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MX2013010172A - Metodo de analisis mutacional correlacionado para mejorar anticuerpos terapeuticos. - Google Patents

Metodo de analisis mutacional correlacionado para mejorar anticuerpos terapeuticos.

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MX2013010172A
MX2013010172A MX2013010172A MX2013010172A MX2013010172A MX 2013010172 A MX2013010172 A MX 2013010172A MX 2013010172 A MX2013010172 A MX 2013010172A MX 2013010172 A MX2013010172 A MX 2013010172A MX 2013010172 A MX2013010172 A MX 2013010172A
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MX
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antibody
antigen
variable domain
sequence
binding protein
Prior art date
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MX2013010172A
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Gunasekaran Kannan
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Amgen Inc
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Abstract

Se describe un método para mejorar la fabricabilidad o desarrollabilidad de anticuerpos mediante un enfoque computacional.

Description

METODO DE ANALISIS MUTACIONAL CORRELACIONADO PARA MEJORAR ANTICUERPOS TERAPEUTICOS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los anticuerpos se han convertido en la modalidad de elección dentro de la industria biofarmacéutica debido a que demostraron ser moléculas terapéuticas muy eficaces y satisfactorias para el tratamiento de varias enfermedades. Con cantidades cada vez mayores de moléculas terapéuticas basadas en anticuerpos que participan en estudios clínicos, la evaluación y mejora de un anticuerpo candidato en la fase temprana del descubrimiento se ha vuelto más importante. Diferentes terminologías, tales como evaluaciones de molécula, fabricabilidad y desarrollabilidad y calidad por diseño, denominaron el proceso. En este sentido, la aplicación de métodos computacionales para el desarrollo de anticuerpos surgió como una valiosa herramienta para el diseño experimental eficaz para reducir costos y tiempo dedicado .
Los anticuerpos pertenecen a la clase de inmunoglobulina de proteínas que incluye IgG, IgA, IgE, IgM e IgD . La clase de inmunoglobulina más abundante en suero humano es IgG, cuya estructura esquemática se muestra en la Figura 1 (Deisenhofer 1981; Huber 1984; Roux 1999) . La estructura de IgG tiene cuatro cadenas, dos cadenas ligeras y dos pesadas, cada Ref.:243323 cadena ligera tiene dos dominios y cada cadena pesada tiene cuatro dominios. El sitio de unión al antígeno está ubicado en la región Fab (fragmento de unión al antígeno) que contiene dominios variables de cadena ligera (VL) y pesada (VH) así como también dominios constantes de cadena ligera (CL) y pesada (CH1) . La región de dominio CH2 y CH3 de la cadena pesada se denomina Fe (Fragmento cristalizable) . La cantidad de enlaces de disulfuro bisagra varía entre las subclases de inmunoglobulina (Papadea y Check 1989) . El sitio de unión a FcRn está ubicado en la región Fe del anticuerpo (Martin et ál . 2001). Los dominios variables VL y VH pueden fusionarse entre sí mediante un polipéptido enlazador y esto provoca la variable del fragmento de cadena simple - scFv. La propia scFv, a pesar de la falta de región Fe que proporciona semivida en suero prolongada, tiene varias aplicaciones en el cáncer. Se reivindica que el menor tamaño de scFv permite mayor penetración en células tumorales .
Se han realizado intentos de mejorar las propiedades farmacéuticas tales como solubilidad y estabilidad de anticuerpos o fragmentos de dominio variable. Estos intentos incluyen la mutación de restos a los más frecuentes según el alineamiento de secuencias de anticuerpo homologas, modificación de giros ß con aminoácidos que son altamente propensos a formar conformación de giros, aumento de la hidrofilicidad de los restos expuestos al solvente, agregado de enlaces de hidrógeno o enlaces de disulfuro adicionales, análisis de biblioteca de grandes cantidades de variantes y evolución dirigida por métodos in vitro o in vivo. También se reportaron en la literatura los métodos que combinan varios de estos enfoques (Monsellier y Bedouelle 2006; ang et ál . 2009). En otro método de modificación, la región determinante de complementariedad de un anticuerpo escasamente expresado o scFv se injertó en un marco preferido que tiene propiedades biofísicas favorables (Jung et ál. 1999). Algunos de estos enfoques se analizan en los artículos publicados ( orn y Pluckthun 2001; Honegger 2008) ) . A pesar de que cada uno de estos métodos solos o en combinación tuvo poco éxito respecto del aumento de la estabilidad, no se garantiza que ninguno de estos funcione en todos los casos de anticuerpos contra diferentes dianas .
En la presente se proporciona un método simplificado que tiene propiedades mejoradas sistemáticamente en los anticuerpos contra múltiples dianas. Aun más importante, los beneficios no son solo la mejora de la estabilidad sino también la reducción del nivel de agregación, mayor resistencia a la oxidación, eliminación de precipitación cuando el pH cambia de 5 a 7 , disminución de la viscosidad y mejora del nivel de expresión.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En la presente se describe un método para mejorar la fabricabilidad o desarrollabilidad de anticuerpos mediante un enfoque computacional . El método descrito en la presente trata acerca de (i) la identificación de posiciones de restos conservados por pares según propiedades fisicoquímicas de los restos, (ii) la evaluación de la forma en que la secuencia de anticuerpo de interés se desvía de esa conservación por pares, y (iii) la sustitución de la posición o posiciones desviadas con aminoácidos encontrados en las posiciones equivalentes en las secuencias de línea germinal o línea germinal relacionada. Este método identifica con frecuencia problemas con restos de línea germinal y sugiere que se remplacen por restos de línea germinal relacionada. Este método computacional se ha aplicado a más de 10 anticuerpos contra varios antígenos. Las mutaciones puntuales simples y combinaciones sugeridas han permitido una mejora constante en una o más propiedades químicas y físicas junto con la expresión.
En un primer aspecto, en la presente se proporciona un método para mejorar una o más características de una proteína de unión al antígeno que comprende un dominio variable de anticuerpo de interés. El método comprende: a) la identificación de posiciones de restos conservados por pares dentro de un marco de dominio variable basado en una propiedad fisicoquímica de los restos; b) determinación de la forma en que el dominio variable de anticuerpo de secuencia de aminoácidos marco de interés se desvía de las posiciones de restos conservados por pares identificadas en a) ; c) sustitución de uno o más restos de aminoácido determinados como desviaciones de b) con aminoácidos encontrados en posiciones equivalentes en las secuencias de línea germinal o línea germinal relacionada.
Los restos conservados por pares pueden identificarse al: i) asignar un subtipo de línea germinal al dominio variable de anticuerpo de interés; ii) alinear regiones marco de múltiples dominios variables pertenecientes al mismo subtipo de línea germinal identificado en (i) ; iii) clasificar el aminoácido en cada posición dentro de un dominio variable alineado como hidrofóbico pequeño, aromático, polar neutro, cargado positivamente, cargado negativamente o glicina/eliminación; iv) calcular una puntuación de conservación para cada posición por pares; y v) determinar pares mutacionales correlacionados o covariantes o posiciones de restos conservados por pares basados en un cálculo umbral.
Un método preferido para determinar una puntuación de conservación incluye calcular la cantidad de pares pertenecientes a las mismas características fisicoquímicas y restarle a la suma la cantidad de pares pertenecientes a diferentes características fisicoquímicas. Por ejemplo, cuando los veinte aminoácidos se clasifican en dos grupos hidrofóbico (H) y polar (P) , la puntuación de conservación = (N.° de HiHj + N.° de PiPj) - N.° de HiPj , donde i = 1, N-l; j= i+1 a N; N = longitud de la secuencia diana de interés.
Las desviaciones dentro del dominio variable de anticuerpo de interés pueden determinarse al comparar pares de aminoácidos de la secuencia diana de interés con los pares correlacionados o covariantes identificados del alineamiento múltiple de secuencias. En otras palabras, las desviaciones en la secuencia diana son aquellas que difieren del patrón observado de posiciones conservadas por pares que se identifican usando la base de datos de secuencias de dominio variable. Uno o más de los aminoácidos que se determina son desviaciones pueden sustituirse con un aminoácido encontrado en esa posición en la secuencia de línea germinal o una secuencia de línea germinal relacionada. En determinadas modalidades, todos los aminoácidos que se determina son desviaciones se sustituyen con un aminoácido encontrado en esa posición en la secuencia de línea germinal o una secuencia de línea germinal relacionada.
En modalidades preferidas, la proteína de unión al antígeno comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera, por ej . , un scFv o un anticuerpo. El dominio variable de cadena pesada y/o dominio variable de cadena ligera puede ser un dominio variable humano. En determinadas modalidades, la proteína de unión al antígeno es un anticuerpo humano.
El método es útil para mejorar una o más características de una proteína de unión al antígeno. En modalidades preferidas, la proteína de unión al antígeno es una proteína terapéutica. Las características que pueden ser alteradas por el método incluyen la expresión mejorada dentro de células hospedadoras transfectadas de forma estable o transitoria, termoestabilidad aumentada, propensión a la agregación reducida, semivida in vivo aumentada, vida útil aumentada, eficacia de plegado aumentada, mayor resistencia a la oxidación inducida por la luz, menos recortes durante las condiciones de almacenamiento, menor viscosidad, menor sensibilidad a cambios de pH y menos degradaciones físicas y químicas.
En un segundo aspecto, en la presente se describen proteínas de unión al antígeno mejoradas mediante un método del primer aspecto.
En un tercer aspecto, en la presente se describen ácidos nucleicos aislados que codifican un dominio variable del anticuerpo de una proteína de unión al antígeno mejorada por el método del primer aspecto. En modalidades preferidas, el método comprende sustituir uno o más restos dentro del dominio variable de anticuerpo con un resto de línea germinal o línea germinal relacionada.
En un cuarto aspecto, en la presente se describen células hospedadoras que comprenden un ácido nucleico aislado del tercer aspecto.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1: Estructura esquemática de un anticuerpo. Diagrama esquemático del anticuerpo IgGl con los dominios indicados. El anticuerpo IgGl es un tetrámero con forma de Y con dos cadenas pesadas (mayor longitud) y dos cadenas ligeras (menor longitud) . Las dos cadenas pesadas están unidas entre sí mediante enlaces de disulfuro (-S-S-) en la región bisagra. Fab - fragmento de unión al antígeno, Fe -fragmento cristalizable , VL - dominio variable de cadena ligera, VH - dominio variable de cadena pesada, CL - dominio constante (sin variación de secuencia) de cadena ligera, CH1 dominio constante de cadena pesada 1, CH2 - dominio constante de cadena pesada 2 , CH3 - dominio constante de cadena pesada 3.
Figura 2. La representación de cinta de la estructura de cristal de un fragmento de dominio variable de un anticuerpo que muestra la región determinante de complementariedad (apenas sombreada) y región marco (FR, por sus siglas en inglés) . El dominio variable consiste en cadenas ligeras (VL) y pesadas (VH por sus siglas en inglés,) . Las regiones determinantes de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) tienen alta variabilidad de secuencia y están implicadas en la unión. La región macro consiste principalmente en giros y estructura secundaria de cadena ß. El dominio VL entra en contacto con el dominio VH provocando una gran región de interfaz.
Figura 3. El diagrama de flujo del esquema usado para analizar pares de aminoácidos correlacionados basados en las propiedades fisicoquímicas (hidrofóbico, aromático, polar neutro, cargado positivamente, cargado negativamente, etc.) e identificar sustituciones de aminoácidos para rectificar las violaciones de covarianza. Las sustituciones de aminoácidos para reparar las violaciones se identifican mediante el examen de los restos en las posiciones equivalentes en las secuencias de línea germinal estrechamente relacionadas. Además, el contexto estructural y la frecuencia de aparición de aminoácidos en la posición equivalente en la base de datos son también tomados en cuenta para limitar adicionalmente la sustitución de aminoácidos simple.
Figuras 4a-4b. Alineamiento de una secuencia de dominio variable de (figura 4a) cadena pesada y (figura 4b) cadena ligera de un anticuerpo diana con las secuencias de línea germinal humana. Solo las 5 líneas germinales más estrechamente relacionadas basadas en el porcentaje de identidad a la secuencia diana se muestran aquí en el alineamiento. Se marcan con un círculo las posiciones identificadas mediante análisis mutacional correlacionado para las modificaciones.
Figura 5. Parte del rendimiento de un programa informático que implementa el método aquí descrito para identificar los pares mutacionales correlacionados y violaciones en la secuencia de anticuerpo diana. Se muestra la posición en la secuencia diana de interés y sus posiciones covariantes según se determina usando la puntuación de conservación y umbral. El número dentro del paréntesis indica la puntuación de conservación. Un más (+) indica que el patrón es similar al observado en las secuencias de anticuerpo conocidas; un menos (-) indica que el patrón difiere del observado en las secuencias de anticuerpo conocidas [desviación o violación de covarianza] . La fracción mostrada dentro de los paréntesis rectos indica entropía -una medida de variabilidad de secuencia en esa posición. Cabe destacar que en el caso de F51, se correlaciona con las posiciones V13, A19, 121, C23, L42, P45, P49, L52, 153, V63, P64, L78, 180, V83, V90 y C93. Sin embargo, F51 es una violación (no correlacionada) en cada caso según se indica por el signo de menos ("-") . Esto sugiere que Phe en la posición 51 debería mutarse en restos hidrofóbicos pequeños.
Figura 6. Expresión transitoria del anticuerpo original y mutantes identificados mediante análisis mutacional correlacionado. Se ve una mejora de hasta 20 veces en la expresión para las variantes en comparación con la molécula original .
Figura 7a. Perfiles de calorimetría diferencial de barrido del anticuerpo original y mutantes identificados mediante análisis mutacional correlacionado. Las variantes exhiben estabilidad térmica igual o mejorada en comparación con la original. En particular, la variante que tiene la máxima cantidad de mutaciones muestra la mayor mejora en la estabilidad térmica.
Figura 7b. Análisis de unión del anticuerpo original y sus variantes usando Kinexa. El anticuerpo original y las variantes exhiben características de unión similares (dentro de doble diferencia en Kd) .
Figuras 8a-8b. Alineamiento de una secuencia de dominio variable de (figura 8a) cadena pesada y (figura 8b) cadena ligera de un anticuerpo diana con las secuencias de línea germinal humana. Solo las 5 líneas germinales más estrechamente relacionadas basadas en el porcentaje de identidad a la secuencia diana se muestran aquí en el alineamiento. Se incluyen las posiciones identificadas mediante el análisis mutacional correlacionado para modificaciones .
Figura 9. Lista de variantes realizadas y analizadas para el segundo anticuerpo diana. Cabe destacar que la mutación Y231F no fue sugerida por el análisis mutacional correlacionado .
Figuras 10a- 10c. Nivel de expresión transitorio del anticuerpo original y sus variantes en formato scFv-Fc. (figura 10a) y (figuralOb) corresponden al nivel de expresión transitorio y rendimiento purificado, respectivamente, en ejecución de producción de 250 mi. (figura 10c) corresponde a las pruebas de expresión repetida en ejecución de producción de 10 mi. Las variantes tuvieron la misma o mejor expresión en comparación con el anticuerpo original. En particular, la variante que tuvo la máxima cantidad de mutaciones mostró la mayor mejora en el nivel de expresión.
Figura 11. El nivel de agregación según se calculó por SEC para el anticuerpo original y sus variantes, en el formato scFv-Fc, que se diseñaron según el análisis mutacional correlacionado.
Figuras 12a-12b. Perfiles de estabilidad térmica del anticuerpo original y sus variantes en (figura 12a) formato scFv-Fc y (figura 12b) formato IgG. Todas las variantes muestran estabilidad térmica igual o mejorada en comparación con el anticuerpo original. En particular, la variante que tiene la máxima cantidad de mutaciones muestra la mayor mejora en la estabilidad térmica (tanto entalpia y temperatura de fusión mejoradas) .
Figuras 13a-13b. (figura 13a) Análisis de unión basado en FACS del anticuerpo original y sus variantes. Todas las variantes muestran perfiles de unión similares en este análisis según lo indica el análisis de media geométrica que se muestra en (figura 13b) .
Figuras 14a-14b. (figura 14a) Nivel de expresión del tercer anticuerpo diana y sus variantes identificados mediante análisis mutacional correlacionado. Las variantes muestran nivel de expresión mejorado de 3 a 4 veces en comparación con el anticuerpo original. La variante que tiene la máxima cantidad de mutaciones muestra la mayor mejora en el nivel de expresión. (figural4b) En este caso en particular, el análisis de unión revela que la variante que tiene la máxima cantidad de mutaciones muestra valor IC50 apenas menor .
Figura 15. De forma coherente con los otros dos ejemplos establecidos, las variantes identificadas mediante análisis mutacional correlacionado muestran estabilidad térmica mejorada. El diseño que tiene la máxima cantidad de mutaciones (F15) muestra la mayor mejora en la estabilidad térmica.
Figura 16. Nivel de titulación de expresión del cuarto anticuerpo original diana y sus variantes diseñados mediante análisis mutacional correlacionado. Se observó una mejora gradual en el nivel de expresión a medida que aumentó la cantidad de mutaciones.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCIÓN "Proteína de unión al antígeno" es una proteína o polipéptido que contiene uno o más dominios variables de anticuerpo y se une específicamente a un antígeno. En modalidades preferidas, la proteína de unión al antígeno comprende dos dominios variables que interactúan y juntos se unen específicamente a un antígeno. Las modalidades de proteínas de unión al antígeno comprenden anticuerpos y fragmentos de estos, tal como se define de varias formas en la presente, que se unen específicamente a un antígeno. Las proteínas de unión al antígeno pueden opcionalmente incluir uno o más modificaciones postraduccionales . wSe une específicamente" tal como se usa en la presente significa que la proteína de unión al antígeno se une preferentemente al antígeno sobre otras proteínas. En algunas modalidades "se une específicamente" significa que la proteína de unión al antígeno tiene una mayor afinidad por el antígeno que por otras proteínas. Las proteínas de unión al antígeno que se unen específicamente a un antígeno pueden tener una afinidad de unión por el antígeno menor que o igual a 1 x 10"7 M, menor que o igual a 2 x 10~7 , menor que o igual a 3 x 1CT7 M, menor que o igual a 4 x 10"7 M, menor que o igual a 5 x 10"7 M, menor que o igual a 6 x 10"7 M, menor que o igual a 7 x 10"7 M, menor que o igual a 8 x 10"7 M, menor que o igual a 9 x 10"7 M, menor que o igual a 1 x 10"8 M, menor que o igual a 2 x 10"8 M, menor que o igual a 3 x 10" 8 M, menor que o igual a 4 x 10"8 M, menor que o igual a 5 x 10~8 M, menor que o igual a 6 x 10"8 M, menor que o igual a 7 x 10~8 M, menor que o igual a 8 x 10"8 M, menor que o igual a 9 x 10"8 M, menor que o igual a 1 x 10"9 M, menor que o igual a 2 x 10~9 M, menor que o igual a 3 x 10"9 M, menor que o igual a 4 x 10"9 M, menor que o igual a 5 x 10~9 M, menor que o igual a 6 x 10~9 M, menor que o igual a 7 x 10"9 M, menor que o igual a 8 x 10~9 M, menor que o igual a 9 x 10"9 M, menor que o igual a 1 x 10"10 M, menor que o igual a 2 x 10"10 M, menor que o igual a 3 x 10"10 M, menor que o igual a 4 x 10~10 M, menor que o igual a 5 x 10"10 M, menor que o igual a 6 x 10"10 M, menor que o igual a 7 x 10"10 M, menor que o igual a 8 x 10"10 M, menor que o igual a 9 x 10"10 M, menor que o igual a 1 x 10"11 M, menor que o igual a 2 x 10"11 M, menor que o igual a 3 x 10"11 M, menor que . o igual a 4 x 10"11 M, menor que o igual a 5 x 10"11 M, menor que o igual a 6 x 10"11 M, menor que o igual a 7 x 10"11 M, menor que o igual a 8 x 10"11 M, menor que o igual a 9 x 10"11 M, menor que o igual a 1 x 10"12 M, menor que o igual a 2 x 10~12 M, menor que o igual a 3 x 10~12 M, menor que o igual a 4 x 10"12 M, menor que o igual a 5 x 10"12 M, menor que o igual a 6 x 10"12 M, menor que o igual a 7 x 10~12 M, menor que o igual a 8 x 10~12 M o menor que o igual a 9 x 10~12 M.
"Anticuerpo" tal como se usa en la presente, es una proteína que contiene al menos dos regiones variables, en muchos casos una región variable de cadena ligera y una pesada. Por lo tanto, el término "anticuerpo" comprende anticuerpos Fv de cadena simple (scFv, que contienen regiones variables de cadena pesada y ligera unidas mediante un enlazador) , anticuerpos Fab, F(ab)2', Fab' , scFv:Fc (tal como se describe en Carayannopoulos y Capra, Cap. 9 en Fundamental Immunology, 3.a ed. , Paul, ed. , Raven Press, Nueva York, 1993, pp. 284-286) o anticuerpos de longitud completa que contienen dos cadenas pesadas de longitud completa y dos cadenas ligeras de longitud completa, tal como anticuerpos IgG de origen natural encontrados en mamíferos. Id. Tales anticuerpos IgG pueden ser del isotipo IgGl, IgG2 , IgG3 o IgG4 y pueden ser anticuerpos humanos. Las porciones de Carayannopoulos y Capra que describieron la estructura de anticuerpos se incorporan en la presente mediante esta referencia. Además, el término "anticuerpo" incluye anticuerpos diméricos que contienen dos cadenas pesadas y ninguna cadena ligera como los anticuerpos de origen natural encontrados en camellos y otras especies de dromedarios y tiburones. Véase, por ej . , Muldermans et ál . , 2001, J. Biotechnol . 74:277-302; Desmyter et ál . , 2001, J. Biol . Chem. 276:26285-90; Streltsov et ál . (2005), Protein Science 14: 2901-2909. Un anticuerpo puede ser monoespecífico (es decir, que se une a solo un tipo de antígeno) o multiespecífico (es decir, que se une a más de un tipo de antígeno) . En algunas modalidades, un anticuerpo puede ser biespecífico (es decir, que se une a dos tipos diferentes de antígeno) . Además, un anticuerpo puede ser monovalente, bivalente o multivalente , lo que significa que puede unirse a uno o dos o más moléculas de antígeno a la vez. Algunos de los posibles formatos para los anticuerpos incluyen anticuerpos monoespecíficos o biespecífieos de longitud completa, anticuerpos monovalentes monoespecíficos (tal como se describe en la Solicitud Internacional WO 2009/089004 y Publicación estadounidense 2007/0105199, las porciones pertinentes de lo que se incorpora en la presente mediante esta referencia) , scFv-Fc bivalentes monoespecíficos o diméricos biespecíficos , scFv-Fc/Fc monovalentes monoespecíficos y las proteínas de unión multiespecíficas e inmunoglobulinas de dominio variable duales descritas en la Publicación estadounidense 2009/0311253 (las partes pertinentes de lo que se incorpora en la presente mediante esta referencia) , entre muchos otros formatos de anticuerpo posibles.
"Dominio variable de anticuerpo" Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo típicamente exhiben la misma estructura general que las regiones marco (FR) relativamente conservadas, unidas por tres regiones hipervariables , es decir, las regiones determinantes de complementariedad o CDR. Las CDR son principalmente responsables del reconocimiento y unión de antígenos. Las CDR de las dos cadenas de cada par se alinean mediante las regiones de marco, permitiendo la unión a un epítopo específico. Del extremo N-terminal al C-terminal, ambas cadenas ligera y pesada contienen los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio se realiza de acuerdo con las definiciones de Kabat (Martin, A.C.R. (2010) Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. En: Antibody Engineering Lab Manual Tomo 2 (2.a Edición), ed. : Duebel, S. and Kontermann, R. , Springer-Verlag, Heidelberg) .
Región "marco de dominio variable" es tal como se define en la definición de Kabat. Sin embargo, las definiciones basadas en estructuras tales como Chothia y AHo podrían también usarse para definir la región marco. Para el reciente análisis acerca de esquemas de numeración de secuencias de anticuerpos conocidos, véase Martin, A.C.R. (2010) Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. En: Antibody Engineering Lab Manual Tomo 2 (2.a Edición), ed. : Duebel, S. and Kontermann, R. , Springer-Verlag, Heidelberg.
"Dominio variable de cadena pesada" es un dominio variable derivado de un lugar de cadena pesada. Este dominio incluye sitios de unión al antígeno o paratopos y la secuencia de aminoácidos puede variar según el antígeno diana o los sitios de unión (epítopo) en la diana.
"Dominio variable de cadena ligera" es un dominio variable derivado de un lugar de cadena ligera. Este dominio incluye sitios de unión al antígeno o paratopos y la secuencia de aminoácidos puede variar según el antígeno diana o los sitios de unión (epítopo) en la diana.
"Dominio variable de cadena ligera humana" es un dominio variable derivado de un lugar de cadena ligera humana. Este dominio incluye sitios de unión al antígeno o paratopos y la secuencia de aminoácidos puede variar según el antígeno diana o los sitios de unión (epítopo) en la diana.
"Dominio variable de cadena pesada humana" es un dominio variable derivado de un lugar de cadena pesada humana. Este dominio incluye sitios de unión al antígeno o paratopos y la secuencia de aminoácidos puede variar según el antígeno diana o los sitios de unión (epítopo) en la diana.
"Anticuerpo humano" es un anticuerpo que comprende una cadena ligera y una cadena pesada donde ambas regiones variable y constante provienen de un lugar humano.
"Agrupamiento o clasificación de aminoácidos según las propiedades fisicoquímicas" Los aminoácidos se clasifican según sus propiedades fisicoquímicas. En un método de agrupamiento, los veinte aminoácidos de origen natural y la eliminación de aminoácidos en la secuencia se clasifican en 6 grupos - hidrofóbico pequeño: Ala, lie, Leu, Met , Cys, Val y Pro; aromático: Phe, Trp y Tyr; polar neutro: Asn, Gln, Ser, Thr; cargado negativamente: Asp y Glu; cargado positivamente: Lys, Arg y His; sin cadena lateral: Gly y eliminación. En otro método de agrupamiento los aminoácidos y la eliminación se clasifican en cuatro grupos - hidrofóbico: Ala, lie, Leu, Met, Cys, Val, Pro, Phe, Trp y Tyr; polar: Asn, Gln, Ser y Thr; cargado: Asp, Glu, Lys, Arg y His; sin cadena lateral: Gly y eliminación. En aun otro método de agrupamiento, el aminoácido Cys puede considerarse un resto hidrofóbico así como también polar neutro, y el His puede considerarse un aminoácido polar.
"Puntuación de conservación" se define como la suma de pares pertenecientes a las mismas características fisicoquímicas y restándole a eso la suma de pares pertenecientes a diferentes características fisicoquímicas. Por ejemplo, para una clasificación de seis grupos, Puntuación de conservación = N.° de Xi Xj - N.° de Xi Yj , donde, X e Y pueden ser aminoácidos hidrofóbicos pequeños, aromáticos, polares neutros, cargados positivamente, cargados negativamente y glicina/eliminación, pero X no es igual a Y; i=l, N-l; j=i+l, N; N = longitud del dominio variable de secuencia diana.
"Umbral" o límite se define como la puntuación de conservación x 100 dividido por la cantidad total de secuencias de dominio variable conocidas (de la base de datos Kabat/IMGT) usadas en los alineamientos múltiples de secuencias. En determinadas modalidades, el umbral es al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, o al menos 95%. En modalidades preferidas, el alineamiento múltiple de secuencias comprende al menos 5 dominios variables conocidos, al menos 10 dominios variables conocidos, al menos 20 dominios variables conocidos, al menos 50 dominios variables conocidos, al menos 75 dominios variables conocidos, al menos 100 dominios variables conocidos, al menos 150 dominios variables conocidos, al menos 200 dominios variables conocidos, al menos 250 dominios variables conocidos, al menos 300 dominios variables conocidos, al menos 400 dominios variables conocidos, al menos 500 dominios variables conocidos, al menos 600 dominios variables conocidos, al menos 700 dominios variables conocidos, al menos 800 dominios variables conocidos, al menos 900 dominios variables conocidos, al menos 1000 dominios variables conocidos, al menos 1500 dominios variables conocidos, al menos 2000 dominios variables conocidos, al menos 3000 dominios variables conocidos, al menos 4000 dominios variables conocidos o al menos 5000 dominios variables conocidos.
"Secuencia de línea germinal" se define como la secuencia de línea germinal humana que tiene el porcentaje más alto de identidad de secuencia con la secuencia de anticuerpo dada. La secuencia de línea germinal se identifica según la comparación de la secuencia de anticuerpo dada con la base de datos de la secuencia de línea germinal humana.
"Secuencias de línea germinal relacionadas" son las secuencias de línea germinal humanas que comparten más de 80% de identidad de secuencia con la secuencia de anticuerpo dada. A menudo, la línea germinal relacionada se refiere a las 5 secuencias de línea germinal humana que tienen el porcentaje más alto de identidad de secuencia con la secuencia de anticuerpo dada. A veces, el límite de porcentaje usado para identificar las secuencias de línea germinal relacionadas disminuye de 80% a 70%, cuando hay menos que 5 secuencias de línea germinal que comparten más del 80% de identidad con la secuencia de anticuerpo diana dada .
Bases de datos usadas: Básicamente puede usarse cualquier base de datos que contenga secuencias de dominio variable de anticuerpo. Las bases de datos preferidas incluyen la base de datos de secuencia de línea germinal humana, base de datos de secuencias de anticuerpos de Kabat (Wu y Kabat 1970) y/o base de datos de secuencias de anticuerpos de IMGT. Estas bases de datos pueden procesarse además para generar bases de datos de pares de cadena ligera y pesada, que se usa para analizar mutaciones por pares correlacionadas en la interfaz VL/VH.
"Mutación correlacionada, posiciones de restos conservados por pares o covarianza" se define, como el cambio concertado en la naturaleza fisicoquímica de pares de aminoácidos. Todos los pares por posiciones posibles en la secuencia de anticuerpo dada son considerados para analizar el comportamiento mutacional correlacionado. Por ejemplo, la posición 1 en la secuencia se compara con la posición 2, y luego con la posición 3, y luego con la posición 4 y así sucesivamente .
"Desviación de la mutación correlacionada, posiciones de restos conservados por pares o covarianza" se define como pares de aminoácidos en la secuencia diana que difieren del patrón observado de posiciones de restos conservados por pares que se identifican usando el alineamiento múltiple de secuencias de secuencias de dominio variable conocidas. Por ejemplo, la posición i y j en la secuencia diana tienen diferentes características fisicoquímicas (por ej . , i es aminoácido hidrofóbico y j es polar) mientras que en la base de datos la posición i y j equivalente pertenece al mismo agrupamiento fisicoquímico (por ej . , tanto i como j pertenecen al grupo hidrofóbico de aminoácidos) .
Las "posiciones equivalentes" se identifican según los alineamientos de secuencia. Dos posiciones pertenecientes a dos diferentes anticuerpos se consideran equivalentes si, cuando se ven en un alineamiento de secuencias tradicional, una se ubica debajo del aminoácido cuando se alinean las dos secuencias .
"Alineamiento de secuencias" Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP. PILEUP crea un alineamiento múltiple de secuencias a partir de un grupo de secuencias relacionadas usando alineamientos progresivos por pares. También puede trazar un árbol que muestre las relaciones de agrupamiento usadas para crear el alineamiento. PILEUP usa una simplificación del método de alineamiento progresivo de Feng & Doolittle, 1987, J. Mol. Evol . 35:351-360; el método es similar al descrito por Higgins y Sharp, 1989, CABIOS 5:151-153. Los parámetros de PILEUP útiles que incluyen un peso de brecha por defecto de 3.00, un peso de longitud de brecha por defecto de 0.10, y brechas finales ponderadas.
Un algoritmo útil adicional es BLAST con brechas según se informa en Altschul et ál . , 1993, Nucí. Acids Res. 25:3389-3402. BLAST con brechas usa puntuaciones de sustitución BLOSUM-62; parámetro T de umbral establecido en 9; los métodos T O-HIT para activar extensiones sin brechas, cargan las longitudes de brechas de k con un costo de 10+k; Xu establecido en 16, y Xg establecido en 40 para etapa de búsqueda en bases de datos y en 67 para la etapa de resultado de los algoritmos. Los alineamientos con brechas se activan mediante una puntuación correspondiente a alrededor de 22 bits.
Otro algoritmo comúnmente usado para el alineamiento de secuencias múltiples es Clustal o Clustal (Higgins y Sharp 1988) . Los parámetros de Clustal incluyen penalización por brecha. El otro algoritmo comúnmente usado se denomina MUSCLE.
"Expresión mejorada" se define en la presente como la expresión aumentada de una proteína de unión al antígeno mejorada por el método de la invención en una célula hospedadora en comparación con la proteína de unión al antígeno antes de la mejora. La célula hospedadora puede transfectarse de forma transitoria o transfectarse de forma estable con uno o más ácidos nucleicos que codifican los componentes de la proteína de unión al antígeno. La expresión mejorada puede ser al menos 5% de mejora, al menos 10% de mejora, al menos 15%, al menos 20% de mejora, al menos 25%, de mejora, al menos 30% de mejora, al menos 35% de mejora, al menos 40% de mejora, al menos 45% de mejora, al menos 50% de mejora, al menos 55% de mejora, al menos 60% de mejora, al menos 65% de mejora, al menos 70% de mejora, al menos 75% de mejora, al menos 80% de mejora, al menos 85% de mejora, al menos 90% de mejora, al menos 95% de mejora, al menos 100% de mejora o 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces , al menos 9 veces , al menos 10 veces , al menos 15 veces , al menos 20 veces , al menos 25 veces , al menos 30 veces, al menos 35 veces, al menos 40 veces , al menos 45 veces , al menos 50 veces , al menos 55 veces , al menos 60 veces , al menos 65 veces , al menos 70 veces , al menos 75 veces , al menos 80 veces , al menos 85 veces , al menos 90 veces, al menos 95 veces o al menos 100 veces.
"Estabilidad térmica mejorada" se define en la presente como un aumento en la temperatura de fusión (Tm) de la proteína de unión al antígeno mejorada por el método de la invención en comparación con la proteína de unión al antígeno antes de la mejora. La mejora en la estabilidad térmica puede ser al menos 1 °C, al menos 2 °C, al menos 3 °C, al menos 4 °C, al menos 5 °C, al menos 6 °C, al menos 7 °C, al menos 8 °C, al menos 9 °C o al menos 10 °C. Los métodos para calcular la Tm de una proteína de unión al antígeno incluyen, de modo no taxativo, Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC, por sus siglas en inglés) , Florimetría Diferencial de Barrido (DSF por sus siglas en inglés, ) , Dicroismo Circular (CD, por sus siglas en inglés) y espectroscopia de UV CD cercano y le ano .
En la presente se describen métodos para mejorar la fabricabilidad o desarrollabilidad de anticuerpos mediante un enfoque computacional . Idealmente, una molécula de anticuerpo candidato debería expresarse bien, no debería tener ningún problema de agregación, debería tener mayor estabilidad física y química y otras propiedades biofísicas mejoradas tales como resistencia a la oxidación inducida por la luz. El método descrito en la presente trata acerca de (i) la identificación de posiciones de restos conservados por pares según las propiedades fisicoquímicas, (ii) la evaluación de la forma en que la secuencia de anticuerpo de interés se desvía de la conservación por pares observada ("violaciones"), y (iii) la sustitución de la posición o posiciones desviadas con aminoácidos encontrados en las secuencias de línea germinal o línea germinal relacionada que preservan el contexto estructural y de secuencia para reducir la inmunogenicidad.
Las violaciones observadas no se limitan a restos que no son de línea germinal y, además, el método identifica con frecuencia problemas con restos de línea germinal y sugiere que sean remplazados con restos de línea germinal relacionada. El método se aplicó a más de una docena de anticuerpos que se unen a diferentes antígenos y se observó una mejora consistente en la estabilidad térmica y expresión transitoria en células 293 y CHO. A menudo, la construcción de anticuerpo que tienen todas las violaciones reparadas muestra la máxima mejora en la estabilidad térmica y expresión. Esto sugiere que las violaciones identificadas por los métodos descritos en la presente son significativas y el éxito no es el resultado de casualidades. En general, la mejora observada en la estabilidad térmica varía de 1 °C a 12 °C según la molécula y cantidad de violaciones reparadas, y la mejora de la expresión varía de 2 veces a 100 veces en la expresión transitoria.
El primer paso de la covarianza o análisis mutacional correlacionado implica identificar posiciones por pares que están correlacionadas o covarían según el alineamiento múltiple de secuencias de secuencias de anticuerpo relacionadas (Figura 3) . A estos efectos, los veinte aminoácidos de origen natural se clasifican en varios grupos según sus propiedades fisicoquímicas. Por ejemplo, en la clasificación de 6 grupos, los veinte aminoácidos se clasifican como restos hidrofóbicos pequeños, aromáticos, polares neutros, cargados positivamente y cargados negativamente. Las glicinas y eliminaciones en las secuencias se consideran el sexto grupo. Para cada posición por pares se calcula una puntuación de conservación usando una fórmula que es similar a la descrita en Gunasekaran et ál . , Proteins 54:179-194, 2004 (Gunasekaran et ál . 2004). La puntuación de conservación se define como la cantidad de pares pertenecientes a los mismos grupos fisioquímicos y restarle a eso la cantidad de pares pertenecientes a diferentes grupos fisioquímicos . Por ejemplo, en el caso de 20 aminoácidos clasificados en tres grupos, la puntuación de conservación = N.° de HiHj + N.° de PiPj - [N. ° de HiPj + N.° de eliminación en i con Hj o Pj ] . Donde, i=l, N-l; j=i+l, N; N = longitud de secuencia de la secuencia diana de interés; H - hidrofóbico; P - Aminoácidos polares. La puntuación de conservación podría ser un número entero positivo o negativo.
Un umbral o límite se define como la puntuación de conservación x 100/cantidad total de secuencias. Según la puntuación de conservación, se identifican posiciones por pares que se correlacionan a diferentes niveles de umbral (60 a 90%) . El segundo paso del análisis mutacional correlacionado implica identificar desviaciones (o violaciones de covarianza) en la secuencia de anticuerpo diana, es decir, pares correlacionados en secuencias de anticuerpo relacionadas (secuencias de anticuerpo conocidas pertenecientes al mismo subtipo que la secuencia diana de interés) pero no correlacionados en la secuencia diana. El tercer paso del análisis mutacional correlacionado implica reparar las violaciones de covarianza. Esto puede realizarse al examinar cuáles aminoácidos ocurren con frecuencia en la posición o posiciones de violación de covarianza en la base de datos de secuencias de anticuerpo relacionadas. Asimismo, en modalidades preferidas, se procura asegurarse de que el aminoácido sustituido se encuentre en las secuencias de línea germinal o línea germinal relacionada y el contexto estructural y de secuencia se mantenga como en las secuencias de línea germinal. Este paso se realiza para reducir la posibilidad de inmunogenicidad que puede surgir debido a la mutación .
Proteínas de unión al antígeno mejoradas por un método de la invención Básicamente cualquier proteína de unión al antígeno que comprende un dominio variable de anticuerpo puede analizarse por los métodos descritos en la presente y, cuando se encuentran violaciones en la secuencia del dominio variable, puede mejorarse mediante la sustitución de los restos violadores con restos no violadores, por ej . , restos de la línea germinal o línea germinal relacionada. Las proteínas de unión al antígeno preferidas son anticuerpos terapéuticos. El anticuerpo terapéutico mejorado puede tener una o más violaciones "reparadas" en el dominio variable de la cadena ligera y/o el dominio variable de la cadena pesada.
En determinadas modalidades, la proteína de unión al antígeno analizada y mejorada por los métodos descritos en la presente es un anticuerpo terapéutico aprobado para usar, en ensayos clínicos, o en desarrollo para uso clínico. Los anticuerpos terapéuticos incluyen, de modo no taxativo, rituximab (Rituxan®, IDEC/Genentech/Roche) (véase, por ejemplo, la patente estadounidense N.° 5,736,137), un anticuerpo anti-CD20 quimérico aprobado para tratar el linfoma no-Hodgkin; HuMax-CD20, un anti-CD20 actualmente en desarrollo por Genmab, un anticuerpo anti-CD20 descrito en la patente estadounidense N.° 5,500,362, AME-133 (Applied Molecular Evolution) , hA20 ( Immunomedics , Inc.), HumaLYM (Intracel) y PRO70769 (PCT/US2003/040426 , denominado " Immunoglobulin Variants and Uses Thereof"), trastuzumab (Herceptin®, Genentech) (véase, por ejemplo, la patente estadounidense N.° 5,677,171), un anticuerpo anti-Her2/neu humanizado aprobado para tratar el cáncer de mama; pertuzumab (rhuMab-2C4, Omnitarg®) , actualmente en desarrollo por Genentech; un anticuerpo anti-Her2 descrito en la patente estadounidense N.° 4,753,894; cetuximab (Erbitux®, Imclone) (patente estadounidense No. 4,943,533; PCT WO 96/40210), un anticuerpo anti-EGFR quimérico en ensayos clínicos para una variedad de cánceres; ABX-EGF (Vectibix®, patente estadounidense N.° 6,235,883), HuMax-EGFr (solicitud estadounidense con N.° de serie 10/172,317), actualmente en desarrollo por Genmab; 425, EMD55900, E D62000 y EMD72000 (Merck KGaA) (patente estadounidense N. ° 5,558,864; urthy et l. 1987, Arch Biochetn Biophys. 252 (2) : 549-60 ; Rodeck et ál . , 1987, J Cell Biochem. 35 (4 ) : 315 -20 ; Kettleborough et ál . , 1991, Protein Eng. 4 (7 ) : 773 -83 ) ; ICR62 (Institute of Cáncer Research) (PCT WO 95/20045; Modjtahedi et ál . , 1993, J. Cell Biophys. 1993, 22 (1-3):12946; Modjtahedi et ál . , 1993, Br J. Cáncer. 1993, 67 (2) : 247-53 ; Modjtahedi et ál, 1996, Br J Cáncer, 73 (2) : 228-35 ; Modjtahedi et ál, 2003, Int J Cáncer, 105 (2) : 273-80) ; TheraCIM hR3 (YM Biosciences, Canadá y Centro de Immunologia Molecular, Cuba (patente estadounidense N.° 5,891,996; patente estadounidense N. ° 6,506,883; Mateo et ál, 1997, Immunotechnology, 3 (1) : 71-81) ; mAb-806 (Lud ig Institue for Cáncer Research, Memorial Sloan-Kettering) (Jungbluth et ál. 2003, Proc Nati Acad Sci USA. 100 (2 ): 639-4 ) ; KSB-102 (KS Biomedix) ; MR1-1 (IVAX, National Cáncer Institute) (PCT WO 0162931A2) ; y SC100 (Scancell) (PCT WO 01/88138) ; alemtuzumab (Campath®, Millenium) , un anticuerpo monoclonal humanizado actualmente aprobado para el tratamiento de leucemia linfocítica crónica de células B; muromonab-CD3 (Orthoclone 0KT3®) , un anticuerpo anti-CD3 desarrollado por Ortho Biotech/Johnson & Johnson, ibritumomab tiuxetan (Zevalin®) , un anticuerpo anti-CD20 desarrollado por IDEC/Schering AG, gemtuzumab ozogamicina (Mylotarg®) , un anticuerpo anti-CD33 (proteína p67) desarrollado por Celltech/Wyeth, alefacept (Amevive®) , una fusión anti-LFA-3 Fe desarrollada por Biogen) , abciximab (ReoPro®) , desarrollado por Centocor/Lilly, basiliximab (Simulect®) , desarrollado por Novartis, palivizumab (Synagis®) , desarrollado por Medimmune, infliximab (Remicade®) , un anticuerpo anti-TNFalfa desarrollado por Centocor, adalimumab (Humira®) , un anticuerpo anti-TNFalfa desarrollado por Abbott, Humicade®, un anticuerpo anti-TNFalfa desarrollado por Celltech, golimumab (CNTO-148) , un anticuerpo TNF completamente humano desarrollado por Centocor, ABX-CBL, un anticuerpo anti-CD147 en desarrollo por Abgenix, ABX-IL8, un anticuerpo anti-IL8 en desarrollo por Abgenix, ABX-MA1, un anticuerpo anti-MUC18 en desarrollo por Abgenix, Pemtumomab (R1549, 90Y-muHMFGl) , un anti-MUCl en desarrollo por Antisoma, Therex (R1550) , un anticuerpo anti-MUCl en desarrollo por Antisoma, AngioMab (AS1405) , en desarrollo por Antisoma, HuBC-1, en desarrollo por Antisoma, Thioplatin (AS1407) en desarrollo por Antisoma, Antegren® (natalizumab) , un anticuerpo anti-alfa-4-beta-l (VLA-4) y alfa-4 -beta-7 en desarrollo por Biogen, VLA-1 mAb, un anticuerpo de integrina anti-VLA-1 en desarrollo por Biogen, LTBR mAb, un anticuerpo del receptor beta anti-linfotoxina (LTBR por sus siglas en inglés, ) en desarrollo por Biogen, CAT-152, un anticuerpo anti-TGF- .beta.2 en desarrollo por Cambridge Antibody Technology, ABT 874 (J695) , un anticuerpo anti-IL-12 p40 en desarrollo por Abbott, CAT-192, un anticuerpo anti-TGF . beta .1 en desarrollo por Cambridge Antibody Technology y Genzyme, CAT-213, un anticuerpo anti-Eotaxinl en desarrollo por Cambridge Antibody Technology, LymphoStat-B® un anticuerpo anti-Blys en desarrollo por Cambridge Antibody Technology y Human Genome Sciences Inc., TRAIL-RlmAb, un anticuerpo anti-TRAIL-Rl en desarrollo por Cambridge Antibody Technology y Human Genome Sciences, Inc., Avastin® bevacizumab, rhuMAb-VEGF) , un anticuerpo anti-VEGF en desarrollo por Genentech, un anticuerpo de la familia del receptor anti-HER en desarrollo por Genentech, Factor Anti-Tejido (ATF, por sus siglas en inglés), un anticuerpo de factor anti-tejido en desarrollo por Genentech, Xolair® (Omalizumab) , un anticuerpo anti-IgE en desarrollo por Genentech, Raptiva® (Efalizumab) , un anticuerpo anti-CDlla en desarrollo por Genentech y Xoma, Anticuerpo LN-02 (anteriormente LDP-02) , en desarrollo por Genentech y Millenium Pharmaceuticals , HuMax CD4 , un anticuerpo anti-CD4 en desarrollo por Genmab, HuMax-IL15, un anticuerpo anti-IL15 en desarrollo por Genmab y Amgen, HuMax-Inflam, en desarrollo por Genmab y Medarex, HuMax-Cáncer, un anticuerpo anti -Heparanase I en desarrollo por Genmab y Medarex y Oxford GcoSciences, HuMax-Lymphoma, en desarrollo por Genmab y Amgen, HuMax-TAC, en desarrollo por Genmab, IDEC-131, y anticuerpo anti-CD40L en desarrollo por IDEC Pharmaceuticals , IDEC- 151 (Clenoliximab) , un anticuerpo anti-CD4 en desarrollo por IDEC Pharmaceuticals, IDEC-114, un anticuerpo anti-CD80 en desarrollo por IDEC Pharmaceuticals, IDEC-152, un anti-CD23 en desarrollo por IDEC Pharmaceuticals, anticuerpos de factor de migración anti-macrófago (MIF) en desarrollo por IDEC Pharmaceuticals, BEC2, un anticuerpo anti-idiotípico en desarrollo por Imclone, IMC-1C11, un anticuerpo anti-KDR en desarrollo por Imclone, DC101, un anticuerpo anti-flk-1 en desarrollo por Imclone, anticuerpos anti-VE cadherina en desarrollo por Imclone, CEA-Cide® ( labetuzumab) , un anticuerpo del antígeno anti-carcinoembriónico (CEA) en desarrollo por Immunomedics , LymphoCide® (Epratuzumab) , un anticuerpo anti-CD22 en desarrollo por Immunomedics, AFP-Cide, en desarrollo por Immunomedics, MyelomaCide, en desarrollo por Immunomedics, LkoCide, en desarrollo por Immunomedics, ProstaCide, en desarrollo por Immunomedics, MDX-010, un anticuerpo anti-CTLA4 en desarrollo por Medarex, MDX-060, un anticuerpo anti-CD30 en desarrollo por Medarex, MDX-070 en desarrollo por Medarex, MDX-018 en desarrollo por Medarex, Osidem® (IDM-1) , y anticuerpo anti-Her2 en desarrollo por Medarex e Immuno-Designed Molecules, HuMax®-CD4, un anticuerpo anti-CD4 en desarrollo por Medarex y Genmab, HuMax-IL15, un anticuerpo anti-IL15 en desarrollo por Medarex y Genmab, CNTO 148, un anticuerpo anti-TNF . alfa . en desarrollo por Medarex y Centocor/J&J, CNTO 1275, un anticuerpo anti -citocina en desarrollo por Centocor/J&J, MOR101 y MOR102, anticuerpos anti-molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-1 por sus siglas en inglés,) (CD54) en desarrollo por MorphoSys, MOR201, un anticuerpo anti-receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 3 (FGFR-3) en desarrollo por MorphoSys, Nuvion® (visilizumab) , un anticuerpo anti-CD3 en desarrollo por Protein Design Labs, HuZAF . RTM . , un anticuerpo anti-gamma interferón en desarrollo por Protein Design Labs, Anti-. alfa. 5. beta.1 Integrina, en desarrollo por Protein Design Labs, anti -IL- 12, en desarrollo por Protein Design Labs, ING-1, un anticuerpo anti-Ep-CAM en desarrollo por Xoma, Xolair® (Omalizumab) un anticuerpo anti-IgE humanizado en desarrollo por Genentech y Novartis, y MLN01, un anticuerpo anti-Beta2 de integrina en desarrollo por Xoma, todas las referencias citadas anteriormente en este párrafo se incorporan expresamente a la presente mediante esta referencia.
Las proteínas de unión al antígeno adicionales que pueden analizarse y mejorarse por los métodos descritos en la presente incluyen las descritas en las siguientes patentes y solicitudes de patente publicadas estadounidenses (que se incorporan a la presente mediante esta referencia en su totalidad) : 7364736; 7872106; 7871611; 7868140; 7867494 7842788 7833527 7824679; 7807798 7807795 7807159 7736644 7728113 7728110; 7718776 7709611 7700742 7658924 7628986 7618633 ; 7601818 7592430 7585500 7579186 7572444 7569387; 7566772 7541438 7537762 7524496 7521053 7521048; 7498420 7449555 7438910 7435796 7423128 7411057; 7378091 7371381 7335743 7288253 7285269 7265212 ; 7135174 7084257 7081523 6169167 6143874 4599306; 4504586 7705130 7592429 6849450 7820877 7794970; 7563442 7422742 7326414 7288251 7202343 7141653; 7090844 7078492 7037498 6924360 6682736 6500429; 6235883 5885574 7872113 7807796 7786271 7767793; 7763434 7744886 7741115 7704501 7638606 7411050; 7304144 7285643 7273609 7199224 7138500 7067475; 7057022 7045128 6793919 6740522 6716587 6596852; 6562949 6521228 6511665 6232447 6184359 6177079; 6150584 6110690 6072037 6015559 6004553 5969110; 5961974 5925740 5892001 5785967 5728813 5717072 ; 5677430 5620889 5591630 5543320 20110052604; 20110045537; 20110044986; 20110040076 20110027287; 20110014201; 20110008841; 7888482; 7887799 20100292442; 20100255538; 20100254975; 20100247545 20100209435; 20100197005; 20100183616; 20100111979 20100098694; 20100047253; 20100040619; 20100036091 20100034818; 20100028906; 20100028345; 20100015723; 7795413 20090306351; 20090285824; 20090274688; 20090263383 20090240038; 20090238823; 20090234106; 20090226447 20090226438; 20090214559; 20090191212; 20090175887 20090155274 ; 20090155164; 20090074758; 20090041784 20080292639; 20080248043 ; 20080221307; 20080166352 20080152587; 20080107655; 20080064104 ; 20080033157 20070237759; 20070196376; 20070065444; 20070014793 20060275292 ; 20060263354 ; 20060246064 ; 20060127393 20060078967; 20060002931; 20050152896; 2050124537 20050004353; 20050003400; 20040260064; 20040097712 20030026806 ; 20010027179; 5552286; 5106760; 4845198; 4558006 20100305307; 7790674; 7695948; 7666839; 20090208489; 20080132688.
En una modalidad, la proteína de unión al antígeno mejorada es un anticuerpo que comprende de una a seis CDR. El anticuerpo puede ser de cualquier tipo que incluye el anticuerpo IgM, IgG (que incluye IgGl, IgG2, IgG3, IgG4) , IgD, IgA o IgE. En una modalidad específica, la proteína de unión al antígeno es un anticuerpo de tipo IgG, por ej . , un anticuerpo IgGl.
En determinadas modalidades, la proteína de unión al antígeno es un anticuerpo multiespecífico, y notablemente un anticuerpo biespecífico, también denominado algunas veces "diacuerpos " . Estos son anticuerpos que se unen a dos o más antígenos diferentes o epítopos diferentes en un único antígeno. En determinadas modalidades, un anticuerpo biespecífico se une a un antígeno en una célula efectora humana (por ej . , célula T) . Los anticuerpos son útiles para dirigir una respuesta de célula efectora contra una célula que expresa la diana, tal como una célula tumoral . En modalidades preferidas, el antígeno de célula efectora humana es CD3. Patentes estadounidense N.° 7,235,641. En la técnica se conocen métodos para realizar anticuerpos biespecíficos . Un método implica desarrollar la porción Fe de las cadenas pesadas tal como para crear "salientes" y "orificios" que faciliten la formación de heterodímeros de las cadenas pesadas al coexpresarse en una célula. Patente estadounidense N.° 7,695,963. Otro método también implica modificar la porción Fe de la cadena pesada pero usa direccionamiento electrostático para fomentar la formación de heterodímeros mientras que inhibe la formación de homodímeros de las cadenas pesadas al coexpresarse en una célula. O 09/089,004, que se incorpora en la presente en su totalidad mediante esta referencia.
En una modalidad, la proteína de unión al antígeno mejorada es un minicuerpo. Los minicuerpos son proteínas tipo anticuerpo minimizadas que comprenden una scFv unida a un dominio CH3. Hu et ál . , 1996, Cáncer Res. 56:3055-3061.
En una modalidad, la proteína de unión al antígeno mejorada es un anticuerpo de dominio véase, por ejemplo, la patente estadounidense N. ° 6,248,516. Los anticuerpos de dominio (dAbs) son dominios de unión funcional de anticuerpos, que corresponden a las regiones variables de cualquiera de las cadenas pesada (VH) o ligera (VL) de anticuerpos humanos. Los dAB tienen un peso molecular de aproximadamente 13 kDa, o menos que la décima parte del tamaño de un anticuerpo completo. Los dAB se expresan bien en una variedad de hospedadores que incluyen sistemas de células bacterianas, de levadura y mamíferas. Además, los dAb son altamente estables y retienen actividad incluso tras someterse a condiciones extremas, tales como liofilización o desnaturalización térmica. Véase, por ejemplo, las patentes estadounidenses 6,291,158; 6,582,915; 6,593,081; 6,172,197; solicitud estadounidense con N.° de serie 2004/0110941; patente europea 0368684; patente estadounidense N.° 6,696,245, PCT O 04/058821, PCT O 04/003019 y PCT WO 03/002609.
En una modalidad, la proteína de unión al antígenó mejorada es un fragmento de anticuerpo. En varias modalidades, las proteínas de unión al anticuerpo mejoradas comprenden, de modo no taxativo, un fragmento F(ab), F(ab'), F(ab')2, Fv, o Fv de cadena simple.
Los ejemplos adicionales de fragmentos de anticuerpos de unión mejorados incluyen, de modo no taxativo, los que comprenden (i) el fragmento Fab que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1, (ii) el fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1, (iii) el fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un único anticuerpo; (iv) el fragmento dAb (Ward et ál . , 1989, Nature 341:544-546) que consta de una única variable, (v) regiones CDR y marco aisladas, (vi) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados (vii) moléculas Fv de cadena sencilla (scFv) , donde un dominio VH y un dominio VL están enlazados por un enlace peptídico que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de unión al antígeno (Bird et ál . , 1988, Science 242:423-426, Huston et ál . , 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883), (viii) dímeros Fv de cadena simple biespecíficos (PCT/US92/09965) y (ix) "diacuerpos " o "triacuerpos" , fragmentos multivalentes o multiespecíficos construidos mediante fusión genética (Tomlinson et . ál . , 2000, Methods Enzymol . 326:461-479; WO94/13804; Holliger eü ál . , 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 90 :6444-6448) .
Los fragmentos de anticuerpo pueden modificarse adicionalmente . Por ejemplo, las moléculas se pueden estabilizar mediante la inclusión de puentes disulfuro que enlazan los dominios VH y VL (Reiter, Y. et ál, (1996) Nature Biotech. 14:1239-1245).
En determinadas modalidades, la proteína de unión al antígeno mejorada es un anticuerpo de cadena simple. Los anticuerpos de cadena simple pueden formarse al unir fragmentos de dominio variable de cadena pesada y ligera (región Fv) mediante un puente aminoácido (enlace peptídico corto) , que da como resultado una cadena simple de polipéptidos . Las Fv de cadena simple (scFv) se han preparado al fusionar ADN que codifica un enlace peptídico entre ADN que codifican los dos polipéptidos de dominio variable (VL y VH) . Los polipéptidos resultantes pueden plegarse en sí mismos para formar monómeros de unión al antígeno, o pueden formar multímeros (por ej . , dímeros, trímeros o tetrámeros), dependiendo de la longitud de un enlace flexible entre los dos dominios variables (Kortt et ál . , 1997, Prot . Eng. 10:423; Kortt et ál . , 2001, Biomol . Eng. 18:95-108). Al combinar diferentes polipéptidos que comprenden VL y VH, uno puede formar scFv multiméricos que se unen a diferentes epítopos (Kriangkum et ál., 2001, Biomol. Eng. 18:31-40). Las técnicas desarrolladas para la producción de anticuerpos de cadena simple incluyen aquellos descritos en la patente estadounidense N.° 4,946,778; Bird, 1988, Science 242:423; Huston et ál., 1988, Proc . Nati. Acad. Sci. USA 85:5879; Ward et ál., 1989, Nature 334:544, de Graaf et ál., 2002, Methods Mol Biol. 178:379-87.
En una modalidad, la proteína de unión al antígeno mejorada es una proteína de fusión de anticuerpo (denominada a veces "conjugado de anticuerpo") . El compañero de conjugado puede ser proteináceo o no proteináceo; el último generalmente generándose al usar grupos funcionales en la proteína de unión al antígeno y en el compañero de conjugado. En determinadas modalidades, el anticuerpo se conjuga a un químico (fármaco) no proteináceo para formar un conjugado de fármaco de anticuerpo.
En algunas modalidades, las proteínas de unión al antígeno mejoradas de la invención son proteínas aisladas o proteínas sustancialmente puras. Una proteína "aislada" no está acompañada por al menos algo del material con el cual se asocia normalmente en su estado natural, por ejemplo constituyendo al menos alrededor de 5%, o al menos alrededor de 50% en peso del total de proteína en una muestra dada. Se entiende que la proteína aislada puede constituir de 5 a 99.9% en peso del contenido total de proteínas según las circunstancias. Por ejemplo, la proteína puede realizarse a una concentración significativamente más alta mediante el uso de un promotor inducible o promotor de alta expresión, de modo que la proteína se realice a niveles de concentración aumentados. La definición incluye la producción de una proteína de unión al antígeno en una amplia variedad de organismos y/o células hospedadoras conocidas en la técnica.
Las proteínas de unión al antígeno mejoradas pueden modificarse adicionalmente . Las modificaciones covalentes de proteínas de unión al antígeno mejoradas se incluyen dentro del alcance de esta invención y generalmente, pero no siempre, se hacen post-traduccionalmente . Por ejemplo, varios tipos de modificaciones covalentes de la proteína de unión al antígeno se introducen a la molécula mediante la reacción de restos de aminoácidos específicos de la proteína de unión al antígeno con un agente de derivación orgánica que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o con los restos del extremo N-terminal o C-terminal.
Los restos de cisteinilo se hacen reaccionar más comúnmente con a-haloacetatos (y aminas correspondientes) tales como ácido cloroacético o cloroacetamida, para proporcionar derivados de carboximetilo o carboxiamidometilo . Los restos de cisteinilo también se derivan mediante la reacción con bromotrifluoroacetona, ácido a-bromo-ß- (5-imidozoil)propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas , disulfuro de 3 -nitro-2 -piridilo, disulfuro de 2-piridilo de metilo, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4 -nitrofenol o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-l, 3-diazol .
Los restos de histidilo se derivan mediante la reacción con dietilpirocarbonato a pH 5.5-7.0 debido a que este agente es relativamente específico para la cadena lateral de histidilo. El bromuro de para-bromofenacilo también es útil; la reacción se realiza preferentemente en cacodilato de sodio 0.1 M a H 6.0 Los restos de lisinilo y del extremo amino se hacen reaccionar con succínico u otros anhídridos de ácido carboxílico. La derivación con estos agentes tiene el efecto de revertir la carga de los restos de lisinilo. Otros reactivos adecuados para derivar restos que contienen alfa-amino incluyen imidoésteres como picolinimidato de metilo, fosfato de piridoxal, piridoxal, cloroborohidruro, ácido trinitrobencenosulfónico, O-metilisourea, 2 , 4 -pentanodiona y reacción catalizada por transaminasa con glioxilato.
Los restos de arginilo se modifican mediante reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos fenilglioxal , 2 , 3-butanodiona, 1 , 2 -ciclohexanodiona y ninhidrina. La derivación con restos de arginina requiere que la reacción se realice en condiciones alcalinas debido al alto p a del grupo funcional de guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina así como el grupo epsilon-amino de arginina.
La modificación específica de los restos de tirosilo se puede realizar, con interés particular en la introducción de marcadores espectrales en restos de tirosilo mediante reacción con compuestos de diazonio aromático o tetranitrometano . Más comúnmente se usan N-acetilimidizol y tetranitrometano para formar especies de 0-acetil tirosilo y derivados de 3 -nitro, respectivamente. Los restos de tirosilo se yodan usando 125I o 131I para preparar proteínas etiquetadas para usarse en radioinmunoensayos , donde el método de cloramina T descrito anteriormente es adecuado.
Los grupos laterales de carboxilo (aspartilo o glutamilo) se modifican selectivamente mediante reacción con carbodiimidas (R1—N=C=N--R" ) , donde R y R' son grupos alquilo opcionalmente diferentes, tales como l-ciclohexil-3 - (2-morfolinil-4 -etil ) carbodiimida o l-etil-3 - (4 -azonia-4 , 4-dimetilpentil ) carbodiimida . Además, los restos de aspartilo y glutamilo se convierten en restos de asparaginilo y glutaminilo mediante reacción con iones de amonio.
La derivación con agentes bifuncionales es útil para reticular proteínas de unión al antígeno a una superficie o matriz de soporte insoluble en agua para usarse en una variedad de métodos. Los agentes de reticulación comúnmente utilizados incluyen, por ej . , 1, 1-bis (diazoacetil ) -2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4 -azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales , incluyendo ésteres de disuccinimidilo como 3 , 31 -ditiobis (succinimidilpropionato) y maleimidas bifuncionales como bis-N-maleimido-1, 8-octano. Los agentes de derivación como metil-3-[(p-azidofenil ) ditio] propioimidato proporcionan intermedios fotoactivables que pueden formar retículos en presencia de luz. De manera alternativa, las matrices reactivas insolubles en agua tales como carbohidratos activados por bromuro de cianogen y los sustratos reactivos descritos en patente estadounidense N.° 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537 y 4,330,440 se emplean para la inmovilización de proteínas.
Los restos de glutaminilo y asparaginilo se desanudan frecuentemente en los restos de glutamilo y aspartilo correspondientes, respectivamente. De manera alternativa, estos restos se desamidan en condiciones levemente ácidas. Cualquier forma de estos restos se encuentra dentro del alcance de la presente invención.
Otras modificaciones incluyen hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de restos de serilo o treonilo, metilación de los grupos a-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86
[1983], incorporadas en su totalidad mediante esta referencia) acetilación de la amina del extremo N-terminal y amidación de cualquier grupo carboxilo del extremo C-terminal.
Otro tipo de modificación covalente de una proteína de unión al antígeno mejorada incluida dentro del alcance de esta invención comprende alterar el patrón de glicosilación de la proteína. Como se sabe en la técnica, los patrones de glicosilación pueden depender tanto de la secuencia de la proteína (por ej . , la presencia o ausencia de restos particulares de aminoácidos de glicosilación, discutidos a continuación) como el organismo o la célula hospedadora donde se produce la proteína. A continuación se discuten sistemas de expresión particulares.
La glicosilación de polipéptidos está típicamente unida a N o unida a O. Unida a N se refiere a la unión del resto carbohidrato a la cadena lateral de un resto de asparagina.
Las secuencias de tripéptidos asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido menos prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del resto carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Por lo tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptidos en un polipéptido crea un posible sitio de glicosilación. La glicosilación unida a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un ácido hidroxiamino, más comúnmente serina o treonina, pese a que también se puede utilizar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina .
La adición de sitios de glicosilación a la proteína de unión al antígeno mejorada se logra convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de forma tal que contenga una o más de las secuencias de tripéptidos descritas anteriormente (para los sitios de glicosilación unidos a N) . La alteración también se puede realizar mediante la adición de, o sustitución por, uno o más restos de serina o treonina a la secuencia de inicio (para los sitios de glicosilación unidos a 0) . Para mayor facilidad, la secuencia de aminoácidos de la proteína de unión al antígeno se altera preferentemente mediante cambios a nivel del ADN, particularmente mediante la mutación del ADN que codifica el polipéptido diana en bases preseleccionadas de forma que se generen codones que se traducirán en aminoácidos deseados.
Otro medio para aumentar la cantidad de restos de carbohidratos en la proteína de unión al antígeno mejorada es mediante acoplamiento químico o enzimático de glicósidos a la proteína. Estos procedimientos son ventajosos en el sentido que no requieren la producción de la proteína en una célula hospedadora que tiene capacidades de glicosilación para la glicosilación unida a N y a O. Dependiendo del modo de acoplamiento usado, uno o más azúcares se pueden unir a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres tales como los de cisteína, (d) grupos hidroxilo libres tales como los de serina, treonina o hidroxiprolina, (e) restos aromáticos tales como los de fenilalanina, tirosina o triptófano o (f) el grupo amida de glutamina. Estos métodos se describen en W0 87/05330 publicada el 11 de setiembre de 1987 y en Aplin y Wriston, 1981, C C Crit. Rev. Biochem. , págs . 259-306.
El retiro de restos de carbohidrato presentes en la proteína de unión al antígeno se puede lograr química o enzimáticamente . La desglicosilación química requiere la exposición de la proteína al compuesto de ácido trifluorometanosulfónico o un compuesto equivalente. Este tratamiento da como resultado la escisión de la mayoría o todos los azúcares con la excepción del azúcar de unión (N-acetilglicosamina o N-acetilgalactosamina) mientras el polipéptido queda intacto. La desglicosilación química es descrita por Hakimuddin et ál . , 1987, Arch. Biochem. Biophys . 259:52 y por Edge et ál . , 1981, Anal. Biochem. 118:131. La escisión enzimática de las porciones de carbohidrato en polipéptidos se puede lograr mediante el uso de una variedad de endo y exo-glicosidasas según lo describen Thotakura eü ál . , 1987, Meth. Enzymol . 138:350. La glicosilación en posibles sitios de glicosilación se pueden prevenir mediante el uso del compuesto tunicamicina según lo describen Duskin et ál., 1982, J. Biol . Che . 257:3105. La tunicamicina bloquea la formación de los enlaces proteína-N-glicósido .
Otro tipo de modificación covalente de la proteína de unión al antígeno mejorada comprende la unión de la proteína de unión al antígeno a varios polímeros no proteináceos , que incluyen, de modo no taxativo, varios polioles tales como polietilenglicol , polipropilenglicol o polioxialquilenos , de la forma establecida en la patente estadounidense N.° 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 o 4,179,337. Además, tal como se sabe en la técnica, las sustituciones de aminoácidos pueden realizarse en diversas posiciones dentro de la proteína de unión al antígeno para facilitar la adición de polímeros tales como PEG.
En algunas modalidades, la modificación covalente de las proteínas de unión al antígeno mejoradas de la invención comprende la adición de una o más etiquetas.
El término "grupo de etiquetado" significa cualquier etiqueta detectable. Los ejemplos de grupos de etiquetado adecuados incluyen, de modo no taxativo, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ej . , 3H, 1C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, llxIn, 125I, 131I) , grupos fluorescentes (por ej . , FITC, rodamina, fósforos a base de lantánidos) , grupos enzimáticos (por ej . , peroxidasa de rábano picante, ß-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), grupos quimioluminiscentes , grupos de biotinilo o epítopos de polipéptidos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (por ej . , secuencias de pares de cremalleras de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominio de unión de metales, etiquetas de epítopos) . En algunas modalidades, el grupo de etiquetado se acopla a la proteína de unión al antígeno mejorada mediante brazos espaciadores de varias longitudes para reducir el potencial impedimento estérico. En la técnica se conocen varios métodos para etiquetar proteínas y pueden usarse para realizar la presente invención.
Las etiquetas específicas incluyen tintes ópticos, que incluyen, de modo no taxativo, cromóforos, fósforos y fluoróforos, siendo este último específico en varias instancias. Los fluoróforos pueden ser ya sea fluoros "de molécula pequeña" o fluoros proteináceos .
"Etiqueta fluorescente" significa cualquier molécula que puede detectarse mediante sus propiedades fluorescentes inherentes. Las etiquetas fluorescentes adecuadas incluyen, de modo no taxativo, fluoresceína , rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, coumarina, metil-coumarinas, pireno, verde de malaquita, estilbeno, amarillo lucifer, azul cascada J, rojo Texas, IAEDA S, EDANS, BODIPY FL, LC Red 640, Cy 5 , Cy 5.5 , LC Red 705, verde Oregón, los tintes Alexa-Fluor (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Ale a Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), azul cascada, amarillo cascada y R-ficoeritrina (PE) (Molecular Probes, Eugene, OR) , FITC, Rodamina y rojo de Texas (Pierce, Rockford, IL) , Cy5 , Cy5.5 , Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA) . Los tintes ópticos adecuados, que incluyen fluoróforos, se describen en Molecular Probes Handbook de Richard P. Haugland, incorporado expresamente a la presente mediante esta referencia.
Las etiquetas fluorescentes proteináceas adecuadas también incluyen, de modo no taxativo, proteína verde fluorescente, que incluye una especie de Renilla, Ptilosarcus o Aequorea de GFP (Chalfie et ál . , 1994, Science 263:802-805), EGFP (Clontech Laboratories, Inc., Número de Acceso Genbank U55762) , proteína azul fluorescente (BFP, Quantum Biotechnologies , Inc. 1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8.° piso, Montreal, Quebec, Canadá H3H 1J9 ; Stauber, 1998, Biotechniques 24:462-471; Heim et ál . , 1996, Curr. Biol . 6:178-182), proteína amarillo fluorescente potenciado (EYFP, Clontech Laboratories, Inc.), luciferasa (Ichiki et ál . , 1993, J. Immunol. 150:5408-5417), ß galactosidasa (Nolan et ál., 1988, Proc. Nati. Acad. Sci . U.S.A. 85:2603-2607) y Renilla (W092/15673, WO95/07463, WO98/14605, W098/26277, WO99/49019, patente estadounidense N.° 5292658, 5418155, 5683888, 5741668, 5777079, 5804387, 5874304, 5876995, 5925558) . La totalidad de las referencias citadas anteriormente se incorporan expresamente a la presente mediante esta referencia. Ácidos nucleicos aislados Los métodos descritos en la presente incluyen pasos donde se altera la secuencia de aminoácidos de una proteína de unión al antígeno. La mejor manera de lograr la alteración de la secuencia de aminoácidos es cambiar uno o más codones dentro de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína de unión al antígeno o la porción de esta. Por lo tanto, en determinados aspectos, la invención se relaciona con ácidos nucleicos aislados que codifican una proteína de unión al antígeno mejorada o porción mejorada de esta, por ejemplo, un dominio variable de cadena ligera o un dominio variable de cadena pesada.
En modalidades preferidas, el codón que reemplaza el codón existente es un codón que es preferentemente usado en la célula que se selecciona para expresar la proteína de unión al antígeno. Por ejemplo, si la proteína de unión al antígeno ha de expresarse en E. coli, se debe tomar la precaución de usar un codón para un aminoácido dado que preferentemente se use en E. coli.
Las moléculas de ácidos nucleicos de la invención incluyen ADN y ARN en forma tanto de cadena simple como de cadena doble, así como las secuencias complementarias correspondientes. El ADN incluye, por ejemplo, ADNc, ADN genómico, ADN sintetizado químicamente, ADN amplificado por PCR y combinaciones de estos. Las moléculas de ácidos nucleicos de la invención incluyen genes de longitud completa o moléculas de ADNc, así como combinaciones de fragmentos de estos. Los ácidos nucleicos de la invención derivan preferentemente de fuentes humanas, pero la invención también incluye aquellos derivados de especies no humanas.
Un "ácido nucleico aislado" es un ácido nucleico que ha sido separado de secuencias genéticas adyacentes presentes en el genoma del organismo del que se aisló el ácido nucleico, en el caso de ácidos nucleicos aislados de fuentes de origen natural. En el caso de ácidos nucleicos sintentizados de forma enzimática a partir de una plantilla o químicamente, tales como productos de PCR, moléculas de ADNc u oligonucleótidos , por ejemplo, se entiende que los ácidos nucleicos resultantes de los procesos son ácidos nucleicos aislados;. Una molécula de ácido nucleico aislada se refiere a una molécula de ácido nucleico en forma de un fragmento separado o como un componente de una construcción de ácido nucleico mayor. En una modalidad preferida, los ácidos nucleicos están sustancialmente libres de material endógeno contaminante. Preferentemente, la molécula de ácido nucleico ha derivado de ADN o ARN aislado al menos una vez en forma sustancialmente pura y en una cantidad o concentración que permite la identificación, manipulación y recuperación de su secuencias de nucleótidos componentes mediante métodos bioquímicos estándar (tales como los detallados en Sambrook et ál . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.a ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) ) . Las secuencias preferentemente se proporcionan y/o construyen en forma de un marco abierto de lectura ininterrumpido por secuencias internas no traducidas, o intrones, que típicamente están presentes en los genes eucariotas . Las secuencias de ADN no traducido pueden estar presentes 5' o 3' de un marco abierto de lectura, donde este no interfiere con la manipulación o expresión de la región de codificación.
Las secuencias de aminoácidos mejoradas de la invención se preparan comúnmente mediante la mutagénesis dirigida al sitio de nucleótidos en el ADN que codifica la proteína de unión al antígeno, usando mutagénesis de cásete o por PCR u otras técnicas conocidas en la técnica, para producir ADN que codifica la variante y, a continuación, expresando el ADN recombinante en un cultivo celular como se detalla en la presente .
Como apreciarán los expertos en la técnica, debido a la degeneración del código genético, puede producirse una cantidad extremadamente grande de ácidos nucleicos, todos los cuales codifican la proteína de unión al antígeno mejorada. Por lo tanto, habiendo identificado una secuencia de aminoácidos particular, los expertos en la técnica podrán producir cualquier cantidad de ácidos nucleicos diferentes, simplemente mediante la modificación de la secuencia de uno o más codones de una forma que no cambie la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada.
La presente invención también proporciona sistemas de expresión y construcciones en forma de plásmidos, vectores de expresión, casetes de transcripción o expresión que comprenden al menos un polinucleótido como se indica anteriormente. Adicionalmente , la invención proporciona células hospedadoras que comprenden los sistemas de expresión o construcciones.
Típicamente, los vectores de expresión usados en cualquiera de las células hospedadoras contendrán secuencias para el mantenimiento de plásmidos y para la clonación y expresión de secuencias de nucleótidos exógenas . Las secuencias, referidas en forma colectiva como "secuencias flanqueantes", en ciertas modalidades típicamente incluirán una o más de las siguientes secuencias de nucleótidos: un promotor, una o más secuencias potenciadoras , un origen de replicación, una secuencia de terminación transcripcional , una secuencia de intrones completa que contiene un sitio de corte donante y aceptor, una secuencia que codifica una secuencia líder para la secreción de polipéptidos , un sitio de unión a ribosomas, una secuencia de poliadenilación, una región poliligadora para insertar el ácido nucleico que codifica el polipéptido a expresarse y un elemento marcador seleccionable . Cada una de estas secuencias se expone en lo que sigue.
Opcionalmente , el vector puede contener una secuencia que codifica "etiquetas", es decir, una molécula de oligonucleótido ubicada en el extremo 5' o 3' de la secuencia de codificación de proteínas de unión al antígeno mejorada; la secuencia de oligonucleótidos codifica poliHis (tal como hexaHis) , u otra "etiqueta" tal como FLAG, HA (hemaglutinina del virus de la influenza) , o yc, para las que existen anticuerpos comercialmente disponibles. Esta etiqueta típicamente se fusiona al polipéptido tras la expresión del polipéptido y puede servir como medio para la purificación por afinidad o detección de la proteína de unión al antígeno mejorada de la célula hospedadora. La purificación por afinidad puede lograrse, por ejemplo, mediante cromatografía en columna usando anticuerpos contra la etiqueta como una matriz de afinidad. Opcionalmente, a continuación, la etiqueta puede eliminarse de la proteína de unión al antígeno mejorada purificada por diversos medios, tal como usando determinadas peptidasas para la escisión.
Las secuencias flanqueantes pueden ser homologas (es decir, de la misma especie y/o cepa que la célula hospedadora) , heterólogas (es decir, de una especie distinta que la especie o cepa de la célula hospedadora) , híbridas (es decir, una combinación de secuencias flanqueantes de más de una fuente), sintéticas o nativas. Como tal, la fuente de un secuencia flanqueante puede ser un organismo procariota o eucariota, cualquier organismo vertebrado o invertebrado o cualquier planta, siempre que la secuencia flanqueante sea funcional en la maquinaria de la célula hospedadora y pueda ser activada por esta.
Las secuencias flanqueantes útiles en los vectores de esta invención pueden obtenerse mediante cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica. Típicamente, las secuencias flanqueantes útiles en la presente se habrán identificado previamente mediante mapeo y/o mediante digestión de endonucleasas de restricción y, por lo tanto, pueden aislarse de la fuente tisular adecuada usando las endonucleasas de restricción adecuadas. En algunos casos, puede conocerse la secuencia de nucleótidos completa de una secuencia flanqueante. Aquí, la secuencia flanqueante puede sintetizarse usando los métodos descritos en la presente para la síntesis o clonación de ácidos nucleicos.
Ya sea que se conozca toda la secuencia flanqueante o solo una porción de esta, se puede obtener usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés,) y/o mediante el análisis de una genoteca con una sonda apropiada tal como un fragmento de secuencia flanqueante y/o de oligonucleótidos de la misma o distinta especie. Cuando no se conoce la secuencia flanqueante, se puede aislar un fragmento de ADN que contenga una secuencia flanqueante de un trozo de ADN mayor que puede contener, por ejemplo, una secuencia de codificación o incluso otro gen o genes. El aislamiento puede lograrse mediante la digestión de endonucleasas de restricción para producir el fragmento de ADN adecuado seguido del aislamiento usando purificación en gel de agarosa, cromatografía en columna Cjiagen8 (Chatsworth, CA) , u otros métodos conocidos por los expertos en la técnica. La selección de enzimas adecuadas para lograr este objetivo será evidente para el experto en la técnica.
Un origen de replicación es típicamente una parte de los vectores de expresión procariotas obtenidos comercialmente , y el origen ayuda en la amplificación del vector en una célula hospedadora. Si el vector seleccionado no contiene un sitio de origen de replicación, se puede sintetizar químicamente uno sobre la base de una secuencia conocida y ligarse al vector. Por ejemplo, el origen de replicación del plásmido pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA) es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram negativas, y diversos orígenes virales (por ejemplo, SV40, polioma, adenovirus, virus de la estomatitis vesicular (VSV por sus siglas en inglés,), o virus del papiloma tales como HPV o BPV) son útiles para clonar vectores en células de mamíferos. Generalmente, el componente del origen de replicación no es necesario para los vectores de expresión mamíferos (por ejemplo, el origen SV40 a menudo se usa solo porque también contiene el promotor temprano del virus) .
Típicamente, una secuencia de terminación de transcripción está ubicada 31 hacia el extremo de una región de codificación de un polipéptido y sirve para terminar la transcripción. Generalmente, una secuencia de terminación de transcripción en células procariotas es un fragmento rico en G-C seguido de una secuencia poli-T. Aunque la secuencia se clona fácilmente a partir de una genoteca o incluso se compra comercialmente como parte de un vector, también puede sintetizarse fácilmente usando métodos para la síntesis de ácidos nucleicos tales como los descritos en la presente.
Un gen marcador seleccionable codifica una proteína necesaria para la supervivencia y el crecimiento de una célula hospedadora cultivada en un medio de cultivo selectivo. Los típicos genes marcadores de selección codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, tetraciclina o kanamicina para las células hospedadoras procariotas; (b) complementan las deficiencias auxotróficas de la célula; o (c) proporcionan nutrientes cruciales no disponibles de medios complejos o definidos. Los marcadores seleccionables específicos son el gen de resistencia a la kanamicina, el gen de resistencia a la ampicilina y el gen de resistencia a la tetraciclina. Ventajosamente, un gen de resistencia a la neomicina también puede usarse para la selección en células hospedadoras tanto procariotas como eucariotas .
Pueden usarse otros genes seleccionables para amplificar el gen que será expresado. La amplificación es el proceso donde los genes requeridos para la producción de una proteína crucial para el crecimiento o la supervivencia celular se reiteran en tándem dentro de los cromosomas de generaciones sucesivas de células recombinantes . Los ejemplos de marcadores seleccionables adecuados para células de mamíferos incluyen genes de dihidrofolato reductasa (DHFR) y tirnidina cinasa sin promotor. Los transformantes de células de mamífero se colocan bajo presión de selección donde solo los transformantes están adaptados de forma única para sobrevivir en virtud del gen seleccionable presente en el vector. La presión de selección se impone cultivando las células transformadas en condiciones en las que la concentración del agente de selección en el medio se aumenta sucesivamente, llevando así a la amplificación de tanto el gen seleccionable como del ADN que codifica otro gen, tal como una proteína de unión al antígeno mejorada. Como resultado, cantidades crecientes de un polipéptido tal como una proteína de unión al antígeno mejorada se sintetizan a partir del ADN amplificado.
Generalmente se necesita un sitio de unión al ribosoma para la iniciación de la traducción del ARNrn y este se caracteriza por una secuencia Shine-Dalgarno (procariontes) o una secuencia Kozak (eucariontes) . Típicamente, el elemento está ubicado 3 ' con respecto al promotor y 51 con respecto a la secuencia de codificación del polipéptido a expresarse. En determinadas modalidades, una o más regiones codificantes pueden estar enlazadas de forma operativa a un sitio interno de unión al ribosoma (IRES) , lo que permite la traducción de dos marcos abiertos de lectura a partir de una única transcripción de ADN.
En algunos casos, tal como cuando se busca la glicosilación en un sistema de expresión de célula hospedadora eucariota, se puede manipular las varias pre o prosecuencias para mejorar la glicosilación o el rendimiento. Por ejemplo, se puede alterar el sitio de escisión de la peptidasa de un péptido de señal particular, o añadir prosecuencias, lo que también puede afectar la glicosilación. El producto proteico final puede tener, en la posición -1 (relativa al primer aminoácido de la proteína madura) uno o más aminoácidos adicionales tendentes a la expresión, que pueden no haberse eliminado por completo. Por ejemplo, el producto final proteico puede tener uno o dos restos de aminoácidos que se encuentran en el sitio de escisión de la peptidasa, ligados al extremo amino. De forma alternativa, el uso de algunos sitios de escisión de enzimas puede resultar en una forma levemente truncada del polipéptido deseado, si la enzima se corta en el área dentro del polipéptido maduro.
Los vectores de expresión y clonación de la invención típicamente contendrán un promotor que es reconocido por el organismo hospedador y está enlazado de forma operativa a la molécula que codifica la proteína de unión al antígeno mejorada. Los promotores son secuencias no transcritas ubicadas corriente arriba (es decir, 5') con respecto al codón de inicio de un gen estructural (generalmente dentro de aproximadamente 100 a 1000 bp) que controlan la transcripción del gen estructural. Los promotores tradicionalmente se agrupan en una de dos clases: promotores inducibles y promotores constitutivos. Los promotores inducibles inician los niveles aumentados de transcripción de ADN bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, como la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura. Los promotores constitutivos, por el contrario, transcriben uniformemente el gen al que están enlazados de forma operativa, es decir, con poco o ningún control sobre la expresión génica. Se conoce una gran cantidad de promotores, reconocidos por diversas células hospedadoras potenciales. Un promotor adecuado está enlazado de forma operativa al ADN que codifica la cadena pesada o la cadena ligera que comprende una proteína de unión al antígeno mejorada de la invención mediante la eliminación del promotor del ADN fuente por digestión de enzimas de restricción e insertando la secuencias de promotores deseada en el vector.
Los promotores adecuados para usar con hospedadores de levadura también se conocen en la técnica. Los potenciadores de levadura se usan ventajosamente con los promotores de levadura. Los promotores adecuados para usar con células hospedadoras de mamíferos son conocidos e incluyen, de modo no taxativo, los obtenidos de los genomas de virus tal como poliomavirus , virus de la viruela aviar, adenovirus (tal como Adenovirus 2) , virus del papiloma bovino, virus sarcoma aviar, citomegalovirus , retrovirus, virus de la hepatitis B y con mayor preferencia Virus del Simio 40 (SV40) . Otros promotores mamíferos adecuados incluyen promotores mamíferos heterólogos, por ejemplo, promotores de choque térmico y el promotor de actina.
Promotores adicionales que pueden ser de interés incluyen, de modo no taxativo: Promotor temprano de SV40 (Benoist y Chambón, 1981, Nature 290:304-310); promotor de CMV (Thornsen et ál . , 1984, Proc . Nati. Acad. USA 81:659-663); el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' del virus sarcoma Rous (Yamamoto et ál . , 1980, Cell 22:787-797) ; promotor de timidina cinasa del herpes (Wagner et ál., 1981, Proc. Nati. Acad. Sci . USA 78:1444-1445); secuencias promotoras y reguladoras del gen de la metalotionina Prinster et ál., 1982, Nature 296:39-42); y promotores procariotas tal como el promotor beta-lactamasa (Villa-Kamaroff et ál . , 1978, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75:3727-3731) ; o el promotor tac (DeBoer et ál . , 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80:21-25). También son de interés las siguientes regiones de control transcripcional animal, que exhiben especificidad tisular y han sido utilizadas en animales transgénicos : la región de control del gen de la elastasa I que está activa en las células acinares pancréaticas (Swift et ál . , 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et ál., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant . Biol . 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); la región de control del gen de la insulina que está activa en las células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122); la región de control del gen de la inmunoglobulina que está activa en las células linfoides (Grosschedl et ál., 1984, Cell 38:647-658; Adames et ál . , 1985, Nature 318:533-538; Alexander et ál., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444); la región de control del virus del tumor mamario murino que está activa en las células de testículos, de mamas, linfoides y mastocitos (Leder et ál . , 1986, Cell 45:485-495); la región de control del gen de la albúmina que está activa en el hígado (Pinkert et ál . , 1987, Genes and Devel . 1 :268-276); la región de control del gen de la alfa-fetoproteína que está activa en el hígado (Krumlauf et ál . , 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et ál., 1987, Science 253:53-58); la región de control del gen alfa 1-antitripsina que está activa en el hígado (Kelsey et ál . , 1987, Genes and Devel. 1:161-171); la región de control del gen de la globina beta que está activa en las células mieloides (Mogram et ál . , 1985, iVature 315:338-340; Kollias et ál . , 1986, Cell 46:89-94); la región de control del gen de la proteína básica de mielina que está activa en las células oligodentrocitas en el cerebro (Readhead et ál., 1987, Cell 48:703-712); la región de control del gen de la miosina de cadena ligera 2 que está activa en el músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314:283-286); y la región de control del gen de la hormona liberadora de gonadotropina que está activa en el hipotálamo (Masón et ál . , 1986, Science 234:1372-1378) .
Se puede insertar una secuencia potenciadora en el vector para aumentar la transcripción de ADN que codifica la cadena ligera o la cadena pesada de una proteína de unión al antígeno mejorada de la invención por eucariotas mayores. Los potenciadores son elementos de ADN que actúan en cis, generalmente de alrededor de 10-300 bp de longitud, que actúan en el promotor para aumentar la transcripción. Los potenciadores son relativamente independientes en cuanto a orientación y posición, y se los ha encontrado en posiciones tanto 5' como 3' con respecto a la unidad de transcripción. Se conocen varias secuencias potenciadoras disponibles de genes mamíferos (por ejemplo, globina, . elastasa, albúmina, alfa-fetoproteína e insulina) . Típicamente, sin embargo, se utiliza un potenciador de un virus. El potenciador de SV40, el potenciador del promotor temprano del citomegalovirus , el potenciador de polioma y los potenciadores del adenovirus conocidos en la técnica son ejemplos de elementos potenciadores para la activación de promotores eucariotas. Aunque un potenciador puede posicionarse en el vector ya sea 5' o 3' con respecto a una secuencia de codificación, típicamente está situado en un sitio 5' del promotor. Una secuencia que codifica una secuencia de señal nativa o heteróloga adecuada (secuencia líder o péptido señal) puede incorporarse en un vector de expresión, para promover la secreción extracelular del anticuerpo. La elección del péptido señal o líder depende del tipo de células hospedadoras en las que el anticuerpo se ha de producir, y una secuencia de señal heteróloga puede reemplazar la secuencia de señal nativa. Los ejemplos de péptidos señal que son funcionales en las células hospedadoras de mamíferos incluyen los siguientes: la señal de secuencia para la interleucina 7 (IL-7) descrita en la patente estadounidense N.° 4,965,195; la secuencia de señal para el receptor de interleucina 2 descrita en Cosman et ál.,1984, Nature 312:768; el péptido señal del receptor de interleucina 4 descrito en la patente EP N. ° 0367 566; el péptido señal del receptor de interleucina 1 tipo I descrito en la patente estadounidense N.° 4,968,607; el péptido señal del receptor de interleucina 1 tipo II descrito en la patente EP N.° 0 460 846.
El vector puede contener uno o más elementos que faciliten la expresión cuando el vector se integra al genoma de la célula hospedadora. Los ejemplos incluyen un elemento EASE (Aldrich et ál . 2003 Biotechnol Prog. 19:1433-38) y una región de unión a la matriz (MAR) . Las MAR median la organización estructural de la cromatina y pueden aislar el vector integrado del efecto "posición" . Por lo tanto, las MAR son particularmente útiles cuando el vector se usa para crear transfectantes estables. En la técnica se conoce una cantidad de ácidos nucleicos que contienen MAR naturales y sintéticos, por ejemplo, las patentes estadounidenses N.° 6,239,328; 7,326,567; 6,177,612; 6,388,066; 6,245,974; 7,259,010; 6,037,525; 7,422,874; 7,129,062.
Los vectores de expresión de la invención pueden construirse a partir de un vector de inicio tal como un vector comercialmente disponible. Tales vectores pueden o no contener todas las secuencias flanqueantes deseadas. Cuando una o más de las secuencias flanqueantes descritas en la presente no están presentes ya en el vector, pueden obtenerse de forma individual y ligarse al vector. Los métodos usados para obtener cada una de las secuencias flanqueantes son conocidos por el experto en la técnica.
Luego de que el vector ha sido construido y una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de unión al antígeno mejorada, o un componente de esta, por ejemplo, una cadena ligera, una cadena pesada, o una cadena ligera y una cadena pesada que comprenden una secuencia de unión al antígeno mejorada, se ha insertado en el sitio apropiado del vector, el vector completo puede insertarse en una célula hospedadora adecuada para la amplificación y/o la expresión del polipéptido. La transformación de un vector de expresión para una proteína de unión al antígeno mejorada en una célula hospedadora seleccionada puede lograrse por métodos conocidos, incluyendo la transfección, infección, coprecipitación con fosfato de calcio, electroporación, microinyección, lipofección, transfección mediada por DEAE-dextrano u otras técnicas conocidas. El método seleccionado será en parte una función del tipo de célula hospedadora a usarse. Estos métodos y otros métodos adecuados son conocidos por el experto en la técnica y se establecen, por ejemplo, en Sambrook et ál . , 2001, supra.
Una célula hospedadora, cuando se cultiva en condiciones adecuadas, sintetiza una proteína de unión al antígeno mejorada que puede recolectarse posteriormente del medio de cultivo (si la célula hospedadora la secreta en el medio) o directamente de la célula hospedadora que la produce (si no es secretada) . La selección de una célula hospedadora adecuada dependerá de diversos factores, tales como los niveles de expresión deseados, las modificaciones del polipéptido que son deseables o necesarias para la actividad (tales como glicosilación o fosforilación) y la facilidad para plegarse en una molécula biológicamente activa. Una célula hospedadora puede ser eucariota o procariota.
Las líneas celulares de mamífero disponibles como hospedadoras para la expresión son conocidas en la técnica e incluyen, de modo no taxativo, líneas celulares inmortalizadas disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) y cualquier línea celular usada en un sistema de expresión que se conozca en la técnica puede usarse para producir los polipéptidos recombinantes de la invención. En general, las células hospedadoras se transforman con uno o más vectores de expresión recombinantes que comprenden ADN que codifica una proteína de unión al antígeno mejorada. Entre las células hospedadoras que pueden emplearse se encuentran los procariontes , las levaduras o las células eucariotas más altas. Los procariontes incluyen los organismos Gram negativo o Gram positivo, por ejemplo, E. coli o bacilli. Las células eucariotas más altas incluyen células de insectos y líneas celulares establecidas de origen mamífero. Los ejemplos de líneas celulares hospedadoras de mamífero adecuadas incluyen la línea COS-7 de células renales de mono (ATCC CRL 1651) (Gluzman et ál . , 1981, Cell 23:175), células L, células 293, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hámster chino (CHO), o sus derivados como Veggie CHO y líneas celulares relacionadas que crecen en medios libres de suero (Rasmussen et ál . , 1998, Cytotechnology 28: 31), células HeLa, líneas celulares BHK (ATCC CRL 10) y la línea celular CVI/EBNA derivada de la línea celular de riñón de mono verde africano CVI (ATCC CCL 70) como describe en McMahan et ál . , 1991, EMBO J. 10: 2821, líneas celulares de riñón embrionarias humanas tales como 293, EBNA 293 o MSR 293, células epidérmicas humanas A431, células humanas Colo205, otras líneas celulares transformadas de primate, células diploides normales, cepas de células derivadas del cultivo in vitro de tejido primario, explantes primarios, células HL-60, U937, HaK o Jurkat . Opcionalmente, las líneas celulares de mamífero tales como HepG2/3B, KB, NIH 3T3 o S49, por ejemplo, pueden usarse para la expresión del polipéptido cuando sea deseable usar el polipéptido en diversos ensayos indicadores o de transducción de señal . De manera alternativa, es posible producir el polipéptido en eucariontes menores tales como levaduras o en procariontes tales como bacterias. Las levaduras adecuadas incluyen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces strains, Candida o cualquier cepa de levadura capaz de expresar polipéptidos heterólogos. Las cepas de bacterias adecuadas incluyen Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium o cualquier cepa de bacterias capaz de expresar polipéptidos heterólogos. Si el polipéptido se produce en levaduras o bacterias, puede ser deseable modificar el polipéptido allí producido, por ejemplo, mediante la fosforilación o glicosilación de los sitios adecuados, con el fin de obtener un polipéptido funcional. Los enlaces covalentes pueden lograrse usando métodos químicos o enzimáticos conocidos. También se puede producir el polipéptido mediante el enlace de forma operativa del ácido nucleico aislado de la invención a secuencias de control adecuadas en uno o más vectores de expresión de insectos y empleando un sistema de expresión de insectos. Los materiales y métodos para los sistemas de expresión de baculovirus/células de insectos están comercialmente disponibles en forma de kit, por ejemplo, de Invitrogen, San Diego, Calif., EUA (el kit MaxBac®) , y Los métodos se conocen en la técnica, como se describe en Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin N.° 1555 (1987), y Luckow y Summers, Bio/Technology 6:47 (1988). También pueden emplearse sistemas de traducción libres de células para producir polipéptidos usando ARN derivados de construcciones de ácidos nucleicos que se describen en la presente. Los vectores de clonación y de expresión adecuados para el uso con células hospedadoras bacterianas, fúngicas, de levadura y de mamífero son descritos por Pouwels et ál . [Cloning Vectors : A Laboratory Manual, Elsevier, Nueva York, 1985). Una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico aislado de la invención, preferentemente ligada de forma operativa a por lo menos una secuencia de control de expresión, es una "célula hospedadora recombinante" .
Composiciones farmacéuticas En algunas modalidades, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una o varias proteínas de unión al antígeno mejoradas junto con un diluyente, portador, solubilizante, emulsificante, conservante y/o adyuvante farmacéuticamente eficaz. En determinadas modalidades, la proteína de unión al antígeno mejorada es un anticuerpo, incluyendo un anticuerpo conjugado con fármaco o un anticuerpo biespecífico . Las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen, de modo no taxativo, composiciones líquidas, congeladas y liofilizadas .
Preferentemente, los materiales de formulación no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas. En modalidades específicas, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión al antígeno mejorada .
En determinadas modalidades, la composición farmacéutica puede contener materiales de formulación para modificar, mantener o preservar, por ejemplo, el pH, la osmolaridad, la viscosidad, la claridad, el color, la isotonicidad, el olor, la esterilidad, la estabilidad, la tasa de disolución o liberación, la absorción o penetración de la composición. En tales modalidades, los materiales de formulación adecuados incluyen, de modo no taxativo, aminoácidos (tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina, prolina o lisina) ; antimicrobianos; antioxidantes (tales como ácido ascórbico, sulfito de sodio o hidrógeno-sulfito de sodio) ; amortiguadores (tales como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos u otros ácidos orgánicos) ; agentes espesantes (tales como manitol o glicina) ; agentes quelantes (tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) ) ; agentes complej antes (tales como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil -beta-ciclodextrina) ; reíleñadores ; monosacáridos ; disacáridos; y otros carbohidratos (tales como glucosa, mañosa o dextriñas) ; proteínas (tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas) ; agentes colorantes, saborizantes y diluyentes; agentes emulsificantes ; polímeros hidrofílieos (tal como polivinilpirrolidona) ; polipéptidos de bajo peso molecular; contraiones que forman sales (tal como sodio) ; conservantes (tales como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico o peróxido de hidrógeno) ; solventes (tales como glicerina, propilenglicol o polietilenglicol) ; alcoholes de azúcar (tales como manitol o sorbitol) ; agentes de suspensión; tensioactivos o agentes humectantes (tales como Pluronics, PEG, ésteres de sorbitán, polisorbatos tales como polisorbato 20, polisorbato, tritón, trometamina, leoitina, colesterol, tiloxapal) ; agentes mejoradores de estabilidad (tales como sacarosa o sorbitol) ; agentes mejoradores de tonicidad (tales como haluros de metales alcalinos, preferentemente cloruro de sodio o de potasio, manitol sorbitol) ; vehículos de administración; diluyentes; excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos. Véase, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18" Edición, (A. R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Company .
En determinadas modalidades, un experto en la técnica determinará la composición farmacéutica óptima dependiendo, por ejemplo, de la vía de administración pretendida, el formato de administración y la dosis deseada. Véase, por ejemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra . En determinadas modalidades, tales composiciones pueden influenciar el estado físico, la estabilidad, la tasa de liberación in vivo y la tasa de depuración in vivo de las proteínas de unión al antígeno de la invención. En determinadas modalidades, el vehículo o portador primario en una composición farmacéutica puede ser de naturaleza acuosa o bien no acuosa. Por ejemplo, un vehículo o portador adecuado puede ser agua para inyección, solución salina fisiológica o líquido cefalorraquídeo artificial, complementado posiblemente con otros materiales comunes en las composiciones para administración parenteral . Otros ejemplos de vehículos son solución salina neutra tamponada o solución salina mezclada con albúmina de suero. En modalidades específicas, las composiciones farmacéuticas comprenden amortiguador Tris con un pH de alrededor de 7.0-8.5, o amortiguador de acetato con un pH de alrededor de 4.0-5.5, y puede incluir adicionalmente sorbitol o un sustituto adecuado de este. En determinadas modalidades de la invención, pueden prepararse composiciones de proteína de unión al antígeno mejorada para almacenar mezclando la composición seleccionada con el grado de pureza deseado con agentes de formulación opcionales (REMINGTON ' S PHARMACEUTICAL SCIENCES , supra) en forma de una torta liofilizada o una solución acuosa. Además, en determinadas modalidades, el producto de proteína de unión al antígeno mejorada puede formularse como un liofilizado usando excipientes adecuados como sacarosa.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden seleccionarse para la administración parenteral . De manera alternativa, las composiciones pueden seleccionarse para inhalación o para la administración por el tracto digestivo, tal como de forma oral. La preparación de las composiciones farmacéuticamente aceptables se encuentra dentro del conocimiento de la técnica. Los componentes de formulación están presentes preferentemente en concentraciones que son aceptables para el sitio de administración. En determinadas modalidades, se utilizan los amortiguadores para mantener la composición a un pH fisiológico o a un pH levemente menor, normalmente en un intervalo de pH entre alrededor de 5 y alrededor de 8.
Cuando se contempla la administración parenteral, las composiciones terapéuticas pueden proporcionarse en forma de una solución acuosa libre de pirógenos parenteralmente aceptable que comprende la proteína de unión al antígeno mejorada deseada en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo particularmente adecuado para la inyección parenteral es el agua destilada estéril en la que la proteína de unión al antígeno se formula como una solución isotónica estéril preservada de forma adecuada. En determinadas modalidades, la preparación puede implicar la formulación de la molécula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas bioerosionables , compuestos poliméricos (tales como ácido poliláctico o ácido poliglicólico) , esferas o liposomas, que pueden proporcionar una liberación controlada o sostenida del producto, el cual puede administrarse mediante inyección de depósito. En determinadas modalidades, también se puede utilizar ácido hialurónico, con el efecto de promover la duración sostenida en la circulación. En determinadas modalidades, pueden utilizarse dispositivos implantables para la administración de fármacos para introducir la proteína de unión al antígeno deseada .
Las composiciones farmacéuticas pueden formularse para su inhalación. En estas modalidades, las proteínas de unión al antígeno mejoradas se formulan ventajosamente como un polvo seco inhalable . En modalidades específicas, las soluciones para inhalación de proteína de unión al antígeno mejorada también pueden formularse con un propelente para la administración en aerosol. En determinadas modalidades, las soluciones pueden ser nebulizadas. Por lo tanto, los métodos de formulación y administración pulmonar se describen adicionalmente en la solicitud de patente internacional N.° PCT/US94/001875 , que se incorpora mediante esta referencia y describe la administración pulmonar de proteínas modificadas químicamente.
También se contempla que las formulaciones pueden administrarse de forma oral. Las proteínas de unión al antígeno mejoradas que se administran de esta manera pueden formularse con o sin portadores usados convencionalmente en la composición de formas de dosificación sólidas tales como comprimidos y cápsulas. En determinadas modalidades, una cápsula puede estar diseñada para liberar la parte activa de la formulación en el tracto gastrointestinal en el punto en que la biodisponibilidad está maximizada y la degradación presistémica se encuentra minimizada. Se pueden incluir agentes adicionales para facilitar la absorción de la proteína de unión al antígeno mejorada. También pueden emplearse diluyentes, saborizantes , ceras con punto de fusión bajo, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión, agentes desintegrantes de comprimidos y aglutinantes.
Las composiciones farmacéuticas adicionales resultarán evidentes para los expertos en la técnica, incluyendo las formulaciones que implican proteínas de unión al antígeno mejoradas en formulaciones de liberación sostenida o controlada. Las técnicas para la formulación de una variedad de otros medios de liberación sostenida o controlada, tales como portadores de liposomas, micropartículas bioerosionables o cuentas porosas e inyecciones de depósito, también son conocidas por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, la solicitud de patente internacional N.° PCT/US93/00829 , que se incorpora mediante esta referencia y describe la liberación controlada de las micropartículas poliméricas porosas para la administración de composiciones farmacéuticas. Las preparaciones de liberación sostenida pueden incluir matrices de polímeros semipermeables en forma de artículos con forma, por ejemplo, películas o microcápsulas . Las matrices de liberación sostenida pueden incluir poliésteres, hidrogeles, polilactidas (como se describe en la patente estadounidense N . ° 3,773,919 y en la publicación de solicitud de patente europea N. ° EP 058481, cada una las cuales se incorpora mediante esta referencia, copolímeros de ácido L-glutámico y gama etil-L-glutamato (Sidman et ál . , 1983, Biopolymers 2:547-556), poli(2-hidroxietil -metacrilato) (Langer et ál . , 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 y Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105), etilenvinilacetato (Langer et ál . , 1981, supra) o ácido poli-D(-) -3-hidroxibutírico (publicación de solicitud de patente europea N.° EP 133,988). Las composiciones de liberación sostenida también pueden incluir liposomas que pueden prepararse mediante cualquiera de los varios métodos conocidos en la técnica. Véase, por ej . , Eppstein et ál . , 1985, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:3688-3692; publicaciones de solicitudes de patente europeas N. ° EP 036,676; EP 088,046 y EP 143,949, que se incorporan mediante esta referencia.
Las composiciones farmacéuticas usadas para la administración in vivo normalmente se proporcionan como preparaciones estériles. La esterilización puede lograrse mediante la filtración a través de membranas de filtración estériles. Cuando la composición se liofiliza, la esterilización utilizando este método puede realizarse ya sea antes o después de la liofilización y reconstitución. Las composiciones para administración parenteral pueden almacenarse en forma liofilizada o en una solución. Las composiciones parenterales generalmente se colocan en un recipiente que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o vial de solución intravenosa con un tapón perforable con una aguja de inyección hipodérmica.
Los aspectos de la invención incluyen formulaciones de proteínas de unión al antígeno mejoradas con capacidad de autorregulación, que pueden usarse como composiciones farmacéuticas, como se describe en la solicitud de patente internacional WO 06138181A2 (PCT/US2006/022599) , que se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia .
Como se describió anteriormente, determinadas modalidades proporcionan composiciones proteicas de proteínas de unión al antígeno mejoradas, particularmente composiciones farmacéuticas de proteínas de unión al antígeno mejoradas que comprenden, además de la proteína de unión al antígeno mejorada, uno o más excipientes tales como los descritos ilustrativamente en esta sección y en otras partes de la presente. Los excipientes pueden usarse en la invención en este sentido con una gran variedad de fines, tales como el ajuste de las propiedades físicas, químicas o biológicas de las formulaciones, tal como el ajuste de la viscosidad, y/o procesos de la invención para mejorar la eficacia y/o para estabilizar las formulaciones y procesos contra la degradación y deterioro a causa de, por ejemplo, daños que ocurren durante la fabricación, transporte, almacenamiento, preparación previa al uso, administración y etapas posteriores.
Existen varias exposiciones disponibles sobre los materiales y métodos para la formulación y estabilización de proteínas útiles en este aspecto, tales como Arakawa et ál . , "Solvent interactions in pharmaceutical formulations" , Pharm Res. 8(3): 285-91 (1991); Kendrick et ál . , "Physical stabilization of proteins in aqueous solution", en: RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS : THEORY AND PRACTICE, Carpenter y Manning, eds . Pharmaceutical Biotechnology . 13: 61-84 (2002), y Randolph et ál . , "Surfactant-protein interactions" , Pharm Biotechnol . 13: 159-75 (2002), cada una de las cuales se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia, particularmente en las partes pertinentes a los excipientes y procesos de estas para las formulaciones proteicas con capacidad de autorregulación de acuerdo con la presente invención, especialmente en cuanto a productos farmacéuticos de proteínas y procesos para el uso médico veterinario y/o humano.
Las sales pueden usarse de acuerdo con determinadas modalidades de la invención, por ejemplo, para ajustar la fuerza iónica y/o la isotonicidad de una formulación y/o para mejorar la solubilidad y/o estabilidad física de una proteína u otro ingrediente de una composición de acuerdo con la invención .
Como es de común conocimiento, los iones pueden estabilizar el estado nativo de las proteínas mediante la unión a restos cargados en la superficie de la proteína y mediante la protección de los grupos cargados y polares en la proteína y la reducción de la fuerza de sus interacciones electrostáticas, atractivas y repulsivas. Los iones también pueden estabilizar el estado desnaturalizado de una proteína mediante la unión, en particular, a los enlaces peptídicos desnaturalizados (--CONH) de la proteína. Además, la interacción iónica con grupos cargados y polares en una proteína también puede reducir las interacciones electrostáticas intermoleculares y, así, prevenir o reducir la insolubilidad y agregación de las proteínas.
Las especies de iones difieren considerablemente en sus efectos sobre las proteínas. Se han desarrollado una cantidad de clasificaciones categóricas de los iones y sus efectos sobre las proteínas que pueden usarse en la formulación de composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención. Un ejemplo es la serie Hofmeister, que clasifica los solutos iónicos y no iónicos polares según su efecto sobre la estabilidad conformacional de las proteínas en solución. Se hace referencia a los solutos estabilizantes como "cosmotrópicos" . Se hace referencia a los solutos desestabilizantes como "caotrópicos" . Los cosmotropos comúnmente se usan en concentraciones altas (por ej . , sulfato de amonio >1 molar) para precipitar las proteínas de la solución ("eliminación de sales"). Los caotropos comúnmente se usan para desnaturalizar y/o solubilizar las proteínas ("incorporación de proteínas"). La eficacia relativa de los iones para "incorporar sales" o "eliminar sales" define su posición en la serie Hofmeister.
Pueden usarse aminoácidos libres en las formulaciones de proteínas de unión al antígeno mejoradas de acuerdo con diversas modalidades de la invención como agentes de relleno, estabilizantes y antioxidantes, así como otros usos estándar. Para estabilizar las proteínas en una formulación puede usarse lisina, prolina, serina y alanina. La glicina es útil en la liofilización para asegurar las correctas propiedades y estructura de la torta. La arginina puede ser útil para inhibir la agregación de proteínas, tanto en formulaciones líquidas como liofilizadas . La metionina es útil como antioxidante.
Los polioles incluyen azúcares, por ej . , manitol, sacarosa y sorbitol y alcoholes polihídricos tales como, por ejemplo, glicerol y propilenglicol y, a los efectos de la descripción en la presente, polietilenglicol (PEG) y sustancias relacionadas. Los polioles son cosmotrópicos . Son agentes estabilizantes útiles en formulaciones tanto líquidas como liofilizadas para proteger las proteínas de procesos de degradación química y física. Los polioles también son útiles para ajustar la tonicidad de las formulaciones.
Entre los polioles útiles en modalidades de la invención selectas se encuentra el manitol, normalmente usado para asegurar la estabilidad estructural de la torta en formulaciones liofilizadas. Asegura estabilidad estructural a la torta. Generalmente se usa con un lioprotector, por ej . , sacarosa. El sorbitol y la sacarosa están entre los agentes preferidos para ajustar la tonicidad y como estabilizantes para proteger contra daños por congelación-descongelación durante el transporte o la preparación de fármacos durante el proceso de fabricación. La reducción de azúcares (que contienen grupos aldehido o cetona libres) , tales como glucosa y lactosa, puede glicar los restos de lisina y arginina de la superficie. Por lo tanto, por lo general no están entre los polioles preferidos para usar de acuerdo con la invención. Además, los azúcares que forman las especies reactivas, tal como la sacarosa, que se hidroliza a fructosa y glucosa en condiciones ácidas y, por consiguiente, genera la glicación, tampoco está entre los polioles preferidos de la invención en este aspecto. El PEG es útil para estabilizar proteínas y como crioprotector y puede usarse en la invención en este aspecto.
Las modalidades de las formulaciones de proteínas de unión al antígeno mejoradas comprenden además tensioactivos . Las molécula proteicas pueden ser susceptibles a la adsorción en superficies y a la desnaturalización y la consiguiente agregación en interfaces aire-líquido, sólido-líquido y líquido-líquido. Estos efectos generalmente presentan una correlación inversa a la concentración de proteínas. Estas interacciones pe judiciales generalmente presentan una correlación inversa a la concentración de proteínas y típicamente se ven exacerbadas por la agitación física, tal como la generada durante el transporte y la manipulación de un producto.
Los tensioactivos se usan rutinariamente para prevenir, minimizar o reducir la adsorción de superficie. Los tensioactivos útiles en la invención en este aspecto incluyen polisorbato 20, polisorbato 80, otros ésteres de ácidos grasos de sorbitán polietoxilados y poloxamer 188.
Los tensioactivos también se usan comúnmente para controlar la estabilidad conformacional de las proteínas. El uso de tensioactivos en este aspecto es específico a la proteína, dado que cualquier tensioactivo dado típicamente estabilizará algunas proteínas y desestabilizará otras.
Los polisorbatos son susceptibles de degradación oxidativa y a menudo, como se proporcionan, contienen cantidades de peróxidos suficientes para causar la oxidación de las cadenas laterales de los restos proteicos, especialmente metionina. Como consecuencia, los polisorbatos deben usarse con cuidado y, cuando se usen, deben emplearse en su concentración eficaz mínima. En este aspecto, los polisorbatos ejemplifican la regla general de que los excipientes deben usarse en sus concentraciones eficaces mínimas .
Las modalidades de las formulaciones de proteínas de unión al antígeno mejoradas' comprenden además uno o más antioxidantes. En cierta medida, la oxidación perjudicial de las proteínas puede prevenirse en las formulaciones farmacéuticas manteniendo niveles adecuados de temperatura y oxígeno ambiente y evitando la exposición a la luz. Los excipientes antioxidantes también pueden usarse para prevenir la degradación oxidativa de las proteínas. Entre los antioxidantes útiles en este aspecto se encuentran los agentes reductores, depuradores de oxígeno/radicales libres y agentes quelantes. Los antioxidantes para usar en las formulaciones de proteínas terapéuticas de acuerdo con la invención preferentemente son hidrosolubles y mantienen su actividad durante la vida útil de un producto. El EDTA es un antioxidante preferido de acuerdo con la invención en este aspecto .
Los antioxidantes pueden dañar las proteínas. Por ejemplo, los agentes reductores, tal como la glutationa en particular, pueden alterar los enlaces de disulfuro intramoleculares. Por lo tanto, los antioxidantes para usar en la invención se seleccionan, entre otras cosas, para eliminar o reducir suficientemente la posibilidad de que estos mismos dañen las proteínas en la formulación.
Las formulaciones de acuerdo con la invención pueden incluir iones metálicos que son cofactores de proteínas y que son necesarios para formar complejos de coordinación de proteínas, tal como el cinc necesario para formar determinadas suspensiones de insulina. Los iones metálicos también pueden inhibir algunos procesos que degradan proteínas. Sin embargo, los iones metálicos también catalizan los procesos físicos y químicos que degradan proteínas.
Los iones de magnesio (10-120 mM) pueden usarse para inhibir, la isomerización de ácido aspártico en ácido isoaspártico . Los iones Ca+2 (hasta 100 mM) pueden aumentar la estabilidad de la desoxirribonucleasa humana. Mg+2, Mn+2 y Zn+2, sin embargo, pueden desestabilizar la rhDNasa . De manera similar, Ca+2 y Sr+2 pueden estabilizar el Factor VIII, que puede desestabilizarse por Mg+2, Mn+2 y Zn+2, Cu+2 y Fe+2, y su agregación puede verse aumentada por iones Al+3.
Las modalidades de las formulaciones de proteínas de unión al antígeno mejoradas comprenden además uno o más conservantes . Los conservantes son necesarios al momento de desarrollar formulaciones parenterales de dosis múltiples que impliquen más de una extracción del mismo recipiente. Su función principal es inhibir el crecimiento de microbios y asegurar la esterilidad del producto durante la vida útil o período de uso del producto farmacéutico. Los conservantes usados normalmente incluyen alcohol bencílico, fenol y m-cresol . Aunque los conservantes tienen extensos antecedentes de uso con productos parenterales de molécula pequeña, el desarrollo de formulaciones de proteínas que incluyen conservantes puede ser un desafío. Los conservantes casi siempre tienen un efecto desestabilizante (agregación) sobre las proteínas, y esto se ha vuelto un factor importante en la limitación de su uso en formulaciones de proteínas de dosis múltiples. Hasta la fecha, la mayoría de los fármacos proteicos se han formulado para uso único solamente. Sin embargo, cuando son posibles las formulaciones de dosis múltiples, tienen la ventaja agregada de permitir la conveniencia del paciente y la mayor comercialización. Un buen ejemplo es el de la hormona de crecimiento humano (hGH) donde el desarrollo de formulaciones conservadas ha llevado a la comercialización de presentaciones de inyecciones de dosis múltiples en forma de lápiz más convenientes. Al menos cuatro de Los dispositivos en forma de lápiz que contienen formulaciones conservadas de hGH están actualmente disponibles en el mercado. La Norditropina (líquida, Novo Nordisk) , Nutropina AQ (líquida, Genentech) & Genotropina (liofilizada- -cartucho de cámara doble, Pharmacia & Upjohn) contienen fenol, mientras que la Somatropina (Eli Lilly) está formulada con m-cresol.
Deben considerarse varios aspectos durante la formulación y el desarrollo de las formas de dosificación conservadas. La concentración eficaz de conservante en el producto farmacéutico debe optimizarse. Esto requiere probar un conservante dado en la forma de dosificación con intervalos de concentración que confieran eficacia antimicrobiana sin comprometer la estabilidad de la proteína.
Como es de esperarse, el desarrollo de formulaciones líquidas que contengan conservantes es más desafiante que las formulaciones liofilizadas . Los productos secados por congelación pueden liofilizarse sin el conservante y reconstituirse con un conservante que contenga diluyente al momento de usarlos. Esto acorta el tiempo durante el cual un conservante está en contacto con la proteína, minimizando considerablemente los riesgos de estabilidad asociados. Con las formulaciones líquidas, la estabilidad y eficacia del conservante deben mantenerse durante toda la vida útil del producto (.alrededor de. 18 a 24 meses). Un aspecto importante para considerar es que la eficacia del conservante debe demostrarse en la formulación final que contiene el fármaco activo y todos los componentes del excipiente.
Generalmente, las formulaciones de proteínas de unión al antígeno mejoradas se diseñarán para vías y métodos de administración específicos, para dosis de administración y frecuencias de administración específicas, para tratamientos específicos de enfermedades específicas, con intervalos de biodisponibilidad y persistencia, entre otras cosas. Por lo tanto, las formulaciones pueden diseñarse de acuerdo con la invención para la administración por cualquier vía adecuada incluyendo, de modo no taxativo, de forma oral, ótica, oftálmica, rectal y vaginal, y por vías parenterales , incluyendo la inyección intravenosa e intraarterial , la inyección intramuscular y la inyección subcutánea.
Una vez que se ha formulado la composición farmacéutica, puede almacenarse en viales estériles como una solución, suspensión, gel, emulsión, sólido, cristal o como un polvo deshidratado o liofilizado. Las formulaciones pueden almacenarse en una forma lista para usar o bien en una forma (por ejemplo, liofilizada) que se reconstituye antes de la administración. La invención también proporciona kits para la producción de una unidad de administración de dosis única. Cada uno de los kits de la invención puede contener tanto un primer recipiente con una proteína seca como un segundo recipiente con una formulación acuosa. En determinadas modalidades de esta invención, se proporcionan kits que contienen jeringas prelleñadas de cámara individual y múltiple (por ejemplo, jeringas líquidas y liojeringas) .
La cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que contiene proteínas de unión al antígeno mejoradas a usarse dependerá, por ejemplo, del contexto y los objetivos terapéuticos. Un experto en la técnica apreciará que los niveles de dosificación adecuados para el tratamiento variarán dependiendo, en parte, de la molécula administrada, la indicación para la cual la proteína de unión al antígeno mejorada se está usando, la vía de administración y el tamaño (peso corporal, superficie corporal o tamaño del órgano) y/o condición (la edad y estado de salud general) del paciente.
En determinadas modalidades, el médico puede titular la dosis y modificar la vía de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo.
Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar usando un dispositivo médico. Los ejemplos de dispositivos médicos para administrar las composiciones farmacéuticas se describen en las patentes estadounidenses N. ° 4,475,196; 4,439,196; 4,447,224; 4,447, 233; 4,486,194; 4,487,603; 4,596,556; 4,790,824; 4,941,880; 5,064,413; 5,312,335; 5,312,335; 5,383,851 y 5,399,163, todas incorporadas a la presente mediante referencia .
EJEMPLOS EJEMPLO 1 En este ejemplo, un anticuerpo 1 de baja expresión con menor estabilidad térmica se modifica para aumentar el nivel de expresión en células transíectadas de forma transitoria junto con estabilidad térmica mejorada. La Figura 4a muestra el alineamiento de la secuencia del anticuerpo 1 con las secuencias de línea germinal humana. Solo las primeras 5 secuencias de línea germinal humana estrechamente relacionadas, según se identificaron por el porcentaje de identidad de secuencia respecto del anticuerpo 1, se muestran en esta figura 4a. En función de esto, se determina el posible subtipo del anticuerpo 1. En este caso, la cadena pesada variable de la secuencia del anticuerpo 1 pertenece al subtipo VH3 y la cadena ligera variable pertenece al subtipo VK2. En la próxima etapa, las secuencias de cadena ligera variable y pesada variable del anticuerpo 1 se alinearon contra las secuencias VK2 y VH3 de la base de datos Kabat ( u y Kabat 1970), respectivamente. Con el fin de identificar los pares de aminoácidos que experimentan mutaciones correlacionadas en los alineamientos múltiples de secuencias, los veinte aminoácidos se clasificaron en 6 grupos en función de sus propiedades fisioquímicas - hidrofóbicos pequeños, aromáticos, neutros polares, cargados positivamente, cargados negativamente y eliminación/glicina. Luego se calculó una puntuación de conservación como se describió anteriormente. Los pares conservados identificados se examinaron a un nivel límite de 60 a 90%. Típicamente, 60% se usa como nivel límite mínimo y por lo general un valor umbral mayor implica mayor significación.
Luego se examinó la secuencia del anticuerpo 1 diana para determinar si los pares mutacionales correlacionados identificados están correlacionados o no. Las posiciones de la secuencia del anticuerpo 1 que se desvían del patrón observado de conservación por pares correlacionados se marcaron para detectar mutaciones. Por ejemplo, la posición F51 en la cadena ligera de la secuencia del anticuerpo 1 no está correlacionada (violación) con las posiciones V13, A19, 121, C23, L42, P45, P49, L52 , 153, V63, P64, L78, 180, V83, V90 y C93 (Figura 5) . La posición F51 de la secuencia del anticuerpo 1 es aromática y las posiciones de los compañeros son de naturaleza hidrofóbica pequeña. Esto implica que para reparar las violaciones, la posición F51 debe sustituirse con un aminoácido hidrofóbico pequeño. Con el fin de identificar el resto hidrofóbico pequeño con el que se sustituirá, se examinaron los restos de la posición equivalente de F51 en las secuencias de línea germinal estrechamente relacionadas como se muestra en la Figura 4b. Además, las frecuencias de los restos de la posición equivalente de F51 en las bases de datos Kabat/IMGT también se tuvieron en cuenta. A partir de la Figura 4b resulta claro que la posición F51 debe mutarse a Leu. Y el resto Leu tiene la mayor frecuencia (69%) en esta posición en la base de datos. Además, la estructura modelada del anticuerpo 1 de dominio variable se examinó para asegurarse de que la mutación F51L no causara ningún problema estructural obvio (como . impedimento estérico, alteración del enlace de hidrógeno, introducción de aminoácidos polares en la región núcleo enterrada, etc.) .
Con el fin de identificar las violaciones en la interfaz VL/VH, los pares de aminoácidos implicados en la interacción dominio-dominio se identificaron en función de la estructura modelada del dominio variable. Se considera que dos restos están interactuando si cualquier átomo pesado de cadena lateral del primer resto está dentro de 6.5 Angstrom respecto de cualquier átomo pesado de cadena lateral del segundo resto. Y a continuación se examinó el alineamiento múltiple de secuencia de la misma manera que en el caso de las cadenas individuales .
Hubo tres violaciones más en esta secuencia del anticuerpo 1 en lá posición P105 en la cadena ligera y en las posiciones Ql y R16 en la cadena pesada. Tales violaciones se repararon como se discutió en el caso de F51. Los niveles de expresión transitorios para las construcciones diseñadas se muestran en la Figura 6. El anticuerpo original tiene una expresión muy baja (2 a 3 mg/L) . Todas las construcciones diseñadas mostraron un nivel de expresión más alto en comparación a la original. La Figura 7a muestra los perfiles de estabilidad térmica según se determinaron mediante Calorimetría de Barrido Diferencial. Todas las construcciones diseñadas muestran una estabilidad térmica igual o mayor, tanto a temperatura de fusión (punto de transición) y entalpia (área debajo de la curva) . En particular, la construcción que tiene todas las violaciones reparadas muestra la mayor mejora en la estabilidad térmica (tanto a temperatura de fusión y entalpia) . La Figura 7b muestra los perfiles de unión para todas las construcciones diseñadas. Como se puede ver, las afinidades de las variantes según se determinó mediante ensayo Kinexa® están dentro de una diferencia de dos veces respecto de la original.
EJEMPLO 2 El anticuerpo 2 contra otra diana es una molécula con baja expresión y menor estabilidad térmica. Además, se observa un alto nivel de agregación cuando este anticuerpo de IgG se convierte a formato scFv - Fe. Se llevó a cabo el análisis mutacional correlacionado como en el caso del Ejemplo 1. Se identificó un total de 8 violaciones en la región marco de la secuencia del anticuerpo 2 (Figura 8) . Las construcciones diseñadas de mutantes puntuales y combinación de mutantes puntuales se enumeran en la Figura 9. Cabe destacar aquí que la mutación Y231F se identificó mediante moldeado de anticuerpo y análisis estructural. Todas las otras mutaciones se identificaron mediante análisis mutacional correlacionado.
Las Figuras 10a-10b muestra los niveles de""- expresión transitorios del anticuerpo 2 y sus variantes en formato scFv-Fc. La Figura 10a muestra el nivel de titulación según se determinó mediante unión a proteína A, la 10b muestra el rendimiento purificado (mg/L) y (c) muestra las pruebas de expresión repetida en una escala de 10ml. Excepto la variante que involucra la mutación Y231F, que se determinó mediante modelado y análisis estructural, todas las otras variantes mostraron una expresión similar o mejor que la molécula original. En particular, la variante que tenía todas las violaciones reparadas (un total de 8 mutaciones) mostró la mayor mejora en el nivel de expresión. La Figura 11 muestra los niveles de agregación, según se determinó mediante Cromatografía de Exclusión por Tamaño, de la original y las variantes. Todas las variantes mostraron un nivel de agregación mucho menor en comparación con la molécula original. La Figura 12a muestra los perfiles de estabilidad térmica de la original y las variantes en el formato scFv-Fc. La Figura 12b muestra los perfiles de estabilidad térmica de la original y las variantes seleccionadas en el formato IgG. La construcción que tiene todas las violaciones reparadas mostró la mayor mejora en la estabilidad térmica (tanto la Tm como la entalpia aumentaron) . Las Figuras 13a-13b muestran el análisis de unión basado en FACS . Como se puede observar, todas las variantes exhibieron un perfil de unión similar.
EJEMPLO 3 Este es un ejemplo que trata con un anticuerpo que tiene una expresión moderadamente buena (30-50mg/L en transfección transitoria en células 293) . Se llevó a cabo el análisis mutacional correlacionado como en los ejemplos anteriores. Se identificó un total de 6 violaciones en este caso. Los niveles de expresión transitoria de la original y sus variantes que se diseñaron sobre la base del análisis mutacional correlacionado se muestran en las Figuras 14a- 14b. Aquí nuevamente, la construcción que tenía todas las violaciones reparadas mostró la mayor mejora en la expresión. La Figura 14b muestra el análisis de inhibición de las variantes. La construcción que tenía la cantidad máxima de mutaciones mostró una disminución en la inhibición de alrededor de 5 veces. Esto probablemente se debió a las dos mutaciones de carga que se ubican cerca de la superficie de la CDR. Sin embargo, también en este ejemplo, la construcción que tenía la cantidad máxima de mutaciones mostró la mayor mejora en la estabilidad térmica (Figura 15) . Más importantemente, las variantes mostraron menor sensibilidad a la variación de pH del tampón de formulación. Las moléculas originales formaron un gel, cuando el pH se aumentóde 5.2 a 7.4. A diferencia de la original, la variante (F15) no precipitó cuando el pH se aumentó de 5.2 a 7.4.
EJEMPLO 4 En este ejemplo, un anticuerpo con baja expresión se analizó mediante análisis mutacional correlacionado. Como en los casos anteriores, las mutaciones sugeridas dieron como resultado una mejora en la expresión en las células 293 transíectadas transitoriamente. La construcción que tiene la cantidad máxima de mutaciones tuvo una expresión 10 veces mejor que la original (Figura 16) .
REFERENCIAS Deisenhofer, J. 1981. Crystallographic refinement and atomic models of a human Fe fragment and its complex with fragment B of protein A from Staphylococcus aureus at 2.9-and 2.8-A resolution. Biochemistry 20: 2361-2370.
Gunasekaran, K., Hagler, A.T., and Gierasch, L.M. 2004. Sequence and structural analysis of cellular retinoic acid-binding proteins reveáis a network of conserved hydrophobic interactions . Proteins 54: 179-194.
Higgins, D.G., and Sharp, P.M. 1988. CLUSTAL: a package for performing múltiple sequence alignment on a microcomputer . Gene 73: 237-244.
Honegger, A. 2008. Engineering antibodies for stability and efficient folding. Handb Exp Pharmacoh 47-68.
Huber, R. 1984. Three-dimensional structure of antibodies. Behring Institute Mitteilungen : 1-14.
Jung, S., Honegger, A., and Pluckthun, A. 1999. Selection for improved protein stability by phage display. Journal of molecular biology 294: 163-180.
Martin, W.L., West, A.P., Jr . , Gan, L . , and Bjorkman, P.J. 2001. Crystal structure at 2.8 A of an FcRn/heterodimeric Fe complex: mechanism of pH-dependent binding. Molecular cell 7: 867-877.
Monsellier, E., and Bedouelle, H. 2006. Improving the stability of an antibody variable fragment by a combination of knowledge-based approaches: validation and mechanisms. Journal of molecular biology 362: 580-593.
Papadea, C. , and Check, I.J. 1989. Human immunoglobulin G and immunoglobulin G subclasses: biochemical, genetic, and clinical aspeets . Critical reviews in clinical laboratory sciences 27: 27-58. oux, K.H. 1999. Immunoglobulin structure and function as revealed by electrón microscopy. International archives of allergy and immunology 120: 85-99.
Wang, . , Smith, W.F., Miller, B.R., Aivazian, D., Lugovskoy, A.A., Reff, M.E., Glaser, S.M., Croner, L.J., and Demarest, S.J. 2009. Conserved amino acid networks involved in antibody variable domain interactions . Proteins 76: 99-114.
Worn, A., and Pluckthun, A. 2001. Stability engineering of antibody single-chain Fv fragments. Journal of molecular biology 305: 989-1010.
Wu, T.T., and Kabat, E.A. 1970. An analysis of the sequences of the variable regions of Bence Jones proteins and myeloma light chains and their implications for antibody complementarity . The Journal of experimental medicine 132: 211-250.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (20)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1. Un método para mejorar una o más características de una proteína de unión al antígeno que comprende un dominio variable de un anticuerpo de interés, cuyo método caracterizado porque comprende : a) la identificación de posiciones de restos conservados por pares dentro de un marco de dominio variable basado en una propiedad fisicoquímica de los restos; b) determinar cómo la secuencia de aminoácidos marco del dominio variable del anticuerpo de interés se desvía de las posiciones de los restos conservados por pares identificados en a) ; c) sustituir uno o más restos de aminoácidos determinados como desviaciones en b) con aminoácidos que se encuentren en posiciones equivalentes en secuencias de líneas germinales o de líneas germinales relacionadas.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los restos conservados por pares se identifican como sigue: i) se asigna un subtipo de línea germinal al dominio variable del anticuerpo de interés; ii) se alinean las regiones marco de dominios variables múltiples que pertenezcan al subtipo de línea germinal identificado en (i) ; iii) se clasifica el aminoácido en cada posición dentro de un dominio variable alineado como hidrofóbico pequeño, aromático, polar neutro, cargado positivamente, cargado negativamente o glicina/eliminación; iv) se calcula una puntuación de conservación para cada posición por pares; y v) se determinan los pares mutacionales correlacionados sobre la base de un cálculo umbral .
3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la puntuación de conservación es igual a la cantidad de pares que pertenecen a la misma clasificación y a este número se le resta la cantidad de pares que pertenecen a una clasificación distinta.
4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque las desviaciones dentro del dominio variable del anticuerpo de interés se determinan mediante la comparación de pares de aminoácidos en la secuencia de interés con el patrón observado de. las posiciones de restos conservados por pares que se identifican usando el alineamiento múltiple de secuencias de secuencias de dominio variable conocidas y el cálculo umbral.
5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque uno o más restos de aminoácidos determinados como desviaciones se sustituyen con un aminoácido que se encuentra en esa posición en la secuencia de línea germinal.
6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque todas las desviaciones se sustituyen con un aminoácido que se encuentra en esa posición en la secuencia de línea germinal.
7. El método de conformidad con cualquiera de conformidad con las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque uno o más restos de aminoácidos determinados como desviaciones se sustituyen con un aminoácido que se encuentra en esa posición en una secuencia de línea germinal relacionada .
8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque todas las desviaciones se sustituyen con un aminoácido que se encuentra en esa posición en una secuencia de línea germinal relacionada.
9. El método de conformidad con la cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque todas las desviaciones se sustituyen con un aminoácido que se encuentra en esa posición en la secuencia de línea germinal o una secuencia de línea germinal relacionada.
10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizado porque la proteína de unión al antígeno comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera.
11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado poprque el dominio variable de cadena pesada es un dominio variable de cadena pesada humano.
12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11, caracterizado porque el dominio variable de cadena ligera es un dominio variable de cadena ligera humano.
13. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la proteína de unión al antígeno es un anticuerpo .
14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado poprque la proteína de unión al antígeno es un anticuerpo humano.
15. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la proteína de unión al antígeno comprende una scFv.
16. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-15, caracterizado porque la expresión de la proteína de unión al antígeno se mejora.
17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16, caracterizado porque la estabilidad térmica de la proteína de unión al antígeno se mejora.
18. Una proteína de unión al antígeno caracterizada porque es mejorada mediante el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17.
19. Un ácido nucleico aislado que codifica un dominio variable del anticuerpo de una proteína de unión al antígeno mejorada mediante el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17, caracterizado porque el método comprende sustituir uno o más restos dentro del dominio variable del anticuerpo con resto de línea germinal o línea germinal relacionada.
20. Una célula hospedadora caracterizada porque comprende el ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 19.
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Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011028952A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
JP5953303B2 (ja) 2010-07-29 2016-07-20 ゼンコア インコーポレイテッド 改変された等電点を有する抗体
US12466897B2 (en) 2011-10-10 2025-11-11 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10738132B2 (en) 2013-01-14 2020-08-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
CA2897987A1 (en) 2013-01-15 2014-07-24 Xencor, Inc. Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies
AU2014232416B2 (en) 2013-03-15 2017-09-28 Xencor, Inc. Modulation of T Cells with Bispecific Antibodies and FC Fusions
US10519242B2 (en) 2013-03-15 2019-12-31 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
US10106624B2 (en) 2013-03-15 2018-10-23 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
MX385936B (es) 2014-03-28 2025-03-11 Xencor Inc Anticuerpos biespecíficos que se unen a cd38 y cd3.
EP3194435A1 (en) 2014-09-15 2017-07-26 Amgen Inc. Bi-specific anti-cgrp receptor/pac1 receptor antigen binding proteins and uses thereof
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
PE20171324A1 (es) 2014-11-26 2017-09-11 Xencor Inc Anticuerpos heterodimericos que se unen a cd3 y a antigenos tumorales
IL252467B (en) 2014-11-26 2022-06-01 Xencor Inc Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cd38
WO2016105450A2 (en) 2014-12-22 2016-06-30 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
WO2016141387A1 (en) 2015-03-05 2016-09-09 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
AU2016365742A1 (en) 2015-12-07 2018-06-21 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and PSMA
CN109475627B (zh) 2016-05-26 2023-01-06 齐鲁普吉湾生物治疗公司 抗体混合物
MX2018015592A (es) 2016-06-14 2019-04-24 Xencor Inc Anticuerpos inhibidores de puntos de control biespecificos.
US10316088B2 (en) 2016-06-28 2019-06-11 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2
CN106290908A (zh) * 2016-08-07 2017-01-04 查文娟 一种用于肾脏损伤检测用试剂盒
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
MA46359A (fr) 2016-09-29 2019-08-07 Amgen Inc Protéines de liaison à l'antigène à viscosité faible et leurs procédés de préparation
UA128669C2 (uk) 2016-10-14 2024-09-25 Ксенкор, Інк. ГЕТЕРОДИМЕРНИЙ Fc-ЗЛИТИЙ БІЛОК IL15/IL15Ra
JOP20190248A1 (ar) * 2017-04-21 2019-10-20 Amgen Inc بروتينات ربط مولد ضد trem2 واستخداماته
EP3645122A1 (en) 2017-06-30 2020-05-06 Xencor, Inc. Targeted heterodimeric fc fusion proteins containing il-15/il-15ra and antigen binding domains
PE20250757A1 (es) 2017-08-03 2025-03-13 Amgen Inc Muteinas de interleucina 21 y metodos de tratamiento
EP3679040B1 (en) 2017-09-08 2022-08-03 Amgen Inc. Inhibitors of kras g12c and methods of using the same
JP2021502100A (ja) 2017-11-08 2021-01-28 ゼンコア インコーポレイテッド 新規抗ｐｄ−１配列を用いた二重特異性および単一特異性抗体
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
US11319355B2 (en) 2017-12-19 2022-05-03 Xencor, Inc. Engineered IL-2 Fc fusion proteins
KR20200110358A (ko) 2018-01-12 2020-09-23 암젠 인크 항-pd-1 항체 및 치료 방법
WO2019195623A2 (en) 2018-04-04 2019-10-10 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
CA3097593A1 (en) 2018-04-18 2019-10-24 Xencor, Inc. Pd-1 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and pd-1 antigen binding domains and uses thereof
KR20210003814A (ko) 2018-04-18 2021-01-12 젠코어 인코포레이티드 IL-15/IL-15Rα Fc-융합 단백질 및 TIM-3 항원 결합 도메인을 함유하는 TIM-3 표적화 이종이량체 융합 단백질
EP3861016A2 (en) 2018-10-03 2021-08-11 Xencor, Inc. Il-12 heterodimeric fc-fusion proteins
CN114173875B (zh) 2019-03-01 2025-04-15 Xencor股份有限公司 结合enpp3和cd3的异二聚抗体
JP7677964B2 (ja) * 2019-11-08 2025-05-15 アムジエン・インコーポレーテツド ヘテロＩｇＧ分子の対合のための電荷対変異の操作
US11919956B2 (en) 2020-05-14 2024-03-05 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (PSMA) and CD3
KR20230166150A (ko) 2020-08-19 2023-12-06 젠코어 인코포레이티드 항-cd28 조성물
JP2024511319A (ja) 2021-03-09 2024-03-13 ゼンコア インコーポレイテッド Ｃｄ３及びｃｌｄｎ６に結合するヘテロ二量体抗体
KR20230154311A (ko) 2021-03-10 2023-11-07 젠코어 인코포레이티드 Cd3 및 gpc3에 결합하는 이종이량체 항체

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7235641B2 (en) * 2003-12-22 2007-06-26 Micromet Ag Bispecific antibodies
BRPI0709598A8 (pt) * 2006-03-17 2019-01-08 Biogen Idec Inc composições de polipeptídeos estabilizados

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Publication number Publication date
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WO2012125495A3 (en) 2014-04-17

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