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MX2011005691A - Metodos para el tratamiento de infecciones y tumores. - Google Patents

Metodos para el tratamiento de infecciones y tumores.

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MX2011005691A
MX2011005691A MX2011005691A MX2011005691A MX2011005691A MX 2011005691 A MX2011005691 A MX 2011005691A MX 2011005691 A MX2011005691 A MX 2011005691A MX 2011005691 A MX2011005691 A MX 2011005691A MX 2011005691 A MX2011005691 A MX 2011005691A
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MX
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lymphocytes
antigen
subject
antibody
antagonist
Prior art date
Application number
MX2011005691A
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Rafi Ahmed
Rama Amara
Gordon Freeman
Vijayakumar Velu
Kehmia Titanji
Original Assignee
Univ Emory
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Publication date
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Abstract

Se describen antagonistas de PD-1 que pueden utilizarse para reducir la expresión o actividad del PD-1 en un sujeto. Una respuesta inmunitaria específica para un agente infeccioso o células tumorales puede mejorarse utilizando estos antagonistas de PD-1 en conjunto con un antígeno del agente infeccioso o tumor. Así, los sujetos con infecciones, tales como infecciones persistentes, pueden tratarse utilizando antagonistas del PD-1. Además, los sujetos con tumores pueden tratarse utilizando los antagonistas de PD-1. En varios ejemplos, los sujetos pueden tratarse transplantando una cantidad terapéuticamente efectiva de linfocitos T activados, que reconocen un antígeno de interés y administrando una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de PD-1. También se describen métodos para determinar la eficacia de un antagonista de PD-1 en un sujeto al que se le administró el antagonista de PD-1. En algunas modalidades, estos métodos incluyen medir la proliferación de linfocitos B de memoria en una muestra de un sujeto al que se le administró el antagonista de PD-1.

Description

MÉTODOS PARA EL TRATAMIENTO DE INFECCIONES Y TUMORES RECLAMO DE PRIORIDAD Esta solicitud reclama el beneficio de la Solicitud de Patente Provisional Estadounidense No. 61/118,570 presentada el 28 de noviembre de 2008, la cual se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.
DECLARACIÓN DEL APOYO GUBERNAMENTAL Esta invención fue realizada con el apoyo del Gobierno de los Estados Unidos bajo las subvenciones NIH Nos. ROI ??057029, ROI AI071852 y ROI AI074417. El gobierno tiene ciertos derechos sobre la invención.
CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN Esta solicitud se relaciona con el uso de antagonistas, específicamente con el uso de antagonistas de PD-1 para el tratamiento de infecciones persistentes y tumores, y con métodos para determinar una dosis efectiva de un antagonista del PD-1.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La inmunosupresión de una respuesta inmunitaria de un hospedante juega un papel en la inmunosupresión de una infección persistente y un tumor. Las infecciones persistentes son infecciones en las cuales el virus no es eliminado, sino que permanece en células especificas de los individuos infectados. Las infecciones persistentes con frecuencia involucran etapas de infección silenciosa y productiva sin destruir rápidamente o incluso producir un daño excesivo de las células hospedantes. Existen tres tipos de interacción virus-hospedantes persistentes: infección latente, crónica y lenta. La infección latente está caracterizada por la falta de un virus infeccioso demostrable entre los episodios de una enfermedad recurrente. La infección crónica está caracterizada por la presencia continua de un virus infeccioso después de la infección primaria, y puede incluir una enfermedad crónica o recurrente. La infección lenta está caracterizada por un periodo de incubación prolongado, seguido por una enfermedad progresiva. A diferencia de las infecciones latentes y crónicas, la infección lenta puede no empezar con un periodo agudo de multiplicación viral. Durante las infecciones persistentes, el genoma viral puede integrarse de manera estable en el ADN celular o mantenerse de manera episomal. La infección persistente ocurre con virus tales como los virus de la leucemia de los linfocitos T humanos, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus , virus del herpes, virus de la varicela-zoster, sarampión, papovavirus, virus xenotrópico relacionado con el virus de la leucemia murina (XMRV) , priones, virus de la hepatitis, adenovirus, parvovirus y virus del papiloma.
Los mecanismos mediante los cuales las infecciones persistentes se mantienen, pueden involucrar la modulación del virus y la expresión del gen celular y la modificación de la respuesta inmunitaria del hospedante. La reactivación de una infección latente puede desencadenarse por varios estímulos, incluyendo cambios en la fisiología celular, súper infección por otro virus y agresión física o trauma. La inmunosupresion del hospedante está asociada con frecuencia con la reactivación de varias infecciones persistentes de un virus .
Muchos estudios muestran respuestas inmunitarias defectuosas en pacientes diagnosticados con cáncer. Se han identificado varios antígenos tumorales que están asociados con cánceres específicos. Muchos antígenos tumorales se han definido en términos de múltiples tumores sólidos: MAGE 1, 2 y 3, definido por la inmunidad; MART-l/Melan-A, gplOO, antígeno carcinoembriónico (CEA) , HER-2, mucinas (es decir, MUC-1), antígeno específico de la próstata (PSA) y fosfatasa ácida prostética (PAP) . Además, las proteínas virales tales como la hepatitis B (HBV) , Epstein-Barr (EBV) y el papiloma humano (HPV) , han mostrado ser importantes en el desarrollo del carcinoma hepatocelular , linfoma y cáncer cervical, respectivamente. Sin embargo, debido a la inmunosupresión de los pacientes diagnosticados con cáncer, el sistema inmune innato de estos pacientes con frecuencia falla en responder a los antigenos tumorales.
Se ha propuesto que la inmunoterapia pasiva y activa se utilicen en el tratamiento de los tumores. La inmunidad pasiva suministra un componente de la respuesta inmunitaria, tal como anticuerpos o linfocitos T citotóxicos al sujeto de interés. La inmunoterapia activa utiliza un agente terapéutico, tal como una citocina, anticuerpo o compuesto químico para activar una respuesta inmunitaria endógena, en donde el sistema inmune es sensibilizado para reconocer al tumor como extraño. La inducción de la inmunidad pasiva y activa ha sido exitosa en el tratamiento de tipos específicos de cáncer.
En general, existe la necesidad de proporcionar métodos terapéuticos seguros y efectivos, y de establecer una dosificación segura de los agentes para el tratamiento de la enfermedad, por ejemplo, enfermedades autoinmunes, trastornos inflamatorios, alergias, rechazo de transplantes, cáncer, inmuno deficiencia, infecciones virales y otros trastornos relacionados con el sistema inmune. También permanece la necesidad de métodos para determinar si una dosis particular de un agente terapéutico, tal como un antagonista de PD-1, está tratando en forma efectiva a un sujeto.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN Los antagonistas del PD-1 reducen la expresión y/o actividad del PD-1. Los sujetos con infecciones, tales como infecciones persistentes, pueden ser tratados utilizando antagonistas del PD-1. Los sujetos con tumores también pueden ser tratados usando antagonistas del PD-1. Adicionalmente, los sujetos pueden tratarse trasplantando una cantidad terapéuticamente efectiva de linfocitos T activados que reconocen un antigeno de interés en conjunto con una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista del PD-1.
Una respuesta inmune puede medirse en un receptor mamífero. En algunas modalidades el método de tratamiento descrito en la presente incluye medir linfocitos B. En algunas modalidades, los métodos incluyen medir la proliferación de linfocitos B de memoria en una muestra de un sujeto.
En algunas modalidades, se describen métodos para determinar la eficacia de un antagonista del PD-1 en un sujeto al que se. le ha administrado el antagonista del PD-1. Estos métodos incluyen medir la proliferación de linfocitos B de memoria en una muestra de un sujeto al cual se le ha administrado el antagonista del PD-1, en donde un incremento en la proliferación de linfocitos B de memoria de la muestra, comparado con un control, indica que el antagonista del PD-1 es eficaz para tratar al sujeto.
También se describen en la presente métodos para determinar la dosis de un antagonista del PD-1 que es útil para tratar a un sujeto. Estos métodos incluyen administrar al sujeto una primera dosis de un antagonista del PD-1, y determinar la proliferación de linfocitos B de memoria en una primera muestra del sujeto. Un incremento en la proliferación de linfocitos B de memoria de la primera muestra, comparada con un control, indica que la primera dosis del antagonista de PD-1 es útil para tratar al sujeto. Una ausencia de alteración significativa en la proliferación de linfocitos B de memoria comparada con el control indica que la primera dosis del antagonista del PD-1 no es suficiente para tratar al sujeto.
Lo anteriormente divulgado y otras características y ventajas serán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de las diversas modalidades, que proceden con referencia a las figuras acompañantes .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1A es una gráfica de barras que muestra los niveles del ARNm de PD-1 en linfocitos T específicos de DbGP33-41 y/o DbGP276-286 de ratones transgénicos no sometidos anteriormente a experimentación, ratones infectados inmunes al virus Armstrong de la coriomeningitis linfocítica (LC V) (aproximadamente 30 días postinfección) , o ratones infectados con LCMV-C1-13 con reducción de CD4 (aproximadamente 30 días postinfección) , medidos mediante un análisis de arreglo de genes. La Figura IB es una serie de imágenes de un experimento de citometría de flujo, que muestra la expresión superficial del PD-1 en los linfocitos T CD8 + tetrámero"1" en ratones inmunes a LCMV Armstrong e infectados con LCMV-C1-13 con reducción de CD4, aproximadamente 60 días postinfección. Los linfocitos T CD8+ anérgicos expresan altos niveles del polipéptido PD-1 en la superficie celular aproximadamente 60 días después de la infección crónica con el virus LCMV-C1-13 (marcados "crónicos"), pero los linfocitos T CD8+ específicos del virus no expresan al polipéptido PD-1 después de la eliminación de una infección aguda con LCMV Armstrong (marcados "inmunes") . La Figura 1C es una serie de imágenes de un experimento de citometría de flujo que demuestra la presencia de PD-L1 en los esplenocitos de ratones infectados de manera crónica y no infectados. Demuestra que la expresión de PD-L1 es la más alta en los esplenocitos que están infectados por el virus.
La Figura 2A es una serie de gráficas de dispersión que muestran que cuando los ratones infectados con Cl-13 se tratan del día 23 al 37 postinfección, hubo aproximadamente un incremento de 3 veces en el número de linfocitos T CD8+ específicos de DbNP396-404 y específicos de DbGP33-41 en comparación con los controles no tratados. Con el fin de determinar cualesquiera cambios en la función, se midió la producción de IFN-? y TNF-a en respuesta a 8 diferentes epitopos de LCMV. La Figura 2B es una gráfica de dispersión que muestra que cuando se miden todas las especificidades conocidas de los linfocitos T CD8 + , hay un incremento de 2.3 veces en el número total de linfocitos T CD8+ específicos de LCMV. La Figura 2C es una serie de gráficas de la citometría de flujo que muestran la producción de IFN-? y TNF-a en respuesta a ocho diferentes epitopos de LCMV. La Figura 2D es una gráfica de dispersión que muestra que más linfocitos T CD8+ específicos del virus en los ratones tratados tienen la capacidad de producir TNF-a. La Figura 2E es una serie de gráficas de barras que muestra que el bloqueo de PD-L1 también dió como resultado un control viral incrementado en el bazo, hígado, pulmón y suero.
La Figura 3A es una gráfica que demuestra el incremento en los linfocitos T CD8+ específicos de DbGP33-41 y DbGP276-286 (marcados "GP33" y "GP276") en los ratones infectados con Cl-13 con reducción de CD4, tratados con anti-PD-Ll (marcados "aPD-Ll") del día 46 al día 60 postinfección versus el control (marcado "untx") , lo que demuestra que los ratones tratados con anti-PD-Ll contenían aproximadamente 7 veces más linfocitos T CD8+ esplénicos específicos de DbGP276-286 y aproximadamente 4 veces más linfocitos T CD8+ esplénicos específicos de DbGP33-41 que los ratones no tratados. La Figura 3B es una serie de imágenes de un experimento de citometría de flujo que demuestra la frecuencia incrementada de linfocitos T CD8+ específicos de DbGP33-41 y DbGP276-286 en el bazo de los ratones infectados con Cl-13 con reducción de CD , tratados con anti-PD-Ll (marcados "aPD-Ll Tx") del día 46 al día 60 postinfección versus el control (marcado "untx") . La Figura 3C es una serie de imágenes de un experimento de citometría de flujo que demuestra la proliferación incrementada de los linfocitos T CD8+ específicos de DbGP276-286 en ratones tratados con anti-PD-Ll, medida mediante la incorporación de BrdU y la expresión de Ki67. La Figura 3D es una gráfica que muestra que los ratones que tienen altos niveles de expansión de los linfocitos T CD8+, demuestran una respuesta apreciable en las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) , como se muestra al comparar los linfocitos T CD8+ específicos de DbGP276-286 en las PBMC, en comparación con los linfocitos T CD8+ específicos de DbGP276-286 en el bazo.
La Figura 4A es una serie de gráficas que demuestran el incremento en los linfocitos CD8+ específicos de DbGP276-286 y DbGP33-41 que producen IFN-? en ratones tratados con anti-PD-Ll, en comparación con los controles. También se detectaron frecuencias más altas de los linfocitos T CD8+ específicos de DbNP396-404, KbNP205-212, DbNP166-175 y DbGP92-101 en los ratones tratados con anti-PD-Ll. La Figura 4B es una gráfica que demuestra que en los ratones tratados con anti-PD-Ll, 50% de los linfocitos T CD8+ específicos de DbGP276-286 producen IFN-?, en comparación con 20% de los linfocitos T CD8+ específicos de DbGP276-286 en los ratones de control. La Figura 4C es una serie de imágenes de un experimento de citometría de flujo que demuestra que los ratones infectados de manera crónica tratados con anti-PD-Ll producen niveles más altos de TNF-a que los ratones infectados de manera crónica, no tratados, pero que todavía producen niveles menores de TNF-a que los ratones inmunes infectados con el virus LCMV Armstrong. La Figura 4D es una gráfica que demuestra que el tratamiento de los ratones infectados con LCMV-C1-13 con anti-PD-Ll, renueva ex vivo la actividad lítica de los linfocitos T específicos del virus, en comparación con los ratones infectados no tratados, medida utilizando un ensayo de liberación de 51Cr. La Figura 4E es una serie de gráficas que demuestran la reducción de los títulos virales en varios órganos después del tratamiento de los ratones infectados con LCMV-C1-13 con cc-PD-Ll. Los títulos virales disminuyeron aproximadamente 3 veces en el bazo, 4 veces en el hígado, 2 veces en el pulmón, y 2 veces en el suero después de 2 semanas de tratamiento con anti-PD-Ll, en comparación con los ratones no tratados.
La Figura 5A es una serie de imágenes de un experimento de citometría de flujo que muestran la expresión superficial de PD-1 utilizando 10 tetrámeros de VIH específicos para los epitopos dominantes seleccionados en la infección crónica con VIH ciado C. Los porcentajes indican el porcentaje de las células tetrámero+ que son PD-1+ . La Figura 5B es una serie de gráficas que demuestran que el porcentaje y la MFI de PD-1 están sobrerregulados de manera significativa en los linfocitos T CD8+ específicos del VIH en comparación con la población de linfocitos T CD8+ totales (p<0.0001) en individuos sin tratamiento previo con la terapia antirretroviral , y el PD-1 está incrementado en la población total de linfocitos T CD8+ en los controles infectados con VIH versus seronegativos a VIH (p=0.0033 y p<0.0001, respectivamente) . 120 tinciones de tetrámero de VIH de 65 individuos infectados con VIH y 11 controles seronegativos a VIH se incluyeron en el análisis. La Figura 5C es una serie de gráficas que muestran el porcentaje medio y la MFI de la expresión de PD-1 en las células tetrámero+ mediante la especificidad del epitopo. La Figura 5D es una gráfica que describe la variación en el porcentaje de las células PD-1+ en diferentes poblaciones especificas del epitopo dentro de individuos con respuestas detectables múltiples. Las barras horizontales indican el porcentaje medio de las células tetrámero+ de VIH PD-1+ en cada individuo.
La Figura 6A es una serie de gráficas que demuestran que no hay correlación entre el número de linfocitos T CD8+ específicos de VIH, medido por la tinción del tetrámero, y la carga viral plasmática, mientras que hay una correlación positiva entre el porcentaje y la MFI de PD-1 en las células tetrámero+ y la carga viral plasmática (p=0.0013 y p<0.0001, respectivamente) . La Figura 6B es una serie de gráficas que muestran que no hay correlación entre el número de células tetrámero+ del VIH y el conteo de CD4, mientras que hay una correlación inversa entre el porcentaje y la MFI de PD-1 en las células tetrámero"1" de VIH y el conteo de CD4 (p=0.0046 y p=0.0150, respectivamente). La Figura 6C es una serie de gráficas que demuestran que el porcentaje y la MFI de PD-1 en la población de linfocitos T CD8+ totales se correlaciona de manera positiva con la carga viral plasmática (p=0.0021 y p<0.0001, respectivamente) . La Figura 6D es una serie de gráficas que muestran que el porcentaje y la MFI de la expresión de PD-1 en la población total de linfocitos T CD8+ se correlacionan de manera inversa con el conteo de CD4 (p=0.0049 y p=0.0006, respectivamente).
La Figura 7A es una serie de imágenes de un experimento de citometria de flujo que muestran de manera representativa la tinción fenotipica de los linfocitos T CD8+ específicos de B*4201 TL9 del sujeto SK222, en quien 98% de los linfocitos T CD8+ específicos de B*4201 TL9 son PD-1+. La Figura 7B es una gráfica que ilustra un resumen de los datos fenotípicos de personas en quienes >95% de los linfocitos T CD8+ específicos de VIH son PD-1+ . Se analizaron de siete a 19 muestras para cada uno de los marcadores fenotípicos indicados. La barra horizontal indica el porcentaje medio de las células PD-1+ tetrámero+ que eran positivas para el marcador indicado.
La Figura 8A es una serie de imágenes de un experimento de citometria de flujo que muestran los datos de un ensayo de proliferación representativo de un sujeto positivo a B*4201. Después de una estimulación de 6 días con el péptido, el porcentaje de linfocitos T CD8+ específicos de B*4201 TL9 se incrementó de 5.7% a 12.4% en la presencia de un anticuerpo que bloquea a anti-PD-Ll. La Figura 8B es una gráfica lineal que describe los datos resumidos del ensayo de proliferación, indicando un incremento significativo en la proliferación de los linfocitos T CD8+ específicos de VIH en la presencia de un anticuerpo que bloquea a anti-PD-Ll (n=28, p=0.0006, prueba t apareada) . La Figura 8C es una gráfica de barras que muestra los efectos diferenciales del bloqueo de PD-1/PD-L1 en la proliferación de los linfocitos T CD8+ específicos de VIH en una base de paciente individual. Las barras blancas indican el incremento de las células tetrámero+ en la presencia del péptido solo, las barras negras indican el incremento de las células tetrámero+ en la presencia del péptido más el anticuerpo que bloquea a anti-PD-Ll. Los individuos en quienes se realizaron ensayos CFSE para más de un epitopo, se indican mediante símbolos de asterisco, cuadrado o triángulo.
Las Figuras 9A-9D son un diagrama y un conjunto de gráficas que muestran el efecto sinergístico de la vacuna terapéutica combinada con el bloqueo de PD-L1 en la frecuencia de los linfocitos T CD8 específicos del antígeno y el título viral en ratones infectados de manera crónica. La Figura 9A es un diagrama esquemático de un protocolo experimental. Los ratones infectados con la clona 13 de LCMV (CL-13) , se vacunaron con un virus de Vaccinia del tipo silvestre (VV/WT) o con un virus de vaccinia que expresa al epitopo GP33-41 de LCMV (VV/GP33) a las 4 (semanas) postinfección . Al mismo tiempo, los ratones se trataron 5 veces cada tres días con o sin anti-PD-L1. La Figura 9B es una serie de imágenes de un experimento de citometría de flujo que muestran la frecuencia de los linfocitos T CD8 específicos de GP33 y GP276 en las PBMC a 1 semana posterapia. El número representa la frecuencia de células tetrámero positivas por linfocitos T CD8. Los datos son representativos de tres experimentos. Las Figuras 9C-9D son gráficas de la frecuencia de los linfocitos T CD8 específicos de GP33 y GP276 (Figura 9C) y los títulos virales (Figura 9D) en la sangre posterapia. Los cambios en los números de los linfocitos T CD8 tetrámero-positivos y los títulos virales se verificaron en la sangre mediante tinción del tetrámero y ensayo de placa, respectivamente, en los puntos de medición indicados. Los números de linfocitos T CD8 tetrámero-positivos y los títulos virales se muestran para los ratones individuales (cuatro paneles superiores) y para múltiples ratones (panel inferior) después de la infección con VV/WT ó VV/GP33 (línea recta) y el tratamiento con anti-PD-Ll (región sombreada) . Las líneas segmentadas representan el límite de detección del virus.
Los resultados se reunieron de tres experimentos.
Las Figuras 10A-10D son gráficas e imágenes digitales que muestran los linfocitos T CD8 específicos del antígeno incrementados y el control viral mejorado en diferentes tejidos de ratones a los que se les proporcionó la vacuna terapéutica combinada con el bloqueo de PD-L1. La Figura 10A es una serie de imágenes de un experimento de citometría de flujo que muestran la frecuencia de los linfocitos T CD8 específicos de GP33 en diferentes tejidos a las 4 semanas posterapia. El número representa la frecuencia de las células tetrámero-positivas GP33 por linfocitos T CD8. Los datos son representativos de dos experimentos. La Figura 10B es una gráfica del número de linfocitos T CD8 específicos de GP33 en diferentes tejidos a las 4 semanas posterapia. La Figura 10C es un conjunto de gráficas de barras que muestran los títulos virales en los tejidos indicados a las 2 semanas (llenas) y 4 semanas (en blanco) posterapia. Las líneas segmentadas representan el límite de detección del virus. n=6 ratones por grupo. Los resultados se reunieron de dos experimentos. La Figura 10D es una imagen digital de la inmunotinción del bazo con antígenos de aLCMV (rojo) a las 2 semanas posterapia. Amplificación, x20.
La Figura 11A-11D son diagramas y gráficas que muestran el restablecimiento mejorado de la función en los linfocitos T CD8 extenuados mediante la vacuna terapéutica combinada con el bloqueo de PD-L1. La Figura 11A es una serie de imágenes de un experimento de citometria de flujo que muestra la producción de IFN-? y la desgranulación por los esplenocitos de los ratones vacunados a las 4 semanas posterapia. Los esplenocitos se estimularon con los péptidos indicados en la presencia de anticuerpos ctCD107a/b y a continuación se cotiñeron para el IFN-?. Los diagramas mostrados están cuadriculados sobre los linfocitos T CD8 y son representativos de dos experimentos independientes. La Figura 11B es una gráfica que muestra el porcentaje de células IFN-y+ CD107+ por linfocitos T CD8 específicos para cada uno de los péptidos LCMV de la Figura 11A, resumidos para múltiples ratones (n=6 para cada respuesta) . Los resultados se reúnen de dos experimentos. La Figura 11C es un conjunto de diagramas que muestran la producción de TNF-a de los linfocitos T CD8 capaces de producir IFN-? en los ratones vacunados. Después de la estimulación de los esplenocitos con el péptido GP33-41 o GP276-286, los linfocitos T CD8 que producen IFN-? se muestran en una cuadrícula, y a continuación se graficaron mediante IFN-? (eje x) versus TNF-a (eje y) . Los números superiores e inferiores en los diagramas indican la frecuencia de las células TNF-a+ entre las células IFN-y+ y la intensidad media de fluorescencia (MFI) de las células IFN-y+, respectivamente. Los datos son representativos de dos experimentos independientes. La Figura 11D es una gráfica que muestra el porcentaje de células TNF-ct+ por células IFN-y+ para el péptido GP33-41 o GP276-286 de la Figura 11C, resumidos para múltiples ratones (n=6 para cada respuesta) .
La Figura 12A-12B es un conjunto de diagramas que muestran que el efecto de una vacuna terapéutica combinada con el bloqueo de PD-L1 cambia el fenotipo de los linfocitos T CD8 específicos del antigeno de ratones infectados de manera crónica. La Figura 12A es un conjunto de diagramas que muestran el fenotipo de los linfocitos T CD8 específicos del tetrámero GP33 en las PBMC a los tiempos indicados posterapia. Los histogramas se muestran en una cuadrícula sobre los linfocitos T CD8 GP33+. La frecuencia de la población que expresa un alto nivel de CD27 o CD127 se indica mediante un porciento en los diagramas. Los números en los histogramas de la Granzima B representan la MFI de la expresión. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. La Figura 12B es un conjunto de diagramas que muestran los cambios fenotípicos de los linfocitos T CD8 específicos del tetrámero GP33 en diferentes tejidos a las 4 semanas posterapia. Los histogramas se muestran en una cuadrícula sobre los linfocitos T CD8 GP33 . La frecuencia de la población que expresa un alto nivel de CD127 o PD-1 se indica mediante un porciento en los diagramas. Los números en los histogramas de la Granzima B y Bcl-2 representan la MFI de la expresión. Los datos son representativos de dos experimentos independientes.
Las Figuras 13A-13E son un diagrama esquemático, diagramas y gráficas que muestran el efecto sinergistico de la vacuna terapéutica combinada con el bloqueo de PD-L1 en el restablecimiento de la función en linfocitos T CD8 extenuados "indefensos". La Figura 13A es un diagrama esquemático del protocolo. Los ratones tenían una reducción de los linfocitos T CD4 y a continuación se infectaron con la clona 13 de LCMV. Algunos ratones se vacunaron con el virus vaccinia del tipo silvestre (VV/WT) o el virus vaccinia que expresa el epitopo GP33-41 de LCMV (VV/GP33) a las 7 semanas postinfección . Al mismo tiempo, los ratones se trataron 5 veces cada tres días con ctPD-Ll o su isotipo. Dos semanas después del tratamiento inicial de los anticuerpos, los ratones se sacrificaron para el análisis. La Figura 13B es una serie de imágenes de un experimento de citometría de flujo y una gráfica de barras que muestran la frecuencia de los linfocitos T CD8 específicos de GP33 en los tejidos indicados a las 4 semanas posterapia. El número representa la frecuencia de las células positivas para tetrámero GP33 por linfocitos T CD8. La frecuencia de las células específicas de GP33 por linfocitos T CD8 en diferentes tejidos a las 2 semanas posterapia también se resume. La Figura 13C es una serie de imágenes de un experimento de citometría de flujo que muestra los resultados de los experimentos, en donde los esplenocitos se estimularon con el péptido GP33 en la presencia de los anticuerpos aCD107a/b y a continuación se cotiñeron para el IFN-?. Los diagramas mostrados están cuadriculados sobre los linfocitos T CD8. El porcentaje de células IFN-y+CD107+ por linfocitos T CD8 específicos para el péptido GP33, se resumen para múltiples ratones. La Figura 13D es una gráfica de barras del porcentaje de células IFN-y+ después de la estimulación con el péptido GP33 por células positivas para el tetrámero GP33-41 restringido a Db, resumido para múltiples ratones. La Figura 13E es una gráfica de barras de los títulos virales en los tejidos indicados a las 2 semanas posterapia. Todos los diagramas son representativos de dos experimentos y todos los resultados resumidos se reunieron de dos experimentos (n=6 ratones por grupo) .
Las Figuras 14A-14B son un conjunto de diagramas y gráficas que muestran que el bloqueo de la trayectoria de señalización de PD1/PD-L1 incrementa el número total de linfocitos T específicos del antígeno después de una transferencia adoptiva en ratones portadores congénitos. Los esplenocitos completos se transfirieron de manera adoptiva en los ratones portadores congénitos con o sin terapia con anti-PD-Ll. La Figura 14A es un conjunto de diagramas de citometria de flujo representativos de puntos de medición específicos cuadriculados sobre los linfocitos T CD8+. La Figura 14B consiste en gráficas que muestran la cinética de la expansión de los linfocitos T CD8 específicos de Db GP33 en la sangre periférica de dos experimentos independientes (n=4 animales por grupo) .
Las Figuras 15A-15E son diagramas y gráficas que muestran que el bloqueo de la trayectoria de PD-1/PDL1 después de la inmunoterapia con linfocitos T adoptivos, mejora la producción de citocina en los linfocitos T CD8 específicos del antígeno. Los esplenocitos se aislaron en el día 17 postransferencia y se analizaron para la expresión de la citocina tras la estimulación con el péptido antigénico. La Figura 15A es un conjunto de diagramas de flujo representativos mostrados para la expresión de IFNy, valorados mediante la tinción de la citocina intracelular después de 5 horas de estimulación con epitopos CD8 definidos o controles sin péptido. Las Figuras 15B y 15D son diagramas representativos mostrados para la expresión dual del TNFa ó 107ab y el IFNy (los datos estadísticos de los cuadrantes son un porcentaje de la cuadricula en CD8) . Las Figuras 15C y 15E son gráficas del porcentaje de las células que producen IFNy, que también producen TNFa ó 107ab (n=3 animales por grupo) .
Las Figuras 16A-16B son una gráfica y diagramas que muestran los niveles incrementados de las células que Secretan el Anticuerpo en los ratones infectados con la Clona-13 de LCMV. Los niveles de ASC totales se midieron en ratones infectados de manera crónica con LCMV, después del tratamiento con aPD-Ll mediante ELISPOT y tinción con CD138. La Figura 16A es una gráfica del número total de ASC esplénicas, que resume los resultados de tres experimentos independientes. La Figura 16B es un conjunto de diagramas que muestran un incremento en las células que secretan el anticuerpo (ASC) en el bazo, que puede medirse mediante el marcador CD138. Mostrando un diagrama representativo, las ASC son CD138+ y B220 bajas/intermedias (cuadriculadas sobre los linfocitos).
La Figura 17 es una gráfica que muestra que el tratamiento de los ratones infectados con LCMV de manera crónica, con anti-PD-Ll no conduce a niveles elevados de ASC de la médula ósea. Los números totales de ASC se numeraron desde el bazo y la médula ósea de ratones infectados de manera crónica con LCMV, 14 dias postratamiento con anti- (a) PD-L1 mediante ELISPOT. La linea representa la media geométrica dentro del grupo.
La Figura 18 es una gráfica que muestra que la coadministración de otPD-Ll y ctCTLA-4 conduce a incrementos sinergisticos en las ASC esplénicas. A los ratones infectados de manera crónica con LCMV se les administró aPD-Ll, aCTLA-4 , o ambos durante 14 días, y las ASC en el bazo se numeraron mediante ELISPOT. La linea representa la media geométrica dentro del grupo de tratamiento.
Las Figuras 19A-19B son diagramas que muestran la proliferación mejorada de los linfocitos B y los linfocitos T CD4 y la actividad del centro germinal en ratones tratados con aPD-Ll. La Figura 19A es un diagrama del análisis de citometria de flujo de los linfocitos T CD4 y los linfocitos B que muestra niveles elevados de Ki-67 después del tratamiento con aPD-Ll. Los resultados se muestran en una cudricula en los linfocitos CD4 o B como se listó anteriormente en cada columna. La Figura 19B es un conjunto de diagramas que muestran una frecuencia incrementada de los linfocitos B que expresan a PNA y altos niveles de FAS, lo cual indica una actividad mejorada del centro germinal en los ratones tratados con aPD-Ll. Los diagramas son una gráfica representativa que resume los resultados de dos experimentos separados.
Las Figuras 20A-20C son diagramas y gráficas que muestran la expresión de PD-1 en subconjuntos de linfocitos T CD8 y CD4. La Figura 20A es una serie de imágenes de un experimento de citometria de flujo que muestran la coexpresión de PD-1 y varios marcadores fenotipicos entre los linfocitos CD8+/CD3+ en la sangre. La Figura 20B es un conjunto de diagramas del porcentaje de varios subconjuntos de linfocitos CD8+/CD3+ y (D) linfocitos T CD4+/CD3+ que expresan PD-1. Las barras horizontales indican el porcentaje medio de PD-1 en los linfocitos T que son positivos (circuios huecos) y negativos (triángulos sólidos) para el marcador indicado. La Figura 20C es un conjunto de diagramas que representan los datos fenotipicos de los linfocitos T CD4+ que expresan el PD-1 de un sujeto.
Las Figuras 21A-B son diagramas y gráficas que demuestran que el PD-1 es expresado de manera más alta entre los linfocitos T CD8 específicos para las infecciones crónicas. La Figura 21A es una serie de imágenes de un experimento de citometria de flujo que muestran la tinción representativa de PD-1 de los linfocitos T CD8 específicos del Virus de Epstein Bar (EBV) , Cilomegalovirus (CMV) , influenza y virus Vaccínia. Se indica la intensidad media de fluorescencia geométrica (GMFI) de la expresión del PD-1 entre las células tetrámero+. La Figura 21B es un diagrama que muestra un resumen de la GMFI de PD-1 en linfocitos T CD8 específicos del EBV, CMV, influenza y virus Vaccínia de voluntarios sanos (n=35) .
La Figura 22A-C son diagramas y gráficas que demuestran que el bloqueo de anti-PD-Ll incrementa la proliferación in vitro de los linfocitos T CD8 específicos para las infecciones crónicas. La Figura 22A es una serie de imágenes de un experimento de citometría de flujo que muestran los linfocitos que se marcaron con CFSE, a continuación se cultivaron durante 6 días bajo las condiciones indicadas. Las imágenes muestran la tinción representativa a partir de los sujetos positivos a EBV y CMV. La Figura 22B es una gráfica de barras de las respuestas específicas del antígeno de EBV, CMV, influenza y virus Vaccínía después del bloqueo con el anticuerpo que bloquea a anti-PD-Ll. Las barras indican el incremento de las células tetrámero+ en la presencia del péptido más el anticuerpo que bloquea a anti-PD-Ll en comparación con el péptido solo. La Figura 22C es una gráfica lineal que muestra la relación entre el incremento en las células tetrámero+ después del bloqueo con el anticuerpo anti-PD-Ll y la expresión de PD-1 (antes del cultivo) .
Las Figuras 23B-23C son diagramas y. gráficas que muestran que los linfocitos T CD8+ específicos del virus de la hepatitis C (HCV) , expresan el PD-1 en la infección crónica con HCV humana. La Figura 23A consiste en diagramas representativos de cinco pacientes con infección crónica con HCV, que muestran la expresión de PD-1 en los linfocitos T CD8+ específicos de HCV. Los números en negrillas identifican la frecuencia de la expresión de PD-1 (eje x) en los linfocitos T CD8+ específicos de HCV (eje y) . Los números en cursivas dentro de los diagramas identifican la frecuencia de las células tetrámero-positivas entre los linfocitos T CD8+ totales. En el eje y, 1073 y 1406, identifican la especificidad del epitopo de HCV del tetrámero. Los pacientes son identificados mediante "Pt", seguido por el número del paciente. Las células se muestran una cuadrícula en los linfocitos CD8+. Las gráficas están a escala logarítmica. La Figura 23B es una comparación de la expresión de PD-1 en los linfocitos T CD8+ de donantes sanos (CD8 Sanos) , pacientes infectados con HCV (CD8 HCV) y en linfocitos T CD8+ específicos de HCV (HCV tet+) . La Figura 23C es una gráfica de la expresión de PD-1 en los linfocitos T CD8+ específicos para el virus de la influenza (Flu tet+ ) de donantes infectados con HCV (HCV+) y sanos (Sanos), en comparación con la expresión de PD-1 en los linfocitos T CD8+ específicos para HCV (HCV tet+) . Se utilizó una prueba t no apareada para comparar las diferencias en la expresión de PD-1 dentro del mismo paciente en los linfocitos T CD8+ totales versus los linfocitos T CD8+ específicos para HCV.
Las Figuras 24A-24D son diagramas y gráficas que muestran que la frecuencia de los linfocitos T CD8+ que expresan a PD-1 del hígado es mayor que en la sangre periférica. La Figura 24A son diagramas representativos de cinco pacientes con infección crónica por HCV que muestran la expresión de PD-1 en los linfocitos T CD8+ totales de la sangre periférica versus hígado. Los números en negrillas dentro de los diagramas identifican la frecuencia de las células con expresión de PD-1 entre los linfocitos T CD8+ totales en la cuadrícula del linfocito. Los diagramas están a escala logarítmica. La Figura 24B es una comparación de la expresión de PD-1 en los linfocitos T CD8+ de la sangre periférica versus hígado en pacientes infectados de manera crónica con HCV. Se utilizó una prueba t apareada para comparar la diferencia en la expresión de PD-1 dentro de los mismos pacientes. La Figura 24C es una comparación de la expresión de PD-1 en las células de la Memoria del Efector CD8+ (TEM) de la sangre periférica versus hígado. Los subconjuntos de la memoria se identificaron mediante la expresión diferencial de CD62L y CD45RA. Los números en negrillas en los diagramas superiores representan la frecuencia de las células en cada cuadrante. Las células se muestran en una cuadrícula en los linfocitos CD8+. El subconjunto TEM se cuadriculó (recuadros) y la expresión de PD-1 se muestra en los diagramas del histograma siguientes. La linea punteada muestra la expresión de PD-1 en los linfocitos T CD8+ sin experimentación previa (utilizados como la población negativa) . Los números en los diagramas del histograma representan la frecuencia de las células que expresan a PD-1. La comparación de la frecuencia de la expresión de PD-1 en las células TEM CD8+ para diez pacientes con infección crónica con HCV se resume a continuación de los diagramas del histograma. Se utilizó una prueba t apareada para comparar la diferencia en la expresión de PD-1 en TEM CD8+ de la sangre periférica versus hígado dentro del mismo paciente. La Figura 24D consiste en diagramas representativos de dos pacientes con infección crónica con HCV, que muestran la diferencia en la expresión de CD127 en los linfocitos T CD8+ totales de la sangre periférica versus hígado. Los números en negrillas identifican la frecuencia de la expresión de CD127 en los linfocitos T CD8+ totales. Las células se muestran en una cuadrícula en los linfocitos CD8+. Los diagramas están a escala logarítmica. Un resumen de la comparación de la expresión de CD127 en los linfocitos T CD8+ totales en la sangre periférica versus hígado se muestra a continuación de los diagramas de FACS. Se utilizó una prueba t apareada para el análisis estadístico .
La Figura 25 es un conjunto de gráficas y diagramas que muestran los linfocitos T CD8+ específicos de HCV en el hígado, que expresan un fenotipo extenuado. Diagramas representativos de la expresión de PD-1 y CD127 en los linfocitos T CD8+ específicos de HCV de la sangre periférica y el hígado de dos pacientes con infección crónica con HCV. La primera hilera de diagramas identifica a la población tetrámero-positiva de HCV (recuadros) . Los números encima de los recuadros representan la frecuencia de las células tetrámero-positivas entre los linfocitos CD3+. La especificidad del epitopo del tetrámero de HCV se identifica en el eje y (1073). La segunda y tercera hileras de diagramas muestran la expresión de PD-1 y CD127 en los linfocitos T CD8+ específicos de HCV de la sangre periférica y el hígado de dos pacientes con infección crónica con HCV. Los números en negrillas representan la frecuencia de la expresión de PD-1 o CD127 en los linfocitos T CD8+ específicos de HCV. Los diagramas están a escala logarítmica y cuadriculados sobre los linfocitos CD3+ CD8+. A continuación de los diagramas de FACS, se muestra un resumen de la comparación de la expresión de PD-1 (izquierda) y la expresión de CD127 (derecha) en los linfocitos T CD8+ totales versus los linfocitos T CD8+ específicos de HCV de la periferia (HCV tet+ PBMC) versus los linfocitos T CD8+ específicos de HCV del hígado (HCV tet+ Hígado) . Se utilizaron pruebas t apareadas para comparar la expresión dentro del mismo paciente.
La Figura 26 es un conjunto de diagramas que muestran que el bloqueo de la trayectoria de PD-1/PD-L1 incrementa la expansión de los linfocitos T específicos de HCV estimulados con el antígeno. Las PBMC marcadas con CFSE de dos pacientes HLA-A2 separados se estimularon utilizando el antígeno del péptido análogo durante 6 días en la presencia de IL-2 y el anticuerpo anti-PD-Ll (panel superior) o el anticuerpo anti-PD-1 (panel inferior) . También se muestra un control no estimulado. El porcentaje de los linfocitos T CD8+ HLA-A2+ específicos para HCV con CFSE baja y CFSE alta que proliferan, se muestran en cada cuadrante.
Las Figuras 27A-27D son diagramas y gráficas que muestran la expresión elevada de PD-1 en los linfocitos T CD8 específicos del virus de la inmunodeficiencia simiana (SIV) después de la infección con SIV239. La Figura 27A es un diagrama que muestra la expresión de PD-1 en los linfocitos T CD8 totales de un macaco normal. La Figura 27B es un diagrama que muestra la expresión de PD-1 en los linfocitos T CD8 totales y específicos de gag de SIV en un macaco infectado con SIV239. El análisis se hizo en las PBMC a las 12 semanas después de la infección con SIV. La Figura 27C es una gráfica que proporciona un resumen de las células positivas para PD-1 en los linfocitos T CD8 totales y específicos para SIV de macacos normales e infectados con SIV. Los datos para los macacos infectados con SIV se representan a las 12 semanas después de la infección. La Figura 27D (último panel) , es una gráfica que proporciona un resumen de la intensidad media de fluorescencia (MFI) de la expresión de PD-1 en los linfocitos T CD8 totales y específicos de SIV de macacos normales e infectados con SIV.
Las Figuras 28A-28B son un diagrama y una gráfica, respectivamente, que muestran que el bloqueo in vitro de PD-1 resulta en la expansión mejorada de los linfocitos T CD8 específicos de SIV. Las PBMC de macacos positivos a Mamu A*01 que se infectaron con SHIV89.6P, se estimularon con el péptido PllC (0.1 g/ml) en la ausencia y la presencia del anticuerpo (Ab) que bloquea a anti-PD-1 (10 µ?/p??) durante seis días. Después de tres días de estimulación, se agregó IL-2 (50 unidades/ml) . Al final de la estimulación, las células se tiñeron en la superficie para CD3, CD8 y el tetrámero Gag-CM9. Las células no estimuladas (nostim) sirvieron como controles negativos. Las células se muestran en una cuadrícula en los linfocitos basándose en la dispersión, a continuación en CD3 y se analizaron para la expresión de CD8 y el tetrámero. La Figura 28A consiste en diagramas de FACS representativos. Los números en la gráfica representan la frecuencia de las células tetrámero-positivas como un porcentaje de los linfocitos CD8 T totales. La Figura 28B es una gráfica que proporciona un resumen de los datos de seis macacos. Los análisis se realizaron utilizando las células obtenidas a las 12 semanas después de la infección. Se calculó el incremento como una relación de la frecuencia de las células tetrámero-positivas en cultivos estimulados con P11C y las células no estimuladas.
La Figura 29 es un conjunto de diagramas que muestran la cinética de la expresión de PD-L1, PD-L2 y PD-1 en diferentes tipos de células después de la infección con LC V. Los ratones se infectaron con 2xl06 ufp de la clona-13 (CL-13) . La expresión de PD-L1, PD-L2 y PD-1 en diferentes tipos de células se mostró como un histograma en los puntos de medición indicados postinfección. Se muestra la intensidad media de fluorescencia ( FI) de la expresión de PD-1 en el tipo de células indicado.
Las figuras 30a-30c son gráficas de FACS mostrando que el bloqueo in vivo de PD-1 durante la infección crónica por SIV aumenta los linfocitos T CD8 específicos para GAG-CM9 con calidad funcional mejorada tanto en sangre como en intestino. La figura 30a consiste en gráficas de FACS representativas para el macaco RRklO. Las figuras 30B y 30C son gráficas de FACS que muestran la magnitud y fenotipo de linfocitos T CD8 tetrámero-positivas de Gag-CM9 en sangre (figura 30b) e intestino (tejido mucoso colorrectal) (figura 30c) . Las gráficas de FACS representativas se muestran en la izquierda y el resumen para todos los animales Mamu A*01-positivos se muestra en el lado derecho. Los números sobre las gráficas de FACS representan la frecuencia de células tetrámero-positivas como un porcentaje de linfocitos T CD8 totales. Las flechas y lineas verticales indican tratamiento con anticuerpo anti-PD-1 o con anticuerpo de control.
Las figuras 31a-31b muestran que el bloqueo del PD-1 in vivo durante la infección crónica por SIV aumenta los linfocitos T CD8 específicos para virus polifuncional . La figura 31a muestra la frecuencia de linfocitos T CD8 secretores de citocina específicos para Gag como un porcentaje de los linfocitos T CD8 totales. Las gráficas de FACS representativas se muestran a la izquierda y el resumen para el grupo se muestra a la derecha. Las flechas y líneas verticales indican tratamiento con anticuerpo anti-PD-1 o con anticuerpo de control. Las líneas representan macacos tratados con anticuerpo anti-PD-1 y las líneas rojas representan macacos tratados con anticuerpo de control. La figura 31b muestra subconjuntos de coexpresión de citocinas expresados como un porcentaje de los linfocitos citocina-positivos . Se muestran los porcentajes medios para cada grupo.
Las figuras 32a-32b muestran que el bloqueo in vivo de PD-1 durante la infección crónica por SIV aumenta la imnunidad humoral especifica para SIV. La figura 32a muestra la expresión de PD-1 en los linfocitos B de memoria (CD20+CD27+CD21") y los que no han sido sometidos a tratamiento (CD20+CD27"CD21+) en sangre después de la infección por SIV y antes del bloqueo in vivo de PD-1. La figura 32b muestra títulos de anticuerpo que se une a Env anti-SIV en suero después del bloqueo. La figura 32c muestra la expresión Ki67 (marcador para proliferación) sobre linfocitos B de memoria y linfocitos B que no han sido sometidos a tratamiento, después del bloqueo. Los números sobre las gráficas de FACS representan células positivas para Ki67 como un porcentaje de las células totales respectivas. Los macacos RAfll y RJdll fueron tratados simultáneamente con anticuerpo anti-PD-1 y terapia anti-retroviral a las 22 semanas después de la infección por SIV.
Las figuras 33a-33c muestran que el bloqueo de PD-1 in vivo reduce la viremia plasmática y prolonga la supervivencia de macacos infectados con SIV. La carga viral plasmática en macacos tratados con anticuerpo anti-PD-1 durante la fase crónica temprana de la infección (figura 33a) , macacos tratados con anticuerpo anti-PD-1 durante la fase crónica tardía de la infección (figura 33b) y macacos tratados con anticuerpo de control durante la fase crónica temprana/tardía de la infección por SIV (figura 33c). Un asterisco indica la muerte del animal. La figura 33d muestra la reducción de la carga viral plasmática entre el día 0 y el día 28 (estudio crónico temprano) o día 9 y dia 21 (estudio crónico tardío) . La figura 33e muestra la supervivencia de macacos infectados por SIV después del b'loqueo de PD-1.
LISTADO DE LAS SECUENCIAS Las secuencias nucleicas y de aminoácidos listadas en el listado de las secuencias acompañante se muestran utilizando abreviaturas con letras estándar para las bases nucleotídicas , y un código de tres letras para los aminoácidos, como se define en 37 C.F.R. 1.822. Únicamente se muestra una hebra de cada secuencia de ácidos nucleicos, pero se entiende que la hebra complementaria está incluida mediante cualquier referencia a la hebra mostrada. En el listado de las secuencias acompañantes: SEQ ID NO: 1 es una secuencia de aminoácidos ejemplar del PD-1 humano.
SEQ ID NO: 2 es una secuencia de aminoácidos ejemplar del PD-1 de ratón.
SEQ ID NO: 3 es una secuencia de aminoácidos ejemplar del PD-L1 humano.
SEQ ID NO: 4 es una secuencia de aminoácidos ejemplar del PD-L2 humano.
SEQ ID Nos: 5-12 son secuencias de aminoácidos ejemplares de las regiones de la estructura humana.
SEQ ID NOs : 13-35 son secuencias de aminoácidos ejemplares de los péptidos antigénicos.
SEQ ID Nos: 36-43 son las secuencias de aminoácidos de los péptidos mayores de la histocompatibilidad.
SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45 son las secuencias de aminoácidos de los epitopos de los linfocitos T.
SEQ ID NO: 46 es una secuencia de aminoácidos ejemplar de un PD-L2 humano variante.
SEQ ID NOS: 47-52 son secuencias de aminoácidos ejemplares de los péptidos antigénicos.
SEQ ID NOS: 53-56 son secuencias de ácidos nucleicos de cebadores.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Esta descripción se relaciona con el uso de los antagonistas de PD-1 para la inducción de una respuesta inmunitaria, tal como para un tumor o una infección viral persistente. Esta descripción también se relaciona con métodos para determinar la dosis de un antagonista del PD-1 que es efectiva para tratar a un sujeto.
Términos A menos que se indique de otra manera, los términos técnicos se utilizan de acuerdo con el uso convencional. Las definiciones de los términos comunes en biología molecular pueden encontrarse en Benjamín Lewin, Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0- 19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd. , 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed. ) , Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8) .
Con el fin de facilitar una revisión de las varias modalidades de esta descripción, se proporcionan las siguientes explicaciones de los términos específicos: Alterar: Un cambio estadísticamente significativo en un parámetro en comparación con un valor de control para ese parámetro. En un ejemplo, un "incremento" es una elevación estadísticamente significativa en un parámetro, tal como el número o proliferación de linfocitos B de memoria, comparada con un control. Los análisis estadísticos adecuados son bien conocidos en la técnica, e incluyen, pero no están limitados a, prueba T de Student y ensayos ANOVA. En algunos ejemplos, este es un valor p<0.05. En otros ejemplos, una alteración significativa, tal como un incremento o decremento es un cambio que es dos desviaciones estándar de la media, o mayor. Una "ausencia de alteración significativa" significa que un cambio en un valor no logró significancia estadística, usando la prueba estadística apropiada. En algunos ejemplos, este es un valor p>0.05. En otros ejemplos, una "ausencia de una alteración significativa" es un incremento o decremento que es menor a dos desviaciones estándar de la media. En algunas modalidades, un "incremento" o "elevación, tal como en la proliferación de las linfocitos B de memoria, es de aproximadamente un 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o un incremento de 2 veces, 3 veces, 4 veces o 5 veces. En un ejemplo, un "decremento" o "reducción" es una declinación estadísticamente significativa en un parámetro, tal como el número o proliferación de linfocitos B de memoria, comparado con un control. Los análisis estadísticos adecuados son bien conocidos en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a, prueba T de Student y ensayos ANOVA. En algunas modalidades, un "decremento" tal como en la proliferación de linfocitos B de memoria, es de aproximadamente un 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o un decremento de 2 veces, 3 veces, 4 veces o 5 veces.
Antisentido, Sentido y Antigen: El ADN tiene dos hebras antiparalelas, una hebra 5' —> 3', referida como la hebra positiva, y una hebra 3' —» 5' , referida como la hebra negativa. Debido a que la ARN polimerasa agrega ácidos nucleicos en la dirección 5' —> 3' , la hebra negativa del ADN sirve como la plantilla para el ARN durante la transcripción. Asi, un transcripto de ARN tendrá una secuencia complementaria a la hebra negativa, e idéntica a la hebra positiva (excepto porque U está sustituida por T) .
Las moléculas antisentido son moléculas que son hibridables de manera especifica o son complementarias de manera especifica ya sea al ARN o a la hebra positiva del ADN. Las moléculas sentido son moléculas que son hibridables de manera especifica o complementarias de manera especifica a la hebra negativa del ADN. Las moléculas antigen son moléculas antisentido o sentido dirigidas a un objetivo de ADN. Un ARN antisentido (ARNas) es una molécula de ARN complementaria a una molécula de ácido nucleico sentido (codificante) .
Amplificación: Cuando se utiliza con referencia a un ácido nucleico, se refiere a técnicas que incrementan el número de copias de una molécula de ácido nucleico en una muestra o espécimen. Un ejemplo de amplificación es la reacción en cadena de la polimerasa, en la cual una muestra biológica recolectada de un sujeto, se pone en contacto con un par de cebadores oligonucleotidicos , bajo condiciones que permiten la hibridación de los cebadores a la plantilla de ácido nucleico en la muestra. Los cebadores se extienden bajo condiciones adecuadas, se disocian de la plantilla y a continuación se recocen, se extienden y disocian para amplificar el número de copias del ácido nucleico. El producto de la amplificación in vitro puede caracterizarse por electroforesis , patrones de escisión de endonucleasa de restricción, hibridación o ligadura oligonucleotidica y/o secuenciamiento de los ácidos nucleicos, utilizando técnicas estándar. Otros ejemplos de técnicas de amplificación in vitro, incluyen la amplificación por desplazamiento de la hebra (véase la Patente de los Estados Unidos No. 5,744,311); amplificación isotérmica libre de transcripción (véase la Patente de los Estados Unidos No. 6, 033, 881); amplificación con reacción en cadena de reparación (véase WO 90/01069) ; amplificación con reacción en cadena de la ligasa (véase la EP-A-320 308); amplificación con reacción en cadena de la ligasa que llena un hueco (véase la Patente de los Estados Unidos No. 5,427,930); detección de la ligasa acoplada y PCR (véase la Patente de los Estados Unidos No. 6,027,889) y amplificación libre de transcripción con ARN NASBA® (véase la Patente de los Estados Unidos No. 6,025,134) .
Anticuerpo: Un ligando polipeptidico que comprende al menos una región variable de la inmunoglobulina de cadena ligera o de cadena pesada que reconoce y se une de manera especifica a un epitopo (por ejemplo, un antigeno tumoral o viral o un fragmento del mismo) . Esto incluye las inmunoglobulinas intactas y las variantes y porciones de ellas bien conocidas en la técnica, tales como fragmentos Fab' , fragmentos F(ab)'2, proteínas Fv de una sola cadena ("scFv") , y proteínas Fv estabilizadas con disulfuro ("dsFv") . Una proteína scFv es una proteína de fusión en la cual una región variable de cadena ligera de una inmunoglobulina y una región variable de cadena pesada de una inmunoglobulina, están unidas por un enlazante, mientras que en las dsFvs, las cadenas han mutado para introducir un enlace disulfuro para estabilizar la asociación de las cadenas. El término también incluye formas diseñadas genéticamente tales como anticuerpos quiméricos (por ejemplo, anticuerpos murinos humanizados), anticuerpos heteroconj ugados (por ejemplo, anticuerpos biespecífieos ) . Véase también, Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) ; Kuby, J., Immunology, 3a Ed., W.H. Freeman & Co., New York, 1997.
Típicamente, una inmunoglobulina tiene una cadena pesada y una ligera. Cada cadena pesada y ligera contiene una región constante y una región variable (las regiones también son conocidas como "dominios") . En combinación, las regiones variables de cadena pesada y ligera se unen de manera especifica al antigeno. Las regiones variables de cadena ligera y pesada contienen una región de "estructura" interrumpida por tres regiones hipervariables, también llamadas "regiones que determinan la complementariedad" o "CDR". La extensión de la región de la estructura y la CDR se ha definido (véase, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, 1991, que se incorpora en la presente como referencia) . La base de datos Kabat es ahora mantenida en linea. Las secuencias de las regiones de estructura de diferentes cadenas ligeras o pesadas se conservan de manera relativa dentro de una especie. La región de estructura de un anticuerpo, que son las regiones de estructura combinadas de las cadenas ligera y pesada constituyentes, sirve para colocar y alinear las CDR en el espacio tridimensional.
Las CDR son las responsables primarias de la unión a un epitopo de un antigeno. Las CDR de cada cadena se refieren típicamente como CDR1, CDR2 y CDR3, numeradas secuencialmente iniciando desde el término N, y también son identificadas típicamente por la cadena en la cual se localiza la CDR particular. Asi, una CDR3 VH se localiza en el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo en la cual se encuentra, mientras que una CDR1 VL es la CDR1 del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo en el cual se encuentra.
Las referencias a "VH" o "VH" se refieren a la región variable de una cadena pesada de la inmunoglobulina, incluyendo aquélla de una Fv, scFv, dsFv o Fab. Las referencias a "VL" o "VL", se refieren a la región variable de una cadena ligera de la inmunoglobulina, incluyendo aquélla de una Fv, scFv, dsFv o Fab.
Un "anticuerpo monoclonal" es un anticuerpo producido por una sola clona de linfocitos B o por una célula en la cual se han transfectado los genes de la cadena ligera y pesada de un solo anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales se producen mediante métodos conocidos por aquellos con experiencia en la técnica, por ejemplo, haciendo células que forman un anticuerpo híbrido a partir de una fusión de células de mieloma con células de bazo inmunes. Los anticuerpos monoclonales incluyen anticuerpos monoclonales humanizados.
Una inmunoglobulina "humanizada" es una inmunoglobulina que incluye una región de estructura humana y una o más CDR de una inmunoglobulina no humana (tal como de ratón, rata o sintética) . La inmunoglobulina no humana que proporciona las CDR se denomina un "donante", y la inmunoglobulina humana que proporciona la estructura se denomina un "aceptor". En una modalidad, todas las CDR son de la inmunoglobulina donante en una inmunoglobulina humanizada. Las regiones constantes no necesitan estar presentes, pero si están, deben ser sustancialmente idénticas a las regiones constantes de la inmunoglobulina humana, es decir, al menos aproximadamente 85-90%, tal como aproximadamente 95% o más idénticas. Por lo tanto, todas las partes de la inmunoglobulina humanizada, excepto posiblemente las CDR, son sustancialmente idénticas a las partes correspondientes de las secuencias de inmunoglobulina humana naturales. Un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo que comprende una inmunoglobulina de cadena ligera humanizada y una de cadena pesada humanizada. Un anticuerpo humanizado se une al mismo antigeno que el anticuerpo donante que proporciona las CDR. La estructura del aceptor de una inmunoglobulina o anticuerpo humanizado puede tener un número limitado de sustituciones por los aminoácidos tomados de la estructura del donante. Los anticuerpos humanizados u otros anticuerpos monoclonales pueden tener sustituciones de aminoácidos conservadoras adicionales, que sustancialmente no tienen efecto en la unión al antígeno u otras funciones de la inmunoglobulina . Las inmunoglobulinas humanizadas pueden construirse por medio de ingeniería genética (por ejemplo, véase la Patente de los Estados Unidos No. 5,585,089).
Un "anticuerpo neutralizante" es un anticuerpo que interfiere con cualquiera de las actividades biológicas de un polipéptido, tal como un polipéptido PD-1. Por ejemplo, un anticuerpo neutralizante puede interferir con la capacidad de un polipéptido PD-1 para reducir una respuesta inmunitaria tal como la citotoxicidad de los linfocitos T. En varios ejemplos, el anticuerpo neutralizante puede reducir la capacidad de un polipéptido PD-1 para reducir una respuesta inmunitaria en aproximadamente 50%, aproximadamente 70%, aproximadamente 90% o más. Puede utilizarse cualquier ensayo estándar para medir las respuestas inmunes, incluyendo aquéllos descritos en la presente, para valorar los anticuerpos potencialmente neutralizantes.
Antigeno: Un compuesto, composición o sustancia que puede estimular la producción de anticuerpos o una respuesta de un linfocito T en un animal, incluyendo composiciones que son inyectadas o absorbidas en un animal. Un antígeno reacciona con los productos de la inmunidad humoral o celular específica, incluyendo aquéllos inducidos por los inmunógenos heterólogos . El término "antígeno" incluye todos los epitopos antigénicos relacionados. "Epitopo" o "determinante antigénico", se refiere a un sitio en un antígeno al cual responden los linfocitos B y/o T. En una modalidad, los linfocitos T responden al epitopo, cuando el epitopo se presenta en conjunto con una molécula MHC . Los epitopos pueden formarse tanto de aminoácidos contiguos como de aminoácidos no contiguos yuxtapuestos mediante el plegado terciario de una proteína. Los epitopos formados de los aminoácidos contiguos son retenidos típicamente con la exposición a solventes desnaturalizantes, mientras que los epitopos formados mediante el plegado terciario, típicamente se pierden con el tratamiento con solventes desnaturalizantes. Un epitopo incluye típicamente al menos 3, y más usualmente al menos 5, aproximadamente 9, o aproximadamente 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única. Los métodos para determinar la conformación espacial del los epitopos incluyen, por ejemplo, cristalografía con rayos x y resonancia magnética nuclear en 2 dimensiones.
Un antígeno puede ser un antígeno específico del tejido, o un antígeno especifico. de la enfermedad. Estos términos no son exclusivos, puesto que un antígeno específico del tejido también puede ser un antígeno específico de la enfermedad. Un antígeno específico del tejido se expresa en un número limitado de tejidos, tal como en un solo tejido. Los ejemplos específicos no limitantes de un antígeno específico del tejido son el antígeno específico de la próstata, un antígeno específico uterino y/o un antígeno específico de los testículos. Un antígeno específico del tejido puede expresarse por más de un tejido, tal como, de manera no exclusiva, un antígeno que se expresa en más de un tejido reproductor, tal como en ambos del tejido de la próstata y uterino. Un antígeno específico de la enfermedad se expresa de manera coincidental con un proceso de enfermedad. Los ejemplos no limitantes específicos de un antígeno específico de la ¦enfermedad son un antígeno cuya expresión se correlaciona con, o es predictiva de la formación de un tumor. Un antígeno específico de la enfermedad puede ser un antígeno reconocido por los linfocitos T o los linfocitos B.
Célula que presenta el antigeno (APC) : Una célula que pueda presentar el antígeno unido a las moléculas clase I o clase II MHC a los linfocitos T. Las APC incluyen, de manera no exclusiva, monocitos, macrófagos, células dendríticas, linfocitos B, linfocitos T y células de Langerhans . Un linfocito T que puede presentar el antígeno a otros linfocitos T (incluyendo los linfocitos T CD4+ y/o CD8+) , es un linfocito T que presenta el antígeno (T-APC) .
Células B: Un subconjunto de linfocitos, esto es, células sanguíneas blancas (leucocitos) . Los linfocitos B maduras se diferencian en células plasmáticas, las cuales producen anticuerpos, y linfocitos B de memoria. Una "progenitora de linfocitos B" es una célula que se puede convertir en un linfocito B maduro. Las progenitoras de linfocitos B incluyen células troncales, células pro-B tempranas, células pro-B tardías, células pre-B grandes, células pre-B pequeñas, y linfocitos B no maduros y linfocitos B transicionales . Generalmente, las células pro-B tempranas (que expresan, por ejemplo, CD43 o B220), sufren de rearreglo de cadena pesada de inmunoglobulina para convertirse en células pro-B tardías y células pre-B, y después sufren rearreglo de cadena ligera de inmunoglobulina para convertirse en linfocitos B inmaduros. Los linfocitos B inmaduros incluyen linfocitos B TI y T2. Por ejemplo, en ratones, los linfocitos B inmaduros incluyen linfocitos B TI que son células AA 1hiCD23l0. Otro ejemplo de un linfocito B inmaduro de ratón es una linfocito B T2 que es una célula AA41hiCD23hi . En humanos, los linfocitos B inmaduros (por ejemplo, los linfocitos B transicionales periféricos inmaduros) incluyen células CD38hi, IgD+, CD10+ , CD24hi, CD4410, CD2310 y CD110. De ese modi, los linfocitos B inmaduros incluyen células que expresan B2200 (CD45R) en donde los genes de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada son reordenados .
En una modalidad, los linfocitos B inmaduros expresan CD45R, clase II, IgM, CD19 y CD40. Los linfocitos B inmaduros no exhiben expresión de cadena ligera subrogada, pero si expresan Ig aß y RAG. Los linfocitos B inmaduros pueden convertirse en linfocitos B maduros, los cuales pueden producir inmunoglobulinas (por ejemplo, IgA, IgG o IgM) . Los linfocitos B maduros han adquirido IgM e IgD superficial, son capaces de responder a antigeno, y expresan marcadores característicos tales como CD21 y CD23 (células CD23hiCD21hi) . Los linfocigtos B pueden ser activados por agentes tales como lipopolisacáridos (LPS) o IL-4 y anticuerpos para IgM. Las fuentes biológicas comunes de linfocitos B y progenitoras de linfocitos B incluyen la médula ósea, sangre periférica, bazo y nodulos linfáticos .
Los linfocitos B que encuentran un antígeno por primera vez se conocen como linfocitos B "inocentes"; las células tienen IgM e IgD en sus superficies celulares. Después de que una progenitora de linfocitos B (por ejemplo, un linfocito pequeño previamente entregado) es estimulado por un antígeno, se convierte en una célula blasto, la cual se convierte en una célula plasmática inmadura que puede convertirse ya sea en una célula plasmática madura o un linfocito B de memoria. Una célula plasmática madura secreta inmunoglobulinas en respuesta a un antígeno específico. Un linfocito B de memoria es una linfocito B que sufre conmutación de isotipo e hipermutación somática que generalmente se encuentra durante una respuesta inmunitaria secundaria (una exposición a antigeno subsecuente después de una exposición primaria) pero también puede detectarse durante una respuesta a antigeno primaria. El desarrollo de los linfocitos B de memoria ocurre en centros germinales (GC) de folículos linfoides donde los linfocitos dirigidos por antígeno sufren hipermutación somática y selección por afinidad, presumiblemente bajo la influencia de linfocitos T ayudantes. Los linfocitos B de memoria generalmente expresan CD27. Comúnmnente, los linfocitos B de memoria también expresan inmunoglobulina específica a antígeno de alta afinidad (receptor de linfocitos B) en su superficie celular. De ese modo, los linfocitos B de memoria pueden ser CD20VCD27", e incluir CD20int/CD21+/CD27", (memoria inactiva), CD20hi/CD21"/CD27+ (memoria activada). Las células CD20hi/CD2lVCD27" son linfocitos B "no convencionales o de memoria de tejido" distintos.
Afinidad de unión: La afinidad de un anticuerpo por un antígeno. En una modalidad, la afinidad se calcula mediante la modificación del método Scatchard descrito por Frankel et al., Mol. Immunol., 16:101-106, 1979. En otra modalidad, la afinidad de unión se mide por medio de una tasa de disociación antígeno/anticuerpo . Todavía en otra modalidad, una afinidad de unión alta se mide por radioinmunoensayo de competencia. En diversos ejemplos, una afinidad de unión alta es al menos de aproximadamente 1 x 10~8 M. En otras modalidades, una afinidad de unión alta es al menos de aproximadamente 1.5 x 10~8, al menos de aproximadamente 2.0 x 1CT8, al menos de aproximadamente 2.5 x 10~8, al menos de aproximadamente 3.0 x 10"8, al menos de aproximadamente 3.5 x 10~8, al menos de aproximadamente 4.0 x 10~8, al menos de aproximadamente 4.5 x 10~8, o al menos de aproximadamente 5.0 x 10~8 M.
Unión o unión estable (oligonucleótido) : Un oligonucleótido se une o se une de manera estable a un ácido nucleico objetivo si una cantidad suficiente del oligonucleótido forma pares de bases o se híbrida a su ácido nucleico objetivo, para permitir la detección de esa unión. La unión puede detectarse mediante propiedades físicas o funcionales del complejo objetivo: oligonucleótido. La unión entre un objetivo y un oligonucleótido puede detectarse mediante cualquier procedimiento conocido por alguien con experiencia en la técnica, incluyendo ensayos de unión funcionales y físicos. Por ejemplo, la unión puede detectarse funcionalmente, determinando si la unión tiene un efecto observable ante un proceso biosintético, tal como la expresión de un gen, replicación, transcripción, traducción del ADN y lo similar.
Los métodos físicos para detectar la unión de las hebras complementarias del ADN o el ARN son bien conocidos en la técnica, e incluyen métodos tales como la DNasa I o la huella química, ensayos de desplazamiento en gel y escisión por afinidad, transferencia Northern, transferencia por puntos y procedimientos de detección con absorción de luz. Por ejemplo, un método que es utilizado ampliamente, debido a que es simple y confiable, involucra observar un cambio en la absorción de la luz de una solución que contiene un oligonucleótido (o un análogo) y un ácido nucleico objetivo, de 220 a 300 nm conforme la temperatura se incrementa lentamente. Si el oligonucleótido o el análogo se ha unido a su objetivo, hay un incremento súbito en la absorción a una temperatura característica conforme el oligonucleótido (o análogo) y el objetivo se disocian uno del otro, o se funden.
La unión entre un oligómero y su ácido nucleico objetivo está caracterizada frecuentemente por la temperatura (Tm) a la cual 50% del oligómero se funde de su objetivo. Una (Tm) más alta, significa un complejo más fuerte o más estable con relación a un complejo con una (Tm) menor.
Cáncer o Tumor: Un neoplasma maligno que se ha sometido a anaplasia característica con la pérdida de diferenciación, incremento de la velocidad del crecimiento, invasión del tejido circundante y que es capaz de metástasis. Un cáncer reproductor es un cáncer que tiene su origen primario en un tejido reproductor, tal como en el útero, testículos, ovario, próstata, trompa de falopio o pene. Por ejemplo, el cáncer de próstata es un neoplasma maligno que surge en o del tejido de la próstata, y el cáncer uterino es un neoplasma maligno que surge en o del tejido uterino, y el cáncer testicular es un neoplasma maligno que surge en los testículos. El cáncer residual es el cáncer que permanece en un sujeto después de cualquier forma de tratamiento proporcionado al sujeto para reducir o erradicar el cáncer de tiroides. El cáncer metastático es un cáncer en uno o más sitios en el cuerpo diferente al sitio de origen del cáncer original (primario) del cual se deriva el cáncer metastásico.
CD28 (Grupo de Diferenciación 28) : Una de las moléculas expresadas en linfocitos T que proporciona señales co-estimulatorias , las cuales son requeridas para activación de los linfocitos T. El CD28 es el receptor para B7.1 (CD80) y B7.2 (CD86) . Cuando se activa mediante ligandos de receptor similares a Toll, la expresión de B7.1 se sobrerregula en células que presentan antígeno (APCs) . La expresión de B .1 sobre células que presentan antígeno es constitutiva. El CD28 es el único receptor B7 expresado constitutivamente en linfocitos T que entran en contacto con un antigeno por primera vez.
Quimioterapia; agentes quimioterapéuticos : Como se utiliza en la presente, cualquier agente químico con utilidad terapéutica en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por el crecimiento celular anormal. Tales enfermedades incluyen tumores, neoplasmas y cáncer, así como enfermedades caracterizadas por el crecimiento hiperplásico, tal como la soriasis. En una modalidad, un agente quimioterapéutico es un agente para utilizarse en el tratamiento de neoplasmas, tales como tumores sólidos. En una modalidad, un agente quimioterapéutico es una molécula radioactiva. Alguien con experiencia en la técnica puede identificar fácilmente un agente quimioterapéutico de uso (por ejemplo, véase Slapak y Kufe, Principies of Cáncer Therapy, Capítulo 86 en Harrison' s Principies of Internal Medicine, 14a edición; Perry et al., Chemotherapy, Capítulo 17 en Abeloff, Clinical Oncology 2a ed. , © 2000 Churchill Livingstone, Inc; Baltzer L, Berkery R (eds) : Oncology Pocket Guide to Chemotherapy, 2a ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1995; Fischer DS, Knobf MF, Durivage HJ (eds) : The Cáncer Chemotherapy Handbook, 4a ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1993) . Los polipéptidos inmunogénicos descritos en la presente pueden utilizarse en conjunto con los agentes quimioterapéuticos adicionales.
CD28: Un antigeno de superficie celular también se conoce como antigeno T90/44 o Tp44 que se expresa en los linfocitos T. El CD28 es un receptor de proteínas co-estimuladoras que actúan sobre linfocitos T. El ligando natural de CD28 es una glicoproteína de 44-54 kDa, llamada B7-1 ó CD80. Existe una molécula relacionada, B7-2. La B7-1 se expresa en linfocitos B activados y otras células que presentan antígenos. Es expresada por macrófagos, keratinocitos, linfocitos B, linfocitos T, células de Langerhans y células dendríticas de sangre periférica. La B7-2 se encuentra en células de Langerhans y células dendríticas sanguíneas, linfocitos B, macrófagos, células de Kupffer, monocitos activados y diversas clonas de células asesinas naturales. La unión de B7 a CD28 en linfocitos T proporciona una señal co-estimuladora que activa la proliferación de linfocitos T.
Nivel de control (parámetro inmune) : Un nivel de línea base de un parámetro inmune. En algunas modalidades, y el nivel de control es el nivel de un componente en el sistema inmune, tal como linfocitos B de memoria o linfocitos B de memoria proliferantes, en la ausencia de agente terapéutico. Un nivel de control puede ser medido en una muestra de un sujeto que no ha sido tratado con un agente de interés, o una muestra de un sujeto que ha sido tratado con un agente de control. El nivel de control también puede ser un nivel estándar, tal como un valor determinado a partir de un promedio de un número grande de muestras a través del tiempo. El nivel de control también puede medirse en una muestra de un sujeto tratado con la dosis especifica de un agente terapéutico, en donde esa dosis no se administra al sujeto al momento en que el sujeto está siendo evaluado. El control puede ser del sujeto bajo evaluación, o puede ser de un sujeto diferente.
Nivel de control (polipéptido o ácido nucleico) : El nivel de una molécula, tal como un polipéptido o ácido nucleico, encontrada normalmente en la naturaleza bajo una cierta condición y/o en una base genética especifica. En ciertas modalidades, un nivel de control de una molécula puede medirse en una célula o espécimen que no se ha sometido, ya sea de manera directa o indirecta, a un tratamiento. En algunos ejemplos, un nivel de control puede ser el nivel en una célula que no se ha puesto en contacto con el agente, tal como un antagonista de PD-1. En los ejemplos adicionales, un nivel de control puede ser el nivel en un sujeto al que no se le ha administrado el antagonista de PD-1.
ADN (ácido desoxirribonucleico) : El ADN es un polímero de cadena larga que comprende el material genético de la mayoría de los organismos vivos (algunos virus tienen genes que comprenden ácido ribonucleico (ARN) ) . Las unidades que se repiten en los polímeros de ADN son cuatro diferentes nucleótidos, cada uno de los cuales comprende una de las cuatro bases, adenina, guanina, citosina y timina unida a un azúcar de desoxirribosa a la cual está unido un grupo fosfato. Los tripletes de nucleótidos (referidos como codones) , codifican cada aminoácido en un polipéptido, o una señal de detención. El término codón también se usa para las secuencias correspondientes (y complementarias) de tres nucleótidos en el ARNm en el cual se transcribe la secuencia de ADN.
A menos que se especifique de otra manera, cualquier referencia a una molécula de ADN pretende incluir el complemento inverso de esa molécula de ADN. Excepto en donde se requiera una sola hebra por el texto en la presente, las moléculas de ADN, aunque escritas para mostrar únicamente una sola hebra, abarcan ambas hebras de una molécula de ADN de doble hebra.
Detectar o detección (célula o biomolécula) : Se refiere a la determinación cuantitativa o cualitativa de la presencia de una biomolécula o un tipo celular especifico, tal como un linfocito B de memoria, bajo investigación. Por ejemplo, determinar cualitativa o cuantitativamente la presencia de linfocitos B de memoria en una muestra de un sujeto, o detectar linfocitos B de memoria proliferantes. Generalmente, la detección de una molécula biológica tal como una proteina, un ácido nucléico, o la detección de un tipo celular especifico o proliferación celular, requiere llevar a cabo un ensayo inmunológico y no por simple observación. Por ejemplo, ensayos que utilizan anticuerpos o sondas de ácidos nucleicos (los cuales pueden ambos estar marcados) , o que pueden ser usados para detectar proteínas o células, respectivamente. Diagnosticar o diagnóstico de la eficacia del tratamiento con un antagonista del PD-1 involucra detectar un cambio significativo en una célula o biomolécula, tal como la proliferacón de linfocitos B de memoria .
Codificar: Se dice que un polinucleótido codifica un polipéptido si, en su estado nativo o cuando se manipula mediante métodos bien conocidos por aquellos con experiencia en la técnica, puede transcribirse y/o traducirse para producir el ARNm para y/o el polipéptido o un fragmento del mismo. La hebra antisentido es el complemento de tal ácido nucleico, y la secuencia codificante puede deducirse de la misma.
Expresión: Es el proceso mediante el cual la información codificada de un gen se convierte en las estructuras presentes y que operan en la célula. Los genes expresados incluyen aquéllos que son transcritos en el ARNm y a continuación traducidos en la proteina y aquéllos que son transcritos en el ARN pero no son traducidos en la proteina (por ejemplo, ARNsi, ARN de transferencia y ARN ribosomal) . Asi, la expresión de una secuencia objetivo, tal como un gen o una región promotora de un gen, puede resultar en la expresión de un ARNm, una proteina o ambos. La expresión de la secuencia objetivo puede inhibirse o mejorarse (disminuirse o incrementarse) .
Secuencias de Control de la Expresión: Secuencias de ácido nucleico que regulan la expresión de una secuencia de ácidos nucleicos heteróloga a la cual está enlazada de manera operable. Las secuencias de control de la expresión están enlazadas de manera operativa a una secuencia de ácidos nucleicos cuando las secuencias de control de la expresión controlan y regulan la transcripción y, conforme sea apropiado, la traducción de la secuencia del ácido nucleico. Asi, las secuencias de control de la expresión pueden incluir promotores, mejoradores, terminadores de la transcripción, un codón de inicio (es decir, ATG) enfrente de un gen que codifica la proteina, señales de empalme, elementos para el mantenimiento del marco de lectura correcto de ese gen para permitir la traducción apropiada del ARNm, y codones de detención apropiados. El término "secuencias de control" pretende incluir, como mínimo, componentes cuya presencia puede influenciar la expresión, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líderes y secuencias del compañero de fusión. Las secuencias de control de la expresión pueden incluir un promotor.
Un promotor es una secuencia mínima suficiente para dirigir la transcripción. También están incluidos aquellos elementos del promotor que son suficientes para volver la expresión del gen dependiente del promotor controlable para ser específica del tipo de célula, específica del tejido, o inducible mediante señales o agentes externos; tales elementos pueden localizarse en las regiones 5' o 3' del gen. Ambos promotores constitutivos e inducibles están incluidos (véase, por ejemplo, Bitter et al., Methods in Enzymology 153:516-544, 1987) . Por ejemplo, cuando se clonan en sistemas bacterianos, pueden utilizarse los promotores inducibles tales como pL del bacteriófago lambda, plac, ptrp, ptac (promotor del híbrido ptrp-lac) y lo similar. En una modalidad, cuando se clonan en sistemas de células de mamífero, pueden utilizarse los promotores derivados del genoma de células de mamífero (tales como el promotor de metalotioneína ) o de virus de mamífero (tales como la repetición terminal larga del retrovirus; el promotor tardío del adenovirus; el promotor 7.5K del virus Vaccinia). Los promotores producidos mediante técnicas sintéticas o de ADN recombinante también pueden utilizarse para proporcionar la transcripción de las secuencias del ácido nucleico.
Heterólogo : Que se origina de fuentes o especies genéticas separadas. Generalmente, un anticuerpo que se une de manera específica a una proteína de interés, no se unirá de manera específica a una proteína heteróloga.
Células hospedantes: Células en las cuales un vector puede propagarse y su ADN expresarse. La célula puede ser procariótica o eucariótica. La célula puede ser de mamífero, tal como una célula de humano. El término también incluye cualquier progenie de la célula hospedante objeto. Se entenderá que toda la progenie puede no ser idéntica a la célula progenitora, puesto que puede haber mutaciones que ocurran durante la replicación. Sin embargo, tal progenie está incluida cuando se utiliza el término "célula hospedante".
Respuesta inmunitaria: Una respuesta de una célula del sistema inmune, tal como un linfocito B, linfocito T o monocito, a un estímulo. En una modalidad, la respuesta es específica para un antígeno particular (una "respuesta específica del antígeno") . En una modalidad, una respuesta inmunitaria es una respuesta de un linfocito T, tal como una respuesta de CD4+ o una respuesta de CD8+. En otra modalidad, la respuesta es una respuesta de un linfocito B, y resulta en la producción de anticuerpos específicos, o en la proliferación de linfocitos B de memoria. Una respuesta de linfocitos B puede ser una respuesta de linfocitos B de memoria o una respuesta de linfocitos B de plasma. Un ejemplo de respuesta de linfocito B de plasma es la producción de anticuerpo. Un ejemplo de respuesta de linfocitto B de memoria es la pñroliferación de linfocitos B de memoria.
"Insensibilidad" con respecto a las células inmunes, incluye la refractividad de las células inmunes a la estimulación, tales como la estimulación vía un receptor activante o una citocina. La insensibilidad puede aparecer, por ejemplo, debido a la exposición a inmunosupresores o la exposición a altas dosis de antígeno. Como se utiliza en la presente, el término "anergia" o "tolerancia", incluye refractividad a la estimulación mediada por el receptor activante. Tal refractividad es generalmente específica del antígeno, y persiste después de que la exposición al antígeno tolerante ha cesado.
Por ejemplo, la anergia en los linfocitos T (en oposición a la insensibilidad) , está caracterizada por la falta de producción de citocina (tal como IL-2) . La anergia del linfocito T aparece cuando los linfocitos T son expuestos al antigeno y reciben una primera señal (una señal mediada por el receptor del linfocito T o por CD-3) en la ausencia de una segunda señal (una señal coestimuladora) . Bajo estas condiciones, la reexposición de las células al mismo antigeno (incluso si la exposición ocurre en la presencia de una molécula coestimuladora) , resulta en la falla para producir citocinas y, por lo tanto, la falla para proliferar. Los linfocitos T anérgicos pueden, sin embargo, montar respuestas a antigenos no relacionados y pueden proliferar si se cultivan con citocinas (tal como IL-2) . Por ejemplo, la anergia de los linfocitos T también puede observarse por la falta de la producción de IL-2 por los linfocitos T, medido mediante ELISA o mediante un ensayo de proliferación utilizando una linea celular indicadora. De manera alterna, puede utilizarse un constructo de un gen reportero. Por ejemplo, los linfocitos T anérgicos fallan en iniciar la transcripción del gen de IL-2 inducida por un promotor heterólogo bajo el control del mejorador del gen 5' de IL-2 o por un multimero de la secuencia API que puede encontrarse dentro del mejorador (Kang et al., Science 257:1134, 1992). Los linfocitos T específicos del antígeno, anérgicos, pueden tener una reducción de al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o incluso 100% en la actividad citotóxica, con relación al linfocito T especifico del antigeno de control correspondiente .
Péptido inmunogénico : Un péptido que comprende un motivo especifico del alelo u otra secuencia, de manera que el péptido se unirá a una molécula del MHC e inducirá una respuesta del linfocito T citotóxico ("CTL"), o una respuesta del linfocito B (por ejemplo, producción de un anticuerpo o proliferación de linfocito B de memoria) especifico del antigeno del cual se deriva el péptido inmunogénico .
En una modalidad, los péptidos inmunogénicos son identificados utilizando los motivos de la secuencia u otros métodos, tales como una red neural o determinaciones polinomiales , conocidas en la técnica. Típicamente, se utilizan algoritmos para determinar el "umbral de unión" de los péptidos para seleccionar aquéllos con las calificaciones que les proporcionen una alta probabilidad de unión a una cierta afinidad y serán inmunogénicos. Los algoritmos están basados ya sea en los efectos en la unión del MHC de un aminoácido particular en una posición particular, los efectos en la unión del anticuerpo de un aminoácido particular en una posición particular, o los efectos de la unión de una sustitución particular en un péptido que contiene un motivo. Dentro del contexto de un péptido inmunogénico, un "residuo conservado" es uno que aparece en una frecuencia significativamente más alta que la que se esperaría por distribución aleatoria en una posición particular en un péptido. En una modalidad, un residuo conservado es uno en donde la estructura del MHC puede proporcionar un punto de contacto con el péptido inmunogénico .
Los péptidos inmunogénicos también pueden identificarse midiendo su unión a una proteína del MHC específica (por ejemplo, HLA-A02.01) y por su capacidad para estimular a CD4 y/o CD8 cuando se presentan en el contexto de la proteína del MHC.
Composición inmunogénica : Una composición que comprende un polipéptido inmunogénico o un ácido nucleico que codifica el polipéptido inmunogénico que induce un respuesta del CTL mensurable contra las células que expresan el polipéptido, o induce una respuesta del linfocito B mensurable (tal como la producción de anticuerpos que se unen de manera específica al polipéptido o proliferación de linfocitos B de memoria) , contra el polipéptido. Para uso in vitro, la composición inmunogénica puede consistir del ácido nucleico aislado, el vector que incluye el ácido nucleico/o péptido inmunogénico. Para uso in vivo, la composición inmunogénica comprenderá típicamente el ácido nucleico, el vector que incluye el ácido nucleico, y/o el polipéptido inmunogénico, en portadores farmacéuticamente aceptables, y/u otros agentes. Una composición inmunogénica puede incluir opcionalmente un adyuvante, un antagonista de PD-1, una molécula coestimuladora, o un ácido nucleico que codifica una molécula coestimuladora. Un polipéptido, o ácido nucleico que codifica el polipéptido, puede probarse fácilmente por su capacidad para inducir un CTL mediante ensayos reconocidos en la técnica.
Condiciones reactivas inmunológicas (in vitro) : Incluye "condiciones suficientes para formar un complejo inmunitario" que permita a un anticuerpo elevado en contra de un epitopo particular unirse a ese epitopo a un grado detectablemente mayor que, y/o a la exclusión considerable de, la unión a prácticamente todos los otros epitopos . Las condiciones reactivas inmnológicamente dependen del formato de la reacción de unión al anticuerpo y comúnmente son aquellas utilizadas en protocolos de inmunoensayo (tales como ELISA o radioinmunoensayo) , FACS o aquellas condiciones encontradas in vivo. Ver Harlow & Lañe, Anticuerpos, Un Manual de Laboratorio, Cold Spring Harbor Publications , Nueva York (1988), para una descripción de formatos de inmunoensayo y condiciones. Las condiciones inmunológicamente reactivas empleadas en los métodos descritos en la presente con "condiciones fisiológicas" que incluyen referencia a condiciones (por ejemplo, temperatura, osmolaridad, pH) que son comunes dentro de un mamífero viviente o una célula de mamífero. Mientras se reconoce que algunos órganos son sujetos a condiciones extremas, el ambiente dentro del organismo o dentro de la célula normalemtne tiene un pH de aproximadamente 7 (es decir, desde pH de 6.0 hasta pH de 8.0, más frecuentemente pH de 6.5 a 7.5), contiene agua como el disolvente predominante, y existe a temperatura por arriba de 0°C y debajo de 50°C. La osmolaridad está dentro del rango que apoya la viabilidad y proliferación celular.
Inhibición o tratamiento de una enfermedad: Inhibir una enfermedad, tal como el crecimiento de un tumor o una infección persistente, se refiere a inhibir el desarrollo completo de una enfermedad o reducir los efectos fisiológicos del proceso de la enfermedad. En varios ejemplos, inhibir o tratar una enfermedad, se refiere a disminuir los síntomas de un tumor o de una infección con un patógeno. Por ejemplo, el tratamiento del cáncer puede evitar el desarrollo del síndrome paraneoplásico en una persona que se sabe que tiene cáncer, o disminuir un signo o síntoma del tumor. En otra modalidad, el tratamiento de una infección puede referirse a inhibir el desarrollo o disminuir un síntoma de la infección. "Tratamiento", se refiere a una intervención terapéutica que alivia un signo o un síntoma de una enfermedad o condición patológica relacionada con la enfermedad. La vacunación terapéutica se refiere a la administración de un agente a un sujeto ya infectado con un patógeno. El sujeto puede ser asintomático, de manera que el tratamiento evita el desarrollo de un síntoma. La vacuna terapéutica también puede reducir la severidad de uno o más síntomas existentes, o reducir la carga del patógeno .
Enfermedad infecciosa: Cualquier enfermedad causada por un agente infeccioso. Los ejemplos de patógenos infecciosos incluyen, de manera no exclusiva: virus, bacterias, micoplasma y hongos. En un ejemplo particular, es una enfermedad causada por al menos un tipo de patógeno infeccioso. En otro ejemplo, es una enfermedad causada por al menos dos diferentes tipos de patógenos infecciosos. Las enfermedades infecciosas pueden afectar cualquier sistema corporal, ser agudas (de corta acción) o crónicas/persistentes (de larga acción) , aparecer con o sin fiebre, golpear un grupo de cualquier edad, y se superponen unas con otras.
Las enfermedades virales aparecen comúnmente después de la inmunosupresión debido a la reactivación de los virus ya presentes en el receptor. Los ejemplos particulares de infecciones virales persistentes incluyen, de manera no exclusiva, neumonía por citomegalovirus (CMV) , enteritis y retinitis; enfermedad linfoproliferativa por el virus de Epstein-Barr (EBV) ; varicela/herpes (causadas por el virus de la varicela zoster, VZV) ; mucositis por HSV-1 y -2; encefalitis por HSV-6, cistitis hemorrágica por el virus BK; influenza viral; neumonía del virus sincitial respiratorio (RSV) ; SIDA (causado por VIH) y hepatitis A, B o C.
Los ejemplos adicionales del virus infeccioso incluyen: Retroviridae; Picornavíridae (por ejemplo, virus de la polio, virus de la hepatitis A; enterovirus, virus coxsackie de humano, rinovirus, ecovirus) ; Calciviridae (tal como las cepas que causan gastroenteritis) ; Togaviridae (por ejemplo, virus de la encefalitis equina, virus de la rubéola); Flaviridae (por ejemplo, virus del dengue, virus de la encefalitis, virus de la fiebre amarilla); Coronaviridae (por ejemplo, coronavirus ) ; Rhabdoviridae (por ejemplo, virus de la estomatitis vesicular, virus de la rabia); Filoviridae (por ejemplo, virus del ébola) ; Paramyxoviridae (por ejemplo, virus de la parainfluenza, virus de las paperas, virus del sarampión, virus sincitial respiratorio) ; Orthomyxoviridae (por ejemplo, virus de la influenza) ; Bungaviridae (por ejemplo, virus Hantaan, virus bunga, flebovirus y virus Nairo); Arena viridae (virus de la fiebre hemorrágica); Reoviridae (por ejemplo, reovirus, orbivirus y rotavirus) ; Birnaviridae; Hepadnaviridae (virus de la Hepatitis B) ; Parvoviridae (parvovirus) ; Papovaviridae (virus del papiloma, virus del polioma) ; Adenoviridae (la mayoría de los adenovirus); Herpesviridae (virus del herpes simple (HSV) 1 y HSV-2, virus de la varicela zoster, citomegalovirus (C V) , virus del herpes); Poxviridae (virus de la viruela, virus vaccinia , virus de enfermedades eruptivas) e Iridoviridae (tal como el virus de la fiebre porcina Africana) ; y virus no clasificados (por ejemplo, los agentes etiológicos de las encefalopatías Esponj iformes , el agente de la hepatitis delta (que se piensa que es un satélite defectuoso del virus de la hepatitis B) , los agentes de la hepatitis que no es A y que no es B (clase 1 = transmitidos internamente; clase 2 = transmitidos parenteralmente (es decir, Hepatitis C) ; Norwalk y virus relacionados, y astrovirus) .
Los ejemplos de infecciones micóticas incluyen, de manera no exclusiva: aspergilosis ; muguet (causado por Candida albicans) ; criptococosis (causada por Cryptococcus) ; e histoplasmosis. Así, los ejemplos de infecciones por hongos incluyen, de manera no exclusiva, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatu , Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candida albicans .
Los ejemplos de bacterias infecciosas incluyen: Helicobacter pyloris, Borelia burgdorferi, Legíonella pneumophilia , Mycobacteria sps (tal como M. tuberculosis, M. avium, M. intracellular, M. kansaii, M. gordonae) , Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (Streptococcus del Grupo A) , Streptococcus agalactiae {Streptococcus del Grupo B) , Streptococcus (grupo viridans) , Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus {anaerobio sps.), Streptococcus pneumoniae, Campylobacter sp. Patogénico, Enterococcus sp. , Haemophilus influenzae, Bacillus anthracis, corynebacterium diphtheriae, corynebacterium sp. , Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perf ingers, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida , Bacteroides sp. , Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira y Actinomyces israelii . Otros organismos infecciosos (tales como protistas) incluyen: Plasmodium falciparum y Toxoplasma gondii.
Una "infección persistente" es una infección en la cual el agente infeccioso (tal como un virus, micoplasma, bacteria, parásito u hongo) no es depurado o eliminado del hospedante infectado, incluso después de la inducción de una respuesta inmunitaria. Las infecciones persistentes pueden ser infecciones crónicas, infecciones latentes o infecciones lentas. La infección latente está caracterizada por la falta de un virus infeccioso demostrable entre los episodios de la enfermedad recurrente. La infección crónica está caracterizada por la presencia continua del virus infeccioso después de la infección primaria y puede incluir una enfermedad crónica o recurrente. La infección lenta está caracterizada por un periodo de incubación prolongado seguido por una enfermedad progresiva. A diferencia de las infecciones latentes y crónicas, la infección lenta puede no empezar con un periodo agudo de multiplicación viral. Aunque las infecciones agudas son relativamente breves (duran unos cuantos días a unas cuantas semanas) y se resuelven del cuerpo por el sistema inmuninatario, las infecciones persistentes pueden durar, por ejemplo, meses, años o incluso toda la vida. Estas infecciones también pueden recurrir frecuentemente durante un largo periodo de tiempo, involucrando etapas de infección silenciosa y productiva sin destrucción de las células o incluso sin producir un daño excesivo a las células hospedantes. Las infecciones persistentes con frecuencia involucran etapas de infección silenciosa y productiva sin destruir rápidamente o incluso producir un daño excesivo de las células hospedantes. Durante las infecciones virales persistentes, el genoma viral puede ser integrado ya sea de manera estable en el ADN celular o bien mantenerse episomalmente . La infección persistente ocurre con virus tales como los virus de la leucemia de los linfocitos T humanos, virus de Epstein-Barr , citomegalovirus , virus del herpes, virus de la varicela-zoster , sarampión, papovavirus, priones, virus de la hepatitis, adenovirus, parvovirus y papilomavirus .
Los agentes infecciosos causantes también pueden detectarse en el hospedante (tales como dentro de las células especificas de los individuos infectados), incluso después de que la respuesta inmunitaria se ha resuelto, utilizando técnicas estándar. Los mamíferos se diagnostican como que tienen una infección persistente de acuerdo con cualquier método estándar conocido en la técnica y descrito, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,368,832, 6,579,854 y 6,808,710 y las Publicaciones de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Nos. 20040137577, 20030232323, 20030166531, 20030064380, 20030044768, 20030039653, 20020164600, 20020160000, 20020110836, 20020107363 y 20020106730, todas las cuales se incorporan en la presente como referencia.
"Aliviar un síntoma de una infección persistente", es mejorar cualquier condición o síntoma asociado con la infección persistente. De manera alterna, aliviar un síntoma de una infección persistente puede involucrar reducir la carga microbiana infecciosa (tal como viral, bacteriana, micótica o parasitaria) en un sujeto, con relación a tal carga en un control no tratado. En comparación con un control no tratado equivalente, tal reducción o grado de prevención es de al menos 5%, 10%, 20%, 40%, 50%, 60%, 80%, 90%, 95% o 100%, medido mediante cualquier técnica estándar. De manera deseable, la infección persistente es eliminada completamente como se detecta mediante cualquier método estándar conocido en la técnica, caso en el cual se considera que la infección persistente ha sido tratada. Un paciente que está siendo tratado para una infección persistente es uno a quien el practicante médico ha diagnosticado como que tiene tal condición. El diagnóstico puede ser mediante cualquier medio adecuado. El diagnóstico y la verificación pueden involucrar, por ejemplo, detectar el nivel de carga microbiana en una muestra biológica (por ejemplo, una biopsia de tejido, prueba de sangre, o prueba de orina), detectar el nivel de un marcador sustituto de la infección microbiana en una muestra biológica, detectar los síntomas asociados con las infecciones persistentes, o detectar las células inmunes involucradas en la respuesta inmunitaria típica de las infecciones persistentes (por ejemplo, detección de los linfocitos T específicos del antígeno que son anérgicos y/o funcionalmente deteriorados). Un paciente en quien el desarrollo de una infección persistente se está evitando, puede o no haber recibido tal diagnóstico. Alguien con experiencia entenderá que estos pacientes pueden haberse sometido a las mismas pruebas estándar descritas anteriormente, o pueden haberse identificado sin examen, como uno con alto riesgo debido a la presencia de uno o más factores de riesgo (tales como historial familiar o exposición al agente infeccioso) .
Aislado: Un componente biológico "aislado" tal (tal como un ácido nucleico o proteína u organelo) , se ha separado sustancialmente o se ha purificado lejos de otros componentes biológicos en la célula del organismo en el cual aparece naturalmente el componente, es decir, otros ADN y ARN, proteínas y organelos cromosomales y extracromosomales . Los ácidos nucleicos y las proteínas que se han "aislado", incluyen ácidos nucleicos y proteínas purificadas mediante métodos de purificación estándar. El término también abarca ácidos nucleicos y proteínas preparadas mediante la expresión recombinante en una célula hospedante, así como ácidos nucleicos sintetizados químicamente.
Un "anticuerpo purificado" está al menos 60% en peso libre de proteínas y moléculas orgánicas naturales con las cuales está asociado naturalmente. En algunos ejemplos, la preparación está al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 99% en peso del anticuerpo, tal como un anticuerpo específico de PD-1, PD-L1 o PD-L2. Un anticuerpo purificado puede obtenerse, por ejemplo, mediante cromatografía por afinidad utilizando una proteína producida de manera recombinante o péptidos con un motivo conservado y técnicas estándar.
Marca: Un compuesto o composición detectable que está conjugado de manera directa o indirecta a otra molécula, tal como un anticuerpo o una proteína, para facilitar la detección de esa molécula. Los ejemplos específicos no limitantes de marcas incluyen marcas fluorescentes, enlaces enzimáticos e isótopos radioactivos. En un ejemplo, un "anticuerpo marcado" se refiere a la incorporación de otra molécula en el anticuerpo. Por ejemplo, la marca es un marcador detectable, tal como la incorporación de un aminoácido radiomarcado o enlace a un polipéptido de entidades biotinilo que puede ser detectado mediante avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede detectarse mediante métodos ópticos o colorimétricos ) . Se conocen en la técnica diversos métodos para marcar polipéptidos y glicoproteinas y pueden utilizar. Ejemplos de marcas para polipéptidos incluyen, de manera no limitativa, los siguientes: radioisótopos o radionucleótidos (ttales como 35S o 1311), marcas fluorescentes (tales como isotiocianato de fluoresceina (FITC), rodamina, fósforos lantánidos), marcas enzimáticas (tales como peroxidasa horseradish, beta-galactosidasa , luciferasa, fosfatasa alcalina), marcadores quimioluminiscentes , grupos biotinilo, epitopos de polipéptido predeterminados reconocidos por un reportero secundario (tal como secuencias pares cierre (zipper) de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metal, marcas de epitopo) , o agentes magnéticos, tales como quelatos de gadolinio. En. algunas modalidades, las marcas se unen mediante brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el impedimento estérico potencial.
Linfocitos : Un tipo de célula sanguínea blanca que está involucrada en la defensa inmune del cuerpo. Existen dos tipos principales de linfocitos: linfocitos B y linfocitos T.
Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) : Una designación genérica que pretende abarcar los sistemas de histocompatibilidad del antígeno descritos en diferentes especies, incluyendo los antigenos de los leucocitos humanos ("HLA") .
Mamífero: Este término incluye tanto humanos como mamíferos no humanos. De manera similar, el término "sujeto" incluye tanto sujetos humanos como veterinarios.
Intensidad Media de Fluorescencia (citometría de flujo) : La citometría de flujo se relaciona con la medida de la intensidad de luz de una célula o partícula, ya sea luz de láser dispersa o fluorescencia emitida por un fluorocromo. La luz es detectada por un tubo fotomultiplicador (PMT) que la convierte mediante un amplificador a un voltaje que es proorcional a la intensidad de fluorescencia original y el voltaje en el PMT. Estos voltajes, que son una distribución continua, se convierten en distribución discreta por medio de un convertidor Analógico a Digital (ADC) que coloca cada señal en un canal específico dependiendo del nivel de fluorescencia. A mayor resolución del ADC, más cerca refleja éste la distribución continua.
Los datos de citometría de flujo pueden desplegarse usando ya sea una escala logarítmica o lineal. El uso de una escala logarítmica se indica en muchas situciones biológicas en donde las distribuciones están desviadas a la derecha. En este caso el efecto es normalizar la distribución -se dice que es Log Normal y los datos han sido transformados logarítmicamente. Las señales lineales vienen a través de un amplificador lineal pero la transformación logarítmica puede lograrse ya sea mediante un amplificador logarítmico o por el uso de Tablas de Revisión (LUT) . Muchos ADCs en citómetros analíticos son de 10 bits, es decir, dividen datos en 2el0 ó 1024 canales, aunque existe una tendencia creciente a usar ADCs de 12 o 14 bits para dar una mayor resolución de datos .
El dato de un solo canal de datos (dispersión o fluorescencia) se despliega como un histograma en el cual el eje x se divide en 1024 canales (para un ADC de 10 bits) . Si el dato está en una escala lineal, el número de canal y el valor lineal para ese canal se obtendrán fácilmente. En una escala logarítmica, el eje x se divide todavía en 1024 canales pero se despliega en una escala de 4 log decimal (en general se usan decimales 4 log) .
Para cuantificar los datos de citometría de flujo se utilizan las medidas de la distribución de una población. Generalmente, las medidas de tendencia central son la media y la mediana. La media es el ^promedio' y puede ser ya sea aritmética o geométrica. La media aritmética se calcula como Sigma(x)/n la media geométrica como n raíz (al x a2 x a3... an) . En general, con datos amplificados logarítmicamente se usa la media geométrica puesto que toma en cuenta el peso de la distribución de datos, y la media aritmética se usa para datos lineales o datos desplegados en una escala lineal. La mediana es el valor central, es decir, el percentil 50, donde la mitad de los valores están por arriba y la mitad por debajo. Una célula con "alta" expresión y "baja" expresión puede ser determinada relativamente dependiendo de la fluorescencia de la población entera; estos parámetros se visualizan rápidamente en gráficas de datos de citometria de flujo.
Neoplasma: Una proliferación celular anormal que incluye tumores benignos y malignos, asi como otros trastornos proliferativos .
Anticuerpo neutralizante: Un anticuerpo que reduce el titulo infeccioso de un agente infeccioso al unirse a un antigeno especifico en el agente infeccioso. En algunos ejemplos el agente infeccioso es un virus, bacteria u hongo.
Oligonucleótido : Una secuencia polinucleotidica lineal de hasta aproximadamente 100 bases nucleotídicas de longitud .
Marco de lectura abierto (ORF) : Una serie de tripletes nucleotídicos (codones), que codifican los aminoácidos sin ningún codón de terminación interno. Estas secuencias son traducibles usualmente en un péptido.
Enlazado de manera operable: Una primera secuencia de ácidos nucleicos está enlazada de manera operable con una segunda secuencia de ácidos nucleicos cuando la primera secuencia de ácidos nucleicos se coloca en una relación funcional con la segunda secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, un promotor está enlazado de manera operable a una secuencia codificante, si el promotor afecta la transcripción o expresión de la secuencia codificante. Generalmente, las secuencias de ADN enlazadas de manera operable son contiguas y, en donde es necesario unir dos regiones que codifican una proteína, en el mismo marco de lectura.
Portadores farmacéuticamente aceptables : Los portadores farmacéuticamente aceptables de uso son convencionales. Remington's Pharmaceutical Sciences, por E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15a Edición (1975), describe composiciones y formulaciones adecuadas para el suministro farmacéutico de las proteínas de fusión descritas en la presente.
En general, la naturaleza del portador dependerá del modo particular de administración siendo empleado. Por ejemplo, las formulaciones parenterales usualmente comprenden fluidos inyectables que incluyen fluidos farmacéutica y fisiológicamente aceptables tales como agua, suero fisiológico, soluciones salinas equilibradas, dextrosa acuosa, glicerol o lo similar como un vehículo. Para las composiciones sólidas (tales como formas en polvo, pildora, tableta o cápsula) , los portadores sólidos no tóxicos convencionales pueden incluir, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón o estearato de magnesio. Además de los portadores biológicamente neutros, las composiciones farmacéuticas a ser administradas, pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes o emulsificantes , conservadores y agentes que amortiguan el pH y lo similar, por ejemplo, acetato de sodio o monolaurato de sorbitan.
Una "cantidad terapéuticamente efectiva" es una cantidad de una composición o una célula para alcanzar un efecto deseado en un sujeto siendo tratado. Por ejemplo, esta puede ser la cantidad de antagonista de PD-1 necesaria para inducir una respuesta inmunitaria, inhibir el crecimiento de un tumor o alterar de manera mensurable los síntomas externos de un tumor o infección persistente. Cuando se administra a un sujeto, se utilizará generalmente una dosificación que alcanzará las concentraciones en el tejido objetivo (por ejemplo, en los linfocitos) , que ha mostrado alcanzar un efecto in vitro.
En ejemplos particulares, una cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad de un agente, tal como un antagonista de PD-1, efectiva para inducir la proliferación de los linfocitos B de memoria. En otro ejemplo particular, una cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad de un antagonista de PD-1 que altera un síntoma o señal de un desorden en un sujeto, tal como un desorden que puede mejorarse al incrementar' una respuesta de linfocitos B de memoria y/o una respuesta de linfocitos T.
Una cantidad efectiva de un agente tal como un antagonista de PD-1 puede administrarse en una sola dosis, o en diversas dosis, por ejemplo diariamente, durante el curso del tratamiento. Sin embargo, la cantidad efectiva de un antagonista de PD-1 será dependiente del sujeto tratado, la severidad y tipo de la condición que se está tratando, y la manera de administración. Los métodos descritos en la presente tienen igual aplicación en situaciones médicas y veterinarias. Por tanto, se entiende que el término general "sujeto siendo tratado" incluye a todos los organismos (por ejemplo, humanos, simios, perros, gatos, caballos y vacas) que requieren un incremento del efecto biológico deseado, tal como una respuesta inmune aumentada.
Polinucleótido : El término polinucleótido o secuencia de ácidos nucleicos, se refiere a una forma polimérica del nucleótido de al menos 10 bases de longitud. Un polinucleótido recombinante incluye un polinucleótido que no está inmediatamente contiguo con ambas de las secuencias codificantes con las cuales está inmediatamente contigua (una en el extremo 5' y otra en el extremo 3' ) en el genoma natural del organismo del cual se deriva. El término incluye, por lo tanto, por ejemplo, un ADN recombinante que está incorporado en un vector; en un plásmido o virus replicante de manera autónoma; o en el ADN genómico de un procariote o eucariote, o que existe como una molécula separada (por ejemplo, un ADNc) independiente de otras secuencias. Los nucleotidos pueden ser ribonucleótidos , desoxirribonucleótidos , o formas modificadas de cualquier nucleótido. El término incluye formas de ADN de una sola hebra y de doble hebra.
Polipéptido: Cualquier cadena de aminoácidos, sin importar la longitud o modificación postraduccional (por ejemplo, glucosilación o fosforilación) . Un polipéptido puede tener entre 3 y 30 aminoácidos de longitud. En una modalidad, un polipéptido tiene de aproximadamente 7 a aproximadamente 25 aminoácidos de longitud. En aún otra modalidad, un polipéptido tiene de aproximadamente 8 a aproximadamente 10 aminoácidos de longitud. En aún otra modalidad, un péptido tiene aproximadamente 9 aminoácidos de longitud. Con respecto a los polipéptidos , "comprende", indica que una secuencia de aminoácidos adicional u otras moléculas pueden incluirse en la molécula, "consiste esencialmente de", indica que las secuencias de aminoácidos adicionales no están incluidas en la molécula, pero que otros agentes (tales como marcas o compuestos químicos) pueden incluirse, y "consiste de", indica que las secuencias de aminoácidos adicionales y agentes adicionales no están incluidos en la molécula .
Proliferación: La división de una célula para producir progenie, la cual puede medirse de diversas maneras conocidas en la técnica. Esto incluye, pero no se limita a, ensayos que cuentan el número total de células, ensayos que cuentan el número total de células de un tipo celular específico, ensayos KI-67, incorporación de timidina, y ensayos de bromodesoxiuridina.
Muerte Programada (PD) -1 : Una proteína que forma un complejo con la proteína PD-L1 o PD-L2 y que está involucrada en una respuesta inmunitaria, tal como la coestimulación de los linfocitos T. Generalmente, la proteína PD-1 es sustancialmente idéntica al PD-1 natural (tipo silvestre) (véase, por ejemplo, Ishida et al. EMBO J. 11:3887-3895, 1992, Shinohara et al., Genomics 23:704-706, 1994; y la Patente de los Estados Unidos No. 5,698,520, todas incorporadas como referencia en la presente en su totalidad). En varios ejemplos, la señalización de PD-1 reduce, por ejemplo, la citotoxicidad de los linfocitos T CD8+ reduciendo la proliferación de los linfocitos T, la producción de citocina, o la eliminación viral. Asi, un polipéptido PD-1 puede reducir la actividad citotóxica de los linfocitos T CD8+ por al menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o más del 100% por debajo de los niveles de control, medido mediante cualquier método estándar.
Como se utiliza en la presente, el término "actividad" con respecto a un polipéptido o proteina PD-1 incluye cualquier actividad que es inherente a la proteina PD-1 natural, tal como la capacidad para modular una señal inhibidora en una célula inmune activada, tal como acoplando un ligando natural en una célula que presenta el antigeno. Tal modulación de una señal inhibidora en una célula inmune resulta en la modulación de la proliferación y/o la supervivencia de una célula inmune y/o secreción de citocina por una célula inmune. La proteina PD-1 también puede modular una señal coestimuladora, compitiendo con un receptor coestimulador para unirse a una molécula B7.
Asi, el término "actividad de PD-1", incluye la capacidad de un polipéptido o proteina PD-1 para unirse a su(s) ligando (s) natural (es), la capacidad para modular las señales coestimuladoras o inhibidoras de la célula inmune, y la capacidad para modular la respuesta inmunitaria.
"Reduce la expresión o actividad de PD-1", se refiere a una disminución en el nivel o actividad biológica de PD-1, con relación al nivel o actividad biológica de la proteina PD-1 en un control, tal como un sujeto o muestra no tratado. En los ejemplos específicos, el nivel o actividad se reduce por al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, o incluso más que el 100%, con relación a un control no tratado. Por ejemplo, la actividad biológica de la proteína PD-1 se reduce si la unión de la proteína PD-1 a PD-L1, PD-L2, o ambas se reduce, resultando por lo tanto en una reducción de la señalización de PD-1 y por lo tanto, resultando en un incremento en la citotoxicidad de los linfocitos T CD8+.
Un "gen PD-1" es un ácido nucleico que codifica una proteína PD-1. Un "gen de fusión de PD-1" es una región que codifica PD-1 enlazada de manera operable a una segunda secuencia heteróloga de ácidos nucleicos. Un gen de fusión de PD-1 puede incluir un promotor de PD-1, o puede incluir un promotor heterólogo. En algunas modalidades, la segunda secuencia de ácidos nucleicos heteróloga es un gen reportero, esto es, un gen cuya expresión puede evaluarse; los genes reporteros incluyen, de manera no exclusiva, aquéllos que codifican la glucuronidasa (GUS) , luciferasa, cloranfenicol transacetilasa (CAT) , proteína fluorescente verde (GFP) , fosfatase alcalina y beta-galactosidasa .
Muestra (muestra biológica) : Incluye muestras biológicas que contienen fluidos, tejidos, células y subcomponentes de los mismos, tales como ADN, ARN y proteínas. Por ejemplo, muestras comunes en el contexto de la prsente invención incluyen médula ósea, bazo, nodulo linfático, sangre, por ejemplo, sangre periférica (pero también puede incluir cualquier otra fuente de la cual sean aislados los linfocitos B o progenitores de linfocitos B, incluyendo orina, saliva, biopsia de tejido, especímenes quirúrgicos, aspirados por aguja fina, materia de autopsia, y lo similar) .
Agente de unión especifica: Un agente que se une sustancialmente sólo a un objetivo definido. Así, un agente de unión específica a PD-1 es un agente que se une sustancialmente a un polipéptido PD-1 y no a los polipéptidos no relacionados. En una modalidad, el agente que se une de manera específica es un anticuerpo monoclonal o policlonal que se une de manera específica al polipéptido PD-1, PD-L1 o PD-L2.
El término "se une de manera específica", se refiere, con respecto a un antígeno tal como PD-1, a la asociación preferencial de un anticuerpo u otro ligando, todo o en parte, con una célula o tejido que porta ese antígeno y no con las células o tejidos que carecen de ese antigeno. Por supuesto, está reconocido que un cierto grado de interacción no especifica puede ocurrir entre una molécula o una célula o tejido no objetivo. Sin embargo, la unión especifica puede distinguirse como mediada a través del reconocimiento especifico del antigeno. Aunque los anticuerpos reactivos de manera selectiva se unen al antigeno, pueden hacerlo con baja afinidad. La unión especifica resulta en una asociación mucho más fuerte entre el anticuerpo (u otro ligando) y las células que portan el antigeno, que entre el anticuerpo (u otro ligando) y las células que carecen del antigeno. La unión especifica resulta típicamente en un incremento mayor que 2 veces, tal como mayor que 5 veces, mayor que 10 veces o mayor que 100 veces en la cantidad de anticuerpo unido u otro ligando (por unidad de tiempo) a una célula o tejido que porta el polipéptido PD-1 en comparación con una célula o tejido que carece del polipéptido. La unión específica a una proteína bajo tales condiciones, requiere un anticuerpo que es seleccionado por su especificidad por una proteína particular. Una variedad de formatos de inmunoensayos son apropiados para seleccionar los anticuerpos u otros ligandos inmunorreactivos de manera específica con una proteína particular. Por ejemplo, los inmunoensayos ELISA en fase sólida se utilizan de manera rutinaria para seleccionar anticuerpos monoclonales que son inmunorreactivos de manera especifica con una proteina. Véase, Harlow & Lañe, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications , New York (1988), para una descripción de los formatos y condiciones de los inmunoensayos que pueden utilizarse para determinar la immunoreactividad especifica.
Linfocito T: Una célula sanguínea blanca crítica para la respuesta inmunitaria. Los linfocitos T incluyen, de manera no exclusiva, linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+. Un linfocito T CD4+ es una célula inmune que porta un marcador en su superficie, conocido como "grupo de diferenciación 4" (CD4). Estas células, también conocidas como linfocitos T cooperadores, ayudan a orquestar la respuesta inmunitaria, incluyendo las respuestas del anticuerpo así como las respuestas de los linfocito T citotóxicos. Los linfocitos T CD8+ portan el marcador del "grupo de diferenciación 8" (CD8) . En una modalidad, un linfocito T CD8+ es un linfocito T citotóxico. En otra modalidad, una célula CD8+ es un linfocito T supresor. Un linfocito T está "activado" cuando puede responder a un antígeno específico de interés presentado en las células que presentan el antígeno.
Transducido/Tranfectado : Una célula transducida es una célula en la cual se ha introducido una molécula de ácido nucleico mediante técnicas de biología molecular.
Como se utiliza en la presente, el término transducción abarca todas las técnicas mediante las cuales una molécula de ácido nucleico puede introducirse en tal célula, incluyendo transfección con vectores virales, transformación con vectores de plásmido, e introducción de un ADN descubierto mediante electroporacion, lipofección y aceleración con pistola de partículas.
Vector: Una molécula de ácido nucleico introducida en una célula hospedante, produciendo por lo tanto una célula hospedante transformada. Un vector puede incluir secuencias de ácidos nucleicos que le permiten replicarse en una célula hospedante, tal como un origen de replicación. Un vector también puede incluir uno o más ácidos nucleicos que codifican un marcador seleccionable y otros elementos genéticos conocidos en la técnica. Los vectores incluyen vectores de plásmidos, incluyendo plásmidos para la expresión de células bacterianas gram negativas y gram positivas. Los vectores ejemplares incluyen aquéllos para la expresión en E. coli y Salmonella. Los vectores también incluyen vectores virales, tales como, de manera no exclusiva, de retrovirus, ortopox, avipox, viruela aviar, capripox, suipox, adenovirales, virus del herpes, virus alfa, baculovirus, virus Sindbis, virus Vaccinia y de poliovirus.
A menos que se explique de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen los mismos significados entendidos comúnmente por alguien con experiencia ordinaria en la técnica a la cual pertenece esta descripción. Los términos singulares "un", "una" y "el, la", incluyen las referencias en plural a menos que el contexto lo indique claramente de otra manera. De manera similar, la palabra "o" pretende incluir "y" a menos que el contexto lo indique claramente de otra manera. Se entenderá además que todos los tamaños de las bases, o los tamaños de los aminoácidos, y todos los pesos moleculares o valores de masa molecular, proporcionados para los ácidos nucleicos o polipéptidos son aproximados, y se proporcionan para descripción. Aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a aquéllos descritos en la presente pueden utilizarse en la práctica o prueba de esta descripción, los métodos y materiales adecuados se describen a continuación. El término "comprende" significa "incluye". Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias mencionadas en la presente, se incorporan como referencia en su totalidad. En caso de conflicto, la presente especificación, incluyendo la explicación de los términos, tendrá el control. Además, los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos únicamente y no pretenden ser limitantes.
Solicitudes Relacionadas La materia descrita también se relaciona con la materia de la solicitud de patente No. PCT/US2007/088851, presentada el 26 de diciembre de 2007, solicitud de patente provisional de Estados Unidos No. 60/688,872, presentada el 8 de junio de 2005, solicitud de utilidad de Estados Unidos No. 11/449,919, presentada el 8 de junio de 2006, y solicitud de patente PCT No. PCT/US2006/22423, del 8 de junio de 2006. Esta solicitud tambén se relaciona a la solicitud provisional de Estados Unidos No. 60/877,518, presentada el 27 de diciembre de 2006. Estas solicitudes previas se incorporan en la presnte en su totalidad.
Antagonistas de PD-1 Los métodos descritos en la presente involucran el uso de inhibidores de la trayectoria de PD-1 (antagonistas de PD-1) . Las moléculas de PD-1 son miembros de la superfamilia del gen de la inmunoglobulina .
El PD-1 humano tiene una región extracelular que contiene el dominio de la superfamilia de la inmunoglobulina, un dominio transmembranal y una región intracelular que incluye un motivo inhibidor basado en la tirosina inmunorreceptora (ITIM) ((Ishida et al., EMBO J. 11:3887, 1992; Shinohara et al., Genomics 23:704, 1994; Patente de los Estados Unidos No. 5,698,520) . Estas características también definen una familia mayor de moléculas, llamada los receptores inmunoinhibidores , que también incluyen a gp49B, PIR-B, y los receptores inhibidores citotóxicos (KIR) (Vivier y Daeron (1997) Immunol . Today 18:286) . Sin estar apegado a una teoría, se cree que el motivo ITIM fosforilado del tirosilo de estos receptores, interactúa con la fosfatasa que contiene el dominio S112, que conduce a las señales inhibidoras. Un subconjunto de estos receptores inmunoinhibidores se une a las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) , tal como los KIR, y CTLA4 se une a B7-1 y B7-2.
En los humanos, PD-1 es un receptor transmembranal del tipo I de 50-55 kDa, que se identificó originalmente en una línea de linfocitos T que se sometió a apoptosis inducida por la activación. PD-1 se expresa en los linfocitos T, en los linfocitos B y en macrófagos . Los ligandos para PD-1 son los miembros de la familia B7 del ligando PD-1 (PD-L1, también conocido como B7-H1) y PD-L2 (también conocido como B7-DC) .
In vivo, el PD-1 se expresa en los linfocitos T, linfocitos B y monocitos activados. Los datos experimentales implican las interacciones de PD-1 con sus ligandos en la desregulación de las respuestas inmunes centrales y periféricas. En particular, la proliferación en los linfocitos T del tipo silvestre, pero no en los linfocitos T con deficiencia de PD-1 se inhibe en la presencia de PD-L1. Además, los ratones con deficiencia de PD-1 exhiben un fenotipo autoinmune.
Una secuencia de aminoácidos ejemplar del PD-1 humano se expone a continuación (véase también Ishida et al., E BO J. 11:3887, 1992; Shinohara et al., Genomics 23:704,1994; Patente de los Estados Unidos No. 5,698,520): mqipqapwpv vwavlqlgwr pgwfldspdr pwnpptffpa llvvtegdna tftcsfsnts esfvlnwyrm spsnqtdkla afpedrsqpg qdcrfrvtql pngrdfhmsv vrarrndsgt ylcgaislap kaqikeslra elrvterrae vptahpspsp rpagqfqtlv vgvvggllgs lvllvwvlav icsraargti garrtgqplk edpsavpvfs vdygeldfqw rektpeppvp cvpeqteyat ivfpsgmgts sparrgsadg prsaqplrpe dghcswpl (SEQ ID NO: 1) Una secuencia de aminoácidos ejemplar del PD-1 de ratón se expone a continuación: mwvrqvpwsf twavlqlswq sgwllevpng pwrsltfypa wltvsegana tftcslsnws edlmlnwnrl spsnqtekqa afcnglsqpv qdarfqiiql pnrhdfhmni Idtrrndsgi ylcgaislhp kakieespga elvvterile tstrypspsp kpegrfqgmv igimsalvgi pvllllawal avfcstsmse argagskddt lkeepsaapv psvayeeldf qgrektpelp tacvhteyat ivfteglgas amgrrgsadg lqgprpprhe dghcswpl (SEQ ID NO: 2) Las secuencias de aminoácidos adicionales se describen en la Patente de los Estados Unidos No. 6,808,710 y en las Publicaciones de Solicitud de Patente de los Estados Unidos Nos. 2004/0137577, 2003/0232323, 2003/0166531, 2003/0064380, 2003/0044768, 2003/0039653, 2002/0164600, 2002/0160000, 2002/0110836, 2002/0107363 y 2002/0106730, las cuales se incorporan en la presente como referencia. PD-1 es un miembro de la superfamilia de la inmunoglobulina (Ig), que contiene un solo dominio similar a Ig V en su región extracelular . El dominio citoplásmico de PD-1 contiene dos tirosinas, con la tirosina más próxima a la membrana (VAYEEL (véanse los aminoácidos 223-228 de la SEQ ID NO: 2) en PD-1 de ratón), localizada dentro de un ITI (motivo inhibidor basado en la tirosina inmunorreceptora) . La presencia de un ITIM en PD-1 indica que esta molécula funciona para atenuar la señalización del receptor del antigeno reclutando las fosfatasas citoplásmicas . Las proteínas PD-1 humanas y murinas comparten aproximadamente 60% de identidad de los aminoácidos con la conservación de cuatro sitios de N glucosilación potenciales, y residuos que definen el dominio de Ig-V. El ITIM en la región citoplásmica y el motivo similar a ITIM que rodea la tirosina carboxiterminal (TEYATI (véanse los aminoácidos 166-181 de la SEQ ID NO: 2) en el humano y el ratón, respectivamente) , también están conservados entre los ortólogos humanos y murinos.
PD-1 es un miembro de la familia CD28/CTLA-4 de moléculas basadas en su capacidad para unirse a PD-L1. In vivo, como CTLA4, PD-1 se induce rápidamente en la superficie de los linfocitos T en respuesta a anti-CD3 (Agata et al., Int. Immunol . 8:765, 1996). En contraste a CTLA , sin embargo, PD-1 también es inducido en la superficie de los linfocitos B (en respuesta a anti-IgM) .
PD-1 también se expresa en un subconjunto de timocitos y células mieloides (Agata et al., (1996) supra; Nishimura et al., (1996) Int. Immunol. 8:773).
La anergia de los linfocitos T es concomitante con una inducción en la expresión de PD-1. Se describe en la presente que la citotoxicidad de los linfocitos T puede incrementarse poniendo en contacto un linfocito T con un agente que reduce la expresión o actividad de PD-1. De manera más especifica, se describe en la presente que un agente que reduce la expresión o actividad de PD-1, puede utilizarse para incrementar una respuesta inmunitaria, tal como a un antigeno viral o un antigeno de tumor.
Sin estar apegado a una teoría, la reducción de la expresión o actividad de PD-1 resulta en un incremento en la actividad de los linfocitos T citotóxicos, incrementado la respuesta inmunitaria específica al agente infeccioso. Con el fin de que los linfocitos T respondan a las proteínas extrañas, deben proporcionarse dos señales por las células que presentan el antígeno (APC) para los linfocitos T en reposo. La primera señal, que confiere especificidad a la respuesta inmunitaria, se transduce vía el receptor del linfocito T (TCR) después del reconocimiento del péptido antigénico extraño presentado en el contexto del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) . La segunda señal, denominada coestimualción, induce a los linfocitos T a proliferar y volverse funcionales. La coestimulación no es específica del antígeno ni está restringida al MHC y se proporciona por uno o más polipéptidos de la superficie celular distintos, expresados por las APC. Si los linfocitos T son únicamente estimulados a través del receptor de los linfocitos T, sin recibir una señal coestimuladora adicional, se vuelven no sensibles, anérgicos, o mueren, resultando en la desregulación de la respuesta inmunitaria.
Las proteínas CD80 (B7-1) y CD86 (B7-2), expresadas en las APC, son polipéptidos coestimuladores críticos. Mientras que B7-2 juega un papel predominante durante las respuestas inmunes primarias, B7-1 es sobrerregulada posteriormente en el curso de una respuesta inmunitaria para prolongar las respuestas primarias del linfocito T o las respuestas coestimuladoras secundarias del linfocito T. Los polipéptidos B7 son capaces de proporcionar señales coestimuladoras o estimuladoras a las células inmunes para fomentar o inhibir las respuestas celulares inmunes. Por ejemplo, cuando se une a un receptor coestimulador , PD-L1 (B7-4) induce la coestimulación de las células inmunes o inhibe la coestimulación de las células inmunes cuando se presenta en una forma soluble. Cuando se une a un receptor inhibidor, las moléculas de PD-L1 pueden transmitir una señal inhibidora a una célula inmune. Los miembros de la familia B7 ejemplares incluyen B7-1, B7-2, B7-3 (reconocidos por el anticuerpo BB-1) , B7h (PD-L1), y B7-4 y fragmentos o derivados solubles de los mismos. Los miembros de la familia B7 se unen a uno o más receptores en una célula inmune, tales como CTLA4 , CD28, ICOS, PD-1 y/u otros receptores, y dependiendo del receptor, tiene la capacidad para transmitir una señal inhibidora o una señal coestimuladora a una célula inmune.
CD28 es un receptor que es expresado de manera constitutiva en los linfocitos T en reposo. Después de la señalización a través del receptor del linfocito T, la ligadura de CD28 y la transducción de una señal coestimuladora , induce a los linfocitos T a proliferar y secretar IL-2. CTLA4 (CD152), un receptor homólogo a CD28, está ausente en los linfocitos T en reposo, pero su expresión es inducida después de la activación de los linfocitos T. CTLA4 juega un papel en la regulación negativa de las respuestas de los linfocitos T. ICOS, un polipéptido relacionado con CD28 y CTLA , está involucrado en la producción de IL-10. PD-1, el receptor al cual se une PD-L1 y PD-L2, también es inducido rápidamente en la superficie de los linfocitos T. PD-1 también se expresa en la superficie de los linfocitos B (en respuesta a anti-IgM) y en un subconjunto de timocitos y células mieloides.
El acoplamiento de PD-1 (por ejemplo, mediante reticulación o mediante agregación) , conduce a la transmisión de una señal inhibidora en una célula inmune, resultando en una reducción de las respuestas inmunes, concomitante con un incremento en la anergia de la célula inmune. Los miembros de la familia de PD-1 se unen a uno o más receptotes, tales como PD-L1 y PD-L2 en las células que presentan al antigeno. PD-L1 y PD-L2, ambos de los cuales son polipéptidos del ligando de PD-1 humano, son miembros de la familia B7 de los polipéptidos (véase anteriormente) . Cada ligando de PD-1 contiene una secuencia de la señal, un dominio de IgV, un dominio de IgC, un dominio transmembranal, y una cola citoplásmica corta. In vivo, estos ligandos han mostrado ser expresados en la placenta, bazo, nodos linfáticos, timo y corazón. PD-L2 también se expresa en el páncreas, pulmón, e hígado, mientras que PD-L1 se expresa en el hígado fetal, los linfocitos T activados y las células endoteliales . Ambos ligandos de PD-1 están sobrerregulados en los monocitos activados y las células dendríticas.
Una secuencia de aminoácidos ejemplar para PD-L1 (GENBANK® No. de Acceso AAG18508, disponible en octubre 4, del 2000), se expone a continuación: mrifavfifm tywhllnaft vtvpkdlyvv eygsnmtiec kfpvekqldl aalivyweme dkniiqfvhg eedlkvqhss yrqrarllkd qlslgnaalq itdvklqdag vyrcmisygg adykritvkv napynkinqr ilvvdpvtse heltcqaegy pkaeviwtss dhqvlsgktt ttnskreekl fnvtstlrin tttneifyct frrldpeenh taelvipelp lahppnerth lvilgaillc lgvaltfifr lrkgrmmdvk kcgiqdtnsk kqsdthleet (SEQ ID NO: 3) Una secuencia de aminoácidos precursora de PD-L2 ejemplar (GENBANK® No. de Acceso AAK15370, disponible en abril 8, del 2002), se expone a continuación: miflllmlsl elqlhqiaal ftvtvpkely iiehgsnvtl ecnfdtgshv nlgaitaslq kvendtsphr eratlleeql plgkasfhip qvqvrdegqy qciiiygvaw dykyltlkvk asyrkinthi lkvpetdeve ltcqatgypl aevswpnvsv pantshsrtp eglyqvtsvl rlkpppgrnf scvfwnthvr eltlasidlq sqmeprthpt wllhifipsc iiafifiatv ialrkqlcqk lysskdttkr pvtttkrevn sai (SEQ ID NO: 4) Una secuencia de aminoácidos de precursor de PD-L2 variante ejemplar (GENBANK® No. de Acceso Q9BQ51, disponible en diciembre 12, del 2006) , se expone a continuación : miflllmlsl elqlhqiaal ftvtvpkely iiehgsnvtl ecnfdtgshv nlgaitaslq kvendtsphr eratlleeql plgkasfhip qvqvrdegqy qciiiygvaw dykyltlkvk asyrkinthi lkvpetdeve ltcqatgypl aevswpnvsv pantshsrtp eglyqvtsvl rlkpppgrnf scvfwnthvr eltlasidlq sqmeprthpt wllhifipfc iiafifiatv ialrkqlcqk lysskdttkr pvtttkrevn sai (SEQ ID NO:46) Los antagonistas de PD-1 incluyen agentes que reducen la expresión o actividad de un ligando 1 de PD (PD-L1) o un ligando 2 de PD (PD-L2), o reduce la interacción entre PD-1 y PD-L1 o la interacción entre PD-1 y PD-L2. Los compuestos ejemplares incluyen anticuerpos (tal como un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-Ll y un anticuerpo anti-PD-L2) , moléculas de ARNi (tales como moléculas de ARNi anti-PD-1, ARNi anti-PD-Ll, y un ARNi anti-PD-L2), moléculas antisentido (tales como un ARN antisentido anti-PD-1, un ARN antisentido anti-PD-Ll, y un ARN antisentido anti-PD-L2), proteínas negativas dominantes (tales como una proteína PD-1 negativa dominante, una proteína PD-L1 negativa dominante, y una proteína PD-L2 negativa dominante) , e inhibidores de molécula pequeña.
Un antagonista de PD-1 es cualquier agente que tenga la capacidad de reducir la expresión o actividad de PD-1 en una célula. La expresión o actividad de PD-1 se reduce por al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100%, en comparación con tal expresión o actividad en un control. Las reducciones ejemplares en la actividad son de al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, o una ausencia completa de actividad detectable. En un ejemplo, el control es una célula que no se ha tratado con el antagonista de PD-1. En otro ejemplo, el control es un valor estándar, o una célula puesta en contacto con un agente, tal como un portador, conocido por no afectar la actividad de PD-1. La expresión o actividad de PD-1 puede determinarse mediante cualquier método estándar en la técnica, incluyendo aquellos descritos en la presente. Opcionalmente, el antagonista de PD-1 inhibe o reduce la unión de PD-1 a PD-L1, PD-L2, o ambos.
A. Anticuerpos Los anticuerpos que se unen de manera especifica a PD-1, PD-L1 o PD-L2 (o una combinación de los mismos) , son de uso en los métodos descritos en la presente. Los anticuerpos incluyen anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados, anticuerpos desinmunizados y proteínas de fusión de la inmunoglobulina (Ig) . Los anticuerpos policlonales anti-PD-1, anti-PD-Ll o PD-L2 pueden prepararse por alguien con experiencia en la técnica, tal como mediante la inmunización de un sujeto adecuado (tal como un sujeto veterinario) , con un ligando de PD-1 o un inmunógeno de PD-1. El título del anticuerpo anti-PD-1, anti-PD-Ll o anti-PD-L2 en el sujeto inmunizado puede verificarse con el tiempo mediante técnicas estándar, tales como con un inmunoanálisis enlazados a enzimas (ELISA) , utilizando un ligando de PD-1 o un polipéptido PD-1 inmovilizado.
En un ejemplo, las moléculas del anticuerpo que se unen de manera especifica a PD-1, PD-L1 o PD-L2 (o combinaciones de los mismos), pueden aislarse del mamífero (tal como del suero) y purificarse además mediante técnicas conocidas por alguien con experiencia en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos pueden purificarse utilizando cromatografía con proteína A para aislar los anticuerpos de IgG.
Las células que producen anticuerpos pueden obtenerse del sujeto y utilizarse para preparar anticuerpos monoclonales mediante técnicas estándar (véase, ohler y Milstein, Nature 256:495 49, 1995; Brown et al., J. Immunol. 127:539 46, 1981; Colé et al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77 96, 1985; Gefter, M. L. et al., (1977) Somatic Cell Genet. 3:231 36; Kenneth, R. H. in Monoclonal Antibodies: A New Dimensión In Biological Analyses. Plenum Publishing Corp., New York, N.Y. (1980); Kozbor et al., Immunol. Today 4:72, 1983; Lerner, E. A. (1981) Yale J. Biol. Med. 54:387 402; Yeh et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 76:2927 31, 1976) . En un ejemplo, una línea de células inmortales (típicamente un mieloma) , se fusiona a los linfocitos (típicamente esplenocitos) de un mamífero inmunizado con PD-1, PD-L1 o PD-L2, y los sobrenadantes del cultivo de las células del hibridoma resultante se seleccionan para identificar un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que se une de manera específica al polipéptido de interés.
En una modalidad, para producir un hibridoma, una línea celular inmortal (tal como una línea de células de mieloma) , se deriva de la misma especie de mamífero que los linfocitos. Por ejemplo, los hibridomas murinos pueden hacerse fusionando los linfocitos de un ratón inmunizado con un péptido PD-1, PD-L1 o PD-L2 con una línea celular de ratón inmortalizada. En un ejemplo, se utiliza una línea celular de mieloma de ratón que es sensible al medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT") . Cualquiera de varias líneas celulares de mieloma puede utilizarse como un patrón de fusión de acuerdo con técnicas estándar, incluyendo, por ejemplo, líneas de mieloma P3-NSl/l-Ag4-l , P3-x63-Ag8.653 o Sp2/0-Agl4, que están disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo (American Type Culture Collection, ATCC) , Rockville, Md. Las células de mieloma de ratón sensibles a HAT pueden fusionarse a esplenocitos de ratón utilizando polietilenglicol ("PEG") .
Las células de hibridoma que resultan de la fusión se seleccionan a continuación Utilizando medio HAT, que destruye las células de mieloma no fusionadas (y fusionadas de manera no productiva) . Las células de hibridoma que producen un anticuerpo monoclonal de interés pueden detectarse, por ejemplo, seleccionando los sobrenadantes del cultivo del hibridoma para la producción de anticuerpos que se unen a la molécula de PD-1, PD-L1 o PD-L2, tal como utilizando un ensayo inmunológico (tal como un inmunoanálisis enlazado a enzimas (ELISA) o un radioinmunoensayo (RIA) .
Como una alternativa para preparar los hibridomas que secretan el anticuerpo monoclonal, un anticuerpo monoclonal que se une de manera especifica a PD-1, PD-L1 o PD-L2 puede identificarse y aislarse seleccionando una biblioteca de inmunoglobulina combinatoria recombinante (tal como una biblioteca de representación del fago del anticuerpo) con PD-1, PD-L1 o PD-L2, para aislar los miembros de la biblioteca de la inmunoglobulina que se unen de manera especifica al polipéptido. Los equipos para generar y seleccionar las bibliotecas de representación del fago están comercialmente disponibles (tales como, de manera no exclusiva, Pharmacia y Stratagene) . Los ejemplos de métodos y reactivos particularmente adecuados para utilizarse en la generación y selección de la biblioteca de representación del anticuerpo, pueden encontrarse en, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5, 223, 409; la Publicación del PCT No. WO 90/02809; la Publicación del PCT No. WO 91/17271; la Publicación del PCT No. WO 92/18619; la Publicación del PCT WO 92/20791; la Publicación del PCT No. WO 92/15679; la Publicación del PCT No. WO 92/01047; la Publicación del PCT WO 93/01288; la Publicación del PCT No. WO 92/09690; Barbas et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 88:7978 7982, 1991; Hoogenboom et al., Nucleic Acids Res. 19:4133 4137, 1991.
La secuencia de aminoácidos de los anticuerpos que se unen a PD-1 se describe, por ejemplo, en la Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 2006/0210567, la cual se incorpora en la presente como referencia. Los anticuerpos que se unen a PD-1 también se describen en la Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 2006/0034826, la cual también se incorpora en la presente como referencia. En varios ejemplos, el anticuerpo se une de manera especifica a PD-1 o a un ligando de PD-1 o PD-2 con una constante de afinidad de al menos 107 M"1, tal como al menos 108 M"1, al menos 5 X 108 M"1 o al menos 109 M"1.
En un ejemplo, se determina la secuencia de las regiones que determinan la especificidad de cada CDR. Los residuos que están en el exterior del SDR (sitios de contacto que no son del ligando) se sustituyen. Por ejemplo, en cualquiera de las secuencias CDR como en la tabla anterior, al menos uno, dos o tres aminoácidos pueden sustituirse. La producción de anticuerpos quiméricos, que incluyen una región de estructura de un anticuerpo y la CDR de un anticuerpo diferente, es bien conocida en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos humanizados pueden producirse de manera rutinaria. El anticuerpo o el fragmento de anticuerpo puede ser una inmunoglobulina humanizada que tiene regiones que determinan la complementariedad (CDR) de un anticuerpo monoclonal donante que se une a PD-1, PD-L1 o PD-L2, y una inmunoglobulina y las estructuras de la región variable de cadena pesada y ligera de las estructuras de cadena pesada y ligera de la inmunoglobulina aceptora humana. Generalmente, la inmunoglobulina humanizada se une de manera especifica a PD-1, PD-L1 o PD-L2 con una constante de afinidad de al menos 107 "1, tal como al menos 108 M"1, al menos 5 X 108 M"1 o al menos 109 "1.
Los anticuerpos monoclonales humanizados pueden producirse transfiriendo las regiones que determinan la complementariedad (CDR) del donante a partir de las cadenas variables pesada y ligera de la inmunoglobulina de ratón del donante (tal como PD-1, PD-L1 o PD-L2) en un dominio variable humano, y a continuación sustituyendo los residuos humanos en las regiones de estructura cuando se requiere mantener la afinidad. El uso de los componentes de anticuerpo derivados de los anticuerpos monoclonales humanizados, obvia los problemas potenciales asociados con la inmunogenicidad de las regiones constantes del anticuerpo donante. Las técnicas para producir anticuerpos monoclonales humanizados se describen, por ejemplo, por Jones et al., Nature 321:522, 1986; Riechmann et al., Nature 332:323, 1988; Verhoeyen et al., Science 239:1534, 1988; Cárter et al., Proc. Nati. Acad. Sci. E.Ü.A. 89:4285, 1992; Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437, 1992; y Singer et. al., J. Immunol. 150:2844, 1993. El anticuerpo puede ser de cualquier isotipo, pero en varias modalidades, el anticuerpo es una IgG, incluyendo, de manera no exclusiva, IgGi, IgG2, IgG3 e IgG .
En una modalidad, la secuencia de la estructura de la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina humanizada puede ser al menos aproximadamente 65% idéntica a la secuencia de la estructura de la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina donante. Asi, la secuencia de la estructura de la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina humanizada puede ser al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 99% o al menos aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de la estructura de la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina del donante. Las regiones de estructura humanas, y las mutaciones que pueden hacerse en las regiones de la estructura del anticuerpo humanizado, se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos No. 5,585,089, la cual se incorpora en la presente como referencia) .
Los anticuerpos humanos ejemplares son LEN y 21/28 CL. Las secuencias de las estructuras de la cadena pesada y ligera son conocidas en la técnica. Las estructuras de la cadena ligera ejemplares del anticuerpo monoclonal MAb LEN humano tienen las siguientes secuencias: FR1: DIVMTQS PDSLAVSLGERATINC (SEQ ID NO: 5) FR2: WYQQKPGQPPLLIY (SEQ ID NO: 6) FR3: GVPDRPFGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC (SEQ ID NO: 7 FR4 : FGQGQTKLEIK (SEQ ID NO: 8) Las estructuras de la cadena pesada ejemplares del anticuerpo monoclonal MAb 21/28' CL humano tienen las siguientes secuencias: FR1: QVQLVQSGAEVKKPQASVKVSCKASQYTFT (SEQ ID NO: 9) FR2 WVRQAPGQRLE G (SEQ ID NO: 10) FR3 RVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 11) FR4 WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 12).
Los anticuerpos, tales como los anticuerpos monoclonales murinos, los anticuerpos quiméricos y los anticuerpos humanizados, incluyen moléculas de longitud completa asi como fragmentos de las mismas, tales como Fab, F(ab')2 y Fv, que incluyen una región variable de cadena pesada y de cadena ligera y son capaces de unirse de manera especifica a los determinantes del epitopo. Estos fragmentos de anticuerpo mantienen alguna capacidad para unirse de manera selectiva con su antigeno o receptor. Estos fragmentos incluyen: (1) Fab, el fragmento que contiene un fragmento que se une al antigeno monovalente de una molécula de anticuerpo, puede producirse mediante la digestión de todo el anticuerpo con la enzima papaina para proporcionar una cadena ligera intacta y una porción de una cadena pesada; (2) Fab', el fragmento de una molécula de anticuerpo puede obtenerse tratando todo el anticuerpo con pepsina, seguido por la reducción, para proporcionar una cadena ligera intacta y una porción de la cadena pesada; dos fragmentos Fab' se obtienen por molécula de anticuerpo; (3) (Fab' )2 el fragmento del anticuerpo que puede obtenerse tratando todo el anticuerpo con la enzima pepsina sin reducción posterior; F(ab')2 es un dimero de dos fragmentos Fab' mantenidos juntos mediante dos enlaces de disulfuro; (4) Fv, un fragmento diseñado genéticamente, que contiene la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada expresadas como dos cadenas; y. (5) Anticuerpo de una sola cadena (tal como scFv) , definido como una molécula diseñada genéticamente, que contiene la región variable de la cadena ligera, la región variable de la cadena pesada, enlazadas por un enlazante polipeptidico adecuado como una molécula de una sola cadena fusionada genéticamente.
Los métodos para hacer estos fragmentos son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow y Lañe, Antibo íes : A aboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988). En varios ejemplos, la región variable incluye la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada expresadas como polipéptidos individuales. Los anticuerpos Fv son típicamente de aproximadamente 25 kDa y contienen un sitio que se une al antígeno completo con tres CDR por cada cadena pesada y cada cadena ligera. Para producir estos anticuerpos, la VH y la VL pueden expresarse de dos constructos de ácidos nucleicos individuales en una célula hospedante. Si la VH y la VL se expresan de manera no contigua, las cadenas del anticuerpo Fv se mantienen juntas típicamente mediante interacciones no covalentes. Sin embargo, estas cadenas tienden a disociarse tras la dilución, de manera que se han desarrollado métodos para reticular las cadenas a través de glutaraldehído, disulfuros intermoleculares, o un enlazante peptídico. Así, en un ejemplo, el Fv puede ser un Fv estabilizado con disulfuro (dsFv) , en donde la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera están enlazadas químicamente mediante enlaces disulfuro.
En un ejemplo adicional, los fragmentos Fv comprenden cadenas VH y VL conectadas por un enlazante peptídico. Estas proteínas que se unen al antígeno de una sola cadena (scFv) se preparan construyendo un gen estructural que comprende secuencias de ADN que codifican los dominios VH y VL conectados por un oligonucleótido . El gen estructural se inserta en un vector de expresión, que se introduce posteriormente en una célula hospedante tal como E. coli. Las células hospedantes recombinantes sintetizan una cadena de un solo polipéptido con un péptido enlazante que puentea los dos dominios V. Los métodos para producir los scFvs son conocidos en la técnica (véase hitlow et al., Methods: a Companion to Methods in Enzymology, Vol. 2, página 97, 1991; Bird et al., Science 242:423, 1988; Patente de los Estados Unidos No. 4,946,778; Pack et al., Bio/Technology 11:1271, 1993 y Sandhu, supra) .
Los fragmentos del anticuerpo pueden prepararse mediante la hidrólisis proteolitica del anticuerpo o mediante la expresión en E. coli del ADN que codifica el fragmento. Los fragmentos del anticuerpo pueden obtenerse mediante la digestión con pepsina o papaina de los anticuerpos completos mediante métodos convencionales. Por ejemplo, los fragmentos del anticuerpo pueden producirse mediante la escisión enzimática de los anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento 5S denotado como F(ab' )2- Este fragmento puede escindirse además utilizando un agente reductor de tiol, y opcionalmente un grupo bloqueante para los grupos sulfhidrilo que resultan de la escisión de los enlaces disulfuro, para producir fragmentos monovalentes 3.5S Fab' . De manera alterna, una escisión enzimática utilizando pepsina produce dos fragmentos Fab' monovalentes y un fragmento Fe directamente (véase la Patente de los Estados Unidos No. 4,036,945 y la Patente de los Estados Unidos No. 4,331,647, y las referencias contenidas en las mismas; Nisonhoff et al., Arch. Biochem.
Biophys. 89:230, 1960; Porter, Biochem. J. 73:119, 1959; Edelman et al., Methods in Enzymology, Vol. 1, página 422, Academic Press, 1967 y Coligan et al., en las secciones 2.8.1-2.8.10 y 2.10.1-2.10.4).
Otros métodos para escindir anticuerpos, tales como la separación de cadenas pesadas para formar fragmentos de cadena ligera-pesada monovalentes, la escisión adicional de los fragmentos u otras técnicas enzimáticas, químicas o genéticas, también pueden utilizarse, siempre que los fragmentos se unan al antígeno que es reconocido por el anticuerpo intacto.
Alguien con experiencia se dará cuenta que pueden producirse las variantes conservadoras de los anticuerpos. Tales variantes conservadoras empleadas en los fragmentos de anticuerpo, tales como fragmentos dsFv o en fragmentos scFv, mantendrán los residuos de aminoácidos críticos necesarios para el plegado correcto y la estabilización entre las regiones VH y VL, y mantendrán las características de carga de los residuos con el fin de preservar la baja pl y una baja toxicidad de las moléculas. Las sustituciones de aminoácidos (tales como al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o al menos cinco sustituciones de aminoácidos) pueden hacerse en las regiones VH y VL para incrementar el rendimiento. Las tablas de las sustituciones conservadoras de los aminoácidos que proporcionan aminoácidos con funcionalidad similar son bien conocidas por alguien con experiencia en la técnica. Los siguientes seis grupos son ejemplos de aminoácidos que se consideran como sustituciones conservadoras unos con respecto a otros : 1) Alanina (A), Serina (S) , Treonina (T) ; 2) Ácido aspártico (D) , Ácido glutámico (E) ; 3) Asparagina (N) , Glutamina (Q) ; 4) Arginina (R) , Lisina (K) ; 5) Isoleucina (I), Leucina (L) , Metionina (M) , Valina (V) ; y 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W) .
Asi, alguien con experiencia en la técnica puede revisar fácilmente las secuencias de aminoácidos de un anticuerpo de interés, localizar uno o más de los aminoácidos en la breve tabla anterior, identificar una sustitución conservadora, y producir la variante conservadora utilizando técnicas moleculares bien conocidas.
Las moléculas efectoras, tales como porciones terapéuticas, de diagnóstico o detección, pueden enlazarse a un anticuerpo que se une de manera especifica a PD-1, PD-L1 o PD-L2, utilizando cualquier número de medios conocidos por aquellos con experiencia en la técnica. Pueden utilizarse medios de unión covalentes y no covalentes. El procedimiento para unir una molécula efectora a un anticuerpo varia de acuerdo con la estructura química del efector. Los polipéptidos contienen típicamente una variedad de grupos funcionales; tales como grupos de ácido carboxílico (COOH) , amina libre (-NH2) o sulfhidrilo (-SH) , que están disponibles para una reacción con un grupo funcional adecuado en un anticuerpo para resultar en la unión de la molécula efectora. De manera alterna, el anticuerpo se deriva para exponer o unir grupos funcionales reactivos adicionales. La derivación puede involucrar la unión de cualquiera de varias moléculas enlazantes, tales como aquellas disponibles de Pierce Chemical Company, Rockford, IL. El enlazante puede ser cualquier molécula utilizada para unir el anticuerpo a la molécula efectora. El enlazante es capaz de formar enlaces covalentes con el anticuerpo y con la molécula efectora. Los enlazantes adecuados son bien conocidos por aquellos con experiencia en la técnica e incluyen, de manera no exclusiva, enlazantes de carbono de cadena lineal o ramificada, enlazantes de carbono heterocíclicos o enlazantes peptídicos. En donde el anticuerpo y la molécula efectora son polipéptidos, los enlazantes pueden unirse a los aminoácidos constituyentes a través de sus grupos laterales (tal como a través de un enlace disulfuro a cisteina) , o al amino del carbón alfa y los grupos carboxilo de los aminoácidos terminales.
Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos pueden prepararse mediante cualquier método adecuado, incluyendo, por ejemplo, clonación de las secuencias apropiadas o mediante síntesis química directa mediante métodos tales como el método de fosfotriéster de Narang et al., Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979; el método de fosfodiéster de Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979; el método de dietilfosforamidita de Beaucage et al., Tetra. Lett. 22:1859-1862, 1981; el método de triéster de fosforamidita en fase sólida descrito por Beaucage & Caruthers, Tetra. Letts. 22(20): 1859-1862, 1981, por ejemplo, utilizando un sintetizador automatizado como se describe en, por ejemplo, Needham-VanDevanter et al., Nucí. Acids Res. 12:6159-6168, 1984; y el método con soporte sólido de la Patente de los Estados Unidos No. 4,458,066. La síntesis química produce un oligonucleótido de una sola hebra. Este puede convertirse a un ADN de doble hebra mediante la hibridación con una secuencia complementaria, o mediante la polimerización con una ADN polimerasa utilizando la hebra sencilla como una plantilla. Alguien con experiencia reconocerá que aunque la síntesis química del ADN está limitada generalmente a secuencias de aproximadamente 100 bases, pueden obtenerse secuencias más largas mediante la ligadura de secuencias más cortas .
Los ácidos nucleicos ejemplares que codifican las secuencias que codifican un anticuerpo que se une de manera especifica a PD-1, PD-L1 o PD-L2, pueden prepararse mediante técnicas de clonación. Los ejemplos de técnicas apropiadas de clonación y secuenciamiento, e instrucciones suficientes para dirigir a las personas con experiencia a través de muchos ejercicios de clonación, se encuentran en Sambrook et al., supra, Berger y Kimmel (eds.), supra, y Ausubel, supra. La información del producto de los fabricantes de los reactivos biológicos y el equipo experimental también proporciona información útil. Tales fabricantes incluyen SIGMA Chemical Company (Saint Louis, MO) , R&D Systems (Minneapolis , MN) , Pharmacia Amersham (Piscataway, NJ) , CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA) , Chem Genes Corp., Aldrich Chemical Company ( ilwaukee, I), Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD) , Fluka Chemica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG, Buchs, Suiza), Invitrogen (San Diego, CA) , y Applied Biosystems (Foster City, CA) , asi como muchas otras fuentes comerciales conocidas por alguien con experiencia.
Los ácidos nucleicos también pueden prepararse mediante métodos de amplificación. Los métodos de amplificación incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , la reacción en cadena de la ligasa (LCR) , el sistema de amplificación basado en la transcripción (TAS) , el sistema de replicación de la secuencia autosustentado (3SR). Una amplia variedad de métodos de clonación, células hospedantes y metodologías de amplificación in vitro, es bien conocida por las personas con experiencia.
En un ejemplo, un anticuerpo de uso se prepara insertando el ADNc que codifica una región variable de un anticuerpo que se une de manera específica a PD-1, PD-L1 o PD-L2, en un vector que comprende el ADNc que codifica una molécula efectora (EM) . La inserción se hace de manera que la región variable y la EM se leen en el marcado, de manera que se produce un polipéptido continuo. Así, el polipéptido codificado contiene una región Fv funcional y una región EM funcional. En una modalidad, el ADNc que codifica un marcador detectable (tal como una enzima) , se liga a un scFv de manera que el marcador se localiza en el término carboxilo del scFv. En otro ejemplo, un marcador detectable está localizado en el término amino del scFv. En un ejemplo adicional, el ADNc que codifica un marcador detectable está ligado a una región variable de la cadena pesada de un anticuerpo que se une de manera específica a PD-1, PD-L1 o PD-L2, de manera que el marcador se localiza en el término carboxilo de la región variable de la cadena pesada. La región variable de la cadena pesada puede ligarse posteriormente a una región variable de la cadena ligera del anticuerpo que se une de manera especifica a PD-1, PD-L1 o PD-L2, utilizando enlaces disulfuro. En aún otro ejemplo, el ADNc que codifica un marcador se liga a una región variable de la cadena ligera de un anticuerpo que se une a PD-1, PD-L1 o PD-L2, de manera que el marcador está localizado en el término carboxilo de la región variable de la cadena ligera. La región variable de la cadena ligera puede ligarse posteriormente a una región variable de la cadena pesada del anticuerpo que se une de manera especifica a PD-1, PD-L1 o PD-L2 utilizando enlaces disulfuro.
Una vez que los ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo se aislan y clonan, la proteina puede expresarse en una célula diseñada de manera recombinante, tal como células de bacteria, planta, levadura, insectos y mamíferos. Una o más secuencias de ADN que codifican el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo pueden expresarse in vitro por la transferencia del ADN en una célula hospedante adecuada. La célula puede ser procariótica o eucariótica. El término también incluye cualquier progenie de la célula hospedante. Se entiende que toda la progenie puede no ser idéntica a la célula progenitora, puesto que puede haber mutaciones que ocurren durante la replicación. Los métodos de transferencia estable, lo que significa que el ADN extraño es mantenido de manera continua en el hospedero, se conocen en la técnica.
Las secuencias polinucleotidicas que codifican el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo pueden enlazarse de manera operable a las secuencias de control de la expresión. Una secuencia de control de la expresión enlazada de manera operable a una secuencia codificante está ligada de manera que la expresión de la secuencia codificante se alcanza bajo condiciones compatibles con las secuencias de control de la expresión. Las secuencias de control de la expresión incluyen, de manera no exclusiva, promotores, mejoradores, terminadores de la transcripción, un codón de inicio (es decir, ATG) enfrente de un gen que codifica una proteína, una señal de empalme para intrones, mantenimiento del marco de lectura correcto de ese gen para permitir la traducción apropiada del ARNm, y codones de detención, apropiados.
Las secuencias polinucleotidicas que codifican el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo, pueden insertarse en un vector de expresión incluyendo, de manera no exclusiva, un plásmido, virus u otro vehículo que puede manipularse para permitir la inserción o incorporación de las secuencias, y puede expresarse en procariotes o eucariotes. Los hospedantes pueden incluir organismos microbianos, de levadura, insectos y mamíferos. Los métodos para expresar las secuencias de ADN que tienen secuencias eucarióticas o virales en los procariotes, son bien conocidos en la técnica. Los vectores de ADN virales y de plásmido biológicamente funcionales capaces de expresión y replicación en un hospedante son conocidos en la técnica.
La transformación de una célula hospedante con el ADN recombinante puede llevarse a cabo mediante técnicas convencionales que son bien conocidas por aquellos con experiencia en la técnica. En donde el hospedante es procariótico, tal como E. coli, las células competentes que son capaces de la captación del ADN pueden prepararse de células recolectadas después de la fase de crecimiento exponencial, y tratarse posteriormente mediante el método de CaCl2 utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica. De manera alterna, puede utilizarse MgCl2 o RbCl. La transformación también puede realizarse después de formar un protoplasto de la célula hospedante si se desea, o mediante electroporación .
Cuando el hospedante es un eucariote, pueden utilizarse métodos de transfección del ADN tales como coprecipitados de fosfato de calcio, procedimientos mecánicos convencionales tales como microinyección, electroporación, inserción de un plásmido encerrado en liposomas, o vectores de virus. Las células eucarióticas también pueden cotransformarse con secuencias polinucleotidicas que codifican el anticuerpo del fragmento funcional del mismo, y una segunda molécula de ADN extraño que codifica un fenotipo seleccionable, tal como el gen de la timidina cinasa del herpes simple. Otro método es utilizar un vector viral eucariótico, tal como el virus 40 simiano (SV40) o el virus del papiloma bovino, para infectar o transformar de manera transitoria las células eucarióticas y expresar la proteina (véase, por ejemplo, Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman ed., 1982). Alguien con experiencia en la técnica puede utilizar fácilmente sistemas de expresión tales como plásmidos y vectores de uso para producir proteínas en las células, incluyendo células eucarióticas superiores, tales como las líneas celulares COS, CHO, HeLa y de mieloma.
El aislamiento y la purificación del polipéptido expresado de manera recombinante, puede llevarse a cabo por medios convencionales, incluyendo cromatografía preparativa y separaciones inmunológicas . Una vez expresados, los anticuerpos recombinantes pueden purificarse de acuerdo con procedimientos estándar de la técnica, incluyendo precipitación con sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía en columna y lo similar (véase, generalmente, R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N. Y., 1982). Las composiciones sustancialmente puras de al menos aproximadamente 90 a 95% de homogeneidad se describen en la presente, y 98 a 99% o más de homogeneidad puede utilizarse para propósitos farmacéuticos. Una vez purificados, parcialmente o hasta homogeneidad como se desee, si se van a utilizar de manera terapéutica, los polipéptidos deben estar sustancialmente libres de endotoxina .
Los métodos para expresión de los anticuerpos de una sola cadena y/o para replegar a una forma activa apropiada, incluyendo anticuerpos de una sola cadena, de bacterias tales como E. coli , se han descrito y son bien conocidos y son aplicados a los anticuerpos descritos en la presente. Véase, Buchner et al., Anal. Biochem. 205:263-270, 1992; Pluckthun, Biotechnology 9:545, 1991; Huse et al., Science 246:1275, 1989 y Ward et al., Nature 341:544, 1989, todos incorporados como referencia en la presente .
Con frecuencia, las proteínas heterólogas funcionales de E. coli u otras bacterias se aislan de cuerpos de inclusión y requieren la solubilización utilizando desnaturalizantes fuertes, y el replegado posterior. Durante el paso de solubilización, como es bien conocido en la técnica, un agente reductor debe estar presente para separar los enlaces disulfuro. Un amortiguador ejemplar con un agente reductor es: Tris 0.1 M, pH 8, guanidina 6 M, EDTA 2 mM, DTE (ditioeritritol ) 0.3 M. La reoxidación de los enlaces disulfuro puede ocurrir en la presencia de reactivos de tiol de bajo peso molecular en forma reducida y oxidada, como se describe en Saxena et al., Biochemistry 9: 5015-5021, 1970, incorporado como referencia en la presente, y especialmente como se describe por Buchner et al., supra .
La renaturalización se logra típicamente mediante dilución (por ejemplo, 100 veces) de la proteína desnaturalizada y reducida en un amortiguador de replegado. Un amortiguador ejemplar es Tris 0.1 M, pH 8.0, L-arginina 0.5 M, glutationa oxidada 8 mM (GSSG) , y EDTA 2 mM.
Como una modificación al protocolo de purificación del anticuerpo con dos cadenas, las regiones de cadena pesada y ligera se solubilizan y reducen de manera separada y a continuación se combinan en la solución de replegado. Un rendimiento ejemplar se obtiene cuando estas dos proteínas se mezclan en una relación molar tal que no se excede un exceso molar de 5 veces de una proteína con respecto a la otra. Es deseable agregar glutationa oxidada en exceso u otros compuestos oxidantes de bajo peso molecular a la solución de replegado después de que se termina la reorganización rédox.
Además de los métodos recombinantes, los anticuerpos y los fragmentos funcionales de los mismos que se describen en la presente, también pueden construirse todos o en parte utilizando síntesis peptídica estándar. La síntesis en fase sólida de los polipéptidos de menos que aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, puede lograrse uniendo el aminoácido C terminal de la secuencia a un soporte insoluble, seguido por la adición secuencial de los aminoácidos restantes en la secuencia. Las técnicas para la síntesis en fase sólida se describen por Barany & Merrifield, The Peptides : Analysis , Synthesis , Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Parte A. pp. 3-284; Merrifield et al., J. Am . Chem . Soc. 85:2149-2156, 1963, y Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2a ed. , Pierce Chem. Co. , Rockford, III., 1984.
Las proteínas de mayor longitud pueden sintetizarse mediante condensación de los términos amino y carboxilo de fragmentos más cortos. Los métodos para formar enlaces peptídicos mediante la activación de un extremo carboxilo terminal (tal como mediante el uso del reactivo de acoplamiento ?,?' -diciclohexilcarbodimida) , son bien conocidos en la técnica.
B. Ácidos Nucleicos Inhibidores Los ácidos nucleicos inhibidores que disminuyen la expresión y/o la actividad de PD-1, PD-L1 o PD-L2, también pueden utilizarse en los métodos descritos en la presente. Una modalidad es un ARN inhibidor pequeño (ARNsi) para la interferencia o inhibición de la expresión de un gen objetivo. Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican a PD-1, PD-L1 y PD-L2 se describen en GENBANK®, Nos. de Acceso N _005018, AF344424, NP_079515, y NP_054862.
Generalmente, los ARNsi se generan mediante la escisión de moléculas de ARN de doble hebra relativamente largas mediante Dicer o enzimas DCL (Zamore, Science, 296:1265-1269, 2002; Bernstein et al., Nature, 409:363-366, 2001). En animales y plantas, los ARNsi son montados en RISC y guian la actividad ribonucleolitica especifica de la secuencia de RISC, resultando por lo tanto, en la escisión de los ARNm u otras moléculas objetivo de ARN en el citoplasma. En el núcleo, los ARNsi también guian la histona asociada con la heterocromatina y la metilación del ADN, resultando en el silenciamiento transcripcional de los genes individuales o grandes dominios de cromatina.
Los ARNsi de PD-1 están comercialmente disponibles, tales como de Santa Cruz Biotechnology, Inc.
La presente descripción proporciona ARN adecuados para la interferencia o inhibición de la expresión de un gen objetivo, dicho ARN incluye ARN de doble hebra de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 nucleótidos, que contienen una saliente de 0 a 5 nucleótidos 3' y/o 5' en cada hebra. La secuencia del ARN es sustancialmente idéntica a una porción de un ARNm o un transcripto de un gen objetivo, tal como PD-1, PD-L1 o PD-L2 ) , para el cual se desea la interferencia o inhibición de la expresión. Para propósitos de esta descripción, una secuencia de ARN "sustancialmente idéntica" a una porción especifica del ARNm o al transcripto de gen objetivo para el cual se desea la interferencia o inhibición de la expresión, difiere por no más que aproximadamente 30 por ciento, y en algunas modalidades no más que aproximadamente 10 por ciento, de la porción especifica del ARNm o el transcripto del gen objetivo. En las modalidades particulares, la secuencia del ARN es exactamente idéntica a una porción especifica del ARNm o el transcripto del gen objetivo.
Asi, los ARNsi descritos en la presente, incluyen un ARN de doble hebra de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 nucleótidos de longitud y una saliente 3' o 5' que tiene una longitud de 0 a 5 nucleótidos en cada hebra, en donde la secuencia del ARN de doble hebra es sustancialmente idéntica a (véase anteriormente) una porción de un ARNm o un transcripto de un ácido nucleico que codifica a PD-1, PD-L1 o PD-L2. En los ejemplos particulares, el ARN de doble hebra contiene de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos, por ejemplo, 20, 21 ó 22 nucleótidos sustancialmente idénticos a un ácido nucleico que codifica a PD-1, PD-L1 o PD-L2. En los ejemplos adicionales, el ARN de doble hebra contiene de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos, 100% idénticos a un ácido nucleico que codifica a PD-1, PD-L1 o PD-L2. Deberá notarse que en este contexto "aproximadamente" se refiere a cantidades enteras únicamente. En un ejemplo, "aproximadamente" 20 nucleótidos se refiere a un nucleótido de 19 a 21 nucleótidos de longitud.
Sin importar la saliente en el ARN de doble hebra, la longitud de la saliente es independiente entre las dos hebras, en que la longitud de una saliente no depende de la longitud de la saliente en la otra hebra. En los ejemplos específicos, la longitud de la saliente 3' o 5' es de 0 nucleótidos en al menos una hebra, y en algunos casos, es de 0 nucleótidos en ambas hebras (por lo tanto, es un ARNds romo) . En otros ejemplos, la longitud de la saliente 3' o 5' es de 1 nucleótido a 5 nucleótidos en al menos una hebra. Más particularmente, en algunos ejemplos, la longitud de la saliente 3' o 5' es de 2 nucleótidos en al menos una hebra, o 2 nucleótidos en ambas hebras. En los ejemplos particulares, la molécula de ARNds tiene salientes 3' de 2 nucleótidos en ambas hebras .
Asi, en una modalidad del ARN proporcionado particular, el ARN de doble hebra contiene 20, 21 ó 22 nucleótidos, y la longitud de la saliente 3' es de 2 nucleótidos en ambas hebras. En las modalidades de los ARN proporcionados en la presente, el ARN de doble hebra contiene aproximadamente 40-60% de adenina+uracilo (AU) y aproximadamente 60-40% de guanina+citosina (GC) . Más particularmente, en los ejemplos específicos, el ARN de doble hebra contiene aproximadamente 50% de AU y aproximadamente 50% de GC .
También como se describió en la presente, existen ARN que incluyen además al menos un ribonucleótido modificado, por ejemplo, en la hebra sentido del ARN de doble hebra. En los ejemplos particulares, el ribonucleótido modificado está en la saliente 3' de al menos una hebra, o más particularmente en la saliente 3' de la hebra sentido. Se contempla particularmente que los ejemplos de los ribonucleótidos modificados incluyan ribonucleótidos que incluyen una marca detectable (por ejemplo, un fluoróforo, tal como rodamina o FITC) , un análogo del nucleótido tiofosfato, un desoxinucleótido (considerado modificado debido a que la molécula base es ácido ribonucleico), un 2 ' -fluorouracilo, un 2'-aminouracilo, una 2 ' -aminocitidina, un 4 -tiouracilo , un 5-bromouracilo, un 5-yodouracilo, un 5- ( 3-aminoalil ) -uracilo, una inosina, o un análogo de 2 ' O-Me-nucleótido .
Las moléculas antisentido y de ribozima para PD-1, PD-L1 y PD-L2 también son de uso en el método descrito en la presente. Los ácidos nucleicos antisentido son moléculas de ADN o ARN que son complementarias a al menos una porción de una molécula de ARNm especifica ( eintraub, Scientific American 262:40, 1990). En la célula, los ácidos nucleicos antisentido se hibridan al ARNm correspondiente, formando una molécula de doble hebra. Los ácidos nucleicos antisentido interfieren con la traducción del ARNm, puesto que la célula no traducirá un ARNm que es de doble hebra. Los oligomeros antisentido de aproximadamente 15 nucleótidos se prefieren, puesto que son sintetizados más fácilmente, y es menos probable que causen problemas que las moléculas más grandes cuando se introducen en la célula objetivo que produce PD-1, PD-L1 o PD-L2. El uso de métodos antisentido para inhibir la traducción in vitro de los genes es bien conocido en la técnica (véase, por ejemplo, Marcus-Sakura, Anal. Biochem. 172:289, 1988) .
Un oligonucleótido antisentido puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 nucleótidos de longitud. Un ácido nucleico antisentido puede construirse utilizando síntesis química y reacciones de ligadura enzimática utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico antisentido puede sintetizarse químicamente utilizando nucleótidos naturales o pueden utilizarse varios nucleótidos modificados diseñados para incrementar la estabilidad biológica de las moléculas o para incrementar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos antisentido y sentido, tales como los derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina puede usarse. Los ejemplos de nucleótidos modificados que pueden utilizarse para generar el ácido nucleico antisentido incluyen 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5- (carboxi hidroxil metil ) uracilo, 5-carboxi metil amino metil-2-tiouridina, 5-carboxi metil amino metil uracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosil queosina, inosina, entre otros.
El uso de un oligonucleótido para detener la transcripción es conocido como la estrategia triplex, puesto que el recubrimiento superficial se enrolla alrededor del ADN de doble hélice, formando una hélice de tres hebras. Por lo tanto, estos compuestos triplex pueden diseñarse para reconocer un sitio único en un gen seleccionado (Maher, et al., Antisense Res. and Dev. 1(3):227, 1991; Helene, C, Anticancer Drug Design 6(6): 569), 1991). Este tipo de oligonucleótido inhibidor es también de uso en los métodos descritos en la presente.
Las ribozimas, que son moléculas de ARN que poseen la capacidad de escindir de manera especifica otro ARN de una sola hebra de una manera análoga a las endonucleasas de restricción del ADN, también son de uso. A través de la modificación de las secuencias nucleotidicas que codifican estos ARN, es posible diseñar moléculas que reconozcan las secuencias nucleotidicas especificas en una molécula de ARN y escindirlas (Cech, J. Amer. Med. Assn. 260:3030, 1988). Una ventaja principal de este procedimiento es que, debido a que son específicas de la secuencia, únicamente los ARNm con secuencias particulares son inactivados.
Existen dos tipos básicos de ribozimas, a saber, del tipo Tetrahymena (Hasselhoff, Nature 334:585, 1988) y del tipo "cabeza de martillo". Las ribozimas del tipo Tetrahymena reconocen las secuencias que son de cuatro bases de longitud, mientras que las ribozimas del tipo "cabeza de martillo" reconocen las secuencias base de lile bases de longitud. Entre más larga sea la secuencia de reconocimiento, mayor es la probabilidad de que la secuencia aparecerá de manera exclusiva en las especies del ARNm objetivo. En consecuencia, las ribozimas del tipo de cabeza de martillo son preferibles a las ribozimas del tipo Tetrahymena , para inactivar una especie de ARNm especifico y las secuencias de reconocimiento de 18 bases son preferibles a las secuencias de reconocimiento más cortas.
Varios sistemas de suministro son conocidos, y pueden utilizarse para administrar los ARNsi y otras moléculas de ácidos nucleicos inhibidores como agentes terapéuticos. Tales sistemas incluyen, por ejemplo, encapsulación en liposomas, microparticulas , microcápsulas , nanoparticulas, células recombinantes capaces de expresar las moléculas terapéuticas (véase, por ejemplo, Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429, 1987), construcción de un ácido nucleico terapéutico como parte de un vector retroviral u otro vector, y lo similar.
C. Inhibidores de Molécula Pequeña Los antagonistas de PD-1 incluyen moléculas que son identificadas de bibliotecas grandes de productos naturales o extractos sintéticos (o semisintéticos ) o bibliotecas químicas de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica. Los métodos de selección que detectan las disminuciones en la actividad de PD-1 (tales como detectar la muerte celular) , son útiles para identificar los compuestos de una variedad de fuentes para la actividad. Las selecciones iniciales pueden realizarse utilizando una biblioteca diversa de compuestos, una variedad de otros compuestos y bibliotecas de compuestos. Así, las moléculas que se unen a PD-1, PD-L1 o PD-L2, las moléculas que inhiben la expresión de PD-1, PD-L1 y/o PD-L2, y las moléculas que inhiben la actividad de PD-1, PD-L1 y/o PD-L2 pueden identificarse. Estas moléculas pequeñas pueden identificarse de bibliotecas combinatorias, bibliotecas de productos naturales u otras bibliotecas de molécula pequeña. Además, el antagonista de PD-1 puede identificarse como compuestos de fuentes comerciales, así como análogos comercialmente disponibles de los inhibidores identificados.
La fuente precisa de los extractos o compuestos de prueba no es crítica para la identificación de los antagonistas del PD-1. En consecuencia, los antagonistas de PD-1 pueden identificarse de virtualmente cualquier número de extractos o compuestos químicos. Los ejemplos de tales extractos o compuestos que pueden ser antagonistas de PD-1 incluyen, de manera no exclusiva, extractos basados en plantas, hongos, procariotes o animales, caldos de fermentación y compuestos sintéticos, asi como la modificación de los compuestos existentes. Numerosos métodos también están disponibles para generar la síntesis aleatoria o dirigida (por ejemplo, semisíntesis o síntesis total) de cualquier número de compuestos químicos, incluyendo, de manera no exclusiva, compuestos basados en sacáridos, lípidos, péptidos y ácidos nucleicos. Las bibliotecas de los compuestos sintéticos están comercialmente disponibles de Brandon Associates (Merrimack, N. H.) y Aldrich Chemical (Milwaukee , Wis.). Los antagonistas de PD-1 pueden identificarse de bibliotecas de compuestos sintéticos que están comercialmente disponibles de varias compañías, incluyendo, Maybridge Chemical Co . (Trevillet, Cornwall, RU) , Comgenex (Princeton, N. J. ) , Brandon Associates (Merrimack, N. H.), y Microsource (New Milford, Conn. ) . Los antagonistas de PD-1 pueden identificarse de una biblioteca química rara, tal como la biblioteca que está disponible de Aldrich (Milwaukee, Wis.). Los antagonistas de PD-1 pueden identificarse en bibliotecas de compuestos naturales en la forma de extractos bacterianos, de hongos, plantas y animales, que están comercialmente disponibles de varias fuentes, incluyendo Biotics (Sussex, UK) , Xenova (Slough, UK) , Harbor Branch Oceangraphics Institute (Ft.
Pierce, Fia.), y PharmaMar, E.U.A. (Cambridge, Mass.). Las bibliotecas y compuestos naturales y producidos de manera sintética se modifican fácilmente a través de medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales.
Los compuestos útiles pueden encontrarse dentro de numerosas clases químicas, aunque típicamente son compuestos orgánicos, incluyendo compuestos orgánicos pequeños . Los compuestos orgánicos pequeños que tienen un peso molecular de más de 50, pero menos que aproximadamente 2,500 daltons, tales como menos que aproximadamente 750 o menos que aproximadamente 350 daltons, pueden utilizarse en los métodos descritos en la presente. Las clases ejemplares incluyen heterociclos , péptidos, sacáridos, esteroides y lo similar. Los compuestos pueden modificarse para mejorar la eficacia, estabilidad, compatibilidad farmacéutica y lo similar. En varias modalidades, los compuestos de uso tienen una Kd para PD-1, PD-L1 o PD-L2 de menos que 1 nM, menos que 10 nm, menos que 1 µ?, menos que 10 µ?, o menos que 1 mM.
D. Variantes del péptido PD-1 como antagonistas En una modalidad, las variantes de una proteína PD-1 que funciona como un antagonista pueden identificarse seleccionando bibliotecas combinatorias de mutantes, tales como mutantes puntuales o mutantes truncos, de una proteína PD-1 para identificar proteínas con actividad antagonista. En un ejemplo, el antagonista es una proteína PD-1 soluble.
Así, una biblioteca de variantes de PD-1 pueden generarse mediante mutagénesis combinatoria a nivel de ácidos nucleicos, y se codifica por una biblioteca de genes abigarrada. Una biblioteca de variantes de PD-1 puede producirse por ejemplo, ligando enzimáticamente una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en las secuencias génicas, de manera que un conjunto degenerado de secuencias de PD-1 potenciales es expresable como polipéptidos individuales, o de manera alterna, como un conjunto de proteínas de fusión más largas (tales como para la representación del fago) , que contienen el conjunto de secuencias de PD-1.
Existe una variedad de métodos que pueden utilizarse para producir bibliotecas de variantes de PD-1 potenciales de una secuencia oligonucleotídica degenerada. La síntesis química de una secuencia génica degenerada puede realizarse en un sintetizador de ADN automático, y el gen sintético se liga a continuación en un vector de expresión apropiado. El uso de un conjunto de genes degenerados permite proporcionar, en una mezcla, todas las secuencias que codifican el conjunto deseado de secuencias del antagonista de PD-1 potencial. Los métodos para sintetizar los oligonucleótidos degenerados se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Narang, et al., Tetrahedron 39:3, 1983; Itakura et al., Annu. Rev. Biochem. 53:323, 1984; Itakura et al., Science 198:1056, 1984) .
Además, las bibliotecas de fragmentos de una secuencia que codifica la proteina PD-1 pueden utilizarse para generar una población de fragmentos de PD-1 para revisar y seleccionar posteriormente las variantes de un antagonista de PD-1. En una modalidad, una biblioteca de fragmentos de la secuencia codificante puede generarse tratando un fragmento de la PCR de doble hebra de una secuencia que codifica PD-1 con una nucleasa, bajo condiciones en donde la formación de muescas ocurre sólo aproximadamente una vez por molécula, desnaturalizar el ADN de doble hebra, renaturalizar el ADN para formar el ADN de doble hebra que puede incluir pares sentido/antisentido de diferentes productos con muescas, retirar las porciones de una sola hebra de los dúplex reformados mediante el tratamiento con nucleasa SI, y ligar la biblioteca del fragmento resultante en un vector de expresión. Mediante este método, puede derivarse una biblioteca de expresión que codifica los fragmentos N terminales, C terminales e internos de varios tamaños de PD-1.
Se conocen varias técnicas en el campo para seleccionar los productos génicos de bibliotecas combinatorias hechas mediante mutaciones puntuales o truncamiento, y para seleccionar las bibliotecas de ADNc para productos génicos que tienen una propiedad seleccionada. Tales técnicas son adaptables para la selección rápida de las bibliotecas génicas generadas mediante la mutagénesis combinatoria de las proteínas PD-1. Las técnicas utilizadas más ampliamente, que son susceptibles de análisis de alto rendimiento, para seleccionar grandes bibliotecas génicas, incluyen típicamente la clonación de la biblioteca génica en vectores de expresión replicables, transformar las células apropiadas con la biblioteca resultante de vectores, y expresar los genes combinatorios bajo condiciones en las cuales la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se detectó. La mutagénesis de conjunto recursiva (REM) puede utilizarse en combinación con los ensayos de selección para identificar los antagonistas de PD-1 (Arkin y Youvan, Proc . Nati. Acad. Sci. EUA 89:7811 7815, 1992; Delagrave et al., Protein Eng. 6(3):327 331, 1993).
En una modalidad, los ensayos basados en células pueden explotarse para analizar una biblioteca de variantes de PD-1. Por ejemplo, una biblioteca de vectores de expresión puede transíectarse en una linea celular que ordinariamente sintetiza y secreta PD-1. Las células transíectadas se cultivan a continuación, de manera que se secreta el PD-1 y una variante particular de PD-1. El efecto de la expresión del mutante en la actividad de PD-1 en los sobrenadantes celulares puede detectarse, tal como mediante cualquiera de los ensayos funcionales. El ADN del . plásmido puede recuperarse entonces de las células, en donde la actividad endógena del PD-1 se inhibe, y las clonas individuales se caracterizan adicionalmente .
También pueden utilizarse peptidomiméticos como antagonistas de PD-1. Los análogos peptidicos se utilizan comúnmente en la industria farmacéutica como fármacos no peptidicos con propiedades análogas a aquéllas del péptido de la plantilla. Estos tipos de compuestos no peptidicos se desarrollan usualmente con la ayuda de modelado molecular computarizado . Los miméticos peptidicos que son estructuralmente similares a los péptidos terapéuticamente útiles, pueden utilizarse para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente. Generalmente, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido de paradigma (por ejemplo, un polipéptido que tiene actividad biológica de PD-1), pero que tiene uno o más enlaces peptidicos reemplazados opcionalmente por enlaces -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (cis y trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2- y -CH2SO- . Estos enlaces peptídicos pueden reemplazarse mediante métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, orley, Trends Pharm. Sci. pp. 463 468, 1980; Hudson et al., Int. J. Pept . Prot . Res. 14:177 185, 1979; Spatola, Life Sci. 38:1243 1249, 1986; Holladay, et al., Tetrahedron Lett. 24:4401 4404, 1983). Los miméticos peptídicos pueden conseguirse de manera económica, son estables y pueden tener una vida media o absorción incrementada. El marcado de los peptidomiméticos involucra usualmente la unión covalente de una o más marcas, directamente o a través de un espaciador (tal como mediante un grupo amida) , a posiciones no interfirientes en el peptidomimético que se predicen mediante datos cuantitativos de la estructura-actividad y/o modelado molecular. Tales posiciones no interfirientes generalmente son posiciones que no forman contactos directos con las macromoléculas a las cuales el peptidomimético se une para producir el efecto terapéutico. La derivación de los peptidomiméticos no debe interferir sustancialmente con la actividad biológica o farmacológica deseada del peptidomimético.
Una proteína negativa dominante o un ácido nucleico que codifica una proteína negativa dominante que interfiere con la actividad biológica de PD-1 (es decir, unión de PD-1 a PD-Ll, PD-L2, o ambos), también puede utilizarse en los métodos descritos en la presente. Una proteina negativa dominante es cualquier molécula de aminoácido que tenga una secuencia que tenga al menos 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, o incluso 99% de identidad de la secuencia con al menos 10, 20, 35, 50, 100, o más de 150 aminoácidos de la proteina del tipo silvestre a la cual corresponde la proteina negativa dominante. Por ejemplo, un PD-Ll negativo dominante tiene mutaciones de manera que se une a PD-1 de manera más estrecha que el PD-1 nativo (tipo silvestre) , pero no activa ninguna señalización celular a través de PD-1.
La proteina negativa dominante puede administrarse como un vector de expresión. El vector de expresión puede ser un vector no viral o un vector viral (por ejemplo, retrovirus, virus adenoasociado recombinante, o un vector adenoviral recombinante) . De manera alterna, la proteina negativa dominante puede administrarse directamente como una proteina recombinante, de manera sistémica o al área infectada utilizando, por ejemplo, técnicas de microinyección .
Los antagonistas polipeptidicos pueden producirse en células hospedantes procarióticas o eucarióticas mediante la expresión de los polinucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos, frecuentemente como parte de un polipéptido mayor (una proteina de fusión, tal como con ras o una enzima) . De manera alterna, tales péptidos pueden sintetizarse mediante métodos químicos . Los métodos para la expresión de las proteínas heterólogas en hospedantes recombinantes , la síntesis química de los polipéptidos y la traducción in vitro son bien conocidos en la técnica (véase, Maniatis el al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), 2a Ed., Cold Spring Harbor, N. Y.; Berger y Kimmel, Methods in Enzymology, Volumen 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Kaiser et al., Science 243:187, 1989; Merrifield, Science 232:342, 1986; Kent, Annu. Rev. Biochem. 57:957, 1988) .
Los péptidos pueden producirse, tal como mediante síntesis química, y utilizarse como antagonistas de una interacción de PD-1 con un ligando. Los péptidos pueden producirse como péptidos modificados, con porciones no peptídicas unidas mediante un enlace covalente al término N y/o al término C. En ciertas modalidades preferidas, ya sea el término carboxi o el término amino o ambos, están modificados químicamente. Las modificaciones más comunes de los grupos amino y carboxilo terminales son la acetilación y la amidación, respectivamente. Las modificaciones amino terminales tales como la acilación (por ejemplo, acetilación) o alquilación (por ejemplo, metilación) y las modificaciones carboxi terminales, tales como la amidación, asi como otras modificaciones terminales, incluyendo la ciclización, pueden incorporarse en varias modalidades. Ciertas modificaciones aminoterminales y/o carboxiterminales y/o extensiones peptidicas a la secuencia central, pueden proporcionar propiedades físicas, químicas, bioquímicas y farmacológicas ventajosas, tales como: estabilidad mejorada, potencia y/o eficacia incrementada, resistencia a las proteasas del suero, propiedades farmacocinéticas deseables y otras.
Método de Tratamiento: Administración de un Antagonista de PD-1 a un Sujeto Se proporciona métodos en la presente para tratar una variedad de infecciones y cánceres. En estos métodos, la infección o el cáncer se trata, se evita o un síntoma es aliviado administrando a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de PD-1. El sujeto puede ser cualquier mamífero tal como un humano, un primate, ratón, rata, perro, gato, vaca, caballo y cerdo. En varios ejemplos, el sujeto es un primate, tal como un humano. En los ejemplos adicionales, el sujeto es un sujeto murino, tal como un ratón. En algunas modalidades, el método incluye medir la proliferación de linfocittos B de memoria en una muestra de un sujeto (ver más adelante). En algunos ejemplos, los métodos también incluyen medir los linfocitos B que no se han encontrado con el antigeno, en una muestra del sujeto. En ejemplos adicionales, los métodos incluyen medir los linfocitos T que expresan células CD28 (CD28+) .
En varias modalidades, el sujeto está en riesgo de desarrollar una infección. Un sujeto en riesgo de desarrollar una infección es un sujeto que aún no tiene la infección, pero puede infectarse mediante el agente infeccioso de interés. En los ejemplos adicionales, el sujeto tiene una infección, tal como una infección persistente, por ejemplo, una infección crónica. Un sujeto con una infección persistente, tal como una infección crónica, puede identificarse mediante métodos estándar adecuados por alguien con experiencia en la técnica, tal como un médico.
En varios ejemplos, el sujeto tiene una infección persistente con una bacteria, virus, hongo o parásito. Generalmente, las infecciones persistentes, en contraste con las infecciones agudas, no son eliminadas de manera efectiva por la inducción de una respuesta inmunitaria del hospedante. El agente infeccioso y la respuesta inmunitaria alcanzan el equilibrio, de manera que el sujeto infectado permanece infeccioso durante un periodo de tiempo largo sin expresar síntomas necesariamente. Las infecciones persistentes incluyen, por ejemplo, infecciones latentes, crónicas y lentas. La infección persistente ocurre con virus tales como los virus de la leucemia de los linfocitos T humanos, virus de Epstein-Barr , citomegalovirus, virus del herpes, virus de la varicela-zoster, sarampión, papovavirus, priones, virus de la hepatitis, adenovirus, XMRV, virus JC de polioma, parvovirus y papilomavirus.
En una infección crónica, el agente infeccioso puede detectarse en el cuerpo en todo momento. Sin embargo, los signos y síntomas de la enfermedad pueden estar presentes o ausentes durante un periodo de tiempo extendido. Los ejemplos de infección crónica incluyen el adenovirus de la hepatitis B (causada por el virus de la hepatitis B (HBV) ) y hepatitis C (causada por el virus de la hepatitis C (HCV) ) adenovirus, citomegalovirus, virus de Epstein-Barr, virus 1 del herpes simple, virus 2 del herpes simple, virus 6 del herpes humano, virus de la varicela-zoster, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis D, virus del papiloma, parvovirus B19, poliomavirus K, poliomavirus JC, XMRV, virus del sarampión, virus de la rubéola, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) , virus I de la leucemia de los linfocitos T humanos y virus II de la leucemia de los linfocitos T humanos. Las infecciones persistentes parasitarias pueden surgir como resultado de infección con Leishmania, Toxoplasma, Tripanosoma, Plasmodio, Esquistosoma y Encefalitozoon .
En una infección latente, el agente infeccioso (tal como un virus), aparentemente está inactivo y aletargado, de manera que el sujeto no siempre exhibe signos o síntomas. En una infección viral latente, el virus permanece en equilibrio con el hospedante durante largos periodos de tiempo antes de que aparezcan nuevamente los síntomas; sin embargo, los virus reales no pueden detectarse hasta que ocurre la reactivación de la enfermedad. Los ejemplos de infecciones latentes incluyen infecciones causadas por el virus del herpes simple (HSV) -1 (ampollas por fiebre), HSV-2 (herpes genital), y virus de la varicela zoster VZV (varicela-herpes) .
En una infección lenta, los agentes infecciosos gradualmente incrementan su número durante un periodo de tiempo muy largo durante el cual no se observan signos o síntomas significativos. Los ejemplos de infecciones lentas incluyen SIDA (causado por VIH-1 y VIH-2) , lentivirus que causan tumores en animales, y priones.
Además, las infecciones persistentes surgen con frecuencia como complicaciones tardías de infecciones agudas. Por ejemplo, la panencefalitis esclerosante subaguda (SSPE) , puede aparecer después de una infección por sarampión aguda o una encefalitis regresiva puede ocurrir como resultado de una infección con rubéola.
En un ejemplo no limitante, un sujeto puede diagnosticarse como que tiene una infección por Clamidia persistente después de la detección de la especie de Clamidia en una muestra biológica de este individuo, utilizando análisis de PCR. Los mamíferos no necesitan haber sido diagnosticados con una infección persistente para tratarse de acuerdo con esta descripción. Los agentes microbianos capaces de establecer una infección persistente incluyen virus (tales como el virus del papiloma, virus de la hepatitis, virus de la deficiencia inmune humana y virus del herpes), bacterias (tales como Escherichia coli y Chlamydia spp.), parásitos' (tales como Leishmania spp., Schistosoma spp., Trypanosoma spp., Toxoplasma spp.) y hongos.
Además del compuesto que reduce la expresión o actividad de PD-1, al sujeto siendo tratado también puede administrársele una vacuna. En un ejemplo, la vacuna puede incluir un adyuvante. En otro ejemplo, la vacuna puede incluir una inmunización de refuerzo principal. La vacuna puede ser una vacuna destruida con calor, una vacuna atenuada o una vacuna de una subunidad. Un sujeto ya infectado con un patógeno puede tratarse con una vacuna terapéutica, tal como un antagonista de PD-1 y un antigeno. El sujeto puede ser asintomático, de manera que el tratamiento evita el desarrollo de un síntoma. La vacuna terapéutica puede reducir también la severidad de uno o más síntomas existentes, o reducir la carga del patógeno .
En varios ejemplos de métodos de tratamiento, al sujeto se le administra una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de PD-1 en conjunto con un antígeno viral. Los ejemplos no limitantes de antígenos virales adecuados incluyen: antígenos de la influenza HA, NA, M, NP y NS; p24 de VIH, pol, gp41 y gpl20; proteínas F y G de Metapneumovirus (hMNV) ; proteínas El, E2 y del núcleo del virus de la Hepatitis C (HCV) ; proteínas El, E2 y del núcleo del virus del Dengue (DEN 1-4); proteína Ll del Virus del Papiloma Humano; péptido gp220/350 y EBNA-3A del Virus de Epstein Barr; glucoproteína gB de Citomegalovirus (CMV) , glucoproteína gH, pp65, IE1 (exón 4) y ppl50; epitopos del péptido IE62 y la glucoproteína E del virus de la Varicela Zoster (VZV) ; epitopos de la Glucoproteína D del Virus Simple del Herpes, polipéptidos del virus del polioma JC, polipéptidos de XMRV, entre muchos otros. Los polipéptidos antigénicos pueden corresponder a polipéptidos de aislados virales animales o humanos naturales, o pueden diseñarse para incorporar o más sustituciones de aminoácidos en comparación con aislado natural (patogénico o no patogénico) . antigenos ejemplares se listan a continuación: Tabla 1 : Ant genco ejemplares de interés (antigenos objetivo) En modalidades adicionales, el sujeto tiene un tumor. El método incluye administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de PD-1, tratando de ese modo el tumor. En varios ejemplos, una cantidad terapéuticamente efectiva de un antigeno del tumor, o un nucleótido que codifica el antigeno del tumor, también se administra también al sujeto. El antagonista de PD-1 y el antigeno del tumor, o el nucleótido que codifica el antigeno del tumor, pueden administrarse de manera simultánea o secuencial.
La administración del antagonista de PD-1 resulta en una disminución en el tamaño, prevalencia o potencial metastásico de un tumor en un sujeto. La valoración del cáncer se hace utilizando protocolos clínicos estándar. La eficacia se determina en asociación con cualquier método conocido para diagnosticar o tratar el tumor particular.
Los tumores (también llamados "cánceres") , incluyen tumores sólidos y leucemias. Los tumores ejemplares incluyen aquéllos listados en la Tabla 2 (junto con los antígenos del tumor conocidos asociados con estos cánceres) .
Tabla 2: Tumores ejemplares y sus antigenos del tumor Tumor Antigenos del tumor Leucemia mielógena aguda Tumor de Wilms 1 (WT1) , antígeno expresado de manera preferencial de melanoma (PRAME) , PRl, proteinasa 3, elastasa, catepsina G Leucemia mielógena crónica T1, PRAME, PRl, proteinasa 3, elastasa, catepsina G Síndrome mielodisplásico WT1, PRAME, PRl, proteinasa 3, elastasa, catepsina G Leucemia linfoblástica aguda PRAME Leucemia linfocítica crónica Survivina Linfoma no de Hodgkin Survivina Mieloma múltiple Esófago New York 1 (NY-Esol) Melanoma maligno MAGE, MART, Tirosinasa, PRAME, GP100 Cáncer de mama WT1, herceptina Cáncer de pulmón WT1 Cáncer de próstata Antígeno específico de la próstata (PSA) Cáncer de colon Antígeno carcinoembriónico (CEA) Carcinoma de las células Factor 5 de crecimiento del fibroblasto renales (RCC) (FGF-5) Tabla 3 : Antigenos del tumor ejemplares de interés incluyen aquéllos listados a continuación Los ejemplos no limitantes específicos son el linfoma angioinmunoblástico o el linfoma de Hodgkin predominante del linfocito nodular. El linfoma angioinmunoblástico (AIL) es un tipo agresivo (progresa rápidamente) de linfoma no de Hodgkin de los linfocitos T, marcado por nodos linfáticos agrandados y por hipergammaglobulinemia (anticuerpos incrementados en la sangre) . Otros síntomas pueden incluir un salpullido en la piel, fiebre, pérdida de peso, prueba de Coomb positiva o sudores nocturnos. Esta malignidad con frecuencia aparece en adultos. Los pacientes tienen usualmente 40-90 años (media alrededor de 65) y con más frecuencia son masculinos. Conforme la progresa, puede desarrollarse hepatoesplenomegalia, anemia hemolítica e hipergammaglobulinemia policlonal. La piel está involucrada en aproximadamente 40-50% de los pacientes.
El linfoma de Hodgkin predominante de los linfocitos nodulares es un neoplasma de los linfocitos B que parece derivarse de los linfocitos B del centro germinal, con genes de inmunoglobulina no funcionales, mutados. Similar al linfoma angioinmunoblástico, las células neoplásicas están asociadas con una malla de células dendriticas foliculares. La expresión de PD-1 se observa en los linfocitos T asociados estrechamente con las células CD20+ neoplásicas en el linfoma de Hodgkin predominante de los linfocitos nodulares, en un patrón similar a aquél observado para los linfocitos T CD57+. CD57 se ha identificado como otro marcador de los linfocitos T asociados con el centro germinal, junto con CXCR5, hallazgos que sustentan la conclusión de que las células neoplásicas en el linfoma de Hodgkin predominante de los linfocitos nodulares tienen una estrecha asociación con los linfocitos T asociados con el centro germinal.
La expresión de un antigeno del tumor de interés puede determinarse a nivel de la proteína o el ácido nucleico, utilizando cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, el análisis de hibridación Northern que utiliza sondas que de manera específica, reconocen una o más de estas secuencias, puede utilizarse para determinar la expresión del gen. De manera alterna, la expresión se mide utilizando ensayos de PCR basados en la transcripción inversa, tal como utilizando cebadores específicos para la secuencia de genes expresada diferencialmente . La expresión también se determina a nivel de la proteína, tal como midiendo los niveles de los péptidos codificados por los productos génicos descritos en la presente, o las actividades de los mismos. Tales métodos son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, inmunoensayos basados en anticuerpos para las proteínas codificadas por los genes. Cualquier material biológico puede utilizarse para la detección/cuantificación de la proteína o la actividad.
En un ejemplo, el sujeto se ha diagnosticado previamente como que tiene cáncer. En los ejemplos adicionales, el sujeto se ha sometido a tratamiento previo para el cáncer. Sin embargo, en algunos ejemplos, el sujeto no se ha diagnosticado previamente como que tiene cáncer. El diagnóstico de un tumor sólido puede hacerse a través de la identificación de una masa en un examen, aunque puede también ser a través de otros medios, tales como diagnóstico radiológico o ultrasonido. El tratamiento del cáncer puede incluir cirugía, o puede incluir el uso de agentes quimioterapéuticos, tales como docetaxel, gemcitabina vinorelbina, capecitabina o combinaciones de ciclofosfamida, metotrexato y fluorouracilo ; ciclofosfamida, doxorrubicina y fluorouracilo ; doxorrubicina y ciclofosfamida ; doxorrubicina y ciclofosfamida con paclitaxel; doxorrubicina seguida por C F (Ciclofosfamida, epirrubicina y fluorouracilo ) . Además, el tratamiento puede incluir el uso de radiación.
En varios ejemplos, una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de PD-1 se administra al sujeto. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un antígeno del tumor, o un ácido nucleico que codifica el antígeno, se administra también al sujeto. La administración puede ser concurrente o puede ser secuencial .
Para el tratamiento de un sujeto con una infección persistente (tal como una infección crónica) o un tumor, una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de PD-1 se administra al sujeto de interés. En un ejemplo, una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de PD-1 es una dosis biológicamente activa, tal como una dosis que inducirá un incremento en la actividad citotóxica de los linfocitos T CD8+, el incremento en la respuesta inmunitaria especifica al agente infeccioso. De manera deseable, el antagonista de PD-1 tiene la capacidad para reducir la expresión o la actividad de PD-1 en células inmunes especificas del antigeno (por ejemplo, linfocitos T tales como linfocitos T CD8+ ) , por al menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o más que el 100% por debajo de los niveles de control no tratados. Los niveles o la actividad de PD-1 en las células inmunes se miden mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, por ejemplo, análisis de transferencia Western, inmunohistoquimica , ELISA y análisis de transferencia Northern. De manera alterna, la actividad biológica de PD-1 se mide valorando la unión de PD-1 a PD-L1, PD-L2, o ambos. La actividad biológica de PD-1 se determina de acuerdo con su capacidad para incrementar la citotoxicidad de los linfocitos T CD8+, incluyendo, por ejemplo, producción de citocina, depuración del agente infeccioso y proliferación de los linfocitos T CD8+ específicos del antígeno. De manera preferida, el agente que reduce la expresión o la actividad de PD-1 puede incrementar la respuesta inmunitaria específica al agente infeccioso o el tumor por al menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o más que el 100% por encima de los niveles de control no tratados. El agente de la presente invención es por lo tanto, un agente que tiene una o más de estas actividades. Aunque el agente se expresa de manera preferida en los linfocitos T CD8+, se entiende que cualquier célula que pueda influenciar la respuesta inmunitaria a las infecciones persistentes, también es susceptible para los métodos de la invención e incluye, por ejemplo, linfocitos B.
Opcionalmente , se le administra al sujeto uno o más agentes terapéuticos adicionales. Los agentes terapéuticos adicionales incluyen, por ejemplo, compuestos antivirales (por ejemplo, vidarabina, aciclovir, ganciclovir, valganciclovir , inhibidor de la transcriptasa inversa del análogo del nucleósido (NRTI) (por ejemplo, AZT (Zidovudina) , ddl (Didanosina) , ddC ( Zalcitabina ) , d4T (Stavudina) o 3TC (Lamivudina) ) , inhibidor de la transcriptasa inversa no del nucleósido (NNRTI) (por ejemplo, (nevirapina o delavirdina) , inhibidor de la proteasa (saquinavir, ritonavir, indinavir o nelfinavir) , ribavirina o interferón) , compuestos antibacterianos, compuestos antimicóticos, compuestos antiparasitarios, compuestos antiinflamatorios, agentes antineoplásicos (quimioterapéuticos ) o analgésicos.
El agente terapéutico adicional se administra antes, de manera concomitante o posterior ' a la administración del antagonista de PD-1. Por ejemplo, el antagonista de PD-1 y el agente adicional se administran en formulaciones separadas en el transcurso de al menos 1, 2, 4, 6, 10, 12, 18 o más que 24 horas de separación. Opcionalmente , el agente adicional se formula junto con el antagonista de PD-1. Cuando el agente adicional está presente en una composición diferente, pueden utilizarse diferentes rutas de administración. El agente se administra a dosis conocidas por ser efectivas para tal agente, para tratar, reducir o prevenir una. infección.
Las concentraciones del antagonista de PD-1 y el agente adicional, dependen de diferentes factores, incluyendo los medios de administración, el sitio objetivo, el estado fisiológico del mamífero, y otro medicamento administrado. Así, las dosificaciones del tratamiento pueden titularse para optimizar la seguridad y la eficacia y está dentro de conocimiento del experto. La determinación de la dosificación y el régimen de administración apropiados para una situación particular, está dentro de la experiencia de la técnica.
Opcionalmente, al sujeto se le administra además una vacuna, que provoca una respuesta inmunitaria protectora contra el agente infeccioso que causa una infección persistente. Por ejemplo, el sujeto recibe una vacuna que provoca una respuesta inmunitaria contra el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), tuberculosis, influenza, XMRV, virus del polioma JC, o hepatitis C, entre otros. Las vacunas ejemplares se describen, por ejemplo, en Berzofsky et al. (J. Clin. Invest. 114:456-462, 2004). Si se desea, la vacuna se administra como una dosis de refuerzo principal o con adyuvantes. La vacuna puede también ser una vacuna para un tumor, tal como una cantidad terapéuticamente efectiva de un antigeno del tumor. En varias modalidades, se administra al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido antigénico, tal como un antigeno viral o del tumor.
Una cantidad terapéuticamente efectiva del antigeno del tumor, o un ácido nucleico que codifica el antigeno del tumor puede administrarse al sujeto. Los polinucleótidos incluyen un ADN recombinante que se incorpora en un vector en un plásmido o virus que se replica de manera autónoma o en el ADN genómico de un procariote o eucariote, o que existe como una molécula separada (tal como un ADNc) independiente de otras secuencias. Los nucleótidos pueden ser ribonucleótidos , desoxirribonucleótidos o formas modificadas de cualquier nucleótido. El término incluye formas sencillas y dobles del ADN.
Se han construido varios vectores virales, incluyendo un polioma, es decir, SV40 (Madzak et al., 1992, J. Gen. Virol, 73:15331536), adenovirus (Berkner, 1992, Cur. Top. Microbiol. Immunol, 158:39-6; Berliner et al., 1988, Bio Techniques, 6:616-629; Gorziglia et al . , 1992, J. Virol, 66:4407-4412; Quantin et al . , 1992, Proc. Nad. Acad. Sci. EUA, 89:2581-2584; Rosenfeld et al., 1992, Cell, 68:143-155; Wilkinson et al., 1992, Nucí Acids Res., 20:2233-2239; Stratford-Perricaudet et al . , 1990, Hum. Gene Ther., 1:241-256), virus Vaccinia (Mackett et al., 1992, Biotechnology, 24:495-499), virus adenoasociados (Muzyczka, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol, 158:91-123; On et al., 1990, Gene, 89:279-282), virus del herpes incluyendo HSV y EBV (Margolskee, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol, 158:67-90; Johnson et al., 1992, J. Virol, 66:29522965; Fink et al., 1992, Hum. Gene Ther. 3:11-19; Breakfield et al., 1987, Mol. Neurobiol, 1:337-371; Fresse et al., 1990, Biochem. Pharmacol, 40:2189-2199), virus Sindbis (H. Herweijer et al., 1995, Human Gene Therapy 6:1161-1167; Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,091,309 y 5,2217,879), alfavirus (S. Schlesinger, 1993, Trends Biotechnol. 11:18-22; I. Frolov et al., 1996, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 93: 11371-11377) y retrovirus de aviares (Brandyopadhyay et al., 1984, Mol. Cell Biol, 4:749-754; Petropouplos et al., 1992, J. Virol, 66:3391-3397), murinos (Miller, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol, 158:1-24; Miller et al., 1985, Mol. Cell Biol, 5:431-437; Sorge et al., 1984, Mol. Cell Biol, 4:1730- 1737; ann et al., 1985, J. Virol, 54:401-407) y de origen humano (Page et al., 1990, J. Virol, 64:5370-5276; Buchschalcher et al., 1992, J. Virol, 66:2731-2739). Los vectores de baculovirus (virus de la polihedrosis multinuclear de Autographa calífornica; AcMNPV) también son conocidos en la técnica, y pueden obtenerse de fuentes comerciales (tales como PharMingen, San Diego, Calif.; Protein Sciences Corp., Meriden, Conn.; Stratagene, La Jolla, Calif. ) .
En una modalidad, el polinucleótido que codifica un antigeno del tumor o un antigeno viral está incluido en un vector viral. Los vectores adecuados incluyen vectores de retrovirus, vectores de ortopox, vectores de avipox, vectores de la viruela aviar, vectores de capripox, vectores de suipox, vectores adenovirales , vectores del virus del herpes, vectores de alfa virus, vectores de baculovirus, vectores de virus Sindbis, vectores de virus Vaccinia y vectores de poliovirus. Los vectores ejemplares específicos son los vectores de poxvirus tales como el virus Vaccinia, el virus de la viruela aviar y un virus Vaccinia altamente atenuado (MVA) , adenovirus, baculovirus y lo similar.
Los virus de la viruela de uso incluyen virus ortopox, suipox, avipox y capripox. Los ortopox incluyen vaccinia, ectromelia y viruela de mapache. Un ejemplo de un ortopox de uso es el vaccinia. Los avipox incluyen la viruela aviar, la viruela de los canarios y la viruela de las palomas . Capripox incluye viruela de las cabras y viruela de las ovejas. En un ejemplo, el suipox es viruela porcina. Los ejemplos de vectores virales de la viruela para la expresión, se describen por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos No. 6, 165,460, la cual se incorpora en la presente como referencia. Otros vectores virales que pueden utilizarse incluyen otros ADN virus tales como el virus del herpes y adenovirus, y ARN virus tales como retrovirus y polio.
En varias modalidades, los antagonistas de PD-1 se administran en una cantidad suficiente para incrementar los linfocitos T, tales como la citotoxicidad de los linfocito. T CD8+. Un incremento en la citotoxicidad de los linfocitos T resulta en una respuesta inmunitaria incrementada y en una reducción de la infección persistente o una reducción en un signo o un síntoma de un tumor. Una respuesta inmunitaria incrementada puede medirse, por ejemplo, mediante un incremento en la proliferación de las células inmunes, tal como la proliferación de los linfocitos T o los linfocitos B, un incremento en la producción de citocina y un incremento en la depuración de un agente infeccioso o una reducción en la carga del tumor. Asi, el método puede resultar en el alivio de uno o más síntomas asociados con la infección persistente o el tumor. Así, la administración del antagonista de PD-1 reduce la infección persistente, inhibe el crecimiento/tamaño de un tumor, o alivia uno o más de los síntomas asociados con la infección persistente o el tumor por al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100%, en comparación con un sujeto no tratado.
El tratamiento es eficaz si el tratamiento conduce a un beneficio clínico tal como una reducción de la carga del agente infeccioso o una reducción de la carga del tumor en el sujeto. Cuando el tratamiento se aplica de manera profiláctica, "eficaz" significa que el tratamiento retarda o previene que se forme una infección, tal como por un perioro de seis meses, un año, dos años, tres años o más. La eficacia puede determinarse utilizando cualquier método conocido para diagnosticar o tratar la infección o tumor particular.
Así, los métodos incluyen administrar a un sujeto, una composición farmacéutica que incluye una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de PD-1. Una cantidad efectiva de un compuesto terapéutico, tal como un anticuerpo, puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 150 mg/kg. Las dosis efectivas varían, como se reconoce por alguien con experiencia en la técnica, dependiendo de la ruta de administración, el uso del excipiente y la coadministración con otros tratamientos terapéuticos, incluyendo el uso de otros agentes antiinfección o agentes terapéuticos para tratar, prevenir o aliviar un síntoma de una infección o cáncer particular. Se utiliza un régimen terapéutico para un paciente humano que sufre de (o está en riesgo de desarrollar) , una infección o cáncer, utilizando métodos estándar.
El antagonista de PD-1 se administra a tal individuo utilizando métodos conocidos en la técnica. Puede utilizarse cualquier antagonista de PD-1, tal como aquéllos descritos en la presente. Además, puede utilizarse más de un antagonista de PD-1. Un antagonista de PD-1 puede administrarse de manera local o sistémica. Por ejemplo, el antagonista de PD-1 se administra de manera oral, rectal, nasal, tópica, parenteral, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular e intravenosa. El antagonista de PD-1 puede administrarse de manera profiláctica, o después de la detección de una infección o tumor. El antagonista de PD-1 se formula opcionalmente como un componente de un cóctel de fármacos terapéuticos para tratar la infección. Los ejemplos de formulaciones adecuadas para la administración parenteral, incluyen soluciones acuosas del agente activo en una solución salina isotónica, una solución de glucosa al 5% u otro excipiente farmacéuticamente aceptable estándar. Los agentes solubilizantes estándar tales como PVP o ciclodextrinas se utilizan también como excipientes farmacéuticos para el suministro de los compuestos terapéuticos.
Los compuestos terapéuticos descritos en la presente se formulan en composiciones para otras rutas de administración utilizando métodos convencionales. Por ejemplo, el antagonista de PD-1 se formula en una cápsula o una tableta para la administración oral. Las cápsulas pueden contener cualesquier materiales farmacéuticamente aceptables estándar, tales como gelatina o celulosa. Las tabletas pueden formularse de acuerdo con los procedimientos convencionales comprimiendo las mezclas de un compuesto terapéutico con un portador sólido y un lubricante. Los ejemplos de portadores sólidos incluyen almidón, azúcar y bentonita. El antagonista de PD-1 puede administrarse en la forma de una tableta o una cápsula de cubierta dura que contiene un aglutinante, tal como lactosa o manitol, un relleno convencional y un agente para la formación de tabletas. Otras formulaciones incluyen un ungüento, supositorio, pasta, roció, parche, crema, gel, esponja resorbible o espuma. Tales formulaciones se producen utilizando métodos bien conocidos en la técnica.
Además, los antagonistas de PD-1 pueden administrarse implantando (ya sea directamente en un órgano (por ejemplo, intestino o hígado) o subcutáneamente) , una matriz sólida o resorbible que libera lentamente el compuesto en los tejidos adyacente y circundantes del sujeto. Por ejemplo, para el tratamiento de la infección gastrointestinal, el compuesto puede administrarse de manera sistémica (por ejemplo, de manera intravenosa, rectal u oral), o localmente (por ejemplo, directamente en el tejido gástrico). De manera alterna, una oblea o esponja resorbible impregnada con el antagonista de PD-1 se coloca en contacto directo con el tejido gástrico. El antagonista de PD-1 se libera lentamente in vivo mediante la difusión del fármaco de la oblea y la erosión de la matriz polimérica. Como otro ejemplo, la infección del hígado (es decir, hepatitis) se trata infundiendo en la vasculatura del hígado una solución que contiene el antagonista de PD-1.
En donde el compuesto terapéutico es un ácido nucleico que codifica un antagonista de PD-1, el ácido nucleico puede administrarse in vivo para fomentar la expresión de la proteína codificada, construyéndolo como parte de un vector de expresión del ácido nucleico apropiado y administrándolo de manera que se vuelve intracelular (tal como, mediante el uso de un vector retroviral, mediante inyección directa, mediante el uso de bombardeo de microparticulas , recubriendo con lipidos o receptores de la superficie celular o agentes de transfección, o administrándolo en enlace con un péptido similar a una homeosecuencia, que se sabe entra en el núcleo. (Véase, por ejemplo, Joliot, et al., Proc Nati Acad Sci EUA 88:1864-1868, 1991), y lo similar. De manera alterna, un ácido nucleico terapéutico se introduce intracelularmente y se incorpora dentro del ADN de la célula hospedante para la expresión, mediante recombinación homologa o permanece episomal.
Para la administración local del ADN, pueden utilizarse vectores de terapia génica estándar. Tales vectores incluyen vectores virales, incluyendo aquéllos derivados de virus de la hepatitis defectuosos para la replicación (tales como HBV y HCV) , retrovirus (véase, Publicación del PCT No. WO 89/07136; Rosenberg et al., N. Eng. J. Med. 323 ( ) : 570-578 , 1990, adenovirus (véase, Morsey et al., J. Cell. Biochem. , Supp. 17E, 1993), virus adenoasociados (Kotin et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 87:2211-2215, 1990), virus del herpes simple defectuosos para la replicación (HSV; Lu et al., Resumen, página 66, Resúmenes de la Junta sobre Terapia Génica (Abstracts of the Meeting on Gene Therapy) , Sept. 22-26, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1992, y cualesquier versiones modificadas de estos vectores. Cualquier otro sistema de suministro puede utilizarse para lograr la transferencia in vivo de los ácidos nucleicos en las células eucarióticas . Por ejemplo, los ácidos nucleicos pueden empacarse en liposomas, tales como liposomas catiónicos (Lipofectina) , sistemas de suministro mediados por el receptor, vectores basados en ácidos nucleicos no virales, en eritrocitos libres de hemoglobina o microesferas (tales como microparticulas , véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 4,789,734; Patente de los Estados Unidos No. 4,925,673; Patente de los Estados Unidos No. 3,625,214). El ADN descubierto también puede administrarse.
Con respecto a los inhibidores del ácido nucleico, una cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad que es capaz de producir un resultado médicamente deseable, por ejemplo, una disminución de un producto génico de PD-1 en un animal tratado. Tal cantidad puede determinarse por alguien con experiencia ordinaria en la técnica. La dosificación para cualquier paciente dado depende de muchos factores, incluyendo la talla del paciente, el área superficial corporal, la edad, el compuesto particular a ser administrado, el sexo, hora y ruta de administración, salud general y otros fármacos que se están administrando de manera concurrente. Las dosificaciones pueden variar, pero una dosificación preferida para la administración intravenosa del ADN es de aproximadamente 106 a 1022 copias de la molécula de ADN.
Típicamente, los plásmidos se administran a un mamífero en una cantidad de aproximadamente 1 nanogramo a aproximadamente 5000 microgramos de ADN. De manera deseable, las composiciones contiene de aproximadamente 5 nanogramos a 1000 microgramos de ADN, de 10 nanogramos a 800 microgramos de ADN, de 0.1 microgramos a 500 microgramos de ADN, de 1 microgramo a 350 microgramos de ADN, de 25 microgramos a 250 microgramos de ADN, o de 100 microgramos a 200 microgramos de ADN. De manera alterna, la administración de los vectores adenovirales recombinantes que codifican el antagonista de PD-1 en un mamífero, puede administrarse a una concentración de al menos 105, 106, 107, 108, 109, 1010 ó 1011 unidades que forman placas (ufp) .
En algunas modalidades, para el tratamiento de las infecciones neurológicas, el antagonista de PD-1 puede administrarse de manera intravenosa o intratecal (por ejemplo, mediante la infusión directa en el fluido cerebroespinal) . Para la administración local, una oblea o una esponja resorbible impregnada con el compuesto, se coloca en contacto directo con el tejido del sistema nervioso central (CNS) . El compuesto o la mezcla de compuestos se libera lentamente in vivo mediante difusión del fármaco de la oblea y la erosión de la matriz polimérica. De manera alterna, el compuesto se infunde en el cerebro o en el fluido cerebroespinal, utilizando métodos estándar. Por ejemplo, un anillo de un orificio del buril con un catéter para utilizarse en un puerto de inyección, se coloca para acoplar el cráneo a un orificio del buril perforado en el cráneo. Se tiene acceso a un reservorio de fluido conectado al catéter mediante una aguja o estilete insertado a través de un septo colocado sobre la parte superior del anillo del orificio del buril. Un montaje de catéter (descrito, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos No. 5,954,687), proporciona una trayectoria de flujo de fluido adecuada para la transferencia de los fluidos a, o desde la ubicación seleccionada en, cerca o dentro del cerebro, para permitir la administración del fármaco durante un periodo de tiempo .
En las modalidades adicionales, para las infecciones cardiacas, el antagonista de PD-1 puede suministrarse, por ejemplo, al tejido cardiaco (tal como el miocardio, pericardio o endocardio) mediante inyección intracoronaria directa a través de la pared del pecho o utilizando métodos basados en catéter percutáneo estándar, bajo la guia fluoroscópica . Asi, el antagonista de PD-1 puede inyectarse directamente en el tejido o puede infundirse desde una endoprótesis o un catéter que se inserta en un orificio corporal. Cualquier variedad de catéter coronario o catéter de perfusión puede utilizarse para administrar el compuesto. De manera alterna, el antagonista de PD-1 está recubierto o impregnando en una endoprótesis que se coloca en un vaso coronario.
Las infecciones pulmonares pueden tratarse, por ejemplo, administrando el antagonista de PD-1 mediante inhalación. Los compuestos son suministrados en la forma de un roció en aerosol desde un recipiente o distribuidor presurizado que contienen un propelente adecuado, como un gas, tal como dióxido de carbono o un nebulizador.
Alguien con experiencia en la técnica entenderá que los pacientes tratados pueden haberse sometido a las mismas pruebas para diagnosticar a un sujeto infectado de manera persistente o puede haberse identificado, sin examen, como alguien con alto riesgo, debido a la presencia de uno o más factores de riesgo (tal como exposición al agente infeccioso, exposición a un sujeto infectado, predisposición genética o tener una condición patológica que predisponga a infecciones secundarias). La reducción de los síntomas o el daño de la infección persistente puede incluir también, de manera no exclusiva, el alivio de los síntomas, disminución del grado de enfermedad, estabilización (no empeoramiento) del estado de la enfermedad, retraso o retardo de la progresión de la enfermedad, y mejora o paliación del estado de la enfermedad. El tratamiento puede ocurrir en casa con la supervisión estrecha por el proveedor del cuidado sanitario o puede ocurrir en una instalación de cuidado sanitario .
Los métodos para medir la respuesta inmunitaria después del tratamiento utilizando los métodos descritos en la presente, son bien conocidos en la técnica. La actividad de los linfocitos T puede valorarse, por ejemplo, mediante ensayos que detectan la producción de citocina, ensayos que miden la proliferación de los linfocitos T, ensayos que miden la eliminación del agente microbiano y ensayos que miden la citotoxicidad de los linfocitos T CD8+. Estos ensayos se describen, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos No. 6,808,710 y las Publicaciones de las Solicitudes de Patente de los Estados Unidos Nos. 20040137577, 20030232323, 20030166531, 20030064380, 20030044768, 20030039653, 20020164600, 20020160000, 20020110836, 20020107363 y 20020106730, todas las cuales se incorporan en la presente como referencia. La medida de una respuesta de los linfocitos B, tal como la respuesta de los linfocitos B de memoria, se describe posteriormente.
Opcionalmente, la capacidad de un antagonista de PD-1 para incrementar la citotoxicidad de los linfocitos T CD8+ se valora mediante ensayos que miden la proliferación de los linfocitos T CD8+ (por ejemplo, incorporación de timidina, ensayos con BrdU y tinción con marcadores del ciclo celular (por ejemplo, Ki67 y CFSE) , descritos, por ejemplo, por Dong et al. (Nature 5:1365-1369, 1999). En un ejemplo, la proliferación de los linfocitos T se verifica cultivando los linfocitos T purificados que expresan a PD-1 con un antagonista de PD-1, una señal de activación primaria como se describió anteriormente y 3H-timidina. El nivel de proliferación de los linfocitos T se determina midiendo la incorporación de la timidina.
La citotoxicidad de los linfocitos T CD8+ también puede valorarse mediante análisis de lisis (tal como los ensayos de liberación de 51Cr o ensayos que detectan la liberación de perforina o granzima) , ensayos que detectan la activación de la caspasa o ensayos que miden la depuración del agente microbiano del sujeto infectado. Por ejemplo, la carga viral en una muestra biológica del sujeto infectado (por ejemplo, suero, bazo, hígado, pulmón o el tejido al cual el virus es trópico), puede medirse antes y después del tratamiento.
La producción de citocinas tales como IFNy, TNF-a e IL-2 también puede medirse. Por ejemplo, los linfocitos T purificados son cultivados en la presencia del antagonista de la proteina PD-1 y una señal de activación primaria. El nivel de varias citocinas en el sobrenadante, puede determinarse mediante inmunoanálisis enlazados a enzimas tipo emparedado u otros ensayos convencionales descritos, por ejemplo, en Dong et al. (Nature 5:1365-1369, 1999).
Si se desea, la eficacia del antagonista de PD-1 se valora por su capacidad para inducir la coestimulación de los linfocitos T. Por ejemplo, un método para la coestimulación in vítro de los linfocitos T involucra proporcionar los linfocitos T purificados que expresan a PD-1 con una señal de activación primera o primaria, mediante los anticuerpos monoclonales anti-CD3 o éster de forbol, o mediante el antigeno en asociación con el MHC de clase II. La capacidad de un agente de un compuesto candidato para reducir la expresión o actividad de PD-1, y por lo tanto, para proporcionar la señal secundaria o coestimuladora necesaria para modular la función inmune, para estos linfocitos T, puede evaluarse mediante cualquiera de varios ensayos convencionales bien conocidos en la técnica.
La respuesta del linfocito B al antagonista de PD-1 puede valorarse mediante ELISA especifico del LCMV, ELISPOT de las células del plasma, ensayo de los linfocitos B de memoria, fenotipificación del linfocito B y análisis de los centros germinales mediante inmunohistoquimica .
Métodos de Tratamiento : Inmunoterapia Adoptiva En la presente se describen métodos para el tratamiento de un sujeto de interés, tal como un sujeto con una infección viral persistente (tal como una infección crónica) o un tumor. Los métodos incluyen la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de linfocitos T citotóxicos específicos para un antígeno de interés, tal como un antígeno viral o un antígeno del tumor, y una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de PD-1. En algunas modalidades, el método también puede incluir medir la proliferación de lifocitos B de memoria en una muestra de un sujeto (ver posteriormente) . En modalidades adicionales, los métodos incluyen medir los linfocitos B que no han entrado en contacto con el antígeno en una muestra de un sujeto. En modalidades adicionales, los métodos también incluyen medir los linfóticos T que expresan CD28. En algunas modalidades, los métodos incluyen medir anticuerpos neutralizantes. De ese modo, los métodos descritos incluyen medir al menos uno de los anticuerpos neutralizantes, proliferación de linfocitos B de memoria, linfocitos B que no han entrado en contacto con el antígeno, y linfocitos T que expresan CD28. Dos, tres o todos estos parámetros pueden medirse usando los métodos descritos en la presente.
En la presente se describen métodos para incrementar la respuesta inmunitaria, tal como para mejorar el sistema inmune en un sujeto. La administración de los linfocitos T específicos del antígeno purificados y de PD-1, como se describe en la presente, incrementará la capacidad de un sujeto para superar las condiciones patológicas, tales como una enfermedad infecciosa o un tumor, seleccionando una respuesta inmunitaria contra un patógeno (tal como un virus o un hongo) o neoplasma. Por lo tanto, al purificar y generar una población purificada de los linfocitos T específicos del antígeno seleccionados de un sujeto ex vivo, e introduciendo una cantidad terapéutica de estas células, la respuesta inmunitaria del sujeto receptor se mejora. La administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de PD-1 también mejora la respuesta inmunitaria del receptor.
En la presente se proporcionan métodos para inducir una respuesta inmunitaria hacia un antígeno de interés en un receptor. El receptor puede ser cualquier sujeto de interés, incluyendo un sujeto con una infección crónica, tal como una infección viral o micótica, o un sujeto con un tumor. Estas infecciones se describen anteriormente .
Las infecciones en personas inmunodeficientes son un problema común en los receptores de células troncales o germinales de aloinjerto y en receptores de transplante de órganos permanentemente inmunosuprimidos . Las infecciones por deficiencia de los linfocitos T resultantes en estos sujetos son usualmente de la reactivación de los virus ya presentes en el receptor. Por ejemplo, una vez adquiridos, la mayoría de los virus del grupo del herpes (tales como CMV, EBV, VZV, HSV) están aletargados, y se mantienen suprimidos por los linfocitos T. Sin embargo, cuando los pacientes están inmunosuprimidos por regímenes de acondicionamiento, los virus aletargados pueden reactivarse. Por ejemplo, la reactivación del CMV, la reactivación del virus de Epstein Barr (EBV) que causa un tumor en los linfocitos B (enfermedad linfoproliferativa por EBV) , y la reactivación del virus BK que causa la cistitis hemorrágica, puede ocurrir después de la inmunosupresión . Además, la infección con VIH y la deficiencia inmune congénita son otros ejemplos de la deficiencia inmune de los linfocitos T. Estas infecciones y reactivaciones virales pueden ser un problema en los sujetos inmunosuprimidos.
En varias modalidades, se proporciona una respuesta inmunitaria contra un tumor para el receptor de un transplante de médula ósea. La inmunidad antitumor puede proporcionarse a un sujeto mediante la administración de los linfocitos T específicos del antígeno que reconocen un antígeno del tumor. Tal administración a un receptor mejorará la respuesta inmunitaria del receptor hacia el tumor, proporcionando linfocitos T que están dirigidos a, reconocen e inmunorreaccionan con un antígeno del tumor de interés.
En un ejemplo, el método incluye aislar del donante una población de células donantes, incluyendo linfocitos T (tal como las células mononucleares de sangre periférica) , y poner en contacto una población de células donantes que comprenden los linfocitos T con una población de células que presentan el antígeno (APC) del donante, que están presentando un antígeno de interés, opcionalmente, en la presencia de PD-1, produciendo por lo tanto una población de células donantes que comprenden los linfocitos T CD4+ y/o CD8+ donantes activados extenuados para los linfocitos T alorreactivos que reconocen un antígeno de interés. Una cantidad terapéuticamente efectiva de la población de los linfocitos CD4+ y/o CD8+ activados donantes en el receptor, produciendo por lo tanto una respuesta inmunitaria hacia el antígeno de interés en el receptor. La administración de los linfocitos T específicos del antígeno, purificados, puede incrementar la capacidad de un sujeto para superar las condiciones patológicas, tales como una enfermedad infecciosa o un tumor, dirigiendo una respuesta inmunitaria contra un patógeno (tal como un virus o un hongo) o neoplasma. Asi, se produce una respuesta inmunitaria en el receptor contra el antígeno de interés.
En varias modalidades, el método también incluye administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de PD-1 al sujeto. La administración de los antagonistas de PD-1 se describe con detalle anteriormente .
Cualquier péptido antigénico (tal como un fragmento inmunogénico) de un antígeno de interés, puede utilizarse para generar una población de linfocitos T específicos para ese antígeno de interés. Varios de tales péptidos antigénicos se conocen en la técnica, tales como antígenos virales y de tumor (véanse, por ejemplo, las Tablas 1-3). Esta descripción no está limitada a utilizar péptidos antigénicos específicos. Los ejemplos particulares de péptidos antigénicos de los antígenos de interés, incluyen, de manera no exclusiva, aquellos antígenos que son antígenos virales, micóticos y de tumor, tales como aquéllos mostrados en las Tablas 1-3. Los péptidos antigénicos adicionales son conocidos en la técnica (por ejemplo, véase Novellino et al., Cáncer Immunol. Immunother. 54(3): 187-207, 2005, y Chen et al., Cytotherapy, 4:41-8, 2002, ambas de las cuales se incorporan en la presente como referencia) .
Aunque las Tablas 1 y 3 describen fragmentos particulares de antigenos de interés de longitud completa, alguien con experiencia en la técnica, reconocerá que otros fragmentos o proteínas de longitud completa también pueden utilizarse en los métodos descritos en la presente. En un ejemplo, un antígeno de interés es un "fragmento inmunogénico" de una secuencia del antígeno de longitud completa. Un "fragmento inmunogénico" se refiere a una porción de una proteína que, cuando es presentada por una célula en el contexto de una molécula del MHC, puede, en un ensayo de activación de los linfocitos T, activar un linfocito T contra una célula que expresa la proteína. Típicamente, tales fragmentos que se unen a las moléculas de MHC clase I son de 8 a 12 aminoácidos contiguos de un antígeno de longitud completa, aunque por supuesto, pueden utilizarse fragmentos más largos. En algunos ejemplos, el fragmento inmunogénico es uno que se une de manera específica a una molécula de MHC en la superficie de un APC, sin procesar adicionalmente la secuencia del epitopo. En los ejemplos particulares, el fragmento inmunogénico es de 8-50 aminoácidos contiguos de una secuencia de antígeno de longitud completa, tal como 8-20 aminoácidos, 8-15 aminoácidos, 8-12 aminoácidos, 8-10 aminoácidos, u 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ó 20 aminoácidos contiguos de una secuencia del antigeno de longitud completa. En algunos ejemplos, los APC se incuban con el fragmento inmunogénico bajo condiciones suficientes para que el fragmento inmunogénico se una de manera especifica a las moléculas de MHC en la superficie del APC, sin la necesidad de procesamiento intracelular .
En un ejemplo, un antígeno incluye un péptido del antigeno de interés con una secuencia de aminoácidos que porta un motivo de unión para una molécula HLA del sujeto. Estos motivos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, HLA-A2 es un alelo común en la población humana. El motivo de unión para esta molécula incluye péptidos con 9 ó 10 aminoácidos, que tienen leucina o metionina en la segunda posición, y valina o leucina en las últimas posiciones (véanse los ejemplos anteriores). Los péptidos que incluyen estos motivos pueden prepararse mediante cualquier método conocido en la técnica (tal como de manera recombinante , química, etc.). Con el conocimiento de una secuencia de aminoácidos de un antígeno de interés, las secuencias del fragmento inmunogénico predichas para unirse a un MHC, pueden determinarse utilizando programas disponibles al público.
Por ejemplo, un programa de un motivo que se une a HLA en la Internet (Bioinformatics and Molecular Analysis Section-BIMAS ) , puede utilizarse para predecir los epitopos de cualquier antigeno asociado con un tumor, virus u hongo, utilizando métodos de rutina. Los antigenos de interés (ya sea proteínas de de longitud completa o un fragmento inmunogénico de las mismas), puede producirse y purificarse entonces, utilizando técnicas estándar. Por ejemplo, un epitopo o los antígenos de interés de longitud completa pueden producirse de manera recombinante o sintetizarse químicamente mediante métodos estándar. Una preparación de un péptido sustancialmente puro proporcionará una sola banda principal en un gel de poliacrilamida no reductor. En otros ejemplos, el antígeno de interés incluye un lisado viral crudo.
En un ejemplo, el antígeno de interés es un antígeno asociado con el tumor y las secuencias de aminoácidos que portan los motivos que se unen a HLA son aquéllos que codifican los epitopos subdominantes o crípticos. Esos epitopos pueden identificarse mediante una afinidad de unión comparativamente menor para la molécula de HLA con respecto a otros epitopos en la molécula, o compararse con otros moléculas que se unen a la molécula de HLA.
A través del estudio de análogos del antígeno sustituidos con un solo aminoácido y el secuenciamiento de péptidos procesados naturalmente unidos de manera endógena, los residuos críticos que corresponden a los motivos requeridos para la unión específica a las moléculas del antígeno de HLA se han identificado (véase, por ejemplo, Southwood et al., J. Immunol. 160:3363, 1998; Ramraensee et al., Immunogenetics 41:178, 1995; Rammensee et al., J. Curr. Opin. Immunol 10:478, 1998; Engelhard, Curr. Opin. Immunol. 6:13, 1994; Sette y Grey, Curr. Opin. Immunol. 4:79, 1992). Además, los análisis cristalográficos con rayos X de los complejos de HLA-péptido han revelado receptáculos dentro de la hendidura de unión al péptido de las moléculas de HLA que alojan, en un modo específico del alelo, los residuos transportados por ligandos peptídicos; estos residuos a su vez determinan la capacidad de unión a HLA de los péptidos en los cuales están presentes. (Véanse, por ejemplo, Madden, Annu . Rev. Immunol. 13:587, 1995; Smith et al., Immunity 4:203, 1996; Fremont et al., Immunity 8:305, 1998; Stern et al., Structure 2:245, 1994; Jones, Curr. Opin. Immunol. 9:75, 1997; Brown et al., Nature 364:33, 1993).
El antígeno de interés se selecciona basándose en el sujeto a ser tratado. Por ejemplo, si el sujeto está en necesidad de inmunidad antiviral o antimicótica incrementada, se seleccionan uno o más antígenos objetivo asociados con virus u hongos. Los antigenos de interés ejemplares de virus, incluyen antigenos del virus de Epstein Barr (EBV) , virus de la hepatitis C (HCV) , citomegalovirus (CMV) , virus del herpes simple (HSV) , virus BK, virus JC, y virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), entre otros. Los antigenos de interés ejemplares de hongos incluyen antigenos de Candida albicans, Cryptococcus, Blastomyces e Histoplasma , u otros agentes infecciosos. En otro ejemplo, el sujeto está en necesidad de inmunidad antitumoral incrementada. Los antigenos de interés ejemplares de tumores incluyen WT1, PSA, PRAME . Los antigenos de interés ejemplares para agentes infecciosos se listan en la Tabla 1. En algunos ejemplos, el antigeno de interés incluye tanto un antigeno viral como un antigeno del tumor, tanto un antigeno micótico como un antigeno del tumor, o un antigeno viral, un antigeno micótico y un antigeno del tumor.
Para el tratamiento de un sujeto con un tumor, el antigeno del tumor de interés se elige basándose en la expresión de la proteina por el tumor del receptor. Por ejemplo, si el receptor tiene un tumor de mama, se selecciona un antigeno del tumor de mama, y si el receptor tiene un tumor de próstata, se selecciona un antigeno de tumor de próstata, y asi sucesivamente. La Tabla 2 lista tumores ejemplares y los antigenos asociados con el tumor respectivos que pueden utilizarse para generar linfocitos T específicos del antígeno, purificados, que pueden administrarse a un sujeto que tiene ese tumor particular. Sin embargo, alguien con experiencia en la técnica reconocerá que el mismo y otros tumores pueden tratarse utilizando antígenos del tumor adicionales.
En un ejemplo, los linfocitos T específicos del antígeno que reconocen un antígeno del tumor, se administran en una cantidad terapéuticamente efectiva a un sujeto que ha tenido, o recibirá un aloinjerto o autoinjerto de células germinales, o que se ha vacunado con el antígeno del tumor. Por ejemplo, puede administrarse una cantidad terapéutica de los linfocitos T específicos del antígeno, que reconocen uno o más antígenos asociados con el tumor, por ejemplo, al menos uno de los antígenos de interés listados en las Tablas 2-3.
En los ejemplos particulares en donde el receptor tiene un tumor y ha recibido o recibirá un aloinjerto de células germinales, los linfocitos T específicos del antígeno del tumor del donante y una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de PD-1, se administran en una cantidad terapéuticamente efectiva después del aloinjerto de las células germinales para prevenir, disminuir o retrasar la recurrencia del tumor, o para tratar una recaída maligna. Los linfocitos T específicos del antígeno, purificados, pueden introducirse nuevamente en el sujeto después de disminuir el volumen. En aún otro ejemplo, el receptor es vacunado con el antígeno del tumor de interés, los linfocitos T específicos del antígeno purificados, purificados del receptor, y a continuación reintroducidos en el receptor con una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de PD-1 para incrementar el sistema inmune del receptor contra el tumor.
La administración de una cantidad terapéutica de los linfocitos T específicos del antígeno del tumor y una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de PD-1 pueden utilizarse de manera profiláctica para evitar la recurrencia del tumor en el receptor, o para tratar una recaída del tumor. Tales linfocitos T específicos del antígeno pueden destruir las células que contienen el antígeno asociado con el tumor o ayudar a otras células inmunes .
En un ejemplo específico, un receptor tiene un tumor y ha recibido o recibirá un aloinjerto de células germinales para reconstituir la inmunidad. Después de la irradiación de la médula ósea o la administración de un fármaco citotóxico que ha cortado o comprometido de otra manera la función de la médula ósea, al menos dos tipos de linfocitos T específicos del antigeno donante se administran en una cantidad terapéuticamente efectiva; los linfocitos T específicos del antígeno que reconocen específicamente un antígeno asociado con un virus (o un antígeno asociado con un hongo) y los linfocitos T específicos del antígeno gue reconocen de manera específica un antígeno asociado con el tumor. Además, una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de PD-1 se administra al sujeto. Tal administración puede utilizarse para inducir un efecto antitumoral y un efecto antiviral (tal como un efecto antiviral) .
Con el fin de producir una población de linfocitos T específicos del antígeno para la administración a un sujeto de interés, una población de células incluyendo los linfocitos T puede ponerse en contacto con las células que presentan el antígeno (APC) , tales como las células dendríticas o T-APC, para presentar el antígeno de interés. En algunas modalidades, los linfocitos T que responden (tales como linfocitos o PBMC) , se tratan con un antagonista de PD-1 y se agregan a las APC que presentan uno o más antígenos de interés, y se incuban bajo condiciones suficientes para permitir la interacción entre las APC que presentan el antígeno y los linfocitos T para producir linfocitos T específicos del antígeno. El tratamiento de los linfocitos T que responden con el antagonista de PD-1 puede ser simultáneo con el contacto de las APC . El tratamiento con el antagonista de PD-1 también puede ser inmediatamente antes del contacto con las APC.
Asi, se proporcionan en la presente métodos para producir una población enriquecida de linfocitos T específicos del antigeno. Generalmente, las T-APC presentan los antigenos a los linfocitos T e inducen una respuesta' restringida al MHC en una clase I (linfocitos T CD8+) y clase II (linfocitos T CD4+) de manera restringida. La respuesta típica de los linfocitos T es la activación y proliferación. Así, se produce una población que incluye los linfocitos T que reconocen de manera específica un antígeno de interés. Así, una cantidad terapéuticamente efectiva de esta población de células puede administrarse a un sujeto, para producir una respuesta inmunitaria, tal como un sujeto con una infección crónica o un tumor.
Generalmente, las APC y los linfocitos T son autólogos. En los ejemplos específicos no limitantes, las APC y los linfocitos T que responden son del mismo individuo. Sin embargo, las APC y los linfocitos T que responden pueden ser singeneicos. Las APC pueden utilizarse para presentar cualquier antígeno a una población de linfocitos T autólogos. Alguien con experiencia en la técnica apreciará que los péptidos antigénicos que se unen a las moléculas de MHC de clase I y II pueden generarse ex vivo (por ejemplo, en lugar de procesarse de una proteina de longitud completa en una célula), y dejarse interactuar con (tal como unirse a) las moléculas de MHC I y II en la superficie celular. Generalmente, las APC presentan el antigeno en el contexto del MHC de clase I y II.
En un ejemplo, el antigeno de interés incubado con las APC es una proteina de fusión que incluye una secuencia de aminoácidos del antigeno de interés (tal como 8-50 aminoácidos contiguos, por ejemplo 8-15 u 8-12 aminoácidos contiguos del antigeno de interés) . Asi, una serie de epitopos que se unen a MHC puede incluirse en un solo polipéptido antigénico, o puede utilizarse un trímero de una sola cadena, en donde cada trímero tiene una molécula de MHC clase I, una microglobulina b2, y un péptido antigénico de interés (véase, Nature 2005; vol . 436, página 578). En algunos ejemplos, únicamente se utiliza un solo antígeno, pero en otras modalidades, se utiliza más de un antígeno, tal como al menos 2 antígenos diferentes, al menos 3 antígenos diferentes, al menos 4 antígenos diferentes, al menos 5 antígenos diferentes, al menos 10 antígenos diferentes, al menos 15 antígenos diferentes, al menos 20 antígenos diferentes, o incluso al menos 50 antigenos diferentes.
En aún otros ejemplos, un antigeno de interés es una secuencia de aminoácidos del antigeno de longitud completa (tal como un antigeno micótico, un antigeno de tumor, o un antigeno viral de longitud completa, por ejemplo, un lisado viral o catepsina G de longitud completa). En los ejemplos adicionales, pueden utilizarse uno o más antigenos de cualquier agente infeccioso. En algunos ejemplos, el antigeno de interés de longitud completa se expresa por las APC.
Las APC pueden producirse utilizando métodos conocidos por alguien con experiencia en la técnica (véanse, Melenhorst et al., Cytotherapy 7, supp. 1, 2005; Melenhorst et al., Blood 106: 671a, 2005; Gagliardi et al., Int. Immunol. 7: 1741-52, 1995, incorporadas en la presente como referencia). En un ejemplo, para producir las T-APC, los monocitos de la sangre periférica donante se activan utilizando IL-2 y un anticuerpo que se une de manera especifica a CD3 (tal como OKT3), durante aproximadamente tres o más días, tal como aproximadamente una o dos semanas, tal como durante aproximadamente siete a diez días.
Se ha observado que en la presencia del antígeno que presenta, los linfocitos T que reconocen al antígeno se unen a las células que presentan el antígeno (APC) que presentan un antígeno de interés más fuertemente que los linfocitos T que no sean específicos para el antígeno (y por lo tanto, no se unen de una manera específica del antígeno) . En un ejemplo particular, los linfocitos T específicos del antígeno se seleccionan exponiendo las APC a un antígeno del péptido objetivo (tal como un antígeno viral objetivo o un antígeno asociado con el tumor objetivo) , contra el cual los linfocitos T deseados se van a dirigir en la presencia de un antagonista de PD-1, de manera que la APC presenta el antígeno en asociación con un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I y/o clase II. Por ejemplo, las APC pueden exponerse a una cantidad suficiente de un antígeno de interés para ocupar de manera suficiente las moléculas de MHC en la superficie de la APC (por ejemplo, al menos 1% de las moléculas de MHC están ocupadas, tal como al menos 5%, al menos 7.5% o al menos 10%) y estimular la unión preferencial de los linfocitos T objetivo en la presencia de un antagonista de PD-1 a las APC que presentan el antígeno de interés (en comparación con las APC que no presentan el antígeno de interés) . Una población de linfocitos T, tal como una población que se ha sensibilizado para el antígeno de interés, se incuba a continuación dentro de las APC, opcionalmente en la presencia de un antagonista de PD-1, tal como un anticuerpo que se une de manera específica a PD-1, para activar de manera preferencial las células, produciendo por lo tanto una población de células enriquecidas con los linfocitos T deseados que reconocen el antigeno de interés.
Los linfocitos T, tales como aquéllos presentes en una población de PBMC o linfocitos, pueden incubarse con uno o más antigenos de interés, opcionalmente en la presencia de un antagonista de PD-1 para generar una población de linfocitos T que está sensibilizada para uno o más antigenos de interés. Los linfocitos T pueden sensibilizarse utilizando cualquier método conocido en la técnica. En los ejemplos particulares, las PBMC o los linfocitos se incuban en la presencia de un antigeno del péptido objetivo purificado, opcionalmente en la presencia de un antagonista de PD-1. En algunos ejemplos, el antigeno de interés es un antigeno de un agente infeccioso, o un antigeno de tumor, tal como, de manera no exclusiva, uno o más de los antigenos de interés listados en las tablas anteriores. El antigeno de interés puede estar en un forma purificada, tal como un péptido sintetizado químicamente. En otros ejemplos, el antígeno de interés está presente en una forma no purificada, tal como en un lisado crudo, por ejemplo, un lisado viral.
La cantidad del antígeno utilizado para sensibilizar los linfocitos T puede determinarse fácilmente utilizando métodos conocidos en la técnica. Generalmente, si el antigeno se utiliza en una forma purificada, se utilizan aproximadamente 1-10 g/ml de péptido. Cuando se utiliza un lisado viral, puede utilizarse aproximadamente 0.1-100 µ? de lisado, tal como aproximadamente 75 µ? . Cuando se utilizan T-APC, pueden utilizarse aproximadamente 4-6 millones de T-APC que presentan el antigeno de interés por cada 40-60 millones de linfocitos T (o linfocitos o PBMC) .
En un ejemplo especifico, los linfocitos son sensibilizados in vitro incubándolos con un antigeno soluble o un lisado viral durante 5-7 días, bajo condiciones que permiten sensibilizar los linfocitos T. Los linfocitos T viables son recuperados, por ejemplo, mediante centrifugación con Ficoll-Hypaque, generando por lo tanto los linfocitos T sensibilizados. Si se desea, los linfocitos T sensibilizados viables pueden sensibilizarse nuevamente una o más veces, por ejemplo, mediante la incubación con el antigeno durante otros 5-7 días, bajo las mismas condiciones que aquellas utilizadas para la primera sensibilización, y los linfocitos T viables se recuperan.
En otro ejemplo, los linfocitos son sensibilizados in vivo inoculando a un sujeto con el antigeno, por ejemplo, en la forma de una vacuna. En este ejemplo, los linfocitos T obtenidos del sujeto después de la inmunización, ya están sensibilizados. Por ejemplo, los linfocitos o las PBMC obtenidas de un sujeto se incuban entonces con las APC en la presencia de un antagonista de PD-1 como se describe en la presente, sin la necesidad de sensibilización adicional.
El método puede incluir además generar las APC que presentan el antígeno de interés. Por ejemplo, las APC pueden incubarse con una cantidad suficiente de uno o más antígenos peptídicos diferentes, bajo condiciones suficientes para que el o los péptidos objetivo sean presentados en la superficie de las APC. Esto genera una población de APC que presentan el antígeno de interés en las moléculas de MHC en la superficie de las APC. Los métodos descritos no están limitados a los métodos particulares de presentar el antígeno de interés en la superficie de una APC.
Los antígenos también pueden expresarse mediante la APC ya sea de manera natural o debido a la inserción de un gen que contiene la secuencia de ADN que codifica la proteína objetivo (antígeno). Un ácido nucleico que codifica el antígeno de interés puede introducirse en los linfocitos T como el ARN mensajero, o utilizando un vector, tal como un vector de expresión de mamífero, o un vector viral (por ejemplo, vectores de adenovirus, poxvirus o retrovirus). Los polinucleótidos que codifican un antigeno de interés incluyen un ADN recombinante que es un plásmido o virus que se replica de manera autónoma, o que esta incorporado en el ADN genóraico de un eucariote, o que existe como una molécula separada independiente de otras secuencias. Un ácido nucleico que codifica un antigeno de interés puede también introducirse utilizando electroporación, lipofección o transfección basada en fosfato de calcio.
Varios vectores virales se han construido, incluyendo un polioma, es decir, SV40 (Madzak et al., 1992, J. Gen. Virol, 73:15331536), adenovirus (Berkner, 1992, Cur. Top. Microbiol. Immunol, 158:39-6; Berliner et al., 1988, Bio Techniques, 6:616-629; Gorziglia et al., 1992, J. Virol, 66:4407-4412; Quantin et al., 1992, Proc. Nad. Acad. Sci EUA, 89:2581-2584; Rosenfeld et al., 1992, Cell, 68:143-155; Wilkinson et al., 1992, Nucí. Acids Res., 20:2233-2239; Stratford-Perricaudet et al., 1990, Hum. Gene Ther., 1:241-256), virus Vaccinia (Mackett et al., 1992, Biotechnology, 24:495-499), virus adenoasociado (Muzyczka, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol, 158:91-123; On et al., 1990, Gene, 89:279-282), incluyendo virus del herpes HSV, CMV y EBV (Margolskee, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol, 158:67-90; Johnson et al., 1992, J. Virol, 66:29522965; Fink et al., 1992, Hum. Gene Ther. 3:11-19; Breakfield et al., 1987, Mol. Neurobiol, 1:337-371; Fresse et al., 1990, Biochem. Pharmacol, 40:2189-2199), virus Sindbis (H. Herweijer et al., 1995, Human Gene Therapy 6:1161-1167; Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,091,309 y 5,2217,879), alfavirus (S. Schlesinger, 1993, Trends Biotechnol. 11:18-22; I. Frolov et al., 1996, Proc. Nati. Acad. Sci . USA 93:11371-11377), y retrovirus de aviares (Brandyopadhyay et al., 1984, Mol. Cell Biol, 4:749-754; Petropouplos et al., 1992, J. Virol, 66:3391-3397), murinos (Miller, 1992, Curr. Top . Microbiol. Immunol, 158:1-24; Miller et al., 1985, Mol. Cell Biol, 5:431-437; Sorge et al., 1984, Mol. Cell Biol, 4:1730-1737; Mann et al., 1985, J. Virol, 54:401-407), y de origen humano (Page et al., 1990, J. Virol, 64:5370-5276; Buchschalcher et al., 1992, J. Virol, 66:2731-2739). Los vectores de baculovirus (virus de la polihedrosis multinuclear de Autographa californica; AcMNPV) también son conocidos en la técnica, y pueden obtenerse de fuentes comerciales (tales como PharMingen, San Diego, Calif.; Protein Sciences Corp., Meriden, Conn.; Stratagene, La Jolla, Calif. ) .
En una modalidad, el polinucleótido que codifica un antigeno de interés se incluye en un vector viral para la transferencia en una APC. Los vectores adecuados incluyen vectores de retrovirus, vectores de ortopox, vectores de avipox, vectores de la viruela aviar, vectores de capripox, vectores de suipox, vectores adenovirales , vectores del virus del herpes, vectores de alfa virus, vectores de baculovirus, vectores del virus Sindbis, vectores del virus Vaccinia y vectores de poliovirus. Los vectores ejemplares específicos son vectores de poxvirus, tales como el virus Vaccinia, el virus de la viruela aviar y un virus Vaccinia altamente atenuado (MVA) , adenovirus, baculovirus y lo similar.
Los virus de la viruela de uso incluyen virus ortopox, suipox, avipox y capripox. Ortopox incluye vaccinia, ectromelia y viruela de los mapaches. Un ejemplo de un ortopox de uso es vaccinia. Avipox incluye viruela aviar, viruela de los canarios y viruela de las palomas. Capripox incluye viruela de las cabras y viruela de las ovejas. En un ejemplo, el suipox es viruela porcina. Los ejemplos de vectores virales de la viruela para la expresión se describen, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos No. 6,165,460, la cual se incorpora en la presente como referencia. Otros vectores virales que pueden utilizarse, incluyen otros ADN virus tales como el virus del herpes y adenovirus, y ARN virus tales como retrovirus y polio.
Los vectores adecuados se describen, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos No. 6,998,252, que se incorpora en la presente como referencia. En un ejemplo, un poxvirus recombinante, tal como un virus Vaccinia recombinante se modifica sintéticamente mediante la inserción de un gen quimérico que contiene las secuencias reguladoras de la vaccinia o las secuencias de ADN funcionalmente equivalentes a las mismas, que flanquean las secuencias de ADN que por naturaleza no están contiguas con las secuencias de ADN reguladoras de la vaccinia flanqueantes, que codifican un antigeno de interés. El virus recombinante que contiene tal gen quimérico es efectivo para expresar el antígeno. En un ejemplo, el vector viral de la vacuna comprende (A) un segmento comprendido de (i) una primera secuencia de ADN que codifica un antigeno y (ii) un promotor del poxvirus, en donde el promotor del poxvirus está adyacente a, y ejerce un control transcripcional sobre la secuencia de ADN que codifica un polipéptido del antigeno; y, flanqueando el segmento, (B) ADN de una región no esencial de un genoma del poxvirus. El vector viral puede codificar un marcador seleccionable . En un ejemplo, el poxvirus incluye, por ejemplo, un gen de la timidina cinasa (véase la Patente de los Estados Unidos No. 6,998,252, que se incorpora en la presente como referencia) .
La población de APC que presenta una densidad suficiente de el o los antigenos se incuba con los linfocitos T (tales como linfocitos o PBMC) , opcionalmente en la presencia de una cantidad efectiva de un antagonista de PD-1, bajo condiciones suficientes para permitir la unión entre las APC que presentan el antigeno y los linfocitos T que pueden inmunorreaccionar de manera especifica con el antigeno (linfocitos T específicos del antígeno) . Se utiliza un número suficiente de APC que expresan una densidad suficiente del antígeno, en combinación con el MHC para estimular la unión mejorada de un linfocito T objetivo a la APC. En los ejemplos particulares, al menos 20% de las APC están presentando el antígeno deseado en las moléculas de MHC en la superficie de la APC, tal como al menos 30% de las APC, al menos 40% de las APC, al menos 50% de las APC, o al menos 60% de las APC. La cantidad óptima de los linfocitos T agregados puede variar dependiendo de la cantidad de APC utilizadas. En algunos ejemplos, se utiliza una relación de linfocito T:APC de al menos 6:1, tal como al menos 8:1, al menos 10:1, al menos 12:1, al menos 15:1, al menos 16:1, al menos 20:1, o incluso al menos 50:1.
Para incrementar el número de linfocitos T específicos del antígeno, la proliferación de las células puede estimularse, por ejemplo, mediante la incubación en la presencia de una citocina, tal como IL-2, IL-7, IL-12 e IL-15. La cantidad de citocina agregada es suficiente para estimular la producción y proliferación de los linfocitos T, y puede determinarse utilizando métodos rutinarios. En algunos ejemplos, la cantidad de IL-2, IL-7, IL-12 o IL-15 agregada es de aproximadamente 0.1-100 UI/mL, tal como al menos 1 UI/mL, al menos 10 UI/mL, o al menos 20 UI/mL.
Después de una cantidad suficiente de unión de los linfocitos T específicos del antígeno a las APC, se producen linfocitos T que reconocen de manera específica al antígeno de interés. Esto genera una población de linfocitos T específicos del antígeno enriquecidos (tal como purificados) , que son específicos para el antígeno de interés. En algunos ejemplos, la población resultante de linfocitos T que son específicos para el antígeno de interés, es al menos 30% pura, tal como al menos 40% pura, o incluso al menos 50% pura. La pureza de la población de los linfocitos T específicos del antígeno puede valorarse utilizando métodos conocidos por alguien con experiencia en la técnica.
En un ejemplo, durante la estimulación de la proliferación de los linfocitos T específicos del antígeno, las células pueden contarse para determinar el número de células. Cuando se alcanza el número deseado de células, se determina la pureza. La pureza puede determinarse, por ejemplo, utilizando marcadores presentes en la superficie de los linfocitos T específicos del antígeno, concomitantes con la valoración de la producción de citocina tras el reconocimiento del antígeno, tal como el interferón (IFN)y, factor de necrosis de tumoral a (TNF) , interleucina (IL)-2, IL-10, factor de crecimiento transformante (TGF)Pl, o IL-4. Generalmente, los linfocitos T específicos del antígeno son positivos para el marcador CD3, junto con el marcador CD4 o CD8, y el IFN-? (que es específico para los linfocitos T activados).
Por ejemplo, puede utilizarse clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para identificar (y clasificar si se desea) , las poblaciones de células que son positivas para CD3, CD4 o CD8, e IFN-? utilizando anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8 y anti-IFN-? coloreados de manera diferente. Brevemente, los linfocitos T específicos del antígeno, estimulados, se incuban en presencia de anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8 y anti-IFN-? (cada uno tiene un fluoroforo diferente unido) , durante un tiempo suficiente para que el anticuerpo se una a las células. Después de retirar el anticuerpo no unido, las células se analizan mediante FACS utilizando métodos de rutina. Los linfocitos T específicos del antígeno son aquéllos que son IFN-? positivos y CD8 positivos o CD4 positivos. En los ejemplos específicos, la población resultante de los linfocitos T antigénicos es al menos 30% pura con relación a la población " total de células positivas a CD4+ o CD8+, tales como al menos 40% pura, al menos 50% pura, al menos 60% pura, o incluso al menos 70% pura, con relación a la población total de células CD4 positivas o CD8 positivas.
En otro ejemplo, el método incluye además determinar la citotoxicidad de los linfocitos T específicos del antígeno. Los métodos para determinar la citotoxicidad son conocidos en la técnica, por ejemplo, un ensayo de liberación de 51Cr (por ejemplo, véanse Walker et al. Nature 328:345-8, 1987; Qin et al., Acta Pharmacol. Sin. 23(6):534-8, 2002; todos incorporados en la presente como referencia) .
Los linfocitos T específicos del antígeno pueden someterse a una o más rondas de selección para incrementar la pureza de los linfocitos T específicos del antígeno. Por ejemplo, los linfocitos T específicos del antígeno purificados generados anteriormente, se incuban nuevamente con las APC que presentan el antígeno de interés, en la presencia de un antagonista de PD-1 bajo condiciones suficientes para permitir la unión entre las APC y los linfocitos T específicos del antígeno purificados. Los linfocitos T específicos del antígeno resultantes, pueden estimularse para proliferar, por ejemplo, con IL-2.
Generalmente, los linfocitos T específicos del antígeno resultantes, que inmunorreaccionan de manera específica con el antígeno de interés, son más puros después de estimulaciones sucesivas con las APC, que con sólo una ronda de selección. En un ejemplo, la población producida de los linfocitos T específicos del antígeno, purificados, es al menos 90% pura con relación a todas las células CD3+ presentes, tal como al menos 95% pura o al menos 98% pura. En un ejemplo particular, la población producida de los linfocitos T específicos del antígeno purificados, es al menos 95% pura con relación a todas las células CD4+ presentes, tal como al menos 98% pura. En otro ejemplo, la población producida de linfocitos T específicos del antígeno purificados, es al menos 90% pura con relación a todas las células CD3+ presentes, tal como al menos 93% pura .
La presente descripción también proporciona composiciones terapéuticas que incluyen los linfocitos T específicos del antígeno enriquecidos (tal como purificados), y un antagonista de PD-1. En los ejemplos particulares, la población enriquecida resultante de los linfocitos T específicos del antígeno (específicos para el antígeno de interés), se coloca en una forma de dosis terapéutica para la administración a un sujeto en necesidad de los mismos. El antagonista de PD-1 también está presente en una forma de dosis terapéutica para la administración a un sujeto en necesidad de tratamiento.
En un ejemplo, la población producida de linfocitos T específicos del antígeno purificados, es al menos 30% pura con relación a todas las células CD3+ presentes, tal como al menos 40% pura, al menos 50% pura, al menos 80% pura, o incluso al menos 90% pura. En un ejemplo particular, la población producida de linfocitos T específicos del antígeno purificados, es al menos 30% pura con relación a todas las células CD3+ presentes, tal como al menos 40% pura, al menos 50% pura, al menos 80% pura, al menos 90% pura, al menos 95% pura, o incluso al menos 98% pura. En otro ejemplo, la población producida de linfocitos T específicos del antígeno purificados, es al menos 50% pura con relación a todas las células CD3+ presentes, tal como al menos 60% pura, al menos 75% pura, al menos 80% pura, al menos 90% pura, o incluso al menos 93% pura. Los linfocitos T específicos del antígeno expandidos y seleccionados pueden probarse para el micoplasma, esterilidad, endotoxina y ser controlados para tener calidad en su función y pureza antes de la crioconservación o antes de la infusión en el receptor.
Una cantidad terapéuticamente efectiva de los linfocitos T específicos del antígeno se administra al sujeto. Los ejemplos específicos no limitantes de una cantidad terapéuticamente efectiva de los linfocitos T específicos del antígeno purificados, incluyen los linfocitos T específicos del antígeno purificados administrados a una dosis de aproximadamente 1X105 células por kilogramo de sujeto a aproximadamente 1X109 células por kilogramo de sujeto, tal como de aproximadamente 1X106 células por kilogramo a aproximadamente 1X108 células por kilogramo, tal como de aproximadamente 5X106 células por kilogramo a aproximadamente 75X106 células por kilogramo, tal como aproximadamente 25X106 células por kilogramo, o aproximadamente 50X106 células por kilogramo.
Los linfocitos T específicos del antígeno, purificados, pueden administrarse en una sola dosis o en múltiples dosis, como se determine por un clínico. Por ejemplo, las células pueden administrarse a intervalos de aproximadamente dos semanas, dependiendo de la respuesta deseada y de la respuesta obtenida. En algunos ejemplos, una vez que se obtiene la respuesta deseada, no se administran más linfocitos T específicos del antígeno. Sin embargo, si el receptor muestra uno o más síntomas asociados con infecciones o la presencia o crecimiento de un tumor, una cantidad terapéuticamente efectiva de los linfocitos T específicos del antígeno puede administrarse en ese momento. La administración puede ser local o sistémica.
Los linfocitos T específicos del antígeno, purificados, descritos en la presente, pueden administrarse con un portador farmacéuticamente aceptable, tal como suero fisiológico. El antagonista de PD-1 también puede formularse en un portador farmacéuticamente aceptable, como se describió anteriormente. En algunos ejemplos, otros agentes terapéuticos se administran con los linfocitos T específicos del antígeno y el antagonista de PD-1. Otros agentes terapéuticos pueden administrarse antes, durante o después de la administración de los linfocitos T específicos del antígeno, dependiendo del efecto deseado. Los agentes terapéuticos ejemplares incluyen, de manera no exclusiva, agentes antimicrobianos, inmunoestimulantes , tales como interferón alfa, agentes quimioterapéuticos o vacunas peptídicas del mismo antígeno utilizado para estimular los linfocitos T ín vitro. En un ejemplo particular, las composiciones que contienen los linfocitos T específicos del antígeno purificados, también incluyen uno o más agentes terapéuticos.
Métodos de Tratamiento y Evaluación Se describe en la presente que la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de PD-1 afecta a los linfocitos B, por ejemplo aumentando la proliferación de linfocitos B de memoria.
En la presente se proporcionan métodos de tratamiento que incluyen la administración de un antagonista de PD-1 a un sujeto, como se describió anteriormente. Estos métodos incluyen medir los linfocitos B, tal como, sin limitarse a, medir la proliferación de linfocitos B de memoria en el sujeto. En algunos ejemplos, los métodos incluyen medir los linfocitos B sin experimentación previa, en una muestra del sujeto. En algunas modalidades, los métodos incluyen medir los linfocitos T CD28 y/o medir anticuerpos neutralizantes para un antigeno de interés. De ese modo, los métodos pueden incluir medir una o más de: proliferación de linfocitos B de memoria, linfocitos B sin experimentación previa, linfocitos T CD28, y anticuerpos nteutralizantes .
Se proporcionan métodos también en la presente para tratar, y medir la eficacia de un antagonista de PD-1, en una variedad de infecciones y cánceres. La presente descripción abarca métodos para determinar si los métodos de tratamiento son efectivos en un sujeto de interés. En estos métodos, se selecciona un sujeto de interés, tal como un sujeto con ua infección persistente o un cáncer. Se le administra al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de PD-1. En algunos ejemplos, se evalúa la proliferación de linfocitos B de memoria para determinar si el método de tratamiento fue efectivi, y/o para determinar si la dosis del antagonista de PD-1 debe modificarse. En ejemplos adicionales, los métodos incluyen medir los linfocitos B sin experimentación previa. En ejemplos adicionales, los métodos incluyen medir los linfocitos T CD28 y/o medir anticuerpos neutralizantes para el antigeno de' interés. De ese modo, los métodos pueden incluir medir uno o más de: la proliferación de linfocitos B de memoria, linfocitos B sin experimentación previa, linfocitos T CD28, y anticuerpos neutralizantes.
El sujeto puede ser cualquier mamífero tal como un humano, primate, ratón, rata, perro, gato, vaca, caballo y cerdo. En diversos ejemplos, el sujeto es un primate, tal como un humano. En ejemplos adicionales, el sujeto es un sujeto murino, tal como un ratón. En diversas modalidades, el sujeto está en riesgo de desarrollar una infección, como se discute anteriormente. Un sujeto en riesgo de desarrollar infección es un sujeto que no tiene todavía la infección, pero puede infectarse por el agente infeccioso de interés. En ejemplos adicionales, se selecciona para tratamiento un sujeto que tiene una infección, tal como una infección persistente. En otras modalidades, el sujeto está en riesgo de desarrollar cáncer o tiene cáncer, como se mencionó anteriormente. Estos sujetos pueden identificarse por métodos estándar adecuados por una persona con habilidad en la técnica, tal como un médico. Los métodos descritos incluyen seleccionar un sujeto de interés, y administrar un antagonista de PD-1, como se describió anteriormente. Se evalúa entonces la proliferación de linfocitos B de memoria. En algunos ejemplos, también se evalúa el número de linfocitos B sin experimentación previa.
En algunas modalidades, el sujeto tiene una infección persistente con una bacteria, virus hongo o parásito, como se mencionó anteriormente. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de PD-1 se administra para tratar al sujeto. La proliferación de linfocitos B de memoria se evalúa entonces para determinar si el método de tratamiento fue efectivo, y/o para determinar si la dosis de antagonista de PD-1 debe ser modificada. Generalmente, las infecciones persistentes, en contraste con las infecciones agudas, no se eliminan de manera efectiva por la inducción de una respuesta inmune del hospedante. El agente infeccioso y la respuesta inmune alcanzan un equilibrio tal que el sujeto infectado permanece infeccioso por un perido largo de tiepo sin expresar necesariamente los síntomas. Las infecciones persistentes incluyen por ejemplo, infecciones lentas, crónicas y latentes. La infección persistente ocurre con virus tales como los virus de leucemia de linfocitos T humanos, XMRV, virus de polioma JC, virus Epstein-Barr , citomegalovirus , virus del herpes, virus de varicela-zoster, sarampión, papovavirus, priones, virus de la hepatitis, adenovirus, parvovirus y virus del papiloma. Las infecciones persistentes adicionales se describen anteriormente. Estos métodos pueden incluir medir los linfocitos B sin experimentación previa, linfocitos T CD28 y/o anticuerpos neutralizantes.
En modalidades adicionales, el sujeto tiene un tumor. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de PD-1 se administra al sujeto para tratar el tumor, como se describe anteriormente. La proliferación de linfocitos B de memoria se evalúa entonces para determinar si la dosis del antagonista de PD-1 debe modificarse. En diversos ejemplos, una cantidad terapéuticamente efectiva de un antigeno de un tumor, o un nucleótido que codifica el antigeno del tumor, también se administra al sujeto. El antagonista de PD-1 y el antigeno del tumor, o nucleótido que codifica al antigeno del tumor, se pueden administrar simultáneamente o secuencialmente . Estos métodos puede incluir la medición de linfocitos B sin experimentación previa, linfocitos T CD28 y/o anticuerpos neutralizantes.
En modalidades adicionales, se le administra al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de linfocitos T citotóxicos específicos para un antígeno de interés, tal como un antígeno viral o un antígeno tumoral, y una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de PD-1. La administración de los linfocitos T específicos del antígeno purificados y de PD-1, como se describe en la presente, aumentará la capacidad de un sujeto para sobreponerse a condiciones patológicas, tales como una enfermedad infecciosa o un tumor, al enfocar una respuesta inmune contra un patógeno (tal como un virus o un hongo) o un neoplasma. Por lo tanto, al purificar y genera una población purificada de linfocitos T específicos a un antígeno seleccionadas a partir de un sujetto ex vivo e introduciendo una cantidad terapéutica de estas células, la respuesta inmune del sujeto receptor aumenta. La administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de PD-1 también aumenta la respuesta inmune del receptor. La proliferación de linfocitos B de memoria se evalúa entonces para determinar si el método de tratamiento fue efectivo, y/o determinar si la dosis del antagonista de PD-1 y/o linfocitos T citotóxicos debe ser modificada. Estos métodos pueden incluir medir los linfocitos B sin experimentación previa, linfocitos T que expresan CD28 (CD28+) y/o anticuerpos neutralizantes.
Por lo tanto, los métodos descritos en la presente para determinar si un antagonista de PD-1 es efectivo, o para determinar si la dosis de un antagonista de PD-1 es efectiva, se pueden usar en combinación con cualquier otro método terapéutico (y en cualquiera de los sujetos) descritos anteriormente.
En algunas modalidades, se miden los linfocitos B de memoria. Un incremento en la proliferación de linfocitos B de memoria de la muestra biológica, comparado con un control, indica que la dosis del antagonista de PD-1 es útil para tratar al sujeto, y en donde una ausencia de alteración significativa en la proliferación de linfocitos B de memoria comparada con el control indica que la dosis del antagonista de PD-1 no es útil para tratar al sujeto.
En modalidades adicionales, los métodos incluyen detectar anticuerpos neutralizantes en una muestra biológica del sujeto, en donde un aumento en los anticuerpos neutralizantes, comparado con un control, indica que la dosis del antagonista de PD-1 es útil para tratar al sujeto, y en donde una ausencia de alteración significativa en los anticuerpos neutralizantes, comparada con el control, indica que la dosis del antagonista de PD-1 no es útil para tratar al sujeto. En modalidades adicionales, los métodos incluyen detectar los linfocitos T que expresan CD28 (CD28+ ) en una muestra biológica del sujeto, en donde un aumento en los linfocitos T CD28+, comparado con un control, indica que la dosis del antagonista de PD-1 es útil para tratar al sujeto, y en donde una ausencia de alteración significativa en los linfocitos T CD28+, comparada con el control, indica que la dosis del antagonista de PD-1 no es útil para tratar al sujeto. Estas medidas se pueden llevar a cabo además de la medición de los linfocitos B de memoria, pero también pueden llevarse a cabo en ausencia de la medición de linfocitos B de memoria.
Se describen en la presente métodos adicionales para determinar si un antagonista de PD-1 particular, o una dosis particular de un antagonista de PD-1, es efectiva para tratar a un sujeto. Estos métodos incluyen medir la proliferación de linfocitos B de memoria, tal como en una muestra del sujeto. Estos métodos también incluyen medir linfocitos B sin experimentación previa, en una muestra del sujeto. Por ejemplo, la expresión de CD27, CD20 y CD21 se puede evaluar (ver adelante) . En algujos ejemplos, la medida de linfocitos B de memoria y/o linfocitos B sin experimentación previa ocurre después de un periodo suficiente de tiempo para que el antagonista de PD-1 disminuya la actividad de PD-1 en el sujeto.
También se pueden emplear los métodos para evaluar la dosis de un antagonista de PD-1 que es terapéuticamente efectiva para un sujeto. Por ejemplo, los métodos descritos en la presente pueden usarse para determinar si la dosis administtrada a un sujeto de interés puede disminuirse y ser todavía efectiva. Los métodos descritos en la presente también pueden usarse para determinar si la dosis administrada a un sujeto es demasiado baja, y por ende debe aumentarse para ser terapéuticamente efectiva.
En algunas modalidades, una primera dosis de un antagonista de PD-1 se administra al sujeto. Un aumento en los linfocitos B de memoria proliferantes, comparado con un control, indica que esta dosis es efectiva. En algunos casos, puede ser ventajoso disminuir la cantidad dell agente administrado al sujeto, tal cmo disminuir efectos secundarios. De ese modo, si la primera dosis aumenta la proliferación de linfocitos B de memoria, una segunda dosis más baja del antagonista de PD-1 puede administrarse al sujeto, y puede obtenerse una segunda muestra que incluye linfocitos B. Un aumento en la proliferación de linfocitos B de memoria de la segunda muestra, comparada con un control, indica que la segunda dosis del antagonista de PD-1 es útil para ttratar al sujeto, y por ende determina que la dosis menor será terapéuticamente efectiva para tratar al sujeto. Una ausencia de una alteración significativa en la proliferación de linfocitos B de memoria en la segunda muestra, comparada con el control, indica que la segunda dosis del antagonista de PD-1 no es terapéuticamente efectiva para tratar al sujeto. El método puede repetirse para determinar la dosis terapéuticamente efectiva más baja para un sujeto de interés.
En modalidades adicionales, una primera dosis de un antagonista de PD-1 se administra al sujeto. Una pérdida de aumento en la proliferacón de linfocitos B de memoria, comparada con un control, indica que esta dosis no es terapéuticamente efectiva para tratar al sujeto. Si la primera dosis no aumentó la proliferación de linfocitos B de memoria, una segunda dosis más alta puede administrarse al sujeto, y puede obtenerse una segunda muestra incluyendo linfocitos B. Un aumento en la proliferación de linfocitos B de memoria de la segunda muestra, comparada con un control, indica que la segunda dosis más alta del antagonista de PD-1 es útil para tratar al sujeto, y por ende determina que la dosis más alta será terapéuticamente efectiva para tratar al sujeto. Una ausencia de alteración significativa en la proliferación de linfocitos B de memoria en la segunda muestra, comparada con el control, indica que la segunda dosis del antagonista de PD-1 no es terapéuticamente efectiva para tratar al sujeto, y por ende que se requiere una tercera dosis más alta. De ese modo, el método se puede repetir para determinar una dosis terapéuticamente efectiva para un sujeto de interés.
Los métodos descritos también pueden ser útiles para determinar si un antagonista de PD-1 particular es terapéuticamente efectivo para tratar a un sujeto, y por ende debe continuarse, o si el antagonista de PD-1 particular no es efectivo para tratar a un sujeto, y por ende que un antagonista de PD-1 diferente debe usarse para tratar al sujeto. Estos métodos incluyen administrar al sujeto un antagonista de PD-1 particular, y evaluar la proliferación de linfocitos B de memoria en la muestra del sujeto. Un aumento en la proliferación de linfocitos B de memria en la muestra, comparado con un control, indica que el antagonista de PD-1 particular es útil para tratar al sujeto. Una ausencia de una alteración significativa en la proliferación de linfocitos B de memoria en la muestra, comparada con un control, indica que el antagonista de PD-1 particular no es terapéuticamente efectivo para tratar al sujeto, y que un antagonista de PD-1 diferente u otro agente terapéutico debe administrarse al sujeto.
De ese modo, la eficacia de un antagonista de PD-1 especifico puede ser monitoreada, o la dosis efectiva de un antagonista de PD-1 puede ser determinada, usando los métodos descritos en la presente. Generalmente, un aumento en la proliferación de linfocitos B de memoria de una muestra de un sujeto al cual se le ha administrado un antagonista de PD-1, comparado con un control, indica que el antagonista de PD-1 es terapéuticamente efectivo para un sujeto, y/o indica que la dosis es suficiente para tratar al sujeto.
Generalmente, medir la proliferación de linfocitos B de memoria incluye obtener una muestra que incluye linfocitos B de un sujeto, y determinar la presencia o número de linfocitos B de memoria proliferantes en la muestra. En algunos ejemplos, la muestra es una muestra de biopsia, una muestra de sangre, o una muestra de células mononucleares de sangre periférica. La muestra puede purificarse, por ejemplo para separar los linfocitos B, tal como los linfocitos B de memoria y/o linfocitos B sin experimentación previa. En algunas modalidades, los métodos incluyen medir la cantidad de linfocitos B de memoria proliferantes y/o la cantidad de linfocitos B sin experimentación previa en una muestra de un sujeto al que se le administra un antagonista de PD-1 de interés. En algunos ejemplos, la cantidad de linfocitos B de memoria proliferantes y/o la cantidad de linfocitos B sin experimentación previa se compara con un control. Con respecto a los linfocitos B de memoria proliferantes, el control puede ser un valor estándar previamente determinado, o la cantidad de linfocitos B de memoria proliferantes de un sujeto al que no se le ha administrado el antagonista de PD-1, o la cantidad de linfocitos B de memoria proliferantes de un sujeto al que se le administró una sustancia control, tal como un vehículo solo. De manera similar, con respecto a los linfocitos B sin experimentación previa, el control puede ser un valor estándar previamente determinado, o la cantidad de linfocitos B sin experimentación previa de un sujeto al que no se le ha administrado el antagonista de PD-1, o la cantidad de linfocitos B sin experimentación previa de un sujeto al que se le ha adminisrado una sustancia de control, tal como un vehículo solo, o la cantidad de linfocitos B sin experimentación previa en un sujeto, respectivamente.
En algunos ejemplos, se identifican linfocitos B de memoria que expresan CD27, tales como aquellas células que expresan CD20 y CD27, pero no expresan CD21 (CD20+CD27+CD21~) comparadas con los linfocitos B sin experimentación previa, los cuales expresan CD20 y CD21, pero no expresan CD27 (CD20+CD27"CD21+) . Los linfocitos B de memoria y linfocitos B sin experimentación previa pueden aislarse y/o detectarse usando anticuerpos que se unen de manera específica a CD20, CD21 y CD27. En algunas modalidades, los linfocitos B de memoria expresan CD27 (CD27+) . En algunas modalidades, los linfocitos B de memoria se identifican como linfocitos B CD27+CD21~, tales como CD20hi/CD21"/CD27+ (memoria activada) .
Los métodos para aislar y detectar linfocitos B son conocidos en la técnica, y en la presente se proporcionan protocolos ejemplares. También se conocen métodos en la técnica para medir la proliferación de linfocitos B de memoria y/o para medir linfocitos B sin experimentación previa. Estos métodos generalmente involucran el uso de técnicas moleculares y/o bioquimicasy no simple observación visual. En algunos ejemplos, se utiliza la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) . La FACS puede usarse para ordenar (aislar) células tales como linfocitos B inmaduros o células plasmáticas diferenciadas o linfocitos de memoria, al poner en contacto las células con un anticuerpo marcado apropiadamente. En una modalidad, diversos anticuerpos (tales como anticuerpos que se unen a CD27, CD20, CD21, CD45R, CD40, CD19 y/o IgM) y la clasificación por FACS pueden utilizarse para producir poblaciones sustancialmente purificadas de linfocitos B inmaduros, células plasmáticas y linfocitos B de memoria.
También se conocen métodos para medir linfocitos T CD28 en una muestra de un sujeto. Estos métodos generalmente involucran el uso de técnicas bioquímicas y/o moleculares y no simple observación visual. En algunos ejemplos, se utiliza la clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) . La FACS se puede usar para clasificar (aislar) células tales como linfocitos B inmaduros o células plasmáticas diferenciadas o linfocitos de memoria, al poner en contacto las células con un anticuerpo etiquetado apropiadamente. En una modalidad, diversos anticuerpos (tales como anticuerpos que se unen a CD3, CD4, CD8 y CD28) y el ordenamiento por FACS se pueden utilizar para producit poblaciones sustancialmente purificadas de linfocitos T CD28+. También se conocen en la técnica métodos para detectar anticuerpos neutralizantes. Estos ensayos incluyen obtener una muestra biológica y detectar la unión de anticuerpos al antigeno de interés, asi como ensayos de neutralización específicos, tales como para un virus, por ejemplo, VIH.
La FACS emplea una pluralidad de canales de color, canales de detección de dispersión de luz obtusa y ángulo bajo, y canales de impedancia, entre otros niveles de detección más sofisticados, para separar u ordenar las células. Cualquier técnica de FACS puede emplearse siempre y cuando no sea en detrimento de la viabilidad de las células deseadas (Para métodos ejemplares de FACS véase la patente de los Estados Unidos No. 5,061,620).
Sin embargo, otras técnicas de diferente eficacia pueden emplearse para purificar y aislar las poblaciones deseadas de células. Las técnicas de separación empleadas deben maximizar la retención de viabilidad de la fracción de células a ser recolectadas. La técnica particular empleada dependerá, por supuesto, de la eficiencia de separación, citotoxicidad del método, y facilidad y rapidez de separación, y de cuál equipo y/o habilidad técnica se requiera.
Los procedimientos de separación incluyen separación magnética, usando esferas magnéticas cubiertas con anticuerpos, cromatografía por afinidad, agentes citotóxicos, ya sea unidos a un anticuerpo monoclonal o usados en conjunto con complemento, y "encuadramiento" , que utiliza un anticuerpo monoclonal unido a una matriz sólida, u otra técnica conveniente. Los anticuerpos unidos a esferas magnéticas y otras matrices sólidas, tales como esferas de agarosa, esferas de poliestireno, membreanas de fibras huecas y charolas de Petri de plástico, permiten la separación directa. Las células unidas por el anticuerpo pueden eliminarse de la suspensión celular simplemente separando físicamente el soporte sólido de la suspensión celular. Las condiciones exactas y duración de la incubación de las células con los anticuerpos unidos a la fase sólida dependerpa de diversos factores específicos para el sistema empleado. La selección de condiciones apropiadas, sin embargo, es bien conocida en la técnica.
Las células no enlazadas pueden ser entonces eluidas o lavadas con amortiguador fisiológico después de que se ha dado tiempo suficiente para que las células que Expresan un marcador de interés (por ejemplo, CD45R ó CD27) se unan a los anticuerpos unidos a la fase sólida. Las células unidas se separan entonces de la fase sólida por cualquier método apropiado, dependiendo principalmente de la naturaleza de la fase sólida y del anticuerpo empleado .
Los anticuerpos pueden estar conjugados a biotina, la cual puede entonces eliminarse con avidina o estreptavidina unida a un soporte, o fluorocromos , los cuales pueden usarse con un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS), para permitir la separación celular.
Por ejemplo, las células que expresan CD45R y/o CD27 son inicialmente separadas de otras células mediante la expresión en la superficie celular de CD45R o CD27. En un ejemplo especifico, no limitante, las células CD45R+ o CD27+ se seleccionan positivamente mediante separación por esferas magnéticas, en donde las esferas magnéticas se cubren con un anticuerpo monoclonal reactivo a CD45 o CD27. Las células CD45R+ ó CD27+ se eliminan entonces de las esferas magnéticas.
La liberación de las células CD45R+ ó de las células CD27+ a partir de las esferas magnéticas puede efectuarse por liberación de cultivo u otros métodos. La pureza de las células CD45R+ o de las células CD27+ se revisa entonces, por ejemplo con un citómetro de flujo FACSCAN® (Becton Dickinson, San José, CA) , si se desea. En una modalidad, se llevan a cabo pasos de purificación adicionales, tales como clasificación por FACS de la población de células liberadas de las esferas magnéticas. En un ejemplo, esta clasificación puede llevarse a cabo para detectar la expresión de MHC clase II, IgM, CD19 y CD40, con el fin de detectar o aislar linfocitos B inmaduros. En otro ejemplo, los linfocitos B maduros pueden aislarse y/o detecarse con base en la expresión de IgD y/o CD21, además de MHC clase II, IgM, CD14 y CD40.
Los métodos para analizar la proliferación de linfocitos B, tal como la evaluación de la proliferación de linfocitos B de memoria, son conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden utilizar procedimientos de dilución por tinción de membrana que incluyen etiquetado químico ex vivo de células de interés con pigmentos fluorescentes. Se puede utilizar el etiquetado con análogos de nucleósido tritiado (comúnmente 3H-timidina desoxirribonucleósido, 3H-TdR) o bromodesoxiuridina (BrdU) . El análisis por FACS está disponible para medir la incorporación de BrdU. Los marcadores sustitutos de proliferación tal como el contenido de ADN y las proteínas asociadas al ciclo celular, también pueden utilizarse.
En un ejemplo, puede utilizarse la medida de Ki67 ó PCNA. El antígeno Ki67 es la proteína nuclear relacionada con el ciclo celular prototípico que se expresa por las células proliferantes en todas las fases del ciclo celular activo (fase Gl, S, G2 y ) . Está ausente en las células (G0) restantes. Los anticuerpos Ki67 pueden usarse para cuantificar células proliferantes entre las células restantes (índice Ki67) . El Ki67 se usa de manera rutinaria como un marcador de la ciclización y proliferación celular; los anticuerpos de Ki67 están comercialmente disponibles, tales como ABCAM®, y están disponibles métodos para usar estos anticuerpos análisis inmunohistoquíicos y FACS.
Se pueden usar otros métodos par adetectar aquellas células que están en el ciclo celular activo en el momento de la muestra. La proliferación de linfocitos, tales como los linfocitos B de memoria, también pueden medirse usando métodos que utilizan isótopos estables para marcar el ADN en muestras biológicas incluyendo células. El ADN está altamente marcado de manera uniforme a través de la vía de síntesis de novo. Las marcas de isótopo estables usadas, por ejemplo, 2H-glucosa o agua pesada 2H20 o H2180) , no son tóxicos para animales y humanos, y generalmente son consideras seguras por la Administración de Fármacos y Alimentos de los Estados Unidos (FDA) (véase la Publicación de la Solicitud de patente de los Estados Unidos No. 2009/0155179) . La medición de la incorporación de la etiqueta de isótopo estable en el ADN del linfocito comprende los siguientes pasos: (i) extracción del ADN o su liberación a partir de cromatina sin aislamiento adicional, hidrólisis de ADN a desoxirribonucleótidos ; (ii) liberación selectiva de desoxirribosa a partir de desoxirribonucleótidos de purina, (iii) derivación de desoxirribosa purina a un derivado volátil (por ejemplo, pentano tetraacetato, derivado de pentafluorobencil tetraacetilo, u otro derivado adecuado) adecuado para el análisis por cromatografía de gases/espectrometría de masas (GC/MS), (iv) análisis por GC/MS de dicho derivado, (v) análisis del patrón de abundancia de isotopómero de masa de dicho derivado, y (vi) cálculo a partir de dicho patrón de un valor de enriquecimiento en exceso que es una medida de la incorporación del isótopo estable. Las modalidades específicas de cada uno de estos métodos han sido descritas (véase patente de los Estados Unidos No. 5, 910, 40) .
Ensayo in Vitro Se describen métodos en la presente para seleccionar un antagonista de PD-1. Estos métodos incluyen determinar si un agente de interés es un antagonista de PD-1. De ese modo, los métodos incluyen seleccionar un número de agentes para determinar si funcionan como antagonistas de PD-1. Este puede ser una biblioteca de compuestos, moléculas pequeñas o anticuerpos, y el ensayo puede llevarse a cabo en un formato de alta prducción.
Los métodos también incluyen deerminar si un antagonista de PD-1 especifico será útil para tratar un individuo especifico de interés. De ese modo, estos métodos descritos pueden usarse para "medicina personalizada" en donde la población de células es de un individuo especifico de interés, y un número de antagonistas de PD-1 potenciales se evalúa para determinar el antagonista de PD-1 más adecuado para tratar a ese individuo particular.
Los métodos incluyen poner en contacto una población aislada de células que comprenden linfocitos B de memoria con un agente in vitro. En algunas modalidades, la población de células es células mononucleares de sangre periférica o linfocitos B de memoria purificados, tales como linfocitos B de memoria activados o en reposo. En un ejemplo, la población de células es una linea de linfocitos B de memoria.
Los métodos pueden incluir detectar la proliferación de linfocitos B de memoria y/o detectar la diferenciación de linfocitos B de memroa en células que secretan anticuerpos. En diversas modalidades, los métodos incluyen ensayos para detectar IgM, IgG y linfocitos B que producen anticuerpos. El ensayo puede ser un ensayo ELISPOT. Los ensayos ELISPOT emplean una técnica muy similar al ensayo por inmunoabsorbencia unida a enzima (ELISA) de emparedado. Ya sea un anticuerpo de captura monoclonal o uno policlonal, se cubre asépticamente sobre una microplaca con soporte de PVDF (polivinilden fluoruro) . Estos anticuerpos se seleccionan por su especificidad para el analito en cuestión. La placa se bloquea, usualmente con una proteina de suero que no es reactiva con cualquiera de los anticuerpos en el ensayo. Después de esto, las células de interés se colocan en una placa a densidades distintas, junto con un antigeno o mitógeno, y después se colocan en una incubadora de C02 a 37 °C humidificada por un periodo de tiempo especificado.
La citocina (u otro producto de interés, tal como anticuerpos de IgM o IgG) secretados por células activadas se captura localmente por el anticuerpo recubierto en la membrana de PVDF de gran área superficial. Después de lavar los pozos para remover células, residuos y componentes del medio, un anticuerpo policlonal biotinilado especifico para el analito escogido se agrega a los pozos. Este anticuerpo es reactivo con un epitopo distinto del objetivo y por ende se emplea para detectar el producto capturado de interés. Después de un lavado para remover cualquier anticuerpo biotinilado no enlazado, el producto detectado se visualiza entonces, como por ejemplo usando una enzima de avidina, y precipitando sustrato para la enzima. El producto final coloreado (una mancha, usualmente coloreada) representa comúnmnente una célula individual que produce producto. Las manchas pueden contarse manualmente (como por ejemplo con un microscopio de disección) o usando un lector automatizado para capturar las imágenes del micropozo y analizar el número y tamaño de las manchas.
También se puede evaluar la proliferación de linfocitos B de memoria. Los ensayos adecuados se describen en la presente (véase llenas arriba) . Los métodos para analizar la proliferación de linfocitos B, tales como la evaluación de la proliferación de linfocitos B de memoria, son conocidos en la técnica. Por ejemplo, los procedimientos de dilución por tinción de membrana (comúnmente 3H-timidina desocirribonucleósido, 3H-TdR) o bromodesoxiuridina (BrdU) pueden ser utilizadas. El análisis FACS está disponible para medir la incorporación de BrdU. Los marcadores sustitutos de proliferación tales como el contenido de ADN y las proteínas asociadas al ciclo celular, también pueden ser usadas. En un ejemplo, la medida de Ki67 o PCNA se puede utilizar. Otros métodos pueden emplearse para detectar aquellas células que están en el ciclo celular activado al momento de la muestra. La proliferación de linfocitos, tales como linfocitos B de memoria, también puede medirse usando métodos que utilizan isótopos estables para marcar ADN en muestras biológicas incluyendo células. Un protocolo ejemplar no limitado para un ensayo de uso se proporciona en los Ejemplos de la siguiente sección.
Generalmente, un incremento en la proliferación de linfocitos B de memoria y/o un incremento en la diferenciación de linfocitos B de memoria dentro de células que secretan anticuerpos y/o un incremento en la producción de anticuerpos indica que el agente es un antagonista de PD-1. El aumento de la proliferación de linfocitos B de memoria y/o un aumento en la diferenciación de linfocitos B de memoria dentro de las células que secretan anticuerpos y/o un aumento en la producción de anticuerpos puede indicar que un antagonista de PD-1 específico será útil para tratar un sujeto.
La descripción se ilustra por medio de los siguientes Ejemplos no limitantes.
EJEMPLOS Ejemplo 1: Inhibición de la Trayectoria de PD-1 en Ratones Infectados de Manera Crónica Utilizando Anticuerpos Anti-PD-Ll Se utilizaron ratones infectados con varias cepas del virus de la coriomeningitis linfocitica (LCMV) para estudiar el efecto de la infección viral crónica en la función de los linfocitos T CD8+. La cepa LCMV Armstrong causa una infección aguda que se elimina en el transcurso de 8 días, dejando atrás una población de larga vida de linfocitos T CD8+ de memoria en reposo, altamente funcionales. La cepa Cl-13 de LCMV, en contraste, establece una infección persistente en el hospedante, caracterizada por una viremia que dura hasta 3 meses. El virus permanece en algunos tejidos de manera indefinida y los linfocitos T CD8+ específicos del antígeno se vuelven funcionalmente deteriorados. Los linfocitos T CD8+ DbNP396-404 son suprimidos físicamente, mientras que los linfocitos T CD8 + DbGP33-41 y DbGP276-286 persisten, pero pierden la capacidad para proliferar o secretar citocinas antivirales, tales como IFN-? y TNF-a.
Los ratones C57BL/6 se compraron del National Cáncer Institute (Frederick, MD) . Los ratones se infectaron intravenosamente (i.v.) con 2xl06 ufp de LCMV-Cl-13. Las reducciones de CD4 se realizaron inyectando 500 µ? de GK1.5 en PBS el día de la infección y el día después de la infección. Los ratones inmunes a LCMV se generaron infectando ratones i.p. con 2xl05 ufp de LCMV Armstrong.
Se realizaron análisis de arreglo de genes en linfocitos T CD8+ transgénicos P14 específicos de DbGP33-41 sin experimentación previa, purificados con FACS, los linfocitos T CD8+ de memoria específicos de DbGP33-41 derivados de los ratones inmunes a Armstrong LCMV, y los linfocitos T CD8+ específicos de DbGP33-41 o específicos de DbGP276-286, derivados de los ratones infectados con Cl-13 LCMV con reducción de CD4+. El aislamiento del ARN y los análisis de arreglo de genes se realizaron como se describe en Kaech et al., (Cell 111:837-51, 2002). El ARNm de PD-1 estuvo altamente expresado en los linfocitos T CD8+ extenuados con relación a los linfocitos T CD8+ de memoria (Figura 1A) . Además, el PD-1 se expresó en la superficie de los linfocitos T CD8+ en ratones infectados con Cl-13 de LCMV, pero no estuvo presente en la superficie de los linfocitos T CD8+ después de la eliminación de LCMV Armstrong (Figura IB) . Los ratones infectados de manera crónica también expresaron niveles más altos de uno de los ligandos de PD—1, PD-L1, en la mayoría de las linfocitos y las APC, en comparación con los ratones no infectados. Así, la persistencia del antígeno viral y la extenuación de los linfocitos T CD8+ son concomitantes con una inducción en la expresión de PD-1.
Para probar la hipótesis de que el bloquear la trayectoria de PD-l/PD-Ll puede restablecer la función de los linfocitos T y mejorar el control viral durante la infección crónica con LCMV, la trayectoria coinhibidora de PD-l/PD-Ll se interrumpió durante la infección crónica con LCMV utilizando anticuerpos que bloquean a aPD-Ll. Un anticuerpo monoclonal bloqueante contra PD-L1 se administró intraperitonealmente (i.p.) cada tercer día a ratones infectados con Cl-13 LCMV (200 iq de anticuerpos monoclonales de IgG2b de PD-L1 anti-ratón de rata (clona 10F.5C5 ó 10F.9G2)), del día 23 al día 37 postinfección . En el día 37, hubo aproximadamente 2.5 veces más linfocitos T CD8+ específicos de DbNP396-404 y 3 veces más linfocitos T CD8+ específicos de DbGP33-41 en los ratones tratados, con relación a los controles no tratados (Figura 2A) . La inducción en la proliferación fue específica de los linfocitos T CD8+, puesto que el número de linfocitos T CD4+ en el bazo fue aproximadamente el mismo en los ratones tratados y los ratones no tratados (~6xl0's IAbGP61-80 de linfocitos T CD4+ por bazo) .
Además de un incremento en la proliferación de los linfocitos T CD8+, la inhibición de la señalización de PD-1 también resultó en una producción incrementada de citocinas antivirales en los linfocitos T CD8+ específicos del virus. Se determinó la producción de IFN-? y de TNF-a por los linfocitos T CD8+ para ocho epitopos CTL diferentes. La respuesta combinada fue 2.3 veces más alta en los ratones tratados en comparación con los ratones no tratados (Figuras 2B y 2C) . También se observó un incremento de 2 veces en la frecuencia de células que producen a TNF-a después del tratamiento (Figura 2D) . La eliminación viral también se aceleró puesto que el virus se eliminó del suero, el bazo y el hígado de los ratones tratados. Se observaron títulos virales reducidos en el pulmón y el riñon (~10 veces) en el día 37 postinfección (14 días después del inicio del tratamiento) en los ratones tratados. Los ratones no tratados, sin embargo, mostraron niveles significativos del virus en todos estos tejidos (Figura 2E) . Los títulos virales en suero y los homogenizados del tejido se determinaron utilizando células Vero, como se describe en Ahmed et al. (J. Virol. 51:34-41, 1984) . Los resultados muestran que un antagonista de PD-1 incrementa la proliferación de los linfocitos T CD8+ y la eliminación viral por lo tanto indica que la inhibición de la señalización de PD-1 restablece la función de los linfocitos T CD8+. Además, la inhibición de la señalización de PD-1 también mejoró las respuestas de los linfocitos B, puesto que el número de células que secretan el anticuerpo especifico para LCMV en el bazo también se incremento (> 10 veces) después del tratamiento .
Los linfocitos T CD4+ juegan un papel clave en la generación y mantenimiento de las respuestas de los linfocitos T CD8+. A este respecto, los linfocitos T CD8+ sensibilizados en la ausencia de los linfocitos T CD4 + (los llamados linfocitos T CD8+ "indefensos") , son capaces de montar respuestas inmunes normales. Además, la infección crónica con LCMV es más severa en la ausencia de los linfocitos T CD4+. En consecuencia, los linfocitos T indefensos generados durante la infección por LCMV-C1-13 muestran un deterioro funcional incluso más profundo que los linfocitos T generados en la presencia de los linfocitos T CD4+. Los linfocitos T CD8+ específicos de DbNP396-404 se suprimieron a niveles indetectables , y los linfocitos T CD8+ DbGP33-41 y DbGP276-286, perdieron completamente la capacidad para secretar IFN-? y TNF-a.
Los linfocitos T CD4+ estaban extenuados al momento de la infección con LCMV-C1-13 y los ratones se trataron con un tratamiento con anticuerpos anti-PD-Ll del dia 46 al día 60 postinfección. Los linfocitos T CD4+ específicos de LCMV no fueron detectables mediante tinción intracelular de IFN-? antes o después del tratamiento. Después del tratamiento, los ratones tratados tenían aproximadamente 7 veces más linfocitos T CD8+ DbGP276-286 y 4 veces más linfocitos T CD8+ DbGP33-41 en sus bazos que los ratones de control no tratados (Figura 3A) . El número de linfocitos T CD8+ específicos del virus en el bazo también se incrementó (Figura 3B) . Este incremento en los linfocitos T CD8+ específicos del virus en los ratones tratados, se atribuyó a un incremento en la proliferación, detectado mediante la incorporación de BrdU. 43% de los linfocitos T CD8+ DbGP276-286 incorporaron niveles intermedios de BrdU y 2% incorporaron niveles altos de BrdU en los ratones no tratados, mientras que 50% de los linfocitos T CD8+ DbGP276-286 incorporaron niveles intermedios de BrdU y 37% incorporaron niveles altos de BrdU en los ratones tratados. El análisis con BrdU se realizó introduciendo 1 mg/ml de BrdU en el agua potable durante el tratamiento, y la tinción se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante (BD Biosciences, San Diego, CA) . Además, los ratones tratados contenían un porcentaje mayor de linfocitos T CD8+ que expresan la proteína KÍ67 asociada con el ciclo celular (60% versus 19% en los ratones no tratados, Figura 3C) . La respuesta al tratamiento en los linfocitos T CD8+ en las PBMC se restringió a ratones que tienen altos niveles de expansión de los linfocitos T CD8+.
La inhibición de PD-1 también incrementó la producción de citocina antiviral en los linfocitos T CD8+ especificos del virus extenuados, indefensos. Después del tratamiento, el número de linfocitos T CD8+ DbGP33-41 y DbGP276-286 que producen IFN-?, se incrementó marcadamente (Figura 4A) , aunque números más altos de los linfocitos T CD8+ específicos de DbNP396-404, KbNP205-212, DbNP166-175 y DbGP92-101, también se detectaron en los ratones tratados (Figura 4A) . 50% de los linfocitos T CD8 + específicos de DbGP276-286 de los ratones tratados, pueden producir IFN-? en comparación con 20% de los linfocitos T CD8+ específicos de DbGP276-286 en los ratones de control no tratados (Figura 4B) . Los niveles de IFN-? y TNF-a producidos por los linfocitos T CD8+ específicos de DbGP276-286 de los ratones tratados, sin embargo, fueron menores que las células de memoria específicas de DbGP276-286 completamente funcionales (Figura 4C) .
La inhibición de PD-1 también incrementó la actividad lítica de los linfocitos T CD8+ específicos del virus, extenuados, indefensos. La actividad lítica ex vivo de los linfocitos T CD8+ específicos del virus se detectó después del tratamiento, utilizando un ensayo de liberación de 51Cr (Wherry et al., 2003. J. Virol. 77:4911-27). Los títulos virales se redujeron aproximadamente 3 veces en el bazo, 4 veces en el hígado, 2 veces en el pulmón, y 2 veces en el suero después de 2 semanas de tratamiento con relación a los ratones no tratados (Figura 4E) .
Por lo tanto, estos resultados demuestran que el bloqueo de la trayectoria de PD-1 rompe la tolerancia periférica del CTL a una infección viral crónica, y que los linfocitos T CD8+ extenuados privados de la ayuda de los linfocito T CD4+, no están inactivados de manera irreversible .
Ejemplo 2 : Administración de una vacuna antiviral y el antagonista de PD-1 Un procedimiento para reforzar las respuestas de los linfocitos T durante una infección persistente es la vacunación terapéutica. La razón de este procedimiento es que los antígenos endógenos pueden no presentarse de una manera óptima o inmunogénica durante la infección viral crónica, y que el proporcionar el antígeno en la forma de una vacuna, puede proporcionar un estímulo más efectivo para los linfocitos T y B específicos del virus. Utilizando el modelo de LCMV crónico, a los ratones se les administró un virus Vaccinia recombinante que expresa el epitopo GP33 de LCMV como una vacuna terapéutica (VVGP33) , que resultó en una mejora modesta de las respuestas de los linfocitos T CD8+ en algunos ratones infectados de manera crónica. Cuatro de los nueve ratones infectados de manera crónica que recibieron la vacuna terapéutica, mostraron una respuesta positiva, mientras que ninguno de los ratones de control tuvo un incremento significativo en la respuesta inmunitaria contra GP33. Cuando esta vacunación terapéutica se combinó con un inhibidor de PD-L1, las respuestas de los linfocitos T específicos de LCMV se reforzaron a un nivel mayor en comparación con cualquier tratamiento solo, y el efecto del tratamiento combinado fue más que aditivo.
Ejemplo 3: Inhibición de la Trayectoria de PD-1 en Ratones Infectados de Manera Crónica Utilizando AR i de PD-1 El ARN de interferencia (ARNi) es capaz de silenciar la expresión de un gen en las células de mamífero. Los ARN de doble hebra larga (ARNds) se introducen en las células y a continuación se procesan en ARN más pequeños, silenciadores (ARNsi) que seleccionan las moléculas de ARNm específicas o un pequeño grupo de ARNm. Esta tecnología es particularmente útil en situaciones en donde los anticuerpos no son funcionales. Por ejemplo, el ARNi puede emplearse en una situación en la cual las variantes empalmadas únicas producen formas solubles de PD-1 y CTLA-4.
Los ARN silenciadores de PD-1 se insertan en un vector de expresión de ARNsi disponible comercialmente , tal como los vectores de expresión pSilencer™ o vectores adenovirales (Ambion, Austin, TX) . Estos vectores se ponen a continuación en contacto con los linfocitos T extenuados objetivo in vivo o ex vivo (véase el Ejemplo 4 siguiente ) .
Ejemplo : Rejuvenecimiento ex vivo de los Linfocitos T Extenuados Los linfocitos T CD8+ extenuados específicos del virus se aislan de ratones infectados de manera crónica con LCMV-C1-13 utilizando perlas magnéticas o centrifugación por densidad. Los linfocitos T CD8+ transfectados se ponen en contacto con un anticuerpo monoclonal que selecciona a PD-L1, PD-L2 o PD-1. Como se describió en el Ejemplo 1, la inhibición de la trayectoria de PD-1 resulta en el rejuvenecimiento de los linfocitos T CD8+. En consecuencia, hay un incremento en la proliferación de los linfocitos T CD8+ y la producción de citocina, por ejemplo. Estos linfocitos T CD8+ rejuvenecidos se reintroducen en los ratones infectados y la carga viral se mide como se describió en el Ejemplo 1.
Ejemplo 5: Selección in vitro de los Compuestos Rejuvenecedores de los Linfocitos T CD8+ Novedosos Los compuestos que modulan la trayectoria de PD-1 pueden identificarse en ensayos de selección in vivo y ex vivo basándose en su capacidad para invertir el desgaste de los linfocitos T CD8+ que resulta de una infección viral crónica.
Los linfocitos T CD8+ extenuados se derivaron de ratones infectados de manera crónica con LCMV-C1-13 y a continuación se pusieron en contacto con un compuesto de prueba. La cantidad de las citocinas antivirales (por ejemplo, IFN-? o TNF-a) liberada de los linfocitos T en contacto, se midió, por ejemplo, mediante ELISA u otro método cuantitativo, y se comparó con la cantidad, si la hay, de la citocina antiviral liberada del linfocito T extenuado no puesto en contacto con el compuesto de prueba. Un incremento en la cantidad de la citocina antiviral liberada por las células tratadas con relación a tal cantidad en las células no tratadas, identifica el compuesto como un antagonista de PD-1, útil para modular la actividad de los linfocitos T.
Ejemplo 6: Selección in vivo de los Compuestos Rejuvenecedores de los Linfocitos T CD8+ Novedosos Los linfocitos T CD8+ extenuados se derivaron de ratones infectados de manera crónica con LC V-C1-13. Un compuesto de prueba se administró intravenosamente a los ratones infectados. La cantidad de las citocinas antivirales (tales como IFN-? o TNF-a) que se libera en el suero de los ratones tratados y no tratados se midió, por ejemplo, mediante ELISA u otro método cuantitativo, y se comparó. Un incremento en la cantidad de la citocina antiviral encontrada en el suero en los ratones tratados con relación a tal cantidad en los ratones no tratados, identifica el compuesto de prueba como un antagonista de PD-1. De manera alterna, el titulo viral (por ejemplo, titulo viral en suero) , puede determinarse antes y posterior al tratamiento del compuesto de prueba.
Ejemplo 7 : Chimpancés como un Modelo para la Inmunoterapia de una Infección Persistente con HCV Los chimpancés proporcionan un modelo de la persistencia de HCV en humanos. Los defectos en la inmunidad de los linfocitos T que conducen a la persistencia del virus de larga vida incluyen un déficit en los linfocitos T cooperadores CD4+ específicos de HCV y una actividad de los linfocitos T CD8+ efectores deteriorada o alterada. Los chimpancés infectados de manera persistente se trataron con los anticuerpos contra CTLA-4, PD-1 o una combinación de los dos. Se determinó la eficacia del bloqueo de las trayectorias inhibidoras, combinada con la vacunación utilizando proteínas HCV estructurales y no estructurales recombinantes, y si tales estrategias pueden mejorar la frecuencia y longevidad de los linfocitos T de memoria específicos del virus. El defecto en la inmunidad de los linfocitos T es exclusivamente específico de HCV en humanos y chimpancés infectados de manera persistente. La sangre y el hígado de los chimpancés infectados se examinaron para la expresión de CTLA-4, PD-1, BTLA y sus ligandos para determinar la presencia de células Treg. La actividad antiviral puede restablecerse entonces suministrando los anticuerpos monoclonales humanizados de chimpancé que bloquean la señalización a través de estas moléculas.
Los chimpancés infectados de manera persistente se trataron con anticuerpos aCTLA-4 (MDX-010, Medarex) o anticuerpos aPD-1 humanizados. La dosis inicial de MDX-010 es de 0.3 mg/kg, seguido 2 semanas más tarde por 1.0 mg/kg, y a continuación 3, 10, 30 mg/kg a intervalos de tres semanas. Después del tratamiento con los anticuerpos para las moléculas coinhibidoras , se determinarán las respuestas inmunes humorales y celulares, así como la carga del ARN de HCV. Las muestras se recolectaron a las semanas 1, 2, 3, 5 y 8, y a continuación a intervalos mensuales. Las muestras incluyen: 1) suero para el análisis de las transaminasas , autoanticuerpos, anticuerpos neutralizantes para HCV y respuestas de la citocina, 2) plasma para la carga viral y la evolución del genoma, 3) PBMC para las mediciones in vítro de la inmunidad, expresión y función del receptor coestimulador/inhibidor , 4) higado fresco (no fijo) para el aislamiento de linfocitos intrahepáticos y ARN, y 5) higado fijo (incluido en formalina/parafina) para análisis de histología e inmunhistoquímicos . Los nodos linfáticos regionales también se recolectaron en 2 ó 3 puntos de medición para valorar la expresión de las moléculas coinhibidoras y las variantes empalmadas mediante técnicas de inmunohistoquímica y moleculares.
Para determinar si la vacunación con los antígenos de HCV potencia el efecto terapéutico de los anticuerpos para PD-1, los chimpancés se trataron como sigue: 1) inmunización intramuscular con las glucoproteínas con cubierta recombinantes El y E2 (en adyuvante MF59) y otras proteínas (núcleo más NS 3, 4 y 5 formulados con ISCOMS) a las semanas 0, 4 y 24; 2) inmunización intramuscular con la vacuna utilizada en 1), pero coadministrada con los anticuerpos otCTLA-4 (30 mg de cada uno/Kg de peso corporal, intravenosamente a las semanas 0, 4 y 24, cuando se proporciona la vacuna); 3) idéntico a 2), excepto que los anticuerpos aPD-1 (o BTLA) se sustituyen por los anticuerpos CTLA-4; 4) idéntico a los Grupos 2 y 3, excepto que se utiliza una combinación de anticuerpos de CTLA-4 y PD-1 (o BTLA) además de la vacuna. Las respuestas de los linfocitos T y B específicos de HCV se verificaron a intervalos mensuales después de la inmunización durante un periodo de 1 año.
Los marcadores examinados en los linfocitos T HCV-tetrámero+ y totales en este análisis, incluyen los marcadores de diferenciación (por ejemplo, CD45RA/RO, CD62L, CCR7 y CD27), de activación (por ejemplo, CD25, CD69, CD38 y HLA-DR) , de supervivencia/proliferación (por ejemplo, bcl-2 y Ki67), del potencial citotóxico (por ejemplo, granzimas y perforina) , y los receptores de la citocina (CD122 y CD127). Existe una correlación interesante entre los niveles preterapia de la quimiocina IP-10 y la respuesta a IFN-y/ribavirina PEG. Los niveles de IP-10 se midieron para investigar una correlación potencial entre las trayectorias reguladoras negativas o las respuestas de los linfocitos T específicos de HCV y los niveles de IP-10. La expresión de los receptores inhibidores y los ligandos en las PBMC se realizó mediante citometría de flujo.
Ejemplo 8: Inmunotinción de PD-1 en el Tejido Linfoide Reactivo El material del caso se obtuvo del Hospital Brigham & Woraen, Boston, MA, de acuerdo con las políticas institucionales. Todos los diagnósticos se basaron en las características histológicas e inmunofenotípicas descritas en el sistema de Clasificación del Linfoma de la Organización Mundial de la Salud (Jaffe ES, et al., 2001), y en todos los casos, el material de diagnóstico se revisó por un hematopatólogo .
La inmunotinción de PD-1 se realizó en secciones de tejido incluidas en parafina, fijas con formalina después de la recuperación del antígeno con microondas en amortiguador de citrato 10 mM, pH 6.0, con un anticuerpo monoclonal del PD-1 antihumano descrito previamente (2H7; 5), utilizando un método estándar indirecto de peroxidasa de rábano picante con avidina-biotina y desarrollo del color con diaminobencidina, como se describió previamente (Jones D, et al., 1999; Dorfman DM, et al., 2003). Los casos se consideraron como inmunorreactivos para PD-1 si al menos 25% de las células neoplásicas exhibían tinción positiva. La tinción de PD-1 se comparó con aquélla del anticuerpo de control del isotipo de IgG de ratón diluido a una concentración de la proteína idéntica para todos los casos estudiados, para confirmar la especificidad de la tinción .
El anticuerpo monoclonal 2H7 para PD-1 se utilizó para teñir especímenes incluidos en parafina, fijos con formalina de tejido linfoide reactivo, timo y una gama de casos de trastornos linfoproliferativos de los linfocitos B y los linfocitos T. En los especímenes de amígdalas que exhiben cambios reactivos, incluyendo hiperplasia folicular, un subconjunto de linfocitos predominantemente pequeños en los centros germinales exhibió una tinción citoplásmica para PD-1, con células de PD-1 positivo poco frecuentes observadas en las zonas de los linfocitos T interfoliculares. El patrón de tinción de PD-1 en los centros germinales fue virtualmente idéntico a aquel observado con un anticuerpo para CD3, un marcador pan-linfocito T, mientras que un anticuerpo para CD20, un marcador pan-linfocito B, tiñó la vasta mayoría de los linfocito B del centro germinal. Se observaron resultados similares en las secciones histológicas de nodo linfático y bazo reactivos. No se observó tinción de PD-1 en el timo de adultos.
Ejemplo 9: Inmunotinción de PD-1 en Secciones de Tejido Incluidas en Parafina de los Trastornos Linfoproliferati os de los Linfocitos B y los Linfocitos T Se estudió una variedad de trastornos linfoproliferativos de los linfocitos B y los linfocitos T, para la expresión de PD-1; los resultados se resumen en la Tabla 4. Cuarenta y dos casos de trastornos linfoproliferativos de los linfocitos B se examinaron para la expresión de PD-1, incluyendo los casos representativos de la leucemia linfoblástica/linforna linfoblástico del precursor B, asi como una variedad de trastornos linfoproliferativos de los linfocitos B maduros, incluyendo varios linfomas no-Hodgkin de los linfocitos B de origen folicular, incluyendo 6 casos de linfoma folicular y 7 casos de linfoma de Burkitt. Ninguno de los trastornos linfoproliferativos de los linfocitos B mostró tinción para PD-1. En algunos casos, estuvo presente un tejido linfoide reactivo no neoplásico, y mostró un patrón de tinción de PD-1 como se observa en las amígdalas y otro tejido linfoide reactivo indicado anteriormente.
De manera similar, en 25 casos de linfoma de Hodgkin, incluyendo 11 casos de linfoma de Hodgkin clásico y 14 casos de linfoma de Hodgkin predominante de los linfocitos, las células neoplásicas no exhibieron tinción para PD-1. De manera interesante, en todos los 14 casos de linfoma de Hodgkin predominante de los linfocitos, los linfocitos T que rodean las células L&H CD20 positivas neoplásicas, fueron inmunorreactivos para PD-1, de manera similar al patrón de tinción notado para los linfocitos T CD57+ en el linfoma de Hodgkin predominante de los linfocitos. Estas células PD-1 positivas fueron un subconjunto de la población de linfocito T CD3+ totales presentes.
Se estudió una gama de trastornos linfoproliferativos de los linfocitos T para la expresión de PD-1; los resultados se resumen en la Tabla 4. Los casos de leucemia linfoblástica/linforna linfoblástico de los linfocitos T precursores, un neoplasma de los linfocitos T inmaduros, fueron negativos para PD-1, como los neoplasmas de los linfocitos T periféricos, postímicos, incluyendo los casos de leucemia prolinfocítica de los linfocitos T, linfoma de los linfocitos T periféricos, linfoma no especificado de las células grandes anaplásicas y leucemia/linforna de los linfocitos T en adultos. En contraste, todos los 19 casos de linfoma angioinmunoblásticos contenían focos de células PD-1 positivas que también eran inmunorreactivas para los marcadores pan-linfocito T tales como CD3. Las células PD-1 positivas se encontraron de manera consistente en los focos de las redes de células dendríticas foliculares (FDC) CD21+ expandidas, un rasgo característico del linfoma angioinmunoblástico .
TABLA 4. Inmunotinción de PD-1 en los trastornos linfoproliferativos .
Abreviaturas: B-LL/LL - linfoma linfoblástico/leucemia linfoblástica del precursor de los linfocitos B precursores; CLL - leucemia linfocitica crónica; MCL -linfoma de las células del manto; FL -linfoma folicular; MZL - linfoma de la zona marginal; HCL - leucemia de las células pilosas; DLBCL - linfoma difuso de los linfocitos B grandes; BL - linfoma de Burkitt; LPL - linfoma linfoplasmacitico; MM - mieloma múltiple; T-LL/L leucemia linfoblástica/linforna linfoblástico del precursor T; T-PLL - leucemia prolinfocitica de los linfocitos T; AIL -linfoma angioinmunoblástico ; PTCL -linfoma de los linfocitos T periféricos, no especificado; ALCL - linfoma de las células grandes anaplásicas; ATLL -leucemia/linforna de los linfocitos T en adultos. * número de casos inmunorreactivos /número total de casos ** Las células PD-1 positivas forman rosetas alrededor de las células L&H neoplásicas en 14/14 casos Ejemplo 10: Métodos Generales para Estudiar la Expresión de PD-1 en Linfocitos T CD8+ Humanos Específicos del VIH Se utilizaron los siguientes métodos para realizar los experimentos detallados en los Ejemplos 11-14.
Sujetos: Los participantes del estudio con infección crónica con VIH-I ciado C se reclutaron de clínicas de pacientes externos en el Hospital McCord, Durban, Sudáfrica, y el Hospital St . Mary, ariannhill , Sudáfrica. La sangre periférica se obtuvo de 65 sujetos en esta cohorte, todos los cuales no habían sido tratados previamente con terapia antirretroviral al momento del análisis. Los sujetos se seleccionaron para la inclusión, basándose en sus alelos HLA expresados, que corresponden a diez tetrámeros de la clase I que se construyeron (véase a continuación) . La carga viral media de la cohorte fue de 42,800 copias del ARN del VIH- I /mi de plasma (intervalo 163 -750,000), y el conteo de CD4 medio absoluto fue de 362 (intervalo 129 -1179) . La información con respecto a la duración de la infección no estaba disponible. Todos los sujetos proporcionaron una consentimiento informado por escrito para el estudio, que se aprobó por los comités locales de revisión institucional.
Construcción de los anticuerpos de PD-1 y PD-Ll: Los anticuerpos monoclonales para el PD-Ll humano (29E.2A3, IgG2b de ratón) y PD-1 (EH12, IgGl de ratón) se prepararon como se describió previamente y han mostrado bloquear la interacción PD-1: PD-Ll.
Tetrámeros de MHC clase I: Se utilizaron diez tetrámeros del HMC de VIH Clase I, sintetizados como se describió previamente (Altman JD, et al. 1996) para este estudio: A*0205 GL9 (p24, GAFDLSFFL; SEQ ID NO:l), A*3002 KIY9 (Integrasa, KIQNFRVYY; SEQ ID NO:2), B*0801 DI8 (p24, DIYKRWII SEQ ID NO:3), B*0801 FL8 (Nef, FLKEKGGL; SEQ ID NO: 4), B 201 RM9 (Nef, RPQVPLRPM; SEQ ID NO: 5), B*4201 TL9 (p24, TPQDLNTML; SEQ ID NO: 6), B*4201 TL10 (Nef, TPGPGVRYPL; SEQ ID NO : 7 ) , B*4201 YL9 (RT, YPGIKVKQL; SEQ ID N0:8), B*8101 TL9 (p24, TPQDLNTML; SEQ ID NO: 9) y Cw0304 YL9 (p24, YVDRFFKTL; SEQ ID NO: 10) .
Análisis de tinción y análisis fenotípicos del tetrámero de HLA clase I: Las células mononucleares de la sangre periférica aisladas recientemente (PBMC, 0.5 millones) se tiñeron con el tetrámero durante 20 minutos a 37°C. Las células se lavaron entonces una vez con suero fisiológico amortiguado con fosfato (PBS), se granularon y se tiñeron directamente con anti-CD8 conjugado con · isotiocianato de fluoresceina (FITC) (Becton Dickinson) , anti-PD-1 conjugado con ficoeritrina (clona EH12), y ViaProbe (Becton Dickinson) . Las células se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente, se lavaron una vez en PBS y se resuspendieron en 200 µ? de PBS con paraformaldehido al 1% y se adquirieron en un clasificador celular activado por fluorescencia ( FACSCalibur™, Becton Dickinson). Se adquirió un mínimo de 100,000 eventos en el FACSCalibur™.
Ensayos de proliferación de CFSE: Un millón de PBMC aisladas recientemente se lavaron dos veces en PBS, se granularon y resuspendieron en 1 mi de diacetato de carboxifluoresceína 0.5 µ?, éster de succinimidilo (CFSE, Sondas Moleculares) durante 7 minutos a 37°C. Las células se lavaron dos veces en PBS, se resuspendieron en 1 mi de medio RIO (RPMI 1640 suplementado con glutationa, penicilina, estreptomicina y suero de becerro fetal [FCS] al 10%), y se emplacaron en un pozo de una placa con 24 pozos. Los estudios iniciales revelaron que una concentración final de 0.2 g/ml de péptido, proporcionaron respuestas proliferativas óptimas, por lo tanto, esta es la concentración final del péptido en el pozo, utilizada para cada ensayo. Los pozos del control negativo consistieron de PBMC en medio solo o PBMC en medio con anti-PD-Ll purificado (10 g/ml) , y los pozos del control positivo se estimularon con 10 vg/ml de fitohemaglutinina (PHA) . Después de una incubación de 6 días en una incubadora a 37 °C, las células se lavaron con 2 mi de PBS y se tiñeron con los tetrámeros de MHC conjugados con PE de la Clase I, ViaProbe (Becton Dickinson) y anticuerpos anti-CD8-APC . Las células se adquirieron en un FACSCalibur y se analizaron mediante el programa CellQuest® (Becton Dickinson) . Las células se muestran en una cuadricula en ViaProbe-linfocitos CD8+. El incremento en las células tetrámero+ se calculó dividiendo el porcentaje de células tetrámero+ CD8+ en la presencia del péptido, entre el porcentaje de células tetrámero+ CD8+ en la ausencia de la estimulación con el péptido .
Análisis Estadístico: Los análisis de la correlación de Spearman, de la prueba de Mann-Whitney y de la prueba t apareada se realizaron utilizando GraphPad Prism Versión 4.0a. Todas las pruebas tenían 2 colas y los valores de p de p<0.05 se consideraron significativos.
Ejemplo 11: Expresión de PD-1 en los Linfocitos T CD8+ específicos del VIH Se sintetizó un panel de 10 tetrámeros de MHC Clase I específicos para los epitopos dominantes de los linfocitos T CD8+ del virus de VIH-I ciado C, basándose en los alelos de HLA prevalecientes y los epitopos seleccionados frecuentemente en Gag, Nef, Integrasa y RT, permitiendo la visualización directa de la expresión superficial de PD-1 en estas células. Se realizó la tipificación de HLA de alta resolución en toda la cohorte, y un subconjunto de 65 personas sin tratamiento previo con terapia antirretroviral se seleccionó para el estudio, basándose en la expresión de los alelos de HLA relevantes. Se examinó un total de 120 epitopos individuales, y la tinción representativa ex vivo de PD-1 en las células tetrámero+ del VIH se muestra en la figura 5A. La expresión de PD-1 fue fácilmente evidente en estas células tetrámero+, y fue significativamente más alta que en la población de linfocitos CD8 totales de los mismos individuos (p<0.0001); a su vez, la expresión de PD-1 en los linfocitos T CD8+ del tetrámero+ y la población de linfocitos T CD8+ totales fue significativamente más alta que en los controles seronegativos al VIH (Figura 5B) . Para ocho de los diez tetrámeros probados, al menos se identificó una persona en quien el nivel de expresión de las células CD8+ especificas del antigeno fue de 100% (Figura 5C) . Las PBMC de 3 a 25 individuos se tiñeron para cada respuesta del tetrámero de VIH, con los niveles de expresión de PD-1 medios que varían de 68% a 94% de las células tetrámero+ (Figura 5C) . Estos hallazgos se confirmaron además, mediante al análisis de la intensidad de la fluorescencia media (MFI) de PD-1 en las células tetrámero+ y la población de linfocitos T CD8+ totales (Figura 5B, C) .
Se determinó a continuación si hay evidencia de diferencias específicas del epitopo en términos de los niveles de expresión de PD-1 en personas con múltiples respuestas detectables. De las 65 personas examinadas, 16 individuos tenían entre 3 y 5 respuestas tetrámero positivas, cada uno. La expresión de PD-1 fue casi idéntica y se aproximó a 100% para cada respuesta analizada para tres de los dieciséis sujetos; sin embargo, los otros 13 individuos mostraron diferentes patrones de expresión de PD-1 dependiendo del epitopo (Figura 5D) . Estos datos indican que la expresión de PD-1 puede expresarse diferencialmente en los linfocitos T CD8+ específicos del epitopo, contemporáneos, de una sola persona, tal vez consistente con los datos recientes que indican las diferencias específicas del epitopo en la eficacia antiviral (Tsomides TJ, et al. 1994; Yang 0, et al. 1996; Loffredo JT, et al. 2005).
Ejemplo 12 : La Relación Entre la Expresión de PD-1 y la Progresión de la Enfermedad por VIH Se determinó la relación entre la expresión de PD-1 en los linfocitos T CD8+ específicos del VIH y la carga viral en el plasma y los conteos de las células CD4+, ambos de los cuales son predictores de la progresión de la enfermedad por VIH. Consistente con los estudios previos, la relación entre el número de células tetrámero positivas y la carga viral o el conteo de las células CD4 + falló en mostrar alguna correlación significativa (Figura 6A, B) . En contraste, existen correlaciones positivas significativas con la carga viral y el porcentaje y la MFI de la expresión de PD-1 en las células tetrámero positivas del VIH (p=0.0013 y p<0.0001, respectivamente; Figura 6?) .
También existen correlaciones inversas entre el conteo de CD4 y el porcentaje y la MFI de PD-1 en las células tetrámero positivas del VIH (p=0.0046 y p=0.0150, respectivamente; Figura 6B) . Puesto que los tetrámeros probados probablemente representan sólo una fracción de la población de los linfocitos T CD8+ específicos de VIH en estos sujetos, la relación entre la expresión de PD-1 y todas las células CD8+ y estos parámetros también se examinó. Hubo correlaciones positivas significativas entre la carga viral y el porcentaje y la MFI de la expresión de PD-1 en la población de linfocitos T CD8+ totales (p=0.0021 y p<0.0001, respectivamente; Figura 6C) , y también se observaron correlaciones inversas entre el conteo de las células CD4+ y el porcentaje y la MFI de la expresión de PD-1 en la población de linfocitos T CD8+ totales (p=0.0049 y p=0.0006, respectivamente; Figura 6D) . En este mismo grupo, la expresión de PD-1 en los linfocitos T CD8+ específicos de CMV se probó en 5 sujetos, y significativamente menos PD-1 se expresó en estas células, en comparación con los linfocitos T CD8 específicos del VIH (media 23% de PD-1+ tetrámero+ de CMV, p=0.0036), y no fue diferente de los linfocitos T CD8+ en volumen en estos mismos individuos, indicando que la alta expresión de PD-1 no es una característica uniforme de todos los linfocitos T CD8+ específicos de los virus.
Estos datos sugieren que el incremento de las cantidades del antígeno en la infección crónica con VIH resulta en una expresión incrementada de PD-1 en los linfocitos T CD8+ , y son consistentes con los datos murinos en la infección crónica con LCMV, en la cual la expresión de PD- 1 está asociada con la extenuación funcional de los linfocitos T CD8+ (Barber DL, et al. 2005) . Además, proporcionan la primera asociación clara, en un estudio grande que incluye el análisis de múltiples epitopos, entre los linfocitos T CD8+ específicos de VIH y la carga viral o el conteo de CD4.
Ejemplo 13: La Relación Entre la Expresión de PD-1 y el Estado y Función de los Linfocitos T CD8 de Memoria La expresión de PD-1 se analizó a continuación en el contexto de varios marcadores fenotípicos adicionales asociados con el estado y función de los linfocitos T CD8+ de memoria, incluyendo CD27, CD28, CD45RA, CD57, CD62L, CD127, CCR7 , perforina, granzima B y Ki67 (Figura 7) . Las tinciones representativas para estos marcadores en las células tetrámero+ B*4201 TL9 de un individuo se muestran en la figura 7A, y los datos agregados para 13 sujetos se muestran en la figura 7B. Estos estudios estuvieron limitados a aquellas respuestas del tetrámero que eran mayores que 95% de PD-1 positivo, puesto que la citometria de flujo con múltiples parámetros de más de 4 colores no estaba disponible en KwaZulu Natal. Las células PD-1+ tetrámero"1" de VIH expresan altos niveles de CD27 y de granzima B, muy bajos niveles de CD28, CCR7 y Ki67 intracelular, bajos niveles de CD45RA y perforina, y niveles intermedios de CD57 y CD62L (Figura 7B) . Estos datos indican que los linfocitos T PD-1+ específicos del VIH, muestran un fenotipo del efector/memoria del efector, y son consistentes con los reportes previos de maduración sesgada de los linfocitos T CD8+ específicos de VIH. Además, el secuenciamiento del virus se realizó para determinar si estas células estaban dirigiendo el escape inmune. De 45 de estas respuestas tetrámero positivas evaluadas, los epitopos virales en sólo 5 fueron diferentes de la secuencia de consenso del ciado C Sudafricano, indicando que estas células ejercen poca presión de selección in vivo.
Los experimentos previos en ratones, utilizando el modelo de LCMV mostraron que el bloqueo in vivo de la interacción de PD-1/PD-L1 mediante la infusión del anticuerpo que bloquea a anti-PD-Ll, resulta en una funcionalidad mejorada de los linfocitos T CD8+ específicos de LCMV, medida mediante la producción de citocina, la capacidad para destruir, la capacidad proliferativa y de manera más sorprendente, la reducción en la carga viral. La estimulación a corto plazo (12 horas) in vitro específica del antígeno de las PBMC aisladas recientemente de 15 sujetos VIH+, en la presencia o ausencia de 10 ug/ml del anticuerpo anti-PD-Ll purificado, falló en incrementar la producción de IFN-?, TNF-a o IL-2.
Ejemplo 14: Efecto del Bloqueo de la Trayectoria de PD-1/PD-L1 en la Proliferación de los Linfocitos T CD8+ Específicos de VIH Debido a que los linfocitos T CD8+ específicos de VIH también exhiben una capacidad proliferativa deteriorada (2004), se determinó si el bloqueo de PD-l/PD-Ll podría mejorar esta función in vitro. Los datos representativos de un individuo positivo para B 201 se muestran en la figura 8A. La incubación de PBMC marcadas con CFSE aisladas recientemente, con medio solo o medio con el anticuerpo anti-PD-Ll, resultó en el mantenimiento de una población de linfocitos T CD8+ específicos de B 201-TL9 (1.2% de linfocitos T CD8+ ) que permaneció CFSEhi después de seis días en cultivo. La estimulación de las PBMC marcadas con CFSE durante 6 días con el péptido TL9 solo, resultó en una expansión de 4.8 veces de las células tetrámero+ de CFSElo B*4201 TL9, mientras que la estimulación de las PBMC marcadas con CFSE con el péptido TL9 en la presencia del anticuerpo que bloquea a anti-PD-Ll, mejoró además la proliferación de las células especificas de TL9, resultando en un incremento de 10.3 veces en las células tetrámero+. Los ensayos de proliferación de CFSE se realizaron en 28 muestras en la presencia y ausencia del anticuerpo que bloquea a anti-PD-Ll humano purificado. Un incremento significativo en la proliferación de los linfocitos T CD8+ específicos de VIH se observó en la presencia del péptido más el anticuerpo que bloquea a anti-PD-Ll, en comparación con la cantidad de proliferación después de la estimulación con el péptido solo (Figura 8B; p=0.0006, prueba t-apareada) . El incremento de las células tetrámero+ en la presencia del anticuerpo que bloquea a anti-PD-Ll, varió por el individuo y por el epitopo dentro de un individuo dado (Figura 8C) , sugiriendo nuevamente diferencias específicas del epitopo en el grado de extenuación funcional de estas respuestas .
Ejemplo 15: La Vacunación Terapéutica en Conjunto con el Bloqueo de la Trayectoria Inhibidora de PD-1 Mejora de Manera Sinergistica el Control Inmune de la Infección Viral Crónica: Un Estudio Conceptual de la Vacuna Terapéutica Combinatoria El deterioro funcional de los linfocitos T, incluyendo la proliferación de la citocina, citólisis y proliferación de los linfocitos T específicos del antígeno, es una característica que define a muchas infecciones crónicas. La respuesta inmunitaria inactivada del linfocito T se observa durante una variedad de diferentes infecciones persistentes causadas por patógenos, incluyendo VIH, HBV, HCV y TB en humanos. La inactivación del linfocito T durante la infección crónica puede correlacionarse con la magnitud y persistencia de la carga del antigeno y originarse de las señales interrumpidas del receptor del linfocito T proximal, la sobrerregulación de las proteínas inhibidoras o la desregulación de las proteínas coestimuladoras , y los defectos en las señales accesorias y de la citocina. El defecto en los linfocitos T extenuados es una razón primaria de la incapacidad del hospedante para eliminar el patógeno persistente. Durante la infección crónica, los linfocitos T CD8 específicos del virus, extenuados, sobrerregulan dos proteínas inhibidoras clave: PD-1 y CTLA-4. Un bloqueo in vivo de PD-1 incrementa el número y la función de los linfocitos T CD8 específicos del virus y resulta en una carga viral disminuida.
Existen varias desventajas de las estrategias de vacunación actuales para las infecciones crónicas. De manera específica, el refuerzo efectivo de las respuestas de los linfocitos T CD8 antivirales no se observa después de la vacunación terapéutica. Además, una alta carga viral y el bajo potencial proliferativo de los linfocitos T que responden durante la infección crónica, probablemente limiten la efectividad de la vacunación terapéutica. Asi, es importante desarrollar una estrategia de vacuna terapéutica para reforzar de manera efectiva las respuestas de los linfocitos T endógenos del hospedante para controlar la infección crónica.
Un modelo de infección crónica bien conocido inducido por la infección con la Clona 13 de LCMV se utilizó para determinar la efectividad de utilizar un antagonista de PD-1 en combinación con una vacuna terapéutica. Un virus Vaccinia que expresa el epitopo GP33 de LCMV se utilizó con una vacuna terapéutica para verificar una respuesta inmunitaria de los linfocitos T CD8 específicos del epitopo. Una vacuna terapéutica se combinó con el anticuerpo anti-PD-Ll para bloquear una trayectoria inhibidora, con el fin de investigar el efecto sinergístico con respecto a una proliferación de los linfocitos T CD8 específicos del antígeno y una resolución del virus persistente.
Los siguientes métodos se utilizaron en estos experimentos: Ratones e infecciones : Los ratones C57BL/6 (hembras de 4 a 6 semanas de edad) fueron de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) . Los ratones se mantuvieron en un vivario libre de patógenos de acuerdo con los lineamientos de Cuidado Animal de NIH. Para el inicio de las infecciones crónicas, los ratones se infectaron con 2X106 UFP de la clona 13 de LCMV (CL-13) como se describió previamente. El crecimiento viral y los ensayos de placa para determinar los títulos virales se han descrito previamente.
Bloqueo del anticuerpo in vivo y vacunación terapéutica: Se administraron doscientos microgramos de PL-L1 anti-ratón de rata (10F:9G2) intraperitonealmente cada tercer día desde las 4 semanas postinfección con CL-13. Al punto de medición del primer tratamiento de anti-PD-L1, 2X106 UFP del virus Vaccinia recombinante que expresa el epitopo GP33-41 (VV/GP33) como la vacuna terapéutica o el virus Vaccinia del tipo silvestre (VV/WT) como la vacuna de control, se administraron intraperitonealmente .
Aislamiento de los linfocitos: Los linfocitos se aislaron de los tejidos y de la sangre como se describió previamente. El hígado y el pulmón se prefundieron con PBS enfriado con hielo antes del retiro para el aislamiento de los linfocitos.
Citometría de Flujo: Los tetrámeros del péptido de HC clase I se generaron y utilizaron como se describió previamente. Todos los anticuerpos se obtuvieron de BD Pharmingen, excepto la granzima B (Caltag) , Bcl-2 (R&D Systems) y CD127 ( eBioscience ) . Toda la tinción de la citocina superficial e intracelular se realizó como se describió (Barber et al., Nature 439:682, 2006). Para detectar la desgranulación, los esplenocitos se estimularon durante 5 horas en la presencia de brefeldina, monensina, anti-CD107a-FITC y anti-CD107b-FITC .
Microscopía Confocal: Los bazos se retiraron de los ratones y se congelaron en OCT (TissueTek) . De estos bloques, se cortaron secciones con el crióstato de 10-20 mm y se fijaron en acetona enfriada con hielo durante 10 minutos. Para la inmunofluorescencia, las secciones se tiñeron con los siguientes anticuerpos: ER-TR7 para detectar las células reticulares (Biogénesis, Kingston, NH) y suero de cobayo anti-LCMV policlonal. Las tinciones se visualizaron con Ig anti-rata de cabra. Alexa Fluor-488 y anti-cobayo de cabra Alexa Fluor-568 (Molecular Probes) y se analizaron mediante microscopía confocal (Leica Microsystems AG, Alemania) . Las imágenes se prepararon utilizando ImageJ (Institutos Nacionales de Salud) y Photoshop (Adobe Systems Inc.) .
Los resultados demostraron que una combinación de la vacuna terapéutica y el anticuerpo anti-PD-Ll muestra un efecto sinergístico en la proliferación de los linfocitos T CD8 específicos del antígeno y la resolución del virus persistente. La vacuna terapéutica podría reforzar de manera efectiva una población de linfocitos T CD8 restablecida funcionalmente mediante el bloqueo de la trayectoria inhibidora de PD-1/PD-L1. La proliferación mejorada de los linfocitos T CD8 específicos del antígeno y el control viral acelerado, se alcanzaron de manera sistemática mediante la vacunación terapéutica combinatoria (Figuras 9A-9D y Figuras 10A-10D) . La vacuna terapéutica combinatoria guía a un incremento dramático de los linfocitos T CD8 funcionalmente activos (Figuras 11A-D) . Además, la vacuna terapéutica que utiliza un vector que expresa un epitopo específico durante el bloqueo de la trayectoria de PD-1/PD-L1, mejora una proliferación del linfocito T CD8 específico para el epitopo codificado en el vector (Figuras 9 y 11) . El nivel de expresión incrementado de CD127 observado en los linfocitos T CD8 específicos del antígeno en el grupo tratado con la vacuna combinatoria, refleja la generación de respuestas de los linfocitos T de memoria a largo plazo, mientras que los niveles de expresión disminuidos de PD-1 y la Granzima B se correlacionan con la resolución del virus persistente (Figuras 12A-12B) .
Hubo un efecto sinergístico de la vacuna terapéutica, combinada con un bloqueo de PD-L1 en el restablecimiento de la función en los linfocitos T CD8 extenuados "indefensos" (véase (Figuras 13A-13E) . Los ratones tenían una reducción de linfocitos T CD4 y a continuación se infectaron con la clona 13 de LCMV. Algunos ratones se vacunaron con el virus Vaccinia del tipo silvestre (VV/WT) o con el virus de Vaccinia que expresa al epitopo GP33-41 de LCMV (VV/GP33) a las 7 semanas postinfección. Al mismo tiempo, los ratones se trataron 5 veces cada tres días con aPD-Ll o su isotipo. Dos semanas después del tratamiento inicial de los anticuerpos, los ratones se sacrificaron para el análisis. Los resultados se muestran en la figura 13A. La frecuencia de los linfocitos T CD8 específicos de GP33 se examinó también (Figura 13B) . Los esplenocitos se estimularon con el péptido GP33 en la presencia de los anticuerpos aCD107a/b y a continuación se cotiñeron para el IFN-?. Los diagramas mostrados están cuadriculados en los linfocitos T CD8 (Figura 13C) . El porcentaje de las células IFN-y+ después de la estimulación con el péptido GP33 por células positivas para el tetrámero GP33-41 restringido a Db, también se determinó (Figura 13D) , así como el título viral (Figura 13E) . Los resultados demuestran el efecto sinergístico de una vacuna combinada con el bloqueo de PD-1.
Estos resultados muestran que las combinaciones de bloquear la trayectoria reguladora negativa y el refuerzo de los linfocitos T CD8 durante la infección crónica, puede utilizarse en el desarrollo de vacunas terapéuticas para mejorar las respuestas de los linfocitos T en pacientes con infecciones o malignidades crónicas. Las intervenciones terapéuticas, tales como el uso de un antagonista de PD-1, que refuerzan las respuestas de los linfocitos T y disminuyen la carga viral, podrían incrementar la supervivencia libre de enfermedad y disminuir la transmisión del virus. La vacunación terapéutica efectiva podría utilizarse para las infecciones virales crónicas y las infecciones bacterianas, parasitarias persistentes. Esta estrategia también es de uso para el tratamiento de malignidades.
Ejemplo 16: Mejora de la Inmunoterapia con los Linfocitos T a Través del Bloqueo de la Trayectoria de PD1/PDL1 Es importante desarrollar estrategias para tratar y eliminar las infecciones virales crónicas, tales como el virus de la Inmunodeficiencia Humana y de la Hepatitis C. Los CDC han reportado recientemente que más de un millón de norteamericanos viven con VIH, ejemplificando la necesidad de terapias más efectivas. Es importante determinar cómo la señalización inhibidora para los linfocitos puede contribuir a la capacidad de un patógeno para evadir de manera persistente la respuesta inmunitaria del hospedero.
El inmunorreceptor inhibidor de PD-1 (un miembro de la familia B7/CD28 de receptores coestimuladores ) y su ligando (PD-L1) han mostrado estar dramáticamente sobrerregulados durante los estados de infección crónica con el virus de la coriomeningitis linfocitica (LCMV) . Los estudios adicionales que utilizan el modelo del LCMV han demostrado que el bloqueo de la trayectoria de PD1/PDL1 aumenta de manera significativa la respuesta del linfocito T CD8 antiviral endógeno durante las fases tardías de la infección crónica, cuando los linfocitos T CD8 están extenuados. Los linfocitos T extenuados están funcionalmente comprometidos y no montan respuestas inmunes efectivas tras el encuentro con un antigeno. Sin embargo, el bloqueo de la trayectoria de PD1/PD-L1 parece invertir la extenuación y restablecer su capacidad funcional. Los datos sugieren que estos efectos persisten bastante más allá del periodo inmediato del tratamiento con anti-PDLl.
Los siguientes experimentos se realizaron con el fin de (1) valorar la capacidad de anti-PDLl para mejorar la proliferación y supervivencia de los linfocitos T CD8 antivirales tras la transferencia adoptiva de los esplenocitos inmunes (memoria) en ratones infectados de manera congénita (portador), (2) evaluar la funcionalidad de los linfocitos T de memoria CD8 específicos del virus, que se han expandido en la presencia del bloqueo de PDl/PDLl, y (3) determinar la expresión de varios marcadores de diferenciación en los linfocitos T CD8 específicos del virus que se han expandido en la presencia del bloqueo de PDl/PDLl.
El papel de la trayectoria de PD-1 se valoró en un modelo bien desarrollado de terapia citoinmune para la infección viral crónica. El modelo descrito en la presente es análogo al de la terapia citoinmune del linfocito T para tumores con respecto a las barreras inmunológicas , el limite de aplicabilidad de estas terapias (tales como respuestas del linfocito T/antitumorales corruptas o suprimidas) . Los ratones infectados de manera neonatal o in útero con LCMV no montan respuestas inmunes específicas endógenas para el LCMV y tienen altos niveles de LCMV infeccioso en la sangre y en todos los tejidos a través de sus vidas. Estos animales son portadores congénitos y son esencialmente tolerantes para el patógeno. Cuando los esplenocitos de un ratón inmune a LCMV se transfieren de manera adoptiva en un portador congénito, las células de memoria inmunes transferidas rápidamente se someten a expansión y establecen una respuesta inmunitaria vigorosa contra el virus. Aproximadamente 2/3 de los animales que reciben la terapia citoinmune adoptiva siguen para eliminar completamente la infección cuando se transfieren altas dosis de esplenocitos .
Los siguientes materiales y métodos se utilizaron en estos experimentos: Ratones e infecciones . Los ratones B57BL/6 hembra de 4-6 semanas de edad se compraron de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine) . La infección aguda se inició mediante la inyección intraperitoneal de 2xl05 UFP de Armstrong LCMV. Los ratones portadores congénitos se criaron en la Universidad de Emory (Atlanta, GA) de colonias derivadas de ratones infectados neonatalmente (104 UFP de la clona 13 de LCMV, intracerebral ) .
Inmunoterapia adoptiva y bloqueo del anticuerpo in vivo. 40xl06 esplenocitos completos de ratones inmunes a LCMV (dia 30-90 postinfección) , se aislaron y se transfirieron de manera intravenosa en ratones portadores de LCMV de 6-12 semanas de edad. 200 microgramos de PD-L1 anti-ratón de rata (10F.9G2) se administraron cada 3er dia durante 15 días después de la terapia adoptiva.
Citometría de flujo y tinción del tetrámero .
Los tetrámeros de MHC clase I de H-2Db complejados con GP33-41 de LCMV se generaron como se describió previamente. Todos los anticuerpos se compraron de BD/Pharmingen (San Diego, CA) . Las células mononucleares de sangre periférica y los esplenocitos se aislaron y tiñeron como se describió previamente. Los datos se adquirieron utilizando un citómetro de flujo FACSCalibur™ (BD) y se analizaron utilizando el programa FlowJoe (Tree Star Inc. Ashland, OR) .
Tinción de la citocina intracelular. Para la tinción de la citocina intracelular, 106 esplenocitos se cultivaron en la presencia o ausencia del péptido indicado (.2 pg/ml) y brefeldina A durante 5-6 horas a 37°C. Después de la tinción para los marcadores superficiales, las células se permeabilizaron y tiñeron para las citocinas intracelulares, utilizando la preparación Cytofix/Cytoperm (BD/Pharmigen) .
Se obtuvieron los siguientes resultados: La terapia anti-PD-Ll incrementa el número de linfocitos T CD8 específicos del virus: Las células mononucleares de la sangre periférica (PB C) se aislaron de animales tratados o no tratados en los días 7, 11, 15, 22 y 35. Las células especificas para el epitopo GP33 Db se valoraron mediante la tinción del tetrámero. En dos experimentos independientes, se encontró que los animales tratados con la terapia anti-PD-Ll durante los primeros 15 días después de la transferencia adoptiva, desarrollaron números significativamente más grandes de linfocitos T CD8 específicos de LCMV cuando se normalizaron al número de células positivas para DbGP33 por millón de PBMC (Figura 14). Estos datos apoyan el papel de la trayectoria de PD-l/PD-Ll para conferir algún grado de supresión proliferativa en los linfocitos T de memoria normales. Además, estos resultados sugieren que la inhibición terapéutica de esta trayectoria, podría aumentar el desarrollo y mantenimiento de la respuesta inmunitaria secundaria generada después de la transferencia adoptiva en un entorno de una infección crónica con una alta carga del antígeno.
El bloqueo de PD-l/PD-Ll mejora la funcionalidad de los linfocitos T CD8 específicos del antigeno: Los esplenocitos se aislaron de animales tratados y no tratados en el día 17 postransferencia adoptiva y se analizaron para la expresión de las citocinas inflamatorias (IFN-gamma y TNF alfa) o CDl07ab (proteína de la membrana asociada con lisomal, LAMP) . A través de todos los epitopos de CD8 definidos, se encontró que la expresión del IFN gamma está mejorada en los animales que reciben el bloqueo anti-PD-Ll en comparación con los animales no tratados (Figura 15a). Además, la coexpresión del IFN gamma y el TNF alfa y CD107ab también se incrementó después de una terapia anti-PD-Ll (Figuras 15B-15E) . Estos hallazgos indican que los esplenocitos de memoria transferidos de manera adoptiva que se expanden en la presencia del bloqueo de PD-L1, son funcionalmente superiores, en términos de la producción de la citocina inflamatoria y la liberación de los gránulos citoliticos, en comparación con los esplenocitos de los animales no tratados .
Ejemplo 17: Respuestas de los Linfocitos B Murinos Durante el Bloqueo de PD-1 Los siguientes experimentos se realizaron con el fin de determinar si el bloqueo de PD-1 mejora las respuestas de los linfocitos B durante una infección crónica con LCMV. Ambas respuestas de los linfocitos B y los linfocitos T son criticas para controlar la infección crónica con LCMV, asi, el mejorar las respuestas de los linfocitos B en los ratones infectados crónicamente con LCMV puede ayudar a disminuir la carga viral y mejorar la función de los linfocitos T.
Se utilizaron los siguientes materiales y métodos en estos experimentos: Ratones y virus: Los ratones C57B1/6 hembra de cuatro a seis semanas de edad se compraron de Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine) . Antes de la infección, los ratones infectados de manera crónica con LCMV tenían una reducción de los linfocitos T CD4 por administración del anticuerpo gk 1.5. Los datos previos demuestran que la administración de 500 ug de gk 1.5 en los días -2 y 0 antes de la exposición viral, resulta en una disminución del 95-99% en el número de linfocitos T CD4 en el bazo y en los nodos linfáticos, con el número de linfocitos T CD4 que se recupera lentamente durante 2 a 4 semanas. Los ratones recibieron 2 x 106 UFP de la cepa de la Clona-13 de LCMV intravenosamente en el dia 0 del inicio de la infección crónica. Los títulos de los virus se determinaron mediante un ensayo de placas de 6 días en las células Vero.
Detección de las ASC mediante ELISPOT: Las suspensiones de una sola célula de bazo y de médula ósea fueron agotadas de células sanguíneas rojas mediante el tratamiento con NHCL al 0.84% y se resuspendieron en RPMI suplementado con FCS al 5%. Las células que secretan el anticuerpo se detectaron emplacando las células en placas de filtración Multiscreen HA de 96 pozos, con fondo de nitrocelulosa ( illipore) . Las placas se recubrieron previamente con 100 ul de 5 ug/ml de IgG+IgM+IgA antiratón de cabra (Caltag/Invitrogen) durante la noche a 4°C. Las placas se lavaron a continuación 3x con PBS/Tween al 0.2% seguido por lx con PBS y se bloquearon durante 2 horas con RPMI + FCS al 10% para evitar la unión no específica. El medio de bloqueo se reemplazó con 100 ul de RPMI + FCS al 5% y 50 ul de lxlO7 células/ml se emplacaron en diluciones en serie de tres veces a través de la placa. Las placas se incubaron durante 6 horas a 37°C y C02 al 5%. Las células se retiraron y las placas se lavaron 3x con PBS y 3x con PBS/Tween al 0.2%. Los pozos se recubrieron a continuación con IgG anti-ratón de cabra biotinilado (Caltag/Invitrogen) , se diluyeron a 1/1000 en PBS/Tween al 0.2%/FCS al 1% y se incubaron durante la noche a 4°C. El anticuerpo secundario se retiró y las placas se lavaron 3x con PBS/Tween al 0.2%. HRP avidina-D (Vector) , diluido a 1/1000 en PBS/Tween al 0.2%/FCS al 1% se incubó durante una hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 3x con PBS/Tween al 0.2% y 3x con PBS y la detección se llevó a cabo agregando 100 mi del sustrato del cromógeno de peroxidasa de rábano picante-H202. El sustrato se preparó agregando 150 ul de una solución de AEC preparada recientemente (10 mg de 3-amino-9-etilcarbazol (ICN) por mi disueltos en dimetilformamida (Sigma) ) a 10 mi de amortiguador de acetato de sodio 0.1 M, pH 4.8), filtrando a través de una membrana de tamaño de poro de 0.2 mm, e inmediatamente antes del uso, agregando 150 mi de H202 al 3%.
Aparecieron puntos rojos granulares en 3 a 5 minutos, y la reacción se terminó mediante enjuague abundante con agua del grifo. Los puntos se enumeraron con un estereomicroscopio equipado con una luz blanca vertical.
Determinación de las células totales de médula ósea: Para el cálculo de la respuesta de las ASC totales en la médula ósea, la respuesta se multiplicó por las células de la médula de dos fémures por un coeficiente de 7.9, puesto que los estudios de distribución de 59Fe han mostrado que 12.6% de la médula ósea total del ratón se localiza en ambos fémures combinados. No se han detectado diferencias entre las actividades de las ASC de las células de la médula ósea del fémur, tibia, húmero, costilla o esternón. Típicamente, dos fémures adultos proporcionan 2.0xl07 a 2.5xl07 células de médula ósea totales .
Citometría de Flujo. Los anticuerpos conjugados directamente se compraron de Pharmingen (anti-B220, anti-CD4, anti-CD138 anti-CD95, anti-Ki67, anti-IgD biotinilados ) , o Vector labs (PNA). La estrepavidina-APC se compró de Molecular Probes. Todas las tinciones se llevaron a cabo a 4°C en PBS suplementado con FCS al 1% y azida de sodio al 0.1%. Las células se fijaron a continuación en formaldehído al 2% (en PBS) , y se analizaron en un FACS Calibur utilizando el programa CellQuest (BD Bioscxences) .
Análisis estadístico: Las pruebas se realizaron utilizando Prism 4.0 (GraphPad, San Diego, CA) . Las estadísticas se hicieron utilizando una prueba T con dos colas, no apareada con límites de 95% de confianza.
El número total de células que secretan el anticuerpo en el bazo se mejora después del bloqueo de PD-1 in vivo: Los ratones infectados con la Clona-13 de LC V se trataron con anti (a)PD-Ll aproximadamente 60 días postinfección. A los ratones se les administraron 200 ug de aPD-Ll cada tercer día durante dos semanas. En el dia 14 del tratamiento con aPD-Ll, los ratones se sacrificaron y se midió el número de células que secretan el anticuerpo en el bazo mediante ELISPOT y tinción con citometria de flujo. En tres experimentos separados, los ratones tratados con aPD-Ll mostraron niveles incrementados de manera significativa de las células que secretan el anticuerpo (ASC) en el bazo (p=0.011) en comparación con los ratones no tratados (Figura 16a) . Las ASC pueden diferenciarse de los linfocitos B en el bazo mediante su desregulación del marcador de los linfocitos B B220 y mediante la expresión de CD138 (syndecam-1 ) . De acuerdo con los resultados del ELISPOT, se observaron números incrementados de células CD138+ B220bajo int en los ratones infectados tratados con aPD-Ll (Figura 16b).
El tratamiento de los ratones inf ctados con LCMV crónico con aPD-Ll no conduce a niveles elevados de las ASC de la médula ósea. Se determinó si las células que secretan el anticuerpo dentro de la médula ósea también estaban aumentadas durante el tratamiento con aPD- Ll . La mayoría de las células del plasma de larga vida reside dentro de la médula ósea, y estas células del plasma son críticas para el mantenimiento a largo plazo de los niveles del anticuerpo en suero. Los ratones infectados de manera crónica con LCMV se trataron con ctPD-Ll aproximadamente 60 días postinfección. En el día 14 del tratamiento con aPD-Ll, los niveles de ASC en el bazo y la médula ósea se midieron mediante ELISPOT. Aunque hubo números elevados de ASC en el bazo dos semanas postratamiento, no hubo cambio en los números de las ASC en la médula ósea en este punto de medición (Figura 17) .
El cotratamiento de los ratones infectados de manera crónica con LCMV con aPD-Ll y 118 CTLA-4 resulta en incrementos sinergísticos en los niveles de las ASC esplénicas: Se investigó además si la señalización del bloqueo con otra molécula reguladora negativa, CTLA-4, mejoraría el efecto observado durante el bloqueo de PD-1. Se piensa que CTLA-4 se une a B7, para competir ambos con la molécula coestimuladora positiva CD28 y/o proporcionar señales TCR que antagonizan directamente. Los ratones infectados con la Clona-13 de LCMV se trataron con aPD-Ll, aCTLA-4, ambos, o se dejaron sin tratar, y dos semanas postratamiento, los niveles de células que secretan el anticuerpo se midieron mediante ELISPOT. Aunque el tratamiento con aCTLA-4 no mostró impacto en los niveles de las ASC, el cotratamiento de ccPD-Ll con ctCTL-4 condujo a un incremento sinergistico en las ASC por encima de lo observado con el tratamiento con PD-Ll solo (Figura 18) .
Proliferación de los linfocitos B y los linfocitos T CD4 y actividad del centro germinal mejoradas en los ratones tratados con aPD-Ll: Los análisis de citometria de flujo de las poblaciones del bazo en los ratones crónicos tratados con aPD-Ll, mostraron niveles aumentados de la proliferación, mediante la tinción incrementada con Ki-67 en los linfocitos T CD4 y los linfocitos B. Los linfocitos B dentro de la reacción del centro germinal pueden identificarse en el bazo por altos niveles de tinción con PNA y FAS. Después del tratamiento con aPD-Ll, hubo un gran incremento en la frecuencia de PNA+FAS+linfocitos B en comparación con los controles no tratados (Figura 19a-19b) .
Ejemplo 17: Expresión de PD-1 en los Linfocitos T Humanos Los linfocitos T CD8 son esenciales para el control de muchas infecciones crónicas. Como se describe en la presente, estos linfocitos T CD8 se extenúan después de una estimulación antigénica crónica, que está caracterizada por la inducción de un estado hipoproliferativo y por la pérdida de la capacidad para producir las citocinas antivirales. Los linfocitos T extenuados tienen una alta expresión de la muerte programada-1 (PD-1) y también, PD-1 está sobrerregulado por la activación de los linfocitos T y puede desencadenarse por los ligandos de PD-1, PD-L1 y PD-L2. Se describe en la presente que la trayectoria inhibidora de PD-1 es un mediador importante del desgaste de los linfocitos T CD8 durante una infección viral crónica en ratones. Los linfocitos T CD8 específicos del virus mantienen altos niveles de expresión de PD-1 en respuesta una infección crónica, pero no en respuesta a una infección que es eliminada de manera exitosa. El bloqueo de la interacción de PD-1/PD-L1 resultó en una proliferación de linfocitos T CD8, producción de citocinas antivirales aumentadas, y una reducción en la carga viral, mej oradas .
Se evaluó si los linfocitos T CD8 específicos para la infección crónica en el humano expresan a PD-1, y si el bloqueo de PD-1 mejora las respuestas de los linfocitos T CD8. Este estudio (1) determinó el patrón de expresión de PD-1 en subconjuntos de células mononucleares de la sangre periférica humana (PB C): CD4, CD8, linfocitos B, NK, monocitos, DC; (2) determinó el fenotipo de los linfocitos T CD4 y CD8 que expresan PD-1; (3) determinó la expresión de PD-1 en un antígeno persistente crónico [ (virus de Epstein-Barr (EBV y citomegalovirus (CMV) ] , y células especificas de un antigeno resuelto agudo (influenza y vaccinia) ; y (4) determinó el efecto de bloquear la interacción de PD-1/PD-L1 en la proliferación de las células especificas del antigeno.
Se utilizaron los siguientes materiales y métodos en estos estudios: Muestras de sangre: Las muestras de sangre periféricas se obtuvieron de 36 individuos sanos que eran seropositivos para los virus EBV, CMV, influenza o vaccinia. Estos sujetos se seleccionaron basándose en su expresión del alelo HLA que corresponde con los tetrámeros de HLA clase I específicos para las proteínas del virus EBV, CMV, influenza o vaccinia. Las PBMC se aislaron de muestras de sangre sobre el medio de separación del linfocito (Cellgro, Herndon, VA) .
Anticuerpos, péptidos y tetrámeros: Se obtuvieron el PD-1 anti humano conjugado con ficoeritrina (EH12, IgGl de ratón) y el PD-L1 humano no conjugado (29E.2A3, IgG2b de ratón). Los anticuerpos conjugados directamente se obtuvieron de Beckman Coulter, San Diego, CA (anti-CD3, CDlla, CD27, CD28, CD38, CD45RA, CD57, CD62L y granzima-B) , BD Pharmingen, San Diego, CA (CD8, CD95, CD195, HLA-DR, Ki-67 y perforina), y R&D systems, Minneapolis, MA (CCR7). Los péptidos se hicieron en el laboratorio de síntesis de péptidos en la Universidad de Emory, Atlanta, GA. Los constructos del plásmido que expresan a HLA-A2 , -B7 y -B8 se proporcionaron generosamente por la NIH Tetramer Core Facility, Atlanta, GA y los tetrámeros de MHC clase I/péptidos marcados con APC que portan los epitopos CTL de EBV ( HLA-A2 -GLCTLVAML (SEQ ID NO: 36), HLA-B8-RAKFKQLL (SEQ ID NO: 37) y FLRGRAYGL (SEQ ID NO: 38)), CMV ( HLA-A2 -NLVPMVATV (SEQ ID NO: 39), HLA-B7 -TPRVTGGGAM (SEQ ID NO: 40)), influenza (HLA-A2 -GILGFVFTL (SEQ ID NO: 41)) y vaccinia (HLA-A2- CLTEYIL V (SEQ ID NO: 42) y KVDDTFYYV (SEQ ID NO: 43)).
Inmunofene-tipificación y proliferación de CFSE: Las muestras de sangre completa humana heparinizada (200 ul) se tiñeron con anticuerpos o tetrámeros, y a continuación se analizaron (Ibegbu et al., J Immunol. 174: 6088-6094, 2005) en un FACS Calibur utilizando el programa CellQuest, o en un citómetro de flujo LSRII utilizando el programa FACSDiva (BD Immunocytometry Systems) . Para los ensayos de CFSE, las PBMC (2xl06/ml) se lavaron abundantemente y se marcaron con diacetato de carboxifluoresceína 3 µ?, éster de succinimidilo (CFSE, Molecular Probes) , a temperatura ambiente en la oscuridad durante 5 minutos (véase, por ejemplo, Weston y Parish, J Immunol Methods 133:87-97, 1990). Las PBMC marcadas con CFSE se estimularon con el péptido solo (1 µg/ml) o el péptido con el anticuerpo anti-PD-Ll (10 g/ml) . Los cultivos de control consistieron de las PBMC solas, las PBMC con el anticuerpo anti-PD-Ll o las PBMC con un anticuerpo de control del isotipo (IgG2b; 10 µ?/ml) . Después de una incubación de 6 dias a 37 °C, las células se lavaron y tiñeron con el tetrámero junto con los anticuerpos anti-CD3 y CD8 extracelularmente .
Se obtuvieron los siguientes resultados: Patrón de expresión de PD-1 en los subconjuntos de PBMC: La expresión de PD-1 se examinó en los subconjuntos de las PBMC en individuos sanos. Se observó que los linfocitos T CD8+ , los linfocitos T CD4+ y los monocitos (CD14+), expresan altos niveles de PD-1, los linfocitos B (CD20+) expresan bajos niveles de PD-1 y las células NK (CD56+) y DC (CDllc+) no expresan a PD-1.
El PD-1 se expresa de manera preferencial entre los linfocitos T CD8 y CD4 de memoria efectores: Los linfocitos T CD8 de individuos sanos normales se examinaron para la coexpresión de PD-1 con varios marcadores fenotipicos asociados con el estado de diferenciación y la función (Figura 20?) . En resumen, los linfocitos T CD8 sin experimentación previa y del fenotipo de la memoria central, expresan únicamente bajos niveles de PD-1, mientras que los linfocitos T CD8 que expresaron varios marcadores asociados con el fenotipo o efector/memoria del efector/o extenuado, también expresaban altos niveles de PD-1 (Figura 20B) . Estos datos sugieren que el PD-1 se expresó de manera preferencial entre los linfocitos T CD8 de memoria efectores. Cuando los linfocitos T CD4 se examinaron, se encontró una tendencia similar (Figura 20C) .
PD-1 es sobrerregulado en los linfocitos T CD8 de memoria específicos del antígeno persistentes: Para evaluar si los linfocitos T CD8 específicos para las infecciones crónicas en humanos muestran una expresión incrementada de PD-1, la expresión de PD-1 en los linfocitos T CD8 de memoria, específicos para los virus persistentes crónicos (EBV y CMV) , se comparó con los linfocitos T específicos del virus agudo (influenza y vaccinia) en 36 individuos sanos, tiñendo con tetrámeros específicos para el virus de EBV, CMV, influenza y vaccinia (Figuras 21A-21B) . La figura 21A muestra GMFI de PD-1 representativos de los linfocitos T CD8 específicos del virus EBV, CMV, influenza y vaccinia. Se encontró que la expresión de PD-1 estaba incrementada en los linfocitos T CD8 específicos de EBV con relación a los linfocitos T CD8 específicos del virus de la influenza (p=0.0335) y vaccinia (p=0.0036) (Figuras 21A-21B) . De manera similar, los linfocitos T CD8 específicos de CMV expresaron más frecuentemente a PD-1 que la influenza (p=0.0431) y vaccinia (p=0.019) (Figuras 21A-21B) . Estos resultados sugieren una correlación entre la expresión de PD-1 y la experiencia del antígeno.
El bloqueo de anti-PD-Ll incrementa la proliferación de los linfocitos T CD8 específicos del virus persistentes crónicos: Se valoró si el bloqueo de PD-1 mejora las respuestas de los linfocitos T CD8 específicos del antígeno persistentes, similares a los resultados observados en ratones. Las células marcadas con CFSE se estimularon con los péptidos específicos del virus EBV, CMV, influenza o vaccinia en la presencia o ausencia de los anticuerpos anti-PD-Ll. Después de 6 días, el porcentaje de las células CFSEbajas tetrámero+ y las células CD8+ CFSEbajas se comparó entre los cultivos que se estimularon con el péptido solo y los cultivos que se estimularon con el péptido y se bloquearon posteriormente con anti-PD-Ll. Los diagramas representativos de la citometría de flujo con la proliferación de los linfocitos T CD8 específicos de CMV y EBV se muestran en la figura 22A. Los datos agregados de los individuos seropositivos a CMV (n= 5) , EBV (n= 5) , influenza (n= 2) y vaccinia (n= 2), se muestran en la figura 22B. El bloqueo de la interacción de PD-1/PD-L1 con el anticuerpo anti-PD-Ll, resultó en una proliferación incrementada de los linfocitos T CD8 específicos de EBV y CMV, mientras que los linfocitos T CD8 específicos del virus de la influenza y vaccinia no mostraron una proliferación después del bloqueo con anti-PD-Ll. Estos resultados muestran que en la presencia del péptido más el anticuerpo que bloquea a anti-PD-Ll, hay un incremento de hasta 3.5 veces en la frecuencia de los linfocitos T CD8 específicos de EBV o CMV en comparación con la estimulación con el péptido solo. Se valoró si la proliferación de los linfocitos T CD8 específicos del antígeno después del bloqueo con el anticuerpo anti-PD-Ll está relacionada con la expresión de PD-1 por estas células. Los datos indican una correlación positiva entre la expresión de PD-1 y la proliferación de los linfocitos T CD8 específicos del antígeno (p=0.0083) (Figura 22C) .
Ejemplo 18: Los Linfocitos que se Infiltran en el Hígado en la Infección con HCV Humana Crónica Muestran un Fenotipo Extenuado con una Alta Expresión de PD-1 y una Baja Expresión de CD127 Los experimentos descritos a continuación documentan que en la infección crónica con HCV, los linfocitos T específicos de HCV periféricos expresan altos niveles de PD-1 y que el bloqueo de la interacción de PD-1/PD-L1 conduce a una capacidad proliferativa mejorada. De manera importante, los linfocitos T específicos de HCV interhepáticos no solo expresan altos niveles de PD-1, sino que también disminuyen el receptor alfa de IL-7 (CD 127), un fenotipo extenuado que era especifico del antigeno de HCV y se compartimentalizaba en el hígado, el sitio de la replicacion viral.
Actualmente, no existe una vacuna para prevenir la infección con HCV y la única terapia aprobada, el interferón alfa (IFNa), ya sea solo o en combinación con el análogo del nucleósido ribavirina, es cara, asociada con, en el mejor de los casos, únicamente una proporción de eliminación del 50% para el genotipo más prevaleciente (genotipo 1) y es complicada por efectos laterales significativos. La escasez de las opciones terapéuticas anti-HCV eficaces resalta la necesidad de intervenciones efectivas dirigidas a aumentar o suplementar la respuesta inmunitaria natural que, solo o en concierto con la terapia con fármacos antivirales, puede evitar las consecuencias perjudiciales de la infección con HCV.
Actualmente, se conoce poco sobre la expresión de PD-1, y su papel en la extenuación de los linfocitos T en la infección crónica con HCV, particularmente en el sitio de la infección activa, el hígado. El presente estudio se llevó a cabo para mejorar el entendimiento del fenotipo de los linfocitos T en la infección con HCV, midiendo la expresión de PD-1 en los linfocitos T CD8+ específicos del antígeno, tanto en el hígado como en la sangre periférica de pacientes con una infección crónica con HCV.
Se utilizaron los siguientes materiales y métodos en estos estudios: Suj etos: Diecisiete pacientes con infección crónica con HCV (anticuerpo de HCV y PCR de HCV positiva) y negativos para VIH, mediante selección del anticuerpo, se inscribieron en el estudio. Todos los pacientes no habían sido tratados anteriormente con terapias antivirales para HCV antes de la inscripción. Siete de los quince pacientes eran positivos a HLA-A2 mediante análisis FACS . Las características de los pacientes se resumen en la Tabla 5.
Tabla 5. Datos demográficos y clínicos de la cohorte de pacientes .
Identificación Género Edad HLA- Genotipo Carga Viral ALT del paciente A2 de HCV de la Linea Basal (ül/ml) 153 HCV* M 43 + 2b 7,340, 000 25 178 HCV* F 48 + 2 18, 330, 000 62 179 HCV M 54 - la 197, 000 197 183 HCV F 56 + la 1,170,000 45 190 HCV M 52 - la 5, 990, 000 27 193 HCV 66 + la 16, 120, 000 30 601 HCV M 60 - Ib 4, 690, 000 25 602 HCV M 48 - la 586, 000 80 603 HCV M 58 + la 1,820,000 36 604 HCV M 58 - la 2,850,000 57 605 HCV F 30 - 1 819, 000 57 606 HCV 50 - Ib 591, 000 18 607 HCV M 59 + 3a 343, 000 31 608 HCV 57 - Ib 395, 000 16 609 HCV M 55 + la 833, 000 67 611 HCV M 53 - la 1,220,000 88 613 HCV 59 - Ib 6, 160, 000 40 Prueba del anticuerpo de HCV, determinación de la carga viral y gene-tipificación: La prueba del anticuerpo de HCV mediante ELISA se realizó utilizando un paquete siguiendo las instrucciones del fabricante (Abbott Diagnostics, Abbott Park, III; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) . La cuantificación de la carga viral de HCV se realizó utilizando un ensayo de RT-PCR en tiempo real (Roche Molecular Systems, Alameda CA) . La genotipificación de HCV se realizó utilizando un ensayo de RT-PCR en tiempo real (Abbott Diagnostics, Abbott Park, III), y utilizando un ensayo de sonda lineal (LIPA) (Bayer Diagnostics, Research Triangle Park, NC) .
Células mononucleares de la sangre periférica: La sangre anticoagulada con EDTA y heparina (50-70 mi) se recolectó de cada paciente y se utilizó ya sea directamente para la tinción con FACS o para el aislamiento de las PBMC . Las PBMC se aislaron utilizando un gradiente de densidad con Ficoll-Paque PLUS (Amersham, Oslo, Noruega) , se lavaron dos veces en PBS, y se analizaron inmediatamente o se crioconservaron en medio que contiene suero de becerro fetal al 90% (Hyclone) y sulfóxido de dimetilo al 10% ( Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) .
Biopsia del hígado: El tejido del hígado se obtuvo mediante una biopsia con aguja guiada por ultrasonido o vía la técnica fluoroscópica transyugular y se puso inmediatamente en medio RP I-1640 (Gibco) , que contiene suero de becerro fetal al 10% (Hyclone, Logan, UT) , para los ensayos inmunológicos . Otro fragmento se fijó en formalina para el examen histológico.
Aislamiento de los linfocitos T íntrahepáticos: La muestra de la biopsia del hígado obtenida en el medio RPMI-1640 (Gibco, Carlsbad, CA) , que contiene suero de becerro fetal al 10% (Hyclone, Logan, UT) , se lavó tres veces con el mismo medio para eliminar los desechos celulares y las RBC . El aislamiento de los linfocitos que se infiltran el hígado se realizó utilizando un sistema de desagregación automatizado, mecánico (Medimachine, Becton Dickinson, San José, CA) . La muestra se insertó en un Medicon de 50 µp? y se insertó en la Medimachine y se corrió durante 15 segundos. Las células desagregadas se retiraron utilizando una jeringa en el puerto de la jeringa. El Medicon se enjuagó dos veces con medio RPMI (Gibco, Carlsbad, CA) , que contiene suero de becerro fetal al 10% (Hyclone, Logan, UT) para asegurar la recuperación celular máxima. Las células se utilizaron inmediatamente para la tinción con FACS.
Anticuerpos, tetrámeros de HLA-A2 y citometría de flujo: Las células se tiñeron con anticuerpos monoclonales marcados con FITC, PE, PerCP y APC o tetrámeros, de acuerdo con las instrucciones el fabricante, y la citometría de flujo se realizó utilizando FACS Calibur (Becton Dickinson, San José, CA) . Los datos de la FACS se analizaron con el programa FlowJo (Treestar) . Se utilizaron los siguientes anticuerpos monoclonales de BD Pharmingen (BD Biosciences, San José, CA) : Anti-CD8 PerCP y anti-CD45RA APC. Anti-CD62L FITC, CD3 FITC y CD127 PE se obtuvieron de Beckman Coulter (Fullerton, CA) . El anticuerpo conjugado con anti-PD-1 PE (clona EH12) se generó como se describió (Dorfman et al., Am. J. Surg. Pathol. 30:802-810, 2006). Los tetrámeros de HLA-A2 fueron específicos para los siguientes epitopos de los linfocitos T CD8+: HCV 1073: CINGVCWTV (SEQ ID NO: 44); HCV-1406: KLVALGINAV (SEQ ID NO: 45). La colección de la citometría de flujo se realizó en un FACSCaliber™ (BD Biosciences, San José, CA) , y el análisis se realizó utilizando el programa FlowJo (v8.1.1).- Marcado con CFSE y bloqueo del anticuerpo: 10x06 PB C se lavaron con PBS y se marcaron con CFSE 3 µ? (Molecular Probes). Las células se ajustaron a lxlO6 células/ml, y se cultivaron en la presencia de 2 g/ml del péptido A2-HCV 1073 (CINGVCWTV, SEQ ID NO: 44) . Se agregaron 10 U/ml de IL-2 en el dia 3 postestimulación. Un control no estimulado se incluyó en cada ensayo. Los anticuerpos bloqueantes específicos (anti-PD-Ll ; clona # 29E y anti-PD-1; clona # EH12 (Dofman et al., supra) , se agregaron a los cultivos celulares a una concentración de 10 µg/ml al momento de la estimulación. Las células se incubaron durante 6 días, se recolectaron y tiñeron con los anticuerpos superficiales y los tetrámeros, y se analizaron mediante citometría de flujo.
Análisis estadísticos : Los resultados se graficaron y analizaron utilizando GraphPad Prism (v4) . Las comparaciones hechas dentro del mismo paciente se realizaron utilizando pruebas t apareadas. Las comparaciones hechas entre pacientes se hicieron utilizando pruebas t no apareadas.
Se obtuvieron los siguientes resultados: Expresión de PD-1 en los linfocitos T CD8+ específíeos del antígeno de HCV: Diecisiete pacientes con infección con HCV (todos negativos a VIH) se estudiaron (Tabla 1) . Quince pacientes se sometieron a toma de muestras de sangre y de hígado para fenotipificar mediante análisis de citometria de flujo, y ninguno se había tratado con la terapia antiviral farmacológica antes de la inscripción al estudio. Siete pacientes en la cohorte eran positivos a HLA-A2 y demostraron una población de linfocitos T CD8+ específicos de HCV en la periferia mediante tinción del tetrámero de HLA (Tabla 1) . Estos linfocitos T CD8+ específicos de HCV se evaluaron para la expresión de PD-1 (Figura 23A) . El nivel de expresión de PD-1 en los linfocitos T CD8+ totales en la sangre periférica de los donantes sanos no fue significativamente diferente de aquél de la colección total de los linfocitos T CD8+ periféricos de los pacientes infectados con HCV (Figura 23B) . En contraste, la mayoría de los linfocitos T CD8+ tetrámero positivos específicos de HCV muestreados de la sangre periférica, fueron PD-1 positivos (media 85%, SEM 3.6) (Figura 23A) , con una expresión significativamente más alta que aquélla de la población de linfocitos T CD8+ totales (p<0.0001) (Figura 23B) . La expresión de las moléculas con función de diferenciación, coestimuladora, de tráfico y efectora en los linfocitos T CD8+ específicos del antígeno también se investigó. Las células tetrámero positivas específicas de HCV exhiben un fenotipo de memoria (alto CDlla, bajo CD45RA) , marcadores de diferenciación temprana (alto CD27, alto CD28, expresión intermedia de CCR7 y CD62L) , y bajos niveles de los mediadores de la función efectora granzima B y perforina. De manera interesante, estos linfocitos T tetrámero positivos de HCV en la sangre periférica, expresaron altos niveles de CD127 (cadena a del receptor de IL-7), un marcador fenotipico que cuando se expresa a bajos niveles, identifica la diferenciación deteriorada de los linfocitos T.
Para determinar si el fenotipo de los linfocitos T CD8+ era diferente del entorno de una infección no crónica, los linfocitos T específicos de la gripe se examinaron en cinco donantes HLA-A2+ sanos quienes no estaban infectados con HCV. El porcentaje de linfocitos T CD8+ tetrámero"1" de la gripe, periféricos, que expresaban a PD-1 fue de 49% (SEM 14.1) (Figura 23C) . Cinco de los siete pacientes con HCV crónicos positivos a HLA-A2 también se identificaron por el análisis del tetrámero como que tenían linfocitos T CD8+ específicos de la gripe. El porcentaje de linfocitos T específicos de la gripe que expresan a PD-1 en estos pacientes con HCV infectados de manera crónica, no fue significativamente diferente de la misma población en los donantes sanos (Figura 23C) . De manera importante, debido a que cinco de los siete pacientes con HCV HLA-A2+ también tenía linfocitos T CD8+ específicos de la gripe detectables, pudo hacerse una comparación, dentro de cada paciente, del PD-1 para los linfocitos T específicos para una infección no crónica (Gripe) y crónica (HCV) . La diferencia entre la expresión de los linfocitos T específicos de la gripe y específicos de HCV de la expresión de PD-1 fue significativa (Figura 23C) . El porcentaje de linfocitos T CD8+ específicos de HCV que expresan a PD-1 (media 83%, SE 6.4), fue mayor que el porcentaje de linfocitos T CD8+ específicos de la gripe PD-1+ (49%, SEM 12.3) (p=0.048) (Figura 23C) .
Expresión de PD-1 en la sangre periférica humana y los linfocitos que se infiltran en el hígado: Se analizaron las biopsias sangre periférica y del hígado para la expresión de PD-1 de quince pacientes infectados de manera crónica con HCV. El análisis de citometría de flujo representativo de cinco pacientes se muestra en la figura 24A. Mientras que en la sangre periférica, 27% (SEM 3.4) de los linfocitos T CD8+ eran PD-1+, la frecuencia de tales células se incrementó dos veces (57%, SEM 3.6) en el hígado (Figura 24B) . Por lo tanto, el hígado está enriquecido con células que expresan altos niveles de PD-1. Mientras que las células sin experimentación previa deberían expresar altos niveles de CD62L y CD45RA, en el hígado, la mayoría de los linfocitos T CD8+ eran CD62L bajos/CD45RA bajos, consistente con un fenotipo de memoria (Figura 24C) . El análisis específicamente de esta población de la memoria en el hígado y la periferia, mostró que la expresión de PD-1 estaba elevada en el hígado, en comparación con la periferia (Figuras 24C) . Estos datos sugieren que el incremento en el porcentaje de células que expresan a PD-1 en los linfocitos T intrahepáticos no se debe simplemente a la ausencia de la población sin experimentación previa en este compartimiento. En su lugar, hay un enriquecimiento preferencial de los linfocitos T CD8+ de memoria efectores PD-1+ (CD62L bajo/CD45RA bajo) dentro del hígado, en comparación con la sangre periférica (Figura 23C) .
Expresión de CD127 en la sangre periférica humana y los linfocitos que se infiltran en el hígado: La IL-7 se requiere para el mantenimiento de los linfocitos T CD8+ de memoria (Kaech et al., Nat Immunol 4: 1191-8, 2003) , y la cadena alfa de su receptor, CD127, se desregula en los linfocitos T específicos del antígeno en las infecciones persistentes con LC V y el virus del herpes gamma (véase, por ejemplo, Fuller et al., J Immunol 174:5926-30, 2005). Esta pérdida de CD127 durante la infección crónica se correlaciona con una producción de citocina deteriorada, una susceptibilidad incrementada a la apoptosis, y una reducción en la capacidad de los linfocitos T CD8+ específicos del virus de memoria para persistir en el hospedante. En consecuencia, la resolución de la infección con el virus de la hepatitis B aguda (HBV) , se correlaciona con la sobrerregulación de la expresión de CD127 y con la pérdida concomitante de la expresión de PD-1 (Boettler et al., J Virol 80:3532-40, 2005) . De manera interesante, en los pacientes con HCV crónica, únicamente 20% (SEM 4.8) de los linfocitos T CD8+ periféricos totales fueron negativos a CD127, pero en los infiltrados de los linfocitos T CD8+ hepáticos, este porcentaje se incrementó de manera significativa 58% (SEM 4.4) (Figura 24D) . Por lo tanto, el hígado está enriquecido con células que expresan un fenotipo extenuado con alto PD-1 y bajas células CD127 predominantes. Estos datos sugieren que los linfocitos T CD8+ que se infiltran en el hígado en los pacientes con HCV crónica no imitan fenotípicamente la población de los linfocitos T CD8+ periféricos. En el entorno de una infección por VIH, en donde el virus infecta a los linfocitos T y los monocitos en la sangre periférica, los bajos niveles de CD127 están asociados con los defectos de los linfocitos T funcionales o de memoria (Boutboul et al., Aids 19:1981-6, 2005). En este estudio, la compartimentalización hepática de las células que muestran este fenotipo extenuado, sugiere que el fenotipo está ligado de manera íntima al sitio de la replicacion viral persistente.
Expresión de PD-1 y CD127 en los linfocitos T CD8+ específicos del antígeno de HCV en el hígado: Dos de nuestros pacientes HLA-A2 en la cohorte también tenían una población específica de HCV identificable mediante tinción del tetrámero en el hígado (Figura 25) . La expresión de PD-1 y CD127 se comparó directamente en los linfocitos T CD8+ tetrámero positivos específicos del HCV en el hígado versus la periferia de estos individuos. Los linfocitos T CD8+ específicos de HCV de la periferia eran principalmente PD-1 positivos (media 85%, SE 3.6) y CD127 positivos (media 84%, SEM 4.0), mientras que los linfocitos T CD8+ específicos de HCV hepáticos eran en su mayoría PD-1 positivos (media 92%) , pero sólo raramente CD127 positivos (media 13%) (Figura 25). En el sitio de la replicación viral, pareció haber una expansión de las células negativas a CD127 que expresan altos niveles de PD-1. El que los linfocitos T CD8+ específicos del antígeno, periféricos, expresen diferencialmente a CD127 en comparación con el compartimiento intrahepático, podría relacionarse con el nivel o la sincronización de la exposición al antígeno, necesaria para causar la desregulación de CD127. En la infección con LCMV de los ratones, la exposición a una carga del antígeno persistente con infección crónica, CD127 estaba desregulada de manera persistente, mientras que una exposición de corta duración al antígeno de LCMV utilizando GP33, únicamente suprimió temporalmente la expresión de CD127 y falló en inducir la extenuación de los linfocitos T (Lang et al., Eur J Immunol 35:738-45, 2005) . También se observó que la dependencia en la disponibilidad del antigeno y el tiempo de exposición afectan la expresión de CD62L y CD127, mientras que el antigeno persistente condujo a una desregulación persistente de CD62L y CD127 (Bachmann et al., J Immunol 175:4686-96, 2005). Sin estar apegados a una teoría, en la infección crónica con HCV, los pocos linfocitos T CD8+ específicos de HCV detectados en la periferia pueden no estar expuestos de manera continua a suficiente antigeno para mantener bajos niveles de CD127. Así, los linfocitos T pueden "creer" que el virus se ha eliminado.
El bloqueo de los PD-1/PD-L1 conduce a una expansión incrementada de los linfocitos T CD8+ tetrámero positivos específicos de HCV: La evidencia de la población del paciente sugiere que el bloqueo de la interacción de PD-1/PD-L1 con anticuerpo anti-PD-Ll o anti-PD-1 incrementa la capacidad proliferativa de los linfocitos T específicos del HCV (Figura 26) . La adición de los anticuerpos de bloqueo en la presencia de IL-2 y del péptido específico para HCV resultó en un incremento de cuatro veces en la expansión de los linfocitos T específicos de HCV, como se demuestra verificando la frecuencia los linfocitos T CD8+ marcados con el tetrámero de éster de carboxifluorescein succinimidilo (CFSE)ba:i0 después de la estimulación con el péptido análogo durante 6 días.
Los resultados muestran que en el sitio de la infección, el hígado, la frecuencia de los linfocitos T CD8+ específicos de HCV que expresan a PD-1 es alta. Segundo, la mayoría de los linfocitos T CD8+ específicos de HCV de la sangre periférica de los pacientes con infección crónica con HCV expresan altos niveles de CD127. El fenotipo de los linfocitos T en la infección crónica con HCV se caracterizó estudiando la expresión de la molécula de PD-1 enlazada a una función efectora deteriorada y a la extenuación del linfocito T. Los resultados muestran que la mayoría de los linfocitos T específicos de HCV en el compartimiento intrahepático expresan a PD-1, pero carecen de CD127, un fenotipo consistente con el desgaste de los linfocitos T. Así, los antagonistas de PD-1 son útiles como agentes terapéuticos para el tratamiento de infección con HCV.
Ejemplo 19: El Bloqueo de PD1 Induce la Expansión de las Células CD8 Especificas de SIV Jn Vitro Los linfocitos T CD8 antivirales juegan un papel crítico en el control de las infecciones con VIH/SIV. Un papel central de los linfocitos T CD8 ha sido mostrado por la reaparición durante las extenuaciones transitorias in vivo en macacos infectados con SIV. Consistente con esto, las estrategias de vacunas contemporáneas diseñadas para provocar frecuencias más altas de linfocitos T CD8 antivirales, han contenido las exposiciones a SHIV y SIV patogénicas en macacos (véase, por ejemplo Barouch et al., Science 290, 486-92 (2000); Casimiro et al., J Virol 79, 15547-55 (2005) .
Tanto la función como la frecuencia de los linfocitos T CD8 antivirales son cruciales para el control de las infecciones virales crónicas tales como el VIH (Migueles et al. Wat Immunol 3, 1061-8, 2002) y el virus de la coriomeningitis linfocitica (LCMV) . Los linfocitos T CD8 antivirales efectivos poseen varias propiedades funcionales, incluyendo la capacidad para producir diferentes citocinas, el potencial citotóxico y el alto potencial proliferativo y baja apoptosis. En las infecciones virales crónicas, los linfocitos T CD8 específicos del virus se someten a una extenuación que está asociada con la pérdida de muchas de estas funciones (Zajac et al., J Exp Med 188, 2205-13, 1998). De manera similar, los linfocitos T CD8 específicos del VIH de individuos con la enfermedad progresiva, han mostrado tener su función deteriorada. Estos linfocitos T CD8 pueden producir citocinas tales como IFN-?, pero están deteriorados para la producción de IL-2, una citocina que es critica para la proliferación y supervivencia de los linfocitos T; la expresión de perforina (Appay et al., J Exp Med 192, 63-75, 2000, una molécula que es critica para la función citolítica; y la capacidad proliferativa, una propiedad que se ha implicado como critica para el control del VIH (véase, por ejemplo, Harari et al., Blood 103, 966-72, 2004) y del SIV. Los linfocitos T específicos del VIH expresan altos niveles de PD-1 y esta expresión es directamente proporcional al nivel de la viremia. Un bloqueo transitorio de la interacción entre PD-1 y PD-L1 in vitro restablece la función de los linfocitos T específicos del VIH.
Se investigó la expresión de PD-1 en los linfocitos T CD8 específicos del SIV, después de la infección con SIV239 patogénico en macacos. Los resultados demuestran que los linfocitos T CD8 específicos del SIV expresan altos niveles de PD-1 y el bloqueo de la trayectoria de PD-1:PDL-1 in vitro resulta en la expansión mejorada de estas células. Se obtuvieron los siguientes resultados : Expresión elevada de PD-1 en los linfocitos T CD8 específicos del SIV después de la infección con SIV239: El nivel de expresión de PD-1 en los linfocitos T CD8 de macacos sanos normales e infectados con SIV se investigó para entender el papel de la expresión de PD-1 y su relación con el control de la infección con SIV. Una proporción significativa (40-50%) de los linfocitos T CD8 totales de los macacos sanos normales expresó a PD-1 (Figura 27A) . La expresión de PD-1 estuvo restringida de manera predominante a las células de memoria y estuvo ausente en los linfocitos T CD8 sin experimentación previa. Un patrón similar de expresión de PD-1 se observó también para los linfocitos T CD8 totales de macacos infectados con SIVmac239 (Figuras 27B y C) . Sin embargo, la mayoría (>95%) de los linfocitos T CD8 específicos de Gag CM9 de SIV fueron positivos para la expresión de PD-1 y una proporción significativa de estas células sobrerreguló además la expresión de PD-1 (MFI de 580) , en comparación con los linfocitos T CD8 totales (MFI de 220) (Figura 27D) . De manera colectiva, estos resultados demuestran que una proporción significativa de los linfocitos T CD8 de memoria de los macacos normales e infectados con SIV, expresa a PD-1 y el nivel de expresión de PD-1 está elevada además en los linfocitos T CD8 específicos de SIV.
El bloqueo in vitro de PD-1 resulta en una expansión mej orada de los linfocitos T CD8 específicos de SIV: Para estudiar el efecto del bloqueo de PD-1 en la función de los linfocitos T CD8 específicos de SIV, se realizaron ensayos de proliferación en la presencia y ausencia de un anticuerpo bloqueante para la molécula de PD-1 humano, que tiene reactividad cruzada con el PD-1 del macaco. Las PBMC de macacos rhesus positivos a Mamu A*01 que estaban infectados con un virus patoqénico de la inmunodeficiencia simiana y humana 89.6P (SHIV 89.6P), se estimularon con el péptido PllC (epitopo Gag-CM9) en la ausencia o presencia del anticuerpo bloqueante anti-PD-1 durante seis dias. La frecuencia de la células tetrámero positivas de Gag CM-9 se evaluó al final de la estimulación. Las células no estimuladas sirvieron como controles negativos. Como puede observarse en las figuras 28A-28B, la estimulación con el péptido PllC resultó en un incremento de aproximadamente 4-80 veces en la frecuencia de las células del tetrámero positivo. Además, en cuatro de seis macacos probados, los estímulos con el péptido PllC en la presencia del anticuerpo bloqueante anti-PD-1 resultó en aproximadamente una mejora adicional de 2-4 veces en la frecuencia de las células tetrámero positivas con respecto a los estímulos con el péptido PllC en la ausencia del anticuerpo bloqueante.
Estos resultados demuestran que el bloqueo de PD-1 mejora la capacidad proliferativa de los linfocitos T CD8 específicos de SIV en los macacos infectados con SIV.
Ejemplo 20: Papel del PD-L2 Dos ligandos de PD-1 difieren en sus patrones de expresión: PD-L1 se expresa de manera constitutiva y se sobrerregula a cantidades más altas en las células hematopoyéticas y no hematopoyéticas , mientras que PD-L2 es sólo expresado de manera inducible en las células dendriticas (DC) y los macrófagos. Aunque algunos estudios para evaluar el papel que juega PD-L2 en la activación de los linfocitos T han demostrado una función inhibitoria para PD-L2, otros estudios reportaron que PD-L2 estimula la proliferación de los linfocitos T y la producción de la citocina. Para delinear el papel de PD-L2 en la respuesta inmunitaria de los linfocitos T, la cinética de la expresión de PD-L2 en diferentes tipos de células ex vivo se examinó después de la infección con LCMV Armstrong (Figura 29) . En contraste con la expresión de PD-L1, la expresión de PD-L2 se hizo de manera limitada en las DC durante un tiempo muy corto (día 1-4 postinfección) . Este resultado sugiere que la expresión de PD-L2 está relacionada estrechamente con la regulación de las DC y resulta en la regulación de la activación de los linfocitos T.
Ejemplo 21: El PD-1 se expresa por la mayoría de los linfocitos T CD8 de memoria efectores en la sangre de humanos sanos Se investigó la expresión de PD-1 en los linfocitos T CD3+/D8+ de la sangre de adultos humanos sanos. En la sangre humana, 20-60% de los linfocitos T CD8 expresaron a PD-1. Se examinó la relación entre el estado diferenciación de los linfocitos T y la expresión de PD-1. Los linfocitos T CD3+/CD8+ se delinearon en subconjuntos de la memoria central (TCM) , memoria del efector (TEM) , y efector diferenciado terminalmente (TEMRA) sin experimentación previa, basándose en los patrones de la expresión de CD45RA y CCR7. PD-1 no se expresó por los linfocitos T sin experimentación previa, y por aproximadamente un tercio de TCM y TEMRA. En contraste, 60% de TEM expresaron a PD-1. Estos datos demuestran que la mayoría de TEM aislados de la sangre de adultos humanos sanos expresan a PD-1.
Basándose en esos análisis, los linfocitos T se subdividieron en múltiples poblaciones basándose en la expresión de CD45RA y CCR7. Se encontró una relación adicional entre la expresión de CD45RA y la expresión de PD-1. De manera específica, los linfocitos T CCR7-/CD8+ con la expresión de CD45RA más baja, contenían la proporción más alta de células PD-1+. En conclusión, PD-1 se expresó de manera predominante por TEM, a un grado menor por TEMRA y TC , y no se expresó entre los linfocitos T CD8 sin experimentación previa. Estos datos ilustran que una gran proporción de linfocitos T CD8 TEM expresan a PD-1 entre los adultos humanos sanos.
Para caracterizar las propiedades de los linfocitos T CD8 PD-1+ adicionalmente, se examinó la coexpresión de PD-1 y varios marcadores de la diferenciación de los linfocitos T. La mayoría de los linfocitos T CD8 PD-1+ portaban marcadores asociados con la experiencia del antígeno y la diferenciación del efector/memoria del efector. Por ejemplo, los linfocitos T CD8 CDlla+/CCR7-/CD62L-/CD45RA-/KLRGl+/granzima B+/perforina+ se enriquecieron en la expresión de PD-1. En contraste, los linfocitos T CD8 (CDlla-/CCR7+/CD62L+/CD45RA+/KLRG1-) del fenotipo sin experimentación previa, expresaron niveles bajos de PD-1. Así, PD-1 se expresó de manera preferencial en los linfocitos T CD8 con experiencia del antígeno con cualidades del efector/memoria del efector.
Ejemplo 22 : El PD-1 se expresa por la mayoría de los linfocitos T CD4 de memoria del efector en la sangre de humanos sanos La expresión de PD-1 entre los linfocitos T CD3+/CD4+ se investigó a continuación. Treinta por ciento de los linfocitos T CD4 expresaron a PD-1 en la sangre de adultos sanos. De manera similar a los linfocitos T CD8, los linfocitos T CD4 sin experimentación previa expresaron poco PD-1. Aunque una minoría de linfocitos T CD4 TCM expresaron a PD-1, la expresión de PD-1 fue enriquecida de manera preferida entre los linfocitos T CD4 TEM (50%).
Para caracterizar además las propiedades de los linfocitos T CD4 que expresan a PD, los linfocitos T CD4+/CD3+ se probaron de la sangre de individuos sanos para la coexpresión de PD-1 y varios marcadores de diferenciación de los linfocitos T. De manera similar a los linfocitos T CD8, la expresión de PD-1 estuvo enriquecida en los linfocitos T CD4 con un fenotipo de efector/memoria del efector, incluyendo las células CD62L-, CD95+, CD45RA-, CCR7- y CCR5+.
Ejemplo 23: El PD-1 se expresa de manera más elevada en los linfocitos T CD8 específicos para las infecciones con EBV y CMV en humanos Para probar si la expresión de PD-1 está correlacionada con la persistencia de un antígeno viral, la expresión de PD-1 se comparó en linfocitos T CD8 específicos para el virus EBV, CMV, influenza y vaccinia. Los linfocitos T CD8 específicos de EBV y CMV expresaron altos niveles de PD-1. En contraste, los linfocitos T CD8 de memoria específicos del virus de la influenza expresaron niveles intermedios de PD-1 y los linfocitos T CD8 específicos del virus vaccinia expresaron bajos niveles de PD-1. Por lo tanto, los linfocitos T CD8 de memoria específicos para las infecciones crónicas (EBV y CMV) , expresaron niveles más altos de PD-1 que las infecciones agudas (influenza y vaccinia) . Estos resultados muestran que los linfocitos T CD8 específicos para las infecciones crónicas (EBV y CMV) , expresaron niveles más altos de PD-1 que las infecciones agudas (virus de la influenza y vaccinia) . Los linfocitos T CD8 específicos para infecciones crónicas muy comunes pueden expresar altos niveles de PD-1.
Ejemplo 24: El bloqueo anti-PD-Ll incrementa la proliferación de los linfoci-bos T CD8 específicos para las infecciones con EBV y CMV en humanos El bloqueo de la trayectoria inhibidora de PD-1 resulta en la expansión clonal mejorada de los linfocitos T CD8 específicos del VIH tras la estimulación in vitro. Puesto que los linfocitos T CD8 específicos para las infecciones crónicas comunes también expresan á PD-1, se probó si el bloqueo de la trayectoria de PD-l/PD-Ll podría mejorar la proliferación de los linfocitos T CD8 específicos para EBV, CMV y también para el virus vaccinia (una infección aguda que resulta en los linfocitos T CD8 de memoria de PD-1). Los linfocitos se aislaron de la sangre de individuos que contienen linfocitos T CD8 específicos para CMV, EBV o VV, se marcaron con CFSE y se cultivaron durante 6 días bajo condiciones varias. Como se esperaba, la incubación de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) aisladas recientemente con el medio solo, o el medio con el anticuerpo anti-PD-Ll, no indujo la proliferación de los linfocitos T CD8 específicos del virus. La estimulación de las PBMC durante 6 días con los péptidos derivados del virus resultó en la división de los linfocitos T CD8 tetrámero+. Sin embargo, la estimulación de las PBMC con el péptido en la presencia del anticuerpo que bloquea a anti-PD-Ll mejoró además la división de los linfocitos T CD8 específicos de EBV y CMV, resultando en una expansión mayor que con el péptido solo. La división mejorada inducida por el anticuerpo que bloquea a anti-PD-Ll, varió entre los individuos y aún entre diferentes epitopos dentro de un individuo dado. Además, el bloqueo de PD-1 no resultó en una expansión mejorada de los linfocitos T CD8 específicos de la vaccinia o de la influenza. El grado de división mejorada inducida por el bloqueo de PD-Ll en el cultivo, podría relacionarse con la cantidad de PD-1 expresado por los linfocitos T CD8 específicos del antigeno antes de la estimulación. Estos datos sugieren que la expresión de PD-1 en los linfocitos T CD8 específicos para las infecciones crónicas, inhibe su capacidad proliferativa tras la estimulación antigénica.
Ejemplo 25: El bloqueo de PD-L1 sostenido incrementa además la proliferación de los linfocitos T CD8 específicos para las infecciones crónicas Tras la estimulación in vitro, la adición del anticuerpo que bloquea PD-L1 condujo a la división incrementada entre los linfocitos T CD8 específicos para EBV y CMV. El anticuerpo monoclonal (mAb) anti-PD-Ll se agregó una vez (día 0), y la proliferación se valoró al final del periodo de cultivo de seis días. El tratamiento con anti-PD-Ll in vivo en ratones, involucró múltiples inyecciones del anticuerpo bloqueante. Además, en estos estudios de murinos, el bloqueo de PD-L1 in vivo, resultó en una rápida sobrerregulación de la expresión de PD-1 entre los linfocitos T CD8 específicos para el antígeno viral crónico. Por estas razones, se probó si las adiciones repetidas de anti-PD-Ll para cultivos de linfocitos T estimulados mejoraría además la proliferación. La adición de un anticuerpo monoclonal a-PD-L1 en los días 0, 2 y 4 de cultivo, resultó en una acumulación aún mayor de los linfocitos T CD8 específicos de EBV que una sola adición del anticuerpo monoclonal en el día 0. Se observaron datos similares para los linfocitos T CD8 específicos de CMV. Estos datos sugieren que el bloqueo continuo de la señalización de PD-1 puede optimizar la capacidad para incrementar el número de linfocitos T CD8 específicos para los antígenos crónicos.
Ejemplo 26: Métodos adicionales para los estudios descritos en el Ejemplo 27 Grupo de estudio: Catorce macacos rhesus de la India (Malaca mulatta) infectados con SIV fueron estudiados. Ocho macados fueron usados para la fase crónica temprana y se infectaron intravenosamente con 200 TCID50 de SIV251. Seis macacos fueron usados para la fase crónica tardía, tres fueron infectados con SIV251 intrarectalmente y tres fueron infectados con SIV239 intravenosamente. Todos los macacos, excepto RDbll, fueron negativos para los alelos Mamu B08 y Mamu B17.. RDbll fue positivo para el alelo Mamul7.
Tratamiento de anticuerpos in vivo: Los macacos se instilaron ya sea con anticuerpo PD-1 anti-humano de ratón parcialmente humanizado (clona EH12-1540) (Dorfman et al., Am J Surg Pathol 30, 802-810 (2006)) o un anticuerpo control (SYNAGIS) . El anticuerpo anti-PD-1 tiene dominio de cadena pesada variable de ratón unida a IgGl humano (mutado para reducir la unión a FcR y al complemento) (Xu et al., Cell Immunol 200, 16-26 (2000)) y el dominio de cadena ligera variable de ratón unida a ? de humano. La clona EH12 se une al PD-1 de macaco y bloquea interacciones entre PD-1 y sus ligandos in vitro (Velu et al., J Virol 81, 5819-5828 (2007)). SINAGYS es un anticuerpo monoclonal de ratón humanizado (IgGlK) especifico a la proteina F del virus sincitial respiratorio (Medimmune) . Los anticuerpos se administraron intravenosamente a 3mg kg"1 de peso corporal en los días 0, 3, 7 y 10.
Respuestas inmunes: Las células mononucleares de sangre periférica a partir de la sangre y linfocitos de biopsias de extricción rectal se aislaron como se describió previamente (Velu et al., J Virol 81, 5819-5828 (2007)). La tinción de tetrámero (Amara et al., Science 292, 69-74 (2001)), producción de citocina intracelular (Kannanganat et al., J Virol 81, 8468-8479 (2007)) y medidas de anticuerpo de unión anti-SIV Env (Lai et al., Virology 369, 153-167 (2007)) se llevaron a cabo como se describió anteriormente.
Respuestas de linfocitos B: Un total de 100 µ? de sangre se tiñó en la superficie con anticuerpos para CD3 (clona SP34-2, BD Biosciences) , CD20 (2H7, e-Biosciences), CD21 (B-ly4, Becton Dickinson) , CD27 (M- T2712, Becton Dickinson) y PD-1 (clona EH-12), cada uno conjugado a un fluorocromo diferente. Las células se lisaron y fijaron con solución lisante de FACS, y se permeabilizaron usando perm FACS (BD Biosciences) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Las células después se tiñeron para Ki67 intracelular usando un anticuerpo anti-Ki67 conjugado a ficoeritrina (PE) (clona B56, Becton Dickinson) . Después de la tinción, las células se lavaron y se adquirieron usando LSRII (BD Biosciences) y se analizaron usando un programa FLO JO®.
Títulos de anticuerpo anti-PD-1 y respuesta de anticuerpo de mono contra anticuerpo anti-PD-1 en suero: Para medir los niveles de anticuerpo anti-PD-1, se cubrieron placas con inmunoglobulina anti-ratón cabra (pre-absorbida a inmunoglobulina humana, Southern Biotech) , se bloquearon e incubaron con diferentes diluciones de suero para capturar al anticuerpo bloqueante. El anticuerpo de unión se detectó usando IgG anti-ratón conjugado a HRP (pre-absorbido a inmunoglobulina humana, Southern Biotech) . Cantidades conocidas de anticuerpo bloqueante capturado en la misma forma se usaron para generar una curva estándar. Para medir los niveles de respuesta del anticuerpo de mono contra el anticuerpo anti-PD-1, las placas se cubrieron con anticuerpo anti-PD-1 (5 µg mi"1) , se bloquearon e incubaron con diferentes diluciones de suero para capturar al anticuerpo anti-bloqueo . El anticuerpo unido se detectó usando anticuerpo especifico de cadena ? antihumano conjugado a HRP (Southern Biotech) . Este anticuerpo de detección no se une al anticuerpo de bloqueo porque solamente las regiones constantes de las cadenas pesada y ligera fueron humanizadas y la región constante de la cadena ligera es ?. La cantidad de inmunoglobulina de mono capturada se estimó usando una curva estándar que consistió de cantidades conocidas de inmunoglobulina de macaco purificada que había sido capturada usando inmunoglobulina anti-macaco.
Cuantificación del número de copias de SIV: El número de copias de SIV se determinó usando un PCR en tiempo real cuantitativo como se describió anteriormente (Amara et al., Science 292, 69-74 (2001)). Todos los especímenes se extrajeron y amplificaron en duplicados, con el resultado medio reportado.
Amplificación y secuenciación del epitopo Tat TL8 Un fragmento de 350 nucleótidos incluyendo al epitopo Tat TL8 se amplificó por dilución limtante RT-PCR. El ARN viral se extrajo usando el mini paquete de ARN Viral QIAAMP® (Qiagen) a partir de plasma. El ARNv se transcribió en forma inversa con el cebador específico para SIVmac239 Tat-RT3 (5' -TGGGGATAATTTTACACAAGGC-3 ' ) y el Superscrito III (Invitrogen) usando el protocolo del fabricante. El ADNc resultante se diluyó y se determinó el número de copias empíricamente en nuestro protocolo PCR jerarquizado. Limitando la dilución, el PCR jerarquizado fue llevado a cabo a aproximadamente 0.2 copias por reacción usando el paquete PCR HiFi (alta fidelidad) Expand (Roche Applied Sciences) con los siguientes cebadores : Cebadores externos: Tat-Fl (5' -GATGAATGGGTAGTGGAGGTTCTGG-3' ) (SEQ ID NO: 53) Tat-R2 (5' -CCCAAGTATCCCTATTCTTGGTTGCAC-3 ' ) (SEQ ID O:54) Cebadores internos: Tat-F3 (5' -TGATCCTCGCTTGCTAACTG-3' ) SEQ ID NO: 55) Tat-R3 (5' -AGCAAGATGGCGATAAGCAG-3' ) (SEQ ID NO: 56).
Las reacciones de la primera ronda se ciclizaron usando el siguiente programa: 94 °C por 1 minuto, seguido de 10 ciclos a 94°C por 30 segundos, 55°C por 30 segundos y 68 °C por 1 minuto, seguido por 25 ciclos más idénticos a los primeros diez excepto por la adición de 5 segundos al tiempo de extensión en cada ciclo, seguido por una extensión final a 68°C por 7 minutos. Las reacciones de la segunda ronda se ciclizaron usando el siguiente programa: 94°C por 1 minuto, seguido por 35 ciclos a 94°C por 30 segundos, 53°C por 30 segundos, y 68°C por 1 minuto, seguido por una extensión final a 68°C por 7 minutos. Después de limpiar con ExoSap-IT (USB Corporation) , los productos de PCR se secuenciaron directamente usando los cebadores internos o un secuenciador automatizado. Se ensamblaron los contiguos usando Sequencher 4.8 (Gene Codes Corporation).' Los fragmentos ampliados (amplicones) que contienen nucleótidos con con dobles picos en el cromatograma se excluyeron .
Análisis Estadístico: Se usaron modelos de efectos mezclados lineales para determinar diferencias en química sanguínea y valores de conteo sanguíneo completos entre los animales tratados con anticuerpo anti-PD-1 y tratados con anticuerpo de control. El método Boniferroni fue usado para ajustar los valores P para múltiples pruebas. Una prueba t apareada fue usada para comparar las respuestas inmunes anes y después del bloqueo PD-1. Los datos transformados logarítmicamente se usaron cuando los datos no eran normales, sino normales logarítmicamente. Una prueba de suma de grados Wilcoxon se usó para comparar las reducciones de veces en cargas virales entre los grupos. Una prueba de grado logarítmico Mantel-Háenszel se usó para comparar las curvas de supervivencia entre los grupos. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando S-PLUS 8.0. Una P<0.05 de dos lados fue considerada estadísticamente significativa.
Ejemplo 27: Proliferación de Linfocitos B de Memoria Inducidos por Bloqueo de PD-1 Las infecciones por virus de inmunodeficiencia crónica se caracterizan por respuestas inmunes antivirales humorales y celulares disfuncionales. Como tal, las terapias moduladores inmunes que mejoran y/o restauran la función de la inmunidad específica a virus pueden proteger del progreso de la enfermedad. La seguridad y restauración inmunológica potencial del bloqueo del receptor co-inhibidor de la muerte celular programada 1 (PD-1) durante la infección por virus de inmunodeficiencia en simios (SIV) crónica fue investigado en macacos. Se demostr'que el bloqueo de PD-1 usando un anticuerpo para PD-1 es bien tolerado y resulta en una rápida expansión de linfocitos T CD8 específicos para el virus con calidad funcional mejorada. Esta inmunidad mejorada de linfocitos T se observó en la sangre y también en los intestinos, reservorios principales de la infección por SIV. El bloqueo de PD-1 también resultó en la proliferación de linfocitos B de memoria e incrementos en el anticuerpo específico para envoltura de SIV. Estas respuestas inmunitarias mejoradas se asociaron con reducciones significativas en la carga viral de plasma y también prolongaron la supervivencia de macacos infectados con SIV. El bloqueo fue efectivo durante las fases temprana (semana 10) y tardía (aproximadamente semana 90) de la infección crónica incluso en condiciones de linfopenia severa. Estos resultados demuestran mejora tanto de la respuesta inmune humoral como celular durante una infección por virus de inmunodeficiencia patogénica mediante el bloqueo de una sola trayectoria inhibitoria e identifican una aproximación terapéutica novedosa para el síndrome de inmunodeficiencia adquirida/virus de inmunodeficiencia humana, y demuestran que el monitoreo de la respuesta de linfocitos B puede emplearse para evaluar la eficacia de la terapia.
Los linfocitos T específicos a virus muestran grados diversos de impedimento funcional durante las infecciones crónicas (Wherry et al., Immunity 27, 670-683 (2007); Klenerman et al., Nat Immunol 6, 873-879 (2005)). Aunque estos linfocitos T retienen algunas funciones antivirales, son menos polifuncionales comparados con linfocitos T antivirales vistos en infecciones agudas. Este defecto en la función de los linfocitos T contribuye enormemente a la incapacidad del hospedante de eliminar el patógeno persistente. Se describe en la presente que la extenuación de linfocitos T específicos de virus está presente durante la infección por LCMV persistente de ratones (Zajac et al., J Exp Med 188, 2205-2213 (1998); Galimore et al., J Exp Med 187, 1383-1393 (1998)) y otras infecciones virfales, incluyendo infecciones por el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) , virus de la hepatitis B (HBV) y virus de la hepatitis C (HCV) en humanos (Letvin et al., Nat Med 9, 861-866 (2001); Pantaleo et al., Nat Med 10, 806-610 (2004); Rehermann et al., Nat Rev Immunol 5, 215-229 (2005)). El receptor co-inhibitorio PD-1 fue altamente expresado en los linfocitos T CD8 específicos de virus extenuados (Barber et al, Nature 439, 682-687 (2006); Sharpe et al., Nat Immunol 8, 239-245 (2007)). El PD-1 también se sobrerregula en específico de VIH-1 (Pettrovas et al., J Exp Med 203, 2281-2292 (2006); Day et al Nature 443, 350-354 (2006) ) y específico de SIV (Velu et al., J Virol 81, 5819-5828 (2007)). Los linfocitos T CD8 y el bloqueo in vitro de PD-1 mejoró la producción de citocina y la capacidad proliverativa de estas células. Un modelo de SIV/macaco se usó para evaluar los efectos del bloqueo in vivo de PD-1 en la seguridad y restablecimiento de la inmunidad humoral y celular específica para virus durante las infecciones por virus de inmunodeficiencia, crónicas.
El bloqueo de PD-1 se llevó a cabo usando un anticuerpo especifico para PD-1 humano que bloquea la interacción entre el PD-1 de macaco y sus ligandos (PDL) in vitro (Velu et al., J Virol 81, 5819-5828 (2007)). El bloqueo se llevó a cabo durante las fases temprana (10 semanas) asi como tardía (aproximadamente 90 semanas) de la infección por SIV crónica. Nueve macacos (cinco durante la fase temprana y cuatro durante la fase tardía) recibieron el anticuerpo anti-PD-1 y cinco macacos (tres durante la fase temprana y dos durante la fase tardía) recibieron un anticuerpo de control de isotipo (Synagis, específico del virus de sarcoma Anti-Rous (RSV) (Malley et al., J Infect Dis 118, 1555-1561 (1998)) .
El bloqueo de PD-1 durante la infección crónica por SIV resultó en una expansión rápida de linfocitos T CD8 específicos para SIV en la sangre de todos los macacos (Figurs 3a, 30b) . Las respuestas de linfocitos T CD8 de dos epitopos inmunodominantes, Gag CM9 y Tat SL8/TL8 (Alien et al., Nature 407, 386-390 (2007)), fue estudiada usando complejos tetraméricos de (MHC) I complejo de histocompatibilidad principal en siete de los macacos tratados con el anticuerpo anti-PD-1 y tres de los macacos tratados con el anticuerpo de control, que expresaron la molécula de histocompatibilidad Mamu A*01. La mayoría (>98%) de los linfocitos T CD8 específicos para el tetrámero Gag-CM9 expresaron PD-1 antes del bloqueo.
Después del bloqueo de PD-1, los linfocitos T CD8 específicos para el tetrámero Gag-CM9 se expandieron rápidamente y exhibieron un pico en los días 7-21. En la respuesta de pico, estos niveles eran de aproximadamente 2.5-11 veces más altos que sus respectivos niveles en el día 0 (P=0.007) y permanecieron elevados hasta los días 28-45 (figura 30b). Se observaron resultados similares con el bloqueo durante las fases temprana y tardía de la infección crónica por SIV. Un aumento de 3 a 4 veces en la frecuencia de los linfocitos T CD8 positivos para el interferón (IFN)-y específicos de Gag también se observó por el día 14 después del bloqueo en os dos animales Mamu A*01-negativos (RTdll y RDbll) , demostrando que el bloqueo de PD-1 puede aumentar la frecuencia de los linfocitos T CD8 específicos al virus, que están restringidos por los alelos distintos a Mamu A*01. Como se esperaba, la expansión de los linfocitos T CD8 específicos para SIV no se observó en los macados tratados con el anticuerpo control (Figura 30) .
El bloqueo de PD-1 también se asoció con un aumento significativo en la frecuencia de linfocitos T CD8 específicos al virus que estaban sufriendo división celular activa in vivo con calidad funcional mejorada (figura 30b) . Consistente con la expansión rápida de los linfocitos T CD8 específicos de SIV, la frecuencia de linfocitos CD8 específicos al tetrámero Gag-CM9 que coexpresaron Ki67 (marcador para células proliferantes) también aumentó tan pronto como por el día 7 después del bloqueo (P = 0.01) De manera similar, un aumento en las frecuencias de los linfocitos T CD8 específicos para el tetrámero Gag-CM9 que co-expresan perforina y granzima B (potencial citolítico; P=0.001 y P=0.03, respectivamente), CD28 (potencial de co-estimulación; P=0.001), CD127 (potencial proliferativo; P=0.0003) (Kaech et al., Nat Immunol 4, 1191-1198 (2003)) y CCR7 (potencial de retorno de nodo linfático; P=0.001) se observó (Salusto et al., Nature 401, 708-712 (1999)). Un aumento transiente de 1.5 a 2 veces en la frecuencia de linfocitos T Cd8 Ki67-positivos y tetrámero-negativos después del bloqueo, también se observó. Estto puede deberse a la expansión de linfocitos T CD8 específocos a otros epitopos en Gag así como otras proteínas de SIV, y otras infecciones crónicas virales en estos animales. No se observó mejora significativa para estos marcadores en los tres macacos ttratados con el anticuerpo de control.
Notablemente, no se observó expansión para linfocitos T CD8 específicos de Tat-TL8 después del bloqueo. Esto puede deberse al escape viral a partir de reconocimiento por los linfocitos T CD8 específicos de Tat-TL8, ya que se sabe que el bloqueo de PD-1 resulta en la expansión de linfocitos T solamente cuando reciben simultáneamente señales a través del receptor de linfocitos T. Para probar esta posibilidad, se secuenciaron los genomas virales presentes en el plasma justo antes de iniciar el bloqueo a partir de todos los tres macacos Mamu A*01 posistivos que fueron infectados con SIV251 y que recibieron el anticuerpo de bloqueo durante la fase temprana de la infección. En realidad, se encontró que las mutaciones en el genoma viral corresponden con la región del epitopo Tat TL8. Todas estas mutaciones han mostrado o se han predicho que reducen la unión del péptido Tat SL8/TL8 a la molécula MHC Mamu A*01 y resultan en escape del reconocimiento por los linfocitos T CD8 específicos de Tat-SL8/TL8 (Alien et al., Journal of Immunology 160, 6062-6071 (1998); (Alien et al., Nature 407, 386-390 (2000). Estos resultados sugieren que el bloqueo in vivo de PD-1 puede no resultar en la expansión de linfocitos T que son específicos para escapar de mutantes de epitopos virales.
El bloqueo de PD-1 también resultó en la expansión de linfocitos T CD8 específicos de Gag-CM9 en el tejido mucoso colorrectal (intestino), un sitio preferente de la replicación de SIV/VIH (Pierson et al., Annu Rev Immunol 18, 665-708 (2000)) (Figura 30c). No se observó expansión para dos de siete macacos, aunque la expansión fue evidente para uno de ellos en sangre. En contraste con la sangre, la expansión en intestino dio un pico mucho después por el dia 42, y en un intervalo de 2 a 3 veces comparado con sus niveles en el dia 0 respectivos (P=0.003). De manera similar a la sangre, los linfocitos específicos al tetrámero Gag-CM9 que co-expresaron Ki67 (P=0.01), perforina (P=0.03), granzima B (P=0.01) y (CD28 (P=0.01) también aumentaron en el intestino después del bloqueo .
El bloqueo de PD-1 también aumentó la calidad funcional de los linfocitos T CD8 antivirales y resultó en la generación de células polifuncionales capaces de co-producir el IFN-? de citocinas, el factor de necrosis tumoral (TNF)-a y la interleucina (IL)-2 (figura 31). En el día de inicio del gloqueo de PD-1 durante la fase crónica tardía de la infección, la frecuencia de linfocitos IFN-? positivos específicos de Gag fue baja y fallaron en co-expresar TNF-a y IL-2 (figura 31a) . Sin embargo, después del bloqueo, la frecuencia de linfocitos IFN-? positivos aumentó en todos los cuatro macacos tratados con el anticuerpo de PD-1 (P=0.03) y adquirieron la capacidad para co-expresar TNF-a y IL-2. La expansión de células IFN-? positivas hizo un pico por los días 14-21 y los niveles de pico fueron de 2 a 10 veces mayores que los niveles en el día 0 respectivos. En el día 21, aproximadamente 16% de las células totales especificas de Gag co-expresaron todas las tres citocinas, y aproximadamente 30% co-expresaron IFN-? y TNF-ct (figura 31b) . Esto es en contraste a <1¾ de las células especificas a Gag que co-expresan todas las tres citocinas (P=0.01), y aproximadamente 14% que coexpresan IFN-? y TNF-a en el día 0 (P=0.04). Resultados similares también se observaron después del bloqueo durante la fase crónica temprana de la infección.
Las infecciones por virus de inmunodeficiencia crónicas se socian con la disfunción de linfocitos B (De Milito, Current HIV Research 2, 11-21 (2001); Moir y Faucci, J Allergy Clin Immunol 122, 12-19; quiz 20-11 (2008)) pero se conoce muy poco acerca del papel de PD-1 en la regulación de la función/extenuamiento de los linfocitos B. Se caracterizaron las respuestas de linfocitos B después del bloqueo de PD-1 en macacos infectados por SIV (figura 32). El análisis de la expresión de PD-1 en diferentes subconjuntos de linfocitos B antes del bloqueo reveló expresión preferencial de PD-1 por linfocitos B de memoria (CD20+CD27+CD21) comparado con linfocitos B que no habían sido sometidas a tratamiento (CD20+CD27-CD21+; figura 32a, P<0.001) . El bloqueo ir-vivo de PD-1 resultó en un incremento de 2 a 8 veces en el título del anticuerpo de unión específico a SIV por el día 28 después del bloqueo (P<0.001; figura 32b).
La proliferación de linfocitos B de memoria se estudió en macados infectados por SIV que fueron tratados simultáneamente con anticuerpo anti-PD-1 y terapia anti-retroviral y se observó tan temprano como el día 3, un aumento significativo en los linfocitos B de memoria KÍ67+ (proliferante) , pero no en aquellos que no habían sido sometidos a tratamiento (figura 32c) . Estos resultados demuestran el papel de la trayectoria PD-l-PDL en la regulación de la disfunción de linfocitos B durante la infección crónica por SIV. Los ensayos de neutralización revelaron un aumento de dos veces enn los títulos contra el SIV251 adaptado al laboratorio, fácilmente neutralizable , y ningún incremento en los títulos contra SIV251 o SIV239, que son de tipo silvestre y difíciles de neutralizar. En dos de nueve animales tratados con el anticuerpo anti-PD-1, solamente una expansión mínima (<2 veces) de anticuerpo específico de SIV fue observada después del bloqueo. Notablemente, la frecuencia de los linfocitos B de memoria totales en estos dos animales fue inferior (aproximadamente 40% de linfocitos B totales) comparrada con los siete animales restantes (60.90% de linfocitos B totales) antes del bloqueo, indicando que el nivel de linfocitos B de memoria específicos de SIV antes del bloqueo puede determinar el nivel de expansión del anticuerpo especifico de SIV después del bloqueo.
El bloqueo de PD-1 resultó en reducciones significativas en la viremia plasmática (P=0.03) y también prologó la supervivencia de macacos infectados con SIV (P=0.0001; figura 33). En dos de cinco macacos tratados con el anticuerpo anti-PD-1 durante la fase crónica temprana, la carga viral declinó por el día 10 y persistió en o debajo este nivel hasta el día 90 (figura 33a) . En un macaco la carga viral declinó de manera transitoria y en los dos macacos restantes aumento de manera transitoria y regresó a niveles de pre-bloqueo. En contraste con la fase crónica temprana, todos los cuatro macacos tratados con el anticuerpo anti-PD-1 durante la fase crónica tardía mostraron un aumento transitorio en la viremia por el día 7, pero rápidamente redujeron la carga viral por el día 21 a niveles por debajo de sus niveles al día 0 respectivos (figura 33b) . Sin embargo, los niveles de ARN viral regresaron a los niveles pre-bloqueo por el día 43. Como se esperaba, no se observaron reducciones significativas en las cargas virales plasmáticas en cualquiera de los cinco macacos tratados con el anticuerpo control (figura 33c) . Por los días 21-28 después del bloqueo, los niveles de ARN viral en los animales tratados con el anticuerpo anti-PD-1 fueron de 2 a 10 veces más bajos que sus niveles al día 0 respectivos (P=0.03; figura 33d) . Por el día 150 después del bloqueo, cuatro de los cinco macacos en el grupo de control fueron eliminados debido a los síntomas relacionados con el SIDA (por ejemplo pérdida de apetito, diarrea, pérdida de peso) , mientras que los nieve animales en el grupo tratado con el anticuerpo anti-PD-1 sobrevivieron (P=0.001; figura 33e) .
La elevación inicial observada en los niveles de viremia plasmática en todos los animales tratados en las fases tardías y algunos de los animales tratados en las fases tempranas, puede deberse a un aumento en la frecuencia de los linfocitos T CD4 activados. Se midió el porcentaje de linfocitos T CD4 totales Ki67-positivos , así como la frecuencia de linfocitos T CD4 que producen IFN-? específicos de SIV-Gag (objetivos preferenciales para repliación de virus (Douek et al., Nature 417, 95-98 (2002)) después del bloqueo. Estos análisis revelaron un aumento transitorio en el porcentaje de linfocitos T CD4 Ki67-positivos por el día 7-14 después del bloqueo (P=0.002) y este aumento fue mayor en animales tratados durante la fase tardía que en la fase temprana de la infección (P=0.015). De manera similar, un aumento en la frecuencia de los linfocitos T CD4 específicos de Gag también fue observado, pero solamente en animales tratados durante la fase tardía de la infección. No se observaron aumentos significativos para estos linfocitos T CD4 activados en los macaos tratados con anticuerpo de control. Estos resultados sugieren que los linfocitos T CD4 pueden haber contribuido a la elevación inicial observada en los niveles de viremia plasmática después del bloqueo.
Antes del inicio del bloqueo de PD-1, la carga viral inicial en el plasma y los linfocitos T CD4 totales en la sangre e intestino fueron similares entre los grupos tratados con anticuerpo anti-PD-1 y los tratados con anticuerpo de control. Sin embargo, las frecuencias de linfocitos Gag CD9+ y Gag CM9+ que co-expresan perforina, granzima B o CD28 no fueron similares entre los dos grupos de tratamiento antes del bloqueo in vivo (figura 30b) . Esto eleva la posibilidad de que estas diferencias podrían haber contribuido a la expansión de las células Gag C 9+ después del bloqueo de PD-1. Para estudiar la influencia de la frecuencia de células Gag CM9+ antes del bloqueo en su expansión después del bllqueo, el grupo tratado con el anticuerpo anti-PD-1 se dividió en dos subgrupos basados en la frecuencia de células Gag CM9+ antes del inicio de bloqueo de modo que un grupo tiene niveles similares y el otro grupo tiene niveles más altos de células Gag CM9+ comparado con el ggrupo tratado con anticuerpo de control. Estos subgrupos fueron después analizados para determinar la expansión de células CM9+ después del bloqueo. La expansión de células CM9+ fue evidente en ambos subgrupos de animales después del bloqueo de PD-1, independientemente de si estos fueron a niveles bajos o altos antes del bloqueo. Resultados similares se observaron también con los análisis de subgrupo basados en la frecuencia de células CM9+ que co-expresan moléculas asociadas con una mejor función de linfocitos T tales como perforina, granzima B, CCR7 , CD127 o CD28. Sin embargo, existió una tendencia hacia una mejor expansión de células CM9+CD28+ en animales con niveles más altos de células CM9+CD28+ antes del bloqueo, lo que sugiere que la expresión de CD28 sirve como un biomarcador para predecir el resultado del bloqueo de PD-1 in vivo.
Para evaluar la seguridad del bloqueo de PD-1, se realizó un análisis extensivo de enzimas de suero, proteínas, iones, lípidos, hígado y riñon, y conteo sanguíneo completo después del bloqueo. Esos análisis revelaron que no hay cambios significativos para todos los parámetros probados entre los macacos tratados con anticuerpo anti-PD-1 y los tratados con anticuerpo de control. De manera similar, losniveles de anticuerpos anti-nucleares (ANA) en el suero (medida de autoinmunidad) tampoco cambió de manera significativa después del tratamiento con anticuerpo anti-PD-1.
Tabla 6 : Parámetros bioquímicos de sangre después del tratamiento con anticuerpo anti-PD-1 Marcadores Pre- Post-infección con SIV, días infección* después del bloqueo de PD-1* (n=5) (n=8) Perfil bioquímico Día 0 Día 14 Día 56 ALT (U/L) 16.8 ±5.0 27 ±11.6 24.8 ±7.7 27 +7.9 AST (U/L) 33.1 ±8.2 35.0 ±8.3 29.8 ±3.6 49.0 ±18.5 Fosfatase alcalina 466 ±135 410 ±367 367 ±78 451 ±89 (U/L) Bilirrubina (g/L) 0.2 +0.1 0.16±0.1 0.12 ±0.0 0.2 ± 0.2 0.9 ±0.1 0.6 +0.1 Creatinina (mg/dL) 0.7 ±0.1 0.66 ±0.1 Proteína Total (g/dL) 7.3 ± 0.3 7.0 ±0.3 7.24 + 0.4 6.9 ± 0.4 Albúmina g/L 4.5 ± 0.3 4.28 ±0.2 4.1 ±0.2 4.1 ±0.2 Globulina (g/dL) 2.7 ± 0.2 2.72 ± 3.14 ±0.3 2.8 ± 0.2 0.3 Albúmina/Globulina 1.7 ±0.2 1.62 ±0.2 1.32±0.1 1.4 ±0.1 (relación) Glucosa (mg/dL) 82±16 69±8 66 ±9 64 ±8.0 Colesterol (mg/dL) 161 ±32 149 +32 145 ±20 140± 18 Triglicéridos (mg/dL) 58 ±19 64 ±12 60 ±7 73 ±34 Nitrógeno de Urea en 18 ± 3 17 ±3 17±3 16±3 Sangre (mg/dL) Nitrógeno de Urea en 21 ±3 24±5 26 ±5 26 ±5 Sangre - creatinina (relación) Lipasa (U/L) 21 ±7 20 ±7 21 ±9 23 ± 10 Creatinina 428 ± 272 537 ±303 486 ±129 462 ±312** fosfocinasa (U/L) Gamma glutamil 74 +23 66 ± 16 58 ± 18 71 ±15 transpeptidasa (U/L) Calcio (mg/dL) 10 ±0.5 10 ± 0.2 10 ±0.5 10 ±0.3 Cloruro (mEq/L) 110 ± 3 107 ±3 108 ±1 107 ±2 Potasio (mEq/L) 4 ± 0.3 4 ± 0.2 4± 0.1 4 ± 0.6 Sodio (mEq/L) 150 ± 5 149 ± 3 149 ± 1 147 ± 2 Fósforo (mg/dL) 5 ± 0.9 5 ± 0.6 5 ± 0.8 6 ± 0.4 Los valores representan media + desviación estándar Se usaron los valores el día 91 debido a la ruptura RBC en el día 56 Tabla : Conteo sanguíneo completo después tratamiento con anticuerpo anti-PD-1 * Los valores representan la media + desviación estándar En un macaco, los niveles de ANA aumentaron aproximadamente 3 veces por el día 10 después del bloqueo, pero regresaron a los niveles del día 0 por el día 56. Estos resultados demuestran que el tratamiento con anticuerpo anti-PD-1 durante la infección crónica por SIV no resulta en toxicidad observable. Esto es consistente con un estudio reciente que demostró la seguridad del bloqueo de PD-1 en pacientes con malignidades hematológicas avanzadas (Berger et al., Clin Cáncer Res 14, 3044-3051 (2008)).
Se estudió la farmacocinética del anticuerpo anti-PD-1 parcialmente humanizado en el suero después del bloqueo in vivo. El titulo del anticuerpo anti-PD-1 rápidamente disminuyó entre los días 14 y 28 después del bloqueo y coincide con macacos que generaron respuesta de anticuerpo contra los dominios variables de inmunoglobulina de ratón del anticuerpo anti-PD-1. De ese modo, el anticuerpo anti-PD-1 completamente humanizado puede permitir periodos más largos de tratamiento que pueden además aumentar la eficacia del bloqueo in vivo.
Los resultados demuestran que el bloqueo in vivo de PD-1 durante la infección crónica por SIV es seguro y resulta en la expansión y restauración rápida de los linfocitos T CD8 polifuncionales específicos para SIV y respuestas de linfocitos B mejoradas. La expansión se observó con bloqueo llevado a cabo durante la fase temprana si como la fase tardía de la infección crónica incluso bajo condiciones de niveles altos de viremia persistente y SIDA. La expansión también fue observada en el tejido mucoso colorrectal, un sitio preferencial de la replicación VIH/SIV (Pierson et al., Annu Rev Immunol 18, 665-708 (2000) ) . De manera importante, el bloqueo de PD-1 resultó en una reducción significativa de la carga viral plasmática y también prolongó la supervivencia de los macacos infectados con SIV. Estos resultados son altamente significativos considerando la falla del bloqueo de una molécula co-inhibitoria relacionada CTLA-4 para expandir los linfocitos T CD8 específicos del virus y para reducir la carga viral plasmática en macacos infectados por SIV (Cecchinato et al., J Immunol 180, 5439-5447 (2008)). Los beneficios terapéuticos del bloqueo de PD-1 podrían mejorarse más utilizando terapia de combinación con vaculas antirretrovirales y/o terapéuticas.
Ejemplo 28: Materiales y Métodos para el Ejemplo 29 Animales , inoculación de SIV y etapas de infección: Se usaron monos Rhesus de la India (Macaca mulatta) y mangabeyes grises. La infección por SIV se llevó a cabo por inoculación intravenosa, y los animales se agruparon por etapa de infección en: -aguda (2 semanas post-infección, p.i.), reciente crónica (10-12 semanas p.i.) y crónica tardía (>1.5 años p.i.).
Medidas de carga viral: La carga viral plasmática se determinó por PCR en tiempo real cuantitativa como se describió previamente (Amara et al., Science 292, 69-74 (2001) ) . Todos los especímenes de ARN vilral se extrajeron y evaluaron por duplicado, con los resultados de media reportados y usados en el análisis.
Análisis fenotipico por citrometría de flujo: Las tinciones de linfocitos en la superficie se llevaron a cabo usando 100 de muestras de sangre completa usando análisis de múltiples parámetros y múltiples colores. Los linfocitos se obtuvieron a partir de tejido necrótico. Se usaron los siguientes anticuerpos: anticuerpos antihumano de ratón contra CD3 (clona SP34-2), CD21 (clona B-Ly4), CD27 (clona M-T2712), CD80 (clona L307.4), CDllc (clona S-HCL-3), todos de BD BIODSCIENCES ®; CD20 (clona 2H7, eBIOSCIENCES ®) , CD40 (clona MAB89, BECKMAN COULTER ®) , CD95 (clona DX2 , CALTAG ®) y PD-1 (clona EH-12). Las células se analizaron en un citómetro de flujo LSRII y los datos se analizaron con un programa FLOWJO® versión 8.8.2.
ELISA de Concanavalina A para medir los títulos de anticuerpos específicos a SIV env y la avidez: Los títulos de anti-env IgG Ab se midieron usando proteínas de envoltura producidas en transíecciones transitorias de linfocitos 293T con ADN/89.6 VLP (51). Brevemente, placas ELISA de 96 pozos (Costar, Corning Life Sciences) se recubrieron con Concavalina A (Con A) 25 µg/ml en 10 m de amortiguador Hepes y se incubaron toda la noche a 4°C. Las placas se lavaron seis veces con PBS conteniendo Tween-20 (PBS.T) al 0.05%, 100 µ? de VLP se agregaron a cada pozo y posteriormente se incubaron 1 hora a temperatura ambiente, se hizo otro lavado y bloqueo por 1 hora a temperatura ambiente con 100 µ? de amortiguador de bloqueo (PBS-T con 4% de suero de leche y 5% de leche seca) por pozo. Las placas se lavaron y se probaron los sueros de leche serialmente diluidos en PBS-T 4% añadidos a los pozos por duplicado e incubados por 1 hora a temperatura ambiente. Para los ensayos ELISA, las placas se lavaron 6 veces con PBS-T, y se detectaron los Ab unidos usando IgG anti-mono conjugado con peroxidasa de rábano picante (Rockland Immunochemicals ) y sustrato de tetametil benceno (TMB) (KPL) , y las reacciones se detuvieron con 100 µ? de H2S04 2N . Cada placa incluyó una curva estándar generada usando IgG anti-mono de cabra (Rockland Immunochemicals) e IgG rhesus (Accurate Chemicals) . Las curvas estándar se ajustaron y las concentraciones de las muestras se interpolaron como µg de Ab por mi de suero usando el programa SOFTMAX ®.
La avidez del Ab a las proteínas de envoltura virales fue determinada midiendo la resistencia de los complejos envoltura-anticuerpo a la elución por el agente caotrópico NaSCN en una modificación de ELISA de Ab env. Los sueros probados se agregaron a las placas por cuadruplicado, en diluciones de 3 veces empezando de 1:100. Después de la unión de los sueros de prueba en la ELISA ConA env, un conjunto de duplicados se trató con PBS y el otro conjunto con NaSCN 1.5M por 10 minutos antes de lavar y detectar con IgG anti-mono conjugado con peroxidasa de rábano picante y sustrato TMB. Las reacciones se detuvieron con con 100 µ? de H2SO 2N. El índice de avidez se calculó dividiendo la dilución del suero que dio una O.D. de 0.5 con el tratamiento con NaSCN entre la dilución del suero que dio una O.D. de 0.5 con PBS, multiplicado por 100.
Ensayo de neutralización: Se midió la neutralización como una función de una reducción en la expresión del gen reportero de luciferasa (luc) después de rondas sencillas de infección en células 5.25. EGFP . Luc. M7 (TCLA SIVmac25) y células TZM-bl (pseudovirus 293T) como se reportó previamente (51, 52). Los valores reportados representan la dilución de suero al acual las unidades de luminiscencia relativa (RLU) se redujeron en un 50%, comparado con pozos de control de virus.
Ensayos de apoptosis : Las PBMC de 7 macacos infectados con SIV se colocó en placas de 06 pozos de fondo redondeado para cultivo de tejido a 2.5 x 105 células/pozo bajo cuatro diferentes condiciones de cultivo: solamente medio RPMI-1640 completo (apoptosis espontánea), medio RPMI-1640 completo + 10 ng/ml de rh] FasL etiquetado con His, soluble (R&D Systems) (apoptosis regulada por Fas) & medio RPMI-1640 completo + 10ng/ml de rhFasL marcado con His, soluble + ??µ?/p?? de anticuerpo de bloqueo anti-PD-1. Las placas se incubaron por 24 horas a 37 °C después de lo cual se tiñeron las células para CD20, CD27, CD21 y Anexina-V, e inmediatamente se analizaron en un citómetro de flujo LSRII .
Las células Huh-7.5 (53) se transíectaron con un plásmido que expresa HLA-A2 bajo el promotor de CMV con un gen resistente a Neomicina. Las clonas se seleccionaron y propagaron, y después se transíectaron con un segundo plásmido (pCNA3.1-Zeo) que expresa el PD-L1 de ADNc humano INCYTE ® de longitud completa (OPEN BIOSYSTEMS ®, Huntsville, AL) . Una segunda ronda de selección y propagación de clonas resistentes tanto a neomicina como a zeocina fue llevada a cabo. La verificación de la expresión de HLA-A2 y PD-L1 se llevó a cabo por citometría de flujo. Las células Huh-7.5. A2. PD-L1 se usaron para evaluar la apoptosis regulada por PD-L1 en linfocitos B de memoria activados, con células Huh-7.5 como control. Ambas lineas celulares se sembraron en placas de 24 pozos separadas y se incubaron a 37 °C un día antes del experimento. Los linfocitos B se aislaron de las PBMC usando microesferas CD20 especificas a NHP ( iltenyi Biotec) y los linfocitos B aislados se agregaron a las lineas celulares y las placas se incubaron a 37°C después de lo cual se tiñeron las células para CD20, CD27, CD21 y Anexina-V, e inmediatamente se analizaron en un citómetro de flujo LSRII.
Estimulación de PBMC in vitro y ensayos ELISpot de linfocitos B de memoria: Las PBMC se estimularon y se usaron en los ensayos ELISpot de linfocitos B de memoria usando modificaciones del método descrito por Crotty et al (23) . Brevemente, las PBMC fueron colocadas en placas de cultivo de tejido de 24 pozos, estériles (Costar) a 0.5 x 106 células/pozo en medio RPMI-1640 completo que contenia ß-2-mercaptoetanol bajo 3 condiciones diferentes de cultivo: solamente medio (control); cepa Cowan de Staphylococcus aureus (SAC) (SIGMA ®)fija, diluida 1:10,000, mitogen cocktail-pokeweed mitogen diluida 1:1000 y 6 µ?/p?? de CpG ODN-2006 (Qiagen-Operon) ; coctail mitógeno+ 10 µg/ml de anticuerpo de bloqueo anti-PD-1 (clona 1540-29C9, proporcionada por GF) en triplicados.
Las células se cultivaron a 37°C con CO2 al 5% por 6 dias.
En el día 5 del cultivo, las placas ELISpot de filtro de 96 pozos se cubrieron con IgM e IgG anti-mono de cabra purificado por afinidad (Rockland Immunochemicals ) a 10 µg/ml, y SIVmac239 gpl30 a 1 µ?/p??, y se incubaron toda la noche a 4°C.
En el dia 6, se lavaron las placas una vez con PBS-T y tres veces con PBS y se bloquearon con RPMI-1640 por 2 horas a 37 °C. Las PBMC cultivadas se lavaron dos veces, se agregaron a las placas ELISpot preparadas y se incubaron a 37 °C por 6 horas. Las placas se lavaron entonces 3X con PBS y 3X con PBS-T y se incubaron toda la noche a 4°C con ^g/ml de IgM anti-mono conjugado con biotina (para detección de IgM ASC total) o ?µ?/ta? de IgG anti-mono (para detección de IgG total y ASC anti-gp 130) diluido en FCS PBS-T/1%. Las placas se lavaron entonces 4X con PBS-T y se incubaron por 1 hora a temperatura ambiente con 5µg/ml de Avidina D conjugada con HRP (Vector laboratorios) diluido en FCS PBS-T/1%. Las placas se lavaron 4X y se revelaron con 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) . Las manchas en las placas reveladas se contaron usando un lector de placa ELISpot. Los datos se representaron como número de manchas (ASC) por 106 PBMC.
Análisis estadísticos : Los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando GRAPHPAD PRISM ®.
Ejemplo 29: Linfocitos B de memoria y PD-1 en el Progreso de una Infección Crónica Cuatro distintos subconjuntos de linfocitos B pueden identificarse en sangre periférica de macaco rhesus: Se caracterizó el compartimiento de linfocitos B de macaco rhesus. Cuatro distintos subconjuntos de linfocitos B en sangre periférica de Macacos Rhesus (RM) : CD20int/CD21"/CD27" (sin tratamiento previo), CD20int/CD21+/CD27+ (de memoria inactivos), CD20hi/CD21" /CD27+ (de memoria activados) y CD20hi/CD21"/CD27" (memoria de tejido o no convencional), todos con intensidad media de fluorescencia (MFI) significativamente diferente de CD20 (P<0.0001) . Los linfocitos B de memoria activados y unos que no habían recibido tratamiento fueron los subconjuntos principales, haciendo un 37% y 36% de linfocitos B totales respectivamente, seguido por linfocitos B de memoria de tejido (18%) e inactivos (9%) . Las células fueron teñidas para IgM e IgD superficial y se encontró que a diferencia de los humanos no había virtualmente células con únicamente IgM Los linfocitos B que no habían sido sometidos a tratamiento, se dividieron de manera uniforme en IgD-solamente y en IgD+IgM+. Los tres subconjuntos de memoria se realizaron a partir de aproximadamente 20% de células IgD-solamente; el resto de los linfocitos B de memoria inactivos fueron IgD+IgM+ (aproximadamente 50%) e IgD~IgM~ (aproximadamente 30%) . Los linfocitos B de memoria activados fueron el subconjunto con mayor cambio de clase, con aproximadamente 60% de ellos siendo IgD'IgM" y aproximadamente 20% siendo IgD+IgM+. Los linfocitos B de memoria similares a tejido por otra parte, fueron en su mayoría IgD+Ig + (aproximadamente 70%) con sólo aproximadamente 10% de IgD'IgM. De ese modo, un nuevo subconjunto de linfocitos B fue identificado para los macaos rhesus (RM) , que a diferencia del subconjunto de linfocitos B de memoria activados, carecía de expresión CD27, pero también fue CD21". Estos linfocitos B podrían ser similares al subconjunto de células de linfocitos B de memoria similares a tejido únicos, cuyo marcador de definición de superficie es la molécula inmunorregulatoria FCRL4 en humanos.
Para caracterizar adicionalmente a los subconjuntos, se evaluó la expresión de los marcadores de activación y diferenciación CD40, CD80, CD95 y CDllc. Virtualmente todos los linfocitos B de memoria en reposo y los que no habían sido sometidos a tratamiento y >70% de linfocitos B de memoria en reposo fueron CD40hl, mientras que la mayoría (>70%) de los linfocitos B de memoria activados fueron CD40int. Los linfocitos B de memoria activados expresaron la mayoría de CD80, CD95 y CDllc, estrechamente seguidos por los linfocitos B de memoria en reposo. CDllc fue únicamente expresado en linfocitos B de memoria no convencionales y activados, y los linfocitos B que ni hablan sido sometidos a tratamiento expresan cantidades despreciables de CD80, CD95 y CDllc.
La infección por SIV conduce a la reducción de linfocitos B de memoria activados : La ruta intravenosa de la infección por SIV, que se usó en este estudio, se ha asociado con un curso más rápido del progreso de la enfermedad en primates no humanos, con hasta 30% de animales inoculados mediante esta ruta progresando a SIDA dentro de los seis meses de la infección. Los animales que desarrollaron síntomas similares al SIDA o SIDA desarrollado y murieron por la semana 24 de la infección, se clasificaron como progresores rápidos y todos los otros animales fueron clasificados como progresores típicos. Uno de los primeros cambios observables que ocurren en el compartimiento de linfocitos B después de las infecciones por VIH y SIV es un marcado decremento en los números de linfocitos B totales, pero no está claro cuáles subconjuntos específicos de linfocitos B son eliminados. Se encontró que tan pronto como dos semanas después de la infección por SIV, los linfocitos B totales de sangre periférica fueron severamente reducidos, sin importar la velocidad del progreso de la enfermedad. Un rebote en los números de linfocitos B ocurrió en la semana doce de la infección tanto en progresores rápidos como típicos, pero los números de linfocitos B permanecieron significativamente diferentes desde los niveles pre-infección (P<0.0001) . Los linfocitos B de memoria en general fueron reducidos después de la infección por SIV con un decremento significativo en el porcentaje y números de linfocitos B de memoria activados. Para la semana 12 post-infección, los progresores rápidos habían perdido 82% de sus linfocitos B de memoria activados, mientras que los progresores típicos habían perdido sólo el 23%. En contraste con los progresores rápidos, las proporciones de linfocitos B de memoria activados regresaron a niveles pre-infección por la semana 12 de la infección en los progresores típicos. Este contraste llamativo en el grado de disminución de la memoria activada entre los progresores rápidos y típicos condujo la investigación de si la disminución de los linfocitos B de memoria activados tiene algún significado para el progreso de la enfermedad y la patogénesis de SIV.
La disminución de linfocitos B de memoria activados es un pronosticador temprano del progreso rápido de la enfermedad: La carga viral inicial (12 semanas postinfección) ha mostrado ser un buen pronosticador del resultado clínico de la infección por SIV. La asociación entre el progreso rápido de la enfermedad y la carga viral ha sido analizada de manera interesante, tanto los progresores rápidos como típicos presentaron cargas virales máximas (semana 2 post-infección) (P=0.8); la carga viral inicial en los progresores rápidos fue sin embargo logarítmicamente mayor que en los progresores típicos P<0.0001). Dado que estas diferencias se observaron en proporciones de linfocitos B de memoria activados tan pronto como a las 2 semanas post-infección, se supone que la disminución de linfocitos B de memoria activados podría ser un pronosticador mucho más temprano del progreso rápido de la enfermedad. Los linfocitos T CD4+ de intestino y de memoria central de sangre (CD28+, CD95+, TCM) también han sido sugeridos como marcadores del progreso de la enfermedad en la infección por SIV, de modo que se formaron previamente comparaciones de todos estos marcadores para evaluar el valor predictivo de cada uno. Dos semanas después de la infección por SIV, los progresores rápidos tuvieron proporciones significativamente menores de linfocitos B de memoria activados, comparados con los progresores típicos y los linfocitos B de memoria activados fueron el único subconjunto de células cuya distribución fue significativamente diferente (P<0.001) entre los progresores rápidos y típicos. Para las 12 semanas postinfección, los linfocitos B de memoria activados fueron eliminados todavía más en los progresores rápidos (P<0.0001), y emergieron diferencias significativas entre progresores rápidos y típicos, con respecto a las proporciones de TCM y linfocitos T CD4+ (P<0.01) (Figura 3B, panel inferior) . Para confirmar adicionalmente la utilidad de la disminución a las 2 semanas de linfocitos B de memoria activados como un marcador temprano del progreso de la enfermedad, se llevaron a cabo análisis de correlación de la carga viral inicial (semana 12 post-infección con SIV) versus los porcentajes a la semana 2 y semana 12 de linfocitos B de memoria activados, linfocitos T CD4+ de intestino y células TCM. Mientras que los linfocitos B de memoria activados a la semana 2 y semana 12 fueron inversamente correlacionados con cargas virales iniciales, solamente los porcentajes de CD4+ de intestino a la semana 12 correlacionaron con la viremia inicial, y las TCM no mostraron alguna correlación con la viremia inicial. La pérdida de linfocitos B de memoria activados es por tanto un pronosticador reciente del progreso rápido de la enfermedad en macacos rhesus (RM) , con mejor valor predictivo temprano que la carga viral máxima, TCM y linfocitos T CD4+ de intestino.
La disminución de linfocitos B de memoria activados en la infección por SIV de progreso rápido, afecta la respuesta inmune humoral específica de SIV y la resistencia a otras infecciones distintas a SIV: Se demostró que RM con infección por SIV que progresa rápidamente, tienen bajas respuestas de anticuerpos como una consecuencia de la destrucción aguda del compartimiento de linfocitos B. Las infecciones oportunisticas y antigenos no relacionados a SIV son una causa significativa de mortalidad en animales infectados con SIV. La pérdida de linfocitos B de memoria activados podría tener consecuencias importantes para la respuesta inmune humoral de animales que progresan rápidamente a SIV y antígenos no SIV. De ese modo, los títulos de suero de anticuerpos que se unen a SIV de manera envolvente fueron medidos tanto en los progresores rápidos como típicos; se encontró que de los 9 progresores rápidos evaluados, solamente 2 presentaron una respuesta de anticuerpo envolvente modesta por la semana 12 y solamente 1 de los animales tenía títulos de anticuerpo sostenido por la semana 20. Los 7 progresores rápidos restantes tuvieron títulos de anticuerpo envolvente SIV no detectables a través de la semana 20 de la infección. Los progresores típicos por otra parte desarrollaron fuertes respuestas de anticuerpo envolvente por las 12 semanas post-infección, con incluso títulos más altos por la semana 20.
Las infecciones oportunisticas bacterianas son una causa significativa de morbilidad en animales infectados con SIV y los agentes causales de estas infecciones son usualmente flagelados. Los títulos de anticuerpo en suero para flagelina (Clic aislada de Salmonella typhimurium) se midieron como un medio para evaluar el efecto de la pérdida de linfocitos B de memoria activados en la inmunidad humoral pre-existente . A pesar del inicio con títulos de anticuerpos anti-FliC comparables, los progresores rápidos tuvieron títulos significativamente menores (P=0.001) por la semana 20 post-infección, comparados con los progresores típicos en los cuales los títulos no fueron cambiados (P=0.9) (Figura 5C) . Los datos de infección clínica se analizaron para ambos grupos durante un periodo de 6 meses después de la infección inicial por SIV y se encontró que una amplia variedad de otras infecciones ocurrieron en los animales después de la infección por SIV. Estas incluían infecciones bacterianas {Campylobacter, Shigella , E. coli enteropatogénica) , parasitarias (Trichomonas, gusanos tricocéfalos , Giardia) y levadura (Candida) . Los progresores rápidos sucumbieron a estas infecciones tan pronto como en 1 mes post-infección y por los tres meses post-infección >50% de los progresores rápidos fueron infectados, comparados con <10% de los progresores típicos. Esta velocidad de infección en los progresores rápidos fue sostenida durante todo el periodo de 6 meses.
El bloqueo in vitro de PD-1 disminuye la apoptosis regulada por Fas, y la ligación de PD-1 induce apoptosis de linfocitos B de memoria activados : El PD-1 se expresa principalmente en linfocitos B de memoria de macacos rhesus. La expresión de PD-1 fue evaluada en todos los subconjuntos de linfocitos B con más detalle antes y después de la infección por SIV, y se encontró que una proporción mayor de todos los 3 subconjuntos de linfocitos B de memoria expresó mayores cantidades (intensidad media de fluorescencia MFI) de PD-1 comparado con linfocitos B que no habían sido sometidos a tratamiento (P<0.001). Los linfocitos de memoria activados no sólo expresaron las cantidades más altas de PD-1, sino también tuvieron la proporción más alta de células PD-1+, comparadas con otros subconjuntos (P<0.001). Después de la infección por SIV, independientemente del estado del progreso de la enfermedad, hubo una disminución preferencial de linfocitos B de memoria PD-1+. Esto elevó la posibilidad de que el PD-1 juega un papel en la disminución de linfocitos B de memoria activados.
Los linfocitos B de memoria en humanos infectados por VIH son preparados para sufrir apoptosis espontánea y apoptosis inducida por el receptor de la muerte de manera notable a través de la vía Fas-FasL, pero existe poca información acerca del papel que juega la vía Fas-FasL en la apopotosis de linfocitos B durante la infección por SIV. Con la finalidad de determinar la susceptibilidad de los linfocitos B de memoria activados para la apoptosis regulada por Fas, e identificar un posible papel del PD-1 en la disminución de linfocitos B de memoria activados, se cultivaron PBMC de 7 animales infectados por SIV con y sin sFasL en combinación con bloqueo de PD-1 y se analizó la expresión de la Anexina-V sobre los linfocitos B de memoria activados después de 24 horas de cultivo. En los 6 animales se observó un aumento significativo de apoptosis con la adición de sFasL a los cultivos, y en 4 animales se observó una disminución en la apoptosis regulada por FasL después del bloqueo de PD-1, indicando que PD-1 podría contribuir a la apoptosis de linfocitos B de memoria activados .
Para demostrar adxcxonalmente el papel de PD-1 en la apoptosis de linfocitos B de memoria activados, la linea celular de hematoma humano, Huh-7.5 transfectada con PD-L1 (Huh-7.5. A2. PD-L1 ) fue usada como una fuente de ligando para los linfocitos B de memoria activados que expresan PD-1. La expresión de PD-L1 verificada por citometria de flujo no mostró expresión de PD-L1 en ls células Huh-7.5 no transíectadas (control) comparado con >90% de expresión de PD-L1 en las células Huh-7.5. A2. PD-L1. Ocurrió una velocidad incrementada de apoptosis en los linfocitos B de memoria activados, cultivados en presencia de PD-L1, comparado con los pozos de control, en 5 de 7 animales probados. En un animal (4) se observó una velocidad similar de apoptosis con o sin PD-L1, y en el otro animal (3) la velocidad de apoptosis espontánea fue >30% y la adición de PD-L1 no modificó significativamente la apoptosis. De ese modo la señalización de PD-1 durante la infección por SIv juega un papel en la apoptosis de linfocitos B de memoria activados.
El bloqueo de la interacción PD-1-PD-L1 mostró aumentar la capacidad de linfocitos T CD8+ específicos de VIH para proliferar y sobrevivir. Por ende, el efecto del bloqueo de PD-1 in vitro sobre la apoptosis de linfocitos B de memoria activados, regulada por Fas y espontánea. El efecto del bloqueo in vitro fue evaluado sobre la capacidad de los linfocitos B de memoria de animales infectados con SIV, para sobrevivir, proliferar en respuesta a estimulación policlonal, y diferenciarse en célula que secretan anticuerpos (ASC) en un ensayo ELISpot de linfocitos B de memoria. El bloqueo resultó en una apoptosis de linfocitos B de memoria activados, regulada por Fas ligeramente disminuida, pero no tuvo un efecto sobre la apoptosis espontánea. Las células estimuladas en la prsencia del anticuerpo de bloqueo de PD-1 proliferaron mejor y produjeron mayores cantidades de ASC contra IgM e IgG totales, pero también produjeron mancias especificas a envoltura .
Los linfocitos B de memoria activados de monos rhesus tienen mayor expresión de BAFF-R, que se disminuye adicionalmente por infección con SIV: El factor de activación de linfocitos B perteneciente a la familia TNF, BAFF (también conocido como B-lys) es un regulador importante de la homeostasis de linfocitos B (21), y los linfocitos B CD21" en macacos cinomólogos mostraron expresar menor expresión de uno de sus receptores, BAFF-R. los linfocitos B CO21üa^° de pacientes virémicos con VIH también mostraron expresar menores niveles de BAFF-R. Se encontró que los linfocitos B de memoria activados y de tejido expresaron los niveles ás bajos de BAFF-R, comparados con linfocitos B de memoria en reposo y los que no habían sido sometidos a tratamiento. La expresión adicionalmente disminuyó 2 semanas post-infección pero de manera interesante se restableció por la semana 12. De ese modo, la expresión baja de BAFF-R puede ser un factor que contribuye en la disminución de linfocitos B de memoria activados .
El bloqueo de PD-1 in vitro aumenta la proliferación de linfocitos B de memoria y producción de anticuerpos : Se investigó si la presencia de PD-1 en linfocitos B de memoria podría afectar su capacidad para proliferar y diferenciarse en células que secretan anticuerpos (ASC) . Se diseñó un ensayo in vítro ELISpot para rastrear linfocitos B de memoria que producen IgM, IgG y SIV gpl30, basándose en los ensayos que han sido descritos. Siguiendo la estimulación policlonal, hubo una umento significativo en ASC IgM (P<0.05) e IgG (P<0.01) tanto en infección temprana (12 semanas, n=3) y crónica tardía (> 1 año, n=2) . Las células estimuladas en prsencia de anticuerpo de bloqueo ot-PD-1 generalmente proliferaron mejor y produjeron un mayor número de manchas que las células estimluladas sin anticuerpo de bloqueo. Las ASC específicas de gp-130 fueron sin embargo detectables sólo en los monos crónicos tardíos y como con las ASC IgM e IgG, la estimulación policlonal resultó en un número significativamente mayor de ASC específicas de gpl30, y el bloqueo de PD-1 además aumentó los números de ASC.
El bloqueo in vivo de PD-1 resulta en títulos de anticuerpo de unión env de SIV con mayor avidez, y títulos de anticuerpo neutralizante incrementados : El bloqueo in vivo de PD-1 en macacos rhesus con infección por SIV crónica resultó en títulos incrementados de anticuerpos env de SIV. Se midió la avidez de los anticuerpos env después del bloqueo de PD-1 in vivo. Se encontró que no sólo se aumentaron los títulos de los anticuerpos env, sino la avidez de los anticuerpos de unión también se aumentó en los animales tratados. Este no fue el caso en el animal tratado con anticuerpo control, en el cual la avidez disminuyó después del tratamiento.
La actividad neutralizante también se evaluó en los animales tratados con PD-1 y se encontró que a pesar de la neutralización contra un aislado de SIV primario no fue significativamente diferente, la neutralización contra una cepa de SIV TCLA fue significativamente diferente en los animales tratados, con 2 de los animales mostrando un aumento de 3 a 6 veces en los títulos de anticuerpo neutralizante .
Distribución de subconjuntos de linfocitos B en mangabeyes grises: Los mangabeyes grises, uno de los hospedantes naturales de SIV, no desarrolla SIDa a pesar de los títulos virales altamente persistentes, comparables con aquellos de los macacos rhesus. Esto hace a los SM un modelo de 'control' interesante para estudios de infección por SIV patogénica en RM. Se estudió ua cohorte de mangabeyes grises infectados con SIV (n=10) y no infectados (n=8). Los SM sanos tuvieron mucho menor número de linfocitos B totales circulando que los RM sanos y a diferencia de los RM, no se obserrvó una disminución en el porcentaje de linfocitos B totales circulantes después de la infección por SIV en SM. Los subconjuntos de linfocitos B idénticos fueron identificados en SM, pero la distribución de subconjuntos en SM fue muy diferente de la de RM. Los linfocitos B que no habían sido sometidos a tratamiento constituyeron el principal subconjunto de linfocitos B de sangre periférica (>40%), y la mayoría del subconjunto de linfocitos B de memoria fueron los linfocitos B de memoria similares a tejido y no los linfocitos B de memoria activados, como en RM. Como los RM, <10% de linfocitos B de memoria circulantes en los SM fueron linfocitos B de memoria inactivos, pero comparado con los RM, el porcentaje de linfocitos B de memoria activados fue significativamente menor en los SM. Después de la infección por SIV, no hubo disminución de los linfocitos B de memoria activados; de hecho hubo un ligero incremento en el porcentaje de los linfocitos B de memoria activados e inactivos, aunque estos cambios no alcanzaron significado estadístico. La expresión de PD-1 sobre subconjuntos de linfocitos B de los SM, así como en los RM, fue el más alto en los linfocitos B de memoria activados, y a diferencia de los RM, la expresión de PD-1 fue igualmente alta en los linfocitos B de memoria de tejido. Otra diferencia significativa entre RM y SM fue que a diferencia de los RM, las proporciones de células que expresan PD-1 se elevó después de la infección por SIV en los SM.
Ejemplo 30: Método para determinar la eficacia de un antagonista de PD-1.
La eficacia de un antagonista de PD-1 para tratar a un sujeto se puede determinar midiendo los linfocitos B, tal coo midiendo la presencia de anticuerpos neutraliantes , la proliferación de linfocitos B de memoria, linfocitos B que no han sido sometidos a tratamiento, y/o linfocitos T CD28+. Generalmente, un aumento estadísticamente significativo en los anticuerpos neutralizantes, la proliferación de linfocitos B de memoria, linfocitos B que no han sido sometidos a tratamiento, y/o midiendo los linfocitos T CD28+, indica que el antagonista de PD-1 es efectivo para tratar al sujeto. Los linfocitos B pueden medirse, por ejemplo, como se describe en las patentes de los Estados Unidos Nos. 7,378,276 y/o 6,376,459, las cuales se incorporan en la presente como referencia. Los antagonistas de PD-1 incluyen anticuerpos que se unen específicamente a PD-L1 y PD-L2, véase por ejemplo la patente de Estados Unidos no. 7,432,059.
La determinación de la eficacia de un antagonista de PD-1 involucra obtener una muestra biológica del sujeto. Una muestra biológica, tal como una muestra de sangre o unamuestra de células mononucleares de sangre periférica, se toma de un sujeto humano, tal como un sujeto con una infección persistente. La presencia de linfocitos B de memoria proliferantes, linfocitos B que no han sido sometidos a tratamiento, y/o linfocitos T CD28+, se mide usando análisis FACS. La presencia de anticuerpos neutralizantes puede medirse, usando por ejemplo ELISA. Los linfocitos B de memoria proliferantes, linfocitos B que no han sido sometidos a tratamiento y/o linfocitos CD28+, y/o la presencia de anticuerpos neutralizantes, puede compararse con un control, tal como en una muestra de un sujeto obtenida antes del tratamiento con el antagonista de PD-1. Se efectúa una prueba estadística. Un aumento estadísticamente significativo en los linfocitos B de memoria, y/o anticuerpos neutralilzantes y/o linfocitos T CD28+ en la muestra de sangre del sujeto después de la administración al sujeto, en comparación con el control, demuestra que el antagonista de PD-1 es efectivo para tratar al sujeto. Sin embargo, los linfocitos B que no han sido sometidos a tratamiento no se ven afectados por la administración del antagonista de PD-1.
Se tratan y se evalúan diversos tipos de sujetos. Estos sujetos incluyen un sujeto con una infección por VIH, un sujeto con infección por virus de leucemia murina xenotrópica-virus relacionado (XMRV) , y un sujeto con una infección por JC poliomavirus . El antagonista de PD-1 puede administrarse con terapia anti-retroviral, tal como para tratar VIH y XMRV. El sujeto adecuado también incluye aquellos con tumores, tal como un tumor sólido o un linfoma o leucemia. A este sujeto también se le puede administrar un agente quimioterapéutico y/o un antigeno tumoral.
Será evidente que los detalles precisos de los métodos o composiciones descritos pueden variarse o modificarse sin apartarse del espíritu de la invención descrita. Reivindicamos que todas aquellas modificaciones y variaciones quedan dentro del alcance y espíritu de las reivindicaciones siguientes.

Claims (52)

REIVINDICACIONES
1. Un método para determinar la dosis de un antagonista de PD-1 que es útil para tratar al sujeto, que comprende: administrar al sujeto una primera dosis de un antagonista de PD-1; determinar la proliferación de linfocitos B de memoria en una primera muestra del sujeto; en donde un aumento en la proliferación de los linfocitos B de memoria de la primera muestra comparada con un control indica que la primera dosis del antagonista de PD-1 es útil para tratar al sujeto, y en donde una ausencia de alteración significativa en la proliferación de linfocitos B de memoria, comparada con un control, indica que la primera dosis del antagonista de PD-1 no es suficiente para tratar al suj eto .
2. El método de la reivindicación 1, que además comprende administrar al sujeto una segunda dosis de un antagonista de PD-1; determinar la proliferación de linfocitos B de memoria en una segunda muestra del sujeto; en donde un aumento en la proliferación de linfocitos B de memoria de la segunda muestra, comparada con un control, demuestra que la segunda dosis del antagonista de PD-1 es útil para tratar al sujeto, y en donde una ausencia de alteración significativa en la proliferación de linfocitos B de memoria, comparada con un control, indica que la segunda dosis del antagonista de PD-1 no es suficiente para tratar al sujeto.
3. El método de la reivindicación 2, en donde existe una ausencia de alteración significativa en la proliferación de linfocitos B de memoria en la primera muestra comparada con el control, y en donde la segunda dosis es más alta que la primera dosis.
4. El método de la reivindicación 2, en donde existe un aumento en la proliferación de linfocitos B de memoria de la primera muestra comparada con un control, y en donde la segunda dosis es menor que la primera dosis.
5. Un método para determinar la eficacia de un antagonista de PD-1 en un sujeto al que se le administró el antagonista de PD-1, que comprende: medir la proliferación de linfocitos B de memoria en una primera muestra del sujeto al que se le administró el antagonista de PD-1; en donde un aumento en la proliferación de los linfocitos B de memoria de la muestra comparada con un control indica que el antagonista de PD-1 es eficaz para tratar al sujeto.
6. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que además comprende medir los linfocitos B que no han sido sometidos a tratamiento en una muestra del sujeto.
7. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la medición de los linfocitos B de memoria proliferantes comprende medir la expresión de Ki67.
8. El método de la reivindicación 7, en donde la medición de la proliferación de los linfocitos B de memoria comprende el uso de un anticuerpo que se une específicamente a Ki67.
9. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la medición de la proliferación de linfocitos B de memoria comprende medir la incorporación de bromodeoxiuridina .
10. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la medición de la proliferación de linfocitos B de memoria comprende el uso de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) .
11. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde el sujeto tiene una infección viral.
12. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde el sujeto tiene una infección viral persistente.
13. El método según cualquiera de las reivindicaciones 11-12, en donde al sujeto se le administra un antigeno viral.
14. El método según cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en donde la infección viral es una infección con un virus de la hepatitis, un virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) , un virus linfotrópico T humano (HTLV) , un virus del herpes, un virus de Epstein-Barr, o un virus del papiloma humano.
15. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde el sujeto tiene un tumor .
16. El método de la reivindicación 15, en donde al sujeto se le administra un antigeno del tumor .
17. El método de la reivindicación 16, en donde el antigeno asociado con el tumor es PRAME, WT1, Survivina, ciclina D, ciclina E, proteinasa 3 y su péptido PR1, neutrófilo elastasa, catepsina G, MAGE, MART, tirosinasa, GP100, NY-Eso-1, herceptina, antigeno carcinoembriónico (CEA) , o antigeno especifico de la próstata (PSA) .
18. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde el sujeto tiene una infección por hongos o una infección bacteriana.
19. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en donde el antagonista de PD-1 es un anticuerpo que se une de manera especifica a PD-1, un anticuerpo que se une de manera especifica al Ligando 1 del Polipéptido de Muerte Programada (PD-Ll), un anticuerpo que se une de manera especifica al Ligando 2 del Polipéptido de Muerte Programada (PD-L2 ) , un ARNi anti-PD-L2 inhibitorio pequeño, un ARN antisentido anti-PD-1, un ARN antisentido anti-PD-Ll, una proteina PD-L1 dominante negativa, una proteina PD-L2 dominante negativa, un inhibidor de PD-1 de molécula pequeña, o combinaciones de los mismos.
20. El método de la reivindicación 19, en donde el anticuerpo que se une de manera especifica a PD-1 es (1) un anticuerpo monoclonal o un fragmento funcional del mismo, (2) un anticuerpo humanizado o un fragmento funcional del mismo, o (3) una proteina de fusión de inmunoglobulina .
21. El método de la reivindicación 19, en donde el anticuerpo que se une a PD-L1 es (1) un anticuerpo monoclonal o un fragmento funcional del mismo, (2) un anticuerpo humanizado o un fragmento funcional del mismo, o (3) una proteina de fusión de inmunoglobulina .
22. El método de la reivindicación 19, en donde el anticuerpo que se une específicamente a PD-L2 es (1) un anticuerpo monoclonal o un fragmento funcional del mismo, (2) un anticuerpo humanizado o un fragmento funcional del mismo, o (3) una proteína de fusión de inmunoglobulina.
23. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-22, en donde el control es una muestra de un sujeto obtenida antes de administrar la primera concentración del antagonista de PD-1 o un valor estándar.
24. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-23, que además comprende administrar una dosis que ha sido determinada para aumentar la proliferación de linfocitos B de memoria en el sujeto.
25. Un método para inducir una respuesta inmunitaria a un antígeno de interés en un receptor mamífero, que comprende: administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de PD-1; y medir la proliferación de linfocitos B de memoria en una muestra del sujeto, produciendo de ese modi una respuesta inmune al antigeno de interés en el receptor mamífero.
26. El método de la reivindicación 25, en donde el sujeto tiene una infección viral.
27. El método de la reivindicación 26, en donde el sujeto tiene una infección viral persistente.
28. El método según cualquiera de las reivindicaciones 26-27, en donde el antígeno de interés es un antígeno viral.
29. El método según cualquiera de las reivindicaciones 26-28, en donde la infección viral es una infección con un virus de la hepatitis, un virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) , un virus linfotrópico T humano (HTLV) , un virus del herpes, un virus de Epstein-Barr, o un virus del papiloma humano.
30. El método de la reivindicación 28, en donde la infección viral es una infección por hepatitis viral, y en donde el antígeno viral es hepatitis gp33.
31. El método según las reivindicaciones 26-28, en donde la infección viral es una infección viral de la inmunodeficiencia humana (VIH) .
32. El método de la reivindicación 28, en donde la infección viral es una infección viral de la inmunodeficiencia humana (VIH) y en donde el antigeno de interés es gpl20.
33. El método de la reivindicación 25, en donde el receptor tiene un tumor.
34. El método de la reivindicación 33, en donde el antigeno de interés es un antigeno del tumor.
35. El método de la reivindicación 34, en donde el antigeno de interés es PRAME, WT1, Survivina, ciclina D, ciclina E, proteinasa 3 y su péptido PR1, neutrófilo elastasa, catepsina G, MAGE, MART, tirosinasa, GP100, NY-Eso-1, herceptina, antigeno carcinoembriónico (CEA) , o antigeno especifico de la próstata (PSA) .
36. El método de la reivindicación 25, en donde el patógeno es un hongo, y el antigeno de interés es un antigeno micótico.
37. El método de la reivindicación 25, en donde el patógeno es una bacteria, y el antigeno de interés es un antigeno bacteriano.
38. El método según cualquiera de las reivindicaciones 25-37, en donde el antagonista de PD-1 es un anticuerpo que se une de manera especifica a PD-1, un anticuerpo que se une de manera especifica al Ligando 1 del Polipéptido de Muerte Programada (PD- Ll), un anticuerpo que se une de manera especifica al Ligando 2 del Polipéptido de Muerte Programada (PD-L2), un ARNi anti-PD-1 inhibidor pequeño, un ARN anti-PD-L1 inhibidor pequeño, un ARNi anti-PD-L2 inhibidor pequeño, un ARN antisentido anti-PD-1, un ARN antisentido anti-PD-Ll, un ARN antisentido anti-PD-L2, una proteina PD-1 negativa dominante, una proteina PD-Ll negativa dominante, una proteina PD-L2 negativa dominante, un inhibidor de molécula pequeña de PD-1, o combinaciones de los mismos.
39. El método de la reivindicación 38, en donde el anticuerpo que se une de manera especifica a PD-1 es (1) un anticuerpo monoclonal o un fragmento funcional del mismo, (2) un anticuerpo humanizado o un fragmento funcional del mismo, o (3) una proteina de fusión de inmunoglobulina .
40. El método de la reivindicación 38, en donde el anticuerpo que se une a PD-L1 es (1) un anticuerpo monoclonal o un fragmento funcional del mismo, (2) un anticuerpo humanizado o un fragmento funcional del mismo, o (3) una proteina de fusión de inmunoglobulina .
41. El método de la reivindicación 38, en donde el anticuerpo que se une a PD-L2 es (1) un anticuerpo monoclonal o un fragmento funcional del mismo, (2) un anticuerpo humanizado o un fragmento funcional del mismo, o (3) una proteina de fusión de inmunoglobulina .
42. El método según cualquiera de las reivindicaciones 25-41, que además comprende medir las células B que no han sido sometidas a tratamiento en una muestra del sujeto.
43. El método según cualquiera de las reivindicaciones 25-42, en donde la medición de los linfocitos B de memoria proliferantes comprende medir la expresión de Ki67.
44. El método de la reivindicación 43, en donde la medición de los linfocitos B de memoria proliferantes comprende el uso de un anticuerpo que se une específicamente a Ki67.
45. Él método según cualquiera de las reivindicaciones 25-44, en donde la medición de la proliferación de linfocitos B de memoria comprende medir la incorporación de bromodesoxiuridina.
46. El método según cualquiera de las reivindicaciones 25-45, en donde la medición de la proliferación de linfocitos B de memoria comprende el uso de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).
47. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-46, que además comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto adicional.
48. El método de la reivindicación 47, en donde dicho segundo compuesto es un compuesto antiviral, un compuesto antibacteriano, un compuesto antimicótico, un compuesto antiparasitario, un compuesto anti-inflamatorio, o un analgésico.
49. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-48, en donde el sujeto está inmunocomprometido .
50. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-49, en donde el sujeto es asintomático .
51. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-50, en donde el sujeto es humano.
52. Un método para seleccionar un antagonista de PD-1 de uso, que comprende: poner en contacto una población de células que comprende linfocitos B de memoria con un agente; y detectar la proliferación de linfocitos B de memoria y/o la diferenciación de linfocitos B de memoria en las células secretoras de anticuerpos, en donde un aumento en la proliferación de linfocitos B de memoria y/o un aumento en la diferenciación de linfocitos B de memoria dentro de las células secretoras de anticuerpos indica que el agente es un antagonista de PD-1.
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