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MX2011004802A - Bacilos de subtilisina que comprenden una o mas mutaciones combinables. - Google Patents

Bacilos de subtilisina que comprenden una o mas mutaciones combinables.

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MX2011004802A
MX2011004802A MX2011004802A MX2011004802A MX2011004802A MX 2011004802 A MX2011004802 A MX 2011004802A MX 2011004802 A MX2011004802 A MX 2011004802A MX 2011004802 A MX2011004802 A MX 2011004802A MX 2011004802 A MX2011004802 A MX 2011004802A
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MX
Mexico
Prior art keywords
subtilisin
variant
detergent
positions
cleaning
Prior art date
Application number
MX2011004802A
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English (en)
Inventor
David A Estell
James T Kellis Jr
Luis G Cascao-Pereira
Original Assignee
Danisco Inc
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Filing date
Publication date
Application filed by Danisco Inc filed Critical Danisco Inc
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Abstract

La presente invención proporciona variantes de proteasa producidas por ingeniería. En particular, las variantes de proteasa comprenden mutaciones combinables en posiciones de superficie seleccionadas que afectan la carga e/o hidrofobicidad de la enzima para aumentar por lo menos una propiedad deseada de la enzima variante resultante en una aplicación seleccionada. También se proporcionan composiciones que comprenden las variantes de proteasa y métodos para usar las mismas.

Description

BACILOS DE SUBTILISINA QUE COMPRENDEN UNA O MAS MUTACIONES COMBINABLES Campo de la Invención La presente invención proporciona variantes de proteasa producidas por ingeniería. En particular, las variantes de proteasa comprenden-.ÍMJ.taciones combinables en posiciones de superficies seleccionadas que afectan la carga e/o hidrofobicidad de la enzima para aumentar por lo menos una propiedad deseada de la enzima variante resultante en una aplicación seleccionada. También se proporcionan composiciones que comprenden las variantes de proteasa y métodos para usar las mismas.
Antecedentes de la Invención Las serina proteasas son un grupo de carbonil hidrolasas que comprenden una clase diversa de enzimas que tienen una amplia gama de especificidades y funciones biológicas. La mayoría de la investigación se ha conducido en las subtilisinas , debido en gran medida a su utilidad en aplicaciones de limpieza y alimentación. Se ha enfocado trabajo adicional en las condiciones ambientales adversas (por ejemplo, exposición a agentes oxidantes, agentes quelantes, extremos de temperatura y/o pH) que pueden disminuir la funcionalidad de estas enzimas en varias REF. : 219439 aplicaciones. No obstante, permanece una necesidad en la técnica por sistemas enzimáticos que sean capaces de resistir estas condiciones adversas y retengan o tengan actividad mejorada sobre aquellos actualmente conocidos en la técnica.
Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona variantes de proteasa producidas por ingeniería. En particular, las variantes de proteasa comprenden mutaciones combinables en posiciones de superficie seleccionadas que afectan la carga e/o hidrofobicidad de la enzima para aumentar por lo menos una propiedad deseada de la enzima variante resultante en una aplicación seleccionada. También se proporcionan composiciones que comprenden las variantes de proteasa y métodos para usar las mismas.
En una modalidad, la variante de proteasa es la forma madura de una variante de subtilisina aislada de una subtilisina de Bacillus que tiene actividad proteolítica y comprende una sustitución de dos o más sustituciones seleccionadas de las posiciones 24, 45, 101, 109, 118, 213 y 217, en donde las posiciones están numeradas por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de B. amyloliquefaciens expuesta como SEQ ID N0:1.
En otra modalidad, la variante de proteasa es la forma madura de una variante de subtilisina aislada de una subtilisina de Bacillus que tiene actividad proteolítica y comprende una sustitución de dos o más posiciones seleccionadas de las posiciones 24, 45, 101, 109, 118, 213 y 217, en donde las posiciones están numeradas por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de B . amyloliquefaciens expuesta como SEQ ID NO: 1, y que tiene un índice de desempeño de nivel de expresión de proteínas (TCA PI) y/o un índice de desempeño de la actividad de remoción de manchas (BMI PI) que es mayor o igual a 0.5.
En otra modalidad, la variante de proteasa es la forma madura de una variante de subtilisina aislada de subtilisina GG36 de Bacillus que tiene actividad proteolítica y comprende dos o más sustituciones en de dos o más posiciones seleccionadas de S24Q, S24E, S24L, S24R, R45Q, R45E, R45L, S101Q, S101E, S101L, S101R, Q109E, Q109L, Q109R, G118Q, G118E, G118L, G118R, T213Q, T213L, T213R, T213E, L217Q, y L217E, en donde las posiciones están numeradas por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de B. amyloliquefaciens expuesta como SEQ ID N0:1.
En otra modalidad, la variante de proteasa es la forma madura de una variante de subtilisina aislada de subtilisina GG36 de Bacillus que tiene actividad proteolítica y comprende dos o más sustituciones en dos o más posiciones seleccionadas de: S24Q, S24E, S24L, S24R, R45Q, R45E, R45L, S101Q, S101E, S101L, S101R, Q109E, Q109L, Q109 R, G118Q, G118E, G118L, G118R, T213Q, T213L, T213R, T213E, L217Q, y L217E, en donde las posiciones están numeradas por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de B. amyloliquefaciens expuesta como SEQ ID NO:l, y que tiene un índice de desempeño de nivel de expresión de proteína relativo (TCA PI) y/o un índice de desempeño de la actividad de remoción de manchas (BMI PI) que es mayor o igual a 0.5.
En otra modalidad, la variante de proteasa es la forma madura de una variante de subtilisina aislada de la subtilisina FNA de Bacillus que tiene actividad proteolítica y comprende dos o más sustituciones en dos o más posiciones seleccionadas de S24Q, S24E, S24L, S24R, A45Q, A45E, A45L, A45R, S101Q, S101E, S101L, S101R, N109Q, N109E, N109L, N109R, K213Q, K213E, K213L, K213R, L217Q, y L217E, en donde las posiciones están numeradas por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de B. amyloliquefaciens expuesta como SEQ ID NO: 1.
En otra modalidad, la variante de proteasa es la forma madura de una variante de subtilisina aislada de la subtilisina FNA de Bacillus que tiene actividad proteolítica y comprende dos o más sustituciones en dos o más posiciones seleccionadas de S24Q, S24E, S24L, S24R, A45Q, A45E, A45L, A45R, S101Q, S101E, S101L, S101R, N109Q, N109E, N109L, N109R, K213Q, K213E, K213L, K213R, L217Q, y L217E, en donde las posiciones están numeradas por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de B. amyloliquefaciens expuesta como SEQ ID NO: 1, y que tiene un índice de desempeño de nivel de expresión de proteínas relativo (TCA PI) y/o un índice de desempeño de la actividad de remoción de manchas (BMI PI) que es mayor o igual a 0.5.
En otra modalidad, la variante de proteasa es la forma madura de una variante de subtilisina aislada de una subtilisina GG36 de Bacillus que tiene actividad proteolítica y comprende una combinación de sustituciones seleccionadas de S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q, R45Q-S101Q-G118Q-T213Q, S101Q-G1 18Q- T213Q, G118Q-T213Q, S24E-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q, S24E-R45E-S101Q-G118Q-T213Q, S24E-R45E-S101E-G118Q-T213Q, S24E-R45E-S101E-Q109E-G118Q-T213Q, S24E-R45E-S101E-Q109E- G118E-T213Q, S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213E, S24L-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q, S24L- R45L-S101Q-G118Q-T213Q, S24L-R45L-S101L-G118Q-T213Q, S24L- R45L-S 101L-Q109L-G118Q-T213Q, S24L-R45L-S101L-Q109L-G118L-T213Q, S24L-R45L-S101L-Q109L-G118L-T213L, S24R-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q, S24R-S101Q-G118Q-T213Q, S24R-S101R-G118Q-T213Q, S24R-S101R-Q109R-G118Q-T213Q, S24R-S101R-Q109R-G118R-T213Q, S24R-S101R-Q109R-G118R- T213R, S24E-S101R-Q109R-G118R-T213R, S24E-R45E-S101R-Q109R-G118R-T213R, S24E-R45E-S101E-Q109R-G118R-T213R, S24E-R45E-S101E-Q109E-G118R- T213R, S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213R, S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213E, S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q-L217Q, y S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q-L217E, en donde las posiciones están numeradas por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de B. amyloliquefaciens expuesta como SEQ ID N0:1 En otra modalidad, la variante de proteasa es la forma madura de una variante de subtilisina aislada de una subtilisina GG36 de Bacillus que tiene actividad proteolítica y comprende la sustitución T213Q, en donde la posición está numerada por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' B. amyloliquefaciens expuesta como SEQ ID NO:l.
En otra modalidad, la variante de proteasa es la forma madura de una variante de subtilisina aislada de una subtilisina FNA de Bacillus que tiene actividad proteolítica y una combinación de sustituciones seleccionadas de S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, N109Q-N118Q-K213Q, N118Q-K213Q, S24E-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S24E-A45E-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S24E-A45E-S101E-N109Q-N118Q-K213Q, S24E-A45E-S101E-N109E-N118Q-K213Q, S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213Q, S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E, S24L-A45Q-S101Q-N109Q- N118Q-K213Q, S24L-A45L-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S24L-A45L-S101L-N109Q-N118Q-K213Q, S24L-A45L-S101L-N109L-N118Q-K213Q, S24L-A45L-S101L-N109L-N118L-K213Q, S24L-A45L-S101L-N109L-N118L-K213L, S24R-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S24R-A45R-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S24R-A45R-S101R-N109Q-N118Q-K213Q, S24R-A45R-S101R-N109R-N118Q-K213Q, S24R-A45R-S101R-N109R-N118R-K213Q, S24R-A45R-S101R-N109R-N118R-K213R, S24E-A45R-S101R-N109R-N118R-K213R, S24E-A45E-S101R-N109R-N118R-K213R, S24E-A45E-S101E-N109R-N118R-K213R, S24E-A45E-S101E-N109E- N118R-K213R, S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213R, S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E, S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q-L217Q, y S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q- K213Q-L217E, en donde las posiciones corresponden a las posiciones de la subtilisina BPN' de SEQ ID NO : 1.
En otra modalidad, la variante de proteasa es la forma madura de una variante de subtilisina aislada de una subtilisina FNA de Bacillus que tiene actividad proteolítica y comprende la sustitución K213Q, en donde la posición está numerada por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de B. amyloliquefaciens expuesta como SEQ ID NO:l.
En otra modalidad, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica cualquiera de las variantes de proteasa descritas anteriormente.
En otra modalidad, la invención proporciona un vector de expresión que comprende un ácido nucleico aislado que codifica cualquiera de las variantes de proteasa descritas anteriormente.
En otra modalidad, la invención proporciona una célula hospedera que comprende un vector de expresión, el cual a su vez comprende un ácido nucleico aislado que codifica cualquiera de las variantes de proteasa descritas anteriormente .
En otra modalidad, la invención proporciona una composición de limpieza que comprende por lo menos una variante de proteasa que es la forma madura de una variante de subtilisina aislada de una subtilisina de Bacillus que tiene actividad proteolítica y que comprende una sustitución de dos o más posiciones seleccionadas de las posiciones 24, 45, 101, 109, 118, 213 y 217, en donde las posiciones están numeradas por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de B. amyloliquefaciens expuesta como SEQ ID N0:1. En algunas modalidades, la composición de limpieza es un detergente. En algunas modalidades, el detergente es un detergente para platos . En otras modalidades, el detergente es un detergente para ropa por ejemplo un detergente para ropa líquido o seco para trabajo pesado. En modalidades alternativas, la composición de limpieza comprende además por lo menos un agente estabilizante .
En otra modalidad, la composición de limpieza comprende por lo menos una variante de proteasa que es la forma madura de una variante de subtilisina aislada de una subtilisina de Bacillus que tiene actividad proteolítica y comprende una sustitución de dos o más posiciones seleccionadas de las posiciones 24, 45, 101, 109, 118, 213 y 217, en donde las posiciones están numeradas por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de De la subtilisina BPN' de B. amyloliquefaciens expuesta como SEQ ID NO: 1, y que tiene un índice de desempeño de nivel de expresión de proteína relativo (TCA PI) y/o un índice de desempeño de la actividad de remoción de manchas (BMI PI) que es mayor o igual a 0.5. En algunas modalidades, la composición de limpieza es un detergente. En algunas modalidades, el detergente es un detergente para platos. En otras modalidades, el detergente es un detergente para ropa por ejemplo detergente para ropa líquido o seco para trabajo pesado. En modalidades alternativas, la composición de limpieza comprende además por lo menos un agente estabilizante .
En otra modalidad, la composición de limpieza comprende por lo menos una variante de proteasa que es la forma madura de una variante de subtilisina aislada de una subtilisina GG36 de Bacillus que tiene actividad proteolítica y comprende dos o más sustituciones en dos o más posiciones seleccionadas de S24Q, S24E, S24L,S24R, R45Q, R45E, R45L, S101Q, S101E, S101L, S101R, Q109E, Q109L, Q109 R, G118Q, G118E, G118L, G118R, T213Q, T213L, T213R, T213E, L217Q, y L217E, en donde las posiciones están numeradas por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de B. amyloliquefaciens expuesta como SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, la composición de limpieza es un detergente. En algunas modalidades, el detergente es un detergente para platos. En otras modalidades, el detergente es un detergente para ropa por ejemplo detergente para ropa líquido o seco para trabajo pesado. En modalidades alternativas, la composición de limpieza comprende además por lo menos un agente estabilizante.
En otra modalidad, la composición de limpieza comprende por lo menos una variante de proteasa que es la forma madura de una variante de subtilisina aislada de una subtilisina GG36 de Bacillus que tiene actividad proteolítica y comprende dos o más sustituciones en dos o más posiciones seleccionadas de: S24Q, S24E, S24L,S24R, R45Q, R45E, R45L, S101Q, S101E, S101L, S101R, Q109E, Q109L, Q109 R, G118Q, G118E, G118L, G118R, T213Q, T213L, T213R, T213E, L217Q, y L217E, en donde las posiciones están numeradas por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de B. amyloliquefaciens expuesta como SEQ ID NO: 1, y que tiene un índice de desempeño de nivel de expresión de proteína relativo (TCA PI) y/o un índice de desempeño de la actividad de remoción de manchas (BMI PI) que es mayor o igual a 0.5. En algunas modalidades, la composición de limpieza es un detergente. En algunas modalidades, el detergente es un detergente para platos. En otras modalidades, el detergente es un detergente para ropa por ejemplo detergente para ropa líquido o seco para trabajo pesado. En modalidades alternativas, la composición de limpieza comprende además por lo menos un agente estabilizante .
En otra modalidad, la composición de limpieza comprende por lo menos una variante de proteasa que es la forma madura de una variante de subtilisina aislada de una subtilisina FNA de Bacillus que tiene actividad proteolítica y comprende dos o más sustituciones en dos o más posiciones seleccionadas de S24Q, S24E, S24L, S24R, A45Q, ?45?, A45L, A45R, S101Q, S101E, S101L, S101R, N109Q, N109E, N109L, N109R, K213Q, K213E, K213L, K213R, L217Q, y L217E, en donde las posiciones están numeradas por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de 23. a yloliquefaciens expuesta como SEQ ID NO:l, y que tiene un índice de desempeño de nivel de expresión de proteína relativo (TCA PI) y/o un índice de desempeño de la actividad de remoción de manchas (BMI PI) que es mayor o igual a 0.5. En algunas modalidades, la composición de limpieza es un detergente. En algunas modalidades, el detergente es un detergente para platos. En otras modalidades, el detergente es un detergente para ropa por ejemplo detergente para ropa líquido o seco para trabajo pesado. En modalidades alternativas, la composición de limpieza comprende además por lo menos un agente estabilizante.
En otra modalidad, la composición de limpieza comprende por lo menos una variante de proteasa que es la forma madura de una variante de subtilisina aislada de una subtilisina GG36 de Bacillus que tiene actividad proteolítica y comprende una combinación de sustituciones seleccionadas de S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q, R45Q-S101Q-G118Q-T213Q, S101Q-G1 18Q-T213Q, G118Q-T213Q, S24E-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q, S24E-R45E-S101Q-G118Q-T213Q, S24E-R45E-S 101E-G118Q-T213Q, S24E-R45E-S101E-Q109E-G118Q-T213Q, S24E-R45E-S101E-Q 109E-G118E-T213Q, S24E-R45E-S101E-Q 109E-G118E-T213E, S24L-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q, S24L-R45L-S101Q-G118Q-T213Q, S24L-R45L-S101L-G118Q-T213Q, S24L-R45L-S101L-Q109L-G118Q-T213Q, S24L-R45L-S101L-Q109L-G118L-T213Q, S24L6 -R45L-S101L-Q109L-G118L-T213L, S24R-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q, S24R-S101Q-G118Q-T213Q, S24R-S101R-G118Q-T213Q, S24R-S101R-Q109R-G118Q-T213Q, S24R-S101R-Q109R-G118R-T213Q, S24R-S101R-Q109R-G118R-T213R, S24E-S101R-Q109R-G118R-T213R, S24E-R45E-S101R-Q109R-G118R-T213R, S24E-R45E-S101E-Q109R-G118R-T213R, S24E-R45E-S101E-Q109E-G118R-T213R, S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213R, S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213E, S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q-L217Q, y S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q-L217E, en donde las posiciones están numeradas por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de B. amyloliquefaciens expuesta como SEQ ID N0:1. En algunas modalidades, la composición de limpieza es un detergente. En algunas modalidades, el detergente es un detergente para platos. En otras modalidades, el detergente es un detergente para ropa por ejemplo detergente para ropa líquido o seco para trabajo pesado. En modalidades alternativas, la composición de limpieza comprende además por lo menos un agente estabilizante.
En otra modalidad, la composición de limpieza comprende por lo menos una variante de proteasa que es la forma madura de una variante de subtilisina aislada de una subtilisina GG36 de Bacillus que tiene actividad proteolítica y comprende la sustitución T213Q, en donde la posición está numerada por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de B . amyloliquefaciens expuesta como SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, la composición de limpieza es un detergente. En algunas modalidades, el detergente es un detergente para platos. En otras modalidades, el detergente es un detergente para ropa por ejemplo detergente para ropa líquido o seco para trabajo pesado. En modalidades alternativas, la composición, de limpieza comprende además por lo menos un agente estabilizante.
En otra modalidad, la invención proporciona una composición e limpieza que comprende por lo menos una variante de proteasa que es la forma madura de una variante de subtilisina aislada de una subtilisina FNA de Bacillus que tiene actividad proteolítica y comprende una combinación de sustituciones seleccionadas de S24Q-A45Q- S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, N109Q-N118Q-K213Q, N118Q-K213Q, S24E-A45Q-S101Q-N109Q-Ñ118Q-K213Q, S24E-A45E- S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S24E-A45E-S101E-N109Q-N118Q-K213Q, S24E-A45E-S101E- N109E-N118Q-K213Q, S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213Q, S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E, S24L-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S24L-A45L-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S24L- A45L-S101L-N109Q-N118Q-K213Q, S24L-A45L-S101L-N109L-N118Q-K213Q, S24L-A45L-S101L-N109L-N118L-K213Q, S24L-A45L-S101L-N109L-N118L-K213L, S24R-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S24R-A45R-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S24R-A45R-S101R-N109Q-N118Q-K213Q, S24R-A45R-S101R-N109R-N118Q- K213Q, S24R-A45R-S101R-N109R-N118R-K213Q, S24R-A45R-S101R-N109R-N118R-K213R, S24E-A45R-S101R-N109R-N118R-K213R, S24E-A45E-S101R-N109R-N118R-K213R, S24E-A45E-S101E-N109R-N118R-K213R, S24E-A45E-S101E-N109E-N118R-K213R, S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213R, S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E, S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q-L217Q, y S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q-L217E, en donde las posiciones corresponden a las posiciones de la subtilisina BPN' de SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, la composición de limpieza es un detergente. En otras modalidades, el detergente es un detergente para platos. En todavía otras modalidades, el detergente es un detergente para ropa por ejemplo detergente para ropa líquido o seco para trabajo pesado. En modalidades alternativas, la composición de limpieza comprende además por lo menos un agente estabilizante.
En otra modalidad, la composición de limpieza comprende por lo menos una variante de proteasa que es la forma madura de una variante de subtilisina aislada de una subtilisina FNA de Bacillus que tiene actividad proteolítica y comprende la sustitución K213Q, en donde la posición está numerada por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de B . amyloliquefaciens expuesta como SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, la composición de limpieza es un detergente. En algunas modalidades, el detergente es un detergente para platos. En otras modalidades, el detergente es un detergente para ropa por ejemplo detergente para ropa líquido o seco para trabajo pesado. En modalidades alternativas, la composición de limpieza comprende además por lo menos un agente estabilizante .
En otra modalidad, la composición de limpieza comprende por lo menos una variante de proteasa que es la forma madura de una variante de subtilisina aislada de una 1 subtilisina de Bacillus que tiene actividad proteolítica y comprende una sustitución de dos o más posiciones seleccionadas de las posiciones 24, 45, 101, 109, 118, 213 y 217, en donde las posiciones están numeradas por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de B. amyloliquefaciens expuesta como SEQ ID NO: 1, y que comprende además una o más enzimas adicionales o derivados de enzimas. Las enzimas adicionales o derivados de enzimas se seleccionan de hemicelulasas , celulasas, peroxidasas, proteasas, metaloproteasas , xilanasas, lipasas, fosfolipasas, esterasas, perhidrolasas, cutinasas, pectinasas, pectatoliasas , mananasas, queratinasas , reductasas, oxidasas, fenoloxidasas , lipoxigenasas , ligninasas, pululanasas, tanasas, pentosanasas , malanasas, ß-glucanasas, arabinosidasas , hialuronidasa, condroitinasa, lacasa, y amilasas, o mezclas de las mismas. En algunas modalidades, la composición de limpieza es un detergente. En algunas modalidades, el detergente es un detergente para platos. En otras modalidades, el detergente es un detergente para ropa por ejemplo detergente para ropa líquido o seco para trabajo pesado. En modalidades alternativas, la composición de limpieza comprende además por lo menos un agente estabilizante.
En otra modalidad, la composición de limpieza comprende por lo menos una variante de proteasa que es la forma madura de una variante de subtilisina aislada de una subtilisina de Bacillus que tiene actividad proteolítica y comprende una sustitución de dos o más posiciones seleccionadas de las posiciones 24, 45, 101, 109, 118, 213 y 217, en donde las posiciones están numeradas por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de B . amyloliquefaciens expuesta como SEQ ID NO: 1, y que tiene un índice de desempeño de nivel de expresión de proteínas relativo (TCA PI) y/o un índice de desempeño de la actividad de remoción de manchas (BMI PI) que es mayor o igual a 0.5, y que comprende además una o más enzimas adicionales o derivados de enzimas. Las enzimas adicionales o derivados de enzimas se selecciona de hemicelulasas , peroxidasas, proteasas, metaloproteasas , celulasas, xilanasas, lipasas, fosfolipasas , esterasas, perhidrolasas , cutinasas, pectinasas, queratinasas , reductasas, oxidasas, fenol -oxidasas , lipoxigenasas , ligninasas, pululanasas, tanasas, pentosanasas , malanasas, ß-glucanasas, arabinosidasas , hialuronidasa, condroitinasa , lacasa, y amilasas, o mezclas de las mismas. En algunas modalidades, la composición de limpieza es un detergente. En algunas modalidades, el detergente es un detergente para platos. En otras modalidades, el detergente es un detergente para ropa por ejemplo detergente para ropa líquido o seco para trabajo pesado. En modalidades alternativas, la composición de limpieza comprende además por lo menos un agente estabilizante.
En otra modalidad, la composición de limpieza comprende por lo menos una variante de proteasa que es la forma madura de una variante de subtilisina aislada de una subtilisina GG36 de Bacillus que tiene actividad proteolítica y comprende dos o más sustituciones en dos o más posiciones seleccionadas de S24Q, S24E, S24L, S24R, R45Q, R45E, R45L, S101Q, S101E, S101L, S101R, Q109E, Q109L, Q109 R, G118Q, G118E, G118L, G118R, T213Q, T213L, T213R, T213E, L217Q, y L217E, en donde las posiciones están numeradas por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de B. amyloliquefaciens expuesta como SEQ ID NO:l, y que comprende además una o más enzimas adicionales o derivados de enzimas. Las enzimas adicionales o derivados de enzimas se seleccionan de hemicelulasas, peroxidasas, proteasas, metaloproteasas , celulasas, xilanasas, lipasas, fosfolipasas , esterasas, perhidrolasas , cutinasas, pectinasas, queratinasas , reductasas, oxidasas, fenol-oxidasas, lipoxigenasas , ligninasas, pululanasas, tanasas, pentosanasas , malanasas, ß-glucanasas , arabinosidasas , hialuronidasa, condroitinasa, lacasa y amilasas, o mezclas de las mismas. En algunas modalidades, la composición de limpieza es un detergente. En algunas modalidades, el detergente es un detergente para platos. En otras modalidades, el detergente es un detergente para ropa por ejemplo detergente para ropa líquido o seco para trabajo pesado. En modalidades alternativas, la composición de limpieza comprende además por lo menos un agente estabilizante.
En otra modalidad, la composición de limpieza comprende por lo menos una variante de proteasa que es la forma madura de una variante de subtilisina aislada de una subtilisina GG36 de Bacillus que tiene actividad proteolítica y comprende dos o más sustituciones en dos o más posiciones seleccionadas de: S24Q, S24E, S24L, S24R, R45Q, R45E, R45L, S101Q, S101E, S101L, S101R, Q109E, Q109L, Q109 R, G118Q, G118E, G118L, G118R, T213Q, T213L, T213R, T213E, L217Q, y L217E, en donde las posiciones están numeradas por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de B. amyloliquefaciens expuesta como SEQ ID NO:l, y que tiene un índice de desempeño de nivel de expresión de proteína relativo (TCA PI) y/o un índice de desempeño de la actividad de remoción de manchas (BMI PI) que es mayor o igual a 0.5, y que comprende además una o más enzimas adicionales o derivados de enzimas. Las enzimas adicionales o derivados de enzimas se seleccionan de hemicelulasas , peroxidasas, proteasas, metaloproteasas , celulasas, xilanasas, lipasas, fosfolipasas , esterasas, perhidrolasas , cutinasas, pectinasas, queratinasas , reductasas, oxidasas, fenol-oxidasas , lipoxigenasas, ligninasas, pululanasas, tanasas, pentosanasas , malanasas, ß-glucanasas, arabinosidasas , hialuronidasa, condroitinasa, lacasa, y amilasas, o mezclas de las mismas. En algunas modalidades, la composición de limpieza es un detergente. En algunas modalidades, el detergente es un detergente para platos. En otras modalidades, el detergente es un detergente para ropa por ejemplo detergente para ropa líquido o seco para trabajo pesado. En modalidades alternativas, la composición de limpieza comprende además por lo menos un agente estabilizante.
En otra modalidad, la composición de limpieza comprende por lo menos una variante de proteasa que es la forma madura de una variante de subtilisina aislada de una subtilisina FNA de Bacillus que tiene actividad proteolítica y comprende dos o más sustituciones en dos o más posiciones seleccionadas de S24Q, S24E, S24L, S24R, A45Q, A45E, A45L, A45R, S101Q, S101E, S101L, S101R, N109Q, N109E, N109L, N109R, K213Q, K213E, K213L, K213R, L217Q, y L217E, en donde las posiciones están numeradas por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de B. amyloliquefaciens expuesta como SEQ ID NO: 1, y que tiene un índice de desempeño de nivel de expresión de proteínas relativo (TCA PI) y/o un índice de desempeño de la actividad de remoción de manchas (BMI PI) que es mayor o igual a 0.5, y que comprende además una o más enzimas adicionales o derivados de enzimas. Las enzimas adicionales o derivados de enzimas se seleccionan de hemicelulasas, peroxidasas, proteasas, metaloproteasas , celulasas, xilanasas, lipasas, fosfolipasas , esterasas, perhidrolasas, cutinasas, pectinasas, queratinasas , reductasas, oxidasas, fenol-oxidasas, lipoxigenasas , ligninasas, pululanasas, tanasas, pentosanasas , malanasas, ß-glucanasas , arabinosidasas , hialuronidasa, condroitinasa , lacasa, y amilasas, o mezclas de las mismas. En algunas modalidades, la composición de limpieza es un detergente. En algunas modalidades, el detergente es un detergente para platos . En otras modalidades, el detergente es un detergente para ropa por ejemplo detergente para ropa líquido o seco para trabajo pesado. En modalidades alternativas, la composición de limpieza comprende además por lo menos un agente estabilizante .
En otra modalidad, la composición de limpieza comprende por lo menos una variante de proteasa que es la forma madura de una variante de subtilisina aislada de una subtilisina GG36 de Bacillus que tiene actividad proteolítica y comprende una combinación de sustituciones seleccionadas de S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q, R45Q-S101Q-G118Q-T213Q, S101Q-G118Q-T213Q, G118Q-T213Q, S24E-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q, S24E-R45E-S101Q-G118Q-T213Q, S24E-R45E-S101E-G118Q-T213Q, S24E- R45E-S101E-Q109E-G118Q-T213Q, S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E- T213Q, S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213E, S24L-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q, S24L-R45L-S101Q-G118Q-T213Q, S24L-R45L-S101L-G118Q-T213Q, S24L-R45L-S101L-Q109L-G118Q-T213Q, S24L-R45L-S101L-Q109L-G118L-T213Q, S24L-R45L-S101L-Q109L-G118L-T213L, S24R-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q, S24R-S101Q-G118Q-T213Q, S24R-S101R-G118Q-T213Q, S24R-S101R-Q109R-G118Q-T213Q, S24R-S101R-Q109R-G118R-T213Q, S24R-S101R-Q109R-G118R-T213R, S24E-S101R-Q109R-G118R-T213R, S24E-R45E-S101R-Q109R-G118R-T213R, S24E-R45E-S101E-Q109R-G118R-T213R, S24E-R45E-S101E-Q109E-G118R-T213R, S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213R, S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213E, S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q-L217Q, y S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q-L217E, en donde las posiciones están numeradas por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de B. amyloliquefaciens expuesta como SEQ ID N0:1, y que comprende además una o más enzimas adicionales o derivados de enzimas. Las enzimas adicionales o derivados de enzimas se seleccionan de hemicelulasas , peroxidasas, proteasas, metaloproteasas , celulasas, xilanasas, lipasas, fosfolipasas , esterasas, perhidrolasas , cutinasas, pectinasas, queratinasas , reductasas, oxidasas, fenol-oxidasas , lipoxigenasas , ligninasas, pululanasas, tanasas, pentosanasas , malanasas, ß-glucanasas , arabinosidasas , hialuronidasa, condroitinasa, lacasa, y amílasas, o mezclas de las mismas. En algunas modalidades, la composición de limpieza es un detergente. En algunas modalidades, el detergente es un detergente para platos. En otras modalidades, el detergente es un detergente para ropa por ejemplo detergente para ropa líquido o seco para trabajo pesado. En modalidades alternativas, la composición de limpieza comprende además por lo menos un agente estabilizante .
En otra modalidad, la composición de limpieza comprende por lo menos una variante de proteasa que es la forma madura de una variante de subtilisina aislada de una subtilisina GG36 de Bacillus que tiene actividad proteolítica y comprende la sustitución T213Q, en donde la posición está numerada por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de B. amyloliquefaciens expuesta como SEQ ID NO : 1, y que comprende además una o más enzimas adicionales o derivados de enzimas. Las enzimas adicionales o derivados de enzimas se seleccionan de hemicelulasas , peroxidasas, proteasas, metaloproteasas , celulasas, xilanasas, lipasas, fosfolipasas , esterasas, perhidrolasas , cutinasas, pectinasas, queratinasas , reductasas, oxidasas, fenol-oxidasas , lipoxigenasas , ligninasas, pululanasas, tanasas, pentosanasas , malanasas, ß-glucanasas , arabinosidasas , hialuronidasa, condroitinasa, lacasa, y amilasas, o mezclas de las mismas. En algunas modalidades, la composición de limpieza es un detergente. En algunas modalidades, el detergente es un detergente para platos. En otras modalidades, el detergente es un detergente para ropa por ejemplo detergente para ropa líquido o seco para trabajo pesado. En modalidades alternativas, la composición de limpieza comprende además por lo menos un agente estabilizante .
En otra modalidad, la composición de limpieza comprende por lo menos una variante de proteasa que es la forma madura de una variante de subtilisina aislada de una subtilisina FNA de Bacillus que tiene actividad proteolítica y que comprende una combinación de sustituciones seleccionadas de S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q- K213Q, A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, N109Q-N118Q-K213Q, N118Q-K213Q, S24E-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S24E-A45E-S101Q-N109Q-N118Q- K213Q, S24E-A45E-S101E-N109Q-N118Q-K213Q, S24E-A45E-S101E-N109E-N118Q-K213Q, S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213Q, S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E, S24L-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S24L-A45L-S101Q-N109Q- N118Q-K213Q, S24L-A45L-S101L-N109Q-N118Q-K213Q, S24L-A45L-S101L-N109L-N118Q-K213Q, S24L-A45L-S101L-N109L-N118L-K213Q, S24L-A45L-S101L-N109L-N118L-K213L, S24R-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S24R-A45R-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S24R-A45R-S101R-N109Q-N118Q-K213Q, S24R-A45R-S101R-N109R-N118Q-K213Q, S24R-A45R-S101R-N109R-N118R-K213Q, S24R-A45R-S101R-N109R-N118R-K213R, S24E-A45R-S101R-N109R-N118R-K213R, S24E-A45E- S101R-N109R-N118R-K213R, S24E-A45E-S101E-N109R-N118R-K213R, S24E-A45E-S101E-N109E-N118R-K213R, S24E-A45E-S101E-N109E- N118E-K213R, S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E , S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q-L217Q, y S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q-L217E, en donde las posiciones corresponden a las posiciones de la subtilisina BPN' de SEQ ID N0:1, y que comprende además una o más enzimas adicionales o derivados de enzimas. Las enzimas adicionales o derivados de enzimas se seleccionan de hemicelulasas , peroxidasas, proteasas, metaloproteasas , celulasas, xilanasas, lipasas, fosfolipasas , esterasas, perhidrolasas , cutinasas, pectinasas, queratinasas , reductasas, oxidasas, fenol -oxidasas , lipoxigenasas , ligninasas, pululanasas, tanasas, pentosanasas , tnalanasas, ß-glucanasas , arabinosidasas , hialuronidasa , condroitinasa , lacasa, y amilasas, o mezclas de las mismas. En algunas modalidades, la composición de limpieza es un detergente. En otras modalidades, el detergente es un detergente para platos. En todavía otras modalidades, el detergente es un detergente para ropa por ejemplo detergente para ropa líquido o seco para trabajo pesado. En modalidades alternativas, la composición de limpieza comprende además por lo menos un agente estabilizante .
En otra modalidad, la composición de limpieza comprende por lo menos una variante de proteasa que es la forma madura de una variante de subtilisina aislada de una subtilisina FNA de Bacillus que tiene actividad proteolítica y comprende la sustitución K213Q, en donde la posición está numerada por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de B. amyloliquefaciens expuesta como SEQ ID NO: 1, y que comprende además una o más enzimas adicionales o derivados de enzimas. Las enzimas adicionales o derivados de enzimas se seleccionan de hemicelulasas , peroxidasas, proteasas, metaloproteasas , celulasas, xilanasas, lipasas, fosfolipasas , esterasas, perhidrolasas , cutinasas, pectinasas, queratinasas , reductasas, oxidasas, fenol-oxidasas , lipoxigenasas , ligninasas, pululanasas, tanasas, pentosanasas , malanasas, ß-glucanasas, arabinosidasas , hialuronidasa, condroitinasa, lacasa, y amilasas, o mezclas de las mismas. En algunas modalidades, la composición de limpieza es un detergente. En algunas modalidades, el detergente es un detergente para platos. En otras modalidades, el detergente es un detergente para ropa por ejemplo detergente para ropa líquido o seco para trabajo pesado. En modalidades alternativas, la composición de limpieza comprende además por lo menos un agente estabilizante .
En otra modalidad, la composición de limpieza comprende por lo menos 0.0001 por ciento en peso de por lo menos una variante de subtilisina que es la forma madura de una variante de subtilisina aislada de una subtilisina de Bacillus que tiene actividad proteolítica y comprende una sustitución de dos o más posiciones seleccionadas de las posiciones 24, 45, 101, 109, 118, 213 y 217, en donde las posiciones están numeradas por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de B. amyloliquefaciens expuesta como SEQ ID NO : 1.
En otra modalidad, la composición de limpieza comprende por lo menos 0.0001 por ciento en peso de por lo menos una variante de subtilisina que es la forma madura de una variante de subtilisina aislada de una subtilisina de Bacillus que tiene actividad proteolítica y comprende una sustitución de dos o más posiciones seleccionadas de las posiciones 24, 45, 101, 109, 118, 213 y 217, en donde las posiciones están numeradas por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de B. amyloliquefaciens expuesta como SEQ ID NO: 1, y que tiene un índice de desempeño de nivel de expresión de proteína relativo (TCA PI) y/o un índice de desempeño de la actividad de remoción de manchas (BMI PI) que es mayor o igual a 0.5.
En otra modalidad, la composición de limpieza comprende por lo menos 0.0001 por ciento en peso de por lo menos una variante de subtilisina que es la forma madura de una variante de subtilisina aislada de una subtilisina GG36 de Bacillus que tiene actividad proteolítica y comprende dos o más sustituciones en dos o más posiciones seleccionadas de S24Q, S24E, S24L,S24R, R45Q, R45E, R45L, S101Q, S101E, S101L, S101R, Q109E, Q109L, Q109R, G118Q, G118E, G118L, G118R, T213Q, T213L, T213R, T213E, L217Q, y L217E, en donde las posiciones están numeradas por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de B. amyloliquefaciens expuesta como SEQ ID NO: 1.
En otra modalidad, la composición de limpieza comprende por lo menos 0.0001 por ciento en peso de por lo menos una variante de subtilisina que es la forma madura de una variante de subtilisina aislada de una subtilisina GG36 de Bacillus que tiene actividad proteolítica y comprende dos o más sustituciones en dos o más posiciones seleccionadas de: S24Q, S24E, S24L,S24R, R45Q, R45E, R45L, S101Q, S101E, S101L, S101R, Q109E, Q109L, Q109R, G118Q, G118E, G118L, G118R, T213Q, T213L, T213R, T213E, L217Q, y L217E, en donde las posiciones están numeradas por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de B. amyloliquefaciens expuesta como SEQ ID NO: 1, y que tiene un índice de desempeño de nivel de expresión de proteína relativo (TCA PI) y/o un índice de desempeño de la actividad de remoción de manchas (BMI PI) que es mayor o igual a 0.5.
En otra modalidad, la invención proporciona una composición de limpieza que comprende por lo menos 0.0001 por ciento en peso de por lo menos una variante de subtilisina que es la forma madura de una variante de subtilisina aislada de una subtilisina FNA de Bacillus que tiene actividad proteolítica y comprende dos o más sustituciones en dos o más posiciones seleccionadas de S24Q, S24E, S24L, S24R, A45Q, A45E, A45L, A45R, S101Q, S101E, S101L, S101R, N109Q, N109E, N109L, N109R, K213Q, K213E, K213L, K213R, L217Q, y L217E, en donde las posiciones están numeradas por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de B. amyloliquefaciens expuesta como SEQ ID NO: 1.
En otra modalidad, la composición de limpieza comprende por lo menos 0.0001 por ciento en peso de por lo menos una variante de subtilisina que es la forma madura de una variante de subtilisina aislada de una subtilisina FNA de Bacillus que tiene actividad proteolítica y comprende dos o más sustituciones en dos o más posiciones seleccionadas de S24Q, S24E, S24L, S24R, A45Q, A45E, A45L, A45R, S101Q, S101E, S101L, S101R, N109Q, N109E, N109L, N109R, K213Q, K213E, K213L, K213R, L217Q, y L217E, en donde las posiciones están numeradas por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de B. amyloliquefaciens expuesta como SEQ ID NO:l, y que tiene un índice de desempeño de nivel de expresión de proteínas relativo (TCA PI) y/o un índice de desempeño de la actividad de remoción de manchas (BMI PI) que es mayor o igual a 0.5.
En otra modalidad, la composición de limpieza comprende por lo menos 0.0001 por ciento en peso de por lo menos una variante de subtilisina que es la forma madura de una variante de subtilisina aislada de una subtilisina GG36 de Bacillus que tiene actividad proteolítica y comprende una combinación de sustituciones seleccionadas de S24Q- R45Q-S101Q-G118Q-T213Q, R45Q-S101Q-G118Q-T213Q, S101Q-G118Q-T213Q, G118Q-T213Q, S24E-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q, S24E-R45E-S101Q-G118Q-T213Q, S24E-R45E-S101E-G118Q- T213Q, S24E-R45E-S101E-Q109E-G118Q-T213Q, S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213Q, S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213E, S24L-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q, S24L-R45L-S101Q-G118Q-T213Q, S24L-R45L-S101L-G118Q-T213Q, S24L-R45L-S101L-Q109L-G118Q-T213Q, S24L-R45L-S101L-Q109L-G118L-T213Q, S24L-R45L-S101L-Q109L-G118L-T213L, S24R-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q, S24R-S101Q-G118Q-T213Q, S24R-S101R- G118Q-T213Q, S24R-S101R-Q109R-G118Q- T213Q, S24R-S101R-Q109R-G118R-T213Q, S24R-S101R-Q109R-G118R-T213R, S24E-S101R-Q109R-G118R-T213R, S24E-R45E-S101R-Q109R-G118R-T213R, S24E-R45E-S101E-Q109R-G118R-T213R, S24E-R45E-S101E-Q109E-G118R-T213R, S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213R, S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213E, S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q-L217Q, y S24Q-R45Q- S101Q-G118Q-T213Q-L217E, en donde las posiciones están numeradas por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de B. amyloliquefaciens expuesta como SEQ ID NO: 1.
En otra modalidad, la composición de limpieza comprende por lo menos 0.0001 por ciento en peso de por lo menos una variante de subtilisina que es la forma madura de una variante de subtilisina aislada de una subtilisina GG36 de Bacillus que tiene actividad proteolítica y comprende la sustitución T213Q, en donde la posición está numerada por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de B . amyloliquefaciens expuesta como SEQ ID NO: 1.
En otra modalidad, la composición de limpieza comprende por lo menos 0.0001 por ciento en peso de por lo menos una variante de subtilisina que es la forma madura de una variante de subtilisina aislada de una subtilisina FNA de Bacillus que tiene actividad proteolítica y comprende una combinación de sustituciones seleccionadas de S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S101Q-N109Q-N118Q- K213Q, N109Q-N118Q-K213Q, N118Q-K213Q, S24E-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S24E-A45E-S101Q-N109Q-N118Q- K213Q, S24E-A45E-S101E-N109Q-N118Q-K213Q, S24E-A45E-S101E-N109E-N118Q-K213Q, S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213Q, S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E, S24L-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S24L-A45L-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S24L- A45L-S101L-N 109Q-N118Q-K213Q, S24L-A45L-S101L-N109L-N118Q-K213Q, S24L-A45L-S101L-N109L-N118L-K213Q, S24L-A45L-S101L-N109L-N118L-K213L, S24R-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S24R-A45R-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S24R-A45R-S101R-N109Q-N118Q-K213Q, S24R- A45R-S101R-N109R-N118Q-K213Q, S24R-A45R-S101R-N109R- N118R-K213Q, S24R-A45R- SIO 1R-N109R-N118R- K213R, S24E-A45R-S101R-N109R-N118R-K213R, S24E-A45E-S101R-N109R- N118R-K213R, S24E-A45E- SIO 1E -NIO 9R-N118R-K213R , S24E-A45E-S101E-N109E-N118R-K213R, S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213R, S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E , S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q-L217Q, y S24Q-A45Q- S1O1Q-N109Q-N118Q-K213Q-L217E , en donde las posiciones corresponden a las posiciones de la subtilisina BPN' de SEQ ID NO: 1.
En otra modalidad, la composición de limpieza comprende por lo menos 0.0001 por ciento en peso de por lo menos una variante de subtilisina que es la forma madura de una variante de subtilisina aislada de una subtilisina FNA de Bacillus que tiene actividad proteolítica y comprende la sustitución K213Q, en donde la posición está numerada por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de B. amylol iquefaciens expuesta como SEQ ID NO: 1.
En otra modalidad, la invención proporciona un método de limpieza que comprende poner en contacto una superficie y/o un artículo que comprende una tela con cualquiera de las composiciones de limpieza escritas, y lavar y/o enjuagar opcionalmente la superficie o artículo.
Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 proporciona una alineación de la forma madura de proteasas GG36 precursoras (SEQ ID:4) y FNA (SEQ ID N0:7) con BPN' (SEQ ID NO: 1). A menos que se especifique de otra manera, las posiciones de sustitución se proporcionan en relación con BPN' .
La Figura 2 proporciona una matriz de cambio de carga que indica el cambio de carga para sustituciones de residuos de aminoácidos en pH 8.6. A partir de esta matriz el cambio de carga neto de una enzima variante como es comparada con una enzima precursora se puede determinar fácilmente.
La Figura 3 proporciona una matriz de cambio de hidropaticidad de Kyte-Doolittle que indica el cambio de hidropaticidad para sustituciones de residuos de aminoácidos. A partir de esta matriz el cambio de hidropaticidad neto de una enzima variante como es comparada con una enzima precursora se puede determinar fácilmente.
La Figura 4 proporciona un mapa de pAC-GG36ci La Figura 5 proporciona un mapa de pAC-FNAre.
Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona variantes de proteasa producidas por ingeniería. En particular, las variantes de proteasa comprenden mutaciones combinables en posiciones de superficie seleccionadas que afectan la carga e/o hidrofobicidad de la enzima para aumentar por lo menos una propiedad deseada de la enzima variante resultante en una aplicación seleccionada. También se proporcionan composiciones que comprenden las variantes de proteasa, y métodos para usar las mismas.
Como se indica en este documento, la introducción de sustituciones que afectan la carga e/o hidrofobicidad de las subtilisina da por resultado una enzima que comprende por lo menos una mutación combinable para proporcionar una proteasa variante que tiene un índice de desempeño para por lo menos una propiedad de interés que es un índice de desempeño >0.5 cuando se compara con aquel de la enzima precursora. Las mutaciones combinables sirven para aumentar el índice de desempaño para por lo menos una propiedad de enzima deseada en una variedad de aplicaciones. Las propiedades de interés incluyen pero no se limitan a carga, hidrofobicidad, solubilidad, desempeño de limpieza por ejemplo remoción de manchas de telas y/o superficies duras, estabilidad térmica, estabilidad de almacenamiento, estabilidad de detergente, aglutinación del substrato, inhibición de enzimas, nivel de expresión, velocidad de reacción y degradación del substrato. En algunas modalidades, la propiedad de interés es una o más propiedades seleccionadas de carga, hidrofobicidad, nivel de expresión (TCA PI) y desempeño de limpieza por ejemplo remoción de manchas (BMI PI) . Aunque se describe en este documento en relación con las proteasas y manchas de sangre, leche y tinta (BMI, por sus siglas en inglés), se contempla que las variantes de proteasa de la presente invención se optimicen para cualquier interacción de enzima-substrato en cualquiera de una variedad de medios de reacción indicados por la solicitud por ejemplo aplicaciones de limpieza.
Previamente, los esfuerzos para desarrollar proteínas superiores se enfocan en la minimización de la adhesión de enzimas a las superficies. Por ejemplo, algunos métodos implicaron alterar la secuencia de la subtilisina para obtener enzimas variantes con adsorción disminuida para substratos insolubles (Véase por ejemplo, el documento WO 95/07991) . En otro procedimiento, se alteró el pl de la subtilisina a fin de obtener enzimas variantes con una carga neta de cero en un pH definido (Véase por ejemplo, el documento WO 91/00345). Sin embargo, como se determina durante el desarrollo de la presente invención, estos procedimientos no siempre son útiles. Durante el desarrollo de la presente invención, se determinó que las propiedades de superficie de las enzimas son en general óptimas que son determinadas como una función del cambio en la carga e/o hidrofobicidad superficial. Aún para las enzimas que son normalmente muy activas, las propiedades superficiales pueden causar la reacción completa que es mucho más lenta bajo algunas condiciones y con algunos substratos que bajo otras condiciones y/o con otros substratos en algunas modalidades la presente invención proporciona proteasas variantes que comprenden propiedades superficiales modificadas obtenidas al cambiar la naturaleza de uno o más aminoácidos sobre 1 superficie de la enzima. Cuando estos cambios se hacen en sitios sobre la superficie que no interactúa con ningunos otros aminoácidos y no son necesarios para la función de la enzima, se predicen las propiedades de la proteína con base en las propiedades de los aminoácidos sustituidos en esas posiciones como se describe en este documento.
Los sitios son fácilmente identificados a partir de los datos de estructura; alternativamente, alineaciones de secuencia homologas, datos de biblioteca de evaluación de sitio y/o cualquier combinación de los mismos encuentran uso. Las matrices de puntuación de aminoácidos (por ejemplo Figura 1) y/o escalas de hidrofobicidad (por ejemplo Figura 2) encuentran uso en la guía de sustitución (es) de aminoácidos y para identificar aquellas propiedades físicas de la proteína que se correlacionan con las propiedades de los aminoácidos sustituidos .
Definiciones A menos que se indique de otra manera, la práctica de la presente invención implica técnicas convencionales usadas comúnmente en biología molecular, microbiología y ADN recombinante, los cuales están dentro de la experiencia de la técnica. Estas técnicas son conocidas por aquellas personas de experiencia en el campo y se describen en numerosos textos y trabajos de referencia bien conocidos por aquellas personas expertas en la técnica. Todas las patentes, solicitudes de patente, artículos y publicaciones mencionados en este documento, tanto supra como infra, se incorporan expresamente por este medio en este documento a manera de referencia.
A menos que se defina de otra manera en este documento, todos los términos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado como es entendido comúnmente por una persona de experiencia ordinaria en la técnica a la cual está invención pertenece. Aunque cualquier método y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en este documento encuentran uso en la práctica de la presente invención, algunos de los métodos y materiales preferidos se describen en este documento. Por consiguiente, los términos definidos inmediatamente a continuación se describen más totalmente a manera de referencia a la especificación en general.
También, como se usa en este documento, el singular "un", "una", y "el", "la" incluyen la referencia plural a menos que el contexto lo indique claramente de otra manera. Los intervalos numéricos son inclusive de los números que definen el intervalo. A menos que se indique de otra manera, los ácidos nucleicos están escritos de izquierda a derecha en la orientación 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos están escritas de izquierda a derecha en la orientación amino a carboxi, respectivamente. Se va a entender que está invención no se limita a la metodología particular, protocolos, y reactivos descritos, ya que estos pueden variar, dependiendo del contexto en que se usen por aquellas personas de experiencia en la técnica.
Se propone que cada limitación numérica máxima proporcionada por toda esta especificación incluya cada limitación numérica inferior, como si estas limitaciones numéricas se escribieran expresamente en este documento. Cada limitación numérica mínima proporcionada por toda esta especificación incluirá cada limitación numérica superior, como si estas limitaciones numéricas superiores se escribieran expresamente en este documento. Cada intervalo numérico proporcionado por toda esta especificación incluirá cada intervalo numérico más reducido que se encuentra dentro de este intervalo numérico más amplio, como si estos intervalos numéricos más reducidos se escribieran expresamente en este documento .
Adicionalmente , los títulos proporcionados en este documento no son limitaciones de los diversos aspectos o modalidades de la invención, los cuales se pueden tener por referencia a la especificación en general. Por consiguiente, los términos definidos inmediatamente a continuación se definen más completamente a manera de referencia a la especificación como en general. No obstante, a fin de facilitar el entendimiento de la invención, se definen a continuación una variedad de términos.
Como se usa en este documento, el término "índice de desempeño (PI, por sus siglas en inglés)" se refiere a la relación del desempeño de una enzima variante relativa con aquella de la enzima precursora o de referencia en un ensayo proporcionado. El PI para el desempeño de limpieza se proporciona en este documento como el desempeño para remover manchas de sangre, leche y tinta (B I) , y se proporciona como un valor BMI PI . El PI para el desempeño de nivel de expresión se proporciona en este documento como el nivel de proteína producida como es medida por la precipitación de ácido tricloroacético (TCA) y se proporciona como un valor TCA PI.
Como se usa en este documento, "mutaciones combinables" son aquellas mutaciones por las cuales la variante que comprende las mutaciones tiene índice de Desempeño (PI) un valor >0.5 para por lo menos una propiedad. Las mutaciones combinables son mutaciones que se pueden combinar para suministrar proteínas con índices de Desempeño apropiados para una o más propiedades deseadas, y tienen cambios en la carga e/o hidrofobicidad . Se llevan a cabo posiciones en las cuales las mutaciones son clasificadas como sigue: posiciones no restrictivas tienen = 20% de mutaciones neutras para por lo menos una propiedad; y posiciones restrictivas tienen < 20% de mutaciones neutras para actividad y estabilidad.
El término "aislado" o "purificado" se refiere a un material que se remueve de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural si es de origen natural) . Por ejemplo, el material se dice que se "purifica" cuando está presente en una composición particular en una concentración superior o inferior que existe en un organismo de origen natural o de tipo silvestre o en combinación con componentes no presentes normalmente en la expresión de un organismo de origen natural o de tipo silvestre. Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido de origen natural presente en un animal vivo no se aisla, sino el mismo polinucleótido o polipéptido, separados de algunos o todos los materiales coexistentes en el sistema natural, se aisla. En algunas modalidades, estos polinucleótidos son parte de un vector y/o estos polinucleótidos o polipéptidos son parte de una composición, y se aislan aún en ese vector o composición que no es parte de su entorno natural. En modalidades preferidas, un ácido nucleico o proteína se dice que se purifica, por ejemplo, si da origen a esencialmente una banda en un gel o tinción electroforática .
El término "aislado" , cuando se usa en referencia con una secuencia de ADN se refiere a una secuencia de ADN que se ha removido de su medio genético natural y de esta manera está libre de otras secuencias de codificación extrañas o no deseadas, y está en una forma adecuada para el uso dentro de los sistemas de producción de proteínas genéticamente diseñados. Estas moléculas aisladas son aquellas que se separan de su entorno natural e incluyen ADNc y clones genómicos. Las moléculas de ADN aislado de la presente invención están libres de otros genes con los cuales se asocian ordinariamente, pero pueden incluir regiones no traducidas 5' y 3' de origen natural tales como promotores y terminadores . La identificación de regiones asociadas será evidente para una persona de experiencia ordinaria en la técnica (Véase por ejemplo, Dynan y Tijan, Nature 316:774-78
[1985] ) . El término "secuencia de ADN" es alternativamente referido como "una secuencia de ADN clonado" .
El término "aislado", cuando se usa en referencia con una proteína, se refiere a una proteína que se encuentra en una condición diferente a su entorno nativo. En una forma preferida, la proteína aislada está sustancialmente libre de otras proteínas, particularmente otras proteínas homologas. Una proteína aislada es más que aproximadamente 10% pura, preferiblemente más que aproximadamente 20% pura, y aún más preferiblemente más que aproximadamente 30% pura, como se determina por el SDS-PAGE. Los aspectos adicionales de la invención incluyen la proteína en una forma altamente purificada (es decir, más que aproximadamente 40% pura, más que aproximadamente 60% pura, más que aproximadamente 70% pura, más que aproximadamente 80% pura, más que aproximadamente 90% pura, más que aproximadamente 95% pura, más que aproximadamente 97% pura, y aún más que aproximadamente 99% pura) , como es determinado por el SDS-PAGE.
Como se usa en este documento, una proteína "precursora" se refiere a la proteína que se modifica por ejemplo al introducir una o más sustituciones de aminoácidos, para generar una o más variantes de la proteína precursora. De esta manera, los términos "variante de proteasa" y "proteasa variante" se usan en referencia con proteasa precursoras que son similares a la proteasa variante, particularmente en su función, pero tienen mutaciones en su secuencia de aminoácidos que las hacen diferentes. En secuencia de la proteasa precursora entre uno a 20 posiciones de aminoácidos. Las secuencias de aminoácidos de la región madura de las proteasas precursoras ejemplares se muestran en la alineación de la FIGURA 1. FNA (SEQ ID NO: 7) y GG36 (SEQ ID NO: 4) son las proteasas precursoras maduras las cuales se han modificado para contener una o más sustituciones combinables para generar las proteasas variantes de la invención. GG36 es una proteasa de Bacillus lentus de tipo silvestre, y FNA es la proteasa BPN' de Bacillus amyloliquefaciens que contiene la sustitución Y217L.
Como se usa en este documento, los términos "proteasa" y "actividad proteolítica" se refieren a una proteína o péptido que exhiben la capacidad de hidrolizar péptidos o substratos que tienen enlaces de péptido. Existen muchos procedimientos bien conocidos para medir la actividad proteolítica (Kalisz, "Microbial Proteinasas , " In: Fiechter (ed.), Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,
[1988] ) . Por ejemplo, la actividad proteolítica se puede verificar por ensayos comparativos que analizan la capacidad de la proteasa respectiva de hidrolizar un substrato comercial. Los substratos ejemplares útiles en el análisis de la actividad de la proteasa o proteolítica, incluyen, pero no se limitan a caseína de dimetilo (Sigma C-9801) , colágeno de bovino (Sigma C-9879) , elastina de bovino (Sigma E-1625) , y queratina de bovino (ICN Biomedical 902111) . Los ensayos colorimétricos que usan estos substratos son bien conocidos en la técnica (Véase por ejemplo, el documento O 99/34011; y la Patente de E.U.A. No. 6,376,450, ambos de los cuales se incorporan en este documento a manera de referencia. El ensayo pNA (Véase por ejemplo, Del Mar y colaboradores, Anal. Biochem. , 99:316- 320
[1979]) también encuentra uso en la determinación de la concentración de enzimas activas para fracciones recolectadas durante la elusión gradiente. Este ensayo mide la velocidad en la cual la p-nitroanilina se libera conforme la enzima hidroliza el substrato sintético soluble, succinilo-alanina-alanina-prolina-fenilalanina-p-nitroanilida (suc-AAPF-pNA) . La velocidad de producción del color amarillo de la reacción de hidrólisis se mide a 410 nm sobre un espectrofotómetro y es proporcional a la concentración de enzimas activas. Además, las mediciones de absorbancia a 280 nm se pueden usar para determinar la concentración de proteínas total. La proporción de enzima activa/proteína total proporciona la pureza de la enzima.
Como se usa en este documento, el término "subtilisina" se refiere a cualquier miembro de la familia de S8 serina-proteasa como se describe en MEROPS - The Peptidase Data base (Rawlings y colaboradores, MEROPS: the peptidase datábase, Nucleic Acids Res, 34 Datábase issue, D270-272, 2006, at the website merops . sanger . ac . RU/cgi-bin/merops . cgi?id=s08 ; action= . ) . La siguiente información se derivó de MEROPS - The Peptidase Data base as of 6 de Noviembre de 2008 "Peptidase family S8 contains the serine endopeptidase subtilisin and its homologues (Biochem J, 290:205-218, 1993). La familia S8, también conocida como la familia subtilasa, es la segunda familia más grande de serina-peptidasas , y se puede dividir en dos subfamilias, con la subtilisina (S08.001) el ejemplo de tipo para la subfamilia S8A y kexina (S08.070) el ejemplo de tipo para la subfamilia S8B. La tripeptidil-peptidasa II (TPP-II; S08.090) se consideró anteriormente que es el ejemplo de tipo de una tercera subfamilia, pero desde entonces se ha determinado que se clasificó erróneamente. Los miembros de la familia S8 tiene una triada catalítica en el orden de Asp, His y Ser en la secuencia, lo cual es un orden diferente a aquel de las familias SI, S9 y S10. En la subfamilia S8A, los residuos de sitio activo se llevan a cabo frecuentemente en los motivos Asp-Thr/Ser-Gly (el cual es similar al motivo de secuencia en las familias de endopeptidasas aspárticas en el clan AA) , His-Gly-Thr-His y Gly-Thr-Ser-Met-Ala-Xaa-Pro . En la subfamilia S8B, los residuos catalíticos se llevan a cabo frecuentemente en los motivos Asp-Asp-Gly, His-Gly-Thr-Arg y Gly-Thr-Ser-Ala/Val-Ala/Ser-Pro . La mayoría de los miembros de la familia S8 son endopeptidasas, y son activos en pH alcalino levemente neutro. Muchas peptidasas en la familia son termoestables . La caseína se usa frecuentemente como un substrato de proteína y un substrato sintético típico es suc-AAPF . La mayoría de miembros de la familia son peptidasas no específicas con una preferencia a la escisión después de los residuos hidrofóbicos . Sin embargo, los miembros de la subfamilia S8B, tal como kexina (S08.070) y furina (S08.071), se parten después de los aminoácidos dibásicos. La mayoría de los miembros de la familia S8 se inhiben por los inhibidores de serina-peptidasa generales tales como DFP y PMSF. Debido a que muchos miembros de la familia enlazan el calcio para estabilidad, la inhibición se puede observar con el EDTA y EGTA, los cuales se creen frecuentemente que son inhibidores específicos de metalopeptidasas . Los inhibidores de proteínas incluyen el tercer dominio ovomucoide de pavo (101.003), inhibidor de subtilisina de Streptomyces (116.003), y miembros de la familia 113 tal como eglin C (113.001) e inhibidor de cebada CI-IA (113.005), muchos de los cuales también inhiben la quimotripsina (S01.001). El propéptido de subtilisina es por sí mismo inhibidor, y el inhibidor de proteinasa B homologa de Saccharomyces inhibe la cerevisina (S08.052) . Ahora se han determinado las estructuras terciarias para varios miembros de la familia S8. Una estructura de proteína S8 típica consiste de tres capas con una hoja ß de siete hebras intercalada entre dos capas de hélices. La subtilisina (S08.001) es la estructura de tipo para el clan SB (SB) . A pesar de la estructura diferente, los sitios activos de la subtilisina y la quimotripsina (S01.001) se puede superponer, lo cual sugiere que la similitud de estos resultados de la evolución convergente antes de divergente .
Como se usa en este documento, los términos "Bacillus" y "género Bacillus" incluyen todas las especies dentro del género "Bacillus" , como es conocido por aquellas personas de experiencia en la técnica, incluyendo, pero no limitado a B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. halodurans, B. megaterium, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, y B. thuringiensis . Se reconoce que el género Bacillus continúa sometiéndose a la reorganización taxonómica. De esta manera, se propone que el género incluya especies que se han reclasificado, incluyendo, pero no limitado a estos organismos como B. stearothermophilus, el cual ahora es llamado "GeoBacillus stearothermophilus" . La producción de endoesporas resistentes en presencia de oxígeno se considera la característica de definición del género Bacillus, aunque esta característica también aplica al recientemente llamado AlicycloBacillus, AmphiBacillus, AneuriniBacilIus, AnoxyBacilIus, BreviBacillus, FiloBacillus, GraciliBacillus, HaloBacillus, PaeniBacillus, SaliBacilIus, ThermoBací11us, UreiBacillus, y VirgiBacillus .
Los términos "proteína" y "polipéptido" se usan intercambiablemente en este documento. El código de 3 letras para los aminoácidos como se define de conformidad con la IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN) se usa por toda esta descripción. También se entiende que un polipéptido se puede codificar por más de una secuencia de nucleótidos debido a la degeneración del código genético.
Una "pro-secuencia" es una secuencia de aminoácidos entre la péptido señal y la región madura de una proteasa. La pro-secuencia se divide durante el proceso de maduración que da por resultado la producción de la forma madura activa de la proteasa.
El término "secuencia señal" o "péptido señal" se refiere a cualquier secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos que participan en la secreción de las formas maduras o precursoras de la proteína. Esta definición de la secuencia señal es una funcional, que propone incluir todas aquellas secuencias de aminoácidos codificadas por la porción N-terminal del gen de proteína, el cual participa en la realización de la secreción de la proteína. Frecuentemente, pero no universalmente, se unen a la porción N-terminal de una proteína o a la porción N-terminal de una proteína precursora. La secuencia señal puede ser endógena o exógena . La secuencia señal puede ser aquella asociada normalmente con la proteína (por ejemplo, proteasa) , o puede ser de un gen que codifica otra proteína secretada. Una secuencia señal exógena ejemplar comprende los primeros siete residuos de aminoácidos de la secuencia señal de la subtilisina de B . subtilis fusionada al resto de la secuencia señal de la subtilisina de B . lentus (ATCC 21536) .
El término "secuencia señal híbrida" se refiere a secuencia señal en la cual parte de la secuencia se obtiene del hospedero de expresión fusionado a la secuencia señal del gen que se expresa. En algunas modalidades, se usan secuencias sintéticas.
El término forma "madura" de una proteína o péptido se refiere a la forma funcional final de la proteína o péptido. Para ejemplificar, la forma madura de la FNA proteasa proporcionada en este documento incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, mientras que una forma madura de la GG36 proteasa incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4.
El término "precursor" en este documento se refiere a la forma de una proteína o péptido que tiene una prosecuencia enlazada operablemente a la amino o carbonil terminal de la proteína madura. Para ejemplificar, la SEQ ID NOS: 3 y 6 son secuencias de los precursores de la GG36 madura (SEQ ID NO : 4 ) y FNA (SEQ ID NO:7), respectivamente. El precursor también puede tener una secuencia "señal" enlazada operablemente, a la aminoterminal de la pro-secuencia . El precursor también puede tener polinucleótidos adicionales que se implican en la actividad pos-traduccional (por ejemplo, polinucleótidos divididos de los mismos para dejar la forma madura de una proteína o péptido) .
"Enzima de origen natural" y "proteína de origen natural" se refieren a una enzima o proteína que tiene la secuencia de aminoácidos no modificada idéntica a aquella encontrada en naturaleza. Las enzimas de origen natural incluyen enzimas nativas, aquellas enzimas expresadas o encontradas naturalmente en el microorganismo específico.
Los términos "derivado de" y "obtenido de" se refiere no únicamente a una enzima (por ejemplo, proteasa) producida o producible por una cepa del organismo en cuestión, sino también una enzima codificada por una secuencia de ADN aislada de esta cepa y producida en un organismo hospedero que contiene esta secuencia de ADN. Adicionalmente , el término se refiere a una enzima que se codifica por una secuencia de ADN de origen sintético y/o ADNc y el cual tiene las características de identificación de la enzima en cuestión.
Un "derivado" dentro del alcance de esta definición retiene en general la actividad proteolítica característica observada en la forma de tipo silvestre, nativa o precursora al grado en que el derivado es útil para propósitos similares como la forma de tipo silvestre, nativa o precursora. Los derivados de enzimas funcionales incluyen péptidos de origen natural, sintética o recombinantemente producidos o fragmentos de péptidos que tienen las características generales de la enzima precursora.
Como se usa en este documento, "por correspondencia a" se refiere a un residuo en la posición numerada en una proteína o péptido.
Como se usa en este documento, "sustituido" y "sustituciones" se refiere al reemplazo (s) de uno o más residuos de aminoácidos o bases de ácido nucleico en una secuencia precursora. En algunas modalidades, la sustitución implica el reemplazo de un residuo o base de origen natural. En algunas modalidades, dos o más aminoácidos se sustituyen para generar una proteasa variante que comprende una combinación de sustituciones de aminoácido. En algunas modalidades, las combinaciones de sustituciones se indican por la posición de aminoácidos en la cual se hace la sustitución. Por ejemplo, una combinación indicada por E6A-E30G significa que el ácido glutámico (E) en la posición 6 se sustituye con Alanina (A) y el ácido glutámico (E) en la posición 30 se sustituye con una Glicina (G) . Las posiciones de aminoácidos se proporcionan por correspondencia a la posición numerada en la región, madura de la subtilisina BPN' (SEQ ID NO: 1) .
La frase "sustitución en dos o más posiciones" en este documento se refiere a una combinación de dos o más sustituciones que se hacen en la misma proteína. De esta manera, "una sustitución en dos o más posiciones" se refiere a cualquiera de una combinación de 2, 3, 4, 5, 6, y 7 sustituciones de aminoácidos.
Como se usa en este documento, los términos "cásete de expresión" y "vector de expresión" se refiere a constructos de ácido nucleico generados recombinante o sintéticamente, con una serie de elementos de ácidos nucleicos especificados que permiten la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula objetivo. El cásete de expresión recombinante se puede incorpora en un plásmido, cromosoma, ADN mitocondrial , ADN plásmido, virus o fragmento de ácido nucleico. Típicamente, la porción de cásete de expresión recombinante de un vector de expresión incluye, entre otras secuencias, una secuencia de ácidos nucleicos que se transcribe y un promotor. En modalidades preferidas, los vectores de expresión tienen la capacidad de incorporar y expresar fragmentos de ADN heterólogos en una célula hospedera. Muchos vectores de expresión procarióticos y eucarióticos son comercialmente disponibles. La selección de vectores de expresión apropiados está dentro del conocimiento de aquellas personas expertas en la técnica. El término "cásete de expresión" se usa intercambiablemente ente documento con "constructo de ADN y sus equivalentes gramáticos. La selección de vectores de expresión apropiados está dentro del conocimiento de aquellas personas expertas en la técnica.
Como se usa en este documento, el término "vector" se refiere a un constructo de polinucleótido diseñado para introducir ácidos nucleicos en uno o más tipos de células.
Los vectores incluyen vectores de clonación, vectores de expresión, vectores lanzadera, plásmidos, casetes y los similares. En algunas modalidades, el constructo de polinucleótido comprende una secuencia de ADN que codifica la proteasa (por ejemplo, proteasa precursora o madura) que se enlaza operablemente a una pro-secuencia adecuada (por ejemplo, secretora, etcétera) capaz de efectuar la expresión del ADN en un hospedero adecuado.
Como se usa en este documento, el término "plásmido" se refiere a un constructo de ADN de doble hebra (ds) circular usado como un vector de clonación, y el cual forma un elemento genético auto-replicante extracromosomal en algunos eucariotas o procariotas, o se integra en el cromosoma hospedero .
Como se usa en este documento, los términos "cepa Hospedera" o "célula hospedera" se refiere a un hospedero adecuado para un vector de expresión que comprende ADN de acuerdo con la presente invención.
Como se usa en este documento, "composiciones de limpieza" y "formulaciones de limpieza" se refiere a composiciones que encuentran uso en la remoción de compuestos indeseados de artículos que se limpian, tal como tela, platos, lentes de contacto, otros substratos sólidos, cabello (champús), piel (jabones y cremas), dientes (lavados bucales, pastas de dientes) etcétera. El término incluye cualquiera de los materiales/compuestos seleccionados para el tipo particular de composición de limpieza deseada en la forma del producto (por ejemplo, líquido, gel, gránulo, polvo o composición de rocío), usada en la composición. La selección específica de materiales de composición de limpieza se hacen fácilmente al considerar la superficie, artículo o tela que se limpia, y la forma deseada de la composición para las condiciones de limpieza durante el uso.
Los términos se refieren adicionalmente a cualquier composición que es adecuada para la limpieza, blanqueado, desinfección, y/o esterilización de cualquier objeto y/o superficie. Se propone que los términos incluyen, pero no se limitan a composiciones detergentes (por ejemplo, detergentes para ropa líquidos y/o sólidos y detergentes para telas finas; formulaciones de limpieza de superficies duras, tal como para vidrio, madera, cerámica y encimeras de metal y ventanas; limpiadores de alfombras; limpiadores de hornos; aromatizantes de telas; suavizantes de telas; y pre-desmanchadores de textiles y ropa, así como también detergentes para platos) .
De hecho, el término "composición de limpieza" como se usa en este documento, incluye a menos que se indique de otra manera, agentes de lavado para todo propósito o para trabajo pesado en forma seca por ejemplo granular o en polvo, especialmente detergentes de limpieza; agentes de lavado para todo propósito en forma líquida, en gel o pasta, especialmente los así llamados tipos de líquido para trabajo pesado (HDL) ; detergentes de telas finas líquidos; agentes de lavado de platos a mano o agentes de lavado de platos de trabajo ligero, especialmente aquellos de tipo de alta espumación; agentes de lavados de platos en máquina, incluyendo los diversos tipo de tabletas, granulares, líquidos y auxiliares de enjuague para uso doméstico e institucional; agentes de limpieza y desinfectantes líquidos, incluyendo tipos de lavado a mano antibacterianos, barras de limpieza, lavados bucales, limpiadores de dentaduras, champús para carro o alfombra, limpiadores de baños; champú para el cabello y en juagues para el cabello; geles de ducha y baños de espuma y limpiadores de metal; así como también auxiliares de limpieza tales como aditivos de blanqueado y "barra para manchas" o tipos de pretratamiento .
Como se usa en este documento, "composiciones de limpieza de telas" incluye composiciones detergentes para ropa a mano y a máquina incluyendo composiciones de aditivo para ropa y composiciones adecuadas para el uso en el remojado y/o pre-tratamiento de telas teñidas (por ejemplo, ropas, ropas de cama y otros materiales textiles) .
Como se usa en este documento, "composiciones de limpieza no de telas" incluyen composiciones de limpieza de superficies no textiles (es decir, telas) , incluyendo pero no limitado a composiciones detergentes de lavado de platos, composiciones de limpieza orales, composiciones de limpieza de dentaduras y composiciones de limpieza personal.
Como se usa en este documento, los términos "composición detergente" y "formulación detergente" se usan en referencia con mezclas las cuales se proponen para el uso en un medio de lavado para la limpieza de objetos manchados. En modalidades preferidas, el término se usa en referencia con detergentes usados para limpiar platos, cubiertos, etcétera (por ejemplo, "detergentes de platos" o "detergentes para lavado de platos") . No se propone que la presente invención se limite a ninguna formulación o composición detergente particular. De hecho, se propone que además de los detergentes que contienen por lo menos una proteasa de la presente invención, el término incluya detergentes que contengan tensioactivos , transferasa (s) , enzimas hidrolíticas , óxido-reductasas , mej oradores, agentes blanqueadores, activadores de blanqueado, agentes azulados y tintes fluorescentes, inhibidores de aglutinación, agentes enmascarantes, activadores de enzimas, antioxidantes y solubilizantes .
Como se usa en este documento, "composición lavaplatos" se refiere a todas las formas de composiciones para limpiar vajillas, incluyendo cubiertos, incluyendo pero no limitado a formas granulares y líquidas. No se propone que la presente invención se limite a ningún tipo particular o composición para vajillas. De hecho, la presente invención encuentra uso en la limpieza de vajillas (por ejemplo, platos, incluyendo, pero no limitado a platos, tasas, vasos, tazones, etcétera) y cubiertos (por ejemplo, utensilios, incluyendo pero no limitado a cucharas, cuchillos, tenedores, utensilios para servir, etcétera) de cualquier material, incluyendo pero no limitado a cerámicas, plásticos, metales, porcelana, vidrio, acrílicos, etcétera. El término "vajilla" se usa en este documento con referencia a tanto platos como cubiertos .
Como se usa en este documento, "detergentes lavaplatos que no contienen fosfato" son detergentes que contienen no más de 0.5% de fósforo (es decir, fósforo es un elemento traza) .
Como se usa en este documento, "desempeño de lavado" o "desempeño de limpieza" de una proteasa variante se refiere a la contribución hecha por una proteasa variante a la capacidad de limpieza de una composición de limpieza cuando se compara con aquella obtenida en ausencia de la variante de proteasa.
El término "condiciones de lavado relevantes" se usa en este documento para indicar las condiciones, particularmente temperatura de lavado, tiempo, mecánica de lavado, concentración de jabonadura, tipo de detergente y dureza del agua, usadas actualmente en los hogares en un segmento de mercado de detergente para platos o ropa.
El término "desempeño de lavado mejorado" se usa para indicar que se obtiene un mejor resultado final en la remoción de manchas bajo condiciones de lavado relevantes, o que menos proteasa variante, en base de peso, es necesaria para obtener el mismo resultado final relativo con la proteasa precursora de tipo silvestre o de partida correspondiente .
Como se usa en este documento, el término "desinfección" se refiere a la remoción de contaminantes de las superficies, así como también a la inhibición o exterminio de microbios sobre las superficies de los artículos. No se propone que la presente invención se limite a ninguna superficie particular, artículo, o contaminante (s) o microbios a ser removidos.
Como se usa en este documento, "cantidad efectiva de enzimas" se refiere a la cantidad de enzimas necesarias para lograr la actividad enzimática requerida en aplicación especifica (por ejemplo, producto para el cuidado personal, composición de limpieza, etcétera) . Estas cantidades efectivas se verifican fácilmente por una persona de experiencia ordinaria en la técnica y se basan en muchos factores, tal como la variante de enzima particular usada, la aplicación de limpieza, la composición específica de la composición de limpieza, y si es requerida una composición líquida o seca (por ejemplo, granular, en barra) y similares.
La forma "compacta" de las composiciones de limpieza en este documento se refleja mejor por la densidad y, en términos de composición, por la cantidad de sal rellenadora inorgánica. Las sales rellenadoras inorgánicas son ingredientes convencionales de composiciones detergentes en forma de polvo. En las composición detergentes convencionales, las sales rellenadoras están presentes en cantidades sustanciales, de manera típica aproximadamente 17 a aproximadamente 35% por ciento en peso de la composición total. En contraste, en las composiciones compactas, la sal rellenadora está presente en cantidad que no exceden a aproximadamente 15% de la composición total. En algunas modalidades, la sal rellenadora está presente en cantidades que no exceden aproximadamente 10%, o más preferiblemente, aproximadamente 5%, en peso de la composición. En algunas modalidades, las sales rellenadoras inorgánicas se seleccionan de las sales de metal alcalino y alcalinotérreo de sulfatos y cloruros. Una sal rellenadora preferida es sulfato de sodio.
Como se usa en este documento, "ingrediente adjunto" o "material adjunto" se refiere a materiales de limpieza que incluyen, pero no se limitan a, tensioac ivos , mej oradores, blanqueadores, activadores de blanqueado, catalizadores de blanqueado, otras enzimas, sistemas estabilizantes de enzimas, quelantes, abrillantadores ópticos, polímeros de liberación de manchas, agentes de transferencia de teñido, dispersantes, supresores de jabonaduras, tintes, perfumes, colorantes, sales rellenadoras , hidrótropos, fotoactivadores , fluorescentes, acondicionadores de telas, tensioactivos hidrolizables , conservadores, anti-oxidantes , agentes anti-encogimiento, agentes anti-arrugas , germicidas, fungicidas, manchas de color, silvercare, agentes anti-tizne y/o anti -corrosión, fuentes de alcalinidad, agentes solubilizantes , portadores, auxiliares de procesamiento, pigmentos, y agentes de control de pH (Véase por ejemplo, las Patentes de E.U.A. Nos. 6,610,642, 6,605,458, 5,705,464, 5,710,115, 5,698,504, 5,695,679, 5,686,014 y 5,646,101, todas de las cuales se incorporan en este documento a manera de referencia) .
Como se usa en este documento, "composición lavaplatos" se refiere a todas las formas de composiciones para limpiar platos, incluyendo pero no limitadas a formas granulares y líquidas.
Como se usa en este documento, "composición de limpieza de telas" se refiere a todas las formas de composiciones detergentes para limpiar telas, incluyendo pero no limitado a, formas granulares, líquidas y en barra.
Como se usa en este documento, "tela" incluye cualquier material textil. De esta manera, se propone que el término incluya prendas, así como también telas, hilos, fibras, materiales no tejidos, materiales naturales, materiales sintéticos, y cualquier otro material textil.
Como se usa en este documento, "textil" se refiere a telas tejidas, así como también fibras discontinuas y filamentos adecuados para la conversión a o uso como hilos, telas tejidas, cocidas, y no tejidas. El término incluye hilos hechos de fibras naturales, así como también sintéticas. Por ejemplo, manufacturadas).
Como se usa en este documento, "materiales textiles" es un término general para fibras, intermediarios de hilo, hilo, telas, y productos hechos de telas (por ejemplo, prendas y otros artículos) .
Las estrategias más actualmente usadas para mejorar el desempeño de proteína en aplicaciones industriales, de consumo o farmacéuticas se han enfocado en sustituciones de aminoácidos en o cerca de un sitio activo de la enzima, a fin de incrementar la eficiencia catalítica. Sin embargo, durante el desarrollo de la presente invención, se determinó que las mutaciones en cualquier lugar sobre la superficie de la enzima incrementa notablemente el desempeño de la enzima más allá de lo que es posible a través de mejoras de eficiencia catalíticas. Básicamente, la velocidad de reacción que controla la conversión de los substratos a productos mediada por enzimas se controla solo parcialmente por la velocidad de la etapa de conversión catalítica química sola. Las enzimas y substratos interactúan como coloides antes de su asociación como un complejo ES de enzima-substrato. Así como también durante la disociación del complejo EP enzima-producto que se forma después de la conversión química. Aún si la etapa de reacción prosigue en una velocidad rápida, el procedimiento de enzimas hacia el substrato puede ser extremadamente lento (por ejemplo, difusión limitada) , como en el caso de coloides con el mismo signo experimentan fuerzas repulsivas electrostáticas. Del mismo modo, la liberación de enzimas del complejo EP enzima-producto puede ser extremadamente lenta (por ejemplo, difusión limitadas) , como en el caso de coloides que experimentan fuerzas hidrofóbicas y dispersantes de corto alcance atractivas. Ambas condiciones incrementan el tiempo de tránsito de la enzima del substrato al producto y se vuelve limitante de etapa de velocidad comparada con la conversión química. Mientras que es posible considerar que los coloides opuestamente cargados acelerarían actualmente la formación de complejos ES (por ejemplo, arriba del límite de difusión) , la disociación subsecuente del complejo EP sería penosamente lento (asumiendo que no se crean cargas tampoco se pierden) y disminuiría la velocidad de reacción total. Por lo tanto, la simetría del potencial de interacción en pares se explota a fin de asegurar tiempos de tránsito mínimos tanto para los complejos ES como EP. Esto es particularmente importante en la biotecnología industrial, puesto que es deseable convertir todo el substrato a producto en la cantidad de tiempo más corta posible bajo condiciones frecuentemente limitadas de enzimas. Históricamente, los ingenieros de proteínas se han enfocado en las interacciones de enzima-substrato específicas de la etapa de conversión química y no han logrado reconocer la contribución de interacciones no específicas tanto de corto como largo plazo, que surgen de fuerzas coloidales y superficiales intermoleculares, las cuales controlan las etapas de asociación y disociación. Un objetivo de la presente invención es proporcionar variantes de proteasa que tienen propiedades superficiales alteradas obtenidas al cambiar la naturaleza de uno o más aminoácidos sobre la superficie de la enzima que optimizan las fuerzas intermoleculares al punto donde la etapa de conversión química se vuelve limitante de velocidad.
La modificación de las propiedades artificiales se logra al introducir sustituciones de aminoácidos que alteran la carga e/o hidrofobicidad de la enzima usando los métodos descritos en este documento. Una vez que la etapa de conversión química se vuelve limitante de velocidad, mejoras adicionales en el desempeño de la enzima variante se puede lograr a través de cambios en el sitio activo de la enzima.
Este objetivo es aplicable si el substrato es un péptido pequeño en solución o en un substrato macroscópico insoluble. No obstante, el conocimiento del (los) mecanismo (s) implicado (s) no es necesario a fin de hacer y usar la presente invención. Tampoco se propone que la presente invención se limite a ningún mecanismo particular.
Brevemente los métodos usados para generar las variantes de proteasa de la presente invención implican (I) Someter a Ensayo las Proteínas Sonda que Abarcan un Intervalo de Propiedades Físicas; (II) Determinar lo Óptimo de la Propiedad Física para un Resultado Favorable Dado; y (III) Proporcionar Proteínas Variantes que Tienen la Propiedad Física Óptima.
I. Ensayo de Proteínas Sonda El ensayo de proteínas sonda implica la prueba de múltiples proteínas sonda (es decir, "plegamientos de proteínas sonda" ) que abarcan el intervalo de una propiedad física de interés (es decir, un "propiedad de interés" es un ensayo apropiado) . Las proteínas sonda incluyen un conjunto limitado de proteínas y/o variantes de las mismas. En algunas modalidades ejemplares, se sometió a prueba por lo menos una serina proteasa para uno o más beneficios. Por ejemplo, se proporcionó el cambio en la carga neta de la variante relativa con la enzima precursora para dos serina proteasas, GG36 y FNA. El cambio de carga neta para las variantes de GG36 y FNA como se describe en este documento, abarca un cambio de carga neta relativa que varía de -7 a 0 como es comparado con las enzimas precursoras respectivas.
II. Determinar lo Óptimo de la Propiedad Física Determinar lo óptimo de la propiedad física es decir determinar lo óptimo de una propiedad de interés, implica identificar un óptimo de una propiedad física o intervalo de la misma para un resultado favorable. En algunas modalidades ejemplares, se determinó el índice de desempeño de limpieza, en este documento proporcionado como el BMI PI de variantes de proteasa FNA y GG36. En otras modalidades, se midió el nivel de expresión en este documento proporcionado como el TCA PI de las variantes de proteasa FNA y GG36. En las presentes modalidades, al comparar los beneficios obtenidos con las proteínas que tiene el mimo plegamiento es decir serina proteasas, se empleo una relativa (por ejemplo, relativa diferencial de carga neta a la proteína de tipo silvestre o precursora) . Alternativamente, al comparar los beneficios obtenidos con las proteínas que tienen diferentes plegamientos , es decir serina proteasas y metaloproteasas, se emplea una escala de propiedad física común (por ejemplo, carga de la proteína reportada como potencial zeta) . Se emplean proteínas sonda que abarcan un amplio intervalo de propiedad física a fin de incrementar la probabilidad de definir un óptimo para esa propiedad física. Una vez que el valor óptimo o intervalo óptimo para un beneficio de interés se ha establecido al someter ensayo las proteínas sonda, es posible predecir tanto la dirección como magnitud general de cambio probablemente que es requerida para convertir un ejecutante inferior (por ejemplo, que yace fuera del intervalo óptimo) a un ejecutante superior (por ejemplo, dentro del intervalo óptimo) .
Se contempla el uso de más de una serie de proteínas sonda para permitir la identificación de diferentes óptimos de la propiedad física para un beneficio de interés. Por ejemplo, en algunas modalidades, ambos cambios en la carga e hidrofobicidad netas relativas con aquella de la enzima precursora de las proteasas detergentes GG36 y FNA se someten a prueba para el desempeño de limpieza en un ensayo de sangre, leche, tinta. En algunos casos, se contempla la misma propiedad física para exhibir diferentes óptimos para los diferentes beneficios. Por ejemplo, existe una carga de proteasa óptima para el desempeño de limpieza para la FNA (B I PI) , el cual es distinto de la carga de proteasa óptima para el nivel de expresión (TCA PI) .
En algunas modalidades, las propiedades físicas relacionadas con carga son comparadas a través de proteínas precursoras comparadas y variantes en términos de potencial zeta medido, carga neta, densidad de carga, y/o conteo superficial de grupos ionizables. En general, cualquier método para determinar la carga de proteínas de mediciones de titulación o electroforéticas es adecuado para comparar diferentes plegamientos de proteínas. La comparación de diferentes variantes de proteínas se hace por el cálculo de una o más de las cantidades anteriores con base en la información de secuencia primaria, secundaria y/o terciaria de ' proteínas cuando sea disponible. Las herramientas bioinformáticas típicas empleadas para estos procesos incluyen calculadoras de punto isoeléctrico que usan la ecuación de Hénderson-Hesselbach (por ejemplo, European Molecular Biology Laboratory) o solucionadores electrostáticos de Poisson-Boltzmann (por ejemplo, DelPhi, MOE) .
III. Proporcionar Protexnas Variantes que Tengan el Óptimo de Propiedad Física Una vez que un valor o intervalo óptimo se ha determinado en la etapa anterior, se proporciona una pluralidad de proteínas candidato las cuales están limitadas para la propiedad física de interés. Los métodos adecuados para proporcionar proteínas candidato incluyen, pero no se limitan a la producción de variantes de enzimas artificiales mediante técnicas recombinantes , así como también la purificación de variantes de enzimas naturales (por ejemplo, homólogos) mediante cromatografía, la síntesis in vitro de variantes de enzimas de glicosilación o fosforilación o la producción in vitro de conjugados de enzimas. Otra forma de alterar la hidrofobicidad de una proteína por la vía de glicosilación es generar nuevos sitios de glicosilación sobre la superficie de la enzima. Estas variantes se glicosilarán in vivo durante la expresión.
En algunas modalidades, las propiedades físicas relacionadas con la hidrofobicidad son comparadas a través de las variantes de proteasa en términos de la contribución total por los residuos sustituidos al cambio neto en la hidrofobicidad de la variante resultante relativa con aquella de la enzima precursora. En algunas modalidades, la contribución hidrofóbica total se calcula usando una o más de las muchas escalas de hidrofobicidad de aminoácidos disponibles en la literatura y conocidas por aquellas personas en la técnica, que toman en cuenta la información de estructura primaria, secundaria y/o terciaria de la proteína. En casos cuando las propiedades físicas relacionadas con la hidrofobicidad son comparadas a través de diferentes plegamientos de proteínas en términos de partición de proteínas medidas entre su entorno acuoso nativo y una fase hidrofóbica. Los ejemplos incluyen pero no se limitan a tensión superficial en las inter-fases de aire-agua o heptano-agua, así como también ángulo de contacto y mediciones de humectación entre las fases que contienen substratos acuosos y sólidos. En general, cualquier método adecuado para caracterizar la partición de una proteína entre dos fases es adecuado para el uso en la presente invención, incluyendo determinaciones ópticas (por ejemplo, elipsometría, resonancia de plasmones superficiales, interferometría y/o reflectividad) , acústicas (por ejemplo, microequilibrio de cuarzo-cristal) , fluorescencia, espectroscopia (por ejemplo, infrarrojo de reflexión total atenuado) o concentración (por ejemplo, actividad enzimática) .
Las escalas de carga e hidrofobicidad no son independientes entre sí puesto que los residuos cargados adicionan carácter hidrofílico. De esta manera, antes de seleccionar simplemente una escala sobre otra, algunas modalidades de la presente invención emplean múltiples escalas diferentes (por ejemplo, teórica o experimentalmente determinadas) para identificar dependencias de propiedad física. Las referencias para 23 de las escalas de hidrofobicidad más comúnmente usadas incluyen: hidrofobicidad (Rao y Argos) calcula el parámetro de hélice enterrada en la membrana. (Rao y Argos, Biochim. Biophys . Acta 869:197-214
[1986] ) ; hidrofobicidad (Black and Mould) calcula la hidrofobicidad de aminoácidos L-alfa fisiológicos (Black y Mould, Anal. Biochem. , 193:72-82
[1991]); hidrofobicidad (Bull y Bréese) calcula la hidrofobicidad (sin energía de transferencia a la superficie en kcal/mol) (Bull y Bréese, Arch. Biochem. Biophys. 161:665-670
[1974]); hidrofobicidad (Chothia) calcula la proporción de 95% de residuos enterrados (en 12 proteínas) (Chothia, J. Mol. Biol . , 105:1-14
[1976]); hidrofobicidad (Kyte y Doolittle) calcula la hidrofobicidad (Kyte y Doolittle, J. Mol. Biol., 157:105-132
[1982]); hidrofobicidad (Eisenberg y colaboradores) calcula la escala de hidrofobicidad consenso normalizada (Eisenberg y colaboradores, J. Mol. Biol. 179:125-142
[1984]); hidrofobicidad (Fauchere y Pliska) calcula la escala de hidrofobicidad (pi-r) (Fauchere y Pliska, Eur. J. Med. Chem. , 18:369-375
[1983]); hidrofobicidad (Guy) calcula la escala de hidrofobicidad con base en la energía libre de transferencia (kcal/mol) (Guy, Biophys J. , 47:61-70
[1985]); hidrofobicidad (Janin) calcula la energía libre de transferencia desde adentro hacia afuera de una proteína globular (Janin, Nature 277:491-492
[1979]); hidrofobicidad (Abraham y Leo) calcula la hidrofobicidad (delta Gl/2cal) (Abraham y Leo, Proteins: Structure, Function and Genetics 2:130-152
[1987]); hidrofobicidad (Manavalan y colaboradores) calcula el promedio que circunda la hidrofobicidad (Manavalan y colaboradores, Nature 275:673-674
[1978]); Hidrofobicidad (Miyazawa y colaboradores) calcula la escala de hidrofobicidad (energía de contacto derivada de datos 3D) (Miyazawa y colaboradores, Macromolecules 18:534-552
[1985]); hidrofobicidad (Aboderin) calcula las movilidades de aminoácidos sobre un papel de cromatografía (RF) (Aboderin, Int. J. Biochem., 2:537-544
[1971]); hidrofobicidad HPLC (Parker y colaboradores) calcula la escala de hidrofilicidad derivada de tiempos de retención de péptido HPLC (Parker y colaboradores, Biochem., 25:5425-5431
[1986]); Hphob. HPLC pH3.4 calcula los índices de hidrofobicidad en pH 3.4 determinado por el HPLC (Cowan y Whittaker, Peptide Res., 3:75-80
[1990]); Hphob. HPLC pH7.5 calcula los índices de hidrofobicidad en pH 7.5 determinados por el HPLC (Cowan y Whittaker, Peptide Res., 3:75-80
[1990]); hidrofobicidad (Rose y colaboradores) (AA) calcula la pérdida de área funcional media (f) [área promedio enterrada/área de estado estándar] (Rose y colaboradores, Science 229:834-838 [1985)); e hidrofobicidad (Roseman) calcula la escala de hidrofobicidad (pi-r) (Roseman, J. Mol. Biol., 200:513-522 [1988) ) .
Otras propiedades físicas que son comparadas a través de proteasas y variantes de las mismas con el mismo plegamiento de proteínas o a través de diferentes plegamientos de proteínas incluyen pero no se limitan a propiedades físicas relacionadas con la solubilidad, propiedades físicas relacionadas con el tamaño y temperaturas de fusión de proteínas. Las propiedades físicas relacionadas con la solubilidad son comparadas a través de diferentes plegamientos de proteínas en términos de escalas tanto de carga como de hidrofobicidad previamente descritas. En general, cualquier cantidad termodinámica o cinética que caracteriza interacciones de proteína-proteína contra proteína-solvente es adecuada para el uso con los métodos de la presente invención. Por ejemplo segundo coeficiente viral {Véase, Wilson, Acta Crystallographica, D50: 361-365
[1994]), parámetro chi , presión osmótica y actividad o coeficientes de fugacidad que reflejan desviaciones del comportamiento de mezclado ideal encuentran uso (Véase por ejemplo, Reid y colaboradores, "The Properties of Gases and Liquids" , 4th Ed. McGraw-Hill,
[1987]). Las propiedades físicas relacionadas con el tamaño son comparadas a través de los plegamientos de proteínas diferentes que usan cualquier medio experimental adecuado para determinar las dimensiones de proteínas o polímeros. El tamaño se infiere del peso molecular usando correlaciones comúnmente disponibles entre la conformación de proteína o polímero (enrollado, globular, ramificado) , su peso molecular y radio hidrodinámico o de giro. Las técnicas adecuadas para la determinación del tamaño o peso molecular incluyen, pero no se limitan a dispersión de luz estática y dinámica, electroforesis en gel, espectroscopia y cromatografía de masas. Alternativamente, el tamaño se estima fácilmente a partir del conocimiento de las estructuras de cristal proteínicas experimentalmente determinadas o los modelos de homología estructurales .
Las temperaturas de fusión de la proteína (Tm) se determinan típicamente a través de la supervisión de una propiedad reportera física a través de un escaneo de temperatura. Los métodos adecuados incluyen, pero no se limitan a calorimetría de exploración diferencial, dicroísmo circular, dispersión de luz dinámica y espectroscopia de UV visible .
Aplicaciones para las Enzimas de Serina Proteasa Se contemplan las mutaciones combinables creadas para generar las variantes de proteasa para servir para aumentar el índice de desempeño por ejemplo localizar el óptimo de desempeño, para por lo menos una propiedad de enzima deseada en una variedad de aplicaciones. La ubicación del óptimo de desempeño/propiedad se afecta en gran medida por el medio usado (por ejemplo, formulación detergente, pH, resistencia iónica, etcétera) , así como también la carga neta y distribución de carga de los residuos de aminoácidos de la enzima de interés. De esta manera, se contempla que exista una enzima óptima para diferentes formulaciones de pH variante, resistencia iónica, tipo y relación de tensioactivo, mejoradores y quelantes, todos de los cuales afectan los fenómenos electrostáticos. El uso de mezclas de enzimas, en las cuales cada miembro de la mezcla provee un diferente óptimo de carga, se contempla para la producción de formulaciones adecuadas para una amplia gama de condiciones (por ejemplo, proteasas en formulaciones detergentes vendidas en diferentes geografías o locales que tienen diferencias en la dureza del agua. El uso de mezclas de enzima, en las cuales cada miembro de la mezcla sobresale en la limpieza de una mancha diferente, también se contempla para la producción de formulaciones adecuadas para la limpieza de una amplia variedad de manchas. Adicionalmente , el uso de mezcla de enzimas, en las cuales cada miembro de la mezcla provee un óptimo de carga diferente, se contempla en casos donde el substrato de enzima se somete por sí mismo a cambios de carga durante la reacción enzimática.
Aunque se describe en este documento en relación con las proteasas y manchas de sangre, leche y tinta, se contempla que las variantes de proteasas de la presente invención se optimicen para cualquier interacción de enzima-substrato en cualquiera de una variedad de medios de reacción (es decir condiciones) dictados por la aplicación por ejemplo aplicaciones de limpieza.
Como se describe con mayor detalle en este documento, las proteasa variantes de la presente invención tienen características importantes que las hacen muy adecuadas para ciertas aplicaciones. Por ejemplo, en algunas modalidades preferidas, las proteasas variantes de la presente invención tienen carga e/o hidrofobicidad alteradas como son comparadas con algunas proteasas actualmente útiles. De esta manera, estas proteasas encuentran uso particular en composiciones de limpieza. De hecho, bajo ciertas condiciones de lavado, las presentes proteasas exhiben expresión comparativa o mejorada y/o actividad de remoción de manchas como son comparadas con las proteasas de subtilisina actualmente usadas. De esta manera, se contempla que las composiciones de limpieza y/o enzimas de la presente invención se proporcionen en una variedad de composiciones de limpieza. De esta manera, las presentes proteasas encuentran uso en varias composiciones de limpieza, así como también en aplicaciones de alimentación de animales, procesamiento de piel (por ejemplo, rendido), hidrólisis de proteínas y en usos textiles. Las proteasas identificadas también encuentran uso en aplicaciones para el cuidado personal.
De hecho, las variantes de proteasa de la presente invención encuentran uso en una variedad de aplicaciones industriales, en particular dentro de las industrias de limpieza, desinfectantes, pienso para animales, y textiles/para piel. En algunas modalidades, la(s) proteasa (s) de la presente invención se combinan con detergentes, mej oradores, agentes blanqueadores y otros ingredientes convencionales para producir una variedad de composiciones de limpieza novedosas útiles en la lavandería y otras técnicas de limpieza tal como, por ejemplo, detergentes para ropa (tanto en polvo como líquidos) , pre-remoj ados para ropa, todos los blanqueadores de telas, detergentes para lavaplatos automáticos (tanto líquidos como en polvo) , limpiadores domésticos, particularmente aplicaciones de jabón en barra y líquido y limpiadores de drenaje. Además, las proteasas variantes encuentran uso en la limpieza de lentes de contacto, así como también otros artículos, al poner en contacto estos materiales con una solución acuosa de la composición de limpieza. Además estas proteínas variantes se pueden usar, por ejemplo en hidrólisis de péptidos, tratamiento residuales, aplicaciones textiles, limpieza de dispositivos médicos, remoción de biopelícula y como enzimas de fusión-escisión en la producción de proteínas, etcétera. La composición de estos productos no es crítica a la presente invención, siempre y cuando la(s) proteasa(s) variante (s) mantenga su función en el entorno de uso. En algunas modalidades, las composiciones se preparan fácilmente al combinar una cantidad efectiva de limpieza de la variante de proteasa o una composición de enzimas que comprende la preparación de enzimas de proteasa variante con los componentes convencionales de estas composiciones en sus cantidades reconocidas en la técnica.
Composiciones de Limpieza A menos que se observe de otra manera, todos los niveles de componente o composición proporcionados en este documento se hacen con referencia al nivel activo de ese componente o composición, y son exclusivos de impurezas, por ejemplo, solventes residuales o subproductos, los cuales puede estar presentes en fuentes comercialmente disponibles. Los pesos de los componentes de enzimas se basan en la proteína activa total. Todos los porcentajes y relaciones se calculan en peso a menos que se indique de otra manera. Todos los porcentajes y relaciones se calculan con base en la composición total a menos que se indique de otra manera. En las composiciones detergentes ejemplificadas, los niveles de enzimas se expresan por la enzima pura en peso de la composición total y a menos que se especifique de otra manera, los ingredientes detergentes se expresan en peso de las composiciones totales.
Como se indica en este documento, en algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden además materiales adjuntos que incluyen, pero no se limitan a, tensioactivos , mejoradores, blanqueadores, activadores de blanqueado, catalizadores de blanqueado, otras enzimas, sistemas estabilizantes de enzimas, quelantes abrillantadores ópticos, polímeros de liberación de manchas, agentes de transferencia de tinte, dispersantes, supresores de jabonaduras, tintes, perfumes, colorantes, sales rellenadoras , hidrótropos, fotoactivadores , fluorescentes, acondicionadores de telas, tensioactivos hidrolizables , conservadores, antioxidantes, agentes antiencogimiento, agentes anti -arrugas, germicidas, fungicidas, manchas de color, silvercare, agentes anti-tizne y/o anti-corrosión, fuentes de alcalinidad, agentes solubilizantes , portadores, auxiliares de procesamiento, pigmentos, y agentes de control de pH (Véase por ejemplo, las Patentes de E.U.A. Nos. 6,610,642, 6,605,458, 5,705,464, 5,710,115, 5,698,504, 5,695,679, 5,686,014 y 5,646,101, todas de las cuales se incorporan en este documento a manera de referencia. Las modalidades de los materiales de composición de limpieza específicos se ejemplifican con detalle a continuación. En modalidades en las cuales los materiales adjuntos de limpieza no son compatibles con las proteasas variantes de la presente invención en las composiciones de limpieza, luego los métodos adecuados para mantener los materiales adjuntos de limpieza y la(s) proteasa(s) separados (es decir, no en contacto entre sí) hasta que es apropiada la condición de los dos componentes. Estos métodos de separación incluyen cualquier método adecuado conocido en la técnica (por ejemplo, cápsulas de gel, encapsulación, tabletas, separación física, etcétera) .
Las composiciones de limpiezas de la presente invención se emplean ventajosamente por ejemplo, en aplicaciones de lavandería, limpieza de superficies duras, aplicaciones de lavaplatos, así como también aplicaciones cosméticas tales como dentaduras, dientes, cabello y piel. Además, debido a las únicas ventajas de efectividad incrementada en soluciones de temperatura más baja, las enzimas de la presente invención son idealmente adecuadas para aplicaciones de lavandería. Adicionalmente , las enzimas de la presente invención encuentran uso en composiciones granulares y líquidas.
Las proteasas variantes de la presente invención también encuentran uso en productos aditivos de limpieza. En algunas modalidades, encuentran uso en aplicaciones de limpieza en solución de temperatura baja. En algunas modalidades, la presente invención proporciona productos de aditivos de limpieza que incluyen por lo menos una enzima de la presente invención que es idealmente adaptada para la inclusión en un proceso de lavado cuando se desea efectividad blanqueadora adicional. Estos casos incluyen, pero no se limitan a aplicaciones de limpieza en solución de temperatura baja. En algunas modalidades, el producto aditivo está en su forma más simple una o más proteasas. En algunas modalidades, el aditivo se empaca en forma de dosificación para la adición a un proceso de limpieza. En algunas modalidades, el aditivo se empaca en forma de dosificación para la adición a un proceso de limpieza donde se emplea una fuente de perioxígeno y se desea efectividad blanqueadora incrementada. Cualquier forma unitaria de dosificación individual adecuada encuentra uso con la presente invención, incluye pero no se limita a pildoras, tabletas, cápsulas de gel, u otras unidades de dosificación individuales tales como polvos o líquidos pre-medidos. En algunas modalidades, se incluyen material (es) rellenador (es) o portador (es) para incrementar el volumen de estas composiciones. Los materiales rellenadores o portadores incluyen, pero no se limitan a, varias sales de sulfato, carbonato y silicato así como también talco, arcilla y similares. Los materiales rellenadores o portadores adecuados para composiciones líquidas incluyen, pero no se limitan a agua, o alcoholes primarios y secundarios de peso molecular bajo incluyendo polioles y dioles. Los ejemplos de estos alcoholes incluyen, pero no se limitan a, metanol, etanol, propanol e isopropanol. En algunas modalidades, las composiciones contienen de aproximadamente 5% a aproximadamente 90% de estos materiales. Los rellenadores ácidos encuentran uso para reducir el pH. Alternativamente, en algunas modalidades, el aditivo de limpieza incluye ingredientes adjuntos, como se describe más completamente a continuación.
Las presentes composiciones de limpieza y los aditivos de limpieza requieren una cantidad efectiva de por lo menos una de las variantes de proteasa proporcionadas en este documento, juntas o en combinación con otras proteasas y/o enzimas adicionales. El nivel requerido de enzima se logra por la adición de una o más variantes de proteasa de la presente invención. Típicamente las presentes composiciones de limpieza comprenderán por lo menos aproximadamente 0.0001 por ciento en peso, de aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 10, de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 1, o aún de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.1 por ciento en peso de por lo menos una de las proteasas variantes de la presente invención.
Se formulan típicamente las composiciones de limpieza en este documento tal que, durante el uso en operaciones de limpieza acuosas, el agua de lavado tendrá un pH de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 11.5 o aún de aproximadamente 7.5 a aproximadamente 10.5. Las formulaciones de producto líquido se formulan típicamente para tener un pH neutro de aproximadamente 3.0 a aproximadamente 9.0 o aún de aproximadamente 3 a aproximadamente 5. Los productos para ropa granulares se formulan típicamente para tener un pH de aproximadamente 9 a , aproximadamente 11. Las técnicas para controlar el pH en niveles de uso recomendados incluyen el uso de soluciones amortiguadoras, álcalis, ácidos, etcétera, y son bien conocidos por aquellas personas expertas en la técnica .
Las composiciones de limpieza con pH bajo adecuadas tienen típicamente un pH neto de aproximadamente 3 a aproximadamente 5, y están típicamente libres de tensioactivos que se hidrolizan en este entorno de pH. Estos tensioactivos incluyen tensioactivos de alquilsulfato de sodio que comprenden por lo menos una porción de óxido de etileno o aún de aproximadamente 1 a aproximadamente 16 moles de óxido de etileno. Estas composiciones de limpieza comprenden típicamente una cantidad suficiente de un modificador de pH, tal como hidróxido de sodio, monoetanolamina o ácido clorhídrico, para proporcionar a esta composición de limpieza con un pH neto de aproximadamente 3 a aproximadamente 5. Estas composiciones comprenden típicamente por lo menos una enzima estable en ácido. En algunas modalidades, las composiciones son líquidos, mientras que en otras modalidades son sólidos. El pH de estas composiciones líquidas se mide típicamente como un pH neto. El pH de estas composiciones sólidas se mide como una solución de sólidos al 10% de la composición en donde el solvente es agua destilada. En estas modalidades, todas las mediciones de pH se toman a 20°C, a menos que se indique de otra manera.
En algunas modalidades, cuando la(s) proteasa (s) variante (s) se emplea (n) en una composición granular o líquida es deseable para la proteasa variante que esté en la forma de una partícula encapsulada para proteger la proteasa variante de otros componentes de la composición granular durante almacenamiento. Además, la encapsulación también es un medio para controlar la disponibilidad de la proteasa variante durante el proceso de limpieza. En algunas modalidades, la encapsulación aumenta el desempeño de la(s) proteasa (s) variante (s) y/o enzimas adicionales. En este aspecto, las proteasas variantes de la presente invención se encapsulan con cualquier material encapsulante adecuado conocido en la técnica. En algunas modalidades, el material encapsulante encapsula típicamente por lo menos parte del catalizador para la(s) proteasa (s) variante (s) de la presente invención. Típicamente, el material encapsulante es soluble en agua y/o dispersable en agua. En algunas modalidades, el material encapsulante tiene una temperatura de transición vitrea (Tg) de 0°C o superior. La temperatura de transición vitrea se describe con más detalle en el documento O 97/11151. El material encapsulante se selecciona típicamente de que consiste de carbohidratos, gomas naturales o sintéticas, quitina, quitosan, celulosa y derivados de celulosa, silicatos, fosfatos, boratos, alcohol polivinílico, polietilenglicol , ceras de parafina y combinaciones de los mismos. Cuando el material encapsulante es un carbohidrato, se selecciona típicamente de monosacáridos , oligosacáridos , polisacáridos , y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades típicas, el material encapsulante es un almidón (Véase por ejemplo, los documentos EP 0 922 499; US 4,977,252; US 5,354,559, y US 5,935,826). En algunas modalidades, el material encapsulante es una microesfera hecha de plástico tal como termoplásticos , acrilonitrilo, metacrilonitrilo, poliacrilonitrilo, polimetacrilonitrilo y mezclas de los mismos; microesferas comercialmente disponibles que encuentran uso incluyen, pero no se limitan a aquellas suministradas por EXPA CELMR (Stockviksverken, Suiza), y PM 6545, PM 6550, P 7220, PM 7228, EXTENDOSPHERESMR, LUXSILMR, Q-CELMR, y SPHERICELMR (PQ Corp., Valley Forge, PA) .
Como se describe en este documento, las proteasas variantes de la presente invención encuentran uso particular en la industria de limpieza, incluyendo, pero no limitado a detergentes para ropa y platos. Estas aplicaciones colocan las enzimas bajo varios estreses ambientales. Las proteasas variantes de la presente invención proporcionan ventajas sobre muchas enzimas actualmente usadas, debido a su estabilidad bajo varias condiciones.
De hecho, existe una variedad de condiciones de lavado que incluyen formulaciones detergentes variantes, volúmenes de agua de lavado, temperaturas de agua de lavado, y duraciones de tiempo de lavado, a las cuales las proteasas implicadas en el lavado se exponen. Además, las formulaciones detergentes usadas en diferentes áreas geográficas tienen diferentes concentraciones de sus componentes relevantes presentes en el agua de lavado. Por ejemplo, los detergentes europeos tienen típicamente de manera aproximada 4500-5000 ppm de componentes detergentes en el agua de lavado, mientras que los detergentes japoneses tienen típicamente de manera aproximada 667 ppm de componentes detergentes en el agua de lavado. En Norte América, particularmente los Estados Unidos, los detergentes tienen típicamente de manera aproximada 975 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado .
Un sistema de concentración detergente baja incluye detergentes donde menos que aproximadamente 800 ppm de componentes detergentes están presentes en el agua de lavado. Los detergentes japoneses se consideran típicamente un sistema de concentración detergente baja ya que tienen aproximadamente 667 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado.
Una concentración detergente media incluye detergentes donde entre aproximadamente 800 ppm y aproximadamente 2000 ppm de componentes detergentes están presentes en el agua de lavado. Los detergentes norte americanos se consideran generalmente que son sistemas de concentración detergente media ya que tienen aproximadamente 975 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado. Brasil tiene típicamente de manera aproximada 1500 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado.
Un sistema de concentración detergente alta incluye detergentes donde mayor que aproximadamente 2000 ppm de componentes detergentes are presentes en el agua de lavado. Los detergentes europeos se consideran generalmente que son sistemas de concentración detergentes alta ya que tienen aproximadamente 4500-5000 ppm de componentes detergentes en el agua de lavado.
Los detergentes de América latina son en general detergentes mejoradores de fosfato con jabonaduras altas y el intervalo de detergentes usados en América Latina puede encontrarse en concentraciones detergentes tanto medias como altas ya que varían de 1500 ppm a 6000 ppm de componentes detergentes en el agua de lavado. Como se menciona anteriormente, Brasil tiene típicamente de manera aproximada 1500 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado. Sin embargo, otras geografías de detergentes mej oradores de fosfato con jabonaduras altas, no limitados a otros países de latino América, pueden tener sistemas de concentración detergente alta de hasta aproximadamente 6000 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado .
En vista de lo anterior, es evidente que las composiciones de concentraciones detergentes en soluciones de lavado típicas por todo el mundo varían de menor que aproximadamente 800 ppm de composición detergente ("geografías de concentración detergente baja"), por ejemplo aproximadamente 667 ppm en Japón, a entre aproximadamente 800 ppm a aproximadamente 2000 ppm ("geografías de concentración detergente media"), por ejemplo aproximadamente 975 ppm en Estados Unidos y aproximadamente 1500 ppm en Brasil, a mayor que aproximadamente 2000 ppm ("geografías de concentración detergente altas"), por ejemplo aproximadamente 4500 ppm a aproximadamente 5000 ppm en Europa y aproximadamente 6000 ppm en geografías de mejoradores de fosfato de jabonaduras altas.
Las concentraciones de las soluciones de lavado típicas se determinan empíricamente. Por ejemplo, en los Estados Unidos, una máquina de lavado típica mantiene un volumen de aproximadamente 64.4 L de solución de lavado. Por consiguiente, a fin de obtener una concentración de aproximadamente 975 ppm de detergente dentro de la solución de lavado se deben agregar aproximadamente 62.79 g de composición detergente a los 64.4 L de solución de lavado. Esta cantidad es la cantidad típica medida en el agua de lavado por el consumidor usando la tasa de medición proporcionada con el detergente.
Como ejemplo adicional, las diferentes geografías usan diferentes temperaturas de lavado. La temperatura del agua de lavado en Japón es típicamente menor que aquella usada en Europa. Por ejemplo, la temperatura del agua de lavado en Norteamérica y Japón es típicamente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 30°C (por ejemplo, aproximadamente 20°C) , mientras que la temperatura del agua de lavado en Europa es típicamente entre aproximadamente 30 y aproximadamente 60°C (por ejemplo, aproximadamente 40°C) . Sin embargo, en el interés de ahorrar energía, muchos consumidores están cambiando para usar lavado de agua fría. Además, en algunas regiones adicionales, el agua fría se usa típicamente para lavandería, así como también aplicaciones para lavar platos. En algunas modalidades, el "lavado con agua fría" de la presente invención usa el lavado a temperaturas de aproximadamente 10°C a aproximadamente 40°C, o de aproximadamente 10 °C a aproximadamente 30°C, o de aproximadamente 15°C a aproximadamente 25°C, así como también otras combinaciones dentro del intervalo de aproximadamente 10°C a aproximadamente 40°C. Como ejemplo adicional, diferentes geografías tienen típicamente diferente dureza de agua. La dureza de agua se describe usualmente en términos de los granos por galón mezclados Ca2+/Mg2+. La dureza es una medición de la cantidad de calcio (Ca2+) y magnesio (Mg2+) en el agua. La mayoría del agua en los Estados Unidos es dura, pero el grado de dureza varía. El agua moderadamente dura (60-120 ppm) a dura (121-181 ppm) tiene 60 a 181 partes por millón (partes por millón convertidos a granos por galón de E.U.A. es ppm # dividido por 17.1 granos iguales por galón) de minerales duros.
Agua Granos por galón Partes por millón Blanda menos de 1.0 menos de 17 Ligeramente dura 1.0 a 3.5 17 a 60 Moderadamente dura 3.5 a 7.0 60 a 120 Dura 7.0 a 10.5 120 a 180 Muy dura mayor que 10.5 mayor que 180 La dureza del agua europea es típicamente mayor que aproximadamente 10.5 (por ejemplo aproximadamente 10.5 a aproximadamente 20.0) granos por galón mezclados Ca2+/Mg2+ (por ejemplo, aproximadamente 15 granos por galón mezclados Ca2+/Mg2+) . La dureza del agua americana es típicamente mayor que la dureza del agua japonesa, pero menor que la dureza del agua europea. Por ejemplo, la dureza del agua norteamericana puede ser entre aproximadamente 3 a aproximadamente 10 granos, aproximadamente 3 a aproximadamente 8 granos o aproximadamente 6 granos. La dureza del agua japonesa es típicamente más baja que la dureza del agua norteamericana, usualmente menor que aproximadamente 4, por ejemplo aproximadamente 3 granos por galón mezclados Ca2+/Mg2+.
Por consiguiente, en algunas modalidades, la presente invención proporciona proteasas variantes que muestran sorprendentemente el desempeño de lavado en por lo menos un conjunto de condiciones de lavado (por ejemplo, temperatura del agua, dureza del agua y/o concentración detergente) . En algunas modalidades, las proteasas variantes de la presente invención son comparables en el desempeño de lavado para otras proteasas de subtilisina. En algunas modalidades, las proteasas variantes de la presente invención exhiben desempeño de lavado amentado como son comparadas con las proteasas de subtilisina actualmente comercialmente disponibles. De esta manera, en algunas modalidades preferidas de la presente invención, las proteasas variantes proporcionadas en este documento exhiben estabilidad oxidante aumentada, estabilidad térmica aumentada, capacidades de limpieza aumentadas bajas varias condiciones, y/o estabilidad quelante mejorada. Además, las proteasas variantes de la presente invención encuentran uso en composiciones de limpieza que no incluyen detergentes, nuevamente ya sea solas o en combinación con mej oradores y estabilizantes.
En algunas modalidades de la presente invención, las composiciones de limpieza comprenden por lo menos una proteasa variante de la presente invención en nivel de aproximadamente 0.00001% a aproximadamente 10% en peso de la composición y el resto (por ejemplo, aproximadamente 99.999% a aproximadamente 90.0%) que comprende materiales adjuntos de limpieza en peso de la composición. En otros aspectos de la presente invención, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden por lo menos una proteasa variante en un nivel de aproximadamente 0.0001% a aproximadamente 10%, de aproximadamente 0., 001% a aproximadamente 5%, de aproximadamente 0. 001% a aproximadamente 2*o / de aproximadamente 0. 005% a aproximadamente 0.5% en peso de la composición y el resto de la composición de limpieza (por ejemplo, de aproximadamente 99.9999% a aproximadamente 90.0%, de aproximadamente 99.999% a aproximadamente 98%, de aproximadamente 99.995% a aproximadamente 99.5% en peso) que comprende materiales adjuntos de limpieza.
En algunas modalidades, las composiciones de limpiezas de la presente invención comprenden una o más enzimas detergentes adicionales, las cuales proporcionan desempeño de limpieza y/o cuidado de telas y/o beneficios de lavado de platos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen pero no se limitan a, hemicelulasas , celulasas, peroxidasas, proteasas, xilanasas, lipasas, fosfolipasas , esterasas, cutinasas, pectinasas, pectato-liases , mananasas, queratinasas , reductasas, oxidasas, fenoloxidasas , lipoxigenasas , ligninasas, pululanasas, tanasas, pentosanasas , malanasas, ß-glucanasas , arabinosidasas , hialuronidasa , condroitinasa, lacasa, y amilasas, o mezclas de las mismas. En algunas modalidades, se usa una combinación de enzimas (es decir, un "cóctel") que comprende enzimas aplicables convencionales similares a proteasa, lipasa, cutinasa y/o celulasa en conjunción con amilasa.
Además de las variantes de proteasa proporcionadas en este documento, cualquier otra proteasa adecuada encuentra uso en las composiciones de la presente invención. Proteasas adecuadas incluyen aquellas de origen animal, vegetal o microbiano. En algunas modalidades particularmente preferidas, se usan proteasas microbianas. En algunas modalidades, se incluyen mutantes química o genéticamente modificados. En algunas modalidades, la proteasa es una serina proteasa, de manera preferible una proteasa microbiana alcalina o una proteasa similar a tripsina. Los ejemplos de proteasas alcalinas incluyen subtilisinas , especialmente aquellas derivadas de Bacillus (por ejemplo, subtilisina, lentus, amyloliquefaciens, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 y subtilisina 168) . Los ejemplos adicionales incluyen aquellas proteasas mutantes descritas en las patentes de E.U.A. Nos. RE 34,606, 5,955,340, 5,700,676, 6,312,936, y 6,482,628, todas de las cuales se incorporan en este documento a manera de referencia. Los ejemplos de proteasas adicionales incluyen, pero no se limitan a tripsina (por ejemplo, de origen porcino o bovino) , y la proteasa de Fusarium descrita en el documento WO 89/06270. En algunas modalidades, las enzimas de proteasa comercialmente disponibles que encuentran uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a MAXATASEMR, MAXACALMR, MAXAPEMMR, OPTICLEANMR, 0PTIMASEMR, PROPERASEMR, PURAFECTMR PROPERASE , EXCELLASEl , PURAFAST , y PURAFECT OXP (Genencor) ; ALCALASEMR, SAVINASEMR, PRIMASEMR, DURAZYMMR, POLARZYMEMR, OVOZYMEMR, LIQUANASEMR, KA NASEMR, NEUTRASEMR, RELASEM y ESPERASEMR (Novozymes) ; y BLAPMr (Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien, Duesseldorf, Alemania. Se describen varias proteasas en los documentos W095/23221, WO 92/21760, Solicitud de Patente de E.U.A. No. 2008/0090747, y Patentes de E.U.A. Nos. 5,801,039, 5,340,735, 5,500,364, 5,855,625, US RE 34,606, 5,955,340, 5,700,676, 6,312,936, y 6,482,628, y varias otras patentes. En algunas modalidades, las metaloproteasas encuentran uso en la presente invención, incluyendo, pero no limitado a la metaloproteasa neutra descrita en el documento WO 07/044993.
Además, cualquier lipasa adecuada encuentra uso en la presente invención. Las lipasas adecuadas incluyen, pero no se limitan a aquellas de origen bacteriano o fúngico. Mutantes química o genéticamente modificados son incluidos por la presente invención. Los ejemplos de lipasas útiles incluyen lipasa de Humicola lanuginosa (Véase por ejemplo, los documentos EP 258 068 y EP 305 216) , lipasa de Rhizo ucor miehei (Véase por ejemplo, el documento EP 238 023) , lipasa de Candida, tal como lipasa de C. antárctica (por ejemplo, la lipasa de A o B de C. antárctica; Véase por ejemplo, el documento EP 214 761) , lipasas de Pseudomonas tal como lipasa de P. alcaligenes y lipasa de P. pseudoalcaligenes (Véase por ejemplo, el documento EP 218 272) , lipasa de P. cepacia (Véase por ejemplo, el documento EP 331 376) , lipasa de P. stutzeri (Véase por ejemplo, el documento GB 1,372,034), lipasa de P. fluorescens, lipasa de Bacillus (por ejemplo, lipasa de B. subtilis [Dartois y colaboradores, Biochem. Biophys. Acta 1131:253-260
[1993]); lipasa de B. stearothermophilus [Véase por ejemplo, el documento JP 64/744992]; y lipasa de B. pumilus [Véase por ejemplo, el documento WO 91/16422]).
Adicionalmente , una variedad de lipasas clonadas encuentran uso en algunas modalidades de la presente invención, incluyendo pero no limitado a lipasa de Penicillium camembertii (Véase, Yamaguchi y colaboradores, Gene 103:61-67
[1991]), lipasa de Geofcricum candidum (Véase, Schimada y colaboradores, J. Biochem., 106:383-388
[1989]), y varias lipasas de Rhizopus tal como lipasa de R. dele ar (Véase, Hass y colaboradores, Gene 109:117-113
[1991]), una lipasa de R. niveus (Kugimiya y colaboradores, Biosci. Biotech. Biochem. 56:716-719
[1992]) y lipasa de R. oryzae.
Otros tipos de enzimas lipolíticas tales como cutinasas también encuentran uso en algunas modalidades de la aprésente invención, incluyendo pero no limitado a la cutinasa derivada de Pseudomonas mendocina (Véase, el documento WO 88/09367) , y la cutinasa derivadas de Fusarium solani pisi (Véase, el documento WO 90/09446) .
Las lipasas adecuadas adicionales incluyen lipasas comercialmente disponibles tales como MI LIPASEMR, LUMA FASTMR, y LIPOMAXMR (Genencor) ; LIPOLASEMR y LIPOLASEMR ULTRA (Novozymes) ; y LIPASE PMR "Amano" (Amano Pharmaceutical Co. Ltd. , Japón) .
En algunas modalidades de la presente invención, las composiciones de limpiezas de la presente invención comprenden además lipasas en un nivel de aproximadamente 0.00001% a aproximadamente 10% de lipasa adicional en peso de la composición y el resto de materiales adjuntos de limpieza en peso de la composición. En otros aspectos de la presente invención, las composiciones de limpieza de la presente invención también comprenden lipasas en un nivel de aproximadamente 0.0001% a aproximadamente 10%, de aproximadamente 0.001% a aproximadamente 5%, de aproximadamente 0.001% a aproximadamente 2%, de aproximadamente 0.005% a aproximadamente 0.5% de lipasa en peso de la composición.
En algunas modalidades de la presente invención, cualquier amilasa adecuada encuentra uso en la presente invención. En algunas modalidades, cualquier amilasa (por ejemplo, alfa y/o beta) adecuada para el uso en soluciones alcalinas también encuentran uso. Las amilasas adecuadas incluyen, pero no se limitan a aquellas de origen bacteriano o fúngico. Mutantes química o genéticamente modificados se 9 incluyen en algunas modalidades. Las amilasas que encuentran uso en la presente invención, incluyen, pero no se limitan a a-amilasas obtenidas de B. licheniformis {Véase por ejemplo, el documento GB 1,296,839). Las amilasas comercialmente disponibles que encuentran uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a DURAMYLMR, TERMAMYLMR, FUNGAMYLMR, STAINZYMEMR, STAINZYME PLUSMR, STAINZYME ULTRA , NATALASEMR, y BANMR (Novozymes) , así como también POWERASEMR, RAPIDASEMR y MAXAM YLMR P (Genencor) .
En algunas modalidades de la presente invención, las composiciones de limpiezas de la presente invención comprenden además amilasas en un nivel de aproximadamente 0.00001% a aproximadamente 10% de amilasa adicional en peso de la composición y el resto de materiales adjuntos de limpieza en peso de la composición. En otros aspectos de la presente invención, las composiciones de limpiezas de la presente invención también comprenden amilasas en un nivel de aproximadamente 0.0001% a aproximadamente 10%, d aproximadamente 0.001% a aproximadamente 5%, de aproximadamente 0.001 % a aproximadamente 2%, aproximadamente 0.005% a aproximadamente 0.5% de amilasa en peso de la composición .
En algunas modalidades adicionales, cualquier celulasa adecuada encuentra uso en las composiciones de limpieza de la presente invención. Las celulasas adecuadas incluyen, pero no se limitan a aquellas de origen bacteriano fúngico. Mutantes química o genéticamente modificados se incluyen en algunas modalidades. Las celulasas adecuadas incluyen, pero no se limitan a celulasas de Humicola insolens (Véase por ejemplo, la Patente de E.U.A. No. 4,435,307). Las celulasas especialmente adecuadas son las celulasas que tienen beneficios para el cuidado del color {Véase por ejemplo, el documento EP 0 495 257) . Las celulasas comercialmente disponibles que encuentran uso en la presente incluyen, pero no se limitan a CELLUZYMEMR, CAREZYMEMR (Novozymes) , y KAC-500(B)MR (Kao Corporation). En algunas modalidades, las celulasas se incorporan como porciones o fragmentos de celulasas de tipo silvestre o variantes maduras, en donde una porción de la N-terminal se suprime (Véase por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 5,874,276). En algunas modalidades, las composiciones de limpiezas de la presente invención comprenden además celulasas en un nivel de aproximadamente 0.00001% a aproximadamente 10% de celulasa adicional en peso de la composición y el resto de materiales adjuntos de limpieza en peso de la composición. En otros aspectos de la presente invención, las composiciones de limpieza de la presente invención también comprenden celulasas en un nivel de aproximadamente 0.0001% a aproximadamente 10%, de aproximadamente 0.001% a aproximadamente 5%, de aproximadamente 0.001% a aproximadamente 2%, de aproximadamente 0.005% a aproximadamente 0.5% de celulasa en peso de la composición.
Cualquier mananasa adecuada para el uso en las composiciones detergentes también encuentra uso en la presente invención. Las mananasas adecuadas incluyen, pero no se limitan a aquellas de origen bacteriano fúngico. Mutantes química o genéticamente modificados e incluyen en algunas modalidades. Varias mananasas son conocidas las cuales encuentran uso en la presente invención {Véase por ejemplo, U.S. Patente de E.U.A. No. 6,566,114, Patente de E.U.A. No.6 , 602 , 842 , y Patente de E.U.A. No. 6,440,991, todas de las cuales se incorporan en este documento a manera de referencia). En algunas modalidades, las composiciones de limpiezas de la presente invención comprenden además mananasas en un nivel de aproximadamente 0.00001% a aproximadamente 10% de mananasa adicional en peso de la composición y el resto de materiales adjuntos de limpieza en peso de la composición. En otros aspectos de la presente invención, las composiciones de limpieza de la presente invención también comprenden mananasas en un nivel de aproximadamente 0.0001% a aproximadamente 10%, de aproximadamente 0.001% a aproximadamente 5%, de aproximadamente 0.001% a aproximadamente 2%, de aproximadamente 0.005% a aproximadamente 0.5% de mananasa en peso de la composición.
En algunas modalidades, las peroxidasas se usan en combinación con peróxido de hidrógeno o una fuente del mismo (por ejemplo, un percarbonato, perborato o persulfato) en las composiciones de la presente invención. En algunas modalidades alternativas, las oxidasas se usan en combinación con oxígeno. Ambos tipos de enzimas se usan para "blanqueamiento en solución" (es decir, para evitar la transferencia de un tinte textil de una tela teñida a otra tela cuando las telas se lavan conjuntamente en un licor de lavado) , de manera preferible junto con un agente mejorador (Véase por ejemplo, los documentos WO 94/12621 y 95/01426) . Peroxidasas/oxidasas adecuadas incluyen, pero no se limitan a aquellas de origen vegetal, bacteriano o fúngicos. Mutantes química o genéticamente modificados se incluyen en algunas modalidades. En algunas modalidades, las composiciones de limpiezas de la presente invención comprenden además enzimas peroxidasa y/u oxidasa de aproximadamente 0.00001% a aproximadamente 10% de peroxidasa y/o oxidasa adicional en peso de la composición y el resto de materiales adjuntos de limpieza en peso de la composición. En otros aspectos de la presente invención, las composiciones de limpieza de la presente invención también comprenden enzimas peroxidasa y/u oxidasa en un nivel de aproximadamente 0.0001% a aproximadamente 10%, de aproximadamente 0.001% a aproximadamente 5%, de aproximadamente 0.001% a aproximadamente 2%, de aproximadamente 0.005% a aproximadamente 0.5% de enzimas peroxidasa y/u oxidasa en peso de la composición.
En algunas modalidades, enzimas adicionales encuentran uso, incluyendo pero no limitado a perhidrolasas {Véase por ejemplo, el documento WO 05/056782) . Además, en algunas modalidades particularmente preferidas, las mezclas de las enzimas mencionadas anteriormente se incluyen en este documento, en particular una o más proteasa, amilasa, lipasa, mananasa adicional y/o por lo menos una celulasa. De hecho, se contempla que varias mezclas de estas enzimas encontrarán uso en la presente invención. También se contempla que los niveles variantes de la(s) proteasa (s) variante (s) y una o más enzimas adicionales ambas pueden variar independientemente a aproximadamente 10%, el resto de la composición de limpieza que son material adjuntos de limpieza. La selección específica de materiales adjuntos de limpieza se hace fácilmente al considerar la superficie, artículo o tela que se limpia, y la forma deseada de la composición para las condiciones de limpieza durante el uso (por ejemplo, a través del uso de detergente de lavado) .
Los ejemplos de materiales adjuntos de limpieza adecuados incluyen, pero no se limitan a, tensioactivos , mej oradores, blanqueadores, activadores de blanqueado, catalizadores de blanqueado, otras enzimas, sistemas estabilizantes de enzimas, quelantes, abrillantadores ópticos, polímeros de liberación de manchas, agente de transferencia de tinte, agentes inhibidores de transferencia de tinte, materiales catalíticos, peróxido de hidrógeno, fuentes de peróxido de hidrógeno, perácidos preformados, agentes dispersantes poliméricos, agentes de remoción de manchas de arcilla, agentes plastificantes estructura, dispersantes, supresores de jabonaduras, tintes, perfumes, colorantes, sales rellenadoras , hidrótropos, fotoactivadores , fluorescentes, acondicionadores de telas, suavizantes de telas, portadores, hidrótropos, auxiliares de procesamiento, solventes, pigmentos, tensioactivos hidrolizables , conservadores, antioxidantes, agentes anti-encogimiento, anti-arrugas, germicidas, fungicidas, manchas de color, silvercare, agentes anti-tizne y/o anti-corrosión, fuentes de alcalinidad, agentes solubilizantes , portadores, auxiliares de procesamiento, pigmentos y agentes de control de pH (Véase por ejemplo, Patentes de E.U.A. Nos. 6,610,642, 6,605,458, 5,705,464, 5,710,115, 5,698,504, 5,695,679, 5,686,014 y 5,646,101, todas de las cuales se incorporan en este documento a manera de referencia. Las modalidades de materiales de composición de limpieza específicos se ejemplifican con detalle a continuación. En modalidades en las cuales los materiales adjuntos de limpieza no son compatibles con las proteasas variantes de la presente invención en las composiciones de limpieza, entonces se usan métodos adecuados para mantener los materiales adjuntos de limpieza y la(s) proteasa(s) separada (s) (es decir, no en contacto entre sí) hasta que sea apropiada la combinación de los dos componentes. Estos métodos de separación incluyen cualquier método adecuado conocido en la técnica (por ejemplo, cápsulas de gel, encapsulación, tabletas, separación física, etcétera) .
En algunas modalidades preferidas, se incluye una cantidad efectiva de una o más proteasa(s) variante (s) proporcionadas en este documento en composiciones útiles para limpiar una variedad de superficies en necesidad de remoción de manchas proteínicas. Estas composiciones de limpieza incluyen composiciones de limpieza para estas aplicaciones como limpiar superficies duras, telas y platos. De hecho, en algunas modalidades, la presente invención proporciona composiciones de limpieza de telas, mientras que otras modalidades, la presente invención proporciona composiciones de limpieza no de telas. Notablemente, la presente invención también proporciona composiciones de limpieza adecuadas para cuidado personal, incluyendo cuidado oral (incluyendo dentífricos, pastas de dientes, lavados bucales etcétera, así como composiciones de limpieza de dentaduras), piel, y composiciones de limpieza para el cabello. Se propone que la presente invención incluya composiciones detergentes en cualquier forma (es decir, líquida, granular, en barra, semisólida, geles, emulsiones, tabletas, cápsulas, etcétera) .
A manera de ejemplos, varias composiciones de limpieza en donde las proteasas variantes de la presente invención encuentran uso se describen con mayor detalle a continuación. En algunas modalidades en las cuales las composiciones de limpieza de la presente invención se formulan como composiciones adecuadas para el uso en el método (s) de lavado en máquina para ropa, las composiciones de la presente invención contienen preferiblemente por lo menos un tensioactivo y por lo menos un compuesto mej orador, así como también uno o más materiales adjuntos de limpieza seleccionados preferiblemente de compuestos polimérico orgánicos, agentes blanqueadores, enzimas adicionales, supresores de jabonaduras, dispersantes, dispersantes de cal-jabón, agentes de suspensión y anti-redeposición de manchas e inhibidores de corrosión. En algunas modalidades, las composiciones para ropa también contienen agentes suavizantes (es decir, como materiales adjuntos de limpieza adicionales) . Las composiciones de la presente invención también encuentran uso en productos aditivos detergentes en forma sólida o líquida. Estos productos aditivos se proponen para suplementar y/o reforzar el desempeño de las composiciones detergentes convencionales y se pueden agregar en cualquier etapa del proceso de limpieza. En algunas modalidades, la densidad de las composiciones detergentes para ropa en este documento varía de aproximadamente 400 a aproximadamente 1200 g/litro, mientras que en otras modalidades, varía de aproximadamente 500 a aproximadamente 950 g/litro de la composición medida a 20°C.
En modalidades formuladas como composiciones para el uso en métodos para el lavado de platos manual, las composiciones de la invención contienen preferiblemente por lo menos un tensioactivos y preferiblemente por lo menos un material adjunto de limpieza adicional seleccionado de compuestos poliméricos orgánicos, agentes mej oradores de jabonaduras, iones de metal del grupo II, solventes, hidrótropos y enzimas adicionales.
En algunas modalidades, varias composiciones de limpieza tales como aquellas proporcionadas en la Patente de E.U.A. No. 6,605,458 encuentran uso con las proteasas variantes de la presente invención. De esta manera, en algunas modalidades, las composiciones que comprenden por lo menos una proteasa variante de la presente invención es una composición de limpieza de telas granular compacta, mientras que en otras modalidades, la composición es una composición de limpieza de telas granular útil en el lavado de telas coloreadas, en modalidades adicionales, la composición es una composición de limpieza de telas granular que proporciona suavidad a través de la capacidad de lavado, en modalidades adicionales, la composición es una composición de limpieza de telas líquida de trabajo pesado. En algunas modalidades, las composiciones que comprenden por lo menos una proteasa variante de la presente invención son composiciones de limpieza de telas tales como aquellas descritas en las Patentes de E.U.A. Nos. 6,610,642 y 6,376,450. Además, las proteasas variantes de la presente invención encuentran uso en composiciones detergentes para ropa granulares de utilidad particular bajo condiciones de lavado europeas o japonesas (Véase por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 6,610,642) .
En algunas modalidades alternativas, la presente invención proporciona composiciones de limpieza de superficies duras que comprenden por lo menos una proteasa variante proporcionada en este documento. De esta manera, en algunas modalidades, las composiciones que comprenden por lo menos una proteasa variante de la presente invención es una composición de limpieza de superficies duras tales como aquellas escritas en las Patentes de E.U.A. Nos. 6,610,642, 6,376,450 y 6,376,450.
En todavía modalidades adicionales, la presente invención proporciona composiciones lavaplatos que comprenden por lo menos una proteasa variante proporcionada en este documento. De esta manera, en algunas modalidades, las composiciones que comprenden por lo menos una proteasa variante de la presente invención es una composición de 10 limpieza de superficies duras tales como aquellas en las Patentes de E.U.A. Nos. 6,610,642 y 6,376,450. En aún algunas modalidades adicionales, la presente invención proporciona composiciones lavaplatos que comprenden por lo menos una proteasa variante proporcionada en este documento. En algunas modalidades adicionales, las composiciones que comprenden por lo menos una proteasa variante de la presente invención comprenden composiciones para el cuidado oral tales como aquellas en las Patentes de E.U.A. Nos. 6,376,450, y 6,376,450. Las formulaciones y descripciones de los compuestos y materiales adjuntos de limpieza contenidos en las Patentes de E.U.A Nos. 6,376,450, 6,605,458, 6,605,458, y 6,610,642 mencionadas anteriormente, encuentran uso con las proteasas variantes proporcionadas en este documento.
Las composiciones de limpiezas de la presente invención se formulan en cualquier forma adecuada y se preparan mediante cualquier proceso seleccionado por el formulador, ejemplos no limitantes de los cuales se describen en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,879,584, 5,691,297, 5,574,005, 5,569,645, 5,565,422, 5,516,448, 5,489,392, y 5,486,303, todas de las cuales se incorporan en este documento a manera de referencia. Cuando se desea una composición de limpieza con pH bajo, el pH de esta composición se ajusta por la vía de la adición de un material tal como monoetanolamina o un material ácido tal como HC1.
Mientras que no es esencial para los propósitos de la presente invención, la lista no limitante de adjuntos ilustrados a partir de ahora son adecuados para el uso en las presentes composiciones de limpieza en algunas modalidades, estos adjuntos se incorporan por ejemplo, para ayudar o aumentar el desempeño de limpieza, para el tratamiento del substrato que se limpia, o para modificar la estética de la composición de limpieza como es el caso con perfumes, colorantes, tintes o similares. Se entiende que estos adjuntos están además de las proteasas variantes de la presente invención. La naturaleza precisa de estos componentes adicionales, y los niveles de incorporación de los mismos, dependerá de la forma física de la composición y la naturaleza de la operación de limpieza para la cual se va a usar. Los materiales adjuntos adecuados incluyen, pero no limitan a, tensioactivos , mejoradores, agentes quelantes, agentes inhibidores de transferencia de tintes, auxiliares de deposición, dispersantes, enzimas adicionales, y estabilizantes de enzimas, materiales catalíticos, activadores de blanqueado, reforzadores de blanqueado, peróxido de hidrógeno, fuentes de peróxido de hidrógeno, perácidos formados, agentes dispersantes poliméricos, agentes de remoción/anti-redeposición de manchas de arcilla, abrillantadores, supresores de jabonaduras, tintes, perfumes, agentes elastificantes de estructura, suavizantes de telas, portadores, hidrótropos, auxiliares de procesamiento y/o pigmentos. Además de la descripción a continuación, los ejemplos adecuados de estos otros adjuntos y niveles de uso se encuentran en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,576,282, 6,306,812, y 6,326,348, incorporadas a manera de referencia. Los ingredientes adjuntos mencionados anteriormente pueden constituir el resto de las composiciones de limpieza de la presente invención.
En algunas modalidades, las composiciones de limpiezas de acuerdo con la presente invención comprenden por lo menos un tensioactivo y/o un sistema tensioactivo en donde el tensioactivo se selecciona de tensioactivos no iónicos, tensioactivos aniónicos, tensioactivos catiónicos, tensioactivos anfolíticos, tensioactivos zwitteriónicos , tensioactivos no iónicos semi-polares y mezclas de los mismos. En algunas modalidades de composición de limpieza con pH bajo (por ejemplo, composiciones que tienen un pH neto de aproximadamente 3 a aproximadamente 5) , la composición no contiene típicamente sulfato etoxilado de alquilo, ya que se cree que este tensioactivo se puede hidrolizar por tales composiciones de contenidos ácidos. En algunas modalidades, el tensioactivo está presente en un nivel de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 60%, mientras que en modalidades alternativas el nivel es de aproximadamente 1% a aproximadamente 50%, mientras que aún en modalidades adicionales el nivel es de aproximadamente 5% a aproximadamente 40%, en peso de la composición de limpieza.
En algunas modalidades, las composiciones de limpiezas de la presente invención comprenden uno o más mejoradores detergentes o sistemas mej oradores. En algunas modalidades que incorporan por lo menos un mej orador, las composiciones de limpieza comprenden por lo menos aproximadamente 1%, de aproximadamente 3% a aproximadamente 60% o aún de aproximadamente 5% a aproximadamente 40% del mej orador en peso de la composición de limpieza. Los mejoradores incluyen, pero no se limitan a, las sales de metal alcalino, de amonio y de alcanolamonio de polifosfatos , silicatos de metal alcalino, carbonatos de metal alcalinotérreos y alcalinos, aluminosilicatos , compuestos de policarboxilato, hidroxipolicarboxilatos de éter, copolímeros de anhídrido maleico con etileno o éter de vinil-metilo, ácido 1 , 3 , 5 -trihidroxi-benzen-2 , 4 , 6-trisulfónico, y ácido carboximetiloxisuccínico, las diversas sales de metal alcalino, amonio y amonio sustituido de ácidos poliacéticos tal como ácido etilendiamin-tetraacético y ácido nitrilotriacético, así como también policarboxilatos tal como ácido melítico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido oxidisuccínico, ácido polimaleico, ácido bencen-1 , 3 , 5-tricarboxílico, ácido carboximetiloxisuccínico, y sales solubles de los mismos. De hecho, se contempla que cualquier mej orador adecuado encontrará uso en varias modalidades de la presente invención.
En algunas modalidades, los mej oradores forman complejos de ión de dureza soluble en agua (por ejemplo, mej oradores secuestrantes) , tal como citratos y polifosfatos (por ejemplo, tripolifosfato de sodio y hexahidrato de tripolifosfato de sodio, tripolifosfato de sodio, y tripolifosfato de sodio y fosfato mezclados, etcétera). Se contempla que cualquier mej orador adecuado encontrará uso en la presente invención, incluyendo aquellos conocidos en la técnica (Véase por ejemplo, el documento EP 2 100 949) .
En algunas modalidades, las composiciones de limpiezas de la presente invención contienen por lo menos un agente quelante. Los agentes quelantes adecuados incluyen, pero no se limitan a agentes quelantes de cobre, hierro y/o manganeso y mezclas de los mismos. En modalidades en las cuales se usa por lo menos un agente quelante, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 15% o aún de aproximadamente 3.0% a aproximadamente 10% de agente quelante en peso de la composición de limpieza sujeto.
En aún algunas modalidades adicionales, las composiciones de limpieza proporcionadas en este documento contienen por lo menos un auxiliar de deposición. Los auxiliares de deposición adecuados incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol , polipropilenglicol , policarboxilato, polímeros de liberación de manchas tal como ácido politeleftálico, arcillas tal como caolinita, montmorilonita, atapulgita, ilita, bentonita, haloisita, y mezclas de las mismas.
Como se indica en este documento, en algunas modalidades, los agentes anti-redeposición encuentran uso en algunas modalidades de la presente invención. En algunas modalidades preferidas, encuentran uso tensioactivos no iónicos. Por ejemplo, en modalidades de lavaplatos automático, los tensioactivos no iónicos encuentran uso para propósitos de modificación de superficies, en particular para laminación, para evitar la formación de película y manchas y para mejorar el brillo. Estos tensioactivos no iónicos también encuentran uso en evitar la redeposición de manchas. En algunas modalidades preferidas, el agente anti-redeposición es un tensioactivo no iónico como es conocido en la técnica. (Véase por ejemplo, el documento EP 2 100 949) .
En algunas modalidades, las composiciones de limpiezas de la presente invención incluyen uno o más de agentes inhibidores de transferencia de tinte. Los agentes inhibidores de transferencia de tinte poliméricos adecuados incluyen, pero no se limitan a, polímeros de polivinilpirrolidona, polímeros de N-óxido de poliamina, copolímeros de N-vinilpirrolidona y N-vinilimidazol , poliviniloxazolidonas y polivinilimidazoles o mezclas de los mismas. En modalidades en las cuales por lo menos se usa un agente de inhibidor de transferencia de tinte, las composiciones de limpiezas de la presente invención comprenden de aproximadamente 0.0001% a aproximadamente 10%, de aproximadamente 0.01% a aproximadamente 5%, o aún de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 3% en peso de la composición de limpieza.
En algunas modalidades, se incluyen silicatos dentro de las composiciones de la presente invención. En algunas de estas modalidades, encuentran uso los silicatos de sodio (por ejemplo, disilicato de sodio, metasilicato de sodio, y filosilicatos cristalinos). En algunas modalidades, los silicatos están presentes en un nivel de aproximadamente 1% a aproximadamente 20%. En algunas modalidades preferidas, los silicatos están presentes en un nivel de aproximadamente 5% a aproximadamente 15% en peso de la composición.
En aún algunas modalidades adicionales, las composiciones de limpiezas de la presente invención también contienen dispersantes. Los materiales orgánicos solubles en agua adecuados incluyen, pero no se limitan a los ácidos homo- o co-poliméricos o sus sales, en los cuales el ácido policarboxílico comprende por lo menos dos radicales de carboxilo separados entre sí por no más de dos átomos de carbono.
En algunas modalidades adicionales, las enzimas usadas en las composiciones de limpieza se estabilizan por cualquier técnica adecuada. En algunas modalidades, las enzimas empleadas en este documento se estabilizan por la presencia de fuentes solubles en agua de iones de calcio y/o magnesio en las composiciones terminadas que proporcionan estos iones a las enzimas. En algunas modalidades, los estabilizantes de enzimas incluyen oligosacáridos , polisacáridos y sales de metal divalentes inorgánicas, incluyendo metales alcalinotérreos , tales como sales de calcio. Se contempla que varias técnicas para la estabilización de enzimas encontrarán uso en la presente invención. Por ejemplo, en algunas modalidades, las enzimas empleadas en este documento se estabilizan por la presencia de fuentes solubles en agua de iones de zinc (II) , calcio (II) y/o magnesio (II) en las composiciones terminadas que proporcionan estos iones a las enzimas, así como también otros iones de metal (por ejemplo, bario (II), escandio (II), hierro (II), manganeso' (II), aluminio (III), estaño (II), cobalto (II) , cobre (II) , níquel (II) y oxovanadio (IV) . Los cloruros y sulfatos también encuentran uso en algunas modalidades de la presente invención. Los ejemplos de oligosacáridos y polisacáridos adecuados (por ejemplo, dextrinas) son conocidos en la técnica [Véase por ejemplo, el documento WO 07/145964). En algunas modalidades, también encuentran uso inhibidores de proteasa reversibles, tales como compuestos que contienen boro (por ejemplo, borato, ácido 4-formil-fenil-borónico) y/o un aldehido tripéptido que encuentran uso para la estabilidad mejorada adicional, como se desee.
En algunas modalidades, los blanqueadores, activadores de blanqueado y/o catalizadores de blanqueado están presentes en las composiciones de la presente invención. En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden compuesto (s) blanqueador (es) inorgánico (s) y/u orgánico(s). Blanqueadores inorgánicos incluyen, pero no se limitan a sales de perhidrato (por ejemplo, sales de perborato, percarbonato, perfosfato, persulfato, y persilicatos) . En algunas modalidades, las sales de perhidrato inorgánicas son sales de metal alcalino. En algunas modalidades, las sales de perhidrato inorgánicas se incluyen como el sólido cristalino, sin protección adicional, aunque en algunas otras modalidades, la sal se recubre. Cualquier sal adecuada conocida en la técnica encuentra uso en la presente invención (Véase por ejemplo, el documento EP 2 100 949) .
En algunas modalidades, los activadores de blanqueado se usan en la composición de la presente invención. Los activadores de blanqueado son precursores de perácido típicamente orgánicos que mejoran la acción blanqueadora en el curso de la limpieza a temperaturas de 60 °C y abajo. Los activadores de blanqueado adecuados para el uso en este documento incluyen compuestos los cuales, bajo condiciones de perhidrólisis , proporcionan ácidos peroxicarboxílicos alifáticos que tienen preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 átomos de carbono, en particular de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 átomos de carbono, y/o ácido perbenzoico opcionalmente sustituido. Los activadores de blanqueado adicionales son conocidos en la técnica y encuentran uso en la presente invención (Véase por ejemplo, el documento EP 2 100 949) .
Además, en algunas modalidades y como se describe adicionalmente en este documento, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden además por lo menos un catalizador de blanqueado. En algunas modalidades, el triazaciclononano de manganeso y complejos relacionados encuentran uso, así como también complejos de cobalto, cobre, manganeso y hierro. Los catalizadores de blanqueado adicionales encuentran uso en la presente invención {Véase por ejemplo, los documentos US 4,246,612, 5,227,084, 4,810410, WO 99/06521, y EP 2 100 949).
En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención contienen uno o más complejos de metal catalítico. En algunas modalidades, un catalizador de blanqueado que contiene metal encuentra uso.
En algunas modalidades preferidas, el catalizador de blanqueado de metal comprende un catalizador que comprende un catión de metal de transición de actividad catalítica de blanqueado definido, (por ejemplo, cationes de cobre, hierro, titanio, rutenio, tungsteno, molibdeno o manganeso) , un catión de metal auxiliar que tiene poco o nada de actividad catalítica de blanqueado (por ejemplo, cationes de zinc o aluminio) , y un secuestrante que tiene constantes de estabilidad definidas para los cationes de metal catalíticos y auxiliares, particularmente ácido etilendiamintetraacético, etilendiaminetetra (ácido metilenfosfónico) y sales solubles en agua de los mismos son usados [Véase por ejemplo, la Patente de E.U.A No. 4,430,243). En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención se catalizan por medio de un compuesto de manganeso. Estos compuestos y niveles de uso son conocidos en la técnica [Véase por ejemplo, la Patente de E.U.A. No. 5,576,282). En modalidades adicionales, los catalizadores de blanqueado de cobalto encuentran uso en las composiciones de limpieza de la presente invención. Varios catalizadores de blanqueado de cobalto son conocidos en la técnica [Véase por ejemplo, las Patentes de E.U.A. Nos. 5,597,936 y 5,595,967) y se preparan fácilmente mediante procedimientos conocidos.
En modalidades adicionales, las composiciones de limpieza de la presente invención incluyen un complejo de metal de transición de un ligando rígido macropolicíclico (MRL) . Como una materia práctica, y no a manera de limitación, en algunas modalidades, las composiciones y procesos de limpieza proporcionados por la presente invención se ajustan para proporcionar en el orden de por lo menos una parte por cientos de millones de la especie MRL activa en el medio de lavado acuoso, y en algunas modalidades preferidas, proporcionan de aproximadamente 0.005 ppm a aproximadamente 25 ppm, más preferiblemente de aproximadamente 0.05 ppm a aproximadamente 10 ppm, y mucho más preferiblemente de aproximadamente 0.1 ppm a aproximadamente 5 ppm, del MRL en el licor de lavado.
Los metales de transición preferidos en el presente catalizador de blanqueado de metal de transición incluyen, pero no se limitan a manganeso, hierro y cromo. Los MRLs preferidos también incluyen, pero no se limitan a ligandos ultra rígidos especiales que están unidos en cruz (por ejemplo, 5 , 12-dietil-l, 5 , 8 , 12-tetraazabiciclo [6.6.2 ] hexadecano) . Los MRLs de metal de transición adecuados se preparan fácilmente mediante procedimientos conocidos (Véase por ejemplo, el documento WO 2000/32601, y la Patente de E.U.A. No. 6,225,464).
En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden agentes para el cuidado de metal. Los agentes para el cuidado de metal encuentran uso en la prevención y/o reducción del empañado, corrosión y/u oxidación de metales, incluyendo, aluminio, acero inoxidable, y metales no ferrosos (por ejemplo, plata y cobre) . Los agentes para el cuidado de metal adecuados incluyen aquellos descritos en los documentos EP 2 100 949, WO 9426860 y WO 94/26859) . En algunas modalidades, el agente para el cuidado de metal es una sal de zinc. En algunas modalidades adicionales, las composiciones de limpiezas de la presente invención comprenden de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 5% en peso de uno o más agente para el cuidado de metal .
Como se indica anteriormente, las composiciones de limpieza de la presente invención se formulan en cualquier forma adecuada y se preparan mediante cualquier proceso seleccionado por el formulador, ejemplos no limitantes de los cuales se describen en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,879,584, 5,691,297, 5,574,005, 5,569,645, 5,516,448, 5,489,392, y 5,486,303, todas de las cuales se incorporan en este documento a manera de referencia. En algunas modalidades en las cuales se desea una composición de limpieza con pH bajo, el pH de esta composición se ajusta por la vía de la adición de un material ácido tal como HC1.
Las composiciones de limpieza dadas a conocer en este documento encuentran uso en la limpieza de un sitio (por ejemplo, una superficie, vajilla o telas). Típicamente, por lo menos una porción del sitio se pone en contacto con una modalidad de la presente composición de limpieza, en forma neta o diluida en un licor de lavado, y luego el sitio se lava y/o se enjuaga opcionalmente . Para propósitos de la presente invención, "lavado" incluye pero no se limita a, restregado, y agitación mecánica. Den algunas modalidades, las composiciones de limpieza se emplean típicamente en concentraciones de aproximadamente 500 ppm a aproximadamente 15,000 ppm en solución. Cuando el solvente de lavado es agua, la temperatura del agua varía típicamente de aproximadamente 5°C a aproximadamente 90°C y, cuando el sitio comprenden una tela, la relación de masa de agua a tela es típicamente de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 30:1.
EXPERIMENTACIÓN Se proporcionan los siguientes ejemplos a fin de demostrar e ilustrar adicionalmente ciertas modalidades preferidas y aspectos de la presente invención y no se deben considerar como limitantes del alcance de la misma.
En la descripción experimental que sigue, aplican las siguientes abreviaciones: °C (grados centígrados); rpm (revoluciones por minuto) ; H20 (agua) ; HCl (ácido clorhídrico) ; aa y AA (aminoácido) ; bp (par base) ; kb (par kilobase) ; kD (kilodaltones) ; gm (gramos) ; µg y ug (microgramos) ; mg (miligramos) ,- ng (nanogramos) ; µ? y ul (microlitros) ; mi (mililitros) ; mm (milímetros) ; nm (nanómetros) ; µp? y um (micrómetro) ; M (molar) ; mM (milimolar) ; µ? y uM (micromolar) ; U (unidades) ; V (voltios) ; MW (peso molecular); seg (segundos); min(s) (minuto/minutos); hr(s) (hora/horas); MgCl2 (cloruro de magnesio); NaCl (cloruro de sodio) ; OD2so (densidad óptica a 280 nm) ; OD405 (densidad óptica a 405 nm) ; OD6oo (densidad óptica a 600 nm) ; PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida) ; EtOH (etanol) ,- PBS (solución salina amortiguada con fosfato [NaCl 150 mM, solución amortiguadora de fosfato de sodio.10 mM, pH 7.2]); LAS ( lauril -sulfonato de sodio); SDS (dodecil-sulfato de sodio); Tris (tris (hidroximetil) aminometano) ; TAED (N, , ' ' -tetraacetiletilendiamina) ; BES (poliestersulfona) ; MES (ácido 2 -morfolinoetanosulfónico, monohidrato; f .w. 195.24; Sigma # M-3671) ; CaC12 (cloruro de calcio, anhidro; f.w. 110.99; Sigma # C-4901) ; SRI (índice de Remoción de Manchas) , BMI (sangre, leche, tinta) y BMI PI (índice de desempeño de sangre, leche, tinta) , TCA (ácido tricloroacético) y TCA PI (índice de desempeño de ácido tricloroacético) .
Además se obtuvieron materiales de algunas de las siguientes instituciones: TIGR (The Institute for Genomic Research, Rockville, MD) ; AATCC (American Association of Textile and Coloring Chemists) ; Amersham (Amersham Life Science, Inc. Arlington Heights, IL) ; Corning (Corning International, Corning, NY) ICN (ICN Pharmaceuticals , Inc., Costa Mesa, CA) ; Pierce (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) ; Equest (Equest, arwick International Group, Inc., Flintshire, RU) ; EMPA (Eidgenossische Material Prufungs und Versuch Anstalt, St . Gallen, Suecia) ; CFT (Center for Test Materials, Vlaardingen, Países Bajos); Amicon (Amicon, Inc., Beverly, MA) ; ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA) ; Becton Dickinson (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ) ; Perkin-Elmer (Perkin-Elmer, Pocilloesley, MA) ; Rainin (Rainin Instrument, LLC, Woburn, MA) ; Eppendorf (Eppendorf AG, Hamburg, Alemania); Waters (Waters, Inc., Milford, MA) ; Geneart (Geneart GmbH, Regensburg, Alemania) ; Perseptive Biosystems (Perseptive Biosystems, Ramsey, M ) ; Molecular Probes (Molecular Probes, Eugene, OR) ; BioRad (BioRad, Richmond, CA) ; Clontech (CLONTECH Laboratories, Palo Alto, CA) ; Cargill (Cargill, Inc., Minneapolis, MN) ; Difco (Difco Laboratories, Detroit, MI) ; GIBCO BRL o Gibco BRL (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) ; New Brunswick (New Brunswick Scientific Company, Inc., Edison, NJ) ; Thermoelectron (Thermoelectron Corp., altham, MA) ; BMG (BMG Labtech, GmbH, Offenburg, Alemania) ; Greiner (Greiner Bio-One, Kremsmuenster, Austria); Novagen (Novagen, Inc., Madison, WI) ; Novex (Novex, San Diego, CA) ; Finnzymes (Finnzymes OY, Finland) Qiagen (Qiagen, Inc., Valencia, CA) ; Invitrogen (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) ; Sigma (Sigma Chemical Co., St . Louis, MO) ; DuPont Instruments (Asheville, NY) ; Global Medical Instrumentation o GMI (Global Medical Instrumentation; Ramsey, MN) ; MJ Research (MJ Research, Waltham, MA) ; Infors (Infors AG, Bottmingen, Suecia) ; Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) ; Roche (Hoffmann La Roche, Inc., Nutley, NJ) ; Agilent (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) ; Merck (Merck & Co. , Rahway, NJ) ; Ion Beam Analysis Laboratory (Ion Bean Analysis Laboratory, The University of Surrey Ion Beam Centre (Guildford, RU) ; TOM (Terg-o-Meter) ; BMI (blood, milk, ink) ; BaChem (BaChem AG, Bubendorf , Suecia) ; Molecular Devices (Molecular Devices, Inc., Sunnyvale, CA) ; Corning (Corning International, Corning, NY) ; MicroCal (Microcal, Inc., Northhampton, MA) ,- Chemical Computing (Chemical Computing Corp., Montreal, Canadá); NCBI (National Center for Biotechnology Information) ; Beckman (Beckman- Coulter, Fullerton, CA) ; SeitzSchenk (SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Bad Kreuznach, Alemania); Pall (Pall Corp., East Hills, NY) ; Malvern Instruments (Malvern Instruments, Inc., Worcestershire, RU) , DNA 2.0 (Menlo Park, CA) , Molecular Devices (Sunnyvale, CA) , Costar (Cambridge, MA) .
EJEMPLO 1 Ensayos En los siguientes ejemplos, se usaron varios ensayos como se expone a continuación para facilitar la lectura. Se indica cualquier desviación de los protocolos proporcionados a continuación.
A. Ensayo TCA Para la Determinación del Contenido de Proteínas en Placas de Microtítulo de 96 Pocilios Para la FNA (por ejemplo, proteasa precursora) y variantes de la misma, este ensayo se inició usando un sobrenadante de cultivo filtrado de placas de microtítulo desarrollado 3-4 días a 33°C con agitación a 230 rpm y humidificado por aireación. Se usó una placa de microtítulo de fondo plano de 96 pocilios reciente (MTP) para el ensayo. Primero, 100 L/pocillo de HCl 0.25 N se colocaron en cada pocilio. Después, se agregaron 50 de caldo de cultivo filtrado. Luego se determinó la dispersión/absorbancia de luz a 405 nm (usando un modo de mezclado de 5 segundos en el lector de placas) , a fin de proporcionar la lectura "en blanco" . · Para la prueba, 100 L/pocillo de ácido tricloroacético 15% (p/v) (TCA) se colocaron en las placas y se incubaron entre 5 y 30 minutos a temperatura ambiente. Luego se determinó la dispersión/absorbancia de luz a 405 nm (usa un modo de mezclado de 5 segundos en el lector de placas) .
Para la GG36 (por ejemplo, propiedades precursora) y variantes de la misma, este ensayo se realizó usando un sobrenadante de cultivo filtrado de placas de microtítulo desarrollado aproximadamente 3 días a 37°C con agitación a 300 rpm y humidificado por aireación. En este ensayo se agregaron 100 de una solución de HCl 0.25 M a cada pocilio de una placa de microtítulo de fondo plano de 96 pocilios. Subsecuentemente, 25 µL de alícuotas de los sobrenadantes de cultivo filtrados (que contienen las proteasas) se agregaron a los pocilios. Luego se determinó la dispersión/absorbancia de luz de 405 nm (usando el modo de mezclado de 5 segundos en lector de placas) , a fin de proporcionar la lectura "en blanco" . Después de esta medición, 100 de una solución de TCA al 30% (p/v) se agregaron a cada pocilio y las placas de microtítulo se incubaron en 5 y 15 minutos a temperatura ambiente. Se determinó la dispersión/absorbancia de luz resultante a 405 nm (usando el modo de mezclado de 5 segundos en el lector de placas) .
El equipo usado fue un Robot Biomek FX (Beckman Coulter) y un Lector MTP SpectraMAX (tipo 340; Molecular Devices); los MTP's fueron de Costar (tipo 9017) . El equipo usado fue un Robot Biomek FX (Beckman Coulter) y un Lector de MTP SpectraMAX de tipo 340 (Molecular Devices) ; y los MTPs fueron del tipo 9017 (Costar) .
Los cálculos se realizaron al restar el blanco (sin TCA) de lectura de prueba con TCA para proporcionar una medición relativa del contenido de proteínas en las muestras.
Si se desea, se puede crear una curva estándar, al calibrar las lecturas de TCA con los ensayos AAPF de los clones con factores de conversión conocidos. Sin embargo, los resultados de TCA son lineales con respecto a la concentración de proteínas de 50 a 500 microgramos de proteína por mi (ppm) y de esta manera se puede graficar directamente contra el desempeño de la enzima para el propósito de seleccionar variantes de buen desempeño. El incremento de turbiedad/dispersión de luz en las muestras se correlaciona con la cantidad total de la proteína precipitable en el sobrenadante de cultivo. "i B. Ensayos de Desempeño de Limpieza El desempeño de remoción de manchas de la serina proteasa de referencia y variante de las mismas en micromuestras se determinó en una escala de placa de microtítulo (MTP) en un detergente TIDEMR 2X Cold comercialmente disponible. Se usó el TIDEMR 2X Cold inactivado con calor (detergente comercial) en el que se confirmó la falta de actividad de proteasa en los ensayos. La activación de calor de las fórmulas de detergente comercial sirve para destruir la actividad enzimática de cualquiera de los componentes de proteínas mientras que retiene las propiedades de los componentes no enzimáticos. De esta manera, este método fue adecuado para preparar detergentes comercialmente comprados para el uso en la prueba de las variantes de enzima de la presente invención. Los reactivos usados fueron: HEPES 5 mM, pH 8.0 o MOPS 5 mM, solución amortiguadora pH 7, 3:1 Ca: Mg para la dureza del agua media: (CaCl2: MgC12*6H20) ; reservas de 15000 granos por galón (gpg) diluidas a 6 gpg. Dos muestras de algodón EMPA-116 BMI (sangre/leche/tinta) procesadas mediante CFT se usaron por pocilio. Las micromuestras se pre-lavaron en agua desionizada durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de la etapa de prelavado, las muestras se colocaron sobre la parte superior de toallas de papel para secado. Las muestras secadas con aire luego se perforaron usando un molde circular de 6.35 mm (1/4 pulgadas) sobre una prensa de expulsión. Finalmente se colocaron dos micromuestras dentro de cada pocilio de un MTP de 96 pocilios verticalmente para exponer el área superficial completa (es decir no planas sobre el fondo del pocilio) . La solución detergente de trabajo se muestra en la Tabla 1-1.
La incubadora se ajustó a 16 °C. Muestras de 10 pL de la placa de dilución maestra de -10 ppm de enzimas se agregaron a placas de 2 muestras de BMI con 190 µ?. de soluciones de detergente de trabajo listadas anteriormente. El volumen se ajustó para proporcionar una concentración final de 0.5 ppm para las variantes en las placas de ensayo. Las placas se transfirieron inmediatamente a la incubadora/agitador iEMS (Thermo/Labsystems) ; y se incubaron durante 30 minutos con agitación de 1400 rpm a temperatura dada. Después de la incubación, 100 µL de sobrenadante se transfirieron en una nueva placa de 96 pocilios (Costar tipo 9017 usada para la lectura de placas de reacción después de la incubación) y se midió la absorbancia en el lector de MTP SpectraMAX MTP (tipo 340; Molecular Devices) a 405nm y/o 600nm. Los pocilios de control que contienen 2 micromuestras y el detergente sin la adición de muestras de proteasa también se incluyeron en la prueba. La medición a 405 nm proporciona un valor más alto y rastrea la remoción de pigmento, mientras que la medición a 600 nm rastrea la turbiedad y limpieza. En este ensayo, las proteasas hidrolizan el substrato y liberan el pigmento y las partículas insolubles del substrato. De esta manera la proporción de turbiedad es una medición de la actividad de la enzima .
Cálculo de la Actividad de la Remoción de Manchas El valor de absorbancia obtenido se corrigió para el valor en blanco (substrato sin enzima), proporcionando una medición de actividad hidrolítica. Para cada muestra (variante) se calculó el índice de desempeño. El índice de desempeño compara el desempeño de la variante (valor actual) y la enzima estándar (valor teórico) en la misma concentración de proteínas. Además, se pueden calcular los valores teóricos, usando los parámetros de la ecuación de Langmuir de la enzima estándar. índice de Desempeño El índice de desempeño compara el desempeño de la variante (valor actual) y la proteasa precursora (valor teórico) en la misma concentración de proteínas. Además, se pueden calcular los valores teóricos, usando los parámetros de la curva de enlace (es decir, ecuación de Langmuir) de la proteasa estándar. Un índice de desempeño (PI) que tiene un valor >0.5 para por lo menos una propiedad identifica una variante que comprenden por lo menos una mutación que se puede combinar con una o más mutaciones para generar proteínas que tienen índices de desempeños apropiados para una o más propiedades de interés diferentes o además de la propiedad de interés por lo cual se midió un valor PI de >0.5.
EJEMPLO 2 Variantes de subtilisina GG36 de Bacill e s btilis En este ejemplo, se describen experimentos conducidos par producir GG36 (también referido en este documento como subtilisina de Bacillus lentus) en B. subtilis . Se realizó la transformación como se conocer en la técnica (Véase por ejemplo, el documento WO 02/14490) .
Producción de Proteasa GG36 en Bacillus subtilis Se ensambló el plásmido de expresión pAC-GG36ci usando el gen mejorado con el codón GG36 fusionado en el octavo codón de la secuencia señal aprE bajo el control del promotor aprE consenso y el terminador transcripcional BPN' . En la secuencia proporcionada a continuación (SEQ ID NO : 2 ) , la fuente en negritas y cursiva indica el promotor aprE consenso, la fuente estándar indica la secuencia de señal, la fuente subrayada indica la pro- secuencia , y la fuente en negritas indica el ADN que codifica la proteasa madura GG36, y la fuente cursiva subrayada indica el terminador BP ' . La secuencia de DNA que codifica la región madura GG36 (SEQ ID NO : 4 ) está flanqueada por los sitios de restricción Kpnl y Xhol para la clonación (véase la Figura 4) . atctcaaaaaaatgggtctactaaaatattactccatctattataataaattcacagaata gtcttt taagtaagtctactctgaafc taaaaggagagggtaaagagtgagaagcaa aaaattgtggatcgtcgcgtcgaccgcattgctgatttctgttgcttttagctcatccatc gcatccgctgctgaagaagcaggaagtcgaaattgaattgcttcatgaatttgaaacgatt cctgtbctgtccgttgagttaagcccagaagatgtggacgcgttagagctcgatccagcta tttcttatattgaagaggatgcagaagtaactacaatggcgcaatcggtaccatggggaat tagcagagtacaagccccagctgcacataaccgtggattgacaggttctggtgtaaaagtt gctgtccttgataccggtatttccactcatccagacttaaatattcgtggtggagctagct ttgtaccaggggaaccatccactcaagatggcaatggacatggcactcatgttgccggcac aatcgcggctcttaacaattcaattggtgttcttggcgtagcgccagcgcagaactatacg ctgttaaagtattaggagcaagcggttcaggctctgtcagctctattgcccaaggattgga atgggcagggaacaatggcatgcacgttgctaatcttagtttaggatctccttcgccaagt gccacacttgagcaagctgttaatagcgcgacttctagaggcgttcttgttgtagcggcct ctggaaattcaggtgcaggctcaatcagctatccggcccgttatgcgaacgctatggcagt cggagctactgaccaaaacaacaaccgcgccagcttttcacagtatggcgcagggcttgac attgtcgcaccaggtgtaaacgtgcagagcacttacccaggttcaacatatgccagcttaa acggtacatcaatggctactcctcatgttgcaggtgcggctgcacttgttaaacaaaagaa cccatcttggtccaatgtacaaatccgcaatcatcttaagaatacggcaactagcttagga agcacaaacttgtatggaagcggacttgtcaatgcagaagctgcaactcgttaaaagctta actcgagataaaaaaccggcct tggccccgccggt 11 tat (SEQ ID NO: 2) El plásmido pAC-GG36ci mostrado en la Figura 4, se usó para la expresión de la proteasa GG36 en B. subtilis. Los elementos de plásmido son como sigue: fragmento pUB 110 = DNA del plásmido pUB 110 [McKenzie T. , Hoshino T., Tanaka T., Sueoka N. (1986) The Nucleotide Sequence of pUBHO : Some Salient Features in Relation to Replication and Its Regulation. Plasmid 15:93-103], fragmento pBR322 = DNA del plásmido pBR322 [Bolívar F, Rodríguez RL, Greene PJ, Betlach MC, Heyneker HL, Boyer H . (1977) Construction and characterizat ion of new cloning vehicles. II. A multipurpose cloning system. Gene 2:95-113], fragmento pC194 = DNA del plásmido pC194 [Horinouchi S., Weisblum B. (1982) Nucleotide sequence and functional map of pC194, a plasmid that specifies inducible chloramphenicol resistance. J. Bacteriol 150 : 815-825] .
Las características del plásmido son como siguen: Orí para el B. subtilis = origen de replicación de pUBUO, CAT = gen de resistencia al cloranfenicol del pC194, origen p Bl = origen de replicación de pBR322, bla beta- lactamasa de pBR322, promotor aprE corto promotor transcripcional consenso, Péptido Señal péptido señal, Pro Péptido = pro-región GG36, Péptido Maduro GG36ci = GG36 maduro (reemplazado por las regiones de codificación para cada variante expresada en este estudio) , Terminador BPN' = terminador transcripcional de subtilisina BP ' .
La secuencia de aminoácidos de la proteína precursora GG36 se proporciona a continuación (SEQ ID NO : 3 ) . En esta secuencia, las negritas indican la proteasa GG36 madura (tipo silvestre), la cual también se proporciona como SEQ ID NO : 4 : MRSKKLWIVASTALLISVAFSSSIASAAEEAKE YLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAIL SEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAISYIEEDAEVTTMAQSVPWGISRVQ APAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAAL SIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAG GMHVANL£3LGSPSPSATLE QAVNSATSRGVLWAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQ NNRASFSQYGAGLDIVAP GVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIR HLK TATSLGSTNL YGSGLVNAEAATR* (SEQ ID NO : 3) AQSVPWGISRVQAPAAH RGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNG HGTHVAGTIAALN SIGVLGVAPSAELYAV VLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVAN LSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLWAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRAS FSQYGAGLDIVAPGV VQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRN HLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR* (SEQ ID NO : 4 ) Diseño y Generación de la Subtilisina de Bacillus 1 en tus (=GG36) Biblioteca de Carga/Hidrof óbica Combinatoria (CCHL) Se diseñó la biblioteca de carga/hidrof obicidad combinatoria (CCHL) de la subtilisina de Bacillus lentus al identificar siete aminoácidos expuestos en la superficie, bien distribuidos. Estos residuos son S24, R45, S101, Q109, G118, T213, y L217. El número de la posición de la sustitución es por correspondencia a la posición numerada en la subtilisina BPN' (numeración BPN' ; Figura 1) . Se creó una biblioteca hidrofóbica combinatoria de 33 miembros (GH2-GH33) al hacer combinaciones de cuatro posibilidades en cada sitio: tipo silvestre, glutamina (Q) , ácido glutámico (E) , leucina (L) y arginina (R) como se muestra en la Tabla 2-1.
El plásmido pAC-GG36ci que contiene el gen GG36 mejorado con codón es envió a ADN 2.0 Inc. (Menlo Park, CA) para la generación de la CHL . La cepa Bacillus subtilis (genotipo: AaprE, AnprE, AspoIIE, amyE : : xylRPxylAcomK-phleo) se proporcionó como la cepa hospedera para la transformación del ADN que codifica las subtilisinas variantes GG36. Las variantes se suministraron como soluciones madre de glicerol en placas de 96 pocilios.
La Tabla 2-2 muestra las sustituciones hechas en la GG36 para crear las variantes. La Tabla 2-1 también proporciona la diferencia en la carga e hidrofobicidad netas entre la GG36 variante y la tipo s i 1ves t re .
Expresión de variantes de proteasa Se replicaron clones de Bacillus subtilis que contienen vectores de expresión GG36 o FNA con un replicador de acero de 96 pocilios de soluciones madre de glicerol en placas de cultivo de 96 pocilio (BD, 353075) que contienen 200 µ? de medio LB + 25 g/ml de cloranfenicol, desarrollados durante toda la noche durante 37°C, 220 rpm en un encerramiento humidi f icado . Se usaron 200 µ? del cultivo durante toda la noche para inocular 2000 µ? de medio definido + 25 yg/ml de cloranfenicol en tubos de agitación de plástico de 5ml . El medio de cultivo fue un medio semi - def inido enriquecido basado en solución amortiguadora de MOPs, con urea, como una fuente de nitrógeno principal, glucosa como la fuente de carbono principal, y suplementado con un soytone al 1% para el crecimiento celular consistente. Los tubos de agitación se incubaron a 37°C, 220 rpm, durante 60 horas. Después de 60 horas, los sobrenadantes se hicieron girar en una centrífuga a mayor que 8000 x RCF . La solución se decantó en tubos cónicos de polipropileno de 15 mi para almacenamiento. No se realizó purificación o concentración adicional. Las reservas de sobrenadantes se formularon a propi lengl icol al 40% para estabilidad a largo plazo y se almacenaron a 4°C. 5 10 20 5 10 20 5 10 15 EJEMPLO 3 Variantes de subtilisina FNA de Bacillua subtilis Producción de proteasa FNA en B. subtilis En este ejemplo, se describen experimentos conducidos para producir FNA (también referida en este documento como subtilisina BPN'-Y217L (=FNA) ) de Bacillus subtilis en B. subtilis . La transformación se realizó como se conoce en la técnica (Véase por ejemplo, el documento WO 02/14490) .
Se ensambló el plásmido de expresión pAC-FNAre usando el gen FNA, fusionado en el 8vo codón de la secuencia señal aprE, bajo el control del promotor aprE consenso y el terminador transcripcional BPN' . En la secuencia proporcionada a continuación (SEQ ID NO: 5), la fuente en negritas y cursiva indica el promotor aprE consenso, la fuente estándar indica la secuencia señal, la fuente subrayada indica la pro-secuencia, la fuente en negritas indica el ADN que codifica la proteasa madura FNA, y la fuente cursiva subrayada indica el terminador BPN' . La región madura FNA contiene los sitios de restricción Kpnl y Xhol para la clonación (véase la Figura 5) . gaattcatctcaaaaaaatgggtctactaaaatattattecatetattataataaattcac agaatagtcttttaagtaagtctactctgaatttttttaaaaggagagggtaaagagtgag aagcaaaaaattgtggatcagtttgctgtttgctttagcgttaatctttacgatggcgttc ggcagcacatccagcgcgcaggctgcagggaaatcaaacggggaaaagaaatatattgtcg ggtttaaacagacaatgagcacgatgagcgccgctaagaagaaagacgtcatttctgcgtc gcttacgttgaagaagatcacgtagcacacgcgtacgcgcagtccgtgccatatggcgtat cacaaattaaagcccctgctctgcactctcaaggctacaccggttcaaatgttaaagtagc ggttatcgacagcggtatcgattc tctcatccagatcttaaagtagcaggcggagccagc atggttccttctgaaacaaatcctttccaagacaacaactctcacggaacacacgttgctg gtaccgttgcggctcttaataactcaatcggtgtattaggcgttgcgccaagcgcatcact ttacgctgtaaaagttctcggcgccgacggttccggccaatacagctggatcattaacgga atcgagtgggcgatcgcaaacaatatggacgttattaacatgagcctcggcggaccgtccg gttctgctgctttaaaagcggcagttgataaagccgttgcatccggcgtcgtagtcgttgc ggcagccggcaacgaaggcacttccggcagctcaagcacagtgggctaccctggtaaatac ccttctgtcattgcagtaggcgctgtcgacagcagcaaccaaagagcatctttctcaagcg taggacctgagctcgatgtcatggcacctggcgtatctatccaaagcacgcttcctggaaa caaatacggcgcgttgaacggtacatcaatggcatctccgcacgttgccggagccgcggct ttgattctttctaagcacccgaactggacaaacactcaagtccgcagctctctagaaaaca ccactacaaaacttggtgattctttctactatggaaaagggctgatcaatgtacaggcggc agetcagtaaaactcgagataaaaaaccggcct tggccccgccggt 111 fc tat (SEQ ID NO: 5) .
El plásmido pAC-FNAre como se muestra en la Figura 5, se usó para la expresión de la proteasa FNA en B. subtilis . Los elementos de plásmido son como sigue: fragmento pUBUO = ADN de plásmido pUBUO [McKenzie T., Hoshino T., Tanaka T. , Sueoka N. (1986) The Nucleotide Sequence of pUBHO: Some Salient Features in Relation to Replication and Its Regulation. Plasmid 15:93-103] , fragmento pBR322 = ADN de plásmido pBR322 [Bolívar F, Rodríguez RL, Greene PJ, Betlach MC, Heyneker HL, Boyer H . (1977) Construction and characterization of new cloning vehicles. II. A multipurpose cloning system. Gene 2:95-113], fragmento pC194 = ADN de plásmido pC194 [Horinouchi S., eisblum B. (1982) Nucleotide sequence and functional map of pC194, a plasmid that specifies inducible chloramphenicol resistance. J. Bacteriol 150:815-825] .
Las características de plásmido son como sigue: Ori para B. súbtilis = originen de replicación de pUB 110, CAT = gen de resistencia al cloranfenicol de pC 194, origen MB 1 = origen de replicación del pBR322, bla = beta-lactamasa de pBR322, promotor aprE corto = promotor transcripcional consenso, Péptido Señal = péptido señal [específica] , Pro Péptido = F A pro región, Péptido Maduro FNA = FNA maduro (reemplazado por las regiones de codificación para cada variante expresada en este estudio) , Terminador BPN' = terminador transcripcional de subtilisina BPN' .
La secuencia de aminoácidos de la proteína precursora FNA se proporciona a continuación (SEQ ID NO:6) . En esta secuencia, las negritas indican la proteasa FNA (tipo silvestre) , la cual también se proporciona como SEQ ID NO : 7. MRSKKLWISLLFALALIFTMAFGSTSSAQAAGKSNGEKKYIVGFKQTMSTMSAAKKKDVIS EKGKVQKQFKYVDAASATLNEKAVKELKKDPSVAYVEEDHVAHAYAQSVPYGVSQIKAPAL HSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPSETNPFQDNNSHGTHVAGTVAALNN SIGVLGVAPSASLYAVKVLGADGSGQYSWIINGIEWAIANN DVINMSLGGPSGSAALKAA VDKAVASGWWAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNQRASFSSVGPELDVM APGVSIQSTLPGNKYGALNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNWTNTQVRSSLENTTTKLGDS FYYGKGLI VQAAAQ* (SEQ ID NO : 6 ) AQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGS VKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPSETNPFQDN NSHGTHVAGTVAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLGADGSGQYSWIINGIEWAIANNMDVI NMSLGGPSGSAALKAAVDKAVASGWWAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSS NQRASFSSVGPELDVMAPGVSIQSTLPGNKYGALNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNWTNT QVRSSLENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ* (SEQ ID N0:7) Diseño y generación de las bibliotecas de carga/hidrofóbicas combinatorias de subtilisina BPN' -Y217L (=FNA) Se diseñó la biblioteca hidrofóbica de carga combinatoria de subtilisina BPN' -Y217L al identificar siete aminoácidos expuestos en la superficie, bien distribuidos. Estos residuos son S24, A45, S101, N109, N118, K213, y L217. Se creó una biblioteca hidrofóbica combinatoria de 32 miembros (FH2-FH33) al hacer combinaciones de cuatro posibilidades en cada sitio: tipo silvestre, glutamina (Q) , ácido glutámico (E) , leucina (L) y arginina (R) como se muestran en la Tabla 3-1.
El plásmido pAC-FNAre que contiene el gen FNA es envió a ADN 2.0 Inc. (Menlo Park, CA) para la generación de las Bibliotecas Hidrofóbicas Combinatorias. La cepa Bacillus subtilis (genotipo: AaprE, AnprE, ?e?????, amyE : :xylRPxylAcomK-phleo) se proporcionó para las transformaciones del ADN que codifica las sustituciones variantes FNA. Las variantes se suministraron como reservas de glicerol en placas de 96 pocilios .
La Tabla 3-1 muestra las sustituciones hechas en la F A para crear las variantes. La Tabla 3-1 también proporciona la diferencia en la carga e hidrofobicidad netas entre la FNA variante y la tipo silvestre.
Expresión de variantes de proteasa Se replicaron clones Bacillus subtilis que contienen vectores de expresión GG36 o FNA con un replicador de 96 pocilios de acero de reservas de glicerol en placas de cultivo de 96 pocilios (Becton Dickinson, 353075) que contienen 200 µ? de medio LB + 25 g/ml de cloranfenicol , desarrollados durante toda la noche a 37°C, 220 rpm en un encerramiento humidificado. Se usaron 200 µ? del cultivo nocturno para inocular 2000 µ? del medio definido + 25 µg/ml de cloranfenicol en tubos de agitación de plástico de 5 mi. El medio de cultivo fue un medio semi-definido enriquecido basado en solución amortiguadora de MOPs, con urea como fuente de nitrógeno principal, glucosa como la fuente de carbono principal, y suplementado con soytona al 1% para el crecimiento celular consistente. Los tubos de agitación se incubaron a 37°C, 220 rpm, durante 60 horas. Después de 60 horas, los sobrenadantes se hicieron girar en una centrífuga a mayor que 8000 x RCF. La solución se decantó en tubos cónicos de polipropileno de 15 mi para almacenamiento. No se realizó purificación o concentración adicional. Las reservas de sobrenadantes se formularon a propilenglicol al 40% para estabilidad a largo plazo y se almacenaron a 4°C. 5 Tabla 3-1: Biblioteca de Carga/Hidrofobicidad Combinatoria FNA. Las mutaciones se Listan De acuerdo con la Numeración BPN' . Los Cambios de Carga/Hidrofobicidad se Calcularon Relativos con FNA. 10 20 5 10 15 20 EJEMPLO 4 Evaluación de la Remoción de Manchas y Expresión Relativa Este ejemplo describe la prueba de variantes de la biblioteca hidrofóbica combinatoria GG36 y FNA en un ensayo de micromuestra de BMI . Se usaron los métodos proporcionados en el Ejemplo 1. Los resultados mostrados en las Tablas 4-1 (GG36) , y las Tablas 4-2 (FNA) son índices de desempeño en los cuales el desempeño de la variante se compara con el precursor respectivo para la expresión de la proteína relativa (TCA PI) y la actividad de la remoción de manchas (BMI PI) . Estos variantes con un índice de desempeño mayor que 0.5 (PI >0.5) tienen desempeño mejorado. El índice de desempeño menor que o igual a 0.05 se ajustó a 0.05 y se indica en negritas cursivas. ND indica no determinado. 4 Tabla 4-1: Expresión Relativa y Desempeño de Remoción de Manchas de las Variantes de la Biblioteca de Hidrofoblcldad de Carga/Combinatoria GG36. Las mutaciones se Listan De acuerdo con la Numeración BFN' . El índice de Desempeño y los Cambios de Carga/Hidrof obicidad se Calcularon Relativos con GG36 (precursora) .
Cambio de Carga Cambio de Variante Negativa Hidrofobicidad # Variante Neta de Kyte-Doolite TCA BMI Relativa Relativa con PI PI con S24E- R45Q- S10IQ-Q109Q- G118Q- T213Q- GH-8 L217L -2 -10.3 1.01 0.47 S24E- R45E- S101Q-Q109Q- G118Q-T213Q- GH-9 L21.7L -3 -10.3 0.89 0.26 S24E- R45E- S101E- Q109Q- G118Q-T213Q- GII-10 L217L -4 -10.3 1.28 0.04 S24E- R45E- S101E-Q109E- G118Q-T213Q- GH-ll L217L -5 -10.3 1.09 0.78 S24E- R45E- S101E-Q109E- G118E-T213Q- GII-12 L217L -6 -10.3 1.10 0.29 S24E- R45E- S101E-Q109E- G118E-T213E- GII-I3 L217L -7 -10.3 1.06 0.71 S24E- R45Q- S101Q-Q109Q- G118Q- T213Q- GH-1 L217L -1 -3 0.96 0.37 S24L- R4.«¡L- S101Q-Q109Q- 118Q- T213Q- GII-15 1,2171. -1 4.3 0.99 0.52 S24L- R45L- S101L-Q1.09Q- GU8Q-T213Q- GI1-16 L217L -1 11.6 0.88 0.08 S24L- R45L- S101L-QI09L- GII8Q-T213Q- GH-17 L217L -1 18.9 0.90 0.40 S24L- R45L- S101L-QL09L- GU8L-T2I3Q- GI1-18 L217L -1 26.2 0.96 0.09 Tabla 4-1: Expresión Relativa y Desempeño de Remoción de Manchas de las Variantes de la Biblioteca de Hidrofoblcldad de Carga/Combinatoria GG36. Las mutaciones se Listan De acuerdo con la Numeración BFN' . El índice de Desempeño y los Cambios de Carga/Hidrofobicidad se Calcularon Relativos con GG36 (precursora) .
Cambio Cambio de de Carga Hidrofoblcldad Variante Negativa de Kytfi-Doolite tt Variante Neta Relativa con TCA HM1 Relativa PI PI con S24L- R45L- S101L- Q109L- G118L-T213L- GH-19 L217L -1 33.5 1.06 0.05 S24R- R45Q- S101Q-Q109Q- G118Q-T213Q- GH-20 L217L 0 -11.3 1.05 0.56 S24R- R45R- S101Q-Q109Q- G118Q-T213Q- GIf-21 L2171, 1 -12.3 0.78 0.21 S24R- R45R- S101R-Q109Q- G118Q-T213Q- GIl-22 L217L 2 -13.3 0.74 0.19 S24R- R45R- S101R-Q109R- G1I8Q-T213Q- GI1-23 L217L 3 -14.3 0.75 0.15 S24R- R45R- S10IR-Q109R- G118R-T213Q- GH-24 L217L 4 -15.3 0.68 0.07 S24R- R45R- SI01R-QI09R- Gl I8R- T213R- GII-25 L217L 5 -16.3 1.09 0.05 S24ÍÍ- R45R- S101R-Q109R- G1I8R-T213R- GH-26 L217L 3 -15.3 0.90 0.05 S24i R45IÍ- S101R-Q109R- G118R-T213R- Gíl-27 1.2I7L 1 -14.3 0.79 0.05 S24L> R45IÍ- SI0IK-Q109R- G1I8R-T213R- GH-28 L217L -1 -13.3 0.87 0.06 S24E- R45E- SI0IE-Q109E- G1I8R-T213R- GH-29 L217L -3 -12.3 0.92 0.31 Tabla 4-1: Expresión Relativa Desempeño de Remoción de Manchas de las Variante de la Biblioteca de Hidrofobicidad de Carga/Combinatoria GG36. Las mutaciones se Listan De acuerdo con la Numeración BPN' . El índice de Desempeño y los Cambios de Carga/Hidrofobicidad se Calcularon Relativos con (precursora) .
Cambio Cambio Variante Hidrofobicidad # TCA Variante BMI PI PI S24E- R45E- S 10 I - Q109E- G118E- T213R- GII-30 L217L -5 -11.3 0.93 0.47 S24E- R45E- S 101E- Q109E- G1 18E- T213E- GH-31 L217L -7 -10.3 1.01 0.40 S24Q- R45Q- S 101Q- Q109Q- G1 I 8Q- T213Q- Gli-32 L217Q -1 -17.6 1.10 0.07 S24Q- R45Q- S101Q- Q109Q- Gl I 8Q- T213Q- GH-33 L217E -2 -17.6 1.11 0.47 Tabla 4-2: Expresión Relativa y Desempeño de Remoción de Manchas de las Variantes de la Biblioteca de Hidro obicidad de Carga/Combinatoria FNA. Las mutaciones se Listan De acuerdo con la Numeración BPN' . El índice de Desempeño y los Cambios de Carga/Hldrofobicidad se Calcularon Relativos con FNA (precursora) .
Variante # TCA BMI Variante PT PI S24S-A45A- S101S-N109N- N 1 18N- 213K- FNA L217L 0 0 1.00 1.00 S24Q-A45Q- S 101Q-N109Q- N1180- 2130- FII-2 L217L -1 -10.3 1.62 0.93 S24S-A45Q- S101Q-N109Q- N 1 18Q-K213Q- Fil-3 L217L -1 -7.6 2.08 1.00 Tabla 4-2: Expresión Relativa y Desempeño de Remoción de Manchas de las Variantes de la Biblioteca de Hidrof obicidad de Carga/Combinatoria FNA. Las mutaciones se Listan De acuerdo con la Numeración BPN' . El índice de Desempeño y loe Cambios de Carga/Hidrofobicidad se Calcularon Relativos con FNA (precursora) .
Cambio de Carga Cambio de Hidrofobicidad Variante Negativa Variante Neta de yte-Doolite TCA BMI # Relativa Relativa con FNA Pl PI con FNA S24S-A45A- S1010-NÍ090- N118Q-K213Q- FII-4 L217L -1 -2.3 1.46 1.01 S24S-A45A- S101S-N109Q- NU8Q-K213Q- FH-5 L217L -1 0.4 1.29 0.95 S24S-A45A- S101S-NI09N- N1I8Q-K2I3Q- FIi-6 L217L -1 0.4 1.70 0.05 S24S-A45A- S101S-N109N- N118N-K213Q- FH-7 L217L -1 0.4 1.95 0.95 S24E-A45Q- S101Q-N109Q- N118Q-K2J3Q- FII-8 L217L -2 -10.3 1.55 0.90 S24E-A45E- S101Q-N109Q- N1]8Q-K213Q- FH-9 L217L -3 -10.3 1.37 0.88 S24E-A45E- S101E-N109Q- N118Q-K213Q- FIMO L2I.7L -4 -10.3 1.52 0.68 S24E-A45E- S101E-N109E- N118Q- 213Q- FH-.1.1 L217L -5 -10.3 2.72 0.81 S24E-A45E- SI01E-NI09E- N118E-K213Q- FH-.12 L2I7L -6 -10.3 1.55 0.56 S24E-A45E- I01 -N109E- N118E- 213E- FIT-13 E217L -7 -10.3 1.56 0.42 S24I^A45Q- S101Q-N109Q- N118Q-K213Q- FIM4 L217L -1 -3 1.27 1.02 Tabla 4-2: Expresión Relativa y Desempeño de Remoción de Manchas de las Variantes de la Biblioteca de Hidrof obicidad de Carga/Combinatoria FNA. Las mutaciones se Listan De acuerdo con la Numeración BPN' . El índice de Desempeño y los Cambios de Carga/Hidrofobicidad se Calcularon Relativos con FNA (precursora) .
Cambio de Cambio de Carga Hldrofobicidad Variante Negativa de yte- « TCA BMI Variante Neta Doolite Relativa Relativa con PI Pl con FNA FNA S24L-A45L- SI01Q-NI09Q- N118Q-K213Q- FII-15 L217L -1 4.3 1.68 0.98 S24L·A4 L- SI01L-N109Q- N118Q-K213Q- FH-16 L217L -1 11.6 1.47 0.94 S24L-A45L- S101L-N109L- N118Q-K213Q- FH-1.7 L217L -1 18.9 1.17 0.89 S24L-A45L- SI01L-NI09L- N118L-K213Q- FH-18 1,217L -1 26.2 1.11 0.23 S24Í^A45L- S101L-N109L- N118L-K213L- FII-19 L217L -1 33.5 1.19 0.20 S24R-A45Q- S101Q-NI09Q- N118Q- 213Q- FII-20 L217L 0 -11.3 1.31 1.01 S24R-A45R- S101Q-N109Q- N118Q-K213Q- ??-21 L217L 1 -12.3 1.29 0.75 S24R-A45R- S101R-N109Q- N1I8Q-K213Q- FH-22 L217L 2 -13.3 1.28 0.46 S24R-A45R- S101 -N109R- N118Q-K213Q- FII-23 L217L 3 -14.3 1.21 0.33 S24R-A45R- S1QIR-N109R- N118R-K213Q- FH-24 L217L 4 -15.3 1.11 0.28 S24R-A45R- SI0IR-N109R- N118R-K2I3R- FII-25 L217L 5 -16.3 0.98 0.23 Tabla 4-2: Expresión Relativa y Desempeño de Remoción de Manchas de las Variantes de la Biblioteca de Hidrofobicidad de Carga/Combinatoria FNA. Las mutaciones se Listan De acuerdo con la Numeración BPN' . El índice de Desempeño y los Cambios de Carga/Hidrofobicidad se Calcularon Relativos con FNA (precursora) .
Todas las patentes y publicaciones mencionadas en la especificación son indicativas de los niveles de aquellas personas expertas en la técnica a la cual la invención pertenece. Aquellas personas de experiencia en la técnica apreciarán fácilmente que la presente invención está bien adaptada para llevar a cabo los objetivos y obtener los fines y ventajas mencionadas, así como también aquellas inherentes en este documento. Las composiciones y métodos descritos en este documento son representativos de modalidades preferidas, son ejemplares y no se proponen como limitaciones en el alcance de la invención. Es fácilmente evidente para una persona experta en la técnica que se pueden hacer sustituciones y modificaciones variantes a la invención dada a conocer en este documento sin apartarse del alcance y espíritu de la invención.
La invención descrita ilustrativamente en este documento se puede practicar adecuadamente en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones que no se dan a conocer específicamente en este documento. Los términos y expresiones que se han empleado se usan como términos de descripción y no de limitación, y no existe intensión de que en el uso de estos términos y expresiones excluyan cualquier equivalente de las características mostradas y descritas o porciones de las mismas, sino se reconoce que las diversas modificaciones son posibles dentro del alcance de la invención reclamada. De esta manera, se debe entender que aunque la presente invención se ha dado a conocer específicamente por las modalidades preferidas y las características opcionales, la modificación y variación de los conceptos en este documento dados a conocer pueden ser recurridas por aquellas personas expertas en la técnica, y que estas modificaciones y variaciones son consideradas que están dentro del alcance de la invención como se define por este documento.
La invención se ha descrito amplia y genéricamente en este documento. Cada una de las especies limitadas y agrupamientos sub-genéricos que se encuentran dentro de la descripción genérica también forman parte de la invención. Esta incluye la descripción genérica de la invención con la condición o limitación negativa que remueve cualquier contenido del género, sin considerar si el material eliminado se cita específicamente o no en este documento.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (19)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Una variante de subtilisina aislada de una subtilisina de Bacillus, caracterizada porque la variante de subtilisina es una forma madura que tiene actividad proteolítica y que comprende una sustitución en dos o más posiciones seleccionadas de las posiciones 24, 45, 101, 109, 118, 213 y 217, en donde las posiciones están numeradas por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de B. amyloliquefaciens expuesta como SEQ ID NO: 1.
2. La variante de subtilisina aislada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la variante de subtilisina tiene un índice de desempeño de nivel de expresión de proteínas relativo (TCA PI) y/o un índice de desempeño de la actividad de remoción de manchas (BMI PI) que es mayor o igual a 0.5.
3. La variante de subtilisina aislada de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque la subtilisina de Bacillus es GG36, y en donde la sustitución en dos o más posiciones se selecciona de: S24Q, S24E, S24L, S24R, R45Q, R45E, R45L, S101Q, S101E, S101L, S101R, Q109E, Q109L, Q109 R, G118Q, G118E, G118L, G118R, T213Q, T213L, T213R, T213E, L217Q, y L217E, en donde las posiciones corresponden a las posiciones de la subtilisina BPN' de SEQ ID NO : 1.
4. La variante de subtilisina aislada de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque la subtilisina de Bacillus es FNA, y en donde la sustitución en dos o más posiciones se selecciona de: S24Q, S24E, S24L, S24R, A45Q, A45E, A45L, A45R, S101Q, S101E, S101L, S101R, N109Q, N109E, N109L, N109R, K213Q, K213E, K213L, K213R, L217Q, L217E, en donde las posiciones corresponden a las posiciones de la subtilisina BPN' de SEQ ID NO: 1.
5. La variante de subtilisina aislada de conformidad con las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque la subtilisina de Bacillus es GG36, y en donde la sustitución en dos o más posiciones se selecciona de S24Q-R45Q-S101Q-G118Q- T213Q, R45Q-S101Q-G118Q-T213Q, S101Q-G118Q-T213Q, G118Q-T213Q, S24E-R45Q-S101Q- G118Q-T213Q, S24E-R45E-S101Q-G118Q-T213Q, S24E-R45E-S101E-G118Q-T213Q, S24E-R45E-S101E-Q109E-G118Q-T213Q, S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213Q, S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213E, S24L-R45Q-S101Q-G118Q- T213Q, S24L-R45L-S101Q-G118Q-T213Q, S24L-R45L- S101L-G1 18Q-T213Q, S24L-R45L-S101L-Q109L-G118Q-T213Q, S24L-R45L-S101L-Q109L-G118L-T213Q, S24L-R45L-S101L-Q109L-G118L-T213L, S24R- R45Q-S101Q-G118Q-T213Q, S24R-S101Q-G118Q-T213Q, S24R-S101R-G118Q-T213Q, S24R-S101R-Q109R-G118Q-T213Q, S24R-S101R-Q109R-G118R-T213Q, S24R-S101R-Q109R-G118R-T213R, S24E-S101R-Q109R-G118R-T213R, S24E-R45E-S101R-Q 109R-G 118R-T213R, S24E-R45E-S 101 E-Q109R-G118R-T213R, S24E-R45E-S101E-Q109E-G118R-T213R, S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213R, S24E-R45E-S101E-Q109E-G118E-T213E, S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q-L217Q, y S24Q-R45Q-S101Q-G118Q-T213Q-L217E, en donde las posiciones corresponden a las posiciones de la subtilisina BPN' de SEQ ID NO: 1.
6. Una variante de subtilisina aislada de la subtilisina GG36 de Bacillus, caracterizada porque la variante de subtilisina es una forma madura que tiene actividad proteolítica y que comprende la sustitución T213Q, en donde la posición corresponde a la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de B. amyloliquefaciens expuesta como SEQ ID NO: 1.
7. La variante de subtilisina aislada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, o 4, caracterizada porque la subtilisina de Bacillus es FNA, y en donde la sustitución en dos o más posiciones se selecciona de S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, N109Q-N118Q-K213Q, N118Q-K213Q, S24E-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S24E-A45E-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S24E-A45E-S101E-N109Q-N118Q-K213Q, S24E-A45E-S101E-N109E-N118Q-K213Q, S24E-A45E-S101E-N109E-N118E- K213Q, S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E, S24L-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S24L-A45L-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S24L-A45L-S101L-N109Q-N118Q-K213Q, S24L-A45L-S101L-N109L-N118Q-K213Q, S24L-A45L-S101L-N109L-N118L-K213Q, S24L-A45L-S101L-N109L-N118L-K213L, S24R-A45Q-S101Q-N109Q- N118Q-K213Q, S24R-A45R-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q, S24R-A45R-S101R-N109Q-N118Q-K213Q, S24R-A45R-S101R-N109R-N118Q-K213Q, S24R-A45R-S101R-N109R-N118R-K213Q, S24R-A45R-S101R-N109R-N118R-K213R, S24E-A45R-S101R-N109R-N118R-K213R, S24E-A45E-S101R-N109R-N118R-K213R, S24E-A45E-S101E-N109R-N118R-K213R, S24E-A45E-S101E-N109E-N118R-K213R, S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213R, S24E-A45E-S101E-N109E-N118E-K213E, S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q- K213Q-L217Q, y S24Q-A45Q-S101Q-N109Q-N118Q-K213Q- L217E, en donde las posiciones corresponden a las posiciones de la subtilisina BPN' de SEQ ID NO: 1.
8. En otra modalidad, la variante de proteasa es la forma madura de una variante de subtilisina aislada de una subtilisina FNA de Bacillus que tiene actividad proteolítica y comprende la sustitución K213Q, caracterizada porque la posición está numerada por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' de B. amyloliquefaciens expuesta como SEQ ID NO : 1.
9. Un ácido nucleico aislado, caracterizado porque codifica la variante de subtilisina expuesta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8.
10. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 9.
11. Una célula hospedera, caracterizada porque comprende el vector de expresión expuesto de conformidad con la reivindicación 10.
12. Una composición de limpieza, caracterizada porque comprende por lo menos una variante de subtilisina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
13. La composición de limpieza de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la composición de limpieza es un detergente.
14. La composición de limpieza de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque el detergente es un detergente para ropa líquido o seco de trabajo pesado.
15. La composición de limpieza de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque el detergente es un detergente para platos .
16. La composición de limpieza de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-15, caracterizada porque además comprende una o más enzimas adicionales o derivados de enzimas seleccionadas de hemicelulasas , celulasas, peroxidasas, proteasas, metaloproteasas , xilanasas, lipasas, fosfolipasas , esterasas, perhidrolasas , cutinasas, pectinasas, pectato-liasas , mananasas, queratinasas , reductasas, oxidasas, fenoloxidasas , lipoxigenasas , ligninasas, pululanasas, tanasas, pentosanasas , malanasas, ß-glucanasas , arabinosidasas , hialuronidasa, condroitinasa, lacasa, y amilasas, o mezclas de las mismas.
17. La composición de limpieza de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-16, caracterizada porque además comprende por lo menos un agente estabilizante.
18. Una composición de limpieza, caracterizada porque comprende por lo menos 0.0001 por ciento en peso de por lo menos una variante de subtilisina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, y opcionalmente , por lo menos un ingrediente adjunto adecuado.
19. Un método de limpieza, caracterizado porque el método comprende las etapas de: a) poner en contacto una superficie y/o un artículo que comprende una tela con la composición de limpieza de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-18; y b) lavar y/o enjuagar opcionalmente la superficie o artículo.
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Families Citing this family (119)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1523553B1 (en) * 2002-01-16 2009-12-02 Genencor International, Inc. Multiply-substituted protease variants
US20090060933A1 (en) * 2004-06-14 2009-03-05 Estell David A Proteases producing an altered immunogenic response and methods of making and using the same
JP2009534022A (ja) * 2006-04-20 2009-09-24 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 卵のシミに対する洗浄能力が向上したサビナーゼ変異体
CN103361196B (zh) 2008-11-11 2016-01-27 宝洁公司 包含一种或多种可组合的突变的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶
EP2589651A3 (en) * 2008-11-11 2013-08-28 Danisco US Inc. Compositions and methods comprising serine protease variants
ES2625354T3 (es) * 2010-04-15 2017-07-19 Danisco Us Inc. Composiciones y métodos que comprenden variantes de proteasas
ES2694398T3 (es) * 2010-05-06 2018-12-20 Danisco Us Inc. Composiciones y métodos que comprenden variantes de subtilisina
US9493755B2 (en) * 2012-02-21 2016-11-15 Bloomage Freda Biopharm Co., Ltd. Bacillus, hyaluronidase, and uses thereof
EP2935575B1 (en) 2012-12-21 2018-04-18 Danisco US Inc. Alpha-amylase variants
WO2014099525A1 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Danisco Us Inc. Paenibacillus curdlanolyticus amylase, and methods of use, thereof
ES2676895T5 (es) 2013-03-11 2022-04-27 Danisco Us Inc Variantes combinatorias de alfa-amilasa
CN105164147B (zh) * 2013-04-23 2020-03-03 诺维信公司 具有稳定的枯草杆菌蛋白酶的液体自动餐具清洗洗涤剂组合物
EP3004314B1 (en) 2013-05-29 2018-06-20 Danisco US Inc. Novel metalloproteases
JP6367930B2 (ja) 2013-05-29 2018-08-01 ダニスコ・ユーエス・インク 新規メタロプロテアーゼ
WO2014194054A1 (en) 2013-05-29 2014-12-04 Danisco Us Inc. Novel metalloproteases
CN105492603B (zh) 2013-05-29 2022-06-03 丹尼斯科美国公司 新型金属蛋白酶
CN104419651B (zh) * 2013-08-19 2018-12-25 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 磷脂酶c及其产生菌株
DE102013218253A1 (de) 2013-09-12 2015-03-12 Henkel Ag & Co. Kgaa Festes Textilwaschmittel mit verbesserter Proteaseleistung
CN105705622A (zh) 2013-10-15 2016-06-22 丹尼斯科美国公司 粘土粒料
CN104560763B (zh) * 2013-10-15 2018-12-25 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 产磷脂酶c的地衣芽孢杆菌及其产生的磷脂酶c
CN104560764B (zh) * 2013-10-17 2018-12-25 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 产磷脂酶c的短小芽孢杆菌及其产生的磷脂酶c
CN105829516A (zh) 2013-11-11 2016-08-03 艺康美国股份有限公司 具有强化的污垢控制和污物分散的高碱性餐具清洗洗涤剂
EP3068861B1 (en) 2013-11-11 2020-03-18 Ecolab USA Inc. Multiuse, enzymatic detergent and methods of stabilizing a use solution
WO2015073772A1 (en) 2013-11-14 2015-05-21 Danisco Us Inc. Stable enzymes by glycation reduction
TR201906371T4 (tr) 2013-12-13 2019-05-21 Danisco Inc Bacillus türlerinin serin proteazları.
DK3080263T3 (da) 2013-12-13 2019-10-07 Danisco Us Inc Serinproteaser af bacillus gibsonii-clade
KR20160099629A (ko) 2013-12-16 2016-08-22 이 아이 듀폰 디 네모아 앤드 캄파니 점도 조절제로서의 폴리 알파-1,3-글루칸 에테르의 사용
MX381013B (es) 2013-12-18 2025-03-12 Nutrition & Biosciences Usa 4 Inc Éteres de poli-alfa-1,3-glucano catiónicos.
WO2015112339A1 (en) 2014-01-22 2015-07-30 The Procter & Gamble Company Fabric treatment composition
WO2015112340A1 (en) 2014-01-22 2015-07-30 The Procter & Gamble Company Method of treating textile fabrics
EP3097172A1 (en) 2014-01-22 2016-11-30 The Procter & Gamble Company Method of treating textile fabrics
EP3097175B1 (en) 2014-01-22 2018-10-17 The Procter and Gamble Company Fabric treatment composition
WO2015123323A1 (en) 2014-02-14 2015-08-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Poly-alpha-1,3-1,6-glucans for viscosity modification
US9695253B2 (en) 2014-03-11 2017-07-04 E I Du Pont De Nemours And Company Oxidized poly alpha-1,3-glucan
DK3119884T3 (da) 2014-03-21 2019-10-14 Danisco Us Inc Serinproteaser af bacillus-arter
US9714403B2 (en) 2014-06-19 2017-07-25 E I Du Pont De Nemours And Company Compositions containing one or more poly alpha-1,3-glucan ether compounds
WO2015195777A1 (en) 2014-06-19 2015-12-23 E. I. Du Pont De Nemours And Company Compositions containing one or more poly alpha-1,3-glucan ether compounds
US20170233710A1 (en) 2014-10-17 2017-08-17 Danisco Us Inc. Serine proteases of bacillus species
CN107075534A (zh) 2014-10-24 2017-08-18 丹尼斯科美国公司 使用三肽基肽酶制备醇的方法
WO2016069557A1 (en) 2014-10-27 2016-05-06 Danisco Us Inc. Serine proteases of bacillus species
WO2016069544A1 (en) 2014-10-27 2016-05-06 Danisco Us Inc. Serine proteases
EP3957729A1 (en) 2014-10-27 2022-02-23 Danisco US Inc. Serine proteases
EP3212662B1 (en) 2014-10-27 2020-04-08 Danisco US Inc. Serine proteases
WO2016069548A2 (en) 2014-10-27 2016-05-06 Danisco Us Inc. Serine proteases
US20160137956A1 (en) 2014-11-17 2016-05-19 The Procter & Gamble Company Benefit agent delivery compositions
ES3017699T3 (en) * 2014-12-15 2025-05-13 Henkel Ag & Co Kgaa Detergent composition comprising subtilase variants
CN107002058B (zh) * 2014-12-15 2026-01-27 诺维信公司 枯草杆菌酶变体
US10131929B2 (en) 2014-12-23 2018-11-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Enzymatically produced cellulose
WO2016176240A1 (en) 2015-04-29 2016-11-03 The Procter & Gamble Company Method of treating a fabric
PL3088502T3 (pl) 2015-04-29 2018-10-31 The Procter & Gamble Company Sposób obróbki tkaniny
EP3088503B1 (en) 2015-04-29 2018-05-23 The Procter and Gamble Company Method of treating a fabric
CN107820515A (zh) 2015-04-29 2018-03-20 宝洁公司 洗涤剂组合物
CN107548415A (zh) 2015-04-29 2018-01-05 宝洁公司 洗涤织物的方法
US20180112204A1 (en) 2015-05-13 2018-04-26 Danisco Us Inc. AprL-CLADE PROTEASE VARIANTS AND USES THEREOF
WO2016201040A1 (en) 2015-06-09 2016-12-15 Danisco Us Inc. Water-triggered enzyme suspension
US20180134997A1 (en) 2015-06-09 2018-05-17 Danisco Us Inc. Osmotic burst encapsulates
WO2016201069A1 (en) 2015-06-09 2016-12-15 Danisco Us Inc Low-density enzyme-containing particles
EP3310911B1 (en) 2015-06-17 2023-03-15 Danisco US Inc. Bacillus gibsonii-clade serine proteases
US10894954B2 (en) 2015-07-06 2021-01-19 Uvic Industry Partnerships Inc. Subtilisin variants and uses thereof
JP7364330B2 (ja) 2015-11-05 2023-10-18 ダニスコ・ユーエス・インク パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属種及びバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種のマンナナーゼ
JP7364331B2 (ja) 2015-11-05 2023-10-18 ダニスコ・ユーエス・インク パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属種マンナナーゼ
EP3374400B1 (en) 2015-11-13 2022-04-13 Nutrition & Biosciences USA 4, Inc. Glucan fiber compositions for use in laundry care and fabric care
WO2017083226A1 (en) 2015-11-13 2017-05-18 E. I. Du Pont De Nemours And Company Glucan fiber compositions for use in laundry care and fabric care
JP2019504932A (ja) 2015-11-13 2019-02-21 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニーＥ．Ｉ．Ｄｕ Ｐｏｎｔ Ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ Ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ 洗濯ケアおよび織物ケアにおいて使用するためのグルカン繊維組成物
US10731111B2 (en) 2015-11-25 2020-08-04 Conopco, Inc. Liquid laundry detergent composition
WO2017100720A1 (en) 2015-12-09 2017-06-15 Danisco Us Inc. Alpha-amylase combinatorial variants
US20180362946A1 (en) 2015-12-18 2018-12-20 Danisco Us Inc. Polypeptides with endoglucanase activity and uses thereof
AU2017240064B8 (en) 2016-03-31 2021-11-11 Gojo Industries, Inc. Antimicrobial peptide stimulating sanitizing composition
AU2017240069B2 (en) 2016-03-31 2024-03-07 Gojo Industries, Inc. Sanitizer composition with probiotic/prebiotic active ingredient
US10806769B2 (en) 2016-03-31 2020-10-20 Gojo Industries, Inc. Antimicrobial peptide stimulating cleansing composition
DE102016205670A1 (de) 2016-04-06 2017-10-12 Henkel Ag & Co. Kgaa Neue Protease mit verbesserter Waschleistung
US11661567B2 (en) 2016-05-31 2023-05-30 Danisco Us Inc. Protease variants and uses thereof
MX2018015559A (es) 2016-06-17 2019-06-06 Danisco Us Inc Variantes de proteasa y sus usos.
EP3535365A2 (en) 2016-11-07 2019-09-11 Danisco US Inc. Laundry detergent composition
CA3043748A1 (en) 2016-11-23 2018-05-31 Gojo Industries, Inc. Sanitizer composition with probiotic/prebiotic active ingredient
US10550443B2 (en) 2016-12-02 2020-02-04 The Procter & Gamble Company Cleaning compositions including enzymes
CN110088261B (zh) 2016-12-02 2022-05-06 宝洁公司 包含酶的清洁组合物
DK3330349T3 (da) 2016-12-02 2024-07-15 Procter & Gamble Rengøringssammensætninger, der indbefatter enzymer
CN110312795B (zh) 2016-12-21 2024-07-23 丹尼斯科美国公司 蛋白酶变体及其用途
CN110312794B (zh) 2016-12-21 2024-04-12 丹尼斯科美国公司 吉氏芽孢杆菌进化枝丝氨酸蛋白酶
CN110914445B (zh) 2017-02-03 2024-08-27 泰莱解决方案美国有限责任公司 工程化糖基转移酶和甜菊醇糖苷葡糖基化方法
US11453871B2 (en) 2017-03-15 2022-09-27 Danisco Us Inc. Trypsin-like serine proteases and uses thereof
EP3601515A1 (en) 2017-03-31 2020-02-05 Danisco US Inc. Delayed release enzyme formulations for bleach-containing detergents
CA3067837A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Danisco Us Inc Low-agglomeration, enzyme-containing particles
CN111373039A (zh) 2017-11-29 2020-07-03 丹尼斯科美国公司 具有改善的稳定性的枯草杆菌蛋白酶变体
CN111742041B (zh) 2017-12-21 2023-06-06 丹尼斯科美国公司 包含耐热干燥剂的含酶的热熔细粒
BR112020016068A2 (pt) 2018-02-08 2020-12-08 Danisco Us Inc. Partículas cera termicamente resistente matriz para encapsulamento de enzima
US20210363470A1 (en) 2018-06-19 2021-11-25 Danisco Us Inc Subtilisin variants
US12415996B2 (en) 2018-06-19 2025-09-16 Danisco Us Inc. Subtilisin variants
JP7584401B2 (ja) 2018-07-30 2024-11-15 テイト アンド ライル ソリューションズ ユー・エス・エー エル・エル・シー 操作されたグリコシルトランスフェラーゼおよびステビオールグリコシドのグルコシル化方法
EP3844255A1 (en) 2018-08-30 2021-07-07 Danisco US Inc. Enzyme-containing granules
EP3856882A1 (en) 2018-09-27 2021-08-04 Danisco US Inc. Compositions for medical instrument cleaning
EP3887515A1 (en) * 2018-11-28 2021-10-06 Danisco US Inc. Subtilisin variants having improved stability
JP7245676B2 (ja) * 2019-03-11 2023-03-24 花王株式会社 変異プロテアーゼ
CN114174504A (zh) 2019-05-24 2022-03-11 丹尼斯科美国公司 枯草杆菌蛋白酶变体和使用方法
CN114174486A (zh) 2019-06-06 2022-03-11 丹尼斯科美国公司 用于清洁的方法和组合物
WO2022023250A1 (en) 2020-07-27 2022-02-03 Unilever Ip Holdings B.V. Use of an enzyme and surfactant for inhibiting microorganisms
WO2022047149A1 (en) 2020-08-27 2022-03-03 Danisco Us Inc Enzymes and enzyme compositions for cleaning
EP3981879A1 (en) * 2020-10-09 2022-04-13 Stada Arzneimittel Ag Method of producing a recombinant protein in a host cell which has a disabled rhamnose metabolism as well as expression vectors, host cells and recombinant proteins thereof
WO2022165107A1 (en) 2021-01-29 2022-08-04 Danisco Us Inc Compositions for cleaning and methods related thereto
WO2023278297A1 (en) 2021-06-30 2023-01-05 Danisco Us Inc Variant lipases and uses thereof
EP4396320A2 (en) 2021-09-03 2024-07-10 Danisco US Inc. Laundry compositions for cleaning
CN117957318A (zh) 2021-09-13 2024-04-30 丹尼斯科美国公司 含有生物活性物质的颗粒
CN118679251A (zh) 2021-12-16 2024-09-20 丹尼斯科美国公司 枯草杆菌蛋白酶变体和使用方法
EP4448750A2 (en) 2021-12-16 2024-10-23 Danisco US Inc. Subtilisin variants and uses thereof
EP4448749A2 (en) 2021-12-16 2024-10-23 Danisco US Inc. Subtilisin variants and methods of use
WO2023168234A1 (en) 2022-03-01 2023-09-07 Danisco Us Inc. Enzymes and enzyme compositions for cleaning
EP4525615A2 (en) 2022-05-14 2025-03-26 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections
CN119487167A (zh) 2022-06-21 2025-02-18 丹尼斯科美国公司 用于清洁的包含具有嗜热菌蛋白酶活性的多肽的组合物和方法
CN120112635A (zh) 2022-09-02 2025-06-06 丹尼斯科美国公司 枯草杆菌蛋白酶变体及其相关方法
CA3265943A1 (en) 2022-09-02 2024-03-07 Danisco Us Inc. DETERGENT COMPOSITIONS AND ASSOCIATED PROCESSES
WO2024050339A1 (en) 2022-09-02 2024-03-07 Danisco Us Inc. Mannanase variants and methods of use
WO2024102698A1 (en) 2022-11-09 2024-05-16 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods of use
EP4658776A1 (en) 2023-02-01 2025-12-10 Danisco US Inc. Subtilisin variants and methods of use
WO2024186819A1 (en) 2023-03-06 2024-09-12 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods of use
EP4680013A1 (en) 2023-03-16 2026-01-21 Nutrition & Biosciences USA 4, Inc. Brevibacillus fermentate extracts for cleaning and malodor control and use thereof
WO2025071996A1 (en) 2023-09-28 2025-04-03 Danisco Us Inc. Variant cutinase enzymes with improved solubility and uses thereof
WO2025085351A1 (en) 2023-10-20 2025-04-24 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods of use
WO2026024922A1 (en) 2024-07-25 2026-01-29 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods of use

Family Cites Families (103)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1296839A (es) 1969-05-29 1972-11-22
GB1372034A (en) 1970-12-31 1974-10-30 Unilever Ltd Detergent compositions
GB2048606B (en) 1979-02-28 1983-03-16 Barr & Stroud Ltd Optical scanning system
DK187280A (da) 1980-04-30 1981-10-31 Novo Industri As Ruhedsreducerende middel til et fuldvaskemiddel fuldvaskemiddel og fuldvaskemetode
GR76237B (es) 1981-08-08 1984-08-04 Procter & Gamble
US4760025A (en) 1984-05-29 1988-07-26 Genencor, Inc. Modified enzymes and methods for making same
US5972682A (en) 1984-05-29 1999-10-26 Genencor International, Inc. Enzymatically active modified subtilisins
US5700676A (en) 1984-05-29 1997-12-23 Genencor International Inc. Modified subtilisins having amino acid alterations
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
DK171161B1 (da) 1985-03-28 1996-07-08 Hoffmann La Roche Fremgangsmåde til påvisning af forekomst eller fravær af mindst én specifik nukleinsyresekvens i en prøve eller til skelnen mellem to forskellige nukleinsyresekvenser i denne prøve
DK154572C (da) 1985-08-07 1989-04-24 Novo Industri As Enzymatisk detergentadditiv, detergent og fremgangsmaade til vask af tekstiler
JPH0697997B2 (ja) 1985-08-09 1994-12-07 ギスト ブロカデス ナ−ムロ−ゼ フエンノ−トチヤツプ 新規の酵素的洗浄剤添加物
US5024943A (en) 1985-11-07 1991-06-18 Gist-Brocades Regulatory region cloning and analysis plasmid for bacillus
DK122686D0 (da) 1986-03-17 1986-03-17 Novo Industri As Fremstilling af proteiner
ES2058119T3 (es) 1986-08-29 1994-11-01 Novo Nordisk As Aditivo detergente enzimatico.
GB8629837D0 (en) 1986-12-13 1987-01-21 Interox Chemicals Ltd Bleach activation
EP0322429B1 (en) 1987-05-29 1994-10-19 Genencor International, Inc. Cutinase cleaning composition
DE3854249T2 (de) 1987-08-28 1996-02-29 Novonordisk As Rekombinante Humicola-Lipase und Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Humicola-Lipasen.
JPS6474992A (en) 1987-09-16 1989-03-20 Fuji Oil Co Ltd Dna sequence, plasmid and production of lipase
WO1989006270A1 (en) 1988-01-07 1989-07-13 Novo-Nordisk A/S Enzymatic detergent
JP3079276B2 (ja) 1988-02-28 2000-08-21 天野製薬株式会社 組換え体ｄｎａ、それを含むシュードモナス属菌及びそれを用いたリパーゼの製造法
US4977252A (en) 1988-03-11 1990-12-11 National Starch And Chemical Investment Holding Corporation Modified starch emulsifier characterized by shelf stability
DE68923398T2 (de) * 1988-05-12 1996-01-25 Procter & Gamble Flüssige Universalwaschmittel, welche anionische und nichtionische oberflächenaktive Mittel, Gerüststoffe und proteolytisches Enzym enthalten.
WO1990009446A1 (en) 1989-02-17 1990-08-23 Plant Genetic Systems N.V. Cutinase
DK316989D0 (da) 1989-06-26 1989-06-26 Novo Nordisk As Enzymer
US6271012B1 (en) 1989-10-11 2001-08-07 Genencor International, Inc. Protease muteins and their use in detergents
KR100236540B1 (ko) 1990-04-14 2000-01-15 레클로우크스 라우에르 알카리성 바실러스-리파제, 이를 코-딩하는 dna 서열 및 리파제를 생산하는 바실러스 균주
US5354559A (en) 1990-05-29 1994-10-11 Grain Processing Corporation Encapsulation with starch hydrolyzate acid esters
SG52693A1 (en) 1991-01-16 1998-09-28 Procter & Gamble Detergent compositions with high activity cellulase and softening clays
GB9108136D0 (en) 1991-04-17 1991-06-05 Unilever Plc Concentrated detergent powder compositions
US5340735A (en) 1991-05-29 1994-08-23 Cognis, Inc. Bacillus lentus alkaline protease variants with increased stability
WO1994012621A1 (en) 1992-12-01 1994-06-09 Novo Nordisk Enhancement of enzyme reactions
US5646101A (en) 1993-01-18 1997-07-08 The Procter & Gamble Company Machine dishwashing detergents containing an oxygen bleach and an anti-tarnishing mixture of a paraffin oil and sequestrant
HU218008B (hu) 1993-05-08 2000-05-28 Henkel Kg. Auf Aktien Ezüst korróziója ellen védő szerek (I) és ezeket tartalmazó gépi tisztítószerek
DK0697035T3 (da) 1993-05-08 1998-09-28 Henkel Kgaa Sølvbeskyttelsesmiddel med korrosion I
DK77393D0 (da) 1993-06-29 1993-06-29 Novo Nordisk As Aktivering af enzymer
US5698504A (en) 1993-07-01 1997-12-16 The Procter & Gamble Company Machine dishwashing composition containing oxygen bleach and paraffin oil and benzotriazole compound silver tarnishing inhibitors
US5486303A (en) 1993-08-27 1996-01-23 The Procter & Gamble Company Process for making high density detergent agglomerates using an anhydrous powder additive
HUT74222A (en) * 1993-09-15 1996-11-28 Procter & Gamble Subtilisin bpn' variants with decreased adsorption and increased hydrolysis
MA23346A1 (fr) * 1993-10-14 1995-04-01 Genencor Int Variantes de la subtilisine
DE4342680A1 (de) 1993-12-15 1995-06-22 Pfeiffer Erich Gmbh & Co Kg Austragvorrichtung für Medien
US5861271A (en) 1993-12-17 1999-01-19 Fowler; Timothy Cellulase enzymes and systems for their expressions
US5691295A (en) 1995-01-17 1997-11-25 Cognis Gesellschaft Fuer Biotechnologie Mbh Detergent compositions
ES2364774T3 (es) 1994-02-24 2011-09-14 HENKEL AG &amp; CO. KGAA Enzimas mejoradas y detergentes que las contienen.
ATE512226T1 (de) 1994-02-24 2011-06-15 Henkel Ag & Co Kgaa Verbesserte enzyme und detergentien damit
US5686014A (en) 1994-04-07 1997-11-11 The Procter & Gamble Company Bleach compositions comprising manganese-containing bleach catalysts
US6599730B1 (en) 1994-05-02 2003-07-29 Procter & Gamble Company Subtilisin 309 variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
DE69527793T2 (de) 1994-06-17 2003-01-02 Genencor International, Inc. Reinigungsverfahren mit pflanzenzellwände abbauendes hemicellulase enzym enthaltender zusammensetzung und deren verwendung in reinigungsverfahren
GB2294268A (en) 1994-07-07 1996-04-24 Procter & Gamble Bleaching composition for dishwasher use
US5879584A (en) 1994-09-10 1999-03-09 The Procter & Gamble Company Process for manufacturing aqueous compositions comprising peracids
US5691297A (en) 1994-09-20 1997-11-25 The Procter & Gamble Company Process for making a high density detergent composition by controlling agglomeration within a dispersion index
US5516448A (en) 1994-09-20 1996-05-14 The Procter & Gamble Company Process for making a high density detergent composition which includes selected recycle streams for improved agglomerate
US5489392A (en) 1994-09-20 1996-02-06 The Procter & Gamble Company Process for making a high density detergent composition in a single mixer/densifier with selected recycle streams for improved agglomerate properties
ES2145315T3 (es) 1994-12-09 2000-07-01 Procter & Gamble Composicion para lavavajillas automaticos que contiene particulas de peroxidos de diacilo.
US5534179A (en) 1995-02-03 1996-07-09 Procter & Gamble Detergent compositions comprising multiperacid-forming bleach activators
US5574005A (en) 1995-03-07 1996-11-12 The Procter & Gamble Company Process for producing detergent agglomerates from high active surfactant pastes having non-linear viscoelastic properties
US5569645A (en) 1995-04-24 1996-10-29 The Procter & Gamble Company Low dosage detergent composition containing optimum proportions of agglomerates and spray dried granules for improved flow properties
AU5646596A (en) 1995-05-05 1996-11-21 Unilever Plc Subtilisin variants
BR9609284A (pt) 1995-06-16 1999-05-11 Procter & Gamble Composições para lavar louça em máquina automática compreendendo catalisadores de cobalto
US5597936A (en) 1995-06-16 1997-01-28 The Procter & Gamble Company Method for manufacturing cobalt catalysts
US5565422A (en) 1995-06-23 1996-10-15 The Procter & Gamble Company Process for preparing a free-flowing particulate detergent composition having improved solubility
DE19530816A1 (de) 1995-08-23 1997-02-27 Cognis Bio Umwelt Verwendung von mutierter Subtilisin-Protease in kosmetischen Produkten
US5576282A (en) 1995-09-11 1996-11-19 The Procter & Gamble Company Color-safe bleach boosters, compositions and laundry methods employing same
ATE321119T1 (de) 1995-09-18 2006-04-15 Procter & Gamble Riechstofffreisetzungssystem
MA24137A1 (fr) 1996-04-16 1997-12-31 Procter & Gamble Fabrication d'agents de surface ramifies .
EP0973855B1 (en) 1997-03-07 2003-08-06 The Procter & Gamble Company Bleach compositions containing metal bleach catalyst, and bleach activators and/or organic percarboxylic acids
BR9808657A (pt) 1997-03-07 2000-05-23 Procter & Gamble Métodos aperfeiçoados de produção de macropoliciclos ligados com ponte cruzada
DE69835814T2 (de) 1997-06-04 2007-01-18 Genencor International, Inc., Palo Alto Protease zur gründlichen reinigung und/oder flecken- und filmreduktion und zusammensetzungen damit
GB2327947A (en) 1997-08-02 1999-02-10 Procter & Gamble Detergent tablet
DE19736591A1 (de) 1997-08-22 1999-02-25 Peter Prof Dr Hegemann Verfahren zum Herstellen von Nukleinsäurepolymeren
DE69839076T2 (de) * 1997-08-29 2009-01-22 Novozymes A/S Proteasevarianten und zusammensetzungen
MA25044A1 (fr) 1997-10-23 2000-10-01 Procter & Gamble Compositions de lavage contenant des variants de proteases multisubstituees.
RU2269572C2 (ru) * 1997-10-23 2006-02-10 Джененкор Интернэшнл, Инк. Варианты протеазы, замещенные в нескольких положениях
US5935826A (en) 1997-10-31 1999-08-10 National Starch And Chemical Investment Holding Corporation Glucoamylase converted starch derivatives and their use as emulsifying and encapsulating agents
US6773907B2 (en) 1997-11-21 2004-08-10 Peter Kamp Hansen Subtilase enzymes
BR9814236A (pt) 1997-11-21 2000-10-03 Novo Nordisk As Enzima subtilase, sua variante, sequência de dna isolada, vetor de expressão, célula microbiana hospedeira, processo para produzir uma subtilase ou uma variante de subtilase, composição, e, uso de uma subtilase ou de uma variante de subtilase.
DK1042501T3 (da) 1997-12-24 2007-08-13 Genencor Int Fremgangsmåde til analyse af vaskeevnen af et enzym
US6835550B1 (en) 1998-04-15 2004-12-28 Genencor International, Inc. Mutant proteins having lower allergenic response in humans and methods for constructing, identifying and producing such proteins
CN100497614C (zh) 1998-06-10 2009-06-10 诺沃奇梅兹有限公司 甘露聚糖酶
US6376450B1 (en) 1998-10-23 2002-04-23 Chanchal Kumar Ghosh Cleaning compositions containing multiply-substituted protease variants
JP2002531457A (ja) 1998-11-30 2002-09-24 ザ、プロクター、エンド、ギャンブル、カンパニー 架橋テトラアザマクロサイクル類の製造方法
BR0010738A (pt) 1999-05-20 2002-02-19 Novozymes As Enzima subtilase do sub gupo i-s1 ou i-s20, enazima subtilase isolada, variante de subtilase, sequência de dna isolada, vetor de expressão, célula hospedeira microbiana, hospedeiro microbiano, método para a produção de uma subtilase ou uma variante de subtilase, composição, e, uso de uma subtilase ou uma variante de subtilase
CZ2002212A3 (cs) 1999-07-22 2002-07-17 The Procter & Gamble Company Varianty subtilisinové proteasy mající aminokyselinové substituce v definovaných epitopových oblastech
BR0012692A (pt) 1999-07-22 2002-04-09 Procter & Gamble Conjugado de protease, composição de limpeza e composição de tratamento pessoal
US6946128B1 (en) 1999-07-22 2005-09-20 The Procter & Gamble Company Protease conjugates having sterically protected epitope regions
CA2379712A1 (en) * 1999-07-22 2001-02-01 The Procter & Gamble Company Subtilisin protease variants having amino acid deletions and substitutions in defined epitope regions
AU2001279254A1 (en) 2000-08-11 2002-02-25 Genencor International, Inc. Bacillus transformation, transformants and mutant libraries
US6440991B1 (en) 2000-10-02 2002-08-27 Wyeth Ethers of 7-desmethlrapamycin
US6582914B1 (en) 2000-10-26 2003-06-24 Genencor International, Inc. Method for generating a library of oligonucleotides comprising a controlled distribution of mutations
DK200101090A (da) * 2001-07-12 2001-08-16 Novozymes As Subtilase variants
EP1523553B1 (en) * 2002-01-16 2009-12-02 Genencor International, Inc. Multiply-substituted protease variants
DE10260805A1 (de) 2002-12-23 2004-07-22 Geneart Gmbh Verfahren und Vorrichtung zum Optimieren einer Nucleotidsequenz zur Expression eines Proteins
EP2295554B1 (en) 2003-12-03 2012-11-28 Danisco US Inc. Perhydrolase
CN105200027B (zh) 2005-10-12 2019-05-31 金克克国际有限公司 储存稳定的中性金属蛋白酶的用途和制备
JP2010501024A (ja) 2006-06-05 2010-01-14 ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニー 酵素安定剤
EP2059591B1 (en) 2006-07-18 2012-09-05 Danisco US Inc. Dishwashing composition that contains a protease variant
EP2100947A1 (en) 2008-03-14 2009-09-16 The Procter and Gamble Company Automatic dishwashing detergent composition
MX2010013101A (es) 2008-06-06 2010-12-21 Danisco Inc Composiciones y metodos que comprenden proteasas microbianas variantes.
CN103361196B (zh) 2008-11-11 2016-01-27 宝洁公司 包含一种或多种可组合的突变的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶
EP3434764A3 (en) 2009-12-09 2019-04-03 The Procter & Gamble Company Fabric and home care products
US20120067373A1 (en) 2010-04-15 2012-03-22 Philip Frank Souter Automatic Dishwashing Detergent Composition

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