MX2010013910A

MX2010013910A - Genes de toxinas y metodos para su uso.

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Publication number: MX2010013910A
Application number: MX2010013910A
Authority: MX
Inventors: Daniel J Tomso; Shruti Agarwal; Chris Campbell; Brian Mcnulty; Kimberly S Sampson
Original assignee: Athenix Corp
Priority date: 2008-06-25
Filing date: 2009-06-25
Publication date: 2011-06-20
Also published as: CN102066408A; EP3904371A2; ZA201009045B; AU2009262153B2; BRPI0914780B8; US9556255B2; PE20110599A1; PE20140942A1; US20100005543A1; EP3470419A1; CA2729294C; CN102066408B; US8461421B2; CA3008307C; EP3470419B1; MX351227B; CL2010001436A1; AU2009262153A1; BRPI0914780A2; US20130310543A1

Abstract

Se proporcionan composiciones y métodos para conferir actividad pesticida contra bacterias, plantas, células vegetales, tejidos y semillas; se proporcionan composiciones que comprenden una secuencia codificadora para un polipéptido de delta-endotoxina; las secuencias codificadoras pueden utilizarse en constructos de ADN o cassettes de expresión para transformación y expresión en plantas y bacterias; las composiciones también comprenden bacterias, plantas, células vegetales, tejidos y semillas transformados; en particular, se proporcionan moléculas aisladas de ácido nucleico de delta-endotoxina; adicionalmente, están comprendidas secuencias de aminoácidos que corresponden a los polinucleótidos y anticuerpos que se unen específicamente a dichas secuencias de aminoácidos; en particular, la presente invención prevé moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos que se muestra en cualquiera de SEQ ID NO: 61-121 y 133-141, o una secuencia de nucleótidos que se indica en SEQ ID NO:1-60,124-132 y 142-283, así como también variantes y fragmentos de las mismas.

Description

GENES DE TOXINAS Y MÉTODOS PARA SU USO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al campo de la biología molecular. Se proporcionan genes nuevos que codifican proteínas pesticidas. Estas proteínas y las secuencias de ácido nucleico que las codifican son útiles para preparar formulaciones pesticidas y en la producción de plantas transgénicas resistentes a plagas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Bacillus thuringiensis es una bacteria del suelo que forma esporas Gram-posítivas caracterizada por su capacidad para producir inclusiones cristalinas que son específicamente tóxicas contra determinados órdenes y especies de insectos, pero que son inofensivas para las plantas y otros organismos no objetivo. Por esta razón, pueden utilizarse composiciones que incluyen cepas de Bacillus thuringiensis o sus proteínas insecticidas como insecticidas ambientalmente aceptables para controlar las plagas de insectos agrícolas o vectores de insectos para una variedad de enfermedades de humanos o animales.

Las proteínas de cristal (Cry) (delta-endotoxinas) de Bacillus thuringiensis tienen una potente actividad insecticida, principalmente contra larvas de lepidópteros, dípteros y coleópteros. Estas proteínas también han demostrado actividad contra las órdenes de plagas Hymenoptera, Homoptera, Phthiraptera, Mallophaga y Acari, así como también otros órdenes de invertebrados tales como Nemathelminthes, Platyhelminthes y Sarcomastigorphora (Feitelson (1993) The Bacillus Thuringiensis family tree. En Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y.) Estas proteínas se clasificaron originalmente como Cryl a CryV en base principalmente a su actividad insecticida. Las clases principales fueron específicas para Lepidoptera (I), específicas para Lepidoptera y Díptera (II), específicas para Coleóptera (III), específicas para Díptera (IV) y específicas para nemátodos (V) y (VI). Las proteínas se clasificaron también en subfamilias; a las proteínas más relacionadas dentro de cada familia se le asignaron letras divisorias tales como CryIA, CryIB, CryIC, etc. A las proteínas aun más estrechamente relacionadas dentro de cada división se les proporcionaron nombres tales como Cry1C1, Cry1C2, etc.

Recientemente se describió una nueva nomenclatura para los genes Cry en base a la homología de la secuencia de aminoácidos en lugar de la especificidad dirigida a insectos (Crickmore et al. (1998) Microbio!. Mol. Biol. Rev. 62:807-813). En la nueva clasificación, a cada toxina se le asigna un nombre único que incorpora un rango primario (un número arábigo), un rango secundario (una letra mayúscula), un rango terciario (una letra minúscula) y un rango cuaternario (otro número arábigo). En la nueva clasificación, los números romanos se han cambiado por números arábigos en el rango primario. Las proteínas con una identidad de menos del 45% tienen diferentes rangos primarios y los criterios para los rangos secundarios y terciarios son 78% y 95%, respectivamente.

La proteína de cristal no exhibe actividad insecticida hasta que se haya ingerido y solubilizado en el intestino medio del insecto. La protoxina ingerida es hidrolizada por proteasas en el tracto digestivo del insecto y se convierte en una molécula tóxica activa. (Hófte y Whiteley (1989) Microbio!. Rev. 53:242-255). Esta toxina se une con receptores apicales de borde en cepillo en el intestino medio de las larvas objetivo y se inserta en la membrana apical, creando canales o poros de iones, lo que resulta en la muerte de las larvas.

Las delta-endotoxinas generalmente tienen cinco dominios de secuencia conservados y tres dominios estructurales conservados (ver, por ejemplo, de Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17:193-199). El primer dominio estructural conservado consiste en siete hélices alfa y está involucrado en la inserción en la membrana y la formación de poros. El dominio II consiste en tres láminas beta dispuestas en una configuración de clave griega, y el dominio III consiste en dos láminas beta antiparalelas en una formación de "remolino" (de Maagd et al., 2001 , supra). Los dominios II y III están involucrados en el reconocimiento y la unión de receptores y, por lo tanto, son considerados determinantes de la especificidad de toxinas.

El uso intensivo de insecticidas basados en B. thuringiensis ha provocado la resistencia en poblaciones de campo de la polilla dorso de diamante, Plutella xylostella (Ferré y Van Rie (2002) Annu. Rev. Entomol. 47:501-533). El mecanismo más común de resistencia es la reducción de la unión de la toxina con sus receptores de intestino medio específicos. Esto también puede conferir resistencia cruzada a otras toxinas que comparten el mismo receptor (Ferré and Van Rie (2002)).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se proporcionan composiciones y métodos para conferir resistencia a plagas a bacterias, plantas, células vegetales, tejidos y semillas. Las composiciones incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican secuencias para polipéptidos de delta-endotoxina, vectores que comprenden dichas moléculas de ácido nucleico y células huésped que comprenden los vectores. Las composiciones también incluyen secuencias de polipéptidos de la endotoxina y anticuerpos contra dichos polipéptidos. Las secuencias de nucleótidos pueden utilizarse en constructos de ADN o cassettes de expresión para transformación y expresión en organismos, incluidos microorganismos y plantas. Las secuencias de nucleótidos o aminoácidos pueden ser secuencias sintéticas que han sido diseñadas para expresión en un organismo incluido, a modo no taxativo, un microorganismo o una planta. Las composiciones también comprenden bacterias, plantas, células vegetales, tejidos y semillas transformados.

En particular, se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que corresponden a secuencias de ácido nucleico. Adicionalmente, están comprendidas las secuencias de aminoácidos que corresponden a los polinucleótidos En particular, la presente invención prevé una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos que se muestra en cualquiera de SEQ ID NO:61-121 y 133-141 , o una secuencia de nucleótidos que se indica en cualquiera de SEQ ID NO:1-60 y 124-132, así como también variantes y fragmentos de las mismas. También están comprendidas secuencias de nucleótidos que son complementarias a una secuencia de nucleótidos de la invención, o que hibridizan una secuencia de la invención.

Las composiciones y métodos de la invención son útiles para la producción de organismos con resistencia a pesticidas, específicamente bacterias y plantas. Estos organismos y composiciones derivadas de ellos son deseables con fines agrícolas. Las composiciones de la invención también son útiles para generar proteínas delta-endotoxinas alteradas o mejoradas que tienen actividad pesticida, o para detectar la presencia de proteínas delta-endotoxinas o ácidos nucleicos en productos u organismos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención está dirigida a composiciones y métodos para regular la resistencia a plagas en organismos, particularmente plantas o células vegetales. Los métodos implican la transformación de organismos con una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina delta-endotoxina de la invención. En particular, las secuencias de nucleótidos de la invención son útiles para preparar plantas y microorganismos que poseen actividad pesticida. De este modo, se proporcionan bacterias, plantas, células vegetales, tejidos vegetales y semillas transformados. Las composiciones son ácidos nucleicos de delta-endotoxina y proteínas de Bacillus thuringiensis. Las secuencias encuentran uso en la construcción de vectores de expresión para la transformación posterior en organismos de interés, como sondas para el aislamiento de otros genes de delta-endotoxina, y para la generación de proteínas pesticidas alteradas por métodos conocidos en la técnica, tales como intercambio o transposición de ADN. Las proteínas encuentran uso en el control o la eliminación de poblaciones de plagas de lepidópteros, coleópteros y nemátodos, y para producir composiciones con actividad pesticida.

"Delta-endotoxina" significa una toxina de Bacillus thuringiensis que tiene actividad tóxica contra una o más plagas, incluidos, a modo no taxativo, miembros de los órdenes Lepidoptera, Díptera y Coleóptera o miembros del filo Nematoda, o una proteína que tiene homología con dicha proteína. En algunos casos, se han aislado proteínas delta-endotoxinas de otros organismos, incluidos Clostridium bifermentans y Paenibacillus popilliae. Las proteínas delta-endotoxinas incluyen secuencias de aminoácidos deducidas de secuencias de nucleótidos de largo completo divulgadas en la presente, y secuencias de aminoácidos que son más cortas que las secuencias de largo completo, debido al uso de un sitio de inicio alternativo aguas abajo, o debido al procesamiento que produce una proteína más corta que tiene actividad pesticida. El procesamiento puede ocurrir en el organismo en el que se expresa, o en la plaga después de la ingestión de la proteína.

Las delta-endotoxinas incluyen proteínas identificadas como cryl hasta cry43, cytl y cyt2 y toxina tipo Cyt. Actualmente hay más de 250 especies conocidas de delta-endotoxinas con una amplia gama de especificidades y toxicidades. Para una lista extensa ver Crickmore et al. (1998), Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813, y para las actualizaciones regulares ver Crickmore et al. (2003) "Bacillus thuríngiensis toxin nomenclature," en www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index.

Se proporcionan en la presente secuencias nuevas de nucleótidos aisladas que confieren actividad pesticida. También se proporcionan las secuencias de aminoácidos de las proteínas delta-endotoxinas. La proteína que resulta de la translación de este gen permite que las células controlen o eliminen las plagas que la ingieren.

Moléculas de ácido nucleico aisladas y variantes y fragmentos de las mismas Un aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas o recombinantes que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas delta-endotoxinas y polipéptidos o porciones biológicamente activas de las mismas, así como también moléculas de ácido nucleico suficientes para utilizar como sondas de hibridación para identificar ácidos nucleicos que codifican delta-endotoxinas. Como se utiliza en la presente, la expresión "molécula de ácido nucleico" significa incluir moléculas de ADN (por ejemplo, ADN recombinante, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y análogos de ADN o ARN generados utilizando análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser de única hebra o de doble hebra, pero preferiblemente es ADN de doble hebra.

Una molécula o proteína de ácido nucleico "aislada" o "purificada", o porción biológicamente activa de la misma, está básicamente libre de otro material celular o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes o básicamente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" está libre de secuencias (preferiblemente secuencias codificadoras de proteína) que flanquean el ácido nucleico (es decir, secuencias ubicadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del cual deriva el ácido nucleico. A efectos de la invención, "aislado", cuando se utiliza en referencia a moléculas de ácido nucleico, excluye a los cromosomas aislados. Por ejemplo, en diversas realizaciones, la molécula de ácido nucleico que codifica delta-endotoxina aislada puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb o 0.1 kb de secuencias de nucleótidos que flanquean naturalmente la molécula de ácido nucleico en ADN genómico de la célula de la cual deriva el ácido nucleico. Una proteína delta-endotoxina que está básicamente libre de material celular incluye preparaciones de proteína que tienen menos de aproximadamente 30%, 20%, 10% o 5% (en peso seco) de proteína no delta-endotoxina (a la que también se hace referencia en la presente como una "proteína contaminante").

Las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas de la presente invención incluyen la secuencia que se indica en la SEQ ID NO: 1-60 y 124-132 y variantes, fragmentos y complementos de la misma. "Complemento" quiere decir una secuencia de nucleótidos que es suficientemente complementaria a una secuencia de nucleótidos dada de forma tal que pueda hibridarse con la secuencia de nucleótidos dada para formar así un dúplex estable. La secuencia de aminoácidos correspondiente para la proteína delta-endotoxina codificada por esta secuencia de nucleótidos se indica en las SEQ ID NO:61-121 y 133-141.

Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de estas secuencias de nucleótidos que codifican delta-endotoxina también están comprendidas por la presente invención. "Fragmento" significa una porción de la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína delta-endotoxina. Un fragmento de una secuencia de nucleótidos puede codificar una porción biológicamente activa de una proteína delta-endotoxina o puede ser un fragmento que puede utilizarse como una sonda de hibridación o cebador de PCR utilizando los métodos divulgados más adelante. Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de una secuencia de nucleótidos de delta-endotoxina comprenden al menos aproximadamente 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1050, 1 100, 1 150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2150, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2600, 2650, 2700, 2750, 2800, 2850, 2900, 2950, 3000, 3050, 3100, 3150, 3200, 3250, 3300, 3350 nucleótidos contiguos, o hasta la cantidad de nucleótidos presentes en una secuencia de nucleótidos que codifica una delta-endotoxina de largo completo divulgada en la presente, dependiendo del uso pretendido. "Nucleótidos contiguos" significa residuos de nucleótidos que son inmediatamente adyacentes entre sí. Fragmentos de las secuencias de nucleótidos de la presente invención codificarán fragmentos de proteína que retienen la actividad biológica de la proteína delta-endotoxina y, por lo tanto, retienen la actividad pesticida. "Retiene actividad" significa que el fragmento tendrá al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 70%, 80%, 90%, 95% o más de la actividad pesticida de la proteína delta-endotoxina. Los métodos para medir la actividad pesticida se conocen bien en la técnica. Ver, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; y Patente de los Estados Unidos No. 5,743,477, que se incorporan a la presente a modo de referencia en su totalidad.

Un fragmento de una secuencia de nucleótidos que codifica una delta-endotoxina que codifica una porción biológicamente activa de una proteína de la invención codificará al menos aproximadamente 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1 100 aminoácidos contiguos, o hasta la cantidad total de aminoácidos presentes en una proteína delta-endotoxina de largo completo de la invención.

Las proteínas delta-endotoxinas preferidas de la presente invención están codificadas por una secuencia de nucleótidos suficientemente idéntica a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1-60 y 124-132. "Suficientemente idéntica" significa una secuencia de aminoácidos o nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 60% o 65% de identidad de secuencia, aproximadamente 70% o 75% de identidad de secuencia, aproximadamente 80% o 85% de identidad de secuencia, aproximadamente 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o una mayor identidad de secuencia en comparación con una secuencia de referencia utilizando uno de los programas de alineación descritos en la presente y utilizando parámetros estándar. Un experto en la técnica reconocerá que estos valores pueden ajustarse apropiadamente para determinar la identidad correspondiente de proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos tomando en cuenta la degeneración de codones, la similitud de aminoácidos, la lectura de posicionamiento de la trama y aspectos similares.

Para determinar la identidad porcentual de dos secuencias de aminoácidos o de dos ácidos nucleicos, las secuencias se alienan a efectos de comparación. La identidad porcentual entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, identidad porcentual = número de posiciones idénticas/número total de posiciones (por ejemplo, posiciones superpuestas) x 100). En una realización, las dos secuencias son del mismo largo. En otra' realización, la comparación se realiza en la totalidad de la secuencia de referencia (por ejemplo, en la totalidad de una de SEQ ID NO: 1-60 y 124-132, o en la totalidad de una de SEQ ID NO:61-121 y 133-141 ). La identidad porcentual entre dos secuencias puede determinarse utilizando técnicas similares a aquellas descritas más adelante, permitiendo intervalos o no. Al calcular la identidad porcentual, se cuentan las coincidencias generalmente exactas.

La determinación de la identidad porcentual entre dos secuencias puede lograrse utilizando un algoritmo matemático. Un ejemplo no taxativo de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU 87:2264, modificado como en Karlin y Altschul ( 993) Proc. Nati. Acad. Sci. EE UU 90:5873-5877. Dicho algoritmo se incorpora en los programas BLASTN y BLASTX de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403. Las búsquedas de nucleótidos BLAST pueden llevarse a cabo con el programa BLASTN, marca = 100, largo de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homologas a moléculas de ácido nucleico de la invención similares a delta-endotoxina. Las búsquedas de proteínas BLAST pueden llevarse a cabo con el programa BLASTX, marca = 50, largo de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homologas a moléculas de ácido nucleico de la invención similares a delta-endotoxina. Para obtener alineaciones abiertas a efectos de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST (en BLAST 2.0) como se describe en AltschuI et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, puede utilizarse PSI-Blast para realizar una búsqueda repetitiva que detecte las relaciones distantes entre las moléculas. Ver AltschuI et al. (1997) supra. Cuando se utilizan los programas BLAST, Gapped BLAST y PSI-Blast, pueden utilizarse los parámetros por detecto de los respectivos programas (por ejemplo, BLASTX y BLASTN). La alineación también puede realizarse manualmente mediante inspección.

Otro ejemplo no taxativo de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo ClustalW (Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680). ClustalW comprara las secuencias y alinea la totalidad de la secuencia de aminoácidos o ADN y, por lo tanto, puede proporcionar datos acerca de la conservación de secuencias de toda la secuencia de aminoácidos. El algoritmo ClustalW se utiliza en varios paquetes de software de análisis de ADN/aminoácidos, tales como el módulo ALIGNX del Paquete del Programa Vector NTI (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Después de la alineación de las secuencias de aminoácidos con ClustalW, puede evaluarse el aminoácido porcentual. Un ejemplo no taxativo de un programa de software útil para el análisis de alineaciones ClustalW es GENEDOC™. GENEDOC™ (Karl Nicholas) permite la evaluación de similitud e identidad de aminoácidos (o ADN) entre múltiples proteínas. Otro ejemplo no taxativo de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4: 1-17. Dicho algoritmo se incorpora en el programa ALIGN (versión 2.0), que es parte del Paquete de Software GCG Wisconsin Genetics, Versión 10 (disponible en Accelrys, Inc., 9685 Scranton Rd., San Diego, CA, USA). Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, puede utilizarse una tabla de residuo de peso PAM120, una penalización por largo de abertura de 12 y una penalización por abertura de 4.

A menos que se indique lo contrario, GAP Versión 10, que utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443-453, se utilizará para determinar la identidad o similitud de secuencia utilizando los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótidos utilizando un peso de abertura de 50 y un largo de abertura de 3, y la matriz de marcado nwsgapdna.cmp; % de identidad o % de similitud para una secuencia de aminoácidos utilizando un peso de GAP de 8 y un largo de abertura de 2, y el programa de puntaje BLOSUM62. Pueden utilizarse programas equivalentes. "Programa equivalente" significa cualquier programa de comparación de secuencias que, para cualquier par de secuencias en cuestión, genera una alineación que tiene coincidencias idénticas de residuos de nucleótidos y una identidad de secuencia porcentual idéntica en comparación con la alineación correspondiente generada por GAP Versión 10.

La invención también comprende variantes de moléculas de ácido nucleico. "Variantes" de las secuencias de nucleótidos que codifican delta-endotoxinas incluyen aquellas secuencias que codifican las proteínas delta-endotoxinas divulgadas en la presente pero que difieren de manera conservadora debido a la degeneración del código genético, así como también aquellas que son suficientemente idénticas como se describió anteriormente. Las variantes alélicas naturales pueden identificarse con el uso de técnicas de biología molecular bien conocidas, tales como las técnicas de reacción en cadena de polimerasa (PCR) e hibridación como se presentan más adelante. Las secuencias de nucleótidos variantes también incluyen secuencias de nucleótidos sintéticamente derivadas que se han generado, por ejemplo, mediante el uso de mutagénesis dirigida al sitio pero que también codifican las proteínas delta-endotoxinas divulgadas en la presente invención como se describe más adelante. Las proteínas variantes comprendidas por la presente invención son biológicamente activas, es decir, continúan contando con la actividad biológica deseada de la proteína nativa, es decir, reteniendo la actividad pesticida. "Retiene actividad" significa que la variante tendrá al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 70%, 80% de la actividad pesticida de la proteína nativa. Los métodos para medir la actividad pesticida se conocen bien en la técnica. Ver, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; y Patente de los Estados Unidos No. 5,743,477, que se incorporan a la presente a modo de referencia en su totalidad.

Los expertos en la técnica apreciarán también que los cambios pueden introducirse por mutación de las secuencias de nucleótidos de la invención, provocando así cambios en la secuencia de aminoácidos de las proteínas delta-endotoxinas codificadas, sin alterar la actividad biológica de las proteínas. De este modo, las moléculas de ácido nucleico aisladas variantes pueden crearse introduciendo una o más sustituciones de nucleótidos, adiciones o eliminaciones en la correspondiente secuencia de nucleótidos descrita en la presente, de forma tal que una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos se introduzcan en la proteína codificada. Las mutaciones pueden introducirse mediante técnicas estándar, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Dichas secuencias de nucleótidos variantes también están comprendidas por la presente invención.

Por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos conservadoras pueden realizarse en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales previstos. Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que puede alterarse de la secuencia tipo silvestre de una proteína delta-endotoxina sin alterar la actividad biológica, mientras que se requiere un residuo de aminoácidos esencial para actividad biológica. Una "sustitución de aminoácidos conservadora" es una sustitución en la que cual el residuo de aminoácido es reemplazado por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han identificado familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin cargar (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).

Las delta-endotoxinas generalmente tienen cinco dominios de secuencia conservada y tres dominios estructurales conservados (ver, por ejemplo, de Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17:193-199). El primer dominio estructural conservado consiste en siete hélices alfa y está involucrado en la inserción en membrana y la formación de poros. El dominio II consiste en tres láminas beta dispuestas en una configuración de clave griega y el dominio III consiste en dos láminas beta antiparalelas en una formación de remolino (de Maagd et al., 2001 , supra). Los dominios II y III están involucrados en el reconocimiento y la unión de receptores y, por lo tanto, son considerados determinantes de la especificidad de las toxinas.

Las sustituciones de aminoácidos pueden realizarse en regiones no conservadas que retienen la función. En general, dichas sustituciones no se realizarían para residuos de aminoácidos conservados ni para residuos de aminoácidos que residen dentro de un motivo conservado, donde dichos residuos son esenciales para la actividad de la proteína. Ejemplos de residuos que son conservados y que pueden ser esenciales para la actividad de la proteína incluyen, por ejemplo, residuos que son idénticos entre todas las proteínas contenidas en una alineación de las secuencias de aminoácidos de la presente invención y secuencias de delta-endotoxina conocidas. Ejemplos de residuos que son conservados pero que pueden permitir sustituciones de aminoácidos conservadoras y retienen también actividad incluyen, por ejemplo, residuos que tienen solo sustituciones conservadoras entre todas las proteínas contenidas en una alineación de las secuencias de aminoácidos de la presente invención y secuencias de delta-endotoxina conocidas. Sin embargo, un experto en la técnica comprendería que las variantes funcionales pueden tener alteraciones conservadas o no conservadas menores en los residuos conservados.

Alternativamente, las secuencias de nucleótidos variantes pueden realizarse introduciendo mutaciones aleatoriamente en toda la secuencia codificadora o parte de ella, por ejemplo mediante mutagénesis por saturación, y la capacidad de los mutantes resultantes para conferir actividad de delta-endotoxina puede monitorearse para identificar mutantes que retienen actividad. Luego de la mutagénesis, la proteína codificada puede expresarse de forma recombinante, y la actividad de la proteína puede determinarse utilizando técnicas de ensayo estándar.

Utilizando métodos tales como PCR, hibridación y similares, pueden identificarse las secuencias de delta-endotoxina correspondientes, teniendo dichas secuencias una identidad importante con las secuencias de la invención. Ver, por ejemplo, Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) y Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY).

En un método de hibridación, toda la secuencia de nucleótidos de delta-endotoxina o parte de la misma puede utilizarse para evaluar ADNc o bibliotecas genómicas. Los métodos para la construcción de dicho ADNc y bibliotecas genómicas se conocen generalmente en la técnica y se divulgan en Sambrook y Russell, 2001 , supra. Las denominadas sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN u otros oligonucleótidos, y pueden etiquetarse con un grupo detectable tal como 32P o cualquier otro marcador detectable, tal como radioisótopos, un compuesto fluorescente, una enzima o un co-factor enzimático. Las sondas para hibridación pueden realizarse etiquetando oligonucleótidos sintéticos en base a la secuencia de nucleótidos conocida que codifica delta-endotoxina divulgada en la presente. Adicionalmente pueden utilizarse cebadores degenerados diseñados en base a los nucleótidos conservados o residuos de aminoácidos en la secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos codificada. La sonda generalmente comprende una región de secuencia de nucleótidos que se hibridiza en condiciones rigurosas hasta al menos aproximadamente 12, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, o 400 nucleótidos consecutivos de secuencia de nucleótidos que codifica una delta-endotoxina de la invención o un fragmento o variante de la misma. Los métodos para la preparación de sondas para hibridación generalmente se conocen en la técnica y se divulgan en Sambrook y Russell, 2001 , supra, incorporado en la presente a modo de referencia.

Por ejemplo, una secuencia de delta-endotoxina entera divulgada en la presente, o una o más porciones de la misma, pueden utilizarse como una sonda capaz de hibridarse específicamente con secuencias similares a delta-endotoxina correspondientes y ARNs mensajeros. Para lograr la hibridación específica en una variedad de condiciones, dichas sondas incluyen secuencias que son únicas y son preferiblemente de al menos 10 nucleótidos de largo, o al menos aproximadamente 20 nucleótidos de largo. Dichas sondas pueden utilizarse para amplificar las secuencias de delta-endotoxina correspondientes de un organismo elegido por PCR. Esta técnica puede utilizarse para aislar secuencias codificadoras adicionales de un organismo deseado o como un ensayo de diagnóstico para determinar la presencia de secuencias codificadoras en un organismo. Las técnicas de hibridación incluyen monitoreo de hibridación de bibliotecas de ADN en placas (ya sean plaquetas o colonias; ver, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2da ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York).

La hibridación de dichas secuencias puede llevarse a cabo en condiciones rigurosas. "Condiciones rigurosas" o "condiciones de hibridación rigurosas" significa condiciones en las que una sonda se hibridará con su secuencia objetivo hasta un grado detectablemente mayor que con otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces por encima del fondo). Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Mediante el control de la rigurosidad de las condiciones de hibridación y/o lavado pueden identificarse las secuencias objetivo que son 100% complementarias a la sonda (sondeos homólogos). Alternativamente, las condiciones de rigurosidad pueden ajustarse para permitir algunos desajustes en las secuencias de forma tal que se detecten grados inferiores de similitud (sondeos heterólogos). Generalmente, una sonda es de menos de aproximadamente 1000 nucleótidos de largo, preferiblemente menos de 500 nucleótidos de largo.

Generalmente, condiciones rigurosas serán aquellas en las cuales la concentración de sal es menos de aproximadamente 1.5 M de ión de Na, generalmente de aproximadamente 0.01 a 1.0 M de ión de Na (u otras sales) en pH 7.0 hasta 8.3 y la temperatura es al menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60°C para sondas largas (por ejemplo, mayor a 50 nucleótidos). Las condiciones rigurosas pueden lograrse también con la adición de agentes desestabilizantes, tales como formamida. Las condiciones de baja rigurosidad ejemplares incluyen hibridación con una solución amortiguadora de 30 a 35% de formamida, NaCI 1 M, SDS al 1 % (dodecil sulfato de sodio) a 37°C, y un lavado en 1X a 2X de SSC (20X de SSC = NaCI 3.0 M/citrato de trisodio 0.3 M) a 50 hasta 55°C. Condiciones de rigurosidad moderada ejemplares incluyen hibridación en 40 a 45% de formamida, NaCI 1.0 M, SDS al 1 % a 37°C, y un lavado en 0.5X a 1X de SSC a 55 hasta 60°C. Condiciones de rigurosidad alta ejemplares incluyen hibridación en 50% de formamida, NaCI 1 M, SDS al 1 % a 37°C, y un lavado en 0.1X de SSC a 60 hasta 65°C. Opcionalmente, las soluciones amortiguadoras de lavado comprenden aproximadamente 0.1% a aproximadamente 1 % de SDS. La duración de la hibridación es generalmente menor a aproximadamente 24 horas, generalmente aproximadamente 4 a aproximadamente 12 horas.

La especificidad es generalmente la función de los lavados posthibridación, siendo los factores críticos la resistencia iónica y la temperatura de la solución final de lavado. Para híbridos de ADN-ADN, la Tm puede aproximarse a partir de la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81.5°C + 16.6 (M log) +0.41 (%GC) - 0.61 (% de form.) -500/L; donde M es la molaridad de cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN, % de form. es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación, y L es el largo del híbrido en pares de bases. La Tm es la temperatura (bajo resistencia iónica definida y pH) en la cual 50% de una secuencia objetivo complementaria se hibridiza con una sonda perfectamente coincidente. La Tm se reduce aproximadamente 1 °C para cada 1 % de desajuste. Por lo tanto, la Tm, hibridación y/o condiciones de lavado pueden ajustarse para hibridarse con secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con >90% de identidad, la Tm puede reducirse 10°C. Generalmente, las condiciones rigurosas se seleccionan para que sean aproximadamente 5°C menos que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica y su complemento en una resistencia iónica y pH definidos. Sin embargo, las condiciones muy rigurosas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 1 , 2, 3 o 4°C menos que el punto de fusión térmica (Tm); las condiciones moderadamente rigurosas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 6, 7, 8, 9 o 10°C menos que el punto de fusión térmica (Tm); las condiciones de baja rigurosidad pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 11 , 12, 13, 14, 15 o 20°C menos que el punto de fusión térmica (Tm). Utilizando la ecuación, las composiciones de hibridación y lavado y la Tm deseada, los expertos en la técnica comprenderán que las variaciones en la rigurosidad de hibridación y/o soluciones de lavado se describen de manera inherente. Si el grado deseado de desajuste resulta en una Tm de menos de 45°C (solución acuosa) o 32°C (solución de formamida), se prefiere aumentar la concentración de SSC para que pueda utilizarse una temperatura más alta. Una extensa guía de la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology— Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, Nueva York); y Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing y Wiley-lnterscience, Nueva York). Ver Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2da ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York).

Proteínas aisladas y variantes y fragmentos de las mismas Las proteínas delta-endotoxinas también están comprendidas en la presente invención. "Proteína delta-endotoxina" significa una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos que se indica en SEQ ID NO:61-121 y 133-141. También se proporcionan fragmentos, porciones biológicamente activas y variantes de las mismas, y pueden utilizarse para poner en práctica los métodos de la presente invención.

"Fragmentos" o "porciones biológicamente activas" incluyen fragmentos de polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente idénticas a la secuencia de aminoácidos que se indica en cualquiera de SEQ ID NO:61-121 y 133-141 y que exhiben actividad pesticida. Una porción biológicamente activa de una proteína delta-endotoxina puede ser un polipéptido que es de, por ejemplo, 10, 25, 50, 100 o más aminoácidos de largo. Dichas porciones biológicamente activas pueden prepararse mediante técnicas recombinantes y evaluarse su actividad pesticida. Los métodos para medir la actividad pesticida se conocen bien en la técnica. Ver, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews ef al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; y Patente de los Estados Unidos No. 5,743,477, que se incorporan a la presente a modo de referencia en su totalidad. Como se utiliza aquí, un fragmento comprende al menos 8 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 61-121 y 133-141. La invención comprende otros fragmentos, sin embargo, tales como cualquier fragmento en la proteína mayor a aproximadamente 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1 100, 1 150, 1200, 1250 o 1300 aminoácidos.

"Variantes" significa proteínas o polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 60%, 65%, aproximadamente 70%, 75%, aproximadamente 80%, 85%, aproximadamente 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO:61-121 y 133-141. Las variantes también incluyen polipéptidos codificados por una molécula de ácido nucleico que se hibridiza con la molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1-60 y 124-132, o un complemento de la misma, en condiciones rigurosas. Las variantes incluyen polipéptidos que difieren en la secuencia de aminoácidos debido a la mutagénesis. Las proteínas variantes comprendidas por la presente invención son biológicamente activas, es decir, continúan contando con la actividad biológica deseada de la proteína nativa, es decir, reteniendo la actividad pesticida. Los métodos para medir la actividad pesticida se conocen bien en la técnica. Ver, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; y Patente de los Estados Unidos No. 5,743,477, que se incorporan a la presente a modo de referencia en su totalidad.

Los genes bacterianos, tales como los genes axmi de la presente invención, muy a menudo cuentan con múltiples codones de iniciación de metionina próximos al comienzo de la trama de lectura abierta. A menudo, la iniciación de traducción en una o más de estos codones de comienzo provocará la generación de una proteína funcional. Estos codones de comienzo pueden incluir codones ATG. Sin embargo, bacterias tales como Bacillus sp. también reconocen el codón GTG como un codón de partida, y las proteínas que inician la traducción en codones GTG contienen una metionina en el primer aminoácido. Asimismo, a menudo no se determina a priori cuáles de estos codones se utilizan naturalmente en la bacteria. De este modo, se comprende que el uso de uno de los codones de metionina alternativos puede también provocar la generación de proteínas delta-endotoxinas que codifican actividad pesticida. Estas proteínas delta-endotoxinas están comprendidas en la presente invención y pueden utilizarse en el método de la presente invención.

Los anticuerpos contra los polipéptidos de la presente invención, o contra variantes o fragmentos de los mismos, también están comprendidos. Los métodos para producir anticuerpos se conocen en la técnica (ver, por ejemplo, Harlow y Lañe (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY¡ Patente de los Estados Unidos No. 4,196,265).

Variantes alteradas o mejoradas Se reconoce que las secuencias de ADN de una delta-endotoxina pueden ser alteradas por varios métodos, y que estas alteraciones pueden resultar en secuencias de ADN que codifican proteínas con secuencias de aminoácidos diferentes que las codificadas por la delta-endotoxina de la presente invención. Esta proteína puede alterarse de diversas formas, incluidas sustituciones, eliminaciones, truncamientos e inserciones de uno o más aminoácidos de SEQ ID NO:61-121 y 133-141 , incluidos hasta aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65, aproximadamente 70, aproximadamente 75, aproximadamente 80, aproximadamente 85, aproximadamente 90, aproximadamente 100, aproximadamente 105, aproximadamente 10, aproximadamente 1 15, aproximadamente 120, aproximadamente 125, aproximadamente 130 o más sustituciones, eliminaciones o inserciones de aminoácidos.

Los métodos para dichas manipulaciones generalmente se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, pueden prepararse variantes de la secuencia de aminoácidos de una proteína delta-endotoxina por medio de mutaciones en el ADN. Esto también puede lograrse por medio de varias formas de mutagénesis y/o en evolución directa. En algunos aspectos, los cambios codificados en la secuencia de aminoácidos no afectarán considerablemente la función de la proteína. Dichas variantes poseerán la actividad pesticida deseada. Sin embargo, se comprende que la capacidad de una delta-endotoxina para conferir actividad pesticida puede mejorarse mediante el uso de dichas técnicas sobre las composiciones de la invención. Por ejemplo, se puede expresar una delta-endotoxina en las células huésped que exhiben altas tasas de incorporación errónea de base durante la replicación de ADN, tal como XL-1 Red (Stratagene). Luego de la propagación en dichas cepas, se puede aislar el ADN de delta-endotoxina (por ejemplo, preparando ADN plásmido o amplificando por PCR y clonando el fragmento de PCR resultante en un vector), cultivar las mutaciones de delta-endotoxina en una cepa no mutagénica e identificar los genes de delta-endotoxina mutados con actividad pesticida, por ejemplo realizando un ensayo para evaluar la actividad pesticida. Generalmente, la proteina se mezcla y utiliza en ensayos de alimentación. Ver, por ejemplo, Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293. Dichos ensayos pueden incluir poner en contacto plantas con una o más plagas y determinar la capacidad de la planta de sobrevivir y/o causar la muerte de las plagas. Ejemplos de mutaciones que resultan en mayor toxicidad se encuentran en Schnepf et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:775-806.

Alternativamente, pueden realizarse alteraciones a la secuencia de proteína de muchas proteínas en el extremo amino o carboxi sin afectar considerablemente la actividad. Esto puede incluir inserciones, eliminaciones o alteraciones introducidas por métodos moleculares modernos, tales como PCR, incluidas amplificaciones de PCR que alteran o extienden la secuencia codificadora proteínas en virtud de la inclusión de secuencias codificadoras de aminoácidos en los oligonucleótidos utilizados en la amplificación de PCR. Alternativamente, las secuencias de proteínas agregadas pueden incluir secuencias enteras codificadoras de proteínas, tales como aquellas utilizadas comúnmente en la técnica para generar fusiones de proteínas. Dichas proteínas de fusión se utilizan a menudo para (1) aumentar la expresión de una proteína de interés (2) introducir un dominio de unión, actividad enzimática o epítopo para facilitar ya sea la purificación de las proteínas, la detección de las proteínas u otros usos experimentales conocidos en la técnica (3) dirigir la secreción o traducción de una proteína a un organelo subcelular, tal como el espacio periplásmico de bacterias Gram-negativas o el retículo endoplásmico de células eucarióticas, el último de los cuales a menudo resulta en la glicosilacíón de la proteína.

Nucleótidos variantes y secuencias de aminoácidos de la presente invención también comprenden secuencias derivadas de procedimientos mutagénicos y recombinogénicos tales como trasposición de ADN. Con un procedimiento tal, una o más regiones codificadoras de proteínas delta-endotoxinas diferentes pueden utilizarse para crear una nueva proteína delta-endotoxína que cuenta con las propiedades deseadas. De este modo, las bibliotecas de polinucleótidos recombinantes se generan de una población de polinucleótidos de secuencias relacionadas que comprenden regiones de secuencias que tienen una identidad de secuencia importante y pueden ser homólogamente recombinadas in vitro o in vivo. Por ejemplo, utilizando este abordaje, los motivos de secuencia que codifican un dominio de interés pueden transponerse entre un gen de delta-endotoxina de la invención y otros genes de delta-endotoxina conocidos para obtener un nuevo gen codificador de una proteína con una propiedad mejorada de interés, tal como una mejor actividad insecticida. Las estrategias para dicha trasposición de ADN se conocen en la técnica. Ver, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 :10747-10751 ; Stemmer (1994) Nature 370:389-391 ; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391 :288-291 ; y las Patentes de los Estados Nos. 5,605,793 y 5,837,458.

El intercambio o trasposición de dominio es otro mecanismo para generar proteínas delta-endotoxinas alteradas. Los dominios II y III pueden intercambiarse entre proteínas delta-endotoxinas, resultando en toxinas híbridas o quiméricas con actividad pesticida mejorada o espectro objetivo. Los métodos para generar proteínas recombinantes y evaluar su actividad pesticida se conocen bien en la técnica (ver, por ejemplo, Naimov et al. (2001 ) Appl. Environ. Microbio!. 67:5328-5330; de Maagd et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:1537-1543; Ge et al. (1991 ) J. Biol. Chem. 266:17954- 17958; Schnepf et al. (1990,) J. Biol. Chem. 265:20923-20930; Rang et al. 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65:2918-2925).

Vectores Una secuencia de delta-endotoxina de la invención puede proporcionarse en un cassette de expresión para su expresión en una planta de interés. "Cassette de expresión vegetal" significa un constructo de ADN que es capaz de resultar en la expresión de una proteína de una trama de lectura abierta en una célula vegetal. Generalmente, estos contienen un promotor y una secuencia codificadora. A menudo, dichos constructos también contendrán una región 3' sin traducir. Dichos constructos pueden contener una "secuencia señal" o "secuencia líder" para facilitar el transporte co-translacional o post-translacional del péptido a determinadas estructuras intracelulares tales como el cloroplasto (u otro plástido), retículo endoplásmico o aparato de Golgi.

"Secuencia señal" significa una secuencia que se conoce o sospecha que resulta en el transporte de péptidos co-translacional o post-translacional en la membrana celular. En organismos eucariotas, esto generalmente implica la secreción en el aparato de Golgi, con un poco de glicosilación resultante. "Secuencia líder" significa cualquier secuencia que cuando se traduce, resulta en una secuencia de aminoácidos suficiente para provocar el transporte co-translacional de la cadena de péptidos a un organelo subcelular. De este modo, esto incluye secuencias líder que apuntan al transporte y/o glicosilación por pasaje hacia el retículo endoplásmico, pasaje hacia las vacuolas, plástidos incluidos cloroplastos, mitocondria y similares.

"Vector de transformación vegetal" significa una molécula de ADN que es necesaria para la transformación eficiente de una célula vegetal. Dicha molécula puede consistir en uno o más cassettes de expresión vegetal, y puede organizarse en más de una molécula de ADN de "vector". Por ejemplos, los vectores binarios son vectores de transformación vegetal que utilizan dos vectores de ADN no contiguos para codificar todas las funciones cis- y trans- para la transformación de células vegetales (Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). "Vector" se refiere a un constructo de ácido nucleico diseñado para la transferencia entre diferentes células huésped. "Vector de expresión" se refiere a un vector que tiene la capacidad de incorporar, integrar y expresar las secuencias o fragmentos de ADN heterólogos en una planta ajena. El cassette incluirá secuencias reguladoras 5' y 3' unidas operativamente a una secuencia de la invención. "Operativamente ligada" significa un enlace funcional entre una secuencia promotora y una segunda secuencia, en donde la secuencia promotora inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN que corresponde a la segunda secuencia. Generalmente, operativamente ligada significa que las secuencias de ácido nucleico ligadas son contiguas y, en caso de que sea necesario unir dos regiones codificadoras de proteínas, contiguas y en el mismo marco de lectura. El cassette puede contener adicionalmente al menos un gen adicional que debe co-transformarse en el organismo. Alternativamente, el gen adicional puede proporcionarse en múltiples cassettes de expresión.

"Promotor" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que funciona para dirigir la transcripción de una secuencia codificadora descendente. El promotor junto con otras secuencias de ácido nucleico reguladoras transcripcionales y translacionales (también denominadas "secuencias testigo") son necesarios para la expresión de una secuencia de ADN de interés.

Dicho cassette de expresión se proporciona con una pluralidad de sitios de restricción para que la inserción de la secuencia de delta-endotoxina esté bajo la regulación transcripcional de regiones reguladoras.

El cassette de expresión incluirá en la dirección 5 -3' de transcripción, una región de iniciación transcripcional y translacional (es decir, un promotor), una secuencia de ADN de la invención, y una región de terminación translacional y transcripcional (es decir, región de terminación) funcional en plantas. El promotor puede ser nativo o análogo, o ajeno o heterólogo, al huésped vegetal y/o a la secuencia de ADN de la invención. Adicionalmente, el promotor puede ser la secuencia natural o alternativamente una secuencia sintética. Cuando el promotor es "nativo" u "homólogo" al huésped vegetal, significa que el promotor se encuentra en la planta nativa en la cual se introduce el promotor. Cuando el promotor es "ajeno" o "heterólogo" a la secuencia de ADN de la invención, significa que el promotor no es el promotor nativo o natural para la secuencia de ADN operativamente ligada de la invención.

La región de terminación puede ser nativa con la región de iniciación transcripcional, puede ser nativa con la secuencia de ADN de interés operativamente ligada, puede ser nativa con el huésped vegetal, o puede derivar de otra fuente (es decir, ajena o heteróloga al promotor, la secuencia de ADN de interés, el huésped vegetal, o cualquier combinación de los mismos). Las regiones de terminación convenientes están disponibles del plásmido Ti de A. tumefaciens, tal como las regiones de terminación de sintasa de octopina y sintasa de nopalina. Ver también Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991 ) Ce// 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2: 1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91 :151-158; Bailas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; y Joshi er a/. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.

En caso de que corresponda, el gen puede optimizarse para una mayor expresión en la célula huésped transformada. Es decir, los genes pueden sintetizarse utilizando codones preferidos de células huésped para una mejor expresión, o pueden sintetizarse utilizando codones en una frecuencia de uso de codones preferidos de huésped. Generalmente, el contenido de GC del gen se aumentará. Ver, por ejemplo, Campbell y Gowri (1990) Plant Physioi. 92:1-1 1 para una descripción de un uso de codones preferido de huésped. Los métodos están disponibles en la técnica para sintetizar genes preferidos de plantas. Ver, por ejemplo, Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,380,831 , y 5,436,391 , y Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, incorporadas en la presente a modo de referencia.

En una realización, la delta-endotoxina se dirige al cloroplasto para expresión. De este modo, cuando la delta-endotoxina no se inserta directamente en el cloroplasto, el cassette de expresión contendrá adicionalmente un ácido nucleico que codifica un péptido de tránsito para dirigir a la delta-endotoxina a los cloroplastos. Dichos péptidos de tránsito se conocen en la técnica. Ver, por ejemplo, Von Heijne et al. (1991 ) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421 ; y Shah et al. (1986) Science 233:478-481.

El gen de delta-endotoxina que debe dirigirse al cloroplasto puede optimizarse para su expresión en el cloroplasto para representar las diferencias en el uso de codones entre el núcleo vegetal y este organelo. De este modo, los ácidos nucleicos de interés pueden sintetizarse utilizando codones preferidos de cloroplastos. Ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5,380,831 , incorporada en la presente a modo de referencia.

Transformación vegetal Los métodos de la invención implican introducir un constructo de nucleótido en una planta. "Introducir" significa presentar en la planta el constructo de nucleótido de forma tal que el constructo tenga acceso al interior de una célula de la planta. Los métodos de la invención no requieren que se utilice un método particular para introducir un constructo de nucleótido a una planta, solamente que el constructo de nucleótido tenga acceso al interior de al menos una célula de la planta. Los métodos para introducir constructos de nucleótidos en plantas se conocen bien en la técnica, incluidos, a modo no taxativo, métodos de transformación estable, métodos de transformación transitoria y métodos mediados por virus.

"Planta" significa plantas enteras, órganos vegetales (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), semillas, células vegetales, propágulos, embriones y progenie de los mismos. Las células vegetales pueden ser diferenciadas o no diferenciadas (por ejemplo, callo, células de cultivo de suspensión, protoplastos, células de hojas, células de semillas, células del líber, polen).

"Plantas transgénicas" o "plantas transformadas" o plantas o células o tejidos "transformados de forma estable" se refiere a plantas que han incorporado o integrado secuencias de ácido nucleico o fragmentos de ADN exógenos en la célula vegetal. Estas secuencias de ácido nucleico incluyen aquellas que son exógenas, o no están presentes en la célula vegetal sin transformar, así como también aquellas que pueden ser endógenas, o presentes en la célula vegetal sin transformar. "Heterólogas" generalmente se refiere a las secuencias de ácido nucleico que no son endógenas a la célula o parte del genoma nativo en el cual están presentes, y se han agregado a la célula por infección, transfección, microinyección, electroporación, microproyección, o similar.

La transformación de células vegetales puede lograrse mediante una de varias técnicas conocidas en la técnica. El gen de delta-endotoxina de la invención puede modificarse para obtener o mejorar la expresión en células vegetales. Generalmente, un constructo que expresa dicha proteína contendría un promotor para impulsar la transcripción del gen, así como también una región 3' sin traducir para permitir la transcripción, terminación y poliadenilación. La organización de dichos constructos se conoce bien en la técnica. En algunas instancias, puede ser útil diseñar el gen de forma tal que el péptido resultante sea secretado, o de otro modo dirigido dentro de la célula vegetal. Por ejemplo, el gen puede diseñarse para contener un péptido señal para facilitar la transferencia del péptido al retículo endoplásmico. También puede ser preferible diseñar el cassette de expresión vegetal para que contenga un intrón, de forma tal que el procesamiento de ARNm del intrón sea necesario para expresión.

Generalmente, este "cassette de expresión vegetal se insertará en un "vector de transformación vegetal". Este vector de transformación vegetal puede estar comprendido por uno o más vectores de ADN necesarios para lograr la transformación vegetal. Por ejemplo, es una práctica común en la técnica utilizar vectores de transformación vegetal que comprenden más de un segmento de ADN contiguo. A menudo se hace referencia a estos vectores en la técnica como "vectores binarios". Los vectores binarios al igual que los vectores con plásmidos auxiliares son más a menudo utilizados para la transformación mediada por Agrobacterium, donde el tamaño y la complejidad de los segmentos de ADN necesaria para lograr una transformación eficiente es bastante grande, y es ventajoso separar las funciones en moléculas de ADN separadas. Los vectores binarios generalmente contienen un vector plásmido que contiene las secuencias de actuación cis necesarias para la transferencia de T-ADN (tal como un borde izquierdo y un borde derecho), un marcador seleccionable que es diseñado para ser capaz de expresión en una célula vegetal y un "gen de interés" (un gen diseñado para ser capaz de expresión en una célula vegetal para la cual se desea la generación de plantas transgénicas. También están presentes en este vector plásmido secuencias necesarias para replicación bacteriana. Las secuencias de actuación cis están dispuestas de un modo que permite la transferencia eficiente en células vegetales y su expresión en las mismas. Por ejemplo, el gen marcador seleccionable y la delta-endotoxina están localizados entre los bordes izquierdo y derecho. A menudo, un segundo vector plásmido contiene los factores de actuación trans que median la transferencia de T-ADN de células vegetales de Agrobacterium. Este plásmido a menudo contiene las funciones de virulencia (genes Vir) que permiten la infección de células vegetales por Agrobacterium, y la transferencia de ADN por escisión en las secuencias borde y la transferencia de ADN mediada por vir, como se comprende en la técnica (Hellens y Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451 ). Pueden utilizarse varios tipos de cepas Agrobacterium (por ejemplo, LBA4404, GV3101 , EHA101 , EHA105, etc.) para transformación vegetal. El segundo vector plásmido no es necesario para transformar las plantas mediante otros métodos tales como microproyección, microinyección, electroporación, polietilenglicol, etc.

En general, los métodos de transformación vegetal implican la transferencia de ADN heterólogo en células vegetales objetivo (por ejemplo, embriones inmaduros o maduros, cultivos de suspensión, callo sin diferenciar, protoplastos, etc.), seguida de la aplicación de un nivel de umbral máximo de selección apropiada (dependiendo del gen marcador seleccionare) para recuperar las células vegetales sin transformar de un grupo de masa celular sin transformar. Los explantes generalmente se transfieren a un suministro nuevo del mismo medio y se cultivan de forma rutinaria. Posteriormente, las células transformadas se diferencian en brotes después de colocarse sobre un medio de regeneración complementado con un nivel de umbral máximo de agente de selección. Los brotes se transfieren luego a un medio de enraizamiento selectivo para recuperar el brote o plántula arraigados. La plántula transgénica crece luego hasta ser una planta madura y produce semillas fértiles (por ejemplo, Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). Los explantes generalmente se transfieren a un suministro nuevo del mismo medio y se cultivan de forma rutinaria. Una descripción general de las técnicas y métodos para generar plantas transgénicas se encuentra en Ayres y Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239 y Bommineni y Jauhar (1997) Maydica 42:107-120. Dado que el material transformado contiene muchas células; tanto las células transformadas como no transformadas están presentes en cualquier pieza de callo objetivo sometido o grupo de células. La capacidad de matar a células no transformadas y permitir que las células transformadas se proliferen resulta en cultivos vegetales transformados. A menudo, la capacidad de eliminar células no transformadas es una limitación a la rápida recuperación de células vegetales transformadas y la generación exitosa de plantas transgénicas.

Los protocolos de transformación al igual que los protocolos para introducir secuencias de nucleótidos en plantas pueden variar dependiendo del tipo de planta o célula vegetal, es decir, monocotiledóneas o dicotiledóneas, objetivo de transformación. La generación de plantas transgénicas puede realizarse por medio de uno o varios métodos, incluidos, a modo no taxativo, microinyección, electroporación, transferencia directa de genes, introducción de ADN heterólogo por Agrobacterium en células vegetales (transformación mediada por Agrobacterium), bombardeo de células vegetales con ADN foráneo heterólogo adherido a partículas, aceleración de partículas balísticas, transformación de haz en aerosol (Solicitud Publicada de los Estados Unidos No.20010026941 ; Patente de los Estados Unidos No. 4.945,050; Publicación Internacional No. WO 91/00915; Solicitud Publicada de los Estados Unidos No. 2002015066), transformación de Lec1 , y varios otros métodos directos no mediados por partículas para transferir ADN.

Los métodos para transformación de cloroplastos se conocen en la técnica. Ver, por ejemplo, Svab et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab y Maliga (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab y Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. El método depende de la administración de ADN por pistola de partículas que contiene un marcador seleccionarle y ADN dirigido al genoma plástido a través de recombinación homologa. Adicionalmente, la transformación del plástido puede lograrse por transactivación de un transgén que porta un plástido silencioso por medio de la expresión preferida de tejido de una polimerasa de ARN nuclear codificado y dirigida al plástido. Dicho sistema se ha reportado en McBride et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 :7301-7305.

Después de la integración de ADN foráneo heterólogo en células vegetales, se debe aplicar un nivel de umbral máximo de selección apropiada en el medio para matar las células sin transformar y separar y proliferar las células supuestamente transformadas que sobreviven a este tratamiento de selección mediante transferencia regular a un medio nuevo. Por el pasaje y el desafío continuos con selección apropiada, se identifican y proliferan las células que se transforman con el vector plásmido. Los métodos moleculares y bioquímicos pueden utilizarse entonces para confirmar la presencia del gen de interés heterólogo integrado en el genoma de la planta transgénica.

Las células que se han transformado pueden cultivarse en plantas de acuerdo con modos convencionales. Ver, por ejemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas pueden cultivarse entonces, y polinizarse con la misma cepa transformada o diferentes cepas, y el híbrido resultante que tiene expresión constitutiva de la característica fenotípica deseada identificada. Pueden cultivarse dos o más generaciones para asegurar que la expresión de la característica fenotípica deseada se mantenga estable y se herede y luego pueden cultivarse las semillas para asegurar que se haya logrado la expresión de la característica fenotípica deseada. De este modo, la presente invención proporciona semillas transformadas (a las que se hace referencia también como "semillas transgénicas") que tienen un constructo de nucleótido de la invención, por ejemplo, un cassette de expresión de la invención, incorporado de manera estable en su genoma.

Evaluación de la transformación vegetal Luego de la introducción de ADN foráneo heterólogo en células vegetales, la transformación o integración de gen heterólogo en el genoma vegetal se confirma mediante varios métodos tales como análisis de ácidos nucleicos, proteínas y metabolitos asociados con el gen integrado.

El análisis por PCR es un método rápido para evaluar en las células, tejido o brotes transformados la presencia de un gen incorporado en la etapa anterior a ser trasplantados al suelo (Sambrook and Russell (2001 ) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). La PCR se lleva a cabo utilizando cebadores de oligonucleótidos específicos para el gen de interés o el fondo de vector Agrobacterium, etc.

La transformación vegetal puede confirmarse mediante análisis Southern blot de ADN genómico (Sambrook and Russell, 2001 , supra). En general, el ADN total se extrae del transformante, se digiere con enzimas de restricción apropiadas, se fracciona en un gel de agarosa y se transfiere a una nitrocelulosa o membrana de nylon. La membrana o "blot" se sondea luego con, por ejemplo, un fragmento de ADN objetivo radioetiquetado 32P para confirmar la integración del gen introducido en el genoma vegetal de acuerdo con técnicas estándar (Sambrool and Russell, 2001 , supra).

En el análisis Northern blot, el ARN se aisla de tejidos específicos del transformante, se fracciona en un gel de agarosa de formaldehído y se transfiere a un filtro de nylon de acuerdo con procedimientos estándar que se utilizan de forma rutinaria en la técnica (Sambrook and Russell, 2001 , supra). La expresión de ARN codificado por la delta-endotoxina se evalúa luego hibridizando el filtro con una sonda radioactiva derivada de una delta-endotoxina, por métodos conocidos en la técnica (Sambrook and Russell, 2001 , supra).

Los ensayos Western blot, bioquímicos y similares pueden llevarse a cabo en las plantas transgénicas para confirmar la presencia de proteína codificada por el gen de delta-endotoxina por medio de procedimientos estándar (Sambrook y Russell, 2001 , supra) utilizando anticuerpos que se unen con uno o más epítopos presentes en la proteína delta-endotoxina.

Actividad pesticida en plantas En otro aspecto de la invención, se pueden generar plantas transgénicas que expresan una delta-endotoxina que tiene actividad pesticida. Los métodos descritos anteriormente a modo de ejemplo pueden utilizarse para generar plantas transgénicas, pero la forma en la que se generan las células vegetales transgénicas no es importante para la presente invención. Pueden utilizarse métodos conocidos o descritos en la técnica tales como transformación mediada por Agrobacterium, transformación biolística y métodos no mediados por partículas, a criterio del experimentador. Las plantas que expresan una delta-endotoxina pueden aislarse por los métodos comunes descritos en la técnica, por ejemplo, por medio de transformación de callo, selección de callo transformado y regeneración de plantas fértiles de dicho callo transgénico. En dicho proceso, se puede utilizar cualquier gen como marcador seleccionable en la medida en que su expresión en células vegetales confiera la capacidad para identificar o seleccionar las células transformadas.

Se han desarrollado una serie de marcadores para utilizar con células vegetales, tales como resistencia al cloranfenicol, el aminoglucósido G418, higromicina o similar. Otros genes que codifican un producto involucrado en el metabolismo de cloroplastos también pueden utilizarse como marcadores seleccionabas. Por ejemplo, genes que proporcionan resistencia a herbicidas vegetales tales como glifosato, bromoxinil o imidazolinona pueden encontrar un uso particular. Dichos genes se han reportado (Staiker et al. (1985) J. Biol. Chem. 263:6310-6314 (gen de nitrilasa con resistencia al bromoxinil); y Sathasivan et al. (1990) Nucí. Acids Res. 18:2188 (gen AHAS de resistencia a imidazolinona). Adicionalmente, los genes divulgados en la presente son útiles como marcadores para evaluar la transformación de células bacterianas o vegetales. Los métodos para detectar la presencia de un transgén en una planta, órgano vegetal (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), semilla, célula vegetal, propágulo, embrión o progenie de los mismos se conocen bien en la técnica. En una realización, la presencia del transgén se detecta evaluando la actividad pesticida.

Puede evaluarse la actividad pesticida de plantas fértiles que expresan una delta-endotoxina, y las plantas que muestran actividad óptima pueden seleccionarse para posterior reproducción. Los métodos están disponibles en la técnica para evaluar la actividad de las plagas. Generalmente, la proteína se mezcla y utiliza en ensayos de alimentación. Ver, por ejemplo, Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293.

La presente invención puede utilizarse para transformación de cualquier especie vegetal, incluidas, a modo no taxativo, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Ejemplos de plantas de interés incluyen, a modo no taxativo, maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, cruciferas, pimientos, papa, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada, y colza, Brassica sp., alfalfa, centeno, mijo, cártamo, maní, boniato, mandioca, café, coco, piña, árboles de cítricos, cacao, té, banana, palta, higo, guayaba, mango, oliva, papaya, castaña de cajú, macadamia, almendra, avenas, verduras, ornamentales y coniferas.

Las verduras incluyen, a modo no taxativo, tomates, lechuga, chauchas, habas, arvejas y miembros del género Curcumis tales como pepino, calabacín y melón de almizcle. Los ornamentales incluyen, a modo no taxativo, azalea, hortensia, hibiscos, rosas, tulipanes, narcisos, petunias, clavel, poinsettía y crisantemo. Preferiblemente, las plantas de la presente invención son plantas de cosecha (por ejemplo, maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, cruciferas, pimientos, papa, algodón, arroz, soja, remolacha, caña de azúcar, tabaco, cebada, colza, etc.).

Uso en control de plagas Los métodos generales para emplear cepas que comprenden una secuencia de nucleótidos de la presente invención, o una variante de la misma, en control pesticida o en diseño de otros organismos como agentes pesticidas se conocen en la técnica.. Ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5,039,523 y el documento EP 0480762A2.

Las cepas Bacillus que contienen una secuencia de nucleótidos de la presente invención, o una variante de la misma, o los microorganismos que se han alterado genéticamente para contener un gen y proteína pesticida pueden utilizarse para proteger de las plagas a las cosechas y productos agrícolas. En un aspecto de la invención, las células enteras, es decir, sin lisar, de un organismo que produce una toxina (pesticida) se tratan con reactivos que prolongan la actividad de la toxina producida en la célula cuando la célula se aplica al ambiente de plagas objetivo.

Alternativamente, el pesticida se produce introduciendo un gen de delta-endotoxina en un huésped celular. La expresión del gen de delta-endotoxina resulta, directa o indirectamente, en la producción intracelular y mantenimiento del pesticida. En un aspecto de la presente invención, estas células se tratan luego en condiciones que prolongan la actividad de la toxina producida en la célula cuando la célula se aplica al ambiente de las plagas objetivo. El producto resultante retiene la toxicidad de la toxina. Estos pesticidas naturalmente encapsulados pueden luego formularse de acuerdo con técnicas convencionales para la aplicación al ambiente que alberga una plaga objetivo, por ejemplo, suelo, agua y follaje de plantas. Ver, por ejemplo, el documento EPA 0192319, y las referencias citadas allí. Alternativamente, se pueden formular las células que expresan un gen de la presente invención tal como para permitir la aplicación del material resultante como un pesticida.

Composiciones pesticidas Los ingredientes activos de la presente invención normalmente se aplican en forma de composiciones y pueden aplicarse al área de la cosecha o planta a ser tratada, simultánea o sucesivamente, con otros compuestos. Estos compuestos pueden ser fertilizantes, herbicidas, citoprotectores, surfactantes, detergentes, jabones pesticidas, aceites inactivos, polímeros, y/o formulaciones de liberación prolongada o portadoras biodegradables que permiten la dosificación de larga duración a un área objetivo luego de una aplicación única de la formulación. También pueden ser herbicidas selectivos, insecticidas químicos, virucidas, microbicidas, amebicidas, pesticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, moluscocidas o mezclas de varias de estas preparaciones, si se desea, junto con otros portadores agrícolamente aceptables, surfactantes o adyuvantes promotores de aplicación empleados normalmente en la técnica de formulación. Los portadores y adyuvantes adecuados pueden ser sólidos o líquidos y corresponden a las sustancias comúnmente empleadas en tecnología de formulación, por ejemplo sustancias minerales naturales o regeneradas, disolventes, dispersantes, agentes humectantes, fijadores, aglutinantes o fertilizantes. De modo similar, las formulaciones pueden prepararse como "carnadas" comestibles o formarse como "trampas" para plagas para permitir la alimentación o ingesta por parte de una plaga objetivo de la formulación pesticida.

Los métodos de aplicación de un ingrediente activo de la presente invención o una composición agroquímica de la presente invención que contiene al menos una de las proteínas pesticidas producidas por las cepas bacterianas de la presente invención incluyen la aplicación de hojas, recubrimiento de semillas y aplicación de tierra. La cantidad de aplicaciones y la velocidad de aplicación dependen de la intensidad de la infestación por parte de la plaga correspondiente.

La composición puede formularse en forma de polvo, gragea, gránulo, spray, emulsión, coloide, solución, so similares, y puede prepararse por medios convencionales tales como desecación, liofilizacíón, homogenización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación, o concentración de un cultivo de células que comprende el polipéptido. En todas dichas composiciones que contienen al menos uno de dichos polipéptidos pesticidas, el polipéptido puede estar presente en una concentración de aproximadamente 1 % a aproximadamente 99% en peso.

Las plagas de lepidóptero, coleóptero o nemátodo pueden eliminarse o reducirse en número en un área dada por medio de los métodos de la invención, o pueden aplicarse profilácticamente a un área ambiental para evitar la infestación por una plaga susceptible. Preferiblemente la plaga ingiere, o está en contacto con, una cantidad pesticidamente efectiva del polipéptido. "Cantidad pesticidamente efectiva" significa una cantidad del pesticida que es capaz de provocarle la muerta a al menos una plaga, o de reducir notoriamente el crecimiento, alimentación o desarrollo fisiológico normal de las plagas. Esta cantidad variará dependiendo de factores como, por ejemplo, las plagas objetivo específicas que deben controlarse, el ambiente específico, la ubicación, planta, cosecha o sitio agrícola a tratar, las condiciones ambientales y el método, tasa, concentración, estabilidad y cantidad de aplicación de la composición de polipéptido pesticidamente efectiva. Las formulaciones también pueden variar con respecto a las condiciones climáticas, consideraciones ambientales y/o frecuencia de aplicación y/o severidad de la infestación con plagas.

Las composiciones pesticidas descritas pueden realizarse formulando la célula bacteriana, suspensión de cristal y/o esporas, o componente de proteína aislado con el portador agrícolamente aceptable. Las composiciones pueden formularse antes de la administración en un medio apropiado tal como liofilizado, secado por congelamiento, disecado, o en un portador acuoso, medio o diluyente adecuado, tal como salina y otra solución amortiguadora. Las composiciones formuladas pueden estar en forma de polvo o material granular, o una suspensión en aceite (vegetal o mineral), o emulsiones de agua o aceite/agua, o como un polvo humectable, o en combinación con otro material portador adecuado para aplicación agrícola. Los portadores agrícolas adecuados pueden ser sólidos o líquidos y se conocen bien en la técnica. La expresión "portador agrícolamente aceptable" cubre todos los adyuvantes, componentes inertes, dispersantes, surfactantes, fijadores, aglutinantes, etc, que se utilizan comúnmente en tecnología de formulación de pesticídas; estos son bien conocidos por los expertos en formulación de pesticídas. Las formulaciones pueden mezclarse con uno o más adyuvantes sólidos o líquidos y prepararse por varios medios, por ejemplo, por mezclado homogéneo, mezcla y/o molido de la composición pesticida con adyuvantes adecuados utilizando técnicas de formulación convencional. Las formulaciones y los métodos de aplicación adecuados se describen en la Patente de los Estados Unidos No. 6,468,523, incorporada en la presente a modo de referencia.

"Plaga" incluye, a modo no taxativo, insectos, hongos, bacterias, nemátodos, ácaros, garrapatas y similares. Las plagas de insectos incluyen insectos seleccionados de los órdenes Coleóptera, Díptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc., particularmente Coleóptera, Lepidoptera, y Díptera.

El orden Coleóptera incluye los subórdenes Adephaga y Polyphaga. El suborden Adephaga incluye las superfamilias Caraboidea y Gyrinoidea, mientras que el suborden Polyphaga incluye las superfamilias Hydrophiloidea, Staphylinoidea, Cantharoidea, Cleroidea, Elateroidea, Dascilloidea, Dryopoidea, Byrrhoidea, Cucujoidea, Meloidea, Mordelloidea, Tenebrionoidea, Bostrichoidea, Scarabaeoidea, Cerambycoidea, Chrysomeloidea, y Curculionoidea. Las superfamilia Caraboidea incluye las familias Cicindelidae, Carabidae, y Dytiscidae. La superfamilia Gyrinoidea incluye la familia Gyrinidae. La superfamilia Hydrophiloidea incluye la familia Hydrophilidae. La superfamilia Staphylinoidea incluye las familias Silphidae y Staphylinidae. La superfamilia Cantharoidea incluye las familias Cantharidae y Lampyridae. La superfamilia Cleroidea incluye las familias Cleridae y Dermestidae. La superfamilia Elateroidea incluye las familias Elateridae and Buprestidae. La superfamilia Cucujoidea incluye la familia Coccinellidae. La superfamilia Meloidea incluye la familia Meloidae. La superfamilia Tenebrionoidea incluye la familia Tenebrionidae. La superfamilia Scarabaeoidea incluye las familias Passalidae y Scarabaeidae. La superfamilia Cerambycoidea incluye la familia Cerambycidae. La superfamilia Chrysomeloidea incluye la familia Chrysomelidae. La superfamilia Curculionoidea incluye las familias Curculionidae y Scolytidae.

El orden Díptera incluye los subórdenes Nematocera, Brachycera, y Cyclorrhapha. El suborden Nematocera incluye las familias Tipulidae, Psychodidae, Culicidae, Ceratopogonidae, Chironomidae, Simuliidae, Bibionidae, y Cecidomyiidae. El suborden Brachycera incluye las familias Stratiomyidae, Tabanidae, Therevidae, Asilidae, Mydidae, Bombyliidae, y Dolichopodidae. El suborden Cyclorrhapha incluye las Divisiones Aschiza y Aschiza. La División Aschiza incluye las familias Phoridae, Syrphidae, y Conopidae. La División Aschiza incluye las Secciones Acalyptratae y Calyptratae. La sección Acalyptratae incluye las familias Otitidae, Tephritidae, Agromyzidae, y Drosophilidae. La sección Calyptratae incluye las familias Hippoboscidae, Oestridae, Tachinidae, Anthomyiidae, Muscidae, Calliphoridae, y Sarcophagidae.

El orden Lepidoptera incluye las familias Papilionidae, Pieridae, Lycaenidae, Nymphalidae, Danaidae, Satyridae, Hesperiidae, Sphingidae, Saturniidae, Geometridae, Arctiidae, Noctuidae, Lymantriidae, Sesiidae, y Tineidae.

Los nemátodos incluyen nemátodos parasíticos tales como anguilulosis de la raíz, quiste, y nemátodos de lesión, incluidos Heterodera spp., Meloidogyne spp. y Globodera spp.; particularmente miembros de los nemátodos de quistes, incluidos, a modo no taxativo, Heterodera glycines (nemátodo de quiste de soja); Heterodera schachtil (nemátodo de quiste de remolacha); Heterodera avenae (nemátodo de quiste de cereal); y Globodera rostochiensis y Globodera pailida (nemátodos de quiste de la papa). Los nemátodos de lesión incluyen Pratylenchus spp.

Las plagas de insectos de la invención para las cuatro cosechas principales incluyen: Maíz: Ostrinia nubilalis, gusano barrenador europeo del maíz; Agrotis Ípsilon, gusano cortador negro; Helicoverpa zea, gusano de la mazorca del maíz; Spodoptera frugiperda, gusano cogollero; Diatraea grandiosella, gusano barrenador del sudoeste; Elasmopalpus lignosellus, gusano barrenador del tallo del maíz; Diatraea saccharalis, gusano barrenador de la caña de azúcar; Diabrotica virgifera, gusano de la raíz occidental; Diabrotica longicornis barberi, gusano de la raíz del maíz del norte; Diabrotica undecimpunctata howardi, gusano de la raíz del maíz del sur; Melanotus spp., larvas mirípodas; Cyclocephala borealis, escarabajo roedor enmascarado del norte (larva blanca); Cyclocephala immaculata, escarabajo roedor enmascarado del sur (larva blanca); Popillia japónica, escarabajo japonés; Chaetocnema pulicaria, pulguilla del maíz; Sphenophorus maidis, gorgojo del maíz; Rhopalosiphum maidis, pulgón de hoja de maíz; Anuraphis maidiradicis, pulgón de la raíz del maíz; Blissus leucopterus leucopterus, chinche de los cereales; Melanoplus femurrubrum, langosta roja; Melanoplus sanguinipes, langosta migratoria; Hylemya platura, mosca de semillas de maíz; Agromyza parvicornis, minador del maíz; Anaphothrips obscrurus, trips del césped; Solenopsis milesta, hormiga ladrona; Tetranychus urticae, arañuela roja de dos puntos; Sorgo: Chilo partellus, gusano barrenador de sorgo; Spodoptera frugiperda, gusano cogollero; Helicoverpa zea, gusano de la mazorca del maíz; Elasmopalpus lignosellus, gusano barrenador del tallo del maíz; Feltia subterránea, gusano cortador de granulado; Phyllophaga crinita, larva blanca; Eleodes, Conoderus, y Aeolus spp., larvas mirípodas; Oulema melanopus, escarabajo de hoja de cereal; Chaetocnema pulicaria, pulguílla del maíz; Sphenophorus maidis, gorgojo del maíz; Rhopalosiphum maidis; pulgón de hoja de maíz; Sipha flava, pulgón de caña de azúcar amarillo; Blissus leucopterus leucopterus, chinche de los cereales; Contarinia sorghicola, mosquita del sorgo; Tetranychus cinnabarinus, arañuela roja carmín; Tetranychus urticae, arañuela roja de dos puntos; Trigo: Pseudaletia unipunctata, gusano soldado; Spodoptera frugiperda, gusano cogollero; Elasmopalpus lignosellus, gusano barrenador del tallo del maíz; Agrotis orthogonia, gusano cortador del oeste; Elasmopalpus lignosellus, gusano barrenador del tallo del maíz; Oulema melanopus, escarabajo de hoja de cereal; Hypera punctata, gorgojo de la hoja del trébol; Diabrotica undecimpunctata howardi, gusano de la raíz del maíz del sur; pulgón de trigo ruso; Schizaphis graminum, chinche verde; Macrosiphum avenae, pulgón de grano inglés; Melanoplus femurrubrum, langosta roja; Melanoplus differentialis, langosta diferencial; Melanoplus sanguinipes, langosta migratoria; Mayetiola destructor, mosca hessiana; Sitodiplosis mosellana, mosquita del sorgo; Meromyza americana, cresa del tallo de trigo; Hylemya coarctata, mosca del bulbo de trigo; Frankliniella fusca, trips del tabaco; Cephus cinctus, avispa del tallo de trigo; Acería tulipae, ácaro del trigo; Girasol: Suleima helianthana, polilla del brote del girasol; Homoeosoma electellum, polilla de girasol; zygogramma exclamationis, escarabajo de girasol; Bothyrus gibbosus, escarabajo de zanahoria; Neolasioptera murtfeldtiana, mosquita de la semilla de girasol; Algodón: Heliothis virescens, gusano de algodón; Helicoverpa zea, gusano bellotero; Spodoptera exigua, gusano soldado de la remolacha; Pectinophora gossypiella, gusano rosado; Anthonomus grandis, gorgojo del algodón; Aphis gossypii, pulgón del algodón; Pseudatomoscelis seriatus, pulga saltona del algodón; Trialeurodes abutilonea, mosca blanca de alas rayadas; Lygus ¡ineolaris, chinche manchador; Melanoplus femurrubrum, langosta roja; Melanoplus differentialis, langosta diferencial; Thrips tabaci, trips de la cebolla; Franklinkiella fusca, trips del tabaco; Tetranychus cinnabarinus, arañuela roja carmín; Tetranychus urticae, arañuela roja de dos puntos; Arroz: Diatraea saccharalis, gusano barrenador de la caña de azúcar; Spodoptera frugiperda, gusano cogollero; Helicoverpa zea, gusano de la mazorca del maíz; Colaspis brunnea, colaspis de la uva; Lissorhoptrus oryzophilus, gorgojo de agua de aceite; Sitophilus oryzae, gorgojo del arroz; Nephotettix nigropictus, chicharrita del arroz; Blissus leucopterus leucopterus, chinche de los cereales; Acrosternum hilare, chinche; Soja: Pseudoplusia includens, oruga de la soja; Anticarsia gemmatalis, oruga del maní; Plathypena scabra, gusano del trébol verde; Ostrinia nubilalis, gusano barrenador europeo del maíz; Agrotis ípsilon, gusano cortador negro; Spodoptera exigua, gusano soldado de la remolacha; Heliothis virescens, gusano de algodón; Helicoverpa zea, gusano bellotero; Epilachna varivestis, escarabajo mejicano del poroto; Myzus persicae, pulgón verde del durazno; Empoasca fabae, chicharrita de la papa; Acrosternum hilare, chinche; Melanoplus femurrubrum, langosta roja; Melanoplus differentialis, langosta diferencial; Hylemya platura, mosca de semillas de maíz; Sericothrips variabilis, trips de la soja; Thrips tabaci, trips de la cebolla; Tetranychus turkestani, arañuela roja de la frutilla; Tetranychus urticae, arañuela roja de dos puntos; Cebada: Ostrinia nubilalis, gusano barrenador europeo del maíz; Agrotis ípsilon, gusano cortador negro; Schizaphis graminum, chinche verde; Blissus leucopterus leucopterus, chinche de los cereales; Acrosternum hilare, chinche; Euschistus servus, chinche marrón; Delia platura, mosca de las semillas de maíz; Mayetiola destructor, mosca hessiana; Petrobia latens, ácaro marrón del trigo; Colza: Brevicoryne brassicae, pulgón del repollo; Phyllotreta cruciferae, pulguilla; Mamestra configurata, gusano soldado Bertha; Plutella xylostella, polilla dorso de diamante; Delia ssp., gusanos de raíces.

Métodos para aumentar el rendimiento vegetal Se proporcionan métodos para aumentar el rendimiento vegetal. Los métodos comprenden introducir en una planta o célula vegetal un polinucleótido que comprende una secuencia pesticida divulgada en la presente. Como se define en la presente, el "rendimiento" de la planta se refiere a la calidad y/o cantidad de biomasa producida por la planta. "Biomasa" significa cualquier producto vegetal medido. Cualquier aumento de producción de biomasa es una mejora en el rendimiento del producto vegetal medido. Aumentar el rendimiento vegetal tiene varias aplicaciones comerciales. Por ejemplo, aumentar la biomasa de las hojas de las plantas puede aumentar el rendimiento de las verduras de hojas para el consumo humano o animal. Adicionalmente, aumentar la biomasa de las hojas puede utilizarse para aumentar la producción de productos farmacéuticos o industriales derivados de plantas. Un aumento en la rentabilidad puede comprender cualquier aumento estadísticamente importante incluido, a modo no taxativo, al menos 1 % de aumento, al menos a 3% de aumento, al menos a 5% de aumento, al menos a 10% de aumento, al menos a 20% de aumento, al menos a 30%, al menos a 50%, al menos a 70%, al menos a 100% o un mayor aumento en el rendimiento en comparación con una planta que no expresa la secuencia pesticida.

En métodos específicos, el rendimiento vegetal aumenta como resultado de una mejor resistencia a plagas de una planta que expresa una proteína pesticida divulgada en la presente. La expresión de la proteína pesticida resulta en una capacidad reducida de una plaga de infestar o alimentar a la planta, mejorando así el rendimiento vegetal.

Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo ilustrativo y no a modo taxativo.

SECCIÓN EXPERIMENTAL EJEMPLO 1 Descubrimiento de genes pesticidas nuevos de Bacillus thuringiensis Se identificaron genes pesticidas nuevos de las cepas bacterianas enumeradas en la Tabla 1 utilizando las siguientes etapas: • Preparación de ADN extracromosómico de la cepa, que incluye plásmidos que generalmente albergan genes de delta-endotoxina · Fragmentación mecánica del ADN extracromosómico para generar fragmentos distribuidos por tamaño • Clonación de fragmentos de -2 Kb a -10 Kb de ADN extracromosómico • Crecimiento de - 500 clones del ADN extracromosómico · Secuenciación parcial de los 1500 clones utilizando cebadores específicos para el vector de clonación (lecturas de extremos) • Identificación de supuestos genes de toxinas por medio de análisis de homología por medio del abordaje MiDAS (como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 20040014091 , que se incorpora en la presente a modo de referencia en su totalidad) • Finalización de secuencia (paseo) de clones que contienen fragmentos de los supuestos genes de toxina de interés TABLA 1 Lista de genes nuevos aislados de Bacillus thuringiensis • 1 Co-actividad potencial cuando se expresa o se aparea con otra toxina tal como Axmi0014 o Axm¡008 • 2Co-actividad potencial cuando se expresa o se aparea con otra toxina tal como Axmi0014 o Axmi009 • 3Un dominio del extremo N homólogo al dominio catalítico C de fosfolipasa • 4Co-actividad potencial cuando se expresa o aparea con otra toxina tal como Axmi052 • 5Co-actividad potencial cuando se expresa o aparea con otra toxina tal como Axmi051 EJEMPLO 2 Descubrimiento de genes pesticidas nuevos de Bacillus thuringiensis Se identificaron genes pesticidas de las cepas enumeradas en la Tabla 2 utilizando el abordaje MiDAS como se describe en la Publicación de Patente de los Estados Unidos Novel No. 20040014091 , que se incorpora en la presente a modo de referencia en su totalidad, utilizando las siguientes etapas: • Preparación de ADN extracromosómico de la cepa. El ADN extracromosómico contiene una mezcla de algunos o todos los siguientes: plásmidos de varios tamaños, cromosomas de fago; fragmentos de ADN genómico no separados por el protocolo de purificación; otras moléculas extracromosómicas sin caracterizar.

• Fragmentación mecánica o enzimática del ADN extracromosómico para generar fragmentos distribuidos por tamaño.

• Secuenciación del ADN fragmentado • Identificación de supuestos genes de toxina por medio de homología y/o otros análisis computacionales.

• Cuando se requiere, la terminación de secuencias del gen se interés por medio de una de varias estrategias de PCR o clonación (por ejemplo, TAIL-PCR).

TABLA 2 Lista de genes nuevos aislados de Bacillus thurinqiensis Este gen es la porción del extremo N de un gen cry separado y se aparea en su contexto nativo con Axmi126, el cual representa la porción del extremo C del par cry separado. Estos genes pueden actuar como cotoxinas y pueden mostrar una actividad mejorada, nueva o alterada cuando se coexpresan o fusionan. La región interviniente entre Axmi125 y el Axmi126 descendente se indica en SEQ ID NO: 122. 2Este gen es la porción del extremo N de un gen cry separado y se aparea en su contexto nativo con Axmi125, el cual representa la porción del extremo N del par cry separado. Estos genes pueden actuar como cotoxinas y pueden mostrar una actividad mejorada, nueva o alterada cuando se coexpresan o fusionan.

EJEMPLO 3 Descubrimiento de un gen de toxina nuevo Axmi068 de la cepa Bacillus thurínpiensis ATX13046 La cepa que codifica axmi068 se identificó de la siguiente forma: • Se utilizó información de la secuencia de genes de toxina conocidos o presuntos para generar una alineación que representa secuencias de ADN conservadas y parcialmente conservadas dentro de un grupo (familia) de toxinas.

· Se utilizó información de la secuencia de genes de toxina conocidos o presuntos para generar una alineación que representa secuencias de ADN conservadas y parcialmente conservadas dentro de un grupo (familia) de toxinas.

• Se diseñaron cebadores de reacción en cadena de polimerasa (PCR) para amplificar selectivamente uno o más miembros de la familia de toxina en base a la secuencia alineada.

• Se monitoreó el ADN aislado de cepas bacterianas mediante PCR para identificar cepas que contienen supuestos homólogos a la familia de genes objetivo.

• Se secuenciaron los productos de PCR para seleccionar una cepa que contiene un gen de interés.

• La secuencia de genes completa se identificó de la cepa seleccionada por medio del abordaje de genómica de MiDAS (Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 20040014091) de la siguiente forma: • Preparación de ADN extracromosómico de la cepa. El ADN extracromosómico contiene una mezcla de algunos o todos los siguientes: plásmidos de varios tamaños, cromosomas de fago; fragmentos de ADN genómico no separados por el protocolo de purificación; otras moléculas extracromosómicas sin caracterizar.

• Clonación de los fragmentos de ADN extracromosómico en un vector plásmido.

• Crecimiento y purificación del ADN extracromosómico clonado.

• Secuenciación parcial de los clones.

• Identificación de supuestos genes de toxina por medio de homología y/o otros análisis computacionales.

• Cuando sea necesario, finalización de secuencia (paseo) de clones que contienen una secuencia de los supuestos genes de toxina de interés • La secuencia de nucleótidos para axmi068 se indica en la SEQ ID NO: 16 y la secuencia de aminoácidos para AXMI068 se indica en la SEQ ID NO:76.

Características de genes y proteínas Largo de genes, pares de bases de ADN 1.791 Largo de proteína, residuos de aminoácidos: 597 Peso molecular estimado de proteína, Da: 66.495 Homólogos conocidos e identidad porcentual aproximada:Cry1 ld1 , 71.4% EJEMPLO 4 Expresión en Bacillus El gen insecticida divulgado en la presente se amplifica por medio de PCR, y el producto de PCR se clona en un vector de expresión de Bacillus pAX916, u otro vector adecuado, por medio de métodos bien conocidos en la técnica. La cepa Bacillus resultante, que contiene el vector con el gen axmi gene se cultiva sobre un medio de crecimiento convencional, tal como medios de CYS (10 g/l de Bacto-casitona; 3 g/l de extracto de levadura; 6 g/l de KH2PO4; 14 g/l de K2HPO4; 0.5 mM de MgSO4; 0.05 mM de MnCI2; 0.05 mM de FeSO4), hasta que la esporulación sea evidente por examen microscópico. Se preparan las muestras y se evalúa su actividad en bioensayos.

EJEMPLO 5 Construcción de secuencias sintéticas En un aspecto de la invención, se generaron secuencias de axmi sintéticas. Estas secuencias sintéticas tienen una secuencia de ADN alterada con respecto a la secuencia de axmi precursora, y codifican una proteína que es colinear con la proteína AXMI precursora a la cual corresponde, pero carece del "dominio de cristal" de extremo C presente en muchas proteínas delta-endotoxinas. Los genes sintéticos se presentan en la Tabla 3.

TABLA 3 Nombre del gen tipo Nombre del gen sintético SEQ ID NO: silvestre axmi050bv01 142 axmi050 axmi050bv02 143 axmi051bv01 144 axmi051 axmi051bv02 145 axmi052bv01 146 axmi052 axmi052bv02 147 axmi053bv01 148 axmi053 axmi053bv02 149 axmi054bv01 150 axmi054 axmi054bv02 151 axmi055bv01 152 axmi055 axmi055bv02 153 axmi056bv01 154 axmi056 axmi056bv02 155 axmi059 2bv02 163 axmi058bv01 158 axmi058 axmi058bv02 159 axmi059 1bv01 160 axmi059 1bv02 161 axmi059 axmi059 2bv01 162 axmi059 2bv02 163 axmi060bv01 164 axmi060 axmi060bv02 165 axmi061bv01 166 axmi061 axmi061bv02 167 axmi067bv01 168 axmi067 axmi067bv02 169 axmi069bv01 170 axmi069 axmi069bv02 171 axmi071bv01 172 axmi071 axmi071bv02 173 axmi072bv01 174 axmi072 axmi072bv02 175 axmi073bv01 176 axmi073 axmi073bv02 177 axmi074bv01 178 axmi074 axmi074bv02 179 axmi075bv01 180 axmi075 axmi075bv02 181 axmi079bv01 182 axmi079 axmi079bv02 183 axmi080bv01 184 axmi080 axmi080bv02 185 axmi082bv01 186 axmi082 axmi082bv02 187 axmi087 1bv01 188 axmi087 1bv02 189 axmi087 axmi087 2bv01 190 axmi087 2bv02 191 axmi088bv01 192 axmi088 axm¡088bv02 193 axmi091bv01 194 axmi091 axmi091bv02 195 axmi093bv01 196 axmi093 axmi093bv02 197 axmi096bv01 198 axmi096 axmi096bv02 199 axmi097 1bv01 200 axmi097 1bv02 201 axmi097 axmi097 2bv01 202 axmi097 2bv02 203 axmi098bv01 204 axmi098 axmi098bv02 205 axmi100bv01 206 axmi100bv02 207 axmHOO optaxmi100v01 282 optaxmi100v02 283 axmi101 1bv01 208 axmi101 1bv02 209 axmi101 axmi101 2bv01 210 axmi101 2bv02 211 axmi102bv01 212 axmi102 axmi102bv02 213 axmi103bv01 214 axmi103 axmi103bv02 215 axmi104bv01 216 axmi104 axmi104bv02 217 axmil07bv01 218 axmi107 axmi107bv02 219 axmi108bv01 220 axmi108 axmi108bv02 221 axmi109bv01 222 axmi109 axmiW9bv02 223 axmi110bv01 224 axmi110 axmi110bv02 225 axmi111bv01 226 axmil 11 axmi111bv02 227 axmi112bv01 228 axmi112 axmi112bv02 229 axmi114bv01 230 axmi114 axmi114bv02 231 axmi116bv01 232 axmi116 axmi116bv02 233 axmi117bv01 234 axmil 17 axmi117bv02 235 axmi118bv01 236 axmil 18 axmi118bv02 237 axmi119bv0l 238 axmi119 axmi119bv02 239 axmi120 1bv01 240 axmi120 1bv02 241 axmi120 axmi120 2bv01 242 axmi120 2bv02 243 axmi121bv01 244 axmi121 axmi121bv02 245 axmi122bv01 246 axmi122 axmi122bv02 247 axmi123bv01 248 axmi123 axmi123bv02 249 axmi124bv01 250 axmi124 axmi124bv02 251 axmi125bv01 252 axmi125 axmi125bv02 253 En otro aspecto de la invención, se diseñan versiones modificadas de genes sintéticos de forma tal que el péptido resultante se dirija a un organelo vegetal, tal como el retículo endoplásmico o apoplasto. Las secuencias de péptidos que se conoce que resultan en la dirección de proteínas de fusión a organelos vegetales se conocen en la técnica. Por ejemplo, se conoce en la técnica que la región del extremo N del gen de fosfatasa ácida del Altramuz Blanco Lupinus albus (ID de Gen Bank Gl:14276838; Miller et al. (2001 ) Plant Physiology 127: 594-606) resulta en dirigir proteínas heterólogas al retículo endoplásmico. Si la proteína de fusión resultante también contiene una secuencia de retención endoplásmica que comprende el péptido extremo N-lisina-ácido aspártico-ácido glutámico-leucina (es decir, el motivo "KDEL" (SEQ ID NO: 123) en el extremo C, la proteína de fusión se dirigirá al retículo endoplásmico. Si la proteína de fusión carece de una secuencia dirigida al retículo endoplásmico en el extremo C, la proteína se dirigirá al retículo endoplásmico, pero en última instancia se secuestrará en el apoplasto.

EJEMPLO 6 Expresión de axmílOO en E. coli y Bacillus El ORF completo de axmi OO (de 3.45kb que codifica una proteína de 1156 aminoácidos de largo) se clonó en un vector de expresión de E. coli en base a pRSFI b (para proporcionar pAX5445) y vector de Bacillus en base a pAX916 (para proporcionar pAX5444). Los clones resultantes se confirmaron por medio de análisis de restricción y finalmente, por secuenciación completa del gen clonado.

Para expresión en E. coli, BL2TDE3 se transformó con pAX5445. La colonia única se inoculó en LB complementado con canamicina y se cultivó toda la noche a 37oC. El día siguiente, el medio nuevo se inoculó en un duplicado con 1 % de cultivo toda la noche y se cultivó a 37oC hasta la fase logarítmica. Posteriormente, los cultivos se indujeron con 1 mM de IPTG durante 3 horas a 37oC o toda la noche a 20oC. Cada granulo celular se suspendió en 50mM de solución amortiguadora de carbonato de sodio, pH 10.5 complementado con 1mM de DTT y se sónico. El análisis por medio de la expresión detectada por SDS-PAGE de una proteína de 140kD que corresponde a Axmi 100.

Para expresión en Bacillus, Bacillus thuringiensis se transformó con pAX5444 y una colonia única se cultivó en un medio de CYS-glu durante 3 días hasta la esporulación. El gránulo celular se extrajo luego con un 50mM de una solución amortiguadora de cabonato de sodio, pH 10.5 complementado con 1 mM de DTT. La fracción soluble mostró la presencia de una proteína AxmM OO de 130kD junto con varias bandas de proteína de menos peso molecular debido al procesamiento de Axmil OO. La tripsinización de Axmil OO dio 2 bandas de proteínas distintas de aproximadamente 65 kD y 55kD.

EJEMPLO 7 Bioensayo de AxmilOO Preparación de las muestras: Los extractos libres de células de células que expresan AXMI-100 se resuspendieron en general en 50mM de solución amortiguadora de carbonato de sodio, pH 10.5, generalmente con inclusión de 1 mM de DTT como un agente reductor. Las muestras con y sin tripsina se prepararon para las pruebas de bioensayo.

Presentación de la metodología de bioensayo: A las placas de cultivo de tejido de 24 pocilios (Corning) se les proporcionó 1 mi de una dieta con múltiples especies (Bio-Serv) y se dejó solidificar. Una vez solidificada, se colocaron 40 µ? de muestra de proteína sobre la superficie de la dieta de cada pocilio y se dejó empapar/secar a temperatura ambiente. Dependiendo del experimento, se colocaron en cada pocilio masas de huevos de gusano barrenador europeo del maíz, diez larvas recién nacidas o una sola larva recién nacida. Las placas se sellaron con membranas permeables al gas (Research Products International) y se incubaron a 25°C y 90% de HR. Después de cinco o siete días (dependiendo del experimento), las muestras se marcaron visualmente en comparación solo con una solución amortiguadora o testigo de extracto no transformado.

Se observó una fuerte actividad de AXMI-100 en el gusano barrenador europeo del maíz y el gusano del tabaco. Se observó la actividad en el gusano cortador negro en altas concentraciones de proteína. Se observó un poco de actividad en altas concentraciones sobre la oruga del maní, pero tanto la actividad del gusano negro como de la oruga del maní fue menos pronunciada y más variable que para otros insectos evaluados. La tripsinización de AxmM OO proporcionó 2 bandas de proteínas distintas de aproximadamente 65kD and 55kD, y aparentemente no requirió actividad de AXMI-100.

EJEMPLO 8 Ensayos adicionales de actividad pesticida La capacidad de una proteína pesticida de actuar como un pesticida sobre una plaga a menudo se evalúa de varias formas. Una forma que se conoce bien en la técnica es la realización de un ensayo de alimentación. En dicho ensayo de realización, se expone la plaga a una muestra que contiene compuestos a ser evaluados o muestras testigo. A menudo esto se lleva a cabo colocando el material a ser evaluado, o una dilución adecuada de dicho material, sobre un material que la plaga ingerirá, tal como una dieta artificial. El material a ser evaluado puede estar compuesto de un liquido, solución o suspensión. El material a ser evaluado puede colocarse sobre la superficie y luego dejarse secar. Alternativamente, el material a ser evaluado puede mezclarse con una dieta artificial fundida, y dispersarse en la cámara de ensayo. La cámara de ensayo puede ser, por ejemplo, una cubeta, un plato o un pocilio de una placa de microtitulación.

Los ensayos para plagas chupadoras (por ejemplo, pulgones) pueden implicar separar el material de prueba del insecto mediante una partición, idealmente una porción que puede ser perforada por las partes de succión de la boca del insecto chupador, para permitir la ingestión del material de prueba. A menudo, el material de prueba se mezcla con un estimulante de alimentación, tal como sacarosa, para promover la ingestión del compuesto de prueba.

Otros tipos de ensayos pueden incluir la microinyección del material de prueba en la boca o los intestinos de la plaga, así como también el desarrollo de plantas transgénicas, seguida de la evaluación de la capacidad de la plaga de alimentarse por la planta transgénica. Las pruebas vegetales pueden implicar el aislamiento de las partes de plantas normalmente consumidas, por ejemplo, pequeñas jaulas conectadas con una hoja, o aislamiento de las plantas enteras en jaulas que contienen insectos.

Otros métodos y abordajes para ensayar plagas se conocen en la técnica y pueden encontrarse, por ejemplo, en Robertson, J. L. & H. K. Preisler. 1992. Bioensayos de pesticidas con artrópodos. CRC, Boca Ratón, FL. Alternativamente, los ensayos se describen comúnmente en las publicaciones "Arthropod Management Tests" y "Journal of Economic Entomology" o mediante análisis con miembros de la Sociedad Entomológica de los Estados Unidos (ESA).

EJEMPLO 9 Bioensayo de Axm¡079 y Axmi082 Expresión y purificación de genes · Las regiones de ADN que codifican los dominios de toxinas de Axmi079 y Axmi082 se clonaron por separado en un vector de expresión de E. coli pMAL-C4x detrás del gen malE que codifica una proteína de unión de maltosa (MBP). Estas fusiones de trama entrante resultaron en la expresión de proteínas de fusión MBP-Axmi en E. coli.

• Para expresión en E. coli, BL21*DE3 se transformó con plásmidos individuales. La colonia única se inoculó en LB complementado con carbenicilina y glucosa y se cultivó toda la noche a 37°C. El día siguiente, el medio nuevo se inoculó con 1 % de cultivo toda la noche y se cultivó a 37°C hasta la fase logarítmica. Posteriormente, los cultivos se indujeron con 0.3mM de IPTG toda la noche a 20°C. Cada gránulo celular se suspendió en 20mM de solución amortiguadora de Tris-CI, pH 7.4 +200mM de NaCI+1 mM de DTT+ inhibidores de proteasa y se sónico. Los análisis por medio de SDS-PAGE confirmaron la expresión de las proteínas de fusión.

• Los extractos totales libres de células se realizaron sobre columna de amilasa conectada a FPLC para purificación por afinidad de proteínas de fusión MBP-axmi. La proteína de fusión unida se eluyó de la resina con 10mM de solución de maltosa. Las proteínas de fusión purificadas se escindieron luego con Factor Xa o tripsina para eliminar la etiqueta MBP del extremo amino de la proteína Axmi. La escisión y solubilidad de las proteínas se determinó mediante SDS-PAGE.

Bioensayos de insectos · Las proteínas escindidas se evaluaron en ensayos de insectos con testigos apropiados. Una lectura de 5 días de las placas mostró las siguientes actividades de estas proteínas.

Proteína de fusión MBP- Proteína Axmi Actividad sobre insectos Axmi escindida con Axmi079 Factor Xa, tripsina Polilla dorso de diamante Axm¡082 Factor Xa, tripsina Polilla dorso de diamante Resultados de los bioensayos de insectos adicionales: VBC = Oruga del maní DBM = Polilla dorso de diamante SWCB = Gusano barrenador del maíz del suroeste CPB = Escarabajo de la papa de Colorado ECB = Gusano barrenador europeo del maíz Hz = Helicoverpa zea Hv = Heliothis virescens * = representado como porcentaje de atrofia y mortalidad donde la atrofia se marca de acuerdo con la siguiente escala: Marca Definición 0 Sin actividad 1 Atrofia leve, no uniforme 2 Atrofia no uniforme 3 Atrofia uniforme 4 Atrofia uniforme con mortalidad (expresada como un porcentaje) 5 Atrofia uniforme con 100% de mortalidad EJEMPLO 10 Vectorización de los genes pesticidas de la invención para expresión vegetal Cada una de las regiones codificadoras de los genes de la invención está conectada independientemente con secuencias promotoras y terminadoras apropiadas para expresión en plantas. Dichas secuencias se conocen bien en la técnica y pueden incluir el promotor de actina de arroz o el promotor de ubiquitina de maíz para la expresión en monocotiledóneas, el promotor UBQ3 o el promotor CaMV 35S para expresión en dicotiledóneas y los terminadores nos o Pinll. Las técnicas para producir y confirmar los constructos promotor - gen - terminador también se conocen bien en la técnica.

EJEMPLO 11 Transformación de los genes de la invención en células vegetales por transformación mediada por Agrobacterium Se recolectaron espigas 8-12 días después de la polinización.

Los embriones se aislan de las espigas, y dichos embriones de 0.8-1.5 mm de tamaño se utilizan para transformación. Los embriones se colocan en placas con el lado del escutelo hacia arriba sobre medios de incubación adecuados, y se incubaron toda la noche a 25°C en la oscuridad. Sin embargo, no es necesario per se incubar los embriones toda la noche. Los embriones se ponen en contacto con una cepa de Agrobacterium que contiene los vectores apropiados para transferencia mediada por plásmidos Ti durante 10-15 min, y luego se colocan en placas sobre medios de co-cultivo durante 3 días (25°C en la oscuridad). Después del co-cultivo, los explantes se transfieren a los medios de período de recuperación durante cinco días (a 25°C en la oscuridad). Los explantes se incuban en medios de selección durante hasta ocho semanas, dependiendo de la naturaleza y las características de la selección particular utilizada. Después del período de selección, el callo resultante se transfiere a medios de maduración de embriones, hasta que se observa la formación de embriones somáticos maduros. Los embriones somáticos maduros resultantes se colocan luego en placas bajo una luz baja, y el proceso de regeneración se inicia como se conoce en la técnica. Los brotes resultantes se dejan arraigar sobre medios de enraizamiento, y las plantas resultantes se transfieren a recipientes para plantas de vivero y se propagan como plantas transgénicas.

EJEMPLO 12 Transformación de células de maíz con los genes pesticidas de la invención Las espigas de maíz se recolectaron 8-12 días después de la polinización. Los embriones se aislan de las espigas, y dichos embriones de 0.8-1.5 mm de tamaño se utilizan para transformación. Los embriones se colocan en placas con el lado del escutelo hacia arriba sobre medios de incubación adecuados, tales como medios DN62A5S (3.98 g/L de sales N6; 1 mL/L (de 1000x concentrado) de Vitaminas N6; 800 mg/L de L-Asparagina; 100 mg/L de Mio-inositol; 1.4 g/L de L-Prolina; 100 mg/L de Casaminoácidos; 50 g/L de sacarosa; 1 mL/L (de 1 mg/mL concentrado) 2,4-D), y se incubaron toda la noche a 25°C en la oscuridad.

Los explantes resultantes se transfieren a cuadrados de malla (30-40 por placa), se transfieren a medios osmóticos durante 30-45 minutos y luego se transfieren a una placa de irradiación (ver, por ejemplo, la Publicación PCT No. WO/0138514 y la Patente de los Estados Unidos No. 5,240,842).

Los constructos de ADN diseñados para expresar los genes de la invención en células vegetales se aceleran en tejidos vegetales utilizando un acelerador de haz en aerosol, utilizando condiciones esencialmente como las descritas en la Publicación PCT No. WO/0138514. Después de la irradiación, los embriones se incuban durante 30 min sobre medios osmóticos, y luego se colocan sobre medios de incubación toda la noche a 25°C en la oscuridad. Para evitar el daño indebido de las plantas irradiadas, se incuban durante el menos 24 horas antes de transferirse a medios de recuperación. Los embriones se distribuyen luego sobre medios de período de recuperación, durante 5 años, 25°C en la oscuridad, y luego se transfieren a un medio de selección. Los explantes se incuban en medios de selección durante hasta ocho semanas, dependiendo de la naturaleza y las características de la selección particular utilizada. Después del período de selección, el callo resultante se transfiere a medios de maduración de embriones, hasta que se observa la formación de embriones somáticos maduros. Los embriones somáticos maduros resultantes se colocan luego en placas bajo una luz baja, y el proceso de regeneración se inicia mediante métodos conocidos en la técnica. Los brotes resultantes se dejan arraigar sobre medios de enraizamiento, y las plantas resultantes se transfieren a macetas de vivero y se propagan como plantas transgénicas.

Materiales Medios DN62A5S Ajustar el pH de la solución a un pH hasta 5.8 con KOH 1 N/KCI 1 N, agregar Gelrite (Sigma) a 3g/L, y autoclave. Después de enfriar hasta 50°C, agregar 2 ml/L de una solución concentrada de 5mg/ml de Nitrato de plata (Phytotechnology Labs). La fórmula proporciona aproximadamente 20 placas.

Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas del nivel de experiencia de los expertos en la técnica a la cual se refiere esta invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan en la presente a modo de referencia con el mismo alcance que si cada publicación o solicitud de patente individual se incorporara a modo de referencia de manera específica e individual.

A pesar de que la invención anterior se ha descrito en detalle a modo de ilustración y ejemplo, a efectos de claridad de comprensión, será evidente que pueden realizarse ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: a) la secuencia de nucleótidos de cualquiera de SEQ ID NO: 1-60 y 124-132; b) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de cualquiera de SEQ ID NO.1-60 y 124-132, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad pesticida; c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO:61-121 y 133-141 ; y d) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos 90% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO:61-121 y 133-141 , en donde dicho polipéptido tiene actividad pesticida.

2. La molécula de acido nucleico aislada de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha secuencia de nucleótidos es una secuencia sintética que ha sido diseñada para expresión en una planta.

3. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 2, caracterizada además porque dicha secuencia de nucleótidos se selecciona de cualquiera de SEQ ID NO: 142-283.

4. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.

5. El vector de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque comprende también una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo.

6. Una célula huésped que contiene el vector de la reivindicación 4.

7. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque es una célula huésped bacteriana.

8. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque es una célula vegetal.

9. Una planta transgénica que comprende la célula huésped de la reivindicación 8.

10. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque dicha planta se selecciona del grupo que consiste en maíz, sorgo, trigo, repollo, girasol, tomate, cruciferas, pimientos, papa, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada y colza.

1 1. Un polipéptido aislado con actividad pesticida, seleccionado del grupo que consiste en: a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO:61-121 y 133-141 ; b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO:61-121 y 133-141 , en donde dicho polipéptido tiene actividad pesticida; c) un polipéptido que es codificado por la secuencia de nucleótidos de cualquiera de SEQ ID NO:1-60, 124-132 y 142-283; y d) un polipéptido que es codificado por una secuencia de nucleótidos que es al menos 90% idéntica a la secuencia de nucleótidos de cualquiera de SEQ ID NO: 1-60, 124-132 y 142-283, en donde dicho polipéptido tiene actividad pesticida.

12. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque comprende también secuencias de aminoácidos heterólogas.

13. Un anticuerpo que se une selectivamente con el polipéptido de la reivindicación 11.

14. Una composición que comprende el polipéptido de la reivindicación 11.

15. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque dicha composición se selecciona del grupo que consiste en un polvo, gragea, gránulo, spray, emulsión, coloide y solución.

16. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque dicha composición se prepara por medio de desecación, liofilización, homogenización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación o concentración de un cultivo de células de Bacillus thuringiensis.

17. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque comprende de aproximadamente 1% a aproximadamente 99% en peso de dicho polipéptido.

18. Un método para controlar una población de plagas de lepidópteros o coleópteros que comprende poner en contacto dicha población con una cantidad pesticidamente efectiva del polipéptido de la reivindicación 1 1.

19. Un método para matar una plaga de lepidópteros o coleópteros que comprende poner en contacto o alimentar dicha plaga con una cantidad pesticidamente efectiva del polipéptido de la reivindicación 1 1.

20. Un método para producir un polipéptido con actividad pesticida que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 6 en condiciones en las cuales se expresa la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido.

21. Una planta que ha incorporado establemente en su genoma un constructor de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene actividad pesticida, en donde dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en: a) la secuencia de nucleótidos de cualquiera de SEQ ID NO: 1-60, 124-132 y 142-283; b) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de cualquiera de SEQ ID NO: 1 -60 y 124-132 y 142-283, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad pesticida; c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO:61-121 y 133-141; y d) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos 90% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO:61-121 y 133-141 , en donde dicho polipéptido tiene actividad pesticida; en donde dicha secuencia de nucleótidos está operativamente unida a un promotor que impulsa la expresión de una secuencia codificadora en una célula vegetal.

22. La planta de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizada además porque dicha planta es una célula vegetal.

23. Una semilla transgénica de la planta de la reivindicación 22.

24. Un método para proteger una planta de una plaga que comprende introducir en dicha planta o célula de la misma al menos un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido pesticida, en donde dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en: a) la secuencia de nucleótidos de cualquiera de SEQ ID ??. -60, 124-132 y 142-283; b) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de cualquiera de SEQ ID NO:1-60 y 124-132 y 142-283, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad pesticida; c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO:61-121 y 133-141 ; y d) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos 90% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO:61-121 y 133-141 , en donde dicho polipéptido tiene actividad pesticida.

25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque dicha planta produce un polipéptido pesticida que tiene actividad pesticida contra una plaga de lepidópteros o coleópteros.