MX2012010600A

MX2012010600A - Plantas que tienen mejores rasgos relacionados con el redimiento y un metodo para producirlas.

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Publication number: MX2012010600A
Application number: MX2012010600A
Authority: MX
Inventors: Christophe Reuzeau; Yves Hatzfeld
Original assignee: Basf Plant Science Co Gmbh
Priority date: 2010-03-18
Filing date: 2011-03-17
Publication date: 2012-10-05
Also published as: AU2011228733A1; US20130036516A1; EP2547773A4; AU2011228733A2; CA2792745A1; EA201290930A1; AR081740A1; DE112011100940T5; CN102892890A; CL2012002568A1; WO2011114305A1; BR112012023505A2; EP2547773A1; ZA201207743B

Abstract

Un método para mejorar rasgos relacionados con el rendimiento en plantas mediante la modulación de la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo CLE 2 o un polipéptido Bl-1 o un polipéptido SEC22. Plantas que tienen expresión modulada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo CLE 2, o un polipéptido Bl-1, o un polipéptido SEC22, en donde dichas plantas tienen mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control. Constructos que comprenden ácidos nucleicos que codifican tipo CLE 2, útiles en la realización de los métodos de la invención. Ácidos nucleicos que codifican Bl-1 y constructos que los comprenden desconocidos hasta el momento, útiles en la realización de los métodos de la invención. Ácidos nucleicos que codifican SEC22 y constructos que los comprenden desconocidos hasta el momento, útiles en la realización de los métodos de la invención.

Description

PLANTAS QUE TIENEN MEJORES RASGOS RELACIONADOS CON EL RENDIMIENTO Y UN MÉTODO PARA PRODUCIRLAS La presente invención se refiere, en general, al campo de la biología molecular y se relaciona con un método para mejorar rasgos relacionados con el rendimiento en plantas mediante la modulación de la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo CLE 2. La presente invención también se refiere a plantas que tienen expresión modulada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo CLE 2, en donde dichas plantas tienen mejores rasgos relacionados con el rendimiento en relación con las correspondientes plantas de tipo silvestre u otras plantas de control. La invención también provee constructos útiles en los métodos de la invención.

La presente invención se refiere, en general, al campo de la biología molecular y se relaciona con un método para mejorar, en plantas, varios rasgos relacionados con el rendimiento de importancia económica. Más específicamente, la presente invención se refiere a un método para mejorar rasgos relacionados con el rendimiento en plantas mediante la modulación de la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido BI-1. La presente invención también se refiere a plantas que tienen expresión modulada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido BI-1 , en donde dichas plantas tienen mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control. La invención también provee ácidos nucleicos que codifican BI-1 y constructos que los comprenden desconocidos hasta el momento, útiles en la realización de los métodos de la invención.

La presente invención se refiere, en general, al campo de la biología molecular y se relaciona con un método para mejorar rasgos relacionados con el rendimiento en plantas mediante la modulación de la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido SEC22. La presente invención también se refiere a plantas que tienen expresión modulada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido SEC22, en donde dichas plantas tienen mejores rasgos relacionados con el rendimiento en relación con las correspondientes plantas de tipo silvestre u otras plantas de control. La invención también provee constructos útiles en los métodos de la invención.

La población mundial en constante crecimiento y la disminución del suministro de tierras arables disponibles para la agricultura estimulan la investigación tendiente a incrementar la eficacia de la agricultura. Los medios convencionales para mejorar los cultivos y la horticultura utilizan técnicas de reproducción selectivas a fin de identificar plantas que tengan características deseables. Sin embargo, dichas técnicas de reproducción selectivas tienen varios inconvenientes, a saber, que estas técnicas generalmente son laboriosas y dan como resultado plantas que, a menudo, contienen componentes genéticos heterogéneos que no siempre resultarán en que el rasgo deseable sea heredado de las plantas progenitoras. Los avances en biología molecular han permitido que el hombre modifique el germoplasma de animales y plantas. La manipulación genética de plantas implica el aislamiento y la manipulación del material genético (típicamente en la forma de ADN o ARN) y la posterior introducción de ese material genético en una planta. Dicha tecnología tiene la capacidad de producir cultivos o plantas que tengan varios rasgos mejorados desde el punto de vista económico, agronómico u hortícola.

Un rasgo de particular interés económico es el aumento del rendimiento. Normalmente, el rendimiento se define como el producto medible de valor económico de un cultivo. Esto se puede definir en términos de cantidad y/o calidad. El rendimiento depende directamente de diversos factores, por ejemplo, la cantidad y el tamaño de los órganos, la arquitectura de la planta (por ejemplo, la cantidad de ramas), la producción de semillas, la senectud de las hojas y otros. El desarrollo de la raíz, la absorción de nutrientes, la tolerancia al estrés y el vigor temprano también pueden ser factores importantes para determinar el rendimiento. En consecuencia, la optimización de los factores antes mencionados puede contribuir a aumentar el rendimiento del cultivo.

El rendimiento de las semillas es un rasgo particularmente importante debido a que las semillas de muchas plantas son importantes para la nutrición de humanos y animales. Los cultivos tales como maíz, arroz, trigo, cañóla y soja representan más de la mitad de la ingesta calórica total de los humanos, ya sea por consumo directo de las semillas mismas o por consumo de productos cárnicos obtenidos de semillas procesadas. También son fuente de azúcares, aceites y muchos tipos de metabolitos que se utilizan en procesos industriales. Las semillas contienen un embrión (fuente de nuevos brotes y raíces) y un endosperma (fuente de nutrientes para el crecimiento del embrión durante la germinación y durante el crecimiento temprano de las plántulas). El desarrollo de una semilla incluye muchos genes y requiere la transferencia de metabolitos desde raíces, hojas y tallos hasta la semilla en crecimiento. El endosperma, en particular, asimila los precursores metabólicos de hidratos de carbono, aceites y proteínas y los sintetiza en macromoléculas de almacenamiento para llenar el grano.

Otro rasgo importante para muchos cultivos es el vigor temprano. Mejorar el vigor temprano es un objetivo importante de los programas modernos de reproducción de arroz en cultivares de arroz templados y tropicales. Las raíces largas son importantes para un adecuado anclaje al suelo en el caso del arroz sembrado en agua. Cuando el arroz se siembra directamente en campos inundados y cuando las plantas deben emerger rápidamente del agua, los brotes más largos se asocian con el vigor. Cuando se practica la siembra mecánica, los mesocotilos y coleoptilos más largos son importantes para el buen surgimiento de las plántulas. La capacidad de manipular por ingeniería genética el vigor temprano en las plantas sería de gran importancia en agricultura. Por ejemplo, el escaso vigor temprano ha sido una limitación a la introducción de híbridos de maíz (Zea mays L.) basados en el germoplasma del cinturón maizero en el Atlántico Europeo.

Otro rasgo importante es una mejor tolerancia al estrés abiótico. El estrés abiótico es una causa principal de la pérdida de cultivos a nivel mundial, lo cual reduce en más del 50% el rendimiento promedio de la mayoría de las plantas de cultivo importantes (Wang et al., Planta 218, 1-14, 2003). El estrés abiótico puede ser causado por estrés por sequía, salinidad, temperaturas extremas, toxicidad química y estrés oxidativo. La capacidad de mejorar la tolerancia de las plantas al estrés abiótico sería de gran ventaja económica para los agricultores en todo el mundo y permitiría la plantación de cultivos en condiciones adversas y en territorios en los cuales la plantación de cultivos no puede ser posible de otra manera.

En consecuencia, se puede aumentar el rendimiento de los cultivos mediante la optimización de uno de los factores antes mencionados.

Según el uso final, se puede favorecer la modificación de ciertos rasgos del rendimiento con respecto a otros. Por ejemplo, para aplicaciones tales como producción de forraje o madera, o recursos de biocombustibles, puede ser deseable un aumento de las partes vegetativas de una planta y, para aplicaciones tales como producción de harina, almidón o aceite, puede ser particularmente deseable un aumento en los parámetros de la semilla. Aun entre los parámetros de semilla, se pueden favorecer algunos con respecto a otros, según la aplicación. Diversos mecanismos pueden contribuir a aumentar el rendimiento de las semillas, ya sea aumentando el tamaño de las semillas o aumentado la cantidad de semillas.

Un enfoque para aumentar el rendimiento (biomasa y/o rendimiento de semilla) en plantas puede ser mediante la modificación de los mecanismos de crecimiento inherentes de una planta, tales como el ciclo celular o varias vías de señalización involucradas en el crecimiento de las plantas o en los mecanismos de defensa.

Ahora se ha descubierto que se pueden mejorar varios rasgos relacionados con el rendimiento en plantas mediante la modulación de la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo CLE 2 o inhibidor de Bax 1 (BI-1 ) o un homólogo de éste o un SEC22 en una planta.

ANTECEDENTES Polipéptido tipo CLE 2 Los polipéptidos CLE representan una familia específica de plantas de pequeñas proteínas (< 15 kDa), con una señal de secreción putativa del terminal N, que se informó participan en procesos de señalización (Whitford et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 105(47): 18625-30, 2008). Todos comparten un dominio conservado de 12 a 14 aminoácidos en el terminal C o cerca de éste. Whitford et al. dividen el grupo de péptidos CLE en un Grupo A y B, en donde el Grupo A comprende los polipéptidos tipo CLE 2. WO 2007/138070 describe un polipéptido CLE que, cuando se reguló de manera descendente su expresión en semillas, exhibió mayor rendimiento de semillas, expresado como cantidad de semillas llenas, peso total de semillas, cantidad total de semillas e índice de cosecha, en comparación con las plantas que carecían del transgén tipo CLE; sin embargo, el polipéptido CLE usado no pertenece al grupo de polipéptidos de tipo CLE 2. WO 01/96582 describe que la expresión ectópica de varios LLP que comprenden el motivo de aminoácido KRXXXXGXXPXHX (en donde X puede ser cualquier aminoácido) da como resultado plantas transgénicas estériles o, en el mejor de los casos, plantas con fertilidad reducida.

Polipéptido inhibidor de Bax 1 (BI-1 ) Las proteínas inhibidoras de Bax 1 (BI-1 ) son proteínas que abarcan la membrana con 6 a 7 dominios transmembranales y un extremo terminal C citoplasmático en el retículo endoplasmático (ER) y en la envoltura nuclear (Hückelhoven, 2004, Apoptosis 9(3):299-307). Son ubicuas y están presentes en organismos eucarióticos y procarióticos. En las plantas, pertenecen a una pequeña familia de genes, por ejemplo, de hasta tres miembros en Arabidopsis, y se expresan en varios tejidos, durante el envejecimiento y en respuesta al estrés abiótico y biótico.

Se ha demostrado que las proteínas BI-1 pueden tener funciones protectoras contra la muerte celular inducida por una disfunción de la mitocondria o mecanismos del ER relacionados con el estrés. Además, también se informó que BI-1 cumple una función durante las interacciones entre los patógenos vegetales, y su actividad puede estar regulada por Ca2+ mediante la unión a CaM (Kamai-Yamada et al. 2009 J Biol Chem. 284(41 ):27998-8003; Watanabe and Lam, 2009, Int J. Mol. Sci. 10(7):3149-67). Además, Nagano et al. (2009, Plant J., 58(1 ): 122-134) identificaron un interactuante Bl-1 que participa en el metabolismo de esfingolípidos (ScFAHI ), que también se ubica en la membrana del ER. Debido a la función de los esfingolípidos en la activación de PCD, este descubrimiento concuerda con la función de BI-1 como reostato, al modular PCD corriente abajo de la vía de estrés de ER (Watanabe and Lam, 2008, Plant Signal Behavior. 3(8):564-6).

PolipéDtido SEC22 En todas las células eucarióticas, el tráfico vesicular es crucial para mantener las funciones de las células y organelas. La superfamilia de receptores de proteínas del adaptador del factor sensible a netilmaleimida (SNARE) cumple funciones clave en la identidad y el intercambio de la vesícula/organela. Las vesículas de transporte portan varias proteínas de carga desde un compartimento donante hasta un compartimento de destino, y descargan la carga en el compartimento de destino mediante la fusión con la membrana del compartimento de destino. Las moléculas de SNARE tienen una función central para iniciar la fusión membranal entre las vesículas de transporte y las membranas blanco al formar un complejo trans-SNARE específico en cada etapa de transporte. Los polipéptidos SNARE forman espontáneamente interacciones entre proteínas muy estables que ayudan a superar la barrera de energía necesaria para la fusión membranal. Las plantas superiores, en comparación con otras eucariotas, codifican una mayor cantidad de proteínas SNARE en sus genomas. Las plantas carecen de subfamilias proteicas SNARE particulares, pero también desarrollaron pocos nuevos tipos de SNARE. Por ejemplo, las plantas carecen de Synaptobrevins, una clase de proteínas SNARE que tienen un corto dominio regulador del terminal N. Las SNARE se pueden clasificar según su localización subcelular (clasificación funcional) o de acuerdo con la presencia de residuos de aminoácidos que no varían en el centro del motivo SNARE (clasificación estructural). La clasificación funcional divide SNARE en SNARE asociadas a vesículas y asociadas a membranas blanco (v- y t-SNARE, respectivamente). De modo alternativo, en la clasificación estructural, las SNARE se pueden agrupar en Q-SNARE y R-SNARE debido a que hay un residuo conservado de glutamina o arginina en el centro del dominio SNARE. En general, las t-SNARE corresponden a Q-SNARE, y las v-SNARE corresponden a R-SNARE. A menudo, las R-SNARE que residen en vesículas se denominan VAMP (proteínas membranales asociadas a vesículas). Las R-SNARE pueden tener una región reguladora corta o larga en el terminal N, y también se las puede subdividir en brevins (lat. brevis, corto) y longins (lat. longus, largo). Todas las R-SNARE vegetales conocidas pertenecen a la categoría longin (Uemura et al. 2005; FEBS Lett. 579:2842-46). Además, las proteínas SNARE son polipéptidos pequeños (aproximadamente 200-400-aminoácidos) caracterizados por la presencia de un dominio peptídico particular, el motivo SNARE (Jahn & Scheller 2006 Nature Reviews 631-643). El dominio SNARE es una porción de 60-70 aminoácidos que consisten en una repetición heptada que puede formar una estructura de bobina en espiral mediante interacciones heterooligoméricas. En general, la asociación de SNARE con bicapas lipídicas se confiere mediante dominios transmembranales del terminal C (dominio sinaptobrevin). Sin embargo, algunas SNARE se unen a membranas mediante anclas lipídicas. Además del dominio SNARE y el dominio transmembranal del terminal C (dominio sinaptobrevin), muchas SNARE contienen motivos de secuencias reguladoras del terminal N que controlan la actividad de proteína SNARE in vivo de acuerdo con un rango de polipéptidos accesorios.

Las R-SNARE codificadas por el genoma vegetal se pueden agrupar en tres subfamilias principales, VAMP, YKT6 y SEC22 (Lipka et al. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2007. 23:147-74).). Todas las R-SNARE de plantas son las llamadas longins, que comprenden una porción del terminal N extendida (el dominio longin) que, sobre la base de datos de R-SNARE humanas, pueden participar en la localización subcelular y la formación de complejos de SNARE, por ejemplo, mediante la interacción con polipéptidos reguladores (Uemura et al. 2005; FEBS Lett. 579:2842-46). Con excepción de un fenotipo de resistencia a la sal descubierto recientemente (Leshemet al. 2006, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 103:18008-13) no se ha descubierto ningún otro fenotipo en un mutante de R-SNARE de Arabidopsis; lo cual sugiere que la mayoría de las R-SNARE actúan al menos de manera parcialmente redundante, lo cual hace difícil deducir su función en las plantas. Los estudios de sobreexpresión en protoplastos vegetales sugieren que Sec22 y Membl 1 participan en el tráfico de proteínas anterógradas en la inferíase de ER-Golgi (Chatre et al. Plant Physiology, 2005, Vol. 139, pp. 1244-1254).

SÍNTESIS Polipéptido tipo CLE 2 Sorprendentemente, ahora se ha descubierto que modular la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo CLE 2 produce plantas que tienen mejores rasgos relacionados con el rendimiento, en particular, mayor rendimiento, con respecto a las plantas de control. De acuerdo con una forma de realización, se provee un método para mejorar rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, con respecto a las plantas de control, que comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo CLE 2.

Polipéptido inhibidor de Bax 1 (BI-1) De modo sorprendente, ahora se ha descubierto que modular la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido inhibidor de Bax 1 (BI-1) produce plantas que tienen mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control, en particular, mayor rendimiento, con respecto a las plantas de control y, más en particular, mayor rendimiento de semillas y/o mayor biomasa, con respecto a las plantas de control. De acuerdo con una forma de realización, se provee un método para mejorar los rasgos relacionados con el rendimiento provistos en la presente en plantas, con respecto a las plantas de control, que comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido inhibidor de Bax 1 , como se define en la presente.

Polipéptido SEC22 Sorprendentemente, ahora se ha descubierto que modular la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido SEC22 produce plantas que tienen mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control. De acuerdo con una forma de realización, se provee un método para mejorar rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, con respecto a las plantas de control, que comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido SEC22.

En una forma de realización preferida, la proteína de interés (POI) es un polipéptido tipo CLE 2. En una segunda forma de realización preferida, la proteína de interés (POI) es un polipéptido inhibidor de Bax 1 (BI-1 ). En una tercera forma de realización preferida, la proteína de interés (POI) es un polipéptido SEC22.

DEFINICIONES Las siguientes definiciones se usarán a lo largo de la presente memoria descriptiva.

Polipéptido(s)/Proteína(s) Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan en forma indistinta en la presente y se refieren a los aminoácidos en una forma polimérica de cualquier longitud, ligados por enlaces peptídicos.

Polinucleótido(s)/Ácido(s) nucleico(s)/Secuencia(s) de ácidos nucleicos/Secuencia(s) de nucleótidos Los términos "polinucleótido(s)", "secuencia(s) de ácidos nucleicos", "secuencia(s) de nucleótidos", "ácido(s) nucleico(s)", "molécula de ácido nucleico" se usan en forma indistinta en la presente y se refieren a nucleótidos, sean ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos o una combinación de ambos, en una forma polimérica no ramificada de cualquier longitud.

Homólogo(s) Los "homólogos" de una proteína abarcan los péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que tienen sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de aminoácidos con respecto a la proteína en cuestión no modificada y que tienen actividad biológica y funcional similar a la proteína no modificada de la cual derivan.

Una eliminación se refiere a la supresión de uno o más aminoácidos de una proteína.

Una inserción se refiere a la introducción de uno o más residuos de aminoácidos en un sitio predeterminado de una proteína. Las inserciones pueden comprender fusiones N-terminal y/o C-terminal y también inserciones intrasecuencia de aminoácidos únicos o múltiples. Generalmente, las inserciones en la secuencia de aminoácidos serán más pequeñas que las fusiones N- o C-terminal, en el orden de alrededor de 1 a 10 residuos. Los ejemplos de péptidos o proteínas de fusión N- o C-terminal incluyen el dominio de unión o dominio de activación de un activador de la transcripción como se usa en el sistema de dos híbridos de levadura, proteínas de recubrimiento de fagos, (histidina)-€-tag, glutatión S-transferasa-tag, proteína A, proteína de unión a maltosa, dihidrofolato reductasa, epitopo Tag*100, epitopo c-myc, epitopo FLAG® , lacZ, CMP (péptido de unión a calmodulina), epitopo HA, epitopo de proteína C y epitopo VS V.

Una sustitución se refiere al reemplazo de aminoácidos de la proteína con otros aminoácidos que tienen propiedades similares (tales como hidrofobicidad, hidrofilicidad, antigenicidad, propensión similar a formar o romper estructuras helicoidales a o estructuras de hoja ß). Las sustituciones de aminoácidos son típicamente de residuos únicos, pero se pueden agrupar según las restricciones funcionales del polipéptido y pueden variar de 1 a 10 aminoácidos; generalmente, las inserciones serán del orden de alrededor de 1 a 10 residuos de aminoácidos. Preferentemente, las sustituciones de aminoácidos son sustituciones conservadoras de aminoácidos. Las tablas de sustituciones conservadoras son conocidas en el arte (véase, por ejemplo, Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman and Company (Eds) y la siguiente Tabla 1).

Tabla 1 : Ejemplos de sustituciones conservadoras de aminoácidos Las sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de aminoácidos se pueden realizar fácilmente mediante las técnicas de síntesis de péptidos conocidas en el arte, tales como síntesis de péptidos en fase sólida y similares, o mediante la manipulación de ADN recombinante. Los métodos para la manipulación de secuencias de ADN para producir sustitución, inserción o eliminación de variantes de una proteína son muy conocidos en el arte. Por ejemplo, las técnicas para realizar mutaciones por sustitución en sitios predeterminados del ADN son muy conocidas por los expertos en el arte e incluyen mutagénesis M13, mutagénesis de T7-Gen in vitro (USB, Cleveland, OH), mutagénesis dirigida al sitio QuickChange (Stratagene, San Diego, CA), mutagénesis dirigida al sitio mediada por PCR u otros protocolos de mutagénesis dirigida al sitio.

Derivados Los "derivados" incluyen péptidos, oligopéptidos, polipéptidos que pueden comprender, en comparación con la secuencia de aminoácidos de la forma natural de la proteína tal como la proteína de interés, sustituciones de aminoácidos por residuos de aminoácidos no naturales o adiciones de residuos de aminoácidos no naturales. Los "derivados" de una proteína también abarcan péptidos, oligopéptidos, polipéptidos que comprenden residuos de aminoácidos alterados de forma natural (glucosilados, adiados, prenilados, fosforilados, miristoilados, sulfatados, etc.) o alterados de forma no natural, en comparación con la secuencia de aminoácidos de una forma natural del polipéptido. Un derivado también puede comprender uno o más sustituyentes o adiciones de no aminoácidos, en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cual deriva, por ejemplo una molécula informadora u otro ligando, unido de forma covalente o no covalente a la secuencia de aminoácidos, tal como una molécula indicadora que se liga para facilitar su detección y residuos de aminoácidos no naturales, con respecto a la secuencia de aminoácidos de una proteína natural. Además, los "derivados" también incluyen fusiones de la forma natural de la proteína con péptidos rotuladores tales como FLAG, HIS6 o tiorredoxina (para una reseña sobre péptidos rotuladores, véase Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533, 2003).

Ortólogo(s)/Parálogo(s) Los ortólogos y parálogos abarcan conceptos evolutivos que se utilizan para describir las relaciones ancestrales de los genes. Los parálogos son genes dentro de la misma especie que han sido originados por duplicación de un gen ancestral; los ortólogos son genes que provienen de diferentes organismos que han sido originados por especiación y también derivan de un gen ancestral común.

Dominio. Motivo/Secuencia de consenso/Característica El término "dominio" se refiere a un conjunto de aminoácidos conservados en posiciones específicas a lo largo de un alineamiento de secuencias de proteínas relacionadas en la evolución. Mientras que los aminoácidos en otras posiciones pueden variar entre homólogos, los aminoácidos altamente conservados en posiciones específicas indican aminoácidos que probablemente son esenciales para la estructura, estabilidad o función de una proteína. Si se los identifica por su alto grado de conservación en secuencias alineadas de una familia de homólogos de proteínas, se los puede utilizar como identificadores para determinar si cualquier polipéptido en cuestión pertenece a una familia de polipéptidos previamente identificada.

El término "motivo" o "secuencia de consenso" o "característica" se refiere a una región corta conservada en la secuencia de proteínas relacionadas en la evolución. Con frecuencia, los motivos son partes altamente conservadas de dominios, pero también pueden incluir sólo parte del dominio, o pueden estar ubicados fuera del dominio conservado (si todos los aminoácidos del motivo están fuera de un dominio definido).

Existen bases de datos especializadas para la identificación de dominios, por ejemplo, SMART (Schuitz et al. (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95, 5857-5864; Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242-244), InterPro (Mulder et al., (2003) Nucí. Acids. Res. 31 , 315-318), Prosite (Bucher and Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds., pp53-61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al., Nucí. Acids. Res. 32:D134-D137, (2004)) o Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1 ): 276-280 (2002)). Un conjunto de herramientas para el análisis ¡n silico de secuencias proteicas se encuentra disponible en el servidor proteómico ExPASy (S iss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al., ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31 :3784-3788(2003)). También se pueden identificar dominios o motivos mediante técnicas de rutina, tales como alineamiento de secuencias.

Los métodos para el alineamiento de secuencias para la comparación son muy conocidos en el arte, dichos métodos incluyen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA. GAP usa el algoritmo de Needleman y Wunsch ((1970) J Mol Biol 48: 443-453) para hallar el alineamiento global (es decir, que abarca las secuencias completas) de dos secuencias que maximiza la cantidad de coincidencias y minimiza la cantidad de brechas. El algoritmo BLAST (AltschuI et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10) calcula el porcentaje de identidad de secuencia y realiza un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias. El software para realizar el análisis BLAST está disponible al público mediante National Centre for Biotechnology Information (NCBI). Se pueden identificar fácilmente homólogos mediante, por ejemplo, el algoritmo ClustalW de alineamiento de secuencia múltiple (versión 1.83), con los parámetros predeterminados de alineamiento de a pares y un método de calificación en porcentaje. Los porcentajes globales de similitud e identidad también se pueden determinar mediante uno de los métodos disponibles en el paquete de software MatGAT (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 2003 Jul 10;4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences.). Se puede realizar edición manual menor para optimizar el alineamiento entre motivos conservados, como sería evidente para un experto en el arte. Además, en lugar de utilizar secuencias de longitud total para la identificación de homólogos, también se pueden utilizar dominios específicos. Los valores de identidad de secuencia se pueden determinar con respecto a la secuencia completa de ácidos nucleicos o aminoácidos, o con respecto a motivo(s) conservado(s) o dominios seleccionados, utilizando los programas antes mencionados con los parámetros predeterminados. Para los alineamientos locales, el algoritmo de Smith-Waterman es particularmente útil (Smith TF, Waterman MS (1981 ) J. Mol. Biol 147(1 );195-7).

BLAST recíproco En general, esto incluye un primer BLAST que implica someter a BLAST una secuencia incógnita (por ejemplo, usando cualquiera de las secuencias enumeradas en la Tabla A de la sección de Ejemplos) con respecto a cualquier base de datos de secuencias, tal como la base de datos disponible al público NCBI. Generalmente, se utiliza BLASTN o TBLASTX (con valores predeterminados estándar) cuando se comienza desde una secuencia de nucleótidos y BLASTP o TBLASTN (con valores predeterminados estándar) cuando se comienza desde una secuencia de proteínas. Los resultados de BLAST se pueden filtrar opcionalmente. Las secuencias de longitud total de los resultados filtrados o de los resultados no filtrados luego se someten de nuevo a BLAST (segundo BLAST) con respecto a secuencias provenientes del organismo del cual deriva la secuencia incógnita Luego se comparan los resultados del primer y segundo BLAST. Se identifica un parálogo si una coincidencia de alto rango del primer blast proviene de la misma especie de la cual deriva la secuencia incógnita, entonces un nuevo blast idealmente daría como resultado que la secuencia incógnita se encuentre entre las mayores coincidencias; se identifica un ortólogo si una coincidencia de alto rango en el primer BLAST no proviene de la misma especie de la cual deriva la secuencia incógnita y preferentemente, daría como resultado que el nuevo BLAST en la secuencia incógnita se encuentre entre las mayores coincidencias.

Las coincidencias de alto rango son aquellas que tienen bajo valor E. Cuanto más bajo es el valor E, más importante es la calificación (o, en otras palabras, menor es la probabilidad de hallar la coincidencia por azar). El cálculo del valor E es bien conocido en el arte. Además de los valores E, las comparaciones también se calificaron por porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad se refiere a la cantidad de nucleótidos (o aminoácidos) idénticos entre las dos secuencias de ácidos nucleicos (o polipéptidos) comparadas a lo largo de una longitud particular. En el caso de grandes familias, se puede utilizar ClustalW, seguido por un árbol de unión cercana, para contribuir a visualizar la agrupación de genes relacionados e identificar ortólogos y parálogos.

Hibridación El término "hibridación", como se define en la presente, es un proceso en el cual las secuencias de nucleótidos complementarias sustancialmente homologas se aparean entre sí. El proceso de hibridación se puede producir por completo en solución, es decir, ambos ácidos nucleicos complementarios están en solución. El proceso de hibridación también se puede producir con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizados en una matriz tal como esferas magnéticas, esferas de sefarosa o cualquier otra resina. El proceso de hibridación también se puede producir con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizados en un soporte sólido tal como una membrana de nitrocelulosa o nylon o inmovilizado, por ejemplo, por fotolitografía, por ejemplo, en un soporte de vidrio silíceo (este último se conoce como arreglos o microarreglos de ácido nucleico o como chips de ácido nucleico). Con el fin de permitir que se produzca la hibridación, las moléculas de ácido nucleico generalmente se desnaturalizan en forma térmica o química para fundir una doble cadena en dos cadenas simples y/o eliminar las horquillas u otras estructuras secundarias de los ácidos nucleicos monocatenarios.

El término "rigurosidad" se refiere a las condiciones en las cuales tiene lugar la hibridación. La rigurosidad de hibridación está influenciada por condiciones tales como temperatura, concentración salina, fuerza iónica y composición del buffer de hibridación. Generalmente, las condiciones de baja rigurosidad se seleccionan para que sean de alrededor de 30 °C por debajo del punto de fusión térmico (Tm) de la secuencia específica con una fuerza iónica y pH definidos. Las condiciones de rigurosidad media son aquellas en que la temperatura es 20 °C por debajo de Tm y las condiciones de rigurosidad alta son aquellas en que la temperatura es 10 °C por debajo de Tm. Las condiciones de rigurosidad alta se utilizan típicamente para aislar secuencias de hibridación que tienen mucha similitud de secuencia con la secuencia de ácidos nucleicos blanco. Sin embargo, los ácidos nucleicos se pueden desviar en secuencia y aún así codificar un polipéptido sustancialmente idéntico, debido a la degeneración del código genético. En consecuencia, algunas veces las condiciones de hibridación de rigurosidad media pueden ser necesarias para identificar dichas moléculas de ácido nucleico.

La Tm es la temperatura con una fuerza iónica y pH definidos, a la cual el 50% de la secuencia blanco se híbrida a una sonda perfectamente apareada. La Tm depende de las condiciones de la solución y la composición base y la longitud de la sonda. Por ejemplo, las secuencias más largas se hibridan específicamente a temperaturas más elevadas. La tasa máxima de hibridación se obtiene de alrededor de 16 °C a 32 °C por debajo de Tm. La presencia de cationes monovalentes en la solución de hibridación reduce la repulsión electroestática entre las dos cadenas de ácido nucleico, promoviendo de este modo la formación de híbridos; este efecto es visible para las concentraciones de sodio de hasta 0,4 M (para mayores concentraciones, este efecto se puede ignorar). La formamida reduce la temperatura de fusión de los dúplex de ADN-ADN y ADN-ARN con 0,6 a 0,7°C para cada porcentaje de formamida, y la adición de 50% de formamida permite que la hibridación se realice de 30 a 45 °C, si bien se reducirá la tasa de hibridación. Los errores de apareamiento de los pares de bases reducen la tasa de hibridación y la estabilidad térmica de los dúplex. En promedio y para sondas grandes, la Tm disminuye alrededor de 1°C por % de errores de apareamiento de las bases. La Tm se puede calcular con las siguientes ecuaciones, según los tipos de híbridos: 1) Híbridos de ADN-ADN (Meinkoth and Wahl, Anal. Biochem., 138: 267-284, 1984): Tm= 81,5eC + 16,6xlog10[Na+]a + 0,41x%[G/Cb] - d???G?0]"1 - 0,61 x% de formamida 2) Híbridos de ADN-ARN o ARN -ARN: Tm= 79,8 + 18,5 (log10[Na+]a) + 0,58 (%G/Cb) + 11 ,8 (%G/Cb)2 - 820/L° 3) Híbridos de oligo-ADN u oligo-ARNd: Para <20 nucleótidos: Tm= 2 (ln) Para 20-35 nucleótidos: Tm= 22 + 1 ,46 (ln) a o para otro catión monovalente, pero sólo exacto en el rango 0,01-0,4 M. b sólo exacto para el % de GC en el rango de 30% a 75%. c L = longitud del dúplex en pares de bases. d oligo, oligonucleótidos; ln, = longitud efectiva del cebador = 2*(No. de G/C)+(No. de NT).

La unión no específica se puede controlar mediante cualquiera de las numerosas técnicas conocidas tales como, por ejemplo, bloqueo de la membrana con soluciones que contienen proteínas, adiciones de ARN, ADN y SDS heterólogos al buffer de hibridación y tratamiento con Rnasa. En las sondas no homologas, se puede realizar una serie de hibridaciones mediante la variación de uno de las siguientes (i) reducir progresivamente la temperatura de apareamiento (por ejemplo, de 68°C a 42°C) o (ii) reducir progresivamente la concentración de formamida (por ejemplo, de 50% a 0%). El experto en el arte conoce varios parámetros que se pueden alterar durante la hibridación y que mantendrán o cambiarán las condiciones de rigurosidad.

Además de las condiciones de hibridación, la especificidad de la hibridación generalmente también depende de la función de los lavados posteriores a la hibridación. Para retirar el fondo que resulta de la hibridación no específica, las muestras se lavan con soluciones salinas diluidas. Los factores críticos de dichos lavados incluyen la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final: a menor concentración salina y mayor temperatura del lavado, mayor rigurosidad del lavado. Las condiciones de lavado se realizan típicamente con la rigurosidad de la hibridación o con una rigurosidad inferior a ésta. Una hibridación positiva produce una señal que es por lo menos el doble de la del fondo. Generalmente, las condiciones de rigurosidad adecuadas para los ensayos de hibridación de ácido nucleico o procedimientos de detección de amplificación génica son como se indicaron anteriormente. También se pueden seleccionar condiciones más o menos rigurosas. El experto en el arte conoce varios parámetros que se pueden alterar durante el lavado y que mantendrán o cambiarán las condiciones de rigurosidad.

Por ejemplo, las condiciones de hibridación de alta rigurosidad típicas para los híbridos de ADN mayores de 50 nucleótidos comprenden hibridación a 65°C en 1x SSC o a 42°C en 1x SSC y 50% de formamida, seguida de lavados a 65eC en 0,3x SSC. Los ejemplos de condiciones de hibridación de rigurosidad media para híbridos de ADN mayores de 50 nucleotidos comprenden hibridación a 50°C en 4x SSC o a 40°C en 6x SSC y 50% de formamida, seguida de lavados a 50°C en 2x SSC. La longitud del híbrido es la longitud prevista para el ácido nucleico de hibridación. Cuando los ácidos nucleicos de secuencia conocida se hibridan, se puede determinar la longitud del híbrido mediante el alineamiento de las secuencias y la identificación de las regiones conservadas descritas en la presente. 1 *SSC es NaCI 0,15 M y citrato de sodio 15 mM; la solución de hibridación y las soluciones de lavado también pueden incluir reactivo de Denhardt 5x, 0,5-1 ,0% de SDS, 100 pg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado, desnaturalizado, 0,5% de pirofosfato de sodio.

A fin de definir el nivel de rigurosidad, se puede hacer referencia a Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition, Coid Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York o a Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989 y las actualizaciones anuales).

Variante de empalme Como se usa en la presente, el término "variante de empalme" abarca variantes de una secuencia de ácidos nucleicos en la cual se escindieron, reemplazaron, desplazaron o agregaron intrones y/o exones seleccionados, o en la cual se acortaron o alargaron intrones. Dichas variantes serán aquellas en las que la actividad biológica de la proteína es sustancialmente retenida; esto se puede obtener mediante la retención selectiva de segmentos funcionales de la proteína. Dichas variantes de empalme se pueden hallar en la naturaleza o pueden ser fabricadas por el hombre. Los métodos para predecir y aislar dichas variantes de empalme son muy conocidos en el arte (véase, por ejemplo, Foissac and Schiex (2005) BMC Bioinformatics 6: 25).

Variante alélica Los alelos o las variantes alélicas son formas alternativas de un gen determinado, ubicado en la misma posición del cromosoma. Las variantes alélicas abarcan polimorfismos de nucleótido único (SNP) y también polimorfismos de inserción/eliminación pequeña (INDEL). Usualmente, el tamaño de los INDEL es menor de 100 pb. Los SNP e INDEL forman el mayor conjunto de variantes de secuencia en las cepas polimórficas naturales de la mayoría de los organismos.

Gen endógeno La referencia en la presente a un gen "endógeno" no sólo se refiere al gen en cuestión como se encuentra en una planta en su forma natural (es decir, sin que medie intervención humana), sino que también se refiere a ese mismo gen (o a un gen/ácido nucleico sustancialmente homólogo) en forma aislada que es (re)introducido posteriormente en una planta (un transgén). Por ejemplo, una planta transgénica que contiene dicho transgén puede presentar una reducción sustancial de la expresión del transgén y/o una reducción sustancial de la expresión del gen endógeno. El gen aislado se puede aislar de un organismo o puede ser preparado por el hombre, por ejemplo, mediante síntesis química.

Transposición génica/Evolución dirigida El transposición génica o la evolución dirigida consiste en iteraciones de transposición de ADN seguido del barrido y/o selección adecuada para generar variantes de ácidos nucleicos o porciones de éstos que codifican proteínas que tienen actividad biológica modificada (Castle et al., (2004) Science 304(5674): 1151-4; patentes estadounidenses 5.811.238 y 6.395.547).

Constructo Otros elementos reguladores pueden incluir mejoradores de la transcripción y de la traducción. Los expertos en el arte conocen las secuencias terminadoras y mejoradoras que pueden ser adecuadas para utilizar en la realización de la invención. También se puede agregar una secuencia intrónica a la región 5' no traducida (UTR) o en la secuencia codificante para aumentar la cantidad de mensaje maduro que se acumula en el citosol, como se describe en la sección de definiciones. Otras secuencias de control (además de las secuencias promotoras, mejoradoras, silenciadoras, intrónicas, regiones 3'UTR y/o 5'UTR) pueden ser elementos estabilizadores de ARN y/o proteína. El experto en el arte conoce dichas secuencias o las puede obtener fácilmente.

Los constructos genéticos de la invención también pueden incluir una secuencia de origen de replicación que es necesaria para el mantenimiento y/o la replicación en un tipo de célula específica. Un ejemplo es cuando es necesario mantener un constructo genético en una célula bacteriana como elemento genético episomal (por ejemplo, una molécula de cósmido o plásmido) Los orígenes de replicacion preferidos incluyen, pero no se limitan a, f1-ori y colE1.

Para detectar la transferencia exitosa de las secuencias de ácidos nucleicos como se usan en los métodos de la invención y/o la selección de plantas transgénicas que comprenden estos ácidos nucleicos, es ventajoso usar genes marcadores (o genes indicadores). Por lo tanto, el constructo genético puede comprender, opcionalmente, un gen marcador seleccionable. Los marcadores seleccionables se describen en mayor detalle en la sección "definiciones" de la presente. Los genes marcadores se pueden retirar o eliminar de la célula transgénica cuando dejan de ser necesarios. Las técnicas para retirar marcadores son conocidas en el arte, se describieron técnicas útiles en la sección de definiciones.

Elemento regulador/Secuencia de control/Promotor Los términos "elemento regulador", "secuencia de control" y "promotor" se utilizan en forma indistinta en la presente y se deben interpretar en un contexto amplio para referirse a secuencias de ácidos nucleicos reguladoras capaces de efectuar la expresión de las secuencias a las cuales están ligadas. El término "promotor" típicamente se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos de control ubicada corriente arriba del inicio de la transcripción de un gen y que participa en el reconocimiento y la unión de ARN polimerasa y otras proteínas, dirigiendo de este modo la transcripción de un ácido nucleico ligado operativamente. Los términos antes mencionados abarcan las secuencias reguladoras transcripcionales derivadas de un gen genómico eucariótico clásico (incluso la caja TATA que es necesaria para la iniciación precisa de la transcripción, con o sin una secuencia de la caja CCAAT) y elementos reguladores adicionales (es decir, secuencias de activación corriente arriba, potenciadores y silenciadores) que alteran la expresión génica en respuesta a los estímulos del desarrollo y/o externos, o de manera específica de tejido. El término también incluye una secuencia reguladora transcripcional de un gen procariótico clásico, en cuyo caso puede incluir una secuencia de la caja -35 y/o secuencias reguladoras transcripcionales de la caja -10. El término "elemento regulador" también abarca una molécula de fusión sintética o derivado que confiere, activa o mejora la expresión de una molécula de ácido nucleico en una célula, un tejido u un órgano.

Un "promotor de planta" comprende elementos reguladores que median la expresión de un segmento de una secuencia codificante en las células de las plantas. En consecuencia, un promotor de planta no necesita ser de origen vegetal, pero se puede originar a partir de virus o microorganismos, por ejemplo de virus que atacan las células de las plantas. El "promotor de planta" también se puede originar a partir de una célula de planta, por ejemplo, de la planta que se transforma con la secuencia de ácidos nucleicos expresada en el proceso de la invención y que se describe en la presente. Esto también se aplica a otras señales reguladoras de "planta", tales como terminadores de "planta". Los promotores corriente arriba de las secuencias de nucleótidos útiles en los métodos de la presente invención se pueden modificar mediante una o más sustituciones, inserciones y/o supresiones de nucleótidos sin interferir con la funcionalidad o actividad de cualquiera de los promotores, el marco de lectura abierto (ORF) o la región reguladora 3' tal como terminadores u otras regiones reguladoras 3' que se localizan fuera del ORF. Además, es posible que la actividad de los promotores aumente mediante la modificación de su secuencia o que sean reemplazados por completo por promotores más activos, incluso promotores de organismos heterólogos. Para la expresión en plantas, la molécula de ácido nucleico, como se describió anteriormente, debe estar ligada operativamente o comprender un promotor adecuado que exprese el gen en el punto temporal correcto y con el patrón de expresión espacial requerido.

Para la identificación de promotores funcionalmente equivalentes, la potencia del promotor y/o el patrón de expresión de un promotor candidato se pueden analizar, por ejemplo, mediante la unión operativa del promotor a un gen indicador y el análisis del nivel de expresión y patrón del gen indicador en varios tejidos de la planta. Los genes indicadores conocidos y adecuados incluyen, por ejemplo, beta-glucuronidasa o beta-galactosidasa. La actividad del promotor se analiza al medir la actividad enzimática de la beta-glucuronidasa o beta-galactosidasa. La potencia del promotor y/o el patrón de expresión luego se pueden comparar con los de un promotor de referencia (tal como el que se utiliza en los métodos de la presente invención). Alternativamente, la potencia del promotor se puede analizar mediante la cuantificación de los niveles de mARN o mediante la comparación de los niveles de mARN del ácido nucleico utilizado en los métodos de la presente invención, con niveles de mARN de genes housekeeping tales como rARN 18S, con los métodos conocidos en el arte, tales como Northern blotting con análisis densitométrico de autorradiogramas, PCR cuantitativo en tiempo real o RT-PCR (Heid et al., 1996 Genome Methods 6: 986-994). Generalmente, por "promotor débil" se entiende un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificante a un nivel bajo. Por "nivel bajo" se entienden niveles de alrededor de 1/10.000 transcriptos a alrededor de 1/100.000 transcriptos, a alrededor de 1/500.0000 transcriptos por célula. Por el contrario, un "promotor fuerte" dirige la expresión de una secuencia codificante a un nivel alto o de alrededor de 1/10 transcriptos a alrededor de 1/100 transcriptos a alrededor de 1/1000 transcriptos por célula. En general, por "promotor de potencia media" se entiende un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificante a un nivel más bajo que un promotor fuerte, en particular a un nivel que es, en todos los casos, inferior al obtenido bajo el control de un promotor 35S CaMV.

Ligado operativamente Como se usa en la presente, el término "ligado operativamente" se refiere a un enlace funcional entre la secuencia del promotor y el gen de interés, de modo que la secuencia del promotor puede iniciar la transcripción del gen de interés.

Promotor constitutivo Un "promotor constitutivo" se refiere a un promotor que es activo en la transcripción durante la mayoría, pero no necesariamente todas, las fases de crecimiento y desarrollo y en la mayoría de las condiciones ambientales, en al menos una célula, un tejido o un órgano. La siguiente Tabla 2a provee ejemplos de promotores constitutivos.

Tabla 2a: Ejemplos de promotores constitutivos Promotor ubicuo Un promotor ubicuo es activo en casi todos los tejidos o células de un organismo.

Promotor regulado por el desarrollo Un promotor regulado por el desarrollo es activo durante ciertas etapas del desarrollo o en partes de la planta que experimentan cambios del desarrollo.

Promotor inducible Un promotor inducible ha inducido o aumentado la iniciación de la transcripción en respuesta a un estímulo químico (para una reseña, véase Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108), ambiental o físico, o puede ser "inducible por estrés", es decir, que se activa cuando una planta se expone a diversas condiciones de estrés, o "inducible por patógeno" es decir, que se activa cuando una planta se expone a diversos patógenos.

Promotor específico de órgano/específico de tejido Un promotor específico de órgano o específico de tejido es un promotor capaz de iniciar preferentemente la transcripción en ciertos órganos o tejidos, tales como hojas, raíces, tejido de semilla, etc. Por ejemplo, un "promotor específico de raíz" es un promotor activo durante la transcripción predominantemente en las raíces de las plantas, excluyendo en gran medida cualquier otra parte de una planta, aun mientras permite cualquier expresión con pérdida en estas otras partes de la planta. Los promotores capaces de iniciar la transcripción sólo en ciertas células se denominan en la presente "específicos de célula".

Los ejemplos de promotores específicos de raíz se enumeran en la siguiente Tabla 2b: Tabla 2b: Ejemplos de promotores específicos de raíz Un promotor específico de semilla es activo durante la transcripción predominantemente en el tejido de semillas, pero no necesariamente en forma exclusiva en el tejido de las semillas (en casos de expresión con pérdida). El promotor específico de semilla puede ser activo durante el desarrollo de la semilla y/o durante la germinación. El promotor específico de semilla puede ser específico de endosperma/aleurona/embrión. Los ejemplos de promotores específicos de semilla (específicos de endosperma/aleurona/embrión) se indican en las siguientes Tabla 2c a Tabla 2f. Otros ejemplos de promotores específicos de semilla se proveen en Qing Qu and Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 113-125, 2004), cuya descripción se incorpora a la presente por referencia como si se indicara en su totalidad.

Tabla 2c: Ejemplos de promotores específicos de semilla Fuente génica Referencia Tabla 2d: Ejemplos de promotores específicos de endosperma Tabla 2e: Ejemplos de promotores específicos de embrión: Tabla 2f: Ejemplos de promotores específicos de aleurona: Un promotor específico de tejido verde, como se define en la presente, es un promotor que es activo durante la transcripción predominantemente en el tejido verde, excluyendo en gran medida cualquier otra parte de una planta, aun mientras permite cualquier expresión con pérdida en estas otras partes de la planta.

Los ejemplos de promotores específicos de tejido verde que se pueden utilizar para llevar a cabo los métodos de la invención se indican en la siguiente Tabla 2g.

Tabla 2g: Ejemplos de promotores específicos de tejido verde Otro ejemplo de un promotor específico de tejido es un promotor específico de meristema, que es activo durante la transcripción predominantemente en tejido meristemático, excluyendo en gran medida cualquier otra parte de una planta, aun mientras permite cualquier expresión con pérdida en estas otras partes de la planta. Los ejemplos de promotores específicos de meristema verde que se pueden utilizar para llevar a cabo los métodos de la invención se indican en la siguiente Tabla 2h.

Tabla 2h: Ejemplos de promotores específicos de meristema Terminador El término "terminador" abarca una secuencia de control que es una secuencia de ADN en el extremo de una unidad de transcripción que señala el procesamiento 3' y la poliadenilación de un transcripto primario y la terminación de la transcripción. El terminador puede derivar del gen natural, de una variedad de otros genes de planta o de T-ADN. El terminador a agregar puede derivar, por ejemplo, de los genes de nopalina sintasa u octopina sintasa o, alternativamente, de otro gen de planta o, con menor preferencia, de cualquier otro gen eucariótico.

(Gen) marcador seleccionable/ Gen indicador "Marcador seleccionable", "gen marcador seleccionable" o "gen indicador" incluyen cualquier gen que confiere un fenotipo a una célula en la cual se expresa para facilitar la identificación y/o selección de las células que son transfectadas o transformadas con un constructo de ácido nucleico de la invención. Estos genes marcadores permiten la identificación de una transferencia exitosa de las moléculas de ácido nucleico mediante una serie de diferentes principios. Los marcadores adecuados se pueden seleccionar a partir de marcadores que confieren resistencia a antibióticos o herbicidas, que introducen un nuevo rasgo metabólico o que permiten la selección visual. Los ejemplos de genes marcadores seleccionares incluyen los genes que confieren resistencia a antibióticos (tales como nptll que fosforita neomicina y canamicina, o hpt que fosforila higromicina, o genes que confieren resistencia, por ejemplo, a bleomicina, estreptomicina, tetraciclina, cloramfenicol, ampicilina, gentamicina, geneticina (G418), espectinomicina o blasticidina), a herbicidas (por ejemplo, bar que provee resistencia a Basta®; aroA o gox que provee resistencia al glifosato o los genes que confieren resistencia, por ejemplo, a imidazolinona, fosfinotricina o sulfonilurea), o genes que proveen un rasgo metabólico (tales como manA que le permite a las plantas utilizar mañosa como única fuente de carbono o xilosa isomerasa para la utilización de xilosa o marcadores antinutritivos tales como la resistencia a 2-desoxiglucosa). La expresión de genes marcadores visuales da como resultado la formación de color (por ejemplo, ß-glucuronidasa, GUS o ß-galactosidasa con sus sustratos con color, por ejemplo X-Gal), luminiscencia (tales como el sistema de luciferina/luciferasa) o fluorescencia (proteína fluorescente verde, GFP, y sus derivados). Esta lista representa sólo una pequeña cantidad de posibles marcadores. El trabajador experto está familiarizado con dichos marcadores. Se prefieren diferentes marcadores según el organismo y el método de selección.

Se sabe que luego de la integración estable o transitoria de los ácidos nucleicos en las células vegetales, sólo una minoría de las células absorbe el ADN extraño y, si se desea, lo integra en su genoma, dependiendo del vector de expresión y la técnica de transfección utilizados. Para identificar y seleccionar estos integrantes, usualmente se introduce un gen que codifica un marcador seleccionare (tales como aquellos descritos anteriormente) en las células huésped junto con el gen de interés. Estos marcadores pueden usarse, por ejemplo, en mutantes en los cuales estos genes no sean funcionales mediante, por ejemplo, eliminación por métodos convencionales. Asimismo, las moléculas de secuencia de ácidos nucleicos que codifican un marcador seleccionable se pueden introducir en una célula huésped en el mismo vector que comprende la secuencia que codifica los polipéptidos de la invención o usados en los métodos de la invención, o de otro modo en un vector separado. Se pueden identificar las células que fueron transfectadas de forma estable con el ácido nucleico introducido, por ejemplo, mediante selección (por ejemplo, las células que integraron el marcador seleccionable sobreviven, mientras que las otras células mueren).

Debido a que los genes marcadores, en particular los genes de resistencia a antibióticos y herbicidas, ya no son necesarios o son indeseados en la célula huésped transgénica, una vez que los ácidos nucleicos han sido introducidos con éxito, el proceso de acuerdo con la invención para introducir los ácidos nucleicos utiliza en forma ventajosa técnicas que permiten la eliminación o escisión de estos genes marcadores. Uno de dichos métodos es conocido como cotransformación. El método de cotransformación usa dos vectores simultáneamente para la transformación, en donde un vector tiene el ácido nucleico de acuerdo con la invención y un segundo vector tiene el/los gen(es) marcadores). Una gran proporción de transformantes recibe o, en el caso de las plantas, comprende (hasta 40% o más de los transformantes), ambos vectores. En el caso de la transformación con Agrobacterias, los transformantes usualmente reciben sólo una parte del vector, es decir, la secuencia flanqueada por el T-ADN, que usualmente representa el cásete de expresión. Los genes marcadores luego se pueden eliminar de la planta transformada mediante la realización de cruzas. En otro método, los genes marcadores integrados en un transposón se utilizan para la transformación junto con el ácido nucleico deseado (conocido como tecnología Ac/Ds). Los transformantes se pueden cruzar con una fuente de transposasa o los transformantes se transforman con un constructo de ácido nucleico que confiere expresión de una transposasa, en forma transitoria o estable. En algunos casos (aprox. 10%), el transposón sale del genoma de la célula huésped una vez que se produce con éxito la transformación, y se pierde. En otros casos, el transposón salta a una ubicación diferente. En estos casos, el gen marcador se debe eliminar mediante la realización de cruzas. En microbiología, se desarrollaron técnicas que posibilitan o facilitan la detección de dichos eventos. Otro método ventajoso es lo que se conoce como sistemas de recombinación, cuya ventaja es que se puede prescindir de la eliminación por cruza. El sistema más conocido de este tipo es el denominado sistema Cre/lox. Creí es una recombinasa que elimina las secuencias ubicadas entre las secuencias loxP. Si el gen marcador se integra entre las secuencias loxP, se lo elimina una vez que se ha producido con éxito la transformación mediante la expresión de la recombinasa. Otros sistemas de recombinación son los sistemas HIN/HIX, FLP/FRT y REP/STB (Tribble et al., J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255-22267; Velmurugan et al, J. Cell Biol., 149, 2000: 553-566). Es posible una integración específica de sitio en el genoma de la planta de las secuencias de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención. Obviamente, estos métodos también se pueden aplicar a microorganismos tales como levadura, hongos o bacterias.

Transgénico/Transgén /Recombinante A los fines de la invención, "transgénico", "transgén" o "recombinante" significa, en relación por ejemplo a una secuencia de ácidos nucleicos, un cásete de expresión, constructo génico o un vector que comprende la secuencia de ácidos nucleicos o un organismo transformado con las secuencias de ácidos nucleicos, casetes de expresión o vectores de acuerdo con la invención, todas aquellas construcciones obtenidas por métodos recombinantes en los cuales (a) las secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas útiles en los métodos de la invención, o (b) secuencia(s) de control genético que está ligada operativamente a la secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, por ejemplo un promotor, o (c) a) y b) no se encuentran en su ambiente genético natural o fueron modificadas por métodos recombinantes, en donde es posible que la modificación sea, por ejemplo, una sustitución, adición, eliminación, inversión o inserción de uno o más residuos de nucleótidos. Ambiente genético natural significa el locus cromosómico o genómico natural en la planta original o la presencia en una biblioteca genómica. En el caso de una biblioteca genómica, preferentemente, se retiene, al menos en parte, el ambiente genético natural de la secuencia de ácidos nucleicos. El ambiente flanquea la secuencia de ácidos nucleicos al menos en un lado y tiene una longitud de secuencia de al menos 50 bp, preferentemente, al menos 500 bp, preferentemente, en especial al menos 1000 bp, con máxima preferencia, al menos 5000 bp. Un cásete de expresión natural - por ejemplo la combinación natural del promotor natural de las secuencias de ácidos nucleicos con la correspondiente secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido útil en los métodos de la presente invención, como se definió anteriormente - se convierte en un cásete de expresión transgénica cuando este cásete de expresión es modificado por métodos de síntesis no naturales ("artificiales") tales como, por ejemplo, tratamiento mutagénico. Los métodos adecuados se describen, por ejemplo, en US 5565350 o WO 00/15815.

Por lo tanto, a los fines de la invención, una planta transgénica significa, como se indicó anteriormente, que los ácidos nucleicos utilizados en el método de la invención no se encuentran en su locus natural en el genoma de dicha planta, siendo posible que los ácidos nucleicos se expresen de manera homologa o heteróloga. Sin embargo, como se mencionó, transgénico también significa que, mientras que los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención o utilizados en el método de la invención se encuentran en su posición natural en el genoma de una planta, la secuencia fue modificada con respecto a la secuencia natural y/o que las secuencias reguladoras de las secuencias naturales fueron modificadas. Preferentemente, transgénico significa la expresión de los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención en un locus no natural en el genoma, es decir que tiene lugar la expresión homologa o, preferentemente, heteróloga de los ácidos nucleicos. Las plantas transgénicas preferidas se mencionan en la presente.

En una forma de realización de la invención, una secuencia de ácidos nucleicos "aislada" se ubica en un ambiente cromosomal no nativo.

Modulación El término "modulación" significa, con respecto a la expresión o expresión génica, un proceso en el que el nivel de expresión es cambiado por dicha expresión génica en comparación con la planta de control, el nivel de expresión se puede aumentar o disminuir. La expresión original no modulada puede ser de cualquier tipo de expresión de un ARN (rARN, tARN) o mARN estructural con la posterior traducción. A los fines de la presente invención, la expresión original no modulada también puede ser ausencia de cualquier expresión. El término "modulación de la actividad" o el término "modular la actividad" significa cualquier cambio de expresión de las secuencias de ácidos nucleicos de la invención o proteínas codificadas, que genera mayor rendimiento y/o mayor crecimiento de las plantas.

La expresión puede aumentar desde cero (ausencia de expresión o expresión no medible) hasta una cierta cantidad, o puede disminuir desde una cierta cantidad hasta cantidades pequeñas no medibles o hasta cero.

Expresión El término "expresión" o "expresión génica" significa la transcripción de un gen específico o genes específicos o constructo genético específico. El término "expresión" o "expresión génica" significa, en particular, la transcripción de un gen o genes o constructo genético en ARN (rARN, tARN) o mARN estructural con o sin la posterior traducción de la última en una proteína. El proceso incluye la transcripción de ADN y el procesamiento del producto de mARN resultante.

Mayor expresión/sobreexpresión Como se usa en la presente, el término "mayor expresión" o "sobreexpresión" significa cualquier forma de expresión que es adicional al nivel de expresión original del tipo silvestre.

Los métodos para aumentar la expresión de los genes o productos génicos están documentados en el arte e incluyen, por ejemplo, la sobreexpresión dirigida por promotores adecuados, el uso de mejoradores de la transcripción o mejoradores de la traducción. Los ácidos nucleicos aislados que actúan como elementos promotores o mejoradores se pueden introducir en una posición adecuada (típicamente corriente arriba) de una forma no heteróloga de un polinucleótido a fin de regular en forma ascendente la expresión de un ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés. Por ejemplo, los promotores endógenos se pueden alterar in vivo mediante mutación, eliminación y/o sustitución (véase, Kmiec, US 5.565.350; Zarling et al., W09322443) o se pueden introducir promotores aislados en una célula de planta en la orientación y distancia adecuadas de un gen de la presente invención a fin de controlar la expresión del gen.

Si se desea la expresión de un polipéptido, generalmente es deseable incluir una región de poliadenilación en el extremo 3' de una región codificante de polinucleótidos. La región de poliadenilación puede derivar del gen natural, de una variedad de otros genes de planta o de T-ADN. La secuencia del extremo 3" a agregar puede derivar, por ejemplo, de los genes de nopalina sintasa u octopina sintasa o, alternativamente, de otro gen de planta o, con menor preferencia, de cualquier otro gen eucariótico.

También se puede agregar una secuencia intrónica a la región 5' no traducida (UTR) o la secuencia codificante de la secuencia codificante parcial para aumentar la cantidad de mensaje maduro que se acumula en el citosol. Se ha demostrado que la inclusión de un intrón empalmable en la unidad de transcripción tanto en los constructos de expresión vegetales y animales aumenta la expresión génica a nivel del ARNm y de las proteínas hasta 1000 veces (Buchman and Berg (1988) Mol. Cell biol. 8: 4395-4405; Callis et al. (1987) Genes Dev 1 :1183-1200). Dicha mejora intrónica de la expresión génica es típicamente mayor cuando se coloca cerca del extremo 5' de la unidad de transcripción. El uso de los intrones del maíz intrón Adh1-S 1 , 2 y 6, el intrón Bronze-1 es conocido en el arte. Para información general véase: The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer. N.Y. (1994).

Menor expresión La referencia en la presente a "menor expresión" o "reducción o eliminación sustancial" de la expresión significa una disminución en la expresión de un gen endógeno y/o en los niveles de polipéptidos y/o en la actividad de polipéptidos con respecto a las plantas de control. La reducción o sustancial eliminación es, en orden creciente de preferencia, al menos 10%, 20%, 30%, 40% o 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% ó 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de reducción en comparación con las plantas de control.

Para la reducción o sustancial eliminación de la expresión de un gen endógeno en una planta, es necesario que los nucleótidos sustancialmente contiguos de una secuencia de ácidos nucleicos tengan una longitud suficiente. A fin de realizar el silenciamiento génico, ésta puede tener tan pocos como 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 o menos nucleótidos, alternativamente ésta puede ser igual al gen entero (incluso UTR 5' y/o 3', ya sea total o parcialmente). La porción de nucleótidos sustancialmente contiguos puede derivar del ácido nucleico que codifica la proteína de interés (gen blanco) o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteína de interés. Preferentemente, la porción de nucleótidos sustancialmente contiguos es capaz de formar uniones de hidrógeno con el gen blanco (ya sea cadena sentido o antisentido), con mayor preferencia, la porción de nucleótidos sustancialmente contiguos tiene, en orden creciente de preferencia, 50%, 60%, 70%, .80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% de identidad de secuencia con el gen blanco (ya sea cadena sentido o antisentido). Una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido (funcional) no es un requisito de los diversos métodos analizados en la presente para la reducción o sustancial eliminación de la expresión de un gen endógeno.

Esta reducción o eliminación sustancial de la expresión se puede lograr mediante herramientas y técnicas de rutina. Un método preferido para la reducción o eliminación sustancial de la expresión del gen endógeno es mediante la introducción y expresión en una planta de un constructo genético en el cual el ácido nucleico (en este caso una porción de nucleótidos sustancialmente contiguo derivados del gen de interés o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las proteínas de interés) se clona como una repetición invertida (total o parcialmente), separada por un espaciador (ADN no codificante).

En dicho método preferido, la expresión del gen endógeno se reduce o elimina sustancialmente mediante el silenciamiento mediado por ARN con el uso de una repetición invertida de un ácido nucleico o una parte de éste (en este caso, una porción de nucleótidos sustancialmente contiguos derivada del gen de interés o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteína de interés), preferentemente, capaz de formar una estructura de horquilla. La repetición invertida se clona en un vector de expresión que comprende secuencias de control. Una secuencia de ácidos nucleicos de ADN no codificante (un separador, por ejemplo un fragmento de la región de unión a la matriz (MAR), un intrón, un poliligador, etc.) se ubica entre los dos ácidos nucleicos invertidos que forman la repetición invertida. Luego de la transcripción de la repetición invertida, se forma un ARN quimérico con una estructura autocomplementaria (total o parcialmente). Esta estructura de ARN bicatenario se denomina ARN horquilla (hpARN). El hpARN es procesado por la planta en siARN que se incorpora en un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). El RISC además diva los transcriptos de mARN, reduciendo sustancialmente de este modo la cantidad de transcriptos de mARN a ser traducidos en polipéptidos. Para más detalles generales, véase, por ejemplo, Grierson et al. (1998) WO 98/53083; Waterhouse et al. (1999) WO 99/53050).

La realización de los métodos de la invención no depende de la introducción y expresión en una planta de un constructo genético en el cual el ácido nucleico se clona como una repetición invertida, sino que se pueden utilizar uno o más de los diversos métodos de "silenciamiento génico" conocidos para lograr los mismos efectos.

Uno de dichos métodos para reducir la expresión del gen endógeno es el silenciamiento de la expresión génica mediado por ARN (regulación descendente). En este caso, el silenciamiento es activado en una planta por una secuencia de ARN bicatenario (dsARN) que es sustancialmente similar al gen endógeno blanco. Este dsARN es procesado adicionalmente por la planta en alrededor de 20 a alrededor de 26 nucleótidos denominados ARN cortos de interferencia (siARN). Los siARN se incorporan en un complejo silenciador inducido por ARN (RISC) que diva los transcriptos de mARN del gen blanco endógeno, reduciendo sustancialmente de esta manera la cantidad de transcriptos de mARN que se deben traducir en un polipéptido. Preferentemente, la secuencia de ARN bicatenario corresponde al gen blanco.

Otro ejemplo de un método de silenciamiento de ARN incluye la introducción de secuencias de ácidos nucleicos o partes de éstas (en este caso, una porción de nucleótidos sustancialmente contiguos derivados del gen de interés o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteína de interés) en orientación sentido en una planta. Orientación sentido" se refiere a una secuencia de ADN que es homologa de uno de sus transcripto de mARN. Por lo tanto, en una planta se habrá introducido al menos una copia de la secuencia de ácidos nucleicos. La secuencia adicional de ácidos nucleicos reducirá la expresión del gen endógeno, originando un fenómeno conocido como cosupresión. La reducción de la expresión génica será más pronunciada si se introducen varias copias adicionales de una secuencia de ácidos nucleicos en la planta, ya que existe una correlación positiva entre los niveles altos de transcriptos y la activación de la cosupresión.

Otro ejemplo de un método de silenciamiento de ARN involucra el uso de secuencias de ácidos nucleicos antisentido. Una secuencia de ácidos nucleicos "antisentido" comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria de una secuencia de ácidos nucleicos "sentido" que codifica una proteína, es decir, complementaria de la cadena codificante de una molécula de cADN bicatenario o complementaria de una secuencia de transcriptos de mARN. Preferentemente, la secuencia de ácidos nucleicos antisentido es complementaria del gen endógeno a silenciar. La complementariedad puede estar ubicada en la "región codificante" y/o en la "región no codificante" de un gen. El término "región codificante" se refiere a la región de la secuencia de nucleótidos que comprende codones que se traducen en residuos de aminoácidos. El término "región no codificante" se refiere a secuencias de 5' y 3' que flanquean la región codificante que se transcriben pero no se traducen en aminoácidos (también denominadas regiones 5' y 3' no traducidas).

Las secuencias de ácidos nucleicos antisentido se pueden diseñar de acuerdo con las reglas de formación de pares de bases de Watson y Crick. La secuencia de ácidos nucleicos antisentido puede ser complementaria de la secuencia entera de ácidos nucleicos (en este caso, una porción de nucleótidos sustancialmente contiguos derivados del gen de interés o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteína de interés), pero también puede ser un oligonucleótido que es antisentido con respecto a sólo una parte de la secuencia de ácidos nucleicos (incluso UTR 5' y 3' de mARN). Por ejemplo, la secuencia de oligonucleótidos antisentido puede ser complementaria de la región que rodea al sitio de inicio de la traducción de un transcripto de mARN que codifica un polipéptido. La longitud de una secuencia de oligonucleótidos antisentido adecuada es conocida en el arte y puede comenzar desde alrededor de 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 o 10 nucleótidos de longitud o menos. Una secuencia de ácidos nucleicos antisentido de acuerdo con la invención se puede construir mediante síntesis química y reacciones de ligadura enzimática utilizando los métodos conocidos en el arte. Por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos antisentido (por ejemplo, una secuencia de oligonucleótidos antisentido) se puede sintetizar químicamente con nucleótidos naturales o nucleótidos modificados de distintas maneras diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre las secuencias de ácidos nucleicos sentido y antisentido, por ejemplo, se pueden utilizar derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos por acridina. Los ejemplos de nucleótidos modificados que se pueden utilizar para generar las secuencias de ácidos nucleicos antisentido son muy conocidos en el arte. Las modificaciones conocidas de nucleótidos incluyen metilación, delación y "caps" y sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales por un análogo, tal como inosina. Otras modificaciones de nucleótido son conocidas en el arte.

La secuencia de ácidos nucleicos antisentido se puede producir de forma biológica usando un vector de expresión en el cual se ha subclonado una secuencia de ácidos nucleicos en orientación antisentido (es decir, el ARN transcripto desde el ácido nucleico insertado tendrá orientación antisentido con respecto al ácido nucleico blanco de interés).

Preferentemente, la producción de secuencias de ácidos nucleicos antisentido en plantas ocurre por medio de un constructo de ácidos nucleicos integrado de forma estable que comprende un promotor, un oligonucleótido antisentido ligado operativamente y un terminador.

Las moléculas de ácido nucleico utilizadas para el silenciamiento en los métodos de la invención (ya sea introducidas en una planta o generadas in situ) se hibridan o se unen a transcriptos de mARN y/o ADN genómico que codifica un polipéptido para inhibir de este modo la expresión de la proteína, por ejemplo, mediante la inhibición de la transcripción y/o traducción. La hibridación puede ocurrir mediante complementariedad de nucleótidos convencional para formar un dúplex estable o, por ejemplo, en el caso de una secuencia de ácidos nucleicos antisentido que se une a dúplex de ADN, mediante interacciones específicas en la cavidad principal de la hélice doble. Se pueden introducir secuencias de ácidos nucleicos antisentido en una planta mediante transformación o inyección directa en un sitio específico de tejido. Alternativamente, las secuencias de ácidos nucleicos antisentido se pueden modificar para que se dirijan a células seleccionadas y luego administrarlas de forma sistémica. Por ejemplo, para la administración sistémica, las secuencias de ácidos nucleicos antisentido pueden modificarse de manera tal que se unen específicamente a receptores o antígenos que se expresan en la superficie celular seleccionada, por ejemplo, mediante la unión de la secuencia de ácidos nucleicos antisentido a los péptidos o anticuerpos que se unen a los antígenos o receptores de la superficie celular. Las secuencias de ácidos nucleicos antisentido también se pueden dirigir a células utilizando los vectores descritos en la presente.

De acuerdo con otro aspecto, la secuencia de ácidos nucleicos antisentido es una secuencia de ácidos nucleicos a-anomérica. Una secuencia de ácidos nucleicos a-anomérica forma híbridos bicatenarios específicos con ARN complementario donde, a diferencia de las unidades b habituales, las cadenas son paralelas entre sí (Gaultier et al. (1987) Nucí Ac Res 15: 6625-6641 ). La secuencia de ácidos nucleicos antisentido también puede comprender 2'-o-metilrribonucleótido (Inoue et al. (1987) Nucí Ac Res 15, 6131-6148) o un análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215, 327-330).

La reducción o sustancial eliminación de la expresión del gen endógeno también se puede realizar mediante el uso de ribozimas. Las ribozimas son moléculas de ARN catalítico con actividad de ribonucleasa que son capaces de clivar una secuencia de ácidos nucleicos monocatenarios, tal como un mARN, con la cual tienen una región complementaria. De este modo, las ribozimas (por ejemplo, las ribozimas hammerhead (descritas en Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334, 585-591 ) se pueden usar para clivar de modo catalítico transcriptos de mARN que codifican un polipéptido, reduciendo sustancialmente, de este modo, la cantidad de transcriptos de mARN a traducir en un polipéptido. Se puede diseñar una ribozima que tiene especificidad para una secuencia de ácidos nucleicos (véase por ejemplo: Cech et al. patente estadounidense No. 4.987.071 ; y Cech et al. patente estadounidense No. 5.1 16.742). Alternativamente, se pueden usar transcriptos de mARN que corresponden a una secuencia de ácidos nucleicos para seleccionar un ARN catalítico que tenga actividad de ribonucleasa específica a partir de un pool de moléculas de ARN (Bartel and Szostak (1993) Science 261 , 1411-1418). El uso de ribozimas para el silenciamiento génico en plantas es conocido en el arte (por ejemplo, Atkins et al. (1994) WO 94/00012; Lenne et al. (1995) WO 95/03404; Lutziger et al. (2000) WO 00/00619; Prinsen et al. (1997) WO 97/13865 and Scott et al. (1997) WO 97/38116).

El silenciamiento génico también se puede lograr mediante mutagénesis de inserción (por ejemplo, inserción de T-ADN o inserción de transposón) o mediante estrategias como las descritas, entre otros, en Angelí and Baulcombe ((1999) Plant J 20(3): 357-62), (Amplicon VIGS WO 98/36083) o Baulcombe (WO 99/15682).

El silenciamiento génico también puede ocurrir si hay una mutación en un gen endógeno y/o una mutación en un ácido nucleico/gen aislado que se introduce posteriormente en una planta. La reducción o sustancial eliminación puede ser causada por un polipéptido no funcional. Por ejemplo, el polipéptido se puede unir a varias proteínas que interactúan; por lo tanto, una o más mutaciones y/o truncamientos pueden generar un polipéptido que aún es capaz de unirse a proteínas que interactúan (tales como proteínas receptoras) pero que no puede exhibir su función normal (tal como un ligando de señalización).

Otro enfoque al silenciamiento génico es mediante el direccionamiento de secuencias de ácidos nucleicos complementarias de la región reguladora del gen (por ejemplo, el promotor y/o mejoradores) para formar estructuras helicoidales triples que evitan la transcripción del gen en las células blanco. Véase Helene, C, Anticancer Drug Res. 6, 569-84, 1991 ; Helene et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 660, 27-36 1992; y aher, L.J. Bioassays 14, 807-15, 1992.

Otros métodos, tales como el uso de anticuerpos dirigidos a un polipéptido endógeno para inhibir su función en la planta, o interferencia en la vía de señalización en la cual se encuentra involucrado el polipéptido, serán bien conocidos por el experto en el arte. En particular, se puede prever que las moléculas fabricadas por el hombre pueden ser útiles para inhibir la función biológica de un polipéptido blanco o para interferir con la vía de señalización en la cual está involucrado el polipéptido blanco.

De modo alternativo, se puede preparar un programa de barrido para identificar, en una población de plantas, las variantes naturales de un gen, en donde dichas variantes codifican polipéptidos con actividad reducida. Dichas variantes naturales también se pueden usar para realizar, por ejemplo, recombinación homologa.

Se puede usar microARN (miARN) artificial y/o natural para knock out la expresión génica y/o la traducción de mARN. Los miARN endógenos son ARN pequeños monocatenarios que generalmente tienen 19-24 nucleótidos de longitud. Funcionan principalmente para regular la expresión génica y/o la traducción de mARN. La mayoría de los microARN (miARN) de plantas tienen complementariedad perfecta o casi perfecta con sus secuencias blanco. Sin embargo, existen blancos naturales con hasta cinco faltas de coincidencia. Se los procesa a partir de ARN no codificantes más largos con estructuras características de replegamiento mediante RNasas bicatenarias específicas de la familia Dicer. Luego del procesamiento, se incorporan en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) mediante la unión a su componente principal, una proteína Argonauta. Los miARN sirven como componentes de especificidad de RISC, ya que forman pares de base para dirigirse a ácidos nucleicos, principalmente mARN, en el citoplasma. Los posteriores eventos reguladores incluyen el clivaje de mARN blanco y la destrucción y/o inhibición de la traducción. De este modo, a menudo se reflejan los efectos de la sobreexpresión de miARN en menores niveles de genes blanco.

Los microARN (amiARN) artificiales, que típicamente tienen 21 nucleótidos de longitud, se pueden modificar mediante ingeniería genética específicamente para regular de forma negativa la expresión génica de un solo gen o de múltiples genes de interés. Los determinantes de la selección de microARN vegetal blanco son muy conocidos en el arte. Se han definido los parámetros empíricos para el reconocimiento del blanco y se pueden usar para ayudar en el diseño de amiARN específicos (Schwab et al., Dev. Cell 8, 517-527, 2005). Las herramientas convenientes para el diseño y la generación de amiARN y sus precursores también están disponibles al público (Schwab et al.. Plant Cell 18, 1 121-1133, 2006).

Para una performance óptima, las técnicas de silenciamiento génico usadas para reducir la expresión en una planta de un gen endógeno requieren el uso de secuencias de ácidos nucleicos de plantas monocotiledoneas para la transformación de plantas monocotiledoneas, y de plantas dicotiledóneas para la transformación de plantas dicotiledóneas. Preferentemente, se introduce una secuencia de ácidos nucleicos de cualquier especie de planta determinada en esa misma especie. Por ejemplo, se transforma una secuencia de ácidos nucleicos del arroz en una planta de arroz. Sin embargo, no es un requisito indispensable que la secuencia de ácidos nucleicos a ser introducida se origine a partir de la misma especie vegetal que la planta en la cual será introducida. Es suficiente que haya homología sustancial entre el gen endógeno blanco y el ácido nucleico a ser introducido.

Se describieron con anteriormente ejemplos de varios métodos para la reducción o sustancial eliminación de la expresión en una planta de un gen endógeno. Un experto en el arte podrá fácilmente adaptar los métodos de silenciamiento antes mencionados a fin de lograr la reducción de expresión de un gen endógeno en una planta entera o en sus partes, por ejemplo, mediante el uso de un promotor adecuado.

Transformación El término "introducción" o "transformación", como se indica en la presente, abarca la transferencia de un polinucleótido exógeno a una célula huésped, independientemente del método utilizado para la transferencia. El tejido de planta capaz de propagación clonal posterior, sea por organogénesis o por embriogénesis, se puede transformar con un constructo genético de la presente invención y regenerar una planta completa a partir de ella. El tejido particular elegido variará según los sistemas de propagación clonal disponibles y más adecuados para la especie particular a transformar. Los ejemplos de tejidos blanco incluyen discos de hoja, polen, embriones, cotiledones, hipocotilos, megagametofitos, tejido de callo, tejido meristemático existente (por ejemplo, meristema apical, brotes axilares y meristemas de raíz) y tejido del meristema inducido (por ejemplo, meristema de cotiledón y meristema de hipocotilo). El polinucleótido se puede introducir en forma transitoria o estable en una célula huésped y se puede mantener no integrado, por ejemplo, como un plásmido. Alternativamente, se lo puede integrar en el genoma del huésped. La célula vegetal transformada resultante luego se puede utilizar para regenerar una planta transformada en una forma conocida por los expertos en el arte.

La transferencia de genes extraños al genoma de una planta se denomina transformación. La transformación de especies de plantas es actualmente una técnica bastante rutinaria. Ventajosamente, se puede utilizar cualquiera de los diversos métodos de transformación para introducir el gen de interés en una célula ancestral adecuada. Los métodos descritos para la transformación y regeneración de las plantas a partir de tejidos de planta o células de planta se pueden utilizar para la transformación transitoria o estable. Los métodos de transformación incluyen el uso de liposomas, electroporación, productos químicos que aumentan la absorción de ADN libre, inyección del ADN directamente en la planta, bombardeo con pistola de partículas, transformación con virus o polen y microproyección. Los métodos se pueden seleccionar del método de calcio/polietilenglicol para protoplastos (Krens, F.A. et al., (1982) Nature 296, 72-74; Negrutiu I et al. (1987) Plant Mol Biol 8: 363-373); electroporación de protoplastos (Shillito R.D. et al. (1985) Bio/Technol 3, 1099-1102); microinyección en material de planta (Crossway A et al., (1986) Mol. Gen Genet 202: 179-185); bombardeo de partículas recubiertas con ADN o ARN (Klein TM et al., (1987) Nature 327: 70) infección con virus (no integrativos) y similares. Las plantas transgénicas, incluso plantas de cultivo transgénicas, se producen preferentemente mediante transformación mediada por Agrobacteríum. Un método de transformación ventajoso es la transformación en la planta. Con este fin, es posible, por ejemplo, permitir que las agrobacterias actúen en las semillas de la planta o inocular el meristema de la planta con agrobacterias. Se ha demostrado que es particularmente oportuno de acuerdo con la invención permitir que una suspensión de agrobacterias transformadas actúe en la planta intacta o al menos en los primordios de la flor. La planta se cultiva posteriormente hasta que se obtienen las semillas de la planta tratada (Clough and Bent, Plant J. (1998) 16, 735-743). Los métodos para la transformación de arroz mediada por Agrobacteríum incluyen métodos muy conocidos para la transformación del arroz, tales como los descritos en cualquiera de los siguientes: solicitud de patente europea EP 1198985 A1 , Aldemita and Hodges (Planta 199: 612-617, 1996); Chan et al. (Plant Mol Biol 22 (3): 491-506, 1993), Hiei et al. (Plant J 6 (2): 271-282, 1994), cuyas descripciones se incorporan a la presente por referencia como si se indicaran en su totalidad. En el caso de la transformación del maíz, el método preferido es como se describe en Ishida et al. (Nat. Biotechnol 14(6): 745-50, 1996) o Frame et al.

(Plant Physiol 129(1 ): 13-22, 2002), cuyas descripciones se incorporan a la presente por referencia como si se indicaran en su totalidad. Dichos métodos se describen también a modo de ejemplo en B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, Vol. 1 , Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung and R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 y en Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant olec. Biol. 42 (1991) 205-225). Los ácidos nucleicos o el constructo que se desea expresar se clonan, preferentemente, en un vector que es adecuado para la transformación de Agrobacteríum tumefaciens. por ejemplo pBin19 (Bevan et al., Nucí. Acids Res. 12 (1984) 871 1). Las agrobacterias transformadas por dicho vector luego se pueden utilizar de la manera conocida para la transformación de plantas, tales como plantas utilizadas como modelo, como Arabidopsis (dentro del alcance de la presente invención, Arabidopsis thaliana no se considera una planta de cultivo) o plantas de cultivo tales como, por ejemplo, las plantas de tabaco, por ejemplo mediante la inmersión de hojas machacadas u hojas picadas en una solución de agrobacterias y luego el cultivo en un medio adecuado. La transformación de plantas por medio de Agrobacteríum tumefaciens se describe, por ejemplo, en Hófgen and Willmitzer en Nucí. Acid Res. (1988) 16, 9877 o se conoce, entre otros, de F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; en Transgenic Plants, Vol. 1 , Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38.

Además de la transformación de células somáticas, que luego se deben regenerar en plantas intactas, también es posible transformar las células de meristemas de plantas y, en particular, las células que se desarrollan en gametos. En este caso, los gametos transformados siguen el desarrollo natural de la planta, produciendo las plantas transgénicas. De este modo, por ejemplo, las semillas de Arabidopsis se tratan con agrobacterias y las semillas se obtienen a partir de las plantas en desarrollo, de las cuales cierta proporción es transformada y, por lo tanto, transgénica [Feldman, KA and Marks MD (1987). Mol Gen Genet 208:274-289; Feldmann K (1992). En: C Koncz, N-H Chua and J Shell, eds, Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapore, pp. 274-289]. Los métodos alternativos se basan en la eliminación reiterada de las inflorescencias y la incubación del sitio de escisión en el centro de la roseta con las agrobacterias transformadas, por la cual las semillas transformadas también se pueden obtener en un momento posterior (Chang (1994). Plant J. 5: 551-558; Katavic (1994). Mol Gen Genet, 245: 363-370). Sin embargo, un método especialmente eficaz es el método de infiltración con vacío con sus modificaciones, tal como el método de "inmersión floral". En el caso de infiltración con vacío de Arabidopsis, las plantas intactas bajo presión reducida se tratan con una suspensión de agrobacterias [Bechthold, N (1993). C R Acad Sci París Life Sci, 316: 1 194-1199], mientras que en el caso del método de "inmersión floral" el tejido floral en desarrollo se incuba por poco tiempo con una suspensión de agrobacterias tratada con tensoactivos [Clough, SJ and Bent AF (1998) The Plant J. 16, 735-743]. En ambos casos se cosecha una cierta proporción de semillas transgénicas y estas semillas se pueden distinguir de las semillas no transgénicas por el cultivo en las condiciones selectivas antes descritas. Además, la transformación estable de los plástidos es ventajosa porque los plástidos se heredan por vía materna en la mayoría de los cultivos, lo cual reduce o elimina el riesgo de flujo de transgenes mediante polen. La transformación del genoma del cloroplasto generalmente se obtiene mediante un proceso que se representa en forma esquemática en Klaus et al., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225-229]. En síntesis, las secuencias a transformar se clonan junto con un gen marcador seleccionable entre las secuencias flanqueadoras homologas del genoma del cloroplasto. Estas secuencias flanqueadoras homologas dirigen la integración específica de sitio en el plastoma. La transformación de los plástidos ha sido descrita para diferentes especies de plantas y se provee una reseña en Bock (2001 ) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J Mol Biol. 2001 Sep 21 ; 312 (3):425-38 o Maliga, P (2003) Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21 , 20-28. Recientemente se ha informado otro progreso biotecnológico en forma de transformantes de plástidos libres de marcadores, que se pueden producir mediante un gen marcador cointegrado transitorio (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225-229).

Las células vegetales modificadas genéticamente se pueden regenerar mediante todos los métodos conocidos por el experto en el arte. Se pueden encontrar métodos adecuados en las publicaciones antes mencionadas de S.D. Kung and R. Wu, Potrykus o Hófgen and Willmitzer.

Generalmente, después de la transformación, las células vegetales o los agrupamientos de células se seleccionan para determinar la presencia de uno o más marcadores que son codificados por genes expresables en plantas cotransferídos con el gen de interés, luego de lo cual el material transformado se regenera en una planta entera. Para seleccionar las plantas transformadas, el material de planta obtenido en la transformación es, como regla, sometido a condiciones selectivas a fin de que las plantas transformadas se puedan distinguir de las plantas no transformadas. Por ejemplo, las semillas obtenidas del modo antes descrito se pueden plantar y, luego de un período de crecimiento inicial, se pueden someter a una selección adecuada mediante pulverización. Otra posibilidad consiste en cultivar las semillas, en caso de ser adecuado, luego de su esterilización, en placas de agar mediante el uso de un agente de selección adecuado a fin de que sólo las semillas transformadas puedan crecer hasta ser plantas. De modo alternativo, las plantas transformadas se controlan para detectar la presencia de un marcador seleccionable, tales como aquellos descritos anteriormente.

Luego de la regeneración y transferencia de ADN, las plantas posiblemente transformadas también se pueden evaluar, por ejemplo, mediante el uso de análisis Southern, para determinar la presencia del gen de interés, la cantidad de copias y/o la organización genómica. De modo alternativo o adicional, se pueden controlar los niveles de expresión del nuevo ADN introducido mediante el uso de análisis Northern y/o Western, ambas técnicas son bien conocidas por los expertos en el arte.

Las plantas transformadas generadas se pueden propagar mediante diversos medios, tales como mediante propagación clonal o técnicas de reproducción clásicas. Por ejemplo, se puede autocruzar una planta transformada de primera generación (o T1 ) y seleccionar transformantes homocigotas de segunda generación (o T2), y las plantas T2 se pueden propagar además mediante técnicas de reproducción clásicas. Los organismos transformados generados pueden adoptar diversas formas. Por ejemplo, pueden ser quimeras de células transformadas y células no transformadas; transformantes clónales (por ejemplo, todas las células transformadas para contener el cásete de expresión); injertos de tejidos transformados y no transformados (por ejemplo, en plantas, un rizoma transformado injertado en un acodo no transformado).

En esta solicitud, una planta, parte de planta, semilla o célula vegetal transformada con - o indistintamente transformada por - un constructo o transformada con un ácido nucleico significa una planta, parte de planta, semilla o célula vegetal que tiene dicho constructo o dicho ácido nucleico como un transgen debido al resultado de la introducción de dicho constructo o ácido nucleico mediante medios biotecnológicos. Por lo tanto, la planta, parte de planta, semilla o célula vegetal comprende dicho constructo recombinante o dicho ácido nucleico recombinante. Cualquier planta, parte de planta, semilla o célula vegetal que ya no contiene dicho constructo recombinante o dicho ácido nucleico recombinante luego de la introducción en el pasado se denomina segregante nulo, nulicigota o control nulo, pero no se considera una planta, parte de planta, semilla o célula vegetal transformada con dicho constructo o con dicho ácido nucleico dentro del significado de la presente solicitud.

Marcación por activación de T-ADN La marcación por activación de T-ADN (Hayashi et al. Science (1992) 1350-1353), incluye la inserción de T-ADN, que usualmente contiene un promotor (también puede ser un mejorador de la traducción o un intrón), en la región genómica del gen de interés o 10 kb corriente arriba o corriente abajo de la región codificante de un gen en una configuración tal que el promotor dirige la expresión del gen blanco. En general, la regulación de la expresión del gen blanco por su promotor natural se altera y el gen cae bajo el control del promotor recién introducido. El promotor está típicamente incluido en un T-ADN. Este T-ADN se inserta en forma aleatoria en el genoma de la planta, por ejemplo, mediante infección con Agrobacterium, y conduce a la expresión modificada de los genes cerca del T-ADN insertado. Las plantas transgénicas resultantes muestran fenotipos dominantes debido a la expresión modificada de los genes cercanos al promotor introducido.

TILLING El término "TILLING" es la abreviatura de "Targeted Induced Local Lesions In Genomes" (Lesiones locales inducidas dirigidas en genomas) y se refiere a una tecnología de mutagénesis útil para generar y/o identificar ácidos nucleicos que codifican proteínas con expresión y/o actividad modificada. TILLING también permite la selección de plantas que portan dichos variantes mutantes. Estas variantes mutantes pueden exhibir expresión modificada, ya sea en potencia o ubicación o duración (por ejemplo, si las mutaciones afectan al promotor). Estas variantes mutantes pueden exhibir mayor actividad que la exhibida por el gen en su forma natural. TILLING combina mutagénesis de alta densidad con métodos de barrido de alto rendimiento. Las etapas que habitualmente se siguen en TILLING son: (a) mutagénesis EMS (Redei GP and Koncz C (1992) In Methods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chua NH, Schell J, eds. Singapore, World Scientific Publishing Co, pp. 16-82; Feldmann et al., (1994) In Meyerowitz EM, Somerville CR, eds, Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp 137-172; Lightner J and Caspar T (1998) In J Martinez-Zapater, J Salinas, eds, Methods on Molecular Biology, Vol. 82. Humana Press, Totowa, NJ, pp 91-104); (b) preparación de ADN y agrupamiento de individuos; (c) amplificación por PCR de una región de interés; (d) desnaturalización y apareamiento para permitir la formación de heterodúplex; (e) DHPLC, cuando se detecta la presencia de un heterodúplex en un pool como un pico extra en el cromatograma; (f) identificación del individuo mutante; y (g) secuenciacion del producto de PCR mutante. Los métodos para TILLING son muy conocidos en el arte (McCallum et al., (2000) Nat Biotechnol 18: 455-457; reseñado por Stemple (2004) Nat Rev Genet 5(2): 145-50).

Recombinación homóloqa La recombinación homologa permite la introducción en un genoma de un ácido nucleico seleccionado en una posición seleccionada definida. La recombinación homologa es una tecnología estándar que se utiliza en forma rutinaria en las ciencias biológicas para organismos inferiores tales como levadura o musgo Physcomitrella.. Los métodos para realizar la recombinación homologa en las plantas han sido descritos no sólo para las plantas modelo (Offringa et al. (1990) EMBO J 9(10): 3077-84) sino también para las plantas de cultivo, por ejemplo, arroz (Terada et al. (2002) Nat Biotech 20(10): 1030-4; lida and Terada (2004) Curr Opin Biotech 15(2): 132-8) y hay enfoques que son aplicables en general, independientemente del organismo blanco (Miller et al, Nature Biotechnol. 25, 778-785, 2007).

Rasgos relacionados con el rendimiento Los rasgos relacionados con el rendimiento comprenden uno o más de los siguientes: rendimiento, biomasa, rendimiento de semilla, vigor temprano, índice de verdor, mayor tasa de crecimiento, mejores rasgos agronómicos (tales como mejor eficiencia en el uso del agua (WUE), eficiencia en el uso de nitrógeno (NUE), etc.).

Rendimiento En general, término "rendimiento" significa un producto mensurable de valor económico, típicamente relacionado con un cultivo, área y período de tiempo específicos. Las partes individuales de las plantas contribuyen directamente al rendimiento sobre la base de su cantidad, tamaño y/o peso, o el rendimiento real es el rendimiento por metro cuadrado para un cultivo y año, el cual se determina dividiendo la producción total (incluye tanto la producción cosechada como la producción calculada) por metro cuadrado plantado.

En la presente, los términos "rendimiento" de una planta y "rendimiento vegetal" se usan de manera indistinta y se refieren a la biomasa vegetal, tal como biomasa de raíz y/o brote, a los órganos reproductivos y/o a los propágulos, tales como semillas, de esa planta.

Si se toma el maíz como ejemplo, el aumento del rendimiento se puede manifestar como uno o más de los siguientes: aumento de la cantidad de plantas establecidas por metro cuadrado, aumento de la cantidad de mazorcas por planta, aumento de la cantidad de hileras, cantidad de granos por hilera, peso del grano, peso de mil granos, longitud/diámetro de la mazorca, aumento de la tasa de llenado de semillas (que es la cantidad de semillas llenas dividido por la cantidad total de semillas y multiplicado por 100), entre otros Si se toma el arroz como ejemplo, el aumento del rendimiento se puede manifestar como el aumento de uno o más de los siguientes: cantidad de plantas por metro cuadrado, cantidad de panículas por planta, longitud de la panícula, cantidad de espículas por panícula, cantidad de flores (florcillas) por panícula, aumento de la tasa de llenado de semillas (que es la cantidad de semillas llenas dividido por la cantidad total de semillas y multiplicado por 100), aumento del peso de mil granos, entre otros. En el arroz, la tolerancia a la inmersión también puede dar como resultado mayor rendimiento.

Tiempo de floración temprano Como se usa en la presente, las plantas que tienen un "tiempo de floración temprano" son plantas que comienzan a florecer antes que las plantas de control. Por lo tanto, este término se refiere a plantas que muestran un inicio de floración más temprano. El tiempo de floración de las plantas se puede evaluar al contar la cantidad de días, es decir, "el tiempo que tardan en florecer", entre la siembra y el surgimiento de la primera inflorescencia. Por ejemplo, el "tiempo de floración" o "el tiempo que tardan en florecer" o "el surgimiento de la primera inflorescencia" de una planta se pueden determinar con el método descrito en WO 2007/093444.

Vigor temprano "Vigor temprano" se refiere al crecimiento activo, sano y equilibrado, especialmente durante las etapas tempranas del crecimiento de la planta, y puede ser el resultado de un mejor estado físico de la planta debido, por ejemplo, a que las plantas se adaptan mejor a su medio ambiente (es decir, optimizan el uso de recursos de energía y los reparten entre los brotes y las raíces). Las plantas que tienen vigor temprano también muestran mayor supervivencia de las plántulas y mejor establecimiento del cultivo, lo que habitualmente da como resultado campos muy uniformes (en donde el cultivo crece de manera uniforme, es decir, la mayoría de las plantas alcanza los diversos estadios del desarrollo sustancialmente al mismo tiempo), y a menudo mejor y mayor rendimiento. Por lo tanto, el vigor temprano se puede determinar al medir varios factores, tales como peso de mil granos, porcentaje de germinación, porcentaje de plantas que emergen, crecimiento de las plántulas, altura de las plántulas, longitud de las raíces, biomasa de las raíces y de los brotes y muchos otros.

Aumento de la tasa de crecimiento El aumento de la tasa de crecimiento puede ser específico de una o más partes de una planta (incluso semillas) o puede ser de casi la totalidad de la planta. Las plantas con mayor tasa de crecimiento pueden tener un ciclo de vida más corto. El ciclo de vida de una planta puede significar el tiempo necesario para que se desarrolle desde la semilla madura seca hasta la etapa en la cual la planta produjo semillas maduras secas, similares al material de inicio. Este ciclo de vida puede estar influenciado por factores tales como velocidad de germinación, vigor temprano, tasa de crecimiento, índice de verdor, tiempo de floración y velocidad de maduración de la semilla. El aumento de tasa de crecimiento puede ocurrir en una o más etapas del ciclo de vida de una planta o durante sustancialmente todo el ciclo de vida de la planta. El aumento de la tasa de crecimiento durante las etapas tempranas del ciclo de vida de una planta puede reflejar mejor vigor. El aumento de la tasa de crecimiento puede alterar el ciclo de cosecha de una planta, lo cual permite sembrar las plantas más tarde y/o cosecharlas antes de lo que sería posible de otro modo (se puede obtener un efecto similar con tiempo de floración más temprano). Si se aumenta lo suficiente la tasa de crecimiento, esto puede permitir la siembra adicional de semillas de la misma especie de planta (por ejemplo, sembrar y cosechar plantas de arroz seguido de la siembra y cosecha de otras plantas de arroz, todo dentro de un período de crecimiento convencional). De modo similar, si se aumenta lo suficiente la tasa de crecimiento, esto puede permitir la siembra adicional de semillas de distintas especies de plantas (por ejemplo, sembrar y cosechar plantas de maíz seguido, por ejemplo, de la siembra y cosecha opcional de soja, papa o cualquier otra planta adecuada). También pueden ser posibles cosechas adicionales de los mismos rizomas, en el caso de algunas plantas de cultivo. La alteración del ciclo de cosecha de una planta puede conducir a un aumento de la producción de biomasa anual por metro cuadrado (debido a un aumento de la cantidad de veces (por ejemplo, por año) que se puede cultivar y cosechar cualquier planta particular). Un aumento de la tasa de crecimiento también puede permitir el cultivo de plantas transgénicas en un área geográfica más amplia que la de sus contrapartes de tipo silvestre, debido a que las limitaciones territoriales para el desarrollo de un cultivo con frecuencia están determinadas por condiciones ambientales adversas al momento de la plantación (estación temprana) o al momento de la cosecha (estación tardía). Dichas condiciones adversas se pueden evitar si se acorta el ciclo de cosecha. La tasa de crecimiento se puede determinar al derivar varios parámetros de las curvas de crecimiento, dichos parámetros pueden ser: T-Mid (el tiempo que tardan las plantas en alcanzar el 50% de su tamaño máximo) y T-90 (el tiempo que tardan las plantas en alcanzar el 90% de su tamaño máximo), entre otros.

Resistencia al estrés El aumento de la tasa de rendimiento y/o de crecimiento ocurre si la planta se encuentre en condiciones sin estrés o si la planta está expuesta a varios tipos de estrés, en comparación con las plantas de control. Las plantas típicamente responden a la exposición al estrés mediante un crecimiento más lento. En condiciones de estrés severo, la planta puede incluso detener su crecimiento por completo. Por otra parte, el estrés leve se define en la presente como cualquier estrés al que está expuesta una planta que no causa el cese por completo del crecimiento de una planta sin la capacidad de reiniciar el crecimiento. El estrés leve, en el sentido de la invención, conduce a una reducción del crecimiento de las plantas estresadas de menos de 40%, 35% ó 25%, con mayor preferencia, menos de 20% ó 15% en comparación con la planta de control en condiciones sin estrés. Debido a los adelantos en las prácticas agrícolas (irrigación, fertilización, tratamientos con plaguicidas), no es frecuente encontrar distintos tipos de estrés severo en plantas de cultivo cultivadas. En consecuencia, el crecimiento comprometido inducido por estrés leve es a menudo una característica indeseable en la agricultura. El estrés leve es el estrés biótico y/o abiótico (ambiental) cotidiano al cual está expuesta una planta. El estrés abiótico se puede deber a sequía o exceso de agua, estrés anaeróbico, estrés salino, toxicidad química, estrés oxidativo y temperaturas cálidas, frías o de congelación.

El estrés abiótico puede ser estrés osmótico causado por estrés hídrico (en particular, debido a sequía), estrés salino, estrés oxidativo o estrés iónico. El estrés biótico típicamente es el estrés causado por patógenos, tales como bacterias, virus, hongos, nemátodos e insectos.

El "estrés biótico" típicamente es el estrés causado por patógenos, tales como bacterias, virus, hongos, nemátodos e insectos.

El "estrés abiótico" puede ser estrés osmótico causado por estrés hídrico, por ejemplo, debido a sequía, estrés salino o estrés por congelación. El estrés abiótico también puede ser estrés oxidativo o estrés por frío. "Estrés por congelación" se refiere a estrés debido a las temperaturas de congelación, es decir, temperaturas en las cuales las moléculas de agua disponibles se congelan y se convierten en hielo. "Estrés por frío", también denominado "estrés por heladas", se refiere a temperaturas frías, por ejemplo, temperaturas menores de 10° o, preferentemente, menores de 5°C, pero a las cuales las moléculas de agua no se congelan.

Como se informó en Wang et al. (Planta (2003) 218: 1-14), el estrés abiótico conduce a una serie de cambios morfológicos, fisiológicos, bioquímicos y moleculares que afectan de manera adversa el crecimiento y la productividad de la planta. Se sabe que el estrés por sequía, salinidad, temperaturas extremas y el estrés oxidativo están interconectados y pueden inducir el crecimiento y daño celular mediante mecanismos similares. Rabbani et al. (Plant Physíol (2003) 133: 1755-1767) describe un grado particularmente alto de "comunicación cruzada" entre estrés por sequía y estrés por alta salinidad. Por ejemplo, la sequía y/o la salinización se manifiestan principalmente como estrés osmótico, lo cual da como resultado la interrupción de la homeóstasis y la distribución iónica en la célula. El estrés oxidativo, que frecuentemente acompaña al estrés por alta o baja temperatura, por salinidad o por sequía, puede causar la desnaturalización de proteínas funcionales y estructurales. Como consecuencia, estos diversos tipos de estrés ambientales a menudo activan vías de señalización celular y respuestas celulares similares, tales como la producción de proteínas por estrés, la regulación en forma ascendente de antioxidantes, la acumulación de solutos compatibles y la detención del crecimiento. Como se usa en la presente, el término condiciones "sin estrés" son las condiciones ambientales que permiten el crecimiento óptimo de las plantas. Los expertos en el arte conocen las condiciones normales del suelo y climáticas para una ubicación determinada. Las plantas en condiciones óptimas de crecimiento (que crecen en condiciones sin estrés) usualmente rinden, en orden creciente de preferencia, al menos 97%, 95%, 92%, 90%, 87%, 85%, 83%, 80%, 77% o 75% de la producción promedio de dicha planta en un ambiente determinado. La producción promedio se puede calcular sobre la base de una cosecha y/o estación. Los expertos en el arte conocen el rendimiento promedio de la producción de un cultivo.

En particular, los métodos de la presente invención se pueden realizar en condiciones sin estrés o en condiciones de sequía leve para obtener plantas con mayor rendimiento con respecto a plantas de control. Como se informó en Wang et al. (Planta (2003) 218: 1-14), el estrés abiótico conduce a una serie de cambios morfológicos, fisiológicos, bioquímicos y moleculares que afectan de manera adversa el crecimiento y la productividad de la planta. Se sabe que el estrés por sequía, salinidad, temperaturas extremas y el estrés oxidativo están interconectados y pueden inducir el crecimiento y daño celular mediante mecanismos similares. Rabbani et al. (Plant Physiol (2003) 133: 1755-1767) describe un grado particularmente alto de "comunicación cruzada" entre estrés por sequía y estrés por alta salinidad. Por ejemplo, la sequía y/o la salinización se manifiestan principalmente como estrés osmótico, lo cual da como resultado la interrupción de la homeóstasis y la distribución iónica en la célula. El estrés oxidativo, que frecuentemente acompaña al estrés por alta o baja temperatura, por salinidad o por sequía, puede causar la desnaturalización de proteínas funcionales y estructurales. Como consecuencia, estos diversos tipos de estrés ambientales a menudo activan vías de señalización celular y respuestas celulares similares, tales como la producción de proteínas por estrés, la regulación en forma ascendente de antioxidantes, la acumulación de solutos compatibles y la detención del crecimiento. Como se usa en la presente, el término condiciones "sin estrés" son las condiciones ambientales que permiten el crecimiento óptimo de las plantas. Los expertos en el arte conocen las condiciones normales del suelo y climáticas para una ubicación determinada. Las plantas en condiciones óptimas de crecimiento (que crecen en condiciones sin estrés) usualmente rinden, en orden creciente de preferencia, al menos 97%, 95%, 92%, 90%, 87%, 85%, 83%, 80%, 77% o 75% de la producción promedio de dicha planta en un ambiente determinado. La producción promedio se puede calcular sobre la base de una cosecha y/o estación. Los expertos en el arte conocen el rendimiento promedio de la producción de un cultivo.

En particular, los métodos de la presente invención se pueden realizar en condiciones sin estrés. Por ejemplo, los métodos de la presente invención se pueden realizar en condiciones sin estrés, tales como sequía leve, para obtener plantas con mayor rendimiento, con respecto a plantas de control.

En otra forma de realización, los métodos de la presente invención se pueden realizar en condiciones con estrés.

Por ejemplo, los métodos de la presente invención se pueden realizar en condiciones con estrés, tales como sequía, para obtener plantas con mayor rendimiento, con respecto a plantas de control.

En otro ejemplo, los métodos de la presente invención se pueden realizar en condiciones con estrés, tales como deficiencia de nutrientes, para obtener plantas con mayor rendimiento, con respecto a plantas de control.

La deficiencia de nutrientes puede ser el resultado de la falta de nutrientes tales como nitrógeno, fosfatos y otros compuestos que contienen fósforo, potasio, calcio, magnesio, manganeso, hierro y boro, entre otros.

Aun en otro ejemplo, los métodos de la presente invención se pueden realizar en condiciones con estrés, tales como estrés salino, para obtener plantas con mayor rendimiento, con respecto a plantas de control.

El término "estrés salino" no está restringido a la sal común (NaCI), sino que puede ser uno o más de los siguientes: NaCI, KCI, LiCI, MgCI2, CaCI2, entre otros.

Incremento/Mejora/Aumento Los términos "incremento", "mejora" o "aumento" son indistintos y significan, en el sentido de la solicitud, al menos 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ó 10%, preferentemente, al menos 15% ó 20%, con mayor preferencia, 25%, 30%, 35% ó 40% más de rendimiento y/o crecimiento en comparación con las plantas de control como se definen en la presente.

Rendimiento de las semillas Un aumento del rendimiento de las semillas se puede manifestar como uno o más de los siguientes: a) mayor biomasa de semillas (peso total de semillas) que puede ser por semilla y/o por planta y/o por metro cuadrado; b) mayor cantidad de flores por planta; c) mayor cantidad y/o mayor cantidad de semillas (llenas); d) mayor tasa de llenado de semillas (que se expresa como la proporción entre la cantidad de semillas llenas dividido por la cantidad total de semillas); e) mayor índice de cosecha, que se expresa como la proporción entre el rendimiento de las partes cosechables, tales como semillas, dividido por la biomasa total de las partes aéreas de la planta; y f) mayor peso de mil granos (TKW), que se extrapola de la cantidad de semillas llenas contadas y su peso total. Un mayor TKW puede ser el resultado de un mayor tamaño de las semillas y/o peso de las semillas, y también puede ser el resultado de un mayor tamaño del embrión y/o endosperma.

Un mayor rendimiento de las semillas también se puede manifestar como un mayor tamaño de las semillas y/o volumen de las semillas. Asimismo, un mayor rendimiento de las semillas también se puede manifestar como una mayor área de la semilla y/o longitud de la semilla y/o ancho de la semilla y/o perímetro de la semilla. Un mayor rendimiento también puede dar como resultado una arquitectura modificada o puede ocurrir debido a una arquitectura modificada. índice de verdor Como se usa en la presente, el "índice de verdor" se calcula de imágenes digitales de plantas. Para cada píxel que pertenece a la planta objeto de la imagen, se calcula la proporción del valor de verde con respecto al valor de rojo (en el modelo RGB para la codificación de color). El índice de verdor se expresa como el porcentaje de píxeles para los cuales la proporción verde-rojo excede un umbral determinado. En condiciones normales de crecimiento, en condiciones de crecimiento con estrés salino y en condiciones de crecimiento con disponibilidad reducida de nutrientes, el índice de verdor de las plantas se mide en la última formación de imágenes antes de la floración. Por el contrario, en condiciones de crecimiento con estrés por sequía, el índice de verdor de las plantas se mide en la primera formación de imágenes después de la sequía.

Biomasa Como se usa en la presente, el término "biomasa" se refiere al peso total de una planta. Dentro de la definición de biomasa, se puede hacer una distinción entre la biomasa de una o más partes de una planta, que pueden incluir: - partes aéreas (cosechables), tales como, por ejemplo, biomasa de brotes, biomasa de semillas, biomasa de hojas, etc. y/o partes subterráneas (cosechables), tales como, por ejemplo, biomasa de raíces, etc., y/o partes cosechables parcialmente insertadas o en contacto con el suelo, tales como, pero sin limitarse a, remolacha y otras áreas del hipocotilo de la planta, rizomas, estolones o rizomas reptantes; biomasa vegetativa, tal como biomasa de raíces, biomasa de brotes, etc., y/o órganos reproductivos, y/o - propágulos, tales como semillas.

Reproducción asistida por marcador Dichos programas de reproducción algunas veces requieren la introducción de variaciones alélicas mediante el tratamiento mutagénico de las plantas, utilizando, por ejemplo, mutagénesis EMS; alternativamente, el programa puede comenzar con una colección de variantes alélicas del denominado origen "natural" causado de manera no intencional. Luego se realiza la identificación de variantes alélicas, por ejemplo, mediante PCR. Luego sigue una etapa de selección de variantes alélicas superiores de la secuencia en cuestión y que produce mayor rendimiento. Generalmente, la selección se realiza mediante el control del crecimiento de las plantas que contienen diferentes variantes alélicas de la secuencia en cuestión. El crecimiento se puede controlar en un invernadero o en el campo. Otras etapas opcionales incluyen la cruza de plantas en las cuales la variante alélica superior se identificó con otra planta. Esto se puede usar, por ejemplo, para realizar una combinación de características fenotípicas de interés.

Uso como sondas en (mapeo genético) El uso de ácidos nucleicos que codifican la proteína de interés para el mapeo genético y físico de genes requiere solamente una secuencia de ácidos nucleicos de al menos 15 nucleótidos de longitud. Estos ácidos nucleicos se pueden utilizar como marcadores de polimorfismos de longitud del fragmento de restricción (RFLP). Los Southern blots (Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) de ADN genómico vegetal digerido por restricción se pueden sondear con los ácidos nucleicos que codifican la proteína de interés. Los patrones de banda resultantes luego se pueden someter a análisis genéticos mediante el uso de programas de computación tales como MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1 : 174-181 ) a fin de construir un mapa genético. Además, los ácidos nucleicos se pueden usar para sondear Southern blots que contienen ADN genómico tratado con endonucleasa de restricción de un conjunto de individuos que representan los progenitores y la progenie de una cruza genética definida Se observa la segregación de los polimorfismos de ADN y se usa para calcular la posición del ácido nucleico que codifica la proteína de interés en el mapa genético que se obtuvo previamente con esta población (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32:314-331 ).

La producción y el uso de sondas derivadas de genes vegetales para usar en el mapeo genético se describen en Bernatzky and Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Repórter 4: 37-41. Numerosas publicaciones describen el mapeo genético de clones de cADN específicos mediante la metodología descrita anteriormente o sus variaciones Por ejemplo, para el mapeo se pueden usar poblaciones de intercruza F2, poblaciones de retrocruza, poblaciones apareadas al azar, líneas isogénicas cercanas y otros conjuntos de individuos. Tales metodologías son muy conocidas por los expertos en el arte.

Las sondas de ácidos nucleicos también se pueden usar para el mapeo físico (es decir, la ubicación de secuencias en mapas físicos; véase Hoheisel et al. In: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996, pp. 319-346, y las referencias allí citadas).

En otra forma de realización, las sondas de ácidos nucleicos se pueden usar en el mapeo de hibridación in situ por fluorescencia directa (FISH) (Trask (1991 ) Trends Genet. 7:149-154). Si bien los métodos actuales de mapeo FISH favorecen el uso de clones grandes (varios kb a varios cientos de kb; véase Laan et al. (1995) Genome Res. 5:13- 20), las mejoras en la sensibilidad pueden permitir la realización del mapeo FISH con sondas más cortas.

Se pueden realizar diversos métodos basados en la amplificación de ácidos nucleicos para el mapeo genético y físico mediante el uso de ácidos nucleicos. Los ejemplos incluyen la amplificación específica de alelos (Kazazian (1998) J. Lab. Clin. Med 11 :95-96), polimorfismo de fragmentos amplificados por PCR (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16:325-332), ligadura específica de alelos (Landegren et al. (1988) Science 241 :1077-1080), reacciones de extensión de nucleótidos (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18:3671 ), mapeo de híbrido por radiación (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7:22-28) y mapeo Happy (Dear and Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17:6795-6807). Para estos métodos, se utiliza la secuencia de un ácido nucleico para diseñar y producir pares de cebadores para utilizar en la reacción de amplificación o en las reacciones de extensión de cebadores. El diseño de dichos cebadores es muy conocido por los expertos en el arte. En los métodos que utilizan mapeo genético basado en PCR, puede ser necesario identificar diferencias de secuencias de ADN entre los progenitores de la cruza por mapeo en la región correspondiente con la secuencia de ácidos nucleicos de la presente. Sin embargo, esto generalmente no es necesario para los métodos de mapeo.

Planta Como se usa en la presente, el término "planta" abarca plantas enteras, antecesores y progenie de las plantas y partes de plantas, incluso semillas, brotes, tallos, hojas, raíces (incluso tubérculos), flores y tejidos y órganos, en donde cada uno de los antes mencionados comprende el gen/ácido nucleico de interés. El término "planta" también abarca células de plantas, cultivos en suspensión, tejidos de callos, embriones, regiones meristemáticas, gametofitos, esporofitos, polen y microesporas, en donde cada uno de los antes mencionados comprende el gen/ácido nucleico de interés.

Las plantas que son particularmente útiles en los métodos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular, plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, incluso forraje o legumbres forrajeras, plantas ornamentales, cultivos para alimentación, árboles o arbustos seleccionados de la lista que comprende Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. fpor ejemplo, Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (por ejemplo, Brassica napus, Brassica rapa ssp. [cañóla, colza oleaginosa, nabo]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucúrbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (por ejemplo, Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp., Eriobotrya japónica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (por ejemplo, Glycine max, Soja hispida o Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. fpor ejemplo, Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. fpor ejemplo, Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. fpor ejemplo, Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapote, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. fpor ejemplo, Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Púnica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Sécale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. fpor ejemplo, Solanum tuberosum, Solanum integrifolium o Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trífolium spp., Tripsacum dactyloides, Triticosecale rimpaui, Triticum spp. fpor ejemplo, Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum monococcum o Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp., entre otros.

Con respecto a las secuencias de la invención, una secuencia de polipéptidos o ácidos nucleicos de origen vegetal tiene la característica de un uso de codón optimizado para la expresión en plantas, y del uso de aminoácidos y sitios reguladores comunes en plantas, respectivamente. Las plantas de origen pueden ser cualquier planta, pero son, preferentemente, las plantas descritas en el párrafo anterior.

Planta(s) de control La elección de plantas de control adecuadas es una parte rutinaria en la preparación experimental y puede incluir las correspondientes plantas de tipo silvestre o las correspondientes plantas sin el gen de interés. Generalmente, la planta de control es de la misma especie de planta o incluso de la misma variedad que la planta a evaluar. La planta de control también puede ser un nulicigota de la planta a evaluar. Los nulicigotas, también denominados plantas de control nulas, son individuos que carecen del trasngen por segregación. Además, se cultivó una planta de control en las mismas condiciones de crecimiento que las plantas de la invención. En general, la planta de control se cultiva en las mismas condiciones de crecimiento y, por lo tanto, cerca de las plantas de la invención y al mismo tiempo. Como se usa en la presente, una "planta de control" se refiere no sólo a las plantas completas, sino también a las partes de las plantas, incluso semillas y partes de semillas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Polipéptido tipo CLE 2 De modo sorprendente, ahora se ha descubierto que modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de tipo CLE genera plantas que tienen mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control. De acuerdo con una primera forma de realización, la presente invención provee un método para mejorar rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, con respecto a las plantas de control, que comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo CLE 2 y/u, opcionalmente, seleccionar plantas que tienen mejores rasgos relacionados con el rendimiento.

Un método preferido para modular (preferentemente, aumentar) la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo CLE 2 es mediante la introducción y expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo CLE 2.

Cualquier referencia de aquí en adelante a una "proteína útil en los métodos de la invención" significa un polipéptido tipo CLE 2, como se define en la presente. Cualquier referencia de aquí en adelante a un "ácido nucleico útil en los métodos de la invención" significa un ácido nucleico capaz de codificar dicho polipéptido tipo CLE 2. El ácido nucleico a introducir en una planta (y, por lo tanto, útil para realizar los métodos de la invención) es cualquier ácido nucleico que codifica el tipo de proteína que se describirá a continuación, en adelante también denominado "ácido nucleico tipo CLE 2" o "gen tipo CLE 2".

Como se define en la presente, un "polipéptido tipo CLE 2" se refiere a cualquier polipéptido que comprende al menos un dominio CLE del grupo 2 (como se define en Oelkers, K. et al. (2008) - Bioinformatic analysis of the CLE signaling peptide family. BMC Plant Biology 2008, 8:1. (doi: 10.1186/1471 -2229-8-1 )) con un tramo conservado de 12 aminoácidos representados por el motivo 1 , cerca del terminal C o en el terminal C. En general, los polipéptidos tipo CLE 2 son péptidos específicos de plantas que participan en la señalización, pequeños con menos de 15 kDa, y comprenden una señal de secreción en el terminal N.

Preferentemente, el dominio de polipéptido CLE de un polipéptido tipo CLE 2 tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO 2.

De manera adicional y/o alternativa, el polipéptido tipo CLE útil en los métodos de la invención comprenden un motivo de secuencia que tienen, en orden creciente de preferencia, 4 o menos desajustes, en comparación con la secuencia del Motivo 1 , 3 o menos desajustes, en comparación con la secuencia del Motivo 1 , 2 o menos desajustes, en comparación con la secuencia del Motivo 1 , 1 o ningún desajuste, en comparación con la secuencia del Motivo 1 ; y/o que tiene al menos, en orden creciente de preferencia, 49%, 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%. 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%. 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o más de identidad de secuencia con el Motivo 1 : RXSPGGP [ND]PXHH (SEQ ID NO: 23). Los aminoácidos indicados entre corchetes en la presente representan aminoácidos alternativos para una posición en particular; X puede ser cualquier aminoácido. En general, el Motivo 1 se encuentra en cualquier polipéptido tipo CLE. Preferentemente, el Motivo 1 es R(R/L/F/V)SPG GP(D/N)P(Q/R)HH (SEQ ID NO: 24). Con mayor preferencia, el Motivo 1 no es precedido por un residuo de lisina.

En una forma de realización de máxima preferencia de la presente invención, el polipéptido tipo CLE 2 útil en los métodos de la invención comprende un motivo de secuencia que tienen, en orden creciente de preferencia, 4 o menos desajustes, en comparación con la secuencia del Motivo 2, 3 o menos desajustes, en comparación con la secuencia del Motivo 2, 2 o menos desajustes, en comparación con la secuencia del Motivo 2, 1 o ningún desajuste, en comparación con la secuencia del Motivo 2; y/o que tiene al menos, en orden creciente de preferencia, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%. 64%. 65%, 66%. 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %. 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%. 78%. 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%. 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% O 99% o más de identidad de secuencia con el Motivo 2: RLSPGGPDPQHH (SEQ ID NO: 25) Se debe tener en cuenta que el Motivo 1 indicado en la presente representa una secuencia de consenso de los motivos presentes en los polipéptidos tipo CLE 2, tales como los representados en la Tabla A. Sin embargo, también se debe tener en cuenta que el Motivo 1 , como se define en la presente, no se limita a su respectiva secuencia, sino que también abarca los correspondientes motivos presentes en cualquier polipéptido tipo CLE 2. Los motivos se derivaron del análisis de secuencia que se muestra en Oelkers er a/. (2008).

De manera adicional y/o alternativa, el homólogo de una proteína tipo CLE 2 tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31 %, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%. 40%. 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%. 52%. 53%. 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%. 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%. 79%, 80%, 81%. 82%. 83%, 84%, 85%. 86%, 87%. 88%, 89%. 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia total con el aminoácido representado por SEQ ID NO: 2, siempre que la proteína homologa comprenda uno o más de los motivos conservados, como se indicó anteriormente. La identidad de secuencia total se puede determinar con un algoritmo de alineamiento global, tal como el algoritmo de Needleman Wunsch en el programa GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), preferentemente, con parámetros predeterminados y, preferentemente, con secuencias de proteínas maduras (es decir, sin considerar las señales de secreción o los péptidos de tránsito). En comparación con la identidad de secuencia total, la identidad de secuencia generalmente será mayor cuando sólo se consideren dominios o motivos conservados. Preferentemente, los motivos en un polipéptido tipo CLE 2 tienen, en orden creciente de preferencia, al menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con los motivos representados por SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 25 (Motivos 1 y 2).

Los términos "dominio", "característica" y "motivo" se definen en la sección "definiciones" de la presente.

Además, los polipéptidos tipo CLE 2 (al menos en su forma nativa) típicamente tienen actividad de señalización. Las herramientas y técnicas para medir la actividad de señalización son conocidas en el arte; véase, por ejemplo, Whitford et al Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 105(47): 18625-30, 2008. Se proveen más detalles en el Ejemplo 4.

Además, los polipéptidos tipo CLE 2, cuando se expresan en el arroz de acuerdo con los métodos de la presente invención como se indica en los Ejemplos 7 y 8, producen plantas que tienen rasgos aumentados relacionados con el rendimiento, en particular, mejor biomasa de raíz y de brote, cantidad de flores y de panículas.

La presente invención se ilustra mediante la transformación de plantas con la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEQ ID NO: 1 que codifica la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 2. Sin embargo, la realización de la invención no se restringe a estas secuencias; los métodos de la invención se pueden realizar ventajosamente mediante el uso de cualquier ácido nucleico que codifica tipo CLE 2 o polipéptido tipo CLE 2, como se define en la presente.

En la Tabla A de la sección de Ejemplos de la presente, se brindan ejemplos de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos tipo CLE 2. Dichos ácidos nucleicos son útiles en la realización de los métodos de la invención. Las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos son secuencias ejemplares de ortólogos y parálogos del polipéptido tipo CLE 2 representado por SEQ ID NO: 2, los términos "ortólogos" y "parálogos" son como se definen en la presente. Otros ortólogos y parálogos se pueden identificar fácilmente mediante la realización de la denominada búsqueda blast recíproca, como se describe en la sección de definiciones; en donde la secuencia incógnita es SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, el segundo BLAST <retro-BLAST) sería contra secuencias de Arabidopsis.

Las variantes de ácidos nucleicos también pueden ser útiles para poner en práctica los métodos de la invención. Los ejemplos de dichas variantes incluyen ácidos nucleicos que codifican homólogos y derivados de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las Tabla A de la sección de Ejemplos, en donde los términos "homólogo" y "derivado" son como se definen en la presente. También son útiles en los métodos de la invención los ácidos nucleicos que codifican homólogos y derivados de ortólogos o parálogos de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos. Los homólogos y derivados útiles en los métodos de la presente invención tienen sustancialmente la misma actividad biológica y funcional que la proteína no modificada de la cual derivan. Otras variantes útiles para poner en práctica los métodos de la invención son las variantes en las cuales se optimiza el uso del codón o en las cuales se retiran los sitios blanco de miARN.

Otras variantes de ácidos nucleicos útiles para poner en práctica los métodos de la invención incluyen porciones de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos tipo CLE 2, ácidos nucleicos que se hibridan con ácidos nucleicos que codifican polipéptidos tipo CLE 2, variantes de empalme de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos tipo CLE 2, variantes alélicas de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos tipo CLE 2 y variantes de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos tipo CLE 2 obtenidos por transposición génica. Los términos secuencia de hibridación, variante de empalme, variante alélica y transposición génica son como se describen en la presente.

Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos tipo CLE 2 no necesitan ser ácidos nucleicos de longitud completa, ya que la realización de los métodos de la invención no depende del uso de secuencias de ácidos nucleicos de longitud completa. De acuerdo con la presente invención, se provee un método para mejorar rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, que comprende introducir y expresar en una planta una porción de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos, o una porción de un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos.

Se puede preparar una porción de un ácido nucleico, por ejemplo, realizando una o más eliminaciones en el ácido nucleico. Las porciones se pueden utilizar en forma aislada o se pueden fusionar con otras secuencias codificantes (o no codificantes) a fin de producir, por ejemplo, una proteína que combine varias actividades. Cuando se fusiona con otras secuencias codificantes, el polipéptido resultante producido luego de la traducción puede ser más grande que el previsto para la porción de proteína.

Las porciones útiles en los métodos de la invención codifican un polipéptido tipo CLE 2 como se define en la presente y tienen sustancialmente la misma actividad biológica que las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos. Preferentemente, la porción es una porción de cualquiera de los ácidos nucleicos indicados en la Tabla A de la sección de Ejemplos, o es una porción de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos. Preferentemente, la porción tiene al menos 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 400, 450, 500 nucleótidos consecutivos de longitud, en donde los nucleótidos consecutivos son de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos, o de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos. Con máxima preferencia, la porción es una porción del ácido nucleico de SEQ ID NO: 1.

Otra variante de ácido nucleico útil en los métodos de la invención es un ácido nucleico capaz de hibridarse, en condiciones de rigurosidad reducida, preferentemente en condiciones de rigurosidad, con un ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo CLE 2, como se define en la presente, o con una porción como se define en la presente.

De acuerdo con la presente invención, se provee un método para mejorar los rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, que comprende introducir y expresar en una planta un ácido nucleico capaz de hibridarse con cualquiera de los ácidos nucleicos indicados en la Tabla A de la sección de Ejemplos, o que comprende introducir y expresar en una planta un ácido nucleico capaz de hibridarse con un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos.

Las secuencias de hibridación útiles en los métodos de la invención codifican un polipéptido tipo CLE 2, como se define en la presente, y tienen sustancialmente la misma actividad biológica que las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos. Preferentemente, la secuencia de hibridación es capaz de hibridarse con el complemento de cualquiera de los ácidos nucleicos indicados en la Tabla A de la sección de Ejemplos, o con una porción de cualquiera de estas secuencias, en donde una porción es como se definió con anterioridad, o la secuencia de hibridación es capaz de hibridarse con el complemento de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos. Con máxima preferencia, la secuencia de hibridación es capaz de hibridarse con el complemento de un ácido nucleico representado por SEQ ID NO: 1 o con una porción de éste.

Otra variante de ácido nucleico útil en los métodos de la invención es una variante de empalme que codifica un polipéptido tipo CLE 2, como se definió con anterioridad; una variante de empalme es como se define en la presente.

De acuerdo con la presente invención, se provee un método para mejorar rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, que comprende introducir y expresar en una planta una variante de empalme de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos, o una variante de empalme de un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos.

Otra variante de ácido nucleico útil para realizar los métodos de la invención es una variante alélica de un ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo CLE 2, como se definió anteriormente en la presente; una variante de alélica es como se define en la presente.

De acuerdo con la presente invención, se provee un método para mejorar los rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, que comprende introducir y expresar en una planta una variante alélica de cualquiera de los ácidos nucleicos indicados en la Tabla A de la sección de Ejemplos, o que comprende introducir y expresar en una planta una variante alélica de un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos.

Los polipéptidos codificados por las variantes alélicas útiles en los métodos de la presente invención tienen sustancialmente la misma actividad biológica que el polipéptido tipo CLE 2 de SEQ ID NO: 2 y cualquiera de los aminoácidos representados en la Tabla A de la sección de Ejemplos. Las variantes alélicas existen en la naturaleza, y el uso de estos alelos naturales está comprendido en los métodos de la presente invención.

También se puede usar transposición génica o evolución dirigida para generar variantes de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos tipo CLE 2, como se definieron anteriormente; el término "transposición génica" es como se define en la presente.

De acuerdo con la presente invención, se provee un método para mejorar los rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, que comprende introducir y expresar en una planta una variante de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos, o que comprende introducir y expresar en una planta una variante de un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos, en donde la variante de ácido nucleico se obtiene mediante transposición génica.

Además, las variantes de ácidos nucleicos también se pueden obtener mediante mutagénesis dirigida a sitio. Hay varios métodos disponibles para lograr la mutagénesis dirigida a sitio, en donde los más comunes son los métodos basados en PCR (Current Protocols ¡n Molecular Biology. Wiley Eds.).

Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos tipo CLE 2 pueden derivar de cualquier fuente natural o artificial. El ácido nucleico se puede modificar de su forma nativa en composición y/o ambiente genómico mediante manipulación humana deliberada.

Preferentemente el ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo CLE 2 es de una planta, con mayor preferencia, de una planta dicotiledónea, con mayor preferencia, de la familia Brassicaceae, con máxima preferencia, el ácido nucleico es de Arabidopsis thaliana.

La realización de los métodos de la invención genera plantas que tienen mejores rasgos relacionados con el rendimiento. En particular, la realización de los métodos de la invención genera plantas que tienen mayor rendimiento, en especial mayor rendimiento de semillas en relación con las plantas de control. Los términos "rendimiento" y "rendimiento de semilla" se describen en mayor detalle en la sección "definiciones" de la presente.

La referencia en la presente a mejores rasgos relacionados con el rendimiento significa un aumento de vigor temprano y/o biomasa (peso) de una o más partes de una planta, que pueden incluir partes aéreas (cosechables) y/o partes subterráneas (cosechables). En particular, dichas partes cosechables se refieren a la biomasa, y la realización de los métodos de la invención da como resultado plantas que tienen mayor biomasa de brote y raíz y mayor cantidad de flores y panículas, con respecto al rendimiento de biomasa de las plantas de control.

La presente invención provee un método para aumentar el rendimiento, en especial, el rendimiento de biomasa de las plantas, con respecto a las plantas de control, en donde el método comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo CLE 2, como se define en la presente.

Debido a que las plantas transgénicas de acuerdo con la presente invención tienen mayor rendimiento, es probable que estas plantas exhiban una mayor tasa de crecimiento (durante al menos parte de su ciclo de vida), con respecto a la tasa de crecimiento de las plantas de control, en una etapa correspondiente de su ciclo de vida.

De acuerdo con una característica preferida de la presente invención, la realización de los métodos de la invención genera plantas que tienen una mayor tasa de crecimiento con respecto a las plantas de control. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se provee un método para aumentar la tasa de crecimiento de las plantas, cuyo método comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo CLE 2, como se define en la presente.

La realización de los métodos de la invención le brinda a las plantas cultivadas en condiciones sin estrés o en condiciones de sequía leve mayor rendimiento con respecto a las plantas de control cultivadas en condiciones comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se provee un método para aumentar el rendimiento en las plantas cultivadas en condiciones sin estrés o en condiciones de sequía leve, cuyo método comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo CLE 2.

En una forma de realización preferida, la realización de los métodos de la invención le brinda a las plantas cultivadas en condiciones de deficiencia de nutrientes, en particular en condiciones de deficiencia de nitrógeno, mayor rendimiento con respecto a las plantas de control cultivadas en condiciones comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se provee un método para aumentar el rendimiento en las plantas cultivadas en condiciones de deficiencia de nutrientes, cuyo método comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo CLE 2.

La realización de los métodos de la invención le brinda a las plantas cultivadas en condiciones de estrés salino mayor rendimiento con respecto a las plantas de control cultivadas en condiciones comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se provee un método para aumentar el rendimiento en las plantas cultivadas en condiciones de estrés salino, cuyo método comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo CLE 2.

La invención también provee constructos genéticos y vectores para facilitar la introducción y/o expresión en plantas de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos tipo CLE 2. Los constructos génicos se pueden insertar en vectores, que pueden estar disponibles en el comercio, adecuados para la transformación en plantas y para la expresión del gen de interés en las células trasformadas. La invención también provee el uso de un constructo génico, como se define en la presente en los métodos de la invención.

Más específicamente, la presente invención provee un constructo que comprende: (a) un ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo CLE 2, como se definió anteriormente; (b) una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos de (a); y opcionalmente (c) una secuencia de terminación de la transcripción.

Preferentemente, el ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo CLE 2 es como se definió anteriormente; Los términos "secuencia de control" y "secuencia de terminación" son como se definen en la presente.

Las plantas se transforman con un vector que comprende cualquiera de los ácidos nucleicos descritos anteriormente. El experto en el arte conoce los elementos genéticos que deben estar presentes en el vector a fin de transformar, seleccionar y propagar exitosamente las células huésped que contienen la secuencia de interés. La secuencia de interés está ligada operativamente a una o más secuencias de control (al menos a un promotor).

De forma ventajosa, se puede utilizar cualquier tipo de promotor, ya sea natural o sintético, para dirigir la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos, pero preferentemente, el promotor es de origen vegetal. Un promotor constitutivo es particularmente útil en los métodos. Preferentemente, el promotor constitutivo es un promotor constitutivo ubicuo de intensidad media. Véase la sección "Definiciones" de la presente para las definiciones de los diversos tipos de promotores.

Debe quedar claro que la aplicabilidad de la presente invención no se restringe al ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo CLE 2, representado por SEQ ID NO: 1 , ni a la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo CLE 2 cuando es dirigido por un promotor constitutivo.

Preferentemente, el promotor constitutivo es un promotor de intensidad media. Con mayor preferencia, es un promotor derivado de plantas, tal como un promotor GOS2 o un promotor que tiene sustancialmente la misma intensidad y el mismo patrón de expresión (un promotor funcionalmente equivalente), con mayor preferencia, el promotor es el promotor GOS2 del arroz. Con mayor preferencia, el promotor constitutivo es representado por una secuencia de ácidos nucleicos sustancialmente similar a SEQ ID NO: 26, con máxima preferencia, el promotor constitutivo es representado por SEQ ID NO: 26. Véase la sección "Definiciones" de la presente para más ejemplos de promotores constitutivos.

Opcionalmente, se pueden utilizar una o más secuencias terminadoras en el constructo introducido en una planta. Preferentemente, el constructo comprende un cásete de expresión que comprende un promotor GOS2, sustancialmente similar a SEQ ID NO: 26, y el ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo CLE 2. Además, puede haber una o más secuencias que codifican marcadores seleccionares en el constructo introducido en una planta.

De acuerdo con una característica preferida de la invención, la expresión modulada es mayor expresión. Los métodos para aumentar la expresión de ácidos nucleicos o genes, o productos génicos, están documentados en el arte y se proporcionan ejemplos en la sección de definiciones.

Como se mencionó anteriormente, un método preferido para modular la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo CLE 2 es mediante la introducción y expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo CLE 2; sin embargo, los efectos de realizar el método, es decir, mejorar los rasgos relacionados con el rendimiento, también se pueden lograr mediante otras técnicas conocidas, que incluyen, pero sin limitación, rotulado por activación de T-ADN, TILLING, recombinación homologa. En la sección de definiciones se provee una descripción de estas técnicas.

La invención también provee un método para la producción de plantas transgénicas que tienen mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control, que comprende la introducción y expresión en una planta de cualquier ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo CLE 2, como se definió anteriormente en la presente.

Más específicamente, la presente invención provee un método para la producción de plantas transgénicas que tienen mejores rasgos relacionados con el rendimiento, en particular mayor biomasa, donde el método comprende: (i) introducir y expresar en una planta o célula de planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo CLE 2; y (ii) cultivar la célula vegetal en condiciones que promuevan el desarrollo y el crecimiento de la planta.

El ácido nucleico de (i) puede ser cualquiera de los ácidos nucleicos capaces de codificar un polipéptido tipo CLE 2, como se define en la presente.

El ácido nucleico se puede introducir directamente en una célula vegetal o en la planta misma (incluso introducirlo en un tejido, órgano o cualquier otra parte de la planta). De acuerdo con una característica preferida de la presente invención, el ácido nucleico se introduce, preferentemente, en una planta mediante transformación. El término "transformación" se describe en mayor detalle en la sección "definiciones" de la presente.

En una forma de realización, la presente invención se extiende claramente a cualquier célula vegetal o planta producida mediante cualquiera de los métodos descritos en la presente y a todas las partes de la planta y sus propágulos. La presente invención abarca plantas o sus partes (incluso semillas) que se pueden obtener mediante los métodos de acuerdo con la presente invención. Las plantas o las partes de éstas comprenden un transgén de ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo CLE 2, como se definió anteriormente. La presente invención también abarca la progenie de una célula, tejido, órgano o planta entera primaria transformada o transfectada que fue producida mediante cualquiera de los métodos antes mencionados, en donde el único requisito es que la progenie exhiba la(s) misma(s) característica(s) genotípica(s) y/o fenotípica(s) que la(s) producida(s) por el progenitor en los métodos de acuerdo con la invención.

En otra forma de realización, la presente invención también se extiende a células de plantas transgénicas y semillas, que comprenden la molécula de ácido nucleico de la invención en un cásete de expresión vegetal o en un constructo de expresión vegetal.

En otra forma de realización, la semilla de la invención comprende, de manera recombinante, los casetes de expresión de la invención, los constructos de (expresión) de la invención, los ácidos nucleicos antes descritos y/o las proteínas codificadas por los ácidos nucleicos antes descritos.

Otra forma de realización de la presente invención se extiende a células vegetales que comprenden el ácido nucleico antes descrito, en un cásete de expresión vegetal recombinante.

Aún en otra forma de realización, las células vegetales de la invención son células que no se propagan, por ejemplo, las células no se pueden usar para regenerar una planta entera de esta célula en su conjunto mediante el uso de técnicas de cultivo celular estándar, es decir, métodos de cultivo celular, pero excluyendo métodos de transferencia de núcleos, organelas o cromosomas in vitro. Si bien las células vegetales generalmente tienen la característica de totipotencia, algunas células vegetales no se pueden usar para regenerar o propagar plantas intactas de dichas células. En una forma de realización de la invención, las células vegetales de la invención son dichas células.

En otra forma de realización, las células vegetales de la invención son células vegetales que no se sostienen a sí mismas por fotosíntesis mediante la síntesis de hidratos de carbono y proteínas de sustancias inorgánicas, tales como agua, dióxido de carbono y sales minerales, es decir, se las puede considerar una variedad no vegetal. En otra forma de realización, las células vegetales de la invención son una variedad no vegetal y no se pueden propagar.

La invención también incluye células huésped que contienen un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido tipo CLE 2, como se definió anteriormente. Las células huésped de la invención pueden ser cualquier célula seleccionada del grupo que consiste en células bacterianas, tales como células de especies de E.coli o Agrobacterium, células de levadura, células de hongos, algas o cianobacterias o células vegetales. En una forma de realización, las células huésped de acuerdo con la invención son células vegetales, levadura, bacterias y hongos. Las plantas huésped para los ácidos nucleicos o el vector usado en el método de acuerdo con la invención, el cásete de expresión o constructo o vector son, en principio, ventajosamente, todas las plantas que son capaces de sintetizar los polipéptidos usados en el método de la invención.

En una forma de realización, las células vegetales de la invención sobreexpresan la molécula de ácido nucleico de la invención.

La invención también incluye métodos para la producción de un producto que comprende a) cultivar las plantas de la invención y b) producir dicho producto de o mediante las plantas de la invención o partes de estas plantas, que incluyen semillas. En otra forma de realización, los métodos comprenden las siguientes etapas: a) cultivar las plantas de la invención, b) retirar las partes cosechables, como se definieron anteriormente, de las plantas, y c) producir dicho producto de o mediante las partes cosechables de la invención.

Los ejemplos de dichos métodos serían cultivar plantas de maíz de la invención, cosechar las mazorcas del maíz y retirar los granos. Estos se pueden usar como forraje o se pueden procesar para obtener almidón o aceite como productos agrícolas.

El producto se puede generar en el lugar donde se cultivó la planta, o se pueden retirar las plantas o partes de éstas del lugar en donde se cultivaron las plantas para obtener el producto. En general, se cultiva la planta, se retiran las partes cosechables deseables de la planta, de ser posible en ciclos repetidos, y se obtiene el producto de las partes cosechables de la planta. La etapa de cultivar la planta se puede realizar solo una vez cada vez que se llevan a cabo los métodos de la invención, mientras que las etapas de producción del producto se pueden realizar varias veces, por ejemplo, mediante el retiro reiterado de las partes cosechables de las plantas de la invención y, de ser necesario, mediante el procesamiento adicional de estas partes para obtener el producto. También es posible reiterar la etapa de cultivo de las plantas de la invención y almacenar las partes de plantas o partes cosechables hasta que se lleva a cabo una vez la generación del producto para las plantas o partes de las plantas acumuladas. Además, las etapas de cultivar las plantas y obtener el producto se pueden superponer en el tiempo, incluso se pueden realizar, en gran medida, de manera simultánea o secuencial. En general, las plantas se cultivan durante cierto tiempo antes de obtener el producto.

Ventajosamente, los métodos de la invención son más eficaces que los métodos conocidos porque las plantas de la invención tienen mayor rendimiento y/o tolerancia a un estrés ambiental, en comparación con una planta de control que se usa en métodos comparables.

En una forma de realización, los productos obtenidos mediante los métodos de la invención son productos vegetales, tales como, pero sin limitación, productos alimenticios, forraje, suplementos alimenticios, suplementos para forraje, fibras, cosméticos o productos farmacéuticos. Los productos alimenticios para humanos se consideran composiciones para la nutrición o para complementar la nutrición. Los productos alimenticios para animales y los suplementos alimenticios para animales, en particular, se consideran productos alimenticios.

En otra forma de realización, los métodos de la invención para la producción se usan para obtener productos agrícolas tales como, pero sin limitación, extractos vegetales, proteínas, aminoácidos, hidratos de carbono, grasas, aceites, polímeros, vitaminas y similares.

Es posible que un producto vegetal consista, en gran medida, en uno o más productos agrícolas.

Aún en otra forma de realización, las secuencias de polinucleótidos o las secuencias de polipéptidos de la invención están comprendidas en un producto agrícola.

En otra forma de realización, las secuencias de ácidos nucleicos y las secuencias proteicas de la invención se pueden usar como marcadores de productos, por ejemplo, para un producto agrícola obtenido por los métodos de la invención. El marcador se puede usar para identificar un producto que se obtuvo mediante un proceso ventajoso que genera no solo mayor eficacia del proceso, sino también mejor calidad del producto, debido a una mayor calidad del material vegetal y de las partes cosechables usados en el proceso. Los marcadores se pueden detectar mediante varios métodos conocidos en el arte, por ejemplo, pero sin limitación, métodos basados en PCR para la detección de ácidos nucleicos o métodos basados en anticuerpos para la detección de proteínas.

Los métodos de la invención se pueden aplicar de forma ventajosa a cualquier planta. Las plantas que son particularmente útiles en los métodos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas que incluyen forraje o legumbres forrajeras, plantas ornamentales, cultivos alimenticios, árboles o arbustos De acuerdo con una forma de realización preferida de la presente invención, la planta es una planta de cultivo. Los ejemplos de plantas de cultivo incluyen soja, remolacha, remolacha azucarera, girasol, cañóla, alfalfa, colza, achicoria, zanahoria, mandioca, trébol, linaza, algodón, tomate, papa y tabaco. Con mayor preferencia, la planta es una planta monocotiledónea. Los ejemplos de plantas monocotiledóneas incluyen caña de azúcar. Con mayor preferencia, la planta es un cereal. Los ejemplos de cereales incluyen arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, triticale, sorgo, emmer, espelta, sécale, trigo einkorn, teff, sorgo milo y avena.

En una forma de realización, las plantas que se usan en los métodos de la invención se seleccionan del grupo que consiste en maíz, trigo, arroz, soja, algodón, colza oleaginosa, que incluye cañóla, caña de azúcar, remolacha azucarera y alfalfa.

En otra forma de realización de la presente invención, las plantas de la invención y las plantas que se usan en los métodos de la invención son plantas de remolacha azucarera con mayor biomasa y/o mayor contenido de azúcar de las remolachas.

La invención también se extiende a las partes cosechables de una planta tales como, pero sin limitación, semillas, hojas, frutos, flores, tallos, raíces, rizomas, tubérculos y bulbos, cuyas partes cosechables comprenden un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido tipo CLE 2. La invención además se refiere a productos derivados o producidos, preferentemente, derivados o producidos directamente, de una parte cosechable de dicha planta, tal como pellets secos o polvos, aceite, grasa y ácidos grasos, almidón o proteínas.

La presente invención también abarca el uso de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos tipo CLE 2, como se describen en la presente, y el uso de estos polipéptidos tipo CLE 2 para mejorar cualquiera de los rasgos relacionados con el rendimiento antes mencionados en plantas. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido tipo CLE 2, como se describe en la presente, o los mismos polipéptidos tipo CLE 2, se pueden usar en programas de reproducción, en donde se identifica un marcador de ADN que se puede ligar genéticamente a un gen que codifica un polipéptido tipo CLE 2. Para definir un marcador molecular se pueden usar ácidos nucleicos/genes o los mismos polipéptidos tipo CLE 2. Este marcador de ADN o proteína luego se puede usar en programas de reproducción para seleccionar plantas que tienen mejores rasgos relacionados con el rendimiento, como se definió anteriormente en los métodos de la invención Además, las variantes alélicas de un ácido nucleico/gen que codifica un polipéptido tipo CLE 2 pueden ser útiles en los programas de reproducción asistidos por marcador. Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos tipo CLE 2 también se pueden usar como sondas para mapear de forma genética y física los genes de los cuales son parte, y como marcadores para los rasgos ligados a esos genes. Dicha información puede ser útil para la reproducción de plantas a fin de desarrollar líneas con los fenotipos deseados.

Polipéptido inhibidor de Bax 1 (BI-1) Sorprendentemente, ahora se ha descubierto que modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido inhibidor de Bax 1 (BI-1) o un polipéptido, como se define en la presente, o un homólogo de éste, como se provee en la presente, produce plantas que tienen mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control.

De acuerdo con una primera forma de realización, la presente invención provee un método para mejorar rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, con respecto a plantas de control, que comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido inhibidor de Bax 1 (BI-1), como se provee en la presente, o un homólogo de éste, como se provee en la presente, y, opcionalmente, seleccionar plantas que tienen mejores rasgos relacionados con el rendimiento. Preferentemente, se provee un método para mejorar rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, con respecto a las plantas de control, que comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido inhibidor de Bax 1 (BI-1) o un homólogo de éste, en donde dicho polipéptido BI-1 o un homólogo de éste comprende un dominio relacionado con un inhibidor Bax.

Un método preferido para modular la expresión y, preferentemente, para aumentar la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido inhibidor de Bax (BI-1 ), como se provee en la presente, o un homólogo de éste, como se provee en la presente, es mediante la introducción y expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido inhibidor de Bax 1 (BI-1) o dicho homólogo.

En una forma de realización, se provee un método en donde dichos mejores rasgos relacionados con el rendimiento comprenden mayor rendimiento, con respecto a las plantas de control, y, preferentemente, comprenden mayor rendimiento de semillas y/o mayor biomasa, con respecto a las plantas de control.

En una forma de realización, se provee un método en donde dichos mejores rasgos relacionados con el rendimiento se obtienen en condiciones sin estrés.

En otra forma de realización, se provee un método en donde dichos mejores rasgos relacionados con el rendimiento se obtienen en condiciones de estrés osmótico, tal como, por ejemplo, estrés por sequía, estrés por frío y/o estrés salino, o en condiciones de deficiencia de nitrógeno.

Cualquier referencia de aquí en adelante a una "proteína útil en los métodos de la invención" significa un polipéptido inhibidor de Bax 1 (BI-1 ), como se define en la presente, o un homólogo de éste, como se define en la presente. Cualquier referencia de aquí en adelante a un "ácido nucleico útil en los métodos de la invención" significa un ácido nucleico capaz de codificar dicho polipéptido inhibidor de Bax 1 (BI-1 ) o un homólogo de éste. El ácido nucleico que se desea introducir en una planta, y, por lo tanto, útil para realizar los métodos de la invención, es cualquier ácido nucleico que codifica el tipo de proteína que se describirá a continuación, en adelante también denominado "ácido nucleico inhibidor de Bax- o "ácido nucleico BI-1" o "gen inhibidor de Bax- o "gen Bl-1".

Como se define en la presente, un "polipéptido inhibidor de Bax o "polipéptido BI-1" se refiere a una proteína conservada en términos evolutivos que contiene múltiples segmentos que abarcan membranas y se ubica predominantemente en las membranas intracelulares. Más en particular, las proteínas inhibidoras de Bax 1 (BI-1 ) son proteínas que abarcan membranas con 6 a 7 dominios transmembranales y un extremo del terminal C citoplasmático en el retículo endoplasmático (E ) y en la envoltura nuclear. Se las describió previamente como reguladoras de las vías de la muerte celular. Como se usa en la presente, el término "polipéptido inhibidor de Bax 1" o "polipéptido BI-1" también pretende incluir homólogos, como se definen en la presente, de "polipéptidos inhibidores de Bax 1".

En una forma de realización preferida, un polipéptido inhibidor de Bax 1 (BI-1 ), como se aplica en la presente, comprende un dominio relacionado con el inhibidor de Bax. En una forma de realización preferida, el dominio relacionado con el inhibidor de Bax corresponde a Pfam PF01027.

Los términos "dominio", "característica" y "motivo" son como se definen en la sección "definiciones" de la presente.

En una forma de realización preferida, el polipéptido BI-1 comprende uno o más de los siguientes motivos: i) Motivo 3a: [DN]TQxxxE[KR][AC]xxGxxDY[VIL]xx[STA] (SEQ ID NO: 131 ). Preferentemente, el motivo es DTQ[ED]IIE[KR]AH[LH]GD[LRM]DY[VI]KH[SA] (motivo 3b; SEQ ID NO: 132). ii) Motivo 4a: xxxxxlSPx[VS]xx[HYR][LI][QRK]xrVFN][YN]xx[^ (SEQ ID NO: 133). Preferentemente, el motivo es KNFRQISP[AV]VQ[TNS]HLK[LRQ]VYL[TS]L (motivo 4b; SEQ ID NO: 134); iii) Motivo 5a: FxxFxxAxxxxxRRxx[LMF][YF][LH]x (SEQ ID NO: 135).

Preferentemente, el motivo es F[GA]CFS[AG]AA[ML][LV]A[RK]RREYLYLG (motivo 5b; SEQ ID NO: 136).

En una forma de realización preferido, el polipéptido BI-1 comprende también uno o más de los siguientes motivos: ¡) Motivo 6a: DTQxl[VI] E[KR]AHxG DxDYVKHx (SEQ ID NO: 137).

Preferentemente, el motivo es: DTQ[ED]IIE[KR]AH[LF]GD[LR]DYVKHA (motivo 6b; SEQ ID NO:138); ¡i) Motivo 7a: x[QE]ISPxVQxHLK[QK]VY[FL]xLC[FC] (SEQ ID NO: 139).

Preferentemente, el motivo es: [RH]QISP[VL]VQ[TN]HLKQVYL[TS]LCC (motivo 7b; SEQ ID NO: 140); iii) Motivo 8a: F[AG]CF[SP][AG]AA[ML][VL][AG]RRREYLYL[AG]G (SEQ ID NO: 141 ). Preferentemente, el motivo es: F[GA]CFS[AG]AA[ML][VL]ARRREYLYLGG (motivo 8b; SEQ ID NO: 142); iv) Motivo 9: [IF]E[VL]Y[FL]GLL[VL]F[VM]GY[VIM][IV][VYF] (SEQ ID NO: 143); v) Motivo 10: [MFL][LV]SSG[VLI]SxLxW[LV][HQ][FL]ASxlFGG (SEQ ID NO: 144); vi) Motivo 11 : H[ILV][LIM][FLW][NH][VI]GG[FTL]LT[A^x[GA]xx[GA]xxxW[LM][LM] (SEQ ID NO: 145); vii) Motivo 12: Rx[AS [LI]L[ML][GAV]xx[LVF][FL][EKQ]GA[STY]IGPL[IV] (SEQ ID NO: 146); Estos motivos adicionales 6 a 12 están presentes, esencialmente, en los polipéptidos BI-1 del grupo de polipéptidos RA BI-1 , como se describe en la presente.

Aún en otra forma de realización preferido, el polipéptido BI-1 comprende también uno o más de los siguientes motivos: i) Motivo 13a: DTQx[IVM][IV]E[KR][AC]xxGxxDxx[KRQ]Hx (SEQ ID NO: 147). Preferentemente, el motivo es: DTQEIIE[RK]AH[HL]GDMDY[IV]KH[AS] (motivo 13b; SEQ ID NO: 148); ii) Motivo 14: E[LV ]Y[GLF]GLx[VLI]rVF]xGY[MVI][LVI]x (SEQ ID NO: 149); ¡ii) Motivo 15: KN[FL]RQISPAVQ[SN]HLK[RL]VYLT (SEQ ID NO: 150); iv) Motivo 16a: Fx[CS]F[S?xA[AS]xx[AS]xRR[ESH][YFW]x[FY][LH][GS][GA]xL (SEQ ID NO: 151 ). Preferentemente, el motivo es: F[AGV]CF[ST][GCA]AA[ILM][LVI]A [KR]RREYL[YF]LG (motivo 16b; SEQ ID NO: 152) Estos motivos adicionales 11 a 14 están presentes, esencialmente, en los polipéptidos BI-1 del grupo de polipéptidos EC/BI-1 , como se describe en la presente.

Los motivos 3b, 4b, 5b, 6a, 7b, 8b, 13b, 15 y 16b, antes indicados, se derivaron con el algoritmo MEME (Bailey and Elkan, Proceedings of the Second International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, pp. 28-36, AAAI Press, Menlo Park, California, 1994). En cada posición dentro de un motivo MEME, se muestran los residuos que están presentes en el conjunto de incógnitas de secuencias con una frecuencia mayor de 0,2. Los otros motivos antes indicados se derivaron, esencialmente, sobre la base del alineamiento de secuencias. Los residuos entre corchetes representan alternativas.

En una forma de realización preferida, un polipéptido BI-1 , como se aplica en la presente, comprende, en orden creciente de preferencia, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9 o los 10 motivos seleccionados del grupo que comprende los motivos 3a, 4a, 5a, 6a, 7a, 8a, 9, 10, 11 y 12, como se indicaron anteriormente. De modo alternativo o adicional, en otra forma de realización preferida, un polipéptido BI-1 , como se aplica en la presente, comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5 o los 6 motivos seleccionados del grupo que comprende los motivos 3b, 4b, 5b, 6b, 7b y 8b, como se indicaron anteriormente.

En otra forma de realización preferida, un polipéptido BI-1 , como se aplica en la presente, comprende, en orden creciente de preferencia, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6 o los 7 motivos seleccionados del grupo que comprende los motivos 3a, 4a, 5a, 13a, 14, 15 y 16a, como se indicaron anteriormente. De modo alternativo o adicional, en otra forma de realización, un polipéptido BI-1 , como se aplica en la presente, comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4 o los 5 motivos seleccionados del grupo que comprende los motivos 3b, 4b, 5b, 13b y 16b, como se indicaron anteriormente.

De manera adicional o alternativa, el homólogo de una proteína relacionada con el rendimiento tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31 %, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41 %, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia total con el aminoácido representado por SEQ ID NO: 30, siempre que la proteína homologa comprenda uno o más de los motivos 3 a 5 conservados, como se indicó anteriormente. La identidad de secuencia total se determina con un algoritmo de alineamiento global, tal como el algoritmo de Needleman Wunsch en el programa GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), preferentemente, con parámetros predeterminados y, preferentemente, con secuencias de proteínas maduras (es decir, sin considerar las señales de secreción o los péptidos de tránsito). En comparación con la identidad de secuencia total, la identidad de secuencia generalmente será mayor cuando sólo se consideren dominios o motivos conservados. Preferentemente, los motivos en un polipéptido BI-1 tienen, en orden creciente de preferencia, al menos 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%. 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con uno o más de los motivos representados por SEQ ID NO: 131 a SEQ ID NO: 136 (Motivos 3a, 3b, 4a, 4b, 5a y 5b).

Los análisis filogenéticos dieron como resultado el establecimiento de un árbol filogenético que muestra dos grupos de proteínas relacionadas con BI-1 (Figura 8): El primer grupo comprende BI-1 de plantas de semillas, que incluyen monocotiledóneas y dicotiledóneas, y plantas que no son de semillas, que incluyen heléchos y musgos. Los miembros de este grupo parecen estar conservados en términos evolutivos, y es posible que se originen de un ancestro común. En la presente, este grupo también se denomina grupo EC/BI-1 o el grupo de polipéptidos BI-1 conservados en términos evolutivos. Un análisis filogenético separado mostró que comparten un ancestro común con la levadura y las bacterias, lo cual sugiere un origen en común.

El segundo grupo comprende proteínas BI-1 que son más específicas de dos grandes grupos de eudicotiledóneas: Asteridae y Rosidae. En la presente, este grupo también se denomina grupo RA/BI-1 o grupo de polipéptidos BI-1 relacionados con Rosid y Asterid (RA). Cabe destacar que algunas especies de este grupo experimentaron duplicación de su genoma durante la evolución, por ejemplo, Glycine max y Populus trichocarpa, que puede estar en el origen de un grupo específico de proteínas relacionadas con BI-1.

En una forma de realización, la secuencia de polipéptidos que, cuando se usa en la construcción de un árbol filogenético, tal como el que se representa en la Figura 8, se agrupa con el grupo de polipéptidos Rosid y Asterid (RA)/BI-1 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 30, en lugar de con cualquier otro grupo.

En otra forma de realización, la secuencia de polipéptidos que, cuando se usa en la construcción de un árbol filogenético, tal como el que se representa en la Figura 8, se agrupa con el grupo de polipéptidos conservados en términos evolutivos (EC)/BI-1 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 37, en lugar de con cualquier otro grupo.

En una forma de realización preferida, la presente invención provee un método para mejorar rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, con respecto a plantas de control, que comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido BI-1 correspondiente a SEQ ID NO: 34 y 35.

En otra forma de realización, la presente invención provee un método para mejorar rasgos relacionados con el rendimiento en plantas con respecto a plantas de control, que comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido BI-1 correspondiente a SEQ ID NO: 32.

Además, los polipéptidos BI-1 (al menos en su forma natural) se describieron como reguladores de la muerte celular programada, más en particular, como moduladores de la muerte celular programada mediada por estrés del ER, y aún más en particular, son capaces de suprimir la muerte celular inducida por Bax en levadura o en cultivos celulares, por ejemplo, como se describe en Chae et al. (2009, Gene 323, 101-13. Los polipéptidos BI-1 también muestran menor sensibilidad al tratamiento con Tunicamycin (Watanabe and Lam, 2007, J. Biol. Chem. 283(6):3200-10). También se demostró que los polipéptidos BI-1 interactúan con AtCb5 (Nagano et al. 2009). Las técnicas y herramientas para medir la actividad de reguladores de la muerte celular programada, tales como proteínas BI-1 , son muy conocidas en el arte. Un ejemplo de éstas se provee en el Ejemplo 1 .

Además, los polipéptidos BI-1 , cuando se expresan en el arroz de acuerdo con los métodos de la presente invención como se indica en los Ejemplos 15, 16, 17 y 19, producen plantas que tienen rasgos aumentados relacionados con el rendimiento, en particular, mayor rendimiento de semillas y/o mayor biomasa. Los polipéptidos BI-1 , cuando se expresan en Arabidopsis de acuerdo con los métodos de la presente invención como se indica en el Ejemplo 20, producen plantas que tienen rasgos aumentados relacionados con el rendimiento, en particular, mayor biomasa.

En una forma de realización, la presente invención se ilustra mediante la transformación de plantas con la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEQ ID NO: 29 que codifica la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 30. En otra forma de realización, la presente invención se ilustra mediante la transformación de plantas con la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEQ ID NO: 31 que codifica la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 32. Sin embargo, la realización de la invención no se restringe a estas secuencias; los métodos de la invención se pueden realizar ventajosamente mediante el uso de cualquier ácido nucleico que codifica BI-1 o un polipéptido BI-1 , como se define en la presente.

En la Tabla C de la sección de Ejemplos de la presente, se brindan otros ejemplos de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos BI-1. Dichos ácidos nucleicos son útiles en la realización de los métodos de la invención. Las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla C de la sección de Ejemplos son secuencias ejemplares de ortólogos y parálogos del polipéptido BI-1 representado por SEQ ID NO: 30, los términos "ortólogos" y "parálogos" son como se definen en la presente. Otros ortólogos y parálogos se pueden identificar fácilmente mediante la realización de la denominada búsqueda blast recíproca, como se describe en la sección de definiciones; en donde la secuencia incógnita es SEQ ID NO: 29 o SEQ ID NO: 30, el segundo BLAST (retro-BLAST) sería contra secuencias de álamo.

La invención también provee ácidos nucleicos que codifican BI-1 y polipéptidos Bl-1 desconocidos hasta el momento, útiles para conferir mejores rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, con respecto a las plantas de control.

De acuerdo con otra forma de realización de la presente invención, se provee una molécula de ácido nucleico aislada seleccionada de: i) un ácido nucleico representado por SEQ ID NO: 43; ii) el complemento de un ácido nucleico representado por SEQ ID NO: 43; ¡ii) un ácido nucleico que codifica un polipéptido BI-1 que tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 44, y de manera adicional o alternativa, que comprende uno o más motivos que tienen, en orden creciente de preferencia, al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con uno o más de los motivos indicados en SEQ ID NO: 131 a SEQ ID NO: 136 (motivos 3a, 3b, 4a, 4b, 5a y 5b) y, con mayor preferencia, que confiere mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control. ¡v) una molécula de ácido nucleico que se híbrida con una molécula de ácido nucleico de (i) a (iii) en condiciones de hibridación muy rigurosa y, preferentemente, confiere mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control.

De acuerdo con otra forma de realización de la presente invención, también se provee un polipéptido aislado seleccionado de: i) una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 44; ii) una secuencia de aminoácidos que tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 44, y de manera adicional o alternativa, que comprende uno o más motivos que tienen, en orden creciente de preferencia, al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con uno o más de los motivos indicados en SEQ ID NO: 131 a SEQ ID NO: 136 (motivos 3a, 3b, 4a, 4b, 5a y 5b) y, con mayor preferencia, que confiere mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control; iii) Derivados de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en (i) o (ii) anteriores.

De acuerdo con aún otra forma de realización de la presente invención, se provee molécula de ácido nucleico aislada seleccionada de: i) un ácido nucleico representado por SEQ ID NO: 89; ii) el complemento de un ácido nucleico representado por SEQ ID NO: 89; iii) un ácido nucleico que codifica un polipéptido BI-1 que tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 90, y de manera adicional o alternativa, que comprende uno o más motivos que tienen, en orden creciente de preferencia, al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con uno o más de los motivos indicados en SEQ ID NO: 131 a SEQ ID NO: 136 (motivos 3a, 3b, 4a, 4b, 5a y 5b) y, con mayor preferencia, que confiere mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control. iv) una molécula de ácido nucleico que se híbrida con una molécula de ácido nucleico de (i) a (iii) en condiciones de hibridación muy rigurosa y, preferentemente, confiere mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control.

De acuerdo con aún otra forma de realización de la presente invención, también se provee un polipéptido aislado seleccionado de: i) una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 90; i¡) una secuencia de aminoácidos que tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 90, y de manera adicional o alternativa, que comprende uno o más motivos que tienen, en orden creciente de preferencia, al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%. 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con uno o más de los motivos indicados en SEQ ID NO: 131 a SEQ ID NO: 136 (motivos 3a, 3b, 4a, 4b, 5a y 5b) y, con mayor preferencia, que confiere mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control; iii) Derivados de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en (i) o (ii) anteriores.

Las variantes de ácidos nucleicos también pueden ser útiles para poner en práctica los métodos de la invención. Los ejemplos de dichas variantes incluyen ácidos nucleicos que codifican homólogos y derivados de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las Tabla C de la sección de Ejemplos, en donde los términos "homólogo" y "derivado" son como se definen en la presente. También son útiles en los métodos de la invención los ácidos nucleicos que codifican homólogos y derivados de ortólogos o parálogos de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla C de la sección de Ejemplos. Los homólogos y derivados útiles en los métodos de la presente invención tienen sustancialmente la misma actividad biológica y funcional que la proteína no modificada de la cual derivan. Otras variantes útiles para poner en práctica los métodos de la invención son las variantes en las cuales se optimiza el uso del codón o en las cuales se retiran los sitios blanco de miARN.

Otras variantes de ácidos nucleicos útiles para poner en práctica los métodos de la invención incluyen porciones de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos BI-1 , ácidos nucleicos que se hibridan con ácidos nucleicos que codifican poiipéptidos BI-1 , variantes de empalme de ácidos nucleicos que codifican poiipéptidos BI-1 , variantes alélicas de ácidos nucleicos que codifican poiipéptidos BI-1 y variantes de ácidos nucleicos que codifican poiipéptidos BI-1 obtenidos por transposición génica. Los términos secuencia de hibridación, variante de empalme, variante alélica y transposición génica son como se describen en la presente.

Los ácidos nucleicos que codifican poiipéptidos BI-1 no necesitan ser ácidos nucleicos de longitud completa, ya que la realización de los métodos de la invención no depende del uso de secuencias de ácidos nucleicos de longitud completa. De acuerdo con la presente invención, se provee un método para mejorar rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, que comprende introducir y expresar en una planta una porción de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en la Tabla C de la sección de Ejemplos, o una porción de un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla C de la sección de Ejemplos.

Las porciones útiles en los métodos de la invención codifican un polipéptido BI-1 como se define en la presente y tienen sustancialmente la misma actividad biológica que las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla C de la sección de Ejemplos. Preferentemente, la porción es una porción de cualquiera de los ácidos nucleicos indicados en la Tabla C de la sección de Ejemplos, o es una porción de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla C de la sección de Ejemplos. Preferentemente, la porción tiene al menos 650, 700, 750, 800, 850 900 nucleótidos consecutivos de longitud, en donde los nucleótidos consecutivos son cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en la Tabla C de la sección de Ejemplos, o de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla C de la sección de Ejemplos.

En una forma de realización preferida, la porción es una porción del ácido nucleico de SEQ ID NO: 29. Preferentemente, la porción codifica un fragmento de una secuencia de aminoácidos que, cuando se usa en la construcción de un árbol filogenético, tal como el que se representa en la Figura 8, se agrupa con el grupo de polipéptidos RA/BI-1 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 30, en lugar de con cualquier otro grupo y/o comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9 o los 10 motivos seleccionados del grupo que comprende los motivos 3a, 4a, 5a, 6a, 7a, 8a, 9, 10, 11 y 12, como se indicaron anteriormente, y/o comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5 o los 6 motivos seleccionados del grupo que comprende los motivos 3b, 4b, 5b, 6b, 7b y 8b, como se indicación anteriormente.

En otra forma de realización preferida, la porción es una porción del ácido nucleico de SEQ ID NO: 31. Preferentemente, la porción codifica un fragmento de una secuencia de aminoácidos que, cuando se usa en la construcción de un árbol filogenético, tal como el que se representa en la Figura 8, se agrupa con el grupo de polipéptidos EC/BI-1 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 32, en lugar de con cualquier otro grupo y/o comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6 o los 7 motivos seleccionados del grupo que comprende los motivos 3a, 4a, 5a, 13a, 14, 15 y 16a, como se indicaron anteriormente, y/o comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4 o los 5 motivos seleccionados del grupo que comprende los motivos 3b, 4b, 5b, 13b y 16b, como se indicaron anteriormente.

Otra variante de ácido nucleico útil en los métodos de la invención es un ácido nucleico capaz de hibridarse, en condiciones de rigurosidad reducida, preferentemente en condiciones de rigurosidad, con un ácido nucleico que codifica un polipéptido PI-1 , como se define en la presente, o con una porción como se define en la presente.

De acuerdo con la presente invención, se provee un método para mejorar los rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, que comprende introducir y expresar en una planta un ácido nucleico capaz de hibridarse con cualquiera de los ácidos nucleicos indicados en la Tabla C de la sección de Ejemplos, o que comprende introducir y expresar en una planta un ácido nucleico capaz de hibridarse con un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en la Tabla C de la sección de Ejemplos.

Las secuencias de hibridación útiles en los métodos de la invención codifican un polipéptido BI-1 , como se define en la presente, y tienen sustancialmente la misma actividad biológica que las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla C de la sección de Ejemplos. Preferentemente, la secuencia de hibridación es capaz de hibridarse con el complemento de cualquiera de los ácidos nucleicos indicados en la Tabla C de la sección de Ejemplos, o con una porción de cualquiera de estas secuencias, en donde una porción es como se definió con anterioridad, o la secuencia de hibridación es capaz de hibridarse con el complemento de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla C de la sección de Ejemplos. Con máxima preferencia, la secuencia de hibridación es capaz de hibridarse con el complemento de un ácido nucleico representado por SEQ ID NO: 29 o con una porción de éste. En otra forma de realización preferida, la secuencia de hibridación es capaz de hibridarse con el complemento de un ácido nucleico representado por SEQ ID NO: 31 o con una porción de éste.

Preferentemente, la secuencia de hibridación codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que, cuando tiene longitud total y se usa en la construcción de un árbol filogenético, tal como el que se representa en la Figura 8, se agrupa con el grupo de polipéptidos RA/BI-1 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 30, en lugar de con cualquier otro grupo y/o comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9 o los 10 motivos seleccionados del grupo que comprende los motivos 3a, 4a, 5a, 6a, 7a, 8a, 9, 10, 1 1 y 12, como se indicaron anteriormente, y/o comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5 o los 6 motivos seleccionados del grupo que comprende los motivos 3b, 4b, 5b, 6b, 7b y 8b, como se indicaron anteriormente.

En otra forma de realización preferida, la secuencia de hibridación codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que, cuando tiene longitud total y se usa en la construcción de un árbol filogenético, tal como el que se representa en la Figura 8, se agrupa con el grupo de polipéptidos EC/BI-1 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 32, en lugar de con cualquier otro grupo y/o comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6 o los 7 motivos seleccionados del grupo que comprende los motivos 3a, 4a, 5a, 13a, 14, 15 y 16a, como se indicaron anteriormente, y/o comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4 o los 5 motivos seleccionados del grupo que comprende los motivos 3b, 4b, 5b, 13b y 16b, como se indicaron anteriormente.

Otra variante de ácido nucleico útil en los métodos de la invención es una variante de empalme que codifica un polipéptido BI-1 , como se definió con anterioridad; una variante de empalme es como se define en la presente.

De acuerdo con la presente invención, se provee un método para mejorar rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, que comprende introducir y expresar en una planta una variante de empalme de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en la Tabla C de la sección de Ejemplos, o una variante de empalme de un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla C de la sección de Ejemplos.

En una forma de realización, las variantes de empalme preferidas son las variantes de empalme de un ácido nucleico representado por SEQ ID NO: 29, o una variante de empalme de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de SEQ ID NO: 30. Preferentemente, la secuencia de aminoácidos codificada por la variante de empalme, cuando se usa en la construcción de un árbol filogenético, tal como el que se representa en la Figura 8, se agrupa con el grupo de polipéptidos RA/BI-1 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 30, en lugar de con cualquier otro grupo y/o comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9 o los 10 motivos seleccionados del grupo que comprende los motivos 3a, 4a, 5a, 6a, 7a, 8a, 9, 10, 11 y 12, como se indicaron anteriormente, y/o comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5 o los 6 motivos seleccionados del grupo que comprende los motivos 3b, 4b, 5b, 6b, 7b y 8b, como se indicaron anteriormente.

En otra forma de realización, las variantes de empalme preferidas son las variantes de empalme de un ácido nucleico representado por SEQ ID NO: 31 , o una variante de empalme de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de SEQ ID NO: 32. Preferentemente, la secuencia de aminoácidos codificada por la variante de empalme, cuando se usa en la construcción de un árbol filogenético, tal como el que se representa en la Figura 8, se agrupa con el grupo de polipéptidos EC/BI-1 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 32, en lugar de con cualquier otro grupo y/o comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6 o los 7 motivos seleccionados del grupo que comprende los motivos 3a, 4a, 5a, 13a, 14, 15 y 16a, como se indicaron anteriormente, y/o comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4 o los 5 motivos seleccionados del grupo que comprende los motivos 3b, 4b, 5b, 13b y 16b, como se indicaron anteriormente.

Otra variante de ácido nucleico útil para realizar los métodos de la invención es una variante alélica de un ácido nucleico que codifica un polipéptido BI-1 , como se definió anteriormente en la presente; una variante de alélica es como se define en la presente.

De acuerdo con la presente invención, se provee un método para mejorar los rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, que comprende introducir y expresar en una planta una variante alélica de cualquiera de los ácidos nucleicos indicados en la Tabla C de la sección de Ejemplos, o que comprende introducir y expresar en una planta una variante alélica de un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla C de la sección de Ejemplos.

Los polipéptidos codificados por las variantes alélicas útiles en los métodos de la presente invención tienen sustancialmente la misma actividad biológica que el polipéptido BI-1 de SEQ ID NO: 30 y cualquiera de los aminoácidos representados en la Tabla C de la sección de Ejemplos. Las variantes alélicas existen en la naturaleza, y el uso de estos alelos naturales está comprendido en los métodos de la presente invención. Preferentemente, la variante alélica es una variante alélica de SEQ ID NO: 29, o una variante alélica de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de SEQ ID NO: 30. Preferentemente, la secuencia de aminoácidos codificada por la variante alélica, cuando se usa en la construcción de un árbol filogenético, tal como el que se representa en la Figura 8, se agrupa con el grupo de polipéptidos RA/BI-1 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 30, en lugar de con cualquier otro grupo y/o comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9 o los 10 motivos seleccionados del grupo que comprende los motivos 3a, 4a, 5a, 6a, 7a, 8a, 9, 10, 11 y 12, como se indicaron anteriormente, y/o comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5 o los 6 motivos seleccionados del grupo que comprende los motivos 3b, 4b, 5b, 6b, 7b y 8b, como se indicaron anteriormente.

En otra forma de realización preferida, la variante alélica es una variante alélica de SEQ ID NO: 31 , o una variante alélica de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de SEQ ID NO: 32. Preferentemente, la secuencia de aminoácidos codificada por la variante alélica, cuando se usa en la construcción de un árbol filogenético, tal como el que se representa en la Figura 8, se agrupa con el grupo de polipéptidos EC/BI-1 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 32, en lugar de con cualquier otro grupo y/o comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6 o los 7 motivos seleccionados del grupo que comprende los motivos 3a, 4a, 5a, 13a, 14, 15 y 16a, como se indicaron anteriormente, y/o comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4 o los 5 motivos seleccionados del grupo que comprende los motivos 3b, 4b, 5b, 13b y 16b, como se indicaron anteriormente.

También se puede usar transposición génica o evolución dirigida para generar variantes de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos BI-1 , como se definieron anteriormente; el término "transposición génica" es como se define en la presente.

De acuerdo con la presente invención, se provee un método para mejorar los rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, que comprende introducir y expresar en una planta una variante de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en la Tabla C de la sección de Ejemplos, o que comprende introducir y expresar en una planta una variante de un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla C de la sección de Ejemplos, en donde la variante de ácido nucleico se obtiene mediante transposición génica.

Preferentemente, la secuencia de aminoácidos codificada por la variante de ácido nucleico que se obtiene por transposición génica, cuando se usa en la construcción de un árbol filogenético, tal como el que se representa en la Figura 8, se agrupa con el grupo de polipéptidos RA/BI-1 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 30, en lugar de con cualquier otro grupo y/o comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9 o los 10 motivos seleccionados del grupo que comprende los motivos 3a, 4a, 5a, 6a, 7a, 8a, 9, 10, 11 y 12, como se indicaron anteriormente, y/o comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5 o los 6 motivos seleccionados del grupo que comprende los motivos 3b, 4b, 5b, 6b, 7b y 8b, como se indicaron anteriormente.

En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos codificada por la variante de ácido nucleico que se obtiene por transposición génica, cuando se usa en la construcción de un árbol filogenético, tal como el que se representa en la Figura 8, se agrupa con el grupo de polipéptidos EC/BI-1 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 32, en lugar de con cualquier otro grupo y/o comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6 o los 7 motivos seleccionados del grupo que comprende los motivos 3a, 4a, 5a, 13a, 14, 15 y 16a, como se indicaron anteriormente, y/o comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4 o los 5 motivos seleccionados del grupo que comprende los motivos 3b, 4b, 5b, 13b y 16b, como se indicaron anteriormente.

Además, las variantes de ácidos nucleicos también se pueden obtener mediante mutagénesis dirigida a sitio. Hay varios métodos disponibles para lograr la mutagénesis dirigida a sitio, en donde los más comunes son los métodos basados en PCR (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Eds.).

Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos BI-1 pueden derivar de cualquier fuente natural o artificial. El ácido nucleico se puede modificar de su forma nativa en composición y/o ambiente genómico mediante manipulación humana deliberada. En una forma de realización, dicho ácido nucleico que codifica un polipéptido BI-1 o un homólogo de éste es, preferentemente, de origen vegetal.

En una forma de realización, dicho ácido nucleico que codifica un polipéptido inhibidor de Bax 1 (BI-1) o un homólogo de éste es de una planta dicotiledónea. En un ejemplo, dicho ácido nucleico que codifica un polipéptido inhibidor de Bax 1 (BI-1 ) o un homólogo de éste es de la familia Brassicaceae, con mayor preferencia, del género Arabidopsis, con máxima preferencia, de Arabidopsis thaliana. En otro ejemplo, dicho ácido nucleico que codifica un polipéptido inhibidor de Bax 1 (BI-1 ) o un homólogo de éste es de la familia Salicaceae, con mayor preferencia, del género Populus, con máxima preferencia, de Populus trichocarpa.

En otra forma de realización, dicho ácido nucleico que codifica un polipéptido inhibidor de Bax 1 (BI-1 ) o un homólogo de éste es de una planta monocotiledónea, preferentemente, de la familia Poaceae, con mayor preferencia, del género Oryza, con máxima preferencia, de Oryza sativa.

Por lo tanto, en una forma de realización preferida de la presente invención, se proveen plantas que tienen mejores rasgos relacionados con el rendimiento, en donde dichos mejores rasgos relacionados con el rendimiento comprenden mayor rendimiento, con respecto a las plantas de control. Preferentemente, dicho mayor rendimiento, en comparación con las plantas de control de la invención, comprende parámetros seleccionados del grupo que comprende mayor rendimiento de semillas y/o mayor biomasa. En una forma de realización, la referencia en la presente a "mejores rasgos relacionados con el rendimiento" significa un aumento de rendimiento, que incluye aumento del rendimiento de semillas y lo aumento de biomasa (peso) de una o más partes de una planta, que pueden incluir partes aéreas (cosechables) y/o partes subterráneas (cosechables). En particular, dichas partes cosechables comprenden semillas o son semillas, y la realización de los métodos de la invención da como resultado plantas que tienen mayor rendimiento de semillas, con respecto al rendimiento de semillas de las plantas de control.

La presente invención provee un método para aumentar rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control, y, en especial, para aumentar el rendimiento, con respecto a las plantas de control y, más en particular, para aumentar el rendimiento de semillas y/o aumentar la biomasa, con respecto a las plantas de control, cuyo método comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido BI-1 como se define en la presente.

De acuerdo con otra característica preferida de la presente invención, la realización de los métodos de la invención genera plantas que tienen una mayor tasa de crecimiento, con respecto a las plantas de control. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se provee un método para aumentar la tasa de crecimiento de las plantas, cuyo método comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido BI-1 , como se define en la presente.

La realización de los métodos de la invención le brinda plantas que se cultivan en condiciones sin estrés o en condiciones de estrés, tales como en condiciones de sequía leve, mayor rendimiento con respecto a las plantas de control cultivadas en condiciones comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se provee un método para aumentar el rendimiento en las plantas cultivadas en condiciones sin estrés o en condiciones de estrés, tales como en condiciones de sequía leve, cuyo método comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido BI-1 , como se define en la presente.

La realización de los métodos de la invención le brinda a las plantas cultivadas en condiciones de deficiencia de nutrientes, en particular en condiciones de deficiencia de nitrógeno, mayor rendimiento con respecto a las plantas de control cultivadas en condiciones comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se provee un método para aumentar el rendimiento en las plantas cultivadas en condiciones de deficiencia de nutrientes, cuyo método comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido BI-1 , como se define en la presente.

La realización de los métodos de la invención le brinda a las plantas cultivadas en condiciones de estrés salino mayor rendimiento con respecto a las plantas de control cultivadas en condiciones comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se provee un método para aumentar el rendimiento en las plantas cultivadas en condiciones de estrés salino, cuyo método comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido BI-1 , como se define en la presente.

La invención también provee constructos genéticos y vectores para facilitar la introducción y/o expresión en plantas de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos BI-1 , como se definen en la presente. Los constructos génicos se pueden insertar en vectores, que pueden estar disponibles en el comercio, adecuados para la transformación en plantas y para la expresión del gen de interés en las células trasformadas. La invención también provee el uso de un constructo génico, como se define en la presente en los métodos de la invención.

Más específicamente, la presente invención provee un constructo que comprende: (a) un ácido nucleico que codifica un polipéptido BI-1 , como se definió anteriormente; (b) una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos de (a); y opcionalmente (c) una secuencia de terminación de la transcripción.

Preferentemente, el ácido nucleico que codifica un polipéptido BI-1 es como se definió anteriormente; Los términos "secuencia de control" y "secuencia de terminación" son como se definen en la presente.

La invención además provee plantas transformadas con un constructo tal como se define anteriormente. En particular, la invención provee plantas transformadas con un constructo tal como se definió anteriormente, cuyas plantas tienen rasgos aumentados relacionados con el rendimiento como se definió en la presente.

De forma ventajosa, se puede utilizar cualquier tipo de promotor, ya sea natural o sintético, para dirigir la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos, pero preferentemente, el promotor es de origen vegetal. Un promotor constitutivo es particularmente útil en los métodos. Preferentemente, el promotor constitutivo es un promotor constitutivo ubicuo. En una forma de realización preferida, el promotor constitutivo es un promotor constitutivo ubicuo de intensidad media. Véase la sección "Definiciones" de la presente para las definiciones de los diversos tipos de promotores.

Debe quedar claro que la aplicabilidad de la presente invención no se restringe al ácido nucleico que codifica un polipéptido BI-1 , representado por SEQ ID NO: 29, ni a la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido BI-1 cuando es dirigido por un promotor constitutivo. Véase la sección "Definiciones" de la presente para más ejemplos de promotores constitutivos.

Preferentemente, el promotor constitutivo es un promotor de intensidad media. Con mayor preferencia, es un promotor derivado de plantas, tal como un promotor GOS2 o un promotor que tiene sustancialmente la misma intensidad y el mismo patrón de expresión (un promotor funcionalmente equivalente).

Otro ejemplo de un promotor derivado de plantas que se puede usar de acuerdo con la presente invención es un promotor de ubiquitina, por ejemplo, un promotor derivado del perejil.

En una forma de realización preferida, el promotor es el promotor GOS2 del arroz.

Con mayor preferencia, el promotor constitutivo es representado por una secuencia de ácidos nucleicos sustancialmente similar a SEQ ID NO: 153, con máxima preferencia, el promotor constitutivo es representado por SEQ ID NO: 153.

Opcionalmente, se pueden utilizar una o más secuencias terminadoras en el constructo introducido en una planta.

En una forma de realización preferida, el constructo comprende un cásete de expresión que comprende un promotor GOS2, sustancialmente similar a SEQ ID NO: 153, y el ácido nucleico que codifica el polipéptido BI-1. En otro ejemplo, el constructo comprende un cásete de expresión que comprende un promotor de ubiquitina y el ácido nucleico que codifica el polipéptido BI-1. Además, puede haber una o más secuencias que codifican marcadores seleccionabas en el constructo introducido en una planta.

Como se mencionó anteriormente, un método preferido para modular la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido BI-1 es mediante la introducción y expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido BI-1; sin embargo, los efectos de realizar el método, es decir, mejorar los rasgos relacionados con el rendimiento, también se pueden lograr mediante otras técnicas conocidas, que incluyen, pero sin limitación, rotulado por activación de T-ADN, TILLING, recombinación homologa. En la sección de definiciones se provee una descripción de estas técnicas.

La invención también provee un método para la producción de plantas transgénicas que tienen mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control, que comprende la introducción y expresión en una planta de cualquier ácido nucleico que codifica un polipéptido BI-1, como se definió anteriormente en la presente.

Más específicamente, la presente invención provee un método para la producción de plantas transgénicas que tienen mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control y, con mayor preferencia, mayor rendimiento de semillas y/o mayor biomasa, con respecto a las plantas de control, que comprende: (i) introducir y expresar en una célula vegetal o célula un ácido nucleico que codifica un polipéptido inhibidor de Bax 1, como se define en la presente, o un constructo genético, como se define en la presente, que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido inhibidor de Bax 1 , como se define en la presente; y (ü) cultivar la célula vegetal, o planta en condiciones que promuevan el desarrollo y el crecimiento de la planta.

El ácido nucleico de (i) puede ser cualquiera de los ácidos nucleicos capaces de codificar un polipéptido BI-1 , como se define en la presente.

La presente invención se extiende claramente a cualquier célula vegetal o planta producida mediante cualquiera de los métodos descritos en la presente y a todas las partes de la planta y sus propágulos. La presente invención abarca plantas o sus partes (incluso semillas) que se pueden obtener mediante los métodos de acuerdo con la presente invención. Las plantas o las partes de éstas comprenden un transgén de ácido nucleico que codifica un polipéptido, como se definió anteriormente. La presente invención también abarca la progenie de una célula, tejido, órgano o planta entera primaria transformada o transfectada que fue producida mediante cualquiera de los métodos antes mencionados, en donde el único requisito es que la progenie exhiba la(s) misma(s) característica(s) genotípica(s) y/o fenotípica(s) que la(s) producida(s) por el progenitor en los métodos de acuerdo con la invención.

La invención también incluye células huésped que contienen un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido BI-1 , como se definió anteriormente. Las células huésped preferidas de acuerdo con la invención son células vegetales. Las plantas huésped para los ácidos nucleicos o el vector usado en el método de acuerdo con la invención, el cásete de expresión o constructo o vector son, en principio, ventajosamente, todas las plantas que son capaces de sintetizar los polipéptidos usados en el método de la invención.

En una forma de realización, la presente invención también provee una planta transgénica que tiene mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control, preferentemente, mayor rendimiento, con respecto a las plantas de control y, con mayor preferencia, mayor rendimiento de semillas y/o mayor biomasa, que es el resultado de modular un ácido nucleico que codifica un polipéptido inhibidor de Bax 1 , como se define en la presente, o una célula vegetal transgénica derivada de dicha planta transgénica. En otras palabras, la invención también se refiere a una planta transgénica que tiene mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control, preferentemente, mayor rendimiento, con respecto a las plantas de control y, con mayor preferencia, mayor rendimiento de semillas y/o mayor biomasa, en donde dicha planta transgénica tiene expresión modulada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido inhibidor de Bax 1 , como se define en la presente.

Los métodos de la invención se aplican de manera ventajosa a cualquier planta, en particular, a cualquier planta como se define en la presente. Las plantas que son particularmente útiles en los métodos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas que incluyen forraje o legumbres forrajeras, plantas ornamentales, cultivos alimenticios, árboles o arbustos De acuerdo con una forma de realización de la presente invención, la planta es una planta de cultivo. Los ejemplos de plantas de cultivo incluyen, pero no se limitan a, achicoria, zanahoria, mandioca, trébol, soja, remolacha, remolacha azucarera, girasol, cañóla, alfalfa, colza, linaza, algodón, tomate, papa y tabaco.

De acuerdo con otra forma de realización de la presente invención, la planta es una planta monocotiledónea. Los ejemplos de plantas monocotiledóneas incluyen caña de azúcar.

De acuerdo con otra forma de realización de la presente invención, la planta es un cereal. Los ejemplos de cereales incluyen arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, triticale, sorgo, emmer, espelta, sécale, trigo einkorn, teff, sorgo milo y avena.

La invención también se extiende a las partes cosechables de una planta tales como, pero sin limitación, semillas, hojas, frutos, flores, tallos, raíces, rizomas, tubérculos y bulbos, cuyas partes cosechables comprenden un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido BI-1. La invención además se refiere a productos derivados, con preferencia derivados directamente, de una parte cosechable de dicha planta, tal como pellets secos o polvos, aceite, grasa y ácidos grasos, almidón o proteínas.

La presente invención también abarca el uso de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos BI-1, como se describen en la presente, y el uso de estos polipéptidos BI-1 para mejorar cualquiera de los rasgos relacionados con el rendimiento antes mencionados en plantas. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido BI-1 , como se describe en la presente, o los mismos polipéptidos BI-1 , se pueden usar en programas de reproducción, en donde se identifica un marcador de ADN que se puede ligar genéticamente a un gen que codifica un polipéptido BI-1. Para definir un marcador molecular se pueden usar ácidos nucleicos/genes o los mismos polipéptidos BI-1. Este marcador de ADN o proteína luego se puede usar en programas de reproducción para seleccionar plantas que tienen mejores rasgos relacionados con el rendimiento, como se definió anteriormente en los métodos de la invención Además, las variantes alélicas de un ácido nucleico/gen que codifica un polipéptido BI-1 pueden ser útiles en los programas de reproducción asistidos por marcador. Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos BI-1 también se pueden usar como sondas para mapear de forma genética y física los genes de los cuales son parte, y como marcadores para los rasgos ligados a esos genes. Dicha información puede ser útil para la reproducción de plantas a fin de desarrollar líneas con los fenotipos deseados.

Polipéptido SEC22 Sorprendentemente, ahora se ha descubierto que modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido SEC22 produce plantas que tienen mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control. De acuerdo con una primera forma de realización, la presente invención provee un método para mejorar rasgos relacionados con el rendimiento en plantas con respecto a plantas de control, que comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido SEC22 y, opcionalmente, seleccionar plantas que tienen rasgos mejorados relacionados con el rendimiento.

Un método preferido para modular (preferentemente, aumentar) la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido SEC22 es mediante la introducción y expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido SEC22.

Cualquier referencia de aquí en adelante a una "proteína útil en los métodos de la invención" significa un polipéptido SEC22, como se define en la presente. Cualquier referencia de aquí en adelante a un "ácido nucleico útil en los métodos de la invención" significa un ácido nucleico capaz de codificar dicho polipéptido SEC22. El ácido nucleico a introducir en una planta (y, por lo tanto, útil para realizar los métodos de la invención) es cualquier ácido nucleico que codifica el tipo de proteína que se describirá a continuación, en adelante también denominado "ácido nucleico SEC2Z o "gen SEC2 .

Como se define en la presente, un "polipéptido SEC22" se refiere a cualquier polipéptido que comprende un dominio tipo Longin, que corresponde a la entrada IPR101012 de la base de datos Interpro y, opcionalmente, un dominio synaptobrevin, que corresponde a la entrada IPR001388 de la base de datos Interpro versión 25.0 del 10 de febrero de 2010, como se describe en Hunter et al. 2009 (Hunter et al. InterPro: the integrative protein signature datábase (2009). Nucleic Acids Res. 37 (Datábase Issue): D224-228).

Preferentemente, el polipéptido SEC22 útil en los métodos de la presente invención comprende un dominio tipo Longin que tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100 % de identidad de secuencia con: (i) un dominio tipo Longin en SEQ ID NO: 156 como se representa con la secuencia ubicada entre los aminoácidos 1 a 131 de SEQ ID NO: 156 (SEQ ID NO: 221 ); (ii) un dominio tipo Longin en SEQ ID NO: 158 como se representa con la secuencia ubicada entre los aminoácidos 1 a 131 de SEQ ID NO: 158 (SEQ ID NO: 222); De manera alternativa y preferible, el polipéptido SEC22 útil en los métodos de la presente invención comprende un dominio tipo Longin que tiene una secuencia representada por SEQ ID NO: 221 o SEQ ID NO: 222, en donde se sustituyen, en orden decreciente de preferencia, al menos 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, hasta 30 aminoácidos con otro aminoácido, preferentemente, con un aminoácido semiconservado, con mayor preferencia, con un aminoácido conservado.

Preferentemente, el dominio Synaptobrevin comprendido en el polipéptido SEC22 útil en los métodos de la presente invención tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31 %, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%. 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%. 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%. 97%, 98%, 99% o 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 223 (el dominio Synaptobrevin de SEQ ID NO: 156).

De manera alternativa y preferible, el polipéptido SEC22 útil en los métodos de la presente invención comprende un dominio Synaptobrevin que tiene una secuencia representada por SEQ ID NO: 223, en donde se sustituyen, en orden decreciente de preferencia, al menos 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, hasta 30 aminoácidos con otro aminoácido, preferentemente, con un aminoácido semiconservado, con mayor preferencia, con un aminoácido conservado.

Con mayor preferencia, el polipéptido SEC22 útil en los métodos de la presente invención comprende un dominio tipo Longin y un dominio Synaptobrevin, aún con mayor preferencia, el polipéptido SEC22 comprende un dominio tipo Longin y carece de un dominio Synaptobrevin.

Los dominios proteicos tipo Longin y Synaptobrevin son como se describieron anteriormente. Además, dichos dominios son muy conocidos en el arte (Longin-like domains: Rossi et al. 2004. Trends in Biochemical Sciences Volume 29, Pages 682-688; Synaptobrevin domain: Sacher et al. The Journal of Biological Chemistry, 272, 17134-17138) y se registran en bases de datos de dominios proteicos, tales como Interpro y/o Pfam (Hunter et al 2009; Finn et al. Nucleic Acids Research (2010) Datábase Issue 38:D211-222). El número de referencia de entrada a Synaptobrevin en Pfam (Pfam 24.0 (octubre de 2009, 11912 familias) es PF00957. Las herramientas para identificar un dominio tipo Longin o Synaptobrevin también se conocen en el arte, por ejemplo, InterproScan permite buscar la presencia de dichos dominios en proteínas cuya secuencia se conoce (Zdobnov E.M. and Apweiler R. Bioinformatics, 2001 , 17(9): p. 847-8). Alternativamente, una comparación de la secuencia de la proteína incógnita con las secuencias de proteínas de la Tabla A permite la determinación de la presencia de un dominio tipo Longin o Synaptobrevin. Se proveen más detalles en la sección de Ejemplos.

De manera adicional o alternativa, el polipéptido SEC22 útil en los métodos de la invención o un homólogo de éste tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31 %, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51 %, 52%. 53%. 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%. 93%, 94%, 95%. 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia total con el aminoácido representado por cualquiera de los polipéptidos de la Tabla A, preferentemente, por SEQ ID NO: 156 o SEQ ID NO: 158, siempre que el polipéptido comprenda los dominios conservados, como se indicó anteriormente. La identidad de secuencia total se determina con un algoritmo de alineamiento global, tal como el algoritmo de Needleman Wunsch en el programa GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), preferentemente, con parámetros predeterminados y, preferentemente, con secuencias de proteínas maduras (es decir, sin considerar las señales de secreción o los péptidos de tránsito). En comparación con la identidad de secuencia total, la identidad de secuencia generalmente será mayor cuando sólo se consideren dominios o motivos conservados.

En una forma de realización preferida, el ácido nucleico y/o polipéptido SEC22 útil en los métodos de la invención es de origen natural, con mayor preferencia, de origen vegetal, con máxima preferencia, de origen dicotiledóneo o monocotiledóneo, tal como del tomate o del arroz, respectivamente.

De manera alternativa o adicional, la secuencia de polipéptidos SEC22 útil en los métodos de la invención, cuando se usa en la construcción de un árbol filogenético, tal como el que se representa en la Figura 12 de Uemura et al. 2004 (CSF, Cell Structure and Function Vol. 29 (2004), No. 2 pp.49-65; se incorpora a la presente por referencia), se agrupa con el grupo de R-SNAREs-VAPM, con máxima preferencia, con AtSEC22 y/o AtYKT61 y AtYKT62 que comprende AtSEC22, una proteína ortóloga de SEQ ID NO: 156 y SEQ ID NO: 158. La Figura 12 de Uemura et al. 2004 se indica en la Figura 13 de la presente.

De manera alternativa o adicional, la secuencia de polipéptidos SEC22 útil en los métodos de la invención, cuando se usa en la construcción de un árbol filogenético sobre la base de un alineamiento múltiple de las proteínas de la Tabla H hasta SEQ ID NO: 220, se agrupa con S.Lycopersicum_XXXXXXXXXXX_153 (SEQ ID NO: 156) o con O.Sativa_XXXXXXXXXXXXXXXXX_75 (SEQ ID NO: 158). Un ejemplo de alineamientos múltiples adecuados y métodos para construir árboles también se detalla en la sección Ejemplos.

Además, los polipéptidos SEC22 (al menos en su forma natural, es decir, cuando comprenden los dominios Longing y Snaptobrevin) generalmente tienen actividad de tráfico de proteínas mediada por vesículas, preferentemente, entre el retículo endoplasmático y el aparato de Golgi. Las herramientas y técnicas para medir la actividad de tráfico de proteínas mediada por vesículas son muy conocidas en el arte. Por ejemplo, la ubicación de una proteína SEC22 fusionada con un indicador, tal como GFP (proteína de fluorescencia verde), en plantas, se puede determinar por microscopio (Chatre et al. Plant Physiol. Vol. 139, 2005, 1244-1254). De manera alternativa o adicional, se puede usar tráfico de indicadores de marcadores específicos entre los diferentes compartimentos del sistema secretor celular.

Preferentemente, los polipéptidos SEC22 útiles en los métodos de la invención, cuando se expresan en una célula vegetal, se ubican en membranas, con mayor preferencia, en membranas del retículo endoplasmático o del aparato de Golgi.

De manera alternativa o adicional, los polipéptidos SEC22, cuando se expresan en el arroz de acuerdo con los métodos de la presente invención como se indica en la sección de Ejemplos, generan plantas que tienen rasgos aumentados relacionados con el rendimiento, en comparación con las plantas de control, en particular, aumento de uno o más de los siguientes: rendimiento de semillas, índice de cosecha, cantidad de flores, biomasa de la hoja, cuando se cultivan en condiciones de estrés por sequía o deficiencia de nitrógeno. Se proveen más detalles de estas condiciones en la sección de Ejemplos.

La presente invención se ilustra mediante la transformación de plantas con la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEQ ID NO: 155 que codifica la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 156. Sin embargo, la realización de la invención no se encuentra restringida a estas secuencias; los métodos de la invención pueden llevarse a cabo ventajosamente mediante el uso de SEQ ID NO: 157 que codifica la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 158 o cualquier ácido nucleico que codifica SEC22 o polipéptido SEC22, como se define en la presente, preferentemente, cualquiera de los indicados en la Tabla H.

En la Tabla H de la sección de Ejemplos de la presente, se brindan ejemplos de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos SEC22. Dichos ácidos nucleicos son útiles en la realización de los métodos de la invención. Las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla H de la sección de Ejemplos son secuencias ejemplares de ortólogos y parálogos del polipéptido SEC22 representado por SEQ ID NO: 156, los términos "ortólogos" y "parálogos" son como se definen en la presente. Otros ortólogos y parálogos se pueden identificar fácilmente mediante la realización de la denominada búsqueda blast recíproca, como se describe en la sección de definiciones; en donde la secuencia incógnita es SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 156, el segundo BLAST (retro-BLAST) sería contra secuencias de S. Lycopersicum.

La invención también provee ácidos nucleicos que codifican SEC22 y polipéptidos SEC22 desconocidos hasta el momento, útiles para conferir mejores rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, con respecto a las plantas de control.

De acuerdo con otra forma de realización de la presente invención, se provee una molécula de ácido nucleico aislada seleccionada de: (i) un ácido nucleico representado por SEQ ID NO: 155, 157, 159, 161 , 163 hasta 219; (ii) el complemento de un ácido nucleico representado por SEQ ID NO: 155, 157, 159, 161 , 163 hasta 219; (iii) un ácido nucleico que codifica un polipéptido SEC22 que tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 156, 158, 160, 162, 164 hasta 220 y, de manera adicional o alternativa, que comprende uno o más de los motivos que tienen, en orden creciente de preferencia, al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con uno o más de los dominios indicados en SEQ ID NO: 221 a SEQ ID NO: 222 y, con mayor preferencia, confiere mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control; (iv) una molécula de ácido nucleico que se híbrida con una molécula de ácido nucleico de (i) a (¡ii) en condiciones de hibridación muy rigurosa y, preferentemente, confiere mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control.

De acuerdo con otra forma de realización de la presente invención, también se provee un polipéptido aislado seleccionado de: (i) una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 156, 158, 160, 162, 164 hasta 220; (¡i) una secuencia de aminoácidos que tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 156, 158, 160, 162, 164 hasta 220 y, de manera adicional o alternativa, que comprende uno o más de los motivos que tienen, en orden creciente de preferencia, al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con uno o más de los motivos indicados en SEQ ID NO: 221 a SEQ ID NO: 222 y, con mayor preferencia, confiere mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control; (iii) Derivados de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en (i) o (ii) anteriores.

Las variantes de ácidos nucleicos también pueden ser útiles para poner en práctica los métodos de la invención. Los ejemplos de dichas variantes incluyen ácidos nucleicos que codifican homólogos y derivados de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las Tabla A de la sección de Ejemplos, en donde los términos "homólogo" y "derivado" son como se definen en la presente. También son útiles en los métodos de la invención los ácidos nucleicos que codifican homólogos y derivados de ortólogos o parálogos de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla H de la sección de Ejemplos. Los homólogos y derivados útiles en los métodos de la presente invención tienen sustancialmente la misma actividad biológica y funcional que la proteína no modificada de la cual derivan. Otras variantes útiles para poner en práctica los métodos de la invención son las variantes en las cuales se optimiza el uso del codón o en las cuales se retiran los sitios blanco de miARN.

Otras variantes de ácidos nucleicos útiles para poner en práctica los métodos de la invención incluyen porciones de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos SEC22, ácidos nucleicos que se hibridan con ácidos nucleicos que codifican polipéptidos SEC22, variantes de empalme de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos SEC22, variantes alélicas de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos SEC22 y variantes de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos SEC22 obtenidos por transposición génica. Los términos secuencia de hibridación, variante de empalme, variante alélica y transposición génica son como se describen en la presente.

Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos SEC22 no necesitan ser ácidos nucleicos de longitud completa, ya que la realización de los métodos de la invención no depende del uso de secuencias de ácidos nucleicos de longitud completa. De acuerdo con la presente invención, se provee un método para mejorar rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, que comprende introducir y expresar en una planta una porción de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en la Tabla H de la sección de Ejemplos, o una porción de un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla H de la sección de Ejemplos.

Las porciones útiles en los métodos de la invención codifican un polipéptido SEC22 como se define en la presente y tienen sustancialmente la misma actividad biológica que las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla H de la sección de Ejemplos. Preferentemente, la porción es una porción de cualquiera de los ácidos nucleicos indicados en la Tabla H de la sección de Ejemplos, o es una porción de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla H de la sección de Ejemplos. Preferentemente, la porción tiene al menos 100, 200, 300, 400, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 nucleótidos consecutivos de longitud, en donde los nucleótidos consecutivos son cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en la Tabla H de la sección de Ejemplos, o de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla H de la sección de Ejemplos. Con máxima preferencia, la porción es una porción del ácido nucleico de SEQ ID NO: 155. Preferentemente, la porción codifica un fragmento de una secuencia de aminoácidos que, cuando se usa en la construcción de un árbol filogenético, tal como el que se representa en la Figura 155 de Uemura et al. 2004, se agrupa con el grupo de polipéptidos AtSEC22 y/o AtYKT61 y/o AtYKT62.

Otra variante de ácido nucleico útil en los métodos de la invención es un ácido nucleico capaz de hibridarse, en condiciones de rigurosidad reducida, preferentemente en condiciones de rigurosidad, con un ácido nucleico que codifica un polipéptido SEC22, como se define en la presente, o con una porción como se define en la presente.

De acuerdo con la presente invención, se provee un método para mejorar los rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, que comprende introducir y expresar en una planta un ácido nucleico capaz de hibridarse con cualquiera de los ácidos nucleicos indicados en la Tabla H de la sección de Ejemplos, o que comprende introducir y expresar en una planta un ácido nucleico capaz de hibridarse con un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en la Tabla H de la sección de Ejemplos.

Las secuencias de hibridación útiles en los métodos de la invención codifican un polipéptido SEC22, como se define en la presente, y tienen sustancialmente la misma actividad biológica que las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla H de la sección de Ejemplos. Preferentemente, la secuencia de hibridación es capaz de hibridarse con el complemento de cualquiera de los ácidos nucleicos indicados en la Tabla H de la sección de Ejemplos, o con una porción de cualquiera de estas secuencias, en donde una porción es como se definió con anterioridad, o la secuencia de hibridación es capaz de hibridarse con el complemento de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla H de la sección de Ejemplos. Con máxima preferencia, la secuencia de hibridación es capaz de hibridarse con el complemento de un ácido nucleico representado por SEQ ID NO: 155 o con una porción de éste.

Preferentemente, la secuencia de hibridación codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que, cuando tiene longitud completa y se usa en la construcción de un árbol filogenético, tal como el que se representa en la Figura 155 de Uemura et al. 2004, se agrupa con el grupo de polipéptidos AtSEC22 y/o AtYKT61 y/o AtYKT62.

Otra variante de ácido nucleico útil en los métodos de la invención es una variante de empalme que codifica un polipéptido SEC22, como se definió con anterioridad; una variante de empalme es como se define en la presente.

De acuerdo con la presente invención, se provee un método para mejorar rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, que comprende introducir y expresar en una planta una variante de empalme de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en la Tabla H de la sección de Ejemplos, o una variante de empalme de un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla H de la sección de Ejemplos.

Las variantes de empalme preferidas son las variantes de empalme de un ácido nucleico representado por SEQ ID NO: 155, o una variante de empalme de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de SEQ ID NO: 156. Preferentemente, la secuencia de aminoácidos codificada por la variante de empalme, cuando se usa en la construcción de un árbol filogenético, tal como el que se representa en la Figura 12 de Uemura et al. 2004, se agrupa con el grupo de polipéptidos AtSEC22 y/o AtYKT61 y/o AtYKT62.

Otra variante de ácido nucleico útil para realizar los métodos de la invención es una variante alélica de un ácido nucleico que codifica un polipéptido SEC22, como se definió anteriormente en la presente; una variante de alélica es como se define en la presente.

De acuerdo con la presente invención, se provee un método para mejorar los rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, que comprende introducir y expresar en una planta una variante alélica de cualquiera de los ácidos nucleicos indicados en la Tabla H de la sección de Ejemplos, o que comprende introducir y expresar en una planta una variante alélica de un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla H de la sección de Ejemplos.

Los polipéptidos codificados por las variantes alélicas útiles en los métodos de la presente invención tienen sustancialmente la misma actividad biológica que el polipéptido SEC22 de SEQ ID NO: 156 y cualquiera de los aminoácidos representados en la Tabla H de la sección de Ejemplos. Las variantes alélicas existen en la naturaleza, y el uso de estos alelos naturales está comprendido en los métodos de la presente invención. Preferentemente, la variante alélica es una variante alélica de SEQ ID NO: 155, o una variante alélica de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de SEQ ID NO: 156. Preferentemente, la secuencia de aminoácidos codificada por la variante alélica, cuando se usa en la construcción de un árbol filogenético, tal como el que se representa en la Figura 12 de Uemura et al. 2004, se agrupa con el grupo de polipéptidos AtSEC22 y/o AtYKT61 y/o AtYKT62.

También se puede usar transposición génica o evolución dirigida para generar variantes de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos SEC22, como se definieron anteriormente; el término "transposición génica" es como se define en la presente.

De acuerdo con la presente invención, se provee un método para mejorar los rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, que comprende introducir y expresar en una planta una variante de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en la Tabla H de la sección de Ejemplos, o que comprende introducir y expresar en una planta una variante de un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla H de la sección de Ejemplos, en donde la variante de ácido nucleico se obtiene mediante transposición génica.

Preferentemente, la secuencia de aminoácidos codificada por la variante de ácido nucleico obtenida por transposición génica, cuando se usa en la construcción de un árbol filogenético, tal como el que se representa en la Figura 12 de Uemura et al. 2004, se agrupa con el grupo de polipéptidos AtSEC22 y/o AtYKT61 y/o AtYKT62.

Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos SEC22 pueden derivar de cualquier fuente natural o artificial. El ácido nucleico se puede modificar de su forma nativa en composición y/o ambiente genómico mediante manipulación humana deliberada. Preferentemente, el ácido nucleico que codifica un polipéptido SEC22 es de una planta, con mayor preferencia, de una planta monocotiledónea o dicotiledónea, con mayor preferencia, de la familia Solanaceae o Poaceae, con máxima preferencia, el ácido nucleico es de Solanum lycopersicum u Oryza sativa, respectivamente.

La referencia en la presente a mejores rasgos relacionados con el rendimiento significa un aumento de vigor temprano y/o biomasa (peso) de una o más partes de una planta, que pueden incluir partes aéreas (cosechables) y/o partes subterráneas (cosechables). En particular, dichas partes cosechables son semillas y la realización de los métodos de la invención da como resultado plantas que tienen mayor rendimiento de semillas con respecto al rendimiento de semillas de las plantas de control.

La presente invención provee un método para aumentar los rasgos relacionados con el rendimiento, en especial, el rendimiento de semillas de las plantas, con respecto a las plantas de control, en donde el método comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido SEC22, como se define en la presente.

Debido a que las plantas transgénicas de acuerdo con la presente invención tienen rasgos aumentados relacionados con el rendimiento, es probable que estas plantas exhiban una mayor tasa de crecimiento (durante al menos parte de su ciclo de vida), con respecto a la tasa de crecimiento de las plantas de control, en una etapa correspondiente de su ciclo de vida.

De acuerdo con una característica preferida de la presente invención, la realización de los métodos de la invención genera plantas que tienen una mayor tasa de crecimiento con respecto a las plantas de control. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se provee un método para aumentar la tasa de crecimiento de las plantas, cuyo método comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido SEC22, como se define en la presente.

La realización de los métodos de la invención le brinda a las plantas cultivadas en condiciones sin estrés o en condiciones de sequía leve mayor rendimiento con respecto a las plantas de control cultivadas en condiciones comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se provee un método para aumentar el rendimiento en las plantas cultivadas en condiciones sin estrés o en condiciones de sequía leve, cuyo método comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido SEC22.

La realización de los métodos de la invención le brinda a las plantas cultivadas en condiciones de deficiencia de nutrientes, en particular en condiciones de deficiencia de nitrógeno, mayor rendimiento con respecto a las plantas de control cultivadas en condiciones comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se provee un método para aumentar el rendimiento en las plantas cultivadas en condiciones de deficiencia de nutrientes, cuyo método comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido SEC22.

La realización de los métodos de la invención le brinda a las plantas cultivadas en condiciones de estrés salino mayor rendimiento con respecto a las plantas de control cultivadas en condiciones comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se provee un método para aumentar el rendimiento en las plantas cultivadas en condiciones de estrés salino, cuyo método comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido SEC22.

La realización de los métodos de la invención le brinda a las plantas cultivadas en condiciones de estrés por sequía mayor rendimiento con respecto a las plantas de control cultivadas en condiciones comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se provee un método para aumentar el rendimiento en las plantas cultivadas en condiciones de estrés por sequía, cuyo método comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido SEC22.

La invención también provee constructos genéticos y vectores para facilitar la introducción y/o expresión en plantas de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos SEC22. Los constructos génicos se pueden insertar en vectores, que pueden estar disponibles en el comercio, adecuados para la transformación en plantas y para la expresión del gen de interés en las células trasformadas. La invención también provee el uso de un constructo génico, como se define en la presente en los métodos de la invención.

Más específicamente, la presente invención provee un constructo que comprende: (a) un ácido nucleico que codifica un polipéptido SEC22, como se definió anteriormente; (b) una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos de (a); y opcionalmente (c) una secuencia de terminación de la transcripción.

Preferentemente, el ácido nucleico que codifica un polipéptido SEC22 es como se definió anteriormente; Los términos "secuencia de control" y "secuencia de terminación" son como se definen en la presente.

Aún con mayor preferencia, el ácido nucleico de (a) es SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 157 y la secuencia de control de (b) es un promotor constitutivo GOS2 del arroz.

Debe quedar claro que la aplicabilidad de la presente invención no se restringe al ácido nucleico que codifica un polipéptido SEC22, representado por SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 157, ni a la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido SEC22 cuando es dirigido por un promotor constitutivo.

Preferentemente, el promotor constitutivo es un promotor de intensidad media, con mayor preferencia, seleccionado de un promotor derivado de una planta, tal como un promotor GOS2, con mayor preferencia, el promotor es un promotor GOS2 del arroz. Con mayor preferencia, el promotor constitutivo es representado por una secuencia de ácidos nucleicos sustancialmente similar a SEQ ID NO: 224, con máxima preferencia, el promotor constitutivo es representado por SEQ ID NO: 224. Véase la sección "Definiciones" de la presente para más ejemplos de promotores constitutivos.

Como se mencionó anteriormente, un método preferido para modular la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido SEC22 es mediante la introducción y expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido SEC22; sin embargo, los efectos de realizar el método, es decir, mejorar los rasgos relacionados con el rendimiento, también se pueden lograr mediante otras técnicas conocidas, que incluyen, pero sin limitación, rotulado por activación de T-ADN, TILLING, recombinación homologa. En la sección de definiciones se provee una descripción de estas técnicas.

La invención también provee un método para la producción de plantas transgénicas que tienen mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control, que comprende la introducción y expresión en una planta de cualquier ácido nucleico que codifica un polipéptido SEC22, como se definió anteriormente en la presente.

Más específicamente, la presente invención provee un método para la producción de plantas transgénicas que tienen mejores rasgos relacionados con el rendimiento, en particular, mayor rendimiento de semillas, cuyo método comprende: introducir y expresar en una planta o célula de planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido SEC22; y (i) cultivar la célula vegetal en condiciones que promuevan el desarrollo y el crecimiento de la planta.

El ácido nucleico de (i) puede ser cualquiera de los ácidos nucleicos capaces de codificar un polipéptido SEC22, como se define en la presente.

La presente invención se extiende claramente a cualquier célula vegetal o planta producida mediante cualquiera de los métodos descritos en la presente y a todas las partes de la planta y sus propágulos. La presente invención abarca plantas o sus partes (incluso semillas) que se pueden obtener mediante los métodos de acuerdo con la presente invención. Las plantas o las partes de éstas comprenden un transgén de ácido nucleico que codifica un polipéptido SEC22, como se definió anteriormente. La presente invención también abarca la progenie de una célula, tejido, órgano o planta entera primaria transformada o transfectada que fue producida mediante cualquiera de los métodos antes mencionados, en donde el único requisito es que la progenie exhiba la(s) misma(s) característica(s) genotípica(s) y/o fenotípica(s) que la(s) producida(s) por el progenitor en los métodos de acuerdo con la invención.

La invención también incluye células huésped que contienen un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido SEC22, como se definió anteriormente. Las células huésped preferidas de acuerdo con la invención son células vegetales. Las plantas huésped para los ácidos nucleicos o el vector usado en el método de acuerdo con la invención, el cásete de expresión o constructo o vector son, en principio, ventajosamente, todas las plantas que son capaces de sintetizar los polipéptidos usados en el método de la invención.

Los métodos de la invención se pueden aplicar de forma ventajosa a cualquier planta. Las plantas que son particularmente útiles en los métodos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas que incluyen forraje o legumbres forrajeras, plantas ornamentales, cultivos alimenticios, árboles o arbustos De acuerdo con una forma de realización preferida de la presente invención, la planta es una planta de cultivo. Los ejemplos de plantas de cultivo incluyen soja, girasol, cañóla, alfalfa, colza, linaza, algodón, tomate, papa y tabaco. Con mayor preferencia, la planta es una planta monocotiledónea. Los ejemplos de plantas monocotiledóneas incluyen caña de azúcar. Con mayor preferencia, la planta es un cereal. Los ejemplos de cereales incluyen arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, triticale, sorgo, emmer, espelta, sécale, trigo einkorn, teff, sorgo milo y avena.

La invención también se extiende a las partes cosechables de una planta tales como, pero sin limitación, semillas, hojas, frutos, flores, tallos, raíces, rizomas, tubérculos y bulbos, cuyas partes cosechables comprenden un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido SEC22. La invención además se refiere a productos derivados, con preferencia derivados directamente, de una parte cosechable de dicha planta, tal como pellets secos o polvos, aceite, grasa y ácidos grasos, almidón o proteínas.

La presente invención también abarca el uso de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos SEC22, como se describen en la presente, y el uso de estos polipéptidos SEC22 para mejorar cualquiera de los rasgos relacionados con el rendimiento antes mencionados en plantas. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido SEC22, como se describe en la presente, o los mismos polipéptidos SEC22, se pueden usar en programas de reproducción, en donde se identifica un marcador de ADN que se puede ligar genéticamente a un gen que codifica un polipéptido SEC22. Para definir un marcador molecular se pueden usar ácidos nucleicos/genes o los mismos polipéptidos SEC22. Este marcador de ADN o proteína luego se puede usar en programas de reproducción para seleccionar plantas que tienen mejores rasgos relacionados con el rendimiento, como se definió anteriormente en los métodos de la invención Además, las variantes alélicas de un ácido nucleico/gen que codifica un polipéptido SEC22 pueden ser útiles en los programas de reproducción asistidos por marcador. Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos SEC22 también se pueden usar como sondas para mapear de forma genética y física los genes de los cuales son parte, y como marcadores para los rasgos ligados a esos genes. Dicha información puede ser útil para la reproducción de plantas a fin de desarrollar líneas con los fenotipos deseados. ÍTEMS Preferentemente, la invención provee los siguientes ítems. 1. Un método para mejorar los rasgos relacionados con el rendimiento en plantas en relación con las plantas de control, que comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo SEC22 que comprende SEQ ID NO: 23 (Motivol ). 2. Método de acuerdo con el ítem 1 , en donde el Motivo es R(R/UF/V)SPGGP(D/N)P(Q/R)HH (SEQ ID NO: 24). 3. Método de acuerdo con el ítem 1 o 2, en donde dicha expresión modulada se realiza mediante la introducción y expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo CLE 2. 4. Método de acuerdo con cualquiera de los ítems 1 a 3, en donde dicho ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo CLE 2 codifica cualquiera de las proteínas enumeradas en la Tabla A o es una porción de dicho ácido nucleico, o un ácido nucleico capaz de hibridarse con dicho ácido nucleico. 5. Método de acuerdo con cualquiera de los ítems 1 a 4, en donde dicha secuencia de ácidos nucleicos codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de las proteínas indicadas en la Tabla A. 6. Método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde los mejores rasgos relacionados con el rendimiento comprenden mayor rendimiento, preferentemente, mayor biomasa y/o mayor rendimiento de semillas, con respecto a las plantas de control.

Método de acuerdo con cualquiera de los ítems 1 a 6, en donde dichos rasgos mejorados relacionados con el rendimiento se obtienen en condiciones de deficiencia de nitrógeno.

Método de acuerdo con cualquiera de los ítems 3 a 7, en donde dicho ácido nucleico se liga operativamente a un promotor constitutivo, preferentemente, a un promotor GOS2, con máxima preferencia, a un promotor GOS2 del arroz.

Método de acuerdo con cualquiera de los ítems 1 a 8, en donde dicho ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo CLE 2 es de origen vegetal, preferentemente, de una planta dicotiledónea, con mayor preferencia, de la familia Brassicaceae, con mayor preferencia, del género Arabidopsis, con máxima preferencia, de Arabidopsis thaliana.

. Planta o parte de ésta, incluso semillas, que se puede obtener mediante un método de acuerdo con cualquiera de los ítems 1 a 9, en donde dicha planta o parte de ésta comprende un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido tipo CLE 2. . Constructo que comprende: (i) , ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo CLE 2 como se define en los ítems 1 o 2; (ii) . una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos de (a); y opcionalmente (iii) . una secuencia de terminación de la transcripción.

. Constructo de acuerdo con el ítem 11 , en donde una de dichas secuencias de control es un promotor constitutivo, preferentemente, un promotor GOS2, con máxima preferencia, un promotor GOS2 del arroz.

. Uso de un constructo de acuerdo con el ítem 11 o 12 en un método para producir plantas que tienen mayor rendimiento, en particular, mayor biomasa y/o mayor rendimiento de semillas, con respecto a las plantas de control.

. Planta, parte de planta o célula vegetal transformada con un constructo de acuerdo con el ítem 11 o 12.

. Método para la producción de una planta transgénica que tiene mayor rendimiento, en particular, mayor biomasa y/o mayor rendimiento de semillas, con respecto a las plantas de control, que comprende: (i), introducir y expresar en una planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo CLE 2 como se define en el ítem 1 o 2; y (¡i), cultivar la célula vegetal en condiciones que promuevan el desarrollo y el crecimiento de la planta.

. Planta transgénica que tiene mayor rendimiento, en particular mayor biomasa y/o mayor rendimiento de semilla, en relación con las plantas de control, que es el resultado de la expresión modulada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo CLE 2 como se define en el ítem 1 o 2, o una célula vegetal transgénica derivada de dicha planta transgénica.

. Planta transgénica de acuerdo con el ítem 10, 14 o 16, o una célula vegetal transgénica derivada de ésta, en donde dicha planta es una planta de cultivo, tal como remolacha o remolacha azucarera, o una monocotiledónea o un cereal, tal como arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, triticale, sorgo, emmer, espelta, sécale, trigo einkorn, teff, sorgo milo y avena.

. Partes cosechables de una planta de acuerdo con el ítem 17, en donde dichas partes cosechables son, preferentemente, biomasa de brote, biomasa de raíz y/o semillas.

. Productos derivados de una planta de acuerdo con el ítem 17 y/o de partes cosechables de una planta de acuerdo con el ítem 19.

. Uso de un ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo CLE 2 para aumentar el rendimiento, en particular, aumentar el rendimiento de semillas, la biomasa de raíces y/o la biomasa de brotes en plantas, con respecto a las plantas de control.

. Un método para mejorar los rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, con respecto a las plantas de control, que comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido inhibidor de Bax 1 (BI-1), en donde dicho polipéptido inhibidor de Bax 1 comprende un dominio relacionado con el inhibidor de Bax (PF01027).

. Método de acuerdo con el ítem 21, en donde dicha expresión modulada se realiza mediante la introducción y expresión en una planta del ácido nucleico que codifica dicho polipéptido inhibidor de Bax 1.

. Método de acuerdo con el ítem 21 o 22, en donde dichos mejores rasgos relacionados con el rendimiento comprenden mayor rendimiento, con respecto a las plantas de control y, preferentemente, comprenden mayor rendimiento de semillas y/o mayor biomasa, con respecto a las plantas de control. 24. Método de acuerdo con cualquiera de los ítems 21 a 23, en donde dichos mejores rasgos relacionados con el rendimiento se obtienen en condiciones sin estrés. 25. Método de acuerdo con cualquiera de los ítems 21 a 23, en donde dichos mejores rasgos relacionados con el rendimiento se obtienen en condiciones de estrés osmótico o deficiencia de nitrógeno. 26. Método de acuerdo con cualquiera de los ítems 21 a 25, en donde dicho polipéptido inhibidor de Bax 1 comprende uno o más de los siguientes motivos: i) Motivo 3a: [DN]TQxxxE[KR][AC]xxGxxDY[VIL]xx[STA] (SEQ ID NO: 131 ), ii) Motivo 4a: xxxxxlSPx[VS]xx[HYR][LI][QRK]x[VFN][YN]xx[l H {SEQ ID NO: 133), iii) Motivo 5a: FxxFxxAxxxxxRRxx[LMF][YF][LH]x (SEQ ID NO: 135), 27. Método de acuerdo con el ítem 26, en donde dicho polipéptido inhibidor de Bax 1 también comprende uno o más de los siguientes motivos: i) Motivo 6a: DTQxl[VI]E[KR]AHxGDxDYVKHx (SEQ ID NO: 137); ii) Motivo 7a: x[QE]ISPxVQxHLK[QK]VY[FL]xLC[FC] (SEQ ID NO: 139); iii) Motivo 8a: F[AG]CF[S P] [AG] AA[M L] [VL][AG] RRRE YL YL[AG]G (SEQ ID NO: 141 ); iv) Motivo 9: [IF]E[VL]Y[FL]GLL[VL]F[VM]GY[VIM][IV][VYF] (SEQ ID NO: 143); v) Motivo 10: [MFL][LV]SSG[VLI]SxLxW[LV][HQ][FL]ASxlFGG (SEQ ID NO: 144); vi) Motivo 11 : H[ILV]tLIM][FLW][NH][VI]GG[FTL]LT[AVT]x[GA]xx[GA]xxxW[LM][LM] (SEQ ID NO: 145); vii) Motivo 12: Rx[AS [LI]L[ML][GAV]xx[LVF][FL][EKQ]GA[STY]IGPL[I ] (SEQ ID NO: 146); 28. Método de acuerdo con el ítem 26, en donde dicho polipéptido inhibidor de Bax 1 también comprende uno o más de los siguientes motivos: i) Motivo 13a: DTQx[IVM][IV]E[KR][AC]xxGxxDxx[KRQ]Hx (SEQ ID NO: 147); Ü) Motivo 14: E[L\AHY[GLF]GLxrVLI][VF]xGY[MVI][LVI]x (SEQ ID NO: 149); üi) Motivo 15: KN[FL]RQISPAVQ[SN]HLK[RL]VYLT (SEQ ID NO: 150); ¡v) Motivo 16a: ??[08]?[8???[?8]??[?8]???[?8?][?? ?]?[??][??][T8][??]?? (SEQ ID NO: 151 ) 29. Método de acuerdo con cualquiera de los ítems 21 a 28, en donde dicho ácido nucleico que codifica un polipéptido inhibidor de Bax 1 es de origen vegetal. 30. Método de acuerdo con cualquiera de los ítems 21 a 29, en donde dicho ácido nucleico que codifica un polipéptido inhibidor de Bax 1 codifica cualquiera de los polipéptidos enumerados en la Tabla C o es una porción de dicho ácido nucleico, o un ácido nucleico capaz de hibridarse con dicho ácido nucleico. 31. Método de acuerdo con cualquiera de los ítems 21 a 30, en donde dicha secuencia de ácidos nucleicos codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de los polipéptidos indicados en la Tabla C. 32. Método de acuerdo con cualquiera de los ítems 21 a 31 , en donde dicho ácido nucleico que codifica el polipéptido inhibidor de Bax 1 corresponde a SEQ ID NO: 30. 33. Método de acuerdo con cualquiera de los ítems 21 a 32, en donde dicho ácido nucleico se liga operativamente a un promotor constitutivo, preferentemente, a un promotor constitutivo de intensidad media, preferentemente, a un promotor vegetal, con mayor preferencia, a un promotor GOS2, con máxima preferencia, a un promotor GOS2 del arroz. 34. Planta, parte de planta, incluso semillas, o célula vegetal que se puede obtener mediante un método de acuerdo con cualquiera de los ítems 21 a 33, en donde dicha planta, parte de planta o célula vegetal comprende un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido inhibidor de Bax 1 , como se define en cualquiera de los ítems 21 y 26 a 32. 35. Constructo que comprende: (i) ácido nucleico que codifica un polipéptido inhibidor de Bax 1 como se define en cualquiera de los ítems 21 y 26 a 32; (i¡) una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos de (i); y opcionalmente (iii) una secuencia de terminación de la transcripción. 36. Constructo de acuerdo con el ítem 35, en donde una de dichas secuencias de control es un promotor constitutivo, preferentemente, un promotor constitutivo de intensidad media, preferentemente, un promotor vegetal, con mayor preferencia, un promotor GOS2, con máxima preferencia, un promotor GOS2 del arroz. 37. Uso de un constructo de acuerdo con el ítem 35 o 36 en un método para producir plantas que tienen mejores rasgos relacionados con el rendimiento, preferentemente, mayor rendimiento, con respecto a las plantas de control y, con mayor preferencia, mayor rendimiento de semillas y/o mayor biomasa, con respecto a las plantas de control. 38. Planta, parte de planta o célula vegetal transformada con un constructo de acuerdo con el ítem 35 o 36. 39. Método para la producción de una planta transgénica que tiene mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control, preferentemente, mayor biomasa, con respecto a las plantas de control y, con mayor preferencia, mayor rendimiento de semillas y/o mayor biomasa, con respecto a las plantas de control, que comprende: (i) introducir y expresar en una célula vegetal o planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido inhibidor de Bax 1 como se define en cualquiera de los ítems 21 y 26 a 32; y (¡i) cultivar la célula vegetal, o planta en condiciones que promuevan el desarrollo y el crecimiento de la planta. 40. Planta transgénica que tiene mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control, preferentemente, mayor rendimiento, con respecto a las plantas de control y, con mayor preferencia, mayor rendimiento de semillas y/o mayor biomasa, que es el resultado de la expresión modulada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido inhibidor de Bax 1 , como se define en cualquiera de los ítems 21 y 26 a 32, o una célula vegetal transgénica derivada de dicha planta transgénica. 41. Planta transgénica de acuerdo con el ítem 34, 38 o 40, o una célula vegetal transgénica derivada de ésta, en donde dicha planta es una planta de cultivo, tal como remolacha, remolacha azucarera o alfalfa, o una monocotiledónea, tal como caña de azúcar, o un cereal, tal como arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, triticale, sorgo, emmer, espelta, sécale, trigo einkorn, teff, sorgo milo o avena. 42. Partes cosechables de una planta de acuerdo con el ítem 41 , en donde dichas partes cosechables son semillas. 43. Productos derivados de una planta de acuerdo con el ítem 41 y/o de partes cosechables de una planta de acuerdo con el ítem 42. 44. Uso de un ácido nucleico que codifica un polipéptido inhibidor de Bax 1 como se define en cualquiera de los ítems 21 y 26 a 32 para mejorar los rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, con respecto a las plantas de control, preferentemente, para aumentar el rendimiento y, con mayor preferencia, para aumentar el rendimiento de semillas y/o para aumentar la biomasa en plantas, con respecto a las plantas de control. 45. Un método para mejorar los rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, con respecto a las plantas de control, que comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido SEC22, en donde dicho polipéptido SEC22 comprende un dominio tipo Longin. 46. Método de acuerdo con el ítem 45, en donde dicho dominio tipo Longin tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41 %, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100 % de identidad de secuencia con: (i) un dominio tipo Longin en SEQ ID NO: 156 como se representa con la secuencia ubicada entre los aminoácidos 77 a 131 de SEQ ID NO: 156 (SEQ ID NO: 221); (ii) un dominio tipo Longin en SEQ ID NO: 158 como se representa con la secuencia ubicada entre los aminoácidos 1 a 131 de SEQ ID NO: 158 (SEQ ID NO: 222). 47. Método de acuerdo con el ítem 45 o 46, en donde dicha expresión modulada se realiza mediante la introducción y expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido SEC22. 48. Método de acuerdo con cualquiera de los ítems 1 a 47, en donde dicho ácido nucleico que codifica un polipéptido SEC22 codifica cualquiera de las proteínas enumeradas en la Tabla H o es una porción de dicho ácido nucleico, o un ácido nucleico capaz de hibridarse con dicho ácido nucleico. 49. Método de acuerdo con cualquiera de los ítems 45 a 48, en donde dicha secuencia de ácidos nucleicos codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de las proteínas indicadas en la Tabla H. 50. Método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde dichos mejores rasgos relacionados con el rendimiento comprenden mayor rendimiento de semillas, preferentemente, mayor cantidad de semillas llenas, con respecto a las plantas de control. 51. Método de acuerdo con cualquiera de los ítems 45 a 50, en donde dichos mejores rasgos relacionados con el rendimiento se obtienen en condiciones de estrés por sequía. 52. Método de acuerdo con cualquiera de los ítems 45 a 50, en donde dichos mejores rasgos relacionados con el rendimiento se obtienen en condiciones sin estrés o de estrés, tal como estrés salino, o deficiencia de nitrógeno. 53. Método de acuerdo con cualquiera de los ítems 47 a 52, en donde dicho ácido nucleico se liga operativamente a un promotor constitutivo, preferentemente, a un promotor GOS2, con máxima preferencia, a un promotor GOS2 del arroz. 54. Método de acuerdo con cualquiera de los ítems 1 a 53, en donde dicho ácido nucleico que codifica un polipéptido SEC22 es de origen vegetal, preferentemente de una planta dicotiledónea, con mayor preferencia de la familia Solanaceae, con mayor preferencia del género Solanum, con máxima preferencia de Solanum lycopersicum. 55. Planta o parte de ésta, incluso semillas, que se puede obtener mediante un método de acuerdo con cualquiera de los ítems 45 a 54, en donde dicha planta o parte de ésta comprende un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido SEC22. 56. Constructo que comprende: (i) ácido nucleico que codifica un polipéptido SEC22 como se define en los ítems 45 o 46; (ii) una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos de (a); y opcionalmente (iii) una secuencia de terminación de la transcripción. 57. Constructo de acuerdo con el ítem 56, en donde una de dichas secuencias de control es un promotor constitutivo, preferentemente, un promotor GOS2, con máxima preferencia, un promotor GOS2 del arroz. 58. Uso de un constructo de acuerdo con el ítem 56 o 57 en un método para producir plantas que tienen mayor rendimiento, en particular, mayor biomasa y/o mayor rendimiento de semillas, con respecto a las plantas de control. 59. Planta, parte de planta o célula vegetal transformada con un constructo de acuerdo con el ítem 56 o 57. 60. Método para la producción de una planta transgénica que tiene mayor rendimiento, en particular, mayor biomasa y/o mayor rendimiento de semillas, con respecto a las plantas de control, que comprende: (i) introducir y expresar en una planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido SEC22 como se define en el ítem 45 o 46; y (ii) cultivar la célula vegetal en condiciones que promuevan el desarrollo y el crecimiento de la planta. 61. Planta transgénica que tiene mayor rendimiento, en particular mayor biomasa y/o mayor rendimiento de semilla, en relación con las plantas de control, que es el resultado de la expresión modulada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido SEC22 como se define en el ítem 45 o 46, o una célula vegetal transgénica derivada de dicha planta transgénica. 62. Planta transgénica de acuerdo con el ítem 55, 59 o 61 , o una célula vegetal transgénica derivada de ésta, en donde dicha planta es una planta de cultivo o una monocotiledónea o un cereal, tal como arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, triticale, sorgo, emmer, espelta, sécale, trigo einkorn, teff, sorgo milo y avena. 63. Partes cosechables de una planta de acuerdo con el ítem 62, en donde dichas partes cosechables son, preferentemente, biomasa de brote y/o semillas. 64. Productos derivados de una planta de acuerdo con el ítem 62 y/o de partes cosechables de una planta de acuerdo con el ítem 63. 65. Uso de un ácido nucleico que codifica un polipéptido SEC2 para aumentar el rendimiento, en particular, aumentar el rendimiento de semillas y/o la biomasa de brotes en plantas, con respecto a las plantas de control. 66.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La presente invención se describirá a continuación con referencia a las siguientes figuras en las cuales: La Figura 1 representa un alineamiento múltiple de SEQ ID NO: 2 y otros polipéptidos tipo CLE. El Motivo 1 se indica en negrita, SEQ ID NO: 2 se representa como AT4G18510.

La Figura 2 muestra una representación de weblogo del patrón de conservación de residuos en cada grupo y para la familia proteica completa, tomada de Oeiker et al (2008). El motivo CLE principal de 12 aminoácidos de longitud se marca con un marco negro. Los residuos específicos de grupo se marcan en negro en varios grupos. Los residuos invariantes se marcan en negro en el logo del extremo inferior. Los residuos conservados se marcan en gris. El tamaño de la letra simboliza la frecuencia de ese residuo en el grupo y en esa posición. Se identificó un motivo secundario alrededor de 50 aminoácidos corriente arriba del motivo CLE primario en los grupos 1 , 2, 8 y 13. Las extensiones del motivo se pueden reconocer en el terminal C y N. Las figuras entre corchetes indican el número de secuencias asignadas al grupo respectivo.

La Figura 3 representa el vector binario usado para una mayor expresión en Oryza sativa de un ácido nucleico que codifica un tipo CLE 2 bajo el control de un promotor GOS2 (pGOS2) del arroz La Figura 4 es una tabla de MATGAT para los polipéptidos tipo CLE 2 de Arabidopsis y de arroz.

La Figura 5 representa la estructura de dominio de SEQ ID NO: 30 con indicación de la posición del dominio relacionado con el inhibidor de Bax (identificado por Pfam (PF 01027), en negrita y subrayado) e indicación de la posición de los motivos 3a, 4a, 5a, 6a, 7a, 8a, 9, 10, 11a y 12.

Las Figuras 6 y 7 representan un alineamiento múltiple de varios polipéptidos BI-1 que pertenecen al grupo RA/BI-1 (panel a) y al grupo EC/BI-1 (panel b). Los asteriscos indican aminoácidos idénticos entre las diversas secuencias proteicas, los dos puntos indican sustituciones de aminoácidos altamente conservados y los puntos representan sustituciones de aminoácidos menos conservados; en otras posiciones no hay conservación de secuencia. Estos alineamientos se pueden usar para definir otros motivos, cuando se usan aminoácidos conservados.

La Figura 8 muestra un árbol filogenético de polipéptidos BI-1. Se alinearon las proteínas con MUSCLE (Edgar (2004), Nucleic Acids Research 32(5): 1792-97). Se calculó un árbol de unión a vecino con QuickTree1.1 (Howe et al. (2002). Bioinformatics 18(11): 1546-7). Se dibujó un cladograma circular sesgado con Dendroscope 2.0.1 (Huson et al. (2007). Bioinformatics 8(1):460). At e=1e-40, se recuperaron los tres genes relacionados con BI-1 de Arabidopsis. El árbol se generó con miembros representativos de cada grupo.

La Figura 9 muestra la tabla de MATGAT (Ejemplo 12) La Figura 10 representa el vector binario que se usa para una mayor expresión en Oryza sativa de un ácido nucleico que codifica BI-1 bajo el control de un promotor GOS2 (pGOS2) del arroz.

La Figura 11 representa el vector binario (pUBI) que se usa para la clonación de un ácido nucleico que codifica BI-1 bajo el control de un promotor de ubiquitina, que comprende los siguientes elementos en la estructura principal del vector: un origen de replicación en E. coli; un origen de replicación en Agrobacterium; una proteína de replicación para la replicación de ADN; una región de estabilidad del origen de replicación en Agrobacterium; y un marcador seleccionable que confiere resistencia a canamicina en bacterias.

La Figura 12 representa un alineamiento múltiple de varios polipéptidos SEC22.

Los aminoácidos conservados están presentes en posiciones equivalentes en varios polipéptidos SEC22. Estos alineamientos se pueden usar para definir otros motivos, cuando se determinan aminoácidos conservados.

La Figura 13 muestra un árbol filogenético de polipéptidos SEC22 de acuerdo con la Figura 12 de Uemura et al. 2004.

La Figura 14 representa el vector binario usado para una mayor expresión en Oryza sativa de un ácido nucleico que codifica SEC22 bajo el control de un promotor GOS2 (pGOS2) del arroz.

EJEMPLOS La presente invención se describirá a continuación con referencia a los siguientes ejemplos, que se proveen solamente a modo ilustrativo. Los siguientes ejemplos no pretenden definir completamente o, de otro modo, limitar el alcance de la invención.

Manipulación de ADN: a menos que se indique de otro modo, las técnicas de ADN recombinante se realizan de acuerdo con los protocolos estándar descritos en (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) o en los Volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Los materiales y métodos estándar para el trabajo molecular en plantas se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) de R.D.D. Croy, publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (UK) y BlackweII Scientific Publications (UK).

Ejemplo 1 : Identificación de secuencias relacionadas con SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 Se identificaron secuencias (de cADN de longitud completa, EST o genómicas) relacionadas con SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 entre aquellas que se mantienen en la base de datos Entrez Nucleotides en el National Center for Biotechnology Information (NCBI) mediante el uso de herramientas de búsqueda de secuencias en base de datos, tales como Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; y Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402). El programa se usa para encontrar regiones de similitud local entre secuencias mediante la comparación de secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos con bases de datos de secuencias y mediante el cálculo de la importancia estadística de las coincidencias. Por ejemplo, el polipéptido codificado por el ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 se usó para el algoritmo TBLASTN, con parámetros predeterminados, y se activó el filtro para ignorar las secuencias de baja complejidad. El resultado del análisis se examinó mediante comparación de a pares y se lo calificó de acuerdo con el puntaje de probabilidad (valor E), donde el puntaje refleja la probabilidad de que un alineamiento en particular se produzca al azar (cuanto menor es el valor E, más importante es la coincidencia). Además de los valores E, las comparaciones también se calificaron por porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad se refiere a la cantidad de nucleótidos (o aminoácidos) idénticos entre las dos secuencias de ácidos nucleicos (o polipéptidos) comparadas a lo largo de una longitud particular. En algunos casos, los parámetros predeterminados se pueden ajustar para modificar la rigurosidad de la búsqueda. Por ejemplo, se puede aumentar el valor E para mostrar coincidencias menos rigurosas. De este modo, se pueden identificar coincidencias cortas casi exactas.

La Tabla A provee una lista de secuencias de ácidos nucleicos relacionadas con SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.

Tabla A: Ejemplos de polipéptidos y ácidos nucleicos tipo CLE 2: Las secuencias se unieron tentativamente y se revelaron al público mediante institutos de investigación, tales como The Institute for Genomic Research (TIGR; comenzando con TA). La base de datos Eukaryotic Gene Orthologs (EGO) se puede usar para identificar dichas secuencias relacionadas, ya sea por búsqueda de palabra clave o usando el algoritmo BLAST con la secuencia de ácidos nucleicos o secuencia de polipéptidos de interés. Se crearon bases de datos especiales de secuencias de ácidos nucleicos para organismos particulares, como por ejemplo, mediante el Joint Genome Institute. Asimismo, el acceso a bases de datos registradas permite la identificación de nuevas secuencias de polipéptidos y ácidos nucleicos.

Ejemplo 2: Alineamiento de secuencias de polipéptidos tipo CLE 2 El alineamiento de secuencias de polipéptidos se realizó con el algoritmo de alineamiento progresivo ClustalW 2.0 (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res 25:4876-4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res 31 :3497-3500) con parámetros estándar (alineamiento lento, matriz de similitud: Gonnet, penalidad por apertura de brecha 10, penalidad por extensión de brecha: 0,2). Se realizó edición manual menor para optimizar adicionalmente el alineamiento. Los polipéptidos tipo CLE 2 se alinean en la Figura 1.

Ejemplo 3: Cálculo del porcentaje de identidad global entre las secuencias de polipéptidos Los porcentajes globales de similitud e identidad entre secuencias de polipéptidos de longitud completa útiles para realizar los métodos de la invención se determinaron mediante uno de los métodos disponibles en el arte, el software MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) (BMC Bioinformatics. 2003 4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein o DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; software albergado por Ledion Bitincka). El software MatGAT genera matrices de similitud/identidad para las secuencias de ADN o proteínas sin que se necesario el prealineamiento de datos. El programa realiza una serie de alineamientos de a pares usando el algoritmo de alineamiento global de Myers y Miller (con una penalidad por apertura de brecha de 12 y una penalidad por extensión de brecha de 2), calcula la similitud e identidad usando, por ejemplo, Blosum 62 (para polipéptidos) y luego ingresa los resultados en una matriz de distancia.

Los resultados del análisis para la similitud e identidad global de la longitud completa de las secuencias de polipéptidos se muestran en la Figura 4. La similitud de secuencia se muestra en la mitad inferior de la línea divisoria y la identidad de secuencia se muestra en la mitad superior de la línea diagonal divisoria. Los parámetros que se usaron en la comparación fueron: Matriz de calificación: Blosum62, Primera brecha: 12, Brecha de extensión: 2. La identidad de secuencia (en %) entre las secuencias de polipéptidos tipo CLE 2 útiles para realizar los métodos de la invención puede ser tan baja como 23,6 %, en comparación con SEQ ID NO: 2.

Ejemplo 4: Ensayo funcional para el polipéptido tipo CLE 2 Un ensayo funcional de polipéptidos tipo CLE 2 se puede encontrar en Whitford et al. (2008) - Plant CLE peptides from two distinct functional classes synergistically induce división of vascular cells. PNAS, vol. 105, no. 47. Pp. 18625-18630 (25 de noviembre de 2008). Se demostró que un péptido sintético derivado del polipéptido CLE 2 representado por SEQ ID NO: 2 detiene el crecimiento de las raíces.

Ejemplo 5: Clonación de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican tipo CLE 2 La secuencia de ácidos nucleicos se amplificó por PCR usando como molde una biblioteca de cADN de plántulas de Arabidopsis thaliana personalizada (en pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, UK). Se realizó PCR con ADN polimerasa Hifi Taq en condiciones estándar, con 200 ng de molde en 50 µ? de mezcla PCR. Los cebadores utilizados fueron prm14832 (SEQ ID NO: 27; sentido, codón de inicio en negrita): 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggctaagttaagcttcact-3' y prm14833 (SEQ ID NO: 28; inverso, complementario): 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtta aacatgtcgaagaaattga-3', que incluyen los sitios AttB para la recombinación Gateway. El fragmento de PCR amplificado se purificó también mediante métodos estándar. Luego se realizó la primera etapa del procedimiento Gateway, la reacción BP, durante la cual el fragmento PCR se recombinó in vivo con el plásmido pDONR201 para producir, de acuerdo con la terminología de Gateway, un "clon de entrada", pTipo CLE 2. El plásmido pDONR201 se compró a Invitrogen, como parte de la tecnología Gateway®.

El clon de entrada que comprende SEQ ID NO: 1 luego se usó en una reacción LR con un vector de destino usado para la transformación de Oryza sativa. Este vector contenía como elementos funcionales dentro de los límites de T-ADN: un marcador seleccionable vegetal; un cásete de expresión del marcador controlable; y un cásete Gateway para la recombinación LR in vivo con la secuencia de ácidos nucleicos de interés ya clonada en el clon de entrada Un promotor GOS2 del arroz (SEQ ID NO: 26) para la expresión constitutiva especifica se ubicó corriente arriba de este cásete de Gateway.

Después de la etapa de recombinación LR, el vector de expresión resultante pGOS2::tipo CLE 2 (Figura 3) se transformó en la cepa LBA4044 de Agrobacteríum de acuerdo con los métodos conocidos en el arte.

Ejemplo 6: Transformación de plantas Transformación de arroz El Agrobacteríum que contiene el vector de expresión se utilizó para transformar plantas de Oryza sativa. Se quitaron las cáscaras de las semillas secas maduras del cultivar de arroz japonés Nipponbare. Se realizó la esterilización mediante la incubación durante un minuto en 70% de etanol, seguido por 30 minutos en 0,2% de HgCI2, seguido por 6 lavados de 15 minutos con agua destilada estéril. Las semillas estériles luego se germinaron en un medio que contenía 2,4-D (medio de inducción de callos). Después de la incubación en la oscuridad durante cuatro semanas, se extrajeron callos embriogénicos, derivados de escutelo, y se propagaron en el mismo medio. Después de dos semanas, los callos se multiplicaron o se propagaron por subcultivo en el mismo medio durante otras 2 semanas. Las piezas de callos embriogénicos se subcultivaron en medio fresco 3 días antes del cocultivo (para estimular la actividad de división celular).

La cepa LBA4404 de Agrobacterium que contiene el vector de expresión se utilizó para el cocultivo. Se inoculó Agrobacterium en un medio AB con los antibióticos apropiados y se cultivó durante 3 días a 28°C. Luego se recogieron las bacterias y se suspendieron en un medio de cocultivo líquido a una densidad (OD60o) de alrededor de 1. La suspensión luego se transfirió a una placa de Petri y se sumergen los callos en la suspensión durante 15 minutos. Los tejidos de los callos luego se secaron en un papel de filtro y se transfirieron a un medio de cocultivo solidificado, y se incubaron durante 3 días en la oscuridad a 25 °C. Los callos cocultivados se cultivaron en un medio que contiene 2,4-D durante 4 semanas en la oscuridad a 28 °C en presencia de un agente de selección. Durante este período, se desarrollan islas de callos resistentes que crecen rápidamente. Después de transferir este material a un medio de regeneración e incubación a la luz, se liberó el potencial embriogénico y se desarrollaron brotes en las siguientes cuatro a cinco semanas. Se retiraron los brotes de los callos y se incubaron durante 2 a 3 semanas en un medio que contenía auxina, desde el cual se transfirieron al suelo. Los brotes endurecidos se cultivaron en condiciones de alta humedad y días cortos en un invernadero.

Se generaron aproximadamente 35 transformantes de arroz T0 independientes para una construcción. Los transformantes primarios se transfirieron de una cámara de cultivo de tejidos a un invernadero. Después de un análisis de PCR cuantitativo para verificar la cantidad de copias del inserto de T-ADN, sólo se conservaron las plantas transgénicas de única copia que presentan tolerancia al agente de selección para cosechar la semilla T1. Las semillas luego se cosecharon de tres a cinco meses después del trasplante. El método produjo transformantes de único locus en una proporción de más de 50 % (Aldemita and Hodges1996, Chan et al. 1993, Hiei et al. 1994).

Ejemplo 7: Transformación de otros cultivos Transformación de maíz La transformación del maíz (Zea mays) se realiza con una modificación del método descrito por Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14(6): 745-50. La transformación depende del genotipo en el maíz y sólo genotipos específicos pueden ser transformados y regenerados. La línea endogámica A188 (Universidad de Minnesota) o los híbridos con A188 como progenitor son una buena fuente de material donante para la transformación, pero también se pueden utilizar exitosamente otros genotipos. Las espigas se cosechan de la planta de maíz aproximadamente 11 días después de la polinización (DAP) cuando el embrión inmaduro tiene una longitud de alrededor de 1 a 1 ,2 mm. Los embriones inmaduros se cocultivan con Agrobacterium tumefaciens que contiene el vector de expresión, y las plantas transgénicas se recuperan por medio de organogénesis. Los embriones extraídos se cultivan en medio de inducción de callos, luego en medio de regeneración de maíz, que contiene el agente de selección (por ejemplo, imidazolinona, pero se pueden utilizar varios marcadores de selección). Las placas de Petri se incuban a la luz a 25 °C durante 2-3 semanas o hasta que se desarrollan los brotes. Los brotes verdes se transfieren de cada embrión al medio de enraizamiento de maíz y se incuban a 25 °C durante 2-3 semanas, hasta que se desarrollan las raíces. Los brotes con raíces se trasplantan al suelo en el invernadero. Las semillas T1 se producen a partir de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una única copia del inserto de T-ADN.

Transformación de trigo La transformación del trigo se realiza con el método descrito por Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14(6): 745-50. Habitualmente, se usa el cultivar Bobwhite (disponible de CIMMYT, Méjico) para la transformación. Los embriones inmaduros se cocultivan con Agrobacterium tumefaciens que contiene el vector de expresión y las plantas transgénicas se recuperan por medio de organogénesis. Después de la incubación con Agrobacterium, los embriones se cultivan in vitro en medio de inducción de callos, luego en medio de regeneración, que contiene el agente de selección (por ejemplo, imidazolinona, pero se pueden utilizar varios marcadores de selección). Las placas de Petri se incuban a la luz a 25 °C durante 2-3 semanas o hasta que se desarrollan los brotes. Los brotes verdes se transfieren de cada embrión al medio de enraizamiento y se incuban a 25 °C durante 2-3 semanas, hasta que se desarrollan las raíces. Los brotes con raíces se trasplantan al suelo en el invernadero. Las semillas T1 se producen a partir de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una única copia del inserto de T-ADN.

Transformación de soja La soja se transforma de acuerdo con una modificación del método descrito en la patente US 5.164.310 de Texas A&M. Diversas variedades de soja comercial son susceptibles de transformación con este método. Habitualmente, se usa el cultivar Jack (disponible de Illinois Seed foundation) para la transformación. Las semillas de soja se esterilizan para la siembra in vitro. Se extraen el hipocotilo, la radícula y un cotiledón de plántulas jóvenes de siete días. El epicotilo y el cotiledón restante se cultivan adicionalmente para que desarrollen nódulos axilares. Estos nódulos axilares se extraen y se incuban con Agrobacterium tumefaciens que contiene el vector de expresión. Después del tratamiento de cocultivo, los explantes se lavan y se transfieren al medio de selección. Los brotes regenerados se extraen y se colocan en un medio de alargamiento de brotes. Los brotes cuya longitud no excede 1 cm se colocan en medio de enraizamiento hasta que se desarrollan las raíces. Los brotes con raíces se trasplantan al suelo en el invernadero. Las semillas T1 se producen a partir de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una única copia del inserto de T-ADN.

Transformación de colza/canola Los pecíolos cotiledonarios y los hipocotilos de plántulas jóvenes de 5-6 días se utilizan como explantes para el cultivo de tejido y se transforman de acuerdo con Babic et al. (1998, Plant Cell Rep 17: 183-188). El cultivar comercial Westar (Agriculture Canadá) es la variedad estándar que se utiliza para la transformación, pero también se pueden utilizar otras variedades. Las semillas de cañóla se esterilizan en superficie para la siembra in vitro. Los explantes de pecíolos cotiledonarios con el cotiledón unido se extraen de las plántulas in vitro y se inoculan con Agrobacterium (que contiene el vector de expresión) sumergiendo el extremo cortado del explante del pecíolo en la suspensión bacteriana. Los explantes luego se cultivan durante 2 días en medio MSBAP-3 que contiene 3 mg/l de BAP, 3 % de sacarosa, 0,7 % de Phytagar a 23 °C, 16 horas de luz. Después de dos días de cocultivo con Agrobacterium, los explantes de pecíolos se transfieren a medio MSBAP-3 que contiene 3 mg/l de BAP, cefotaxima, carbenicilina o timentina (300 mg/l) durante 7 días, y luego se cultivan en medio MSBAP-3 con cefotaxima, carbenicilina o timentina y agente de selección hasta la regeneración de los brotes. Cuando los brotes tienen 5 - 10 mm de longitud, se los corta y transfiere a medio de alargamiento de brotes (MSBAP-0,5, que contiene 0,5 mg/l de BAP). Los brotes de alrededor de 2 cm de longitud se transfieren al medio de enraizamiento (MSO) para la inducción de raíces. Los brotes con raíces se trasplantan al suelo en el invernadero. Las semillas T1 se producen a partir de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una única copia del inserto de T-ADN.

Transformación de alfalfa Se transforma un clon regenerador de alfalfa (Medicago sativa) con el método de (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839-847). La regeneración y transformación de alfalfa dependen del genotipo y, por lo tanto, se requiere una planta regeneradora. Se han descrito métodos para obtener plantas regeneradoras. Por ejemplo, éstas se pueden seleccionar del cultivar Rangelander (Agriculture Canadá) o de cualquier otra variedad de alfalfa comercial como se describe en Brown DCW y A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111-112). Alternativamente, se seleccionó la variedad RA3 (Universidad de Wisconsin) para usar en el cultivo de tejidos (Walker et al., 1978 Am J Bot 65:654-659). Los explantes de pecíolos se cocultivan, durante la noche, con un cultivo de C58C1 pMP90 de Agrobacterium tumefaciens (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839-847) o LBA4404 que contiene el vector de expresión. Los explantes se cocultivan durante 3 días en la oscuridad en medio de inducción SH que contiene 288 mg/L de Pro, 53 mg/L de tioprolina, 4,35 g/L de K2S04 y 100 pm de acetosiringinona. Los explantes se lavan en medio Murashige-Skoog de concentración media (Murashige and Skoog, 1962) y se colocan en placas en el mismo medio de inducción SH sin acetosiringinona pero con un agente de selección adecuado y antibiótico adecuado para inhibir el crecimiento de Agrobacterium. Después de varias semanas, los embriones somáticos se transfieren a medio de desarrollo BOÍ2Y que no contiene reguladores del crecimiento, ni antibióticos y 50 g/L de sacarosa. Posteriormente, los embriones somáticos se germinan en medio Murashige-Skoog de concentración media. Las plántulas con raíces se trasplantan a macetas y se cultivan en un invernadero. Las semillas T1 se producen a partir de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una única copia del inserto de T-ADN.

Transformación de algodón El algodón se transforma con Agrobacterium tumefaciens de acuerdo con el método descrito en US 5.159.135. Las semillas de algodón se esterilizan en superficie en 3% de solución de hipoclorito de sodio durante 20 minutos y se lavan en agua destilada con 500 pg/ml de cefotaxima. Luego se transfieren las semillas al medio SH con 50 pg/ml de benomilo para la germinación. Se extraen los hipocotilos de las plántulas que tienen de 4 a 6 días, se los corta en trozos de 0,5 cm y se los coloca en 0,8% de agar. Se usa una suspensión de Agrobacterium (aprox. 108 células por mi, diluidas de un cultivo de toda la noche transformado con el gen de interés y marcadores de selección adecuados) para la inoculación de los explantes de hipocotilos. Luego de 3 días a temperatura ambiente y luz, los tejidos se transfieren a un medio sólido (1 ,6 g/l de Gelrite) con sales Murashige y Skoog con vitaminas B5 (Gamborg et al., Exp. Cell Res. 50:151-158 (1968)), 0,1 mg/l de 2,4-D, 0,1 mg/l de 6-furfurilaminopurina y 750 pg/ml de MgCL2, y con 50 a 100 pg/ml de cefotaxima y 400-500 pg/ml de carbenicilina para eliminar las bacterias residuales. Se aislan las líneas celulares individuales luego de dos a tres meses (con subcultivos cada cuatro a seis semanas) y se cultivan adicionalmente en un medio selectivo para la amplificación del tejido (30°C, fotoperíodo de 16 horas). Posteriormente, los tejidos transformados se cultivan adicionalmente en medio no selectivo durante 2 a 3 meses para que se generen embriones somáticos. Los embriones de aspecto saludable de al menos 4 mm de longitud se transfieren a tubos con medio SH en vermiculita fina, suplementado con 0,1 mg/l de ácido indol acético, 6 furfurilaminopurina y ácido giberélico. Los embriones se cultivan a 30°C con un fotoperíodo de 16 horas, y los plantines en la etapa de 2 a 3 hojas se transfieren a macetas con vermiculita y nutrientes. Las plantas se vuelven más resistentes y posteriormente se las transfiere al invernadero para continuar el cultivo.

Transformación de la remolacha azucarera Las semillas de la remolacha azucarera (Beta vulgarís L.) se esterilizan en 70% de etanol durante un minuto, seguido de 20 min. con agitación en 20% de lejía de hipoclorito, por ejemplo, lejía regular Clorox® (disponible en el comercio de Clorox, 1221 Broadway, Oakland, CA 94612, EEUU). Las semillas se enjuagan con agua estéril y se secan con aire, seguido de la colocación en placas en un medio de germinación (medio basado en Murashige and Skoog (MS)) (véase Murashige, T., and Skoog, ., 1962. A revised médium for rapid growth and bioassays with tobáceo tissue cultures. Physiol. Plant, vol. 15, 473-497) que incluye vitaminas B5 (Gamborg et al.; Nutrient requirements of suspensión cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res., vol. 50, 151-8.) suplementado con 10 g/l de sacarosa y 0,8% de agar). Básicamente, el tejido de los hipocotilos se usa para la iniciación de cultivos de brotes de acuerdo con Hussey and Hepher (Hussey, G., and Hepher, A., 1978. Clonal propagation of sugarbeet plants and the formation of polylpoids by tissue culture. Annals of Botany, 42, 477-9) y se mantienen en un medio basado en MS suplementado con 30g/l de sacarosa más 0,25mg/l de becilamino purina y 0,75% de agar, pH 5,8 a 23-25°C, con un fotoperíodo de 16 horas.

La cepa de Agrobactérium tumefaciens que tiene un plásmido binario que alberga un gen del marcador seleccionable, por ejemplo, nptil, se usa en los experimentos de transformación. Un día antes de la transformación, se desarrolla un cultivo líquido de LB, que incluye antibióticos, en un agitador (28°C, 150 rpm) hasta alcanzar una densidad óptica (O.D.) a 600 nm de ~1. Los cultivos bacterianos desarrollados durante la noche se centrifugan y resuspenden en un medio de inoculación (O.D. -1 ) que incluye Acetosyringone, pH 5,5.

El tejido a base de brotes se corta en rodajas (1 ,0 cm x 1 ,0 cm x 2,0 mm aproximadamente). El tejido se sumerge durante 30 segundos en un medio líquido de inoculación bacteriana. El exceso de líquido se retira mediante secado con papel de filtro. El cocultivo ocurre durante 24-72 horas en un medio basado en MS, que incluye 30g/l de sacarosa, seguido de un período no selectivo, que incluye el medio basado en MS, 30g/l de sacarosa con 1 mg/l de BAP para inducir el desarrollo de brotes y cefotaxim para eliminar Agrobactérium. Luego de 3-10 días, los explantes se transfieren a un medio selectivo similar que alberga, por ejemplo, canamicina o G418 (50-100 mg/l dependiente de genotipo).

Los tejidos se transfieren a un nuevo medio cada 2-3 semanas para mantener la presión de selección. La muy rápida iniciación de los brotes (luego de 3-4 días) indica la regeneración de meristemas existentes, en lugar de la organogénesis de meristemas transgénicos recién desarrollados. Los brotes pequeños se transfieren luego de varias rondas de subcultivo al medio de inducción de raíces que contiene 5 mg/l de NAA y canamicina o G418. Se realizan etapas adicionales para reducir el potencial de generar plantas transformadas que sean quiméricas (parcialmente transgénicas). Las muestras de tejido de los brotes regenerados se usan para el análisis de ADN.

Otros métodos de transformación de la remolacha azucarera se conocen en el arte, por ejemplo, los de Linsey & Gallois (Linsey, K., and Gallois, P., 1990. Transformation of sugarbeet (Beta vulgaris) by Agrobactérium tumefaciens. Journal of Experimental Botany; vol. 41 , No. 226; 529-36) o los métodos publicados en la solicitud internacional publicada como W09623891A.

Transformación de la caña de azúcar Los husos se aislan de plantas de caña de azúcar de 6 meses cultivadas en el campo (véase Arencibia A., at al., 1998. An efficient protocol for sugarcane (Saccharum spp. L.) transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens. Transgenic Research, vol. 7, 213-22; Enriquez-Obregon G., et al. , 1998. Herbicide-resistant sugarcane (Saccharum officinarum L.) plants by Agrabacterium-mediated transformation. Planta, vol. 206, 20-27). El material se esteriliza por inmersión en 20% de lejía de hipoclorito, por ejemplo, lejía regular Clorox® (disponible en el comercio de Clorox, 1221 Broadway, Oakland, CA 94612, EEUU) durante 20 minutos. Las secciones transversales de alrededor de 0,5 cm se colocan en el medio en la dirección de relleno. El material vegetal se cultiva durante 4 semanas en un medio basado en MS (Murashige, T., and Skoog, ., 1962. A revised médium for rapid growth and bioassays with tobáceo tissue cultures. Physiol. Plant, vol. 15, 473-497), que incluye vitaminas B5 (Gamborg, O., et al., 1968. Nutrient requirements of suspensión cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res., vol. 50, 151-8) suplementado con 20g/l de sacarosa, 500 mg/l de hidrolisato de caseína, 0,8% de agar y 5mg/l de 2,4-D a 23°C en la oscuridad. Los cultivos se transfieren luego de 4 semanas a un nuevo medio idéntico.

La cepa de Agrobacterium tumefaciens que tiene un plásmido binario que alberga un gen del marcador seleccionare, por ejemplo, hpt, se usa en los experimentos de transformación. Un día antes de la transformación, se desarrolla un cultivo líquido de LB, que incluye antibióticos, en un agitador (28°C, 150 rpm) hasta alcanzar una densidad óptica (O.D.) a 600 nm de -0,6. Los cultivos bacterianos desarrollados durante la noche se centrifugan y resuspenden en un medio de inoculación basado en MS (O.D. -0,4) que incluye acetosyringone, pH 5,5.

Los trozos de callos embriogénicos de caña de azúcar (2-4 mm) se aislan sobre la base de las características morfológicas como estructura compacta y color amarillo, y se secan durante 20 minutos en la campana de flujo, seguido de inmersión en un medio líquido de inoculación bacteriana durante 10-20 minutos. El exceso de líquido se retira mediante secado con papel de filtro. El cocultivo ocurre durante 3-5 días en la oscuridad sobre papel de filtro, que se coloca en la parte superior del medio basado en MS, que incluye vitaminas B5, que contiene 1 mg/l de 2,4-D. Luego del cocultivo, los callos se enjuagan con agua estéril, seguido de un período no selectivo en un medio similar que contiene 500 mg/l de cefotaxime para eliminar Agrobacterium. Luego de 3-10 días, los explantes se transfieren al medio selectivo basado en MS, que incluye vitaminas B5, que contiene 1 mg/l de 2,4-D, durante otras 3 semanas y que alberga 25 mg/l de higromicina (dependiente de genotipo). Todos los tratamientos se realizan a 23°C en condiciones de oscuridad.

Los callos resistentes también se cultivan en un medio que carece de 2,4-D, que incluye 1 mg/l de BA y 25 mg/l de higromicina, en un fotoperíodo de 16 h de luz; esto genera el desarrollo de estructuras de brotes. Los brotes se aislan y cultivan en un medio selectivo de enraizamiento (basado en MS, que incluye 20g/l de sacarosa, 20 mg/l de higromicina y 500 mg/l de cefotaxime).

Las muestras de tejido de los brotes regenerados se usan para el análisis de ADN. Otros métodos de transformación de la caña de azúcar se conocen en el arte, por ejemplo, de la solicitud internacional publicada como WO2010/151634A y la patente europea concedida EP1831378.

Ejemplo 8: Procedimiento de evaluación fenotípica 8.1 Preparación de la evaluación Se generaron aproximadamente 35 transformantes de arroz T0 independientes. Los transformantes primarios se transfirieron de una cámara de cultivo de tejidos a un invernadero para el cultivo y la cosecha de la semilla T1. Se retuvieron seis eventos, de los cuales la progenie de T1 segregó 3:1 para la presencia/ausencia del transgén. Para cada uno de estos eventos, se seleccionaron aproximadamente 10 plántulas T1 que contenían el transgén (heterocigotas y homocigotas) y aproximadamente 10 plántulas T1 que no tenían el transgén (nulicigotas) mediante el control de la expresión del marcador visual. Las plantas transgénicas y los correspondientes nulicigotas se cultivaron lado a lado en posiciones al azar. Las condiciones del invernadero fueron de días cortos (12 horas de luz), 28°C a la luz y 22°C en la oscuridad y humedad relativa de 70%.

Desde la etapa de siembra hasta la etapa de madurez, las plantas se pasaron varias veces a través de un gabinete de formación de imágenes digitales. En cada punto de tiempo, se tomaron imágenes digitales (2048x1536 píxeles, 16 millones de colores) de cada planta desde al menos 6 ángulos diferentes.

Control de sequía Se cultivan plantas de semillas T2 en tierra para maceta en condiciones normales hasta que alcanzan la etapa de espigazón. Luego se las transfiere a una sección "seca" donde dejan de recibir irrigación. Se insertan sondas de humedad en macetas elegidas al azar para controlar el contenido de agua en el suelo (SWC). Cuando el SWC es inferior a ciertos umbrales, las plantas se riegan nuevamente de forma automática y continua hasta alcanzar de nuevo un nivel normal. A continuación, las plantas se transfieren nuevamente a condiciones normales. El resto del proceso de cultivo (maduración de la planta, cosecha de semillas) es igual que para las plantas no cultivadas en condiciones de estrés abiótico. Los parámetros de crecimiento y rendimiento se registran como se detalla para el crecimiento en condiciones normales.

Control de la eficacia en el uso de nitrógeno Se cultivaron plantas de arroz de semillas T1 en tierra para maceta en condiciones normales excepto por la solución de nutrientes. Las macetas se regaron, desde que son trasplantadas hasta su maduración, con una solución de nutrientes específica con contenido reducido de nitrógeno (N) N, usualmente de 7 a 8 veces menos. El resto del proceso de cultivo (maduración de la planta, cosecha de semillas) fue igual que para las plantas no cultivadas en condiciones de estrés abiótico. Los parámetros de crecimiento y rendimiento se registraron tal como se detalló para el crecimiento en condiciones normales.

Control de estrés salino Las plantas se cultivan en un substrato hecho de fibras de coco y argex (proporción 3 a 1 ). Se usa una solución normal de nutrientes durante las primeras dos semanas luego de trasplantar los plantines al invernadero. Luego de las dos primeras semanas, se agregan 25 mM de sal (NaCI) a la solución de nutrientes hasta que se cosechan las plantas. Luego se miden los parámetros relacionados con las semillas. 8.2 Análisis estadístico: Prueba F Se utilizó ANOVA (análisis de variantes) de dos factores como modelo estadístico para la evaluación total de las características fenotípicas de la planta. Se realizó una prueba F en todos los parámetros medidos de todas las plantas de todos los eventos transformados con el gen de la presente invención. La prueba F se realizó para controlar el efecto del gen en todos los eventos de transformación y para verificar el efecto total del gen, también conocido como efecto global del gen. El umbral de significancia para un efecto global y verdadero del gen se fijó en un nivel de probabilidad de 5% para la prueba F. Un valor significativo de la prueba F indica un efecto del gen, es decir que no es sólo la mera presencia o posición del gen lo que causa las diferencias en el fenotipo. 8.3 Parámetros medidos Medición de parámetros relacionados con la biomasa Desde la etapa de siembra hasta la etapa de madurez, las plantas se pasaron varias veces a través de un gabinete de formación de imágenes digitales. En cada punto de tiempo, se tomaron imágenes digitales (2048x1536 píxeles, 16 millones de colores) de cada planta desde al menos 6 ángulos diferentes.

Se determinó el área aérea de la planta (o biomasa del follaje) al contar la cantidad total de píxeles en las imágenes digitales de las partes aéreas de las plantas diferenciadas del fondo. Este valor se promedió para las fotos tomadas en el mismo punto de tiempo desde los diferentes ángulos y se convirtió a un valor de superficie física expresado en mm cuadrados por calibración. Los experimentos muestran que el área aérea de la planta medida de este modo se correlaciona con la biomasa de las partes aéreas de la planta. El área aérea es el área medida en el punto de tiempo en el cual la planta ha alcanzado su máxima biomasa de follaje. El vigor temprano es el área aérea de la planta (plántula) tres semanas posteriores a la germinación. El aumento en la biomasa de la raíz se expresa como un aumento en la biomasa total de la raíz (medida como la biomasa máxima de las raíces observada durante el ciclo de vida de una planta); o como un aumento en el índice de raíz/brote (medido como la relación entre la masa de la raíz y la masa del brote durante el período de crecimiento activo de la raíz y del brote).

El vigor temprano se determina contando la cantidad total de píxeles de las partes aéreas de las plantas diferenciadas del fondo. Este valor se promedia para las fotos tomadas en el mismo punto de tiempo desde diferentes ángulos y se convierte a un valor de superficie física expresado en mm cuadrados por calibración.

Medición de parámetros relacionados con las semillas Las panículas primarias maduras se cosecharon, contaron, embolsaron, rotularon con códigos de barras y luego se secaron durante tres días en un horno a 37°C. Luego se trillaron las panículas, y se recogieron y contaron todas las semillas. Las cáscaras llenas se separaron de las vacías con un dispositivo de soplado de aire. Las cáscaras vacías se descartaron y la fracción restante se contó nuevamente. Las cáscaras llenas se pesaron en una balanza analítica. La cantidad de semillas llenas se determinó al contar la cantidad de cáscaras llenas que permanecieron después de la etapa de separación. El rendimiento total de las semillas se midió pesando todas las cáscaras llenas cosechadas de una planta. La cantidad total de semillas por planta se midió al contar la cantidad de cáscaras cosechadas de una planta. El peso de mil granos (TKW) se extrapola a partir de la cantidad de semillas llenas contadas y su peso total. El índice de cosecha (Hl) en la presente invención se define como la relación entre el rendimiento total de la semilla y el área aérea (mm2), multiplicado por un factor 106. La cantidad total de flores por panícula, como se define en la presente invención, es la relación entre la cantidad total de semillas y la cantidad de panículas primarias maduras. La tasa de llenado de semillas, como se define en la presente invención, es la proporción (expresada como %) de la cantidad de semillas llenas con respecto a la cantidad total de semillas (o florcillas).

Ejemplo 9: Resultados de la evaluación fenotípica de las plantas transgénicas Los resultados de la evaluación de las plantas transgénicas de arroz que expresan un ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 2 en condiciones de limitación de nitrógeno se indican a continuación (Tabla B). Véase los Ejemplos previos para detalles de las generaciones de las plantas transgénicas.

Se observó un aumento de al menos 5 % para la biomasa aérea (Área máx.), biomasa total de raíz (Raíz máx.), cantidad de florcillas de una planta (cant. total de semillas, verdor de una planta antes de la floración (GNbfFIow), cantidad de panículas en el primer brote (primera panícula), cantidad de flores por panícula (flor por panícula), altura de la planta (Gravedad máx.), cantidad de raíces delgadas (Delgadez máx.).

Tabla B: Síntesis de datos de las plantas transgénicas de arroz; se muestra el porcentaje de aumento total, y para cada parámetro, el valor p es <0,05 y superior al 5% del umbral.

Ejemplo 10: Identificación de secuencias relacionadas con SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30 Se identificaron secuencias (de cADN de longitud completa, EST o genómicas) relacionadas con SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30 entre aquellas que se mantienen en la base de datos Entrez Nucleotides en el National Center for Biotechnology Information (NCBI) mediante el uso de herramientas de búsqueda de secuencias en base de datos, tales como Basic Local Alignment Tool (BLAST) (AltschuI et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; y AltschuI et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402). El programa se usa para encontrar regiones de similitud local entre secuencias mediante la comparación de secuencias de ácidos nucleicos o poiipéptidos con bases de datos de secuencias y mediante el cálculo de la importancia estadística de las coincidencias. Por ejemplo, el polipéptido codificado por el ácido nucleico de SEQ ID NO: 29 se usó para el algoritmo TBLASTN, con parámetros predeterminados, y se activó el filtro para ignorar las secuencias de baja complejidad. El resultado del análisis se examinó mediante comparación de a pares y se lo calificó de acuerdo con el puntaje de probabilidad (valor E), donde el puntaje refleja la probabilidad de que un alineamiento en particular se produzca al azar (cuanto menor es el valor E, más importante es la coincidencia). Además de los valores E, las comparaciones también se calificaron por porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad se refiere a la cantidad de nucleótidos (o aminoácidos) idénticos entre las dos secuencias de ácidos nucleicos (o poiipéptidos) comparadas a lo largo de una longitud particular. En algunos casos, los parámetros predeterminados se pueden ajustar para modificar la rigurosidad de la búsqueda. Por ejemplo, se puede aumentar el valor E para mostrar coincidencias menos rigurosas. De este modo, se pueden identificar coincidencias cortas casi exactas.

La Tabla C provee una lista de ácidos nucleicos y poiipéptidos del inhibidor de Bax 1.

Tabla C: Ejemplos de poiipéptidos y ácidos nucleicos inhibidores de Bax 1: Las secuencias se unieron tentativamente y se revelaron al público mediante institutos de investigación, tales como The Institute for Genomic Research (TIGR; comenzando con TA). La base de datos Eukaryotic Gene Orthologs (EGO) se puede usar para identificar dichas secuencias relacionadas, ya sea por búsqueda de palabra clave o usando el algoritmo BLAST con la secuencia de ácidos nucleicos o secuencia de polipéptidos de interés. Se crearon bases de datos especiales de secuencias de ácidos nucleicos para organismos particulares, como por ejemplo, mediante el Joint Genome Institute. Asimismo, el acceso a bases de datos registradas permite la identificación de nuevas secuencias de polipéptidos y ácidos nucleicos.

Ejemplo 11: Alineamiento de secuencias de polipéptidos BI-1 El alineamiento de secuencias de polipéptidos se realizó con el programa MUSCLE 3.7 (Edgar, Nucleic Acids Research 32, 1792-1797, 2004). Los valores predeterminados son para la penalidad por apertura de brecha de 10, para la penalidad por extensión de brecha de 0,1 y la matriz de peso seleccionada es Blosum 62 (si los polipéptidos están alineados). Se realizó edición manual menor para optimizar adicionalmente el alineamiento. Los polipéptidos BI-1 se alinean en las Figuras 6 y 7. La Figura 6 representa un alineamiento múltiple de varios polipéptidos BI-1 que pertenecen al grupo RA/BI-1, la Figura 7 representa un alineamiento múltiple de varios polipéptidos BI-1 que pertenecen al grupo EC/BI-1.

Se construyó un árbol filogenético de polipéptidos BI-1 (Figura 8). Se alinearon las proteínas con MUSCLE (Edgar (2004), Nucleic Acids Research 32(5): 1792-97). Se calculó un árbol de unión a vecino con QuickTree1.1 (Howe et al. (2002). Bioinformatics 18(1 1 ): 1546-7). Se dibujó un cladograma circular sesgado con Dendroscope 2.0.1 (Huson et al. (2007). Bioinformatics 8(1 ):460). At e=1e-40, se recuperaron los tres genes relacionados con BI-1 de Arabidopsis. El árbol se generó con miembros representativos de cada grupo.

Ejemplo 12: Cálculo del porcentaje de identidad global entre las secuencias de polipéptidos Los porcentajes globales de similitud e identidad entre secuencias de polipéptidos de longitud completa útiles para realizar los métodos de la invención se determinaron mediante uno de los métodos disponibles en el arte, el software MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) (BMC Bioinformatics. 2003 4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein o DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; software albergado por Ledion Bitincka). El software MatGAT genera matrices de similitud/identidad para las secuencias de ADN o proteínas sin que se necesario el prealineamiento de datos. El programa realiza una serie de alineamientos de a pares usando el algoritmo de alineamiento global de Myers y Miller (con una penalidad por apertura de brecha de 12 y una penalidad por extensión de brecha de 2), calcula la similitud e identidad usando, por ejemplo, Blosum 62 (para polipéptidos) y luego ingresa los resultados en una matriz de distancia.

Los resultados del análisis con software se indican en la Figura 9 para la similitud e identidad global de las secuencias de polipéptidos de longitud completa. La similitud de secuencia se muestra en la mitad inferior de la línea divisoria y la identidad de secuencia se muestra en la mitad superior de la línea diagonal divisoria. Los parámetros que se usaron en la comparación fueron: Matriz de calificación: Blosum62, Primera brecha: 12, Brecha de extensión: 2. En general, la identidad de secuencia (en %) entre las secuencias de polipéptidos BI-1 útiles para realizar los métodos de la invención es mayor de 36%, en comparación con SEQ ID NO: 30 y puede aumentar hasta 85%.

Con referencia a la Figura 9, los números de ID indicados corresponden a las siguientes secuencias: Ejemplo 13: Identificación de dominios comprendidos en secuencias de polipéptidos útiles para la realización de los métodos de la invención La base de datos Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites (InterPro) es una interfaz integrada para las bases de datos de firmas que se utilizan habitualmente para búsquedas basadas en texto y en secuencias. La base de datos InterPro combina estas bases de datos, que utilizan diferentes metodologías y diversos grados de información biológica sobre proteínas bien caracterizadas, para derivar firmas de proteínas Las bases de datos que colaboran incluyen SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS, ProDom y Pfam, Smart y TIGRFAM. Pfam es una gran colección de alineamientos de secuencias múltiples y modelos Markov ocultos que abarcan muchos dominios y familias de proteínas comunes. Pfam se encuentra en el servidor de Sanger Institute en el Reino Unido. InterPro se encuentra en el European Bioinformatics Institute en el Reino Unido.

Los resultados de la búsqueda por InterPro de la secuencia de polipéptidos representada por SEQ ID NO: 30 se indican en la Tabla D.

Tabla D: Resultados de la búsqueda por InterPro (números de acceso principales) de la secuencia de polipéptidos representada por SEQ ID NO: 30.

Ejemplo 14: Ensayo funcional para el polipéptido BI-1 Fue demostrado por Nagano et al. (2009 Plant J., 58(1 ): 122-134) que los polipéptidos BI-1 interactúan con AtCb5. Nagano et al. identificaron el citocromo b(5) (AtCb5) de Arabidopsis como interactor de BI-1 (AtBI-1) de Arabidopsis mediante el análisis de la biblioteca de cADN de Arabidopsis con el sistema de dos híbridos de levadura split-ubiquitina (suY2H). Cb5 es una proteína de transferencia de electrones que se ubica principalmente en la membrana de ER. Además, el ensayo de Complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC) y el análisis de Transferencia de energía fluorescente por resonancia (FRET) confirmaron que AtBI-1 interactuaba con AtCb5 en las plantas. Nagano et al. también demostraron que la supresión de la muerte celular mediada por AtBI en la levadura requiere hidroxilasa de ácido graso 1 de Saccharomyces cerevisiae (ScFAHI), que tiene un dominio tipo Cb5 en el terminal N e interactúa con AtBI-1. La ScFAHI es una hidroxilasa de ácido graso esfingolípido 2 que se ubica en la membrana de ER. Por el contrario, AtFAHI y AtFAH2, que son homólogos funcionales de ScFAHI en Arabidopsis, no tenían ningún dominio tipo Cb5 y, en cambio, interactuaban con AtCb5 en las plantas. Nagano et al. también describieron que AtBI-1 interactúa con AtFAH mediante AtCb5 en las células vegetales.

Ejemplo 15: Clonación de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican BI-1 15.1 Ejemplo 1 En este ejemplo, la secuencia de ácidos nucleicos se amplificó por PCR usando como molde una biblioteca de cADN de plántulas de Populus trichocarpa personalizada (en pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, UK). Se realizó PCR con ADN polimerasa Hifi Taq en condiciones estándar, con 200 ng de molde en 50 µ? de mezcla PCR. Los cebadores utilizados fueron prm12053 (SEQ ID NO: 125; sentido): 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggaatcgttcgcttcc-3' y prm12054 (SEQ ID NO: 126; inverso, complementario): 5 -ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcgagca catagtcagtcttcc-3', que incluyen los sitios AttB para la recombinación Gateway. El fragmento de PCR amplificado se purificó también mediante métodos estándar. Luego se realizó la primera etapa del procedimiento Gateway, la reacción BP, durante la cual el fragmento PCR se recombinó in vivo con el plásmido pDONR201 para producir, de acuerdo con la terminología de Gateway, un "clon de entrada", pBI-1. El plásmido pDONR201 se compró a Invitrogen, como parte de la tecnología Gateway®.

El clon de entrada que comprende SEQ ID NO: 29 luego se usó en una reacción LR con un vector de destino usado para la transformación de Oryza sativa. Este vector contenía como elementos funcionales dentro de los límites de T-ADN: un marcador seleccionare vegetal; un cásete de expresión del marcador controlable; y un cásete Gateway para la recombinación LR in vivo con la secuencia de ácidos nucleicos de interés ya clonada en el clon de entrada Un promotor GOS2 del arroz (SEQ ID NO: 153) para la expresión constitutiva especifica se ubicó comente arriba de este cásete de Gateway.

Después de la etapa de recombinación LR, el vector de expresión resultante pGOS2::BI-1 (Figura 10) se transformó en la cepa LBA4044 de Agrobacterium de acuerdo con los métodos conocidos en el arte. 15.2 Ejemplo 2 En este ejemplo, la secuencia de ácidos nucleicos se amplificó por PCR usando como molde una biblioteca de cADN de plántulas de Oryza sativa personalizada (en pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, UK). Se realizó PCR con ADN polimerasa Hifi Taq en condiciones estándar, con 200 ng de molde en 50 µ? de mezcla PCR. Los cebadores utilizados fueron prm 14082 (SEQ ID NO: 127; sentido): 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggacgccttctactcgac-3' y prm 14083 (SEQ ID NO: 128; inverso, complementario): 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcgggaagagaag ctctcaag-3', que incluyen los sitios AttB para la recombinación Gateway. El fragmento de PCR amplificado se purificó también mediante métodos estándar. Luego se realizó la primera etapa del procedimiento Gateway, la reacción BP, durante, la cual el fragmento PCR se recombinó in vivo con el plásmido pDONR201 para producir, de acuerdo con la terminología de Gateway, un "clon de entrada", pBI-lo. El plásmido pDONR201 se compró a Invitrogen, como parte de la tecnología Gateway®.

El clon de entrada que comprende SEQ ID NO: 31 luego se usó en una reacción LR con un vector de destino usado para la transformación de Oryza sativa. Este vector contenía como elementos funcionales dentro de los límites de T-ADN: un marcador seleccionare vegetal; un cásete de expresión del marcador controlable; y un cásete Gateway para la recombinación LR in vivo con la secuencia de ácidos nucleicos de interés ya clonada en el clon de entrada Un promotor GOS2 del arroz (SEQ ID NO: 153) para la expresión constitutiva especifica se ubicó corriente arriba de este cásete de Gateway.

Después de la etapa de recombinación LR, el vector de expresión resultante pGOS2:BI-1o (Figura 10) se transformó en la cepa LBA4044 de Agrobacterium de acuerdo con los métodos conocidos en el arte. El vector fue similar al vector representado en la Figura 5, excepto por la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido Bl-1.

Ejemplo 16: Transformación de plantas Transformación de arroz El Agrobacterium que contiene los vectores de expresión (véanse los ejemplos 15.1 y 15.2) se usaron para transformar plantas de Oryza sativa. Se quitaron las cáscaras de las semillas secas maduras del cultivar de arroz japonés Nipponbare. Se realizó la esterilización mediante la incubación durante un minuto en 70% de etanol, seguido por 30 minutos en 0,2% de HgCI2, seguido por 6 lavados de 15 minutos con agua destilada estéril. Las semillas estériles luego se germinaron en un medio que contenía 2,4-D (medio de inducción de callos). Después de la incubación en la oscuridad durante cuatro semanas, se extrajeron callos embriogénicos, derivados de escutelo, y se propagaron en el mismo medio. Después de dos semanas, los callos se multiplicaron o se propagaron por subcultivo en el mismo medio durante otras 2 semanas. Las piezas de callos embriogénicos se subcultivaron en medio fresco 3 días antes del cocultivo (para estimular la actividad de división celular).

Ejemplo 17: Transformación de otros cultivos Transformación de maíz La transformación del maíz (Zea mays) se realiza con una modificación del método descrito por Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14(6): 745-50. La transformación depende del genotipo en el maíz y sólo genotipos específicos pueden ser transformados y regenerados. La línea endogámica A188 (Universidad de Minnesota) o los híbridos con A188 como progenitor son una buena fuente de material donante para la transformación, pero también se pueden utilizar exitosamente otros genotipos. Las espigas se cosechan de la planta de maíz aproximadamente 11 días después de la polinización (DAP) cuando el embrión inmaduro tiene una longitud de alrededor de 1 a 1 ,2 mm. Los embriones inmaduros se cocultivan con Agrobacterium tumefaciens que contiene el vector de expresión, y las plantas transgénicas se recuperan por medio de organogénesis. Los embriones extraídos se cultivan en medio de inducción de callos, luego en medio de regeneración de maíz, que contiene el agente de selección (por ejemplo, imidazolinona, pero se pueden utilizar varios marcadores de selección). Las placas de Petri se incuban a la luz a 25 °C durante 2-3 semanas o hasta que se desarrollan los brotes. Los brotes verdes se transfieren de cada embrión al medio de enraizamiento de maíz y se incuban a 25 °C durante 2-3 semanas, hasta que se desarrollan las raíces. Los brotes con raíces se trasplantan al suelo en el invernadero. Las semillas T1 se producen a partir de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una única copia del inserto de T-ADN.

Transformación de soja La soja se transforma de acuerdo con una modificación del método descrito en la patente US 5.164.310 de Texas A&M. Diversas variedades de soja comercial son susceptibles de transformación con este método. Habitualmente, se usa el cultivar Jack (disponible de Illinois Seed foundation) para la transformación. Las semillas de soja se esterilizan para la siembra ¡n vitro. Se extraen el hipocotilo, la radícula y un cotiledón de plántulas jóvenes de siete días. El epicotilo y el cotiledón restante se cultivan adicionalmente para que desarrollen nodulos axilares. Estos nodulos axilares se extraen y se incuban con Agrobacteríum tumefaciens que contiene el vector de expresión. Después del tratamiento de cocultivo, los explantes se lavan y se transfieren al medio de selección. Los brotes regenerados se extraen y se colocan en un medio de alargamiento de brotes. Los brotes cuya longitud no excede 1 cm se colocan en medio de enraizamiento hasta que se desarrollan las raices. Los brotes con raíces se trasplantan al suelo en el invernadero. Las semillas T1 se producen a partir de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una única copia del inserto de T-ADN.

Transformación de colza/canola Los pecíolos cotiledonarios y los hipocotilos de plántulas jóvenes de 5-6 días se utilizan como explantes para el cultivo de tejido y se transforman de acuerdo con Babic et al. (1998, Plant Cell Rep 17: 183-188). El cultivar comercial Westar (Agriculture Canadá) es la variedad estándar que se utiliza para la transformación, pero también se pueden utilizar otras variedades. Las semillas de cañóla se esterilizan en superficie para la siembra in vitro. Los explantes de pecíolos cotiledonarios con el cotiledón unido se extraen de las plántulas in vitro y se inoculan con Agrobacteríum (que contiene el vector de expresión) sumergiendo el extremo cortado del explante del pecíolo en la suspensión bacteriana. Los explantes luego se cultivan durante 2 días en medio MSBAP-3 que contiene 3 mg/l de BAP, 3 % de sacarosa, 0,7 % de Phytagar a 23 °C, 16 horas de luz. Después de dos días de cocultivo con Agrobacteríum, los explantes de pecíolos se transfieren a medio MSBAP-3 que contiene 3 mg/l de BAP, cefotaxima, carbenicilina o timentina (300 mg/l) durante 7 días, y luego se cultivan en medio MSBAP-3 con cefotaxima, carbenicilina o timentina y agente de selección hasta la regeneración de los brotes. Cuando los brotes tienen 5 - 10 mm de longitud, se los corta y transfiere a medio de alargamiento de brotes (MSBAP-0,5, que contiene 0,5 mg/l de BAP). Los brotes de alrededor de 2 cm de longitud se transfieren al medio de enraizamiento (MS0) para la inducción de raíces. Los brotes con raíces se trasplantan al suelo en el invernadero. Las semillas T1 se producen a partir de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen. una única copia del inserto de T-ADN.

Transformación de alfalfa Se transforma un clon regenerador de alfalfa (Medicago sativa) con el método de (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839-847). La regeneración y transformación de alfalfa dependen del genotipo y, por lo tanto, se requiere una planta regeneradora. Se han descrito métodos para obtener plantas regeneradoras. Por ejemplo, éstas se pueden seleccionar del cultivar Rangelander (Agriculture Canadá) o de cualquier otra variedad de alfalfa comercial como se describe en Brown DCW y A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111-112). Alternativamente, se seleccionó la variedad RA3 (Universidad de Wisconsin) para usar en el cultivo de tejidos (Walker et al., 1978 Am J Bot 65:654-659). Los explantes de pecíolos se cocultivan, durante la noche, con un cultivo de C58C1 pMP90 de Agrobacterium tumefaciens (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839-847) o LBA4404 que contiene el vector de expresión. Los explantes se cocultivan durante 3 días en la oscuridad en medio de inducción SH que contiene 288 mg/L de Pro, 53 mg/L de tioprolina, 4,35 g/L de K2S04 y 100 µ?? de acetosiringinona. Los explantes se lavan en medio Murashige-Skoog de concentración media (Murashige and Skoog, 1962) y se colocan en placas en el mismo medio de inducción SH sin acetosiringinona pero con un agente de selección adecuado y antibiótico adecuado para inhibir el crecimiento de Agrobacterium. Después de varias semanas, los embriones somáticos se transfieren a medio de desarrollo BOÍ2Y que no contiene reguladores del crecimiento, ni antibióticos y 50 g/L de sacarosa. Posteriormente, los embriones somáticos se germinan en medio Murashige-Skoog de concentración media. Las plántulas con raíces se trasplantan a macetas y se cultivan en un invernadero. Las semillas T1 se producen a partir de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una única copia del inserto de T-ADN.

Ejemplo 18: Procedimiento de evaluación fenotípica de las plantas de arroz 18.1 Preparación de la evaluación Se generaron aproximadamente 35 transformantes de arroz T0 independientes. Los transformantes primarios se transfirieron de una cámara de cultivo de tejidos a un invernadero para el cultivo y la cosecha de la semilla T1. Se retuvieron seis eventos, de los cuales la progenie de T1 segregó 3:1 para la presencia/ausencia del transgén. Para cada uno de estos eventos, se seleccionaron aproximadamente 10 plántulas T1 que contenían el transgén (heterocigotas y homocigotas) y aproximadamente 10 plántulas T1 que no tenían el transgén (nulicigotas) mediante el control de la expresión del marcador visual. Las plantas transgénicas y los correspondientes nulicigotas se cultivaron lado a lado en posiciones al azar. Las condiciones del invernadero fueron de días cortos (12 horas de luz), 28°C a la luz y 22°C en la oscuridad y humedad relativa de 70%. Las plantas cultivadas en condiciones sin estrés se regaron en intervalos regulares para asegurar que el agua y los nutrientes no fueran limitantes y para satisfacer las necesidades de las plantas.

Control de la eficacia en el uso de nitrógeno Se cultivan plantas de arroz de semillas T2 en tierra para maceta en condiciones normales excepto por la solución de nutrientes. Las macetas se riegan, desde que son trasplantadas hasta su maduración, con una solución de nutrientes específica con contenido reducido de nitrógeno N (N), usualmente de 7 a 8 veces menos. El resto del proceso de cultivo (maduración de la planta, cosecha de semillas) es igual que para las plantas no cultivadas en condiciones de estrés abiótico. Los parámetros de crecimiento y rendimiento se registran como se detalla para el crecimiento en condiciones normales. Control de estrés salino Las plantas se cultivan en un substrato hecho de fibras de coco y argex (proporción 3 a 1 ). Se usa una solución normal de nutrientes durante las primeras dos semanas luego de trasplantar los plantines al invernadero. Luego de las dos primeras semanas, se agregan 25 mM de sal (NaCI) a la solución de nutrientes hasta que se cosechan las plantas. Luego se miden los parámetros relacionados con las semillas. 18.2 Análisis estadístico: Prueba F Se utilizó ANOVA (análisis de variantes) de dos factores como modelo estadístico para la evaluación total de las características fenotípicas de la planta. Se realizó una prueba F en todos los parámetros medidos de todas las plantas de todos los eventos transformados con el gen de la presente invención. La prueba F se realizó para controlar el efecto del gen en todos los eventos de transformación y para verificar el efecto total del gen, también conocido como efecto global del gen. El umbral de significancia para un efecto global y verdadero del gen se fijó en un nivel de probabilidad de 5% para la prueba F. Un valor significativo de la prueba F indica un efecto del gen, es decir que no es sólo la mera presencia o posición del gen lo que causa las diferencias en el fenotipo. 18.3 Parámetros medidos Desde la etapa de siembra hasta la etapa de madurez, las plantas se pasaron varias veces a través de un gabinete de formación de imágenes digitales. En cada punto de tiempo, se tomaron imágenes digitales (2048x1536 píxeles, 16 millones de colores) de cada planta desde al menos 6 ángulos diferentes.

Medición de parámetros relacionados con la biomasa Se determinó el área aérea de la planta (o biomasa del follaje) al contar la cantidad total de píxeles en las imágenes digitales de las partes aéreas de las plantas diferenciadas del fondo. Este valor se promedió para las fotos tomadas en el mismo punto de tiempo desde los diferentes ángulos y se convirtió a un valor de superficie física expresado en mm cuadrados por calibración. Los experimentos muestran que el área aérea de la planta medida de este modo se correlaciona con la biomasa de las partes aéreas de la planta. El área aérea es el área medida en el punto de tiempo en el cual la planta ha alcanzado su máxima biomasa de follaje. El aumento en la biomasa de la raíz se expresa como un aumento en la biomasa total de la raíz (medida como la biomasa máxima de las raíces observada durante el ciclo de vida de una planta); o como un aumento en el índice de raíz/brote (medido como la relación entre la masa de la raíz y la masa del brote durante el período de crecimiento activo de la raíz y del brote).

Parámetros relacionados con el tiempo de desarrollo El vigor temprano es el área aérea de la planta (plántula) tres semanas posteriores a la germinación._EI vigor temprano se determinó al contar la cantidad total de píxeles de las partes aéreas de las plantas diferenciadas del fondo. Este valor se promedió para las fotos tomadas en el mismo punto de tiempo desde los diferentes ángulos y se convirtió a un valor de superficie física expresado en mm cuadrados por calibración.

El "tiempo de floración" de la planta se puede determinar con el método descrito en WO 2007/093444.

Ejemplo 19: Resultados de la evaluación fenotípica de las plantas transgénicas de arroz 19.1 Ejemplo 1 Los resultados de la evaluación de las plantas transgénicas de arroz en la generación T2 que expresan un ácido nucleico que codifica el polipéptido BI-1 de SEQ ID NO: 30 (véase el Ejemplo 15.1) en condiciones sin estrés se indican en la siguiente Tabla E. Cuando se cultivan en condiciones sin estrés, se observó un aumento de al menos el 5 % para la biomasa de raíz (Grosor máx. de raíz) y para el rendimiento de semillas, como se ilustra con el peso total de semillas, la cantidad de semillas llenas, la tasa de llenado y el índice de cosecha.

Tabla E: Síntesis de datos de las plantas transgénicas de arroz; para cada parámetro, se muestra el porcentaje de aumento total para la confirmación (generación T2), para cada parámetro el valor p es <0,05.

Grosor máx. de raíz 7,9 Además, las plantas que expresan dicho ácido nucleico BI-1 mostraron vigor temprano y un mayor preso de mil granos. 19.2 Ejemplo 2 Los resultados de otra evaluación de las plantas transgénicas de arroz en la generación T2 que expresan un ácido nucleico que codifica el polipéptido BI-1 de SEQ ID NO: 32 (véase el Ejemplo 15.2) en condiciones sin estrés se indican en la siguiente Tabla F. Cuando se cultivan en condiciones sin estrés, se observó un aumento de al menos el 5 % para el rendimiento de semillas, como se ilustra con el peso total de semillas, la tasa de llenado y el índice de cosecha.

Tabla F: Síntesis de datos de las plantas transgénicas de arroz; para cada parámetro, se muestra el porcentaje de aumento total para la confirmación (generación T2), para cada parámetro el valor p es <0,05.

Además, las plantas que expresan dicho ácido nucleico BI-1 mostraron vigor temprano, mayor peso de mil granos y mayor cantidad de semillas llenas.

Ejemplo 20: Plantas transgénicas de Arabidopsis que expresan una secuencia de ácidos nucleicos que codifican BI-1 Ejemplo 20.1 Preparación del constructo SEQ ID NO: 30 de Populus trichocarpa se amplificó mediante PCR como se describe en el protocolo de la ADN polimerasa PfuUltra (Stratagene). La composición para el protocolo de la ADN polimerasa PfuUltra fue la siguiente: 1 x PCR tampón, 0,2 mM de cada dNTP, 5 ng del plásmido pBI-1 (véase el Ejemplo 15.1 ) que contiene SEQ ID NO:30, 50 pmol del cebador directo, 50 pmol del cebador inverso, con o sin betaína 1 , 2,5 u de ADN polimerasa PfuUltra.

Los ciclos de amplificación fueron los siguientes: 1 ciclo con 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 61 °C, 15 minutos a 72°C, luego 2 ciclos con 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 60°C, 15 minutos a 72°C, luego 3 ciclos con 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 59°C, 15 minutos a 72°C, luego 4 ciclos con 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 58°C, 15 minutos a 72°C, luego 25 ciclos con 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 57°C, 15 minutos a 72°C, luego 1 ciclo con 10 minutos a 72°C y finalmente 4-16°C.

Para la amplificación y clonación de SEQ ID NO: 30, se usaron los siguientes cebadores: cebador 1 (cebador directo): 5'-TTGCTCTTCCATGGAATCGTTCGCTTCCTTC-3' (SEQ ID NO: 129), que consiste en una secuencia adaptadora (subrayada) y una secuencia específica de ORF; y cebador 2 (cebador inverso): 5* -TTGCTCTTCGTCAATCTCTTCTTTTCTTCTTC-3 ' (SEQ ID NO: 130), que consiste en una secuencia adaptadora (subrayada) y una secuencia específica de ORF. Las secuencias adaptadoras permiten la clonación del ORF en los diversos vectores que contienen los adaptadores Colic.

Luego se construyó un vector binario para la expresión no dirigida de la proteína. En este contexto, expresión "no dirigida" significa que no se agregaron secuencias de direccionamiento adicionales al ORF que se desea expresar. Para la expresión no dirigida, el vector binario que se usó para la clonación fue pUBI como se representa en la Figura 11. Como elemento funcional, este vector contiene un marcador seleccionable vegetal dentro de los límites del T-ADN. El vector también contiene un promotor de ubiquitina del perejil (Petroselinum crispum) para la expresión constitutiva, preferentemente, en tejidos verdes.

Para la clonación de SEQ ID NO: 30, el ADN del vector se trató con las enzimas de restricción Pací y Ncol según el protocolo estándar (MBI Fermentas). En todos los casos, la reacción se detuvo mediante inactivación a 70 °C durante 20 minutos y se purificó sobre columnas QIAquick o NucleoSpin Extract II según el protocolo estándar (Qiagen o Macherei-Nagel).

Luego se trató el producto de PCR que representa el ORF amplificado con las respectivas secuencias adaptadoras y el ADN vector con T4 ADN polimerasa de acuerdo con el protocolo estándar (MBI Fermentas) para producir salientes monocatenarias con los parámetros de 1 unidad de T4 ADN polimerasa a 37 °C durante 2-10 minutos para el vector y 1-2 u de T4 ADN polimerasa a 15-17 °C durante 10-60 minutos para el producto PCR que comprende SEQ ID NO: 30. La reacción se detuvo mediante adición de un tampón de alta salinidad y se purificó sobre columnas QIAquick o NucleoSpin Extract II según el protocolo estándar (Qiagen o acherei-Nagel).

Aproximadamente 30-60 ng de vector preparado y una cantidad definida de amplificado preparado se mezclan y se hibridan a 65 °C durante 15 minutos seguido de 37 °C 0,1 °C/1 segundo, seguido de 37°C 10 minutos, seguido de 0,1 °C/1 segundo, luego 4-10 °C.

Los constructos ligados se transforman en el mismo recipiente de reacción mediante la adición de células de E. coli competentes (cepa DH5alpha) y la incubación durante 20 minutos a 1°C seguido de shock térmico durante 90 segundos a 42 °C y enfriamiento a 1-4 °C. Luego, se agrega el medio completo (SOC) y la mezcla se incuba durante 45 minutos a 37 °C. Posteriormente, la mezcla completa se coloca en una placa de agar con 0,05 mg/ml de canamicina y se incuba durante la noche a 37 °C.

El resultado de la etapa de clonación se verifica por amplificación con la ayuda de cebadores que se unen corriente arriba y corriente abajo del sitio de integración, permitiendo de este modo la amplificación de la inserción. Las amplificaciones se realizan como se describe en el protocolo de Taq ADN polimerasa (Gibcc— BRL). Los ciclos de amplificación fueron los siguientes: 1 ciclo de 1-5 minutos a 94°C, seguido de 35 ciclos, en cada caso, de 15-60 segundos a 94°C, 15-60 segundos a 50-66°C y 5-15 minutos a 72°C, seguido de 1 ciclo de 10 minutos a 72°C, luego 4-16°C.

Se transfiere una porción de una colonia positiva a un recipiente de reacción llenado con el medio completo (LB) suplementado con canamicina y se incuba durante la noche a 37 °C.

La preparación del plásmido se realiza como se especifica en el protocolo estándar Qiaprep o NucleoSpin ulti-96 Plus (Qiagen o Macherey-Nagel).

La secuencia del cásete génico que comprende el promotor de ubiquitina (que contiene un intrón) fusionado con el gen BI-1 es representado por SEQ ID NO: 154.

Ejemplo 20.2 Transformación de Arabidospis Este ejemplo ilustra la generación de plantas transgénicas que expresan SEQ ID NO: 30.

Se transforman 1-5 ng del ADN del plásmido aislado mediante electroporación o transformación en células competentes de Agrobacteríum tumefaciens de la cepa GV 3101 pMP90 (Koncz and Schell, Mol. Gen. Gent. 204, 383 (1986)). Luego, se agrega el medio completo (YEP) y la mezcla se transfiere a un recipiente de reacción nuevo durante 3 horas a 28 °C. Posteriormente, se coloca toda la mezcla de la reacción en placas de agar YEP suplementadas con los respectivos antibióticos, por ejemplo rifampicina (0,1 mg/ml), gentamicina (0,025 mg/ml y canamicina (0,05 mg/ml) y se incuba durante 48 horas a 28 °C.

Las agrobacterias que contienen el constructo del plásmido luego se usan para la transformación de las plantas. Se recoge una colonia de la placa de agar con la ayuda de la punta de una pipeta y se absorbe en 3 mi de medio TB líquido, que también contiene antibióticos adecuados como se describió anteriormente. El precultivo se cultiva durante 48 horas a 28 eC y 20 rpm.

Se usan 400 mi del medio LB que contiene los mismos antibióticos que se indicaron anteriormente para el cultivo principal. El precultivo se transfiere al cultivo principal. Se cultiva durante 18 horas a 28 °C y 120 rpm. Después de la centrifugación a 4 000 rpm, el pellet se resuspende en el medio de infiltración (medio MS, 10% de sacarosa).

Para cultivar las plantas para la transformación, se llenan hasta la mitad placas (Piki Saat 80, verde, provistas con un filtro de observación, 30 x 20 x 4,5 cm, de Wiesauplast, Kunststofftechnik, Alemania) con un sustrato GS 90 (suelo estándar, Werkverband E.V., Alemania). Las placas se riegan durante la noche con 0,05% de solución Proplant (Chimac-Apriphar, Bélgica). Se dispersan semillas de A. thaliana C24 (Nottingham Arabidopsis Stock Centre, UK; NASC Stock N906) sobre la placa, aproximadamente 1 000 semillas por placa. Las placas se cubren con una campana y se colocan en la instalación de estratificación (8 hs, 110 pmol/mV, 22°C; 16 hs, oscuridad, 6°C). Después de 5 días, las placas se colocan en una cámara de ambiente controlado de días cortos (8 hs, 130 pmol/m2/s-1, 22 °C; 16 hs, oscuridad, 20 °C), donde permanecen durante aproximadamente 10 días hasta que se forman las primeras hojas verdaderas.

Las plántulas se transfieren a macetas que contienen el mismo sustrato (macetas Teku, 7 cm, serie LC, fabricadas por Póppelmann GmbH & Co, Alemania). Se trasplantan cinco plantas a cada maceta. Luego las macetas regresan a la cámara de ambiente controlado de días cortos para que la planta continúe creciendo.

Después de 10 días, las plantas se transfieren al gabinete de invernadero (iluminación complementaria, 16 hs, 340 E/m2s, 22 °C; 8 hs, oscuridad, 20 °C), donde se las deja crecer durante 17 días más.

Para la transformación, se sumergen plantas de Arabidopsis de 6 semanas, que recién habían comenzado a florecer, durante 10 segundos en la suspensión de agrobacterias descrita anteriormente que había sido previamente tratada con 10 µ? de Silwett L77 (Crompton S.A., Osi Specialties, Suiza). El método en cuestión es descrito por Clough J.C. y Bent A.F. (Plant J. 16, 735 (1998)).

Luego, las plantas se colocan en una cámara húmeda durante 18 horas. Posteriormente, las macetas regresan al invernadero para que las plantas continúen creciendo. Las plantas permanecen en el invernadero durante otras 10 semanas hasta que las semillas están listas para la cosecha. Según el marcador de tolerancia usado para la selección de las plantas transformadas, las semillas cosechadas se plantan en el invernadero y se someten a una selección por pulverización o primero se esterilizan y luego se cultivan en placas de agar suplementadas con el agente de selección respectivo. Debido a que el vector contiene el gen bar como marcador de tolerancia, las plantas se pulverizan cuatro veces en un intervalo de 2 a 3 días con 0,02 % de BASTA® y se deja que las plantas transformadas produzcan semillas. Las semillas de las plantas transgénicas de A. thaliana se almacenan en el congelador (a -20°C).

Ejemplo 20.3 Análisis de plantas para determinar el crecimiento con suministro limitado de nitrógeno Se evalúan 4-7 líneas transgénicas independientes (=eventos) por constructo transgénico (21-28 plantas por constructo). Se cultivan semillas de Arabidopsis thaliana en macetas que contienen 1 :0,45:0,45 (v:v:v) de una mezcla de suelo desprovisto de nutrientes ("Einheitserde Typ 0", 30% de arcilla, Tantau, Wansdorf, Alemania), arena y vermiculita. Según el contenido de nutrientes de cada lote de suelo desprovisto de nutrientes, se agregaron macronutrientes, excepto nitrógeno, a la mezcla de suelo para obtener un contenido de nutrientes en el suelo previamente fertilizado, en comparación con el suelo completamente fertilizado. Se agregó nitrógeno a un contenido de alrededor de 15% en comparación con el suelo completamente fertilizado. La concentración media de macronutrientes en el suelo completamente fertilizado y desprovisto de nitrógeno se indica en la Tabla G.

Tabla G: Se induce la germinación mediante un período de cuatro días a 4°C, en la oscuridad. Luego se cultivan las plantas en condiciones de crecimiento estándar (fotoperíodo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad, 20 °C, 60% de humedad relativa y una densidad de flujo de fotones de 200 µ?). Las plantas se cultivan y desarrollan, inter alia se riegan con agua desionizada cada dos días. Luego de 9 a 10 días se individualizan las plantas. Luego de un período total de 29 a 31 días, las plantas se cosechan y clasifican por el peso fresco de las partes aéreas de las plantas. El aumento de biomasa se mide como una proporción del peso fresco de las partes áreas (por encima del suelo) de las respectivas plantas transgénicas y plantas de tipo silvestre no transgénicas.

La producción de biomasa de Arabidopsis thaliana transgénica cultivada en condiciones de suministro limitado de nitrógeno se midió al pesar las rosetas de las plantas. El aumento de biomasa se calcula como la relación entre el peso promedio de las plantas transgénicas y el peso promedio de las plantas de control de tipo silvestre del mismo experimento. El aumento de biomasa promedio de los constructos transgénicos fue de 1 ,57 (valor de significancia < 0,3 y aumento de biomasa > 5% (proporción > 1 ,05)), lo cual indica que hubo un aumento del 57% en la biomasa, en comparación con las plantas de control.

Ejemplo 21: Identificación de secuencias relacionadas con SEQ ID NO: 155 y SEQ ID NO: 156 Se identificaron secuencias (de cADN de longitud completa, EST o genómicas) relacionadas con SEQ ID NO: 155 y SEQ ID NO: 156 entre otras y, principalmente, entre aquellas que se mantienen en la base de datos Entrez Nucleotides en el National Center for Biotechnology Information (NCBI) mediante el uso de herramientas de búsqueda de secuencias en base de datos, tales como Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; y Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389- 3402). El programa se usa para encontrar regiones de similitud local entre secuencias mediante la comparación de secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos con bases de datos de secuencias y mediante el cálculo de la importancia estadística de las coincidencias. Por ejemplo, el polipéptido codificado por el ácido nucleico de SEQ ID NO: 155 se usó para el algoritmo TBLASTN, con parámetros predeterminados, y se activó el filtro para ignorar las secuencias de baja complejidad. El resultado del análisis se examinó mediante comparación de a pares y se lo calificó de acuerdo con el puntaje de probabilidad (valor E), donde el puntaje refleja la probabilidad de que un alineamiento en particular se produzca al azar (cuanto menor es el valor E, más importante es la coincidencia). Además de los valores E, las comparaciones también se calificaron por porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad se refiere a la cantidad de nucleótidos (o aminoácidos) idénticos entre las dos secuencias de ácidos nucleicos (o polipéptidos) comparadas a lo largo de una longitud particular. En algunos casos, los parámetros predeterminados se pueden ajustar para modificar la rigurosidad de la búsqueda. Por ejemplo, se puede aumentar el valor E para mostrar coincidencias menos rigurosas. De este modo, se pueden identificar coincidencias cortas casi exactas.

La Tabla H provee una lista de secuencias de ácidos nucleicos relacionadas con SEQ ID NO: 155 y SEQ ID NO: 56.

Tabla H: Ejemplos de polipéptidos y ácidos nucleicos SEC22: Las secuencias se unieron tentativamente y se revelaron al público mediante institutos de investigación, tales como The Institute for Genomic Research (TIGR; comenzando con TA). La base de datos Eukaryotic Gene Orthologs (EGO) se puede usar para identificar dichas secuencias relacionadas, ya sea por búsqueda de palabra clave o usando el algoritmo BLAST con la secuencia de ácidos nucleicos o secuencia de polipéptidos de interés. Se crearon bases de datos especiales de secuencias de ácidos nucleicos para organismos particulares, como por ejemplo, mediante el Joint Genome Institute. Asimismo, el acceso a bases de datos registradas permite la identificación de nuevas secuencias de polipéptidos y ácidos nucleicos.

Ejemplo 22: Alineamiento de secuencias de polipéptidos SEC22 El alineamiento de secuencias de polipéptidos se realizó con el algoritmo de alineamiento progresivo ClustalW 2.0 (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res 25:4876-4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res 31 :3497-3500) con parámetros estándar (alineamiento lento, matriz de similitud: Blosum 62 (alternativamente, se puede usar Gonnet), penalidad por apertura de brecha 10, penalidad por extensión de brecha: 0,2). Se realizó edición manual menor para optimizar adicionalmente el alineamiento. Los polipéptidos SEC22 se alinean en la Figura 12.

Se reproduce un árbol filogenético de polipéptidos SEC22, con modificaciones menores de Uemura et al 2004. Alternativamente, se puede usar un algoritmo de agrupamiento de unión a vecino en el programa AlignX de Vector NTI (Invitrogen).

Ejemplo 23: Cálculo del porcentaje de identidad global entre las secuencias de polipéptidos Los porcentajes globales de similitud e identidad entre secuencias de polipéptidos de longitud completa útiles para realizar los métodos de la invención se determina mediante uno de los métodos disponibles en el arte, el software MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) (BMC Bioinformatics. 2003 4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein o DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; software albergado por Ledion Bitincka). El software MatGAT genera matrices de similitud/identidad para las secuencias de ADN o proteínas sin que se necesario el prealineamiento de datos. El programa realiza una serie de alineamientos de a pares usando el algoritmo de alineamiento global de Myers y Miller (con una penalidad por apertura de brecha de 12 y una penalidad por extensión de brecha de 2), calcula la similitud e identidad usando, por ejemplo, Blosum 62 (para polipéptidos) y luego ingresa los resultados en una matriz de distancia.

Los parámetros útiles en la comparación son: Matriz de calificación: Blosum62, Primera brecha: 12, Brecha de extensión: 2.

Ejemplo 24: Identificación de dominios comprendidos en secuencias de polipéptidos útiles para la realización de los métodos de la invención La base de datos Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites (InterPro) es una interfaz integrada para las bases de datos de firmas que se utilizan habitualmente para búsquedas basadas en texto y en secuencias. La base de datos InterPro combina estas bases de datos, que utilizan diferentes metodologías y diversos grados de información biológica sobre proteínas bien caracterizadas, para derivar firmas de proteínas Las bases de datos que colaboran incluyen SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS, ProDom y Pfam. Smart y TIGRFAM. Pfam es una gran colección de alineamientos de secuencias múltiples y modelos Markov ocultos que abarcan muchos dominios y familias de proteínas comunes. Pfam se encuentra en el servidor de Sanger Institute en el Reino Unido. InterPro se encuentra en el Eurqpean Bioinformatics Institute en el Reino Unido. Se realiza una búsqueda en Pfam mediante el uso de la secuencia de polipéptidos del polipéptido SEC22 wuery. Se consulta la base de datos Interpro con la ayuda de la herramienta InterProScan. Se detectan los dominios Longin y/o Synaptobrevin en los polipéptidos SEC22.

Ejemplo 25: Predicción de topología de las secuencias de polipéptidos SEC22 TargetP 1.1 predice la ubicación subcelular de proteínas eucarióticas. La asignación de la ubicación se basa en la presencia prevista de cualquiera de las presecuencias N-terminal: péptido de transito a cloroplasto (cTP), péptido de direccionamiento a mitocondria (mTP) o péptido de señal de la vía secretora (SP). Los puntajes sobre los cuales se basa la predicción final no son realmente probabilidades y no necesariamente suman uno. Sin embargo, la ubicación con el puntaje más alto es la más probable de acuerdo con TargetP, y la relación entre los puntajes (la clase de confiabilidad) puede indicar el nivel de certeza de la predicción. La clase de confianza (RC) está en el rango de 1 a 5, donde 1 indica la predicción más factible. TargetP se conserva en el servidor de la Universidad Técnica de Dinamarca.

Para las secuencias que se prevé que contienen una presecuencia N-terminal, también se puede predecir un posible sitio de clivaje.

Alternativamente, se pueden utilizar muchos otros algoritmos para realizar dichos análisis, incluso: • ChloroP 1 ,1 alojado en el servidor de la Universidad Técnica de Dinamarca; • Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor versión 1.2 alojado en el servidor del Institute for Molecular Bioscience, Universidad de Queensland, Brisbane, Australia; · PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2,5 alojado en el servidor de la Universidad de Alberta, Edmonton, Alberta, Canadá; • TMHMM, alojado en el servidor de la Universidad Técnica de Dinamarca • PSORT (URL: psort.org) • PLOC (Park and Kanehisa, Bioinformatics, 19, 1656-1663, 2003).

Ejemplo 26: Clonación de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican SEC22 La secuencia de ácidos nucleicos se amplificó por PCR usando como molde una biblioteca de cADN de plántulas de Solanum lycopersicum personalizada (en pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, UK). Se realizó PCR con ADN polimerasa Hifi Taq en condiciones estándar, con 200 ng de molde en 50 µ? de mezcla PCR. Los cebadores que se utilizaron fueron como se representa en (SEQ ID NO: 225; sentido) y SEQ ID NO: 226; (inverso, complementario) que incluyen los sitios AttB para la recombinación Gateway. El fragmento de PCR amplificado se purificó también mediante métodos estándar. Luego se realizó la primera etapa del procedimiento Gateway, la reacción BP, durante la cual el fragmento PCR se recombinó in vivo con el plásmido pDONR201 para producir, de acuerdo con la terminología de Gateway, un "clon de entrada", pSEC22. El plásmido pDONR201 se compró a Invitrogen, como parte de la tecnología Gateway®.

En un segundo experimento, mediante el uso de un ácido nucleico que codifica para SEQ ID NO: 157, la secuencia de ácidos nucleicos se amplificó mediante PCR usando como molde una biblioteca de cADN de plántulas de Oryza sativa personalizada. También se realizó PCR mediante el uso de ADN polimerasa Hifi Taq, como se describió anteriormente. Para la clonación de un ácido nucleico que codifica SEQ ID NO: 157, se usaron los cebadores representados por SEQ ID NO: 227 y 228.

El clon de entrada que comprende SEQ ID NO: 155 luego se usó en una reacción LR con un vector de destino usado para la transformación de Oryza sativa. Este vector contenía como elementos funcionales dentro de los límites de T-ADN: un marcador seleccionable vegetal; un cásete de expresión del marcador controlable; y un cásete Gateway para la recombinación LR in vivo con la secuencia de ácidos nucleicos de interés ya clonada en el clon de entrada Un promotor GOS2 del arroz (SEQ ID NO: 224) para la expresión constitutiva especifica se ubicó corriente arriba de este cásete de Gateway.

Después de la etapa de recombinación LR, el vector de expresión resultante pGOS2::SEC22 (Figura 157) se transformó en la cepa LBA4044 de Agrobacterium de acuerdo con los métodos conocidos en el arte. Para la construcción del vector de expresión que comprendía SEQ ID NO: 157, se realizó una reacción LR similar para generar PGOS2::SEQIDNO:157.

Ejemplo 27: Transformación de plantas Transformación de arroz El Agrobacterium que contiene el vector de expresión se utilizó para transformar plantas de Oryza sativa. Se quitaron las cáscaras de las semillas secas maduras del cultivar de arroz japonés Nipponbare. Se realizó la esterilización mediante la incubación durante un minuto en 70% de etanol, seguido por 30 minutos en 0,2% de HgCI2, seguido por 6 lavados de 15 minutos con agua destilada estéril. Las semillas estériles luego se germinaron en un medio que contenía 2,4-D (medio de inducción de callos). Después de la incubación en la oscuridad durante cuatro semanas, se extrajeron callos embriogénicos, derivados de escutelo, y se propagaron en el mismo medio. Después de dos semanas, los callos se multiplicaron o se propagaron por subcultivo en el mismo medio durante otras 2 semanas. Las piezas de callos embriogénicos se subcultivaron en medio fresco 3 días antes del cocultivo (para estimular la actividad de división celular).

La cepa LBA4404 de Agrobacterium que contiene el vector de expresión se utilizó para el cocultivo. Se inoculó Agrobacterium en un medio AB con los antibióticos apropiados y se cultivó durante 3 días a 28°C. Luego se recogieron las bacterias y se suspendieron en un medio de cocultivo líquido a una densidad (OD600) de alrededor de 1. La suspensión luego se transfirió a una placa de Petri y se sumergen los callos en la suspensión durante 15 minutos. Los tejidos de los callos luego se secaron en un papel de filtro y se transfirieron a un medio de cocultivo solidificado, y se incubaron durante 3 días en la oscuridad a 25 °C. Los callos cocultivados se cultivaron en un medio que contiene 2,4-D durante 4 semanas en la oscuridad a 28 °C en presencia de un agente de selección. Durante este período, se desarrollan islas de callos resistentes que crecen rápidamente. Después de transferir este material a un medio de regeneración e incubación a la luz, se liberó el potencial embriogénico y se desarrollaron brotes en las siguientes cuatro a cinco semanas. Se retiraron los brotes de los callos y se incubaron durante 2 a 3 semanas en un medio que contenía auxina, desde el cual se transfirieron al suelo. Los brotes endurecidos se cultivaron en condiciones de alta humedad y días cortos en un invernadero.

Ejemplo 28: Transformación de otros cultivos Transformación de maíz La transformación del maíz (Zea mays) se realiza con una modificación del método descrito por Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14(6): 745-50. La transformación depende del genotipo en el maíz y sólo genotipos específicos pueden ser transformados y regenerados. La línea endogámica A188 (Universidad de Minnesota) o los híbridos con A188 como progenitor son una buena fuente de material donante para la transformación, pero también se pueden utilizar exitosamente otros genotipos. Las espigas se cosechan de la planta de maíz aproximadamente 11 días después de la polinización (DAP) cuando el embrión inmaduro tiene una longitud de alrededor de 1 a 1 ,2 mm. Los embriones inmaduros se cocultivan con Agrobacterium tumefaciens que contiene el vector de expresión, y las plantas transgénicas se recuperan por medio de organogénesis. Los embriones extraídos se cultivan en medio de inducción de callos, luego en medio de regeneración de maíz, que contiene el agente de selección (por ejemplo, imidazolinona, pero se pueden utilizar varios marcadores de selección). Las placas de Petri se incuban a la luz a 25 °C durante 2-3 semanas o hasta que se desarrollan los brotes. Los brotes verdes se transfieren de cada embrión al medio de enraizamiento de maíz y se incuban a 25 °C durante 2-3 semanas, hasta que se desarrollan las raíces. Los brotes con raíces se trasplantan al suelo en el invernadero. Las semillas T1 se producen a partir de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una única copia del inserto de T-ADN.

Transformación de soja La soja se transforma de acuerdo con una modificación del método descrito en la patente US 5.164.310 de Texas A&M. Diversas variedades de soja comercial son susceptibles de transformación con este método. Habitualmente, se usa el cultivar Jack (disponible de Illinois Seed foundation) para la transformación. Las semillas de soja se esterilizan para la siembra in vitro. Se extraen el hipocotilo, la radícula y un cotiledón de plántulas jóvenes de siete días. El epicotilo y el cotiledón restante se cultivan adicionalmente para que desarrollen nodulos axilares. Estos nódulos axilares se extraen y se incuban con Agrobacterium tumefaciens que contiene el vector de expresión. Después del tratamiento de cocultivo, los explantes se lavan y se transfieren al medio de selección. Los brotes regenerados se extraen y se colocan en un medio de alargamiento de brotes. Los brotes cuya longitud no excede 1 cm se colocan en medio de enraizamiento hasta que se desarrollan las raíces. Los brotes con raíces se trasplantan al suelo en el invernadero. Las semillas T1 se producen a partir de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una única copia del inserto de T-ADN.

Transformación de alfalfa Se transforma un clon regenerador de alfalfa (Medicago sativa) con el método de (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839-847). La regeneración y transformación de alfalfa dependen del genotipo y, por lo tanto, se requiere una planta regeneradora. Se han descrito métodos para obtener plantas regeneradoras. Por ejemplo, éstas se pueden seleccionar del cultivar Rangelander (Agriculture Canadá) o de cualquier otra variedad de alfalfa comercial como se describe en Brown DCW y A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111-112). Alternativamente, se seleccionó la variedad RA3 (Universidad de Wisconsin) para usar en el cultivo de tejidos (Walker et al., 1978 Am J Bot 65:654-659). Los explantes de pecíolos se cocultivan, durante la noche, con un cultivo de C58C1 pMP90 de Agrobacterium tumefaciens (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839-847) o LBA4404 que contiene el vector de expresión. Los explantes se cocultivan durante 3 días en la oscuridad en medio de inducción SH que contiene 288 mg/L de Pro, 53 mg/L de tioprolina, 4,35 g/L de K2S04 y 100 pm de acetosiringinona. Los explantes se lavan en medio Murashige-Skoog de concentración media (Murashige and Skoog, 1962) y se colocan en placas en el mismo medio de inducción SH sin acetosiringinona pero con un agente de selección adecuado y antibiótico adecuado para inhibir el crecimiento de Agrobacterium. Después de varias semanas, los embriones somáticos se transfieren a medio de desarrollo BOi2Y que no contiene reguladores del crecimiento, ni antibióticos y 50 g/L de sacarosa. Posteriormente, los embriones somáticos se germinan en medio Murashige-Skoog de concentración media. Las plántulas con raíces se trasplantan a macetas y se cultivan en un invernadero. Las semillas T1 se producen a partir de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una única copia del inserto de T-ADN.

Transformación de algodón El algodón se transforma con Agrobacterium tumefaciens de acuerdo con el método descrito en US 5.159.135. Las semillas de algodón se esterilizan en superficie en 3% de solución de hipoclorito de sodio durante 20 minutos y se lavan en agua destilada con 500 g/ml de cefotaxima. Luego se transfieren las semillas al medio SH con 50 pg/ml de benomilo para la germinación. Se extraen los hipocotilos de las plántulas que tienen de 4 a 6 días, se los corta en trozos de 0,5 cm y se los coloca en 0,8% de agar. Se usa una suspensión de Agrobacterium (aprox. 108 células por mi, diluidas de un cultivo de toda la noche transformado con el gen de interés y marcadores de selección adecuados) para la inoculación de los explantes de hipocotilos. Luego de 3 días a temperatura ambiente y luz, los tejidos se transfieren a un medio sólido (1 ,6 g/l de Gelrite) con sales Murashige y Skoog con vitaminas B5 (Gamborg et al., Exp. Cell Res. 50:151-158 (1968)), 0,1 mg/l de 2,4-D, 0,1 mg/l de 6-furfurilaminopurina y 750 pg/ml de MgCL2, y con 50 a 100 pg/ml de cefotaxima y 400-500 pg/ml de carbenicilina para eliminar las bacterias residuales. Se aislan las líneas celulares individuales luego de dos a tres meses (con subcultivos cada cuatro a seis semanas) y se cultivan adicionalmente en un medio selectivo para la amplificación del tejido (30°C, fotoperíodo de 16 horas). Posteriormente, los tejidos transformados se cultivan adicionalmente en medio no selectivo durante 2 a 3 meses para que se generen embriones somáticos. Los embriones de aspecto saludable de al menos 4 mm de longitud se transfieren a tubos con medio SH en vermiculita fina, suplementado con 0,1 mg/l de ácido indol acético, 6 furfurilaminopurina y ácido giberélico. Los embriones se cultivan a 30°C con un fotoperíodo de 16 horas, y los plantines en la etapa de 2 a 3 hojas se transfieren a macetas con vermiculita y nutrientes. Las plantas se vuelven más resistentes y posteriormente se las transfiere al invernadero para continuar el cultivo.

Ejemplo 29: Procedimiento de evaluación fenotípica 29.1 Preparación de la evaluación Se generaron aproximadamente 35 transformantes de arroz T0 independientes.

Los transformantes primarios se transfirieron de una cámara de cultivo de tejidos a un invernadero para el cultivo y la cosecha de la semilla T1. Se retuvieron eventos, de los cuales la progenie de T1 segregó 3:1 para la presencia/ausencia del transgén. Para cada uno de estos eventos, se seleccionaron aproximadamente 10 plántulas T1 que contenían el transgén (heterocigotas y homocigotas) y aproximadamente 10 plántulas T1 que no tenían el transgén (nulicigotas) mediante el control de la expresión del marcador visual. Las plantas transgénicas y los correspondientes nulicigotas se cultivaron lado a lado en posiciones al azar. Las condiciones del invernadero fueron de días cortos (12 horas de luz), 28°C a la luz y 22°C en la oscuridad y humedad relativa de 70%. Las plantas cultivadas en condiciones sin estrés se riegan en intervalos regulares para asegurar que el agua y los nutrientes no sean limitantes y para satisfacer las necesidades de las plantas para que completen su crecimiento y desarrollo.

También se evaluaron eventos T1 en la generación T2 de acuerdo con el mismo procedimiento de evaluación que para la generación T1 pero con más individuos por evento. Desde la etapa de siembra hasta la etapa de madurez, las plantas se pasaron varias veces a través de un gabinete de formación de imágenes digitales. En cada punto de tiempo, se tomaron imágenes digitales (2048x1536 píxeles, 16 millones de colores) de cada planta desde al menos 6 ángulos diferentes.

Control de sequía Se cultivaron plantas de semillas T1 en tierra para maceta en condiciones normales hasta que alcanzaron la etapa de espigazón. Luego se las transfirió a una sección "seca" donde dejaron de recibir irrigación. Se insertaron sondas de humedad en macetas elegidas al azar para controlar el contenido de agua en el suelo (SWC). Cuando el SWC era inferior a ciertos umbrales, las plantas se regaron nuevamente de forma automática y continua hasta alcanzar de nuevo un nivel normal. A continuación, las plantas se transfirieron nuevamente a condiciones normales. El resto del proceso de cultivo (maduración de la planta, cosecha de semillas) fue igual que para las plantas no cultivadas en condiciones de estrés abiótico. Los parámetros de crecimiento y rendimiento se registraron tal como se detalló para el crecimiento en condiciones normales.

Control de la eficacia en el uso de nitrógeno Se cultivaron plantas de arroz de semillas T2 en tierra para maceta en condiciones normales excepto por la solución de nutrientes. Las macetas se regaron, desde que son trasplantadas hasta su maduración, con una solución de nutrientes específica con contenido reducido de nitrógeno (N) N, usualmente de 7 a 8 veces menos. El resto del proceso de cultivo (maduración de la planta, cosecha de semillas) fue igual que para las plantas no cultivadas en condiciones de estrés abiótico. Los parámetros de crecimiento y rendimiento se registraron tal como se detalló para el crecimiento en condiciones normales.

Control de estrés salino Las plantas se cultivan en un substrato hecho de fibras de coco y argex (proporción 3 a 1 ). Se usa una solución normal de nutrientes durante las primeras dos semanas luego de trasplantar los plantines al invernadero. Luego de las dos primeras semanas, se agregan 25 mM de sal (NaCI) a la solución de nutrientes hasta que se cosechan las plantas. Luego se miden los parámetros relacionados con las semillas. 29.2 Análisis estadístico: Prueba F Se utilizó ANOVA (análisis de variantes) de dos factores como modelo estadístico para la evaluación total de las características fenotípicas de la planta. Se realizó una prueba F en todos los parámetros medidos de todas las plantas de todos los eventos transformados con el gen de la presente invención. La prueba F se realizó para controlar el efecto del gen en todos los eventos de transformación y para verificar el efecto total del gen, también conocido como efecto global del gen. El umbral de significancia para un efecto global y verdadero del gen se fijó en un nivel de probabilidad de 5% para la prueba F. Un valor significativo de la prueba F indica un efecto del gen, es decir que no es sólo la mera presencia o posición del gen lo que causa las diferencias en el fenotipo.

Se realizó un análisis combinado debido a que se realizaron dos experimentos con eventos superpuestos para el ensayo de eficacia en el uso de nitrógeno. Esto es útil para verificar la consistencia de los efectos en los dos experimentos y, de ser este el caso, acumular pruebas de ambos experimentos a fin de aumentar la confianza en la conclusión. El método que se utilizó fue un enfoque de modelo mixto que considera la estructura de múltiples niveles de los datos (es decir, experimento - evento -segregantes). Los valores P se obtuvieron al comparar la prueba de proporción de probabilidad con las distribuciones ji cuadrado. 29.3 Parámetros medidos Medición de parámetros relacionados con la biomasa Desde la etapa de siembra hasta la etapa de madurez, las plantas se pasaron varias veces a través de un gabinete de formación de imágenes digitales. En cada punto de tiempo, se tomaron imágenes digitales (2048x1536 píxeles, 16 millones de colores) de cada planta desde al menos 6 ángulos diferentes.

El vigor temprano se determinó al contar la cantidad total de píxeles de las partes aéreas de las plantas diferenciadas del fondo. Este valor se promedió para las fotos tomadas en el mismo punto de tiempo desde los diferentes ángulos y se convirtió a un valor de superficie física expresado en mm cuadrados por calibración. Los resultados descritos más adelante son para plantas tres semanas después de la germinación.

Ejemplo 30: Resultados de la evaluación fenotípica de las plantas transgénicas Los resultados de la evaluación de las plantas transgénicas de arroz en la generación T1 y que expresan un ácido nucleico que comprende el marco de lectura abierto más largo en SEQ ID NO: 155 en las condiciones de estrés por sequía de los Ejemplos anteriores se indican a continuación. Véase los Ejemplos previos para detalles de las generaciones de las plantas transgénicas.

Los resultados de la evaluación de las plantas transgénicas de arroz en condiciones de sequía se indican a continuación. Se observó un aumento de al menos 5 % en el rendimiento total de las semillas (peso total semilla), cantidad de semillas llenas (cant. semillas llenas), tasa de llenado (tasa llenado) e índice de cosecha (índice cosecha).

Los resultados de la evaluación de las plantas transgénicas de arroz en las generaciones T1 y T2 y que expresan un ácido nucleico que comprende el marco de lectura abierto más largo en SEQ ID NO: 157 en condiciones de nitrógeno reducido de los Ejemplos anteriores se indican a continuación. Véase los Ejemplos previos para detalles de las generaciones de las plantas transgénicas.

Los resultados de la evaluación de las plantas transgénicas de arroz en la generación T1 en condiciones de nitrógeno reducido se indican a continuación. Se observó un aumento de al menos el 5 % para el área máxima cubierta por la biomasa del follaje durante el ciclo de vida de una planta (Área máx.), peso total de semillas (peso total semillas), cantidad de semillas llenas (cant. semillas llenas), tasa de llenado (tasa llenado), verdor antes de la floración (GNBfFIow) y altura del centro de gravedad de la biomasa del follaje de las plantas (Gravedad máx.).

Los resultados de la evaluación de las plantas transgénicas de arroz en la generación T2 en condiciones de nitrógeno reducido se indican a continuación. Se observó un aumento de al menos el 5 % en el rendimiento total de semillas (peso total semillas), cantidad de florcillas por panícula (flor por panícula) y cantidad de semillas llenas (cant. semillas llenas).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para mejorar los rasgos relacionados con el rendimiento en plantas en relación con las plantas de control, caracterizado porque comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo SEC22 que comprende SEQ ID NO: 23 (Motivol ).

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizado porque el Motivo es R(R/L/F/V)SPGGP(D/N)P(Q/R)HH (SEQ ID NO: 24).

3. Método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque dicha expresión modulada se realiza mediante la introducción y expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo CLE 2.

4. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicho ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo CLE 2 codifica cualquiera de las proteínas enumeradas en la Tabla A o es una porción de dicho ácido nucleico, o un ácido nucleico capaz de hibridarse con dicho ácido nucleico.

5. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque dicha secuencia de ácidos nucleicos codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de la proteínas indicadas en la Tabla A.

6. Método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque los mejores rasgos relacionados con el rendimiento comprenden mayor rendimiento, preferentemente, mayor biomasa y/o mayor rendimiento de semillas, con respecto a las plantas de control.

7. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque dichos rasgos mejorados relacionados con el rendimiento se obtienen en condiciones de deficiencia de nitrógeno.

8. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, caracterizado porque dicho ácido nucleico se liga operativamente a un promotor constitutivo, preferentemente, a un promotor GOS2, con máxima preferencia, a un promotor GOS2 del arroz.

9. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque dicho ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo CLE 2 es de origen vegetal, preferentemente, de una planta dicotiledónea, con mayor preferencia, de la familia Brassicaceae, con mayor preferencia, del género Arabidopsis, con máxima preferencia, de Arabidopsis thaliana.

10. Planta o parte de ésta, incluso semillas, que se puede obtener mediante un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque en donde dicha planta o parte de ésta comprende un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido tipo CLE 2.

11. Constructo caracterizado porque comprende: (i) ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo CLE 2 como se define en las reivindicaciones 1 o 2; (ii) una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos de (a); y opcionalmente {¡ii) una secuencia de terminación de la transcripción.

12. Constructo de acuerdo con la reivindicación 11 , caracterizado porque una de dichas secuencias de control es un promotor constitutivo, preferentemente, un promotor GOS2, con máxima preferencia, un promotor GOS2 del arroz.

13. Uso de un constructo de acuerdo con la reivindicación 11 o 12 en un método para producir plantas caracterizado porque tienen mayor rendimiento, en particular, mayor biomasa y/o mayor rendimiento de semillas, con respecto a las plantas de control.

1 . Planta, parte de planta o célula vegetal caracterizada porque estar transformada con un constructo de acuerdo con la reivindicación 11 o 12.

15. Método para la producción de una planta transgénica que tiene mayor rendimiento, en particular, mayor biomasa y/o mayor rendimiento de semillas, con respecto a las plantas de control, caracterizado porque comprende: (i) introducir y expresar en una planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo CLE 2 como se define en la reivindicación 1 o 2; y (¡i) cultivar la célula vegetal en condiciones que promuevan el desarrollo y el crecimiento de la planta.

16. Planta transgénica que tiene mayor rendimiento, en particular mayor biomasa y/o mayor rendimiento de semilla, en relación con las plantas de control, que es el resultado de la expresión modulada de un ácido nucleico caracterizada porque codifica un polipéptido tipo CLE 2 como se define en la reivindicación 1 o 2, o una célula vegetal transgénica derivada de dicha planta transgénica.

17. Planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 10, 14 o 16, o una célula vegetal transgénica derivada de ésta, caracterizada porque dicha planta es una planta de cultivo, tal como remolacha o remolacha azucarera, o una monocotiledónea o un cereal, tal como arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, triticale, sorgo, emmer, espelta, sécale, trigo einkorn, teff, sorgo milo y avena.

18. Partes cosechables de una planta de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizadas porque dichas partes cosechables son, preferentemente, biomasa de brote, biomasa de raíz y/o semillas.

19. Productos caracterizados por ser derivados de una planta de acuerdo con la reivindicación 17 y/o de partes cosechables de una planta de acuerdo con la reivindicación 19.

20. Uso de un ácido nucleico caracterizado porque codifica un polipéptido tipo CLE 2 para aumentar el rendimiento, en particular, aumentar el rendimiento de semillas, la biomasa de raíces y/o la biomasa de brotes en plantas, con respecto a las plantas de control.

21. Un método para mejorar los rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, con respecto a las plantas de control, caracterizado porque comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido inhibidor de Bax 1 (BI-1 ), en donde dicho polipéptido inhibidor de Bax 1 comprende un dominio relacionado con el inhibidor de Bax (PF 01027).

22. Método de acuerdo con la reivindicación 21 , caracterizado porque dicha expresión modulada se realiza mediante la introducción y expresión en una planta del ácido nucleico que codifica dicho polipéptido inhibidor de Bax 1.

23. Método de acuerdo con la reivindicación 21 o 22, caracterizado porque dichos mejores rasgos relacionados con el rendimiento comprenden mayor rendimiento, con respecto a las plantas de control y, preferentemente, comprenden mayor rendimiento de semillas y/o mayor biomasa, con respecto a las plantas de control.

24. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, caracterizado porque dichos mejores rasgos relacionados con el rendimiento se obtienen en condiciones sin estrés.

25. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, caracterizado porque dichos mejores rasgos relacionados con el rendimiento se obtienen en condiciones de estrés osmótico o deficiencia de nitrógeno.

26. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25, caracterizado porque dicho polipéptido inhibidor de Bax 1 comprende uno o más de los siguientes motivos: (i) Motivo 3a: [DN]TQxxxE[KR][AC]xxGxxDY[VIL]xx[STA] (SEQ ID NO: 131), (ii) Motivo 4a: xxxxxlSPx[VS]xx[HYR][LI][QRK]x[VFN][YN]xx[l n (SEQ ID NO: 133), (iii) Motivo 5a: FxxFxxAxxxxxRRxx[LMF][YF][LH]x (SEQ ID NO: 135),

27. Método de acuerdo con la reivindicación 26, caracterizado porque dicho polipéptido inhibidor de Bax 1 también comprende uno o más de los siguientes motivos: i) Motivo 6a: DTQxl[VI]E[KR]AHxGDxDYVKHx (SEQ ID NO: 137); ii) Motivo 7a: x[QE]ISPxVQxHLK[QK]VY[FL]xLC[FC] (SEQ ID NO: 139); iii) Motivo 8a: F[AG]CF[SP][AG]AA[ML][VL][AG]RRREYLYL[AG]G (SEQ ID NO: 141); iv) Motivo 9: [IF]E[VL]Y[FL]GLL[VL]F[VM]GY[VIM][IV][VYF] (SEQ ID NO: 143); v) Motivo 10: [MFL][LV]SSG[VLI]SxLxW[LV][HQ][FL]ASxlFGG (SEQ ID NO: 144); vi) Motivo 11 : H[ILV][LIM][FLW][NH][VI]GG[FTL]LT[A\rnx[GA]xx[GA]xxxW[LM][LM] (SEQ ID NO: 145); vii) Motivo 12: Rx[AS?[LI]L[ML][GAV]xx[LVF][FL][EKQ]GA[STY]IGPL[I ] (SEQ ID NO: 146);

28. Método de acuerdo con la reivindicación 26, caracterizado porque dicho polipéptido inhibidor de Bax 1 también comprende uno o más de los siguientes motivos: i) Motivo 13a: DTQx[IVM][IV]E[KR][AC]xxGxxDxx[KRQ]Hx (SEQ ID NO: 147); ii) Motivo 14: E[L\^Y[GLF]GLx[VLI][VF]xGY[MVI][LVI]x (SEQ ID NO: 149); iii) Motivo 15: KN[FL]RQISPAVQ[SN]HLK[RL]VYLT (SEQ ID NO: 150); iv) Motivo 16a: Fx[CS]F^xA[AS]xx[AS]xRR[ESH][YFW]x[FY][LH][GS][GA]xL (SEQ ID NO: 151 )

29. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 28, caracterizado porque dicho ácido nucleico que codifica un polipéptido inhibidor de Bax 1 es de origen vegetal.

30. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 29, caracterizado porque dicho ácido nucleico que codifica un polipéptido inhibidor de Bax 1 codifica cualquiera de los polipéptidos enumerados en la Tabla C o es una porción de dicho ácido nucleico, o un ácido nucleico capaz de hibridarse con dicho ácido nucleico.

31. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 30, caracterizado porque dicha secuencia de ácidos nucleicos codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de los polipéptidos indicados en la Tabla C.

32. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 31 , caracterizado porque dicho ácido nucleico que codifica el polipéptido inhibidor de Bax 1 corresponde a SEQ ID NO: 30.

33. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 32, caracterizado porque dicho ácido nucleico se liga operativamente a un promotor constitutivo, preferentemente, a un promotor constitutivo de intensidad media, preferentemente, a un promotor vegetal, con mayor preferencia, a un promotor GOS2, con máxima preferencia, a un promotor GOS2 del arroz.

34. Planta, parte de planta, incluso semillas, o célula vegetal que se puede obtener mediante un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 33, en donde dicha planta, parte de planta o célula vegetal caracterizada porque comprende un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido inhibidor de Bax 1, como se define en cualquiera de las reivindicaciones 21 y 26 a 32.

35. Constructo caracterizado porque comprende: (i) ácido nucleico que codifica un polipéptido inhibidor de Bax 1 como se define en cualquiera de las reivindicaciones 21 y 26 a 32; (ii) una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos de (i); y opcionalmente (iii) una secuencia de terminación de la transcripción.

36. Constructo de acuerdo con la reivindicación 35, caracterizado porque una de dichas secuencias de control es un promotor constitutivo, preferentemente, un promotor constitutivo de intensidad media, preferentemente, un promotor vegetal, con mayor preferencia, un promotor GOS2, con máxima preferencia, un promotor GOS2 del arroz.

37. Uso de un constructo de acuerdo con la reivindicación 35 o 36 en un método para producir plantas caracterizado porque tienen mejores rasgos relacionados con el rendimiento, preferentemente, mayor rendimiento, con respecto a las plantas de control y, con mayor preferencia, mayor rendimiento de semillas y/o mayor biomasa, con respecto a las plantas de control.

38. Planta, parte de planta o célula vegetal caracterizada por estar transformada con un constructo de acuerdo con la reivindicación 35 o 36.

39. Método para la producción de una planta transgénica que tiene mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control, preferentemente, mayor biomasa, con respecto a las plantas de control y, con mayor preferencia, mayor rendimiento de semillas y/o mayor biomasa, con respecto a las plantas de control, caracterizado porque comprende: (i) introducir y expresar en una célula vegetal o planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido inhibidor de Bax 1 como se define en cualquiera de las reivindicaciones 21 y 26 a 32; y (ii) cultivar la célula vegetal, o planta en condiciones que promuevan el desarrollo y el crecimiento de la planta.

40. Planta transgénica que tiene mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control, preferentemente, mayor rendimiento, con respecto a las plantas de control y, con mayor preferencia, mayor rendimiento de semillas y/o mayor biomasa, caracterizada porque es el resultado de la expresión modulada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido inhibidor de Bax 1 , como se define en cualquiera de las reivindicaciones 21 y 26 a 32, o una célula vegetal transgénica derivada de dicha planta transgénica.

41. Planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 34, 38 o 40, o una célula vegetal transgénica derivada de ésta, caracterizada porque dicha planta es una planta de cultivo, tal como remolacha, remolacha azucarera o alfalfa, o una monocotiledónea, tal como caña de azúcar, o un cereal, tal como arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, triticale, sorgo, emmer, espelta, sécale, trigo einkorn, teff, sorgo milo o avena.

42. Partes cosechables de una planta de acuerdo con la reivindicación 41 , caracterizadas porque dichas partes cosechables son semillas.

43. Productos caracterizados por ser derivados de una planta de acuerdo con la reivindicación 41 y/o de partes cosechables de una planta de acuerdo con la reivindicación 42.

44. Uso de un ácido nucleico caracterizado porque codifica un polipéptido inhibidor de Bax 1 como se define en cualquiera de las reivindicaciones 21 y 26 a 32 para mejorar los rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, con respecto a las plantas de control, preferentemente, para aumentar el rendimiento y, con mayor preferencia, para aumentar el rendimiento de semillas y/o para aumentar la biomasa en plantas, con respecto a las plantas de control.

45. Un método para mejorar los rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, con respecto a las plantas de control, caracterizado porque comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido SEC22, en donde dicho polipéptido SEC22 comprende un dominio tipo Longin.

46. Método de acuerdo con la reivindicación 45, caracterizado porque dicho dominio tipo Longin tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100 % de identidad de secuencia con: (i) un dominio tipo Longin en SEQ ID NO: 156 como se representa con la secuencia ubicada entre los aminoácidos 1 a 131 de SEQ ID NO: 156 (SEQ ID NO: 221 ) ; (ii) un dominio tipo Longin en SEQ ID NO: 158 como se representa con la secuencia ubicada entre los aminoácidos 1 a 131 de SEQ ID NO: 158 (SEQ ID NO: 222) .

47. Método de acuerdo con la reivindicación 45 o 46, caracterizado porque dicha expresión modulada se realiza mediante la introducción y expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido SEC22.

48. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 45 a 47, caracterizado porque dicho ácido nucleico que codifica un polipéptido SEC22 codifica cualquiera de las proteínas enumeradas en la Tabla H o es una porción de dicho ácido nucleico, o un ácido nucleico capaz de hibridarse con dicho ácido nucleico.

49. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 45 a 48, caracterizado porque dicha secuencia de ácidos nucleicos codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de la proteínas indicadas en la Tabla H.

50. Método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque dichos mejores rasgos relacionados con el rendimiento comprenden mayor rendimiento de semillas, preferentemente, mayor cantidad de semillas llenas, con respecto a las plantas de control.

51. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 45 a 50, caracterizado porque dichos mejores rasgos relacionados con el rendimiento se obtienen en condiciones de estrés por sequía.

52. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 45 a 50, caracterizado porque dichos mejores rasgos relacionados con el rendimiento se obtienen en condiciones sin estrés o de estrés, tal como estrés salino, o deficiencia de nitrógeno.

53. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 47 a 52, caracterizado porque dicho ácido nucleico se liga operativamente a un promotor constitutivo, preferentemente, a un promotor GOS2, con máxima preferencia, a un promotor GOS2 del arroz.

54. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 45 a 53, caracterizado porque dicho ácido nucleico que codifica un polipéptido SEC22 es de origen vegetal, preferentemente de una planta dicotiledónea, con mayor preferencia de la familia Solanaceae, con mayor preferencia del género Solanum, con máxima preferencia de Solanum lycopersicum.

55. Planta o parte de ésta, incluso semillas, que se puede obtener mediante un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 45 a 54, caracterizada porque dicha planta o parte de ésta comprende un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido SEC22.

56. Constructo caracterizado porque comprende: (i) ácido nucleico que codifica un polipéptido SEC22 como se define en las reivindicaciones 45 o 46; (ii) una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos de (a); y opcionalmente (¡ii) una secuencia de terminación de la transcripción.

57. Constructo de acuerdo con la reivindicación 56, caracterizado porque una de dichas secuencias de control es un promotor constitutivo, preferentemente, un promotor GOS2, con máxima preferencia, un promotor GOS2 del arroz.

58. Uso de un constructo de acuerdo con la reivindicación 56 o 57 en un método para producir plantas caracterizado porque tienen mayor rendimiento, en particular mayor biomasa y/o mayor rendimiento de semillas, en relación con las plantas de control.

59. Planta, parte de planta o célula vegetal caracterizada por estar transformada con un constructo de acuerdo con la reivindicación 56 o 57.

60. Método para la producción de una planta transgénica caracterizado porque tiene mayor rendimiento, en particular, mayor biomasa y/o mayor rendimiento de semillas, con respecto a las plantas de control, que comprende: (i) introducir y expresar en una planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido SEC22 como se define en la reivindicación 45 o 46; y (ii) cultivar la célula vegetal en condiciones que promuevan el desarrollo y el crecimiento de la planta.

61. Planta transgénica que tiene mayor rendimiento, en particular mayor biomasa y/o mayor rendimiento de semilla, en relación con las plantas de control, caracterizada porque es el resultado de la expresión modulada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido SEC22 como se define en la reivindicación 45 o 46, o una célula vegetal transgénica derivada de dicha planta transgénica.

62. Planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 55, 59 o 61 , o una célula vegetal transgénica derivada de ésta, caracterizada porque la planta es una planta de cultivo o una monocotiledónea o un cereal, tal como arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, triticale, sorgo, emmer, espelta, sécale, trigo einkorn, teff, sorgo milo y avena.

63. Partes cosechables de una planta de acuerdo con la reivindicación 62, caracterizadas porque las partes cosechables son, preferentemente, biomasa de brote y/o semillas.

64. Productos caracterizado por ser derivados de una planta de acuerdo con la reivindicación 62 y/o de partes cosechables de una planta de acuerdo con la reivindicación 63.

65. Uso de un ácido nucleico caracterizado porque codifica un polipéptido SEC2 para aumentar el rendimiento, en particular, aumentar el rendimiento de semillas y/o la biomasa de brotes en plantas, con respecto a las plantas de control. RESUMEN Un método para mejorar rasgos relacionados con el rendimiento en plantas mediante la modulación de la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo CLE 2 o un polipéptido BI-1 o un polipéptido SEC22. Plantas que tienen expresión modulada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido tipo CLE 2, o un polipéptido BI-1 , o un polipéptido SEC22, en donde dichas plantas tienen mejores rasgos relacionados con el rendimiento, con respecto a las plantas de control. Constructos que comprenden ácidos nucleicos que codifican tipo CLE 2, útiles en la realización de los métodos de la invención. Ácidos nucleicos que codifican BI-1 y constructos que los comprenden desconocidos hasta el momento, útiles en la realización de los métodos de la invención. Ácidos nucleicos que codifican SEC22 y constructos que los comprenden desconocidos hasta el momento, útiles en la realización de los métodos de la invención.