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MX2011007833A - Polipeptidos fc estabilizados con funcion efectora reducida y metodos de uso. - Google Patents

Polipeptidos fc estabilizados con funcion efectora reducida y metodos de uso.

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MX2011007833A
MX2011007833A MX2011007833A MX2011007833A MX2011007833A MX 2011007833 A MX2011007833 A MX 2011007833A MX 2011007833 A MX2011007833 A MX 2011007833A MX 2011007833 A MX2011007833 A MX 2011007833A MX 2011007833 A MX2011007833 A MX 2011007833A
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MX
Mexico
Prior art keywords
polypeptide
stabilized
region
binding
amino acid
Prior art date
Application number
MX2011007833A
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English (en)
Inventor
Eric Chan
Scott Glaser
Ellen Garber
Stephen Demarest
Brian Robert Miller
Christopher L Reyes
Frederick R Taylor
Original Assignee
Biogen Idec Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biogen Idec Inc filed Critical Biogen Idec Inc
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Abstract

La invención proporciona un método para producir polipéptidos que contienen Fc, tales como anticuerpos, que tienen regiones Fc estabilizadas. La invención proporciona también polipéptidos Fc estabilizados producidos de acuerdo con estos métodos así como métodos para usar tales anticuerpos como compuestos terapéuticos.

Description

POLIPEPTIDOS FC ESTABILIZADOS CON FUNCION EFECTORA REDUCIDA Y METODOS DE USO Antecedentes de la Invención La respuesta inmunitaria adquirida es un mecanismo por el cual el cuerpo se defiende a sí mismo contra los organismos extraños que lo invaden y causan infecciones o enfermedades. Un mecanismo se basa en la capacidad de los anticuerpos producidos o administrados al hospedador de unir el antígeno a través de su región variable. Una vez que se une el antígeno por el anticuerpo, se fija el antígeno como diana para su destrucción, mediada a veces, al menos en parte, por la región constante o la región Fe del anticuerpo.
Existen varias funciones o actividades efectoras mediadas por la región Fe de un anticuerpo. Una función efectora es la capacidad de unir proteínas del complemento que puedan ayudar en la lisis del antígeno diana, por ejemplo, un patógeno celular, en un proceso llamado citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) . Otra actividad efectora de Ia región Fe es unirse a los receptores Fe (por ejemplo, FcyRs) sobre la superficie de inmunocitos o las llamadas células efectoras, que tienen la capacidad de disparar otros efectos inmunitarios . Estos efectos inmunitarios (por ejemplo, citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) y fagocitosis celular dependiente del anticuerpo (ADCP) ) actúan REF: 222305 en la remoción de patógenos/antígenos, por ejemplo, liberando los activadores inmunitarios y regulando la producción de anticuerpos, endocitosis, fagocitosis y destrucción de células. En algunas solicitudes clínicas estas respuestas son cruciales para la eficacia del anticuerpo, mientras que en otros casos provocan efectos colaterales no deseados. Un ejemplo de un efecto colateral mediado por efector es la liberación de citocinas inflamatorias que causan fiebre aguda. Otro ejemplo es la eliminación a largo plazo de las células que portan antígenos.
Se puede evitar la función efectora de un anticuerpo mediante el uso de fragmentos de anticuerpos que no tengan la región Fe (por ejemplo, tal como un Fab, F(ab' )2 o Fv (scFv) de cadena simple) . Sin embargo, estos fragmentos tienen semividas reducidas debido a la rápida depuración a través de los ríñones. En el caso de los fragmentos Fab y scFv, tienen únicamente un sitio de unión al antígeno en lugar de dos, lo que puede comprometer cualquier ventaja debido a la avidez de unión, y pueden presentar desafíos en su fabricación.
Enfoques alternativos tienen como objetivo reducir las funciones efectoras de un anticuerpo de longitud completa mientras que retienen otros atributos valiosos de la región Fe (por ejemplo, semivida prolongada y heterodimerización) . Un enfoque para reducir la función efectora es la generación de los llamados anticuerpos aglicosilados eliminando los azúcares que están unidos a residuos particulares en la región Fe. Los anticuerpos aglicosilados pueden generarse, por ejemplo, retirando o alterando el residuo al que está unido el azúcar, retirando enzimáticamente los azúcares, produciendo el anticuerpo en células cultivadas en presencia de un inhibidor de glicosilación o expresando el anticuerpo en células que no pueden glicosilar proteínas (por ejemplo, células hospederas bacterianas) . Otro enfoque es utilizar regiones Fe a partir de un anticuerpo IgG4 , en lugar de IgGl . Se sabe que los anticuerpos IgG4 se caracterizan por tener niveles más bajos de activación del complemento y citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo que IgGl.
A pesar de las ventajas de estos enfoques alternativos, está bien establecido que la remoción de los oligosacáridos de la región Fe del anticuerpo tiene efectos adversos importantes en su conformación y estabilidad. De manera adicional, los anticuerpos IgG4 tienen menor estabilidad en general dado que el dominio CH3 del IgG4 no tiene estabilidad comparable al dominio CH3 de IgGl. En todos los casos, la pérdida de estabilidad o la estabilidad disminuida del anticuerpo pueden presentar pruebas de desarrollo del proceso ocasionando de manera adversa el desarrollo de fármacos del anticuerpo.
Por consiguiente, existe una necesidad de anticuerpos mejorados y otros polipéptidos que contienen Fe con función efectora reducida o alterada y estabilidad mejorada y de métodos para realizar estas moléculas.
Breve Descripción de la Invención La invención resuelve los problemas de los anticuerpos sin efectores de la técnica previa, efectivamente cualquier proteína sin efectores que contiene Fe, proporcionando métodos mejorados para potenciar la estabilidad de una región Fe. Por ejemplo, la invención proporciona polipéptidos Fe genéticamente modificados por estabilidad, por ejemplo, anticuerpos IgG estabilizados u otras moléculas de unión que contienen Fe, que comprenden aminoácidos estabilizadores en la región Fe del polipéptido. En una modalidad, la invención proporciona un método para la introducción de mutaciones en posiciones de residuos de aminoácidos específicas en la región Fe de un polipéptido Fe principal, lo que da como resultado la estabilidad potenciada de la región Fe. De preferencia, los polipéptidos Fe estabilizados tienen una función efectora alterada o reducida (en comparación con un polipéptido que no comprende el o los aminoácidos estabilizadores) y presenta estabilidad potenciada en comparación con el polipéptido Fe principal.
Por consiguiente, la invención presenta varias ventajas que incluyen, pero no se limitan a, lo siguiente: proporcionar polipéptidos Fe aglicosilados estabilizados que comprenden regiones Fe aglicosiladas estabilizadas, por ejemplo, proteínas de fusión estabilizadas o anticuerpos IgG aglicosilados , adecuados como compuestos terapéuticos debido a su función efectora reducida; proporcionar polipéptidos Fe estabilizados que comprenden regiones Fe que se derivan de anticuerpos IgG4 , por ejemplo, proteínas de fusión o anticuerpos IgG4 aglicosilados o glicosilados estabilizados, adecuados como compuestos terapéuticos debido a su función efectora reducida; - un método eficaz para la producción de polipéptidos Fe estabilizados con alteraciones mínimas al polipéptido (por ejemplo, introduciendo cambios en un polipéptido principal no estabilizado o expresando una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido Fe estabilizado) ; un método para potenciar la estabilidad de un polipéptido Fe mientras se evita todo aumento en la inmunogenicidad y/o función efectora; - métodos para potenciar la adaptabilidad, fabricación y/o estabilidad a largo plazo de un polipéptido Fe y - métodos para tratar un sujeto que necesita terapia con un polipéptido Fe estabilizado de la invención.
En un aspecto, la invención se refiere a un polipéptido estabilizado que comprende una región Fe quimérica, donde el polipéptido estabilizado comprende al menos un dominio constante derivado de un anticuerpo IgG4 humano y al menos un dominio constante derivado de un anticuerpo IgGl humano.
En una modalidad, la región Fe es una región Fe glicosilada .
En una modalidad, la región Fe es una región Fe aglicosilada .
En una modalidad, la región Fe es una región Fe aglicosilada que comprende una glutamina (Q) en la posición 297 o una alanina (A) en la posición 299 de la región Fe (convención de numeración UE) .
En otro aspecto, la invención se refiere a un polipéptido estabilizado que comprende una región Fe aglicosilada, donde el polipéptido estabilizado comprende uno o más aminoácidos Fe estabilizados en una o más posiciones de aminoácidos en al menos un resto Fe de la región Fe, donde las posiciones de aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste en 297, 299, 307, 309, 399, 409 y 427 (convención de numeración UE) .
En una modalidad, la región Fe quimérica comprende un dominio CH2 de un anticuerpo IgG del isotipo IgG4 y un dominio CH3 de un anticuerpo IgG del isotipo IgGl.
En una modalidad, la región Fe quimérica comprende un dominio bisagra, CH1 y CH2 de un anticuerpo IgG del isotipo IgG4 y un dominio CH3 de un anticuerpo IgG del isotipo IgGl, y donde el anticuerpo comprende una prolina en la posición de aminoácidos 228, numeración UE .
En otro aspecto, la invención se refiere a un polipéptido estabilizado que comprende un resto CH2 de una región Fe de un anticuerpo IgG4 , donde el polipéptido estabilizado comprende uno o más aminoácidos estabilizadores en una o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en 240F, 262L, 264T, 266F, 297Q, 299A, 299K, 307P, 309K, 309M, 309P, 323F, 399S y 427F (Convención de Numeración UE) .
En una modalidad, una polipéptido estabilizado comprende un Gln en la posición de aminoácidos 297.
En un aspecto, la invención se refiere a un polipéptido estabilizado que comprende un resto CH2 de una región Fe de un anticuerpo IgGl, donde el polipéptido estabilizado comprende uno o más aminoácidos estabilizadores en una o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en 299K y 297D (Convención de Numeración UE) .
En una modalidad, un polipéptido estabilizado de la invención comprende un Lys en la posición de aminoácidos 299.
En una modalidad, un polipéptido estabilizado de la invención comprende un Lys en la posición de aminoácidos 299 y un Asp en la posición de aminoácidos 297.
En una modalidad, la región Fe es una región Fe aglicosilada .
En una modalidad, el anticuerpo IgG es un anticuerpo humano .
En una modalidad, la temperatura de fusión (Tm) del polipéptido estabilizado se potencia en al menos 1°C con relación al polipéptido principal que no tiene el aminoácido estabilizado .
En una modalidad, la temperatura de fusión (Tm) del polipéptido Fe estabilizado se potencia en aproximadamente 1°C o más, aproximadamente 2 °C o más, aproximadamente 3°C o más, aproximadamente 4 °C o más, aproximadamente 5 °C o más, aproximadamente 6 °C o más, aproximadamente 7 °C o más, aproximadamente 8 °C o más, aproximadamente 9°C o más, aproximadamente 10 °C o más, aproximadamente 15 °C o más y aproximadamente 20 °C o más.
En una modalidad, la temperatura de fusión (Tm) se potencia en un pH neutro (aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7.5) .
En otra modalidad, la temperatura de fusión (Tm) se potencia en un pH ácido de aproximadamente 6.5 o menos, aproximadamente 6.0 o menos, aproximadamente 5.5 o menos, aproximadamente 5.0 o menos, aproximadamente 4.5 o menos y aproximadamente 4.0 o menos .
En una modalidad, el polipéptido estabilizado se expresa en un rendimiento mayor con relación a un polipéptido principal que no tiene mutación estabilizadora .
En otra modalidad, el polipéptido Fe estabilizado se expresa en cultivo celular en un rendimiento de aproximadamente 5 mg/L o más, aproximadamente 10 mg/L o más, aproximadamente 15 mg/L o más, aproximadamente 20 mg/L o más.
En una modalidad, la turbidez del polipéptido estabilizado se reduce con relación al polipéptido principal que no tiene el aminoácido estabilizado.
En otra modalidad, la turbidez se reduce por un factor seleccionado del grupo que consiste en aproximadamente 1 vez o más, aproximadamente 2 veces o más, aproximadamente 3 veces o más, aproximadamente 4 veces o más, aproximadamente 5 veces o más, aproximadamente 6 veces o más, aproximadamente 7 veces o más, aproximadamente 8 veces o más, aproximadamente 9 veces o más, aproximadamente 10 veces o más, aproximadamente 15 veces 0 más, aproximadamente 50 veces o más y aproximadamente 100 veces o más .
En otra modalidad, el polipéptido estabilizado tiene una función efectora reducida en comparación con el polipéptido Fe principal que no tiene mutación estabilizadora .
En una modalidad, la función efectora reducida es actividad ADCC reducida.
En otra modalidad, la función efectora reducida es unión reducida a un receptor Fe (FcR) seleccionado del grupo que consiste en Fc/RI , Fc/RII y FcyRIII.
En una modalidad, la función efectora se reduce por un factor seleccionado del grupo que consiste en aproximadamente 1 vez o más, aproximadamente 2 veces o más, aproximadamente 3 veces o más , aproximadamente 4 veces o más , aproximadamente 5 veces o más, aproximadamente 6 veces o más, aproximadamente 7 veces o más, aproximadamente 8 veces o más, aproximadamente 9 veces o más, aproximadamente 10 veces o más, aproximadamente 15 veces o más, aproximadamente 50 veces o más y aproximadamente 100 veces o más.
En una modalidad, el polipéptido estabilizado tiene semivida potenciada en comparación con un polipéptido Fe principal .
En otra modalidad, la semivida potenciada sucede debido a la unión potenciada al receptor neonatal (FcRn) .
En una modalidad, la semivida se potencia por un factor seleccionado del grupo que consiste en aproximadamente 1 vez o más, aproximadamente 2 veces o más, aproximadamente 3 veces o más, aproximadamente 4 veces o más, aproximadamente 5 veces o más, aproximadamente 6 veces o más, aproximadamente 7 veces o más, aproximadamente 8 veces o más, aproximadamente 9 veces o más, aproximadamente 10 veces o más, aproximadamente 15 veces o más, aproximadamente 50 veces o más y aproximadamente 100 veces o más.
En una modalidad, la región Fe es una región Fe dimérica.
En otra modalidad, la región Fe es una región Fe de cadena simple.
En una modalidad, todos los restos Fe de la región Fe son aglicosilados .
En una modalidad, la región Fe aglicosilada comprende una sustitución en la posición 299 de la región Fe (convención de numeración UE) .
En otra modalidad, la región Fe aglicosilada se aglicosila como resultado de su producción en una célula hospedera bacteriana. En una modalidad, la región Fe aglicosilada se aglicosila como resultado de desglicosilación por medios enzimáticos o químicos. En una modalidad, la región Fe aglicosilada comprende un dominio bisagra quimérico.
En una modalidad, el dominio bisagra quimérico comprende una sustitución con residuo de prolina en la posición de aminoácidos 228 (convención de numeración UE) .
En una modalidad, el o los aminoácidos estabilizadores se seleccionan independientemente del grupo que consiste en (i) un aminoácido no cargado en la posición 297, (ii) un aminoácido cargado positivamente en la posición 299, (iii) un aminoácido polar en la posición 307, (iv) un aminoácido polar o cargado positivamente en la posición 309, (v) un aminoácido polar en la posición 399, (vi) un aminoácido polar o cargado positivamente en la posición 409 y (vii) un aminoácido polar en la posición 427.
En una modalidad, al menos un aminoácido estabilizador es un Gln en la posición de aminoácidos 297 (numeración UE) .
En una modalidad, al menos uno de los aminoácidos estabilizadores es una lisina (K) o tirosina (Y) en la posición 299.
En una modalidad, al menos uno de los aminoácidos estabilizadores es una prolina (P) o metionina (M) en la posición 307.
En una modalidad, al menos uno de los aminoácidos estabilizadores es una prolina (P) , metionina (M) o lisina (K) en la posición 309.
En una modalidad, al menos una de las mutaciones estabilizadoras es una serina (S) en la posición 399.
En una modalidad, al menos una de las mutaciones estabilizadoras es una fenilalanina (F) en la posición 240.
En una modalidad, al menos una de las mutaciones estabilizadoras es una leucina (L) en la posición 262.
En una modalidad, al menos una de las mutaciones estabilizadoras es una treonina (T) en la posición 264.
En una modalidad, al menos una de las mutaciones estabilizadoras es una fenilalanina (F) en la posición 266.
En una modalidad, al menos una de las mutaciones estabilizadoras es una fenilalanina (F) en la posición 323.
En una modalidad, al menos una de las mutaciones estabilizadoras es una lisina (K) o metionina (M) en la posición 409.
En una modalidad, al menos una de las mutaciones estabilizadoras es una fenilalanina (F) en la posición 427.
En una modalidad, un polipéptido estabilizado de la invención comprende dos o más mutaciones estabilizadoras que comprenden (i) una alanina (A) o lisina (K) en la posición 299 y (ii) una fenilalanina (F) en la posición 266.
En una modalidad, un polipéptido estabilizado de la invención comprende dos o más mutaciones estabilizadoras que comprenden (i) una alanina (A) o lisina ( ) en la posición 299 y (ii) una prolina (P) en la posición 307.
En una modalidad, un polipéptido estabilizado de la invención comprende dos o más mutaciones estabilizadoras que comprenden (i) una lisina (K) en la posición 299 y (ii) una serina (S) en la posición 399.
En una modalidad, un polipéptido estabilizado de la invención comprende dos o más mutaciones estabilizadoras que comprenden (i) una lisina (K) en la posición 299 y (ii) una fenilalanina (F) en la posición 427.
En una modalidad, un polipéptido estabilizado de la invención comprende tres o más mutaciones estabilizadoras que comprenden (i) una alanina (A) o lisina (K) en la posición 299, (ii) una leucina (L) en la posición 262 y (iii) una treonina (T) en la posición 264.
En una modalidad, un polipéptido estabilizado de la invención comprende tres o más mutaciones estabilizadoras que comprenden (i) una lisina (K) en la posición 299, (ii) una prolina (P) en la posición 307 y (iii) una serina (S) en la posición 399.
En una modalidad, un polipéptido estabilizado de la invención comprende tres o más mutaciones estabilizadoras que comprenden (i) una lisina (K) en la posición 299, (ii) una lisina (K) en la posición 309 y (iii) una serina (S) en la posición 399.
En una modalidad, un polipéptido estabilizado de la invención comprende tres o más mutaciones estabilizadoras que comprenden (i) una lisina (K) en la posición 299, (ii) una fenilalanina (F) en la posición 348 y (iii) una fenilalanina (F) en la posición 427.
En una modalidad, un polipéptido estabilizado de la invención comprende tres o más mutaciones estabilizadoras que comprenden (i) una lisina (K) en la posición 299, (ii) una serina (S) en la posición 399 y (iii) una fenilalanina (F) en la posición 427.
En una modalidad, un polipéptido estabilizado de la invención comprende cuatro o más mutaciones estabilizadoras que comprenden (i) una alanina (A) o lisina (K) en la posición 299, (ii) una leucina (L) en la posición 262, (iii) una treonina (T) en la posición 264 y (iv) una fenilalanina (F) en Ia posición 266.
En una modalidad, un polipéptido estabilizado de la invención comprende dos o más mutaciones estabilizadoras que comprenden (i) una prolina (P) en la posición 307 y (ii) una serina (S) en la posición 276.
En una modalidad, un polipéptido estabilizado de la invención comprende dos o más mutaciones estabilizadoras que comprenden (i) una prolina (P) en la posición 307 y (ii) una treonina (T) en la posición 286.
En una modalidad, un polipéptido estabilizado de la invención .comprende dos o más mutaciones estabilizadoras que comprenden (i) una prolina (P) en la posición 307 y (ii) una fenilalanina (F) en la posición 323.
En una modalidad, un polipéptido estabilizado de la invención comprende dos o más mutaciones estabilizadoras que comprenden (i) una prolina (P) en la posición 307 y (ii) una prolina (P) , lisina (K) o metionina (M) en la posición 309.
En una modalidad, un polipéptido estabilizado de la invención comprende dos o más mutaciones estabilizadoras que comprenden (i) una prolina (P) en la posición 307 y (ii) una serina (S) en la posición 399.
En una modalidad, un polipéptido estabilizado de la invención comprende dos o más mutaciones estabilizadoras que comprenden (i) una prolina (P) en la posición 307 y (ii) una fenilalanina (F) en la posición 427.
En una modalidad, un polipéptido estabilizado de la invención comprende tres o más mutaciones estabilizadoras que comprenden (i) una prolina (P) en la posición 307, (ii) una serina (S) en la posición 276 y (iii) una treonina (T) en la posición 286.
En una modalidad, un polipéptido estabilizado de la invención comprende tres o más mutaciones estabilizadoras que comprenden (i) una prolina (P) en la posición 307, (ii) una prolina (P) , lisina (K) o metionina (M) en la posición 309 y (iii) una serina (S) en la posición 399.
En una modalidad, un polipéptido estabilizado de la invención comprende tres o más mutaciones estabilizadoras que comprenden (i) una prolina (P) en la posición 307, (ii) una serina (S) en la posición 399 y (iii) una fenilalanina (F) en la posición 427.
En una modalidad, un polipéptido estabilizado de la invención comprende tres o más mutaciones estabilizadoras que comprenden (i) una prolina (P) , lisina (K) o metionina (M) en la posición 309 y (ii) una isoleucina (I) en la posición 308.
En una modalidad, un polipéptido estabilizado de la invención comprende dos o más mutaciones estabilizadoras que comprenden (i) una prolina (P) , lisina (K) o metionina (M) en la posición 309 y (ii) una serina (S) en la posición 399.
En una modalidad, la región Fe está operativamente unida a un sitio de unión.
En una modalidad, el sitio de unión se selecciona de un sitio de unión al antígeno, una porción de unión al ligando de un receptor o una porción de unión al receptor de un ligando.
En una modalidad, el sitio de unión se deriva de un anticuerpo modificado seleccionado del grupo que consiste en un scFv, un Fab, un minicuerpo, un diacuerpo, un triacuerpo, un nanocuerpo, un anticuerpo de camélido y un Dab.
En una modalidad, el polipéptido estabilizado es un anticuerpo de longitud completa estabilizado.
En una modalidad, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humano y un anticuerpo humanizado.
En una modalidad, al menos un sitio de unión comprende seis CDR, una región variable ligera y variable pesada o un sitio de unión al antígeno de un anticuerpo que se selecciona del grupo que consiste en Rituximab, Daclizumab, Galiximab, CB6, LÍ33, 5c8, CBE11, BDA8 , 14A2 , B3F6, 2B8, Lym 1, Lym 2, LL2, Her2, 5E8, Bl, MB1, BH3 , B4 , B72.3, CC49 y 5E10.
En una modalidad, el anticuerpo de longitud completa estabilizado se fusiona con una molécula scFv estabilizada o convencional.
En una modalidad, el polipéptido estabilizado es una inmunoadhesina estabilizada.
En una modalidad, un sitio de unión está revestido sobre la superficie de la región Fe del polipéptido estabilizado.
En una modalidad, el sitio de unión se deriva de una molécula de unión no de inmunoglobulina .
En una modalidad, la molécula de unión no de inmunoglobulina se selecciona del grupo que consiste en una adnectina, un affibody®, un DARPin y una anticalina.
En una modalidad, la porción de unión al ligando de un receptor se deriva de un receptor seleccionado del grupo que consiste en un receptor de la superfamilia de Inmunoglobulina (Ig) , un receptor de la superfamilia del receptor TNF, un receptor de la superfamilia del receptor acoplado a la proteína G (GPCR) , un receptor de la superfamilia del receptor de tirosina cinasa (TK) , un receptor de la superfamilia regulada por ligandos (LG) , un receptor de la superfamilia del receptor de quimiocina, superfamilia del receptor Il-l/tipo Toll (TLR) , un receptor de la familia de receptores del factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF) y una superfamilia del receptor de citocinas .
En una modalidad, la porción de unión al receptor de un ligando se deriva de un ligando inhibidor.
En una modalidad, la porción de unión al receptor de un ligando se deriva de un ligando activador.
En una modalidad, el ligando une un receptor seleccionado del grupo que consiste en un receptor de la superfamilia de Inmunoglobulina (Ig) , un receptor de la superfamilia del receptor TNF, un receptor de la superfamilia del receptor acoplado a la proteína G (GPCR) , un receptor de la superfamilia del receptor de tirosina cinasa (TK) , un receptor de la superfamilia regulada por ligandos (LG) , un receptor de la superfamilia del receptor de quimiocina, superfamilia del receptor IL-l/tipo Toll (TLR) y una superfamilia del receptor de citocinas.
En una modalidad, la invención se refiere a una composición que comprende un polipéptido estabilizado de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable.
En un aspecto, la invención se refiere a un método para estabilizar un polipéptido Fe principal que comprende una región Fe quimérica aglicosilada o porción de la misma, el método comprende la sustitución de un aminoácido elegido en al menos un resto Fe de la región Fe con un aminoácido estabilizador para producir un polipéptido Fe estabilizado con estabilidad potenciada con relación al polipéptido de partida, donde la sustitución se realiza en una posición de aminoácidos del resto Fe seleccionado del grupo que consiste en 297, 299, 307, 309, 399, 409 y 427 (Convención de Numeración UE) .
En una modalidad, la región Fe quimérica comprende un dominio CH2 de un anticuerpo IgG del isotipo IgG4 y un dominio CH3 de un anticuerpo IgG del isotipo IgGl.
En una modalidad, la posición de aminoácidos y el aminoácido presente en el polipéptido Fe estabilizado se selecciona del grupo que consiste en 297Q, 299A, 299K, 307P, 309K, 309M, 309P, 323F, 399E, 399S, 409K, 409M y 427F.
En una modalidad, el polipéptido Fe estabilizado comprende un Gln en la posición 297 (numeración UE) .
En otro aspecto, la invención se refiere a un método para potenciar el rendimiento de un polipéptido Fe principal que comprende una región Fe o porción de la misma, el método comprende la sustitución de un aminoácido elegido en al menos un resto Fe de la región Fe con uno o más aminoácidos estabilizadores para producir un polipéptido Fe estabilizado con rendimiento potenciado con relación al polipéptido principal, donde los aminoácidos estabilizadores se seleccionan independientemente del grupo que consiste en 240F, 262L, 264T, 266F, 299K, 307P, 309K, 309M, 309P, 323F, 399S y 427F (Convención de Numeración UE) .
En una modalidad, la región Fe de partida es una región Fe de IgGl.
En una modalidad, un polipéptido estabilizado de la invención de la región Fe de partida es una región Fe de IgG4.
En una modalidad, la región Fe de partida es una región Fe aglicosilada de IgGl.
En otra modalidad, la región Fe de partida es una región Fe aglicosilada de IgG4.
En una modalidad, el polipéptido Fe estabilizado comprende dos o más aminoácidos estabilizadores. En una modalidad, el polipéptido Fe estabilizado comprende tres o más aminoácidos estabilizadores.
En otro aspecto, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de unión estabilizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones que obran más adelante.
En una modalidad, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena polipeptídica de un polipéptido de unión estabilizado.
En una modalidad, la invención se refiere a un vector que comprende la molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de unión estabilizado o una cadena polipeptídica del mismo.
En una modalidad, la invención se refiere a una célula hospedera que expresa un vector.
En una modalidad, la invención se refiere a un método para producir un polipéptido Fe estabilizado de la invención que comprende cultivar la célula hospedera en un medio de cultivo de modo que se produzca el polipéptido Fe estabilizado.
En un aspecto, la invención se refiere a un método para la fabricación a gran escala de un polipéptido que comprende una región Fe estabilizada, el método comprende: (d) fusionar genéticamente al menos un resto Fe estabilizado con un polipéptido para formar una proteína de fusión estabilizada; (e) transfectar una célula hospedera de mamífero con una molécula de ácido nucleico que codifique la proteína de fusión estabilizada ; ( (f ) cultivar la célula hospedera del paso (f ) en 10L o más de medio de cultivo en condiciones en las cuales se exprese la proteína de fusión estabilizada; para producir de este modo una proteína de fusión estabilizada.
En una modalidad, la región Fe estabilizada es Fe quimérica que comprende un dominio CH2 de un anticuerpo IgG del isotipo IgG4 y un dominio CH3 de un anticuerpo IgG del isotipo IgGl .
En una modalidad, la región Fe estabilizada comprende un Gln en la posición de aminoácidos 297 (numeración UE) .
En una modalidad, la invención se refiere a un método para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno en un sujeto, que comprende una molécula de unión de la invención o una composición que comprende la molécula de unión a un sujeto [sic] que padece la enfermedad o trastorno para tratar o prevenir de este modo una enfermedad o trastorno.
En una modalidad, la enfermedad o el trastorno se selecciona del grupo que consiste en un trastorno inflamatorio, un trastorno neurológico, un trastorno autoinmunitario y un trastorno neoplásico.
Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción y de las reivindicaciones detalladas a continuación.
Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 representa la estructura de un polipéptido de unión al antígeno típico (anticuerpo IgG) y las propiedades funcionales de la unión al antígeno y la función efectora (por ejemplo, unión al receptor Fe (FcR) ) del anticuerpo. También se muestra cómo la presencia de azúcares (glicosilación) en el dominio CH2 del anticuerpo altera la función efectora (unión a FcR) pero no afecta la unión al antígeno.
Las Figuras 2A-2D representan los dos dominios CH3 que interactúan (Fig. 2A) desde una estructura de cristal de rayos x de IgGl (código pdb lhzh) . Se resaltan los residuos IgGl K409 y D399. La fig. 2B representa la alineación de las secuencias de dominio constante IgGl/kappa humanas usando un HMM basado en la estructura ( ang, N., Smith, ., Miller, B., Aivazian, D., Lugovskoy, A., Reff, . , Glaser, S., Croner, L . , Demarest, S. (2008) Conserved amino acid networks involved in antibody variable domain interactions . Proteins; Struct. Func . Bioinform. In Press.). Se resaltan en gris las posiciones de los residuos de CL, CH1 y CH3 que están involucradas en interacciones inter-dominio y posiciones de aminoácidos que covarían firmemente con los aminoácidos en contacto directo con el carbohidrato. Debajo de la alineación se proporcionan los números Kabat y UE . La Figura 2C representa el diagrama de cinta de la estructura del dominio IgGl-CH2 (Sondermann eü al., 2000) . Se marcan los residuos de valina enterrados por el carbohidrato ligado a N y el único bucle de 6 aminoácidos dentro del domino CH2. La Figura 2D representa la alineación de la secuencia IgGl-CH2 natural y la secuencia IgGl-CH2 completamente modificada. Se muestran en negro las posiciones de los residuos que fueron modificados. El número UE de las posiciones modificadas se muestra por encima de la alineación.
Las Figuras 3A-3B representan la turbidez (fig. 3A) y el % de contenido de monómeros (fig. 3B) de los ejemplos de construcciones Fe de IgG de la invención luego de la agitación .
La Figura 4 representa la altura de picos relativa a lo largo del tiempo de las construcciones FC de IgG en un pH bajo estable (pH 3.1).
La Figura 5 representa las velocidades de unión iniciales de los ejemplos de construcciones Fe de IgGl e IgG4 de la invención con relación a los receptores Fcy como se midieron por la resonancia de plasmones superficiales de afinidad de solución.
Las Figuras 6A-6B representan las curvas de titulación usadas para calcular los IC50 para la unión de ejemplos de construcciones Fe de IgGl e IgG4 de la invención para CD64 (FCYRI) (Figura 6A) y CD16 (FcYRIIIa V158) (Figura 6B) .
Las Figuras 7A-7B representan las curvas de titulación destacando la reducción en la unión del T299 de IgGl en comparación con el T299A de IgGl y el tipo salvaje de IgGl para CD64 (FcyRI) (Figura 7A) y la unión de los ejemplos de construcciones Fe de IgG4 que incorporan la mutación de T299K en comparación con los otros ejemplos de construcciones Fe de IgG4 que incorporan la mutación de T299A y tipo salvaje de IgGl para CD64 (FCYRI) (Figura 7B) .
La Figura 8 representa la unión de ejemplos de construcciones Fe de IgG4 que incorporan la mutación de T299K en comparación con el otro ejemplo de construcciones Fe de IgG4 que incorporan la mutación T299A y tipo salvaje de IgGl para CD16 (FcYRIIIa V158) .
La Figura 9 representa las curvas de titulación usadas para evaluar la unión de ejemplos de construcciones Fe de IgGl e IgG4 de la invención para el factor del complemento Clq.
Las figuras 10A y 10B ilustran la curva de titulación usadas para evaluar la unión de varias construcciones Fe para CD64 y CD16, respectivamente. La Fig. 10C ilustra que N297Q IgG4 -CH2/IgGl-CH3 tiene la misma semivida que el anticuerpo T299A (que es un poco más corta que el IgGl aglicosilado) .
La Figura 11A ilustra las curvas de titulación usadas para evaluar la unión de las construcciones de T299X a CD64 y que las cadenas laterales cargadas positivamente T299R y T299K imparten bajas afinidades para CD64. La fig. 11B ilustra las curvas de titulación usadas para evaluar la unión de CD64 a varias construcciones alternativas. Las figs. 11C y 11D ilustran las curvas de titulación usadas para evaluar la unión de construcciones a CD32aR y las figs. 11E y 11F ilustran la unión de construcciones a CD16. Las figs. 11G y 11H ilustran los resultados de un ELISA Clq.
La figura 12A ilustra las curvas de titulación usadas para evaluar la unión de construcciones a CD64 y la fig. 12B ilustra las curvas de titulación usadas para evaluar la unión de construcciones a CD16.
Descripción Detallada de la Invención Se ha desarrollado un método para producir polipéptidos Fe estabilizados con función efectora reducida, por ejemplo, anticuerpos aglicosilados o anticuerpos IgG4 , incluyendo uno o más aminoácidos estabilizadores en la región Fe del polipéptido Fe. El método es adecuado en especial para la producción de polipéptidos terapéuticos que contienen Fe en células eucariotas únicamente con alteraciones de aminoácidos mínimas al polipéptido. Por consiguiente, los métodos de la presente invención evitan la introducción de la secuencia de aminoácidos en el polipéptido que pueda ser inmunógeno . De preferencia, los aminoácidos estabilizadores estabilizan la región Fe del polipéptido sin influenciar la glicosilación y/o la función efectora del polipéptido, y no alteran significativamente otras funciones deseadas del polipéptido (por ejemplo, afinidad de unión al antígeno o semivida) .
Para proporcionar un mejor entendimiento de la memoria descriptiva y de las reivindicaciones, se proporcionan convenientemente las siguientes definiciones.
Definiciones Tal como se usa en la presente, el término "función efectora" se refiere a la capacidad funcional de la región Fe o porción de la misma de unir proteínas y/o células del sistema inmune y mediar varios efectos biológicos. Las funciones efectoras pueden ser dependientes del antígeno o independientes del antígeno. Una disminución en la función efectora se refiere a una disminución en una o más funciones efectoras, mientras que se mantiene la actividad de unión al antígeno de la región variable del anticuerpo (o fragmento del mismo) . Se pueden expresar aumentos o disminuciones en la función efectora, por ejemplo, unión de Fe a un receptor Fe o proteína del complemento, en términos del cambio múltiplo (por ejemplo, cambió 1 vez, 2 veces y similares) y se puede calcular con base, por ejemplo, en los cambios porcentuales en la actividad de unión determinados usando ensayos que son bien conocidos en la técnica.
Tal como se usa en la presente, el término "función efectora dependiente del antígeno" se refiere a una función efectora que se induce normalmente luego de la unión de un anticuerpo a un antígeno correspondiente. Las funciones efectoras dependientes del antígeno típicas incluyen la capacidad de unir una proteína del complemento (por ejemplo, Clq) . Por ejemplo, la unión del componente Cl del complemento a la región Fe puede activar el sistema de complemento clásico que conduce a la opsonizacion y lisis de patógenos celulares, un proceso llamado citotoxicidad dependiente del complemento (CDCC) . La activación del complemento estimula también la respuesta inflamatoria y puede estar implicada también en hipersensibilidad autoinmune.
Otras funciones efectoras dependientes del antígeno son mediadas por la unión de anticuerpos, a través de su región Fe, a determinados receptores Fe ( " FcR" ) en células. Existen varios receptores Fe que son específicos para diferentes clases de anticuerpos, incluyendo IgG (receptores gamma o IgyR) , IgE (receptores epsilon o Ig R) , IgA (receptores alfa o IgaR) e IgM (receptores mu o IgyR) . La unión del anticuerpo a los receptores Fe sobre superficies celulares dispara una cantidad de respuestas biológicas importantes y diversas incluyendo endocitosis de complejos inmunes, inmersión y destrucción de partículas recubiertas por anticuerpos o microorganismos (también llamado fagocitosis dependiente del anticuerpo o ADCP) , depuración de complejos inmunes, lisis de células diana recubiertas por anticuerpos mediante linfocitos citolíticos (llamado citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo o ADCC) , liberación de mediadores inflamatorios, regulación de activación celular del sistema inmune, transferencia de placenta y control de producción de inmunog1obulina.
Determinados receptores Fe, los receptores gamma Fe (FCYR) , juegan un papel crítico en la abrogación o mejora del reclutamiento inmune. Los FcyR se expresan en leucocitos y están compuestos por tres clases distintas: FcyRI, FcyRII y FCYRIII (Gessner et al., Ann. Hematol . , (1998), 76: 231-48). Estructuralmente, los FcyR son todos miembros de la superfamilia de inmunoglobulina, que tienen una cadena alfa de unión a IgG con una porción extracelular compuesta por dos o tres dominios del tipo Ig. El FcYRI (CD64) humano se expresa en monocitos humanos, presenta alta afinidad de unión (Ka=108-io9 M"1) a los IgGl, IgG3 e IgG4 monoméricos . El FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16) humanos presentan baja afinidad para IgGl e IgG3 (Ka <107 M"1) y pueden unir únicamente formas complejas o poliméricas de estos isotipos IgG. Asimismo, las clases FcyRII y FcyRII comprenden ambas formas "A" y "B" . FcyRIIa (CD32a) y FcyRIIIa (CD16a) se unen a la superficie de macrófagos, linfocito citolítico natural y algunas células T por un dominio transmembrana mientras que FcyRIIb (CD32b) y FcyRIIIb (CD16b) se unen selectivamente a la superficie celular de granulocitos (por ejemplo, neutrófilos) a través de un ancla fosfatidilinositol glicano (GPI) . Los homólogos murinos respectivos de FcyRI, FcyRII y FcyRIII humanos son FcyRIIa, FcyRIIb/1 y FcyRlo.
Tal como se usa en la presente, el término "función efectora independiente del antígeno" se refiere a una función efectora que puede inducirse por un anticuerpo, sin importar si ha unido su antígeno correspondiente. Las funciones efectoras independientes del antígeno típicas incluyen transporte celular, semivida circulante y velocidades de depuración de inmunoglobulinas y facilitación de la purificación. Un receptor Fe estructuralmente único, el "receptor Fe neonatal" o "FcRn", también conocido como el receptor de reciclaje, tiene un papel crítico en la regulación de la semivida y del transporte celular. Otros receptores Fe purificados a partir de células microbianas (por ejemplo, Proteína Estafilocócica A o G) son capaces de unirse a la región Fe con alta afinidad y pueden usarse para facilitar la purificación del polipéptido que contiene Fe.
A diferencia de los FcyR que pertenecen a la superfamilia de inmunoglobulina, los FcRn humanos se asemejan estructuralmente a los polipéptidos del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC) de Clase I (Ghetie and ard, Immunology Today, (1997), 18(12) : 592-8). El FcRn se expresa típicamente como un heterodímero que consiste en una transmembrana a o de cadena pesada en complejo con ß soluble o de cadena ligera (microglobulina ß2) . El FcRn comparte 22-29% de identidad de secuencia con moléculas del MHC de Clase I y tiene una versión no funcional de la ranura que une el péptido del MHC (Simister y Mostov, Nature, (1989), 337: 184-7). Como MHC, la cadena a del FcRn consiste en tres dominios extracelulares (al, a2 , a3) y una cola citoplásmica corta afirma la proteína a la superficie celular. Los dominios al y a2 interactúan con los sitios de unión a FcR en la región Fe de los anticuerpos (Raghavan et al., Immunity, (1994), 1: 303-15) . El FcRn se expresa en la placenta maternal o en la bolsa del vitelo de mamíferos y está implicado en la transferencia de los IgG de la madre al feto. El FcRn se expresa también en el intestino delgado de roedores neonatos, donde se involucra en la transferencia a través del epitelio de microvellosidades del IgG maternal desde el calostro o la leche ingeridos. El FcRn se expresa también en una diversidad de otros tejidos en varias especies, así como en varias líneas celulares endoteliales . También se expresa en el endotelio vascular de adultos humanos, vasculatura muscular y sinusoides hepáticos. Se cree que el FcRn tiene un papel adicional en la mantención de semivida circulatoria o niveles en suero de IgG uniéndola y reciclándola al suero. La unión de FcRn a moléculas de IgG es estrictamente dependiente del pH con una unión óptima en un pH menor a 7.0.
Tal como se usa en la presente, el término "semivida" se refiere a una semivida biológica de un polipéptido de unión particular in vivo. La semivida puede representarse por el tiempo requerido para que la mitad de la cantidad administrada a un sujeto se elimine de la circulación y/u otros tejidos en el animal. Cuando una curva de depuración de un polipéptido de unión dado se construye como una función de tiempo, usualmente la curva es bifásica con una fase rápida y una fase ß más larga. La fase o¡ representa típicamente un equilibrio del polipéptido Fe administrado entre el espacio intra y extravascular y, en parte, se determina por el tamaño del polipéptido. La fase ß representa típicamente el catabolismo del polipéptido de unión en el espacio intravascular . Por lo tanto, en una modalidad preferida, el término semivida, tal como se usa en la presente se refiere a la semivida del polipéptido de unión en la fase ß. La semivida de fase ß típica de un anticuerpo humano en humanos es de 21 días.
Tal como se usa en la presente, el término "polipéptido" se refiere a un polímero de dos o más de los aminoácidos naturales o aminoácidos no naturales. El término "polipéptido Fe" se refiere a un polipéptido que comprende una región Fe o una porción de la misma (por ejemplo, un resto Fe) . En modalidades preferidas, el polipéptido Fe se estabiliza de acuerdo con los métodos de la invención. En modalidades opcionales, el polipéptido Fe comprende adicionalmente un sitio de unión que está operativamente ligado a o fusionado con la región Fe (o porción de la misma) del polipéptido Fe.
Tal como se usa en la presente, el término "proteína" se refiere a un polipéptido (por ejemplo, un polipéptido Fe) o una composición que comprende más de un polipéptido. Por consiguiente, las proteínas pueden ser monómeros (por ejemplo, un polipéptido Fe simple) o multímeros. Por ejemplo, en una modalidad, una proteína de la invención es un dímero. En una modalidad, los dímeros de la invención son homodímeros, que comprenden dos subunidades o polipéptidos monoméricos idénticos (por ejemplo, dos polipéptidos Fe idénticos) . En otra modalidad, los dímeros de la invención son heterodímeros , que comprenden dos subunidades o polipéptidos monoméricos no idénticos (por ejemplo, dos polipéptidos Fe no idénticos o un polipéptido Fe y un segundo polipéptido distinto de un polipéptido Fe) . Las subunidades del dímero pueden comprender una o más cadenas polipeptídicas , donde al menos uno de las cadenas polipeptídicas es un polipéptido Fe. Por ejemplo, en una modalidad, los dímeros comprenden al menos dos cadenas polipeptídicas (por ejemplo, al menos dos cadenas polipeptídicas de Fe) . En una modalidad, los dímeros comprenden dos cadenas polipeptídicas, donde una o ambas cadenas son cadenas polipeptídicas de Fe. En otra modalidad, los dímeros comprenden tres cadenas polipeptídicas, donde una, dos o todas las cadenas polipeptídicas son cadenas polipeptídicas de Fe. En otra modalidad, los dímeros comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, donde una, dos, tres o todas las cadenas polipeptídicas son cadenas polipeptídicas de Fe .
Tal como se usa en la presente, los términos "unido", "fusionado" o "fusión" se utilizan de manera intercambiable. Estos términos se refieren a la unión de dos elementos o componentes adicionales, por cualquier medio incluyendo conjugación química o medios recombinantes . Se conocen en la técnica los métodos de conjugación química (por ejemplo, usando agentes de reticulación heterobifuncionales ) . Tal como se usa en la presente, el término "fusionado genéticamente" o "fusión genética" se refiere a la unión o enlace co-lineal y covalente de dos o más proteínas, polipéptidos o fragmentos de los mismos a través de sus esqueletos peptídicos individuales, a través de expresión genética de una molécula de polinucleótidos simple que codifica aquellas proteínas, polipéptidos o fragmentos. La fusión genética da como resultado la expresión de una secuencia genética contigua simple. Las fusiones genéticas preferidas se encuentran en el mismo marco, es decir, dos o más marcos de lectura abierta (ORF) se fusionan para formar un ORF más largo continuo, de manera que mantenga el marco de lectura correcto de los ORF originales. De este modo, la proteína de fusión recombinante resultante es un polipéptido simple que contiene dos o más segmentos de proteínas que corresponden a los polipéptidos codificados por los ORF originales (los segmentos no se unen normalmente por naturaleza) . Aunque el marco de lectura se hace de este modo continuo a través de los segmentos genéticos fusionados, los segmentos de proteínas pueden separarse física o espacialmente , por ejemplo, mediante un enlazador de polipéptidos en el mismo marco.
Tal como se usa en la presente, el término "región Fe" deberá definirse como la porción de una inmunoglobulina formada por dos o más restos Fe de las cadenas pesadas del anticuerpo. En determinadas modalidades, la región Fe es una región Fe dimérica. Una "región Fe dimérica" o "dcFc" se refiere al dímero formado por los restos Fe de dos cadenas pesadas de inmunoglobulina separadas. La región Fe dimérica puede ser un homodímero de dos restos Fe idénticos (por ejemplo, una región Fe de una inmunoglobulina de origen natural) o un heterodímero de dos restos Fe no idénticos. En otras modalidades, la región Fe es una región Fe de "de cadena simple" o monomérica (es decir, una región scFc) . Las regiones Fe de cadena simple están comprendidas por restos Fe unidos genéticamente dentro de una cadena polipeptídica simple (es decir, codificados en una secuencia genética contigua simple) . Ejemplos de regiones scFc se describen en la Solicitud PCT No. PCT/US2008/006260 , presentada el 14 de mayo de 2008, que se incorpora en la presente a modo de referencia.
Tal como se usa en la presente, el término "resto Fe" se refiere a una secuencia derivada de la porción de una cadena pesada de inmunoglobulina que comienza en la región bisagra justo corriente arriba del sitio de escisión de papaína (es decir, residuo 216 en IgG, tomando el primer residuo de la región constante de cadena pesada como 114) y finaliza en el extremo C-terminal de la cadena pesada de inmunoglobulina. Por consiguiente, un resto Fe puede ser un resto Fe completo o una porción (por ejemplo, un dominio) del mismo. Un resto Fe completo comprende al menos un dominio bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3 (por ejemplo, las posiciones de aminoácidos UE 216-446) . Un residuo de lisina adicional (K) se encuentra presente a veces en el extremo C-terminal del resto Fe, pero a menudo se escinde del anticuerpo maduro. Se han enumerado cada una de las posiciones de aminoácidos dentro de una región Fe de acuerdo con el sistema de numeración UE de Kabat reconocido en la técnica, véase, por ejemplo, por Kabat et al., en "Sequences of Proteins of Immunological Interest" , U.S. Dept . Health and Human Services, 1983 y 1987.
En determinadas modalidades, un resto Fe comprende al menos uno de: un dominio de bisagra (por ejemplo, región bisagra superior, media y/o inferior), un dominio CH2 , un dominio CH3 o una variante, porción o fragmento del mismo. En modalidades preferidas, un resto Fe comprende al menos un dominio CH2 o un dominio CH3. En determinadas modalidades, el resto Fe es un resto Fe completo. En otras modalidades, el resto Fe comprende una o más inserciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos con relación a un resto Fe de origen natural. Por ejemplo, se puede eliminar al menos uno de un dominio bisagra, dominio CH2 o dominio CH3 (o porción de los mismos) . Por e emplo, un resto Fe puede comprender o consistir en: (i) dominio bisagra (o porción del mismo) fusionado con un dominio CH2 (o porción del mismo) , (ii) un dominio bisagra (o porción del mismo) fusionado con un dominio CH3 (o porción del mismo), (iii) un dominio CH2 (o porción del mismo) fusionado con un dominio CH3 (o porción del mismo) , (iv) un dominio CH2 (o porción del mismo) y (v) un dominio CH3 o porción del mismo.
Como se estableció en la presente, un experto en la técnica entenderá que el resto Fe puede modificarse de modo que varíe en la secuencia de aminoácidos del resto Fe completo de una molécula de inmunoglobulina de origen natural, mientras que retiene al menos una función deseable conferida por el resto Fe de origen natural. Por ejemplo, el resto Fe puede comprender o consistir en al menos la porción de un resto Fe que se conoce en la técnica como que se necesita para la unión a FcRn o semivida extendida. En otra modalidad, un resto Fe comprende al menos la porción conocida en la técnica como que se necesita para la unión a FcyR. En una modalidad, una región Fe de la invención comprende al menos la porción conocida en la técnica como que se necesita para la unión a la Proteína A. En una modalidad, un resto Fe de la invención comprende al menos la porción de una molécula de Fe conocida en la técnica como que se necesita para la unión a la proteína G.
En determinadas modalidades, los restos Fe de la región Fe son del mismo isotipo. Por ejemplo, los restos Fe pueden derivarse de una inmunoglobulina (por ejemplo, una inmunoglobulina humana) de un isotipo IgGl o IgG4. Sin embargo, la región Fe (o uno o más restos Fe de una región Fe) puede ser también quimérica. Una región Fe quimérica puede comprender restos Fe derivados de diferentes isotipos de inmunoglobulina. En determinadas modalidades, al menos dos de los restos Fe de una región Fe de cadena simple o dimérica pueden ser de diferentes isotipos de inmunoglobulina. En modalidades alternativas o adicionales, las regiones Fe quiméricas pueden comprender uno o más restos Fe quiméricos. Por ejemplo, la región o el resto Fe quimérico puede comprender una o más porciones derivadas de una inmunoglobulina de un primer isotipo (por ejemplo, un isotipo IgGl, IgG2 o IgG3) en tanto el remanente de la región o resto Fe es de un isotipo diferente. Por ejemplo, una región o resto Fe de un polipéptido Fe puede comprender un dominio CH2 y/o CH3 derivado de una inmunoglobulina de un primer isotipo (por ejemplo, un isotipo IgGl, IgG2 o IgG4) y una región bisagra de una inmunoglobulina de un segundo isotipo (por ejemplo, un isotipo IgG3) . En otra modalidad, la región o resto Fe comprende un dominio bisagra y/o CH2 derivado de una inmunoglobulina de un primer isotipo (por ejemplo, un isotipo IgG4) y un dominio CH3 de una inmunoglobulina de un segundo isotipo (por ejemplo, un isotipo IgGl, IgG2 o IgG3) . En otra modalidad, la región Fe quimérica comprende un resto Fe (por ejemplo, un resto Fe completo) de una inmunoglobulina de un primer isotipo (por ejemplo, un isotipo IgG4) y un resto Fe de una inmunoglobulina de un segundo isotipo (por ejemplo, un isotipo IgGl, IgG2 o IgG3) . En un ejemplo de modalidad, la región o resto Fe comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina IgG4 y un dominio CH3 de una inmunoglobulina IgGl. En otra modalidad, la región o resto Fe comprende un dominio CH1 y un dominio CH2 de una inmunoglobulina IgG4 y un dominio CH3 de una inmunoglobulina IgGl. En otra modalidad, la región o resto Fe comprende una porción de un dominio CH2 de un isotipo particular del anticuerpo, por ejemplo, posiciones UE 292-340 de un dominio CH2. Por ejemplo, en una modalidad, una región o resto Fe comprende aminoácidos en las posiciones 292-34 de CH2 derivados de un resto IgG4 y el remanente de CH2 derivado de un resto IgGl (alternativamente, 292-34 de CH2 pueden derivarse de un resto IgGl y el remanente de CH2 se puede derivar de un resto IgG4) .
En otras modalidades, la región o el resto Fe puede comprender una región bisagra quimérica. La bisagra quimérica puede derivarse, en parte, de una molécula de IgGl, IgG2 o IgG4 (por ejemplo, una secuencia bisagra media superior e inferior) y, en parte, de una molécula de IgG3 (por ejemplo, una secuencia de bisagra media) . En otro ejemplo, una región o resto Fe puede comprender una bisagra quimérica derivada, en parte, de una molécula de IgGl y, en parte, de una molécula de IgG4. En una modalidad particular, la bisagra quimérica puede comprender dominios bisagra superior e inferior de una molécula de IgG4 y un dominio bisagra medio de una molécula de IgGl . La bisagra quimérica puede realizarse introduciendo una sustitución de prolina (Ser228Pro) en una posición UE 228 en el domino bisagra medio de una región bisagra IgG4. En otra modalidad, la bisagra quimérica puede comprender aminoácidos en las posiciones UE 233-236 de un anticuerpo IgG2 y/o la mutación Ser228Pro, donde los aminoácidos remanentes de la bisagra provienen de un anticuerpo IgG4 (por ejemplo, una bisagra quimérica de la secuencia ESKYGPPCPPCPAPPVAGP) . Las bisagras quiméricas adicionales se describen en la Solicitud de Patente estadounidense No. 10/880,320, que se incorpora a la presente a modo de referencia en su totalidad.
En la definición de "región Fe" se incluye específicamente la "región Fe aglicosilada" . Tal como se usa en la presente, "región Fe aglicosilada" es una región Fe que no tiene un oligosacárido o glicano unido covalentemente , por ejemplo, en el sitio de N-glicosilación en la posición UE 297, en uno o más de los restos Fe del mismo. En determinadas modalidades, la región Fe aglicosilada está completamente aglicosilada, es decir, ninguno de sus restos Fe tienen carbohidratos. En otras modalidades, la aglicosilación está parcialmente aglicosilada (es decir, hemi-glicosilada) . La región Fe aglicosilada puede ser una región Fe desglicosilada, que es una región Fe para la cual se retiró el carbohidrato de Fe, por ejemplo química o enzimáticamente . De manera alternativa, la región Fe aglicosilada puede ser no glicosilada o sin glicosilar, esto es, un anticuerpo que se expresó sin carbohidrato de Fe, por ejemplo mediante mutación de uno o más residuos que codifican el patrón de glicosilación, por ejemplo, en el sitio de N-glicosilación en la posición UE 297 o 299, mediante expresión en un organismo que no enlaza naturalmente carbohidratos a proteínas (por ejemplo, bacterias) o mediante expresión en una célula hospedera u organismo cuya maquinaria de glicosilación se volvió deficiente por manipulación genética o por la adición de inhibidores de glicosilación (por ejemplo, inhibidores de glicosiltransferasa) . En modalidades alternativas, la región Fe es una "región Fe glicosilada", es decir, está completamente glicosilada en todos los sitios de glicosilación disponibles .
El término "polipéptido Fe principal" incluye un polipéptido que contiene una región Fe (por ejemplo, un anticuerpo IgG) para el cual se desea estabilización. De preferencia, el polipéptido Fe principal es un polipéptido Fe sin efectores. De este modo, el polipéptido Fe principal representa el polipéptido Fe original sobre el cual se realizan los métodos de la presente invención o que pueden utilizarse como punto de referencia para comparaciones de estabilidad. El polipéptido principal puede comprender una región o resto Fe natural (es decir, una región o resto Fe de IgG4 humano) o una región Fe con modificaciones de secuencias de aminoácido pre-existentes (tales como, inserciones, eliminaciones y/u otras alteraciones) de una secuencia de origen natural, pero que no tiene uno o más aminoácidos estabilizadores .
Se debería entender que el término "mutación" o "que muta" incluye la modalidad física de una mutación en un polipéptido Fe principal (por ejemplo, mediante alteración, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio, un codón de una molécula de ácido nucleico que codifica un aminoácido para dar como resultado un codón que codifique un aminoácido diferente) o síntesis de una región Fe variante que tiene un aminoácido no encontrado en la región Fe principal (por ejemplo, mediante conocimiento de la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico que codifica una región Fe principal y mediante diseño de la síntesis de una molécula de ácido nucleico que comprenda una secuencia de nucleótidos que codifica una variante de la región Fe principal sin la necesidad de mutar uno o más nucleótidos de una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido estabilizado de la invención) .
En un ejemplo de modalidad, el polipéptido Fe principal comprende una región Fe de un polipéptido Fe sin efectores. Tal como se usa en la presente, el término "polipéptido Fe sin efectores" se refiere a un polipéptido Fe que tiene una función efectora alterada o reducida en comparación con un anticuerpo aglicosilado de tipo salvaje del isotipo IgGl . De preferencia, la función efectora que está reducida o alterada es una función efectora dependiente del anticuerpo, por ejemplo, ADCC y/o ADCP . En una modalidad, un polipéptido Fe sin efectores tiene una función efectora reducida como resultado de glicosilación modificada o reducida en la región Fe del polipéptido Fe, por ejemplo, una región Fe aglicosilada . En otra modalidad, el polipéptido Fe sin efectores tiene una función efectora reducida debido a la incorporación de una región Fe de IgG4 o porción de la misma (por ejemplo, un dominio CH2 y/o CH3 de un anticuerpo IgG4) .
Los términos "polipéptido Fe variante" o "variante de Fe" incluyen un polipéptido Fe derivado de un polipéptido Fe principal. La variante de Fe difiere del polipéptido Fe principal en el hecho de que comprende la estabilización de uno o más residuos de aminoácidos estabilizadores, por ejemplo, debido a la introducción de al menos una mutación estabilizadora de Fe. En determinadas modalidades, las variantes de Fe de la invención comprenden una región Fe (o resto Fe) que es idéntica en secuencia a la del polipéptido principal, salvo por la presencia de uno o más aminoácidos de Fe estabilizadores. En modalidades preferidas, la variante de Fe tendrá estabilidad potenciada en comparación con el polipéptido Fe principal y, opcionalmente , tendrá función efectora equivalente o reducida en comparación con el polipéptido Fe principal.
Un polipéptido o secuencia de aminoácidos "derivado/a de" un polipéptido o proteína designada se refiere al origen del polipéptido. De preferencia, el polipéptido o la secuencia de aminoácidos que se deriva de una secuencia particular tiene una secuencia de aminoácidos que es esencialmente idéntica a esa secuencia o una porción de la misma, donde la porción consiste en al menos 10-20, preferentemente al menos 20-30 aminoácidos, más preferentemente al menos 30-50 aminoácidos, o que, de otro modo, un experto en la técnica identifica que tiene su origen en la secuencia. En el contexto de polipéptidos , una "secuencia lineal" o una "secuencia" es el orden de aminoácidos en un polipéptido en una dirección amino a carboxilo terminal en la que los residuos cercanos en la secuencia son contiguos en la estructura primaria del polipéptido .
Los polipéptidos (por ejemplo, polipéptidos Fe variantes) que se derivan de otro polipéptido (por ejemplo, un polipéptido Fe principal) pueden tener una o más mutaciones con relación al polipéptido principal o de partida, por ejemplo, uno o más residuos de aminoácidos que se han sustituido con otros residuos de aminoácidos o que tienen una o más inserciones o eliminaciones de residuos de aminoácidos.
De preferencia, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que no es de origen natural. Las variantes tienen necesariamente menos de 100% de identidad de secuencia o de similitud con el polipéptido de partida. En una modalidad preferida, la variante tendrá una secuencia de aminoácidos de aproximadamente 75% a menos de 100% de identidad o similitud de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos del polipéptido de partida, más preferentemente de aproximadamente 80% a menos de 100%, más preferentemente de aproximadamente 85% a menos de 100%, más preferentemente de aproximadamente 90% a menos de 100% (por ejemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) y más preferentemente de aproximadamente 95% a menos de 100%, por ejemplo, con respecto a la longitud completa de la molécula variante o una porción de la misma (por ejemplo, una región Fe o resto Fe) . En una modalidad, existe una diferencia de aminoácidos entre la secuencia de polipéptidos de partida (por ejemplo, la región Fe de un polipéptido Fe principal) y la secuencia derivada de la misma (por ejemplo, la región Fe de un polipéptido Fe variante) . En otras modalidades, existen entre dos y diez diferencias de aminoácidos entre la secuencia de polipéptidos de partida y el polipéptido variante (por ejemplo, aproximadamente 2-20, aproximadamente 2-15, aproximadamente 2-10, aproximadamente 5-20, aproximadamente 5-15, aproximadamente 5-10 diferencias de aminoácidos) . Por ejemplo, puede haber menos de aproximadamente 10 diferencias de aminoácidos (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez diferencias de aminoácidos). Identidad o similitud con respecto a esta secuencia se define en la presente como el porcentaje de residuos de aminoácidos en la secuencia de candidatos que son idénticos (es decir, el mismo residuo) a los residuos de aminoácidos de partida, luego de alinear las secuencias e introducir espacios, en caso de que sea necesario, para alcanzar el porcentaje máximo de identidad de secuencia.
Los polipéptidos Fe preferidos de la invención comprenden una secuencia de aminoácidos (por ejemplo, al menos una región Fe o resto Fe) derivada de una secuencia de inmunoglobulina humana (por ejemplo, una región Fe o resto Fe de una molécula de IgG humana) . Sin embargo, los polipéptidos pueden comprender uno o más aminoácidos de otras especies de mamíferos. Por ejemplo, puede incluirse un resto Fe de primate o un sitio de unión de primate en los polipéptidos objeto de la presente. De manera alternativa, uno o más aminoácidos de murino pueden estar presentes en el polipéptido Fe. Los polipéptidos Fe preferidos de la invención no son inmunógenos.
Un experto en la técnica entenderá también que los polipéptidos Fe de la invención pueden alterarse de modo que varíen en la secuencia de aminoácidos a partir de los polipéptidos principales de los que se derivaron, en tanto retienen una o más actividades deseables (por ejemplo, función efectora reducida) de los polipéptidos principales. En modalidades particulares, se realizan sustituciones de nucleótidos o aminoácidos que estabilizan el polipéptido Fe. En una modalidad, se puede crear una molécula de ácido nucleico aislada que codifique una variante de Fe mediante la introducción de una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de nucleótidos en la secuencia de nucleótidos del polipéptido Fe principal de modo que se introduzcan una o tnás sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos en la proteína codificada. Las mutaciones (por ejemplo, mutaciones estabilizadoras) se pueden introducir por técnicas estándar, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR.
Tal como se usa en la presente, el término "estabilidad de proteína" se refiere a una medida reconocida en la técnica del mantenimiento de una o más propiedades físicas de una proteína en respuesta a una condición ambiental (por ejemplo, temperatura elevada o disminuida) . En una modalidad, la propiedad física es el mantenimiento de la estructura covalente de la proteína (por ejemplo, la ausencia de escisión proteolítica, oxidación o desamidación no deseada) . En otra modalidad, la propiedad física es la presencia de la proteína en un estado adecuadamente plegado (por ejemplo, la ausencia de agregados o precipitados solubles o insolubles) . En una modalidad, la estabilidad de una proteína se mide mediante el ensayo de una propiedad biofísica de la proteína, por ejemplo, estabilidad térmica, perfil de despliegue de pH, remoción estable de glicosilación, solubilidad, función bioquímica (por ejemplo, capacidad de unirse a una proteína (por ejemplo, un ligando, un receptor, un antígeno, etc.) o resto químico, etc.) y/o combinaciones de los mismos. En otra modalidad, la función bioquímica se demuestra por la afinidad de unión de una interacción. En una modalidad, una medida de estabilidad de proteínas es estabilidad térmica, es decir, resistencia a la prueba térmica. La estabilidad puede medirse usando métodos conocidos en la técnica y/o descritos en la presente. Por ejemplo, se puede medir la "Tm" , también conocida como la "temperatura de transición" . La Tm es la temperatura en la cual el 50% de una macromolécula, por ejemplo, molécula de unión, se vuelve desnaturalizada y se considera como el parámetro estándar para la descripción de estabilidad térmica de una proteína.
El término "aminoácido" incluye alanina (Ala o A) ; arginina (Arg o R) ; asparagina (Asn o N) ; ácido aspártico (Asp o D) ,- cisteína (Cys o C) ; glutamina (Gln o Q) ; ácido glutámico (Glu o E) ; glicina (Gly o G) ; histidina (His o H) ; isoleucina (lie o I) : leucina (Leu o L) ; lisina (Lys o K) ; metionina (Met o M) ; fenilalanina (Phe o F) ; prolina (Pro o P) ; serina (Ser o S) ; treonina (Thr o T) ; triptófano (Trp o W) ; tirosina (Tyr o Y) y valina (Val o V) . Los aminoácidos no tradicionales se encuentran también dentro del alcance de la invención e incluyen norleucina, omitina, norvalina, homoserina y otros análogos de residuos de aminoácidos, tales como los descritos en Ellman et al. Meth. Enzym. 202:301-336 (1991). Para generar los residuos de aminoácidos de origen no natural, se pueden utilizar los procedimientos de Noren et al. Science 244:182 (1989) y Ellman et al., supra . En resumen, estos procedimientos implican la activación química de un supresor AR t con un residuo de aminoácidos de origen no natural seguido de transcripción y traducción in vitro del ARN. También se puede lograr la introducción del aminoácido no tradicional usando químicas de péptidos conocidas en la técnica. Tal como se usa en la presente, el término "aminoácido polar" incluye aminoácidos que tienen carga neta cero, pero tienen cargas parciales diferentes a cero en diferentes porciones de sus cadenas laterales (por ejemplo, M, F, W, S, Y, N, Q, C) . Estos aminoácidos pueden participar en interacciones hidrofóbicas e interacciones electrostáticas. Tal como se usa en la presente, el término "aminoácido cargado" incluye aminoácidos que pueden tener carga neta diferente cero en sus cadenas laterales (por ejemplo, R, K, H, E, D) . Estos aminoácidos pueden participar en interacciones hidrofóbicas e interacciones electrostáticas. Tal como se usa en la presente, el término "aminoácidos con suficiente volumen estérico" incluye aquellos aminoácidos que tienen cadenas laterales que ocupan un mayor espacio tridimensional. Los ejemplos de aminoácidos que tienen químicas de cadenas laterales con suficiente volumen estérico incluyen tirosina, triptófano, arginina, lisina, histidina, ácido glutámico, glutamina y metionina o análogos o miméticos de los mismos.
Una "sustitución de aminoácidos" se refiere al reemplazo de al menos un residuo de aminoácidos existente en una secuencia de aminoácidos predeterminada (una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de partida) con un segundo residuo de aminoácidos de "reemplazo" diferente. Una "inserción de aminoácidos" se refiere a la incorporación de al menos un aminoácido adicional en una secuencia de aminoácidos predeterminada. Mientras que la inserción consistirá usualmente en la inserción de uno o dos residuos de aminoácidos, pueden realizarse "inserciones peptídicas" presentes más grandes, por ejemplo, mediante inserción de aproximadamente tres a aproximadamente cinco o hasta aproximadamente diez, quince o veinte residuos de aminoácidos. El o los residuos insertados pueden ser de origen natural o de origen no natural como se describió anteriormente. Una "eliminación de aminoácidos" se refiere a la remoción de al menos un residuo de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos predeterminada. Como se estableció anteriormente, estos términos incluyen cambios reales a una molécula de ácido nucleico física o cambios realizados durante un proceso de diseño (por ejemplo, en papel o en una computadora) a una secuencia de ácido nucleico existente.
En determinadas modalidades, los polipéptidos de la invención son polipéptidos de unión. Tal como se usa en la presente, el término "polipéptido de unión" se refiere a polipéptidos (por ejemplo, polipéptidos Fe) que comprenden al menos un sitio de unión o dominio de unión diana que se une específicamente a una molécula diana (tal como, un antígeno o compañero de unión) . Por ejemplo, en una modalidad, un polipéptido de unión de la invención comprende un sitio de unión al antígeno de inmunoglobulina o la porción de una molécula del receptor responsable de la unión al ligando o la porción de una molécula del ligando que es responsable de la unión al receptor. Los polipéptidos de unión de la invención comprenden al menos un sitio de unión. En una modalidad, los polipéptidos de unión de la invención comprenden al menos dos sitios de unión. En una modalidad, los polipéptidos de unión comprenden dos sitios de unión. En otra modalidad, los polipéptidos de unión comprenden tres sitios de unión. En otra modalidad, los polipéptidos de unión comprenden cuatro sitios de unión. En una modalidad, los sitios de unión se unen entre sí en tándem. En otras modalidades, los sitios de unión se colocan en diferentes posiciones del polipéptido de unión, por ejemplo, en uno o más extremos N o C-terminales de la región Fe de un polipéptido Fe. Por ejemplo, cuando la región Fe es una región scFc, se puede unir un sitio de unión a un extremo N-terminal, el extremo C-terminal o ambos extremos de la región scFc . Cuando la región Fe es una región Fe dimérica, los sitios de unión pueden unirse a uno o ambos extremos N-terminal y/o uno o ambos extremos C-terminales .
Tal como se usa en la presente, los términos "dominio de unión", "sitio de unión" o "resto de unión" se refieren a la porción, región o al sitio de un polipéptido de unión que tiene actividad biológica (distinta a una actividad biológica mediada por Fe) , por ejemplo, que media la unión específica con una molécula diana (por ejemplo, un antígeno, ligando, sustrato o inhibidor) . Los ejemplos de dominios de unión incluyen proteínas o restos biológicamente activos, un sitio de unión al antígeno, un dominio de unión al receptor de un ligando, un dominio de unión al ligando de un receptor o un dominio enzimático. En otro ejemplo, el término "resto de unión" se refiere a las moléculas biológicamente activas o porciones de las mismas que se unen a componentes de un sistema biológico (por ejemplo, proteínas en suero o en la superficie de células o en la matriz celular) y cuya unión da como resultado un efecto biológico (por ejemplo, como se midió por un cambio en el resto activo y/o el componente al que se une (por ejemplo, una escisión del resto activo y/o el componente al que se une, la transmisión de una señal o el aumento o la inhibición de una respuesta biológica en una célula o en un sujeto) ) .
Tal como se usa en la presente, el término "dominio de unión al ligando" se refiere a un receptor natural (por ejemplo, receptor de superficie celular) o una región o derivado de la misma que retiene al menos una capacidad de unión al ligando cualitativa y, preferentemente, la actividad biológica del receptor natural correspondiente. Tal como se usa en la presente, el término "dominio de unión al receptor" se refiere a un ligando natural o a una región o derivado de la misma que retiene al menos una capacidad de unión al receptor cualitativa y, preferentemente, la actividad biológica del ligando natural correspondiente. En una modalidad, los polipéptidos de unión de la invención tienen al menos un dominio de unión específico para una molécula diana para la reducción o eliminación, por ejemplo, un antígeno de superficie celular o un antígeno soluble. En modalidades preferidas, el dominio de unión comprende o consiste en un sitio de unión al antígeno (por ejemplo, que comprende una secuencia de cadena pesada variable y secuencia de cadena ligera variable o seis CDR de un anticuerpo colocados en regiones flanqueantes alternativas (por ejemplo, regiones flanqueantes humanas que comprenden opcionalmente una o más sustituciones de aminoácidos) ) .
Tal como se usa en la presente, el término "afinidad de unión" incluye la fuerza de una interacción de unión y, por lo tanto, incluye la afinidad de unión real así como la afinidad de unión aparente. La afinidad de unión real es una proporción de la velocidad de asociación sobre la velocidad de disasociación. Por lo tanto, conferir u optimizar afinidad de unión incluye alterar ambos o algunos de estos componentes para lograr el nivel deseado de afinidad de unión. La afinidad aparente puede incluir, por ejemplo, la avidez de la interacción .
Tal como se usa en la presente, el término "energía libre de unión" incluye su significado reconocido en la técnica y, en particular, como se aplicó al ligando del sitio de unión o interacciones Fc-FcR en un solvente. Las reducciones en la energía libre de unión potencian las afinidades, mientras que los aumentos en la energía libre de unión reducen las afinidades.
El término "especificidad" incluye la cantidad de sitios de unión potenciales que unen específicamente (por ejemplo, inmunorreaccionan con) una diana dada. Un polipéptido de unión puede ser monoespecífico y puede contener uno o más sitios de unión que unen específicamente la misma diana (por ejemplo, el mismo epítopo) o el polipéptido de unión puede ser multiespecífico y puede contener dos o más sitios de unión que unen específicamente regiones diferentes de la misma diana (por ejemplo, epítopos diferentes) o dianas diferentes. En una modalidad, se puede realizar un polipéptido de unión multiespecífico (por ejemplo, un polipéptido biespecífico) que tiene especificidad de unión para más de una molécula diana (por ejemplo, más de un antígeno o más de un epítopo en el mismo antígeno) . En otra modalidad, el polipéptido de unión multiespecífico tiene al menos un dominio de unión específico para una molécula diana para la reducción o eliminación y al menos un dominio de unión específico para una molécula diana en una célula. En otra modalidad, el polipéptido de unión multiespecífico tiene al menos un dominio de unión específico para una molécula diana para la reducción o eliminación y al menos un dominio de unión específico para un fármaco. En aun otra modalidad, el polipéptido de unión multiespecífico tiene al menos un dominio de unión específico para una molécula diana para la reducción o eliminación y al menos un dominio de unión específico para un profármaco. En aun otra modalidad, los polipéptidos de unión multiespecífieos son anticuerpos tetravalentes que tienen dos dominios de unión específicos para una molécula diana y dos sitios de unión específicos para la segunda molécula diana.
Tal como se usa en la presente, el término "valencia" se refiere a la cantidad de dominios de unión potenciales en una proteína o un polipéptido de unión. Cada dominio de unión une específicamente una molécula diana. Cuando un polipéptido de unión comprende más de un dominio de unión, cada dominio de unión puede unir específicamente las mismas moléculas o diferentes (por ejemplo, puede unirse a ligandos diferentes o antígenos diferentes o epítopos diferentes en el mismo antígeno) . En una modalidad, los polipéptidos de unión de la invención son monovalentes. En otra modalidad, los polipéptidos de unión de la invención son multivalentes . En otra modalidad, los polipéptidos de unión de la invención son bivalentes. En otra modalidad, los polipéptidos de unión de la invención son trivalentes. En aun otra modalidad, los polipéptidos de unión de la invención son tetravalentes.
En determinados aspectos, los polipéptidos de unión de la invención utilizan enlazadores polipeptídicos . Tal como se usa en la presente, el término "enlazadores polipeptídicos" se refiere a una secuencia de péptidos o polipéptidos (por ejemplo, una secuencia de péptidos o polipéptidos sintética) que conecta dos dominios en una secuencia de aminoácidos lineal de una cadena polipeptídica . Por ejemplo, los enlazadores polipeptídicos se pueden usar para conectar un sitio de unión a una región Fe (o resto Fe) de un polipéptido Fe de la invención. De preferencia, los enlazadores polipeptídicos proporcionan flexibilidad a la molécula de polipéptidos. Por ejemplo, en una modalidad, un dominio VH o dominio VL se fusiona con o se une a un enlazador polipeptídico y el extremo N o C-terminal del enlazador polipeptídico se une al extremo C o N-terminal de una región Fe (o resto Fe) y el extremo N-terminal del enlazador polipeptídico se une al extremo N o C-terminal del dominio VH o VL) . En determinadas modalidades, el enlazador polipeptídico se usa para conectar (por ejemplo, fusionar genéticamente) dos restos o dominios Fe de un polipéptido scFc. Los enlazadores polipeptídicos también se refieren en la presente como polipéptidos que conectan Fe. Tal como se usa en la presente, el término "polipéptido que conecta Fe" se refiere específicamente a un polipéptido enlazador que conecta (por ejemplo, fusiona genéticamente) dos restos o dominios Fe. Una molécula de unión de la invención puede comprender más de un enlazador peptídico.
Tal como se usa en la presente, el término "polipéptido adecuadamente plegado" incluye polipéptidos (por ejemplo, polipéptidos de unión de la invención) en los que todos los dominios funcionales que comprenden el polipéptido son claramente activos. Tal como se usa en la presente, el término "polipéptido inadecuadamente plegado" incluye polipéptidos en los que al menos uno de los dominios funcionales del polipéptido no es activo. Tal como se usa en la presente, un "polipéptido Fe adecuadamente plegado" o "región Fe adecuadamente plegada" comprende una región Fe (por ejemplo, una región scFc) en la cual al menos dos restos Fe del componente se pliegan adecuadamente de modo que la región Fe resultante comprenda al menos una función efectora.
Tal como se usa en la presente, el término " inmunoglobulina" incluye un polipéptido que tiene una combinación de dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras que posean o no cualquier inmunorreactividad específica relevante. Tal como se usa en la presente, el término "anticuerpo" se refiere a los ensamblajes (por ejemplo, moléculas de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o variantes de los mismos intactos) que tienen actividad inmunorreactiva específica conocida a un antígeno de interés (por ejemplo, un antígeno asociado a un tumor) . Los anticuerpos y las inmunoglobulinas comprenden cadenas pesadas y ligeras, con o sin un enlace covalente intercatenario entre ellos. Las estructuras de inmunoglobulina básicas en sistemas vertebrados se entienden relativamente bien.
Como se describirá con más detalle a continuación, el término genérico "anticuerpo" incluye cinco clases distintas de anticuerpos que se pueden distinguir bioquímicamente. Los restos Fe de cada clase de anticuerpos se encuentran claramente dentro del alcance de la presente invención. La siguiente descripción se dirigirá en general a la clase IgG de moléculas de inmunoglobulina. Con respecto a IgG, las inmunoglobulinas comprenden dos cadenas polipeptídicas ligeras idénticas de peso molecular de aproximadamente 23,000 Daltons y dos cadenas pesadas idénticas de peso molecular 53,000-70,000. Las cuatro cadenas están unidas por enlaces disulfuro en una configuración "Y" donde las cadenas ligeras agrupan las cadenas pesadas comenzando en la boca de la "Y" y continuando a través del dominio variable.
Las cadenas ligeras de una inmunoglobulina se clasifican como kappa o lambda (?,?) . Cada clase de cadena pesada puede estar unida con una cadena ligera kappa o lambda. En general, las cadenas ligera y pesada están unidas covalentemente entre sí y las porciones de "cola" de las dos cadenas pesadas están unidas entre sí por enlaces covalentes disulfuro o enlaces no covalentes donde las inmunoglobulinas se generan por hibridomas, linfocitos o células hospederas modificadas genéticamente. En la cadena pesada, las secuencias de aminoácidos van desde el extremo N-terminal en los extremos bifurcados de la configuración Y hacia el extremo C-terminal al final de cada cadena. Los expertos en la técnica observarán que las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o epsilon, (?, µ, a, d, e) con algunas subclases entre ellos (por ejemplo, ?1-?4) . Es de naturaleza de esta cadena que determina la "clase" del anticuerpo como IgG, IgM, IgA IgG o IgE, respectivamente. Las subclases de inmunoglobulina (isotipos) , por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1( etc. se caracterizan bien y se sabe que confieren especialización funcional. Las versiones modificadas de cada una de estas clases e isotipos son fácilmente discernibles para los expertos en la técnica en vista de la presente descripción y, por consiguiente, se encuentran dentro del alcance de la presente invención.
Tanto la cadena ligera como la pesada se dividen en regiones de homología estructural y funcional. El término "región" se refiere a una parte o porción de una inmunoglobulina simple (como es el caso del término "región Fe") o a una cadena de anticuerpo simple e incluye regiones constantes o regiones variables, así como más partes o porciones separadas de los dominios. Por ejemplo, los dominios variables de cadena ligera incluyen "regiones determinantes de complementariedad" o "CDR" intercaladas entre las "regiones flanqueantes" o "FR", tal como se definió en la presente.
Determinadas regiones de una inmunoglobulina se pueden definir como regiones "constantes" (C) o regiones "variables" (V) , con base en la falta relativa de variación de secuencias dentro de las regiones de varios miembros de clases en el caso de una "región constante" o la variación significativa dentro de las regiones de varios miembros de clases en el caso de una "región variable" . Los términos "región constante" y "región variable" también pueden usarse de manera funcional. En lo que a esto respecta, se observará que las regiones variables de una inmunoglobulina o de un anticuerpo determinan el reconocimiento y la especificidad del antígeno. A la inversa, las regiones constantes de una inmunoglobulina o de un anticuerpo confieren funciones efectoras importantes tales como secreción, movilidad transplacental , unión al receptor Fe, unión al complemento y similares. Se conocen las estructuras de subunidades y la configuración tridimensional de las regiones constantes de las diversas clases de inmunog1obu1ina .
Las regiones variables y constantes de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina se pliegan en dominios. El término "dominio" se refieren a una región globular independientemente plegada de un polipéptido de cadena pesada o ligera que comprende bucles peptídicos (por ejemplo, que comprende de 3 a 4 bucles peptídicos) estabilizados, por ejemplo, mediante lámina plegada ß y/o enlace disulfuro intracatenario . Los dominios de región constante en la cadena ligera de una inmunoglobulina se llaman de manera intercambiable "dominios de región constantes de cadena ligera", "regiones CL" o "dominios CL" . Los dominios constantes en la cadena pesada (por ejemplo, dominios bisagra, CH1, CH2 o CH3 ) se llaman de manera intercambiable "dominios de región constante de cadena pesada", "dominios de región CH" o "dominios CH" . Los dominios variables en la cadena ligera se llaman de manera intercambiable "dominios de región variable de cadena ligera", "dominios de región VL" o "dominios VL" . Los dominios variables en la cadena pesada se llaman de manera intercambiable "dominios de región variable de cadena pesada", "dominios de región VH" o "dominios VH" .
Como es usual, la numeración de los dominios de región constante y variable aumenta a medida que se alejan más del sitio de unión al antígeno o del extremo amino terminal de la inmunoglobulina o del anticuerpo. El extremo N-terminal de cada cadena de inmunoglobulina pesada y ligera es una región variable y e el extremo C-terminal es una región constante; los dominios CH3 y CL comprenden de hecho el extremo carboxi terminal de la cadena pesada y ligera, respectivamente. Por consiguiente, los dominios de una inmunoglobulina de cadena ligera se disponen en una orientación VL-CL, mientras que los dominios de la cadena pesada se disponen en la orientación VH-CHl-bisagra-CH2-CH3.
Las posiciones de aminoácidos en una región constante de cadena pesada, incluyendo posiciones de aminoácidos en los dominios CH1, bisagra, CH2 y CH3 , se enumeran en la presente de acuerdo con el sistema de numeración de índices UE (véase Kabat et al., en "Sequences of Proteins of Immunological Interest" , U.S. Dept . Health and Human Services, 5ta edición, 1991) . Por el contrario, las posiciones de aminoácidos en una región constante de cadena ligera (por ejemplo, dominios CL) se enumeran en la presente de acuerdo con el sistema de numeración de índices de Kabat (véase Kabat et al . , ibid) .
Tal como se usa en la presente, el término "dominio VH" incluye el dominio variable amino terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina y el término "dominio VL" incluye el dominio variable amino terminal de una cadena ligera de inmunoglobulina de acuerdo con el sistema de numeración de índices de Kabat .
Tal como se usa en la presente, el término "dominio CH1" incluye el primer dominio de región constante (más amino terminal) de una cadena pesada de inmunoglobulina que se extiende, por ejemplo, desde aproximadamente las posiciones UE 118-215. El dominio CH1 es adyacente al dominio VH y amino terminal a la región bisagra de una molécula de cadena pesada de inmunoglobulina y no forma parte de la región Fe de una cadena pesada de inmunoglobulina. En una modalidad, un polipéptido de unión de la invención comprende un dominio CH1 derivado de una molécula de cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, una molécula de IgGl o IgG4 humana) .
Tal como se usa en la presente, el término "región bisagra" incluye la porción de una molécula de cadena pesada que une el dominio CH1 al dominio CH2. La región bisagra comprende aproximadamente 25 residuos y es flexible, permitiendo de este modo que las dos regiones de unión al antígeno del extremo N-terminal se muevan independientemente. Las regiones bisagra pueden subdividirse en tres dominios distintos: dominios bisagra superior, medio e inferior (Roux et al. J. Immunol. 1998, 161:4083) .
Tal como se usa en la presente, el término "dominio CH2" incluye la porción de una molécula de inmunoglobulina de cadena pesada que se extiende, por ejemplo, desde aproximadamente las posiciones UE 231-340. El dominio CH2 es único en el sentido de que no está íntimamente emparejado con otro dominio. En cambio, dos cadenas de carbohidratos ramificados enlazadas por N se interponen entre los dos dominios CH2 de una molécula de IgG natural intacta. En una modalidad, un polipéptido de unión de la invención comprende un dominio CH2 derivado de una molécula de IgGl (por ejemplo, una molécula de IgGl humana) . En otra modalidad, un polipéptido de unión de la invención comprende un dominio CH2 derivado de una molécula de IgG4 (por ejemplo, una molécula de IgG4 humana) . En un ejemplo de modalidad, un polipéptido de la invención comprende un dominio CH2 (posiciones UE 231-340) o una porción del mismo.
Tal como se usa en la presente, el término "dominio CH3" incluye la porción de una molécula de inmunoglobulina de cadena pesada que se extiende aproximadamente 110 residuos del extremo N-terminal del dominio CH2 , por ejemplo, desde aproximadamente la posición 341-446b (sistema de numeración UE) . El dominio CH3 forma típicamente la porción del extremo C-terminal del anticuerpo. Sin embargo, en algunas inmunoglobulinas , los dominios adicionales pueden extenderse desde el dominio CH3 para formar la porción del extremo C-terminal de la molécula (por ejemplo, el dominio CH4 en la cadena µ de IgM y la cadena e de IgE) . En una modalidad, un polipéptido de unión de la invención comprende un dominio CH3 derivado de una molécula de IgGl (por ejemplo, una molécula de IgGl humana) . En otra modalidad, un polipéptido de unión de la invención comprende un dominio CH3 derivado de una molécula de IgG4 (por ejemplo, una molécula de IgG4 humana) .
Tal como se usa en la presente, el término "dominio CL" incluye el primer dominio de región constante (más amino terminal) de una cadena ligera de inmunoglobulina que se extiende, por ejemplo, desde aproximadamente la posición Kabat 107A-216. El dominio CL es adyacente al dominio VL. En una modalidad, un polipéptido de unión de la invención comprende un dominio CL derivado de una cadena ligera kappa (por ejemplo, una cadena ligera kappa humana) .
Tal como se indicó anteriormente, las regiones variables de un anticuerpo permiten que reconozca selectivamente y que una específicamente epítopos sobre antígenos. Esto eso, el dominio VL y el dominio VH de un anticuerpo se combinan para formar la región variable (Fv) que define un sitio de unión al antígeno tridimensional. Esta estructura de anticuerpo cuaternaria forma el sitio de unión al antígeno presente al final de cada brazo de la Y. Más específicamente, el sitio de unión al antígeno se define por tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) en cada una de las regiones variables de cadena pesada y ligera.
Tal como se usa en la presente, el término "sitio de unión al antígeno" incluye un sitio que une específicamente (inmunorreacciona con) un antígeno, tal como una superficie celular o antígeno soluble. En una modalidad, el sitio de unión incluye una región variable de cadena ligera y cadena pesada de inmunoglobulina y el sitio de unión formado por estas regiones variables determina la especificidad del anticuerpo. Un sitio de unión al antígeno se forma por las regiones variables que varían de un polipéptido a otro. En una modalidad, un polipéptido de unión de la invención comprende un sitio de unión al antígeno que comprende al menos una CDR de cadena ligera o pesada de una molécula de anticuerpo (por ejemplo, la secuencia que se conoce en la técnica o se describe en la presente) . En otra modalidad, un polipéptido de unión de la invención comprende un sitio de unión al antígeno que comprende al menos dos CDR de una o más moléculas de anticuerpo. En otra modalidad, un polipéptido de unión de la invención comprende un sitio de unión al antígeno que comprende al menos tres CDR de una o más moléculas de anticuerpo. En otra modalidad, un polipéptido de unión de la invención comprende un sitio de unión al antígeno que comprende al menos cuatro CDR de una o más moléculas de anticuerpo. En otra modalidad, un polipéptido de unión de la invención comprende un sitio de unión al antígeno que comprende al menos cinco CDR de una o más moléculas de anticuerpo. En otra modalidad, un polipéptido de unión de la invención comprende un sitio de unión al antígeno que comprende al menos seis CDR de una o más moléculas de anticuerpo. Los ejemplos de moléculas de anticuerpo que comprenden al menos una CDR que se pueden incluir en los polipéptidos de unión objeto de la presente se conocen en la técnica y se describen en la presente ejemplos de moléculas .
Tal como se usa en la presente, el término "CDR" o "región determinante de complementariedad" significa los sitios de unión al antígeno no contiguos encontrados dentro de la región variable de los polipéptidos de cadena ligera y pesada. Estas regiones particulares se han descrito por Kabat et al., J. Biol . Chem. 252, 6609-6616 (1977) y Kabat et al., Sequences of protein of immunological interest. (1991) y por Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) y por MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), donde las definiciones incluyen subconjuntos de residuos de aminoácidos o superposiciones al compararlos entre sí. Se establecen para su comparación los residuos de aminoácidos que abarcan las CDR como se definieron por cada una de las referencias anteriores. De preferencia, el término "CDR" es una CDR como se definió por Kabat basado en comparaciones de secuencia.
Definiciones de CDR Kabat1 Chothia2 acCallum3 CDR1 de VH 31 -35 26 -32 30 -35 CDR2 de VH 50 -65 53 -55 47 -58 CDR3 de VH 95 -102 96 -101 93 -101 CDR1 de vL 24 -34 26 -32 30 -36 CDR2 de vL 50 -56 50 -52 46 -55 CDR3 de vL 89 -97 91 -96 89 -96 -"-La numeración de residuos sigue la nomenclatura de Kabat et al . , supra . 2La numeración de residuos sigue la nomenclatura de Chothia et al., supra. 3La numeración de residuos sigue la nomenclatura de MacCallum et al., supra.
Tal como se usa en la presente, el término "región flanqueante" o "región FR" , incluye los residuos de aminoácidos que forman parte de la región variable, pero no forman parte de las CDR (por ejemplo, usando la definición de las CDR de Kabat) . Por lo tanto, una región flanqueante variable tiene entre aproximadamente 100-120 aminoácidos de longitud pero incluye únicamente aquellos aminoácidos fuera de las CDR. Para el ejemplo específico de una región variable de cadena pesada y para las CDR como las definió Kabat et al., la región flanqueante 1 corresponde al dominio de la región variable que abarca los aminoácidos 1-30; la región flanqueante 2 corresponde al dominio de la región variable que abarca los aminoácidos 36-49; la región flanqueante 3 corresponde al dominio de la región variable que abarca los aminoácidos 66-94 y la región flanqueante 4 corresponde al dominio de la región variable de los aminoácidos 103 al final de la región variable. Las regiones flanqueantes para la cadena ligera están separadas del mismo modo por cada una de las CDR de región variable de cadena ligera. De modo similar, usando la definición de las CDR por Chothia et al . o McCallum et al., los límites de la región flanqueante se separan por los términos de CDR respectivos como se describieron anteriormente. En modalidades, preferidas, las CDR son como se definieron por Kabat .
En anticuerpos de origen natural, las seis CDR presentes en cada anticuerpo monomérico son secuencias cortas y no contiguas de aminoácidos que se colocan específicamente para formar el sitio de unión al antígeno dado que el anticuerpo asume su configuración tridimensional en un ambiente acuoso. El remanente de los dominios variables ligeros y pesados muestra menos variabilidad intermolecular en la secuencia de aminoácidos y se llaman regiones flanqueantes. Las regiones flanqueantes adoptan en gran medida conformación ß-lámina y las CDR forman bucles que conectan y, en algunos casos, forman parte de la estructura ß-lámina. De este modo, estas regiones flanqueantes actúan para formar un andamio que proporciona el posicionamiento de seis CDR en correcta orientación mediante interacciones no covalentes inter-catenarias . El sitio de unión al antígeno formado por las CDR posicionadas define una superficie complementaria al epítopo en el antígeno inmuno eacti o . Esta superficie de complementaria promueve la unión no covalente del anticuerpo al epítopo del antígeno inmunorreactivo . Un experto en la técnica puede identificar fácilmente la posición de las CDR.
En determinadas modalidades, los polipéptidos de unión de la invención comprenden al menos dos dominio de unión al antígeno (por ejemplo, dentro del mismo polipéptido de unión (por ejemplo, en ambos extremos N- y C-terminal de un polipéptido simple) o unido a cada polipéptido de unión componente de una proteína de unión multimérica de la invención) que proporciona asociación del polipéptido de unión con el antígeno seleccionado. Los dominios de unión al antígeno no necesitan derivarse de la misma molécula de inmunoglobulina . En lo que a esto respecta, la región variable puede o no derivarse de cualquier tipo de animal que puede inducirse para montar una respuesta humoral y para generar inmunoglobulinas contra el antígeno deseado. Como tal, la región variable puede, por ejemplo, tener un origen de mamífero, por ejemplo, puede ser humana, murina, de primate no humano (tales como, monos cinomolgos, macacos, etc.), lupina, camélida (por ejemplo, de camellos, llamas y especies relacionadas) .
El término "variante de anticuerpo" o "anticuerpo modificado" incluye un anticuerpo de origen no natural y que tiene una secuencia de aminoácidos o una química de cadena lateral de aminoácidos que difiere de la del anticuerpo derivado naturalmente en al menos un aminoácido o modificación de aminoácido como se describe en la presente. Tal como se usa en la presente, el término "variante de anticuerpo" incluye formas sintéticas de anticuerpos que se alteran de modo que no tengan origen natural, por ejemplo, anticuerpos que comprenden al menos dos porciones de cadena pesada pero no dos cadenas pesadas completas (tales como, anticuerpos de dominio eliminado o minicuerpos) ,- formas multiespecíficas de anticuerpos (por ejemplo, biespecífieos , triespecífieos , etc.) alteradas para unirse a dos o más antígenos diferentes o a epítopos diferentes en un antígeno simple; moléculas de cadena pesada unidas a moléculas scFv; anticuerpos de cadena simple; diacuerpos; triacuerpos y anticuerpos con función efectora alterada y similares.
Tal como se usa en la presente, el término "molécula scFv" incluye moléculas de unión que consisten en un dominio variable de cadena ligera (VL) o porción del mismo y un dominio variable de cadena pesada (VH) o porción del mismo, donde cada dominio variable (o porción del mismo) se deriva de los mismos o distintos anticuerpos. Las moléculas scFv comprenden preferentemente un eniazador scFv interpuesto entre el dominio VH y el dominio VL. Las moléculas scFv se conocen en la técnica y se describen, por ej , en la patente estadounidense 5,892,019, Ho et al. 1989. Gene 77:51; Bird et al. 1988 Science 242:423; Pantoliano et al. 1991. Biochemistry 30:10117; Milenio et al. 1991. Cáncer Research 51:6363; Takkinen et al. 1991. Protein Engineering 4:837.
Tal como se usa en la presente, un "eniazador scFv" se refiere a un resto interpuesto entre los dominios VL y VH del scFv. Los enlazadores scFv mantienen preferentemente la molécula scFv en una conformación de unión al antígeno. En una modalidad, un eniazador scFv comprende o consiste en un enlace peptídico de scFv. En determinadas modalidades, un enlace peptídico de scFv comprende o consiste en un enlace peptídico gly-ser. En otras modalidades, un eniazador de scFv comprende un enlace disulfuro.
Tal como se usa en la presente, el término "eniazador polipeptídico gly-ser" se refiere a un péptido que consiste en residuos de glicina y serina. Un ejemplo de un eniazador peptídico gly/ser comprende la secuencia de aminoácidos (Gly4 Ser)n. En una modalidad, n=l. En una modalidad, n=2. En otra modalidad, n=3, es decir, (Gly4 Ser) 3. En otra modalidad, n=4, es decir, (Gly4 Ser)4. En otra modalidad, n=5. En aun otra modalidad, n=6. En otra modalidad, n=7. En aun otra modalidad, n=8. En otra modalidad, n=9. En aun otra modalidad, n=10. Otro ejemplo de enlazador polipeptídico gly/ser comprende la secuencia de aminoácidos Ser (Gly4Ser) n . En una modalidad, n=l. En una modalidad, n=2. En una modalidad preferida, n=3. En otra modalidad, n=4. En otra modalidad, n=5. En aun otra modalidad, n=6.
Tal como se usa en la presente, el término "cisteína natural" debería referirse a un aminoácido de cisteína que ocurre naturalmente en una posición de aminoácido particular de un polipéptido y que no se ha modificado, introducido o alterado por el hombre. El término "residuo de cisteína modificado o análogo del mismo" o "cisteína modificada o análogo de la misma" debería referirse a un residuo de cisteína no natural o un análogo de cisteína (por ejemplo, análogos que contienen tiol, tal como ácido tiazolin-4-carboxílico y ácido tiazolidin-4-carboxílico ( trioprolina, Th) ) , que se introdujo por medios sintéticos (por ejemplo, mediante técnicas recombinantes , síntesis peptídica in vitro, mediante acoplamiento enzimático o químico de péptidos o alguna combinación de estas técnicas) en una posición de aminoácidos de un polipéptido que contiene naturalmente un residuo de cisteína o análogo del mismo en esa posición.
Tal como se usa en la presente, el término "enlace disulfuro" incluye el enlace covalente formado entre dos átomos de azufre. La cisteína de aminoácido comprende un grupo tiol que puede formar un enlace o puente disulfuro con un segundo grupo tiol. En moléculas de IgG de origen más natural, las regiones CH1 y CL se unen por enlaces disulfuro naturales y las dos cadenas pesadas se unen por dos enlaces disulfuro naturales en posiciones que corresponden a 239 y 242 usando el sistema de numeración de Kabat (posición 226 o 229, sistema de numeración UE) .
Tal como se usa en la presente, el término "cisteína enlazada" debería referirse a un residuo de cisteína natural o modificada dentro de un polipéptido que forma un enlace disulfuro u otro enlace covalente con una segunda cisteína natural o modificada u otro residuo presente dentro del mismo polipéptido u otro diferente. Una "cisteína enlazada intercatenaria" debería referirse a una cisteína enlazada que se une covalentemente a una segunda cisteína presente dentro del mismo polipéptido (es decir, un enlace disulfuro intercatenario) . Una "cisteína enlazada intercatenaria" debería referirse a una cisteína enlazada que se une covalentemente a una segunda cisteína presente dentro de un polipéptido diferente (es decir, un enlace disulfuro intercatenario) .
Tal como se usa en la presente, el término "cisteína libre" se refiere a residuos de aminoácidos de cisteína natural o modificada dentro de una secuencia de polipéptidos (y análogos o miméticos de los mismos, por ejemplo, ácido tiazolin-4 -carboxílico y ácido tiazolidin- -carboxílico (tioprolina, Th) ) que existe en una forma sustancialmente reducida. Las cisteínas libres son preferentemente capaces de modificarse con un resto efector de la invención.
El término "reactivo de modificación por tiol" debería referirse a un agente químico que es capaz de reaccionar selectivamente con el grupo tiol de un residuo de cisteína modificado o análogo del mismo en un polipéptido de unión (por ejemplo, dentro de un enlazador polipeptídico de un polipéptido de unión) y de esa forma proporcionar medios para adición o reticulación química específica al sitio de restos efectores al polipéptido de unión, formando así un polipéptido de unión modificado. De preferencia, el reactivo de modificación por tiol explota el grupo funcional tiol o sulfhidrilo que está presente en un residuo de cisteína libre. Los ejemplos de reactivos de modificación por tiol incluyen maleimidas, alquilo y haluros de arilo, a-haloacilos y disulfuros de piridilo.
El término "resto funcional" incluye restos que, preferentemente, agregan una función deseable al polipéptido de unión. De preferencia, la función se agrega sin alterar significativamente una actividad deseable intrínseca del polipéptido, por ejemplo, la actividad de unión al antígeno de la molécula. Un polipéptido de unión de la invención puede comprender uno o más restos funcionales, que pueden ser iguales o diferentes. Los ejemplos de restos funcionales útiles incluyen, pero no se limitan a, un resto efector, un resto por afinidad y un resto bloqueador.
Los ejemplos de restos bloqueadores incluyen restos de volumen y/o carga estérica suficiente de modo de que ocurra la glicosilación reducida, por ejemplo, mediante bloqueo de la capacidad de una glicosidasa de glicosidar el polipéptido. El resto bloqueador puede, adicional o alternativamente, reducir la función efectora, por ejemplo, mediante inhibición de la capacidad de la región Fe de unir un receptor o proteína del complemento. Los restos bloqueadores preferidos incluyen aductos de cisteína, cisteína, aductos de disulfuro mezclados y restos PEG. Los ejemplos de restos detectables incluyen restos fluorescentes, restos radioisotópicos , restos radiopacos y similares.
Con respecto a la conjugación de restos químicos, el término "resto enlazador" incluye restos que son capaces de unir un resto funcional al remanente del polipéptido de unión. El resto enlazador se puede seleccionar de manera que sea escindible o no escindible. Los restos enlazadores no escindibles tienen en general estabilidad sistémica alta, pero pueden tener también farmacocinética no favorable.
El término 11 resto espaciador" es un resto de no proteína diseñado para introducir espacio en una molécula. En una modalidad, un resto espaciador puede ser una cadena opcionalmente sustituida de 0 a 100 átomos, seleccionados de carbono, oxígeno, nitrógeno, azufre, etc. En una modalidad, el resto espaciador se selecciona de modo que sea soluble en agua. En otra modalidad, el resto espaciador es polialquilenglicol , por ejemplo, polietilenglicol o polipropilenglicol .
Los términos "resto de PEGilación" o "resto PEG" incluye un compuesto de polialquilenglicol o un derivado del mismo, con o sin agentes de acoplamiento o derivación con restos de acoplamiento o activación (por ejemplo, con tiol, triflato, tresilato, azirdina, oxirano o preferentemente con un resto de maleimida, por ejemplo, PEG-maleimida) . Otros compuestos de polialquilenglicol adecuados incluyen, PEG monometoxi maleimido, polipropilenglicol de PEG activado, pero también polímeros cargados o neutrales de los siguientes tipos: dextrano, ácidos colomínicos u otros polímeros basados en carbohidratos, polímeros de aminoácidos y derivados de biotina .
Tal como se usa en la presente, el término "resto efector" (E) puede comprender agentes terapéuticos y de diagnóstico (por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos, lípidos, restos de fármacos y fragmentos de los mismos) con actividad biológica u otra actividad funcional. Por ejemplo, un polipéptido de unión que comprende un resto efector conjugado a un polipéptido de unión tiene al menos una función o propiedad adicional en comparación con el polipéptido sin conjugar. Por ejemplo, la conjugación de un resto de fármaco citotóxico (por ejemplo, un resto efector) con un polipéptido de unión (por ejemplo, a través de su enlazador polipéptidico) da como resultado la formación de un polipéptido modificado con citotoxicidad de fármaco como segunda función (es decir, además de la unión al antígeno) . En otro ejemplo, la conjugación de un segundo polipéptido de unión al primer polipéptido de unión puede conferir propiedades de unión adicionales.
En un aspecto, donde el resto efector es una proteína o ácido nucleico terapéutico o de diagnóstico genéticamente codificado, el resto efector puede sintetizarse o expresarse por síntesis peptídica o métodos de ADN recombinante que se conocen bien en la técnica. En otro aspecto, donde el efector es un péptido no genéticamente codificado o un resto de fármaco, el resto efector puede sintetizarse artificialmente o purificarse a partir de una fuente natural.
Tal como se usa en la presente, el término "resto de fármaco" incluye agentes terapéuticos anti-inflamatorios, anticancerígenos, antiinfecciosos (por ejemplo, antifúngico, antibacterial, antiparasitario, antiviral, etc.) y anestésicos. En una modalidad adicional, el resto de fármaco es un agente anticancerígeno o citotóxico. Los restos de fármacos compatibles también pueden comprender profármacos.
Tal como se usa en la presente, el término "profármaco" se refiere a una forma precursora o derivada de un agente farmacéuticamente activo que es menos activo, reactivo o propenso a efectos colaterales en comparación con el fármaco principal y es capaz de activarse enzimáticamente o, de otro modo, convertirse en una forma más activa in vivo. Los profármacos compatibles con la invención incluyen, pero no se limitan a, profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen aminoácidos, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptidos, profármacos que contienen ß-lactama, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, profármacos de 5 - fluorocitosina y otros 5-fluorouridina que se pueden convertir en el fármaco libre citotóxico más activo. Un experto en la técnica puede realizar modificaciones químicas al resto de fármaco deseado o su profármaco para hacer que las reacciones de ese compuesto sean más convenientes con el .fin de preparar proteínas de unión modificadas de la invención. Los restos de fármacos incluyen también derivados, sales farmacéuticamente aceptables, ésteres, amidas y éteres de los restos de fármacos descritos en la presente. Los derivados incluyen modificaciones a fármacos identificados en la presente que pueden mejorar o no reducir significativamente una actividad terapéutica deseada de un fármaco particular.
Tal como se usa en la presente, el término "agente anticancerígeno " incluye agentes que son perjudiciales para el crecimiento y/o la proliferación de células neoplásicas o tumorales y pueden actuar para reducir, inhibir o destruir la neoplasia. Ejemplos de los agentes incluyen, pero no se limitan a, agentes citostáticos , agentes alquilantes, antibióticos, nucleósidos citotóxicos, agentes de unión a la tubulina, hormonas y antagonistas de hormonas y similares. Cualquier agente que actúa para retardar o ralentizar el crecimiento de células inmunorreactivas o células malignas se encuentra dentro del alcance de la presente invención.
Una "etiqueta de afinidad" o un "resto de afinidad" es un resto químico que se une a uno o más de los polipéptidos de unión, enlazadores peptídicos o resto efector para facilitar su separación de otros componentes durante un procedimiento de purificación. Los ejemplos de dominios de afinidad incluyen la etiqueta His, el dominio de unión a la quitina, dominio de unión a la maltosa, biotina y similares.
Una "resina de afinidad" es una superficie química capaz de unir el dominio de afinidad con alta afinidad para facilitar la separación de la proteína unida al dominio de afinidad de los otros componentes de una mezcla de reacción. Las resinas de afinidad se pueden recubrir en la superficie de un soporte sólido o una porción del mismo. De manera alternativa, la resina de afinidad puede comprender el soporte sólido. Los soportes sólidos pueden incluir una columna de cromatografía modificada, placa de microtitulación, perla o biochip (por ejemplo, oblea de vidrio) . Los ejemplos de resinas de afinidad están comprendidas por níquel, quitina, amilasa y similares.
El término "vector" o "vector de expresión" se usa en la presente para hacer referencia a vectores usados de acuerdo con la presente invención como un vehículo para introducir en y expresar un polinucleótido deseado en una célula. Como ya saben los expertos en la técnica, tales vectores se pueden seleccionar fácilmente a partir del grupo que consiste en plásmidos, fagos, virus y retrovirus. En general, los vectores compatibles con la presente invención comprenderán un marcador de selección, sitios de restricción adecuados para facilitar la clonación del gen deseado y la capacidad de ingresar a y/o replicarse en células eucariotas o procariotas.
A los efectos de esta invención se pueden emplear numerosos sistemas de vector de expresión. Por ejemplo, una clase de vector utiliza elementos de ADN que provienen de virus animales tales como virus de papiloma bovino, virus de papiloma, adenovirus, virus vaccinia, baculovirus, retrovirus, (RSV, MMTV o MOMLV) o virus SV40. Otros implican el uso a sistemas policistrónicos con sitios internos de unión a ribosoma. Los ejemplos de vectores incluyen aquellos descritos en la Patente estadounidense No. 6,159,730 y 6,413,777 y la Solicitud de Patente estadounidense No. 2003 0157641 Al. Además, las células que tienen el ADN integrado en sus cromosomas se pueden seleccionar introduciendo uno o más marcadores que permiten la selección de células hospederas transfectadas . El marcador puede proporcionar prototrofía a un hospedador auxotrófico, resistencia a biocidas (por ejemplo, antibióticos) o resistencia a metales pesados, tales como cobre. El gen marcador seleccionable puede estar unido directamente a las secuencias de ADN para expresarse o introducirse en la misma célula por cotransformación. En una modalidad, se puede utilizar un sistema de expresión inducible. Los elementos adicionales también se pueden necesitar para la síntesis óptima de ARNm. Estos elementos pueden incluir secuencias de señal, secuencias corte y empalme, así como promotores transcripcionales , potenciadores y señales de terminación. En una modalidad, una señal de secreción, por ejemplo, cualquiera de los diversos péptidos líderes de bacterias bien caracterizados (por ejemplo, pelB, phoA u ompA) , pueden fusionarse en el marco con el extremo N-terminal de un polipéptido de la invención para obtener secreción óptima del polipéptido. (Lei et al. (1988), Wature, 331:543; Better et al. (1988) Science, 240:1041; Mullinax et al., (1990). PNAS, 87:8095).
El término "célula hospedera" se refiere a una célula que se ha transformado con un vector construido usando técnicas de ADN recombinante y codificando al menos un gen heterólogo. En las descripciones de procesos para el aislamiento de proteínas de hospedadores recombinantes , los términos "célula" y "cultivo celular" se usan de manera intercambiable para indicar la fuente de proteína a menos que se especifique claramente lo contrario. En otras palabras, la recuperación de proteínas desde las "células" puede significar desde células enteras centrifugadas o desde el cultivo celular que contiene tanto el medio como las células suspendidas. La línea celular hospedera usada para la expresión de proteínas es más preferentemente de origen mamífero. Los expertos en la técnica tienen la capacidad de determinar preferentemente las líneas celulares hospederas particulares que son más aptas para el producto genético deseado a ser expresado allí. Los ejemplos de líneas celulares hospederas incluyen, pero no se limitan a, DG44 y DUXB11 (líneas de ovario de hámster chino, menos DHFR) , HELA (carcinoma cervical humano) , CVI (línea de riñon de mono) , COS (un derivado de CVI con antígeno SV40 T) , R1610 (fibroblasto de hámster chino) , BALBC/3T3 (fibroblasto de ratón) , HAK (línea de riñon de hámster) , SP2/0 (mieloma de ratón), P3x63-Ag3.653 (mieloma de ratón), BFA-lclBPT (células endoteliales bovinas) , RAJI (linfocito humano) y 293 (riñon humano) . Las células CHO son particularmente preferidas. Las líneas celulares de hospedador están típicamente disponibles de los servicios comerciales, American Tissue Culture Collection o de literatura publicada. Los polipéptidos de la invención pueden expresarse también en células que no son de mamífero, tales como bacterias o levadura o células vegetales. En lo que a esto respecta, se observará que también pueden transformarse varios microorganismos no mamíferos unicelulares, tales como bacterias, es decir, aquellos capaces de crecer en cultivos o fermentación. Las bacterias, que son susceptibles a la transformación, incluyen miembros de enterobacteriaceae, tales como cepas de Escherichia coli o Salmonella; Bacillaceae, tales como Bacillus subtilis; Pneumococcus ; Streptococcus y Haemophilus influenzae. También se observará que, cuando se expresan en bacterias, los polipéptidos se vuelven típicamente parte de los cuerpos de inclusión. Los polipéptidos se deben aislar, purificar y luego ensamblar en moléculas funcionales.
Además de los procariotas, también se pueden usar microbios eucariotas . Saccharomyces cerevisiae o levadura de panadero común es la más comúnmente usada entre microorganismos eucariotas pese a que se encuentran comúnmente disponibles una cantidad de otras cepas, incluyendo, Pichia pastoris . Para la expresión en Saccharomyces, el plásmido YRp7, por ejemplo, (Stinchcomb et al., (1979), Nature, 282:39; Kingsman et al., (1979), Gene, 7:141; Tschemper et al., (1980), Gene, 10:157) es comúnmente usado. El plásmido ya contiene el gen TRP1 que proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que no tiene la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1 (Jones, (1977), Genetics, 85:12). La presencia de la lesión trpl como una característica del genoma de célula hospedera de levadura proporciona entonces un entorno efectivo para detectar la transformación por crecimiento en ausencia de triptófano .
La producción in vi tro permite que el aumento proporcione grandes cantidades de los polipéptidos de unión alterados deseados de la invención. Las técnicas de cultivo de células de mamíferos en condiciones de cultivo de tejido se conocen en la técnica e incluyen cultivo de suspensión homogéneo, por ejemplo, en un reactor aerotransportado o en un reactor de agitación continuo o cultivo celular inmovilizado o atrapado, por ejemplo, en fibras huecas, microcápsulas o microperlas de agarosa o cartuchos de cerámica. En caso de ser necesario y/o deseado, las soluciones de los polipéptidos pueden purificarse mediante los métodos de cromatografía normales, por ejemplo, filtración en gel, cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC, cromatografía sobre celulosa en DEAE o cromatografía de afinidad) .
Tal como se usa en la presente, "antígenos asociados con tumor" significa un antígeno que se asocia generalmente con células tumorales, es decir, que ocurren en la misma o mayor medida en comparación con células normales. Más generalmente, los antígenos asociados al tumor comprenden cualquier antígeno que proporciona la localización de anticuerpos inmunorreactivos en una célula neoplásica independientemente de su expresión en células no malignas. Los antígenos pueden ser relativamente específicos del tumor y limitados en su expresión con relación a la superficie de células malignas. De manera alternativa, los antígenos pueden encontrarse en células malignas y no malignas. En determinadas modalidades, los polipéptidos de unión de la presente invención se unen preferentemente a antígenos asociados con el tumor. Por consiguiente, el polipéptido de unión de la invención puede derivarse, generarse o fabricarse de cualquiera de una cantidad de anticuerpos que reaccionan con moléculas asociadas al tumor.
Tal como se usa en la presente, el término "neoplasia" se refiere a un tumor no benigno o un cáncer. Tal como se usa en la presente, el término "cáncer" incluye una neoplasia caracterizada por el crecimiento celular desregulado o no controlado. Los ejemplos de cáncer incluyen: carcinomas, sarcomas, leucemias y linfornas. El término "cáncer" incluye tumores malignos primarios (por ejemplo, aquellos cuyas células no han migrado a sitios en el cuerpo del sujeto además del sitio del tumor original) y tumores malignos secundarios (por ejemplo, aquellos que surgen de metástasis, la migración de células tumorales a sitios secundarios que son diferentes del sitio del tumor original) .
Tal como se usa en la presente, la frase "sujeto que se beneficiaría de la administración de un polipéptido de unión" incluye sujetos, tales como sujetos mamíferos, que se beneficiarían de la administración de polipéptidos de unión usados, por ejemplo, para la detección de un antígeno reconocido por un polipéptido de unión de la invención (por ejemplo, para un procedimiento de diagnóstico) y/o a partir del tratamiento con un polipéptido de unión para reducir o eliminar la diana reconocida por el polipéptido de unión. Por ejemplo, en una modalidad, el sujeto se puede beneficiar de la reducción o eliminación de una molécula soluble o en partículas de la circulación o del suero (por ejemplo, una toxina o patógeno) o de la reducción o eliminación de una población de células que expresan la diana (por ejemplo, células tumorales) . Tal como se describió anteriormente, el polipéptido de unión puede utilizarse en forma no conjugada o puede ser conjugado, por ejemplo, a un fármaco, profármaco o un isótopo, para formar un polipéptido de unión modificado para la administración al sujeto.
El término "pegilación" , "polietilenglicol " o "PEG" incluye un compuesto de polialquilenglicol o un derivado del mismo, con o sin agentes de acoplamiento o derivación con restos de acoplamiento o activación (por ejemplo, con tiol, triflato, tresilato, azirdina, oxirano o preferentemente con un resto de maleimida, por ejemplo, PEG-maleimida) . Otros compuestos de polialquilienglicol adecuados incluyen, pero no se limitan a, PEG monometoxi maleimido, polipropilenglicol PEG activado, pero también polímeros cargados o neutrales de los siguientes tipos: dextrano, ácidos colomínicos u otros polímeros basados en carbohidrato, polímeros de aminoácidos y derivados de biotina.
(II) Polipéptidos Fe principales Los polipéptidos Fe variantes pueden derivarse de polipéptidos Fe principales o de partida conocidos en la técnica. En una modalidad preferida, el polipéptido Fe principal es como un anticuerpo, y preferentemente inmunoglobulina IgG por ejemplo, del subtipo IgGl, IgG2 , IgG3 o IgG4, y preferentemente, del subtipo IgGl o IgG4. El polipéptido Fe principal comprende una región Fe derivada de una inmunoglobulina, pero de manera adicional puede comprender opcionalmente un sitio de unión que está operativamente ligado a o fusionado con la región Fe. En una modalidad preferida, "el polipéptido anterior se une a un antígeno, tal como un ligando, citocina, receptor, antígeno de superficie celular o antígeno de células cancerosas. Aunque los Ejemplos de la presente utilizan un anticuerpo IgG, se entiende que el método puede aplicarse igualmente a una región Fe dentro de cualquier polipéptido Fe. Cuando el polipéptido Fe es un anticuerpo, el anticuerpo puede ser sintético, de origen natural (por ejemplo, de suero) , producido por una línea celular (por ejemplo, un hibridoma) o producido en un organismo transgénico.
En determinadas modalidades, los polipéptidos Fe de la invención comprenden un resto Fe simple de una región Fe. En otras modalidades, el polipéptido Fe es un polipéptido dcFc. Un polipéptido dcFc se refiere a un polipéptido que comprende una región Fe dimérica (o dcFc) . En otras modalidades, los polipéptidos Fe de la invención son polipéptidos scFc. Tal como se usa en la presente, el término polipéptido scFc se refiere a un polipéptido que comprende una región Fe de cadena simple (scFc) , por ejemplo, un polipéptido scFc que comprende al menos dos restos Fe que se fusionan genéticamente, por ejemplo, a través de un enlazador polipeptídico flexible interpuesto entre al menos dos de los restos Fe. Ejemplos de regiones scFc se describen en la Solicitud PCT No. PCT/US2008/006260 , presentada el 14 de mayo de 2008, que se incorpora en la presente a modo de referencia.
En determinadas modalidades, los polipéptidos de la invención pueden comprender una región Fe que comprende restos Fe de la misma o sustancialmente la misma composición de secuencia (en la presente llamada "región Fe homomérica" ) . En otras modalidades, los polipéptidos de la invención pueden comprender una región Fe que comprende al menos dos restos Fe que están formados por diferentes composiciones de secuencias (es decir, en la presente llamada una "región Fe heteromérica" ) . En determinadas modalidades, los polipéptidos de unión de la invención comprenden una región Fe que comprende al menos una inserción o sustitución de aminoácidos. En un ejemplo de modalidad, la región Fe heteromérica comprende una sustitución de aminoácidos en un primer resto Fe, pero no en un segundo resto Fe.
En una modalidad, el polipéptido de unión de la invención puede comprender una región Fe que tiene dos o más de sus restos Fe constituyentes seleccionados independientemente de los restos Fe descritos en la presente. En una modalidad, los restos Fe son los mismos. En otra modalidad, al menos dos de los restos Fe son diferentes. Por ejemplo, los restos Fe de los polipéptidos Fe de la invención comprenden la misma cantidad de residuos de aminoácidos o pueden diferir en longitud por uno o más residuos de aminoácidos (por ejemplo, por aproximadamente 5 residuos de aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o 5 residuos de aminoácidos) , aproximadamente 10 residuos, aproximadamente 15 residuos, aproximadamente 20 residuos, aproximadamente 30 residuos, aproximadamente 40 residuos o aproximadamente 50 residuos) . En aun otras modalidades, los restos Fe pueden diferir en secuencia en o más posiciones de aminoácidos [sic] .
Por ejemplo, al menos dos de los restos Fe pueden diferir en aproximadamente 5 posiciones de aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o 5 posiciones de aminoácidos), aproximadamente 10 posiciones, aproximadamente 15 posiciones, aproximadamente 20 posiciones, aproximadamente 30 posiciones, aproximadamente 40 posiciones o aproximadamente 50 posiciones) .
Los polipéptidos Fe principales pueden ensamblarse juntos o junto con otros polipéptidos para formar polipéptidos Fe multiméricos o proteínas (también llamados en la presente "multímeros " ) . Las proteínas o el polipéptido Fe multimérico de la invención comprenden al menos un polipéptido Fe principal de la invención. Por consiguiente, el polipéptido principal incluye sin limitación polipéptidos o proteínas Fe monoméricos, así como multiméricos (por ejemplo, diméricos, triméricos, tetraméricos y hexaméricos) y similares. En determinadas modalidades, los polipéptidos Fe constituyentes de los multímeros son los mismos (es decir, multímeros homoméricos, por ejemplo, homodímeros, homotrímeros , homotetrámeros) . En otras modalidades, al menos dos polipéptidos Fe constituyentes de las proteínas multiméricas de la invención son diferentes (es decir, multímeros heteroméricos , por ejemplo, heterodímeros , heterotrímeros , heterotetrámeros) . En determinadas modalidades, al menos dos de los polipéptidos Fe son capaces de formar un dímero.
En otra modalidad, un polipéptido Fe de la invención comprende una región Fe dimérica (tanto un polipéptido de cadena simple que forma un dímero como un polipéptido de dos cadenas que forman un dímero) y es monomérico con respecto al resto biológicamente activo presente en la molécula. Por ejemplo, la construcción de Fe puede comprender únicamente un resto biológicamente activo. Se desean construcciones monoméricas de Fe estabilizadas de una o dos cadenas, por ejemplo, cuando no se desea la reticulación de moléculas diana (por ejemplo, en el caso de determinados anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos anti-CD40) . En otra modalidad, la construcción de Fe puede comprender dos restos biológicamente activos diferentes. En aun otra modalidad, la construcción de Fe puede comprender dos de los mismos restos biológicamente activos. En aun otra modalidad, la construcción de Fe puede comprender más de dos de los mismos restos biológicamente activos .
A. Restos Fe Los restos Fe útiles para la producción de polipéptidos Fe principales de la presente invención se pueden obtener a partir de una cantidad de fuentes distintas. En modalidades preferidas, un resto Fe del polipéptido de unión se deriva de una inmunoglobulina humana. Sin embargo, se entiende que el resto Fe puede derivarse de una inmunoglobulina de otra especie de mamífero, incluyendo por ejemplo, especies de roedores (por ejemplo, un ratón, una rata, un conejo, un cobayo) o de primates no humanos (por ejemplo, chimpancé, macaco) . Asimismo, el Fe puede derivarse de cualquier clase de inmunoglobulina, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE y cualquier isotipo de inmunoglobulina, incluyendo IgGl , IgG2 , IgG3 e IgG4. En modalidades preferidas, se usa el isotipo humano IgGl o IgG4.
Se encuentran disponibles una variedad de secuencias génicas de restos Fe (por ejemplo, secuencias génicas de región constante humana) en la forma de depósitos públicamente accesibles. Los dominios de región constante que comprenden una secuencia de resto Fe se pueden seleccionar con una función efectora particular (o sin de una función efectora particular) o con una modificación particular para reducir la inmunogenicidad . Se han publicado varias secuencias de anticuerpos y genes que codifican anticuerpos y se pueden derivar secuencias de restos Fe adecuadas (por ejemplo, bisagra, secuencias CH2 y/o CH3 o porciones de los mismos) de estas secuencias usando las técnicas reconocidas. El material genético obtenido usando cualquiera de los métodos precedentes puede alterarse luego o sintetizarse para obtener polipéptidos Fe de la presente invención. Se observará adicionalmente que el alcance de la presente invención abarca alelos, variantes y mutaciones de secuencias de ADN de región constante.
Las secuencias de restos Fe se pueden clonar, por ejemplo, usando la reacción en cadena de la polimerasa y cebadores que se seleccionan para amplificar el dominio de interés. Para clonar una secuencia de resto Fe de un anticuerpo, se puede aislar el ARNm del hibridoma, bazo o células linfáticas, transcribir de forma inversa en el ADN y amplificar genes de anticuerpo por PCR. Los métodos de amplificación de PCR se describen con detalle en la Patente estadounidense No. 4,683,195; 4,683,202; 4,800,159; 4,965,188 y, por ejemplo, en "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications" Innis et al. eds . , Academic Press, San Diego, CA (1990); Ho et al. 1989. Gene 77:51; Horton et al. 1993. Methods Enzymol . 217:270) . La PCR se puede iniciar por cebadores de región constante unánimes o por cebadores más específicos basados en las secuencias publicadas de ADN de cadena pesada y ligera y de aminoácidos. Tal como se describió anteriormente, la PCR también se puede usar para aislar clones de ADN que codifican las cadenas ligera y pesada de anticuerpos. En este caso se pueden explorar las bibliotecas por cebadores de consenso o sondas homologas más grandes, tales como sondas de región constante de ratón. Varios conjuntos de cebadores adecuados para amplificación de genes de anticuerpos se conocen en la técnica (por ejemplo, cebadores 5' basados en la secuencia del extremo N-terminal de anticuerpos purificados (Benhar and Pastan. 1994. Protein Engineering 7:1509); amplificación rápida de extremos de ADNc (Ruberti, F. et al. 1994. J. Immunol . Methods 173:33); secuencias líderes de anticuerpo (Larrick et al. 1989 Biochem. Biophys . Res. Commun . 160:1250) . La clonación de secuencias de anticuerpos se describe adicionalmente en Newraan et al., Patente estadounidense No. 5,658,570, presentada el 25 de enero de 1995, que se incorporan la presente a modo de referencia .
Los polipéptidos Fe principales de la invención pueden comprender un resto Fe simple o restos Fe múltiples. Cuando hay dos o más restos Fe (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más restos Fe, al menos dos de los restos Fe se asocian para formar una región Fe adecuadamente doblada (por ejemplo, una región Fe dimérica o una región Fe de cadena simple (scFc) ) . En una modalidad, los restos Fe pueden ser de diferentes tipos. En una modalidad, al menos un resto Fe presente en el polipéptido Fe principal comprende un dominio bisagra o una porción del mismo. En otra modalidad, el polipéptido Fe principal comprende al menos un resto Fe que comprende al menos un dominio CH2 o una porción del mismo. En otra modalidad, el polipéptido Fe principal comprende al menos un resto Fe que comprende al menos un dominio CH3 o una porción del mismo. En otra modalidad, el polipéptido Fe principal comprende al menos un resto Fe que comprende al menos un dominio CH4 o porción del mismo. En otra modalidad, el polipéptido Fe principal comprende al menos un resto Fe que comprende al menos un dominio bisagra o una porción del mismo y al menos un dominio CH2 o una porción del mismo (por ejemplo, en la orientación bisagra-CH2) . En otra modalidad, el polipéptido Fe principal comprende al menos un resto Fe que comprende al menos un dominio CH2 o una porción del mismo y al menos un dominio CH3 o una porción del mismo (por ejemplo, en la orientación CH2-CH3). En otra modalidad, el polipéptido Fe principal comprende al menos un resto Fe que comprende al menos un dominio bisagra o una porción del mismo, al menos un dominio CH2 o una porción del mismo y al menos un dominio CH3 o una porción del mismo, por ejemplo, en la orientación bisagra-CH2-CH3 , bisagra-CH3 -CH2 o CH2 -CH3 -bisagra .
En determinadas modalidades, el polipéptido Fe principal comprende al menos una región Fe completa derivada de una o más cadenas pesadas de inmunoglobulina (por ejemplo, un resto Fe incluyendo bisagra, dominios CH2 y CH3 , aunque estos no necesitan derivarse del mismo anticuerpo) . En otras modalidades, el polipéptido Fe principal comprende al menos dos regiones Fe completas derivadas de una o más cadenas pesadas de inmunoglobulina. En modalidades preferidas, el resto Fe completo se deriva de una cadena pesada de inmunoglobulina IgG humana (por ejemplo, IgGl humano o IgG4 humano) .
En otra modalidad, un polipéptido Fe principal comprende al menos un resto Fe que comprende un dominio CH3 completo (aproximadamente aminoácidos 341-438 de una región Fe de anticuerpo de acuerdo con la numeración UE) . En otra modalidad, un polipéptido Fe principal comprende al menos un resto Fe que comprende un dominio CH2 completo (aproximadamente aminoácidos 231-340 de una región Fe de anticuerpo de acuerdo con la numeración UE) . En otra modalidad, un polipéptido Fe principal comprende al menos un resto Fe que comprende al menos un dominio CH3 y al menos una región bisagra (aproximadamente aminoácidos 216-230 de una región Fe de anticuerpo de acuerdo con la numeración UE) y un dominio CH2. En una modalidad, un polipéptido Fe principal comprende al menos un resto Fe que comprende una bisagra y un dominio CH3. En otra modalidad, un polipéptido Fe principal comprende al menos un resto Fe que comprende una bisagra, un dominio CH2 y CH3. En modalidades preferidas, el resto Fe se deriva de una cadena pesada de inmunoglobulina IgG humana.
Los dominios de región constante o porciones de los mismos que forman un resto Fe pueden derivarse de diferentes moléculas de inmunoglobulina. Por ejemplo, un polipéptido Fe principal puede comprender una bisagra y/o dominio CH2 o porción de los mismos derivados de una molécula de IgG4 y una región CH3 o porción de la misma derivada de una molécula de IgGl . En otra modalidad, un polipéptido Fe principal puede comprender un dominio bisagra quimérico. Por ejemplo, la bisagra quimérica puede comprender un dominio bisagra derivado, en parte, de una molécula de IgGl y, en parte, de una molécula de IgG3. En otra modalidad, la bisagra quimérica comprende un dominio bisagra medio de una molécula de IgGl y dominios bisagra superior e inferior de una molécula de IgG4.
Como se estableció en la presente, un experto en la técnica entenderá que un resto Fe principal puede ser idéntico al resto Fe correspondiente de inmunoglobulina de origen natural o puede alterarse de modo que varíe en la secuencia de aminoácidos. En determinadas modalidades, un polipéptido Fe principal se altera, por ejemplo, mediante mutación de aminoácidos (por ejemplo, adición, eliminación o sustitución). Por ejemplo, el polipéptido Fe principal puede ser un resto Fe que tiene al menos una sustitución de aminoácidos en comparación con el Fe de tipo salvaje del cual se deriva el resto Fe. Por ejemplo, cuando el resto Fe se deriva de un anticuerpo IgG humano, una variante comprende al menos una mutación de aminoácidos (por ejemplo, sustitución) en comparación con un aminoácido de tipo salvaje en la posición correspondiente de la región Fe de IgGl humana.
La o las sustituciones de aminoácidos pueden estar ubicadas en una posición dentro del resto Fe llamada "correspondiente" al número de posición que se le daría a ese residuo en una región Fe en un anticuerpo (como se estableció usando la convención de numeración UE) . Un experto en la técnica puede generar fácilmente alineaciones para determinar cuál sería el número UE "correspondiente" a una posición en un resto Fe.
En una modalidad, la sustitución está en una posición de aminoácidos ubicada en un dominio bisagra o porción del mismo. En otra modalidad, la sustitución está en una posición de aminoácidos ubicada en un dominio CH2 o porción del mismo. En otra modalidad, la sustitución está en una posición de aminoácidos ubicada en un dominio CH3 o porción del mismo. En otra modalidad, la sustitución está en una posición de aminoácidos ubicada en un dominio CH4 o porción del mismo.
En determinadas modalidades, el polipéptido Fe principal comprende más de una sustitución de aminoácidos. El polipéptido Fe principal puede comprender, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sustituciones de aminoácidos con relación a una región Fe de tipo salvaje. De preferencia, las sustituciones de aminoácidos se posicionan espacialmente entre sí mediante un intervalo de al menos 1 posición de aminoácidos o más, por ejemplo, al menos, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 posiciones de aminoácidos o más. Más preferentemente, los aminoácidos modificados se posicionan espacialmente entre sí mediante un intervalo de al menos 5, 10, 15, 20 o 25 posiciones de aminoácidos o más.
En determinadas modalidades, la sustitución confiere una alteración de al menos una función efectora impartida por una región Fe que comprende un resto Fe de tipo salvaje (por ejemplo, una reducción en la capacidad de la región Fe de unirse a receptores Fe (por ejemplo, FcyRI , FC/ II o FcYRIII) o proteínas del complemento (por ejemplo, Clq) o de disparar citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) , fagocitosis o citotoxicidad dependiente del complemento .(CDC) ) .
Los polipéptidos Fe principales pueden utilizar sustituciones reconocidas en la técnica que se sabe imparten una alteración de la función efectora. Específicamente, un polipéptido Fe principal de la invención puede incluir, por ejemplo, un cambio (por ejemplo, una sustitución) en una o más de las posiciones de aminoácidos descritos en las Publicaciones de PCT Internacionales WO88/07089A1 , 096/14339A1, O98/05787A1 , W098/23289A1 , W099/51642A1 , W099/58572A1, WO00/09560A2 , O00/32767A1 , WO00/42072A2 , O02/44215A2 , WO02/060919A2 , WO03/074569A2 , WO04/016750A2 , O04/029207A2, WO04/035752A2 , WO04/063351A2 , O04/074455A2 , O04/099249A2, WO05/040217A2 , WO04/044859, O05/070963A1, WO05/077981A2, WO05/092925A2 , O05/123780A2 , O06/019447A1, O06/047350A2 y WO06/085967A2 ; Publicaciones de Patente estadounidenses No. US2007/0231329 , US2007/0231329 , US2007/0237765, US2007/0237766 , US2007/0237767 , US2007/0243188, US20070248603 , US20070286859 , US20080057056 ; o las Patentes estadounidenses 5,648,260; 5,739,277; 5,834,250; 5,869,046; 6,096,871; 6,121,022; 6,194,551; 6,242,195; 6,277,375; 6,528,624; 6,538,124; 6,737,056; 6,821,505; 6,998,253; 7,083,784 y 7,317,091, cuyas partes referentes a las mutaciones Fe se incorporan a la presente a modo de referencia. En una modalidad, el cambio específico (por ejemplo, la sustitución específica de uno o más aminoácidos descritos en la técnica) puede realizarse en una o más de las posiciones de aminoácidos descritas. En otra modalidad, se puede hacer un cambio diferente en una o más de las posiciones de aminoácidos descritas (por ejemplo, la sustitución diferente de una o más posiciones de aminoácidos descritas en la técnica) .
En modalidades preferidas, un polipéptido Fe principal puede comprender un resto Fe que comprende una sustitución de aminoácidos en una posición de aminoácidos que corresponde a una posición de aminoácidos UE que se encuentra dentro de la "Zona de Contacto de 15 Angstroms" de un resto Fe. La Zona de Contacto de 15 Angstroms incluye residuos ubicados en posiciones UE 243 a 261, 275 a 280, 282-293, 302 a 319, 336 a 348, 367, 369, 372 a 389, 391, 393, 408 y 424-440 de un resto Fe de tipo salvaje y longitud completa.
En otra modalidad, un polipéptido Fe principal comprende una región Fe que comprende uno o más restos Fe truncados que no obstante son suficientes para conferir una o más funciones a la región Fe. Por ejemplo, la porción de un resto Fe que se une a FcRn (es decir, la porción de unión a FcRn) comprende de aproximadamente 282-438, numeración UE. De este modo, un resto Fe de un polipéptido Fe principal puede comprender o consistir en una porción de unión a FcRn. Las porciones de unión a FcRn pueden derivarse de cadenas pesadas de cualquier isotipo, incluyendo IgGl, IgG2 , IgG3 e IgG4. En una modalidad, se usa una porción de unión a FcRn de un anticuerpo del isotipo humano IgGl. En otra modalidad, se usa una porción de unión a FcRn de un anticuerpo del isotipo humano IgG4. En determinadas modalidades, la porción de unión a FcRn es aglicosilada . En otras modalidades, la porción de unión a FcRn es glicosilada.
En determinadas modalidades, un polipéptido Fe principal comprende una sustitución de aminoácidos para un resto Fe que altera las funciones efectoras independientes del antígeno del anticuerpo, en particular la semivida circulante del anticuerpo. Los polipéptidos presentan unión tanto aumentada como disminuida a FcRn en comparación con los polipéptidos que no tienen estas sustituciones y, por lo tanto, tienen semivida en suero aumentada o disminuida, respectivamente. Se anticipa que los polipéptidos Fe principales con afinidad mejorada para FcRn tengan semividas en suero más prolongadas y tales moléculas tienen aplicaciones útiles en métodos para el tratamiento de mamíferos, donde se desea la semivida prolongada del polipéptido administrado, por ejemplo, para tratar una enfermedad o un trastorno crónico. En contraste, los polipéptidos Fe principales con afinidad de unión a FcRn disminuida se espera que tengan semividas más cortas y las moléculas también son útiles, por ejemplo, para la administración a un mamífero donde el tiempo de circulación acortado puede ser ventajoso, por ejemplo, para imagenología de diagnóstico in vivo o en situaciones donde el polipéptido de partida tiene efectos colaterales tóxicos presentes en la circulación durante períodos prolongados. También es menos probable que los polipéptidos Fe principales con afinidad de unión a Fc n disminuida crucen la placenta y, de este modo, son útiles también en el tratamiento de enfermedades o trastornos en mujeres embarazadas. De manera adicional, otras aplicaciones en las que puede ser deseable la afinidad de unión a FcRn reducida incluyen aquellas aplicaciones en las que se desea la localización del cerebro, riñon y/o hígado. En un ejemplo de modalidad, los polipéptidos Fe principales presentan transporte reducido a través del epitelio de glomérulos del riñon desde la vascultura. En otra modalidad, los polipéptidos de unión de la invención presentan transporte reducido a través de la barrera hematoencefálica (BBB) desde el cerebro, al espacio vascular. En una modalidad, un polipéptido Fe principal con unión a FcRn alterada comprende al menos un resto Fe (por ejemplo, uno o dos restos Fe) que tiene una o más sustituciones de aminoácidos dentro del "bucle de unión a FcRn" de un resto Fe. El bucle de unión a FcRn comprende residuos de aminoácidos 280-299 (de acuerdo con la numeración UE) de un resto Fe de longitud completa de tipo salvaje. En otras modalidades, un polipéptido Fe principal que tiene afinidad de unión a FcRn alterada comprende al menos un resto Fe (por ejemplo, uno o dos restos Fe) que tiene una o más sustituciones de aminoácidos dentro de la "zona de contacto" FcRn de 15 Á.
Tal como se usa en la presente, el término "zona de contacto" FcRn de 15 Á incluye residuos en las siguientes posiciones de un resto Fe de longitud completa de tipo salvaje: 243-261, 275-280, 282-293, 302-319, 336- 348, 367, 369, 372-389, 391, 393, 408, 424, 425-440 (numeración UE) . En modalidades preferidas, un polipéptido Fe principal que tiene afinidad de unión a FcRn alterada comprende al menos un resto Fe (por ejemplo, uno o dos restos Fe) que tiene una o más sustituciones de aminoácidos en una posición de aminoácidos correspondiente a cualquiera de las siguientes posiciones UE : 256, 277-281, 283-288, 303-309, 313, 338, 342, 376, 381, 384, 385, 387, 434 (por ejemplo, N434A o N434K) y 438. Los ejemplos de sustituciones de aminoácidos con actividad de unión a FcRn alterada se describen en la Publicación PCT Internacional No. O05/047327, que se incorpora en la presente a modo de referencia .
En otras modalidades, un polipéptido Fe principal comprende al menos un resto Fe que tiene un residuo de cisteína modificado o análogo del mismo que se ubica en la superficie expuesta al solvente. Un residuo de cisteína modificado preferente o análogo del mismo no interfiere con una función efectora conferida por la región Fe. En modalidades preferidas, los polipéptidos Fe comprenden un resto Fe que comprende al menos un residuo de cisteína libre modificado o análogo del mismo que está sustancialmente libre de enlace disulfuro con un segundo residuo de cisteína. En modalidades preferidas, los polipéptidos Fe pueden comprender un resto Fe que tenga residuos de cisteína modificados o análogos de los mismos en una o más de las siguientes posiciones en el dominio CH3 : 349-371, 390, 392, 394-423, 441-446 y 446b (numeración UE) . En modalidades más preferidas, los polipéptidos Fe comprenden una variante de Fe que tiene residuos de cisteína modificados o análogos de los mismos en cualquiera de las siguientes posiciones: 350, 355, 359, 360, 361, 389, 413, 415, 418, 422, 441, 443 y posición UE 446b (numeración UE) . Cualquiera de los residuos de cisteína modificados o análogos de los mismos anteriores pueden posteriormente conjugarse con un resto funcional usando técnicas reconocidas en la técnica (por ejemplo, se pueden conjugar con un enlazador heterobifuncional reactivo con tiol) .
B. Polipéptidos Fe sin efectores En determinadas modalidades, los polipéptidos Fe principales son polipéptidos Fe "sin efectores" con función efectora alterada o reducida. De preferencia, la función efectora que está reducida o alterada es una función efectora dependiente del antígeno. Por ejemplo, un polipéptido Fe principal puede comprender una variación de secuencia (por ejemplo, una sustitución de aminoácidos) que reduce las funciones efectoras dependientes del antígeno del polipéptido, en particular ADCC o activación del complemento, por ejemplo, en comparación con un polipéptido Fe de tipo salvaje. Desafortunadamente, los polipéptidos Fe principales tienen muchas veces estabilidad reducida, la que los hace candidatos ideales para la estabilización de acuerdo con los métodos de la invención.
Se espera que los polipéptidos Fe con afinidad de unión a FcyR disminuida reduzcan la función efectora y las moléculas también son útiles, por ejemplo, para el tratamiento de afecciones en las que la destrucción de células diana no son deseables, por ejemplo, donde las células normales pueden expresar moléculas diana o donde la administración crónica del polipéptido puede dar como resultado una activación no deseada del sistema inmune. En una modalidad, el polipéptido Fe presenta una reducción en al menos una función efectora dependiente del antígeno seleccionada del grupo que consiste en opsonización, fagocitosis, citotoxicidad dependiente del complemento, citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) o modulación celular efectora, en comparación con un polipéptido Fe que comprende una región Fe de tipo salvaje. En una modalidad el polipéptido Fe presenta unión alterada a un FcyR activador (por ejemplo, FcyRI , FcyRIla o FcyRIIIa) . En otra modalidad, el polipéptido Fe presenta afinidad de unión alterada a un FcyR inhibidor (por ejemplo, FcYRIIb) . En otras modalidades, un polipéptido Fe con afinidad de unión a FcyR disminuida (por ejemplo, afinidad de unión a FcyRI , FcyRII o FcyRIIIa disminuida) comprende a menos un resto Fe (por ejemplo, uno o dos restos Fe) que tiene una sustitución de aminoácidos en una posición de aminoácidos que corresponde a una o más de las siguientes posiciones: 234, 236, 239, 241, 251, 252, 261, 265, 268, 293, 294, 296, 298, 299, 301, 326, 328, 332, 334, 338, 376, 378 y 435 (numeración UE) . En otras modalidades, un polipéptido Fe con afinidad de unión al complemento disminuida (por ejemplo, afinidad de unión a Clq disminuida) comprende un resto Fe (por ejemplo, uno o dos restos Fe) que tiene una sustitución de aminoácidos en una posición de aminoácidos que corresponde a una o más de las siguientes posiciones: 239, 294, 296, 301, 328, 333 y 376 (numeración UE) . Los ejemplos de sustituciones de aminoácidos con actividad de unión al complemento o FcyR alterado se describen en la Publicación PCT Internacional No. O05/063815, que se incorpora en la presente a modo de referencia. En determinadas modalidades preferidas, un polipéptido de unión de la invención puede comprender una o más de las siguientes sustituciones específicas: S239D, S239E, M252T, H268D, H268E, I332D, I332E, N434A y N434K (es decir, una o más de estas sustituciones en una posición de aminoácidos que corresponde a una o más de estas posiciones numeradas UE en una región Fe del anticuerpo) .
En determinados ejemplos de modalidades, la función efectora del polipéptido "sin efector" principal puede ser alterada o reducida debido a una región Fe aglicosilada dentro del polipéptido Fe principal. En determinadas modalidades, la región Fe aglicosilada se genera mediante sustitución de aminoácidos que altera la glicosilación de la región Fe. Por ejemplo, la asparagina en la posición UE 297 dentro de la región Fe puede ser alterada (por ejemplo, mediante sustitución, inserción, eliminación o mediante modificación química) para inhibir su glicosilación. En otro ejemplo de modalidad, el residuo de aminoácidos en la posición UE 299 (por ejemplo, Treonina (T) ) se sustituye con (por ejemplo, con Alanina (A) ) para reducir la glicosilación en el residuo adyacente 297. Los ejemplos de sustituciones de aminoácidos que reducen o alteran la glicosilación se describen en la Publicación PCT Internacional No. WO05/018572 y la Publicación de Patente estadounidense No. 2007/0111281, que se incorporan en la presente a modo de referencia. En otras modalidades, la región Fe aglicosilada se genera mediante remoción enzimática o química de oligosacáridos o expresión del polipéptido Fe en una célula hospedera que no es capaz de glicosilar la región Fe (por ejemplo, una célula hospedera bacteriana o una célula hospedera de mamífero con maquinaria de glicosilación alterada) .
En determinadas modalidades, la región Fe aglicosilada es parcialmente aglicosilada o hemi -glicosilada . Por ejemplo, la región Fe puede comprender un primer resto Fe glicosilado (por ejemplo, una región CH2 glicosilada) y un segundo resto Fe aglicosilado (por ejemplo, una región CH2 aglicosilada) . En otras modalidades, la región Fe puede estar completamente aglicosilada, es decir, ninguno de sus restos Fe son glicosilados .
La región Fe aglicosilada de un polipéptido "sin efector" puede ser de cualquier isotipo de IgG (por ejemplo, IgGl, IgG2 , IgG3 o IgG4) . En un ejemplo de modalidad, el polipéptido Fe principal puede comprender la región Fe aglicosilada de un anticuerpo IgG4 , tal como "IgG4.P agli". IgG4. P agli es una forma modificada de un anticuerpo IgG4 que incluye una sustitución de prolina (Ser228Pro) en la región bisagra y una mutación Thr299Ala en el dominio CH2 para producir una región Fe aglicosilada (numeración UE) . IgG4. P agli ha demostrado no tener función efectora inmune medible in vitro. En otro ejemplo de modalidad, el polipéptido Fe principal comprende la región Fe aglicosilada de un anticuerpo IgGl, tal como "IgGl agli". IgGl agli es una forma aglicosilada de IgGl de inmunoglobulina IgG con una mutación Thr299Ala (numeración UE) que confiere un perfil de función efectora bajo. Ambos anticuerpos IgG4. P agli e IgGl agli representan una clase importante de reactivos terapéuticos donde no se desea la función efectora inmune.
En determinados ejemplos de modalidades, el polipéptido Fe principal "sin efector" comprende una región Fe que se deriva de un anticuerpo IgG4. La región Fe IgG4 puede ser idéntica a la región Fe de tipo salvaje o puede tener una o más modificaciones a la secuencia de IgG4 de tipo salvaje. Los polipéptidos Fe tipo IgG4 tienen función efectora reducida como resultado de la capacidad inherentemente reducida de un anticuerpo IgG4 para unirse al complemento y/o receptores Fe. Los polipéptidos Fe principales del isotipo IgG4 pueden ser glicosilados o aglicosilados . Asimismo, la región Fe de un polipéptido Fe tipo IgG4 puede comprender el resto Fe completo de un anticuerpo IgG4 o puede comprender un resto Fe quimérico donde una porción del resto Fe es de un anticuerpo IgG4 y el remanente es de un anticuerpo de otro isotipo. En un ejemplo de modalidad, el resto Fe quimérico comprende un dominio CH3 de un anticuerpo IgGl y un dominio CH2 de un anticuerpo IgG4. En otra modalidad, el anticuerpo lgG4 comprende una bisagra quimérica, donde los dominios bisagra superior e inferior son de un anticuerpo IgG4 pero el dominio bisagra medio es de un anticuerpo IgGl como resultado de una sustitución de prolina (Ser228Pro) en la región bisagra. En aun otra modalidad, el anticuerpo IgG4 quimérico principal comprende una bisagra quimérica, donde los dominios bisagra superior e inferior son de un anticuerpo IgG4 pero el dominio bisagra medio es de un anticuerpo IgGl como resultado de una sustitución de prolina (Ser228Pro) en la región bisagra, un dominio CH1 de un anticuerpo IgGl o IgG4, un dominio CH2 (o posiciones 292-340, numeración UE) de un anticuerpo IgG4 y un dominio CH1CH3 de un anticuerpo IgGl.
En determinadas modalidades, la función efectora reducida de un polipéptido de "sin efector" es una unión reducida a un receptor Fe (FcR) , tal como el receptor FC/RI , FcyRII, FC/RIII y/o Fc IIIb o una proteína del complemento, por ejemplo, la proteíná del complemento Clq. Este cambio en la unión puede ser por un factor de aproximadamente 1 vez o más, por ejemplo, por aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 50 o 100 veces o más o por cualquier intervalo del mismo. Estas disminuciones en la función efectora, por ejemplo, la unión de Fe a un receptor Fe o proteína del complemento, se calculan fácilmente con base, por ejemplo, en las reducciones porcentuales en la actividad de unión determinadas usando los ensayos descritos en la presente o ensayos conocidos en la técnica.
En una modalidad de la invención un polipéptido Fe estabilizado comprende una región Fe de cadena simple. Las regiones Fe de cadena simple se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, WO200801243, WO2008131242 ; WO2008153954 ) y se pueden realizar usando métodos conocidos. Los aminoácidos estabilizadores, como se describen en la presente, pueden incorporarse en uno o más restos Fe de las construcciones usando métodos conocidos por los expertos en la técnica. Las regiones Fe de cadena simple o regiones Fe genéticamente fusionadas son regiones Fe sintéticas que comprenden dominios Fe (o restos Fe) genéticamente unidos dentro de una cadena polipeptídica simple (es decir, codificadas en una secuencia genética contigua simple) . Por consiguiente, una región Fe genéticamente fusionada (es decir, una región scFc) es monomérica en el sentido de que comprende una cadena polipeptídica y aun así las porciones adecuadas de la molécula se dimerizan para formar una región Fe. Se entenderá que las enseñanzas en la presente con relación a los restos Fe se aplican en los dímeros Fe de dos cadenas y dímeros Fe de cadena simple. Por ejemplo, cualquier tipo de construcciones de regiones Fe pueden derivarse de, por ejemplo, un anticuerpo IgGl o IgG4 o pueden ser quiméricas (por ejemplo, que comprende una bisagra quimérica y/o que comprende un dominio CH2 de un anticuerpo IgG4 y un dominio CH3 de un anticuerpo IgGl .
(III). Polipéptidos Fe variantes con regiones Fe estabilizadas En determinados aspectos, la invención proporciona polipéptidos Fe variantes que comprenden secuencias de aminoácidos que son variantes de cualquiera de los polipéptidos Fe principales descritos anteriormente. En particular, los polipéptidos Fe variantes de la invención comprenden una región Fe (o resto Fe) con una secuencia de aminoácidos que se deriva de la región Fe (o resto Fe) de un polipéptido Fe principal. De preferencia, el polipéptido Fe variante difiere del polipéptido Fe principal por la presencia de al menos una de las mutaciones de Fe estabilizadoras descritas en la presente. En determinadas modalidades, la variante de Fe puede comprender alteraciones de secuencias de aminoácidos adicionales. En modalidades preferidas, la variante de Fe tendrá estabilidad potenciada en comparación con el polipéptido Fe principal y, opcionalmente , función efectora alterada en comparación con el polipéptido Fe principal. Por ejemplo, el polipéptido Fe variante puede tener una función efectora dependiente del antígeno que es equivalente o menor a la función efectora dependiente del antígeno (por ejemplo, ADCC y/o CDC) del polipéptido Fe principal. De manera adicional o alternativa, el polipéptido Fe variante puede tener una función efectora independiente del antígeno (por ejemplo, semivida extendida) con relación al polipéptido Fe principal.
En determinadas modalidades, el polipéptido Fe variante comprende una región Fe (o resto Fe) que es esencialmente idéntica a la región Fe de un polipéptido Fe principal (resto Fe) salvo por una o más mutaciones (por ejemplo, aproximadamente 1 a aproximadamente 20, aproximadamente 1 a aproximadamente 15, aproximadamente 1 a aproximadamente 10, aproximadamente 1 a aproximadamente 5 , aproximadamente 1 a aproximadamente 4 , aproximadamente 1 a aproximadamente 3 , aproximadamente 2 a aproximadamente 20, aproximadamente 2 a aproximadamente 15, aproximadamente 2 a aproximadamente 10, aproximadamente 5 a aproximadamente 20 o aproximadamente 5 a aproximadamente 10) mutaciones con relación al polipéptido principal o de partida, por ejemplo, uno o más residuos de aminoácidos que se han sustituido con otro residuo de aminoácidos o que tiene una o más inserciones o eliminaciones de residuos de aminoácidos. En determinadas modalidades, el polipéptido Fe variante tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 mutaciones con relación al polipéptido de partida. De preferencia, el polipéptido variante comprende una secuencia de aminoácidos que no es de origen natural .
Las variantes tienen necesariamente menos de 100% de identidad de secuencia o de similitud con el polipéptido de partida. En una modalidad preferida, la variante tendrá una secuencia de aminoácidos de aproximadamente 75% a menos de 100% de identidad o similitud de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos del polipéptido de partida, más preferentemente de aproximadamente 80% a menos de 100%, más preferentemente de aproximadamente 85% a menos de 100%, más preferentemente de aproximadamente 90% a menos de 100% (por ejemplo, 91-99%, 92-99%, 93-99%, 94-99%, 95-99%, 96-99%, 97-99%, 98-99% o 99%) y más preferentemente de aproximadamente 95% a menos de 100%, por ejemplo, sobre la longitud completa de la molécula variante o una porción de la misma (por ejemplo, una región Fe o resto Fe) . En una modalidad, existe una diferencia de aminoácidos entre la secuencia de polipéptidos de partida (por ejemplo, la región Fe de un polipéptido Fe principal) y la secuencia derivada del mismo (por ejemplo, la región Fe de un polipéptido Fe variante) .
En determinadas modalidades, los polipéptidos Fe variantes de la invención son polipéptidos Fe estabilizados. Esto es, los polipéptidos estabilizados comprenden al menos una variación o mutación de secuencia, que es mutación Fe estabilizadora . Tal como se usa en la presente, el término "mutación Fe estabilizadora" incluye una mutación dentro de una región Fe de un polipéptido Fe variante que confiere un polipéptido Fe principal con estabilidad de proteína potenciada (por ejemplo, estabilidad térmica) en comparación con el polipéptido del cual se deriva. De preferencia, la mutación estabilizadora comprende la sustitución de un aminoácido desestabilizador en una región Fe con un aminoácido de reemplazo que confiere estabilidad de proteína potenciada (en la presente un "aminoácido estabilizador") a la región Fe.
En una modalidad, un polipéptido Fe estabilizado de la invención comprende una o más mutaciones Fe estabilizadoras de aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 mutaciones estabilizadoras) . Las mutaciones Fe estabilizadoras se introducen preferentemente en un dominio CH2 , un dominio CH3 o ambos dominios CH2 y CH3 de una región Fe .
En determinados ejemplos de modalidades, un polipéptido Fe variante de la invención es una variante estabilizada de un polipéptido Fe principal "sin efector" descrito anteriormente. Esto es, la variante estabilizada tiene estabilidad potenciada con relación al "polipéptido Fe principal sin efector" . En un ejemplo de modalidad, el polipéptido Fe variante es una variante estabilizada de un polipéptido Fe principal que comprende la región Fe aglicosilada de un anticuerpo IgGl, por ejemplo, una región Fe IgGl aglicosilada que comprende una mutación T299A (numeración UE) . En otro ejemplo de modalidad, el polipéptido Fe variante es una variante estabilizada de un polipéptido Fe principal que comprende la región Fe de un anticuerpo IgG4 glicosilado o aglicosilado . Por ejemplo, el polipéptido Fe variante puede comprender una mutación estabilizadora en una región Fe derivada de un anticuerpo "IgG4. P agíi" .
De preferencia, los polipéptidos Fe estabilizados de la invención presentan estabilidad potenciada en comparación con el polipéptido Fe variante en condiciones de medición idénticas. Se reconocerá, sin embargo, que el grado al cual la estabilidad del polipéptido variante de Fe se potencia con relación a su polipéptido Fe principal puede variar en las condiciones de medición elegidas. Por ejemplo, la mejora de la estabilidad se puede observar en un pH particular, por ejemplo, un pH ácido, neutral o básico. En una modalidad, la estabilidad potenciada se observa en un pH ácido de menos de aproximadamente 6.0 (por ejemplo, aproximadamente 6.0, aproximadamente 5.5, aproximadamente 5.0, aproximadamente 4.5 o aproximadamente 4.0). En otra modalidad, la estabilidad potenciada se observa en un pH neutro de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 8.0 (por ejemplo, aproximadamente 6.0, aproximadamente 6.5, aproximadamente 7.0, aproximadamente 7.5, aproximadamente 8.0). En otra modalidad, la estabilidad potenciada se observa en un pH básico de aproximadamente 8.0 a aproximadamente 10.0 (por ejemplo, aproximadamente 8.0, aproximadamente 8.5, aproximadamente 9.0, aproximadamente 9.5, aproximadamente 10.0) .
La estabilidad térmica potenciada del polipéptido Fe variante se puede evaluar, por ejemplo, usando cualquiera de los métodos descritos a continuación. En determinadas modalidades, los polipéptidos Fe estabilizados tienen regiones Fe (o restos Fe) con una estabilidad térmica (por ejemplo, un temperatura de fusión o Tm) que es mayor a aproximadamente 0.1, aproximadamente 0.25, aproximadamente 0.5, aproximadamente 0.75, aproximadamente 1, aproximadamente 1.25, aproximadamente 1.5, aproximadamente 1.75, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14, aproximadamente 15, aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18, aproximadamente 19, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 40 o aproximadamente 50 grados Celsius mayor que el polipéptido principal del cual se deriva.
En determinadas modalidades, las variantes . de polipéptidos Fe estabilizados de la invención se expresan como una proteína soluble monomérica no es mayor a 25% en forma dimérica, tetramérica o de otro modo agregada (por ejemplo, menos de aproximadamente 25%, aproximadamente 20%, aproximadamente 15%, aproximadamente 10% o aproximadamente 5%) .
En otras modalidades, los polipéptidos Fe estabilizados tienen una T50 mayor a 40°C (por ejemplo, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49°C o más) en un ensayo de prueba térmico (véase la Solicitud de Patente estadounidense No. 11/725,970, que se incorpora en la presente a modo de referencia, así como también el Ejemplo 2, a continuación). En modalidades más preferidas, las moléculas de Fe estabilizadas de la invención tienen una T50 mayor a 50°C (por ejemplo, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58°C o más) . En modalidades más preferidas, las moléculas de Fe estabilizadas de la invención tienen una T50 mayor a 60°C (por ejemplo, 60, 61, 62, 63, 64, 65°C o más). Aun en modalidades más preferidas, las moléculas de Fe estabilizadas de la invención tienen una T50 mayor a 65 °C (por ejemplo, 65, 66, 67, 68, 69, 70°C o más) . Aun en modalidades más preferidas, las moléculas de Fe estabilizadas de la invención tienen una T50 mayor a 70°C (por ejemplo, 70, 71, 73, 74, 75°C o más) .
En determinadas modalidades, las moléculas de Fe estabilizadas de la invención tienen dominios CH2 con valores de Tm mayores a aproximadamente 60°C (por ejemplo, aproximadamente 61, 62, 63, 64, 65°C o mayores), mayores a 65°C (por ejemplo, 65, 66, 67, 68, 69°C o mayores) o mayores a aproximadamente 70°C (por ejemplo, 71, 72, 73, 74, 75°C o mayores). En otras modalidades, las moléculas de Fe estabilizadas de la invención tienen dominios CH3 con valores de Tm mayores a aproximadamente 70°C (por ejemplo, 71, 72, 73, 74, 75°C o mayores), mayores a aproximadamente 75°C (por ejemplo, 76, 77, 78, 79, 80°C o mayores) o mayores a 80°C (por ejemplo, 81, 82, 83, 84, 85 °C o mayores) . En modalidades particulares, los polipéptidos Fe estabilizados son variantes de un polipéptido Fe principal que comprende una región Fe aglicosilada o de glicosilación de un anticuerpo IgG4 (por ejemplo, IgG4. P agli) . En otras modalidades, los polipéptidos Fe estabilizados son variantes de un polipéptido Fe principal que comprende una región Fe aglicosilada de un anticuerpo IgGl (por ejemplo, IgGl agli) . En aun otras modalidades, la molécula de Fe estabilizada de la invención tiene una región Fe o resto Fe (por ejemplo, un dominio CH2 y/o CH3) con una estabilidad térmica que es sustancialmente la misma o mayor que la del anticuerpo IgGl glicosilado.
En determinadas modalidades, los polipéptidos Fe variantes de la invención dan como resultado una agregación reducida en comparación con los polipéptidos Fe principales de los que se derivan. En una modalidad, una molécula de Fe estabilizada producida por los métodos de la invención tiene una disminución en la agregación de al menos 1% con relación a la molécula de Fe principal. En otras modalidades, el polipéptido Fe estabilizado tiene una disminución en la agregación de al menos 2%, al menos 5%, al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 50%, al menos 75% o al menos 100%, con relación a la molécula principal.
En otras modalidades, los polipéptidos Fe estabilizados de la invención dan como resultado una estabilidad a largo plazo o tiempo de durabilidad aumentado en comparación con los polipéptidos Fe principales de los que se derivan. En una modalidad, una molécula de fe estabilizada producida por los métodos de la invención tiene un aumento en el tiempo de durabilidad de al menos 1 día con relación a la molécula de unión no estabilizada. Esto quiere decir que una preparación de polipéptidos Fe estabilizados tiene sustancialmente la misma cantidad de polipéptidos Fe variantes biológicamente activos como se presentan en día anterior y la preparación no tiene ninguna agregación o descomposición apreciable del polipéptido variante. En otras modalidades, la molécula de Fe estabilizada tiene un aumento en el tiempo de durabilidad de al menos 2 días, al menos 5 días, al menos 1 semana, al menos 2 semanas, al menos 1 mes, al menos 2 meses, al menos 6 meses o al menos 1 año, con relación a la molécula de Fe no estabilizada .
En determinadas modalidades, los polipéptidos Fe estabilizados de la invención se expresan en un rendimiento aumentado en comparación con sus polipéptidos Fe principales. En una modalidad, un polipéptido Fe estabilizado de la invención tiene un aumento en el rendimiento de al menos 1% con relación a la molécula de Fe principal. En otras modalidades, el polipéptido Fe estabilizado tiene un aumento en el rendimiento de al menos 2%, al menos 5%, al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 50%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 100%, con relación a la molécula de Fe principal.
En ejemplos de modalidades, los polipéptidos Fe estabilizados de la invención se expresan en rendimientos aumentados (en comparación con sus polipéptidos Fe principales) en una célula hospedera, por ejemplo, una célula hospedera bacteriana o eucariota (por ejemplo, de levadura o mamífero) . Los ejemplos de células hospederas de mamífero que se pueden usar para expresar una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido Fe estabilizado de la invención incluyen células de ovario de hámster chino (CHO) , células HELA (carcinoma cervical humano) , células CVI (línea de riñon de mono) , células COS (un derivado de CVI con antígeno SV40 T) , células R1610 (fibroblasto de hámster chino) , células BALBC/3T3 (fibroblasto de ratón) , células HAK (línea de riñon de hámster) , células SP2/0 (mieloma de ratón) , células BFA-lclBPT (células endoteliales bovinas) , células RAJI (linfocito humano), PER.C6® (línea celular derivada de retina humana, Crucell, Países Bajos) y células 293 (riñon humano).
En otras modalidades, los polipéptidos Fe estabilizados de la invención se expresan en rendimientos aumentados (con relación a sus polipéptidos Fe principales) en una célula hospedera en condiciones a gran escala (por ejemplo, escala comercial) . En ejemplos de modalidades, la molécula de Fe estabilizada tiene un rendimiento aumentado cuando se expresa en al menos 10 litros de medio de cultivo. En otras modalidades, una molécula de unión a fe estabilizada tiene un aumento en rendimiento cuando se expresa de una célula hospedera en al menos 20 litros, al menos 50 litros, al menos 75 litros, al menos 100 litros, al menos 200 litros, al menos 500 litros, al menos 1000 litros, al menos 2000 litros, al menos 5,000 litros o al menos 10,000 litros de medio de cultivo. En un ejemplo de modalidad, se producen al menos 10 mg (por ejemplo, 10 mg, 20 mg, 50mg o lOOmg) de una molécula de Fe estabilizada por cada litro de medio de cultivo. (a) Aminoácidos de Fe estabilizadores En determinadas modalidades, las moléculas de Fe estabilizadas de la invención comprenden uno o más de los siguientes aminoácidos Fe estabilizadores en las posiciones indicadas (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más mutaciones Fe estabilizadoras) que se seleccionan independientemente del grupo que consiste en: a) una sustitución de un aminoácido en la posición UE 240, por ejemplo, con fenilalanina (240F) , b) sustitución de un aminoácido (por ejemplo, valina) en la posición UE 262, por ejemplo, con leucina (262L) ; c) sustitución de un aminoácido (por ejemplo, valina) en la posición UE 266, por ejemplo, con fenilalanina (266F) ; d) sustitución de un aminoácido (por ejemplo, treonina) en la posición UE 299, por ejemplo, con lisina (299K) ; e) sustitución de un aminoácido (por ejemplo, treonina) en la posición UE 307, por ejemplo, con prolina (307P) ; f) sustitución de un aminoácido (por ejemplo, leucina) en la posición UE 309, por ejemplo, con lisina (309K) , metionina (309M) o prolina (309P) ; g) una sustitución de un aminoácido (por ejemplo, valina) en la posición UE 323, por ejemplo, con fenilalanina (323F) ; h) una sustitución de un aminoácido (por ejemplo, ácido aspártico) en la posición UE 399, por ejemplo, con serina (399S) ; i) una sustitución de un aminoácido (por ejemplo, arginina) en la posición UE 409, por ejemplo, con lisina (409K) o metionina (409L) y j) una sustitución de un aminoácido (por ejemplo, valina) en la posición UE 427, por ejemplo, con fenilalanina (427F) .
En un ejemplo de modalidad, el polipéptido Fe estabilizado comprende una mutación de Fe estabilizada (a) .
En otro ejemplo de modalidad, el polipéptido Fe estabilizado comprende una mutación de Fe estabilizada (b) .
En otro ejemplo de modalidad, el polipéptido Fe estabilizado comprende una mutación de Fe estabilizada (c) .
En otro ejemplo de modalidad, el polipéptido Fe estabilizado comprende una mutación de Fe estabilizada (d) .
En otro ejemplo de modalidad, el polipéptido Fe estabilizado comprende una mutación de Fe estabilizada (e) .
En otro ejemplo de modalidad, el polipéptido Fe estabilizado comprende una mutación de Fe estabilizada (f ) .
En otro ejemplo de modalidad, el polipéptido Fe estabilizado comprende una mutación de Fe estabilizada (g) .
En otro ejemplo de modalidad, el polipéptido Fe estabilizado comprende una mutación de Fe estabilizada (h) .
En otro ejemplo de modalidad, el polipéptido Fe estabilizado comprende una mutación de Fe estabilizada (i) .
En otro ejemplo de modalidad, el polipéptido Fe estabilizado comprende una mutación de Fe estabilizada (j) .
En un ejemplo de modalidad, un polipéptido Fe estabilizado de la invención comprende dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4 o 5) de las mutaciones estabilizadoras (a)-(j) anteriores. En determinadas modalidades, dos o más de las mutaciones estabilizadoras (d)-(j) o (d) - (h) . Por ejemplo, un polipéptido Fe estabilizado de la invención puede comprender cualquiera de las siguientes combinaciones de mutaciones estabilizadoras: (d) y (e) , (d) y (f ) , (d) y (g) , (d) y (h) , (d) e (i), (d) y (j), (e) y (f ) , (e) y (g) , (e) y (h) , (e) e (i), (e) y (j), (f) y (g) , (f) y (h) , (f) e (i), (f) y (j), (h) e (i), (h) y (j), (i) y (j). En otro ejemplo de modalidad, un polipéptido Fe estabilizado de la invención comprende las mutaciones (d) , (e) y (f) . En otro ejemplo de modalidad, un polipéptido Fe estabilizado de la invención comprende las mutaciones (d) , (e) y (g) . En otro ejemplo de modalidad, un polipéptido Fe estabilizado de la invención comprende las mutaciones (d) , (e) y (h) . En otro ejemplo de modalidad, un polipéptido Fe estabilizado de la invención comprende las mutaciones (d) , (f ) y (g) . En otro ejemplo de modalidad, un polipéptido Fe estabilizado de la invención comprende las mutaciones (d) , (g) y . (h) . En otro ejemplo de modalidad, un polipéptido Fe estabilizado de la invención comprende las mutaciones (e) , (f) y (g) . En otro ejemplo de modalidad, un polipéptido Fe estabilizado de la invención comprende las mutaciones (e) , (g) y (h) . En otro ejemplo de modalidad, un polipéptido Fe estabilizado de la invención comprende las mutaciones (f) , (g) y (h) . En otro ejemplo de modalidad, un polipéptido Fe estabilizado de la invención comprende las mutaciones (e) , (f) , (g) y (h) .
En otra modalidad, ün polipéptido Fe estabilizado de invención comprende un dominio CH2 (o los aminoácidos 292-340 de los mismos) de una molécula de IgG4 y un dominio CH3 de una molécula de IgGl, que tiene un residuo Gln (Q) en la posición 297. En otra modalidad, un polipéptido Fe estabilizado de la invención comprende un dominio CH2 y CH3 de una molécula de IgGl y un residuo Lys (K) en la posición 299, solo o en combinación con un residuo Asp (D) en la posición 297. (b) Ejemplos de restos Fe estabilizados Los ejemplos de restos Fe estabilizados de la invención se pueden encontrar a lo largo de la solicitud, los Ejemplos y el listado de secuencias.
En determinados ejemplos de modalidades, un polipéptido Fe estabilizado de la invención comprende una región Fe IgG4 estabilizada que comprende una, dos o más de las secuencias de aminoácidos de restos Fe establecidas en la Tabla 1 a continuación. Las mutaciones Fe estabilizadoras se subrayan en cursiva y negrita.
Tabla 1: Restos Fe IgG4 estabilizados Resto Fe Secuencia (Estado de glicosilación de la o las mutaciones Fe) pCN579 : ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT SEQ ID (T299K, PEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREE NO: 1 agíicosilado) QFNSKYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN GLPSSI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTK QVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS RLTVDKSRWQEG VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG EC301 ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT SEQ ID (T299K, PEVTC WDVSQEDPEVQFN YVDGVEVHNAKTKPREE NO: 2 V427F QFNSJCYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSI aglicosilado) EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS RLTVDKSRWQEGNVFSCSFMHEALHNHYTQKSLSLSLG EC302 E S K Y G P P C P P C P A P E F L G G SEQ ID (T299 , P S V F L F P P K P K D T L M I S R T NO: 3 D399S, P E V T C V V V D V S Q E D P E V Q F aglicosilado) N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q F N S Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K G L P S S I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S Q E E M T K N Q V S L T C L V K Resto Fe Secuencia (Estado de glicosilación de la o las mutaciones Fe) G F Y P S D I A V E w E s N G Q P E N N Y K T T P P V L S s D G S F F L Y S R L T V D K s R i Q E G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L s L G EC303 E S K Y G P P C P P c P A P E F L G G SEQ ID (T307P, P S V F L F P P K P K D T L M I S R T NO: 4 V427F P E V T C V V V D V s Q E D P E V Q F glicosilado) N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q F N S T Y R V V S V L P V L H Q D L G K E Y K C K V S N K G L P S S I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S Q E E M T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E w E s N G Q P E N N Y K T T P P V L D s D G S F F L Y S R L T V D K S R W Q~ E G N V F S C S F M H E A L H N H Y T Q K S L S L s L G EC304 E S K Y G P P C P P c P A P E F L G G SEQ ID (T307P, P S V F L F P P K P K D T L M I S R T NO: 5 D399S, P E V T C V V V D V s Q E D P E V Q F glicosilado) N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q F N S T Y R V V S V L P V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K G L P S S I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S Q E E T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E w E S N G Q P E N N Y K T T P P V L 3 s D G S F F L Y S R L T V D K c R W Q E G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S L G EC305 E S K Y G P P C P P c P A P E F L G G SEQ ID (T299K, P S V F L F P P K P K D T L M I S R T NO: 6 D399S, V427F P E V T C V V V D V s Q E D P E V Q F Resto Fe Secuencia (Estado de glicosilación de la o las mutaciones Fe) aglicosilado) N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q F N s K Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K G L P S S I E K T I S K A K G. Q P R E P Q V Y T L P P S Q E E M T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E w ? S N G Q P E N N Y K T T P P V L S s D G S F F L Y S R L T V D K s R W Q E N V F S C S F M H E A L H N H Y T Q K S L S L S L G EC306: E S K Y G P P C P P c P A P E F L G G SEQ ID (T307P, P S V F L F P P K P K D T L M I S R T NO: 7 D399S, V427F P E V T C V V V D V s Q E D P E V Q F glicosilado) N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q F N S T Y R V V s V L P V L H Q D W L N G K E Y K c K V S N K G L P S S I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P s Q E E M T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L S s D G S F F L Y S R L T V D K s R W Q E G N V F S c S F M H E A L H N H Y T Q K S L S L s L G EC307 E S K Y G P P C P P c P A P E F L G G SEQ ID (T299K, P S V F L F P P K P K D T L M I S R T NO: 8 V348F, V427F P E V T C V V V D V s Q E D P E V Q F aglicosilado) N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q F N s K Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V s N K G L P s S I E K T I S K A K G Q P R E P Q F Y T L P P S Q E E M T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E w E s N G Q P E N N Y K T T P P V L D s D G S F F L Y S R L T V D K S R 2 E G N V F S C S Resto Fe Secuencia (Estado de glicosilación de la o las mutaciones Fe) F H E A L H N H Y T Q K s L S L S L G EC308 E S K Y G P P C P P C P A P E F L G G SEQ ID (T307P, P S V F L F P P K P K D T L M I S R T NO: 9 V323F P E V T C V V V D V S Q E D P E V Q F glicosilado) N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q F N S T Y R V V S V L P V L H Q D W L N G K E Y K C K F S N K G L P S S I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S Q E E M T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D- I A V E w E s N G Q P E N N Y K T T P P V L D s D G S F F L Y S R L T V D K s K W Q ] E N V F S c S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L s L G EC309 (V240F E S K Y G P P C P P c P A P E F L G G SEQ ID glicosilado) P S F F L F P P K P K D T L M I S R T NO: 10 P E V T C V V V D V s Q E D P E V Q F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q F N s T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K G L P S S I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P s Q E E M T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E w E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D s D G S F F L Y S R L T V D K c R W Q E G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S L G EC300 (T307P E S K Y G P P C P P c P A P E F L G G SEQ ID glicosilado) P S V F L F P P K P K D T L M I S R T NO: 11 P E V T C V V V D V s Q E D P E V Q F N Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q F N S T Y R V V S V L P V L H Q D W Resto Fe Secuencia (Estado de glicosilación de la o las mutaciones Fe) L N G K E Y K C K V s N K G L P S S I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P s Q E E M T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E w E S N. G Q P E N N Y K T T P P V L D s D G S F F L Y S R L T V D K s R W Q ] E G N V F S c S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L s L G EC321 E S K Y G P P C P P c P A P E F L G G SEQ ID (L309P, P S V F L F P P K P K D T L M I S R T NO: 12 D399S P E V T C V V V D V s Q E D P E V Q F glicosilado) N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q F N S T Y R V V S V L T V P H Q D W L N G K E Y K C K V S N K G L P S S I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S Q E E M T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L S s D G S F F L Y S R L T V D K s R Q E G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S L G EC322 E S K Y G P P C P P c P A P E F L G G SEQ ID (L309 , P S V F L F P P K P K D T L M I S R T NO: 13 D399S P E V T C V V V D V s Q E D P E V Q F glicosilado) N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q F N S T Y R V V S V L T V M H Q D W L M G K E Y K C K V S N K G L P s S I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S Q E E M T K N Q V S L T c L V K G F Y P S D I A V E w E S N G Q P E N N Y T T P P V L S s D G S F F L Y S R L T V D K c R W 3 E G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S L G Resto Fe Secuencia (Estado de glicosilación de la o las mutaciones Fe) EC323 E S K Y G P P C P P C P A P E F L G G SEQ ID (L309K, P S V F L F P P K P K D T L M I S R f NO: 14 D399S P E V T C V V V D V s Q E D P E V Q F glicosilado) N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q F N S T Y R V V S V L T V K H Q D W L N G K E Y K C K V S N K G L P S S I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S Q E E M T K N Q V ? L T c L V K G F Y P S D I A V E w E S N G Q P E N N Y K T T P P V L S s D G S F F L Y S R L T V D K s R W Q E N V F S C S V M H E . A L H N H Y T Q K S L S L S L G EC324 E S K Y G P P C P P c P A P E F L G G SEQ ID (T307P, P S V F L F P P K P K D T L M I S R T NO: 15 L309P, D399S P E V T C V V V D V s Q E D P E V Q F glicosilado) N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q F N S T Y R V V S V L P V P H Q D W L N G K E Y K C K V S N K G L P S S I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S Q E E M T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E E s N G Q P E N N Y K T T P P V L 3 s D G S F F L Y S R L T V D K s R W Q E G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S L G EC325 E S K Y G P P C P P c P A P E F L G G SEQ ID (T307P, P S V F L F P P K P K D T L M I S R T NO: 16 L309M, D399S P ? V T C V V V D V s Q E D P E V Q F glicosilado) N W Y V D G V E V H N A K T K P R E É Q F N S T Y R V V s V L P V M H Q D W L N G K E Y K C K V S N K G L P S S I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S Q E E M T K N Q V S L T c L V K Resto Fe Secuencia (Estado de glicosilación de la o las mutaciones Fe) G F Y P S D I A V E w E s N G Q P E N Y K T T P P V L S s D G S F F L Y S R L T V D K s R W 2 E G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S L.
G EC326 E S K Y G P P C P P c P A P E F L G G SEQ ID (T307P, P S V F L F P P K P K D T L M I S R T NO: 17 L309K, D399S P E V T C V V V D V s Q E D P E V Q F glicosilado) N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q F N S T Y R V V S V L P V K H Q D W L N G K E Y K C K V S N K G L P s S I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P s Q E E M T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E w E S N G Q P E N N Y K T T P P V L S s D G S F F L Y S R L T V D K s R W Q E G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S L YC401 ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT SEQ ID (T299A, PEVTCWVDVSQEDPEVQFN YVDGVEVHNAKTKPREE NO: 18 T307P, D399S QFNSAYRWSVLPVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSI aglicosi lado EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEE TKNQVSLTCLVK ) GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLSSDGSFFLYS RLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG YC 02 ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT SEQ ID (T299A, PEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREE NO: 19 L309K, D399S QFNSAYRWSVLTVKHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSI aglicosilado) EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEE TKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLSSDGSFFLYS RLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG YC403 ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTL ISRT SEQ ID (T299A, PEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREE NO: 20 T307P, QFNSAYRWSVLPVKHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSI L309K, EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK Resto Fe Secuencia (Estado de glicosilación de la o las mutaciones Fe) aglicosilado) GFYPSDIAVEWESNGQPEN Y TTPPVLSSDGSFFLYS RLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG YC404 ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT SEQ ID (T299K, PEVTCWVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREE NO: 21 T307P, D399S QFNSíCYRWSVL VLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSI aglicosilado) EKTIS AKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLSSDGSFFLYS RLTVD SR QEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG YC405 ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTL ISRT SEQ ID (T299K, PEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNA TKPREE NO: 22 L309K, D399S QFNSKYRWSVLTVKHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSI aglicosilado) EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTK QVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLSSDGSFFLYS RLTVDKSRWQEG VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG YC406 ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTL ISRT SEQ ID (T299K, PEVTCVWDVSQEDPEVQFN YVDGVEVHNAKTKPREE NO:23 T307P, QFNSKYRWSVL VfCHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSI L309K, D399S EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTK QVSLTCLVK aglicosilado) GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLSSDGSFFLYS RLTVDKSRWQEG VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG En otros ejemplos de modalidades, un polipéptido Fe estabilizado de la invención comprende una región Fe quimérica estabilizada con una, dos o más de las secuencias de aminoácidos de restos Fe quiméricos establecidas en la Tabla 2 a continuación.
Tabla 2: Restos Fe quiméricos estabilizados Resto Fe Secuencia (Estado de glicosilación de la o las mutaciones de Fe) EAG2296 ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP SEQ . ID (T299A, EVTCWVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQF NO: 24 quimeras CH2 NSAYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKT de IgG4/CH3 ISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY · de IgGl) SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCS MHEALHNHYTQKSLSLSPG EAG2287 ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP SEQ ID (T299K, EVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQF NO: 25 quimeras CH2 NSJCYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKT de IgG4/CH3 ISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP de IgGl) SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG EC330 (T299A, ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP SEQ ID T307P EVTCWVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQF NO : 26 quimeras CH2 NSAYRWSVLPVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKT de IgG4/CH3 ISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP de IgGl) SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG EC331 (T299K, ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP SEQ ID T307P EVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQF NO: 27 quimeras CH2 NSKYRWSVLPVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKT de IgG4/CH3 ISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP de IgGl) SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG pEAG2300 ESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE SEQ ID (IgG4 bisagra VTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFN NO: 28 quimérica + STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTI CH3 de IgGl) SKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (N297Q, ESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE SEQ ID quimeras CH2 VTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQ NO: 59 de IgG4/CH3 STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTI de IgGl) SKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG En otros ejemplos de modalidades, un polipéptido Fe estabilizado de la invención comprende una región Fe IgGl aglicosilada estabilizada con una, dos o más de las secuencias de aminoácidos de restos Fe IgGl establecidas en la Tabla 3 a continuación.
Tabla 3: Restos Fe IgGl aglicosilados estabilizados Resto Fe Secuencia (Estado de glicosilación de la o las mutaciones Fe) SDE1 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI SEQ ID (T299K, SRTPEVTCLWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP NO: 29 V262L REEQY SKYRWSVLTVLHQD LNGKEYKCKVSNKALP aglicosi- APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTC lado) LVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NY TTPPVLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPG SDE2 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI SEQ ID (T299K, SRTPEVTCWTDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP NO: 30 V264T, REEQYNSJTYRWSVLTVLHQD LNGKEYKC VSNKALP aglicosi - APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTC lado) LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPG SDE3 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL I SEQ ID (T299K, SRTPEVTCWVDFSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP NO: 31 V266F, REEQYNS YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP aglicosi - APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTC lado) LVKGFYPSDIAVE ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF Resto Fe Secuencia (Estado de glicosilación de la o las mutaciones Fe) LYSKLTVDKSR QQG VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPG SDE4 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI SEQ ID (T299K, SRTPEVTCLVTDVSHEDPEVKFN YVDGVEVHNAKTKP NO: 32 V262L, REEQYNSJTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP V264T, APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTK QVSLTC aglicosi - LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF lado) LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPG SDE5 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI SEQ ID (T299K, SRTPEVTCWTOFSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP NO: 33 V264T, REEQYNSÍCYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP V266F, APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTC aglicosi - LVKGFYPSDIAVE ESNGQPEN YKTTPPVLDSDGSFF lado) LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPG SDE6 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI SEQ ID (T299K, SRTPEVTCWVDVS PDP VKFNWYVDGVEVHNAKTK NO: 34 reemplazo PREEQYNSJCYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL de bucle, PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTK QVSLT aglicosi - CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NYKTTPPVLDSDGSF lado) FLYSKLTVD SRWQQG VFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPG SDE7 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL I SEQ ID (T299K, SRTPEVTCLVTDVS PDP VKFNWYVDGVEVHNAKTK NO: 35 reemplazo PREEQYNSXYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL de bucle, PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLT V262L/V264T, CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF aglicosi - FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS lado) LSPG Resto Fe Secuencia (Estado de glicosilación de la o las mutaciones Fe) SDE8 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI SEQ ID (T299K, SRTPEVTCLVTDFSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP NO: 36 V262L, REEQYNSJCYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP V264T, APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTC V266F, LVKGFYPSDIAVE ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF aglicosi - LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL lado) SPG SDE9 (T299K, EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI SEQ ID reemplazo de SRTPEVTCLVTDFS PDP VKFN YVDGVEVHNAKTK NO: 37 bucle, V262L/ PREEQYNSXYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL V264T/ V266F, PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLT aglicosilado) CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV HEALHNHYTQKSLS LSPG CN578 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL I SEQ ID (T299K) SRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP NO : 60 REEQYNSJCYRWSVLTVLHQD LNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVE ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVF?CSVMHEALHNHYTQKSLSL SPG CN647 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI SEQ ID (T299K + SRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP NO: 61 N297D) REEQYJSJCYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPG CN646 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI SEQ ID (T299K + SRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP NO: 62 N297S) REEQYSS^YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP Resto Fe Secuencia (Estado de glicosilación de la o las mutaciones Fe) APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN YKTTPPVLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPG CN645 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL I SEQ ID (T299K + SRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP NO: 63 N297P) REEQYPSKYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSKLTVDKSR QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPG (IV) . Métodos para la estabilización de polipéptidos Fe variantes estabilizadores En determinados aspectos, la invención se refiere a un método de estabilizar un polipéptido que comprende una región Fe (por ejemplo, una región Fe aglicosilada) , el método comprende: (a) seleccionar una o más posiciones de aminoácidos dentro de al menos un resto Fe de una región Fe de partida para la mutación y (b) mutar la o las de las posiciones seleccionadas para la mutación, estabilizando así el polipéptido.
En una modalidad, la región Fe de partida es una región Fe de IgGl. En otra modalidad, la región Fe de partida es una región Fe de IgG4. En otra modalidad, la región Fe de partida es una región Fe quimérica. En una modalidad, la región Fe de partida es una región Fe de IgGl aglicosilada . En otra modalidad, la región Fe de partida es una región Fe de IgG4 aglicosilada.
En una modalidad, una posición de aminoácidos seleccionada para mutación se encuentra en un bucle extendido en la región Fe de una molécula de IgG de partida (por ejemplo, una molécula de IgG4) . En otra modalidad, la posición de aminoácidos seleccionada para mutación se encuentra en la interfase entre los dominios CH3. En otra modalidad, una posición de aminoácidos seleccionada para la mutación se encuentra cerca del sitio de contacto con el carbohidrato en la estructura cristalina de lhzh (por ejemplo, V264, R292 o V303). En otras modalidades, la posición del aminoácido puede estar cerca de la interfase CH3/CH2 o cerca de la interfase CH3/CH2 (por ejemplo, H310) . En otra modalidad, se pueden realizar una o más mutaciones que alteran la carga de la superficie general de la región Fe, por ejemplo, en uno o más de un conjunto de residuos de glutamina expuestos en la superficie (Q268, Q274 o Q355) . En otra modalidad, las posiciones de aminoácidos son residuos de valina encontrados en el "núcleo de valina" de CH2 y CH3. El "núcleo de valina" en CH2 es cinco residuos de valina (V240, V255, V263, V302 y V323) que están todos orientados en el mismo núcleo interior próximo del dominio CH2. Se observa un "núcleo de valina" similar para CH3 (V348, V369, V379, V397, V412 y V427) . En otra modalidad, una posición de aminoácidos seleccionada para la mutación se encuentra en la posición que se predice que interactúa con o pone en contacto el carbohidrato ligado a N en el aminoácido 297. Las posiciones de aminoácidos se pueden identificar mediante examinación de una estructura cristalina de la región Fe unida a un receptor Fe cognado (por ejemplo, FcYRIIIa) . Los ejemplos de aminoácidos que forman interacciones con N297 incluyen un bucle formado por los residuos 262-270.
Los ejemplos de posiciones de aminoácidos incluyen las posiciones de aminoácidos 240, 255, 262-266, 267-271, 292-299, 302-309, 379, 397-399, 409, 412 y 427 de acuerdo con la convención de numeración UE. En determinadas modalidades, la posición o las posiciones de aminoácidos seleccionadas para la mutación son una o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: 240, 255, 262, 263, 264, 266, 268, 274, 292, 299, 302,. 303, 307, 309, 323, 348, 355, 369, 379, 397, 399, 409, 412 y 427. En determinadas modalidades, la posición o las posiciones de aminoácidos seleccionadas para la mutación son una o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: 240, 262, 264, 266, 297, 299, 307, 309, 399, 409 y 427. En otra modalidad, la posición o las posiciones de aminoácidos seleccionadas para la mutación son una o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: 297, 299, 307, 309, 409 y 427. En otra modalidad, la posición o las posiciones de aminoácidos se seleccionan de uno o más residuos de aminoácidos 240, 262, 264 y 266. En otra modalidad, al menos una de las posiciones de aminoácidos se encuentra en la posición UE 297. En otra modalidad, al menos una de las posiciones de aminoácidos se encuentra en la posición UE 299. En otra modalidad, al menos una de las posiciones de aminoácidos se encuentra en la posición UE 307. En otra modalidad, al menos una de las posiciones de aminoácidos se encuentra en la posición UE 309. En otra modalidad, al menos una de las posiciones de aminoácidos se encuentra en la posición UE 399. En otra modalidad, al menos una de las posiciones de aminoácidos se encuentra en la posición UE 409. En otra modalidad, al menos una de las posiciones de aminoácidos se encuentra en la posición UE 427.
En determinadas modalidades, la región Fe es una región Fe de IgGl . En determinadas modalidades, donde la región Fc.es una región Fe de IgGl, la posición o más posiciones de aminoácidos se seleccionan de los residuos de aminoácidos 240, 262, 264, 299, 297 y 266. En otras modalidades, donde la región Fe es una región Fe de IgG4 , la posición o más posiciones de aminoácidos se seleccionan de los residuos de aminoácidos 297, 299, 307, 309, 399, 409 y 427.
En una modalidad, la mutación reduce el tamaño de la cadena lateral de aminoácidos en la posición de aminoácidos (por ejemplo, una sustitución con una alanina (A) , una serina (S) o treonina (T) ) . En otra modalidad, la mutación es una sustitución con un aminoácido que tiene una cadena lateral no polar (por ejemplo, una sustitución con una glicina (G) , una alanina (A) , una valina (V) , una leucina (L) , una isoleucina (I) , una metionina (M) , una prolina (P) , una fenilalanina (F) y un triptófano (W) ) . En otra modalidad, una mutación agrega hidrofobicidad a la interfase CH3 , por ejemplo, para aumentar la asociación entre los dos dominios interactuantes (por ejemplo, Y349F, T350V.y T394V) o aumentar el volumen en las cadenas laterales de la interfase (por ejemplo, F405Y) . En otra modalidad, uno o más aminoácidos del "núcleo de valina" se sustituyen con isoleucinas o fenilalaninas para aumentar su estabilidad. En otra modalidad, los aminoácidos (por ejemplo, L351 y/o L368) se mutan hasta cadenas laterales hidrofóbicas ramificadas mayores.
En una modalidad, la mutación es una sustitución con una alanina (A) . En una modalidad, la mutación es una sustitución con una fenilalanina (F) . En otra modalidad, la mutación es una sustitución con una leucina (L) . En una modalidad, la mutación es una sustitución con una treonina (T) . En otra modalidad, la mutación es una sustitución con una lisina (K) . En una modalidad, la mutación es una sustitución con una prolina (P) . En una modalidad, la mutación es una sustitución con una fenilalanina (F) .
En una modalidad, la mutación comprende una o más de las mutaciones o sustituciones establecidas en la Tabla 1.1, Tabla 1.2, Tabla 1.3 y/o Tabla 1.,4 a continuación.
En determinadas modalidades, la mutación comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en: 240F, 262L, 264T, 266F, 297Q, 297S, 297D, 299A, 299K, 307P, 309K, 309M, 309P, 323F, 399S, 409M y 427F (Convención de numeración UE) . En otra modalidad, la mutación comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en: 299A, 299K, 307P, 309K, 309M, 309P, 323F, 399E, 399S, 409K, 409M y 427F. En otra modalidad, la posición o más posiciones de aminoácidos se seleccionan de los residuos de aminoácidos 240F , 262L, 264T y 266F. En -otra modalidad, al menos una de las sustituciones es 299A. En otra modalidad, al menos una de las sustituciones es 299K. En otra modalidad, al menos una de las sustituciones es 307P. En otra modalidad, al menos una de las sustituciones es 309K. En otra modalidad, al menos una de las sustituciones es 309M. En otra modalidad, al menos una de las sust tuciones es 309P. En otra modalidad, al menos una de las sustituciones es 323F. En otra modalidad, al menos una de las sustituciones es 399S. , En otra modalidad, al menos una de las susti uciones es 399E. , En otra modalidad, al menos una de las sustituciones es 409K. . En otra modalidad, al menos una de las sustituciones es 409M. En otra modalidad, al menos una de las sustituciones es 427F.
En otra modalidad, la mutación comprende dos o más sustituciones (por ejemplo, 2, 3, 4 o 5) . En otra modalidad, la mutación comprende tres o más sustituciones (por ejemplo, 3, 4, 5 o 6) . En aun otra modalidad, la región Fe estabilizada comprende cuatro o más sustituciones (por ejemplo, 4, 5, 6 o 7) .
En otro aspecto, la invención se refiere a un método para realizar una molécula de unión estabilizada que comprende una región Fe estabilizada, el método comprende fusionar genéticamente un polipéptido que comprende una región Fe estabilizada de la invención con el extremo amino terminal o el extremo carBoxi terminal de un resto de unión. En determinadas modalidades, la región Fe estabilizada se estabiliza de acuerdo con los métodos de la invención.
V. Métodos para evaluar la estabilidad de proteínas Las propiedades de estabilidad de las composiciones de la invención se pueden analizar usando métodos conocidos en la técnica. Se pueden usar parámetros de estabilidad aceptables para los expertos en la técnica. Los ejemplos de parámetros se describen con más detalle a continuación. En ejemplos de modalidades se evalúa la estabilidad térmica. En modalidades preferidas, se evalúan los niveles de expresión (por ejemplo, como se midió según el % de rendimiento) de las composiciones de la invención. En otras modalidades preferidas, se evalúan los niveles de agregación de las composiciones de la invención.
En determinadas modalidades, se comparan las propiedades de estabilidad de. un polipéptido Fe con las de un control adecuado. Los ejemplos de controles incluyen un polipéptido Fe principal, tal como un polipéptido Fe de tipo salvaje, anticuerpo IgGl o IgG4 (glicosilado) de tipo salvaje. Otro ejemplo de control es un polipéptido Fe aglicosilado, un anticuerpo IgGl o IgG4 aglicosilado.
En una modalidad, se miden uno o más parámetros descritos a continuación. En una modalidad, se miden uno o más de estos parámetros luego de la expresión en una célula de mamífero. En una modalidad, se miden uno o más parámetros descritos a continuación en condiciones de fabricación a gran escala (por ejemplo, expresión de polipéptido Fe o moléculas que comprenden un polipéptido Fe en un bioreactor) . a) Estabilidad térmica La estabilidad térmica de las composiciones de la invención se puede analizar usando una cantidad de técnicas bioquímicas o biofísicas no limitativas conocidas en la técnica. En determinadas modalidades, la estabilidad se evalúa mediante espectroscopia analítica.
Un ejemplo de método de espectroscopia analítica es la Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC) . La DSC utiliza un calorímetro que es sensible a las absorbancias del calor que acompañan el despliegue de la mayoría de las proteínas o dominios de proteínas (véase, por ejemplo, Sanchez-Ruiz , et al., Bioche istry, 27: 1648-52, 1988) . Para determinar la estabilidad térmica de una proteína, se inserta una muestra de la proteína en el calorímetro y se aumenta la temperatura hasta que se despliega el polipéptido Fe (o un dominio CH2 o CH3 del mismo) . La temperatura a la cual se despliega la proteína indica la estabilidad general de las proteínas.
Otro ejemplo de método de espectroscopia analítica es espectroscopia de dicroísmo circular (CD) . La espectrometría de CD mide la actividad óptica de una composición como una función para aumentar la temperatura. La espectroscopia de dicroísmo circular (CD) mide las diferencias en la absorción de luz polarizada izquierda contra la luz polarizada derecha debido a la asimetría estructural. Una estructura desordenada o desplegada da como resultado un espectro de CD muy diferente al de una estructura ordenada o plegada. El espectro de CD refleja la sensibilidad de las proteínas a . los efectos desnaturalizantes del aumento de la temperatura y, por lo tanto, indica una estabilidad térmica de las proteínas (véase, van Mierlo y Steemsma, J. Biotechnol . , 79(3) :281-98, 2000).
Otro ejemplo de método de espectroscopia analítica para medir la estabilidad térmica es la Espectroscopia de Emisión de Fluorescencia (véase, van Mierlo y Steemsma, supra) . Aun otro ejemplo del método de espectroscopia analítica para medir la estabilidad térmica es la espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) (véase, por ejémplo, van Mierlo y Steemsma, supra) .
En otras modalidades, se mide bioquímicamente la estabilidad térmica de una composición de la invención. Un ejemplo del método bioquímico para evaluar la estabilidad térmica es un ensayo de prueba térmica. En un "ensayo de prueba térmica", se somete una composición de la invención a un intervalo de temperaturas elevadas para un período de tiempo establecido. Por ejemplo, en una modalidad, el polipéptido Fe de prueba que comprende, regiones Fe se somete a un intervalo de temperaturas en aumento, por ejemplo, durante 1-1.5 horas. Luego se analiza la capacidad de la región Fe de unir un receptor Fe (por ejemplo, un FcyR, Proteína A o Proteína G) mediante un ensayo bioquímico relevante (por ejemplo, ELISA o DELFIA) . Se describe un ejemplo de ensayo de prueba térmico en el Ejemplo 2 a continuación.
En una modalidad, el ensayo puede realizarse en un formato de alto rendimiento. En otra modalidad, se puede crear una biblioteca de variantes de Fe usando métodos conocidos en la técnica. Se puede inducir la expresión de Fe y el Fe se puede someter a prueba térmica. Las muestras de prueba sometidas a ensayo se pueden analizar para determinar la unión y aquellos polipéptidos Fe que son estables se pueden aumentar por escala y caracterizar adicionalmente .
En determinadas modalidades, la estabilidad térmica se evalúa mediante medición de la temperatura de fusión (Tm) de una composición de la invención usando cualquiera de las técnicas anteriores (por ejemplo, técnicas de espectroscopia analítica) . La temperatura de fusión es la temperatura en el punto medio de una curva de transición térmica donde el 50% de las moléculas de una composición se encuentran en un estado de plegamiento .
En otras modalidades, la estabilidad térmica se evalúa mediante medición del calor específico o la capacidad del calor (Cp) de una composición de la invención usando una técnica calorimétrica analítica (por ejemplo, DSC) . El calor específico de una composición es la ' energía (por ejemplo, en kcal/mol) requerida para aumentar en 1°C, la temperatura de 1 mol de agua. La Cp elevada es una característica de una composición de proteínas desnaturalizadas o inactivadas. En determinadas modalidades, el cambio en la capacidad del calor (ACp) de una composición se mide determinando el calor específico de una composición antes y después de su transición térmica. En otras modalidades, la estabilidad térmica se puede evaluar midiendo o determinando otros parámetros de estabilidad termodinámica incluyendo la energía libre de Gibbs de desplegamiento (AG) , entalpia de desplegamiento (??) o entropía de desplegamiento (AS) .
En otras modalidades, se usan uno o más de los ensayos bioquímicos anteriores (por ejemplo, un ensayo de prueba térmico) para determinar la temperatura (es decir, el valor Tc) en la cual el 50% de la composición retiene su actividad (por ejemplo, actividad de unión) . b) % de agregación En determinadas modalidades, la estabilidad de una composición de la invención se determina mediante medición de su tendencia a la agregación. La agregación se puede medir mediante una cantidad de técnicas bioquímicas o biofísicas no limitativas. Por ejemplo, la agregación de una composición de la invención se puede evaluar usando cromatografía, por ejemplo, cromatografía de exclusión por tamaños (SEC) . SEC separa las moléculas según su tamaño. Se carga una columna con perlas semi- sol idas de un gel polimérico que admitirá iones y moléculas pequeñas en su interior pero no de las grandes. Cuando se aplica una composición de proteínas a la parte superior de la columna, se distribuyen las proteínas de plegamiento compactas (es decir, proteínas no agregadas) a través de un volumen más grande de solvente que el que está disponible para los agregados de proteínas grandes. En consecuencia, los agregados grandes se mueven más rápidamente a través de la columna y, de este modo, la mezcla se puede separar o fraccionar en sus componentes. Cada fracción puede estar individualmente cuantificada (por ejemplo, mediante diseminación de luz) mientras se eluye del gel. Por consiguiente, el % de agregación de una composición de la invención se puede determinar mediante comparación de la concentración de una fracción con la concentración total de una proteína aplicada al gel. Las compos ciones estables se eluyen de la columna esencialmente como una fracción simple y aparecen esencialmente como un pico simple en el perfil de elución o cromatogram .
En modalidades preferidas, se usa SEC junto con una diseminación de luz en línea (por ejemplo, diseminación de luz clásica o dinámica) para determinar el % de agregación de una composición. En determinadas modalidades preferidas, se usa la diseminación de luz estática para medir la masa de cada fracción o pico, independiente de la forma molecular o la posición de elución. En otras modalidades preferidas, se usa la diseminación de luz dinámica para medir el tamaño hidrodinámico de una composición. Otros ejemplos de métodos para la evaluación de estabilidad de proteínas incluyen SEC de alta velocidad (véase, por ejemplo, Corbett et al., Biochemistry . 23 ( 8 ) : 1888- 94 , 1984).
En una modalidad preferida, el % de agregación se determina mediante medición de la fracción de agregados de proteína dentro de la muestra de proteínas. En una modalidad preferida, el % de agregación de una composición se mide determinando la fracción de proteína plegada dentro de la muestra de proteínas. c) % de rendimiento En otras modalidades, la estabilidad de una composición de la invención se evalúa mediante medición de la cantidad de proteína que se recupera (en la presente el "% de rendimiento") luego de la expresión (por ejemplo, expresión recombinante) de la proteína. Por ejemplo, el % de rendimiento se puede medir determinando los miligramos de proteína recuperados por cada mi de medio de cultivo hospedador (es decir, mg/ml de proteína) . En una modalidad preferida, el % de rendimiento se evalúa luego de la expresión en una célula hospedera de mamífero (por ejemplo, una célula- -CHO) . d) % de pérdida En aun otras modalidades, la estabilidad de una composición de la invención se evalúa controlando la pérdida de proteína en un intervalo de temperaturas (por ejemplo, de -80 a 25 °C) luego del almacenamiento durante un período de tiempo definido. La cantidad o concentración de proteína recuperada, se puede determinar usando cualquier método de cuantificación de proteínas conocido en la técnica, y en comparación con la concentración inicial de proteína. Los ejemplos de métodos de cuantificación de proteína incluyen análisis SDS-PAGE o el ensayo de Bradford (Bradford, et al., Anal. Biochem. 72, 248, (1976)). Un método preferido para evaluar el % de pérdida utiliza cualquiera de los métodos SEC analíticos descritos anteriormente. Se observará que las mediciones de % de pérdida se pueden determinar en cualquier condición de almacenamiento o formulación de almacenamiento deseada, incluyendo, por ejemplo, preparaciones de proteínas liofilizadas . e) % de proteólisis En aun otras modalidades, la estabilidad de una composición de la invención se evalúa determinando la cantidad de proteína que se proteoliza luego del almacenamiento en condiciones estándar. En un ejemplo de modalidad, la proteólisis se determina por una muestra SDS-PAGE de la proteína donde la cantidad de proteína intacta se compara con la cantidad de fragmentos de bajo peso molecular que aparecen en el gel SDS-PAGE. En otro ejemplo de modalidad, la proteólisis se determina por espectrometría de masas (MS) , donde la cantidad de proteína del peso molecular esperado se compara con la cantidad de fragmentos de bajo peso molecular dentro de la muestra. f) Afinidad de unión En aun otras modalidades, la estabilidad de una composición de la invención se puede evaluar determinanado su afinidad de unión diana. Se conoce en la técnica una amplia variedad de métodos para determinar la afinidad de unión. Un ejemplo de método para determinar la afinidad de unión utiliza la resonancia de plasmones superficiales. La resonancia de plasmones superficiales es un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones bioespecí icas en tiempo real mediante detección de alteraciones en las concentraciones de proteína dentro de una matriz biosensor, por ejemplo, usando el sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, NJ) . Para descripciones adicionales, véase Jónsson, U., et al. (1993) Ann. Biol . Clin. 51:19-26; Jónsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit . 8:125-131 y Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277. g) Otros estudios de unión En aun otras modalidades,. la estabilidad de una composición de la invención se puede evaluar mediante cuantificación de la unión de un compuesto marcado a porciones desnaturalizadas o desplegadas de una molécula de unión. Las moléculas son preferentemente hidrofóbicas , dado que preferentemente se unen a o interactúan con parches hidrofóbicos grandes de aminoácidos que se entierran normalmente en el interior de la proteína natural, pero que se exponen en una molécula de unión desnaturalizada o desplegada. Un ejemplo de compuesto marcado es el tinte fluorescente hidrofóbico, sulfonato de l-anilino^8~-'haftalina (A S) .
(VI) Polipéptidos de unión estabilizados que comprenden regiones Fe estabilizadas determinados aspectos, la invención proporciona polipéptidos de unión estabilizados que comprenden los polipéptidos Fe estabilizados de la invención. Tal como se describe en la presente, polipéptidos Fe variantes dé la invención (y/o los polipéptidos Fe principales de los que se derivan) pueden comprender adicionalmente un sitio de unión para formar un polipéptido de unión estabilizado. Una variedad de polipéptidos de unión de diseños alternativos se encuentra dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, uno o más sitios de unión se pueden fusionar con o unir a o incorporar en (por ejemplo, revestir en) una región Fe del polipéptido Fe en múltiples orientaciones. En un ejemplo de modalidad, un polipéptido de unión comprende un sitio de unión fusionado con un extremo N-terminal de la región Fe. En otro ejemplo de modalidad, un polipéptido de unión comprende un sitio de unión en un extremo C-terminal de la región Fe. El polipéptido de unión de la invención puede comprender sitios de unión tanto en el extremo C-terminal como en el extremo N-terminal de una región Fe. En aun otras modalidades, el polipéptido de unión puede comprender un sitio de unión en una región interdominio del extremo N-terminál y/o C-terminal de una región Fe (por ejemplo, entre los dominios CH2 y CH3 de un resto Fe) . De forma alternativa, el sitio de unión se puede incorporar en una región interdominio entre los dominios bisagra y CH2 de un resto Fe. En otras modalidades, donde la región Fe del polipéptido Fe es una región scFc, un polipéptido de unión puede comprender uno o más sitios de unión dentro de un polipéptido de enlace que enlaza dos o más restos Fe de una región scFc como una única secuencia contigua.
En aun modalidades adicionales, el polipéptido de unión estabilizado de la invención comprende un sitio de unión que se introduce en un resto Fe de una región Fe estabilizada. Por ejemplo, un sitio de unión puede estar revestido en un dominio de CH2 del extremo N-terminal, un dominio CH3 del extremo N-terminal, un dominio CH2 del extremo C-terminal y/o un dominio CH3 del extremo C-terminal. En una modalidad, los bucles de CDR de un anticuerpo están revestidos en uno o ambos dominios CH3 de la región scFc . Se describen métodos para revestir bucles de CDR y otros restos de unión en los dominios CH2 y/o CH3 de una región Fe, por ejemplo, en la Publicación PCT Internacional No. WO 08/003116, que se incorpora a la presente a modo de referencia.
Aquellos expertos en la técnica reconocen que el polipéptido de unión estabilizado puede comprender dos o más sitios, de unión (por ejemplo, 2, 3, 4 o más sitios de unión) que están enlazados, fusionados o integrados (por ejemplo, revestidos) en una región Fe estabilizada de un polipéptido Fe de la invención usando cualquier combinación de orientaciones.
En determinadas modalidades, los polipéptidos de unión de la invención comprenden dos sitios de unión y al menos una región Fe estabilizada. Por ejemplo, los sitios de unión se pueden enlazar de forma operativa tanto al extremo N-terminal como al C-terminal de una región Fe estabilizada. En otro ejemplo de modalidad, los sitios de unión se pueden enlazar de forma operativa tanto al extremo N-terminal como al C-terminal de múltiples regiones Fe estabilizadas. Cuando la región Fe estabilizada es una región scFc, dos o más de las regiones scFc pueden estar enlazadas juntas en serie para formar una matriz tándem de regiones Fe estabilizadas.
En otras modalidades, dos o más sitios de unión están enlazados entre sí (por ejemplo, mediante un enlace polipeptídico) en serie y la matriz tándem de los sitios de unión se enlaza de forma operativa (por ejemplo, se conjuga químicamente o se fusiona genéticamente (por ejemplo, ya sea directamente o mediante un enlace polipeptídico) ) a ya sea el extremo C-terminal o N-terminal de una región Fe estabilizada o una matriz tándem de regiones Fe estabilizadas (es decir, regiones scFc estabilizadas en tándem) . En otras modalidades, la matriz tándem de sitios de unión se enlaza de forma operativa tanto al extremo C-terminal como al N-terminal de una región Fe simple estabilizada o una matriz tándem de regiones Fe estabilizadas.
En otras modalidades, un polipéptido de unión estabilizado de la invención es un polipéptido de unión trivalente que comprende tres sitios de unión. Un ejemplo de polipéptido de unión trivalente de la invención es biespecífico o triespecífico . Por ejemplo, un polipéptido de unión trivalente puede ser bivalente (es decir, tiene dos sitios de unión) para una especificidad y monovalente para una segunda especificidad.
En aun otras modalidades, un polipéptido de unión estabilizado de la invención es un polipéptido de unión tetravalente que comprende cuatro sitios de unión. Un ejemplo de polipéptido de unión tetravalente de la invención es biespecífico. Por ejemplo, un polipéptido de unión tetravalente puede ser bivalente (es decir, tiene dos sitios de unión) para cada especificidad.
Tal como se mencionó anteriormente, en otras modalidades, uno o más sitios de unión pueden estar insertados entre dos restos Fe de una región scFc estabilizada. Por ejemplo, uno o más sitios de unión pueden formar la totalidad o parte de un enlace polipeptídico de un polipéptido de unión de la invención.
Polipéptidos de unión preferidos de la invención comprenden al menos uno de un sitio de unión al antígeno (por ejemplo, un sitio de unión al antígeno de un anticuerpo, variante de anticuerpo o fragmento de anticuerpo) , una porción de unión al receptor de un ligando o una porción de unión al ligando de un receptor.
En otras modalidades, los polipéptidos de unión de la invención comprenden al menos un sitio de unión que comprende uno o más de cualquiera de los péptidos biológicamente relevantes descritos anteriormente.
En determinadas modalidades, los polipéptidos de unión de la invención tienen al menos un sitio de unión específico para una molécula diana que media un efecto biológico. En una modalidad, el sitio de unión modula la activación o inhibición celular (por ejemplo, mediante la unión a un receptor de superficie celular que da como resultado la transmisión de una señal de activación o inhibitoria) . En una modalidad, el sitio de unión es capaz de iniciar la transducción de una señal que da como resultado la muerte de la célula (por ejemplo, por una senda inducida por una señal celular, por fijación del complemento o exposición a una carga útil (por ejemplo, una carga útil tóxica) presente en la molécula de unión) o que modula una enfermedad o trastorno en un sujeto (por ejemplo, mediando o promoviendo la muerte celular mediante la promoción de la lisis de un coágulo de fibrina o la promoción de la formación de coágulos o modulando la cantidad de una sustancia que es biodisponible (por ejemplo, potenciando o reduciendo la cantidad de un ligando tal como TNFa en el sujeto) ) . En otra modalidad, los polipéptidos de. unión de la invención tienen al menos un sitio de unión específico para un antígeno diana para la reducción o eliminación, por ejemplo, un antígeno de superficie celular o un antígeno soluble, junto con al menos una región Fe fusionada genéticamente (es decir, región scFc) .
En otra modalidad, la unión de los polipéptidos de unión de la invención a una molécula diana (por ejemplo, antígeno) da como resultado la reducción o eliminación de la molécula diana, por ejemplo, de un tejido o de la circulación. En otra modalidad, los polipéptidos de unión tienen al menos un sitio de unión específico para una molécula diana que se puede usar para detectar la presencia de una molécula diana (por ejemplo, para detectar un contaminante o diagnosticar una afección o un trastorno) . En aun otra modalidad, un polipéptido de unión de la invención comprende al menos un sitio de unión que dirige la molécula a un sitio específico en un sujeto (por ejemplo, a una. célula tumoral, un inmunocito o un coágulo de sangre) .
En determinadas modalidades, los polipéptidos de unión de la invención pueden comprender dos o más sitios de unión. En una modalidad, los sitios de unión son idénticos. En otra modalidad, los sitios de unión son diferentes.
En otras modalidades, los polipéptidos de unión de la invención se pueden ensamblar entre sí o con otros polipépticios para formar proteínas de unión que tienen dos o más polipéptidos ("proteínas de unión" o "multímeros " ) , donde al menos un polipéptido del multímero es un polipéptido de unión de la invención. Ejemplos de formas multiméricas incluyen proteínas de unión alteradas diméricas, triméricas, tetraméricas , hexaméricas y similares. En una modalidad, los polipépticios de la proteína de unión son los mismos (es decir, proteínas de unión alterada homoméricas , por ejemplo, homodímeros, homotetrámeros) . En otra modalidad, los polipéptidos de la proteína de unión son diferentes (por e emplo, heteroméricos) .
En una modalidad, un polipéptido de la invención un dominio CHl de un anticuerpo IgG4 [sic] , un dominio CH2 de un anticuerpo IgG4 y un dominio CH3 de un anticuerpo IgGl . En una modalidad, el polipéptido comprende adicionalmente una sustitución Ser228Pro. El polipéptido puede comprender adicionalmente una mutación en el aminoácido 297 y/o 299, por ejemplo, 297Q y/o 299K o 297S y/o 299K. El polipéptido puede comprender además un dominio CHl de un anticuerpo IgGl o IgG4, un dominio CH2 de un anticuerpo IgG4 y un dominio CH3 de un anticuerpo IgGl; este polipéptido puede comprender una o más sustituciones de Ser228Pro, 297Q o 299K. La secuencia de aminoácidos de una región Fe que consiste en un dominio CHl de una molécula IgG4 (con una sustitución Ser228Pro) , un dominio CH2 de un anticuerpo IgG4 y un dominio CH3 de un anticuerpo IgGl se proporciona en la SEQ ID NO: 28. En una modalidad, un polipéptido Fe estabilizado de la invención comprende una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 25 En una modalidad, un polipéptido Fe estabilizado de la invención comprende una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 59 En una modalidad, un polipéptido Fe estabilizado de la invención comprende una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 60 En una modalidad, un polipéptido Fe estabilizado de la invención comprende una secuencia de aminoácidos establecida en la' SEQ ID N0:61 En una modalidad, un polipéptido Fe estabilizado de la invención comprende una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 62.
En una modalidad, la región Fe de un polipéptido de la invención es una cadena simple (scFc) . En una modalidad, una molécula que comprende una región Fe descrita en este párrafo es monovalente. En una modalidad, la molécula que comprende una región Fe descrita en este párrafo es monovalente y la región Fe es una scFc . Las moléculas que comprenden una región Fe descritas en la presente pueden comprender además una scFc. i. Sitios de unión al antígeno (a) Anticuerpos En determinadas modalidades, un polipéptido de unión de la invención comprende al menos un sitio de unión al antígeno de un anticuerpo. Los polipéptidos de unión de la invención pueden comprender una región variable o una porción de la misma (por ejemplo, un dominio VL y/o VH) derivada de un anticuerpo usando protocolos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el dominio variable se puede derivar de un anticuerpo producido en un mamífero no humano, por ejemplo, murino, cobayo, pximate, conejo o rata, mediante la inmunización del mamífero con el antígeno o fragmento del mismo. Véase Harlow & Lañe, anteriormente, que se incorpora a la presente a todos los efectos a modo de referencia. La inmunoglobulina se puede generar por medio de múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales del antígeno correspondiente (por ejemplo, tumor purificado asociado a antígenos o células o extractos celulares que comprenden los antígenos) y un adyuvante. Esta inmunización típicamente provoca una respuesta inmune que comprende la producción de anticuerpos reactivos al antígeno de esplenocitos o linfocitos activados.
Mientras que la región variable se puede derivar de anticuerpos policlonales recolectados del suero de un mamífero inmunizado, normalmente se desea - aislar linfocitos individuales del bazo, nodulos linfáticos o sangre periférica para proporcionar preparaciones homogéneas de anticuerpos monoclonales (MAb) de los cuales se deriva la región variable deseada. Típicamente se usan conejos o cobayos para crear anticuerpos policlonales. Típicamente se usan ratones para crear anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar contra con un fragmento mediante la inyección de un fragmento de anticuerpo en un ratón, preparando "hibridomas" y detectando los hibridomas para detectar un anticuerpo que se une específicamente al antígeno. En este proceso conocido (Kohlerefc al ., (1975) ,Nature, 256:495) los linfocitos de vida relativamente corta o mortales del ratón al que se le inyectó el antígeno se fusionan con una línea celular tumoral inmortal (por ejemplo, una línea celular de mieloma) , produciendo por tanto células híbridas o "hibridomas " que son tanto inmortales como capaces de producir el anticuerpo codificado genéticamente por la célula B. Los híbridos resultantes se segregan en cepas genéticas simples por selección, dilución y neoformación con cada cepa individual que comprende genes específicos para la formación de un anticuerpo simple. Estos producen anticuerpos que son homogéneos contra el antígeno deseado y, con referencia a su parentesco genético puro, se denominan "monoclonales" .
Las células de hibridoma preparadas de esta manera se siembran y cultivan en un medio de cultivo adecuado que preferentemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parental no fusionadas . Los expertos en la técnica observarán que los reactivos, las líneas celulares y el medio para la formación, selección y el crecimiento de hibridomas están disponibles comercialmente de una cantidad de fuentes y se establecen protocolos estándar. En general, el medio de cultivo en el que están creciendo las células de hibridoma se analiza para determinar la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno deseado. Preferentemente, la especificidad de unión de anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación o por un ensayo in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) . Luego de que se identifican las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones se pueden subclonar. por procedimientos de limitación de dilución y se pueden cultivar por métodos estándar (Goding, Monoclonal antibodies : Principies and Practice, pp 59-103 (Academic Press, 1986)). Se apreciará adicionalmente que los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se pueden separar del medio de cultivo, el fluido de ascitis o suero por procedimientos convencionales de purificación tales como, por ejemplo, cromatografía de afinidad (por ejemplo, cromatografía de afinidad de proteína A, proteína G o proteína L) cromatografía de hidroxilapatita , electroforesis en gel o diálisis.
Opcionalmente , se puede analizar la unión de los anticuerpos a una región específica o un fragmento deseado del antígeno sin unirlos a otros fragmentos del antígeno que no se superponen. El último análisis se puede lograr determinando la unión de un anticuerpo a una colección de imitantes de eliminación del antígeno y determinando qué mutantes de eliminación se unen al anticuerpo. Se puede evaluar la unión mediante western blot o ELISA. El fragmento más pequeño que muestra la unión específica al anticuerpo define el epítopo del anticuerpo. De forma alternativa, la especificidad del epítopo se puede determinar por un ensayo de competición donde un anticuerpos de prueba y de referencia compiten por la unión al antígéno. Si los anticuerpos de prueba y de referencia compiten, entonces se unen al mismo o a los mismos epítopos suficientemente próximos, de forma tal que la unión de un anticuerpo interfiere con la unión del otro.
El ADN que codifica el anticuerpo monoclonal deseado se puede aislar y secuenciar fácilmente usando cualquiera de los procedimientos convencionales descritos anteriormente para el aislamiento de las secuencias de dominio y región constante (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos) . Las células aisladas y de hibridoma subclonadas sirven como una fuente preferida de tal ADN. Más particularmente, el ADN aislado (que puede ser sintético, tal como se describe en la presente) se puede usar para clonar las secuencias de región variable deseadas para su incorporación en los polipéptidos de unión de la invención.
En otras modalidades, el sitio de unión se deriva de un anticuerpo completamente humano. Los anticuerpos humanos o sustancialmente humanos se pueden generar en animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son incapaces de producción de inmunoglobulina endógena (véase por ejemplo, No. de patentes estadounidenses 6,075,181, 5,939,598, 5,591,669 y 5,589,369, que se incorporan a modo de referencia). Por ejemplo, se ha descrito que la eliminación homocigótica de la región de unión de cadena pesada al anticuerpo en ratones quiméricos y mutantes de línea germinal, da como resultado una inhibición completa, de la producción endógena de anticuerpos. La transferencia de una matriz genética de genes de inmunoglobulina humana en el ratón mutante de línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos luego de la prueba de antígeno. Otros medios preferidos para generar anticuerpos humanos usando ratones SCID se describen en la patente estadounidense No. 5,811,524 que se incorpora a la presente a modo de referencia. Se apreciará que el material genético asociado a estos anticuerpos humanos también se puede aislar y manipular tal como se describe en la presente.
Aun otro medio altamente eficiente para generar anticuerpos recombinantes se describe en Ne man, Biotechnology, 10: 1455-1460 (1992). En particular, esta técnica da como resultado la creación de anticuerpos primatizaclos que contienen dominios variables de mono y secuencias constantes humanas. Esta referencia se incorpora a la presente a modo de referencia en su totalidad. Además, esta técnica también se describe en las patentes estadounidenses cedidas de forma conjunta No. 5,658,570, 5,693,780 y 5,756,096 que se incorporan a la presente a modo de referencia.
En otra modalidad, los linfocitos se pueden seleccionar por micromanipulación y los genes variables se pueden aislar. Por ejemplo, las células mononucleares de sangre periférica se pueden aislar a partir de un mamífero inmunizado y cultivar durante aproximadamente 7 días in vitro. Se pueden analizar los para detectar las IgG específicas que cumplan con los criterios de detección. Las células de pocilios positivos se pueden aislar. Las células B que producen Ig individual se pueden aislar por FACS o identificándolas en un ensayo de placa hemolítica mediada por complemento. Las células B que producen Ig se pueden micromanipular en un tubo y los genes VH y VL se pueden ampliar usando, por ejemplo, RT-PCR. Los genes VH y VL se pueden clonar en un vector de expresión de anticuerpo y se pueden transfectar en células (por ejemplo, células eucariotas y procariotas) para su expresión.
De forma alternativa, los dominios variables (V) se pueden obtener de bibliotecas de secuencias de genes variables del animal que se elija. Las bibliotecas que expresan combinaciones al azar de dominios, por ejemplo, dominios VH and VL, se pueden detectar con un antígeno deseado para identificar elementos que tienen las características de unión deseadas. Los métodos de tal detección son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los repertorios genéticos de anticuerpo se pueden clonar en un vector de expresión de bacteriófago ? (Huse, WD et al. (1989). Science, 2476:1275). Además, se pueden detectar células (Francisco et al. (1994), PNAS, 90:10444; Georgiou et al . (1997), Nat . Biotech. , 15:29; Boder and Wittrup (1997) Nat . Biotechnol . 15:553; Boder et al. (2000), PNAS, 97:10701; Daugtherty, P. et al . (2000) J. Immunol . Methods . 243:211) o virus (por ejemplo, Hoogenboom, HR. (1998), Immunotechnology 4:1; Winter et al. (1994). Annu. Rev. I munol. 12:433; Griffiths, AD. (1998). Curr. Opin. Biotechnol. 9:102) que expresan anticuerpos en su superficie.
Los expertos en la técnica también observarán que los dominios variables del anticuerpo que codifica el ADN también se pueden derivar de bibliotecas de anticuerpos expresados en fago, levadura o bacterias usando métodos conocidos en la técnica. Ejemplos de métodos se establecen en, por ejemplo, EP 368 684 Bl; patente estadounidense No. 5,969,108; Hoogenboom et al., (2000) Immunol. Today 21:371; Nagy et al. (2002) Nat. Med. 8:801; Huie et al. (2001), PNAS, 98:2682; Lui et al. (2002), J. Mol. Biol. 315:1063, que se incorporan a la presente a modo de referencia. Varias publicaciones (por ejemplo, Marks et al. (1992), Bio/Technology 10:779-783) han descrito la producción de anticuerpos de alta afinidad humana por transposición de cadenas, así como una infección combinatoria y una recombinación in vivo como una estrategia para la construcción de grandes bibliotecas de fagos. En otra modalidad, la expresión ribosomal se puede usar para reemplazar el bacteriófago como la plataforma de expresión (véase, por ejemplo, Hanes, et al. (1998), PNAS 95:14130; Hanes and Pluckthun. (1999) , Curr. Top. Microbiol . Immunol . 243:107; He and Taussig. (1997) , Nuc . Acids Res., 25:5132; Hanes et al . (2000) , Nat . Biotechnol . 18:1287; Wilson et al . (2001), PNAS, 98:3750; or Irving et al . (2001) J". Im unol . Methods 248 : 31) .
Las bibliotecas preferidas para la detección son bibliotecas de genes variables. También se pueden usar dominios VL y VH de fuente no humana. Las bibliotecas no activadas pueden pertenecer a sujetos inmunizados o semisintéticos (Hoogenboom and Winter. (1992) . J. Mol. Biol. 227:381; Griffiths et al. (1995) EMBO J. 13:3245; de Kruif et al. (1995) . J. Mol. Biol. 248:97; Barbas et al. (1992) , PNAS, 89:4457) . En. una modalidad, se pueden crear mutaciones a los dominios de inmunoglobulina para crear una biblioteca de moléculas de ácido nucleico con mayor heterogeneidad (Thompson et al. (1996) J. Mol. Biol. 256:77; Lamminmaki et al. (1999) J. Mol. Biol. 291:589; Caldwell and Joyce . (1992), PCR Methods Appl . 2:28; Caldwell and Joyce. (1994), PCR Methods Appl . 3:S136) . Se pueden usar procedimientos de detección estándares para seleccionar variantes de afinidad. En otra modalidad, se pueden realizar cambios a las secuencias VH y VL para aumentar la avidez del anticuerpo, por ejemplo, usando información obtenida a partir de estructuras cristalinas usando técnicas conocidas en la técnica.
Además, las secuencias de región variable útiles para la producción de polipéptidos de unión de la presente invención se pueden obtener a partir de una cantidad de fuentes distintas. Por ejemplo, tal como se discutió anteriormente, una variedad de secuencias de genes humanos están disponibles en la forma de depósitos accesibles públicamente. Se han publicado varias secuencias de anticuerpos y genes que codifican anticuerpos y se pueden sintetizar químicamente secuencias adecuadas de región variable (por ejemplo, secuencias VL y VH) a partir de estas secuencias usando métodos reconocidos en la técnica.
En otra modalidad, al menos un dominio de región variable presente en un polipéptido de unión de la invención es catalítico (Shokat and Schultz. (1990) . Annu. Rev. Immunol . 8:335) . Se pueden crear dominios de región variable con especificidades de unión catalítica usando técnicas conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, patente estadounidense No. 6,590,080 y patente estadounidense No. 5,658,753). Las especificidades de unión catalíticas pueden funcionar mediante una cantidad de mecanismos básicos similares a aquellos identificados para que las enzimas estabilicen el estado de transición, reduciendo así la energía libre de activación. Por ejemplo, se pueden posicionar óptimamente residuos generales ácidos y básicos para participar en la catálisis dentro de sitios activos catalizadores; se pueden formar intermedios covalentes de enzima-sustrato; los anticuerpos catalizadores también pueden estar en orientación adecuada para reaccionar y aumentar la concentración eficaz de reactivos en al menos siete órdenes de magnitud (Fersht et al., (1968), J. Am. Chem. Soc. 90:5833) y por tanto reducir en gran medida la entropía de una reacción química. Finalmente, los anticuerpos catalíticos pueden convertir la energía obtenida tras la unión y/o la estabilización subsiguiente del sustrato del intermedio en estado de transición para conducir la reacción.
Los residuos ácidos o básicos se pueden introducir en el sitio de unión al antígeno usando una molécula cargada complementariamente como un inmunógeno . Esta técnica ha probado ser exitosa en la provocación de anticuerpos con un hapteno que contiene un ión de amonio cargado positivamente (Shokat, et al., (1988), Chem. Int. Ed. Engl . 27:269-271). En otro enfoque, los anticuerpos se pueden provocar para dar compuestos estables semejantes en tamaño, forma y carga al intermedio en estado de transición de una reacción deseada (es decir, análogos en estado de transición) . Véase la patente estadounidense No. 4,792,446 y patente estadounidense No. 4,963,355 que describen el uso de análogos en estado de transición para inmunizar animales y la producción de anticuerpos catalíticos. Ambas patentes se incorporan a la presente a modo de referencia. Tales moléculas se pueden administrar como parte de un inmunoconjugado, por ejemplo, con una molécula portadora inmunogénica, tal como LH.
En otra modalidad, un dominio de región variable de un anticuerpo alterado de la invención consiste en un dominio VH, por ejemplo, derivado de camélidos, que es estable en ausencia de una cadena VL (Hamers-Casterman et al. (1993). Nature, 363:446; Desmyter et al. (1996) . Nat . Struct. Biol . 3: 803; Decanniere et al. (1999). Structure, 7:361; Davies et al. (1996). Protein En . , 9:531; Kortt et al. (1995) . J. Protein Chem. , 14 : 167) .
Además, un polipéptido de unión de la invención puede comprender un dominio variable o CDR derivado de un anticuerpo totalmente murino, totalmente humano, quimérico, humanizado, de primate no humano o primatizado. Los anticuerpos no humanos o fragmentos o dominios de los mismos se pueden alterar para reducir su inmunogenicidad usando métodos reconocidos en la técnica. Los anticuerpos humanizados son anticuerpos derivados de anticuerpos no humanos que han sido modificados para retener o retener sustancialmente las propiedades de unión del anticuerpo principal pero que son menos inmunogénicos en humanos que en anticuerpos no humanos principales. En el caso de anticuerpos diana humanizados, esto se puede lograr por varios métodos que incluyen, (a) injertar la totalidad de los dominios variables no humanos en regiones constantes humanas para generar anticuerpos diana quiméricos; (b) injertar al menos una parte de una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) no humanas en regiones flanqueantes y humanas con o sin retención de residuos flanqueantes críticos; (c) transplantar la totalidad de los dominios variables pero "ocultándolos" con una sección similar a la humana mediante el reemplazo de residuos superficiales. Tales métodos se describen en Morrison et al., (1984), PNAS . 81: 6851-5; Morrison et al., (1988), Adv. Immunol . 44: 65-92; Verhoeyen et al., (1988), Science 239: 1534-1536; Padlan, (1991), Molec. Immun. 28: 489-498; Padlan, (1994), Molec. Immun. 31: 169-217; y las patentes estadounidenses No. 5,585,089, 5,693,761 y 5,693,762 que se incorporan a la presente a modo de referencia en su totalidad.
También se puede usar la desinmunización para reducir la inmunogenicidad de un polipéptido de unión de la invención. Tal como se usa en la presente, el término "desinmunización11 incluye la modificación de epítopos de células T (véase, por ejemplo, W09852976A1, WO0034317A2) . Por ejemplo, se analizan las secuencias VH y VL y se genera un "mapa" de epítopo de célula T de cada región V que muestra la ubicación de epítopos con relación a las regiones determinantes de complementariedad (CDR) y otros residuos clave dentro de la secuencia. Los epítopos de células T individuales del mapa de epítopo de célula T se analizan para poder identificar las sustituciones de aminoácidos alternativas con poco riesgo de alterar la actividad del anticuerpo final. Se diseñan secuencias VH y VL alternativas que comprenden combinaciones de sustituciones de aminoácidos y estas secuencias se incorporan posteriormente en un intervalo de polipéptidos de la invención a los que se les prueba su funcionamiento. Típicamente, se generan y prueban entre 12 y 24 anticuerpos variantes. Luego se clonan genes completos de cadena pesada y ligera que comprenden regiones modificadas V y humanas C, en vectores de expresión y los plásmidos subsiguientes se introducen en líneas celulares para producir anticuerpos totales. Luego se comparan los anticuerpos en ensayos bioquímicos y biológicos apropiados y se identifica la variante óptima.
En una modalidad, los dominios variables empleados en un polipéptido de unión de la invención se alteran por al menos un reemplazo parcial de una o más CDR. En otra modalidad, los dominios variables se pueden alterar opcionalmente, por ejemplo, por un reemplazo parcial de la región flanqueante y un cambio de secuencias. Al realizar una región variable humanizada las CDR pueden derivarse de un anticuerpo de la misma clase o aun subclase que el anticuerpo de donde se derivan las regiones flanqueantes, sin embargo, se prevé que as CDR se derivarán de un anticuerpo de una clase distinta y preferentemente de un anticuerpo de una especie diferente. Puede no ser necesario reemplazar todas las CDR con las CDR completas de la región variable donante para transferir la capacidad de unión al antígeno de un dominio variable a otro. En cambio, puede solo ser necesario transferir aquellos residuos que son necesarios para mantener la actividad del dominio de unión. Dadas las explicaciones proporcionadas en las patentes estadounidenses No. 5,585,089, 5,693,761 y 5,693,762, estará en la competencia de aquellos expertos en la técnica, ya sea realizando experimentos de rutina o por el método de prueba y error, obtener un sitio funcional de unión al antígeno con inmunogenicidad reducida.
En una modalidad, un polipéptido de unión de la invención comprende al menos una CDR de un anticuerpo que reconoce una diana deseada. En otra modalidad, un anticuerpo alterado de la presente invención comprende al menos dos CDR de un anticuerpo que reconoce una diana deseada. En otra modalidad, un anticuerpo alterado de la. presente invención comprende al menos tres CDR de un anticuerpo que reconoce una diana deseada. En otra modalidad, un anticuerpo alterado de la presente invención comprende al menos cuatro CDR de un anticuerpo que reconoce una diana deseada. En otra modalidad, un anticuerpo alterado de la presente invención comprende al menos cinco CDR de un anticuerpo que reconoce una diana deseada. En otra modalidad, un anticuerpo alterado de la presente invención comprende las seis CDR de un anticuerpo que reconoce una diana deseada.
En una modalidad, los sitios de unión al antígeno empleados en los polipéptidos de unión de la presente invención pueden ser inmunorreactivos con uno o más antígenos asociados al tumor. Por ejemplo, para tratar un cáncer o una neoplasia, un dominio de unión al antígeno de un polipéptido de unión se une preferentemente a un antígeno asociado al tumor seleccionado. Dada la cantidad de antígenos reportados asociados con neoplasias y la cantidad de anticuerpos relacionados, aquellos expertos en la técnica observarán que un polipéptido de unión de la invención puede comprender una secuencia de región variable o una porción de la misma derivada de cualquiera de los anticuerpos enteros. Más generalmente, la secuencia de región variable se puede obtener o derivar de cualquier anticuerpo (incluidos aquellos previamente reportados en la bibliografía) que reaccionan con un antígeno o un marcador asociado con. la afección seleccionada. Ejemplos de antígenos asociados a un tumor unidos por un polipéptido de unión de la invención incluyen, por ejemplo, antígenos pan B (por ejemplo, CD20 encontrado en la superficie tanto de células B malignas como no malignas tales como las de linfoma no de Hodgkin) y antígenos de células pan T (por ejemplo, CD2 , CD3 , CD5, CD6, CD7) . Otros ejemplos de antígenos asociados a tumores comprenden pero no se limitan a MAGE-1, MAGE-3, MUC-1, HPV 16, HPV E6 & E7, TAG-72, CEA, -Lewisy, antígeno L6 , CD19, CD22, CD23, CD25, CD30, CD33, CD37, CD44, CD52, CD56, CD80, mesotelina, PSMA, HLA-DR, receptor EGF, VEGF, receptor VEGF, antígeno Cripto y receptor HER2.
En otras modalidades, el polipéptido de unión de la invención puede comprender el sitio de unión al antígeno completo (o regiones variables o secuencias de CD de las mismas) de anticuerpos que previamente reportaron haber reaccionado con antígenos asociados a tumores. Ejemplos de anticuerpos capaces de reaccionar con antígenos asociados a tumores incluyen: 2B8, Lym 1, Lym 2, LL2, Her2, Bl, BR96, MB1 , BH3, B4, B72.3, 5E8 , B3F6, 5E10, a-CD33, a-CanAg, a-CD56, a-CD44v6, -Lewis y OÍ-CD30. Más específicamente, estos ejemplos de anticuerpos incluyen pero no se limitan a 2B8 y C2B8 (Zevalin® y Rituxan"5, Biogen Idee, Cambridge) , Lym 1 y Lym 2 (Techniclone) , LL2 (Immunomedics Corp., Nueva Jersey), Trastuzumab (Herceptin , Genentech Inc., San Francisco del Sur) , Tositumomab (Bexxar , Coulter Pharm. , San Francisco) , Alemtzumab (Campath®, Millennium Pharmaceuticals , Cambridge), ® Gemtuzumab ozogamicina (Mylotarg , Wyeth-Ayerst , Filadelfía) , Abagovomab (Menarini, Italia), CEA-Scan™ (Immunomedics, Morris Plains, NJ) , Capromab (Prostascint® , Cytogen Corp.), Edrecolomab (Panorex®, Johnson & Johnson, New Brunswick, NJ) , Igovomab (CIS Bio Intl., Francia), Mitumomab (BEC2, Imclone Systems, Somerville, NJ) , Nofetumomab (Verluma®, Boehringer Ingleheim, Ridgefield, CT) , OvaRex (Altarex Corp., Waltham, MA) , Satumomab (Onoscint®, Cytogen Corp.), Apolizumab (REMITOGEN ™, Protein Design Labs, Fremont, CA) , Labetuzumab (CEACIDE ™, Immunomedics Inc., Morris Plains, NJ) , Pertuzumab (OMNITARG ™, Genentech Inc . , San Francisco del Sur, CA) , Panitumumab (Vectibix®, Amgen, Thousand Oaks, CA) , Cetuximab (Erbitux's, Imclone Systems, Nueva York) , Bevacizumab ® (Avastin , Genentech Inc., San Francisco del Sur), BR96, BL22, LMB9, LMB2, MB1 , BH3 , B4 , B72.3 (Cytogen Corp.), SS1 (NeoPharm) , CC49 (National Cáncer Institute) , Cantuzumab mertansina (ImmunoGen, Cambridge), NL 2704 ( illeneum Pharmaceuticals , Cambridge), Bivatuzumab mertansina (Boehringer Ingelheim, Alemania) , Trastuzumab-DMl (Genentech, San Francisco del Sur) , My9-6-DMl (ImmunoGen, Cambridge) , SGN-10, -15, -25, y -35 (Seattle Genetics, Seattle) y 5E10 (University of Iowa) . En aun otras modalidades, los polipéptidos de unión pueden comprender el sitio de unión de un anticuerpo anti-CD23 (por ejemplo, Lumiliximab) y un anticuerpo anti-CD80 (por ejemplo, Galiximab) o un anticuerpo anti-VL5/a5ßl-integrina (por ejemplo, Volociximab) . En otras modalidades, los polipéptidos de unión de la presente invención se unirán a los mismos antígenos asociados a tumores que los anticuerpos enumerados inmediatamente antes. En modalidades particularmente preferidas, los polipéptidos se derivan de o se unen a los mismos antígenos que Y2B8, C2B8, CC49 y C5E10.
Otros sitios de unión que se pueden incorporar en las moléculas de unión en el sujeto incluyen aquellos encontrados en: Ortoclone 0KT3 (anti-CD3) (JohnsonkJohnson, Brunswick, NJ) , ReoPro® (anti-GpIIb/glla) (Centocor, Horsham, PA) , Zenapax® (anti-CD25) (Roche, Basilea, Suiza), Remicade® (anti-TNFa) (Centocor, Horsham, PA) , Simulect® (anti-CD25) (Novartis, Basilea, Suiza) , Synagis® (anti-RSV) (Medimmune, Gaithersburg, MD) , Humira® (anti-TNFa) (Abbott, Abbott Park, IL) , Xolair® (anti-IgE) (Genentech, San Francisco del Sur, CA) , Raptiva® (anti-CDlla) (Genentech) , Tysabri® (Biogenldec, Cambridge, MA) , Lucentis® (anti-VEGF) (Genentech) y Soliris® (Alexion Pharmaceuticals , Cheshire, CT) .
En una modalidad, una molécula de unión de la invención puede tener uno o más sitios de unión derivados de uno o más de los siguientes anticuerpos: tositumomab (BEXXAR®) , muromonab (ORTHOCLONE®) e ibritumomab (ZEVALIN®) , cetuximab (ERBITUX™) , rituximab (MABTHERA®/RITUXA ®) , infliximab (REMICADE®) , abciximab (REOPRO®) y basiliximab (SIMULECT®) , efalizumab (RAPTIVA®, bevacizumab (AVASTIN®) , alemtuzumab (CAMPATH®) , trastuzumab (HERCEPTIN®) , gemtuzumab (MYLOTARG®) , palivizumab (SYNAGIS®) , omalizumab (XOLAIR®) , daclizumab ( ZENAPAX®) , natalizumab (TYSABRI®) y ranibizumab (LUVENTIS®) , adalimumab (HUMIRA®) y panitumumab (VECTIBIX®) .
En una modalidad, el polipéptido de unión se unirá al mismo antígeno que Rituxan^. Rituxan*8 (también conocido como, rituximab, IDEC-C2B8 y C2B8) fue el primer anticuerpo monoclonal aprobado por la FDA para el tratamiento de linfomas de células B (véase, patentes estadounidenses No. 5,843,439; 5,776,456 y 5,736,137 que se incorporan a la presente a modo de referencia) . Y2B8 (2B8 marcado con 90Y; Zevalin®,-ibritumomab tiuxetano) es el anticuerpo murino principal de C2B8. Rituxan® es un anticuerpo monoclonal quimérico anti-CD20 que es inhibitorio del crecimiento y sensibiliza considerablemente algunas líneas celulares de linfoma a la apoptosis por medio de agentes quimioterapéuticos in vitro. El anticuerpo se une eficazmente a un complemento humano, tiene una fuerte unión a FcR y puede eficazmente matar linfocitos humanos in vitro mediante ambos mecanismos dependientes del complemento (CDC) y dependientes del anticuerpo (ADCC) (Reff et al., Blood 83: 435-445 (1994)). Los expertos en la técnica observarán que el polipéptido de unión de la invención puede comprender regiones variables o CDR de C2B8 o 2B8, para proporcionar polipéptidos de unión que son aun más eficaces en el tratamiento de pacientes que presentan neoplasias CD20+.
En otras modalidades de la presente invención, el polipéptido de unión de la invención se unirá al mismo antígeno asociado a tumores que CC49. CC49 se une al antígeno asociado a tumores humano TAG-72 que se asocia a la superficie de determinado tumor de células de origen humano, específicamente la línea celular tumoral LS174T. LS174T es una variante de la línea de adenocarcinoma de colon LS180.
Los polipéptidos de unión de la invención pueden comprender sitios de unión al antígeno derivados de varios anticuerpos monoclonales de murino que se han desarrollado y que tienen especificidad de unión a TAG-72. Uno de estos anticuerpos monoclonales denominados B72.3 es una IgGl murina producida por el hibridoma B72.3. B72.3 es una primera generación de anticuerpos monoclonales desarrollados usando un extracto de carcinoma humano de mama como el inmunógeno (véase Colcher et al., Proc . Nati. Acad. Sci. (EUA) , 78:3199-3203 (1981); y patentes estadounidenses No. 4,522,918 y 4,612,282, que se incorporan a la presente a modo de referencia) . Otros anticuerpos monoclonales dirigidos contra TAG-72 se denominan "CC" para el cáncer de colon. Tal como se describe en Schlom et al. (patente estadounidense No. 5,512,443 que se incorpora a la presente a modo de referencia) los anticuerpos monoclonales CC son una familia de segunda generación de anticuerpos monoclonales murinos que se prepararon usando TAG-72 purificado con B72.3. Dadas sus afinidades de unión relativamente buenas a TAG-72, se prefieren los siguientes anticuerpos CC: CC49, CC 83, CC46, CC92, CC30, CC11 y CC15. Schlom et al. también produjeron variantes del anticuerpo humanizado CC49 tal como se describe en PCT/US99/25552 y construcciones de cadena simple Fv (scFv) tal como se describe en la patente estadounidense No. 5,892,019, que se incorpora a la presente a modo de referencia. Aquellos expertos en la técnica observarán que cada uno de los anticuerpos, construcciones o recombinantes anteriores o variantes de los mismos, pueden ser sintéticos y usarse para proporcionar sitios de unión para la producción de polipéptidos de unión de acuerdo con la presente invención.
Además de los anticuerpos anti-TAG-72 analizados anteriormente, muchos grupos también han reportado la construcción y la caracterización parcial de anticuerpos de dominio eliminado CC49 y B72.3 (por ejemplo, Calvo et al. Cáncer Biotherapy, 8(1):95-109 (1993), Slavin-Chiorini et al. Int. J. Cáncer 53:97-103 (1993) y Slavin-Chiorini et al. Cáncer. Res. 55:5957-5967 (1995). Por consiguiente, lo polipéptidos de unión pueden comprender sitios de unión al antígeno, una región variable o las CDR derivadas asimismo de estos anticuerpos.
En una modalidad, un polipéptido de unión de la invención comprende un sitio de unión al antígeno que se une al antígeno CD23 (patente estadounidense No. 6.011.138). En una modalidad preferida, un polipéptido de unión de la invención se une al mismo epítopo que el anticuerpo 5E8. En otra modalidad, un polipéptido de unión de la invención comprende al menos una CDR (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 CDR) de un anticuerpo anti-CD23, por ejemplo, el anticuerpo 5E8 (por ejemplo, Lumiliximab) .
En una modalidad, un polipéptido de unión de la invención se une al antígeno CRIPTO-I (WO02/088170A2 o WO03/083041A2) . En una modalidad más preferida, un polipéptido de unión de la invención se une al mismo epítopo que el anticuerpo B3F6. En aun otra modalidad, un anticuerpo alterado de la invención comprende al menos una CDR (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 CDR) o una región variable de un anticuerpo anti-CRIPTO-I, por ejemplo, el anticuerpo B3F6.
En otra modalidad, un polipéptido de unión de la invención se une al antígeno que es miembro de los receptores de la superfamilia TNF ( "TNFR" ) . En otra modalidad, las moléculas de unión de la invención se unen a al menos una diana que transduce una señal a una célula; por ejemplo, mediante la unión a un receptor de superficie celular, tal como un receptor de la familia TNF. Por "transducir una señal" se refiere a que mediante la unión a la célula, la molécula de unión convierte la influencia extracelular en el receptor de superficie celular en una respuesta celular; por ejemplo, modulando una senda de transducción de señales. El término "receptor TNF" o "miembro de la familia del receptor TNF" se refiere a cualquier receptor que pertenece a receptores de la superfamilia del factor de necrosis tumoral ("TNF") . Miembros de la superfamilia del receptor TNF ("TNFRSF") se caracterizan por una región extracelular con dos o más dominios ricos en cisteína (-40 aminoácidos cada uno) dispuestos como nudos de cisteína (véase Dempsey et al., Cytokine Growth Factor Rev. (2003). 14 (3-4) : 193-209) . Tras la unión de los ligandos de TNF cognados, los receptores de TNF transducen señales mediante la interacción directa o indirecta con proteínas adaptadoras citoplásmicas conocidas como TRAF (factores asociados al receptor TNF) . Los TRAF pueden inducir la activación de varias cascadas de cinasa que en última instancia llevan a la activación de sendas de transducción de señales tales como NF-KappaB, JNK, ERK, p38 y PI3K, que a su vez regulan los procesos celulares que varían entre la función inmune y la diferenciación tisular hasta la apoptosis. Las secuencias de nucleótido y de aminoácidos de varios miembros de la familia del receptor TNF son conocidos en la técnica e incluyen al menos 29 genes humanos. TNFRSF1A (TNFR1, también conocido como DR1 , CD120a, TNF-R-I p55, TNF-R, TNFRI , TNFAR, TNF-R55, p55TNFR, p55R, o TNFR60, GenBank GI No. 4507575; véase también US 5,395,760)), TNFRSF1B (CD120b, también conocido como p75, TNF-R, TNF-R-II, TNFR80, TNFR2 , TNF-R75 , TNFBR, o p75TNFR; GenBank GI No. 4507577) , TNFRSF3 (receptor de linfotoxina beta (LTßR) , también conocido como TNFR2-RP, CD18, TNFR-RP, TNFCR, o TNF-R-III; GI Nos. 4505038 y 20072212), TNFRSF4 (OX40, también conocido como antígeno ACT35, TXGP1L o CD134; GI Nos. 4507579 y 8926702), TNFRSF5 (CD40, también conocido como p50 o Bp50; GI Nos. 4507581 y 23312371), TNFRSF6 (FAS, también conocido como FAS-R, DcR-2, DR2 , CD95, APO-1, o APT1 ; GenBank GI Nos. 4507583, 23510421, 23510423, 23510425, 23510427, 23510429, 23510431, y 23510434)), TNFRSF6B (DcR3, DR3 ; GenBank GI Nos. 4507569, 23200021, 23200023, 23200025, 23200027, 23200029, 23200031, 23200033, 23200035, 23200037, y 23200039), TNFRSF7 (CD27, también conocido como Tp55 o S152 GenBank GI No. 4507587), TNFRSF8 (CD30, también conocido como Ki-1, o D1S166E; GenBank GI Nos. 4507589 y 23510437), TNFRSF9 (4-1-BB, también conocido como CD137 o ILA; GI Nos. 5730095 y 728738), TNFRSF10A (TRAIL-R1, también conocido como DR4 o Apo2 ; GenBank GI No. 21361086), TNFRSF10B (TRAIL-R2 , también conocido como DR5 , KILLER, TRICK2A, o TRICKB; GenBank GI Nos. 22547116 y 22547119) , TNFRSF10C (TRAIL-R3, también conocido como DcRl, LIT o TRID; GenBank GI No. 22547121), TNFRSF10D (TRAIL-R4, también conocido como DcR2 o TRUNDD) , TNFRSF11A (RANK; GenBank GI No. 4507565; véanse las patentes estadounidenses No. 6,562,948; 6,537,763; 6,528,482; 6,479,635; 6,271,349; 6,017,729), TNFRSF11B (Osteoprotegerina (OPG) , también conocida como OCIF o TR1 ; GI Nos. 38530116, 22547122 y 33878056) , TNFRSF12 (Proteína de membrana asociada a la cadena de translocación (TRAMP) , también conocida como DR3 , WSL-1, LARD, WSL-LR, DDR3 , TR3 , APO-3, Fnl4, o TWEAKR; GenBank GI No. 7706186; publicación de solicitud de patente estadounidense No. 2004/0033225A1) , TNFRSF12L (DR3L) , TNFRSF13B (TACI; GI No. 6912694), TNFRSF13C (BAFFR; GI No. 16445027), TNFRSF14 (Mediador de Entrada del Virus del Herpes (HVEM) , también conocido como ATAR, TR2 , LIGHTR, o HVEA; GenBank GI Nos. 23200041, 12803895 y 3878821) , TNFRSF16 (Receptor del Factor de Crecimiento Nervioso de baja afinidad (LNGFR) , también conocido como Receptor de Neurotrofinas o p75 (NTR) ; GenBank GI Nos. 128156 y 4505393) , TNFRSF17 (BCM, también conocido como BCMA; GI No . 23238192) , TNFRSF18 (AITR, también conocido como GITR; GenBank GI Nos. 4759246, 23238194 y 23238197), TNFRSF19 (Troy/Trade, también conocido como TAJ; GenBank GI Nos. 23238202 y 23238204) , TNFRSF20 (RELT, también conocido como FLJ14993; GI Nos. 21361873 y 23238200), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (SOBa, también conocido como Tnfrh2 o 2810028K06Rik) y TNFRSF23 (mSOB, también conocido como Tnfrhl) . Otros miembros de la familia TNF incluyen EDAR1 (receptor de Ectodisplasina A, también conocido como Downless (DL) , ED3 , ED5, ED1R, EDA3, EDA1R, EDA-AIR; GenBank GI No. 11641231; patente estadounidense No. 6,355,782), XEDAR (también conocido como EDA-A2R; GenBank GI No. 11140823) ; y CD39 (GI Nos. 2135580 y 765256) . En otra modalidad, un anticuerpo alterado de la invención se une a un miembro de la familia del receptor TNF que carece de un dominio de muerte. En una modalidad, el receptor TNF que carece de un dominio de muerte está implicado en la diferenciación tisular. En una modalidad más específica, el receptor TNF implicado en la diferenciación tisular se selecciona del grupo que consiste en LT R, RANK, EDAR1 , XEDAR, Fnl4, Troy/Trade, y NGFR. En otra modalidad, el receptor TNF que carece de dominio de muerte está implicado en la regulación inmune. En una modalidad más específica, el miembro de la familia del receptor TNF implicado en la regulación inmune se selecciona del grupo que consiste en TNFR2 , HVEM, CD27, CD30, CD40, 4-1BB, 0X40 y GITR. Ejemplos de anticuerpos pueden proporcionar sitios de unión específicos para estas así como otras dianas descritas en la presente son conocidos en la técnica. Por ejemplo, ejemplos de secuencias de anticuerpo anti-CD40 se pueden encontrar, por ejemplo, en las patentes estadounidenses No. 6.051.228 y 6.312.693.
En otra modalidad, un polipéptido de unión de la invención se une a un ligando TNF que pertenece a la superfamilia del ligando TNF. Los ligandos TNF se unen a distintos receptores de la superfamilia del receptor TNF y muestran 15-25% de homología de secuencia de aminoácidos entre sí (Gaur et al., Biochem. Pharmacol . (2003), 66 (8) : 1403-8) . Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de varios miembros de la superfamilia del receptor TNF (ligando) ( "TNFSF" ) son conocidas en la técnica e incluyen al menos 16 genes humanos. TNFSF1 (también conocido como Linftoxina-a (LTA) , T F o LT, GI No.:34444 y 6806893), TNFSF2 (también conocido como TNF, TNFOÍ o DIF; GI No. 25952111) , TNFSF3 (también conocido como Linfotoxina- ß (LTB) , TNFC o p33), TNFSF4 (también conocido como OX-40L, gp34, CD134L o glucoproteína activada transcripcionalmente por tax 1, 34kD (TXGP1) ; GI No. 4507603) , TNFSF5 (también conocido como CD40LG, IMD3, HIGM1 , CD40L, hCD40L, TRAP, CD154 o gp39; GI No. 4557433) , TNFSF6 (también conocido como FasL o APT1LG1; GenBank GI No. 4557329), TNFSF7 (también conocido como CD70, CD27L o CD27LG; GI No. 4507605) , TNFSF8 (también conocido como CD30LG, CD30L o CD153; GI No. 4507607), TNFSF9 (también conocido como 4-1BB-L o ligando ILA; GI No. 4507609), TNFSF10 (también conocido como TRAIL, Apo-2L o TL2 ; GI No. 4507593), TNFSF11 (también conocido como TRANCE, RANKL, OPGL o ODF; GI Nos. 4507595 y 14790152) , TNFSF12 (también conocido como Fnl4L, TWEAK, DR3LG o AP03L; GI Nos. 4507597 y 23510441), TNFSF13 (también conocido como APRIL) , TNFSF14 (también conocido como LIGHT, LTg o HVEM-L; GI Nos. 25952144 y 25952147) , TNFSF15 (también conocido como TL1 o VEGI) o TNFSF16 (también conocido como AITRL, TL6 , hGITRL o GITRL; GI No..4827034) . Otros miembros de la familia del ligando TNF incluyen el ligando EDAR1 & XEDAR (EDI; GI No. 4503449; Monreal et al. (1998) Am J Hum Genet . 63:380), el ligando Troy/Trade, BAFF (también conocido como TALLl; GI No. 5730097) y los ligandos NGF (por ejemplo, NGF-ß (GI No. 4505391), NGF-2/NTF3; GI No. 4505469), NTF5 (GI No. 5453808)), BDNF (GI Nos. 25306267, 25306235, 25306253, 25306257, 25306261, 25306264; IFRD1 (GI No. 4504607)) . En una modalidad más específica, el ligando TNF está implicado en la regulación inmune (por ejemplo, CD40L o TWEAK) .
En aun otras modalidades, un polipéptido de unión de la invención se une a una molécula que es útil para tratar una enfermedad o un trastorno autoinmunitario o inflamatorio.
Por ejemplo, un polipéptido de unión se puede unir a un antígeno presente en un inmunocito (por ejemplo, una célula B o T) o un autoantígeno responsable de una enfermedad o trastorno autoinmunitario . El antígeno asociado a un trastorno autoinmunitario o inflamatorio puede ser un antígeno asociado a tumores descrito anteriormente. Por tanto, un antígeno asociado a tumores también puede ser un trastorno autoinmunitario o inflamatorio. Tal como se usa en la presente, el término "enfermedad o trastorno autoinmunitario" se refiere a trastornos o afecciones en un sujeto donde el sistema inmunológico ataca las células de su propio cuerpo causando la destrucción tisular. Las enfermedades autoinmunitarias incluyen enfermedades atoinmunitarias generales, es decir, donde la reacción autoinmune ocurre simultáneamente en una cantidad de tejidos o enfermedades autoinmunitarias específicas de un órgano, es decir, donde la reacción autoinmune se dirige a un único órgano. Ejemplos de enfermedades autoinmunitarias que se pueden diagnosticar, prevenir o tratar mediante los métodos y las composiciones de la presente invención incluyen pero no se limitan a la enfermedad de Crohn; enfermedad inflamatoria intestinal (IBD); lupus eritematoso sistémico; colitis ulcerosa; artritis reumatoide; síndrome de Goodpasture ; enfermedad de Grave; tiroiditis de Hashimoto; pénfigo vulgar; miastenia grave; escleroderma ; anemia autoinmune hemolítica; púrpura trombocitopénica autoinmune; polimiositis y dermatomiositis ; anemia perniciosa; síndrome de Sjógren; espondilitis anquilosante; vasculitis; diabetes mellitus tipo 2; trastornos neurológicos , esclerosis múltiple y enfermedades secundarias ocasionadas como resultado de enfermedades autoinmunes .
En otras modalidades, los polipéptidos de unión de la invención se unen a una molécula diana asociada a una enfermedad o trastorno inflamatorio. Tal como se usa en la presente, el término "enfermedad o trastorno inflamatorio" incluye enfermedades o trastornos que son provocados, al menos parcialmente, o exacerbados por una inflamación, por ejemplo, flujo sanguíneo aumentado, edema, activación de inmunocitos (por ejemplo, proliferación, producción de citocina o fagocitosis potenciada). Por ejemplo, un polipéptido de unión de la invención se puede unir a un factor inflamatorio (por ejemplo, una metaloproteinasa de matriz (MMP) , TNFa, una interleucina, una proteína plasmática, una citocina, un metabolito lipídico, una proteasa, un radical tóxico, una proteína mitocondrial , una proteína apoptótica, una molécula de adhesión, etc.) implicado o presente en un área en cantidades aberrantes, por ejemplo, en cantidades que pueden ser ventajosas para alterar, por ejemplo, beneficiar al sujeto. El proceso inflamatorio es la respuesta del tejido vivo al daño. La causa de la inflamación se puede deber a daño físico, sustancias químicas, microorganismos, necrosis tisular, cáncer u otros agentes. La inflamación aguda es poco duradera, por ejemplo, dura solo unos pocos días. Sin embargo, si es muy duradera, entonces se puede referir a ella como una inflamación crónica.
Los trastornos inflamatorios incluyen trastornos inflamatorios agudos, trastornos inflamatorios crónicos y trastornos inflamatorios recurrentes. Los trastornos inflamatorios agudos son generalmente de duración relativamente corta y duran desde aproximadamente unos pocos minutos hasta aproximadamente uno o dos días, aunque pueden durar algunas semanas. Las principales características de los trastornos inflamatorios agudos incluyen flujo sanguíneo aumentado, exudación de fluido y proteínas plasmáticas (edema) y emigración de leucocitos, tales como neutrófilos. Los trastornos inflamatorios crónicos, en general, son de mayor duración, por ejemplo, semanas, meses, años o aun más y están asociados histológicamente a la presencia de linfocitos y macrófagos y a la proliferación de vasos sanguíneos y tejido conjuntivo. Los trastornos inflamatorios recurrentes incluyen trastornos que se vuelven a presentar luego de un período de tiempo o que tienen episodios periódicos. Ejemplos de trastornos inflamatorios recurrentes incluyen asma y esclerosis múltiple. Algunos trastornos pueden entrar en una o más categorías. Los trastornos inflamatorios están caracterizados generalmente por calor, enrojecimiento, hinchazón, dolor y pérdida de función. Ejemplos de causas de trastornos inflamatorios incluyen pero no se limitan a, infecciones microbianas (por ejemplo, infecciones bacterianas, virales y fúngicas) , agentes físicos (por ejemplo, quemaduras, radiación y traumatismos) , agentes químicos (por ejemplo, toxinas y sustancias cáusticas) , necrosis tisular y varios tipos de reacciones inmunológicas . Ejemplos de trastornos inflamatorios incluyen, pero no se limitan a, osteoartritis , artritis reumatoide, infecciones agudas y crónicas (bacterianas, virales y fúngicas) ; bronquitis agudas y crónicas, sinusitis y otras infeccionas respiratorias, que incluyen un resfrío común; gastroenteritis y colitis aguda y crónica; cistitis y uretritis aguda y crónica; síndrome de distrés respiratorio agudo; fibrosis cística; dermatitis aguda y crónica; conjuntivitis aguda y crónica; serositis aguda y crónica (pericarditis, peritonitis, sinovitis, pleuritis y tendinitis) ; pericarditis urémica; colecistis aguda y crónica; vaginitis aguda y crónica; uveítis aguda y crónica; reacciones por fármacos y quemaduras (térmicas, químicas y eléctricas).
En una modalidad preferida, un polipéptido de unión de la invención se une al anticuerpo CD40L (por ejemplo, al mismo epítopo que (es decir, compite con) un anticuerpo 5C8) . En aun otra modalidad, un polipéptido de la invención comprende al menos un sitio de unión al antígeno, una o más CDR (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 CDR), o una o más regiones variables (VH o VL) de un anticuerpo anti-CD40L (por ejemplo, un anticuerpo 5C8) . CD40L (CD154, gp39) , una proteína transmembrana está expresada en células T CD4+ activadas, mastocitos, basófilos, eosinófilos, linfocitos citolíticos naturales (NK) y plaquetas activadas. CD40L es importante para las respuestas de células B dependientes de células T. Una función prominente de la CD40L, el intercambio de isotipos, se demuestra mediante el síndrome de hiperinmunoglobulina M (Igm) donde la CD40L es deficiente congénitamente . La interacción CD40L-CD40 (en células que presentan antígeno tales como células dendríticas) es esencial para el cebado de células T y la respuesta inmunitaria humoral dependiente de células T. Por lo tanto, la interrupción de la interacción CD40L-CD40 con un anticuerpo monoclonal anti-CD40L (mAb) ha sido considerada una posible estrategia terapéutica en enfermedades autoinmunitarias humanas, según la información precedente y estudios en animales. Ejemplos de anticuerpos anti-CD40L de donde pueden derivarse los polipéptidos de unión de la invención, incluyen el anticuerpo 5C8 de ratón descrito en la patente estadounidense No. 5.474.771 que se incorpora a la presente a modo de referencia, así como versiones humanizadas del mismo, por ejemplo, el anticuerpo Hu5C8 descrito en los Ejemplos. Otros anticuerpos anti-CD40L son conocidos en la técnica (véase por ejemplo, la patente estadounidense No. 5.961.974 y la publicación internacional No. WO96/23071) . En modalidades particulares, un polipéptido de unión anti-CD40L de la invención comprende una secuencia VH y/o VL del anticuerpo 5C8.
En aun otras modalidades, un polipéptido de unión de la invención se une a una molécula que es útil para tratar una enfermedad o un trastorno neurológico.
Por ejemplo, un polipéptido de unión se puede unir a un antígeno presente en una célula neural (por ejemplo, una neurona, una célula glial o un) [sic] . En determinadas modalidades, el antígeno asociado a un trastorno neurológico puede ser un trastorno autoinmunitario o inflamatorio descrito anteriormente. Tal como se usa en la presente, el término "enfermedad o trastorno neurológico" incluye trastornos o afecciones en un sujeto donde el sistema nervioso se degenera (por ejemplo, trastornos neurodegenerativos así como trastornos donde el sistema nervioso no puede desarrollarse apropiadamente) o no logra regenerarse luego de la lesión, por ejemplo, lesión espinal. Ejemplos de trastornos neurológicos que se pueden diagnosticar, prevenir o tratar mediante los métodos y las composiciones de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, esclerosis múltiple, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, dolor neuropático, lesión cerebral traumática, síndrome Guillain-Barré y polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP) .
Ejemplos de moléculas que son útiles en el tratamiento de una enfermedad o trastorno neurologico y contra los cuales los polipéptidos de unión de la invención pueden dirigirse incluyen una proteína LINGO, por ejemplo, LINGO -1 y LINGO -4; una proteína semaforina, por ejemplo, semaforina- 6A; una proteína del receptor de muerte (DR) , por ejemplo, DR6 , una proteína TRAIN (o TAJ) ; TRKA, TRKB y una proteína NOGO . (b) Fragmentos de unión al antígeno En otras modalidades, un sitio de unión de un polipéptido de unión de la invención puede comprender un fragmento de unión al antígeno. El término "fragmento de unión al antígeno" se refiere a un fragmento de polipéptido de una inmunoglobulina, un anticuerpo o una variante de anticuerpo que se une al antígeno o compite con un anticuerpo intacto (es decir, con el anticuerpo intacto del que se deriva) para la unión al antígeno (es decir, unión específica) . Por ejemplo, los fragmentos de unión al antígeno se pueden derivar de cualquiera de los anticuerpos o variantes de anticuerpo descritos anteriormente. Los fragmentos de unión al antígeno se pueden producir mediante métodos recombinantes o bioquímicos que son conocidos en la técnica. Ejemplos de fragmentos de unión al antígeno incluyen anticuerpos de dominio simple, Fv, scFv, Fab, Fab' y (Fab') 2· En ejemplos de modalidades, un polipéptido de unión de la invención comprende al menos un fragmento de unión al antígeno que se enlaza de forma operativa (por ejemplo, se conjuga químicamente o fusiona genéticamente (por ejemplo, se fusiona directamente o se fusiona mediante un enlace polipeptídico) al extremo C-terminal y/o extremo N-terminal de una región Fe estabilizada de un polipéptido Fe variante. En un ejemplo de modalidad, un polipéptido de unión de la invención comprende un fragmento de unión al antígeno (por ejemplo, un Fab) que se enlaza de forma operativa al extremo N-terminal (o C-terminal) de al menos una región Fe estabilizada a través de un dominio bisagra o una porción del mismo (por ejemplo, una bisagra IgGl o una porción de esta, por ejemplo, una bisagra IgGl humana) . Un ejemplo de porción de dominio bisagra comprende la secuencia DKTHTCPPCPAPELLGG. (c) Moléculas de unión de cadena simple En otras modalidades, una molécula de unión de la invención puede comprender un sitio de unión de una molécula de unión de cadena simple (por ejemplo, una región variable de cadena simple o scFv) . Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena simple (patente estadounidense No. 4,694,778; Bird, Science 242:423-442 (1988); Huston et al., Proc . Nati. Acad. Sci . USA 85:5879-5883 (1988) y ard et al., Nature 334:544-554 (1989)) se pueden adaptar para producir moléculas de unión de cadena simple. Los anticuerpos de cadena simple se forman mediante el enlace de fragmentos pesados y ligeros o la región Fv mediante un puente de aminoácidos, dando como resultado un anticuerpo de cadena simple. Se pueden usar también técnicas para el ensamblaje de fragmentos Fv funcionales en E coli (Skerra et al., Science 242: 1038-1041 (1988) ) .
En determinadas modalidades, un polipéptido de unión de la invención comprende una o más regiones o sitios de unión que comprenden o consisten en una secuencia de región variable de cadena simple (scFv) . Las secuencias variables de cadena simple comprenden un polipéptido simple que tiene uno o más sitios de unión al antígeno, por ejemplo, un dominio VL enlazado por un enlace flexible a un dominio VH. Los dominios VL y/o VH se pueden derivar de cualquiera de los anticuerpos o variantes de anticuerpo descritos anteriormente. Las moléculas scFv se pueden construir en una orientación VH-enlace-VL o una orientación VL-enlace-VH . El enlace flexible que enlaza los dominios VL y VH que componen el sitio de unión al antígeno comprende preferentemente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 50 residuos de aminoácidos. En una modalidad, el enlace polipeptídico es un enlace polipeptídico gly-ser. Un ejemplo de enlace polipeptídico gly/ser es de la fórmula (Gly4Ser)n, donde n es un número entero positivo (por ej ,- 1, 2, 3, 4, 5 o 6) . Otros enlaces polipeptídicos son conocidos en la técnica. Anticuerpos con secuencias de región variable de cadena simple (por ejemplo, anticuerpos Fv de cadena simple) y métodos para crear tales anticuerpos de cadena simple son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Ho et al. 1989. Gene 77:51; Bird et al. 1988 Science 242:423; Pantoliano et al. 1991. Biochemistry 30:10117; Milenic et al. 1991. Cáncer Research 51:6363; Takkinen et al. 1991. Protein Engineering 4:837).
En determinadas modalidades, una modalidad scFv usada en el polipéptido de unión de la invención es una molécula scFv estabilizada. En una modalidad, la molécula cFv estabilizada puede comprender un enlace scFv interpuesto entre un dominio VH y un dominio VL, donde los dominios VH y VL se enlazan mediante un enlace disulfuro entre un aminoácido en el VH y un aminoácido en el dominio VL. En otras modalidades, la molécula scFv estabilizada puede comprender un enlace scFv que tiene una longitud o composición optimizada. En aun otras modalidades, la molécula scFv estabilizada puede comprender un dominio VH o VL que tiene al menos una sustitución o sustituciones de aminoácidos estabilizadora . En aun otra modalidad, una molécula scFv estabilizada puede tener al menos dos de los rasgos estabilizadores listados anteriormente. Las moléculas scFv estabilizadas tienen una estabilidad proteica mejorada o imparten una estabilidad proteica al polipéptido de unión al que están enlazadas de forma operativa. Los enlaces scFv preferidos de la invención mejoran la estabilidad térmica de un polipéptido de unión de la invención en al menos aproximadamente 2°C o 3°C en comparación con un polipéptido de unión convencional. Se pueden realizar comparaciones, por ejemplo, entre las moléculas scFv de la invención. En determinadas modalidades preferidas, la molécula scFv estabilizada comprende un enlace (Gly4Ser)4 scFv y un enlace disulfuro que une el aminoácido 44 VH y el aminoácido 100 VL. Otros ejemplos de moléculas scFv estabilizadas que se pueden emplear en los polipéptidos de unión de la invención se describen en la solicitud de patente provisional estadounidense No. 60/873,996, presentada el 8 de diciembre de 2006 o la solicitud de patente estadounidense No. 11/725,970, presentada el 19 de marzo de 2007, que se incorporan a la presente a modo de referencia en su totalidad.
En algunos ejemplos de modalidades, los polipéptidos de unión de la invención comprenden al menos un fragmento de unión al antígeno que se enlaza de forma operativa (por ejemplo, se conjuga químicamente o fusiona genéticamente (por ejemplo, se fusiona directamente o se fusiona mediante un enlace polipeptídico) al extremo C-terminal y/o extremo N-terminal de una región Fe fusionada genéticamente (es decir, una región scFc) . En un ejemplo de modalidad, un polipéptido de unión de la invención comprende al menos una molécula scFv (por ejemplo, una o más moléculas scFv estabilizadas) que se enlaza de forma operativa al extremo N-terminal (o C-terminal) de al menos una región Fe fusionada genéticamente mediante un dominio bisagra o una porción del mismo (por ejemplo, una bisagra IgGl o una porción de esta, por ejemplo, una bisagra IgGl humana). Un ejemplo de porción de dominio bisagra comprende la secuencia DKTHTCPPCPAPELLGG.
En determinadas modalidades, un polipéptido de unión de la invención comprende un sitio de unión tetravalente o una región formada por la fusión de dos o más moléculas scFv en serie. Por ejemplo, en una modalidad, las moléculas scFv se combinan de forma tal que una primera molécula scFv se une de forma operativa en su extremo N-terminal (por ejemplo, mediante un enlace polipeptídico (por ejemplo, un enlace polipeptídico gly/ser)) a al menos una molécula scFv adicional que tiene la misma o diferente especificidad de unión. Las matrices tándem de moléculas scFv se unen de forma operativa al extremo N-terminal y/o extremo C-terminal de al menos una región Fe fusionada genéticamente (es decir, una región scFc) para formar un polipéptido de unión de la invención.
En otra modalidad, un polipéptido de unión de la invención comprende un sitio o una región de unión tetravalente que se forma uniendo de forma operativa una molécula scFv (por ejemplo, mediante un enlace polipeptídico) a un fragmento de unión al antígeno (por ejemplo, un fragmento Fab) . Tales sitios o regiones de unión tetravalente se unen de forma operativa al extremo N-terminal y/o extremo C-terminal de al menos una región Fe fusionada genéticamente (es decir, una región scFc) para formar un polipéptido de unión de la invención . (d) Anticuerpos modificados En otros aspectos, los polipéptidos de unión de la invención pueden comprender sitios de unión al antígeno o porciones de los mismos, derivados de formas modificadas de anticuerpos. Ejemplos de tales formas incluyen, por ejemplo, minicuerpos, diacuerpos, triacuerpos, nanocuerpos, camélidos, Dabs , anticuerpos tetravalentes, intradiacuerpos (por ejemplo, Jendreyko et al. 2003. J. Biol . Chem. 278:47813), proteínas de fusión (por ejemplo, proteínas de fusión de citosina-anticuerpo, proteínas fusionadas con al menos una porción de un receptor Fe) y anticuerpos biespecíficos . Otros anticuerpos modificados se describen, por ejemplo, en la patente estadounidense No. 4,745,055; EP 256,654; Faulkner et al., Nature 298:286 (1982); EP 120,694; EP 125,023; Morrison, J. Immun. 123:793 (1979); Kohler et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 77:2197 (1980); Raso et al., Cáncer Res. 41:2073 (1981); Morrison et al., Ann. Rev. Immunol . 2:239 (1984); Morrison, Science 229:1202 (1985); Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:6851 (1984); EP 255,694; EP 266,663 y WO 88/03559. También se conocen cadenas de inmunoglobulina reordenada. Véase por ejemplo, la patente estadounidense No. 4,444,878; WO 88/03565; y EP 68,763 y las referencias citadas en las mismas.
En una modalidad, un polipéptido de unión de la invención comprende un sitio o región de unión al antígeno que es un minicuerpo o un sitio de unión al antígeno derivado del mismo. Los minicuerpos son moléculas diméricas compuestas por dos cadenas de polipéptidos y cada una comprende una molécula scFv que se fusiona a un dominio CH3 o a una porción del mismo mediante un enlace polipeptídico . Los minicuerpos se pueden formar enlazando un componente scFv y un componente CH3 -enlace polipeptídico usando métodos descritos en la técnica (véase, por ejemplo, la patente estadounidense 5,837,821 o O 94/09817A1) . Estos componentes se pueden aislar de plásmidos separados como fragmentos de restricción y luego ligarse y clonarse nuevamente en un vector apropiado (por ejemplo, un vector de expresión) . Se puede verificar un ensamblaje apropiado (por ejemplo, del marco abierto de lectura (ORF) que codifica la cadena de polipéptidos del minic pero monomérico) mediante digestión de restricción y análisis de la secuencia de ADN. En una modalidad, un polipéptido de unión de la invención comprende el componente scFv de un minicuerpo que se une de forma operativa a al menos una región Fe estabilizada de un polipéptido Fe variante. En otra modalidad, un polipéptido de unión de la invención comprende un minicuerpo tetravalente como un sitio o región de unión. Los minicuerpos tetravalentes se pueden construir de la misma manera que los minicuerpos, salvo que dos moléculas scFv se unen usando un enlace polipeptídico. La construcción enlazada scFv-scFv luego se une de forma operativa a una región Fe estabilizada para formar un polipéptido de unión de la invención.
En otra modalidad, un polipéptido de unión de la invención comprende un sitio o región de unión al antígeno que es un diacuerpo o un sitio de unión al antígeno derivado del mismo.. Los diacuerpos son moléculas diméricas, tetravalentes, cada una con un polipéptido similar a las moléculas scFv pero normalmente tienen un enlace residual corto de aminoácidos (por ejemplo, menor a 10 y preferentemente de 1-5) que conecta ambos dominios variables VL y VH, de forma tal que los dominios en la misma cadena polipeptídica no interactúan. En cambio, el dominio VL y VH de una cadena polipeptídica interactúan con el dominio VH y VL (respectivamente) en una segunda cadena polipeptídica (véase, por ejemplo, O 02/02781) . En una modalidad, un polipéptido de unión de la invención comprende un diacuerpo que se une de forma operativa al extremo N-terminal y/o C-terminal de al menos una región Fe estabilizada de un polipéptido Fe de la invención.
En determinadas modalidades, la molécula de unión comprende una molécula de unión de dominio simple (por ejemplo, un anticuerpo de dominio simple) unida a una región Fe estabilizada. Ejemplos de moléculas de dominio simple incluyen un dominio variable de cadena pesada aislada (VH) de un anticuerpo, es decir, un dominio variable de cadena pesada sin un dominio variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena ligera aislada (VL) de un anticuerpo, es decir, un dominio variable de cadena ligera sin un dominio variable de cadena pesada. Ejemplos de anticuerpos de dominio simple empleados en las moléculas de unión de la invención incluyen, por ejemplo, el dominio variable de cadena pesada de camélidos (aproximadamente entre 118 y 136 residuos de aminoácidos) tal como se describe en Hamers-Casterman, et al., Nature 363:446-448 (1993) y Dumoulin, et al., Protein Science 11:500-515 (2002) . Otros ejemplos de anticuerpos de dominio simple incluyen dominios VH o VL simples, también conocidos como Dabs® (Domantis Ltd. , Cambridge, RU) . Aun otros anticuerpos de dominio simple incluyen anticuerpos de tiburón (por ejemplo, Ig-NAR de tiburón) . Los Ig-NAR de tiburón comprenden un homodímero en un dominio variable (V-NAR) y cinco dominios constantes tipo C (C-NAR) donde la diversidad se concentra en una región CDR3 alargada que varía entre 5 y 23 residuos de longitud. En especies de camélidos (por ejemplo, llamas) , la región variable de cadena pesada, referida como VHH, forma todo el dominio de unión al antígeno. Las diferencias principales entre las regiones variables VHH de camélido y aquellas derivadas de anticuerpos convencionales (VH) incluyen (a) más aminoácidos hidrofóbicos en la superficie de contacto de la cadena ligera de VH en comparación con la región correspondiente en VHH, (b) una CDR3 más larga en VHH, y (c) la aparición frecuente de un enlace disulfuro entre CDR1 y CDR3 en VHH. Métodos para hacer moléculas de unión de dominio simple se describen en las patentes estadounidenses No. 6.005,079 y 6.765.087, que se incorporan a la presente a modo de referencia. Ejemplos de anticuerpos de dominio simple que comprenden dominios VHH incluyen Nanobodies® (Ablynx NV, Ghent, Bélgica) . (e) Moléculas de unión no de inmunoglobulina En determinadas modalidades, los polipéptidos de unión de la invención comprenden uno o más sitios de unión derivados de una molécula de unión no de inmunoglobulina. Tal como se usa en la presente, el término "moléculas de unión no de inmunoglobulina" se refiere a moléculas cuyos sitios de unión comprenden una porción (por ejemplo, andamiaje o marco) que se deriva de un polipéptido distinto de inmunoglobulina pero que puede estar modificado (por ejemplo, mutagenizado) para conferir una especificidad de unión deseada.
Otros ejemplos de moléculas de unión que comprenden sitios de unión no derivados de moléculas de anticuerpos incluyen sitios de unión al receptor y sitios de unión al ligando que se describen más detalladamente a continuación.
Las moléculas de unión no de inmunoglobulina pueden comprender porciones de sitios de unión derivadas de un miembro de la superfamilia de inmunoglobulina que no es una inmunoglobulina (por ejemplo, un receptor de células T o una proteína de adhesión a una célula (por ejemplo, CTLA-4, N-CAM, telokin) ) . Tales moléculas de unión comprenden una porción de sitio de unión que retiene la confirmación de un pliegue de inmunoglobulina y es capaz de unirse específicamente a una molécula de unión. En otras modalidades, las moléculas de unión no de inmunoglobulina de la invención también comprenden un sitio de unión con una topología de proteína que no se basa en el pliegue de inmunoglobulina (por ejemplo, tal como las proteínas de repetición de anquirina o fibronectinas) , pero que, sin embargo, son capaces de unirse específicamente a una diana .
Las moléculas de unión no de inmunoglobulina se pueden identificar mediante selección o aislamiento de una variante de unión a la diana de una biblioteca de moléculas de unión con sitios de unión diversificados artificialmente. Las bibliotecas diversificadas se pueden generar usando enfoques completamente al azar (por ejemplo, PCR propensa a errores, transposición de exones o evolución dirigida) o ayudar mediante estrategias de diseño reconocidas por la técnica. Por ejemplo, las posiciones de aminoácidos que normalmente están implicadas cuando los sitios de unión interactúan con su molécula diana cognata se pueden aleatorizar mediante la inserción de codones redundantes, trinucleótidos , péptidos al azar o bucles enteros en posiciones correspondientes dentro del ácido nucleico que codifica el sitio de unión (véase, por ejemplo, publicación estadounidense No. 20040132028). La ubicación de las posiciones de aminoácidos se puede identificar mediante la investigación de la estructura cristalina del sitio de unión junto con la molécula diana. Las posiciones candidato para aleatorización incluyen bucles, superficies planas, hélices y cavidades de unión del sitio de unión. En determinadas modalidades, los aminoácidos dentro del sitio de unión que son candidatos posibles para diversificación se pueden identificar mediante su homología con el pliegue de inmunoglobulina . Por ejemplo, los residuos dentro de los bucles similares a CDR de fibronectina se pueden aleatorizar para generar una biblioteca de moléculas de unión a la fibronectina (véase, por ejemplo, Koide et al., J. Mol. Biol., 284: 1141-1151 (1998)). Otras porciones del sitio de unión que se pueden aleatorizar incluyen superficies planas. Luego de la aleatorización, la biblioteca diversificada se puede someter luego a un procedimiento de selección o detección para obtener moléculas de unión con características de unión deseadas. Por ejemplo, se puede lograr la selección mediante métodos reconocidos en la técnica tales como expresión en fagos, expresión en levaduras o expresión en ribosomas.
En una modalidad, una molécula de unión de la invención comprende un sitio de unión de una molécula de unión a la fibronectina. Las moléculas de unión a la fibronectina (por ejemplo, moléculas que comprenden dominios de tipo fibronectina tipo I, II o III) expresan bucles similares a CDR que, en contraste con las intnunoglobulinas , no se apoyan en los enlaces disulfuro intracatenarios . Métodos para crear polipéptidos de unión a la fibronectina se describen, por ejemplo, en WO 01/64942 y en las patentes estadounidenses No. 6,673,901, 6,703,199, 7,078,490 y 7,119,171, que se incorporan a la presente a modo de referencia. En un ejemplo de modalidad, el polipéptido de unión a la fibronectina es como AdNectin® (Adnexus Therpaeutics, Waltham, MA) .
En otra modalidad, una molécula de unión de la invención comprende un sitio de unión de un Affibody® (Abcam, Cambridge, MA) . Los affibody® se derivan de los dominios de unión a la inmunoglobulina de la proteína A estafilocócica (SPA) (véase, por ejemplo, Nord et al., Nat . Biotechnol . , 15: 772-777 (1997) ) . Los sitios de unión al affibody® empleados en la invención se pueden sintetizar mutagenizando una proteína relaciona con SPA (por ejemplo, proteína Z) derivada de un dominio de SPA (por ejemplo, dominio B) y seleccionando polipéptidos relacionados con mutantes SPA que tienen una afinidad de unión deseada. Otros métodos para hacer sitios de unión al affibody® se describen en las patentes estadounidenses No. 6.740.734, 6.602.977 y en la WO 00/63243, que se incorporan a la presente a modo de referencia.
En otra modalidad, una molécula de unión de la invención comprende un sitio de unión de un Anticalin® (Pieris AG, Friesing, Alemania) . Las anticalinas (también conocidas como lipocalinas) son miembros de una familia diversa de proteínas de barril beta cuya función es enlazar moléculas diana en su región barril/bucle. Los sitios de unión a la lipocalina se pueden modificar para enlazarse a una diana deseada aleatorizando secuencias de bucle que conectan hebras del barril (véase, por ejemplo, Schlehuber et al., Drug Discov. Today, 10: 23-33 (2005); Beste et al., PNAS, 96: 1898-1903 (1999) . Los sitios de unión a la anticalina empleados en las moléculas de unión de la invención se pueden obtener a partir de polipéptidos de la familia de lipocalina que se mutan en cuatro segmentos que corresponden a las posiciones de secuencia de la cadena lineal de polipéptidos que comprende las posiciones de aminoácidos 28 a 45, 58 a 69, 86 a 99 y 114 a 129 de la proteína de unión a bilina (BBP) de Pieris brassica. Otros métodos para hacer sitios de unión a la anticalina se describen en W099/16873 y O 05/019254, que se incorporan a la presente a modo de referencia.
En otra modalidad, una molécula de unión de la invención comprende un sitio de unión de un polipéptido rico en cisteína. Los dominios ricos en cisteína empleados en la práctica de la presente invención no forman típicamente una hélice a, una lámina ß o una estructura ß-barril. Típicamente, los enlaces disulfuro promueven el pliegue del dominio en una estructura tridimensional. Normalmente, los dominios ricos en cisteína tienen al menos dos enlaces disulfuro, más típicamente al menos tres enlaces disulfuro. Un ejemplo de polipéptido rico en cisteína es una proteína de dominio A. Los dominios A (algunas veces llamados "repeticiones de tipo complemento") contienen aproximadamente 30-50 o 30-65 aminoácidos. En algunas modalidades, los dominios comprenden aproximadamente 35-45 aminoácidos y en algunos casos aproximadamente 40 aminoácidos. Dentro de los 30-50 aminoácidos hay aproximadamente 6 residuos de cisteína. De las seis cisteínas, típicamente se encuentran enlaces disulfuro en las siguientes cisteínas: Cl y C3 , C2 y C5 , C4 y C6. El dominio A constituye un resto de unión al ligando. Los residuos de cisteína del dominio se enlazan al disulfuro para formar un resto compacto, estable, funcionalmente independiente. Agrupaciones de estas repeticiones conforman un dominio de unión al ligando y la agrupación diferencial puede impartir especificidad con respecto a la unión al ligando. Ejemplos de proteínas que contienen dominios A incluyen, por ejemplo, componentes complementarios (por ejemplo, C6 , C7 , C8, C9 y Factor I), proteasas de serina (por ejemplo, enteropeptidasa , matriptasa y corina) , proteínas transmembrana (por ejemplo, ST7 , LRP3 , LRP5 y LRP6) y receptores endocíticos (por ejemplo, receptor relacionado con Sortilina, receptor LDL, VLDLR, LRP1, LRP2 y ApoER2 ) . Se describen métodos para crear proteínas del dominio A de una especificidad de unión deseada, por ejemplo, en WO 02/088171 y O 04/044011, que se incorporan a la presente a modo de referencia.
En otras modalidades, una molécula de unión de la invención comprende un sitio de unión de una proteína de repetición. Las proteínas de repetición son proteínas que contienen copias consecutivas de pequeñas unidades estructurales o repeticiones (por ejemplo, aproximadamente entre 20 y aproximadamente 40 residuos de aminoácidos) que se apilan para formar dominios contiguos. Las proteínas de repetición se pueden modificar para adecuarse a un sitio de unión diana particular ajustando la cantidad de repeticiones en la proteína. Ejemplos de proteínas de repetición incluyen proteínas de repetición de anquirina diseñadas (es decir, DARPins®, Molecular Partners, Zúrich, Suiza) (véase, por ejemplo, Binz et al., Nat . Biotechnol . , 22: 575-582 (2004)) o proteínas de repetición ricas en leucina (es decir, LRRP) (véase, por ejemplo, Pancer et al., Nature, 430: 174-180 (2004)). Todas las estructuras terciarias determinadas hasta el momento de unidades de repetición de anquirina comparten una característica compuesta por una horquilla ß seguida de dos hélices a antiparalelos y terminando con un bucle que conecta la unión de repetición con la próxima. Los dominios construidos a partir de unidades de repetición de anquirina se forman apilando las unidades de repetición hasta lograr una estructura extendida y curva. Los sitios de unión a LRRP forman parte del sistema inmune adaptativo de lamprea de mar y otros peces sin mandíbula y se asemejan anticuerpos en que están formados por la recombinación de un sistema de genes de repetición ricos en leucina durante la maduración de linfocitos. Métodos para hacer sitios de unión a DARpin o LRRP se describen en WO02/20565 y WO 06/083275, que se incorporan a la presente a modo de referencia.
Otros sitios de unión no de inmunogíobulina que se pueden emplear en moléculas de unión de la invención incluyen sitios de unión derivados de dominios de homología Src (por ejemplo, dominios SH2 o SH3) , dominios PDZ, beta-lactamasa, inhibidores de proteasa de alta afinidad o pequeños andamiajes de proteína de enlace disulfuro tales como toxinas de escorpión. Métodos para hacer sitios de unión derivados de estas moléculas se han descrito en la técnica, véase, por ejemplo, Silverman et al., Nat . Biotechnol . , 23(12) : 1493-4 (2005); Panni et al, J. Biol . Chem. , 277: 21666-21674 (2002), Schneider et al., Nat. Biotechnol., 17: 170-175 (1999); Legendre et al., Protein Sci., 11:1506-1518 (2002); Stoop et al., Nat. Biotechnol., 21: 1063-1068 (2003) y Vita et al., PNAS, 92: 6404-6408 (1995) . Aun otros sitios de unión se pueden derivar de un dominio de unión seleccionado del grupo que consiste en un dominio tipo EGF, un dominio Kringle, un dominio PAN, un dominio Gla, un dominio SRCR, un dominio inhibidor de tripsina pancreática Kunitz/Bovina , un dominio inhibidor de proteasa serina tipo Kazal, un dominio trefoil (tipo P) , un dominio C de factor tipo C von illebrand, un dominio similar a la anafilatoxina, un dominio CUB, una repetición de tipo I de trioglobulina, un dominio clase A receptora de LDL, un dominio Sushi, un dominio Link, un dominio tipo I de trombospondina , un dominio tipo inmunoglobulina, un dominio de lectina tipo C, un dominio MAM, un dominio tipo A de factor von Willebrand, un dominio de Somatomedina B, un dominio central disulfuro WAP tipo cuatro, un dominio F5/8 tipo C, un dominio hemopexina, un dominio similar a EGF tipo laminina, un dominio C2 , un dominio CTLA-4 y otros dominios similares conocidos para aquellos expertos en la técnica, así como derivados y/o variantes de los mismos. Polipéptidos de unión no de inmunoglobulina adicionales incluyen Avimers® (Avidia, Inc., Mountain View, CA -véase la publicación internacional PCT No. WO 06/055689 y la publicación de patente estadounidense 2006/0234299), Telobodies® (Biotech Studio, Cambridge, MA) , Evibodies® (Evogenix, -Sidney, Australia -véase patente estadounidense No. 7,166,697) y Microbodies® (Nascacell Technologies, Múnich, Alemania) . ii Porciones de unión de receptores y ligandos En otros aspectos, los polipéptidos de unión de la invención comprenden un sitio de unión al ligando de un receptor y/o una porción de unión al receptor de un ligando que se une de forma operativa a una región Fe estabilizada.
En determinadas modalidades, el polipéptido de unión es una fusión de una porción de unión al ligando de un receptor y/o una porción de unión al receptor de un ligando con una región Fe estabilizada. Toda región transmembrana o secuencias de reconocimiento de ancla lípido o fosfolípido del receptor de unión al ligando se inactivan o se eliminan preferentemente previo a la fusión. El ADN que codifica el ligando o el compañero de unión al ligando se escinde por medio de una enzima de restricción en o próximo a los extremos 51 y 31 del ADN que codifica el segmento ORF deseado. El fragmento de ADN resultante luego se inserta fácilmente (por ejemplo, ligado en el marco) en el ADN que codifica una región Fe fusionada genéticamente. El sitio preciso en el que se realiza la fusión se puede seleccionar empíricamente para optimizar las características de unión o secreción de la proteína de fusión soluble. El ADN que codifica la proteína de fusión luego se subclona en un vector de expresión apropiado que se puede transfectar en una célula hospedera para expresión.
En una modalidad, un polipéptido de unión de la invención combina el o los sitios de unión del ligando o receptor (por ejemplo, el dominio extracelular (ECD) de un receptor) con una región Fe estabilizada. En una modalidad, el dominio de unión del dominio del ligando o receptor se unirá de forma operativa (por ejemplo, fusionado a través de un enlazador polipeptídico) al extremo C-terminal de una región Fe estabilizada. También son posibles las fusiones al extremo N-terminal. En ejemplos de modalidades, las fusiones se realizan al extremo C-terminal de la región Fe estabilizada o extremo N-terminal inmediatamente al dominio bisagra de una región Fe estabilizada.
En determinadas modalidades, el sitio o dominio de unión de la porción de unión al ligando de un receptor se puede derivar de un receptor enlazado por un anticuerpo o variante de anticuerpo descrito anteriormente. En otras modalidades, la porción de unión al ligando de un receptor se deriva de un receptor seleccionado del grupo que consiste en un receptor de la superfamilia de inmunoglobulina (Ig) (por ejemplo, un receptor de células T. soluble, por ejemplo, mTCR® (Medigene AG, Múnich, Alemania) , un receptor de la superfamilia del receptor TNF descrito anteriormente (por ejemplo, un receptor TNFa soluble de una inmunoadhesina , por ejemplo, Enbrel® (Wyeth, Madison, NJ) ) , un receptor de la superfamilia del receptor del factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF) (por ejemplo, GFRa3) , un receptor de la superfamilia del receptor acoplado a la proteína G (GPCR) , un receptor de la superfamilia del receptor tirosina cinasa (TK) , un receptor de la superfamilia regulada por ligandos (LG) , un receptor de la superfamilia del receptor de quimiocina, superfamilia del receptor IL-l/tipo Toll (TLR) y una superfamilia del receptor de citocinas.
En otras modalidades, el sitio o dominio de unión de la porción de unión al ligando de un ligando se puede derivar de un ligando enlazado por un anticuerpo o variante de anticuerpo descrito anteriormente. Por ejemplo, el ligando puede unir un receptor seleccionado del grupo que consiste en un receptor de la superfamilia de Inmunoglobulina (Ig) , un receptor de la superfamilia del receptor TNF, un receptor de la superfamilia del receptor acoplado a la proteína g (GPCR) , un receptor de la superfamilia del receptor de tirosina cinasa (TK) , un receptor de la superfamilia regulada por ligandos (LG) , un receptor de la superfamilia del receptor de quimiocina, superfamilia del receptor IL-l/tipo Toll (TLR) y una superfamilia del receptor de citocinas. En un ejemplo de modalidad, el sitio de unión de la porción de unión al receptor de un ligando se deriva de un ligando que pertenece a la superfamilia del ligando TNF descrito anteriormente (por ejemplo, CD40L) . En otra modalidad, un ejemplo de molécula diana es CD200 o CD200R.
En otros ejemplos de modalidades, una polipéptido de unión de la invención puede comprender uno o más dominios de unión al ligando o dominios de unión al receptor derivados de una o más de las siguientes proteínas: 1. Citocinas y receptores de citocinas Las citocinas tienen efectos pleiotrópicos sobre la proliferación, diferenciación y la activación funcional de linfocitos . Se pueden utilizar varias citocinas o porciones de unión al receptor de las mismas, en las proteínas de fusión de la invención. Los ejemplos de citocinas incluyen las interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13 e IL-18), los factores de estimulación de colonias (CSF) (por ejemplo, CSF de granulocitos (G-CSF) , CSF de macrófago-granulocito (GM-CSF) y CSF de macrófago de monocitos (M-CSF) ) , factor de necrosis tumoral (TNF) alfa y beta, antígeno 4 de linfocito T citotóxico (CTLA-4) e interferones , tales como interferón a, ß o y (Patentes estadounidenses Nos. 4, 925^793 y 4,929,554) .
Los receptores de citocina consisten típicamente en una cadena alfa específica del ligando y una cadena beta común. Los ejemplos de receptores de citocina incluyen aquellos para GM-CSF, IL-3 (Patente estadounidense No. 5,639,605), IL-4 (Patente estadounidense No. 5,599,905), IL-5 (Patente estadounidense No. 5,453,491), receptor IL10, IFNy (EP0240975) y la familia TNF de receptores (por ejemplo, TNFa (por ejemplo TNFR-1 (EP 417, 563), TNFR-2 (EP 417,014) receptor beta de linfotoxina) . 2. Proteínas de adhesión Las moléculas de adhesión son proteínas unidas a la membrana que permiten que las células interactúen entre sí. Las diversas proteínas de fusión, incluyendo los receptores de alojamiento de leucocitos y las moléculas de adhesión celular o porciones de unión al receptor de los mismos, se pueden incorporar en una proteína de fusión de la invención. Los receptores de alojamiento de leucocitos se expresan en superficies celulares de leucocitos durante la inflamación e incluyen las integrinas ß-l (por ejemplo, VLA-1, 2, 3, 4, 5 y 6) que median la unión a los componentes de matriz extracelular y las integrinas ß2 (por ejemplo, LFA-1, LPAM-1, CR3 y CR4) que unen las moléculas de adhesión celular (CAM) sobre el endotelio vascular. Los ejemplos de CAM incluyen ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1 y MAdCAM-1. Otras CAM incluyen aquellas de la familia de selectina incluyendo E-selectina, L-selectina y P-selectina. 3. Quimiocinas Las quimiocinas, proteínas quimiotác icas que estimulan la migración de leucocitos hacia un sitio de infección, se pueden incorporar también a una proteína de fusión de la invención. Los ejemplos de quimiocinas incluyen proteínas inflamatorias de macrófagos (???-1- y ???-1-ß) , factor quimiotáctico de neutrófilos y RA TES (regulador de la activación de las células T normalmente expresadas y secretadas) . 4. Factores de crecimiento y receptores del factor de crecimiento Los factores de crecimiento o sus receptores (o unión al receptor o porciones de unión al ligando del mismo) se pueden incorporar en las proteínas de fusión de la invención. Los ejemplos de factores de crecimiento incluyen el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y sus isoformas (Patente estadounidense No. 5,194,596); factores del crecimiento fibroblástico (FGF) , incluyendo aFGF y bFGF; factor natriurético atrial (ANF) ; factores de crecimiento hepático (HGFs; Patentes estadounidense Nos. 5,227,158 y 6,099,841) , factores neurotróficos tal como el factor neurotróf ico derivado de huesos (BDNF) , ligandos del factor neurotrófico derivado de células gliales (por ejemplo, GDNF, neuturina, artemina y persefina) , neurotrófina-3 , -4, -5 o -6 (NT-3, NT-4, NT-5 o NT-6) o un factor de crecimiento nervioso tal como el factor de crecimiento derivado de plaquetas NGF-ß (PDGF) (Patentes estadounidenses Nos. 4,889,919, 4,845,075, 5,910,574 y 5,877,016); factores de crecimiento de transformación (TGF) tales como TGF-alfa y TGF-beta (WO 90/14359) , factores osteoinductivos incluyendo la proteína morfogenética del hueso (BMP) ; factores de crecimiento de tipo insulina I y II (IGF-I e IGF- II; Patentes estadounidenses Nos. 6,403,764 y 6,506,874) ; Eritropoietina (EPO) ; Trombopoeitina (TPO; factor de células madre (SCF) , trombopoietina (TPO, ligando c-Mpl) y los polipéptidos nt (Patente estadounidense No. 6, 159,462) .
Los ejemplos de receptores del factor de crecimiento que se pueden utilizar como dominios del receptor diana de la invención incluyen receptores EGF; receptores VEGF (por ejemplo, Fltl o Flkl/KDR) , receptores PDGF (WO 90/14425); receptores HGF (Patentes estadounidenses Nos. 5,648,273 y 5,686,292), y receptores neurotróficos incluyendo el receptor de baja afinidad (LNGFR) , también llamado p75NTR o p75, que une NGF, BDNF y NT-3, y receptores de alta afinidad que son miembros de la familia trk del receptor tirosina cinasas (por ejemplo, trkA, trkB (EP 455,460), trkC (EP 522,530)). 5. Hormonas Los ejemplos de hormonas de crecimiento para su uso como agentes diana en las proteínas de fusión de la invención incluyen renina, hormona de crecimiento humano (HGH; Patente estadounidense No. 5,834,598), hormona de crecimiento humana N-metionilo ; hormona de crecimiento bovina; factor de liberación de la hormona de crecimiento; hormona paratiroide (PTH) ; hormona estimuladora de la tiroides (TSH) ; tiroxina; proinsulina e insulina (Patentes estadounidenses Nos. 5,157,021 y 6,576,608); hormona estimuladora del folículo (FSH) ; calcitonina, hormona luteinizante (LH) , leptina, glucagones; bombesina; somatropina; sustancia inhibidora de Müllerian; relaxina y prorelaxina; péptido asociado a la gonadotropina; prolactina; lactógeno placentario; proteína OB o sustancia inhibidora de Müllerian. 6. Factores de coagulación Los ejemplos de factores de coagulación sanguínea para su uso como agentes diana en las proteínas de fusión de la invención incluyen los factores de coagulación (por ejemplo, factores V, VII, VIII, IX, X, XI, XII y XIII, factor de von Willebrand) ; factor tisular (Patente estadounidense Nos. 5,346,991, 5,349,991, 5,726,147 y 6,596,84); trombina y protrombina ; fibrina y fibrinógeno; plasmina y plasminógeno; activadores de plasminógenos , tal como urocinasa o urina humana o activador del plasminógeno de tipo tisular (t-PA) . III. Polipéptidos de unión multiespecífieos En determinadas modalidades particulares, un polipéptido de unión de la invención es multiespecífico, es decir, tiene al menos un sitio de unión que se une a una primera molécula o epítopo de una molécula y al menos un segundo sitio de unión que se une a una segunda molécula o a un segundo epítopo de la primera molécula. Las moléculas de unión multiespecíficas pueden comprender al menos dos sitio de unión, donde al menos uno de los sitios de unión se deriva de o comprende un sitio de unión de una de las moléculas de unión descritas anteriormente. En determinadas modalidades, al menos un sitio de unión de una molécula de unión multiespecífica de la invención es una región de unión al antígeno de un anticuerpo o un fragmentos de unión al antígeno del mismo (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo descrito anteriormente) . (a) Moléculas biespecíficas En una modalidad, un polipéptido de unión de la invención es biespecífica . Los polipéptidos de unión biespecíficos se pueden unir a dos sitios diana diferentes, por ejemplo, en la misma molécula diana o en diferentes moléculas diana. Por ejemplo, en el caso de los polipéptidos de unión de la invención, una variante biespecífica de los mismos se puede unir a dos epítopos diferentes, por ejemplo, en el mismo antígeno o en dos antígenos diferentes. Los polipéptidos de unión biespecíficos se pueden usar, por ejemplo, en aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico. Por ejemplo, se pueden usar para inmovilizar enzimas para su uso en inmunoensayos . También se pueden usar para el diagnóstico y tratamiento del cáncer, por ejemplo, mediante unión de ambos a una molécula asociada al tumor y un marcador detectable (por ejemplo, un quelante que une firmemente un radionucleido) . También se puede usar un polipéptido de unión biespecífico para terapia humana, por ejemplo, dirigiendo la citotoxicidad a una diana específica (por ejemplo, mediante unión a un patógeno o célula de tumor y a una molécula de activación citotóxica, tal como el receptor de linfocitos T o el receptor Fcy) . También se pueden usar polipéptidos de unión biespecíficos , por ejemplo, como agentes fibrinolíticos o adyuvantes de vacunas.
Los ejemplos de polipéptidos de unión biespecíficos incluyen aquellos con al menos dos brazos dirigidos contra diferentes antígenos de células tumorales; proteínas de unión alteradas biespecíf icas con al menos un brazo dirigido contra un antígeno de célula tumoral y al menos un brazo dirigido contra una molécula de activación citotóxica (tales como, anti - Fe . gamma .RI/anti-CD15, anti-pl85.sup. HER2 /Fe . gamma .RUI (CD16), célula B anti-CD3/anti-neoplásica (1D10), anti-CD3/ant i-pl85. su . HER2 , anti -CD3 /anti -p97 , carcinoma de célula anti-CD3/anti-renal , anti-CD3/anti-OVCAR-3 , anti-CD3/L-Dl (carcinoma anti-colon) , análogo de la hormona estimuladora de anti-CD3/anti-melanocitos , receptor anti-EGF/anti-CD3 , anti-CD3/anti-CAMAl, anti-CD3/anti-CD19 , anti-CD3/MoV18, molécula de adhesión de células anti-neurales (NCAM) /anti-CD3 , anti-proteína de unión a folato (FBP) /anti-CD3 , antígeno de carcinoma anti-pan asociado (AMOC-31) /anti-CD3) ; polipéptidos de unión biespecíf icos con al menos un brazo que se unen específicamente a un antígeno tumoral y al menos un brazo que se une a una toxina (tales como, anti-saporina/anti-Id-1, anti-CD22/anti-saporina, anti-CD7/anti-saporina, anti-CD38/anti-saporina, cadena A anti -CEA/anti -ricina, anti-interferón- .alfa. (IFN- .alfa. ) /idiotipo anti-hibridoma, anti-CEA/anti -vinca alcaloide) ; polipéptidos de unión biespecífieos para convertir profármacos activados por enzimas (tales como, anti -CD30/anti -alcalina fosfatasa (que cataliza la conversión de profármacos de fosfato de mitomicina a alcohol de mitomicina) ) ; polipéptidos de unión biespecíficos que se pueden usar como agentes fibrinolíticos (tales como, activador de plasminógenos anti-fibrina/anti-tisular (tPA) , activador de plasminógenos del tipo anti-fibrina/anti-urocinasa (uPA) ) ; polipéptidos de unión biespecíficos para dirigir complejos inmunes a receptores de superficie celular (tales como, anti-lipoproteína de baja densidad (LDL) /receptor anti-Fc (por ejemplo, Fe. gamma. RI, Fe. gamma. RII o Fe . gamma . RUI )) ; polipéptidos de unión biespecíficos para su uso en terapia de enfermedades infecciosas (tales como, anti -CD3/virus antiherpes simple (HSV) , anti-receptor de linfocitos T:complejo CD3/anti- influenza, anti-Fc . gamma . R/anti-HIV; polipéptidos de unión biespecíficos para detección tumoral in vitro o in vivo tales como anti-CEA/anti-EOTUBE, anti-CEA/anti-DPTA, anti-pl85HER2/anti-hapteno) ; polipéptidos de unión biespecíficos como adyuvantes de vacunas (véase Fanger et al., supra) ; y polipéptidos de unión biespecíficos como herramientas de diagnóstico (tales como, anti-conejo IgG/anti-ferritina, peroxidasa de rábano anti-caballo (HRP) /anti-hormona, anti-somatostatina/anti-sustancia P, anti-HRP/anti-FITC, anti-CEA/anti- .beta. -galactosidasa (véase, Nolan et al., supra)). Los ejemplos de polipéptidos triespecífieos incluyen anti-CD3/anti-CD4/anti-CD37, anti-CD3/anti-CD5/anti-CD37 y anti-CD3/anti-CD8/anti-CD37.
En una modalidad preferida, un polipéptido de unión biespecífico de la invención tiene un brazo que se une a CRIPTO-I. En otra modalidad preferida, un polipéptido de unión biespecífico de la invención tiene un brazo que se une a ??Gß? . En otra modalidad preferida, un polipéptido de unión biespecífico de la invención tiene un brazo que se une a TRAIL-R2. En otra modalidad preferida, un polipéptido de unión biespecífico de la invención tiene un brazo que se une a LT R y un brazo que se une a TRAIL-R2.
El polipéptido de unión multiespecífico de la invención puede ser monovalente para cada especificidad o multivalente para cada especificidad. Por ejemplo, los polipéptidos de unión de la invención pueden comprender un sitio de unión que reacciona con una primera molécula diana y un sitio de unión que reacciona · con una segunda molécula diana o puede comprender dos sitios de unión que reaccionan con una primera molécula diana y dos sitios de unión que reaccionan con una segunda molécula diana.
Los polipéptidos de unión de la invención pueden tener al menos dos especificidades de unión de dos o más dominios de unión de un ligando o receptor. Pueden ensamblarse como heterodímeros , heterotrímeros o heterotetrámeros , esencialmente como se describió en WO 89/02922 (publicada el 6 de abril de 1989), en EP 314, 317 (publicada el 3 de mayo de 1989) y en la Patente estadounidense No. 5,116,964 emitida el 2 de mayo de 1992. Los ejemplos incluyen CD4 - IgG/receptor TNF- IgG y CD4-IgG/L-selectina-IgG. La molécula mencionada en último lugar combina la función de unión al nodulo linfático del receptor de alojamiento de linfocitos (LHR, L-selectina) y la función de unión a VIH de CD4 y tiene aplicación potencial en la prevención o el tratamiento de infección por VIH, afecciones relacionadas o como un diagnóstico, (b) Moléculas de unión multiespecíficas que contienen scFv En una modalidad, las moléculas de unión multiespecíficas de la invención son moléculas de unión multiespecíficas que comprenden al menos una molécula scFv, por ejemplo, una molécula scFv descrita anteriormente. En otras modalidades, las moléculas de unión multiespecíficas de la invención comprenden dos moléculas scFv, por ejemplo, un scFv biespecífico (Bis-scFv) . En determinadas modalidades, la molécula scFv es una molécula scFv convencional. En otras modalidades, la molécula scFv es una molécula scFv estabilizada descrita anteriormente. En determinadas modalidades, una molécula de unión multiespecífica se puede crear uniendo una molécula scFv (por ejemplo, una molécula scFv estabilizada) a una estructura de molécula de unión que comprenda una molécula scFc. En una modalidad, la molécula de partida se selecciona de las moléculas de unión descritas anteriormente y la molécula scFv y la molécula de unión de partida tienen diferentes sitios de unión. Por ejemplo, una molécula de unión de la invención puede comprender una molécula scFv con una primera especificidad de unión unida a una segunda molécula scFv o una molécula de no unión a scFv, que imparte segunda especificidad de unión. En una modalidad, una molécula de unión de la invención es un anticuerpo de origen natural al cual se fusionó una molécula scFv estabilizada .
Cuando una scFv estabilizada se une a una molécula de unión principal, la unión de la molécula scFv estabilizada mejora preferentemente la estabilidad térmica de la molécula de unión al menos por aproximadamente 2°C o 3°C. En una modalidad, la molécula de unión que contiene scFv de la invención tiene una estabilidad térmica mejorada de 1°C en comparación con una molécula de unión convencional. En otra modalidad, la molécula de unión de la invención tiene una estabilidad térmica mejorada de 2°C en comparación con una molécula de unión convencional. En otra modalidad, la molécula de unión de la invención tiene una estabilidad térmica mejorada de 4, 5, 6°C en comparación con una molécula de unión convencional.
En una modalidad, las moléculas de unión multiespecíficas de la invención comprenden al menos una scFv (por ejemplo, 2, 3 o 4 scFv, por ejemplo, scFv estabilizadas) . Detalles adicionales con respecto a las moléculas scFv se pueden encontrar en USSN 11/725,970, incorporada en la presente a modo de referencia.
En una modalidad, las moléculas de unión de la invención son moléculas de unión multivalentes multiespecíficas que tienen al menos un fragmento de scFv con una primera especificidad de unión y al menos una scFv con una segunda especificidad de unión. En modalidades preferidas, al menos una de las moléculas scFv es estabilizada.
En otra modalidad, las moléculas de unión de la invención son moléculas de unión tetravalentes scFv. En modalidades preferidas, al menos una de las moléculas scFv es estabilizada. (c) Fragmentos de moléculas de unión multiespecíficas En determinadas modalidades, un polipéptido de unión de la invención puede comprender un sitio de unión de un fragmento de molécula de unión multiespecífica . Los fragmentos de moléculas de unión multiespecíficas incluyen moléculas Fab2 biespecíficas o Fab3 multiespecíficas (por ejemplo, triespecíficas) . Por ejemplo, un fragmento de moléculas de unión multiespecíficas pueden comprender multímeros químicamente conjugados (por ejemplo, dímeros, trímeros o tetrámeros) de moléculas Fab o scFv que tienen diferentes especificidades . (d) Moléculas de unión de dominio variable en tándem En otras modalidades, la molécula de unión multiespecífica puede comprender una molécula de unión que comprende sitios de unión al antígeno en tándem. Por ejemplo, un dominio variable puede comprender una cadena pesada del anticuerpo que se modificó genéticamente para incluir al menos dos (por ejemplo, dos, tres, cuatro o más) dominios pesados variables (dominios VH) que se fusionan o unen directamente en serie, y una cadena ligera del anticuerpo que se modificó genéticamente para incluir al menos dos (por ejemplo, dos, tres, cuatro o más) dominios ligeros variables (dominios VL) que se fusionan o unen directamente en serie. Los dominios VH interactúan con los dominios VL correspondientes para formar una serie de sitios de unión al antígeno donde al menos dos de los sitios de unión unen epítopos diferentes. Las moléculas de unión de dominio variable en tándem pueden comprender dos o más de las cadenas ligeras o pesadas y son de valencias de orden más alto (por ejemplo, bivalentes o tetravalentes) . Se conocen en la técnica los métodos para realizar moléculas de unión de dominio variable en tándem, véase, por ejemplo, WO 2007/024715. (e) Moléculas de unión de especificidad dual En otras modalidades, la molécula de unión multiespecífica de la invención puede comprender un sitio de unión simple que tenga especificidad de unión dual. Por ejemplo, una molécula de unión de especificidad dual de la invención puede comprender un sitio de unión que presente reactividad cruzada con dos epítopos. Se conocen en la técnica los métodos reconocidos en la práctica para la producción de moléculas de unión de especificidad dual. Por ejemplo, las moléculas de unión de especificidad dual se pueden aislar mediante análisis de moléculas de unión que unen el primer epítopo y mediante selección inversa de las moléculas de unión aisladas para la capacidad de unirse a un segundo epítopo. (f) Proteínas de fusión multiespecíficas En otra modalidad, una molécula de unión multiespecífica de la invención es una proteína de fusión multiespecífica . Tal como se usa en la presente, la frase "proteína de fusión multiespecífica" designa proteínas de fusión (como se definieron anteriormente en la presente) que tienen al menos dos especificidades de unión y comprenden adicionalmente una scFc. Las proteínas de fusión multiespecíficas pueden ensamblarse, por ejemplo, como heterodímeros , heterotrímeros o heterotetrámeros , esencialmente como se describió en WO 89/02922 (publicada el 6 de abril de 1989), en EP 314, 317 (publicada el 3 de mayo de 1989) y en la Patente estadounidense No. 5,116,964, emitida el 2 de mayo de 1992. Las proteínas de fusión multiespecíficas preferidas son biespecíficas . En determinadas modalidades, al menos [sic] de las especificidades de unión de la proteína de fusión multiespecífica comprende una scFv, por ejemplo, una scFv estabilizada.
Los expertos en la técnica pueden desarrollar una variedad de otras construcciones de anticuerpos multivalentes usando técnicas de ADN recom inante de rutina, por ejemplo como se describió en la Solicitud Internacional PCT PCT/US86/02269 ; Solicitud de Patente Europea No. 184,187; Solicitud de Patente Europea No. 171,496; Solicitud de Patente Europea No. 173,494; Publicación Internacional PCT No. WO 86/01533; Patente estadounidense No. 4,816,567; Solicitud de Patente Europea No. 125,023; Better efc al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci . USA 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol . 139:3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Cáncer Res. 47:999-1005; ood et al. (1985) Nature 314:446-449; Shaw efc al. (1988) J". Nati. Cáncer Inst. 80:1553-1559); Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; Patente estadounidense No. 5,225,539; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060 y Winter y Milstein, Nature, 349, pp . 293-99 (1991) ) . Los anticuerpos no humanos preferidos se "humanizan" mediante unión del dominio de unión al antígeno no humano a un dominio constante humano (por ejemplo, Cabilly et al., Patente estadounidense No. 4,816,567; Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 81, pp . 6851-55 (1984)).
Otros métodos que se pueden usar para preparar construcciones de anticuerpos multivalentes se describen en las siguientes publicaciones: Ghetie, Maria-Ana et al. (2001) Blood 97:1392-1398; Wolff, Edith A . et al . (1993) Cáncer Research 53:2560-2565; Ghetie, Maria-Ana et al . (1997) Proc. Natl. Acad. Sci . 94 : 7509-7514 ; Kim, J.C. et al . (2002) Int . J. Cáncer 97 (4) :542-547 ; Todorovska, Aneta et al . (2001) Journal of Immunological Methods 248:47-66; Coloma M.J. et al . (1997) Nature Biotechnology 15:159-163; Zuo, Zhuang et al . (2000) Protein Engineering (Suppl.) 13 (5) : 361-367; Santos A.D., et al . (1999) Clinical Cáncer Research 5 : 3118s-3123s; Presta, Leonard G. (2002) Current Pharmaceutical Biotechnology 3:237-256; van Spriel, Annemiek. et al . , (2000) Review Immunology Today 21(8) 391-397.
(VII) . Producción de polipéptidos Fe estabilizados Los polipéptidos Fe estabilizados de la invención se pueden sintetizar o expresar en células que expresan moléculas de ácido nucleico que codifican la secuencia de aminoácidos del polipéptido. Las secuencias de codificación se pueden seleccionar usando el código genético y, opcionalmente , optimizar para el sistema de expresión seleccionado.
Por ejemplo, habiendo seleccionado un polipéptido Fe variante con estabilidad potenciada, por ejemplo, un anticuerpo IgG quimérico, humano, humanizado o sintético, se encuentran disponibles una variedad de métodos para producir los polipéptidos. Como resultado de la degeneración del código, una variedad de secuencias de ácido nucleico codificará cada secuencia de aminoácidos del polipéptido. Las secuencias de ácido nucleico deseadas se pueden producir por síntesis de ADN de fase sólida de novo o por mutagénesis por PCR de un polinucleótido preparado anteriormente que codifica el polipéptido Fe. La mutagénesis mediada por oligonucleótidos es un método para la sustitución del codón que codifica un aminoácido de un polipéptido con una mutación estabilizadora. Por ejemplo, el ADN del polipéptido diana se altera hibridizando un oligonucleótido que codifica la mutación deseada a una plantilla de ADN de cadena simple. Luego de la hibridación, se usa una polimerasa de ADN para sintetizar una segunda hebra complementaria completa, de la plantilla que incorpora el cebador del oligonucleótido y codifica la alteración seleccionada en el ADN de polipéptido variante. En una modalidad, la modificación genética, por ejemplo, mutagénesis por PCR basada en cebadores, es suficiente para alterar el primer aminoácido, como se definió en la presente, para producir un polinucleótido que codifique un polipéptido que, cuando se exprese en una célula eucariota, tendrá ahora una región Fe estabilizada, por ejemplo, región Fe aglicosilada estabilizada.
Los polipéptidos Fe variantes de la invención comprenderán típicamente al menos una porción de una región constante del anticuerpo (Fe) , típicamente la de una inmunoglobulina humana. Comúnmente, el anticuerpo contendrá tanto la región variable de cadena pesada como la de cadena ligera. La región variable de cadena pesada incluye normalmente las regiones CH1, bisagra, CH2 y CH3 derivadas de anticuerpos del mismo o diferente isotipo. Sin embargo, se entiende que los anticuerpos descritos en la presente incluyen anticuerpos que tienen todos los tipos de regiones constantes, incluyendo IgM, IgG, IgD e IgE y cualquier isotipo, incluyendo IgGl, IgG2 , IgG3 e IgG . En una modalidad, se usa el isotipo humano IgGl. En otra modalidad, se usa el isotipo humano IgG4. En una modalidad, se usa la región Fe quimérica. Las regiones variables de cadena ligera pueden ser lambda o kappa . El anticuerpo humanizado puede comprender secuencias de más de una clase o isotipo. Los anticuerpos pueden expresarse como tetrámeros que contienen dos cadenas pesadas y dos ligeras, como cadenas pesadas y cadenas ligeras separadas, como Fab, Fab', F(ab')2 y Fv o como anticuerpos Fv de cadena simple (scFv) en los que se unen los dominios variables de cadena ligera y pesada a través de un espaciador.
Se describen en la presente los métodos para determinar la función efectora de un polipéptido que comprende una región Fe, por ejemplo, un anticuerpo tal como se describió en la presente, e incluyen ensayos puente basados en células para determinar cambios en la capacidad de una región Fe modificada para unirse a un receptor Fe. Se pueden usar otros ensayos de unión para determinar la capacidad de una región Fe de unirse a una proteína del complemento, por ejemplo, la proteína del complemento Clq. Se describen en la técnica métodos adicionales para determinar la función efectora de una región Fe modificada.
VIII. Polipéptidos que contienen Fe estabilizados que comprenden restos funcionales Los polipéptidos que contienen Fe variantes de la invención se pueden modificar adicionalmente para proporcionar un efecto deseado. Por ejemplo, la región Fe del polipéptido Fe variante se puede unir, por ejemplo, unir covalentemente , a un resto adicional, es decir, un resto funcional tales como, por ejemplo, un resto bloqueador, un resto detectable, un resto de diagnóstico y/o un resto terapéutico. Los ejemplos de restos funcionales se describen primero a continuación seguidos de químicas útiles para unir los restos funcionales a las diferentes químicas de cadenas laterales de aminoácidos.
Ejemplos de restos funcionales útiles incluyen, pero no se limitan a, un resto bloqueador, un resto detectable, un resto de diagnóstico y un resto terapéutico.
Los ejemplos de restos bloqueadores incluyen restos de suficiente volumen y/o carga estérica de modo que se reduzca la función efectora, por ejemplo, mediante inhibición de la capacidad de la región Fe de unir un receptor o proteína del complemento. Los restos bloqueadores preferidos incluyen un resto de polialquilenglicol , por ejemplo, un resto PEG y, preferentemente, un resto PEG-maleimida . Los restos de pegilación preferidos (o polímeros relacionados) pueden ser, por ejemplo, polietilenglicol ("PEG"), polipropilenglicol ("PPG"), glicerol polioxietilado ("POG") y otros polioles polioxietilados , alcohol polivinílico ("PVA") y otros óxidos de polialquileno, sorbitol polioxietilado o glucosa polioxietilada . El polímero puede ser un homopolímero, un copolímero aleatorio o de bloqueo, un terpolímero basado en los monómeros listados anteriormente, de cadena recta o ramificados, sustituidos o sin sustituir, mientras tenga al menos un resto de sulfona activa. La porción polimérica puede ser de cualquier longitud o peso molecular pero estas características pueden afectar las propiedades biológicas. Los pesos moleculares promedio del polímero particularmente útiles para disminuir velocidades de depuración en aplicaciones farmacéuticas se encuentran en el intervalo de 2,000 a 35,000 daltons . De manera adicional, si dos grupos se unen al polímero, cada uno en un extremo, la longitud del polímero puede impactar en la distancia efectiva y otras relaciones espaciales entre los dos grupos. De este modo, un experto en la técnica puede variar la longitud del polímero para optimizar o conferir la actividad biológica deseada. PEG es útil en las aplicaciones biológicas por varias razones. PEG es típicamente transparente, incoloro, inoloro, soluble en agua, estable al calor, inerte a varios agentes químicos, no se hidroliza y no es tóxico. La pegilación puede mejorar el rendimiento f rmacocinético de una molécula aumentando el peso molecular aparente de una molécula. El peso molecular aparente aumentado reduce la velocidad de depuración del cuerpo luego de la administración subcutánea o sistémica. En varios casos, la pegilación puede disminuir la antigenicidad y la inmunogenicidad . De manera adicional, la pegilación puede aumentar la solubilidad de una molécula biológicamente activa.
Los anticuerpos pegilados y fragmentos de anticuerpos se pueden usar generalmente para tratar afecciones que pueden aliviarse o modularse mediante administración de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos descritos en la presente. En general, los anticuerpos aglicosilados pegilados y fragmentos de anticuerpos tienen semivida aumentada en comparación con los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos aglicosilados no pegilados. Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos aglicosilados pegilados se pueden emplear solos, juntos o en combinación con otras composiciones farmacéuticas.
Los ejemplos de restos detectables que son útiles en los métodos y polipéptidos de la invención incluyen restos fluorescentes, restos radioisotópicos , restos radiopacos y similares, por ejemplo, marcadores detectables tal como, biotina, fluoróforos, cromóforos, sondas de resonancia de rotación o radioetiquetas . Los ejemplos de fluoróforos incluyen tintes fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína, rodamina y similares) y otras moléculas luminiscentes (por ejemplo, luminal) . Un fluoróforo puede ser tan sensible al ambiente que cambia su fluorescencia si está ubicado cerca de uno o más residuos en la proteína modificada que se somete a cambios estructurales tras la unión de un sustrato (por ejemplo, sondas de dansilo) . Los ejemplos de radioetiquetas incluyen moléculas pequeñas que contienen átomos con uno o más núcleos de baja sensibilidad (13C, 15N, 2H, 1251 , 123I, 99Tc, 43K, 52Fe, 67Ga, 68Ga, 1:uIn y similares) . Se conocen en la técnica otros restos útiles.
Los ejemplos de restos de diagnóstico que son útiles para los métodos y polipéptidos de la invención incluyen restos detectables adecuados para revelar la presencia de una enfermedad o trastorno. Típicamente, un resto de diagnóstico permite determinar la presencia, ausencia o el nivel de una molécula, por ejemplo, un péptido, proteína o proteínas diana que se asocian con una enfermedad o trastorno. Los diagnósticos son adecuados también para el pronóstico y/o diagnóstico de una enfermedad o trastorno y su desarrollo.
Los ejemplos de restos terapéuticos que son útiles para los métodos y polipéptidos de la invención incluyen, por ejemplo, agentes antiinflamatorios, agentes anticancerígenos, agentes antineurodegenerativos y agentes antiinfecciosos. El resto funcional puede tener también una o más de las funciones mencionadas anteriormente.
Los ejemplos de compuestos terapéuticos incluyen radionucleidos con radiación ionizante de gran energía que son capaces de ocasionar múltiples roturas de hebras en el ADN nuclear y, por consiguiente, son útiles para inducir la muerte celular (por ejemplo, de un cáncer). Los ejemplos de radionucleidos de gran energía incluyen: 90Y, 125I, 131I, 123I, In, Rh, Sm, Cu, Ga, Ho, Lu, Re y Re. Estos isótopos producen típicamente partículas de gran energía a o ß que tienen una longitud de camino corto. Los radionucleidos matan las células que se encuentran próximas, por ejemplo, células neoplásicas a las cuales se ha unido o ingresado el conjugado. Tienen poco efecto o ninguno sobre las células no localizadas y son esencialmente no inmunógenos .
Los ejemplos de compuestos terapéuticos incluyen también agentes citotóxicos, tales como citostáticos (por ejemplo, agentes alquilantes, inhibidores de síntesis de ADN, intercaladores o reticuladores de ADN o reguladores de transcripción ADN-ARN) , inhibidores de enzimas, reguladores génicos, nucleósidos citotóxicos, agentes de unión a tubulina, hormonas y antagonistas de hormonas, agentes an i -angiogénesis y similares.
Los ejemplos de compuestos terapéuticos incluyen también agentes alquilantes, tales como familias de antraciclina de fármacos (por ejemplo, adriamicina, carminomicina, ciclosporina-A, clorocina, metopterina, mitramicina, porfiromicina, estreptonigrina , porfiromicina, antracendionas y aziridinas) . En otra modalidad, el resto quimioterapéutico es un agente citostático, tal como un inhibidor de síntesis de ADN. Los ejemplos de inhibidores de síntesis de ADN incluyen, pero no se limitan a, metotrexato y diclorometotrexato, 1,4-dióxido de 3-amino-l, 2 , 4 -benzotriazina , aminopterina, citosina ß-D-arabinofuranosida, 5-fluoro-51 -desoxiuridina, 5-fluorouracilo, ganciclovir, hidroxiurea, actinomicina-D y mitomicina C. Los ejemplos de intercaladores o reticuladores de ADN incluyen, pero no se limitan a, bleomicina, carboplatino, carmustina, clorambucilo, ciclofosfamida, diclorhidrato de cis-diaminoplatino ( II ) (cisplatina) , melfalán, mitoxantrona y oxaliplatino .
Los ejemplos de compuestos terapéuticos incluyen también reguladores de transcripción, tales como actinomicina D, daunorubicina , doxorubicina, homoharringtonina e idarubicina. Otros ejemplos de agentes citostáticos que son compatibles con la presente invención incluyen benzoquinonas de ansamicina, derivados de quinonoide (por ejemplo, quinolonas, genisteína, bactaciclina) , busulfán, ifosfamida, mecloretamina, triazicuona, diazicuona, carbazilquinona, indoloquinona E09, DZQ metil diaziridinil-benzoquinona, trietilenfosforamida y compuestos de nitrosourea (por ejemplo, carmustina, lomustina, semustina) .
Los ejemplos de compuestos terapéuticos incluyen también nucleósidos citotóxicos, por ejemplo, arabinósido de adenosina, citarabína, arabinósido de citosina, 5-fluorouracilo, fludarabina, floxuridina, ftorafur y 6-mercaptopurina; agentes de unión a tubulina, tales como taxoides (por ejemplo, paclitaxel, docetaxel, taxano) , nocodazol, rizoxina, dolastatinas (por ejemplo, Dolastatina-10, -11 o -15), colchicina y colchicinoides (por ejemplo, ZD6126) , combretastatinas (por ejemplo, Combretastatina A-4, AVE-6032) y alcaloides de la vinca (por ejemplo, vinblastina, vincristina, vindesina y vinorelbina (navelbina) ) ; compuestos antiangiogénesis , tales como Angiostatina Kl-3, DL-OÍ-difluorometil-ornitina , endostatina, fumagilina, genisteína, minociclina, estaurosporina y (±) -talidomida .
Los ejemplos de compuestos terapéuticos incluyen también hormonas y antagonistas de hormonas, tales como corticosteroides (por ejemplo, prednisona) , progestinas (por ejemplo, hidroxiprogesterona o medroprogesterona) , estrógenos, (por ejemplo, dietilstilbestrol) , antiestrógenos (por ejemplo, tamoxifeno) , andrógenos (por ejemplo, testosterona) , inhibidores de aromatasa (por ejemplo, aminoglutetimida) , 17- (alilamino) -17-demetoxigeldanamicina, 4-amino-l, 8-naftalimida, apigenina, brefeldina A, cimetidina, ácido diclorometilen-difosfónico, leuprolida ( leuprorelina) , hormona de liberación de la hormona luteinizante , pifitrina-a , rapamicina, globulina de unión a la hormona sexual y tapsigargina .
Los ejemplos de compuestos terapéuticos incluyen también inhibidores, tales como S (+) -camptotecina curcumina, ( - ) -deguelina, ?-ß-D-ribofuranosida de 5 , 6 -diclorobenc-imidazol, etopósido, formestano, fostriecina, hispidina, ácido 2-imino-l-imidazolidinacético (ciclocreatina) , mevinolina, tricostatina A, tirfostina AG 34 y tirfostina AG 879.
Los ejemplos de compuestos terapéuticos incluyen también reguladores, tales como 5-aza-21 -desoxicitidina, 5-azacitidina, colecalciferol (vitamina D3) , 4-hidroxitamoxifeno, melatonina, mifepristona, raloxifeno, trans-retinal (aldehidos de vitamina A) , ácido retinoico, ácido de vitamina A, ácido 9-cis-retinoico, ácido 13-cis-retinoico, retinol (vitamina A), tamoxifeno y troglitazona .
Los ejemplos de compuestos terapéuticos incluyen también agentes citotóxicos, tales como por ejemplo, la familia de pteridina de fármacos, diinenos y las podofilotoxinas . Los miembros particularmente útiles de esas clases incluyen, por ejemplo, metopterina, podofilotoxina o derivados de podofilotoxina, tales como etopósido o fosfato de etopósido, leurosidina, vindesina, leurosina y similares.
Aun otras citotoxinas que son compatibles con las enseñanzas de la presente incluyen auristatinas (por ejemplo, auristatina E y monometilauristan E) , calicheamicina, gramicidina D, maitansanoides (por ejemplo, maitansina) , neocarzinostatina, topotecán, taxanos, citocalasina B, bromuro de etidio, emetina, tenopósido, colchicina, dihidroxi de antracendiona , mitoxant ona , procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, puromicina y análogos u homólogos de los mismos.
Se conocen en la técnica otros tipos de restos funcionales y se pueden usar fácilmente para los métodos y composiciones de la presente invención con base en las enseñanzas contenidas en la presente.
Se conocen en la técnica las químicas para la unión de los restos funcionales precedentes que pueden ser moléculas pequeñas, ácidos nucleicos, polímeros, péptidos, proteínas, compuestos quimioterapéuticos u otros tipos de moléculas a cadenas laterales de aminoácidos particulares (para un resumen detallado de enlazadores específicos, véase, por ejemplo, Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press (1996) ) .
IX. Expresión de polipéptidos Fe estabilizados Los polipéptidos Fe variantes de la invención se producen preferentemente mediante expresión recombinante de moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de la invención. En una modalidad, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido Fe estabilizado de la invención está presente en un vector. En el caso de anticuerpos, los ácidos nucleicos que codifican las regiones variables de cadena pesada y ligera, unidos opcionalmente a regiones constantes, se insertan en vectores de expresión. Las cadenas pesadas y ligeras se pueden clonar en los mismos vectores de expresión o diferentes. Los segmentos de ADN que codifican las cadenas de inmunoglobulina se unen de forma operativa a las secuencias de control en el o los vectores de expresión que aseguran la expresión de polipéptidos de inmunoglobulina. Las secuencias de control de expresión incluyen, pero no se limitan a, promotores (por ejemplo, promotores heterólogos o asociados naturalmente), secuencias de señal, elementos potenciadores y secuencias de terminación de transcripción. De preferencia, las secuencias de control de expresión son sistemas de promotores eucariotas en vectores capaces de transformar o transfectar células hospederas eucariotas. Una vez que el vector se incorporó en el hospedador adecuado, el hospedador se mantiene en condiciones adecuadas para expresión de alto nivel de las secuencias de nucleótidos y la recolección y purificación de los anticuerpos que presentan reactividad cruzada.
Estos vectores de expresión se replican típicamente en los organismos hospedadores como episomas o como una parte integral del ADN cromosomal hospedador. Comúnmente, los vectores de expresión contienen marcadores de selección (por ejemplo, resistencia a la ampicilina, resistencia a la higromicina, resistencia a la tetraciclina o resistencia a la neomicina) para permitir la detección de esas células transformadas con las secuencias de ADN deseado (véase, por ejemplo, Itakura et al., Patente estadounidense 4,704,362).
E. coli es un hospedador procariota particularmente útil para clonar los polinucleótidos (por ejemplo, secuencias de ADN) de la presente invención. Otros hospedadores microbianos adecuados para su uso incluyen bacilli, tales como Bacillus subtilus y otros enterobacteriaceae , tales como Salmonella, Serratia y varias especies de Pseudomonas .
Otros microbios, tal como levadura, son útiles para su expresión. Saccharomyces y Pichia son ejemplos de hospedadores de levadura, con vectores adecuados que tienen secuencias de control de expresión (por ejemplo, promotores) , un origen de replicación, secuencias de terminación y similares, según se desea. Los promotores típicos incluyen 3 -fosfoglicerato cinasa y otras enzimas glicolíticas . Los promotores de levadura inducibles incluyen, entre otros, promotores de deshidrogenasa de alcohol, isocitocromo C y enzimas responsables del uso de metanol, maltosa y galactosa.
En adición a los microorganismos, se puede usar también el cultivo tisular de mamíferos para expresar y producir los polipéptidos de la presente invención (por ejemplo, polinucleótidos que codifican inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas) . Véase Winnacker, From Genes to Clones, Editores VCH, N.Y., N.Y. (1987). De hecho se prefieren las células eucariotas, dado que se han desarrollado en la técnica una cantidad de líneas de células hospederas capaces de secretar proteínas heterólogas (por ejemplo, inmunoglobulinas intactas) e incluyen líneas de células CHO, varias líneas de células COS, células HeLa, células 293, líneas de células de mieloma, células B transformadas e hibridomas . Los vectores de expresión para estas células pueden incluir secuencias de control de expresión, tales como un origen de replicación, un promotor y un potenciador (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)) y sitios de información de procesamiento necesarios, tales como sitios de unión a ribosomas, sitios de corte y empalme del ARN, sitios de poliadenilación y secuencias de terminación transcripcional . Las secuencias de control de expresión preferidas son promotores derivados de genes de inmunoglobulina, SV40, adenovirus, virus de papiloma bovino, citomegalovirus y similares. Véase, Co et al., J". Immunol. 148:1149 (1992). En modalidades preferidas, se entenderá que un polipéptido de la invención es un polipéptido maduro, es decir, que no tiene una secuencia de señal.
De manera alternativa, las secuencias que codifican polipéptidos Fe variantes de la invención se pueden incorporar en transgenes para la introducción en el genoma de un animal transgénico y la expresión posterior en la leche del animal transgénico (véase, por ejemplo, Deboer et al., US 5,741,957, Rosen, US 5,304,489 y Meade et al., US 5,849,992). Los transgenes adecuados incluyen secuencias de codificación para cadenas pesadas y/o ligeras en unión operativa con un promotor y potenciador de un gen específico de glándula mamaria, tal como caseína o beta lactoglobulina .
Los vectores que contienen las secuencias de polinucleótidos de interés (por ejemplo, las secuencias codificadoras de cadena ligera y pesada y secuencias de control de expresión) se pueden transferir en una célula hospedera por métodos bien conocidos, que varían dependiendo del tipo de hospedador celular. Por ejemplo, la transfección de cloruro de calcio se utiliza comúnmente para las células procariotas, mientras que para otros hospedadores celulares se puede usar tratamiento de fosfato de calcio, electroporacion, lipofección, biolísticos o transfección viral. (Véase, en general, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2da ed., 1989) . Otros métodos usados para transformar células de mamífero incluyen el uso de polibreno, fusión de protoplastos , liposomas, electroporacion y microinyeccion (véase, en general, Sambrook et al., supra) . Para la producción de animales transgénicos , los transgenes se puden microinyectar en oocitos fertilizados o se pueden incorporar en el genoma de células madre embriónicas y los núcleos de las células se transfieren en oocitos enucleados.
Los polipéptidos de la invención se pueden expresar usando un vector simple o dos vectores. Por ejemplo, cuando las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo se clonan en vectores de expresión separados, los vectores se transfectan conjuntamente para obtener la expresión y ensamblaje de inmunoglobulinas intactas. Una vez que se expresaron, todos los anticuerpos, sus dímeros, las cadenas pesadas y ligeras individuales u otras formas de inmunoglobulina de la presente invención se pueden purificar de acuerdo con los procesos estándar de la técnica, incluyendo precipitación de sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía en columna, purificación por HPLC, electroforesis en gel y similares (véase, por ejemplo, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., (1982)). Se prefieren las inmunoglobulinas sustancialmente puras de al menos aproximadamente 90 a 95% de homogeneidad y se prefieren aun más de 98 a 99% o más de homogeneidad, para usos farmacéuticos.
Las moléculas Fe estabilizadas de la invención son particularmente adecuadas para la producción a gran escala dado que son resistentes a la agitación que ocurre cuando se aumenta a escala la producción. De manera adicional, estas moléculas son estables durante el envío y almacenamiento.
En una modalidad, la invención pertenece a un método para la fabricación a gran escala de un polipéptido que comprende una proteína de fusión Fe estabilizada, el método comprende : (a) fusionar genéticamente al menos un resto Fe estabilizado a un polipéptido para formar una proteína de fusión estabilizada; (b) transfectar una célula hospedera de mamífero con una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión estabilizada; (c) cultivar la célula hospedera del paso (b) en 10L o más de medio de cultivo en condiciones en las cuales se exprese la proteína de fusión estabilizada, de modo que se produzca la proteína de fusión estabilizada .
En otra modalidad, el método comprende: cultivar una célula hospedera que expresa una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión estabilizada en 10L o más de medio de cultivo en condiciones en las cuales se exprese la proteína de fusión estabilizada y se recupere la proteína de fusión estabilizada del medio de cultivo. Opcionalmente , se pueden usar uno o más pasos de purificación para obtener una composición de la pureza deseada (por ejemplo, en la cual se reduzca la contaminación de proteínas irrelevantes, agregados, formas inactivas de moléculas) .
X. Métodos profilácticos, de diagnóstico y terapéuticos La presente invención se dirige también, entre otros, al uso de polipéptidos Fe estabilizados para el pronóstico, diagnóstico o tratamiento de enfermedades, incluyendo, por ejemplo, trastornos donde se desea la unión de un antígeno usando un anticuerpo terapéutico pero se evita el disparo de la función efectora.
Por consiguiente, en determinadas modalidades, los polipéptidos Fe variantes de la presente invención son útiles en la prevención o el tratamiento de trastornos inmunitarios incluyendo, por ejemplo, glomerulonefritis , escleroderma, cirrosis, esclerosis múltiple, nefritis lúpica, aterosclerosis , enfermedad inflamatoria intestinal o artritis reumatoide . En otra modalidad, los polipéptidos Fe variantes de la invención se pueden usar para tratar o prevenir enfermedades inflamatorias, incluyendo, pero sin limitarse a, enfermedad de Alzheimer, asma grave, dermatitis atópica, caquexia, CHF-isquemia, restenosis coronaria, enfermedad de Crohn, nefropatía diabética, linfoma, psoriasis, fibrosis/radiación- inducida , artritis juvenil, apoplejía, inflamación del cerebro o sistema nervioso central causado por trauma y colitis ulcerativa.
Otras enfermedades inflamatorias que se pueden prevenir o tratar con los polipéptidos Fe variantes de la invención incluyen inflamación debido a transplante de córnea, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, hepatitis C, mieloma múltiple y osteoartritis .
En otra modalidad, los polipéptidos Fe variantes de la invención se pueden usar para prevenir o tratar neoplasia, incluyendo, pero sin limitarse a, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, sarcoma de Kaposi, melanoma, cáncer de ovario, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de estómago, leucemia/linforna y mieloma múltiple. Las afecciones de neoplasia adicionales incluyen, cáncer cervical, cáncer colorrectal, cáncer endometrial, cáncer de riñon, cáncer de pulmón de células no escamosas y cáncer de próstata.
En otra modalidad, los polipéptidos Fe variantes de la invención se pueden usar para prevenir o tratar trastornos neurodegenerativos, incluyendo, pero sin limitación, enfermedad de Alzheimer, apoplejía y lesiones del sistema nervioso central o cerebrales traumáticas. Los trastornos neurodegenerativos adicionales incluyen, enfermedad de la neurona motora/ALS, neuropatía periférica diabética, retinopatía diabética, enfermedad de Huntington, degeneración macular y enfermedad de Parkinson.
En aun otra modalidad, los polipéptidos Fe variantes de la invención se pueden usar para prevenir o tratar una infección causada por un patógeno, por ejemplo, un virus, organismo procariota u organismo eucariota.
En aplicaciones clínicas, un sujeto se identifica como que tiene o que está en riesgo de desarrollar una de las afecciones mencionadas anteriormente presentando al menos un signo o síntoma de la enfermedad o trastorno. Al menos un polipéptido Fe variante de la invención o composiciones que comprenden al menos un polipéptido Fe variante se administra en una cantidad suficiente para tratar al menos un síntoma de una enfermedad o trastorno, por ejemplo, tal como se mencionó anteriormente. En una modalidad, se identifica un sujeto como que tiene al menos un signo o síntoma de una enfermedad o trastorno asociado con actividad CD154 perjudicial (también conocida como ligando CD40 o CD40L; véase, por ejemplo, Yamada et al., Transplantation, 73:S36-9 (2002); Schonbeck et al., Cell. Mol. Life Sci. 42:4-43 (2001); Kirk et al., Philos. Trans . R. Soc . Lond. B. Sci. 356:691-702 (2001); Fiumara et al., Br. J. Haematol . 113:265-74 (2001) y iancone et al., Int. J. Mol. Med. 3(4) :343-53, 1999).
Por consiguiente, un polipéptido Fe variante de la invención es adecuado para la administración como un reactivo inmunológico terapéutico a un sujeto en condiciones que generan una respuesta terapéutica beneficiosa en un sujeto, por ejemplo, para la prevención o el tratamiento de una enfermedad o trastorno, por ejemplo, como se describió anteriormente .
Los agentes terapéuticos de la invención típicamente son sustancialmente puros del contaminante no deseado. Esto significa que un agente tiene típicamente al menos aproximadamente 50% p/p, (peso/peso) de pureza, así como es sustancialmente libre de las proteínas y los contaminantes que interfieren. A veces los agentes tienen al menos aproximadamente 80% p/p y, más preferentemente, al menos 90 o aproximadamente 95% p/p de pureza. Sin embargo, usando técnicas de purificación de proteínas convencionales, por ejemplo, tal como se describió en la presente, se pueden obtener péptidos homogéneos de al menos 99% p/p.
Los métodos se pueden usar en sujetos asintomáticos y en aquellos que muestran actualmente síntomas de la enfermedad.
En otro aspecto, la invención presenta la administración de un polipéptido Fe variante con un portador farmacéutico como una composición farmacéutica. De manera alternativa, el polipéptido Fe variante se puede administrar a un sujeto mediante la administración de un polinucleótido que codifica el polipéptido. Cuando el polipéptido Fe es un anticuerpo, el polinucleótido se puede expresar para producir una o ambas cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo. En determinadas modalidades, el polinucleótido se expresa para producir las cadenas ligeras y pesadas en el sujeto. En ejemplos de modalidades, el sujeto se controla para el nivel de anticuerpo administrado en la sangre del sujeto.
La invención satisface así una necesidad prolongada de regímenes terapéuticos para la prevención o mejora de afecciones inmunitarias, por ejemplo, afecciones inmunitarias asociadas a CD154.
Se entiende también que los anticuerpos de la invención son adecuados para el diagnóstico o la búsqueda de aplicaciones, especialmente, por ejemplo, una aplicación de diagnóstico o búsqueda que comprende un ensayo basado en células donde se desea la función efectora reducida.
XI. Modelos animales para probar la eficacia del polipéptido Fe Se puede administrar un anticuerpo de la invención a un mamífero no humano que necesita, por ejemplo, una terapia con un polipéptido Fe, con fines veterinarios o como un modelo animal de enfermedad humana, por ejemplo, una enfermedad o afección inmunitaria establecida anteriormente. Con respecto a lo último, los modelos animales pueden ser útiles para evaluar la eficacia terapéutica de los anticuerpos de la invención (por ejemplo, probar la función efectora, dosificaciones y cursos de tiempo de administración) .
Los ejemplos de modelos animales que se pueden usar para evaluar la eficacia terapéutica de polipéptidos Fe de la invención para prevenir o tratar artritis reumatoide (AR) incluyen: AR inducida por adyuvante, AR inducida por colágeno y AR inducida por colágeno mAb (Holmdahl et al., (2001) Immunol . Rev. 184:184; Holmdahl et al., (2002) Ageing Res. Rev. 1:135; Van den Berg (2002) Curr. Rheumatol . Rep. 4:232).
Los ejemplos de modelos animales que se pueden usar para evaluar la eficacia terapéutica de anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de la invención para prevenir o tratar la enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) incluyen: IBD inducida por TNBS, IBD inducida por DSS y (Padol et al. (2000) Eur. J. Gastrolenterol . Hepatol . 1:1?>?; Murthy et al. (1993) Dig. Dis. Sci. 38:1722).
Los ejemplos de modelos animales que se pueden usar para evaluar la eficacia terapéutica de anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de la invención para prevenir o tratar la glomerulonefritis incluyen: glomerulonefritis inducida por anti-GBM ( ada et al. (1996) Kidney Int. 49 : 761-767) y glomerulonefritis inducida por anti-thyl (Schneider et al. (1999) Kidney Int. 56:135-144) .
Los ejemplos de modelos animales que se pueden usar para evaluar la eficacia terapéutica de polipéptidos Fe variantes de la invención para prevenir o tratar la esclerosis múltiple incluyen: encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) (Link y Xiao (2001) Immunol. Rev. 184:117-128).
Los modelos animales también se pueden usar para evaluar la eficacia terapéutica de los polipéptidos Fe variantes de la invención para prevenir o tratar afecciones relacionadas con CD154, tales como lupus eritematoso sistémico (SLE) , por ejemplo usando ratones MRL-Faslpr (Schneider, supra; Tesen et al. (1999) J. Exp. Med. 190).
XII. Regímenes de tratamiento y dosificaciones En las aplicaciones profilácticas, las composiciones farmacéuticas o medicamentos se administran a un sujeto que sufre de un trastorno tratable con un polipéptido que tiene una región Fe, por ejemplo, un trastorno del sistema inmune, en una cantidad suficiente para eliminar o reducir el riesgo, disminuir la gravedad o retrasar el comienzo del trastorno, incluyendo síntomas bioquímicos, histológicos y/o de comportamiento del trastorno, sus complicaciones y fenotipos patológicos intermedios que se presentan durante el desarrollo del trastorno. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones o los medicamentos se administran a un sujeto que se sospecha que sufre o que ya sufre del trastorno en una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente, los síntomas del trastorno (bioquímicos, histológicos y/o de comportamiento) , incluyendo sus complicaciones y fenotipos patológicos intermedios en el desarrollo del trastorno. Los polipéptidos de la invención son particularmente útiles para la modulación de la actividad, biológica de un antígeno de superficie celular que resta en la sangre, donde la enfermedad que se trata o previene está originada al menos en parte por la actividad biológica anormalmente alta o baja del antígeno.
En algunos métodos, la administración del agente reduce o elimina el trastorno inmunitario, por ejemplo, inflamación, tal como asociada con la actividad CD154. Una cantidad adecuada para lograr el tratamiento terapéutico o profiláctico se define como una dosis terapéutica o profilácticamente eficaz. En ambos regímenes profilácticos y terapéuticos, los agentes se administran usualmente en varias dosificaciones hasta que se alcanza una respuesta inmunitaria suficiente.
Las dosis eficaces de las composiciones de la presente invención para el tratamiento de las afecciones descritas anteriormente varían dependiendo de varios factores diferentes, incluyendo medios de administración, sitio diana, estado fisiológico del sujeto, si el sujeto es humano o un animal, otros medicamentos administrados y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Normalmente, el sujeto es un humano pero también se pueden tratar los mamíferos no humanos que incluyen mamíferos transgénicos .
Para la inmunización pasiva con un polipéptido Fe variante, la dosificación oscila desde aproximadamente 0.0001 a 100 mg/kg, y más normalmente 0.01 a 20 mg/kg del peso corporal del hospedador. Por ejemplo, las dosificaciones pueden ser de 1 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro. del intervalo de 1-10 mg/kg, preferentemente al menos 1 mg/kg. Tales dosis se pueden administrar a los sujetos diariamente, en días alternados, semanalmente o de acuerdo con cualquier otro cronograma determinado por análisis empírico. Un ejemplo de tratamiento implica una administración en dosificaciones múltiples durante un período prolongado, por ejemplo, de al menos seis meses. Los ejemplos de regímenes de tratamiento adicionales implican una administración de una vez cada dos semanas o una vez por mes o una vez cada 3 a 6 meses. Los ejemplos de cronogramas de dosificaciones incluyen 1-10 mg/kg o 15 mg/kg en días consecutivos, 30 mg/kg en días alternados o 60 mg/kg por semana. En algunos métodos, dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de unión se administran de manera simultánea, en cuyo caso la dosificación de cada anticuerpo administrado se encuentra dentro de los intervalos indicados.
Los polipéptidos se administran normalmente en múltiples ocasiones. Los intervalos entre dosificaciones simples pueden ser semanales, mensuales o anuales. En algunos métodos, se ajusta la dosificación para alcanzar una concentración del anticuerpo en plasma de 1-1000 µ9/??1 y, en algunos métodos, 25-300 µg/ml . De manera alternativa, los polipéptidos se pueden administrar como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se necesita una administración menos frecuente. La dosificación y frecuencia varían dependiendo de la semivida del anticuerpo en el sujeto. En general, los anticuerpos humanos muestran la semivida más larga, seguidos de anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos y anticuerpos no humanos .
La dosificación y frecuencia de administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen los anticuerpos presentes o un cóctel de los mismos se administran a un sujeto que ya no está en el estado de enfermedad para potenciar la resistencia del sujeto. La cantidad se define como una "dosis profilácticamente eficaz". En este uso, las cantidades precisas dependen nuevamente del estado de salud y de la inmunidad general del sujeto, pero oscila generalmente de 0.1 a 25 mg por dosis, especialmente 0.5 a 2.5 mg por dosis. Se administra una dosificación relativamente baja en intervalos relativamente no frecuentes durante un largo período de tiempo. Algunos sujetos continúan recibiendo tratamiento por el resto de sus vidas.
En aplicaciones terapéuticas, a veces se necesita una dosificación relativamente alta (por ejemplo, de aproximadamente 1 a 200 mg del anticuerpo por dosis, con dosificaciones de 5 a 25 mg, siendo la más comúnmente usada) en intervalos relativamente cortos hasta que se reduzca o finalice el desarrollo de la enfermedad y, preferentemente, hasta que el sujeto muestre una mejora parcial o completa de síntomas de la enfermedad. Luego, se le puede administrar al paciente un régimen profiláctico.
Las dosis para ácidos nucleicos que codifican anticuerpos oscilan de aproximadamente 10 ng a 1 g, 100 ng a 100 mg, 1 µg a 10 mg o 30-300 µg de ADN por sujeto. Las dosis para vectores virales infecciosos varían de 10-100 o más viriones por dosis.
Los agentes terapéuticos se pueden administrar por medios parenterales , tópicos, orales, subcutáneos, intraarteriales , intracraneales, intraperitoneales , intranasales o intramusculares para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico. La vía de administración más típica de un fármaco de proteína es intravascular, subcutánea o intramuscular, aunque también pueden ser efectivas otras vías. En algunos métodos, los agentes se inyectan directamente en un tejido particular donde se han acumulado los depósitos, por ejemplo, inyección intracraneal. En algunos métodos, los anticuerpos se administran como una composición o dispositivo de liberación sostenida, tal como un dispositivo Medipad™. El fármaco de proteína se puede administrar también a través del tracto respiratorio, por ejemplo, usando un dispositivo de inhalación en polvo seco.
Los agentes de la invención se pueden administrar opcionalmente en combinación con otros agentes que son al menos parcialmente efectivos en el tratamiento de trastornos inmunitarios .
XIII. Composiciones farmacéuticas Las composiciones terapéuticas de la invención incluyen al menos un polipéptido Fe estabilizado de la invención en un portador farmacéuticamente aceptable. Un "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere al menos a un componente de una preparación farmacéutica que se usa normalmente para la administración de ingredientes activos. Como tal, un portador puede contener cualquier excipiente farmacéutico usado en la técnica y cualquier forma de vehículo para administración. Las composiciones pueden ser, por ejemplo, soluciones inyectables, suspensiones o soluciones acuosas, suspensiones o soluciones no acuosas, formulaciones orales sólidas y líquidas, pomadas, geles, ungüentos, parches intradérmicos , cremas, lociones, comprimidos, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida y similares. Los excipientes adicionales pueden incluir, por ejemplo, colorantes, agentes que enmascaran el sabor, asistentes de solubilidad, agentes de suspensión, agentes de compresión, recubrimientos entéricos, asistentes de liberación sostenida y similares .
Los agentes de la invención se administran a veces como composiciones farmacéuticas que comprenden un agente terapéutico activo, es decir, una variedad de otros componentes farmacéuticamente aceptables. Véase, Remington ' s Pharmaceutical Science (15ta ed. , Mack Publishing Company, Easton, Pensilvania (1980) ) . La forma preferida depende del modo de administración y la aplicación terapéutica pretendidas. Las composiciones pueden incluir también, dependiendo de la formulación deseada, portadores o diluyentes no tóxicos, farmacéuticamente aceptables, que se definen como vehículos usados comúnmente para formular composiciones farmacéuticas para administración animal o humana. El diluyente se selecciona de modo de no afectar la actividad biológica de la combinación. Ejemplos de los diluyentes son agua destilada, solución salina tamponada con fosfato fisiológica, solución de Ringer, solución de dextrosa y solución de Hank. De manera adicional, la composición o formulación farmacéutica puede incluir también otros portadores, adyuvantes o estabilizadores no tóxicos, no terapéuticos, no inmunogénicos y similares.
Los polipéptidos Fe variantes se pueden administrar en la forma de una inyección de depósito o preparación de implantes, que se pueden formular de manera tal que permitan una liberación sostenida del ingrediente activo. Un ejemplo de composición comprende un anticuerpo monoclonal a 5 mg/mL, formulado en amortiguador acuoso que consiste en 50 mM de L-histidina, 150 mM de NaCl , ajustado a pH 6.0 con HCl .
Típicamente, las composiciones se preparan como inyectables, tanto como soluciones o suspensiones líquidas; también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para la solución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección. La preparación también puede emulsificarse o encapsularse en liposomas o micropartículas , tal como poliláctido, poliglicólido o copolímero para un efecto de adyuvante potenciado, tal como se describió anteriormente (véase, Langer, Science 249: 1527 (1990) y Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28:97 (1997)) .
Los siguientes ejemplos se incluyen con fines ilustrativos y no deberían interpretarse como limitantes de la invención .
EJEMPLOS A través de los ejemplos se usaron los siguientes materiales y métodos a menos que se establezca lo contrario. Materiales y métodos En general, la práctica de la presente invención utiliza, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de química, biología molecular, tecnología de ADN recombinante, inmunología (especialmente, por ejemplo, tecnología de anticuerpos) y técnicas estándar en electroforesis . Véase, por ejemplo, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ; Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology) , 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed. , Irl Pr (1996); Antibodies : A Laboratory Manual, Harlow et al., C.S.H.L. Press, Pub. (1999) y Current Protocols in Molecular Biology, eds . Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992) .
Anticuerpos principales Para la producción de anticuerpos estabilizados de la invención, se introdujeron los polinucleótidos que codifican un anticuerpo humano modelo (por ejemplo, hu5c8) , anticuerpos variantes del mismo o regiones Fe correspondientes, en vectores de expresión estándar. El anticuerpo humano hu5c8 y variantes del mismo se describen, por ejemplo, en Patente estadounidense Nos. 5,474,771 y 6,331,615. A continuación se proporcionan las secuencias de aminoácidos para, respectivamente, la cadena pesada de IgG4 hu5c8 (SEQ ID NO: 37) , cadena ligera hu5c8 (SEQ ID NO: 38) , Fab hu5c8 (SEQ ID NO:39), resto Fe completo del anticuerpo IgG4 principal (SEQ ID NO:40) , resto Fe de IgG4 principal con mutación S228P (SEQ ID NO: 41) y resto Fe de IgG4 aglicosilado principal con mutaciones S228P/T299A (SEQ ID NO: 42) . La secuencia líder para la cadena pesada era DWTWRVFCLLAVAPGAHS .
También se proporcionan la cadena pesada (SEQ ID NO: 43) y secuencias del resto Fe (SEQ ID NO: 4) de un anticuerpo hu5c8 aglicosilado de IgGl principal.
Cadena pesada de IgG4 Hu 5c8 (EAG1807) (SEQ ID NO: 37) Q V Q L V Q S G A E V V K P G A S V K L S C K A S G Y I F T S Y Y M Y W V K Q A P G Q G L E W I G E I N P S.N G D T N F N E K F K S K A T L T V D K S A S T A Y M E L S S L R S E D T A V Y Y C T R S D G R N D M D S W G Q G T L V T V S S A S T K G P S V F P L A P C S R S T S E S T A A L G C L V K D Y F P E P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S V V T V P S S S L G T K T Y T C N V D H K P S N T K V D K R V E S K Y G P P C P P C P A P E F L G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S Q E D P E V Q F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q F N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K G L P S S I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S Q E E M T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S R L T V D K S R W Q E G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S L G Cadena ligera de Hu 5c8 (SEQ ID NO: 38) DIVLTQSPATLSVSPGERATISCRASQRVSSSTYSYMH YQQKPGQPPKLLIKYAS NLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFATYYCQHSWEIPPTFGGGTKLEIKRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Dominios VH/CH1 de Hu 5c8 (SEQ ID NO: 39) Q V Q L V Q S G A E V V K P G Á S V K L S C K A S G Y I F T S Y Y M Y V K Q A P G Q G L E I G E I N P S N G D T N F N E K F K S K A T L T V D K S A S T A Y M E L S S L R S E D T A V Y Y C T R S D G R N D M D S W G Q G T L V T V S S A S T K G P S V F P L A P C S R S T S E S T A A L G C L V K D Y F P E P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V.L Q S S G L Y S L S S V V T V P S S S L G T K T Y T C N V D H K P S N T K V D K R V Resto Fe de IgG4 principal (SEQ ID NO:40) E S K Y G P P C P S C P A P E F L G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S Q E D P E V Q F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q F N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K G L P S S I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S Q E E M T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S R L T V D K S R W Q E G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S L G Resto Fe de IgG4 principal con mutación S228P (SEQ ID N0:41) E S K Y G P P C P P C P A P E F L G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S Q E D P E V Q F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q F N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K G L P S S I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S Q E E M T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S R L T V D K S R Q E G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S L G Resto Fe aglicosilado de IgG4 principal con mutaciones S228P/T299A (YC407) (SEQ ID NO:42) ES YGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSQEDPEVQ FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSAYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE ESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG Resto Fe aglicosilado de IgGl principal (SEQ ID NO:43) EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKT PREEQY SAYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTK QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Fe aglicosilado de IgG4 principal con mutaciones S228P/N297Q (EAG2412) (SEQ ID NO: 44) ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQ FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP IgGl principal (SEQ ID NO: 45) EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDP EVKFN YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKC VSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE ESNGQPE NYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Ejemplo 1. Diseño racional de estabilidad ganada de mutaciones Fe de IgG Los anticuerpos aglicosilados representan una clase importante de reactivos terapéuticos donde no se desea la función efectora inmune. Sin embargo, está bien establecido que la eliminación de los oligosacáridos asociados a CH2 en IgGl e IgG4 afecta la conformación y estabilidad del anticuerpo. La pérdida de estabilidad del anticuerpo puede presentar pruebas de desarrollo del proceso impactando de manera adversa los horarios y las fuentes del programa. Aquí detallamos una cantidad de métodos usados para diseñar una biblioteca de posiciones de aminoácidos en CH2 y CH3 para generar estabilidad aumentada para Fe de IgG.
A. Covariación y diseños de frecuencia de residuos para las IgG sin efectores : Dominio CH2 de IgG4 Los análisis de covariación con la base de datos de secuencias de pliegue a Ig de clase Cl diversa se realizaron tal como se describió previamente (Glaser et al., 2007; ang et al., 2008). La compilación y estructura/alineación basada en HMM de secuencias de pliegue a Ig de clase Cl también se realizaron tal como se describió previamente (Glaser et al., 2007) . Los análisis de covariación consisten en un conjunto de .datos de coeficientes de correlación, valores f, con relación a cómo un par de aminoácidos es o no co-conservado dentro de secuencias de proteínas particulares, Los valores f oscilan de -1.0 a 1.0. Un valor f de 1.0 indica que cuando un aminoácido está en una posición dentro de un subconjunto de secuencias, otro aminoácido en una posición de residuos diferente también está siempre presente en ese subconjunto. Un valor f de -1.0 indica que cuando un aminoácido está en una posición dentro de un subconjunto de secuencias, otro aminoácido en una posición de residuos diferente nunca está presente en esa secuencia de subconjuntos . Se encontró que los valores f absolutos mayores a 0.2 eran estadísticamente significativos para el conjunto de datos que se analizaron (Glaser efc al., 2007; Wang et al., 2008) . Con base en la experiencia con el conjunto de datos, los valores f > 0.25 se consideraron significativos (es decir, es probable que haya una razón física para la co-existencia del par de aminoácidos), mientras que los valores f > 0.5 se consideraron muy fuertes y posiblemente co-conservados para razones funcionales o estructurales importantes.
Para este estudio, se usó la secuencia CH2 de IgG4 como una secuencia de consulta y se usó un valor f > 0.3 como un corte para identificar mutaciones por covariación. Los residuos identificados a partir del análisis de covariación se listaron en la Tabla 1.1 (todos los residuos subsiguientes detallados a lo largo del resto del Ejemplo 1 se listan en la Tabla 1.1) . En la Tabla 1.1, cada residuo le da referencia a las sustituciones de aminoácidos deseadas en la posición de acuerdo al sistema de numeración UE . "Razón" se refiere al método de diseño empleado. La covariación y la frecuencia de residuos se describen con detalle en la Solicitud de Patente estadounidense No. 11/725,970. La cantidad de uniones de covariación adicionales se refiere a las relaciones de covariación adicionales formadas por mutación al tipo de aminoácido listado en una posición dada menos la cantidad de relaciones de covariación perdidas debido a la modalidad de esta sustitución. La cantidad de uniones de covariación adicionales significa una medida adicional de la calidad de la mutación de covariación' sugerida. En el caso en que se sugieren que las sustituciones de aminoácidos múltiples no tienen una predominante cantidad adicional asociada de uniones de covariación, se usó un enfoque de biblioteca en esta posición en la que se analizaron los 20 aminoácidos usando el ensayo de prueba térmica Delphia (detallado en el Ejemplo 2). Usando esta metodología, se identificaron seis posiciones de aminoácidos con mutaciones de covariación específicas, que sugirieron: L242P (que significa que L en la posición 242 cambió a P) , Q268D, N286T, T307P, Y319F y S330A. De manera adicional, se identificó que cinco posiciones de residuos tienen sustituciones preferidas múltiples (uniones de covariación adicionales positivas) y se usó un enfoque de biblioteca. Estas posiciones son: D270, P271, E294, A299 y N315.
Se usaron con éxito los métodos para mejorar la estabilidad con base en el análisis de frecuencia de residuos en posiciones individuales dentro de un pliegue de proteínas (Steipe, 2004; Demarest et al., 2006) y se describieron previamente en la solicitud de patente BGNA242-1 "POLIPÉPTIDOS ESTABILIZADOS Y MÉTODOS PARA EVALUAR Y AUMENTAR LA ESTABILIDAD DE LOS MISMOS" para identificar las posiciones de biblioteca dentro de los dominios VH y VL BHA10 del anticuerpo anti-LT R. Se usó el análisis de frecuencia de residuos para identificar cinco posiciones de residuos para mutaciones de estabilidad ganada: N276S, K288R, V308I, S324N y G327A. De manera adicional, se generaron dos residuos por error de PCR en la producción de las mutaciones de frecuencia de residuos y covariación: L309 y N325.
Tabla 1.1. Residuos para ganar estabilidad en mutaciones razón Número de Residuo Número Residu Frecuencia Covariació uniones de Mutaciones más Razón EU o lgG4 de residuo n 0.3 covariación realizadas frecuente adicionales 242 L .1 0.27 P 1 P Covariación 268 Q Q 1.00 D 1 D Covariación * 270 D D 1.00 biblioteca nnk Covariación * 271 P P 1.00 biblioteca nnk Covariación 286 N T 0.17 T 10 T Covariación * 294 E E 1.00 biblioteca nnk Covariación 299 A T 1.00 * biblioteca K, Y, L Covariación 307 T P 0.35 P 5 P Covariación 315 N N 1.00 * biblioteca nnk Covariación 319 Y F 0.27 F 1 F Covariación 330 S A 1.00 A 10 A Covariación Frecuencia de 276 N S 0.70 S residuo Frecuencia de 288 K R 0.91 R residuo Frecuencia de 308 V 1 0,35 I residuo Frecuencia de 324 s N 0.21 H, N residuo Frecuencia de 327 G A 1.00 A residuo 309 L , ?, ? Análisis 325 N N H Análisis Análisis de 269 E biblioteca estructura: En bucle extendido Análisis de 349 Y F estructura: Interfase Análisis de 350 T V estructura: Interfase Análisis de 394 T V estructura: Interfase Análisis de 399 D -· E, S estructura: Interfase Análisis de 405 F Y estructura: Interfase Número de Residuo Número Residu Frecuencia Covariació uniones de Mutaciones más Razón EU o lgG4 de residuo n 0.3 covariación realizadas frecuente adicionales Análisis de 409 R K, M, I estructura: Interfase Análisis de 266 V F, Y estructura: Volumen interior Análisis de estructura: 264 V K, T, N Carbohidrato cercano Análisis de estructura: 292 R S, F Carbohidrato cercano Análisis de estructura: 303 V S Carbohidrato cercano Análisis de 310 H K, S, A estructura: CH3 cercano Análisis de 268 Q H estructura: Carga de residuo Análisis de 274 Q H, R estructura: Carga de residuo Análisis de 355 Q R, H estructura: Cargo de residuo Análisis de 419 E Q, estructura: Carga de residuo Análisis de 240 V I estructura: Termoestable Análisis de 255 V I estructura: Termoestable Análisis de 263 V I estructura: Número de Residuo Número Residu Frecuencia Covariació uniones de Mutaciones más Razón EU o lgG4 de residuo n 0.3 covariación realizadas frecuente adicionales Termoestable Análisis de 302 V estructura: 1 Termoestable Análisis de 323 V estructura: 1 Termoestable Análisis de 348 V estructura: ' Termoestable Análisis de 351 L estructura: Termoestable Análisis de 363 V estructura: Termoestable Análisis de 368 L estructura: Termoestable Análisis de 369 V estructura: 1 Termoestable Análisis de 379 V estructura: 1 Termoestable Análisis de 397 V estructura: Termoestable Análisis de 412 V estructura: Termoestable Análisis de 427 V l, F estructura: Termoestable B. Diseños de análisis estructural para los IgG sin efectores En adición al diseño de mutaciones por análisis de frecuencia de residuos y covariación, análisis de estructura de la estructura cristalina publicada del anticuerpo IgG b.12 humano intacto (código pdb : lhzh; ref : Saphire, E.O., et al. (2001) Crystal structure of a neutralizing human IGG against HIV-1: a témplate for vaccine design. Science 293:1155-1159). El análisis estructural identificó cualidades estructurales que se pudieron modificar para mejorar la estabilidad de las moléculas de IgG. Para hacer más cercana la estabilidad de una molécula de IgG a la estabilidad de una IgGl , se realizaron una cantidad de mutaciones para compensar las diferencias estructurales entre las moléculas de IgGl e IgG . La mutación se ubica en un bucle extendido en IgG4 , E269. Se usó un enfoque de biblioteca para analizar los residuos que podrían compensar la longitud adicional de este bucle. Este bucle fue también el sujeto de cambios adicionales como se detalló en la parte C de este Ejemplo.
La interfase entre los dominios CH3 constituye el área de contacto proteína-proteína más grande en el dominio Fe de las moléculas de IgG. Se ubica una diferencia sustitucional simple en la interfase entre IgGl e IgG4 en el residuo 409. En IgGl, se ubica una lisina en la posición 409 y en las moléculas de IgG4 se ubica una arginina en la posición 409. Se diseñó la sustitución de R409 en IgG4 al K409 de IgGl para introducir las cualidades de estabilidad superiores observadas para el CH3 de IgGl. También se diseñaron 409M y R409I para probar esta teoría. Para acomodar mejor el volumen agregado de la arginina en la interfase CH3 de IgG4, se realizó una cantidad de mutaciones en el residuo de contacto D399 a partir del dominio CH3 opuesto: D399E y D399S (Figura 2A) . Mediante la sustitución de una cadena lateral más pequeña en esta posición, el dominio CH3 opuesto podría acomodar mejor el volumen agregado de la arginina y aumentar la estabilidad general del dominio CH3. Se usó otro enfoque para diseñar mutaciones que agregaron hidrofobicidad a la interfase CH3 para aumentar la asociación entre los dos dominios interactuantes (Y349F, T350V y T394V) así como para aumentar el volumen en las cadenas laterales de la interfase (F405Y) . También se diseñaron mutaciones para probar la estabilización en los residuos que se ubicaron cerca de los sitios de contacto con el carbohidrato en la estructura cristalina lhzh (V264, R292, V303) así como H310 cerca de la interfase CH3/CH2. Un conjunto de residuos de glutamina expuestos a la superficie (Q268, Q274 y Q355) también fue el centro de una cantidad de mutaciones para alterar la carga de superficie general. Se usó el mismo enfoque para E419.
Finalmente, uno de los mecanismos más comunes usados para explicar la termoestabilidad aumentada de proteínas termofílicas implica un embalaje más apretado del núcleo interior de la proteína (ref: Jaenicke, R. y Zavodszky, P. 1990. Proteins under extreme physical conditions. FEBS Lett. 268: 344-349) . Para recapitular este fenómeno, los residuos de valina encontrados en el "núcleo de valina" de CH2 y CH3 se sustituyeron con isoleucinas o fenilalaninas . Se predijo el aumento en la estabilidad a partir de las cadenas laterales ramificadas adicionales y un mayor volumen asociado. El "núcleo de valina" en CH2 es cinco residuos de valina (V240, V255, V263, V302 y V323) que se orientaron todos en el mismo núcleo interior próximo del dominio CH2. Se observa un "núcleo de valina" similar para CH3 (V348, V369, V379, V397, V412 y V427) . De manera adicional, L351 y L368 se mutaron para mayores cadenas laterales hidrofóbicas ramificadas.
C. Diseños de covariación para los IgG sin efectores: Las mutaciones concertadas cerca del sitio de glicosilación de CH2 con base en los patrones de covariación observados en otros dominios Ig de clase C El dominio CH2 de IgG co-conserva varios residuos para mantener interacciones con ambos carbohidratos unidos a N en la posición UE N297 e interacciones con las varias formas FcyR de CD16, CD32 y CD64. La eliminación del carbohidrato conduce a una reducción dramática en la unión a FcyR por IgG-Fc (Taylor y Garber, 2005) . Para los diseños descritos en la presente, se investigó la co-mutabilidad de residuos cerca del carbohidrato unido a N dentro del IgG-Fc mediante la sustitución por aminoácidos que eran co- conservados en otros dominios de pliegue a Ig de clase C. Se investigó el daño que tendrían estas co-mutaciones en la unión a FcyR y en la estabilidad del dominio CH2 en la presencia y ausencia del carbohidrato unido a N, dado que es posible que estas modificaciones podrían ser particularmente bien toleradas dentro de Fe aglicosíl y podría reducir las interacciones con los FcyR en ambos restos Fe glicosilados y aglicosilados .
Los residuos importantes para interactuar potencialmente con el carbohidrato unido a N fueron los centros de este estudio. Los residuos IgGl-CH2 que hacen contacto directo con el carbohidrato en N297 se identificaron usando una estructura cristalina publicada del IgGl-Fc enlazado a FcYRIIIa y el programa MOLMOL (Sondermann, P., Huber, R. , Oosthuizen, V., Jacob, U. (2000) The 3.2 Á crystal structure of the human IgGl Fe fragment-FcgRIII complex. iVature, 406: 267-273; . Koradi, R. , Billeter, . & Wuthrich, K. (1996) MOLMOL: a program for display and analysis of macromolecular structures. J. Mol. Graph. 14: 51-55). Estos aminoácidos fueron el centro de los análisis y diseños de covariación.
La compilación y estructura/alineación basada en HMM de las secuencias de pliegue a Ig de clase Cl se llevó a cabo tal como se describió anteriormente (Glaser et al., 2007) . Los análisis de covariación con las diversas bases de datos de secuencia de pliegue a Ig de clase Cl también se llevaron a cabo tal como se describió anteriormente (Glaser et al., 2007; Wang et al., 2008). Los análisis de covariación consisten en un conjunto de datos de coeficientes de correlación, valores f , con relación a cómo un par de aminoácidos es o no co- conservado dentro de secuencias de proteína particulares. Los valores f oscilan de -1.0 a 1.0. Un valor f de 1.0 indica que cuando un aminoácido está en una posición dentro de un subconjunto de secuencias, otro aminoácido en una posición de residuos diferente también está siempre presente en ese subconjunto. Un valor f de -1.0 indica que cuando un aminoácido está en una posición dentro de un subconjunto de secuencias, otro aminoácido en una posición de residuos diferente nunca está presente en esa secuencia de subconjuntos . Los valores f absolutos mayores a 0.2 se consideraron estadísticamente importantes para el conjunto de datos que se analizó (Glaser et al., 2007; Wang et al., 2008). Con base en la experiencia con el conjunto de datos, los valores f > 0.25 se consideraron significativos (es decir, es probable que haya una razón física para la co-existencia del par de aminoácidos), mientras que los valores f > 0.5 se consideraron muy fuertes y es probable que se co-conserven para razones estructurales o funcionales importantes.
Con base en los análisis estructurales, se encontró que los residuos hidrofóbicos V262 y V264 forman un parche hidrofóbico en la superficie del dominio CH2 que se secuestra del solvente por el carbohidrato unido a N: De manera adicional, el V266 es un residuo en la proximidad de V262 y V264 y es único para los dominios CH2 , aunque existe en un bucle y se entierra a sí mismo en el interior del dominio. Se encontró que V262, V264 y V266 estaban altamente co-conservados dentro del dominio IgG-CH2 con correlación altamente significativa entre sí (valores f : V262-V264= 0.44; V262-V26=0.40; V264 -V266=0.54 ) . Los residuos se destacaron en nuestra alineación de secuencia basada en estructura de los dominios constantes de IgG (Figura 2B) .
Los tres residuos de valina (262, 264 y 266) tienen también fuertes coeficientes de correlación con residuos que forman una estructura de bucle única en los dominios CH2 (residuos 267-271) . Este bucle es dos aminoácidos más largo que los bucles de consenso formados por los otros dominios constantes de IgG CL, (¾1 y CH3. Las correlaciones específicas se encuentran entre V262 y E269 y D270 (valores f = 0.38 y 0.31, respectivamente) , V264 y S267, D268 y E269 (valores f = 0.27, 0.44 y 0.52, respectivamente) y V266 y S267 (valor f = 0.30) . Con base en estas correlaciones, suponemos que este bucle podría ser importante para el posicionamiento del bucle que contiene N297 y su carbohidrato, así como el posicionamiento del bucle que contiene los residuos 325-330 que se sabe es importante para las interacciones con los FcyR (Sondermann et al., 2000; Shields efc al., 2001) .
Con base en estas observaciones, generamos diseños para investigar la tolerabilidad (es decir, el impacto en el pliegue y la estabilidad del dominio CH2) de otros tipos de aminoácidos en estas posiciones, particularmente en IgG aglicosil. Otro aspecto que deseamos observar fue la modificación dañada en estos sitios que podría tener en las propiedades de unión a FcyR de un IgG. Los cambios que se realizaron en aminoácidos dentro del dominio CH2 con base en estas observaciones se listan en la Tabla 1.2 y se muestran en la estructura de IgG-Fc en la Figura 2C (Sondermann, P. , Huber, R. , Oosthuizen, V. , Jacob, U. (2000) The 3.2 Á crystal structure of the human IgGl Fe fragment-FcgRIII complex. Nature, 406: 267-273) . En la Figura 2D se muestra una alineación de la secuencia natural contra la secuencia (SDE9) que contiene todas las mutaciones.
Tabla 1.2. Mutaciones al dominio CH2 de IgGl aglicosil.
Construcción Aminoácido (s) natural (es) /Número EU/aminoácido mutante SD401 A299K3, V262L SD402 A299Ka, V264T SD403 A299Ka, V266F SD404 A299Ka, V262L, V264T SD405 A299K3, V264T, V266F SDE8 A299Ka, V262L, V264T, V266F SD407 A299Ka, Reemplazo de bucle (6 aminoácidos) - 267SHEDPE272 con (4 aminoácidos) -PDPV SDE7 A299K3, V262L, V264T, Reemplazo de bucle (6 aminoácidos) -267SHEDPE272 con (4 aminoácidos) -PDPV SDE9b A299K , V262L, V264T, V266F, Reemplazo de bucle (6 aminoácidos) -267SHEDPE272 con (4 aminoácidos) -PDPV aSe realizó la mutación a A299K para interrumpir el motivo de glicosilación de unión a N que da como resultado un IgG aglicosil. bEn la Figura ID se muestra la alineación de la secuencia natural contra la secuencia completamente modificada .
D. Mutaciones de apoyo Para probar la especificidad de un tipo particular de mutación en una posición de residuos dada, hemos diseñado una serie de mutaciones adicionales. Estas incluyen la prueba de diferentes tipos de aminoácidos (polares, hidrofóbicos y cargados) en las posiciones de residuos que mostraron aumentar la estabilidad. También probaremos la aplicación de todas las mutaciones de estabilidad ganada con respecto a los diversos isotipos de IgG y estados de glicosilación. Estas mutaciones se listan en la Tabla 1.3.
Tabla 1.3 Mutaciones de apoyo Ya Cantidad Formato Construcciones hechas Posiciona IgG4.P 1 agíi 1 T299D 2 T299R 3 T299F 4 T299E 5 T299P 6 T299Q 7 T299N Ya Cantidad Formato Construcciones hechas 8 T299S 9 T307V 10 T307D 11 T307K 12 T307S 13 L309I 14 L309D 15 L309R 16 L309T 17 D399A D399E EC311 18 D399K D3Q9N, EC310 19 T307P, L309K, T299K, R409K 20 T307P, L309K, T299K, R409M T307P, L309K, T299K, R409 , 21 D399N T307P, L309K, T299K, R409M, 22 D399E Isotipo IgGl agli 23 T307P 24 L309K 25 T307P, L309K 26 T307P, L309K, T299K Isotipo IgGl 27 T307P 28 L309K 29 T307P, L309K Variable BIIB022 30 EC326 31 EC331 32 pEAG2300 E. Construcciones de mutaciones múltiples adicionales Para reducir los epítopos de células T potenciales generados a partir de péptidos con mutación de estabilidad de T299K y para utilizar las mutaciones de estabilidad de T307P y D399S en combinación con otras mutaciones que dan como resultado un IgGl e IgG4 aglicosilados , generaremos también las siguientes construcciones (Tabla 1.4) .
Tabla 1.4 Construcciones de mutaciones múltiples adicionales Ejemplo 2. Análisis de estabilidad térmica de dominios del anticuerpo Fe de IgG producidos en E. coli Se utilizó un ensayo de prueba térmica modificado descrito en la Solicitud de Patente estadounidense No .11/725 , 970 como un análisis de estabilidad para determinar la cantidad de proteína Fe de IgG soluble a 40°C retenida luego de un evento de prueba térmica a pH 4.5.
Se transformó la cepa W3110 de E. coli (ATCC, Manassas, Va. Cat. # 27325) con plásmidos que codifican pBRM012 (IgGl) y pBRM013 (IgG4 con mutaciones S228P, T299A) de las Fe más etiqueta de Histidina del extremo C-terminal bajo el control de un promotor ara C inducible. Los transformantes se cultivaron durante la noche en un medio de expresión que consiste en SB (Teknova, Half Moon Bay, Ca. Cat. # S0140) suplementado con 0.6% de glicina, 0.6% de Tritón X100, 0.02% de arabinosa y 50 de carbenicilina a 30°C. Se sedimentaron las bacterias mediante centrifugación y los sobrenadantes se recolectaron para tratamiento adicional.
Luego de la prueba térmica, se eliminó el material agregado mediante centrifugación y se ensayaron las muestras de Fe solubles que permanecieron en el sobrenadante limpio y tratado para la unión a la Proteína A (Sigma P7837) mediante ensayo DELFIA. Se recubrieron dos placas de 96 pocilios (MaxiSorp, Nalge Nunc, Rochester, Y, Cat. # 437111) durante una hora a 37°C con la Proteína A a 0.5 yg/ml en PBS y luego se bloquearon con amortiguador de ensayo DELFIA (DAB, 10 mM de Tris HC1, 150 mM de NaCl , 20 µ? de EDTA, 0.5 % de BSA, 0.02% de Tween 20, 0.01% de NaN3, pH 7.4) durante una hora con agitación a temperatura ambiente. La placa se lavó 3 veces con DAB sin BSA (amortiguador de lavado) y se agregaron 10 µ? del sobrenadante a 90 µ? de DAB para alcanzar un volumen final de 100 µ? (placa de referencia) . Luego se agregaron 10 µ? de 10% de HOAc a cada sobrenadante en una placa de polipropileno para alcanzar una muestra de pH de 4.5. Se incubó la placa durante 90 minutos a 40°C y se eliminaron las proteínas desnaturalizadas mediante centrifugación a 1400 x g. Se agregaron 10 µ? de ácido y sobrenadante tratado con calor a otra placa DELFIA que contenía 90 µ? de DAB suplementado con 100 raM de Tris, pH 8.0 (placa de prueba) . Las placas DELFIA se incubaron a temperatura ambiente con agitación durante una hora y se lavaron 3 veces como se hizo anteriormente. Se detectó Fe de unión mediante la adición de 100 µ? por pocilio de DAB que contenía 250 ng/ml de anticuerpo anti-His6 etiquetado con Eu (Perkin Elmer, Boston, MA, Cat . # AD0109) y se incubó a temperatura ambiente con agitación durante üna hora. La placa se lavó 3 veces con amortiguador de lavado y se agregaron 100 µ? de solución potenciada por DELFIA (Perkin Elmer, Boston, MA, Cat. # 4001-0010) por pocilio. Luego de la incubación durante 15 minutos, la placa se leyó usando el método Europium en un Víctor 2 (Perkin Elmer, Boston, MA) . Se analizaron los datos puntuando la proporción de fluorescencia de Eu entre las placas de prueba y referencia para las varias construcciones a 40°C. Los valores de fluorescencia mayores al valor para pBRM013 se interpretaron como un aumento en la estabilidad sobre la construcción diana (IgG4.P agli) . Los datos se muestran en la Tabla 2.1.
Tabla 2.1. Resultados del ensayo de prueba térmica Delphia Número Residuo UE de IgG4 Mutante Razón normAvgF (T=40°C) 242 L P Covariacion <4.33 Frecuencia 242 L I de residuo <4.33 268 Q D Covariacion <4.33 Carga de 268 Q H residuo <4.33 270 D nnk Covariacion <4.33 271 P nnk Covariacion <4.33 Carga de 274 Q H residuo <4.33 Carga de 274 Q R residuo <4.33 Frecuencia 276 N S de residuo <4.33 286 N T Covariacion <4.33 Frecuencia 288 K R de residuo <4.33 294 E nnk Covariacion <4.33 299 A K Covariacion 4.83 299 A Y Covariacion 4.71 299 A L Covariacion <4.33 307 T P Covariacion 5.43 Frecuencia 308 V I de residuo <4.33 309 L M 5.17 309 L K <4.33 309 L P <4.33 315 N nnk Covariacion <4.33 319 Y F Covariacion <4.33 Frecuencia 324 S H de residuo <4.33 Número Residuo UE de IgG4 Mutante Razón normAvgF (T=40°C) Frecuencia 324 S N de residuo <4.33 Frecuencia 327 G A de residuo <4.33 Frecuencia 330 S A de residuo <4.33 Carga de 355 Q R residuo <4.33 Carga de 355 Q H residuo <4.33 Carga de 419 E Q residuo <4.33 Carga de 419 E K residuo <4.33 IgGl agíi en peso 5.45 IgGé.P agíi en peso 4.33 Combinaciones 276 N S 5.49 307 T P 286 N T 5.31 307 T P 276 N s 5.25 286 N T 307 T P 308 V I 4.99 309 L K Ejemplo 3. Producción de anticuerpos Fe de IgG estabilizados A. Mutagénesis, expresión transitoria de restos Fe de IgG estabilizados en E. coli y purificación Las mutaciones de estabilidad se incorporaron en la construcción BRM13 detallada previamente en el Ejemplo 2 mediante mutagénesis dirigida al sitio usando un kit de mutagénesis Stratagene Quik-Change Lightning. Los cebadores se diseñaron entre 36-40 bases de longitud con la mutación en el medio con 10-15 bases de secuencia correcta en ambos lados, al menos 40% de contenido GC, comenzando y finalizando en una o más bases C/G. Todas las construcciones de mutantes se listan en la Tabla 3.1 a continuación.
Tabla 3.1. Construcciones IgG-Fc expresadas y purificadas a partir de E. coli Sustitución AA final BRM013 IgG4. P S228P, T299A BRM023 S228P, T299A, T307P BR 030 S228P, T299K CRIO3 S228P, T299A, R409K CR104 S228P, T299A, R409M CR105 S228P, T299A, R409L CR106 S228P, T299A, R409I CRIO7 S228P, T299A, D399S CR108 S228P, T299A, D399N CRIO9 S228P, T299A, D399E CR110 S228P, T299A, V369I CR111 S228P, T299A, V379I CR112 S228P, T299A, V397I CR113 S228P, T299A, V427I CR114 S228P, T299A, V427F CR115 S228P, T299A, V240I Sustitución AA final CR116 S228P, T299A, V263I CR117 S228P, T299A, V273I CR118 S228P, T299A, V302I CR119 S228P, T299A, V323I Luego del PCR usando los cebadores que introducirían la mutación, se digirió cada mutagenesis con una enzima de restricción Dpn I a 37 °C durante 5 minutos para digerir completamente el plásmido principal. Luego se transformaron las reacciones de mutagénesis en células ultracompetentes de E. Coli XLl-Blue. Se analizaron las colonias resistentes a la ampicilina y se usó la secuencia del ADN para confirmar la secuencia correcta de la reacción de mutagénesis.
La secuencia que confirmó el ADN se transformó en células 3110 mediante electroporación usando el programa EC3. Se escogieron colonias únicas y se cultivaron en un cultivo de partida en 10 mi de LB-amp durante la noche. Este cultivo previo se transfirió a un medio de expresión de 1L [SB + 0.02% de arabinosa + 50 mg/L de' amp/carb] y se cultivó durante la noche a 32 °C. Las células se centrifugaron usando centrifugación y se volvieron a suspender completamente en los 100 mi de amortiguador de esferoplasto (20% de sucrosa, lmM de EDTA, 10 mM de HC1 de Tris, pH 8.0 y lisozima (0.01% p/v) ) . Las células se centrifugaron y la proteína resultante estaba en sobrenadante .
Las construcciones IgG-Fc se purificaron mediante purificación por lotes usando Sefarosa FF de Proteína A (GE Healthcare) . La molécula Fe se eluyó de la Sefarosa de Proteína A usando 0.1 M de glicina a pH 3.0, neutralizada con base Tris y finalmente se sometió a diálisis en PBS usando los casetes de diálisis de 10 mi Pierce (corte a 10,000 M CO) .
B. Mutagénesis, expresión transitoria de anticuerpos estabilizados en células CHO , purificación y caracterización de anticuerpos Las mutaciones de estabilidad se incorporaron en un anticuerpo IgG4. P (una construcción VH que ya contenía una mutación bisagra de prolina en el aminoácido 228) mediante mutagénesis dirigida al sitio usando un kit de mutagénesis Stratagene Quik-Change Lightning. El antígeno que reconoce el Fab era del anticuerpo 5c8 anti-CD40. Los cebadores se diseñaron entre 36-40 bases de longitud con la mutación en el medio con 10-15 bases de secuencia correcta en ambos lados, al menos 40% de contenido GC, comenzando y terminando en una o más bases C/G. Todas las construcciones mutantes glicosiladas y agí icos i ladas se listan en la Tabla 3.2.
Tabla 3.2. Rendimiento de proteínas a partir de 1L de cultivo y % de monómeros como se midió mediante cromatografía exclusión por tamaños (construcciones de IgGl en cursiva) Rendimiento % de Sustitución AA final (mg) monómeros I. Glicosilado EC301. S228P, A299K, V427F 2.2 53% EC302 S228P, A299K, D399S 4.3 98.60% EC303 S228P, T307P, V427F 1.7 98.20% EC304 S228P, T307P, D399S 2.9 99.00% EC305 S228P, A299K, V427F, D399S 5 99.10% EC306 S228P, T307P, V427F, D399S 15.3 28% EC307 S228P, A299K, V427F, V348F 0 EC308 S228P, T307P, V323F 9 99.50% EC309 S228P, V240F 15.75 98.10% EC321 S228P, D399S, L309P 13.3 97.80% EC322 S228P, D399S, L309M 13.3 97.50% EC323 S228P, D399S, L309K 13.41 98.40% EC324 S228P, T307P, D399S, L309P 15.66 97% EC325 S228P, T307P, D399S, L309M 8.1 97.80% EC326 S228P, T307P, D399S, L309K 21.1 98.60% EC300 S228P, T307P 16 98.30% II. Aglicosilados EC330 S228P/T299A/T307/lgGl-CH3 21.42 98.10% EC331 S228P/T299K/T307/lgGl-CH3 7 98.70% YC401 S228P, T299A, T307P, D399S 3 96% YC 02 S228P, T299A, L309K, D399S 3 95% S228P, T299A, T307P, D399S, YC403 L309K 4 95.10% YC404 S228P, T299K, T307P, D399S 5 97.22% YC405 S228P, T299K, L309K, D399S 4.5 95% YC406 S228P, T299K, T307P, D399S, 3.5 96% Rendimiento % de Sustitución AA final (mg) monómeros L309K YC407 S228P, T299A 4.07 96.90% CN578 T299K (IgGl) 9.38 100% CN579 S228P, T299K 11.55 90% pEAG2296 S228P/T299A/ IgGl -CH3 7.24 98% pEAG2287 S228P/T299K/IgGl-CH3 14.2 100% SDE1 A299K, V262L 4.91 100% SDE2 A299K, V264T 2.8 100% SDE3 A299K, V266F 8.96 95.15% SDE4 A299K, V262L, V264T 2.6 95.20% SDE5 A299K, V264T, V266F 3.93 95.40% SDE6 A299K, Reemplazo de bucle 2.11 95.95% SDE7 A299K, bucle+V262L/V264T 8.54 99.10% SDE8 A299K, V262L, V264T, V266F 6.83 98.90% A299K, bucle+ SDE9 V262L/V264T/V266F 6.46 99.20% Luego del PCR usando los cebadores que introducirían la mutación, se digirió cada mutagénesis con una enzima de restricción Dpn I a 37 °C durante 5 minutos para digerir completamente el plásmido principal. Luego se transformaron las reacciones de mutagénesis en células · ultracompetentes de E. Coli XLIO-Gold. Se analizaron las colonias resistentes a la ampicilina y se usó la secuencia del ADN para confirmar la secuencia correcta de la reacción de mutagénesis.
El ADN de secuencias confirmadas se aumentó por escalas y se transformó en células competentes de E. coli TOP10 (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) . Las colonias de E. coli transformadas para la resistencia a fármacos de ampicilina se analizaron para la presencia de inserciones. Luego se cultivaron las colonias en cultivo a gran escala de 250 mi. Se usó un kit Qiagen HiSpeed Maxiprep para extraer y purificar el ADN del cultivo de bacterias para transfección transitoria. Se cuantificó el ADN usando un e280 para medir la concentración de ADN a usarse en la transfección.
Luego se usaron los plásmidos mutantes junto con una cantidad igual de plásmido VL 5c8 para co-transíectar las células CHO-S para expresión transitoria de la proteína del anticuerpo. La cantidad de ADN a usarse para la transfección fue 0.5 . mg/L de la VH y 0.5mg/L de la VL. El medio de transfección (CHO-S-SFMII de Invitrogen con LONG R4IGF-1 de SAFC) se preparó a 5% del volumen de transfección con 1 mg/ml de PEI (Polysciences Cat . #23966) en una proporción de 3 mg de PEI a 1 mg de ADN. Se agregó ADN al medio de transíección/solución PEI y se quitó, luego se dejó a temperatura ambiente durante 5 minutos . Luego se agregó la mezcla a 500 mi de células CHO-S a le6 células/ml. Luego de 4 horas a 37°C a 5% de C02, se agregó volumen de medio de expansión 1 vez (CHOM37 + 20g/l de PDSF + Penstrep/anfostericina) para un volumen de cultivo final dé 1 L. El día 1, se agregaron 10 mi de hidrolizado de algodón a 200 g/L y la temperatura cayó hasta 28 °C. La viabilidad del cultivo se controló hasta que la viabilidad cayó por debajo del 70% (8-12 días) . En este momento se controlaron también las titulaciones para la expresión de proteínas usando el Octet (ForteBio) para medir la unión a puntas anti-IgG. Las células se cultivaron centrifugando los cultivos a 2400 rpm durante 10 minutos y luego se filtró el sobrenadante a través de ultrafiltros de 0.2 um.
El anticuerpo 5C8 se capturó del sobrenadante usando Sefarosa FF de Proteína A (GE Healthcare) en AKTA (Amersham Biosciences) . La molécula de anticuerpo se eluyó de la Proteína A usando 0.1 M de glicina a pH 3.0 , se neutralizó con base Tris, se sometió a diálisis en PBS usando los casetes de diálisis de 10 mi Pierce (corte a 10,000 MWCO) , se concentró hasta 1 mi de volumen final y luego se purificó usando cromatografía de exclusión por tamaños (TOSOHASS, TOSOH Biosciences) . La molécula 5C8 se sometió a diálisis en un citrato de 20 mmol , 150 mmol de solución NaCl a pH 6.0. Se evaluaron la pureza y el porcentaje del producto de anticuerpo de monómero por 4-20% de Tris-glicina SDS-PAGE y HPLC por exclusión de tamaños analítica, respectivamente.
B. Confirmación de secuencias de proteínas y modificaciones post-traduccionales de anticuerpos modificados genéticamente de estabilidad usando análisis de espectro de masas Las muestras se analizaron en condiciones reductoras . La reducción tuvo lugar en lOOmM de DTT en la presencia de 4M de HCl de guanidina durantel hora a 37°C. Antes de la inyección, las muestras se diluyeron 1:1 con PBS . Se agregó ácido acético glacial a la mezcla hasta una concentración final de 2% (v/v) . Se inyectaron 5 g de cada muestra en una columna de fenilo y se analizaron mediante ESI-TOF. Se usó un método de unión y elución. El amortiguador A contiene 0.03% de TFA en agua y el amortiguador B contiene 0.025% de TFA en acetronitrilo . La velocidad de flujo se mantuvo constante a ???µ? por minuto. Se obtuvieron los espectros a partir del software Analyst y se deconvolucionaron usando MaxEntl. Luego del análisis reducido, 3 de las muestras se detectaron como glicoformas, por lo tanto, la deglicosilación se llevó a cabo en las 3 muestras: EC323, EC326 y EAG2300. La deglicosilación se llevó a cabo en condiciones de reducción: lmU de N-glicanasa / 2µg de proteína en la presencia de 20mM de DTT, lOmM de Tris pH 7.0. Las muestras se desglicosilaron a 37°C. Después de 2 horas, se agregaron 30mM de DTT adicionales a las muestras en la presencia de 2.7 de HC1 de guanidina y se incubaron a 37°C durante unos 30 minutos adicionales. Se inyectaron 5µg de cada muestra reducida y desglicosilada en una columna de fenilo y se analizaron tal como se detalló anteriormente .
Los resultados confirmaron las identidades de las 13 muestras con conversión de la glutamina del extremo N-terminal (Q) de la cadena pesada al ácido piroglutamínico (PE) . La Tabla 3.3 lista las masas obtenidas para todas las muestras, glicosiladas y desglicosiladas . Todas las cadenas ligeras y las cadenas pesadas contenían niveles bajos de glicación de 1% o menos. Se observaron las masas correspondientes a la glutamina del extremo N- terminal sin modificar en cada una de las muestras en una intensidad relativa de ~20-40%. Como se esperaba, todos los espectros deconvolucionados de cadena ligera fueron idénticos.
Tabla 3.3. Masas detectadas ID de muestra Asignación probable Masa Masa detectada teórica YC401 LC 1-218 23857 23858 HC 1-444 Q?PE 48640 48641 YC402 LC 1-218 23857 23858 HC 1-444 Q?PE 48659 48660 YC403 LC 1-218 23857 23858 HC 1-444 Q?PE 48655 48656 YC404 LC 1-218 23857 23858 HC 1-444 Q-PE 48697 48698 YC405 LC 1-218 23857 23858 HC 1-444 Q?PE 48716 48717 YC406 LC 1-218 23857 23858 HC 1-444 Q?PE 48712 48713 YC407 LC 1-218 23857 23858 HC 1-444 Q?PE 48672 48673 EC323 LC 1-218 23857 23858 HC 1-444 Q?PE, GOF 50134 50135 HC 1-444 Q?PE, GIF 50297 50297 HC 1-444 Q?PE, G2F · 50459 50459 HC 1-444 Q?PE, G0 (Menos 49988 49989 fucosa) EC323 LC 1-218 23857 23858 ID de muestra Asignación probable Masa Masa detectada teórica Desglicosilado HC 1-444 Q?PE 48690 48690 EC326 LC 1-218 23857 23858 HC 1-444 Q?PE, GOF 50130 50131 HC 1-444 Q?PE, GIF 50293 50293 HC 1-444 Q?PE, G2F 50454 50455 HC 1-444 Q?PE, GO (Menos 49984 49985 fucosa) EC326 LC 1-218 23857 23858 Desglicosilado HC 1-444 Q?PE 48685 48686 EC331 LC 1-218 23857 23858 HC 1-444 Q?PE 48676 48677 EAG2300 LC 1-218 23857 23858 HC 1-443 Q-.PE, GOF 49919 49920 HC 1-443 Q?PE, GIF 50081 50082 HC 1-443 Q?PE, G2F 50243 50244 EAG2300 LC 1-218 23857 23858.
Desglicosilado HC 1-443 Q?PE 48473 48475 CN578 LC 1-218 23857 23858 HC 1-447 Q?PE 48885 48885 CN579 LC 1-218 23857 23858 HC 1-444 Q?PE 48729 48730 Las muestras EC323, EC326 y EAG2300 contenían los glicanos biantenarios G0F7 GIF, G2F usuales siendo GOF la especie más abundante, seguido por GIF y luego G2F. Las muestras EC323 y EC326 contenían un pico a -146Da del pico GOF que corresponde al glicano GOF que no tiene una fucosa núcleo (G0) . Para EC323, el porcentaje de identidad relativo de G0 (menos fucosa) era de 2% mientras que el de la muestra EC326 era de 23%. Las 3 muestras glicosiladas contenían niveles bajos (<1%) de ácido siálico del glicano G2F.
Todas las cadenas de muestra contenían un pico -18Da que mostró ser un artefacto de instrumento relacionado con temperatura de gas elevada del ESI-TOF. Se usó una temperatura de 350°C para eliminar los aductos de TFA.
Ejemplo 4. Estabilidad térmica de anticuerpos Fe de IgG agíieosilados La estabilidad de proteínas es un tema central para el desarrollo y el aumento a escalas de proteínas terapéuticas. La estabilidad insuficiente puede llevar a una cantidad de asuntos en desarrollo que varían desde inaptitud para la producción en aumento por escala en bioreactores, dificultades en purificación de proteínas e inaptitud para la preparación y el uso farmacéutico. Para generar un esqueleto Fe deficiente de la función efectora, se introdujeron las mutaciones en IgG4. P agli (S228P) para aumentar la estabilidad general de los dominios CH2 y CH3. El objetivo de este estudio es investigar si las mutaciones diseñadas aumentan la estabilidad térmica. Por lo tanto, se evaluó la termoestabilidad de cada construcción usando calorimetría de escaneo diferencial (DSC) . Ambas construcciones de dominio Fe producidas por E. coli y las construcciones de anticuerpo de longitud completa se evaluaron por DSC. Los métodos de purificación y expresión para las construcciones de dominio Fe producidas por E. coli y las construcciones de anticuerpo de cadena completa se detallan en el Ejemplo 3.
Los anticuerpos se sometieron a diálisis contra 25 mM de citrato de sodio, 150 mM de amortiguador de NaCl a pH 6.0. Se concentraron los anticuerpos hasta 1 mg/mL y se midieron por absorbancia UV. Se llevaron a cabo los escaneos usando un DSC capilar automatizado (MicroCal, LLC, Northampton, MA) . Se llevaron a cabo dos escaneos de amortiguador para sustracción de los valores básales. Los escaneos oscilaban de 20-105°C a l°C/min usando el modo de retroalimentación del medio. Luego se analizaron los escaneos usando el software Origin (MicroCal LLC, Northampton, MA) . Los valores básales diferentes de cero se corrigieron usando un polinomio de tercer orden y se adecuaron las transiciones de despliegue de cada anticuerpo usando los dos modelos de despliegue de no estado. Para evaluar adicionalmente la estabilidad de estas construcciones, los anticuerpos de longitud completa se sometieron a diálisis contra 25 mM de fosfato de sodio, 25 mM de citrato de sodio, 150 nM amortiguador de NaCl a pH 4.5. Se usó el mismo protocolo de DSC tal como se detalló anteriormente.
Se usaron las construcciones de dominio Fe expresadas en ?· coli que no tienen el dominio Fab para probar el incremento de estabilidad de las mutaciones identificadas en el ensayo de prueba térmica Delphia, tal como se detalló en el Ejemplo 2. Las construcciones BRM023, BRM030 y CR103-119 se listan junto con sus temperaturas de fusión en la Tabla 4.1.
Tabla 4.1. Temperaturas de fusión de construcciones de IgG expresadas en E. coli como se midieron por DSC.
DSC Tm (°C) Fuente Sustitución CH2 CH3 Fab AA final IgGl (agíi b/c BRM012 65.9 82.6 n/c E. coli expresado en E. coli ) IgG4. P BRM013 S228P, 62,3 71, 15 n/c E. coli T299A S228P, BRM023 T299A, 66.2 69.9 n/c E. coli T307P S228P, BRM030 65.7 70 n/c E. coli T299K S228P, CRIO3 T299A, 58.3 83.2 n/c E. coli R409K S228P, CR104 T299A, 60.9 77.7 n/c E. coli R409M S228P, CRIO5 T299A, - - n/c E. coli R409L S228P, CRIO6 T299A, X X n/c E. coli R409I S228P, CRIO7 T299A, 58.4 74.9 n/c E. coli D399S S228P, CRIO8 57.2 70.4 n/c E. coli T299A, DSC Tm (°C) Fuente Sustitución CH2 CH3 Fab AA final D399N S228P, CRIO9 T299A, 58.4 66.9 n/c E. coli D399E S228P, CRIO9 T299A, 57.1 68.1 n/c E.. coli 2 D399E S228P, CR110 T299A, 60.5 65.6 n/c E. coli V369I S228P, CR111 T299A, 57.7 66.8 n/c E. coli V379I S228P, CR112 T299A, 59.7 72 n/c E. coli V397I S228P, CR113 T299A, X X n/c E. coli V427I S228P, CR114 T299A, 61.6 75.3 n/c E. coli V427F S228P, CR115 T299A, X X n/c E. coli V240I S228P, CR116 T299A, X X n/c E. coli V263I S228P, CR117 T299A, X X n/c E. coli V273I DSC Tm (°C) Fuente Sustitución CH2 CH3 Fab ?? final S228P, CR118 T299A, 59.7 71.7 n/c E. coli V302I S228P, CR119 T299A, 59.1 59.1 n/c E. coli V323I Tal como se representó en la Tabla 4.1, los controles del resto Fe de IgGl e IgG4. P agli (S228P, T299A) tenían temperaturas de fusión de 65.9 °C y 62.3°C, respectivamente para CH2 y 82.6 °C y 71.2 °C, respectivamente para CH3. De las mutaciones del sitio simples, BRM023 (T307P) y BRM030 (T299K) mostraron un aumento de 3.4-3.9°C en la temperatura de fusión de CH2 durante el control de IgG4. P agli (S228P, T299A) . La sustitución en la posición R409 con Lisina o Metionina mostró un aumento de 12 y 6.6°C en la temperatura de fusión de CH3. La sustitución a cadenas laterales hidrofóbicas , más pequeñas (Leu e lie) no confirieron estabilidad aumentada para CH3. Esta posición representa la única diferencia en la interfase CH3 entre IgGl e IgG4. Se realizaron mutaciones en la posición D399 para compensar el volumen agregado de la cadena lateral de Arginina en la posición 409 en la interfase CH3 de IgG4 (como se detalló en el Ejemplo 1) . Una sustitución de una cadena lateral más pequeña (Ser) facilitó un aumento en la temperatura de fusión de ~4°C. La sustitución a la cadena lateral con el mismo tamaño pero sin carga (Asp) o a una cadena lateral más grande con la misma carga (Glu) no mostró aumento en la estabilidad. Las sustituciones en el núcleo de valina hidrofóbico como se detalló en el Ejemplo 1, no mostraron ningún efecto o una disminución en la temperatura de fusión con la excepción de V427F que mostró un aumento en la temperatura de fusión de CH3 de ~4°C.
Para evaluar combinaciones de mutaciones múltiples y simples, se usaron las moléculas de IgG de cadena completa. Se incorporaron las mutaciones en anticuerpos 5c8 de cadena completa, tal como se detalló en el Ejemplo 3. Los efectos de las mutaciones en las temperaturas de fusión de los dominios CH2 y CH3 como se midieron por DSC a pH 6.0 y pH 4.5 se resumen en la Tabla 4.2 a continuación.
Tabla 4.2. Temperaturas de fusión de construcciones IgG de longitud completa como se midieron por DSC.
DSC Tm ( °C) Fuente pH 6.0 pH 4.5 Sustitución AA final CH2 CH3 Fab CH2 CH3 Fab lgG4.P agli (S228P, T299A) 53.8 70 76.67 38.5 60.2 69 CHO lgG4.P (S228P) 64.4 73.66 77.2 51.04 63.23 68.84 CHO lgG1 agli (T299A) 58.8 85.3 77.2 CHO lgG1 71.5 84.9 77.5 60 75.5 69 CHO EC301 S228P, T299K, V427F 44.8 54.77 76.26 CHO EC302 S228P, T299K, D399S 60.4 74.4 77 42.8 66.37 69.61 CHO EC303 S228P, T307P, V427F 63 75 76.6 CHO EC304 S228P, T307P, D399S 67.4 75.4 77.6 54.46 66.74 69.85 CHO S228P, T299K, V427F, EC305 47.1 74.81 77.1 CHO D399S DSC Tm ( °C) Fuente pH 6.0 pH 4.5 Sustitución AA final CH2 CH3 Fab CH2 CH3 Fab S228P, T307P, V427F, EC306 52.8 75 77.4 CHO D399S S228P, T299K, V427F, EC307 CHO V348F EC308 S228P, T307P, V323F 63.47 73.71 77.15 CHO EC309 S228P, V240F 50.1 73.5 77.3 CHO EC321 S228P, D399S, L309P 60.2 75.1 77.5 CHO EC322 S228P, D399S, L309 62.1 74.8 77.4 CHO EC323 S228P, D399S, L309K 64.7 74.8 77.5 53.11 66.6 69.82 CHO S228P, T307P, D399S, EC324 62.7 74.8 77.5 CHO L309P S228P, T307P, D399S, EC325 65.21 74.98 77.5 CHO L309 S228P, T307P, D399S, EC326 67.5 75.23 77.6 56.48 66.73 69.95 CHO L309K EC300 S228P, T307P 62.5 74.8 77.4 CHO S228P/T299A/T307/lgG1 - EC330 60.5 84.5 76.8 43 77.36 68.75 CHO CH3 S228P/T299K/T307/lgG1 - EC331 65.5 84.77 76.6 47.4 77 A 68.2 CHO CH3 S228P, T299A, T307P, YC401 61.55 75 77.15 46.35 71.31 68.04 CHO D399S S228P, T299A, L309K, YC402 59.95 74.52 77.02 47.14 72.54 69.32 CHO D399S S228P, T299A, T307P, YC403 62.21 74.77 77.1 51.64 73.53 70.44 CHO D399S, L309K S228P, T299K, T307P, YC404 63.44 75.14 77.24 50.8 71.93 68.76 CHO D399S S228P, T299K, L309K, YC405 63.16 74.81 77.16 49.4 71.92 68.66 CHO D399S S228P, T299K, T307P, YC406 66.2 74.1 77.23 53.53 72.3 69.25 CHO D399S, L309K YC407 S228P, T299A 55.8 73.05 76.78 41.52 72.52 67.53 CHO CN578 T299K (lgG1) 65.4 85.2 77.7 47.6 72.2 67.8 CHO CN579 S228P, T299K 60.9 73.7 77.2 42.1 61.1 68.6 CHO pEAG2296 S228P/T299//gG 1-CH3 54.6 85.2 76.4 35.1 77.5 68.1 CHO pEAG2287 S228P T299K//gG 1-CH3 60 85.2 76.4 41.4 77.4 68.1 CHO SDE1 T299K, V262L CHO SDE2 T299K, V264T 64.81 85.12 77.32 50.61 73.72 70.01 CHO SDE3 T299K, V266F 58.03 85.25 77.3 CHO DSC Tm ( °C) Fuente pH 6.0 pH 4.5 Sustitución AA final CH2 CH3 Fab CH2 CH3 Fab SDE4 T299K, V262L, V264T 63.24 85.11 77.22 CHO SDE5 T299K, V264T, V266F 58.3 84.95 77.35 CHO SDE6 T299K, Reemplazo de bucle 61.68 85.16 77.16 CHO SDE7 T299K, Bucle+V13UV15T 59.2 84.89 76.97 CHO T299K, V262L, V264T, SDE8 56.98 85.21 77.13 CHO V266F T299K, Bucle+ SDE9 53.45 85.04 77.03 CHO V13UV15T/V17F Tal como se representó en la Tabla 4.2, la mutación D399S aumentó la estabilidad térmica del dominio CH3 en IgG4. P agli en promedio por 2°C a pH 6.0 y como mucho por 10°C a pH 4.5. Se usó el mutante T299K para generar un CH2 aglicosilado . La sustitución de lisina en la posición 299 aumenta la temperatura de fusión por 5°C a pH 6.0 y por ll°C a pH 4.5 en la molécula de IgG4.P en una sustitución de alanina en esta posición. La mutación T299K aumenta también la Tm para CH2 de IgGl por 6°C a pH 6.0. La mutación T307P mostró un aumento de 4°C para el dominio CH2 de IgG4. P aglicosilado cuando se usa en combinación con D399S. Por sí mismo, T307P no aumentó la temperatura de fusión en la forma de IgG4. P glicosilada. En la forma aglicosilada, la mutación T307P aumentó la Tm de CH2 por 6°C. Cuando se combina con la mutación T299K, la Tm para CH2 aumentó por 8°C. La mutación L309K confirió un aumento del 1°C en la estabilidad para el IgG4. P aglicosilado cuando está en combinación con T307P y T299A. Sin embargo, en combinación de T307P y T299K, la mutación L309K confirió un aumento del 3°C. En la forma glicosilada de IgG4.P, la mutación L309K aumenta la Tm para CH2 por 2°C. La mutación L309K confirió un aumento de 1°C en la estabilidad para el IgG4. P aglicosilado en combinación con T307P y T299A. Sin embargo, en combinación de T307P y T299K, la mutación L309K confirió un aumento del 3°C a pH 4.5. La mutación V323F en CH2 no mostró efecto en la temperatura de fusión del dominio CH2 mientras que una mutación V240F disminuyó la temperatura de fusión por 13 °C. De manera adicional, la mutación V427F mostró también una disminución en la Tm de 13°C para CH2.
El aumento más dramático en temperaturas de fusión se observa en la combinación de T299K, T307P, L309K y D399S en IgG4.P. Esta construcción muestra un aumento en al Tm para CH2 de 11°C (pH 6.0) y 12°C (pH 4.5) en comparación con IgG4. P de T299A. De hecho, la mutación T299K aumenta la Tm por 2-3°C cuando se combina con T307P, L309K y D399S sobre la mutación T299A. De manera adicional, la introducción de T299K en el GH2 de IgG4. P en combinación con la conversión del CH3 del isotipo IgG4. P al CH3 de IgGl dio como resultado un aumento de 6°C y 15 °C para los dominios CH2 y CH3 , respectivamente, sobre el IgG4. P agíi.
Las mutaciones identificadas en los estudios de covariación de glicosilación de CH2 mostraron de ningún a poco efecto sobre la Tm para CH2 de IgGl (V262L y V264T en combinación con V262L, reemplazo de bucle) o un efecto disminuido del 7°C (V266F, V264T & V266F, bucle & V264T & V266F) . Se observó una gran disminución en la Tm de fusión de 10-12°C para la combinación de V262L, V264T y V266F.
En resumen, T299K, T307P, L309K mostraron la capacidad de aumentar la estabilidad térmica del dominio CH2 como mutaciones simples o en combinación entre sí. D399S confirió estabilidad al dominio CH3 de IgG4.P.
Ejemplo 5. Agitación y estudios STEP de pH estable de anticuerpos Fe de IgG Es altamente deseable para una proteína terapéutica tener una vida útil larga, con cambios mínimos a las propiedades físicas o químicas de la proteína durante la producción de fabricación y el almacenamiento. La evaluación de tensiones relacionadas es una parte importante del desarrollo de formulación. Se evaluaron dos tipos de tensiones asociadas para los mutantes Fe de IgG.
A. Tensión de agitación La agitación imita las tensiones observadas durante la fabricación y el procesamiento así como estimula la tensión durante el envío real (es decir, el envío de los recipientes del producto del fármaco para probar el sitio) . Por lo tanto, se analizó la estabilidad de agitación durante el curso de 48 horas y se controló la agregación o precipitación de proteínas usando cromatografía de exclusión por tamaños (SEC) y se midió la turbidez controlando la absorbancia a 320 nM. La turbidez es una medida de diseminación de luz debido a la formación de agregación y precipitante que hace a la proteína/solución reguladora turbia o aun opaca en casos extremos . Se usó el siguiente método de manera consistente en cada conjunto de experimentos: Se agitó 1 mi de cada muestra a 0.5 mg/ml en un tubo de formulación de 3 mi a 650 rpm, se selló con un tapón de goma y se selló de nuevo con parafilm. Se extrajeron 100 µ? en los momentos de tiempo necesarios (0, 6, 24 y 48 horas) y se centrifugaron a 14,000 rpm durante 5 minutos para centrifugar los agregados o precipitantes formados. Se ejecutaron las muestras y se analizaron en una columna SEC analítica. La proteína agregada eluye en tiempos de retención más cortos y los productos de degradación de la proteína eluyen en tiempos de retención más largos en el perfil de elución SEC. Por lo tanto, se usó el porcentaje de especies de monómeros para controlar la estabilidad general de la proteína en un momento de tiempo dado.
Se eligieron las construcciones con la estabilización térmica más alta (véase el Ejemplo 4) para los estudios de agitación. Para las moléculas de IgG4 aglicosiladas , se seleccionaron YC401 a YC403 (T299A y D399S de IgG4. P todas aglicosiladas [más T307P, L309K y T307P/L309K, respectivamente] , YC404 a YC406 (T299K y D399S de IgG4. P todas aglicosiladas [más T307P, L309K y T307P/L309K, respectivamente], YC407 como el control de IgG4. P aglicosilada (T299A) de tipo salvaje, CN578 (A299K de IgGl aglicosilada) , EC331 (que es la T299K y T307P de IgG4. P aglicosilada con un dominio CH3 de IgGl), una IgGl aglicosilada (T299A) , IgG4. aglicosilada (T299A) y una IgGl aglicosilada (T299A) para su estudio. Para las moléculas glicosiladas , se seleccionaron EC304 (T307P, D399S de IgG4. P glicosilada) , EC323 (D399S, L309K de IgG4. P glicosilada), EC326 (T307P, D399S, L309K de IgG4.P glicosilada), T299A de IgG4. P glicosilada e IgGl glicosilada para su estudio.
Comparando los mutantes aglicosilados en términos de turbidez (véase Tabla 5.1 a continuación y la Figura 3A) , YC403 (T299A, T307P, L309K y D399S de IgG4. P aglicosilada) y YC406 (T299K, T307P, L309K y D399S de IgG4. aglicosilada) mostró la cantidad más baja de turbidez en comparación con YC407 de tipo salvaje (T299A de IgG4. P aglicosilada). Ambas construcciones muestran de manera consistente un tercio de turbidez en comparación con el de tipo salvaje en cada momento de tiempo. La única diferencia entre las dos construcciones es T299A (YC403) y T299K (YC406) .
Tabla 5.1: Turbidez de construcciones en momentos de tiempo durante la agitación Tiempo 0 hr 6 hr 24 hr 48 hr EC304 0 0.232 0.584 0.89 EC323 0 0.333 0.672 1.139 Tiempo 0 hr 6 hr 24 hr 48 hr EC326 0 0.088 0.316 0.595 EC331 0 0.157 0.343 0.54 YC401 0 0.51 1.406 1.49 YC402 0 0.717 1.331 1.54 YC403 0 0.221 0.675 0.892 YC404 0 0.334 0, 884 0.977 YC405 0 0.885 1.94 1.841 YC406 0 0.29 0.838 0.993 YC407 0 0.772 2,5 2.709 CN578 0 0.029 0.078 0.072 T299A de IgGl 0 0.019 0.144 0.348 T299K de IgG4. P 0 1.322 1.51 1.657 299T de IgGl 0 0.009 0.01 0.008 299T de IgG4 0 0.009 0.0465 0.0185 Al comparar el % de monómeros (véase Tabla 5.2 a continuación y Figura 3B) , toda la construcción del mutante mostró agregación reducida en el transcurso del tiempo. En el momento de tiempo 24 horas, todas las construcciones de mutantes eran mejores que las de tipo salvaje y en el momento de tiempo 48 horas, la mayoría de las construcciones eran al menos doblemente mejores. Sin embargo, la construcción que retuvo el % de monómeros más alto fue YC403, seguido por YC402 (T299A, L309K y D399S de IgG4. P aglicosilada) y luego YC406 (T299K, T307P, L309K y D399S de IgG4. P aglicosilada) . Estas construcciones mostraron la menor pérdida gradual de % de monómeros durante el transcurso del tiempo. La mutación común observada entre las construcciones de mejor puntuación es la mutación L309K. Estos datos demuestran que las mutaciones escogidas mejoran la estabilidad general en un contexto de tensión mecánica. Comparando ambas medidas de agitación para las construcciones de IgG4. P aglicosiladas , las construcciones YC403 (T299A, T307P, L309 y D399S de IgG4. P aglicosilada) y YC406 (T299K, T307P, L309K y D399S de IgG4. P aglicosilada) resisten mejor la tensión mecánica durante el transcurso del tiempo. Ambas moléculas muestran mutaciones aditivas (T307P/L309K) que permiten la estabilidad térmica y estructural que necesitan mejorar.
Tabla 5.2: % de monómeros de construcciones en momentos de tiempo durante la agitación Tiempo 0 hr 6 hr 24 hr 48 hr EC304 100 96.5 90.52 87.22 EC323 100 98.16 96.29 94.37 EC326 100 98.11 95.89 93.35 EC331 100 100 100 100 YC401 96.5 90.17 73.63 71.07 YC402 96.6 89.45 85.49 80.88 YC403 95 95.382 90.03 84.75 YC404 97 95.45 83.78 73.5 YC405 92.7 87.46 76.72 72.1 Tiempo 0 hr 6 hr 24 hr 48 hr YC406 95.5 94.12 83.89 74.8 YC407 97 95.88 72.3 33.4 CN578 99.73 100 100 99.3 T299A de IgGl 100 100 100 100 T299K de IgG4. P 96.7 100 0 0 299T de IgGl 100 99.01 98.85 99 299T de IgG4 80.51 80.2 80.35 78.06 Para las moléculas de IgGl aglicosiladas , CN578 (A299K de IgGl glicosilada) mostró turbidez mínima y también mostró esencialmente ninguna agregación a través de todo el experimento. CN578 tiene un mejor rendimiento que T299A de IgGl y también la molécula 299T de IgGl de tipo salvaje, mostrando así que la mutación A299K tiene un efecto mínimo en la agitación para una molécula de IgGl aglicosilada . CN578 es 5 veces mejor en el estudio de turbidez que la T299A de IgGl. La molécula CN578 tampoco mostró ninguna agregación durante un lapso de tiempo de 48 horas, que es el mismo resultado de ambas T299A de IgGl aglicosilada y 299T de IgGl glicosilada. EC331 (que es la T299K y T307P de IgG4. P aglicosilada con un dominio CH3 de IgGl) tuvo un muy buen rendimiento en comparación con las otras construcciones, dado que mantuvo también 100% de monómeros a través del estudio de agitación. Mostró una mejora doble en turbidez en comparación con las construcciones IgG4. P agli (serie YC) . Estos datos sugieren que la porción CH3 de IgGl ayuda en gran medida en ambas estabilidades térmicas y estructurales de la molécula.
Entre las moléculas glicosiladas , EC304 (T307P, D399S de IgG4.P glicosilada) , EC323 (D399S, L309K de IgG4. P glicosilada) , EC326 (T307P, D399S, L309K de IgG4. P glicosilada) , hay una mejora en el % de monómeros durante el transcurso del estudio de agregación en comparación con la molécula de IgG4.P glicosilada de tipo salvaje (véase, Tabla 5.2 y Figura 3B) . Aun así la turbidez aumenta en gran medida en cada momento de tiempo aun hasta 75 veces. De manera consistente, cada molécula contiene una D399S, por lo tanto es posible que esta mutación desestabilice la estabilidad térmica tal como lo muestran los datos.
B. Estudios STEP de pH estable bajo Es altamente deseable que una proteína terapéutica tenga facilidad de fabricación y escalabilidad. La modalidad de un estudio STEP de pH estable es esencial para el desarrollo del proceso. Un estudio de pH estable imita el desarrollo del proceso durante las etapas de producción y purificación de la proteína. Para la etapa de producción, son esenciales la reproducibilidad y consistencia en la proteína para la aseguración de la cualidad. Este método se puede usar para medir la estabilidad de una proteína en un pH alto o bajo. Para el estudio, se cargó 1 mg de proteína en una columna de Proteína A en AKTA (Pharmacia Biotech, ahora GE Healthcare) y se eluyó con amortiguador de acetato a pH 3.1. La proteína se mantuvo en el pH bajo durante intervalos de 2 horas hasta 6 horas. Se tomó una alícuota de 100 µ? y luego se ejecutó en SEC analítico para medir la pérdida de proteína debido a la degradación y agregación. Los resultados se resumen en la Tabla 5.3 (véase a continuación) y la Figura 4.
Tabla 5.3: Altura de picos relativa durante el transcurso del tiempo de Fe de IgG a pH estable bajo Para este estudio, se seleccionaron EC304 (T307P, D399S de IgG4.P glicosilada) , EC323 (D399S, L309K de IgG4. P glicosilada) , EC326 (T307P, D399S, L309K de IgG4.P glicosilada), T299A, EC331 de IgG4. P glicosilada (que es T299K y T307P de IgG . aglicosilada con un dominio CH3 de IgGl), una IgGl aglicosilada (T299A) , IgG4. P aglicosilada (T299A) y IgGl glicosilada para su estudio. De los datos, se muestra que EC331 es capaz de resistir el pH bajo estable durante al menos 6 horas sin perder mucho rendimiento. Esta es una mejora en comparación con el control de tipo salvaje de IgG4 aglicosilada que se ejecutó. Se predice que las otras construcciones aglicosiladas no perderán ninguna proteína debido a la degradación ya que esta construcción era capaz de resistir el pH estable bajo. Siendo ambos glicosilados , EC304 y EC326 también mantienen sus rendimientos, que también es comparable con el tipo salvaje de IgGl glicosilado. EC323, que también es glicosilado, no tuvo tan buen rendimiento durante el transcurso del tiempo. Se presume que la mutación L309K necesita también estabilizarse junto con una mutación T307P, que se ve en la construcción EC326 más estabilizada.
Ejemplo 6. Unión al receptor Fe de los anticuerpos Fe de IgG modificados genéticamente por su estabilidad La función efectora de los anticuerpos variantes aglicosilados de la invención se caracterizó por su capacidad de unir receptores Fe o una molécula del complemento, tal como Clq.
A. Experimentos Biacore de competencia de fase en solución Se analizó la unión a los receptores Fcy usando resonancia de plasmones superficiales de afinidad de solución (ref Day ES, Cachero TG, Qian F, Sun Y, Wen D, Pelletier M, Hsu YM, Whitty A. S¾*ectivity of BAFF/BLyS and APRIL for binding to the TNF family receptors BAFFR/BR3 and BCMA Biochemistry . 2005 Feb 15 ; 44 (6 ) : 1919-31. ) El método utiliza condiciones llamadas unión "limitada a la transferencia de masas", en las que la velocidad inicial de la unión al ligando (unión de proteína a sensor chip) es proporcional a la concentración del ligando en solución (ref BIApplicat ions Handbook (1994) Chapter 6: Concentration measurement, pp 6-1-6-10, Pharmacia Biosensor AB) . En estas condiciones, la unión del analito soluble (proteína fluyendo sobre la superficie del chip) a la proteína inmovilizada en el chip es rápida en comparación con la difusión del analito en la matriz de dextrano en la superficie del chip. Por lo tanto, las propiedades de difusión del analito y la concentración del analito en solución fluyendo sobre la superficie del chip determina la velocidad en la cual el analito se une a la pieza. En este experimento, la concentración del receptor Fe libre en solución se determina por la velocidad inicial de unión a un chip Biacore CM5 que contiene un MAb de IgGl inmovilizado. En estas soluciones del receptor Fe se titularon las construcciones modificadas genéticamente por estabilidad (véase Tabla 6.1 a continuación) . La concentración de inhibición (IC50) media máxima (50%) de estas construcciones se demostró por su capacidad de inhibir receptores Fe de la unión al anticuerpo IgGl inmovilizado en la superficie del sensorchip. Las velocidades de unión iniciales se obtuvieron de los datos de sensograma en bruto (Figura 5) . Las curvas de titulación que se usaron para calcular los IC50 se muestran en la Figura 6A para CD64 (FcyRI) y la Figura 6B para CD16 (FcYRIIIa V158) . Los resultados se muestran en la Tabla 6.1 y se informaron como el promedio de dos titulaciones.
Tabla 6.1. Caracterización de afinidad of FcyR de variantes de Fe En el ensayo de unión a CD64, el anticuerpo de control de IgGl presentó un IC50 de 9.6 µ?, mientras que el T299A de IgGl (agli) y T299A de IgG4. P (agli) presentó IC50 de 205 y 739 µ?, respectivamente. Como se esperaba, las moléculas de IgGl tienen mayor afinidad para CD64 que la molécula de IgG4 y la IgGl aglicosilada mostró una afinidad reducida en comparación con la IgGl glicosilada. Las moléculas de IgG4.P glicosiladas modificadas genéticamente por estabilidad (EC300 y EC326) presentaron valores IC50 a aproximadamente 8 µ?, en comparación con las moléculas de IgG4. P aglicosiladas modificadas genéticamente por estabilidad (serie EC331 y YC400) que oscilaron entre 440 y >5000 uM. Los IC50 para las moléculas glicosiladas de IgG4. P modificadas genéticamente por estabilidad (EC300, EC326) fueron equivalentes al control de IgGl glicosilada y la IgG . P aglicosilada modificada genéticamente por estabilidad con T299A (YC401, YC403) tuvo el equivalente log de IC50 como el control T299A de IgG4. P aglicosilada. Sin embargo, la IgG4.P aglicosilada modificada genéticamente por estabilidad con T299K, mostró una reducción mayor de 1 a 2 log en afinidad en comparación con las moléculas equivalentes con una sustitución de T299A en la Figura 7A. Este resultado se observó también para la T299K de IgGl aglicosilada modificada genéticamente por estabilidad (CN578) que mostró una reducción log en afinidad en comparación con el control T299A de IgGl aglicosilada (Figura 7B) . De hecho, la sustitución de T299K hace que la molécula (T299A) de IgGl aglicosilada que tiene mayor afinidad para CD64 que el control T299A de IgG4. P aglicosilada, tenga afinidad reducida para la IgGl (T299K) aglicosilada en comparación con el control de IgG4. P aglicosilada (Figura 7B) . En resumen, la mutación T299K reduce la afinidad para CD64 en ambas moléculas de IgGl e IgG4.
Para el ensayo de CD16, el control IgGl presentó un IC50 de 105 µ?, mientras que T299A de IgG4. P aglicosilada y T299A de IgGl presentaron IC50 >1000 µ?. Las moléculas de IgG4. P glicosiladas modificadas genéticamente por estabilidad presentaron valores IC50 en el equivalente log al control de IgGl y todas las moléculas aglicosiladas modificadas genéticamente por estabilidad (ambas IgG4. P e IgGl) presentaron IC50 >1000 µ?. Para investigar si T299K redujo adicionalmente la afinidad a CD16, se probaron dos conjuntos de construcciones con la sustitución T299K como la única diferencia (YC401, YC404 e YC403, YC406) en concentraciones altas del anticuerpo (5 µ?) . Las curvas de unión muestran una reducción en la afinidad a CD16 causada por la mutación T299 en la concentración alta (Figura 8) . En resumen, la mutación T299K reduce la afinidad para CD16 en las moléculas de IgG. B. ELISA de unión a Clq El ensayo de unión a Clq se realizó recubriendo placas ELISA Maxisorb de 96 pocilios (Nalge-Nunc Rochester, NY, EÜA) con 50 µ? de ligando CD40 humano soluble recombinante a 10 ug/m durante la noche a 4°C en PBS . Los pocilios se aspiraron y lavaron tres veces con amortiguador de lavado (PBS, 0.05% de Tween 20) y bloquearon durante 1 hora con 200 µ?/pocillo de amortiguador de bloqueo/diluyente (0.1 M de Na2HP04, pH 7.0, 1 M de NaCl, 0.05 % de Tween 20, 1 % de gelatina) . Los anticuerpos se diluyeron en amortiguador de bloqueo/diluyente con 3 diluciones y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Luego de la aspiración y el lavado como se indicó anteriormente, se agregaron 50 pl/pocillo de 2 J. de gel de Clq humano Sigma (C0660) diluido en amortiguador de bloqueo/diluyente y se incubaron durante 1.5 h a temperatura ambiente .
Luego de la aspiración y el lavado como se indicó anteriormente, se agregaron 50 J. de anti Clq de oveja (Serotec AHP033) , 3 diluido, 560 veces de amortiguador de bloqueo/diluyente . Luego de la incubación durante 1 h a temperatura ambiente, los pocilios se aspiraron y lavaron como se indicó anteriormente. Luego se agregaron 50 pll/pocillo de conjugado HRP de IgG anti -oveja de burro (Jackson ImmunoResearch 713-035-147) diluido hasta 1:10,000 en bloqueo/diluyente y los pocilios se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente.
Luego de la aspiración y el lavado como se indicó anteriormente, se agregaron 100 sustratos TMB (420 plM de TMB, 0.004% de H202 en 0.1 M de amortiguador de acetato de sodio/ácido cítrico, pH 4.9) y se incubaron durante 2 min antes de que se parara la reacción con 100 ul de ácido sulfúrico 2 N. La absorbancia se leyó a 450 nm con un instrumento PRO Softmax y se usó el software Softmax para determinar la afinidad de unión relativa (valor C) con un ajuste de 4 parámetros.
Los resultados del experimento mostraron que ambos CN578 (IgGl T299K) y YC406 (T299K, T307P, L309K y D399S de IgG . P aglicosilada) no tienen unión medible a Clq (Figura 9) mientras que T299A de IgGl tiene algo de unión residual.
Ejemplo 8. CH3 de IgGl estabiliza el CH2 de IgG4 aglicolsilada sin función efectora Las proteínas descritas en la sección se derivan del anticuerpo 5c8 y, a menos que se indique de otro modo, comprenden una región CHl de IgG4 , un dominio CH2 de IgG4 y un dominio CH3 de un anticuerpo de IgGl o IgG4 (tal como se indicó) . La proteína se produjo y purificó como se describió en el Ejemplo 3. La termoestabilidad de los dominios CH2 y CH3 de los anticuerpos modificados se midieron por DSC a pH 6.0 y pH 4.5 (detallado en Ejemplo 4) . El efecto de la tensión de agitación se midió por SEC analítica y por medidas de turbidez a A320 nm (Ejemplo 5) . La función efectora de los anticuerpos variantes aglicosilados de la invención se caracterizaron por su capacidad de unir receptores Fe o una molécula del complemento tal como Clq. Se analizó la unión a receptores Fcy usando resonancia de plasmones superficiales de afinidad de solución y se analizó la unión al factor del complemento Clq mediante ELISA (Ejemplo 6) . Finalmente, se determinó la semivida sérica mediante estudios farmacocinéticos llevados a cabo en ratas Sprague-Dawley (Ejemplo 7) .
Las construcciones aglicosiladas IgG4-CH2/ IgGl-CH3 se expresaron en CHO como se detalló en el Ejemplo 3, con rendimientos que van desde 7 a 14 mg por 1 litro de cultivo. La introducción de IgGl-CH3 parece impartir un rendimiento mayor (-1.5 X) en comparación con la misma construcción que tiene el CH3 de IgG4 (Tabla 8.1) . De manera adicional, el IgG4-CH2/IgGl-CH3 aglicosil IgGl tenía estabilidad térmica aumentada en el dominio CH3 (Tm = 85°C de [sic] ) en comparación con la estabilidad del dominio CH3 de IgG4 aglicosil de tipo salvaje (Tm = 74°C, Tabla 8.2 y 4.2) . Una observación interesante es que el CH3 de IgGl es la característica determinante en la estabilidad de agitación (Tabla 8.3) dado que se pensó previamente que la pérdida de los glicanos en el dominio CH2 sería un factor dominante en la estabilidad .
Se observó que la construcción EAG2412 (N297Q IgG4- CH2/IgGl-, es decir, región variable 5c8 (marco de IgGl) , CH1 de IgG4, CH2 de IgG4 , CH3 de IgGl con sustituciones N297Q y Ser228Pro) muestra un mejor perfil de función efectora, con la unión más baja para CD64 y CD32, en comparación con T299A y T299K IgG4-CH2/lgGl-CH3. Se encontró que IgGl-CH3 no presentó efectos en la unión a los receptores Fe ?. Ninguna de las construcciones que contienen dominio IgG4-CH2 aglicosil se une a Clq.
Los estudios farmacocinéticos se llevaron a cabo en ratas Sprague-Dawley para dirigir la estabilidad y semivida sérica de las moléculas de IgG4/IgGl modificadas genéticamente por estabilidad. Las ratas se mantuvieron de acuerdo con el Biogen Idee Institutional Animal Care and Use Committee y los lineamientos federales, estatales y de la ciudad para el tratamiento humano y el cuidado de animales de laboratorio. Se administró una inyección en bolo simple de 1 mg/kg (1 mg/ml) del anticuerpo diluido en solución salina tamponada (PBS) por IV en ratas Sprague-Da ley macho. Las ratas se sacrificaron a 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 6, 24, 48, 96, 168, 216, 264 y 336 horas luego de la inyección. Las muestras séricas se prepararon para análisis a niveles cuant if icados del anticuerpo. Las muestras se diluyeron en DAB suplementado con 5% de suero de ratón normal (Jackson Immuno esearch 015-000-120) y el reactivo de detección fue un anticuerpo Fe anti-humano de ratón etiquetado con Eu (Perkin Elmer 1244-330) usado en la concentración final de 250 ng/ml. La cuantitación se llevó a cabo usando la función TREND de Excel en comparación con una curva estándar del anticuerpo purificado.
IgG4 -CH2/IgGl -CH3 de N297Q tuvo la misma semivida que el anticuerpo de IgG4 T299A que, como se esperaba, fue mínimamente más corta que la IgGl aglicosilada (Tabla 8.5) . Los datos se muestran en la Figura 10. C.
Tabla 8.1: Rendimiento de proteínas a partir de 1L de cultivo y % de monómeros como se midió por cromatografía de exclusión por tamaños Tabla 8.2: Temperaturas de fusión de construcciones IgG4-CH2/IgGl-CH3 como se midieron por DSC.
Tabla 8.3: Turbidez y % de monómeros de construcciones en momentos de tiempo durante la agitación Turbidez % de monómeros Tiempo 0 hr 6 hr 24 hr 48 hr 0 hr 6 hr 24 hr 48 hr EAG229 S228P/T299A 0 0.007 0.16 0.12 100 100 96.2 95.3 6 /lgGl-CH3 EAG228 S228P/T299K 0 0.005 0.077 0.045 100 100 100 95.7 7 /IgGl-CH3 EAG241 S228P/N297Q 0 0.006 0.18 0.14 100 100 97.3 95.2 2 /IgGl-CH3 Tabla 8.4: Caracterización de afinidad de FcyR de variantes IgG4/IgGl (NB indica que no hay unión) a No se observó unión Tabla 8.5: Farmacocinética de construcciones modificada genéticamente por estabilidad en ratas Farmacocinética de construcciones modificadas genéticamente por estabilidad en ratas Sprague-Dawley macho luego de una única inyección en bolo por IV de 1 mg/kg Compuesto Animal Inf Co , Tl2 AUC CL Vss ID o extrapolad Hr Hr*mg/ mL/hr/k mL/k o µg mL L g g Rata #1 26 149 2 , 900 0.34 73 IgGl Rata #2 18 143 2,425 0.41 84 Rata #3 25 83 1, 918 0.52 63 N 3 3 3 3 3 Promedio 23 125 2 , 414 0.43 73 SE 2 21 284 0.05 6 CV% 18 29 20 21 15 Rata #4 24 134 1, 919 0.52 86 IgGl de Rata #5 22 128 2,360 0.42 76 N297Q Rata #6 30 66 1, 557 0.64 60 N 3 3 3 3 3 Promedio 25 109 1, 945 0.53 74 SE 2 22 232 0.06 7 Fármaco-cinética de construcciones modificadas genéticamente por estabilidad en ratas Sprague-Da ley macho luego de una única inyección en bolo por IV de 1 mg/kg Compuesto Animal Inf Tl/2 AUC CL Vss _ID o extrapolad Hr Hr*mg/ mL/hr/k mL/k o g/mL L g g cv% 15 35 21 21 18 Rata #7 26 78 1, 709 0.59 64 IgG4. P de Rata #8 20 49 1, 046 0.96 66 T299A Rata #9 26 98 1, 964 0.51 69 N 3 3 3 3 3 Promedio 24 75 1, 573 0.68 66 SE 2 14 273 0.14 1 CV% 15 33 30 35 3 Rata #10 21 87 1, 802 0.55 70 CH2 de Rata #11 25 75 1, 574 0.64 .67 IgG4.P/IgGl -CH3 de N297Q Rata #12 29 70 1, 552 0.64 65 N 3 3 3 3 3 Promedio 25 78 1, 643 0.61 67 SE 2 5 80 0.03 1 CV% 16 11 8 8 4 Ejemplo 9. T299 es un determinante de estabilidad y función efectora Las proteínas descritas en esta sección se derivan todas del anticuerpo 5c8 y, a menos que se indique lo contrario, comprenden un dominio CHl, CH2 y CH3 de un anticuerpo IgGl . proteína se produjo y purificó como se describió en el Ejemplo Los efectos de las mutaciones en las temperaturas de fusión de los dominios CH2 y CH3 de los anticuerpos modificados se midieron por DSC a pH 6.0 y pH 4.5 (detallado en Ejemplo 4) . La función efectora de los anticuerpos variantes aglicosilados de la invención se caracterizaron por su capacidad de unir receptores Fe o una molécula del complemento, tal como Clq. Se analizó la unión a los receptores Fcy usando resonancia por plasmones superficiales de afinidad de solución y se analizó la unión al factor del complemento Clq mediante ELISA (Ejemplo 6) .
Las construcciones T299X y N297X/T299K de IgGl aglicosiladas se expresaron en CHO como se detalló en el Ejemplo 3, con rendimientos que van de 7 a 30 mg por 1 litro de cultivo (Tabla 9.1) . La adición de mutaciones secundarias en la posición N297 en combinación con T299K disminuyó la estabilidad térmica del dominio CH2 por 1.5 a 4.4°C (Tabla 9.2) . De manera adicional, las mutaciones T299X mostraron estabilidad ganada de las cadenas laterales cargadas positivamente de Arg (T299R) y Lys (T299K) (Tabla 9.2) . Las dos cadenas laterales polares, Asn (T299N) y Gln (T299Q) , mostraron una mayor estabilidad en comparación con T299A pero no tan mayor como las cadenas laterales cargadas positivamente. Prolina (T299P) mostró una pequeña disminución en la estabilidad en comparación con T299A y la cadena lateral hidrofóbica más grande Phe (T299F) disminuyó la estabilidad térmica del dominio CH2 por 2.4°C. Finalmente, la cadena lateral cargada negativamente Glu (T299E) presentó poco efecto en la estabilidad térmica de CH2. Estos resultados demuestran las propiedades novedosas de sustituir una cadena lateral cargada positivamente en la posición T299 para aumentar la estabilidad térmica en el dominio CH2.
Se observa que las mutaciones N297X, T299K (CN645, CN646 y CN647) aumentaron mínimamente la afinidad para CD64 mientras que mantuvieron la muy baja afinidad para CD32a y CD16 (Figuras 11B, 11D y 11F) . Las mutaciones T299X mostraron una afinidad consistentemente baja para CD16, sin embargo, la baja afinidad para CD32a se aumentó en el caso de T299E (Tabla 9.3 y Figuras 11C, 9E) . Es interesante destacar también que no solo las cadenas laterales cargadas positivamente T299R y T299K imparten bajas afinidades para CD64 (Tabla 9.3 y Figura 11A) . Finalmente, T299K, T299P y T299Q no siguen la unión a Clq; T299N, T299E, T299F muestran unión mínimamente elevada pero aún muy baja a Clq (Figuras 11G y 11H) . N297P/T299K, N297D/T299K y N297S/T299K no muestran unión a Clq (Figura 11H) .
Tabla 9.1: Rendimiento de proteína a partir de 1L de cultivo y % de monómeros como se midió por cromatografía de exclusión por tamaños analítica Sustitución AA Rendimiento % de final (mg) monómeros CN6 7 N297D, T299K 7.4 100% CN6 6 N297S, T299K 30.47 98.5% CN645 N297P, T299K 9.3 100% EAG2389 T299Q 12.6 100% Sustitución AA Rendimiento % de final (mg) monómeros EAG2390 T299P 22.3 100% EAG2377 T299N 8.7 100% EAG2378 T299R 14.1 100.00% EAG2379 T299E 10.1 100% EAG2380 T299F 12.6 100% Tabla 9.2: Temperaturas de fusión de construcciones T299X como se midieron por DSC pH 6.0 pH 4.5 Fuent e Sustitució CH2 CH3 Fab CH2 CH3 Fab n final AA IGgl agli 58. 85.3 77.2 45.1 77 68.4 CHO (T299A) 8 IgGl en 71. 84.9 77.4 60 75.5 69 CHO peso 5 8 CN578 T299K 65. 85.2 77.7 47.6 72.2 67.8 CHO 4 2 2 CN647 N297D, 63. 85.2 77.5 49.3 74 69.5 CHO T299K 9 CN646 N297S, 61 84.3 77.5 44.5 74.2 70.1 CHO T299K CN645 N297P, 62. 85.3 77.6 45.6 73.5 70 CHO T299K 1 EAG2389 T299Q 61. 85.1 76.8 CHO 4 EAG2390 T299P 58. 85 76.9 CHO 2 EAG2377 T299N 61. 85 76.7 CHO 9 EAG2378 T299R 64. 85.3 77.7 CHO 9 EAG2379 T299E 59. 85.1 76.8 CHO 4 EAG2380 T299F 56. 85.1 77.5 CHO 4 Tabla 9.3: Caracterización de afinidad FcyR de variantes 99X (NB indica que no hay unión) Ejemplo 10. Construcciones Fe estabilizadas muestran que la aplicación de mutantes de estabilidad es independiente de Fab Las proteínas descritas en esta sección comprenden sitios de unión derivados del anticuerpo 5c8. La construcción EAG2476 comprende restos Fe de una molécula de inmunoglobulina IgG4 y EAG2478 comprende restos Fe de una molécula de IgGl (EAG2476 y EAG2478 son las versiones Fe (sin Fab) de construcciones YC406 y CN578, respectivamente).
La proteína se produjo y purificó como se describió en el Ejemplo 3. Los resultados de las mutaciones en las temperaturas de fusión de los dominios CH2 y CH3 se midieron por DSC a pH 6.0 (detallado en el Ejemplo 4) . La función efectora de los anticuerpos variantes aglicosilados de la invención se muestra en las Figuras 12A y 12B. Los anticuerpos se caracterizaron por su capacidad de unir receptores Fe. Se analizó la unión a receptores FCY usando resonancia por plasmones superficiales de afinidad de solución (Ejemplo 6) .
Las construcciones aglicosiladas de Fe estabilizadas se expresaron en CHO como se detalló en el Ejemplo 3, con rendimientos detallados en (Tabla 10.1) . Las mutaciones en el dominio CH2 (T299K, T307P y L309K) mostraron la misma estabilidad térmica en la presencia o ausencia de Fab (Tabla 10.2) así como tienen las mismas afinidades de unión al receptor Fe ? (Tabla 10.3) . Juntas, las mutaciones estabilizadoras detalladas en la presente invención son independientes de Fab como se esperaba y se aplican para estabilizar el dominio Fe sin perjuicio de la contribución de Fab.
Tabla 10.1: Rendimiento de proteína a partir del cultivo de 4L y % de monómeros como se midió por cromatografía de exclusión por tamaños analítica Tabla 10.2: Temperaturas de fusión de construcciones como se midieron por DSC pH 6.0 Sustitución AA final CH2 CH3 Fab EAG2476 YC406-FC 65 67 YC406 S228P, T299K, T307P, 66.2 74.1 77.23 D399S, L309K EAG2478 CN578-FC 66 84 CN578 T299K (IgGl) 65.4 85.22 11.1 Tabla 10.3: Caracterización de afinidad FcyR variantes de T299X (NB indica que no hay unión) Ejemplo 11. Conformación, dinámica y estructura de la proteína de anticuerpos sin efectores estabilizados como se determinó por espectroscopia de masas en intercambio de hidrógeno/deuterio y cristalografía de rayos X La estructura y dinámica contribuyen significativamente a la función de proteínas. El entendimiento de los mecanismos estructurales subyacentes es crítico para explicar los efectos funcionales observados. Por esta, razón, hemos examinado los resultados de las mutaciones con estabilidad ganada previamente mencionadas en la estructura y dinámica de la proteína por espectroscopia de masas con intercambio de hidrógeno/deuterio ( (H/DX MS) y cristalografía de rayos X. A. Espectroscopi de masas con intercambio de hidrógeno/deuterio La detección de intercambio de hidrógeno/deuterio por espectroscopia de masas es un enfoque para la caracterización de la dinámica y conformación de la proteína. La dinámica/conformación de la proteína afecta la velocidad de intercambio de deuterio a hidrógeno en proteínas, por lo tanto medir la deuteración de proteínas en el transcurso del tiempo puede iluminar cambios a la conformación cuando se modifica una estructura de proteínas (tal como, con mutaciones) . Por lo tanto, examinamos los resultados de las mutaciones estabilizadoras en el intercambio de hidrógeno/deuterio de nuestro esqueleto Fe del anticuerpo aglicosilado .
Se diluyó el anticuerpo (en 50 mM de fosfato de sodio, 100 mM de H20 cloruro de sodio, pH 6.0) 20 veces con 50 mM de fosfato de sodio, 100 mM de cloruro de sodio, D20, pD [sic] 6.0 y se incubó a temperatura ambiente durante varias cantidades de tiempo (10 s, 1, 10, 60 y 240 min) . La reacción del intercambio se inactivo reduciendo el pH hasta 2.6 con una dilución 1:1 con 200 mM de fosfato de sodio, 0.5 M de TCEP y 4 M de HCl de guanidina, H20, pH 2.4. Las muestras inactivadas se digirieron, desalaron y separaron en línea usando un sistema aters UPLC con base en una plataforma nanoACQUITY. Se inyectaron aproximadamente 20 praoles del anticuerpo intercambiado e inactivado en una columna de pepsina inmovilizada. La digestión en línea se realizó durante 2 min en agua que contenía 0.05% de ácido fórmico a 15°C a una velocidad de flujo de 0.1 mL/min. Los péptidos resultantes se atraparon en una trampa de péptidos de 1.7 ym ACQUITY UPLC BEH C18 (Waters, Milford, A) mantenidos a 0°C y se desalaron con agua, 0.05% de ácido fórmico. Se desvió el flujo mediante una válvula de intercambio y los péptidos atrapados eluyeron de la trampa a 40 yL/min en una columna de 1 mm x 100 mm, 1.7 µt?, Waters ACQUITY UPLC BEH C18 mantenida a 0°C (la contrapresión promedio era de aproximadamente 9000 psi) . Se usó un gradiente lineal de acetonitrilo de 6 min (8-40%) con 0.05% de ácido fórmico para separar los péptidos. El eluato se dirigió en un espectrómetro de masas Waters Synap con ionización de electropulverización y corrección de LOCK-MASS (usando péptido Glu-fibrinógeno) . Se adquirieron los espectros de masas en el intervalo m/z 260-1800. Se identificaron los fragmentos de pepsina usando una combinación de masa exacta y MS/MS, ayudada por el software Waters IdentityE. Los niveles de deuterio del péptido se determinaron tal como se describió en Weis et al. usando el programa HX-Express basado en Excel.
Se recogieron los datos H/DX-MS para IgG4. P intacta contra IgG4. P de N297Q, IgG4. de N297Q contra N297Q IgG4. P-CH2/lgGl-CH3 y IgG4.P de T299A contra YC406 (T299K, T207P, L309K, D399S) tal como se describió anteriormente. La comparación de la IgG4 (glicosilada) intacta y la IgG4 de ¿SI297Q aglicosilada muestra regiones de secuencia en las que la forma aglicosilada muestra mayor intercambio. Se observa más intercambio H/D en los péptidos L235-F241, F241-D249, 1253-V262, V263-F275 y H310-E318. Un intercambio mayor en los péptidos IgG4 M358-L365, T411-V422 y A431-S442 en comparación con los mismos péptidos en la construcción N297Q IgG4.P-CH2/IgGl-CH3 muestra la estabilidad ganada generada a partir de IgGl-CH3 en combinación con IgG4-CH2 de N297Q. En este caso, el dominio CH3 de IgG4 muestra un mayor intercambio en 3 regiones distintas del CH3 en comparación con IgGl-CH3. Finalmente, los péptidos L235-F241, F241-M252, V263-F275, V266-F275 y V282-F296 muestran estabilidad ganada por la construcción mutante YC406 en comparación con IgG4 aglicosilada (T299A) en las regiones de secuencias específicamente más tendientes al intercambio debido a la desglicosilación . De manera interesante, la mutación D399S en el dominio CH3 , en tanto genera un pequeño aumento en la estabilidad térmica, imparte mayor intercambio que la secuencia de tipo salvaje. En general, el MS de intercambio H/D mostró que los cambios en la conformación como resultado de desglicosilación eran parcial o completamente recuperados Por l¾s mutaciones de estabilidad.
B. Cristalografía de rayos X de construcciones Fe potenciadas de estabilidad La construcción EAG2476 (T299 , T307P, L309K, D399S de IgG4-Fc agli) se cristalizó y se recogieron los datos a resolución 2.8Á (integridad de datos en general 92%; núcleo de alta resolución 66%) . La estructura se construyó en la densidad de electrones y se refino hasta un R/libre de R de 27.7/33.9%, respectivamente. La estructura revela las dos cadenas Fe en la unidad asimétrica (ASU) superimpuestas con cada pequeña desviación entre las dos cadenas. Los bucles V266-E272 y, en particular P291-V302, son bastante diferentes a los observados en la estructura cristalina de IgG4 de tipo salvaje (pdb 1ADQ) . Esto puede ser un resultado directo de la mutación T299K.
La estructura cristalina de la construcción EAG2478 (T299K Fe de IgGl agli) se disolvió hasta una resolución de 2.5Á (integridad de datos en general 92%; núcleo de alta resolución 66%) . La estructura se construyó y refino hasta un R/libre de R de 27.4/35.8%, respectivamente. A diferencia de la estructura de EAG2476, las dos cadenas de Fe en ASU no son idénticas en la estructura de EAG2478. Se observa que la cadena A es más similar a la estructura de un Fe de IgGl enzimáticamente desglicosilada (pdb 3DNK) . Los dominios CH2 en la estructura EAG2478 se encuentran más cercanos que lo que se observa en el Fe de IgGl enzimáticamente desglicosilado (pdb 3DNK) y un Fe de IgGl aglicosilado murino (pdb 3HKF) . Los dominios CH2 son más abiertos en la estructura EAG2476 que lo que se observa en la estructura EAG2478. Las estructuras revelan que en ambos casos la mutación T299K está dirigida hacia la cadena lateral Y129 de un receptor III gamma Fe anclados, que explicarían la afinidad disminuida para el receptor observada para esta mutación.
Equivalentes Para un experto en la técnica, el hecho de usar únicamente la experimentación de rutina, proporciona varios equivalentes a las modalidades específicas de la invención descritas en la presente. Se pretende que los equivalentes estén comprendidos por las siguientes reivindicaciones.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (37)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Un polipéptido estabilizado que comprende una región Fe quimérica, caracterizado porque el polipéptido estabilizado comprende i) al menos un resto CH2 de un anticuerpo IgG del isotipo IgG4 y al menos un resto CH3 de un anticuerpo IgG del isotipo IgGl, donde el polipéptido estabilizado comprende uno o más aminoácidos de Fe estabilizadores en una o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en 297, 299, 307, 309, 399, 409 y 427 (Convención de Numeración UE) ; ii) un resto CH2 de una región Fe de un anticuerpo IgG4, donde el polipéptido estabilizado comprende uno o más aminoácidos estabilizadores en una o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en 240F, 262L, 264T, 266F, 297Q, 299A, 299K, 307P, 309K, 309M, 309P, 323F, 399S y 427F (Convención de Numeración UE) o iii) un resto CH2 de una región Fe de un anticuerpo IgGl, donde el polipéptido estabilizado comprende uno o más aminoácidos estabilizadores en una o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en 299K y 297D (Convención de Numeración UE) .
2. El polipéptido estabilizado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende i) un resto CH2 de un anticuerpo IgG del isotipo IgG4 y comprende adicionalmente un resto CH1 y bisagra de un anticuerpo IgG del isotipo IgG4 y un dominio CH3 de un anticuerpo IgG del isotipo IgGl, y donde el anticuerpo comprende adicionalmente una prolina en la posición de aminoácidos 228, numeración UE; ii) un resto CH2 de una región Fe de un anticuerpo IgG4 que comprende un Gln en la posición de aminoácidos 297; iii) un resto CH2 de una región Fe de un anticuerpo IgGl que comprende un Lys en la posición de aminoácidos 299 o iv) un resto CH2 de una región Fe de un anticuerpo IgGl que comprende un Lys en la posición de aminoácidos 299 y un Asp en la posición de aminoácidos 297.
3. El polipéptido estabilizado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la región Fe es una región Fe aglicosilada .
4. El polipéptido estabilizado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la temperatura de fusión (Tm) del polipéptido Fe estabilizado i ) se potencia en aproximadamente 1°C o más , aproximadamente 2°C o más , aproximadamente 3°C o más , aproximadamente 4°C o más , aproximadamente 5°C o más , aproximadamente 6°C o más , aproximadamente 7°C o más , aproximadamente 8°C o más , aproximadamente 9°C o más , aproximadamente 10°C o más , aproximadamente 15°C o más y aproximadamente 20°C o más ; ii) se potencia en un pH neutro (aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7.5) o iii) se potencia en un pH ácido de aproximadamente 6.5 o menos, aproximadamente 6.0 o menos, aproximadamente 5.5 o menos, aproximadamente 5.0 o menos, aproximadamente 4.5 o menos y aproximadamente 4.0 o menos con relación a un polipéptido principal que carece del aminoácido estabilizador.
5. El polipéptido estabilizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el polipéptido estabilizado se expresa en un rendimiento mayor con relaqión a un polipéptido principal que carece de mutación estabilizadora .
6. El polipéptido estabilizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la turbidez del polipéptido estabilizado i) se reduce con relación a un polipéptido principal que carece del aminoácido estabilizador o ii) se reduce por un factor seleccionado del grupo que consiste en aproximadamente 1 vez o más, aproximadamente 2 veces o más, aproximadamente 3 veces o más, aproximadamente 4 veces o más, aproximadamente 5 veces o más, aproximadamente 6 veces o más, aproximadamente 7 veces o más, aproximadamente 8 veces o más, aproximadamente 9 veces o más, aproximadamente 10 veces o más, aproximadamente 15 veces o más, aproximadamente 50 veces o más y aproximadamente 100 veces o más.
7. El polipéptido estabilizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el polipéptido estabilizado tiene una función efectora reducida en comparación con un polipéptido Fe principal que carece de mutación estabilizadora y donde la función efectora reducida : i) tiene actividad ADCC reducida; ii) tiene unión reducida a un receptor Fe (FcR) seleccionado del grupo que consiste en FcyRl , FcyRll y FC/RIII o iii) se reduce por un factor seleccionado del grupo que consiste en aproximadamente 1 vez o más, aproximadamente 2 veces o más, aproximadamente 3 veces o más, aproximadamente 4 veces o más, aproximadamente 5 veces o más, aproximadamente 6 veces o más, aproximadamente 7 veces o más, aproximadamente 8 veces o más, aproximadamente 9 veces o más, aproximadamente 10 veces o más, aproximadamente 15 veces o más, aproximadamente 50 veces o más y aproximadamente 100 veces o más.
8. El polipéptido estabilizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el polipéptido estabilizado tiene una semivida potenciada en comparación con un polipéptido Fe principal.
9. El polipéptido estabilizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque la región Fe es una región Fe dimérica que comprende dos cadenas polipeptídicas .
10. El polipéptido estabilizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque la región Fe es una región de cadena Fe simple.
11. El polipéptido . estabilizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque todos los restos Fe de la región Fe son aglicosilados.
12. El polipéptido estabilizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la región Fe es aglicosilada debido a i) una sustitución en la posición 299 de la región Fe (convención de numeración UE) ; ii) como resultado de su producción en una célula hospedera bacteriana; o iii) como resultado de desglicosilación por medios químicos o enzimáticos.
13. El polipéptido estabilizado de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la región Fe es aglicosilada y el polipéptido comprende un dominio bisagra quimérico que comprende una sustitución con residuo de prolina en la posición de aminoácidos 228 (convención de numeración UE) .
14. El polipéptido estabilizado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el o los aminoácidos estabilizadores se seleccionan independientemente del grupo que consiste en (i) un aminoácido no cargado en la posición 297, (ii) un aminoácido cargado positivamente en la posición 299, (iii) un aminoácido polar en la posición 307, (iv) un aminoácido polar o cargado positivamente en la posición 309, (v) un aminoácido polar en la posición 399, (vi) un aminoácido polar o cargado positivamente en la posición 409 y (vii) un aminoácido polar en la posición 427.
15. El polipéptido estabilizado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque al menos un aminoácido estabilizador es un Gln en la posición de aminoácidos 297 (numeración UE) .
16· El polipéptido estabilizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque al menos uno de los aminoácidos estabilizadores es: i) una lisina (K) o tirosina (Y) en la posición 299; ii) una prolina (P) o metionina (M) en la posición 307; iii) una prolina (P) , metionina (M) o lisina (K) en la posición 309; o iv) serina (S) en la posición 399.
17. El polipéptido estabilizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la región Fe se une de forma operativa con un sitio de unión .
18. El polipéptido estabilizado de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el sitio de unión se selecciona de un sitio de unión al antígeno, una porción de unión al ligando de un receptor, una porción de unión al receptor de un ligando, un anticuerpo modificado, un scFv, un Fab, un minicuerpo, un diacuerpo, un triacuerpo, un nanocuerpo, un anticuerpo de camélido y un Dab.
19. El polipéptido estabilizado de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque comprende un anticuerpo de longitud completa estabilizado.
20. El polipéptido estabilizado de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el anticuerpo de longitud completa estabilizado se fusiona con una molécula ScFv convencional o estabilizada.
21. El polipéptido estabilizado de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque es una inmunoadhesina estabilizada .
22. El polipéptido estabilizado de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el sitio de unión se reviste en la superficie de la región Fe del polipéptido estabilizado .
23. El polipéptido estabilizado de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el sitio de unión se deriva de una molécula de unión no de inmunoglobulina .
24. El polipéptido estabilizado de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la molécula de unión no de inmunoglobulina se selecciona del grupo que consiste en adnectina, un affibody®, un DARPin y una anticalina.
25. Una composición caracterizada porque comprende un polipéptido estabilizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un portador farmacéuticamente aceptable .
26. Una molécula de ácido nucleico caracterizada porque comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de unión estabilizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
27. Una molécula de ácido nucleico caracterizada porque comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena polipeptídica de un polipéptido de unión estabilizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
28. Un vector caracterizado porque comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 26 o 27.
29. Una célula hospedera caracterizada porque expresa el vector de conformidad con la reivindicación 28.
30. Un método para producir un polipéptido Fe estabilizado de la invención caracterizado porque comprende cultivar la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 29 en un medio de cultivo de modo que se produzca el polipéptido Fe estabilizado.
31. Un método para estabilizar un polipéptido Fe principal que comprende una región Fe quimérica aglicosilada o porción de la misma, caracterizado porque comprende la sustitución de un aminoácido elegido en al menos un resto Fe de la región Fe con un aminoácido estabilizador para producir un polipéptido Fe estabilizado con estabilidad potenciada con relación al polipéptido de partida, donde la sustitución se realiza en una posición de aminoácidos del resto Fe seleccionado del grupo que consiste en: i) 297, 299, 307, 309, 399, 409 y 427 (Convención de Numeración UE) .
32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la región Fe quimérica comprende un dominio CH2 de un anticuerpo IgG del isotipo IgG4 y un dominio CH3 de un anticuerpo IgG del isotipo IgGl .
33. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la posición de aminoácidos y el aminoácido presente en el polipéptido Fe estabilizado se selecciona del grupo que consiste en 297Q, 299A, 299K, 307P, 309K, 309M, 309P, 323F, 399E, 399S, 409K, 409M y 427F.
34. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el polipéptido Fe estabilizado comprende un Gln en la posición 297 (numeración UE) .
35. Un método para la fabricación a gran escala de un polipéptido que comprende una región Fe estabilizada, caracterizado porque comprende: (a) fusionar genéticamente al menos un resto Fe estabilizado a un polipéptido para formar una proteína de fusión estabilizada; (b) transfectar una célula hospedera de mamífero con una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión estabilizada; (c) cultivar la célula hospedera del paso (f) en 10L o más de medio de cultivo en condiciones en las cuales se exprese la proteína de fusión estabilizada; para producir así una proteína de fusión estabilizada.
36. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la región Fe estabilizada: i) es una región Fe quimérica que comprende un dominio CH2 de un anticuerpo IgG del isotipo IgG4 y un dominio CH3 de un anticuerpo IgG del isotipo IgGl o ii) comprende un Gln en la posición de aminoácidos 297 (numeración UE) .
37. Un método para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar la composición de conformidad con la reivindicación 25 a un sujeto que sufre de la enfermedad o trastorno para, de este modo, tratar o prevenir una enfermedad o trastorno.
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