dichas propiedades in vitro se traducían en una eficacia in vivo superior en modelos de xenoinjerto.
Ejemplo 19 Eficacia in vivo de inmunocon ugados Fab-IL2-Fab dirigidos contra FAP y TNC A2 en xenoinjertos de lineas celulares tumorales humanas Se sometieron a ensayo los inmunoconj ugados Fab-IL2-Fab dirigidos contra FAP y TNC A2 para su eficacia antitumoral en varios modelos de xenoinjerto.
Modelo de xenoinjerto LS174T Se sometió a ensayo el inmunoconj ugado Fab-IL2-Fab 2B10 con diana en TNC A2 en la línea celular colorrectal humana LS174T, inyectado intraesplénicamente en ratones SCID.
Las células LS174T (células de carcinoma de colon humano) se obtuvieron originalmente de ECACC (European Collection of Cell Culture) y tras la expansión se depositaron en el banco celular interno de Glycart. Se cultivaron LS174T en medio de Eagle MEM que contenia 10% de FCS (PAA Laboratories, Austria) , glutamax al 1% y aminoácidos no esenciales MEM al 1% (Sigma) . Las células se cultivaron a 37°C en una atmósfera saturada en agua con 5% de C02. Se utilizó el pase ín vitro 15 para la inyección intraesplénica, a una viabilidad de 92,8%. Se realizó una incisión pequeña en el sitio abdominal izquierdo de ratones SCID/beige anestesiados. Se inyectaron cincuenta microlitros (3xl06 células LS174T en medio AimV) de suspensión celular a través de la pared abdominal inmediatamente debajo de la cápsula del bazo. Se cerraron las heridas de la piel utilizando grapas.
Ratones SCID hembra; de 8 a 9 semanas de edad al inicio del experimento (adquiridos de Taconics, Dinamarca) se mantuvieron bajo condiciones libres de patógenos específicos, con ciclos diarios de 12. horas de luz/12 horas de oscuridad, de acuerdo con directrices acordadas (GV-Solas, Felasa, TierschG) . El protocolo del estudio experimental fue revisado y autorizado por el gobierno local (P 2008016) . Tras su recepción, los animales se mantuvieron durante una semana para aclimatarse al nuevo ambiente y para la observación. Se llevó a cabo un seguimiento continuo de su salud de manera regular .
Los ratones recibieron inyecciones intraesplénicas el día de estudio 0 de 3xl06 células . LS174T, se aleatorizaron y se pesaron. Una semana después de la inyección de células tumorales, los ratones recibieron inyecciones i.v. de Fab-IL2-Fab 2B10 con diana en TNC A2 ( Fab-IL2-Fab-SH2B10) , diacuerpo L19 de IL-2 con diana en EDB de la fibronectina, o proleuquina dos veces a la semana durante tres semanas.
Todos los ratones recibieron inyecciones i.v. de 200 µ? de la solución apropiada. Los ratones en el grupo de vehículo recibieron una inyección de PBS y los grupos de tratamiento con el constructo Fab-IL2-Fab, el diacuerpo o la proleuquina. Para obtener la cantidad apropiada de inmunoconjugado por cada 200 µ?, las soluciones madre se diluyeron con PBS en caso necesario.
La figura 39 muestra que el inmunoconjugado Fab-IL2-Fab 2B10 con diana en TNC A2 medió una eficacia superior en términos de una mediana de supervivencia incrementada en comparación con la IL-2 desnuda (proleuquina) y la molécula de diacuerpo de IL-2 con diana en EDB de fibronectina .
TABLA 21: 4 Modelo de xenoinjerto de ACHN Los inmunoconj ugados Fab-IL2-Fab 3F2 o 4G8 con diana en FAP se sometieron a ensayo en la linea celular renal humana ACHN, inyectados intrarrenalmente en ratones SCID.
Las células ACHN (células de adenocarcinoma renal humano) se obtuvieron originalmente de la ATCC (American Type Culture Collection) y tras la expansión se depositaron en el banco celular interno de Glycart. Se cultivaron ACHN en DMEM que contenía FCS al 10%. Las células se cultivaron a 37°C en una atmósfera saturada en agua con 5% de C02. Se utilizó el pase in vitro 9 para la inyección intrarrenal, a una viabilidad de 97,7%. Se realizó una incisión pequeña (2 cm) en el flanco derecho y en la pared peritoneal de los ratones SCID bajo anestesia. Se inyectaron cincuenta µ? (lxlO6 células ACHN en medio AimV) de suspensión celular 2 mm subcapsularmente en el riñon. Se cerraron las heridas de la piel y de la pared peritoneal utilizando grapas.
Ratones SCID hembra; de 8 a 9 semanas de edad al inicio del experimento (adquiridos de Charles River, Sulzfeld, Alemania) se mantuvieron bajo condiciones libres de patógenos específicos, con ciclos diarios de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad de acuerdo con directrices de una' comisión (GV-Solas,. Felasa, TierschG) . El protocolo del estudio experimental fue revisado y autorizado por el gobierno local (P 2008016) . Tras su recepción, los animales se mantuvieron durante una semana para aclimatarse al nuevo ambiente y para la observación. Se llevó a cabo un seguimiento continuo de su salud de manera regular.
Los ratones recibieron inyecciones intrarrenales el día de estudio 0 de lxlO6 células ACHN, se aleatorizaron y se pesaron. Una semana después de la inyección de células tumorales, los ratones recibieron inyecciones i.v. de proleuquina, diacuerpo L19 de IL-2 o inmunoconj ugados Fab-IL2-Fab 3F2 o 4G8 con diana en FAP dos veces a la semana durante tres semanas.
Todos los ratones recibieron inyecciones i.v. de 200 µ? de la solución apropiada. Los ratones en el grupo de vehículo recibieron inyecciones de PBS y los grupos de tratamiento, de proleuquina, diacuerpo L19 de IL-2 o inmunoconjugados Fab- IL2-Fab 3F2 o 4G8 con diana en FAP. Para obtener la cantidad apropiada, de inmunoconj ugado por cada 200 µ?, las soluciones madre se diluyeron con PBS en caso necesario.
La figura 40 muestra que el inmunoconjugado Fab-IL2-Fab 3F2 y 4G8 con diana en FAP medió una eficacia superior en términos de una mediana de supervivencia incrementada en comparación con la IL-2 desnuda (proleuquina) y la molécula de diacuerpo de IL-2 con diana en EDB de fibronectina . El Fab-IL2-Fab basado en 4G8, que presenta una afinidad más alta para la FAP murina, medió una eficacia superior que el Fab-IL2-Fab basado en 3F2.
TABLA 22: Modelo de xenoinjerto A549 Se sometió a ensayo el inmunocon ugado Fab-IL2-Fab 2B10 con diana en TNC A2 en la linea celular de NSCLC A549, inyectado i.v. en ratones transgénicos FCYRIII SCID-humanos .
Las células de carcinoma pulmonar de células no pequeñas A549 se obtuvieron orignalmente de la ATCC (CCL-185) y tras la expansión se depositaron en el banco celular interno de Glycart. La linea celular tumoral se cultivó rutinariamente en DMEM que contenia FCS al 10% (Gibco) a 37°C en una atmósfera saturada de agua con 5% de C02. Se utilizó el pase 2 para el trasplante, a una viabilidad de 98%. Se inyectaron i.v. 2xl06 células por animal en la vena de la cola en 200 µ? de medio de cultivo celular AimV (Gibco) .
Ratones SCID-Fc-yRIII hembra (GLYCART-RCC) , de 8 a 9 semanas de edad al inicio del experimento (criados en RCC, Suiza) se mantuvieron bajo condiciones libres de patógenos específicos, con ciclos diarios de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad de acuerdo con directrices de una comisión (GV-Solas, Felasa, TierschG) . El protocolo del estudio experimental fue revisado y autorizado por el gobierno local (P 2008016). Tras su recepción, los animales se mantuvieron durante una semana para aclimatarse al nuevo ambiente y para la observación. Se llevó a cabo un seguimiento continuo de su salud de manera regular .
Los ratones recibieron inyecciones i.v. el día de estudio 0 de 5xl06 células A549, se aleatorizaron y se pesaron. Una semana después de la inyección de células tumorales, los ratones recibieron inyecciones i.v. de Fab-IL2-Fab 2B10 o diacuerpo L19 de IL-2 dos veces a la semana durante tres semanas .
Todos los ratones recibieron inyecciones i.v. de 200 µ? de la solución apropiada. Los ratones en el grupo de vehículo recibieron una inyección de PBS y el grupo de tratamiento, de constructo Fab-IL2-Fab o diacuerpo L19 de IL-2. Para obtener la cantidad apropiada de inmunoconjugado por cada 200 µ?, las soluciones madre se diluyeron con PBS en caso necesario.
La figura 41 muestra que el inmunoconjugado Fab-IL2-Fab 2B10 con diana en TNC A2 medió una eficacia superior en términos de mediana de supervivencia incrementada en comparación con la molécula de diacuerpo de IL-2 con diana en EDB de fibronectina .
TABLA 23: Ejemplo 20 Purificación de inmunoconjugado Fab-GM-CSF-Fab de GM-CSF dirigido La purificación inicial del inmunoconj ugado Fab-GM-CSF-Fab con L19 (ligante de ectodominio B de la fibronectina ) como fragmento Fab se llevó a cabo en sobrenadantes de células HEK 293 EBNA transitoriamente transíectadas . Brevemente, se 5 purificó Fab-GM-CSF-Fab mediante cromatografía de proteína A seguido de cromatografía de exclusión por tamaño. Se equilibró la columna de proteína A en fosfato sódico 20 mM, citrato sódico 20 mM, pH 7,5. Se cargó el sobrenadante y la columna se lavó en primer lugar con fosfato sódico 20 mM, -^Q citrato sódico 20 mM, pH 7,5, seguido de fosfato sódico 20 mM, citrato sódico 20 mM, cloruro sódico 100 mM, pH 7,5. Se eluyó GM-CSF dirigido utilizando citrato sódico 20 mM, cloruro sódico 100 mM, glicina 100 mM, pH 3, y se neutralizó posteriormente. Para la formulación se aplicó el tampón siguiente: Fosfato de potasio 25 mM, cloruro sódico 125 mM, glicina 100 mM, pH 6,7.
La figura 42 muestra los perfiles de elución de la purificación y los resultados de la caracterización analítica del producto mediante SDS-PAGE (minigel Bis-Tris Novex 20 NuPAGE, Invitrogen, tampón de corrido MOPS, reducido y no reducido) . El rendimiento fue 4,8 mg/1.
Ejemplo 21 Ensayo de actividad biológica inmunocon ugado 25 dirigido Fab-GM-CSF-Fab de GM-CSF El inmunoconjugado Fab-GM-CSF-Fab purificado con L19 (ligante de ectodominio B de ibronectina) como Fab se analizó posteriormente, en un ensayo de proliferación dependiente de GM-CSF. Brevemente, se sembraron células TF-1, que crecen en dependencia de GM-CSF, tras el ayuno durante la noche a una densidad de 10.000 células/pocilio en una placa de 96 pocilios de fondo plano. Se titularon GM-CSF recombinante humano (Miltenyi n° 130-093-862) o inmunoconjugado Fab-GM-CSF-Fab sobre las células en solución. Tras 2 días de proliferación a 37°C en un incubador humidifcado con 5% de CO2, las células se lisaron y se midió el contenido de ATP con el ensayo CellTiter Glo de Promega. Las células no tratadas con GM-CSF se fijaron a 0% de crecimiento para el cálculo. Los resultados en la figura 43 muestran que el inmunoconjugado Fab-GM-CSF-Fab indujo una fuerte proliferación de las células TF-1.
Ejemplo 22 Purificación de inmunoconjugado dirigido Fab-IL12-Fab de IL-2 La purificación inicial del inmunoconjugado Fab-IL12-Fab 4G8 (ligante de FAP) como fragmento Fab se llevó a cabo en sobrenadantes de células HEK 293 EBNA transitoriamente transíectadas . Brevemente, se purificó Fab-IL12-Fab mediante cromatografía de proteína A seguido de cromatografía de exclusión por tamaño. Se equilibró la columna de proteína A en fosfato sódico 20 mM y citrato sódico 20 mM, pH 7,5.' Se cargó el sobrenadante y la columna se lavó con fosfato sódico 20 mM, citrato sódico 20 mM y cloruro sódico 500 mM, pH 7,5.
Se llevó a cabo un segundo lavado con fosfato sódico 13,3 mM, citrato sódico 20 mM y cloruro sódico 500 mM, pH 5,45. Tras un tercer lavado con MES 10 mM y cloruro sódico 50 mM, pH 5, se eluyó IL-12 dirigido utilizando citrato sódico 20 mM, cloruro sódico 100 mM y glicina 100 mM, pH 3, y posteriormente se neutralizó. Para la formulación se aplicó el tampón siguiente: fosfato de potasio 25 mM, cloruro sódico 125 mM y glicina 100 mM, pH 6,7.
La figura 44 muestra los perfiles de elución de la purificación y los resultados de la caracterización analítica del producto mediante SDS-PAGE (minigel Bis-Tris Novex NuPAGE, Invitrogen; tampón de corrido MOPS, reducido y no reducido). El rendimiento fue de 43 mg/1.
Ejemplo 23 Ensayos de actividad biológica con inmunoconjugados dirigidos Fab-IL2-Fab de IL2 inmunoconjugado Fab-IL12-Fab 4G8 purificado (ligante FAP) como Fab se. analizó posteriormente para la liberación de IFN-? inducida por IL-12, comparando el efecto de IL-12 y el inmunoconj ugado Fab-IL12-Fab 4G8 purificado, en PB Cs aisladas a partir de sangre humana fresca procedente de un 5 donante sano.
Brevemente, se aislaron PBMCs de sangre humana fresca procedente de un donante sano y se sembraron en una placa de 96 pocilios de fondo en U (l,5xl05 células/pocilio) en medio AIM V. Se añadió a todos los pocilios una concentración -^Q constante de 10 ng/ml de IL-2 hu (Preprotech) . El constructo Fab-IL12-Fab se diluyó en el medio y se tituló sobre las PBMCs. Se recogieron los sobrenadantes tras aproximadamente 20 horas para determinar las concentraciones de IFN-? utilizando el kit ELISA II para IFN-? hu de Becton Dickinson (n° 550612) .
Los resultados en la figura 45 muestran que: A) la cantidad seleccionada de IL-2 humano (hu) solo, asi como de IL-12 solo no era capaz de inducir una liberación significativa de IFN-? por parte de las PBMCs humanas, mientras que la combinación 20 de ambas citoquinas condujo a una liberación significativa de IFN-? por parte de las PBMCs. B) El constructo Fab-IL-12-Fab indujo la liberación de IFN-? por parte de las PBMCs humanas de una manera dependiente de la concentración en presencia de 10 ng/ml de IL-2 humana. 25 Ejemplo 24 Purificación de inmunoconjugado dirigido Fab-IFN a2-Fab de IFN-cc La purificación inicial del inmunoconj ugado Fab-IFNa2-Fab con L19 (ligante de ectodominio B de la fibronectina) como fragmento Fab se llevó a cabo en sobrenadantes de células HEK 293 EBNA transitoriamente transfectadas . Brevemente, se purificó Fab-IFNa2-Fab mediante cromatografía de proteína A seguido de cromatografía de exclusión por tamaño. Se equilibró la columna de proteína A en fosfato sódico 20 mM y citrato sódico 20 mM, pH 7,5. Se cargó el sobrenadante y la columna se lavó en primer lugar con fosfato sódico 20 mM y citrato sódico 20 mM, pH 7,5, seguido de fosfato sódico 20 mM, citrato sódico 20 mM y cloruro sódico 100 mM, pH 7,5. Se eluyó el Fab-IFNa2-Fab con citrato sódico 20 mM, cloruro sódico 100 mM y glicina 100 mM, pH 3, y se neutralizó posteriormente. Para la formulación se aplicó el tampón siguiente: fosfato de potasio 25 mM, cloruro sódico 125 mM, glicina 100 mM, pH 6,7.
La figura 46 muestra los perfiles de . elución de la purificación y los resultados de la caracterización analítica del producto mediante SDS-PAGE (minigel Bis-Tris Novex NuPAGE, Invitrogen, tampón de corrido MOPS, reducido y no reducido). El rendimiento fue de 8,4 mg/1.
Ejemplo 25 Ensayo de actividad biológica de inmunoconjugado Fab- IFNcx2-Fab de IFN-á El inmunoconjugado Fab-IFNa2-Fab purificado con L19 (ligante de ectodominio B de la fibronectina ) como Fab posteriormente se analizó para la inhibición de la proliferación inducida por IFN-á de células T de Jurkat y células tumorales A549, comparando el efecto de IFN-á (Roferon A, Roche) y el inmunoconjugado Fab-IFNa2-Fab L19 purificado. Brevemente, las células A549 y T de Jurkat, que son susceptibles a la inhibición de la proliferación inducida por IFN-á se sembraron a una densidad de 5.000 células/pocilio (A549) ó 10.000 células/pocilio (Jurkat) en placas de 96 pocilios de fondo plano. Las diluciones de Roferon A (Roche) o de Fab-IFNa2-Fab en el medio de cultivo celular apropiado se titularon sobre las células en solución. Tras 2 días de proliferación a 37°C en un incubador humidifcado con 5% de C02, las células se lisaron y se midió el contenido de ATP con el ensayo CellTiter Glo de Promega. Las células no tratadas con IFN-á se fijaron a 0% de crecimiento para el cálculo .
Los resultados en la figura 47 muestran que los constructos Fab-IFNoí2-Fab inhiben la proliferación de: A) células T de Jurkat, y B) células A549 de una manera dependiente de la concentración comparable a la de IFN-á (Roferon A) .
Ejemplo 26 Preparación de inmunoconjugado Fab-IL2-Fab con diana en MCSP El anticuerpo MHLG anti-MCSP humanizado se generó tal como se describe en la patente WO n° 2006/100582 (ver, en particular, el Ejemplo 1 en la misma), el contenido completo de la cual se incorpora en la presente memoria como referencia, y se convirtió al formato Fab-IL2-Fab (ver las secuencias SEC ID n° 255, 256, 261, 262) .
Se generó el anticuerpo MHLG1 anti-MCSP humanizado de la manera siguiente: La secuencia de aminoácidos murina del anticuerpo anti-MCSP 225.28 (cadena ligera, y cadena pesada, ver posteriormente) se alineó a una colección de genes de anticuerpo V de la linea germinal humana y se clasificaron según la identidad y homología de las secuencias. 225.28 cadena ligera; GenBank n° de acceso CAA65007 (SEC ID n° 267) : DIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVDTNVAWYQQKPGQSPEPLLFSASYRYTGVPDR FTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNSYPLTFGGGTKLEIK 225.28 cadena pesada; GenBank n° de acceso disponible (SEC ID n° 268) : QVKLQQSGGGLVQPGGSMKLSCVVSGFTFSNY NWVRQSPEKGLEWIAEIRLKSNNFGRY YAESVKGRFTISRDDSKSSAYLQMINLRAEDTGIYYCTSYGNYVGHYFDHWGQGTTVTVSS Se seleccionó- la secuencia aceptora potencial basándose en una homología global elevada, y la presencia de los residuos canónicos correctos ya en la secuencia aceptora. Se seleccionó la secuencia de la ' línea germinal humana IGHV3-15 (IMGT n° de acceso X92216) como el aceptor para la cadena pesada, y la secuencia IGKV1-9 (IMGT n° de acceso Z00013) para la cadena ligera. Los constructos humanizados se denominan M-KV1 (ver las secuencias SEC ID n° 263, 264, 269 y 270), 7 (SEC ID n° 265, 266, 271 y 272), y 9 (SEC ID n° 253, 254, 259, 260) para la cadena ligera, y MHLG1 (ver las secuencias SEC ID n° 251, 252, 257, 258), para la cadena pesada.
Los genes para dichas secuencias de anticuerpo diseñadas se generaron mediante técnicas de PCR convencional y se fusionaron a dominios constantes de IgGl y kappa humanos para la construcción de los plásmidos de expresión.
Los anticuerpos se expresaron como IgG o como proteínas de fusión Fab-IL2-Fab en sistemas de cultivo celular de mamífero, por ejemplo HEK o CHO, y se purificaron mediante cromatografía de proteína A y cromatografía de exclusión por tamaño. La comparación de los datos de unión de las variantes de cadena ligera -KV1 y M-KV7 reveló que un residuo de prolina en la posición Kabat 46 resulta esencial para la unión funcional al antigeno. Se adoptaron dos enfoques 5 diferentes para garantizar la presencia de dicho aminoácido: A) se introdujo una retromutación en el marco humano de IGKV1-9, y B) para evitar la presencia de retromutaciones , se intercambió la región de marco 2 completa (posiciones Kabat 35 a 49) por la región correspondiente del anticuerpo humano ¦j_Q con la entrada de GenBank AAA17574. Este anticuerpo presenta naturalmente un residuo de prolina en la posición 46.
Se purificó Fab-IL2-Fab MHLG KV9 con diana en MCSP mediante el método descrito anteriormente (Ejemplo 9) , compuesto de una etapa de afinidad (proteina A) , seguido de cromatografía _. de exclusión por tamaño (Superdex 200, GE Healthcare) . Se equilibró la columna de proteina A en fosfato sódico 20 mM, citrato sódico 20 mM, pH 7,5, se cargó el sobrenadante, y la columna se lavó con fosfato sódico 20 mM, citrato sódico 20 mM, cloruro sódico 500 mM, pH 7,5, seguido de un lavado con 20 fosfato sódico 13,3 mM, citrato sódico 20 mM y cloruro sódico 500 mM, pH 5,45. Opcionalmente se llevó a cabo un tercer lavado con MES 10 mM y cloruro sódico 50 mM, pH 5. Se eluyó Fab-IL2-Fab con citrato sódico 20 mM, cloruro sódico 100 mM y glicina 100 mM, pH 3. Las fracciones eluidas se agruparon y 25 se purificaron mediante cromatografía por exclusión por tamaños en el tampón de formulación final. Fosfato de potasio 25 mM, cloruro sódico 125 mM, glicina 100 mM, pH 6,7.
La figura 48 muestra: (A) los perfiles de elución de la purificación, y (B) los resultados de la caracterización analítica del Fab-IL2-Fab MHLG con diana en MCSP mediante SDS-PAGE (minigel Bis-Tris Novex NuPAGE , Invitrogen; tampón de corrido MOPS, reducido y no reducido) . El rendimiento fue 30 mg/1.
Ejemplo 27 Ensayo de actividad biológica con inmunoconjugado dirigido Fab-IL2-Fab de MCSP El inmunoconjugado Fab-IL2-Fab purificado con MHLG KV9 (ligante de MCSP) como Fab se analizó posteriormente para la liberación de IFN-? inducida por IL-2, comparando el efecto del Fab-IL2-Fab 4G8 purificado (ligante de FAP) con el de Fab-IL2-Fab MHLG sobre las células NK92.
Se sembraron células NK92 privadas de IL-2 en una placa de 96 pocilios de fondo en U (105 células/pocilio) en medio NK (MEMa + FCS al 10% + suero de caballo al 10% + 2-mercaptoetanol 0,1 mM + inositol 0,2 mM + ácido fólico 0,02 mM) . El inmunoconjugado Fab-IL-2-Fab basado en MHLG con diana en MCSP se diluyó en medio y se tituló sobre las células NK92 en una comparación directa entre el inmunoconjugado Fab-IL2-Fab basado en 4G8 con diana en FAP. Se recogieron los sobrenadantes tras aproximadamente 22 horas para determinar las concentraciones de IFN-? utilizando el kit ELISA II para IFN-? hu de Becton Dickinson (n° 550612) .
Los resultados en la figura 49 muestran que ambos inmunoconj ugados Fab-IL2-Fab, con diana contra CSP o FAP, indujeron una secreción comparable de IFN-? en células NK92 de una manera dependiente de la concentración, con independencia del anticuerpo de direccionamiento utilizado.
Debe apreciarse que se pretende que la sección de descripción detallada, pero no las secciones de descripción resumida y de resumen, sean utilizadas para interpretar las reivindicaciones. Las secciones de descripción resumida y de resumen pueden proporcionar una o más, pero no la totalidad, de las realizaciones ejemplares de 1.a presente invención según contemplan el inventor o inventores, y de esta manera, no pretenden limitar la presente invención ni las reivindicaciones adjuntas en modo alguno.
La presente invención ha sido descrita anteriormente con ayuda de bloques constructivos funcionales que ilustran la implementación de funciones . especificadas y relaciones entre las mismas. Los limites de dichos bloques constructivos funcionales han sido arbitrariamente definidos en la presente memoria a conveniencia de la descripción. Pueden definirse limites alternativos a condición de que las funciones especificadas y las relaciones entre las mismas se lleven a cabo apropiadamente.
La descripción anterior de las realizaciones especificas de esta manera revela completamente la naturaleza general de la invención de modo que otros puedan, mediante la aplicación de los conocimientos comprendidos en el estado de la técnica, modificar y/o adaptar fácilmente para diversas aplicaciones dichas realizaciones especificas, sin necesidad de experimentación indebida, sin apartarse del concepto general de la presente invención. Por lo tanto, dichas adaptaciones y modificaciones pretenden encontrarse comprendidas dentro del significado y alcance de los equivalentes de las realizaciones dadas a conocer, basándose en la enseñanza y guia presentada en la presente memoria. Debe entenderse que las expresiones o terminología en la presente memoria se proporcionan con el propósito de descripción y no de limitación, de manera que la terminología o las expresiones de la presente memoria deben ser interpretadas por el experto en la materia a la luz de las enseñanzas y guías.
La amplitud y alcance de la presente invención no deben encontrarse limitadas por cualquiera de las realizaciones ejemplares anteriormente descritas, sino que deberían definirse únicamene de acuerdo con las reivindicaciones siguientes y sus equivalentes.

Claims (202)

Reivindicaciones
1. Inmunoconjugado que comprende: (a) por- lo menos un primer grupo efector de una cadena, y (b) un primer y un segundo grupos de unión a antigeno independientemente seleccionados de entre el grupo que consiste de un Fv y un Fab, en el que dicho primer grupo efector comparte un enlace peptidico amino-terminal o carboxi-terminal con dicho primer grupo de unión a antigeno, y en el que dicho segundo grupo de unión a antigeno comparte un enlace peptidico amino-terminal o carboxi-terminal con i) dicho primer grupo efector, o ii) dicho primer grupo de unión a antigeno.
2. Inmunoconjugado según la reivindicación 1, en el que dicho inmunoconjugado consiste esencialmente de un primer grupo efector y primer y segundo grupos de unión a antigeno unidos por una o más secuencias de linker.
3. Inmunoconjugado según la reivindicación 1 ó 2, en el que cada uno de dichos primer y segundo grupos de unión a antigeno es una molécula Fab.
4. Inmunoconjugado según la reivindicación 3, en el que dicha primera molécula de Fab se encuentra unida en su aminoácido carboxi-terminal de cadena pesada o de cadena ligera al aminoácido amino-terminal de la cadena pesada o cadena ligera de la segunda molécula Fab.
5. Inmunoconj ugado según la reivindicación 4, en el que dicha segunda molécula de Fab se encuentra unida en su aminoácido carboxi-terminal de cadena pesada o de cadena ligera al aminoácido amino-terminal de dicho grupo efector.
6. Inmunoconj ugado según la reivindicación 4, en el que dicho grupo efector se encuentra unida en su aminoácido carboxi-terminal al aminoácido amino-terminal de dicha primera molécula Fab.
7. Inmunoconjugado según la reivindicación 3, en el que dicha primera molécula de Fab se encuentra unida en su aminoácido carboxi-terminal de cadena pesada o de cadena ligera al aminoácido amino-terminal de dicho grupo efector.
8. Inmunoconjugado según la reivindicación 7, en el que dicha grupo efector se encuentra unido en su aminoácido carboxi-terminal al aminoácido terminal de la cadena pesada o de la cadena ligera de la segunda molécula Fab.
9. Inmunoconjugado que comprende un primer grupo efector de una cadena unido en su aminoácido amino-terminal a una o más moléculas de scFv, y en el que dicho primer grupo efector de una cadena se encuentra unido en su aminoácido carboxi-terminal a una o más moléculas de scFv.
10. Inmunoconjugado que comprende: a) por lo menos un primer grupo efector de una cadena, b) primer y segundo grupos de unión a antigeno, en los que cada uno de dichos grupos de unión a antigeno comprende una molécula de scFv unida en su aminoácido carboxi-terminal a una región constante que comprende un dominio constante de inmunoglobulina seleccionado independientemente de entre el grupo que consiste de: CHl de IgG, Ckappa de IgG y CH4 de IgE. en el que dicho primer grupo de unión a antigeno se encuentra unido en su aminoácido carboxi-terminal de región constante al aminoácido amino-terminal de dicho primer grupo efector, y en el que dicho primer y segundo grupos de unión a antigeno se encuentran covalentemente unidos mediante por lo menos un enlace disulfuro.
11. Inmunoconj ugado según la reivindicación 10, en el que cada uno de dichos grupos de unión a antigeno comprende una molécula de scFv unida en su aminoácido carboxi-terminal a una región constante que comprende un dominio CHl de IgG.
12. Inmunoconjugado según la reivindicación 10, en el que cada uno de dichos grupos de unión a antigeno comprende una molécula de scFv unida en su aminoácido carboxi-terminal a una región constante que comprende un dominio CH4 de IgE.
13. Inmunoconjugado según la reivindicación 10, en el que cada uno de dichos grupos de unión a antigeno comprende una molécula de scFv unida en su aminoácido carboxi-terminal a una región constante que comprende un dominio CkapPa de IgG.
14. Inmunoconj ugado según la reivindicación 10, en el que dicho primer grupo de unión a antigeno comprende una molécula de scFv unida en su aminoácido carboxi-terminal a una región constante que comprende un dominio CH1 de IgG, y en el que dicho segundo grupo de unión a antigeno comprende una molécula de scFv unida en su aminoácido carboxi-terminal a una región constante que comprende un dominio Ckappa de IgG.
15. Inmunoconj ugado que comprende: a) por lo menos un primer grupo efector de una cadena, y b) primer y segundo grupos de unión a antigeno, en los que cada uno de dichos grupos de unión a antigeno comprende una molécula de scFv unida en su aminoácido carboxi-terminal a un dominio CH3 de IgG. en el que dicho primer grupo de unión a antigeno se encuentra unido en su aminoácido carboxi-terminal al aminoácido amino-terminal de dicho primer grupo efector, y en el que dicho primer y segundo grupos de unión a antigeno se encuentran covalentemente unidos mediante por lo menos un enlace disulfuro.
16. Inmunoconj ugado según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, en el que la región constante de dicho primer grupo de unión a antigeno se encuentra unida covalentemente a la región constante de dicho segundo grupo de unión a antigeno mediante por lo menos un enlace disulfuro .
17. Inmunoconj ugado según la reivindicación 16, en el que el dominio de inmunoglobulina de dicha primer grupo de unión a antigeno se encuentra covalentemente unido al dominio de inmunoglobulina de dicho grupo de unión a antigeno mediante un enlace disulfuro.
18. Inmunoconj ugado según la reivindicación 16, en el que por lo menos un enlace disulfuro se encuentra situado carboxi-terminalmente respecto a los dominios de inmunoglobulina de dicho primer y segundo grupos de unión a antígeno .
19. Inmunoconjugado según la reivindicación 16, en el que por lo menos un enlace disulfuro se encuentra situado amino-terminalmente respecto a los dominios de inmunoglobulina de dicho primer y segundo grupos de unión a antigeno .
20. Inmunoconj ugado según la reivindicación 19, en el que por lo menos dos enlaces disulfuro se encuentran situados amino-terminalmente respecto a los dominios de inmunoglobulina de dicho primer y segundo grupos de unión a antigeno .
21. Inmunoconjugado según la reivindicación 10, en el que dicho inmunoconj ugado comprende además un segundo grupo efector y en el que dicho segundo grupo de unión a antigeno se encuentra unido en su aminoácido carboxi-terminal de región constante al aminoácido amino-terminal de dicho segundo grupo efector.
22. Inmunoconjugado que comprende: a) primer y segundo grupos efectores de una cadena, y b) primer y segundo grupos de unión a antigeno, en los que cada uno de dichos grupos de unión a antigeno comprende una molécula de Fab unida en su aminoácido carboxi-terminal de cadena pesada o de cadena ligera a un dominio CH3 de IgGl. en el que dichos dominios CH3 de IgGl se encuentran unidos en su aminoácido carboxi-terminal al aminoácido amino-terminal de uno de dichos grupos efectores, y en el que dicho primer y segundo grupos de unión a antigeno se encuentran covalentemente unidos mediante por lo menos un enlace disulfuro.
23. Inmunoconjugado según la reivindicación 22, en el que dichos dominios CH3 de IgGl se encuentran unidos mediante un único enlace disulfuro.
24. Inmunoconjugado según la reivindicación 22 ó 23, en el que por lo menos un enlace disulfuro se encuentra situado carboxi-terminalmente respecto a los dominios CH3 de IgGl de dichos primer y segundo grupos de unión a antigeno.
25. Inmunoconjugado según la reivindicación 22 ó 23, en el que por lo menos un enlace disulfuro se encuentra situado amino-terminalmente respecto a los dominios CH3 de IgGl de dichos primer y segundo grupos de unión a antigeno.
26. Inmunoconjugado según la reivindicación 25, en el que por lo menos dos enlaces disulfuro se encuentran situados amino-terminalmente respecto a los dominios CH3 de IgGl de dichos primer y segundo grupos de unión a antigeno.
27. Inmunoconj ugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, en el que los sitios de corte proteolitico se encuentran situados entre dichos grupos de unión a antigeno y dichos grupos efectores.
28. Inmunoconj ugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, en el que las regiones variables de dicho primer y segundo grupos de unión a antigeno son especificas para el mismo antigeno.
29. Inmunoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1. a 26, en el que la región variable de dicho primer y segundo grupos de unión a antigeno son especificas para diferentes antigenos.
30. Inmunoconj ugado según la reivindicación 28, en el que dicho primer y segundo grupos de unión a antigeno son específicos para el dominio extra B de la fibronectina (EDB) .
31. Inmunoconjugado según la reivindicación 29, en el que dicho primer y segundo grupos de unión a antígeno son específicos para el dominio extra B de la fibronectina (EDB) .
32. Inmunoconj ugado según la reivindicación 30 ó 31, en el que dichos uno o dos grupos de unión a antígeno que son específicos para EDB compiten con el anticuerpo monoclonal L19 para la unión a un epítopo de EDB.
33. Inmunoconj ugado según la reivindicación 30 ó 32, en el que dicho inmunoconj ugado comprende la secuencia polipeptídica SEC ID n° 95.
34. Inmunoconj ugado según la reivindicación 30 ó 32, en el que dicho inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleótida que presenta una identidad de por lo menos 80% respecto a la secuencia SEC ID n° 108.
35. Inmunoconjugado según la reivindicación 34, en el que dicho inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por la secuencia polinucleótida SEC ID n° 108.
36. Inmunoconjugado según la reivindicación 30 ó 32, en el que dicho inmunoconj ugado comprende la secuencia polipeptídica SEC ID n° 104.
37. Inmunoconjugado según la reivindicación 30 ó 32, en el que dicho inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleótida que presenta una identidad de por lo menos 80% respecto a la secuencia SEC ID n° 117.
38. Inmunoconjugado según la reivindicación 37, en el que dicho inmunoconj ugado comprende una ' secuencia polipeptídica codificada por la secuencia polinucleótida SEC ID n° 117.
39. Inmunoconjugado según la reivindicación 30 ó 32, en el que dicho . inmunoconjugado comprende la secuencia polipeptidica SEC ID n°_105.
40. Inmunoconjugado según la reivindicación 30 ó 32, en el que dicho inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptidica codificada por una secuencia polinucleótida que presenta una identidad de por lo menos 80% respecto a la secuencia SEC ID n° 118.
41. Inmunoconjugado según la reivindicación 40, en el que dicho inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptidica codificada por la secuencia polinucleótida SEC ID n° 118.
42. Inmunoconjugado según la reivindicación 30 ó 32, en el que dicho inmunoconjugado comprende la secuencia polipeptidica SEC ID n° 106.
43. Inmunoconjugado según la reivindicación 30 ó 32, en el que dicho inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptidica codificada por una secuencia polinucleótida que presenta una identidad de por lo menos 80% respecto a la secuencia SEC ID n° 119.
44. Inmunoconjugado según la reivindicación 43, en el que dicho inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptidica codificada por la secuencia polinucleótida SEC ID n° 119.
45. Inmunoconjugado según la reivindicación 30 ó 32, en el que dicho inmunoconjugado comprende la secuencia polipeptidica SEC ID n° 107.
46. Inmunoconjugado según la reivindicación 30 ó 32, en el que dicho inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptidica codificada por una secuencia polinucleótida que presenta una identidad de por lo menos 80% respecto a la secuencia SEC ID n° 120.
47. Inmunoconjugado según la reivindicación 46, en el que dicho inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptidica codificada por la secuencia polinucleótida SEC ID n° 120.
48. Inmunoconjugado según la reivindicación 30 ó 32, en el que dicho inmunoconjugado comprende la secuencia polipeptidica SEC ID n° 96.
49. Inmunoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 32, en el que dicho inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptidica codificada por una secuencia polinucleótida que presenta una identidad de por lo menos 80% respecto a la secuencia SEC ID n° 109.
50. Inmunoconjugado según la reivindicación 49, en el que dicho inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptidica codificada por la secuencia polinucleótida SEC ID n° 109.
51. Inmunoconjugado según la reivindicación 33 a 47, en el que dicho inmunoconj ugado comprende además la secuencia polipeptidica SEC ID n° 96.
52. Inmunoconj ugado según la reivindicación 28, en el que dicho primer y segundo grupos de unión a antigeno son específicos para el dominio Al de la tenascina (TNC-Al) .
53. Inmunoconj ugado según la reivindicación 29, en el que dicho primer y segundo grupos de unión a antígeno son específicos para el dominio Al de la tenascina (TNC-Al) .
54. Inmunoconj ugado según la reivindicación 52 ó 53, en el que dichos uno o dos grupos de unión a antígeno que son específicos para TNC-Al compiten con el anticuerpo monoclonal F16 para la unión a un epítopo de TNC-Al.
55. Inmunoconjugado según la reivindicación 52 ó 54, en el que dicho inmunoconj ugado comprende la secuencia polipeptidica SEC ID n° 99.
56. Inmunoconjugado según la reivindicación 52 ó 54, en el que dicho inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptidica codificada por una secuencia polinucleótida que presenta una identidad de por lo menos 80% respecto a la secuencia SEC ID n° 112.
57. Inmunoconj ugado según la reivindicación 56, en el que dicho inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptidica codificada por la secuencia polinucleótida SEC ID n° 112.
58. Inmunoconjugado según la reivindicación 52 ó 54, en el que dicho inmunocon ugado comprende la secuencia polipeptídica SEC ID n° 100.
59. Inmunoconj ugado según la reivindicación 52 ó 54, en el que dicho inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por un polinucleótido que presenta una identidad de por lo menos 80% respecto a la secuencia SEC ID n° 113.
60. Inmunoconjugado según la reivindicación 59, en el que dicho inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por la secuencia polinucleótida SEC ID n° 113.
61. Inmunoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 52 a 54, en el que dicho inmunoconjugado comprende la secuencia polipeptídica SEC ID n° 101.
62. Inmunoconj ugado según cualquiera de las reivindicaciones 52 a 54, en el que dicho inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleótida que presenta una identidad de por lo menos 80% respecto a la secuencia SEC ID n° 114.
63. Inmunoconj ugado según la reivindicación 62, en el que dicho inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por la secuencia polinucleótida SEC ID n° 114.
64. Inmunoconj ugado según cualquiera de las reivindicaciones 58 a 60, en el que dicho inmunoconj ugado comprende además la secuencia polipeptxdica SEC ID n° 101.
65. Inmunoconj ugado según la reivindicación 52, en el que dicho inmunoconj ugado comprende la secuencia polipeptídica SEC ID n° 215.
66. Inmunoconj ugado según la reivindicación 52, en el que dicho inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por un polinucleótido que presenta una identidad de por lo menos 80% respecto a la secuencia SEC ID n° 216.
67. Inmunoconj ugado según la reivindicación 66, en el que dicho inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por la secuencia polinucleótida SEC ID n° 216.
68. Inmunoconj ugado según la reivindicación 52 ó 53, en el que dicho inmunoconj ugado comprende la secuencia polipeptídica SEC ID n° 235.
69. Inmunoconj ugado según la reivindicación 52 ó 53, en el que dicho inmunocon ugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleótida que presenta una identidad de por lo menos 80% respecto a la secuencia SEC ID n° 236.
70. Inmunoconj ugado según la reivindicación 69, en el que dicho inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por la secuencia polinucleótida SEC ID n° 236.
71. Inmunoconj ugado según cualquiera de -las reivindicaciones 65 a 67, en el que dicho inmunoconj ugado comprende además la secuencia polipeptidica SEC ID n° 235.
72. Inmunoconj ugado según la reivindicación 52 ó 53, en el que dicho inmunoconj ugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada SEC ID n° 13 o SEC ID n° 15.
73. Inmunoconj ugado según la reivindicación 52 ó 53, en el que dicho inmunoconj ugado comprende una secuencia de región variable de cadena ligera SEC ID n° 9 o SEC ID n° 11.
74. Inmunoconj ugado según la reivindicación 72, en el que dicho inmunoconj ugado comprende además una secuencia de región variable de cadena ligera SEC ID n° 9 o SEC ID n° 11.
75. Inmunoconj ugado según la reivindicación 72, en el que dicha secuencia de región variable de cadena pesada se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida' que presenta una identidad de por lo menos 80% respecto a la secuencia SEC ID n° 14 o n° 16.
76. Inmunoconj ugado según la reivindicación 75, en el que dicha secuencia de región variable de cadena pesada se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida SEC ID n° 14 o n° 16.
77. Inmunoconj ugado según la reivindicación 73, en el que dicha secuencia de región variable de cadena ligera se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida que presenta una identidad de por lo menos 80% respecto a la secuencia SEC ID n° 10 o n° 12.
78. Inmunoconj ugado según la reivindicación 77, en el que dicha secuencia de región variable de cadena ligera se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida SEC ID n° 10 o n° 12.
79. Inmunoconj ugado según la reivindicación 28, en el que dicho primer y segundo grupos de unión a antigeno son específicos para el dominio A2 de la tenascina (TNC-A2) .
80. Inmunoconj ugado según la reivindicación 29, en el que dicho primer y segundo grupos de unión a antígeno son específicos para el dominio A2 de la tenascina (TNC-A2) .
81. Inmunoconj ugado según la reivindicación 79 ó 80, en el que dicho inmunoconj ugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 7, SEC ID n° 179, SEC ID n° 183, SEC ID n° 187, SEC ID n° 191, SEQ ID NO:195, SEC ID n° 199, SEC ID n° 203 y SEC ID n° 207.
82. Inmunoconj ugado según la reivindicación 79 ó 80, en el . que dicho inmunoconj ugado comprende una secuencia de región variable de cadena ligera seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 3, SEC ID n° 5, SEC ID n° 177, SEC ID n° 181, SEC ID n° 185, SEQ ID NO:189, SEC ID n° 193, SEC ID n° 197, SEC ID n° 201 y SEC ID n° 205.
83. Inmunoconj ugado según la reivindicación 81, en el que dicho inmunoconj ugado comprende además una secuencia de región variable de cadena ligera seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 3, SEC ID n° 5, SEC ID n° 177, SEC ID n° 181, SEC ID n° 185, SEQ ID n° 189, SEC ID n° 193, SEC ID n° 197, SEC ID n° 201 y SEC ID n° 205.
84. Inmunoconj ugado según la reivindicación 81, en el que dicha secuencia de región variable de cadena pesada se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida que presenta una identidad de por lo menos 80% respecto a una secuencia seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 8, SEC ID n° 180, SEC ID n° 184, SEC ID n° 188, SEC ID n° 192, SEC ID n° 196, SEC ID n° 200, SEC ID n° 204 y SEC ID n° 208.
85. Inmunoconj ugado según la reivindicación 84, en el que dicha secuencia de región variable de cadena pesada se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 8, SEC ID n° 180, SEC ID n° 184, SEC ID n° 188, SEC ID n° 192, SEC ID n° 196, SEC ID n° 200, SEC ID n° 204 y SEC ID n° 208.
86. Inmunoconj ugado según la reivindicación 82, en el que dicha secuencia de región variable de cadena ligera se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida que presenta una identidad de por lo menos 80% respecto a una secuencia seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 4, SEC ID n° 6, SEC ID n° 178, SEC ID n° 182, SEC ID n° 186, SEC ID n° 190, SEC ID n° 194, SEC ID n° 198, SEC ID n° 202 y SEC ID n° 206.
87. Inmunoconj ugado según la reivindicación 86, en el que dicha secuencia de región variable de cadena ligera se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 4, SEC ID n° 6, SEC ID n° 178, SEC ID n° 182, SEC ID n° 186, SEC ID n° 190, SEC ID n° 194, SEC ID n° 198, SEC ID n° 202 y SEC ID n° 206.
88. Inmunoconj ugado según la reivindicación 79, en el que dicho inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptidica seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° SEC ID n° 239, SEC ID n° 241 y SEC ID n° 243.
89. Inmunoconj ugado según la reivindicación 79, en el que dicho inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptidica codificada por un polinucleótido que presenta una identidad de por lo menos 80% respecto a una secuencia seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 240, SEC ID n° 242 y SEC ID n° 244.
90. Inmunoconj ugado según la reivindicación 89, en el que dicho inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptidica codificada por una secuencia polinucleótida seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 240, SEC ID n° 242 y SEC ID n° 244.
91. Inmunoconj ugado según la reivindicación 79 ó 80, en el que dicho inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptidica seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 245, SEC ID n° 247 y SEC ID n° 249.
92.. Inmunoconjugado según la reivindicación 79 ó 80, en el que dicho inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptidica codificada por un polinucleótido que presenta una secuencia que presenta una identidad de por lo menos 80% respecto a una secuencia seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 246, SEC ID n° 248 y SEC ID n° 250.
93. Inmunoconj ugado según la reivindicación 92, en el que dicho inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptidica codificada por una secuencia polinucleótida seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 246, SEC ID n° 248 y SEC ID n° 250.
94. Inmunoconj ugado según las reivindicaciones 88 a 90, en el que dicho inmunoconjugado comprende además una secuencia polipeptidica seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 245, SEC ID n° 247 y SEC ID n° 249.
95. Inmunoconj ugado según la reivindicación 28, en el que dicho primer y segundo grupos de unión a antigeno son específicos para la proteína activada por fibroblastos (FAP) .
96. Inmunoconjugado según la reivindicación 29, en el que dicho primer y segundo grupos de unión a antígeno son específicos para la proteína activada por fibroblastos (FAP).
97. Inmunoconjugado según la reivindicación 95 ó 96, en el que dicho inmunoconj ugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID n° 21, SEC ID n° 25, SEC ID n° 27, SEC ID n° 31, SEC ID n° 35, SEC ID n° 39, SEC ID n° 43, SEC ID n° 47, SEC ID n° 51, SEC ID n° 69, SEC ID n° 73, SEC ID n° 77, SEC ID n° 81, SEC ID n° 85, SEC ID n° 89, SEC ID n° 93, SEC ID n° 123, SEC ID n° 127, SEC ID n° 131, SEC ID n° 135, SEC ID n° 139, SEC ID n° 143, SEC ID n° 147, SEC ID n° 151, SEC ID n° 155, SEC ID n° 159, SEC ID n° 163, SEC ID n° 167, SEC ID n° 171 y SEC ID n° 175.
98. Inraunoconjugado según la reivindicación 95 ó 96, en el que dicho inmunoconj ugado comprende una secuencia de región variable de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID n° 17, SEC ID n° 19, SEC ID n° 23, SEC ID n° 29, SEC ID n° 33, SEC ID n° 37, SEC ID n° 41, SEC ID n° 45, SEC ID n° 49, SEC ID n° 67, SEC ID n° 71, SEC ID n° 75, SEC ID n° 79, SEC ID n° 83, SEC ID n° 87, SEC ID n° 91, SEC ID n° 121, SEC ID n° 125, SEC ID n° 129, SEC ID n° 133, SEC ID n° 137, SEC ID n° 141, SEC ID n° 145, SEC ID n° 149, SEC ID n° 153, SEC ID n° 157, SEC ID n° 161, SEC ID n° 165, SEC ID n° 169 y SEC ID n° 173.
99. Inmunoconj ugado según la reivindicación 97, en el que dicho inmunoconj ugado comprende además una secuencia de región variable de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID n° 17, SEC ID n° 19, SEC ID n° 23, SEC ID n° 29, SEC ID n° 33, SEC ID n° 37, SEC ID n° 41, SEC ID n° 45, SEC ID n° 49, SEC ID n° 67, SEC ID n° 71, SEC ID n° 75, SEC ID n° 79, SEC ID n° 83, SEC ID n° 87, SEC ID n° 91, SEC ID n° 121, SEC ID n° 125, SEC ID n° 129, SEC ID n° 133, SEC ID n° 137, SEC ID n° 141, SEC ID n° 145, SEC ID n° 149, SEC ID n° 153, SEC ID n° 157, SEC ID n° 161, SEC ID n° 165, SEC ID n° 169 y SEC ID n° 173. 5
100. Inmunoconj ugado según la reivindicación 97, en el que dicha secuencia de región variable de cadena pesada se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida que presenta una identidad de por lo menos 80% respecto a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC 10 ID n° 22, SEC ID n° 26, SEC ID n° 28, SEC ID n° 32, SEC ID n° 36, SEC ID n° 40, SEC ID n° 44, SEC ID n° 48, SEC ID n° 52, SEC ID n° 70, SEC ID n° 74, SEC ID n° 78, SEC ID n° 82, SEC ID n° 86, SEC ID n° 90, SEC ID n° 94, SEC ID n° 124, SEC ID n° 128, SEC ID n° 132, SEC ID n° 136, SEC ID n° 140, SEC ID n° 144, SEC ID n° 148, SEC ID n° 152, SEC ID n° 156, SEC ID b n° 160, SEC ID n° 164, SEC ID n° 168, SEC ID n° 172 y SEC ID n° 176.
101. Inmunoconj ugado según la reivindicación 100, en el que dicha secuencia de región variable de cadena pesada se 20 encuentra codificada por una secuencia polinucleótida seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID n° 22, SEC ID n° 26, SEC ID n° 28, SEC ID n° 32, SEC ID n° 36, SEC ID n° 40, SEC ID n° 44, SEC ID n° 48, SEC ID n° 52, SEC ID n° 70, SEC ID n° 74, SEC ID n° 78, SEC ID n° 82, SEC ID n° 86, 25 SEC ID n° 90, SEC ID n° 94, SEC ID n° 124, SEC ID n° 128, SEC ID n° 132, SEC ID n° 136, SEC ID n° 140, SEC ID n° 144, SEC ID n° 148, SEC ID n° 152, SEC ID n° 156, SEC ID n° 160, SEC ID n° 164, SEC ID n° 168, SEC ID n° 172 y SEC ID n° 176.
102. Inmunoconjugado según la reivindicación 98, en el que dicha secuencia de región variable de cadena ligera se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida que presenta una identidad de por lo menos 80% respecto a una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID n° 18, SEC ID n° 20, SEC ID n° 24, SEC ID n° 30, SEC ID n° 34, SEC ID n° 38, SEC ID n° 42, SEC ID n° 46, SEC ID n° 50, SEC ID n° 68, SEC ID n° 72, SEC ID n° 76, SEC ID n° 80, SEC ID n° 84, SEC ID n° 88, SEC ID n° 92, SEC ID n° 122, SEC ID n° 126, SEC ID n° 130, SEC ID n° 134, SEC ID n° 138, SEC ID n° 142, SEC ID n° 146, SEC ID n° 150, SEC ID n° 154, SEC ID n° 158, SEC ID n° 162, SEC ID n° 166, SEC ID n° 170 y SEC ID n° 174.
103. Inmunoconj ugado según la reivindicación 102, en el que dicha secuencia de región variable de cadena ligera se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID n° 18, SEC ID n° 20, SEC ID n° 24, SEC ID n° 30, SEC ID n° 34, SEC ID n° 38, SEC ID n° 42, SEC ID n° 46, SEC ID n° 50, SEC ID n° 68, SEC ID n° 72, SEC ID n° 76, SEC ID n° 80, SEC ID n° 84, SEC ID n° 88, SEC ID n° 92, SEC ID n° 122, SEC ID n° 126, SEC ID n° 130, SEC ID n° 134, SEC ' ID n° 138, SEC ID n° 142, SEC ID n° 146, SEC ID n° 150, SEC ID n° 154, SEC ID n° 158, SEC ID n° 162, SEC ID n° 166, SEC ID n° 170 y SEC ID n° 174.
104. Inmunoconj ugado según la reivindicación 95, en el que dicho inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptidica seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 209, SEC ID n° 211, SEC ID n° 213, SEC ID n° 217, SEC ID n° 219, SEC ID n° 221, SEC ID n° 223, SEC ID n° 225 y SEC ID n° 227.
105. Inmunoconjugado según la reivindicación 95, en el que dicho inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptidica codificada por un polinucleótido que presenta una identidad de por lo menos 80% respecto a una secuencia seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 210, SEC ID n° 212, SEC ID n° 214, SEC ID n° 218, SEC ID n° 220, SEC ID n° 222, SEC ID n° 224, SEC ID n° 226 y SEC ID n° 228.
106. Inmunoconjugado según la reivindicación 105, en el que dicho inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptidica codificada por una secuencia polinucleótida seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 210, SEC ID n° 212, SEC ID n° 214, SEC ID n° 218, SEC ID n° 220, SEC ID n° 222, SEC ID n° 224, SEC ID n° 226 y SEC ID n° 228.
107. Inmunoconjugado según la reivindicación 95 ó 96, en el que dicho inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptidica seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 229, n° SEC ID n° 231, SEC ID n° 233 y SEC ID n° 237.
108. Inmunoconj ugado según la reivindicación 95 ó 96, en el que dicho inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptidica codificada por una secuencia polinucleótida que presenta una identidad de por lo menos 80% respecto a una secuencia seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 230, SEC ID n° 232, SEC ID n° 234 y SEC ID n° 238.
109. Inmunoconj ugado según la reivindicación 108, en el que dicho inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptidica codificada por una secuencia polinucleótida seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 230, SEC ID n° 232, SEC ID n° 234 y SEC ID n° 238.
110. Inmunoconj ugado según la reivindicación 95, en el que dicho inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptidica seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 211, SEC ID n° 219 y SEC ID n° 221, y una secuencia polipeptidica SEC ID n° 231.
111. Inmunoconj ugado según la reivindicación 95, en el que dicho inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptidica seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 209, SEC ID n° 223, SEC ID n° 225 y SEC ID n° 227, y una secuencia polipeptidica SEC ID n° 229.
112. Inmunoconj ugado según la reivindicación 95, en el que dicho inmunoconj ugado comprende la secuencia polipeptidica SEC ID n° 213 y la secuencia polipeptidica SEC ID n° 233.
113. Inmunoconj ugado según la reivindicación 95, en el que dicho inmunoconjugado comprende la secuencia polipeptidica SEC ID n° 217 y la secuencia polipeptidica SEC ID n° 237.
114. Inmunoconj ugado según la reivindicación 28, en el que dicho primer y segundo grupos de unión a, antigeno son específicos para el proteoglicano condroitin sulfato del melanoma (MCSP) .
115. Inmunoconj ugado según la reivindicación 29, en el que dicho primer o dicho segundo grupo de unión a antígeno son específicos para el proteoglicano condroitin sulfato del melanoma (MCSP) .
116. Inmunoconj ugado según la reivindicación 114 ó 115, en el que dicho inmunoconj ugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada SEC ID n° 257 o SEC ID n° 261.
117. Inmunoconj ugado según la reivindicación 114 ó 115, en el que dicho inmunoconj ugado comprende una secuencia de región variable de cadena ligera SEC ID n° 259 o SEC ID n° 271.
118. Inmunoconj ugado según la reivindicación 116, en el que dicho inmunoconj ugado comprende además una secuencia de región variable de cadena ligera SEC ID n° 259 o SEC ID n° 271.
119. Inmunoconj ugado según la reivindicación 116, en el que dicha secuencia de región variable de cadena pesada se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida que presenta una identidad de por lo menos 80% respecto a la secuencia SEC ID n° 258 o n° 262.
120. Inmunoconjugado según la reivindicación 119, en el que dicha secuencia de región variable de cadena pesada se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida SEC ID n° 258 o n° 262.
121. Inmunoconjugado según la reivindicación 117, en el que dicha secuencia de región variable de cadena ligera se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida que presenta una identidad de por lo menos 80% respecto a la secuencia SEC ID n° 260 o n° 272.
122. Inmunoconjugado según la reivindicación 121, en el que dicha secuencia de región variable de cadena ligera se encuentra codificada por una secuencia polinucleótida SEC ID n° 260 o n° 272.
123. Inmunoconj ugado según la reivindicación 114, en el que dicho inmunoconjugado comprende la secuencia polipeptidica SEC ID n° 251 o SEC ID n° 255.
124. Inmunoconj ugado según la reivindicación 114, en el que dicho inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptidica codificada por un polinucleótido que presenta una identidad de por lo menos 80% respecto a la secuencia SEC ID n° 252 o SEC ID n° 256.
125. Inmunocon ugado según la reivindicación 124, en el que dicho inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por la secuencia polinucleótida SEC ID n° 252 o SEC ID n° 256.
126. Inmunoconj ugado según la reivindicación 114 ó 115, en el que dicho inmunoconj ugado comprende la secuencia polipeptídica SEC ID n° 253 o SEC ID n° 265.
127. Inmunoconjugado según la reivindicación 114 ó 115, en el que dicho inmunoconjugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por una secuencia polinucleótida que presenta una identidad de por lo menos 80% respecto a la secuencia SEC ID n° 254 o SEC ID n° 266.
128. Inmunoconjugado según la reivindicación 127, en el que dicho inmunoconj ugado comprende una secuencia polipeptídica codificada por la secuencia polinucleótida SEC ID n° 254 o SEC ID n° 266.
129. Inmunoconj ugado según la reivindicación 123 a 125, en el que dicho inmunoconjugado comprende además la secuencia polipeptídica SEC ID n° 253 o SEC ID n° 265.
130. Inmunoconj ugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, en el que las regiones variables de dicho primer y segundo grupos de unión a antígeno son específicos para un antígeno de superficie celular de una célula de cáncer o de una célula infectada por virus o para una molécula de ECM expresada en un tumor.
131. Inmunoconj ugado según la reivindicación 130, en el que dicho antigeno de superficie celular es un antigeno asociado a tumor o un antigeno vírico.
132. Inmunoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el que dicho inmunoconjugado presenta únicamente un grupo efector, y en el que dicho grupo efector es una citoquina.
133. Inmunocon ugado según la reivindicación 132, en el que dicha citoquina se selecciona de entre el grupo que consiste de: interleuquina-2 (IL-2), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (G -CSF) , interferón- á (INF-á) e interleuquina-12 (IL-12) .
134. Inmunoconj ugado según la reivindicación 133, en el que dicha citoquina es IL-2.
135. Inmunoconj ugado según la reivindicación 133, en el que dicha citoquina es IL-12.
136. Inmunoconj ugado según cualquiera de las reivindicaciones 132 a 135, en el que dicha citoquina induce una respuesta citotóxica por parte de células que portan un receptor para dicha citoquina.
137. Inmunoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 132 a 135, en el que dicha citoquina induce una respuesta proliferativa por parte de células que portan un receptor para dicha citoquina.
138. Inmunoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 10 a 26, en el que dicho inmunocon ugado presenta únicamente dos grupos efectores, y en el que dichos grupos efectores son citoquinas.
139. Inmunoconjugado según la reivindicación 138, en el que cada una de dichas citoquinas se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste de: IL-2, GM-CSF, INF-á, and IL-12.
140. Inmunoconj ugado según la reivindicación 139, en el que dicha citoquina es IL-2.
141. Inmunoconjugado según la reivindicación 139, en el que dicha citoquina es IL-12.
142. Inmunoconj ugado según cualquiera de las reivindicaciones 138 a 141, en el que dichas citoquinas induce una respuesta citotóxica por parte de células que4 portan receptores para dichas citoquinas.
143. Inmunoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 138 a 141, en el que dichas citoquinas inducen una respuesta proliferativa por parte de células que portan receptores para dichas citoquinas.
144. Inmunoconj ugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 143, en el que dicho inmunoconj ugado se une a un receptor de grupo efector con una constante de disociación (KD) que es por lo menos 2 veces mayor que la de un grupo efector de control.
145. Inmunoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 144, en el que dicho inmunoconj ugado inhibe un incremento del volumen tumoral in vivo en por lo menos 30% al final de un periodo de administración.
146. Polinucleótido aislado codificante de un fragmento del inmunoconjugado según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho polinucleótido codifica las cadenas pesadas de dichos primer y segundo grupos de unión a antigeno y dicho primer grupo efector.
147. Polinucleótido aislado codificante de un fragmento del inmunoconj ugado según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho polinucleótido codifica las cadenas ligeras de dichos primer y segundo grupos de unión a antigeno y dicho primer grupo efector.
148. Polinucleótido aislado codificante de un fragmento del inmunoconj ugado según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho polinucleótido codifica una cadena ligera de dicho primer grupo de unión a antigeno, una cadena pesada de dicho segundo grupo de unión a antigeno y dicho primer grupo efector .
149. Polinucleótido aislado codificante de un fragmento del inmunocon ugado según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, en el que dicho polinucleótido codifica las cadenas pesadas de dicha primera y segunda moléculas de Fab y de dicho grupo efector.
150. Polinucleótido aislado codificante de un fragmento del inmunoconj ugado según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, en el que dicho polinucleótido codifica las cadenas ligeras de dicha primera y segunda moléculas de Fab y de dicho grupo efector.
151. Polinucleótido aislado codificante de un fragmento del inmunoconj ugado según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, en el que dicho polinucleótido codifica una cadena ligera de dicha primera molécula de Fab, una cadena pesada de dicho segunda molécula de Fab y dicho grupo efector.
152. Polinucleótido aislado codificante del inmunoconj ugado según la reivindicación 9.
153. Polinucleótido aislado codificante de un fragmento del inmunoconj ugado según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 20, en el que el inmunoconj ugado presenta únicamente un grupo efector, y en el que dicho polinucleótido codifica uno de dichos grupos de unión a antigeno y dicho grupo efector.
154. Polinucleótido aislado codificante de un fragmento del inmunoconj ugado según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 21, en el que el inmunoconj ugado presenta dos grupos efectores, y en el que dicho polinucleótido codifica uno de dichos grupos de unión a antigeno y uno de dichos grupos efectores .
155. Polinucleótido aislado codificante de un fragmento del inmunoconj ugado según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26, en el que dicho polinucleótido comprende una secuencia codificante de la región variable de cadena pesada de dicho primer grupo de unión a' antigeno y dicho primer grupo efector.
156. Polinucleótido aislado codificante de un fragmento del inmunoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26, en el que dicho polinucleótido comprende una secuencia codificante de la región variable de cadena ligera de dicho primer grupo de unión a antigeno y de dicho primer grupo efector.
157. Cásete de expresión que comprende la secuencia polinucleótida según cualquiera de las reivindicaciones 146 a 156.
158. Vector de expresión que comprende el cásete de expresión según la reivindicación 157.
159. Célula huésped que comprende el vector de expresión según la reivindicación 158.
160. Célula huésped según la reivindicación 159, definida adicionalmente como una célula huésped procariótica .
161. Célula . huésped según la reivindicación 159, definida adicionalmente como una célula huésped eucariótica.
162. Método para producir el inmunocon ugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 145, en el que el método comprende cultivar la célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 159 a 161 bajo condiciones adecuadas para la expresión del inmunoconjugado .
163. Método para estimular la proliferación y la diferenciación en un linfocito T activado, que comprende poner en contacto un linfocito T activado con una cantidad eficaz del inmunoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 145.
164. Método según la reivindicación 163, en el que dicho inmunoconj ugado induce la actividad de células T citotóxicas (CTL) .
165. Método para estimular la proliferación y la diferenciación de un linfocito B activado, que comprende poner en contacto un linfocito B activado con una cantidad eficaz del inmunoconj ugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 134, 136 a 140 ó 142 a 145.
166. Método para estimular la proliferación y la diferenciación de una célula asesina natural (NK) , que comprende poner en contacto una célula NK con una cantidad eficaz del inmunoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 145.
167. Método según la reivindicación 166, en el que dicho inmunoconj ugado induce citotoxicidad antitumoral de NK/células asesinas activadas por linfoquinas (LAK) .
168. Método según cualquiera de las reivindicaciones 163 a 167, en el que por lo menos un grupo efector de dicho inmunoconj ugado es IL-2.
169. Método para estimular la proliferación y la diferenciación de un granulocito, un monocito o una célula dendritica, que comprende poner en contacto un granulocito, un monocito o una célula dendritica con una cantidad eficaz del inmunoconj ugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 133, 137 a 139 ó 143 a 145.
170. Método según la reivindicación 169, en el que por lo menos un grupo efector de dicho inmunoconj ugado es GM-CSF.
171. Método para estimular la proliferación y la diferenciación de los linfocitos T activados, que comprende poner en contacto un linfocito T activado con una cantidad eficaz del inmunoconj ugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 145.
172. Método según cualquiera de las reivindicaciones 163, 166 ó 171, en el que por lo menos un grupo efector de dicho inmunoconj ugado es IL-12.
173. Método para inhibir la replicación vírica, que comprende poner en contacto una célula infectada por un virus con una cantidad eficaz del inmunoconj ugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 133, 138, 139, 144 ó 145.
174. Método para regular positivamente la expresión del complejo mayor de histocompatibilidad I (MHC I) , que comprende poner en contacto una célula con una cantidad eficaz del inmunoconj ugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 133, 138, 139, 144 ó 145.
175. Método según cualquiera de las reivindicaciones 173 ó 174, en el que por lo menos un grupo efector de dicho inmunoconjugado es IFN-á.
176. Método para inducir la muerte celular, que comprende administrar en una célula una cantidad eficaz del inmunoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 132, 136, 138, 142, 144 ó 145.
177. Método según la reivindicación 176, en el que dicho inmunoconjugado es especifico para EDB.
178. Método según la reivindicación 176, en el que dicho inmunoconjugado es especifico para TNC-Al.
179. Método según la reivindicación 176, en el que dicho inmunoconjugado es especifico para TNC-A2.
180. Método según la reivindicación 176, en el que dicho inmunoconjugado es especifico para MCSP.
181. Método según la reivindicación 176, en el que el grupo efector de dicho inmunoconjugado se selecciona de entre el grupo que consiste de: IL-2, factor-á de necrosis tumoral (TNF-OÍ) y factor-ß de necrosis tumoral (TNF-ß)
182'. Método según la reivindicación 181, en el que dicho grupo efector es IL-2.
183. Método para inducir la quimiotaxis en una célula diana, que comprende administrar en una célula diana una cantidad eficaz del inmunoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 132, 138, 144 ó 145.
184. Inmunoconjugado según la reivindicación 183, en el que el grupo efector de dicho inmunoconjugado se selecciona de entre el grupo que consiste de: interleuquina-8 (IL-8), proteina-lá inflamatoria de macrófagos (???-?a) , proteina-?ß inflamatoria de macrófagos (MIP-?ß) y factor ß de crecimiento transformante (TGF-ß) .
185. Método según cualquiera de las reivindicaciones 163 a 184, en el que dicha célula se encuentra presente in vivo.
186. Método para tratar una enfermedad en un individuo, que comprende las etapas de administrar en dicho individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende el inmunoconj ugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 145.
187. Método según la reivindicación 186, en el que dicha enfermedad es cáncer.
188. Método según la reivindicación 186 ó 187, en el que dicho inmunoconj ugado es especifico para EDB.
189. Método según la reivindicación 186 ó 187, en el que dicho inmunoconj ugado es especifico para TNC-Al.
190. Método según la reivindicación 186 ó 187, en el que dicho inmunoconj ugado es especifico para TNC-A2.
191. Método según la reivindicación 186 ó 187, en el que dicho inmunoconj ugado es especifico para FAP.
192. Método según la reivindicación 186 ó 187, en el que dicho inmunoconjugado es especifico para MCSP.
193. Método según cualquiera de las reivindicaciones 186 a 192, en el que dicho inmunoconj ugado comprende IL-2.
194. Método según cualquiera de las reivindicaciones 186 a 193, en el que dicha composición se administra por via intravenosa, intradérmica, intraarterial , intraperitoneal , intralesional, intracraneal, intraprostática, intraesplénica, intrarrenal, intrapleural , intratraqueal, intranasal, intravitrea, intravaginal, intrarrectal, tópica, intratumoral, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, subconj untival , intravesicular, mucosal, intrapericárdica, intraumbilical, intraocular, oral, tópica, local, mediante inhalación, mediante inyección, mediante infusión, mediante infusión continua, mediante perfusión localizada bañando las células diana directamente, mediante un catéter, mediante un lavado, en una crema o en una composición de lipidos.
195. Composición que comprende el inmunoconj ugado según cualquiera de- las reivindicaciones 1 a 145 y un portador farmacéutico .
196. Inmunoconj ugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 145 o la composición según la reivindicación 195 para la utilización en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad en un paciente que necesita el mismo.
197. Método según la reivindicación 196, en el que dicha enfermedad es cáncer.
198. Utilización del inmunoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 145 o de la composición según la reivindicación 195, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad en un paciente que necesita el mismo.
199. Utilización según la reivindicación 198, en la que dicha enfermedad es cáncer.
200. Inmunoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 145 para el tratamiento de una enfermedad en una paciente que necesita el mismo.
201. Inmunoconjugado según la reivindicación 200, en el que dicha enfermedad es cáncer.
202. Invención según se ha descrito anteriormente en la presente memoria.
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