MX2010013100A - Composiciones y metodos que comprenden proteasas microbianas variantes. - Google Patents

Abstract

La presente invención provee subtilisinas variantes y composiciones que comprenden por lo menos una subtilisina variante expuesta aquí, así como métodos para usar estas variantes y composiciones. En algunas modalidades, la presente invención provee proteasas variantes adecuadas para aplicaciones de limpieza para lavandería.

Description

OSICIONES Y METODOS QUE COMPRENDEN PROTEASAS MICR VARIANTES Campo de la Invención La presente invención provee subtilisinas v mposiciones que comprende por lo menos una sub nte expuesta en la presente, así como métodos p variantes y composiciones.

Antecedentes de la Invención Las serina proteasas son un subgrupo de c lasas que comprenden una clase diversa de enz n una amplia gama de especificidades y f gicas . Se ha conducido mucha investigación s ilisinas, debido en gran medida a su util caciones de limpieza y alimento para animales.

Breve Descripción de la Invención La presente invención provee subtilisinas v posiciones que comprenden por lo menos una sub nte expuesta en la presente, así como métodos p variantes y composiciones. En particular, la ción provee proteasas variantes adecuada aciones de limpieza de ropa.

La presente invención provee subtilisina v omprenden por lo menos una modificación, en dond una modificación se selecciona de G100C, S101D , M124G, L126G, S132H, S161N, Q275Z, y/o por lo t nto de modificaciones seleccionado /L096V/G097S/A098D/D099I, A001V/G097S/A098 /A098D/D099G, V004M/D099R/G100S/Z /G127C/G128S/P129R, V004M/M119 I/A098G/D099R, V008I/A098N, V008I/M119 /Z128.01G/Z128.02G, G020D/G097R/A098 /P129Z/S130G/G131R/S132C, N025Y/S101 /G097R/A098S, S033I/T066G/H067R/V068 /A098R/D099S, V044I/G097C/A098 /G097R/A098R, V044I/G100 /G097C/A098R/D099S, A048V/G097L/A098 /G100R/S101G, A048V/G128S/P129L/Z129. OIG, M050 /S130I/S132G, S053T/D099H/S101Z , E054D/A098 I/S101R/Q103R, T055S/T066I/Z066. OIG/Z /D099S/S101G, Q059H/M119S/D120R, Q059K/ 119 /P129G, . N061D/G128R/P129V/Z /G097D/A098R/D099S, G065R/Z101.01R/Z /H067S7 V068C/A069G, V068C/A069G/H238Q, V068 /A069G/V150I, V068G/A069S, V068I/A069 I/G097D/A098G/D099Z/G100R, V068L/A069G, V068 /A069G, V068S/A069G/A116T, A069G/T071G, A069 /S101G, A088T/S130R/G131 /G100Z/S101C/Q103R, A088V/P129Z, A092 /V093C, A092G/V093I, A092G/V093L, A092L/V093 /K094V, A092S/V093C, A092S/V093G, A092 /V093L, V093I/G128D/P129R, V093 /Z093.01G/K094R, K094E/V095D , K094 I/N118R/M119C/D120G/A151V, Z096.01 .01H/A098G, Z096.01N/A098H, Z096.01 .01R/A098G, Z096.01R/A098G/V19 1 , Z096.01 .01R/A098R/V192A, ?096.01R/A098S, ?096. 01R/A098 .01R/Z096.02G, Z096.01R/Z096.02G/V147I , Z096. OI .01S/A098N, G097C/A098D/D099S, GO 97C/A098 C/A098G/D099N, GO 97C/A098 C/A098G/D099S/G100Z, GO 97C/A098 C/A098N/D099S, G097C/A098R, GO 97C/A098 C/A098R/D099H, G097C/A098R/D099H, GO 97C/A098 /A098G/D099Z/A151V, G097H/A098G/D099 /A098G/D099Z/G100V, G097H/A098G/D099Z/S101 /A098R, G097H/A098R/D099G, G097H/A098 /A098R/D099N, G097H/A098S/D0 9G, G097H/A098 /A098S/D099L, G097H/A098S/D099 /A098C/D099S, G097L/A098 /A098G/D099S/G100Z, G097L/A098G/D099Z , G097 /A098R/D099N, G097L/A098V, G097N/A098 /A098G/D099R, G097N/A098G/D099 /A098G/D099S, G097N/A098 /A098G/D099V/A151V, G097N/A098G/D099 /A098H/D099N, G097N/A098R/D0 9R, G097N/A098 /A098R/D099V, G097N/A098S/D099S , G097 /A098C/D099S, G097R/A098F/A200V, G097 /A098G/D099C, G097R/A098 /A098G/D099G/A273T, G097R/A098 /Z097.01S/A098R, G097S/A098C, G097S/A098 /A098C/D099H, G097S/A098C/D099L, G097S/A098 /A098C/D099S, G097S/A098C/D099Z , G097S/A098 /A098G/D099G, G097S/A098G/D099G, G097S/A098 /A098G/D099Z, G097S/A098G/D099 /A098H/D099C, G097S/A098H/D099G, G097S/A098 /A098R, G097S/A098R/D099C, G097S/A098 /A098R/D099L, G097S/A098R/D099V, G097S/A098 /A098S/D099G, G097S/A098S/D099G/A133V/A153 /A098S/D099G/A153V, G097S/A098 /Z097.01D/A098G/A144T/Q271H, G097S/Z097.01 /Z097.01S/A098G, G097S/Z097.01S/A098 /Z097. OIY, G097V/A098R, G097V/A098 /A098S/D099S, G097Y/A098H/D099N, G097Z/A098 01D/A098R/D099G, Z097.01D/A098 01D/A098V/D099G, Z097. OIG, Z097. OI /D099G/S101P, A098G/D099G/T244S , A098 /D099H, A098G/D099L, A098G/D099R, A098G/D099 /D099R/G100D, A098G/D099R/V148I , A098 /D099S/L267M, A098G/D099V, A098G/D099Z, ?098 /D099G, A098H/D099G/A216T, A098H/D099 /D099G/G100N/L267M, A098H/D099 /D099G/V143I, A098H/D099R, A098H/D099 /D099S/G100C, A098H/D099S/G100N, A098 /D099G, A098I/D099S, A098L/D099G, ?098 /D099G, A098N/D099L, A098N/D099S, A098 R/A274V, A098R/D099C, A098R/D099G, A098R/D099 R/D099G/G100D, A098R/D099G/G100 R/D099G/G100N, A098R/D099G/G100R, A098R/D099 R/D099G/V150I , A098R/D099H, A098R/D099I , A098 R/D099N, A098R/D099N/G100L, A098 R/D099R/G100D, A098R/D099R/S101Z , A0 8R/D099 /D099V, A098T/P129Z/S130R/S132G, A098 /D099G, A098V/D099G/G100D, A098V/D0 9G/G100 /D099G/G100S, A098Y/D09 /D099R/G100Z/S101Z/G102D, A098Z/S101R, Z OIR, Z098. OIR/GIOOR, D099C/K136N, D099 /S101R, D099C/S101Z, D099C/Z09 . OIS , D099C/Z /S101Z, D099G/G100C, D099G/G100D/S101R, D099 /GIOOR/SIOIV, D0 G/G100S/S101R, D099 /S101H, D099G/S101V, D099G/S101Z, D099G/S101 /Z099. OIN, D099G/Z099. OIR/GIOOS, D099G/Z /ZIOO.OIG, D099G/Z100.01G/S183N/Q275K, D099 /S101Z/V150I, D09 H/Z100. OI /?100. OIG/ZIOO .02G, D099I/Z099. OIS, D099 /S101G, D099L/S101V, D099L/Z100. OIG, D0991 /GIOOR/SIOIV, D099N/S101G, D099N/S101H, D099 /Z099.01S, D099N/Z100. OIG, D099R/S101D, D099 /L267R/I268V, G100R/S101G, G10OR/S101G/G16O /S101G/Q103Z/Y104Z/S161N, GIOOR/SIOI /S101N,. GIOOR/SIOIR, G100R/S101R/Q103 /S101Z/G102C/Q103D, GIOOS/SIOIC, GIOO /S101R, GIOOS/SIOIR, GIOOS/SIOIV, GIOOS/SIOI OIG, ZIOO.OIL, ZIOO.OIN, ZIOO.OIR, Z100.01 /Q103I, S101C/Q103S, S101D/Q103C, S101 /Q103F, S101D/Q103H, S101D/Q103H, S101 /Q103R/H238Y, S101D/Q103S, S101D/Q103V, S101 /A151V, S101G/A179V, S101G/G102S, S101 /Q103L, S101G/Q103N, S101G/Q103R, S101G/Q103 /Q103R/G157D, S101G/Q103S, S101G/Q103 /Q103S/L233S, S101G/Q245H, S101G/S249N, S101 /Z101. OIR, S101G/Z101.01R/A200T, S101G/Z /G102S, S101H/Q103D, S101H/Q103G, S101H/Q103 /Q103H, S101H/Q103I, SlOl /Q103N, S101R/Q103R, S101R/Q103 /Q103R/V148I, S101R/Q103S, S101R/Q103 /Q103V, S101V/Q103G, S101V/Q103H, S101V/Q103N/Z /Q103R, S101V/Q103V, S101Y/G102S/Q103R, S101 /Q103S, S101Y/Q103V, S101Z/G102I/Q103H/Y104 /G102V/Q103R/Y104L, S101Z/Q103D, S101 /Q103L, S101Z/Q103R, G102C/Q103 /Q103C/Y104C/V192I, G102R/Q103 /Q103R/Z103.01G, G102Z/Q103S, Z102.01 01G/Q103R/L267V, Z102.01G/Z102.02R/Z /Y104N/Q275Z, Q103N/E156D, Q103R/I122L/N123 /Y104F, Q103Y/S182N, S105G/P129S/S130 /A116D/N117S/N118C, N109S/ 119C/D120 /N117Z/N118R/M119C; A116H/N117 /N118G/M119S, · N117C/N118G/M119 /N118G/ 119C, N117G/N118R/M119C, N117H/N118 /N118H/M119V, N117S/N118R/M119V, N117V/N118 /N118H/M119C, N117Y/N118G/M119S, N117Y/N118 01G/N118R/M119C, N118C/M119 /Z118.01G/M119C, N118D/M119C/D120L, N118D/M119 /M119C/D120G, N118G/M119C/D120L, N118G/M119 / 119N, N118G/M119S/D120G, N118G/M119 /M119V/D120G, N118G/M119V/D120 /M119C/D120R, N118H/M119I/D120G, N118H/M119 /M119S/D120G, N118H/M119V/D120G, N118 /M119C/D120G, N118R/M119C/D120R, N118 /M119S/D120G, N118R/M119S/D120R, N118R/M119 /M119V/D120C, N118R/M119 /M119V/D120G/A232T, N118S/M119C/D120R# /D120G/V121I, M119C/D120G/V121L, M119 /D120H/A187V, M119C/D120R, M119H/V121I , /D120G, M119I/D120R, M119L/D120G, 119 /I122S/N123I , V121I/I122V/N123S, V121L/I122 /N123C, I122C/N123C, I122C/N123 /N123V/ 124L, I122G/N123C/M124L , I122G/N123G/Z /N123V/ 124LI122S/N123S, I122V/N123G/M124 /N123S/M124I, I122V/S183G, N123C/M124S , N123 /M124L, N123S/M124S, M124C/L126S , M124C/L126 /L126V, M124I/L126H, L126F/P129Z, L126F/P129 I/P129Z, L126R/G127R, Z126.01S, G127C/G128 /P129G, G127C/P129G/A200T, G127 /P129R/A153T, G127D/P129G, G127D/P129S, G127 /P129R/ G127L/P129R, G127N/P129C, G127 /P129G/A133T, G127N/P129G/A151V/K213N, G127 /P129S/A273V, G127N/P129V, G127R/A230V, G127 /P129D/L217S/ G127R/P129G, G127R/P129R, G127 /P129D, G127S/P129F, G127S/P129G, G127S/P129 S/P129G/I175T, G127S/P129R, G127S/P129S, G127 /P129R/Z129.01G, G128H/P129R/Z /P129S/Z12 . OIG, G128H/P129S/Z /P129S/Z129.01R/S248N, G128 /Z128.01R/P129D, G128H/Z128. OI /Z128.01R/P129S/A144T, G128H/Z P129R/Z129. OIG, G128N/P12 R/Z /P129S/Z129. OID, G128N/Z128.01R/P129S, G128 /P129H/Z129. OIG, G128R/P129L/Z13 O . OIS , G128 /P129R/Z129. OIG, G128R/P129R/Z129. OI /P129S, G128R/P129S/Z129. OIG, 128R/P129Z/S13 O /Z128.01R/P129D, G128R/Z128.01R/P129F, G128 /P129C/ 129. OIR, G128S/P129D, G128S/P129 /P129D/T244N, G128S/P129G, G128S/P129 /P129H/Z129. OIR, G128S/P129 /P129R/Z129. OIG, G128S/P129S/Z /P129S/Z12 . OIR, G128S/P129V, G128Y/P129R/Z /Z130.01D/Z130.02S, P129R/G131 /S130D/S132Z, P12 R/S130N/G131Z , P129 /S132Z, P129R/Z129.01G, P12 R/Z129.01G/Z /Z129.01G/Z129.02G/A144T, P129R/Z129.01G/Z129.02 /Z12 .01G/Z129.02R, P129R/Z /Z129.01R/Z129.02G, P129S/G131ZP129S/S13 O /Z129.01C, P129S/Z129.01R/Z /Z130.01N/Z130.02S, P129V/S132Z, /G131R/S132C, P129Z/S130G, P129Z/S130G/G131 /S130G/G131V, P129Z/S130H, P129Z/S130 /S130H/S132N, P129Z/S130L, P129 /S130R/G131C, P129Z/S130 /S130R/G131D/S132C, P129Z/S130R/G131 /S130R/G131H/S132D, P129Z/S130R/G131 /S130R/L267M, P129Z/S130R/S132C, P129Z/S130 Z/S130V/S132G, P129Z/S130Z/G131 /G131H/S132C, S130V/S132N, S130 /G131H/S132C, S130Y/S132G, S130Z/G131 /S132L/W241R, G131N/S132C, G131S/S132G, G131Y/ /G211V en donde las posiciones corresponden iones de subtilisina BP ' de SEQ ID NO : 2.

La presente invención también provee vari ilisina que comprenden por lo menos un conj ficaciones, en donde el conjunto de modificac cciona de: V072G/G097A/G128A/Y217Q, G097A/G128 /G128S/P129D/Y217Q, G097A/G128A/A134 /L126A/Y217Q, G097A/G128A/P129D/Y217 /G128A/P129D/Y217Q, G097A/G128S/P129V/A134 /G128S/P129V/Y217Q, V068I/G097A/G128S/P129 /S101D/G128S/S204F/Y217Q/S236F/T254P, /S101D/G128S/Y217Q, G097A/G128A/P129 /S101D/G128A/Y217Q, G097A/S101D/G128S/P129 /Z099.01S/G128S/P129D/Y217Q, /G100S/G128S/P129D/Y217Q, .01D/G097A/A098R/G128A/Y217Q, /Z099.01S/I122S/N123G/G128A/Y217Q, /Z099.01S/I122S/N123G/G128A/Y217Q/T220A/A232T, /G097A/Z099.01S/S101D/G128A/Y217Q, /S101D/G128A/P129V/Y217Q, /K094S/V095C/L096S/G097A/G128A/Y217Q, /G100S/S101D/G128A/Y217Q/A232P, .01D/G097A/A098R/S101D/G128A/Y217Q, /Z099.01S/G100S/G128A/Y217Q, en donde las po sponden a las posiciones de subtilisina BP ' d La presente invención además provee vari ilisina que comprenden por lo menos un conj ficaciones, en donde el conjunto de modificac /G128S/P129L/Y217Q, G097A/P129 /P129W/Y217Q, G097A/P129Z/S130 /G128H/P129R/Y217Q, G097A/G128H/P129 /P129G/Y217Q, G097A/G128N/P129 /G128H/Y217Q, G097A/G128S/P129 /P129Z/Y217Q, G097A/G128N/Z128.01A/P129 /G128N/Y217Q, G097A/G128A/P129 /G128T/P129N/Y217Q, G097A/G128H/P129 /G128M/P129R/Y217Q, G097A/G128Q/P129 /G128T/P129Q/Y217Q, G097A/G128T/P129 /G128T/P129R/Y217Q, G097A/G128D/P129 /G128T/P129T/Y217Q, G097A/G128T/P129 /G128Z/P129Z/Y217Q, G097A/G128S/Z128.01A/P129J /G128N/P129M/Y217Q, G097A/G128N/P129 /G128E/P129K/Y217Q, G097A/G128N/Z128.01A/P129 /G128C/P129R/Y217Q, G097A/G128T/P129 /G128C/P129H/Y217Q, G097A/G128T/Z128.01?/?129 /G128C/Z128.01A/P129A/Y217Q, /G128S/Z128.01A/P129I/Y217Q, /G128S/Z128.01A/P129E/Y217Q/Q271H, /G128S/Z128.01A/P129L/Y217Q, /G128Y/Z128.01A/P129S/Y217Q, /G128S/Z128.01A/P129M/R186H/Y217Q, /G128E/Z128.01A/P129D/Y217Q, G097A/G128T/P129 /G128F/P129D/Y217Q, G097A/G128V/Z128.01A/P129 /G128L/Z128.01A/P129S/Y217Q, G097A/G128Y/P129 /G128C/P129Y/Y217Q, G097A/G128C/P1 9T/Y217Q# e posiciones corresponden a las posiciones de sub de SEQ ID NO : 2.

La presente invención también provee vari ilisina que comprenden por lo menos un conj ficaciones, en donde el conjunto de modificac /Z098.01S/M124V/L126A/Y217Q, A073V/Z098.01S/N123 /Z098.01S/G128A/Y217Q, I011L/Z098.01S/G128 /Z096.01D/A098R/N123G/Y217Q, Z098.01S/N123G/A138 98.01S/N123G/Y217Q, en donde las posiciones corr posiciones de subtilisina BPN 1 de SEQ ID NO : 2.

La presente invención también provee vari lisina que comprenden la substitución Y217L y ad íenos un conjunto de cualquiera de los conju icación provistos anteriormente, en donde las po sponden a las posiciones de subtilisina BPN' d La presente invención además provee varía lisina que comprenden las substi G128A/Y217Q y que comprenden además por lo m icación de cualquiera de los conjuntos de modifi stos en la presente , en donde las po sponden a las posiciones de subtilisina BPN' d n detergente para vajillas. En algunas mod onales, las composiciones de limpieza comprende o más enzimas o derivados de enzima adi cionados del grupo que consiste de hemice idasas, proteasas, celulasas, xilanasas, lipasas, esterasas, cutinasas, pectinasas, quera tasas, oxidasas, fenol oxidasas, lipoxi nasas, pululanasas, tanasas, pentosanasas, malan nasas, arabinosidasas , hialuronidasa , condro a y amilasas, o mezclas de las mismas. En idades adicionales, las composiciones de enden además por lo menos un agente estabiliz as modalidades adicionales, las composici ieza comprenden por lo menos 0.0001 por ciento en lo menos una de cualquiera de las varía ilisina provistas en la presente, y opcionalmente lisina provista en la presente/ así como compo ocesamiento de alimentos que comprenden por lo m nte de subtilisina provista en la presente.

Breve Descripción de las Figuras La figura 1 muestra un diagrama que ilustra e para crear supresiones e inserciones en marco y se talle en las figuras 1A-1C. La biblioteca- se dis 33% de los clones con substituciones; 33% de lo nserciones y 33% de los clones con supresiones.

La figura 2A es un mapa de plásmido de pA elementos de plásmido son como sigue: pUBHO = F DN del plásmido pUBl 10 (McKenzie et al, Plasmi

[1986] , pBR322 = Fragmento de ADN del plásmid ivar et al, Gene 2:95-113

[1977]), pC194 = Fragi del plásmido pC194 (Horinouchi y Weisblum, J. B posiciones que comprenden por lo menos una var lisina expuesta en la presente, así como méto estas variantes y composiciones. La modificació asas precursoras de la invención para produci lisinas variantes incluye por lo menos una subst lo menos una supresión, o por lo menos una inser as modalidades, la modificación compren nación de mutaciones. Por ejemplo, en idades, la modificación incluye una combinación enos una substitución y por lo menos una supre as otras modalidades, la modificación incl nación de por lo menos una substitución y por inserción. En algunas modalidades adiciona icación incluye una combinación de por lo me sión y por lo menos una inserción. En otras mod ionales, la modificación incluye una combinació ecombinación. Los métodos comúnmente usados posiciones de ADN (véase, Stemmer, Proc Nati 25:10747-51

[1994]), métodos basados en recombin oga de genes (v.gr. ITCHY) (Ostermeier et al, Bi . 7:2139-44

[1999]), SCRACHY (Lutz et al. Proc N USA. 98:11248-53

[2001]), SHIPREC (Sieber et chnol., 19:456-60

[2001]), y NRR (Bittker et chnol., 20:1024-9

[2001]; Bittker et al, Proc N USA. 101 :7011- 6

[2004]), y métodos que se bas e oligonucleótidos para insertar mutaciones alea idas, supresiones y/o inserciones (Ness et chnol. 20: 1251-5

[2002]; Coco et al, Nat Biot 46-50

[2002]; Zha et al, Chembiochem. 3:34-9 r et al, J Immunol . , 149:3903-13

[1992], S le, Proc Nati Acad Sci USA 89:3581-5

[1992], Nucleic Acids Res., 32:el58

[2004], Osuna et al, rchik et al, Prot . Eng. Des. Select, 20:257-265 lgunas modalidades, se provee una ventaja adici la enzima de restricción usada en la- present a de su secuencia de reconocimiento, lo que pe tión de prácticamente cualquier secuencia de nuc ita la formación de una cicatrización de s icción. Primero, como se describe en la presente se presenta naturalmente que codifica la prot tud completa se obtiene y es secuenciado y esc uno o más puntos en los cuales se desea ha ión (supresión, inserción, substitución I nación de los mismos) en uno o más aminoáci ión del gen para cambiar su secuencia para confo ecuencia deseada se logra por extensión del ce do con métodos generalmente conocidos. Los frag zquierda y a la derecha del punto (s) desead nucleótidos pueden ser sintetizados para tener de restricción, y no se necesitan enl ticos para crear los sitios de restricción rido por algunos otros métodos.

Composiciones La presente invención provee proteasas va mpos iciones que comprenden por lo menos una ilisinas variantes expuestas aquí. En lidades, la presente invención provee medi ucir proteasa con varias aplicaciones comerci e se desea la degradación o síntesis de polip incluyen composiciones de limpieza, as onentes de alimento para animales, procesami iles, acabado de pieles, procesamiento de esamiento de carne, procesamiento de al Composiciones de limpieza La composición de limpieza de la presente i tiliza ventajosamente por ejemplo en aplicaci dería. De hecho, debido a las ventajas ún ividad incrementada en soluciones de temperat , las enzimas de la presente invención están id adas para aplicaciones de lavandería. Adem as de la presente invención se pueden utilizar siciones granuladas como líquidas.

Las proteasas variantes de la presente i én encuentran uso en productos aditivos de limp as modalidades, encuentran uso en aplicaciones de lucion a temperatura baja. El producto aditivo pu u forma más simple, una o más proteasas. En idades, el aditivo está empacado en forma de do on a un proceso de limpieza. Cualquier forma ulo adecuados para composiciones líquidas incluy limitan a, agua o alcoholes primarios y secund molecular bajo que incluyen polioles y dioles. Eje alcoholes incluyen, pero no se limitan a, metanol, nol, e isopropanol. En algunas modalidade siciones contienen de aproximadamente 5% a aproxim de esos materiales. Los llenadores ácidos se u ir el pH. Alternativamente, el aditivo de limpieza dientes auxiliares como se describe en forma más delante .

Las composiciones de limpieza y adit ieza de la presente requieren una cantidad efe lo menos una de las variantes de proteasa provist S o en combinación con otras proteasas y/o ionales. El nivel requerido de enzima se logra dición de una o más variantes de proteasa de la ciones de limpieza acuosas, el agua de lavado t aproximadamente 5.0 a aproximadamente 11.5 o in imadamente 7.5 a aproximadamente 10.5. Las formu oducto líquido son típicamente formuladas para eto de aproximadamente 3.0 a aproximadamente so de aproximadamente 3 a aproximadamente ctos de lavandería granulados son típicamente fo tener un pH de aproximadamente 9 a aproximadam técnicas para controlar el pH a niveles endados incluyen el uso de reguladores de pH, s, etc., y son bien conocidos por los experto ca .

Las composiciones de limpieza de pH bajo a amente tienen un pH neto de aproximadamen imadamente 5, y son típicamente libres de oactivos que hidrolizan en ese ambiente de lo menos una enzima estable al ácido. En idades, las composiciones son líquidas mientras modalidades, son sólidas. El pH de las compo das se mide típicamente como un pH neto. El pH siciones sólidas se mide como una solución con os de la composición en donde el solvente lada. En estas modalidades, todas las medicione rnan a 20°C.

En algunas modalidades, cuando la(s) pro nte(s) se utiliza (n) en una composición gran da, es deseable que la proteasa variante esté na partícula encapsulada para proteger la nte de otros componentes de la composición g te el almacenamiento. Además, la encapsula en un medio para controlar la disponibilida asa variante durante el proceso de limpieza. En ial encapsulador tiene una temperatura de trans o (Tv) de 0°C o más alta. La temperatura de tr idrio se describe con más detalle en WO 97/11 ial encapsulador se selecciona de aquel que con hidratos, gomas naturales o sintéticas, sán, celulosa y derivados de celulosa, si tos, boratos, alcohol polivinílico, polietile de parafina y combinaciones de los mismos. C ial encapsulador es un carbohidrato, típicam ciona de monosacáridos , oligosacáridos , polisac naciones de los mismos. Típicamente el sulador es un almidón. Los almidones adecú iben en EP 0922499; US 4,977,252; US 5,354,5 ,826. En algunas modalidades, el material enca a microesfera hecha de plástico tal como termopl lonitrilo, metaacrilonitrilo, poliacrilo as bajo varios estreses ambientales. Las p ntes de la presente invención proveen ventaja s enzimas actualmente usadas , debido a su ad varias condiciones.

De hecho, hay una variedad de condiciones d incluyen formulaciones detergentes variables, v agua de lavado, temperaturas de agua de l tudes de tiempo de lavado, a las cuales se exp asas involucradas en el lavado. Ademá laciones detergentes usadas en diferentes áficas tienen diferentes concentraciones nentes pertinentes presentes en el agua de lav lo, un detergente europeo típicamente imadamente 4500-5000 ppm de componentes deterg agua de lavado, mientras que un detergente amenté tiene aproximadamente 667 ppm de com n aproximadamente 667 ppm de componentes dét ntes en el agua de lavado.

Una concentración de detergente media gentes en donde entre aproximadamente 800 imadamente 2000 ppm de componentes detergente ntes en el agua de lavado. Los dét americanos generalmente se considera que son sis ntración de detergente media ya que imadamente 975 ppm de componentes detergentes p el agua de lavado. Brasil típicamente imadamente 1500 ppm de componentes detergentes p agua de lavado.

Un sistema de concentración de detergen ye detergentes en donde más de aproximadamente omponentes detergentes están presentes en el o. Los detergentes europeos generalmente se c onó antes, Brasil típicamente tiene aproximadame de componentes detergentes en el agua de lava go, otras geografías con detergente con mejo gencia de fosfato de alta espumación, no lim países de Latinoamérica, pueden tener sist ntración de detergente alta de hasta aproxim ppm de componentes detergentes presentes en el o.

A la luz de lo anterior, es evide ntraciones de composiciones detergentes en soluc o típicas en todo el mundo varían de m imadamente 800 ppm de composición de grafías de concentración de detergente bajas lo aproximadamente 667 ppm en Japón, a imadamente 800 ppm a aproximadamente 20 ografías de concentración de detergente medias en de aproximadamente 64.4 L de solución de lav guiente, a fin de obtener una concentrae imadamente 975 ppm de detergente dentro de la avado aproximadamente 62.79 g de composición de ebe al medir a 64.4 L de solución de lavad dad es la cantidad típica medida en el agua d el consumidor mediante el uso de la tasa sta con el detergente.

Como un ejemplo adicional, diferentes ge diferentes temperaturas de lavado. La tempera de lavado en Japón es típicamente menos que en Europa. Por ejemplo, la temperatura del o en Norte América y Japón es típicamente ent (v.gr., aproximadamente 20°C) , mientras ratura del agua de lavado en Europa es típicamen 60°C (v.gr., aproximadamente 40°C) . ual a gramos por litro) de minerales de dureza.

La dureza del agua en Europa es típicamen 179.55 (por ejemplo 179.55-342) gramos por 1 g2+ mixto (v.gr. , aproximadamente 256.5 gramos p a2+Mg2+ mixto) . La dureza del agua en Norte Am amente mayor que la dureza del agua japonesa, pe la dureza del agua eµropea. Por ejemplo, la du en Norte América puede ser entre 51.3 y 171 -136.8 granos o aproximadamente 102.6 granos. L comparables en desempeño de lavado con otras sub asas. En algunas modalidades, las proteasas vari presente invención presentan rendimientos de mentados en comparación con subtilisina p cialmente disponibles en la actualidad. Por lo t as modalidades preferidas de la presente invenc asas variantes provistas aquí presentan est tiva incrementada, estabilidad térmica incremen ilidad a quelatadores incrementada. Ademá asas variantes de la presente invención encuen omposiciones de limpieza que no incluyen dete rnente ya sea solas o en combinación con mejora rgencia y estabilizadores.

En algunas modalidades de la presente i composiciones de limpieza comprenden por lo m easa variante de la presente invención a un imadamente 0.005% a aproximadamente 0.5% en pes sición y el resto de la composición de limpieza imadamente 99.9999% a aproximadamente imadamente 99.999% a aproximadamente imadamente 99.995% a aproximadamente 99.5% en p ende materiales auxiliares de limpieza.

En algunas modalidades, las composici eza preferidas comprenden una o más enzimas adi rivados de enzimas que proveen desempeño de lim ficios de cuidado de telas, además de una o más asas variantes provistas en la presente. Esas yen, pero no se limitan a otras proteasas, asas, amilasas, celulasas, peroxidasas, oxidasas sas) , y/o mananasas.

Cualquier otra proteasa adecuada encuentra composiciones de la presente invención. Las p lisina, lentus, amyloliquefacients, sub berg, subtilisina 309, subtilisina 147 y sub Ejemplos adicionales incluyen aquellas p tes descritas en las patentes de E.U.A. Nos. RE ,340, 5,700,676, 6,312,936, y 6,482,628, to s se incorporan aquí por referencia. Ejem asas adicionales incluyen, pero no se limitan a . , de origen porcino o bovino) , y proteasa de ita en WO 89/06270. Las enzimas proteasa comerc nibles preferidas incluyen MAXATASE® , EM™, OPTICLEAN®, OPTIMASE®, PROPERASE®, PURA ECT® OXP (Genencor) ; ALCALASE®, SAVINASE®, P YM™, RELASE® y ESPERASE® (Novozymes) ; y BLAP™ nditgesellschaft auf Aktien, Duesseldorf, A s proteasas se describen en 095/23221, WO 92/ patentes de E.U.A. Nos 5,801,039, 5,340,735, 5, . , EP 238 023), lipasa de Candida, tales como l tárctica (v.gr., la C. antárctica lipasa A o B . , EP 214761) , lipasa de Pseudomonas tal como l lcaligenes y P. pseudoalcaligenes (véase, v. 2), lipasa de P. cepacia (véase, v.gr., EP a de P. stutzeri (véase, v.gr., GB1 , 372 , 034) , l escens, lipasa de Bacillus (v.gr., lipasa de B. ois et al., Biochem. Biophys. Acta 1131 ] ) ; lipasa de B. stearothermophilus [véase, /744992] ; y lipasa de B . pumilus [véase, /16422] ) .

Además, un número de lipasas clonadas en en algunas modalidades de la presente invenc yen pero no se limitan a lipasa de Pe Tubertii (véase, Yamaguchi et al., Gene 103:61-67 a de Geotricum candidum (véase, Schimada et 367) , y la cutinasa derivada de Fusarium so e, WO 90/09446) .

Lipasas adecuadas adicionales incluyen cialmente disponibles tales como MI LIPASE™, LUM IPOMAX™ (Genencor) ; LIPOLASE® y LIPOLASE® zymes) ; y LIPASE P™ "Amano" (Amano Pharmaceut , Japón) .

En algunas modalidades de la presente composiciones de limpieza de la presente invenció enden lipasas a un nivel de aproximadamente 0. imadamente 10% de lipasa adicional en peso sición y el resto de materiales auxiliares de so de la composición. En otros aspectos de la in composiciones de limpieza de la presente i ién comprenden lipasa a un nivel de aproxim 01% a aproximadamente 10%, - aproximadamente 0 ntran uso en la presente invención incluyen, pe an a, a-amilasas obtenidas de B. lichenifor i , GB 1 , 296 , 839) . Las amilasas comercialmente dis ncuentran uso en la presente invención incluyen, limitan a DURA YL®, TERMAMYL®, FU GAMYL® zymes) y RAPIDASE® y MAXAMYL® P (Genencor) .

En algunas modalidades de la presente in composiciones de limpieza de la presente i enden además amilasas a un nivel de aproxim 01% a aproximadamente 10% de amilasa adicional a composición y el resto de materiales auxil eza en peso de la composición. En otros aspect nte invención, las composiciones de limpieza nte invención también comprenden amilasas a un imadamente 0.0001% a aproximadamente imadamente 0.001% a aproximadamente 5%, aproxim e v.gr., patente de E.U.A. No. 4,435,307). Las c ialmente adecuadas son las celulasas que icios de cuidado de color (véase v.gr. , EP 0 4 celulasas comercialmente disponibles que encuen a presente invención incluyen, pero no se li ZYME® (Novozymes) , y KAC-500(B)™ (Kao Corporat as modalidades, las celulasas se incorpor ones o fragmentos de celulasas de tipo silvestre riantes, en donde una porción del N-terminal es e v.gr., patente de E.U.A. No. 5,874,276). En idades, las composiciones de limpieza de la ción además comprenden celulasas a un n imadamente 0.00001% a aproximadamente 10% de onal en peso de la composición y el resto de ma iares de limpieza en peso de la composición. tos de la presente invención, las composici imitan a, aquellas de origen bacteriano o tes químicamente o genéticamente modificados se lgunas modalidades. Varias mananasas son conoc s encuentran en la presente invención (véase te de E.U.A. No. 6,566,114, patente de E.U 2,842, y patente de E.U.A. No. 6,440,991, to es se incorporan aquí por referencia) . En lidades, las composiciones de limpieza de la ción además comprenden mananasas a un n imadamente 0.00001% a aproximadamente 10% de ional en peso de la composición y el resto ríales auxiliares de limpieza en peso de la comp tros aspectos de la presente invención, las compo limpieza de la presente invención también co asas a un nivel de aproximadamente 0.0 imadamente 10%, aproximadamente 0.001% a aproxim ión" (es decir, para evitar la transferencia ante textil de una tela teñida a otra tela cu son lavadas juntas en una solución de riblemente junto con un agente incrementador , WO 94/12621 y WO 95/01426). Las peroxidasas/ adas incluyen, pero no se limitan a, aquellas d al, bacteriano o fúngico. Mutantes química icamente modificados se incluyen en algunas moda lgunas modalidades, las composiciones de limpiez nte invención además comprenden enzimas de pe oxidasa a un nivel de aproximadamente 0.0 imadamente 10% de peroxidasa y/u oxidasa adic de la composición y el resto de materiales auxil eza en peso de la composición. En otros aspect nte invención, las composiciones de limpieza nte invención también comprenden enzimas peroxi as anteriormente mencionadas son abarcadas nte, en particular una o más proteasa, amilasa, asa, y/o por lo menos una celulasa adiciona , se contempla que varias mezclas de estas trarán uso en la presente invención. Tam mpla que los niveles variables de las p ntes y una o más enzimas adicionales pueden endientemente a aproximadamente 10%, el rest sición de limpieza es materiales auxiliares de l elección específica de materiales auxiliares de ace fácilmente al considerar la superficie, pr que ha de ser limpiada, y la forma desead sición para las condiciones de limpieza durant ., a través del uso de detergente de lavado) .

Ejemplos de materiales auxiliares de yen, pero no se limitan a, agentes tensio cidas, funguicidas, motas de colores, cuidad , agentes antiherrumbre y/o anticorrosión, fue inidad, agentes solubilizantes , vehículos, auxil samiento, pigmentos y agentes de control de p patentes de E.U.A. Nos. 6,610,642, 6, ,464, 5,710,115, 5,698,504, 5,695,679, 5,68 ,101, todas las cuales se incorporan a encia) . Modalidades de materiales de composi eza específicos se ilustran con detalle más adel idades en las cuales los materiales auxili ieza no son compatibles con las proteasas variant nte invención en las composiciones de limpieza, san métodos adecuados para mantener los ma liares de limpieza y las proteasas separadas (e n contacto unas con otras) hasta que la combin dos componentes es apropiada. Esos métodos de se na lavadora, las composiciones de la presente i riblemente contienen por lo menos un agente tens r lo menos un compuesto mej orador de detergenc uno o más materiales auxiliares de riblemente seleccionados de compuestos pol icos, agentes blanqueadores, enzimas adic sores de espumas, dispersantes, dispersantes , agentes de suspensión de suciedad y antirrede suciedad e inhibidores de corrosión. En dades, las composiciones para lavandería enen agentes suavizantes (es decir, ma iares de limpieza adicionales) . Las composicion nte invención también encuentran uso en p vos detergentes en forma sólida o líquid ctos aditivos están diseñados para complemen zar el desempeño de las composiciones dét . No. 6,605,458 encuentran uso con las p ntes de la presente invención. Por lo tanto, en idades, las composiciones que comprenden por 1 proteasa variante de la presente invención sición de limpieza de telas granulada compacta, i en otras modalidades, la composición es una com impieza de telas granulada útil en el lavado de , en modalidades adicionales, la composición sición de limpieza de telas granulada que izado a través de la capacidad de lavado, en mod ionales, la composición es una composición de lim S líquida de trabajo pesado. En algunas modalida siciones que comprenden por lo menos una nte de la presente invención son composici ieza de telas tales como aquellas descritas tes de E.U.A. Nos. 6,610,642 y 6,376,450. Ade ,645, 5,565,422, 5,516,448, 5,489,392, y 5, las cuales se incorporan aquí por referencia. C una composición de limpieza de pH bajo, el p sición se ajusta mediante la adición de un mate monoetañolamina o un material ácido tal como HCl .

Aunque no es esencial para los propósito nte invención, el listado no limitante de au rados de aquí en adelante es adecuado para usars siciones de limpieza de la presente invenc as modalidades, estos auxiliares son incorpora lo, para ayudar o incrementar el desempeño de l tratamiento del sustrato que ha de ser limpiad icar la estética de la composición de limpieza so con perfumes, colorantes, tintes o similar der que los auxiliares son además de las p ntes de la presente invención. La naturaleza pr zadores de blanqueo, peróxido de hidrógeno, f ido de hidrógeno, perácidos preformados , age rsión polimérica, agentes de remoción/anti-rede suciedad de arcilla, abrillantadores, supres a, colorantes, perfumes, agentes de elastic ctura, suavizantes de telas, vehículos, hidr liares de procesamiento y/o pigmentos. Además íente descripción, ejemplos adecuados de otros au eles de uso se encuentran en las patentes de E.U 6,282, 6,306,812, y 6,326,348, que se incorpo rencia. Los ingredientes auxiliares antes men n constituir el resto de la composición de lim resente invención.

En algunas modalidades, las composici ieza de conformidad con la presente invención co gente tensioactivo o sistema de agente tensioa tergencia. Los mej oradores de detergencia incluy e limitan a, las sales de metal alcalino, a olamonio de polifosfatos , silicatos de metal a natos de metal alcalino térreo y alcalino, mej detergencia de alúminosilicato, compuest arboxilato. Eter hidroxipolicarboxilatos , copolí rido maleico con etileno o éter vinilmetílico -trihidroxibencen-2 , 4 , 6 -trisulfónico, y ximetiloxisuccínico, las varias sales de metal a o y amonio sustituido de ácidos poliacético ta etilendiaminotetraacético y ácido nitrilotri como policarboxilatos tales como ácido melític nico, ácido cítrico, ácido oxidisuccínico, aleico, ácido bencen-1 , 3 , 5-tricarboxílico, ximetiloxisuccínico y sales solubles de los mism En algunas modalidades adicionales ácido politereftálico, arcillas tales como ca orillonita, atapulgita, ilita, bentonita, halo as de las mismas.

En algunas modalidades adicionales siciones de limpieza de la presente invención yen uno o más agentes inhibidores de transier ante . Los agentes inhibidores de transiere ante poliméricos adecuados incluyen, pero no se olímeros de polivinilpirrolidona , polímeros N- mina, copolímeros de N-vinilpirrolidona limidazol, poliviniloxazolidonas y polivinilimid las de los mismos.

En algunas modalidades adicionales osiciones de limpieza de la presente invención ienen dispersantes. Los materiales orgánicos sol adecuados incluyen los ácidos homo- o co-polim asas, pectinasas, queratinasas , reductasas, o oxidasas, lipoxigenasas , ligninasas, pulu as, pentosanasas, malanasas, ß-glu nosidasas, hialuronidasa, condroitinasa, la sas, o mezclas de las mismas. Una combinación t óctel de enzimas aplicables convencionales que lo menos una proteasa, por lo menos una lipasa, una cutinasa, y/o por lo menos una celulasa j o menos una amilasa.

En algunas modalidades adicionales, las s en las composiciones de limpieza son estabiliz uier técnica adecuada. En algunas modalidad as utilizadas aquí son estabilizadas por la pres es solubles en agua de iones de calcio y/o mag composiciones acabadas que proveen esos iones as . ? secuestrante que tiene constantes de est idas para los cationes de metal catalít iares, particularmente ácido etilendiaminotetra etilendiaminotetra (metilenfosfónico) y sales ua de los mismos. Esos catalizadores se describ te de E.U.A. No. 4,430,243.

En algunas modalidades, las composicione nte invención son catalizadas por medio de un c anganeso. Esos compuestos y niveles de uso s idos en la técnica en incluyen, por ejemp izadores a base de manganeso descritos en la pa . No. 5,576,282. Además, catalizadores de bla ito útiles en la presente son conocidos y se de ejemplo, en las patentes de E.U.A. Nos. 5,59 5,967. Esos catalizadores de cobalto se lmente por procedimientos conocidos, tales como riblemente proveerá de aproximadamente 0.005 imadamente 25 ppm, muy preferiblemen imadamente 0.05 ppm a aproximadamente 10 ppm, riblemente aún de aproximadamente 0.1 imadamente 5 ppm, del MRL en la solución de lav ies de transición preferidos en el cataliz ueo de metal de transición de la presente neso, hiero y cromo. MRLs preferidos en la pres po especial de ligando ultra-rígido que es cr te tal como 5 , 12 -dietil-1 azabiciclo [6.6.2] hexadecano . Los MRLs de m sición adecuados son fácilmente preparad edimientos conocidos, tales como aquellos enseñ lo en WO 00/332601, y la patente de E.U.A. No .6 , Como se indicó anteriormente, las composic ieza de la presente invención se formulan en c on del lugar se pone en contacto con una modalid nte composición de limpieza, en forma neta o di solución de lavado, y después el lugar es opció o y/o enjuagado. Para propósitos de la ción, "lavado" incluyen pero no se limitan a fro n mecánica. En algunas modalidades, las composic eza típicamente se utilizan a concentraci imadamente 500 ppm a aproximadamente 15,000 ión. Cuando el solvente de lavado es a ratura de lavado típicamente varía de aproxim a aproximadamente 90 °C y, cuando el lugar compr , la relación en masa de agua a tela es típica imadamente 1:1 a aproximadamente 30:1.

Definiciones A menos que se indique otra cosa, la prácti itudes, artículos y publicaciones mencionadas nte, tanto anteriormente como posteriormente, so expresamente incorporados aquí por referencia.

A menos que se defina e otra manera en la p los términos técnicos y científicos usados aqu ismo significado que es comúnmente entendido to en la técnica al cual está dirigida esta in en varios diccionarios disponibles y conocidos tos en la técnica para proveer definiciones inos. Aunque cualesquiera métodos o materiales s ivalentes a aquellos descritos aquí encuentran u ica de la presente invención, los métodos y ma ridos se describen en la presente. Por consiguie inos definidos inmediatamente a continuación letamente descritos por referencia a la especi un todo. También, como se usa en la prese ivos descritos, ya que esos pueden variar, S xto en que sean usados por los expertos en la té La práctica de la presenté invención uti que se indique otra cosa, técnicas convenció icación de proteína, biología molecular, microb eas de ADN recombinante y secuenciación de pr las cuales están dentro del alcance de los exp mpo .

Además, los encabezados provistos aquí aciones de varios aspectos o modalidades de la i se pueden tener por referencia a la especificac todo. Por consiguiente, los términos d iatamente a continuación son definidos en fo eta por referencia a la especificación como un t go, a fin de facilitar el entendimiento de la mero de términos se definen a continuación. idad de la proteasa respectiva para hidrol ato comercial. Sustratos ilustrativos útiles sis de actividad de proteasa o proteolítica i no se limitan a di-metil caseína (Sigma eno de bovino (Sigma C-9879) , elastina de bovin 5) , y queratina de bovino (ICN Biomedical as colorimétricas que utilizan estos sustratos idas en la técnica (véase v.gr. , WO 99/34011; y .U.A. No. 6,376,450, ambas de las cuales se in por referencia) . La prueba de pNA (véase v.gr., l . , Anal. Biochem. , 99:316-320

[1979]) también e en la determinación de la concentración de enzim fracciones recolectadas durante la eluc ientes. Esta prueba mide la velocidad a la anilina es liberada a medida que la enzima hidr ato sintético soluble, succinil-alanina-alanina- nocido por los expertos en la técnica, que incl limitan a B. subtilis, B. licheniformis, B. le s, B. stearothermophilus, B. alkalophil liquefaciens, B. clausii, B. halodurans, B. meg oagulansf B. circulans, B. lautus y B. thuringie ocido que el género Bacillus continú anización taxonómica. Por lo tanto, se - pretend o incluya especies que han sido reclasificad yen pero no se limitan a organismos tales ofchermophilus, que es ahora nombrado "Geo othermophilus" . La producción de endosporas B resencia de oxígeno se considera la caract itoria del género Bacillus, aunque esta caract ién se aplica a los recién nombrados Alicyclob lbacillus, Aneurinibacillus, Anoxib ibacillus, Filobacillus, Gracilibacillus, Halob a y pirimidina, u otras bases de nucleótidos na camente, biológicamente modificadas, no natu adas . Los siguientes son ejemplos no limita ucleótidos: genes, fragmentos de gen, fr sómicos, ESTs, exones , intrones, ARNm, ARN imas, ADNc, polinucleótidos recomb ucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN ualquier secuencia, ARN aislados de cualquier se s de ácido nucleico y cebadores. En algunas moda polinucleótidos comprenden nucleótidos modificad nucleótidos metilados y análogos de nucl ilo, otros azúcares y grupos enlazadores tal oribosa y tioato, y ramificaciones de nucleó lidades alternativas, la secuencia de nucleót rumpida por componentes que no son nucleótidos.

Como se usa en la presente, los ntos adicionales tales como elementos de control tores, etc.). El constructo de ADN ademá ender un marcador seleccionable . Además puede co secuencia de entrada flanqueada por cajas de ho na modalidad adicional, el ADN transformante c S secuencias no homologas, añadidas a los r. , secuencias de relleno o flancos) . En lidades, los extremos de la secuencia de entra ados de tal manera que el ADN transformante lo cerrado. Las secuencias transformantes puede silvestre, mutantes o modificadas. En lidades, el constructo de ADN comprende se logas al cromosoma de la célula hospedera. En lidades, el constructo de ADN comprende secue logas. Una vez que el constructo de ADN es ensam o se puede usar para: 1) insertar secuencias het ificados que permiten transcripción de un ácido cular en una célula objetivo. El cásete de e binante se puede incorporar en un plásmido, er itocondrial, ADN de plástido, virus o fragmento ico. Típicamente, la porción de cásete de e binante del vector de expresión incluye, entr ncías, una secuencia de ácido nucleico que ha crita y un promotor. En modalidades preferid res de expresión tienen la capacidad para inco sar fragmentos de ADN heterólogos en una dera. Muchos vectores de expresión procarió ióticos están comercialmente disponibles. La s vectores de expresión apropiados está den imiento de los expertos en la técnica. El "c sión" se usa intercambiablemente aquí con "co DN" , y sus equivalentes gramaticales. La sele asa (v.gr., proteasa precursora o madura) q blemente enlazada a una prosecuencia adecuada tora, etc.) capaz de efectuar la expresión de A dero adecuado.

Como se usa en la presente, el término "p efiere a un constructo de ADN de doble cade lar como un vector de clonación, y que forma un ico auto-replicable extracromosómico en iotas o procariotas, o se integra en el cromo dero .

Como se usa en la presente en el cont ducir una secuencia de ácido nucleico en una cé no "introducido" se refiere a cualquier método transferir la secuencia de ácido nucleico en la métodos de introducción incluyen pero no se l n de protoplastos , transfección, transfo o es colocado en una relación funcional c ncia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN que íder secretor (es decir, un péptido de señal bléntente enlazado a ADN para un polipéptido sado como una preproteína que participa en la s polipéptido; un promotor o incrementado blemente enlazado a una secuencia codificante s ranscripción de la secuencia; o un sitio de soma está operablemente enlazado a una s ficante si está colocado para facilitar la tra aímente, "operablemente enlazado" significa ncias de ADN que están enlazadas son contiguas de un líder secretor, contiguas y en fase de embargo, los incrementadores no tienen que ser co nlace se logra mediante ligación en los si ricción convenientes. Si esos sitios no exist ren a un par de genes de especies diferente mente relacionadas, que corresponden unas a otr idénticas o muy similares unas a otras. El términ que son separados por especiación (es de rollo de nuevas especies) (v.gr. , genes ortólog genes que han sido separados por duplicación ., genes parálogos) .

Como se usa en la presente, "ortólogo" logos" se refieren a genes en diferentes especies cionado a partir de un gen ancestral común (es d homólogo) por especiación. Típicamente, los o nen la misma función durante el curso de la ev dentificación de ortólogos encuentra uso en la pr iable de la función del gen en genomas recie nciados .

Como se usa en la presente, "parálogo" Como se usa en la presente, las prote en como que tienen un "doblez" común si tie s estructuras secundarias principales en l sición y con las mismas conexiones topo entes proteínas con el mismo doblez a menudo ntos periféricos de estructura secundaria y reg a que difieren en el tamaño y conformación. En , estas regiones periféricas diferentes ender la mitad de la estructura. Las proteínas c s en la misma categoría de doblez no necesa n un origen evolutivo común (v.gr. , sim cturales que se producen a partir de la física y as proteínas que favorecen ciertas disposici ue y topologías de cadena) .

Como se usa en la presente, "homología" se militud o identidad de secuencia, de las cu Como se usa en la presente, una "secuencia a en donde la función del gen es esencialmente gen el basado en la subtilisina proteasa stre. Además, genes análogos incluyen por l imadamente 45%, aproximadamente 50%, aproxim aproximadamente 60%, aproximadamente imadamente 70%, aproximadamente 75%, aproxim aproximadamente 85%, aproximadamente imadamente 95%, aproximadamente 97%, aproxim aproximadamente 99%, o aproximadamente 100% de i ecuencia con la secuencia de la subtilisina pro silvestre. Alternativamente, secuencias análoga alineación de entre aproximadamente 70 a aproxim de los genes encontrados en la región de sub asa de B. amyloliquefaciens. En modalidades adic de una de las propiedades anteriores se apli aciones en pares progresivas. También puede gra que muestre las relaciones de agrupación usa la alineación. PILEUP usa una simplificación de lineación progresivo de Feng y Doolittle ttle, J. Mol. Evol., 35:351-360

[1987]) . El m ar al descrito por Higgins y Sharp (Higgins S 5:151-153

[1989]) . Los parámetros de PILEUP út yen un peso de espacio por omisión de 3.00, un tud de espacio por omisión de 0.10, y espacios rados .

Otro ejemplo de un algoritmo útil es el a , descrito por Altschul et al., (Altschul et Biol., 215:403-410,

[1990] ; y Karlin et al., Pro I Sci. USA 90:5873-5787

[1993]) . Un programa cularmente útil es el programa WU-BLAST-2 hul et al., Meth. Enzymol . , 266:460-480 [1996 n ser ajustados para incrementar la sensibili de % de identidad de secuencia de aminoác mina por el número de residuos idénticos coin ido entre el número total de residuos de la s larga" en la región alineada. La secuencia "má na que tiene los residuos más reales en la ada (espacios introducidos por WU-Blast-2 para ximo la puntuación alineada son ignorados) .

Por lo tanto, "por ciento (%) de ident ncia de ácido nucleico" se define como el porce úos de nucleótido en una secuencia candidata icos con el residuos de nucleótido de la secu o (es decir, la secuencia de interés) . Un rido utiliza el módulo de BLASTN de WU-BLAST-2 parámetros por omisión, con el alcance de trasl ión de traslape fijados a 1 y 0.125, respectivam soluto como resultado de intervención humana del mbinación" "recombinar" y generación de u ico "recombinado" son generalmente el ensamble fragmentos de ácido nucleico en donde el ens n a un gen quimérico.

En algunas modalidades preferidas, secue utante son generadas con la mutagénesis de satur en por lo menos un codón. En otra modalidad pr tagénesxs de saturación de sitio es realizada pa codones. En una modalidad adicional, las secue mutante tienen más de aproximadamente 50%, imadamente 55%, más de aproximadamente 60%, imadamente 65%, más de aproximadamente 70%, imadamente 75%, más de aproximadamente 80%, imadamente 85%, más de aproximadamente 90%, imadamente 95%, o más de aproximadamente oporcionadamente replicadas de tal manera que ficado se hace presente en un número de copia ue estaba inicialmente presente en el genoma . En idades, la selección de células por crecimi ncía de un fármaco (v.gr., un inhibidor de un ible) da por resultado la amplificación ya sea d eno que codifica el producto de gen requeri r en presencia de fármaco o por amplifica ncías exógenos (es decir, de entrada) que codifi cto de gen, o ambos.

"Amplificación" es un caso especial de rep eído nucleico que implica especificidad de plant e contrastar con replicación de plantilla no es decir, replicación que es dependiente de la ap no dependiente de una plantilla específi cificidad de plantilla aquí se distingue de fide re a un oligonucleótido, ya sea que ocurra natu en una digestión por restricción purificada o p ticamente, que sea capaz de actuar como un p o de síntesis cuando se coloca bajo condiciones s la síntesis del producto de extensión del ceb omplementario a la cadena de ácido nucleico es decir, en presencia de nucleótidos y un agente como ADN polimerasa y a una temperatura y pH ade ebador es preferiblemente de cadena sencilla par iencia en amplificación, pero alternativamente p ble cadena. Si es de doble cadena, el cebador pr para separar sus cadenas antes de usarse para ctos de extensión. Preferiblemente, el cebado desoxirribonucleótido . El cebador deb cientemente largo para cebar la síntesis de prod sión en presencia del agente inductor. Las lo a. Las sondas son útiles en la detección, identi islamiento de secuencias de genes particula mpla que cualquier sonda usada en la presente i marcada con cualquier "molécula reportera" , de detectable en cualquier sistema de detecci ye, pero no se limitan a enzima (v.gr. , ELISA, as histoquímicas basadas en enzimas) , escentes, radioactivos y luminiscentes. No se la presente invención esté limitada a algún s eta de detección particular.

Como se usa en la presente, el término "ob o se usa en referencia a la reacción en ca erasa, se refiere a la región de ácido nuclei los cebadores usados para reacción en ca erasa. Por lo tanto, se busca que el "objet ribuido desde otras secuencias de ácido nucle ivo consiste de introducir un gran exceso ores de oligonucleótidos a la mezcla de AND que ecuencia objetivo deseada, seguido por una s sa de ciclación térmica en presencia de AND pol dos cebadores son complementarios a sus ctivas de la secuencia objetivo de doble cade uar la amplificación, a mezcla es desnaturaliza ores son después alineados a sus se lementarias dentro de la molécula objetivo. Despu ación, los cebadores son extendidos con una po formar un nuevo par de cadenas complementari de desnaturalización, alineación de cebador y e olimerasa se pueden repetir muchas veces (es turalización, alineación y extensión constit 1o"; puede haber numerosos "ciclos") para obt concentración de un segmento amplificado de la s que son "amplificados por PCR" .

Como se usa en la presente, el término "r amplificación" se refiere a aquellos r osfatos de desoxirribonucleótido, reguladores , necesarios para amplificación excepto para ce illa de ácido nucleico y la enzima de amplif amente, los reactivos de amplificación junto c nentes de reacción son colocados y contenido iente de reacción (tubo de ensayo, micropozos, e Como se usa en la presente, el término "RT re a la replicación y amplificación de secue En este método, la transcripción inversa es ac muy frecuentemente mediante el uso de procedim a en el cual se utiliza una polimerasa termo se describe en la patente de E.U.A. No. 5, pora aquí por referencia. En RT-PCR, la plantill Un "sitio de restricción" se refiere ncia de nucleótidos reconocida y digerida cleasa de restricción y es frecuentemente el si nserción de fragmentos de ADN. En ciertas moda itios de restricción de la invención están genét ulados en el marcador selectivo y en extremos onstructo de ADN.

"Recombinación homologa" significa el int ragmentos de ADN entre dos moléculas de ADN o er dos en el sitio de secuencias de nucleótidos idé idénticas. En -una modalidad preferida, la int sómica es recombinación homologa.

Como se usa en la presente "aminoácido" se cuencias de péptido o proteína o porciones de las términos "proteína", "péptido" y "polipéptido" rcambiablemente . do de señal (es decir, una extensión amino-ter proteína que ha de ser secretada) . Casi to ínas secretadas usan una extensión de proteína nal que juega un papel crucial en la orientación locación de proteínas precursoras a través ana. La extensión es proteolíticamente removida dasa de señal durante o inmediatamente des ferencia de membrana.

Se dice que un polinucleótido "codifica" u lipéptido si, en su estado nativo o cuando es ma étodos conocidos por los expertos en la técnic transcrito y/o traducido para producir el éptido o fragmento del mismo. La cadena anti-se cido nucleico se dice que codifica las secuenci noce en la técnica, un ADN puede ser transcrito polimerasa para producir ARN, pero un ARN pu silvestre correspondiente.

Los términos proteína" y "polipéptido" cambiablemente en la presente. El código de 3 aminoácidos como se define de conformidad clatura IUPAC-IUB Joint Commission on Bio clature (JCBN) se usa a lo largo de esta desc entender que un polipéptido puede ser codificado a secuencia de nucleótidos debido a la degenera o genético.

Una "prosecuencia" es una secuencia de ami la secuencia de señal y proteasa madura aria para la secreción de la proteasa. La dige osecuencia da por resultado una proteasa activa El término wsecuencia de señal" o wpép " se refiere a cualquier secuencia se nucleó ácidos que pueda participar en la secreción lmente asociada con la proteína (v.gr., prote ser de un gen que codifica otra proteína secret ncía de señal exogena ilustrativa comprende los residuos de aminoácidos de la señal de secu ilisina de Bacillus subtilis fusionados al rest ncia de señal de la subtilisina de Bacillus lent ) .

El término "secuencia de señal híbrida" se S secuencias de señal en las cuales parte de la s btenida del hospedero de expresión fusionad ncia de señal del gen que ha de ser exprés as modalidades, se utilizan secuencias sintética El término forma "madura" de una proteína o efiere a la forma funcional final de la pr ido. Por ejemplo, la forma madura de la subtilis easa de la presente invención incluye por lo nal de la proteína. El precursor puede te ncía de "señal" operablemente enlazada, al nal de la prosecuencia. El precursor también pue ucleótidos adicionales que están implicados idad post-traduccional (v.gr. , polinucleótidos d os mismos para dejar la forma madura de una pr ido) .

"Enzima que se presenta naturalmente" se r enzima que tiene la secuencia de aminoác ficada idéntica a aquella encontrada en la nat enzimas que ocurren naturalmente incluyen as, aquellas enzimas naturalmente expres tradas en el microorganismo particular.

Los términos "derivado de" y "obtenido eren a no sólo una proteasa producida o produc cepa del organismo en cuestión, sino también una a u original a un grado que el derivado es ú sitos similares como la forma de tipo silvestre, iginal . Derivados funcionales de serina proteasa dos o fragmentos de péptido que ocurren natur cidos sintéticamente o recombinantemente, que ti terísticas generales de la serina proteasa nte invención.

El término "derivado funcional" se refie ado de un ácido nucleico que tiene las carácte onales de un ácido nucleico que codifica asa. Derivados funcionales de un ácido nucle ica serina proteasa de la presente invención s nucleicos o fragmentos que ocurren natur cidos sintéticamente o recombinantemente, y c a proteasa característica de la presente invenc s nucleicos de tipo silvestre que codifican El término "alineación óptima" se refie ación que da la puntuación de por ciento de i lta .

"Por ciento de identidad de secuencia" , "po dentidad de secuencia de aminoácidos" , "por ci idad de secuencia de genes" , y/o "por ci idad de secuencia de ácido nucleico/polinucle especto a dos secuencias de aminoácidos, polinuc genes (según sea apropiado) , se refiere al porce úos que son idénticos en dos secuencias cua ncias son alineadas en forma óptima. Por lo ta entidad de secuencia de aminoácidos significa qu aminoácidos en dos secuencias de polipéptidos a rma óptima son idénticas.

La frase "sustancialmente idéntica" en el s aminoácidos o polpéptidos por lo tanto se refi imadamente 99% de identidad de secuencia en com una secuencia de referencia que usa los prog itmos ( . gr . , BLAST, ALIGN, CLUSTAL) mediante el etros estándares. Una indicación de que dos poli ustancialmente idénticos es que el primer polipé ológicamente reactivo en forma cruzada con el éptido. Típicamente, los polipéptidos que difi tuciones de aminoácidos conservadores ológicamente reactivos en forma cruzada. Por l olipéptido es sustancialmente idéntico a un éptido, por ejemplo, en donde los dos poli ren sólo por una sustitución conservador ación de que dos secuencias de ácido nucle ncialmente idénticas es que las dos moléculas otra bajo condiciones astringentes (v.gr., dent valo de astringencia media a alta) . imadamente 90%, por lo menos aproximadamente 91% aproximadamente 92%, por lo menos aproximadame lo menos aproximadamente 94%, por lo imadamente 95%, por lo menos aproximadamente 96% aproximadamente 97%, por lo menos aproxim /o por lo menos aproximadamente 99%, de ident ncía a la subtilisina proteasa madura que t ncía de aminoácidos de SEQ ID NO : 2.

El término "aislado" o "purificado" se refi ial que es removido de su ambiente original (v nte natural si ocurre naturalmente) . Por eje que el material es "purificado" cuando está pre composición particular en una concentración más baja de la que existe en un organismo que se aímente o de tipo silvestre o en combinac nentes que normalmente no están presentes bajo e de su ambiente natural. En modalidades prefer que un ácido nucleico o proteína es purifica ío, si da origen a esencialmente una franja en roforático o material de transferencia.

El término "aislado" , cuando se usa en refe secuencia de ADN, se refiere a una secuencia de ido removida de su medio genético natural y por ibre de otras secuencias codificantes extraña das, y está en una forma adecuada dentro de los roducción de proteína genéticamente manipulado ulas aisladas son aquellas que son separadas nte natural e incluyen ADNc y clones genómic ulas de ADN aisladas de la presente invención so ros genes con los cuales están ordinariamente as pueden incluir regiones 5 'y 3' no traducidas que almente tales como promotores y terminado otras proteínas, particularmente otras p ogas. Una proteína aislada es más de aproximadam , preferiblemente más de aproximadamente 20% riblemente aún más de aproximadamente 30% pura, mina por SDS-PAGE. Aspectos adicionales de la i an la proteína en una forma altamente purific , más de aproximadamente 40% pura, imadamente 60% pura, más de aproximadamente 8 de aproximadamente 90% pura, más de aproximadam , más de aproximadamente 97% pura, y aun imadamente 99% pura) , como se determina por SDS- Como se usa en la presente, el término "mut inatoria" se refiere a métodos de los cuales se iotecas de variantes de secuencias de inicio. iotecas, las variantes contienen una o varias mu idas de un conjunto de mutaciones predefinido.

Como se usa en la presente, el término wbi tantes" se refiere a una población de células icas en la mayor parte de su genoma pero entes homólogos , de uno o más genes. Esas biblio n usar, por ejemplo, para identificar genes u asgos mejorados.

Como se usa en la presente, el término o" se refiere a un gen de interés que codif ína de interés que ha de ser mejorada y/o nte el uso de la presente invención.

Como se usa en la presente, el término wal cuencia múltiple" ( "MSA" ) se refiere a las secue ogos múltiples de un gen de inicio que son a nte el uso de algún algoritmo (v.gr. , Clustal ) Como se usa en la presente, los términos "s onsenso" y "secuencia canónica" se refieren e inicio y una secuencia de consenso. Las mutac nso son identificadas al comparar las secuencias icio y las secuencias de consenso que resultan Algunas modalidades, las mutaciones de conse ducidas en el gen de inicio de tal manera que similares a la secuencia de consenso. Las mutac nso también incluyen cambios de aminoácidos que minoácido en un gen de inicio a un aminoácido ntra más frecuentemente en una MSA en aquella iva a la frecuencia del aminoácido en el gen de o tanto, el término mutación de consenso compren cambios de aminoácidos individuales que reempl ácido del gen de inicio por un aminoácido que ante que el aminoácido en la MSA.

Como se usa en la presente, el término "bi utagénesis de consenso combinatoria increment minaciones selectivas son favorecidas. En idades preferidas, esto se logra al omitir cebad ican mutaciones reductoras de desempeño o al inc oncentración de cebadores que codifican mu mentadoras de desempeño en relación con otros c e usaron en bibliotecas de CCM anteriores .

Como se usa en la presente, el término "mu toras de rendimiento" se refiere a mutaciones oteca de mutagénesis de consenso combinatoria frecuentemente encontradas en aciertos que res minación selectiva en comparación con una bibli énesis de consenso combinatoria no dét tivamente. En modalidades preferidas, el pro minación selectiva remueve y/o reduce la abund ntes que contienen "mutaciones reductor miento" . ivo" se refiere a la propiedad del gen de inici er alterada. No se pretende que la presente i limitada a ninguna propiedad objetivo particul go, en algunas modalidades preferidas, la p ivo es la estabilidad de un producto de gen tencia a desnaturalización, proteólisis u otros dadores) , otras modalidades, el nivel de produ ospedero de producción es alterado. De he mpla que cualquier propiedad de un gen de ntre uso en la presente invención. .

El término "propiedad" o equivalentes gram mismo en el contexto de un ácido nucleico, com , se refieren a cualquier característica o atribu nucleico que puede ser seleccionada o detectad edades, incluyen pero no se limitan a, una propi a la unión a un polipéptido, una propiedad con ío, un sitio de unión para un factor de transc erasa, factor regulador, etc., de un ácido ser alterado para producir características de identificar características no deseadas.

El término "propiedad" o equivalentes gram a misma en el contexto de un polipéptido (que ínas) , como se usa en la presente, se ref uier característica o atributo de un polipépt ser seleccionada o detectada. Estas pro yen, pero no se limitan a estabilidad ox ificidad de sustrato, actividad catalítica, est ica, estabilidad alcalina, perfil de actividad tencia a degradación proteolítica, relac at/kcat/kM, doblez de proteína, que induce una r ológica, capacidad para unirse a un ligando, c unirse a un receptor, capacidad para ser se irse a una secuencia que incluye una su ción, o interrupción de secuencia de ácido nucl resenta naturalmente. En algunas modalidades pre roducto de expresión de la secuencia modificada ína truncada (v.gr. , si la modificación es una s terrupción de la secuencia) . En algunas mod icularmente preferidas, la proteína truncada idad biológica. En modalidades alternativas, el xpresión de la secuencia modificada es una ada (v.gr., modificaciones que comprenden una i a secuencia de ácido nucleico) . En algunas moda inserción conduce a una proteína truncada (v.gr. nserción da por resultado la formación de un ción) . Por lo tanto, una inserción puede itado ya sea una proteína truncada o una ada como un producto de expresión.

Los términos "cebador mutagénic onucleótido mutagénico" (usados intercambiable esente) se refieren a composiciones de oligonuc orresponden a una porción de la secuencia de pla son capaces de hibridar a la misma. Con res ores mutagénicos, el cebador no coincidirá prec el ácido nucleico de la plantilla, la discor rdancias en el cebador se usan para introd ión deseada en la biblioteca de ácido nucleico. en la presente, "cebador no mutagén onucleótido no mutagénico" se refiere a composic nucleótido que coincidirán en forma precisa con ico de la plantilla. En una modalidad de la in se usan cebadores mutagénicos . En otra m rida de la invención, los cebadores están dise anera que para por lo menos una región en la cu as posiciones mientras que otros miembros son sos sitios, los cebadores no mutagénicos pro idad para obtener un nivel específico de mie tes dentro de la biblioteca de ácido nucleico úo dado. Los métodos de la invención nucleótidos mutagénicos y no mutagénicos aímente entre 10-50 bases de longitu riblemente de aproximadamente 15-45 bases de l embargo. Puede ser necesario usar cebadores que ás cortos que 10 bases o más largos que 50 ba er el resultado de mutagénesis deseado. Con re ores mutagénicos y no mutagénicos correspondie ecesario que los oligonucleótidos correspondien icos en longitud, si no que solo hay traslap n correspondiente a la mutación que se ha de ebadores se pueden añadir en una relación predef nucleico mutante.

Como se usa en la presente, la frase "mu guas" se refiere a mutaciones que se presenta ismo cebador de oligonucleótido . Por ejemplo, mu guas pueden ser adyacentes o cercanas una a o go, serán introducidas en los ácidos nucle illa mutante resultantes por el mismo cebador.

Los términos "secuencia de tipo silvestre" tipo silvestre" se usan intercambiablemente nte, para referirse a una secuencia que es nati resenta naturalmente en una célula hospedera. En lidades, la secuencia de tipo silvestre se refie ncia de interés que es el punto de inicio de un ingeniería de proteína (es decir, la s inal" ) . La secuencia de tipo silvestre puede c ea una proteína homologa o heteróloga. Una ares al tipo silvestre u otro progenitor en su tiene mutaciones en su secuencia de aminoácidos diferentes en secuencia de la proteasa stre u original (v.gr., subtilisina) .

A menos que se indique otra cosa, los nú ión de aminoácidos se refieren a aquellos asigna ncia de subtilisina madura de liquefacients de SEQ ID NO: 2. La invenci go, no está limitada a la mutación de esta sub cular, sino que se extiende a proteasas precurs ienen residuos de aminoácidos en posiciones ivalentes" a los residuos identificados particu btilisina de Bacillus amyloliquefacients .

Como se usa en la presente, los ificación" y "mutación" se refieren a cualquier ración en una secuencia de aminoácidos. Se pret condiciones que prevalecen durante los olítico, hidrolizante, de limpieza u otros pro nvención, por ejemplo, mientras se expone a o cto con agentes blanqueadores o agentes oxida as modalidades, las proteasas retienen por l imadamente 50%, aproximadamente 60%, aproxim aproximadamente 75%, aproximadamente imadamente 85%, aproximadamente 90%, aproxim aproximadamente 95%, aproximadamente imadamente 97%, aproximadamente 98%, o aproxim de actividad proteolítica después de ponerse en n agente blanqueador u oxidante durante un perío ejemplo, por lo menos aproximadamente 1 imadamente 3 minutos, aproximadamente 5 imadamente 8 minutos, aproximadamente 12 imadamente 16 minutos, aproximadamente 20 minut nen por lo menos aproximadamente 50%, aproxim aproximadamente 70%, aproximadamente imadamente 80%, aproximadamente 85%, aproxim aproximadamente 92%, aproximadamente imadamente 96%, aproximadamente 97%, aproxim aproximadamente 99% de actividad proteolítica contacto con un agente quelatador durante un , por ejemplo por lo menos aproximadamente 10 t imadamente 20 minutos, aproximadamente 40 t imadamente 60 minutos, aproximadamente 100 minut lgunas modalidades, la estabilidad al quelatador se describe en los ejemplos.

Los términos "térmicamente establ oestable" se refieren a proteasas de la ción que retienen una cantidad especificada de a ática después de la exposición a temp aproximadamente 95%, aproximadamente imadamente 97%, aproximadamente 98%, o aproxim de actividad proteolítica después de expos raturas alteradas durante un período dado, por lo menos aproximadamente 60 minutos, aproximadam tos, aproximadamente 180 minutos, aproximadame os, aproximadamente 300 minutos, etc. En lidades, la termoestabilidad se determina ribe en los ejemplos.

El término "estabilidad incrementada" exto de una proteasa estable a oxidación, que icamente y/o al pH se refiere a actividad prot ida más alta durante el tiempo en comparación c na proteasas (v.gr . , subtilisina proteasas) y/o ipo silvestre.

El término "estabilidad disminuida" en el cto (v.gr., composición líquida, granulada, en p , pasta, aspersión, tableta, gel; o de espuma íales también son preferiblemente compatibles a proteasa usada en la composición. En idades, las composiciones granuladas están e acta" , mientras que en otras modalidade siciones líquidas están en una forma "concentrad El término "desempeño incrementado" en el ctividad de limpieza se refiere a una activ eza incrementada o mayor de manchas sensibles a as tales como huevo, leche, pasto o sangre, mina por evaluación usual después de un ciclo d idar y/o múltiples ciclos de lavado.

El término "desempeño disminuido" en el con idad de limpieza se refieren a una actividad de inuida o menor de ciertas manchas sensibles a roteasa OPTIMASE™ (Genencor) , productos de ECT ™ (Genencor) , proteasa SAVINASE ™ (Nov ntes de BNP' , (véase, v.gr., patente de E.U.A. 6), proteasa RELASE™, DURAZYME™, EVERLASE™ , KA zymes) , proteasas MAXACAL™ , MAXAPEM™, PROP ncor; véase también, patente de E.U.A. No. Re 3 tes de E.U.A. Nos. Nos. 5,700,676; 5,955,340; 6, 482,628), y productos de proteasa variantes de B .,aquellos descritos en WO 92/21760, WO 95/2322 770) .

Los rendimientos de limpieza se pueden de omparar las proteasas de la presente invenc ias subtilisina proteasas en varias pruebas de ionadas con manchas sensibles a la enzima ta , sangre o leche, como se determina por meto trofotométricas o analíticas usuales desp particular de composición de limpieza deseado y roducto (v.gr. , composición líquida, en gel, gra spersión) , siempre que la composición sea compat erhidrolasa y otras enzimas usadas en la composi ción específica de materiales de composición de ace fácilmente al considerar la superficie, ar que se ha de limpiar, y la forma deseada siciones para las condiciones de limpieza du Los términos además se refieren a c sición que es adecuada para limpiar, bl fectar y/o esterilizar cualquier objeto y/o sup retende que los términos incluyan, pero no se l siciones detergentes (v.gr., detergentes para idos y/o sólidos y detergentes para telas laciones de limpieza de superficies duras-, ta gentes de limpieza; agentes para lavado d sitos en forma líquida, de gel o pasta, espec denominados tipos líquidos de trabajo pesado gentes líquidos para telas finas; agentes par l de vajillas o agentes para lavado de va i jo ligero, especialmente aquellos del tipo ación; agentes para lavado de vajillas en lav ias, que incluyen los diversos tipos de t lados, líquidos, y auxiliares de enjuague ? tico e institucional; agentes de limpieza y desi dos, que incluyen tipos de lavado acterianos, barras limpiadoras, enjuagues adores de dentadura, champúes para autos bras, limpiadores para baño; champúes para el c gues de cabello; geles para lavado y baños de iadores de metal; así como auxiliares de limpie re a otros detergentes, tales como aquellos usa ar vajillas, cubertería, etc. (v.gr, , etergen o de vajillas") . No se pretende que la ción este limitada alguna formulación o com gente particular. De hecho, se pretende que adem Ídrolasa, el término abarque detergentes que c es tensioactivos , transferasa (s) , enzimas hidro reductasas , mejoradores de detergencia, ueadores, activadores de blanqueo, agentes blanq rillantadores y colorantes fluorescentes, inhibi ción de torta, agentes cubridores, activad as, antioxidantes y solubilizantes .

Como se usa en la presente, "composici ieza de telas" incluyen composiciones detergen o de ropa a mano y en maquina lavadora que siciones aditivas de lavandería y compo dura y composiciones de limpieza personal.

La forma "compacta" de las composici ieza en la presente se refleja mejor por densid inos de composición, por la cantidad de sal 1 ánica. Las sales llenadoras inorgánicas son ingr ncionales de composiciones detergentes en f . En composiciones detergente convencionales, l adoras están presentes en cantidades substa camente de aproximadamente 17 a aproximadamente de la composición total. Por el contra siciones compactas, la sal llenadora está pre idades que no exceden aproximadamente 15% osición total. En algunas modalidades, la sal 1 presente en cantidades que no exceden aproxim o muy preferiblemente aproximadamente 5% en pes osición. En algunas modalidades, las sales ll Sección Experimental La presente invención se describe con onal en los siguientes ejemplos que de ningun nden limitar el alcance de la invención indica. Las figuras anexas tienen la intención ideradas como partes integrales de la especifi ipción de la invención. Los siguientes ejer en para ilustrar, pero no para limitar, la i indicada .

En la descripción experimental que si an las siguientes abreviaturas: PI o Pi (ín imiento) , ppm (partes por millón) ; M (mol imolar) ; µ? (micromolar) ; nM (nanomolar) ; mol (milimóles) ; µmol (micromoles) ; nmol (nanomo os) ; mg (miligramos) ; µg (microgramos) ; pg (pico itros) ; mi y mL (mililitros) ; µ? y µL (microlit (ADN de doble cadena) ; d TP (tr irribonucleótido) ; ARN (ácido ribonucleico) ; uro de magnesio) ; NaCl (cloruro de sodio) ; p/v en) ; v/v (volumen a volumen) ; g (gravedad) ; DO ( a) ; solución regulada en su pH por Dulbecco (DP de bacto- triptona, 0.5% de extracto de Bacto l 10 mM, KC1 2.5 mM) ; caldo terrífico (TB; 12 g ona, 24 g/1 de glicerol, 2.31 g/1 de KH2P04, y 1 2HP04) ; D028o (densidad óptica a 280 nm) ; D060o ( a a 600 nm) ; A40s (absorbancia a 405 nm) ; V idad inicial máxima de una reacción cataliz a) ; PAGE (electroforesis de gel de poliacrilami ci n salina regulada en su pH con fosfato [NaCl ador de pH de fosfato de sodio 10 mM, pH 7.2] 0.25% TWEEN® 20); PEG (polietilenglicol ) ; PCR ( dena de polimerasa) ; RT-PCR (PCR-transcripción i ilo); DTT (1, 4-ditio-DL-treitol) ; SA (ácido si o s, 5-dimetoxi-4 -hidroxi cinámico); TCA oroacético) ; Glut y GSH (glutatión reducido atión- oxidado); TCEP (Tris [2 -carboxietil] fosfi es) ; mCi (miliCuries) ; µ?? (microCuries) atografía de líquidos de alta presión) ; atografía de líquidos de alta presión de fase i (cromatografía de capa delgada) ; MALDI-TOF (dese asistida por matriz/ ionización-tiempo de vu ilo) ; Bn (bencilo) ; Ph (fenilo) ; Ms (mesilo) ; Et (metilo) ; Taq (ADN polimerasa de Thermus aqu W (fragmento grande de ADN polimerasa I (Klenow lenglicol-éter bis ( ß-aminoetílico) ácido N, acético) ; EDTA (ácido etilendiaminotetracético) ; masa o gen de resistencia a ampicilina) ; HDL (lí densidad) ; J Research ( J Research, Ren eal, Canadá) ; New Brunswick (New Brunswick Sci Edison, NJ) ; CFT (Center for Test Ma dingen, Países Bajos) ; Test Fabrics (Test Fabric Pittiston, PA) , Procter & Gamble (Procter & , Cincinnati, OH); Epicentre (Epicentre Biotechn on, WI) ; GE Healthcare (GE Healthcare, Chalf , Reino Unido) ; OXOID (Oxoid, Basingstoke, Hat ) ; Megazyme ( egazyme International Ireland Lt ess Park, Bray, Co. , Wicklow, Irlanda) ; F zymes Oy, Espoo, Finlandia) ; Kelco (CP ngton, DE) ; Corning (Corning Life Sciences, (NEN (NEN Life Science Products, Boston, MA) ; P ma AS, Oslo, Noruega); Dynal (Dynal, Oslo, N ynthesis (Bio-Synthesis, Lewisville, TX) ; ATCC ( Culture Collection, Rockville, MD) ; G o/BRL, Grand Island , NY) ; Sigma (Sigma Chemi ateen, Herndon, VA; Santa Cruz (Sant chnology, Inc., Santa Cruz, CA) ; Oxoicl (Oxoi sburg, NY) ; Worthington (Worthington Biochemica old, NJ) ; GIBCO BRL o Gibco BRL (Life Techn , Gaithersburg, D) ; Millipore (Millipore# Bi Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA) ; Invitrogen (In ., San Diego, CA) ; New England Biolabs y NEB (New bs, Ipswich, A) ; Sigma (Sigma Chemical Co . , St Pierce (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) ; ra Bio Inc. Otsu, Japón) ; Roche . (Hoffmann-La , Suiza) ; EM Science (EM Science, Gibbstown, NJ) en, Inc., Valencia, CA) ; Biodesign (Biodesign , Maine) ; Aptagen (Aptagen, Inc., Herndon, VA); a Sorvall, de. Kendro Laboratory Products, As United States Testing (United States Testi en, NJ) ; Molecular Devices (Molecular Devices, ument Services, Inc., Ringoes, NJ) ; Waters , Milford, MA) ; Matrix Science (Matrix Science, Dionex (Dionex, Corp., Sunnyvale, CA) ; I santo Co., St . Louis, MO) ; Wintershall (Winters l, Alemania); BASF (BASF Co., Florham Par sman (Huntsman Petrochemical Corp., Salt Lake Ci em (Enichem Ibérica, Barcelona, España) ; Fluka C ka Chemie AG, Buchs, Suiza); Gist-Brocades ades, NV, Delft, Países Bajos); Dow Corning (Dow ., Midland, MI); y Microsoft (Microsoft, Inc., E emplo 1 Pruebas En los siguientes ejemplos, se usaron varias A. Prueba de TCA para Determinación de Cont ína en Placas de Microtitulación de 96 Pozos Para BPN1 (v.gr., proteasa de refere ntes de BPN', esta prueba se inició mediante e nadante de cultivo filtrado de placas de microti crecieron 3-4 días a 33°C con agitación a 23 ión humidificada . Una placa de microtitulación de 96 pozos fresca (MTP) se usó para la ro, 100 pL/pozo de HCl 0.25 N se puso en ca és, se añadió 50 pL de caldo de cultivo filt rsión de la luz/absorbancia a 405 nm (con el uso ezclado durante 5 seg en el lector de pla minó después, a fin de proveer la lectura del " la prueba, 100 pL/pozo de 15% (p/v) d oroacético (TCA) se puso en las placas y se incu 30 min a temperatura ambiente. La dispersió TCA) de la lectura de la prueba con TCA para pro ión relativa del contenido de proteína en las m e desea, se puede crear una curva estándar al lecturas de TCA con pruebas de AAPF de clo res de conversión conocidos. Sin embargo, los re CA son lineales con respecto a la concentra ína de 50 a 500 proteína por mi (ppm) y por lo graficar directamente contra desempeño de enz ropósito de escoger variantes de buen desemp mento de turbidez/dispersión de la luz en las correlaciona con la cantidad total de pitable en el sobrenadante de cultivo.

B. Prueba de Proteasa AAPF en Pla titulación de 96 Pozos A fin de determinar la actividad de proteas rar una solución de trabajo de suc-AAPF-pNA, ión de abastecimiento de suc-AAPF-pNA se añadió ador de pH Tris/Ca y se mezcló bien por lo menos egundos. La prueba se realizó mediante la adici de solución de proteasa diluida a cada iatamente seguida por la adición de 190 µ? 1 ión de . trabajo de suc-AAPF-pNA. Las soluci aron durante 5 seg, y el cambio de absorbanci cinético (20 lecturas en 5 minutos) se leyó a 4 ctor de MTP, a 25°C. La actividad de proteasa se AU (actividad = ??? min_1 mi"1) .

C. Pruebas de Estabilidad a Agente Tensio tador La estabilidad a LAS y LAS/EDTA se midió de ación de la proteasa de prueba en presencia d DTA respectivamente, como una función de a mM .

Solución de abastecimiento de LAS: Se pre ión al 10.5 % de LAS en agua MQ (=10.5 g por 1 Regulador de pH TRIS - 100 mM / pH 8.6 (1 O.005% de Tween®-80) Regulador de pH TRIS-Ca, pH 8.6 (100 mM de CaC12/0.005% de Tween-®80) Equipo : MTPs de fondo redondo (Costar No. 9017) Biomek FX Multipipetas ASYS Lector Spectramax MTP, Incubadora/Agitador iEMS Incubadora/Agitador Innova 4330 Pipeta de canales múltiples Biohit ntración de los controles de proteasa en las p miento (actividad AAPF) . La concentración de da fue 80 ppm.

Diez µ? del sobrenadante diluido se añadier e regulador de pH LAS al 0.063%/pozo . La MTP s inta, se agitó durante unos cuantos segundos y s na incubadora (Innova 4230) a 45°C durante 60 m rpm de agitación. La actividad inicial (t=10 min minó después de 10 minutos de incubación al tr de la mezcla en cada pozo a una MTP fresca que µ? de solución de trabajo de suc-AAPF-pNA iones se mezclaron bien y la actividad de AAPF nte el uso de un lector de MTP (20 lecturas en 5 °C) .

La actividad final (t=60 minutos) se dete er otros 10 µ? de solución de la placa de in ncía de un agente tensioactivo aniónico repres alquilbecensulfonato lineal, dodecilbencensulf -DOBS) y EDTA de di -sodio se midió después de in condiciones definidas y la actividad resi minó mediante el uso de la prueba de AAPF. Los r s fueron dodecilbencensulfonato, sal de sodio No. D- 2525), TWEEN®-80 (Sigma No. P-8074) , ??? (Siegfried Handel No. 164599-02), HEPES (Sigm ), regulador de pH sin estrés: 50 m de HEPES (1 005% de TWEEN®-80, pH 8.0, regulador de pH con es e HEPES (11.9 g/1) , 0.1% de (p/v) DOBS (1 g/1) , (3.36 g/1), pH 8.0, sobrenadantes de cultivo de eferencia y variante de proteasa, que contenían 2 l de proteína. El equipo usado fue MTP con fond como placas de dilución (Greiner 651101 y ectivamente) , MTP de fondo en F (Corning 901 iestra de la placa de dilución maestra se añadió contenían 180 µ? de regulador de pH sin estrés concentración de incubación final de 2.5 p nidos se mezclaron y se mantuvieron a tem nte y se realizó una prueba de AAPF en esta plac estra de la placa de dilución maestra también s acas que contenían 180 µ? de regulador de pH co M de HEPES (11.9 g/1) , 0.1% (p/v) de DOBS (1 g/1 DTA (3.36 g/1), pH 8.0) . Las soluciones se mez iatamente se colocaron en agitador de iEMS te 30 min a 400 rpm. Después de 30 min ación, se realizó una prueba de AAPF sobre la s. La estabilidad de las muestras se deter lar la relación de la actividad de AAPF res ial como sigue: Actividad residual (%) = [mOD.m s] *100 / [mOD. min-1 sin estrés]. rar detergentes comercialmente comprados para u r las variantes de enzima de la presente invenci Micromuestras : Micromuestras de 0.635 cm de diámetro cir ieron de CFT. Micromuestras individuales muestras se colocaron verticalmente en cada poz e 96 pozos para exponer el área de superficie en , no plana en el fondo del pozo) .

Prueba de micromuestra de BMI Micromuestras que contenían sangre, leche de 0.635 cm de diámetro circular se obtuvieron de cortar las muestras, la tela (EMPA 116) se Una micromuestra se colocó verticalmente en c a placa de microtitulación de 96 pozos para ex gitación a 1400 rpm. Después de la incubación ciones apropiadas, 100 µ? de la solución de cada firió a una MTP fresca. La nueva MTP que contení olución/pozo se leyó a 405 nm mediante el us r de MTP SpectraMax. Los controles de testigo, ontrol que contenía dos micromuestras y deterge zima también se incluyeron.

Muestra "Pre-lavada" Este tipo de micromuestra fue pre-lavada . nizada durante 20 minutos a temperatura a és del paso de pre- lavado, las muestras se toallas de papel para secarlas. Las muestras aire después se perforaron mediante el uso de lar de 0.635 cm en una prensa de expulsión. Fin micromuestras se pusieron en cada pozo de una M aron de tiendas de supermercado locales. Ta gentes no calentados como calentados se probaro minutos de disolver el detergente para determi itud el porcentaje desactivado. La actividad a se probó mediante la prueba de AAPF.

Para probar la actividad de la enz gentes inactivados con calor, las soluciones de s detergentes se hicieron a partir de los mater ecimiento inactivados con calor. Cantidades ap reza de agua (102.6 gramos por litro o 205.2 gr ) y regulador de pH se añadieron a las so gentes para coincidir con las condiciones desea iones se mezclaron al someter a acción de re tir las botellas.

Enzimas y Equipo proteasas hidrolizan el sustrato y liberan pig culas insolubles del sustrato. Por lo ta idad de turbidez es una medición de actividad de El desempeño de remoción de manchas de serina eferencia y variantes de las mismas en micromue minó en una escala de MTP en detergente inactivado c cialmente disponible. Los reactivos usados fueron: , pH 8.0 ó 5 mM de MOPS, pH 7 buffer, 3:1 de Ca a de agua media. (CaCl2: MgCl2*6H20) 256,500 gr (g/1) de material de abastecimiento diluido a 102. litro, 2 muestras de BMI (sangre/leche/tinta) po ras de algodón de BMI EMPA-116 procesadas por C gadas y perforadas 2 muestras por pozo, y deterge de anaquel TIDE® 2X inactivado con calor en el rmó falta de actividad de proteasa.

La incubadora se fijó a la temperatura o 32°C) . 10 \ih de muestras de la placa de ra de -10 ppm de enzima se añadió a placas con 2 MI con 190 pL de soluciones de detergente de das anteriormente. El volumen se ajustó para ntración final de 0.5 ppm para variantes en la rueba. Las placas fueron inmediatamente transf adoras iEMS y se incubaron durante 30 minutos de agitación a la temperatura dada. Después ación, 100 L de sobrenadante fue transferid placa de 96 pozos y la absorbancia se midi r de MTP a 405 nm y/o 600 nm. Pozos de cont enían 1 ó 2 micromuestras y detergente sin la ad tras de proteasa también se incluyeron en la pr ción a 405 nm provee un valor más alto y ra ción de pigmento, mientras que la medición a enzima estándar (valor teórico) a la entración de proteína. Además, los valores teó en calcular mediante el uso de los parámetro ción de Langmuir de la enzima estándar.

E. Actividad Específica Relativa de Prot antes de las Mismas A fin de discriminar las variantes de p ctividad específica relativa se calculó medi de suc-AAPF-pNA como un sustrato, que perm aración y clasificación de las variantes ve easa de tipo silvestre o estándar. La a cífica sobre el suc- sustrato AAPF-pNA se dete dir la actividad proteolítica por los valores dos de cada muestra, mediante el uso de las ritas anteriormente. Al usar estos valores, se uir de la proteasa estándar. Un índice de d que es mayor que 1 (PI>1) identifica un ante en comparación con la estándar (v.gr. estre) , mientras que un PI de 1 (PI=I) identif ante que realiza lo mismo que la estándar, y u enor que 1 (PI<1) identifica una variante que mpeño pero que la estándar. Por lo tanto, tifica ganadores, así como variantes que so ables para usarse bajo ciertas circunstancias.

Ejemplo 2 trucción de Biblioteca de ISD ( Inserción- Subs t Supresión) Orientada Un método a base de PCR se usó para cr ioteca de subtilisina BPN'-Y217L oácidos, tanto en dirección hacia delante rsa se usaron para amplificar los segmentos 5' orción del gen de BPN' -Y217L. La región codifi roteasa madura BPN'-Y217L contiene los si ricción Kpnl y Xhol para propósitos de clonaci tctcaaaaaaatgggtctactaaaatattattccatctattataataaattcaca ^a^g^^ a^ ^¾a^afl^c aa a ^gtgagaagcaaaaaattgtggatcagtttgctgtttgctttagcgtt cagcacatccagcgcgcaggctgcagggaaatcaaacggggaaaagaaatatattgtcgggtttaaacagacaa agaagaaagacgtcatttctgaaaaaggcgggaaagtgcaaaagcaattcaaatatgtagacgcagctagcgct aaagaattgaaaaaagacccgagcgtcgcttacgttgaagaagatcacgtagcacacgcgtacgcgcagtccgt attaaagcccctgctctgcactctcaaggctacaccggttcaaatgttaaagtagcggttatcgacagcggt cttaaagtagcaggcggagccagcatggttccttctgaaacaaatcctttccaagacaacaactctcacgga ttgcggctcttaataactcaatcggtgtattaggcgtgcgccaagcgcatcactttacgctgtaaaagttctc aatacagctggatcattaacggaatcgagtgggcgatcgcaaacaatatggacgttattaacatgagcctc tgctttaaaagcggcagttgataaagccgttgcatccggcgtcgtagtcgttgcggcagccggcaacgaag cacagtgggctaccctggtaaatacccttctgtcattgcagtaggcgctgtcgacagcagcaaccaaagag cctgagctcgatgtcatggcacctggcgtatctatccaaagcacgcttcctggaaacaaatacggcgcgttg tccgcacgttgccggagccgcggctttgattctttctaagcacccgaactggacaaacactcaagtccgca caaaacttggtgattctttctactatggaaaagggctgatcaatgtacaggcggcagctcagtaaoo / g cccczcceettttttat (SEQIDN0:3).

La secuencia de aminoácidos de la proteína p Y217L se provee más adelante. En esta secuen YGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPSETNP THVAGTVAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLGADGSGQYSWIINGIEWAIA SLGGPSGSAALKAAVDKAVASGVVWAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVI QRASFSSVGPELDVMAPGVSIQSTLPGNKYGALNGTSMASPHVAGAAALIL NTQVRSSLENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ (SEQ ID N0:5).

Cada ol igonucleót ido contenía aproxima 4 nucleótidos necesarios para alinear tilla, codones orientados (con o sin degenera ecuencia de reconocimiento Eaml 1041. Cada eguimiento se movió 3 bp en dirección 3' ha alcanzó el extremo de la región orienta ciones de PCR (segmentos 5' y 31) contenían ol igonucleót idos que flanqueaban los gene ante 5' o de reversa 3', cada uno en combinac ol igonucleót idos opuestamente ce espondientes. Los fragmentos 5' fueron ampli artir del plásmido pAC-FNA10 (véase figu Tabla 2-1 adores Usados para Construcción de Biblioteca BPN' NOMBRE ID DEL CEBADOR SECUENCIA DEL CEBADOR P4328 AAACTCTTCANDTNDTCACGGAACTCACGTTGCC P4329 AAACTCTTCANDTNDTGGAACTCACGTTGCCGGC P4330 AAACTCTTCANDTNDTACTCACGTTGCCGGCACA P4331 AAACTCTTCANDTNDTCACGTTGCCGGCACAGTT P4332 AAACTCTTCANDTNDTGTTGCCGGCACAGTTGCG P4333 AAACTCTTCANDTNDTGCCGGCACAGTTGCGGCT P4334 AAACTCTTCANDTNDTCGGCACAGTTGCGGCTCT P4335 AAACTCTTCANDTNDTACAGTTGCGGCTCTTAAT P4336 AAACTCTTCANDTNDTGTTGCGGCTCTTAATAAC P4337 AAACTCTTCANDTNDTGCGGCTCTTAATAACTCA P4338 AAACTCTTCA DTNDTGCTCTTAATAACTCAATC P4339 AAACTCTTCANDTNDTCTTAATAACTCAATCGGT P4340 AAACTCTTCANDTNDTAATAACTCAATCGGTGTA P4341 AAACTCTTCANDTNDTAACTCAATCGGTGTATTA P4342 AAACTCTTCANDTNDTTCAATCGGTGTATTAGGC P4343 AAACTCTTCANDTTCAATCGGTGTATTAGGCGTT P4344 AAACTCTTCANDTNDTAAAGTTCTCGGTGCTGAC P4345 AAACTCTTCANDTNDTGTTCTCGGTGCTGACGGT P4346 AAACTCTTCANDTNDTCTCGGTGCTGACGGTTCC P4347 AAACTCTTCANDTNDTGGTGCTGACGGTTCCGGC P4348 AAACTCTTCANDTNDTGCTGACGGTTCCGGCCAA P4364 AAACTCTTCANDTNDTGCGATCGCAAACAATATG P4365 AAACTCTTCANDTNDTATCGCAAACAATATGGAC P4366 AAACTCTTCANDTNDTGCAAACAATATGGACGTT P4367 AAACTCTTCANDTNDTAACAATATGGACGTTATT P4368 AAACTCTTCA DTNDTAATATGGACGTTATTAAC P4369 AAACTCTTCANDTNDTATGGACGTTATTAACATG P4370 AAACTCTTCANDTNDTGACGTTATTAACATGAGC P4371 AAACTCTTCANDTNDTGTTATTAACATGAGCCTC P4372 AAACTCTTCA DTNDTATTAACATGAGCCTCGGC P4373 AAACTCTTCANDTNDTAACATGAGCCTCGGCGGA P4374 AAACTCTTCANDTNDTATGAGCCTCGGCGGACCT P4375 AAACTCTTCA DTNDTAGCCTCGGCGGACCTTCT P4376 AAACTCTTCANDTNDTCTCGGCGGACCTTCTGGT P4377 AAACTCTTCA DTNDTGGCGGACCTTCTGGTTCT P4378 AAACTCTTCANDTNDTGGACCTTCTGGTTCTGCT P4379 AAACTCTTCANDTNDTCCTTCTGGTTCTGCTGCT P4380 AAACTCTTCANDTNDTTCTGGTTCTGCTGCTTTA P4381 AAACTCTTCANDTNDTGGTTCTGCTGCTTTAAAA P4382 AAACTCTTCA DTNDTTCTGCTGCTTTAAAAGCG P4383 AAACTCTTCANDTNDTGCTGCTTTAAAAGCGGCA P4384 AAACTCTTCANDTGCTGCTTTAAAAGCGGCAGTT P4385 AAACTCTTCAAHNGTTGTCTTGGAAAGGATTTGT P4386 AAACTCTTCAAHNAHNGTTGTCTTGGAAAGGATT P4387 AAACTCTTCAAHNAHNGTTGTTGTCTTGGAAAGG P4388 AAACTCTTCAAHNAHNAGAGTTGTTGTCTTGGAA P4389 AAACTCTTCAAHNAHNGTGAGAGTTGTTGTCTTG P4390 AAACTCTTCAAHNAHNTCCGTGAGAGTTGTTGTC P4391 A^ACTCTTCAAHNAHNAGTTCCGTGAGAGTTGTT AAACTCTTCAAHNAHNGAGAACTTTTACAGCGTA AAACTCTTCAAHNAHNACCGAGAACTTTTACAGC AAACTCTTCAAHNAHNAGCACCGAGAACTTTTAC AAACTCTT CAAHNAHNGTCAGCACCGAGAACTTT AAACTCTT C AAHNAHNAC CGTCAGCAC CGAGAAC AAACTCTT C AAH AHNGG AAC CGT C AGC AC CGAG AAACTCTTCAAHNAHNGCCGGAACCGTCAGCACC AAACTCTT CAAHNAHNTTGGCCGGAAC CGT CAGC AAACTCTTCAAHNAHNGTATTGGCCGGAACCGTC AAACTCTTCAAHNAHNGCTGTATTGGCCGGAACC AAACTCTTCAAHNAHNCCAGCTGTATTGGCCGGA AAACTCTTCAAHNAHNGATCCAGCTGTATTGGCC AAACTCTTCAAHNAHNAATGATCCAGCTGTATTG AAACTCTTCAAHNAHNGTTAATGATCCAGCTGTA AAACTCTTCAAHNAHNTCCGTTAATGATCCAGCT AAACTCTTCAAHNAHNGATTCCGTTAATGATCCA AAACTCTTCAAHNAHNCTCGATTCCGTTAATGAT AAACTCTTCAAHNAHNCCACTCGATTCCGTTAAT AAACTCTTCAAHNAHNCGCCCACTCGATTCCGTT AAACTCTTCAAHNAHNGATCGCCCACTCGATTCC AAACTCTTCAAHNAHNTGCGATCGCCCACTCGAT AAACTCTTCAAHNAHNGTTTGCGATCGCCCACTC AAACTCTTCAAHNAHNATTGTTTGCGATCGCCCA AAACTCTTCAAHNAHNCATATTGTTTGCGATCGC AAACTCTTCAAHNAHNGTCCATATTGTTTGCGAT AAACTCTTCAAHNAHNAACGTCCATATTGTTTGC AAACTCTTCAAHNAHNAATAACGTCCATATTGTT AAACTCTTCAAHNAHNGTTAATAACGTCCATATT abs) . La mezcla de PCR (20 ul) se ialmente a 95°C durante 2.5 min seguida os de desnaturalización a 94°C durante 1 eación a 55°C durante 15 seg y extensión nte 40 seg. Después de la amplif icació mentos de izquierda o derecha generados ciones de PCR fueron purificados en gel y me oximadamente 200 ng de cada fragmento) . Cada enía tres fragmentos de izquierda que ori codones adyacentes y tres fragmentos de dere ntaban los mismos codones. Estas mezclas ridas con Eamll04I, ligadas con ADN ligasa ificadas por cebadores de flanqueo GAAGAAGATCACGTAGCA; SEQ ID NO: 122, y TTTTATAAACTCATTCCCTGAT; SEQ ID NO: 123 eritos resultantes fueron digeridos con MluI CTTTTGGAAGAAAATATAGGGAAAATGGTACTTGTTAAAAATTCGGAATAT TATCATATGTTTCACATTGAAAGGGGAGGAAAATCGTGAAACAACAAAAAC TCTAGCAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCAG GCTTTAGCGTTAATCTTTACGATGGCGTTCGGCAGCACATCCTCTGCCCAG AAATCAAACGGGGAAAAGAAATATATTGTCGGGTTTAAACAGACAATGAG GCGCCGCTAAGAAGAAAGATGTCATTTCTGAAAAAGGCGGGAAAGTGCAA CAAATATGTAGACGCAGCTTCAGCTACATTAAACGAAAAAGCTGTAAAAGA AAGACCCGAGCGTCGCTTACGTTGAAGAAGATCACGTAGCACACGCGTACG GTGCCTTACGGCGTATCACAAATTAAAGCCCCTGCTCTGCACTCTCAAGGCT TCAAATGTTAAAGTAGCGGTTATCGACAGCGGTATCGATTCTTCTCATCCTG GTAGCAGGCGGAGCCAGCATGGTTCCTTCTGAAACAAATCCTTTCCAAGAC TCACGGAACTCACGTTGCCGGCACAGTTGCGGCTCTTAATAACTCAATCGGT CGTTGCGCCAAGCGCATCACTTTACGCTGTAAAAGTTCTCGGTGCTGACGGT ATACAGCTGGATCATTAACGGAATCGAGTGGGCGATCGCAAACAATATGGA ACATGAGCCTCGGCGGACCTTCTGGTTCTGCTGCTTTAAAAGCGGCAGTTGA TTGCATCCGGCGTCGTAGTCGTTGCGGCAGCCGGTAACGAAGGCACTTCCG AGCACAGTGGGCTACCCTGGTAAATACCCTTCTGTCATTGCAGTAGGCGCTG AGCAACCAAAGAGCATCTTTCTCAAGCGTAGGACCTGAGCTTGATGTCATG CGTATCTATCCAAAGCACGCTTCCTGGAAACAAATACGGCGCGTTGAACGG GGCATCTCCGCACGTTGCCGGAGCGGCTGCTTTGATTCTTTCTAAGCACCC CAAACACTCAAGTCCGCAGCAGTTTAGAAAACACCACTACAAAACTTGGTG_ TACTATGGAAAAGGGCTGATCAACGTACAGGCGGCAGCTCAGTAAACTCGA GGATTTCCTGAAGGAAATCCGTTTTTTTATTTTAAGCTTG (SEQ ID NO: 124) Las mezclas de ligación fueron ampl nte el uso de amplificación de círculo rod rmidad con la recomendación del fabricante (Epi l de la mezcla de ligación se mezcló con 5 xilosa (véase, v.gr., Hahn et al., Mol Mic 63-775

[1996]) fueron transformados c iotecas que contenían secuencias de A fican proteasa BPN'-Y217L con regiones mutad ías se hicieron crecer en 1 mi de caldo d a 37°C durante 1 hora y después se coloc as de LB que contenían 1.6% de leche descrema de neomicina, y fueron incubadas durante la . Por lo menos 2000 clones de cada una de iotecas se determinaron selectivamente para p s . Cuando se colocaron sobre placas de remada, 0.05% a 20% de los clones generaron úmero de los clones que generaron halos enciados. Estos clones variaron en la rela rciones y supresiones, pero ninguna de ell ciones de desplazamiento de marco. Los clo Ejemplo 3 empeño de Remoción de Manchas de Variantes de BPN' Generadas por ISD Orientado Los resultados de experimentos conducid minar actividad de remoción de manchas (pr muestra para determinar desempeño de remoción de licaciones de lavandería mediante el uso de mué 116 (mancha de BMI , CFT) a pH 8/l6°C y determin ína por precipitación de TCA (pruebas de propie és) de variantes de BPN'-Y217L generadas ibió antes se muestran en la tabla 3-1. Los re tuvieron mediante el uso de los métodos descrit lo 1, con las siguientes modificaciones para l esempeño de remoción de manchas. El detergente d fue detergente Tide 2X inactivado con calor (P es. Tanto los detergentes no calentados como ca obaron dentro de 5 minutos de disolución del de determinar con exactitud el porcentaje desacti idad de la enzima se probó por la prueba de AA scribió, la funcionalidad de variantes de BPN1 - ificó como un índice de desempeño ("Pi" o "PI")/ elación de desempeño de una variante para la nal BPN'-Y217L. Las variantes de BPN»-Y217L que i alor de PI mayor que o igual a 0.5 para dese ión de manchas de BMI y/o precipitación de TC icios de limpieza y/o expresión mejorados.

Las mutaciones se nombran por el código para el aminoácido original, seguido por un n ión de tres dígitos y después el código de u el aminoácido variante. Por ejemplo, la gli te en la posición 87 a serina (S) está represent tado(s), más 0.01 para cada aminoácido. Por ejem ción de tres aminoácidos alanina (A) , serina ina (Y) entre la posición 87 y la 88 se mues .01 A/Z087.02S/Z087.03Y. " Por lo tanto, al las mutaciones anteriores más una supresió ión 100 es: "G087S/Z087.01A/Z087.02S/Z /A100Z. " Tabla 3-1 aciones e Indice de Desempeño para Actividad de P TCA y BMI para Variantes de B " -Y217L Mutaciones PI de PI TCA BMI 8 1 1T/L096V/G097S/A098D/D099I 0.45 1V/G097S/A098R/D099G 0.66 3F 1.08 4M/A098D/D099G 0.69 V/N118G/M119I 0.5 V/P129Z/S130H/S132G 0.47 L/N062D/S101R/Q103S 0.41 S/A098S/D099G 0.56 T/V068N/A069G 0.52 M/G128R/P129R/Z12 .01G 0.5 Q/G127R/P129G 0.54 R 0.5 1 Y/A098R/D099I 0.42 Y/A098R/D099Z/S101G 0.6 Y/P129R 0.685 Y/S130Y/G131S/S132L 0.38 H/G128R/Z128.01R/P129D 0.4 H/Z128.01G/Z128.02G 0.56 D/G097R/A098G/D099C 0.39 D/P129Z/S130G/G131R/S132C 0.37 Y/S101L/Q103N 1.05 V/G097R/A098S 0.44 G 0.9 I/T066G/H067R/V068D/A216E 0.88 F/A098R/D099S 0.98 I/G097C/A0 8D/D099G 0.42 I/G097R/A098R 0.83 I/G100S/S101G 0.36 V/G097C/A098R/D099S 0.41 V/G097L/A098G/D099S 0.42 V/G100R/S101G 0.65 1 R/Z101.01R/Z101.02G 0.57 S/H067S 0.51 C/A069G 0.42 C/A069G/H238Q 0.32 G/A069G 0.36 G/A069G/V150I 0.33 G/A069S 0.34 I/A069G/A144V 0.46 I/G097D/A098G/D099Z/G100R 0.41 L/A069G 0.445 0 L/A069S 0.47 S/A069G 0.48 S/A069G/A116T 0.4 G 0.7 G/T071G 0.23 G/T071I 0.79 G/N076G/N077Z 0.29 1 0.78 R/N076G/N077Z 0.34 D/D099R/Z100.01G 0.28 F/A098G 1.16 A/S101R/Q103V 0.4 I/G097R/A098G/D099C 0.36 D/G097S/A098G/D099N 0.42 I/G127C/P129G 1.28 I/G127L 0.88 V/A098G 0.75 T/S101G 1.13 T/S130R/G131H/S132N 1.24 V/G100Z/S101C/Q103R 0.52 V/P129Z 0.61 G 0.61 G/S249R 0.69 G/V093C 0.2 0 G/V093I 0.5 G/V093L 0.275 L/V093G/K094Z 0.54 S/K094V 0.47 S/V093C 0.72 S/V093G 0.21 S/V093S 0.33 V/V093L 0.34 0 I/G128D/P129R 0.6 I/P129Z 0.6 R/Z093.01G/K094R 0.28 E/V095D 0.87 G . 0.33 S/V148I 0.3 I/N118R/ 119C/D120G/A151V 0.29 .01D/A098R 0.66 .01H/A098G 0.32 .01N/A098H 0.65 .01R/A098C 0.47 .01R/A098G 0.39 7C/A098G/D099V 0.43 7C/A098N/D099S 0.45 7C/A098R 1.24 7C/A098R/D099G 0.40 7C/A098R/D099H 0.45 7C/A098R/D099H 0.46 7C/A098R/D099N 0.79 7C/A098R/D099R 0.4 7C/A098R/D099R/N109D/A114S 0.56 7C/A098S/D099H/A151V 0.32 7C/A098V/D099S 0.2 7C/Z097.01G/A098H/T253I 0.32 7C/Z097.01S/A098G 0.45 97D/A098C 1 97D/A098G/D099G 0.89 0 7D/A098G/D099R 1.00 7D/A098H/D099R 1.24 7D/A098H/D099V 0.95 7D/A098R/D099G 0.955 7D/A098R/D099R 1.29 7D/A098R/D099S 1.11 7D/A098R/D099Z 0.255 7D/G100C/S101R 1.15 7D/G100R/S101G 0.47 7H/A098C/D099G 0.34 97H/A098D/D099N 0.5 97H/A098G 0.67 H/A098S/D099S/K237E 0.53 L/A098C/D099S 0.26 L/A098G/D099S 0.33 L/A098G/D099S/G100Z 0.28 L/A098G/D099Z 0.29 L/A098H 0.71 L/A098R/D099N 0.5 L/A098V 0.42 N/A098G/D099C 0.74 N/A098G/D099R 0.82 N/A098G/D099R/V270I 0.74 N/A098G/D099S 0.45 N/A098G/D099V 0.47 N/A098G/D099V/A151V O .3 N/A098G/D099V/S101F 0.54 N/A098H/D099N 0.79 N/A098R/D099R 0.69 N/A098R/D099S 0.94 N/A098R/D099V 0.59 N/A098S/D099S 0.72 R/A098C 1.04 R/A098C/D099S 0.28 R/A098F/A200V 0.305 R/A098G 0.97 R/A098G/D099C 0.31 R/A098G/D099G 0.33 R/A098G/D099G/A273T 0.48 R/A098S/D099L 0.2 R/A098S/D099R 0.45 R/A098S/D099S 0.33 R/A098S/D099V 0.32 R/A098V/D099G 0.45 R/Z097.01H/A098C 0.56 R/Z097.01R/A098G 0.5 R/Z097.01R/A098G/V147I 0.56 R/Z097.01R/A098S 0.4 R/Z097. OIR 0.39 R/Z097.01S/A098G 0.57 R/Z097.01S/A098R 0.53 S/A098C 0.87 S/A098C/D099G 0.47 S/A098C/D099H 0.62 S/A098C/D099L 0.45 S/A098C/D099R 0.575 S/A098C/D099S 0.71 S/A098C/D099Z 0.2 S/A098G/D099F 0.28 S/A098G/D099G 0.43 S/A098G/D099G 0.43 S/A098G/D099S 0.56 S/A098G/D099Z 0.3 S/A098G/D099Z/G100R 0.3 S/A098H/D099C 0.46 S/A098H/D099G 0.42 G/D099G/G100H 0.58 G/D099G/N243D 0.27 G/D099G/S101P 0.55 G/D099G/T244S 0.51 0 G/D099G 0.49 G/D099H 0.44 G/D099L 0.4 G/D099R 0.56 G/D099R/A116T 0.6 G/D099R/G100D 0.28 G/D099R/V148I 0.79 G/D099S 0.58 G/D099S/L267M 0.48 G/D099V 0.32 G/D099Z 0.25 H 1.04 H/D099C 0.46 H/D099G 0.82 H/D099G/A216T 0.72 H/D099G/G100D 0.52 H/D099G/G100N/L267M 0.35 H/D099G/G100S 0.355 H/D099G/V143I 0.41 H/D099R 1.07 H/D099R/G100S 0.37 H/D099S/G100C 0.33 H/D099S/G100N 0.43 R/D099G/G100D 0.83 R/D099G/G100L/S145T 0.68 R/D099G/G100N 0.66 R/D099G/G100R 0.57 R/D099G/G100S 0.55 R/D099G/V150I 0.84 R/D099H 0.85 R/D099I 0.39 0 R/D099L 0.54 R/D099N 1 0 R/D099N/G100L 0.57 R/D099R 0.72 R/D099R/G100D 0.41 R/D099R/S101Z 0.61 R/D099R/S130F 0.23 R/D099R 0.64 R/D099S 0.75 R/D099S/G100L/A153V 0.55 R/D099S 0.87 R/D099V 0.505 0 R/D099Z/S101G 0.395 R/G100C/A137T 0.64 R/G100S 0.95 S/D099C 0.655 0 S/D099G 0.89 S/D099G/G100C 0.35 S/D099G/G100D 0.26 T/P129Z/S130R/S132G 0.33 T/S101G 0.785 0 V/D099G 0.965 V/D099G/G100D 0.5 V/D099G/G100D/A153V 0.41 V/D099G/G100S 0.66 Y/D099R/G100L 0.31 Y/D099R/G100Z/S101Z/G102D 0.98 Z/S101R 0.56 .01N 0.5 . OIR 0.54 . OIR/GIOOR 0.55 C/K136N 0.3 C/S101D 0.73 C/S101R 0.655 C/S101Z 0.40 C/Z09 . OIS 0.3 C/Z100. OIG 0.36 F/S101Z 0.35 G/G100C 0.5 G/G100D/S101R 0.54 G/G100H 1 0.62 G/G100R/S101V 0.45 G/G100S/S101R 0.55 G/S101G 0.67 G/S101H 0.79 G/S101V 0.85 H/S101G 0.35 H/S101R 0.74 0 L/S101G 0.775 1 L/S101R 1.24 N/S101D 0.5 N/S101L 0.93 1 N/S101R 1.27 R 0.64 R/L267R/I268V 0.7 R/S101G 0.46 R/S101G/G160S/S182N 0.5 R/S101G/Q103Z/Y104Z/S161N 0.33 R/S101G/S163N 0.55 R/S101N 0.78 R/S101R 0.60 R/S101R/Q103Z/V270I 0.58 R/S101Z/G102C/Q103D 0.5 S 0.59 S/S101C 0.69 S/S101G 0.47 S/S101R 0.75 S/S101R 0.94 S/S101V 0.53 S/S101V/A231T 0.51 .01G 0.43 .01L 0.43 .01N 0.43 D/Q103V 0.41 F/Q103G 0.32 G 0.83 G/A151V 0.41 G/A179V 0.29 G/G102S 0.42 G/Q103G 0.38 G/Q103L 0.74 G/Q103N 0.75 G/Q103R 0.71 G/Q103R/A179T 0.32 G/Q103R/G157D 0.59 G/Q103S 0.57 G/Q103S/L233S 0.8 G/Q103S/L233S 0.45 G/Q245H 0.56 G/S249N 0.77 1 G/V139I 0.85 G/Z101.01 0.435 0 G/Z101.01R/A200T 0.52 G/Z102. OIG 0.465 H 0.92 H/G102S 0.68 H/Q103D 0.985 1 H/Q103G 0.38 H/Q103G/E251Q 0.37 H/Q103H 1.07 L/Q103S 1.04 L/Q103V 0.66 L/Z101. OIR 0.5 N/Q103R 0.94 0 N/Z102. OIG 0.49 R 0.85 R/A151V 0.4 R/A273V 0.78 R/E156G 1.1 R/G102L/Q103G 0.95 R/G102S 1.58 R/G102S/Q103R 0.81 R/G102S/Q103V 0.54 R/G131D 1.45 R/Q103C 1.05 R/Q103D 0.75 R/Q103D/S248R 0.89 R/Q103G 0.49 R/Q103G/A116T 0.52 R/Q103G/V147I/A153V 0.445 1 R/Q103G 0.49 R/Q103L 0.80 R/Q103N 1.00 R/Q103R 0.74 R/Q103R/S161N 1.35 R/Q103R/V148I 0.58 R/Q103S 0.93 Z/G102V/Q103R/Y104L 0.37 Z/Q103D 0.52 Z/Q103F 0.45 Z/Q103L 0.41 Z/Q103R 0.49 C/Q103L/Y104S 0.96 R/Q103C/Y104C/V192I 0.33 R/Q103G/Y104R 0.25 R/Q103R/Z103.01G 0.655 0 Z/Q103S 0.33 .01G/Q103R 0.41 .01G/Q103R/L267V 0.31 .01G/Z102.02R/Z102.03G 0.53 D 1.04 G 0.335 H/Y104N/Q275Z 0.56 N/E156D 0.92 R 0.75 R/I122L/N123S/M124V 0.68 R/Y104F 0.7 0 S 1.35 V 0.61 0 Y/S182N 0.87 G/P129S/S130H/G131H 1.09 C/A116D/N117S/N118C 0.47 S/M119C/D120G/V121L 0.28 G/N117Z/N118R/M119C 0.37 R/M119C O .97 R/M119C/D120G 0.63 R/M119C/D120R 0.8 R/M119S 0.45 R/M119S/D120G 0.32 R/M119S/D120R 0.29 R/M119S/D120S 0.28 R/M119V/D120C 0.27 R/M119V/D120G 0.56 R/M119V/D120G/A232T 0.32 S/M119C/D120R 0.56 C/D120G 0.58 C/D120G/V121I 0.48 C/D120G/V121L 0.39 C/D120H 0.91 C/D120H/A187V 0.44 C/D120R 0.76 H/V121I 0.42 I/D120C 0.44 I/D120G 0.47 I/D120R 0.67 L/D120G 0.39 S/D120R 0.28 S/D120S/V121I 0.46 S/V121I 0.44 V/D120C 0.27 V/D120G 0.43 G 0.67 I/P129Z 0.53 R/G127R 0.54 S 1.08 Y 1.04 . OIS 0.67 C/G128S/P129R 0.77 C/P129G 1.53 C/P129G/A200T 0.56 C/P129R 1.785 0 C/P129R/A153T 0.76 D/P129G 0.91 D/P129S 0.71 H/P129G 1.65 H/P129R 1.1 L 1.14 L/P129R 1.02 N/P129C 1.05 N/P129G 1.1 N/P129G/A133T 0.87 N/P129G/A151V/K213N 0.37 N/P129R 1.10 N/P129S/A273V 1.07 N/P129V 1.16 R/A230V 0.5 R/P129D 1.01 R/P129D/L217S 0.76 .01G/Z127.02H/P129G O .55 .01G/Z127.02H/P129R O .52 .01H/G128C/P129C/A230V O .57 .01H/P129G O .59 .01H/P129G/V148I O .61 .01H/P129R O .57 .01N/G128C/P129V 0.5 .01N/G128S/P129S 0.585 .01N/G128S/P129V 0.57 .01N/P129R 0.59 .01R/G128S/P129S 0.67 .01R/P129G 0.485 .01S/P129D 0.58 .01S/P129G 0.65 .01S/P129R 0.42 D/P129G 0.53 D/P129R/Z12 . OIR O .7 D/P129S/G154S 0.5 H/P129C 0.58 H/P129H/Z12 .01G 0.65 H/P129H/Z129. OIR O .595 H/P129R 0.78 H/P129R/Z129.01G O .52 H/P129R/Z129. OIR O .57 H/P129S/Z129.01G 0.66 H/P129S/Z129. OIR 0.47 H/P129S/Z129.01R/S248N O .54 H 0.79 H/G131Z 0.6 H/G131Z/S132C 0.52 H/G131Z/S132H 0.43 H/S132Z 0.41 H/Z130.01D/Z130.02S 0.44 L 1 R 0.80 R/G131Z/S132H 0.58 R/S130D/S132Z 0.745 R/S130N/G131Z 1.23 R/S132T 0.37 R/S132Z 0.395 0 R/Z129.01G 0.42 R/Z12 .01G/Z12 .02G 0.49 R/Z129.01G/Z129.02G/A144T 0.64 R/Z129.01G/Z129.02G/G146D 0.53 R/Z129.01G/Z129.02R 0.52 R/Z129.01G 0.46 R/Z129.01R/Z129.02G 0.58 S 0.92 S/G131Z 0.75 S/S130H/S132Z 0.52 S/Z129.01C 0.55 S/Z129.01R/Z129.02S 0.59 S/Z130.01N/Z130.02S 0.45 V 1.32 Z/S130R/G131H/A144E 0.86 Z/S130R/G131H/S132D 0.33 Z/S130R/G131R/S132D 0.37 Z/S130R/L267 0.67 Z/S130R/S132C 0.72 Z/S130R/S132G 0.42 Z/S130V/S132G 0.37 Z/S130Z/G131N/S132G 0.5 C 1.25 D/G131C/S132D 0.71 D/G131R 0.77 D/G131R/S132D 0.52 D/G131Z 1.53 D/G131Z/S132H 0.68 F/G131N/S132V 0.59 F/G131S/S132V 0.48 F/S132V 0.29 G 0.8 G/G131D/S132C 1.13 G/G131H/S132D 0.51 G/G131S/S132I 0.4 G/S132G 0.635 H 1.01 H/G131C/S132G 0.94 H/G131H/S132R 0.53 H/G131R/S132C 0.74 H/G131S 1.08 V/S132Z 0.35 Y/G131H/S132C 1.14 Y/S132G 0.97 Z/G131H/S132H 0.78 H/S132L/W241R 0.35 N/S132C 0.94 S/S132G 0.42 Y/S132G 0.33 0 H 0.65 Z 0.795 1 T 0.66 V 0.55 V/G211V 0.33 T 0.89 N 0.92 T 0.5 Y 1.14 T 0.69 R 0.54 G 0.96 F 0.81 L 0.58 G 1.06 S 1.21 Z 0.79 Tabla 3-2 Mutaciones POS Variante 118.01 Z118.01G 6.01 Z066.01G 123.01 Z123.01C 3.01 Z093.01G 126.01 Z126. OIS 6.01 Z096. OID 127.01 Z127.01G 6.01 Z096.01H 127.01 Z127.01H 6.01 Z096.01N 127.01 Z127.01N 6.01 Z096. OIR 127.01 Z127.01R 6.01 Z096. OIS 127.01 Z127.01S 6.02 Z09 .02G 127.02 Z127.02H 7.01 Z097. OID 128.01 Z128.01G 7.01 Z097.01G 128.01 Z128.01R 7.01 Z097.01H 128.01 Z128.01Y 7.01 Z097.01R 128.02 Z128.02G 7.01 Z097.01S 128.02 Z128.02H 7.01 Z097.01Y 128.02 Z128.02R 8.01 Z098.01N 129.01 Z129.01C 8.01 Z098. OIR 129.01 Z129. OID 9.01 Z099.01H 12 .01 Z12 .01G 9.01 Z099.01L 129.01 Z129. OIR 9.01 Z099.01N 129.02 Z129.02D 9.01 Z099. OIR 129.02 Z12 .02G 9.01 Z099. OIS 129.02 Z12 .02R Ejemplo 4 Construcción de Variantes Combinatorias de BPN1 Al usar BP ' G97A-G128A-Y217Q ("BPN' 3") c inal, variantes combinatorias fueron creadas tegia que implicó PCR de extensión (fusión) med de cuatro fragmentos del gen. El fragmento ificado por cebadores P4974 y P4977 (véase tabla entó 4 fue amplificado por cebadores 4978 y P497 . Tanto el fragmento 1 como el 4 no contenían ción. Los fragmentos 2 y 3 cada uno fueron crea conjunto de 12 y 16 secuencias respectivame enían las mutaciones deseadas, mediante el uso plantilla o en ausencia de plantilla mediante e dores hacia delante y en reversa pare lapables. El conjunto de secuencias de fragmento 09: P4995 y P4996 (sin plantilla) 10: P4997 y P4998 (sin plantilla) 11: P4999 y P5000 (sin plantilla) 12: P5001 y P5002 (sin plantilla) El conjunto de secuencias de Fragmento 3 ificadas por los siguientes cebadores: 01 : P5003 y ' P5004 (BPN'3 como una 02 : P5005 y P5006 (sin plantilla) 03 : P5007 y P5008 (sin plantilla) 04 : P5009 y P5010 (sin plantilla) 05 : P5011 y P5012 (sin plantilla) 06 : P5013 y P5014 (sin plantilla) 07 : P5015 y P5016 (sin plantilla) 08: P5017 y P5018 (sin plantilla) 09: P5019 y P5020 (sin plantilla) 10: P5021 y P5022 (sin plantilla) Tabla 4-1 ecuencias de Cebador y Mutaciones Introducidas en Variantes Combinatorias de BPN# 3 ID Nombre del cebador Secuencia 5 P4948 GTGTTTTTCTTGGAATTGTGCTG 6 P4974 GCCTCACATTTGTGCCACCTA 7 P4975 CATATGAGTTATGCAGTTTGTAG 8 P4976 CCTCTCGGTTATGAGTTAGTTC 9 P4977 GTAGAGCGAAGCAGACGGGGCTA 0 P4978 CTTAAAGCAGCAGTTGATAAAGCT 1 P4979 CTTGGTGTAGCCCCGTCTGCTT 2 P4980 ATCCATGTTATTCGCGATGGCCCATT CTTGGTGTAGCCCCGTCTGCTTCGCTCTACGCCT 3 P4981 CTGCAGCAGACGGATCAGGCCAATACTCATGGAT ATCCATGTTATTCGCGATGGCCCATTCGATGCCG 4 P4982 ATCCATGAGTATTGGCCTGATCCGTCTGCTGCAG CTTGGTGTAGCCCCGTCTGCTTCGCTCTACGCCG 5 P4983 TTCTTGATGCACGTGACGGATCAGGCCAATACTC ATCCATGTTATTCGCGATGGCCCATTCGATGCCG 6 P4984 ATCCATGAGTATTGGCCTGATCCGTCACGTGCAT CTTGGTGTAGCCCCGTCTGCTTCGCTCTACGCCG 7 P4985 TTCTTGCAGCAGACTCTGGATCAGGCCAATACTC ATCCATGTTATTCGCGATGGCCCATTCGATGCCG ?ta??t?tt?tta?a??t??????tta??t??? ATCCATGAGTATTGGCCTGAAGAGTCACGTGCAT CTTGGTGTAGCCCCGTCTGCTTCGCTCTACGCC TTCTTGATGCACGTGACGGAGATGGCCAATACTC ATCCATGTTATTCGCGATGGCCCATTCGATGCC ATCCATGAGTATTGGCCATCTCCGTCACGTGCA CTTGGTGTAGCCCCGTCTGCTTCGCTCTACGCC TTCTTGCAGCAGACTCTTCTTCAGGCCAATACT ATCCATGTTATTCGCGATGGCCCATTCGATGCC ATCCATGAGTATTGGCCTGAAGAAGAGTCTGCT CTTGGTGTAGCCCCGTCTGCTTCGCTCTACGCC TTCTTGCAGCAGACTCTGGAGATGGCCAATACT ATCCATGTTATTCGCGATGGCCCATTCGATGCC ATCCATGAGTATTGGCCATCTCCAGAGTCTGCT CTTGGTGTAGCCCCGTCTGCTTCGCTCTACGCC TTCTTGCAGCAGACTCTGATGGCCAATACTCAT ATCCATGTTATTCGCGATGGCCCATTCGATGCC ATCCÁTGAGTATTGGCCATCAGAGTCTGCTGCA ATCGAATGGGCCATCGCGAAT TGCAACAGCTTTATCAACTGCT _ ATCGAATGGGCCATCGCGAATAACATGGATGTA TGAGCCTGGGAGCACCAAGCGGCAGT TGCAACAGCTTTATCAACTGCTGCTTTAAGTGC CCGCTTGGTGCTCCCAGGCTCATTCCAGAT ATCGAATGGGCCATCGCGAATAACATGGATGTA TGAGCCTGGGATCTCCAAGCGGCAGT TGCAACAGCTTTATCAACTGCTGCTTTAAGTGC CCGCTTGGAGATCCCAGGCTCATGTTGATT ATCGAATGGGCCATCGCGAATAACATGGATGTA ? ?T???T?????????????????????????? P5017 TGAGCCTGGGAGCACCAGTTGATAT TGCAACAGCTTTATCAACTGCTGCTTTAAGTGCC P5018 TCAACTGGTGCTCCCAGGCTCATGTTGATT ATCGAATGGGCCATCGCGAATAACATGGATGTAA P5019 TGAGCCTGGGAGCACCAAGCGGCAGT TGCAACAGCTTTATCAACTGCTGCTTTAAGTGTC P5020 CCGCTTGGTGCTCCCAGGCTCATGTTGATT ATCGAATGGGCCATCGCGAATAACATGGATGTAT P5021 TGAGCCTGGGA CTCCAAGCGGCAGT TGCAACAGCTTTATCAACTGCTGCTTTAAGTGCC P5022 CCGCTTGGAGATCCCAGGCTCATTCCAGAT ATCGAATGGGCCATCGCGAATAACATGGATGTAT P5023 TGAGCCTGGGAGCAGTAAGCGGCAGT TGCAACAGCTTTATCAACTGCTGCTTTAAGTGCC P5024 CCGCTTACTGCTCCCAGGCTCATTCCAGAT ATCGAATGGGCCATCGCGAATAACATGGATGTA P5025 TGAGCCTGGGAGCAGATAGCGGCAGT TGCAACAGCTTTATCAACTGCTGCTTTAAGTGC P5026 CCGCTATCTGCTCCCAGGCTCATTCCAGAT ATCGAATGGGCCATCGCG ATAACATGGATGTA P5027 TGAGCCTGGGAGCAAGCGGCAGTGCGGCA TGCAACAGCTTTATCAACTGCTGCTTTAAGTGC P5028 CCGCTTGCTCCCAGGCTCATTCCAGATACATCC ATCGAATGGGCCATCGCGAATAACATGGATGTA P5029 TGAGCCTGGGATCTGTTAGCGGCAGT TGCAACAGCTTTATCAACTGCTGCTTTAAGTGC P5030 CCGCTAACAGATCCCAGGCTCATGTTGATT ATCGAATGGGCCATCGCGAATAACATGGATGTA erasa Vent (New England Biolabs) . La mezcla de se calentó inicialmente a 95°C durante 2.5 min 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante ación a 55°C durante 15 seg y extensión a 72°C eg. Después de la amplificación, todos los fr n purificados por el kit de purificación en f (Qiagen) y se mezclaron para servir como plantil CR de fusión mediante el uso de cebadores P4975 ragmento de ADN de longitud completa a parti ión de PCR de fusión fue purificado en gel por e icación en franja de gel de QIAGEN, digerido as de restricción BamHI y HindIII y ligado ido de expresión de Bacillus pHPLT-BPN pare ra 2C) , que se cortó con las mismas enz icción .

Las mezclas de ligación fueron ampl as de Bacillus subtilis (genotipo: AaprE, IE, amyE: :xilRPxilAco K-phleo) como se describ ío 2. Las transformaciones se colocaron en plac contenían 1.6% de leche descremada y 10 ppm de n incubaron durante la noche a 37°C. Sólo colo s se recogieron y se hicieron crecer en pi titulación para análisis posterior como se des jemplo 2. La concentración de proteína de sobre ultivo se determinó por precipitación de TCA ribe en el ejemplo 1.

Tabla 4.5 iante Nombre 1 V093Z/K094S/V095C/L096S/G097A/G128A/Y217Q 2 Z096.01D/G097G/A098R/G128A/Y217Q 3 G097A/Z099.01S/G128A/Y217Q G097A/Z099.01S/S101D/I122S/N123G/G128A/Y217Q G097A/G100S/S101D/I122S/N123G/G128A/Y217Q G097A/G128S/Y217Q V093Z/K094S/V095C/L096S/G097A/G128S/Y217Q ?096.01D/G097G/A098R/G128S/Y217Q G097A/Z099.01S/G128S/Y217Q G097A/G100S/G128S/Y217Q G097A/S101D/G128S/Y217Q ?096.01D/G097G/A098R/Z099.01S/G128S/Y217Q ?096.01D/G097G/A098R/G100S/G128S/Y217Q ?096.01D/G097G/A098R/S101D/G128S/Y217Q G097A/Z099. OIS/GIO 0S/G128S/Y217Q G097A/Z099. O 1S/S101D/G128S/Y217Q G097A/G100S/S101D/G128S/Y217Q G097A/G128A/P129V/Y217Q V093Z/ Q94S/V095C/L096S/G097A/G128A/P129V/Y217Q Z09 .01D/G097G/A098R/G128A/P129V/Y217Q G097A/Z099.01S/G128A/P129V/Y217Q G097A/G100S/G128A/P129V/Y217Q G097A/S101D/G128A/P129V/Y217Q Z096.01D/G097G/A098R/Z099.01S/G128A/P129V/Y217Q Z096.01D/G097G/A098R/G100S/G128A/P129V/Y217Q Z096.01D/G097G/A098R/S101D/G128A/P129V/Y217Q G097A/Z099.01S/G100S/G128A/P129V/Y217Q G097A/Z099.01S/S101D/G128A/P129V/Y217Q G097A/G1005/S101D/G128A/P129V/Y217Q G097A/G128A/P129D/Y217Q V093Z/K094S/V095C/L096S/G097A/G128A/P129D/Y217Q Z096.01D/G097G/A098R/G128A/P129D/Y217Q G097A/Z099.01S/G128A/P129D/Y217Q G097A/G100S/G128A/P129D/Y217Q G097A/S101D/G128A/P129D/Y217Q Z096.01D/G097G/A098R/Z099.01S/G128A/P129D/Y217Q Z096.01D/G097G/A098R/G100S/G128A/P129D/Y217Q 74 Z096.01D/G097G/A098R/G128A/P129G/S130Z/Y217Q 75 G097A/Z099.01S/G128A/P129G/S130Z/Y217Q 76 G097A/G100S/G128A/P129G/S130Z/Y217Q 77 G097A/S101D/G128A/P129G/S130Z/Y217Q 78 Z096.01D/G097G/A098R/Z099.01S/G128A/P129G/S130Z/Y21 79 Z096.01D/G097G/A098R/G100S/G128A/P129G/S130Z/Y217Q 80 Z096.01D/G097G/A098R/S101D/G128A/P129G/S130Z/Y217Q 81 G097A/Z09 .01S/G100S/G128A/P129G/S130Z/Y217Q 82 G097A/Z099.01S/S101D/G128A/P129G/S130Z/Y217Q 83 G097AG100S/S101D/G128A/P129G/S130Z/Y217Q 84 G097A/G128A/S130V/G131D/S132I/Y217Q 85 V093Z/K094S/V095C/L096S/G097A/G128A/S130V/G131D/S13 86 Z096.01D/G097G/A098R/G128A/S130V/G131D/S132I/Y217Q 87 G097A/Z099.01S/G128A/S130V/G131D/S132I/Y217Q 88 G097A/G100S/G128A/S130V/G131D/S132I/Y217Q 89 G097A/S101D/G128A/S130V/G131D/S132I/Y217Q 90 Z096.01D/G097G/A098R/Z099.01S/G128A/S130V/G131D/S13 91 Z096.01D/G097G/A098R/G100S/G128A/S130V/G131D/S132I/ 92 Z096.01D/G097G/A098R/S101D/G128A/S130V/G131D/S132I/ 93 G097A/Z099.01S/G100S/G128A/S130V/G131D/S132I/Y217Q 94 G097A/Z099.01S/S101D/G128A/S130V/G131D/S132I/Y217Q 95 G097A/G100S/S101D/G128A/S130V/G131D/S132I/Y217Q 96 G097A/G128A/A134T/Y217Q 97 V093Z/K094S/V095C/L096S/G097A/G128A/A134T/Y217Q 98 Z096.01D/G097G/A098R/G128A/A134T/Y217Q 99 G097A/Z099.01S/G128A/A134T/Y217Q 100 G097A/G100S/G128A/A134T/Y217Q 101 G097A/S101D/G128A/A134T/Y217Q 102 Z096.01D/G097G/A098R/Z099.01S/G128A/A134T/Y217Q 103 Z096.01D/G097G/A098R/G100S/G128A/A134T/Y217Q 104 Z096.01D/G097G/A098R/S101D/G128A/A134T/Y217Q 105 G097A/Z09 .01S/G100S/G128A/A134T/Y217Q 106 G097A/Z09 .01S/S101D/G128A/A134T/Y217Q 107 G097A/G100S/S101D/G128A/A134T/Y217Q Z096.01D/G097G/A098R/Z099.01S/I122S/N123G/G128A/P12 Z096.01D/G097G/A098R/G100S/I122S/N123G/G128A/P129V/ Z096.01D/G097G/A098R/S101D/I122S/N123G/G128A/P129V/ G097A/Z099.01S/G100S/I122S/N123G/G128A/P129V/Y217Q G097A/Z099.01S/S101D/I 122S/N123G/G128A/P129V/Y217Q G097A/G100S/S101D/I122S/N123G/G128A/P129V/Y217Q G097A/I122S/N123G/G128A/P129D/Y217Q V093Z/K094S/V095C/L096S/G097A/I122S/N123G/G128A/P12 Z096.01D/G097G/A098R/I122S/N123G/G128A/P129D/Y217Q G097A/Z09 .01S/I122S/N123G/G128A/P129D/Y217Q G097A/G100S/I122S/N123G/G128A/P129D/Y217Q G097A/S101D/I122S/N123G/G128A/P129D/Y217Q Z0 6.01D/G097G/A098R/Z099.01S/I122S/N123G/G128A/P12 Z096.01D/G097G/A098R/G100S/I122S/N123G/G128A/P129D/ Z096.01D/G097G/A098R/S101D/I122S/N123G/G128A/P129D/ G097A/Z09 .01S/G100S/I122S/N123G/G128A/P129D/Y217Q G097A/Z099.01S/S101D/ll22S/N123G/G128A/P129D/Y217Q G097A/G100S/S101D/I122S/N123G/G128A/P129D/Y217Q G097A/I122S/N123G/G128A/P129Z/Y217Q V093Z/ 094S/V095C/L096S/G097A/I122S/N123G/G128A/P12 Z096.01D/G097G/A098R/I122S/N123G/G128A/P129Z/Y217Q G097A/Z099.01S/I122S/N123G/G128A/P129Z/Y217Q G097A/G100S/I122S/N123G/G128A/P129Z/Y217Q G097A/S101D/I122S/N123G/G128A/P129Z/Y217Q Z096.01D/G097G/A098R/Z099.01S/I122S/N123G/G128A/P12 Z096.01D/G097G/A098R/G100S/I122S/N123G/G128A/P129Z/ Z096.01D/G097G/A098R/S101D/I122S/N123G/G128A/P129Z/ G097A/Z099.01S/G100S/I122S/N123G/G128A/P129Z/Y217Q G097A/Z099.01S/S101D/I122S/N123G/G128A/P129Z/Y217Q G097A/G100S/S101D/I122S/N123G/G128A/P129Z/Y217Q G097A/G128S/P129V/Y217Q V093Z/K094S/V095C/L096S/G097A/G128S/P129V/Y217Q Z09 .01D/G097G/A098R/G128S/P129V/Y217Q G097A Z099.01S G128S P129V Y217 178 G097A/Z099.01S/S101D/G128S/P129D/Y217Q 179 G097A/G100S/S101D/G128S/P129D/Y217Q 180 G097A/G128S/P129Z/Y217Q 181 V093Z/K094S/V095C/L096S/G097A/G128S/P129Z/Y217Q 182 Z096.01D/G097G/A098R/G128S/P129Z/Y217Q 183 G097A/Z099.01S/G128S/P129Z/Y217Q 184 G097A/G100S/G128S/P129Z/Y217Q 185 G097A/S101D/G128S/P129Z/Y217Q 186 Z096.01D/G097G/A098R/Z099.01S/G128S/P129Z/Y217Q 187 Z096.01D/G097G/A098R/G100S/G128S/P129Z/Y217Q 188 Z096.01D/G097G/A098R/S101D/G128S/P129Z/Y217Q 189 G097A/Z099.01S/G100S/G128S/P129Z/Y217Q 190 G097A/Z099.01S/S101D/G128S/P129Z/Y217Q 191 G097AG100S/S101D/G128S/P129Z/Y217Q Ejemplo 5 mpeño de Remoción de Manchas de Variantes Combin de BPN'3 La actividad de remoción de manchas de v inatorias de BPN' 3 generadas como se describ lo 4 se probó como se describe en el ejemplo describió en todo respecto, la funcionali antes de BPN' se cuantificó como un índ Tabla 5-1 sempeño de Remoción de Manchas y Expresión de Var Combinatorias de BPN'3 Variantes TCA 2G/G097A/G128A/Y217Q 0.93 7A/G128S/Y217Q 1.16 8A/Y217Q 1.07 7A/G128S/P129D/Y217Q 0.85 7A/G128A/A134T/Y217Q 0.56 4V/L126A/Y217Q 1.05 7A/G128A/P129D/Y217Q/A232P 0.46 7A/G128A/P129D/Y217Q 0.57 7A/G128S/P129V/A134T/Y217Q 0.29 7A/G128S/P129V/Y217Q 0.31 8I/G097A/G128S/P129D/Y217Q 0.41 7A/S101D/G128S/S204F/Y217Q/S236F/T254P 0.41 7A/S101D/G128S/Y217Q 0.43 7A/G128A/P129V/Y217Q 0.30 7A/S101D/G128A/Y217Q 0.50 7A/S101D/G128S/P129D/Y217Q 0.35 7A/S101D/G128A/A134T/Y217Q 0.40 7A/Z099.01S/A114S/G128S/Y217Q 0.21 7A/S101D/G128A/P194L/Y217Q 0.35 7A/Z099.01S/G128S/Y217Q 0.39 7A/S101D/G128A/P129D/Y217Q 0.36 9R/G097A/Z099.01S/G128S/P129D/Y217Q 0.33 Ejemplo 6 onstruccion de Variantes Combinatorias de BPN'3 e Posiciones 128, 129 y 130 Bibliotecas combinatorias enfocadas alred posiciones 128/129/130 en BPN ' G97A-G128A-Y217Q rearon mediante el uso de mutagénesis de sa ífica del sitio y/o inserción y/o supresión esp sitio. Las variantes generadas contienen mutaci itución, inserción y supresión. Las bibliotecas e basan en la posición WT S130S y L4 se basa e o bibliotecas de saturación enfocadas alrededo iones 128/129 y 130 fueron construidas como se tabla 6-1.

Tabla 6-1 struccion de Biblioteca de Saturación en las Po y 129 en la secuencia de BPN3 ' para inact asa . Esto se hizo para asegurar un fondo b ido progenitor en las bibliotecas. El nitor (pHPLT-BP 13 ) fue metilado mediante el us gramos de ADN de plásmido y metílasa (New bs) , de conformidad con el protocolo de NEB. ado se purificó después con un kit de lim ntrador de ADN de Zymo Research. La mutagén izó mediante el uso de métodos conocidos en la e Amin et al., Biotechniques 35: 1134-1140, nte el uso de una versión modificada del énesis dirigida a multisitios QuikChange (Q agene .

La reacción de mutagénesis contenía 60 ido de plantilla, 0.5 ul de cebador hacia 129 Stop F (25 uM) , 0.5 ul de cebador de reversa amplificación de círculo rodante (RCA) mediante kit Templiphi (Amersham) de conformidad con el p bricante .

Tabla 6-2 Cebadores ID : Nombre del cebador Secuencia del cebador / 5Phos/CATGAGCCTGGGATA 128/129 detención F GCGGCAGTGCGGCACTTAAAGC /5Phos/GTGCCGCACTGCCGC 128/129 detención R TATCCCAGGCTCATGTTGATTA Un microlitro del ADN amplificado se u sformar 100 de células de Bacillus tentes (genotipo: AaprE, AnprE, : :xilRPxilAcomK-phleo) . Alícuotas de 20 uL u 80 1a de transformación se colocaron en placas de El plásmido pHPLT-BP 1 128/129 Stop fue me como plantilla con los pares de cebadores deg ados en la tabla 6-3.

Tabla 6-3 Secuencias de Cebador de mutagénesis de NNS Nombre del cebador Secuencia /5Phos/CAT GAG CCT GGG ANN 128/129 deg QC F CGG CAG TGC GGC ACT TAA AGC /5Phos/CCG CAC TGC CGC TSN 128/129 deg QC R CCA GGC TCA TGT TGA TTA CAT /5Phos/CAT GAG CCT GGG ANN 128/129 del QC F CAG TGC GGC ACT TAA AGC AG /5Phos/CCG CAC TGC CGC TSN 128/129 del QC R GGC TCA TGT TGA TTA CAT C /5Phos/CAT GAG CCT GGG ANN 128 A 129 QC F SAG CGG CAG TGC GGC ACT TAA /5Phos/CCG CAC TGC CGC TSN 128 A 129 QC R NTC CCA GGC TCA TGT TGA TTA /5Phos/CAT GAG CCT GGG ANN formaciones se colocaron en placas de agar d ementado con 10 pg/ml de neomicina + 1.6% d emada. Todas las colonias formadoras de ieron en dos placas de microtitulación que conte e medio LB complementado con 10 ug/ml de neomic s fueron secuenciados por Quintara Bioscience sión de proteína, se hicieron crecer cultivos du en placas de micro-filtro (.22um, Millipo nían 180 ul de un medio semi -definido enriquecid egulador de pH MOPs, con urea como fuente de n ipal, glucosa como la fuente de carbono principa ne para crecimiento de células robustas, y compl 2.5 ug/ml de neomicina. Los cultivos se hiciero te 64 horas a 37°C, 250 rpm, y 70% de hume ntracion de proteína de los sobrenadantes de cu minó por precipitación de TCA como se describ ncionalidad de variantes de ???' , se cuantifico e de desempeño (Pi) , que es la relación de dese variante a proteína original BPN*3. Las varia que muestran un valor de Pi mayor que o igua desempeño de remoción de manchas de B pitación de TCA mostraron beneficios de limpi sión mejorados. Los resultados se muestran en Tabla 7-1 mpefío de Remoción de Manchas y Expresión de Varia BPN'3 en las Posiciones 128, 129 y 130 íante TCA B 7A/G128S/P129T/Y217Q 0.77 1. 7A/G128A/P129S/Y217Q 0.70 1. 7A/G128S/P129C/Y217Q 0.61 1. 7A/G128S/P129Q/Y217Q 0.96 1.

A/G128H/P129S/Y217Q 0.59 0. A/G128N/P129S/Y217Q/V270A 0.51 0. A/G128S/P129L/Y217Q 0.45 0. A/P129R/Y217Q 0.70 0. A/P129 /Y217Q 0.51 0. A/P129Z/S130A/Y217Q 0.51 0. A/G128H/P129R/Y217Q 0.58 0. A/G128H/P129T/Y217Q 0.57 0. A/P129G/Y217Q 0.55 0. A/G128N/P129A/Y217Q 0.42 0. A/G128H/Y217Q 0.58 0. A/G128S/P129W/Y217Q 0.36 0. A/P129Z/Y217Q 0.47 0. A/G128N/Z128.01A/P129S/Y217Q 0.39 0. A/G128N/Y217Q 0.47 0. A/G128A/P129L/Y217Q 0.39 0. A/G128T/P129N/Y217Q 0.39 0. A/G128H/P129A/Y217Q 0.50 ?. A/G128M/P129R/Y217Q 0.53 0. A/G128Q/P129K/Y217Q 0.49 ?. A/G128T/P129Q/Y217Q 0.42 0. A/G128T/P129H/Y217Q 0.41 0. A/G128T/P129R/Y217Q 0.40 0. A/G128D/P129E/Y217Q 0.46 0. A/G128T/P129T/Y217Q 0.37 0. A/G128T/P129A/Y217Q 0.39 0. A/G128Z/P129Z/Y217Q 0.45 0. 7A/G128Y/Z128.01A/P129R/Y217Q 0.41 0. 7A/G128C/P129D/Y217Q 0.84 0. L/G097A/P129Z/Y217Q 0.46 0. 7A/G128R/P129D/Y217Q 0.51 0. 7A/G128A/Z128.01A/P129H/E195A/Y217Q 0.35 0. 7A/G128S/Z128.01A/P129Y/Y217Q 0.40 0. 7A/G128N/P129L/Y217Q 0.51 0. 7A/G128C/P129H/Y217Q 0.71 0. 7A/G128T/Z128.01A/P129T/Y217Q 0.38 0. 7A/G128C/Z128.01A/P129A/Y217Q 0.39 0. 7A/G128S/Z128.01A/P129I/Y217Q 0.41 0. 7A/G128S/Z128.01A/P129E/Y217Q/Q271H 0.41 0. 7A/G128S/Z128.01A/P12 L/Y217Q 0.42 0. 7A/G128Y/Z128.01A/P12 S/Y217Q 0.43 0. 7A/G128S/Z128.01A/P129M/R186H/Y217Q 0.44 0. 7A/G128E/Z128.01A/P129D/Y217Q 0.44 0. 7A/G128T/P129L/Y217Q 0.46 0. 7A/G128F/P129D/Y217Q 0.47 0. 7A/G128V/Z128.01A/P129R/Y217Q 0.47 0. 7A/G128L/Z128.01A/P129S/Y217Q 0.49 0. 7A/G128Y/P129T/Y217Q 0.51 0. 7A/G128C/P129Y/Y217Q 0.53 0. 7A/G128C/P129T/Y217Q 0.59 0. ginal: G097A/G128A/Y217Q 1.00 1. nte combinatorio creado, la molécula inal, mutaciones introducidas y cebadores os se listan en la Tabla 8-1. Para cre nte, dos fragmentos 1 y 2 fueron genera cebadores de PCR (tabla 8-2) en las region el gen mediante el uso de la molécula o ectiva listada en la tabla 8-1. Estos fra on mezclados y amplificados por los ce queadores P4973 y P4950 (tabla 8-2) para r en de longitud completa.

Cada reacción de amplificación cont de cada cebador de PCR y 100 ng del tilla. Las amplificaciones se llevaron ante el uso de ADN polimerasa Vent (New abs) . La mezcla de PCR (20 ul) se ialmente a 95°C durante 2.5 min seguida rido por las enzimas de restricción BamKI y igado con el vector pHPLT-BPN' que conte culas originales respectivas, que tamb aron con las mismas enzimas de restricci las de ligación fueron amplificadas mediante mplificación de círculo rodante de conformi recomendación del fabricante (Epicentr olitro de la mezcla de ligación se mezcló c regulador de pH de la muestra, se calentó nte 3 min y se enfrió sobre hielo. Enseguid regulador de pH de reacción y 0.2 ul de la ñadieron a cada tubo, seguido por incubación nte 10 horas. Los productos de la amplifica ulo rodante se diluyeron 100 veces y se usar sformar células de Bacillus subtilis (ge , AnprE, ñspoIIE, amyE ; ; i lRPxi lAcomK-phle Tabla 8-1 de ADN Original, Mutaciones Introducidas y C ara la Generación de Variantes Combinatorias Tabla 8-2 ecuencias de Cebador de PCR Usadas para la Creaci P4955 GTTAAAGTTCTTGATGCACGTGACGGATCAGGCCAAT P4956 GATCCGTCACGTGCATCAAGAACTTTAACGGCGTAGA P4957 GTTAAAGTTCTTGATGGTCGTGACGGATCAGGCCAAT P4958 GATCCGTCACGACCATCAAGAACTTTAACGGCGTAGA P4959 TGAGCCTGGGAGCAGTAAGCGGCAGTGCGGCACTTAA P4960 GCACTGCCGCTTACTGCTCCCAGGCTCATGTTGATTA P4961 TTAGCGCAGGAGGAGTAAGCGGCAGTGCGGCACTTAA P4962 GCACTGCCGCTTACTCCTCCTGCGCTAACGTTGATTA P4963 GAGCCTGGGAGGAGTAAGCGGCAGTGCGGCACTTAAA P4964 TGCCGCACTGCCGCTTACTCCTCCCAGGCTCATGCCG P4965 GAGCCTGGGAGCAGTAAGCGGCAGTGCGGCACTTAAA P4966 GCACTGCCGCTTACTGCTCCCAGGCTCATGTTGATT P4967 AACGGGACTTCCCAAGCCTCGCCGCATGTAGCTG P4968 ACATGCGGCGAGGCTTGGGAAGTCCCGTTTTGCGCAC P4973 AAAGGATCCTAATCGGCGCTTTTC Ejemplo 9 em eño de Remoción de Manchas de Variantes Combin de BPN La actividad de remoción de manchas de v inatorias de BPN' generadas como se describe lo 8 se probaron como se describe en el ejemplo ran en la tabla 9-1.

Tabla 9-1 mpeño de Remoción de Manchas y Expresión de Varia BPN' BMI Variantes TCA pH 8/16 7A/G128A/Y217Q/M222Q 0.56 0.8 4V/L126A/P129V/Y217Q 0.69 0.7 8A/P129V/Y217Q 0.36 0.7 7A/G128A/P129V/Y217Q 0.27 0.7 3G/P129V/Y217Q 0.47 0.3 I/Z096.01D/G097A/A098R/G128A/Y217Q 0.54 0.1 6.01D/A098R/G128A/Y217Q 0.47 0.1 6.01D/A098R/ 124V/L126A/Y217Q 0.49 0.1 7A/Z098.01S/G128A/Y217Q 0.71 0.1 .01D/A098R/N123G/Y217Q 0.54 0.1 6.01D/G097A/A098R/G128A/Y217Q/S236F 0.78 0.1 8.01S/M124V/L126A/Y217Q 0.45 0.1 8.01S/G128A/Y217Q 0.56 0.0 .01D/G097A/A098R/G128A/Y217Q 0.55 0.0 3I/Z098.01S/M124V/L126A/Y217Q 0.64 0.0 ción está bien adaptada para llevar a cabo los o er los extremos y ventajas mencionadas, a íos inherentes en la misma. Las composiciones y itos en la presente son representativos de mod ridas, son ilustrativos, y no se pretende que lit ce de la invención. Es fácilmente evidente to en la técnica que se pueden hacer substitu icaciones variables a la invención descrita a arse del alcance y esencia de la invención.

La invención ilustrativamente descrit adamente se puede poner en práctica en ause uier elemento o elementos, limitación o limitaci se describen específicamente aquí. Los tér siones que se han utilizado se usan como tér ipción y no de limitación, y no hay intención te el uso de esos términos y expresiones de stán dentro del alcance de esta invención como s la presente.

La invención se ha descrito amplía ricamente aquí. Cada una de las especies y agru enéricas más estrechas que caen dentro de la des rica también forma parte de la invención. Esta in ripción genérica de la invención con una con tación negativa de eliminar cualquier materia del endientemente de si el material eliminado e cíficamente mencionado en la presente.

Se hace constar que con relación a esta f r método conocido por la solicitante para llev tica la citada invención, es el que resulta cia ente descripción de la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como ante ma como propiedad lo contenido en las si ndicaciones . 1. Una variante de subtilisina caracterizad ende por lo menos una modificación, do icación se selecciona de: G100C, S101D, S101H, , L126G, S132H, S161N, Q275Z, y/o por lo m nto de modificaciones seleccionadas de /L096V/G097S/A098D/D099I, A001V/G097S/A098 /A098D/D099G, V004 /D099R/G100S/Z /G127C/G128S/P129R, V004M/M119 /A098G/D099R, V008I/A098N, V008I/M119 /G097R/A098C/D099S, K012N/A098 /G097D/A098H/D099G, A013T/S101 /G097R/A098S, S033I/T066G/H067R/V068 /A098R/D099S, V044I/G097C/A098 /G097R/A098R, V044I/G100 /G097C/A098R/D099S, A048V/G097L/A098 /GIOOR/SIOIG, A048V/G128S/P129L/Z129. OIG, M050 /S130I/S132G, S053T/D099H/S101Z , E054D/A098 /S101R/Q103R, T055S/T066I/Z066. OIG/Z /D099S/S101G, Q059H/M119S/D12 OR, Q059 /M119 /P129G, N061D/G128R/P129V/Z /G097D/A098R/D099S, G065R/Z101.01R/Z /H067S, V068C/A069G, V068C/A069G/H238Q, V068 /A069G/V150I, V068G/A069S, V068I/A069 I/G097D/A098G/D099Z/G100R, V068L/A06 G, V068 /A069G, V068S/A069G/A116T, A069G/T071G, A069 /N076G/N077Z, L075R/N076G/N077Z , N076D/D099R/Z /A098G, V081A/S101R/Q103V, V081I/G097R/A098 /V093C, A092G/V093I, A092G/V093L, A092L/V093 /K094V, A092S/V093C, A092S/V093G, A092 /V093L, V093I/G128D/P129R, V093 /Z093.01G/K094R, K094E/V095D, K094 /N118R/M119C/D120G/A151V, Z096.01 .01H/A098G, Z096.01N/A098H, Z096. OI .01R/A098G, Z096.01R/A098G/V192I , Z096.OI .01R/A098R/V192A, Z096.01R/A098S, Z096.01R/A098 .01R/Z096.02G, Z096.01R/Z096.02G/V147I Z096.01 01S/A098N, G097C/A098D/D099S, G097C/A098 /A098G/D099N, G097C/A098 /A098G/D099S/G100Z, G097C/A098 /A098N/D099S, G097C/A098R, G097C/A098 /A098R/D099H, G097C/A098R/D099H, G097C/A098 /A098R/D099R, G097C/A098R/D099R/N109 /A098S/D099H/A151V, G097C/A098 /A098R, G097H/A098R/D099G, G097H/A098 /A098R/D099N, G097H/A098S/D099G, G097H/A098 /A098S/D099L, GO 97H/AO 98S/D099 /A098C/D099S, G097L/A098 /A098G/D099S/G100Z, G097L/A098G/D099Z , G097 /A098R/D099N, G097L/A098V, G097N/A098 /A098G/D099R, G097N/A098G/D099 /A098G/D099S, G097N/A098 /A098G/D099V/A151V, G097N/A098G/D0 9 /A098H/D099N, G097N/A098R/D099R, G097N/A098 /A098R/D099V, G097N/A098S/D099S , G097 /A098C/D099S, G097R/A098F/A200V, G097 /A098G/D099C, G097R/A098 /A098G/D099G/A273T, G097R/A098 /A098G/D099S/A133D, G097R/A098 /A098H/D099C/S182N, G097R/A098 /A098C/D099S, G097S/A098C/D099Z , G097S/A098 /A098G/D099G, G097S/A098G/D099G, G097S/A098 /A098G/D099Z, G097S/A098G/D099 /A098H/D099C, G097S/A098H/D099G, G097S/A098 /A098R, G097S/A098R/D099C, G097S/A098 /A098R/D099L, G097S/A098R/D099V, G097S/A098 /A098S/D099G, G097S/A098S/D099G/A133V/A153 /A098S/D099G/A153V, G097S/A098 /Z097.01D/A098G/A144T/Q271H, G097S/Z097.01 /Z097.01S/A098G, G097S/Z097.01S/A098 /Z097. OIY, G097V/A098R, G097V/A098 /A098S/D099S, G097Y/A098H/D099N, G097Z/A098 .01D/A098R/D099G, Z097.01D/A098 .01D/A098V/D099G, Z097. OIG, Z097. OI .01G/A098G/D099S, Z097.01G/A098R, Z097.01G/A098 .01G/A098R/D099G, Z097.01G/A098R/D099S , A098 /D099R/G100D, A098G/D099R/V148I , A098 /D099S/L267M, A098G/D099V, A098G/D099Z, ?098 /D099G, A098H/D099G/A216T, A098H/D099 /D099G/G100N/L267ii/ A098H/D099 /D099G/V143I, A098H/D099R, A098H/D099 /D099S/G100C, A098H/D099S/G100N, ?098 /D099G, A098I/D099S, A098L/D099G, A098 /D099G, A098N/D099L, A098N/D099S , A098 /A274V, A098R/D099C, A098R/D099G, A098R/D099 /D099G/G100D, A098R/D099G/G100 /D099G/G100N, A098R/D099G/G100R, A098R/D099 /D099G/V150I, A098R/D099H, A098R/D099I, A098 /D099N, A098R/D099N/G100L, A098 /D099R/G100D, A098R/D099R/S101Z , A098R/D099 /D099R, A098R/D099S, A098R/D099S/G100 /D099S, A098R/D099V, A098R/D099 /D099G/G100S, A098Y/D099 /D099R/G100Z/S101Z/G102D, A098Z/S101R, Z .OIR, Z098.01R/G100R, D099C/K136N, D099 /S101R, D099C/S101Z, D09.9C/Z099. OIS , D099C/Z /S101Z, D099G/G100C, D099G/G100D/S101R, D099 /GIOOR/SIOIV, D0 9G/G100S/S101R, D099 /S101H, D099G/S101V, D099G/S101Z, D099G/S101 /Z099. OIN, D099G/Z099. OIR/GIOOS, D099G/Z /ZIOO . OIG, D099G/Z100.01G/S183N/Q275K, D099 /S101Z/V150I, D099H/Z100. OI /?100. OIG/ZIOO .02G, D099I/Z099. OIS , D099 /S101G, D099L/S101V, D099L/Z100. OIG, D0991 /GIOOR/SIOIV, D099N/S101G, D099N/S101H, D099 /Z099.01S, D099N/Z100. OIG, D099R/S101D, D099 /S101V, D099R/S101Z, D099R/S101Z/A133T, D099R/Z /Z099.01S, D099R/Z100. OIG, D099R/Z100. OIN, D099 /S101N, GIOOR/SIOIR, G100R/S101R/Q103 /S101Z/G102C/Q103D, GIOOS/SIOIC, GIOO /S101R, GIOOS/SIOIR, GIOOS/SIOIV, GIO OS/S101 .OIG, ZIOO.OIL, ZIOO.OIN, ZIOO.OIR, Z100.01 /Q103I, S101C/Q103S, S101D/Q103C, S101 /Q103F, S101D/Q103H, S101D/Q103H, S101 /Q103R/H238Y, S101D/Q103S, S101D/Q103V, S101 /A151V, S101G/A179V, S101G/G102S, S101 /Q103L, S101G/Q103N, S101G/Q103R, S101G/Q103 /Q103R/G157D, S101G/Q103S, S101G/Q103 /Q103S/L233S, S101G/Q245H, S101G/S249N, S101 /Z101. OIR; S101G/Z101.01R/A200T, S101G/Z /G102S, S101H/Q103D, S101H/Q103G, S101H/Q103 /Q103H, S101H/Q103I, SlOl /Q103R/A274Z/Q275Z, S101H/Q103S , SlOl I/Q103R, S101L/G102S/Q103R, S101L/Q103D, S101 /Q103V, S101V/Q103G, S101V/Q103H, S101V/Q103N/Z /Q103R, S101V/Q103V, S101Y/G102S/Q103R; S101 /Q103S, S101Y/Q103V, S101Z/G102I/Q103H/Y104 /G102V/Q103R/Y104L, S101Z/Q103D, S101 /Q103L, S101Z/Q103R, G102C/Q103 /Q103C/Y104C/V192I, G102R/Q103 /Q103R/Z103. OIG, G102Z/Q103S, Z102. OI .01G/Q103R/L267V, Z102.01G/Z102.02R/Z /Y104N/Q275Z, Q103N/E156D, Q103R/I122L/N123 /Y104F, Q103Y/S182N, S105G/P129S/S130 /A116D/N117S/N118C, N109S/M119C/D120 /N117Z/N118R/M119C, A116H/N117 /N118G/M119S, N117C/N118G/ 119 /N118G/M119C, N117G/N118R/M119C, N117H/N118 /N118D/M119S, N117H/N118G/M119C, N117H/N118 /N11¾G/M119S, N117H/N118G/M119V, N117H/N118 .01G/N118R/M119C, N118C/M119 /Z118.01G/M119C, N118D/M119C/D120L, N118D/M119 /M119C/D120G, N118G/M119C/D120L, N118G/M119 /M119N, N118G/M119S/D120G, N118G/ 119 /M119V/D120G, N118G/M119V/D120 /M119C/D120R, N118H/M119I/D120G, N118H/M119 /M119S/D120G, N118H/M119V/D120G, N118 /M119C/D120G, N118R/M119C/D120R, N118 /M119S/D120G, N118 /M119S/D12OR, N118R/M119 /M119V/D120C, N118R/M119 /M119V/D120G/A232T, N118S/M119C/D120R, M119 /D120G/V121I, M119C/D120G/V121L, M119 /D120H/A187V, M119C/D120R, M119H/V121I, M119 /D120G, M119I/D120R, M119L/D120G, M119 S/D120S/V121I, M119S/V121I, M119V/D120C, M119 /D120R, M119V/D120S/V198L, D120 /N123V/M124L, I122G/N123C/M124L, I122G/N123G/Z /N123V/M124LI122S/N123S, I122V/N123G/M124 /N123S/M124I, I122V/S183G, N123C/M124S, N123 /M124L, N123S/M124S, M124C/L126S, M124C/L126 /L126V, 124I/L126H, L126F/P129Z, L126F/P129 /P129Z, L126R/G127R, Z126.01S, G127C/G128 /P129G, G127C/P129G/A200T, G127 /P129R/A153T, G127D/P129G, G127D/P129S, G127 /P129R, G127L/P129R, G127N/P129C, G127 /P129G/A133T, G127N/P129G/A151V/K213N, G127 /P129S/A273V, G127N/P129V, G127R/A230V, G127 /P129D/L217S, G127R/P129G, G127R/P129R, G127 /P129D, G127S/P129F, G127S/P129G, G127S/P129 /P129G/I175T, G127S/P129R, G127S/P129S, G127 /P129G, G127V/P129R, Z127.01G/Z127.02 .01G/Z127.02H/P129G, Z127.01G/Z127.02 /P129S/Z129.01R/S248N, G128 /Z128.01R/P129D, G128H/Z128. OI /Z128.01R/P129S/A144T, G128H/Z P129R/Z129.01G, G128N/P129R/Z /P129S/Z129. OID, G128N/Z128.01R/P129S, G128 /P129H/Z12 .01G, G128R/P129L/Z13 O . OIS , G128 /P129R/Z12 .01G, G128R/P129R/Z12 .01 /P129S, G128R/P129S/Z129.01G, 128R/P129Z/S130 /Z128.01R/P129D, G128R/Z128.01R/P129F, G128 /P129C/Z129. OIR, G128S/P129D, G128S/P129 /P129D/T244N, G128S/P129G, G128S/P129 /P129H/Z12 . OIR, G128S/P129 /P129R/Z129.01G, G128S/P129S/Z /P129S/Z129. OIR, G128S/P129V, G128Y/P129R/Z .01G, Z128.01G/P129D, Z128.01 .01G/P129S/A134T, Z128.01G/Z128.02G, Z128.01 /S132Z, P129R/Z129.01G, P129R/Z12 . OIG/Z /Z129.01G/Z129.02G/A144T, P129R/Z129.01G/Z129.02 /Z129.01G/Z129.02R, P129R/Z /Z129.01R/Z129.02G, P129S/G131ZP129S/S13 O /Z129.01C, P129S/Z129.01R/Z /Z130.01N/Z130.02S, P129V/S132Z, /G131R/S132C, P129Z/S130G, P129Z/S130G/G131 /S130G/G131V, P129Z/S130H, P129Z/S130 /S130H/S132N, P129Z/S130L, P129 /S130R/G131C, P129Z/S130 /S130R/G131D/S132C, P129Z/S130R/G13 l /S130R/G131H/S132D, P129Z/S130R/G131 /S130R/L267M, P129Z/S130R/S132C, P129Z/S130 /S130V/S132G, P129Z/S130Z/G131 /G131C/S132D, S130D/G131R, S130D/G131 /G131Z, S130D/G131Z/S132H, S130F/G131 /S132L/W241R, G131N/S132C, G131S/S132G, G131Y/S /G211V, en donde las posiciones corresponden iones de subtilisina BPN' de SEQ ID NO : 2. 2. Una variante de subtilisina caracterizad ende por lo menos una modificación, d ón se selecciona de: V072G/G097A/G128 /G128S/Y217Q, G097A/G128S/P129 /G128A/A134T/Y217Q, M124V/L126 /G128A/P129D/Y217Q/A232P, G097A/G128A/P129 /G128S/P129V/A134T/Y217Q, G097A/G128S/P129 /G097A/G128S/P129D/Y217Q, /S101D/G128S/S204F/Y217Q/S236F/T254P, /S101D/G128S/Y217Q, G097A/G128A/P129 /S101D/G128A/Y217Q, G097A/S101D/G128S/P129 /S101D/G128A/A134T/Y217Q, /Z099.01S/A114S/G128S/Y217Q, .01D/G097A/A098R/G128A/Y217Q, /Z099.01S/I122S/N123G/G128A/Y217Q, /Z099.01S/I122S/N123G/G128A/Y217Q/T220A/A232T, /G097A/Z099.01S/S101D/G128A/Y217Q, /S101D/G128A/P129V/Y217Q, /K094S/V095C/L096S/G097A/G128A/Y217Q, /G100S/S101D/G128A/Y217Q/A232P, .01D/G097A/A098R/S101D/G128A/Y217Q, /Z099.01S/G100S/G128A/Y217Q, en donde las po sponden a las posiciones de subtilisina BPN' d 3. Una variante de subtilisina caracterizad ende por lo menos dos modificaciones, en do icaciones se seleccionan de: G097A/G128S/P129 /G128A/P129S/Y217Q, G097A/G128S/P129 /G128S/P129Q/Y217Q, G097A/G128S/P129 /P129G/Y217Q, G097A/G128N/P129 /G128H/Y217Q, G097A/G128S/P129 /P129Z/Y217Q, G097A/G128N/Z128.01A/P129 /G128N/Y217Q, G097A/G128A/P129 /G128T/P129N/Y217Q, G097A/G128H/P129 /G128 /P129R/Y217Q, G097A/G128Q/P129 /G128T/P129Q/Y217Q, G097A/G128T/P129 /G128T/P129R/Y217Q, G097A/G128D/P129 /G128T/P129T/Y217Q, G097A/G128T/P129 /G128Z/P129Z/Y217Q, G097A/G128S/Z128.01A/P129 /G128E/P129K/Y217Q, G097A/G128N/Z128.01A/P129 /G128G/P129R/Y217Q, G097A/G128T/P129 /G128R/Z128.01A/P129S/Y217Q, /G128S/Z128.01A/P129A/Y217Q, G097A/G128 /G128T/P129Y/Y217Q, G097A/G128R/P129 /G128S/Z128.01A/P129E/Y217Q/Q271H, /G128S/Z128.01A/P129L/Y217Q# /G128Y/Z128.01A/P129S/Y217Q, /G128S/Z128.01A/P129M/R186H/Y217Q, /G128E/Z128.01A/P129D/Y217Q, G097A/G128T/P129 /G128F/P129D/Y217Q, G097A/G128V/Z128.01A/P129 /G128L/Z128.01A/P129S/Y217Q, G097A/G128Y/P129 /G128C/P129Y/Y217Q, G097A/G128C/P129T/Y217Q, en d iones corresponden a las posiciones de subtilis Q ID NO: 2. 4. Una variante de subtilisina caracterizad ende por lo menos dos modificaciones, en do icaciones se seleccionan de: /G128A/Y217Q/M222Q, M124V/L126A/P129V/Y217Q, /P129V/Y217Q, G097A/G128A/P129V/Y217Q, /P129V/Y217Q, V30I/Z096.01D/G097A/A098R/G128A/Y21 osiciones de subtilisina BPN' de SEQ ID NO: 2. 5. Una variante de subtilisina caracterizad ende la substitución Y217L, y además comprende una modificación expuesta en cualquiera ndicaciones 1-4, y en donde las posiciones corr posiciones de subtilisina BPN7 de SEQ ID NO: 2. 6. Una variante ,de subtilisina caracterizad ende las substituciones G97A/G128A/Y217Q y que e comprende por lo menos una modificación exp uiera de las reivindicaciones 1-4, y en do iones corresponden a las posiciones de subtilis Q ID NO: 2. 7. Una composición de limpieza caracterizad ende por lo menos una variante de subtili uiera de las reivindicaciones 1 a 6. 8. La composición de limpieza de conformida uiera de las reivindicaciones 7-10, caracterizad ende además una o más enzimas o derivados de onales seleccionados del grupo que consi elulasas, peroxidasas, proteasas, celulasas, xi as, fosfolipasas , esterasas, cutinasas, pec tinasas, reductasas, oxidasas, fenol o igenasas, ligninasas, . pululanasas, sanasas, malanasas, ß-glucanasas , arabino ronidasa, condroitinasa, lacasa y amilasas, o me ismas . 12. La composición de limpieza de conform uiera de las reivindicaciones 7-11, caracterizad ende por lo menos un agente estabilizador. 13. Una composición de limpieza carac e comprende por lo menos 0.0001 por ciento en lo menos una variante de subtilisina de cualquier 15. Un alimento para animales caracterizad ende por lo menos una variante de subtili uiera de las reivindicaciones 1-7. 16. Una composición de procesamiento de a terizada porque comprende por lo menos una var ilisina de cualquiera de las reivindicaciones 1-7.