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MX2008011664A - Anticuerpos anti-tat226 e inmunoconjugados. - Google Patents

Anticuerpos anti-tat226 e inmunoconjugados.

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Publication number
MX2008011664A
MX2008011664A MX2008011664A MX2008011664A MX2008011664A MX 2008011664 A MX2008011664 A MX 2008011664A MX 2008011664 A MX2008011664 A MX 2008011664A MX 2008011664 A MX2008011664 A MX 2008011664A MX 2008011664 A MX2008011664 A MX 2008011664A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
antibody
amino acid
acid sequence
hvr
seq
Prior art date
Application number
MX2008011664A
Other languages
English (en)
Inventor
Chie Sakanaka
Yan Wu
Wei-Ching Liang
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of MX2008011664A publication Critical patent/MX2008011664A/es

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Abstract

Se proporcionan anticuerpos anti TAT226 e inmunoconjugados de los mismos. Se proporcionan métodos de uso de los anticuerpos anti-TAT226 y de los inmunoconjugados de los mismos.

Description

ANTICUERPOS ANTI-TAT226 E INMUNOCONJUGADOS Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de EE.UU. n.° 60/783.746, presentada el 17 de marzo de 2006, cuyo contenido completo se incorpora en la presente memoria descriptiva a modo de referencia.
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a los anticuerpos anti-TAT226 y a los inmunoconj ugados de los mismos. La presente invención se refiere también' a los métodos de utilización de los anticuerpos anti-TAT226 y de los inmunoconj ugados de los mismos .
ANTECEDENTES Se ha demostrado que los anticuerpos que se unen a polipéptidos que se expresan en la superficie de células cancerosas son eficaces como tratamiento antineoplásico . Estos anticuerpos actúan a través de diversos mecanismos, incluida, por ejemplo, la activación de la citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC) ; la inducción por el anticuerpo de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) ; el aumento de la liberación de citocinas; y la inducción de la apoptosis. Véase, por ejemplo, Cardarelli et al. (2002) Cáncer Immunol . Immunother. 51:15-24. Por ejemplo, HERCEPTIN® y RITUXAN® (ambos de Genentech Inc., South San Francisco, California) son anticuerpos que se han utilizado con éxito para el tratamiento del cáncer de mama y el linfoma no Hodgkin, respectivamente. HERCEPTIN® es un anticuerpo monoclonal humanizado derivado de ADN recombinante que se une selectivamente al dominio extracelular del protooncogen del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico (HER2). En el 25-30% de las neoplasias malignas primarias de mama se observa sobreexpresión de la proteina HER2. RITUXAN® es un anticuerpo monoclonal quimérico humano/murino y creado mediante ingeniería genética, dirigido contra el antígeno CD20 que se encuentra en la superficie de linfocitos B cancerosos y normales. Estos dos anticuerpos se producen de forma recombinante en células CHO. HERCEPTIN® parece actuar, al menos en parte, mediante la inhibición de la angiogénesis (Izumi et al. (2002) Nature 16:279-280), y RITUXAN® parece actuar, al menos en parte, mediante inducción de la apoptosis (Cardarelli et al. (2002) Cáncer Immunol. Immunother. 51:15-24) . Los inmunoconj ugados , o anticuerpos conjugados con fármacos, son útiles para la administración local de agentes citotóxicos en el tratamiento del cáncer. Véase, por ejemplo, Syrigos et al. (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz et al. (1997) Adv. Drug Deliv. Rev. 26:151-172; Patente de EE.UU. n.° 4.975.278. Los inmunoconj ugados permiten la administración dirigida de una fracción de fármaco a un tumor, mientras que la administración sistémica de agentes citotóxicos no conjugados puede ocasionar niveles inaceptables de toxicidad a células normales asi como a las células tumorales que se pretende eliminar. Véase Baldwin et al. (Mar. 15, 1986) Lancet pp. 603-05; Thorpe (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review, " en Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clínical Applications (A. Pinchera et al., eds . ) pp. 475-506. Se han desarrollado y siguen desarrollándose inmunoconj ugados que tienen como diana polipéptidos de la superficie celular para el tratamiento del cáncer. Para una revisión, véase, por ejemplo, Hamann et al. (2005) Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15:1087-1103. Es evidente que existe una necesidad continua de agentes que tengan como diana polipéptidos de la superficie celular con fines diagnósticos y/o terapéuticos. La invención descrita en la presente memoria descriptiva satisface esta necesidad y ofrece otros beneficios.
Todas las referencias citadas en la misma, incluidas las solicitudes de patentes y publicaciones, quedan incorporadas en su totalidad a modo de referencia.
COMPENDIO La invención proporciona anticuerpos anti-TAT226 y métodos de utilización de los mismos. En un aspecto, se proporciona un anticuerpo que se une a TAT226, en el que el anticuerpo comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR selecionadas entre: (1) una HVR-H1 que comprenda la secuencia de aminoácidos de identi ficador de secuencia n.°: 4; (2) una HVR-H2 que comprenda la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 5 ; (3) una HVR-H3 que comprenda una secuencia de aminoácidos que se adapte a la secuencia de consenso de identificador de secuencia n.°: 11; (4) una HVR-Ll que comprenda la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 12; (5) una HVR-L2 que comprenda la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 13; y (6) una HVR-L3 que comprenda una secuencia de aminoácidos que se adapte a la secuencia de consenso de identificador de secuencia n.°: 19. En otro aspecto, un anticuerpo que se une a TAT226 comprende (a) una HVR-H3 que contiene una secuencia de aminoácidos que se adapta a la secuencia de consenso de identificador de secuencia n.°: 11, y (b) al menos una, dos, tres, cuatro o cinco HVR seleccionadas entre: (1) una HVR-Hl que comprenda la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 4 ; (2) una HVR-H2 que comprenda la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 5; (3) una HVR-L1 que comprenda la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 12; (5) una HVR-L2 que comprenda la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 13; y (6) una HVR-L3 que comprenda una secuencia de aminoácidos que se adapte a la secuencia de consenso de identificador de secuencia n.°: 19. En una forma de realización, el anticuerpo comprende una HVR-L3 que contiene una secuencia de aminoácidos que se adapta a la secuencia de consenso de identificador de secuencia n.°: 19.
En una forma de realización, el anticuerpo comprende, además, una HVR-H1 que contiene la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 4 y una HVR-H2 que contiene la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 5. En una forma de realización, el anticuerpo comprende, además, una HVR-L1 que contiene la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 12 y una HVR-L2 que contiene la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 13. En una forma de realización, el anticuerpo comprende una HVR-H3 que contiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre los identificadores de secuencia núms:6-10. En una forma de realización, el anticuerpo comprende, además, una HVR-L3 que contiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre los identificadores de secuencia núms : 14-18. En una forma de realización, la HVR-H3 comprende la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°:9 y la HVR-L3 comprende la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°:17. En una forma de realización, la HVR-H3 comprende la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°:10 y la HVR-L3 comprende la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°:18. En una forma de realización, el anticuerpo comprende, además, una HVR-H1 que contiene la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 4 y una HVR-H2 que contiene la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 5. En una forma de realización, el anticuerpo comprende, además, una HVR-L1 que contiene la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 12 y una HVR-L2 que contiene la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 13. En un aspecto, se proporciona un anticuerpo que se une a TAT226, en el que el anticuerpo comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR selecionadas entre: (1) una HVR-H1 que comprenda la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 1 ; (2) una HVR-H2 que comprenda la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 2; (3) una HVR-H3 que comprenda la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 3; (4) una HVR-L1 que comprenda la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 12; (5) una HVR-L2 que comprenda la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 13; y (6) una HVR-L3 que comprenda la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 14.
En otro aspecto, un anticuerpo que se une a TAT226 comprende (a) una HVR-H3 que contiene la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 3, y (b) al menos una, dos, tres, cuatro o cinco HVR seleccionadas entre: (1) una HVR-H1 que comprenda la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 1 ; (2) una HVR-H2 que comprenda la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 2 ; (3) una HVR-Ll que comprenda la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 12; (4) una HVR-L2 que comprenda la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 13; y (5) una HVR-L3 que comprenda la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 14. En una forma de realización, el anticuerpo comprende una HVR-L3 que contiene la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°:14. En una forma de realización, el anticuerpo comprende, además, una HVR-H1 que contiene la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 1 y una HVR-H2 que contiene la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 2. En una forma de realización, el anticuerpo comprende, además, una HVR-Ll que contiene la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 12 y una HVR-L2 que contiene la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 13. En ciertas formas de realización, cualquiera de los anticuerpos anteriores comprende, además, al menos una estructura seleccionada entre una estructura de consenso del subgrupo III de VH y una estructura de consenso del subgrupo I de VL. En un aspecto, se proporciona un anticuerpo que se une a TAT226, en el cual el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena pesada con al menos un 90% de identificación de la secuencia con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada entre los identificadores de secuencia núms:21-25. En una forma de realización, el anticuerpo comprende, además, un dominio variable de la cadena ligera con al menos un 90% de identificación de la secuencia con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada entre los identificadores de secuencia núms:26-31. En una forma de realización, el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena pesada con al menos un 90% de identificación de la secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°:24. En una forma de realización, el anticuerpo comprende, además, un dominio variable de la cadena ligera con al menos un 90% de* identificación de la secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°:29. En una forma de realización, el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:24, y el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:29. En una forma de realización, el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena pesada con al menos un 90% de identificación de la secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°:25. En una forma de realización, el anticuerpo comprende, además, un dominio variable de la cadena ligera con al menos un 90% de identificación de la secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°:30. En una forma de realización, el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:25, y el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:30. En un aspecto, se proporciona un anticuerpo que se une a TAT226, en el cual el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena pesada con al menos un 90% de identificación de la secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°:20. En una forma de realización, el anticuerpo comprende, además, un dominio variable de la cadena ligera con al menos un 90% de identificación de la secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°:26. En una forma de realización, el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:20, y el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:26. En ciertas formas de realización, se proporciona un polinucleótidos que codifique cualquiera de los anticuerpos anteriores. En una forma de realización, se proporciona un vector que comprenda el polinucleotido. En una forma de realización, se proporciona un anfitrión celular que comprende el vector. En una forma de realización, el anfitrión celular es una célula eücariótica. En una forma de realización, el anfitrión celular es una célula CHO. En una forma de realización, se proporciona un método de fabricación de un anticuerpo anti-TAT226, en la cual el método comprende el cultivo del anfitrión celular en condiciones aptas para la expresión del polinucleotido que codifica al anticuerpo y el aislamiento del anticuerpo.
En un aspecto, se proporciona un anticuerpo que se une a TAT226 expresado en la superficie de una célula. En una forma de realización, el anticuerpo se une a un epitopo dentro de una región de TAT226 de 21-115 aminoácidos del identificador de secuencia n.°:75. En una forma de realización, la célula es una célula cancerosa. En una forma de realización, la célula cancerosa es una célula de cáncer de ovario, una célula de tumor cerebral o una célula de tumor de Wilm. En ciertas formas de realización, cualquiera de los anticuerpos anteriores es un anticuerpo monoclonal. En una forma de realización, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo seleccionado entre el fragmento Fab, Fab ' -SH, Fv, scFv o (Fab' )2- En una forma de realización, el anticuerpo es humanizado. En una forma de realización, el anticuerpo es humano. En una forma de realización, el anticuerpo se une al mismo epitopo que un anticuerpo seleccionado entre YW0.32, YW0.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 e YWO.49.H6. En una aspecto, se proporciona un método de detección de la presencia de TAT226 en una muestra biológica y dicho método comprende establecer el contacto de la muestra biológica y cualquiera de los anticuerpos anteriores en condiciones que faciliten la unión del anticuerpo a TAT226 y detectar si un complejo está formado por el anticuerpo y TAT226. En una forma de realización, la muestra biológica comprende células de tumor de ovario, células de tumor cerebral o células de tumor de Wilms. En un aspecto, se proporciona un método de diagnóstico de un trastorno de proliferación celular asociado a un aumento de la expresión de TAT226 y dicho método comprende establecer un contacto entre un célula de ensayo y cualquiera de los anticuerpos anteriores; determinar el nivel de expresión de TAT226 mediante la detección de la unión del anticuerpo a TAT226; y comparar el nivel de expresión de TAT226 por la célula de prueba con el nivel de expresión de TAT226 por una célula de control, donde un nivel más elevado de expresión de TAT226 por la célula de prueba frente a la célula de control indica la presencia de un trastorno de proliferación celular asociado a un aumento de la expresión de TAT226. En una forma de realización, la célula de prueba es una célula de un paciente que se cree que padece un trastorno de proliferación celular. En una forma de realización, el trastorno de proliferación celular se selecciona entre cáncer de ovario y tumor de Wilms. En una forma de realización, el método comprende la determinación del nivel de expresión de TAT226 en la superficie de la célula de prueba y la comparación del nivel de expresión de TAT226 en la superficie de la célula de prueba con el nivel de expresión de TAT226 en la superficie de la célula de control . La invención proporciona, además, inmunoconj ugados y métodos de utilización de los mismos. En un aspecto, un inmunoconj ugado comprende cualquiera de los anticuerpos anti-TAT226 unidos covalentemente a un agente citotóxico. En una forma de realización, el agente citotóxico se selecciona a partir de una toxina, un agente quimioterapéutico , un anticuerpo, un isótopo radioactivo y una enzima nucleolitica . En un aspecto, se proporciona un inmunoconj ugado con la fórmula Ab-(L-D)p, donde: (a) Ab es cualquiera de los anticuerpos anti-TAT226 anteriores ; (b) L es un enlazador; (c) D es un fármaco de fórmula DE o DF y donde R2 y R6 son, cada uno, metilo; R3 y R4 son cada uno isopropilo; R7 es sec butilo, cada R8 se selecciona independientemente entre CH3, 0-CH3, OH, and H; R9 es H; R10 es aril; Z es -0- o -NH-; R11 es H, Ci-C8 alquilo o - (CH2) 2-0- (CH2) 2-0- (CH2) 2-0-CH3; y R18 es -C (R8) 2-C (R8) 2-aril; y (d) p oscila entre 1 y 8. En una forma de realización, el anticuerpo (Ab) comprende 1) una HVR-H3 que contiene una secuencia de aminoácidos que se adapta a la secuencia de consenso de identificador de secuencia n.°: 11, y 2) al menos una, dos, tres, cuatro o cinco HVR seleccionadas entre: (i) una HVR-Hl que comprenda la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 4 ; (ii) una HVR-H2 que comprenda la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 5; (iii) una HVR-L1 que comprenda la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 12; (iv) una HVR-L2 que comprenda la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 13; y (v) una HVR-L3 que comprenda una secuencia de aminoácidos que se adapte a la secuencia de consenso de identificador de secuencia n.°: 19. En una forma de realización, el anticuerpo comprende una HVR-L3 que contiene una secuencia de aminoácidos que se adapta a la secuencia de consenso de ident ificador de secuencia n.°: 19. En una forma de realización, el anticuerpo comprende una HVR-H3 que incluye la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°:9 y la HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°:17. En una forma de realización, el anticuerpo comprende una HVR-H3 que incluye la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°:10 y la HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°:18. En una forma de realización, el anticuerpo comprende, además, una HVR-H1 que contiene la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°:4; una HVR-H2 que commprende la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°:5, una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°:12 y una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°:13. En una forma de realización, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada con al menos 90% de identificación de la secuencia con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada entre los identificadores de secuencia núms: 21-25 y una región variable de cadena ligera con al menos el 90% de la identificación de la secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos seleccionada entre los identificadores de secuencia : 26-31. En una forma de realización, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada con al menos 90% de identificación de la secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°: 24 y una región variable de cadena ligera con al menos el 90% de la identificación de la secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°:29. En una forma de realización, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:24, y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:29. En una forma de realización, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada con al menos 90% de identificación de la secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°:25 y una región variable de cadena ligera con al menos el 90% de la identificación de la secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°:30. En una forma de realización, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:25, y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:30. Se proporcionan también las formas de realización siguientes para cualquiera de los inmunoconj ugados anteriores. En una forma de realización, un inmunoconj ugado tiene actividad destructora de células in vitro o in vivo. En una forma de realización, el enlazador se une al anticuerpo a través de un grupo tiol en el anticuerpo. En una forma de realización, el enlazador es escindible mediante una proteasa. En una forma de realización, el enlazador comprende un dipéptido val-cit. En una forma de realización, el enlazador comprende una unidad p-aminobenzilo . En una forma de realización, la unidad p-aminobenzilo está situada entre el fármaco y un sitio de escisión de la proteasa en el enlazador. En una forma de realización, la unidad p-aminobenzilo es un p-aminobenziloxicarbonilo (PAB). En una forma de realización, el enlazador comprende 6-maleimidocaproilo . En una forma de realización, 6-maleimidocaproilo está situado entre el anticuerpo y un sitio de escisión de la proteasa en el enlazador. Las formas de realización anteriores pueden darse por separado o combinadas entre si. En una forma de realización, el fármaco se selecciona entre MMAE y MMAF. En una forma de realización, el inmunoconj ugado tiene la fórmula donde Ab es cualquiera de los anticuerpos anti-TAT226 anteriores, S es un átomo de sulfuro y p oscila entre 2 y 5.
En una forma de realización, el inmunoconj ugado tiene la fórmula donde Ab es cualquiera de los anticuerpos anti-TAT226 anteriores, S es un átomo de sulfuro y p oscila entre 2 y 5.
En un aspecto, se proporciona una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los inmunoconj ugados anteriores y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En un aspecto, se proporciona un método para el tratamiento de un trastorno de proliferación celular, en el cual dicho método comprende la administ ación a un sujeto de la composición farmacéutica. En una forma de realización, el trastorno de proliferación celular se selecciona entre cáncer de ovario, cáncer de útero, tumor cerebral y tumor de Wilms. En una forma de realización, el trastorno de proliferación celular se asocia a un aumento de la expresión de ???226 en la superficie de una célula. En un aspecto, se proporciona un método para inhibir la proliferación celular, en el cual dicho método comprende la exposición de un a célula a cualquiera de los inmunoconj ugados anteriores en condiciones que favorezcan la unión del inmunoconj ugado a TAT226. En una forma de realización, la célula es una célula tumoral. En una forma de realización, la célula tumoral es una célula de tumor en ovario, una célula de tumor en útero, una célula de tumor cerebral o una célula de un tumor de Wilms. En una forma de realización, la célula es un xenotrasplante . En una forma de realización, la exposición se produce in vitro. En una forma de realización, la exposición se produce in vivo.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra una alineación de TAT226 procedente de humano, mono cynomolgus, ratón y rata. Los residuos sombreados son idénticos en todas las especies. Los residuos no sombreados difieren en al menos dos de las cuatro especies. El porcentaje de identificación de los aminoácidos entre las secuencias de ???226 procedentes de humanos, mono cynomolgus, ratón y rata se muestra en la tabla debajo de la alineación. El porcentaje de la identificación se calculó utilizando el programa ClustalW. La Figura 2 muestra las secuencias de la región hipervariable (HVR) de la cadena pesada de Hl, H2 y H3 de los anticuerpos monoclonales anti-TAT226 denominadas Y 0.32 e YW0.49, como se describe en el Ejemplo B. Las posiciones de los aminoácidos están numeradas siguiendo el sistema de numeración de Kabat descrito más adelante. La Figura 3 muestra las secuencias de la HVR de la cadena ligera de Ll, L2 y L3 de los anticuerpos monoclonales anti-TAT226 denominadas Y 0.32 e YW0.49, como se describe en el Ejemplo B. Las posiciones de los aminoácidos están numeradas siguiendo el sistema de numeración de Kabat descrito más adelante. La Figura 4 muestra las secuencias de la HVR-H3 y HVR-L3 de YW0.49 e YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 e YWO.49.H6, que fueron generadas mediante maduración de afinidad de Y 0.49 utilizando librerías de aleatori zación flexible de HVR-H3 y HVR-L3, como se describe en el Ejemplo B. También se muestran las secuencias de consenso de HVR-H3 y HVR-L3. Las Figuras 5A y 5B muestran ejemplos de secuencias de estructuras de consenso humanas pesadas variables (VH) de aceptor para uso en la práctica de la invención con identificadores de secuencia como se indica a continuación: - estructura "A" de consenso del subgrupo I humano de VH menos las CDR de Kabat (identificadores de secuencia núms . : 32, 33, 34, 35) . - estructuras "B", "C" y "D" de consenso del subgrupo I humano de VH menos las regiones hipervariables extendidas (identificadores de secuencia núms.: 36, 37, 34, 35; identificadores de secuencia núms.: 36, 37, 38, 35; e identificadores de secuencia núms.: 36, 37, 39, 35) . estructura "A" de consenso del subgrupo II humano de VH menos las CDR de Kabat ( identificadores de secuencia núms. : 40, 41, 42, 35) . estructuras "B", "C" y "D" de consenso del subgrupo II humano de VH menos las regiones hipervariables extendidas ( identificadores de secuencia núms.: 43, 44 , 42, 35; identificadores de secuencia núms.: 43, 44, 45, 35; e identificadores de secuencia núms.: 43, 44 , 46 y 35) . estructura "A" de consenso del subgrupo III humano de VH menos las CDR de Kabat ( identificadores de secuencia núms. : 47 , 48, 49, 35) . estructuras "B", "C" y "D" de consenso del subgrupo III humano de VH menos las regiones hipervariables extendidas ( identificadores de secuencia núms.: 50, 51, 49, 35; identificadores de secuencia núms.: 50, 51, 52, 35; e identificadores de secuencia núms.: 50, 51, 53, 35) . estructura "A" del aceptor humano de VH menos las CDR de Kabat ( identificadores de secuencia núms.: 54, 48, 55, 35) . estructuras "B" y "C" del aceptor humano de VH menos las regiones hipervariables extendidas ( identificadores de secuencia núms . : 50, 51, 55, 35; e identificadores de secuencia núms. : 50, 51, 56, 35) . - estructura "A" del aceptor 2 humano de VH menos las CDR de Kabat (identificadores de secuencia núms. : 54, 48, 57, 35) . - estructuras "B", "C" y "D" del aceptor 2 humano de VH menos las regiones hipervariables extendidas (identificadores de secuencia núms. : 50, 51, 57, 35; identificadores de secuencia núms. : 50, 51, 58, 35; e identificadores de secuencia núms. : 50, 51, 59, 35) . Las Figuras 6A y 6B muestran ejemplos de secuencias de estructuras de consenso humanas ligeras variables (VL) de aceptor para uso en la práctica de la invención con identificadores de secuencia como se indica a continuación: - estructura de consenso del subgrupo I kappa humano de VL (???) : identificadores de secuencia núms. : 60, 61, 62, 63 - estructura de consenso del subgrupo II kappa humano de VL (KV2) : identificadores de secuencia núms. : 64, 65, 66, 63 - estructura de consenso del subgrupo III kappa humano de VL (??3) : identificadores de secuencia núms. : 67, 68, 69, 63 - estructura de consenso del subgrupo IV kappa humano de VL (KV4) : identificadores de secuencia núms . : 70, 71, 72, 63 La Figura 7 muestra las secuencias de estructura de las cadenas ligera y pesada de huMAb4D5-8. Los números que aparecen como superindice/negrita indican posiciones de aminoácidos según Kabat . La Figura 8 muestra las secuencias de estructura de las cadenas ligera y pesada de huMAb4D5-8, con las modificaciones indicadas. Los números que aparecen como superindice/negrita indican posiciones de aminoácidos según Kabat. La Figura 9 muestra las secuencias de la región variable (VH) de la cadena pesada de Y 0.32, YW0.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 e YWO.49.H6. Las HVR aparecen subrayadas. La Figura 10 muestra las secuencias de la región variable de la cadena ligera (VL) de Y 0.32, YW0.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 e YWO.49.H6. También se muestran la secuencias de VL del anticuerpo monoclonal humanizado 4D5-8 ( "huMAb4 D5-8 " ) y un huMAb4D5-8 humanizado en el identificador de secuencia n.°:31 y en el identif icador de secuencia n.°:26, respectivamente. YW0.32 e Y 0.49 tienen la misma secuencia de VL que la VL del huMAb4D5-8 "modificado" ( identificador de secuencia n.°:26), que contiene las sustituciones siguientes relativas al identificador de secuencia n.°: 31: N30S, R66G y H91S. Las HVR aparecen subrayadas . La Figura 11 muestra una alineación las secuencias de la región variable de la cadena pesada de Y 0.32, YW0.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 e YWO.49.H6. Las HVR aparecen en recuadros. Los residuos de las HVR-H3 de YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 e YWO.49.H6 que difieren de los residuos pertinentes de la HVR-H3 de YW0.49 aparecen sombreados. La Figura 12 muestra una alineación las secuencias de la región variable de la cadena ligera de YW0.32, YW0.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 e YWO.49.H6. Las HVR aparecen en recuadros. Los residuos de las HVR-L3 de YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 e YWO.49.H6 que difieren de los residuos pertinentes de la HVR-L3 de YW0.49 aparecen sombreados. La Figura 13 muestra una representación gráfica de los niveles de expresión génica del TAT226 humano en diversos tejidos, como se describe en el Ejemplo A. La Figura 14 muestra una representación gráfica de los niveles de expresión génica de TAT226 humano en ovario normal; trompas de Fallopio normales; cáncer de ovario de los subtipos cistoadenocarcinoma seroso, mucinoso y de células claras; cáncer de ovario metastásico; y otros tipos de cáncer de ovario, como se describe en el Ejemplo A. La Figura 15 muestra los resultados de la separación de células activada por fluorescencia (FACS) de células 0VCAR3 en ausencia o presencia de los anticuerpos anti-TAT226 señalados, como se describe en el Ejemplo D. La Figura 16 muestra la expresión proteinica y el ARNm del TAT226 según valoración del ensayo de nucleasa 5' (TaqMan®) y análisis inmunohistoquimico (IHC) realizados en células OVCAR3 y un grupo de muestras de cáncer de ovario, como se describe en el Ejemplo F. La Figura 17 muestra la actividad in vitro de diversos conjugados de anticuerpos con fármacos (ADC) de YWO.49.H2 e YWO.49.H6 en un ensayo de destrucción de células OVCAR3, como se describe en el Ejemplo H. La Figura 18 muestra la actividad in vitro de diversos ADC de YWO.49.H2 e YWO.49.H6 en un ensayo de destrucción de células utilizando transíectantes estables HCT116#9-4, como se describe en el Ejemplo H. La Figura 19 muestra la actividad in vivo de los ADC de YWO.49.H6 utilizando ratones xenotrasplantados , como se describe en el Ejemplo H.
La Figura 20 muestra la actividad in vivo de los ADC de YWO.49.H6 utilizando ratones xenotrasplantados derivados de tumores de pacientes humanos, como se describe en el Ejemplo H.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS FORMAS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN Se proporcionan anticuerpos aislados que se unen a TAT226. Se proporcionan, además, inmunoconj ugados que comprenden anticuerpos anti-TAT226. Los anticuerpos e inmunoconj ugados de la invención son útiles, por ejemplo, para el diagnóstico o tratamiento de trastornos asociados a una expresión alterada, por ejemplo, una expresión aumentada, de TAT226. En determinadas formas de realización, los anticuerpos o inmunoconj ugados de la invención son útiles para el diagnóstico o tratamiento de un trastorno de proliferación celular, como un tumor o cáncer. En determinadas formas de realización, los anticuerpos o inmunoconj ugados de la invención son útiles para la detección de TAT226, por ejemplo, TAT226 expresado en la superficie celular. Se proporcionan polinucleótidos que codifican anticuerpos anti-TAT226. Se proporcionan vectores que comprenden polinucleótidos que codifican anticuerpos anti-TAT226, asi como células huésped que comprendan dichos vectores. También se proporcionan composiciones, incluidas formulaciones farmacéuticas, que comprendan uno o más de los polinucleótidos, anticuerpos anti-TAT226 o inmunoconj ugados de la invención.
I. TÉCNICAS GENERALES Las técnicas y procedimientos descritos o referenciados en la presente memoria descriptiva se conocen bien, por lo general, y se emplean habituarmente con la metodología tradicional usada por los expertos en la materia, como, por ejemplo, las metodologías ampliamente utilizadas descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds . , (2003)); la serie Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): Per 2: A Practical Approach (M. J. MacPherson, B. D. Hames y G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow y Lañe, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, y Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed . , 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney) , ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather y P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A . Doyle, J. B. Griffiths, y D. G. Newell, eds . , 1993-8) J. iley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds . ) ; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller y M. P. Calos, eds., 1987) ; PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullís et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999) ; Immunobiology (C. A. Janeway y P. Travers, 1997) ; Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989) ; Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd y C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow y D. Lañe (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999) ; The Antibodies (M. Zanetti y J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); y Cáncer : Principies and Practice of Oncology (V. T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993) .
II. DEFINICIONES Y ABREVIACIONES A. Definiciones Un anticuerpo "aislado" es aquel que se ha identificado y separado, y/o recuperado a partir de un componente de su entorno natural . Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que podrían interferir en la investigación, el diagnóstico o los usos terapéuticos del anticuerpo y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos y no proteináceos . En algunas formas de realización, un anticuerpo se purificará (1) en más del 95% de su peso tal como se determina, por ejemplo, por el método de Lowry, y en algunas formas de realización, en más del 99% de su peso, (2) en un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de una secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante, por ejemplo, un secuenciador de taza giratoria, o (3) hasta alcanzar la homogeneidad mediante SDS-PAGE, en condiciones reductoras o no reductoras, empleando, por ejemplo, la tinción con azul de Coomassie o plata. Los anticuerpos aislados incluyen el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes , ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. En cualquier caso, normalmente, el anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación. Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que se separa de al menos de otra molécula de ácido nucleico con la que se asocia habitualmente , por ejemplo, en su entorno natural. Una molécula aislada de ácido nucleico incluye, además, una molécula de ácido nucleico contenida en células que habitualmente expresan la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente extracromosómicamente o en una ubicación cromosómica diferente de su ubicación cromosómica natural. Por "purificada" se entiende una molécula que está presente en una muestra a una concentración de al menos el 95% de su peso, o al menos el 98% del peso de la muestra en la que está contenida. Las frases " sustancialmente similar" o " sustancialmente el/la mismo (a)", tal y como se usan en la presente memoria descriptiva", denotan un grado suficientemente elevado de similitud entre dos valores numéricos (por ejemplo, uno asociado a un anticuerpo de la invención y el otro asociado a un anticuerpo de control/referencia), de forma que alguien experto en la materia consideraría la diferencia entre los dos valores de escasa o ninguna significación estadística y/o biológica dentro del contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, valores Kd) . La diferencia entre dichos dos valores es, por ejemplo, inferior al 50% aproximadamente, al 40% aproximadamente, al 30% aproximadamente, al 20% aproximadamente y/o al 10% aproximadamente como función del valor para la molécula de control/referencia. Las frases " sustancialmente reducido (a )" , " sustancialmente diferente", tal y como se usan en la presente memoria descriptiva" denotan un grado suficientemente elevado de diferencia entre dos valores numéricos (por lo general, uno asociado a una molécula y el otro asociado a una molécula de control/referencia), de forma que alguien experto en la materia consideraría que la diferencia entre los dos valores tiene una significación estadística y/o biológica dentro del contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, valores Kd) . La diferencia entre dichos dos valores es, por ejemplo, superior al 10% aproximadamente, al 20% aproximadamente, al 30% aproximadamente, al 40% aproximadamente y/o al 50% aproximadamente como función del valor para la molécula de control/referencia.
En la presente memoria descriptiva, por "vector" se entiende una molécula de un ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que hace referencia a un ADN circular de doble hebra al que se pueden ligar segmentos adicionales de ADN. Otro tipo de vector es un vector fágico. Otro tipo de vector es un vector vírico, en el que segmentos adicionales de ADN se pueden ligar al genoma vírico. Algunos vectores tienen capacidad de replicación autónoma en un anfitrión celular en el que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores episomales en mamíferos). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episomales en mamíferos) se pueden integrar en el genoma de un anfitrión celular al introducirse en el anfitrión y, de este modo, se replican al mismo tiempo que el genoma del anfitrión. Asimismo, hay vectores capaces de dirigir la expresión de genes a los que están enlazados por su función. Estos vectores se denominan en la presente memoria descriptiva "vectores de expresión recombinantes" , o simplemente "vectores recombinantes" . En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante tienen con frecuencia la forma de plásmidos. En la presente especificación, los términos "plásmido" y "vector" son intercambiables, dado que el plásmido es la forma de vector más frecuentemente usada. En la presente memoria descriptiva, "polinucleótido" , o "ácido nucleico", son términos usados indistintamente y se refieren a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud e incluyen ADN y ARN . Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos , ribonucleótidos , nucleótidos modificados o bases, y/o sus análogos, o cualquier sustrato que se pueda incorporar a un polímero mediante ADN o ARN polimerasa o mediante una reacción sintética. Un polinucleótido puede incluir nucleótidos modificados, como nucleótidos metilados y sus análogos. De estar presente, la modificación de la estructura del nucleótido se puede producir antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos puede ser interrumpida por componentes no nucleótidos. Un polinucleótido puede comprender una o más modificaciones realizadas tras síntesis, como conjugación a un marcador. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, "cofias", sustitución de uno o más de los nucleótidos que se producen de forma natural por un análogo; modificaciones de enlaces internucleótidos, como aquellas en las que intervienen enlaces no cargados (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres , fosfoamidatos , carbamatos, etc.) y enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos , fosforodit ioatos , etc.); las que contienen porciones colgantes, como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos de señal, poli-L-lisina , etc.) ; las que contienen intercaladores (por ejemplo, acridina, psoralen, etc.) ; las que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radioactivos, boro, metales oxidativos, etc.) ; las que contienen alquilantes; las que contienen enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos anoméricos alfa, etc.) , así como formas no modificadas de polinucleótido ( s ) . Asimismo, cualquiera de los grupos hidroxilo presentes habitualmente en los azúcares puede ser sustituido, por ejemplo, por grupos de fosfonatos, grupos fosfatos, protegidos por grupos protectores estándar, o activados para preparar enlaces adicionales a nucleótidos adicionales, o puede ser conjugado a soportes sólidos o semisólidos. El OH terminal 5' y. 3 ' puede ser fosforilado y sustituido por aminas o porciones de grupos orgánicos en casquete (capping) de 1 a 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos también pueden ser derivatizados a grupos protectores estándar. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de azúcares ribosa o desoxirribosa que son generalmente conocidos en este ámbito; por ejemplo, 2 ' -O-metil-, 2'-0-allil, 2'-fluoro- o 2 ' -azido-ribosa, análogos de azúcares carbocíclicos , azúcares a-anoméricos , azúcares epiméricos como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares piranosas, azúcares furanosas, sedoheptulosas , análogos aciclicos y análogos nucleósidos básicos como metil ribosida. Uno o más enlaces de fosfodiéster pueden ser sustituidos por otros grupos de enlace alternativos. Estos grupos alternativos de enlace incluye formas de realización en las que el fosfato es sustituido por P(0)S ("tioato") , P(S)S ("ditioato") , "(0)NR2 ( "amidato" ) , P(0)R, P(0)OR', CO o CH2 ("formacetal") , donde cada R o R' es independientemente H o alquilo sustituido o no sustituido (1 a 20 átomos de carbono) que contiene opcionalmente un enlace a éter (-0-) , aril, alquenil, cicloalquil, cicloalquenil o aradil. No todos los enlaces en un polinucleótido tienen que ser idénticos. La descripción anterior se aplica a todos los polinucleót idos mencionados en la presente memoria descriptiva, incluido el ARN y el AD . En la presente memoria descriptiva, "oligonucleótido" se refiere por lo general a polinucleótidos cortos, habitualmente de hebra única y sintéticos que suelen tener una longitud inferior a 200 nucleótidos, aunque no necesariamente. Los términos "oligonucleótido" y "poligonucleótido" no se excluyen mutuamente. La descripción anteriormente incluida sobre polinucleótidos es aplicable igualmente y en su integridad a los oligonucleótidos . "El "Porcentaje (%) de identificación de la secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia de polipéptidos de referencia se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en un secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos en la secuencia polipeptidica de referencia, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de identificación de la secuencia y no considerar ninguna sustitución conservadora parte de la identificación de la secuencia. A efectos de determinar el porcentaje de identificación de la secuencia de aminoácidos, la alineación se puede conseguir de varias formas que son conocidas en este ámbito; por ejemplo, usar software comercializado como BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR) . Los expertos en este campo pueden determinar parámetros apropiados para la alineación de secuencias, incluidos los algoritmos necesarios para lograr la alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, a efectos de la presente memoria descriptiva, los valores porcentuales de identificación de la secuencia de aminoácidos se generan utilizando el software de comparación de secuencias ALIGN-2. Dicho software fue creado por Genentech, Inc. y el código fuente ha sido presentado, junto con la documentación del usuario, en la Oficina de Derechos de Autor de Estados Unidos, Washington D.C., 20559, donde está inscrito con el n.° de Registro de Derechos de Autor de Estados Unidos TXU510087. El programa ALIGN-2 está comercializado por Genetech, Inc., South San Francisco, California, o se puede compilar a partir del código fuente. Este programa debe ser compilado para su uso en un sistema operativo UNIX, preferiblemente UNIX V4.0D digital. El programa ALIGN-2 define todos los parámetros de comparación de secuencias, que no varían. En situaciones en las que se emplea ALIGN-2 para comparaciones de secuencias de aminoácidos, el porcentaje de identificación de la secuencia de aminoácidos de una determinada secuencia aminoacídica A con respecto a una determinada secuencia aminoacídica B (lo que también se puede expresar diciendo que una determinada secuencia aminoacídica A tiene o contiene un porcentaje concreto de identificación de la secuencia aminoacídica con respecto a una determinada secuencia aminoacídica B) se calcula de la siguiente manera: 100 veces la fracción X/Y en la que X es la cantidad de residuos de aminoácidos establecidos como coincidencia total por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en la alineación hecha por ese programa de A y B, y en la que Y es la cantidad total de residuos de aminoácidos en B. Se detectará que, cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no sea igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el porcentaje de identificación de la secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no será igual al porcentaje de identificación de la secuencia de aminoácidos de B con respecto a A. Salvo indicación expresa en contrario, todos los valores del porcentaje de la identidad de la secuencia de aminoácidos usados en la presente memoria descriptiva se obtienen como se han descrito en el párrafo precedente, utilizando el programa informático ALIGN-2. Por "TAT226" tal y como se usa en la presente memoria descriptiva, comprende cualquier TAT226 nativo procedente de vertebrados, incluidos mamíferos como primates (por ejemplo, humanos) y roedores (por ejemplo, ratas y ratones), salvo especificación en contrario. El término engloba TAT226 no procesado "de longitud completa", así como cualquier forma de TAT226 que se derive del procesamiento en la célula. El término también engloba variantes de TAT226 presentes naturalmente, por ejemplo, variantes de ayuste o variantes alélicas. Una "forma madura" de TAT226 es una forma de TAT226 que ha sido sometida a procesamiento, por ejemplo, una forma de TAT226 que ha sido sometida a escisión del extremo C-terminal y/o N-terminal (por ejemplo, secuencia de señal) y/o modificación mediante unión de un anclaje a GPI . En una forma de realización, una "forma madura" de TAT226 se expresa en la superficie celular. Los "anticuerpos" (Ab) e "inmunoglobulinas" (Ig) son glicoproteíñas que tienen características estructurales similares. Mientras que los anticuerpos presentan especificidad de unión a un antígeno específico, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas similares a anticuerpos que por lo general no presentan especificidad a antígenos. Por ejemplo, _ los polipéptidos de la última clase se producen a niveles bajos en el sistema linfático y a niveles mayores por los mielomas. Los términos "anticuerpo" e " inmunoglobulina" se usan indistintamente en el sentido más amplio e incluyen anticuerpos monoclonales (por ejemplo, anticuerpos monoclonales intactos o de longitud completa), anticuerpos policlonales , anticuerpos monovalentes, anticuerpos polivalentes, anticuerpos multiespecificos (por ejemplo, anticuerpos biespecificos en tanto en cuanto presenten la actividad biológica deseada) y también pueden incluir determinados de anticuerpos (como se describe en mayor detalle en la presente memoria descriptiva) . Un anticuerpo puede ser quimérico, humano, humanizado y/o con afinidad madurada . Por "anticuerpo anti-TAT226" o "anticuerpo que se une a TAT226" se entenderá un anticuerpo con capacidad de unión a TAT226, con suficiente afinidad para que dicho anticuerpo sea útil como agente diagnóstico y/o terapéutico para actuar contra TAT226. Preferiblemente, el alcance de la unión de un o anticuerpo anti-TAT226 a una proteina no afín no relacionada con TAT226 presenta menos de un 10% aproximadamente de unión del anticuerpo a TAT226, según medición, por ejemplo, mediante radioinmunoensayo (RIA) . En ciertas formas de realización, un anticuerpo que se une a TAT226 tiene una constante de disociación (Kd) de = ?µ?, < 100 nM, < 10 nM, = 1 nM o = 0.1 nM. En ciertas formas de realización, un anticuerpo anti-TAT226 se une a un epitopo de TAT226 que se conserva entre TAT226 de distintas especies.
Por "región variable" o "dominio variable" de un anticuerpo" se entienden los dominios amino terminales de la cadena pesada o ligera del anticuerpo. El dominio variable de la cadena pesada se puede referir como "VH" . El dominio variable de la cadena ligera se puede referir como "VL" . Estos dominios suelen ser las partes más variables de un anticuerpo y contienen los sitios de unión a antigeno. El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren ampliamente en sus secuencias de un anticuerpo a otro y se utilizan para la unión y especificidad de cada anticuerpo en particular con relación a su antigeno particular. De todos modos, la variabilidad no se distribuye uniformemente en todos los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados regiones de determinación de complementariedad (CDR) o regiones hipervariables (HVR) de los dominios variables tanto de la cadena ligera como de la pesada. Las porciones más conservadas de los dominios variables se llaman regiones de estructura (FR). Cada dominio variable de las cadenas pesada y ligera nativas comprende cuatro FR que, en gran parte, adoptan una configuración de hoja-ß, conectadas por tres CDR, que crean bucles que conectan la estructura de la hoja-ß, y, en algunos casos, forman parte de ella. Las CDR de cada cadena se mantienen unidas y en estrecha proximidad mediante las regiones FR y, junto a las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antigeno de los anticuerpos (véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Los dominios constantes no participan directamente en la unión de un anticuerpo a un antigeno, pero desarrollan diversas funciones efectoras, como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad dependiente de anticuerpos. Las "cadenas ligeras" de anticuerpos ( inmunoglobulinas ) de cualquier vertebrado pueden asignarse a una de dos clases claramente diferenciadas, denominadas kappa (?) y lambda (?) , en función de las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes . Según las secuencias de aminoácidos de los dominios constantes de sus cadenas pesadas, los anticuerpos (inmunoglobulinas) se pueden asignar a distintas clases. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de éstas pueden seguir dividiéndose en subclases (isotipos) , por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las distintas clases de inmuno-globulinas se denominan a, d, e, ? y µ, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las distintas clases de inmunoglobulinas son bien conocidas y se describen de forma general, por ejemplo, en Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology , 4th ed. (2000) . Un anticuerpo puede formar parte de una molécula de fusión más amplia, formada por asociación covalente o no covalente del anticuerpo a una o más proteínas o péptidos. En la presente memoria descriptiva, los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo entero" se usan indistintamente para hacer referencia a un anticuerpo en su forma sustancialmente intacta, no a fragmentos de anticuerpo definidos a continuación. Estos términos hacen referencia en concreto a un anticuerpo con cadenas pesadas que contiene la región Fe.
Los "fragmentos de anticuerpos" contienen únicamente una porción de un anticuerpo intacto, en la que la porción conserva al menos una, aunque también puede conservar la totalidad o la mayoría, de las funciones normalmente asociadas a esa porción cuando está presente en un anticuerpo intacto. En una forma de realización, un fragmento de anticuerpo contiene un sitio de unión a antígeno del anticuerpo intacto y, de este modo, conserva la capacidad para unirse al antigeno. En otra forma de realización, un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, uno que contiene la región Fe, conserva al menos una de las funciones biológicas habitualmente asociadas a la región Fe cuando está presente en un anticuerpo intacto, como la unión a FcRn, la modulación de la semivida del anticuerpo, la función de la ADCC y la unión a complemento. En una forma de realización, un fragmento de anticuerpo es un anticuerpo monovalente que in vivo tiene una semivida sustancialmente similar a la de un anticuerpo intacto. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo de este tipo puede contener un brazo de unión a antigeno enlazado a una secuencia Fe capaz de dar estabilidad in vivo al fragmento. La digestión con papaina de anticuerpos produce dos fragmentos idénticos de unión a antigeno, llamados fragmentos "Fab", cada uno de ellos con un solo sitio de unión a antigeno, y un fragmento "Fe" residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizarse fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación a antigeno y sigue siendo capaz de establecer una reticulación con el antigeno.
El "Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio completo de unión a antígeno. En una forma de realización, una especie Fv de dos cadenas está compuesta por un dímero de un domino variable de cadena pesada y otro de cadena ligera en una estrecha asociación no covalente. En una especie Fv de cadena única (scFv) , un dominio variable de cadena pesada y otro de cadena ligera se pueden enlazar covalentemente mediante un enlazador peptídico flexible, de forma que las cadenas pesada y ligera se asocien en una estructura "dimérica" análoga a la presente en una especie Fv de dos cadenas. En esta configuración, las tres regiones CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, las seis regiones CDR confieren al anticuerpo una especificidad de unión a antígeno. No obstante, incluso un dominio variable simple (o la mitad de un Fv que comprenda únicamente tres regiones CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer un antígeno y unirse a él, aunque con una afinidad inferior a la del sitio de unión completo. El fragmento Fab contiene los dominios variables de cadena pesada y ligera y también contienen el dominio constante de la cadena ligera del primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' se diferencian de los Fab por la adición de algunos residuos en el extremo carboxi terminal del dominio CH1 de la cadena pesada, incluyendo una o más cisteinas de la región bisagra de un anticuerpo. Fab'-SH es la denominación que se da en la presente memoria descriptiva al Fab' en el que el (los) residuo (s) de cisteina de los dominios constantes presenta (n) un grupo tiol libre. Los fragmentos F(ab')2 de anticuerpos se producían originalmente como pares de fragmentos Fab' con cisteinas bisagra entre ellos. También se conocen otros emparejamientos químicos de fragmentos de anticuerpos. Los fragmentos "Fv de cadena simple" o "scFv" de un anticuerpo comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo presentes en una cadena simple de polipéptidos . Por lo general, el polipéptido scFv comprende también un enlazador de polipéptidos entre los dominios VH y VL que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión a antígeno. Para una revisión de los scFv, véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds . , Springer-Verlag, New York, pp . 269-315 (1994) . El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión a antígeno que comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptidos (VH - VL) . Mediante el uso de un enlazador que sea demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, estos dominios se ven obligados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antigeno. Los diacuerpos pueden ser bivalentes o biespecificos . Los diacuerpos se describen con más detalle, por ejemplo, en la Patente Europea EP 404.097; el documento W093/1161; Hudson et al. (2003) Wat. Med. 9:129-134; y Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993) . Los triacuerpos y tetracuerpos también se describen en Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134. Por "anticuerpo monoclonal" se entiende, en la presente memoria descriptiva, un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que forman la población son idénticos, excepto en posibles mutaciones, por ejemplo, mutaciones de formación natural que podrían estar presentes en cantidades insignificantes. Por lo tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo, que consiste en que no es una mezcla de anticuerpos discretos. En determinadas formas de realización, dicho anticuerpo monoclonal incluye típicamente un anticuerpo que comprende una secuencia polipeptídica que se une a una diana, en la que la secuencia polipeptídica de unión a dicha diana se obtuvo mediante un procedimiento que incluye la selección de una sola secuencia polipeptídica de unión a la diana a partir de muchas secuencias polipeptídicas . Por ejemplo, el procedimiento de selección puede ser una selección de un solo clon a partir de muchos clones, como un conjunto de clones de hibridoma, clones fágicos o clones de ADN recombinante . Es conveniente saber que una secuencia seleccionada de unión a la diana puede alterarse adicionalmente , por ejemplo, para mejorar la afinidad por la diana, para humanizar la secuencia de unión a la diana, para mejorar su producción en cultivos celulares, para reducir su inmunogenia in vivo, para crear un anticuerpo multiespecífico, etc., y que un anticuerpo que comprenda la secuencia de unión a la diana alterada es, además, un anticuerpo monoclonal de esta invención. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen típicamente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales está dirigido contra un solo determinante en un antígeno. Además de su especificidad, las preparaciones de anticuerpos monoclonales tienen la ventaja de que no suelen estar contaminadas por otras inmunoglobulinas . El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo, que consiste en que se ha obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, y no debe interpretarse que sea necesario producir el anticuerpo por algún procedimiento en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se utilicen de conformidad con la presente invención pueden obtenerse a partir de diversas técnicas, incluido, por ejemplo, el procedimiento del hibridoma (por ejemplo, Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), los métodos del ADN recombinante (véase, por ejemplo, Patente de EE.UU. n.° 4.816.567), las tecnologías de reproducción de imágenes de fagos (véase, por ejemplo, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) ; Marks et al., J. Mol. Biol . 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2) : 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5) : 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 101(34) : 12467-12472 (2004); y Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2) : 119-132(2004), y técnicas para producir anticuerpos humanos o semejantes a los humanos en animales que tienen partes o la totalidad de los loci de la inmunoglobulina humana o los genes que codifican las secuencias de la inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, el documento W098/24893; el documento WO96/34096; el documento 096/33735; el documento WO91/10741; Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993) ; Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993) ; Patentes de EE.UU. núms . 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016; arks et al., Bio. Technology 10: 779-783 (1992) ; Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996) ; Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996) y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995) . En la presente memoria descriptiva, los anticuerpos monoclonales incluyen específicamente los anticuerpos "quiméricos", en los cuales una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homologa a las secuencias correspondientes de anticuerpos obtenidos de una especie en particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpos en particular, mientras que el resto de las cadenas es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes de anticuerpos obtenidos de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, asi como también fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada (patente de EE.UU. n.° 4.816.567 y Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81 : 6851-6855 (1984) ) . Las formas "humanizadas" de los anticuerpos no humanos (por ejemplo, los murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no humana. En una forma de realización, un anticuerpo humanizado es una inmunoglobulina humana (anticuerpo receptor) en la que los residuos de una región hipervariable del receptor se sustituyen por residuos procedentes de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante), como ratón, rata, conejo o primates no humanos, que tenga la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región de estructura (FR) de la inmunoglobulina humana se sustituyen por sus correspondientes residuos no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentren en el anticuerpo receptor o donante. Estas modificaciones se pueden llevar a cabo para refinar aún más el rendimiento del anticuerpo. En general, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos los dominios variables, o al menos uno, y típicamente dos, en los que todos, o sustancialmente todos, los bucles hipervariables correspondan a los de una inmunoglobulina no humana y todas, o sustancialmente todas, las FR sean las de una secuencia de inmunoglobulina humana. Opcionalmente , el anticuerpo humanizado también comprenderá al menos una porción de una región constante (Fe) de inmunoglobulina, típicamente de una inmunoglobulina humana. Para obtener más información, véase Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986), Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988) y Presta, Curr. Op. Struct. Biol . , 2:593-596 (1992) . Consúltense también los siguientes artículos y bibliografía citada en los mismos: Vaswani and Hamilton, Ann . Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle y Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994) . Un "anticuerpo humano" es aquel que contiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un humano y/o que se ha producido utilizando cualquiera de las técnicas para producción de anticuerpos humanos expuestas en la presente memoria descriptiva. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que contenga residuos de unión a antigeno no humanos. En la presente memoria descriptiva, por "región hipervariable" , "HVR" o "HV" se entienden las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en su secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos. Por lo general, los anticuerpos contienen seis regiones hipervariables: tres en la VH (Hl, H2, H3) y tres en la VL (Ll, L2, L3) . En anticuerpos nativos, H3 y L3 muestran la máxima diversidad en las seis regiones hipervariables y se cree que H3 en concreto desempeña un papel único en otorgar una buena especificidad a los anticuerpos. Xu et al. (2000) Immunity 13:37-45; Johnson y Wu (2003) en Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ) . De hecho, los anticuerpos anti-camélidos que se producen naturalmente y están formados por una cadena pesada son sólo funcionales y estables en ausencia de la cadena ligera. Hamers-Casterman et al. (1993) Nature 363:4 6-448; Sheriff et al. (1996) Nature Struct. Biol . 3:733-736. En la presente memoria descriptiva se usan y engloban diversas delineaciones de regiones hipervariables. Las regiones de determinación de complementariedad (CDR) de Kabat están basadas en la variabilidad de las secuencias y son las más frecuentemente usadas (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Chothia, en cambio, se refiere a la ubicación de los bucles estructurales (Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Las regiones hipervariables de anticuerpos monoclonales representan una solución intermedia entre las CDR de Kabat y los bucles estructurales de Chothia y son las utilizadas en el software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. Las regiones hipervariables "de contacto" se basan en un análisis de las estructuras de cristales complejos disponibles. Los residuos procedentes de cada una de estas regiones hipervariables se indican a continuación.
Bucle Kabat AbM Chothia Contacto Ll L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96 Hl H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (Numeración de Kabat) Hl H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Numeración de Chothia) H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58 H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101 Las regiones hipervariables pueden comprender "regiones hipervariables ampliadas" como se indica a continuación: 24-36 ó 24-34 (Ll), 46-56 ó 50-56 (L2) y 89-97 ó 89-96 (L3) en la VL y 26-35 (Hl), 50-65 ó 49-65 (H2) y 93-102, 94-102 ó 95-102 (H3) en la VH . Los residuos de dominio variable están variables según Kabat y col., como se ha indicado anteriormente, para cada una de estas definiciones. Los residuos de una "estructura" o "FR" son aquellos residuos de un dominio variable distintos de los de una región hipervariable, tal como se define en la presente memoria descriptiva.
El término "numeración de residuos de dominio variable como en Kabat" o "numeración de la posición de los aminoácidos como en Kabat", y las variaciones de los mismos, se refiere al sistema de numeración usado para los dominios variables de cadena pesada o los dominios de cadena variable de la compilación de anticuerpos en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) . Utilizando este sistema de numeración, la secuencia lineal real de aminoácidos puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales que correspondan a un acortamiento de una FR o HVR del domino variable o a una inserción en ellas, respectivamente. Por ejemplo, un dominio variable de la cadena pesada puede incluir una única inserción de aminoácidos (residuo 52a según Kabat) después del residuo 52 de H2 y residuos insertados (por ejemplo, residuos 82a, 82b y 82c, etc. según Kabat) después de un residuo 82 de la FR de la cadena pesada. La numeración de Kabat de los residuos puede estar determinada para un anticuerpo dado por una alineación en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia "estándar" numerada según Kabat.
Un anticuerpo con "maduración de afinidad" es aquél con una o más alteraciones en una o más HVR del mismo que dan lugar a una mejora de la afinidad del anticuerpo por el antigeno, en comparación con un anticuerpo padre que no incluye dicha (s) alteración ( es ) . En una forma de realización, un anticuerpo con maduración de afinidad presenta afinidades nanomolares e incluso picomolares para el antigeno diana. Los anticuerpos con maduración de afinidad se obtienen mediante procedimientos bien conocidos de la materia. En Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992) , se describe la maduración de afinidad a través de la eliminación de los dominios VH y VL . La mutagénesis aleatoria de la HVR y/o los residuos estructurales se describen en: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA, 91:3809-3813 (1994) , Schier et al., Gene 169:147-155 (1995) ; Yelton et al., J. Immunol. 155:1994-2004 (1995) ; Jackson et al., J. Immunol. 154 ( 7 ) : 3310-9 (1995) ; y Hawkins et al., J. Mol. Biol . 226:889-896 (1992) . Un anticuerpo "de bloqueo" o un anticuerpo "antagonista" es aquel que inhibe o reduce la actividad biológica del antigeno al que se une. Algunos anticuerpos de bloqueo o anticuerpos antagonistas inhiben sustancial o completamente la actividad biológica del antigeno. En la presente memoria descriptiva, un "anticuerpo agonista" es un anticuerpo que imita al menos una de las actividades funcionales de un polipéptido de interés.
Las "funciones efectoras" de un anticuerpo hacen referencia a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fe (una región Fe de una secuencia nativa o una región Fe variable de una secuencia aminoacidica ) de un anticuerpo y puede variar con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de un anticuerpo incluyen: la unión de Clq y citotoxicidad dependiente de complemento, la unión de receptores de Fe, la citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC) , la fagocitosis, la regulación a la baja de los receptores en la superficie celular (por ejemplo, el receptor de células B) y la activación de las células B. Los términos "receptor de Fe" o "FcR" describen un receptor que se une a la región Fe de un anticuerpo. En algunas formas de realización, un FcR es un FcR nativo humano. En algunas formas de realización, un FcR es aquel que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye las subclases de receptores FcyRI, FcyRII y FcyRIII, incluidas las variantes alélicas y las formas con ayuste alternativo de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen el FcyRIIA (un "receptor activador") y el FcyRIIB (un "receptor inhibidor"), los cuales tienen secuencias similares de aminoácidos que difieren principalmente en sus dominios citoplásmicos . El receptor activador FcyRIIA contiene en su dominio citoplásmico un motivo activador inmunorreceptor basado en tirosina (ITAM) . El receptor inhibidor FCYRIIB contiene en su dominio citoplasmático un motivo inhibidor inmunorreceptor basado en la tirosina (ITIM) . (Véase Daéron, Annu. Rev . Immunol. 15:203-234 (1997)) . En Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol, 9:457-92 (1991) , Capel et al., Immunomethods, 4:25-34 (1994) y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. , 126:330-41 (1995) también se analizan los FcR. Otros FcR, incluidos aquellos que se identifiquen en el futuro, se engloban en el término "FcR" de la presente memoria descriptiva . El término "receptor Fe" o "FcR" también incluye el receptor neonatal, FcRn, responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol., 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol., 24:249 (1994)), y regula la homeostasis de las inmunoglobulinas . Se conocen los métodos de medición de la unión al FcRn (véase, por ejemplo, Ghetie 1997, Hinton 2004) . La unión al FcRn humano in vivo y la semivida sérica los polipéptidos de unión al FcRn humano de alta afinidad pueden analizarse, por ejemplo, en ratones transgénicos o lineas celulares humanas t ransfectadas que expresan el FcRn humano, o en primates a los que se administran polipéptidos de variante Fe.
El documento WO00/42072 (Presta) describe variantes de anticuerpos con capacidad de unión a los FcR mejorada o disminuida. El contenido de esta publicación de patente se incorpora específicamente en la presente memoria descriptiva a modo de referencia. Véase, además, Shields et al., J. Biol. Chem., 9(2): 6591-6604 (2001) . Las "células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcR y realizan funciones efectoras. En determinadas formas de realización, las células expresan al menos el FCYRIII y realizan la función o funciones efectoras de ADCC. Ejemplos de leucocitos humanos que median en la ADCC serían las células mononucleares de la circulación periférica (PBMC), las células asesinas naturales (NK) , los monocitos, las células T citotóxicas y los neutrófilos. Las células efectoras se pueden aislar de una fuente nativa, por ejemplo, de la sangre. La "citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en la cual una IgG secretada y unida a los receptores Fe (FcR) presentes en determinadas células citotóxicas (p. ej . , células asesinas naturales (NK) , neutrófilos y macrófagos) posibilita que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula diana que porte un antígeno y, posteriormente, destruyan dicha célula diana con citotoxinas. Las células primarias para mediar en la ADCC, células NK, expresan sólo FcyRIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresión del FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol, 9:457-92 (1991). Para evaluar la actividad de la ADCC de una molécula de interés, se puede realizar un ensayo de ADCC in vi tro, como el que se describe en las Patentes de EE.UU. núms . 5.500.362 ó 5.821.337 o se puede realizar el ensayo de Presta que se describe en la Patente de Estados Unidos n.° 6.737.056. Entre las células efectoras útiles para estos ensayos se encuentran las células mononucleares de la circulación periférica (PBMC) y las células asesinas naturales (NK) . Como alternativa, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal como el que se muestra en Clynes et ai., PNAS (USA) 95: 652-656 (1998) . La "citotoxicidad dependiente de complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una célula diana en presencia del complemento. La activación de la vía clásica del complemento se inicia mediante la unión del primer componente del sistema del complemento (Clq) a los anticuerpos (de la subclase apropiada) que están unidos a su antigeno cognado. A fin de evaluar la activación del complemento, se puede efectuar un ensayo de CDC, como, por ejemplo, el que se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996) . Las variantes polipeptidicas con secuencias aminoacidicas de la región Fe alteradas y capacidad aumentada o disminuida de unión a Cql se describen en la Patente de EE.UU. n.° 6.194.551B1 y el documento W099/51642. El contenido de dichas publicaciones de patentes se incorpora específicamente en la presente memoria descriptiva a modo de referencia. Véase, además, Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000) . Por "polipéptido que comprende una región Fe" se entiende un polipéptido, como un anticuerpo o una inmunoadhesina , que comprende una región Fe. La lisina en el extremo C terminal (residuo 447 según el sistema de numeración de EU) de la región Fe puede ser eliminada, por ejemplo, durante la purificación del polipéptido, o recombinando el ácido nucleico que codifica el polipéptido. Por lo tanto, una composición que contenga un polipéptido con una región Fe según esta invención puede comprender polipéptidos con K447, con todos los K447 eliminados, o una mezcla de polipéptidos con y sin el residuo K447.
A efectos de la presente memoria descriptiva, una "estructura humana del aceptor" es una estructura que comprende la secuencia aminoacidica de una estructura de VL o VH derivada de una estructura de inmunoglobulinas humanas, o de una estructura de consenso humana. Una estructura humana del aceptor "derivada de" una estructura de inmunoglobulinas humanas o una estructura de consenso humana puede comprender la misma secuencia de aminoácidos de estas o puede contener cambios preexistentes en la secuencia de aminoácidos. En algunas formas de realización, el número de cambios preexistentes en la secuencia de aminoácidos es 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos o 2 o menos. En el caso de que haya cambios preexistentes de aminoácidos en una VH, estos cambios, preferentemente, se dan sólo en tres, dos o una de las posiciones 71H, 73H y 78H; por ejemplo, los residuos de aminoácidos en estas posiciones pueden ser 71A, 73T y/o 78A. En una forma de realización, la estructura humana de VL del aceptor tiene una secuencia idéntica a la de la estructura de VL de la inmunoglobulina humana o a la estructura de consenso humana . Una "estructura de consenso humana" es una estructura que representa los residuos de aminoácidos más frecuentes en una selección de secuencias de estructura de VL o VH de inmunoglobulina humana. Por lo general, la selección de secuencias de VL o VH de inmunoglobulina humana se realiza en un subgrupo de secuencias de dominio variable. Por lo general, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como- en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest , 5th Ed . Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) . En una forma de realización, para VL, el subgrupo es un subgrupo kappa I como en Kabat et al., citado anteriormente. En una forma de realización, para VH, el subgrupo es un subgrupo III como en Kabat et al., citado anteriormente. Una "estructura de consenso del subgrupo III de VH" comprende la secuencia de consenso obtenida de las secuencias de aminoácidos en el subgrupo III variable pesado de Kabat et al., citado anteriormente. En una forma de realización, la secuencia de aminoácidos de la estructura de consenso del subgrupo III VH comprende al menos una parte, o la totalidad, de las siguientes secuencias: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (identificador de secuencia n . ° : 50 ) -Hl-WVRQAPGKGLE V ( identificador de secuencia n.°:51)-H2- RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC (identificador de secuencia n. ° : 59) -H3-WGQGTLVTVSS (identificador de secuencia n.°:35) .
Una "estructura de consenso del subgrupo I de VL" comprende la secuencia de consenso obtenida de las secuencias de aminoácidos en el subgrupo I kappa variable ligero de Kabat et al., citado anteriormente. En una forma de realización, la secuencia de aminoácidos de la estructura de consenso del subgrupo I VH comprende al menos una parte, o la totalidad, de las siguientes secuencias: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC ( identificador de secuencia n.°: 60)-Ll-WYQQKPGKAPKLLIY ( identificador de secuencia n.°: 61)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC ( identificador de secuencia n.°: 62) -L3-FGQGTKVEIK ( identificador de secuencia n.°: 63) .
Por "afinidad de unión" generalmente se entiende la fuerza de la suma total de las interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su molécula de enlace (por ejemplo, un antigeno) . Salvo indicación en contrario, tal como se usa en la presente memoria descriptiva, por "afinidad de unión" se entiende la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno) . La afinidad de una molécula X por su molécula de enlace Y se puede representar, por lo general, mediante la constante de disociación (Kd) . La afinidad se puede medir mediante métodos habituales conocidos en este ámbito, incluidos los descritos en la presente memoria descriptiva. Los anticuerpos de baja afinidad se suelen unir al antigeno lentamente y se suelen disociar de inmediato, mientras que los anticuerpos de alta afinidad se unen al antigeno más rápidamente, por lo general, y suelen permanecer unidos más tiempo. Son diversos los métodos de medición de la afinidad de unión conocidos en este ámbito y todos ellos se pueden utilizar para los fines de la presente invención. A continuación, se describen, a modo de ejemplo, formas de realización especificas. En una forma de realización, el " d" o el "valor Kd" según esta invención se mide mediante un ensayo de unión a antigeno radiomarcado (RIA) realizado con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antigeno, como se describe en el siguiente ensayo. La afinidad de unión en solución de Fab a antigenos se mide equilibrando los Fab con una concentración mínima del antígeno marcado (125j) en presencia de una serie de titulación de antígeno no marcado y, luego, capturando el antígeno unido con una placa de anticuerpo de revestimiento anti-Fab (Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881) . Para establecer las condiciones del ensayo, las placas ,de microt itulación (Dynex) son recubiertas durante toda la noche con 5 pg/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en 50 mM de carbonato sódico (pH 9,6) y, a continuación, son bloqueadas con 2% (p/v) de albúmina de suero bovino en PBS durante dos a cinco horas a temperatura ambiente (23 °C aproximadamente) . En una placa no adsorbente (Nunc n.° 269620), 100 pM o 26 pM de antigeno marcado con [125j] se mezclan con diluciones seriadas de un Fab de interés (por ejemplo, que concuerde con la evaluación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et al., (1997) Cáncer Res. 57:4593-4599). A continuación, el Fab de interés se incuba durante toda la noche; no obstante, 1?. incubación puede continuar durante más tiempo (por ejemplo, 65 horas) para garantizar que se alcanza el equilibrio. Después, las mezclas se transfieren a la placa de captura para su incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora) . Luego, se extrae la solución y se lava la placa ocho veces con Tween-20 al 0,1% en PBS. Una vez secas las placas, se añaden 150 µ?/pocillo de centelleador (MicroScint-20 ; Packard) y las placas se cuentan en un contador gamma Topcount (Packard) durante diez minutos. Se eligen concentraciones de cada Fab que proporcionan menos del 20% de unión máxima o un 20% para uso en ensayos de unión competitivos .
Según otra forma de realización, el Kd o valor Kd se mide utilizando análisis de resonancia plasmón de superficie que usa BIAcore™-2000 o BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, New Jersey) a 25 °C con chips CM5 de antigeno inmovilizado a -10 unidades de respuesta (RU) . Los biosensores de dextrano carboximet ilado (CM5, BIAcore Inc) se activan con clorhidrato de W-etil-W- ( 3-dimetilaminopropil ) -carbodiimida (EDC) y W-hidroxisuccinimida (NHS), según las instrucciones del proveedor. El antigeno se diluye con 10 mM de acetato sódico, pH 4,8, a 5 g/ml (-0,2 µ?) antes de la inyección a un caudal de 5 µ?/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de la proteina emparejada. Tras la inyección del antigeno, se inyecta 1 M de etanolamina para bloquear grupos no reaccionados. Para mediciones cinéticas, se inyecta el doble de diluciones seriadas de Fab (0,78 nM a 500 mM) en PBS con 0,05% de Tween 20 (PBST) a 25 °C a un caudal de 25 µ?/min aproximadamente. Las tasas de asociación (kon) y las tasas de disociación (kQff) se calculan utilizando un sencillo modelo de unión uno a uno de Langmuir (BIAcore Evaluation Software, versión 3.2) al encajar simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación de equilibrio (Kd) se calcula como el cociente k0ff/kon_ Véase, por ejemplo, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Si la tasa de asociación excede de 106 1 s 1 según el ensayo de resonancia plasmón de superficie mencionado anteriormente, la tasa de asociación se puede determinar utilizando una técnica de absorción fluorescente que mide el aumento o disminución de la intensidad de la emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, 16 nm de frecuencia) a 25 °C de 20 nM de un anticuerpo anti-antigeno (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones cada vez más elevadas de an^ígeno según medición en un espectrómetro, como un espectrómetro equipado con módulo "stop-flow" (interruptor de flujo) (Aviv Instruments) o un espectrómetro SLM-Aminco serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta con agitador. También se puede determinar una "tasa de asociación" o "kon" según esta invención como se describe anteriormente, utilizando un sistema BIAcore™-2000 o un sistema BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) . Un "trastorno" es un proceso o enfermedad que se beneficiaría del tratamiento con una sustancia/molécula o método de la invención. Incluye trastornos crónicos y agudos, incluidos los procesos patológicos que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. Entre los ejemplos de trastornos que se pueden tratar según la presente memoria descriptiva están tumores, por ejemplo, carcinomas (tumores epiteliales) y blastomas (tumores derivados de tejido embrionario) , y, en algunas formas de realización, cáncer de ovario, cáncer de útero (incluido cáncer endometrial ) , tumores cerebrales (por ejemplo, astrocitomas y gliomas) y cáncer de riñon, incluidos nefroblastomas (por ejemplo, tumor de Wilms ) . Los términos "trastorno de la proliferación celular" y "trastorno de la proliferación" se refieren a trastornos asociados a algún grado de proliferación celular anómala. En una forma de realización, el trastorno de la proliferación celular es cáncer. En la presente memoria descriptiva, por "tumor" se entiende todo crecimiento y proliferación celular neoplásica, tanto benigna como maligna, asi como todas las células y tejidos cancerosos y precancerosos. Tal y como se usan en la presente memoria descriptiva,. los términos "cáncer", "canceroso", "trastorno de proliferación celular", "trastorno de proliferación" y "tumor" no se excluyen mutuamente. Los términos "cáncer" y "canceroso" describen o se refieren al estado fisiológico de los mamíferos típicamente caracterizado por un crecimiento/proliferación celular no regulado. Entre los ejemplos de cáncer están carcinoma, linfoma (por ejemplo, linfoma de Hodgkin y linfoma no Hodgkin) , blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos más concretos de estas clases de cáncer son el cáncer de células escamosas, el cáncer de células pulmonares pequeñas, el adenocarcinoma pulmonar, el carcinoma pulmonar escamoso, el cáncer de peritoneo, el cáncer hepatocelular , el cáncer gastrointestinal, el cáncer pancreático, el glioma, el cáncer de cuello uterino, el cáncer de ovario, el cáncer de hígado, el cáncer de vejiga, el hepatoma, el cáncer de mama, el cáncer de colon, el cáncer colorrectal, el carcinoma endometrial o uterino, el carcinoma de las glándulas salivales, el cáncer de riñon, el cáncer de hígado, el cáncer de próstata, el cáncer vulval, el cáncer de tiroides, el carcinoma hepático, la leucemia y otros trastornos linfoproliferativos y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello . En la presente memoria descriptiva, por "tratamiento" (y variaciones de dicho término, como "tratar" o "tratados") se entiende una intervención clínica en un intento de alterar el proceso natural del individuo o célula tratada y se puede realizar bien como prevención bien durante la evolución de la enfermedad. Son efectos deseables del tratamiento la prevención de la enfermedad o de su recidiva, el alivio de los síntomas, la disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, la prevención de la metástasis, la disminución del ritmo de progresión de la enfermedad, la mejora o los cuidados paliativos del estado de la enfermedad y la remisión o un pronóstico de mejoría. En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención se utilizan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o trastorno o para ralentizar la progresión de una enfermedad o trastorno. Un "sujeto" es un vertebrado. En algunas formas de realización, el vertebrado es un mamífero. Los mamíferos incluyen animales de granja (como vacas), animales utilizados en actividades deportivas, animales de compañía (como gatos, perros y caballos), primates, ratones y ratas. En algunas formas de realización, el mamífero es un humano. Una "cantidad eficaz" es una cantidad eficaz, a las dosis y durante el tiempo necesarios, para lograr el efecto terapéutico o profiláctico deseado. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de una sustancia/molécula de la invención puede variar según factores como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo y la capacidad de la sustancia/molécula para dar lugar a una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz comprende aquella cantidad a la que los efectos tóxicos o perjudiciales de la sustancia/molécula son contrarrestados por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una "cantidad eficaz desde el punto de vista profiláctico" es una cantidad eficaz, a las dosis y durante el tiempo necesarios, para lograr el efecto terapéutico o profiláctico deseado. Habitualmente , aunque no necesariamente, dado que una dosis profiláctica se utiliza en sujetos antes de la enfermedad o en una etapa temprana, la cantidad profilácticamente eficaz seria inferior a la cantidad terapéuticamente eficaz. El término "agente citotóxico", en el contexto de la presente memoria descriptiva, se refiere a una sustancia que inhibe o impide la función de las células y/o causa muerte o destrucción celular. El término pretende incluir isótopos radioactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, 919 " 9 919 Sm , Bi" , P , PfcT" e isótopos radiactivos de Lu) , agentes quimioterapéuticos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina , vinblastina, etoposido) , doxorubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucil, daunorubicina u otros agentes intercaladores , enzimas y fragmentos de estas como enzimas nucleoliticas , antibióticos y toxinas como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimát icamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluidos fragmentos y/o variantes de estos y los diversos agentes antineoplásicos o antitumorales divulgados más adelante. Otros agentes citotóxicos se describen más adelante. Un agente tumoricida causa la destrucción de las células tumorales. Una "toxina" es una sustancia con capacidad para tener un efecto perjudicial en el crecimiento o proliferación de una célula. Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéut icos serían los agentes alquilantes como la tiotepa y la ciclofosfamida (CYTOXAN®) ; los sulfonatos de alquilo como el busulfán, el improsulfán y el piposulfán; las aziridinas como la benzodopa, la carboquona, la meturedopa y la uredopa; las etiloniminas y met ilamelaminas incluyendo la altretamina, la trietilenomelamina , la trietilenofosforamida, la trietilenotiofosforamida y la trimet ilolomelamina ; los acetogeninos (en especial, el bullatacín y la bullatacinona ) ; el delta-9-tetrahidrocannabinol (dronabinol, MARINOL®) ; la beta-lapachona; el lapachol; las colchicinas ; el ácido betulínico, una camptotecina (incluyendo el topotecán análogo sintético (HYCAMTIN®) , el CPT-11 (irinotecán, CAMPTOSAR®) , la acet ilcamptotecina , la escopolectina y la 9-aminocamptotecina ) ; la briostatina; la callistatina ; el CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adocelesina, carcelesina y bicelesina ) ; la podofilotoxina ; el ácido podofilinico; la teniposida; las criptoficinas (particularmente la criptoficina 1 y la 8) ; la dolastatina; la duocarmicina- (incluyendo los análogos sintéticos KW-2189 y CB1-TM1); la eleuterobina ; la pancratistatina ; una sarcodict ina ; la espongistatina ; los gases nitrógeno como el clorambucil, la clornafacina , la colofosfamida , la estramustina , la ifosfamida, la mecloretamina, el clorhidrato de óxido de mecloretamina, el melfalán, la novembichina , la fenesterina, la prednimust ina , la trofosfamida y la uramustina; las nitrosureas como la carmustina, la clorozotocina, la fotemustina, la lomustina., la nimustina y la ranimustina; los antibióticos como los de enedina (por ejemplo, la calicheamicina , especialmente la calicheamicina gamma II y la omega II (véase, por ejemplo, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)) ; la dinemicina, incluyendo la dinemicina A; una esperamicina ; el cromóforo de neocarcinostat ina y los cromóforos de antibióticos de enedina cromoproteina relacionados (las aclacinomisinas , la act inomicina , la autramicina, la azaserina, las bleomicinas, la cact inomicina , la carabicina, la carminomicina , la carcinofilina , las cromomicinas , la dact inomicina , la daunorrubicina , la detorrubicina , la 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, la doxorrubicina (incluyendo ADRIAMYCIN®, la morfolino-doxorrubicina , la cianomorfolino-doxorrubicina , la 2-pirrolino-doxorrubicina y la desoxidoxorrubicina ) , la epirrubicina , la esorrubicina , la idarrubicina , la marcelomicina , las mitomicinas como la mitomicina C, el ácido micofenólico, la nogalamicina , las olivomicinas , la peplomicina, la porfiromicina, la puromicina, la quelamicina, la rodorrubicina , la estreptonigrina , la estreptozocina , la tubercidina, el ubenimex, la cinostatina y la zorrubicina ) ; los antimetabolitos como el metotrexato y el 5-fluorouracilo (5-FU); los análogos del ácido fólico como la denopterina, el metotrexato, la teropterina y el trimet rexato ; los análogos de la purina como la fludarabina, la 6-mercaptopurina , la tiamiprina y la tioguanina; los análogos de la pirimidina como la ancitabina, la azacitidina, la 6-azauridina , el carmofur, la citarabina, la didesoxiuridina , la doxifluridina , la enocitabina y la floxuridina ; los andrógenos como la calusterona, el propionato de dromostanolona , el epitiostanol , el mepitiiostano, la testolactona los ant iadrenérgicos como la aminoglutetimida , el mitotano y el trilostano; un reabastecedor del ácido fólico como el ácido folinico; la aceglatona; el glucósido aldofosfamida ; el ácido aminolevulinico; el eniluracilo; la amsacrina; el bestrabucil ; el bisantreno; el edatraxato; la defofamina; la demecolcina ; la diaziquona; la elfornitina ; el acetato de eliptinio; una epotilona; el etoglúcido; el nitrato de galio; la hidroxiurea; el lentinan; la lonidainina; los maitansinoides como la maitansina y las ansamitocinas; la mitoguazona; la mitoxantrona ; el mopidanmol; la nitraerina; la pentostat ina ; el fenamet; la pirarrubicina ; la losoxantrona ; la 2-etilhidracida ; la procarbacina ; el complejo polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR) ; el razoxano; la rizoxina; el sizofiran; el espirogermanio ; el ácido tenuazónico; la triaciquona; la 2 , 2 2 " -triclorotriet ilamina ; los tricotecenos (especialmente la toxina T-2, el verracurin A, el roridin A y la anguidina); el uretano; la vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®) ; la dacarbacina; la manomustina; el mitobronitol ; el mitolactol; el pipobromán; la gacitosina; la arabinosida ("Ara-C"); la tiotepa; los taxoides, por ejemplo, el paclitaxel (TAXOL®) (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), la formulación de nanopart iculas de paclitaxel mediante ingeniería de albúmina libre de Cremofor (ABRAXANE ) (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) y el docetaxel (TAXOTERE®) ( Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia) ; el clorambucil ; la gemcitabina (GE ZAR®) ; la 6-t ioguanina ; la mercaptopurina ; el metatrexato ; los análogos de platino como el cisplatino y el carboplat ino ; la vinblastina (VELBAN®) ; el platino; el etopóido (VP-16) ; la ifosfamida ; la mitoxantrona ; la vincristina (ONCOVIN®) ; el oxaliplatino ; la leucovovina; la vinorrelbina (NAVELBINE®) ; la novantrona; el edatrexato; la daunomicina; la aminopterina ; el ibandronato; el inhibidor RFS 2000 de la topoisomerasa ; la difluorometilornitina (DMFO) ; los retinoides como el ácido retinoico; capecitabina (XELODA®) ; las sales, los ácidos o los derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de las sustancias anteriores, asi como las combinaciones de una o más de las sustancias anteriores como la CHOP, la abreviatura de una terapia combinada de ciclofosfamida , doxorrubicina , vincristina y prednisolona , y la FOLFOX, la abreviatura de un régimen de tratamiento con oxaliplatino (ELOXATIN™) combinado con 5-FU y leucovovina. También se incluyen en esta definición los agentes antihormonales que regulan, reducen, bloquean o inhiben los efectos de las hormonas que pueden promover el crecimiento del cáncer y se presentan a menudo en la forma de un tratamiento sistémico o del cuerpo entero. Estos agentes pueden ser hormonas. Como ejemplos tendríamos los antiestrógenos y los moduladores selectivos de receptores de estrógenos (SERM), incluyendo, por ejemplo, el tamoxifeno (también el tamoxifeno NOLVADEX®) , el raloxifeno (EVISTA®) , el droloxifeno, el 4-hidroxitamoxifeno, el trioxifeno, el keoxifeno, el LY117018, la onapristona y el toremifeno ( FARESTON®) ; las ant iprogesteronas ; los reguladores a la baja de los receptores de estrógenos (ERD) ; los agentes que oprimen o cierran los ovarios, por ejemplo, los agonistas de la hormona liberadora de la hormona luteinizante (LHRH) como el acetato de leuprolida (LUPRON® y ELIGARD®) , el acetato de goserelina, el acetato de buserelina y la tripterelina; otros antiandrógenos como la flutamida, la nilutamida y la bicalutamida y los inhibidores de la aromatasa que inhiben el enzima aromatasa, encargado de regular la producción de estrógenos en las glándulas suprarrenales, como, por ejemplo, las ( 5 ) -imidazolas , la aminoglutetimida , el acetato de megestrol (MEGASE®) , el exemestano (AROMASIN®) , la formestania, la fadrozola, la vorozola (RIVISOR®) , el letrozol (FEMARA®) y la anastrozola (ARIMIDEX®) . Además, esta definición de los agentes quimioterapéuticos incluye los bisfosfonatos como el clodronato (por ejemplo, BONEFOS® u OSTAC®) , el etidronato (DIDROCAL®), el NE-58095, el ácido zoledrónico/zoledronato (ZO ETA®), el alendronato (FOSAMAX®), el pamidronato (AREDIA®) , el tiludronato (SKELID®) o el risedronato (ACTONEL®) , asi como la troxacitabina (un análogo de la citosina nucleósida 1 , 3-dioxolano ) ; los oligonucleótidos antisentido, en particular los que inhiben la expresión génica en las rutas de señalización implicadas en la proliferación celular aberrante, como, por ejemplo, el PKC-alfa, el Raf, el H-Ras y el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R) ; las vacunas como THERATOPE® y las que se aplican para terapias génicas, por ejemplo, la ALLOVECTIN®, la LEUVECTIN® y la VAXID®; el inhibidor de la topoisomerasa 1 (por ejemplo, LURTOTECAN®) ; el rmRH (por ejemplo, ABARELIX®) ; el ditosilato de lapatinib (un inhibidor de molécula pequeña doble tirosincinasa del ErbB-2 y el EGFR conocido también como GW572016) y las sales, los ácidos o los derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de las sustancias anteriores. Por "agente inhibidor del crecimiento" se entiende, en el contexto de la presente memoria descriptiva, un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula (como una célula que exprese TAT226) tanto in vitro como en vivo.
Así, el agente inhibidor del crecimiento puede reducir significativamente el porcentaje de células que expresen (como una célula que exprese TAT226) en la fase S. Ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento serían los agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un punto distinto de la fase S) , como los agentes que inducen la detención de la Gl y la fase M. Entre los bloqueadores clásicos de la fase M se incluyen las vincas (vincristina y vinblastina) , los taxanos y los inhibidores de la topoisomerasa II como la doxorrubicina , la epirrubicina , la daunorrubicina , el etopósido y la bleomicina. Esos agentes que detienen la Gl también se desbordan en la detención de la fase S, por ejemplo, los agentes de alquilación del ADN como el tamoxifeno, la prednisona, la dacarbacina, la mecloretamina , el cisplatino, el metotrexato, el 5-fluorouracilo y la ara-C. Puede encontrarse más información al respecto en The Molecular Basis of Cáncer, Mendelsohn e Israel, eds . , capítulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and ant ineoplastic drugs" ("Regulación del anillo celular, oncogenes y fármacos antineoplásicos" por Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia , 1995), especialmente p. 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son antineoplásicos derivados los dos del tejo del Pacífico. El docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer) se deriva del tejo europeo y es un análogo semisintético del paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb) . El paclitaxel y el docetaxel promueven la unión de microtúbulos a partir de dímeros de tubulina y estabilizan los microtúbulos al prevenir la despolimerización, que ocasiona la inhibición de mitosis en células . Por "metabolito intracelular" se entiende un compuesto que se deriva de un proceso o reacción metabólicos que se produce en el interior de una célula en un conjugado de anticuerpos con fármacos (ADC) . El proceso o reacción metabólicos puede ser un proceso enzimático, como escisión proteolitica de un enlazador peptidico del ADC, o hidrólisis de un grupo funcional, como una hidrazona, un éster o una amida. Los metabolitos intracelulares incluyen anticuerpos y fármacos libres que han sufrido escisión intracelular tras entrada, difusión, absorción o transporte a una célula. Por "escindido intracelularmente" y "escisión intracelular" se entiende un proceso o reacción metabólicos en el interior de una célula de un conjugado de anticuerpos con fármacos (ADC) donde se rompe la unión covalente, es decir, el enlazador, entre el fragmento del fármaco (D) y el anticuerpo (Ab) , lo que da lugar a que el fármaco libre se disocie del anticuerpo en el interior de la célula. Los fragmentos escindidos del ADC son, por lo tanto, metabolitos intracelulares . Por "biodisponibilidad" se entiende la disponibilidad sistémica (es decir, concentración en sangre/plasma) de una cantidad determinada de fármaco administrada a un paciente. El término biodisponibilidad tiene un carácter absoluto e indica medición tanto del tiempo (velocidad) como de la cantidad total (alcance) del fármaco que alcanza la circulación general a partir de una dosis administrada. Por "actividad citotóxica" se entenderá un efecto inhibidor del crecimiento, citostático o de destrucción celular de un conjugado de anticuerpos con fármacos o un metabolito intracelular de un conjugado de anticuerpos con fármacos. La actividad citotóxica se puede expresar como el valor de IC50 que es la concentración (molar o masa) por unidad de volumen a la que sobreviven la mitad de las células . "Alquil" es hidrocarbono C1-C18 que contiene átomos de carbono normales, secundarios, terciarios o cíclicos. Ejemplos son metil (Me, -CH3) , etil (Et, -CH2CH3) , 1-propil (n-Pr, n-propil, -CH2CH2CH3), 2-propil (i-Pr, i-propil, CH(CH3)2), 1-butil (n-Bu, n-butil, -CH2CH2CH2CH3 ) , 2-metil-l-propil (i-Bu, i-butil, -CH2CH (CH3 ) 2 ) , 2-butil (s-Bu, s-butil, -CH ( CH 3 ) CH2CH3) , 2-metil-2-propil (t-Bu, t-butil, -C ( CH 3 ) 3 ) , 1-pentil (n-pentil, -CH2CH2CH2CH2CH3 ) , 2-pentil (-CH (CH3) CH2CH2CH3) , 3-pentil ( -CH (CH2CH3 ) 2 ) , 2-raetil-2-butil (-C (CH3) 2CH2CH3) , 3-metil-2-butil ( -CH (CH3 ) CH (CH3 ) 2 ) , 3-metil-l-butil ( -CH2CH2CH ( CH3 ) 2 ) , 2-metil-l-butil (- CH2CH ( CH 3 ) CH2CH3) , 1-hexil (-CH2CH2CH2CH2CH2CH3) , 2-hexil (-CH (CH3) CH2CH2CH2CH3) , 3-hexil ( -CH (CH2CH3 ) (CH2CH2CH3 ) ) , 2-metil-2-pentil (-C (CH3) 2CH2CH2CH3) , 3-metil-2-pentil (-CK (CH3) CH (CH3) CH 2 CH 3 ) , 4-metii-2-pentil (- CH (CH3) CH2CH (CH3) 2) , 3-metil-3-pentil ( -C ( CH3 ) (CH2CH3 ) 2 ) , 2-metil-3-pentil ( -CH (CH2CH3 ) CH (CH3 ) 2 ) , 2 , 3-dimetil-2-butil (-C (CH3) 2CH (CH3) 2) , 3, 3-dimetil-2-butil ( -CH (CH3 ) C (CH3 ) 3. Por "Ci-Cs alquil" tal y como se utiliza en la presente memoria descriptiva se entiende un hidrocarbono de cadena recta o ramificada, saturado o no saturado, con 1 a 8 átomos de carbono. Entre los grupos " Ci -Cs alquil" representantivos se incluyen -metil, -etil, -n-propil, -n-butil, -n-pentil, -n-hexil, -n-heptil, -n-octil, -n-nonil and -n-decil; mientras que los grupos Ci-Cs alquil incluyen -isopropil, -sec-butil, -isobutil, -tert-butil, -isopentil, 2-metilbutil ; los grupos no saturados C i -Cs alquil incluyen -vinil, -allil, -1-butenil, -2-butenil, -isobutilenil , -1-pentenil, -2-pentenil, 3-metil-l-butenil, -2-metil-2-butenil , 2 , 3-dimetil-2-butenil , 1-hexil, 2-hexil, 3-hexil, -acetilenil, -propinil, -1-butinil, -2-butinil, -1-pentinil, -2-pentinil, -3-metil-l butinil, metil, etil, propil, isopropil, n-butil, isobutil, sec-butil, tert-butil, n-pentil, isopentil, neopentil, n-hexil, isohexil, 2-metilpentil , 3-metilpentil , 2 , 2-dimet ilbutil , 2 , 3-dimetilbutil , 2 , 2-dimetilpentil , 2,3-dimetilpentil, 3 , 3-dimet ilpent il , 2 , 3 , 4 -trimet ilpent il , 3-metilhexil, 2 , 2-dimetilhexil , 2 , 4 -dimet ilhexil , 2,5-dimetilhexil , 3, 5-dimetilhexil , 2 , 4-dimetilpentil , 2-metilheptil, 3-metilheptil , n-heptil, isoheptil, n-octil, e isooctil. Un grupo Ci-C8 alquil se puede sustituir o no con uno o más grupos, incluidos, -Ci-C8 alquil, -O- (Ci-Cs alquil), -aril, -C(0)R', -OC(0)R', -C(0)OR', -C(0)NH2 , -C(0)NHR', -C(0)N(R' )2 -NHC(0)R', -S03R' , -S(0)2R', -S (O) R' , -OH, halógeno, -N3 , -NH2, -NH(R'), -N(R' ) 2 -CN; donde cada R' se selecciona independientemente entre H, -Ci-Ce alquil y aril. "Alquenil" es hidrocarbono C2-C18 que contiene átomos de carbono normales, secundarios, terciarios o cíclicos con al menos un sitio de insaturación, por ejemplo un enlace doble sp2 carbono-carbono. Entre los ejemplos, están: etileno o vinilo (-CH=CH2) , alil ( -CH2CH=CH2 ) , ciclopentenil (-C5H7), y -hexenil (-CH2 CH2CH2CH2CH=CH2 ) "Alquinil" es hidrocarbono C2-C18 que contiene átomos de carbono normales, secundarios, terciarios o cíclicos con al menos un sitio de insaturación, por ejemplo un enlace triple sp carbono-carbono. Entre los ejemplos, están: acetilénico (-OCH) y propargil (-CH2C=CH) , Por "alquileno" se entiende un radical hidrocarbono saturado, cíclico o de cadena recta o ramificada de 1 a 18 átomos de carbono, con dos centros radicales monovalentes derivados mediante la eliminación de dos átomos de hidrógeno del mismo átomo o de dos átomos de carbono distintos de un alcano padre. Entre los radicales alquílenos típicos, están: metileno (-CH2-) 1,2-etil (-CH2CH2-) , 1,3-propil ( -CH2CH2CH2- ) , 1,4-butil (-CH2CH2CH2CH2-) , etc. Un "C1-C10 alquileno" es un grupo hidrocarbono saturado de cadena recta de la fórmula -(CH2)i_io-. Ejemplos de un C1-C10 alquileno son metileno, etileno, propileno, butileno, pentileno, hexileno, heptileno, ocitileno, nonileno y decaleno. Por "alquenileno" se entiende un radical hidrocarbono insaturado, cíclico o de cadena recta o ramificada de 2 a 18 átomos de carbono, con dos centros radicales monovalentes derivados mediante la eliminación de dos átomos de hidrógeno del mismo átomo o de dos átomos de carbono distintos de un alqueno padre. Entre los radicales alquenilenos típicos, están: 1,2-etileno (-CH=CH-). Por "alquinileno" se entiende un radical hidrocarbono insaturado, cíclico o de cadena recta o ramificada de 2 a 18 átomos de carbono, con dos centros radicales monovalentes derivados mediante la eliminación de dos átomos de hidrógeno del mismo átomo o de dos átomos de carbono distintos de un alquino padre. Entre los radicales alquinilenos típicos, están: acetileno (-C=C-), propargil (-CH2C=C-), y 4-pentinil (-CH2CH2CH2C=C-) . Por "aril" se entiende un grupo aromático carbocíclico . Ejemplos de grupos aril son fenil, naftil y antracenil. Un grupo aromático carbocíclico o un grupo aromático heterocíclico se puede sustituir o no con uno o más grupos, incluidos, -Cx-Cs alquil, -O- (Ci-C8 alquil), -aril, -C(0)R', -OC(0)R', -C(0)OR', -C(0)NH2 , -C(0)NHR', -C(0)N(R')2 NHC(0)R', -S(0)2R', -S(0)R', -OH, -halógeno, -N3 , -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; donde cada R' se selecciona independientemente entre H, -Ci-C8 alquil y aril.
Un "arileno" es un grupo aril que tiene dos enlaces covalentes y puede estar en configuraciones orto, meta o para, como se muestra en las estructuras siguientes: en el que el grupo fenil se puede sustituir o no con hasta cuatro grupos, incluidos, -Ci-C8 alquil, -O- (Ci-C8 alquil), -aril, -C(0)R', -OC(0)R', -C(0)OR' , -C(0)NH2 , -C(0)NHR', -C(0)N(R')2 -NHC(0)R', -S(0)2R', -S(0)R', -OH, -halógeno, -N3 , -NH2, -NH(R'), -N(R' ) 2 y -CN; donde cada R' se selecciona independientemente entre H, -Ci-Ce alquil y aril. Por "arilalquil" se entiende un radical alquilo aciclico en el que uno de los átomos de hidrógeno unido a un átomo de carbono, por lo general un átomo de carbono sp3 o terminal, se sustituye por un radical aril. Habitualmente, los grupos arilalquil incluyen benzil, 2-feniletan-l-il , 2-fenileten-1-il, naftilmetil, 2-naftiletan-l-il , 2-naftileten-l-il , naftobenzil, 2-naftofeniletan-l-il y similares. El grupo arilalquil comprende de 6 a 20 átomos de carbono, por ejemplo, la porción alquil, incluidos los grupos alcanil, alquenil o alquinil, del grupo arilalquil está formada por 1 a 6 átomos de carbono y la porción aril tiene de 5 a 14 átomos de carbono. Por "heteroarilalquil " se entiende un radical alquilo aciclico en el que uno de los átomos de hidrógeno unido a un átomo de carbono, por lo general un átomo de carbono sp3 o terminal, se sustituye por un radical heteroaril. Los grupos heteroarilalquil típicos incluyen 2-benzimidazolilmetil, 2-furiletil y similares. El grupo heteroarilalquil comprende de 6 a 20 átomos de carbono, por ejemplo, la fracción alquil, incluidos los grupos alcanil, alquenil o alquinil, del grupo heteroarilalquil contiene de 1 a 6 átomos de carbono y la fracción heteroaril tiene de 5 a 14 átomos de carbono y de 1 a 3 heteroátomos seleccionados entre N, O, P y S. La fracción heteroaril del grupo hetroarilalquil puede ser un monociclo que tenga de 3 a 7 anillos (2 a 6 átomos de carbono o un biciclo con 7 a 10 anillos (4 a 9 átomos de carbono y 1 a 3 heteroátomos seleccionados entre N, O, P y S), por ejemplo: un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] o [6,6]. Por "alquil sustituido", "aril sustituido" y "arilalquil sustituido" se entienden alquil, aril y arilalquil respectivamente, en los que uno o más átomos de hidrógeno son sustituidos independientemente por un sustituyente . Entre los sustituyentes típicos están, -X, -R, -O-, -OR, -SR, -S~, -NR2, -NR3, =NR, -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -N=C=0, -NCS, -NO, -N02, =N2, -N3, NC(=0)R, -C(=0)R, -C(=0)NR2, -S03~, -S03H, -S(=0)2R, -OS(=0)2OR, -S(=0)2NR, -S(=0)R, -OP (=0) (OR) 2, -P(=0) (OR)2, -P0"3, -P03H2, -C(=0)R, -C(=0)X, -C(=S)R, -C02R, -C02", -C(=S)OR, -C(=0)SR, -C(=S)SR, -C(=0)NR2, -C(=S)NR2, -C(=NR)NR2, donde cada X es independientemente un halógeno: F, Cl, Br o I; y cada R es independientemente -H, C2-Ci8 alquil, C6-C2o aril, C3-C14 heterociclo, grupo protector o fracción de profármaco. Los grupos alquileno, alquenileno y alquinileno descritos anteriormente también se pueden sustituir de forma similar. Por "heteroaril" y "heterociclo" se entiende un sistema de anillos en el que uno o más átomos en anillo es un heteroátomo, por ejemplo, nitrógeno, oxigeno y sulfuro. El radical heterociclo comprende de 1 a 20 átomos de carbono y de 1 a 3 heteroátomos seleccionados entre N, O, P y S. Un heterociclo puede ser un monociclo con 3 a 7 anillos (de 2 a 6 átomos de carbono y de 1 a 3 heteroátomos seleccionados entre N, 0, P y S) o un biciclo con 7 a 10 anillos (de 4 a 9 átomos de carbono y de 1 a 3 heteroátomos seleccionados entre N, 0, P y S), por ejemplo: un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] o [6,6] . Los heterociclos se describen en Paquette, Leo A. ; "Principies of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamín, New York, 1968), especialmente en los capítulos 1, 3, 4, 6, 7 y 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, 1950 to present) , en concreto en los Volúmenes 13, 14, 16, 19 y 28; y J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566. Ejemplos de heterociclos son piridil, dihidroipiridil , tet rahidropiridil (piperidil), tiazolil, tet rahidrot iofenil , sulfur oxidized tetrahidrotiofenil , pirimidinil, furanil, tienil, pirrolil, pirazolil, imidazolil, tetrazolil, benzofuranil , tianaftalenil , indolil, indolenil, quinolinil, isoquinolinil , benzimidazolil , piperidinil, -piperidonil , pirrolidinil , 2-pirrolidonil , pirrolinil, tetrahidrofuranil , bis-tet rahidrofuranil , tetrahidropiranil , bis-tetrahidropiranil, tetrahidroquinolinil, tetrahidroisoquinolinil, decahidroquinolinil , octahidroisoquinolinil, azocinil, triazinil, 6H-1,2,5-tiadiazinil, . 2H, 6H-1, 5, 2-ditiazinil, tienil, tiantrenil, piranil, isobenzofuranil , chromenil, xantenil, fenoxatinil, 2H-pirrolil, isotiazolil, isoxazolil, pirazinil, piridazinil, indolizinil, isoindolil, 3H-indolil, lH-indazolil , purinil, 4H-quinolizinil, ftalazinil, naft iridinil , quinoxalinil , quinazolinil , cinnolinil, pteridinil, 4aH-carbazolil , carbazolil, ß-carbolinil , fenantridinil , acridinil, pirimidinil , fenantrolinil , fenazinil , fenotiazinil , furazanil , fenoxazinil , isochromanil , chromanil , imidazolidinil , imidazolinil , pirazolidinil , pirazolinil, piperazinil , indolinil , isoindolinil , quinuclidinil , morfolinil, oxazolidinil , benzotriazolil , benzisoxazolil, oxindolil, benzoxazolinil, e isatinoil. A modo de ejemplo, los heterociclos con enlace a carbono se enlazan en la posición 2, 3, 4, 5 ó 6 de una piridina, posición 3, 4, 5 ó 6 de una piridazina, posición 2, 4, 5 ó 6 de una pirimidina, posición 2, 3, 5 ó 6 de una pirazina, posición 2, 3, 4 ó 5 de un furano, tetrahidrofurano, tiofurano, tiofeno, pirrol o tetrahidropirrol , posición 2, 4 ó 5 de una oxazola, imidazola o tiazola, posición 3, 4 ó 5 de una isoxazola, pirazola o isotiazola, posición 2 ó 3 de una aziridina, posición 2, 3 ó 4 de una azetidina, posición 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 de una quinolina o posición 1, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 de una isoquinolina . Aún es más habitual que los heterociclos con enlace a carbono incluyan 2-piridil, 3-piridil, 4-piridil, 5-piridil, 6-piridil, 3-piridazinil , 4-piridazinil, 5-piridazinil , 6-piridazinil , 2-pirimidinil , 4-pirimidinil, 5-pirimidinil , 6-pirimidinil , 2-pirazinil, 3-pirazinil, 5-pirazinil, ß-pirazinil, 2-tiazolil, 4-tiazolil o 5-tiazolil .
A modo de ejemplo, los heterociclos con enlace a nitrógenos están enlazados en la posición 1 de una aziridina, azetidina, pirrol, pirrolidina, 2-pirrolina, 3-pirrolina, imidazol, imidazolidina, 2-imidazolina, 3-imidazolina, pirazol, pirazolina, 2-pirazolina, 3-pirazolina, piperidina, piperazina, indol, indolina, lH-indazol, posición 2 de un isoindol, o isoindolina, posición 4 de una morfolina, y posición 9 de un carbazol, o ß-carbolina. Aún es más típico que los heterociclos con enlace a nitrógeno incluyan 1-aziridil, 1-azetedil, 1-pirrolil, 1-imidazolil , 1-pirazolil, y 1-piperidinil . Por "C3-C8 heterociclo" se entiende un C3-C8 carbociclo aromático o no aromático en el que de uno a cuatro de los átomos de carbono en anillo son sustituidos independientemente por un heteroátomo del grupo formado por 0, S y N. Ejemplos representativos de un C2-C8 heterociclo incluyen benzofuranil , benzot iofene , indolil, benzopirazolil , coumarinil, isoquinolinil , pirrolil, tiofenil, furanil, tiazolil, imidazolil, pirazolil, triazolil, quinolinil, pirimidinil, piridinil, piridonil, pirazinil, piridazinil, isotiazolil, isoxazolil y tetrazolil. Un C3-C8 heterociclo se puede sustituir o no con hasta siete grupos, incluidos, -Ci-Cs alquil, -0-(Ci-C8 alquil), -aril, -C(0)R', -0C(0)R', -C(0)0R', -C(0)NH2 , -C(0)NHR', -C(0)N(R' )2 -NHC(0)R', -S(0)2R', S(0)R', -OH, -halógeno, -N3 , -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; donde cada R' se selecciona independientemente entre H, -Ci-Ce alquil y aril. Por "C3-Cs heterociclo" se entiende un grupo C3-C8 heterociclo como se define anteriormente, donde uno de los átomos de hidrógeno del grupo heterociclo es sustituido por un enlace. Un C3-C8 heterociclo se puede sustituir o no con hasta seis grupos, incluidos, -Ci-Ce alquil, -0- (Ci-Cg alquil), -aril, -C(0)R', -OC(0)R', -C(0)0R', -C(0)NH2 , -C(0)NHR', -C(0)N(R' )2 -NHC(0)R', -S(0)2R', -S (0) R' , -OH, -halógeno, -N3 , -NH2, -NH(R'), -N(R' )2 y -CN; donde cada R' se selecciona independientemente entre H, -Ci-Ce alquil y aril. Por "carbociclo" se entiende un anillo saturado o insaturado con 3 a 7 átomos de carbono como monociclo o 7 a 12 átomos de carbono como biciclo. Los carbociclos monociclicos tienen de 3 a 6 átomos en anillo y aún con más frecuencia 5 ó 6 átomos en anillo. Los carbociclos biciclicos tienen de 7 a 12 átomos en anillo, por ejemplo, dispuestos como un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] o [6,6] o de 9 a 10 átomos en anillo dispuestos como un sistema biciclo [5,6] o [6,6] . Ejemplos de carbociclos monociclicos incluyen ciclopropil, ciclobutil, ciclopentil, 1-ciclopent-l-enil , 1-ciclopent-2-enil , l-ciclopent-3-enil, ciclohexil, 1-ciclohex-1-enil, l-ciclohex-2-enil , l-ciclohex-3-enil , cicloheptil y ciclooct il . Un "C3-C8 carbociclo" es un anillo carbociclico no aromático, saturado o insaturado, de 3-, 4-, 5-, 6-, 7- u 8-átomos . Entre los C3-C8 carbociclos representativos están -ciclopropil, -ciclobutil, -ciclopent il , -ciclopentadienil , ciclohexil, -ciclohexenil , -1 , 3-ciclohexadienil , -1,4-ciclohexadienil , -cicloheptil, -1 , 3-cicloheptadienil , -1,3,5-cicloheptat rienil , -ciclooctil y -ciclooctadienil . Un grupo C3-C8 carbociclo se puede sustituir o no con uno o más grupos, incluidos, -Ci-Cs alquil, -O- (Ci-C8 alquil), -aril, -C(0)R', -OC(0)R', -C(0)OR', -C(0)NH2 , -C(0)NHR', -C(0)N(R' )2 NHC(0)R', -S(0)2R', -S(0)R', -OH, -halógeno, -N3 , -NH2, -NH(R' ), -N(R' )2 y -CN; donde cada R' se selecciona independientemente entre H, -Ci-Cs alquil y aril. Por "C3-C8 carbociclo" se entiende un grupo C3-C8 carbociclo como se define anteriormente, donde uno de los átomos de hidrógeno del grupo carbociclo es sustituido por un enlace. Por "enlazador" se entiende una fracción química que comprende un enlace covalente o una cadena de átomos que unen covalentemente un anticuerpo a una fracción de un fármaco. En varias formas de realización, los enlazadores incluyen un radical divalente, como un alquildiil, un arildiil, un heteroarildiil , fracciones como: - (CR2) n0 (CR2) n-, unidades repetidoras de alquiloxi (por ejemplo, polietilenoxi , PEG, polimetileneoxi ) y alquilamino (por ejemplo, polietileneamino, Jeffamine™) ; y éster diácido y amidas como succinato, succinamida, diglicolato, malonato y caproamida. Por "quiral" se entiende moléculas que tienen la propiedad de no superimposición de la molécula de enlace que constituye la contraimagen, mientras que por "aquiral" se entiende las moléculas que son superponibles a su contraimagen . Por "estereoisomeros " se entienden los compuestos que tienen idéntica constitución química pero difieren en la disposición de los átomos o grupos en el espacio. Por "diastereomero" se entiende un estereosiomero con dos o más centros de quiralidad y con moléculas que no son contraimágenes la una de la otra. Los diastereomeros tienen propiedades físicas distintas, por ejemplo, puntos de fusión, puntos de ebullición, propiedades espectrales y reacti idades. Las mezclas de diastereomeros se pueden separar mediante procedimientos analíticos de alta resolución, como electroforesis y cromatografía.
Por "enantiomeros" se entiende dos estereoisomeros de un compuesto que no se superponen como contraimagen el uno del otro . Las definiciones y convenciones estereoquímicas usadas en la presente memoria descriptiva siguen, por lo general, a S. P. Parker, Ed . , McGraw-Híll Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; and Eliel, E. y Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., New York. Existen muchos compuestos orgánicos en formas ópticamente activas, es decir, con capacidad para rotar el plano a luz polarizada en el plano. Al describir un compuesto ópticamente activo, se utilizan los prefijos D y L, o R y S, para denotar la configuración absoluta de la molécula sobre su centro o sus centros quirales. Los prefijos d y 1 o ( + ) y (-) se emplean para designar el signo de rotación de luz polarizada/plano por el compuesto, donde (-) o 1 significan que el compuesto es levorotarorio . Un compuesto con prefijo ( + ) o d es dextrorotatorio . Para una estructura química dada, estos estereoisomeros son idénticos, salvo que son contraimagen el uno del otro. Un esteroisomero específico también se puede considerar un enantiomero y una mezcla de dichos isómeros se denomina con frecuencia una mezcla enantiomérica . Una mezcla de enantiomeros en una proporción 50:50 se considera una mezcla racémica o un racemato, que puede ocurrir cuando no ha habido estereoselección o estereoespecificidad en una reacción o proceso químico. Por "mezcla racémica" o "racemato" se entiende una mezcla equimolar de dos especies enatioméricas , desprovista de actividad óptica. Por "grupo saliente" se entiende un grupo funcional que se puede sustituir por otro grupo funcional. Determinados grupos salientes son bien conocidos en el sector y entre los ejemplos están un halido (por ejemplo, cloruro, bromuro, yoduro), metanesulfonil (mesil), p-toluenesulfonil (tosil), trifluorometilsulfonil (triflato) y trifluorometilsulfonato .
B. Abreviaciones COMPONENTES DEL ENLAZADOR: MC = 6-maleimidocaproil Val-Cit o "ve" = valina-citrulina (un dipéptido ejemplar en un enlazador escindible por una proteasa) Citrulina = ácido 2-amino-5-ureido pentanóico PAB = p-aminobenziloxicarbonilo (un ejemplo de un componente enlazador "autoinmolador" ) Me-Val-Cit = N-metil-valina-citrulina (donde el enlace peptídico del enlazador se ha modificado para prevenir su escisión mediante catepsina B) MC ( PEG) 6-OH = maleimidocaproil- polietilenglicol (se puede unir a cisternas del anticuerpo). FÁRMACOS CITOTÓXICOS: MMAE = mono-metil auristatina E (MW 718) MMAF = variante de la auristatina E (MMAE) con una fenilalanina en el extremo C-terminal del fármaco (MW 731.5) MMAF- DMAEA = MMAF con DMAEA (dimetilaminoetilamina ) en un enlace de amida a la fenilalanina en el extremo C-terminal (MW 801.5) MMAF-TEG = MMAF con tetraetilenglicol esterificado a la fenilalanina MMAF-NtBu = N-t-butil, unido como una amida al extremo C-terminal de MMAF Otras abreviaturas son: AE es auristatina E, Boc es N- ( t-butoxicarbonil ) , cit es citrullina, dap is dolaproina, DCC es 1 , 3-diciclohexilcarbodiimida, DCM es diclorometano , DEA es dietilamina, DEAD es dietilazodicarboxilato, DEPC es dietilfosforilcianidato, DIAD es diisopropilazodicarboxilato, DIEA es W/iV-diisopropiletilamina, dil es dolaisoleucina , DMA es dimetilacetamida, DMAP es -dimetilaminopiridina , DME es etileneglicol dimetil éter (o 1 , 2-dimetoxietano ) , DMF es N,N-dimetilformamida, DMSO es dimetilsulfoxido, doe es dolafenina, dov es N, A7-dimetilvalina , DTNB es 5,5'-ditiobis ( 2-ácido nitrobenzoico) , DTPA es ácido dietilenetriaminepentaacético, DTT es ditiotreitol , EDCI es hidrocloruro de 1- ( 3-dimetilaminopropil ) -3-etilcarbodiimida, EEDQ es 2 -etoxi- 1-etoxicarbonil- 1 , 2 -dihidroquinolina , ES-MS es espectrometría de masas por electrospray, EtOAc es acetato de etilo, Fmoc es N- ( 9-fluorenilmetoxicarbonil ) , gly es glicina, HATU es O- (7-azabenzotriazol-l-il) -?,?,?' ,?' -tet rametiluronium hexafluorofosfato, HOBt es 1-hidroxibenzot riazol , HPLC es cromatografía líquida de alta presión, ile es isoleucina, lys es lysina, MeCN (CH3CN) es acetonitrilo, MeOH es metanol, Mtr es 4-anisildifenilmetil (o -metoxitrit il ) , ñor es (1S, 2R) - ( + ) -norefedrina , PBS es solución salina fosfatada (pH 7,4), PEG es polietilenglicol , Ph es fenil, Pnp es p-nitrofenil , MC es 6-maleimidocaproil , phe es L-fenilalanina , PyBrop es bromo tris-pirrolidino fosfonium hexafluorofosfato, SEC es cromatografía por exclusión de tamaño, Su es succinimida, TFA es ácido trifluoroacético, TLC es cromatografía de capa fina, UV es ultravioleta y val es valina.
III. COMPOSICIONES Y METODOS DE FABRICACION DE LAS MISMAS Se proporcionan anticuerpos que se unen a TAT226. Se proporcionan inmunocon ugados que comprenden anticuerpos anti-TAT226. Los anticuerpos e inmunoconj ugados de la invención son útiles, por ejemplo, para el diagnóstico o tratamiento de trastornos asociados a una expresión alterada, por ejemplo, una expresión aumentada, de TAT226. En determinadas formas de realización, los anticuerpos o inmunoconj ugados de la invención son útiles para el diagnóstico o tratamiento de un trastorno de proliferación celular, como un cáncer.
A. Anticuerpos anti-TAT226 TAT226 ("Diana antigénica asociada a tumores n.° 226") es una proteina que se procesa y expresa en la superficie de determinados tipos de células, incluidas células tumorales. En concreto, se ha referido en ocasiones anteriores que la TAT226 humana está sobreexpresada en determinados tipos de tumores, incluidos tumores de ovario, útero, endometrio, riñon, pulmón, páncreas, glándulas suprarrenales y hepatocelulares . Consúltense, por ejemplo, las publicaciones de solicitudes de Patentes de EE.UU. núms US 2003/0148408 Al, US 2004/0229277 Al y US 2003/0100712 Al (que se refieren a TAT226 como "PR09917"); y la Patente de EE.UU. n.°. 6.710.170 B2 (identificador de secuencia n.°:215) . Otras entradas en bases de datos y descripciones relativas a TAT226 son las siguientes: adquisición por NCBI n.° AY358628_1 (que se refiere a TAT226 como "PSCA Hlog") ; adquisición por NCBI n.° AAQ88991.1 y "gi" n.° 37182378 (que se refiere a TAT226 como "PSCA Hlog"); ADNc RIKEN 2700050C12; solicitud de patente de EE.UU. US 2003/0096961 Al ( identificador de secuencia n.°:16) ; solicitud de patente de EE.UU. US 2003/0129192 Al ( identificador de secuencia n.°:215); solicitud de patente de EE.UU. US 2003/0206918 Al (Ejemplo 5; identificador de secuencia n.°:215) ; solicitud de patente de EE.UU. US 2003/0232056 Al ( identificador de secuencia n.°:215); solicitud de patente de EE.UU. US 2004/0044179 Al ( identificador de secuencia n.°:16) ; solicitud de patente de EE.UU. US 2004/0044180 Al ( identificador de secuencia n.°:16); solicitud de patente de EE.UU. US 2005/0238649 Al (que se refiere a TAT226 humano como "PSCA Hlog") ; documento WO 2003/025148 ( identif icador de secuencia n.°:292); documento WO 2003/105758 ( identificador de secuencia n.°:14); y Patente Europea EP 1347046 ( identif icador de secuencia n. ° :2640) .
Se somete a TAT226 de longitud completa a procesamiento en la célula para generar una forma madura a la proteina que se expresa en la superficie celular. Por ejemplo, una TAT22 6 humana de longitud completa como se muestra en el identificador de secuencia n.°:75 contiene una secuencia previsible de péptidos de señal de aminoácidos 1-20 ó 1-22, que se prevé que se escinda de la proteina. Se prevé que el extremo C-terminal de los aminoácidos 116-141 se escinda de la proteina y una fracción de GPI se una a la proteina en el aminoácido 115. Se prevé que una forma madura de TAT226 humana, procedente de los aminoácidos 21-115 ó 23-115 del identificador de secuencia n. ° : 75, se ancle a la superficie celular a través de la fracción de GPI. La TAT226 de mono y roedor (véanse, por ejemplo, identificadores de secuencia núms: 76-78) son muy similares a la TAT226 humana y, por ello, se cree que se pueden escindir y modificar en las posiciones aminoacidicas equivalentes. Véase la Figura 1. Las formas maduras resultantes de TAT226 humana, de mono y de ratón de los aminoácidos 21-115 ó 23-115 (como se muestra en la Figura 1) son 100% idénticas. Otras características de la TAT226 humana incluyen un sitio previsible de N-glicosilación en el aminoácido 45, que se ha confirmado empíricamente, y un dominio previsible Ly6/u-PAR de los aminoácidos 94-107 del identificador de secuencia n.°:75. La TAT226 humana tiene un 32% de homología de aminoácidos con antígenos de células madre de la próstata (PSCA), un antígeno tumoral específico del cáncer de próstata que se expresa en la superficie celular mediante una unión a GPI. Véase Reiter et al. (1998) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 95:1735-1740. El PSCA está sobreexpresado en más del 80% de las neoplasias malignas de próstata. Id. Al igual que TAT226, contiene un dominio previsto Ly6/u-PAR, que, al parecer, interviene en funciones celulares como transducción de la señal y adhesión celular. Id. En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos que se unen a TAT226. En algunas formas de realización, se proporcionan anticuerpos que se unen a una forma madura de TAT226. En una de esas formas de realización, una forma madura de TAT226 tiene una secuencia de aminoácidos del aminoácido 21-115 ó 23-115 del identificador de secuencia n.°:75. En algunas formas de realización, un anticuerpo anti-TAT226 se une a una forma madura de TAT226 expresada en la superficie celular. En algunas formas de realización, un anticuerpo que se une a una forma madura de TAT226 expresada en la superficie celular inhibe el crecimiento de una célula. En algunas formas de realización, un anticuerpo anti-TAT226 que se une a una forma madura de TAT226 expresada en la superficie celular inhibe la proliferación celular. En algunas formas de realización, un anticuerpo anti-TAT226 se une a una forma madura de TAT226 expresada en la superficie celular e induce la muerte celular. En algunas formas de realización, un anticuerpo anti-TAT226 se une a una forma madura de TAT226 expresada en la superficie de células cancerosas. En algunas formas de realización, un anticuerpo anti-TAT226 se una a una forma madura de TAT226 que está sobreexpresada en la superficie de células cancerosas con respecto a células normales del mismo origen tisular. En un aspecto, un anticuerpo anti-TAT226 es un anticuerpo monoclonal. En un aspecto, un anticuerpo anti-TAT226 es un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un fragmento Fab, Fab ' -SH, Fv, scFv o (Fab' )2- En un aspecto, un anticuerpo anti-TAT226 es un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. En un aspecto, cualquiera de los anticuerpos anti-TAT226 descritos en la presente memoria descriptiva está purificado. En la presente memoria descriptiva se proporcionan anticuerpos monoclonales ejemplares derivados de una librería de fagos, como se describe en el Ejemplo B. El antígeno usado para la detección de la librería era un polipéptido con la secuencia de aminoácidos 1-115 del identificador de secuencia n.°:75, que correspondía a una forma de TAT226 que carecía de los aminoácidos que están en el extremo C-terminal del sitio de unión a GPI putativo. Los anticuerpos que se obtienen de la detección de la librería son YW0.32 e Y 0.49. YW0.49 tenía maduración de afinidad para generar YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 e YWO.49.H6. En las Figuras 11 y 12 se muestran, respectivamente, las alineaciones de las secuencias de los dominios variables de la cadena ligera y pesada de Y 0.32, YW0.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 e YWO.49.H6. En un aspecto, se proporcionan los anticuerpos monoclonales que compiten con YW0.32, YW0.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 o YWO.49.H6 para la unión a TAT226. También se proporcionan anticuerpos monoclonales que se unen al mismo epitopo como YW0.32, YW0.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 o YWO.49.H6. En un aspecto de la invención, se proporcionan polinucleótidos que codifican anticuerpos anti-TAT226. En ciertas formas de realización, se proporcionan vectores que comprenden polinucleótidos que codifican anticuerpos anti-TAT226. En ciertas formas de realización, se proporcionan células huésped que comprenden estos vectores. En otro aspecto de la invención, se proporcionan composiciones que comprenden anticuerpos anti-TAT226 o polinucleót idos que codifican anticuerpos anti-TAT226. En determinadas formas de realización, una composición de la invención es una formulación farmacéutica para el tratamiento de un trastorno de proliferación celular, como los enumerados en la presente memoria descriptiva. A continuación se incluye una descripción detallada de anticuerpos anti-TAT226 ejemplares. 1. Formas de realización específicas de anticuerpos anti-TAT226 En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas entre (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:l ó del identificador de secuencia n.°:4; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:2 o del identificador de secuencia n.°:5; (c) una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el identificador de secuencia n.°:3 y 6-11; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:12; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:13; y (f) una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el identificador de secuencia n.°:14-19. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-TAT226 que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias HVR de VH seleccionadas entre (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:l o identificador de secuencia n . ° : 4 ; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:2 o del identificador de secuencia n.°:5; y (c) una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre identificador de secuencia n.°:3 y 6-11. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-TAT226 que comprende una región HVR-H1 que contiene la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°: l o del identificador de secuencia n.°: 4. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-TAT226 que comprende una región HVR-H2 que contiene la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°: 2 o del identificador de secuencia n.°: 5. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-TAT226 que comprende una región HVR-H3 que contiene la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°: 3 y 6-11. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-TAT226 que comprende una región HVR-H3 que contiene la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°: 9 ó 10. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-TAT226 que comprende una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del identificador de secuencia n.°:3 y 6-11 y una HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del identificador de secuencia n.°:l y del identificador de secuencia n.°:4. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-TAT226 que comprende una región HVR-H3 que contiene la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:6-ll y una HVR-H1 que comprenda el identificador de secuencia n.°:4. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-TAT226 que comprende una región HVR-H3 que contiene el identificador de secuencia n.°:9 ó 10 y una HVR-H1 que comprenda el identificador de secuencia n.°:4. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-TAT226 que comprende una región HVR-H3 que contiene el identificador de secuencia n.°:3 y una HVR-H1 que comprenda el identificador de secuencia n.°:l. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-TAT226 que comprende una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del identificador de secuencia n.°:3 y 6-11 y una HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del identificador de secuencia n.°:2 y del identificador de secuencia n.°:5. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-TAT226 que comprende una región HVR-H3 que contiene la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:6-ll y una HVR-H2 que comprenda el identificador de secuencia n.°:5. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-TAT226 que comprende una región HVR-H3 que contiene el identificador de secuencia n.°:9 ó 10 y una HVR-H2 que comprenda el identificador de secuencia n.°:5. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-TAT226 que comprende una región HVR-H3 que contiene el identificador de secuencia n.°:3 y una HVR-H2 que comprenda el identificador de secuencia n.°:2. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-TAT226 que comprende una HVR-Hl que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:l o del identificador de secuencia n.°:4; una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos del identif icador de secuencia n.°:2 o del identificador de secuencia n.°:5; y una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del identif icador de secuencia n.°:3 y 6-11. En una forma de realización, la HVR-H1 comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n . ° : 4 ; la HVR-H2 comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:5; y la HVR-H3 comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el identif icador de secuencia n.°:6-ll. En una forma de realización, la HVR-H1 comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n . ° : 4 ; la HVR-H2 comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:5; y la HVR-H3 comprende el identificador de secuencia n.°:9 ó 10. En una forma de realización, la HVR-H1 comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n . ° : 1 ; la HVR-H2 comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n . ° : 2 ; y la HVR-H3 comprende la secuencia de aminoácidos deel identificador de secuencia n.°:3. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-TAT226 que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias HVR de VL seleccionadas entre (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:12; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:13; y (c) una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre identificador de secuencia n.°: 14-19. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-TAT226 que comprende una región HVR-L3 que contiene la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°: 14-19. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-TAT226 que comprende una región HVR-L3 que contiene la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°: 17 ó 18. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-TAT226 que comprende (a) una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del identificador de secuencia n.°:3 y 6-11 y (b) una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del identificador de secuencia n.°: 14-19. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-TAT226 que comprende (a) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:3 y (b) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:14. En algunas formas de realización, el anticuerpo anti-TAT226 comprende, además, (a) una HVR-H1 que comprende el identificador de secuencia n.°:l y una HVR-H2 que comprende el identificador de secuencia n.°:2.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-TAT226 que comprende (a) una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del identificador de secuencia n.°:6-ll y (b) una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del identificador de secuencia n.°: 14-19. En algunas formas de realización, la HVR-H3 comprende la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°:9 y la HVR-L3 comprende la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°:17. En algunas formas de realización, la HVR-H3 comprende la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°:10 y la HVR-L3 comprende la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°:18. En algunas formas de realización, el anticuerpo anti-TAT226 comprende, además, una HVR-H1 que comprende el identificador de secuencia n.°:4 y una HVR-H2 que comprende el identificador de secuencia n.°:5. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-TAT226 que comprende (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:l o del identificador de secuencia n . ° : 4 ; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:2 o del identificador de secuencia n.°:5; (c) una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del identificador de secuencia n.°:3 y 6-11; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:12; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:13; y (f) una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del identif icador de secuencia n.°: 14-19. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-TAT226 que comprende (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:l; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n . ° : 2 ; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n . ° : 3 ; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:12; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:13; y (f) una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:14. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-TAT226 que comprende (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:4; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos del ident i ficador de secuencia n.°:5; (c) una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del identificador de secuencia n.°:6-11; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:12; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:13; y (f) una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del ident ificador de secuencia n.°: 14-19. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-TAT226 que comprende (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n . ° : 4 ; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:5; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos del ident ificador de secuencia n.°:9; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:12; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos del ident ificador de secuencia n.°:13; y (f) una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:17.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-TAT226 que comprende (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n . ° : 4 ; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:5; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:10; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:12; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:13; y (f) una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:18. En algunas formas de realización, un anticuerpo anti-TAT226 tiene maduración de afinidad para obtener la afinidad de unión a la diana deseada. En algunas formas de realización, uno o más aminoácidos de un anticuerpo son sustituidos en las posiciones de la HVR siguientes (numeración de Kabat) : H98, H99, H100, H100B, L90, L92, L93, L96 y L97. Por ejemplo, en algunas formas de realización, se pueden realizar una o más de las sustituciones siguientes en cualquier combinación: - en HVR-H3 ( identificador de secuencia n.°:6) : V98I; S99T; R100L o I; GlOObA, S o P - en HVR-L3 ( identificador de secuencia n.°:14): Q90R, K, H o N; Y92V; T93F, N, G o A; P96F; T97I o A Todas las combinaciones posibles de las sustituciones anteriores quedan englobadas por las secuencias de consenso del identificador de secuencia n.°:ll (HVR-H3) y del identificador de secuencia n. ° : 19 (HVR-L3). Un anticuerpo anti-TAT226 puede comprender cualquier secuencia de dominio variable de la estructura adecuada, siempre que el anticuerpo conserve la capacidad de unirse a TAT226. Por ejemplo, en algunas formas de realización, los anticuerpos anti-TAT226 de la invención comprenden una secuencia de consenso de la estructura de la cadena pesada del subgrupo III humano. En una forma de realización de estos anticuerpos, la secuencia de consenso de la estructura de la cadena pesada comprende una o más sustituciones en la posición 71, 73 y/o 78. En una forma de realización de estos anticuerpos, la posición 71 es A, la posición 73 es T y/o la posición 78 es A. En una forma de realización, estos anticuerpos comprenden una secuencia de estructura de dominio variable de la cadena pesada de huMAb4D5-8, por ejemplo, identificador de secuencia n.°:50, 51, 59, 35 (FR1, 2, 3, 4, respectivamente) . huMAb4D5-8 se conoce comercialmente como HERCEPTIN®, Genentech, Inc., South San Francisco, California, EE.UU.; también mencionado en las Patentes de EE.UU. núms . 6.407.213 y 5.821.337 y en Lee et al., J. Mol. Biol . (2004), 340 ( 5 ) : 1073-93. En una de estas formas de realización, estos anticuerpos comprenden, además, una secuencia de consenso de la estructura de la cadena ligera ?? humana. En una de estas formas de realización, estos anticuerpos comprenden una secuencia de estructura de dominio variable de la cadena ligera de huMAb4D5-8. En una forma de realización, un anticuerpo anti-TAT226 comprende un dominio variable de la cadena pesada que incluye una secuencia de estructura y regiones hipervariables , donde la secuencia de estructura comprende las secuencias FR1-FR4 seleccionadas entre las mostradas en las Figuras 5A y 5B; la HVR Hl comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:4; la HVR-H2 comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:5; y la HVR-H3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del identificador de secuencia n.°:6-11. En una forma de realización de estos anticuerpos, la HVR-H3 comprende la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°:9 ó 10. En una forma de realización, un anticuerpo anti-TAT226 comprende un dominio variable de la cadena ligera que incluye una secuencia de estructura y regiones hipervariables, donde la secuencia de estructura comprende las secuencias FR1-FR4 seleccionadas entre las mostradas en las Figuras 6A y 6B; la HVR Ll comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:12; la HVR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos del' identificador de secuencia n. ° : 13; y la HVR-L3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del identificador de secuencia n.°: 14-19. En una forma de realización de estos anticuerpos, la HVR-L3 comprende la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°:17 ó 18. En una forma de realización, un anticuerpo anti-TAT226 comprende un dominio variable de la cadena pesada que incluye una secuencia de estructura y regiones hipervariables, donde la secuencia de estructura comprende las secuencias FR1-FR4 del identificador de secuencia n.°:50, 51, 59 y 35, como se muestra en la Figura 7; la HVR Hl comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n . ° : 4 ; la HVR-H2 comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:5; y la HVR-H3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del ident ificador de secuencia n.°:6-ll. En una forma de realización de estos anticuerpos, la HVR-H3 comprende la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°:9 ó 10. En una forma de realización, un anticuerpo anti-TAT226 comprende un dominio variable de la cadena ligera que incluye una secuencia de estructura y regiones hipervariables, donde la secuencia de estructura comprende las secuencias FR1-FR4 del identificador de secuencia n.°:60, 61, 62 y 63, como se muestra en las Figuras 6A y 6B; la HVR Ll comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:12; la HVR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:13; y la HVR-L3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del identificador de secuencia n.°: 14-19. En una forma de realización de estos anticuerpos, la HVR-L3 comprende la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n.°:17 ó 18. En una forma de realización, un anticuerpo anti-TAT226 comprende un dominio variable de la cadena pesada que incluye una secuencia de estructura y regiones hipervariables, donde la secuencia de estructura comprende las secuencias FR1-FR4 del identificador de secuencia n.°:50, 51, 53 y 35, como se muestra en la Figura 8; la HVR Hl comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n . ° : ; la HVR-H2 comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n . ° : 5 ; y la HVR-H3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del identificador de secuencia n.°:6-ll. En una forma de realización de estos anticuerpos, la HVR-H3 comprende la secuencia de aminoácidos de identificador de secuencia n . ° : 9 ó 10. En una forma de realización, un anticuerpo anti-TAT226 comprende un dominio variable de la cadena ligera que incluye una secuencia de estructura y regiones hipervariables , donde la secuencia de estructura comprende las secuencias FR1-FR4 del identificador de secuencia n.°:60, 61, 62 y 74, como se muestra en la Figura 8; la HVR Ll comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:12; la HVR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:13; y la HVR-L3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del identificador de secuencia n.°:14-19. En una forma de realización de estos anticuerpos, la HVR-L3 comprende la secuencia de aminoácidos de j dentificador de secuencia n.°:17 ó 18. En algunas formas de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-TAT226 que comprende un dominio variable de la cadena pesada que contiene una secuencia de aminoácidos con al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identificación de la secuencia con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del identificador de secuencia n.°:20-25. En algunas formas de realización, una secuencia de aminoácidos con al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identificación de la secuencia contiene sustituciones, inserciones o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo que comprende esa secuencia de aminoácidos conserva la capacidad de unión a TAT226. En algunas formas de realización, un total de 1 a 10 aminoácidos han sido sustituidos, insertados o eliminados en una secuencia seleccionada a partir del identificador de secuencia n.°: 20-25. En algunas formas de realización, las sustituciones, inserciones o eliminaciones se producen en regiones situadas fuera de las HVR (es decir, en las FR) . En algunas formas de realización, un anticuerpo anti-TAT226 comprende un dominio variable de la cadena pesada que contiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del identificador de secuencia n.°:20-25. En algunas formas de realización, la invención proporcina un anticuerpo anti-TAT226 que comprende un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo humanizado 4D5 (huMAb4D5-8) (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., South San Francisco, California, EE.UU) (al que también se hace referencia en la Patente de EE.UU. n.° 6.407.213 y en Lee et al., J. Mol. Biol. (2004) , 340 ( 5 ) : 1073-93 ) como se muestra en el identificador de secuencia n.°: 31 más adelante. 1 Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 108 ( identificador de secuencia n.°:31) (los residuos de la HVR aparecen subrayados) En algunas formas de realización, la secuencia del dominio variable de la cadena ligera de huMAb4D5-8 se modifica en una o más las posiciones 30, 66 y 91 (Asn, Arg y His, como se ha indicado en negrita/cursiva antes, respectivamente) . En una forma de realización, la secuencia huMAb4D5-8 modificada comprende Ser en la posición 30, Gly en la posición 66 y/o Ser en la posición 91. Según esto, en una forma de realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio variable de la cadena ligera, que comprende la secuencia mostrada en el identificador de secuencia n.°: 26 a continuación : 1 Asp lie Gln et Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 108 ( identificador de secuencia n.°: 26) (los residuos de la HVR aparecen subrayados) Los residuos sustituidos con respecto a huMAb4D5-8 aparecen en negrita/cursiva arriba. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-TAT226 que comprende un dominio variable de la cadena ligera que contiene una secuencia de aminoácidos con al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identificación de la secuencia con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del identificador de secuencia n.°:26-31. En algunas formas de realización, una secuencia de aminoácidos con al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identificación de la secuencia contiene sustituciones, adiciones o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo que comprende esa secuencia de aminoácidos conserva la capacidad de unión a ???226. En algunas formas de realización, un total de 1 a 10 aminoácidos han sido sustituidos, insertados o eliminados en una secuencia seleccionada a partir del identificador de secuencia n.°:26-31. En algunas formas de realización, las sustituciones, inserciones o eliminaciones se producen en regiones situadas fuera de las HVR (es decir, en las FR) . En algunas formas de realización, un anticuerpo anti-TAT226 comprende un dominio variable de la cadena ligera que contiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del identificador de secuencia n.°:26-31. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-TAT226 que comprende (a) un dominio variable de la cadena pesada que contiene una secuencia de aminoácidos con al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identificación de la secuencia con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del identificador de secuencia n.°:20-25; y (b) un dominio variable de la cadena ligera que contiene una secuencia de aminoácidos con al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identificación de la secuencia con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del identificador de secuencia n.°: 26-31. En algunas formas de realización, una secuencia de aminoácidos con al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identificación de la secuencia contiene sustituciones, adiciones o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo que comprende esa secuencia de aminoácidos conserva la capacidad de unión a TAT226. En algunas formas de realización, un total de 1 a 10 aminoácidos han sido sustituidos, insertados o eliminados en la secuencia de referencia. En algunas formas de realización, las sustituciones, inserciones o eliminaciones se producen en regiones situadas fuera de las HVR (es decir, en las FR ) . En algunas formas de realización, un anticuerpo anti-TAT22 6 comprende un dominio variable de la cadena pesada que contiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del identificador de secuencia n.°: 20-25 y un dominio variable de la cadena ligera que contiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del identificador de secuencia n.°:26-31. En algunas formas de realización, un anticuerpo anti-TAT226 comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:20, y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:26. En algunas formas de realización, un anticuerpo anti-TAT226 comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:21, y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:26. En algunas formas de realización, un anticuerpo anti-TAT226 comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:22, y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:27. En algunas formas de realización, un anticuerpo anti-TAT226 comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:23, y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:28. En algunas formas de realización, un anticuerpo ant-i-TAT226 comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:24, y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:29. En algunas formas de realización, un anticuerpo anti-TAT226 comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n.°:25, y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del identificador de secuencia n. ° : 30. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-TAT226 que comprende (a) una, dos o tres HVR de VH seleccionadas a partir de las mostradas en las Figuras 2 y 4 y/o (b) una, dos o tres HVR de VL seleccionaas a partir de las mostradas en. las Figuras 3 y 4. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-TAT226 que comprende un dominio variable de la cadena pesada seleccionado entre los mostrados en las Figuras 9 y 11 y un dominio variable de la cadena ligera seleccionado entre los mostrados en las Figuras 10 y 12. 2. Fragmentos de anticuerpos La presente invención engloba fragmentos de anticuerpos. Los fragmentos de anticuerpos se pueden generar por métodos tradicionales, como digestión enzimática, o mediante técnicas recombinantes . En determinadas circunstancias, existen ventajas en el uso de fragmentos de anticuerpos, en vez de anticuerpos completos. El menor tamaño de los fragmentos permite una rápida eliminación y puede llevar a un mejor acceso a tumores sólidos. Para una revisión de determinados fragmentos de anticuerpos, véase Hudsor. et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134. Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente , estos fragmentos se obtenían mediante digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, orimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); y Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos ahora pueden producirse directamente en células huésped recombinantes. Los fragmentos de anticuerpos Fab, Fv y ScFv pueden expresarse todos en E. coli y secretarse a partir de E. coli, lo que permite la fácil producción de grandes cantidades de estos fragmentos.
Los fragmentos de anticuerpos se pueden aislar de las librerías de fagos descritas anteriormente. Como alternativa, los fragmentos Fab' -SH pueden recuperarse directamente de E. coli y unirse químicamente para formar fragmentos F(ab' ) 2 (Cárter y col., Bio/Technology 10:163-167 (1992) ) . Según otro método, los fragmentos F(ab')2 se pueden aislar directamente de los cultivos de células huésped recombinantes . El fragmento Fab y F(ab')2 con mayor semivida in vivo que comprende residuos de un epítopo de unión a receptor de rescate se describe en la patente de Estados Unidos n.° 5.869.046. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán conocidas por el médico cualificado. En determinadas formas de realización, un anticuerpo es un fragmento Fv de cadena única (scFv) . Véase el documento WO 93/16185; la Patente de EE.UU. n.° 5.571.894 y la Patente de EE.UU. n ° 5.587.458. Fv y scFv son las únicas especies con puntos de combinación intactos que están privados de regiones constantes; por ello, pueden ser aptos para una unión no específica reducida durante el uso in vivo. Las proteínas de fusión scFv se pueden construir para obtener la fusión de una proteína efectora en el extremo carboxi terminal o amino terminal de un scFv. Véase Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, citado anteriormente. El fragmento de anticuerpo puede ser también un "anticuerpo lineal", por ejemplo, tal y como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 5.641.870. Estos anticuerpos lineales pueden ser monoespecificos o biespecificos . 3. Anticuerpos humanizados La presente invención engloba anticuerpos humanizados. Son diversos los procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos que están descritos en la materia. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado puede tener uno o más residuos de aminoácidos introducido en el mismo desde una fuente que es no humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos se conocen a menudo como residuos "importados", que generalmente se toman de un dominio variable de "importación". La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el método de Winter y sus colaboradores (Jones et al., (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536), sustituyendo las secuencias de la región hipervariable por las secuencias pertinentes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente de EE.UU. n.° 4.816.567) en los que se ha sustituido sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son generalmente anticuerpos humanos en que algunos residuos de la región hipervariable y posiblemente algunos residuos FR se sustituyen por residuos de puntos análogos de anticuerpos de roedores. La elección de los dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, para realizar los anticuerpos humanizados puede ser muy importante para disminuir la antigenicidad . De acuerdo con el procedimiento llamado "la más apta", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de un roedor se coteja con toda la librería de secuencias conocidas de dominios variables humanos. La secuencia humana que se parece más a la del roedor se acepta, entonces, como la estructura humana para el anticuerpo humanizado (Sims et al. (1993) J. Immunol. 151:2296; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901. Otro procedimiento utiliza una estructura concreta derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo en particular de cadenas ligeras o pesadas. Esta misma estructura se puede usar para varios anticuerpos humanizados diferentes (Cárter et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:4285; Presta et al. (1993) J. Immunol., 151:2623.
Es deseable también, por lo general, que los anticuerpos se humanicen con retención de alta afinidad con el antigeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, siguiendo uno de los procedimientos, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y varios productos humanizados conceptuales que utilizan modelos tridimensionales de las secuencias parentales y las humanizadas. Los modelos tridimensionales de la inmunoglobulina se encuentran generalmente disponibles y son conocidos por los expertos en la materia. También se encuentran disponibles algunos programas informáticos que ilustran y muestran posibles estructuras conformacionales tridimensionales de las secuencias de inmunoglobulinas candidatas seleccionadas. La inspección de estas visualizaciones posibilita el análisis de la posible función de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de aquellos residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antigeno. De esta manera, los residuos de FR se pueden seleccionar y combinar a partir de las secuencias receptoras y de importación para lograr la característica deseada del anticuerpo, como por ejemplo, una mayor afinidad para el antigeno o los antigenos diana. En general, los residuos de la región hipervariable influyen directamente y en mayor medida en la unión al antigeno. 4. Anticuerpos humanos Los anticuerpos humanos anti-TAT226 de la invención se pueden construir combinando una o más secuencias de dominio variable Fv de clones seleccionadas de librerías de representación en imágenes de fagos derivados de humanos con una o más secuencias de domino constante humanas, como se ha descrito anteriormente. Alternativamente, los anticuerpos humanos monoclonales anti-TAT226 de la invención se pueden producir por el procedimiento del hibridoma. Las estirpes celulares del mieloma humano y del heteromieloma humano-murino para la producción de anticuerpos monoclonales humanos se han descrito, por ejemplo, en Kozbor J. Immunol . , 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987) ; y Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991) . Actualmente es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que sean capaces, una vez inmunizados, de generar un repertorio completo de anticuerpos humanos cuando no se produzca inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la eliminación homocigótica del gen de la cadena pesada del anticuerpo que se une al gen de la región (JH) en ratones con mutaciones quiméricas y en lineas germinales ocasiona la completa inhibición de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia del grupo de genes de la inmunoglobulina de la linea germinal humana en dichos ratones mutantes generará la producción de anticuerpos humanos frente a la exposición al antigeno. Véase, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993) ; Bruggermann et al., Year in Immunol . , 7: 33 (1993) . También se puede utilizar la transposición de genes para derivar anticuerpos humanos de no humanos, por ejemplo, anticuerpos de roedores, en los que el anticuerpo humano tiene afinidades y especificidades similares al anticuerpo no humano de inicio. Según este método, que también se denomina "impronta de epitopos", la región variable de cadena pesada o ligera de un fragmento de anticuerpo no humano obtenido mediante técnicas de representación en imágenes de fagos como las descritas en la presente memoria descriptiva se sustituye por un repertorio de genes de dominio V humanos, lo que crea una población de quimeras Fab o scFv de cadena humana/cadena no humana. La selección con el antigeno da lugar al aislamiento de un Fab o scFV quimérico de cadena humana/cadena no humana, en el que la cadena humana restaura el sitio de unión a antigeno destruido al eliminar la cadena no humana correspondiente del clon de la representación del fago primario; es decir, el epitopo rige (sella) la elección de la molécula de la cadena humana. Cuando se repite el proceso para sustituir la cadena no humana restante, se obtiene un anticuerpo humano (véase PCT WO 93/06213 publicado el 1 de abril de 1993). A diferencia de la tradicional humanización de anticuerpos no humanos mediante transplante de CDR, esta técnica proporciona anticuerpos completamente humanos que no tienen residuos FR o CDR de origen no humano.
. Anticuerpos biespecificos Los anticuerpos biespecificos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión con al menos dos antigenos diferentes. En algunas realizaciones, los anticuerpos biespecificos son anticuerpos humanos o humanizados. En determinadas formas de realización, una de las especificidades de unión corresponde a TAT226 y la otra, a cualquier otro antigeno. En determinadas formas de realización, los anticuerpos biespecificos se pueden unir a dos epitopos diferentes de TAT226. Los anticuerpos biespecificos también se pueden utilizar para localizar agentes citotóxicos de las células que expresan el TAT226. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión a TAT226 y un brazo que se une a un agente citotóxico, por ejemplo, saporin, anti-interferón- a, alcaloide de la vinca, cadena A de ricino, metotrexato o hapteno con un isótopo radiactivo. Los anticuerpos biespecificos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, los anticuerpos biespecificos F(ab' )2) . Los procedimientos para realizar anticuerpos biespecificos son conocidos en la materia. La producción recombinante tradicional de anticuerpos biespecificos se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina , en los que las dos cadenas tienen distintas especificidades (Milstein y Cuello, Nature, 305: 537 (1983)). Debido a la variedad aleatoria de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas diferentes de anticuerpos, de las cuales sólo una posee la estructura biespecifica correcta. La purificación de la molécula correcta, que generalmente se realiza mediante etapas de cromatografía de afinidad, es bastante complicada, y la cantidad de producto que se obtiene es baja. Se describen procedimientos similares en el documento O 93/08829, publicado el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker et al., EMBO J. , 10: 3655 (1991) . Según una técnica distinta, los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (puntos de combinación anticuerpo-antigeno) se fusionan con las secuencias de domino constante de inmunoglobulina . La fusión es, por ejemplo, con un dominio constante de cadena pesada de la inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. En algunas realizaciones, la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contengan el lugar necesario para la unión de la cadena ligera está presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, de la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se co-transfectan a un organismo huésped adecuado. Esto proporciona una gran flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipeptidicos en realizaciones en las que las proporciones desiguales de las tres cadenas de polipéptidos utilizadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias de codificación de dos o de las tres cadenas de polipéptidos en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos de estas cadenas de polipéptidos con proporciones iguales da como resultado rendimientos altos o cuando las proporciones no tienen particular importancia. En una forma de realización de este método, los anticuerpos biespecificos están compuestos por una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se observó que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de cadena de inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en sólo una de las mitades de la molécula biespecífica proporciona un método de fácil separación. Este método se describe en el documento O 94/04690. Para obtener mayores detalles sobre la generación de anticuerpos biespecificos, véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986). Según otro método, la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpos se puede modificar para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan de un cultivo celular recombinante . La interfaz comprende al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante del anticuerpo.
En este procedimiento, una o más cadenas laterales cortas de aminoácidos de la interfaz de la primera molécula del anticuerpo se reemplazan por cadenas laterales más largas (por ejemplo, tirosina o triptófano) . Las "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la(s) cadena (s) lateral (es) larga (s) se crean en la interfaz de la segunda molécula del anticuerpo al reemplazar las cadenas laterales o largas de aminoácidos por cadenas más cortas (por ejemplo, alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodimero sobre los productos finales no deseados, tales como los homodimeros.
Los anticuerpos biespecificos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconj ugados" . Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconj ugado se puede unir a la avidina; el otro, a la biotina. Estos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para conseguir que las células del sistema inmunitario actúen sobre células no deseadas (patente de EE.UU. n.° 4.676.980) y para el tratamiento de la infección de VIH (documentos WO 91/00360 y WO 92/00373 y la patente europea EP 03089). Los anticuerpos heteroconj ugados pueden obtenerse utilizando cualquier procedimiento reticulante conveniente. Los agentes reticulantes adecuados se conocen bien en la materia y se describen en la patente de EE.UU. n.° 4.676.980, junto con una serie de técnicas de reticulación. Las técnicas para generar anticuerpos biespecificos a partir de fragmentos de anticuerpos también se han descrito en la bibliografía. Por ejemplo, los anticuerpos biespecificos pueden prepararse utilizando una unión química. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) describe un procedimiento en el que los anticuerpos intactos se escinden proteolíticamente para generar fragmentos F(ab' ) 2- Estos fragmentos se reducen en la presencia de arsenito de sodio del agente que forma complejos con ditiol para estabilizar los ditioles vecinales y evitar la formación de disulfuros intermoleculares. Los fragmentos Fab' generados se convierten entonces en derivados del tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados Fab' -TNB se reconvierte entonces en Fab' -tiol mediante la reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar de otro derivado Fab' -TNB para formar un anticuerpo biespecifico . Los anticuerpos biespecificos producidos pueden utilizarse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas. Los avances recientes han facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab' -SH de E. coli, que se pueden unir químicamente para formar anticuerpos biespecificos . Shalaby et al., J. Exp. Med. , 175: 217-225 (1992) describen la producción de una molécula de anticuerpo biespecífico F(ab' ) 2 completamente humanizado. Cada uno de los fragmentos Fab' se secretó por separado a partir de E. coli y se sometió a unión química dirigida in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. Por lo tanto, el anticuerpo biespecífico formado era capaz de unirse a células que sobreexpresaban el receptor HER2 y las células T humanas normales, así como desencadenar la actividad lítica de los linfocitos citotóxicos humanos contra dianas de tumor de mama humano. También se han descrito diversas técnicas para fabricar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecificos directamente de cultivos celulares recombinantes . Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecificos utilizando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol . , 148 (5) : 1547-1553 (1992) . Los péptidos con cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los homodímeros del anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y después se reoxidaron para formar los heterodímeros del anticuerpo. Este procedimiento también puede utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpos. La tecnología "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para la fabricación de fragmentos de anticuerpos biespecífieos . Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) mediante un enlazador que es demasiado corto como para permitir el apareamiento entre los dos dominios de la misma cadena. Por consiguiente, los dominios VH y VL de un fragmento se ven obligados a aparearse con los dominios complementarios VL y VH de otro fragmento, formando, por lo tanto, dos lugares de unión a antígeno. También se ha informado de otra estrategia para fabricar fragmentos de anticuerpos biespecífieos mediante la utilización de dímeros Fv de cadena única (sFv) . Véase Gruber et al. , J. Immunol., 152:5368 (1994) . Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecífieos . Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991) . 6. Anticuerpos ultivalentes Un anticuerpo multivalente puede internalizarse (y/o catabolizarse) más rápidamente que un anticuerpo bivalente por medio de una célula que exprese un antigeno al que se unen los anticuerpos. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos multivalentes (que son los que no pertenecen a la clase IgM) con tres o más sitios de unión al antigeno (por ejemplo, anticuerpos tetravalentes), que pueden producirse fácilmente mediante expresión recombinante del ácido nucleico que codifica las cadenas de polipéptidos del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerización y tres o más sitios de unión al antigeno. En ciertas formas de realización, el dominio de dimerización comprende una región Fe o una región bisagra o consiste en ellas. En esta situación, el anticuerpo comprenderá una región Fe y tres o más sitios de unión al antigeno amino-terminal a la región Fe. En determinadas formas realización, un anticuerpo multivalente comprende entre tres y unos ocho sitios de unión a antigeno, o está formado por ellos. En una de estas formas de realización, un anticuerpo multivalente comprende cuatro sitios de unión a antigeno o está formado por ellos. El anticuerpo multivalente comprende al menos una cadena de polipéptidos (por ejemplo, dos cadenas de polipéptidos) en la que la cadena o cadenas de polipéptidos comprenden dos o más dominios variables. Por ejemplo, la cadena o las cadenas de polipéptidos pueden comprender VD1- (XI ) n-VD2- (X2 ) n-Fc, en la que VD1 es un primer dominio de variable, VD2 es un segundo dominio de variable, Fe es una cadena de polipéptidos de una región Fe, XI y X2 representan una aminoácido o polipéptido y n es 0 ó 1. Por ejemplo, la cadena o las cadenas de polipéptidos pueden comprender: VH-CHl-enlazador flexible-VH-CH1- cadena de la región FC o VH-CHl-VH-CHl-cadena de la región Fe. El anticuerpo multivalente de la presente memoria descriptiva puede comprender, además, preferentemente, al menos dos (por ejemplo, cuatro) polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. El anticuerpo multivalente de la presente memoria descriptiva, por ejemplo, puede comprender entre dos y cuatro polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. Los polipéptidos de dominio variable de cadena ligera considerados en la presente memoria descriptiva comprenden un dominio variable de cadena ligera y, opcionalmente, un dominio CL. 7. Anticuerpos de dominio único En algunas formas de realización, un anticuerpo de la invención es un anticuerpo de dominio único. Un anticuerpo de dominio único es una cádena polipeptidica única que comprende la totalidad o parte del dominio variable de la cadena pesada o la totalidad o parte del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo. En algunas formas de realización, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo humano de dominio único (Domantis, Inc., Waltham, A; véase, por ejemplo, Patente de EE.UU. 6.248.516 Bl) . En una forma de realización, un anticuerpo de dominio único está formado por la totalidad o parte del dominio variable de la cadena pesada de un anticuerpo. 8. Variantes de anticuerpos En algunas realizaciones, se contemplan la(s) modificación (es) de la secuencia de aminoácidos descrita (s) en la presente memoria. Por ejemplo, se puede querer mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo se pueden preparar mediante la introduccción de cambios adecuados en la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo, o mediante síntesis del péptido. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, eliminaciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo y/o inserciones en esos residuos y/o sustituciones de los mismos. Cualquier combinación de eliminación, inserción y sustitución se puede realizar para llegar a la construcción final, siempre que ésta posea las características deseadas. Las alteraciones aminoacídicas pueden ser introducidas en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo del sujeto en el momento en que se realiza la secuencia. Un método útil para la identificación de determinados residuos o regiones del anticuerpo que son ubicaciones preferidas para la mutagenia se denomina "mutagenia de barrido de alanina", tal como se describe en Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085. En la presente memoria descriptiva, se identifica un residuo o grupo de residuos de dianas (por ejemplo, residuos cargados como arg, asp, his, lys y glu) y se sustituyen por un aminoácido con carga negativa o neutral (alanina o polialanina) para afectar a la interacción de los aminoácidos con el antígeno. Estas ubicaciones de los aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan entonces introduciendo más variantes en los puntos de sustitución o para estos puntos, u otras variantes distintas. Por lo tanto, a pesar de que el sitio en el que introducir una variación de una secuencia de aminoácidos esté predeterminado, no es necesario que la naturaleza de la mutación por si misma tenga un carácter predeterminado. Por ejemplo, para analizar el rendimiento de una mutación en un lugar dado, se realiza el barrido de alanina o mutagénesis aleatoria en el codón o región diana y las inmunoglobulinas expresadas se monitorizan para detectar la actividad deseada. Las inserciones en las secuencia de aminoácidos incluyen fusiones en los extremos amino y/o carboxi terminal que varían en longitud desde un simple residuo hasta polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones dentro de la secuencia de uno o múltiples residuos de aminoácidos. Entre los ejemplos de inserciones en los extremos terminal se encuenta un anticuerpo con un residuo metionil en el extremo N-terminal. Otras variantes de inserción de la molécula del anticuerpo incluyen la fusión del extremo N o C terminal del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que aumente la semivida sérica del anticuerpo. . En determinadas formas de realización, un anticuerpo de la invención se altera para aumentar o reducir la glicosilación del anticuerpo. La glicosilación de los polipéptidos se realiza generalmente por enlace N u O. El enlace N se refiere a la unión de una fracción de carbohidratos a la cadena lateral de un residuo de asparraguina . Las secuencias de tripéptidos asparraguina-X-serina y asparraguina-X-treonina , donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la porción de carbohidratos a la cadena lateral de la asparraguina . Por lo tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptidos en un polipéptido crea un punto de glicosilación potencial. La glicosilación por enlace 0 se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina , galactosa o xilosa a un ácido hidroxiamino , más comúnmente serina o treonina, a pesar de que también se puede utilizar 5-hidroxiprolina y 5-hidroxilisina. La adición o eliminación de sitios de glicosilación al anticuerpo se logra cómodamente al alterar la secuencia del aminoácido para que se cree o elimine una o más de las secuencias de tripéptidos descritas anteriormente (para sitios de glicosilación unidos por enlace tipo N) . La alteración también se puede realizar mediante la adición de uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilación unidos por enlace tipo 0) , o la eliminación de estos residuos o su sustitución . Cuando el anticuerpo comprende una región Fe, se puede alterar el carbohidrato unido al mismo. Por ejemplo, los anticuerpos con una estructura de carbohidratos madura que carece de fucosa unida a una región Fe del anticuerpo se describen en la Solicitud de Patente de EE.UU. n.° 2003/0157108 (Presta, L . ) . Véase también US 2004/0093621 (Kyo a Hakko Kogyo Co . , Ltd) . Los anticuerpos con una N-acetilglucosamina (GlcNAc) bisectriz en el carbohidrato unido a una región Fe del anticuerpo se describen en el documento WO 2003/011878, Jean-Mairet et al. y en la Patente de Estados Unidos n.° 6.602.684, Umana et al. Los anticuerpos con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido unido a una región Fe del anticuerpo se describen en el documento WO 1997/30087, Patel et al. Véanse, también, los documentos WO 1998/58964 (Raju, S.) y WO 1999/22764 (Raju, S.) con respecto a los anticuerpos con carbohidratos alterados unidos a la región Fe de los mismos. Véase también US 2005/0123546 (Umana et al.) sobre moléculas de unión a antigeno con glicosilación modificada . En determinadas formas de realización, una variante de glicosilación comprende una región Fe, en la que una estructura de carbohidratos anexa a la región Fe carece de fucosa. Estas variantes han mejorado la función de la ADCC . Opcionalmente, la región Fe también comprende una o más sustituciones de aminoácidos en la misma que mejora aún más la ADCC; por ejemplo, sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fe (numeración Eu de residuos) . Entre las publicaciones relacionadas con anticuerpos "defucosilados" o "con déficit de fucosa" podríamos citar: US 2003/0157108; O 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004) ; Yamane-Ohnuki et al. Bíotech. Bioeng. 87: 614 (2004) . Entre los ejemplos de líneas celulares que producen anticuerpos defucosilados encontraríamos las células Lecl3 CHO con déficit de fucosilación de proteínas (Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys . 249:533-545 (1986); la Solicitud de Patente de EE.UU. n.° US 2003/0157108 Al, Presta, L y el documento WO 2004/056312 Al, Adams et al., especialmente el ejemplo 11) y las líneas celulares con eliminación de un gen, como el gen alfa-1, 6-fucosiltransferasa , FUT8 y células CHO con eliminación de un gen (Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)) . Otra clase de variante es una variante de sustitución de un aminoácido. Estas variantes sustituyen al menos un residuo de aminoácidos en la molécula del anticuerpo por un residuo diferente. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis por sustitución incluyen las regiones hipervariables , pero también se contemplan las alteraciones FR. Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1 en el titulo "sustituciones preferentes". Si dichas sustituciones ocasionan un cambio deseable en la actividad biológica, entonces los productos se pueden examinar y se pueden introducir cambios más sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares" en la Tabla 1, o como se describe con más detalle a continuación con referencia a las clases de aminoácidos .
TABLA 1 Las modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo se logran seleccionando sustituciones que difieran significativamente en su efecto de mantener (a) la estructura de la columna vertebral del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación plana o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el residuo de la cadena lateral. Los aminoácidos pueden agruparse conforme a las similitudes de las propiedades de sus cadenas laterales (en A. L. Lehninger, Biochemistry, segunda edición., pp . 73-75, Worth Publishers, Nueva York (1975) ) : (1) no polares: Ala (A), Val (V), Leu (L) , lie (I), Pro (P), Phe ( F) , Trp (W) , Met (M) (2) polares no cargados: Gly (G) , Ser (S) , Thr (T) , Cys (C) , Tyr (Y) , Asn (N) , Gln (Q) (3) ácidos: Asp ( D) , Glu (E) (4) básicos: Lys (K) , Arg (R) , His (H) Alternativamente, los residuos que se obtienen naturalmente pueden dividirse en grupos en función de las propiedades comunes de las cadenas laterales: (1) hidrófobos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; (2) hidrófilos neutrales: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácidos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) residuos que tienen influencia en la orientación de la cadena: Gly, Pro; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe. Las sustituciones no conservadoras supondrán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase. Estos residuos sustituidos también se pueden introducir en sitios de sustitución conservadora o en los sitios restantes (no conservados). Un tipo de variante de sustitución implica sustituir uno o más residuos de región hipervariable de un anticuerpo parental (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano) . Por lo general, la(s) variante (s) resultante ( s ) seleccionada ( s ) para profundizar en su desarrollo tendrá (n) propiedades biológicas modificadas (es decir, mejoradas) con relación al anticuerpo parental desde el cual se generó (generaron) . Una manera conveniente de generar dichas variantes de sustitución supone la maduración de afinidad utilizando una representación en imágenes de fagos. De manera resumida, varios sitios de regiones hipervariables (por ejemplo, 6-7 sitios) se mutan para generar todas las sustituciones posibles de aminoácidos en cada sitio. Los anticuerpos asi generados se representan a partir de partículas de fagos filamentosos como fusiones a, al menos, parte de una proteína de revestimiento de fagos (por ejemplo, con el producto del gen III de M13 que hay dentro de cada partícula. Las variantes representadas en imágenes de fagos se examinan entonces para detectar su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) . Para identificar los lugares de la región hipervariable candidatos para la modificación, se puede realizar mutagenia mediante barridos (por ejemplo, barridos de alanina para identificar residuos de la región hipervariable que contribuyan significativamente a la unión del antígeno. Como alternativa, o adicionalmente , puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo antigeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antigeno. Dichos residuos de contacto y los residuos adyacentes son candidatos a la sustitución de acuerdo con las técnicas conocidas en el sector, incluidas las explicadas en la presente memoria descriptiva. Una vez generadas dichas variantes, el panel de variantes está sujeto a examen utilizando técnicas conocidas en el sector, incluidas las descritas en la presente memoria descriptiva, y los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos pertinentes se pueden seleccionar para profundizar en su desarrollo. Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican las variantes de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo se preparan mediante una variedad de procedimientos conocidos en el sector. Estos procedimientos incluyen aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de la secuencia de los aminoácidos que se produzcan naturalmente) o preparación por mutagénesis mediada por oligonucleótido (o dirigida al sitio) , mutagénesis dirigida mediante PCR y mutagénesis por inserción de un cásete de una variante preparada anteriormente o de una versión no variante del anticuerpo.
Puede ser deseable introducir una o más modificaciones en los aminoácidos en la región Fe de anticuerpos de la invención, lo que genera una variante de la región Fe. La variante de la región Fe puede comprender una secuencia de la región Fe humana (por ejemplo, una región Fe de IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4 humanas) que contenga una modificación de aminoácidos (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones de aminoácidos, incluida la de la cisteina bisagra . Según esta descripción y los conocimientos del sector, se contempla que en algunas realizaciones un anticuerpo de la invención pueda comprender una o más alteraciones, frente a su anticuerpo homólogo de tipo natural, por ejemplo, en la región Fe. Estos anticuerpos conservarían, no obstante, las mismas características necesarias para uso terapéutico, frente a su homólogo de tipo natural. Por ejemplo, se cree que se pueden realizar algunas alteraciones en la región Fe que daría como resultado la unión Clq alterada y/o en Citotoxicidad Dependiente de Complementos (CDC) , por ejemplo, como se describe en 099/51642. Véase también Duncan & Winter Nature 322:738-40 (1988); Patente de EE.UU. n.° 5.648.260; Patente de EE.UU. 5.624.821; y 094/29351 que tratan otro ejemplos de variantes de regiones Fe. Los documentos WO00/42072 (Presta) y WO 2004/056312 (Lowman) describen variantes de anticuerpos con capacidad de unión a los FcR mejorados o disminuidos. El contenido de estas publicaciones de patentes se incorpora específicamente en la presente memoria descriptiva a modo de referencia. Véase, además, Shields et al., J. Biol. Chem., 9(2) : 6591-6604 (2001) . Los anticuerpos con un aumento de su semivida y una unión mejorada al receptor neonatal Fe (FcRn), que es responsable de la transmisión de las IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), se describen en US2005/0014934A1 (Hinton et al.) . Estos anticuerpos comprenden una región Fe con una o más sustituciones en la zona que mejoran la unión de la región Fe al FcRn. Las variantes polipept ídicas con secuencias aminoacídicas de la región Fe alteradas y capacidad aumentada o disminuida de unión a Cql se describen en la Patente de EE.UU. n.° 6.194.551B1 y el documento W099/51642. El contenido de dichas publicaciones de patentes se incorpora específicamente en la presente memoria descriptiva a modo de referencia. Véase, además, Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000) . En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos que comprenden modificaciones en la interfaz de polipéptidos Fe que comprenden la región Fe, donde las modificaciones facilitan y/o fomentan heterodimerización . Estas modificaciones comprenden la introducción de una protuberancia en un primer polipéptido Fe y una cavidad en un segundo polipéptido Fe, donde la protuberancia se puede posicionar en la cavidad para que fomente la acomple ación del primer y segundo polipéptidos Fe. Los métodos de generación de anticuerpos con estas modificaciones se conocen en esta especialidad, por ejemplo, los descritos en la Patente de EE.UU. n.° 5.731.168. 9. Derivados del anticuerpo Los anticuerpos de la invención pueden modificarse aún más a fin de que contengan fracciones no proteicas adicionales que son conocidas en el sector y se encuentran disponibles. Preferiblemente, las fracciones adecuadas para la derivatización del anticuerpo son polímeros solubles en agua. Ejemplos no limitantes de los polímeros solubles en agua incluyen los siguientes componentes: poliet ilenglicol (PEG), copolímero de etilenglicol / propilenglicol , carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinilo, polivinilpirrolidona, poli-1 , 3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero anhídrido etileno/maleico, poliaminoácidos (ya sean homopolimeros o copolímeros aleatorios), y dextrano o poli (n-vinilpirrolidona) polietilenglicol , homopolimeros de propropilenglicol , copolímeros de oxido de prolipropileno/oxido de etileno, polialcoholes polioxietilados (por ej . glicerol), alcohol polivinilo, y mezclas de los mismos. Es posibleJ que el polietilenglicol propionaldehído ofrezca ventajas en la elaboración, dada su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede ser ramificado o no. La cantidad de polímetros adheridos al anticuerpo puede variar y, si se une más de un polímero, los polímeros pueden ser las mismas o diferentes moléculas. Generalmente, la cantidad y/o tipo de polímeros utilizados para la derivatización pueden determinarse en función de ciertas consideraciones, como las propiedades o funciones particulares del anticuerpo que se desea mejorar, si el anticuerpo derivatizado va a ser utilizado en un tratamiento en condiciones definidas, etc. En otra forma de realización, se proporcionan los conjugados del anticuerpo y la fracción no proteica que puede calentarse selectivamente mediante la exposición a radiación. En una forma de realización, la fracción no proteica es un nanotubo de carbono (Kam et al., Proc . Nati. Acad. Sci . 102: 11600-11605 (2005)). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda, e incluye una longitud de onda que no dañe las células comunes, pero que caliente las fracciones no proteicas hasta una temperatura en la cual se eliminen las células próximas a las fracciones no proteicas del anticuerpo .
B. Algunos métodos de elaboración de anticuerpos I . Algunos métodos de hibridoma Pueden conseguirse los anticuerpos monoclonales anti-TAT226 de la invención por el método del hibridoma, descrito por primera vez en Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o con el método del ADN recombinante (Patente de Estados Unidos n. ° 4.816.567) . En el método del hibridoma, un ratón u otro animal huésped apropiado, como un hámster, se inmuniza para obtener linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína utilizada para la inmunización. Los anticuerpos anti-TAT226 se producen generalmente en animales mediante inyecciones subcutáneas (se) o intraperitonales (ip) de TAT226 y un adyuvante. La TAT226 se puede preparar usando métodos bien conocidos en este ámbito, algunos de los cuales se describen con más detalle en la presente memoria descriptiva. Por ejemplo, TAT226 se puede producir de forma recombinante . En una forma de realización, se inmuniza a los animales con un derivado de TAT226 que contiene una porción de dominio extracelular de TAT226 fusionado a la porción Fe de una cadena pesada de inmunoglobulina . En una forma de realización, se inmuniza a los animales con una proteina de fusión TAT226-IgGl. En una forma de realización, se inmuniza a animales con derivados inmunogénicos de TAT226 en una solución con monofosforil lipido A (MPL) /dicrinomicolato de trehalosa (TDM) (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, MT) y la solución se inyecta intradérmicamente en múltiples puntos. Dos semanas más tarde los animales reciben dosis de recuerdo. Entre siete y catorce días más tarde se extrae sangre a los animales y el suero se analiza para titular los anticuerpos anti-TAT226. Los animales reciben dosis de recuerdo hasta obtener los niveles adecuados de titulación. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro. A continuación, los linfocitos se fusionan con las células de mieloma utilizando un agente fusionante adecuado, como por ejemplo, polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)) .
Por lo tanto, las células de hibridoma preparadas se siembran y cultivan en un medio de cultivo adecuado, por ejemplo, un medio que contenga una o más sustancias que inhiban el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parental no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma parentales no poseen la enzima hipoxant ina-guanina-fosforribosil-transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo para los hibridomas generalmente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT) , que son sustancias que evitan el crecimiento de células con déficit de HGPRT. En determinadas formas de realización, las células de mieloma son aquellas que se fusionan eficazmente, soportan altos niveles estables de producción de anticuerpos por las células productoras de anticuerpos seleccionadas y son sensibles a un medio como el medio HAT. Entre las células de mieloma ejemplares están las lineas de mieloma murino, como aquellas derivadas de los tumores de ratones MOPC-21 y MPC-11, disponibles en Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, EE.UU., y las células SP-2 o X63-Ag8-653, disponibles en el American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, EE.UU. Las lineas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol . , 133:3001 (1984) ; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987) ) . El medio de cultivo en el cual las células de hibridoma crecen se analiza para la producción de anticuerpos monoclonales que se unan a TAT226. Preferentemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma está determinada por la inmunoprecipitación o por un ensayo de unión in vitro, como el radioinmunoensayo (RIA) o ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) . La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede determinarse, por ejemplo, mediante el análisis Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem. , 107:220 (1980) . Después de identificar las células de hibridoma que producen anticuerpos con la especificidad, afinidad y/o actividad deseada, los clones se pueden subclonar limitando los procedimientos de dilución y pueden cultivarse mediante métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986) ) . Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden crecer in vivo como tumores asciticos en un animal. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, los fluidos asciticos o el suero mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas , como por ejemplo, la proteina-A-sefarosa , la cromatografía de hidroxilapat ita , la electroforesis en gel, la diálisis o la cromatografía de afinidad . 2. Algunos métodos de detección de librerías Los anticuerpos anti-TAT226 de la invención se pueden obtener utilizando librerías combinatorias para detectar anticuerpos con la actividad o actividades deseadas. Por ejemplo, se conocen en el sector diversos métodos para generar librerías de representación en imágenes de fagos y detectar dichas librerías para anticuerpos que posean las características de unión deseadas. Lstos métodos se describen de forma general en Hoogenboom et al. (2001) en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ) , y en ciertas formas de realización, en Lee et al. (2004) J. Mol. Biol. 340:1073-1093.
En principio, los clones de anticuerpos sintéticos se seleccionan mediante la detección de librerías de fagos que contienen fagos que representan diversos fragmentos de la región variable (Fv) de anticuerpos fusionados a proteína de revestimiento de fagos. Estas librerías de fagos son cribadas mediante cromatografía de afinidad para detectar el antígeno deseado. Los clones que expresan fragmentos Fv capaces de unirse al antígeno deseado son adsorbidos al antígeno y, de este modo, separados de los clones de la biblioteca que no tienen capacidad de unión. Los clones con capacidad de unión se eluyen entonces del antígeno y pueden ser enriquecidas aún más mediante ciclos adicionales de adsorción/elución de antígenos. Cualquiera de los anticuerpos anti-TAT226 de la invención se puede obtener diseñando un procedimiento apropiado de detección de antígenos para seleccionar el clon del fago de interés, seguido por la construcción de un clon del anticuerpo anti-TAT226 de longitud completa utilizando las secuencias de Fv del clon del fago de interés y secuencias de la región constante (Fe) convenientes, descritas en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3.
En determinadas formas de realización, el dominio de unión a antigeno de un anticuerpo está formado a partir de dos regiones variables (V) de unos 110 aminoácidos, una correspondiente a la cadena ligera (VL) y otra correspondiente a la cadena pesada (VH) , que presentan en ambos casos tres bucles hipervariables (HVR) o regiones de determinación de complementariedad (CDR) . Los dominios variables se pueden representar funcionalmente en el fago, bien como fragmentos de Fv de cadena única (scFv), en los que VH y VL están covalentemente enlazadas por medio de un péptido corto y flexible, o como fragmentos Fab, en los que están fusionados a un dominio constante e interactúan no covalentemente, como se describe en Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Como se usa en la presente memoria descriptiva, los clones de fagos que codifican scFv y los clones de fagos que codifican Fab se denominan colectivamente "clones de fagos Fv" o "clones Fv" . Los repertorios de genes de VH y VL se pueden clonar por separado mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y recombinar aleatoriamente en librerías de fagos, en las que se puede buscar por clones de unión a antígeno, como se describe en Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Las librerías procedentes de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad al inmunógeno sin la necesidad de construir hibridomas. Alternativamente, el repertorio virgen se puede clonar para proporcionar una única fuente de anticuerpos humanos a una gran variedad de antigenos extraños y también de autoantigenos sin ninguna inmunización como se describe en Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Por último, las librerías vírgenes también se pueden producir sintéticamente mediante la clonación de segmentos de genes V no reorganizados procedentes de células madre y utilizando cebadores de la PCR que contenga secuencias aleatorias para codificar las regiones CDR3 muy variables y para conseguir la reorganización in vitro como se describe en Hoogenboom y inter, J. Mol. Biol . , 227: 381-388 (1992). En determinadas formas de realización, el fago filamentoso se utiliza para representar fragmentos de anticuerpos mediante fusión a la proteína de revestimiento menor pIII. Los fragmentos de anticuerpos se pueden representar como fragmentos Fv de cadena única, en los que los dominios de VH y VL están conectados a la misma cadena polipeptídica mediante un separador de polipéptidos flexible, como se describe en Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), o como fragmentos Fab, en los que una cadena se fusiona a pIII y la otras se segregan en el periplasma del anfitrión celular bacteriano donde el ensamblaje de una estructura proteinica de revestimiento de Fab se representa en la superficie del fago mediante el desplazamiento de las proteínas de revestimiento de tipo natural, por ejemplo, como se describe en Hoogenboom et al., Nucí. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991) . En general, los ácidos nucleicos que codifican fragmentos de genes de anticuerpos se obtienen a partir de inmunocitos recolectados de humanos o animales. Si se desea una librería que presente un sesgo a favor de clones anti-TAT226, el sujeto es inmunizado con TAT226 para generar una respuesta a anticuerpos y las células esplénicas y/o los linfocitos B circulantes u otros linfocitos de la circulación periférica (PBL) se recuperan para la construcción de la librería. En una forma de realización preferente, una librería de fragmentos de genes de anticuerpos humanos sesgada a favor de clones de anti-TAT226 humanos se obtiene generando una respuesta a un anticuerpo anti-TAT22 6 en ratones transgénicos portadores de una matriz de genes humanos funcionales de la inmunoglobulina (y carentes de un sistema funcional de producción de anticuerpos endógenos) , de forma que la inmunización con TAT226 da lugar a linfocitos B productores de anticuerpos humanos anti-TAT226. La generación de ratones transgénicos productores de anticuerpos humanos se describe más adelante. El enriquecimiento adicional de poblaciones celulares reactivas a anti-TAT226 se puede obtener mediante un procedimiento de detección adecuado para aislar linfocitos B que expresen un anticuerpo unido a membrana especifico de TAT226, por ejemplo, mediante separación celular con cromatografía de afinidad a TAT226 o adsorción de células a TAT226 marcada con flurocromo seguida de separación de células activadas por fluorescencia (FACS). Alternativamente, el uso de células esplénicas y/o linfocitos B u otros PBL procedentes de un donante no inmunizado ofrecen una mejor representación del posible repertorio de anticuerpos y también permite la construcción de una librería de anticuerpos usando cualquier especie animal (humana o no humana) en la que TAT226 no es antigénica. En el caso de librerías que incorporen construcción de genes de anticuerpos in vitro, las células madre se recolectan del sujeto para proporcionar ácidos nucleicos que codifiquen segmentos de genes de anticuerpos no organizados. Los inmunocitos de interés se pueden obtener de diversas especies animales, como humanos, ratón, rata, lagomorfa, luprina, canina, felina, porcina, bovina, equina y especies aviares, etc. Los segmentos de regiones variables de genes de anticuerpos que codifican ácidos nucleicos (incluidos los segmentos VH y VL) se recuperan a partir de las células de interés y se amplifican. En el caso de librerías de genes de VH y VL reorganizadas, el ADN deseado se puede obtener aislando el ADN o el ARNm genómico de los linfocitos, seguido de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores que se acoplen a los extremos 5' y 3' de los genes de la VH y la VL reorganizados, como se describe en Orlandi et al., Proc. Nati. Acad. Sci . (USA), 86: 3833-3837 (1989) , lo que permite obtener diversos repertorios de genes V para su expresión. Los genes V se pueden amplificar a partir del ADNc y del ADN genómico con cebadores reversos en el extremo 5' del exon que codifica el dominio V maduro y cebadores anversos dentro del segmento J como se describe en Orlandi et al. (1989) y en Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989) . Sin embargo, para amplificar desde el ADNc, los cebadores reversos también se pueden situar en el exon líder, como se describe en Jones et al., Biotechnol., 9: 88-89 (1991) , y los cebadores anversos dentro de la región constante, como se describe en Sastry et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (USA), 86: 5728-5732 (1989) . Para maximízar la complementariedad, se puede incorporar la degeneración en los cebadores como se describe en Orlandi et al. (1989) o Sastry et al. (1989) . En algunas formas de realización, la diversidad de las librerías se maximiza utilizando cebadores de la PCR dirigidos a cada familia de genes V para amplificar todas las organizaciones disponibles de VH y VL presentes en la muestra de ácidos nucleicos de inmunocitos, por ejemplo, como se describe en el método de Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) o como se describe en el método de Orum et al., Nucleic ñcids Res., 21: 4491-4498 (1993) . Para la clonación del ADN amplificado en vectores de expresión, se pueden introducir sitios de restricción poco habituales dentro del cebador de la PCR como una marca en un extremo, como se describe en Orlandi et al. (1989), o mediante una nueva amplificación de la PCR con un cebador marcado, como se describe en Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) . De segmentos de genes V in vitro se pueden derivar repertorios de genes V sintéticamente reorganizados. La mayoría de los segmentos de genes VH humanos se han clonado y secuenciado (según Tomlinson et al., J. Mol. Biol., 227: 776-798 (1992)), y mapeados (explicados en Matsuda et al., Nature Genet . , 3: 88-94 (1993); estos segmentos clonados (incluidos todas las principales conformaciones del bucle Hl y H2) se pueden utilizar para generar diversos repertorios de genes VH con cebadores de la PCR que codifican bucles de H3 de secuencia y longitud diversas, como se describe en Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol . , 227: 381-388 (1992) . Los repertorios de VH también se pueden hacer con toda la diversidad de secuencias centrada en un bucle de H3 largo de una única longitud, como se describe en Barbas et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461 (1992). Los segmentos de VK y VA humanos se han clonado y secuenciado (explicado en Williams y Winter, Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461 (1993)) y se pueden utilizar para hacer repertorios sintéticos de la cadena ligera. Los repertorios de genes V sintéticos, basados en una gran variedad de dominios de VH y VL y longitudes de L3 y H3, codificarán anticuerpos de considerable diversidad estructural. Tras la amplificación de los ADN codificadores de genes V, los segmentos de genes V de linea germinal se pueden reorganizar in vitro según los procedimientos de Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Se pueden construir repertorios de fragmentos de anticuerpos mediante combinación de repertorios de genes de VH y VL juntos de varias formas. Cada repertorio se puede crear en vectores diferentes y los vectores se pueden recombinar in vitro, por ejemplo, como se describe en Hogrefe et al., Gene, 128: 119-126 (1993), o in vivo mediante infección combinatoria, por ejemplo, el sistema loxP descrito en Waterhouse et al., Nucí. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993) . El procedimiento de la recombinación in vivo se aprovecha de las dos cadenas de los fragmentos Fab para superar el limite en el tamaño de la librería impuesto por la eficacia de transformación de E. coli. Los repertorios de VH y VL vírgenes se clonan por separado, uno en un fagémido y el otro en un vector fágico. Las dos librerías se combinan a continuación mediante infección fágica de bacterias que contienen fagémidos, de forma que cada célula contiene una combinación distinta y el tamaño de la librería sólo esté limitado por el número de células presente (unos 1012 clones) . Los dos vectores contienen señales de recombinación in vivo, por lo que los genes VH y VL se recombinan en un único replicón y se introducen en viriones fágicos. Estas enormes librerías proporcionan gran número de diversos anticuerpos con buena afinidad (Kd_1 de aproximadamente 10~8 M) . Alternativamente, los repertorios se pueden clonar secuencialmente en el mismo vector, por ejemplo, como se describe en Barbas et al., Proc . Nati. Acad. Sci . USA, 88: 7978-7982 (1991), o ensamblar juntos mediante PCR y, luego, clonarlos, como se describe en Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) . El ensamblaje de la PCR también se puede utilizar para unir los ADN de la VH y la VL con ADN que codifica un espaciador peptidico flexible para formar repertorios de Fv de cadena única (scFv) . En otra técnica, "el ensamblaje de la PCR en el interior de la célula" se usa para combinar genes VH y VL dentro de linfocitos mediante PCR y, luego, clonar repertorios de genes enlazados, como se describe en Embleton et al., Nucí. Acids Res., 20: 3831-3837 (1992) . Los anticuerpos producidos por librerías vírgenes (bien natural bien sintéticas) pueden ser de afinidad moderada ( (Kd~ 1 de aproximadamente 106 a 107 -1), pero la maduración de la afinidad también se puede imitar in vitro mediante construcción y reselección a partir de librerías secundarias, como se describe en Winter et al. (1994), citado anteriormente. Por ejemplo, la mutación se puede introducir aleatoriamente in vitro utilizando polimerasa con tendencia al error (explicado en Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989)) en el procedimiento de Hawkins et al., J. Mol. Biol . , 226: 889-896 (1992) o en el procedimiento de Gram et al., Proc. Nati. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580 (1992). Asimismo, la maduración de la afinidad se puede realizar mediante mutación aleatorizada de una o más CDR, por ejemplo, utilizando PCR con cebadores de secuencia aleatoria que abarquen la CDR de interés, en clones de Fv de individuos seleccionados y detecten clones de afinidad más alta. El documento WO 9607754 (publicado el 14 de marzo de 1996) describía un procedimiento para inducir la mutagenia en una región de determinación de complementariedad de una cadena ligera de inmunoglobulinas para crear una librería de genes de la cadena ligera. Otro método eficaz consiste en recombinar los dominios de VH o VL seleccionados por representación de fagos con repertorios de variantes de domino V que se producen naturalmente obtenidos a partir de donantes no inmunizados y detectar los de mayor afinidad en varias series de nueva transposición de cadenas, como se describe en Marks et al., Biotechnol . , 10: 779-783 (1992) . Esta técnica permite la producción de anticuerpos y de fragmentos de anticuerpos con afinidades del orden de 10"9 M o menos. La detección de las librerías se puede lograr mediante diversas técnicas conocidas en el sector. Por ejemplo, se puede utilizar TAT226 para revestir los pocilios de placas de adsorción, expresada en anfitriones celulares en placas de adsorción o utilizada en separación celular, o conjugada con biotonina para captura con partículas revestidas de estreptavidina, o utilizadas en cualquier otro procedimiento para detectar librerías de representación de imágenes de fagos . Las muestras de librerías de fagos están en contacto con TAT226 inmovilizada en condiciiones aptas para la unión de al menos una porción de partículas de fago con el adsorbente. Normalmente, las condiciones, incluido le pH, la concentración iónica, la temperatura y similares, se seleccionan de forma que imiten condiciones fisiológicas. Los fagos unidos a la fase sólida se lavan y, luego, se eluyen mediante ácido, por ejemplo, como se describe en Barbas et al., Proc. Nati. Acad. Sci USA, 88: 7978-7982 (1991), o mediante álcali, por ejemplo como se describe en Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), o mediante competición antigénica con TAT226, por ejemplo, en un procedimiento similar al procedimiento de competición antigénica de Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991). Los fagos se pueden enriquecer de 20 a 1.000 veces en una única serie de selección. Además, los fagos enriquecidos se pueden cultivar en cultivos bacterianos y estar sometidos a nuevas series de selección. La eficacia de la selección depende de muchos factores, incluida la cinética de la disociación durante el lavado y si múltiples fragmentos de anticuerpos de un único fago se pueden unir simultáneamente a antigeno. Los anticuerpos con rápida cinética de disociación (y afinidades de unión débiles) se pueden conservar mediante el uso de lavados cortos, representación de imágenes de fagos multivalente y densidad de revestimiento alta del antigeno en fase sólida. La densidad elevada no sólo estabiliza al fago durante las interacciones multivalentes , sino que, además, favorece la unión del fago disociado otra vez. La selección de anticuerpos con lenta cinética de disociación (y buenas afinidades de unión) se puede promover mediante el uso de largos lavados y representación de imágenes de fagos monovalentes, como se describe en Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990) y en el documento WO 92/09690, y una baja densidad de revestimiento del antigeno como se describe en Marks et al., Biotechnol . , 10: 779-783 (1992) . Es posible seleccionar entre anticuerpos de fagos de distintas afinidades, incluso con afinidades que difirieren ligeramente, para TAT226. Sin embargo, la mutación aleatoria de un anticuerpo seleccionado (por ejemplo, como la realizada en algunas de las técnicas de maduración de la afinidad) es probable que ocasione muchos mutantes, la mayoría de unión a antígeno, y unos cuantos con afinidad más alta. Con una TAT226 limitada, es raro que se pudieran completar fagos de alta afinidad. Para conservar todos los mutantes de afinidad más altas, los fagos se pueden incubar con una cantidad mayor de TAT226 biotinilada, pero con la TAT226 biotinilada a una concentración de molaridad menor de la constante de afinidad molar diana para TAT226. Los fagos con afinidad de unión más alta pueden, entonces, ser capturados por partículas paramagnéticas revestidas de estreptavidina . Esta "captura en equilibrio" permite seleccionar los anticuerpos según sus afinidades de unión, con una sensibilidad que permite aislar clones mutantes con una afinidad tan solo dos veces más elevada, frente a la enorme cantidad de fagos con afinidad menor. Las condiciones usadas en el lavado de fagos unidos a una fase sólida también se pueden manipular para distinguirlos en función de la cinética de disociación. Los clones anti-TAT226 se pueden seleccionar en función de la actividad. En determinadas formas de realización, la invención proporciona anticuerpos anti-TAT226 que se unen a células vivas que expresan naturalmente TAT226. En una forma de realización, la invención proporciona anticuerpos anti-TAT22 6 que bloquean la unión entre un ligando de TAT22 6 y TAT22 6 , pero no bloquean la unión entre un ligando de TAT22 6 y una segunda proteína. Los clones de Fv que corresponden a estos anticuerpos anti-TAT226 se pueden seleccionar (1) aislando clones anti-TAT226 de una librería de fagos como se ha descrito antes y, opcionalmente , amplificando la población aislada de clones de fagos cultivando la población en un anfitrión bacteriano apropiado; (2) seleccionando TAT226 y una segunda proteína contra la que se desea una actividad bloqueante y no bloqueante, respectivamente; (3) adsorbiendo los clones de fagos anti-TAT226 a TAT226 inmovilizada; (4) usando una mayor cantidad de la segunda proteína para eluir los clones no deseados que reconocen los determinantes de unión a TAT226 que se solapan o son compartidos con los determinantes de unión de la segunda proteína; y (5) elución de los clones que no se han adsorbido aún tras el paso (4) . Opcionalmente, los clones con las propiedades bloqueantes/no bloqueantes deseadas se pueden enriquecer también mediante repetición de los procedimientos de selección descritos en la presente memoria descriptiva una o más veces. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales derivados de hibridroma o los clones de Fv de la invención es rápidamente aislado y secuenciado utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando cebadores oligonucleóticos diseñados para amplificar específicamente las regiones que codifican las cadenas ligera y pesada de interés de plantillas de ADN de fagos o hibridoma) . Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, que después se transfectan en células anfitrión, como por ejemplo las células E. coli, las células COS de monos, las células de ovario de hámster chino (CHO) o las células de mieloma que, de otro modo, no producen la proteina de la inmunoglobulina, para obtener la síntesis de los anticuerpos monoclonales deseados en las células anfitrión recombinantes . Los artículos de revisión sobre expresión recombinante en bacterias del ADN que codifican el anticuerpo incluyen Skerra et al., Curr. Opinión in Immunol . , 5: 256 (1993) y Pluckthun, Immunol. Revs, 130: 151 (1992). El ADN que codifica los clones de Fv de la invención se pueden combinar con secuencias de ADN conocidas que codifican las regiones constantes de la 'cadena ligera y/o la cadena pesada (por ejemplo, las secuencias de ADN apropiadas se pueden obtener según Kabat et al., como se ha descrito anteriormente) para formar clones que codifiquen cadenas ligeras y/o pesadas de longitud total o parcial. Se tendrá en cuenta que las regiones constantes de cualquier isótopo se pueden utilizar para este fin, incluidas las regiones constantes IgG, IgM, IgA, IgD e IgE y que dichas regiones constantes se pueden obtener de cualquier especie animal o humana. Un clon de Fv se deriva del ADN del dominio variable de una especie animal (por ejemplo, un humano) y, luego, se fusiona al ADN de la región constante de otra especie animal para formar una o más secuencias de codificación, puesto que una cadena ligera y/o pesada de longitud completa e "híbrida" está incluida en la definición de anticuerpo "híbrido" y "quimérico" como se usa en la presente memoria descriptiva. En determinadas formas de realización, un clon de Fv derivado de ADN variable humano se fusiona con ADN de región constante humano para formar una o más secuencias de codificación para todas las cadenas ligeras y/o pesadas de longitud parcial o completa y humanas. El ADN que codifica un anticuerpo anti-TAT226 derivado de un hibridoma de la invención también se puede modificar, por ejemplo, mediante sustitución de las secuencias murinas homologas derivadas . del clon de hibridoma por la secuencia de codificación para los dominios constantes de la cadena ligera y pesada humanas (por ejemplo, como en el método de Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81: 6851-5855 (1984)) . El ADN que codifica un anticuerpo o fragmento derivado del clon de Fv o un hibridoma se puede modificar a su vez mediante la unión covalente a la secuencia de codificación de la inmunoglobulina de la totalidad o parte de la secuencia de codificación de un polipéptido que no sea inmunoglobulina . De este modo, se preparan anticuerpos "quiméricos" o "híbridos" que tiene la especificidad de unión de los anticuerpos de la invención derivados del clon de hibridoma o del clon de Fv. 3. Vectores, células huésped y métodos recombinantes Para la producción recombinante de un anticuerpo de la invención, el ácido nucleico que lo codifica se aisla e inserta en un vector replicable para clonación subsiguiente (amplificación del ADN) o para expresión. Se aisla el ADN que codifica el anticuerpo y se secuencia utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo). Existen muchos vectores disponibles. Le elección del vector depende en parte del anfitrión celular que se utilice. Por los general, las células huésped son de origen procariótico o eucariótico (por lo general, de mamíferos). Se tendrá en cuenta que las regiones constantes de cualquier isótopo se pueden utilizar para este fin, incluidas las regiones constantes IgG, IgM, IgA, IgD e IgE y que dichas F regiones constantes se pueden obtener de cualquier especie animal o humana. a ) Generación de anticuerpos usando células huésped eucarióticas (1) Construcción de vectores Las secuencias de polinucleótidos que codifiquen componentes de polipéptidos del anticuerpo de la invención se pueden obtener utilizando técnicas recombinante estándar. Las secuencias deseadas de polinucleótidos se pueden aislar y secuenciar a partir de anticuerpos que producen células como células de hibridoma. Alternativamente, los polinucleótidos se pueden sintetizar usando técnicas de PCR o sintetizador de nucleótidos. Una vez obtenidas, las secuencias que codifican los polipéptidos se insertan en un vector recombinante capaz de replicar y expresar polinucleótidos heterólogos en los huéspedes procarióticos . Muchos vectores que están disponibles son conocidos en el sector se pueden utilizar para el fin de la presente invención. La selección de un vector apropiado dependerá principalmente del tamaño de los ácidos nucleicos que se van a insertar en el vector y de la célula huésped concreta que se transformará con el vector. Cada vector contiene diversos componentes, dependiendo de su función (amplificación o expresión de polinucleótido heterólogo o ambas) y su compatibilidad con la célula huésped concreta en la que resida. Los componentes del vector incluyen, por lo general: un origen de replicación, un gen marcador de la selección, un promotor, un sitio de unión a ribosoma (RBS) , una secuencia de señal, la inserción del ácido nucleico heterólogo y una secuencia de terminación de la transcripción. En general, los vectores plásmidos que contienen secuencias de control y replicón que se derivan de especies compatibles con la célula huésped se usan en conexión con estos huéspedes. Por lo general, el vector lleva un sitio de replicación, asi como secuencias de marcado, que son capaces de proporcionar selección fenotipica en células transformadas. Por ejemplo, E. coli se transforma habitualmente usando pBR322, un plásmido derivado de una especie E. coli . El pBR322 contiene genes que codifican la resistencia a ampiciiina (Amp) y tetraciclina (Tet) y, de este modo, proporcionan una forma fácil de identificar células transformadas. El pBR322, sus derivados, u otros plásmidos microbianos o bacteriófagos pueden contener también, o ser modificados para que contengan, promotores que pueden ser utilizados por el organismo microbiano para la expresión de proteínas endógenas. Ejemplos de derivados del pBR322 usados para la expresión de anticuerpos concretos se describen en detalle en Cárter et al., Patente de EE.UU. n.° 5.648.237. Además, los vectores fágicos que contienen secuencias de control y replicón que son compatibles con los microorganismos huésped se pueden usar como vectores de transformación en relación con estos huéspedes. Por ejemplo, un bacteriófago como ?T??.??.-?? se puede utilizar para marcar un vector recombinante que se pueda utilizar para transformar células huésped susceptibles como E. coli LE392.
El vector de expresión de la invención puede comprender dos o más pares de promotores de cistrón, que codifiquen cada uno de los componentes polipeptídicos . Un promotor es una secuencia reguladora no traducida situada antes del extremo 5' del promotor en un cistrón que modula su expresión. Los promotores procariót icos suelen pertenecer a dos clases: inducibles y constitutivos. El promotor inducible es aquel que inicia un aumento de los niveles de transcripción del cistrón bajo su control en respuesta a cambios en las condiciones del cultivo, por ejemplo, la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio de temperatura.
Se conocen un gran número de promotores reconocidos por diversas células huésped posibles. El promotor seleccionado puede ser funcionalmente enlazado al ADN del cistrón que codifica la cadena pesada o ligera mediante eliminación del promotor del ADN fuente por medio de digestión enzimática mediante restricción e inserción de la secuencia aislada del promotor en el vector de la invención. Tanto la secuencia nativa del promotor como muchos promotores heterólogos se pueden utilizar para dirigir la amplificación y/o expresión de los genes diana. En algunas realizaciones, se utilizan promotores heterólogos, puesto que por lo general permiten una mayor transcripción y una mayor producción del gen diana o expresado, frente al promotor polipeptidico diana nativo. Los promotores aptos para su uso con huéspedes procarióticos incluyen el promotor PhoA, los sistemas promotores de lactosa y ß-galactamasa, un sistema promotor a base de triptofano (trp) y promotores híbridos como el promotor tac o el trc. Sin embargo, otros promotores que son funcionales en bacterias (como otros promotores de fagos o bacterianos conocidos) también son aptos. Se han publicado sus secuencias de nucleótidos, lo que permite que un experto pueda ligarlas a cistrones que codifiquen las cadenas pesada y ligera dianas (Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269) usando enlazadores o adaptadores que proporcionen sitios de restricción necesarios. En un aspecto de la invención, cada cistrón dentro del vector recombinante comprende un componente de la secuencia de señal de la secreción que dirige la translocación de los polipéptidos expresados en una membrana. En general, la secuencia de señal puede ser un componente del vector, o puede ser parte del ADN del polipéptido diana que se inserta en el vector. La secuencia de señal seleccionada a efectos de esta invención es aquella que la célula huésped reconoce y procesa (es decir, escindida por una peptidasa de señal) . Para las células huésped procarióticas que no reconocen ni procesan las secuencias de señal nativas a los polipéptidos heterólogos, la secuencia de señal es sustituida por una secuencia de señal procariótica seleccionada, por ejemplo, entre un grupo formado por fosfatasa alcalina, penicilasa, lpp o líderes de enterotoxina II termoestable (STII), LamB, PhoE, PelB, OmpA y MBP. En una realización de la invención, las secuencias de señal usada en los dos cistrones del sistema de expresión son secuencias de señal STII o variantes de ellas. En otro aspecto, la producción de las inmunoglobulinas según la invención puede tener lugar en el citoplasma de la célula huésped y, por lo tanto, no requiere la presencia de secuencias de señal de secreción dentro de cada cistrón. A este respecto, las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina se expresan, multiplican y ensamblan para formar inmunoglobulinas funcionales dentro del citoplasma. Determinadas cepas de huéspedes (por ejemplo, las cepas de E. coli trxB-) ofrecen condiciones citoplasmát icas que son favorables a la formación de uniones de disulfuros, lo que permite una multiplicación y ensamblaje correctos de las subunidades de las proteínas expresadas. Proba and Pluckthun Gene, 159:203 (1995) . Los anticuerpos de la invención también se pueden producir usando un sistema de expresión en el que la relación cuantitativa de los componentes poli peptídicos expresados se pueda modular para maximizar la producción de anticuerpos secretados y debidamente ensamblados de la invención. Esta modulación se logra al menos en parte mediante modulación simultánea de concentraciones translacionales para los componentes polipeptídicos . Una técnica para la modulación de la concentración translacional se divulga en Simmons et al., Patente de EE.UU. n.° 5.840.523. Utiliza variantes de la región de iniciación translacional (TIR) dentro de un cistrón. Para una TIR dada, se puede crear una serie de variantes de secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos con un intervalo de concentraciones translacionales , lo que proporciona un medio conveniente mediante el cual ajustar este factor al nivel de expresión deseado de la cadena especifica. Las variantes de la TIR se pueden generar mediante técnicas de mutagenia convencionales que dan lugar a cambios en codones que pueden alterar la secuencia aminoacidica . En algunas realizaciones, los cambios en la secuencia de nucleótidos son silenciosos. Las alteraciones en la TIR pueden incluir, por ejemplo, alteraciones en el número o espaciado de secuencias de Shine-Dalgarno, junto con alteraciones en la secuencia de la señal. Un método para generar secuencias de señal mutantes es generar un "banco de codones" al inicio de una secuencia de codificación que no cambie la secuencia de aminoácidos de la secuencia de la señal (es decir, los cambios son silenciosos) . Esto se puede conseguir cambiando la posición del tercer nucleótido de cada codón; además, algunos aminoácidos, como leucina, serina y arginina, tiene múltiples posiciones primera y segunda que pueden añadir complejidad para realizar el banco. Este método de mutagenia se describe en detalle en Yansura et al. (1992) METHODS : A Companion to Methods in Enzymol. 4:151-158.
En una forma de realización, un conjunto de vectores se genera con un intervalo de concentraciones de TIR para cada cistrón en ellos. Este conjunto limitado permite una comparación de los niveles de expresión de cada cadena, asi como la producción de los productos deseados de anticuerpos en varias combinaciones de concentraciones de TIR. Las concentraciones TIR se puede determinar cuantificando el nivel de expresión de un gen indicador como se describe en detalle en Simmons et al. Patente de EE.UU. n.° 5.840.523. En función de la comparación de las concentraciones translacionales, las TIR individuales se seleccionan para su combinación en los constructos del- vector de expresión de la invención . Las células huésped procarióticas aptas para la expresión de anticuerpos de la invención incluyen Archaebacteria y Eubacteria, como microorganismos grampositivos o gramnegativos . Entre los ejemplos de bacterias útiles están Escherichia (por ejemplo, E. coli) , Bacilli (por ejemplo, B. subtilis), Enterobacteria , las especies Pseudomonas (por ejemplo, P. aeruginosa) , Salmonella typhimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla, o Paracoccus . En una forma de realización, se utilizan células gramnegativas . En una forma de realización, se utilizan células E. coli como huéspedes para la invención. Entre los ejemplos de cepas E. coli están W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol . 2 (Washington, D.C. : American Society for Microbiology , 1987), pp. 1190-1219; Deposito en ATCC n.o 27.325) y derivados de las mismas, que incluyen la cepa 33D3 con el genotipo W3110 AfhuA (AtonA) ptr3 lac Iq lacL8 AompTA(nmpc-fepE) degP41 kanR (Patente de EE.UU. n.° 5.639.635) . Otras cepas y derivados de las mismas, como E. coli 294 (ATCC 31.446), E. coli B, E. coli 1776 (ATCC 31.537) y E. coli RV308 (ATCC 31.608) también están indicados. Estos ejemplos tienen carácter ilustrativo y no restrictivo. Los métodos para construcción de derivados de cualquiera de las bacterias antes mencionadas con genotipos definidos son conocidos en el sector y se describen, por ejemplo, en Bass et al., Proteins , 8^:309-314 (1990) . Por lo general, es necesario seleccionar las bacterias apropiadas que tiene en cuenta la replicabilidad del replicón en las células de una bacteria. Por ejemplo, las especies E. coli, Serratia o Salmonella se pueden usar bien como huésped cuando plásmidos bien conocidos como pBR322, pBR325, pACYC177 o pKN410 se utilizan para suministrar al replicón. Típicamente, la célula huésped debe secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticas puede ser deseable incorporar al cultivo celular inhibidores adicionales de la proteasa. (2) Producción de anticuerpos Las células huésped se transforman con los vectores de expresión descritos anteriormente y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados como es adecuado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Transformación significa introducir ADN en el huésped procariótico de forma que el ADN sea replicable, bien como elemento extracromosómico bien como integrante cromosómico. Dependiendo de la célula huésped usada, la transformación se realiza utilizando técnicas estándar apropiadas para dichas células. El tratamiento con calcio que emplea cloruro de calcio se usa por lo general para células bacterianas que contienen barreras sustanciales en la pared celular. Otro método de transformación emplea polietilenglicol/DMSO. Otra técnica utilizada es la electroporación . Las células procarióticas usadas para producir los polipéptidos de la invención se cultivan en medios conocidos en el sector y aptos para cultivo de células huésped seleccionadas. Ejemplos de medios apropiados son caldo de luria (LB) más nutrientes suplementarios necesarios. En algunas realizaciones, los medios también contienen un agente de selección, elegido en función de la construcción del vector de expresión, para permitir el crecimiento selectivo de células procarióticas que contengan el vector de expresión. Por ejemplo, se añade ampicilina a los medios de cultivo para el crecimiento de células que expresan un gen resistente a ampicilina. Los anticuerpos necesarios aparte de carbono, nitrógeno y fuentes inorgánicas de fosfato también se pueden incluir a concentraciones apropiadas introducidas solas en una mezcla con otro suplemento o medio de cultivo como una fuente de nitrógeno compleja. Opcionalmente , el medio de cultivo puede contener uno o más agentes reductores seleccionados a partir del grupo formado por glutationa, cisteina, cistamina, tioglicolato, ditioeritriol y ditiotreitol . Las células huésped procarióticas se cultivan a temperaturas apropiadas. En algunas formas de realización, para el crecimiento de E. coli, las temperaturas oscilan entre 20 °C y unos 39 °C; entre 25 °C y unos 37 °C; o unos 30 °C. El pH del medio de cultivo puede ser cualquiera comprendido entre 5 y 9, dependiendo principalmente del organismo huésped. En determinadas formas de realización, el pH para E. coli puede oscilar entre 6,8 y 7,4 aproximadamente o ser de 7,0. Si un promotor inducible se utiliza en el vector de expresión de la invención, la expresión de la proteina se induce en condiciones aptas para la activación del promotor. En un aspecto de la invención, los promotores PhoA se utilizan para controlar la transcripción de los polipéptidos . Según esto, las células huésped transformadas se cultivan en un medio limitador de fosfato para la inducción. En algunas formas de realización, el medio de cultivo limitador de fosfato es el C.R.A.P (véase, por ejemplo, Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147) . Se pueden utilizar otros inductores diversos, según el constructo de vector empleado, como se sabe en el sector. En una forma de realización, los polipéptidos expresados de la presente invención se secretan en el periplasma de las células huésped y se recuperan allí. La recuperación de las proteínas supone la ruptura de los microorganismos, por lo general mediante choque osmótico, sonicación o lisis. Una vez producida la ruptura de las células, los desechos celulares o células enteras se pueden eliminar mediante centrifugación o filtración. Las proteínas pueden ser purificadas más, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad con resina. De manera alternativa, pueden transportarse proteínas dentro del medio de cultivo y aislarse en él. Las células pueden retirarse del cultivo, y el sobrenadante del cultivo puede filtrarse y concentrarse para proceder a la posterior purificación de las proteínas producidas. Los polipéptidos expresados pueden volver a aislarse e identificarse mediante métodos comunes conocidos tales como la electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) y ensayos Western blot . En uno de los aspectos de la invención, la producción de anticuerpos se realiza en gran cantidad mediante proceso de fermentación. Existen varios procesos disponibles de fermentación de lotes alimentados a gran escala para la producción de proteínas recombinantes . Las fermentaciones a gran escala se realizan en dispositivos de al menos 1000 litros de capacidad y, en ciertas formas de realización, entre 1.000 y 100.000 litros de capacidad. Estos fermentadores utilizan agitadores de hélice para distribuir oxígeno y nutrientes, especialmente glucosa (la fuente preferente de carbono/energía). La fermentación a pequeña escala hace referencia generalmente a la fermentación en fermentadores de aproximadamente no más de 100 litros de capacidad volumétrica, y pueden variar de 1 a 100 litros aproximadamente .
En un proceso de fermentación, la inducción de expresión proteica se inicia típicamente después de que las células hayan crecido en condiciones adecuadas hasta alcanzar la densidad deseada, p. ej . una OD550 de entre 180-220, momento en el cual las células se encuentran en la fase estacionaria temprana. Pueden utilizarse distintos inductores, de acuerdo con el constructo del vector utilizado, tal y como se conoce' en el sector y como se ha descrito anteriormente. Las células pueden hacerse crecer durante períodos más cortos antes de la inducción. Las células se inducen normalmente durante unas 12-50 horas, aunque es posible utilizar tiempos de inducción más cortos o más prolongados. Pueden modificarse distintas condiciones de fermentación para mejorar el rendimiento de producción y la calidad de los polipéptidos de la invención. Por ejemplo, para mejorar el ensamblaje adecuado y el plegamiento de los polipéptidos de anticuerpos secretados, pueden utilizarse vectores adicionales que sobreexpresan la proteína chaperona, tales como proteínas Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD y/o DsbG) o FkpA (una peptidil-propil cis , trans-isomerasa con actividad chaperona) para co-transformar las células huésped procarióticas . Se ha demostrado que las proteínas chaperonas facilitan la solubilidad y el plegamiento adecuado de proteínas heterólogas producidas en células bacteriales huésped. Chen et al. (1999) J Bio Chem 274:19601-19605; Georgiou et al., Patente de EE.UU. n.° 6.083.715; Georgiou et al., Patente de EE.UU. n.° 6.027.888; Bothmann y Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105; Ramm y Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113; Arie et al. (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210. Pueden utilizarse ciertas cepas huésped con deficiencia de enzimas proteolít icas para minimizar la proteólisis de proteínas heterólogas (especialmente las que son sensibles desde el punto de vista proteolítico ) . Por ejemplo, las cepas de células huésped pueden modificarse para efectuar mutaciones genéticas relativas a los genes que codifican proteasas bacteriales conocidas tales como la Proteasa III, OmpT, DegP, Tsp, Proteasa I, Proteasa Mi, Proteasa V, Proteasa VI y combinaciones de éstas. Algunas cepas de E. coli con deficiencia de proteasas están disponibles, y descritas, por ejemplo en Joly et al. (1998), citado anteriormente; Georgiou et al., Patente de EE.UU. n.° 5.264.365; Georgiou et al., Patente de EE.UU. n.° 5.508.192; Hará et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996) . En una forma de realización, en el sistema de expresión de la invención se utilizan como células huésped cepas de E. coli con deficiencia de enzimas proteoliticas transformadas con plásmidos que sobreexpresan una o más proteínas chaperonas . (3) Purificación de anticuerpos En una forma de realización, la proteína de anticuerpo que se produce mediante la invención descrita en la presente memoria se purifica de nuevo para obtener preparaciones que son substancialmente homogéneas para posteriores ensayos y usos. Pueden emplearse métodos estándar del sector para la purificación de proteínas. Los siguientes procedimientos son ejemplos de procedimientos de purificación adecuados: fraccionamiento en columnas de intercambio iónico o de inmunoafinidad, precipitación en etanol, HPLC de fase reversa, cromatografía en anhídrido silícico o en una resina de intercambio catiónico tal como DEAE, cromatoisoenfoque, SDS-PAGE, precipitación en sulfato de amonio y filtrado en gel mediante, por ejemplo, Sephadex G-75. En un aspecto, se utiliza Proteína A inmovilizada en una fase sólida para purificación por inmunoafinidad de los productos de anticuerpos de la invención. La proteína A es una proteína de pared celular de 41kD del Staphylococcus áureas que se une con gran afinidad por la región Fe de los anticuerpos. Lindmark et al. (1983) J. Immunol . Meth. 62:1-13. La fase sólida a la que se fija la Proteina A puede ser una columna que contenga una superficie de vidrio o anhídrido silícico, o una columna de ácido silícico o de vidrio poroso controlado. En ciertas aplicaciones, la columna se recubre con un reactivo, como el glicerol, para evitar una posible adherencia inespecífica de contaminantes. Como primer paso de purificación, una preparación derivada del cultivo celular, según lo descrito anteriormente, puede aplicarse a una fase sólida de Proteína A inmovilizada para permitir la unión específica del anticuerpo de interés a la Proteína A. La fase sólida se lavaría a continuación, para eliminar los contaminantes unidos inespecí ticamente a ella. Finalmente, el anticuerpo de interés se recupera de la fase sólida mediante elución. b) Generación de anticuerpos usando células huésped eucariót icas : Un vector para uso en una célula huésped eucariótica incluye, por lo general, uno o más de los siguientes componentes no limitantes: una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes de marcador, un potenciador, un promotor y una secuencia de finalización de la transcripción . (1) Componente de secuencia de señal Un vector para uso en una célula huésped eucariótica puede también contener una secuencia de señal u otro polipéptido con una escisión especifica en el término N de la proteina madura o polipéptido. La secuencia de señal heteróloga seleccionada puede ser aquella que la célula huésped reconoce y procesa (es decir, escindida por una peptidasa de señal) . En la expresión celular de los mamíferos, están disponibles las secuencias de señal de los mamíferos así como los líderes secretores víricos, por ejemplo, la señal del herpes simplex gD. El ADN para la región de dicho precursor está ligado en la estructura de lectura al ADN que codifica el anticuerpo. (2) Origen de la replicación Por lo general, un componente origen de la replicación no es preciso para los vectores de expresión en mamíferos. Por ejemplo, el origen SV40 se puede utilizar habitualmente sólo porque contiene el promotor precoz. (3) Componente gen de selección Los vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, también denominado marcador seleccionable . Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) otorgan resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina , (b) complementan las deficiencias auxotróficas , si procede o (c) suministran nutrientes básicos no disponibles a partir de medios complejos. Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Las células que se transforman exitosamente con un gen heterólogo producen una proteina que otorga resistencia al fármaco y, de esta manera, sobreviven a la estrategia de selección. Los ejemplos de dicha selección dominante utilizan los fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina. Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamíferos son los que permiten la identificación de las células encargadas de absorber el ácido nucleico del anticuerpo, como DHFR, timidina cinasa, metalotioneína I y II, preferiblemente, genes de metalotioneína en primates) adenosina deaminasa, ornitina decarboxilasa , etc. Por ejemplo, en algunas formas de realización, las células transformadas con el gen de selección DHFR se identifican primero a través del cultivo de todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx) , un antagonista competitivo del DHFR. En algunas formas de realización, una célula huésped adecuada cuando se utiliza el DHFR de tipo natural es la linea celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad del DHFR (por ejemplo, ATCC CRL-9096) . Alternativamente, las células huésped (en especial los huéspedes naturales que contienen DHFR endógeno) transformadas o co-transformadas con secuencias de ADN que codifican un anticuerpo, la proteina DHFR natural y otro marcador seleccionable como la aminoglicosida 3'-fosfotransferasa (APH) puede seleccionarse mediante crecimiento celular en medio que contenga un agente de selección para el marcador seleccionable, como un antibiótico aminoglicosidico, por ejemplo, canamicina, neomicina o G418. Véase la patente de EE.UU. n.° 4.965.199. (4) Componente promotor Los vectores de expresión y clonación suelen contener un promotor que es reconocido por el organismo huésped y está operativamente enlazado al ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés (por ejemplo, un anticuerpo) . Se conocen secuencias de promotores para las eucariotas. Por ejemplo, prácticamente todos los genes eucarióticos poseen una región rica en AT situada aproximadamente entre las bases 25 y 30 antes del extremo 5' del promotor desde donde se inicia la transcripción. Otra secuencia encontrada entre las bases 70 y 80 antes del extremo 5' del promotor desde el inicio de la transcripción de diversos genes es la región CNCAAT, en la que N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucarióticos hay una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola de poli (A) al extremo 3' de la secuencia de codificación. En determinadas formas de realización, la totalidad o algunas de estas secuencias se pueden insertar sin problemas en vectores de expresión eucarióticos. La trascripción a partir de los vectores en células huésped de mamíferos está controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos a partir de los genomas de virus como el poliomavirus , el virus de la viruela de las aves de corral, el adenovirus (como el Adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma aviario, el citomegalovirus , un retrovirus, el virus de la hepatitis B y el Simian Virus 40 (SV40) ; a partir de promotores heterólogos de mamíferos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina , o a partir de promotores de choque térmico, siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de las células huésped. Los promotores precoces y tardíos del virus SV40 se obtienen fácilmente en forma de un fragmento de restricción del SV40 que también contiene el origen viral de replicación del SV40. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene fácilmente en forma de un fragmento de restricción HindIII E. Un sistema para la expresión del ADN en huéspedes de mamíferos que utilizan el virus del papiloma bovino como vector se da a conocer en la patente de EE.UU n.° 4.419.446. Una modificación de este sistema se describe en la patente de EE.UU n.° 4.601.978. Véase también Reyes y col., Nature 297:598-601 (1982) para la expresión del ADNc del interferón beta humano en células de ratón bajo el control de un promotor timidina cinasa del virus del herpes simplex. Alternativamente, la repetición del terminal largo del virus del sarcoma de Rous se puede utilizar como promotor. (5) Componente elemento potenciador La trascripción de ADN que codifique un anticuerpo de esta invención a través de eucariotas más altas se aumenta con frecuencia al insertar la secuencia de un potenciador en el vector. Se conocen ya muchas secuencias de potenciadores de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, fetoproteína alfa e insulina) . No obstante, lo habitual es que se utilice un potenciador procedente de un virus de células eucarióticas . Algunos ejemplos incluyen el potenciador SV40 en el lado tardío del origen de la replicación (bp 100-270), el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus , el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de la replicación y los potenciadores de adenovirus. Véase también Yaniv, Nature 297:17-18 (1982), que describe los elementos de potenciación para activar los promotores eucarióticos . El potenciador puede empalmarse en el vector en una posición 5' a 3' a la secuencia de codificación del polipéptido del anticuerpo, pero está situado generalmente en un sitio 5' desde el promotor. (6) Componente de finalización de la transcripción Los vectores de expresión utilizados en células huésped eucarióticas pueden también contener secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para la estabilización del ARNm. Estas secuencias se encuentran generalmente disponibles desde las regiones no traducidas del extremo 5' , y ocasionalmente el 3' , de los ADN o ADNc virales o eucarióticos. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica un anticuerpo. Un componente útil de finalización de la transcripción es la región de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovina. Véase el documento WO94/11026 y el vector de expresión que se da a conocer en el mismo. (7) Selección y transformación de células huésped Entre las células huésped apropiadas para clonación o expresión del ADN en los vectores de la presente memoria descriptiva están células eucariotas más altas, incluidas células huésped de vertebrados. La propagación de células de vertebrados en cultivos (cultivo tisular) se ha convertido en un procedimiento habitual. Ejemplos de lineas celulares útiles de mamíferos son la línea CV1 de riñon del mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de riñon embrionario humano (293 ó 293 células subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)) ; células de riñon de crías de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); células sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñon de mono (CV1 ATCC CCL 70) ; células de riñon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células caninas de riñon (MDCK, ATCC CCL 34); células de riñon de ratas búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células humanas de pulmón (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); tumor de mama de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51 ) ; células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una linea de hepatoma humano (Hep G2 ) . Las células huésped se transforman con los vectores de expresión o clonación descritos anteriormente para la producción del anticuerpo y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados como es adecuado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. (8) Cultivo de células huésped Las células huésped utilizadas para producir un anticuerpo de esta invención se pueden cultivar en diversos medios. Medios comercialmente disponibles como Ham's FIO (Sigma) , Minimal Essential Médium ( (MEM) , (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y Dulbecco's Modified Eagle's Médium ( ( DMEM) , Sigma) son aptos para el cultivo de células huésped. Además, cualquiera de los medios de cultivo descritos en Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), Patentes de EE.UU. núms 4.767.704, 4.657.866, 4.927.762, 4.560.655 ó 5.122.469; el documento WO 90/03430; el documento WO 87/00195; o la patente de EE.UU. Ref. 30.985 puede utilizarse como medios de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios puede complementarse según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico) , sales (tales como cloruro sódico, calcio, magnesio y fosfato) , soluciones (como HEPES) , nucleótidos (tales como adenosina y timidina) , antibióticos (como el fármaco GENTAMYCIN™) , oligoelementos (definidos como los compuestos inorgánicos generalmente presentes en las concentraciones finales del intervalo micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. También pueden incluirse otros suplementos en las concentraciones adecuadas conocidas por los expertos en la materia. Las condiciones del cultivo, tales como la temperatura o el pH, entre otras, son las utilizadas anteriormente con la célula huésped seleccionada para la expresión y serán evidentes para los expertos. (9) Purificación del anticuerpo Al utilizar técnicas recombinantes , se puede producir el anticuerpo intracelularmente , en el espacio periplásmico, en el espacio periplasmático, o directamente se puede secretar en el medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como primer paso, los residuos de partículas, bien células huésped o fragmentos Usados, se puede eliminar, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltrado . Cuando el anticuerpo es secretado en el medio, los sobrenadantes de dichos sistemas de expresión se pueden concentrar primero utilizando un filtro para concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo una unidad de ultrafiltrado Amicon o illipore Pellicon. Se puede incluir un inhibidor de la proteasa como PMSF en cualquiera de las fases anteriores para inhibir la proteolisis y se pueden incluir antibióticos para impedir el crecimiento de contaminantes casuales. La composición del anticuerpo preparado a partir de las células se puede purificar utilizando, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita , elect roforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad. Esta última es una técnica de purificación cómoda. La idoneidad de la proteína A como ligando de afinidad depende de las especies y del isotipo de cualquier domino Fe de inmunoglobulina que está presente en el anticuerpo. La proteína A se puede utilizar para purificar anticuerpos que se basan en cadenas pesadas humanas ??, ?2, o ?4 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983) ) . La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para la ?3 humana (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)) . La matriz a la que el ligando de afinidad se une puede ser agarosa, pero también están disponibles otras matrices. Las matrices mecánicamente estables, tales como vidrio poroso controlado o poli (estirenodivinil) benceno, permiten tasas de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que los que se pueden lograr con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, New Jersey) es útil para la purificación. También están disponibles, dependiendo del anticuerpo que quiera recuperarse, otras técnicas para la purificación de las proteínas, como fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación en etanol, HPLC de fase reversa, cromatografía en anhídrido silícico, cromatografía en heparina SEPHAROSE™, cromatografía en una resina de intercambio iónico o catiónico (como una columna de ácido poliaspártico) , cromatoisoenfoque, SDS-PAGE y precipitación en sulfato de amonio. Siguiendo cualquiera de las fases preliminares de purificación, la mezcla que contiene el anticuerpo de interés y los contaminantes puede estar sujeta a nuevas etapas de purificación, por ejemplo, mediante cromatografía de interacción hidrófoba con pH bajo utilizando una solución de elución a un pH entre 2,5 y 4,5, generalmente a concentraciones bajas en sal (por ejemplo, entre 0-0, 25M aproximadamente) .
En general, están consolidados en el sector diversos métodos para la preparación de anticuerpos para uso en investigación, pruebas y uso clínico, son coherentes con todo lo anterior y/o se consideran apropiados por un experto en el sector para un anticuerpo concreto de interés.
C. Inmunoconjugados La invención también proporciona inmunoconj ugados (también denominados "conjugados de anticuerpos con fármacos" o "ADC"), que comprenden cualquiera de los anticuerpos anti-TAT226 de la invención conjugado a uno o más agentes citotóxicos como por ejemplo un agente quimioterapéutico, un fármaco, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, animal o vegetal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radioactivo (es decir, un radipconjugado) . Los inmunoconj ugados se pueden utilizar para la administración local de agentes citotóxicos, es decir los fármacos para destruir o inhibir el crecimiento o la proliferación de células tumorales en el tratamiento del cáncer (Syrigos y Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz y Springer (1997) Adv. Drug Delív. Rev. 26:151-172; Patente de EE.UU. n.° 4.975.278) . Los inmunoconj ugados permiten la administración dirigida a un tumor de una fracción de un fármaco y la acumulación intracelular en dicho tumor, cuando la administración sistémica de fármacos no conjugados puede dar lugar a concetraciones inaceptables de toxicidad en células normales, asi como en las células tumorales que se pretende eliminar (Baldwin et al., Lancet (Mar. 15, 1986) pp. 603-05; Thorpe (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Revie , " en Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications (A. Pinchera et al., eds.) pp . 475-506. Tanto los anticuerpos monoclonales como los policlonales , han sido considerados útiles en estas estrategias (Rowland et al., (1986) Cáncer Immunol . I munother. 21:183-87) . Algunos fármacos empleados en estos métodos incluyen la daunomicina, la doxorrubicina , el metotrexato y la vindesina (Rowland et al., (1986) citado anteriormente) . Entre las toxinas empleadas en anticuerpos conjugados con toxinas se encuentran toxinas bacterianas como la toxina de la difteria, toxinas vegetales como la ricina, toxinas de pequeñas moléculas como la geldanamicina (Mandler et al. (2000) Jour. of the Nat. Cáncer Inst. 92(19) : 1573-1581; Mandler et al. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), maitansinoides (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Nati. Acad . Sci . USA 93:8618-8623), y calicheamicina (Lode et al. (1998) Cáncer Res. 58:2928; Hinman et al. (1993) Cáncer Res. 53:3336-3342) . Las toxinas pueden ejercer sus efectos citotóxicos mediante mecanismos que incluyen la unión de tubulina, la unión de ADN o la inhibición de la topoisomerasa . Algunos medicamentos citotóxicos tienden a ser inactivos o menos activos cuando se conjugan con grandes anticuerpos o ligandos receptores de proteínas. ZEVALIN® (ibritumomab tiuxetan, Biogen/Idec) es un anticuerpo conjugado con radioisótopos compuesto de un anticuerpo monoclonal kappa IgGl murina dirigido contra el antígeno CD20 encontrado en la superficie de los linfocitos B cancerosos y normales y contra el radioisótopo ???? o 90Y unido por un quelante enlazador de tiourea ( iseman et al. (2000) Eur. Jour. Nucí. Med. 27 ( 7 ) : 766-77 ; Wiseman et al. (2002) Blood 99 (12) : 4336-42; Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20 (10) : 2453-63; Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol . 20 (15) : 3262-69) . A pesar de que el ZEVALIN presenta actividad contra las células B del linfoma non-Hodgkin (NHL) , su administración tiene como resultado unas citopenias severas y prolongadas en la mayor parte de los pacientes. MYLOTARG™ (Gentuzumab ozogamicina , yeth Pharmaceuticals), un anticuerpo conjugado con fármaco compuesto de un anticuerpo hu CD33 enlazado a calicheamicina , se aprobó en 2000 para el tratamiento de leucemia mieloide aguda por inyección (Drugs of the Future (2000) 25(7): 686; Patentes de EE.UU. núms . 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001). Cantuzumab mertansina (Inmugen, Inc.), un anticuerpo conjugado con fármaco compuesto por el anticuerpo huC242 enlazado al grupo de fármacos de los maitansinoides , DM1, por medio de un enlazador de disulfuro SPP está bien avanzado en ensayos clínicos de Fase II para el tratamiento de neoplasias malignas que expresan CanAg, como los de colon, de páncreas, gástricos y otros. MLN-2704 (Millennium Pharm. , BZL Biologics, Immunogen Inc.), un anticuerpo conjugado con fármaco compuesto por el anticuerpo monoclonal del antígeno de membrana antiprostático (PSMA) enlazado al grupo de los maitansinoides, DM1, está en fase de desarrollo para el tratamiento potencial de los tumores de próstata. Los péptidos auriestatinos , auristatina E (AE) y monometilauristatina (MMAE) , análogos sintéticos de dolastatina, fueron conjugados a anticuerpos monoclonales quiméricos cBR96 (específicos para Lewis Y en carcinomas) y cAClO (específicos para CD30 en tumores hematológicos (Doronina et al. (2003) Nature Biotechnol. 21 ( 7 ) : 778-784 ) y están en fase de desarrollo terapéutico. En algunas formas de realización, un inmunoconj ugado comprende un anticuerpo anti-TAT226 y un agente quimioterapéutico u otra toxina. Los agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de inmunocon ugados se describen en la presente memoria descriptiva (por ejemplo, anteriormente). También se pueden utilizar toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas y se describen en la presente memoria descriptiva. En ciertas formas de realización, un inmunoconj ugado comprende un anticuerpo anti-TAT226 y una o más toxinas de molécula pequeña, incluidos fármacos de molécula pequeña como calicheamicina, maitansinoide , dolastatina, auristatina, tricoteceno y CC1065, asi como los derivados de estos fármacos que tengan actividad citotóxica. A continuación, se describen detalladamente ejemplos de estos inmunoconj ugados . 2. Iiuanoconj gados ejemplares Un inmunoconj ugado (o "conjugado de anticuerpo con fármaco" ("ADC")) de la invención puede tener la Fórmula I que figura a continuación, donde un anticuerpo anti-TAT226 se conjuga (es decir, se une covalentemente ) con una o más fracciones de fármaco (D) a través de un enlazador opcional (L) .
Ab-(L-D)p I Según esto, el anticuerpo anti-TAT226 se puede conjugar con el fármaco bien directamente bien mediante un enlazador. En la Fórmula I, p es el promedio de fracciones de fármaco por anticuerpo, que puede oscilar, por ejemplo, entre 1 y 20, aproximadamente, fracciones de fármaco por anticuerpo y, en determinadas formas de realización, entre 1 y unas 8 fracciones de fármaco por anticuerpo. a) Enlazadores ejemplares Un enlazador puede comprender uno o más componentes enlazadores. Los componentes de enlace ejemplares incluyen: 6-maleimidocaproilo ("MC"), maleimidopropanoilo ("MP"), valina-citrulina ("val-cit" o "ve"), alanina-fenilalanina ("ala-phe"), p-aminobensiloxicarbonil ("PAB"), N-Succinimidil 4- (2-piridiltio) pentanoato ("SPP"), N-Succinimidil 4-(N-maleimidometil ) ciclohexano-1 carboxilato ("SMCC), y N-Succinimidil ( -yodo-acetil ) aminobenzoato ("SIAB") . Diversos componentes enlazadores son conocidos en el sector y algunos se describen más adelante.
Un enlazador puede ser un "enlazador escindible", que facilite la liberación de un fármaco en la célula. Por ejemplo, puede utilizarse un enlazador lábil al ácido (por ejemplo, hidrazona) , un enlazador sensible a la proteasa (por ejemplo, sensible a la peptidasa) , un enlazador de fotolabilo, un enlazador de dimetilo o un enlazador que contenga disulfuro (Chari et al., Cáncer Research 52:127131 (1992); patente de EE.UU. n.° 5.208.020). En algunas formas de realización, un componente enlazador puede comprender una "unidad de extensión" que une un anticuerpo con otro componente enlazador o con una fracción de un fármaco. A continuación se muestran unidades de extensión ejemplares (en las que la linea ondulada indica sitios de unión covalente a un anticuerpo) : MP En ciertas formas de realización, un componente enlazador puede comprender una unidad de aminoácidos. En una de estas formas de realización, la unidad de aminoácidos permite la escisión del enlazador por una proteasa, lo que facilita la liberación del fármaco desde el inmunoconj ugado tras exposición a proteasas intracelulares , como enzimas lisosomales. Véase, por ejemplo, Doronina et al. (2003) Wat. Biotechnol. 21:778-784. Entre las unidades de aminoácidos ejemplares se encuentra un dipéptido, un tripéptido, un tetrapéptido y un pentapéptido . Los dipéptidos ejemplares incluyen: valina-citrulina (ve o val-cit) , alanina-fenilalanina (af o ala-phe) ; fenilalanina-lisina (fk o phe-lis); o N-metil-valina-citrulina (Me-val-cit ) . Los tripéptidos ejemplares incluyen: glicina-valina-citrulina (gly-val-cit ) y glicina-glicina-glicina (gly-gly-gly) . Una unidad de aminoácidos puede comprender residuos de aminoácidos que que ocurren de forma natural, asi como aminoácidos menores y análogos de aminoácidos que no ocurren de forma natural, como la citrulina. Las unidades de aminoácidos pueden designarse y optimizarse en su selectividad para la escisión mediante una enzima específica, por ejemplo, una proteasa asociada a un tumor, catepsina B, C y D, o una proteasa plasmina. En algunas formas de realización, un componente enlazador puede comprender una unidad "espaciadora" que une el anticuerpo a una fracción de un fármaco, bien directamente bien mediante una unidad de extensión y/o una unidad de aminoácidos. Una unidad espaciadora puede ser "autoinmoladora" o "no autoinmoladora " . Una unidad espaciadora "no autoinmoladora" es aquella en la la totalidad o parte de la unidad espaciadora permanece unida a la fracción del fármaco tras escisión enzimática (por ejemplo, proteolítica ) del ADC . Entre los ejemplos de unidades espadadoras no autoinmoladoras están una unidad espaciadora de glicina y una unidad espaciadora de glicina-glicina. También se consideran otras combinaciones de espaciadores peptídicos susceptibles de escisión enzimática específica para una secuencia. Por ejemplo, la escisión enzimática de un ADC que contenga una unidad espadadora de glicina-glicina por una proteasa asociada a una célula tumoral daría lugar a la liberación de la fracción de fármaco de glicina-glicina desde el resto del ADC. En una de estas formas de realización, la fracción del fármaco de glicina-glicina está entonces sujeta a una fase independiente de hidrólisis, lo que permite la escisión de la unidad espaciadora de glicina-glicina de la fracción del fármaco. Una unidad espaciadora "autoinmoladora" permite la liberación de la fracción del fármaco sin una fase de hidrólisis independiente. En determinadas formas de realización, una unidad espaciadora de un enlazador comprende una unidad p-aminobenzilo . En una de estas formas de realización, un alcohol p-aminobenzilo se une a una unidad de aminoácidos mediante una unión amida, y un carbamato, metilcarbamato, o carbonato se realiza entre el alcohol de bencilo y un agente citotóxico. Véase, por ejemplo, Hamann et al., (2005) Expert Opín. Ther. Patents (2005) 15:1087-1103. En una forma de realización, la unidad espaciadora es p-aminobenciloxicarbonilo (PAB) . En determinadas formas de realización, la porción de fenileno de una unidad de benzilo p-amino se sustituye por Qm, donde Q es -Ci-C8 alquilo, -O- (Ci-Ce alquilo), -halógeno,- nitro o -ciano; y m es un número entero que oscila entre 0 y 4. Otros ejemplos de unidades espadadoras autoinmoladoras incluyen compuestos aromáticos que son electrónicamente similares a alcohol de p-aminobencilo (véase, por ejemplo, US 2005/0256030 Al), como derivados de 2-aminoimidazol-5-metanol (Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237) y orto- o para-aminobencilacetales . Se pueden utilizar espaciadores que se sometan a ciclización tras hidrólisis de la unión amida, como amidas a ácido 4 -aminobutirico sustituido y no sustituido (Rodrigues et al., Chemistry Biology, 1995, 2, 223) ; sistemas en anillo biciclo [ 2.2.1 ] y biciclo [ 2.2.2 ] sustituidos adecuadamente (Storm, et al., J. Amer. Chem. Soc, 1972, 94, 5815); y amidas de ácido 2-aminofenilpropiónico (Amsberry, et al., J. Org. Chem., 1990, 55, 5867) . La eliminación de fármacos con contenido en aminas que se sustituyen en la posición a de glicina (Kingsbury, et al., J. Med. Chem., 1984, 27, 1447) también constituye un ejemplo de espaciadores autoinmoladores útiles en ADC . En una forma de realización, una unidad espadadora es una unidad ramificada bis ( hidroximet il ) estireno (BHMS) como se muestra a continuación, que se puede utilizar para incorporar y liberar múltiples fármacos. escisión enzimática 2 fármacos donde Q es -Ci-C8 alquil, -0- (Ci-C8 alquil), -halógeno, -nitro o -ciano; m es un entero comprendido entre 0 y 4; n es 0 ó 1 ; y los rangos de p oscilan entre 1 y unos 20.
Un enlazador puede comprender uno o más componentes enlazadores anteriores. En determinadas formas de realización, un enlazador es como se muestra entre corchetes en la siguiente Fórmula II de ADC.
Ab—HAa- w-Yy]-D)p II donde A es una unidad de extensión y a es un entero comprendido entre 0 y 1; W es una unidad de aminoácidos y w es un entero comprendido entre 0 y 12; Y es una unidad espadadora e y es 0, 1 ó 2; y Ab, D y p se definen como se ha hecho anteriormente para la Fórmula I. Formas de realización ejemplares de estos enlazadores se describen en US 2005-0238649 Al, que se incorpora expresamente en la presente memoria descriptiva a modo de referencia. Los componentes enlazadores ejemplares y las combinaciones de los mismos se muestran a continuación en el contexto de los ADC de la Fórmula II: Los componentes enlazadores, incluidas las unidades de extensión, espadadora y de aminoácidos, se pueden sintetizar mediante métodos conocidos en el sector, como los descritos en US 2005-0238649 Al. b) Fracciones de fármacos ejemplares (1) Maitansina y maitansinoides En algunas realizaciones, un inmunocon ugado comprende un anticuerpo de la invención conjugado con una o más moléculas de maitansinoides. Los maitansinoides son inhibidores mitóticos que actúan inhibiendo la polimerización de la tubulina. La maitansina se aisló por primera vez del arbusto de África oriental Maytenus serrata (patente de EE.UU. n.° 3896111). Posteriormente, se descubrió que determinados microbios también producían maitansinoides, como el maitansinol y los ásteres de C-3 maitansinol (patente de EE.UU. n.° 4.151.042). El maitansinol sintético y sus derivados y análogos se revelan, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. núms. 4.137.230; 4.248.870; 4.256.746; 4.260.608; 4.265.814; 4.294.757; 4.307.016; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.313.946; 4.315.929; 4.317.821; 4.322.348; 4.331.598; 4.361.650; 4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663; y 4.371.533. Las fracciones de fármacos maitansinoides son fracciones de fármacos que resultan atractivas para la elaboración de conjugados de anticuerpos con fármacos por sus siguientes características: (i) son relativamente accesibles en lo que se refiere a su preparación mediante fermentación, modificación química o derivación de productos de fermentación, (ii) son fáciles de someter a derivación, con grupos funcionales adecuados para conjugación a través de los enlazadores no disulfuro con anticuerpos, (iii) estabilidad en plasma, y (iv) resultan efectivos frente a distintas líneas celulares tumorales. Los compuestos de maitansina aptos para uso como fracciones de fármacos maitansinoides son bien conocidos en el sector y se pueden aislar de fuentes naturales según métodos conocidos o se pueden producir mediante técnicas de ingeniería genética (véase Yu et al. (2002) PNAS 99:7968-7973) . El maitansinol y los análogos del maitansinol también se pueden preparar de forma sintética mediante métodos conocidos . Las fracciones ejemplares de fármacos maitansinoides incluyen los que tienen un anillo aromático modificado, como: C-19-dicloro (Patente de EE.UU. n.° 4256746) (preparado por reducción de ansamitocina P2 mediante hidruro de litio-aluminio) ; C-20-hidroxi (o C-20-dimetil) +/-C-19-dicloro (Patentes de EE.UU. núms . 4361650 y 4307016) (preparado mediante desmetilación utilizando Streptomyces o Actinomyces o declorinación con LAH) ; y C-20-dimetoxi , C-20-aciloxi (-OCOR), +/-dicloro (Patente de EE.UU. n.° 4.294.757) (preparado mediante acilación usando cloruros de acilo) y aquellos que tienen modificaciones en otras posiciones. Entre las fracciones ejemplares de fármacos maitansinoides' también están las que tienen modificaciones como: C-9-SH (Patente de EE.UU. n.° 4424219) (preparado mediante reacción de maitansinol con H2S o P2S5) ; C-14-alcoximetil (dimetoxi/CH2 OR) (US 4331598) ; C-14-hidroximetil o aciloximetil (CH2OH o CH2OAc) (Patente de EE.UU. n.° 4450254) (preparado a partir de Nocardia) ; C-15-hidroxi/aciloxi (US 4364866) (preparado mediante la conversión de maitansinol por Streptomyces); C-15-metoxi (Patentes de EE.UU. núms. 4313946 y 4315929) (aislado a partir de Trewia nudiflora); C-18-N-dimetil (Patentes de EE.UU. núms . 4362663 y 4322348) (preparado por desmetilación de maitansinol por Streptomyces ) ; y 4,5-deoxi (US 4371533) (preparado por la reducción de maitansinol mediante tricloruro de titanio/LAH) .
A continuación se citan algunos ejemplos de formas de realización ejemplares de fracciones de fármacos maitansinoides : DM1; DM3; y DM4, con las estructuras: donde la línea ondulada indica la unión covalente del átomo de sulfuro del fármaco a un enlazador (L) de un conjugado de anticuerpo con fármaco. Se ha hablado de HERCEPTIN® (trastuzumab) enlazado por SMCC a DM1 (documento WO 2005/037992; US 2005/0276812 Al) . Otros conjugados ejemplares de anticuerpo con fármacos maitansinoides tienen las estructuras y abreviaciones siguientes (donde Ab es el anticuerpo y p está comprendido entre 1 y 8 aproximadamente) : Ab-SMCC-DMl Los conjugados ejemplares de anticuerpo con fármaco donde DM1 se enlace a través de un enlazador BMPEO a un grupo tiol del anticuerpo tienen la estructura y abreviación: donde Ab es el anticuerpo; n es 0, 1 ó 2 ; y p es 1, 2, 3 ó 4.
Los inmunoconj ugados que contienen maitansinoides , los métodos para elaborar éstos, y su uso terapéutico se revela, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU núms . 5.208.020, 5.416.064, US 2005/0276812 Al y en la Patente Europea EP 0 425 235 Bl, y lo descrito en las mismas se incorpora expresamente en la presente memoria descriptiva a modo de referencia. Liu et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 93:8618-8623 (1996) describe los inmunoconj ugados que comprenden un maitansinoide denominado DM1 enlazado al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra el cáncer colorrectal humano. Se descubrió que el conjugado era altamente citotóxico para con las células de cáncer de colon en cultivo y demostró actividad ant ineoplásica en ensayos de crecimiento tumoral in vivo. Chari et al. Cáncer Research 52:127-131 (1992) describe inmunoconj ugados en los que un maitansinoide se conjugaba por medio de un enlazado de disulfido al anticuerpo murino A7 que se une a un antigeno en las lineas celulares de cáncer de colon humanas, o a otro anticuerpo monoclonal murino TA.l que se une al oncogen HER-2/neu. La citotoxicidad del conjugado TA .1-maitansinoide se probó in vitro en la linea celular de cáncer de mama SK-BR-3, que expresa 3 x 105 antigenos de superficie HER-2 por célula. El conjugado de fármaco consiguió un alto grado de citotoxicidad similar al fármaco maitansinoide libre, que podría aumentarse si se aumenta el número de moléculas maitansinoides por cada molécula de anticuerpo. El conjugado A7-maitansinoide mostró una citotoxicidad sistémica baja en ratones. Los conjugados de anticuerpo-maitansinoide se preparan mediante enlace químico de un anticuerpo a una molécula de maitansinoide sin hacer que disminuya significativamente la actividad biológica de ambos elementos del conjugado. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. n.° 5.208.020 (lo descrito en la misma se incorpora expresamente en la presente memoria descriptiva a modo de referencia) . Una media de 3-4 moléculas maitansinoides conjugadas por anticuerpo ha mostrado eficacia en la mejora de la citotoxicidad de las células diana sin afectar negativamente a la función o solubilidad del anticuerpo, a pesar de que podría esperarse que incluso una molécula toxina/anticuerpo mejore la citotoxicidad en relación con el uso del anticuerpo desnudo. Los maitansinoides son muy conocidos en la materia y pueden sintetizarse mediante técnicas conocidas o aislarse de fuentes naturales. Se revelan maitansinoides adecuados, por ejemplo, en la patente de EE.UU. N° 5.208.020 y en otras patentes y publicaciones no patentadas a las que se ha hecho referencia anteriormente en la presente memoria descriptiva. Los maitansinoides preferidos son el maitansinol y análogos modificados del maitansinol, en el anillo aromático o en otras posiciones de la molécula de maitansinol, como distintos ésteres del maitansinol. Se conocen muchos grupos de enlace en la materia para producir conjugados maitansinoides de anticuerpos, incluidos, por ejemplo, los revelados en la Patente de Estados Unidos n.° 5208020 o en la Patente Europea 0 425 235 Bl, y Chari et al., Cáncer Research 52:127-131 (1992); y US 2005/016993 Al, y lo descrito en los mismos se incorpora expresamente en la presente memoria descriptiva a modo de referencia. Los conjugados de anticuerpo y maitansinoides que comprenden el componente enlazador S CC pueden ser preparados como se indica en US 2005/0276812 Al, "Conjugados de anticuerpo con fármaco y métodos". Los enlazadores comprenden grupos disulfuro, grupos de tioéteres, grupos lábiles al ácido, grupos fotolábiles, grupos lábiles a la peptidasa o grupos lábiles a la esterasa, como se revelan en las patentes mencionadas anteriormente. En la presente memoria descriptiva se dan ejemplos y se describen enlazadores adicionales. Los conjugados del anticuerpo y el maitansinoide se pueden realizar utilizando una variedad de agentes de unión a proteina bifuncionales como por ejemplo N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil-4- (N-maleimidometil ) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (como el dimetiladipimidato HCI), ásteres activos (por ejemplo, disuccinimidil suberato) , aldehidos (por ejemplo, glutaráldehidos ) , compuestos bis-azido (como bis (p-azidobenzoil ) hexanodiamina) , derivados de bis-diazonio (como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilenodiamina) , diisocianatos (por ejemplo, 2 , ß-diisocianato de tolueno), y compuestos bis-activos de fluoruro (como 1 , 5-difluoruro-2 , -dinitrobenceno) . En algunas formas de realización, el agente de unión que se prefieren sobre todo son N-sucinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 (1978)) y N-sucinimidil-4- (2-piridilditio) pentanoato (SPP) para proporcionar un enlace disulfuro. El enlazador se puede unir a la molécula maitansinoide en varias posiciones, dependiendo del tipo de enlace. Por ejemplo, un enlace con éster se puede formar mediante reacción con un grupo hidroxilo que utilice técnicas de unión convencionales. La reacción puede ocurrir en la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo , la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxilo. En una forma de realización, el enlace se forma en la posición C-3 del maitansinol o un análogo del maitansinol. (2) Auristatinas y dolasta tinas En algunas formas de realización, un inmunoconj ugado comprende un anticuerpo de la invención conjugado con dolastatina o un análogo o derivado peptidico de la dolastatina, por ejemplo, una auristatina (Patentes de EE.UU. núms. 5635483; 5780588) . Se ha establecido que las dolastatinas y las auristatinas interfieren con la dinámica de microtúbulos , la hidrólisis GTP, y la división nuclear y celular ( oyke et al. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45 ( 12 ) : 3580-358 ) y tiene actividad antineoplásica (Patente de EE.UU. n.°5663149) y antifúngica (Pettit et al. (1998) Antimicrob. Agents Che other. 42:2961-2965) . La porción del fármaco auristatina o dolastatina puede estar unida al anticuerpo a través de los extremos terminales N (amino) ó C (carboxil) de la porción peptidica del fármaco (WO 02/088172) . Entre las formas de realización ejemplares de auristatina están las fracciones DE y DF de fármacos de monometilauristatina enlazados al extremo N-terminal, descritas en Senter et al, Proceedings of the American Association for Cáncer Research, Volume 45, Abstract Number 623, presentada el 28 de marzo de 2004, cuya contenido se incorpora expresamente en su totalidad a modo de referencia.
Una fracción peptidica de un fármaco se puede seleccionar entre las Fórmulas DE and DF siguientes: donde la línea ondulada de DE y DF indica el sitio de unión covalente a un anticuerpo o a un componente enlazador a anticuerpo, e independientemente en cada ubicación: R2 se selecciona entre H y Ci-C8 alquil; R3 se selecciona entre H, Ci-C8 alquil, C3-C8 carbociclo, aril, Ci-C8 alquil-aril, Ci-C8 alquil- (C3-C8 carbociclo), C3-C8 heterociclo y Cx-C8 alquil- (C3-C8 heterociclo); R4 se selecciona entre H, Ci-C8 alquil, C3-C8 carbociclo, aril, Ci-C8 alquil-aril, Ci-C8 alquil- (C3-C8 carbociclo), C3-C8 heterociclo y Ci-C8 alquil- (C3-C8 heterociclo); R5 se selecciona entre H y metilo; o R4 y R5 forman conjuntamente un anillo carbocíclico y tienen la fórmula -(CRaRb)n_ donde Ra y Rb se seleccionan independientemente entre H, Ci-C8 alquil y C3-C8 carbociclo, y n se selecciona entre 2, 3, 4, 5 y 6; R6 se selecciona entre H y Ci-C8 alquil; R7 se selecciona entre H, Ci-C8 alquil, C3-C8 carbociclo, aril, Ci-C8 alquil-aril, Ci-C8 alquil- (C3-C8 carbociclo), C3-C8 heterociclo y Ci-C8 alquil- (C3-C8 heterociclo); cada R8 se selecciona independientemente entre H, OH, Ci-C8 alquil, C3-C8 carbociclo y 0-(Ci-C8 alqui); R9 se selecciona entre H y Ci-C8 alquil; R10 se selecciona entre aril o C3-C8 heterociclo; Z es O, S, NH o NRi¿, donde R1¿ es Ci-C8 alquil; R11 se selecciona entre H, C1-C20 alquil, aril, C3-C8 heterociclo, - ( R130) m-R1 , o - ( R130) m-CH ( R15 ) 2 ; m es un entero comprendido entre 1 y 1000; R13 es C2-C8 alquil; R14 es H o Cl-C8 alquil; cada R15 es independientemente H, COOH, - (CH2) n-N (R16) 2, -(CH2)n-S03H, o - (CH2) n-S03-Ci-C8 alquil; cada R16 es independientemente H, Ci-C8 alquil, o -(CH2)n-COOH ; R18 se selecciona entre -C ( R8 ) 2—C ( R8 ) 2—aril , -C ( R8 ) 2-C ( R8 ) 2-(C3-C8 heterociclo), y -C (R8) 2-C (R8) 2- (C3-C8 carbociclo) ; y m es un entero comprendido entre 0 y 6.
En una forma de realización R3, R4 y R7 son independientemente isopropil o sec-butil y R5 es -H o metilo. En una forma ejemplar de realización, R3 y R4 son isopropil, R5 es -H, y R7 es sec-butil. En otra forma de realización, R2 y R6 son metilo y R9 es -H. En otra forma de realización, cada R8 es -0CH3.
En una forma ejemplar de realización, R3 y R4 son isopropilo, R2 y R6 son metilo, R5 es -H, R7 es sec-butil, cada R8 es -OCH3, y R9 es -H. En una forma de realización, Z es -0- o -NH- . En una forma de realización, R10 es aril. En una forma ejemplar de realización, R10 es -fenil. En una forma ejemplar de realización, cuando Z es -O-, R11 es -H, metilo o t-butilo. En una forma de realización, cuando Z es -NH, R11 es -CH(R15)2, donde R15 es - (CH2) n-N (R16) 2, y R16 es -Ci-C8 alquil o -(CH2) n-COOH. En otra forma de realización, cuando Z es -NH, R11 es -CH(R1 )2, donde R15 es - (CH2) n-S03H .
Una forma ejemplar de realización con auristatina de la fórmula DE es MMAE, donde la linea ondulada indica la unión covalente a un enlazador (L) de un conjugado de anticuerpo con fármaco: MMAE Una forma ejemplar de realización con auristatina de la fórmula DF es MMAF, donde la linea ondulada indica la unión covalente a un enlazador (L) de un conjugado de anticuerpo con fármaco (véase US 2005/0238649 y Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124): Otras fracciones de fármaco incluyen los siguientes derivados de MMAF, donde la linea ondulada indica la unión covalente a un enlazador (L) de un conjugado de anticuerpo con fármaco: En un aspecto, los grupos hidrofílicos que incluyen ésteres de glicol trietileno (TEG) , como se muestra anteriormente, se pueden unir a la fracción del fármaco en R . Sin unión mediante una teoría concreta, los grupos hidrofilicos ayudan a la internalización y no aglomeración de la fracción del fármaco. Las formas ejemplares de realización de los ADC de la Fórmula I que comprenden una auristatina/dolastatina o un derivado de la misma se describen en US 2005-0238649 Al y Doronina et al. (2006) Bioconjugaté Chem . 17:114-124, que se incorpora expresamente en la presente memoria descriptiva a modo de referencia. Formas ejemplares de realización de los ADC de Fórmula I que comprenden MMAE o MMAF y diversos componentes enlazadores tienen las siguientes estructuras y abreviaciones (donde "Ab" es un anticuerpo; p está comprendido entre 1 y 8 aproximadamente, "Val-Cit" es un dipéptido valina-citrulina ; y "S" es un átomo de sulfuro.
Ab-MC-vc-PAB-MMAF Ab-MC-vc-PAB-MMAE Ab-MC-MMAE Ab-MC-MMAF Las formas de realización ejemplares de los ADC de la Fórmula I que comprenden MMAF y varios componentes enlazadores incluyen, además, Ab-MC- PAB-MMAF y Ab-PAB-MMAF. Es interesante señalar que se ha demostrado que los inmunocon ugados que comprenden MMAF unido a un anticuerpo mediante un enlazador que no sea proteoliticamente escindible poseen una actividad similar a la de los inmunoconj ugados que comprenden MMAF unido a un anticuerpo mediante un enlazador proteoliticamente escindible. Véase Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124. En estas sustancias, se cree que la liberación del fármaco se efectúa mediante la degradación del anticuerpo en la célula. Id.
Por lo general, las porciones de fármacos basadas en péptidos pueden prepararse formando un enlace peptidico entre uno o más aminoácidos y/o fragmentos de péptidos. Estos enlaces peptidicos pueden prepararse, por ejemplo, de acuerdo con el método de síntesis de fase líquida (véase E. Schróder y K. Lübke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press) que es bien conocido en el campo de la química de péptidos. Las porciones de fármacos auristatina/dolastatina pueden prepararse de acuerdo con los métodos siguientes: US 2005-0238649 Al; Patente de EE.UU. n.° 5635483; Patente de EE.UU. n.° 5780588; Pettit et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettit et al. (1998) Anti-cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G.R., et al. Synthesis, 1996, 719-725; Pettit et al. (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863; y Doronina (2003) Wat. Biotechnol. 21 (7) :778-784. En concreto, las fracciones de fármacos auristatina/dolastatina de la fórmula DF, como MMAF y derivados de la misma, se pueden preparar usando métodos descritos en US 2005-0238649 Al y Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124. Las fracciones de fármacos auristatina/dolastatina de la fórmula DE, como MMAE y derivados de las mismas, se pueden preparar usando métodos descritos en Doronina et al. (2003) Wat. Biotech. 21:778-784. Las fracciones del enlazador a fármacos MC-MMAF , MC-MMAE, C-vc-PAB-MMAF y MC-vc-PAB-MMAE se pueden sintetizar cómodamente mediante métodos habituales, por ejemplo, como se describe en Doronina et al. (2003) Nat. Biotech. 21:778-784, y la publicación de la Solicitud de Patente n.° US 2005/0238649 Al, y, luego conjugar con un anticuerpo de interés . (3) Caliqueamicina En algunas realizaciones, el inmunoconj ugado comprende un anticuerpo de la invención conjugado con una o más moléculas de calicheamicina . La familia de antibióticos de la calicheamicina es capaz de producir la ruptura del ADN de hebra doble en concentraciones por debajo de picomolar. Para la preparación de conjugados de la familia de la caliqueamicina, véanse las patentes de EE.UU. núms . 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001, 5.877.296 (todas para American Cyanamid Company) . Entre los análogos estructurales de la calicheamicina que se pueden utilizar están ??1, 2?, OÍ31 , N-acetil-??1, PSAG y T1! (Hinman et al., Cáncer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cáncer Research 58:2925-2928 (1998) y las Patentes de EE.UU. anteriormente mencionadas para American Cyanamid) . Otro fármaco antineoplásico con el que es posible conjugar el anticuerpo es QFA que es un atifolato. Tanto la caliqueamicina como el QFA tienen puntos intracelulares de acción y no atraviesan fácilmente la membrana plasmática. Por ello, la absorción celular de estos agentes a través de la internalización mediada por el anticuerpo potencia enormemente sus efectos citotóxicos . c) Otros agentes citotóxicos Otros agentes antitumorales que se pueden conjugar con los anticuerpos de la invención incluyen BCNU, estreptozoicina, vincristina y 5-fluorouracilo , la familia de agentes conocidos colectivamente como complejo LL-E33288 descrito en las Patentes de EE.UU. núms . 5.053.394, 5.770.710, asi como las esperamicinas (Patente de EE.UU. n.° 5.877.296) . Las toxinas enzimáticamente activas y los fragmentos de las mismas que se pueden utilizar incluyen cadena de difteria A, fragmentos activos sin unión de la toxina de la difteria, cadena de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena de ricina A, cadena de abrina A, cadena de modecina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor de la omordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de la Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina , restrictocina , fenomicina, enomicina y el tricotecenos . Véase, por ejemplo, el documento WO 93/21232 publicado el 28 de octubre de 1993. Esta invención también contempla un inmunocon j ugado formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolítica (por ejemplo, una ribonucleasa o una endonucleasa de ADN como por ejemplo la desoxiribonucleasa; ADNasa) . En determinadas formas de realización, un inmunoconj ugado puede contener un átomo muy radioactivo. Hay disponibles una variedad de isótopos radiactivos para la producción de anticuerpos radioconj ugados . Ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radiactivos de Lu . Cuando el inmunoconj ugado se utiliza para la detección, puede comprender un átomo radioactivo para gammagrafía, por ejemplo TC99m o I123, una etiqueta rotatoria para resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como diagnóstico por imágenes obtenidas mediante resonancia magnética) , como yodo-123, yodo-131, indio-111, fluorina-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxigeno-17, gadolinio, manganeso o hierro. Pueden incorporarse etiquetas radiactivas o de otro tipo al inmunoconj ugado utilizando las formas conocidas. Por ejemplo, el péptido se puede biosinteti zar o sintetizar mediante síntesis química de aminoácidos utilizando precursores adecuados de aminoácidos que contengan, por ejemplo, fluorina-19 en vez de hidrógeno. Etiquetas como TC99m o I123, .Re186, Re188 e In111 se pueden unir a través de un residuo de cisteína en el péptido. El itrio-90 puede unirse a través de un residuo de lisina. El método IODOGEN (Fraker et al. (1978) Biochem. Biophys . Res. Commun. 80: 49-57 se puede utilizar para incorporar yodo-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Anticuerpos monoclonales en inmunogammagrafía ) (Chatal, CRC Press 1989) describe otros métodos detalladamente. En determinadas formas de realización, un inmunoconj ugado puede comprender un anticuerpo anti-TAT226 de la invención conjugado con una enzima activadora del profármaco que convierte un profármaco (por ejemplo, un agente quimioterapéutico peptidil, véase el documento O 81/01145) en un fármaco activo, como un antineoplásico . Estos inmunoconj ugados son útiles en el tratamiento con un profármaco mediado por enzimas y dependiente de anticuerpos ("ADEPT") . Las enzimas que se pueden conjugar con un anticuerpo anti-TAT226 de la presente invención incluyen fosfatasas alcalinas, útiles para convertir los profármacos que contienen fosfatasa en fármacos libres; arilsulfatasas , útiles para convertir los profármacos que contienen sulfato en fármacos libres; citosina deamínasa, útil para convertir 5-fluorocitosine no tóxica en el antineoplásico, 5-fluorouracil ; proteasas, como serratia proteasa, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (como catepsinas B y L) , que son útiles para convertir profármacos que contienen péptidos en fármacos libres; D-alanilcarboxipept idasas , útiles para convertir profármacos que contienen sustituyentes D-aminoácido; enzimas que escinden carbohidratos, como ß-galactosidasa y neuraminidasa, útiles para convertir los profármacos glicosilados en fármacos libres; ß-lactamasa, útil para convertir fármacos derivados de ß-lactamasa en fármacos libres; y penicilina amidasas, como penicilina V amidasa y penicilina G amidasa, útiles para convertir fármacos derivados en sus nitrógenos de amino de grupos fenoxiacetil o fenilacetil, respectivamente, en fármacos libres. Las enzimas se pueden unir covalentemente a los anticuerpos anti-TAT226 de la invención mediante técnicas de ADN recombinante bien conocidas en el sector.
Véase, por ejemplo, Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984) . d) Concentración del fármaco La concentración del fármaco se representa mediante p, el promedio de fracciones de fármaco por anticuerpo en una molécula de la Fórmula I. La concentración del fármaco puede oscilar entre 1 y 20 fracciones de fármaco (D) por anticuerpo. Los ADC de la Fórmula I incluyen conjuntos de anticuerpos conjugados con una variedad de fracciones de fármaco, de 1 a 20. El promedio de fracciones de fármaco por anticuerpo en preparaciones de ADC procedentes de reacciones de la conjugación se puede determinar mediante medios convencionales, como espectroscopia de masas, ensayo ELISA y HPLC. También se puede determinar la distribución cuantitativa de ADC en función de p. En algunos ejemplos, la separación, purificación y determinación del ADC homogéneo, donde p es un valor determinado de ADC con otras concentraciones de fármaco se puede lograr por métodos como HPLC de fase reversa o electroforesis . En el caso de algunos conjugados de anticuerpos con fármacos, p puede verse limitado por el número de sitios de unión en el anticuerpo. Por ejemplo, cuando la unión es un tiol de la cisteina, como en las formas de realización ejemplares anteriores, puede que un anticuerpo sólo tenga uno o varios grupos tiol de la cisteina, o puede tener sólo uno o varios grupos tiol suficientemente reactivos a través de los cuales se puede unir un enlazador. En algunas formas de realización, una concentración más alta de fármaco, por ejemplo, p > 5, puede causar agregación, insolubilidad, toxicidad o pérdida de permeabilidad celular de determinados conjugados de anticuerpos con fármacos. En determinadas formas de realización, la concentración de fármaco para un ADC de la invención oscila entre 1 y unos 8, entre unos 2 y unos 6 o entre unos 3 y unos 5. De hecho, se ha demostrado que para determinados ADC, la proporción óptima de fracciones de fármaco por anticuerpo puede ser inferior a 8 y puede estar entre 2 y 5 aproximadamente. Véase US 2005-0238649 Al.
En determinadas formas de realización, un número menor al máximo teórico d fracciones de fármacos se conjuga con un anticuerpo durante una reacción de conjugación. Un anticuerpo puede contener, por ejemplo, residuos de lisina que no reacciona con el enlazador a fármaco intermedio o el reactivo del enlazador, como se señala más adelante. Por lo general, los anticuerpos no contienen muchos grupos tioles de la cisteína libres y reactivos que se puedan unir a una fracción de fármaco; de hecho, la mayoría de los residuos tiol de la cisteína en anticuerpos están en forma de puentes disulfuro. En determinadas formas de realización, un anticuerpo se puede reducir con un agente reductor como ditiotreitol (DTT) o tricarboniletilfosfina (TCEP) , en condiciones totales o parciales de reducción, para generar grupos tiol de cisteína reactivos. En determinadas formas de realización, un anticuerpo está sujeto a condiciones desnaturalizantes para revelar grupos nucleofílieos reactivos como lisina o cisteína . La concentración (proporción fármaco/anticuerpo) de un ADC se puede controlar de distintas formas, por ejemplo: (i) limitando el exceso molar del enlazador a fármaco intermedio o reactivo enlazador con respecto al anticuerpo, (ii) limitando el tiempo o temperatura de reacción de la conjugación y (iii) medainte condiciones reductivas parciales o limitadas para la modificación del tiol de la cisteína. Hay que comprender que, cuando más de un grupo nucleofílico reacciona con un enlazador a fármaco intermedio o a un reactivo enlazador seguido por el reactivo de la fracción del fármaco, el producto resultante es una mezcla de compuestos de ADC con una distribución de una o más fracciones de fármaco unidas a un anticuerpo. El promedio de fármacos por anticuerpo se puede calcular a partir de la mezcla mediante un ensayo ELISA dual con anticuerpos, que sea especifico para el anticuerpo y especifico para el fármaco. Las moléculas de ADC individuales se pueden identificar en la mezcla mediante espectroscopia de masas y separar mediante HPLC, por ejemplo, cromatografía de interacción hidrófoba (véase, por ejemplo, Hamblett, K.J., et al., "Effect of drug loading on the pharmacology , pharmacokinet ics , and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjúgate," Abstract No. 624, American Association for Cáncer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004; Alley, S.C., et al., "Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates," Abstract No. 627, American Association for Cáncer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004) . En determinadas formas de realización, un ADC homogéneo con un único valor de concentración se puede aislar de la mezcla de la conjugación mediante electroforesis o cromatografía. e) Algunos métodos de preparación de inmunocon ugados Un ADC de la formula I se pueden preparar por varios medios, empleando reacciones químicas orgánicas, condiciones y reactivos conocidos por los expertos, como: (1) una reacción de un grupo nucleofílico de un anticuerpo con un agente enlazador bivalente, para formar un Ab-L, mediante una unión bivalente, seguida de la reacción con una fracción del fármaco D; y (2) una reacción de un grupo nucleofílico de una fracción del fármaco ccn un reactivo enlazador bivalente, para formar D-L, mediante un enlace covalente, seguido de la reacción con un grupo nucleofílico del anticuerpo. Los métodos ejemplares de preparación de un ADC de la Fórmula I por medio de la última vía se describen en US 2005-0238649 Al, que se incorpora expresamente a la presente memoria descriptiva a modo de referencia. Los grupos nucleofí lieos en los anticuerpos incluyen: (i) grupos amino N-terminal, (ii) grupos amino de la cadena lateral, por ej . lisina, (iii) grupos tiol de la cadena lateral, por e . cisterna, y (iv) grupos amino o hidroxilo de azúcares donde el anticuerpo es glicosilado. Los grupos amino, tiol e hidroxilo son nucleofí lieos y son capaces de reaccionar para formar uniones covalentes con grupos electrofilicos en las porciones del enlazador y los reactivos enlazadoras, que incluyen: (i) ésteres activos como los ésteres NHS, los ésteres HOBt, haloformos, y haluro de ácido; (ii) haluros de alquilo y bencilo como las haloacetamidas ; (iii) aldehidos, cetonas, carboxilo, y grupos maleimidos . Ciertos anticuerpos contienen bisulfuros de intercadena reducible, es decir, puentes de cisteina. Se puede hacer que los anticuerpos sean reactivos para la conjugación con reactivos del enlazador mediante tratamiento con un agente reductor como DTT (ditiotreitol ) o tricarboniletilfosfina (TCEP) , de forma que el anticuerpo quede total o parcialmente reducido. Por lo tanto, cada puente de cisteina formará, en teoría, dos nucleofilos tiol reactivos. Los grupos nucleofilicos adicionales pueden introducirse en los anticuerpos a través de la modificación de las lisinas residuales, por ejemplo, mediante reacción de residuos de lisina con 2-iminotiolano (reactivo de Traut) lo que da lugar a la conversión de una amina en un tiol. Los grupos tiol reactivos pueden ser introducidos en un anticuerpo (o un fragmento del mismo) mediante la introducción de uno, dos, tres, cuatro o mas residuos de cisteina (por ej . preparando variantes de anticuerpos que comprendan uno o más residuos de aminoácidos de cisteinas no nativas). Los conjugados de anticuerpos con fármacos de la invención también se pueden producir mediante reacción entre un grupo electrofilico en un anticuerpo, como un grupo carbonilo cetona o aldehido, con un grupo nucleofilico en un fármaco o reactivo enlazador. Entre los grupos nucleofilicos útiles en un reactivo enlazador están hidracida, oxima, amina, hidrazina, tiosemicarbazona , carboxilato de hidrazina y arilhidrazida . En una forma de realización, un anticuerpo se modifica para introducir fracciones electrofilicas que puedan reaccionar con sustituyentes nucleofilicos en el fármaco o reactivo enlazador. En otra forma de realización, los azúcares de los anticuerpos glicosilados pueden oxidarse, por ej . con reactivos oxidantes de periodato, a fin de formar grupos cetonas o aldehidos, los cuales pueden reaccionar con el grupo amina de los reactivos enlazadores o las fracciones del fármaco. Los grupos resultantes de amina base de Schiff pueden formar un ligamiento estable, o pueden reducirse, por ej . mediante los reactivos de hidruro de boro para formar enlaces amina estables. En una forma de realización, la reacción de la porción carbohidratada de un anticuerpo glicosilado, ya sea con galactosa oxidasa o con metaperiodato de sodio, puede producir grupos de carbonilo (aldehidos y cetonas) en el anticuerpo que pueden reaccionar con los grupos apropiados en el fármaco (técnicas de bioconjugado de Hermanson) . En otra forma de realización, los anticuerpos que contienen residuos de serina o treonina N-terminal pueden reaccionar con metaperiodato de sodio, lo que da lugar a la producción de un aldehido en lugar del primer aminoácido (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; US 5362852). Este aldehido se puede hacer que reaccione con un fragmento de fármaco o un nucleófilo enlazador. Los grupos nucleofilicos en una fracción del fármaco incluyen los siguientes compuestos: los grupos amino, tiol, hidroxilo, hidracida, oxima, hidracina, tiosemicarbazona , carboxilato de hidracina y aril-hidracida , capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrofilicos en las fracciones enlazadoras y reactivos enlazadores, que incluyen: (i) ásteres activos como los ésteres NHS, los ésteres HOBt, haloformos, y haluro de ácido; (ii) haluros de alquilo y bencilo como las haloacetamidas ; (iii) aldehidos, cetonas, carboxilo, y grupos maleimidos. Los compuestos de la invención contemplan expresamente el ADC preparado con los reactivos reticulares siguientes: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB y SVSB ( sucinimidil-( 4 -vinilsulfona ) benzoata ) que está comercializado (por ejemplo, por Pierce Biotechnology , Inc., Rockford, IL., EE.UU; véanse páginas 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog.) . Los inmunoconj ugados que comprenden un anticuerpo y un agente citotóxico se pueden también realizar utilizando una variedad de agentes de unión a proteina bifuncionales como por ejemplo N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) , succinimidil- - (N-maleimidometil ) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (como el dimet iladipimidato HCI), ésteres activos (por ejemplo, disuccinimidil suberato) , aldehidos (por ejemplo, glutaráldehidos ) , compuestos bis-azido (como bis (p-azidobenzoil ) hexanodiamina) , derivados de bis-diazonio (como bis- (p-diazoniobenzoil ) -et ilenodiamina ) , diisocianatos (por ejemplo, 2 , 6-diisocianato de tolueno), y compuestos bis-activos de fluoruro (como 1 , 5-difluoruro-2 , 4 -dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina se puede preparar tal y como se describe en Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987) . El ácido triaminopentaacét ico 1-isot iocianatobencil-3-met ildiet ileno marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un ejemplo de agente quelante para la conjugación de un radionucleótido al anticuerpo. Véase el documento O94/11026. Alternativamente, se puede realizar una fusión de proteínas que contengan un anticuerpo y un agente citotóxico, por ej. mediante técnicas recombinantes o síntesis de péptidos. Una molécula de ADN recombinante puede incluir regiones que codifiquen el anticuerpo y las porciones citotóxicas del conjugado, ya sea adyacente uno a otro o en forma separada por una región que codifica un péptido de enlace, el cual no destruye las propiedades deseadas del conj ugado . En otra forma de realización, un anticuerpo puede conjugarse con un "receptor" (como la estreptavidina ) y actuar previamente contra el tumor, donde se administra al paciente el conjugado receptor del anticuerpo, luego, se elimina de la circulación el conjugado no unido, utilizando un agente de eliminación, y posteriormente se administra un "ligando" (por ej . la avidina) que se conjuga con un agente citotóxico (por ej . un radionucleótido) .
D. Formulaciones farmacéuticas En un aspecto, la invención proporciona, además, formulaciones farmacéuticas que comprenden al menos un anticuerpo anti-TAT226 de la invención y/o al menos un inmunoconj ugado del mismo. En algunas formas de realización, una formulación farmacéutica comprende 1) un anticuerpo anti-TAT226 y/o un inmunoconj ugado del mismo y 2) un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas formas de realización, una formulación farmacéutica comprende 1) un anticuerpo anti-TAT226 y/o un inmunoconj ugado del mismo y 2) al menos, un agente terapéutico adicional. Otros agentes terapéuticos adicionales incluyen los descritos más adelante en el apartado E.2. Las formulaciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo o inmunoconj ugado de la invención se preparan para su almacenamiento mezclando el anticuerpo o inmunoconj ugado que tenga el grado de pureza deseado con vehículos, excipientes o estabilizadores opcionales que sean fisiológicamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Editores (1980)), en forma de formulaciones acuosas, liofilizadas u otras formulaciones liofilizadas . Los vehículos, excipientes, o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en todas las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen soluciones tamponadas tales como fosfato, citrato, histidina y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (como por ejemplo, cloruro amonio de octadecildimetilbencilo; cloruro de hexametonio ; cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio; alcohol bencilo, fenol o butilo benzil alcohol; alquil parabeno como el metal o propel parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol ; 3-pentanol; y m-cresol) ; bajo peso molecular (menos de 10 residuos) polipéptidos ; proteínas, como cera albúmina, gelatina, o inmunoglobulinas ; polímetros hidroilicos como la polivinilpirrolidone; aminoácidos como glicerina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacaridos , disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes como la EDTA; azúcares como sucrosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contra-iones de formación salina como el sodio; complejos metálicos (por ej . complejos Zn-proteína) ; y/o tensoactivos no surfactantes como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG) . Las formulaciones farmacéuticas para administrar in vivo deben ser, por lo general, estériles. Esto se logra mediante la filtración a través de membranas de filtración estériles.
Los principios activos también se pueden atrapar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y poli-(met ilmetacrilato ) , respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nanopart iculas y nanocápsulas ) , o en macroemulsiones . Dichas técnicas se muestran en Remington ' s Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Oslo, A., Ed., (1980) . Se pueden preparar preparaciones de liberación controlada. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación controlada incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo o inmunoconj ugado de la invención, cuyas matrices están en forma de elementos moldeados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación controlada incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli- (2-hidroxietil-metacrilato) , o poli- ( vinilalcohol ) ) , poliláctidos (Patente de EE.UU. n.° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y ? etil-L-glutamato, acetato de etilenvinilo no degradable, copolímeros degradables de ácido glicólico-ácido láctico como por ejemplo LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas por copolímeros de ácido glicólico-ácido láctico y acetato de leuprolida), y ácido poli-D- ( - ) -3-hidroxibutí rico . Mientras que los polímeros tales como el acetato de etilenvinilo y el ácido glicólico-ácido láctico permiten la liberación de moléculas durante un periodo de más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos o inmunocon ugados encapsulados permanecen en el organismo por un largo periodo de tiempo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición la humedad a 37 °C, resultando enana perdida de la actividad biológica y en posibles cambios en la inmunogenicidad . Es posible idear estrategias racionales para su estabilización, dependiendo del mecanismo involucrado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es de formación de uniones intermoleculares S-S mediante el intercambio tio-disulfuro, se puede lograr la estabilización modificando los residuos sulfidrilos, liofilizando a partir de soluciones acídicas, controlando la humedad, utilizando aditivos adecuados y desarrollando composiciones de matrices de polímeros específicas.
E. Métodos de utilización de anticuerpos anti-TAT226 e inmunoconjugados 1. Métodos diagnósticos y métodos de detección En un aspecto, los anticuerpos anti-TAT226 y los inmunoconj ugados de la invención son útiles para detectar la presencia de TAT226 en una muestra biológica. Por "detectar" se entiende en la presente memoria descriptiva una detección cuantitativa o cualitativa. En determinadas formas de realización, una muestra biológica comprende un tejido o célula, como los tejidos enumerados en la Figura 13. En algunas formas de realización, estos tejidos incluyen tejidos normales y/o cancerosos que expresan TAT226 a niveles más altos que en otros tejidos, por ejemplo, tejido de ovario, riñon, cerebro, endometrial, suprarrenal, óseo, pulmonar, cutáneo y tejidos blandos. En un aspecto, la invención proporciona un método de detección de la presencia de TAT226 en una muestra biológica. En determinadas formas de realización, el método comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo anti-TAT226 en condiciones que faciliten la unión del anticuerpo anti-TAT226 a TAT226 y detectar si se ha formado un complejo entre el anticuerpo anti-TAT226 y TAT226.
En un aspecto, la invención proporciona un método de diagnóstico de un trastorno asociado a un aumento de la expresión de TAT226. En algunas formas de realización, el método supone poner en contacto una célula de prueba con un anticuerpo anti-TAT226 ; determinar el nivel de expresión (bien cuantitativo o cualitativo) de TAT226 por la célula de prueba mediante detección de la unión del anticuerpo anti-TAT226 a TAT226; y comparar el nivel de expresión de TAT226 por la célula de prueba con el nivel de expresión de TAT226 por una célula de control (por ejemplo, una célula normal del mismo origen tisular que la célula de prueba o una célula que exprese TAT226 a niveles similares a dicha célula normal), donde un nivel más alto de expresión de TAT226 por la célula de prueba con respecto a la célula de control indica la presencia de un trastorno asociado a un aumento de la expresión de TAT226. En determinadas formas de realización, la célula de prueba se obtiene a partir de un sujeto que posiblemente tenga un trastorno asociado a un aumento de la expresión de TAT226. En algunas formas de realización, el trastorno es un trastorno de proliferación celular, como un cáncer o un tumor. Entre los ejemplos de trastornos de proliferación celular que se pueden diagnosticar utilizando un anticuerpo de la invención están tumores, por ejemplo, carcinomas (tumores epiteliales) y blastomas (tumores derivados de tejido embrionario), y, en algunas formas de realización, cáncer de ovario, cáncer de útero (incluido cáncer endometrial ) , y cáncer de riñon, incluidos nefroblastomas (por ejemplo, tumor de Wilms) . El cáncer de ovario, en concreto, engloba a un grupo heterogéneo de tumores malignos derivados del ovario. Aproximadamente el 90% de los tumores malignos de ovario son de origen epitelial; el resto son tumores estromales y de linea germinal. Los tumores epiteliales de ovario se clasifican en los siguientes subtipos histológicos: adenocarcinomas serosos (que constituyen un 50% aproximadamente de los tumores epiteliales de ovario); adenocarcinomas endometrioides (-20%); adenocarcinomas mucinos (-10%) ; carcinomas de células claras (~5-10%); tumores de Brenner (células transicionales ) (relativamente poco frecuente),. El pronóstico del cáncer de ovario, que es el sexto más frecuente en mujeres, suele ser malo, con tasas de supervivencia a los cinco años que oscilan entre 5-30%. Para revisiones del cáncer de ovario, véase Fox et al., (2002) "Pathology of epithelial ovarían cáncer," en Ovarían Cáncer ch. 9 (Jacobs et al., eds . , Oxford University Press, New York) ; Morin et al. (2001) "Ovarían Cáncer," en Encyclopedic Reference of Cáncer, pp.654-656 (Schwab, ed., Springer-Verlag , New York) . La presente invención considera métodos de diagnóstico o tratamiento de cualquiera de los subtipos epiteliales de tumor de ovario descritos anteriormente y, en concreto, del subtipo adenocarcinoma seroso . En determinadas formas de realización, un método de diagnóstico o detección, como los descritos anteriormente, comprende la detección de la unión de un anticuerpo anti-TAT226 a TAT226 expresado en la superficie de una célula o en una preparación de membrana obtenida de una célula que exprese TAT226 en su superficie. En determinadas formas de realización, el método comprende poner en contacto una célula con un anticuerpo anti-TAT226 en condiciones que faciliten la unión del anticuerpo anti-TAT226 a TAT226 y detectar si se ha formado un complejo entre el anticuerpo anti-TAT226 y TAT226 en la superficie celular. Un ensayo ejemplar para la detección de la unión de un anticuerpo anti-TAT226 a TAT22 6 que expresaba TAT226 en la superficie de una célula es un ensayo "FACS", como el descrito en el Ejemplo D, más adelante . Se pueden utilizar otros métodos para detectar la unión de anticuerpos anti-TAT226 a TAT226. Estos métodos incluyen ensayos de unión a antigeno que son bien conocidos en el sector, como Western blot, radioinmunoensayos , ELISA (ensayos de inmunoabsorción enzimática), inmunoensayos tipo "sandwich", ensayos de inmunoprecipitación, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteina A y ensayos inmunohistoquimicos (IHC). En determinadas formas de realización, los anticuerpos anti-TAT226 están marcados. Los marcadores incluyen marcas o fracciones que se detectan directamente (como marcadores fluorescentes, cromofóricos , densos en electrones, quimioluminescentes y radioacivos ) , asi como fracciones, como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, por ejemplo, mediante una reacción enzimática o interacción molecular. Ejemplos de estos marcadores son los radioisótopos 32P, 1 C, 125I, 3H y 131I, fluoroforos como algunos quelantes tórreos raros o fluoresceina y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansil, umbeliferon, luceriferasas (por ejemplo, luciferasa de la luciérnaga y luciferasa bacteriana (Patente de EE.UU. n.° 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalazinadionas , peroxidasa de rábano picante (HRP) , fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa , glucoamilasa, lisozima, oxidasas sacáridas, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa , oxidasas heterocí clicas como uricasa y xantina oxidasa, acopladas con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de tinte como HRP, lactoperoxidasa , o microperoxidasa, biot ina/avidina , marcadores rotatorios, marcadores bacteriófagos, radicales libres estables y similares . En algunas formas de realización, los anticuerpos anti-TAT226 están inmovilizados en una matriz insoluble. La inmovilización supone separar el anticuerpo anti-TAT226 de cualquier TAT226 que permanezca libre en solución. Tradicionalmente , esto se consigue bien insolubilizando el anticuerpo anti-TAT226 antes del procedimiento de ensayo, como mediante adsorción en una superficie o matriz insoluble a agua (Bennich et al.., EE.UU. 3.720.760), mediante acoplamiento covalente (por ejemplo, usando reticulación con glutaraldehido) , o mediante insolubilización del anticuerpo anti-TAT226 después de la formación de un complejo entre el anticuerpo anti-TAT226 y TAT226, por ejemplo, mediante inmunoprecipitación . Cualquiera de las formas de realización anteriores para diagnóstico o detección se pueden llevar a cabo utilizando un inmunoconj ugado de la invención en lugar de un anticuerpo anti-TAT226 o en adición a él. 2. Métodos terapéuticos Un anticuerpo o inmunoconj ugado de la invención se pueden usar, por ejemplo, en métodos terapéuticos in vitro, ex vivo e in vivo. En un aspecto, la invención proporciona métodos para inhibir el crecimiento o la proliferación celular bien in vivo o in vitro y dicho método comprende la exposición de una célula a un anticuerpo anti-TAT226 o un inmunoconj ugado del mismo en condiciones que faciliten la unión del inmunoconj ugado a TAT226. "Inhibir el crecimiento o proliferación celular" supone reducir el crecimiento o proliferación de una célula en al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 100% e incluye inducir la muerte celular. En algunas formas de realización, la célula es una célula tumoral. En algunas formas de realización, la célula es una célula de tumor en ovario, una célula de tumor en útero, una célula de tumor cerebral o una célula de un tumor de riñon. En algunas formas de realización, la célula es un xenotrasplante , por ejemplo, como se ejemplifica en la presente memoria descriptiva. En un aspecto, un anticuerpo o inmunoconj ugado de la invención se usa para tratar o prevenir un trastorno de proliferación celular. En determinadas formas de realización, el trastorno de proliferación celular se asocia a un aumento de la expresión y/o actividad de TAT226. Por ejemplo, en determinadas formas de realización, el trastorno de proliferación celular se asocia a un aumento de la expresión de TAT226 en la superficie de una célula. En determinadas formas de realización, el trastorno de proliferación celular es un tumor o un cáncer. Entre los ejemplos de trastornos de proliferación celular que se pueden tratar mediante los anticuerpos o inmunoconj ugados de la invención están tumores, por ejemplo, carcinomas (tumores epiteliales) y blastomas (tumores derivados de tejido embrionario) , y, en algunas formas de realización, cáncer de ovario, cáncer de útero (incluido cáncer endometr ial ) , tumores cerebrales (por ejemplo, astrocitomas , que abarcan gliomas en fase avanzada, también conocidos como glioblastoma multiforme) y cáncer de riñon, incluidos nefroblastomas (por ejemplo, tumor de Wilms) . En un aspecto, la invención proporciona métodos para el tratamiento de un trastorno de proliferación celular que comprende la administración a un sujeto de una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-TAT226 o inmunoconj ugado del mismo. En determinadas formas de realización, un método para el tratamiento de un trastorno de proliferación celular supone la administración a un sujeto de una cantidad eficaz de una formulación farmacéutica que comprenda un anticuerpo anti-TAT226 y, opcionalmente, al menos un agente terapéutico adicional, como los proporcionados más adelante. En determinadas formas de realización, un método para el tratamiento de un trastorno de proliferación celular supone la administración a un sujeto de una cantidad eficaz de una formulación farmacéutica que comprenda 1) un inmunoconj ugado que contenga un anticuerpo anti-TAT226 y un agente citotóxico, y, opcionalmente, 2) al menos un agente terapéutico adicional, como los proporcionados más adelante.
En un aspecto, al menos algunos de los anticuerpos o inmunoconj ugados de la invención se pueden unir a TAT226 de especies distintas a la humana. Por consiguiente, los anticuerpos o inmunoconj ugados de la invención pueden usarse para unirse a TAT226, por ejemplo, en un cultivo celular que contenga TAT226, en humanos o en otros mamíferos que tengan un TAT226 con el que un anticuerpo o inmunoconj ugado de la invención reaccione (ej . chimpancé, babuino, tití, macaco de Java y macaco de la India, cerdo o ratón) . En una forma de realización, un anticuerpo anti-TAT226 o inmunoconj ugado se puede utilizar para inhibir una actividad de TAT226 haciendo entrar en contacto el anticuerpo o inmunoconj ugado con TAT226, de forma que la actividad de TAT226 se inhibe. En una forma de realización, el TAT226 es TAT226 humano. En una forma de realización, un anticuerpo anti-TAT226 o un inmunoconj ugado se puede utilizar en un método para unir TAT226 en un sujeto que padezca un trastorno asociado a un aumento de la expresión y/o actividad de TAT226 y dicho método comprende la administración al sujeto del anticuerpo o inmunoconj ugado de forma que, en el sujeto, se une TAT226. En una forma de realización, TAT226 es TAT226 humano y el sujeto es un humano. Alternativamente, el sujeto puede ser un mamífero que exprese TAT226 al que se une un anticuerpo anti-TAT226. Además, el sujeto puede ser un mamífero al que se le ha introducido TAT226 (ej . mediante la administración de TAT226 o mediante la expresión de un trasgén que codifique TAT226) . Un anticuerpo anti-TAT226 o un inmunoconj ugado se puede administrar a un humano con fines terapéuticos. Además, un anticuerpo anti-TAT226 o un inmunoconj ugado de la invención se puede administrar a mamíferos no humanos que expresan TAT226 con el que el anticuerpo reaccione (ej . primate, cerdo, rata o ratón) para fines veterinarios o como modelo animal de una enfermedad humana. Sobre esto último, dichos modelos animales pueden ser útiles para evaluar la eficacia terapéutica de los anticuerpos o inmunoconj ugados de la invención (ej . pruebas de dosis y periodos de administración) . Los anticuerpos o inmunoconj ugados de la invención se pueden usar solos o junto con otras composiciones en un tratamiento. Por ejemplo, un anticuerpo o inmunoconj ugado de la invención se puede administrar conjuntamente con al menos un agente terapéutico adicional y/o adyuvante. En algunas formas de realización, un agente terapéutico adicional es un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico o un agente inhibidor del crecimiento. En una de estas formas de realización, un agente quimioterapéutico es un agente o una combinación de agentes usados en el tratamiento del cáncer de ovario, como un compuesto de platino (por ejemplo, cisplatino o carboplatino ) ; un taxano (por ejemplo, paclitaxel o docetaxel); topotecan; una antraciclina (por ejemplo, doxorrubicina (ADRIAMYCIN®) o doxorrubicina liposomal (DOXIL®) ) ; gemcitabina ; ciclofosfamida ; vinorelbina (NAVELBINE®) ; hexametilmelamina ; ifosfamida; y etoposido. En otra de stas formas de realización, un agente quimioterapéutico es un agente o una combinación de agentes usados en el tratamiento de cáncer uterino o endometrial, como cisplatino, carboplatino, doxorrubicina, paclitaxel, metotrexano, fluorouracil y medroxiprogesterona . En otra de estas formas de realización, un agente quimioterapéutico es un agente o combinación de agentes usados en el tratamiento de tumores cerebrales como una nitrosourea (por ejemplo, camustina o lomustina); un agente citotóxico (por ejemplo, irinotecan o temozolamida ) ; un agente antiangiogénico (por ejemplo, talidomida, TNP-470, factor plaquetario 4, inferieron y endostatina) ; un agente diferenciador (por ejemplo, retinoides, fenilbutirato, fenilacetato y antineoplastones ) ; un agente antiinvasor (por ejemplo, inhibidores de metaloproteinasas de matriz, como marimastat); un modulador de la trasducción de la señal (por ejemplo, tamoxifeno, briostatina y 0-6 benziguanina ) ; un inhibidor de la topoisomerasa (por ejemplo, irinotecan o topotecan) ; y un inhibidor del factor de crecimiento (por ejemplo, un inhibidor de la tirosincinasa ) . En otra de estas formas de realización, un agente quimioterapéutico es un agente o una combinación de agentes usados en el tratamiento de cáncer renal (por ejemplo, tumor de ilms) , como vincristina, actinomicina D, adriamicina, doxorrubicina , ciclofosfamida, ifosfamida, etoposido y carboplatino . En determinadas formas de realización, un anticuerpo de la invención se puede combinar con un antiinflamatorio y/o antiséptico.
Las terapias combinadas descritas anteriormente incluyen administración combinada (en la que los dos o más agentes se incluyen en la misma o en formulaciones separadas), y administración separada, en cuyo caso, la administración del anticuerpo o inmunoconj ugado de la invención puede ocurrir con anterioridad, simultáneamente y/o después, la administración de la terapia o terapias adicionales y/o complementarias. Los anticuerpos o inmunoconj ugados de la invención se pueden también usar en combinación con radioterapia. Un anticuerpo o inmunoconj ugado de la invención (y agente terapéutico adicional o complementario) puede administrarse por cualquier medio apto, incluyendo las vías parenteral, subcutánea, intraperitoneal , intrapulmonar e intranasal, y, si se desea para tratamiento local, la vía intralesional . Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial , intraperitoneal o subcutánea. Además, el anticuerpo o inmunoconj ugadose administra correctamente mediante infusión de efecto rápido con dosis del anticuerpo o inmunoconj ugado cada vez menores. La dosificación puede realizarse mediante cualquier vía adecuada, por ej . mediante inyecciones vía intravenosa o subcutánea, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. Cuando la diana de unión se localiza en el cerebro, algunas formas de realización de la invención proporcionan al anticuerpo o inmunoconj ugado que atraviese la barrera hematoencefálica . Existen varios enfoques en el sector para el transporte de moléculas a través de la barrera hematoencefálica , entre otros, métodos físicos y métodos basados en lípidos, métodos basados en células madre y métodos de receptor y de canal. Los métodos físicos de transporte de un anticuerpo o inmunocon ugado a través de la barrera hematoencefálica incluyen, entre otros, la circunvalación completa de la barrera hematoencefálica o la creación de aperturas en la misma. Los métodos de circunvalación incluyen, entre otros, la inyección directa en el cerebro (véase, por ej . , Papanastassiou et al., Gene .Therapy 9: 398-406 (2002)), entrega aumentada de infusión y convención intersticial (véase, por e . Bobo y col. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91: 2076-2080 (1994)), e implantación de un dispositivo de administración en el cerebro (véase por ej . Gilí y col. Nature Med. 9: 589-595 (2003) ; y Gliadel Wafers™, Guildford Pharmaceutical ) . Los métodos de creación de aperturas en la barrera incluyen, ente otros, ultrasonidos (véase por ej . , Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. n.° 2002/0038086), presión osmótica (por ej . mediante administración de manitol hipertónico (Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 & 2, Plenum Press, N.Y. (1989)), permeabili zación , por ej . bradicinina o permeabilizador A-7 (véase ej . Patentes de EE.UU. núms. 5.112.596, 5.268.164, 5.506.206 y 5.686.416), transfección de neuronas a ambos lados de la barrera hematoencefálica con vectores que contienen genes que codifican el anticuerpo (véase, por ej . , Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. n.° 2003/0083299). Los métodos de transporte de un anticuerpo o inmunoconj ugado a través de la barrera hematoencefálica basados en lipidos incluyen, entre otros, el encapsulamiento del anticuerpo o inmunoconj ugado en liposomas que se emparejan a los fragmentos de unión del anticuerpo para unirse a los receptores en el endotelio vascular de dicha barrera (véase por ej . , Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. n.° 20020025313), y el recubrimiento del anticuerpo o inmunoconj ugado en partículas lipoproteínicas de baja densidad (véase por ej . , Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. n.° 20040204354) o apolipoproteína E (véase por ej . , Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. n.° 20040131692) . Los métodos basados en células madre para el transporte de un anticuerpo o inmunocon ugado a través de la barrera hematoencefálica supone la intervención de células progenitoras neurales (NPC) genéticamente diseñadas para expresar el anticuerpo o inmunocon ugado de interés y, luego, la implantación de las células madre en el cerebro del sujeto que se va a tratar. Véase Behrstock et al. (2005) Gene Ther. 15 de diciembre de 2005, publicación online (en la que se refiere que las NPC genéticamente diseñadas para expresar el factor neurotrófico GDNF reducía los síntomas de la enfermedad de Parkinson cuando se implantaban en el cerebro de modelos de primates y roedores) . Los métodos de transporte de un anticuerpo o inmunoconj ugado a través de la barrera hematoencefálica de receptor y de canal incluyen, entre otros, el uso de bloqueadores glucocorticoides para aumentar la permeabilidad de dicha barrera (véase por ej . , Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. núms . 2002/0065259, 2003/0162695, y 2005/0124533); canales activantes de potasio (véase, por ej . , Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. n.° 2005/0089473), transportadores de fármaco inhibidor ABC (véase por ej , Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. n.° 2003/0073713); anticuerpos o inmunocon ugados recubridores con una actividad de transferrina y modulante de uno o más receptores de transferrina (véase, por ej . , Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. n.° 2003/0129186) , y cationi zación de los anticuerpos o inmunocon ugados (véase, por ej . Patente de EE.UU. n.° 5.004.697) . La composición de anticuerpos o inmunoconj ugados de la invención debería formularse, dosificarse y administrarse de una manera consistente empleando una práctica médica adecuada. Los factores a considerar en este contexto incluyen el trastorno concreto tratado, el mamífero concreto tratado, la enfermedad del paciente en particular, la causa del trastorno, la localización de la administración del agente, el método de administración, la regulación de la administración y otros factores conocidos por los facultativos. El anticuerpo o inmunoconj ugado puede formularse opcionalmente con uno o más agentes utilizados actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de dichos agentes depende de la cantidad de anticuerpo o inmunoconj ugado presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento, y otros factores ya abordados con anterioridad. Estos son generalmente usados en las mismas dosis y con las mismas vías de administración descritas en la presente memoria descriptiva o aproximadamente entre 1 y 99% de las dosis descritas en la misma, o en cualquier dosis y mediante cualquier vía empírica y clínicamente considerada apropiada. Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosis adecuada de un anticuerpo o inmunoconj ugado de la invención (cuando se utiliza aislado o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales como los quimioterapéuticos ) dependerá del tipo de enfermedad que se tratará, el tipo de anticuerpo o inmunocon ugado, la gravedad y el curso de la enfermedad, de si el anticuerpo o inmunoconj ugado se administra para fines preventivos o terapéuticos, la terapia anterior, la historia clínica del paciente y la respuesta al anticuerpo o inmunoconj ugado y la discreción del médico tratante. El anticuerpo o inmunoconj ugado se administra adecuadamente al paciente una vez o en una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y la gravedad de la enfermedad, una dosis inicial candidata para la administración en un paciente es de aproximadamente de 1 µg/kg a 15 mg/kg (por ej . 0,lmg/kg-10 mg/kg) de anticuerpo o inmunoconj ugado, ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas o mediante una infusión continua. Una dosis diaria normal puede oscilar entre aproximadamente 1 g/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores anteriormente mencionados. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la enfermedad, el tratamiento se mantendría, por lo general, hasta que ocurriese una supresión deseada de los síntomas de la misma. Un ejemplo de dosis del anticuerpo o inmunocon ugado se encontraría en el intervalo de aproximadamente de 0,05 mg/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg. Por lo tanto, se puede administrar al paciente una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas) . Dichas dosis se pueden administrar de manera intermitente, por ej . una vez por semana o cada tres semanas (por ej . de modo que el paciente reciba desde aproximadamente dos a aproximadamente veinte, o por ej . aproximadamente seis dosis del anticuerpo o inmunoconj ugado) . Se puede administrar una mayor carga de dosis inicial seguida de una o más dosis menores. Un ejemplo de pauta posológica comprende la administración de una dosis inicial aproximada de 4 mg/kg, seguida de una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 2 mg/kg del anticuerpo. Sin embargo, también pueden ser eficaces otras pautas de dosificación. El progreso de este tratamiento se controla fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales . 3. Ensayos Los anticuerpos anti-TAT226 o inmunocon ugados de la invención se pueden caracterizar por sus propiedades fisicoquímicas y/o por sus actividades biológicas mediante varios ensayos conocidos en la especialidad. a ) Ensayos de actividad En un aspecto, se proporcionan ensayos para la identificación de anticuerpos anti-TAT226 o inmunoconj ugados de los mismos con actividad biológica. La actividad biológica puede incluir, por ejemplo, la capacidad de inhibir el crecimiento o proliferación celular (por ejemplo, actividad de "destrucción celular"), o la capacidad de inducir la muerte celular, incluida la muerte celular programada (apoptosis). También se proporcionan anticuerpos o inmunocon ugados con dicha actividad biológica in vivo y/o in vitro. En determinadas formas de realización, se comprueba la capacidad de un anticuerpo anti-TAT226 o un inmunoconj ugado del mismo para inhibir el crecimiento o proliferación celular in vitro. Los ensayos para la inhibición del crecimiento o proliferación celular son bien conocidos en el sector. Determinados ensayos para la proliferación celular, e emplificados mediantes ensayos "de destrucción de células" descritos en la presente memoria descriptiva, miden la viabilidad celular. Uno de estos ensayos es el Ensayo de Viabilidad celular por luminiscencia CellTiter-Glo™, que está comercialmente disponible en Promega (Madison, WI) . Este ensayo determina el número de células viable sen cultivo basado en cuantificación de ATP presente, que indica las células activas metabólicamente . Véase Crouch et al. (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88, Patente de EE.UU. n.° 6602677. El ensayo se puede realizar en un formato de 96 ó 384 pocilios, lo que hace posible su uso para detección automatizada de alto rendimiento (HTS) . Véase Cree et al. (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404. El procedimiento de este ensayo supone añadir un único reactivo (Reactivo CellTiter-Glo®) directamente a las células en el cultivo. Ello da lugar a lisis celular y generación de una señal luminescente producida por una reacción con luciferasa. La señal luminiscente es proporcional a la cantidad de ATP presente, que es directamente proporcional al número de células viables presentes en el cultivo. Los datos se pueden registrar mediante un luminómetro o un dispositivo de captación de imágenes mediante cámara CCD. La producción de luminiscencia se expresa como unidades de luz relativas (RLU) . Otro ensayo para la proliferación celular es el ensayo "M T" un ensayo colorimétrico que mide la oxidación de bromuro 3- ( 4 , 5-dimetiltiazol-2-il ) -2 , 5-difeniltetrazolium a formazan mediante reductasa mitocondrial . Como el ensayo CellTiter-Glo™, este ensayo indica el número de células metabólicamente activas presentes en un citocultivo. Véase, por ejemplo, Mosmann (1983) J. Immunol. Meth. 65:55-63, y Zhang et al. (2005) Cáncer Res. 65:3877-3882. En un aspecto, se comprueba la capacidad de un anticuerpo anti-TAT226 para inducir muerte celular in vitro. Los ensayos para la inducción de la muerte celular son bien conocidos en la materia. En algunas formas de realización, estos ensayos miden, por ejemplo, la pérdida de integridad de la membrana, como se indica mediante absorción de yoduro de propidio (PI), azul de tripan (véase Moore et al. (1995) Cytotechnology, 17:1-11), o 7AAD. En un ensayo ejemplar de absorción de PI, las células se cultivan en medio Dulbecco's Modified Eagle Médium ( D-MEM) : Ham ' s F-12 (50:50) enriquecido con 10% de FBS inactivado por calor (Hyclone) y 2 mM de L-glutamina. De este modo, el ensayo se realiza en ausencia de complemento e inmunocitos efectores. Las células se siembran a una densidad de 3 x 106 por placa en placas de 100 x 20 mm y se deja que se emparejen durante la noche. Después el medio se retira y se reemplaza con un medio nuevo solo o que contenga diversas concentraciones del anticuerpo o inmunoconj ugado . Las células se incuban durante 3 días. Tras el tratamiento, las monocapas se lavan con PBS y se separan mediante tripsinización . A continuación, las células se centrifugan a 1200 rpm durante 5 minutos a 4 °C; el pellet se resuspendió en 3 mi de solución tamponada fría de unión a Ca2+ (10 mM Hepes, pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2) y se alicuotan en tubos de 35 mm con filtro de 12 x 75 mm (1 mi por tubo, 3 tubos por grupo de tratamiento) para la eliminación de la agregación celular. Los tubos reciben entonces el PI (10 µg/ml) . Las muestras se analizan utilizando un citómetro de flujo FACSCAN™ y software FACSCONVERT™ CellQuest (Becton Dickinson) . Se identifican asi los anticuerpos o inmunoconj ugados que inducen niveles estadísticamente significativos de muerte celular, como se determina mediante absorción de PI . En un aspecto, se comprueba la capacidad de un anticuerpo anti-TAT226 o inmunoconj ugado para inducir la apoptosis (muerte celular programada) in vitro. Un ensayo ejemplar para anticuerpos o inmunoconj ugados que inducen la apoptosis es un ensayo de unión a anexina. En un ensayo ejemplar de unión a anexina, las células se cultivan y se siembran en placas tal y como se describe en el párrafo anterior. Después el medio se retira y se reemplaza con un medio nuevo solo o que contenga de 0,001 a 10 µ?/??? del anticuerpo o inmunocon ugado . Después de un periodo de incubación de tres días, las monocapas se lavan con PBS y se separan por tripsinización . Después las células se centrifugan, se resuspenden en un tampón de unión a Ca2+ y se alicuotan en tubos tal y como se describe anteriormente. Después, se añade a los tubos la anexina marcada (por ej . anexina V-FTIC) (1 µg/ml) . Las muestras se analizan utilizando un citómetro de flujo FACSCAN™ y software FACSCONVERT™ CellQuest (BD Biosciences) . Se identifican asi los anticuerpos o inmunoconj ugados que inducen niveles estadísticamente significativos de unión a anexina con respecto a controles. Otro ensayo ejemplar para anticuerpos o inmunoconj ugados que inducen apoptosis es un ensayo colorimétrico ELISA con complejos ADN-histonas para la detección de degradación internucleosomal de ADN genómico. Este ensayo se puede llevar a cabo utilizando, por ejemplo, el Kit ELISA de detección de muerte celular (Roche, Palo Alto, CA) . Las células para uso en cualquiera de los ensayos in vitro anteriores incluyen células o lineas celulares que expresan naturalmente TAT226 o que han sido diseñadas para expresar TAT226. Estas células incluyen células tumorales que sobreexpresan TAT226 con respecto a células normales del mismo origen tisular. Estas células también incluyen lineas celulares (incluidas lineas celulares tumorales) que expresan TAT226 y lineas celulares que normalmente no expresan TAT226 pero han sido transfectadas con ácido nucleico que codifica TAT226. Entre las lineas celulares proporcionadas en la presente memoria descriptiva para uso en cualquiera de los ensayos in vitro anteriores están la linea de células de cáncer de ovario humanas 0VCAR3, que expresan TAT226, y la linea de células de cáncer de colon humanas HCT116 transfectadas con ácido nucleico que codifica TAT226. En un aspecto, se comprueba la capacidad de un anticuerpo anti-TAT226 o un inmunoconj ugado del mismo para inhibir el crecimiento o proliferación celular in vivo. En determinadas formas de realización, se comprueba la capacidad de un anticuerpo anti-TAT226 o un inmunoconj ugado del mismo para inhibir el crecimiento tumoral in vivo. Los sistemas de modelos in vivo, como modelos xenotrasplantados, se pueden utilizar para estas pruebas. En un sistema xenotrasplantado ejemplar, las células tumorales humanas se introducen en un animal no humano inmunodeprimido apto, por ejemplo, un ratón atimico. Se administra al animal un anticuerpo o inmunoconj ugado de la invención. Se mide la capacidad del anticuerpo o inmunoconj ugado para inhibir o reducir el crecimiento tumoral. En algunas formas de realización del sistema xenotrasplantado anterior, las células tumorales humanas son células tumorales procedentes de un paciente humano. Estos modelo xenotrasplantados están comercialmente disponibles en Oncotest GmbH (Frieberg, Alemania) . En algunas formas de realización, las células tumorales humanas son células procedentes de una linea de células tumorales humanas, como células OVCAR3, como se ejemplifica en la presente memoria descriptiva. En determinadas formas de realización, las células tumorales humanas se introducen en un animal no humano debidamente inmunodeprimido mediante inyección subcutánea o mediante trasplante en un sitio apto, como panículos adiposos mamarios. b) Ensayos de unión y otros ensayos En un aspecto, se prueba la actividad de unión de un anticuerpo anti-TAT226 al antigeno. Por ejemplo, en determinadas formas de realización, se comprueba la capacidad de un anticuerpo anti-TAT226 para unirse a TAT226 expresado en la superficie de una célula. Se puede utilizar un ensayo FACS como el descrito en el Ejemplo D para estas pruebas. En un aspecto, se pueden utilizar ensayos de competición para identificar un anticuerpo monoclonal que compita con YW0.32, YW0.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 o YWO.49.H6 para la unión a TAT226. En determinadas formas de realización, este anticuerpo competitivo se une al mismo epitopo (por ejemplo, un epitopo lineal o conformacional ) que se une mediante YW0.32, YW0.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 o YWO.49.H6. Entre los ensayos de competición ejemplares están ensayos habituales como los indicados en Harlow y Lañe (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) . Métodos ejemplares detallados para el mapeo de un epitopo al que se une un anticuerpo se señalan en Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," en Methods in Molecular Biology vol . 66 (Humana Press, Totowa, NJ) . Se dice que dos anticuerpos se unen al mismo epitopo si cada uno bloquea la unión del otro en un 50% o más. En un ensayo de competición ejemplar, TAT226 inmovilizado se incuba en una solución que comprenda un primer anticuerpo marcado que se una a TAT226 (por ejemplo, YW0.32, Y 0.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 o YWO.49.H6) y un segundo anticuerpo sin marcar del que se comprueba su capacidad para competir con el primero para su unión a TAT226. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de hibridoma. Como control, se incuba TAT226 inmovilizado en una solución que contenga el primer anticuerpo marcado pero no el segundo anticuerpo no marcado. Tras la incubación en condiciones que favorezcan la unión del primer anticuerpo a TAT226, se elimina el anticuerpo no unido sobrante y se mide la cantidad de marcador asociada a TAT226 inmovilizado. Si la cantidad de marcador asociada a TAT226 inmovilizado es sustancialmente reducida en la muestra de prueba con respecto a la muestra de control, esto indica que el segundo anticuerpo está compitiendo con el primero para la unión a TAT226. En determinadas formas de realización, TAT226 inmovilizado está presente en la superfice de una célula o en una preparación de membrana obtenida a partir de una célula que exprese TAT226 en su superficie.
En un aspecto, los anticuerpos purificados anti-TAT226 se pueden caracterizar mediante una serie de ensayos que incluyen la secuenciación del extremo N-terminal, análisis de aminoácidos, cromatografía líquida de alta resolución no desnaturalizante de exclusión por tamaño (HPLC) , espectrometría de masas, cromatografía de intercambio iónico y digestión con papaína. En una forma de realización, la invención contempla un anticuerpo alterado que tiene algunas, pero no la totalidad, de las funciones efectoras, lo que le convierte en un candidato deseable para muchas aplicaciones en las que la semivida del anticuerpo in vivo es importante, pero determinadas funciones efectoras (como complemento y ADCC) son innecesarias o dañinas. En algunas formas de realización, se miden las actividades Fe del anticuerpo para asegurar que sólo se mantienen las propiedades deseadas. Se pueden llevar a cabo ensayos de citotoxicidad in vitro o in vivo para confirmar la reducción/depleción de actividades de CDC y/o ADCC. Por ejemplo, los ensayos de unión del receptor Fe (FcR) pueden ser realizados para asegurar que el anticuerpo carece de unión a FcyR (por eso es probable que carezca de actividad ADCC), pero conserva la capacidad de unión a FcRn. Las células primarias para mediar en la ADCC, células NK, expresan sólo Fc(RIII, mientras que los monocitos expresan Fc(RI, Fc(RII y Fc(RIII. La expresión del FcR en células hematopoyét icas se resume en la Tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu . Rev . Immunol, 9:457-92 (1991) . ' Se describe un ejemplo de un ensayo in vitro para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés en la patente de EE.UU. n.° 5.500.362 o 5.821.337. Entre las células efectoras útiles para tales ensayos se encuentran las células mononucleares de la circulación periférica (PB C) y las células asesinas (NK) . Como alternativa, o adicionalmente , la actividad de ADCC de la molécula de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal como el que se muestra en Clynes et al., PNAS (USA) 95:652-656 (1998) . También se pueden llevar a cabo ensayos de unión Clq para confirmar que el anticuerpo no puede unirse al Clq y por ello carece de actividad CDC. A fin de evaluar la activación del complemento, se puede efectuar un ensayo de CDC, como, por ejemplo, el que se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996) . También se pueden realizar la unión de FcRn y eliminación in vi o/determinaciones de semivida con el uso de métodos conocidos en la especialidad.
F. Artículos de fabricación En otro aspecto de la invención, se propone un articulo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los desórdenes descritos anteriormente. El elemento de fabricación comprende un envase y una etiqueta o prospecto en el envase o asociado a él. Entre los envases adecuados se encuentran, por ejemplo, botes, viales y jeringas. Los envases pueden estar hechos de diversos materiales, tales como vidrio o plástico. El envase tiene una composición que es eficaz, por s misma o combinada con otra composición, en el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de la enfermedad y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el envase puede ser una bolsa para solución intravenosa o un vial con un tapón perforable por una aguja hipodérmica ) . Al menos un agente activo de la composición es un anticuerpo o inmunoconj ugado de la invención. La etiqueta o prospecto indica que la composición se ha utilizado para el tratamiento: de la afección elegida. Además, el articulo de fabricación puede comprender (a) un envase con una composición en su interior, donde la composición comprende un anticuerpo o inmunoconj ugado de la invención; y (b) un segundo envase con una composición en su interior, donde la composición comprende otro citotóxico o, de lo contrario, un agente terapéutico. El articulo de fabricación en esta forma de realización de la invención puede comprender además un prospecto que indica que las composiciones pueden usarse para tratar una afección concreta. De modo alternativo, o adicional, el elemento de fabricación puede comprender un segundo (o tercer) envase que contiene una solución farmacéuticamente aceptable, como agua bacteriostática para inyección (B FI), una solución salina fosfatada, una solución de Ringer y una solución de dextrosa. También puede incluir otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluidas otras soluciones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.
IV. EJEMPLOS A continuación se muestran ejemplos de los métodos y composiciones de la invención. Se entiende que se pueden dar varias formas de realización, dada la descripción general proporcionada anteriormente.
A. Análisis de la expresión génica de TAT226 Se analizó la expresión génica de TAT226 humano utilizando una base de datos propietaria que contenia información sobre expresión génica (GeneExpress®, Gene Logic Inc., Gaithersburg, MD) . El análisis gráfico de la base de datos GeneExpress® se realizó usando un visor de perfiles de micromatrices . La Figura 13 es una representación gráfica de la expresión génica de TAT226 en diversos tejidos, que se enumeran a la izquierda. La escala a lo largo de la parte superior del gráfico indica los niveles de expresión génica basados en la intensidad de la señal de hibridación. Los puntos aparecen tanto por encima como por debajo de la linea adyacente a cada tejido enumerado. Los puntos que aparecen por encima de la linea representan la expresión génica en tejido normal y los puntos que aparecen por debajo de la linea representan la expresión génica en tumores o tejidos enfermos. La Figura 13 muestra una tendencia hacia una mayor expresión génica de TAT226 en tumores o tejidos enfermos con respecto a tumores o tejidos sanos. En concreto, TAT226 muestra una sobreexpresion sustancial en ovario tumoral y enfermo con respecto a un ovario normal y en tumor de ilms con respecto a un riñon normal. Otros tejidos que muestran sobreexpresion en tejido tumoral o enfermo con respecto a tejido normal incluyen tejido endometrial, suprarrenal, óseo, pulmonar, cutáneo y de partes blandas. Además, TAT226 está fuertemente expresado en tejido cerebral normal (como rinencéfalo, hipocampo y ganglios básales) y en tejido cerebral tumoral o enfermo, como gliomas. La base de datos GeneExpress® se utilizó también para analizar la expresión génica de TAT226 humana en ovario normal; trompas de falopio normales; cáncer de ovario de los subtipos cistoadenocarcinoma seroso, mucinoso y de células claras; cáncer de ovario metastásico; y otros tipos de cáncer de ovario. Los resultados se reflejan gráficamente en la Figura 14 y los tipos concretos de tejido se indican debajo del gráfico. La escala en el eje de ordenadas del gráfico indica los niveles de expresión génica basados en la intensidad de la señal de hibridación. El cistoadenocarcinoma seroso y el cáncer de ovario metastásico demostraron una fuerte sobreexpresión de TAT226 con respecto al ovario normal. Los subtipos mucinoso y de células claras demostraron una expresión similar a la del ovario normal. Las trompas de falopio normales también demostraron una expresión sustancial de TAT226. Es de destacar que el subtipo seroso del cáncer de ovario se parece enormemente, desde el punto de vista histológico, al epitelio de las trompas de Falopio y tanto el ovario como las trompas de Falopio se derivan del mismo tejido embrionario. Véase Fox et al. (2002) "Pathology of epithelial ovarían cáncer," en Ovarían Cáncer ch . 9 (Jacobs et al., eds . , Oxford University Press, New York) B. Generación de anticuerpos anti-TAT226 Los anticuerpos anti-TAT226 fueron generados mediante detección de una librería de representación de imágenes de fagos con una proteína de fusión "TAT226-His" recombinante que comprende los aminoácidos 1-115 del identificador de secuencia n. ° : 75 y una marca de polihist idina en el extremo C-terminal. La librería de representación de imágenes de fagos era una librería sintética ( Fab ' ) 2 generada usando un sistema de fagos de cremallera de Fab' . Véase Lee et al. (2004) J. Immunol. Methods 284:119-132. La biblioteca que comprende una biblioteca de HVR de cadena pesada en la estructura de la región variable de la cadena pesada de huMAb4D5-8 (véanse las Figuras 5A y 5B, segundo aceptor "B", identificadores de secuencia núms:50, 51, 57, 35) y una región variable de la cadena ligera de huMAb4 D5-8 fijo, como se muestra en el identificador de secuencia n.°:26. Los clones seleccionados utilizando la biblioteca de fagos se detectaron de TAT226-His utilizando ELISA para fagos (véase, por ejemplo, Sidhu et al. (2004) J. Mol. Biol. 338:299-310) .
Los clones YW0.32 e YW0.49 se seleccionaron para otro análisis. Para mejorar la afinidad de Y 0.49, se generaron librerías de representación de imágenes de fagos en el marco de YW0.49, y HVR-H3 y HVR-L3 se destinaron a aleatori zación flexible, en los que los residuos de aminoácidos seleccionados en las HVR designadas se mantuvieron constantes, mientras otros estuvieron sujetos a mutagénesis. Los clones seleccionados fueron detectados mediante ELISA para fagos. Los anticuerpos con maduración de afinidad denominados YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 e YWO.49.H6 se seleccionaron para otro análisis. Las secuencias de polipéptidos codificadas y de nucleótidos de las regiones de VH y VL de YW0.32, YW0.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 e YWO.49.H6 se determinaron como se muestra en las Figuras 9 y 10. Las secuencias de la HVR de la cadena ligera y pesada de YW0.32, YW0.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 e YWO.49.H6 se muestran en las Figuras 2-4. Las secuencias de consenso de HVR-H3 y HVR-L3 derivadas de Y 0.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 e YWO.49.H6 se muestran también en la Figura 4. YW0.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 e YWO.49.H6 fueron "reformateados" como IgG de longitud completa mediante trasplante de fragmentos Fab ' en las regiones constantes apropiadas usando técnicas recombinantes . Los experimentos descritos a continuación se realizaron utilizando los anticuerpos reformateados .
C. Caracterización de la afinidad de unión al antigeno recombinante La afinidad de unión de YW0.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 e YWO.49.H6 por el antigeno recombinante se determinó mediante medición con resonancia plasmón de superficie utilizando un sistema BIACORE® 3000 (Biacore, Inc., Piscataway, NJ) . Los biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, Biacore Inc) se activaron con clorhidrato de W-etil-W- ( 3-dimetilaminopropil ) -carbodiimida (EDC) y W-hidroxisuccinimida (NHS) , según las instrucciones del proveedor. Un anticuerpo anti-TAT226 se diluyó con 10 mM de acetato sódico, pH 4,8, a 5 yg/ml antes de la inyección a un caudal de 5 µ?/minuto para lograr aproximadamente 500 unidades de respuesta (RU) del anticuerpo emparejado. A continuación, se inyectó 1M etanolamina para bloquear grupos no reaccionados. Para mediciones cinéticas, se inyectó el doble de diluciones seriadas de TAT226-His (de 0,7 nM a 500 nM) en PBS con 0,05% Tween 20 a 25 °C a un caudal de 25 ul/min. Las tasas de asociación (kon) y las tasas de disociación (k0ff) se calcularon usando un sencillo modelo de unión uno a uno de Langmuir (BIAevaluation Software versión 3.2) . La constante de disociación de equilibrio (Kd) se calculaba como el cociente k0ff/kon- Los resultados de este experimento se muestran en la Tabla 2. TABLA 2 (nM) YWO.49 0, 074 3,49 47, 16 YWO.49.B7 0,27 <0, 05 <0, 18 YWO.49.C9 1,53 <0, 05 <0, 03 YWO.49.H2 0,22 0, 05 0,23 YWO.49.H6 1,86 0,09 0, 05 D. Caracterización de la unión del anticuerpo a TAT226 de superficie celular Se examinó la capacidad de los anticuerpos anti-TAT226 para unirse a TAT226 expresados en la superficie de OVCAR3, una estirpe celular de cáncer de ovario humano. Se realizó separación de células activadas por fluorescencia (FACS) en células OVCAR3 en ausencia y en presencia de YWO.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 o YWO.49.H6. Las células separadas se incubaron con anticuerpo primario de 5 g/ml durante 1 'hora en hielo; se lavaron y se incubaron con anticuerpo secundario (anticuerpo anti-IgG humano conjugado con ficoeritrina ) durante 30 minutos en hielo. Se realizó la FACS utilizando un citómetro de flujo FACScan™ (BD Biosciences, San José, CA) . Los resultados del análisis FACS para YW0.49, YWO.49.H2 e Y O.H6 se muestran en la Figura 15. Los picos en la parte izquierda de cada gráfico representan la unión "de fondo", es decir, la unión del anticuerpo secundario únicamente. Los picos situados en la parte derecha de cada gráfico representan la unión del anticuerpo anti-TAT226 indicado. YWO.49.B7 no se unió de forma significativa a células 0VCAR3 mediante FACS, aunque se unió a antigeno recombinante con una Kd dentro del rango de Kd observado para YW0.49 y los otros anticuerpos con maduración de afinidad (véanse los resultados del análisis de BIACORE®, tabla 2 anterior) . La unión de YWO.49.C9 fue similar a la observada para YWO.49.H2 e YWO.H6.
E. Caracterización de la afinidad de unión al antigeno de superficie celular La afinidad de unión de YWO.49.H2 e YWO.49.H6 por TAT226 expresada en la supeficie de células OVCAR3 se examinó utilizando un ensayo competitivo. Se permitió que YWO.49.H2 o YWO.49.H6 marcado (yodado) se uniera a células OVCAR3 en presencia de anticuerpo no marcado. La afinidad de unión de los anticuerpos se determinó según la metodología de análisis de Scatchard descrito inicialmente en Munson et al., Anal.
Biochem. 107:220 (1980). Los resultados de este experimento se muestran en la Tabla 3.
TABLA 3 Kd Clon (nM) YWO.49.H2 0,348 YWO.49.H6 0,404 La Kd de YWO.49.H2 e YWO.49.H6 es más elevada para TAT226 expresado en la superficie de células 0VCAR3 frente a TAT226- His recombinante (frente a las Kd para YWO.49.H2 e YWO.49.H6 en las tablas 2 y 3) , lo que indica que YWO.49.H2 e YWO.49.H6 se une con afinidad ligeramente más elevada a TAT226-His recombinante que a TAT226 expresado en la superficie de células OVCAR3.
F. ARNm de TAT226 y expresión de la pro eína La expresión del ARNm de TAT226 en células OVCAR3 y en un panel de muestras de cáncer de ovario se analizó utilizando un ensayo de 5' nucleasa (TaqMan®) y PCR cuantitativa en tiempo real. Las muestras de cáncer de ovario, designadas "HF ####" en la Figura 16, fueron cortes histológicos helados. El ARN se aisló de los cortes histológicos, amplificados utilizando el kit essage Amp II de Ambion (Ambion, Austin, TX) y transcripción reversa en ADNc. El ARN se aisló de células 0VCAR3 y se realizó la transcripción reversa en ADNc. El ADNc de TAT226 se amplificó mediante PCR en tiempo real en presencia de una sonda indicadora no extensible especifica para el producto de amplificación. El ciclo umbral o "Ct" (el ciclo en el que la señal generada de la escisión de la sonda indicadora excedía del fondo) se determinó y usó para calcular los niveles iniciales del ARNm de TAT226. El nivel del ARNm de TAT226 en el panel de las muestras de cáncer de ovario se expresó con respecto al nivel del ARNm de TAT226 en células OVCAR3 , como se muestra en el gráfico de barras de la Figura 16. La expresión de la proteína TAT226 en células OVCAR3 y en el panel superior de muestras de cáncer de ovario se analizó utilizando ensayo inmunohistoquimico (IHC) como se indica a continuación. Los cortes tisulares (congelados o fijados en parafina) de las muestras de cáncer de ovario se fijaron durante 5 minutos en acetona/etanol. Los cortes se lavaron en PBS, se bloquearon con avidina y biotina (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) durante 10 minutos cada uno, y se lavaron otra vez en PBS. Los cortes se bloquearon después con 10% de suero durante 20 minutos y se limpiaron para eliminar el exceso de suero. Luego, se añadió el anticuerpo primario (YWO.49.H2 o YWO.49.H6) a los cortes a una concentración de 10 yg/ml durante 1 hora. Los cortes se lavaron a continuación en PBS. El anticuerpo secundario antihumano biotinilado se añadió a los cortes durante 30 minutos y, luego, los cortes se lavaron con PBS. Después, los cortes se expusieron a los reactivos del kit Vecto ABC (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) durante 30 minutos y, luego, se lavaron en PBS. A continuación, los cortes se expusieron a diaminobenzidina (Pierce) durante 5 minutos y, luego, se lavaron en PBS. Después, se procedió a una tinción de contraste de los cortes con hematoxilina de Mayers, se cubrió con un cubreobjetos y se visualizó. Se realizó ensayo IHC en células OVCAR3 utilizando el mismo protocolo, salvo que las células se granularon primero, se congelaron y, luego, se cortaron. A continuación, los cortes se sometieron al protocolo anterior. Los resultados se incluyen cualitativamente en la Figura 16 y los niveles de expresión se categorizaron como "+/-", or "+". En lineas generales, había una correlación global entre el nivel de expresión del ARNm de TAT226 y la expresión de la proteína TAT226 en la superficie de células OVCAR3. Los experimentos IHC también confirmaron que los anticuerpos reconocían TAT226 en la superficie celular. La histología de cada célula en el panel de células de . cáncer de ovario también se incluye en la Figura 16 y la abreviación "adenoca" denota "adenocarcinoma" .
G. Producción de los ADC de los anticuerpos anti-TAT226 Los ADC de los anticuerpos anti-TAT226 se produjeron conjugando YWO.49.H2 e YWO.49.H6 con las siguientes fracciones de enlazadores de fármacos: MC-vc-PAB-MMAE ; MC-vc-PAB-MMAF; y MC-MMAF, que se muestran anteriormente en el Apartado III.C.l.b.2. Antes de la conjugación, los anticuerpos se redujeron parcialmente con TCEP utilizando métodos estándar según la metodología descrita en el documento WO 2004/010957 A2. Los anticuerpos parcialmente reducidos se conjugaron con las fracciones del enlazador de fármacos anteriores utilizando métodos estándar según la metodología descrita en Doronina et al. (2003) Nat. Biotechnol . 21:778-784 y US 2005/0238649 Al. Los anticuerpos parcialmente reducidos se combinaron con las fracciones del enlazador de fármacos para permitir la conjugación de las fracciones a residuos de cisteína. Las reacciones de la conjugación se absorben y se purifican los ADC . La concentración del fármaco (promedio de fracciones de fármaco por anticuerpo) para cada ADC se determinó mediante HPLC, de la siguiente manera: H. Ensayos de destrucción de células Se realizaron pruebas en los conjugados de anticuerpos con fármacos (ADC) para comprobar su capacidad para inhibir la proliferación de células que expresaban TAT226 en los siguientes ensayos de destrucción de células in vitro e in vivo : 1. OVCAR3 en ensayo de destrucción de células in vitro Se comprobó la capacidad de los ADC de YWO.49.H2 e YWO.49.H6 para inhibir la proliferación de células 0VCAR3. Se sembraron células 0VCAR3 en placas con 96 pocilios en RPMI con FBS al 20%. Se incubaron células OVCAR3 a una densidad de 3000 células por pocilio, con concentraciones diversas de los ADC, como se muestra en la Figura 17. El anticuerpo anti-MUC16/CA125 conjugado con C-vc- PAB-MMAE se utilizó como un control positivo. MUC16/CA125 es un antigeno conocido del cáncer de ovario. Véase, por ejemplo, Yin et al., (2001) J. Biol. Chem. 276:273 1-27375. El anticuerpo anti-IL-8 conjugado con MC-vc- PAB-MMAE se utilizó como un control negativo. Tras 5 días de incubación, se midió la viabilidad de las células utilizando el Ensayo de viabilidad celular por luminiscencia CellTiter-Glo™ (Promega, Madison, WI), según las instrucciones del fabricante. La escala en el eje de ordenadas de la Figura 17 indica las unidades de luz relativas, o "RLU", con respecto a la luminiscencia de la luciferasa, que es una medida de la viabilidad celular.
La Figura 17 muestra que, de forma similar al control positivo, YWO.49. H2-MC-VC-PAB-MMAF e YWO .49. ?ß-MC-vc-PAB-MMAF tenían una marcada actividad de destrucción celular, en especial a concentraciones en torno a 0,01 y 0,1 g/ml. YWO.49.H2-MC-VC-PAB-MMAE e YWO .49. ?ß-MC-vc-PAB-MMAE también tenían una actividad de destrucción celular, pero en menor medida que la observada con YWO . 9. H2-MC-vc-PAB-MMAF e YWO.49.H6-MC-VC-PAB-MMAF. La IC50 para YWO .49. H2-MC-vc-PAB-MMAF e YW0.49.H6-MC-VC-PAB-MMAF estaba en torno a 0,005 nM, y la IC50 para YWO .49. H2- C-vc-PAB-MMAE e YWO .49. H6-MC-vc-PAB-MMAE estaba en torno a 0,2 nM. La IC50 para MMAE libre era de unos 0,1 nM. YWO .49. H2-MC-MMAF e YWO .49. ?ß-MC-MMAF no demostraron una actividad de destrucción celular significativa en este ensayo. En este sistema de ensayo concreto, cabe señalar que, a concentraciones elevadas de ADC, incluido ADC de control negativo, la viabilidad celular disminuye sustancialmente debido a la alta concentración total de MMAE y MMAF. 2. Ensayo de destrucción celular in vitro utilizando células transf ctadas HCT116 Se comprobó la capacidad de los ADC de YWO.49.H2 e YWO.49.H6 para inhibir la proliferación de células HCT116, una estirpe celular del cáncer de colon, que había sido transfectado de forma estable con ácido nucleico que codificaba la TAT226 humana. Las células HCT116 no transfectadas son normalmente entre 5 y 6 veces menos sensible a MMAE libre (no conjugado) que las células 0VCAR3.
Las células HCT116 fueron transíectadas de la manera que se indica a continuación. El ácido nucleico que codifica la TAT226 humana marcada con epitopo se construyó en el vector de expresión pcDNA3.1 de mamífero (Invitrogen, Carlsbad, CA) . La marca de epitopo estaba formada por los aminoácidos 1-53 del virus herpes simplex de la glicoproteína D de tipo 1 (la marca "gD") que sustituyó la secuencia de señal de los aminoácidos 1-22 en el extremo N-terminal de la TAT226 humana. El vector recombinante fue transfectado en células HCT116 utilizando Lipofectamine200 (Invitrogen) según el protocolo del fabricante. Las células HCT116 transíectadas se cultivaron en medio de cultivo McCoy 5a con FBS al 10% y 0,4 mg/ml de G418. Se procedió a la tinción de las células utilizando anticuerpos anti-gD y se separaron mediante FACS para seleccionar clones individuales que expresaban la proteína de fusión TAT226 humana :gD recombinante. Uno de los clones, desigando HCT116#9-4, se seleccionó para nuevo análisis .
Para realizar el ensayo de destrucción celular, las células HCT116#9-4 se sembraron en placas de 96 pocilios. Se incubaron células HCT116#9-4 a una densidad de 1000 células por pocilio, con concentraciones diversas de los ADC, como se muestra en la Figura 18. El anticuerpo anti-gpl20 conjugado con MC-vc-PAB-MMAE se utilizó como un control negativo. Tras 3 días de incubación, se midió la viabilidad de las células utilizando el Ensayo de viabilidad celular por luminiscencia CellTiter-Glo™ (Promega, Madison, WI), según las instrucciones del fabricante. La Figura 18 muestra que, de forma similar al control positivo, YWO.49. H2-MC-VC-PAB-MMAF e YWO .49. H6-MC-vc-PAB-MMAF tenían una marcada actividad de destrucción celular, en especial a unos 0,01 pg/ml y hasta las máximas concentraciones probadas. La IC50 para YWO .49. H2-MC-vc-PAB-MMAF e YWO.49. ?ß-MC-vc-PAB-MMAF estaba en torno a 0,05 nM, y la IC50 para MMAE libre estaba en torno a 0,9 nM. YWO.49.H2-MC-vc-PAB-MMAE e YWO . 9. H6-MC-vc-PAB-MMAE no tenían una actividad de destrucción celular sustancial con respecto al control negativo en este ensayo concreto. La diferencia entre la actividad de destrucción celular de YWO .49. H2-MC-vc-PAB-MMAE e YWO.49. ?ß-MC-vc-PAB-MMAE en este ensayo con respecto al ensayo de destrucción de células OVCAR3 (citado anteriormente) se puede atribuir a diversos factores, por ejemplo, densidad celular y/o diferencias en sensibilidad al fármaco. Cabe señalar que, para algunas otras estirpes celulares probadas que suelen expresar el ARNm o la proteina de TAT226, los ADC de YWO.49.H2 e YWO.49.H6 no mostraban una actividad de destrucción celular significativa. Ello se puede deber a diversos factores, por ejemplo, efectos específicos del tipo de célula, los niveles de la expresión de TAT226 en la superficie celular y/o las diferencias en la sensibilidad al fármaco . 3. Ensayo in vivo usando xenotrasplante de HCT116#9-4 Un modelo xenotrasplantado in vivo se utilizó para determinar la capacidad de YWO.49.H6 conjugado y no conjugado para inhibir la proliferación de células tumorales que expresan TAT226 in vivo. Los tumores fueron inducidos en ratones desnudos atímicos mediante inyección subcutánea de unas 5xl06 células HCT116#9-4 en los flancos dorsales del ratón. Se dejó que los tumores crecieran hasta que alcanzaron una media de volumen tumoral de 200 mm3. Ese punto en el tiempo se designó como "día 0". Como se muestra en la Figura 19, el ratón recibió inyecciones intravenosas de 3 mg/kg de los anticuerpos no conjugados indicados o ADC en los días 0, 7 y 16. Los anticuerpos anti-ragweed (Ab) conjugados y no conjugados sirvieron como controles negativos. La media del volumen tumoral se midió en los días 3, 7, 10, 16 y 21. Como se muestra en la Figura 19, Y O .49. H6-MC-vc-PAB-MMAF mostró una actividad de destrucción de células tumorales significativas, según medición mediante la media del volumen tumoral, frente al anticuerpo anti-ragweed Ab-MC-vc-PAB-MMAF en este modelo xenot rasplantado concreto. YWO .49. H6-MC-vc-PAB-M AE no mostró una actividad de destrucción de células tumorales significativa con respecto al anticuerpo anti-ragweed Ab-MC-vc-PAB-MMAE en este modelo xenotrasplantado . Sin embargo, este modelo xenotrasplantado puede no reflejar la actividad de destrucción celular de YWO .49. H6-MC-vc-PAB- MAE observada in vitro para diversos factores, por ejemplo, debido a diferencias en sensibilidad al fármaco o niveles de expresión de TAT226 de superficie celular en el microentorno del tumor xenotrasplantado. 4. Otros modelos xenotrasplantados Otros modelos xenotrasplantados se pueden utilizar para determinar la capacidad de anticuerpos anti-TAT226 conjugados y no conjugados para inhibir la proliferanción de células tumorales que expresen TAT226 in vivo. Por ejemplo, los modelos xenotrasplantados para tumores de ovario y cerebro pueden ser proporcionados por fuentes públicas como Oncotest GmbH (Frieberg, Alemania) y Southern Research Institute (Birmingham, AL) . En concreto, los modelos de Oncotest se desarrollaron mediante el crecimiento de tumores de pacientes en ratones atímicos inmunodeficientes . Los xenot rasplantes que expresan ARNm y/o proteína de TAT226 pueden ser útiles a la hora de demostrar la actividad de destrucción celular de anticuerpos anti-TAT226 in vivo. Se realizaron pruebas en YWO.49.H6 conjugado en el modelo OVXF1023 de Oncotest para determinar la capacidad de inhibir la proliferación de células tumorales de ovario in vivo. El modelo OVXF1023 de Oncotest se deriva de un carcinoma de ovario adenomatoso seroso papilar escasamente diferenciado y metastásico, en estadio MI. Los ratones OVXF1023 fueron tratados con los ADC indicados en la Figura 20. En la Figura 20, YWO.49.H6 se designa como "H6"; el anticuerpo anti-ragweed (control) se designa como "RW"; y el enlazador -MC-vc-PAB- se abrevia como "ve". Los ADC se administraron los días y a las concentraciones indicadas en la Figura 20. Los resultados mostrados en la Figura 20 indican que Y O .49. H6-MC-vc-PAB-MMAF e Y O .49. H6-MC-MMAF reducían significativamente el volumen del tumor con respecto a los demás ADC. El experimento anterior se repitió con OVXF1023 en condiciones similares, pero con cambios en las dosis y en los ADC de control. En el experimento repetido, los ratones fueron tratados con una dosis más elevada (5 mg/kg) de YWO. 9. ?ß-MC-vc-PAB-MMAE y con dosis menores (5 mg/kg) de YWO .49. H6-MC-vc-PAB- MAF e YWO .49. H6-MC-MMAF . Los resultados demostraron que los ADC de H6 (y en concreto YWO .49. H6-MC-vc-PAB-MMAE) mostraban una reducción del volumen tumoral con respecto a sus ADC de control respectivos (anti-gpl20-MC-vc-PAB-MMAE a 6,4 mg/kg; anti-gpl20-MC-vc-PAB-MMAF a 7,2 mg/kg; y anti-gpl20-MC-MMAF a 5,4 mg/kg), aunque la diferencia en eficacia entre los ADC de H6 y sus ADC de control respectivos no era estadísticamente significativa para algunos puntos de datos. (No figuran los datos.) La diferencia entre estos resultados y los resultados obtenidos en el primer experimento con OVXF1023 se pueden atribuir a las diferencias en dosificación de los ADC de H6 y la observación de que los ADC de control de los anticuerpos anti-gpl20 mostraban una actividad inesperada en la reducción del volumen tumoral.
Asimismo, los ADC de H6 también se probaron en otro modelo de Oncotest, OVXF899, que se deriva de un carcinoma de ovario seroso papilar moderadamente diferenciado (tumor primario) . Los ADC de H6 no reducían el volumen tumoral en este modelo. (No figuran los datos.) Sin embargo, este modelo concreto de Oncotest mostraba una baja expresión de TAT226, lo que puede explicar los resultados observados.
I. ThioMAbs Se crearon anticuerpos diseñados con cisteína, o "thioMAbs", en los que un residuo seleccionado de YWO.49.H6 fue sustituido por cisteína, con el fin de proporcionar un sitio adicional para conjugación de una fracción del fármaco enlazador. En concreto, se realizó una sustitución de A118C (numeración de EU) en la cadena pesada de YWO.49.H6 o una sustitución de V205C (numeración de Kabat) en la cadena ligera de YWO.49.H6. El thioMAb A118C resultante se conjugó, entonces, con MC-MMAF y el thioMAb V205C resultante se conjugó entonces con MC-MMAF o MC-vc-PAB-MMAE . Todos los thioMAbs tenían capacidad de unión a células OVCAR3 mediante análisis FACS. (No figuran los datos.) Aunque la anterior invención se ha descrito en detalle a modo de ejemplo a efectos de claridad y comprensión, las descripciones y ejemplos no se deben interpretar de forma que limite el ámbito de la invención. El contenido de todas las patentes y documentos científicos citados en la presente memoria descriptiva quedan expresamente incorporados en la misma en su integridad a modo de referencia.

Claims (38)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un anticuerpo monoclonal que se une a TAT226, en donde el anticuerpo comprende: (1) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4; (2) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5; (3) una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos que se adapta a la secuencia de consenso de la SEQ ID NO: 11 (4) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12; (5) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13; y (6) una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos que se adapta a la secuencia de consenso de la SEQ ID NO: 19.
  2. 2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 6-10, y una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 14-18.
  3. 3. El anticuerpo de la reivindicación 2, en donde la HVR-H3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 y la HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17.
  4. 4. El anticuerpo de la reivindicación 2, en donde la HVR-H3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 y la HVR-L3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18.
  5. 5. El anticuerpo de la reivindicación 1, que comprende además, al menos una estructura seleccionada entre una estructura de consenso del subgrupo III de VH y una estructura de consenso del subgrupo I de VL .
  6. 6. Un anticuerpo monoclonal que se une a ???226, en donde el anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada con al menos un 90% de identidad de secuencia con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NO: 21-25 y un dominio variable de cadena ligera con al menos un 90% de identidad de secuencia con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NO: 26-31.
  7. 7. El anticuerpo de la reivindicación 6, en donde el anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada con al menos un 90% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 24 y un dominio variable de cadena ligera con al menos un 90% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29.
  8. 8. El anticuerpo de la reivindicación 7, en donde el dominio variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 24, y el dominio variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 29.
  9. 9. El anticuerpo de la reivindicación 6, en donde el anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada con al menos un 90% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25 y un dominio variable de cadena ligera con al menos un 90% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 30.
  10. 10. El anticuerpo de la reivindicación 9, en donde el dominio variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 25, y el dominio variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 30.
  11. 11. El anticuerpo de la reivindicación 1 o 6, en donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo seleccionado entre un fragmento Fab, Fab ' -SH, Fv, scFv o (Fab' )2·
  12. 12. El anticuerpo de la reivindicación 1 o 6, en donde el anticuerpo es humanizado.
  13. 13. El anticuerpo de la reivindicación 1 o 6, en donde el anticuerpo es humano.
  14. 14. Un anticuerpo monoclonal que se une al mismo epitopo que un anticuerpo seleccionado entre Y 0.32, YW0.49, YWO.49.B7, YWO.49.C9, YWO.49.H2 e YWO.49.H6.
  15. 15. Un inmunoconj ugado que comprende un anticuerpo que se une a TAT226 como en las reivindicaciones 1 o 6 unido covalentemente a un agente citotóxico.
  16. 16. El inmunoconj ugado de la reivindicación 15, en donde el agente citotóxico se selecciona a partir de una toxina, un agente quimioterapéutico, un antibiótico, un isótopo radioactivo y una enzima nucleolitica .
  17. 17. Un inmunoconj ugado con la fórmula Ab-(L-D)p, en donde: (a) Ab es un anticuerpo que se une a TAT226 y que comprende (i) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4; (ii) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5; (iii) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos que se adapta a la secuencia de concenso de la SEQ ID NO: 11 (iv) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12; (v) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13; y (vi) una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos que se adapta a la secuencia de consenso de la SEQ ID NO: 19; L es un enlazador; D es un fármaco de la fórmula DE o DF y en donde R2 y R6 son, cada uno, metilo; R3 y R4 son cada uno isopropilo; R7 es sec-butilo, cada R8 se selecciona independientemente entre CH3, 0-CH3, OH, y H; R9 es H; R10 es arilo; Z es -0- o -NH-; Ru es H, alquilo Ci-C8 o -(CH2)2-0-(CH2)2-0-(CH2)2-0-CH3; y R18 es -C ( R8 ) 2-C ( R8 ) 2-arilo ; y (d) p oscila entre 1 y 8. 18. El inraunoconj ugado de la reivindicación 17, en donde el anticuerpo comprende una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 6-10 y una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 14-
  18. 18.
  19. 19. El inmunoconj ugado de la reivindicación 18, en donde la HVR-H3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 y la HVR-L3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17.
  20. 20. El inmunoconj ugado de la reivindicación 18, en donde la HVR-H3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 y la HVR-L3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18.
  21. 21. Un inmunoconjugado con la fórmula Ab-(L-D)p, en donde: (a) Ab es un anticuerpo que se une a TAT226 y que comprende una región variable de cadena pesada con al menos un 90% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 21-25 y una región variable de cadena ligera con al menos un 90% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 36-31. (b) L es un enlazador; (c) D es un fármaco de la fórmula DE o DF DF y en donde R2 y R6 son, cada uno, metilo; R3 y R4 son cada uno isopropilo; R' es sec-butilo, cada R8 se selecciona independientemente entre CH3, 0-CH3, OH, y H; R9 es H; R10 es arilo; Z es -O- o -NH-; R11 es H, alquilo Ci-C8 o - (CH2) 2-0- (CH2) 2-0- (CH2) 2-O-CH3; y R18 es -C (R8) 2-C (R8) 2-arilo; y (d) p oscila entre 1 y 8.
  22. 22. El inmunoconj ugado de la reivindicación 21, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada con al menos un 90% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 24 y una región variable de cadena ligera con al menos un 90% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29.
  23. 23. El inmunoconj ugado de la reivindicación 22, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29.
  24. 24. El inmunoconj ugado de la reivindicación 21, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada con al menos un 90% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25 y una región variable de cadena ligera con al menos un 90% de identidad de secuencia con respecto a la _ secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 30.
  25. 25. El inmunocon ugado de la reivindicación 24, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30.
  26. 26. El inmunoconj ugado de la reivindicación 17 o 21, en donde el enlazador se une al anticuerpo a través de un grupo tiol en el anticuerpo.
  27. 27. El inmunoconj ugado de la reivindicación 17 o 21, en donde el fármaco se selecciona entre MAE y MMAF.
  28. 28. El inmunoconj ugado de la reivindicación 27, en donde el fármaco es MMAE .
  29. 29. El inmunoconj ugado de la reivindicación 27, en donde el fármaco es MMAF.
  30. 30. El inmunoconj ugado de la reivindicación 27, en donde el enlazador es desdoblable mediante una proteasa.
  31. 31. El inmunoconj ugado de la reivindicación 30, en donde el enlazador comprende un dipéptido val-cit .
  32. 32. El inmunoconj ugado de la reivindicación 30, en donde el enlazador comprende una unidad p-aminobencilo .
  33. 33. El inmunoconj ugado de la reivindicación 30, en donde el enlazador comprende 6-maleimidocaproilo .
  34. 34. El inmunoconj ugado de la reivindicación 28, en donde el inmunoconj ugado tiene la fórmula en donde S es un átomo de azufre y p oscila entre 2 y 5.
  35. 35. El inmunoconj ugado de la reivindicación 29, en donde el inmunoconj ugado tiene la fórmula en donde S es un átomo de azufre y p oscila entre 2 y 5.
  36. 36. Una composición farmacéutica que comprende un inmunoconj ugado con la fórmula Ab-(L-D)p, en donde: (a) Ab es un anticuerpo que se une a TAT226; (b) L es un enlazador; (c) D es un fármaco de la fórmula DE o DF y en donde R2 y R6 son, cada uno, metilo; R3 y R4 son cada uno isopropilo; R7 es sec-butilo, cada R8 se selecciona independientemente entre CH3, 0-CH3, OH, y H; R9 es H; R10 es arilo; Z es -O- o -NH-; R11 es H, alquilo Ci-C8 o - (CH2) 2-0- (CH2) 2-0- (CH2) 2-O-CH3; y R18 es -C (R8) 2-C (R8) 2-arilo; y (d) p oscila entre 1 y 8. para utilizarse en el tratamiento de un trastorno proliferativo celular.
  37. 37. La composición farmacéutica de la reivindicación 36, en donde el trastorno proliferativo celular se selecciona de un cáncer en ovario, un cáncer en útero, tumor cerebral y tumor de Wi litis.
  38. 38. La composición farmacéutica de la reivindicación 36, en donde el inmunoconj ugado es el inmunoconj ugado de la reivindicación 17 o 21.
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