MX2010011470A - Estimacion in vitro de la vida in vivo de proteinas de enalce. - Google Patents

Abstract

La presente invención describe métodos utilizados para estimar la vida media in vivo de una proteína de enlace de interés. Los métodos descritos comprenden (a) determinar para una proteína de enlace de interés y para cada una de por lo menos dos proteínas de enlace de referencia diferentes una vida media in vitro utilizando un ensayo de reacción de proteasa in vitro, en donde dichas proteínas de enlace de referencia tienen vidas medias in vivo conocidas diferentes, (b) determinar la correlación entre las vidas medias in vivo conocidas y las vidas medias proteoliticas in vitro de cada una de las proteínas de enlace de referencia, y (c) estimar de dicha correlación entre las vidas medias in vivo conocidas y las vidas medias proteolíticas in vitro de las proteínas de enlace de referencia la vida media in vivo de la proteína de enlace de interés que se correlaciona con la vida media proteolítica in vitro de la proteína de enlace de interés.

Description

ESTIMACIÓN IN VITRO DE LA VIDA MEDIA IN VIVO DE PROTEÍNAS DE ENLACE Referencia Cruzada con Solicitud Relacionada La presente solicitud reclama la prioridad sobre la Solicitud Provisional de Patente Norteamericana Serie No. 61/046,062 presentada en Abril 18, 2008, cuyos contenidos están incorporados a la presente descripción como referencia.

Campo de la Invención La presente invención pertenece generalmente a las proteínas de enlace. En particular, la presente invención proporciona métodos in vitro para estimar las vidas medias ¡n vivo de las proteínas de enlace terapéuticas.

Antecedentes de la Invención La duración de un agente terapéutico en la circulación de un sujeto depende de una variedad de factores. Generalmente, la persistencia de cualquier agente en el sistema circulatorio se caracteriza como un valor farmacocinético cuantificable, tal como la vida media (t1/2). Dependiendo del agente particular, algunos de los factores más obvios que afectan su vida media incluyen, pero no están limitados a, la sensibilidad del agente a diferentes actividades degradantes del plasma o el hígado (por ejemplo, proteolíticas, glicolíticas), la solubilidad del agente en la sangre, la inmunogenicidad del agente, la capacidad del hígado para filtrar el agente, y la capacidad del mismo para enlazarse a una o más proteínas de enlace del suero (por ejemplo, albúmina de suero).

Para muchos agentes terapéuticos candidatos, la vida media farmacocinética es de importancia crítica para determinar si dichas moléculas candidato pueden ser desarrolladas en agentes terapéuticos eficaces. Por lo tanto, no importa lo activas que puedan parecer las moléculas candidato para estar hacia un objetivo deseado en un programa de selección de alta producción tal como una molécula puede generalmente tener poco valor terapéutico si carece de vida media in vivo que permita que la molécula persista el suficiente tiempo en la circulación de un sujeto para lograr una concentración de condición estable apropiada con el objeto de proporcionar un beneficio terapéutico deseado. Por consiguiente, en algún punto del proceso de selección para los agentes terapéuticos candidatos, se debe de evaluar una indicación de la farmacocinética de la vida media in vivo de cada molécula candidato prospecto con el objeto de eliminar del proceso aquellas moléculas que tienen vidas medias in vivo no deseables.

Generalmente, la primera indicación de si las moléculas candidato pueden tener una vida media in vivo aceptable es obtenida utilizando mamíferos pequeños, tales como ratas o ratones. Sin embargo, dichos mamíferos pequeños pueden ser valiosos en los estudios de la vida media in vivo, y dichos procedimientos agregan mano de obra humana, tiempo y gastos, al proceso de selección. Claramente, el proceso de selección para nuevos agentes terapéuticos podría hacerse más eficiente y más económico si hubiera medios in vitro simples confiables disponibles para determinar si las moléculas candidato tienen farmacocinética de vidas medias in vivo que garanticen su inclusión continuada en un proceso de desarrollo de fármacos.

Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona métodos in vitro simples, eficientes y confiables para estimar la vida media in vivo de las proteínas de enlace. En un aspecto, las proteínas de enlace de la presente invención comprenden proteínas de enlace terapéuticas. En otro aspecto, las proteínas de enlace de la presente invención comprenden proteínas de enlace de referencia. En un aspecto particular, la presente invención proporciona métodos in vitro para estimar la vida media farmacocinética in vivo (t /2) para las proteínas de enlace que posee uno o más enlaces de inmunoglobulina (Ig). Los métodos se adaptan fácilmente a procedimientos de selección de alta producción robótica y automatizada permitiendo la estimación de las vidas medias in vivo de múltiples proteínas de enlace de una manera eficiente y oportuna. Por consiguiente, los métodos son particularmente útiles en programas para la selección y desarrollo de nuevas proteínas de enlace terapéuticas, tales como varias construcciones de anticuerpos dirigidas contra objetivos terapéuticos. Una modalidad de la presente invención se refiere a la estimación de la vida media in vivo de las proteínas de enlace de interés que comprende los siguientes pasos: (a) determinar por una proteína de enlace de interés y por cada una de por lo menos dos proteínas de enlace de referencia diferentes una vida media in vitro utilizando un ensayo de reacción de proteasa in vitro, en donde dichas proteínas de enlace de referencia tienen vidas medias in vivo diferentes y conocidas, (b) determinar la correlación entre las vidas medias in vivo conocidas y las vidas medias proteolíticas in vitro de cada una de las proteínas de enlace de referencia, (c) estimar de la correlación entre las vidas medias in vivo y las vidas medias proteolíticas in vitro conocidas de las proteínas de enlace de referencia la vida media in vivo de la proteína de enlace de interés que se correlaciona con la vida media proteolítica in vitro de la proteína de enlace de interés.

En un aspecto, las vidas medias in vivo de las proteínas de enlace se refieren a vidas medias en un humano. Otras especies de animales, incluyendo tanto especies de vertebrados como invertebrados, también son aplicables para la presente invención. Las especies de ejemplo incluyen, pero no están limitadas a, mamíferos, aves, peces, reptiles y anfibios.

En un aspecto, las proteínas de enlace de interés son agentes terapéuticos. En un aspecto particular, las proteínas de enlace de interés poseen uno o más dobleces de inmunoglobulina.

La correlación entre las vidas medias in vivo conocidas de cada una de las proteínas de enlace de referencia y sus respectivas vidas medias proteolíticas in vitro determinadas por un ensayo de reacción proteolítica pueden ser trazadas para producir la gráfica de referencia (curva estándar), por ejemplo, trazando la vida media in vivo conocida contra la vida media proteolítica in vitro determinada para cada una de las proteínas de enlace de referencia. Dicha curva estándar puede también ser generada por medio de una computadora sin hacer un trazo real de los datos.

Una variedad de proteasas adecuadas o combinaciones de proteasas pueden ser utilizadas en un ensayo de proteasa in vitro para estimar la vida media in vivo de la proteína de enlace (por ejémplo, una proteína de enlace de interés) como aquí se describe. Los ejemplos de las proteasas adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, termolisina, elastasa, pepsina, tripsina, quimiotripsina, papaína, y combinaciones de las mismas.

Una proteína de enlace de referencia como se usa en la presente descripción generalmente enlaza un ligando similar conocido y posee una vida media in vivo de valor conocido, por ejemplo, la vida media en un humano. En un aspecto, la proteína de enlace de referencia comprende uno o más dobleces de inmunoglobulina. Los ejemplos de dichas proteínas de enlace de referencia son moléculas de anticuerpos terapéuticos conocidas así como otras proteínas de enlace terapéuticas conocidas que tienen, por ejemplo, uno o más dobleces de inmunoglobulina.

En una modalidad, los métodos aquí proporcionados para estimar las vidas medias in vivo de una proteína de enlace de interés es determinando la vida media in vitro en un ensayo de reacción proteolítica y posteriormente calculando la vida media in vivo estimada de acuerdo con la fórmula lineal: y = mx + b (eq.1 ) en donde "y" es la vida media in vivo (por ejemplo, en días), "m" es la inclinación observada de la correlación lineal entre la vida media in vivo y la vida media proteolítica portada por la proteasa in vitro, "x" es la vida media in vitro determinada en un ensayo de reacción proteolítica, y la constante "b" es el cruce-y, es decir, la vida media in vivo teórica correspondiente a una vida media proteolítica in vitro de cero (x = 0) a lo largo de la correlación lineal.

Una modalidad de la presente invención pertenece a un método para estimar la vida media in vivo de la proteína de enlace de interés que comprende determinar su vida media in vitro en un ensayo de proteólisis y posteriormente estimar su vida media in vivo que corresponde a su vida media proteolítica in vitro en una gráfica, por ejemplo, una curva estándar, generada mediante el trazo de los valores de la vida media in vivo contra los valores de la vida media proteolítica in vitro de por lo menos dos proteínas de enlace de referencia. Dicha curva estándar es una representación gráfica de la correlación entre la vida media in vivo y la vida media proteolítica in vitro de las proteínas de enlace de referencia. Un ejemplo de dicha curva estándar lineal se muestra en la figura 1.

Un aspecto proporciona una alternativa para utilizar una curva estándar, ilustrada en la figura 1, que es para generar una correlación o curva estándar (gráficamente o por computadora) de una de las vidas medias humanas in vivo conocidas de dos o más proteínas de enlace de referencia y sus respectivas vidas medias proteolíticas in vitro. Ventajosamente, las vidas medias proteolíticas in vitro de las proteínas de enlace de referencia pueden ser determinadas en paralelo o de acuerdo con un procedimiento idéntico para determinar la vida media proteolítica in vitro de una proteína de enlace de interés. De este modo, la vida media in vivo de la proteina de enlace de interés es estimada entonces a partir de una curva estándar generada recientemente. En otro aspecto de la presente invención se proporciona un método para determinar las vidas medias in vivo relativas de dos o más proteínas de enlace de interés que comprenden determinar por cada proteína de enlace una vida media proteolítica in vitro in un ensayo de reacción proteolítico in vitro, en donde la diferencia relativa entre las vidas medias proteolíticas in vitro de las proteínas de enlace de interés indican la diferencia relativa entre las vidas medias in vivo de las proteínas de enlace de interés. Aunque este método no proporciona un valor para cada una de las vidas medias in vivo de las proteínas de enlace de interés, sin embargo permite el ordenamiento de las proteínas de enlace con respecto a sus vidas medias in vivo debidas a la correlación fuerte descrita para la primera vez en la presente descripción entre la vida media proteolítica in vitro y la vida media in vivo de las proteínas de enlace. Dicho ordenamiento es particularmente útil en la caracterización de una población de proteínas de enlace cuando la vida media in vivo real de cada miembro de la población no es necesaria o requerida inmediatamente. Además, la capacidad para ordenar de esta manera una población grande de proteínas de enlace de interés de acuerdo con sus vidas medias in vivo relativas proporciona un medio para identificar, dentro de una población, las proteínas de enlace individuales o una sub-población de proteínas de enlace de ciertas propiedades (por ejemplo, vidas medias más largas) en comparación con el resto de la población. Esta ordenación o clasificación relativa de las moléculas hace posible que se haga una selección de un subconjunto de moléculas candidato sin tener que someter inmediatamente a la población completa a una prueba in vivo para aprender cuales miembros de la población tendrán propiedades farmacocinéticas necesarias para permanecer siendo candidatos para el desarrollo clínico.

Por lo tanto, los métodos aquí descritos proporcionan las ventajas en el descubrimiento y desarrollo de agentes terapéuticos reduciendo el gasto de tiempo y recursos (ambos en términos de gastos y personal) necesarios para identificar las proteínas de enlace que muestran una promesa como agentes terapéuticos.

Breve Descripción de los Dibujos La figura 1 es una gráfica (curva estándar) que muestra una correlación lineal fuerte (R2 = 0.885) entre las vidas medias humanas in vivo conocidas y las vidas medias proteolíticas de termolisina in vitro calculadas de las proteínas de enlace de referencia.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención está basada en parte en el descubrimiento de que un ensayo proteolítico in vitro puede ser utilizado para estimar una vida media in vivo para una proteína de enlace de interés. Las proteínas de enlace terapéuticas exhiben un amplio rango de vidas medias in vivo (ti 2). En algún punto del proceso de selección de proteínas de enlace candidatas para el desarrollo posible en agentes terapéuticos útiles, una predicción pre-clínica de la vida media in vivo para una molécula de proteína de enlace candidato se hace con el objeto de evitar el desperdicio de recursos adicionales en una molécula que no puede persistir en el sistema circulatorio de un animal (por ejemplo, humano) por un período de tiempo suficiente para producir efectivamente el beneficio terapéutico deseado a un sujeto o que puede persistir por un período de tiempo largo no deseable en el sistema circulatorio de ese sujeto. Lo que puede ser considerado una vida media in vivo aceptable para una proteína de enlace candidato que continua siendo de interés en un programa de desarrollo de fármacos dependerá de las metas y opiniones de los practicantes del desarrollo del fármaco, no obstante, dicha estimación debe ser hecha en algún punto para enfocar los recursos de una o más moléculas que poseen la mejor adaptación de propiedades o la adaptación óptima para ser desarrolladas en fármacos terapéuticos eficaces. La predicción pre-clínica de la vida media in vivo (por ejemplo, para un candidato de fármaco humano) generalmente requiere estudios en mamíferos pequeños (por ejemplo, en ratones o ratas) y técnicas de analítica sofisticadas que, debido a su costo y mano de obra, son reservadas mejor para el estudio de un número relativamente pequeño de moléculas candidato. Por lo tanto, el uso de un ensayo in vitro simple que pueda ser utilizado de manera rutinaria para pronosticar un parámetro farmacocinético como útil y como importante como la vida media in vivo en cualquier momento en una selección de fármacos y proceso de desarrollo puede tener un impacto tremendo en la eficiencia general, la economía, y la dirección de un programa de desarrollo de fármacos.

La presente invención proporciona un ensayo in vitro que es inesperadamente predictivo de la vida media in vivo de las proteínas de enlace en un sujeto sin una precisión sorprendente. Está basada en la observación de una correlación cercana entre la vida media in vitro en un ensayo de disociación de proteasa y en la vida media in vivo de las proteínas de enlace conocidas (proteínas de enlace de referencia) que son aprobadas para la administración a un sujeto(s) y actualmente disponibles en el mercado. En un aspecto, el sujeto es un animal que es ya sea un vertebrado o invertebrado. Dichos vertebrados pueden incluir mamíferos, peces, aves, anfibios, y reptiles. En un aspecto particular, el sujeto es un humano.

Con el objeto de describir de una manera más clara la presente invención se definen los siguientes términos: Los términos "proteína de enlace" se refieren a cualquier molécula de proteína que se enlaza a un ligando (ligando similar, asociado de enlace similar). Como se usa en la presente descripción, existen dos categorías amplias de proteínas de enlace: (1) proteínas de enlace de referencia y (2) proteínas de enlace de interés; ambas se explicarán más adelante. En un aspecto, la proteína de enlace tiene por lo menos un doblez de inmunoglobulina. Cuando la proteína de enlace es un anticuerpo, el ligando es un antígeno. Los dobleces de inmunoglobulina son dominios estructurales globulares tridimensionales identificados primero en las regiones variable (V) y constante (C) de las moléculas de longitud completa de inmunoglobulina, por ejemplo, moléculas de anticuerpo de longitud completa (ver, por ejemplo, el libro de Janeway y Travers, "El Sistema Inmune en la Salud y Enfermedad" (The Immune System In Health and Disease) (Current Biology Ltd and Garland Publishing, Inc., New York, 1994), páginas 3.6 a 3.7). Un doblez de inmunoglobulina comprende dos capas antiparalelas o láminas de hilos de cadena polipéptida, en donde cada hilo de polipéptidos tiene una conformación conocida como un hilo-ß, y cada capa de hilos es denominada una lámina ß. Un enlace disulfuro enlaza los hilos ß centrales de cada lámina ß de modo que las dos láminas ß son mantenidas juntas y forman una forma simplemente cilindrica (a la que también nos referimos como un "barril de llave Griego"). El doblez de inmunoglobulina de una región C de una molécula de inmunoglobulina tiene dos laminas ß antiparalelas, en donde una de las láminas ß tiene cuatro hilos antiparalelos ß y la otra tiene tres hilos antiparalelos ß. El doblez de inmunoglobulina de una región V de una molécula de inmunoglobulina tiene dos laminas antiparalelas ß, en donde una de las láminas ß tiene cuatro hilos antiparalelos ß y la otra lámina ß tiene cinco hilos antiparalelos ß.

Las proteínas de enlace que pueden ser utilizadas en los métodos aquí descritos incluyen moléculas de anticuerpos de longitud completa que comprenden cuatro cadenas de polipéptidos, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) así como cualquiera de una variedad de construcciones de anticuerpos que poseen un dominio de enlace del antígeno (ligando) y por lo menos un doblez Ig. Como se observó anteriormente, la molécula de anticuerpo de longitud completa tiene múltiples dominios V y C y por lo tanto, múltiples dobleces Ig. Las construcciones de anticuerpos incluyen fragmentos funcionales de anticuerpos, fusiones, mutantes, variantes, o derivados de moléculas de anticuerpo de longitud completa, y dichas construcciones de anticuerpos pueden tener solamente un doblez Ig. En una molécula de inmunoglobulina de longitud completa (por ejemplo, IgG, IgM, e IgA), cada cadena pesada comprende una región variable de cadena ligera (VH) y una región constante de cadena pesada (CH). La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende un dominio (CL). Las regiones VH y VL pueden ser subdivididas adicionalmente en regiones de hipervariabilidad denominadas "regiones de determinación de complementariedad" (CDR), intercaladas con regiones que son más conservadas, a las que nos referimos como "regiones de la estructura" (FR). Cada VH y VL está compuesta de tres CDRs y cuatro FRs, acomodados desde la terminal amino a la terminal carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las moléculas de inmunoglobulina de longitud completa pueden ser de cualquier tipo de clase (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, e IgY), o subclase (por ejemplo, Ig G 1 , lgG2, lgG3, lgG4, lgA1, e lgA2), o subclase.

Varias construcciones de anticuerpo han mostrado que la función de enlace de antígeno puede ser realizada por fragmentos o porciones de moléculas de inmunoglobulina de longitud completa. Dichas construcciones de anticuerpo pueden tener formatos bi-específicos (enlazar dos moléculas idénticas al antígeno), específicos dobles (enlazar dos moléculas de antígeno diferentes), o formatos multi-específicos que pueden enlazar una combinación de dos o más antígenos diferentes. Los ejemplos de las construcciones de anticuerpo comprendidos dentro de los términos "proteína de enlace" incluyen un fragmento Fab, el cual es un fragmento monovalente (que comprende un solo sitio de enlace) que comprende los dominios VL, VH, CL, y CH1; un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente (que comprende dos sitios de enlace) que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente disulfuro en una región de articulación; un fragmento Fd que comprende los dominios VH y CH1; un fragmento Fv que comprende los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; un anticuerpo de un solo dominio (dAb) (Ward y asociados, Nature, 341: páginas 544 a 546 (1989); Winter y asociados, publicación PCT documento WO 90/05144 A1, incorporados a la presente descripción como referencia), que comprende un solo dominio variable; anticuerpos de dominio variable doble (DVD); y regiones de determinación de complementariedad aisladas (CDRs) de regiones V de una molécula de anticuerpo. Es bien conocido que los fragmentos Fab son fácilmente generados por la disociación de una molécula de anticuerpo de longitud completa con papaína y que los fragmentos F(ab')2 pueden ser generados por la disociación de moléculas de anticuerpo de longitud completa con pepsina.

Aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, son codificados por genes separados, los genes que codifican los dominios pueden ser unidos con una secuencia enlazadora sintética utilizando métodos de ADN recombinante de modo que el gen recombinante codifica una sola cadena de proteína en la cual las regiones VL y VH están unidas por medio de un enlazador péptido para formar una molécula monovalente conocida como Fv de una sola cadena (scFv) (ver por ejemplo, Bird y asociados en Science, 242: páginas 423 a 426 (1988); Huston y asociados, en Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 85: páginas 5879 a 5883 (1988)). Dichas construcciones de anticuerpo scFv poseen un dominio de enlace al ligando (antígeno) y por lo menos un doblez Ig y por lo tanto están comprendidos por los términos "proteína de enlace" y pueden ser utilizados en los métodos aquí descritos. Los diacuerpos también están comprendidos por los términos "proteína de enlace". Los diacuerpos son bivalentes, anticuerpos bi-específicos en los cuales los dominios VH y VL son expresados en una sola cadena polipéptida, utilizando un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre dos dominios en la misma cadena, forzando de esta manera que los dominios se apareen con dominios complementarios de otra cadena y creen dos sitios de enlace al antígeno (ver por ejemplo, las publicaciones de Holliger y asociados, en Proc. Nati. Acad. Sci. EUA , 90: páginas 6444 a 6448 (1993); Poljak y asociados, en Structure, 2: páginas 1121 a 1123 (1994)). Los términos "proteína de enlace" comprenden también anticuerpos de dominio variable doble (DVD) como lo describen, por ejemplo, en la publicación PCT documento No. WO 2007/024715. Todas las moléculas anteriores son proteínas de enlace útiles en los métodos aquí descritos debido a que comprenden un dominio de enlace funcional para un asociado de enlace a fin o similar, por ejemplo, un antígeno, y comprenden por lo menos un doblez Ig de una región V o C de inmunoglobulina.

Una proteína de enlace útil en los métodos aquí descritos puede ser una proteína de fusión que comprende una molécula receptora de células o una porción de enlace del ligando de las mismas enlazada a una región Fe. Dichas proteínas de fusión generalmente poseen una estructura que imita una molécula Ig del anticuerpo y, debido a la región Fe, pueden formar formas diméricas u otras formas multiméricas de una manera similar a las moléculas IgG o Ig . Un ejemplo de dicha proteína de fusión Fc/receptor de células el fármaco terapéutico etanercept. El etanercept es una proteína de fusión dimérica que comprende una porción de enlace de ligando extracelular del receptor del factor de necrosis del tumor (TNFR) (p75) de 75 kilodaltons enlazado a la porción Fe del lgG1 humano. El componente Fe del etanercept comprende el dominio CH2, el dominio CH3, y la región de articulación, pero no el dominio CH1, del lgG1.

Una "proteína de enlace de interés" es cualquier proteína de enlace para la cual se va a estimar la vida media in vivo (por ejemplo, humana) utilizando un método in vitro aquí descrito. Dependiendo del contexto, la proteína de enlace de interés puede ser considerada un candidato terapéutico.

Una "proteína de enlace de referencia" es una proteína de enlace que tiene una vida media in vivo conocida (por ejemplo, humana). Generalmente, los métodos in vitro aquí descritos para estimar la vida media in vivo (por ejemplo, en los humanos) de una proteína de enlace de interés emplea por lo menos dos proteínas de enlace de referencia. Las proteínas de enlace de referencia útiles en los métodos aquí descritos generalmente tienen diferentes vidas medias in vivo conocidas (por ejemplo, en los humanos) de entre ellos y generalmente también tienen diferentes vidas medias proteolíticas in vitro en el ensayo proteolítico in vitro. Dichas diferencias se requieren para producir la correlación o la curva estándar entre la vida media in vivo y la vida media proteolítica in vitro. El uso de dos proteínas de enlace de referencia que tienen diferentes vidas medias in vivo e in vitro proporcionan de esta manera el mínimo de datos necesarios para determinar una correlación o producir una curva estándar de la vida media in vivo contra la vida media proteolítica in vitro. Por consiguiente, se encuentra dentro del alcance de la presente invención utilizar más de dos proteínas de enlace de referencia en los métodos aquí descritos con el objeto de producir más datos para determinar la correlación entre la vida media in vivo y la vida media proteolítica in vitro de las proteínas de enlace.

Las proteínas de enlace de referencia pueden incluir, pero no están limitadas a, aquellas proteínas de enlace terapéuticas aprobadas para el tratamiento de humanos. Una variedad de proteínas de enlace terapéuticas han sido aprobadas para su uso en ensayos clínicos o están en desarrollo para el uso clínico e incluyen, por ejemplo, rituximab (Rituxan®, I DEC/Genentech/Roche) (ver, la Patente Norteamericana No. 5,736,137), un anticuerpo anti-CD20 quimérico aprobado para tratar el linfoma que no es de Hodgkin; HuMax-CD20, una proteína anti-CD20 que está siendo actualmente desarrollada por Genmab, un anticuerpo anti-CD20 descrito en la Patente Norteamericana No. 5,500,362, A E-133 (Applied Molecular Evolution), hA20 (Immunomedics, Inc.), HumaLYM (Intracel), y PRO70769 (PCT/US2003/040426, titulada "Variantes de I nmunoglobulina y Usos de los Mismos" (Immunoglobulin Variants and Uses Thereof); trastuzumab (Herceptin®, Genentech) (ver, la Patente Norteamericana No. 5,677,171), un anticuerpo anti-Her2/neu humanizado aprobado para tratar el cáncer de mama; pertuzumab (rhuMab-2C4, Omnitarg®), que está siendo desarrollado actualmente por Genentech, un anticuerpo anti-Her2 descrito en la Patente Norteamericana No. 4,753,894; cetuximab (Erbitux®, Imclone) (Patente Norteamericana No. 4,943,533; PCT documento WO 96/40210), un anticuerpo anti-EGFR quimérico en ensayos clínicos para una variedad de cánceres; ABX-EGF (Patente Norteamericana No. 6,235,883), que está siendo desarrollada actualmente por Abgenix-lmmunex-Amgen; HuMax-EGFr (Patente Norteamericana Serie No. 10/172,317), que está siendo desarrollada actualmente por Genmab; 425, EMD55900, EMD62000, y EMD72000 (Merck KGaA) (Patente Norteamericana No. 5,558,864; Murthy y asociados 1987, en Arch. Biochem. Biophys., 252(2): páginas 549 a 560; Rodeck y asociados, 1987, en J Cell Biochem., 35(4): páginas 315 a 320; Kettleborough y asociados, 1991, en Protein Eng. 4(7): páginas 773 a 783); ICR62 (Institute of Cáncer Research) (PCT documento WO 95/20045; Modjtahedi y asociados, 1993, en J. Cell Biophys., 1993, 22(1-3): páginas 129 a 146; Modjtahedi y asociados, 1993, en Br. J Cáncer, 1993, 67(2): páginas 247 a 253; Modjtahedi y asociados, 1996, en Br. J. Cáncer, 73(2): páginas 228 a 235; Modjtahedi y asociados, 2003, en Int. J. Cáncer, 105(2): páginas 273 a 280); TheraCIM hR3 (YM Biosciences, Canadá y Centro de Inmunología Molecular, Cuba (la Patente Norteamericana No. 5,891,996; la Patente Norteamericana No. 6,506,883; Mateo y asociados, 1997, en Immunotechnology, 3(1): páginas 71 a 81); mAb-806 (Ludwig Institue for Cáncer Research, Memorial Sloan-Kettering) (Jungbluth y asociados 2003, en Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 100(2): páginas 639 a 644); KSB-102 (KS Biomedix); MR1-1 (IVAX, National Cáncer Institute) (PCT WO 0162931A2); y SC100 (Scancell) (PCT documento WO 01/88138); alemtuzumab (Campath®, Millenium), un anticuerpo monoclonal humanizado actualmente aprobado para el tratamiento de la leucemia linfocítica crónica de la célula-B; muromonab-CD3 (Orthoclone OKT3®), un anticuerpo anti-CD3 desarrollado por Ortho Biotech/Johnson & Johnson, ibritumomab tiuxetan (Zevalin®), un anticuerpo anti-CD20 desarrollado por IDEC/Schering AG, gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg®), un anticuerpo anti-CD33 (proteína p67) desarrollado por Celltech/Wyeth , alefacept (Amevive®), una fusión Fe anti-LFA-3 desarrollada por Biogen), abciximab (ReoPro®), desarrollado por Centocor/Lilly , basiliximab (Simulect®), desarrollado por Novartis, palivizumab (Synagis®), desarrollado por Medimmune, infliximab (Remicade®), un anticuerpo anti-TNFa desarrollado por Centocor, adalimumab (Humira®), D2E7, un anticuerpo anti-TNFa desarrollado por Abbott, Humicade®, un anticuerpo anti-TNFa desarrollado por Celltech, golimumab (CNTO- 48), un anticuerpo TNF completamente humano desarrollado por Centocor, etanercept (Enbrel®), una fusión Fe del receptor TNF p75 desarrollada por Immunex/Amgen ; lenercept, una fusión Fe del receptor TNF p55 anteriormente desarrollada por Roche, ABX-CBL, un anticuerpo anti-CD147 que está siendo desarrollado por Abgenix, ABX-IL8, un anticuerpo anti-l L8 que está siendo desarrollado por Abgenix, ABX-MAI , un anticuerpo anti-MUC18 que está desarrollado por Abgenix, Pemtumomab (R1549, 90Y-muHMFG 1 ), un anticuerpo anti- UC1 en desarrollo por Antisoma, Therex (R1550), un anticuerpo anti-MUC1 que está siendo desarrollado por Antisoma, AngioMab (AS 1405), que está siendo desarrollado por Antisoma, HuBC-1, que está siendo desarrollado por Antisoma, Thioplatin (AS1407) que está siendo desarrollado por Antisoma, Antegren® (nataiizumab), un anticuerpo anti-alpha-4-beta-1 y alpha-4-beta-7 (VLA-4) que está siendo desarrollado por Biogen, VLA-1 mAb, un anticuerpo anti-VLA-1 a integrina que está siendo desarrollado por Biogen, LTBR mAb, un anticuerpo receptor de anti-linfotoxina beta (LTBR) que está siendo desarrollado por Biogen, CAT-152, un anticuerpo anti-TGF-32 que está siendo desarrollado por Cambridge Antibody Technology, ABT 874 (J695), un anticuerpo anti-IL-12 p40 que está siendo desarrollado por Abbott, CAT-192, un anticuerpo anti-TGFpl que está siendo desarrollado por Cambridge Antibody Technology and Genzyme, CAT-213, un anticuerpo anti-Eotaxinal que está siendo desarrollado por Cambridge Antibody Technology, LymphoStat-B® , un anticuerpo anti-Blys que está siendo desarrollado por Cambridge Antibody Technology and Human Genome Sciences Inc., TRAIL-R1 mAb, un anticuerpo anti-TRAI L-R1 que está siendo desarrollado por Cambridge Antibody Technology and Human Genome Sciences, Inc., Avastin® bevacizumab, rhuMAb-VEGF), un anticuerpo anti-VEGF que está siendo desarrollado por Genentech, un anticuerpo de la familia receptora anti-HER que está siendo desarrollado por Genentech, un Factor Anti-Tejido (ATF), que está siendo desarrollado por Genentech, Xolair® (Omalizumab), un anticuerpo anti-lgE que está siendo desarrollado por Genentech, Raptiva® (Efalizumab), aun anticuerpo anti- CD11a que está siendo desarrollado por Genentech and Xoma, un Anticuerpo MLN-02 (anteriormente LDP-02), que está siendo desarrollado por Genentech and Millenium Pharmaceuticals, HuMax CD4, un anticuerpo anti-CD4 que está siendo desarrollado por Genmab, HuMax-IL15, un anticuerpo anti-IL15 que está siendo desarrollado por Genmab and Amgen, HuMax-Inflam, que está siendo desarrollado por Genmab and Medarex, HuMax-Cancer, un anticuerpo anti-Heparanase I que está siendo desarrollado por Genmab and Medarex and Oxford GcoSciences, Linfoma HuMax, que está siendo desarrollado por Genmab and Amgen, HuMax-TAC, que está siendo desarrollado por Genmab, IDEC-131, y un anticuerpo anti-CD40L que está siendo desarrollado por IDEC Pharmaceuticals, IDEC-151 (Clenoliximab) , un anticuerpo anti- CD4 que está siendo desarrollado por IDEC Pharmaceuticals, IDEC-114, un anticuerpo anti-CD80 que está siendo desarrollado por IDEC Pharmaceuticals, IDEC- 152, un anticuerpo anti-CD23 que está siendo desarrollado por IDEC Pharmaceuticals, anticuerpos del factor de migración anti-macrófagos (MIF) que están siendo desarrollados por IDEC Pharmaceuticals, BEC2, un anticuerpo anti-idiotípico que está siendo desarrollado por Imclone, IMC-1C11, un anticuerpo anti-KDR que está siendo desarrollado por Imclone, DC 101, un anticuerpo anti-flk-1 que está siendo desarrollado por Imclone, anticuerpos anti-VE caderina que están siendo desarrollados por Imclone, CEA-Cide® (labetuzumab), un anticuerpo del antígeno anti-carcinoembrionario (CEA) que está siendo desarrollado por Immunomedics, LymphoCide® (Epratuzumab), un anticuerpo anti-CD22 que está siendo desarrollado por Immunomedics, AFP-Cide, que está siendo desarrollado por Immunomedics, MyelomaCide , que está siendo desarrollado por Immunomedics, LkoCide, que está siendo desarrollado por Immunomedics, ProstaCide, que está siendo desarrollado por Immunomedics, MDX-010, un anticuerpo anti-CTLA4 que está siendo desarrollado por Medarex, MDX-060, un anticuerpo anti-CD30 que está siendo desarrollado por Medarex, MDX-070 que está siendo desarrollado por Medarex, MDX-018 que está siendo desarrollado por Medarex, Osidem® (IDM-I), y un anticuerpo anti-Her2 que está siendo desarrollado por Medarex and Immuno-Designed Molecules, HuMax®-CD4, un anticuerpo anti-CD4 que está siendo desarrollado por Medarex and Genmab, HuMax-IL15, un anticuerpo anti-l L 15 que está siendo desarrollado por Medarex and Genmab, CNTO 148, un anticuerpo anti-TNFa que está siendo desarrollado por Medarex and Centocor/J&J, CNTO 1275, un anticuerpo anti-citocina que está siendo desarrollado por Centocor/J&J, MOR101 y MOR102, anticuerpos de molécula-1 de adhesión anti- intercelular (ICAM-1) (CD54) que está siendo desarrollado por MorphoSys, MOR201, un anticuerpo del receptor 3 del factor de crecimiento anti-fibroblasto (FGFR-3) que está siendo desarrollado por MorphoSys, Nuvion® (visilizumab), un anticuerpo anti-CD3 que está siendo desarrollado por Protein Design Labs, HuZAF®, un anticuerpo interferón anti-? que está siendo desarrollado por Protein Design Labs, Integrina anti-a 5ß1, que está siendo desarrollada por Protein Design Labs, anticuerpo anti-IL-12, que está siendo desarrollado por Protein Design Labs, ING-1, un anticuerpo anti-Ep-CAM que está siendo desarrollado por Xoma, Xolair® (Omalizumab), un anticuerpo anti-lgE humanizado desarrollado por Genentech and Novartis, y MLN01, un anticuerpo ant¡^2 integrina que está siendo desarrollado por Xoma. Todas las referencias anteriormente citadas en este párrafo están expresamente incorporadas a la presente descripción como referencia.

Los ejemplos particulares de las proteínas de enlace terapéuticas útiles en los métodos descritos en la presente descripción incluyen infliximab (anti-TNF-a, vida media humana in vivo de 8 días), trastuzumab (anti-HER2, vida media humana in vivo de 12 días), rituximab (anti-CD20, vida media humana in vivo de 20 días en pacientes de artritis reumatoide), palivizumab (virus sincitial anti-respiratorio (RSV), vida media humana in vivo de 18 días), daclizumab (anti-CD25, por ejemplo, receptor anti-IL-2, vida media humana in vivo de 20 días), y basiliximab (anti-CD25, por ejemplo, el receptor anti-IL-2, vida media humana in vivo de 7.2 días), y etanercept (se enlaza al TNFa, vida media humana in vivo de 4.25 días). La proteína de enlace recombinante etanercept tiene la porción de enlace de ligando del receptor p75 de TNF fusionada a una región Fe de ¡nmunoglobulina, la cual comprende un doblez de Ig. Por consiguiente, como se demostró en el Ejemplo 2, el etanercept es útil como una proteína de enlace de referencia para los métodos aquí descritos.

En cualquier composición o método aquí descrito, los equivalentes conocidos o descritos de cualquier elemento o paso esencial nombrado pueden ser substituidos por ese elemento o paso.

A menos que se indique específicamente, una composición o método no está limitada por orden particular alguno de los elementos o pasos de la lista.

A menos que se indique lo contrario, el significado de otros términos será claro a partir del contexto o será entendido como el mismo como lo entienden y son utilizados por los expertos en la técnica.

La presente invención está basada en parte en el descubrimiento de que la vida media calculada (t1/2) de la proteína de enlace en una reacción de disociación de proteasa in vitro está altamente correlacionada con su vida media in vivo, por ejemplo, su vida media en los humanos. Por consiguiente, se proporcionan métodos que pueden ser utilizados para estimar la vida media in vivo de la proteína de enlace de interés sin emplear mano de obra, tiempo, y gastos para realizar los estudios farmacocinéticos humanos o de mamíferos pequeños in vivo reales. En particular, los métodos aquí descritos para la estimación de la vida media in vivo de una proteína de enlace de interés comprende calcular la vida media proteolítica in vitro para la proteína de enlace de interés y por cada una de por lo menos dos proteínas de enlace de referencia para las cuales son conocidas las vidas medias in vivo. Una correlación entre las vicias medias in vivo conocidas y las vidas medias proteolíticas in vitro calculadas de cada una de las proteínas de enlace de referencia es determinada (por ejemplo, gráficamente o por medio de computadora). La vida media proteolítica in vitro de la proteína de enlace de interés puede entonces ser aplicada a la correlación para estimar su vida media in vivo correspondiente.

En una modalidad de la presente invención, un método para estimar la vida media in vivo de una proteína de enlace de interés comprende: (a) determinar la vida media proteolítica in vitro en un ensayo de reacción de proteasa in vitro por cada una de por lo menos dos proteínas de enlace de referencia y para una proteína de enlace de interés, en donde las proteínas de enlace de referencia tienen diferentes vidas medias in vivo conocidas en un sujeto, (b) determinar una correlación entre las vidas medias in vivo conocidas del sujeto y las vidas medias proteolíticas in vitro de las proteínas de enlace de referencia, (c) estimar de la correlación entre las vidas medias in vivo conocidas del sujeto y las vidas medias proteolíticas in vitro de las proteínas de enlace de referencia la vida media in vivo del sujeto de las proteínas de enlace de interés que se correlacionan con la vida media proteolítica in vitro de la proteína de enlace de interés.

En un aspecto, el sujeto puede ser un animal. El animal puede incluir tanto invertebrados como vertebrados incluyendo mamíferos, peces, aves, reptiles, y anfibios. Los mamíferos pueden incluir ratas, ratones, cobayos, conejos, monos, ovejas, cabras, caballos, y similares. En un aspecto particular, el sujeto es un humano.

Se conocen una variedad de proteasas y están fácilmente disponibles en la técnica para utilizarse en los métodos aquí descritos. Dichas proteasas incluyen, pero no están limitadas a, termolisina, elastasa, pepsina, tripsina, quimiotripsina, papaína, y combinaciones de las mismas. Otras proteasas que se consiguen comercialmente están incluidas dentro del alcance de la presente invención y son bien conocidas para los expertos en la técnica. Una proteasa o combinación de proteasas útiles en los métodos aquí descritos es una para la cual las condiciones pueden ser optimizadas para producir la disociación significante, pero que se puede medir, de cada una de las dos o más proteínas de enlace de referencia así como las cantidades significativamente diferentes de disociación para cada una de las dos o más proteínas de enlace de referencia. En un aspecto, el ensayo proteolítico in vitro es realizado en las proteínas de enlace de referencia proteolíticas tratadas y una o más proteínas de enlace de interés en un día o menos, en tres horas o menos, en dos horas o menos, o en una hora o menos.

Cualquiera de una variedad de métodos conocidos en la técnica puede ser utilizada, sola o en combinación, para seguir y medir la disociación proteolítica de una proteína. Dichos métodos incluyen, pero no están limitados a, electroforesis de gel de poliacrilamida, electroforesis en un chip de microfluido (ver Ejemplo 2), separación cromatográfica y análisis de proteínas o fragmentos de las mismas, técnicas de inmunodetección para identificar una proteína o fragmentos de las mismas, y espectrometría de masa de una proteína de enlace o fragmentos de las mismas. Por lo tanto, una proteasa o combinación de proteasas para utilizarse en los métodos aquí descritos disociará las proteínas de enlace de referencia y las proteínas de enlace de interés en un período de tiempo que permite la determinación exacta de la cantidad de disociación y, a la vez, un cálculo exacto de la vida media proteolítica in vitro para cada proteína de enlace.

En un aspecto, una proteasa o combinación de proteasas útiles en los métodos aquí descritos disociarán las proteínas de enlace de referencia y las proteínas de enlace de interés en un período de tiempo que es lo suficientemente rápido para permitir el uso de rutina en un programa de selección de alta producción, por ejemplo, de modo que las vidas medias proteolíticas in vitro de una o más proteínas de enlace de interés pueden ser determinadas en un período de tiempo razonable, por ejemplo, de un día o menos.

Un ejemplo de una proteasa adecuada para utilizarse en los métodos aquí descritos es la termolisina, la cual como aquí se muestra (Ejemplo 2), puede ser utilizada en un ensayo de rutina in vitro para disociar las proteínas de enlace de tal manera que las vidas medias proteolíticas portadas por termolisina in vitro calculadas están altamente correlacionadas con sus vidas medias in vivo del sujeto respectivo, por ejemplo, un humano. La termolisina es adecuada en parte debido a que las condiciones de la proteólisis pueden ser optimizadas para producir una correlación lineal entre la vida media proteolítica in vitro de las proteínas de enlace de referencia y sus vidas medias in vivo del sujeto conocidas respectivas.

La correlación entre la vida media in vivo del sujeto y la vida media in vitro proteolítica puede ser determinada gráficamente trazando las vidas medias in vivo del sujeto conocidas de dos o más proteínas de enlace de referencia contra sus vidas medias de proteasa in vitro calculadas y dibujando la curva estándar que mejor se adapte (lineal o de otra forma) a través de los puntos de datos para revelar la correlación de una vida media in vivo del sujeto con una vida media proteolítica in vitro. Por su puesto no es necesario dibujar realmente dicha curva estándar, ya que cualquier correlación puede ser determinada por computadora, por ejemplo, utilizando una calculadora, programa de cómputo, y similar, o simplemente utilizando la correlación determinada por la computadora para estimar la vida media in vivo de una proteína de enlace de interés.

Una curva estándar adecuada útil en los métodos aquí descritos, es una representación gráfica de una correlación lineal entre la vida media in vivo en un sujeto y la vida media proteolítica in vitro de las proteínas de enlace. Un ejemplo de dicha curva estándar histórica se muestra en la figura 1. La exactitud de la estimación de la vida media in vivo en un sujeto para una proteína de enlace de interés que utiliza una curva estándar generada anteriormente será mejorada hasta el grado de que el ensayo de reacción proteolítico utilizado para calcular los datos de vida media proteolítica in vitro de las proteínas de enlace de referencia sea repetido para determinar los datos de la vida media proteolítica in vitro para la proteína de enlace de interés. Por ejemplo, la curva estándar lineal de la figura 1 fue producida como se describió en el Ejemplo 2; y la vida media humana in vivo estimada por comparación de la vida media proteolítica in vitro de una proteína de enlace de interés contra la curva estándar en la figura 1 es la más exacta siempre que el ensayo de proteólisis in vitro sea realizado bajo condiciones idénticas a las utilizadas para generar esa curva estándar.

La correlación entre la vida media humana in vivo y la vida media proteolítica de termolisina in vitro mostrada en la curva estándar de la figura 1 es estadísticamente importante y predictiva de la vida media in vivo como lo indica el cuadrado del coeficiente de correlación (R2) = 0.885. Entre más cercano sea el valor de R2 a 1.00, el valor de la vida media in vitro es más predictivo para el valor de la vida media in vivo. Un valor R2 de 0.885 indica que el 88.5% del valor de los puntos de datos es explicado por la regresión lineal. Por lo tanto, un R2 de 0.885 para una curva estándar lineal como se muestra en la figura 1, indica objetivamente que la disociación portada por termolisina in vitro de las proteínas de enlace es un método válido para pronosticar las vidas medias humanas in vivo de las proteínas de enlace. Por consiguiente, los métodos aquí descritos que emplean una reacción de disociación proteolítica portada por termolisina in vitro (o su equivalente) y las proteínas de enlace de referencia con vidas medias humanas in vivo producen valores importantes estadísticamente para las vidas medias humanas in vivo de las proteínas de enlace de interés. Sin embargo, se pueden utilizar otras proteasas también en los métodos aquí descritos.

Un método de acuerdo con la presente invención para estimar la vida media in vivo de una proteína de enlace de interés por medio de computadora, por ejemplo, sin producir una nueva curva estándar, comprende determinar la vida media in vitro de un ensayo de reacción proteolítica que utiliza, por ejemplo, la termolisina y posteriormente calcular la vida media in vivo estimada de acuerdo con la fórmula lineal: y = 0.27x + 2.79 en donde "y" es la vida media humana in vivo en días, "0.27" es la inclinación de la correlación lineal entre la vida media in vivo y la vida media proteolítica de termolisina in vitro, "x" es la vida media in vitro en un ensayo de proteólisis de termolisina, y la constante "2.79" es la vida media in vivo correspondiente a una vida media proteolítica in vitro de cero a lo largo de la correlación lineal. Los valores para "m" y "b" en la fórmula de correlación lineal anterior fueron obtenidos de una curva estándar de la figura 1 que fue generada de los datos del Ejemplo 2 los cuales determinaron las vidas medias proteolíticas de termolisina in vitro de las siguientes proteínas de enlace de referencia: infliximab (anti-TNF-a, vida media humana in vivo de 8 días), trastuzumab (anti-HER2, vida media humana in vivo de 12 días), rituximab (anti-CD20, vida media humana in vivo de 20 días), palivizumab (virus sincitial anti-respiratorio (RSV), vida media humana in vivo de 18 días), daclizumab (anti-CD25, es decir, el receptor anti-IL-2, vida media humana in vivo de 20 días), basiliximab (anti-CD25, es decir, el receptor anti-IL-2, vida media humana in vivo de 7.2 días), y etanercept (enlaza el TNF-a, vida media humana in vivo de 4.25 días). Por consiguiente, el uso de la fórmula de correlación lineal anterior, es necesario para determinar la vida media proteolítica de termolisina in vitro de una proteína de enlace de interés utilizando las mismas condiciones de reacción para un ensayo que se describió en el Ejemplo 2.

En un procedimiento alternativo, también deberá quedar entendido que si los materiales de las proteínas de enlace de referencia están disponibles, entonces se puede generar una nueva correlación, por ejemplo, una curva estándar nueva (gráficamente o por computadora) para las vidas medias in vivo del sujeto conocidas de las proteínas de enlace de referencia y sus vidas medias proteolíticas in vitro respectivas (tales como portadas por termolisina) determinadas en paralelo y en el mismo momento que la vida media proteolítica in vitro para la proteína de enlace de interés. De este modo, una vida media in vivo del sujeto de una proteína de enlace de interés puede ser estimada de una curva estándar generada recientemente o la fórmula de computación correspondiente.

Generalmente, las mezclas de reacción de proteasa son relativamente simples de preparar, operar, y terminar ya sea manual o robóticamente. Las reacciones de disociación proteolítica estándar generalmente comprenden una proteasa seleccionada o combinación de proteasas, un regulador para producir una reacción de pH apropiada, cualesquiera especies iónicas que pueden ser requeridas para la actividad proteolítica, y un substrato de proteína seleccionada (por ejemplo, una proteína de enlace como aquí se describe).

Varios reguladores para mantener el pH apropiado y/u otras condiciones para una reacción de disociación portada por una proteasa seleccionada o combinación de proteasas son conocidas y fácilmente disponibles para el practicante con experiencia en la técnica y son fácilmente determinadas por optimización de rutina. En el caso de una reacción de disociación proteolítica portada por termolisina, los reguladores útiles incluyen, pero no están limitados a, regulador de acetato de sodio/cloruro de calcio (pH alrededor de 7.8), 1X PBS/cloruro de calcio (pH alrededor de 7.5), y HEPES/cloruro de calcio.

En el caso de termolisina, un ensayo proteolítico de termolisina adecuado útil en los métodos aquí descritos comprende: proteína de enlace (hasta alrededor de 50 pg); 1X PBS/cloruro de calcio (pH de aproximadamente 7.5); y termolisina (por ejemplo, de aproximadamente 2 hasta aproximadamente 4 unidades de termolisina tal y como se consiguen en Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, Missouri, catálogo No. T7902). En un aspecto, la reacción se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 37°C y las muestras son removidas periódicamente para analizar la disociación de la proteína de enlace.

La reacción de la disociación proteolítica puede ser terminada por cualquiera de una variedad de medios. Si un ión de metal divalente es crítico para la actividad de la proteasa (por ejemplo, calcio, magnesio), entonces la reacción de disociación proteolítica puede ser terminada fácilmente mediante la adición de uno o más queladores de ión de metal, tales como EDTA o EGTA. Alternativamente, la reacción de disociación proteolítica puede ser terminada por medios más generales incluyendo, pero sin limitarse a, la desnaturalización de la proteasa por medio de calentamiento o ebullición, la desnaturalización por medio de un reactivo químico (por ejemplo, detergente, solvente orgánico, agente caotrópico), y la remoción selectiva de proteasa o substrato de la mezcla de reacción (por ejemplo, cuando la proteasa o sus substratos están enlazados a una partícula que se puede recuperar u otro substrato sólido que puede ser secuestrado o separado de otro modo de la mezcla de reacción).

Como se observó anteriormente, la determinación de la cantidad de disociación de la proteína de enlace o, alternativamente, la fracción restante de la proteína de enlace no disociada con el paso del tiempo en una reacción de disociación proteolítica in vitro es fácilmente obtenida por medios disponibles en la técnica (por ejemplo, métodos electroforéticos, métodos de inmunodetección, espectrometría de masa). Por ejemplo, las muestras que son removidas en diferentes tiempos de una reacción de disociación proteolítica in vitro de uno a proteína de enlace pueden ser sometidas a electroforesis a través de un gel de poliacrilamida, y el gel teñido o sometido a inmunoteñido para revelar una o más bandas correspondientes a las moléculas de la proteína de enlace y/o los fragmentos de disociación de la misma. De este modo, es posible monitorear la desaparición de una banda de gel correspondiente a la proteína de enlace sin disociar en el curso de la reacción de disociación proteolítica. La fracción restante de la proteína de enlace no disociada entonces puede ser cuantificada en cada punto del tiempo, por ejemplo, explorando la banda de gel particular en cada punto del tiempo (por ejemplo, columna en el gel) con un densitómetro láser, o instrumento equivalente. Una mejora reciente en el análisis electroforético estándar de los productos de disociación proteolítica es el uso de un chip de microfluido acoplado con un software de computadora. Un ejemplo del uso del chip de microfluido es proporcionado en el Ejemplo 2. Dichos chips de microfluido emplean volúmenes de muestra muy pequeños (por ejemplo, microlitros, nanolitros) para separar y analizar las proteínas de la muestra. Las proteínas separadas en una migración electroforética pueden ser detectadas y cuantificadas utilizando fluorescencia inducida por láser, y los datos recopilados y analizados por un software apropiado en una computadora conectada al chip. Los datos pueden ser procesados para producir la imagen de gel virtual para ilustrar la separación electroforética y la migración de las proteínas de la muestra.

La desaparición de la banda de proteína correspondiente a la proteína de enlace sin disociar (en una banda de gel o una banda de gel virtual) puede por lo tanto ser monitoreada y cuantificada en el curso de la reacción de disociación proteolítica por diferentes métodos. La cantidad de una banda de proteína puede ser trazada gráficamente o por computadora contra el tiempo de reacción para determinar la vida media proteolítica in vitro. La constante del índice del pseudo-primer orden aparente de disminución (Kapp) y la vida media aparente (ti/2) para una proteína de enlace en una reacción de disociación proteolítica in vitro son calculadas fácilmente mediante fórmulas estándar familiares para los expertos en la técnica. La fracción no disociada restante (r) de la proteína de enlace puede entonces ser cuantificada midiendo el área debajo de la curva de la proteína restante (y) en el momento específico (t) dividido entre el área bajo la curva del anticuerpo no disociado (y0) en el tiempo cero (r = y/y0). El trazo de la fracción restante (r) contra el tiempo proporciona la función de disminución exponencial que describe la disociación de la proteína de enlace portada por la proteasa. Por lo tanto, en el caso de una correlación lineal, la fórmula estándar r = e"(Kapp l) puede ser solucionada entonces para obtener la constante del índice de pseudo-primer orden aparente Kapp, la cual a la vez puede ser utilizada para calcular la vida media proteolítica in vitro de la proteína de enlace de la fórmula estándar t1 2 = 1n 2/Kapp.

Las vidas medias proteolíticas in vitro de dos o más proteínas de enlace de referencia pueden entonces ser trazadas (gráficamente o por computadora) contra sus vidas medias humanas in vivo conocidas. Como se observó anteriormente, la línea de referencia histórica (curva estándar) de la figura 1 puede ser utilizada para estimar la vida media humana in vivo de una proteína de enlace de interés para la cual ha sido obtenida la vida media proteolítica in vitro en una reacción de proteólisis portada por termolisina utilizando las condiciones de reacción descritas en el Ejemplo 2. La exactitud de la vida media in vivo estimada utilizando la figura 1 es mejorada hasta el grado de que el ensayo de reacción proteolítica de termolisina utilizado para producir los datos de la vida media proteolítica in vitro de las proteínas de enlace de referencia es repetida para producir los datos de la vida media proteolítica in vitro para una proteína de enlace de interés.

Debido al descubrimiento de que la vida media proteolítica in vitro de una proteína de enlace está correlacionada fuertemente con la vida media humana in vivo de la proteína de enlace, las vidas medias proteolíticas in vitro pueden ser utilizadas para obtener dos o más proteínas de enlace de interés con respecto a sus vidas medias in vivo en una base relativa, por ejemplo, en la ausencia de elaborar una estimación de las vidas medias in vivo como se describieron anteriormente. Dicho ordenamiento de las proteínas de enlace de interés tiene un valor particular en la selección de alta producción de números relativamente grandes de proteínas de enlace candidato para utilizarse en la terapia. Por ejemplo, un rango relativamente amplio de diferencias entre las vidas medias proteolíticas in vitro entre las diferentes proteínas de enlace de interés indica un amplio rango de diferencias en sus vidas medias in vivo respectivas. En dicho caso, el practicante puede decidir que es más eficiente y económico enfocar la selección o desarrollo adicional en un subgrupo que contiene proteínas de enlace que tienen vidas medias proteolíticas in vitro relativamente altas en comparación con otras proteínas de enlace .

En los estudios o procedimientos para modificar o mejorar una o más propiedades de una proteína de enlace de interés, la vida media proteolítica in vitro es una indicación fácilmente obtenida de si una modificación impactará la vida media in vivo de la proteína de enlace de interés, ya sea de manera adversa o de una manera deseable. Por ejemplo, en un programa de maduración por afinidad, en donde una familia de moléculas de anticuerpos es creada la cual tiene pequeñas variaciones, por ejemplo, en uno o más de los CDRs de la molécula del anticuerpo de origen, todos los miembros de la familia pueden tener una afinidad de enlace aceptable para un antígeno particular, pero el impacto de las variaciones puede tener un impacto perjudicial sobre otras propiedades deseables, tales como la vida media in vivo. En dicha situación, los métodos aquí descritos son útiles para determinar cuales miembros de una familia de moléculas de anticuerpo tienen vidas medias in vivo relativamente más largas y las cuales tienen vidas medias in vivo relativamente cortas.

Deberá quedar entendido que las condiciones para un ensayo proteolítico in vitro utilizadas en los métodos aquí descritos son diseñadas para obtener las vidas medias proteolíticas in vitro para las dos o más proteínas de enlace de referencia y, a la vez, generar una correlación o curva estándar para pronosticar la vida media in vivo de una proteína de enlace de interés. Igual que con cualquier ensayo que comprende una correlación o curva estándar, los valores más confiables para las vidas medias in vivo de las proteínas de enlace de interés serán aquellas que son obtenidas dentro de la región de la correlación o curva estándar que se encuentra entre los puntos de datos de dos o más proteínas de enlace de referencia, por ejemplo, en donde los valores son interpolados entre los datos de referencia, y los valores menos confiables para las vidas medias in vivo de las proteínas de enlace de interés probablemente para aquellas que son obtenidas fuera de esa región de la correlación o la curva estándar, por ejemplo, en donde los valores son extrapolados más allá de los datos de las proteínas de enlace de referencia.

Las modalidades adicionales y características de la presente invención se podrán apreciar a partir de los siguientes ejemplos no limitativos.

EJEMPLOS Ejemplo 1. Selección inicial de proteasas para las reacciones de disociación parcial in vitro de las proteínas de enlace de referencia terapéuticas.

La tripsina, elastasa, quimiotripsina , y termolisina fueron inicialmente probadas por su capacidad para producir diferentes cantidades de disociación de proteínas de enlace con vidas medias humanas in vivo conocidas. Se emplearon condiciones de reacción de disociación de proteasa estándar, y el curso de la disociación de cada proteína de enlace por cada una de las proteasas fue seguida durante el tiempo utilizando electroforesis de gel de poliacrilamida.

Las preparaciones del material (10 mg/mL) fueron hechas en solución salina regulada por fosfato 1X (PBS) de las siguientes proteínas de enlace (por ejemplo, proteínas de enlace de referencia): ¡nfliximab (REM ICADE® infliximab, Centocor, Inc., Horsham, Pennsylvania), trastuzumab (HERCEPTIN® trastuzumab, Genentech, Inc., South San Francisco, California), rituximab (RITUXAN® rituximab, Genentech, Inc., South San Francisco, California y Biogen IDEC, Cambridge, Massachusetts), palivizumab (SYNAGIS® palivizumab, Medlmmune, Inc., Gaithersburg , Maryland), daclizumab (ZENAPAX® daclizumab, Hoffmann-La Roche Inc., Nutley, New Jersey), basiliximab (SEVIULECT® basiliximab, Novartis International AG, Basel, Suiza), y etanercept (ENBREL® etanercept, AMGEN, Thousand Oaks, California y Wyeth Pharmaceuticals, Inc., Philadelphia, Pennsylvania).

El análisis inicial indicó que todas las proteínas de enlace fueron susceptibles hasta algún grado de disociación por cada una de las proteasas. Por ejemplo, la termolisina fue efectiva para proporcionar la disociación que se puede observar de cada proteína de enlace de referencia con el tiempo así como para producir diferentes cantidades de disociación proteolítica para cada una de las proteínas de enlace de referencia. Los datos de la proteólisis portada por termolisina de cada una de las proteínas de enlace de referencia anteriormente mencionadas se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. Disociación Portada por Termolisina de las Moléculas de Anticuerpo de Referencia Proteína Porcentaje de Fracción Restante de las Proteínas de Enlace de de Enlace Referencia en los Tiempos de Reacción Indicados de Referencia (minutos) Ejemplo 2. Proteólisis de termolisina in vitro para estimar la vida media in vivo (ti/2) de proteínas de enlace de interés.

Este ejemplo demuestra una correlación altamente lineal entre la vida media humana in vivo (t1 2) y la vida media proteolítica portada por termolisina in vitro de las proteínas de enlace.

Materiales y Métodos La termolisina de Bacillus thermoproteolyicus rokko fue obtenida en Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, Missouri, catálogo No. T7902).

Regulador de Reacción 10X: 500 mM de acetato de sodio, 100 mM cloruro de calcio, pH = 7.

Equipo del chip de microfluido Express LabChip proteína HT (Lote No. B911A, Caliper Life Sciences, Hopkinton, Massachusetts).

Las microplacas de reacción de cadena de polimerasa (PCR) de 96 depósitos (catálogo no. PCR-96-FS-C, Axygen Scientific, Inc., Union City, California).

Solución de Detención: EDTA 0.5 M, pH 7.5.

Regulador de Desnaturalización: Regulador de muestra de proteína HT que contiene LDS de Caliper Life Sciences (Este regulador de propiedad es proporcionado por el fabricante Labchip LC90).

Proteólisis v análisis de la Molécula de Proteína de Enlace Se prepararon soluciones de proteína de enlace (1 mg/mL) en PBS 1X. La solución de proteasa de termolisina se volvió a suspender en agua en 8 mg/mL antes de iniciar la reacción de disociación proteolítica.

Reacción de disociación de proteasa de termolisina: Un tubo de reacción eppendorf de 1.5 ml_ contenía: 40 µ?_ de proteína de enlace (1 mg/mL), 50 µ!_ de Regulador de Reacción 10X para formar el Regulador de Reacción 1X, 5 µ?_ de termolisina (8 mg/mL) para elaborar una proporción de anticuerpo: proteasa 1:1 (p:p).

La reacción de disociación fue incubada a una temperatura de 37°C En los tiempos especificados en la reacción de disociación, las muestras (4 pL) fueron removidas y mezcladas con Solución de Detención EDTA (2 pL) en depósitos de microplacas PCR de 96 depósitos. Se agregó el regulador de desnaturalización (6 pL) a cada depósito, y la microplaca fue incubada a temperatura ambiente (RT) durante 2 horas o durante la noche. Luego, se le agregaron 10 pL de agua a cada depósito antes de leerlo en el chip de microfluido LabChip Caliper 90 preparado y utilizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Una lectura de una muestra de control (no es termolisina) en el tiempo = 0 es crítica para la cuantificación de la disociación proteolítica. Las muestras de las reacciones de disociación proteolítica de termolisina fueron removidas y terminadas a los 0, 10, 20, 45, 60, 80, 100, 120, y 150 minutos. Una muestra de control (que no es termolisina) fue tomada también a los 150 minutos y como una revisión de la estabilidad de la molécula del anticuerpo.

Resultados Las preparaciones que se consiguen comercialmente de las proteínas de enlace de referencia con vidas medias humanas in vivo conocidas sirvieron como substratos en una reacción de disociación proteolítica portada por termolisina in vitro. La termolisina produjo una disociación significativa pero mensurable de cada una de las proteínas de enlace de referencia así como significativamente diferentes cantidades de disociación de cada una de las proteínas de enlace de referencia. Las cantidades respectivas de disociación in vitro (por minuto) fueron determinadas para cada una de las proteínas de enlace. Las cantidades de disociación proteolítica in vitro fueron entonces utilizadas para calcular las vidas medias (catalíticas) proteolíticas portadas por termolisina aparentes correspondientes (minutos).

La tabla 2 resume las cantidades de disociación proteolítica in vitro aparentes (por minuto), la vida media proteolítica in vitro aparente (minutos), y los medios publicados de las vidas medias humanas in vivo (días) para cada una de las proteínas de enlace terapéuticas.

Tabla 2 El trazo de la farmacocinética humana media publicada de la vida media in vivo (días) contra vida media proteolítica portada por termolisina in vitro (minutos) proporciona la curva estándar mostrada en la figura 1. De manera notable, el cuadrado de coeficiente de correlación (R2) para la curva estándar es de 0.885 indicando un alto grado de correlación entre la vida media proteolítica portada por termolisina in vitro de una proteína de enlace y su vida media humana in vivo correspondiente. Este valor alto de R2 demuestra que la disociación portada por termolisina in vitro de las proteínas de enlace modelo válido para un mecanismo predominante que limita las vidas medias in vivo humanas de las proteínas de enlace. Por lo tanto, en la vida media proteolítica de termolisina in vitro para cualquier proteína de enlace determinada utilizando las condiciones de reacción de disociación de termolisina descritas en este estudio se pueden utilizar para estimar la vida media humana in vivo respectiva de la curva estándar mostrada en la figura 1.

Todas las patentes, publicaciones, y solicitudes citadas en el texto anterior están incorporadas a la presente descripción como referencia.

Otras variaciones y modalidades de la presente invención aquí descritas podrán ser apreciadas por los expertos en la técnica sin salirse del alcance de la presente invención.

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Un método para estimar la vida media in vivo en un sujeto de una proteína de enlace de interés que comprende: (a) determinar la vida media proteolítica in vitro en un ensayo de reacción de proteasa in vitro para cada uno de por lo menos dos proteínas de enlace de referencia diferentes y para una proteína de enlace de interés, en donde dichas proteínas de enlace de referencia tienen diferentes vidas medias del sujeto in vivo, (b) determinar una correlación entre la vida media del sujeto in vivo conocida en las vidas medias proteolíticas in vitro de las proteínas de enlace de referencia, (c) estimar de la correlación del punto (b) entre las vidas medias del sujeto in vivo conocidas y las vidas medias proteolíticas in vitro de las proteínas de enlace de referencia las vidas medias del sujeto in vivo de las proteínas de enlace de interés que se correlacionan con las vidas medias proteolíticas in vitro de la proteína de enlace de interés.

2. El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque dicha correlación es una correlación lineal.

3. El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el sujeto es un animal.

4. El método tal y como se describe en la reivindicación 3, caracterizado porque dicho animal es un vertebrado o un invertebrado.

5. El método tal y como se describe en la reivindicación 4, caracterizado porque dicho vertebrado es seleccionado del grupo consistente de mamíferos, peces, aves, reptiles y anfibios.

6. El método tal y como se describe en la reivindicación 5, caracterizado porque dicho mamífero es seleccionado del grupo consistente de rata, ratones, ovejas, cabras, monos, caballos, y humanos.

7. El método tal y como se describe en la reivindicación 6, caracterizado porque el mamífero es un humano.

8. El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque dicha proteasa seleccionada del grupo consistente de termolisina, elastasa, pepsina, tripsina, quimotripsina, papaina, y combinaciones de las mismas.

9. El método tal y como se describe en la reivindicación 8, caracterizado porque dicha proteasa es termolisina.

10. El método tal y como se describe en la reivindicación 1 caracterizado porque dicha correlación es lineal y representada por la fórmula: y = mx + b en donde "y" es la vida media in vivo, "m" es la inclinación observada de la correlación lineal entre la vida media in vivo y la vida media proteolítica portada por proteasa in vitro, "x" es la vida media in vitro determinada en el ensayo de reacción proteolítica, "b" es el cruce de y- correspondiente a una vida media proteolítica in vitro de cero (x = 0) a lo largo de la correlación lineal.

11. El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína de enlace posee uno o más dobleces de inmunoglobulina.

12. El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque por lo menos dos proteínas de enlace de referencia de diferentes son seleccionadas del grupo consistente de: rituximab, daclizumab, HuMax-CD20, HuMax-EGFr, 425, EMD55900, EMD62000, EMD72000, TheraCIM hR3, mAb-806, MR1-1, SC100, alemtuzumab, muromonab-CD3, ibritumomab tiuxetan, gemtuzumab ozogamicin, alefacept, abciximab, basiliximab, palivizumab, infliximab, adalimumab, D2E7, Humicade®, golimumab, etanercept, lenercept, ABX-CBL, ABX- IL8, ABX-MA1, Pemtumomab, Therex (R1550), AngioMab (AS1405), HuBC-1, Thioplatin (AS1407), Antegren® (natalizumab), VLA-1 mAb, LTBR mAb, CAT- 152, ABT 874 (J695), CAT-192, CAT-213, LymphoStat-B® , TRAIL-RImAb, Avastin® bevacizumab, rhuMAb-VEGF, Factor Anti-Tejido (ATF), Xolair® (Omalizumab), Raptiva® (Efalizumab), Anticuerpo MLN- 02, HuMax CD4, HuMax-IL15, HuMax-Inflam, HuMax-Cancer, HuMax-Lymphoma, HuMax-TAC, IDEC-131, IDEC-151, IDEC- 114, IDEC- 152, BEC2, IMC-1C11, DC101, anticuerpos anti-VE de caderina, CEA-Cide® (labetuzumab), LymphoCide® (Epratuzumab), AFP-Cide, MyelomaCide, LkoCide, MDX-010, DX-060, MDX-070, DX-018, Osidem® (IDM-1), HuMax®-CD4, un anticuerpo anti-CD4 está siendo desarrollado por Medarex and Genmab, HuMax-IL15, CNTO 148, CNTO 1275, MOR101, MOR102, MOR201, Nuvion® (visilizumab) , HuZAF®, anti-a 5ß1 Integrin, anti-IL-12, ING-1, Xolair® (Omalizumab), y MLN01.

13. El método tal y como se describe en la reivindicación 12, caracterizado porque al menos dos proteínas de enlace de referencia son seleccionadas infliximab, trastuzumab, rituximab, palivizumab, daclizumab, basiliximab, y etanercept.

14. Un método para estimar la vida media humana in vivo de una proteína de enlace de interés que comprende: (a) determinar la vida media proteolítica in vitro en un ensayo de reacción de proteasa in vitro para cada uno de por lo menos dos proteínas de enlace de referencia diferentes y para una proteína de enlace de interés, en donde dichas proteínas de enlace de referencia tienen vidas medias humanas in vivo conocidas diferentes, (b) determinar una correlación entre las vidas medias humanas in vivo conocidas y las vidas medias proteolíticas in vitro de las proteínas de enlace de referencia, (c) estimar de la correlación del punto (b) entre las vidas medias humanas in vivo conocidas y las vidas medias proteolíticas in vitro de las proteínas de enlace de referencia, las vidas medias humanas in vivo de las proteínas de enlace de interés que se correlacionan con las vidas medias proteolíticas in vitro de la proteína de enlace de interés.

15. El método tal y como se describe en la reivindicación 14, caracterizado porque dicha correlación es lineal y representada por la fórmula: y = 0.27x + 2.79 en donde "y" es la vida media humana in vivo en días, "0.27" es la inclinación de la correlación lineal entre la vida media in vivo y la vida media proteolítica de termolisina in vitro, "x" es en la vida media in vitro en un ensayo de proteólisis de termolisina in vitro y la constante "2.79" es la vida media in vivo correspondiente de una vida media proteolítica in vitro de cero (0 días) a lo largo de la correlación lineal.

16. Un método para determinar las vidas medias humanas in vivo relativas de dos o más proteínas de enlace de interés que comprenden: (a) determinar la vida media proteolítica in vitro en un ensayo de reacción de proteasa in vitro para cada uno de por lo menos dos proteínas de enlace de interés, y (b) comparar las vidas medias proteolíticas in vitro de cada una de las dos o más proteínas de enlace de interés en el paso (a), en donde dicha media humana proteolítica in vitro por cada una de dichas dos o más proteínas de enlace de interés determinada en el paso (a) se correlaciona con la vida media in vivo de cada una de dichas dos o más proteínas de enlace de interés.