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TWI406871B - 抗ｔａｔ２２６抗體及免疫接合物 - Google Patents

抗ｔａｔ２２６抗體及免疫接合物 Download PDF

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TWI406871B
TWI406871B TW96109168A TW96109168A TWI406871B TW I406871 B TWI406871 B TW I406871B TW 96109168 A TW96109168 A TW 96109168A TW 96109168 A TW96109168 A TW 96109168A TW I406871 B TWI406871 B TW I406871B
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Taiwan
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antibody
amino acid
seq
acid sequence
hvr
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TW96109168A
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English (en)
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TW200813092A (en
Inventor
Wei Ching Liang
Chie Sakanaka
Yan Wu
Original Assignee
Genentech Inc
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Description

抗TAT226抗體及免疫接合物
本發明係關於抗TAT226抗體及其免疫接合物。本發明進一步係關於使用抗TAT226抗體及其免疫接合物之方法。
已證明結合至表現於癌細胞表面之多肽之抗體為有效抗癌療法。此等抗體係經由各種機制起作用，該等機制包括例如活化抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；由具有補體依賴性細胞毒性(CDC)之抗體誘導；增強細胞激素釋放及誘導細胞凋亡。參見例如Cardarelli等人(2002)Cancer Immunol.Immunother .51：15－24。舉例而言，HERCEPTIN及RITUXAN(二者均來自Genentech Inc.,South San Francisco,California)分別為已成功地用以治療乳癌及非霍奇金氏淋巴瘤(non－Hodgkin's lymphoma)之抗體。HERCEPTIN為選擇性地結合至人類表皮生長因子受體2(HER2)原癌基因之細胞外結構域的重組DNA衍生之人化單株抗體。在25－30%之原發性乳癌中觀測到HER2蛋白過度表現。RITUXAN為對抗在正常及惡性B淋巴細胞表面上發現之CD20抗原的基因改造嵌合鼠/人類單株抗體。該兩種抗體均於CHO細胞中重組產生。HERCEPTIN似乎(至少部分)藉由抑制血管生成來起作用(Izumi等人(2002)Nature 416：279－280)且RITUXAN似乎(至少部分)藉由誘導細胞凋亡來起作用(Cardarelli等人(2002)Cancer Immunol.Immunother .51：15－24)。
免疫接合物或"抗體－藥物接合物"適用於在癌症治療中局部傳遞細胞毒性劑。參見例如Syrigos等人(1999)Anticancer Research 19：605－614；Niculescu－Duvaz等人(1997)Adv.Drug Deliv.Rev .26：151－172；美國專利第4,975,278號。免疫接合物使得可將藥物部分靶向傳遞至腫瘤，而全身投予未接合之細胞毒性劑可對正常細胞以及待消除之腫瘤細胞產生不可接受程度之毒性。參見Baldwin等人(1986年3月15日)Lancet 第603－05頁；Thorpe(1985)Monoclonal Antibodies'84：Biological and Clinical Applications (A.Pinchera等人編)中之"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review,"第475－506頁。已研發且將繼續研發靶向細胞表面多肽之免疫接合物以用於治療癌症。關於論述參見例如Hamann等人(2005)Expert Opin.Ther.Patents (2005)15：1087－1103。
顯然，持續需要靶向細胞表面多肽之藥劑以用於診斷及/或治療目的。本文所述之本發明滿足此需要且提供其他益處。
本文引用之所有文獻，包括專利申請案及公開案之全文係以引用的方式併入本文中。
本發明提供抗TAT226抗體及其使用方法。
在一態樣中，提供結合至TAT226之抗體，其中該抗體包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(1)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列之HVR－H1；(2)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR－H2；(3)包含與SEQ ID NO：11之一致序列相符之胺基酸序列的HVR－H3；(4)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR－L1；(5)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR－L2；及(6)包含與SEQ ID NO：19之一致序列相符之胺基酸序列的HVR－L3。
在另一態樣中，結合至TAT226之抗體包含(a)包含與SEQ ID NO：11之一致序列相符之胺基酸序列的HVR－H3及(b)至少一個、兩個、三個、四個或五個選自以下之HVR：(1)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列之HVR－H1；(2)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR－H2；(3)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR－L1；(5)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR－L2；及(6)包含與SEQ ID NO：19之一致序列相符之胺基酸序列的HVR－L3。
在一實施例中，抗體包含具有與SEQ ID NO：19之一致序列相符之胺基酸序列的HVR－L3。在一實施例中，抗體另外包含具有SEQ ID NO：4之胺基酸序列之HVR－H1及具有SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR－H2。在一實施例中，抗體另外包含具有SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR－L1及具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR－L2。
在一實施例中，抗體包含具有選自SEQ ID NO：6－10之胺基酸序列之HVR－H3。在一實施例中，抗體另外包含具有選自SEQ ID NO：14－18之胺基酸序列之HVR－L3。在一實施例中，HVR－H3包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列，且HVR－L3包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列。在一實施例中，HVR－H3包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列，且HVR－L3包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列。在一實施例中，抗體另外包含具有SEQ ID NO：4之胺基酸序列之HVR－H1及具有SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR－H2。在一實施例中，抗體另外包含具有SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR－L1及具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR－L2。
在一態樣中，提供結合至TAT226之抗體，其中該抗體包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(1)包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列之HVR－H1；(2)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR－H2；(3)包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列之HVR－H3；(4)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR－L1；(5)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR－L2；及(6)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR－L3。
在另一態樣中，結合至TAT226之抗體包含(a)包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列之HVR－H3及(b)至少一個、兩個、三個、四個或五個選自以下之HVR：(1)包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列之HVR－H1；(2)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR－H2；(3)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR－L1；(4)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR－L2；及(5)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR－L3。
在一實施例中，抗體包含具有SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR－L3。在一實施例中，抗體另外包含具有SEQ ID NO：1之胺基酸序列之HVR－H1及具有SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR－H2。在一實施例中，抗體另外包含具有SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR－L1及具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR－L2。
在某些實施例中，以上任何抗體另外包含至少一個選自由VH子群III一致框架及VL子群I一致框架之框架。
在一態樣中，提供結合至TAT226之抗體，其中該抗體包含與選自SEQ ID NO：21－25之胺基酸序列具有至少90%序列一致性的重鏈可變結構域。在一實施例中，該抗體另外包含與選自SEQ ID NO：26－31之胺基酸序列具有至少90%序列一致性的輕鏈可變結構域。在一實施例中，該抗體包含與SEQ ID NO：24之胺基酸序列具有至少90%序列一致性之重鏈可變結構域。在一實施例中，該抗體另外包含與SEQ ID NO：29之胺基酸序列具有至少90%序列一致性之輕鏈可變結構域。在一實施例中，重鏈可變結構域包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列，且輕鏈可變結構域包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列。在一實施例中，該抗體包含與SEQ ID NO：25之胺基酸序列具有至少90%序列一致性之重鏈可變結構域。在一實施例中，該抗體另外包含與SEQ ID NO：30之胺基酸序列具有至少90%序列一致性之輕鏈可變結構域。在一實施例中，重鏈可變結構域包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列，且輕鏈可變結構域包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列。
在一態樣中，提供結合至TAT226之抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO：20之胺基酸序列具有至少90%序列一致性之重鏈可變結構域。在一實施例中，該抗體另外包含與SEQ ID NO：26之胺基酸序列具有至少90%序列一致性之輕鏈可變結構域。在一實施例中，重鏈可變結構域包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列，且輕鏈可變結構域包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列。
在某些實施例中，提供編碼以上任何抗體之聚核苷酸。在一實施例中，提供包含聚核苷酸之載體。在一實施例中，提供包含載體之宿主細胞。在一實施例中，宿主細胞為真核的。在一實施例中，宿主細胞為CHO細胞。在一實施例中，提供一種製造抗TAT226抗體之方法，其中該方法包含在適合表現編碼抗體之聚核苷酸之條件下培養宿主細胞且分離該抗體。
在一態樣中，提供結合至表現於細胞表面之TAT226之抗體。在一實施例中，該抗體結合至來自SEQ ID NO：75之胺基酸21－115之TAT226區內的抗原決定基。在一實施例中，該細胞為癌細胞。在一實施例中，該癌細胞為卵巢癌細胞、腦腫瘤細胞或威爾姆氏腫瘤細胞(Wilm's tumor cell)。
在某些實施例中，以上任何抗體均為單株抗體。在一實施例中，該抗體為選自Fab、Fab'－SH、Fv、scFv或(Fab')2 片段之抗體片段。在一實施例中，該抗體為人化的。在一實施例中，該抗體為人類的。在一實施例中，該抗體結合至與選自YWO.32、YWO.49、YWO.49.B7、YWO.49.C9、YWO.49.H2及YWO.49.H6之抗體相同之抗原決定基。
在一態樣中，提供一種偵測生物樣本中TAT226存在之方法，該方法包含在容許抗體結合至TAT226之條件下使該生物樣本與以上任何抗體接觸且偵測在抗體與TAT226之間是否形成複合物。在一實施例中，該生物樣本包含卵巢腫瘤細胞、腦腫瘤細胞或威爾姆氏腫瘤細胞。
在一態樣中，提供一種診斷與TAT226表現之增加相關聯之細胞增殖性病症的方法，該方法包含使測試細胞與以上任何抗體接觸；藉由偵測抗體與TAT226之結合確定TAT226之表現程度；且比較測試細胞對TAT226之表現程度與對照細胞對TAT226之表現程度，其中與對照細胞相比，測試細胞對TAT226之較高表現程度指示存在與TAT226之表現增加相關聯之細胞增殖性病症。在一實施例中，測試細胞為來自懷疑患有細胞增殖性病症之患者的細胞。在一實施例中，細胞增殖性病症係選自卵巢癌及威爾姆氏腫瘤。在一實施例中，該方法包含確定TAT226在測試細胞表面上之表現程度且比較TAT226在測試細胞表面上之表現程度與TAT226在對照細胞表面上之表現程度。
本發明進一步提供免疫接合物及其使用方法。
在一態樣中，免疫接合物包含以上任何共價連接至細胞毒性劑之抗TAT226抗體。在一實施例中，細胞毒性劑係選自毒素、化療劑、抗生素、放射性同位素及核分解酶。
在一態樣中，提供具有式Ab－(L－D)p之免疫接合物，其中：(a)Ab為以上任何抗TAT226抗體，(b)L為連接子；(c)D為式DE 或DF 之藥物 且其中R2 及R6 各自為甲基，R3 及R4 各自為異丙基，R7 為第二丁基，各R8 係獨立地選自CH3 、O－CH3 、OH及H；R9 為H；R10 為芳基；Z為－O－或－NH－；R11 為H、C1 －C8 烷基或－(CH2 )2 －O－(CH2 )2 －O－(CH2 )2 －O－CH3 ；且R18 為－C(R8 )2 －C(R8 )2 －芳基；且(d)p在約1至8之範圍內。
在一實施例中，抗體(Ab)包含1)包含與SEQ ID NO：11之一致序列相符之胺基酸序列的HVR－H3及2)至少一個、兩個、三個、四個或五個選自以下之HVR：(i)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列之HVR－H1；(ii)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR－H2；(iii)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR－L1；(iv)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR－L2；及(v)包含與SEQ ID NO：19之一致序列相符之胺基酸序列之HVR－L3。
在一實施例中，抗體包含具有與SEQ ID NO：19之一致序列相符之胺基酸序列之HVR－L3。在一實施例中，抗體包含具有SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR－H3及具有SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR－L3。在一實施例中，抗體包含具有SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR－H3及具有SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR－L3。在一實施例中，抗體另外包含具有SEQ ID NO：4之胺基酸序列之HVR－H1；具有SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR－H2；具有SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR－L1及具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR－L2。在一實施例中，抗體包含與選自SEQ ID NO：21－25之胺基酸序列具有至少90%序列一致性之重鏈可變區及與選自SEQ ID NO：26－31之胺基酸序列具有至少90%序列一致性之輕鏈可變區。在一實施例中，抗體包含與SEQ ID NO：24之胺基酸序列具有至少90%序列一致性之重鏈可變區及與SEQ ID NO：29之胺基酸序列具有至少90%序列一致性之輕鏈可變區。在一實施例中，抗體包含具有SEQ ID NO：24之胺基酸序列之重鏈可變區及具有SEQ ID NO：29之胺基酸序列之輕鏈可變區。在一實施例中，抗體包含與SEQ ID NO：25之胺基酸序列具有至少90%序列一致性之重鏈可變區及與SEQ ID NO：30之胺基酸序列具有至少90%序列一致性之輕鏈可變區。在一實施例中，抗體包含具有SEQ ID NO：25之胺基酸序列之重鏈可變區及具有SEQ ID NO：30之胺基酸序列之輕鏈可變區。
另外提供關於以上任何免疫接合物之以下實施例。在一實施例中，免疫接合物具有活體外或活體內細胞殺死活性。在一實施例中，連接子係經由抗體上之硫醇基連接至抗體。在一實施例中，連接子可藉由蛋白酶裂解。在一實施例中，連接子包含val－cit二肽。在一實施例中，連接子包含對胺基苄基單元。在一實施例中，將對胺基苄基單元置於藥物與連接子中之蛋白酶裂解位點之間。在一實施例中，對胺基苄基單元為對胺基苄氧羰基(PAB)。在一實施例中，連接子包含6－馬來醯亞胺己醯基。在一實施例中，將6－馬來醯亞胺己醯基置於抗體與連接子中之蛋白酶裂解位點之間。以上實施例可單獨或以彼此之任何組合形式發生。
在一實施例中，藥物係選自MMAE及MMAF。在一實施例中，免疫接合物具有下式 其中Ab為以上任何抗TAT226抗體，S為硫原子且p介於2至5之範圍內。
在一實施例中，免疫接合物具有下式 其中Ab為以上任何抗TAT226抗體，S為硫原子且p介於2至5之範圍內。
在一態樣中，提供一種包含以上任何免疫接合物及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。在一態樣中，提供一種治療細胞增殖性病症之方法，其中該方法包含向個體投予醫藥組合物。在一實施例中，細胞增殖性病症係選自卵巢癌、子宮癌、腦腫瘤及威爾姆氏腫瘤。在一實施例中，細胞增殖性病症係與TAT226在細胞表面上之表現增加相關聯。
在一態樣中，提供一種抑制細胞增殖之方法，其中該方法包含在容許免疫接合物結合至TAT226之條件下將細胞暴露於以上任何免疫接合物。在一實施例中，細胞為腫瘤細胞。在一實施例中，腫瘤細胞為卵巢腫瘤細胞、子宮腫瘤細胞、腦腫瘤細胞或威爾姆氏腫瘤細胞。在一實施例中，細胞為異種移植物。在一實施例中，暴露發生於活體外。在一實施例中，暴露發生於活體內。
提供結合至TAT226之經分離抗體。另外提供包含抗TAT226抗體之免疫接合物。例如，本發明之抗體及免疫接合物適用於診斷或治療與TAT226之變化表現(例如增加之表現)相關聯之病症。在某些實施例中，本發明之抗體或免疫接合物適用於診斷或治療細胞增殖性病症，諸如腫瘤或癌症。在某些實施例中，本發明之抗體或免疫接合物適用於偵測TAT226，例如於細胞表面上表現之TAT226。
提供編碼抗TAT226抗體之聚核苷酸。提供包含編碼抗TAT226抗體之聚核苷酸之載體且提供包含此等載體之宿主細胞。亦提供包含本發明之聚核苷酸、抗TAT226抗體或免疫接合物中之任一或多者之組合物，包括醫藥調配物。
I.通用技術
本文所述或參考之技術及程序一般為熟習此項技術者所熟知且通常係使用習知方法來採用，諸如在以下文獻中所述之廣泛使用之方法：Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual 第3版(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.；Current Protocols in Molecular Biology (F.M.Ausubel等人編，(2003))；the seriesMethods in Enzymology (Academic Press,Inc.)：Pcr 2：A Practical Approach (M.J.MacPherson,B.D.Hames及G.R.Taylor編(1995)),Harlow及Lane編(1988)Antibodies,A Laboratory Manual及Animal Cell Culture (R.I.Freshney編(1987))；Oligonucleotide Synthesis (M.J.Gait編，1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology：A Laboratory Notebook (J.E.Cellis編，1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney)編，(1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P.Mather及P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures (A.Doyle,J.B.Griffiths及D.G.Newell編，1993－8)J.Wiley及Sons；Handbook of Experimental Immunology (D.M.Weir及C.C.Blackwell編)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M.Miller及M.P.Calos編，1987)；PCR：The Polymerase Chain Reaction ,(Mullis等人編，1994)；Current Protocols in Immunology (J.E.Coligan等人編，1991)；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley及Sons,1999)；Immunobiology (C.A.Janeway及P.Travers,1997)；Antibodies (P.Finch,1997)；Antibodies：A Practical Approach (D.Catty.編，IRL Press,1988－1989)；Monoclonal Antibodies：A Practical Approach (P.Shepherd及C.Dean編，Oxford University Press,2000)；Using Antibodies：A Laboratory Manual (E.Harlow及D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies (M.Zanetti及J.D.Capra編，Harwood Academic Publishers,1995)；及Cancer：Principles and Practice of Oncology (V.T.DeVita等人編，J.B.Lippincott Company,1993)。
II.定義及縮寫 A.定義
"經分離"抗體為經識別且自其天然環境之組份分離及/或回收之抗體。其天然環境之污染物組份為干擾抗體研究、診斷或治療用途之物質，且可包括酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶質。在一些實施例中，將抗體(1)純化至如例如勞裏法(Lowry method)所測定之大於95重量%之抗體且在一些實施例中，大於99重量%；(2)純化至藉由使用例如旋杯式定序儀足以獲得至少15個殘基之N端或內部胺基酸序列之程度；或(3)藉由在還原或非還原條件下使用例如庫馬斯亮藍(Coomassie blue)或銀染色之SDS－PAGE純化至均質。經分離抗體包括重組細胞中原位之抗體，此係因為抗體天然環境之至少一種組份將不存在。然而，經分離抗體通常將藉由至少一個純化步驟來製備。
"經分離"核酸分子為自通常在例如其天然環境中與其相關聯之至少一種其他核酸分子分離之核酸分子。經分離核酸分子另外包括通常表現核酸分子之細胞中所含之核酸分子，但該核酸分子係存在於染色體外或存在於不同於其天然染色體位置之染色體位置。
"經純化"意謂分子以在含有其之樣本中至少95重量%或至少98重量%之濃度存在於該樣本中。
如本文所用之術語"大體上相似"或"大體上相同"表示兩個數值(例如，一者與本發明之抗體相關聯且另一者與參考/比較抗體相關聯)之間足夠高之相似度，以使得熟習此項技術者認為兩個值之間之差異在由該等值(例如Kd值)所量測之生物持徵情形中幾乎無或無生物及/或統計學顯著性。該兩個值之間之差異作為參考/比較值之函數，例如小於約50%、小於約40%、小於約30%、小於約20%及/或小於約10%。
如本文所用之短語"大體上降低"或"大體上不同"表示兩個數值(一般為一者與分子相關聯且另一者與參考/比較分子相關聯)之間足夠高之差異度，以使得熟習此項技術者認為兩個值之間之差異在由該等值(例如Kd值)所量測之生物特徵情形中具有統計學顯著性。該兩個值之間之差異作為參考/比較分子之值的函數，例如大於約10%、大於約20%、大於約30%、大於約40%及/或大於約50%。
如本文所用之術語"載體"意欲係指能夠轉運其所連接至之另一核酸的核酸分子。一種類型之載體為"質體"，其係指可接合額外DNA區段之環狀雙鏈DNA。另一種類型之載體為噬菌體載體。另一種類型之載體為病毒載體，其中額外DNA區段可接合至病毒染色體組中。某些載體能夠在引入其之宿主細胞(例如具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)中自主複製。可將其他載體(例如非游離型哺乳動物載體)在引入宿主細胞中時整合於宿主細胞之染色體組中，且藉此與宿主染色體組一起複製。此外，某些載體能夠指引其可操作性地連接之基因的表現。此等載體在本文中稱作"重組表現載體"或簡言之稱作"表現載體"。一般而言，用於重組DNA技術中之表現載體通常為質體形式。在本說明書中，由於質體為最常用之載體形式，因此"質體"與"載體"可交替使用。
如本文可交替使用之"聚核苷酸"或"核酸"係指任何長度之核苷酸聚合物，且包括DNA及RNA。核苷酸可為脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼及/或其類似物，或可藉由DNA或RNA聚合酶或藉由合成反應併入聚合物中之任何受質。聚核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其類似物。若存在，則可在組裝聚合物之前或之後對核苷酸結構進行修飾。核苷酸序列可藉由非核苷酸組份中斷。聚核苷酸可包含在合成後進行之修飾，諸如與一標記結合。其他類型之修飾例如包括"帽子"；以類似物取代天然存在之一或多種核苷酸；核苷酸間修飾，諸如彼等具有不帶電鍵聯(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、膦醯胺酸酯、胺基甲酸酯等)及具有帶電鍵聯(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)者；彼等含有附屬部分者，諸如蛋白(例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、ply－L－離胺酸等)；彼等具有嵌入劑者(例如吖啶、補骨脂素等)；彼等含有螯合劑者(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)；彼等含有烷化劑者；彼等具有經修飾鍵聯者(例如α變旋異構核酸等)以及未經修飾形式之聚核苷酸。此外，可將通常存在於糖中之任何羥基(例如)經膦酸酯基、磷酸酯基置換；由標準保護基保護或經活化以製備額外核苷酸之額外鍵聯，或可結合至固體或半固體支撐物。5'及3'端OH可經磷酸化或經胺或具有1至20個碳原子之有機封端基團部分取代。其他羥基亦可衍生為標準保護基。聚核苷酸亦可含有一般為此項技術中已知之類似形式之核糖或去氧核糖，包括例如2'－O－甲基－；2'－O－烯丙基－；2'－氟－或2'－疊氮基－核糖；碳環基糖類似物；α－變旋異構糖；差向異構糖，諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖；哌喃糖；呋喃糖；景天庚酮糖(sedoheptulose)；非環式類似物及諸如甲基核糖苷基之鹼性核苷類似物。一或多個磷酸二酯鍵可經替代性鍵聯基團置換。該等替代性鍵聯基團包括(但不限於)其中磷酸酯由P(O)S("硫代酯")、P(S)S("二硫代酯")、(O)NR2 ("醯胺酯")、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2 ("甲縮醛")置換之實施例，其中各R或R'獨立地為H或視情況含有醚(－O－)鍵之經取代或未經取代烷基(1－20個C)、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烷基(araldyl)。聚核苷酸中之所有鍵無需均相同。先前描述適用於本文提及之所有聚核苷酸，包括RNA及DNA。
如本文所用之"寡核苷酸"一般係指長度一般(但非必需)小於約200個核苷酸之短、一般為單鏈、一般為合成之聚核苷酸。術語"寡核苷酸"及"聚核苷酸"並不相互排斥。以上關於聚核苷酸之描述可等同地且完全適用於寡核苷酸。
關於參考多肽序列之"胺基酸序列一致性百分比(%)"係定義為在對準序列且(若需要)引入間隙以達成最大序列一致性百分比之後，候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基相同之胺基酸殘基的百分比，且不認為任何保守性取代為序列一致性之部分。為測定胺基酸序列一致性百分比目的之對準可經此項技術中之各種方式來達成，例如使用可公開獲得之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST－2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。彼等熟習此項技術者可確定用於對準序列之適當參數，包括需要用以達成對所比較序列全長之最大對準的任何演算法。然而，為本文之目的，使用序列比較電腦程式ALIGN－2產生胺基酸序列一致性%值。ALIGN－2序列比較電腦程式係由Genentech,Inc.創造，且源代碼已在U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559中以使用者文件申請，其係於U.S.Copyright註冊號TXU510087下註冊。ALIGN－2程式可自Genentech,Inc.,South San FranciSco,California公開獲得或可自源代碼編譯。ALIGN－2程式應經編譯以用於UNIX作業系統，較佳為數位UNIX V4.0D。所有序列比較參數係藉由ALIGN－2程式設定且不變化。
在採用ALIGN－2用於胺基酸序列比較之情況下，指定胺基酸序列A與指定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%(可替代性地表述為與指定胺基酸序列B具有或包含特定胺基酸序列一致性%之指定胺基酸序列A)係如下計算：100×分數X/Y其中X為在A與B之程式對準中，藉由序列對準程式ALIGN－2標記為相同匹配之胺基酸殘基的數目，且其中Y為B中胺基酸殘基之總數。應瞭解，在胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度時，A與B之胺基酸序列一致性%將不等於B與A之胺基酸序列一致性%。除非另外特定描述，否則本文所用之所有胺基酸序列一致性%值係如前段所述使用ALIGN－2電腦程式獲得。
除非另外指出，否則如本文所用之術語"TAT226"係指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)及齧齒類動物(例如小鼠及大鼠))之任何原生TAT226。術語涵蓋"全長"未加工TAT226及由加工細胞所產生之任何形式TAT226。術語亦涵蓋天然產生之TAT226變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。"成熟形式"之TAT226為已經受加工之TAT226形式，例如已經受N端(例如信號序列)及/或C端裂解及/或由連接GPI固著劑修飾之TAT226形式。在一實施例中，"成熟形式"之TAT226係於細胞表面上表現。
"抗體"(Ab)及"免疫球蛋白"(Ig)為具有類似結構特徵之糖蛋白。儘管抗體對特異性抗原展現結合特異性，但免疫球蛋白包括一般缺少抗原特異性之抗體及其他抗體樣分子。後一種多肽例如由淋巴系統以低含量產生及由骨髓瘤以增加之含量產生。
術語"抗體"及"免疫球蛋白"最廣義上可互換使用且包括單株抗體(例如全長或完整單株抗體)、多株抗體、單價抗體、多價抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體，只要其展現所需生物活性即可)，且亦可包括某些抗體片段(如本文更詳細描述)。抗體可為嵌合抗體、人類抗體、人化抗體及/或親和力成熟之抗體。
術語"抗TAT226抗體"或"結合至TAT226之抗體"係指能夠以充分親和力結合TAT226之抗體，以使得抗體適合用作靶向TAT226之診斷及/或治療劑。較佳地，如例如藉由放射免疫檢定(RIA)所量測，抗TAT226抗體與非相關、非TAT226蛋白之結合程度小於抗體與TAT226結合之約10%。在某些實施例中，結合至TAT226之抗體具有1 μM、100 nM、10 nM、1 nM或0.1 nM之解離常數(Kd)。在某些實施例中，抗TAT226抗體結合至在來自不同物種之TAT226中保守之TAT226抗原決定基。
抗體之"可變區"或"可變結構域"係指抗體重鏈或輕鏈之胺基端結構域。重鏈可變結構域可稱作"VH"。輕鏈可變結構域可稱作"VL"。該等結構域一般為抗體之最可變部分且含有抗原結合位點。
術語"可變"係指抗體間可變結構域之特定部分之序列普遍不同且用於各特定抗體與其特定抗原之結合且特異性。然而，可變性在抗體之整個可變結構域中並非均勻分佈。其集中於均位於輕鏈及重鏈可變結構域中稱為互補判定區(CDR)或高變區(HVR)之三個區段中。可變結構域之較高度保守部分稱作框架區(FR)。原生重鏈及輕鏈之可變結構域各自包含大量採用β折疊構型、由三個CDR連接之四個FR區，其形成環連接且在一些情況下形成β折疊結構之部分。將各鏈中之CDR藉由FR區緊鄰地固持在一起，且與其他鏈之CDR一起有助於形成抗體之抗原結合位點(參見Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest ，第五版，National Institute of Health,Betheada,MD(1991))。恆定結構域不直接涉及在抗體與抗原之結合中，但展現各種效應功能，諸如抗體參與抗體依賴型細胞毒性。
可將來自任何脊椎動物物種之抗體(免疫球蛋白)之"輕鏈"基於其恆定結構域之胺基酸序列指定為稱為及λ之兩種完全不同類型中之一種。
抗體(免疫球蛋白)可視其重鏈恆定結構域之胺基酸序列而指定為不同種類。存在五種主要種類之免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且可將其中若干進一步分為例如IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 及IgA2 之子類(同型)。將對應於不同免疫球蛋白種類之重鏈恆定結構域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。不同種類免疫球蛋白之次單位結構及三維構型係眾所熟知，且一般例如描述於Abbas等人Cellular and Mol.Immunology ，第4版(2000)中。抗體可為藉由抗體與一或多種其他蛋白或肽之共價或非共價締合所形成之較大融合分子的部分。
術語"全長抗體"、"完整抗體"及"全抗體"在本文中可互換使用，以係指其大體上完整形式之抗體，而非如下文所定義之抗體片段。該等術語尤其係指具有含有Fc區之重鏈之抗體。
"抗體片段"僅包含完整抗體之一部分，其中該部分保持通常與彼部分存在於完整抗體中時相關之至少一種，且盡可能為大部分或所有功能。在一實施例中，抗體片段包含完整抗體之抗原結合位點，且因此保持結合抗原之能力。在另一實施例中，抗體片段(例如包含Fc區之抗體片段)保持通常與Fc區存在於完整抗體中時相關之至少一種生物功能，該等生物功能諸如FcRn結合，抗體半衰期調變、ADCC功能及補體結合。在一實施例中，抗體片段為具有與完整抗體大體上類似之活體內半衰期之單價抗體。舉例而言，此抗體片段可包含能夠賦予片段活體內穩定性之連接至Fc序列之抗原結合臂。
抗體之番木瓜酶消化產生各自具有單一抗原結合位點之稱為"Fab"片段之兩個相同抗原結合片段，及名稱反映其易於結晶之能力的一個殘餘"Fc"片段。胃蛋白酶處理產生具有兩個抗原組合位點且仍可交聯抗原之F(ab')2 片段。
"Fv"為含有完全抗原結合位點之最小抗體片段。在一實施例中，雙鏈Fv物種由緊密非共價締合之一個重鏈與一個輕鏈可變結構域之二聚體組成。在單鏈Fv(scFv)物種中，一個重鏈與一個輕鏈可變結構域可由彈性肽連接子共價連接，以使得輕鏈與重鏈可以與雙鏈Fv物種中類似之"二聚"結構締合。在此構型中，各可變結構域之三個CDR相互作用以定義VH－VL二聚體表面上之抗原結合位點。總而言之，六個CDR賦予抗體以抗原結合特異性。然而，即使單一可變結構域(或僅包含三個對抗原具特異性之CDR之半數Fv)亦具有識別及結合抗原之能力，儘管其具有比全結合位點較低之親和力。
Fab片段含有重鏈及輕鏈可變結構域，且亦含有輕鏈之恆定結構域及重鏈之第一恆定結構域(CH1)。Fab'片段因為在包括來自抗體鉸鏈區之一或多個半胱胺酸之重鏈CH1結構域的羧基端添加數個殘基而不同於Fab片段。Fab'－SH在本文中命名為Fab'，其中恆定結構域之半胱胺酸殘基帶有游離硫醇基。F(ab')2 抗體片段初始係以其間具有鉸鏈半胱胺酸之Fab'片段對之形式而產生。抗體片段之其他化合偶合亦為已知。
"單鏈Fv"或"scFv"抗體片段包含抗體之VH及VL結構域，其中該等結構域係存在於單一多肽鏈中。一般而言，scFv多肽在VH與VL結構域之間另外包含多肽連接子，其使得scFv可形成抗原結合所需之結構。關於scFV之論述參見Pluckthun，在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies ，第113卷中，Rosenburg及Moore編，Springer－Verlag,New York，第269－315頁(1994)。
術語"雙功能抗體"係指具有兩個抗原結合位點之小抗體片段，該等片段包含連接至相同多肽鏈中之輕鏈可變結構域(VL)之重鏈可變結構域(VH)(VH－VL)。藉由使用過短而不能使相同鏈上之兩個結構域之間成對的連接子，迫使該等結構域與另一鏈之互補結構域成對且產生兩個抗原結合位點。雙功能抗體可為二價的或雙特異性的。雙功能抗體係更全面描述於例如EP 404,097；WO 93/11161；Hudson等人(2003)Nat.Med .9：129－134；及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA ,90：6444－6448(1993)中。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson等人(2003)Nat.Med .9：129－134中。
如本文所用之術語"單株抗體"係指由大體上均質之抗體群體(亦即除可微量存在之可能突變(例如天然產生之突變)以外，包含該群體之個別抗體係相同的)所獲得之抗體。因此，修飾語"單株"表示不為離散抗體之混合物之抗體特徵。在某些實施例中，此單株抗體通常包括包含結合靶之多肽序列之抗體，其中該靶結合多肽序列係藉由包括自複數個多肽序列選擇單一靶結合多肽序列之方法而獲得。舉例而言，選擇方法可為自複數個純系(諸如融合瘤純系、噬菌體純系或重組DNA純系之總和)選擇獨特純系。應瞭解，所選擇之靶結合序列可經進一步改變，例如以改良對靶之親和力；使靶結合序列人化；改良其在細胞培養物中之產生；降低其活體內免疫原性；產生多特異性抗體等，且包含經改變靶結合序列之抗體亦為本發明之單株抗體。與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑相反，單株抗體製劑之各單株抗體係針對抗原上之單一決定子。除其特異性之外，單株抗體製劑之優勢在於其通常不受其他免疫球蛋白之污染。
修飾語"單株"表示由大體上均質之抗體群體所獲得之抗體的特徵，且不將其理解為需要藉由任何特定方法產生抗體。舉例而言，待根據本發明使用之單株抗體可藉由各種技術來製造，該等技術包括例如融合瘤法(例如Kohler等人，Nature ,256：495(1975)；Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual ,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版1988)；Hammerling等人，在Monoclonal Antibodies and T－Cell Hybridomas 563－681(Elsevier,N.Y.,1981)中)、重組DNA法(參見例如美國專利第4,816,567號)、噬菌體呈現技術(參見例如Clackson等人，Nature ,352：624－628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol .222：581－597(1992)；Sidhu等人，J.Mol.Biol .338(2)：299－310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol .340(5)：1073－1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467－12472(2004)；及Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1－2)：119－132(2004))及在具有編碼人類免疫球蛋白序列之部分或所有人類免疫球蛋白基因座或基因之動物體內產生人類或人類樣抗體之技術(參見例如WO 98/24893；WO 96/34096；WO 96/33735；WO 91/10741；Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551(1993)；Jakobovits等人，Nature 362：255－258(1993)；Bruggemann等人，Year in Immunol .7：33(1993)；美國專利第5,545,807號；第5,545,806號；第5,569,825號；第5,625,126號；第5,633,425號；第5,661,016號；Marks等人，Bio.Technology 10：779－783(1992)；Lonberg等人，Nature 368：856－859(1994)；Morrison,Nature 368：812－813(1994)；Fishwild等人，Nature Biotechnol .14：845－851(1996)；Neuberger,Nature Biotechnol .14：826(1996)及Lonberg及Huszar,Intern.Rev.Immunol .13：65－93(1995))。
本文之單株抗體特別包括"嵌合"抗體，其中重鏈及/輕鏈之部分與衍生自特定物種或屬於特定抗體種類或子類之抗體中之對應序列相同或同源，而鏈之剩餘部分與衍生自另一物種或屬於另一抗體種類或子類之抗體中之對應序列相同或同源；以及此等抗體之片段，只要其展現所需生物活性即可(美國專利第4,816,567號；及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851－6855(1984))。
非人類(例如鼠)抗體之"人化"形式為含有衍生自非人類免疫球蛋白之最小序列之嵌合抗體。在一實施例中，人化抗體為其中受體高變區之殘基經具有所需特異性、親和力及/或容量之非人類物種(供體抗體)(諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物)之高變區之殘基置換的人類免疫球蛋白(受體抗體)。在一些情況下，人類免疫球蛋白之框架區(FR)殘基係由對應之非人類殘基置換。此外，人化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中未發現之殘基。可進行該等修飾以進一步改進抗體效能。一般而言，人化抗體將包含大體上所有之至少一個且通常兩個可變結構域，其中所有或大體上所有高變環對應於非人類免疫球蛋白之彼等環，且所有或大體上所有FR為人類免疫球蛋白序列之彼等FR。人化抗體視情況亦將包含免疫球蛋白(通常為人類免疫球蛋白)恆定區(Fc)之至少一部分。關於進一步詳述，參見Jones等人，Nature 321：522－525(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323－329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol .2：593－596(1992)。亦參見以下綜述文章及其中引用之參考文獻：Vaswani及Hamilton,Ann.Allergy,Asthma & Immunol .1：105－115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions 23：1035－1038(1995)；Hurle及Gross,Curr.Op.Biotech .5：428－433(1994)。
"人類抗體"為具有與人類產生之抗體之胺基酸序列對應之胺基酸序列及/或已使用如本文所揭示之製造人類抗體之任何技術製得之抗體。人類抗體之該定義特別排除包含非人類抗原結合殘基之人化抗體。
當於本文中使用時，術語"高變區"、"HVR"或"HV"係指序列高變及/或形成結構上限定之環之抗體可變結構域的區域。一般而言，抗體包含六個高變區；三個在VH(H1、H2、H3)中且三個在VL(L1、L2、L3)中。在原生抗體中，H3及L3呈現最大多樣性之六個高變區，且尤其咸信H3具有賦予抗體優良特異性之獨特作用。Xu等人(2000)Immunity 13：37－45；Johnson及Wu(2003)於Methods in Molecular Biology 248：1－25(Lo編，Human Press,Totowa,NJ)中。實際上，僅由重鏈組成之天然產生之駱駝抗體(camelid antibody)在不存在輕鏈下具有功能性且為穩定的。Hamers－Casterman等人(1993)Nature 363：446－448；Sheriff等人(1996)Nature Struct.Biol .3：733－736。
本文中使用且涵蓋多種高變區之定義。Kabat互補判定區(CDR)係基於序列可變性且最常用(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest ，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。相反，Chothia係指結構化環之位置(Chothia及LeskJ.Mol.Biol .196：901－917(1987))。AbM高變區代表Kabat CDR與Chothia結構化環之間之折衷，且為Oxford Molecular's AbM抗體模型化軟體所使用。"接觸"高變區係基於對可用複合晶體結構之分析。來自該等高變區各自之殘基係如下所述。
高變區可包含如下之"擴展高變區"：VL中24－36或24－34(L1)、46－56或50－56(L2)及89－97或89－96(L3)及VH中26－35(H1)、50－65或49－65(H2)及93－102、94－102或95－102(H3)。可變結構域殘基係根據Kabat等人(同上)關於該等各自之定義進行編號。
"框架"或"FR"殘基為不同於本文所定義之高變區殘基之彼等可變結構域殘基。
術語"如Kabat中之可變結構域殘基編號"或"如Kabat中之胺基酸位置編號"及其變化形式係指在Kabat等人之Sequences of Proteins of Immunological Interest ，第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中用於抗體編譯之重鏈可變結構域或輕鏈可變結構域之編號系統。使用此編號系統，實際為線性之胺基酸序列可含有對應於縮短或插入可變結構域之FR或HVR之較少數或額外胺基酸。舉例而言，重鏈可變結構域可包括在H2之殘基52後插入之單一胺基酸(根據Kabat之殘基52a)及在重鏈FR殘基82後插入之殘基(例如根據Kabat之殘基82a、82b及82c等)。可藉由在抗體之序列同源區與"標準" Kabat編號序列對準來確定指定抗體之殘基Kabat編號。
"親和力成熟"抗體為在其一或多個HVR中具有一或多處變化之抗體，與不具有彼等變化之親本抗體相比，該等變化致使改良抗體對抗原之親和力。在一實施例中，親和力成熟抗體對靶抗原具有奈莫耳或甚至皮莫耳之親和力。親和力成熟抗體係藉由此項技術中已知之程序而產生。Marks等人Bio/Technology 10：779－783(1992)描述藉由VH及VL結構域改組之親和力成熟。HVR及/或框架殘基之隨機突變係由以下文獻描述：Barbas等人Proc Nat.Acad.Sci.USA 91：3809－3813(1994)；Schier等人Gene 169：147－155(1995)；Yelton等人J.Immunol .155：1994－2004(1995)；Jackson等人，J.Immunol .154(7)：3310－9(1995)；及Hawkins等人J.Mol.Biol .226：889－896(1992)。
"阻斷"抗體或"拮抗"抗體為抑制或降低其所結合抗原之生物活性之抗體。某些阻斷抗體或拮抗抗體大體上或完全抑制抗原之生物活性。
如本文所用之"促效抗體"為模擬所關注多肽之至少一種功能活性之抗體。
抗體"效應功能"係指彼等可歸因於抗體Fc區(原生序列Fc區或胺基酸序列變異Fc區)之生物活性，且因抗體同型而不同。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)下調及B細胞活化。
"Fc受體"或"FcR"描述結合至抗體Fc區之受體。在一些實施例中，FcR為原生人類FcR。在一些實施例中，FcR為結合IgG抗體之受體(γ受體)且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII子類之受體，包括該等受體之對偶基因變異體及替代性之剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA("活化受體")及FcγRIIB("抑制受體")，其具有主要在其細胞質域中不同之類似胺基酸序列。活化受體FcγRIIA在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之活化基元(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之抑制基元(ITIM)。(參見Daron,Annu.Rev.Immunol .15：203－234(1997))。FcR係於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol 9：457－92(1991)；Capel等人，Immunomethods 4：25－34(1994)；及de Haas等人，J.Lab.Clin.Med .126：330－41(1995)中論述。包括彼等欲在未來識別者之其他FcR係以術語"FcR"涵蓋於本文中。
術語"Fc受體"或"FcR"亦包括負責將母體IgG轉移至胎兒(Guyer等人，J.Immunol .117：587(1976)及Kim等人，J.Immunol .24：249(1994))且調節免疫球蛋白穩定性之新生兒受體，FcRn。量測與FcRn結合之方法為已知的(參見例如Ghetie 1997,Hinton 2004)。可於(例如)表現人類FcRn之轉殖基因小鼠或經轉染人類細胞株或投予Fc變異多肽之靈長類動物中檢定人類FcRn高親和力結合多肽與人類FcRn之活體內結合及血清半衰期。
WO 00/42072(Presta)描述與FcRs具有改良或減低之結合的抗體變異體。該等專利公開案之內容係以特定引用的方式併入本文。亦參見Shields等人J.Biol.Chem .9(2)：6591－6604(2001)。
"人類效應細胞"為表現一或多種FcR且執行效應功能之白血球。在某些實施例中，細胞至少表現FcγRIII且執行ADCC效應功能。介導ADCC之人類白血球之實例包括周邊血液單核細胞(PBMC)、天然殺死(NK)細胞、單核細胞、細胞毒性T細胞及嗜中性白血球。效應細胞可自例如血液之原生來源分離。
"抗體依賴性細胞介導之細胞毒性"或"ADCC"係指其中經分泌Ig結合至存在於特定細胞毒性細胞(例如天然殺死(NK)細胞、嗜中性白血球及巨噬細胞)上之Fc受體(FcR)上而使得該等細胞毒性效應細胞特異性地結合至攜帶抗原之靶細胞且隨後以細胞毒性殺死靶細胞之細胞毒性形式。介導ADCC之初級細胞，NK細胞僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血細胞上之FcR表現係概述於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol 9：457－92(1991)第464頁之表3中。為評估所關注分子之ADCC活性，可進行諸如美國專利第5,500,362號或第5,821,337號或Presta美國專利第6,737,056號中所述之活體外ADCC檢定。適用於此等檢定之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及天然殺死(NK)細胞。或者，或另外，所關注分子之ADCC活性可於活體內評估，例如於諸如Clynes等人，PNAS(USA) 95：652－656(1998)中揭示之動物模型中評估。
"補體依賴性細胞毒性"或"CDC"係指靶細胞在補體存在下之溶解。經典補體路徑之活化係藉由將補體系統之第一組份(Clq)結合至與其同源抗原結合之抗體(適當子類之抗體)來起始。為評估補體活化，可進行例如於Gazzano－Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所述之CDC檢定。
具有變化之Fc區胺基酸序列及增加或減低之C1q結合能力之多肽變異體係描述於美國專利第6,194,551 B1號及WO 99/51642中。彼等專利公開案之內容係以特定引用的方式併入本文中。亦參見Idusogie等人J.Immunol .164：4178－4184(2000)。
術語"包含Fc區之多肽"係指包含Fc區之多肽，諸如抗體或免疫黏附素。可例如在多肽純化期間或藉由重組工程設計編碼多肽之核酸來移除Fc區之C端離胺酸(根據EU編號系統之殘基447)。因此，包含具有本發明之Fc區之多肽的組合物可包含具有K447之多肽；所有K447經移除之多肽或具有與不具有K447殘基之多肽混合物。
為本文目的之"受體人類框架"為包含衍生自人類免疫球蛋白框架或人類一致框架之VL或VH框架之胺基酸序列的框架。"衍生自"人類免疫球蛋白框架或人類一致框架之受體人類框架可包含其相同胺基酸序列，或其可含有先前存在(pre－existing)之胺基酸序列改變。在一些實施例中，先前存在之胺基酸改變數目為10或更小、9或更小、8或更小、7或更小、6或更小、5或更小、4或更小、3或更小或2或更小。當先前存在之胺基酸改變係存在於VH中時，彼等改變較佳僅發生於位置71H、73H及78H中之三個、兩個或一個位置；例如彼等位置之胺基酸殘基可為71A、73T及/或78A。在一實施例中，VL受體人類框架之序列與VL人類免疫球蛋白框架序列或人類一致框架序列相同。
"人類一致框架"為表示在人類免疫球蛋白VL或VH框架序列之選擇中最常發生之胺基酸殘基的框架。一般而言，人類免疫球蛋白VL或VH序列係選自可變結構域序列之子群。一般而言，序列之子群為如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest ，第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中之子群。在一實施例中，對於VL而言，子群為如同上文之Kabat等人中之子群I。在一實施例中，對於VH而言，子群為如同上文之Kabat等人中之子群III。
"VH子群III一致框架"包含由Kabat等人(同上文)中之可變重子群III中之胺基酸序列所獲得之一致序列。在一實施例中，VH子群III一致框架胺基酸序列包含以下序列各自之至少一部分或所有：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO：50)－H1－WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO：51)－H2－RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC(SEQ ID NO：59)－H3－WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：35)。
"VL子群I一致框架"包含由Kabat等人(同上文)中之可變輕子群I中之胺基酸序列所獲得之一致序列。在一實施例中，VH子群I一致框架胺基酸序列包含以下序列各自之至少一部分或所有：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：60)－L1－WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：61)－L2－GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO：62)－L3－FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：63)。
"結合親和力"一般係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間非共價相互作用之總強度。除非另外指出，否則如本文所用之"結合親和力"係指反映結合對成員(例如抗體與抗原)之間1：1相互作用之固有結合親和力。分子X對其搭配物Y之親和力一般可藉由解離常數(Kd)來表示。親和力可藉由此項技術中已知之通用方法(包括本文所述之彼等方法)來量測。低親和力抗體一般與抗原緩慢結合且傾向於易於解離，而高親和力抗體一般與抗原較快速結合且傾向於更長久地保持結合。此項技術中已知各種量測結合親和力之方法，任何該等方法均可用於本發明之目的。特定說明性實施例係描述於下文中。
在一實施例中，根據本發明之"Kd"或"Kd值"係藉由以所關注之Fab型抗體及所述之其抗原藉由以下檢定進行之經放射性標記抗原結合檢定(RIA)來量測。在未標記抗原之連續滴定存在下，藉由使Fab與最小濃度之經(125 I)－標記之抗原平衡，接著捕獲與經抗Fab抗體塗覆之板結合之抗原來量測Fab對抗原之溶液結合親和力(Chen等人，(1999)J.Mol Biol 293：865－881)。為確立檢定條件，將微量滴定盤(Dynex)以50 mM碳酸鈉(pH值為9.6)中之5 μg/ml所俘獲之抗Fab抗體(Cappel Labs)隔夜塗覆且隨後於室溫(約23℃)下以PBS中之2%(w/v)牛血清白蛋白阻斷歷時兩至五小時。在無吸附劑之盤(Nunc #269620)中，將100 pM或26 pM[125 I]抗原與所關注之Fab連續稀釋液混合(例如，與抗VEGF抗體，Fab－12之評估一致，Presta等人，(1997)Cancer Res .57：4593－4599)。接著將所關注之Fab培育隔夜；然而，培育可持續更長時期(例如約65小時)以確保達到平衡。其後，於室溫下將混合物轉移至捕獲盤中以供培育(例如一小時)。接著將溶液移除且將盤以PBS中之0.1%吐溫20(Tween－20)洗滌八次。當盤乾燥時，每孔添加150 μl之閃爍體(MicroScint－20；Packard)且將盤於Topcount γ計數器(Packard)上計數10分鐘。選擇產生小於或等於20%最大結合濃度之各Fab以用於競爭性結合檢定中。
根據另一實施例，藉由於25℃下使用BIAcoreTM －2000或BIAcoreTM －3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)，使用表面電漿共振檢定以約10個反應單位(RU)之固定抗原CM5晶片量測Kd或Kd值。簡言之，根據供應商說明以N－乙基－N'－(3－二甲胺基丙基)－碳化二醯亞胺鹽酸鹽(EDC)及N－羥基琥珀醯亞胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物感應器晶片(CM5,BIAcore Inc.)。在以每分鐘5 μl之流動速率注射之前，將抗原以pH 4.8之10 mM乙酸鈉稀釋至5 μg/ml(約0.2 μM)以達成約10個反應單位(RU)之偶合蛋白。注射抗原後，注射1 M乙醇胺以阻斷未反應之基團。為動力學量測之目的，於25℃下以約25 μl/min之流動速率在含有0.05%吐溫20之PBS(PBST)中注射Fab之兩倍連續稀釋液(0.78 nM至500 nM)。使用簡單的一對一朗繆耳結合模型(Langmuir binding model)(BIAcore Evaluation Software 3.2版本)，藉由同時擬合締合及解離生物感應曲線計算締合速率(kon )及解離速率(koff )。將平衡解離常數(Kd)以koff /kon 之比率計算。例如參見Chen,Y.等人(1999)J.Mol Biol .293：865－881。若藉由上述表面電漿共振檢定之締合速率大於106 M－1 s－1 ，則可在如由諸如裝備有滯流之分光光度計(Aviv Instruments)或具有攪拌光析管之8000系列SLM－Aminco分光光度計(ThermoSpectronic)之分光計中所量測之增加濃度之抗原存在下，於25℃下藉由使用量測20 nM抗－抗原抗體(Fab形式)在pH 7.2之PBS中之螢光放射強度增加或降低之螢光淬滅技術(激發＝295 nm；放射＝340 nm，16 nm帶通)來測定締合速率。
本發明之"締合速率"或"kon "亦可如上文所述使用BIAcore TM －2000或BIAcoreTM －3000系統(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)測定。
"病症"為受益於以本發明之物質/分子或方法治療之任何病況或疾病。其包括慢性或急性病症，包括彼等使哺乳動物易患所論及病症之病理學病況。本文中待治療之病症之非限制性實例包括癌病，諸如腫瘤，例如癌瘤(上皮腫瘤)及母細胞瘤(胚胎組織衍生之腫瘤)，且在一些實施例中為卵巢癌、子宮癌(包括子宮內膜癌)、腦腫瘤(例如星形細胞瘤及神經膠質瘤)及腎癌，包括腎胚細胞瘤(例如威爾姆氏腫瘤)。
術語"細胞增殖性病症"及"增殖性病症"係指與一定程度之異常細胞增殖相關聯之病症。在一實施例中，細胞增殖性病症為癌症。
如本文所用之"腫瘤"係指所有贅生性細胞生長及增殖(不管為惡性或良性)及所有癌前期及癌細胞及組織。如本文所提及之術語"癌症"、"癌"、"細胞增殖性病症"、"增殖性病症"及"腫瘤"不相互排除。
術語"癌症"及"癌"係指或描述通常特徵在於未經調節之細胞生長/增殖之哺乳動物生理學病況。癌症之實例包括(但不限於)癌瘤、淋巴瘤(例如霍奇金氏及非霍奇金氏淋巴瘤)、母細胞瘤、肉瘤及白血病。此等癌症之更特別實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀細胞癌、腹膜癌、肝細胞癌、腸胃癌、胰腺癌、神經膠質瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝腫瘤、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、陰門癌、甲狀腺癌、肝癌瘤、白血病及其他淋巴增殖性病症及各種類型之頭頸癌。
如本文所用之"治療"係指試圖改變所治療個體或細胞之自然進程之臨床介入，且可為預防之目的或在臨床病理過程期間進行。所需治療效應包括預防疾病之發生或復發；緩解症狀；減少疾病之任何直接或間接病理結果；預防癌轉移；減低疾病發展速率；改善或減輕疾病病況且緩解或改良預後。在一些實施例中，本發明之抗體係用以延遲疾病或病症之發展或減緩疾病或病症之發展。
"個體"為脊椎動物。在某些實施例中，脊椎動物為哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)家畜(諸如牛)、競技類動物、寵物(諸如貓、犬及馬)、靈長類動物、小鼠及大鼠。在某些實施例中，哺乳動物為人類。
"有效量"係指有效達成所需治療或預防結果所必需之劑量及時間量。
本發明之物質/分子之"治療有效量"可根據諸如疾病病況、個體年齡、性別及體重以及物質/分子在個體內引發所需反應之能力之諸因素而不同。治療有效量亦涵蓋治療有益效應超過物質/分子之任何毒性或有害效應之量。"預防有效量"係指有效達成所需預防結果所必需之劑量及時間量。通常但並非必需，由於預防劑量係在疾病之前或早期用於受檢者，因此預防有效量應小於治療有效量。
如本文所用之術語"細胞毒性劑"係指抑制或阻礙細胞功能及/或引起細胞死亡或破壞之物質。術語意欲包括放射性同位素(例如At211 、I131 、I125 、Y90 、Re186 、Re188 、Sm153 、Bi212 、P32 、Pb212 及Lu之放射性同位素)；化療劑，例如甲胺喋呤、阿黴素(adriamicin)、長春藤鹼(長春新鹼、長春鹼、依託泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂黴素C、苯丁酸氮芥、道諾黴素(daunorubicin)；或其他嵌入劑、酶及其片段，諸如核分解酶、抗生素及毒素，諸如細菌、真菌、植物或動物來源之小分子毒素或酶活性毒素(包括其片段及/或變異體)及下文揭示之各種抗腫瘤劑或抗癌劑。其他細胞毒性劑描述於下文中。殺腫瘤劑引起腫瘤細胞之破壞。
"毒素"為能夠對細胞生長或增殖具有有害效應之任何物質。
"化療劑"為適用於治療癌症之化合物。化療劑之實例包括烷基化劑，諸如塞替派(thiotepa)及CYTOXAN環磷醯胺；磺酸烷酯，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，諸如苯佐多帕(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、麥曲多帕(meturedopa)及尤利多帕(uredopa)；伸乙基亞胺及甲基三聚氰胺(methylamelamine)，包括六甲蜜胺、三伸乙基三聚氰胺、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫代磷醯胺及三羥甲基三聚氰胺；乙醯精寧(acetogenin)(尤其為泡番荔枝辛(bullatacin)及泡番荔枝辛酮(bullatacinone))；δ－9－四羥基大麻酚(曲大麻酚(dronabinol),MARINOL)；β－拉帕酮(β－lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙鹼(colchicine)；樺木酸(betulinic acid)；喜樹鹼(camptothecin)(包括合成類似物拓朴替康(topotecan)(HYCAMTIN)、CPT－11(伊立替康(irinotecan),CAMPTOSAR)、乙醯基喜樹鹼(acetylcamptothecin)、司考波萊辛(scopolectin)及9－胺基喜樹鹼)；苔蘚蟲素(bryostatin)；開利斯塔汀(callystatin)；CC－1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)及比折來新(bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼毒素酸(podophyllinic acid)；替尼泊甙(teniposide)；念珠藻環肽(cryptophycin)(尤其為念珠藻環肽1及念珠藻環肽8)；海兔毒素(dolastatin)；多卡黴素(duocarmycin)(包括合成類似物，KW－2189及CB1－TM1)；艾榴素(eleutherobin)；潘卡替斯汀(pancratistatin)；沙科地辛(sarcodictyin)；斯旁斯汀(spongistatin)；芥子氮，諸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、膽磷醯胺、雌莫司汀(estramustine)、異環磷醯胺、氮芥(mechlorethamine)、鹽酸氧化氮芥、美法侖、新恩比星(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲洛磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶芥子氣(uracil mustard)；亞硝基脲，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲黴素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及萊尼莫司汀(ranimnustine)；抗生素，諸如烯二炔抗生素(例如卡奇黴素(calicheamicin)，尤其為卡奇黴素γ1I及卡奇黴素ωI1(例如參見Agnew,Chem Intl.Ed.Engl.,33：183－186(1994))；地奈黴素(dynemicin)，包括地奈黴素A；艾司匹拉黴素(esperamicin)；以及新抑癌蛋白發色團及相關色素蛋白烯二炔抗生素發色團)、阿克萊諾米星(aclacinomysins)、放線菌素、奧萊米星(authramycin)、偶氮絲胺酸(azaserine)、博萊黴素(bleomycins)、放線菌素C、卡拉比星(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、卡莫黴素(chromomycinis)、放線菌素D、道諾黴素、地托比星(detorubicin)、6－重氮基－5－側氧基－L－正白胺酸、ADRIAMYCIN多柔比星(包括嗎啉基－多柔比星、氰基嗎啉基－多柔比星、2－吡咯基－多柔比星及去氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、黃膽素(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、諸如絲裂黴素C之絲裂黴素、黴酚酸、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycins)、培洛黴素(peplomycin)、波替諾黴素(potfiromycin)、嘌羅黴素(puromycin)、炔萊黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑黴素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、左柔比星(zorubicin)；抗代謝劑，諸如甲胺喋呤及5－氟尿嘧啶(5－FU)；葉酸類似物，諸如迪諾特寧(denopterin)、甲胺喋呤、喋羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉賓(fludarabine)、6－巰嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6－氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙去氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氮尿苷(floxuridine)；雄激素，諸如卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾內酪(testolactone)；抗腎上腺素，諸如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充物，諸如醛葉酸(frolinic acid)；醋葡醛內酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；胺基乙醯丙酸；尹陸萊辛(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；貝曲布辛(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；伊達曲仙(edatraxate)；德弗法明(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；伊弗尼辛(elfornithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；艾普塞隆(epothilone)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基尿素；蘑菇多糖(lentinan)；洛尼達寧(lonidainine)；麥坦西諾(maytansinoids)，諸如美登素(maytansine)及安沙米托辛(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫吡丹莫(mopidanmol)；尼曲伊寧(nitraerine)；噴司他丁(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；比柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2－乙醯肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多醣複合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)；雷佐生(razoxane)；根瘤菌素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2"－三氯三乙胺；單端孢黴烯(trichothecene)(尤其為T－2毒素、維萊庫寧A(verracurin A)、桿孢菌素A(roridin A)及安古定(anguidine))；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)(ELDISINE、FILDESIN)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；瓜西托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)("Ara－C")；塞替派(thiotepa)；紫杉醇類，例如TAXOL紫杉醇(Bristol－Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、ABRAXANETM 游離型十六醇聚氧乙烯醚、經白蛋白工程加工之紫杉醇奈米粒子調配物(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Illinois)及TAXOTERE多烯紫杉醇(Rhne－Poulenc Rorer,Antony,France)；氯萊布辛(chloranbucil)；吉西他濱(gemcitabine)(GEMZAR)；6－硫鳥嘌呤；巰嘌呤；甲胺喋呤；鉑類似物，諸如順鉑及卡鉑；長春花鹼(vinblastine)(VELBAN)；鉑；依託泊苷(VP－16)；異環磷醯胺；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新鹼(vincristine)(ONCOVIN)；奧賽力鉑(oxaliplatin)；氯扣沃新(leucovovin)；長春瑞濱(vinorelbine)(NAVELBINE)；諾消靈(novantrone)；依達曲沙(edatrexate)；道諾黴素；胺基喋呤(aminopterin)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；諸如視黃酸之類視色素；卡西他濱(capecitabine)(XELODA)；以上任何醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物；以及以上兩種或兩種以上之組合，諸如CHOP(環磷醯胺、多柔比星、長春新鹼與潑尼龍之組合療法之縮寫)及FOLFOX(以奧賽力鉑(ELOXATINTM )與5－FU及氯扣沃新組合之治療方案的縮寫)。
該定義中亦包括用以調節、降低、阻斷或抑制可促進癌生長之激素效應且通常為全身或全體治療形式之抗激素劑。其自身可為激素。實例包括抗雌激素及選擇性雌激素受體調節劑(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX他莫昔芬)、EVISTA雷諾昔酚(EVISTAraloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4－羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、科奧昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)及FARESTON托瑞米芬(FARESTONtoremifene)；抗－孕酮；雌激素受體下調劑(ERD)；用以抑制或中止卵巢之藥劑，例如黃體生成激素釋放激素(LHRH)促效劑，諸如LUPRON及ELIGARD乙酸亮丙立德(ELIGARDleuprolide acetate)、乙酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、乙酸布舍瑞林(buserelin acetate)及曲特來寧(tripterelin)；其他抗雄激素，諸如氟他胺(flutamide)、尼魯胺(nilutamide)及比卡魯胺(bicalutamide)；及抑制調節腎上腺中雌激素產生之酶芳香酶的芳香酶抑制劑，諸如4(5)－咪唑、胺魯米特(aminoglutethimide)、MEGASE乙酸甲地孕酮、AROMASIN依西美坦(AROMASINexemestane)、福美斯坦(formestanie)、法屈唑(fadrozole)、RIVISOR伏氯唑(RIVISORvorozole)、FEMARA雷曲唑(FEMARAletrozole)及ARIMIDEX安美達錠(ARIMIDEXanastrozole)。此外，化療劑之此定義包括雙膦酸鹽，諸如氯屈膦酸鹽(clodronate)(例如BONEFOS或OSTAC)、DIDROCAL依替膦酸鹽(DIDROCALetidronate)、NE－58095、ZOMETA唑來膦酸/唑來膦酸鹽、FOSAMAX阿侖膦酸鹽、AREDIA帕米膦酸鹽、SKELID替魯膦酸鹽或ACTONEL利塞膦酸鹽(risedronate)；以及曲沙他濱(troxacitabine)(1,3－二氧戊環核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，尤其為彼等抑制異常細胞增殖中涉及之信號路徑中之基因表現的寡核苷酸，諸如PKC－α、Raf、H－Ras及表皮生長因子受體(EGF－R)；疫苗，諸如THERATOPE疫苗及基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN疫苗及VAXID疫苗；LURTOTECAN1型拓撲異構酶抑制劑；ABARELIXrmRH；拉帕替尼二甲苯磺酸鹽(lapatinib ditosylate)(亦稱為GW572016之ErbB－2及EGFR雙酪胺酸激酶小分子抑制劑)及以上任何醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。
本文使用之"生長抑制劑"係指抑制活體外或活體內細胞(諸如表現TAT226之細胞)生長之化合物或組合物。因此，生長抑制劑可為顯著降低S相細胞(諸如表現TAT226之細胞)百分比之生長抑制劑。生長抑制劑之實例包括阻斷細胞週期進程(除S相以外之位置)之藥劑，諸如誘導G1停滯及M相停滯之藥劑。經典M相阻斷劑包括長春蔓(vinca)(長春新鹼及長春鹼)、紫杉烷(taxane)及II型拓樸異構酶抑制劑，諸如多柔比星、表柔比星、道諾黴素、依託泊苷及博萊黴素。停滯G1之彼等藥劑亦溢流入S相停滯中，例如DNA烷化劑，諸如他莫昔芬、強的松(prednisone)、達卡巴嗪、氮芥、順鉑、甲胺喋呤、5－氟尿嘧啶及阿糖胞苷(ara－C)。其他資訊可見於Murakami等人之The Molecular Basis of Cancer ,Mendelsohn及Israel編，第1章，標題為"Cell cycle regulation,oncogenes,and antineoplastic drugs"(WB Saunders：Philadelphia,1995)中，尤其為第13頁。紫杉烷(紫杉醇及多烯紫杉醇(docetaxel))均為衍生自紫杉樹之抗癌藥物。自歐洲紫杉衍生之多烯紫杉醇(TAXOTERE,Rhone－Poulenc Rorer)為紫杉醇(TAXOL,Bristol－Myers Squibb)之半合成類似物。紫杉醇及多烯紫杉醇促進由微管蛋白二聚體組裝微管且藉由防止解聚合穩定微管，其致使抑制細胞中之有絲分裂。
術語"細胞內代謝物"係指由抗體－藥物接合物(ADC)之細胞內之代謝過程或反應所產生之化合物。代謝過程或反應可為酶促過程，諸如蛋白水解裂解ADC之肽連接子或水解諸如腙、酯或醯胺之官能基。細胞內代謝物包括(但不限於)在進入、擴散、吸收或轉運至細胞中之後經受細胞內裂解之抗體及游離藥物。
術語"細胞內裂解"係指抗體－藥物接合物(ADC)細胞內之代謝過程或反應，藉此破壞共價連接，亦即藥物部分(D)與抗體(Ab)之間之連接子，導致游離藥物自細胞內之抗體解離。因此ADC之裂解部分為細胞內代謝物。
術語"生物有效度"係指投予患者之指定量藥物之全身有效度(亦即血液/血漿含量)。生物有效度為表示對藥物自投予劑型達到總循環之時間(速率)及總量(程度)之量測的絕對形式。
術語"細胞毒性活性"係指抗體－藥物接合物或抗體－藥物接合物之細胞內代謝物之細胞殺死、細胞生長抑制或生長抑制效應。細胞毒性活性可表現為IC50 值，其為一半細胞存活時每單位體積之濃度(莫耳或質量)。
"烷基"為含有常態、第二、第三或環狀碳原子之C1 －C18 烴。實例為甲基(Me、－CH3 )、乙基(Et、－CH2 CH3 )、1－丙基(n－Pr、正丙基、－CH2 CH2 CH3 )、2－丙基(i－Pr、異丙基、－CH(CH3 )2 )、1－丁基(n－Bu、正丁基、－CH2 CH2 CH2 CH3 )、2－甲基－1－丙基(i－Bu、異丁基、－CH2 CH(CH3 )2 )、2－丁基(s－Bu、第二丁基、－CH(CH3 )CH2 CH3 )、2－甲基－2－丙基(t－Bu、第三丁基、－C(CH3 )3 )、1－戊基(正戊基、－CH2 CH2 CH2 CH2 CH3 )、2－戊基(－CH(CH3 )CH2 CH2 CH3 )、3－戊基(－CH(CH2 CH3 )2 )、2－甲基－2－丁基(－C(CH3 )2 CH2 CH3 )、3－甲基－2－丁基(－CH(CH3 )CH(CH3 )2 )。3－甲基－1－丁基(－CH2 CH2 CH(CH3 )2 )、2－甲基－1－丁基(－CH2 CH(CH3 )CH2 CH3 )、1－己基(－CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH3 )、2－己基(－CH(CH3 )CH2 CH2 CH2 CH3 )、3－己基(－CH(CH2 CH3 )(CH2 CH2 CH3 ))、2－甲基－2－戊基(－C(CH3 )2 CH2 CH2 CH3 )、3－甲基－2－戊基(－CH(CH3 )CH(CH3 )CH2 CH3 )、4－甲基－2－戊基(－CH(CH3 )CH2 CH(CH3 )2 )、3－甲基－3－戊基(－C(CH3 )(CH2 CH3 )2 )、2－甲基－3－戊基(－CH(CH2 CH3 )CH(CH3 )2 )、2,3－二甲基－2－丁基(－C(CH3 )2 CH(CH3 )2 )、3,3－二甲基－2－丁基(－CH(CH3 )C(CH3 )3 )。
如本文所用之術語"C1 －C8 烷基"係指具有1至8個碳原子之直鏈或支鏈、飽和或不飽和烴。代表性"C1 －C8 烷基"包括(但不限於)－甲基、－乙基、－正丙基、－正丁基、－正戊基、－正己基、－正庚基、－正辛基、－正壬基及－正癸基；而支鏈C1 －C8 烷基包括(但不限於)－異丙基、－第二丁基、－異丁基、－第三丁基、－異戊基、2－甲基丁基；不飽和C1 －C8 烷基包括(但不限於)－乙烯基、－烯丙基、－1－丁烯基、－2－丁烯基、－異丁烯基、－1－戊烯基、－2－戊烯基、－3－甲基－1－丁烯基、－2－甲基－2－丁烯基、－2,3－二甲基－2－丁烯基、1－己基、2－己基、3－己基、－乙炔基、－丙炔基、－1－丁炔基、－2－丁炔基、－1－戊炔基、－2－戊炔基、－3－甲基－1－丁炔基、甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、正戊基、異戊基、新戊基、正己基、異己基、2－甲基戊基、3－甲基戊基、2,2－二甲基丁基、2,3－二甲基丁基、2,2－二甲基戊基、2,3－二甲基戊基、3,3－二甲基戊基、2,3,4－三甲基戊基、3－甲基己基、2,2－二甲基己基、2,4－二甲基己基、2,5－二甲基己基、3,5－二甲基己基、2,4－二甲基戊基、2－甲基庚基、3－甲基庚基、正庚基、異庚基、正辛基及異辛基。C1 －C8 烷基可未經取代或經一或多個包括(但不限於)以下基團之基團取代：－C1 －C8 烷基、－O－(C1 －C8 烷基)、－芳基、－C(O)R'、－OC(O)R'、－C(O)OR'、－C(O)NH2 、－C(O)NHR'、－C(O)N(R')2 －NHC(O)R'、－SO3 R'、－S(O)2 R'、－S(O)R'、－OH、－鹵素、－N3 、－NH2 、－NH(R')、－N(R')2 及－CN；其中各R'係獨立地選自H、－C1 －C8 烷基及芳基。
"烯基"為具有至少一個不飽和(亦即碳－碳，sp 2 雙鍵)位點之含有常態、第二、第三或環狀碳原子之C2 －C18 烴。實例包括(但不限於)：伸乙基或乙烯基(－CH＝CH2 )、烯丙基(－CH2 CH＝CH2 )、環戊烯基(－C5 H7 )及5－己烯基(－CH2 CH2 CH2 CH2 CH＝CH2 )。
"炔基"為具有至少一個不飽和(亦即碳－碳，sp參鍵)位點之含有常態、第二、第三或環狀碳原子之C2 －C18 烴。實例包括(但不限於)：乙炔基(－C≡CH)及炔丙基(－CH2 C≡CH)。
"伸烷基"係指具有1－18個碳原子且具有藉由自母體烷烴之相同或兩個不同碳原子移除兩個氫原子衍生之兩個單價基團中心的飽和、支鏈或直鏈或環狀烴基。典型伸烷基包括(但不限於)：亞甲基(－CH2 －)、1,2－乙基(－CH2 CH2 －)、1,3－丙基(－CH2 CH2 CH2 －)、1,4－丁基(－CH2 CH2 CH2 CH2 －)及其類似基團。
"C1 －C10 伸烷基"為式－(CH2 )1－10 －之直鏈飽和烴基。C1 －C10 伸烷基之實例包括亞甲基、伸乙基、伸丙基、伸丁基、伸戊基、伸己基、伸庚基、伸辛基、伸壬基及伸癸基。
"伸烯基"係指具有2－18個碳原子且具有藉由自母體烯烴之相同或兩個不同碳原子移除兩個氫原子衍生之兩個單價基團中心的不飽和、支鏈或直鏈或環狀烴基。典型伸烯基包括(但不限於)：1,2－伸乙基(－CH＝CH－)。
"伸炔基"係指具有2－18個碳原子且具有藉由自母體炔烴之相同或兩個不同碳原子移除兩個氫原子衍生之兩個單價基團中心的不飽和、支鏈或直鏈或環狀烴基。典型伸炔基包括(但不限於)：乙炔基(－C≡C－)、炔丙基(－CH2 C≡C－)及4－戊炔基(－CH2 CH2 CH2 C≡C－)。
"芳基"係指碳環芳族基。芳基之實例包括(但不限於)苯基、萘基及蒽基。碳環芳族基或雜環芳族基可未經取代或經一或多個包括(但不限於)以下基團之基團取代：－C1 －C8 烷基、－O－(C1 －C8 烷基)、－芳基、－C(O)R'、－OC(O)R'、－C(O)OR'、－C(O)NH2 、－C(O)NHR'、－C(O)N(R')2 －NHC(O)R'、－S(O)2 R'、－S(O)R'、－OH、－鹵素、－N3 、－NH2 、－NH(R')、－N(R')2 及－CN；其中各R'係獨立地選自H、－C1 －C8 烷基及芳基。
"伸芳基"為如以下結構所示之具有兩個共價鍵且可為鄰位、間位或對位構型之芳基： 其中苯基可未經取代或經至多四個包括(但不限於)以下基團之基團取代：－C1 －C8 烷基、－O－(C1 －C8 烷基)、－芳基、－C(O)R'、－OC(O)R'、－C(O)OR'、－C(O)NH2 、－C(O)NHR'、－C(O)N(R')2 －NHC(O)R'、－S(O)2 R'、－S(O)R'、－OH、－鹵素、－N3 、－NH2 、－NH(R')、－N(R')2 及－CN；其中各R'係獨立地選自H、－C1 －C8 烷基及芳基。
"芳烷基"係指其中鍵結至碳原子(通常為末端或sp3 碳原子)之氫原子之一經芳基置換之非環狀烷基。典型芳烷基包括(但不限於)苄基、2－苯基乙烷－1－基、2－苯基乙烯－1－基、萘基甲基、2－萘基乙烷－1－基、2－萘基乙烯－1－基、萘幷苄基、2－萘幷苯基乙烷－1－基及其類似基團。芳烷基包含6至20個碳原子，例如芳烷基之烷基部分(包括烷基、烯基或炔基)為1至6個碳原子且芳基部分為5至14個碳原子。
"雜芳烷基"係指其中鍵結至碳原子(通常為末端或sp3 碳原子)之氫原子之一經雜芳基置換之非環狀烷基。典型雜芳烷基包括(但不限於)2－苯幷咪唑基甲基、2－呋喃基乙基及其類似基團。雜芳烷基包含6至20個碳原子，例如雜芳烷基之烷基部分(包括烷基、烯基或炔基)為1至6個碳原子且雜芳基部分為5至14個碳原子及1至3個選自N、O、P及S之雜原子。雜芳烷基之雜芳基部分可為具有3至7個環成員之單環(2至6個碳原子)或具有7至10個環成員之雙環(4至9個碳原子及1至3個選自N、O、P及S之雜原子)，例如：雙環[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系統。
"經取代之烷基"、"經取代之芳基"及"經取代之芳烷基"分別意謂其中一或多個氫原子各自獨立地經取代基置換之烷基、芳基及芳烷基。典型取代基包括(但不限於)－X、－R、－O－、－OR、－SR、－S－ 、－NR2 、－NR3 、＝NR、－CX3 、－CN、－OCN、－SCN、－N＝C＝O、－NCS、－NO、－NO2 、＝N2 、－N3 、NC(＝O)R、－C(＝O)R、－C(＝O)NR2 、－SO3 － 、－SO3 H、－S(＝O)2 R、－OS(＝O)2 OR、－S(＝O)2 NR、－S(＝O)R、－OP(＝O)(OR)2 、－P(＝O)(OR)2 、－PO3 －、－PO3 H2 、－C(＝O)R、－C(＝O)X、－C(＝S)R、－CO2 R、－CO2 － 、－C(＝S)OR、－C(＝O)SR、－C(＝S)SR、－C(＝O)NR2 、－C(＝S)NR2 、－C(＝NR)NR2 ，其中各X獨立地為鹵素：F、Cl、Br或I；且各R獨立地為－H、C2 －C18 烷基、C6 －C20 芳基、C3 －C14 雜環、保護基或前藥部分。如上所述之伸烷基、伸烯基及伸炔基亦可類似地經取代。
"雜芳基"及"雜環"係指其中一或多個環原子為雜原子(例如氮、氧及硫)之環系統。雜環基包含1至20個碳原子及1至3個選自N、O、P及S之雜原子。雜環可為具有3至7個環成員之單環(2至6個碳原子及1至3個選自N、O、P及S之雜原子)或具有7至10個環成員之雙環(4至9個碳原子及1至3個選自N、O、P及S之雜原子)，例如：雙環[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系統。
雜環係描述於Paquette,Leo A.；"Principles of Modern Heterocyclic Chemistry"(W.A.Benjamin,New York,1968)，尤其是第1、3、4、6、7及9章；"The Chemistry of Heterocyclic Compounds,A series of Monographs"(John Wiley & Sons,New York,1950至今)，尤其是第13、14、16、19及28卷；及J.Am.Chem.Soc .(1960)82：5566中。
雜環之實例以實例而非限制之方式包括吡啶基、二氫吡啶基、四氫吡啶基(哌啶基)、噻唑基、四氫噻吩基、經硫氧化之四氫噻吩基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、四唑基、苯幷呋喃基、噻萘基、吲哚基、吲哚啉基、喹啉基、異喹啉基、苯幷咪唑基、哌啶基、4－哌啶酮基、吡咯啶基、2－吡咯酮基、吡咯啉基、四氫呋喃基、雙－四氫呋喃基、四氫哌喃基、雙－四氫哌喃基、四氫喹啉基、四氫異喹啉基、十氫喹啉基、八氫異喹啉基、吖辛因基、三嗪基、6H－1,2,5－噻二嗪基、2H,6H－1,5,2－二噻嗪基、噻吩基、噻嗯基、哌喃基、異苯幷呋喃基、烯基、基、啡噁噻基、2H－吡咯基、異噻唑基、異噁唑基、吡嗪基、噠嗪基、吲嗪基、異吲哚基、3H－吲哚基、1H－吲唑基、嘌呤基、4H－喹嗪基、呔嗪基、啶基、喹喏啉基、喹唑啉基、喏啉基、喋啶基、4aH－咔唑基、咔唑基、β－咔啉基、啡啶基、吖啶基、嘧啶基、啡啉基、啡嗪基、啡噻嗪基、呋吖基、啡噁嗪基、異基、基、咪唑啶基、咪唑啉基、吡唑啶基、吡唑啉基、哌嗪基、吲哚啉基、異吲哚啉基、啶基、嗎啉基、噁唑啶基、苯幷三唑基、苯幷異噁唑基、羥基吲哚基、苯幷噁唑啉基及吲哚滿二酮基(isatinoyl)。
以實例而非限制之方式，碳鍵結之雜環係於以下位置鍵結：吡啶之位置2、3、4、5或6；噠嗪之位置3、4、5或6；嘧啶之位置2、4、5或6；吡嗪之位置2、3、5或6；呋喃、四氫呋喃、硫呋喃、噻吩、吡咯或四氫吡咯之位置2、3、4或5；噁唑、咪唑或噻唑之位置2、4或5；異噁唑、吡唑或異噻唑之位置3、4或5；氮丙啶之位置2或3；吖丁啶之位置2、3或4；喹啉之位置2、3、4、5、6、7或8或異喹啉之位置1、3、4、5、6、7或8。更通常地，碳鍵結之雜環包括2－吡啶基、3－吡啶基、4－吡啶基、5－吡啶基、6－吡啶基、3－噠嗪基、4－噠嗪基、5－噠嗪基、6－噠嗪基、2－嘧啶基、4－嘧啶基、5－嘧啶基、6－嘧啶基、2－吡嗪基、3－吡嗪基、5－吡嗪基、6－吡嗪基、2－噻唑基、4－噻唑基或5－噻唑基。
以實例而非限制之方式，氮鍵結之雜環係於以下位置鍵結：氮丙啶、吖丁啶、吡咯、吡咯啶、2－吡咯啉、3－吡咯啉、咪唑、咪唑啶、2－咪唑啉、3－咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2－吡唑啉、3－吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、吲哚啉、1H－吲唑之位置1；異吲哚或異吲哚啉之位置2；嗎啉之位置4及咔唑或β－咔啉之位置9。更通常地，氮鍵結之雜環包括1－氮丙啶基、1－吖唉基(azetedyl)、1－吡咯基、1－咪唑基、1－吡唑基及1－哌啶基。
"C3 －C8 雜環"係指其中環碳原子之一至四者獨立地經選自由O、S與N組成之群之雜原子置換的芳族或非芳族C3 －C8 碳環。C3 －C8 雜環之代表性實例包括(但不限於)苯幷呋喃基、苯幷噻吩、吲哚基、苯幷吡唑基、香豆素基、異喹啉基、吡咯基、噻吩基、呋喃基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、三唑基、喹啉基、嘧啶基、吡啶基、吡啶酮基、吡嗪基、噠嗪基、異噻唑基、異噁唑基及四唑基。C3 －C8 雜環可未經取代或經至多七個包括(但不限於)以下基團之基團取代：－C1 －C8 烷基、－O－(C1 －C8 烷基)、－芳基、－C(O)R'、－OC(O)R'、－C(O)OR'、－C(O)NH2 、－C(O)NHR'、－C(O)N(R')2 、－NHC(O)R'、－S(O)2 R'、－S(O)R'、－OH、－鹵素、－N3 、－NH2 、－NH(R')、－N(R')2 及－CN；其中各R'係獨立地選自H、－C1 －C8 烷基及芳基。
"C3 －C8 雜環基"指其中雜環基之氫原子之一經一鍵置換的以上定義之C3 －C8 雜環基。C3 －C8 雜環基可未經取代或經至多六個包括(但不限於)以下基團之基團取代：－C1 －C8 烷基、－O－(C1 －C8 烷基)、－芳基、－C(O)R'、－OC(O)R'、－C(O)OR'、－C(O)NH2 、－C(O)NHR'、－C(O)N(R')2 、－NHC(O)R'、－S(O)2 R'、－S(O)R'、－OH、－鹵素、－N3 、－NH2 、－NH(R')、－N(R')2 及－CN；其中各R'係獨立地選自H、－C1 －C8 烷基及芳基。
"碳環"意謂具有3至7個碳原子之單環形式或7至12個碳原子之雙環形式之飽和或不飽和環。單環碳環具有3至6個環原子，更通常為5或6個環原子。雙環碳環具有例如以雙環[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系統形式排列之7至12個環原子，或以雙環[5,6]或[6,6]系統排列之9或10個環原子。單環碳環之實例包括環丙基、環丁基、環戊基、1－環戊－1－烯基、1－環戊－2－烯基、1－環戊－3－烯基、環己基、1－環己－1－烯基、1－環己－2－烯基、1－環己－3－烯基、環庚基及環辛基。
"C3 －C8 碳環"為3－、4－、5－、6－、7－或8－員飽和或不飽和非芳族碳環。代表性C3 －C8 碳環包括(但不限於)－環丙基、－環丁基、－環戊基、－環戊二烯基、－環己基、－環己烯基、－1,3－環己二烯基、－1,4－環己二烯基、－環庚基、－1,3－環庚二烯基、－1,3,5－環庚三烯基、－環辛基及環辛二烯基。C3 －C8 碳環基可未經取代或經一或多個包括(但不限於)以下基團之基團取代：－C1 －C8 烷基、－O－(C1 －C8 烷基)、－芳基、－C(O)R'、－OC(O)R'、－C(O)OR'、－C(O)NH2 、－C(O)NHR'、－C(O)N(R')2 －NHC(O)R'、－S(O)2 R'、－S(O)R'、－OH、－鹵素、－N3 、－NH2 、－NH(R')、－N(R')2 及－CN；其中各R'係獨立地選自H、－C1 －C8 烷基及芳基。
"C3 －C8 碳環基"係指其中碳環基之氫原子之一經一鍵置換的以上定義之C3 －C8 碳環基。
"連接子"係指包含將抗體共價連接至藥物部分之共價鍵或原子鏈之化學部分。在各種實施例中，連接子包括二價基，諸如烷二基、芳二基、雜芳二基；諸如以下之部分：－(CR2 )n O(CR2 )n －、烷氧基之重複單元(例如聚伸乙氧基、PEG、聚亞甲氧基)及烷胺基(例如聚伸乙胺基、JeffamineTM )；及二酸酯及醯胺，包括琥珀酸酯、琥珀醯胺、二羥乙酸酯、丙二酸酯及己醯胺。
術語"對掌性"係指具有鏡像搭配物之非重疊特性之分子，而術語"非對掌性"係指關於其鏡像搭配物重疊之分子。
術語"立體異構體"係指具有相同化學組成，但原子或基團之空間排列不同之化合物。
"非對映異構體"係指具有兩個或兩個以上對掌性中心且其分子彼此不為鏡像之立體異構體。非對映異構體具有不同物理特性，例如熔點、沸點、光譜特性及反應性。非對映異構體之混合物可於高解析分析程序(諸如電泳及層析)下分離。
"對映異構體"係指為彼此為不可重疊鏡像之化合物的兩種立體異構體。
本文所用之立體化學定義及慣例一般係依據S.P.Parker編之McGraw－Hill Dictionary of Chemical Terms (1984)McGraw－Hill Book Company,New York；及Eliel,E.及Wilen,S.,Stereochemistry of Organic Compounds (1994)John Wiley & Sons,Inc.,New York。許多有機化合物係以光活性形式存在，亦即其具有旋轉平面偏振光平面之能力。在描述光活性化合物中，字首D及L或R及S係用以表示分子關於其對掌性中心之絕對構型。字首d及l或(＋)及(－)係用以表示以化合物旋轉平面偏振光之標記，其中(－)或l意謂化合物為左旋的。以(＋)或d為字首之化合物為右旋的。對於指定化學結構而言，該等立體異構體除為彼此之鏡像以外為相同的。特定立體異構體亦可稱作對映異構體且此等異構體之混合物通常稱作對映異構體混合物。對映異構體之50：50混合物稱作外消旋混合物或外消旋體，其可在化學反應或過程中不存在立體選擇性或立體特異性時產生。術語"外消旋混合物"及"外消旋體"係指無光活性之兩種對映異構體物種之等莫耳混合物。
"脫離基"係指可經另一種官能基取代之官能基。某些脫離基於此項技術中已熟知且實例包括(但不限於)鹵化物(例如氯化物、溴化物、碘化物)、甲磺醯基(mesyl)、對甲苯磺醯基(tosyl)、三氟甲基磺醯基(三氟甲磺酸酯基(triflate))及三氟甲基磺酸酯基。
B.縮寫
連接子組份：MC＝6－馬來醯亞胺己醯基Val－Cit或"vc"＝纈胺酸－瓜胺酸(可被蛋白酶裂解之連接子中的例示性二肽)瓜胺酸＝2－胺基－5－脲基戊酸PAB＝對胺基苄氧羰基("自毀性(self immolative)"連接子組份之實例)Me－Val－Cit＝N－甲基－纈胺酸－瓜胺酸(其中連接子肽鍵經改質以防止其被組織蛋白酶B裂解)MC(PEG)6－OH＝馬來醯亞胺己醯基－聚乙二醇(可連接至抗體半胱胺酸)
細胞毒性藥物：MMAE＝單甲基auristatin E(MW 718)MMAF＝於藥物之C端具有苯丙胺酸之auristatin E(MMAE)變異體(MW 731.5)MMAF－DMAEA＝於與C端苯丙胺酸之醯胺鍵中具有DMAEA(二甲胺基乙胺)之MMAF(MW 801.5)MMAF－TEG＝具有經酯化為苯丙胺酸之四乙二醇之MMAF MMAF－NtBu＝作為醯胺連接至MMAF之C端之N－第三丁基
其他縮寫如下：AE為auristatin E；Boc為N－(第三丁氧羰基)；cit為瓜胺酸；dap為多拉苯丙普寧(dolaproine)；DCC為1,3－二環己基碳化二醯亞胺；DCM為二氯甲烷；DEA為二乙胺；DEAD為偶氮二甲酸二乙酯；DEPC為氰酸磷醯基二乙酯；DIAD為偶氮二甲酸二異丙酯；DIEA為N,N －二異丙基乙胺；dil為多拉異白胺酸；DMA為二甲基乙醯胺；DMAP為4－二甲胺基吡啶；DME為乙二醇二甲醚(或1,2－二甲氧基乙烷)；DMF為N,N－二甲基甲醯胺；DMSO為二甲亞碸；doe為多拉苯寧(dolaphenine)；dov為N,N －二甲基纈胺酸；DTNB為5,5'－二硫雙(2－硝基苯甲酸)；DTPA為二伸乙三胺五乙酸；DTT為二硫蘇糖醇；EDCI為1－(3－二甲胺基丙基)－3－乙基碳化二醯亞胺鹽酸鹽；EEDQ為2－乙氧基－1－乙氧羰基－1,2－二氫喹啉；ES－MS為電噴質譜分析；EtOAc為乙酸乙酯；Fmoc為N －(9－茀基甲氧羰基)；gly為甘胺酸；HATU為O －(7－氮雜苯幷三唑－1－基)－N,N,N',N'－四甲六氟磷酸鹽；HOBt為1－羥基苯幷三唑；HPLC為高壓液相層析；ile為異白胺酸；lys為離胺酸；MeCN(CH3 CN)為乙腈；MeOH為甲醇；Mtr為4－大茴香基二苯基甲基(或4－甲氧基三苯甲基)；nor為(1S,2R )－(＋)－去甲麻黃鹼；PBS為磷酸鹽緩衝生理食鹽水(pH 7.4)；PEG為聚乙二醇；Ph為苯基；Pnp為對硝基苯基；MC為6－馬來醯亞胺己醯基；phe為L－苯丙胺酸；PyBrop為溴基參吡咯啶基六氟磷酸鏻；SEC為尺寸排阻層析法；Su為琥珀醯亞胺；TFA為三氟乙酸；TLC為薄層層析法；UV為紫外線；且val為纈胺酸。
III.組合物及其製造方法
提供結合至TAT226之抗體。提供包含抗TAT226抗體之免疫接合物。本發明之抗體及免疫接合物適用於例如診斷或治療與TAT226之變化表現(例如增加之表現)相關聯之病症。在某些實施例中，本發明之抗體或免疫接合物適用於診斷或治療細胞增殖性病症，諸如癌症。
A.抗TAT226抗體
TAT226("腫瘤相關抗原靶第226號")為經加工且於特定細胞類型(包括腫瘤細胞)表面上表現之蛋白。詳言之，先前已報導人類TAT226於特定類型之腫瘤(包括卵巢、子宮、子宮內膜、腎、肺、胰腺、腎上腺及肝細胞腫瘤)中過度表現。參見例如美國專利申請公開案US 2003/0148408 A1、US 2004/0229277 A1及US 2003/0100712 A1(將TAT226稱作"PRO9917")；及美國專利第6,710,170 B2號(SEQI D NO：215)。與TAT226相關之其他資料庫條目及揭示內容如下：NCBI寄存編號AY358628_1(將人類TAT226稱作"PSCA Hlog")；NCBI寄存編號AAQ88991.1及"gi"第37182378號(將人類TAT226稱作"PSCA Hlog")；RIKEN cDNA 2700050C12；US 2003/0096961 A1(SEQ ID NO：16)；US 2003/0129192 A1(SEQ ID NO：215)；US 2003/0206918 A1(實例5；SEQ ID NO：215)；US 2003/0232056 A1(SEQ ID NO：215)；US 2004/0044179 A1(SEQ ID NO：16)；US 2004/0044180 A1(SEQ IDNO：16)；US 2005/0238649 A1(將人類TAT226稱作"PSCA Hlog")；WO 2003/025148(SEQ ID NO：292)；WO 2003/105758(SEQ ID NO：14)；及EP 1347046(SEQ ID NO：2640)。
全長TAT226於細胞內經受加工以產生在細胞表面上表現之成熟形式蛋白。舉例而言，如SEQ ID NO：75所示之全長人類TAT226含有來自胺基酸1－20或1－22之預測信號肽序列，其經預測將自蛋白裂解。預測胺基酸116－141之C端將自蛋白裂解且GPI部分於胺基酸115處連接至蛋白。預測來自SEQ ID NO：75之胺基酸21－115或23－115之成熟形式人類TAT226將經由GPI部分固著至細胞表面。猴及齧齒動物TAT226(參見例如SEQ ID NO：76－78)與人類TAT226高度相似且因此咸信其將於等效胺基酸位置被裂解及修飾。參見圖1。所得來自胺基酸21－115或23－115之成熟形式之人類、猴及齧齒動物TAT226(如圖1所示)係100%相同的。
人類TAT226之其他特徵包括已經經驗證實之胺基酸45處之預測N糖基化位點及來自SEQ ID NO：75之胺基酸94－107之預測Ly6/u－PAR結構域。人類TAT226與前列腺幹細胞抗原(PSCA)(一種經由GPI鍵聯表現於細胞表面上之前列腺癌特異性腫瘤抗原)具有約32%之胺基酸同源性。參見Reiter等人(1998)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 95：1735－1740。PSCA在超過80%之前列腺癌中過度表現。(同上)。如同TAT226，其含有預測Ly6/u－PAR結構域，其涉及在諸如信號轉導及細胞黏著之細胞功能中。(同上)。
在一態樣中，本發明提供結合至TAT226之抗體。在一些實施例中，提供結合至成熟形式TAT226之抗體。在一個此實施例中，成熟形式之TAT226具有來自SEQ ID NO：75之胺基酸21－115或23－115之胺基酸序列。在一些實施例中，TAT226之抗體結合至於細胞表面上表現之成熟形式TAT226。在一些實施例中，結合至於細胞表面上表現之成熟形式TAT226的抗體抑制細胞生長。在一些實施例中，抗TAT226抗體結合至於細胞表面上表現之成熟形式TAT226且抑制細胞增殖。在某些實施例中，抗TAT226抗體結合至於細胞表面上表現之成熟形式TAT226且誘導細胞死亡。在一些實施例中，抗TAT226抗體結合至於癌細胞表面上表現之成熟形式TAT226。在一些實施例中，抗TAT226抗體結合至相對於相同組織來源之正常細胞於癌細胞表面上過度表現之成熟形式TAT226。
在一態樣中，抗TAT226抗體為單株抗體。在一態樣中，抗TAT226抗體為抗體片段，例如Fab、Fab'－SH、Fv、scFv或(Fab')2 片段。在一態樣中，抗TAT226抗體為嵌合、人化或人類抗體。在一態樣中，純化本文所述之任何抗TAT226抗體。
如實例B中所述，本文提供衍生自噬菌體庫之例示性單株抗體。用於篩檢庫之抗原為具有SEQ ID NO：75之胺基酸1－115序列之多肽，對應於缺少為假定GPI連接位點C端之胺基酸的TAT226形式。將由庫篩檢產生之抗體命名為YWO.32及YWO.49。YWO.49為親和力成熟的以產生YWO.49.B7、YWO.49.C9、YWO.49.H2及YWO.49.H6。YWO.32、YWO.49、YWO.49.B7、YWO.49.C9、YWO.49.H2及YWO.49.H6之重鏈及輕鏈可變結構域序列之對準分別展示於圖11及12中。
在一態樣中，提供與YWO.32、YWO.49、YWO.49.B7、YWO.49.C9、YWO.49.H2或YWO.49.H6競爭結合至TAT226之單株抗體。亦提供結合至與YWO.32、YWO.49、YWO.49.B7、YWO.49.C9、YWO.49.H2或YWO.49.H6相同之抗原決定基之單株抗體。
在本發明之一態樣中，提供編碼抗TAT226抗體之聚核苷酸。在某些實施例中，提供包含編碼抗TAT226抗體之聚核苷酸之載體。在某些實施例中，提供包含此等載體之宿主細胞。在本發明之另一態樣中，提供包含抗TAT226抗體或編碼抗TAT226抗體之聚核苷酸之組合物。在某些實施例中，本發明之組合物為用於治療諸如彼等於本文中列舉者之細胞增殖性病症之醫藥調配物。
例示性抗TAT226抗體之詳述如下： 1.抗TAT226抗體之特定實施例 在一態樣中，本發明提供包含選自以下之至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個HVR之抗體：(a)包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4之胺基酸序列之HVR－H1；(b)包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR－H2；(c)包含選自SEQ ID NO：3及6－11之胺基酸序列之HVR－H3；(d)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR－L1；(e)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR－L2；及(f)包含選自SEQ ID NO：14－19之胺基酸序列之HVR－L3。
在一態樣中，本發明提供包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列之抗TAT226抗體：(a)包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4之胺基酸序列之HVR－H1；(b)包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR－H2；及(c)包含選自SEQ ID NO：3及6－11之胺基酸序列之HVR－H3。在一態樣中，本發明提供包含具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4之胺基酸序列之HVR－H1的抗TAT226抗體。在一態樣中，本發明提供包含具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR－H2的抗TAT226抗體。在一態樣中，本發明提供包含具有選自SEQ ID NO：3及6－11之胺基酸序列之HVR－H3的抗TAT226抗體。在一態樣中，本發明提供包含具有SEQ ID NO：9或10之胺基酸序列之HVR－H3的抗TAT226抗體。
在一態樣中，本發明提供包含具有選自SEQ ID NO：3及6－11之胺基酸序列之HVR－H3及具有選自SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：4之胺基酸序列之HVR－H1的抗TAT226抗體。在一態樣中，本發明提供包含具有選自SEQ ID NO：6－11之胺基酸序列之HVR－H3及具有SEQ ID NO：4之HVR－H1的抗TAT226抗體。在一態樣中，本發明提供包含具有SEQ ID NO：9或10之HVR－H3及具有SEQ ID NO：4之HVR－H1的抗TAT226抗體。在一態樣中，本發明提供包含具有SEQ ID NO：3之HVR－H3及具有SEQ ID NO：1之HVR－H1的抗TAT226抗體。
在一態樣中，本發明提供包含具有選自SEQ ID NO：3及6－11之胺基酸序列之HVR－H3及具有選自SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR－H2的抗TAT226抗體。在一態樣中，本發明提供包含具有選自SEQ ID NO：6－11之胺基酸序列之HVR－H3及具有SEQ ID NO：5之HVR－H2的抗TAT226抗體。在一態樣中，本發明提供包含具有SEQ ID NO：9或10之HVR－H3及具有SEQ ID NO：5之HVR－H2的抗TAT226抗體。在一態樣中，本發明提供包含具有SEQ ID NO：3之HVR－H3及具有SEQ ID NO：2之HVR－H2的抗TAT226抗體。
在一態樣中，本發明提供包含具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4之胺基酸序列之HVR－H1；具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR－H2；及具有選自SEQ ID NO：3及6－11之胺基酸序列之HVR－H3的抗TAT226抗體。在一實施例中，HVR－H1包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列；HVR－H2包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列；且HVR－H3包含選自SEQ ID NO：6－11之胺基酸序列。在一實施例中，HVR－H1包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列；HVR－H2包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列；且HVR－H3包含SEQ ID NO：9或10。在一實施例中，HVR－H1包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列；HVR－H2包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列；且HVR－H3包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列。
在一態樣中，本發明提供包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列之抗TAT226抗體：(a)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR－L1；(b)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR－H2；及(c)包含選自SEQ ID NO：14－19之胺基酸序列之HVR－H3。在一態樣中，本發明提供包含具有選自SEQ ID NO：14－19之胺基酸序列之HVR－L3的抗TAT226抗體。在一態樣中，本發明提供包含具有SEQ ID NO：17或18之胺基酸序列之HVR－L3的抗TAT226抗體。
在一態樣中，本發明提供包含以下之抗TAT226抗體：(a)包含選自SEQ ID NO：3及6－11之胺基酸序列之HVR－H3及(b)包含選自SEQ ID NO：14－19之胺基酸序列之HVR－L3。在一態樣中，本發明提供包含以下之抗TAT226抗體：(a)包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列之HVR－H3及(b)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR－L3。在一些實施例中，TAT226抗體另外包含(a)包含SEQ ID NO：1之HVR－H1及包含SEQ ID NO：2之HVR－H2。
在一態樣中，本發明提供包含以下之抗TAT226抗體，(a)包含選自SEQ ID NO：6－11之胺基酸序列之HVR－H3及(b)包含選自SEQ ID NO：14－19之胺基酸序列之HVR－L3。在一些實施例中，HVR－H3包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列且HVR－L3包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列。在一些實施例中，HVR－H3包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列且HVR－L3包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列。在一些實施例中，TAT226抗體另外包含具有SEQ ID NO：4之HVR－H1及具有SEQ ID NO：5之HVR－H2。
在一態樣中，本發明提供包含以下之抗TAT226抗體：(a)包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4之胺基酸序列之HVR－H1；(b)包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR－H2；(c)包含選自SEQ ID NO：3及6－11之胺基酸序列之HVR－H3；(d)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR－L1；(e)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR－L2；及(f)包含選自SEQ ID NO：14－19之胺基酸序列之HVR－L3。
在一態樣中，本發明提供包含以下之抗TAT226抗體：(a)包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列之HVR－H1；(b)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之HVR－H2；(c)包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列之HVR－H3；(d)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR－L1；(e)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR－L2；及(f)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR－L3。
在一態樣中，本發明提供包含以下之抗TAT226抗體：(a)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列之HVR－H1；(b)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR－H2；(c)包含選自SEQ ID NO：6－11之胺基酸序列之HVR－H3；(d)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR－L1；(e)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR－L2；及(f)包含選自SEQ ID NO：14－19之胺基酸序列之HVR－L3。
在一態樣中，本發明提供包含以下之抗TAT226抗體：(a)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列之HVR－H1；(b)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR－H2；(c)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR－H3；(d)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR－L1；(e)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR－L2；及(f)包含選自SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR－L3。
在一態樣中，本發明提供包含以下之抗TAT226抗體：(a)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列之HVR－H1；(b)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR－H2；(c)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR－H3；(d)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR－L1；(e)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR－L2；及(f)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR－L3。
在一些實施例中，抗TAT226抗體為親和力成熟的以獲得所要之靶結合親和力。在一些實施例中，抗體之任一或多個胺基酸係於以下HVR位置(Kabat編號)經取代：H98、H99、H100、H100B、L90、L92、L93、L96及L97。舉例而言，在一些實施例中，可以任何組合進行以下任一或多種取代：－在HVR－H3(SEQ ID NO：6)中：V98I；S99T；R100L或I；G100bA、S或P－在HVR－L3(SEQ ID NO：14)中：Q90R、K、H或N；Y92V；T93F、N、G或A；P96F；T97I或A SEQ ID NO：11(HVR－H3)及SEQ ID NO：19(HVR－L3)之一致序列涵蓋以上取代之所有可能組合。
抗TAT226抗體可包含任何合適之框架可變結構域序列，其限制條件為抗體保持結合TAT226之能力。舉例而言，在一些實施例中，本發明之抗TAT226抗體包含人類子群III重鏈框架一致序列。在該等抗體之一實施例中，重鏈框架一致序列包含位置71、73及/或78處之取代。在該等抗體之一實施例中，位置71為A、位置73為T及/或位置78為A。在一實施例中，該等抗體包含huMAb4D5－8之重鏈可變結構域框架序列，例如SEQ ID NO：50、51、59、35(分別為FR1、2、3、4)。huMAb4D5－8商業上稱作HERCEPTIN,Genentech,Inc.,South San Francisco,CA,USA；亦於美國專利第6,407,213號&第5,821,337號及Lee等人，J.Mol.Biol.(2004),340(5)：1073－93中提及。在一個此實施例中，該等抗體另外包含人類I輕鏈框架一致序列。在一個此實施例中，該等抗體包含huMAb4D5－8之輕鏈可變結構域框架序列。
在一實施例中，抗TAT226抗體包含具有框架序列及高變區之重鏈可變結構域，其中框架序列包含選自彼等展示於圖5A及5B中之FR1－FR4序列；HVR H1包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列；HVR－H2包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列；且HVR－H3包含選自SEQ ID NO：6－11之胺基酸序列。在該等抗體之一實施例中，HVR－H3包含SEQ ID NO：9或10之胺基酸序列。在一實施例中，抗TAT226抗體包含具有框架序列及高變區之輕鏈可變結構域，其中框架序列包含選自彼等展示於圖6A及6B中之FR1－FR4序列；HVR－L1包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列；HVR－L2包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列；且HVR－L3包含選自SEQ ID NO：14－19之胺基酸序列。在該等抗體之一實施例中，HVR－L3包含SEQ ID NO：17或18之胺基酸序列。
在一實施例中，抗TAT226抗體包含具有框架序列及高變區之重鏈可變結構域，其中框架序列如圖7所示包含SEQ ID NO：50、51、59及35之FR1－FR4序列；HVR H1包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列；HVR－H2包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列；且HVR－H3包含選自SEQ ID NO：6－11之胺基酸序列。在該等抗體之一實施例中，HVR－H3包含SEQ ID NO：9或10之胺基酸序列。在一實施例中，抗TAT226抗體包含具有框架序列及高變區之輕鏈可變結構域，其中框架序列如圖6A及6B所示包含SEQ ID NO：60、61、62及63之FR1－FR4序列；HVR－L1包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列；HVR－L2包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列；且HVR－L3包含選自SEQ ID NO：14－19之胺基酸序列。在該等抗體之一實施例中，HVR－L3包含SEQ ID NO：17或18之胺基酸序列。
在一實施例中，抗TAT226抗體包含具有框架序列及高變區之重鏈可變結構域，其中框架序列如圖8所示包含SEQ ID NO：50、51、53及35之FR1－FR4序列；HVR H1包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列；HVR－H2包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列；且HVR－H3包含選自SEQ ID NO：6－11之胺基酸序列。在該等抗體之一實施例中，HVR－H3包含SEQ ID NO：9或10之胺基酸序列。在一實施例中，抗TAT226抗體包含具有框架序列及高變區之輕鏈可變結構域，其中框架序列如圖8所示包含SEQ ID NO：60、61、62及74之FR1－FR4序列；HVR－L1包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列；HVR－L2包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列；且HVR－L3包含選自SEQ ID NO：14－19之胺基酸序列。在該等抗體之一實施例中，HVR－L3包含SEQ ID NO：17或18之胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明提供包含具有與選自SEQ ID NO：20－25之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之序列一致性的胺基酸序列之重鏈可變結構域之抗TAT226抗體。在一些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之序列一致性之胺基酸序列相對於參考序列含有取代、插入或缺失，但包含彼胺基酸序列之抗體保持結合至TAT226之能力。在一些實施例中，在選自SEQ ID NO：20－25之序列中總共1至10個胺基酸經取代、插入或缺失。在一些實施例中，取代、插入或缺失發生於HVR外之區域(亦即在FR中)。在一些實施例中，抗TAT226抗體包含具有選自SEQ ID NO：20－25之胺基酸序列之重鏈可變結構域。
在一些實施例中，本發明提供包含如以下SEQ ID NO：31所述之人化4D5抗體(huMAb4D5－8)之輕鏈可變結構域的抗TAT226抗體(HERCEPTIN,Genentech,Inc.,South San Francisco,CA,USA)(亦於美國專利第6,407,213號及Lee等人，J.Mol.Biol.(2004),340(5)：1073－93中提及)。
1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr CysArg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile TyrSer Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr CysGln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 108(SEQ ID NO：31)(HVR殘基為加下劃線的)
在一些實施例中，huMAb4D5－8輕鏈可變結構域序列於位置30、66及91(分別為如上文以粗體/斜體所示之Asn、Arg及His)之一或多處經修飾。在一實施例中，經修飾之huMAb4D5－8序列包含位置30之Ser、位置66之Gly及/或位置91之Ser。因此，在一實施例中，本發明之抗體包含具有如以下SEQ ID NO：26所述序列之輕鏈可變結構域：1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr CysArg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile TyrSer Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr CysGln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 108(SEQ ID NO：26)(HVR殘基為加下劃線的)
關於huMAb4D5－8之經取代殘基係於上文以粗體/斜體表示。
在一態樣中，本發明提供包含具有與選自SEQ ID NO：26－31之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列之輕鏈可變結構域的抗TAT226抗體。在一些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之序列一致性之胺基酸序列相對於參考序列含有取代、添加或缺失，但包含彼胺基酸序列之抗體保持結合至TAT226之能力。在一些實施例中，在選自SEQ ID NO：26－31之序列中總共1至10個胺基酸經取代、插入或缺失。在一些實施例中，取代、插入或缺失發生於HVR外之區域(亦即在FR中)。在一些實施例中，抗TAT226抗體包含具有選自SEQ ID NO：26－31之胺基酸序列之輕鏈可變結構域。
在一態樣中，本發明提供包含以下之抗TAT226抗體(a)包含與選自SEQ ID NO：20－25之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列的重鏈可變結構域；及(b)包含與選自SEQ ID NO：26－31之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列的輕鏈可變結構域。在一些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列相對於參考序列含有取代、添加或缺失，但包含彼胺基酸序列之抗體保持結合至TAT226之能力。在一些實施例中，在參考序列中總共1至10個胺基酸經取代、插入或缺失。在一些實施例中，取代、插入或缺失發生於HVR外之區域(亦即在FR中)。在一些實施例中，抗TAT226抗體包含具有選自SEQ ID NO：20－25之胺基酸序列之重鏈可變結構域及具有選自SEQ ID NO：26－31之胺基酸序列之輕鏈可變結構域。
在一些實施例中，抗TAT226抗體包含具有SEQ ID NO：20之胺基酸序列之重鏈可變區及具有SEQ ID NO：26之胺基酸序列之輕鏈可變區。在一些實施例中，抗TAT226抗體包含具有SEQ ID NO：21之胺基酸序列之重鏈可變區及具有SEQ ID NO：26之胺基酸序列之輕鏈可變區。在一些實施例中，抗TAT226抗體包含具有SEQ ID NO：22之胺基酸序列之重鏈可變區及具有SEQ ID NO：27之胺基酸序列之輕鏈可變區。在一些實施例中，抗TAT226抗體包含具有SEQ ID NO：23之胺基酸序列之重鏈可變區及具有SEQ IDN O：28之胺基酸序列之輕鏈可變區。在一些實施例中，抗TAT226抗體包含具有SEQ ID NO：24之胺基酸序列之重鏈可變區及具有SEQ ID NO：29之胺基酸序列之輕鏈可變區。在一些實施例中，抗TAT226抗體包含具有SEQ ID NO：25之胺基酸序列之重鏈可變區及具有SEQ ID NO：30之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在一態樣中，本發明提供包含以下之抗TAT226抗體：(a)選自彼等於圖2及4中展示之一個、二個或三個VH HVR；及/或(b)選自彼等於圖3及4中展示之一個、二個或三個VL HVR。在一態樣中，本發明提供包含選自彼等於圖9及11中所展示之重鏈可變結構域及選自彼等於圖10及12中展示之輕鏈可變結構域的抗TAT226抗體。
2.抗體片段 本發明涵蓋抗體片段。抗體片段可由諸如酶消化之傳統方式或藉由重組技術產生。在特定情況下，使用抗體片段比全抗體具有優勢。較小尺寸之片段使得可快速清除且可導致實體腫瘤之改良獲取。關於特定抗體片段之論述，參見Hudson等人(2003)Nat.Med .9：129－134。
已研發各種產生抗體片段之技術。傳統上，該等片段係經由完整抗體之蛋白水解消化作用而產生(參見例如Morimoto等人，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24：107－117(1992)；及Brennan等人，Science ,229：81(1985))。然而，該等片段現可直接藉由重組宿主細胞而產生。Fab、Fv及ScFv抗體片段均可於大腸桿菌(E.coli)中表現及自其分泌，從而使得可易於產生大量該等片段。抗體片段可自上述抗體噬菌體庫分離。或者，Fab'－SH片段可自大腸桿菌直接回收且化學偶合以形成F(ab')2 片段(Carter等人，Bio/Technology 10：163－167(1992))。根據另一途徑，F(ab')2 片段可直接自重組宿主細胞培養物分離。包含殘餘受體(salvage receptor)結合抗原決定基殘基之具有增加的活體內半衰期之Fab及F(ab')2 片段係描述於美國專利第5,869,046號中。用於產生抗體片段之其他技術將為熟習實踐者顯而易見。在某些實施例中，抗體為單鏈Fv片段(scFv)。參見WO 93/16185；美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。Fv及scFv為具有無恆定區之完整組合位點之僅有物種；因此在活體內使用期間其適用於降低之非特異性結合。scFv融合蛋白可經建構以於scFv之胺基或羧基端產生效應蛋白之融合。參見Borrebaeck編之Antibody Engineering (同上文)。例如，如美國專利第5,641,870號中所述，抗體片段亦可為"線性抗體"。此等線性抗體可為單特異性的或雙特異性的。
3.人化抗體 本發明涵蓋人化抗體。此項技術中已知各種使非人類抗體人化之方法。舉例而言，人化抗體可具有自非人類來源引入其之一或多個胺基酸殘基。該等非人類胺基酸殘基通常稱作"引入"殘基，其通常係自"引入"可變結構域獲得。人化作用基本上可根據Winter及其合作者(Jones等人(1986)Nature 321：522－525；Riechmann等人(1988)Nature 332：323－327；Verhoeyen等人(1988)Science 239：1534－1536)之方法，藉由以高變區序列取代對應之人類抗體序列來進行。因此，此等"人化"抗體為嵌合抗體(美國專利第4,816,567號)，其中大體上欠完整之人類可變結構域已由來自非人類物種之對應序列取代。實際上，人化抗體通常為其中一些高變區殘基及可能之一些FR殘基係由來自齧齒動物抗體之類似位點之殘基取代的人類抗體。
選擇待用於製造人化抗體之人類可變結構域(輕及重)對於降低抗原性而言可為重要的。根據所謂"最佳擬合"法，針對已知人類可變結構域序列之全庫篩檢齧齒動物抗體之可變結構域序列。接著接受最接近齧齒動物序列之人類序列作為人化抗體之人類框架(Sims等人(1993)J.Immunol .151：2296；Chothia等人(1987)J.Mol.Biol .196：901)。另一種方法使用衍生自輕鏈或重鏈之特定子群之所有人類抗體一致序列的特定框架。相同框架可用於若干種不同之人化抗體(Carter等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA ,89：4285；Presta等人(1993)J.Immunol .,151：2623)。
一般進一步需要經人化抗體具有保留之高抗原親和力及其他有利之生物特性。為達成此目的，根據一種方法，藉由使用親本及人化序列之三維模型分析親本序列及各種概念上之人化產物之方法來製備人化抗體。三維免疫球蛋白模型通常為可用的且為熟習此項技術者所熟悉。可使用說明且呈現所選候選免疫球蛋白序列之可能三維構形結構的電腦程式。檢驗該等呈現使得可分析殘基在候選免疫球蛋白序列功能中可能之作用，亦即分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原之能力的殘基。以此方式，可自受體及引入序列選擇FR殘基且將其組合，以使得達成所需抗體特徵，諸如對靶抗原增加之親和力。一般而言，高變區殘基直接且最大程度上涉及在影響抗原結合中。
4.人類抗體 本發明之人類抗TAT226抗體可藉由組合選自人類來源之噬菌體呈現庫之Fv純系可變結構域序列與上述已知人類恆定結構域序列來建構。或者，本發明之人類單株抗TAT226抗體可由融合瘤法來製造。用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠－人類雜合骨髓瘤細胞株係由例如RozborJ.Immunol .,133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications ，第51－63頁(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)及Boerner等人，J.Immunol .,147：86(1991)描述。
目前可能產生能夠在免疫時在不存在內源性免疫球蛋白產生之情況下產生人類抗體全譜系之轉殖基因動物(例如小鼠)。舉例而言，已描述嵌合及生殖系突變小鼠體內之抗體重鏈接合區(JH)基因之同型接合缺失致使對內源抗體產生之完全抑制。此等生殖系突變小鼠體內之人類生殖系免疫球蛋白基因陣列之轉移將致使在抗原挑釁時產生人類抗體。參見例如Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA ,90：2551(1993)；Jakobovits等人，Nature ,362：255(1993)；Bruggermann等人，Year in Immunol .,7：33(1993)。
基因改組亦可用以自例如齧齒動物之非人類抗體衍生人類抗體，其中人類抗體具有與起始非人類抗體類似之親和力及特異性。根據此方法(亦稱作"抗原決定基影響")，以人類V結構域基因譜系置換如本文所述之藉由噬菌體呈現技術獲得之非人類抗體片段之重鏈或輕鏈可變區，產生非人類鏈/人類鏈scFv或Fab嵌合體之群體。以抗原選擇致使非人類鏈/人類鏈嵌合scFv或Fab分離，其中人類鏈回收在移除初級噬菌體呈現純系中之對應非人類鏈時損壞之抗原結合位點，亦即抗原決定基支配(影響)人類鏈搭配物之選擇。當重複此方法以置換剩餘之非人類鏈時，獲得人類抗體(參見於1993年4月1日公開之PCT WO 93/06213)。與藉由CDR移植之傳統非人類抗體人化不同，此技術提供不具有非人類來源之FR或CDR殘基之完全人類抗體。
5.雙特異性抗體 雙特異性抗體為對至少兩種不同抗原具有結合特異性之單株抗體。在某些實施例中，雙特異性抗體為人類或人化抗體。在某些實施例中，結合特異性中之一者係對於TAT226且另一者係對於任何其他抗原。在某些實施例中，雙特異性抗體可結合至TAT226之兩個不同抗原決定基。雙特異性抗體亦可用以使細胞毒性劑侷限於表現TAT226之細胞中。該等抗體具有TAT226結合臂及結合細胞毒性劑(例如沙泊寧(saporin)、抗干擾素α、長春鹼類、蓖麻毒素A鏈、甲胺喋呤或放射性同位素半抗原)之臂。雙特異性抗體可製備為全長抗體或抗體片段之形式(例如F(ab')2 雙特異性抗體)。
此項技術中已知製造雙特異性抗體之方法。傳統上，雙特異性抗體之重組產生係基於兩個免疫球蛋白重鏈－輕鏈對之共表現，其中兩條重鏈具有不同特異性(Milstein及Cuello,Nature ,305：537(1983))。由於免疫球蛋白重鏈及輕鏈之隨機分類，因此該等融合瘤(雜交瘤)產生10個不同抗體分子之可能混合物，其中僅一者具有恰當雙特異性結構。通常藉由親和層析步驟進行之恰當分子之純化相當繁複，且產率較低。類似程序係揭示於1993年5月13日公開之WO 93/08829及Traunecker等人，EMBO J .,10：3655(1991)中。
根據不同方法，將具有所需結合特異性(抗體－抗原組合位點)之抗體可變結構域融合至免疫球蛋白恆定結構域序列。例如，與包含至少部分鉸鏈區、CH2區及CH3區之免疫球蛋白重鏈恆定結構域融合。在某些實施例中，在融合之至少一者中存在含有輕鏈結合必需位點之第一重鏈恆定區(CH1)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合及(若需要)免疫球蛋白輕鏈之DNA插入獨立表現載體中且經共轉染至合適宿主生物體中。在建構中使用不等比率之三個多肽鏈提供最佳產率之實施例中，其使三個多肽片段之相互比例之調節具有較大彈性。然而，當以相等比率表現至少兩條多肽鏈導致高產率時或當比率不具有特定顯著性時，則可能在一種表現載體中插入兩個或所有三個多肽鏈之編碼序列。
在該方法之一實施例中，雙特異性抗體係由一個臂中具有第一結合特異性之雜交免疫球蛋白重鏈與另一臂中雜交免疫球蛋白重鏈－輕鏈對(提供第二結合特異性)組成。發現該不對稱結構促使所需雙特異性化合物自非所需免疫球蛋白鏈組合分離，因為僅存在半數雙特異性分子之免疫球蛋白輕鏈提供輕易分離之方式。該方法係揭示於WO 94/04690中。關於產生雙特異性抗體之其他詳述，例如參見Suresh等人，Methods in Enzymology ,121：210(1986)。
根據另一方法，抗體分子對之間之界面可經工程設計以使自重組細胞培養物回收之雜二聚體之百分比最大化。界面包含抗體恆定結構域之至少一部分CH 3結構域。以此方法，以較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)置換來自第一抗體分子界面之一或多個小胺基酸側鏈。藉由以較小者(例如丙胺酸或蘇胺酸)置換較大胺基酸側鏈，於第二抗體分子界面上產生具有與較大側鏈相同或類似尺寸之補償性"空穴"。此提供增加雜二聚體之產率使其高於諸如均二聚體之其他非所需終產物的機制。
雙特異性抗體包括交聯或"雜接合"抗體。舉例而言，可將雜接合之抗體之一偶合至抗生物素蛋白，將其他抗體偶合至生物素。例如，已提出將此等抗體用以將免疫系統細胞靶向非所需細胞(美國專利第4,676,980號)且用於治療HIV感染(WO 91/00360、WO 92/00373及EP 03089)。雜接合抗體可使用任何便利之交聯法來製造。此項技術中已熟知合適交聯劑，且連同許多交聯技術一起揭示於美國專利第4,676,980號中。
亦已於文獻中描述由抗體片段產生雙特異性抗體之技術。舉例而言，可使用化學鍵聯製備雙特異性抗體。Brennan等人，Science ,229：81(1985)描述其中完整抗體經蛋白水解裂解以產生F(ab')2 片段之程序。該等片段可於二硫醇複合劑亞砷酸鈉存在下經還原以穩定鄰二硫醇且防止分子間形成二硫化物。接著將所產生之Fab'片段轉化為硫硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。接著將Fab'－TNB衍生物之一藉由以巰基乙胺還原再轉化為Fab'－硫醇且與等莫耳量之其他Fab'－TNB衍生物混合以形成雙特異性抗體。所產生之雙特異性抗體可用作使酶選擇性固定之藥劑。
最近之進展促使自大腸桿菌直接回收Fab'－SH片段，該等Fab'－SH片段可經化學偶合以形成雙特異性抗體。Shalaby等人，J.Exp.Med .,175：217－225(1992)描述完全人化雙特異性抗體F(ab')2 分子之產生。各Fab'片段係自大腸桿菌獨立地分泌且於活體外經受定向化學偶合以形成雙特異性抗體。如此形成之雙特異性抗體可結合至過度表現HER2受體之細胞及正常人類T細胞，以及觸發人類細胞毒性淋巴細胞對抗人類乳房腫瘤靶之溶胞活性。
亦已描述由重組細胞培養物直接製造且分離雙特異性抗體片段之各種技術。舉例而言，已使用白胺酸拉鏈製造雙特異性抗體。Kostelny等人，J.Immunol .,148(5)：1547－1553(1992)。藉由基因融合將來自Fos及Jun蛋白之白胺酸拉鏈肽連接至具有兩個不同抗體之Fab'部分。將抗體均二聚體於鉸鏈區還原以形成單體且接著再氧化以形成抗體雜二聚體。此方法亦可用於產生抗體均二聚體。由Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA ,90：6444－6448(1993)描述之"雙功能抗體"技術已提供用於製造雙特異性抗體片段之替代機制。該等片段包含藉由連接子連接至輕鏈可變結構域(VL)之重鏈可變結構域(VH)，該連接子過短而不可使相同鏈上之兩個結構域成對。因此，迫使一片段之VH及VL結構域與另一片段之互補VL及VH結構域成對，藉此形成兩個抗原結合位點。亦已報導藉由使用單鏈Fv(sFv)二聚體製造雙特異性抗體片段之另一策略。參見Gruber等人，J.Immunol .,152：5368(1994)。
涵蓋具有二價以上之抗體。舉例而言，可製備三特異性抗體。Tutt等人J.Immunol .147：60(1991)。
6.多價抗體 藉由表現抗體所結合之抗原的細胞，多價抗體可比二價抗體更快速地內在化(及/或分解代謝)。本發明之抗體可為具有三個或三個以上抗原結合位點之多價抗體(不同於IgM種類)(例如四價抗體)，其可易於藉由重組表現編碼抗體多肽鏈之核酸而產生。多價抗體可包含二聚化結構域及三個或三個以上抗原結合位點。在某些實施例中，二聚化結構域包含Fc區或鉸鏈區(或由其組成)。在此情形中，抗體將包含Fc區及三個或三個以上至Fc區之抗原結合位點胺基端。在某些實施例中，多價抗體包含三個至約八個抗原結合位點(或由其組成)。在一個此實施例中，多價抗體包含四個抗原結合位點(或由其組成)。多價抗體包含至少一條多肽鏈(例如兩條多肽鏈)，其中多肽鏈包含兩個或兩個以上可變結構域。舉例而言，多肽鏈可包含VD1－(X1)n－VD2－(X2)n－Fc，其中VD1為第一可變結構域，VD2為第二可變結構域，Fc為Fc區之一條多肽鏈，X1及X2表示胺基酸或多肽，且n為0或1。舉例而言，多肽鏈可包含：VH－CH1－彈性連接子－VH－CH1－Fc區鏈；或VH－CH1－VH－CH1－Fc區鏈。本文之多價抗體可另外包含至少兩個(例如四個)輕鏈可變結構域多肽。例如，本文之多價抗體可包含約兩個至約八個輕鏈可變結構域多肽。本文所涵蓋之輕鏈可變結構域多肽包含輕鏈可變結構域且視情況進一步包含CL結構域。
7.單結構域抗體 在一些實施例中，本發明之抗體為單結構域抗體。單結構域抗體為包含抗體之所有或部分重鏈可變結構域或所有或部分輕鏈可變結構域之單一多肽鏈。在某些實施例中，單結構域抗體為人類單結構域抗體(Domantis,Inc.,Waltham,MA；參見例如美國專利第6,248,516 B1號)。在一實施例中，單結構域抗體係由抗體之所有或部分重鏈可變結構域組成。
8.抗體變異體 在一些實施例中，涵蓋本文所述抗體之胺基酸序列修飾。舉例而言，可能需要改良抗體之結合親和力及/或其他生物特性。可藉由向編碼抗體之核苷酸序列中引入適當變化或藉由肽合成來製備抗體之胺基酸序列變異體。例如，此等修飾包括抗體之胺基酸序列中殘基之缺失及/或插入及/或取代。可進行缺失、插入及取代之任何組合以達成最終建構，其限制條件為最終建構具有所需特徵。可將胺基酸變化於序列生成時引入受檢者抗體胺基酸序列中。
如Cunningham及Wells(1989)Science,244：1081－1085所述，適用於識別為突變較佳位置之特定抗體殘基或區域之方法稱作"丙胺酸掃描突變"。此處，識別殘基或靶殘基之群(例如帶電殘基(諸如arg、asp、his、lys及glu))且將其以中性或帶負電荷之胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)置換以影響胺基酸與抗原之相互作用。接著藉由在取代位點處或為取代位點引入另外或其他變異體來改進對取代表現功能敏感性的彼等胺基酸位置。因此，儘管引入胺基酸序列變異之位點為預定的，但無需預定突變本身之性質。舉例而言，為分析指定位點之突變效能，於靶密碼子或靶區進行ala掃描或隨機突變且篩檢經表現免疫球蛋白之所需活性。
胺基酸序列插入包括長度為一個殘基至含有數百或更多殘基之多肽範圍內的胺基端及/或羧基端融合，以及單一或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他插入變異包括抗體N端或C端與酶(例如ADEPT)或增加抗體血清半衰期之多肽的融合。
在某些實施例中，本發明之抗體經改變以增加或減低抗體糖基化之程度。多肽之糖基化通常為N連接或O連接的。N連接係指將碳水化合物部分連接至天冬醯胺酸殘基之側鏈。三肽序列天冬醯胺酸－X－絲胺酸及天冬醯胺酸－X－蘇胺酸(其中X為除脯胺酸以外之任何胺基酸)為將碳水化合物部分酶性連接至天冬醯胺酸側鏈之識別序列。因此，多肽中之存在該等三肽序列中之任一者均產生可能之糖基化位點。O連接之糖基化係指將糖N－乙醯半乳胺糖、半乳糖或木糖中之一者連接至羥胺酸，該羥胺酸最通常為絲胺酸或蘇胺酸，儘管亦可使用5－羥基脯胺酸或5－羥基離胺酸。
抗體糖基化位點之添加或刪除係藉由改變胺基酸序列以使得產生或移除上述三肽序列中之一或多個(用於N連接糖基化位點)而便利地完成。改變亦可藉由在初始抗體序列(用於O連接糖基化位點)中添加、缺失或取代一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基來進行。
當抗體包含Fc區時，可改變與其連接之碳水化合物。舉例而言，在美國專利申請案第US 2003/0157108號(Presta,L.)中描述在連接至抗體Fc區之成熟碳水化合物結構中缺少海藻糖之抗體。亦參見US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。Jean－Mairet等人之WO 2003/011878及Umana等人之美國專利第6,602,684號中引用在連接至抗體Fc區之碳水化合物中具有平分N－乙醯半乳胺糖(GlcNAc)之抗體。於Patel等人之WO 1997/30087中報導在連接至抗體Fc區之寡醣中具有至少一個半乳糖殘基之抗體。亦參見關於具有連接至其Fc區之經改變碳水化合物之抗體的WO 1998/58964(Raju,S.)及WO 1999/22764(Raju,S.)。亦參見關於具有經修飾糖基化之抗原結合分子之US 2005/0123546(Umana等人)。
在某些實施例中，糖基化變異體包含Fc區，其中連接至Fc區之碳水化合物結構缺少海藻糖。此等變異體具有改良之ADCC功能。視情況而言，Fc區另外包含進一步改良ADCC之一或多個胺基酸取代，例如於Fc區之位置298、333及/或334處(殘基之Eu編號)取代。關於"去海藻糖化"或"海藻糖缺乏"抗體之公開案實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742；Okazaki等人J.Mol.Biol .336：1239－1249(2004)；Yamane－Ohnuki等人Biotech.Bioeng .87：614(2004)。產生去海藻糖化抗體之細胞株實例包括在蛋白海藻化中缺乏之Lec13 CHO細胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys .249：533－545(1986)；美國專利申請案第US 2003/0157108 A1號，Presta,L；及Adams等人之WO 2004/056312 A1，尤其在實例11中)及基因剔除細胞株，諸如α－1,6－海藻糖基轉移酶基因FUT8 、基因剔除CHO細胞(Yamane－Ohnuki等人Biotech.Bioeng .87：614(2004))。
另一變異體類型為胺基酸取代變異體。該等變異體在經不同殘基置換之抗體分子中具有至少一個胺基酸殘基。用於取代型突變之所關注位點包括高變區，但亦涵蓋FR變化。保守性取代係於表1中在標題"較佳取代"下展示。若此等取代致使生物活性發生所需改變，則可引入於表1中命名為"例示性取代"或以下參考胺基酸種類進一步描述之更多實質變化且篩檢產物。
抗體生物特性之實質改質係藉由選擇取代來完成，該等取代對維持(a)例如折疊或螺旋構形之取代區多肽主鏈結構；(b)靶位點處分子之電荷或疏水性，或(c)大量側鏈之效應顯著不同。胺基酸可根據其側鏈特性之相似性分組(於A.L.Lehninger之Biochemistry，第2版，第73－75頁中，Worth Publishers,New York(1975))：(1)非極性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)(2)不帶電之極性：Gly(G)、Ser(s)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)(3)酸性：Asp(D)、Glu(E)(4)鹼性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)
或者，可將天然產生之殘基基於共同側鏈特性分組：(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈定向之殘基：Gly、Pro；(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代將引起將該等種類中之一員交換為另一種類。亦可將此等經取代殘基引入保守性取代位點或剩餘(非保守性)位點中。
一種取代變異體類型包括取代親本抗體(例如人化或人類抗體)之一或多個高變區殘基。一般而言，為進一步研發所選擇之所得變異體相對於產生其之親本抗體將具有經改質(例如改良)之生物特性。產生此等取代型變異體之便利方式涉及使用噬菌體呈現親和力成熟。簡言之，使若干高變區位點(例如6－7位點)突變以於各位點產生所有可能之胺基酸取代。如此產生之抗體作為與封裝於各顆粒內之至少部分噬菌體鞘蛋白(例如M13之基因III產物)之融合物自絲狀噬菌體顆粒呈現。接著根據其生物活性(例如結合親和力)篩檢噬菌體呈現之變異體。為識別用於修飾之候選高變區位點，可進行掃描突變(例如丙胺酸掃描)以識別顯著有助於抗原結合之高變區殘基。或者或另外，分析抗原－抗體複合物之晶體結構以識別抗體與抗原之間之接觸點可為有益的。根據此項技術中已知之技術，此等接觸殘基及相鄰殘基為供取代之候選物。一旦產生此等變異體，則使變異體板經受使用此項技術中已知技術(包括本文中所述之彼等)之篩檢且可選擇在一或多個相關檢定中具有優越特性之抗體以供進一步研發。
藉由此項技術中已知之各種方法製備編碼抗體胺基酸序列變異體之核酸分子。該等方法包括(但不限於)自天然來源分離(在天然產生之胺基酸序列變異體之情況下)或藉由寡核苷酸介導之(或定點)突變、PCR突變及先前製備之抗體變異或非變異譯本之序列盒突變來製備。
可能需要於本發明抗體之Fc區引入一或多個胺基酸修飾，藉此產生Fc區變異體。Fc區變異體可包含於包括鉸鏈半胱胺酸之一或多個胺基酸位置包含胺基酸修飾(例如取代)之人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。
根據此項技術之此描述及教示，在一些實施例中涵蓋本發明之抗體與野生型對應物抗體相比可(例如)於Fc區包含一或多處變化。然而，該等抗體與其野生型對應物相比將大體上保持治療用途所需之相同特徵。舉例而言，例如WO 99/51642所述，認為可於Fc區中進行產生經變化(亦即改良或減低)之C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)之特定變化。亦參見關於Fc區變異體之其他實例的Duncan & WinterNature 322：738－40(1988)；美國專利第5,648,260號；美國專利第5,624,821號；及WO 94/29351。WO 00/42072(Presta)及WO 2004/056312(Lowman)描述具有對FcR之改良或減低結合之抗體變異體。該等專利公開案之內容係以特定引用的方式併入本文。亦參見Shields等人J.Biol.Chem .9(2)：6591－6604(2001)。負責將母體IgG轉移至胎兒之具有增加之半衰期及對新生兒Fc區受體(FcRn)改良之結合的抗體(Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等人，J.Immunol.24：249(1994))係描述於US 2005/0014934 A1(Hinton等人)中。該等抗體包含其中具有改良Fc區與FcRn之結合的一或多個取代之Fc區。具有經改變Fc區胺基酸序列及增加或減低之C1q結合能力之多肽變異體係描述於美國專利第6,194,551 B1號、WO 99/51642中。彼等專利公開案之內容係以特定引用的方式併入本文。亦參見Idusogie等人J.Immunol .164：4178－4184(2000)。
在一態樣中，本發明提供在包含Fc區之Fc多肽界面中包含修飾之抗體，其中該等修飾促使及/或促進異源二聚化。該等修飾包含將突起引入第一Fc多肽中且將空腔引入第二Fc多肽中，其中該突起可定位於空腔中以促進第一與第二Fc多肽之複合。例如美國專利第5,731,168號中所述，此項技術中已知用於產生具有該等修飾之抗體的方法。
9.抗體衍生物 本發明之抗體可經進一步修飾以含有此項技術中已知且易於獲得之額外非蛋白質部分。適用於衍生抗體之部分較佳為水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇之共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚－1,3－二氧戊環、聚－1,3,6－三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及葡聚糖或聚(正乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛因其在水中之穩定性而在製造中具有優勢。聚合物可具有任何分子量且可為支鏈或非支鏈的。連接至抗體之聚合物數量可不同，且若連接一種以上之聚合物，則其可為相同或不同分子。一般而言，用於衍生之聚合物的數量及/或類型可基於包括(但不限於)以下考慮因素來確定：待改良抗體之特定特性或功能、抗體衍生物是否將用於界定條件下之療法等。
在另一實施例中，提供可藉由曝露於輻射而選擇性加熱之抗體及非蛋白質部分之接合物。在一實施例中，非蛋白質部分為碳奈米管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.102：11600－11605(2005))。輻射可具有任何波長，且包括(但不限於)不損害正常細胞但將非蛋白質部分加熱至殺死鄰近抗體－非蛋白質部分之細胞之溫度的波長。
B.製造抗體之特定方法
1.基於特定融合瘤之方法 本發明之抗TAT226單株抗體可使用首先由Kohler等人，Nature ,256：495(1975)所述之融合瘤法來製造，或可藉由重組DNA法(美國專利第4,816,567號)製造。
以融合瘤法，小鼠或諸如倉鼠之其他適當宿主動物經免疫以引出產生或能夠產生特異性結合至用於免疫之蛋白之抗體的淋巴細胞。TAT226之抗體一般係藉由多次皮下(sc)或腹膜內(ip)注射TAT226及佐劑而於動物體內增加。可使用此項技術中所熟知之方法來製備TAT226，其中一些係於本文中進一步描述。舉例而言，TAT226可經重組產生。在一實施例中，動物係以含有與免疫球蛋白重鏈之Fc部分融合之TAT226細胞外部分的TAT226衍生物免疫。在一實施例中，動物係以TAT226－IgG1融合蛋白免疫。在一實施例中，動物係以與單磷醯基脂質A(MPL)/海藻糖二黴菌酸酯(TDM)(Ribi Immunochem.Research,Inc.,Hamilton,MT)之溶液中之TAT226免疫原性衍生物免疫，且於多個部位經皮內注射溶液。兩週後激發動物。七至十四天後將動物放血且檢定血清之抗TAT226力價。激發動物直至力價達到平穩狀態。
或者，可使淋巴細胞於活體外免疫。接著使用諸如聚乙二醇之合適融合劑將淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合以形成融合瘤細胞(Goding,Monoclonal Antibodies：Principles and Practice ，第59－103頁(Academic Press,1986))。
使如此製備之融合瘤細胞於例如含有抑制非融合親本骨髓瘤細胞生長或存活之一或多種物質的合適培養基中接種且生長。舉例而言，若親本骨髓瘤細胞缺少次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT或HPRT)，則融合瘤之培養基通常將包括次黃嘌呤、胺基喋呤及胸苷(HAT培養基)，該等物質阻止缺乏HGPRT之細胞生長。
在某些實施例中，骨髓瘤細胞為彼等有效融合，藉由所選產生抗體之細胞支持抗體之穩定高含量產生，且對諸如HAT培養基之培養基敏感之細胞。例示性骨髓瘤細胞株包括(但不限於)小鼠骨髓瘤細胞株，諸如彼等衍生自可購自Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,California USA之MOPC－21及MPC－11小鼠腫瘤，及可購自American Type Culture Collection,Rockville,Maryland USA之SP－2或X63－Ag8－653細胞之骨髓瘤細胞株。亦已關於產生人類單株抗體描述人類骨髓瘤及小鼠－人類雜合骨髓瘤細胞株(Kozbor,J.Immunol .,133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications ，第51－63頁(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。
為產生結合至TAT226之單株抗體，檢定融合瘤細胞生長於其中之培養基。較佳地，藉由免疫沉澱反應或藉由諸如放射免疫檢定(RIA)或酶聯結免疫吸附檢定(ELISA)之活體外結合檢定確定由融合瘤細胞產生之單株抗體的結合特異性。例如，單株抗體之結合親和力可藉由Munson等人，Anal.Biochem .,107：220(1980)之史卡查分析(Scatchard analysis)來確定。
在識別產生具有所需特異性、親和力及/或活性之抗體的融合瘤細胞之後，可使純系藉由限制性稀釋程序次選殖且藉由標準方法生長(Goding,Monoclonal Antibodies：Principles and Practice ，第59－103頁(Academic Press,1986))。例如，用於此目的之合適培養基包括D－MEM或RPMI－1640培養基。此外，融合瘤細胞可如動物體內之腹水腫瘤於活體內生長。可將由次純系分泌之單株抗體藉由習知免疫球蛋白純化程序(諸如蛋白A瓊脂糖、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和力層析)而自培養基、腹水或血清合適地分離。
2.特定庫篩檢法 本發明之抗TAT226抗體可藉由使用組合庫以篩檢具有所需活性之抗體來製造。舉例而言此項技術中已知用於產生噬菌體呈現庫且為具有所需結合特徵之抗體篩檢此等庫之各種方法。此等方法一般描述於Hoogenboom等人(2001)之Methods in Molecular Biology 178：1－37(O'Brien等人編，Human Press,Totowa,NJ)中，且在某些實施例中描述於Lee等人(2004)J.Mol.Biol .340：1073－1093中。
實際上，合成抗體純系係藉由篩檢含有呈現與噬菌體鞘蛋白融合之抗體可變區(Fv)之各種片段的噬菌體之噬菌體庫來選擇。此等噬菌體庫係藉由對抗所需抗原之親和層析法而淘出。將表現可結合至所需抗原之Fv片段的純系吸附至抗原上且從而與庫中之非結合純系分離。接著使結合純系自抗原溶離，且可藉由額外抗原吸附/溶離循環而進一步富集。可藉由以下步驟獲得本發明之任何抗TAT226抗體：設計用以選擇所關注噬菌體純系之合適抗原篩檢程序，繼而使用Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest ，第五版，NIH Publication 91－3242,Bethesda MD(1991)，第1－3卷中描述之來自所關注噬菌體純系之Fv序列及合適恆定區(Fc)序列建構全長抗TAT226抗體純系。
在某些實施例中，抗體之抗原結合結構域係由約110個胺基酸之兩個可變(V)區形成，其各自來自輕鏈(VL)及重鏈(VH)，二者均存在三個高變環(HVR)或互補判定區(CDR)。如Winter等人，Ann.Rev.Immunol .,12：433－455(1994)中所述，可變結構域可以單鏈Fv(scFv)片段(其中VH與VL經由短、彈性肽共價連接)或Fab片段(其中其各自融合至恆定結構域且非共價地相互作用)形式功能性地呈現於噬菌體上。如本文所用之編碼噬菌體純系之scFv及編碼噬菌體純系之Fab統稱為"Fv噬菌體純系"或"Fv純系"。
如Winter等人，Ann.Rev.Immunol .,12：433－455(1994)中所述，VH及VL基因之譜系可藉由聚合酶鏈反應(PCR)獨立地選殖且於噬菌體庫中隨機重組，接著可為抗原結合純系搜尋噬菌體庫。來自經免疫源之庫在無需建構融合瘤之情況下提供免疫原之高親和力抗體。或者，如Griffiths等人，EMBO J ,12：725－734(1993)所述，可選殖天然譜系以在無任何免疫之情況下提供廣泛範圍之非自體抗原以及自體抗原之人類抗體的單一來源。最後，如Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol .,227：381－388(1992)所述，亦可藉由自幹細胞選殖未重排之V基因區段且使用含有隨機序列之PCR引子以編碼高變CDR3區且完成活體外重排來合成製造天然庫。
在某些實施例中，絲狀噬菌體係藉由與微量鞘蛋白pIII融合而用以呈現抗體片段。抗體片段可呈現為單鏈Fv片段形式(其中VH及VL結構域係藉由彈性多肽間隔基連接至相同多肽鏈上，例如Marks等人，J.Mol.Biol .,222：581－597(1991)所述)或Fab片段形式(其中一條鏈融合至pIII且另一條經分泌入細菌宿主細胞周質中，於該周質中藉由移動一些野生型鞘蛋白來組裝呈現於噬菌體表面上之Fab鞘蛋白結構，例如Hoogenboom等人，Nucl.Acids Res .,19：4133－4137(1991)中所述)。
一般而言，編碼抗體基因片段之核酸係由自人類或動物採集之免疫細胞獲得。若需要偏利於抗TAT226純系之庫，則以TAT226使受檢者免疫以產生抗體反應，且回收脾細胞及/或循環B細胞，其他周邊血液淋巴細胞(PBL)以用於建構庫。在一較佳實施例中，藉由在載運功能人類免疫球蛋白基因陣列(且缺少功能內源性抗體產生系統)之轉殖基因小鼠體內產生抗TAT226抗體反應，以使得TAT226免疫產生對抗TAT226之產生使B細胞之人類抗體而獲得偏利於抗TAT226純系之人類抗體基因片段庫。下文描述產生人類抗體之轉殖基因小鼠之產生。
可藉由使用合適篩檢程序以分離表現TAT226特異性膜結合抗體之B細胞，例如藉由使用TAT226親和層析法之細胞分離或將細胞吸附於螢光染料標記之TAT226，繼而藉由流式活化細胞檢選(FACS)而獲得抗TAT226反應性細胞群體之額外富集。
或者，使用來自未經免疫供體之脾細胞及/或B細胞或其他PBL提供可能抗體譜系之更佳代表，且亦容許使用其中TAT226不具抗原性之任何動物(人類或非人類)物種建構抗體庫。對於併入活體外抗體基因建構之庫而言，自受檢者採集幹細胞以提供編碼未重排抗體基因區段之核酸。所關注之免疫細胞可自各種動物物種獲得，諸如人類、小鼠、大鼠、兔類、狼(luprine)、犬科、貓科、豬、牛、馬及禽類等。
將編碼抗體可變基因區段(包括VH及VL區段)之核酸自所關注細胞回收且擴增。在重排VH及VL基因庫之情況下，如Orlandi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA), 86：3833－3837(1989)中所述，可藉由將染色體組DNA或mRNA自淋巴細胞分離，繼而與匹配重排VH及VL基因之5'端及3'端之引子進行聚合酶鏈反應(PCR)獲得所需DNA，藉此製造供表現之不同V基因譜系。如Orlandi等人(1989)及Ward等人，Nature ,341：544－546(1989)中所述，可自cDNA及染色體組DNA擴增V基因，其中後向引子在編碼成熟V結構域之外顯子5'端處且正向引子基於J區段內。然而，對於自cDNA擴增而言，如Jones等人，Biotechnol .,9：88－89(1991)中所述，後向引子亦可基於導引外顯子內；且如Sastry等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) ,86：5728－5732(1989)中所述，正向引子位於恆定區內。為使互補最大化，如Orlandi等人(1989)或Sastry等人(1989)所述，可將簡併性併入引子中。在某些實施例中，例如Marks等人，J.Mol.Biol .,222：581－597(1991)之方法中所述或Orum等人，Nucleic Acids Res .,21：4491－4498(1993)之方法中所述，藉由使用靶向各V基因家族之PCR引子使庫多樣性最大化，從而擴增免疫細胞核酸樣品中存在之所有可用VH及VL排列。為將經擴增DNA選殖入表現載體中，可將極少之限制位點如Orlandi等人(1989)中所述作為一端之標記或如Clackson等人，Nature ,352：624－628(1991)中所述藉由以經標記引子進一步PCR擴增而引入PCR引子內。
合成重排之V基因譜系可活體外衍生自V基因區段。大部分人類VH基因區段已經選殖及定序(於Tomlinson等人，J.Mol.Biol .,227：776－798(1992)中報導)且繪圖(於Matsuda等人，Nature Genet .,3 ：88－94(1993)中報導)；如Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol .,227：381－388(1992)中所述，該等經選殖區段(包括H1及H2環之所有主要構形)可用以產生具有編碼不同序列及長度之H3環之PCR引子的不同VH基因譜系。如Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA ,89：4457－4461(1992)中所述，亦可製造所有序列多樣性聚集於單一長度之長H3環中之VH譜系。人類V及Vλ區段已經選殖且定序(於Williams及Winter,Eur.J.Immunol .,23：1456－1461(1993)中報導)且可用以製造合成輕鏈譜系。基於VH及VL折疊及L3及H3長度範圍之合成V基因譜系將編碼具有大量結構多樣性之抗體。在編碼DNA之V基因擴增後，可根據Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol .,227：381－388(1992)之方法活體外重排生殖系V基因區段。
可藉由以若干方式將VH與VL基因譜系組合在一起來建構抗體片段譜系。各譜系可於不同載體中產生且將載體於活體外重組，例如Hogrefe等人，Gene ,128：119－126(1993)中所述，或藉由組合感染於活體內重組，例如Waterhouse等人，Nucl.Acids Res .,21：2265－2266(1993)中所述之loxP系統。活體內重組途徑利用Fab片段之雙鏈性質以克服大腸桿菌轉運效率對庫大小所施加之限制。將天然VH及VL譜系獨立地選殖，一個選殖入噬菌粒中且另一個選殖入噬菌體載體中。接著將兩個庫藉由含有噬菌粒之細菌的噬菌體感染組合，以使得各細胞含有不同組合且庫大小僅受所存在細胞數之限制(約1012 個純系)。兩載體均含有活體內重組信號，以使得VH及VL基因重組於單一複製子上且共封裝於噬菌體病毒粒子中。該等巨庫提供大量具有優良親和力(約10－8 M之Kd －1 )之各種抗體。
或者，可將譜系例如如Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA ,88：7978－7982(1991)中所述連續選殖入相同載體中，或由PCR組裝在一起且接著例如如Clackson等人，Nature ,352：624－628(1991)中所述選殖。PCR組裝亦可用以接合VH及VLDNA與編碼彈性肽間隔基之DNA以形成單鏈Fv(scFv)譜系。在另一技術中，如Embleton等人，Nucl.Acids Res .,20：3831－3837(1992)中所述，"細胞內PCR組裝"係用以在淋巴細胞內由PCR組合VH與VL基因，且接著選殖連接基因之譜系。
如同上文之Winter等人(1994)所述，經天然庫(天然或合成)產生之抗體可具有適度親和力(約106 至107 M－1 之Kd －1 )，但亦可藉由建構第二庫且自其再選擇而於活體外模擬親和力成熟。舉例而言，可藉由Hawkins等人，J.Mol.Biol .,226：889－896(1992)之方法及Gram等人，Proc.Natl.Acad .Sci USA ,89：3576－3580(1992)之方法，使用易誤用之聚合酶(於Leung等人，Technique ,1：11－15(1989)中報導)活體外隨機引入突變。此外，可藉由在所選擇之個別Fv純系中例如使用具有載運橫跨所關注CDR之隨機序列之引子的PCR使一或多個CDR隨機突變且篩檢較高親和力純系來進行親和力成熟。WO 9607754(公開於1996年3月14日)描述用於在免疫球蛋白輕鏈之互補判定區中誘導突變以產生輕鏈基因庫之方法。如Marks等人，Biotechnol .,10：779－783(1992)中所述，另一種有效途徑為使由噬菌體呈現所選擇之VH或VL結構域與自未經免疫之供體所獲得之天然產生之V結構域變異體譜系重組，且在若干回合之鏈改組中篩檢具有較高親和力者。此技術使得可產生具有10－9 M或小於10－9 M之親和力的抗體及抗體片段。
可藉由此項技術中已知之各種技術來完成庫之篩檢。舉例而言，TAT226可用以塗覆吸附板之孔，表現於附著至吸附板之宿主細胞上或用於細胞檢選中，或接合至生物素以由經抗生蛋白鏈菌素(streptavidin)塗覆之珠粒俘獲或用於篩檢噬菌體呈現庫之任何其他方法中。
在適用於使至少一部分噬菌體粒子與吸附劑結合之條件下使噬菌體庫樣本與固定化TAT226接觸。通常，選擇包括pH值、離子強度、溫度及其類似者之條件以模擬生理條件。洗滌結合至固相之噬菌體且接著例如Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA ,88：7978－7982(1991)所述將其以酸溶離；或例如Marks等人，J.Mol.Biol .,222：581－597(1991)所述以鹼溶離；或例如以類似於Clackson等人，Nature ,352：624－628(1991)之抗原競爭法之程序藉由TAT226抗原競爭溶離。噬菌體可以單回合選擇富集20－1,000倍。此外，可使經富集噬菌體生長於細菌培養物中且另外經受數回合之選擇。
選擇效率視多種因素而定，包括洗滌期間之解離動力學及單一噬菌體之多個抗體片段是否可同時與抗原嚙合。可藉由在固相中使用短時間洗滌(short washes)、多價噬菌體呈現及高抗原塗覆密度保持具有快速解離動力學(及弱結合親和力)之抗體。高密度不僅經由多價相互作用穩定噬菌體，且有利於使解離之噬菌體再結合。可藉由使用如Bass等人，Proteins ,8：309－314(1990)及WO 92/09690中所述之長時間洗滌及單價噬菌體呈現及如Marks等人，Biotechnol .,10：779－783(1992)中所述之低抗原塗覆密度促進選擇具有緩慢解離動力學(及優良結合親和力)之抗體。
可能在對TAT226具有不同親和力之噬菌體抗體(即使具有略微不同之親和力)之間進行選擇。然而，所選抗體之隨機突變(例如，以一些親和力成熟技術進行之突變)可能產生多種突變體，其中大部分與抗原結合且較少部分具有較高親和力。藉由限制TAT226，競爭淘汰極少之高親和力噬菌體。為保持所有較高親和力突變體，可將噬菌體以過量經生物素標記之TAT226培育，但其中經生物素標記之TAT226具有比TAT226之恆定靶莫耳濃度親和力低之莫耳濃度。接著可藉由經抗生蛋白鏈菌素塗覆之順磁性珠粒俘獲高親和力結合噬菌體。此"平衡俘獲"藉由容許將具有低至兩倍高之親和力之突變純系與具有較低親和力之大量過量噬菌體分離的敏感性，使得可根據其結合親和力選擇抗體。亦可操控用於洗滌與固相結合之噬菌體之條件以基於解離動力學來區別。
可基於活性來選擇抗TAT226純系。在某些實施例中，本發明提供結合至天然表現TAT226之活細胞的抗TAT226抗體。在一實施例中，本發明提供阻斷TAT226配位體與TAT226之間之結合，但不阻斷TAT226配位體與第二蛋白之間之結合的抗TAT226抗體。對應於此等抗TAT226抗體之Fv純系可藉由以下方法來選擇：(1)如上所述將抗TAT226純系自噬菌體庫分離且視情況藉由增長合適細菌宿主中之群體而擴增所分離之噬菌體純系群體；(2)選擇分別需要阻斷及非阻斷活性之TAT226及第二蛋白；(3)將抗TAT226噬菌體純系吸附至固定TAT226；(4)使用過量第二蛋白以溶離識別與第二蛋白之結合決定子重疊或共用之TAT226結合決定子的任何非所需純系；及(5)溶離步驟(4)後保持吸附之純系。視情況而言，可將具有所需阻斷/非阻斷特性之純系藉由將本文所述之選擇程序重複一或多次而進一步富集。
使用習知程序(例如藉由使用經設計以自融合瘤或噬菌體DNA模板特異性擴增所關注之重鏈及輕鏈編碼區的寡核苷酸引子)，易於分離且定序編碼本發明之融合瘤衍生之單株抗體或噬菌體呈現Fv純系的DNA。經分離後，可將DNA置於表現載體中，接著將其轉染至不另外產生免疫球蛋白之宿主細胞(諸如大腸桿菌細胞、猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞)中以於重組宿主細胞中獲得所需單株抗體之合成。關於在細菌中重組表現編碼抗體之DNA之綜述文章包括Skerra等人，Curr.Opinion in Immunol .,5：256(1993)及Pluckthun,Immunol.Revs ,130：151(1992)。
可將編碼本發明之Fv純系之DNA與編碼重鏈及/或輕鏈恆定區之已知DNA序列(例如，可自Kabat等人(同上文)獲得之適當DNA序列)組合以形成編碼全長或部分長度重鏈及/或輕鏈之純系。應瞭解，任何同型之恆定區均可用於此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD及IgE恆定區，且此等恆定區可自任何人類或動物物種獲得。如本文所用之定義"嵌合"或"雜交"抗體中包括衍生自一種動物(諸如人類)物種之可變結構域DNA且接著與另一動物物種之恆定區DNA融合以形成用於"雜交"全長重鏈及/或輕鏈之編碼序列的Fv純系。在某些實施例中，將衍生自人類可變DNA之Fv純系與人類恆定區DNA融合以形成用於全長或部分長度人類重鏈及/或輕鏈之編碼序列。
亦可例如藉由以人類重鏈及輕鏈恆定結構域之編碼序列代替衍生自融合瘤純系之同源鼠序列來修飾編碼本發明之衍生自融合瘤之抗TAT226抗體的DNA(例如Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA ,81：6851－6855(1984)之方法)。可藉由共價連接至免疫球蛋白編碼序列、非免疫球蛋白多肽之所有或部分編碼序列來進一步修飾編碼衍生自融合瘤或Fv純系之抗體或片段之DNA。以此方式，製備具有本發明之衍生自Fv純系或融合瘤純系之抗體的結合特異性之"嵌合"或"雜交"抗體。
3.載體、宿主細胞及重組方法 為重組產生本發明之抗體，將編碼其之核酸分離且插入可複製載體中以進一步選殖(擴增DNA)或表現。編碼抗體之DAN係使用習知程序(例如，藉由使用可特異性結合至編碼抗體之重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)輕易地分離及定序。可使用多種載體。載體之選擇部分取決於待使用之宿主細胞。一般而言，宿主細胞具有原核或真核(一般為哺乳動物)來源。將瞭解，任何同型之恆定區均可用於此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD及IgE恆定區，且此等恆定區可自任何人類或動物物種獲得。
a)使用原核宿主細產生抗體： (1)載體建構 可使用標準重組技術獲得編碼本發明抗體之多肽組份的聚核苷酸序列。可將所要聚核苷酸序列自產生抗體之細胞(諸如融合瘤細胞)分離且定序。或者，可使用核苷酸合成器或PCR技術合成聚核苷酸。獲得之後，將編碼多肽之序列插入可於原核宿主中複製及表現異源性聚核苷酸之重組載體中。此項技術中可用且已知之諸多載體均可用於本發明之目的。適當載體之選擇將主要取決於待插入載體中之核酸尺寸及待經載體轉化之特定宿主細胞。各載體視其功能(異源性聚核苷酸之擴增或表現，或此兩者)及其與其所存在之特定宿主細胞之相容性而含有各種組份。載體組份一般包括(但不限於)：複製起點、標記基因之選擇、啟動子、核糖體結合位點(RBS)、信號序列、異源性核酸插入及轉錄終止序列。
一般而言，將含有複製子及衍生自與宿主細胞相容之物種之對照序列的質體載體與該等宿主聯合使用。載體通常攜帶複製位點，以及可在轉化細胞中提供表型選擇之標記序列。舉例而言，大腸桿菌通常係使用衍生自大腸桿菌物種之質體pBR322轉化。pBR322含有編碼安比西林(ampicillin)(Amp)及四環素(Tet)抗性之基因，且因此提供識別轉化細胞之簡易方式。pBR322、其衍生物或其他微生物質體或噬菌體亦可含有或經改質以含有可由微生物體用於表現內源性蛋白之啟動子。用於表現特定抗體之pBR322衍生物之實例係詳細描述於Carter等人之美國專利第5,648,237號中。
此外，可將含有複製子及與宿主微生物相容之對照序列之噬菌體載體與該等宿主聯合用作轉化載體。舉例而言，可將諸如λGEM.TM.－11之噬菌體用於製造可用以轉化諸如大腸桿菌LE392之敏感宿主細胞的重組載體。
本發明之表現載體可包含編碼各多肽組份之兩個或兩個以上啟動子－順反子對。啟動子為定位於調節其表現之順反子上游(5')之未轉譯調節序列。原核啟動子通常分為兩類：誘導性及組成性。誘導性啟動子為在其反應培養條件(例如存在或不存在營養物或溫度改變)改變之控制下引發增加程度之順反子轉錄的啟動子。
眾所熟知大量由各種可能之宿主細胞辨識之啟動子。藉由將啟動子經由限制酶消化作用自源DNA移除且將經分離之啟動子序列插入本發明之載體中，可將所選擇之啟動子可操作性地連接至編碼輕鏈或重鏈之順反子DNA。原生啟動子序列及許多異源性啟動子可用以直接擴增及/或表現靶基因。在一些實施例中，利用異源性啟動子，因其與原生靶多肽啟動子相比一般容許經表現靶基因之更多轉錄及更高產率。
適用於與原核宿主一起使用之啟動子包括PhoA啟動子、β－半乳糖苷酶及乳糖啟動子系統、色胺酸(trp)啟動子系統及諸如tac或trc啟動子之雜交啟動子。然而，在細菌中起作用之其他啟動子(諸如其他已知之細菌或噬菌體啟動子)亦為適用的。其核苷酸序列已公開，藉此使得熟習此項技術者可使用連接子或接附物將其可操作性地接合至編碼靶輕鏈及重鏈之順反子(Siebenlist等人(1980)Cell 20：269)，從而供應任何所需之限制位點。
在本發明之一態樣中，重組載體中之各順反子包含引導經表現多肽橫穿膜移位之分泌信號序列組份。一般而言，信號序列可為載體之組份，或其可為插入載體之靶多肽DNA之一部分。為本發明目的所選擇之信號序列應為由宿主細胞所識別及加工(亦即藉由信號肽酶裂解)之信號序列。對於不識別及加工異源性多肽原生之信號序列的原核宿主細胞而言，信號序列經原核信號序列取代，該原核信號序列係選自例如由鹼性磷酸酶、青黴素酶、Ipp或熱穩定性腸毒素II(STII)導引子、LamB、PhoE、PelB、OmpA及MBP組成之群。在本發明之一實施例中，用於表現系統之兩個順反子之信號序列為STII信號序列或其變異體。
在另一態樣中，根據本發明之免疫球蛋白之產生可發生於宿主細胞之細胞質中，且因此無需在各順反子中存在分泌信號序列。就此而言，免疫球蛋白輕鏈及重鏈經表現、折疊且組裝以於細胞質內形成功能性免疫球蛋白。特定宿主菌株(例如大腸桿菌trxB－菌株)提供有利於二硫鍵形成之細胞質條件，藉此容許經表現蛋白次單位之適當折疊及組裝。Proba及PluckthunGene ,159：203(1995)。
本發明之抗體亦可藉由使用表現系統而產生，在該表現系統中，可調節經表現多肽組份之定量比率以使本發明之經分泌及適當組裝之抗體的產率最大化。此調節至少部分藉由同時調節多肽組份之轉譯強度而完成。
一種調節轉譯強度之技術係揭示於Simmons等人之美國專利第5,840,523號中。其利用順反子中之轉譯起始區(TIR)變異體。對於指定TIR而言，可於轉譯強度範圍內產生一系列胺基酸或核酸序列變異體，藉此提供將此因素調節至特定鏈之所需表現程度的便利方式。TIR變異體可藉由導致可改變胺基酸序列之密碼子改變的習知突變技術而產生。在某些實施例中，核苷酸序列變化為靜止的。例如，TIR改變可包括Shine－Dalgarno序列之數量或間距之改變以及信號序列之改變。一種產生突變信號序列之方法為在編碼序列開始處產生"密碼子組"，其不改變信號序列之胺基酸序列(亦即改變為靜止的)。此可藉由改變各密碼子之第三核苷酸位置來完成；此外，一些胺基酸(諸如白胺酸、絲胺酸及精胺酸)具有多個可增加製造該組複雜性之第一及第二位置。此突變方法係詳細描述於Yansura等人(1992)METHODS：A Companion to Methods in Enzymol .4：151－158中。
在一實施例中，以其中各順反子之TIR強度範圍產生一組載體。此限制性組提供各鏈表現程度以及所需抗體產物產率在各種TIR強度組合下之比較。如Simmons等人之美國專利第5,840,523號中所詳述，可藉由量化報導體基因之表現程度來確定TIR強度。基於轉譯強度比較，選擇所需個體TIR以於本發明之表現載體建構中組合。
適用於表現本發明之抗體之原核宿主細胞包括原始細菌(Archaebacteria)及真細菌(Eubacteria)，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體。適用細菌之實例包括埃希氏菌屬(Escherichia)(例如大腸桿菌)、桿菌屬(Bacilli)(例如枯草桿菌(B.subtilis))、腸內菌(Enterobacteria)、假單胞菌種(Pseudomonas species)(例如綠膿桿菌(P.aeruginosa))、減毒鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、黏質沙雷氏菌(Serratia marcescans)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、變形桿菌屬(Proteus)、志賀桿菌屬(Shigella)、根瘤菌(Rhizobia)、透明顫菌(Vitreoscilla)或副球菌(Paracoccus)。在一實施例中，使用革蘭氏陰性細胞。在一實施例中，將大腸桿菌細胞用作本發明之宿主。大腸桿菌菌株之實例包括菌株W3110(Bachmann,Cellular and Molecular Biology，第2卷(Washington,D.C.：American Society for Microbiology,1987)，第1190－1219頁；ATCC保藏號第27,325號)及其衍生物，包括具有基因型W3110 △fhuA(△tonA)ptr3 lac Iq lacL8 △ompT△(nmpc－fepE)degP41 kanR之菌株33D3(美國專利第5,639,635號)。其他菌株及其衍生物，諸如大腸桿菌294(ATCC 31,446)、大腸桿菌B、大腸桿菌λ1776(ATCC 31,537)及大腸桿菌RVS08(ATCC 31,608)亦為適用的。該等實例為說明性的而非限制性的。用於建構具有所定義基因型之上述任何細菌之衍生物的方法於此項技術中已知且例如描述於Bass等人，Proteins,8：309－314(1990)中。一般需要考慮細菌細胞中複製子之可複製性來選擇適當細菌。舉例而言，當將諸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410之熟知質體用以供應複製子時，可將大腸桿菌、沙雷氏菌(Serratia)或沙門氏菌種(Salmonella species)合適地用作宿主。宿主細胞通常應分泌最小量之蛋白水解酶，且可將額外蛋白酶抑制劑理想地併入細胞培養物中。
(2)抗體產生 將宿主細胞以上述表現載體轉化，且培養於改質為適用於誘導啟動子、選擇轉化體或擴增編碼所需序列之基因的習知營養培養基中。
轉化意謂將DNA引入原核宿主中以使得DNA作為染色體外元素或藉由染色體成分為可複製的。視所用宿主細胞而定，使用適於此等細胞之標準枝術進行轉化。採用氮化鈣之鈣處理一般係用於含有實質細胞壁障壁之細菌細胞。另一種轉化方法採用聚乙二醇/DMSO。所用之另一技術為電穿孔。
用以產生本發明多肽之原核細胞係生長於此項技術中已知且適用於培養所選擇之宿主細胞之培養基中。合適培養基之實例包括魯利亞肉湯(luria broth)(LB)加必需之營養補充物。在一些實施例中，培養基亦含有基於表現載體之建構所選擇之選擇劑，以選擇性地容許含有表現載體之原核細胞生長。舉例而言，將安比西林添加至用於使表現安比西林抗性基因之細胞生長的培養基中。
除碳、氮及無機磷酸鹽源以外，亦可以適當濃度單獨引入或以與諸如複合氮源之另一補充物或培養基之混合物的形式包括任何必需補充物。培養基可視情況含有一或多種還原劑，其係選自由麩胱甘肽、半胱胺酸、胱胺、巰乙酸酯、二硫赤糖醇及二硫蘇糖醇組成之群。
將原核宿主細胞於合適溫度下培養。在某些實施例中，對於大腸桿菌生長而言，生長溫度為約20℃至約39℃；約25℃至約37℃，或約30℃。培養基之pH值主要視宿主生物體而定，可為約5至約9範圍內之任何pH值。在某些實施例中，對於大腸桿菌而言，pH值為約6.8至約7.4，或約7.0。
若將誘導性啟動子用於本發明之表現載體，則在適用於啟動子活化之條件下誘導蛋白表現。在本發明之一態樣中，使用PhoA啟動子以控制多肽之轉錄。因此，將經轉化之宿主細胞培養於磷酸鹽限制性培養基中以用於誘導。在某些實施例中，磷酸鹽限制性培養基為C.R.A.P培養基(例如參見Simmons等人，J.Immunol.Methods(2002),263：133－147)。如此項技術中已知，根據所採用之載體建構可使用各種其他誘導物。
在一實施例中，使本發明之經表現多肽分泌於宿主細胞周質中且自宿主細胞周質回收。蛋白回收通常包括一般藉由諸如滲透衝擊、超音波處理或溶胞之方式破壞微生物。破壞細胞之後，可藉由離心或過濾移除細胞碎片或全細胞。可將蛋白(例如)藉由親和樹脂層析進一步純化。或者，可將蛋白傳輸至培養基中且於其中分離。將細胞自培養物移除且將培養物上清液過濾且濃縮以用於進一步純化所產生之蛋白。可使用諸如聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)及西方墨點檢定之通常已知方法進一步分離及識別經表現之多肽。
在本發明之一態樣中，藉由醱酵法進行大量抗體之產生。可使用各種大規模分批饋入醱酵程序來產生重組蛋白。大規模醱酵具有至少1000公升之容量，且在某些實施例中為約1,000至100,000公升之容量。該等醱酵器使用攪拌葉輪以分配氧及營養物，尤其為葡萄糖(較佳為碳/能源)。小規模醱酵一般係指在容量不大於約100公升且可在約1公升至約100公升範圍內之醱酵器中之醱酵。
在醱酵法中，蛋白表現之誘導通常在細胞於合適條件下生長至例如約180－220之OD550之所需密度後(在此階段，細胞處於早期生長停滯期)起始。如此項技術中已知及如上文所述，可根據所採用之載體建構使用各種誘導物。在誘導之前細胞可生長較短時期。儘管可使用更長或更短之誘導時間，但細胞通常誘導約12－50小時。
為改良本發明多肽之生產產率及品質，可改進各種醱酵條件。舉例而言，為改良所分泌抗體多肽之適當組裝及折疊，可使用過度表現伴隨蛋白之額外載體，諸如Dsb蛋白(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD及/或DsbG)或FkpA(具有伴隨蛋白活性之肽基脯胺醯基順反異構酶)以共轉化宿主原核細胞。已證明伴隨蛋白促進在細菌宿主細胞中所產生之異源性蛋白的適當折疊及溶解性。Chen等人(1999)J Bio Chem 274：19601－19605；Georgiou等人之美國專利第6,083,715號；Georgiou等人之美國專利第6,027,888號；Bothmann及Pluckthun(2000)J.Biol.Chem .275：17100－17105；Ramm及Pluckthun(2000)J.Biol.Chem .275：17106－17113；Arie等人(2001)Mol.Microbiol.39：199－210。
為使所表現異源性蛋白之蛋白水解最小化(尤其為彼等蛋白水解敏感者)，可將缺乏蛋白水解酶之特定宿主菌株用於本發明。舉例而言，可修飾宿主細胞菌株以達成編碼已知細菌蛋白酶之基因中的基因突變，該等細菌蛋白酶諸如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其組合。一些大腸桿菌蛋白酶缺乏之菌株為可用的且描述於例如Joly等人(1998)(同上文)；Georgiou等人之美國專利第5,264,365號；Georgiou等人之美國專利第5,508,192號；Hara等人，Microbial Drug Resistance ,2：63－72(1996)中。
在一實施例中，將缺乏蛋白水解酶且經過度表現一或多種伴隨蛋白之質體轉化之大腸桿菌菌株用作本發明表現系統中之宿主細胞。
(3)抗體純化 在一實施例中，進一步純化本文所產生之抗體蛋白以獲得大體上均質之製劑以用於進一步檢定及使用。可採用此項技術中已知之標準蛋白純化方法。以下程序為例示之合適純化程序：免疫親和性分餾或離子交換管柱、乙醇沉澱、逆相HPLC、二氧化矽層析或諸如DEAE之離子交換樹脂層析、層析聚焦、SDS－PAGE、硫酸銨沉澱及使用例如Sephadex G－75之凝膠過濾。
在一態樣中，將固定於固相上之蛋白A用於本發明抗體產物之免疫親和性純化。蛋白A為以高親和力結合至抗體Fc區之來自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureas )之41 kD細胞壁蛋白。Lindmark等人(1983)J.Immunol.Meth.62：1－13。固定蛋白A之固相可為包含玻璃或二氧化矽表面之管柱，或為經控制之孔隙玻璃管柱或矽酸管柱。在一些應用中，以諸如甘油之試劑塗覆管柱以試圖防止污染物之非特異性黏著。
作為純化之第一步驟，可將如上所述衍生自細胞培養物之製劑塗覆於固定蛋白A之固相上以使得所關注之抗體特異性結合至蛋白A。接著洗滌固相以移除非特異性結合至固相之污染物。最後，藉由溶離自固相回收所關注之抗體。
b)使用真核宿主細胞產生抗體： 用於真核宿主細胞之載體一般包括以下非限制性組份之一或多種：信號序列、複製起點、一或多種標記基因、增強子元素、啟動子及轉錄終止序列。
(1)信號序列組份 用於真核宿主細胞之載體亦可含有在所關注之成熟蛋白或多肽之N端具有特異性裂解位點之信號序列或其他多肽。所選擇之異源性信號序列可為由宿主細胞識別及加工(亦即由信號肽酶裂解)之信號序列。在哺乳動物細胞表現中，可使用哺乳動物信號序列以及病毒分泌性引導物，例如單純疱疹gD信號。此前驅物區之DNA於閱讀框架中接合至編碼抗體之DNA。
(2)複製起點 一般而言，哺乳動物表現載體無需複製起點組份。舉例而言，通常可使用SV40起點，僅因其含有早期啟動子。
(3)選擇基因組份 表現及選殖載體可含有選擇基因，亦稱為可選擇標記。典型選擇基因編碼(a)對抗生素或其他毒素(例如安比西林、新黴素、甲胺喋呤或四環素)賦予抗性；(b)補充營養缺陷(相關時)或(c)供應不可自複合培養基獲得之標準營養物之蛋白。
選擇機制之一實例利用使宿主細胞生長停滯之藥物。以異源性基因成功轉化之彼等細胞產生賦予藥物抗性且因此保全選擇方案之蛋白。此優勢選擇之實例使用藥物新黴素、黴酚酸及濕黴素。
哺乳動物細胞之合適可選擇標記的另一實例為彼等使得可識別能夠吸收抗體核酸之細胞的可選擇標記，其諸如DHFR；胸苷激酶；金屬硫蛋白I及II，較佳為靈長類動物金屬硫蛋白基因；腺苷脫胺酶；鳥胺酸脫羧酶等。
舉例而言，在一些實施例中，首先藉由於含有甲胺喋呤(Mtx)、DHFR之競爭性拮抗劑之培養基中培養所有轉化體來識別經DHFR選擇基因轉化之細胞。在一些實施例中，當採用野生型DHFR時，適當宿主細胞為缺乏DHFR活性之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株(例如ATCC CRL－9096)。
或者，可藉由在含有諸如胺基糖苷類抗生素(例如康黴素(kanamycin)、新黴素或G418)之可選擇標記選擇劑之培養基中之細胞生長來選擇經編碼抗體之DNA序列轉化或共轉化之宿主細胞(尤其為含有內源性DHFR之野生型宿主)、野生型DHFR蛋白及另一可選擇標記，諸如胺基糖苷3'－磷酸轉移酶(APH)。參見美國專利第4,965,199號。
(4)啟動子組份 表現及選殖載體通常含有以宿主生物體識別且可操作性地連接至編碼所關注多肽(例如抗體)之核酸的啟動子。已知真核細胞之啟動子序列。舉例而言，實際上所有真核基因均具有定位於轉錄起始位點上游約25至30個鹼基處之AT富集區。於許多基因轉錄起始上游70至80個鹼基處發現之另一序列為其中N可為任何核苷酸之CNCAAT區。大部分真核基因3'端為AATAAA序列，其可為向編碼序列3'端添加聚A尾之信號。在某些實施例中，任何或所有該等序列均可合適地插入真核表現載體中。
自哺乳動物宿主細胞中之載體轉錄係(例如)藉由獲自以下之啟動子來控制：病毒染色體組，該等病毒諸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒、禽肉瘤病毒、細胞巨大病毒、反轉錄病毒、B型肝炎病毒及猿猴病毒40(SV40)；異源性哺乳動物啟動子，例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子；熱休克啟動子，其限制條件為此等啟動子與宿主細胞系統相容。
SV40病毒之早期及晚期啟動子以亦含有SV40病毒複製起點之SV40限制片段形式便利地獲得。人類細胞巨大病毒之即刻早期啟動子以HindIII E限制片段形式便利地獲得。使用牛乳頭狀瘤病毒作為載體於哺乳動物宿主中表現DNA之系統揭示於美國專利第4,419,446號中。此系統之修正描述於美國專利第4,601,978號中。亦參見Reyes等人，Nature 297：598－601(1982)，其描述人類β干擾素cDNA在來自單純疱疹病毒之胸苷激酶啟動子控制下於小鼠細胞中之表現。或者，可將勞斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)長末端重複序列用作啟動子。
(5)增強子元素組份 藉由更高級真核細胞轉錄編碼本發明抗體之DNA通常藉由將增強子序列插入載體中而增加。現已知許多增強子序列來自哺乳動物基因(血球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α－胎蛋白及胰島素)。然而，通常使用來自真核細胞病毒之增強子。實例包括位於複製起點後側(bp 100－270)之SV40增強子；細胞巨大病毒早期啟動子增強子；複製起點後側之多瘤增強子及腺病毒增強子。亦參見描述用於活化真核啟動子之增強子元素的Yaniv,Nature 297：17－18(1982)。可將增強子於編碼抗體多肽之序列之5'或3'位置剪接至載體中，但通常定位於啟動子之5'位點。
(6)轉錄終止組份 用於真核宿主細胞之表現載體亦含有終止轉錄及穩定mRNA所必需之序列。此等序列通常可自真核或病毒DNA或cDNA之5'及(偶爾)3'未轉譯區獲得。該等區域含有在編碼抗體之mRNA之未轉譯部分中轉錄為多聚腺嘌呤片段之核苷酸區段。一種適用之轉錄終止組份為牛生長激素多聚腺嘌呤區。參見WO 94/11026及其中所揭示之表現載體。
(7)宿主細胞之選擇及轉化 選殖或表現本文載體中之DNA的合適宿主細胞包括本文所述之更高級真核細胞，包括脊椎宿主細胞。脊椎動物細胞在培養物(組織培養物)中之繁殖已成為常規程序。適用之哺乳動物宿主細胞株之實例為經SV40轉化之猴腎CV1細胞株(COS－7,ATCC CRL 1651)；人類胚胎腎細胞株(次選殖以於懸浮培養物中生長之293或293細胞，Graham等人，J.Gen Virol .36：59(1977))；幼倉鼠腎細胞(BHK,ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/－DHFR(CHO,Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；小鼠足細胞(TM4,Mather,Biol.Reprod .23：243－251(1980))；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO－76,ATCC CRL－1587)；人類子宮頸癌細胞(HELA,ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK,ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝細胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138,ATCC CCL 75)；人類肝臟細胞(Hep G2,HB 8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562,ATCC CCL51)；TRI細胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci .383：44－68(1982))；MRC 5細胞；FS4細胞及人類肝腫瘤細胞株(Hep G2)。
將宿主細胞以上述表現或選殖載體轉化以產生抗體，且在視需要經改質之習知營養培養基中培養以用於誘導啟動子、選擇轉化體或擴增編碼所需序列之基因。
(8)培養宿主細胞 可於各種培養基中培養用以產生本發明抗體之宿主細胞。市售培養基，諸如Ham's F10(Sigma)、最少之基本培養基(Minimal Essential Medium)((MEM),Sigma)、RPMI－1640(Sigma)及杜貝科氏改質伊格氏培養基((DMEM),Sigma)適用於培養宿主細胞。此外，可將Ham等人，Meth.Enz .58：44(1979),Barnes等人，Anal.Biochem .102：255(1980)，美國專利第4,767,704號；第4,657,866號；第4,927,762號；第4,560,655號或第5,122,469號；WO 90/03430；WO 87/00195或美國專利Re.30,985中所述之任何培養基均可用作宿主細胞之培養基。任何該等培養基均可視需要補充以激素及/或其他生長因子(諸如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)；鹽(諸如氯化鈉、鈣鹽、鎂鹽及磷酸鹽)、緩衝液(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷及胸苷)、抗生素(諸如GENTAMYCINTM 藥物)、痕量元素(定義為通常以微莫耳範圍之最終濃度存在之無機化合物)及葡萄糖或等效能源。亦可以彼等熟習此項技術者已知之適當濃度包括任何其他補充物。諸如溫度、pH值及其類似條件之培養條件為彼等先前用於為表現而選擇之宿主細胞的條件，且將為一般熟習此項技術者所顯而易見。
(9)抗體之純化 當使用重組技術時，抗體可於細胞內產生或直接分泌入培養基中。若抗體於細胞內產生而作為第一步驟，則(例如)藉由離心或超濾移除微粒碎片(宿主細胞或溶胞片段)。當抗體分泌入培養基中時，首先使用市售之蛋白濃縮過濾器(例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元)濃縮來自此等表現系統之上清液。可於前述任何步驟中包括諸如PMSF之蛋白酶抑制劑以抑制蛋白水解，且可包括抗生素以防止外來污染物之生長。
由細胞製備之抗體組合物可使用例如羥基磷灰石層析、凝膠電泳法、透析及親和層析純化，其中親和層析為便利技術。蛋白A作為親和力配位體之適用性取決於抗體中所存在之任何免疫球蛋白Fc結構域的種類及同型。蛋白A可用以純化基於人類γ1、γ2或γ4重鏈之抗體(Lindmark等人，J.Immunol.Methods 62：1－13(1983))。推薦將蛋白G用於所有小鼠同型及用於人類γ3(Guss等人，EMBO J.5：15671575(1986))。親和力配位體所連接之基質可為瓊脂糖，但可使用其他基質。諸如受控微孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯之機械穩定基質使得可獲得與瓊脂糖可達成者相比更快之流動速率及更短之加工時間。當抗體包含CH3結構域時，Bakerbond ABXTM 樹脂(J.T.Baker,Phillipsburg,NJ)適用於純化。視待回收之抗體而定，亦可使用諸如離子交換管柱分餾、乙醇沉澱、逆相HPLC、二氧化矽層析、肝素SEPHAROSETM 層析、陰離子或陽離子交換樹脂層析(諸如聚天冬胺酸管柱)、層析聚焦、SDS－PAGE及硫酸銨沉澱之其他蛋白純化技術。
任何初步純化步驟之後，可使包含所關注抗體及污染物之混合物例如藉由較佳於低鹽濃度(例如約0－0.25 M鹽)下進行之使用pH值介於約2.5－4.5之間之溶離緩衝液的低pH值疏水性相互作用層析而經受進一步純化。
一般而言，此項技術中已確定用以製備用於研究、測試及臨床用途之抗體的各種方法，與上述方法一致及/或由熟習此項技術者認為適用於所關注之特定抗體。
C.免疫接合物
本發明亦提供包含接合至一或多種細胞毒性劑之本發明之任何抗TAT226抗體的免疫接合物(可交替稱作"抗體－藥物接合物"或"ADC")，該(等)細胞毒性劑諸如化療劑、藥物、生長抑制劑、毒素(例如細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素或其片段))或放射性同位素(亦即放射性接合物)。
免疫接合物在癌症治療中可用於局部傳遞細胞毒性劑，亦即殺死或抑制腫瘤細胞生長或增殖之藥物(Syrigos及Epenetos(1999)Anticancer Research 19：605－614；Niculescu－Duvaz及Springer(1997)Adv.Drug Deliv.Rev .26：151－172；美國專利第4,975,278號)。免疫接合物可容許將藥物部分靶傳遞至腫瘤及於其中進行細胞內積累，其中全身投予未接合之藥物可對正常細胞以及待消除之腫瘤細胞產生不可接受程度之毒性(Baldwin等人，Lancet (1986年3月15日)第603－05頁)；Thorpe(1985)"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer The rapy：A Review,"於Monoclonal Antibodies'84：Biological And Clinical Applications (A.Pinchera等人編)第475－506頁。已報導多株抗體及單株抗體均適用於此等策略(Rowland等人，(1986)Cancer Immunol.Immunother .21：183－87)。用於此等方法之藥物包括道諾黴素、多柔比星、甲胺喋呤及長春地辛(同上文之Rowland等人，(1986))。用於抗體－毒素接合物之毒素包括細菌毒素，諸如白喉毒素；植物毒素，諸如蓖麻毒素；小分子毒素，諸如格爾德黴素(geldanamycin)(Mandler等人(2000)J.of the Nat.Cancer Inst .92(19)：1573－1581；Mandler等人(2000)Bioorganic & MedChem.Letters 10：1025－1028；Mandler等人(2002)Bioconjugate Chem .13：786－791)；美登鹼(maytansinoids)(EP 1391213；Liu等人，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618－8623)及卡奇黴素(Lode等人(1998)Cancer Res. 58：2928；Hinman等人(1993)Cancer Res .53：3336－3342)。該等毒素可藉由包括微管蛋白結合、DNA結合或拓樸異構酶抑制之機制發揮其細胞毒性作用。一些細胞毒性藥物當接合至大抗體或蛋白受體配位體時傾向於為惰性或低活性的。
ZEVALIN(替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)，Biogen/Idec)為抗體－放射性同位素接合物，其係由對抗在正常及惡性B淋巴細胞表面發現之CD20抗原之鼠科IgG1單株抗體及以硫脲連接子－螯合劑結合之111 In或90 Y放射性同位素組成(Wiseman等人，(2000)Eur.Jour.Nucl.Med. 27(7)：766－77；Wiseman等人，(2002)Blood 99(12)：4336－42；Witzig等人，(2002)J.Clin.Oncol .20(10)：2453－63；Witzig等人，(2002)J.Clin.Oncol .20(15)：3262－69)。儘管ZEVALIN具有對抗B細胞非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)之活性，但是投藥在大部分患者體內均導致嚴重且長期之血細胞減少症。於2000年批准一種由連接至卡奇黴素之hu CD3抗體組成之抗體藥物接合物MYLOTARGTM (吉妥單抗(gemtuzumab ozogamicin),Wyeth Pharmaceuticals)藉由注射來治療急性骨髓白血病(Drugs of the Future(2000)25(7)：686；美國專利第4970198號；第5079233號；第5585089號；第5606040號；第5693762號；第5739116號；第5767285號；第5773001號)。由經由二硫連接子SPP連接至美登鹼藥物部分DM1之huC242抗體組成之抗體藥物接合物坎突單抗(Cantuzumab mertansine)(Immunogen,Inc.)進展至治療表現CanAg之癌症(諸如結腸癌、胰腺癌、胃癌及其他)之II期試驗。由連接至美登鹼藥物部分DM1之抗前列腺特異性膜抗原(PSMA)單株抗體組成之抗體藥物接合物MLN－2740(Millennium Pharm.,BZL Biologics,Immunogen Inc.)處於前列腺腫瘤的可能治療研發中。海兔毒素(dolastatin)之合成類似物auristatin肽、auristatin E(AE)及單甲基auristatin(MMAE)係接合至嵌合單株抗體cBR96(對癌瘤上之路易斯Y(Lewis Y)具有特異性)及cAC10(對血液科惡性腫瘤上之CD30具有特異性)(Doronina等人(2003)Nature Biotechnol .21(7)：778－784)且處於治療研發中。
在某些實施例中，免疫接合物包含抗TAT226抗體及化療劑或其他毒素。適用於產生免疫接合物之化療劑於本文中描述(例如上文)。亦可使用酶活性毒素及其片段且其係描述於本文中。
在某些實施例中，免疫接合物包含抗TAT226抗體及一或多種小分子毒素，包括(但不限於)小分子藥物，諸如卡奇黴素、美登鹼、海兔毒素、auristatin、單端孢黴烯(trichothecene)及CC1065；以及具有細胞毒性活性之此等藥物的衍生物。此等免疫接合物之實例係於下文進一步詳述。
1.例示性免疫接合物 本發明之免疫接合物(或"抗體－藥物接合物"("ADC"))可具有下式I，其中抗TAT226抗體經由可選連接子(L)接合(亦即共價連接)至一或多個藥物部分(D)。Ab－(L－D)p I因此，抗TAT226抗體可直接或經由連接子接合至藥物。在式I中，p為每抗體藥物部分之平均數量，其可在例如每抗體約1至約20個藥物部分之範圍內，且在某些實施例中為每抗體1至約8個藥物部分之範圍內。
a)例示性連接子 連接子可包含一或多個連接子組份。例示性連接子組份包括6－馬來醯亞胺己醯基("MC")、馬來醯亞胺丙醯基("MP")、纈胺酸－瓜胺酸("val－cit"或"vc")、丙胺酸－苯丙胺酸("ala－phe")、對胺基苄氧羰基("PAB")、N－琥珀醯亞胺基4－(2－吡啶硫基)戊酸酯("SPP")、N－琥珀醯亞胺基4－(N－馬來醯亞胺甲基)環己烷－1甲酸酯("SMCC")及N－琥珀醯亞胺基(4－碘－乙醯基)胺基苯甲酸酯("SIAB")。此項技術中已知各種連接子組份，其中一些於下文中描述。
連接子可為促進細胞中藥物釋放之"可裂解連接子"。舉例而言，可使用酸不穩定連接子(例如腙)、蛋白酶敏感(例如肽酶敏感)連接子、光不穩定連接子、二甲基連接子或含有二硫鍵之連接子(Chari等人，Cancer Research 52：127－131(1992)；美國專利第5,208,020號)。
在一些實施例中，連接子組份可包含將抗體連接至另一連接子組份或連接至藥物部分之"拉伸單元"。例示性拉伸單元係展示於下文中(其中波浪線表示與抗體之共價連接位點)：
在一些實施例中，連接子組份可包含胺基酸單元。在一個此實施例中，胺基酸單元使得可由蛋白酶裂解連接子，藉此促進藥物在暴露於諸如溶酶體酶之細胞內蛋白酶時自免疫接合物釋放。參見例如Doronina等人(2003)Nat.Biotechnol .21：778－784。例示性胺基酸單元包括(但不限於)二肽、三肽、四肽及五肽。例示性二肽包括：纈胺酸－瓜胺酸(vc或val－cit)；丙胺酸－苯丙胺酸(af或ala－phe)；苯丙胺酸－離胺酸(fk或phe－lys)；或N－甲基－纈胺酸－瓜胺酸(Me－val－cit)。例示性三肽包括：甘胺酸－纈胺酸－瓜胺酸(gly－val－cit)及甘胺酸－甘胺酸－甘胺酸(gly－gly－gly)。胺基酸單元可包含天然產生之胺基酸殘基，以及微量胺基酸及非天然產生之胺基酸類似物，諸如瓜胺酸。胺基酸單元可經設計及最優化其選擇性以由特定酶(例如腫瘤相關蛋白酶，組織蛋白酶B、C及D或纖溶酶蛋白酶)酶促裂解。
在一些實施例中，連接子組份可包含直接或藉由拉伸單元及/或胺基酸單元將抗體連接至藥物部分之"間隔"單元。間隔單元可為"自毀壞性"或"非自毀壞性"的。"非自毀壞性"間隔單元為部分或所有間隔單元在ADC之酶促(例如蛋白水解)裂解時保持結合至藥物部分的間隔單元。非自毀壞性間隔單元之實例包括(但不限於)甘胺酸間隔單元及甘胺酸－甘胺酸間隔單元。亦涵蓋易受序列特異性酶促裂解影響之肽間隔劑之其他組合。舉例而言，藉由腫瘤細胞相關蛋白酶酶促裂解含有甘胺酸－甘胺酸間隔單元之ADC將導致自ADC之剩餘物中釋放甘胺酸－甘胺酸藥物部分。在一個此實施例中，接著使甘胺酸－甘胺酸藥物部分於腫瘤細胞中經受獨立水解步驟，從而自藥物部分裂解甘胺酸－甘胺酸間隔單元。
"自毀壞性"間隔單元使得無需獨立水解步驟即可釋放藥物部分。在某些實施例中，連接子之間隔單元包含對胺基苄基單元。在一個此實施例中，將對胺基苄醇經由醯胺鍵連接至胺基酸單元，且在苄醇與細胞毒性劑之間形成胺基甲酸酯、胺基甲酸甲酯或碳酸酯。參見例如Hamann等人(2005)Expert Opin.Ther.Patents (2005)15：1087－1103。在一實施例中，間隔單元為對胺基苄氧羰基(PAB)。在某些實施例中，對胺基苄基單元之伸苯基部分經Qm取代，其中Q為－C1 －C8 烷基、－O－(C1 －C8 烷基)、－鹵素、－硝基或－氰基；且m為0－4範圍內之整數。自毀壞性間隔單元之實例另外包括(但不限於)與對胺基苄醇電學相似之芳族化合物(參見例如US 2005/0256030 A1)，諸如2－胺基咪唑－5－甲醇衍生物(Hay等人(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett .9：2237)及鄰或對－胺基苄基縮醛。可使用在醯胺鍵水解時經受環化之間隔劑，諸如經取代及未經取代之4－胺基丁酸醯胺(Rodrigues等人，Chemistry Biology ,1995,2,223)；經適當取代之雙環[2.2.1]及雙環[2.2.2]環系統(Storm等人，J.Amer.Chem.Soc .,1972,94,5815)；及2－胺基苯基丙酸醯胺(Amsberry等人，J. Org.Chem .,1990,55,5867)。於甘胺酸之a位置經取代之含胺藥物的消除反應(Kingsbury等人，J.Med.Chem .,1984,27,1447)亦為適用於ADC之自毀壞性間隔劑之實例。
在一實施例中，間隔單元為如下所述之支鏈雙(羥甲基)苯乙烯(BHMS)，其可用以併入及釋放多種藥物。
其中Q為－C1 －C8 烷基、－O－(C1 －C8 烷基)、－鹵素、－硝基或－氰基；m為0－4範圍內之整數；n為0或1；且p介於1至約20之範圍內。
連接子可包含以上連接子組份中之任一或多種。在某些實施例中，連接子如以下ADC式II中之支架所展示： 其中A為拉伸單元且a為0至1之整數；W為胺基酸單元且w為0至12之整數；Y為間隔單元；且y為0、1或2；且Ab、D及p如上文關於式I所定義。此等連接子之例示性實施例於以引用的方式明確併入本文之US 2005－0238649 A1中描述。
例示性連接子組份及其組合於下文式II之ADC內容中展示：
連接子組份，包括拉伸單元、間隔單元及胺基酸單元可藉由此項技術中已知之方法合成，諸如US 2005－0238649 A1中所述之彼等方法。
b)例示性藥物部分 (1)美登素及美登鹼 在一些實施例中，免疫接合物包含接合至一或多個美登鹼分子之本發明抗體。美登鹼為藉由抑制微管蛋白聚合而起作用之有絲分裂抑制劑。美登素首先自東非灌木齒葉美登木(east African shrub Maytenus serrata)分離(美國專利第3,896,111號)。隨後，發現某些微生物亦產生美登鹼，諸如美登醇及C－3美登醇酯(美國專利第4,151,042號)。合成美登醇及其衍生物及類似物揭示於以下專利中，例如美國專利第4,137,230號；第4,248,870號；第4,256,746號；第4,260,608號；第4,265,814號；第4,294,757號；第4,307,016號；第4,308,268號；第4,308,269號；第4,309,428號；第4,313,946號；第4,315,929號；第4,317,821號；第4,322,348號；第4,331,598號；第4,361,650號；第4,364,866號；第4,424,219號；第4,450,254號；第4,362,663號及第4,371,533號。
美登鹼藥物部分為抗體－藥物接合物中具有吸收力之藥物部分，因為其：(i)相對易於藉由醱酵或化學修飾或醱酵產物之衍生作用來製備，(ii)易受與適用於經由非二硫連接子接合至抗體之官能基衍生作用的影響，(iii)於血漿中穩定；及(iv)有效對抗各種腫瘤細胞株。
此項技術中已熟知適合用作美登鹼藥物部分之美登素化合物且可根據已知方法自天然來源分離或使用基因工程設計技術產生(參見Yu等人(2002)PNAS 99：7968－7973)。美登醇及美登醇類似物亦可根據已知方法合成地製備。
例示性美登鹼藥物部分包括彼等具有經改質芳環者，諸如：C－19－去氯(美國專利第4256746號)(藉由安沙黴素P2(ansamytocin P2)之氫化鋁鋰還原反應所製備)；C－20－羥基(或C－20－去甲基)＋/－C－19－去氯(美國專利第4361650號及第4307016號)(藉由使用鏈黴素(Streptomyces)或放線菌(Actinomyces)之去甲基作用或使用LAH之脫氯作用所製備)；及C－20－去甲氧基、C－20－醯氧基(－OCOR)＋/－去氯(美國專利第4,294,757號)(藉由使用醯基氯之醯化作用所製備)及彼等於其他位置具有改質者。
例示性美登鹼藥物部分亦包括彼等具有諸如以下改質者：C－9－SH(美國專利第4424219號)(藉由美登醇與H2 S或P2 S5 反應所製備)；C－14－烷氧基甲基(去甲氧基/CH2 OR)(US 4331598)；C－14－羥甲基或醯氧基甲基(CH2 OH或CH2 OAc)(美國專利第4450254號)(由奴卡菌屬(Nocardia)所製備)；C－15－羥基/醯氧基(US 4364866)(藉由以鏈黴素轉化美登醇所製備)；C－15－甲氧基(美國專利第4313946號及第4315929號)(自Trewia nudlflora分離)；C－18－N－去甲基(美國專利第4362663號及第4322348號)(藉由以鏈黴素使美登醇去甲基化所製備)及4,5－去氧基(US 4371533)(藉由美登醇之三氯化鈦/LAH還原所製備)。
美登鹼藥物部分之例示性實施例包括：具有以下結構之DM1、DM3及DM4： 其中波浪線表示藥物之硫原子與抗體－藥物接合物之連接子(L)之共價連接。已報導由SMCC連接至DM1之HERCEPTIN(曲妥珠單抗(trastuzumab))(WO 2005/037992；US 2005/0276812 A1)。
其他例示性美登鹼抗體－藥物接合物具有以下結構及縮寫(其中Ab為抗體且p為1至約8)：
其中DM1經由BMPEO連接子連接至抗體之硫醇基的例示性抗體－藥物接合物具有以下結構及縮寫： 其中Ab為抗體；n為0、1或2；且p為1、2、3或4。
含有美登鹼之免疫接合物、製造其之方法及其治療用途揭示於以下專利中，例如美國專利第5,208,020號、第5,416,064號、US 2005/0276812 A1及歐洲專利EP 0 425 235 B1，該等揭示內容係以引用的方式明確併入本文中。Liu等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618－8623(1996)描述包含連接至針對人類結腸直腸癌之單株抗體C242之命名為DM1的美登鹼之免疫接合物。發現接合物對經培養結腸癌細胞具有高細胞毒性，且於活體內腫瘤生長檢定中展現抗腫瘤活性。Chari等人Cancer Research 52：127－131(1992)描述其中美登鹼經由二硫連接子接合至與人類結腸癌細胞株上之抗原結合之鼠類抗體A7或接合至與HER－2/neu致癌基因結合之另一鼠類單株抗體TA.1的免疫接合物。於活體外測試TA.1－美登鹼接合物對在每一細胞中表現3×105 HER－2表面抗原之人類乳癌細胞株SK－BR－3的細胞毒性。藥物接合物達成與游離美登鹼藥物類似之細胞毒性度，其可藉由增加每一抗體分子之美登鹼分子數量而增加。A7美登鹼接合物於小鼠體內展示低的全身細胞毒性。
抗體美登鹼接合物係藉由在不顯著減低抗體或美登鹼分子之生物活性下將抗體化學連接至美登鹼分子來製備。參見例如美國專利第5,208,020號(其揭示內容以引用的方式明確併入本文)。每抗體分子平均接合3－4個美登鹼分子已展示增強靶細胞之細胞毒性而不對抗體之功能或溶解性產生不利影響之功效，儘管即使僅預期一個毒素/抗體分子在裸抗體使用期間增強細胞毒性。此項技術中已熟知美登鹼且可藉由已知技術合成或自天然來源分離。合適美登鹼例如揭示於美國專利第5,208,020號及上文提及之其他專利及非專利公開案中。較佳美登鹼為美登醇及在美登醇分子之芳環或其他位置改質之美登醇類似物，諸如各種美登醇酯。
此項技術中已知許多用於製造抗體－美登鹼接合物之連接基團，包括例如於美國專利第5208020號或EP專利0 425 235 B1；Chari等人Cancer Research 52：127－131(1992)；及US 2005/016993 A1中所揭示之彼等，該等揭示內容以引用的方式明確併入本文。包含連接子組份SMCC之抗體－美登鹼接合物可如US 2005/0276812 A1,"Antibody－drug conjugates and Methods"中所揭示來製備。如上述專利所揭示，連接子包含二硫基、硫醚基、酸不穩定基、光不穩定基、肽酶不穩定基或酯酶不穩定基。其他連接子於本文中描述且例示。
抗體與美登鹼之接合物可使用各種雙官能性蛋白偶合劑來製造，諸如N－琥珀醯亞胺基－3－(2－吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)、琥珀醯亞胺基－4－(N－馬來醯亞胺基甲基)環己烷－1－甲酸酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、醯亞胺基酯之雙官能性衍生物(諸如己二醯亞胺二甲酯HCl)、活性酯(諸如辛二酸二琥珀醯亞胺基酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苄醯基)己二胺)、雙重氮鹽衍生物(諸如雙(對重氮苄醯基)－乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6－二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5－二氟－2,4－二硝基苯)。在某些實施例中，偶合劑為N－琥珀醯亞胺基－3－(2－吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等人，Biochem.J .173：723－737(1978))或N－琥珀醯亞胺基－4－(2－吡啶硫基)戊酸酯(SPP)以提供二硫鍵。
連接子可視連接類型於各種位置連接至美登鹼。舉例而言，可藉由使用習知偶合技術與羥基反應而形成酯鍵。反應可發生於具有羥基之C－3位置、經羥甲基改質之C－14位置、經羥基改質之C－15位置及具有羥基之C－20位置。在一實施例中，於美登醇或美登醇類似物之C－3位置形成鍵聯。
(2)Auristatin及海兔毒素 在一些實施例中，免疫接合物包含接合至海兔毒素或海兔毒性肽類似物或衍生物(例如auristatin)之本發明抗體(美國專利第5635483號；第5780588號)。已證實海免毒素及auristatin干擾微管動力學、GTP水解及核與細胞分裂(Woyke等人(2001)Antimicrob.Agents and Chemother .45(12)：3580－3584)且具有抗癌(美國專利第5663149號)及抗真菌活性(Pettit等人(1998)Antimicrob.Agents Chemother .42：2961－2965)。海兔毒素或auristatin藥物部分可經由肽藥物部分之N(胺基)端或C(羧基)端連接至抗體(WO 02/088172)。
例示性auristatin實施例包括N端連接之單甲基auristatin藥物部分DE及DF，其揭示於2004年3月28日公開之Senter等人，Proceedings of the American Association for Cancer Research，第45卷，文摘號623中，其揭示內容之全文係以引用的方式明確併入本文。
肽藥物部分可選自以下式DE 及DF ：
其中DE 及DF 之波浪線表示與抗體或抗體－連接子組份之共價連接位點，且於各位置獨立：R2 係選自H及C1 －C8 烷基；R3 係選自H、C1 －C8 烷基、C3 －C8 碳環、芳基、C1 －C8 烷基－芳基、C1 －C8 烷基－(C3 －C8 碳環)、C3 －C8 雜環及C1 －C8 烷基－(C3 －C8 雜環)；R4 係選自H、C1 －C8 烷基、C3 －C8 碳環、芳基、C1 －C8 烷基－芳基、C1 －C8 烷基－(C3 －C8 碳環)、C3 －C8 雜環及C1 －C8 烷基－(C3 －C8 雜環)；R5 係選自H及甲基；或R4 及R5 接合形成碳環且具有式－(CRa Rb )n －，其中Ra 及Rb 獨立地選自H、C1 －C8 烷基及C3 －C8 碳環且n係選自2、3、4、5及6；R6 係選自H及C1 －C8 烷基；R7 係選自H、C1 －C8 烷基、C3 －C8 碳環、芳基、C1 －C8 烷基－芳基、C1 －C8 烷基－(C3 －C8 碳環)、C3 －C8 雜環及C1 －C8 烷基－(C3 －C8 雜環)；各R8 係獨立地選自H、OH、C1 －C8 烷基、C3 －C8 碳環及O－(C1 －C8 烷基)；R9 係選自H及C1 －C8 烷基；R10 係選自芳基或C3 －C8 雜環；Z為O、S、NH或NR12 ，其中R12 為C1 －C8 烷基；R11 係選自H、C1 －C20 烷基、芳基、C3 －C8 雜環、－(R13 O)m －R14 或－(R13 O)m －CH(R15 )2 ；m為1－1000範圍內之整數；R13 為C2 －C8 烷基；R14 為H或C1 －C8 烷基；每次出現之R15 獨立地為H、COOH、－(CH2 )n －N(R16 )2 、－(CH2 )n －SO3 H或－(CH2 )n －SO3 －C1 －C8 烷基；每次出現之R16 獨立地為H、C1 －C8 烷基或－(CH2 )n －COOH；R18 係選自－C(R8 )2 －C(R8 )2 －芳基、－C(R8 )2 －C(R8 )2 －(C3 －C8 雜環)及－C(R8 )2 －C(R8 )2 －(C3 －C8 碳環)；及n為0至6範圍內之整數。
在一實施例中，R3 、R4 及R7 獨立地為異丙基或第二丁基且R5 為－H或甲基。在一例示性實施例中，R3 及R4 各自為異丙基，R5 為－H且R7 為第二丁基。
在又一實施例中，R2 及R6 各自為甲基且R9 為－H。
在又一實施例中，每次出現之R8 為－OCH3 。
在一例示性實施例中，R3 及R4 各自為異丙基，R2 及R6 各自為甲基，R5 為－H，R7 為第二丁基，每次出現之R8 為－OCH3 且R9 為－H。
在一實施例中，Z為－O－或－NH－。
在一實施例中，R10 為芳基。
在一例示性實施例中，R10 為－苯基。
在一例示性實施例中，當Z為－O－時，R11 為－H、甲基或第三丁基。
在一實施例中，當Z為－NH時，R11 為－CH(R15 )2 ，其中R15 為－(CH2 )n －N(R16 )2 ，且R16 為－C1 －C8 烷基或－(CH2 )n －COOH。
在另一實施例中，當Z為－NH時，R11 為－CH(R15 )2 ，其中R15 為－(CH2 )n －SO3 H。
式DE 之例示性auristatin實施例為MMAE，其中波浪線表示共價連接至抗體－藥物接合物之連接子(L)：
式DF 之例示性auristatin實施例為MMAF，其中波浪線表示共價連接至抗體－藥物接合物之連接子(L)(參見US 2005/0238649及Doronina等人(2006)Bioconjugate Chem .17：114－124)：
其他藥物部分包括以下MMAF衍生物，其中波浪線表示與抗體－藥物接合物之連接子(L)之共價連接：
在一態樣中，可將如上所示包括(但不限於)三乙二醇酯(TEG)之親水性基團於R11 處連接至藥物部分。在不受任何特定理論約束下，親水性基團有助於藥物部分之內化作用及不凝聚。
包含auristatin/海兔毒素或其衍生物之式I之ADC的例示性實施例係描述於以引用的方式明確併入本文之US 2005－0238649 A1及Doronina等人(2006)Bioconjugate Chem .17：114－124中。包含MMAE或MMAF及各種連接子組份之式I之ADC的例示性實施例具有以下結構及縮寫(其中"Ab"為抗體；p為1至約8；"Val－Cit"為纈胺酸－瓜胺酸二肽且"S"為硫原子)：
包含MMAF及各種連接子組份之式I之ADC的例示性實施例另外包括Ab－MC－PAB－MMAF及Ab－PAB－MMAF。有趣的是，已展示包含由不可蛋白水解裂解之連接子連接至抗體之MMAF的免疫接合物具有可與包含藉由可蛋白水解裂解之連接子連接至抗體之MMAF的免疫接合物相比之活性。參見Doronina等人(2006)Bioconjugate Chem .17：114－124。在此等情況下，咸信藥物釋放係藉由細胞中之抗體降解而實現。同上文。
以肽為主之藥物部分通常可藉由在兩個或兩個以上胺基酸及/或肽片段之間形成肽鍵來製備。此等肽鍵例如可根據肽化學領域中所熟知之液相合成法(參見E.Schrder及K.Lbke,"The Peptides"，第1卷，第76－136頁，1965,Academic Press)來製備。Auristatin/海兔毒素藥物部分可根據以下文獻中之方法來製備：US 2005－0238649 A1、美國專利第5635483號；美國專利第5780588號；Pettit等人(1989)J.Am.Chem.Soc .111：5463－5465；Pettit等人(1998)Anti－Cancer Drug Design 13：243－277；Pettit,G.R.等人Synthesis ,1996,719－725；Pettit等人(1996)J.Chem.Soc.Perkin Trans .1 5：859－863；及Doronina(2003)Nat.Biotechnol .21(7)：778－784。
詳言之，式DF 之auristatin/海兔毒素藥物部分，諸如MMAF及其衍生物可使用US 2005－0238649 A1及Doronina等人(2006)Bioconjugate Chem .17：114－124中所述之方法來製備。式DE 之Auristatin/海兔毒素藥物部分，諸如MMAE及其衍生物可使用Doronina等人(2003)Nat.Biotech .21：778－784中所述之方法來製備。藥物－連接子部分MC－MMAF、MC－MMAE、MC－vc－PAB－MMAF及MC－vc－PAB－MMAE可藉由例如Doronina等人(2003)Nat.Biotech .21：778－784及專利申請公開案第US 2005/0238649 A1號中所述之常規方法便利地合成，且接著接合至所關注抗體。
(3)卡奇黴素 在其他實施例中，免疫接合物包含接合至一或多個卡奇黴素分子之本發明抗體。抗生素之卡奇黴素家族能夠在皮莫耳以下之濃度下產生雙鏈DNA斷裂。對於卡奇黴素家族之接合物的製備而言，參見美國專利第5,712,374號、第5,714,586號、第5,739,116號、第5,767,285號、第5,770,701號、第5,770,710號、第5,773,001號、第5,877,296號(均屬於American Cyanamid Company)。可用之卡奇黴素之結構類似物包括(但不限於)γ1 I 、α2 I 、α3 I 、N－乙醯基－γ1 I 、PSAG及θI 1 (Hinman等人，Cancer Research 53：3336－3342(1993),Lode等人，Cancer Research 58：2925－2928(1998)，且屬於American Cyanamid之上述美國專利)。可接合抗體之另一種抗腫瘤藥物為QFA，其為抗葉酸劑(antifolate)。卡奇黴素及QFA均具有細胞內作用位點且不易橫穿質膜。因此，該等藥劑經由抗體介導之內化作用吸收細胞大幅地增強其細胞毒性效應。
c)其他細胞毒性劑 可接合至本發明抗體之其他抗腫瘤劑包括BCNU、鏈脲黴素(streptozocin)、長春新鹼及5－氟脲嘧啶，總稱作LL－E33288複合物之藥劑家族(描述於美國專利第5,053,394號、第5,770,710號中)以及艾司匹拉黴素(esperamicin)(美國專利第5,877,296號)。
可用之酶活性毒素及其片段包括白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A鏈、相思子鹼A鏈、莫迪素A鏈(modeccin A chain)、α－帚麴菌素(alpha－sarcin)、油酮(Aleurites fordii)蛋白、康乃馨蛋白、洋商陸蛋白(PAPI、PAPII及PAP－S)、苦瓜抑制劑(momordica charantia inhibitor)、麻楓樹蛋白(curcin)、巴豆素(crotin)、葡萄纈草(sapaonaria officinalis)抑制劑、介樂寧(gelonin)、有絲分裂素、侷限麴菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)及黴菌毒素。參見例如1993年10月28日公開之WO 93/21232。
本發明進一步涵蓋在抗體與具有核分解活性之化合物之間形成之免疫接合物(例如核糖核酸酶或DNA核酸內切酶，諸如去氧核糖核酸酶；DNase)。
在某些實施例中，免疫接合物可包含高度放射性原子。可使用各種放射性同位素用於產生放射性接合之抗體。實例包括At211 、I131 、I125 、Y90 、Re186 、Re188 、Sm153 、Bi212 、P32 、Pb212 及Lu之放射性同位素。當將免疫接合物用於偵測時，其可包含用於閃爍掃描研究之放射性原子，例如tc99m 或I123 ，或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱作磁共振成像，mri)之自旋標記，諸如碘－123、碘－131、銦－111、氟－19、碳－13、氮－15、氧－17、釓、錳或鐵。
可經已知方式將放射性標記或其他標記併入免疫接合物中。舉例而言，肽可經生物合成或可藉由使用合適胺基酸前驅體之化學胺基酸合成(例如包括以氟－19代替氫)而合成。諸如tc99m 或I123 、Re186 、Re188 及In111 之標記可經由肽中之半胱胺酸殘基連接。釔－90可經由離胺酸殘基連接。IODOGEN方法(Fraker等人(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun .80：49－57)可用以併入碘－123。"Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy"(Chatal,CRC Press 1989)詳細描述其他方法。
在某些實施例中，免疫接合物可包含接合至將前藥(例如肽基化療劑，參見WO 81/01145)轉化為活性藥物(諸如抗癌藥物)之前藥活化酶之本發明的抗TAT226抗體。此等免疫接合物適用於抗體依賴性酶介導之前藥療法("ADEPT")。可接合至本發明之抗TAT226抗體之酶包括(但不限於)鹼性磷酸酯酶，其適用於將含有磷酸酯之前藥轉化為游離藥物；芳基硫酸酯酶，其適用於將含有硫酸酯之前藥轉化為游離藥物；胞嘧啶去胺酶，其適用於將非毒性5－氟基胞嘧啶轉化為抗癌藥物5－氟尿嘧啶；蛋白酶，諸如沙雷氏菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶及組織蛋白酶(諸如組織蛋白酶B及L)，其適用於將含肽前藥轉化為游離藥物；D－丙胺醯基羧肽酶，其適用於轉化含有D－胺基酸取代基之前藥；碳水化合物－裂解酶，諸如β－半乳糖苷酶及神經胺糖酸苷酶，其適用於將糖基化前藥轉化為游離藥物；β－內醯胺酶，其適用於將以β－內醯胺衍生之藥物轉化為游離藥物；及盤尼西林醯胺酶(penicillin amidase)，諸如盤尼西林V醯胺酶及盤尼西林G醯胺酶，其適用於將以苯氧基乙醯基或苯基乙醯基於其胺氮處衍生之藥物分別轉化為游離藥物。可藉由此項技術中所熟知之重組DNA技術將酶共價結合至本發明之抗TAT226抗體。參見例如Neuberger等人，Nature 312：604－608(1984)。
d)載藥率 載藥率以p表示，其為式I分子中每抗體之藥物部分的平均數。載藥率可在每抗體1至20個藥物部分(D)之範圍內。式I之ADC包括與大量藥物部分(1至20個)接合之抗體集合。由接合反應製備ADC中每抗體之藥物部分的平均數可由諸如質譜分析、ELISA檢定及HPLC之習知方式來表徵。亦可根據p確定ADC之定量分佈。在一些情況下，可藉由諸如逆相HPLC或電泳之方式達成均質ADC(其中p為特定值)自具有其他載藥率之ADC的分離、純化及表徵。
對於一些抗體－藥物接合物而言，p可受抗體上之連接位點數之限制。舉例而言，如在上文例示性實施例中，當連接為半胱胺酸硫醇時，抗體可僅具有一或若干個半胱胺酸硫醇基，或可僅具有一或若干個經由其可連接連接子之充分反應性硫醇基。在某些實施例中，例如p>5之較高載藥率可引起某些抗體－藥物接合物之聚集、不溶、毒性或細胞滲透性損失。在某些實施例中，本發明之ADC之載藥率在1至約8、約2至約6或約3至約5之範圍內。事實上，已證實對於特定ADC而言，每抗體藥物部分之最佳比率可小於8且可為約2至約5。參見US 2005－0238649 A1。
在某些實施例中，小於理論最大值之藥物部分在接合反應期間接合至抗體。如下文所述，抗體可含有例如不與藥物－連接子中間物或連接子試劑反應之離胺酸殘基。一般而言，抗體不含有許多可連接至藥物部分之游離及反應性半胱胺酸硫醇基；事實上，抗體中之大部分半胱胺酸硫醇殘基以二硫橋之形式存在。在某些實施例中，抗體可於部分或完全還原條件下經諸如二硫蘇糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)之還原劑還原以產生反應性半胱胺酸硫醇基。在某些實施例中，抗體經受變性條件以暴露諸如離胺酸或半胱胺酸之反應性親核基團。
ADC之載率(藥物/抗體比率)可以不同方式控制：例如藉由：(i)限制藥物－連接子中間物或連接子試劑相對於抗體莫耳過量；(ii)限制接合反應時間或溫度；及(iii)部分或限制半胱胺酸硫醇改質之還原條件。
應瞭解，當一個以上之親核性基團與藥物－連接子中間物或連接子試劑反應，繼而與藥物部分試劑反應時，則所得產物為具有一或多個藥物部分連接至抗體之分佈的ADC化合物之混合物。可藉由雙重ELISA抗體檢定由混合物計算每抗體之藥物平均數，該平均數特異於抗體且特異於藥物。個別ADC分子可藉由質譜分析而於混合物中識別且藉由例如疏水性相互作用層析之HPLC分離(參見例如Hamblett,K.J.等人"Effect of drug loading on the pharmacology,pharmacokinetics,and toxicity of an anti－CD30 antibody－drug conjugate,"文摘號624,American Association for Cancer Research,2004 Annual Meeting,2004年3月27－31日，Proceedings of the AACR，第45卷，2004年3月；Alley,S.C.等人"Controlling the location of drug attachment in antibody－drug conjugates,"文摘號627,American Association for Cancer Research,2004 Annual Meeting,2004年3月27－31日，Proceedings of the AACR，第45卷，2004年3月)。在某些實施例中，可藉由電泳或層析將具有單一載率值之均質ADC自接合混合物分離。
e)製備免疫接合物之特定方法 式I之ADC可藉由採用彼等熟習此項技術者已知之有機化學反應、條件及試劑之若干途徑來製備，包括：(1)抗體之親核性基團與二價連接子試劑反應以經由共價鍵形成Ab－L，繼而與藥物部分D反應；及(2)藥物部分之親核性基團與二價連接子試劑反應以經由共價鍵形成D－L，繼而與抗體之親核性基團反應。經由後一途徑製備式I之ADC之例示性方法描述於以引用的方式明確併入本文之US 2005－0238649 A1中。
抗體之親核性基團包括(但不限於)：(i)N端胺基；(ii)側鏈胺基，例如離胺酸；(iii)側鏈硫醇基，例如半胱胺酸及(iv)抗體經糖基化之糖羥基或胺基。胺、硫醇及羥基為親核性的且能夠反應以與包括以下之連接子部分及連接子試劑上之親電子基團形成共價鍵：(i)活性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵甲酸酯及酸鹵化物；(ii)烷基及苄基鹵化物，諸如鹵乙醯胺；(iii)醛類、酮類、羧基及馬來醯亞胺基。特定抗體具有可還原之鏈間二硫鍵，亦即半胱胺酸橋。可藉由經諸如DTT(二硫蘇糖醇)或三羰基乙基膦(TCEP)之還原劑處理而使抗體具有與連接子試劑接合之反應性，以使得抗體完全或部分還原。因此，各半胱胺酸橋在理論上將形成兩個反應性硫醇親核體。可經由例如藉由使離胺酸殘基與2－亞胺基硫雜環戊烷(Traut氏試劑)反應改質離胺酸殘基將額外親核性基團引入抗體中，從而將胺轉化為硫醇。可藉由引入一個、兩個、三個、四個或四個以上半胱胺酸殘基(例如藉由製備包含一或多個非原生半胱胺酸胺基酸殘基之變異抗體)而將反應性硫醇基引入抗體中。
本發明之抗體－藥物接合物亦可藉由抗體上之親電子基團(諸如醛或酮羰基)與連接子試劑或藥物上之親核性基團之間反應而產生。連接子試劑上適用之親核性基團包括(但不限於)：醯肼、肟、胺基、肼、縮胺基硫脲、羧酸肼及芳基醯肼。在一實施例中，抗體經改質以引入能夠與連接子試劑或藥物上之親核性取代基反應之親電子部分。在另一實施例中，糖基化抗體之糖可例如經過碘酸鹽氧化試劑氧化以形成可與連接子試劑或藥物部分之胺基反應之醛基或酮基。所得亞胺Schiff鹼基可形成穩定鍵聯，或可例如經硼氫化物試劑還原以形成穩定胺鍵。在一實施例中，糖基化抗體之碳水化合物部分與半乳糖氧化酶或偏過碘酸鈉之反應可產生可與藥物上之適當基團反應之抗體中的羰(醛及酮)基(Hermanson,Bioconjugate Techniques)。在另一實施例中，含有N端絲胺酸或蘇胺酸殘基之抗體可與偏過碘酸鈉反應，導致產生醛代替第一胺基酸(Geoghegan & Stroh,(1992)Bioconjugate Chem .3：138－146；US 5362852)。此醛可與藥物部分或連接子親核體反應。
藥物部分上之親核性基團包括(但不限於)：能夠反應以與連接子部分及連接子試劑上之親電子基團形成共價鍵之胺、硫醇、羥基、醯肼、肟、肼、縮胺基硫脲、羧酸肼及芳基醯肼基，該等連接子部分及連接子試劑包括：(i)活性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵甲酸酯及酸鹵化物；(ii)烷基及苄基鹵化物，諸如鹵乙醯胺；(iii)醛類、酮類、羧基及馬來醯亞胺基。
本發明之化合物明確涵蓋(但不限於)由以下交聯試劑製備之ADC：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC－SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基－EMCS、磺基－GMBS、磺基－KMUS、磺基－MBS、磺基－SIAB、磺基－SMCC及磺基－SMPB及SVSB(琥珀醯亞胺基－(4－乙烯基碸)苯甲酸酯)，其為市售的(例如可購自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A；參見例如2003－2004申請手冊及目錄第467－498頁)。
包含抗體及細胞毒性劑之免疫接合物亦可使用各種雙官能性蛋白偶合劑來製造，諸如N－琥珀醯亞胺基－3－(2－吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)、琥珀醯亞胺基－4－(N－馬來醯亞胺基甲基)環己烷－1－甲酸酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、醯亞胺基酯之雙官能性衍生物(諸如己二醯亞胺二甲酯HCl)、活性酯(諸如辛二酸二琥珀醯亞胺基酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苄醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對重氮苄醯基)－乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6－二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5－二氟－2,4－二硝基苯)。舉例而言，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人，Science 238：1098(1987)中所述來製備。經碳－14標記之1－異硫氰基苄基－3－甲基二乙烯三胺戊乙酸(MX－DTPA)為用於將放射性核苷酸接合至抗體之例示性螯合劑。參見WO 94/11026。
或者，可例如藉由重組技術或肽合成來製造包含抗體及細胞毒性劑之融合蛋白。重組DNA分子可包含編碼抗體之區域及彼此相鄰或由不破壞接合物所需特性之編碼連接子肽之區域分離之接合物的細胞毒性部分。
在又一實施例中，可將抗體接合至"受體"(諸如抗生蛋白鏈菌素)以用於腫瘤預靶向中，其中將抗體－受體接合物投予患者，繼而使用清除劑將未結合之接合物自循環移除且接著投予接合至細胞毒性劑(例如放射性核苷酸)之"配位體"(例如抗生物素蛋白)。
D.醫藥調配物
在一態樣中，本發明進一步提供包含至少一種本發明之抗TAT226抗體及/或其至少一種免疫接合物之醫藥調配物。在一些實施例中，醫藥調配物包含1)抗TAT226抗體及/或其免疫接合物，及2)醫藥學上可接受之載劑。在一些實施例中，醫藥調配物包含1)抗TAT226抗體及/或其免疫接合物，及視情況之2)至少一種其他治療劑。其他治療劑包括(但不限於)於下文E.2部分中所述之彼等。
包含本發明之抗體或免疫接合物之醫藥調配物係藉由將具有所需純度之抗體或免疫接合物與可選之生理學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences 第16版，Osol,A.編(1980))混合而以水溶液或凍乾或其他乾燥調配物形式製備以供儲存。所採用劑量及濃度之可接受之載劑、賦形劑或穩定劑對受體而言為非毒性的且其包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽、組胺酸及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八基二甲基苄基氯化銨、氯化六羥季銨、氯化苯甲烴銨、苄索氯銨)；酚、丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3－戊醇及間甲酚；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；形成鹽之抗衡離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn－蛋白錯合物)及/或非離子性界面活性劑，諸如TWEENTM 、PLURONICSTM 或聚乙二醇(PEG)。待用於活體內投藥之醫藥調配物一般為無菌的。此易於藉由經無菌過濾膜過濾來完成。
在膠狀藥物傳遞系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)或在巨乳液中，活性成份亦可俘獲於例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合所製備之微囊中，例如分別為羥甲基纖維素或明膠－微囊及聚－(甲基丙烯酸甲酯)微囊。此等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences第 16版，Osol,A.編(1980)中。
可製備持續釋放型製劑。持續釋放型製劑之合適實例包括含有本發明之抗體或免疫接合物之固體疏水性聚合物的半透性基質，該等基質為成形物品之形式，例如薄膜或微囊。持續釋放型基質之實例包括聚酯；水凝膠(例如，聚(2－羥乙基－甲基丙烯酸脂)或聚(乙烯醇))；聚乳酸交酯(美國專利第3,773,919號)；L－麩胺酸與γ乙基－L－麩胺酸酯之共聚物；不可降解之乙烯－乙酸乙烯酯；不可降解之乳酸－乙醇酸共聚物，諸如LUPRON DEPOTTM (由乳酸－乙醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林組成之可注射微球體)；及聚－D－(－)－3－羥基丁酸。儘管諸如乙烯－乙酸乙烯酯及乳酸－乙醇酸之聚合物使得分子可釋放100天以上，但某些水凝膠仍釋放蛋白歷時較短時期。當經囊封之抗體或免疫接合物在體內保持較長時間時，其可因在37℃下暴露於水份而變性或凝集，導致生物活性損失及可能之免疫原性變化。可視所涉及之機制設計用於穩定作用之合理策略。舉例而言，若發現凝集機制為經由硫－二硫鍵互換之分子間S－S鍵形成，則可藉由改質硫氫基殘基，自酸性溶液凍乾，控制水份含量，使用適當添加劑且研發特異性聚合物基質組合物來達成穩定作用。
E.使用抗TAT226抗體及免疫接合物之方法
1.診斷方法及偵測方法 在一態樣中，本發明之抗TAT226抗體及免疫接合物適用於偵測生物樣本中TAT226之存在。如本文所用之術語"偵測"涵蓋定量或定性偵測。在某些實施例中，生物樣本包含細胞或組織，諸如圖13中列出之組織。在某些實施例中，此等組織包括以相對於其他組織而言較高之程度表現TAT226之正常及/或癌組織，例如卵巢、腎、腦、子宮內膜、腎上腺、骨骼、肺、皮膚及軟組織。
在一態樣中，本發明提供一種偵測生物樣本中TAT226存在之方法。在某些實施例中，該方法包含在容許將抗TAT226抗體結合至TAT226之條件下使生物樣本與抗TAT226抗體接觸，且偵測在抗TAT226抗體與TAT226之間是否形成複合物。
在一態樣中，本發明提供一種診斷與TAT226之表現增加相關聯之病症的方法。在某些實施例中，該方法包含使測試細胞與抗TAT226抗體接觸；藉由偵測抗TAT226抗體與TAT226之結合確定測試細胞對TAT226之表現程度(定量或定性)；且比較測試細胞對TAT226之表現程度與對照細胞對TAT226之表現程度(對照細胞例如為與測試細胞相同組織來源之正常細胞，或以可與此正常細胞相比之程度表現TAT226之細胞)，其中與對照細胞相比測試細胞對TAT226之較高表現程度表示存在與增加之TAT226表現相關聯之病症。在某些實施例中，測試細胞獲自懷疑患有與TAT226之增加表現相關聯之病症的個體。在某些實施例中，該病症為細胞增殖性病症，諸如癌症或腫瘤。
可使用本發明之抗體診斷之例示性細胞增殖性病症包括癌症病況，諸如腫瘤，例如癌瘤(上皮腫瘤)及母細胞瘤(胚胎組織衍生之腫瘤)；且在某些實施例中為卵巢癌、子宮癌(包括子宮內膜癌)及腎癌，包括腎胚細胞瘤(例如威爾姆氏腫瘤)。詳言之，卵巢癌涵蓋自卵巢衍生之惡性腫瘤的異質群。大約90%之惡性卵巢腫瘤為上皮來源的；其餘為生殖細胞腫瘤及基質腫瘤。上皮卵巢腫瘤分為以下組織學亞型：漿液性腺癌(佔上皮卵巢腫瘤之約50%)；子宮內膜樣腺癌(約20%)；黏液性腺癌(約10%)；透明細胞癌(約5－10%)；布倫納氏(Brenner)(移行細胞)腫瘤(相對不常見)。第六種最常見之女性癌症卵巢癌之預後通常較差，其中五年存活率在5－30%之範圍內。關於卵巢癌之論述參見Fox等人(2002)"Pathology of epithelial ovarian cancer,"在Ovarian Cancer 第9章(Jacobs等人編，Oxford University Press,New York)中；Morin等人(2001)"Ovarian Cancer"在Encyclopedic Reference of Cancer ，第654－656頁(Schwab編，Springer－Verlag,New York)中。本發明涵蓋診斷或治療上述任何上皮卵巢腫瘤亞型(且詳言之為漿液性腺癌亞型)之方法。
在某些實施例中，諸如上述彼等之診斷或偵測方法包含偵測抗TAT226抗體與於細胞表面上表現或在自其表面上表現TAT226之細胞獲得之膜製劑中表現之TAT226的結合。在某些實施例中，該方法包含在容許將抗TAT226抗體結合至TAT226之條件下使細胞與抗TAT226抗體接觸，且偵測在抗TAT226抗體與細胞表面上之TAT226之間是否形成複合物。用於偵測抗TAT226抗體與於細胞表面上表現TAT226之TAT226之結合的例示性檢定為"FACS"檢定，諸如下文實例D中所述者。
某些其他方法可用以偵測抗TAT226抗體與TAT226之結合。此等方法包括(但不限於)此項技術中所熟知之抗原結合檢定，諸如西方墨點法、放射性免疫檢定、ELISA(酶聯免疫吸附檢定)、"夾層"免疫檢定、免疫沉澱檢定、螢光免疫檢定、蛋白A免疫檢定及免疫組織化學(IHC)。
在某些實施例中，抗TAT226抗體為經標記的。標記包括(但不限於)經直接偵測之標記或部分(諸如螢光標記、發色標記、電子緻密標記、化學發光標記及放射性標記)以及例如經由酶促反應或分子相互作用間接偵測之部分，諸如酶或配位體。例示性標記包括(但不限於)放射性同位素32 P、14 C、125 I、3 H及131 I；螢光團，諸如稀土螯合劑或螢光素及其衍生物、若丹明(rhodamine)及其衍生物、丹醯基、繖酮、螢光素酶(例如螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶(美國專利第4,737,456號))、螢光素；2,3－二氫酞嗪二酮；辣根過氧化物酶(HRP)；鹼性磷酸酶；β－半乳糖苷酶；葡萄糖澱粉酶；溶菌酶；醣氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖－6－磷酸鹽脫氫酶)；雜環氧化酶，諸如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶，其與採用過氧化氫以氧化染料前驅體之酶(諸如HRP、乳過氧化物酶或微過氧化物酶)偶合；生物素/抗生物素蛋白；自旋標記、噬菌體標記、穩定自由基及其類似物。
在某些實施例中，抗TAT226抗體固定於不溶性基質上。固定需要將抗TAT226抗體自在溶液中保持游離之任何TAT226分離。其習知係藉由在檢定程序之前如藉由吸附至水不溶性基質或表面(Bennich等人，U.S.3,720,760)或藉由共價偶合(例如使用戊二醛交聯)使抗TAT226抗體不溶，或藉由在抗TAT226抗體與TAT226之間形成複合物之後例如藉由免疫沉澱使抗TAT226抗體不溶來完成。
任何上述診斷或偵測實施例均可使用代替抗TAT226抗體或除抗TAT226抗體以外之本發明之免疫接合物來進行。
2.治療方法 例如，本發明之抗體或免疫接合物可用於活體外、離體及活體內治療方法中。在一態樣中，本發明提供活體內或活體外抑制細胞生長或增殖之方法，該方法包含在容許將免疫接合物結合至TAT226之條件下，將細胞暴露於抗TAT226抗體或其免疫接合物。"抑制細胞生長或增殖"意謂將細胞生長或增殖減低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%，且包括誘導細胞死亡。在某些實施例中，細胞為腫瘤細胞。在某些實施例中，細胞為卵巢腫瘤細胞、子宮腫瘤細胞、腦腫瘤細胞或腎腫瘤細胞。在某些實施例中，例如本文所例示，細胞為異種移植物。
在一態樣中，將本發明之抗體或免疫接合物用以治療或預防細胞增殖性病症。在某些實施例中，細胞增殖性病症與TAT226之增加表現及/或活性相關聯。舉例而言，在某些實施例中，細胞增殖性病症與TAT226於細胞表面上增加之表現相關聯。在某些實施例中，細胞增殖性病症為腫瘤或癌症。欲以本發明之抗體或免疫接合物治療之細胞增殖性病症的實例包括(但不限於)癌性病況，諸如腫瘤，例如癌瘤(上皮腫瘤)及母細胞瘤(由胚胎組織衍生之腫瘤)且在某些實施例中為卵巢癌；子宮癌，包括子宮內膜癌；腦腫瘤(例如，星形細胞瘤，涵蓋晚期神經膠質瘤，亦稱作多形性膠質母細胞瘤)；及腎癌，包括腎胚細胞瘤(例如威爾姆氏腫瘤)。
在一態樣中，本發明提供用於治療細胞增殖性病症之方法，其包含向個體投予有效量之抗TAT226抗體或其免疫接合物。在某些實施例中，治療細胞增殖性病症之方法包含向個體投予有效量之醫藥調配物，該醫藥調配物包含抗TAT226抗體及視情況之至少一種其他治療劑，諸如下文提供之彼等。在某些實施例中，治療細胞增殖性病症之方法包含向個體投予有效量之醫藥調配物，該醫藥調配物包含1)包含抗TAT226抗體及細胞毒性劑之免疫接合物；及視情況之2)至少一種其他治療劑，諸如下文提供之彼等。
在一態樣中，至少一些本發明之抗體或免疫接合物可結合來自除人類以外之物種的TAT226。因此，本發明之抗體或免疫接合物可用以例如在含有TAT226之細胞培養物中，於人類體內或於具有與本發明之抗體或免疫接合物交叉反應之TAT226的其他哺乳動物(例如黑猩猩、狒狒、狨猿、食蟹猴及獼猴、豬或小鼠)體內結合TAT226。在一實施例中，抗TAT226抗體或免疫接合物可用於藉由使抗體或免疫接合物與TAT226接觸以使得抑制TAT226活性來抑制TAT226活性。在一實施例中，TAT226為人類TAT226。
在一實施例中，抗TAT226抗體或免疫接合物可用於在患有與增加之TAT226表現及/或活性相關聯之病症的個體中結合TAT226的方法中，該方法包含向個體投予抗體或免疫接合物，以便結合個體中之TAT226。在一實施例中，TAT226為人類TAT226，且個體為人類個體。或者，個體可為結合抗TAT226抗體之表現TAT226的哺乳動物。此外，個體可為其中引入TAT226(例如藉由投予TAT226或藉由表現編碼TAT226之轉殖基因)之哺乳動物。
可因治療目的向人類投予抗TAT226抗體或免疫接合物。此外，可因獸醫學目的或作為人類疾病之動物模型向表現與抗體交叉反應之TAT226之非人類哺乳動物(例如靈長類動物、豬、大鼠或小鼠)投予抗TAT226抗體或免疫接合物。關於後者，此等動物模型可適用於評估本發明之抗體或免疫接合物之治療功效(例如測試投藥之劑量及時程)。
本發明之抗體或免疫接合物在治療中可單獨或與其他組合物組合使用。舉例而言，本發明之抗體或免疫接合物可與至少一種其他治療劑及/或佐劑共投予。在某些實施例中，其他治療劑為細胞毒性劑、化療劑或生長抑制劑。在此等實施例之一中，化療劑為用於治療卵巢癌之藥劑或藥劑組合，諸如鉑化合物(例如順鉑或卡波鉑)；紫杉烷(例如紫杉醇或多烯紫杉醇)；拓朴替康；蒽環黴素(例如多柔比星(ADRIAMYCIN)或脂質多柔比星(DOXIL)；吉西他濱；環磷醯胺；長春瑞濱(NAVELBINE)；六甲蜜胺；異環磷醯胺及依託泊苷。在此等實施例之另一者中，化療劑為用於治療子宮癌或子宮內膜癌之藥劑或藥劑組合，諸如順鉑、卡波鉑、多柔比星、紫杉醇、甲胺喋呤、氟尿嘧啶及甲羥孕酮。在此等實施例之另一者中，化療劑為用於治療腦腫瘤之藥劑或藥劑組合，諸如亞硝基脲(例如卡莫司汀或洛莫司汀)；細胞毒性劑(例如伊立替康或替莫唑胺(temozolamide))；抗血管生成劑(例如沙立度胺、TNP－470、血小板因子4、干擾素及內皮抑制素)；分化劑(例如類視色素、苯基丁酸酯、苯基乙酸酯及抗新普拉通(anti－neoplaston))；抗侵入劑(例如基質金屬蛋白酶抑制劑，諸如馬立馬司他(marimastat))；信號轉導調節劑(例如他莫昔芬、苔蘚抑素及O－6苄基鳥嘌呤)；拓樸異構酶抑制劑(例如伊立替康或拓朴替康)及生長因子抑制劑(例如酪胺酸激酶抑制劑)。在此等實施例之另一者中，化療劑為用於治療腎癌(例如威爾姆氏腫瘤)之藥劑或藥劑組合，諸如長春新鹼、放射菌素D、阿黴素(adriamycin)、多柔比星、環磷醯胺、異環磷醯胺、依託泊苷及卡波鉑。在某些實施例中，本發明之抗體可與消炎劑及/或防腐劑組合。
上述此等組合療法涵蓋組合投予(其中在相同或獨立調配物中包括兩種或兩種以上治療劑)及獨立投予，在該情況下，本發明之抗體或免疫接合物之投予可於投予其他治療劑及/或佐劑之前、同時及/或之後發生。本發明之抗體或免疫接合物亦可與放射療法組合使用。
本發明之抗體或免疫接合物(及任何其他治療劑或佐劑)可藉由任何合適之方式投予，包括非經腸、皮下、腹膜內、肺內及鼻內投予，且若需要局部治療，則病灶內投予。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投予。此外，抗體或免疫接合物係藉由尤其以降低之抗體或免疫接合物劑量脈動式輸注(pulse infusion)而合適地投予。部分視短暫或長期投藥而定，可藉由任何合適途徑給藥，例如藉由注射，諸如靜脈內或皮下注射。
當結合靶位於腦中時，本發明之某些實施例提供抗體或免疫接合物以橫穿血腦障壁。存在若干此項技術中已知之方式以轉運分子橫穿血腦障壁，包括(但不限於)物理方法、基於脂質之方法、基於幹細胞之方法及基於受體及通道之方法。
轉運抗體或免疫接合物橫穿血腦障壁之物理方法包括(但不限於)完全包圍血腦障壁或藉由在血腦障壁上產生開口。包圍法包括(但不限於)直接向腦中注射(參見例如Papanastassiou等人，Gene Therapy 9：398－406(2002))；間質輸注/對流增強型傳遞(參見例如Bobo等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：2076－2080(1994))及於腦內植入傳遞裝置(參見例如Gill等人，Nature Med .9：589－595(2003)；及Gliadel WafersTM ,Guildford Pharmaceutical)。於障壁中產生開口之方法包括(但不限於)超音(參見例如美國專利公開案第2002/0038086號)；滲透壓(例如藉由投予高滲性甘露糖醇)(Neuwelt,E.A.,Implication of the Blood－Brain Barrier and its Manipulation ，第1&2卷，Plenum Press,N.Y.(1989))；藉由例如緩激肽或滲透劑A－7滲透(參見例如美國專利第5,112,596號、第5,268,164號、第5,506,206號及第5,686,416號)及以含有編碼抗體之基因之載體轉染跨越血腦障壁之神經元(參見例如美國專利公開案第2003/0083299號)。
轉運抗體或免疫接合物橫穿血腦障壁之基於脂質之方法包括(但不限於)將抗體或免疫接合物囊封於偶合至與血腦障壁之血管內皮上之受體結合之抗體結合片段的脂質體中(例如參見美國專利申請公開案第20020025313號)且以低密度脂蛋白顆粒(參見例如美國專利申請公開案第20040204354號)或脂蛋白元E(參見例如美國專利申請公開案第20040131692號)塗覆抗體或免疫接合物。
轉運抗體或免疫接合物橫穿血腦障壁之基於幹細胞之方法需要基因工程設計神經祖細胞(NPC)以表現所關注之抗體或免疫接合物且接著將幹細胞植入待治療個體之腦中。參見Behrstock等人(2005)Gene Ther .2005年12月15日高級線上公開案(報導當植入齧齒動物及靈長類動物模型之腦中時，NPC經基因工程設計以表現帕金森病(Parkinson disease)之神經營養因子GDNF降低之症狀)。
轉運抗體或免疫接合物橫穿血腦障壁之基於受體及通道之方法包括(但不限於)使用糖皮質激素阻斷劑以增加血腦障壁之滲透性(參見例如美國專利申請公開案第2002/0065259號、第2003/0162695號及第2005/0124533號)；活化鉀通道(參見例如美國專利申請公開案第2005/0089473號)；抑制ABC藥物轉運體(參見例如美國專利申請公開案第2003/0073713號)；以轉鐵蛋白塗覆抗體或免疫接合物且調節一或多種轉鐵蛋白受體之活性(參見例如美國專利申請公開案第2003/0129186號)且使抗體或免疫接合物陽離子化(參見例如美國專利第5,004,697號)。
本發明之抗體或免疫接合物將以與優良藥學實踐一致之方式調配、給藥及投予。在此上下文中考慮之因素包括治療之特定病症、治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病況、病症誘因、藥劑傳遞部位、投藥方法、投藥時程及醫學實踐者已知之其他因素。抗體或免疫接合物無需(但視情況)與目前用以預防或治療所論及病症之一或多種藥劑調配。此等其他藥劑之有效量視調配物中所存在之抗體或免疫接合物之量、病症或治療類型及上述其他因素而定。其一般係以與上文所述相同之劑量及投藥途徑，或以上文所述之約1至99%之劑量，或以經驗/臨床上確定為適當之任何劑量及任何途徑來使用。
為預防或治療疾病，本發明抗體或免疫接合物之適當劑量(當單獨或與諸如化療劑之一或多種其他額外治療劑組合使用時)將視待治療之疾病類型、抗體或免疫接合物類型、疾病嚴重性及進程、為預防或治療目的是否投予抗體或免疫接合物、先前療法、患者臨床病史及對抗體或免疫接合物之反應及主治醫師之判斷而定。抗體或免疫接合物適合一次性或經一系列治療投予至患者。視疾病類型及嚴重性而定，約1 μg/kg至15 mg/kg(例如0.1 mg/kg－10 mg/kg)之抗體或免疫接合物可為向患者投藥之候選起始劑量，無論例如藉由一或多次獨立投藥或藉由連接輸注。視上述因素而定，一種典型每日劑量可在約1 μg/kg至100 mg/kg或更大之範圍內。對於經若干天或更長時間之重複投藥而言，視病況而定，一般將持續治療直至發生對疾病症狀之所需抑制作用。抗體或免疫接合物之一種例示性劑量在約0.05 mg/kg至約10 mg/kg之範圍內。因此，可向患者投予約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg或10 mg/kg(或其任何組合)之一或多種劑量。此等劑量可例如以每週或每三週間歇性投予(例如，以便患者接收約二至約二十，或例如約六次劑量之抗體或免疫接合物)。可投予較高之起始負載劑量，繼而投予一或多次較低劑量。例示性給藥方案包含投予約4 mg/kg之起始負載劑量，繼而為約2 mg/kg抗體之每週維持劑量。然而，其他給藥方案可適用。此治療進程易於由習知技術及檢定來監控。
3.檢定 本發明之抗TAT226抗體及免疫接合物可藉由此項技術中已知之各種檢定來表徵其物理/化學特性及/或生物活性。
a)活性檢定 在一態樣中，提供識別具有生物活性之抗TAT226抗體或其免疫接合物之檢定。生物活性可包括例如抑制細胞生長或增殖之能力(例如"細胞殺死"活性)或誘導細胞死亡，包括漸進式細胞死亡(細胞凋亡)之能力。亦提供在活體內及/或活體外具有此生物活性之抗體或免疫接合物。
在某些實施例中，測試抗TAT226抗體或其免疫接合物於活體外抑制細胞生長或增殖之能力。此項技術中熟知用於抑制細胞生長或增殖之檢定。以本文所述之"細胞殺死"檢定例示之用於細胞增殖的特定檢定量測細胞生存力。一種此檢定為可購自Promega(Madison,WI)之CellTiter－GloTM 發光細胞生存力檢定。彼檢定基於對所存在ATP之定量來測定培養物中可生存細胞之數量，其為對代謝活性細胞之指示。參見Crouch等人(1993)J.Immunol.Meth .160：81－88，美國專利第6602677號。該檢定可以96或384孔格式進行，使其受到自動高產量篩檢(HTS)之影響。參見Cree等人(1995)AntiCancer Drugs 6：398－404。檢定程序包括將單一試劑(CellTiter－Glo試劑)直接添加至經培養細胞中。此導致細胞溶解且產生由螢光素酶反應所產生之發光信號。發光信號與所存在ATP之量成比例，所存在ATP之量直接與培養物中所存在之可生存細胞的數量成比例。可藉由光度計或CCD攝影成像裝置記錄資料。將發光輸出表示為相對光單位(RLU)。
另一種細胞增殖檢定為"MTT"檢定，其為量測由粒線體還原酶將溴化3－(4,5－二甲基噻唑－2－基)－2,5－二苯基四唑鹽氧化為甲臢之比色檢定。如同CellTiter－GloTM 檢定，此檢定指示細胞培養物中所存在之代謝活性細胞的數量。參見例如Mosmann(1983)J.Immunol.Meth .65：55－63及Zhang等人(2005)Cancer Res .65：3877－3882。
在一態樣中，測試抗TAT226抗體活體外誘導細胞死亡之能力。此項技術中熟知誘導細胞死亡之檢定。在一些實施例中，此等檢定量測例如由碘化丙錠(PI)、錐蟲藍(參見Moore等人(1995)Cytotechnology ,17：1－11)或7AAD吸收所指示之膜完整性損失。在例示性PI吸收檢定中，將細胞培養於補充以10%熱失活FBS(Hyclone)及2 mM L－麩醯胺酸之杜貝科氏經改質伊格培養基(D－MEM)：Ham氏F－12(50：50)中。因此，在不存在補體及免疫效應細胞之情況下進行此檢定。將細胞以每盤3×106 之密度接種於100×20 mm之盤中且使得隔夜附著。將培養基移除且以單獨之新鮮培養基或含有各種濃度之抗體或免疫接合物之培養基替換。將細胞培育3天之時期。處理之後，將單層以PBS洗滌且藉由胰蛋白酶作用分離。接著將細胞於4℃下以1200 rpm離心5分鐘，將離心塊再懸浮於3 ml冷Ca2＋ 結合緩衝劑(10 mM Hepes，pH 7.4，140 mM NaCl，2.5 mM CaCl2 )中且等分入以35 mm濾網覆蓋之12×75 mm管中(每管1 ml，每處理組3支管)以移除細胞塊。接著使管接收PI(10 μg/ml)。使用FACSCANTM 流式細胞儀及FACSCONVERTTM CellQuest軟體(Becton Dickinson)分析樣本。因此識別如由PI吸收測定之誘導統計學上顯著程度之細胞死亡的抗體或免疫接合物。
在一態樣中，測試抗TAT226抗體或免疫接合物活體外誘導細胞凋亡(漸進式細胞死亡)之能力。用於誘導細胞凋亡之抗體或免疫接合物之例示性檢定為膜聯蛋白結合檢定。在例示性膜聯蛋白結合檢定中，將細胞如前段所述於盤中培養且接種。將培養基移除且以單獨之新鮮培養基或含有0.001至10 μg/ml抗體或免疫接合物之培養基替換。三天培育期之後，將單層以PBS洗滌且藉由胰蛋白酶作用分離。接著如前段所述將細胞離心，再懸浮於Ca2＋ 結合緩衝劑中且等分入管中。接著使管接收經標記之膜聯蛋白(例如膜聯蛋白V－FITC)(1 μg/ml)。使用FACSCANTM 流式細胞儀及FACSCON VERTTM CellQuest軟體(BD Biosciences)分析樣本。因此，識別相對於對照組而言誘導統計學上顯著程度之膜聯蛋白結合之抗體或免疫接合物。誘導細胞凋亡之抗體或免疫接合物的另一種例示性檢定為用於偵測染色體組DNA之核小體間降解之組蛋白DNA ELISA比色檢定。可使用例如細胞死亡偵測ELISA套組(Roche,Palo Alto,CA)來進行此檢定。
用於上述任何活體外檢定之細胞包括天然表現TAT226或已經工程設計以表現TAT226之細胞或細胞株。此等細胞包括相對於相同組織來源之正常細胞過度表現TAT226之腫瘤細胞。此等細胞亦包括表現TAT226之細胞株(包括腫瘤細胞株)及非正常表現TAT226而已經編碼TAT226之核酸轉染之細胞株。本文所提供之用於上述任何活體外檢定之例示性細胞株包括表現TAT226之OVCAR3人類卵巢癌細胞株及經編碼TAT226之核酸轉染之HCT116人類結腸癌細胞株。
在一態樣中，測試抗TAT226抗體或其免疫接合物活體內抑制細胞生長或增殖之能力。在某些實施例中，測試抗TAT226抗體或其免疫接合物活體內抑制腫瘤生長之能力。活體內模型系統(諸如異種移植物模型)可用於此測試。在例示性異種移植物系統中，可將人類腫瘤細胞引入例如無胸腺"裸"小鼠之適當免疫功能不足之非人類動物體內。可將本發明之抗體或免疫接合物投予動物。量測抗體或免疫接合物抑制或減低腫瘤生長之能力。在以上異種移植物系統之某些實施例中，人類腫瘤細胞為來自人類患者之腫瘤細胞。此等異種移植物模型可購自Oncotest GmbH(Frieberg,Germany)。在某些實施例中，如本文所例示，人類腫瘤細胞為來自人類腫瘤細胞株之細胞，諸如OVCAR3細胞。在某些實施例中，藉由皮下注射或藉由移植入合適部位(諸如乳腺脂肪墊)將人類腫瘤細胞引入適當免疫功能不足的非人類動物體內。
b)結合檢定及其他檢定 在一態樣中，測試抗TAT226抗體之抗原結合活性。舉例而言，在某些實施例中，測試抗TAT226抗體與於細胞表面上表現之TAT226結合之能力。諸如實例D中所述之FACS檢定可用於此測試。
在一態樣中，競爭檢定可用以識別與YWO.32、YWO.49、YWO.49.B7、YWO.49.C9、YWO.49.H2或YWO.49.H6競爭結合TAT226之單株抗體。在某些實施例中，此競爭抗體結合至由YWO.32、YWO.49、YWO.49.B7、YWO.49.C9、YWO.49.H2或YWO.49.H6結合之相同抗原決定基(例如線性或構形抗原決定基)。例示性競爭檢定包括(但不限於)諸如Harlow及Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual 第14章(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)中所提供之彼等常規檢定。繪製結合抗體之抗原決定基的詳細例示性方法係於Methods in Molecular Biology 第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)中之Morris(1996)"Epitope Mapping Protocols"中提供。據稱若兩種抗體各自阻斷另一者50%或更多之結合，則二者均結合至相同抗原決定基。
在例示性競爭檢定中，於包含結合至TAT226之第一經標記抗體(例如YWO.32、YWO.49、YWO.49.B7、YWO.49.C9、YWO.49.H2或YWO.49.H6)及經測試其與第一抗體競爭結合TAT226之能力之第二未經標記抗體的溶液中培育固定TAT226。第二抗體可存在於融合瘤上清液中。作為對照組，於包含第一經標記抗體但不包含第二未經標記抗體之溶液中培育固定TAT226。於容許第一抗體結合至TAT226之條件下培育後，移除過量未結合之抗體且量測與固定TAT226相關聯之標記量。若測試樣本中與固定TAT226相關聯之標記量相對於對照樣本大體上降低，則其表示第二抗體與第一抗體競爭結合至TAT226。在某些實施例中，固定TAT226存在於細胞表面上或存在於自於其表面表現TAT226之細胞所獲得之膜製劑中。
在一態樣中，經純化抗TAT226抗體可由一系列檢定進一步表徵，該等檢定包括(但不限於)N端定序、胺基酸分析、非變性尺寸排阻高壓液相層析(HPLC)、質譜分析、離子交換層析及番木瓜酶消化。
在一實施例中，本發明涵蓋具有一些而非所有效應功能之經改變抗體，此使其在抗體之活體內半衰期為重要的，而某些效應功能(諸如補體及ADCC)為非必需或有害之諸多應用中為理想候選物。在某些實施例中，量測抗體之Fc活性以確保僅保持所需特性。可進行活體外及/或活體內細胞毒性檢定以確認降低/耗盡CDC及/或ADCC活性。舉例而言，可進行Fc受體(FcR)結合檢定以確保抗體缺少FcγR結合(因此可能缺少ADCC活性)，但保持FcRn結合能力。用於介導ADCC之初級細胞，即NK細胞僅表現FcλRIII，而單核細胞表現FcλRI、FcλRII及FcλRIII。造血細胞上之FcR表現係概述於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol 9：457－92(1991)第464頁之表3中。評估所關注分子之ADCC活性之活體外檢定的實例描述於美國專利第5,500,362號或第5,821,337號中。適用於此等檢定之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及天然殺死(NK)細胞。或者，或另外，可於活體內，例如於諸如Clynes等人PNAS(USA) 95：652－656(1998)中揭示之動物模型中評估所關注分子之ADCC活性。亦可進行C1q結合檢定以確認抗體不能夠結合C1q且因此缺少CDC活性。為評估補體活化作用，可進行例如Gazzano－Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所述之CDC檢定。亦可使用此項技術中已知之方法進行FcRn結合及活體內清除/半衰期測定。
F.製品
在本發明之另一態樣中，提供含有適用於治療、預防及/或診斷上述病症之物質的製品。製品包含容器及容器上或與容器相關聯之標記或包裝插頁。合適容器包括例如瓶子、小瓶、針筒等。容器可由諸如玻璃或塑料之各種材料形成。該容器固持獨立或與有效治療、預防及/或診斷病況之另一種組合物組合之組合物，且可具有無菌入口(例如容器可為靜脈內溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿之塞子的小瓶)。組合物中至少一種活性劑為本發明之抗體或免疫接合物。標記或包裝插頁指示組合物係用於治療所選擇之病況。此外，製品可包含(a)具有組合物含於其中之第一容器，其中組合物包含本發明之抗體或免疫接合物；及(b)具有組合物含於其中之第二容器，其中組合物包含其他細胞毒性劑或治療劑。本發明之此實施例中之製品可另外包含指示組合物可用以治療特定病況之包裝插頁。或者，或另外，製品可另外包含第二(或第三)容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝劑，諸如注射用抑菌水(BWFI)、經磷酸鹽緩衝之生理食鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。其可進一步包括就商業或使用者觀點而言所需之其他物質，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及針筒。
IV.實例
以下為本發明之方法及組合物之實例。應瞭解，在給定上文提供之一般描述下可實踐各種其他實施例。
A.TAT226基因表現之分析
使用含有基因表現資訊之專屬資料庫(GeneExpress,Gene Logic Inc.,Gaithersburg,MD)分析人類TAT226基因表現。使用微陣列分佈檢視器進行GeneExpress資料庫之圖解分析。圖13為各種組織中TAT226基因表現之圖示，其於左側列出。橫穿圖頂部之刻度指示基於雜交信號強度之基因表現程度。線上方及下方所呈現之點與各自之所列組織相鄰。線上方呈現之點表示正常組織中之基因表現，且線下方呈現之點表示腫瘤或病變組織中之基因表現。圖13展示相對於其正常對應物，腫瘤或病變組織中趨向增加TAT226基因表現。詳言之，TAT226在腫瘤及病變卵巢中相對於正常卵巢展示實質上之過度表現，且在威爾姆氏腫瘤中相對於正常腎展示實質上之過度表現。相對於正常組織在腫瘤或病變組織中展示過度表現之其他組織包括子宮內膜、腎上腺、骨骼、肺、皮膚及軟組織。此外，TAT226於正常腦組織(諸如嗅腦、海馬及基底神經節)中及腫瘤或病變腦組織(諸如神經膠質瘤)中較強表現。
GeneExpress資料庫亦用以分析正常卵巢；正常輸卵管；透明細胞、黏液性及漿液性囊腺癌亞型之卵巢癌；轉移性卵巢癌及其他類型卵巢癌中之人類TAT226基因表現。結果於圖14中圖解報導，其中特定組織類型在圖下方表示。圖中y軸之刻度指示基於雜交信號強度之基因表現程度。漿液性囊腺癌及轉移性卵巢癌相對於正常卵巢展示TAT226之較強過度表現。透明細胞及黏液性亞型展示與正常卵巢相當之表現。正常輸卵管亦展示TAT226之實質性表現。應注意，卵巢癌之漿液性亞型與輸卵管上皮組織極為類似，且卵巢及輸卵管均衍生自相同胚胎組織。參見Fox等人(2002)"Pathology of epithelial ovarian cancer,"於Ovarian Cancer 第9章(Jacobs等人編，Oxford University Press,New York)中。
B.抗TAT226抗體之產生
藉由以包含SEQ ID NO：75之胺基酸1－115及C端聚組胺酸標記之重組"TAT226－His"融合蛋白篩檢噬菌體呈現庫而產生TAT226之抗體。噬菌體呈現庫為使用Fab'－zip－噬菌體系統所產生之合成(Fab')2 庫。參見Lee等人(2004)J.Immunol.Methods 284：119－132。庫包含huMAb4D5－8重鏈可變區(參見圖5A及5B，第二受體"B"，SEQ ID NO：50、51、57、35)與如SEQ ID NO：26所示之固定huMAb4D5－8輕鏈可變區之框架中的重鏈HVR庫。使用噬菌體ELISA針對TAT226－His篩檢使用噬菌體呈現所選擇之純系(參見例如Sidhu等人(2004)J.Mol.Biol .338：299－310)。選擇純系YWO.32及YWO.49用於進一步分析。
為改良YWO.49之親和力，在YWO.49背景中以靶向軟體隨機化之HVR－H3及HVR－L3產生噬菌體呈現庫，其中使指定HVR中所選擇之胺基酸殘基保持恆定，而其他殘基則經受突變。藉由噬菌體ELISA篩檢所選擇之純系。選擇命名為YWO.49.B7、YWO.49.C9、YWO.49.H2及YWO.49.H6之親和力成熟抗體用於進一步分析。如圖9及10所示，確定YWO.32、YWO.49、YWO.49.B7、YWO.49.C9、YWO.49.H2及YWO.49.H6之VH及VL區之核苷酸及經編碼之多肽序列。YWO.32、YWO.49、YWO.49.B7、YWO.49.C9、YWO.49.H2及YWO.49.H6之重鏈及輕鏈HVR序列展示於圖2－4中。衍生自YWO.49、YWO.49.B7、YWO.49.C9、YWO.49.H2及YWO.49.H6之一致HVR－H3及HVR－L3序列亦展示於圖4中。將YWO.49、YWO.49.B7、YWO.49.C9、YWO.49.H2及YWO.49.H6藉由使用重組技術將Fab'片段移植於適當恆定區上而"重排"為全長IgG。使用重排抗體進行下文所述之實驗。
C.重組抗原結合親和力之表徵
藉由使用BIACORE3000系統(Biacore,Inc.,Piscataway,NJ)之表面電漿共振量測確定YWO.49、YWO.49.B7、YWO.49.C9、YWO.49.H2及YWO.49.H6對重組抗原之結合親和力。簡而言之，根據供應商說明，以N －乙基－N' －(3－二甲胺基丙基)－碳化二醯亞胺鹽酸鹽(EDC)及N －羥基琥珀醯亞胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物感應晶片(CM5,BIAcore Inc)。在以每分鐘5 μl之流動速率注射之前，將抗TAT226抗體以pH 4.8之10 mM乙酸鈉稀釋至5 μg/ml以達成大約500個反應單位(RU)之偶合抗體。其次，注射1 M乙醇胺以阻斷未反應之基團。對於動力學量測而言，於25℃下以25 μl/min之流動速率將兩倍連續稀釋之TAT226－His(0.7 nM至500 nM)注射至具有0.05%吐溫20之PBS中。使用簡單一對一朗繆爾結合模型(one－to－one Langmuir binding model)(BIA評估軟體3.2版)計算締合速率(kon )及解離速率(koff )。以koff /kon 之比率計算平衡解離常數(Kd)。此實驗結果展示於下表2中。
D.結合至細胞表面TAT226之抗體的表徵
檢驗抗TAT226抗體結合至在OVCAR3(人類卵巢癌細胞株)表面上所表現之TAT226的能力。在存在及不存在YWO.49、YWO.49.B7、YWO.49.C9、YWO.49.H2或YWO.49.H6下，於OVCAR3細胞上進行螢光活化細胞揀選(FACS)。簡而言之，將經分離細胞以5 μg/ml初級抗體於冰上培育一小時，洗滌且以第二抗體(接合至藻紅素之抗人類IgG)於冰上培育30分鐘。使用FACScanTM 流式細胞儀(BD Biosciences,San Jose,CA)進行FACS。
對YWO.49、YWO.49.H2及YWO.H6之FACS分析結果展示於圖15中。各圖左側之峰值表示"背景"結合，亦即僅二級抗體之結合。各圖右側之峰值表示指定抗TAT226抗體之結合。由FACS可見，YWO.49.B7不顯著結合至OVCAR3，即使其以關於YWO.49及其他親和力成熟抗體所觀測之Kd範圍內(參見上表2中BIACORE分析之結果)之Kd結合至重組抗原。YWO.49.C9之結合可相當於關於YWO.49.H2及YWO.H6所觀測之結合。
E.與細胞表面抗原之結合親和力之表徵
使用競爭檢定檢驗YWO.49.H2及YWO.49.H6對於OVCAR3細胞表面上所表現之TAT226之結合親和力。簡而言之，使經標記(碘化)之YWO.49.H2或YWO.49.H6在未經標記抗體之存在下結合至OVCAR3細胞。根據Munson等人，Anal.Biochem .107：220(1980)中初始描述之斯卡查德分析法(Scatchard analysis methodology)確定抗體之結合親和力。此實驗結果展示於下表3中。
與重組TAT226－His相比，YWO.49.H2及YWO.49.H6對於OVCAR3細胞表面所表現之TAT226的Kd較高(比較表2及3中YWO.49.H2及YWO.49.H6之Kd)，此指示YWO.49.H2及YWO.49.H6以比結合至於OVCAR3細胞表面所表現之TAT226稍微較高之親和力結合至重組TAT226－His。
F. TAT226 mRNA及蛋白表現
使用5'核酸酶(TaqMan)檢定及即時定量PCR分析TAT226 mRNA於OVCAR3細胞及卵巢癌樣本板中之表現。圖16中命名為"HF ####"之卵巢癌樣本為冷凍組織切片。將RNA自組織切片分離，使用Ambion's Message Amp II套組(Ambion,Austin,TX)擴增且逆相轉錄為cDNA。將RNA自OVCAR3細胞分離且逆相轉錄為cDNA。在對擴增產物具有特異性之不可延伸性報導體探針存在下，藉由即時PCR擴增TAT226 cDNA。測定臨限週期或"Ct"(自報導體探針裂解所產生之信號超過背景值之週期)且將其用以計算起始TAT226 mRNA含量。如圖16之條形圖所示，相對於OVCAR3細胞中之TAT226 mRNA含量表示卵巢癌樣本板中之TAT226 mRNA含量。
如下使用免疫組織化學(IHC)分析OVCAR3細胞及上述卵巢癌樣本板中之TAT226蛋白表現。將卵巢癌樣本之組織切片(冷凍或嵌埋有番木瓜酶)固定於丙酮/乙醇中歷時5分鐘。將切片於PBS中洗滌，以抗生物素蛋白及生物素(Vector Laboratories,Inc.,Burlingame,CA)各自阻斷10分鐘且再次於PBS中洗滌。接著將切片以10%血清阻斷20分鐘且洗乾以移除過量血清。接著將初級抗體(YWO.49.H2或YWO.49.H6)以10 μg/ml之濃度添加至切片中歷時1小時。接著將切片以PBS洗滌。將經生物素標記之二級抗人類抗體添加至切片中歷時30分鐘，且接著以PBS洗滌切片。接著將切片暴露於Vector ABC套組(Vector Laboratories,Inc.,Burlingame,CA)之試劑歷時30分鐘且接著於PBS中洗滌。接著將切片暴露於二胺基聯苯胺(Pierce)歷時5分鐘且接著於PBS中洗滌。接著將切片以Mayers蘇木精對比染色，以蓋玻片覆蓋且觀測。除首先將細胞粒化、冷凍且接著切片以外，使用相同實驗方案於OVCAR3細胞上進行IHC。接著使切片經受以上實驗方案。
將結果定性報導於圖16中，表現程度分類為"－"、"＋/－"或"＋"。一般而言，在TAT226 mRNA表現程度與OVCAR3細胞表面上之TAT226蛋白表現之間存在總體相關性。IHC實驗亦確定識別細胞表面上之TAT226之抗體。卵巢癌細胞板中各細胞之組織學亦於圖16中報導，其中縮寫"adenoca."表示"腺癌"。
G.抗TAT226 ADC之產生
藉由將YWO.49.H2及YWO.49.H6接合至以下藥物－連接子部分而產生抗TAT226 ADC：MC－vc－PAB－MMAE、MC－vc－PAB－MMAF及MC－MMAF，其在上文第III部分C.1.b.2中描述。在接合之前，根據WO 2004/010957 A2中所述之方法，使用標準方法將抗體以TCEP部分還原。根據Doronina等人(2003)Nat.Biotechnol .21：778－784及US 2005/0238649 A1中所述之方法，使用標準方法將經部分還原之抗體接合至以上藥物－連接子部分。簡而言之，將經部分還原之抗體與藥物連接子部分組合以使得該等部分與半胱胺酸殘基接合。中止接合反應且純化ADC。藉由HPLC測定各ADC之載藥率(每抗體之藥物部分平均數)，如下：
H.細胞殺死檢定
在以下活體外及活體內細胞殺死檢定中，測試抗體－藥物接合物(ADC)抑制表現TAT226之細胞增殖之能力。
1. OVCAR3活體外細胞殺死檢定 測試YWO.49.H2及YWO.49.H6ADC抑制OVCAR3細胞增殖之能力。將OVCAR3細胞接種於具有20% FBS之RPMI中之96孔板中。如圖17所示，以不同濃度之ADC培育密度為每孔3000個細胞之OVCAR3細胞。將接合至MC－Vc－PAB－MMAE之抗MUC16/CA125抗體用作正性對照。MUC16/CA125為已知卵巢癌抗原。參見例如Yin等人(2001)J.Biol.Chem.276：27371－27375。將接合至MC－vc－PAB－MMAE之抗IL－8抗體用作負性對照。培育5天後，根據製造商說明使用CellTiter－GloTM 發光細胞生存力檢定(Promega,Madison,WI)量測細胞生存力。圖17中y軸上之刻度表示來自螢光素酶發光之相對光單位或"RLU"，其為對於細胞生存力之量測。
圖17展示，類似於正性對照，YWO.49.H2－MC－vc－PAB－MMAF及YWO.49.H6－MC－vc－PAB－MMAF具有顯著細胞殺死活性，尤其在約0.01及0.1 μg/ml之濃度時更是如此。YWO.49.H2－MC－vc－PAB－MMAE及YWO.49.H6－MC－vc－PAB－MMAE亦具有細胞殺死活性，但其程度低於以YWO.49.H2－MC－vc－PAB－MMAF及YWO.49.H6－MC－vc－PAB－MMAF所見之程度。YWO.49.H2－MC－vc－PAB－MMAF及YWO.49.H6－MC－vc－PAB－MMAF之IC50 為約0.005 nM，且YWO.49.H2－MC－vc－PAB－MMAE及YWO.49.H6－MC－vc－PAB－MMAE之IC50 為約0.2 nM。游離MMAE之IC50 為約0.1 nM。YWO.49.H2－MC－MMAF及YWO.49.H6－MC－MMAF在此檢定中不表現顯著之細胞殺死活性。在該特定檢定系統中，應注意由於MMAE及MMAF之總體高濃度，因此在高濃度之ADC(包括負性對照ADC)下，細胞生存力大體上減低。
2.使用經HCT116轉染細胞之活體外細胞殺死檢定 測試YWO.49.H2及YWO.49.H6 ADC抑制經編碼人類TAT226之核苷酸穩定轉染之HCT116細胞(即結腸癌細胞株)增殖的能力。未經轉染之HCT116細胞通常對游離(未接合)MMAE之敏感性比對OVCAR3細胞低約5－6倍。
簡而言之，HCT116細胞經如下轉染。在哺乳動物表現載體pcDNA3.1(Invitrogen,Carlsbad,CA)中建構編碼經抗原決定基標記之人類TAT226的核苷酸。抗原決定基標記由單醇疱疹病毒1型糖蛋白D("gD"標記)之胺基酸1－53組成，其於人類TAT226之N端置換來自胺基酸1－22之信號序列。根據製造商實驗方案，使用Lipofectamine200(Invitrogen)將重組載體轉染至HCT116細胞中。將經轉染之HCT116細胞培養於具有10% FBS及0.4 mg/ml G418之McCoy氏5a培養基中。將細胞使用抗gD抗體染色且藉由FACS揀選以選擇表現重組gD：人類TAT226融合蛋白之個別純系。選擇命名為HCT116#9－4之純系之一以用於進一步分析。
為進行細胞殺死檢定，將HCT116#9－4細胞接種於96孔板中。如圖18所示以不同濃度之ADC培育密度為每孔1000個細胞之HCT116#9－4細胞。將接合至MC－vc－PAB－MMAE之抗gp120抗體用作負性對照。培育3天後，根據製造商說明使用CellTiter－GloTM 發光細胞生存力檢定(Promega,Madison,WI)量測細胞生存力。
圖18展示YWO.49.H2－MC－vc－PAB－MMAF及YWO.49.H6－MC－vc－PAB－MMAF具有顯著細胞殺死活性，尤其在約0.01 μg/ml及高達所測試最高濃度時更是如此。YWO.49.H2－MC－vc－PAB－MMAF及YWO.49.H6－MC－vc－PAB－MMAF之IC50 為約0.05 nM，且游離MMAE之IC50 為約0.9 nM。在此特定檢定中，相對於負性對照，YWO.49.H2－MC－vc－PAB－MMAE及YWO.49.H6－MC－vc－PAB－MMAE不具有實質性細胞殺死活性。與OVCAR3細胞殺死檢定(以上)相比，此檢定中YWO.49.H2－MC－vc－PAB－MMAE與YWO.49.H6－MC－vc－PAB－MMAE之細胞殺死活性之間的差異可歸因於各種因素，例如細胞密度及/或藥物敏感性之差異。
應注意，對於所測試之通常表現TAT226 mRNA或蛋白之一些其他細胞株而言，YWO.49.H2及YWO.49.H6 ADC不展示顯著之細胞殺死活性。其可歸因於各種因素，例如細胞類型特異性效應、細胞表面TAT226表現程度及/或藥物敏感性差異。
3.使用HCT116#9－4異種移植物之活體內檢定 活體內異種移植物模型係用以測試未經接合及經接合YWO.49.H6活體內抑制表現TAT226之腫瘤細胞增殖的能力。藉由向小鼠背側中經皮下注射約5×106 HCT116#9－4細胞而於無胸腺裸"nu－nu"小鼠體內誘導腫瘤。使腫瘤生長直至其達到200 mm3 之平均腫瘤體積。將此時間點指定為"第0天"。如圖19所示，小鼠於第0天、第7天及第16天接收3 mg/kg之指定未經接合抗體或ADC的靜脈注射。將未經接合及經接合抗豚草抗體(Ab)用作負性對照。於第3天、第7天、第10天、第16天及第21天量測平均腫瘤體積。如圖19所示，如以平均腫瘤體積所量測，在此特定異種移植物模型中與抗豚草Ab－MC－vc－PAB－MMAF相比，YWO.49.H6－MC－vc－PAB－MMAF展示顯著之腫瘤細胞殺死活性。在此異種移植物模型中，相對於抗豚草Ab－MC－vc－PAB－MMAE，YWO.49.H6－MC－vc－PAB－MMAE不展示顯著之腫瘤細胞殺死活性。然而，由於各種因素，例如由於異種移植物腫瘤微環境中之細胞表面TAT226之藥物敏感性或表現程度的差異，此異種移植物模型不能反映在活體外所觀測之YWO.49.H6－MC－vc－PAB－MMAE之細胞殺死活性。
4.其他異種移植物模型 其他異種移植物模型可用以測試未經接合及經接合抗TAT226抗體活體內抑制表現TAT226之腫瘤細胞增殖的能力。舉例而言，卵巢及腦腫瘤之異種移植物模型可由諸如Oncotest GmbH(Frieberg,Germany)及Southern Research Institute(Birmingham,AL)之公開來源提供。詳言之，Oncotest模型係由在免疫缺陷裸小鼠體內生長患者腫瘤而形成。表現TAT226 mRNA及/或蛋白之異種移植物可適用於活體內表現抗TAT226抗體之細胞殺死活性。
於Oncotest模型OVXF1023中測試經接合YWO.49.H6於活體內抑制卵巢腫瘤細胞增殖之能力。Oncotest模型OVXF1023係來源於癌轉移之不良分化乳頭狀漿液性腺瘤卵巢癌(M1階段)。以圖20中所示之ADC處理OVXF1023小鼠。在圖20中，將YWO.49.H6命名為"H6"；將抗豚草(對照)抗體命名為"RW"且將連接子－MC－vc－PAB－縮寫為"vc"。於圖20指定之日且以此濃度投予ADC。圖20中所示之結果指示相對於其他ADC，YWO.49.H6－MC－vc－PAB－MMAF及YWO.49.H6－MC－MMAF顯著降低腫瘤體積。
在類似條件下，但改變劑量及對照ADC，以OVXF1023重複上述實驗。在重複實驗中，以較高劑量(5 mg/kg)之YWO.49.H6－MC－vc－PAB－MMAE及較低劑量(5 mg/kg)之YWO.49.H6－MC－vc－PAB－MMAF及YWO.49.H6－MC－MMAF處理小鼠。結果表明H6 ADC(且尤其為YWO.49.H6－MC－vc－PAB－MMAE)展示相對於其各自之對照ADC(6.4 mg/kg之抗gp120－MC－vc－PAB－ MMAE；7.2 mg/kg之抗gp120－MC－vc－PAB－MMAF；及5.4 mg/kg之抗gp120－MC－MMAF)降低之腫瘤體積，儘管H6 ADC與其各自之對照ADC之間的功效差異對於一些資料點而言在統計學上不顯著。(資料未圖示)。該等結果與第一OVXF1023實驗中所獲結果之間的差異可歸因於H6 ADC之劑量差異及所觀測到之對照抗gp120 ADC在降低腫瘤體積中展示意料之外之活性。
此外，亦於另一Oncotest模型OVXF899中測試H6 ADC，該模型係來源於經適度分化之乳頭狀漿液性卵巢癌(原發性腫瘤)。在此模型中H6 ADC不降低腫瘤體積。(資料未圖示)。然而，此特定Oncotest模型展示TAT226之較低表現，其可說明所觀測之結果。
I.ThioMAb
產生經半胱胺酸工程設計之抗體或"thioMAb"，其中所選擇之YWO.49.H6殘基經半胱胺酸取代以提供用於接合連接子－藥物部分之額外位點。特定言之，在YWO.49.H6之重鏈中進行A118C取代(EU編號)，或在YWO.49.H6之輕鏈中進行V205C取代(Kabat編號)。接著將所得A118C thioMAb接合至MC－MMAF，且接著將所得V205C thioMAb接合至MC－MMAF或MC－vc－PAB－MMAE。由FACS分析可見，所有thioMAb均可結合至OVCAR3細胞。(資料未圖示)。
儘管為清楚理解之目的，已以說明及實例之方式詳細描述本發明，但不應將描述及實例理解為對本發明範疇之限制。本文所引用之所有專利及科學文獻之揭示內容全文以引用的方式明確併入本文。
圖1展示來自人類、食蟹猴("cyno")、小鼠及大鼠之TAT226的對準。加陰影之殘基在各物種中相同。未加陰影之殘基於四個物種之至少兩者之間不同。來自人類、食蟹猴、小鼠及大鼠之TAT226序列之間之胺基酸一致性百分比係展示於對準下方之表中。使用ClustalW程式計算一致性百分比。
圖2展示如實例B中所述命名為YWO.32及YWO.49之抗TAT226單株抗體之H1、H2及H3重鏈高變區(HVR)序列。根據如下所述之Kabat編號系統對胺基酸位置進行編號。
圖3展示如實例B中所述命名為YWO.32及YWO.49之抗TAT226單株抗體之L1、L2及L3輕鏈HVR序列。根據如下所述之Kabat編號系統對胺基酸位置進行編號。
圖4展示如實例B中所述藉由使用HVR－H3及HVR－L3軟體隨機化庫對YWO.49進行親和力成熟而產生之YWO.49及YWO.49.B7、YWO.49.C9、YWO.49.H2及YWO.49.H6的HVR－H3及HVR－L3序列。亦展示一致之HVR－H3及HVR－L3序列。
圖5A及5B展示用於實踐本發明之具有如下序列識別符之例示性受體人類可變重(VH)一致框架序列：－人類VH子群I一致框架"A"減去Kabat CDR(SEQ ID NO：32、33、34、35)。－人類VH子群I一致框架"B"、"C"及"D"減去擴展之高變區(SEQ ID NO：36、37、34、35；SEQ ID NO：36、37、38、35；及SEQ ID NO：36、37、39、35)。－人類VH子群II一致框架"A"減去Kabat CDR(SEQ ID NO：40、41、42、35)。－人類VH子群II一致框架"B"、"C"及"D"減去擴展之高變區(SEQ ID NO：43、44、42、35；SEQ ID NO：43、44、45、35；及SEQ ID NO：43、44、46及35)。－人類VH子群III一致框架"A"減去Kabat CDR(SEQ ID NO：47、48、49、35)。－人類VH子群III一致框架"B"、"C"及"D"減去擴展之高變區(SEQ ID NO：50、51、49、35；SEQ ID NO：50、51、52、35；及SEQ ID NO：50、51、53、35)。－人類VH受體框架"A"減去Kabat CDR(SEQ ID NO：54、48、55、35)。－人類VH受體框架"B"及"C"減去擴展之高變區(SEQ ID NO：50、51、55、35；及SEQ ID NO：50、51、56、35)。－人類VH受體2框架"A"減去Kabat CDR(SEQ ID NO：54、48、57、35)。－人類VH受體2框架"B"、"C"及"D"減去擴展之高變區(SEQ ID NO：50、51、57、35；SEQ ID NO：50、51、58、35：及SEQ ID NO：50、51、59、35)。
圖6A及6B展示用於實踐本發明之具有如下序列識別符之例示性受體人類可變輕(VL)一致框架序列：－人類VL子群I一致框架(v1)：SEQ ID NO：60、61、62、63。－人類VL子群II一致框架(v2)：SEQ ID NO：64、65、66、63。－人類VL子群III一致框架(v3)：SEQ ID NO：67、68、69、63。－人類VL子群IV一致框架(v4)：SEQ ID NO：70、71、72、63。
圖7展示huMAb4D5－8輕鏈及重鏈之框架序列。上標/粗體之數字表示根據Kabat之胺基酸位置。
圖8展示具有指定修飾之huMAb4D5－8輕鏈及重鏈框架序列。上標/粗體之數字表示根據Kabat之胺基酸位置。
圖9展示YWO.32、YWO.49、YWO.49.B7、YWO.49.C9、YWO.49.H2及YWO.49.H6之重鏈可變區(VH)序列。HVR係加下劃線的。
圖10展示YWO.32、YWO.49、YWO.49.B7、YWO.49.C9、YWO.49.H2及YWO.49.H6之輕鏈可變區(VL)序列。人化單株抗體4D5－8("huMAb4D5－8")及"經修飾"huMAb4D5－8之VL序列亦分別展示於SEQ ID NO：31及SEQ ID NO：26中。YWO.32及YWO.49具有與"經修飾"huMAb4D5－8 VL(SEQ ID NO：26)相同之VL序列，其含有與SEQ ID NO：31相關之以下取代：N30S、R66G及H91S。HVR係加下劃線的。
圖11展示YWO.32、YWO.49、YWO.49.B7、YWO.49.C9、YWO.49.H2及YWO.49.H6之重鏈可變區序列之對準。HVR係括入框中。對不同於YWO.49之HVR－H3對應殘基之YWO.49.B7、YWO.49.C9、YWO.49.H2及YWO.49.H6之HVR－H3殘基加陰影。
圖12展示YWO.32、YWO.49、YWO.49.B7、YWO.49.C9、YWO.49.H2及YWO.49.H6之輕鏈可變區序列之對準。HVR係括入框中。對不同於YWO.49之HVR－L3對應殘基之YWO.49.B7、YWO.49.C9、YWO.49.H2及YWO.49.H6之HVR－L3殘基加陰影。
圖13展示如實例A中所述人類TAT226基因在各種組織中之表現程度的圖示。
圖14展示如實例A中所述，人類TAT226基因在正常卵巢；正常輸卵管；透明細胞、黏液性及漿液性囊腺癌亞型之卵巢癌；轉移性卵巢癌及其他類型卵巢癌中之表現程度的圖示。
圖15展示如實例D中所述，在存在或不存在指定抗TAT226抗體下，OVCAR3細胞之螢光活化細胞揀選(FACS)結果。
圖16展示如實例F中所述，如藉由對OVCAR3細胞及卵巢癌樣本板進行之5'核酸酶(TaqMan)檢定及免疫組織化學(IHC)所確定之TAT226 mRNA及蛋白表現。
圖17展示如實例H中所述，各種YWO.49.H2及YWO.49.H6抗體－藥物接合物(ADC)於OVCAR3細胞殺死檢定中之活體外活性。
圖18展示如實例H中所述，各種YWO.49.H2及YWO.49.H6 ADC在使用HCT116#9－4穩定轉染物之細胞殺死檢定中之活體外活性。
圖19展示如實例H中所述，使用小鼠異種移植物之YWO.49.H6 ADC之活體內活性。
圖20展示如實例H中所述，使用衍生自人類患者腫瘤之小鼠異種移植物之YWO.49.H6 ADC的活體內活性。
<110> 美商建南德克公司<120> 抗TAT226抗體及免疫接合物<130> P2324R1 <140> 096109168 <141> 2007－03－17 <150> US 60/783,746 <151> 2006－03－17 <160> 78 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> HVR－H1 <400> 1<210> 2 <211> 18 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> HVR－H2 <400> 2<210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> HVR－H3 <400> 3<210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> HVR－H1 <400> 4<210> 5 <211> 18 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> HVR－H2 <400> 5<210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> HVR－H3 <400> 6<210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> HVR－H3 <400> 7<210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> HVR－H3 <400> 8<210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> HVR－H3 <400> 9<210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> HVR－H3 <400> 10<210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> HVR－H3一致序列<220> <221> Other <222> 4 <223> Xaa＝Val或Ile <220> <221> Other <222> 5 <223> Xaa＝Ser或Thr <220> <221> Other <222> 6 <223> Xaa＝Arg、Leu或Ile <220> <221> Other <222> 8 <223> Xaa＝Gly、Ala、Ser或Pro <400> 11<210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> HVR－L1 <400> 12<210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> HVR－L2 <400> 13<210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> HVR－L3 <400> 14<210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> HVR－L3 <400> 15<210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> HVR－L3 <400> 16<210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> HVR－L3 <400> 17<210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> HVR－L3 <400> 18<210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> HVR－L3一致序列<220> <221> Other <222> 2 <223> Xaa＝Arg、Lys、His、Asn或Gln <220> <221> Other <222> 4 <223> Xaa=Tyr或Val <220> <221> Other <222> 5 <223> Xaa＝Thr、Phe、Asn、Gly或Ala <220> <221> Other <222> 8 <223> Xaa＝Pro或Phe <220> <221> Other <222> 9 <223> Xaa＝Thr、Ile或Ala <400> 19<210> 20 <211> 122 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> YWO.32之重鏈可變區<400> 20<210> 21 <211> 120 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> YWO.49之重鏈可變區<400> 21<210> 22 <211> 120 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> YWO.49.B7之重鏈可變區<400> 22 <210> 23 <211> 120 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> YWO.49.C9之重鏈可變區<400> 23<210> 24 <211> 120 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> YWO.49.H2之重鏈可變區<400> 24 <210> 25 <211> 120 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> YWO.49.H6之重鏈可變區<400> 25<210> 26 <211> 108 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> YWO.32、YWO.49及經修飾huMAb4D5－8之輕鏈可變區<400> 26 <210> 27 <211> 108 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> YWO.49.B7之輕鏈可變區<400> 27<210> 28 <211> 108 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> YWO.49.C9之輕鏈可變區<400> 28<210> 29 <211> 108 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> YWO.49.H2之輕鏈可變區<400> 29<210> 30 <211> 108 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> YWO.49.H6之輕鏈可變區<400> 30<210> 31 <211> 108 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> huMAb4D5－8之輕鏈可變區<400> 31 <210> 32 <211> 30 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 序列係經合成的<400> 32<210> 33 <211> 14 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 序列係經合成的<400> 33<210> 34 <211> 32 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 序列係經合成的<400> 34<210> 35 <211> 11 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 序列係經合成的<400> 35 <210> 36 <211> 25 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 序列係經合成的<400> 36<210> 37 <211> 13 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 序列係經合成的<400> 37<210> 38 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 序列係經合成的<400> 38<210> 39 <211> 30 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 序列係經合成的<400> 39<210> 40 <211> 30 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 序列係經合成的<400> 40 <210> 41 <211> 14 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 序列係經合成的<400> 41<210> 42 <211> 32 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 序列係經合成的<400> 42<210> 43 <211> 25 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 序列係經合成的<400> 43<210> 44 <211> 13 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 序列係經合成的<400> 44<210> 45 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 序列係經合成的<400> 45<210> 46 <211> 30 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 序列係經合成的<400> 46<210> 47 <211> 30 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 序列係經合成的<400> 47<210> 48 <211> 14 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 序列係經合成的<400> 48<210> 49 <211> 32 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 序列係經合成的<400> 49<210> 50 <211> 25 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 序列係經合成的<400> 50 <210> 51 <211> 13 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 序列係經合成的<400> 51<210> 52 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 序列係經合成的<400> 52<210> 53 <211> 30 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 序列係經合成的<400> 53<210> 54 <211> 30 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 序列係經合成的<400> 54<210> 55 <211> 32 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 序列係經合成的<400> 55 <210> 56 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 序列係經合成的<400> 56<210> 57 <211> 32 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 序列係經合成的<400> 57<210> 58 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 序列係經合成的<400> 58<210> 59 <211> 30 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 序列係經合成的<400> 59<210> 60 <211> 23 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 序列係經合成的<400> 60<210> 61 <211> 15 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 序列係經合成的<400> 61<210> 62 <211> 32 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 序列係經合成的<400> 62<210> 63 <211> 10 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 序列係經合成的<400> 63<210> 64 <211> 23 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 序列係經合成的<400> 64<210> 65 <211> 15 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 序列係經合成的<400> 65<210> 66 <211> 32 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 序列係經合成的<400> 66<210> 67 <211> 23 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 序列係經合成的<400> 67<210> 68 <211> 15 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 序列係經合成的<400> 68<210> 69 <211> 32 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 序列係經合成的<400> 69<210> 70 <211> 23 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 序列係經合成的<400> 70<210> 71 <211> 15 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 序列係經合成的<400> 71<210> 72 <211> 32 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 序列係經合成的<400> 72<210> 73 <211> 32 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 序列係經合成的<400> 73<210> 74 <211> 10 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 序列係經合成的<400> 74<210> 75 <211> 141 <212> PRT <213> 人類<400> 75<210> 76 <211> 141 <212> PRT <213> 食蟹猴<400> 76<210> 77 <211> 141 <212> PRT <213> 小家鼠<400> 77 <210> 78 <211> 141 <212> PRT <213> 褐家鼠<400> 78
(無元件符號說明)

Claims (34)

  1. 一種結合至TAT226之單株抗體，其中該抗體包含：(1)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列之HVR-H1；(2)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-H2；(3)包含選自SEQ ID NO：7-10之胺基酸序列之HVR-H3；(4)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-L1；(5)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L2；及(6)包含選自SEQ ID NO：15-18之胺基酸序列之HVR-L3；其中該結合至TAT226之抗體具有≦10nM之解離常數(KD )。
  2. 如請求項1之結合至TAT226之單株抗體，其中該抗體包含(a)、(b)、(c)或(d)：(a)(1)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列之HVR-H1；(2)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-H2；(3)包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列之HVR-H3；(4)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-L1；(5)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L2；及(6)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-L3；(b)(1)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列之HVR-H1；(2)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-H2；(3)包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列之HVR-H3；(4)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-L1；(5)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L2；及(6)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-L3； (c)(1)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列之HVR-H1；(2)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-H2；(3)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-H3；(4)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-L1；(5)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L2；及(6)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-L3；(d)(1)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列之HVR-H1；(2)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-H2；(3)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-H3；(4)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-L1；(5)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L2；及(6)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-L3。
  3. 如請求項2之抗體，其中該抗體包含(c)。
  4. 如請求項2之抗體，其中該抗體包含(d)。
  5. 如請求項2之抗體，其另外包含至少一個選自下列之框架：VH子群III一致框架及VL子群I一致框架。
  6. 一種結合至TAT226之單株抗體，其中該抗體包含與選自SEQ ID NO：22-25之胺基酸序列具有至少95%序列一致性的重鏈可變結構域，及與選自SEQ ID NO：27-30之胺基酸序列具有至少95%序列一致性的輕鏈可變結構域。
  7. 如請求項6之抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO：24之胺基酸序列具有至少95%序列一致性的重鏈可變結構域，及與SEQ ID NO：29之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之輕鏈可變結構域。
  8. 如請求項7之抗體，其中該重鏈可變結構域包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列，且該輕鏈可變結構域包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列。
  9. 如請求項6之抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO：25之胺基酸序列具有至少95%序列一致性的重鏈可變結構域，及與SEQ ID NO：30之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之輕鏈可變結構域。
  10. 如請求項9之抗體，其中該重鏈可變結構域包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列，且該輕鏈可變結構域包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列。
  11. 2或6之抗體，其中該抗體為選自Fab、Fab'-SH、Fv、scFv或(Fab')2 片段之抗體片段。
  12. 2或6之抗體，其中該抗體為人化的。
  13. 2或6之抗體，其中該抗體為人類的。
  14. 一種免疫接合物，其包含共價連接細胞毒性劑之如請求項1至13中任一項所定義之結合TAT226的抗體。
  15. 如請求項14之免疫接合物，其中該細胞毒性劑係選自毒素、化療劑、抗生素、放射性同位素及核分解酶。
  16. 一種具有式Ab-(L-D)p之免疫接合物，其中：(a)Ab為如請求項1至13中任一項所定義之單株抗體；(b)L為一連接子；(c)D為式DE 或DF 之藥物 且其中R2 及R6 各自為甲基，R3 及R4 各自為異丙基，R5 為-H或甲基，R7 為第二丁基，各R8 係獨立地選自CH3 、O-CH3 、OH及H；R9 為H；R10 為芳基；Z為-O-或-NH-；R11 為H、C1 -C8 烷基或-(CH2 )2 -O-(CH2 )2 -O-(CH2 )2 -O-CH3 ；且R18 為-C(R8 )2 -C(R8 )2 -芳基；且(d)p在約1至8之範圍內。
  17. 如請求項16之免疫接合物，其中該連接子係經由該抗體上之硫醇基連接至該抗體。
  18. 如請求項16之免疫接合物，其中該藥物係選自MMAE及MMAF。
  19. 如請求項18之免疫接合物，其中該藥物為MMAE。
  20. 如請求項18之免疫接合物，其中該藥物為MMAF。
  21. 如請求項18之免疫接合物，其中該連接子可由蛋白酶裂解。
  22. 如請求項21之免疫接合物，其中該連接子包含val-cit二肽。
  23. 如請求項21之免疫接合物，其中該連接子包含對胺基苄基單元。
  24. 如請求項21之免疫接合物，其中該連接子包含6-馬來醯亞胺基己基(6-maleimidocaproyl)。
  25. 如請求項19之免疫接合物，其中該免疫接合物具有下式 其中S為硫原子，且p在2至5之範圍內。
  26. 如請求項20之免疫接合物，其中該免疫接合物具有下式 其中S為硫原子，且p在2至5之範圍內。
  27. 一種醫藥組合物，其包含如請求項14至26中任一項所界定之免疫接合物，其係用於治療細胞增殖性病症。
  28. 如請求項27之醫藥組合物，其中該細胞增殖性病症係選自卵巢癌、子宮癌、腦腫瘤及威爾姆氏腫瘤(Wilms' tumor)。
  29. 一種如如請求項14至26中任一項所界定之免疫接合物之用途，其係用於製備治療細胞增殖性病症之藥物。
  30. 如請求項29之用途，其中該細胞增殖性病症係選自卵巢癌、子宮癌、腦腫瘤及威爾姆氏腫瘤。
  31. 如請求項25之免疫接合物，其中Ab為如請求項2之(c)或請求項8所定義之單株抗體。
  32. 如請求項25之免疫接合物，其中Ab為如請求項2之(d)或 請求項10所定義之單株抗體。
  33. 如請求項26之免疫接合物，其中Ab為如請求項2之(c)或請求項8所定義之單株抗體。
  34. 如請求項26之免疫接合物，其中Ab為如請求項2之(d)或請求項10所定義之單株抗體。
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