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MX2011000402A - Derivado de pirimidil sulfonamida y su uso para el tratamiento de enfermedades mediadas por quimiocinas. - Google Patents

Derivado de pirimidil sulfonamida y su uso para el tratamiento de enfermedades mediadas por quimiocinas.

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Publication number
MX2011000402A
MX2011000402A MX2011000402A MX2011000402A MX2011000402A MX 2011000402 A MX2011000402 A MX 2011000402A MX 2011000402 A MX2011000402 A MX 2011000402A MX 2011000402 A MX2011000402 A MX 2011000402A MX 2011000402 A MX2011000402 A MX 2011000402A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
compound
formula
pharmaceutically acceptable
modification
acceptable salt
Prior art date
Application number
MX2011000402A
Other languages
English (en)
Inventor
Premji Meghani
Jeffrey Paul Stonehouse
Andrew James Robbins
Original Assignee
Astrazeneca Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Astrazeneca Ab filed Critical Astrazeneca Ab
Publication of MX2011000402A publication Critical patent/MX2011000402A/es

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Abstract

Se describe un compuesto de la fórmula (I) y sales farmacéuticamente aceptables del mismo para usarse en el tratamiento de enfermedades y afecciones mediadas por quimiocinas.

Description

DERIVADO DE PIRIMIDIL SULFONAMIDA Y SU USO PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES MEDIADAS POR QUIMIOCINAS Descripción de la Invención La presente invención se refiere a ciertos compuestos heterocílieos , a procedimientos e intermediarios usados en su preparación, a composiciones farmacéuticas que los contienen y a su uso en terapia.
Las quimiocinas juegan un papel importante en respuestas inmunitarias e inflamatorias en varias enfermedades y trastornos, incluyendo asma y enfermedades alérgicas, así como patologías autoinmunes tales como artritis reumatoide y aterosclerosis . Estas pequeñas moléculas secretadas son una superfamilia creciente de proteínas de 8-14 kDa caracterizadas por un motivo de cisteína conservado. Actualmente, la superfamilia de quimiocinas comprende tres grupos que exhiben motivos estructurales característicos, las familias C-X-C, C-C y C-X3-C. Las familias C-X-C y C-C- tienen similitud de secuencia y se distinguen unas de otras con base en una sola inserción de aminoácido entre el par NH-proximal de residuos de cisteína. La familia C-X3-C se distingue de las otras dos familias sobre la base de que tiene una triple inserción de aminoácido entre el par NH-proximal de residuos de cisteína.
Las quimiocinas C-X-C incluyen varios potentes REF. : 216610 quimioatractores y activadores de neutrófilos tales como interleucina-8 (IL-8) y péptido 2 de activación de neutrófilo (NAP-2) .
Las quimiocinas C-C incluyen potentes quimioatractores de monocitos y . linfocitos pero no neutrófilos. Ejemplos incluyen proteínas quimiotácticas monocíticas humanas 1-3 (MCP-1, MCP-2 y MCP-3), RA TES (Regulada en Activación, T Normal Expresada y Secretada) , eotaxina y las proteínas inflamatorias de macrófagos la y 1ß (MIP-10C y ???-1ß) .
La. quimiocina C-X3-C (conocida también como fractalquina) es un potente quimioatractor y activador de microglía en el sistema nervioso central (SNC) así como de monocitos, células T, células NK y células cebadas.
Los estudios han demostrado que las acciones de las quimiocinas son mediadas por subfamilias de receptores acoplados a proteína G, entre los cuales están los receptores designados CCR1, CCR2 , CCR2A, CCR2B, CCR3 , CCR4 , CCR5 , CCR6 , CCR7, CCR8 , CCR9, CCR10 y CCR11 (para la familia C-C); CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4 y CXCR5 (para la familia C-X-C) y CX3CRI para la familia C-X3-C. Estos receptores representan adecuados objetivos para desarrollo de fármacos toda vez que agentes que modulen estos receptores serían útiles en el tratamiento de trastornos y enfermedades tales como aquellos mencionados arriba.
En nuestra solicitud de patente de PCT WO 2004/011443 describimos derivados de pirimidinil sulfonamida para usarse como moduladores de receptores de quimiocina.
La presente invención proporciona ahora el compuesto de la fórmula (I) y sales farmacéuticamente aceptables del mismo. Este compuesto no es anticipado por referencia a los compuestos descritos en WO-2004/011443 , habiendo siempre por lo menos dos diferencias estructurales. Además hemos encontrado que el compuesto de la fórmula (1) muestra un perfil farmacológico mejorado cuando se compara con estos compuestos. Específicamente el compuesto de la fórmula (1) tiene al menos una propiedad farmacológica mejorada como se establece en adelante en la presente. Aunque no se desea ser limitados por consideraciones teóricas, se anticipa que el perfil farmacológico mejorado del compuesto de la fórmula 1 produce una duración más larga de acción en el hombre. En un aspecto de la invención puede concluirse para una o dos veces de dosis diaria del compuesto de la fórmula 1.
La síntesis de formas ópticamente activas puede llevarse a cabo mediante técnicas estándares de química orgánica bien conocidas en la técnica, por ejemplo mediante síntesis a partir de materiales de partida ópticamente activos o mediante resolución de una forma racémica (por ejemplo, véase Enantioselective Synthesis of Fully protected anti 3-amino-2-hydroxy butyrates; Tetrahedron Asymmetry; 1995 , vol . 6, no. .9, p g. 2329-2342). De manera similar, la actividad mencionada arriba puede ser evaluada usando las técnicas de laboratorio estándares mencionadas en la presente más adelante.
Dentro de la presente invención se debe entender que el compuesto de la fórmula (1) o una sal o solvato del mismo puede exhibir el fenómeno de tautomerismo y que los dibujos de fórmula dentro de esta descripción pueden representar sólo una de las formas tautoméricas posibles. Debe entenderse que la invención abarca cualquier forma tautomérica y mezclas de las mismas y no debe limitarse simplemente a cualquier forma tautomérica utilizada en los dibujos de fórmulas. Los dibujos de fórmulas dentro de esta descripción pueden representar sólo una de las posibles formas tautoméricas y debe entenderse que la descripción abarca todas las formas tautoméricas posibles de los compuestos dibujados no sólo aquellas formas que haya sido posible mostrar gráficamente en la presente.
También debe entenderse que el compuesto de la fórmula (1) y sales del mismo puede existir en formas solvatadas así como no solvatadas tales como, por ejemplo, formas hidratadas . Debe entenderse que la invención abarca todas estas formas solvatadas o hidratadas .
La presente invención se refiere al compuesto de la fórmula (1) como el definido anteriormente en la presente así como a las sales del mismo. Las sales para usarse en composiciones farmacéuticas serán sales farmacéuticamente aceptables, pero otras sales pueden ser útiles en ¦ la producción del compuesto de la fórmula (1) y sus sales farmacéuticamente aceptables. Las sales farmacéuticamente aceptables de la invención pueden incluir sales de adición básicas del compuesto de la fórmula (1) como el definido anteriormente en la presente las cuales sean suficientemente básicas como para formar estas sales. Estas sales pueden formarse con una base inorgánica u orgánica que brinde un catión farmacéuticamente aceptable. Estas sales con bases inorgánicas u orgánicas incluyen por ejemplo una sal metálica alcalina, tal como una sal sodio o potasio, una sal de metal alcalinotérreo tal como una sal calcio o magnesio, o una sal de amina orgánica, por ejemplo una sal con tris- (2-hidroxietil) amina, dietanolamina o etanolamina.
La presente invención proporciona además un procedimiento para la preparación del compuesto de la fórmula (1) como el definido arriba, que comprende: (a) tratar un compuesto de la fórmula (2a) (2a) en donde PG es un grupo protector o dos átomos de hidrógeno separados y L es un grupo saliente tal como halógeno con la sulfonamida (2c) : en presencia de una base, catalizador y solvente adecuado, y opcionalmente posteriormente (i) o (ii) en cualquier orden: i) remover cualquier grupo protector; ii) formar una sal.
La reacción de los compuestos de la fórmula (2a) con la sulfonamida (2c) pueden llevarse a cabo en presencia de un catalizador adecuado y calentarse térmicamente o por microondas.
Ejemplos de bases adecuadas incluyen bicarbonatos metálicos tales como aquellos de cesio, potasio, litio o sodio o fosfatos metálicos tales como aquellos de litio, sodio o potasio (por ejemplo fosfato de potasio (K3P04) ) o trialquilaminas tales como trietilamina o N,N-di-isopropiletilamina . Más convenientemente se usa carbonato de cesio. Los solventes adecuados incluyen tolueno y éteres tales como anisol, tetrahidrof rano, 2-metiltetrahdirofurano, 1,4-dioxano, glima y diglima o ásteres tales como n-butilacetato o acetato de isopropilo. Convenientemente, se usa 1,4-dioxano. La reacción se puede llevar a cabo a temperaturas de entre 10°C y 120°C, convenientemente a 105°C. Ejemplos de catalizadores adecuados incluyen fuentes de paladio (0) adecuadas tales como paladio tris (dibencilidenacetona) dipaladio (0) (Pd2(dba)3), o tetrakistrifenilfosfi'napaladio (Pd(Ph3)4) (ya sea en equivalentes de 0.01-0.5 moles) en presencia de un ligando adecuado tal como ( 9 , 9-dimetil-9H-xanten-4 , 5-diil) bis [difenil-fosfina (Xantphos) , o 2-diciclohexil-fosfino-2 ' - (N, -dimetilamino) bifenilo o 2 -diciclohexil -fosfino-2' ,4' , 6' -tri - isopropil , 1, 1' -bifenilo (XPHOS) (ya sea en equivalentes de 0.01-0.5 molares). Convenientemente la combinación de catalizadores es tris (dibencilidenacetona) dipaladio (0) (Pd2(dba)3) con 2-diciclohexil-fosfino-2 ' ,4' ,6' -tri-isopropil, 1, 1' -bifenilo (Xphos) en equivalentes de 0.01-05 moles en 1,4-dioxano a 105 °C con carbonato de cesio como la base.
Los grupos protectores (PG) adecuados incluyen compuestos tanto acíclicos como cíclicos. Ejemplos de grupos protectores acíclicos incluyen bencilo, para-nitrobencilo o para-metoxibencilo . Convenientemente PG es cíclico.
Ejemplos de grupos protectores cíclicos adecuados incluyen ciclohexilidenos , ciclopentilidenos y acetónidos.
Convenientemente el grupo protector acetónido es usado, o como alternativa; (b) tratar un compuesto de la fórmula (2b) (2b) en donde PG2 es un grupo protector y L es un grupo saliente tal como halógeno con una amina de la fórmula (2d) (2d) en donde PG es un grupo protector adecuado o dos átomos de hidrógeno separados, en presencia de una base y solvente adecuados, y opcionalmente posteriormente (i) y/o (ii) en cualquier orden: i) remover cualquier grupo protector; ii) formar una sal.
La reacción de los compuestos de la fórmula (2b) con la amina (2d) se puede llevar a cabo en presencia de una base adecuada, solvente y calentarse térmicamente o por microondas.
Ejemplos de bases adecuadas incluyen (bi ) carbonates metálicos tales como sodio, potasio, cesio o trialquilaminas tales como trietilamina o N, -di- isopropiletilamina . Se usa convenientemente bicarbonato de sodio.
Los solventes adecuados incluyen N, N-dimetilamidas , l-metil-2 -pirrolidinona, tolueno y éteres tales como anisol, tetrahidrofurano, 2-metiltetrahidrofurano, 1,4-dioxano, glima, diglima y ésteres tales como acetato de n-butilo o acetato de isopropilo y alquilnitrilos tales como acetonitrilo o butironitrilo . Se usa convenientemente acetonitrilo .
La reacción se puede llevar a cabo a temperaturas de entre 10°C y 120°C.
Los compuestos de la fórmula (2a) pueden prepararse a partir de compuestos de la fórmula (3) (3) en donde L es un grupo saliente tal como halógeno, mediante tratamiento con la amina (2d) en donde PG es un grupo protector o dos átomos de hidrógeno separados, en. presencia de una base y solvente adecuados .
Ejemplos de bases adecuadas incluyen (bi) carbonatos metálicos tales como sodio, potasio, cesio o trialquilaminas tales como trietilamina o N,N-di-isopropiletilamína. Convenientemente se usa bicarbonato de sodio.
Los solventes adecuados incluyen N, N-dimetilamidas , 1-metil-2-pirrolidinona, éteres tales como tetrahidrofurano, 2 -metiltetrahidrofurano, 1,4-dioxano, glima y · diglima y ásteres tales como butilacetato o isopropilacetato y alquilnitrilos tales como acetonitrilo o butironitrilo . Se usa convenientemente acetonitrilo.
La reacción se puede llevar a cabo a temperaturas de entre 10°C y 120°C, convenientemente a 100°C.
Los compuestos de la fórmula (2b) en los que L es un grupo saliente tal como halógeno y PG2 es ya sea un g^po protector adecuado o hidrógeno, pueden prepararse mediante reacción de los compuestos de la fórmula (3) , en donde L es un grupo saliente tal como halógeno con la sulfonamida (2c) en presencia de una base adecuada, solvente con o sin un catalizador adecuado calentado térmicamente o por microondas, y opcionalmente posteriormente (i) o (ii) en cualquier orden: i) añadir cualquier grupo protector; ii) convertir el compuesto de la fórmula (2b) en un compuesto de la fórmula (2b) adicional.
Ejemplos de bases adecuadas incluyen los hidruros metálicos alcalinos tales como sodio o potasio, o alcóxidos metálicos tales como ter-butóxido de litio, sodio o potasio, hexametildisilazidas metálicas alcalinas tales como hexametildisilazida de litio, sodio o potasio, o carbonatos metálicos tales como sodio, potasio y cesio. Los solventes adecuados incluyen acetonitrilo, tetrahidrofurano, 2-metiltetrahidrofurano, 1,4-dioxano, glima y diglima. La temperatura de la reacción se puede llevar a cabo entre 0°C y 120°C. Ejemplos de catalizadores adecuados incluyen una fuente de paladio (0) tal como tetrakistrifenilfosfinapaldio (Pd(Ph3)4) o tris (dibencilidenacetona) dipaladio (0) (Pd2(dba)3) en presencia de un ligando adecuado tal como (9, 9-dimetil-9H-xanteno-4 , 5-diil) bis [difenil-fosfina (Xantphos) o 2-diciclohéxil -fosfino-2 ' - (N, -dimetilamino) bifenilo o 2-diciclohexil-fosfino-2 ' , 4 ' , 6' -tri- isopropil , 1,1' -bifenilo (XPHOS) .
Ejemplos de grupos protectores convenientes (PG2) incluyen éteres tales como éteres trimetilsililmetílicos (SEM) mediante alquilación usando [2- (clorometoxi ) etil] (trimetil) silano o un grupo para-metoxibencilo (PMB) mediante alquilación usando cloruro de para-metoxibencilo .
Los compuestos de la fórmula (3) en los que L es halógeno pueden prepararse a partir de compuestos de la fórmula (3) en los que L es un grupo hidroxi mediante reacción con un agente halogenante tal como oxicloruro( de fósforo con o sin un solvente adecuado. La reacción se puede llevar a cabo en presencia o ausencia de N, iV-dimetilanilina . Los solventes adecuados incluyen tolueno, xilenos, acetonitrilo, tetrahidrofurano, 2-metiltetrahidrofurano, 1,4- dioxano, glima y diglima.
La reacción se puede llevar a cabo a temperaturas de entre 90°C-150°C.
Los compuestos de la fórmula (3) en los que L es un grupo hidroxi pueden prepararse a partir de compuestos de la fórmula (4) : (4) en donde L es un grupo hidroxi mediante reacción con 1- (bromometil) -2 , 3-difluorobenceno, en presencia de una base y solvente adecuados .
Ejemplos de bases adecuadas incluyen los hidróxidos metálicos alcalinos tales como litio, sodio, potasio o (bi ) carbonatos metálicos tales como litio, sodio, potasio, cesio o acetatos metálicos tales como litio, sodio, potasio o cesio o alcóxidos metálicos tales como ter-butóxido de litio, sodio o potasio. Los solventes adecuados incluyen agua, N,N-dimetilamidas, l-metil-2-pirrolidinona, éteres tales como tetrahidrofurano, 2 -metiltetrahidrofurano, 1,4-dioxano, glima y diglima y alcoholes tales como metanol, etanol y ter-butanol y acetonitrilo . Se usa convenientemente acetato de sodio en metanol y mezclas en agua del mismo a 30-60°C. Más convenientemente se usa acetato de sodio en acetonitrilo y mezclas en agua del mismo a 40°C.
Los compuestos de la fórmula (4) , en donde L es un grupo hidroxi, (2c) y (2d) , en donde PG es ya sea un grupo protector tal como un acetónido o ciclohexilideno o dos átomos de hidrógeno separados se preparan ya sea usando procedimientos descritos en la presente, están disponibles comercialmente , se conocen bien en la literatura o pueden prepararse fácilmente usando técnicas conocidas.
En cada una de las variantes de proceso delineadas arriba para la preparación de compuestos de la fórmula (1) o una sal, solvato o éster hidrolizable in vivo farmacéuticamente aceptable de los mismos, cada uno de los materiales convenientes o adecuados indicados o condiciones de reacción representa un aspecto individual y distinto de la presente invención.
Se apreciará por aquellos expertos en la técnica que en los procedimientos de la presente invención ciertos grupos funcionales tales como grupos hidroxilo o amino en los reactivos de partida o compuestos intermediarios pueden tener que ser protegidos por grupos protectores. Así, la preparación de los compuestos de la fórmula (1) puede implicar, en una etapa adecuada, la remoción de uno o más grupos protectores. La protección y desprotección de grupos funcionales se describe completamente en ' Protective Groups in Organic Chemistry' , editado por J. W. F. McOmie, Plenum Press (1973), y 'Protective Groups in Organic Synthesis' , 2a edición, T. W. Greene & P. G. M. uts, iley- Interscience (1991) .
Ejemplos de grupos salientes convenientes se proporcionan en libros de texto de química estándares tales como "Organic Chemistry" por Jonathan Clayden et al, publicado por Oxford University Press (3a edición, 2005). Incluyen grupos halógeno, mesilato y tosilato. Halógeno, tal como cloro o bromo, convenientemente cloro es un grupo saliente conveniente.
El compuesto de la fórmula (1) anterior puede convertirse en una sal farmacéuticamente aceptable o solvato del mismo, como se describió arriba. La sal es convenientemente una sal de adición básica.
El compuesto de la fórmula (1) tiene actividad como un farmacéutico, en particular como un modulador de la actividad del receptor de quimiocinas (especialmente CXCR2) , y puede usarse en el tratamiento (terapéutico o profiláctico) de afecciones/enfermedades en humanos y animales no humanos las cuales sean exacerbadas o causadas por una producción excesiva o subregulada de quimiocinas . Ejemplos de estas afecciones/enfermedades incluyen, en donde cada afección/enfermedad se toma independientemente o en cualquier combinación de la misma: (1) el tracto respiratorio - enfermedades obstructivas de las vías respiratorias incluyendo enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) ; asma, tal como asma bronquial, alérgica, intrínseca, extrínseca y por polvo, particularmente asma crónica o inveterada (por ejemplo, asma tardía e hiper-responsividad de la vía respiratoria) ; bronquitis; rinitis aguda, alérgica, atrófica y rinitis crónica incluyendo rinitis caseosa, rinitis hipertrófica, rinitis purulenta, rinitis seca y rinitis medicamentosa; rinitis membranosa incluyendo rinitis cruposa, fibrinosa y pseudomembranosa y rinitis escrofulosa; rinitis estacional incluyendo rinitis nerviosa (fiebre del heno) y rinitis vasomotora; sarcoidosis, pulmón del granjero y enfermedades relacionadas, pulmón fibroide y neumonía intersticial idiopática; (2) hueso y articulaciones - artritis reumatoide, osteoartritis , espondiloartropatías seronegativas (incluyendo espondilitis anquilosante, artritis psoriásica y enfermedad de Reiter) , enfermedad de Behghet, síndrome de Sjógren y esclerosis sistémica; (3) piel - psoriasis, dermatitis atópica, dermatitis por contacto y otras dermatitis eccematosas, dermatitis seborreica, liquen plano, pénfigo, pénfigo ampollar, epidermólisis ampollar, urticaria, angiodermas, vasculitides , eritemas, eosinofilias cutáneas, uveítis, alopecia areata y conjuntivitis vernácula; (4) tracto gastrointestinal - enfermedad celíaca, proctitis, gastroenteritis eosinofílica, mastocitosis , enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, colitis indeterminada, colitis microscópica, enfermedad inflamatoria del intestino, síndrome del intestino irritable, diarrea no inflamatoria, alergias relacionadas con alimento las cuales tengan efectos más allá del intestino, por ejemplo, migraña, rinitis y eczema; (5) sistema nervioso central y periférico enfermedades neurodegenerativas y trastornos de demencia, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica y otras enfermedades neuronales motoras, enfermedad de Creutzfeldt-Jacob y otras enfermedades priónicas, encefalopatía por VIH (complejo de SIDA-demencia) , enfermedad de Huntington, demencia frontotemporal , demencia de cuerpos de Lewy y demencia vascular; polineuropatías , por ejemplo, síndrome de Guillain-Barré , polirradiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, neuropatía motora multifocal, plexopatías; desmielinización del SNC, por ejemplo, esclerosis múltiple, encefalomielitis diseminada/hemorrágica aguda y panencefalitis esclerosante subaguda; trastorno neuromusculares, por ejemplo, miastenia grave y síndrome de Lambert-Eaton; trastornos espinales, por ejemplo, paraparesis espástica trópica y síndrome del hombre rígido; síndromes paraneoplásicos , por ejemplo, degeneración cerebelar y encefalomielitis ; trauma del SNC; migraña y apoplej ía ; (6) otros tejidos y enfermedades sistémicas aterosclerosis , síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) , lupus eritematoso, lupus eritematoso sistémico, tiroiditis de Hashimoto, diabetes tipo I, síndrome nefrótico, fascitis eosinofílica, síndrome hiper IgE, lepra lepromatosa y púrpura trombocitopénia idiopática; adherencias postoperatorias y sépsis; (7) rechazo de aloinjertos - agudo y crónico después de, por ejemplo, trasplante de riñon, corazón, hígado, pulmón, médula ósea, piel y córnea; y enfermedad de injerto contra huésped crónica; (8) cánceres - especialmente cáncer pulmonar no microcítico (NSCLC) , melanoma maligno, cáncer de próstata y sarcoma escamoso y metástasis tumoral, cáncer de piel no melanoma y metástasis de quimioprevención; (9) enfermedades - en las cuales la angiogénesis está asociada con niveles elevados de quimiocina CXCR2 (por ejemplo, NSCLC, retinopatía diabética) ; (10) fibrosis uística; (11) lesiones por quemaduras y úlceras de piel crónicas ; (12) enfermedades reproductivas - por ejemplo trastornos de ovulación, menstruación e implantación, parto prematuro, endometriosis ; (13) lesión de reperfusión - en el corazón, cerebro, extremidades periféricas y otros órganos, inhibición de aterosclerosis .
De esta manera, la presente invención proporciona el compuesto de la fórmula (1) , o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, solvato o un éster hidrolizable in vivo del mismo, como el definido anteriormente en la presente para usarse en terapia.
Convenientemente el compuesto de la invención se usa para tratar enfermedades en las cuales el receptor de quimiocina pertenezca a la subfamilia del receptor de quimiocinas CXC, más convenientemente el receptor de quimiocina objetivo es el receptor CXCR2.
Las afecciones particulares que pueden ser tratadas con el compuesto de la invención son cáncer, enfermedades en las cuales angiogénesis esté asociada con niveles elevados de quimiocina CXCR2 , y enfermedades inflamatorias tales como asma, rinitis alérgica, COPD, artritis reumatoide, psoriasis, enfermedades inflamatorias del intestino, osteoartritis u osteoporosis . Cada afección/enfermedad listada arriba cuando se toma independientemente o en cualquier combinación representa una modalidad independiente de la invención.
El compuesto de la invención también se puede usar para tratar enfermedades en las cuales el receptor de quimiocina pertenezca a la subfamilia del receptor de quimiocina CCR, más convenientemente el receptor de quimiocina objetivo es el receptor CCR2b.
En un aspecto más, la presente invención proporciona un compuesto de la fórmula (1) , o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato o éster hidrolizable in vivo del mismo, como el definido anteriormente en la presente, para usarse como un medicamento.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso del compuesto de la fórmula (1) , o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato o éster hidrolizable in vivo del mismo, como el definido anteriormente en la presente para usarse como un medicamento en el tratamiento de enfermedades o afecciones humanas en las cuales la modulación de la actividad del receptor de quimiocinas sea benéfica.
En otro aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso del compuesto de la fórmula (1) , o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato o éster hidrolizable in vivo del mismo, como el definido anteriormente en la presente para usarse como un medicamento para el tratamiento de asma, rinitis alérgica, cáncer, COPD, artritis reumatoide, psoriasis, enfermedades inflamatorias del intestino, osteoartritis u osteoporosis .
En un aspecto más, la presente invención proporciona el uso del compuesto de la fórmula (1) , o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato o éster hidrolizable in vivo del mismo, como el definido anteriormente en la presente en la elaboración de un medicamento para usarse en terapia.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso del compuesto de la fórmula (1) , o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato o éster hidrolizable in vivo del mismo, como el definido anteriormente en la presente en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades o afecciones humanas en las cuales sea benéfica la modulación de la actividad del receptor de quimiocinas.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso del compuesto de la fórmula (1) , o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato o éster hidrolizable in vivo del mismo, como el definido anteriormente en la presente en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de asma, rinitis alérgica, cáncer, COPD, artritis reumatoide', psoriasis, enfermedades inflamatorias del intestino, osteoartritis u osteoporosis.
En el contexto de la presente descripción, el término "terapia" incluye también "profilaxis" a menos que haya indicaciones específicas de lo contrario. Los términos "terapéutico" y "terapéuticamente" deben considerarse en consecuencia .
La invención proporciona también además un método para tratar una enfermedad mediada por quimiocinas en donde la quimiocina se une a un receptor de quimiocina (especialmente CXCR2) , que comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto de la fórmula, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable como el definido anteriormente en la presente.
La invención proporciona también un método para tratar una enfermedad inflamatoria, especialmente asma, rinitis alérgica, COPD, artritis reumatoide, psoriasis, enfermedades inflamatorias del intestino, osteoartritis u osteoporosis , en un paciente que sufra de, o esté en riesgo de, la enfermedad, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto de la fórmula (1), o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, como el definido anteriormente en la presente.
Para los usos terapéuticos mencionados arriba la dosis administrada, por supuesto, variará con el compuesto empleado, el modo de administración, el tratamiento deseado y el trastorno indicado.
El compuesto de la fórmula (1) y sales o solvatos farmacéuticamente aceptables del mismo puede usarse por su propia cuenta pero generalmente se administrará en forma de una composición farmacéutica en la cual el compuesto de la fórmula ( 1) /sal/solvato (ingrediente activo) esté en asociación con un adyuvante, diluyente o portador farmacéuticamente aceptable. Dependiendo del modo de administración, la composición farmacéutica comprenderá adecuadamente de 0.05 a 99% en peso, muy convenientemente de 0.05 a 80% en peso, aún más convenientemente de 0.10 a 70% en peso y todavía más convenientemente de 0.10 a 50% en peso de ingrediente activo, todos los porcentajes en peso basándose en la composición total.
La presente invención proporciona también una composición farmacéutica que comprende el compuesto de lá fórmula (1) , o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, como el definido anteriormente en la presente, en asociación con un adyuvante, diluyente o portador farmacéuticamente aceptable.
La invención proporciona además un procedimiento para la preparación de una composición farmacéutica de la invención que comprende mezclar el compuesto de la fórmula (1), o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, como el definido anteriormente en la presente, con un adyuvante, diluyente o portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse tópicamente (por ejemplo, al pulmón y/o vía respiratoria o a la piel) en forma de soluciones, suspensiones, aerosoles de heptafluoroalcano y formulaciones en polvo secas; o sistémicamente , por ejemplo, mediante administración oral en forma de tabletas, cápsulas, jarabes, polvos o gránulos, o mediante administración parenteral en forma de soluciones o suspensiones, o mediante administración subcutánea o mediante administración rectal en forma de supositorios o transdérmicamente . Convenientemente, los compuestos de la invención se administran oralmente.
Además de su uso como medicinas terapéuticas, los compuestos de la fórmula (1) y sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables también son útiles como herramientas farmacológicas en el desarrollo y estandarización de sistemas de prueba in vitro e in vivo para la evaluación del efecto de la actividad de modulación de quimiocinas en animales de laboratorio tales como gatos, perros, conejos, monos, ratas y ratones, como parte de la investigación para nuevos agentes terapéuticos.
La invención se refiere además a terapias de combinación en las que un compuesto de la fórmula (1) o sales o solvatos farmacéuticamente aceptables del mismo, o una composición o formulación farmacéutica que comprende un compuesto de la fórmula (1), se administra concurrentemente o secuencialmente con terapia y/o un agente para el tratamiento de cualquiera de asma, rinitis alérgica, cáncer, COPD, artritis reumatoide, psoriasis, enfermedad inflamatoria del intestino, síndrome del intestino irritable, osteoartritis u osteoporosis .
En particular, para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, artritis reumatoide, psoriasis, enfermedad inflamatoria del intestino, síndrome del intestino irritable, COPD, asma y rinitis alérgica, los compuestos de la invención pueden combinarse con agentes tales como inhibidores de TNF-a tales como anticuerpos monoclonales anti-TNF (tales como Remicade, CDP-870 y D2.E7.) y moléculas, de inmunoglobulina del receptor de TNF tales como Etanercept (Enbrel) , inhibidores de C0X-1/C0X-2 no selectivos (tales como piroxicám, diclofenaco) , ácidos propiónicos tales como naproxeno, flubiprofeno, fenoprofeno, quetoprofeno e ibuprofeno) , fenamatos (tales como ácido mefenámico, indometacina, sulindac, apazona) , pirazolonas (tales como fenilbutazona) , salicilatos (tales como aspirina) , inhibidores de COX-2 (tales como meloxicam, celecoxib, rofecoxib, valdecoxib y etoricoxib) , metotrexato de baja dosis, lefunomida; ciclesonida ; hidroxicloroquina, d-penicilamina , auranofina u oro parenteral u oral. Para enfermedad inflamatoria del intestino y trastorno del intestino irritable agentes convenientes adicionales incluyen sulfasalazina y 5-ASAs, esteroides tópicos y sistémicos, inmunomoduladores e inmunosupresores , antibióticos, probióticos y anti-integrinas .
La presente invención se refiere también además a la combinación del compuesto de la invención junto con el inhibidor de biosíntesis de leucotrienos , inhibidor de 5-lipoxigenasa (5 -LO) o antagonista de proteína activadora de 5-lipoxigenasa (FLAP) tal como zileuton; ABT-761; fenleuton; tepoxalina; Abbott-79175 ; Abbott-85761 ; N- (5-sustituido) -tiofeno-2 -alquilsulfonamidas ; 2 , 6-di- er-butilfenol hidrazonas; metoxitetrahidropiranos tales como Zeneca ZD-2138; el compuesto SB-210661; compuestos de 2 -cianonaftaléno piridinil-sustituidos tales como L-739,010; compuestos de 2-cianoquinolina tales como L-746,530; compuestos de indol y quinolina tales como MK-591, MK-886 y BAY x 1005.
La presente invención se refiere también además a la combinación del compuesto de la invención junto con un antagonista receptor para leucotrienos LTB4 , LTC4 , LTD4 , y LTE seleccionado del grupo que consiste en fenotiazin-3-onas tales como L-651,392; compuestos amidino tales como CGS-25019c; benzoxalaminas tales como ontazolast; bencencarboximidamidas tales como BUL 284/260; y compuestos tales como zafirlukast, ablukast, montelukast, pranlukast, verlukast (MK-679) , rg-12525, Ro-245913, iralukast (CGP 45715A) y BAY x 7195.
La presente invención se refiere también además a la combinación del compuesto de la invención junto con un inhibidor de PDE4 incluyendo inhibidores de la isoforma PDE4D .
La presente invención se refiere también además a la combinación del compuesto de la invención junto con antagonistas del receptor anti-histamínico Hx tales como cetrizina, loratadina, desloratadina, fexofenadina, astemizol, azelastina y clorfeniramina .
La presenté invención se refiere también además a la combinación del compuesto de la invención junto con un antagonista del receptor H2 gastroprotector .
La presente invención se refiere también además a la combinación del compuesto de la invención junto con un agonista del adrenoceptor a- y a2, vasoconstrictor, agente simpatomimético tal como propilhexedrina, fenilefrina, fenilpropanolamina, pseudoefedrina, clorhidrato de nafazolina, clorhidrato de oximetazolina, clorhidrato de tetrahidrozolina, clorhidrato de xilometazolina y clorhidrato de etilnorepinefriña .
La presente invención se refiere también además a la combinación del compuesto de la invención junto con agentes anticolinérgicos tales como bromuro de ipratropio; bromuro de tiotropio; bromuro de oxitropio; pirenzepina y telenzepina.
La presente invención se refiere también además a la combinación del compuesto de la invención junto con agonistas del adrenoceptor ß? a ß4 tales como metaprotereriol , isoproterenol , isoprenalina, albuterol, salbutamol, formoterol, salmeterol, terbutalina, orciprenalina, mesilato de bitolterol y pirbuterol; o metilxantaninas incluyendo teofilina y aminofilina; cromoglicato de sodio; o antagonista del receptor muscarínico (MI, M2 y M3 ) .
La presente invención se refiere también además a la combinación del compuesto de la invención junto con un mimético de factor de crecimiento tipo insulina tipo I (IGF-1) · La presente invención se refiere también además a la combinación del compuesto de la invención junto con un grupo corticoide inhalado con efectos secundarios sistémicos reducidos, tal como prednisona, prednisolona, flunisolida, acetónido de triamcinolona, dipropionato de beclometasona , budesonida, propionato de fluticasona y furoato de mometasona .
La presente invención se refiere también además a la combinación del compuesto de la invención junto con un inhibidor de metaloproteasas de matriz (MMPs) , es decir, las estromelisinas , las colagenasas y las gelatinasas, así como agrecanasa; especialmente colagenasa-1 (MMP-1) , colagenasa-2 (MMP-8) , colagenasa-3 (MMP-13) , estreomelisina- 1 (MMP-3) , estromelisina-2 (MMP-10) y estromelisina-3 (MMP-11) y MMP-12.
La presente invención se refiere también además a la combinación del compuesto de la invención junto con otros moduladores de la función del receptor de quimiocinas tales como CCR1, CCR2 , CCR2A, CCR2B , CCR3 , CCR4 , CCR5 , CCR6 , CGR7 , CCR8 , CCR9, CCR10 y CCR11 (para la familia C-.C) ; CXCR1 , CXCR3 , CXCR4 y CXCR5 (para' la familia C-X-C) y CX3CR1 para la familia C-X3-C.
La presente invención se refiere también además a la composición del compuesto de la invención junto con agentes antivirales tales como Viracept, AZT, aciclovir y famciclovir, y compuestos antisepsis tales como Valant.
La presente invención se refiere también además a la combinación del compuesto de la invención junto con agentes cardiovasculares tales como blgqueadores de canales de calcio, agentes reductores de lípidos tales como estatinas, fibratos, beta-bloqueadores , inhibidores de ACE, antagonistas del receptor de angiotensina-2 e inhibidores de agregación plaquetaria.
La presente invención se refiere también además a la combinación del compuesto de la invención junto con agentes del SNC tales como antidepresivos (tales como sertralina) , · fármacos anti-Parkinsonianos (tales como deprenil, L-dopa, Requip, Mirapex, inhibidores de MAOB tales como selegina y . rasagilina, inhibidores de comP tales como Tasmar, inhibidores de A-2, inhibidores de reabsorción de dopamina, antagonistas de NMDA, agonistas de nicotina, agonistas de dopamina e inhibidores de óxido nítrico sintasa neuronal) , y fármacos anti-Alzheimer tales como donepezil, tacrina, inhibidores de COX-2, propentofilina o metrifonato.
La presente invención se refiere también además a la combinación del compuesto de la invención junto con (i) inhibidores de triptasa; (ii) antagonistas de factor de activación plaquetaria (PAF) ; (iii) inhibidores de enzima convertidora de interleucina (ICE); (iv) inhibidores de IMPDH; (v) inhibidores de molécula de adhesión incluyendo antagonistas de VLA-4; (vi) catepsinas; (vii) inhibidores de MAP cinasa; (viii) inhibidores de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa ; (ix) antagonistas del receptor de cinina ?? y B2; (x) agentes anti-gota, por ejemplo, colchicina; (xi) inhibidores de xantina oxidasa, por ejemplo, alopurinol; (xii) agentes uricosúricos , por ejemplo, probenecid, sulfinpirazona y benzbromarona ; (xiii) secretagogues de hormonas de crecimiento; (xiv) factor de crecimiento por transformación (TGF ) ; (xv) factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) ; (xvi) factor de crecimiento de fibroblastos; por ejemplo, factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) ; (xvii) factor estimulador de colonia de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) ; (xviii) crema de capsaicina; (xix) antagonistas del receptor de taquicinina Ki y NK3 seleccionados del grupo que consiste en NKP-608C; SB-233412 (talnetant) ; y D-4418; (xx) inhibidores de elastasa seleccionados del grupo que consiste en UT-77 y ZD-0892; (xxi) inhibidores de enzima de conversión de TNFa (TACE) ; (xxii) inhibidores de óxido nítrico sintasa inducida (iNOS) o (xxiii) molécula homologa del receptor de quimioatractor expresada en células TH2 (antagonistas de CRTH2) .
El compuesto de la presente invención también se puede usar en combinación con agentes de osteoporosis tales como roloxifeno, droloxifeno, lasofoxifeno o fosomax y agentes inmunosupresores tales como FK-506, rapamicina, ciclosporina, azatioprina y metotrexato.
El compuesto de la invención también se puede usar en combinación con agentes terapéuticos existentes para el tratamiento de osteoartritis . Los agentes adecuados que se usarán en combinación incluyen agentes anti- inflamatorios no esteroides estándares (en adelante NSAIDs) tales como piroxicam, diclofenaco, ácidos propiónicos tales como naproxeno, flubiprofeno, fenoprofeno, quetoprofeno e ibuprofeno, fenamatos tales como ácido mefenámico, indometacina, sulindac, apazona, pirazolonas tales como fenilbutazona, salicilatos tales como aspirina, inhibidores de COX-2 tales como celecoxib, valdecoxib, rofecoxib' y etoricoxib, analgésicos y terapias intraarticulares tales como corticosteroides y ácidos hialurónicos tales como hialgan y antagonistas del receptor sinvisc y P2X7.
El compuesto e la invención también se puede usar en combinación con agentes terapéuticos existentes para el tratamiento de cáncer. Los agentes adecuados que se usarán en combinación incluyen: (i) fármacos antiproliferativos/antineoplásicos y combinaciones de los mismos, como los usados en oncología médica, tales como agentes alquilantes (por ejemplo cisplatino, carboplatino, ciclofosfamida, mostaza nitrogenada, melfalano, clorambucilo, busulfan y nitrosoureas) ; antimetabolitos (por ejemplo antifolatos tales como fluoropirimidinas como 5-fluorouracilo y tegafur, raltitrexed, metotrexato, arabinósido de citosina, hidroxiurea, gemcitabina y paclitaxel (Taxol"9) ; antibióticos antitumor (por ejemplo antraciclinas tales como adriamicina, bleomicina, doxorrubicina, daunomicina, epirrubicina, idarrubicina, mitomicina-C, dactinomicina y mitramicina) ; agentes antimitóticos (por ejemplo vinca alcaloides tales como vincristina, vinblastina, vindesina y vinorelbina- y taxoides tales como taxol y taxotere) e inhibidores de topoisomerasa (por ejemplo epipodofilotoxinas tales como etopósido y tenipósido, ansacrina, topotecan y camptotecina) ; (ii) agentes citoestáticos tales como antioestrógenos (por ejemplo, tamoxifen, toremifen, raloxifen, droloxifen y yodoxifen) , subreguladores del receptor de estrógenos (por ejemplo, fulvestrant) , antiandrógenos (por ejemplo, bicalutamida, flutamida, nilutamida y acetato de cirpoterona) , antagonistas de LHRH o agonistas de LHRH (por ejemplo goserelina, leuprorelina y buserelina) , progestógenos (por ejemplo, acetato de megestrol) , inhibidores de aromatasa (por ejemplo anastrozol, letrozol, vorazol y exemestano) e inhibidores de 5a-reductasa tales como finasteride ; (iii) agentes que inhiben la invasión de células cancerosas (por ejemplo, inhibidores de metaloproteinasas tales como marimastat e inhibidores de la función de receptor de activador de plasminógeno de urocinasa) ; (iv) inhibidores de función de factor de crecimiento, por ejemplo inhibidores tales como anticuerpos de factores de crecimiento, anticuerpos de receptor de factor de crecimiento (por ejemplo el anticuerpo anti-erbb2 trastuzumab [Herceptin™] y el anticuerpo anti-erbbl cetuximab [C225] ) , inhibidores de farnesil transferasa, inhibidores de tirosina cinasa e inhibidores de serina/treonina cinasa, por ejemplo inhibidores de la familia del factor de crecimiento epidérmico (por ejemplo, inhibidores de tirosina cinasa de la familia de EGFR tales como - (3-cloro-4-fluorofenil) -7-metoxi-6- (3-morfolinopropoxi) quinazolin-4 -amina (gefitinib, AZD1839) , - (3 -etinilfenil ) -6 , 7-bis (2-metoxietoxi) quinazolin-4-amina (erlotinib, OSI-774) y 6 -acrilamido-N- ( 3 -cloro-4 -fluorofenil) -7- ( 3 -morfolinopropoxi ) quinazolin-4 -amina (C11033)), por ejemplo inhibidores de la familia del factor de crecimiento derivado de plaquetas y por ejemplo inhibidores de la familia del factor de crecimiento de hepatocitos ; (v) agentes antiangiogénicos tales como aquellos que inhiben los efectos de factor de crecimiento endotelial vascular (por ejemplo el anticuerpo anti factor de crecimiento celular endotelial vascular bevacizumab [Avastin™] , compuestos tales como aquellos descritos en las solicitudes de patente internacionales WO 97/22596, WO 97/30035, WO 97/32856 y WO 98/13354) y compuestos que funcionan mediante otros mecanismos (por ejemplo, linomida, inhibidores de la función de integrina a?ß3 y angiostatina) ; (vi) agentes de daño vascular tales como Combrestatina A4 y compuestos descritos en las solicitudes de patente internacionales WO 99/02166, WOOO/40529, WO 00/41669, WO01/92224, WO02/04434 y WO02/08213; (vii) terapias antisentido, por ejemplo aquellas que están dirigidas a los objetivos listados arriba, tales como ISIS 2503, un anti-ras antisentido; (viii) enfoques de terapia génica, incluyendo por ejemplo enfoques para reemplazar genes aberrantes tales como p53 aberrante o enfoques de BRCA1 o BRCA2 , GDEPT (terapia de profármaco enzimático dirigida a genes) tales como aquellos que usan citosina desaminasa, timidina cinasa o una enzima nitrorreductasa bacteriana y enfoques para incrementar1 la tolerancia de pacientes a quimioterapia o radioterapia tales como terapia génica de resistencia a varios fármacos; y (ix) enfoques de inmunoterapia , incluyendo por ejemplo enfoques ex- vivo o in vivo para incrementar la inmunogenicidad de células tumorales de pacientes, tales como transfección con citocinas tales como interleucina 2, interleucina 4 o facto estimulador de colonia de granulocitos -macrófagos , enfoques para reducir la anergia de células T, enfoques usándo células inmunes transíectadas tales como ' células dendríticas transfectadas con citocinas, enfoques que usan líneas de células tumorales transfectadas con citocinas y enfoques que usan anticuerpos anti-idiotípicos .
La invención se ilustrará ahora pero no se limitará por referencia a la siguiente descripción específica, ejemplos, datos biológicos y ejemplos de referencia .
Descripción específica El compuesto de la fórmula (1) tiene al menos una propiedad farmacológica mejorada en comparación con cualquiera de los compuestos conocidos identificados abajo (véase tablas 1 y 2) .
El componente metabólico hepático de depuración humana es predicho a partir de los datos de depuración intrínseca (CLint) in vitro escalados de hepatocitos humanos (véase Chem Biol Interact. 2007, 168(1), 2-15) y del grado de unión a la sangre humana, principalmente debido a la unión a proteínas en plasma. El modelo bien agitado del hígado es un modelo para predecir la depuración en sangre en el hígado de la depuración intrínseca (CLint) determinada usando hepatocitos (véase Drug Metab Dispos. 2005, 33(9), 1304-11). El modelo se escribe normalmente como: Q.A.B.CLmt.fuham!m 1000.(B/P)./Wmc Chuman (ml/mill/kg) = A.tí.LLint.Juhmn¡m + Q 1000.(B/P)./w. en donde A es millones de hepatocitos por gramo de hígado, B es gramos de hígado por kilogramo de peso corporal (los valores estándares de estos parámetros son A = 120 y B = 22.1), fuhuman es la fracción libre humana en plasma, fuinc es la f acción libre en la matriz de hepatocitos y B/P es la relación de concentración de sangre a plasma en sangre humana.
Es claro a partir del modelo anterior que reducir la depuración intrínseca (CLint) de hepatocitos humanos in vitro reduce la depuración metabólica humana (CL) . Reducir la depuración metabólica (CL) incrementa la vida media de eliminación (ti 2) y de esta manera la duración de acción del fármaco como puede verse al considerar la siguiente ecuación bien conocida: La vida media de eliminación (t1(2) es el tiempo que tarda en alcanzar las concent aciones en plasma medias (en la fase asociada con el área más grande del perfil de concent ación en pl asma - 1 i empo ) y Vd es el volumen de distribución (véase Clinical Pharmacokinet ics , concepts and appl i cat ions , 3a edición, 1995 por M Rowland y T.N. Tozer, Publisher Williams and Wilkins y véase Current Drug Matabolism, 2006 , 7(3), 251-64) .
Se concluye de lo anterior que depuraciones más bajas (CLint) y (CL) impactarán tanto a la dosis requerida para lograr concentraciones terapéuticas de fármaco como también la frecuencia de dosificación. Una (CL) más baja significa que se requiere una dosis más baja de fármaco para lograr concentraciones terapéuticas.
En particular, una comparación de los compuestos de WO 2004/011443 es decir, ejemplos 21 y 39-42 (véase tabla 1) , con el compuesto de la fórmula (1) (véase tabla 2) muestra que el compuesto de la fórmula (1) tiene tanto potencia mejorada (pIC50 = 8.2) como depuración intrínseca hepática reducida (Clint= 2.1) como una medida de su estabilidad metabólica hepática.
Específicamente, el ejemplo 21 (pIC50= 5.6 ) (tabla 1) de WO 2004/011443 exhibió un valor de depuración intrínseca hepática bajo (Clint=2.3) comparable con el compuesto de la fórmula (1) (Clint= 2.1) . Sin embargo, este compuesto es significativamente menos potente que los compuestos de los ejemplos 39-42 (316-1,000 veces) y el compuesto de la fórmula (1) (398 veces) .
Las modificaciones estructurales abarcadas en algunos compuestos de los ejemplos 39-42 (tabla 1) de WO 2004/011443 llevaron a potencias más altas (pIC50 = 8.1-8.6) en comparación con el compuesto de la fórmula (1) (pIC50 = 8.2) . Sin embargo, los compuestos de los ejemplos 39-42 son metaból icamente menos estables como lo evidencia sus depuraciones intrínsecas hepáticas más altas en comparación con el compuesto del ejemplo 21 de WO - 2004 / 022443 (2.2-7.4 veces) y el compuesto de la fórmula (1) (2.4-8.1 veces) . Además, el compuesto de la fórmula (1) exhibe una fracción libre favorable en plasma humano. Una fracción libre mejorada en plasma humano se espera que se traduzca en una potencia en sangre entera humana total mejorada en el hombre.
Tabla 1 Estructuras y perfil farmacológico de los compuestos descritos en WO 2004/011443 - indica datos no determinados.
Tabla 2 Estructura y perfil farmacológico del compuesto de la formula (1) La invención se ilustrará ahora por medio de los siguientes ejemplos no limitativos en los cuales, a menos que se indique lo contrario: (i) cuando se dan, los espectros de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) fueron medidos en un espectrómetro Varían Unity Inova 300 ó 400 MHz . Los datos de XH RMN se citan en forma de valores delta para protones de diagnóstico mayores, dados en partes por millón (ppm) con relación a tetrametilsilano (TMS) como un estándar interno. (ii) los espectros de Espectrometría de Masas (MS) fueron medidos en un espectrómetro Finnigan Mat SSQ7000 o Mcriomass Platform. (iii) los compuestos de los títulos y subtítulos de los ejemplos y métodos fueron nombrados usando el programa IUPAC ACD Ñame (versión 8.0) de Advanced Chemical Developtment Inc, Canadá. (iv) la cromatografía en columna en fase normal y HPLC en fase normal se llevaron a cabo usando una columna de sílice. La purificación por Cromatografía de Líquidos de Alta Presión de Fase Inversa (HPLC) se llevó a cabo usando ya sea un Waters Micromass LCZ con, un controlador de bomba Waters 600, detector Waters 2487 y colector de fracción Gilson FC024 o un Waters Delta Prep 4000 o un Sistema de Autopurificación Gilson, usando una columna de sílice de fase inversa Symmetry, NovaPak o ExTerra. (v) las rotaciones ópticas se midieron usando un polarímetro AA-1000. [a] D se midieron a una temperatura de 20°C y a la longitud de onda de la línea de sodio D, 589.3 nm. (vi) el análisis de difracción en polvo de rayos X (XRPD) mostrado en las figuras 1-6 se llevó a cabo usando una máquina PANalytical CubiX PRO. Los datos fueron recogidos en la máquina PANalytical CubiX PRO en la configuración T-2T sobre la escala de barrido de 2o a 40° 2? con exposición de 100 segundos por incremento de 0.02°. Los rayos X fueron generados por un tubo de foco fino largo de cobre operado a 45 kV y 40 mA. La longitud de onda de los rayos X de cobre fue de 1.5418 Á. Los datos se recabaron sobre sostenedores de fondo cero en los cuales ~2 mg del compuesto se pusieron. El sostenedor se hizo a partir de un solo cristal de silicio, el cual había sido cortado a lo largo de un plano de no difracción y luego se pulió en un acabado plano ópticamente. Los rayos X incidentes en esta superficie fueron negados por extinción de Bragg. Todos los picos indicados son precisos a ± 0.1 T. (vii) se usaron las siguientes abreviaturas: Xphos 2-diciclohexil-fosfino-2 ' ,4' ,6' -tri- isopropil ,1,1' -bifenilo AcOH ácido acético CHC13 cloroformo DCM diclorometano DMF N, iV-dimetilformamida í DMSO sulfóxido de dimetilo Et20 éter dietílico EtOAc acetato de etilo MgS04 sulfato de magnesio NMP l-metilpirrolidin-2 -ona THF tetrahidrofurano H20 agua NH3 amonia TFA ácido trifluoroacético MeOH metanol EtOH etanol Ejemplo 1 -V- (2- [ (2,3-difluorobencil) tio] -6-( [ (1R,2R) -2 , 3 -dihidroxi-1- metilporpil] amino}pirimidin-4-il) azetidin-l-sulfonamida i) 1- [ (4S) -2 , 2-dimetil-l, 3 -dioxolan-4 -il] etanona Ácido cítrico (70 g, 0.37 moles) en agua (67 mL) se añadió a una solución agitada de 2 , 2-dimetil-l, 3 -dioxolan-4 -carboxilato de (S) -potasio (J. Med. Chem. 1991, 34, (1), 392-397), (75 g, 0.41 moles) en agua (89 mL) y acetato de etilo (600 mL) . La solución orgánica se separó y la solución acuosa se extrajo con acetato de etilo (3 x 300 mL) . Los extractos orgánicos combinados se secaron (MgS0 ) , . se filtraron, se concentraron al vacío y luego se secaron al alto vacío a temperatura ambiente para dar un aceite transparente (59 g, 0.41 moles). El ácido libre (ácido (AS) -2 , 2-dimetil-l, 3 -dioxolan-4 -carboxílico) se disolvió en éter diétílico seco (800 mL) con agitación y se enfrió a 0°C bajo una atmósfera de nitrógeno. Se añadió por goteo bromuro de metilmagnesio (3 M en éter diétílico, 200 mL, 0.60 moles) . Luego se añadió una cantidad adicional de éter diétílico seco (300 mL) , seguida por una cantidad adicional de bromuro de metil magnesio (3M en éter dietílico, 97 mL, 0.29 moles). La adición se completó durante 75 minutos. La mezcla de reacción se agitó a 0°C durante 30 minutos más, después se dejó calentar a la temperatura ambiente y se agitó durante 18 horas adicionales. Se añadió por goteo acetato de etilo (91 mL) durante 5 minutos periodo durante el cual la temperatura se elevó de 21 a 25°C, y la mezcla se agitó durante 15 minutos. La mezcla de reacción se vertió por lotes en cloruro de amonio acuoso (230 g en 730 mL) pre-enfriado en un baño de hielo a 5°C, tiempo durante el cual la temperatura se elevó a 10°C. La fase orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con éter dietílico (4 x 600 mL) . Las fracciones orgánicas combinadas se secaron (MgS0 ) y se concentraron al vacío (temperatura de baño menor que 20°C) para dar el producto como un aceite amarillo pálido (27 g, 46%) .
XH RM (400 MHz, CDC13) : d 4.41 (t, 1H) , 4.20 (t, 1H) , 4.00 (dd, 1H) , 2.26 (s, 3H) , 1.49 (s, 3H) , 1.40 (s, 3H) . ii) (IR) -1- [ (4R) -2>2-dimetil-l,3-dioxolan-4-il] -N- [ (IR) -1- feniletil] etanamina (R) - (a) -Metilbencilamina (29.6 g, 31 mL, 0.24 moles) se añadió por goteo durante 2 minutos a una solución agitada del producto de la etapa i) (1- [ (4S) -2 , 2-dimetil-l, 3-dioxolan-4-il] etanona) (27.1 g, 0.19 moles) en acetonitrilo seco (430 mL) bajo una atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se enfrió en un baño de agua mientras ácido acético (14.6 g, 13.9 mL, 0.24 moles) se añadió por goteo durante 10 minutos . Durante este periodo la temperatura se mantuvo entre 20-23°C. Después de agitar durante 10 minutos más, se añadió por lotes durante una hora triacetoxiborohidruro de sodio (99.7 g, 0.47 moles), manteniendo la temperatura entre 24 y 26 °C. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 72 horas (durante el fin de semana) . La mezcla se vertió sobre bicarbonato de sodio acuoso y se añadió bicarbonato de sodio sólido hasta que la efervescencia cesara (pH 7-8) . La solución orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con éter dietílico (2 x 500 mL) . Los extractos orgánicos combinados se lavaron con cloruro de sodio acuoso (300 mL) , se secaron (MgS04) , se filtraron y se concentraron al vacío para dejar un aceite de dos fases (transparente/amarillo) (43.5 g) . Se añadió isohexano y la capa inferior viscosa se separó. El extracto de isohexano se concentró después al vacío para dar el producto crudo como un aceite amarillo pálido.
La reacción anterior se repitió dos veces más usando 10.3 g y 33.6 g de (R) - (a) -metilbencilamina con 9.4 g y 30.8 g de 1- [ (4S) -2, 2-dimetil-l, 3 -dioxolan-4 - il] etanona respectivamente para dar 14.7 g y 43 g de producto crudo respectivamente. Los productos crudos combinados (100.7 g) se purificaron como sigue: La mezcla de productos diastereoméricos se purificó en lotes (aproximadamente 22.5 g cada corrida) mediante cromatografía en sílice (Biotage, EtOAc: isohexano : triet ilamina 20:80:0.5) . Fracciones adecuadas que contenían el producto deseado (punto superior) se combinaron en dos lotes separados (fracción 1:32.9 g y fracción 2: 19.5 g) y se volvieron a someter a cromatografía por separado (fracción 1 en 2 lotes, fracción 2 en un lote) para dar el compuesto del subtítulo como un aceite amarillo pálido (39.2 g, 33%) .
¾ RMN (300 Hz, CDC13) : d 7.31 (m, 4H) , 7.23 (m, 1H) , 4.01 (m, 2H) , 3.84 (m, 2H) , 2.73 (m, 1H) , 1.43 (s, 3H) , 1.36 (s, 3H) , 1.31 (d, 3H) , 0.95 (d, 3H) .
Pureza por GC MS 100% MS: APCI (tve) 105 (pico base), 234 (M-15) , 250[M+H] + Pureza por HPLC MS 97.5%; (Sin impurezas >0.8%) [a]D+33.17 @ 589 nm, c = 8.35 mg/ml de MeOH.
Pureza por HPLC quiral 100% @ 220 nm. (columna Chirobiotic V 4.6 x 100 mm eluyendo con 6.7:3.3:90, 0.1% de AcOH en MeOH: 0.1% de TEA en MeOH:MeOH, 1 mL/min, 20°C durante 15 minutos) . iii) { {IR) -1- [ (4J¾) -2,2-dimetil-l,3-dioxolan-4-il] etil)carbamato de fcer-butilo Una mezcla del producto · de la etapa ii) ( (IR) -1- [ (4i¾) - 2,2-dimetil-l, 3 -dioxolan-4 - il] -N- [(IR) -1-feniletil] etanamina) (18.9 g, 76 mmoles) , dicarbonato de di-ter-butilo (16.9 g, 76 mmoles) y 20% de hidróxido de paladio(II) sobre carbón (0.92 g) en etanol (270 mL) se hidrogenó a una presión de 4 atmósferas de hidrógeno a temperatura ambiente con agitación durante 72 horas (durante el fin de semana) . La mezcla de reacción se filtró a través de Hyflo y el solvente se evaporó para dar el compuesto del subtítulo como un sólido cristalino incoloro (18.7 g, 100%) .
¾ RM (400 MHz, CDCl3) : d 4.56 (bs, 1H) , 4.02 (t + bs, 2H) , 3.76 (q + bs , 2H) , 1.44 (s, 9H) , 1.43 (s, 3H) , 1.34 (s, 3H) , 1.15 (d, 3H) .
Pureza GC MS 100% , MS: APCI (+ve) 57 (pico base) , 230 (M-15) [a]D + 12.49 @ 589 nm, c = 9.6 mg/ml MeOH iv) clorhidrato de {2R,3R) -3-aminobutano-l, 2-diol Una solución del producto de la etapa iii) ({ (1J?)-1- [ (4R) -2, 2-dimetil-l, 3 -dioxolan-4 - il] et il } carbamato de ter-butilo) (10 g, 41 mmoles) en metanol (51 mL) se trató con HC1 4 M en dioxano (51 mL) por goteo durante 10 minutos con agitación, manteniendo la temperatura entre 21°C a 25°C con un baño de agua, y la mezcla se agitó después a temperatura ambiente durante 18 horas. El solvente se removió al vacío, el residuo se sometió a destilación azeotrópica dos veces con tolueno y luego se secó al alto vacío para dar el compuesto del subtítulo como una goma viscosa amarilla que conservaba cierto solvente residual (7.3 g) .
¾ RM (300 MHz, DMSO) : d 7.79 (bs, 3H) , 3.67 (m, 1H) , 3.42 (dd, 1H) , 3.30 (m, 2H) , 1.10 (d, 3H) . v) (2R,3R) -3- ({6-cloro-2- [ (2,3-difluorobencil) tio [pirimidin-4 -il)amino) butano- 1, 2 -diol Una mezcla del producto de la etapa iv) (clorhidrato de (2R, 3R) -3-aminobutano-l, 2-diol) (3.3 g, (con base en 75% en peso del análisis RMN) , 2.5 g, 17 mmoles) , 4 , 6-dicloro-2- [ (2 , 3 -difluorobencil ) tio] pirimidina (WO-2004/011443) (5.0 g, 16 mmoles) y carbonato ácido de sodio (4.4 g, 53 mmoles) en acetonitrilo (80 mL) se calentó a reflujo con agitación bajo una atmósfera de nitrógeno durante 18 horas. La mezcla de reacción se enfrió a la temperatura ambiente, el solvente se removió al vacío y el residuo se dividió entre agua y acetato de etilo. La fase orgánica se separó y se lavó con agua y salmuera antes de ser secada (MgS04) , filtrada y concentrada al vacío para dar un aceite amarillo (7.5 g) . El aceite se purificó mediante cromatografía en sílice (Biotage, acetato de etilo : isohexano, 8:2) para dar el producto como una espuma blanca (5.7 g, 95%) .
¾ R (300 MHz, DMSO) : 6 7.70 (d, 1H) , 7.32 (m, 2H) , 7.15 (m, 1H) , 6.32 (s, 1H) , 4.83 (d, 1H) , 4.59 (t, 1H) , 4.37 (q, 2H) , 4.21 (bm, 1H) , 3.52 (m, 1H) , 3.34 (m, 2H) , 1.02 (d, 3H) .
Pureza por HPLC MS 100%; MS: APCI(+ve) 376/378 [M+H] + vi) N- (2- [ (2,3-difluorobencil) tio] -6-{ [ (1R,2R) -2,3-dihidroxi- 1-metilpropil] amino}pirimidin-4-il) azetidin-1-sulfonamida Una mezcla del producto de la etapa v) ( (2R,3R)-3 ( {6 -cloro- 2- [ (2 , 3-difluorobencil) tio] pirimidin-4 -il } amino) butano- 1 , 2 -diol ) (5.3 g, 14 mmoles) , azetidin-1 sulfonamida (WO-2004/011443 ) (2.7 g, 19 mmoles), paladio(II tris (dibencil idenacetona) dipaladio (0) (0.82 g) , Xphos (0.82 g) y carbonato de cesio (6.4 g, 20 mmoles) en dioxano seco (85 mL) se calentó a 105°C durante 90 minutos con agitación bajo una atmósfera de nitrógeno. La mezcla se dejó enfriar a la temperatura ambiente, se añadió ácido acético (3 mL) y el solvente se removió al vacío. Los residuos se dividieron entre agua y acetato de etilo, y la fracción orgánica se separó, se lavó con agua y salmuera, se secó (MgS04) , se filtró y se concentró al vacío para dar una espuma roja (10.0 g) . El producto se purificó dos veces mediante cromatografía (Si02, EtOAc) para dar una espuma amarilla que se suspendió en DCM, se llevó a reflujo durante 10 minutos y luego se dejó enfriar a la temperatura ambiente durante la noche con agitación. El sólido se filtró y se secó al vacío para dar el compuesto del título como un sólido incoloro (4.2 g, 63%) asignado como una forma cristalina de modificación A.
H RMN (400 MHz, DMSO) : d 10.49 (s, 1H) , 7:35 (m, 2H) , 7.14 (m, 1H) , 5.99 (s, 1H) , 4.71 (s, 1H) , 4.53 (s, 1H) , 4.39 (q, 2H) , 4.17 (bs, 1H) , 3.88. (t, 4H) , 3,48 (m, 1H) , 2.12 (m, 2H) , 1.04 (d, 3H) , 3.33 (m (parcialmente oscurecido por señal HOD) , 2H) Pureza por HPLC MS 99.2%; MS: APCI(+ve) 476 [M+H] + Análisis elemental: encontrado: C, 45.32; H, 4.86; N, 14.79; S, 13.47%.
Calculado para: [Ci8H23N50 S2F2 ] : C, 45.46; H, 4.87; N, 14.73; S, 13.48%. p.f. 116-116.5°C. [a]D+28.3 @ 589 nm, c=0.972 mg/ml de MeOH.
Pureza quiral HPLC 98.3% @ 220 nm. (columna Chiralcel OD 4.6 x 250 mm eluyendo con 90:10, 0.1% de TFA en isohexano; isopropanol, 1 mL/min, 40°C durante 90 minutos) . La cristal inidad de la modificación A se mejoró al suspender el material (10.8 mg) en agua (150 µ?) a temperatura ambiente durante una semana. El sólido se aisló de la suspensión después de una semana y se analizó mediante XRPD . El patrón XRPD para la modificación A se muestra en la figura 1. Algunos de los picos característicos para la modificación A se listan en la tabl 3.
. Tabla 3 Algunos picos característicos para la modificación A La modificación B se preparó al suspender la modificación A (8.9 mg) en ciclohexano (70 µ?) a temperatura ambiente durante una semana. El sólido se aisló de la suspensión después de una semana y se analizó mediante XRPD . El patrón XRPD para la modificación B se muestra en la figura 2. Algunos de los picos característicos para la modificación B se listan en la tabla 4. La modificación B también se produjo al suspender la modificación A en isopropanol a temperatura ambiente y en hexano, ciclohexano, agua o tolueno a 70°C todo durante una semana.
Tabla 4 Algunos picos característicos para la modificación B La modificación C se preparó al suspender la modificación A (9.6 mg) en dioxano (50 µ?) a temperatura ambiente durante una semana. El sólido se aisló de la suspensión después de una semana y se analizó mediante XRPD. El patrón XRPD para la modificación C se muestra en la figura 3. Algunos de los picos característicos para la modificación C se listan en la tabla 5.
Tabla 5 Algunos picos característicos para la modificación C La modificación D se preparó al suspender la modificación A (9.1 mg) en acetato de etilo (50 µ?) a temperatura ambiente durante una semana. El sólido se aisló de la suspensión después de una . semana y se analizó mediante XRPD. El patrón XRPD para la modificación D se muestra en la figura 4. Algunos picos característicos para la modificación D se listan en la tabla 6. La modificación D también se preparó al suspender la modificación A en acetato de etilo a 70 °C durante una semana.
Tabla 6 Algunos picos característicos para la modificación D La modificación E se preparó al suspender la modificación A (6.8 mg) en hexano (100 µ?) a temperatura ambiente durante una semana. El sólido se aisló de la suspensión después de una semana y se analizó mediante XRPD. El patrón XRPD para la modificación E se muestra en la figura 5. Algunos de los picos característicos para la modificación E se listan en la tabla 7.
Tabla 7 Algunos picos característicos para la modificación E La modificación F se preparó al suspender 1 la modificación A (9.1 mg) en éter dietílico (70 µ?) a temperatura ambiente durante una semana. El sólido se aisló de la suspensión después de una semana y se analizó mediante XRPD. El patrón XRPD para la modificación F se muestra en la figura 6 abajo. Algunos de los picos característicos para la modificación F se listan en la tabla 8.
Tabla 8 Algunos picos característicos para la modificación F Pos . [°2Th. ] separación- d [Á] 8.7 10.2 13.0 6.8 13.3 6.7 16.9 5.3 19.9 4.5 Ejemplo 2 Preparación alternativa del compuesto del ejemplo 1 a) [IR) -1- [ (4J¾) -2, 2-dimetil-l, 3-dioxolan-4-il] etanamina Al producto del ejemplo 1, etapa ii) ( (IR) -1- [4i?) - 2 , 2-dimetil-l, 3 -dioxolan- - il] -N- [ (IR) -1-feniletil] etanamina) (2 g, 8.0 mmoles) en etanol (30 mL) se le añadió hidróxido de paladio (0.05 g, 20% Pd) y la mezcla se hidrogenó con agitación a 5 bares a temperatura ambiente durante 16 horas. Se añadió hidróxido de paladio adicional (0.2 g) y la mezcla se hidrogenó durante 72 horas más. La mezcla se filtró a través de Hyflo y se concentró al vacío para dar el producto como un aceite transparente (0.79 g, 67%) .
¾ RM (400 MHz , CDC13) : d 4.00 (t, 1H) , 3.93 (mq, 1H) , 3.81 (t, 1H) , 3.06 (ra, 1H) , 1.43 (s, 3H) , 1.36 (s, 3H) , 1.08 (d, 3H) .
Pureza por GC MS 100% MS: APCI(+ve) 44 (pico base), 145 [M+H] + b) 6-cloro-2- [ (2,3-difluorobencil) tio] -iV-( (1J¾) -1- [ (4J¾) - 2 , 2-dimetil-l, 3 -dioxolan-4 -il] etil)primidin-4-amina Una mezcla del producto de la etapa a) ( {IR) -1- [ (4J?) -2, 2-dimetil-1, 3-dioxolan-4-il] etanamina) (0.40 g, 2.8 mmoles) , 4,6-dicloro-2- [ (2,3-difluorobencil) tio] pirimidina (WO-2004/011443) (0.77 g, 2.5 mmoles) y carbonato ácido de sodio (0.24 g, 2.8 mmoles) en acetonitrilo (12 mL) se calentó a reflujo con agitación bajo una atmósfera de nitrógeno durante 18 horas. La mezcla de reacción se enfrió a la temperatura ambiente, el solvente se removió al vacío y el residuo se dividió entre agua y acetato de etilo. La fase orgánica se separó y se lavó con agua y salmuera antes de ser secada (MgS04) , filtrada y concentrada al vacío para dar un aceite amarillo (1.2 g) . El aceite se purificó mediante cromatografía en sílice (Biotage, acetato de etilo: isohexano 2.5:7.5) para dar el compuesto del subtítulo como un aceite viscoso transparente (1.1 g, 95%) .
¾ RMN (300 MHz, CDC13) : 5 7.28 (m, 2H) , 7.02 (m, 2H) , 6.07 (s, 1H) , 5.00 (bs, 1H), 4.42 (t, 2H) , 4.05 (m, 2H) , 3.76 (dd, 1H) , 1.42 (s, 3H) , 1.33 (s, 3H) , 1.17 (d, 3H) .
Pureza por HPLC MS 100%; MS: APCI(+ve) 416/418 [M+H] + c) N- [2- [(2,3-difluorobencil) tio] -6-( (IR) -1- [ (4J¾) -2 , 2 -dimetil-1, 3 -dioxolan-4 -il] etil}amino) pirimidin-4 -11] azetidin- 1- sulfonamida Una mezcla del producto de la etapa b) (6-cloro-2 - [ (2, 3 -difluorobencil ) tio]-iV-{ (l_¾)-l-[(4R)-2,2-dimetil-l,3 -dioxolan-4 -il] etil}pirimidin-4- amina) (1.1 g, 25 mmoles) , azet idin- 1 - sul fonamida (W0-2004/011443) (0.51 g, 3.8 mmoles) , paladio ( I I ) tris (dibenci 1 idenacetona ) dipáladio (0) (0.15 g) , XPhos (0.15 g ) y carbonato de cesio (1.2 g, 20 mmoles) en dioxano seco (15 mL) se calentó en un microondas en un recipiente abierto a 100°C/300W máximos durante 12 minutos con agitación. La mezcla se dejó enfriar a la temperatura ambiente, se añadió ácido acético (2.4 mL) y el solvente se removió al vacío. Los residuos se dividieron entre agua> y acetato de etilo, y la fracción orgánica se separó, se layó con agua y salmuera, se secó (MgS04) , se filtró al vacío para dar una goma roja (1.7 g) . El producto se purificó dos veces mediante cromatografía (Si02, EtOAc : i sohexano , 1:1 después EtOAc : i s.ohexano , 4:6) para dar el producto como una espuma incolora (1.0 g, 75%) . 1 K RMN (300 MHz , CDCl3) : d 7.22 (m, 1H) , 7.02 (m, 2H) , 5.99 (s, 1H) , 4.96 (bd, 1H), 4.35 (q, 2H) , 4.15 (m, 2H) , 3.98 (t, 4H) , 3.78 (dd, 1H) , 2.24 '(m, 2H) , 1.44 (s, 3H) , 1.34 (s, 3H) , 1.18 (d, 3H) .
Pureza por HPLC MS 98.0%; MS : APCI (+ve) 516 [M+H] + d) N- (2- [ (2,3-difluorobencil) tio] -6-{ ( (1.R, 2J¾) -2,3-dihidroxi-l-metilpropil] amino}pirimidin-4-il) azetidin-1-sulfonamida Una mezcla del producto de la etapa c) (N- [2- [ (2 , 3-difluorobencil) tio] -6- ({ (IR) -1- [ (4i?) -2 , 2 -dimetil-1 , 3 -dioxolan-4 - il] etil } amino) irimidin-4 - il] azetidin-1-sulfonamida) (0.87 g, 1.7 mmoles) y ácido para-toluensulfónico (0.85 g, 3.4 mmoles) en metanol (19.5 mL) y agua (5 gotas) se calentó a 60°C durante 20 horas. El solvente se evaporó y el residuo se recogió en acetato de etilo el cual se lavó con agua, se secó (MgS04) y se evaporó para dar una espuma amarillo pálido (0.74 g) . La purificación mediante cromatografía (SÍO2, EtOAc : isohexano , 9:1) dio una espuma que se secó al alto vacío a 40°C durante 18 horas para dar el compuesto del título como un sólido incoloro (0.54 g, 67%) XH RMN (300 MHz , DMSO) : d 10.49 (s, 1H) , 7.35 (m, 2H) , 7.14 (m, 1H) , 5.99 (s, 1H) , 4.71 (s, 1H) , 4.53 (s, 1H) , 4.39 (q, 2H) , 4.17 (bs, 1H) , 3.88 (t, 4H) , 3.48 (m, 1H) , 2.12 (m, 2H) , 1.04 (d, 3H) , 3.33 (m (parcialmente oscurecido por señal de HOD) , 2H) MS: APCI(+ve) 476 [M+H] + Análisis elemental: encontrado: C, 45.15; H, 4.79; N, 14.50; S, 13.36%.
Calculado para: [ Ci8H23 504S2F2 ] : C, 45.46; H, 4.87; N, 14.73; S, 13.48%.
Ejemplo 3 Preparación del compuesto del ejemplo 1 repetida a grandes escalas usando la ruta delineada en el esquema de reacción 1 (mostrado abajo) Cetona Amina Boc amina C6HgK04 C7H12O3 C,5H23N02 C,2H23N04 Peso mol.: 184.23 Peso mol.: 144.17 Peso mol.: 249.35 Peso mol.: 245.32 A inodiol C4H,2CIN02 Peso mol.: 141.6 1: (i) ácido cítrico, H20, EtOAc; (ii) MeMgBr, Et20 2: (R)-(+)-1-Feniletilam¡na, NaBH(CH3C02)3, MeCN 3: Boc20, 20% Pd(OH)2 en carbón, H2, IMS 4: 4M HCI en dioxano, MeOH 5: 4,6-dicloro-2-[(2,3-d¡fluorobencil)tio]p¡r¡midina, NaHC03, MeCN 6: azetidin-1-sulfonamida, Pd2(dba)3, X-Phos, Cs2C03, 1 ,4-dioxano Esquema de reacción 1 Etapa 1 (ii) MeMgBr, Et20 Cetona C6H9KO4 C7H12O3 Peso Mol.: 184.23 Peso Mol.: 144.17 Ácido cítrico (848 g, 4.41 moles) en agua (800 mi) se añadió a una solución agitada de 2 , 2 -dimetil - 1 , 3 -dioxolan-4-carboxilato de potasio (J. Med. Chem. 1991, 34, (1), 392-397), (900 g, 4.89 moles) en agua (1062 mi) y acetato de etilo (7150 mi) luego se agitó durante 15 minutos para dar una solución bifásica incolora. No se observó exotermia durante la adición. La fase orgánica se separó y se secó (MgS04) . La capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (2 x 3,500 mi) y los orgánicos se secaron (MgS04) . Las fracciones orgánicas se combinaron, se concentraron al vacío y se secaron al alto vacío a temperatura ambiente para dar un aceite transparente (685.1 g, 4.66 moles). El aceite se almacenó a -30°C durante 2 días sin efecto en la calidad del producto mediante análisis 1H R N. El aceite se disolvió en éter dietílico (13,000 mi) y se enfrió a 5°C bajo una atmósfera de nitrógeno. Se añadió a la mezcla de reacción por goteo bromuro de metil magnesio (3.0M en éter dietílico, 3,500 mi, 10.50 moles) durante un periodo de 90 minutos manteniendo la temperatura de reacción entre 0-10°C. Después de concluir la adición la mezcla se agitó a 10°C durante 30 minutos luego se dejó calentar a la temperatura ambiente con agitación durante la noche. Se añadió acetato de metilo (75 mi, 0.94 mol) a la mezcla de reacción dando como resultado evolución de gas y una ligera exotermia. La mezcla de reacción se añadió a cloruro de amonio acuoso (2750 g en 8700 mi) manteniendo la temperatura debajo de 25°C durante ; la adición y se agitó durante 10 minutos. La fase orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con éter dietílico (3 x 7,100 mi). Los extractos orgánicos combinados se secaron (MgS04) y se concentraron al vacío para dar la acetona como un aceite amarillo.
Etapa 2 Cetona Amina C7H12O3 C15H23N02 Peso Mol.: 144 Peso Mol.: 249.35 (R) - (+ ) -1-Feniletilamina (715 g, 5.90 moles) se añadió por goteo durante 55 minutos a una solución agitada de la cetona (700 g, 4.86 moles) en acetonitrilo (11100 mi) bajo una atmósfera de nitrógeno. Se observó una pequeña exotermia durante la adición. La mezcla de reacción se enfrió a 10°C y se añadió por goteo ácido acético (348 mi, 6.03 moles) durante 45 minutos manteniendo la temperatura debajo de 25°C dando como resultado la formación de un precipitado blanco. Después de agitar durante 10 minutos más, se añadió triacetoxiborohidruro de sodio (2340 g, 11.04 moles) en porciones durante 1 hora manteniendo la temperatura debajo de 25 °C y se observó evolución de gas. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se añadió después a agua (11,000 mi) con agitación bajo una atmósfera de nitrógeno (5 L/min de velocidad de flujo) durante 90 minutos. La adición dio como resultado una reducción en la temperatura y evolución de gas. Se añadió bicarbonato de sodio (1560 g, 18.57 moles) a la mezcla en porciones hasta que la solución alcanzara pH 7. La adición dio como resultado una exotermia y evolución de gas. La fase orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con éter dietílico (2 x 10,000 mi). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con cloruro de sodio acuoso (2,760 g en 7,000 mi), se secaron (MgS04) , se filtraron y se concentraron al vacío para dar un aceite bifásico (transparente/amarillo) . Se añadió heptano (2,000 mi) y la capa inferior viscosa se separó. El extracto de heptano se concentró después al vacío para dar el producto crudo como un aceite amarillo pálido (929.3 g, 76.7%). La mezcla de productos diastereomérica se purificó mediante cromatografía en sílice (acetato de etilo : heptano : trietilamina, 20:80:0.5) por lotes para dar el producto como un aceite amarillo. La amina aislada con pureza diastereomérica más baja se sometió otra vez a cromatografía para dar un segundo lote de producto.
Repeticiones Cantidad de Cantidad de Rendimiento de (%) por experimentacetona (g) amina (g) (%) LC guiral les 1 28.1 17.8 35.7 98.7% 2 900 463.8 37.0 >99% Amina Boc amina C15H23N02 C12H23N04 Peso Mol.: 249.35 Peso Mol.: 245.32 Una mezcla de la amina (236.1 g, 0.95 moles), di-ter-butildicarbonato (208.0 g, 0.95 moles) y 20% de hidróxido de paladio(II) en carbón (11.5 g) en IMS (3,375 mi) se hidrogenó a presión de 4 bares de hidrógeno a temperatura ambiente con agitación durante 7 días. La mezcla de reacción se filtró a través de Hyflo y se concentró al vacío para dar un sólido cristalino incoloro.
Etapa 4 Boc amina Aminodiol C12H23N04 C4H12CIN02 Peso Mol.: 245.32 Peso Mol.: 141.6 HCl 4M en dioxano (1,800 mi, 7.22 moles) se añadió por goteo a una solución enfriada de la amina Boc (353.5- g, 1.44 moles) en metanol (1,800 mi) bajo una atmósfera , de nitrógeno. La temperatura de la reacción varió de 14 a 20°C con un baño de agua presente durante la adición. La mezcla se agitó después a temperatura ambiente durante 18 horas. El solvente se removió al vacío, y el residuo se sometió a destilación azeotrópica dos veces con tolueno (2 x 500 mi) y luego se secó al alto vacío para dar una goma viscosa café.
Etapa 5 Aminodiol Cloropirimidina C4H12CIN02 C15H16CIF2N302S Peso Mol.: 141 .6 Peso Mol.: 375.82 Una mezcla del aminodiol (266.4 g, aproximadamente 75% en peso, 199.8 g, 1.38 moles), 4 , 6-dicloro-2- [ (2, 3-difluorobencil ) tio] pirimidina (390.0 g, 1.27 moles) y bicarbonato de sodio (361.0 g, 4.30 moles) en acetonitrilo (6,500 mi) se calentó a reflujo con agitación bajo atmósfera de nitrógeno durante 17 horas. Durante este tiempo se formó una suspensión blanquecina. La mezcla de reacción se enfrió a la temperatura ambiente, el solvente se removió al vacío y el residuo se dividió entre acetato de etilo (4,000 mi) y agua (4,000 mi). La capa orgánica se separó y se lavó con agua (2,000 mi) y salmuera (2,000 mi) antes de ser secada (MgS04) , filtrada y concentrada al vacío para dar un aceite amarillo oscuro. El aceite se purificó mediante cromatografía en sílice (acetato de etilo :heptano, 4:1) para dar la cloropirimidina como una goma amarilla.
Etapa 6 Cloropirimidina ASA pirimidina C15H16CIF2N302S ^18^23^2^50452 Peso Mol.: 375.82 Peso Mol.: 475.53 Una mezcla de la cloropirimidina (382.1 g, 1.02 moles), azet idin- 1 - sulfonamida (200.0 g, 1.48 moles), di-paladio- tris (dibencilidenacetona) (56.1 g) , X-Phos (56.5 g) y carbonato de cesio (465.0 g, 1.43 moles) en 1,4-dioxano (6,400 mi) se calentó a 105°C durante 90 minutos bajo una atmósfera de argón con agitación. La mezcla de reacción se dejó enfriar a la temperatura ambiente y se añadió ácido acético (950 mi) a la mezcla y se agitó durante 10 minutos. Se observó una isotermía durante la adición. Se removió el solvente de la solución roja al vacío y los residuos se dividieron entre acetato de etilo (3,500 mi) y agua (3,500 mi) . La fase orgánica se separó, se lavó con agua (2,500 mi) y salmuera (2,500 mi), se secó ( gS04) y se filtró. La solución roja resultante se concentró al vacío para dar una espuma roja. El producto se purificó mediante cromatografía en sílice (acetato de etilo : heptano , 1:1 seguido por acetato de etilo) para dar una espuma amarilla. La espuma amarilla se disolvió en diclorometano , se llevó á reflujo durante 10 minutos, dando como resultado la formación de un precipitado amarillo pálido y se dejó enfriar a la temperatura ambiente. El precipitado se filtró y luego se recristalizó (acetato de etilo : heptano) , se filtró y se secó al vacío a 60°C para dar la pirimidina ASA como un sólido incoloro. El sólido se suspendió más en DCM (2 L) a temperatura ambiente durante 5 días con agitación. El sólido se filtró y se secó al vacío para dar el compuesto del título del ejemplo 1 como un sólido incoloro.
RepetiCantidad Cantidad de Rendi - Pureza Ee (%) ciones de ASA miento (%) por por LC expericloropir¿ pirimidina LCMS (%) guiral mentales midina (ejemplo 1) (g) (g) 1 20 14.8 58.6 >98% >99% 2 382.1 270.5 56.0 >98% >99% Datos biológicos Ensayo de depuración intrínseca hepática (CLint) humana Para la mayoría de los fármacos, un gran componente de su depuración de plasma es contribuido por el metabolismo hepático. La depuración intrínseca (CLint) es una medida del potencial de un compuesto para sufrir metabolismo y puede estar relacionada con la depuración hepática in vivo a partir de una consideración de la unión a proteínas en plasma y el flujo de sangre en el hígado. Por lo tanto, CLint puede usarse como un índice de la estabilidad metabólica relativa de compuestos dentro de un proyecto y compararse con otras sustancias de sonda externas. Además, la medición de CLint in vi tro dentro de un proyecto de investigación, en donde la depuración metabólica hepática se conoce que es un aspecto, podría ser un medio útil para entender el diferente comportamiento farmacocinético de los compuestos in vivo.
Descripción de la prueba La siguiente descripción delinea un método para calcular la depuración intrínseca (CLint) a partir de incubaciones de hepatocitos humanos usando regulador de pH en suspensión que no contenía HSA (albúmina de suero humana) y manteniendo condiciones fisiológicas de pH 7.4.
Para que un científico capacitado reproduzca las características operativas de este procedimiento de prueba, se hace referencia a proveedores específicos y números de catálogo para los reactivos usados en el momento de la validación inicial y la finalización del procedimiento de prueba. Esto no impide la sustitución con reactivos alternativos adecuados ya sea con una especificación comparable documentada o después de una confirmación experimental de que la sustitución no afecta significativamente las características operativas del ensayo.
Los hepatocitos se prepararon mediante un método de perfusión con colagenasa in situ de dos etapas de una porción del hígado humano, suspendida en regulador de pH libre de proteínas (véase abajo) , y almacenada en hielo, antes de incubación.
Aislamiento de hepatocitos humanos mediante perfusión con colagenasa in situ Este método se basa en el procedimiento de Seglen (Preparation of rat liver cells. I. Effect of Ca2+ on enzymatic dispersión of isolated, perfused liver. Exptl. Cell Res. 1972, 74, pág. 450 and preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol . , 1976, 13, pág. 29) que a su vez fue desarrollado a partir del procedimiento de una etapa de Berry and Friend (High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells. J. Cell Biol . , 1969, 43, p g. 506).
Describimos ahora la preparación de una suspensión celular libre de proteínas.
Químicos y reactivos Peróxido de hidrógeno al 5%: peróxido de hidrógeno al 60% (p/v) (Fisher Scientific) diluido con agua Milli-Q.
Medio de perfusión de hígado: suministrado listo para usar por Gibson Life Technologies (Cat. No. 17701).
Medio de digestión de hígado: suministrado listo para usar por Gibson Life Technologies (Cat. No. 17703) .
Medio de suspensión: 2.34 g de Na HEPES, 2.0 g de fracción de HSA V, 0.4 g de D-fructosa, DMEM (equivalente en polvo de 1 litro, Sigma; w/l g.l"1 glucosa, p/Na piruvato de sodio, w/o NaHC03, w/o rojo fenol), constituida a 1 L con agua Milli-Q, pH a 7.4 con HC1 1 M. (El regulador de pH de suspensión libre de proteínas se hace omitiendo 2.0 g de fracción HSA V) .
Aislamiento de hepatocitos La cápsula de un hígado que ha sido perfundido con medio de digestión se corta y se abre y las células se retiran suavemente y se pasan al medio. Las células se pasan después a través de una malla (aproximadamente 250 µ?) dentro de un vaso de precipitados que contiene 50 mL de medio de suspensión. La malla se enjuaga a través en el vaso de precipitados con regulador de pH de suspensión adicional hasta un volumen final de 100 mi. La suspensión se divide entre dos tubos centrífugos de 50 mL de plástico (pre-enfriados en hielo) y se centrifuga a 50 xg durante 2 minutos a 4°C. Los sobrenadantes se decantan y los sedimentos se vuelven a suspender en regulador de pH de suspensión libre de proteína hasta el volumen original. La etapa de centrifugación se repite y cada sedimento se vuelve a suspender en aproximadamente 10 mi de regulador de pH . de suspensión libre de proteínas. Las suspensiones se combinan y el volumen se constituye a 50 mL con regulador de pH de suspensión libre de proteína.
Cálculo del rendimiento y viabilidad de hepatocitos Una alícuota de suspensión celular (0.2 mL) se diluye con 0.2 mi de regulador de pH de suspensión libre de proteínas. A las células diluidas se les añade 0.2 mL de solución de azul tripano (0.4% p/v) seguida por mezclado suave. Después de 1 minuto, se usa una pipeta Pasteur para retirar una muestra y se llena una cámara de conteo Neubauer mejorada mediante acción capilar. Las células se contaron después (cuadrado central únicamente) usando un microscopio invertido, las células viables que eran capaces de excluir el colorante y las células no viables siendo teñidas. El porcentaje de células viables en la preparación se calcula entonces : Recuento de células viables 100 n/ , , , , x = % viabilidad Recuento de células totales 1 La concentración de células viables fue calculada: Células viables mi'1 = recuento de células viables x 104 x 3 x 50 El procedimiento de conteo se lleva a cabo por duplicado.
La suspensión celular se diluye con un volumen adecuado de regulador de pH en suspensión libre de proteínas para dar la concentración requerida de células viables y, se almacena en hielo durante hasta 1 hora antes de usar.
Remoción de proteínas Hepatocitos humanos frescos se reciben generalmente en regulador de pH en suspensión que contiene HSA. 1 El siguiente procedimiento describe la remoción de la proteína. Células criopreservadas pueden ser simplemente preparadas usando regulador de pH en suspensión sin proteína.
Regulador de pH en suspensión libre de proteínas se prepara de una manera análoga a aquella del regulador de pH en suspensión con proteínas, simplemente omitiendo el HSA. La suspensión celular se vuelve a centrifugar a 50 xg, como se describió arriba y el sobrenadante se descarta. Esto se reemplaza después con un volumen adecuado de regulador de pH en suspensión libre de proteínas. Este proceso se repite una segunda vez para remover cualquier resto de proteínas, asegurando que la resuspensión final de las células de una concentración que sea el doble que aquella de la concentración de incubación requerida.
Procedimiento de prueba El compuesto de prueba que será incubado se añade a partir de una solución de abastecimiento concentrada de 0.1 mM en DMSO (1% v/v de concentración de solvente final) hasta un volumen adecuado (0.5 mL) de regulador de pH en suspensión libre de proteínas en un frasco adecuado. Un volumen adecuado de células (0.5 mL) a una concentración de 2xl06 células. mL"1 (el doble de la concentración de células ; de incubación final, viabilidad >85% mediante exclusión con azul tripano) se pone en un frasco separado y ambos frascos son pre- incubados en un baño de agua a 37 °C.
Después de 5 minutos de pre- incubación un volumen adecuado del regulador de pH y compuestos fueron añadidos a las células para de esta manera dar una concentración en células final de lxlO6 células .mL"1 y las reacciones se dejaron proceder.
En puntos de tiempo adecuados (por ejemplo, 5, 10, 20, 30, 60, 90 y 120 minutos), se tomaron alícuotas (50 µ?) de la mezcla de incubación y se añadieron a 2 volúmenes de solvente metanol enfriado en hielo para terminar las reacciones y desnaturalizar los hepatocitos. También se llevaron a cabo incubaciones de control en las cuales células de compuesto fueron omitidos. Una vez que las incubaciones hubieron sido inactivadas, las muestras se agitaron durante 5 minutos, se almacenaron a -20°C o debajo durante 2 horas para ayudar a la precipitación de las proteínas y luego se centrifugaron durante 15 minutos a 3,000 rpm y 4°C. Los sobrenadantes fueron transferidos a frascos de HPLC y analizados mediante HPLC-MS usando el siguiente método como un punto de partida adecuado: Solventes: A: 0.1% de ácido fórmico en metanol y B: 0.1% de ácido fórmico en agua (v/v) Columna: agua Xterra C1820 x 3.9 mm, 3.5 pm Velocidad de flujo 1.5 ml.min"1 Gradiente: 0% de B durante 0.3 minutos, 0% a 100% de B durante 0.7 minutos, mantenido a 100% de B durante 0.2 minutos, 100% a 0% de B durante 0.01 minutos.
Análisis de datos y métodos de cálculo Las áreas pico resultantes de los compuestos incubados se tomaron en una hoja de cálculo Excel y se produjo una gráfica de ln [concentración residual] contra el tiempo. El tratamiento de los datos es entonces equivalente a un modelo farmacocinét ico de un compartimento. Como dosis/C0 da un plazo para el volumen de la incubación (expresado en ml-106 células"1) y la constante de velocidad de eliminación k = 0.693/ti/2, una ecuación que expresaba Clint en términos de tx 2 puede derivarse como se da en la ecuación 1: Volumen x 0.693 Ecuación 1 La ti 2 y CLint de la pérdida del compuesto de origen a partir de la incubación se determinó entonces.
Potencia (p!C50) -Ensayo de unión a ligando La potencia de los antagonistas en el receptor de CXCR2 humano se determinó in vitro al cuantificar su capacidad para inhibir la unión específica del radioligando CXCR2 , [125I] interleucina-8 (IL-8) , de membranas de células HEK293 transfectadas con el receptor CXCR2 recombinante humano .
Procedimiento experimental Materiales Los materiales de origen comercial se obtuvieron como sigue: placas de 96 pocilios con fondo en U (3799) y matraces de cultivo con tapa ventilada de 225 cm2 (3001) de Costar, Corning, Kent , Reino Unido. Placas de filtro¦ de Multiscreen (0.45 \im; MAHV N45 50) , distribuidor de vacío y bomba (XF54 230 50) de Millipore, Watford, Reino Unido. N- [2-hidroxietil] iperazin-N' - [ácido 2 -etansulfónico] (HEPES; H-3375) , ácido etilendiaminotetraacético (EDTA; E1644) , cloruro de magnesio (M-9272) , gelatina (G9382) , ditiotreitol (DTT; D06052) , cloruro de sodio (S3160/63) , hidróxido de sodio (B6506) , bacitracin (B0125) suero de becerro fetal inactivado (FCS; CR0848) y DMSO Fluka Chemika (41648) de Sigma, Poole, Reino Unido. MicroScint-0 (6013611) Packard BioScience, Pangbourne, Reino Unido. Tabletas de coctel inhibidor de proteasa completas (1836145) de Boehringer Mannheim, GmbH, Alemania. [125I] IL-8 recombinante humana 74 TBq/mmoles, 0.712 MBq/ml (IM249) de Amersham, Horsham Reino Unido. Todos los demás reactivos de cultivo de tejidos se compraron de Invitrogeri, Paisley, Scotland, Reino Unido. Todos los demás reactivos químicos fueron grado analítico de Fisher Scientific, Loughborough, Reino Unido.
Soluciones Solución salina de pH regulado con HEPES, pH 7.4 que contenía HEPES (10 mM) , cloruro de potasio (2.7 mM) , cloruro de sodio (137 mM) , fosfato ácido de potasio (0.4 mM) , cloruro de calcio (1.8 mM) , cloruro de magnesio (1 mM) , gelatina (0.1% (p/v) ) y bacitracina (100/ug/ml).
Solución de Tyrode regulada en pH con HEPES, pH 7.4 que contenía HEPES (10 mM) , cloruro de potasio (2.7 mM) , cloruro de sodio (137 mM) , fosfato ácido de potasio (0.4 mM) , y glucosa (11 mM) .
Regulador de pH hipotónico: mezcla 3:1 de agua : solución de Tyrode regulada en pH con HEPES.
Cultivo de células y preparación de membranas Células HEK293 fueron transfectadas con ADNc de CXCR2 (EMBL L19593) humano, clonado previamente en el vector de expresión eucariótico RcCMV. Líneas de células clonadas fueron generadas a partir de poblaciones resistentes a geneticina transfectadas establemente. Las células fueron cultivadas rutinariamente hasta una confluencia de aproximadamente 80% en medio DMEM que contenía 10% (v/v) de suero bovino fetal y glutamina (2 mM) en una incubadora humidificada a 37°C, 5% de C02. Las células se cosecharon de matraces usando Accutase™ a 37°C durante 3 a 5 minutos y se resuspendieron en hielo en regulador de pH hipotónico a una densidad de 2xl07 células/mL. Las membranas fueron preparadas en hielo por homogeneización usando un homogeneizador de tejidos politrón puesto a 22,000 rpm. La fracción de membrana se purificó mediante centrifugación en gradiente de sucrosa en donde células homogeneizadas fueron estratificadas sobre 41% (p/v) de solución de sucrosa y luego centrifugadas a 140,000 g durante 1 hora a 4°C. La fracción de membrana se cosechó en la interfaz, se diluyó 4 veces con solución de Tyrode regulada en pH con HEPES y centrifugada a 100,000 g durante 20 minutos a 4°C. El sedimento de membrana fue resuspendido a lxlO8 equivalentes de células/mL en solución de Tyrode regulada en pH con HEPES y posteriormente se almacenó en alícuotas a -80°C. Todos los reguladores de pH usados para la preparación de membrana y almacenamiento se hicieron en presencia de 1 mM de DTT y tabletas de coctel de Complete Protease Inhibitor™, hechas según las instrucciones de los fabricantes.
Protocolo de ensayo Se llevaron a cabo ensayos en solución salina de pH regulado con HEPES en placas de 96 pocilios. Se usó [125I] IL-8 a una concentración final de 0.06 nM, pre-diluida a partir de una solución de abastecimiento de 9.6 nM. La concentración de DMSO final en el ensayo fue de 1% (v/v) . Los compuestos de prueba se prepararon mediante dilución' en serie en DMSO seguidos por una dilución de diez veces en solución salina de pH regulado con HEPES para dar una solución de trabajo que contenía compuesto y 10% de DMSO. El control para la unión total (B0) de [125I]IL-8 se determinó en la ausencia de compuesto. El control para la unión no específica (NSB) se determinó al medir la unión de [125I] IL-8 en presencia de ( IR) -5- [ [ (3 -cloro-2 -fluorofenil ) metil] tio] -7- [ [2-hidroxi-l-metiletil] amino] tiazolo [ , 5-d] pirimidin-2 (3H) -ona dihidratado, sal sodio a una concentración final de 1 µ?. Alícuotas congeladas de membranas fueron descongeladas y diluidas hasta una concentración que previamente se determinó que daba aproximadamente una unión del 10% de radiomarcador total añadido, típicamente alrededor de lxlO6 equivalentes celulares/mL . Los componentes de ensayo fueron añadidos a cada pocilio como sigue; un décimo de volumen de compuestos de prueba o controles en regulador de pH que contenía 10% de DMSO, un décimo de volumen de radiomarcador, ocho décimos de volumen de membranas diluidas. Las placas fueron selladas e incubadas durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de la incubación, la mezcla de ensayo se filtró y luego se lavó con dos volúmenes de solución salina de pH regulado con HEPES fría usando un distribuidor de vacío Millipore. La placa de filtración se dejó secar al aire y luego ya sea los filtros individuales se punzonaron en tubos de ensayo de polipropileno y la radioactividad se midió mediante conteo gama directo usando un contador gama Cobra II (Packard BioScience) durante 1 minuto por muestra o como alternativa, la placa de filtración entera se puso en una placa portadora y 50 uL de MicroScint-0 se añadieron a cada pocilio. El recuento por centelleo de placa de 96 pocilios se llevó a cabo usando un instrumento TopCount (Packard BioScience) durante un minuto por pocilio de muestra.
Análisis de los datos La unión específica de [125I]IL-8 se calculó al restar la media de los valores NSB de control determinados en cada placa de ensayo. Los datos se transformaron en gráficas de respuesta a concentración y se expresaron como un porcentaje en relación a [125I]IL-8 (BO-NSB) unida específicamente total. La IC50 se definió como concentración molar de compuesto requerida para dar 50% de inhibición de [125I]IL-8 unida específicamente. Los valores IC50 fueron transformados en el logaritmo recíproco (pIC50) para el cálculo de estadística descriptiva (media ± SM) . Los valores pIC50 se aproximaron a la afinidad de unión (pKi) toda vez que la concentración de [125I]IL-8 usada (0.06 nM) estuvo debajo de la Kd (constante de disociación en equilibrio) determinada para IL-8 (1.2 nM) .
El compuesto de la fórmula (1) se encontró que tenía un valor pIC5o de >8.
Medición de la unión a proteínas plasmáticas (PPB) El grado de unión de un fármaco a proteínas plasmáticas es un factor crucial para determinar su potencia in vivo y farmacocinética . El método usado para determinar el grado de unión a proteína plasmática incluye la diálisis en equilibrio del compuesto entre plasma y regulador de pH a 37°C. Las concentraciones del compuesto en el regulador de pH y plasma fueron entonces determinadas usando la cromatografía de líquidos de alta presión (HPLC) con detección por espectroscopia de masas (MS) . El método de diálisis incluye el uso de mezclas de hasta 10 compuestos simultáneamente. Se ha demostrado que a las concentraciones usadas en el ensayo, no hay diferencia significativa en los resultados cuando los compuestos se prueban individualmente o en mezclas.
Método Membranas (límite de peso molecular 5,000) se prepararon primero al sumergir en el regulador de pH de diálisis durante un mínimo de 1 hora. Las membranas de diálisis fueron después montadas en las células de diálisis.
Soluciones de abastecimiento de los compuestos 1 en sulfóxido de dimetilo (DMSO) fueron preparadas. Esto, y todas las etapas de manejo y líquido subsecuentes, sé hicieron normalmente usando un robot de manejo de líquidos Tecan. Mezclas de hasta cinco compuestos fueron usadas. La concentración de cada compuesto en una mezcla normalmente fue de 1 mM. Las mezclas se seleccionaron de tal manera que cada mezcla contuviera compuestos que tuvieran todos al menos una diferencia de 5 unidades en peso molecular entre sí.
Plasma congelado (anticoagulante EDTA) se ,usó normalmente para el experimento de unión en plasma humano. El pH del plasma se ajustó a 7.4 usando HCl 1M inmediatamente antes de usar.
La solución de abastecimiento de DMSO de los compuestos (7.5 ]il¡) se añadió después a las células de diálisis junto con plasma (750 µ?) . Esto se hizo por duplicado para cada mezcla. Esto dio una solución de DMSO al 1% en plasma con cada compuesto a una concentración de 10 µ? (si la solución de abastecimiento era el estándar de 1 mM) . Las células de diálisis fueron después selladas, aseguradas en una unidad giratoria Dianorm y equilibrada durante 18 horas a 37°C. Mientras las células de diálisis estaban siendo equilibradas, las soluciones de abastecimiento de DMSO se usaron para generar métodos de HPLC/MS optimizados para usarse en el análisis final de las muestras de plasma y regulador de pH. Después del equilibrio, las células fueron abiertas y se usó un robot de manejo de líquidos Tecan para remover alícuotas del plasma y los lados del regulador de pH de cada una de las células de diálisis. Plasma en blanco fue después añadido a las muestras de regulador de pH y después se añadió regulador de pH a las muestras de plasma de tal manera que cada muestra estuviera en una matriz de plasma diluido 6 veces. Después se prepararon estándares a partir de las soluciones de abastecimiento de DMSO y en blanco diluidas 6 veces en plasma. Las concentraciones de cuatro estándares normalmente fueron de 50 nM, 150 nM, 500nM y 2,500 nM.
Las muestras y estándares se analizaron después usando HPLC con detección MS, lo cual permite la desconvolución de las mezclas de compuestos. El método HPLC incluyó una técnica de cambio de columna de enjuague que permite la inyección directa del plasma diluido.
Cálculo de resultados Los cromatogramas fueron procesados usando software MassLynx que calcula automáticamente una curva de calibración para cada compuesto en una mezcla y luego interpola las concentraciones de muestras de regulador de pH y plasma. Estas concentraciones aún requieren correcciones para la dilución del plasma. El porcentaje unido se calculó a partir de los datos MassLynx usando la siguiente ecuación: o/ %unido El factor de 1.2 en el numerador equivale a la dilución pequeña de las muestras acuosas con plasma. El factor de 6 en el denominador sirve para corregir la dilución de 6 veces de las muestras de plasma con regulador de pH. , El % libre (100-% unido) para cada compuesto se calculó a partir de los datos de concentración, y luego se registró.
Biodisponibilidad (F) en la rata Esto describe los métodos usados para métodos de farmacocinética in vivo en la rata macho. Es aplicable para usarse con cualquier compuesto pero puede requerir modificación con base en parámetros tales como solubilidad, sensibilidad al ensayo, depuración anticipada y vida media, cuando la formulación pre-establecida, nivel de dosis o intervalos de muestreo pueden ser inadecuados . El método descrito aquí representa un enfoque estándar a partir del cual se pueden hacer modificaciones justificadas y documentadas . Este método permite también que compuestos individuales o mezclas (casetes) sean administrados.
Preparación de la dosis Se preparó una solución de dosis estándar de 1 mg-mL"1. El vehículo de dosis recomendado (si el compuesto, no era suficientemente soluble en solución salina isotónica) era 50% de PEG 400:50% de agua estéril. La masa requerida del compuesto se disolvió en el PEG400 antes de la adición del agua. Esta concentración del compuesto a la solución! de dosis se ensayó al diluir una alícuota hasta una concentración nominal de 50 g-mLT1 y calibrando contra inyecciones duplicadas de una solución estándar y un estándar QC a esta concentración.
Dosificación Los compuestos se administraron intravenosamente como un bolo en una vena caudal a grupos de tres ratas de 250-350 g (aproximadamente 1 mL-kg"1). Para la dosis oral, un grupo separado de tres animales fue dosificado mediante alimentación forzada oral (3 mL-kg"1) . Las dosis suministradas fueron estimadas mediante pérdida de peso.
El alimento no se retiró normalmente de los animales antes de la dosificación aunque este efecto se puede investigar si es necesario.
Toma de muestras Muestras antes de la dosis se tomaron del grupo oral. Se tomaron muestras de sangre (0.25 mL) en jeringas de 1 mi, se transfirieron a tubos con EDTA y el plasma se preparó por centrifugación (3 minutos a 13,000 rpm) justo después de la recolección de la toma de muestra.
Tiempos de muestreo (minuto) para los protocolos estándares Análisis de las muestras La concentración de los analitos se determinó en plasma cuantitativo mediante espectrometría de masas.
Preparación de estándares y QCs Soluciones de abastecimiento estándares y ; de control de calidad fueron preparadas a una concentración; de 50 ug/mL en metanol. Las soluciones de abastecimiento de estándares y QC fueron diluidas mediante el TECA GENESIS y salpicadas en plasma de acuerdo con la siguiente tabla: Diez microlitros de cada una de las soluciones A-H anteriores, producidas mediante dilución en serie de la solución de abastecimiento estándar combinada, y 10 ih de soluciones B, D y G, producidas mediante dilución en serie de la solución de la solución de abastecimiento QC combinada, se añadieron a tubos de polipropileno de 1.2 mL de 96 pocilios que contenían 50 µ??? de plasma en blanco mediante el TECA . Las concentraciones finales de la curva estándar y muestras de QC producidas se muestran en la tabla arriba. Los intervalos más altos o más bajos pueden obtenerse usando una solución de abastecimiento inicial concentrada o diluida.
Preparación de las muestras A cada una de las muestras de prueba, estándares y QCs fueron añadidos 150 µL de agua. Las muestras fueron dispuestas en el orden definido a continuación: 1. Estándares en orden de concentración ascendente 2. QCs en orden de concentración ascendente ¦ de estándar manual 3. Muestras de prueba a partir de animales dosificados IV (muestras de 1M, 2M y luego 3M) 4. QCs en orden de concentración ascendente 5. Muestras de prueba de animales dosificados PO (muestras de 4M, 5M y luego 6M) 6. QCs en orden de concentración ascendente 7. Estándares en orden de concentración ascendente Las muestras fueron después tapadas, mezcladas mediante inversión repetida y luego centrifugadas a 3,500 rpm en una centrífuga IEC CENTRA durante 20 minutos. Alícutoas (120 uD de cada muestra fueron analizados por LC/MS .
Espectrometría de masas Un espectrómetro de masas TSQ700 o TSQ o SSQ7000 con un sistema de HPLC HP1100 fue usado. Las fuentes usadas fueron APCI o ESI . Muestras estándares y de control de calidad que cubrían la gama de concentraciones encontrada en las muestras de prueba se esperó que estuvieran dentro de 25% de la concentración nominal.
Resultados El análisis y tabulación de los datos farmacocinéticos se lograron usando WinNonlin y Excel. Un análisis no compartimental estándar se usó para calcular los parámetros tabulados. La biodisponibilidad (F) se calculó a partir de la relación de la AUC iv y oral (la integral de la curva en tiempo de concentración en plasma) una vez que la dosis se normalizó.
Medición de solubilidad (S) La solubilidad de un compuesto es una propiedad importante que afecta la preparación de soluciones del compuesto para tamizado, así como influencia en la absorción de dosis sólidas del compuesto en estudios en animales y humanos. El método descrito abajo para medir la solubilidad incluye la generación de una solución saturada del compuesto, seguida por el ensayo de la solución usando HPLC con cuantif icación UV e identificación por MS.
Método Soluciones saturadas para determinar la solubilidad se prepararon al poner aproximadamente 0.3-3.0 mi de solvente en tubos de ensayo con tapa roscada de vidrio junto con una parte del compuesto. Los tubos se agitan después durante la noche en la habitación de temperatura constante (20°'C) . Después de agitar, material no disuelto debe estar presente en la solución, y se continúa agitando si éste no es el caso. Las muestras se transfieren después a un tubo centrífugo y se centrifugan usando una centrífuga Heraeus Biofuge Fresco a 13,000 rpm durante aproximadamente 30 minutos. El sobrenadante se retira después, se pone en un tubo centrífugo nuevo y se vuelve a centrifugar durante alrededor de 30 minutos a 13,000 rpm. El material no disuelto forma un sedimento en el fondo del tubo y el líquido por arriba del sedimento se remueve para ensayo. La solución se analiza después usando HPLC con cuantificación UV. Si la respuesta para el compuesto es muy potente entonces la solución debe diluirse en forma precisa de tal manera que la respuesta se encuentre dentro de un intervalo más adecuado de respuesta UV. También se preparó un estándar al pesar de manera precisa una muestra del compuesto y disolverla en un volumen adecuado de un solvente que la disuelve completamente (típicamente. DIVISO, etanol o metanol) . Esta muestra . se analizó después mediante HPLC/UV. Nuevamente la respuesta de este estándar debe estar dentro de una escala adecuada , de respuesta UV de otra manera una concentración más adecuada debe prepararse y analizarse mediante HPLC/UV.
Resultados La solubilidad (S) se calculó a partir de las áreas pico observadas en los cromatogramas de HPLC/UV con correcciones para cualquier dilución de la muestra y diferencias en volúmenes de inyección. Se usó la siguiente ecuación : Conc. Std(mgml).ÁreaPicoMuestra.FactorDiluciónMuestra.Vol.InyStd Solubilidad(mg/ml) = Área Pico Std.Vol.Iny.Muestra Ejemplo de referencia 1 N- (2- [ (2,3-difluorbbencil) tio] -6-{ [ (1J¾,2S) -2 , 3 -dihidroxi- 1- metilpropil] amino}pirimidin-4 -il) azetidin-l-sulfonamida i) 1- [ (4J¾) -2 , 2 -dimetil-1, 3 -dioxolan-4-il] etanona A una solución de ( +) -metil- (R) -2 , 2-dimetil-l, 3· dioxolan-4-carboxilato (5 mL) en éter dietílico seco/pentano 1:1 (160 mi) a -115°C bajo nitrógeno se le añadió metil litio 1.6M (18 mL) por goteo durante 30 minutos. Después de agitación adicional durante 1 hora 40 minutos, la mezcla se inactivo con solución acuosa saturada de cloruro de amonio (80 mL) y luego se dejó alcanzar la temperatura ambiente. La capa orgánica se recoge y la capa acuosa se extrae más con éter dietílico dos veces. Los orgánicos se combinan, se secan (MgS04) y los solventes se evaporan al vacío para dar el compuesto del subtítulo como un aceite transparente. Rendimiento: 4.77 g. 1H . RMN (300 MHz, CDCl3) : d 1.40 (s, 3H) , 1.47 (s, 3H) , 2.24 (s, 3H) , 3.97 (m, 1H) , 4.19 (m, 1H) , 4.41 (m, 1H) . ii) (IR) -1- [ (45) -2,2-dimetil-l,3-dioxolan-4-il) -N-fenilmetil] etanamina A una solución del producto de la etapa (i) (1- [ (4i?) -2 , 2-dimetil-l, 3 -dioxolan-4 -il] etanona) (3.58 g) en dicloroetano (40 mL) se le añadió bencilamina (3 mL) y ácido acético glacial (1.6 mL) seguidos por enfriamiento de la mezcla en un baño de hielo. Después se añade en porciones durante 25 minutos triacetoxiborohidruro de sodio (7.4 g) . La mezcla se deja después agitar a la temperatura ambiente durante 14 horas. La mezcla se inactiva con solución saturada de bicarbonato de sodio y después se extrae con dielorómetaño 4 veces. Los orgánicos combinados se recogen, se secan (MgS04) y los solventes se evaporan para dejar un aceite amarillo pálido. La purificación mediante cromatografía en columna con gel de sílice eluyendo con isohexano/acetato de etilo mezclas de 10 a 20 a 30 a 40% de acetato de etilo da el compuesto del subtítulo como el primer diastereoisómero eluyente como un aceite amarillo pálido: rendimiento 3.66 g.
¾ RMN (300 MHz, CDC13) : d 1.07 (d, 3H) , 1.36 (s, 3H) , 1.44 (s, 3H) , 2.83 (quinteto, 1H) , 3.77 (m, 1H) , 3.88 (, 2H) , 4.02 (m, 2H) , 7.22 (ra, 1H) , 7.35 (m, 4H) . iii) {IR) -1- [ (4S) -2,2-dimetil-l,3-dioxolan-4-il] etanamina A una solución del producto de la etapa (ii) ((12?)-1- [ (4S) -2 , 2-dimetil-l, 3 -dioxolan- - il] -N-fenilmetil] etanamina) (3.65 g) en etanol (50 mL) se le añadió 10% de paladio en carbón (0.4 g) y todo se hidrogena a 4 bares a temperatura ambiente durante 12 horas. La mezcla se filtra y el solvente se evapora al vacío para dejar el compuesto del subtítulo como un aceite amarillo pálido. Rendimiento: 2.5 g.
XH RMN (300 MHz, CDCl3) : 5 1.07 (d, 3H) , . 1.36. ( s , 3H) , 1.46 (s, 3?) , 3.08 (quinteto, 1?) , 3.82 (m, 1H) , 3.93 (m, 1H) , 3.99 (m, 1H) . iv) 6-cloro-2- [ (2,3-difluorobencil) tio] -N-{ {IR) -1-[ (4S) -2 , 2-dimetil-l, 3-dioxolan-4-il] etil}pirimidin- -amina A una solución del producto de la etapa (iii) { {IR) -1- [{AS) -2, 2-dimetil-l, 3 -dioxolan-4-il] etanamina) (0.67 g) en acetonitrilo (15 mL) se le añade 4 , 6 -dicloro-2 - [ ( 2 , 3 -difluorobencil) tio] pirimidina (WO-2004/011443) (1.3 g) , bicarbonato de sodio (0.39 g) y la mezcla se pone a reflujo bajo nitrógeno durante 12 horas. La mezcla de reacción enfriada se divide entre acetato de etilo y agua. La capa orgánica se recoge y la capa acuosa se extrae más con acetato de etilo. Los orgánicos combinados, se secan (MgSCU) y se evaporó el solvente. El residuo se purifica mediante cromatografía en columna con gel de sílice eluyendo con mezclas de isohexano/acetato de etilo de 5 a 20% de acetato de etilo para dar el compuesto del subtítulo como un aceite claro. Rendimiento: 1.25 g. 2H RMN (300 MHz, CDC13) : d 1.17 (d, 3H) , 1.34 (s, 3H) , 1.43 (s, 3H) , 3.77 (dd, 1H) , 4.14 (ra, 2H) , 4.37 (m, 2H) , 5.02(bs, 1H) , 6.06 (s, 1H) , 7.02 (m, 2H) , 7.26 (m, 1H) . v) N- [2-, [ (2, 3-difluorobencil) tio] -6- ({ {IR) -1- [ (4S) -1- [ (4ff) -2, 2-dimetil-l, 3-dioxolan-4-il] etil}amino) pirimidin-4 -il] azetidin-l-sulfonamida Una mezcla del producto de la etapa (iv) (6-cloro-2- [ (2, 3-difluorobencil) tio] -N- { (IR) -1- [ (4S) -2 , 2-dimetil-l , 3-dioxolan-4-il] etil }pirimidin-4 -amina) ) (0.45 g) , azetidin-1-sulfonamida (WO-2004/011443 ) (0.295 g) , paladio(II) tris (dibencilidenacetona) dipaladio (0) (0.1 g) , XPhos (0.52 g) y carbonato de cesio (0.53 g) en dioxano seco (6 mL) se calentó en un microondas en un recipiente abierto a 100°C/300 máximos durante 15 minutos con agitación. La mezcla se dejó enfriar a la temperatura ambiente, se añadió ácido acético (2.4 mL) y el solvente se removió al vacío. Los residuos se dividieron entre agua y acetato de etilo, y la fracción orgánica se separó, se lavó con agua y salmuera, se secó (MgS04) , se filtró y se concentró al vacío para dar una goma roja (1.1 g) . El residuo se purificó mediante cromatografía en columna con gel de sílice eluyendo con mezclas de isohexano/acetato de etilo de 5 a 40% de acetato de etilo para dar el compuesto del subtítulo como una espuma amarillo pálido. Rendimiento: 0.4 g.
? RMN (300 MHz, DMSO) : d 1.07 (d, 3H) , 1.26 (s, 3H) , 1.33 (s, 3H) , 2.14 (quinteto, 2H) , 3.67 (ra, 1H) , 3.85 (t, 4H) , 3.94 (m, 2H) , 4.15 (bs, 1H) , 4.38 (m, 2H) , 5.96 (s, 1H) , 7.14 (m, 1H) , 7.33 (m, 1H) , 7.38 (m, 1H) , 7.46 (ra, 1H) . vi) N- (2- [ (2,3-difluorobencil) tio] - 6 - { [ (IR, 2S) -2 , 3 -dihidroxi-l-metilpropil] amino}pirimidin-4-il) azetidin-1-sulfonamida Una mezcla del producto de la etapa (v) ((N-[2- [ (2, 3-difluorobencil) tio] -6-({ (IR) -1- [ (4S) -2 , 2-dimetil-l , 3 -dioxolan-4 - il] etil}amino) pirimidin-4-il] azetidin-1-sulfonamida) (0.38 g) y ácido para-toluensulfónico (0.093 g) en metanol (5 mL) y agua (3 gotas) se calentó a 60°C durante 4 horas. El solvente se evaporó y el residuo se recogió en acetato de etilo que se lavó con agua, se secó (MgS04) y se evaporó para dar una espuma amarillo pálido (0.29 g) . La purificación mediante trituración con diclorometano dio el compuesto del título como un sólido blanquecino. Rendimiento: 0.23 g.
XH RMN (300 MHz, DMSO) : d 1.04 (d, 3H) , 2.12 (quinteto, 2H) , 3.30 (m, 2H) , 3.47 (m, 1H) , 3.86 (m, 4H) , 4.17 (m, 1H) , 4.41 (m, 1H) , 4.53 (bs, 1H) , 4.73 (bs, 1H) , 5.98 (bs, 1H) , 7.15 (m, 1H) , 7.32 (m, 1H) , 7.42 (m, 1H) , 10.50 (bs, 1H) .
MS: APCI (+ve) 476 [M+H] + .
Ejemplo de referencia 2 N- (2- [ (2,3-difluorobencil) tio] -6-{ [ (!S,2i¾) -2 , 3 -dihidroxi- 1- metilpropil] amino)pirimidin-4-il) azetidin-l-sulfonamida A una solución de (-) -metil- (S) -2 , 2-dimetil-l, 3-dioxolan-4-carboxilato (1 mL) en éter dietílico seco/pentáno, 1:1 (35 mL) a -115°C bajo nitrógeno se le añadió metil litio 1.6M (5.6 mL) por goteo durante 10 minutos. Después de la agitación adicional durante 80 minutos la mezcla se inactivo con solución acuosa saturada de cloruro de amonio (15 mL) y después se dejó alcanzar la temperatura ambiente. La capa orgánica se recogió y la capa acuosa se extrajo más con éter dietílico dos veces. Los orgánicos se combinaron, se secaron (MgS04) y los solventes se evaporaron al vacío para dar el compuesto del subtítulo como un aceite transparente. Rendimiento: 0.25 g.
XH RM (300 MHz , CDCl3) : d 1.40 (s, 3H) , 1.50 (s, 3H) , 2.25 (s, 3H) , 4.00 (dd, 1H) , 4.19 (t, 1H) , 4.42 (dd, 1H) . ¦ ii) (1S) -1- [ (4J¾) -2,2-dimetil-l,3-dioxolan-4-il] -N-fenilmetil] etanamina A una solución del producto de la etapa (i) (1^ [ (4S) -2 , 2-dimetil-l, 3-dioxolan-4-il] etanona) (1.3 g) en dicloroetano (15 mL) se le añadió bencilamina (1.1 mL) y ácido acético glacial (0.575 mL) seguidos por el enfriamiento de la mezcla en un baño de hielo. Después se añadió en porciones durante 25 minutos triacetoxiborohidruro de sodio (2.68 g) . La mezcla se dejó después agitar a temperatura ambiente durante 14 horas. La mezcla se inactivo con solución saturada de bicarbonato de sodio y después se extrajo con diclorometano 4 veces. Los orgánicos se recogieron, se secaron (MgS04) y los solventes se evaporaron para dejar un aceite amarillo pálido. La purificación mediante cromatografía en columna con gel de sílice eluyendo con mezclas de isohexano/acetato de etilo de 10 a 20 a 30 a 40% de acetato de etilo dio el compuesto del subtítulo como el primer diastereoisómero eluyente como un aceite transparente: rendimiento: 1.1 g.
XH RMN (300 MHz , CDCl3) : d 1.08 (d, 3H) , 1.36 (s, r 3H) , 1.42 (s, 3?) , 1.47 (bs, 1?) , 2.84 (quinteto, 1H) , 3.77 (m, 1H) , 3.89 (, 2H) , 4.03 (m, 2H) , 7.24 (m( 1H) , 7.34 (m, 4H) . iii) (15) -1- [ (4K) -2,2-dimetil-l,3-dioxolan-4-il] etanamina A una solución del producto de la etapa (ii) ( (1S) -1- [ (4R) -2, 2-dimetil-l, 3-dioxolan-4-il] -N-fenilmetil] etanamina) (1.4 g) en etanol (20 mL) se le añadió 10% de paladio en carbón (0.18 g) y todo se hidrogenó a 4 bares a temperatura ambiente durante 12 horas. La mezcla se filtró y el solvente se evaporó al vacío para dejar el compuesto del subtítulo como un aceite amarillo pálido. Rendimiento: 0.82 g.
XH RM (300 MHz, CDCl3) : d 1.06 (d, 3H) , 1.35 (s, 3H) , 1.44 (s, 3H) , 3.06 (quinteto, 1H) , 3.82 (m, 1H) , 3.96 (m, 2H) . iv) 6-cloro-2- [ (2 , 3 -difluorobencil) tio] -N-{ (1S) -1- [ (4J¾) - 2 , 2-dimetil-l, 3 -dioxolan-4 -il] etil}pirimidin-4- amina A una solución del producto de la etapa (iii) ( (1S) -1- [ (4i?) - 2, 2-dimetil-l, 3 -dioxolan-4 - il] etanamina) (0.655 g) en acetonitrilo (10 mL) se le añadió 4,6-dicloro- 2- [ (2 , 3 -difluorobencil ) tio] pirimidina (WO-2004/011443) (1.2 g) , bicarbonato de sodio (0.38 g) y la mezcla se puso a reflujo bajo nitrógeno durante 12 horas. La mezcla de reacción enfriada se dividió entre acetato de etilo y agua. La capa orgánica se recogió y la capa acuosa se extrajo más con acetato de etilo. Los orgánicos combinados se secaron (MgS04) y el solvente se evaporó. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna con gel de sílice eluyendo con mezclas de isohexano/acetato de etilo de 50 a 20% de acetato de etilo para dar el compuesto del subtítulo como un aceite transparente. Rendimiento: 1.5 g. 2H RMN (300 MHz , CDC13) : d 1.17 (d, 3H) , 1.34 (s, 3H) , 1.43 (s, 3H) , 3.77 (dd, 1H) , 4.15 (m, 2H) , 4.37 (m, 2H) , 4.98 (bs, 1H) , 6.06 (s, 1H) , 7.03 (m, 2H) , 7.26 (m, 1H) . v) N- [2- [ (2, 3-difluorobencil) tio] -6- ({ (1S) -1- [ (4K) -2 , 2-dimetil-l, 3 -dioxolan-4 -il] etil}amino) irimidin-4 -il] azetidin-l-sulfonamida Una mezcla del producto de la etapa (iv) (6-cloro-2- [(2, 3 -dif luorobencil) tio] -N- { (1S) -1- [ ( J¾) -2 , 2-dimetil-1, 3 -dioxolan-4 -il]etil}piriraidin-4- amina) ) (0.52 g) , azetidin-l-sulfonamida ( WO - 2004 / 011443 ) (0.34 g) , paladio(II) tris (dibencilidenacetona) dipaladio ( 09 ) (0.115 g) , XPhos (0.06 g) y carbonato de cesio (0.612 g) en dioxano seco (8 mL) se calentó en un microondas en un recipiente abierto a 100°C/300W máximos durante 20 minutos con agitación. La mezcla se dejó enfriar a la temperatura ambiente, se añadió ácido acético (2.4 mL) y el solvente se removió al vacío. Los residuos se dividieron entre agua y acetato de etilo, y la fracción orgánica se separó, se lavó con agua y salmuera, se secó (MgS04) , se filtró y se concentró al vacío para dar una goma roja (2 g) . El residuo se purificó mediante cromatografía en columna con gel de sílice eluyendo con mezclas de isohexano/acetato de etilo de 5 a 40% de acetato de etilo para dar el compuesto del subtítulo como una espuma color crema. Rendimiento: 0.42 g . < XH RMN (300 MHz, DMSO) : d 1.04 (d, 3H) , 1.26 (s, 3H) , 1.33 (s, 3H) , 2.14 (quinteto, 2H) , 3.65 (m, 1H) , 3.85 (t, 4H) , 3.88 (m, 4H) , 3.94 (m, 2H) , 4.38 (m, 2H) , 5.96 (s, 1H) , 7.13 (m, 1H) , 7.33 (m, 1H) , 7.38 (m, 1H) , 7.46 (m, 1H) , 10.56 (bs, 1H) . vi) N- (2- [ (2,3-difluorobencil) tio] -6-f [ (1S,2R) -2,3-dihidroxi-l-metilpropil] amino}pirimidin-4-il) azetidin-1-sulfonamida Una mezcla del producto de la etapa (v) ( (N- [2- [ (2, 3-difluorobencil) tio] -6- ( { (1S) -1- [ (4fl) -2 , 2-dimetil-l, 3-dioxolan-4 - il] etil}amino) pirimidin-4-il] azetidin-1-sulfonamida) (0.31 g) y ácido para-toluensulfónico (0.076 g) en metanol (5 mL) y agua (3 gotas) se calentó a 60°C durante 4.5 horas. El solvente se evaporó y el residuo se recogió en acetato de etilo el cual se lavó con agua, se secó (MgS04) y se evaporó para dar una espuma amarillo pálido. La purificación mediante cromatografía en gel de sílice eluyendo con mezclas de diclorometano/metanol (1 a 2% de metanol) seguida por la titulación con diclorometano dio el compuesto del título como un sólido blanco. Rendimiento: 0.185 g.
¾ RMN (300 MHz , DMSO) : d 1.07 (d, 3H) , 2.13 (quinteto, 2H) , 3.23 (m, 2H) , 3.46 (m, 1H) , 3.87 (t, 4H) , 4.23 (bs, 1H) , 4.39 (q, 1H) , 4.50 (bs, 1H) , 4.76 (bs, 1H) , 6.02 (bs, 1H) , 7.15 (m, 1H) , 7.22 (bs, 1H) , 7.33 (m, 1H) , 7.44 (t, 1H) , 10.49 (bs, 1H) .
APCI(+ve) 476 [M+H] + Ejemplo de referencia 3 N- (2- [ (2,3-difluorobencil) tio] -6-{ [ (1S,2S) -2 , 3 -dihidroxi- 1- metilpropil] amino}pirimidin-4-il) azetidin-l-sulfonamida i) 1- [ (4J¾) -2 , 2-dimetil-l, 3-dioxolan-4-il] etanona A una solución de (+) -metil- (R) -2 , 2-dimetil-l, 3-dioxolan-4 -carboxilato (5 mL) en éter dietílico seco/pentano, 1:1 (160 mi) a -115°C bajo nitrógeno se le añadieron metil litio 1.6 M (18 mL) por goteo durante 30 minutos. Después de agitación adicional durante 1 hora 40 minutos la mezcla se inactivo con solución acuosa saturada de cloruro de amonio (80 mL) y luego se dejó alcanzar la temperatura ambiente. La capa orgánica se recogió y la capa acuosa se extrajo más con éter dietílico dos veces. Los orgánicos se combinaron, se secaron (MgS04) y los solventes se evaporaron al vacío para dar el compuesto del subtítulo como un aceite transparente. Rendimiento: 4.77 g.
? RMN (300 MHz, CDCl3) : 6 1.40 (s, 3H) , 1.47 (s, 3H) , 2.24 (s, 3H) , 3.97 (m, 1H) , 4.19 (m, 1H) , 4.41 (m, 1H) . ii) (1S) -1- [ (4S) -2,2-dimetil-l,3-dioxolan-4-il] -arfenilmetil] etanamina A una solución del producto de la etapa (i) (1- [ (4i?) -2, 2-dimetil-l, 3-dioxolan-4-il] etanona) (3.58 g) en dicloroetano (40 mL) se le añadió bencilamina (3 mL) y ácido acético glacial (1.6 mL) seguido por el enfriamiento de la mezcla en un baño de hielo. Después se añadió en porciones durante 25 minutos triacetoxiborohidruro de sodio (7.4 g) . La mezcla se dejó agitar después a la temperatura ambiente durante 14 horas. La mezcla se inactivo con solución saturada de bicarbonato de sodio y luego se extrajo con diclorometano 4 veces . Los orgánicos combinados se recogieron, se secaron (MgS04) y los solventes se evaporaron para dejar un aceite amarillo pálido. La purificación mediante cromatografía en columna de gel de sílice eluyendo con mezclas de isohexano/acetato de etilo de 10 a 20 a 30 a 40% de acetato de etilo dio el compuesto del subtítulo como el segundo diastereoisómero eluyente como un aceite amarillo pálido: Rendimiento 0.74 g.
*? RM (300 MHz, CDCl3) : d 1.02 (d, 3H) , 1.36 (s, 3H) , 3.38 (s, 3H) , 2.80 (bs, 1H) , 2.76 (quinteto, 2H) , 3,68 (m, 2H) , 3.96 (m, 1H) , 7.22 (m, 1H) , 7.35 (m, 4H) . iii) (1S) -1- [ (4S) -2, 2 -dimetil- 1,3 -dioxolan-4 -il] etanamina A una solución del producto de la etapa (ii) ( - 1- [ (4S) -2, 2-dimetil-l, 3-dioxolan-4-il] -N-pentilmetil] etanamina (0.073 g) en etanol (20 mL) se le añadió 10% de paladio en carbón (0.1 g) y todo se hidrogenó a 4 bares a temperatura ambiente durante 12 horas. La mezcla se filtró y el solvente se evaporó al vacío para dejar el compuesto del subtítulo como un aceite amarillo pálido.
Rendimiento: 0.43 g.
XH RMN (300 MHz, CDCl3) : d 1.00 (d, 3H) , 1.35 (s, 3H) , 1.43 (s, 3H) , 2.87 (quinteto, 1H) , 3.63 (t, 1H) , 3.78 (m, 1H) , 4.03 (m, 1H) . iv) 6-cloro-2- [ (2,3-difluorobencil) tio] -N-{ (1S) -1- [ (4S) -2, 2-dimetil-l, 3 -dioxolan-4 -il] etil}pirimidin-4 -amina A una solución del producto de la etapa (iii) ( (1S) -1- [ (4S) -2, 2-dimetil-l, 3 -dioxolan-4 - il] etanamina) (0.32 g) en acetonitrilo (8 mL) se le añadió 4 , 6 -dicloro-2 - [ (2 , 3 -difluorobencil) tio] pirimidina ( O-2004/011443) (0.616 g) , bicarbonato de sodio (0.185 g) y la mezcla se puso a reflujo bajo nitrógeno durante 2 horas. La mezcla de reacción enfriada se dividió entre acetato de etilo y agua. La capa orgánica se recogió y la capa acuosa se extrajo más con acetato de etilo. Los orgánicos se combinaron, se secaron (MgS0 ) y el solvente se evaporó. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna con gel de sílice eluyendo con mezclas de isohexano/acetato de etilo de 5 a 20% ; de acetato de etilo para dar el compuesto del título como un aceite transparente. Rendimiento: 0.58 g. 2H RM (300 MHz, CDC13) : d 1.23 (d, 3H) , 1.36 (s, 3H) , 1.44 (s, 3H) , 3.58 (t, 1H) , 3.98 (t, 2H) , 4.14 (m, 1H) , 4.37 (s, 2H) , 5.07 (bs, 1H) , 6.05 (s, 1H) , 7.02 (m, 2H) , 7.30 (m, 1H) . v) N- [2- [ (2, 3-difluorobencil) tio] -6- (( (1S) -1- [ (4S) - 2, 2-dimetil-l, 3-dioxolan-4-il] etil)amino)pirimidin-4-il] azetidin- 1- sulfonamida Una mezcla del producto de la etapa (iv) (6-cloro-2- [ (2, 3-difluorobencil) tio] -N- { (1S) -1- [ (4S) -2 , 2-dimetil-l, 3-dioxolan-4-il] etil }pirimidin-4 -amina) ) (0.37 g) , azetidin-1-sulfonamida (WO-2004/011443 ) (0.24 g) , paladio(II) tris (dibencilidenacetona) dipaladio (0) (0.082 g) , XPhos (0.042 g) y carbonato de cesio (0.435 g) en dioxano seco (5 mL) se calentó en un microondas en un recipiente abierto a 100°C/300 máximo durante 15 minutos con agitación. La mezcla se' dejó enfriar a la temperatura ambiente, se añadió ácido acético (2.4 mL) y el solvente se removió al vacío. Los residuos se dividieron entre agua y acetato de etilo, y la fracción orgánica se separó, se lavó con agua y salmuera, se secó (MgS04) , se filtró y se concentró al vacío para dar una goma roja (1.1 g) . El residuo se purificó mediante cromatografía en columna con gel de sílice eluyendo con mezclas de isohexano/acetato de etilo de 10 a 40% de acetato de etilo para dar el compuesto del subtítulo como una espuma amarillo pálido. Rendimiento: 0.36 g.
¾ RM (300 MHz, CDCl3) : d 1.24 (d, 3H) , 1.36 (s, 3H) , 1.45 (s, 3H) , 2.26 (quinteto, 2H) , 3.62 (t, 1H) , 3.95 (t, 1H) , 3.99 (m, 4H) , 4.27 (m, 1H) , 4.34 (m, 2H) , 5.06 (bs, 1H) , 5.92 (s, 1H) , 7.02 (m, 2H) , 7.23 (m, 1H), 7.38 (m, 1H) , 7.46 (m, 1H) . vi) iV- (2- [(2,3-difluorobencil) tio] -6-( [ (1S,2S) -2,3-dihidroxi-l-metilpropil] amino}pirimidin-4-il) azetidin-1-sulfonantida Una mezcla del producto de la etapa (v) ( {N-[2- [ (2, 3-difluorobencil) tio] -6- ( { (1S) -1- [ (4S) -2 , 2-dimetil-l , 3 -dioxolan-4 -il] etil }amino) irimidin-4- il] azetidin- 1-sulfonamida) (0.346 g) y ácido para-toluensulfónico (0.084 g) en raetanol (5 mL) y agua (2 gotas) se calentó a 60°C durante 3 horas. El solvente se evaporó y el residuo se recogió en acetato de etilo el cual se lavó con agua, se secó (MgS04) y se evaporó para dar una espuma amarillo pálido.
La purificación mediante cromatografía en gel de sílice eluyendo con mezclas de diclorometano/metanol (2 a 4% de metanol) seguida por trituración con diclorometano dio el compuesto del título como un sólido blanco. Rendimiento: 0.185 g.
*H RM (300 MHz , CDC13) : d 1.27 (d, 3H) , 2.26 (quinteto, 2H) , 3.56 (m, 2H) , 3.71 (m, 1H) , 3.96 (m, 4H) , 4.17 (t, 4H) , 4.25 (m, 1H) , 4.35 (s, 2H) , 5.14 (bd, 1H) , 6.01 (s, 1H) , 7.06 (m, 2H) , 7.23 (m, 1H) .
MS: APCI(+ve) 476 [M+H] + .
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (14)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Un compuesto caracterizado porque tiene la fórmula (1) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
2. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, caracterizado porque es para usarse en el tratamiento de una enfermedad o afección mediada por quimiocinas.
3. El compuesto de conformidad con la reivindicación 2 o una sal farmacéuticamente aceptable 1 del mismo, caracterizado . porque es para usarse como un medicamento para el tratamiento de asma, rinitis alérgica, COPD, enfermedad intestinal inflamatoria, osteoartritis , osteoporosis , artritis reumatoide o psoriasis.
4. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el compuesto de conformidad con la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable .
5. Un procedimiento para la preparación del compuesto de conformidad con la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, caracterizado porque comprende : (a) tratar un compuesto de la fórmula (2a) (2a) en donde PG es ya sea un grupo protector o dos átomos de hidrógeno separados y L es un grupo saliente, con una sulfonamida de la fórmula (2c) : (2c) en presencia de una base, catalizador y solvente adecuado, y opcionalmente posteriormente (i) y/o (ii) en cualquier orden: i) remover cualquier grupo protector; ii) formar una sal; o como alternativa; (b) tratar un compuesto de la fórmula (2b) en donde PG2 es un grupo protector y L es un grupo saliente con una amina de la fórmula (2d) (2d) en donde PG es un grupo protector o dos átomos de hidrógeno separados, en presencia de una base y solvente adecuados, y opcionalmente posteriormente (i) y/o (ii) en cualquier orden: i) remover cualquier grupo protector; ii) formar una sal.
6. Un compuesto caracterizado porque tiene la fórmula (la) (la) y sales farmacéuticamente aceptables del mismo.
7. Un compuesto caracterizado porque tiene fórmula (2a) , (2a) en donde L es halógeno
8. Un compuesto caracterizado porque tiene la fórmula (2e) , (2e) en donde L es halógeno
9. Una terapia de combinación caracterizada porque comprende administrar el compuesto de la fórmula (1) de conformidad con la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una composición o formulación farmacéutica que comprende el compuesto de la fórmula (1) , concurrentemente o secuencialmente con otra terapia y/u otro agente farmacéutico.
10. La terapia de combinación de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque es para el tratamiento de asma, rinitis alérgica, COPD, enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad del intestino irritable, osteoartritis, osteoporosis , artritis reumatoide o psoriasis.
11. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el compuesto de la fórmula (1) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en conjunto con otro agente farmacéutico.
12. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque es para el tratamiento de asma, rinitis alérgica, COPD, enfermedad intestinal inflamatoria, osteoartritis, osteoporosis, artritis reumatoide o psoriasis.
13. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque es para el tratamiento de cáncer.
14. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, caracterizado porque está en cualquiera de las siguientes formas cristalinas: (a) según se caracteriza por un patrón de difracción de polvo de rayos X (XRPD) como el mostrado en la tabla 3 en la presente, asignado como modificación A; (b) según se caracteriza por un patrón . de difracción de polvo de rayos X (XRPD) como el mostrado en la tabla 4 en la presente, asignado como modificación B; (c) según se caracteriza por un patrón de difracción de polvo de rayos X (XRPD) como el mostrado en la tabla 5 en la presente, asignado como modificación C; (d) según se caracteriza por un patrón de difracción de polvo de rayos X (XRPD) como el mostrado en la tabla 6 en la presente, asignado como modificación D; (e) según se caracteriza por un patrón de difracción de polvo de rayos X (XRPD) como el mostrado en la tabla 7 en la presente, asignado como modificación E; o (f) según se caracteriza por un patrón de difracción de polvo de rayos X (XRPD) como el mostrado en la tabla 8 en la presente, asignado como modificación F.
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