CN102066575A - 结合蛋白体内半衰期的体外估测 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于估测目标结合蛋白的体内半衰期的方法。公开的方法包含，(a)使用体外蛋白酶反应试验，测定目标结合蛋白和至少2种不同参照结合蛋白中的每一种的体外半衰期，其中所述参照结合蛋白具有已知的不同的体内半衰期，(b)确定每种参照结合蛋白的已知体内半衰期和体外蛋白水解半衰期之间的关系，和(c)从所述参照结合蛋白的已知体内半衰期和体外蛋白水解半衰期之间的所述关系，估测与目标结合蛋白的体外蛋白水解半衰期相关联的目标结合蛋白的体内半衰期。

Description

结合蛋白体内半衰期的体外估测

相关申请的交叉参考

本申请要求2008年4月18日提交的美国临时申请系列号61/046,062的优先权，其内容并入本文。

技术领域

本发明概况地涉及结合蛋白。具体地，本发明提供了用于估测治疗性结合蛋白的体内半衰期的体外方法。

背景技术

治疗剂在受试者的循环中的持续时间取决于多种因素。典型地，将任意药剂在循环系统中的持久性表征为可量化的药代动力学值，诸如半衰期(t_1/2)。根据具体的药剂，可能影响它的半衰期的一些更明显的因素包括、但不限于：药剂对不同的血浆或肝降解活性(例如，蛋白水解活性、糖酵解活性)的敏感性、药剂在血液中的溶解度、药剂的免疫原性、肝的滤出药剂的能力和它的结合一种或更多种血清结合蛋白(例如，血清白蛋白)的能力。

对于许多候选治疗剂，在确定这样的候选分子是否可以开发成有效的治疗剂时，药代动力学半衰期非常重要。因而，无论在高通量筛选计划中候选分子表现得对目标靶物如何有活性，如果它缺少允许该分子在受试者的循环中持续足够长以达到适当稳态浓度从而提供希望的治疗益处的体内半衰期，这样的分子可能实际上几乎不具有治疗价值。因此，在候选治疗剂的筛选过程中的某个时刻，必须评估每种有希望的候选分子的药代动力学体内半衰期的指征，以便从该过程排除具有不希望的体内半衰期的那些分子。

典型地，使用诸如大鼠或小鼠等小哺乳动物，得到候选分子是否具有可接受的体内半衰期的首要指征。无论这样的小哺乳动物体内半衰期研究可能有怎样的价值，但是，这样的程序将大量的人力、时间和费用消耗在筛选过程上。显然，如果在药物开发过程中可以使用可靠的且简单的体外方法来测定候选分子是否具有保证它们的持续包含的药代动力学体内半衰期，会使新治疗剂的筛选过程更有效且更经济。

发明内容

本发明提供了简单的、有效的且可靠的估测结合蛋白的体内半衰期的体外方法。在一个方面，本发明的结合蛋白包含治疗性结合蛋白。在另一个方面，本发明的结合蛋白包含参照结合蛋白。在一个具体的方面，本发明提供了估测结合蛋白的体内药代动力学半衰期(t_1/2)的体外方法，所述结合蛋白具有一个或更多个免疫球蛋白(Ig)折叠。所述方法可容易地适应自动化的和机器人的（robotic）高通量筛选程序，允许以有效且省时的方式估测多种结合蛋白的体内半衰期。因此，所述方法特别适用于筛选和开发新的治疗性结合蛋白（例如针对治疗靶标的不同抗体构建体）的程序。

本发明的一个实施方案涉及估测目标结合蛋白的体内半衰期，其包含下述步骤:

(a) 使用体外蛋白酶反应试验，测定目标结合蛋白和至少2种不同参照结合蛋白中的每一种的体外半衰期，其中所述参照结合蛋白具有已知的不同的体内半衰期，

(b) 确定每种参照结合蛋白的已知体内半衰期和体外蛋白水解半衰期之间的关系，

(c) 从所述参照结合蛋白的已知体内半衰期和体外蛋白水解半衰期之间的关系，估测与目标结合蛋白的体外蛋白水解半衰期相关联的目标结合蛋白的体内半衰期。

在一个方面，结合蛋白的体内半衰期是指在人中的半衰期。其它动物物种，包括脊椎动物和无脊椎动物物种，也适用于本发明。示例性的物种包括、但不限于：哺乳动物、鸟纲（aves）、pices、爬行动物和两栖动物。

在一个方面，目标结合蛋白是治疗剂。在一个具体方面，目标结合蛋白具有一个或更多个Ig折叠。

可以将通过蛋白水解反应试验测得的每种参照结合蛋白的已知体内半衰期和它们各自的体外蛋白水解半衰期之间的关系绘图，例如，通过相对于测得的每种参照结合蛋白的体外蛋白水解半衰期绘制已知体内半衰期，得到参照图(标准曲线)。这样的标准曲线也可以计算得到，无需制作数据的实际图表。

许多合适的蛋白酶或蛋白酶组合可以用于本文所述的估测结合蛋白(例如，目标结合蛋白)的体内半衰期的体外蛋白酶试验中。合适的蛋白酶的实例包括、但不限于：嗜热菌蛋白酶、弹性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶及其组合。

本文使用的参照结合蛋白通常结合已知的同源配体，并具有已知值的体内半衰期，例如，在人中的半衰期。在一个方面，参照结合蛋白包含一个或更多个Ig折叠。这样的参照结合蛋白的实例是具有例如一个或更多个Ig折叠的已知的治疗性抗体分子以及其它已知的治疗性结合蛋白。

在一个实施方案中，本文提供的估测目标结合蛋白的体内半衰期的方法是，通过在蛋白水解反应试验中测定体外半衰期，然后根据线性公式计算估测的体内半衰期:

y = mx + b (方程式1)

其中“y”是体内半衰期(例如，按天计算)，m”是体内半衰期和体外蛋白酶介导的蛋白水解半衰期之间的线性关系的实测斜率，“x”是在蛋白水解反应试验中测得的体外半衰期，且常数“b”是y-截距, 即，按照所述线性关系与体外蛋白水解半衰期为零(x = 0)时相对应的理论体内半衰期。

本发明的一个实施方案涉及估测目标结合蛋白的体内半衰期的方法，其包含，在蛋白水解试验中测定它的体外半衰期，然后在图（即，标准曲线）上估测与它的体外蛋白水解半衰期相对应的它的体内半衰期，所述图通过相对于至少2种参照结合蛋白的体外蛋白水解半衰期值绘制体内半衰期值而得到。这样的标准曲线是参照结合蛋白的体内半衰期和体外蛋白水解半衰期之间的关系的图示。在图1中显示了这样的线性标准曲线的一个实例。

一个方面提供了使用图1所示的标准曲线的一种替代方案，是从2种或更多种参照结合蛋白的已知的体内人半衰期和它们各自的体外蛋白水解半衰期，建立关系或标准曲线(图解地或计算地)。有利地，可以与测定目标结合蛋白的体外蛋白水解半衰期平行地或根据相同方法，测定参照结合蛋白的体外蛋白水解半衰期。以此方式，则可以从新得到的标准曲线估测目标结合蛋白的体内半衰期。

在本发明的另一个方面，提供了测定2种或更多种目标结合蛋白的相对体内半衰期的方法，其包含，在体外蛋白水解反应试验中测定每种结合蛋白的体外蛋白水解半衰期，其中目标结合蛋白的体外蛋白水解半衰期之间的相对差异，指示目标结合蛋白的体内半衰期之间的相对差异。尽管该方法没有提供每种目标结合蛋白的体内半衰期的值，但是允许按照它们的体内半衰期对结合蛋白排序，这归因于本文首次公开的结合蛋白的体外蛋白水解半衰期和体内半衰期之间的强关联性。在表征一群结合蛋白的情况下，当不立即需要或要求该群体的每个成员的实际体内半衰期时，这样的排序特别有用。此外，以此方式根据它们的相对体内半衰期排序一大群目标结合蛋白的能力，提供了在群内鉴别相对于该群的剩余成员具有某种性质(例如，更长的半衰期)的单个结合蛋白或结合蛋白亚群的方法。分子的这种相对排序或排列允许选择候选分子子集，不需要立即对整个群体进行体内试验来获知该群体中的哪些成员具有将候选物保留用于临床开发所需的药代动力学性质。

因而，本文所述的方法通过减少鉴别表现出作为治疗剂的希望的结合蛋白所需的时间和资源消耗(二者都是以费用和人员的方式)，在治疗剂的发现和开发中提供了优点。

附图说明

图1是一幅图(标准曲线)，它显示了参照结合蛋白的已知的体内人半衰期和计算的体外嗜热菌蛋白酶蛋白水解半衰期之间的强线性关系(R² = 0.885)。

具体实施方式

本发明部分地基于下述发现，即体外蛋白水解试验可以用于估测目标结合蛋白的体内半衰期。治疗性结合蛋白会表现出宽范围的体内半衰期 (t_1/2)。在筛选候选结合蛋白可能开发成有用的治疗剂的过程中的某个时刻，进行候选结合蛋白分子的体内半衰期的临床前预测，以便避免将其它资源耗费在这样的分子上，其不能在动物(例如，人)的循环系统中持续足以有效地为受试者提供希望的治疗益处的时间段，或者可能在该受试者的循环系统中持续不希望长的时间段。对于在药物开发计划中继续感兴趣的特定候选结合蛋白而言被视作可接受的体内半衰期取决于药物开发人员的目标和判断，但是，这样的估测必须在某个时刻进行，以将资源聚焦在一个或更多个分子上，所述分子具有适合开发成有效的治疗药物的最佳的或最理想的一组性质。体内半衰期(例如，对于人药物候选物)的临床前预测通常需要小哺乳动物研究(例如，在小鼠或大鼠中)和复杂的分析技术，由于它们的成本和工作，对于相对小量的候选分子的研究最好将它们保留。因此，在药物筛选和开发过程中的任意时间使用简单的体外试验，所述体外试验可以常规地用于预测象体内半衰期一样有用和重要的药代动力学参数，可能对药物开发计划的总效率、经济学和方向具有重大影响。

本发明提供了体外试验，其可以意外地以令人惊奇的准确度预测结合蛋白在受试者中的体内半衰期。它是基于已知结合蛋白(参照结合蛋白)在蛋白酶切割试验中的体外半衰期和体内半衰期之间的密切关系的发现，所述已知结合蛋白被批准施用于受试者，且目前可在市场上得到。在一个方面，受试者是脊椎动物或无脊椎动物。这样的脊椎动物可以包括哺乳动物、pices、鸟纲、两栖动物和爬行动物。在一个具体方面，受试者是人。

为了更清楚地描述本发明，定义了下面的术语：

术语“结合蛋白”是指结合配体(同源配体、同源结合配偶体)的任意蛋白分子。如本文使用的，存在2大类结合蛋白: (1) 参照结合蛋白和 (2) 目标结合蛋白；二者都在下面予以讨论。在一个方面，结合蛋白具有至少一个Ig折叠。当结合蛋白是抗体时，配体是抗原。Ig折叠是首先在全长免疫球蛋白分子（即，全长抗体分子）的可变(V)和恒定(C)区中鉴别出的三维球状结构域 (参见，例如，Janeway和Travers, The Immune System In Health and Disease (Current Biology Ltd和Garland Publishing, Inc., New York, 1994), 第3.6-3.7页)。Ig折叠包括多肽链的2个反向平行的层或片，其中每个多肽链具有称作β链的构象，且每个链层称作β片。二硫键连接每个β片的中心β链，使得2个β片在一起，并形成大致圆柱形状(也称作“Greek关键桶”)。免疫球蛋白分子的C区的Ig折叠具有2个反向平行的β片，其中一个β片具有4个反向平行的β链，且另一个β片具有3个反向平行的β链。免疫球蛋白分子的V区的Ig折叠具有2个反向平行的β片，其中一个β片具有4个反向平行的β链，且另一个β片具有5个反向平行的β链。

可以用于本文所述方法中的结合蛋白包括由4个多肽链、2个重(H)链和2个轻(L)链组成的全长抗体分子以及具有抗原(配体)结合域和至少一个Ig折叠的众多抗体构建体中的任一种。如上所述，全长抗体分子具有多个V和C结构域，且因此具有多个Ig折叠。抗体构建体包括全长抗体分子的功能性抗体片段、融合体、突变体、变体或衍生物，且这样的抗体构建体可以仅具有一个Ig折叠。在全长免疫球蛋白分子(例如，IgG、IgM和IgA)中，每个重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每个轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由结构域(CL)组成。VH和VL区可以进一步细分成称作“互补性决定区”(CDR)的超变区，其间夹杂有称作“框架区”(FR)的更保守的区域。每个VH和VL由3个CDR和4个FR组成，从氨基末端向羧基末端以下述次序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。全长免疫球蛋白分子可以是任意类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。

不同的抗体构建体已经证实，抗原结合功能可以由全长免疫球蛋白分子的片段或部分来执行。这样的抗体构建体可能具有双特异性的(结合2个相同的抗原分子)、双重特异性的(结合2个不同的抗原分子)或可结合2种或更多种不同抗原的组合的多特异性的形式。包含在术语“结合蛋白”内的抗体构建体的实例包括：Fab片段，它是包含VL、VH、CL和CH1结构域的单价(包含单个结合部位)片段；F(ab')₂片段，即包含通过在铰链区的二硫键相连的2个Fab片段的二价(包含2个结合部位)片段；Fd片段，其包含VH和CH1结构域；Fv片段，其包含抗体的单条臂的VL和VH结构域；单结构域抗体(dAb) (Ward 等人, Nature, 341: 544-546 (1989)；Winter 等人, PCT公开WO 90/05144 A1, 通过引用并入本文)，其包含单个可变结构域；双可变结构域(DVD)抗体；和分离的抗体分子V区的互补性决定区(CDR)。众所周知，通过用木瓜蛋白酶切割全长抗体分子，可以容易地产生Fab片段，且通过用胃蛋白酶切割全长抗体分子，可以产生F(ab')₂片段。

尽管Fv片段的2个结构域VL和VH是由分开的基因编码，可以使用重组DNA方法用合成的连接序列将编码所述结构域的基因连接起来，使得重组基因编码单个蛋白链，其中VL和VH区通过肽接头相连，形成称作单链Fv (scFv)的单价分子 (参见例如，Bird 等人 Science, 242: 423-426 (1988)；Huston 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988))。这样的scFv抗体构建体具有一个配体(抗原)结合域和至少一个Ig折叠，因此被包含在术语“结合蛋白”内，且可以用于本文所述的方法中。双抗体(diabody)也被包含在术语“结合蛋白”内。双抗体是二价的双特异性的抗体，其中VH和VL结构域表达在单个多肽链上，但是使用这样的连接物，它太短，不足以允许同一链上的2个结构域之间配对，由此迫使结构域与另一链的互补结构域配对，并产生2个抗原结合部位 (参见例如，Holliger等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)；Poljak 等人, Structure, 2: 1121-1123 (1994))。术语“结合蛋白”也包括在例如PCT公开号WO 2007/024715中所述的双可变域(DVD)抗体。所有上述的分子都是可用于本文所述方法中的结合蛋白，因为它们包含同源结合配偶体（即，抗原）的功能性结合域，且包含来自免疫球蛋白V或C区的至少一个Ig折叠。

可用于本文所述方法中的结合蛋白可以是融合蛋白，其包含与Ig Fc区相连的细胞受体分子或其配体结合部分。这样的融合蛋白通常具有模仿抗体Ig分子的结构，且由于Fc区，可以以类似于IgG或IgM分子的方式形成二聚体或其它多聚体形式。这样的细胞受体/Fc融合蛋白的一个实例是治疗性药物依那西普。依那西普是一种二聚体融合蛋白，其包含与人IgG1的Fc部分相连的人75千道尔顿(p75)肿瘤坏死因子受体(TNFR)的胞外配体结合部分。依那西普的Fc组分包含IgG1的CH2结构域、CH3结构域和铰链区，但是不包含CH1结构域。

“目标结合蛋白”是要使用本文所述体外方法估测其体内(例如，人)半衰期的任意结合蛋白。根据上下文，目标结合蛋白可以视作治疗候选物。

“参照结合蛋白”是具有已知的体内(例如，人)半衰期的结合蛋白。典型地，本文所述的估测目标结合蛋白的体内半衰期(例如，在人中)的体外方法采用至少2种参照结合蛋白。用于本文所述方法中的参照结合蛋白通常具有彼此不同的已知体内半衰期 (例如，在人中)，且通常还在体外蛋白水解试验中具有不同的体外蛋白水解半衰期。这样的差异是生成体内半衰期和体外蛋白水解半衰期之间的关系或标准曲线所必需的。具有不同的体内和体外半衰期的2种参照结合蛋白的使用，因而提供了确定体内半衰期相对体外蛋白水解半衰期之间的关系或生成它们的标准曲线所需的最少数据。因此，为了提供更多的数据用于确定结合蛋白的体内半衰期和体外蛋白水解半衰期之间的关系，在本文所述方法中使用超过2种参照结合蛋白，是在本发明的范围内。

参照结合蛋白可以包括、但不限于，被批准用于治疗人的那些治疗性结合蛋白。许多治疗性结合蛋白已经被批准用于临床试验中，或处于临床应用开发中，包括，例如，利妥昔单抗 (Rituxan®, IDEC/Genentech/Roche) (参见，美国专利号5,736,137)，即被批准用于治疗非霍奇金淋巴瘤的嵌合的抗-CD20抗体；HuMax-CD20，即目前正由Genmab开发的抗-CD20，在美国专利号5,500,362中所述的抗-CD20抗体，AME-133 (Applied Molecular Evolution)，hA20 (Immunomedics, Inc.)，HumaLYM (Intracel),和PRO70769 (PCT/US2003/040426，标题为" Immunoglobulin Variants and Uses Thereof ")；曲妥单抗 (Herceptin®, Genentech) (参见，美国专利号5,677,171)，即被批准用于治疗乳腺癌的人化的抗-Her2/neu抗体；帕妥珠单抗 (rhuMab-2C4, Omnitarg®)，目前正由Genentech开发，在美国专利号4,753,894中描述的抗-Her2抗体；西妥昔单抗 (Erbitux®, Imclone) (美国专利号4,943,533；PCT WO 96/40210)，即处于多种癌症的临床试验中的嵌合的抗-EGFR抗体；ABX-EGF (美国专利号6,235,883)，目前正由Abgenix-Immunex-Amgen开发；HuMax-EGFr (美国系列号 10/172,317)，目前正由Genmab开发；425、EMD55900、EMD62000和EMD72000 (Merck KGaA) (美国专利号5,558,864；Murthy 等人 1987, Arch. Biochem. Biophys., 252(2): 549-60；Rodeck 等人, 1987, J Cell Biochem., 35(4): 315-20；Kettleborough 等人, 1991, Protein Eng. 4(7): 773-83)；ICR62 (Institute of Cancer Research) (PCT WO 95/20045；Modjtahedi 等人, 1993, J. Cell Biophys., 1993, 22(1-3): 129-46；Modjtahedi 等人, 1993, Br J Cancer, 1993, 67(2):247-53；Modjtahedi 等人, 1996, Br. J. Cancer, 73(2): 228-35；Modjtahedi 等人, 2003, Int. J. Cancer, 105(2): 273-80)；TheraCIM hR3 (YM Biosciences, Canada and Centro de Immunologia Molecular, Cuba (美国专利号5,891,996；美国专利号6,506, 883；Mateo 等人, 1997, Immunotechnology, 3(1): 71-81)；mAb-806 (Ludwig Institue for Cancer Research, Memorial Sloan-Kettering) (Jungbluth 等人 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(2): 639-44)；KSB-102 (KS Biomedix)；MR1-1 (IVAX, National Cancer Institute) (PCT WO 0162931A2)；和SC100 (Scancell) (PCT WO 01/88138)；阿仑珠单抗 (Campath®, Millenium)，即目前被批准用于治疗B-细胞慢性淋巴细胞白血病的人化的单克隆抗体；莫罗单抗-CD3 (Orthoclone OKT3®)，即由Ortho Biotech/Johnson & Johnson开发的抗-CD3抗体，替伊莫单抗 (Zevalin®)，即由IDEC/Schering AG开发的抗-CD20抗体，吉妥单抗(Mylotarg®)，即由Celltech/Wyeth开发的抗-CD33 (p67蛋白)抗体，阿来法塞 (Amevive®)，即由Biogen开发的抗-LFA-3 Fc融合体)，由Centocor/Lilly开发的阿昔单抗 (ReoPro®)，由Novartis开发的巴利昔单抗(Simulect®)，由Medimmune开发的帕利珠单抗 (Synagis®)，英夫利昔单抗 (Remicade®)，即由Centocor开发的抗-TNFα抗体，阿达木单抗 (Humira®)，D2E7，即由Abbott开发的抗-TNFa抗体，Humicade®，即由Celltech开发的抗-TNFa抗体，戈利木单抗 (CNTO-148)，即由Centocor开发的全人TNF抗体，依那西普 (Enbrel®)，即由Immunex/Amgen开发的p75 TNF受体Fc融合体；来那西普，即以前由Roche开发的p55 TNF受体Fc融合体，ABX-CBL，即正由Abgenix开发的抗-CD147抗体，ABX-IL8，即由Abgenix开发的抗-IL8抗体，ABX-MA1，即由Abgenix开发的抗-MUC18抗体，Pemtumomab (R1549, 90Y-muHMFG1)，即正由Antisoma开发的抗-MUC1，Therex (R1550)，即正由Antisoma开发的抗-MUC1抗体，正由Antisoma 开发的AngioMab (AS1405)，正由Antisoma开发的HuBC-1，正由Antisoma开发的Thioplatin (AS1407)，Antegren® (那他珠单抗)，即正由Biogen 开发的抗-α-4-β-1 (VLA-4)和α-4-β-7抗体，VLA-1 mAb，即正由Biogen开发的抗-VLA-1 整联蛋白抗体，LTBR mAb，即正由Biogen开发的抗-淋巴毒素β受体 (LTBR)抗体，CAT-152，即正由Cambridge Antibody Technology开发的抗-TGF-β2抗体，ABT 874 (J695)，即正由Abbott开发的抗-IL-12 p40抗体，CAT-192，即正由Cambridge Antibody Technology and Genzyme开发的抗-TGFβ1抗体，CAT-213，即正由Cambridge Antibody Technology开发的抗-嗜酸性粒细胞趋化因子1抗体，LymphoStat-B®，即正由Cambridge Antibody Technology和Human Genome Sciences Inc.开发的抗-Blys抗体，TRAIL-R1mAb，即正由Cambridge Antibody Technology和Human Genome Sciences Inc.开发的抗-TRAIL-R1抗体，阿伐他汀®贝伐单抗, rhuMAb-VEGF），即正由Genentech开发的抗-VEGF抗体，即正由Genentech开发的抗-HER受体家族抗体，抗-组织因子(ATF)，即正由Genentech开发的抗-组织因子抗体，Xolair® (奥马珠单抗)，即正由Genentech开发的抗-IgE抗体，Raptiva® (依法珠单抗)，即正由Genentech和Xoma开发的抗-CD11a抗体，正由Genentech和Millenium Pharmaceuticals 开发的MLN-02抗体(以前的LDP-02)，HuMax CD4，即正由Genmab开发的抗-CD4抗体，HuMax-IL15，即正由Genmab和Amgen开发的抗-IL15抗体，正由Genmab和Medarex 开发的HuMax-Inflam，HuMax-Cancer，即正由Genmab和Medarex和Oxford GcoSciences开发的抗-类肝素酶I抗体，正由Genmab和Amgen 开发的HuMax-Lymphoma，正由Genmab开发的HuMax-TAC，正由IDEC Pharmaceuticals开发的IDEC-131和抗-CD40L抗体，IDEC-151 (克立昔单抗)，即正由IDEC Pharmaceuticals开发的抗-CD4抗体，IDEC-114，即正由IDEC Pharmaceuticals开发的抗-CD80抗体，IDEC-152，即正由IDEC Pharmaceuticals开发的抗-CD23，正由IDEC Pharmaceuticals开发的抗-巨噬细胞迁移因子(MIF)抗体，BEC2，即正由Imclone开发的抗-个体基因型抗体，IMC-1C11，即正由Imclone开发的抗-KDR抗体，DC101，即正由Imclone开发的抗-flk-1抗体，正由Imclone开发的抗-VE 钙粘蛋白抗体，CEA-Cide® (拉贝珠单抗)，即正由Immunomedics开发的抗-癌胚胎抗原(CEA)抗体，LymphoCide® (依帕珠单抗)，即正由Immunomedics开发的抗-CD22抗体，正由Immunomedics开发的AFP-Cide，正由Immunomedics开发的MyelomaCide，正由Immunomedics开发的LkoCide，正由Immunomedics开发的ProstaCide，MDX-010，即正由Medarex开发的抗-CTLA4抗体，MDX-060，即正由Medarex开发的抗-CD30抗体，正由Medarex开发的MDX-070，正由Medarex开发的MDX-018 ，正由Medarex和 Immuno-Designed Molecules 开发的Osidem® (IDM-1)和抗-Her2抗体，HuMax®-CD4，即正由Medarex和Genmab开发的抗-CD4抗体，HuMax-IL15，即正由Medarex和Genmab开发的抗-IL15抗体，CNTO 148，即正由Medarex和Centocor/J&J开发的抗-TNFα抗体，CNTO 1275，即正由Centocor/J&J开发的抗-细胞因子抗体，MOR101和MOR102，正由MorphoSys开发的抗-细胞间粘附分子-1 (ICAM-1) (CD54)抗体，MOR201，即正由MorphoSys开发的抗-成纤维细胞生长因子受体3 (FGFR-3)抗体，Nuvion® (维西珠单抗)，即正由Protein Design Labs开发的抗-CD3抗体，HuZAF®，即正由Protein Design Labs开发的抗-γ干扰素抗体，正由Protein Design Labs开发的抗-α 5β1 整联蛋白，正由Protein Design Labs开发的抗-IL-12，ING-1，即正由Xoma开发的抗-Ep-CAM抗体，由Genentech和Novartis 开发的一种人化的抗-IgE抗体Xolair® (奥马珠单抗)，和MLN01，即正由Xoma开发的抗-β2 整联蛋白抗体。在该段中在上面引用的所有参考文献都特别地通过引用并入本文。

可用于本文所述方法中的治疗性结合蛋白的具体实例包括，英夫利昔单抗 (抗-TNF-a，体内人半衰期为8 天)、曲妥单抗 (抗-HER2，体内人半衰期为12 天)、利妥昔单抗 (抗-CD20，在类风湿性关节炎患者体内人半衰期为20 天)、帕利珠单抗 (抗-呼吸道合胞病毒(RSV)，体内人半衰期为18 天)、达珠单抗 (抗-CD25，即，抗-IL-2受体，体内人半衰期为20 天)和巴利昔单抗 (抗-CD25，即，抗-IL-2受体，体内人半衰期为7.2 天)和依那西普 (结合TNFa，体内人半衰期为4.25 天)。重组结合蛋白依那西普具有与免疫球蛋白Fc区融合的p75 TNF受体的配体结合部分，其包含Ig折叠。因此，如在实施例2中所证实的，依那西普可用作本文所述方法中的参照结合蛋白。

在本文公开的任意组合物或方法中，可以用任何提及的基本元件或步骤的已知的或公开的等效物替换该元件或步骤。

除非特别指出，组合物或方法不受列出的元件或步骤的任何具体次序的限制。

除非另外指出，其它术语的含义可以从上下文中明白，或应当理解为与本领域技术人员所理解和使用的相同。

本发明部分地基于下述发现，即计算的结合蛋白在体外蛋白酶切割反应中的半衰期(t_1/2)与它的体内半衰期（例如，它在人中的半衰期）高度相关。因此，提供了可以用于估测目标结合蛋白的体内半衰期的方法，无需采用进行实际的体内小哺乳动物或人药代动力学研究所需的劳动、时间和花费。具体地，本文所述的估测目标结合蛋白的体内半衰期的方法包含，计算目标结合蛋白和已知其体内半衰期的至少2种参照结合蛋白中的每一种的体外蛋白水解半衰期。确定(例如，图解地或计算地)已知体内半衰期和计算的每种参照结合蛋白的体外蛋白水解半衰期之间的关系。然后可以将目标结合蛋白的体外蛋白水解半衰期应用于该关系，以估测它的对应的体内半衰期。

在本发明的一个实施方案中，估测目标结合蛋白的体内半衰期的方法包含:

(a) 测定至少2种参照结合蛋白中的每一种和目标结合蛋白在体外蛋白酶反应试验中的体外蛋白水解半衰期，其中所述参照结合蛋白在受试者中具有不同的已知体内半衰期，

(b) 确定参照结合蛋白的已知体内受试者半衰期和体外蛋白水解半衰期之间的关系，

(c) 从参照结合蛋白的已知体内受试者半衰期和体外蛋白水解半衰期之间的关系，估测与目标结合蛋白的体外蛋白水解半衰期相关的目标结合蛋白的体内受试者半衰期。

在一个方面，受试者可以是动物。动物可以包括无脊椎动物和脊椎动物，包括哺乳动物、pices、鸟纲、爬行动物和两栖动物。哺乳动物可以包括大鼠、小鼠、豚鼠、兔、猴、绵羊、山羊、马等。在一个具体方面，受试者是人。

用于本文所述方法中的许多蛋白酶是已知的，且可以在市场上容易地得到。这样的蛋白酶包括、但不限于：嗜热菌蛋白酶、弹性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶及其组合。其它可商业得到的蛋白酶包括在本发明范围内，且是本领域技术人员熟知的。可用于本文所述方法中的蛋白酶或蛋白酶组合是这样的，其条件可以优化，以提供显著的、但是可测量的2种或更多种参照结合蛋白中的每一种的切割，以及2种或更多种参照结合蛋白中的每一种的明显不同的切割速率。在一个方面，体外蛋白水解试验是在蛋白水解处理的参照结合蛋白和一种或更多种目标结合蛋白上进行一天或更短、3小时或更短、2小时或更短、或1小时或更短。

本领域已知的许多方法中的任一种，可以单独地或组合地使用，以跟踪和测量蛋白的蛋白水解切割。这些方法包括、但不限于：聚丙烯酰胺凝胶电泳、在微流体芯片上的电泳(参见实施例2)、蛋白或其片段的色谱分离和分析、鉴别蛋白或其片段的免疫检测技术、和结合蛋白或其片段的质谱法。因而，用于本文所述方法中的蛋白酶或蛋白酶组合会切割参照结合蛋白和目标结合蛋白一段时间，该段时间允许精确测定切割速率，并反过来精确计算每种结合蛋白的体外蛋白水解半衰期。

在一个方面，用于本文所述方法中的蛋白酶或蛋白酶组合会切割参照结合蛋白和目标结合蛋白一段时间，其迅速得足以允许常规地应用于高通量筛选计划中，例如，从而可以在合理的时间段内（例如，一天或更短）测定一种或更多种目标结合蛋白的体外蛋白水解半衰期。

适用于本文所述方法中的蛋白酶的一个实例是嗜热菌蛋白酶，其如在本文(实施例2)中所证实的，可以用于常规体外试验中，以使计算的体外嗜热菌蛋白酶介导的蛋白水解半衰期与它们各自的体内受试者（例如，人）半衰期高度相关的方式，切割结合蛋白。嗜热菌蛋白酶是合适的，这部分地归因于可以优化蛋白水解的条件，以提供参照结合蛋白的体外蛋白水解半衰期和它们各自的已知体内受试者半衰期之间的线性关系。

可以如下图解地确定体内受试者半衰期和蛋白水解体外半衰期之间的关系：通过相对于它们的计算的体外蛋白酶半衰期绘制2种或更多种参照结合蛋白的已知体内受试者半衰期，并通过数据点绘制最佳拟合标准曲线 (线或其它形状)，以揭示体内受试者半衰期与体外蛋白水解半衰期的关系。当然，不一定实际绘制这样的标准曲线，因为也可以计算地确定任何关系，例如，使用计算器、电脑程序等，和简单地使用计算地确定的关系，估测目标结合蛋白的体内半衰期。

适用于本文所述方法中的标准曲线是在受试者中的体内半衰期和结合蛋白的体外蛋白水解半衰期之间的线性关系的图示。这样的历史标准曲线的一个实例如图1所示。使用以前建立的标准曲线估测目标结合蛋白在受试者中的体内半衰期的准确度，将会提高至下述程度，即可以重复用于计算参照结合蛋白的体外蛋白水解半衰期数据的蛋白水解反应试验，以测定目标结合蛋白的体外蛋白水解半衰期数据。例如，如实施例2所述得到图1的线性标准曲线；通过对比目标结合蛋白的体外蛋白水解半衰期和图1的标准曲线估测出的体内人半衰期是最准确的，只要体外蛋白水解试验是在与用于制备标准曲线所用的条件相同的条件下进行。

在图1的标准曲线中显示的体内人半衰期和体外嗜热菌蛋白酶蛋白水解半衰期之间的关系是统计上显著的，且可以预测体内半衰期，如通过相关系数的平方(R²) = 0.885所指示的。R²的值越接近1.00，体外半衰期值对体内半衰期值的预测性更高。0.885 的R² 值表明，通过线性回归可以解释88.5%的数据点的值。因而，如图1所示的线性标准曲线的0.885 的R²客观地表明，体外嗜热菌蛋白酶介导的结合蛋白切割是预测结合蛋白的体内人半衰期的有效方法。因此，本文所述的采用体外嗜热菌蛋白酶介导的蛋白水解切割反应(或它的等效反应)和具有已知体内人半衰期的参照结合蛋白的方法，会为目标结合蛋白的体内人半衰期提供统计上显著的值。但是，在本文所述方法中也可以使用其它蛋白酶。

通过计算（即，不制备新的标准曲线）估测目标结合蛋白的体内半衰期的根据本发明的方法包含，使用例如嗜热菌蛋白酶，在蛋白水解反应试验中测定体外半衰期，然后根据线性公式计算估测的体内半衰期:

y = 0.27x + 2.79

其中“y”是体内人半衰期，按天计算，“0.27”是体内半衰期和体外嗜热菌蛋白酶蛋白水解半衰期之间的线性关系的斜率，“x”是在嗜热菌蛋白酶蛋白水解试验中的体外半衰期，且常数“2.79”是按照所述线性关系与体外蛋白水解半衰期为零时相对应的体内半衰期。在上述线性关系式中的“m”和“b”的值，从由实施例2的数据制备的图1标准曲线得到，所述实施例2测定了下述参照结合蛋白的体外嗜热菌蛋白酶蛋白水解半衰期：英夫利昔单抗 (抗-TNF-a，体内人半衰期为8 天)、曲妥单抗 (抗-HER2，体内人半衰期为12 天)、利妥昔单抗 (抗-CD20，体内人半衰期为20 天)、帕利珠单抗 (抗-呼吸道合胞病毒(RSV)，体内人半衰期为18 天)、达珠单抗 (抗-CD25、即，抗-IL-2受体，体内人半衰期为20 天)、巴利昔单抗 (抗-CD25、即，抗-IL-2受体，体内人半衰期为7.2 天)和依那西普 (结合TNF-a，体内人半衰期为4.25 天)。因此，为了使用上述线性关系式，必须使用与实施例2所述试验相同的反应条件，测定目标结合蛋白的体外嗜热菌蛋白酶蛋白水解半衰期。

在一个替代方案中，还应当理解，如果可得到参照结合蛋白的复数的存货（stock），则可以为参照结合蛋白的已知体内受试者半衰期和它们各自的体外蛋白水解半衰期 (诸如嗜热菌蛋白酶介导的)建立(图解地或计算地)新的关系（即，新的标准曲线），这与目标结合蛋白的体外蛋白水解半衰期平行地和同时地测定。以此方式，可以从新产生的标准曲线或对应的计算式估测目标结合蛋白的体内受试者半衰期。

典型地，手工地或机器人地，使蛋白酶反应混合物相对简单地建立（set up）、运行和终止。标准的蛋白水解切割反应通常包含选定的蛋白酶或蛋白酶组合、用于提供适当反应pH的缓冲液、蛋白水解活性可能需要的任何离子物质、和选定的蛋白底物(例如，本文所述的结合蛋白)。

用于维持选定的蛋白酶或蛋白酶组合介导的切割反应的适当pH和/或其它条件的不同缓冲液是已知的，且本领域技术人员可容易地得到，或可通过常规优化容易地确定。在嗜热菌蛋白酶介导的蛋白水解切割反应的情况下，有用的缓冲液包括、但不限于：醋酸钠/氯化钙缓冲液(pH约7.8)、1X PBS/氯化钙 (pH约7.5),和HEPES/氯化钙。

在嗜热菌蛋白酶的情况下，适用于本文所述方法中的嗜热菌蛋白酶蛋白水解试验包含：结合蛋白 (高达约50 µg)；1X PBS/氯化钙 (pH约7.5)；和嗜热菌蛋白酶（例如，对于可从Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, Missouri, 目录号T7902)得到的嗜热菌蛋白酶，约2至约4单位）。在一个方面，在约37℃进行反应，并定期取出样品，以分析结合蛋白的切割。

通过多种方式中的任一种，可以终止蛋白水解切割反应。如果二价金属离子(例如，钙、镁)对于蛋白酶活性而言是至关重要的，则通过加入一种或更多种金属离子螯合剂（诸如EDTA或EGTA），可以容易地终止蛋白水解切割反应。或者，通过更一般的方式，可以终止蛋白水解切割反应，所述方式包括、但不限于，通过加热或煮沸使蛋白酶变性、通过化学试剂(例如，去污剂、有机溶剂、离液剂)变性、和从反应混合物选择性地去除蛋白酶或基质(例如，当蛋白酶或它的底物连接在可取回的颗粒或其它固体基质上时，所述可取回的颗粒或其它固体基质可以从反应混合物隔绝(sequester)或以其它方式分离)。

如上所述，通过本领域可得到的方法(例如，电泳方法、免疫检测方法、质谱法)，可以容易地测定在体外蛋白水解切割反应中随时间切割的结合蛋白的量，或者，未切割的结合蛋白的剩余部分。例如，通过聚丙烯酰胺凝胶，可以对在不同时间从结合蛋白的体外蛋白水解切割反应取出的样品进行电泳，并进行凝胶染色，或进行免疫印迹，以显示与结合蛋白分子和/或其切割片段相对应的一条或更多条带。以此方式，可能监测随着蛋白水解切割反应的进程与未切割的结合蛋白相对应的凝胶带的消失。然后可以在每个时间点定量未切割的结合蛋白的剩余部分，例如，通过用激光密度计或等效仪器扫描在每个时间点的特定凝胶带(即，凝胶中的泳道)。蛋白水解切割产物的标准电泳分析的最新进展是，使用与适当电脑软件相偶联的微流体芯片。在实施例2中提供了使用微流体芯片的一个实例。这样的微流体芯片采用非常小的样品体积(例如，微升、纳升)来分离和分析样品中的蛋白。使用激光诱发的荧光，可以检测和定量在电泳迁移中分离的蛋白，并通过适当的软件，在与该芯片相联的计算机中编译和分析数据。可以加工数据，以生成虚拟凝胶图像，显示样品中蛋白的电泳分离和迁移。

因而，通过不同的方法，可以随着蛋白水解切割反应的进程，监测和定量与未切割的结合蛋白相对应的蛋白带(在凝胶带中或在虚拟凝胶带上)的消失。可以相对于反应时间图解地或计算地绘制蛋白带的量，以测定体外蛋白水解半衰期。通过本领域技术人员熟悉的标准公式，可以容易地计算结合蛋白在体外蛋白水解切割反应中的衰退表观拟一阶速率常数(K_app)和表观半衰期(t_1/2)。然后，通过测量在特定时间(t)时的剩余蛋白的曲线下面积(y)，除以在时间零时的未切割抗体的曲线下面积(y₀)，可以定量结合蛋白的剩余的未切割部分(r) (r = y/y₀)。相对于时间绘制剩余部分(r) ，会提供指数式衰退函数，它描述了由蛋白酶介导的结合蛋白的切割。因而，在线性关系的情况下，可以分解标准公式r = e^{-(Kapp x t)}，得到表观的拟一阶速率常数K_app，后者又可以用于从标准公式t_1/2 = ln 2/K_app计算结合蛋白的体外蛋白水解半衰期。

然后，可以相对于它们各自的已知体内人半衰期，绘制(图解地或计算地) 2种或更多种参照结合蛋白的体外蛋白水解半衰期。如上所述，在图1中的历史参照线(标准曲线)可以用于估测目标结合蛋白的体内人半衰期，所述目标结合蛋白的体外蛋白水解半衰期已经使用实施例2所述的反应条件在嗜热菌蛋白酶介导的蛋白水解反应中获得。使用图1估测体内半衰期的准确度被提高至这样的程度，即可以重复用于生成参照结合蛋白的体外蛋白水解半衰期数据的嗜热菌蛋白酶蛋白水解反应试验，以生成目标结合蛋白的体外蛋白水解半衰期数据。

由于下述发现，即结合蛋白的体外蛋白水解半衰期与结合蛋白的体内人半衰期强烈相关，体外蛋白水解半衰期可以用于在相对基础上获得2种或更多种目标结合蛋白的体内半衰期，即，无需进行如上所述的体内半衰期估测。这样的目标结合蛋白排序在用于治疗的相对大量候选结合蛋白的高通量筛选中具有特殊价值。例如，不同的目标结合蛋白的体外蛋白水解半衰期之间的相对宽范围的差异，指示它们各自体内半衰期的宽范围的差异。在这样的情况下，从业人员可以确定，将进一步的筛选或开发聚焦在包含与其它结合蛋白相比具有相对高的体外蛋白水解半衰期的结合蛋白亚群上，是更有效的且更经济的。

在修饰或改善目标结合蛋白的一种或更多种性质的研究或程序中，体外蛋白水解半衰期是修饰是否会不利地或以希望的方式影响目标结合蛋白的体内半衰期的一种容易得到的指征。例如，在亲和力成熟程序中，其中建立了具有小变动（例如，在母体抗体分子的一个或更多个CDR中）的抗体分子家族，该家族的所有成员可能都具有可接受的对特定抗原的结合亲和力，但是所述变动的影响可能对其它希望的性质（诸如体内半衰期）具有有害影响。在这样的情形下，本文所述方法可以用于确定抗体分子家族的哪些成员具有相对更长的体内半衰期和哪些具有相对短的体内半衰期。

应当理解，在本文所述方法中使用的体外蛋白水解试验的条件，是用于得到2种或更多种参照结合蛋白的体外蛋白水解半衰期，且反过来用于生成关系或标准曲线，后者用于预测目标结合蛋白的体内半衰期。与包含关系或标准曲线的任何试验一样，目标结合蛋白的体内半衰期的最可靠值，将是在2种或更多种参照结合蛋白的数据点之间的关系或标准曲线区域内得到的那些值，即其中所述值插入参照数据之间，且目标结合蛋白的体内半衰期的更低可靠性的值，可能是在关系或标准曲线区域以外得到的那些值，即其中所述值外推到参照结合蛋白数据以外。

从下面的非限制性实施例，可以明白本发明的其它实施方案和特征。

实施例

实施例1. 治疗性参照结合蛋白的体外部分切割反应的蛋白酶的初期筛选。

初期检查了胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和嗜热菌蛋白酶的提供具有已知体内人半衰期的结合蛋白的不同切割速率的能力。采用标准的蛋白酶切割反应条件，并使用聚丙烯酰胺凝胶电泳，随时间检测每种蛋白酶对每种结合蛋白的切割进程。

在1X 磷酸盐缓冲盐水(PBS)中制备下述结合蛋白(即，参照结合蛋白)的母液制品(10 mg/mL)：英夫利昔单抗 (REMICADE® 英夫利昔单抗, Centocor, Inc., Horsham, Pennsylvania)、曲妥单抗 (HERCEPTIN® 曲妥单抗, Genentech, Inc., South San Francisco, California)、利妥昔单抗 (RITUXAN® 利妥昔单抗, Genentech, Inc., South San Francisco, California和Biogen IDEC, Cambridge, Massachusetts)、帕利珠单抗 (SYNAGIS® 帕利珠单抗, MedImmune, Inc., Gaithersburg, Maryland)、达珠单抗 (ZENAPAX® 达珠单抗, Hoffmann-La Roche Inc., Nutley, New Jersey)、巴利昔单抗 (SIMULECT® 巴利昔单抗, Novartis International AG, Basel, Switzerland)和依那西普 (ENBREL® 依那西普, AMGEN, Thousand Oaks, California和Wyeth Pharmaceuticals, Inc., Philadelphia, Pennsylvania)。

该初期分析表明，所有结合蛋白都在一定程度上易于被每种蛋白酶切割。例如，嗜热菌蛋白酶可以有效地随时间提供每种参照结合蛋白的可观测的切割，以及有效地提供每种参照结合蛋白的不同的蛋白水解切割速率。在表1中显示了每种上述的参照结合蛋白的嗜热菌蛋白酶介导的蛋白水解的数据。

实施例2. 估测目标结合蛋白的体内半衰期(t_1/2)的体外嗜热菌蛋白酶蛋白水解。

本实施例证实了结合蛋白的体内人半衰期(t_1/2)和体外嗜热菌蛋白酶介导的蛋白水解半衰期之间的高线性关系。

材料和方法

从Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, Missouri, 目录号T7902)，得到来自Bacillus thermoproteolyicus rokko 的嗜热菌蛋白酶。

10X反应缓冲液: 500 mM 醋酸钠, 100 mM 氯化钙, pH = 7。

HT Protein Express LabChip 微流体芯片试剂盒(Lot No. B911A, Caliper Life Sciences, Hopkinton, Massachusetts)。

96-孔聚合酶链式反应(PCR)微量培养板(目录号PCR-96-FS-C, Axygen Scientific, Inc., Union City, California)。

停止溶液: 0.5 M EDTA, pH 7.5。

变性缓冲液: 来自Caliper Life Sciences的含有LDS的HT蛋白样品缓冲液 (该专卖缓冲液由Labchip LC90的生产商提供)。

结合蛋白分子蛋白水解和分析

在1X PBS中制备结合蛋白溶液(1 mg/mL)。在开始蛋白水解切割反应之前，以8 mg/mL，将嗜热菌蛋白酶蛋白酶溶液重新悬浮于水中。

嗜热菌蛋白酶蛋白酶切割反应:

1.5 mL eppendorf反应试管含有:

40 µL结合蛋白 (1 mg/mL)，

5 µL 10X反应缓冲液，用于制备1X反应缓冲液，

5 µL 嗜热菌蛋白酶 (8 mg/mL) ，用于制备1:1 (w:w) 抗体:蛋白酶比。

在37℃温育切割反应。在切割反应过程中指定的时间，取出样品(4 µL)，并与EDTA 停止溶液(2 µL)在96-孔PCR微量培养板的孔中相混合。将变性缓冲液(6 µL)加入每个孔，在室温(RT) 温育微量培养板2小时或过夜。然后，将10 µL水加入每个孔，然后在根据生产商的说明书制备和使用的LabChip Caliper 90 微流体芯片上读数。在时间= 0时对照样品(无嗜热菌蛋白酶)的读数，对于蛋白水解切割的定量是至关重要的。在0、10、20、45、60、80、100、120和150分钟，取出嗜热菌蛋白酶蛋白水解切割反应的样品，并结束。还在150分钟取对照样品(无嗜热菌蛋白酶) ，作为抗体分子稳定性的检查。

结果

可商业得到的具有已知体内人半衰期的参照结合蛋白制品用作体外嗜热菌蛋白酶介导的蛋白水解切割反应的底物。嗜热菌蛋白酶提供了显著的、但是可测量的每种参照结合蛋白的切割以及明显不同的每种参照结合蛋白的切割速率。测定每种结合蛋白各自的体外切割速率(每分钟)。然后，将体外蛋白水解切割速率用于计算对应的表观的嗜热菌蛋白酶介导的蛋白水解的(催化的)半衰期 (分钟)。

表2总结了每种治疗性结合蛋白的表观的体外蛋白水解切割速率(每分钟)、表观的体外蛋白水解半衰期(分钟)和公开的平均体内人半衰期(天)。

相对于体外嗜热菌蛋白酶介导的蛋白水解半衰期(分钟)绘制公开的平均人药代动力学体内半衰期(天)，提供了图1所示的标准曲线。值得注意的是，该标准曲线的相关系数的平方(R²)是0.885，指示结合蛋白的体外嗜热菌蛋白酶介导的蛋白水解半衰期和它的对应的体内人半衰期之间的高度相关性。如此高的R²值表明，结合蛋白的体外嗜热菌蛋白酶介导的切割是限制结合蛋白的体内人半衰期的主要机理的有效模型。因而，使用该研究中所述的嗜热菌蛋白酶切割反应条件测得的任何结合蛋白的体外嗜热菌蛋白酶蛋白水解半衰期，可以用于从图1所示的标准曲线估测各自的体内人半衰期。

在上文中引用的所有专利、申请和出版物都通过引用并入本文。

现在，本领域普通技术人员会明白本文所述的本发明的其它变体和实施方案，而不脱离本发明的范围。

Claims (16)

1.估测目标结合蛋白在受试者中的体内半衰期的方法，其包含:

(a) 在体外蛋白酶反应试验中，测定至少2种不同参照结合蛋白中的每一种和目标结合蛋白的体外蛋白水解半衰期，其中所述参照结合蛋白具有不同的已知体内受试者半衰期，

(b) 确定参照结合蛋白的已知体内受试者半衰期和体外蛋白水解半衰期之间的关系，

(c) 从(b)中参照结合蛋白的已知体内受试者半衰期和体外蛋白水解半衰期之间的关系，估测与目标结合蛋白的体外蛋白水解半衰期相关联的目标结合蛋白的体内受试者半衰期。

2.根据权利要求1的方法，其中所述关系是线性关系。

3.权利要求1的方法，其中所述受试者是动物。

4.权利要求3的方法，其中所述动物是无脊椎动物或脊椎动物。

5.权利要求4的方法，其中所述脊椎动物选自：哺乳动物、pices、鸟纲、爬行动物和两栖动物。

6.权利要求5的方法，其中所述哺乳动物选自：大鼠、小鼠、绵羊、山羊、猴、马和人。

7.权利要求6的方法，其中所述哺乳动物是人。

8.权利要求1的方法，其中所述蛋白酶选自：嗜热菌蛋白酶、弹性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶及其组合。

9.根据权利要求8的方法，其中所述蛋白酶是嗜热菌蛋白酶。

10.根据权利要求1的方法，其中所述关系是线性的，且由下述公式表示：

y = mx + b

其中“y”是体内半衰期，m”是体内半衰期和体外蛋白酶介导的蛋白水解半衰期之间的线性关系的实测斜率，“x”是在蛋白水解反应试验中测得的体外半衰期，且常数“b”是y-截距, 其按照所述线性关系与体外蛋白水解半衰期为零(x = 0)时相对应。

11.权利要求1的方法，其中所述结合蛋白具有一个或更多个Ig折叠。

12.根据权利要求1的方法，其中所述至少2种不同的参照结合蛋白选自：利妥昔单抗、达珠单抗、HuMax-CD20、HuMax-EGFr、425、EMD55900、EMD62000、EMD72000、TheraCIM hR3、mAb-806、MR1-1、SC100、阿仑珠单抗、莫罗单抗-CD3、替伊莫单抗、吉妥单抗、阿来法塞、阿昔单抗、巴利昔单抗、帕利珠单抗、英夫利昔单抗、阿达木单抗、D2E7、Humicade®、戈利木单抗、依那西普、来那西普、ABX-CBL、ABX-IL8、ABX-MA1、Pemtumomab、Therex (R1550)、AngioMab (AS1405)、HuBC-1、Thioplatin (AS1407)、Antegren® (那他珠单抗)、VLA-1 mAb、LTBR mAb、CAT-152、ABT 874 (J695)、CAT-192、CAT-213、LymphoStat-B®、TRAIL-R1mAb、阿伐他汀® 贝伐单抗、rhuMAb-VEGF、抗-组织因子 (ATF)、Xolair® (奥马珠单抗)、Raptiva® (依法珠单抗)、MLN-02 抗体、HuMax CD4、HuMax-IL15、HuMax-Inflam、HuMax-Cancer、HuMax-Lymphoma、HuMax-TAC、IDEC-131、IDEC-151、IDEC-114、IDEC-152、BEC2、IMC-1C11、DC101、抗-VE 钙粘蛋白抗体、CEA-Cide® (拉贝珠单抗)、LymphoCide® (依帕珠单抗)、AFP-Cide、MyelomaCide、LkoCide、MDX-010、MDX-060、MDX-070、MDX-018、Osidem® (IDM-1)、HuMax®-CD4，即由Medarex和Genmab开发的抗-CD4抗体、HuMax-IL15、CNTO 148、CNTO 1275、MOR101、MOR102、MOR201、Nuvion® (维西珠单抗)、HuZAF®、抗-α 5β1 整联蛋白、抗-IL-12、ING-1、Xolair® (奥马珠单抗)和MLN01。

13.根据权利要求12的方法，其中所述至少2种参照结合蛋白选自： 英夫利昔单抗、曲妥单抗、利妥昔单抗、帕利珠单抗、达珠单抗、巴利昔单抗和依那西普。

14.估测目标结合蛋白的体内人半衰期的方法，其包含:

(a) 在体外蛋白酶反应试验中，测定至少2种不同参照结合蛋白中的每一种和目标结合蛋白的体外蛋白水解半衰期，其中所述参照结合蛋白具有不同的已知体内人半衰期，

(b) 确定参照结合蛋白的已知的体内人半衰期和体外蛋白水解半衰期之间的关系，

(c) 从(b)中参照结合蛋白的已知的体内人半衰期和体外蛋白水解半衰期之间的关系，估测与目标结合蛋白的体外蛋白水解半衰期相关联的目标结合蛋白的体内人半衰期。

15.权利要求14的方法，其中所述关系是线性的，且由下述公式表示：

y = 0.27x + 2.79

其中“y”是体内人半衰期，按天计算，“0.27”是体内半衰期和体外嗜热菌蛋白酶蛋白水解半衰期之间的线性关系的斜率，“x”是在体外嗜热菌蛋白酶蛋白水解试验中的体外半衰期，且常数“2.79”是按照所述线性关系与体外蛋白水解半衰期为零时(0天)相对应的体内半衰期。

16.测定2种或更多种目标结合蛋白的相对体内人半衰期的方法，其包含：

(a) 在体外蛋白酶反应试验中测定2种或更多种目标结合蛋白中的每一种的体外蛋白水解半衰期，和

(b) 对比步骤(a)的2种或更多种目标结合蛋白中的每一种的体外蛋白水解半衰期，其中在步骤(a)中测得的所述2种或更多种目标结合蛋白中的每一种的体外蛋白水解半衰期与所述2种或更多种目标结合蛋白中的每一种的体内半衰期相关联。

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