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MX2011004097A - Modulacion de la expresion del factor 11. - Google Patents

Modulacion de la expresion del factor 11.

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Publication number
MX2011004097A
MX2011004097A MX2011004097A MX2011004097A MX2011004097A MX 2011004097 A MX2011004097 A MX 2011004097A MX 2011004097 A MX2011004097 A MX 2011004097A MX 2011004097 A MX2011004097 A MX 2011004097A MX 2011004097 A MX2011004097 A MX 2011004097A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
factor
compound
modified oligonucleotide
seq
complementary
Prior art date
Application number
MX2011004097A
Other languages
English (en)
Inventor
Susan M Freier
Brett P Monia
Hong Zhang
Chenguang Zhao
Jeffrey R Crosby
Andrew M Siwkowski
Original Assignee
Isis Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Isis Pharmaceuticals Inc filed Critical Isis Pharmaceuticals Inc
Publication of MX2011004097A publication Critical patent/MX2011004097A/es

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Abstract

La invención se refiere a compuesto antisentido y métodos para disminuir el Factor 11 y tratar o prevenir las complicaciones tromboembólicas en un individuo que lo necesite. Los ejemplos de estados de enfermedad que pueden ser mejorados con la administración de compuestos antisentido que tienen como objetivo el Factor 11 incluyen trombosis, embolia y tromboembolia, tales como trombosis venosa profunda, embolia pulmonar, infarto al miocardio y accidente vascular cerebral. Los compuestos antisentido que tienen como objetivo el Factor 11 pueden utilizarse también como un tratamiento profiláctico para evitar una trombosis y una embolia en individuos con riesgo.

Description

MODULACION DE LA EXPRESION DEL FACTOR 11 Referencia Cruzada con Solicitudes Relacionadas Esta solicitud reivindica la prioridad bajo 35 U.S.C. § 1 1 9(e) para la Solicitud Provisional de E. U. No. 61 /1 05, 772, presentada el 15 de octubre de 2008 y la Solicitud Provisional de E. U. No. 61 /1 74,461 , presentada el 30 de abril de 2009. Cada una de las solicitudes anteriores se incorpora en la presente por referencia en su totalidad . Listado de Secuencias La presente solicitud se presenta junto con un Listado de Secuencias en formato electrónico. El Listado de Secuencias se proporciona como un archivo titulado 20091 01 5_BIOL01 07WOSEQ .txt creado el 1 5 de octubre de 2009, el cual es de 92 Kb de tamaño. La información en el formato electrónico del listado de secuencias se incorpora en la presente por referencia en su totalidad.
Campo de la Invención Las modalidades de la presente invención proporcionan métodos, compuestos y composiciones para reducir la expresión del mARN del Factor 1 1 y proteína en un animal . Tales métodos, compuestos y composiciones son útiles para tratar, prevenir o mejorar las complicaciones tromboembólicas.
Antecedentes de la Invención El sistema circulatorio requiere mecanismos que evitan la pérdida de sangre, así como también aquellos que contrarrestan obstrucciones ¡ntravasculares ínapropiadas. Generalmente, la coagulación comprende una cascada de reacciones que culminan en la conversión de fibrinógeno soluble en un gel de fibrina insoluble. Los pasos de la cascada involucran la conversión de un zimógeno inactivo a una enzima activada. La enzima activa cataliza después el siguiente paso en la cascada.
Cascada de Coagulación La cascada de coagulación se puede iniciar a través de dos ramificaciones, la trayectoria de factor de tejido (también "trayectoria extrínseca"), que es la trayectoria principal y la trayectoria de activación por contacto (también "trayectoria intrínseca"). La trayectoria de factor de tejido se inicia por el factor de tejido (TF, aludido también como factor I I I ) de receptor de superficie de célula, que se expresa constitutivamente por células extravasculares (pericitos , cardiomiocitos, células de músculo liso y queratinocitos) y se expresa mediante monocitos vasculares y células endoteliales por inducción mediante citoquinas inflamatorias o endotoxina . (Drake et al. , Am J Pathol 1 989, 1 34: 1 087-1097). El TF es el receptor celular de alta afinidad para el factor de coagulación Vila, una serina proteasa . En la ausencia de TF, Vila tiene actividad catalítica muy baja , y la unión a TF es necesaria para hacer funcional a Vila a través de un mecanismo alostérico. (Drake et al . , Am J Pathol 1989, 1 34: 1 087-1097). El complejo TF-Vila activa el factor X a Xa. Xa a su vez se asocia con su factor Va co-factor en un complejo de protrombinasa que a su vez activa la protrombina (conocida también como factor I I o factor 2) o trombina (conocida también como factor Ha , o factor 2a). La trombina activa las plaquetas, convierte el fibrinógeno a fibrina y promueve el entrelazamiento de fibrina activando el factor XI I I , formando así un tapón estable en sitios donde se expone el TF en células extravasculares. Además, la trombina refuerza la respuesta de cascada de coagulación activando los factores V y VI I I .
La trayectoria de activación de contacto se dispara mediante la activación del factor XI I a Xl la. El factor Xl la convierte XI a Xla, y Xla convierte IX a IXa. IXa se asocia con su Vila cofactor para convertir X a Xa. Las dos trayectorias convergen en este punto como factor Xa que asocia factor Va para activar la protrombina (factor I I ) a trombina (factor Ha).
Inhibición de Coagulación Por lo menos tres mecanismos mantienen la cascada de coagulación en control , a saber la acción de proteína C activada , antitrombina e inhibidor de trayectoria de factor de tejido. La proteína C activada es una serina proteasa que degrada los cofactores Va y Villa. La proteína C es activada por trombina con trombomodulina y requiere coenzima de proteína S para funcionar. La antitrombina es un inhibidor de serina proteasa (serpin) que inhibe serina proteasas: trombina, Xa, Xl la, Xla y IXa. El inhibidor de trayectoria de factor de tejido inhibe la acción de Xa y el complejo TF-Vl la. (Schwartz AL et al . , Trends Cardiovasc Med . 1997; 7:234-239).
Enfermedad La trombosis es el desarrollo patológico de coágulos de sangre y ocurre un embolismo cuando un coágulo de sangre emigra a otra parte del cuerpo e interfiere con la función del órgano. La tromboembolia puede causar condiciones tales como trombosis venosa profunda, embolia pulmonar, infarto al miocardio y derrame cerebral . Significativamente, la tromboembolia es una causa mayor de morbilidad que afecta a más de dos millones de americanos cada año. (Adcock et al. American Journal of Clinical Pathology. 1997; 1 08:434-49). Aunque la mayoría de los casos de trombosis se debe a problemas extrínsecos adquiridos , por ejemplo, cirugía, cáncer, inmovilidad , algunos casos se deben a una predisposición genética, por ejemplo, síndrome antifosfolípido y la condición autosomal dominante, Factor V Leiden (Bertina RM et al. Nature 1 994; 369:64-67).
Tratamiento Los anticoagulantes más comúnmente usados, warfarina , heparina y heparina debajo peso molecular (L WH) tienen todos desventajas significativas.
La warfarina se usa típicamente para tratar pacientes que sufren de fibrilacion atrial. El fármaco interactúa con factores de coagulación dependientes de la vitamina K los cuales incluyen factores I I , VI I , IX y X.
Las proteínas C y S anticoagulantes son inhibidas también por la warfarina . La terapia con fármaco usando warfarina se complica además por el hecho de que la warfarina interactúa con otros medicamentos, incluyendo fármacos usados para tratar la fibrilacion atrial , tal como amiodarone. Debido a que la terapia con warfarina es difícil de predecir, los pacientes deben ser monitoreados cuidadosamente con el fin de detectar cualesquiera signos de sangrado anómalo.
La heparina funciona mediante la activación de antitrombina que inhibe tanto la trombina como el factor X. (Bjork I , Lindahl U . Mol Cell Biochem . 1982 48: 161 -182). El tratamiento con heparina puede causar una reacción inmunológica que hace que las plaquetas se agreguen dentro de los vasos sanguíneos lo que puede conducir a la trombosis. Este efecto secundario es conocido como trombocitopenia inducida por heparina (H IT) y requiere el monitoreo del paciente. El tratamiento prolongado con heparina puede conducir también a osteoporosis. La LMWH puede inhibir también el Factor 2, pero en un grado menor que la heparina no fraccionada (U FH). La LMWH ha sido implicada en el desarrollo de HIT. Así, los agentes anticoagulantes actuales carecen de la habilidad de predicción y especificidad y, por lo tanto, requieren el monitoreo cuidadoso del paciente para evitar efectos secundarios adversos, tales como complicaciones de sangrado. No hay actualmente anticoagulantes que apunten solamente a la trayectoria intrínseca o extrínseca .
Breve Descripción de la Invención En la presente se proporcionan métodos, compuestos y composiciones para modular la expresión del mARN del Factor 1 1 y proteína. En ciertas modalidades, inhibidores específicos de Factor 1 1 modulan la expresión de mARN de Factor 1 1 y proteína. En ciertas modalidades, los inhibidores específicos del Factor 1 1 son ácidos nucleicos, proteínas o moléculas pequeñas.
En ciertas modalidades, la modulación puede ocurrir en una célula o un tejido. En ciertas modalidades, la célula o el tejido está en un animal . En ciertas modalidades, el animal es un humano. En ciertas modalidades, los niveles de mARN del Factor 1 1 están reducidos. En ciertas modalidades, los niveles de proteína de Factor 1 1 están reducidos. Tal reducción puede ocurrir en una manera dependiente del tiempo o en una manera dependiente de la dosis.
También se proporcionan métodos, compuestos y composiciones útiles para evitar, tratar y mejorar enfermedades, trastornos y condiciones. En ciertas modalidades, tales enfermedades, trastornos y condiciones son complicaciones tromboembólicas. Tales complicaciones tromboembólicas incluyen las categorías de trombosis, embolia y tromboembolia . En ciertas modalidades, tales complicaciones tromboembólicas incluyen trombosis venosa profunda , embolia pulmonar, infarto al miocardio y derrame cerebral .
Tales enfermedades, trastornos y condiciones pueden tener uno o más factores de riesgo, causas o resultados en común . Ciertos factores de riesgo y causas para el desarrollo de una complicación tromboembólica incluyen inmovilidad, cirugía (particularmente cirugía ortopédica), malignidad, embarazo, edad avanzada, uso de anticonceptivos orales, fibrilación atrial , complicación tromboembólica previa , enfermedad inflamatoria crónica y trastornos de coágulos protrombóticos heredados o adquiridos. Ciertos resultados asociados con el desarrollo de una complicación tromboembólica incluyen flujos sangu íneos disminuidos a través de un vaso afectado, muerte de tejido y muerte.
En ciertas modalidades , los métodos de tratamiento incluyen administrar un inhi bidor de Factor 1 1 específico a un individuo que lo necesita .
Descri pción Detallada de la Invención Se entiende que tanto la descripción general precedente como la siguiente descripción detallada son ejemplificativas y explicativas solamente y n son restrictivas de la invención , como se reivindica . En la presente , el uso del si ngular incluye el plural a menos que se establezca específicamente otra cosa . Como se usa en la presente, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique otra cosa . Además , el uso del término "que incluye" así como también otras formas, tales como "i ncluye" e "incluido", no es limitante. También , los términos tales como "elemento" o "componente" abarcan ambos elementos y componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden más de una subunidad , a menos que se ind ique específicamente otra cosa .
Los encabezados de sección usados en la presente son pa ra propósitos de organización solamente y no se deben interpretar como limitantes del asunto descrito. Todos los documentos, o porciones de documentos, citados en esta solicitud , incluyendo, pero no lim itados a , patentes , solicitudes de patente, artículos, libros y tratados se incorporan expresamente en la presente por referencia para las porciones del documento discutido en la presente, así como también en sus totalidades.
Defin iciones A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada en relación con , y los procedimientos y técnicas de, qu ímica anal ítica, química orgánica de síntesis, y química medicinal y farmacéutica descritos en la presente son aquéllos bien conocidos y comúnmente usados en la técnica. Se pueden usar técnicas estándar para síntesis química y análisis químico. Cuando se permita, todas las patentes, solicitudes, solicitudes publicadas y otras publicaciones, números de acceso a GENBAN K e información de secuencias asociada obtenibles a través de bases de datos tales como National Center for Biotechnoiogy I nformation (NCBI) y otros datos aludidos en toda la descripción en la presente se incorporan por referencia para las porciones del documento discutido en la presente, así como también en sus totalidades.
A menos que se indique otra cosa, los siguientes términos tienen los siguientes significados: "2'-0-metoxietilo" (también 2'-MOE y 2 -0(CH2 )2-OCH3) se refiere una modificación de O-metoxi-etilo de la posición 2' de un anillo de furosilo. Un azúcar modificada con 2'-0-metoxietilo es un azúcar modificada.
"N ucleótido de 2'-0-metoxietilo" significa un nucleótido que comprende una porción de azúcar modificada con 2'-0-metoxietilo. "5-metilcitosina" significa una citosina modificada con un grupo metilo unido en la posición 5' . Una 5-metilcitosina es una nucleobase modificada. "Agente farmacéuticamente activo" significa la substancia o las sustancias en una composición farmacéutica que proporciona un beneficio terapéutico cuando se administra a un individuo . Por ejemplo, en ciertas modalidades, un oligonucleótido antisentido dirigido al Factor 1 1 es un agente farmacéuticamente activo.
"Región activa objetivo" o "región objetivo" significa una región a la cual se apuntan uno o más compuestos antisentido activos. "Compuestos antisentido activos" significa compuestos antisentido que reducen los niveles de ácido nucleico o niveles de proteína objetivos.
"Administrado concomitantemente" se refiere a la coadministración de dos agentes en cualquier manera en la cual los efectos farmacológicos de ambos se manifiestan en el paciente al mismo tiempo. La administración concomitante no requiere que ambos agentes se administren en una sola composición farmacéutica, en la misma forma de dosificación o por la misma ruta de administración . Los efectos de ambos agentes no necesitan manifestarse por sí mismos al mismo tiempo. Los efectos solamente necesitan ser traslapados durante un periodo de tiempo y no necesitan ser coextensivos.
"Administrar" significa proporcionar un agente farmacéutico a un individuo e incluye pero no está limitado a, administrar por un profesional médico y auto-administrar.
"Mejoría" se refiere a una disminución de por lo menos un indicador, señal o síntoma de una enfermedad , trastorno o condición asociado. La severidad de los indicadores se puede determinar mediante medidas subjetivas u objetivas, las cuales son conocidas por aquellos expertos en la técnica.
"Animal" se refiere a un animal humano o no humano, incluyendo. pero no limitado a , ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y primates no humanos, incluyendo, pero no limitados a, monos y chimpancés.
"Compuesto antídoto" se refiere a un compuesto capaz de disminuir la intensidad o duración de cualquier actividad antisentido mediada.
"Oligonucleótido antídoto" significa un compuesto antídoto que comprende un oligonucleótido que es complementario de y capaz de hibridar con un compuesto antisentido.
"Proteína antídoto" significa un compuesto antídoto que comprende un péptido.
"Anticuerpo" se refiere a una molécula caracterizada por reaccionar específicamente con un antígeno en alguna manera , donde el anticuerpo y el antígeno se definen cada uno en términos del otro . Anticuerpo se puede referir a una molécula completa de anticuerpo o a cualquier fragmento o región de la misma, tal como la cadena pesada, la cadena ligera, la región Fab y la región Fe.
"Actividad antisentido" significa cualquier actividad detectable o mesurable atribuible a la hibridación de un compuesto antisentido con su ácido nucleico objetivo. En ciertas modalidades, la actividad antisentido es una disminución en la cantidad o expresión de un ácido nucleico objetivo o proteína codificada por tal ácido nucleico objetivo.
"Compuesto antisentido" significa un compuesto oligomérico que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico objetivo a través de enlazamiento de hidrogeno.
"Inhibición antisentido" significa la reducción de niveles de ácido nucleico objetivo o niveles de proteína objetivo en la presencia de un compuesto antisentido complementario a un ácido nucleico objetivo en comparación con niveles de ácido nucleico objetivo o niveles de proteína objetivo en la ausencia del compuesto antisentido.
"Oligonucleótido antisentido" significa un oligonucleótido de hebra sencilla que tiene una secuencia de nucleobases que permite la hibridación con una región o segmento correspondiente de un ácido nucleico objetivo.
"Azúcar bicíclica" significa un anillo de furosilo modificado por el puenteo de dos átomos de anillo no gemínales. Un azúcar bicíclica es una azúcar modificada.
"Acido nucleico bicíclico" o "BNA" se refiere a un nucleósido o nucleótido en donde la porción de furanosa del nucleósido o nucleótido incluye un puente que conecta dos átomos de carbono en el anillo de furanosa, por lo que se forma un sistema de anillo bicíclico.
"Estructura de tapa" o "porción de tapa terminal" significa modificaciones qu ímicas, las cuales se han incorporado en cualquier término de un compuesto antisentido.
"Región químicamente distinta" se refiere a una región de un compuesto antisentido que es de alguna manera químicamente diferente a otra región del mismo compuesto antisentido. Por ejemplo , una región que tiene nucleótidos 2'-0-metoxietilo es químicamente distinta de una región que tiene nucleótidos sin modificaciones 2'-0-metoxietilo.
"Compuesto antisentido quimérico" significa un compuesto antisentido que tiene por lo menos dos regiones químicamente distintas.
"Co-administración" significa la administración de dos o más agentes farmacéuticos a un individuo. Los dos o más agentes farmacéuticos pueden estar en una sola composición farmacéutica , o pueden estar en composiciones farmacéuticas separadas. Cada uno de los dos o más agentes farmacéuticos puede administrarse a través de la misma o diferentes rutas de administración. La co-administración abarca la administración paralela o secuencial.
"Factor de coagulación" significa cualquiera de los factores I , I I , III , IV, V, VI I , XI I I , IX, X, XI , XI I , XI I I o TAFI en la cascada de coagulación de la sangre. "Acido nucleico del factor de coagulación" significa cualquier ácido nucleico que codifica un factor de coagulación . Por ejemplo, en ciertas modalidades, un ácido nucleico de factor de coagulación incluye, sin limitación una secuencia de ADN que codifica un factor de coagulación (incluyendo ADN genómico que comprende intrones y exones), una secuencia de ARN transcrita a partir de ADN que codifica un factor de coagulación, y una secuencia de mARN que codifica un factor de coagulación . "mARN de factor de coagulación" significa un mARN que codifica una proteína de factor de coagulación.
"Complementariedad" significa la capacidad de apareamiento entre nucleobases de un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico.
"Nucleobases contiguas" significa nucleobases inmediatamente adyacentes unas de otras.
"Diluyente" significa un ingrediente en una composición que carece de actividad farmacológica, pero es necesario o deseable farmacéuticamente. Por ejemplo, el diluyente en una composición inyectada puede ser un líquido, por ejemplo, solución salina.
"Dosis" significa una cantidad específica de un agente farmacéutico proporcionado en una sola administración, o en un periodo de tiempo específico. En ciertas modalidades, se puede administrar una dosis en uno, dos o más bolos, tabletas o inyecciones. Por ejemplo, en ciertas modalidades donde se desea la administración subcutánea, la dosis deseada requiere un volumen no fácilmente acomodado por una sola inyección, por lo tanto, se pueden usar dos o más inyecciones para lograr la dosis deseada. En ciertas modalidades, el agente farmacéutico se administra mediante infusión en un periodo de tiempo extendido o continuamente. Las dosis se pueden establecer como la cantidad de agente farmacéutico por hora, día, semana o mes.
"Cantidad efectiva" significa la cantidad de agente farmacéutico activo suficiente para efectuar un resultado fisiológico deseado en un individuo que necesita el agente. La cantidad efectiva puede variar entre individuos dependiendo de la salud y la condición física del individuo que se trata, el grupo taxonómico de los individuos que se tratan , la formulación de la composición, evaluación de la condición médica del individuo y otros factores relevantes.
"Acido nucleico del Factor 1 1 " o "acido nucleico del Factor XI" o "acido nucleico de F 1 1 " o acido nucleico de F XI" significa cualquier ácido nucleico que codifica el Factor 11. Por ejemplo, en ciertas modalidades, un ácido nucleico de Factor 11 incluye una secuencia de ADN que codifica el Factor 11, una secuencia de ARN transcrita a partir de ADN que codifica el Factor 11 (incluyendo ADN genómico que comprende intrones y exones), y una secuencia de mARN que codifica el Factor 11. "mARN de Factor 11" significa un mARN que codifica una proteína de Factor 11.
"Inhibidor específico de Factor 11" se refiere a cualquier agente capaz de inhibir específicamente la expresión de mARN de Factor 11 y/o proteína de Factor 11 a nivel molecular. Por ejemplo, los inhibidores específicos de Factor 11 incluyen ácidos nucleicos (incluyendo compuestos antisentido), péptidos, anticuerpos, moléculas pequeñas y otros agentes capaces de inhibir la expresión de mARN de Factor 11 y/o proteína de Factor 11. En ciertas modalidades, modulando específicamente la expresión de mARN de Factor 11 y/o la expresión de proteína de Factor 11, los inhibidores específicos de Factor 11 pueden afectar otros componentes de la cascada de coagulación incluyendo componentes corriente abajo. De manera similar, en ciertas modalidades, los inhibidores específicos de Factor 11 pueden afectar otros procesos moleculares en un animal.
"Antídoto de inhibidor específico de Factor 11" significa un compuesto capaz de disminuir el efecto de un inhibidor específico de Factor 11. En ciertas modalidades, un antídoto de inhibidor específico de Factor 11 se selecciona de un péptido de Factor 11; un oligonucleótido de antídoto de Factor 11, incluyendo un compuesto antídoto de Factor 1 1 complementario para un compuesto antisentido de Factor 1 1 ; y cualquier compuesto o proteína que afecte la trayectoria de coagulación intrínseca o extrínseca.
"Completamente complementario" o "100% complementario" significa cada nucleobase de un primer ácido nucleico tiene una nucleobase complementaria en un segundo ácido nucleico. En ciertas modalidades, un primer ácido nucleico es un compuesto antisentido y un ácido nucleico objetivo es un segundo ácido nucleico.
"Gapmer" significa un compuesto quimérico antisentido en el cual una región interna que tiene una pluralidad de nucleósidos que soporta la escisión de RNasa H se posiciona entre regiones externas que tienen uno o más nucleósidos, en donde los nucleósidos que comprenden la región interna son qu ímicamente distintos del nucleósido o nucleósidos que comprenden las regiones externas. La región interna puede aludirse como un "segmento de espacio" y las regiones externas se pueden aludir como "segmentos de ala" .
"Gap-ampliado" significa un compuesto quimérico antisentido que tiene un segmento de espacio de 1 2 o más 2'-deoxiribonucleósidos contiguos posicionados entre e inmediatamente adyacentes a segmentos de ala 5' y 3' que tienen de uno a seis nucleósidos.
"Hibridación" significa el recocido de moléculas de ácido nucleico complementario. En ciertas modalidades, las moléculas de ácido nucleico complementario incluyen un compuesto antisentido y un ácido nucleico objetivo.
"Identificar un animal en riesgo de complicaciones tromboembólicas" significa identificar un animal que ha sido diagnosticado con una complicación tromboembolica o identificar un animal predispuesto a desarrollar una complicación tromboembolica . Los individuos predispuestos a desarrollar una complicación tromboembolica incluyen aquéllos que tienen uno o más factores de riesgo par complicaciones tromboembólicas incluyendo inmovilidad , cirugía (particularmente cirugía ortopédica), malignidad, embarazo, edad avanzada, uso de anticonceptivos orales y trastornos de coagulación protrombótica hereditaria o adquirida. Tal identificación se puede realizar mediante cualquier método incluyendo la evaluación de un historial médico del individuo y pruebas o evaluaciones cl ínicas normales.
"Inmediatamente adyacente" significa que no hay elementos que intervengan entre los elementos inmediatamente adyacentes.
"Individuo" significa un animal humano o no humano seleccionado para tratamiento o terapia.
"Vinculación de internucleósido" se refiere al enlace qu ímico entre nucleósidos.
"N ucleósidos vinculados" significa nucleósidos adyacentes que están enlazados conjuntamente.
"Desigualdad" o "nucleobase no complementaria" se refiere al caso cuando una nucleobase de un primer ácido nucleico no es capaz de aparearse con la nucleobase correspondiente de un segundo ácido nucleico u objetivo.
"Vinculo de internucleósido modificado" se refiere a una sustitución o cualquier cambio de un enlace de internucleósido que ocurre naturalmente (es decir, un enlace de internucleósido de fosfodiéster).
"Nucleobase modificada" se refiere a cualquier nucleobase diferente a adenina, citosina, guanina , timidina o uracilo. Una "nucleobase sin modificar" significa las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U).
"Nucleótido modificado" significa un nucleótido que tiene, independientemente, una porción de azúcar modificada, enlace de internucleósido modificado o nucleobase modificada. Un "nucleósido modificado" significa un nucleósido que tiene, independientemente, una porción de azúcar modificada o nucleobase modificada.
"Oligonucleótido modificado" significa un oligonucleótido que comprende un enlace internucleósido modificado, un azúcar modificada, o una nucleobase modificada.
"Azúcar modificada" se refiere a una sustitución o cambio de un azúcar natural .
"Motivo" significa el patrón de regiones químicamente distintas en un compuesto antisentido.
"Enlace internucleósido que ocurre naturalmente" significa un enlace de fosfodiéster de 3' a 5' .
"Porción de azúcar natural" significa un azúcar encontrada en ADN (2'-H) o ARN (2'-OH).
"Acido nucleico" se refiere a moléculas compuestas por nucleótidos monoméricos. Un ácido nucleico incluye ácidos ribonucleicos (ARN), ácidos deoxiribonucieicos (ADN), ácidos nucleicos de hebra sencilla, ácidos nucleicos de doble hebra, ácidos ribonucleicos interferentes pequeños (siARN ) y microARNs (miARN).
"Nucleobase" significa una porción heterocíclica capaz de aparearse con una base de otro ácido nucleico.
"Secuencia de nucleobase" significa el orden de nucleobases contiguas independientes de cualquier modificación de azúcar, enlace o nucleobase.
"N ucleósido" significa una nucleobase vinculada a un azúcar.
"Mimético de nucleósido" incluye aquellas estructuras usadas para remplazar el azúcar o el azúcar y la base y no necesariamente el vinculo en una o más posiciones de un compuesto oligomérico tal como, por ejemplo, miméticos de nucleósido que tienen miméticos de morfolino, ciclohexenilo, ciclohexilo, tetrahidropiranilo, azúcar biciclo o triciclo, por ejemplo, unidades de azúcar no furanosa. El mimético de nucleótido incluye aquellas estructuras usadas para remplazar el nucleósido y el vinculo en una o más posiciones de un compuesto oligomérico tal como, por ejemplo, ácidos nucleicos de péptido o morfolinos (morfolinos vinculados mediante -N(H )-C(=0)-0- u otro vinculo no fosfodiéster). El sucedáneo de azúcar traslapa con el término ligeramente más amplio mimético de nucleósido, pero se pretende indicar el remplazo de la unidad de azúcar (anillo de furanosa) solamente. Los anillos de tetrahidropiranilo proporcionados en la presente son ilustrativos de un ejemplo de un sucedáneo de azúcar en donde el grupo de azúcar furanosa ha sido remplazado con un sistema de anillo tetrahidropiranilo.
"Nucleótido" significa un nucleósido que tiene un grupo fosfato vinculado de manera covalente con la porción de azúcar del nucleósido.
"Compuesto oligomérico" u "oligómero" significa un pol ímero de subunidades monomélicas vinculadas que es capaz de hibridar con por lo menos una región de una molécula de ácido nucleico.
"Oligonucleótido" significa un pol ímero de nucleósidos vinculados cada uno de los cuales puede ser modificado o no modificado, independientemente uno de otro.
"Administración parenteral" significa la administración a través de inyección o infusión. La administración parenteral incluye administración subcutánea, administración intravenosa, administración intramuscular, administración intraarterial, administración intraperitoneal, o administración intracraneal, por ejemplo, administración intratecal o intracerebroventricular.
"Péptido" significa una molécula formada mediante vinculación de por lo menos dos aminoácidos medíante enlaces de amida. Péptido se refiere a polipéptídos y proteínas.
"Composición farmacéutica" significa una mezcla de sustancias adecuada para administrar a un individuo. Por ejemplo, una composición farmacéutica puede comprender uno o más agentes farmacéuticos activos y una solución acuosa estéril .
"Sales farmacéuticamente aceptables" significa sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, es decir, sales que retienen la actividad biológica deseada del oligonucleótido padre y no imparten efectos toxicológicos indeseables al mismo.
"Vinculo fosforotioato" significa un enlace entre nucleósidos donde el enlace de fosfodiéster está modificado mediante el remplazo de los átomos de oxígeno no puenteados con un átomo de azufre. Un vinculo fosforotioato ( P=S) es un vinculo de internucleósido modificado.
"Porción" significa un número definido de nucleobases contiguas (es decir, vinculadas) de un ácido nucleico. En ciertas modalidades, una porción es un número definido de nucleobases contiguas de un ácido nucleico objetivo. En ciertas modalidades, una porción es un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido.
"Prevenir" se refiere a retrasar o impedir el comienzo o desarrollo de una enfermedad, trastorno o condición durante un periodo de tiempo desde minutos hasta indefinidamente. Prevenir significa también reducir el riesgo de desarrollar una enfermedad , trastorno o condición.
"Profármaco" significa un agente terapéutico que se prepara en una forma inactiva que se convierte a una forma activa dentro del cuerpo o las células del mismo mediante la acción de enzimas endógenas u otros productos químicos o condiciones.
"Efectos secundarios" significa respuestas fisiológicas atribuibles a un tratamiento diferente a los efectos deseados. En ciertas modalidades, los efectos secundarios incluyen reacciones en el sitio de inyección, anormalidades en prueba de función del h ígado, anormalidades en la función renal , toxicidad del h ígado, toxicidad renal , anormalidades del sistema nervioso central , miopatías , y malestar. Por ejemplo, los niveles incrementados de aminotransferasa en suero pueden indicar toxicidad del hígado o anormalidad en la función del h ígado. Por ejemplo, la bilirrubina incrementada puede indicar toxicidad del hígado o anormalidad de la función del h ígado.
"Oligonucleótido de hebra sencilla" significa un oligonucleótido que no se híbrida con una hebra complementaria.
"Hibridable específicamente" se refiere a un compuesto antisentido que tiene un grado suficiente de complementariedad entre un oligonucleótido antisentido y un ácido nucleico objetivo para inducir un efecto deseado, mientras que exhibe efectos m ínimos o nulos en ácidos nucleicos no objetivo bajo condiciones en las cuales se desea la unión específica , es decir, bajo condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo y tratamientos terapéuticos.
"Selección de objetivo" u "objetivo seleccionado" significa el proceso de diseño y selección de un compuesto antisentido que hibridará específicamente con un ácido nucleico objetivo e inducirá un efecto deseado.
"Acido nucleico objetivo", "ARN objetivo" y "transcripto de ARN objetivo" se refieren todos a un ácido nucleico capaz de ser seleccionado como objetivo por compuestos antisentido.
"Segmento objetivo" significa la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico objetivo al cual se apunta un compuesto antisentido . "Sitio objetivo 5"' se refiere al nucleótido más en 5' de un segmento objetivo. "Sitio objetivo 3"' se refiere al nucleótido más en 3' de un segmento objetivo.
"Cantidad terapéuticamente efectiva" significa una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio terapéutico a un individuo.
"Complicación tromboembólica" significa cualquier enfermedad, trastorno o condición que involucra una embolia causada por un trombo. Ejemplos de tales enfermedades, trastornos y condiciones incluyen las categorías de trombosis, embolia y tromboembolia. En ciertas modalidades, tales trastornos de enfermedad y condiciones incluyen trombosis venosa profunda, embolia pulmonar, infarto al miocardio y derrame cerebral.
"Tratar" se refiere a administrar una composición farmacéutica para efectuar una alteración o mejoría de una enfermedad, trastorno o condición. "Nucleótido no modificado" significa un nucleótido compuesto por nucleobases que ocurren naturalmente, porciones de azúcar y vínculos internucleósido. En ciertas modalidades, un nucleótido no modificado es un nucleótido de ARN (es decir, ß-D-ribonucleósidos) o un nucleótido de ADN (es decir, ß-D-deoxiribonucleósido).
Ciertas Modalidades Las modalidades de la presente invención proporcionan métodos compuestos y composiciones para disminuir la expresión de mARN y proteína del Factor 1 .
Las modalidades de la presente invención proporcionan métodos, compuestos y composiciones para el tratamiento, prevención o mejoría de enfermedades trastornos y condiciones asociadas con el Factor 1 1 en un individuo que necesita los mismos. Están contemplados también métodos y compuestos para la preparación de un medicamento para el tratamiento, prevención o alivio de una enfermedad, trastorno o condición asociado con el Factor 1 1 . Las enfermedades, trastornos y condiciones asociados con el Factor 1 1 incluyen complicaciones tromboembólicas tales como trombosis, embolia, tromboembolia , trombosis venosa profunda, embolia pulmonar, infarto al miocardio y derrame cerebral.
Las modalidades de la presente invención proporcionan un inhibidor específico del Factor 1 1 para uso en el tratamiento, prevención o alivio de una enfermedad asociada con el Factor 1 1 . En ciertas modalidades, los inhibidores específicos de Factor 1 1 son ácidos nucleicos (incluyendo compuestos antisentido), péptidos, anticuerpos, moléculas pequeñas y otros agentes capaces de inhibir la expresión de mARN de Factor 1 1 y/o proteína de Factor 1 1 .
En ciertas modalidades de la presente invención , los inhibidores específicos de Factor 1 1 son péptidos o proteínas, tales como, pero n limitados a, inhibidores de alfa 1 proteasa, antitrombina III, inhibidores Cl, e inhibidores alfa 2 plasmin como se describe en J Clin Invest 1 982, 69:844-852; alfa 1 antitripsina (alfa IAT) como se describe en Thromb Res 1 987, 48: 145-1 51 ; inhibidores de péptido de Factor 1 1 como se describe en USPPN 2008/021 998 y Blood 1 998, 92:41 98-206; MAP4-RGKWC como se describe en Thromb Res 2001 , 104:451 -465; beta 2 GPI como se describe en Proc Nati Acad Sci 2004, 1 01 :3939-44; inhibidor de lentinus proteinasa como se describe en Eur J Biochem 1999 , 262:91 5-923; inhibidor del dominio Kunitz precursor de proteasa nexin-2/amiloide beta proteína (APPI ) y antitrombina (AT) como se describe en J Biol Chem 2004, 279 :29485-29492; y aprotinina como se describe en J Biol Chem 2005, 280:23523-30.
En ciertas modalidades de la presente invención, los inhibidores específicos del Factor 1 1 son anticuerpos, tales como , pero no limitados a, Winston-Salem (lgG3 kappa) y Baltimore (IgGI kappa) como se describe en Blood 1988, 72: 1 748-54; 5F4, 3C1 , y I FI como se describe en J Biol Chem 1985, 260: 07 4-719; anticuerpos monoclonales como se describe en Throm Haemost 1990, 63:41 7-23; XI-5108 como se describe en J Thromb Haem 2006, 4: 1496-1 501 ; anticuerpos monoclonales 4-1 como se describe en Tromb Res 1 986, 42:225-34; y anticuerpo abcixmab como se describe el Ejemplo 1 9 de USPN 6, 566 , 140.
En ciertas modalidades de la presente invención, los inhibidores específicos del Factor 1 1 son moléculas pequeñas, tales como, pero no limitadas a , diisopropil fluorofosfatos (DFP); los inhibidores de molécula pequeña como se describe en los Ejemplos 1 a 7 de USPPN 2004/ 01 80855; y p-aminobenzamidina (pAB) como se describe en J Biol Chem 2005, 280:23523-30. Las modalidades de la presente invención proporcionan un inhibidor específico del Factor 1 1 , como se describe en la presente, para uso en el tratamiento, prevención o alivio de complicaciones tromboembólicas tales como trombosis, embolia, tromboembolia, trombosis venosa profunda, embolia pulmonar, infarto al miocardio y derrame cerebral .
Las modalidades de la presente invención proporcionan el uso de inhibidores específicos del Factor 1 1 como se describe en la presente en la elaboración de un medicamento para tratar, aliviar o prevenir una complicación tromboembólica tal como trombosis, embolia , tromboembolia, trombosis venosa profunda, embolia pulmonar, infarto al miocardio y derrame cerebral .
Las modalidades de la presente invención proporcionan un inhibidor específico del Factor 1 1 como se describe en la presente para uso en el tratamiento, prevención o alivio de una complicación tromboembólica como se describe en la presente medíante terapia en combinación con un agente adicional o terapia como se describe en la presente. Los agentes o terapias se pueden co-administrar o administrar concomitantemente.
Las modalidades de la presente invención proporcionan el uso de un inhibidor específico del Factor 1 1 como se describe en la presente en la elaboración de un medicamento para tratar, prevenir o aliviar una complicación tromboembólica como se describe en la presente mediante terapia en combinación con un agente o terapia adicional como se describe en la presente. Los agentes o terapias se pueden co-administrar o administrar concomitantemente.
Las modalidades de la presente invención proporcionan el uso de un inhibidor específico del Factor 1 como se describe en la presente en la elaboración de un medicamento para tratar, prevenir o aliviar una complicación tromboembólica como se describe en la presente en un paciente quien es administrado subsecuentemente con un agente o terapia adicional como se describe en la presente.
Las modalidades de la presente invención proporcionan un paquete para tratar, prevenir o aliviar una complicación tromboembólica como se describe en la presente en donde el paquete comprende: (i) un inhibidor específico del Factor 1 1 como se describe en la presente; y alternativamente (ii) un agente o terapia adicional como se describe en la presente.
Un paquete de la presente invención puede incluir además instrucciones para usar el paquete para tratar, prevenir o aliviar una complicación tromboembólica como se describe en la presente mediante terapia en combinación como se describe en la presente.
Las modalidades de la presente invención proporcionan compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico del Factor 1 1 . En ciertas modalidades, el ácido nucleico del Factor 1 1 es cualquiera de las secuencias expuestas en GENBANK No. de Acceso N M_0001 28.3 (incorporada en la presente como SEQ I D NO: 1 ), GENBANK No. de Acceso NT_022792.17, truncada de 1 9598000 a 1 9624000, (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 2), GENBANK No. de Acceso N M_028066.1 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 6), exones 1 -1 5 GENBANK No. de Acceso NW_001 1 18167.1 , (incorporada en la presente como SEQ I D NO: 274).
En ciertas modalidades, la invención proporciona un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado. En ciertas modalidades, el compuesto de la invención comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 1 2 a 30 nucleósidos vinculados.
En ciertas modalidades, el compuesto de la invención puede comprender un oligonucleótido modificado que comprende una secuencia de nucleobase por lo menos 80% , por lo menos 85% , por lo menos 90% , por lo menos 95% , por lo menos 96% , por lo menos 97% , por lo menos 98%, o por lo menos 99% complementaria a una porción de igual longitud de SEQ ID NO: 1 . En ciertas modalidades, el compuesto de la invención puede comprender un oligonucleótido modificado que comprende una secuencia de nucleobase 100% complementaria a una porción de longitud igual de SEQ I D NO: 1 .
En ciertas modalidades, la invención proporciona un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que comprende una secuencia de nucleobase complementaria a por lo menos una porción de nucleobases 656 a 676 de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender por lo menos 8, por lo menos 1 0, por lo menos 1 2, por lo menos 14, por lo menos 16, por lo menos 1 8 o 20 nucleobases contiguas complementarias a una porción de longitud igual de nucleobases 656 a 676 de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de nucleobase por lo menos 80% , por lo menos 85%, por lo menos 90% , por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98% , o por lo menos 99% complementaria a una porción de longitud igual de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de nucleobase 100% complementaria a una porción de longitud igual de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede lograr por lo menos 80% de inhibición de niveles de mRNA humano según determinación usando un método de ensayo RT-PCR, opcionalmente en células HepG2 (por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 3).
En ciertas modalidades, la invención proporciona un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que comprende una secuencia de nucleobase complementaria a por lo menos una porción de nucleobases 665 a 687 de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender por lo menos 8, por lo menos 1 0, por lo menos 1 2 , por lo menos 1 4, por lo menos 16, por lo menos 18 o 20 nucleobases contiguas complementarias a una porción de longitud igual de nucleobases 665 a 687 de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de nucleobase por lo menos 80% , por lo menos 85% , por lo menos 90% , por lo menos 95% , por lo menos 96% , por lo menos 97%, por lo menos 98% , o por lo menos 99% complementaria a una porción de longitud igual de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de nucleobase 1 00% complementaria a una porción de longitud igual de SEQ ID NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede lograr por lo menos 50% de inhibición de niveles de m RNA humano según determinación usando un método de ensayo RT-PCR, opcionalmente en células HepG2 (por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 3).
En ciertas modalidades, la invención proporciona un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que comprende una secuencia de nucleobase complementaria a por lo menos una porción de nucleobases 675 a 704 de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender por lo menos 8, por lo menos 1 0, por lo menos 1 2, por lo menos 1 4, por lo menos 16, por lo menos 1 8 o 20 nucleobases contiguas complementarias a una porción de longitud igual de nucleobases 675 a 704 de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de nucleobase por lo menos 80% , por lo menos 85%, por lo menos 90% , por lo menos 95% , por lo menos 96% , por lo menos 97%, por lo menos 98% , o por lo menos 99% complementaria a una porción de longitud igual de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de nucleobase 1 00% complementaria a una porción de longitud igual de SEQ ID NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede lograr por lo menos 50% de inhibición de niveles de mRNA humano según determinación usando un método de ensayo RT-PCR, opcionalmente en células HepG2 (por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 3).
En ciertas modalidades, la invención proporciona un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que comprende una secuencia de nucleobase complementaria a por lo menos una porción de nucleobases 677 a 704 de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender por lo menos 8, por lo menos 1 0, por lo menos 12 , por lo menos 14, por lo menos 16, por lo menos 1 8 o 20 nucleobases contiguas complementarias a una porción de longitud igual de nucleobases 677 a 704 de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de nucleobase por lo menos 80% , por lo menos 85% , por lo menos 90% , por lo menos 95% , por lo menos 96% , por lo menos 97% , por lo menos 98% , o por lo menos 99% complementaria a una porción de longitud igual de SEQ ID NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de nucleobase 1 00% complementaria a una porción de longitud igual de SEQ ID NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede lograr por lo menos 60% de inhibición de niveles de mRNA humano según determinación usando un método de ensayo RT-PCR, opcionalmente en células HepG2 (por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 3).
En ciertas modalidades, la invención proporciona un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que comprende una secuencia de nucleobase complementaria a por lo menos una porción de nucleobases 678 a 697 de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender por lo menos 8, por lo menos 10, por lo menos 12, por lo menos 14, por lo menos 16, por lo menos 18 o 20 nucleobases contiguas complementarias a una porción de longitud igual de nucleobases 678 a 697 de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de nucleobase por lo menos 80% , por lo menos 85% , por lo menos 90% , por lo menos 95% , por lo menos 96%, por lo menos 97% , por lo menos 98% , o por lo menos 99% complementaria a una porción de longitud igual de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de nucleobase 100% complementaria a una porción de longitud igual de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede lograr por lo menos 70% de inhibición de niveles de mRNA humano según determinación usando un método de ensayo RT-PCR, opcionalmente en células HepG2 (por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 3).
En ciertas modalidades, la invención proporciona un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que comprende una secuencia de nucleobase complementaria a por lo menos una porción de nucleobases 680 a 703 de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender por lo menos 8, por lo menos 1 0 , por lo menos 1 2, por lo menos 14 , por lo menos 16, por lo menos 18 o 20 nucleobases contiguas complementarias a una porción de longitud igual de nucleobases 680 a 703 de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de nucleobase por lo menos 80% , por lo menos 85%, por lo menos 90% , por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97% , por lo menos 98% , o por lo menos 99% complementaria a una porción de longitud igual de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de nucleobase 100% complementaria a una porción de longitud igual de SEQ ID NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede lograr por lo menos 80% de inhibición de niveles de mRNA humano según determinación usando un método de ensayo RT-PCR, opcionalmente en células HepG2 (por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 3).
En ciertas modalidades, la invención proporciona un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que comprende una secuencia de nucleobase complementaria a por lo menos una porción de nucleobases 683 a 702 de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender por lo menos 8, por lo menos 10, por lo menos 12, por lo menos 14, por lo menos 16, por lo menos 18 o 20 nucleobases contiguas complementarias a una porción de longitud igual de nucleobases 683 a 702 de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de nucleobase por lo menos 80% , por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97% , por lo menos 98% , o por lo menos 99% complementaria a una porción de longitud igual de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de nucleobase 100% complementaria a una porción de longitud igual de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede lograr por lo menos 90% de inhibición de niveles de m RNA humano según determinación usando un método de ensayo RT-PCR, opcionalmente en células HepG2 (por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 3).
En ciertas modalidades, la invención proporciona un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que comprende una secuencia de nucleobase complementaria a por lo menos una porción de nucleobases 738 a 759 de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender por lo menos 8, por lo menos 1 0, por lo menos 1 2, por lo menos 1 4, por lo menos 16, por lo menos 1 8 o 20 nucleobases contiguas complementarias a una porción de longitud igual de nucleobases 738 a 759 de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de nucleobase por lo menos 80% , por lo menos 85% , por lo menos 90% , por lo menos 95% , por lo menos 96% , por lo menos 97%, por lo menos 98%, o por lo menos 99% complementaria a una porción de longitud igual de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de nucleobase 1 00% complementaria a una porción de longitud igual de SEQ ID NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede lograr por lo menos 80% de inhibición de niveles de mRNA humano según determinación usando un método de ensayo RT-PCR, opcionalmente en células HepG2 (por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 3).
En ciertas modalidades, la invención proporciona un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que comprende una secuencia de nucleobase complementaria a por lo menos una porción de nucleobases 738 a 760 de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender por lo menos 8, por lo menos 1 0, por lo menos 1 2, por lo menos 14, por lo menos 16, por lo menos 1 8 o 20 nucleobases contiguas complementarias a una porción de longitud igual de nucleobases 738 a 760 de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de nucleobase por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97% , por lo menos 98% , o por lo menos 99% complementaria a una porción de longitud igual de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de nucleobase 1 00% complementaria a una porción de longitud igual de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede lograr por lo menos 60% de inhibición de niveles de m RNA humano según determinación usando un método de ensayo RT-PCR, opcionalmente en células HepG2 (por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 3).
En ciertas modalidades, la invención proporciona un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que comprende una secuencia de nucleobase complementaria a por lo menos una porción de nucleobases 738 a 762 de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender por lo menos 8, por lo menos 1 0, por lo menos 1 2 , por lo menos 14, por lo menos 16, por lo menos 18 o 20 nucleobases contiguas complementarias a una porción de longitud igual de nucleobases 738 a 762 de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de nucleobase por lo menos 80% , por lo menos 85% , por lo menos 90% , por lo menos 95% , por lo menos 96% , por lo menos 97%, por lo menos 98% , o por lo menos 99% complementaria a una porción de longitud igual de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de nucleobase 100% complementaria a una porción de longitud igual de SEQ ID NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede lograr por lo menos 45% de inhibición de niveles de mRNA humano según determinación usando un método de ensayo RT-PCR, opcionalmente en células HepG2 (por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 3).
En ciertas modalidades, la invención proporciona un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que comprende una secuencia de nucleobase complementaria a por lo menos una porción de nucleobases 101 8 a 1042 de SEQ ID NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender por lo menos 8, por lo menos 10, por lo menos 1 2, por lo menos 14, por lo menos 16, por lo menos 18 o 20 nucleobases contiguas complementarias a una porción de longitud igual de nucleobases 101 8 a 1 042 de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de nucleobase por lo menos 80% , por lo menos 85% , por lo menos 90% , por lo menos 95% , por lo menos 96% , por lo menos 97%, por lo menos 98% , o por lo menos 99% complementaria a una porción de longitud igual de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de nucleobase 1 00% complementaria a una porción de longitud igual de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede lograr por lo menos 80% de inhibición de niveles de mRNA humano según determinación usando un método de ensayo RT-PCR, opcionalmente en células HepG2 (por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 3).
En ciertas modalidades, la invención proporciona un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que comprende una secuencia de nucleobase complementaria a por lo menos una porción de nucleobases 1062 a 1089 de SEQ ID NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender por lo menos 8, por lo menos 10, por lo menos 1 2 , por lo menos 14, por lo menos 16, por lo menos 1 8 o 20 nucleobases contiguas complementarias a una porción de longitud igual de nucleobases 1 062 a 1 089 de SEQ ID NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de nucleobase por lo menos 80% , por lo menos 85% , por lo menos 90% , por lo menos 95% , por lo menos 96% , por lo menos 97% , por lo menos 98%, o por lo menos 99% complementaria a una porción de longitud igual de SEQ ID NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de nucleobase 100% complementaria a una porción de longitud igual de SEQ ID NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede lograr por lo menos 70% de inhibición de niveles de mRNA humano según determinación usando un método de ensayo RT-PCR, opcionalmente en células HepG2 (por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 3).
En ciertas modalidades, la invención proporciona un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que comprende una secuencia de nucleobase complementaria a por lo menos una porción de nucleobases 1062 a 1090 de SEQ ID NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender por lo menos 8, por lo menos 1 0, por lo menos 12, por lo menos 14, por lo menos 16, por lo menos 18 o 20 nucleobases contiguas complementarias a una porción de longitud igual de nucleobases 1062 a 1090 de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de nucleobase por lo menos 80% , por lo menos 85%, por lo menos 90% , por lo menos 95% , por lo menos 96% , por lo menos 97% , por lo menos 98% , o por lo menos 99% complementaria a una porción de longitud igual de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de nucleobase 1 00% complementaria a una porción de longitud igual de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede lograr por lo menos 60% de inhibición de niveles de mRNA humano según determinación usando un método de ensayo RT-PCR, opcionalmente en células HepG2 (por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 3).
En ciertas modalidades, la invención proporciona un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que comprende una secuencia de nucleobase complementaria a por lo menos una porción de nucleobases 1062 a 1 091 de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender por lo menos 8, por lo menos 1 0, por lo menos 1 2, por lo menos 14, por lo menos 1 6 , por lo menos 18 o 20 nucleobases contiguas complementarias a una porción de longitud igual de nucleobases 1 062 a 1091 de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de nucleobase por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90% , por lo menos 95% , por lo menos 96%, por lo menos 97% , por lo menos 98% , o por lo menos 99% complementaria a una porción de longitud igual de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de nucleobase 1 00% complementaria a una porción de longitud igual de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede lograr por lo menos 20% de inhibición de niveles de mRNA humano según determinación usando un método de ensayo RT-PCR, opcionalmente en células HepG2 (por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 3).
En ciertas modalidades, la invención proporciona un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que comprende una secuencia de nucleobase complementaria a por lo menos una porción de nucleobases 1275 a 1 301 de SEQ ID NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender por lo menos 8, por lo menos 10, por lo menos 1 2 , por lo menos 14, por lo menos 16, por lo menos 1 8 o 20 nucleobases contiguas complementarias a una porción de longitud igual de nucleobases 1275 a 1 301 de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de nucleobase por lo menos 80% , por lo menos 85%, por lo menos 90% , por lo menos 95% , por lo menos 96% , por lo menos 97%, por lo menos 98% , o por lo menos 99% complementaria a una porción de longitud igual de SEQ ID NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de nucleobase 1 00% complementaria a una porción de longitud igual de SEQ ID NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede lograr por lo menos 80% de inhibición de niveles de mRNA humano según determinación usando un método de ensayo RT-PCR, opcionalmente en células HepG2 (por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 3).
En ciertas modalidades, la invención proporciona un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que comprende una secuencia de nucleobase complementaria a por lo menos una porción de nucleobases 1276 a 1 301 de SEQ ID NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender por lo menos 8, por lo menos 10, por lo menos 12, por lo menos 14, por lo menos 16 , por lo menos 1 8 o 20 nucleobases contiguas complementarias a una porción de longitud igual de nucleobases 1 276 a 1 301 de SEQ ID NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de nucleobase por lo menos 80% , por lo menos 85% , por lo menos 90% , por lo menos 95% , por lo menos 96% , por lo menos 97% , por lo menos 98%, o por lo menos 99% complementaria a una porción de longitud igual de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de nucleobase 1 00% complementaria a una porción de longitud igual de SEQ ID NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede lograr por lo menos 80% de inhibición de niveles de mRNA humano según determinación usando un método de ensayo RT-PCR, opcionalmente en células HepG2 (por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 3).
En ciertas modalidades, la invención proporciona un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que comprende una secuencia de nucleobase complementaria a por lo menos una porción de nucleobases 1284 a 1 308 de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender por lo menos 8, por lo menos 1 0, por lo menos 1 2, por lo menos 14, por lo menos 1 6, por lo menos 18 o 20 nucleobases contiguas complementarias a una porción de longitud igual de nucleobases 1284 a 1308 de SEQ ID NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de nucleobase por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 96% , por lo menos 97% , por lo menos 98% , o por lo menos 99% complementaria a una porción de longitud igual de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de nucleobase 1 00% complementaria a una porción de longitud igual de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede lograr por lo menos 80% de inhibición de niveles de mRNA humano según determinación usando un método de ensayo RT-PCR, opcionalmente en células HepG2 (por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 3).
En ciertas modalidades, la invención proporciona un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que comprende una secuencia de nucleobase complementaria a por lo menos una porción de nucleobases 1291 a 1 317 de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender por lo menos 8, por lo menos 10, por lo menos 12 , por lo menos 14, por lo menos 1 6, por lo menos 18 o 20 nucleobases contiguas complementarias a una porción de longitud igual de nucleobases 1291 a 131 7 de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de nucleobase por lo menos 80% , por lo menos 85%, por lo menos 90% , por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98% , o por lo menos 99% complementaria a una porción de longitud igual de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de nucleobase 1 00% complementaria a una porción de longitud igual de SEQ ID NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede lograr por lo menos 80% de inhibición de niveles de mRNA humano según determinación usando un método de ensayo RT-PCR, opcionalmente en células HepG2 (por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 3).
En ciertas modalidades, la invención proporciona un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que comprende una secuencia de nucleobase complementaria a por lo menos una porción de nucleobases 1 275 a 1 318 de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender por lo menos 8, por lo menos 1 0, por lo menos 1 2, por lo menos 1 4, por lo menos 16, por lo menos 18 o 20 nucleobases contiguas complementarias a una porción de longitud igual de nucleobases 1 275 a 1 318 de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de nucleobase por lo menos 80% , por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95% , por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98% , o por lo menos 99% complementaria a una porción de longitud igual de SEQ I D NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de nucleobase 1 00% complementaria a una porción de longitud igual de SEQ ID NO: 1 . Dicho oligonucleótido modificado puede lograr por lo menos 70% de inhibición de niveles de mRNA humano según determinación usando un método de ensayo RT-PCR, opcionalmente en células HepG2 (por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 3).
Las modalidades de la presente invención proporcionan compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste de 1 2 a 30 nucleósidos vinculados y que tienen una secuencia de nucleobase que comprende por lo menos 8, por lo menos 10 , por lo menos 1 2 , por lo menos 14 , por lo menos 16, por lo menos 1 8 o 20 nucieobases contiguas de una secuencia de nucleobase seleccionada de las secuencias de nucleobase mencionadas en SEQ ID Nos: 1 5 a 241 .
Las modalidades de la presente invención proporcionan compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste de 1 2 a 30 nucleósidos vinculados y que tienen una secuencia de nucleobase que comprende por lo menos 8, por lo menos 1 0, por lo menos 12, por lo menos 14, por lo menos 16 , por lo menos 18 o 20 nucieobases contiguas de una secuencia de nucleobase seleccionada de las secuencias de nucleobase mencionadas en SEQ ID Nos: 1 5 a 269.
Las modalidades de la presente invención proporcionan compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste de 12 a 30 nucleósidos vinculados y que tienen una secuencia de nucleobase que comprende por lo menos 8, por lo menos 1 0, por lo menos 12, por lo menos 14, por lo menos 1 6, por lo menos 1 8 o 20 nucieobases contiguas de una secuencia de nucleobase seleccionada de las secuencias de nucleobase mencionadas en SEQ I D Nos: 242 a 269.
En ciertas modalidades, el oligonucleótido modificado comprende por lo menos 8, por lo menos 10, por lo menos 12, por lo menos 1 4, por lo menos 16 o por lo menos 18 nucieobases de una secuencia de nucleobase seleccionada de ISIS Nos: 22, 31, 32, 34, 36 a 38, 40, 41, 43, 51 a 53, 55, 56, 59, 60, 64, 66, 71, 73, 75, 96, 98 a 103, 105 a 109, 113 a 117, 119, 124, 127, 129, 171, 172, 174, 176, 178, 179, 181 a 197, 199 a 211 y 213 a 232. En ciertas modalidades, el oligonucleótido modificado comprende una secuencia de nucleobase seleccionada de SEQ ID Nos: 22, 31, 32, 34, 36 a 38, 40, 41, 43, 51 a 53, 55, 56, 59, 60, 64, 66, 71, 73, 75, 96, 98 a 103, 105 a 109, 113 a 117, 119, 124, 127, 129, 171, 172, 174, 176, 178, 179, 181 a 197, 199 a 211 y 213 a 232. En ciertas modalidades, el oligonucleótido modificado consiste de una secuencia de nucleobase seleccionada de SEQ ID Nos: 22, 31, 32, 34, 36 a 38, 40, 41, 43, 51 a 53, 55, 56, 59, 60, 64, 66, 71, 73, 75, 96, 98 a 103, 105 a 109, 113 a 117, 119, 124, 127, 129, 171, 172, 174, 176, 178, 179, 181 a 197, 199 a 211 y 213 a 232. Dicho oligonucleótido modificado puede lograr por lo menos 70% de inhibición de niveles de mARN humano según determinación usando un método de ensayo RT-PCR, opcionalmente en células HepG2 (por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 3).
En ciertas modalidades, el oligonucleótido modificado comprende por lo menos 8, por lo menos 10, por lo menos 12, por lo menos 14, por lo menos 16 o por lo menos 18 nucleobases de una secuencia de nucleobase seleccionada de ISIS Nos: 22, 31, 34, 37, 40, 43, 51 a 53, 60, 98, 100 a 102, 105 a 109, 114, 115, 119, 171, 174, 176, 179, 181, 186, 188 a 193, 195, 196, 199 a 210 y 213 a 232. En ciertas modalidades, el oligonucleótido modificado comprende una secuencia de nucleobase seleccionada de SEQ ID NOs: 22, 31, 34, 37, 40, 43, 51 a 53, 60, 98, 100 a 102, 105 a 109, 114, 115, 119, 171, 174, 176, 179, 181, 186, 188 a 193, 195, 196, 199 a 210 y 213 a 232. En ciertas modalidades, el oligonucleótido modificado consiste de una secuencia de nucleobase seleccionada de SEQ ID NOs: 22, 31, 34, 37, 40, 43, 51 a 53, 60, 98, 100 a 102, 105 a 109, 114, 115, 119, 171, 174, 176, 179, 181, 186, 188 a 193, 195, 196, 199 a 210 y 213 a 232. Dicho oligonucleótido modificado puede lograr por lo menos 80% de inhibición de niveles de mARN humano según determinación usando un método de ensayo RT-PCR, opcionalmente en células HepG2 (por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 3).
En ciertas modalidades, el oligonucleótido modificado comprende por lo menos 8, por lo menos 10, por lo menos 12, por lo menos 14, por lo menos 16 o por lo menos 18 nucleobases de una secuencia de nucleobase seleccionada de ISIS Nos: 22, 31, 34, 37, 40, 43, 51 a 53, 60, 98, 100 a 102, 105 a 109, 114, 115, 119, 171, 174, 176, 179, 181, 186, 188 a 193, 195, 196, 199 a 210 y 213 a 232. En ciertas modalidades, el oligonucleótido modificado comprende una secuencia de nucleobase seleccionada de SEQ ID NOs: 22, 31, 34, 37, 40, 43, 51 a 53, 60, 98, 100 a 102, 105 a 109, 114, 115, 119, 171, 174, 176, 179, 181, 186, 188 a 193, 195, 196, 199 a 210 y 213 a 232. En ciertas modalidades, el oligonucleótido modificado consiste de una secuencia de nucleobase seleccionada de SEQ ID NOs: 31, 37, 100, 105, 179, 190 a 193, 196, 202 a 207, 209, 210, 214 a 219, 221 a 224, 226, 227, 229 y 231. En ciertas modalidades, el oligonucleótido modificado comprende una secuencia de nucleobase seleccionada de SEQ ID NOs: 31, 37, 100, 105, 179, 190 a 193, 196, 202 a 207, 209, 210, 214 a 219, 221 a 224, 226, 227, 229 y 231. En ciertas modalidades, el oligonucleotido modificado consiste de una secuencia de nucleobase seleccionada de SEQ ID NOs: 31, 37, 100, 105, 179, 190 a 193, 196, 202 a 207, 209, 210, 214 a 219, 221 a 224, 226, 227, 229 y 231. Dicho oligonucleotido modificado puede lograr por lo menos 90% de inhibición de niveles de mARN humano según determinación usando un método de ensayo RT-PCR, opcionalmente en células HepG2 (por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 3).
En ciertas modalidades, el oligonucleotido modificado comprende por lo menos 8, por lo menos 10, por lo menos 12, por lo menos 14, por lo menos 16 o por lo menos 18 nucleobases de una secuencia de nucleobase seleccionada de SEQ ID NOs: 34, 52, 53, 114, 115, 190, 213 a 232, 242 a 260 y 262 a 266. En ciertas modalidades, el oligonucleotido modificado comprende una secuencia de nucleobase seleccionada de SEQ ID NOs: 34, 52, 53, 114, 115, 190, 213 a 232, 242 a 260 y 262 a 266. En ciertas modalidades, el oligonucleotido modificado consiste de una secuencia de nucleobase seleccionada de SEQ ID NOs: 34, 52, 53, 114, 115, 190, 213 a 232, 242 a 260 y 262 a 266. Dichos oligonucleótidos modificados pueden lograr por lo menos 70% de inhibición de niveles de mARN humano según determinación usando un método de ensayo RT-PCR, opcionalmente en células HepG2 (por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 30).
En ciertas modalidades, el oligonucleotido modificado comprende por lo menos 8, por lo menos 10, por lo menos 12, por lo menos 14, por lo menos 1 6 o por lo menos 18 nucleobases de una secuencia de nucleobase seleccionada de SEQ I D NOs: 34, 52, 53, 1 14, 1 1 5, 1 90, 21 3 a 21 6, 21 8 a 226, 243 a 246, 248 , 249, 252 a 259, 264 y 265. En ciertas modalidades, el oligonucleótido modificado comprende una secuencia de nucleobase seleccionada de SEQ I D NOs: 34 , 52, 53, 1 14, 1 1 5, 1 90, 21 3 a 216, 21 8 a 226, 243 a 246, 248, 249, 252 a 259, 264 y 265. En ciertas modalidades, el oligonucleótido modificado consiste de una secuencia de nucleobase seleccionada de SEQ ID NOs: 34, 52, 53, 1 1 4, 1 15, 190, 21 3 a 216, 21 8 a 226, 243 a 246, 248, 249, 252 a 259, 264 y 265. Dichos oligonucleótidos modificados pueden lograr por lo menos 80% de inhibición de niveles de mARN humano según determinación usando un método de ensayo RT-PCR, opcionalmente en células HepG2 (por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 30).
En ciertas modalidades, el oligonucleótido modificado comprende por lo menos 8, por lo menos 10, por lo menos 12, por lo menos 1 4, por lo menos 1 6 o por lo menos 18 nucleobases de una secuencia de nucleobase seleccionada de SEQ I D NOs: 34, 190, 21 5, 222, 223, 226, 246 y 254. En ciertas modalidades, el oligonucleótido modificado consiste de una secuencia de nucleobase seleccionada de SEQ I D NOs: 34, 1 90, 21 5, 222, 223, 226, 246 y 254. En ciertas modalidades, el oligonucleótido modificado consiste de una secuencia de nucleobase seleccionada de SEQ I D NOs: 34, 190, 21 5, 222, 223, 226, 246 y 254. Dichos oligonucleótidos modificados pueden lograr por lo menos 90% de inhibición de niveles de mARN humano según determinación usando un método de ensayo RT-PCR, opcionalmente en células HepG2 (por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 30).
En ciertas modalidades, el compuesto consiste de un oligonucleótido modificado de hebra sencilla.
En ciertas modalidades, el oligonucleótido modificado consiste de 20 nucleósidos vinculados.
En ciertas modalidades, la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado es 1 00% complementaria a una secuencia de nucleobase de SEQ I D NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o SEQ I D NO: 6 o SEQ I D NO: 274.
En ciertas modalidades, el compuesto tiene por lo menos un vínculo de internucleósido modificado. En ciertas modalidades el vínculo de internucleósido es un vínculo de internucleósido de fosforotioato.
En ciertas modalidades, el compuesto tiene por lo menos un azúcar modificada . En ciertas modalidades, la por lo menos un azúcar modificada es un azúcar bicíclica. En ciertas modalidades, la por lo menos un azúcar modificada comprende un 2'-0-metoxietilo.
Las modalidades de la presente invención proporcionan compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste de 13 a 30 nucleósidos vinculados y que tienen una secuencia de nucleobase que comprende por lo menos 8, por lo menos 1 0, por lo menos 1 2, por lo menos 14, por lo menos 16, por lo menos 1 8 o 20 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobase seleccionada de las secuencias de nucleobase mencionadas en SEQ ID Nos: 1 5 a 241 , SEQ ID Nos: 1 5 a 269 o SEQ ID Nos: 242 a 269, en donde por lo menos un nucleósido comprende un azúcar modificada.
En ciertas modalidades, dicha por lo menos un azúcar modificada es un azúcar bicíclica.
En ciertas modalidades, dicha por lo menos un azúcar bicíclica comprende un puente 4'-(CH2)n-0-2' , en donde n es uno o dos.
En ciertas modalidades, dicha por lo menos un azúcar bicíclica comprende un puente 4'-CH(CH3)-0-2'.
En ciertas modalidades, dicha por lo menos un azúcar modificada comprende un grupo 2'-0-metoxietilo.
Las modalidades de la presente invención proporcionan compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste de 12 a 30 nucleosidos vinculados y que tienen una secuencia de nucleobase que comprende por lo menos 8, por lo menos 1 0, por lo menos 1 2, por lo menos 1 4, por lo menos 16, por lo menos 18 o 20 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobase seleccionada de las secuencias de nucleobase mencionadas en SEQ I D Nos: 1 5 a 241 , SEQ ID Nos: 1 5 a 269 o SEQ I D Nos: 242 a 269, que comprenden por lo menos un nucleósido modificado con tetrahidropirano en donde un anillo de tetrahidropirano remplaza al anillo de furanosa.
En ciertas modalidades, dicho por lo menos un nucleósido modificado con tetrahidropirano tiene la estructura: En ciertas modalidades, el compuesto tiene por lo menos un nucleósido que comprende una nucleobase modificada . En ciertas modalidades, la nucleobase modificada es una 5-metilcitosina.
En ciertas modalidades, el oligonucleótido modificado del compuesto comprende: (i) un segmento de espacio que consiste de deoxinucleósidos vinculados; (ii) un segmento de ala en 5' que consiste de nucleósidos vinculados; (iii) un segmento de ala en 3' que consiste de nucleósidos vinculados, en donde el segmento de espacio está colocado inmediatamente adyacente a y entre el segmento de ala en 5' y el segmento de ala en 3' y en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado. En algunas de tales modalidades, cada citosina en el oligonucleótido modificado es una 5-metilcitosina.
En ciertas modalidades, el oligonucleótido modificado del compuesto comprende: (i) un segmento de espacio que consiste con frecuencia de deoxinucleósidos vinculados; (ii) un segmento de ala en 5' que consiste de cinco nucleósidos vinculados; (iii) un segmento de ala en 3' que consiste de cinco nucleósidos vinculados, en donde el segmento de espacio está colocado inmediatamente adyacente a y entre el segmento de ala en 5' y el segmento de ala en 3', en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar de 2'-0-metoxietilo; y en donde cada vinculo de internucleósido es un vinculo de fosforotioato. En algunas de tales modalidades, cada citosina en el oligonucleótido modificado es una 5-metilcitosina.
En ciertas modalidades, el oligonucleótido modificado del compuesto comprende: (i) un segmento de espacio que consiste de catorce deoxinucleósidos vinculados; (ii) un segmento de ala en 5' que consiste de tres nucleósidos vinculados; (iii) un segmento de ala en 3' que consiste de tres nucleósidos vinculados, en donde el segmento de espacio está colocado inmediatamente adyacente a y entre el segmento de ala en 5' y el segmento de ala en 3', en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar de 2'-0-metoxietilo; y en donde cada vinculo de internucleósido es un vinculo de fosforotioato. En algunas de tales modalidades, cada citosina en el oligonucleótido modificado es una 5-metilcitosina.
En ciertas modalidades, el oligonucleótido modificado del compuesto comprende: (i ) un segmento de espacio que consiste de trece deoxinucleósidos vinculados; (ii) un segmento de ala en 5' que consiste de dos nucleosidos vinculados; (iii) un segmento de ala en 3' que consiste de cinco nucleosidos vinculados, en donde el segmento de espacio está colocado inmediatamente adyacente a y entre el segmento de ala en 5' y el segmento de ala en 3', en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar de 2'-0-metoxietilo; y en donde cada vinculo de internucleósido es un vinculo de fosforotioato. En algunas de tales modalidades, cada citosina en el oligonucleótido modificado es una 5-metilcitosina.
Las modalidades de la presente invención proporcionan una composición que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 1 2 a 30 nucleosidos vinculados y que tiene una secuencia de nucleobase que comprende por lo menos 12 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobase seleccionada de las secuencias de nucleobase mencionadas en SEQ I D NOs: 15 a 241 o una sal de las mismas y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Las modalidades de la presente invención proporcionan una composición que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 1 2 a 30 nucleosidos vinculados y que tiene una secuencia de nucleobase que comprende por lo menos 12 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobase seleccionada de las secuencias de nucleobase mencionadas en SEQ I D NOs: 1 5 a 269 o una sal de las mismas y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Las modalidades de la presente invención proporcionan una composición que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 1 2 a 30 nucleósidos vinculados y que tiene una secuencia de nucleobase que comprende por lo menos 12 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobase seleccionada de las secuencias de nucleobase mencionadas en SEQ I D NOs: 241 a 269 o una sal de las mismas y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Las modalidades de la presente invención proporcionan métodos que comprenden administrar a un animal un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 1 2 a 30 nucleósidos vinculados y que tiene una secuencia de nucleobase que comprende por lo menos 8 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobase seleccionada de las secuencias de nucleobase mencionadas en SEQ I D NOs: 1 5 a 241 .
Las modalidades de la presente invención proporcionan métodos que comprenden administrar a un animal un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 1 2 a 30 nucleósidos vinculados y que tiene una secuencia de nucleobase que comprende por lo menos 8 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobase seleccionada de las secuencias de nucleobase mencionadas en SEQ I D NOs: 1 5 a 269.
Las modalidades de la presente invención proporcionan métodos que comprenden administrar a un animal un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 1 2 a 30 nucleósidos vinculados y que tiene una secuencia de nucleobase que comprende por lo menos 8 nucleobases contiguas de una secuencia de nucleobase seleccionada de las secuencias de nucleobase mencionadas en SEQ I D NOs: 241 a 269.
En ciertas modalidades, el animal es un humano.
En ciertas modalidades, la administración previene la trombosis venosa profunda o la embolia pulmonar.
En ciertas modalidades, el compuesto se co-administra con cualquiera del grupo seleccionado de aspirina , clopidogrel , dipiridamole, heparina, lepirudin, ticlopidina, warfarina, apixaban, rivaroxaban y LOVENOX.
En ciertas modalidades, el compuesto se co-administra con cualquier inhibidor de Factor Xa.
En ciertas modalidades, el inhibidor del Factor Xa es cualquiera de Rivaroxaban, LY417717, YM 1 50, apixaban, PRT054021 , y DU-1 76b.
En ciertas modalidades, el compuesto se administra de manera concomitante con cualquiera del grupo seleccionado de aspirina, clopidogrel , dipiridamole, heparina , lepirudin , ticlopidina, warfarina , apixaban, rivaroxaban y LOVENOX.
En ciertas modalidades, la administración es administración parenteral.
En ciertas modalidades, la administración parenteral es cualquiera de administración subcutánea o intravenosa .
Las modalidades de la presente invención proporcionan métodos que comprenden identificar un animal en riesgo de desarrollar complicaciones tromboembolicas y administrar al animal en riesgo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 12 a 30 nucleósidos vinculados, en donde el oligonucleótido modificado es complementario a un ácido nucleico del Factor 1 1 .
En ciertas modalidades, la complicación tromboembólica es trombosis venosa profunda, embolia pulmonar o una combinación de las mismas.
Las modalidades de la presente invención proporcionan métodos que comprenden identificar un animal que tiene un trastorno de coagulación mediante la administración al animal de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 12 a 30 nucleósidos vinculados, en donde el oligonucleótido modificado es complementario a un ácido nucleico de Factor 1 1 .
En ciertas modalidades, el compuesto se co-administra con cualquiera del grupo seleccionado de aspirina, clopidogrel, dipiridamole, heparina, lepirudin, ticlopidina, warfarina, apixaban, rivaroxaban y LOVENOX.
En ciertas modalidades, el compuesto se administra de manera concomitante con cualquiera del grupo seleccionado de aspirina, clopidogrel, dipiridamole, heparina, lepirudin, ticlopidina, warfarina, apixaban, rivaroxaban y LOVENOX.
Las modalidades de la presente invención proporcionan métodos que comprenden reducir el riesgo de complicaciones tromboembolicas en un animal mediante la administración al animal de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 1 2 a 30 nucleósidos vinculados, en donde el oligonucleótido modificado es complementario a un ácido nucleico de Factor 1 1 .
Las modalidades de la presente invención proporcionan métodos que comprenden tratar un trastorno de coagulación en un animal mediante la administración al animal de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 12 a 30 nucleósidos vinculados, en donde el oligonucleótido modificado es complementario a un ácido nucleico de Factor 1 1 .
Las modalidades de la presente invención proporcionan métodos que comprenden inhibir la expresión del Factor 1 1 en un animal mediante la administración al animal de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 1 2 a 30 nucleósidos vinculados, en donde el oligonucleótido modificado es complementario a un ácido nucleico de Factor 1 1 .
En ciertas modalidades la inhibición del Factor 1 1 en el animal se invierte mediante la administración de un antídoto para el oligonucleótido modificado.
En ciertas modalidades, el antídoto es un oligonucleótido complementario al oligonucleótido modificado.
Compuestos Antisentido Los compuestos oligoméricos incluyen, pero no están limitados a, oligonucleótidos, oligonucleósidos, análogos de oligonucleótidos, miméticos de oligonucleótidos, compuestos antisentido, oligonucleótidos antisentido y siARNs. Un compuesto oligomérico puede ser "antisentido" para un ácido nucleico objetivo, lo que significa que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico objetivo a través de enlaces de hidrógeno.
En ciertas modalidades, un compuesto antisentido tiene una secuencia de nucleobase que, cuando se escribe en la dirección de 5' a 3' , comprende el complemento inverso del segmento objetivos de un ácido nucleico objetivo al cual está dirigido . En ciertas de tales modalidades, un oligonucleótido antisentido tiene una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en la dirección de 5' a 3' , comprende el complemento inverso del segmento objetivo de un ácido nucleico objetivo al cual está dirigido.
En ciertas modalidades, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Factor 1 1 es de 1 2 a 30 subunidades de longitud . En otras palabras, tales compuestos antisentido son desde 1 2 hasta 30 subunidades vinculadas. En otras modalidades, el compuesto antisentido es de 8 a 20, 12 a 50, 1 5 a 30, 18 a 24, 19 a 22 o 20 subunidades vinculadas. En ciertas modalidades, los compuestos antisentido 8, 9, 1 0, 1 1 , 1 2, 1 3, 14, 1 5, 1 6, 1 7, 18, 1 9, 20, 21 , 22 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76 , 77, 78, 79 , u 80 subunidades vinculadas de longitud, o un rango definido por cualesquiera dos de los valores anteriores. En algunas modalidades, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido, y las subunidades vinculadas son nucleótidos. En ciertas modalidades, los oligonucleótidos antisentido dirigidos a un ácido nucleico del Factor 1 1 pueden estar acortados o truncados. Por ejemplo, una sola subunidad puede ser eliminada del extremo 5' (truncamiento en 5' ) o alternativamente del extremo 3' (truncamiento en 3'). Un compuesto antisentido acortado o truncado apuntado a un ácido nucleico del Factor 1 1 puede tener dos subunidades eliminadas del extremo 5' o alternativamente puede tener dos subunidades eliminadas del extremo 3', del compuesto antisentido. Alternativamente, los nucleósidos eliminados pueden dispersarse en todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene un nucleósido eliminado del extremo 5' y un nucleósido eliminado del extremo 3' .
Cuando está presente una sola subunidad adicional en un compuesto antisentido alargado, la subunidad adicional puede estar ubicada en el extremo 5' o 3' del compuesto antisentido. Cuando están presentes dos o más subunidades adicionales, las subunidades agregadas pueden estar adyacentes entre ellas, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene dos subunidades agregadas en el extremo 5' (adición en 5' ), o alternativamente en el extremo 3' (adición en 3' ), del compuesto antisentido. Alternativamente, las subunidades agregadas pueden dispersarse en todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene una subunidad agregada en el extremo 5' y una subunidad agregada en el extremo 3' .
Es posible incrementar o disminuir la longitud de un compuesto antisentido, tal como un oligonucleótido antisentido, y/o introduci r bases desiguales sin eliminar actividad . Por ejemplo, en Woolf et al . (Proc. Nati . Acad . Sci . USA 89:7305-7309, 1992), una serie de 1 3-25 nucleobases de longitud de oligonucleótidos antisentido se probaron para su habilidad de inducir escisión de un ARN objetivo en un modelo de inyección de oocito. Oligonucleótidos antisentido de 25 nucleobases de longitud con 8 u 1 1 bases desiguales cerca de los extremos de los oligonucleótidos antisentido fueron capaces de dirigir la escisión específica del mARN objetivo, aunque en una extensión menor que los oligonucleótidos antisentido que no conten ían desigualdades. De manera similar, se logró la escisión específica objetivo usando oligonucleótidos antisentido de 1 3 nucleobases, incluyendo aquéllos con 1 o 3 desigualdades.
Gautschi et al (J. Nati. Cáncer I nst. 93:463-471 , Marzo 2001 ) demostraron la habilidad de un oligonucleótido que tiene 1 00% de complementariedad con el mARN bcl-2 y que tiene 3 desigualdades con el mARN bcl-xL para reducir la expresión de ambos bcl-2 y bcl-xL in vitro e in vivo. Además, este oligonucleótido demostró actividad antitumor potente in vivo.
Maher y Dolnick (Nuc. Acid . Res. 16:3341 -3358, 1 988) probaron una serie de oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobases en tándem y oligonucleótidos antisentido de 28 y 42 nucleobases constituidos por la secuencia de dos o tres de los oligonucleótidos antisentido en tándem , respectivamente, para su habilidad de detener la traducción de DHFR humano en un ensayo de reticulocito en conejo. Cada uno de los tres oligonucleótidos antisentido de 1 4 nucleobases solo fue capaz de inhibir la traducción, aunque en un nivel más modesto que los oligonucleótidos antisentido de 28 o 42 nucleobases.
Motivos de Compuesto Antisentido En ciertas modalidades, los compuestos antisentido apuntados a un ácido nucleico de Factor 1 1 tienen subunidades químicamente modificadas dispuestas en patrones, o motivos, para conferir a los compuestos antisentido propiedades tales como aumentar la actividad inhibitoria , afinidad de unión aumentada para un ácido nucleico objetivo, o resistencia a la degradación mediante nucleasas in vivo.
Los compuestos quiméricos antisentido contienen típicamente por lo menos una región modificada para conferir resistencia incrementada a la degradación de nucleasa , toma celular incrementada, afinidad de unión incrementada para el ácido nucleico objetivo y/o actividad inhibitoria incrementada. Una segunda región de un compuesto quimérico antisentido puede servir opcionalmente como un sustrato para la RNasa H de endonucleasa celular, que escinde la hebra de ARN de un dúplex de ARN:ADN .
Los compuestos antisentido que tienen un motivo gapmer se consideran compuestos quiméricos antisentido. En un gapmer una región interna que tiene una pluralidad de nucleótidos que soporta la escisión de RNasa H se posiciona entre regiones externas que tienen una pluralidad de nucleótidos que son químicamente distintos de los nucleósidos de la región interna. En el caso de un oligonucleótido antisentido que tiene un motivo gapmer, el segmento gap generalmente sirve como el sustrato para la escisión de endonucieasa, mientras que los segmentos ala comprenden nucleósidos modificados. En ciertas modalidades, las regiones de un gapmer están diferenciadas por los tipos de porciones de azúcar que comprende cada región distinta. Los tipos de porciones de azúcar que se usan para diferenciar las regiones de un gapmer pueden incluir, en algunas modalidades, [beta]-D-ribonucleósidos, [beta]-D-deoxiribonucleósidos, nucleósidos modificados en 2' (tales nucleósidos modificados en 2' pueden incluir 2'-MOE y 2'-0-CH3, entre otros) y nucleósidos modificados de azúcar bicíclica (tales nucleósidos modificados de azúcar bicíclica pueden incluir aquéllos que tienen un puente 4'-(CH2)r-0-2', donde n = 1 o n = 2). De preferencia cada región distinta comprende porciones uniformes de azúcar. El motivo ala-espacio-ala se describe con frecuencia como "X-Y-Z", donde "X" representa la longitud de la región ala de 5', "Y" representa la longitud de la región de espacio, y "Z" representa la longitud de la región ala de 3'. Como se usa en la presente, un gapmer descrito como "X-Y-Z" tiene una configuración tal que el segmento de espacio (gap) se posiciona inmediatamente adyacente a cada uno del segmento ala de 5' y del segmento ala de 3'. Así, no existen nucleótidos interferentes entre el segmento ala 5' y el segmento espacio, o el segmento espacio y el segmento ala 3'. Cualquiera de los compuestos antisentido descritos en la presente pueden tener un motivo gapmer. En algunas modalidades, X y Z son las mismas, en otras modalidades son diferentes. En una modalidad preferida, Y está entre 8 y 15 nucleótidos. X, Y o Z pueden ser de cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 o más nucleótidos. Así, los gapmers de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, por ejemplo, 5-10-5, 4-8-4, 4-12-3, 4-12-4, 3-14-3, 2-13-5, 2-16-2, 1-18-1, 3-10-3, 2-10-2, 1-10-1, 2-8-2, 5-8-5, o 6-8-6.
En ciertas modalidades, el compuesto antisentido tiene un motivo "wingmer", que tiene una configuración de wing-gap o gap-wing, es decir una configuración de X-Y o Y-Z como se describe antes para la configuración gapmer. Así, las configuraciones wingmer de la presente invención incluyen, pero no están limitadas a, por ejemplo 5-10, 8-4, 4-12, 12-4, 3-14, 16-2, 18-1, 10-3, 2-10, 1-10, 8-2, 2-13, 5-13, 5-8, o 6-8.
En ciertas modalidades, los compuestos antisentido apuntados a un ácido nucleico del Factor 11 tienen un motivo gapmer 5-10-5.
En ciertas modalidades, los compuestos antisentido apuntados a un ácido nucleico del Factor 11 tienen un motivo gapmer 3-14-3.
En ciertas modalidades, los compuestos antisentido apuntados a un ácido nucleico del Factor 11 tienen un motivo gapmer 2-13-5.
En ciertas modalidades, los compuestos antisentido apuntados a un ácido nucleico del Factor 11 tienen un motivo gapmer 5-8-5.
En ciertas modalidades, los compuestos antisentido apuntados a un ácido nucleico del Factor 11 tienen un motivo gapmer 6-8-6.
En ciertas modalidades, un compuesto antisentido apuntado a un ácido nucleico del Factor 11 tiene un motivo gap-ampliado.
En ciertos motivos, un oligonucleótido antisentido gap-ampliado apuntado a un ácido nucleico del Factor 1 1 tiene un segmento gap de catorce 2'-deoxiribonucleótidos posicionados inmediatamente adyacentes a y entre segmentos ala (wing) de tres nucleósidos modificados químicamente. En ciertas modalidades, la modificación química comprende una modificación de 2'-azúcar. En otra modalidad , la modificación química comprende una modificación de azúcar2'-MOE.
En ciertas modalidades, un oligonucleótido antisentido gap-ampliado apuntado a un ácido nucleico del Factor 1 1 tiene un segmento gap de trece 2'-deoxiribonucleótidos posicionados inmediatamente adyacentes a y entre un segmento ala 5' de dos nucleósidos modificados químicamente y un segmento ala 3' de cinco nucleósidos modificados químicamente. En ciertas modalidades, la modificación química comprende una modificación 2'-azúcar. En otra modalidad , la modificación química comprende una modificación de azúcar 2'-MOE. Acidos Nucleicos Objetivo, Regiones y Secuencias de Nucleótidos Objetivo Las secuencias de nucleótidos que codifican el Factor 1 1 incluyen, sin limitación, las siguientes: GENBANK No. de acceso NM_001 28.3, depositada primero en G ENBANK el 24 de Marzo de 1 999 incorporada en la presente como SEQ I D NO: 1 ; NT_022792.1 7, truncada de 1 9598000 a 19624000, depositada primero en GENBANK el 29 de Noviembre de 2000 e incorporada en la presente como SEQ I D NO: 2; GENBANK No. de acceso N M_028066.1 , depositada primero en GEN BANK el 2 de Junio de 2002, incorporada en la presente como SEQ I D NO: 6; y exones 1 -1 5 GENBANK No. de acceso NW_001 1 8167.1 , depositada primero en GENBANK el 28 de Marzo de 2006 , incorporada en la presente como SEQ I D NO: 274.
Se entiende que la secuencia expuesta en cada SEQ I D NO en los Ejemplos contenidos en la presente es independiente de cualquier modificación a una porción de azúcar, un vinculo de internucleósido, o una nucleobase. Como tal , los compuestos antisentido definidos mediante una SEQ ID NO pueden comprender, independientemente, una o más modificaciones a una porción de azúcar, un vinculo de internucleósido o una nucleobase. Los compuestos antisentido descritos mediante el Número Isis ( Isis No. ) indica una combinación de secuencia de nucleobase y motivo.
En ciertas modalidades, una región objetivo es una región definida estructuralmente del ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, una región objetivo puede abarcar una 3' UTR, una 5' UTR, un exón, un intrón , un empalme de exón/intrón , una región de codificación, una región de iniciación de traducción, región de terminación de traducción u otra región definida del ácido nucleico. Las regiones definidas estructuralmente para el Factor 1 1 se pueden obtener mediante el número de acceso de bases de datos de secuencias tales como NCB I y tal información se incorpora en la presente por referencia. En ciertas modalidades, una región objetivo puede abarcar la secuencia desde un sitio 5' objetivo de un segmento objetivo en la región objetivo hasta un sitio 3' objetivo de otro segmento objetivo en la misma región objetivo.
La selección de objetivos incluye la determinación de por lo menos un segmento objetivo con el cual híbrida un compuesto antisentido, de manera que ocurre un efecto deseado. En ciertas modalidades, el efecto deseado es una reducción en niveles de ácido nucleico objetivo de mARN . En ciertas modalidades, el efecto deseado es la reducción de niveles de proteína codificada por el ácido nucleico objetivo o un cambio fenotípico asociado con el ácido nucleico objetivo. Una región objetivo puede contener uno o más segmentos objetivo. Los segmentos objetivo múltiples en una región objetivo pueden ser traslapantes. Alternativamente, pueden ser no traslapantes. En ciertas modalidades, los segmentos objetivo en una región objetivo están separados por no más de aproximadamente 300 nucleótidos. En ciertas modalidades, los segmentos objetivo en una región objetivo están separados por un número de nucleótidos que es, es aproximadamente, es no más de, es no más de aproximadamente, 250, 200, 1 50, 1 00, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 o 10 nucleótidos en el ácido nucleico objetivo, o es un rango definido por cualesquiera dos de los valores precedentes. En ciertas modalidades, los segmentos objetivo en una región objetivo están separados por no más de, o no más de aproximadamente, 5 nucleótidos en el ácido nucleico objetivo . En ciertas modalidades, los segmentos objetivo son contiguos. Están contempladas regiones objetivo definidas por un rango que tiene un ácido nucleico de partida que es cualquiera de los sitios 5' objetivo o sitios 3' objetivo enlistados en la presente.
Los segmentos objetivo adecuados pueden encontrarse en un UTR 5' , una región de codificación, un UTR 3' , un intrón, un exón o un empalme de exón/intrón. Los segmentos objetivo que contienen un codón de inicio o un codón de alto son también segmentos objetivo adecuados. Un segmento objetivo adecuado puede excluir específicamente una cierta región definida estructuralmente tal como el codón de inicio o el codón de alto.
La determinación de segmentos objetivo adecuados puede incluir una comparación de la secuencia de un ácido nucleico objetivo con otras secuencias en todo el genoma. Por ejemplo, se puede usar el algoritmo BLAST para identificar regiones de similitud entre ácidos nucleicos diferentes. Esta comparación puede prevenir la selección de secuencias de compuesto antisentido que pueden hibridar en una manera no específica con otras secuencias diferentes al ácido nucleico objetivo seleccionado (es decir, secuencias no objetivo o fuera de objetivo).
Puede haber una variación en la actividad (por ejemplo , como se define mediante porciento de reducción de niveles de ácido nucleico objetivo) de los compuestos antisentido con una región objetivo activa . En ciertas modalidades, las reducciones en niveles de mARN del Factor 1 1 son indicativas de la inhibición de la expresión del Factor 1 1 . La reducción de niveles de una proteína de Factor 1 1 son indicativas también de la inhibición de la expresión de mARN objetivo. Además, los cambios fenotípicos son indicativos de la inhibición de la expresión del Factor 1 1 . Por ejemplo, un tiempo de aPTT prolongado puede ser indicativo de inhibición de la expresión del Factor 1 1 . En otro ejemplo , el tiempo aPTT prolongado en conjunto con un tiempo PT normal puede ser indicativo de la inhibición de la expresión del Factor 1 1 . En otro ejemplo, una cantidad disminuida de Factor 4 de plaqueta (PF-4) puede ser indicativa de la inhibición de la expresión del Factor 1 1 . En otro ejemplo, la formación reducida de trombos o el tiempo incrementado para la formación de trombos puede ser indicativa de la inhibición de la expresión del Factor 1 1 .
Hibridación En algunas modalidades, la hibridación ocurre entre un compuesto antisentido descrito en la presente y un ácido nucleico del Factor 1 1 . El mecanismo más común de hibridación involucra enlaces hidrógeno (por ejemplo, enlaces hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen inversos) entre nucleobases complementarias de las moléculas de ácido nucleico. La hibridación puede ocurrir bajo condiciones variables. Las condiciones astringentes son dependientes de la secuencia y se determinan por la naturaleza y la composición de las moléculas de ácido nucleico a ser hibridado. Los métodos para determinar si una secuencia puede hibridar específicamente con un ácido nucleico objetivo son bien conocidos en la técnica. En ciertas modalidades, los compuestos antisentido proporcionados en la presente pueden hibridar específicamente con un ácido nucleico de Factor 1 1 .
Complementar ¡edad Un compuesto antisentido y un ácido nucleico objetivo son complementarios entre ellos cuando un número suficiente de nucleobases del compuesto antisentido pueden unirse mediante enlaces de hidrógeno con las correspondientes nucleobases del ácido nucleico objetivo, de manera que, ocurrirá un efecto deseado (por ejemplo, inhibición de antisentido de un ácido nucleico objetivo, tal como un ácido nucleico del Factor 1 1 ).
Las nucleobases no complementarias entre un compuesto antisentido y un ácido nucleico de Factor 1 1 pueden ser toleradas siempre que el compuesto antisentido permanezca capaz de hibridar específicamente con un ácido nucleico objetivo. Además, un compuesto antisentido puede hibridar en uno o más segmentos de un ácido nucleico del Factor 1 1 de manera que los segmentos interferentes o adyacentes no se involucran en el evento de hibridación (por ejemplo, una estructura de rizo, una estructura desigual o de horquilla de cabello). En ciertas modalidades, los compuestos antisentido proporcionados en la presente o una porción específica de los mismos son, o son por lo menos, 70%, 80% , 85% , 86% , 87% , 88% , 89% , 90% , 91 % , 92% , 93%, 94% , 95% , 96% , 97% , 98% , 99% o 1 00% complementarios al ácido nucleico del Factor 1 1 , o una región objetivo, un segmento objetivo, o una porción específica de los mismos. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con un ácido nucleico objetivo puede ser determinado usando métodos de ruti na.
Por ejemplo, un compuesto antisentido en el cual 1 8 de 20 nucleobases del compuesto antisentido son complementarias a una región objetivo, y por lo tanto, hibridaría específicamente, podría representar el 90 porciento de complementariedad. En este ejemplo, las nucleobases restantes no complementarias pueden ser agrupadas o intercaladas con nucleobases complementarias y no necesitan ser contiguas una con otra o con nucleobases complementarias. Como tal , un compuesto antisentido que es de 1 8 nucleobases de longitud que tiene 4 (cuatro) nucleobases no complementarias que están flanqueadas por dos regiones de complementariedad total con el ácido nucleico objetivo tendría 77.8% de complementariedad global con el ácido nucleico objetivo y, así, caería dentro del alcance de la presente invención . El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una región de un ácido nucleico objetivo puede determinarse rutinariamente usando programas BLAST (herramientas de búsqueda de alineación local básica) y programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul et al. , J. Mol . Biol . , 1 990, 21 5, 403 410; Zhang y Madden, Genome Res., 1997 , 7, 649 656). El porcentaje de homología , identidad o complementariedad de secuencia , puede determinarse mediante, por ejemplo, el programa Gap (Winsconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Parck, Madison, Wis. ), usando posiciones por omisión , que utiliza el algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl . Math . , 1981 , 2, 482 489).
En ciertas modalidades, los compuestos antisentido proporcionados en la presente o porciones específicas de los mismos, son totalmente complementarios (es decir, 100% complementarios) a un ácido nucleico objetivo, o porción específica del mismo. Por ejemplo, un compuesto antisentido puede ser totalmente complementario a un ácido nucleico del Factor 1 1 , o a una región objetivo , o un segmento objetivo o secuencia objetivo del mismo. Como se usa en la presente, "totalmente complementario" significa que cada nucleobase de un compuesto antisentido es capaz de apareamiento preciso de bases con las nucleobases correspondientes de un ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, un compuesto antisentido de 20 nucleobases es totalmente complementario a una secuencia objetivo que es de 400 nucleobases de largo, siempre que haya una porción correspondiente de 20 nucleobases del ácido nucleico objetivo que es totalmente complementario al compuesto antisentido. Totalmente complementario se puede usar también en referencia a una porción específica del primer y/o del segundo ácido nucleico. Por ejemplo, una porción de 20 nucleobases de un compuesto antisentido de 30 nucleobases puede ser "totalmente complementaria" a una secuencia objetivo que es de 400 nucleobases de largo. La porción de 20 nucleobases del oligonucleótido de 30 nucleobases es totalmente complementaria a la secuencia objetivo si la secuencia objetivo tiene una porción correspondiente de 20 nucleobases en donde cada nucleobase es complementaria a la porción de 20 nucleobases del compuesto antisentido. Al mismo tiempo, el compuesto antisentido entero de 30 nucleobases puede o puede no ser totalmente complementario a la secuencia objetivo, dependiendo de si las 10 nucleobases restantes del compuesto antisentido son complementarias también a la secuencia objetivo.
La ubicación de una nucleobase no complementaria puede ser en el extremo 5' o el extremo 3' del compuesto antisentido. Alternativamente la nucleobase o nucleobases no complementarias pueden estar en una posición interna del compuesto antisentido. Cuando dos o más nucleobases no complementarias están presentes, pueden ser contiguas (es decir, vinculadas) o no contiguas. En una modalidad , una nucleobase no complementaria está ubicada en el segmento wing de un oligonucleótido antisentido de gapmer. En ciertas modalidades, los compuestos antisentido que son, o son hasta de 1 2, 13, 14, 1 5, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleobases de longitud comprenden no más de 4, no más de 3, no más de 2 o no más de 1 nucleobase(s) no complementaria(s) con relación a un ácido nucleico objetivo , tal como un ácido nucleico de Factor 1 1 , o porción específica del mismo.
En ciertas modalidades, los compuestos antisentido que son , o son hasta de 1 2, 13, 1 4, 1 5, 1 6, 1 7, 1 8, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleobases de longitud comprenden no más de 6, no más de 5, no más de 4, no más de 3, no más de 2 o no más de 1 nucleobase(s) no complementaria(s) con relación a un ácido nucleico objetivo, tal como un ácido nucleico de Factor 1 1 , o porción específica del mismo.
Los compuestos antisentido proporcionados en la presente incluyen también aquéllos que son complementarios a una porción de un ácido nucleico objetivo. Como se usa en la presente, "porción" se refiere a un número definido de nucleobases contiguas (es decir, vinculadas) dentro de una región o segmento de un ácido nucleico objetivo. Una "porción" se puede referir también a un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido. En ciertas modalidades, los compuestos antisentido son complementarios a por lo menos una porción de 8 nucleobases de un segmento objetivo . En ciertas modalidades, los compuestos antisentido son complementarios a por lo menos una porción de 12 nucleobases de un segmento objetivo. En ciertas modalidades, los compuestos antisentido son complementarios a por lo menos una porción de 1 5 nucleobases de un segmento objetivo. También están contemplados compuestos antisentido que son complementarios a por lo menos 9, 1 0, 1 1 , 1 2, 1 3, 14, 1 5, 1 6, 1 7, 1 8, 1 9, 20 o porción de más nucleobases de un segmento objetivo, o un rango definido por cualesquiera dos de estos valores.
Identidad Los compuestos antisentido proporcionados en la presente pueden tener también un porcentaje definido de identidad con una secuencia de nucleótidos en particular, SEQ I D NO, o compuesto representado por un número Isis específico, o porción del mismo. Como se usa en la presente, un compuesto antisentido es idéntico a la secuencia descrita en la presente si tiene la misma habilidad de apareamiento de nucleobases. Por ejemplo, un ARN que contiene uracil en lugar de timidina en una secuencia de ADN descrita se consideraría idéntico a la secuencia de ADN puesto que ambos uracil y timidina hacen par con adenina. Las versiones acortada y alargada de los compuestos antisentido descritos en la presente así como también compuestos que tienen bases no idénticas con relación a los compuestos antisentido proporcionados en la presente están contemplados también. Las bases no idénticas pueden estar adyacentes unas con otras o dispersas en todo el compuesto antisentido. El porciento de identidad de un compuesto antisentido se calcula de acuerdo con el número de bases que tienen apareamiento de bases idéntico en relación con la secuencia con la cual se compara.
En ciertas modalidades, los compuestos antisentido, o porciones de los mismos, son por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idénticos a uno o más de los compuestos antisentido o SEQ ID Nos, o a una porción de los mismos, descritos en la presente.
En ciertas modalidades, una porción del compuesto antisentido se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico objetivo. En ciertas modalidades, una porción de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleobases se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico objetivo.
En ciertas modalidades, una porción del oligonucleótido antisentido se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico objetivo. En ciertas modalidades, una porción de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleobases se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico objetivo. Modificaciones Un nucleósido es una combinación de base-azúcar. La porción de nucleobase (conocida también como base) del nucleósido es normalmente un núcleo de base heterocíclico. Los nucleótidos son nucleósidos que incluyen además un grupo fosfato unido de manera covalente a la porción de azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar de pentofuranosil, el grupo fosfato puede estar vinculado a la porción 2' , 3' o 5' hidroxilo del azúcar. Los oligonucleótidos se forman a través de la unión covalente de nucleósidos adyacentes entre ellos, para formar un oligonucleótido polimérico lineal . En la estructura del oligonucleótido, los grupos fosfato se aluden comúnmente formadores de los vínculos de internucleósido del oligonucleótido.
Las modificaciones a compuestos antisentido abarcan sustituciones o cambios a enlaces de internucleósido, porciones de azúcar o nucleobases. Los compuestos antisentido modificados se prefieren con frecuencia a las formas nativas debido a sus propiedades deseables, tales como, por ejemplo, toma celular aumentada , afinidad aumentada para ácido nucleico objetivo, estabilidad incrementada en la presencia de nucleasas o actividad inhibitoria incrementada. Los nucleósidos químicamente modificados se pueden emplear también para aumentar la afinidad de unión de un oligonucleótido antisentido acortado o truncado con su ácido nucleico objetivo. En consecuencia, con frecuencia se pueden obtener resultados comparables con compuestos antisentido más cortos que tienen tales nucleósidos modificados químicamente.
Enlaces Modificados de Internucleósido El enlace de ¡nternucleósido que ocurre naturalmente de ARN y ADN es un enlace de fosfodiéster de 3' a 5' . Los compuestos antisentido que tienen uno o más enlaces de ¡nternucleósido modificados, es decir, que no ocurren naturalmente, se seleccionan con frecuencia sobre los compuestos antisentido que tienen enlaces de ¡nternucleósido que ocurren naturalmente debido a sus propiedades deseables tales como, por ejemplo, toma celular aumentada, afinidad aumentada por ácidos nucleicos objetivo y estabilidad incrementada en la presencia de nucleasas.
Los oligonucleótidos que tienen enlaces de ¡nternucleósido modificados incluyen enlaces de ¡nternucleósido que retienen un átomo de fósforo así como también enlaces de ¡nternucleósido que no tienen un átomo de fósforo. Los enlaces de ¡nternucleósido que contienen fósforo representativos incluyen, pero no están limitados a , fosfodiésteres, fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforamidato y fosforotioatos. Los métodos de preparación de enlaces que contienen fósforo y que no contienen fósforo son bien conocidos.
En ciertas modalidades, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de Factor 1 1 comprenden uno o más enlaces de ¡nternucleósido modificados. En ciertas modalidades, los enlaces de ¡nternucleósido modificados son enlaces de fosforotioato. En ciertas modalidades, cada enlace de ¡nternucleósido de un compuesto antisentido es un enlace de ¡nternucleósido de fosforotioato.
Porciones de Azúcar Mod ificada Los compuestos antisentido de la invención pueden contener opcionalmente uno o más nucleósidos en donde el grupo azúcar ha sido modificado. Tales nucleósidos modificados de azúcar pueden impartir estabilidad aumentada de la nucleasa, afinidad incrementada de unión o alguna otra propiedad biológica benéfica a los compuestos antisentido. En ciertas modalidades, los nucleósidos comprenden porciones de anillo de ribofuranosa qu ímicamente modificadas. Ejemplos de anillos de ribofuranosa qu ímicamente modificados incluyen sin limitación adición de grupos sustituyentes (incluyendo grupos sustituyentes en 5' y 2' , puenteo de átomos de anillo no gemínales para formar ácidos nucleicos bicíclicos (BNA), reemplazo del átomo de oxígeno del anillo de ribosil con S, N(R) o C(R1 )(R)2 (R = H , alquilo de C1 -C1 2 o un grupo protector)) y combinaciones de los mismos. Ejemplos de azúcares químicamente modificados incluyen nucleósido sustituido con 2'-F-5'-metilo (ver solicitud internacional PCT WO 2008/ 101 1 57 publicada el 8/21 /08 para otros nucleósidos sustituidos 5', 2 -bis) o reemplazo del átomo de oxígeno del anillo de ribosil con S con sustitución adicional en la posición 2' (ver solicitud de patente de E . U . publicada US2005-01 30923, publicada el 1 6 de junio de 2005) o alternativamente sustitución en 5' de un BNA (ver solicitud internacional PCT WO 2007/1 34181 publicada el 1 1 /22/07 en donde LNA está sustituido con, por ejemplo, un grupo 5'-metilo o 5'-vínilo).
Ejemplos de nucleósidos que tienen porciones de azúcar modificada incluyen , sin limitación, nucleósidos que comprenden grupos sustituyentes 5'-vilnilo, 5'-metilo (R o S), 4'-S , 2'-F, 2'-OCH3 y 2'-0(CH2)20CH3. El sustituyente en la posición 2' se puede seleccionar también de alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-alquilo de C1 -C1 0, OCF3, 0(CH2)2SCH3, 0(CH2)2-0-N( Rm)(Rn) y 0-CH2-C( = 0)-N(Rm)( Rn), donde cada Rm y Rn es, independientemente, H o alquilo de C1 -C10 sustituido o insustituido.
Ejemplos de ácidos nucleicos bicíclicos (BNAs) incluyen , sin limitación, nucleosidos que comprenden un puente entre los átomos del anillo de ribosil 4' y 2' . En ciertas modalidades, los compuestos antisentido proporcionados en la presente incluyen uno o más nucleosidos de BNA en donde el puente comprende una de las fórmulas: 4'-(CH2)-0-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)-0-2' (LNA); 4'-(CH2)2-0-2' ( ENA); 4'-C(CH3)2-0-2' (ver PCT/US2008/068922); 4'-CH(CH3)-0-2' y 4,-C-H(CH20CH3)--0-2' (ver U.S. Patente 7,399,845, emitida el 1 5 de Julio de 2008); 4'-CH2-N(OCH3)-2' (ver PCT/US2008/ 064591 ); 4'-CH2-0-N(CH3)-2' (ver Solicitud de Patente de E. U . US2004-01 71 570, publicada el 2 de Septiembre de 2004); 4'-CH2-N( R)-0-2' (ver U .S. Patente 7 ,427 ,672, emitida el 23 de Septiembre de 2008); 4'-CH2-C(CH3)-2' y 4'-CH2-C-( = CH2)-2' (ver PCT/US2008/ 0661 54); y en donde R es, independientemente, H , alquilo de C1 -C1 2 , o un grupo protector. Cada uno de los BNAs precedentes incluyen varias configuraciones estereoquímicas de azúcar incluyendo, por ejemplo, [alfa]-L-ribofuranosa y [beta]-D-ribofuranosa (ver solicitud internacional de PCT PCT/DK98/00393, publicada el 25 de marzo de 1999 como WO 99/14226.
En ciertas modalidades, los nucleosidos se modifican mediante reemplazo del anillo de ribosil con sucedáneo de azúcar. Tal modificación incluye, sin limitación, el reemplazo del anillo de ribosil con un sistema de anillo sucedáneo (algunas veces aludidos como análogos de ADN ) tal como un anillo de morfolino, un anillo de ciclohexenilo, un anillo de ciclohexilo o un anillo de tetrahidropiranilo tal como uno que tiene uno de la fórmula: Se conocen en la técnica también muchos otros sistemas de anillos biciclo y triciclo sucedáneo de azúcar que se pueden usar para modificar nucleósidos para incorporación de en compuestos antisentido (ver, por ejemplo, artículo de revisión: Leumann , J . C, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2002, 1 0, 841 -854). Tales sistemas de anillos pueden experimentar varias sustituciones adicionales para aumentar la actividad .
Los métodos para las preparaciones de azúcares modificados son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. En nucleótidos que tienen porciones de azúcar modificada, las porciones de nucleobase (natural , modificada o una combinación de las mismas) se mantienen para hibridación con un objetivo de ácido nucleico apropiado.
En ciertas modalidades, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico del Factor 1 1 comprenden uno o más nucleótidos que tienen porciones de azúcar modificada. En ciertas modalidades, la porción de azúcar modificada es 2 - OE. En ciertas modalidades, los nucleótidos modificados con 2'-MOE están dispuestos en un motivo gapmer.
Nucieobases Mod ificadas Las modificaciones o sustituciones de nucleobase (o base) son estructuralmente distinguibles de, aunque intercambiables funcionalmente con, nucieobases no modificadas que ocurren naturalmente o sintéticas. Las nucieobases tanto naturales como sintéticas son capaces de participar en enlaces de hidrógeno. Tales modificaciones de nucieobases pueden impertir estabilidad , afinidad de unión o alguna otra propiedad biológica benéfica a los compuestos antisentido. Las nucieobases modificadas incluyen nucieobases sintéticas y naturales tales como, por ejemplo, 5-metilcitosina (5-me-C). Ciertas sustituciones de nucleobase, incluyendo sustituciones de 5-metilcitosina, son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de un compuesto antisentido para un ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, las sustituciones de 5'-metilcitosina han mostrado que incrementan la estabilidad dúplex de ácido nucleico en 0.6 a 1 .2[grad]C (Sanghvi , Y. S. , Crooke, S. T. y Lebleu, B. , eds. , Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Ratón, 1993, pp. 276-278).
Nucieobases modificadas adicionales incluyen 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadeni na, 6-metilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracil, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracil y citosina, 5-propinil (-C[idéntico a]C-CH3) uracil y citosina y otros derivados de alquinilo de bases de pirimidina, 6-azo uracil, citosina y timina, 5-uracil (pseudouracil), 4-tiouracil , 8-halo, 8-amino, 8-tiol , 8-tioalquMo, 8-h¡droxilo y otras adeninas y guaninas 8-substituidas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-substituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-ami no-adenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina , 7-deazaguanina y 7-deazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina .
Las porciones de base heterocíclica pueden incluir también aquéllas en las cuales la base de purina o pirimidina es remplazada con otros heterociclos, por ejemplo, 7-deaza-adenina , 7-deazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Las nucleobases que son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de los compuestos antisentido incluyen pirimidinas 5-substitudas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y 0-6 substituidas, incluyendo 2 aminopropiladenina, 5-propiniluracil y 5-propinilcitosina.
En ciertas modalidades, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico del Factor 1 1 comprenden una o más nucleobases modificadas. En ciertas modalidades, los oligonucleótidos antisentido gap-ampliados dirigidos a un ácido nucleico del Factor 1 1 comprenden una o más nucleobases modificadas. En ciertas modalidades, la nucleobase modificada es 5-metilcitosina. En ciertas modalidades, cada citosina es una 5-metilcitosina.
Composiciones y Métodos Para Formular Composiciones Farmacéuticas Los oligonucleótidos antisentido pueden mezclarse con sustancias activas o inertes farmacéuticamente aceptables para la preparación de composiciones o formulaciones farmacéuticas. Las composiciones y los métodos para la formulación de composiciones farmacéuticas dependen de un número de criterios, incluyendo, pero no limitados a , ruta de administración, grado de la enfermedad o la dosis a ser administradas.
Un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico del Factor 1 1 puede ser utilizado en composiciones farmacéuticas combinando el compuesto antisentido con un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable. Un diluyente farmacéuticamente aceptable incluye salina amortiguada con fosfato (PBS). La PBS es un diluyente adecuado para uso en composiciones para ser entregadas parenteralmente. En consecuencia, en una modalidad, empleada en los métodos descritos en la presente hay una composición farmacéutica que comprende un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico del Factor 1 1 y un diluyente farmacéuticamente aceptable. En ciertas modalidades, el diluyente farmacéuticamente aceptable es PBS. En ciertas modalidades, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos antisentido abarcan cualesquiera sales, ésteres o sales de tales ésteres farmacéuticamente aceptables o cualquier otro oligonucleótido el cual, por administración a un animal , incluyendo un humano, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biológicamente activo o residuo del mismo. En consecuencia, por ejemplo, la descripción abarca también sales farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, profármacos, sales farmacéuticamente aceptables de tales profármacos y otros bioequivalentes. Las sales adecuadas farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no están limitadas a, sales de sodio y de potasio.
Un profármaco puede inclui r la incorporación de nucleósidos adicionales en uno o ambos extremos de un compuesto antisentido que son escindidos por nucleasas endógenas dentro del cuerpo, para formar el compuesto antisentido activo.
Compuestos Antisentido Conjugados Los compuestos antisentido pueden estar enlazados de manera covalente a una o más porciones o conjugados que aumentan la actividad , la distribución celular o toma celular de los oligonucleótidos antisentido resultantes. Los grupos conjugados típicos incluyen porciones de colesterol y porciones de l ípidos. Los grupos conjugados adicionales incluyen carbohidratos, fosfolípidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas , cumarinas y colorantes o tintes.
Los compuestos antisentido pueden modificarse también para tener uno o más grupos que se unen generalmente a uno o ambos términos de los compuestos antisentido para mejorar propiedades tales como, por ejemplo , estabilidad de nucleasa. Incluidos en los grupos estabilizadores están las estructuras de remate. Estas modificaciones terminales protegen al compuesto antisentido que tienen ácido nucleico terminal de la degradación de exonucleasa y pueden ayudar en la entrega y/o localización en una célula. El remate puede estar presente en el término 5' (5'-remate) o en el término 3' (3'-remate) o puede estar presente en ambos términos. Las estructuras de remate son bien conocidas en la técnica e incluyen , por ejemplo, remates abásicos deoxi invertidos. Además, los grupos 3' y 5'-estabilizadores que se pueden usar para rematar uno o ambos extremos de un compuesto antisentido para impartir estabilidad de nucleasa incluyen aquéllos descritos en WO 03/004602 publicada el 16 de enero de 2003.
Cultivo de Células y Tratamiento con Compuestos Antisentido Los efectos de los compuestos antisentido en el nivel, actividad o expresión de los ácidos nucleicos del Factor 1 1 pueden ensayarse in vitro en una variedad de tipos de células. Los tipos de células usados para tales análisis están disponibles de vendedores comerciales (por ejemplo, American Type Culture Collection , Manassus, VA; Zen-Bio, Inc. , Research Triangle Park, NC; Clonetics Corporation , Walkersville, M D) y se cultivan de acuerdo con las instrucciones del vendedor usando reactivos comercialmente disponibles (por ejemplo, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Los tipos de células ilustrativos incluyeb, pero no están limitados a, células HepG2, células Hep3B , y hepatocitos primarios.
Prueba In Vitro de Oligonucleótidos Antisentido Descritos en la presente hay métodos para el tratamiento de células con oligonucleótidos antisentido, los cuales pueden modificarse apropiadamente para tratamiento con otros compuestos antisentido.
En general , las células se tratan con oligonucleótidos antisentido cuando las células alcanzan aproximadamente de 60 a 80% de confluencia en el cultivo.
Un reactivo usado comúnmente para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye el reactivo de transfección de lípidos catiónicos LI POFECTIN (Invitrogen, Carísbad , CA). Los oligonucleótidos antisentido se mezclan con LI POFECTI N en OPTI -M EM 1 ( I nvitrogen , Carísbad , CA) para alcanzar la concentración final deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LI POFECTI N que fluctúa típicamente de 2 a 12 ug/mL por oligonucleótido antisentido 1 00 nM .
Otro reactivo usado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye LI POFECTAMINE (Invitrogen, Carísbad , CA). El oligonucleótido antisentido se mezcla con LI POFECTAM I NE en medio de suero reducido con OPTI-M EM 1 (Invitrogen , Carísbad , CA) para alcanzar la concentración deseada de oligonucleótido antisentído y una concentración de LI POFECTAM I NE que fluctúa típicamente de 2 a 12 ug/mL por oligonucleótido antisentido 100 nM .
Otra técnica usada para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye la electroporación.
Las células se tratan con oligonucleótidos antisentido mediante métodos de rutina. Las células se cultivan típicamente de 16 a 24 horas después del tratamiento con oligonucleótido antisentido, en cuyo tiempo se miden los niveles de ADN o proteína de ácidos nucleicos objetivo mediante métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente. En general , cuando se realizan los tratamientos en replicados múltiples, los datos se presentan como el promedio de los tratamientos replicados.
La concentración de oligonucleótido antisentido usada varía de l ínea celular a l ínea celular. Los métodos para determinar la concentración óptima de oligonucleótido antisentido para una l ínea celular en particular son bien conocidos en la técnica. Los oligonucleótidos antisentido se usan típicamente en concentraciones que fluctúan desde 1 nM hasta 300 nM cuando se transfectan con LIPOFECTAMINE. Los oligonucleótidos antisentido se usan en concentraciones mayores que fluctúan desde 625 hasta 20,000 nM cuando se transfectan usando electroporación.
Aislamiento de ARN El análisis de ARN se puede realizar en ARN celular o poli(A)+ mARN total . Los métodos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El ARN se prepara usando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, usando el reactivo TRIZOL (Invitrogen , Carlsbad , CA) de acuerdo con los protocolos recomendados por el fabricante. Análisis de Inhibición de Niveles o Expresión Objetivo La inhibición de niveles o expresión de un ácido nucleico del Factor 1 1 puede ser ensayada en una variedad de formas conocidas en la técnica. Por ejemplo, los niveles de ácido nucleico objetivo se pueden cuantificar mediante, por ejemplo, análisis de mancha Northern, reacción en cadena de polimerasa (PCR) competitiva o PCR cuantitativa en tiempo real. El análisis de ARN se puede realizar en ARN celular total o poli(A) + mARN . Los métodos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El análisis de mancha Northern es también de rutina en la técnica. La PCR cuantitativa en tiempo real se puede realizar convenientemente usando el Sistema de Detección de Secuencia AB I PRISM 7600, 7700 o 7900, disponible de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA y usado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Análisis de PCR Cuantitativa en Tiempo Real de Niveles de ARN Objetivo La cuantificación de niveles de ARN objetivo se puede realizar mediante PCR cuantitativa en tiempo real usando el Sistema de Detección de Secuencia ABI PRISM 7600, 7700 o 7900, (PE-Applied. Biosystems, Foster City, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los métodos de PCR cuantitativa en tiempo real son bien conocidos en la técnica.
Antes de la PCR en tiempo real, el ARN aislado se sujeta a una reacción de transcriptasa (RT) inversa, que produce ADN complementario (cADN ) que se usa después como el sustrato para la amplificación de PCR en tiempo real . Las reacciones de RT y PCR en tiempo real se efectúan de manera secuencial en el mismo pozo de muestra . Los reactivos para RT y PCR en tiempo real se obtienen de Invitrogen (Carlsbad , CA). Las reacciones de RT y PCR en tiempo real se llevan a cabo mediante métodos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica.
Las cantidades objetivo de gen (o ARN) obtenidas mediante PCR en tiempo real se normalizan usando ya sea el nivel de expresión de un gen cuya expresión es constante, tal como ciclofilin A, o mediante la cuantificación del ARN total usando RIBOGREEN (Invitrogen , Inc.
Carlsbad , CA). La expresión de ciclofilin A se cuantifica mediante PCR de tiempo real , corriéndose simultáneamente con el objetivo, multiplex o separadamente. El ARN total se cuantifica usando reactivo de cuantificación de ARN de RI BOGREEN ( I nvitrogen, Inc. Eugene, OR). Los métodos de cuantificación de ARN mediante de RIBOGREEN se enseñan en Jones, L. J . , et al, (Analytical Biochemistry, 1 998, 265, 368-374). Se usa un instrumento CYTOFLUOR 4000 (PE Applied Biosystems) para medir fluorescencia de RIBOGREEN .
Sondas y cebos se diseñan para hibridar con un ácido nucleico del Factor 1 1 . Los métodos para diseñar sondas y cebos de PCR en tiempo real son bien conocidos en la técnica, y pueden incluir el uso de software tal como software PRIMER EXPRESS (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Anál isis de Niveles de Proteína La inhibición antisentido de ácidos nucleicos del Factor 1 1 se puede evaluar mediante la medición de los niveles de proteína del Factor 1 1 . Los niveles de proteína del Factor 1 1 se pueden evaluar o cuantificar en una variedad de maneras bien conocidas en la técnica, tales como inmunoprecipitación , análisis de Western blot (inmunoblotting), ensayo de inmunosorbencia vinculada a enzima (ELISA), ensayos cuantitativos de proteína, ensayos de actividad de proteína (por ejemplo, ensayos de actividad caspasa), inmunohistoquímica, inmunocitoquímica o clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Los anticuerpos dirigidos a una diana u objetivo pueden identificarse y obtenerse a partir de una variedad de fuentes, tal como el catálogo de MSRS de anticuerpos (Aeire Corporation , Birmingham , M I), o se pueden preparar vía métodos convencionales de generación de anticuerpos monoclonales o policlonales bien conocidos en la técnica. Los anticuerpos útiles para la detección de Factor 1 1 de ratón , rata , mono y humano están disponibles comercialmente.
Ensayo In Vivo de Compuestos Antisentido Los compuestos antisentido, por ejemplo , oligonucleótidos antisentido, se ensayan en animales para evaluar su habilidad para inhibir la expresión del Factor 1 1 y producir cambios fenotípicos, tales como aPTT prolongado, tiempo de aPTT prolongado en conjunto con una PT normal , cantidad disminuida de Factor 4 de Plaquetas (PF-4) y formación reducida de trombos o tiempo incrementado para la formación de trombos. Los ensayos se pueden realizar en animales normales, o en modelos enfermos experimentales. Para la administración a animales, los oligonucleótidos antisentido se formulan en un diluyente farmacéuticamente aceptable, tal como salina amortiguada con fosfato. La administración incluye rutas parenterales de administración , tales como intraperitoneal, intravenosa y subcutánea. El cálculo de la dosificación de oligonucleótidos antisentido y frecuencia de dosificación está dentro de las habilidades de aquellos expertos en la técnica, y depende de factores tales como la ruta de administración y el peso corporal de animal . Después de un periodo de tratamiento con oligonucleótidos antisentido, el ARN se aisla de tejido del hígado y se miden los cambios en la expresión de ácido nucleico del Factor 1 1 . Los cambios en los niveles de proteína del Factor 1 1 se miden también usando un ensayo de generación de trom bina . Además, se determinan los efectos en tiempos de coagulación , por ejemplo PT y aPTT usando plasma de ani males tratados.
Tolerancia En ciertas modalidades, los compuestos proporcionados en la presente exhiben efectos secundarios mínimos . Los efectos secundarios incluyen respuestas a la administración d el compuesto antisentido que no están relacionados típicamente con la selección de objetivo del Factor 1 1 , tal como una respuesta inflamatoria en el animal. En ciertas modalidades , los compuestos son bien tolerados por el animal . La tolerancia incrementada puede depender de un nú mero de factores , incluyendo, pero no limitados a , la secuencia de n ucleótido del compuesto antisentido, modificaciones químicas a los nucleótidos , el motivo particular de nucleósidos sin modificar y modificados en el compuesto antisentido o combinaciones de los mismos. La tolerancia se puede determi nar mediante un número de factores. Tales factores incluyen peso corporal , peso del órgano, función del h ígado, función del riñon , conteo de plaquetas, conteo de células blancas en sangre.
En ciertas modalidades, los compuestos proporcionados en la presente demuestran efectos m íni mos en el peso del órgano. En ciertas modalidades, los compuestos demuestran menos que un incremento de 7 veces , 6 veces , 5 veces, 4 veces, 3 veces, 2 veces o no significativo en el peso del bazo y/o h ígado. En ciertas modalidades, los compuestos proporcionados en la presente demuestran un efecto mínimo en la función del hígado. Los factores para la evaluación de la función del hígado incluyen niveles de ALT, niveles de AST, niveles de bilirrubina en plasma y niveles de albúmina en plasma. En ciertas modalidades , los compuestos proporcionados en la presente demuestran un incremento menor que 7 veces, menor que 6 veces, menor que 5 veces, menor que 4 veces, menor que 3 veces o menor que 2 veces o no significativo en ALT o AST. En ciertas modalidades, los compuestos proporcionados en la presente demuestran un incremento menor que 3 veces, menor que 2 veces o no significativo en niveles de bilirrubina en plasma.
En ciertas modalidades, los compuestos proporcionados en la presente demuestran un efecto mínimo en la función del riñon . En ciertas modalidades, los compuestos proporcionados en la presente demuestran un incremento menor que 3 veces, menor que 2 veces o no significativo en concentraciones en plasma de nitrógeno de urea en sangre (BUN ). En ciertas modalidades, los compuestos proporcionados en la presente demuestran un incremento menor que 6 veces, 5 veces, 4 veces, 3 veces, 2 veces o no significativo en la proporción de proteína en orina a creatinina.
En ciertas modalidades, los compuestos proporcionados en la presente demuestran un efecto mínimo en factores hematológicos. En ciertas modalidades, los compuestos proporcionados en la presente demuestran una disminución menor que 60%, 50%, 40%, 30%, 20% , 10% o 5% en el conteo de plaquetas. En ciertas modalidades, los compuestos proporcionados en la presente demuestran un incremento menor que 4 veces, menor que 3 veces, menor que 2 veces o no significativo en el conteo de monocitos.
En ciertas modalidades, los compuestos exhiben además una farmacocinética favorable. En ciertas modalidades, los compuestos antisentido exhiben vidas medias relativamente altas en fluidos o tejidos biológicos importantes. En ciertas modalidades, los compuestos o las composiciones exhiben además viscosidad favorable. En ciertas modalidades, la viscosidad del compuesto o de la composición es de no más del 40 cP a una concentración de 1 65 a 1 85 mg/mL.
En otras modalidades, los compuestos exhiben combinaciones de las características anteriores y reducen la expresión de mARN en Factor 1 en un modelo animal con elevada eficiencia.
Ciertas Indicaciones En ciertas modalidades, la invención proporciona métodos de tratamiento de un individuo, que comprenden administrar una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención . En ciertas modalidades, el individuo tiene una complicación de tromboembolia. En ciertas modalidades, el individuo está en riesgo de un trastorno de taponamiento de sangre, incluyendo, pero no limitado a, infarto, trombosis, embolia, tromboembolia tal como trombosis venosa profunda , embolia pulmonar, infarto al miocardio y derrame. Esto incluye individuos con un problema, enfermedad o trastorno adquirido que conduce a un riesgo de trombosis, por ejemplo, cirugía , cáncer, inmovilidad , sepsis, fibrilación atrial de aterosclerosis, así como también predisposición genética, por ejemplo, síndrome de antifosfol ípido y la condición autosomal dominante, Factor V Leiden . En ciertas modalidades, el individuo ha sido identificado como en necesidad de terapia de anticoagulación . Ejemplos de tales individuos incluyen , pero no están limitados a, aquéllos que experimentan cirugía ortopédica mayor (por ejemplo, reemplazo de cadera/rodilla o cirug ía por fractura de cadera) y pacientes que necesitan tratamiento crónico , tales como aquéllos que sufren de fibrilación arterial para evitar derrame cerebral . En ciertas modalidades, la invención proporciona métodos para reducir profilácticamente la expresión del Factor 1 1 en un individuo. Ciertas modalidades incluyen tratar un individuo que lo necesita mediante la administración a un individuo de una cantidad terapéuticamente efectiva de un ácido nucleico del Factor 1 1 .
En una modalidad, la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico del Factor 1 1 se acompaña por el monitoreo de los niveles del Factor 1 1 en el suero de un individuo, para determinar una respuesta del individuo a la administración del compuesto antisentido. Una respuesta del individuo a la administración del compuesto antisentido se usa por un facultativo para determinar la cantidad y la duración de la intervención terapéutica.
En ciertas modalidades, la administración de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico del Factor 1 1 resulta en la reducción del la expresión del Factor 1 1 en por lo menos 1 5, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99% , o un rango definido por cualesquiera dos de estos valores. En ciertas modalidades, la administración de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico del Factor 1 1 resulta en un cambio en una medida de taponamiento de sangre como se mide mediante una prueba estándar, por ejemplo, pero no limitado a , prueba de tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT), prueba de tiempo de protrombina (PT), tiempo de trombina (TCT), tiempo de sangrado, o D-d ímero. En ciertas modalidades, la administración de un compuesto antisentido de Factor 1 1 aumenta la medida en por lo menos 1 5, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99% , o un rango definido por cualesquiera dos de estos valores. En algunas modalidades, la administración de un compuesto antisentido de Factor disminuye la medida en por lo menos 1 5, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 , 75, 80, 85, 90, 95 o 99% , o un rango definido por cualesquiera dos de estos valores.
En ciertas modalidades, las composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto antisentido dirigido a el Factor 1 1 se usan para la preparación de un medicamento para tratar un paciente que sufre o es susceptible a una complicación de tromboembolia.
Ciertas Terapias en Combinación En ciertas modalidades, se co-administran una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención con uno u otros más agentes farmacéuticos. En ciertas modalidades, tal uno o más de otros agentes farmacéuticos están diseñados para tratar la misma enfermedad , trastorno o condición con una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención. En ciertas modalidades, tal uno u otros más agentes farmacéuticos están diseñados para tratar una enfermedad , trastorno o condición diferente que la una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención. En ciertas modalidades, tales uno u otros más agentes farmacéuticos están diseñados para tratar un efecto secundario indeseable de una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención . En ciertas modalidades, se co-administra una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención con otro agente farmacéutico para tratar un efecto indeseable de aquel otro agente farmacéutico. En ciertas modalidades, se co-administra una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención con otro agente farmacéutico para producir un efecto en combinación. En ciertas modalidades, se co-administra una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención con otro agente farmacéutico para producir un efecto sinérgico. En ciertas modalidades, se administra una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención y uno u otros más agentes farmacéuticos al mismo tiempo. En ciertas modalidades, se administra una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención y uno u otros más agentes farmacéuticos en tiempos diferentes. En ciertas modalidades, se prepara una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención y uno u otros más agentes farmacéuticos conjuntamente en una sola formulación. En ciertas modalidades, se prepara una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención y uno u otros más agentes farmacéuticos por separado. En ciertas modalidades, los agentes farmacéuticos que se pueden coadministrar con una composición farmacéutica de la presente invención incluyen agentes anticoagulantes o antiplaquetas. En ciertas modalidades, los agentes farmacéuticos que se pueden co-administrar con una composición farmacéutica de la presente invención incluyen inhibidores de NSAID/Ciclooxigenasa, tal como aspirina. En ciertas modalidades, los agentes farmacéuticos que se pueden co-administrar con una composición farmacéutica de la presente invención incluyen inhibidores de receptor de adenosina disfosfato (ADP), tales como clopidogrel (PLAVIX) y tlicopidine (TICLI D). En ciertas modalidades, los agentes farmacéuticos que se pueden co-administrar con una composición farmacéutica de la presente invención incluyen inhibidores de fosfodiesterasa tal como cilostazol (PLETAL). En ciertas modalidades, los agentes farmacéuticos que se pueden co-administrar con una composición farmacéutica de la presente invención incluyen inhibidores de glicoproteína I IB/I I IA tales como abciximab ( REOPRO), eptifibatide (INTEGRILI N), tirofiban (AGGRASTAT) y defibrotide. En ciertas modalidades, los agentes farmacéuticos que se pueden co-administrar con una composición farmacéutica de la presente invención incluyen inhibidores de retqma de adenosina, tal como dipiridamole (PERSANTI NE). En ciertas modalidades, los agentes farmacéuticos que se pueden co-administrar con una composición farmacéutica de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, warfarina (y cumarinas relacionadas), heparina, inhibidores directos de trombina (tales como lepirudin , bivalirudin), apixaban , LOVENOX y compuestos moleculares pequeños que interfieren directamente con la acción enzimática de factores de coagulación particulares (por ejemplo, rivaroxaban , que interfiere con el Factor Xa). En ciertas modalidades, los agentes farmacéuticos que se pueden co-administrar con un inhibidor específico de Factor 1 1 de la presente invención incluyen , pero no están limitados a, un inhibidor adicional de Factor 1 1 . En ciertas modalidades, el agente anticoagulante o antiplaquetas se administra antes de la administración de una composición farmacéutica de la presente invención. En ciertas modalidades, el agente anticoagulante o antiplaquetas se administra después de la administración de una composición farmacéutica de la presente invención . En ciertas modalidades, el agente antícoagulante o antiplaquetas se administra al mismo tiempo que una composición farmacéutica de la presente invención. En ciertas modalidades, la dosis de un agente anticoagulante o antiplaquetas es la misma dosis que la dosis que se administraría si el agente anticoagulante o antiplaquetas se administrara solo. En ciertas modalidades, la dosis de un agente anticoagulante o antiplaquetas co-administrado es menor que la dosis que sería administrada si el agente anticoagulante o antiplaquetas se administrara solo. En ciertas modalidades, la dosis de un agente anticoagulante o antiplaquetas co-administrado es mayor que la dosis que sería administrada si el agente anticoagulante o antiplaquetas se administrara solo.
En ciertas modalidades, la co-administración de un segundo compuesto aumenta el efecto anticoagulante de un primer compuesto, de manera que la co-administración de los compuestos resulta en un efecto anticoagulante que es mayor que el efecto de la administración del primer compuesto solo. En otras modalidades, la co-administración resulta en efectos anticoagulantes que son aditivos de los efectos de los compuestos cuando se administran solos. En ciertas modalidades, la co-administración resulta en efectos anticoagulantes que son supra-aditivos a los efectos de los compuestos cuando se administran solos. En ciertas modalidades, la co-administración de un segundo compuesto aumenta la actividad antitrombótica sin aumentar el riesgo de sangrado. En ciertas modalidades , el primer compuesto es un compuesto antisentido. En ciertas modalidades, el segundo compuesto es un compuesto antisentido.
En ciertas modalidades, se administra un antídoto en cualquier momento después de la administración de un inhibidor específico del Factor 1 1 . En ciertas modalidades, se administra un antídoto en cualquier momento después de la administración de un oligonucleótido antisentido que apunta al Factor 1 1 . En ciertas modalidades, se administra un antídoto minutos, horas, días, semanas o meses después de la administración de un compuesto antisentido que apunta al Factor 1 1 . En ciertas modalidades, el antídoto es complementario (por ejemplo, la hebra sentido) al compuesto antisentido que apunta al Factor 1 1 . En ciertas modalidades, el antídoto es una proteína del Factor 7, Factor 7a, Factor 1 1 o Factor 1 1 a. En ciertas modalidades, la proteína del Factor 7, Factor 7a , Factor 1 1 o Factor 1 1 a es una proteína del Factor 7 humano, Factor 7a humano, Factor 1 1 humano o Factor 1 1 a humano. En ciertas modalidades, la proteína del Factor 7 es NOVESEVEN .
Ciertas Terapias de Antiplaquetas Co-admi nistradas En ciertas modalidades, los inhibidores del Factor 1 1 se combinan con terapias de antiplaquetas. En ciertas modalidades, la administración de un inhibidor del Factor 1 1 en combinación con una terapia de antiplaquetas resulta en un aumento pequeño a no apreciable o detectable del riesgo de sangrado en comparación con la terapia de antiplaquetas sola. En ciertas modalidades, el perfil del riesgo o indicaciones de riesgo no cambian con la terapia de antiplaquetas sola.
La combinación de terapias de antiplaquetas y anticoagulante se usa en la práctica cl ínica más frecuentemente en pacientes diagnosticados con , por ejemplo, tromboembolia, fibrilación atrial , un trastorno de válvulas cardiacas, enfermedad cardiaca valvular, derrame cerebral , CAD, y en pacientes que tienen una válvula mecánica. El beneficio de la terapia dual se refiere al efecto aditivo probable de suprimir ambas actividades de factor de plaquetas y coagulación . El riesgo de la terapia dual es el potencial para sangrado incrementado (Dowd , M . Plenary Sessions/Thrombosis Research 123 (2008)).
Las combinaciones anteriores de terapias antiplaqueta y anticoagulante han demostrado que incrementan el riesgo de sangrado en comparación con la terapia anticoagulante o de antiplaquetas sola. Tales combinaciones incluyen inhibidores de FXa (por ejemplo, apixiban y rivaroxaban ) con receptor de ADP/inhibidores P2Y 1 2 (Tienopiridinas tal como clopidogrel - conocido también como PLAVIX ) y NSAI Ds (por ejemplo, aspirina y naproxen) (Kubitza, D. 35 al , Br. J . CHn . Pharmacol . 63:4 (2006); Wong , P. C. et al . Journal of Thrombosis and Haemostasis 6 (2008); FDA Advisory Committee Briefing Document for New Drug Application 22-406 (209)). Por ejemplo, Wong reporta que la adición de ciertas dosis de apixaban a la aspirina y a aspirina más clopidrogel produjo un incremento significativo en tiempo de sangrado en comparación con la aspirina sola y la aspirina más clopidrogel . Kubitza reporta que la administración en combinación de rivaroxaban y naproxen aumentó significativamente el tiempo de sangrado sobre el naproxen solo.
Ejem plos Descripción no Limitante e Incorporación por Referencia Aunque ciertos compuestos, composiciones y métodos descritos en la presente han sido descritos con especificidad de acuerdo con ciertas modalidades, los siguientes ejemplos sirven solamente para ilustrar los compuestos descritos en la presente y no se pretende que limiten a los mismos. Cada una de las referencias citadas en la presente solicitud se incorpora en la presente por referencia en su totalidad .
Ejemplo 1 : Inhibición Antisentido del Factor 1 1 Humano en Cél ulas HepG2 Se ensayaron oligonucleótidos antisentido dirigidos a un ácido nucleico del Factor 1 1 para sus efectos sobre mARN del Factor 1 1 in vitro. Se transfectaron células HepG2 cultivadas a una densidad con 10,000 células por pozo usando reactivo de lipofectin con oligonucleótido antisentido 75 nM . Después de un periodo de tratamiento de aproximadamente 24 horas, el ARN se aisló de las células y los niveles de mARN del Factor 1 1 se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Los niveles de mARN del Factor 1 1 se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN , según medición mediante RI BOGREEN . Los resultados se presentan como porciento de inhibición del Factor 1 1 , con relación a células de control no tratadas. Los oligonucleótidos antisentido quiméricos en las Tablas uno y dos se designaron como gapmers MOE 5-10-5. Los gampers son 20 nucleótidos de longitud, en donde el segmento central de gap está comprendido de 1 0 2'-deoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5' y 3' ) por alas que comprenden 5 nucleótidos cada una. Cada nucleótido en el segmento de ala 5' y cada nucleótido en el segmento de ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces de internucleósido a través de cada gapmer son enlaces de fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citidina a través de cada gapmer son 5-metilcitidinas. "Sitio de inicio objetivo" indica que el nucleótido más 5' al cual está apuntado el gapmer. "Sitio de alto de objetivo" indica el nucleótido más 3' al cual está dirigido el gapmer. Cada gapmer enlistado en la Tabla 1 está dirigido a SEQ I D NO: 1 (No. de Acceso GENBANK NM_000128.3) y cada gapmer enlistado en la Tabla 2 está apuntado a SEQ ID NO: 2 (No. de Acceso GENBANK NT_022792.1 7, truncado de 1 9598000 a 196240000).
Tabla 1 I nhibición de niveles de mARN del Factor 1 1 humano med iante ol igonucleótidos antisentido qui méricos que tienen alas M OE 5- 1 0-5 y gapdeoxi apu ntados a SEQ I D NO: 1 Oligo Sitio Sitio Secuencia % SEQ ID Inicio Alto Inhibición ID Objetivo Objetivo NO 412187 38 57 TTCAAACAAGTGACATACAC 21 15 412188 96 115 TGAGAGAATTGCTTGCCTTTC 21 16 412189 106 125 AAATATACCTTGAGAGAATT 8 17 412190 116 135 AGTATGTCAGAAATATACCT 24 18 412191 126 145 TTAAAATCTTAGTATGTCAG 14 19 412192 146 165 CAGCATATTTGTGAAAGTCG 44 20 412193 222 241 TGTGTAGGAAATGGTCACTT 38 21 412194 286 305 TG C AATTCTTAATAAGG GTG 80 22 412195 321 340 AAATCATCCTGAAAAGACCT 22 23 412196 331 350 TGATATAAGAAAATCATCCT 25 24 412197 376 395 ACACATTCACCAGAAACTGA 45 25 412198 550 569 TTCAGGACACAAGTAAACCA 21 26 412199 583 602 TTCACTCTTGGCAGTGTTTC 66 27 412200 612 631 AAGAATACCCAGAAATCGCT 59 28 412201 622 641 CATTGCTTGAAAGAATACCC 66 29 412202 632 651 TTGGTGTGAGCATTGCTTGA 65 30 412203 656 675 AATGTCTTTGTTGCAAGCGC 91 31 412204 676 695 TTCATGTCTAGGTCCACATA 74 32 412205 686 705 GTTTATGCCCTTCATGTCTA 69 33 412206 738 757 CCGTGCATCTTTCTTGGCAT 87 34 412207 764 783 CGTGAAAAAGTGGCAGTGGA 64 35 412208 811 830 AGACAAATGTTACGATGCTC 73 36 412209 821 840 GTGCTTCAGTAGACAAATGT 91 37 412210 896 915 TGCACAGGATTTCAGTGAAA 73 38 412211 906 925 GATTAGAAAGTGCACAGGAT 64 39 412212 1018 1037 CCGGGATGATGAGTGCAGAT 88 40 412213 1028 1047 AAACAAGCAACCGGGATGAT 71 41 412214 1048 1067 TCCTGGGAAAAGAAGGTAAA 58 42 412215 1062 1081 Al ICI I IGGGCCA1 ICCTGG 81 43 412216 1077 1096 AAAGAI I ICI I I GAGA I TCT 43 44 412217 1105 1124 AAICCACICICAGAIGI I 11 47 45 412218 1146 1165 AACCAGAAAGAGCTTTGCTC 27 46 412219 1188 1207 GGCAGAACACTGGGATGCTG 56 47 412220 1204 1223 TGGTAAAATGAAGAATGGCA 58 48 412221 1214 1233 ATCAGTGTCATGGTAAAATG 48 49 412222 1241 1263 AACAATATCCAGTTCTTCTC 5 50 412223 1275 1294 ACAGTTTCTGGCAGGCCTCG 84 51 412224 1285 1304 GCATTGGTGCACAGTTTCTG 87 52 412225 1295 1314 GCAGCGGACGGCATTGGTGC 86 53 412226 1371 1390 TTGAAGAAAGCTTTAAGTAA 17 54 412227 1391 1410 AGTATTTTAGTTGGAGATCC 75 55 412228 1425 1 44 ATGTGTATCCAGAGATGCCT 71 56 412229 1456 1475 ÜIACACICAI IAICCAI 111 64 57 412230 1466 1485 GAI 11 IGGIGGIACACICAI 52 58 412231 1476 1495 ICCIGGGCI IGAI 11 IGGIG 74 59 412232 1513 1532 GGCCACTCACCACGAACAGA 80 60 412233 1555 1574 TGTCTCTGAGTGGGTGAGGT 64 61 412234 1583 1602 GTTTCCAATGATGGAGCCTC 60 62 412235 1593 1612 ATATCCACTGGTTTCCAATG 57 63 412236 1618 1637 CCATAGAAACAGTGAGCGGC 72 64 412237 1628 1647 TGACTCTACCCCATAGAAAC 48 65 412238 1642 1661 CGCAAAATCTTAGGTGACTC 71 66 412239 1673 1692 TTCAGATTGATTTAAAATGC 43 67 412240 1705 1724 TGAACCCCAAAGAAAGATGT 32 68 412241 1715 1734 TATTATTTCTTGAACCCCAA 41 69 412242 1765 1784 AACAAGGCAATATCATACCC 49 70 412243 1775 1794 TTCCAGTTTCAACAAGGCAA 70 71 412244 1822 1841 GAAGGCAGGCATATGGGTCG 53 72 412245 1936 1955 GTCACTAAGGGTATCTTGGC 75 73 412246 1992 2011 AGATCATCTTATGGGTTATT 68 74 412247 2002 2021 TAGCCGGCACAGATCATCTT 75 75 412248 2082 2101 CCAGATGCCAGACCTCATTG 53 76 412249 2195 2214 C ATTC ACACTG CTTG AGTTT 55 77 412250 2268 2287 TGGCACAGTGAACTCAACAC 63 78 412251 2263 2345 CT AG CATTTTCTT ACAAAC A 58 79 412252 2450 2469 TTATGGTAATTCTTGGACTC 39 80 412253 2460 2479 AAATATTGCCTTATGGTAAT 20 81 412254 2485 2504 TATCTG CCTATATAGTAATC 16 82 412255 2510 2529 ÜCCAC I AC I I GG I I A I I I I C 38 83 412256 2564 2583 AACAAATCTATTTATGGTGG 39 84 412257 2622 2641 CTGCAAAATGGTGAAGACTG 57 85 412258 2632 2651 GTGTAGATTCCTGCAAAATG 44 86 412259 2882 2901 I I I I CAGGAAA I I A I C I I 37 87 412260 2892 2911 CACAAATCATTTTTCAGGAA 27 88 412261 2925 2944 TCCCAAGATATTTTAAATAA 3 89 412262 3168 3187 AATG AG ATAAATATTTG C AC 34 90 412263 3224 3243 TGAAAGCTATGTGGTGACAA 33 91 412264 3259 3278 CACACTTGATGAATTGTATA 27 92 413460 101 120 TACCTTGAGAGAATTGCTTG 40 93 413461 1 1 1 130 GTCAGAAATATACCTTGAGA 39 94 413462 121 140 ATCTTAGTATGTCAGAAATA 12 95 413463 381 400 GAGTCACACATTCACCAGAA 74 96 413464 627 646 GTGAGCATTGCTTGAAAGAA 42 97 413465 637 656 CTTATTTGGTGTGAGCATTG 80 98 413466 661 680 ACA I AAA I U I C I I I G I I GCA 79 99 413467 666 685 GGTCCACATAAATGTCTTTG 91 100 413468 671 690 GTCTAGGTCCACATAAATTGT 84 101 413469 681 700 TGCCCTTCATGTCTAGGTCC 84 102 413470 692 711 GTTATAGTTTATGCCCTTCA 72 103 413471 816 835 TCAGTAGACAAATGTTACGA 67 104 413472 826 845 TGGGTGTGCTTCAGTAGACA 99 105 413473 911 930 AGCCAGATTAGAAAGTGCAC 80 106 413474 1023 1042 AGCAACCGGGATGATGAGTG 84 107 413475 1053 1072 GCCATTCCTGGGAAAAGAAG 80 108 413476 1067 1086 TTGAGATTCTTTGGGCCATT 88 109 413477 1151 1170 ACTGAAACCAGAAAGAGCTT 54 1 10 413478 1193 1212 AGAATGGCAGAACACTGGGA 53 1 1 1 413479 1209 1228 TGTCATGGTAAAATGAAGAA 40 1 12 413480 1219 1238 AAGAAATCAGTGTCATGGTA 71 113 413481 1280 1299 GGTGCACAGTTTCTGGCAGG 86 114 413482 1290 1309 GGACGGCATTGGTGCACAGT 85 115 413483 1300 1319 AACTGGCAGCGGACGGCATT 78 116 413484 1430 1449 CCTTAATGTGTATCCAGAGA 74 117 413485 1461 1480 TGGTGGTACACTCATTATCC 68 118 413486 1471 1490 GGCTTGA I I I I G TGGTACA 83 1 19 413487 1481 1500 AACGATCCTGGGCTTGATTT 57 120 413488 1560 1579 ACAGGTGTCTCTGAGTGGGT 49 121 413489 1588 1607 CACTGGTTTCCAATGATGGA 68 122 413490 1623 1642 CTACCCCATAGAAACAGTGA 57 123 413491 1633 1652 TTAGGTGACTCTACCCCATA 73 124 413492 1647 1666 AGACACGCAAAATCTTAGGT 68 125 413493 1710 1729 TTTCTTGAACCCCAAAGAAA 65 126 413494 1780 1799 ? I G I I I CCA I I I CAACAA 70 127 413495 1921 1940 TTGGCTTTCTGGAGAGTATT 58 128 413496 1997 2016 G G C AC AG ATC ATCTTATG G G 72 129 413497 2627 2646 GATTCCTGCAAAATGGTGAA 39 130 413498 2637 2656 GCAGAGTGTAGATTCCTGCA 60 131 413499 2887 2906 A I CA I I I I I GAGGAAA I I 52 132 Tabla 2 I nhibición de niveles de mARN del Factor 1 1 humano mediante ol igonucleótidos antisentido quiméricos que tienen alas MOE 5- 1 0-5 y gapdeoxi apuntados a SEQ I D NO: 2 Oligo Sitio Sitio Secuencia % SEQ ID Inicio Alto Inhibición ID NO Objetivo Objetivo 413500 1658 1677 GTGAGACAAATCAAGACTTC 15 133 413501 2159 2178 TTAGTTTACTGACACTAAGA 23 134 413502 2593 2612 CTGCTTTATGAAAAACCAAC 22 135 413503 3325 3344 ATACCTAGTACAATGTAAAT 29 136 413504 3548 3567 GGCTTGTGTGTGGTCAATAT 54 137 413505 5054 5073 TGGGAAAGCTTTCAATATTC 57 138 413506 6474 6493 ATGGAATTGTGCTTATGAGT 57 139 413507 7590 7909 TTTCAAGCTCAGGATGGGAA 55 140 413508 7905 7924 GTTGGTAAAATGCAACCAAA 64 141 413509 8163 8182 TCAGGACACAAGTAAACCTG 66 142 413510 9197 9216 TGCAAGCTGGAAATAAAAGC 17 143 41351 1 9621 9640 TGCCAATTTAAAAGTGTAGC 43 144 413512 9800 9819 ATATTTCAAAATCCAGTATG 39 145 413513 9919 9938 TTCTGAATATACAAATTAAT 27 146 413514 9951 9970 TTTACTATGAAAATCTAAAT 5 147 413515 11049 11068 G GTATCCTG AGTG AG ATCTA 36 148 413516 11269 11288 CCAGCTATCAGGAAAATTCC 50 149 413517 12165 12184 AAAG CTATTG G AG ACTCAG A 51 150 413518 12584 12603 ATGGAATCTCTTCATTTCAT 49 151 413519 12728 12747 ATGGAGACATTCATTTCCAC 59 152 413520 13284 13303 GCTCTGAGAGTTCCAATTCA 52 153 413521 14504 14523 I GGGAAG I AA I I I I I AG 62 154 413522 14771 14790 TCAAGAGTCTTCATGCTACC 42 155 413523 15206 15225 TCAGTTTACCTGGGATGCTG 61 156 413524 15670 15689 GACATTATACTCACCATTAT 7 157 413525 15905 15924 GTATAAATGTGTCAAATTAA 43 158 413526 16482 16501 G I AAAG I I I I ACCT I AACC I 47 159 413527 17298 17317 CCATAATGAAGAAGGAAGGG 52 160 413528 17757 17776 TTAAGTTACATTGTAGACCA 48 161 413529 18204 18223 TGTGTGGGTCCTGAAATTCT 52 162 413530 18981 19000 ATCTTGTAATTACACACCCC 27 163 413531 19174 19193 GTACACTCTGCAACAGAAGC 47 164 413532 19604 19623 AGGGAATAACATGAAGGCCC 32 165 413533 20936 20955 ATCCAGTTCACCATTGGAGA 48 166 413534 21441 21460 TTTTCCAGAAGAGACTCTTC 31 167 413535 21785 21804 GTCACATTTAAAATTTCCAA 41 168 413536 23422 23441 TTAATATACTGGCAGAGAACC 37 169 413537 25893 25912 AGAAATATCCCCAGACAGAG 16 170 Ejemplo 2: Inhibición antisentido dependiente de dosis del Factor 11 humano en células HepG2 Doce gapmers que exhiben más de 84 porciento o más de inhibición in vitro del Factor 1 1 humano, se ensayaron a varias dosis en células HepG2. Las células se colocaron en placa a una densidad de 10 ,000 células por pozo y se transfectaron usando reactivo de lipofectina con concentraciones de 9.375 nM , 1 8.75 nM, 37.5 nM , 75 nM y 1 50 nM de oligonucleótido antisentido, como se especifica en la Tabla 3. Después de un periodo de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de mARN del Factor 1 1 mediante PCR cuantitativa en tiempo real . Se usó RTS de conjunto de sonda de cebo de Factor 1 1 humano (secuencia hacía adelante: CAGCCTGGAGCATCGTAACA, incorporada en la presente como SEQ I D NO: 3; secuencia inversa : TTTATCGAGCTTCGTTATTCTGGTT, incorporada en la presente como SEQ ID NO: 4; secuencia de sonda: TTGTCTACTGAAGCACACCCAAACAGGGAX, incorporada en la presente como S EQ ID NO: 5) para medir niveles de mARN . Se ajustaron los niveles de mARN del Factor 1 1 de acuerdo con el contenido total de ARN , según medición mediante RIBOGREEN . Los resultados se presentan como porciento de inhibición del Factor 1 1 , con relación a células de control no tratadas. Como se ilustra en la Tabla 3, los niveles de mARN del Factor 1 1 se redujeron en una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótido.
Tabl a 3 Inhibición antisentido dependiente de dosis de Factor 1 1 humano en células HepG2 9.375 18.75 37.5 nM 75 nM 150 nM IC50 (nM) SEQ ID nM nM No. 412203 29 15 61 77 82 33 31 412206 28 44 68 80 89 22 34 412212 28 45 59 73 88 25 40 412223 33 48 62 76 81 21 51 412224 24 45 57 70 81 28 52 412225 32 42 65 78 73 23 53 413467 2 35 49 61 47 43 100 413468 14 34 56 78 75 35 101 413469 24 33 53 70 84 33 102 413476 26 44 64 73 82 25 109 413481 22 38 56 67 83 32 114 413482 26 39 59 74 82 28 115 Ejemplo 3: Inhibición antisentido del Factor 1 1 humano en células HepG2 mediante oligonucleótidos diseñados por microwaik Se diseñaron gapmers adicionales con base en los gapmers presentados en la Tabla 3. Estos gapmers fueron diseñados creando gapmers cambiados ligeramente corriente arriba y corriente abajo (es decir, "microwaik") de los gapmers originales de la Tabla 3. Los gapmers se crearon también con varios motivos, por ejemplo 5-10-5 MOE 3-1 4-3 MOE y 2-1 3-5 MOE . Estos gapmers fueron ensayados in vitro . Células HepG2 cultivadas a una densidad de 1 0,000 células por pozo fueron transfectadas usando reactivo de lipofectin con oligonucleótido antisentido 75 nM . Después de un periodo de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de mARN del Factor 1 1 mediante PCR cuantitativa en tiempo real . Se ajustaron los niveles de mARN del Factor 1 1 de acuerdo con el contenido total de ARN , según medición mediante RI BOGREEN . Los resultados se presentan como porciento de inhibición del Factor 1 1 , con relación a células de control no tratadas.
Los datos de inhibición in vitro para los gapmers diseñados mediante microwaik se compararon después con los datos de inhibición in vitro para los gapmers de la Tabla 3, como se indica en las Tablas 4, 5, 6, 7 y 8. Los oligonucleótidos se despliegan de acuerdo con la región en el mARN humano (No. de Acceso GENBANK NM_0001 28.3) para la cual mapean.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos de la Tabla 4 fueron diseñados como gapmers 5-10-5 MOE, 3-14-3 OE y 2-1 3-5 MOE. Los primeros gapemrs enlistados en la Tabla 4 son los gapmers originales (ver Tabla 3) a partir de los cuales se diseñaron los gapmers restantes vía microwalk y están designados mediante un asterisco. Los gapmers 5-10-5 son de 20 nucleotidos de longitud , en donde el segmento gap central está comprendido de 10 2'-deoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5' y 3') por alas que comprenden 5 nucleotidos cada una. Los gapmers 3-14-3 son de 20 nucleotidos de longitud , en donde el segmento gap central está constituido por 1 4 2 -deoxinucleótidos y esta flaqueado en ambos lados (en las direcciones 5' y 3') mediante alas que comprenden 3 nucleotidos cada una . Los gapmers 2-1 3-5 son de 20 nucleotidos de longitud , en donde el segmento gap central está constituido por 1 3 2'-deoxinucleótidos. El gap central está flanqueado en el extremo 5' con un ala que comprende 2 nucleotidos y en el extremo 3' con un ala que comprende 5 nucleotidos. Para cada uno de los motivos (5-10-5, 3-14-3 y 2-1 3-5), cada nucleótido en el segmento de ala 5' y cada nucleótido en el segmento de ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces de internucleósido a través de cada gapmer son enlaces de fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citidina a través de cada gapmer son 5-metilcitidinas. "Sitio de inicio objetivo" indica el nucleótido más 5' al cual está apuntado el gapmer. "Sitio de alto de objetivo" indica el nucleótido más 3' al cual está apuntado el gapmer. Cada gapmer enlistado en la Tabla 4 está dirigido a SEQ ID NO: 1 (No. de Acceso GENBANK N M_000128.3).
Como se muestra en la Tabla 4, todos los gapemrs 5-10-5 MOE, gapmers 3-14-3 MOE y gapmers 2-13-5 MOE dirigidos a la región objetivo que comienza en el sitio de inicio objetivo 656 y termina en el sitio de alto de objetivo 704 (es decir, nucleobases 656-704) de SEQ ID NO: 1 exhiben por lo menos 20% de inhibición de mARN del Factor 11. Muchos de los gapmers exhiben por lo menos 60% de inhibición. Varios de los gapmers exhiben por lo menos 80% de inhibición, incluyendo ISIS números: 416806, 416809, 416811, 416814, 416821, 416825, 416826, 416827, 416828, 416868, 416869, 416878, 416879, 416881, 416883, 416890, 416891, 416892, 416893, 416894, 416895, 416896, 416945, 416946, 416969, 416970, 416971, 416972, 416973, 412203, 413467, 413468 y 413469. Los siguientes ISIS números exhibieron por lo menos 90% de inhibición: 412203, 413467, 416825, 416826, 416827, 416868, 416878, 416879, 416892, 416893, 416895, 416896, 416945, 416972 y 416973. Los siguientes ISIS números exhibieron por lo menos 95% de inhibición: 416878, 416892, 416895 y 416896.
Tabla 4 Inhibición de niveles de mARN del Factor 11 humano mediante oligonucleótidos antisentido quiméricos dirigidos a las nucleobases 656 a 704 de SEQ ID NO: 1 (No. de Acceso GENBANK NM_000, 128.3) ISI No. Sitio Sitio Secuencia (5' a 3') % Motivo SEQ Inicio Alto InhibiID Objetivo Objetivo ción NO *412203 656 675 AATGTCTTTGTTGCAAGCGC 97 5-10-5 31 *413467 666 685 GGTCCACATAAATGTCTTTG 92 5-10-5 100 13468 671 690 GTCTAGGTCCACATAAATGT 83 5-10-5 101 13469 681 700 TGCCCTTCATGTCTAGGTCC 86 5-10-5 102 416868 656 675 AATGTCTTTGTTGCAAGCGC 93 3-14-3 31 416845 656 675 AATGTCTTTGTTGCAAGCGC 94 2-13-5 31 416806 657 676 AAATGTCTTTGTTGCAAGCG 86 5-10-5 171 416869 657 676 AAATGTCTTTGTTGCAAGCG 81 3-14-3 171 416946 657 676 AAATGTCTTTGTTGCAAGCG 86 2-13-5 171 416807 658 677 TAAATGTCTTTGTTGCAAGC 51 5-10-5 172 416870 658 677 TAAATGTCTTTGTTGCAAGC 76 3-14-3 172 416947 658 677 TAAATGTCTTTGTTGCAAGC 62 2-13-5 172 416808 659 678 ATAAATGTCTTTGTTGCAAG 55 5-105 173 416871 659 678 ATAAATGTCTTTGTTGCAAG 28 3-14-3 173 416948 659 678 ATAAATGTCTTTGTTGCAAG 62 2-13-5 173 416809 660 679 CATAAATGTCTTTGTTGCAA 86 5-10-5 74 416872 660 679 C AT AAATGTCTTTGTTG CAA 20 3-14-3 174 416949 660 679 CATAAATGTCTTTGTTGCAA 64 2-13-5 174 416873 661 680 ACATAAATGTCTTTGTTGCA 51 3-14-3 99 416950 661 680 ACATAAATGTCTTTGTTGCA 71 2-13-5 99 416810 662 681 CACATAAATGTCTTTGTTGC 68 5-10-5 175 416874 662 681 CACATAAATGTCTTTGTTGC 49 3-14-3 175 416951 662 681 CACATAAATGTCTTTGTTGC 48 2-13-5 175 416811 663 682 CCACAT AAATGTCTTTGTTG 84 5-10-5 176 416875 663 682 CCACAT AAATGTCTTTGTTG 75 3-14-3 176 416952 663 682 CCACAT AAATGTCTTTGTTG 51 2-13-5 176 416812 664 68 TCCACATAAATGTCTTTGTT 59 5-10-5 177 416876 664 683 TCCACATAAATGTCTTTGTT 37 3-14-3 177 416953 664 683 TCCACATAAATGTCTTTGTT 45 2-13-5 177 416813 665 684 GTCCACATAAATGTCTTTGT 70 5-10-5 178 416877 665 684 GTCCACATAAATGTCTTTGT 51 3-14-3 178 416954 665 684 GTCCACATAAATGTCTTTGT 61 2-13-5 178 416878 666 685 GGTCCACATAAATGTCTTTG 95 3-14-3 100 416955 666 685 GGTCCACATAAATGTCTTTG 75 2-13-5 100 416814 667 686 AGGTCCACATAAATGTCTTT 83 5-10-5 179 416879 667 686 AGGTCCACATAAATGTCTTT 92 3-14-3 179 416956 667 686 AGGTCCACATAAATGTCTTT 61 2-13-5 179 416815 668 687 TAGGTCCACATAAATGTCTT 63 5-10-5 180 416880 668 687 TAGGTCCACATAAATGTCTT 66 3-14-3 180 416957 668 687 TAGGTCCACATAAATGTCTT 59 2-13-5 180 416816 669 688 CTAGGTCCACATAAATGTCT 79 5-10-5 181 416881 669 688 CTAGGTCCACATAAATGTCT 81 3-14-3 181 416958 669 688 CTAGGTCCACATAAATGTCT 43 2-13-5 181 416817 670 689 TCTAGGTCCACATAAATGTC 74 5-10-5 182 416882 670 689 TCTAGGTCCACATAAATGTC 60 3-14-3 182 416959 670 689 TCTAGGTCCACATAAATGTC 25 2-13-5 182 416883 671 690 GTCTAGGTCCACATAAATGT 82 3-14-3 101 416960 671 690 GTCTAGGTCCACATAAATGT 60 2-13-5 101 416818 672 691 TGTCTAGGTCCACATAAATG 76 5-10-5 183 416884 672 691 TGTCTAGGTCCACATAAATG 69 3-14-3 183 416961 672 691 TGTCTAGGTCCACATAAATG 40 2-13-5 183 416819 673 692 ATGTCTAGGTCCACATAAAT 56 5-10-5 184 416885 673 692 ATGTCTAGGTCCACATAAAT 67 3-14-3 184 416962 673 692 ATGTCTAGGTCCACATAAAT 77 2-13-5 184 416820 674 693 CATGTCTAGGTCCACATAAA 77 5-10-5 185 416886 674 693 CATGTCTAGGTCCACATAAA 74 3-14-3 185 416963 674 693 CATGTCTAGGTCCACATAAA 48 2-13-5 185 416821 675 694 TCATGTCTAGGTCCACATAA 84 5-10-5 186 416964 675 694 TCATGTCTAGGTCCACATAA 69 2-13-5 186 412204 676 695 TTCATGTCTAGGTCCACATA 76 5-10-5 32 416888 676 695 TTCATGTCTAGGTCCACATA 76 3-14-3 32 416965 676 695 TTCATGTCTAGGTCCACATA 53 2- 3-5 32 416822 677 696 CTTCATGTCTAGGTCCACAT 76 5-10-5 187 416889 677 696 CTTCATGTCTAGGTCCACAT 60 3-14-3 187 416966 677 696 CTTCATGTCTAGGTCCACAT 64 2-13-5 187 416823 678 697 CCTTCATGTCTAGGTCCACA 77 5-10-5 188 416890 678 697 CCTTCATGTCTAGGTCCACA 87 3-14-3 188 416967 678 697 CCTTCATGTCTAGGTCCACA 75 2-13-5 188 416824 679 698 CCCTTCATGTCTAGGTCCAC 64 5-10-5 189 416891 679 698 CCCTTCATGTCTAGGTCCAC 81 3-14-3 189 416968 679 698 CCCTTCATGTCTAGGTCCAC 73 2-13-5 189 416825 680 699 GCCCTTCATGTCTAGGTCCA 92 5-10-5 190 416892 680 699 GCCCTTCATGTCTAGGTCCA 100 3-14-3 190 416969 680 699 GCCCTTCATGTCTAGGTCCA 80 2-13-5 190 416893 681 700 TGCCCTTCATGTCTAGGTCC 90 3-14-3 102 416970 681 700 TGCCCTTCATGTCTAGGTCC 88 2-13-5 102 416826 682 701 ATGCCCTTCATGTCTAGGTC 94 5-10-5 191 416894 682 701 ATGCCCTTCATGTCTAGGTC 85 3-14-3 191 416971 682 701 ATGCCCTTCATGTCTAGGTC 83 2-13-5 191 416827 683 702 TATGCCCTTCATGTCTAGGT 93 5-10-5 192 416895 683 702 TATGCCCTTCATGTCTAGGT 95 3-14-3 192 416972 683 702 TATGCCCTTCATGTCTAGGT 90 2-13-5 192 416828 684 703 TTATGCCCTTCATGTCTAGG 87 5-10-5 193 416896 684 703 TTATGCCCTTCATGTCTAGG 95 3-14-3 193 416973 684 703 TTATGCCCTTCATGTCTAGG 92 2-13-5 193 416829 685 704 TTTATGCCCTTCATGTCTAG 72 5-10-5 194 416897 685 704 TTTATGCCCTTCATGTCTAG 66 3-14-3 194 416974 685 704 TTTATGCCCTTCATGTCTAG 73 2-13-5 194 Los oligonucleótidos antisentido quiméricos en la Tabla 5 fueron diseñados como gapmers 5-1 0-5 MOE, 3-14-3 MOE y 2-1 3-5 MOE. El primer gapmer enlistado en la Tabla 5 es el gapmer original (ver Tabla 3) a partir del cual se diseñaron los gapmers restantes vía microwaik y están designados mediante un asterisco. Los gapmers 5-1 0-5 son de 20 nucleótidos de longitud, en donde el segmento gap central está constituido por 10 2'-deoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5' y 3') por alas que comprenden 5 nucleótidos cada una. Los gapmers 3-14-3 son de 20 nucleótidos de longitud , en donde el segmento gap central está constituido por 1 4 2 -deoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5* y 3' ) por alas que comprenden 3 nucleótidos cada una. Los gapmers 2-1 3-5 son de 20 nucleótidos de longitud , en donde el segmento gap central está constituido por 1 3 2'-deoxinucleótidos. El gap central está flanqueado en el extremo 5' con un ala que comprende 2 nucleótidos y en el extremo 3' con un ala que comprende 5 nucleótidos. Para cada uno de los motivos (5-10-5, 3-14-3 y 2-1 3-5), cada nucleótido en el segmento de ala 5' y cada nucleótido en el segmento de ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces de internucleósido a través de cada gapmer son enlaces de fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citidina a través de cada gapmer son 5-metilcitidinas. "Sitio de inicio objetivo" indica el nucleótido más 5' al cual está apuntado el gapmer. "Sitio de alto de objetivo" indica el nucleótido más 3' al cual está apuntado el gapmer. Cada gapmer enlistado en la Tabla 5 está dirigido a SEQ I D NO: 1 (No. de Acceso GENBANK NM_000128.3).
Como se muestra en la Tabla 5, todos los gapemrs 5-1 0-5 MOE, gapmers 3-1 4-3 MOE y gapmers 2-1 3-5 MOE dirigidos a la región objetivo que comienzan en el sitio de inicio objetivo 738 y terminan en el sitio de alto de objetivo 762 (es decir, nucleobases 738-762) de SEQ I D NO: 1 exhiben por lo menos 45% de inhibición de mA N del Factor 1 1 . La mayor parte de los gapmers exhiben por lo menos 60% de inhibición . Varios de los gapmers exhiben por lo menos 80% de inhibición , incluyendo ISIS números: 412206, 41 6830, 41 6831 , 41 6898, 416899, 41 6900, 41 6903, 416975, 416976, 416977 y 416980. Los siguientes ISIS números exhibieron por lo menos 90% de inhibición: 412206, 416831 y 416900.
Tabla 5 Inhibición de niveles de mARN del Factor 1 1 humano mediante oligonucleótidos antisentido quiméricos dirigidos a nucleobases 738 a 762 de SEQ I D NO: 1 (No. de Acceso GENBAN K N M_0001 28.3) ISIS No. Sitio Sitio Secuencia (5' a 3') % Motivo SEQ Inicio Alto InhibiID Objetivo Objetivo ción NO '412206 738 757 CCGTGCATCTTTCTTGGCAT 93 5-10-5 34 416898 738 757 CCGTGCATCTTTCTTGGCAT 88 3-14-3 34 416975 738 757 CCGTGCATCTTTCTTGGCAT 87 2-13-5 34 416830 739 758 TCCGTGCATCTTTCTTGGCA 81 5-10-5 195 416899 739 758 TCCGTGCATCTTTCTTGGCA 86 3-14-3 195 416976 739 758 TCCGTGCATCTTTCTTGGCA 83 2-13-5 195 416831 740 759 ATCCGTGCATCTTTCTTGGC 91 5-10-5 196 416900 740 759 ATCCGTGCATCTTTCTTGGC 90 3-14-3 196 416977 740 759 ATCCGTGCATCTTTCTTGGC 82 2-13-5 196 416832 741 760 CATCCGTGCATCTTTCTTGG 79 5-10-5 197 416901 741 760 CATCCGTGCATCTTTCTTGG 65 3-14-3 197 416978 741 760 CATCCGTGCATCTTTCTTGG 76 2-13-5 197 416833 742 761 TCATCCGTGCATCTTTCTTG 65 5-10-5 198 416902 742 761 TCATCCGTGCATCTTTCTTG 46 3-14-3 198 416979 742 761 TCATCCGTGCATCTTTCTTG 63 2-13-5 198 416834 743 762 GTCATCCGTGCATCTTTCTT 58 5-10-5 199 416903 743 762 GTCATCCGTGCATCTTTCTT 88 3-14-3 199 416980 743 762 GTCATCCGTGCATCTTTCTT 87 2-13-5 199 Los oligonucleótidos antisentido quiméricos en la Tabla 6 se designaron como gapmers 5-10-5 MOE , 3-14-3 MOE y 2-13-5 MOE. Los primeros gapmers enlistados en la Tabla 6 son los gapmers originales (ver Tabla 3) a partir de los cuales se diseñaron los gapmers restantes vía microwalk y están designados mediante un asterisco . Los gapmers 5-1 0-5 son de 20 nucleótidos de longitud , en donde el segmento gap central está constituido por 10 2'-deoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5' y 3' ) por alas que comprenden 5 nucleótidos cada una. Los gapmers 3-14-3 son de 20 nucleótidos de longitud, en donde ei segmento gap central está constituido por 14 2'-deoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5' y 3') por alas que comprenden 3 nucleótidos cada una. Los gapmers 2-1 3-5 son de 20 nucleótidos de longitud , en donde el segmento gap central está constituido por 1 3 2'-deoxinucleótidos. El gap central está flanqueado en el extremo 5' con un ala que comprende 2 nucleótidos y en el extremo 3' con un ala que comprende 5 nucleótidos. Para cada uno de los motivos (5-10-5, 3-1 4-3 y 2-1 3-5), cada nucleótido en el segmento de ala 5' y cada nucleótido en el segmento de ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces de internucleósido a través de cada gapmer son enlaces de fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citidina a través de cada gapmer son 5-metilcitidinas. "Sitio de inicio objetivo" indica el nucleótido más 5' al cual está apuntado el gapmer. "Sitio de alto de objetivo" indica el nucleótido más 3' al cual está apuntado el gapmer. Cada gapmer enlistado en la Tabla 6 está dirigido a SEQ I D NO: 1 (No. de Acceso GENBANK N M_000128.3).
Como se muestra en la Tabla 6, todos los gapmers 5-10-5 MOE, gapmers 3-14-3 MOE y gapmers 2-1 3-5 MOE dirigidos a la región objetivo que comienzan en el sitio de inicio objetivo 1 01 8 y terminan en el sitio de alto de objetivo 1 042 (es decir, nucleobases 101 8-1 042) de SEQ I D NO: 1 exhiben por lo menos 80% de inhibición de mARN del Factor 1 1 . Los siguientes ISIS números exhibieron por lo menos 90% de inhibición: 41 3474, 416837, 41 6838, 416904, 41 6907 y 41 6908.
Tabla 6 Inhibición de niveles de mARN del Factor 1 1 humano mediante oligonucieótidos antisentido quiméricos dirigidos a nucleobases 101 8 a 1 042 de SEQ ID NO: 1 (No. de Acceso GENBAN K N M_0001 28.3) ISIS No. Sitio Sitio Secuencia (5' a 3') % Motivo SEQ Inicio Alto InhibiID Objetivo Objetivo ción NO 12212 1018 037 CCGGGATGATGAGTGCAGAT 89 5-10-5 40 416904 1018 1037 CCGGGATGATGAGTGCAGAT 90 3-14-3 40 416981 1018 1037 CCGGGATGATGAGTGCAGAT 87 2-13-5 40 416835 1019 1038 ACCGGGATGATGAGTGCAGA 83 5-10-5 200 416905 1019 1038 ACCGGGATGATGAGTGCAGA 85 3-14-3 200 416982 1019 1038 ACCGGGATGATGAGTGCAGA 84 2-13-5 200 416836 1020 1039 AACCGGGATGATGAGTGCAG 89 5-10-5 201 416906 1020 1039 AACCGGGATGATGAGTGCAG 88 3-14-3 201 416983 1020 1039 AACCGGGATGATGAGTGCAG 86 2-13-5 201 416837 1021 1040 CAACCGGGATGATGAGTGCA 90 5-10-5 202 416907 1021 1040 CAACCGGGATGATGAGTGCA 90 3-14-3 202 416984 1021 1040 CAACCGGGATGATGAGTGCA 89 2-13-5 202 416838 1022 1041 GCAACCGGGATGATGAGTGC 94 5-10-5 203 416908 1022 1041 GCAACCGGGATGATGAGTGC 98 3-14-3 203 416985 1022 1041 GCAACCGGGATGATGAGTGC 88 2-13-5 203 413474 1023 1042 AGCAACCGGGATGATGAGTG 93 5-10-5 107 Los ol igonucleótidos antisentido q ui méricos en la Ta bla 7 fueron diseñados como gapmers 5-1 0-5 MOE , 3- 1 4-3 MOE y 2- 1 3-5 MOE . El primer gapmer enlistado en la Tabla 7 es el gapmer original (ver Tabla 3) a partir del cual se d iseñaron los gapmers restantes vía microwal k y se desig na med iante un asterisco . Los gapmers 5- 1 0-5 son de 20 nucleótidos de longitud , en donde el segmento gap central está constituido por 1 0 2'-deoxinucleótidos y está flanqueado en a mbos lados (en las direcciones 5' y 3' ) por alas que comprenden 5 nucleótidos cada una. Los gapmers 3-1 4-3 son de 20 n ucleótidos de longitud , en donde el segmento gap central está constituido por 1 4 2 -deoxi n ucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las d irecciones 5' y 3') por alas q ue comprenden 3 n ucleótidos cada una . Los gap mers 2-13-5 son de 20 nucleótidos de longitud, en donde el segmento gap central está constituido por 132'-deoxinucleótidos. El gap central está flanqueado en el extremo 5' con un ala que comprende 2 nucleótidos y en el extremo 3' con un ala que comprende 5 nucleótidos. Para cada uno de los motivos (5-10-5, 3-14-3 y 2-13-5), cada nucleotido en el segmento de ala 5' y cada nucleotido en el segmento de ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces de internucleósido a través de cada gapmer son enlaces de fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citidina a través de cada gapmer son 5-metilcitidinas. "Sitio de inicio objetivo" indica el nucleotido más 5' al cual está apuntado el gapmer. "Sitio de alto de objetivo" indica el nucleotido más 3' al cual está apuntado el gapmer. Cada gapmer enlistado en la Tabla 7 está dirigido a SEQ ID NO: 1 (No. de Acceso GENBANK NM_000128.3).
Como se muestra en la Tabla 7, todos los gapemrs 5-10-5 MOE, gapmers 3-14-3 MOE y gapmers 2-13-5 MOE dirigidos a la región objetivo que comienzan en el sitio de inicio objetivo 1062 y terminan en el sitio de alto de objetivo 1091 (es decir, nucleobases 1062-1091) de SEQ ID NO: 1 exhiben por lo menos 20% de inhibición de mARN del Factor 11. Muchos de los gapmers exhiben por lo menos 50% de inhibición, incluyendo: 412215, 413476, 413476, 416839, 416840, 416841, 416842, 416843, 416844, 416845, 416846, 416847, 416909, 416910, 416911, 416912, 416913, 416914, 416915, 416916, 416917, 416918, 416986, 416987, 416988, 416989, 416990, 416991, 416992, 416993, 416994, 416995. Los siguientes ISIS números exhibieron por lo menos 80% de inhibición: 412215, 413476, 413476, 416839, 416840, 416841, 416842, 416843, 416844, 416845, 416910, 416911, 416912, 416913, 416914, 416916, 416917, 416986, 416987, 416989, 416991, 416992, 416993 y 416994. Los siguientes ISIS números exhibieron por lo menos 90% de inhibición: 413476, 413476, 416842, 416844, 416910, 416911, 416912, 416913, 416916, 416917 y 416993.
Tabla 7 Inhibición de niveles de mARN del Factor 11 humano mediante oligonucleótidos antisentido quiméricos dirigidos a nucleobases 1062 a 1091 de SEQ ID NO: 1 (No. de Acceso GENBANK NMJD00128.3) ISIS No. Sitio Sitio Secuencia (5' a 3') % Motivo SEQ Inicio Alto InhibiID Objetivo Objetivo ción NO •413476 1067 1086 TTGAGATTCTTTGGGCCATT 93 5- 0-5 109 412215 1062 1081 ATTCTTTGGGCCATTCCTGG 82 5-10-5 43 416909 1062 1081 ATTCTTTGGGCCATTCCTGG 78 3-14-3 43 416986 1062 1081 ATTCTTTGGGCCATTCCTGG 88 2-13-5 43 416839 1063 1082 GATTCTTTGGGCCATTCCTG 89 5-10-5 204 416910 1063 1082 GATTCTTTGGGCCATTCCTG 90 3-14-3 204 416987 1063 1082 GATTCTTTGGGCCATTCCTG 80 2-13-5 204 416840 1064 1083 AGATTCTTTGGGCCATTCCT 85 5-10-5 205 416911 1064 1083 AGATTCTTTGGGCCATTCCT 90 3-14-3 205 416988 1064 1083 AGATTCTTTGGGCCATTCCT 76 2-13-5 205 416841 1065 1084 GAGATTCTTTGGGCCATTCC 87 5-10-5 206 416912 1065 1084 GAGATTCTTTGGGCCATTCC 92 3-14-3 206 416989 1065 1084 GAGATTCTTTGGGCCATTCC 88 2-13-5 206 416842 1066 1085 TGAGATTCTTTGGGCCATTC 94 5-10-5 207 416913 1066 1085 TGAGATTCTTTGGGCCATTC 93 3-14-3 207 416990 1066 1085 TGAGATTCTTTGGGCCATTC 76 2-13-5 207 413476 1067 1086 TTGAGATTCTTTGGGCCATT 93 5-10-5 109 416914 1067 1086 TTGAGATTCTTTGGGCCATT 87 3-14-3 109 416991 1067 1086 TTGAGATTCTTTGGGCCATT 87 2-13-5 109 416843 1068 1087 TTTGAGATTCTTTGGGCCAT 89 5-10-5 208 416915 1068 1087 TTTGAGATTCTTTGGGCCAT 79 3-14-3 208 416992 1068 1087 TTTGAGATTCTTTGGGCCAT 84 2-13-5 208 416844 1069 1088 CTTTGAGATTCTTTGGGCCA 90 5-10-5 209 416916 1069 1088 CTTTGAGATTCTTTGGGCCA 91 3-14-3 209 416993 1069 1088 CTTTGAGATTCTTTGGGCCA 91 2-13-5 209 416845 1070 1089 TCTTTGAGATTCTTTGGGCC 86 5-10-5 210 416917 1070 1089 TCTTTGAGATTCTTTGGGCC 92 3-14-3 210 416994 1070 1089 TCTTTGAGATTCTTTGGGCC 83 2-13-5 210 416846 1071 1090 TTCTTTGAGATTCTTTGGGC 72 5-10-5 211 416918 1071 1090 TTCTTTGAGATTCTTTGGGC 63 3-14-3 211 416995 1071 1090 TTCTTTGAGATTCTTTGGGC 64 2-13-5 21 1 416847 1072 1091 TTTCTTTGAGATTCTTTGGG 50 5-10-5 212 416919 1072 1091 TTTCTTTGAGATTCTTTGGG 27 3-14-3 212 416996 1072 1091 TTTCTTTGAGATTCTTTGGG 22 2-13-5 212 Los oligonucleótidos antisentido quiméricos en la Tabla 8 fueron diseñados como gapmers 5-10-5 MOE, 3-14-3 MOE y 2-1 3-5 OE . Los primeros gapmers enlistados en la Tabla 8 son los gapmers originales (ver Tabla 3) a partir de los cuales se diseñaron los gapmers restantes vía microwalk y se designan mediante un asterisco. Los gapmers 5-1 0-5 son de 20 nucleótidos de longitud, en donde el segmento gap central está constituido por 1 0 2'-deoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5' y 3') por alas que comprenden 5 nucieótidos cada una. Los gapmers 3-14-3 son de 20 nucieótidos de longitud , en donde el segmento gap central está constituido por 14 2'-deoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5' y 3' ) por alas que comprenden 3 nucieótidos cada una . Los gapmers 2-1 3-5 son de 20 nucieótidos de longitud , en donde el segmento gap central está constituido por 1 3 2'-deoxinucleótidos. El gap central está flanqueado en el extremo 5' con un ala que comprende 2 nucieótidos y en el extremo 3' con un ala que comprende 5 nucieótidos. Para cada uno de los motivos (5-1 0-5, 3-1 4-3 y 2-13-5), cada nucleótido en el segmento de ala 5' y cada nucleótido en el segmento de ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces de internucleósido a través de cada gapmer son enlaces de fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citidina a través de cada gapmer son 5-metilcitidinas. "Sitio de inicio objetivo" indica el nucleótido más 5' al cual está apuntado el gapmer. "Sitio de alto de objetivo" indica el nucleótido más 3' al cual está apuntado el gapmer. Cada gapmer enlistado en la Tabla 8 está dirigido a SEQ ID NO: 1 (No. de Acceso GENBANK NM_0001 28.3).
Como se muestra en la Tabla 8, todos los gapemrs 5-10-5 MOE , gapmers 3-14-3 MOE y gapmers 2-1 3-5 MOE dirigidos a la región objetivo que comienzan en el sitio de inicio objetivo 1 275 y terminan en el sitio de alto de objetivo 1 318 (es decir, nucleobases 1 275-1 31 8) de SEQ I D NO: 1 exhiben por lo menos 70% de inhibición de mARN del Factor 1 1 . Muchos de los gapmers exhiben por lo menos 80% de inhibición , incluyendo: 412223, 41 2224, 412225, 41 3482, 41 6848, 416849, 41 6850, 41 6851 , 416852, 41 6853, 416854, 41 6855, 41 6856, 416857, 416858, 416859, 416860, 416861, 416862, 416863, 416864, 416865, 416866, 416867, 416920, 416921, 416922, 416923, 416924, 416925, 416926, 416927, 416928, 416929, 416930, 416931, 416932, 416933, 416934, 416935, 416936, 416937, 416938, 416939, 416940, 416941, 416942, 416943, 416944, 416997, 416998, 416999, 417000, 417001, 417002, 417003, 417004, 417006, 417007, 417008, 417009, 417010, 417011, 417013, 417014, 417015, 417016, 417017, 417018, 417019 y 417020. Los siguientes ISIS números exhibieron por lo menos 90% de inhibición: 412224, 416850, 416853, 416856, 416857, 416858, 416861, 416862, 416864, 416922, 416923, 416924, 416925, 416926, 416928, 416931, 416932, 416933, 416934, 416935, 416937, 416938, 416940, 416941, 416943, 416999, 417002, 416854 y 416859.
Tabla 8 Inhibición de niveles de mARN del Factor 11 humano mediante oligonucleótidos antisentido quiméricos dirigidos a nucleobases 1275 a 1318 de SEQ ID NO: 1 (No. de Acceso GENBANK NM_000128.3) ISIS No. Sitio Sitio Secuencia (5' a 3') % Motivo SEQ Inicio Alto InhibiID Objetivo Objetivo ción NO 12223 1275 1294 ACAGTTTCTGGCAGGCCTCG 85 5-10-5 51 *412224 1285 1304 GCATTGGTGCACAGTTTCTG 93 5-10-5 52 *413482 1290 1309 GGACGGCATTGGTGCACAGT 89 5-10-5 115 *412225 1295 1314 GCAGCGGACGGCATTGGTGC 86 5-10-5 53 416920 1275 1294 ACAGTTTCTGGCAGGCCTCG 88 3-14-3 51 416997 1275 1294 ACAGTTTCTGGCAGGCCTCG 84 2-13-5 51 416848 1276 1295 CACAGTTTCTGGCAGGCCTC 86 5-10-5 213 416921 1276 1295 CACAGTTTCTGGCAGGCCTC 88 3-14-3 213 416998 1276 1295 CACAGTTTCTGGCAGGCCTC 88 2-13-5 213 416849 1277 1296 GCACAGTTTCTGGCAGGCCT 88 5-10-5 214 416922 1277 1294 GCACAGTTTCTGGCAGGCCT 94 3-14-3 214 416999 1277 1296 GCACAGTTTCTGGCAGGCCT 92 2-13-5 214 416850 1278 1297 TGCACAGTTTCTGGCAGGCC 93 5-10-5 215 416923 1278 1297 TGCACAGTTTCTGGCAGGCC 96 3-14-3 215 417000 1278 1297 TGCACAGTTTCTGGCAGGCC 89 2-13-5 215 416851 1279 1298 GTGCACAGTTTCTGGCAGGC 88 5-10-5 216 416924 1279 1298 GTGCACAGTTTCTGGCAGGC 96 3-14-3 216 417001 1279 1298 GTGCACAGTTTCTGGCAGGC 83 2-13-5 216 416925 1280 1299 GGTGCACAGTTTCTGGCAGG 98 3-14-3 1 14 417002 1280 1299 GGTGCACAGTTTCTGGCAGG 92 2-13-5 114 416852 1281 1300 TGGTGCACAGTTTCTGGCAG 84 5-10-5 217 416926 1281 1300 TGGTG C AC AGTTTCTGGC AG 93 3-14-3 217 417003 1281 1300 TGGTGCACAGTTTCTGGCAG 89 2-13-5 217 416853 1282 1301 TTGGTGCACAGTTTCTGGCA 91 5-10-5 218 416927 1282 1301 TTGGTGCACAGTTTCTGGCA 87 3-14-3 218 417004 1282 1301 TTGGTGCACAGTTTCTGGCA 86 2-13-5 218 416854 1283 1302 ATTGGTGCACAGTTTCTGGC 90 5-10-5 219 416928 1283 1302 ATTGGTGCACAGTTTCTGGC 91 3-14-3 219 417005 1283 1302 ATTGGTGCACAGTTTCTGGC 79 2-13-5 219 416855 1284 1303 CATTGGTGCACAGTTTCTGG 87 5-10-5 220 416929 1284 1303 CATTGGTGCACAGTTTCTGG 83 3-14-3 220 417006 1284 303 CATTGGTGCACAGTTTCTGG 81 2-13-5 220 416930 1285 1304 GCATTGGTGCACAGTTTCTG 87 3-14-3 52 417007 1285 1304 GCATTGGTGCACAGTTTCTG 82 2-13-5 52 416856 1286 1305 GGCATTGGTGCACAGTTTCT 95 5-10-5 221 416931 1286 1305 GGCATTGGTGCACAGTTTCT 96 3-14-3 221 417008 1286 1305 GGCATTGGTGCACAGTTTCT 82 2-13-5 221 416857 1287 1306 CGGCATTGGTGCACAGTTTC 92 5-10-5 222 416932 1287 306 CGGCATTGGTGCACAGTTTC 92 3-14-3 222 417009 1287 1306 CGGCATTGGTGCACAGTTTC 85 2-13-5 222 416858 1288 1307 ACGGCATTGGTGCACAGTTT 93 5-10-5 223 416933 1288 1307 ACGGCATTGGTGCACAGTTT 92 3-14-3 223 417010 288 1307 ACGGCATTGGTGCACAGTTT 81 2- 3-5 223 416859 1289 1308 GACGGCATTGGTGCACAGTT 90 5-10-5 224 416934 1289 1308 GACGGCATTGGTGCACAGTT 90 3-14-3 224 417011 1289 1308 GACGGCATTGGTGCACAGTT 86 2-13-5 224 416935 1290 1309 GGACGGCATTGGTGCACAGT 92 3-14-3 115 417012 1290 1309 GGACGGCATTGGTGCACAGT 72 2-13-5 115 416860 1291 1310 CGGACGGCATTGGTGCACAG 88 5-10-5 225 416936 1291 1310 CGGACGGCATTGGTGCACAG 89 3-14-3 225 417013 1291 1310 CGGACGGCATTGGTGCACAG 86 2-13-5 225 416861 1292 1311 GCGGACGGCATTGGTGCACA 92 5-10-5 226 416937 1292 1311 GCGGACGGCATTGGTGCACA 93 3-14-3 226 417014 1292 1311 GCGGACGGCATTGGTGCACA 87 2-13-5 226 416862 1293 1312 AGCGGACGGCATTGGTGCAC 90 5-10-5 227 416938 1293 1312 AGCGGACGGCATTGGTGCAC 90 3-14-3 227 417015 1293 1312 AGCGGACGGCATTGGTGCAC 87 2-13-5 227 416863 1294 1313 CAGCGGACGGCATTGGTGCA 83 5-10-5 228 416939 1294 1313 CAGCGGACGGCATTGGTGCA 88 3-14-3 228 417016 1294 1313 CAGCGGACGGCATTGGTGCA 85 2-13-5 228 416940 1295 1314 GCAGCGGACGGCATTGGTGC 92 3-14-3 53 417017 1295 1314 GCAGCGGACGGCATTGGTGC 82 2-13-5 53 416864 1296 1315 GGCAGCGGACGGCATTGGTG 93 5-10-5 229 416941 1296 1315 GGCAGCGGACGGCATTGGTG 95 3-14-3 229 417018 1296 1315 GGCAGCGGACGGCATTGGTG 82 2-13-5 229 416865 1297 1316 TGGCAGCGGACGGCATTGGT 88 5-10-5 230 416942 1297 1316 TGGCAGCGGACGGCATTGGT 85 3-14-3 230 417019 1297 1316 TGGCAGCGGACGGCATTGGT 84 2-13-5 230 416866 1298 1317 CTGGCAGCGGACGGCATTGG 88 5-10-5 231 416943 1298 1317 CTGGCAGCGGACGGCATTGG 92 3-14-3 231 4 7020 298 1317 CTGGCAGCGGACGGCATTGG 84 2-13-5 231 416867 1299 1318 ACTGGCAGCGGACGGCATTG 83 5-10-5 232 416944 1299 1318 ACTGGCAGCGGACGGCATTG 83 3-14-3 232 417021 1299 1318 ACTGGCAGCGGACGGCATTG 74 2-13-5 232 Ejemplo 4: Inhibición antisentido dependiente de dosis del Factor 11 h umano en cél ulas HepG2 Se ensayaron los gapmers del Ejemplo 3 (ver Tablas 4, 5, 6, 7 y 8), que exhiben inhibición in vitro del Factor 1 1 humano, a varias dosis en células HepG2. Las células se colocaron en placas a una densidad de 1 0,000 células por pozo y se transfectaron usando reactivo de lipofectin con concentraciones de 9.375 nM , 18.75 nM , 37.5 nM y 75 nM de oligonucleótido antisentido, como se especifica en la Tabla 9. Después de un periodo de tratamiento de aproximadamente 1 6 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de mARN del Factor 1 1 mediante PCR cuantitativa en tiempo real . Se usó RTS 2966 de conjunto de sonda de cebo del Factor 1 1 humano para medir niveles de mARN . Se ajustaron los niveles de mARN del Factor 1 1 de acuerdo con el contenido total de ARN , según medición mediante RI BOGREEN. Los resultados se presentan como porciento de inhibición del Factor 1 1 , con relación a células de control no tratadas. Como se ilustra en la Tabla 9, se redujeron los niveles de mARN del Factor 11 en una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótido antisentido.
Tabla 9 Inhibición antisentido dependiente de la dosis del Factor 11 humano en células HepG2 vía transfección de oligonucleótidos con lipofectin 9.375 18.75 37.5 nM 75 nM Motivo ICso (nM) SEQ ID nM nM No. 412203 33 40 62 74 5-10-5 24 31 412206 24 47 69 86 5-10-5 21 34 413467 35 51 62 69 5-10-5 20 100 413474 29 44 57 67 5-10-5 28 107 413476 24 58 62 77 5-10-5 21 109 416825 23 52 73 92 5-10-5 20 190 416826 8 36 58 84 5-10-5 29 191 416827 31 42 62 77 5-10-5 23 192 416838 31 51 64 86 5-10-5 19 203 416842 18 33 62 71 5-10-5 31 207 416850 4 30 67 84 5-10-5 29 215 416856 21 45 58 74 5-10-5 27 221 416858 0 28 54 82 5-10-5 33 223 416864 18 43 62 78 5-10-5 26 229 416878 22 34 60 82 5-10-5 27 100 416892 16 50 70 85 3-14-3 23 190 416895 39 57 66 71 3-14-3 15 192 416896 22 39 57 81 3-14-3 27 193 416908 36 57 67 76 3-14-3 16 203 416922 14 25 49 75 3-14-3 36 214 416923 36 47 60 67 3-14-3 23 215 416924 25 38 56 59 3-14-3 36 216 416925 13 38 59 75 3-14-3 30 114 416926 31 43 63 82 3-14-3 22 217 416931 44 39 57 71 3-14-3 22 221 416941 33 54 63 78 3-14-3 19 229 416945 34 45 62 65 2-13-5 24 31 416969 17 39 61 76 2-13-5 28 190 416972 32 40 60 69 2-13-5 26 192 416973 60 75 85 87 2-13-5 3 193 416984 26 50 62 81 2-13-5 22 202 416985 17 30 47 57 2-13-5 49 203 416989 18 41 62 83 2-13-5 26 206 416993 15 37 50 68 2-13-5 36 209 416999 24 37 55 73 2-13-5 30 214 417000 35 47 58 70 2-13-5 23 215 417002 35 52 67 70 2-13-5 19 114 417003 26 44 60 56 2-13-5 33 217 Los gapmers se transfectaron también vía electroporación y se midió su inhibición dependiente de la dosis de mARN del Factor 1 1 humano. Las células se colocaron en placas a una densidad de 20,000 células por pozo y se transfectaron vía electroporación con concentraciones de 0.7 [mu]M, 2.2 [mu]M, 6.7 [mu]M y 20 [mu]M de oligonucleótido antisentido, como se especifica en la Tabla 1 0. Después de un periodo de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de mARN del Factor 1 1 mediante PCR cuantitativa en tiempo real . Se usó RTS 2966 de conjunto de sonda de cebo del Factor 1 1 humano para medir los niveles de mARN . Se ajustaron los niveles de mARN del Factor 1 1 de acuerdo con el contenido total de ARN, según medición mediante RIBOGREEN. Los resultados se presentan como porciento de inhibición del Factor 1 1 , con relación a células de control no tratadas. Como se ilustra en la Tabla 10 , los niveles de mARN del Factor 1 se redujeron en una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótido antisentido.
Tab la 1 0 Inhibición antisentido dependiente de la dosis de Factor 1 1 humano en células HepG2 vía transfección de oligonucleótidos con electroporación 0.7 µ? 2.2 µ? 6.7 µ? 20 µ? ICso SEQ ID (µ?) No. 412203 11 60 70 91 2.7 31 412206 22 39 81 94 2.7 34 413467 5 31 65 89 4.2 100 413474 0 5 52 81 6.9 107 413476 40 69 88 93 0.9 109 416825 27 74 92 98 1.3 190 416826 2 47 86 82 3.2 191 416827 37 68 87 92 1.1 192 416838 5 30 55 83 5.1 203 416842 0 10 66 92 5.0 207 416850 14 25 81 91 3.4 215 416856 0 29 47 93 5.1 221 416858 5 20 56 86 5.3 223 416864 32 65 78 90 1.4 229 416878 1 26 75 85 4.3 100 416892 14 52 82 92 2.5 190 416895 0 62 70 91 3.0 192 416896 12 35 81 89 3.2 93 416908 7 58 74 89 2.8 203 416922 35 51 77 91 1.7 214 416923 15 30 60 90 4.0 215 416924 22 40 63 70 4.1 216 416925 0 40 76 80 3.9 114 416926 47 71 91 94 0.6 217 416931 7 24 60 82 5.1 221 416941 16 38 79 89 3.0 229 416945 48 70 81 88 0.6 31 416969 25 34 86 92 2.5 190 416972 25 30 48 88 4.3 192 416973 20 48 86 93 2.3 193 416984 43 54 88 90 1.1 202 416985 12 48 45 69 5.8 203 416989 32 65 88 94 1.3 206 416993 22 48 87 92 2.2 209 416999 20 42 77 88 2.8 214 417000 46 73 76 89 0.6 215 417002 32 38 82 91 2.2 114 417003 0 34 75 89 3.9 217 Ejemplo 5: Selección y confirmación de inhibición antisentido dependiente de la dosis de Factor 11 humano en células HepG2 Los gapmers que exhiben inhibición significativa dependiente de la dosis del Factor 1 1 humano en el Ejemplo 4 se seleccionaron y se ensayaron a varias dosis en células HepG2. Las células se colocaron en placas a una densidad de 1 0,000 células por pozo y se transfectaron usando reactivo de lipofectin con concentraciones de 2.34 nM , 4.69 nM , 9.375 n , 1 8.75 nM , 37.5 nM y 75 nM de oligonucleótido antisentido, como se especifica en la Tabla 1 1 . Después de un periodo de tratamiento de aproximadamente 1 6 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de mARN del Factor 1 1 humano mediante PCR cuantitativa en tiempo real . Se usó RTS 2966 de conjunto de sonda de cebo del Factor 1 1 humano para medir los niveles de mARN . Se ajustaron los niveles de mARN del Factor 1 1 de acuerdo con el contenido total de ARN, según medición mediante RI BOGREEN . Los resultados se presentan como porciento de inhibición del Factor 1 1 humano con relación a células de control no tratadas. Como se ilustra en la Tabla 1 1 , los niveles de mARN del Factor 1 1 se redujeron en una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótido antisentido en comparación con el control.
Tabla 1 1 Inhibición antisentido dependiente de la dosis del Factor 1 1 humano en células HepG2 vía transfección de oligonucleótidos con lipofectin 2.34 4.69 9.375 18.75 37.5 75 Motivo IC50 SEQ nM nM nM nM nM nM (nM) ID No. 416825 4 22 39 57 79 89 5-10-5 13 190 416826 15 22 32 54 76 90 5-10-5 15 191 416838 21 37 50 63 74 83 5-10-5 10 203 416850 24 31 49 55 70 77 5-10-5 13 215 416858 11 35 46 61 75 77 5-10-5 11 223 416864 13 34 42 65 68 80 5-10-5 15 229 416892 14 34 49 70 84 93 3-14-3 9 190 416925 24 34 45 56 67 72 3- 4-3 13 114 416999 10 26 42 62 72 80 2-13-5 14 214 417002 17 26 49 61 81 84 2-13-5 12 114 417003 6 29 48 64 73 82 2-13-5 11 217 Los gapmers se transfectaron también vía electroporación y se midió su inhibición dependiente de la dosis de mARN del Factor 1 1 humano. Las células se colocaron en placas a una densidad de 20,000 células por pozo y se transfectaron vía electroporación con concentraciones de 625 nM , 1 250 nM , 2500 nM , 5,000 nM, 10,000 nM y 20,000 nM de oligonucleótido antisentido, como se especifica en la Tabla 1 2. Después de un periodo de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de mARN del Factor 1 1 humano mediante PCR cuantitativa en tiempo real . Se usó RTS 2966 de conjunto de sonda de cebo del Factor 1 1 humano para medir los niveles de mARN . Se ajustaron los niveles de mARN del Factor 1 1 de acuerdo con el contenido total de ARN , según medición mediante RI BOGREEN . Los resultados se presentan como porciento de inhibición del Factor 1 1 humano con relación a células de control no tratadas. Como se ilustra en la Tabla 12, los niveles de mARN del Factor 1 1 se redujeron en una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótido antisentido en comparación con el control .
Tabla 12 Inhibición antisentido dependiente de la dosis de Factor 1 humano en células HepG2 vía transfeccion de oligonucleótidos con electroporación Ejemplo 6: Selección y confirmación de inhibición antisentido dependiente de la dosis efectiva del Factor 11 humano en hepatocitos primarios ciano Se ensayó también el Factor 1 1 a varias dosis en hepatocitos primarios ciano. Las células se colocaron en placas a una densidad de 35,000 células por pozo y se transfectaron vía electroporación con concentraciones de 0.74 nM , 2.2 nM , 6.7 nM , 20 nM , 60 nM y 1 80 nM de oligonucleótido antisentido, como se especifica en la Tabla 1 3. Después de un periodo de tratamiento de aproximadamente 1 6 horas , se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de mARN del Factor 1 1 humano mediante PCR cuantitativa en tiempo real . Se usó RTS 2966 de conjunto de sonda de cebo del Factor 1 1 humano para medir los niveles de mARN . Se ajustaron los niveles de mARN del Factor 1 1 de acuerdo con el contenido total de ARN , según medición mediante RI BOGREEN . Los resultados se presentan como porciento de inhibición del Factor 1 1 humano con relación a células de control no tratadas. Como se ilustra en la Tabla 1 3, los niveles de mARN del Factor 1 1 se redujeron en una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótido antisentido en comparación con el control.
Tabla 13 Inhibición antisentido dependiente de la dosis de Factor 1 1 humano en hepatocitos primarios ciano 0.74 2.2 6.7 20 60 180 IC50 SEQ nM nM nM nM nM nM (µ?) ID No. 416825 5 22 51 61 77 84 1.0 190 416826 13 24 34 67 69 71 1.3 191 416838 0 0 21 34 48 62 6.9 203 416850 2 20 24 65 69 67 1.6 215 416858 2 13 22 44 63 68 3.7 223 416864 0 1 15 23 47 64 7.7 229 416892 20 20 43 62 88 92 1.0 190 416999 3 40 36 62 67 82 1.3 214 417002 32 16 28 38 55 71 4.0 114 417003 12 18 19 39 58 74 4.1 217 Ejemplo 7 : Selección y confirmación de in hibición antisentido dependiente de la dosis efectiva del Factor 11 humano en células HepB3 mediante gapmers Los gapmers que exhiben inhibición in vitro del Factor 1 1 humano en el Ejemplo 4 se ensayaron a varias dosis en células HepB3 humanas. Las células se colocaron en placas a una densidad de 4,000 células por pozo y se transfectaron usando reactivo de lipofectin con concentraciones de 2.3 nM , 4.7 nM , 9.4 nM, 18.75 nM , 37.5 nM y 75 nM de oligonucleótido antisentido, como se especifica en la Tabla 1 4. Después de un periodo de tratamiento de aproximadamente 1 6 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de mARN del Factor 1 1 humano mediante PCR cuantitativa en tiempo real . Se usó RTS 2966 de conjunto de sonda de cebo del Factor 1 1 humano para medir los niveles de mARN . Se ajustaron los niveles de mARN del Factor 1 1 de acuerdo con el contenido total de ARN , según medición mediante RI BOGREEN . Los resultados se presentan como porciento de inhibición del Factor 1 1 con relación a células de control no tratadas. Como se ilustra en la Tabla 14, los niveles de mARN del Factor 1 1 se redujeron en una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótido antisentido en comparación con el control.
Tabla 14 Inhibición antisentido dependiente de la dosis del Factor 11 humano en células HepB3 Los gapmers se transfectaron también vía electroporación y se midió su inhibición dependiente de la dosis de mARN del Factor 11 humano. Las células se colocaron en placas a una densidad de 20,000 células por pozo y se transfectaron vía electroporación con concentraciones de 41.15 nM, 123.457 nM, 370.37 nM, 1,111.11 nM, 3,333.33 nM y 10,000 nM de olígonucleótido antisentido, como se especifica en la Tabla 15. Después de un periodo de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de mARN del Factor 11 humano mediante PCR cuantitativa en tiempo real . Se usó RTS 2966 de conjunto de sonda de cebo del Factor 1 1 humano para medir los niveles de mARN . Se ajustaron los niveles de mARN del Factor 1 1 de acuerdo con el contenido total de ARN , según medición mediante RI BOGREEN . Los resultados se presentan como porciento de inhibición del Factor 1 1 humano con relación a células de control no tratadas. Como se ilustra en la Tabla 1 5, los niveles de mARN del Factor 1 1 se redujeron en una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótido antisentido en comparación con el control .
Tabla 15 Inhibición antisentido dependiente de la dosis del Factor 1 1 humano en células HepB3 Ejemplo 8 : In hibición antisentido del Factor 1 1 de murino en hepatocitos primarios de ratón Oligonucleotidos antisentido quiméricos que apuntan al Factor 1 1 de murino se designaron como gapemrs 5-10-5 MOE que apuntan al Factor 1 1 de murino (No. de Acceso G EN BANK N M_028066.1 , incorporada en la presente como SEQ I D NO: 6). Los gapmers son de 20 nucleótidos de longitud , en donde el segmento gap central está constituido por 1 0 2'-deoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5' y 3') por alas que comprenden 5 nucleótidos cada una. Cada nucleótido en cada segmento de ala tiene una modificación T-MOE. Los enlaces de internucleósido a través de cada gapmer son enlaces de fosforotioato (P=S). Todos los resid uos de citidina a través de cada gapmer son 5-metilcitidinas. Se evaluaron los oligonucleotidos antisentido para su habilidad para reducir el mARN del Factor 1 1 de murino en hepatocitos primarios de ratón.
Los hepatocitos primarios de ratón se trataron con 6.25 nM , 12.5 nM, 25 nM , 50 nM , 1 00 nM y 200 nM de oligonucleotidos durante un periodo de aproximadamente 24 horas. Se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de mARN del Factor 1 1 de murino mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó RTS 2898 de conjunto de sonda de cebo del Factor 1 1 de murino (secuencia adelante ACATGACAGGCGCGATCTCT, incorporada en la presente como SEQ I D NO: 7; secuencia inversa TCTAGGTTCACGTACACATCTTTGC , incorporada en la presente como SEQ ID NO: 8; secuencia de sonda TTCCTTCAAGCAATGCCCTCAGCAATX, incorporada en la presente como SEQ I D NO: 9) para medir los niveles de mARN . Se ajustaron los niveles de mARN del Factor 1 1 de acuerdo con el contenido total de ARN , según medición mediante RI BOGREEN. Varios de los oligonucleótidos antisentido de murino redujeron los niveles de mARN del Factor 1 1 en una manera dependiente de la dosis.
Ejemplo 9: In hibición antisentido reactiva cruzada del Factor 1 1 de murino en hepatocitos primarios de ratón Se ensayaron oligonucleótidos antisentido dirigidos a un ácido nucleico del Factor 1 1 de murino para sus efectos sobre el mARN del Factor 1 1 in vitro. Se trataron hepatocitos primarios de ratón cultivados a una densidad de 10,000 células por pozo con oligonucleótido antisentido 100 nM . Después de un periodo de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de mARN del Factor 1 1 de ratón mediante PCR cuantitativa en tiempo real . Se ajustaron los niveles de mARN del Factor 1 1 de acuerdo con el contenido total de ARN , según medición mediante RIBOGREEN . Los resultados se presentan como porciento de inhibición del Factor 1 1 con relación a células de control no tratadas.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos en la Tabla 1 6 se designaron como gapmers 5-10-5 MOE. Los gapmers son de 20 nucleótidos de longitud , en donde el segmento gap central está constituido por 10 2'-deoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5' y 3') por alas que comprenden 5 nucleótidos cada una. Cada nucleótido en el segmento de ala 5' y cada nucleótido en el segmento de ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces de internucleósido a través de cada gapmer son enlaces de fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citidina a través de cada gapmer son 5-metilcitidinas. "Sitio de inicio objetivo de ratón" indica el nucleótido más 5' al cual está apuntado el gapmer. "Sitio de alto de objetivo de ratón" indica el nucleótido más 3' al cual está apuntado el gapmer. Todos los oiigonucleótidos de ratón enlistados muestran reactividad cruzada entre el mARN del Factor 1 1 de ratón (No. de Acceso GENBANK NM_028066.1 ), incorporada en la presente como SEQ I D NO: 6 y mARN del Factor 1 1 humano (No. de Acceso GEN BANK NM_0001 28.3), incorporada a la presente como SEQ I D NO: 1 . "Sitio de I nicio de Objetivo Humano" indica el nucleótido más 5' en el mARN humano ( No. de Acceso GENBANK NM_000128.3) al cual está apuntado el oligonucleótido antisentido. "Sitio de Alto de Objetivo Humano" indica el nucleótido más 3' en el mARN humano (No. de Acceso GENBANK NM_0001 28.3) al cual está apuntado el oligonucleótido antisentido. "Número de desigualdades" indica las desigualdades entre el oligonucleótido de ratón y la secuencia de mARN humana.
Tabla 16 I nhibición de niveles de mARN del Factor 1 1 de ratón mediante oiigonucleótidos antisentido quiméricos que tienen alas 5-10-5 MOE y deoxi gap apuntado a SEQ I D NO: 1 y SEQ ID NO: 6 Sitio de Sitio de Sitio de Sitio de Inicio Alto % SEQ Inicio Alto No. de ISIS No. Objetivo Objetivo Secuencia (5' a 3') InhibiID Objetivo Objetivo Desigualde de ción No. de de dades Ratón Ratón Humano Humano 404050 379 398 TGCTTGAAGGAATATCCAGA 82 233 619 638 2 404054 448 467 TAGTTCATGCCCTTCATGTC 45 234 688 707 1 404055 453 472 TGTTATAGTTCATGCCCTTC 27 235 693 712 1 404066 686 705 AATGTCCCTGATACAAGCCA 37 236 926 945 1 404067 691 710 GGGAAAATGTCCCTGATACA 39 237 931 950 1 404083 1299 1318 TGTGCAGAGTCACCTGCCAT 47 238 1533 1552 2 404087 1466 1485 TTCTTGAACCCTGAAGAAAG 29 239 1709 1728 2 404089 1477 1496 TGAATTATCATTTCTTGAAC 6 240 1720 1739 2 404090 1483 1502 TGATCATGAATTATCATTTC 42 241 1726 1745 2 Ejemplo 10 : Inhibición antisentido in vivo del Factor 1 1 de murino Se evaluaron in vivo varios oligonucleótidos antisentido apuntados al mARN del Factor 1 1 de murino (No. de Acceso GENBANK N _028066.1 , incorporada en la presente como SEQ I D NO: 6) que muestran inhibición dependiente de la dosis estadísticamente significativa. Ratones BALB/c se trataron con ISIS 404057 (TCCTGGCATTCTCGAGCATT, sitio 487 de inicio de objetivo, incorporada en la presente como SEQ ID NO: 10) e IS IS 404071 (TGGTAATCC ACTTTC AGAGG, sitio 869de inicio de objetivo, incorporada en la presente como SEQ I D NO: 1 1 ).
Tratamiento Ratones BALB/c se inyectaron con 5 mg/kg , 1 0 mg/kg, 25 mg/kg o 50 mg/kg de ISIS 404057 o ISIS 404071 dos veces a la semana durante 3 semanas. Un grupo de ratones de control se inyectó con salina amortiguada con fosfato (PBS) dos veces a la semana durante 3 semanas. Los ratones se sacrificaron 5 días después de recibir la última dosis. Se cosechó h ígado entero para análisis de ARN y se recogió plasma para análisis de coagulación (PT y aPTT) y análisis de proteína.
Análisis de ARN Se extrajo ARN del tejido de hígado para análisis del Factor 1 1 con PCR en tiempo real . Como se muestra en la Tabla 1 7, los oligonucleótidos antisentido lograron una reducción del Factor 1 1 de murino dependiente de la dosis sobre la PBS de control . Los resultados se presentan como porciento de inhibición del Factor 1 1 , con relación al control .
Tabla 17 Inhibición antisentido de mARN del Factor 1 1 de murino dependiente de la dosis en ratones BALB/c Ensayo de PT y aPTT Se midieron el Tiempo de Protrombina (PT) y Tiempo de Tromboplastina Parcial Activada (aPTT) usando plasma pobre en plaquetas (PPP) de ratones tratados con ISIS 404057 e I S IS 404071 . Los valores de PT y aPTT proporcionados en la Tabla 1 8 se reportan como valores de Proporción Normalizada Internacional (I NR). Los valores de INR para PT y aPTT se determinaron dividiendo el valor de PT o de aPTT para cada grupo experimental (es decir, tratamiento con 5 mg/kg, 1 0 mg/kg, 25 mg/kg y 50 mg/kg de ISIS 404057 o ISIS 404071 ) entre el PT o aPTT para el grupo tratado con PBS . Está proporción se elevó entonces a la potencia del I ndice de Sensibilidad Internacional (ISI ) del factor de tejido usado. Como se muestra en la Tabla 1 8, el PT no fue significativamente prolongado en ratones tratados con ISIS 404057 o ISIS 404071 . Sin embargo, el aPTT fue prolongado en una manera dependiente de la dosis en ratones tratados con ISIS 404057 e ISIS 404071 . Estos datos sugieren que la reducción antisentido del Factor 1 1 afecta la trayectoria de activación de contacto, pero no la trayectoria extrínseca de la coagulación de la sangre.
Tabla 1 8 Efecto de IS IS 404071 y 404057 en PT y aPTT en ratones BALB/c Análisis de Proteína Dosis en mg/kg PT INR aPTT INR ISIS 404057 5 1.00 1.07 10 0.94 1.19 25 1.02 1.27 50 1.00 1.37 ISIS 404071 5 1.06 1.09 10 1.08 1.13 25 1.06 1.35 50 1.02 2.08 Se midió la proenzima del Factor 1 1 del plasma de ratones tratados con IS IS 404071 usando un ensayo de F1 1 con base en el tiempo de coagulación. Los tiempos de coagulación se determinaron en duplicado con un instrumento de coagulación semiautomático (Diagnostica Stago, NJ ). Se incubaron treinta µ? de plasma citrada de muestra diluida en amortiguador de HEPES-NaCI 1 /20 con BSA con 30 µ? de reactivo de aPTT (reactivo de Factor 3 de plaquetas más activador en partículas) y 30 pl de plasma citrada deficiente de Factor 1 1 (congénito humano, George King Bio-Medical Inc. ) a 37°C para iniciar la coagulación. Los resultados se interpolaron en una curva estándar de plasma citrada de murino de control diluida serial mente.
Como se muestra en la Tabla 19, el tratamiento con IS IS 404071 resultó en una reducción significativa de proteína del Factor 1 1 dependiente de la dosis. Los resultados se presentan como porciento de inhibición del Factor 1 1 , con relación a PBS de control.
Tabla 19 Inhibición dependiente de la dosis de la proteína del Factor 1 1 de murino por ISIS 404071 en ratones BALB/c Ejemplo 1 1 : Efecto in vivo de inhibición antisentido del Factor 1 1 de murino en el modelo de trombosis venosa (VT) inducida con FeCI3 en com paración con warfarina Tratamiento Se evaluaron ISIS 404071 y warfarina (COUMADIN ) en el modelo de ratón con VT inducida por FeCI3. Se trataron seis grupos de ratones BALB/c con 1 .25 mg/kg , 2.5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg , 20 mg/kg o 40 mg/kg de I SIS 404071 , administrados subcutáneamente dos veces a la semana durante 3 semanas. Dos d ías después de recibir la última dosis de ISIS 404071 , los ratones se anestesiaron con 1 50 mg/kg de cetamina con 10 mg/kg de xilazina administrados mediante inyección intraperitoneal . Se trataron 6 grupos de ratones BALB/c adicionales con 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg y 5 mg/kg de warfarina, administrados intraperitonealmente durante seis d ías. Cuatro horas después de la última dosis de warfarina, los ratones fueron anestesiados con 1 50 mg/kg de cetamina mezclada con 1 0 mg/kg de xilazina administrados mediante inyección intraperitoneal . Dos grupos de ratones BALB/c de control se trataron con PBS , administrada de manera subcutánea dos veces a la semana durante 3 semanas. Dos días después de la última dosis de PBS, los ratones en ambos grupos fueron anestesiados con 150 mg/kg de cetamina mezclada con 10 mg/kg de xilazina administradas mediante inyección intraperitoneal. La formación de trombos se indujo con FeCI3 en todos los grupos de ratones excepto el primer grupo de control.
En ratones que experimentaron el tratamiento con FeCI3, la formación de trombos se indujo aplicando una pieza de papel filtro (2 x 4 mm) presaturado con solución de FeCI3 al 10% directamente en la vena cava. Después de 3 minutos de exposición, se removió el papel filtro. Treinta minutos después de la aplicación del papel filtro, se disecó una longitud fija de la vena que contiene el trombo para análisis de plaquetas. El hígado se recolectó para análisis de ARN.
Análisis de ARN Se extrajo ARN del tejido del hígado para análisis del Factor 11 con PCR en tiempo real. Los resultados se presentan como porciento de inhibición del Factor 11 con relación a la PBS de control. Como se muestra en la Tabla 20, el tratamiento con ISIS 404071 resultó en una reducción significativa dependiente de la dosis de mARN del Factor 11 en comparación con la PBS de control. De manera inversa, el tratamiento con warfarina no resultó en una reducción significativa del Factor 1 en comparación con la PBS de control.
Tabla 20 Reducción de mARN del Factor 11 dependiente de la dosis en el modelo de trombosis venosa inducida con FeCI3 Tratamiento Dosis en mg/kg % inhibición Warfarina 0.5 0 1 0 2 1 3 5 4 8 5 11 ISIS 404071 1.25 0 2.5 8 Cuantificación de composición de plaquetas Se usó la cuantificación con PCR en tiempo real del Factor-4 de plaquetas (PF-4) para cuantificar las plaquetas en la vena cava como una medida de formación de trombos. Los resultados se presentan como un porcentaje de PF-4 en ratones tratados con ISIS 404071 o warfarina, en comparación con los dos grupos de control tratados con PBS. Como se muestra en la Tabla 21 , el tratamiento con ISIS 404071 resultó en una reducción de PF-4 dependiente de la dosis en comparación con la PBS de control para dosificaciones de 5 mg/kg o más. El tratamiento con warfarina resultó en una reducción de PF-4 en comparación con la PBS de control para dosificaciones de 2 mg/kg y más. Por lo tanto, la reducción del Factor 1 1 mediante los compuestos proporcionados en la presente es útil para inhibir la formación de trombos y coágulos.
Tabla 21 Análisis de formación de trombos mediante cuantificación con PCR en tiempo real de PF-4 en el modelo de trombosis venosa inducida con FeCI3 Ejemplo 12: Efecto in vivo de inhibición antisentido del Factor 1 1 de murino en comparación con warfarina en un ensayo de sangrado en cola Tratamiento El sangrado por cola se midió para observar si el tratamiento con ISIS 404071 o warfarina causa hemorragia interna en ratones. Se evaluaron ISI S 404071 y warfarina (COUMADIN) en ensayos de sangrado por cola. Se trataron seis grupos de ratones BALB/c con 1 .25 mg/kg , 2.5 mg/kg, 5 mg/kg , 1 0 mg/kg , 20 mg/kg o 40 mg/kg de ISIS 404071 , administrados de manera subcutánea dos veces por semana durante 3 semanas. Se trataron 6 grupos adicionales de ratones BALB/c con 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg , 3 mg/kg, 4 mg/kg y 5 mg/kg de warfarina, administrados de manera intraperitoneal diariamente durante 6 d ías. Un grupo separado de control de ratones BALB/c se trató con PBS, administrada de manera subcutánea dos veces a la semana durante 3 semanas.
Ensayo de sangrado por cola Dos días después del tratamiento final con ISIS 404071 , warfarina o PBS, los ratones se colocaron en una cámara de sangrado por la cola. Los ratones se anestesiaron en la cámara con isoflurano y se cortó con pinzas estériles una pequeña pieza de la cola (aproximadamente 4 mm desde la punta). La cola cortada se colocó inmediatamente en un tubo Falcon de 15 mL con aproximadamente 10 mL de solución búfer de NaCI al 0.9% calentada a 37°C. La sangre se recogió en el curso de 40 minutos. Los tubos llenos con salina se pesaron tanto antes como después del sangrado. Los resultados se proporcionan en la Tabla 22.
El tratamiento con ISIS 404071 no afectó el sangrado en comparación con ratones tratados con PBS . Sin embargo, la warfarina incrementó el sangrado en ratones en comparación con la PBS de control. Las dosis incrementadas de warfarina correlacionaron positivamente con la pérdida aumentada de sangre. Estos datos sugieren que el potencial hemorrágico de los compuestos proporcionados en la presente es bajo, especialmente en comparación con la warfarina. Estos datos tomados con los resultados proporcionados en el Ejemplo 1 1 sugieren que la inhibición del Factor 1 1 con los compuestos descritos en la presente son útiles para proporcionar actividad antitrombótica sin riesgo asociado de sangrado .
Tabla 22 Ensayo de sangrado por la cola en el modelo de trombosis venosa inducida con FeCI3 Ejemplo 13: Efecto in vivo de inhibición antisentido en el Factor 1 1 de murino en comparación con warfarina sobre el PT y el aPTT Tratamiento Se midieron el PT y el aPTT usando PPP de ratones tratados con ISIS 404071 o warfarina. Seis grupos de ratones BALB/c se trataron con 1.25 mg/kg, 2.5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg o 40 mg/kg de ISIS 404071, administrados de manera subcutánea dos veces por semana durante 3 semanas. 6 grupos adicionales de ratones BALB/c se trataron con 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg y 5 mg/kg de warfarina, administrados de manera intraperitoneal diariamente durante 6 días. En un grupo de control, se trataron ratones BALB/c con PBS, administrada de manera subcutánea dos veces por semana durante 3 semanas. Dos días después de la administración de la dosis final se recolectó PPP y se realizaron ensayos de PT y aPTT.
Ensayo de PT y aPTT Los valores de PT y aPTT proporcionados en la Tabla 16 se reportan como valores de Proporción Normalizada Internacional (INR). Los valores de INR para PT y aPTT fueron determinados dividiendo el valor de PT o aPTT para cada grupo experimental (es decir, con tratamiento de 5 mg/kg, 10 mg/kg, 25 mg/kg y 50 mg/kg de ISIS 404071) entre el PT o aPTT del grupo tratado con PBS. Esta proporción se elevó después a la potencia del Indice de Sensibilidad Internacional (ISI) del factor del tejido usado. Como se muestra en la Tabla 23, el PT en ratones tratados con warfarina se prolonga significativamente en cada dosis. El aPTT en ratones tratados con warfarina fue prolongado, particularmente en dosificaciones de 1 mg/kg y mayores. ISIS 404071 no afectó significativamente el PT, pero prologó el aPTT; sin embargo, no tan significativamente como en ratones tratados con warfarina. Estos datos sugieren que el ISIS 404071 afecta la trayectoria de activación de contacto, pero no la trayectoria extrínseca de coagulación de sangre mientras que la warfarina afecta tanto la trayectoria de activación de contacto como la trayectoria extrínseca de coagulación de la sangre.
Tabla 23 Efecto de ISIS 404071 y warfarina en PT y aPTT de ratones BALB/c Ejemplo 14: Efecto in vivo de inhibición antisentido del Factor 11 de murino en el modelo de trombosis venosa (VT) inducida con FeCI3 en comparación con Apixaban Tratamiento Se evaluaron ISIS 404071 y Apixaban en el modelo de VT en ratón inducida con FeCI3. Se trataron seis grupos de ratones BALB/c con 1 .25 mg/kg , 2.5 mg/kg , 5 mg/kg, 1 0 mg/kg , 20 mg/kg o 40 mg/kg de ISIS 404071 , administrados de manera subcutánea dos veces por semana durante 3 semanas. Dos d ías después de recibir la última dosis de ISIS 404071 , los ratones se anestesiaron con 1 50 mg/kg de cetamina mezclada con 1 0 mg/kg de xilazina administrados mediante inyección intraperitoneal . Se trataron 6 grupos adicionales de ratones BALB/c con 0.5 mg/kg , 1 mg/kg, 2 mg/kg , 3 mg/kg, 4 mg/kg y 5 mg/kg de Apixaban, administrados de manera subcutánea una vez. Veinte minutos después de recibir Apixaban, los ratones fueron anestesiados con 1 50 mg/kg de cetamina mezclada con 10 mg/kg de xilazina administrados mediante inyección intraperitoneal . Dos grupos de control de ratones BALB/c se trataron con PBS, administrada de manera subcutánea dos veces por semana durante 3 semanas. Dos días después de la última dosis de PBS, los ratones en ambos grupos se anestesiaron con 150 mg/kg de cetamina mezclada con 1 0 mg/kg de xilazina administrados mediante inyección intraperitoneal . La formación de trombos se indujo con FeCI3 en todos los ratones excepto el primer grupo de control.
En ratones que experimentaron tratamiento con FeCI3, la formación de trombos se indujo aplicando una pieza de papel filtro (2 x 4 mm) presaturado con solución de FeCI3 al 1 0% directamente en la vena cava. Después de 3 minutos de exposición , se removió el papel filtro. Treinta minutos después de la aplicación del papel filtro, se disecó una longitud fija de la vena que contiene el trombo para análisis de plaquetas. Se recolectó hígado para análisis de ARN.
Análisis de ARN Se extrajo ARN del tejido del hígado para análisis del Factor 1 1 con PCR en tiempo real. Los resultados se presentan como porciento de inhibición del Factor 1 1 , con relación al control de PBS. Como se muestra en la Tabla 24, el tratamiento con ISIS 404071 resultó en la reducción significativa dependiente de la dosis del mARN del Factor 1 1 en comparación con el control de PBS. De manera inversa , el tratamiento con Apixaban no resultó en la reducción significativa del Factor 1 1 en comparación con el control de PBS.
Tabla 24 Reducción dependiente de la dosis de mARN del Factor 1 1 en el modelo de trombosis venosa inducida con FeCI3 Dosis en mg/kg % inhibition Apixaban 0.5 5 2 8 5 12 10 2 20 0 ISIS 404071 1.25 15 2.5 44 5 63 10 76 25 91 50 95 Cuantificación de Composición de Plaquetas Se usó la cuantificación del factor-4 de plaquetas (PF-4) con PCR en tiempo real para cuantificar las plaquetas en la vena cava como una medida de la formación de trombos. Como se muestra en la Tabla 25, el tratamiento con ISIS 404071 resultó en la reducción de PF-4 en comparación con el control de PBS . El tratamiento con Apixaban resultó también en la reducción de PF-4 en comparación con el control de PBS. Los resultados se presentan como un porcentaje de PF-4 en ratones tratados con ISIS 404071 o Apixaban, en comparación con los dos grupos de control tratados con PBS.
Tabla 25 Análisis de formación de trombos mediante cuantificación de PF-4 con PCR en tiempo real en el modelo de trombosis venosa inducida con FeCI3 Tratamiento Dosis en mg/kg PF-4 PBS-FeCI3 0 PBS+FeCI3 100 Apixaban 0.5 67 2 46 5 15 10 5 20 26 ISIS 404071 1.25 42 2.5 87 2.5 87 5 60 10 28 25 14 50 4 Ejemplo 15: Efecto in vivo de la inhibición antisentido del Factor 1 1 de murino en comparación con Apixaban en el ensayo de sangrado por la cola Tratamiento Se midió el sangrado por la cola para observar si el tratamiento con IS IS 404071 o warfarina causa hemorragia interna en ratones. Se evaluaron ISIS 404071 y Apixaban en el modelo de sangrado por la cola . Seis grupos de ratones BALB/c se trataron con 1 .25 mg/kg , 2.5 mg/kg , 5 mg/kg, 1 0 mg/kg, 20 mg/kg o 40 mg/kg de ISIS 404071 , administrados de manera subcutánea dos veces por semana durante 3 semanas. Se trataron 6 grupos adicionales de ratones BALB/c con 0.5 mg/kg , 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg , 4 mg/kg y 5 mg/kg de Apixaban, administrados en una sola dosis subcutánea. Un grupo de control separado de ratones BALB/c se trató con PBS, administrada de manera subcutánea dos veces por semana durante 3 semanas.
Ensayo de Sangrado por la Cola Dos días después del tratamiento final con ISI S 404071 , Apixaban o PBS, los ratones se colocaron en una cámara de sangrado por la cola . Los ratones fueron anestesiados en la cámara y se cortó una pequeña pieza de cola (aproximadamente 4 mm desde la punta) con tijeras estériles. La cola cortada se colocó inmediatamente en un tubo Falcon de 1 5 mL con aproximadamente 10 mL de solución de búfer de NaCI al 0.9% calentada a 37°C. La sangre se recogió en el curso de 40 minutos. Los tubos llenos con salina se pesaron antes y después del sangrado.
Como se muestra en la Tabla 26, el tratamiento con ISIS 404071 no afectó el sangrado en comparación con los ratones tratados con PBS. Sin embargo, el Apixaban aumentó el sangrado en ratones en comparación con el control de PBS. Las dosis incrementadas de Apixaban correlacionaron positivamente con la pérdida de sangre aumentada. Estos datos sugieren que el potencial hemorrágico de los compuestos proporcionados en la presente es bajo, especialmente en comparación con Apixaban. Estos datos tomados con los resultados proporcionados en el Ejemplo 14 sugieren que la inhibición del Factor 1 1 con los compuestos descritos en la presente son útiles para proporcionar antitrombosis sin riesgo asociado de sangrado.
Tabla 26 Ensayo de sangrado por la cola en ratones BABL/c mg/kg Sangre (g) PBS 0 0.06 Apixaban 0.5 0.03 2 0.34 5 0.37 10 0.40 20 0.52 ISIS 1.25 0.00 404071 2.5 0.03 5 0.00 10 0.04 25 0.01 50 0.01 Ejemplo 16: Efecto ex vivo de inhibición antisentido del Factor 1 1 de mu rino en combinación con LOVENOX Tratamiento Se trataron tres grupos de ratones BALB/c con 10 mg/kg, 20 mg/kg o 40 mg/kg de ISIS 404071 , administrados de manera subcutánea dos veces por semana durante 3 semanas. Un grupo de control de ratones se trató con PBS, administrados dos veces por semana durante 3 semanas. Cinco días después de la última dosis, se sacrificaron los ratones y se recogió plasma. La heparina de bajo peso molecular (LMW), LOVENOX, se administró al plasma ex vivo en concentraciones variables de 0 Mg/ml , 2.5 pg/ml , 5.0 pg/ml y 7.5 Mg/ml . Los PT y aPTT se midieron 20 minutos después de la administración de LOVENOX.
Ensayo de PT y aPTT Como se muestra en la Tabla 27, el tratamiento con LOVENOX aumenta el PT en una manera dependiente de la dosis. El tratamiento con ISIS 404071 no aumentó significativamente el PT. El PT no se afecta significativamente con el tratamiento con ISIS 404071. No hay evidencia de un efecto combinatorio sobre el PT en plasma tratado con ISIS 404071 y LOVENOX.
Tabla 27 Efecto de combinación de ISIS 404071 y LOVENOX en INR de PT en plasma de murino Como se muestra en la Tabla 28, el tratamiento con LOVENOX aumenta el aPTT en una manera dependiente de la dosis. El tratamiento con ISIS 404071 aumenta también el aPTT en una manera dependiente de la dosis. Además, el tratamiento combinado de ISIS 404071 y LOVENOX parece tener un efecto sinérgico sobre el aPTT.
Tabla 28 Efecto de la combinación de ISIS 404071 y LOVENOX en INR de aPTT en plasma de murino ISIS 404071 LOVENOX (mg/ml) (mg/kg) 0 2.5 5.0 7.5 0 1.00 1.53 2.10 2.70 10 1.14 1.76 2.39 3.20 20 1.28 1.95 2.83 3.65 40 1.52 2.66 n.d. 4.78 n.d. = no datos Ejemplo 17 : Efecto in vivo de la i nhibición antisentido del Factor 1 1 de murino en combinación con LOVENOX en el modelo de trombosis venosa (VT) inducida por FeCI3 Tratamiento Se evaluó la combinación de I SIS 404071 y LOVENOX en el modelo de VT de ratón inducida por FeCI3. Se trataron 4 grupos de ratones BALB/c con 1 5 mg/kg, 30 mg/kg, 45 mg/kg o 60 mg/kg de LOVENOX, administrados de manera subcutánea una vez al d ía durante 3 días. Se trataron 4 grupos adicionales de ratones BALB/c con 20 mg/kg de ISIS 404071 , administrados de manera subcutánea dos veces por semana durante 3 semanas. Después de la última dosis de IS IS 404071 , los ratones se trataron con 1 5 mg/kg, 30 mg/kg , 45 mg/kg o 60 mg/kg de LOVENOX, administrados de manera subcutánea una vez al día durante 3 días. Se trataron dos grupos de control de ratones BALB/c con PBS, administrada de manera subcutánea dos veces por semana durante 3 semanas. La formación de trombos se indujo con FeCI3 en todos los ratones excepto el primer grupo de control. Todos los ratones fueron anestesiados con 1 50 mg/kg de cetamina mezclada con 1 0 mg/kg de xilazina administradas mediante inyección intraperitoneal .
En ratones que experimentaron tratamiento con FeCI3, la formación de trombos se indujo mediante la aplicación de una pieza de papel filtro (2 x 4 mm) presaturado con solución de FeCI3 al 1 0% directamente sobre la vena cava. Después de 3 minutos de exposición, se removió el papel filtro. Treinta minutos después de la aplicación del papel filtro, se disecó una longitud fija del la vena que contiene el trombo para análisis de plaquetas.
Cuantificación de Composición de Plaquetas Se usó la cuantificación de PF-4 con PCR en tiempo real para cuantificar las plaquetas en la vena cava como una medida de la formación de trombos. Como se muestra en la Tabla 29, el tratamiento con LOVENOX resultó en una reducción de PF-4 en comparación con el control de PBS. El tratamiento con LOVENOX en combinación con ISIS 404071 resultó en una reducción mayor de PF-4 en comparación con LOVENOX solo.
Tabla 29 Análisis de la formación de trombos mediante cuantificación de PF-4 con PCR en tiempo real en el modelo de trombosis venosa inducida por FeCI3 Tratamiento mg/kg PF-4 PBS-FeCI3 0 PBS+FeCI3 100 LOVENOX 15 57 30 33 45 10 60 5 LOVENOX (+ ISIS 15 0 404071 ) 30 0 45 11 60 5 Ejemplo 18 : Efecto in vivo de la inhibición antisentido del Factor 1 1 de murino en combinación con LOVENOX sobre el sangrado Tratamiento Se midió el sangrado por la cola para observar si el tratamiento con IS IS 404071 y LOVENOX causa hemorragia interna en los ratones. Se administró ISIS 404071 de manera subcutánea a una dosificación de 20 mg/kg dos veces por semana durante 3 semanas a 4 grupos de ratones BALB/c y se administró LOVENOX de manera subcutánea a varias dosificaciones de 1 5 mg/kg, 30 mg/kg, 45 mg/kg y 60 mg/kg de LOVENOX, una vez al día en los últimos 3 días del tratamiento con ISIS 404071 . En un quinto grupo, se administró ISI S 404071 de manera subcutánea a ratones BALB/c a una dosificación de 20 mg/kg dos veces por semana durante 3 semanas. En un sexto grupo, se administró PBS de manera subcutánea dos veces por semana durante 3 semanas a ratones BALB/c, como un control .
Ensayo de Sangrado por Cola Dos días después de recibir su tratamiento final , los ratones se colocaron en una cámara de sangrado por la cola. Los ratones se anestesiaron en la cámara con isoflurano y se cortó una pequeña pieza de cola (aproximadamente 4 mm desde la punta) con tijeras estériles . La cola cortada se colocó inmediatamente en un tubo Falcon de 1 5 mL lleno con solución de búfer de NaCI al 0.9% con aproximadamente 1 0 mL calentada a 37°C. La sangre se recolectó en el curso de 40 minutos. Los tubos llenos con salina se pesaron tanto antes como después del sangrado.
Como se muestra en la Tabla 30, el LOVENOX aumentó el sangrado en ratones en comparación con los ratones tratados con PBS . Las dosis incrementadas de LOVENOX correlacionaron positivamente con la pérdida incrementada de sangre. ISIS 404071 combinado con LOVENOX no aumentó significativamente el sangrado más allá de la pérdida incrementada de sangre mostrada en ratones tratados solamente con LOVENOX.
Tab la 30 Ensayo de sangrado por cola que compara LOVENOX y la combinación de LOVENOX e ISIS 404071 Dosis en mg/kg Sangre (g) PBS 0.05 LOVENOX 15 0.11 30 0.20 45 0.27 60 0.47 LOVENOX (+ ISIS 404071 ) 15 0.14 30 0.19 45 0.36 60 0.61 Ejemplo 19: Efecto in vivo de la inhibición antisentido del Factor 1 1 de murino en combinación con LOVENOX en PT y aPTT Tratamiento Se midieron PT y aPTT usando PPP de ratones tratados con I S I S 404071 en combinación con LOVENOX. En la primera cohorte, se administró ISIS 404071 de manera subcutánea a ratones BALB/c a una dosificación de 25 mg/kg dos veces por semana durante 3 semanas. Se recolectó plasma de estos ratones 5 días después de recibir la última dosis de ISIS 404071 . En la segunda cohorte, se administró LOVENOX de manera subcutánea a ratones BALB/c a una dosificación de 20 mg/kg una vez al d ía durante 3 días. Se recolectó plasma de estos ratones 4 horas después de recibir la última dosis de LOVENOX. En la tercera cohorte, se administró ISIS 404071 de manera subcutánea a ratones BALB/c a una dosificación de 20 mg/kg dos veces por semana durante 3 semanas y dos días después de recibir la última dosis de ISIS 404071 se administró LOVENOX de manera subcutánea a una dosificación de 20 mg/kg una vez al día. Se recolectó plasma de estos ratones 4 horas después de la última dosis de LOVENOX. En una cuarta cohorte, se administró PBS de manera subcutánea dos veces por semana durante 3 semanas, como un control. Se recolectó plasma de estos ratones 5 d ías después de la última dosis.
Ensayo de PT y aPTT Los valores de PT y aPTT proporcionados en la Tabla 31 se reportan como valores de Proporción Normalizada Internacional (I N R). Como se muestra en la Tabla 31 , el PT no se afectó significativamente por el tratamiento con ISIS 404071 , LOVENOX o tratamiento con IS IS 404071 combinado con LOVENOX. Estos datos sugieren que no hay efecto combinatorio sobre PT por ISIS 404071 combinado con LOVENOX. Mostrado también en la Tabla 31 , el tratamiento con LOVENOX y el tratamiento con ISIS 404071 combinado con LOVENOX aumenta el aPTT. Estos datos sugieren que el tratamiento combinado de ISIS 404071 y LOVENOX tiene un efecto aditivo en aPTT.
Tabla 31 Efecto de la combinación de ISIS 404071 y LOVENOX sobre PT y aPTT en plasma de murino Ejemplo 20 : Efecto in vivo de la inhibición antisentido del Factor 1 1 de murino en combinación con Apixaban sobre PT y aPTT Tratamiento Se midieron PT y aPTT usando PPP de ratones tratados con IS IS 404071 en combinación con Apixaban . En la primera cohorte, se administró ISIS 404071 de manera subcutánea a ratones BALB/c a una dosificación de 25 mg/kg dos veces por semana durante 3 semanas. Se recolectó plasma de estos ratones 5 días después de recibir la última dosis de ISIS 404071. En la segunda cohorte, se administró Apixaban de manera subcutánea a ratones BALB/c a una dosificación de 6 mg/kg dos veces al día durante 3 días. Se recolectó plasma de estos ratones 20 minutos después de recibir la última dosis de Apixaban. En la tercera cohorte, se administró ISIS 404071 de manera subcutánea a ratones BALB/c a una dosificación de 20 mg/kg dos veces por semana durante 3 semanas y se administró Apixaban de manera subcutánea a una dosificación de 6 mg/kg dos veces al día en los tres últimos días del tratamiento con ISIS 404071. Se recolectó plasma de estos ratones 20 minutos después de recibir la última dosis de Apixaban. En una cuarta cohorte, se administró PBS de manera subcutánea dos veces por semana durante 3 semanas, como un control. Se recolectó plasma 5 días después de la última dosis de PBS.
Ensayo de PT y aPTT Los valores de PT y aPTT proporcionados en la Tabla 32 están reportados como valores de Proporción Normalizada Internacional (INR). Como se muestra en la Tabla 32, el PT no se afectó significativamente por el tratamiento con ISIS 404071. Sin embargo, Apixaban y Apixaban combinado con ISIS 404071 aumentaron el PT. También mostrado en la Tabla 32, Apixaban, ISIS 404071 e ISIS 404071 combinado con Apixaban aumentaron el aPTT.
Tabla 32 Efecto de la combinación de ISIS 404071 y Apixaban sobre PT y aPTT en plasma de murino Ejemplo 21 : Efecto in vivo de la i nh ibición antisentido en el Factor 11 de muri no en combinación con warfarina sobre PT y aPTT Tratamiento Se midieron PT y aPTT usando PPP de ratones tratados con I S IS 404071 en combinación con warfarina. Dos grupos de ratones BALB/c se trataron con 25 mg/kg o 50 mg/kg de ISIS 404071 , administrados de manera subcutánea dos veces por semana durante 3 semanas. Se recolectó plasma de cada grupo 5 d ías después de la administración de la última dosis. En un tercer grupo, se trataron ratones BALB/c con 2 mg/kg de warfarina una vez al d ía durante 5 días. Se recolectó plasma 6 horas después de la administración de la última dosis de warfarina. Dos grupos adicionales de ratones de BALB/c se trataron con 25 mg/kg o 50 mg/kg de ISIS 404071 , administrados de manera subcutánea dos veces por semana durante 3 semanas y la warfarina se administró de manera subcutánea a una dosificación de 2 mg/kg una vez al d ía durante los 5 últimos días del tratamiento con ISIS 404071 . Se recolectó plasma de cada grupo 6 horas después del último tratamiento con warfarina. En un grupo final de ratones BALB/c, se administró PBS de manera subcutánea dos veces por semana durante 3 semanas, como un control. Se recolectó plasma 5 días después del último tratamiento con PBS.
Ensayo de PT y aPTT Los valores de PT y aPTT proporcionados en la Tabla 33 están reportados como valores de Proporción Normalizada Internacional (INR). Como se muestra en la Tabla 33, el PT no es afectado por el tratamiento con PBS o ISIS 404071 en cualquier dosificación. Sin embargo, el tratamiento con 2 mg/kg de warfarina, 25 mg/kg de ISIS 404071 en combinación con 2 mg/kg de warfarina y 50 mg/kg de ISIS 404071 en combinación con 2 mg/kg de warfarina aumentan el PT. Estos datos sugieren que el tratamiento combinado de ISIS 404071 y warfarina tiene un efecto aditivo sobre PT. Mostrado también en la Tabla 33, el aPTT es afectado por el tratamiento con ISIS 404071 y warfarina. La combinación de ISIS 404071 y warfarina muestra un aumento en aPTT mayor que cualquier fármaco solo. Estos datos sugieren que el tratamiento combinado de ISIS 404071 y warfarina tiene un efecto sinérgico sobre aPTT.
Tabla 33 Efecto de la combinación de ISIS 404071 y warfarina sobre PT y aPTT en plasma de murino.
Dosis en PT INR aPTT INR mg/kg ISIS 404071 25 0.98 1.37 50 0.93 1.49 2 21.33 2.52 ISIS 404071 25 25.77 4.45 (+Warfar¡na) 50 36.33 4.75 Ejemplo 22: Efecto de antitrombosis in vivo de la inhibición antisentido del Factor 1 1 de murino en la trombosis venosa mesentérica en ratones Tratamiento En una primera cohorte, se administró ISIS 404071 de manera subcutánea a ratones C57BL/6 dos veces por semana durante 3 semanas a una dosis de 50 mg/kg . En una segunda cohorte, se administraron de manera subcutánea a ratones C57B 1 /6 un oligonucleótido de control, ISIS 405277 (AAGGACCTACACATGGAAT; oligonucleótido antisentido para el Factor 2), incorporada en la presente como SEQ I D NO: 12, dos veces por semana durante 3 semanas a una dosis de 50 mg/kg.
Preparación de Plaquetas Se recolectó sangre del plexus venoso retro-orbital de ratones simples C57BL/6 mediante punción y se recolectó en tubos de polipropileno que contienen 300 µ? de heparina (30 U/ml ). Se obtuvo plasma rico en plaquetas (PRP) mediante centrifugación a 1 000 rpm durante 5 minutos. La PRP se transfirió a tubos frescos que contienen 2 µ? de Prostaglandina l2 (PG I2) (2 pg/ml) y se incubó a 37°C durante 5 minutos. Después de centrifugación a 2600 rpm , se resuspendió la granza en 1 mi de búfer de HEPES de Tyrode modificado (NaCI 1 37 mM , Na2HP04 0.3 mM , KCI 2 mM , NaHC03 1 2 mM , HEPES 5 mM , glucosa 5 mM , BSA 0.35% , pH 7.2) conteniendo 2 µ? de PGI2 y se incubó a 37°C durante 5 minutos. La granza suspendida se centrifugó a 2600 rpm durante 5 minutos. Para remover PGI2, se repitió el paso de lavado dos veces y las plaquetas se etiquetaron de manera fluorescente con calceína AM 2.5 Mg/mL (Molecular Probes, Eugene, OR) durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Microscopía Intravital para Trombosis Se inyectaron de manera intravenosa plaquetas etiquetadas con fluorescencia en ratones C57BL/6 tratados con ISIS 404071 y tratados con oligonucleótido de control . Los ratones fueron anestesiados con avertin 2.5% y se hizo una incisión a través de la pared abdominal para exponer las venas mesentéricas de 250 a 300 pm de diámetro y que tiene un régimen de corte de aproximadamente 1 50 s"1. El mesenterio expuesto se mantuvo húmedo en todo el experimento mediante superfusión periódica con PBS caliente (37°C). El mesenterio fue transluminado con una fuente estabilizada de CD de 1 2V, 1 00W. Las venas se visualizaron usando un microscopio invertido Zeiss Axiovert 135 (Alemania) (objetivo 32X) conectado a una grabadora de video SVHS (AG-6730; Panasonic, Tokio, Japón) usando una videocámara de CCD (Hamamatsu Photonic Systems, Hamamatsu City, Japón). Se midió la velocidad de eritrocitos de línea central (Vrbc) usando un velocímetro óptico Doppler (Microcirculation Research Institute, Texas A&M College of Medicine, College Station, TX). Se calculó el régimen de esfuerzo cortante venular (t) con base en la ley de Poiseuille para un fluido newtoniano, t = 8(Vmed¡a/Dv) donde Dv es el diámetro de la vénula y Vmedia se estima a partir de la Vrbc usando la correlación empírica Vmedia = Vrbc/ 1 .6.
Análisis de Resu ltados Se realizó la trombosis venosa mesentérica dos d ías después de la última inyección de oligonucleótido antisentido. Se indujo la trombosis aplicando papel Whatman empapado en una solución de FeCI3 al 1 0% durante 5 minutos en la vena mesentérica. La vena se monitoreó durante 40 minutos, o hasta la oclusión . Se observó el tiempo transcurrido antes de los primeros trombos de 30 a 50 µ?t? de diámetro y el tiempo transcurrido antes de que cesara de fluir la sangre durante 30 segundos.
Las formación de trombos (30 pm de diámetro) ocurrió en ratones tratados con ISIS 404071 a los 14.8 ± 1 .7 minutos. La formación de trombos (30 pm de diámetro) ocurrió en ratones de control a los 8.9 ± 0.6 minutos. Se formaron trombos oclusivos en ratones de control a los 1 9.3 ± 0.8 minutos y se ocluyeron todas las vénulas dañadas. En contraste, la mayoría de las venas en ratones tratados con ISIS 404071 no se ocluyeron cuando se terminó la observación 40 minutos después del daño y aquellas venas que muestran oclusión. La única vena que mostró oclusión en ratones tratados con ISIS 404071 ocluyó a los 29.5 minutos y se reabrió después de 5 minutos, antes del final del estudio. Ejemplo 23: Antídoto de oligonucleótido de sentido in vivo para la inh i bición anti sentido del Factor 1 1 de m u ri no en ratones BALB/c Tratam iento El efecto del oligonucleótido sentido específico para ISIS 404071 como un antídoto se ensayó en ratones BALB/c. En una primera cohorte, se administró ISIS 404071 de manera subcutánea a ratones BALB/c dos veces por semana durante 3 semanas a una dosis de 40 mg/kg . En una segunda cohorte, se administró ISIS 404057 de manera subcutánea a ratones BALB/c dos veces por semana durante 3 semanas a una dosis de 40 mg/kg. El antídoto específico de ISIS 404071 , ISIS 41 8026 (CCTCTGAAAGTGCATTACCA; complementaria para ISIS 404071 ), incorporada en la presente como SEQ I D NO: 1 3, se administró a ambas cohortes de manera subcutánea en una sola inyección de 90 mg/kg 48 horas después del tratamiento final de IS I S 404071 o 404057. En una tercera cohorte, se administró ISIS 404071 de manera subcutánea a ratones BALB/c dos veces por semana durante 3 semanas a una dosis de 40 mg/kg. Después del último tratamiento de ISIS 404071 , los ratones se inyectaron de manera subcutánea con PBS. En una cuarta cohorte, se administró ISIS 404057 de manera subcutánea a ratones BALB/c dos veces por semana durante 3 semanas a una dosis de 40 mg/kg. Después del último tratamiento de ISIS 404057 , los ratones se inyectaron de manera subcutánea con PBS. Después de la administración de antídoto, se sacrificó un grupo de 4 ratones de cada cohorte a las 12 horas, 1 d ía, 2 días, 3 d ías, 7 días y 14 días. Se recogió el hígado entero para análisis de ARN y se recogió PPP para análisis de aPTT.
Análisis de ARN Se extrajo ARN del tejido del h ígado para análisis del Factor 1 1 con PCR en tiempo real. Los resultados se presentan como porciento de inhibición del Factor 1 1 con relación al control de PBS. Como se muestra en la Tabla 34, los ratones tratados con ISIS 404071 sin antídoto mostraron una disminución progresiva de la inhibición en el periodo de observación de 1 4 días. Sin embargo, los ratones tratados con ISIS 404071 y antídoto mostraron una disminución acelerada de la inhibición en el periodo de observación de 14 días en comparación con ratones que no recibieron antídoto. También se muestra en la Tabla 34, que el tratamiento con ISIS 418026 no tuvo efecto sobre la inhibición de la expresión de mARN del Factor 1 1 en ratones tratados con ISIS 404057.
Tabla 34 Porciento de inhibición de mARN del Factor 1 1 de ratón en comparación con el control de PBS n.d. = no datos Ensayo de aPTT Como se muestra en la Tabla 35, los ratones tratados con ISIS 404071 y antídoto (ISIS 418026) mostraron disminución progresiva de aPTT en el periodo de observación de 14 días en comparación con ratones tratados con ISIS 404071 sin antídoto.
Tabla 35 Efecto de tratamiento de antídoto en INR de aPTT Ejemplo 24: Proteína antídoto del Factor 7a in vivo para la inhibición antisentido del Factor 11 de murino en ratones BALB/c Tratamiento Se ensayó en ratones BALB/c, el efecto de la proteína del Factor 7a humano (Factor VI la) como un antídoto para ISIS 404071. Se trataron dos grupos experimentales de ratones BALB/c con 20 mg/kg de ISIS 404071, administrados de manera subcutánea dos veces por semana durante 3 semanas. Dos grupos de control de ratones BALB/c se trataron con PBS, administrada de manera subcutánea dos veces por semana durante 3 semanas. La formación de trombos se indujo con FeCI3 en todos los ratones excepto el primer grupo de control. Quince minutos antes del tratamiento con FeCI3, el primer grupo experimental se trató con 5 pg/kg de la proteína antídoto del Factor 7a humano (producto No. 407act, American Diagnostica Inc.). Dos días después de su última dosis, todos los ratones fueron anestesiados con 1 50 mg/kg de cetamina mezclada con 10 mg/kg de xilazina administradas mediante inyección intraperitoneal.
En los ratones que experimentaron el tratamiento con FeCI3, se indujo la formación de trombos aplicando una pieza de papel filtro (2 x 4 mm) presaturado con solución de FeCI3 al 1 0% directamente en la vena cava. Después de 3 minutos de exposición , se removió el papel filtro. Treinta minutos después de la aplicación del papel filtro, se disecó una longitud fija de la vena que contiene el trombo para análisis de plaquetas.
Cuantificación de la Composición de Plaq uetas Se usó la cuantificación del Factor-4 de plaquetas (PF-4) por PCR en tiempo real para cuantificar las plaquetas en la vena cava como una medida de la formación de trombos. Los resultados se presentan como un porcentaje de PF-4 en ratones tratados con antídoto y no tratados, en comparación con los dos grupos de control tratados con PBS. Como se muestra en la Tabla 36, los animales tratados con la proteína antídoto del Factor 7a humano expresaron más PF-4 en comparación con animales tratados con ISIS 404071 solamente. Estos datos indican que el Factor 7a humano es exitoso para rescatar el efecto de la inhibición de oligonucleótido antisentido.
Tabla 36 Análisis e formación de trombos mediante cuantificación con PCR en tiempo real de PF-4 en el modelo de trombosis venosa inducida con FeCI3 Tratamiento PF-4 PBS-FeCI3 0 PBS+FeCI3 100 ISIS 404071 18 ISIS 404071 +hFV7a 68 Ejemplo 25: Inhibición antisentido in vivo del Factor 1 1 de murino en el modelo de hemorragia intracerebral inducida por colagenasa Tratamiento Se examinaron ISIS 404071 y warfarina (COUMADI N ) en el modelo de hemorragia intracerebral inducida por colagenasa. En una primera cohorte, se administró ISIS 404071 de manera subcutánea a ratones BALB/c dos veces por semana durante 2 semanas a una dosis de 40 mg/kg . En una segunda cohorte, se administró warfarina de manera intraperitoneal a ratones dos veces por semana durante 2 semanas a una dosis de 2 mg/kg . En una tercera cohorte, se administró ISIS 41 1 208 (TCGGAAGCGACTCTTATATG , 8 desigualdades con el Factor 1 1 de murino, incorporada en la presente como SEQ I D NO: 14) de manera subcutánea a ratones BALB/c dos veces por semana durante 2 semanas a una dosis de 40 mg/kg. En una cuarta cohorte, se administró PBS a ratones BALB/c dos veces por semana durante 2 semanas.
Dos d ías después de recibir su dosis final , todos los ratones en todas las cohortes fueron anestesiados con 5 pg/g de avertin .
Después, los ratones se inyectaron a -1 AP, 1 mm R ML, -4 mm DV de cráneo simple de bregma con una jeringa Hamilton de 10 pl_ conteniendo 0.075 U de colagenasa ( 1 50 U/mL). La colagenasa se entregó durante 5 minutos y después la aguja se mantuvo en el lugar durante 5 minutos adicionales para evitar el reflujo. Los ratones se analizaron después para el tamaño de la hemorragia, marca del déficit neurológico y mortalidad .
La Tabla 37 presenta el volumen de la hemorragia detectada en ratones después del tratamiento con colagenasa, la Tabla 38 presenta la marca del déficit neurológico de los ratones y la Tabla 39 presenta el régimen de mortalidad de los ratones. El déficit neurológico se mide por un sistema de marcación estándar donde la carencia de deficiencia es cero y el déficit severo es cinco. Colectivamente, los datos sugieren que ISIS 404071 no tiene un efecto significativo en el tamaño de la hemorragia, la marca del déficit neurológico o la mortalidad de los ratones. Así, el riesgo de hemorragia intracerebral (un factor de riesgo para individuos tratados con warfarina) se reduce significativamente en ratones tratados con ISIS 404071 en comparación con los ratones tratados con warfarina.
Tabla 37 Volumen hemorrágico después del tratamiento con colagenasa Volumen (mm3) PBS 51 ISIS 421208 41 ISIS 404071 38 Tabla 38 Marca de déficit neurologico después del tratamiento con colagenasa Tabla 39 Mortalidad después del tratamiento con colagenasa Ejemplo 26: Efecto in vivo de la inhibición antisentido del Factor 1 1 de murino en combi nación con PLAVIX en el modelo de trombosis venosa (VT) inducida con FeCI3 Tratamiento Se evaluó la combinación de ISIS 404071 y PLAVIX en el modelo de VT en ratón inducida por FeCl3. Se trataron cuatro grupos de ocho ratones BALB/c, pesando aproximadamente 25 g cada uno, con 6.25 mg/kg , 1 2.50 mg/kg, 25.00 mg/kg o 50.00 mg/kg de PLAVIX. A los ratones se les dieron dos dosis de PLAVIX en el día uno y una dosis de PLAVIX en el día dos, dos horas antes de la cirug ía.
Se trataron cuatro grupos adicionales de ocho ratones BALB/c, pesando aproximadamente 25 g cada uno, con 20 mg/kg de ISIS 404071 , administrados de manera subcutánea dos veces por semana durante 3 semanas. Después de la última dosis de ISIS 404071 , los ratones se trataron con 6.25 mg/kg , 12.50 mg/kg , 25.00 mg/kg o 50.00 mg/kg de PLAVIX. Se administraron dos dosis de PLAVIX a los ratones en el d ía uno y se administró una dosis de PLAVIX en el día dos, dos horas antes de cirugía.
Dos grupos de control de ocho ratones BALB/c, pesando aproximadamente 25 g cada uno, no se trataron con ISIS 404071 o PLAVIX. Se trataron dos grupos de control adicionales de ocho ratones BALB/c, pesando aproximadamente 25 g cada uno , con 20 mg/kg de ISIS 404071 , administrados de manera subcutánea dos veces por semana durante 3 semanas, pero no se trataron con PLAVIX. La formación de trombos fue inducida con FeCI3 en todos los ratones excepto el primer y el tercer grupos de control. Todos los ratones fueron anestesiados con 150 mg/kg de cetamina mezclada con 1 0 mg/kg de xilazina administrados mediante inyección intraperitoneal .
En los ratones que experimentaron tratamiento con FeCI3, la formación de trombos fue inducida aplicando un pedazo de papel filtro (2 x 4 mm) presaturado con solución de FeCI3 al 10% directamente sobre la vena cava inferior. Después de tres minutos de exposición, se removió el papel filtro. Treinta minutos después de la aplicación del papel filtro, se disecó una longitud fija de la vena que contiene el trombo para análisis de plaquetas.
Cu a ntificación de la Com posición de Plaquetas Cuantificación de PF-4 con PCR en tiempo real se usó para cuantificar las plaquetas en la vena cava como una medida de la formación de trombos. Como se muestra en la Tabla 40, el tratamiento con PLAVIX resultó en una reducción de PF-4 en comparación con el control de PBS. El tratamiento con PLAVIX en combinación con ISIS 404071 resultó en una mayor reducción de PF-4 en comparación con PLAVIX solamente. Por lo tanto, la combinación de terapia antiplaquetas con el Factor 1 1 ASO aumenta la actividad antitrombótica . La información se presenta como porciento de mARN de PF-4 en comparación con el control de PBS más FeCI3.
Tabla 40 Análisis de la formación de trombos mediante cuantificación de PF-4 con PCR en tiempo real en el modelo de trombosis venosa inducida con FeCI3 Tratamiento ISIS 404071 mg/kg PLAVIX mg/kg PF-4 PBS- FeCI3 0 0 29 PBS+ FeCI3 0 0 100 PLAVIX solamente 0 6.25 59 0 12.50 37 0 25.00 30 0 50.00 30 ISIS 404071-FeCI3 20 0 27 ISIS 404071 +FeCI3 20 0 40 PLAVIX (+ ISIS 404071) 20 6.25 35 20 12.50 38 20 25.00 25 20 50.00 35 Ejem plo 27: Efecto in vivo de la inh ibición antisentido del Factor 1 1 de murino en combinación con PLAVIX sobre el sangrado Tratamiento Se midió el sangrado por la cola para observar si el tratamiento con ISIS 404071 en combinación con PLAVIX causa un aumento en la tendencia al sangrado. Se administró ISIS 404071 de manera subcutánea a una dosificación de 20 mg/kg dos veces por semana durante 3 semanas a 5 grupos de ocho ratones BALB/c. Después de la última dosis de ISIS 404071 , los ratones se trataron con 0 mg/kg , 6.25 mg/kg , 1 2.50 mg/kg, 25.00 mg/kg o 50.00 mg/kg de PLAVIX. Se administraron dos dosis de PLAVIX a los ratones en el día uno y se administró una dosis de PLAVIX en el d ía dos, dos horas antes del sangrado.
Se trataron 5 grupos adicionales de ocho ratones BALB/c de manera similar, excepto que no recibieron inyecciones de ISIS 404071 . Ensayo de Sangrado por la Cola Dos horas después de recibir su tratamiento final, los ratones se colocaron en una cámara de sangrado por la cola. Los ratones fueron anestesiados en la cámara con isoflurano y se cortó una pequeña pieza de cola (aproximadamente 4 mm desde la punta) con tijeras estériles. La cola cortada se colocó inmediatamente en un tubo Falcon de 1 5 mL con aproximadamente 10 mL de solución de búfer de NaCI al 0.9% calentada a 37°C. La sangre se recogió en el curso de 40 minutos. Los tubos llenos con salina se pesaron tanto antes como después del sangrado.
Tomados con los resultados del Ejemplo 26, estos datos muestran que la combinación de una terapia anti-plaquetas con el Factor 1 1 ASO aumenta la actividad antitrombótica sin aumentar el riesgo de sangrado.
Tabla 41 Ensayo de sangrado por la cola comparando PLAVIX y la combinación de PLAVIX e ISIS 404071 Ejemplo 28 : Efecto in vivo de un inhibidor de molécula pequeña del Factor Xa en combinación con PLAVIX sobre el sangrado Tratamiento Se midió el sangrado por la cola para observar si el tratamiento con una molécula pequeña del Factor 10a en combinación con PLAVIX causa un aumento en la tendencia al sangrado. Cinco grupos de ocho ratones BALB/c se trataron con 0 mg/kg, 6.25 mg/kg, 1 2.50 mg/kg , 25.00 mg/kg o 50.00 mg/kg de PLAVIX . A los ratones se les dieron dos dosis de PLAVIX en el día uno y una dosis de PLAVIX en el día dos, dos horas antes del sangrado.
Se trataron cinco grupos adicionales de ocho ratones BALB/c con 0 mg/kg , 6.25 mg/kg, 1 2.50 mg/kg, 25.00 mg/kg o 50.00 mg/kg de PLAVIX. A los ratones se les dieron dos dosis de PLAVIX en el d ía uno y una dosis de PLAVIX en el día dos, dos horas antes del sangrado. A estos ratones se les trató también con 0.5 mg/kg de Apixaban, un inhibidor de Factor 10a de molécula pequeña, intraperitonealmente una vez 20 minutos antes del sangrado.
Ensayo de Sangrado por la Cola Dos horas después de recibir su tratamiento final , los ratones se colocaron en una cámara de sangrado por la cola. Los ratones fueron anestesiados en la cámara con isoflurano y se cortó una pequeña pieza de cola (aproximadamente 4 mm desde la punta) con tijeras estériles. La cola cortada se colocó inmediatamente en un tubo Falcon de 1 5 mL lleno con aproximadamente 1 0 mL de solución de búfer de NaCI al 0.9% calentada a 37°C. La sangre se recogió en el curso de 40 minutos. Los tubos llenos con salina se pesaron tanto antes como después del sangrado.
Como se muestra más adelante en la Tabla 42, estos datos muestran que la combinación de terapia anti-plaquetas con un inhibidor del Factor 10a de molécula pequeña, tal como Apixaban , aumenta el riesgo de sangrado. Por lo tanto, el tratamiento con la combinación de terapia anti-plaquetas con un Factor 1 1 ASO proporciona un mejor perfil de seguridad en comparación con el perfil de seguridad de una combinación de terapia anti-plaquetas con un inhibidor del Factor 1 0a de molécula pequeña.
Tabla 42 Ensayo de sangrado por la cola comparando PLAVIX, Apixaban, y la combinación de PLAVIX y Apixaban Ejemplo 29: Curso del tiempo de la reducción mediada con antisentido, in vivo del Factor 1 1 de murino y que corresponde a la anticoagulación en sangre Tratamiento Se observó el curso del tiempo de la reducción mediada con antisentido del mARN del Factor 11 de murino en ratones BALB/c. Se administró una dosis de 50 mg/kg de ISIS 404071 de manera subcutánea a ratones BALB/c. Después de la administración de ISIS 404071, los ratones se sacrificaron a las doce horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 7 días, 14 días, 28 días y 56 días. Se recolectó el hígado entero para análisis de ARN y se recolectó PPP para análisis de aPTT. Un segundo grupo de control de ratones se trató con una dosis subcutánea de PBS.
Análisis de ARN Se extrajo ARN del tejido del hígado para análisis del Factor 11 con PCR en tiempo real. Los resultados se presentan con relación al control de PBS. Los ratones tratados con ISIS 404071 mostraron una sub-regulación significativa de mARN del Factor 11 en el día 1. Los ratones empezaron a recuperar la expresión de mARN del Factor 11 por el día 14. Los ratones recuperaron la expresión completa de mARN del Factor 11 por el día 28 y los resultados del día 56 indican que el mARN del Factor 11 se mantuvo en niveles de pretratamiento. Por lo tanto, los ratones tratados con ISIS 404071 no experimentaron un efecto de rebote.
El efecto de rebote se ha observado previamente en reducción del Factor 11 mediada por anticuerpo (Blood, First Edition Paper, republicado en línea el 22 de octubre de 2008; Prevención de oclusión por injerto bascular y generación de trombina asociada con trombos mediante inhibición del Factor XI ). Debido a que la sobreexpresión del Factor 1 1 puede ser dañada conduciendo a una coagulación incrementada, estos datos sugieren que la inhibición del Factor 1 1 mediada por antisentido es más segura que la inhibición del Factor 1 1 medida por anticuerpo puesto que la inhibición del Factor 1 1 mediada por antisentido no rebota.
Ensayo de aPTT Los valores de aPTT proporcionados en la Tabla 43 están reportados como valores de Proporción Normalizada Internacional (INR). Los valores de I N R para aPTT se determinaron dividiendo el valor de aPTT para ratones tratados con ISIS 404071 entre el aPTT para el grupo tratado con PBS. Esta proporción se elevó después a la potencia del Indice de Sensibilidad I nternacional (ISI) del factor del tejido usado. Como se muestra en la Tabla 43, los ratones tratados con ISI 404071 mostraron una disminución progresiva de aPTT hasta el día 4 y después un aumento progresivo hasta niveles de pretratamiento desde el día 7 hasta el día 28.
Tabla 43 Efecto del tratamiento con ISIS 404071 en INR* de aPTT Ejemplo 30: Inhibición antisentido del Factor 1 1 humano en células HepG2 med iante oligonucleótidos diseñados por microwaik Se diseñaron gapmers adicionales con base en ISIS 41 6850 e ISIS 41 6858 (ver Tabla 8 anterior). Estos gapmers fueron desviados ligeramente corriente arriba y corriente abajo (es decir, "microwaik") de ISIS 416850 e ISIS 416858. Los gapmers de microwaik fueron diseñados con motivos ya sea 5-8-5 MOE o 6-8-6 MOE.
Estos gapmers de microwaik se ensayaron in vitro. Células cultivadas de HepG2 a una densidad de 20,000 células por pozo se transfectaron usando electroporación con oligonucleótido antisentido 8,000, nM . Después de un periodo de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de mARN del Factor 1 1 mediante PCR cuantitativa en tiempo real . Se ajustaron los niveles de mARN del Factor 1 1 de acuerdo con el contenido total de ARN según medición mediante RIBOGREEN . Los resultados se presentan como porciento de inhibición del Factor con relación a las células de control no tratadas.
Se reensayaron in vitro ISIS 41 6850 e ISIS 416858, así como también gapmers seleccionados de las Tablas 1 y 8 (es decir, IS IS 412206, ISIS 41 2223, ISIS 412224, ISIS 412225, ISIS 41 3481 , IS IS 413482, IS IS 41 6825, ISIS 416848, ISIS 416849, ISIS 41 6850, ISIS 416851 , IS IS 41 6852, ISIS 416853, ISIS 416854, ISIS 416855, IS I S 416856, ISIS 41 6857, ISIS 416858, ISIS 416859, ISIS 41 6860, IS I S 416861 , ISIS 416862, ISIS 416863, ISIS 416864, ISIS 41 6865 , ISIS 416866 e ISIS 416867) junto con los gapmers de microwaik bajo la misma condición se describe antes.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos en la Tabla 44 fueron designados como gapmers 5-10-5 MOE, 5-8-5 y 6-8-6 MOE. Los dos primeros gapmers enlistados en la Tabla 44 son los gapmers originales (ISIS 41 6850 e ISIS 41 6858) a partir de los cuales se diseñaron IS IS 445493-445543 vía microwalk y se indican mediante un asterisco. Los gapmers 5-1 0-5 son de 20 nucleótidos de longitud , en donde el segmento de gap central está constituido por diez 2'-deoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5' y 3') por alas que comprenden cinco nucleótidos cada una . Los gapmers 5-8-5 son de 1 8 nucleótidos de longitud, en donde el segmento de gap central está constituido por ocho 2'-deoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5' y 3') por alas que comprenden cinco nucleótidos cada una. Los gapmers 6-8-6 son de 20 nucleótidos de longitud , en donde el segmento de gap central está constituido por ocho 2'-deoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5' y 3') por alas que comprenden seis nucleótidos cada una. Para cada uno de los motivos (5-1 0-5, 5-8-5 y 6-8-6), cada nucleótido en el segmento de ala 5' y cada nucleótido en el segmento de ala 3' tiene una modificación 2'-MOE . Los enlaces de internucleósido a través de cada gapmer son enlaces de fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citidina a través de cada gapmer son 5-metilcitidinas. "Sitio de inicio objetivo humano" indica el nucleótido más 5' al cual está apuntado el gapmer en la secuencia humana . "Sitio de alto de objetivo humano" indica el nucleótido más 3' al cual está apuntado el gapmer en la secuencia humana. Cada gapmer enlistado en la Tabla 44 está apuntado a SEQ ID NO: 1 (No. de Acceso GENBANK NM_000128.3). Cada gapmer en la Tabla 44 es completamente reactivo en cruz con la secuencia del gen del Factor 11 del mono Rhesus, designado en la presente como SEQ ID NO: 274 (exones 1-15 No. de Acceso GENBANK NW_001118167.1 ). "Sitio de inicio de mono Rhesus" indica el nucleótido más 5' al cual está apuntado el gapmer en la secuencia del mono Rhesus. "Sito de alto del mono Rhesus" indica el nucleótido más 3' al cual está apuntado el gapmer en la secuencia del mono Rhesus.
Como se muestra en la Tabla 44, todos los gapmer diseñados por microwalk apuntados a la región objetivo que empieza en el sitio de inicio objetivo 1275 y termina en el sitio de alto objetivo 1317 (es decir, nucleobases 1275-1317) de SEQ ID NO: 1 exhibieron por lo menos 60% de inhibición de mARN del Factor 11. De manera similar, todos los gapmers reensayados de las Tablas 1 y 8 exhibieron por lo menos 60% de inhibición.
Varios de los gapmers exhibieron por lo menos 70% de inhibición, incluyendo ISIS números: 412206, 412224, 412225, 413481, 413482, 416825, 416848, 416849, 416850, 416851, 416852, 416853, 416854, 416855, 416856, 416857, 416858, 416859, 416860, 416861, 416862, 416863, 416864, 416865, 416866, 416867, 445494, 445495, 445496, 445497, 445498, 445499, 445500, 445501, 445502, 445503, 445504, 445505, 445506, 445507, 445508, 445509, 445510, 445511, 445512, 445513, 445514, 445515, 445516, 445517, 445518, 445519, 445520, 445521, 445522, 445523, 445524, 445525, 445526, 445527, 445528, 445529, 445530, 445531, 445532, 445533, 445534, 445535, 445536, 445537, 455538, 445539, 445540, 445541, 445542 y 445543.
Varios de los gapmers exhitibieron por lo menos 80% de inhibición, incluyendo ISIS números: ISIS 412206, 412224, 412225, 413481, 413482, 416825, 416848, 416849, 416850, 416851, 416852, 416853, 416854, 416855, 416856, 416857, 416858, 416859, 416860, 416861, 416862, 416863, 416864, 416865, 416866, 416867, 445494, 445495, 445496, 445497, 445498, 445500, 445501, 445502, 445503, 445504, 445505, 445506, 445507, 445508, 445509, 445510, 445513, 445514, 445519, 445520, 445521, 445522, 445525, 445526, 445529, 445530, 445531, 445532, 445533, 445534, 445535, 445536, 455538, 445541 y 445542.
Varios de los gapmers exhibieron por lo menos 90% de inhibición, incluyendo ISIS números: ISIS 412206, 416825, 416850, 416857, 416858, 416861, 445522 y 445531.
Tabla 44 Inhibicón de niveles de mARN del Factor 11 humano mediante oligonucleótidos antisentido quiméricos apuntados a SEQ ID NO: 1 (No. de Acceso GENBANK M_000128.3) Sitio Sitio de Sitio Sitio de SEQ inicio alto inicio alto Secuencia Porciento ID mono mono ISIS No. Humano Humano (5' a 3') inhibición Motivo No. Rhesus Rhesus TGCACAGTTTC '416850 1278 1297 TGGCAGGCC 91 5/10/2005 215 1277 1296 ACGGCATTGG *416858 1288 1307 TGCACAGTTT 90 5/10/2005 223 1287 1306 GCCCTTCATG 416825 680 699 TCTAGGTCCA 90 5-10-5 190 679 698 CCGTGCATCT 412206 738 757 TTCTTGGCAT 91 5-10-5 34 737 756 ACAGTTTCTG 412223 1275 1294 GCAGGCCTCG 62 5-10-5 51 1274 1293 ACAGTTTCTG 445493 1275 1294 GCAGGCCTCG 69 6-8-6 51 1274 1293 AGTTTCTGGC 445518 1275 1292 AGGCCTCG 75 5-8-5 242 1274 1291 CACAGTTTCTG 416848 1276 1295 GCAGGCCTC 87 5-10-5 213 1275 1294 CACAGTTTCTG 445494 1276 1295 GCAGGCCTC 85 6-8-6 213 1275 1294 CAGTTTCTGG 445519 1276 1293 CAGGCCTC 81 5-8-5 243 1275 1292 GCACAGTTTCT 416849 1277 1296 GGCAGGCCT 88 5-10-5 214 1276 1295 GCACAGTTTCT 445495 1277 1296 GGCAGGCCT 89 6-8-6 214 1276 1295 ACAGTTTCTG 445520 1277 1294 GCAGGCCT 82 5-8-5 244 1276 1293 TGCACAGTTTC 445496 1278 1297 TGGCAGGCC 87 6-8-6 215 1277 1296 CACAGTTTCTG 445521 1278 1295 GCAGGCC 87 5-8-5 245 1277 1294 GTGCACAGTT 416851 1279 1298 TCTGGCAGGC 89 5-10-5 216 1278 1297 GTGCACAGTT 445497 1279 1298 TCTGGCAGGC 81 6-8-6 216 1278 1297 GCACAGTTTCT 445522 1279 1296 GGCAGGC 91 5-8-5 246 1278 1295 GGTGCACAGT 413481 1280 1299 TTCTGGCAGG 82 5-10-5 114 1279 1298 GGTGCACAGT 445498 1280 1299 TTCTGGCAGG 83 6-8-6 114 1279 1298 TGCACAGTTTC 445523 1280 1297 TGGCAGG 73 5-8-5 267 1279 1296 TGGTGCACAG 416852 1281 1300 TTTCTGGCAG 87 5-10-5 217 1280 1299 TGGTGCACAG 445499 1281 1300 TTTCTGGCAG 75 6-8-6 217 1280 1299 GTGCACAGTT 445524 1281 1298 TCTGGCAG 75 5-8-5 247 1280 1297 TTGGTGCACA 416853 1282 1301 GTTTCTGGCA 84 5-10-5 218 1281 1300 TTGGTGCACA 445500 1282 1301 GTTTCTGGCA 81 6-8-6 218 1281 1300 GGTGCACAGT 445525 1282 1299 TTCTGGCA 85 5-8-5 248 1281 1298 ATTGGTGCAC 416854 1283 1302 AGTTTCTGGC 86 5-10-5 219 1282 1301 ATTGGTGCAC 445501 1283 1302 AGTTTCTGGC 83 6-8-6 219 1282 1301 TGGTGCACAG 445526 1283 1300 TTTCTGGC 81 5-8-5 249 1282 1299 CATTGGTGCA 416855 1284 1303 CAGTTTCTGG 85 5-10-5 220 1283 1302 CATTGGTGCA 445502 1284 1303 CAGTTTCTGG 83 6-8-6 220 1283 1302 TTGGTGCACA 445527 1284 1301 GTTTCTGG 70 5-8-5 250 1283 1300 GCATTGGTGC 412224 1285 1304 ACAGTTTCTG 84 5-10-5 52 1284 1303 GCATTGGTGC 445503 1285 1304 ACAGTTTCTG 89 6-8-6 52 1284 1303 ATTGGTGCAC 445528 1285 1302 AGTTTCTG 73 5-8-5 251 1284 1301 GGCATTGGTG 416856 1286 1305 CACAGTTTCT 84 5-10-5 221 1285 1304 GGCATTGGTG 445504 1286 1305 CACAGTTTCT 87 6-8-6 221 1285 1304 CATTGGTGCA 445529 1286 1303 CAGTTTCT 85 5-8-5 252 1285 1302 CGGCATTGGT 416857 1287 1306 GCACAGTTTC 91 5-10-5 222 1286 1305 CGGCATTGGT 445505 1287 1306 GCACAGTTTC 89 6-8-6 222 1286 1305 GCATTGGTGC 445530 1287 1304 ACAGTTTC 83 5-8-5 253 1286 1303 ACGGCATTGG 445506 1288 1307 TGCACAGTTT 86 6-8-6 223 1287 1306 GGCATTGGTG 445531 1288 1305 CACAGTTT 90 5-8-5 254 1287 1304 GACGGCATTG 416859 1289 1308 GTGCACAGTT 85 5-10-5 224 1288 1307 GACGGCATTG 445507 1289 1308 GTGCACAGTT 85 6-8-6 224 1288 1307 CGGCATTGGT 445532 1289 1306 GCACAGTT 89 5-8-5 255 1288 1305 GGACGGCATT 413482 1290 1309 GGTGCACAGT 88 5-10-5 115 1289 1308 GGACGGCATT 445508 1290 1309 GGTGCACAGT 81 6-8-6 115 1289 1308 ACGGCATTGG 445533 1290 1307 TGCACAGT 87 5-8-5 256 1289 1306 CGGACGGCAT 416860 1291 1310 TGGTGCACAG 89 5-10-5 225 1290 1309 CGGACGGCAT 445509 1291 1310 TGGTGCACAG 84 6-8-6 225 1290 1309 GACGGCATTG 445534 1291 1308 GTGCACAG 82 5-8-5 257 1290 1307 GCGGACGGCA 416861 1292 1311 TTGGTGCACA 90 5-10-5 226 1291 1310 GCGGACGGCA 445510 1292 1311 TTGGTGCACA 88 6-8-6 226 1291 1310 GGACGGCATT 445535 1292 1309 GGTGCACA 83 5-8-5 258 1291 1308 AGCGGACGGC 416862 1293 1312 ATTGGTGCAC 89 5-10-5 227 1292 1311 AGCGGACGGC 44551 1 1293 1312 ATTGGTGCAC 77 6-8-6 227 1292 1311 CGGACGGCAT 445536 1293 1310 TGGTGCAC 82 5-8-5 259 1292 1309 CAGCGGACGG 416863 1294 1313 CATTGGTGCA 86 5-10-5 228 1293 1312 CAGCGGACGG 445512 1294 1313 CATTGGTGCA 79 6-8-6 228 1293 1312 GCGGACGGCA 445537 1294 1311 TTGGTGCA 78 5-8-5 260 1293 1310 GCAGCGGACG 412225 1295 1314 GCATTGGTGC 86 5-10-5 53 1294 1313 GCAGCGGACG 445513 1295 1314 GCATTGGTGC 85 6-8-6 53 1294 1313 AGCGGACGGC 445538 1295 1312 ATTGGTGC 80 5-8-5 261 1294 131 1 GGCAGCGGAC 416864 1296 1315 GGCATTGGTG 88 5-10-5 229 1295 1314 GGCAGCGGAC 445514 1296 1315 GGCATTGGTG 81 6-8-6 229 1295 1314 CAGCGGACGG 445539 1296 1313 CATTGGTG 79 5-8-5 262 1295 1312 TGGCAGCGGA 416865 1297 1316 CGGCATTGGT 86 5-10-5 230 1296 1315 TGGCAGCGGA 445515 1297 1316 CGGCATTGGT 75 6-8-6 230 1296 1315 GCAGCGGACG 445540 1297 1314 GCATTGGT 74 5-8-5 263 1296 1313 CTGGCAGCGG 416866 1298 1317 ACGGCATTGG 84 5-10-5 231 1297 1316 CTGGCAGCGG 445516 1298 1317 ACGGCATTGG 79 6-8-6 231 1297 1316 GGCAGCGGAC 445541 1298 1315 GGCATTGG 80 5-8-5 264 1297 1314 ACTGGCAGCG 416867 1299 1318 GACGGCATTG 85 5-10-5 232 1298 1317 ACTGGCAGCG 445517 1299 1318 GACGGCATTG 74 6-8-6 232 1298 1317 TGGCAGCGGA 445542 1299 1316 CGGCATTG 83 5-8-5 265 1298 1315 CTGGCAGCGG 445543 1300 1317 ACGGCATT 74 5-8-5 266 1299 1316 Ejemplo 31 : In hibición antisentido dependiente de la dosis del Factor 1 1 humano en células HepG2 Los gapmers del Ejemplo 30 que exhiben inhibición in vitro del Factor 1 1 humano fueron ensayados a varias dosis en células HepG2. Las células se colocaron en placas a una densidad de 20,000 células por pozo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de 1 23.46 nM , 370.37 nM , 1 , 1 1 1 .1 1 nM , 3,333.33 nM y 1 0,000 nM de oligonucleótido antisentido, como se especifica en la Tabla 45. Después de un periodo de tratamiento de aproximadamente 1 6 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de mARN del Factor 1 1 mediante PCR cuantitativa en tiempo real . Se usó RTS 2966 de conjunto de sonda de cebo del Factor 1 1 humano para medir niveles de mARN. Se ajustaron los niveles de mARN del Factor 1 1 de acuerdo con el contenido total de ARN , según medición mediante RI BOGREEN . Los resultados se presentan como porciento de inhibición del Factor 1 1 con relación a células de control no tratadas. Como se ilustra en la Tabla 45, los niveles de mARN del Factor 1 1 se red ujeron en una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótido antisentido.
La concentración inhibitoria media máxima ( I C50) de cada oligonucleótido se calculó graficando la concentración de los oligonucleótidos antisentido usados versus el porciento de inhibición de la expresión de mARN del Factor 1 1 alcanzado en cada concentración y anotando la concentración de oligonucleótido antisentido a la cual se alcanza el 50% de inhibición de la expresión de mARN del Factor 1 1 en comparación con el control de PBS . Los valores de IC50 se presentan en la tabla 45.
Tabla 45 I nhibición antisentido dependiente de la dosis del Factor 1 1 humano en células HepG2 vía trasnfección de oligonucleótidos usando electroporación n .d . = no datos Ej mplo 32: Inhibición antis ntido dependiente de la dosis del Factor 11 humano en células HepG2 mediante oligonucleótidos diseñados por microwaik Se diseñaron gapmers adicionales con base en ISIS 416850 e ISIS 416858 (ver Tabla 8 anterior). Estos gapmers están ligeramente desviados corriente arriba y corriente abajo (es decir, microwaik) de ISIS 416850 e ISIS 416858. Los gapmers diseñados por microwaik tienen motivos 3-8-3 MOE, 4-8-4 MOE, 2-10-2 MOE, 3-10-3 MOE o 4-10-4 MOE.
Estos gapmers fueron ensayados a varias dosis en células HepG2. Las células se colocaron en placas a una densidad de 20,000 células por pozo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de 375 nM, 750 nM, 1,500 nM, 3,000 nM, 6,000 nM y 12,000 nM de oligonucleótido antisentido, como se especifica en la Tabla 47. Después de un periodo de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de mARN del Factor 11 mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó RTS 2966 de conjunto de sonda de cebo del Factor 11 humano para medir niveles de mARN. Se ajustaron los niveles de mARN del Factor 11 de acuerdo con el contenido total de ARN, según medición mediante RIBOGREEN. Los resultados se presentan como porciento de inhibición del Factor 1 con relación a células de control no tratadas.
Se reensayaron in vitro ISIS 416850, ISIS 416858, ISIS 445522 e ISIS 445531 (ver Tabla 45 anterior) junto con los gapemrs microwaik bajo las mismas condiciones antes descritas.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos en la Tabla 46 se designaron como gapemrs 3-8-3 MOE , 4-8-4 MOE, 2-1 0-2 MOE, 3-1 0-3 MOE o 4-1 0-4 MOE . El gapmer 3-8-3 es de 14 nucleótidos de longitud , en donde el segmento de gap central está constituido por ocho 2'-deoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5' y 3' ) por alas que comprenden tres nucleótidos cada una. El gapmer 4-8-4 es de 1 6 nucleótidos de longitud , en donde el segmento de gap central está constituido por ocho 2'-deoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5' y 3') por alas que comprenden cuatro nucleótidos cada una. El gapmer 2-10-2 es de 14 nucleótidos de longitud , en donde el segmento de gap central está constituido por diez 2'-deoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5' y 3' ) por alas que comprenden dos nucleótidos cada una . El gapmer 3-1 0-3 es de 1 6 nucleótidos de longitud , en donde el segmento de gap central está constituido por diez 2'-deoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5' y 3') por alas que comprenden tres nucleótidos cada una. El gapmer 4-1 0-4 es de 1 8 nucleótidos de longitud, en donde el segmento de gap central está constituido por diez 2'-deoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5' y 3') por alas que comprenden cuatro nucleótidos cada una. Para cada uno de los motivos (3-8-3, 4-8-4, 2-1 0-2 , 3-1 0-3 y 4-1 0-4), cada nucleótido en el segmento de ala de 5' y cada nucleótido en el segmento de ala de 3' tiene una modificación 2'-M OE . Los enlaces de internucleósido a través de cada gapmer son enlaces de fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citidina a través de cada gapmer son 5-metilcitidinas. "Sitio de inicio objetivo humano" indica el nucleótido más 5' al cual está apuntado el gapmer en la secuencia humana. "Sitio de alto objetivo humano" indica el nucleótido más 3' al cual está apuntado el gapmer en la secuencia humana . Cada gapmer enlistado en la Tabla 46 está apuntado hacia S EQ I D NO: 1 (No. de Acceso GENBANK NM_0001 28.3). Cada gapmer en la Tabla 46 es también completamente reactivo en cruz con la secuencia del gen del Factor 1 1 del mono Rhesus, designada en la presente como SEQ I D NO: 274 (exones 1 -1 5 No. de Acceso GEN BAN K NW_001 1 1 81 67. ). "Sitio de inicio de mono Rhesus" indica el nucleótido más 5' al cual está apuntado el gapmer en la secuencia del mono Rhesus. "Sito de alto del mono Rhesus" indica el nucleótido más 3' al cual está apuntado el gapmer en la secuencia del mono Rhesus.
Tab la 46 Oligonucleótidos antisentido quiméricos apuntados hacia SEQ I D NO: 1 (No. de Acceso G ENBAN K NM_0001 28.3) y diseñados mediante microwalk de ISIS 41 6850 e IS IS 416858 La información de la inhibición de respuesta a la dosis se da en la Tabla 47. Como se ilustra en la Tabla 47, los niveles de mARN del Factor 11 se redujeron en una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótido antisentido. También se calculó y se presenta en la Tabla 47 el IC5o de cada oligonucleótido antisentido. Los primeros dos gapmers enlistados en la Tabla 47 son los gapmers originales (ISIS 416850 e ISIS 416858) a partir de los cuales se diseñaron los gapmers restantes vía microwalk y están indicados con un asterisco.
Tabla 47 Inhibición antisentido dependiente de la dosis del Factor 11 humano en células HepG2 vía transfección de oligonucleótidos usando electroporación n.d. = no datos Ej mplo 33: Tolerancia de oligonucleótidos antisentido que apuntan al Factor 1 1 humano en ratones CD1 Se trataron ratones CD1 con oligonucleotidos antisentido IS IS que apuntan al Factor 1 1 humano y se evaluaron para cambios en los niveles de varios marcadores metabólicos.
Tratamiento Grupos de cinco ratones CD1 se inyectaron de manera subcutánea dos veces por semana durante 2, 4 o 6 semanas con 50 mg/kg de IS IS 416825, ISIS 416826, ISIS 416838, ISIS 41 6850, ISIS 41 6858, IS IS 41 6864, ISIS 416892 , ISIS 41 6925, I SIS 41 6999, ISI S 41 7002 o ISIS 41 7003. Un grupo de control de cinco ratones se inyectó de manera subcutánea con PBS durante dos semanas. Todos los grupos experimentales (es decir, ratones tratados con ASO en 2, 4, 6 semanas) se compararon con el grupo de control (es decir, PBS, dos semanas).
Tres d ías después de que se administró la última dosis a todos los grupos, los ratones fueron sacrificados. Se registraron los pesos de los órganos y se recogió sangre para análisis posteriores.
Peso de Organos Se determinaron los pesos del hígado, bazo y riñon al final del estudio y se presentan en las Tablas 48, 49 y 50 como un porciento del control de PBS, normalizados con el peso corporal . Estos oligonucleotidos antisentido que no afectaron más de seis veces de incremento en el peso del hígado y el bazo ante los controles de PBS fueron seleccionados para estudios adicionales.
Tabla 48 Cambio de porciento en el peso del h ígado de ratones CD1 después del tratamiento con oligonucleótido antisentido Tab la 49 Cambio de porciento en el peso del bazo de ratones CD 1 después del tratamiento con oligonucleótido antisentido 417002 +29 +26 +108 416892 +24 +30 +65 417003 +12 +101 +98 Tabla 50 Cambio de porciento en el peso del riñon de ratones CD1 después del tratamiento con oligonucleótido antisentido F u nción del H ígado Para evaluar el efecto de oligonucleótidos IS IS sobre la función hepática, se midieron las concentraciones en plasma de transaminasas usando un analizador de química clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Las mediciones de alanina transaminasa (ALT) y aspartato transaminasa (AST) se expresan en I U/L y los resultados se presentan en las Tablas 51 y 52. Se midieron también los niveles en plasma de bilirrubina y albúmina usando el mismo analizador de qu ímica cl ínico, y expresados en mg/d L. Los resultados se presentan en las Tablas 53 y 54. Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron un incremento en los niveles de ALT/AST por arriba de siete veces de los niveles de control se seleccionaron para estudios posteriores. Aquellos oligonucleótidos antisentido que no incrementaron los niveles de bilirrubina en más de dos veces de los niveles de control se seleccionaron para estudios posteriores.
Tabla 51 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre ALT ( I U/L) en ratones CD1 n .d. = no datos Tabla 52 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre AST (IU/L) en ratones CD1 n.d. = no datos Tabla 53 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre bilirrubina (mg/dL) en ratones CD1 ISIS 416850 0.46 0.23 0.22 ISIS 416858 0.57 0.24 0.16 ISIS 416864 0.40 0.26 0.22 ISIS 416925 0.45 0.25 0.25 ISIS 416999 0.48 0.18 0.28 ISIS 417002 0.50 0.25 0.29 ISIS 416892 0.38 2.99 0.50 ISIS 417003 0.33 0.15 0.24 n.d. = no datos Tabla 54 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre albúmina (mg/dL) en ratones CD 1 n .d. = no datos Función del Ri ñon Para evaluar el efecto de oligonucleotidos IS IS sobre la función del riñon , se midieron las concentraciones en plasma de nitrógeno de urea de la sangre (BUN ) y creatinina usando un analizador de qu ímica cl ínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en las Tablas 55 y 56, expresados en mg/d L. Aquellos oligonucleotidos antisentido que no afectaron en más de dos veces el incremento en los niveles de B UN en comparación con el control de PBS se seleccionaron para estudios posteriores.
Tabla 55 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre BUN (mg/dL) en ratones CD 1 n .d. = no datos Tabla 56 Efecto del tratamiento con oligonucleotido antisentido sobre creatini na (mg/dL) en ratones CD1 n .d. = no datos Ensayos de Hematolog ía La sangre obtenida de todos los grupos de ratones se envió a Antech Diagnostics for hematocrit (HCT), para mediciones y análisis de volumen corpuscular medio (MCV), hemoglobina corpuscular media (MCH) y concentración de hemoglobina corpuscular media , así como también mediciones de varias células sanguíneas, tales como WBC (neutrófilos, linfocitos y monocitos), RBC y plaquetas y contenido total de hemoglobina . Los resultados se presentan en las Tablas 57 a 67.
Los porcentajes dados en las Tablas indican el porciento del conteo total de células sanguíneas. Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron una disminución en el conteo de plaquetas de más de 50% y/o un incremento en el conteo de monocitos de más de tres veces se seleccionaron para estudios posteriores.
Tabla 57 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre HCT (% ) en ratones CD1 n .d. = no datos Tabla 58 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre MCB (fL) en ratones CD1 2 semanas 4 semanas 6 semanas PBS 61 n.d. n.d.
ISIS 416825 58 53 51 ISIS 416826 56 52 53 ISIS 416838 56 54 48 ISIS 416850 57 51 50 ISIS 416858 59 51 50 ISIS 416864 57 52 51 ISIS 416925 61 52 47 ISIS 416999 60 49 48 ISIS 417002 61 50 52 ISIS 416892 59 49 53 ISIS 417003 60 48 45 n .d . = no datos Tab la 59 Efecto del tratamiento con ol igonucleótido antisentido sobre MCH (pg ) en ratones CD 1 ISIS 416999 17 16 15 ISIS 417002 17 16 16 ISIS 416892 18 16 16 ISIS 417003 17 16 16 n .d. = no datos Tab la 60 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre MCHC (% ) en ratones CD1 n.d. = no datos Tab la 61 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre el conteo de WBC (células/nL) en ratones CD1 2 semanas 4 semanas 6 semanas PBS 6 n.d. n.d.
ISIS 416825 8 8 6 ISIS 416826 5 6 8 ISIS 416838 4 6 5 ISIS 416850 4 5 5 ISIS 416858 6 7 4 ISIS 416864 7 6 5 ISIS 416925 6 6 1 1 ISIS 416999 4 9 7 ISIS 417002 8 8 16 ISIS 416892 5 8 9 ISIS 417003 7 9 10 n .d . = no datos Tabla 62 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre el conteo de RBC (células/pL) en ratones CD 1 ISIS 416999 9 9 8 ISIS 417002 9 9 10 ISIS 416892 7 9 9 ISIS 417003 8 9 10 n.d. = no datos Tabla 63 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre el conteo de neutrófilos (%) en ratones CD1 n.d. = no datos Tabla 64 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre el conteo de linfocitos (%) en ratones CD1 2 semanas 4 semanas 6 semanas PBS 81 n.d. n.d.
ISIS 416825 82 53 71 ISIS 416826 70 61 67 ISIS 416838 76 64 60 ISIS 416850 82 73 76 ISIS 416858 83 73 65 ISIS 416864 84 71 74 ISIS 416925 86 58 57 ISIS 416999 86 72 69 ISIS 417002 83 64 51 ISIS 416892 79 52 64 ISIS 417003 86 54 66 n .d . = no datos Tab la 65 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre el co nteo de monocitos (% ) en ratones CD 1 ISIS 416999 2 4 8 ISIS 417002 3 4 12 ISIS 416892 3 6 7 ISIS 417003 2 6 8 n.d. = no datos Tabla 66 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre el conteo de plaquetas (células/nL) en ratones CD1 n.d. = no datos Tabla 67 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre el contenido de hemoglobina (g/dL) en ratones CD1 2 semanas 4 semanas 6 semanas PBS 15.1 n.d. n.d.
ISIS 416825 14.5 14.1 12.1 ISIS 416826 13.4 12.8 11.0 ISIS 416838 12.4 13.6 12.6 ISIS 416850 13.1 13.5 11.6 ISIS 416850 13.1 13.5 11.6 ISIS 416858 14.8 14.2 14.1 ISIS 416864 15.2 13.9 13.0 ISIS 416925 14.9 14.8 15.3 ISIS 416999 14.2 13.3 12.8 ISIS 417002 14.7 14.0 15.7 ISIS 416892 13.0 13.5 13.1 ISIS 417003 13.7 13.4 14.0 n.d. = no datos Ejemplo 34: Medición de la vida media del oligonucleótido antisentido en hígado de ratones CD1 Se trataron ratones CD1 con oligonucleótidos antisentido ISIS que están dirigidos al Factor 11 humano y se evaluó la vida media del oligonucleótido así como también el tiempo transcurrido para la degradación del oligonucleótido y la eliminación del hígado.
Tratamiento Grupos de quince ratones CD1 se inyectaron, cada uno, de manera subcutánea dos veces por semana durante dos semanas con 50 mg/kg de ISIS 416825, ISIS 416826, ISIS 416838, ISIS 416850, ISIS 416858, ISIS 416864, ISIS 416892, ISIS 416925, ISIS 416999, ISIS 417002 o ISIS 417003. Cinco ratones de cada grupo fueron sacrificados 3 días, 28 días y 56 días después de la dosis final. Los hígados se cultivaron para análisis.
Medición de la Concentración de Oligonucleótido Se midió la concentración del oligonucleótido de longitud completa así como también la concentración total de oligonucleótido (incluyendo la forma degradada). El método usado es una modificación de los métodos publicados previamente (Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999) que consiste de una extracción con fenol-cloroformo (liquidólíquido) seguido por una extracción en fase sólida. Se agregó un estándar interno (ISIS 355868, un oligonucleótido de fosforotioato modificado con 27-mer 2'-0-metoxietilo, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, designado en la presente como SEQ ID NO: 270) antes de la extracción. Se calcularon las concentraciones de muestra de tejido usando curvas de calibración, con un límite inferior de cuantificación (LLOQ) de aproximadamente 1.14 pg/g. Después se calcularon las vidas medias usando software WinNonlin (PHARSIGHT).
Los resultados se presentan en las Tablas 68 y 69, expresados como pg/g de tejido de hígado. La vida media de cada oligonucleótido se presenta en la Tabla 70.
Tabla 68 Concentración de oligonucleótido de longitud completa (pg/g) hígado de ratones CD1 ISIS No. Motivo día 1 día 28 día 56 416825 5-10-5 151 52 7 416826 5-10-5 186 48 8 416838 5-10-5 170 46 10 416850 5-10-5 238 93 51 416858 5-10-5 199 102 18 416864 5-10-5 146 38 25 416999 2-13-5 175 26 0 417002 2-13-5 1 19 24 1 417003 2-13-5 245 42 4 416925 3-14-3 167 39 5 416892 3-14-3 135 31 6 Tabl a 69 Concentración total de ol igonucleótido ( pg/g ) en el h ígado de ratones CD 1 ISIS No. Motivo día 1 día 28 día 56 416825 5-10-5 187 90 39 416826 5-10-5 212 61 12 416838 5-10-5 216 98 56 416850 5-10-5 295 157 143 416858 5-10-5 273 185 56 416864 5-10-5 216 86 112 416999 2-13-5 232 51 0 417002 2-13-5 206 36 1 417003 2-13-5 353 74 4 416925 3-14-3 280 72 8 416892 3-14-3 195 54 6 Tabla 70 Vida media de oligonucleótidos antisentido en el hígado de ratones CD1 Ejemplo 35: Tolerancia de los oligonucleótidos antisentido que apuntan al Factor 11 humano en ratas Sprague-Dawley Se trataron ratas Sprague-Dawley con oligonucleótidos antisentido ISIS que apuntan al Factor 11 humano y se evaluaron para cambios en los niveles de varios marcadores metabólicos.
Tratamiento Grupos de cuatro ratas Sprague-Dawley se inyectaron de manera subcutánea dos veces por semana durante 6 semanas con 50 mg/kg de ISIS 416825, ISIS 416826, ISIS 416838, ISIS 416850, ISIS 416858, ISIS 416848, ISIS 416864, ISIS 416892, ISIS 416925, ISIS 416999, ISIS 41 7002 o IS IS 41 7003. Un grupo de control de cuatro ratas Sprague-Dawley se inyectó de manera subcutánea con PBS dos veces por semana durante 6 semanas. Se tomaron mediciones de peso corporal antes y durante el periodo de tratamiento. Se tomaron muestras de ori na antes del inicio del tratamiento. Tres d ías después de la última dosis, se tomaron muestras de orina y las ratas se sacrificaron. Se midieron los pesos de los órganos y se recolectó sangre para análisis posterior.
Peso Corporal y Peso de Organos Se midieron los pesos corporales de las ratas en el comienzo del estudio y subsiguientemente dos veces por semana. Los pesos corporales se presentan en la Tabla 71 y se expresan como un porciento de cambio sobre los pesos tomados en el inicio del estudio . Se midieron los pesos de hígado, bazo y riñon al final del estudio y se presentan en la Tabla 71 como un porciento del control de salina normalizado al peso corporal . Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron en más de seis veces de incremento en el peso del h ígado y el bazo sobre el control de PBS se seleccionaron para estudios posteriores.
Tabla 71 Porciento de cambio en peso de órganos de ratas Sprague-Dawley después del tratamiento con oligonucleótido antisentido 416826 +81 +537 +44 -40 416838 +8 +212 -0.5 -23 416850 +23 +354 +47 -33 416858 +8 +187 +5 -21 416864 +16 +204 +16 -24 416925 +44 +371 +48 -32 416999 +51 +405 +71 -37 417002 +27 +446 +63 -29 416892 +38 +151 +32 -39 417003 +51 +522 +25 -40 Función del Hígado Para evaluar el efecto de oligonucleótidos IS IS sobre la función hepática, se midieron las concentraciones en plasma de transminasas usando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Las mediciones de alani na transminasa (ALT) y aspartato transminasa (AST) se expresan en I U/L y los resultados se presentan en la Tabla 72. Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron en un incremento en los niveles de ALT/AST por arriba de siete veces de los niveles de control se seleccionaron para estudios posteriores. Se midieron también los niveles en plasma de bilirrubina y albúmina con el mismo analizador cl ínico y los resultados se presentan también en la Tabla 72 , expresados en mg/dL. Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron en un incremento en los niveles de bilirrubina de más de dos veces de los niveles de control por el tratamiento de oligonucleótido antisentido se seleccionaron para estudios posteriores.
Tabla 72 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre los marcadores metabólicos en el hígado de ratas Sprague-Dawley F un ció n del Ri ño n Para evaluar el efecto de la función del riñon , se midieron las concentraciones en plasma de nitrógeno de urea sangu ínea (BUN ) y creatinina usando un analizador de química cl ínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la Tabla 73, expresados en mg/dL. Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron en más de dos veces de incremento de los niveles de BUN en comparación con el control de PBS fueron seleccionados para estudios posteriores. Se calculó también la proporción de proteína en orina a creatinina en las muestras totales de orina antes y después del tratamiento con oligonucleótido antisentido y se presenta en la Tabla 74. Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron en más de cinco veces de incremento en las proporciones de proteína en orina/creatinina en comparación con el control de PBS se seleccionaron para estudios posteriores.
Tab la 73 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre los marcadores metabólicos en el riñon de ratas Sprague-Dawley Tabl a 74 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre la proporción de proteína en orina/creatinina en ratas Sprague-Dawley Ensayos de Hematolog ía Sangre obtenida de todos los grupos de ratas se enviaron a Antech Diagnostics para mediciones y análisis de hematocritos (HCT), volumen corpuscular medio (MCV), hemoglobina corpuscular media ( CV) y concentración media de hemoglobina corpuscular (MCHC), así como también mediciones del varias células de la sangre , tales como WBC (neutrófilos, linfocitos y monocitos), RBC y plaquetas así como también el contenido de hemoglobina. Los resultados se presentan en las Tablas 75 y 76. Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron en una disminución en el conteo de plaquetas de más de 50% y en un aumento en el conteo de monocitos de más de tres veces, se seleccionaron para estud ios posteriores.
Tabla 75 Efecto del tratamiento con oligonucleotido antisentido sobre el conteo de cél ulas de sangre en ratas Sprague-Dawley Tabla 76 Efecto del tratamiento con ol igonucleotido antisentido en factores hematológicos (% control ) en ratas Sprague-Dawley Hemoglobina HCT MCV MCH (pg) MCHC (%) (9/dL) (%) (fL) PBS 6 4 6 2 4 ISIS 416825 2 2 4 2 4 ISIS 416826 7 7 6 3 4 ISIS 416838 2 5 4 2 5 ISIS 416850 4 5 3 4 2 ISIS 416858 2 3 2 2 1 ISIS 416864 4 2 4 2 4 ISIS 416925 6 8 5 2 4 ISIS 416999 6 5 2 3 1 ISIS 417002 5 7 7 3 5 ISIS 416892 14 13 1 2 0 ISIS 417003 11 8 6 4 4 Ejemplo 36: Medición de la vida media de oligonucleótido antisentido en hígado y riñon de ratas Sprague-Dawley Se trataron ratas Sprague-Dawley con oligonucleótidos antisentido ISIS dirigidos al Factor 11 humano y se evaluó la vida media del oligonucleótido así como también el tiempo transcurrido para la degradación y eliminación del oligonucleótido del hígado y del riñon. Tratamiento Grupos de cuatro ratas Sprague-Dawley cada uno se inyectaron de manera subcutánea dos veces por semana durante 2 semanas con 20 mg/kg de ISIS416825, ISIS 416826, ISIS 416838, ISIS 416850, ISIS 416858, ISIS 416864, ISIS 416892, ISIS 416925, ISIS 416999, ISIS 417002 o ISIS 417003. Tres días después de la última dosis, las ratas se sacrificaron y se recolectaron los hígados y los ríñones para análisis.
Medición de la Concentración de Oligonucleótidos Se midió la concentración del oligonucleótido de longitud completa así como también la concentración total de oligonucleótido (incluyendo la forma degradada). El método usado es una modificación de métodos previamente publicados (Leeds et al . , 1 996; Geary et al . , 1 999) que consiste de una extracción con fenol-cloroformo (líquido-líquido) seguido por una extracción de fase sólida . Se agregó un estándar interno ( ISIS 355868, un oligonucleótido de fosforotioato modificado con 27-mer 2'-0-metoxietilo , GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, designado en la presente como SEQ I D NO : 270) antes de la extracción . Se calcularon las concentraciones de muestras de tejidos usando curvas de calibración , con un límite inferior de cuantificación (LLOQ) de aproximadamente 1 .14 pg/g . Los resultados se presentan en las Tablas 77 y 78, expresados como pg/g de tejido de hígado o de riñon. Se calcularon después las vidas medias usando software WinNolin (PHARS IGHT).
Tabla 77 Concentración (pg/g) de oligonucleótido de longitud completa en el h ígado y el riñon de ratas Sprague-Dawley ISIS No. Motivo Riñon Hígado 416825 5-10-5 632 236 416826 5-10-5 641 178 416838 5-10-5 439 171 416850 5-10-5 259 292 416858 5-10-5 575 255 416864 5-10-5 317 130 416999 2-13-5 358 267 417002 2-13-5 291 118 417003 2-13-5 355 199 416925 3-14-3 318 165 416892 3-14-3 351 215 Tabla 78 Concentración total (pg/g) de oligonucleótido en el h ígado y el riñon de ratas Sprague-Dawley Tabla 79 Vida media (días) de oligonucleótidos I SI S en el h ígado y el riñon de ratas Sprague-Dawley ISIS No. Motivo Vida media 416825 5-10-5 16 416826 5-10-5 13 416838 5-10-5 13 416850 5-10-5 18 416858 5-10-5 26 416864 5-10-5 13 416999 2-13-5 9 417002 2-13-5 11 417003 2-13-5 10 416925 3-14-3 12 416892 3-14-3 12 Ejemplo 37: Tolerancia de oligonucleótidos antisentido que apuntan al Factor 11 humano en ratones CD1 Se trataron ratones CD1 con oligonucleótidos antisentido ISIS que apuntan al Factor 11 humano y se evaluaron para cambios en los niveles de varios marcadores metabólicos.
Tratamiento Grupos de cinco ratones CD1, cada uno, se inyectaron de manera subcutánea dos veces por semana durante 6 semanas con 50 mg/kg de ISIS 412223, ISIS 412224, ISIS 412225, ISIS 413481, ISIS 413482, ISIS 416848, ISIS 416849, ISIS 416850, ISIS 416851, ISIS 416852, ISIS 416853, ISIS 416854, ISIS 416855, ISIS 416856, ISIS 416857, ISIS 416858, ISIS 416859, ISIS 416860, ISIS 416861, ISIS 416862, ISIS 416863, ISIS 416864, ISIS 416865, ISIS 41686 o ISIS 416867. Un 2 grupo de control de diez ratones CD1 se inyectó de manera subcutánea con PBS dos veces por semana durante 6 semanas . Se tomaron mediciones de peso corporal antes y durante el periodo de tratamiento. Tres d ías después de la última dosis, los ratones se sacrificaron , se midieron los pesos de los órganos y se recolectó la sangre para análisis posterior.
Peso Corporal y Pesos de los Org anos Se midió el peso corporal en el comienzo del estudio y subsiguientemente dos veces por semana. Los pesos corporales de los ratones se presentan en la Tala 80 y expresan el incremento en gramos sobre el peso del control de PBS tomado antes del inicio del tratamiento. Se midieron los pesos del hígado, el bazo y el riñon al final del estudio, y se presentan también en la Tabla 80 como porcentaje del peso corporal . Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron en más de seis veces de i ncremento en el peso del h ígado y el bazo por arriba del control de PBS se seleccionaron para estudios posteriores.
Tab l a 80 Cambio en pesos de cuerpo y órganos de ratones CD 1 después del tratamiento con oligonucleótido antisentido ISIS 416864 5 1.6 0.3 12 ISIS 412223 6 1.5 0.4 12 ISIS 412224 6 1.6 0.5 10 ISIS 412225 6 1.5 0.4 10 ISIS 413481 6 1.5 0.5 9 ISIS 413482 6 1.6 0.5 1 1 ISIS 416848 6 1.5 0.4 1 1 ISIS 416849 8 1.5 0.4 8 ISIS 416851 7 1.5 0.5 1 1 ISIS 416852 6 1.5 0.4 10 ISIS 416853 8 1.5 0.7 13 ISIS 416854 7 1.2 0.4 13 ISIS 416855 8 1.4 0.6 12 ISIS 416856 6 1.4 0.4 10 ISIS 416857 7 1.6 0.5 10 ISIS 416859 6 1.5 0.4 10 ISIS 416860 6 1.4 0.4 10 ISIS 416861 5 1.3 0.4 9 ISIS 416862 6 1.5 0.4 10 ISIS 416863 5 1.5 0.4 9 ISIS 416865 6 1.5 0.4 8 ISIS 416866 5 1.6 0.4 10 ISIS 416867 5 1.4 0.4 9 Fu nción del H ígado Para eval uar el efecto de ol igon ucleótidos I S I S sobre la funció n hepática , se midieron las concentraciones en plasma de trasminasas usando un analizador de qu ímica cl ínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Las mediciones de alanina transminasa (ALT) y aspartato transminasa (AST) se expresan en I U/L y los resultados se presentan en la Tabla 81 . Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron en un incremento en los niveles de ALT/AST por arriba de siete veces de los niveles del control se seleccionaron para estudios posteriores. Se midieron también los niveles en plasma de bilirrubina, colesterol y albúmina usando el mismo analizador de química cl ínica y se presentan en la Tabla 81 expresados en mg/d L. Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron en un incremento en los niveles de bilirrubina de más de dos veces los niveles de control por el tratamiento con oligonucleótido antisentido se seleccionaron para estudios posteriores.
Tab la 81 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre marcadores metabólicos en el h ígado de ratones CD 1 ISIS 413481 85 143 0.18 3.2 153 ISIS 413482 54 77 0.24 3.0 138 ISIS 416848 153 153 0.19 3.1 151 ISIS 416849 1056 582 0.22 2.5 109 ISIS 416851 47 76 0.19 3.1 106 ISIS 416852 49 91 0.16 4.9 125 ISIS 416853 1023 1087 0.25 3.1 164 ISIS 416854 1613 1140 0.21 5.5 199 ISIS 416855 786 580 0.25 4.2 162 ISIS 416856 130 129 0.23 5.2 109 ISIS 416857 370 269 0.22 3.7 94 ISIS 416859 214 293 0.20 4.2 160 ISIS 416860 189 160 0.23 3.5 152 ISIS 416861 38 85 0.27 4.3 133 ISIS 416862 225 172 0.36 3.9 103 ISIS 416863 41 101 0.24 3.6 118 ISIS 416865 383 262 0.27 4.1 95 ISIS 416866 36 120 0.29 4.3 113 ISIS 416867 45 82 0.21 3.3 144 Función del Riñon Para evaluar el efecto de oligonucleótidos ISIS sobre la función del riñon, se midieron las concentraciones en plasma de nitrógeno de urea en sangre (BUN) usando un analizador de química clínica automatizado y los resultados se presentan en la Tabla 82 expresados en mg/dL. Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron en más de dos veces de incremento en los niveles de BUN en comparación con el control de PBS se seleccionaron para estudios posteriores.
Tabla 82 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre los niveles de B U N (mg/dL) en el ri ñon de ratones CD 1 ISIS 416861 23 ISIS 416862 21 ISIS 416863 22 ISIS 416865 20 ISIS 416866 22 ISIS 416867 20 Ensayos de Hematolog ía La sangre obtenida de todos los grupos de ratones se envió a Antech Diagnositcs para mediciones de hematocritos (HCT), así como también mediciones de varias células de sangre, tales como WBC (neutrófilos, linfocitos y monocitos), RBC y plaquetas así como también el análisis de contenido total de hemoglobina . Los resultados se presentan en las Tablas 83 y 84. Se seleccionaron aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron en una disminución del conteo de plaquetas de más de 50% y un incremento en el conteo de monocitos de más de tres veces para estudios posteriores.
Tabla 83 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre factores hematológicos en ratones CD1 ISIS 412223 9 15 48 7 ISIS 412224 10 15 50 9 ISIS 412225 9 15 50 7 ISIS 413481 9 13 45 7 ISIS 413482 10 15 50 8 ISIS 416848 9 14 47 7 ISIS 416849 9 14 48 9 ISIS 416851 9 14 47 6 ISIS 416852 9 14 49 5 ISIS 416853 1 1 17 56 8 ISIS 416854 9 13 43 12 ISIS 416855 9 14 50 6 ISIS 416856 9 14 47 5 ISIS 416857 10 15 53 6 ISIS 416859 10 15 49 6 ISIS 416860 10 15 51 7 ISIS 416861 9 14 48 7 ISIS 416862 9 14 49 6 ISIS 416863 9 14 48 7 ISIS 416865 9 14 50 7 ISIS 416866 9 15 51 6 ISIS 416867 10 14 47 8 Tabla 84 Efecto del tratamiento con ol igonucleótido anti sentido sobre el conteo de cél u las sangu íneas en ratones CD 1 Neutrófilos Linfocitos Monocitos Plaquetas (células/µ?-) (células/µ-.) (células/µ-.) (103/µ?-) PBS 1023 6082 205 940 ISIS 416850 1 144 4004 156 916 ISIS 416858 2229 5480 248 782 ISIS 416864 973 3921 141 750 ISIS 412223 1756 4599 200 862 ISIS 412224 2107 6284 195 647 ISIS 412225 1547 4969 293 574 ISIS 413481 1904 4329 204 841 ISIS 413482 1958 5584 275 818 ISIS 416848 1264 5268 180 953 ISIS 416849 1522 6967 253 744 ISIS 416851 1619 4162 194 984 ISIS 416852 1241 3646 189 903 ISIS 416853 2040 5184 225 801 ISIS 416854 2082 9375 455 1060 ISIS 416855 1443 4236 263 784 ISIS 416856 1292 3622 151 753 ISIS 416857 1334 3697 215 603 ISIS 416859 1561 4363 229 826 ISIS 416860 1291 4889 161 937 ISIS 416861 1 122 51 19 219 836 ISIS 416862 1118 4445 174 1007 ISIS 416863 1330 5617 226 1131 ISIS 416865 1227 5148 315 872 ISIS 416866 1201 4621 21 1 1045 ISIS 416867 1404 6078 188 1006 Ejemplo 38: Medición de la vida media de oligonucleótido antisentido en el hígado de ratón CD1 Quince oligonucleótidos antisentido que habían sido evaluados en ratones CD1 (Ejemplo 37) se evaluaron adicionalmente. Los ratones CD1 se trataron con oligonucleótidos antisentido ISIS y se evaluó la vida media del oligonucleótido así como también el tiempo transcurrido para la degradación y eliminación de oligonucleótido en el hígado.
Tratamiento Grupos de quince ratones CD1 se inyectaron, cada uno, de manera subcutánea dos veces por semana durante dos semanas con 50 mg/kg de ISIS 412223, ISIS 412225, ISIS 413481, ISIS 413482, ISIS 416851, ISIS 416852, ISIS 416856, ISIS 416860, ISIS 416861, ISIS 416863, ISIS 416866, ISIS 416867, ISIS 412224, ISIS 416848 o ISIS 416859. Cinco ratones de cada grupo se sacrificaron a los 3 días, 28 días y 56 días después de la última dosis, los hígados se recolectaron para análisis.
Medición de la Concentración de Oligonucleótido Se midió la concentración del oligonucleótido de longitud completa. El método usado es una modificación de métodos publicados previamente (Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999) que consiste de una extracción con fenol-cloroformo (líquido-líquido) seguida por una extracción de fase sólida. Se agregó un estándar interno (ISIS 355868, un oligonucleótido de fosforotioato modificado con 27-mer 2'-0- metoxietilo, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, designado en la presente como SEQ I D NO: 270) antes de la extracción . Se calcularon las concentraciones de muestras de tejidos usando curvas de calibración con un límite inferior de cuantificación (LLOQ) de aproximadamente 1 .1 .4 pg/g . Los resultados se presentan en la Tabla 85 expresados como pg/g de tejido de hígado. La vida media de cada oligonucleótido se presenta también en la Tabla 85.
Tabla 85 Concentración de oligonucleótido de longitud completa y vida media en el hígado de ratones CD 1 ISIS No Motivo día 3 día 28 día 56 Vida media (días) 412223 5-10-5 276 127 52 21.9 412224 5-10-5 287 111 31 16.6 412225 5-10-5 279 91 47 20.7 413481 5-10-5 185 94 31 20.6 413482 5-10-5 262 95 40 19.5 416848 5-10-5 326 147 68 23.5 416851 5-10-5 319 147 68 23.8 416852 5-10-5 306 145 83 28.4 416856 5-10-5 313 115 46 19.2 416859 5-10-5 380 156 55 19.0 416860 5-10-5 216 96 36 20.6 416861 5-10-5 175 59 39 24.5 416863 5-10-5 311 101 48 19.8 416866 5-10-5 246 87 25 16.0 416867 5-10-5 246 87 35 18.9 Ejemplo 39: Tolerancia de oligonucleótidos antisentido que apuntan al Factor 11 humano en ratas Sprague-Dawley Quince oligonucleótidos antisentido que habían sido evaluados en ratones CD1 (Ejemplo 37) se evaluaron adicionalmente en ratas Sprague-Dawley para cambios en los niveles de varios marcadores metabólicos.
Tratamiento Grupos de cuatro ratas Sprague-Dawley se inyectaron, cada una, de manera subcutánea dos veces por semana durante 6 semanas con 50 mg/kg de ISIS 412223, ISIS 412224, ISIS 412225, ISIS 413481, ISIS 413482, ISIS 416848, ISIS 416851, ISIS 416852, ISIS 416856, ISIS 416859, ISIS 416860, ISIS 416861, ISIS 416863, ISIS 416866 o ISIS 416867. Un grupo de control de cuatro ratas Sprague-Dawley se inyectó de manera subcutánea con PBS dos veces por semana durante 6 semanas. Se tomaron mediciones de peso corporal antes y durante el periodo de tratamiento. Tres días después de la última dosis, se recolectaron muestras de orina y después se sacrificaron las ratas, se midieron los pesos de los órganos y se recolectó sangre para análisis posterior.
Peso Corporal y Pesos de los Organos Se midieron los pesos corporales de las ratas en el comienzo del estudio y subsiguientemente dos veces por semana. Los pesos corporales se presentan en la Tabla 86 y se expresan como incrementos en gramos sobre el peso del control de PBS antes del inicio del tratamiento. Se midieron los pesos del hígado, el bazo y el riñon al final del estudio y se presentan también en la Tabla 86 como un porcentaje del peso corporal . Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron en más de seis veces de incremento en el peso del hígado y el bazo por arriba del control de PBS se seleccionaron para estudios posteriores.
Tab la 86 Cambio en peso corporal y de órganos de ratas Sprague-Dawley después del tratamiento con oligonucleótido antisentido Fun ción del H ígado Para evaluar el efecto de oligonucleótidos IS IS sobre la función hepática, se midieron las concentraciones en plasma de transminasas usando un analizador de qu ímica clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Las mediciones de alanina transminasa (ALT) y aspartato transminasa (AST) se expresan en I U/L y los resultados se presentan en la Tabla 87. Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron en un incremento en los niveles de ALT/AST por arriba de 7 veces de los niveles de control se seleccionaron para estudios posteriores. Se midieron también los niveles en plasma de bilirrubina y albúmina usando el mismo analizador de qu ímica cl ínica y los resultados se presentan en la Tabla 87 expresados en mg/dL. Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron en un incremento en los niveles de bilirrubina de más de dos veces los niveles de control por el tratamiento con oligonucleótido antisentido se seleccionaron para estud ios posteriores.
Tabla 87 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre marcadores metabólicos en el h ígado de ratas Sprague-Dawley ALT AST Bilirrubina Albúmina (IU/L) (IU/L) (mg/dL) (mg/dL) PBS 42 71 0.13 4 ISIS 412223 85 180 0.14 5 ISIS 412224 84 132 0.12 4 ISIS 412225 48 108 0.15 5 ISIS 413481 54 80 0.22 4 ISIS 413482 59 157 0.14 4 ISIS 416848 89 236 0.14 3 ISIS 416851 64 91 0.14 4 ISIS 416852 49 87 0.15 4 ISIS 416856 123 222 0.13 4 ISIS 416859 114 206 0.21 5 ISIS 416860 70 157 0.15 4 ISIS 416861 89 154 0.15 5 ISIS 416863 47 78 0.13 4 ISIS 416866 41 78 0.16 4 ISIS 416867 47 126 0.17 4 Función del Riñon Para evaluar el efecto de oligonucleótidos IS IS sobre la función del riñon , se midieron las concentraciones en plasma de nitrógeno de urea sanguínea (B UN ) y creatinina usando un analizador de qu ímica cl ínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la Tabla 88, expresados en mg/dL . Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron en más de un aumento de dos veces en los niveles de BUN en comparación con el control de PBS , se seleccionaron para estudios posteriores. Se calcularon la proteína total en orina y la proporción de proteína en orina a creatinina en muestras de orina total después del tratamiento con oligonucleótido antisentido y se presentan también en la Tabla 88. Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron en más de cinco veces de aumento en las proporciones de proteína en orina/creatinina en comparación con el control de PBS, se seleccionaron para estudios posteriores.
Tabla 88 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre marcadores metabólicos en el riñon de ratas Sprague-Dawley Proteína total Proporción de BUN Creatinina en orina proteína en (mg/dL) (mg/dL) (mg/dL) orina/creatinina PBS 19 38 60 1.7 ISIS 412223 24 46 224 4.6 ISIS 412224 24 44 171 3.8 ISIS 412225 23 58 209 4.0 ISIS 413481 26 45 148 3.6 ISIS 413482 23 34 157 4.8 ISIS 416848 26 64 231 3.9 ISIS 416851 24 70 286 4.0 ISIS 416852 25 60 189 3.0 ISIS 416856 23 48 128 2.7 ISIS 416859 24 44 144 3.3 ISIS 416860 23 58 242 4.6 ISIS 416861 22 39 205 5.1 ISIS 416863 29 73 269 3.8 ISIS 416866 22 85 486 6.2 ISIS 416867 22 70 217 3.1 Ensayos de Hematología Sangre obtenida de todos los grupos de ratas se envió a Antech Diagnostics para mediciones de hematocritos (HCT) así como también mediciones de varias células de sangre, tales como WBC (neutrófilos y linfocitos), RBC y plaquetas y contenido total de hemoglobina . Los resultados se presentan en las Tablas 89 y 90. Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron en una disminución en el conteo de plaquetas de más de 50% y un aumento en el conteo de monocitos de más de tres veces, se seleccionaron para estudios posteriores .
Tabla 89 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre factores hematológicos en ratas Sprague-Dawley RBC Hemoglobina HCT WBC (106/mL) (9/dL) (%) (103/ml_) PBS 6.9 13.2 42 9 ISIS 412223 7.2 13.1 41 20 ISIS 412224 7.4 13.4 42 20 ISIS 412225 7.4 13.4 42 15 ISIS 413481 7.5 14.2 43 14 ISIS 413482 7.1 13.2 40 13 ISIS 416848 6.0 1 1.1 35 17 ISIS 416851 7.4 13.7 42 11 ISIS 416852 7.2 13.4 42 13 ISIS 416856 7.7 14.1 43 19 ISIS 416859 7.8 14.0 45 16 ISIS 416860 7.8 14.1 45 17 ISIS 416861 7.7 14.6 45 15 ISIS 416863 7.6 14.1 45 17 ISIS 416866 7.8 14.0 44 20 ISIS 416867 7.8 14.0 45 14 Tabla 90 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre el conteo de cél ulas sang u íneas en ratas Sprag ue-Dawl ey ISIS 416856 3280 14328 740 ISIS 416859 1414 14323 853 ISIS 416860 1841 13986 669 ISIS 416861 1813 12865 1008 ISIS 416863 1720 14669 674 ISIS 416866 1916 16834 900 ISIS 416867 3044 10405 705 Ejemplo 40: Medición de la vida media de oligonucleotido antisentido en el hígado y el riñon de ratas Sprague-Dawley Se trataron ratas Sprague-Dawley con oligonucleótidos antisentido ISIS que apuntan al Factor 11 humano y se evaluó la vida media del oligonucleotido así como también el tiempo transcurrido para la degradación y la eliminación del oligonucleotido del hígado y el riñon.
Tratamiento Grupos de cuatro ratas de Sprague-Dawley se inyectaron de manera subcutánea dos veces por semana durante 2 semanas con 20 mg/kg de ISIS 412223, ISIS 412224, ISIS 412225, ISIS 413481, ISIS 413482, ISIS 416848, ISIS 416851, ISIS 416852, ISIS 416856, ISIS 416859, ISIS 416860, ISIS 416861, ISIS 416863, ISIS 416866 o ISIS 416867. Tres días después de la última dosis, se sacrificaron las ratas y se cultivaron los hígados y los ríñones.
Medición de la Concentración de Oligonucleotido Se midió la concentración del oligonucleotido de longitud completa así como también la concentración total de oligonucleotido (incluyendo la forma degradada). El método usado es una modificación de métodos publicados previamente (Leeds et al . , 1 996; Geary et al. , 1 999) que consiste de una extracción con fenol-cloroformo (l íquido-l íquido) seguida por una extracción de fase sólida. Se agregó un estándar interno (ISIS 355868, un oligonucleótido de fosforotioato modificado con 27-mer 2'-0-metoxietilo , GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, designado en la presente como SEQ I D NO : 270) antes de la extracción. Se calcularon las concentraciones de muestras de tejidos usando curvas de calibración , con un l ímite inferior de cuantificación (LLOQ) de aproximadamente 1 .1 4 pg/g . Los resultados se presentan en las Tablas 91 t 92 , expresados como pg/g de tejido de hígado o de riñon . Después se calcularon las vidas medias usando software WinNonlin (PHARS IGHT).
Tabla 91 Concentración (pg/g) de oligonucleótido de longitud completa en el hígado y el riñon de ratas Sprague-Dawkey ISIS No Motif Kidney Liver 412223 5-10-5 551 97 412224 5-10-5 487 107 412225 5-10-5 202 119 413481 5-10-5 594 135 413482 5-10-5 241 95 416848 5-10-5 488 130 416851 5-10-5 264 193 416852 5-10-5 399 108 416856 5-10-5 378 84 416859 5-10-5 253 117 416860 5-10-5 247 94 416861 5-10-5 187 159 416863 5-10-5 239 82 416866 5-10-5 210 98 416867 5-10-5 201 112 Tabla 92 Concentración total ( i g/g ) de oligonucleótido en el h ígado y el ri ñon d e ratas Sprague-Dawkey ISIS No Motivo Riñon Hígado 412223 5-10-5 395 86 412224 5-10-5 292 78 412225 5-10-5 189 1 17 413481 5-10-5 366 96 413482 5-10-5 217 91 416848 5-10-5 414 1 15 416851 5-10-5 204 178 416852 5-10-5 304 87 416856 5-10-5 313 80 416859 5-10-5 209 1 12 416860 5-10-5 151 76 416861 5-10-5 165 144 416863 5-10-5 203 79 416866 5-10-5 145 85 416867 5-10-5 157 98 Tabla 93 Vida media (días) de oligonucleótidos ISIS en el hígado y el riñon de ratas Sprague-Dawley Ejemplo 41: Tolerancia de oligonucleótidos antisentido dirigidos al Factor 11 humano en ratones CD1 Se administraron oligonucleótidos ISIS con motivos 6-8-6 y 5-8-5 dirigidos al Factor 11 humano en ratones CD1 evaluados para cambios en los niveles de varios marcadores metabólicos.
Tratamiento Grupos de cinco ratones CD1 se inyectaron de manera subcutánea dos veces por semana durante 6 semanas con 50 mg/kg de ISIS 41 6850, IS IS 445498, ISIS 445503, ISI S 445504, ISIS 445505 , ISIS 445509 , ISIS 44551 3, IS IS 445522 , ISIS 445530, ISIS 445531 o ISIS 445532. Un grupo de control de cinco ratones CD1 se inyectó de manera subcutánea con PBS dos veces por semana durante 6 semanas. Se tomaron mediciones de peso corporal antes y al final del periodo del tratamiento . Tres d ías después de la últi ma dosis, se sacrificaron los ratones, se midieron los pesos de los órganos y se recolectó la sangre para análisis posteriores.
Peso Corporal y Peso de Organos Los cambios de los pesos corporales en los ratones se presentan en la Tabla 94 y se expresan en incrementos en gramos sobre el peso de control de PBS tomado antes del comienzo del tratamiento. Se midieron los pesos del hígado , el bazo y el riñon al final del estudio y se presentan también en la Tabla 94 como porcentaje del peso corporal . Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron en más de seis veces de incremento en el peso del h ígado y el bazo por arriba de control de PBS se seleccionaron para estudios posteriores.
Tabla 94 Cambio en los pesos corporales y de órganos de ratones CD1 después del tratamiento con oligonucleótido antisentido ISIS 416850 11 6 1.5 0.4 ISIS 445498 10 6 1.6 0.5 ISIS 445503 9 8 1.4 0.6 ISIS 445504 11 6 1.6 0.4 ISIS 445505 12 6 1.5 0.5 ISIS 445509 10 6 1.6 0.5 ISIS 445513 9 5 1.6 0.4 ISIS 445522 11 6 1.7 0.4 ISIS 445530 11 6 1.5 0.5 ISIS 445531 10 6 1.5 0.5 ISIS 445532 10 6 1.6 0.4 Función del Hígado Para eval uar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, se midieron las concentraciones en plasma de transminasas usando un analizador de qu ímica cl ínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Las mediciones de alanina transminasa (ALT) y aspartato transminasa (AST) se expresan en I U/L y los resultados se presentan en la Tabla 96. Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron en un incremento a los niveles de ALT/AST por arriba de 7 veces de los niveles de control se seleccionaron para estudios posteriores. Se midieron también los niveles en plasma de bilirrubina y albúmina y los resultados se presentan también en la Tabla 95 y se expresan en mg/dL . Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron en un incremento de los niveles de bilirrubina de más de dos veces los niveles de control mediante el tratamiento con oligonucleótido antisentido seleccionaron para estudios posteriores.
Tabla 95 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre los marcadores metabólicos en el h ígado de ratones CD 1 Fu nción del Ri ñon Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos IS IS sobre la función del riñon , se midieron las concentraciones en plasma de nitrógeno de urea en sangre (B UN ) usando un analizador de qu ímica cl ínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la Tabla 96, expresados en mg/dL . Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron en más de dos veces de un incremento en los niveles de BU N en comparación con el control de PBS se seleccionaron para estudios posteriores.
Tabla 96 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre los niveles de BUN (mg/dL) en el riñon de ratones CD1 E nsayos de Hematolog ía La sangre obtenida de todos los grupos de ratones se envió a Anteen Diagnostics para mediciones de hematocritos (HCT), así como también mediciones de las varias células de sangre, tales como WBC (neutrófilos y linfocitos), RBC y plaquetas y contenido total de hemoglobina. Los resultados se presentan en las Tablas 97 y 98. Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron en una disminución en el conteo de plaquetas de más de 50% y un incremento en el conteo de monocttos de más de tres veces, se seleccionaron para estudios posteriores.
Tabla 97 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre factores hematológicos en ratones CD1 Tabla 98 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido en el conteo de células sangu íneas en ratones CD1 Neutrófilos Linfocitos Plaquetas (/mL) (/mL) (103/mL) PBS 1356 4166 749 ISIS 416850 1314 4710 614 ISIS 445498 1197 3241 802 ISIS 445503 1475 6436 309 ISIS 445504 959 3578 826 ISIS 445505 818 3447 725 ISIS 445509 1104 3758 1085 ISIS 445513 959 5523 942 ISIS 445522 698 3997 1005 ISIS 445530 930 5488 849 ISIS 445531 2341 6125 996 ISIS 445532 1116 5490 689 Ejemplo 42: Tolerancia de oligonucleótidos antisentido d irig idos al Factor 1 1 humano en ratas Sprag ue-Dawley Ocho oligonucleótidos antisentido que habían sido eval uados en ratones CD 1 ( Ejemplo 4) se evaluaron posteriormente en ratas Sprague-Dawley para cambios en los niveles de varios marcadores metabólicos.
Tratam iento Grupos de cuatro ratas Sprague-Dawley se inyectaron de manera subcutánea dos veces por semana durante 6 semanas con 50 mg/kg de IS IS 445498, IS IS 445504, ISIS 445505, ISI S 445509, IS IS 44551 3, ISIS 445522, IS IS 445530 o ISIS 445531 . Un grupo de control de ratas Sprague-Dawley se inyectó de manera subcutánea con PBS dos veces por semana durante 6 semanas. Se tomaron mediciones de los pesos corporales antes y durante el periodo de tratamiento. Tres d ías después de la última dosis, se recolectaron muestras de orina y las ratas se sacrificaron después, se midieron los pesos de los órganos y se recolectó la sangre para análisis posteriores.
Peso Corporal y Peso de Organos Se midieron los pesos corporales de las ratas en el comienzo del estudio y subsiguientemente dos veces por semana. Los pesos corporales se presentan en la Tabla 99 y se expresan como porciento de incremento sobre el peso del control de PBS tomado antes del comienzo del tratamiento. Se midieron los pesos del hígado, el bazo y el ri ñon al final del estudio, y se presentan también en la Tabla 99 como un porcentaje del peso corporal . Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron en más de seis veces de incremento en el peso del h ígado y el bazo contra el control de PBS , se seleccionaron para estudios posteriores.
Tabla 99 Cambio en los pesos corporales y de órganos de ratas Sprague-Dawley después del tratamiento con oligonucleótido antisentido (% ) Función d I H ígad Para eval uar el efecto de los oligonucleótidos IS IS sobre la función hepática, se midieron las concentraciones en plasma de transminasas usando un analizador de qu ímica clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Se midieron las concentraciones en plasma de ALT (alanina transminasa) y AST (aspartato transmi nasa) y los resultados se presentan en la Tabla 100 expresados en I U/L. Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron un incremento en os niveles de ALT/AST por arriba de siete veces los niveles de control se seleccionaron para estudios posteriores . Se midieron también los niveles en plasma de bilirrubina y albúmina usando el mismo analizador de química cl ínica; los resultados se presentan en la Tabla 100 y se expresan en mg/dL. Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron un incremento en los niveles de bilirrubina de más de dos veces los niveles de control por el tratamiento con oligonucleótido antisentido se seleccionaron para estudios posteriores.
Tab la 1 00 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre marcadores metabólicos en el hígado de ratas Sprague-Da ley ISIS 445505 356 243 0.15 3.6 ISIS 445509 676 291 0.14 3.5 ISIS 445513 214 91 0.15 3.5 ISIS 445522 240 138 0.47 3.6 ISIS 445530 116 56 0.11 3.7 ISIS 445531 272 137 0.12 3.7 F u nción del Ri ñon Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función del riñon , se midieron las concentraciones en plasma del nitrógeno de urea en sangre (BUN ) y creatinina usando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la Tabla 1 01 , expresados en mg/d L. Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron en más de dos veces un incremento en los niveles de BUN en comparación con el control de PBS se seleccionaron para estudios posteriores. Se calcularon la proteína total en orina y la proporción de proteína en orina a creatinina en muestras totales de orina después del tratamiento con oligonucleótido antisentido y se presentan también en la Tabla 1 01 . Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron en más de un incremento de cinco veces en las proporciones de proteína en orina/creatinina en comparación con el control de PBS se seleccionaron para estudios posteriores.
Tab la 1 01 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre los marcadores metabólicos en el riñon de ratas Sprague-Dawley Ensayos de Hematología La sangre obtenida de todos los grupos de ratas se envió a Antech Diagnostics para mediciones de hematocritos (HCT), así como también mediciones del las varias células de la sangre, tales como WBC (neutrófilos, linfocitos y monocitos), RBC y plaquetas y el contenido total de hemoglobina. Los resultados se presentan en las Tablas 1 02 y 103. Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron a una disminución en el conteo de plaquetas de más del 50% y un aumento en el conteo de monocitos de más de tres veces, se seleccionaron para estudios posteriores.
Tabla 102 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre factores hematológicos en ratas Sprague-Dawley RBC Hemoglobina HCT (%) WBC (/nl_) (/PL) (g/dL) PBS 8.8 16.0 55 13 ISIS 445498 8.5 14.7 49 13 ISIS 445504 8.9 14.7 50 16 ISIS 445505 9.1 15.0 50 21 ISIS 445509 8.4 14.1 47 17 ISIS 445513 7.8 13.0 44 17 ISIS 445522 7.7 13.6 47 18 ISIS 445530 8.9 14.7 50 12 ISIS 445531 8.8 14.8 50 13 Tabla 103 Efecto del tratamiento con oligonucleótido anti sentido sobre el conteo de cél u las sangu íneas en ratas Sprague-Dawley Neutrófllos Linfocitos Monocitos Plaquetas (%) (%) (%) (/nL) PBS 14 82 2.0 1007 ISIS 445498 9 89 2.0 1061 ISIS 445504 10 87 2.0 776 ISIS 445505 10 87 2.5 1089 ISIS 445509 11 84 3.8 11 15 ISIS 445513 14 82 3.5 1051 ISIS 445522 13 84 2.8 1334 ISIS 445530 1 1 87 2.0 1249 ISIS 445531 10 86 2.8 1023 Ejem plo 43: Tolerancia de oligonucleótidos antisentido d irig idos al Factor 1 1 humano en ratones CD1 Los oligonucleótidos IS IS con motivos 4-8-4 MOE , 3-8-3 MOE, 2-1 0-2 MOE , 3-10-3 MOE y 4-1 0-4 MOE dirigidos al Factor 1 1 humano se administraron a ratones CD1 eval uados para cambios en los niveles de varios marcadores metabólicos.
Tratamiento Grupos de cinco ratones CD1 se inyectaron de manera subcutánea dos veces por semana durante 6 semanas con 50 mg/kg de ISIS 449707, IS IS 449708, IS IS 449409, ISIS 449710 o ISIS 44971 1 . Un grupo de control de cinco ratones CD 1 se inyectó de manera subcutánea con PBS dos veces por semana durante 6 semanas. Se tomaron mediciones de pesos corporales antes y al término del periodo del tratamiento. Tres d ías después de la última dosis, se sacrificaron los ratones, se pesaron los órganos y se recolectó la sangre para análisis posteriores.
Peso Corporal y Peso de Organos Se tomaron los pesos corporales de los ratones al final del estudio y se presentan en la Tabla 1 04 y se expresan en gramos. También se pesaron el hígado, el bazo y el riñon al final del estudio y se presentan también en la Tabla 1 04, como porcentaje del peso corporal . Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron en más de seis veces de incremento en el peso del h ígado y del bazo por arriba del control de PBS se seleccionaron para estudios posteriores .
Tabla 104 Cambio en los pesos corporales y de órganos en ratones CD 1 después del tratamiento con oligonucleótido antisentido Fu n ció n del H ígado Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos I SIS sobre la función hepática, se midieron las concentraciones en plasma de transminasas usando un analizador de qu ímica cl ínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Se midieron las concentraciones en plasma de ALT (alanina transminasa) y AST (aspartato transmi nasa) y los resultados se presentan en la Tabla 105 expresados en I U/L. Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron un incremento en los niveles de ALT/AST por arriba de siete veces los niveles de control se seleccionaron para estudios posteriores. Se midieron también los niveles en plasma de bilirrubina y albúmi na usando el mismo analizador de química cl ínica; los resultados se presentan en la Tabla 1 05 y se expresan en mg/dL. Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron un incremento en los niveles de bilirrubina de más de dos veces los niveles de control por el tratamiento con oligonucleótido antisentido se seleccionaron estudios posteriores.
Tabla 105 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre los marcadores metabólicos en el h ígado de ratones CD 1 Función del Riñon Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función del riñon , se midieron las concentraciones en plasma del nitrógeno de urea en sangre (B U N ) y creatinina usando un analizador de qu ímica cl ínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville , NY). Los resultados se presentan en la Tabla 1 06, expresados en mg/dL. Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron en más de dos veces de incremento en los niveles de BUN en comparación con el control de PBS se seleccionaron para estudios posteriores.
Tabla 106 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre marcadores metabólicos (mg/d L) en el riñon de ratones CD1 BUN Creatinina PBS 28 0.3 ISIS 449707 27 0.2 ISIS 449708 28 0.2 ISIS 449709 34 0.3 ISIS 449710 29 0.2 ISIS 449711 26 0.2 Ensayos de Hematología La sangre obtenida de todos los grupos de ratones se envió a Anteen Diagnostics para mediciones de hematocritos (HCT), así como también mediciones del las varias células de la sangre, tales como WBC (neutrófilos, linfocitos y monocitos), RBC y plaquetas y el contenido total de hemoglobina. Los resultados se presentan en las Tablas 1 07 y 108. Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron a una disminución en el conteo de plaquetas de más del 50% y un aumento en el conteo de monocitos de más de tres veces, se seleccionaron para estudios posteriores.
Tabla 107 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre factores hematológicos en ratones CD1 ALT AST Bilirrubina Albúmina (IU/L) (IU/L) (mg/dL) (mg/dL) PBS 39 52 0.22 3.2 ISIS 449707 8.4 12.4 45 6 ISIS 449708 9.2 13.2 48 7 ISIS 449709 9.2 13.2 49 5 ISIS 449710 9.1 13.5 48 7 ISIS 449711 9.0 13.3 48 6 Tabla 108 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre el conteo de células de la sangre en ratones CD1 Ejemplo 44: Tolerancia de oligonucleótidos antisentido dirigidos al Factor 11 humano en ratas Sprague-Dawley Cinco oligonucleótidos antisentido que habían sido evaluados en ratones CD1 (Ejemplo 43) se evaluaron adicionalmente en ratas Sprague-Dawley para cambios en los niveles de varios marcadores metabólicos.
Tratamiento Grupos de cuatro ratas Sprague-Dawley se inyectaron de manera subcutánea dos veces por semana durante 6 semanas con 50 mg/kg de IS IS 449707 , I SIS 449708, IS IS 449709, ISIS 44971 0 o ISIS 44971 1 . Un grupo de control de cuatro ratas Sprague-Dawley se inyectó de manera subcutánea con PBS dos veces por semana durante 6 semanas. Se tomaron mediciones de los pesos corporales antes y durante todo el periodo de tratamiento. Tres d ías después de la última dosis, se recolectaron muestras de orina y después se sacrificaron las ratas, se pesaron los órganos y se recolectó sangre para análisis posteriores.
Peso Corporal y Peso de Organos Se midieron los pesos corporales de las ratas al comienzo del estudio y al final del estudio. Los cambios de los pesos corporales se presentan en la Tabla 1 09 y se expresan como incremento en gramos sobre el peso del control de PBS tomado antes del inicio del tratamiento. Se tomaron los pesos del hígado, el bazo y el riñon al final del estudio y se presentan también en la Tabla 1 09 como un porcentaje del peso corporal . Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron en más de seis veces de incremento en el peso del h ígado y el bazo arriba del control de PBS se seleccionaron para estudios posteriores.
Tabla 109 Cambio en los pesos corporales y de órganos en ratas Sprague-Dawley después del tratamiento con oligonucleótido antisentido Peso corporal (g) Hígado (%) Bazo (%) Riñon (%) PBS 478 - - - ISIS 449707 352 +41 +400 +80 ISIS 449708 382 +31 +259 +40 ISIS 449709 376 +8 +231 +19 ISIS 449710 344 +82 +302 +50 ISIS 449711 362 +52 +327 +72 Fu nción del H ígad o Para evaluar el impacto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, se midieron las concentraciones en plasma de ALT y AST usando un analizador de qu ímica cl ínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Se midieron las concentraciones en plasma de alanina transminasa (ALT) y aspartato transminasa (AST) y los resultados se presentan en la Tabla 1 1 0 expresados en I U/L . Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron un incremento en los niveles de ALT/AST por arriba de siete veces los niveles de control se seleccionaron para estudios posteriores. Se midieron también los niveles en plasma de bilirrubina y albúmina y los resultados se presentan en la Tabla 1 1 0 y se expresan en mg/dL . Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron un incremento en los niveles de bilirrubina de más de dos veces los niveles de control por el tratamiento con oligonucleótido antisentido se seleccionaron para estudios posteriores.
Tabla 1 1 0 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre marcadores metabólicos en el hígado de ratas Sprague-Dawley Función del Riñon Para evaluar el impacto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función del riñon, se midieron las concentraciones en plasma de BU N y creatinina usando un analizador de qu ímica cl ínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la Tabla 1 1 1 , expresados en mg/dL. Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron en más de dos veces de incremento en los niveles de B U N en comparación con el control de PBS se seleccionaron para estudios posteriores. Se calcularon la proteína total en orina y la proporción de proteína en orina a creatinina en muestras de orina total después del tratamiento con oligonucleótido antisentido y se presentan también en la Tabla 1 1 1 . Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron en más de cinco veces de incremento en las proporciones de proteína en ori na/creatinina en comparación con el control de PBS se seleccionaron para estudios posteriores.
Tabla 1 1 1 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre marcadores metabolicos en el riñon de ratas Sprague-Dawley E nsayos de Hematolog ía La sangre obtenida de todos los grupos de ratas se envió a Antech Diagnostics para mediciones de hematocritos (HCT), así como también mediciones del las varias células de la sangre, tales como WBC (neutrófilos, linfocitos y monocitos), RBC y plaquetas y el contenido total de hemoglobina. Los resultados se presentan en las Tablas 1 1 2 y 1 1 3. Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron a una disminución en el conteo de plaquetas de más del 50% y un aumento en el conteo de monocitos de más de tres veces, se seleccionaron para estudios posteriores.
Tabla 1 1 2 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre factores hematológicos en ratas Sprague-Dawley RBC Hemoglobina Hematocrito WBC (/pL) (g/dL) (%) (/nl_) PBS 8.2 15.1 50 16 ISIS 449707 6.0 12.0 40 20 ISIS 449708 6.6 12.2 40 22 ISIS 449709 6.9 12.6 41 14 ISIS 449710 6.3 12.5 41 13 ISIS 449711 6.4 12.6 43 13 Tabla 113 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre el conteo de células de la sangre en ratas Sprague-Dawley Ejemplo 45: Efecto farmacológico dependiente de la dosis de oligonucleótidos antisentido dirigidos al Factor 11 humano n monos cynomolgus Se probaron varios oligonucleótidos antisentido en monos cynomolgus para determinar los efectos farmacológicos de los oligonucleótidos sobre la actividad del Factor 11, anticoagulación y tiempos de sangrado, distribuciones en el hígado y el riñon y tolerancia . Todos los oligonucleótidos IS IS usados en este estudio están dirigidos al mARN del Factor 1 1 humano y también son completamente reactivos cruzados con la secuencia de genes del mono Rhesus (ver Tabla 44). Se espera que los oligonucleótidos IS IS del mono Rhesus sean completamente reactivos cruzados con la secuencia de genes del mono cynomolgus también . En el momento que se efectuó el estudio, no estaba disponible la secuencia genómica del mono cynomolgus en la base de datos de National Center for Biotechnology I nformation (NCB I ); por lo tanto, no se pudo confirmar la reactividad cruzada con la secuencia de genes del mono cynomolgus. Tratamiento Se inyectaron grupos, cada uno consistiendo de dos monos macho y tres hembras, de manera subcutánea con ISIS 416838, IS IS 41 6850 , ISIS 41 6858, IS IS 41 6864 o IS IS 41 7002 en dosis crecientes. El oligonucleótido antisentido se administró a los monos a 5 mg/kg tres veces por semana para la semana 1 ; 5 mg/kg dos veces por semana para las semanas 2 y 3; 1 0 mg/kg tres veces por semana para la semana 4; 1 0 mg/kg dos veces por semana para las semanas 5 y 6; 25 mg/kg tres veces por semana en la semana 7; y 25 mg/kg dos veces por semana en las semanas 8, 9, 1 0, 1 1 y 1 2. Un grupo de control , que consiste de dos monos macho y tres hembras, se inyectó de manera subcutánea con PBS de acuerdo con el mismo régimen de dosificación . Un grupo experimental adicional, que consiste de dos monos macho y tres hembras, se inyectó de manera subcutánea con I SIS 41 6850 en un régimen crónico, de dosis menor. Se administró un oligonucleótido antisentido a los monos a 5 mg/kg tres veces por semana en la semana 1; 5 mg/kg dos veces por semana en las semanas 2 y 3; 10 mg/kg tres veces por semana en la semana 4; y 10 mg/kg dos veces por semana en las semanas 5 a 12. Los pesos corporales se midieron semanalmente. Se recolectaron muestras de sangre 14 días y 5 días antes del comienzo del tratamiento y subsiguientemente 1 vez por semana para análisis de actividad de proteína de Factor 11 en plasma, medición de fibrinógeno, mediciones de PT y aPTT, tiempos de sangrado y medición de varios factores hematológicos. En el día 85 a los monos se les hizo la eutanasia por desangrado mientras estaban bajo anestesia profunda y los órganos se cultivaron para análisis posterior.
Análisis de ARN En el día 85, se extrajo ARN del tejido hepático para análisis de PCR en tiempo real del Factor 1 usando el conjunto de sonda de cebo LTS 00301 (secuencia hacia adelante ACACGCATTAAAAAGAGCAAAGC, designada en la presente como SEQ ID NO: 271; secuencia inversa de cebo CAGTGTCATGGTAAAATGAAGAATGG, designada en la presente como SEQ ID NO: 272; y secuencia de sonda TGCAGGCACAGCATCCCAGTGTTCTX, designada en la presente como SEQ ID NO: 273). Los resultados se presentan como porciento de inhibición del Factor 11, con relación al control de PBS. Como se muestra en la Tabla 114, el tratamiento con oligonucleótidos ISIS resultó en la reducción significativa de mARN del Factor 1 1 en comparación con el control de PBS.
Tabla 1 14 I nhibición de mARN del Factor 1 1 en el hígado de mono cynomolgus con relación al control de PBS Anál isis de Proteína Se analizaron mediante un ensayo de ELISA de tipo emparedado (Affinity Biologicals Inc. ) muestras de plasma de todos los grupos de monos tomadas en días diferentes usando un anticuerpo anti-Factor 1 1 policional purificado por afinidad como el anticuerpo de captura y un anticuerpo anti-Factor 1 1 policional conjugado con peroxidasa como el anticuerpo detector. Plasma de mono se diluyó 1 :50 para el ensayo. La actividad de la peroxidasa se expresó mediante la incubación con el sustrato de o-fenilendiamina. Se cuantificó el color producido usando un lector de microplaca a 490 nm y se consideró como proporcional a la concentración del Factor 1 1 en las muestras.
Los resultados se presentan en la Tabla 1 1 5 expresados como porcentaje de red ucción con relación a aquél del control de PBS . El tratamiento con IS IS 41 6850 e IS IS 41 6858 resultó en una reducción dependiente del tiempo de los niveles de proteína.
Tabla 115 Inhibición de la proteína del Factor 11 en el hígado del cynomolgus con relación al control de PBS Ensayo de PT y aPTT Se recolectaron muestras de sangre en tubos que contenían citrato de sodio. Se determinaron en duplicado PT y aPTT con un instrumento de coagulación ACL 9000 (Instrumentation Laboratory, Italia). Los resultados se interpolaron en una curva estándar de plasma de mono de control citrado en disoluciones seriarles probada para dar un resultado reportado en porciento normal .
Se midieron el tiempo de protrombina (PT) y tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT) usando plasma deficiente en plaquetas (PPP) de monos tratados con oligonucleótidos I SIS. En las Tablas 1 1 6 y 1 1 7 se proporcionan valores de PT y aPTT y se reportan como valores de International Normalized Ratio ( I N R). Los valores I N R para PT y aPTT se determinaron dividiendo el valor de PT o aPTT para cada grupo experimental entre el PT o aPTT del grupo tratado con PBS . Esta proporción se elevó después a la potencia del International Sensitívity I ndex ( I SI ) del factor de tejido usado. El oligonucleótido ISIS , IS IS 41 6850, dado con el régimen crónico de dosis se distingue de los otros oligonucleótidos con un asterisco (*).
Como se muestra en la Tabla 1 1 6, el PT no fue significativamente prolongado en monos tratados con oligonucleótidos IS IS ya sea en el régimen creciente de dosis o el régimen crónico de dosis. Sin embargo, aPTT fue prolongado en una manera dependiente de la dosis, como se indica en la Tabla 1 17. Estos datos sugieren que la reducción antisentido del Factor 1 1 afecta la trayectoria de activación por contacto, pero no la trayectoria extrínseca de coagulación de la sangre. Por lo tanto, la reducción antisentido del Factor 1 1 es útil para inhibir la formación de un trombo o coagulo en respuesta a una pared de vaso anormal , pero no en respuesta a daño del tejido.
Tabla 1 16 Efecto de los oligonucleótidos antisentido ISIS sobre la proporción de PT en monos cynomolgus ISIS ISIS ISIS ISIS ISIS ISIS día 416838 416850 416858 416864 417002 416850* -14 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 -5 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 8 1.03 1.00 1.05 1.02 1.02 1.03 15 1.03 1.02 1.07 1.07 1.04 1.06 22 1.07 1.02 1.06 1.03 1.04 1.06 29 1.03 1.03 1.08 1.06 1.01 1.00 36 1.05 1.02 1.07 1.06 1.05 1.06 43 1.03 1.01 1.08 1.04 1.03 1.02 50 1.02 1.02 1.03 1.01 0.99 0.98 57 1.04 1.04 1.09 1.08 1.03 n.d. 64 1.04 1.03 1.09 1.10 1.03 n.d. 71 1.02 1.03 1.07 1.07 0.99 n.d. 78 1.04 1.05 1.10 1.08 1.02 n.d. 85 1.05 1.04 1.07 1.13 1.02 n.d. n .d . = no datos Tabla 1 1 7 Efecto de los ol igonucleótidos antisentido I S IS sobre l a proporción de aPTT en monos cynomolg us ISIS ISIS ISIS ISIS ISIS ISIS día 416838 416850 416858 416864 417002 416850* -14 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 -5 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 8 1.07 1.05 1.03 1.05 1.05 1.12 15 1.05 1.05 1.07 1.03 1.03 1.07 22 1.20 1.13 1.18 1.11 1.16 1.21 29 1.19 1.13 1.20 1.13 1.11 1.26 36 1.20 1.26 1.36 1.19 1.18 1.34 43 1.18 1.17 1.28 1.07 1.06 1.22 50 1.25 1.68 1.55 1.26 1.18 1.35 57 1.21 1.59 1.59 1.19 1.22 n.d. 64 1.18 1.64 1.60 1.12 1.11 n.d. 71 1.15 1.76 1.70 1.18 1.16 n.d. 78 1.19 1.88 1.79 1.18 1.18 n.d. 85 1.22 1.99 1.76 1.25 1.20 n.d. n.d. = no datos Análisis de la Actividad de Proteínas Se recolectaron muestras de sangre en varios momentos y se midió la proenzima del Factor 11 usando un ensayo F11 con base en el tiempo de coagulación. Los tiempos de coagulación se determinaron en duplicado con un instrumento de coagulación ST4 semiautomático (Diagnostica Stago, NJ). Treinta µ? de plasma de muestra citrada diluida 1/20 en búfer de HEPES-NaCI con BSA se incubaron con 30 µ? de reactivo aPTT (Automated aPTT, Organon Technika, NC) y 30 µ? de plasma citrado deficiente en Factor 11 (George King Bio-Medical Inc) a 37°C durante 5 minutos, seguido por la adición de 30 µ? de CaCI2 25 mM para iniciar la coagulación. Los resultados se interpolaron en una curva estándar de plasma de control citrado diluido en serie.
Los resultados se presentan en la Tabla 118 como porciento de inhibición de la actividad del Factor 11, con relación al control de PBS.
El oligonucleótido ISIS, IS IS 41 6850, dado con el régi men crónico de dosis se distingue de los otros oligonucleótidos con un asterisco (*).
Tabla 1 18 Inhibición de la proteína del Factor 1 1 mediante oligonucleótidos antisentido ISIS dados en régi men escalonado de dosis/dosis crónica en monos cynomolgus n .d . = no datos Ensayo de Fibri nógeno Se recolectaron nueve partes de plasma fresco de mono en una parte de citrato trisódico. Las muestras se evaluaron para contenido de fibrinógeno usando un instrumento de coagulación ACL 9000 (Instrumentation Laboratory, Italia). Los resultados se presentan en la Tabla 119 expresados en mg/dL. El oligonucleótido ISIS, ISIS 416850, dado con el régimen de dosis crónica se distingue de los otros oligonucleótidos con un asterisco (*).
Tabla 119 Efecto de los oligonucleótidos antisentido ISIS sobre los niveles de fibrinógeno en monos cynomolgus n.d. = no datos Ensayo d Sangrado En d ías diferentes durante el periodo de tratamiento, se realizó un ensayo de sangrado usando un dispositivo Surgicutt Jr. (ITC, New Jersey). Los monos se colocaron en sillas de mono con sus brazos colocados en un soporte estable. El brazo se rasuró ligeramente y se colocó un esfigmomanómetro en el antebrazo. La mancuerna del esfigmomanómetro se infló a 40 mm de Hg y esta presión se mantuvo durante todo el procedimiento. El área del antebrazo a ser incidida se limpió con un hisopo antiséptico y se usó el dispositivo Surgicutt J r para hacer una incisión en la superficie volar, aspecto lateral del antebrazo, paralela a y 5 cm abajo del pliegue antecubital . En el momento exacto en que se hizo la incisión, se inició un cronómetro. Cada 30 segundos la sangre de la incisión se absorbió usando un papel secante sin tocar di rectamente la incisión , de manera de no perturbar la formación del tapón de plaquetas. La sangre se absorbió cada 30 segundos hasta que la sangre ya no tiñó el papel . Entonces se detuvo el cronómetro y se determinó el tiempo de sangrado. Se removió el esfigmomanómetro del brazo del animal , el sitio de la incisión se frotó con un hisopo de manera antiséptica y se aplicó cinta para cerrar la herida. Los resultados se proporcionan en la Tabla X, expresados en segundos. Los resultados se proporcionan en la Tabla 1 20. El oligonucleótido ISIS , ISIS 41 6850 , dado con el régi men de dosis crónica se distingue de los otros oligonucleótidos con un asterisco (*).
Estos datos sugieren que el potencial hemorrágico de los compuestos proporcionados en la presente es bajo .
Tabla 120 Ensayo de Sangrado en Monos cynomolgus n.d. = no datos Ensayo de Agregación de Plaquetas La agregación de plaquetas se inició agregando ADP 1 mmol/L y/o 3 pg de colágeno (dependiendo del día de la recolección, como se delinea en la Tabla 121) a muestras de plasma y se dejó avanzar durante 10 minutos. La agregación se caracterizó mediante el registro del cambio en la resistencia eléctrica o impedancia y el cambio en la pendiente inicial de la agregación después del cambio de forma de plaquetas. La prueba de agregación se llevó a cabo dos veces por muestra en cada día de recolección y se tomó el valor promedio. El oligonucleótido ISIS, ISIS 416850, dado con el régimen de dosis crónica se distingue de los otros oligonucleótidos con un asterisco (*).
Tabla 121 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre la agregación de plaquetas en monos cynomolgus en Ohmios n .d . = no datos Pesos Corporal y de Organos Los pesos corporales se tomaron una vez a la semana durante el régi men de dosificación . Las mediciones de cada grupo se dan en la Tabla 1 22 expresadas en gramos. Los resultados indican que el tratamiento con los oligonucleótidos antisentido no causaron cambios adversos en la salud de los animales, lo cual puede haber resultado en una alteración significativa en el peso en comparación con el control de PBS . Los pesos de los órganos se tomaron después de la eutanasia de los animales y se cultivaron los h ígados, ríñones y bazos y se pesaron . Los resultados se presentan en la Tabla 1 23 y tampoco muestran alteración significativa en los pesos en comparación con el control de PBS , excepto para ISIS 41 6858, el cual muestra un aumento en el peso del bazo. El oligonucleótido ISIS , ISI S 41 6850, dado con el régimen de dosis crónica se distingue de los otros oligonucleótidos con un asterisco (*).
Tabla 122 Mediciones semanales de pesos corporales (g) de monos cynomolgus n .d. = no datos Tabla 123 Pesos de órganos (g) de monos cynomolgus después del tratamiento con oligonucleótido antisentido Hígado Bazo Riñon PBS 46 4 11 ISIS 416838 63 5 12 ISIS 416580 64 4 16 ISIS 416858 60 12 13 ISIS 416864 53 5 14 ISIS 417002 51 5 15 Fu nción del Hígado Para evaluar el impacto de los oligonucleótidos I SIS sobre la función hepática, se midieron las concentraciones en plasma de transaminasas usando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, elville, NY). Se midieron las concentraciones de ALT (alanina transminasa) y AST (aspartato transminasa) y los resultados se presentan en las Tablas 1 24 y 1 25 expresados en I U/L. Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron en un incremento en los niveles de ALT/AST por arriba de siete veces de los niveles de control se seleccionaron para estudios posteriores. Se midieron también los niveles en plasma de bilirrubina y los resultados se presentan en la Tabla 1 26 expresados en mg/d L. Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron en un incremento en los niveles de bilirrubina de más de dos veces de los niveles de control por el tratamiento con oligonucleótido antisentido se seleccionaron para estudios posteriores. El oligonucleótido ISIS, ISIS 416850, dado con el régimen de dosis crónica se distingue de los otros oligonucleótidos con un asterisco (*).
Tabla 124 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre ALT (IU/L) en el hígado de monos cynomolgus n.d. = no datos Tabla 125 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre AST (IU/L) en el hígado de monos cynomolgus n.d. = no datos Tabla 126 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre la bilirrubina (mg/d L) en el hígado de monos cynomolgus Función del Ri ñon Para evaluar el impacto de los oligonucleótidos IS IS sobre la función del riñon se recolectaron muestras de orina. Se calculó la proporción de proteína en orina a creatinina en muestras de orina después del tratamiento con oligonucleótido antisentido y se presenta en la Tabla 1 27. Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron en más de cinco veces de un incremento en las proporciones de proteína en orina/creatinina en comparación con el control de PBS se seleccionaron para estudios posteriores.
Tabla 127 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre la proporción de proteína en orina a creatinina en monos cynomolgus ISIS 416858 0.10 0.07 ISIS 416864 0.36 0.34 ISIS 417002 0.18 0.24 Med ición de la Concentración de Oligonucleótido Se evaluó la concentración del oligonucleótido de longitud completa así como también el tiempo transcurrido para la degradación del oligonucleótido y la eliminación del hígado y el riñon . El método usado es una modificación de métodos previamente publicados (Leeds et at. , 1996; Geary et al . , 1 999) que consiste de una extracción con fenol-cloroformo (l íquido-líquido) seguida por una extracción de fase sólida. Se agregó un estándar interno ( ISIS 355868, un oligonucleótido de fosforotioato modificado con 27-mer 2'-0-metoxietilo , GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, designado en la presente como SEQ I D NO : 270) antes de la extracción. Se calcularon las concentraciones de muestra de tejido usando curvas de calibración , con un l ímite inferior de cuantificación (LLOQ) de aproximadamente 1 .1 4 pg/g . Después se calcularon las vidas medias usando software WinNonlin ( PHARS IGHT). Los resultados se presentan en las Tablas 1 28 y 1 29, expresados como pg/g de tejido de hígado o de ri ñon .
Tabla 128 Concentración (pg/g) de oligonucleótido de longitud completa en el h ígado y el riñon de monos cynomolgus.
ISIS No. Riñon Hígado 416838 1339 1087 416850 2845 1225 416858 1772 1061 416864 2093 1275 417002 2162 1248 Tabla 1 29 Concentración (pg/g) de oligonucleótido total en el h ígado y el riñon de monos cynomolgus E nsayos de Hematolog ía La sangre obtenida de todos los grupos de monos se enviaron al Korea I nstitute of Toxicology (KIT) para análisis de HCT, MCV, MCH y MCHC, así como también mediciones de las varias células de la sangre, tales como WBC (neutrófilos, linfocitos, monocitos, eosinófilos, basófilos, reticulocitos), RBC, plaquetas y contenido de hemoglobina total . Los resultados se presentan en las Tablas 1 30-1 43. Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron en una disminución del conteo de plaquetas de más del 50% y un aumento en el conteo de monocitos de más de tres veces se seleccionaron para estudios posteriores. El oligonucleótido ISIS, I SIS 416850, dado con el régimen de dosis crónica se distingue de los otros oligonucleótidos con un asterisco (*).
Tabla 1 30 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre el conteo de WBC (?1 03/µ?_) en monos cynomolgus n .d . = no datos Tabl a 1 31 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre el conteo de RBC (?1 03/µ?_) en monos cynomolgus ISIS ISIS ISIS ISIS ISIS ISIS PBS 416838 416850 416858 416864 417002 416850* día -14 5.7 5.6 5.3 5.6 5.5 5.6 5.5 día -5 5.7 5.6 5.5 5.6 5.6 5.6 5.5 día 8 5.7 5.7 5.4 5.6 5.7 5.6 5.5 día 15 5.6 5.6 5.3 5.4 5.7 5.4 5.3 día 22 5.5 5.4 5 5.3 5.3 5.2 5.1 día 29 5.6 5.3 4.9 5.3 5.3 5.2 5.2 día 36 5.7 5.5 5.3 5.5 5.6 5.4 5.3 día 43 5.7 5.6 5.2 5.5 5.5 5.4 5.2 día 50 5.8 5.5 5.2 5.5 5.6 5.4 5.3 día 57 5.7 5.5 5.2 5.6 5.5 4.9 n.d. día 64 5.8 5.6 5.4 5.7 5.6 5.4 n.d. día 71 5.6 5.5 5.4 5.6 5.6 5.5 n.d. día 78 5.6 5.4 5.3 5.4 5.3 5.4 n.d. día 85 5.6 5.5 5.5 5.5 5.4 5.4 n.d. n .d . = no datos Tabla 1 32 Efecto del tratam iento con oligonucleótido antisentido sobre hemoglobi na (g/d L ) en monos cynomolgus día 15 12.9 12.9 12.1 12.6 12.8 12.3 12.2 día 22 12.7 12.5 11.6 12.4 12.1 12.1 11.7 día 29 12.8 12.4 11.5 12.3 12.1 12.0 12.0 día 36 13.0 12.8 12.2 12.6 12.5 12.5 12.3 día 43 12.9 12.7 11.8 12.4 12.2 12.3 11.8 día 50 12.6 12.3 11.8 12.2 12.1 12.3 11.9 día 57 13.1 12.6 12.1 12.7 12.3 11.3 n.d. día 64 13.1 12.6 12.3 12.8 12.1 12.2 n.d. día 71 12.9 12.7 12.3 12.7 12.2 12.5 n.d. día 78 13.0 12.5 12.2 12.4 11.9 12.4 n.d. día 85 13.2 12.4 12.7 11.9 12.3 12.2 n.d. n.d. = no datos Tabla 133 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre hematocritos (%) en monos cynomolgus día 57 46 43 42 41 42 38 n.d. día 64 47 44 43 42 42 41 n.d. día 71 46 44 43 42 44 43 n.d. día 78 43 41 41 39 39 40 n.d. día 85 43 42 42 39 40 41 n.d. n.d. = no datos Tabla 134 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre MCV (fL) en monos cynomolgus n.d. = no datos Tabla 135 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre MCH (pg) en monos cynomolgus n.d. = no datos Tabla 136 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre MCHC (g/dL) en monos cynomolgus día -14 29 30 30 31 29 30 29 día -5 30 31 30 31 29 30 30 día 8 30 30 29 30 29 29 29 día 15 30 31 30 31 30 31 30 día 22 28 29 28 30 29 29 29 día 29 28 29 28 30 29 29 28 día 36 28 30 29 31 30 30 30 día 43 28 30 29 31 29 30 30 día 50 26 28 28 30 28 29 29 día 57 29 29 29 31 29 29 n.d. día 64 28 29 29 30 29 30 n.d. día 71 28 29 28 30 28 29 n.d. día 78 30 30 29 32 30 31 n.d. día 85 31 30 30 31 30 30 n.d. n .d . = no datos Tabla 1 37 Efecto del tratam iento con oligonucleótido antisentido sobre el conteo de plaquetas (x 1 03 µ ?) en monos cynomolgus ISIS ISIS ISIS ISIS ISIS ISIS PBS 416838 416850 416858 416864 417002 416850* día -14 349 377 528 419 434 442 387 día -5 405 425 573 463 456 466 434 día 8 365 387 548 391 438 435 401 día 15 375 387 559 400 439 410 396 día 22 294 319 466 316 364 377 347 día 29 31 1 337 475 336 397 410 370 día 36 326 370 505 371 428 415 379 día 43 336 365 490 342 351 393 391 día 50 379 372 487 331 419 389 351 día 57 345 371 528 333 409 403 n.d. día 64 329 358 496 295 383 436 n.d. día 71 322 365 465 286 394 490 n.d. día 78 309 348 449 262 366 432 n.d. día 85 356 344 458 267 387 418 n.d. n . d . = no datos Tabl a 1 38 Efecto del tratamiento con ol igonucleótido antisentido sobre reticulocitos (% ) en monos cynomolg us día 71 1.6 1.3 1.8 1.3 1.0 1.3 n.d. día 78 1.5 1.4 1.8 1.2 1.2 1.3 n.d. día 85 1.5 1.5 2.3 1.3 1.5 1.4 n.d. n.d. = no datos Tabla 139 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre neutrófilos (%) en monos cynomolgus n.d. = no datos Tabla 140 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre linfocitos (%) en monos cynomolgus n.d. = no datos Tabla 141 Efecto del tratamiento con oligonucleotido antisentido sobre eosinófilos (%) en monos cynomolgus día 8 0.9 0.4 1.1 0.3 0.7 0.2 0.5 día 15 0.7 0.3 1.0 0.3 0.5 0.1 0.2 día 22 0.9 0.5 0.7 0.6 0.9 0.3 0.5 día 29 0.9 0.3 1.2 0.6 0.9 0.3 0.8 día 36 0.9 0.5 1.7 0.4 0.6 0.2 0.4 día 43 0.9 0.6 1.2 0.3 0.6 0.2 0.4 día 50 1.2 0.8 1.2 0.4 0.7 0.1 0.3 día 57 0.7 0.6 1.0 0.3 0.4 0.2 n.d.
Día 64 1.0 0.7 1.3 0.4 0.7 0.2 n.d.
Día 71 1.6 0.8 1.8 0.9 1.1 0.3 n.d.
Día 78 1.0 0.9 1.0 0.5 1.2 0.1 n.d.
Día 85 1.3 1.5 1.2 0.6 1.6 0.2 n.d. n .d . = no datos Tabla 1 42 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre monocitos (% ) en monos cynomolgus día 50 2.6 3.2 3.7 4.6 2.9 3.1 1.8 día 57 2.6 3.2 n.d.3.2 3.8 2.4 3.6 n.d.
Día 64 2.6 3.5 n.d.3.5 4.4 2.8 4.0 n.d.
Día 71 3.4 4.3 n.d.4.7 4.9 3.7 4.7 n.d.
Día 78 3.3 3.6 n.d.4.5 4.9 3.7 4.7 n.d.
Día 85 4.4 3.7 n.d.3.5 6.1 3.7 5.3 n.d. n .d . = no datos Tabla 143 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre los basófi los (% ) en monos cynomolgus ISIS ISIS ISIS ISIS ISIS ISIS PBS 416838 416850 416858 416864 417002 416850* día -14 0.3 0.2 0.2 0.3 0.2 0.3 0.2 día -5 0.3 0.3 0.2 0.3 0.2 0.3 0.3 día 8 0.2 0.2 0.2 0.3 0.2 0.3 0.3 día 15 0.3 0.3 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 día 22 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.1 día 29 0.3 0.2 0.2 0.2 0.3 0.2 0.3 día 36 0.3 0.4 0.3 0.3 0.3 0.2 0.1 día 43 0.3 0.4 0.3 0.3 0.4 0.3 0.2 día 50 0.4 0.3 0.3 0.4 0.4 0.3 0.2 día 57 0.2 0.3 0.4 0.2 0.3 0.3 n.d.
Día 64 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.2 n.d.
Día 71 0.2 0.5 0.3 0.4 0.4 0.3 n.d.
Día 78 0.2 0.4 0.3 0.4 0.3 0.3 n.d.
Día 85 0.3 0.3 0.3 0.3 0.4 0.3 n.d. n.d. = no datos Ensayos de Citocina y Quemocina Muestras de sangre obtenidas de los grupos de monos tratados con PBS, ISIS 416850 e ISIS 416858 administrados en el régimen de dosis escalonadas se enviaron a Pierce Bioctechnology (Woburn, MA) para medición de los niveles de quemocina y citocina. Se midieron los niveles de I L - 1 ß , IL-6, IFN-? y TNF-a usando los anticuerpos respectivos de primate y se midieron los niveles de IL-8, MIP-1a, MCP-1, ???-1ß y RANTES usando los anticuerpos humanos de reacción cruzada respectivos. Las mediciones se tomaron 14 días antes del inicio del tratamiento y en el día 85, cuando se sacrificaron por eutanasia los monos. Los resultados se presentan en las Tablas 144 y 145.
Tabla 144 Efecto de tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre los niveles de citocina/quemocina (pg/mL) en monos cynomolgus en el día 14 Tabla 145 Efecto de tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre los niveles de citocina/quemocina (pg/mL) en monos cynomolgus en el día 85 TNF- MIP- MCP- MIP- IL-1 p IL-6 IFN-? IL-8 RANTES a 1a 1 1 ß PBS 7 4 102 34 87 23 442 74 84430 ISIS 416850 1 3 1 7 1 8 27 1 72 41 2330 21 6 83981 ISIS 416858 5 25 1 8 45 303 41 1 752 221 1 2551 1 Ejem plo 46 : Efecto farmacológico de oligonucleótidos antis ntido dirigidos al Factor 1 1 humano en monos cynomolgus Varios oligonucleótidos antisentido seleccionados de estudios de tolerancia en roedores (Ejemplos 41 a 44) se probaron en monos cynomolgus para determinar sus efectos farmacológicos con relación a la eficacia sobre la actividad del Factor 1 1 y la tolerancia en un modelo de mono cynomolgus. Los oligonucleótidos antisentido se compararon también con I S IS 416850 e ISI S 41 6858 seleccionados del estudio en monos antes descrito (Ejemplo 45). Todos los oligonucleótidos ISIS usados en este estudio apuntan al mARN del Factor 1 1 humano y son completamente reactivos cruzados con la secuencia de genes del mono Rhesus (ver Tablas 44 y 46). Se espera que los oligonucleótidos ISIS del mono Rhesus sea reactivo cruzado completamente con la secuencia de genes del mono cynomolgus también . En el momento del estudio la secuencia genómica del mono cynomolgus no estaba disponible en la base de datos de National Center for Biotechnology Information (NCB I ); por lo tanto, no se pudo confirmar la reactividad cruzada con la secuencia de genes del mono cynomolgus.
Tratamiento Se inyectaron de manera subcutánea grupos que consisten cada uno de dos monos machos y dos hembras, con 25 mg/kg de ISIS 416850, ISIS 449709, ISIS 445522, ISIS 449710, ISIS 449707, ISIS 449711, ISIS 449708, 416858 y ISIS 445531. El oligonucleótido antisentido se administró a los monos a 25 mg/kg tres veces por semana en la semana 1 y 25 mg/kg dos veces por semana para las semanas 2 a 8. Un grupo de control, que cosiste de dos monos machos y dos hembras, se inyectó de manera subcutánea con PBS de acuerdo con el mismo régimen de dosificación. Se tomaron los pesos corporales 14 días y 7 días antes de iniciar el tratamiento y se midieron después semanalmente durante todo el periodo de tratamiento. Se recolectaron muestras de sangre 14 y 5 días antes del inicio del tratamiento y subsiguientemente varias veces durante el régimen de dosificación para mediciones de PT y aPTT y mediciones de varios factores hematológicos. En el día 55 se les hizo la eutanasia a los monos mediante desangrado mientras estaban con anestesia profunda y los órganos se cultivaron para análisis posteriores.
Análisis de ARN En el día 55 se extrajo ARN del tejido hepático para análisis de PCR en tiempo real del Factor 11 usando el paquete de sonda de cebo LTS00301. Los resultados se presentan como porciento de inhibición del Factor 11, con relación al control de PBS. Como se muestra en la Tabla 146, el tratamiento con ISIS 416850, ISIS 449709, ISIS 445522, ISIS 449710, ISIS 449707, ISIS 449708, ISIS 416858 e ISIS 445531 resultó en la reducción significativa del mARN del Factor 11 en comparación con el control de PBS.
Tabla 146 I nhibición de mARN del Factor 1 1 en el hígado del monos cynomolgus con relación al control de PBS .
Anál isis de Proteína Se analizaron muestras de plasma de todos los grupos de monos tomadas en días diferentes mediante un ensayo de ELISA de tipo emparedado (Affinity Biologicals I nc. ) usando un anticuerpo anti-Factor 1 1 policlonal purificado por afinidad como el anticuerpo de captura y un anticuerpo anti-Factor 1 1 policlonal conjugado con peroxidasa como el anticuerpo detector. Se diluyó 1 :50 plasma de mono para el ensayo. La actividad de la peroxidasa se expresó mediante incubación con el substrato de o-fenilendiamina. El color producido se cuantificó usando un lector de microplaca a 490 nm y se consideró como proporcional a la concentración del Factor 1 1 en las muestras.
Los resultados se presentan en la Tabla 1 47 , expresados como porcentaje de reducción con relación a aquélla del control de PBS. El tratamiento con ISIS 416850, ISIS 449709, ISIS 445522 e ISIS 416858 resultó en una disminución dependiente del tiempo de los niveles de proteína.
Tabla 147 Inhibición de la proteína del Factor 11 en el hígado del cynomolgus con relación al control de PBS.
Ensayo de PT y aPTT Se midieron PT y aPTT usando plasma deficiente en plaquetas (PPP) de ratones tratados con oligonucleótidos ISIS. Los valores de PT y aPTT se proporcionan en las Tablas 148 y 149 y se reportan como valores de International Normalized Ratio (INR). Los valores INR para PT y aPTT se determinaron dividiendo el valor de PT o aPTT para cada grupo experimental entre el PT o aPTT del grupo tratado con PBS. Esta proporción se elevó después a la potencia del International Sensitivity Index ( I SI ) del factor de tejido usado. Como se muestra en la Tabla 1 48 , el PT no fue significativamente prolongado en ratones tratados con oligonucleótidos ISIS . Sin embargo, el aPTT fue significativamente prolongado en grupos tratados con ISIS 41 6850, ISIS 445522 e I S IS 416858, como se presentan en la Tabla 149. Estos datos sugieren que la reducción antisentido del Factor 1 1 afecta la trayectoria de activación por contacto, pero no la trayectoria extrínseca de coagulación de la sangre. Por lo tanto, la red ucción antisentido del Factor 1 1 con estos oligonucleótidos ISIS es útil para inhibir la formación de un trombo o coagulo en respuesta a una pared e vaso anormal , pero no en respuesta a daño del tejido.
Tabl a 148 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre la proporción de PT en monos cynomolgus ISIS 1.01 0.94 0.95 0.97 0.95 0.96 1.00 0.96 0.96 1.00 449707 ISIS 1.00 0.95 0.94 0.95 0.94 0.98 1.02 1.01 1.00 1.07 449711 ISIS 1.03 0.95 0.98 1.00 0.95 1.06 0.99 0.99 0.99 1.04 449708 ISIS 1.01 0.96 0.96 0.98 0.95 1.00 0.97 1.00 0.99 1.01 416858 ISIS 1.06 1.00 1.00 1.06 1.02 1.04 1.03 1.01 1.04 1.06 445531 Tabla 149 Efecto del tratamiento con ol igonucleótido antisentido sobre la proporción de aPTT en monos cynomolgus ISIS 1.07 1.01 1.06 1.05 1.01 1.09 1.06 1.06 1.08 1.11 449708 ISIS 1.03 0.96 1.07 1.13 1.21 1.32 1.41 1.49 1.53 1.61 416858 ISIS 1.00 0.89 0.95 1.05 1.00 1.07 1.06 1.13 1.15 1.19 445531 Pesos de C uerpo y de Organ os Los pesos corporales de cada grupo se dan en la Tabla 1 50 expresados en gramos. Los resultados indican que el tratamiento con los oligonucleótidos antisentido no causaron ningún cambio adverso en la salud de los animales, lo cual puede haber resultado en una alteración significativa en el peso en comparación con el control de PBS . Los pesos de los órganos se tomaron después del someter a eutanasia a los animales en el d ía 55 y los h ígados, los ríñones y los bazos fueron cultivados. Los resultados se presentan en la Tabla 1 50 expresados como un porcentaje del peso corporal y tampoco muestran alteración significativa en los pesos en comparación con el control de PBS , con la excepción de ISIS 44971 1 , que causó un aumento en el peso del bazo .
Tabla 1 50 Mediciones semanales de pesos corporales (g ) de monos cynomolgus 1 2131 2083 2112 2047 2131 2107 2123 2130 2115 2125 8 2186 2072 2075 2094 2120 2088 2123 2148 2149 2119 15 2201 2147 2085 2092 2145 2120 2103 2125 2162 2109 22 2206 2139 2117 2114 21 7 2142 2171 2110 2188 2143 29 2204 2159 2068 2125 2149 2155 2203 2095 2196 2148 36 2246 2136 2064 2121 2180 2158 2227 2100 2210 2191 43 2304 2186 2106 2142 2227 2197 2251 2125 2238 2233 50 2274 2143 2147 2127 2201 2185 2227 2076 2225 2197 Tabla 1 51 Pesos de órganos (g) de monos cynomolgus después del tratamiento con oligonucleótido antisentido Fu nción del Hígado Para evaluar el impacto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, se midieron las concentraciones en plasma de ALT y AST usando un analizador de qu ímica cl ínica automatizado ( Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Se midieron las concentraciones en plasma de alanina transminasa (ALT) y aspartato transminasa (AST) y los resultados se presentan en las Tablas 1 52 y 1 53 expresados en I U/L . Se midieron también los niveles en plasma de bilirrubina y los resultados se presentan en la Tabla 1 54 expresados en mg/dL. Como se observa en las Tablas 1 52 a 1 54, no hubo incrementos significativos en ninguno de los marcadores metabólicos del h ígado después del tratamiento con oligonucleótido antisentido.
Tabla 152 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre ALT ( I U/L) en el h ígado de monos cynomolgus.
Tabla 153 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre AST ( I U/L) en el hígado de monos cynomolgus.
Día -14 Día -5 Día 31 Día 55 PBS 65 45 44 47 ISIS 416850 62 45 46 57 ISIS 449709 62 51 45 71 ISIS 445522 62 47 46 79 ISIS 449710 52 38 37 64 ISIS 449707 64 53 50 52 ISIS 449711 58 78 47 47 ISIS 449708 74 53 56 50 ISIS 416858 64 100 60 69 ISIS 445531 78 46 47 49 Tabla 154 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre la bilirrubina (mg/dL) en el hígado de monos cynomolgus Función del Riñon Para evaluar el impacto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función del riñon , se recolectaron muestras de orina en d ías diferentes. Se midieron los niveles de BU N en varios momentos usando un analizador de qu ímica cl ínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY) y los resultados se presentan en la Tabla 1 55. Se calculó también la proporción de proteína en orina a creatinina en muestras de orina después del tratamiento con oligonucieótido antisentido en el d ía 49 y los resultados se presentan en la Tabla 1 56. Como se observa en las Tablas 1 55 y 1 56, no hubo incrementos significativos en ninguno de los marcadores metabólicos de riñon después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido.
Tabla 155 Efecto del tratamiento con oligonucieótido antisentido sobre niveles de BUN (mg/d L) en monos cynomolgus Tabla 156 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre la proporción de proteína en orina a creatinina en monos cynomolgus.
Ensayos de Hematología La sangre obtenida de todos los grupos de monos en días diferentes se envió a Korea Institute of Toxicology (KIT) para mediciones de HCT, HCV, MCH y MCHC, así como también mediciones de las varias células de la sangre, tales como WBC (neutrófilos y monocitos), RBC y plaquetas, así como también el contenido de hemoglobina total. Los resultados se presentan en las Tablas 157 a 166.
Tabla 157 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre HCT (%) en monos cynomolgus Tabl a 1 58 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre el conteo de plaquetas (x 1 00/µ?_) en monos cynomolgus ISIS 416850 1.9 2.9 3.2 3.7 3.8 3.4 ISIS 449709 4.0 2.0 3.0 2.8 3.6 3.4 ISIS 445522 2.1 2.3 3.6 3.9 4.4 3.0 ISIS 449710 1.3 2.0 2.5 2.4 3.4 1.6 ISIS 449707 1.3 2.3 3.2 4.2 4.0 4.8 ISIS 449711 1.2 2.3 5.9 6.9 7.6 7.8 ISIS 449708 1.7 2.6 5.4 5.8 7.0 6.2 ISIS 416858 2.0 2.7 4.0 4.7 4.6 4.6 ISIS 445531 1.3 2.2 3.4 4.1 4.4 4.1 Tabla 1 61 Efecto del tratamiento con ol igonucleótido antisentido sobre el contenido de hemoglobina (g/dL) en monos cynomolgus Tabl a 1 62 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre el conteo de WBC (?103/µ?_) en monos cynomolgus Tabla 163 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antísentido sobre el conteo de RBC (?106/µ?_) en monos cynomolgus ISIS 44971 1 5.6 5.7 5.6 5.4 5.4 5.3 ISIS 449708 5.7 5.9 5.9 5.8 6.0 5.8 ISIS 416858 5.5 5.5 5.6 5.6 5.5 5.3 ISIS 445531 5.7 5.7 5.8 5.6 5.5 5.6 Tabla 164 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre M CV (fL ) en monos cynomolg us Tabla 165 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre MC H (pg ) en monos cynomolg us Día - Día - Día Día Día Día 14 5 17 31 45 55 PBS 22.1 22.4 22.3 22.1 22.0 22.0 ISIS 416850 23.7 23.7 23.7 23.3 22.7 22.9 ISIS 449709 22.4 22.3 22.5 22.2 21.0 22.0 ISIS 445522 22.6 22.5 22.8 22.4 22.4 22.2 ISIS 449710 23.0 22.8 23.1 22.6 21.8 22.7 ISIS 449707 22.2 22.2 22.1 22.1 22.6 21.9 ISIS 449711 22.6 22.7 22.2 22.1 21.7 21.3 ISIS 449708 22.9 22.7 22.9 22.7 22.2 22.5 ISIS 416858 23.2 23.5 23.1 23.0 22.2 22.8 ISIS 445531 22.2 22.2 22.1 22.0 21.6 21.7 Tabl a 1 66 Efecto del tratam iento con oligonucleótido antisentido sobre M C H C (g/d L) en monos cynomolgus Ensayos de Citocina y Quetocina Muestras de sangre obtenidas de todos los grupos de monos se enviaron a Pierce Biotechnology (Woburn, MA) para mediciones de los niveles de quemocina y citocina. Se midieron los niveles de t L- ß , IL-6, IFN-? y TNF-a usando los anticuerpos respectivos de primate y se midieron los niveles de IL-8, MIP-1a, MCP-1, ???-1ß y RANTES usando los anticuerpos humanos respectivos de reacción cruzada. Las mediciones se tomaron 14 días antes del inicio del tratamiento y en el día 55, cuando se sometieron a eutanasia los monos. Los resultados se presentan en las Tablas 167 y 168.
Tabla 167 Efecto del tratamiento con oligonucleótido antisentido sobre niveles de citocina/quemocina (pg/mL) en monos cynomolgus en el día 14.
Tabla 168 Efecto del tratamiento con oligonucleotido antisentido sobre niveles de citocina/quemocina (pg/mL) en monos cynomolgus en el día 55.
Ejemplo 47 : Medición de viscosidad de oligon ucleótidos antisentido ISIS dirigidos al Factor 1 1 humano La viscosidad de los oligonucleótidos antisentido dirigidos al Factor 1 1 humano se midieron con la ayuda de la clasificación de oligonucleótidos antisentido que tienen una viscosidad mayor que 40 cP a una concentración de 1 65 a 1 85 mg/mL.
Los oligonucleótidos ISIS (32 a 35 mg) se pesaron en un frasco de vidrio, se agregaron 1 20 pL de agua y el oligonucleotido antisentido se disolvió en solución calentando el frasco a 50°C. Parte (75 pL) de la muestra precalentada se pipeteó a un micro-viscosímetro (Cambridge). La temperatura del micro-viscosímetro se estableció en 25°C y se midió la viscosidad de la muestra. Otra parte (20 pL) de la muestra precalentada se pipeteó en 1 0 mL de agua para lectura de UV a 260 nM a 85°C (Cary UV instrument). Los resultados se presentan en la Tabla 1 69.
Tabla 169 Viscosidad y concentración de oligonucleótidos antisentido ISI S dirigidos al Factor 1 1 humano 2 5 15

Claims (54)

RE IVI N DI CACION ES
1 . Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 1 2 a 30 nucleosidos enlazados y que comprende una secuencia de nucleobases que comprende por lo menos 1 2 nucleobases contiguas de SEQ I D NO: 223.
2. El compuesto de la reivindicación 1 , que consiste de un oligonucleótido de cadena sencilla modificado.
3. El compuesto de la reivindicación 2, en donde la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado es 1 00% complementaria a una secuencia de nucleobases de SEQ I D NO: 1 .
4. El compuesto de la reivindicación 2, en donde por lo menos un enlace de internucleósido es un enlace de i nternucleósido modificado.
5. El compuesto de la reivindicación 4, en donde cada enlace de internucleósido es un enlace de internucleósido de fosforotioato.
6. El compuesto de la reivindicación 1 , en donde por lo menos un nucleósido comprende un azúcar modificada.
7. El compuesto de la reivindicación 6, en donde por lo menos un azúcar modificada es un azúcar bicíclica.
8. El compuesto de la reivindicación 7, en donde cada una de la por lo menos un azúcar bicíclica comprende un puente 4'-(CH2)n-0-2' , en donde n es 1 o 2.
9. El compuesto de la reivindicación 7, en donde cada una de la por lo menos un azúcar bicíclica comprende un puente 4'-CH(CH3)-0-2'.
1 0. El compuesto de la reivindicación 6, en donde por lo menos un azúcar modificada comprende un grupo 2'-0-metoxietilo.
1 1 . El compuesto de la reivindicación 1 , que comprende por lo menos un nucleosido de tetrahidropirano modificado en donde un anillo de tetrahidropirano reemplaza al anillo de furanosa.
1 2. El compuesto de la reivindicación 1 1 , en donde cada uno del por lo menos un nucleosido de tetrahidropirano modificado tiene la estructura: en donde Bx es una porción de base heterocíclica opcionalmente protegida .
1 3. El compuesto de la reivindicación 2, en donde por lo menos un nucleosido comprende una nucleobase modificada.
1 4. El compuesto de la reivindicación 1 3, en donde la nucleobase modificada es una 5-metilcitosina.
1 5. El compuesto de la reivindicación 1 , en donde el oligonucleótido modificado comprende: un segmento gap que consiste de deoxinucleósidos enlazados; un segmento wing (de ala) 5' que consiste de nucleósidos enlazados; un segmento wing 3' que consiste de nucleósidos enlazados; en donde el segmento gap está posicionado inmediatamente adyacente a y entre el segmento wing 5' y el segmento wing 3' y en donde cada nucleósido de cada segmento wing comprende un azúcar modificada.
1 6. El compuesto de la reivindicación 1 5, en donde el oligonucleótido modificado comprende: un segmento gap que consiste de diez deoxinucleósidos enlazados; un segmento wing (de ala) 5' que consiste de cinco nucleósidos enlazados; un segmento wing 3' que consiste de cinco nucleósidos enlazados; en donde el segmento gap está posicionado inmediatamente adyacente y entre el segmento wing 5' y el segmento wing 3' , en donde cada nucleósido de cada segmento wing comprende un azúcar con 2'-O-metoxietilo; y en donde cada enlace de internucleósido es un enlace de fosforotioato .
1 7. El compuesto de la reivindicación 1 6, en donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
1 8. El compuesto de la reivindicación 2 o 1 7, en donde el oligonucleótido modificado consiste de 20 nucleósidos enlazados.
1 9. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 8 para tratar complicaciones tromboembólicas.
20. El compuesto de la reivindicación 19, en donde el animal es un humano.
21 . El compuesto de la reivindicación 20, para prevenir la trombosis venosa profunda.
22. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 20, para evitar la embolia pulmonar.
23. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 9, para coadministración con cualquiera del grupo seleccionado de aspirina, clopidogrel , dipyridamole, heparina, lepirudina, ticlopidina , warafina , apixaban , rivaroxaban , LOVENOX e inhibidor de Factor Xa.
24. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 9, para administración concomitante con cualquiera del grupo seleccionado de aspirina, clopidogrel , dipyridamole, heparina, lepirudina, ticlopidina, warafina, apixaban , rivaroxaban , LOVENOX e inhibidor de Factor Xa .
25. El compuesto de la reivindicación 23, para admi nistración parental .
26. El compuesto de la reivindicación 24, para administración parental .
27. El compuesto de la reivindicación 23, para admi nistración parental .
28. El compuesto de la reivindicación 26, para administración subcutánea o intravenosa .
29. Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 1 2 a 30 nucleósidos enlazados, en donde el oligonucleótido modificado es complementario a un ácido nucleico del Factor 1 1 para tratar un trastorno de coagulación .
30. El uso del compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 8 con cualquiera del grupo seleccionado de aspirina , clopidogrel , dipyridamole, heparina, lepirudina, ticlopidina, warafina , apixaban , rivaroxaban y LOVENOX para la elaboración de un medicamento para tratar complicaciones tromboembólicas.
31 . Una composición que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 1 2 a 30 nucleósidos enlazados y que comprende una secuencia de nucleobases que comprende por lo menos 1 2 nucleobases contiguas de SEQ I D N O: 223 o una sal de los mismos y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
32. La composición de la reivindicación 31 , que consiste de un oligonucleótido de cadena sencilla.
33. La composición de la reivindicación 32 , en donde el oligonucleótido modificado consiste de 20 nucleósidos enlazados.
34. Un método que comprende identificar un animal en riesgo de complicaciones tromboembólicas; y administrar al animal en riesgo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 1 2 a 30 nucleósidos enlazados, en donde el oligonucleótido modificado es complementario a un ácido nucleico del Factor 1 1 .
35. El método de la reivindicación 34, en donde la complicación tromboembólica es trombosis venosa profunda, embolia pulmonar o una combinación de las mismas.
36. Un método que comprende identificar un animal que tiene un trastorno de coagulación ; y administrar al animal una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 12 a 30 nucleósidos enlazados, en donde el oligonucleótido modificado es complementario a un ácido nucleico del Factor 1 1 .
37. El método de la reivindicación 36, que comprende co-administrar el compuesto y cualquiera del grupo seleccionado de aspirina , clopidogrel , dipyridamole, heparina, lepirudina, ticlopidina, warafina, apixaban , rivaroxaban , LOVENOX e inhibidor de Factor Xa .
38. Un método que comprende reducir el riesgo de complicaciones tromboembólicas en un animal ; y administrar al animal una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 12 a 30 nucleósidos enlazados, en donde el oligonucleótido modificado es complementario a un ácido nucleico del Factor 1 1 .
39. Un método que comprende tratar un trastorno de coagulación en un animal ; y administrar al animal una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 1 2 a 30 nucleósidos enlazados, en donde el oligonucleótido modificado es complementario a un ácido nucleico del Factor 1 1 .
40. El método de la reivindicación 39, que comprende invertir la inhibición del Factor 1 1 en el animal mediante la administración de un antídoto para el oligonucleótido modificado.
41 . El método de la reivindicación 39, en donde el antídoto es un oligonucleótido complementario al oligonucleótido modificado.
42. El método de la reivindicación 40, que comprende invertir la inhibición del Factor 1 1 en el animal mediante la ad ministración de cualquiera del grupo seleccionado de proteína de Factor 7, Factor 7a , Factor 1 1 o Factor 1 1 a.
43. Un método que comprende identificar un animal en riesgo de complicaciones tromboembólicas; y administrar al animal en riesgo una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor específico del Factor 1 1 y terapia antiplaquetas.
44. Un método que comprende identificar un animal que tiene un trastorno de coagulación ; y administrar al animal una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor específico del Factor 1 1 y terapia anti-plaquetas.
45. Un método que comprende reducir el riesgo de complicaciones tromboembólicas en un animal; y administrar al animal una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor específico del Factor 1 1 y terapia anti-plaquetas.
46. Un método que comprende tratar un trastorno de coagulación en un animal ; y administrar al animal una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor específico del Factor 1 1 y terapia anti-plaquetas.
47. El método de cualquiera de las reivindicaciones 43 a 46, en donde la terapia anti-plaquetas se selecciona de un inhibidor del receptor ADP, NSAI D, inhibidor de fosfodiesterasa, inhibidor de glicoproteína I I B/I I IA o inhibidor de retoma de adenocina o una combinación de los mismos.
48. El método de la reivindicación 47, en donde el N SAI D es aspirina, naproxen o una combinación de ambos.
49. El método de la reivindicación 47 , en donde el inhibidor de receptor ADP/P2Y 1 2 es una tienopiridi na.
50. Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 1 2 a 30 nucleósidos enlazados y que comprende una secuencia de nucleobases que comprende una porción de por lo menos 8 nucleobases contiguas complementarias a una porción de igual longitud de nucleobases 738 a 762 de SEQ I D NO: 1 ; y en donde la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado es por lo menos 90% complementaria a SEQ I D NO: 1 .
51 . Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 1 2 a 30 nucleósidos enlazados y que comprende una secuencia de nucleobases que comprende una porción de por lo menos 8 nucleobases contiguas complementarias a una porción de igual longitud de nucleobases 656 a 704 de SEQ I D NO: 1 ; y en donde la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado es por lo menos 90% complementaria a SEQ I D NO: 1 .
52. Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 1 2 a 30 nucleósidos enlazados y que comprende una secuencia de nucleobases que comprende una porción de por lo menos 8 nucleobases contiguas complementarias a una porción de igual longitud de nucleobases 1 01 8 a 1 042 de SEQ I D NO: 1 ; y en donde la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado es por lo menos 90% complementaria a SEQ I D NO: 1 .
53. Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 1 2 a 30 nucleósidos enlazados y que comprende una secuencia de nucleobases que comprende una porción de por lo menos 8 nucleobases contiguas complementaria a una porción de igual longitud de nucleobases 1062 a 1091 de SEQ I D NO: 1 ; y en donde la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado es por lo menos 90% complementaria a SEQ I D NO: 1 .
54. Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 1 2 a 30 nucleósidos enlazados y que comprende una secuencia de nucleobases que comprende una porción de por lo menos 8 nucleobases contiguas complementaria a una porción de igual longitud de nucleobases 1275 a 1 31 8 de SEQ I D NO: 1 ; y en donde la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado es por lo menos 90% complementaria a SEQ I D NO: 1 . RESU M EN La invención se refiere a compuestos antisentido y a métodos para disminuir el Factor 1 1 y tratar o prevenir las complicaciones tromboembólicas en un individuo que lo necesita. Ejemplos de estados de enfermedad que pueden ser mejorados con la administración de compuestos antisentido apuntados contra el Factor 1 1 incluyen trombosis, embolia y tromboembolia, tales como trombosis venosa profunda , embolia pulmonar, infarto al miocardio y accidente vascular cerebral . Los compuestos antisentido dirigidos contra el Factor 1 1 se pueden utilizar también como tratamiento profiláctico para prevenir una trombosis y una embolia en los individuos con riesgo.
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