MX2008011586A

MX2008011586A - Polinucleotidos que codifican un gen de resistencia a herbicidas de maiz y metodos de uso de los mismos.

Info

Publication number: MX2008011586A
Application number: MX2008011586A
Authority: MX
Inventors: Mark A Williams; Thao Dam; Anthony D Guida Jr; Christine B Hazel; Bailin Li
Original assignee: Du Pont
Priority date: 2006-03-09
Filing date: 2007-03-09
Publication date: 2008-09-22
Also published as: CN101437844B; US20080096218A1; CN103146828B; CA2644130C; US20080050818A1; US20080050823A1; CN103146828A; US20080050822A1; EP1991567A2; EP1991567B1; TW200808961A; US7705200B2; BRPI0708711A2; US20080052796A1; US20080052798A1; US20070214515A1; US20090217415A1; US20080050824A1; CA2644130A1; WO2007103567A2

Abstract

Secuencias de polinucleótidos que codifican un gen que puede conferir resistencia a por lo menos un herbicida. La invención se relaciona además con plantas y semillas de plantas que contienen genes quiméricos que comprenden dichas secuencias de polinucleótidos, que aumentan o confieren resistencia a por lo menos un herbicida y métodos para obtener dichas plantas y semillas. La invención presenta además secuencias que se pueden usar como marcadores moleculares que a su vez pueden emplearse para identificar la región de interés en líneas de maíz que son el resultado de cruzamientos nuevos y para seleccionar de manera rápida y eficiente las mejores líneas para estrategias de cría al poder evitar las líneas sensibles.

Description

POLINUCLEÓTIDOS QUE CODIFICAN UN GEN DE RESISTENCIA A HERBICIDAS DE MAÍZ Y MÉTODOS DE USO DE LOS MISMOS Campo de la invención Esta invención se relaciona con composiciones y métodos que son de utilidad para crear o mejorar la resistencia a herbicidas en plantas. Además, la invención se relaciona con plantas que han sido transformadas genéticamente con las composiciones de la invención. Antecedentes de la invención En la producción de cultivos comerciales, es deseable eliminar de manera fácil y rápida las plantas ¡ndeseadas (es decir, las "malezas") de un campo de plantas de cultivo. Un tratamiento ideal sería uno que pudiera aplicarse a un campo entero, pero que eliminara solamente las plantas no deseadas, al tiempo que dejara las plantas de cultivo intactas. Un sistema de tratamiento tal comprende el uso de plantas de cultivo que son tolerantes a un herbicida. Cuando el herbicida es rociado sobre un campo de plantas de cultivo tolerantes al herbicida, las plantas de cultivo continúan creciendo en tanto las malezas no tolerantes al herbicida mueren o son severamente dañados. La tolerancia de un cultivo a herbicidas específicos puede ser conferida mediante manipulación con ingeniería genética para introducir genes en los cultivos que codifican las enzimas apropiadas del metabolismo del herbicida. En algunos casos, estas enzimas, y los ácidos nucleicos que codifican las mismas, se originan en una planta. En otros casos, derivan de otros organismos, tales como microbios. Véanse, por ejemplo, Padgette et al. (1996) "New weed control opportunities: Development of soybeans with a Roundup Ready® gene", y Vasil (1996) "Phosphinothricin-resistant crops", ambos en Herbicide-Resistant Crops, editado por Duke (CRC Press, Boca Ratón, Florida) págs. 54-84 y págs. 85-91. Más aún, se han diseñado plantas transgénicas para que expresen una variedad de genes de tolerancia a herbicidas de una variedad de organismos, incluyendo un gen que codifica una proteína quimérica del citocromo de rata P4507A1 y la citocromo NADPH P450 oxidorreductasa de levadura (Shiota et al. (1994) Plant Physiol. 106: 17), entre otros genes P450 de plantas (véase, por ejemplo, Didierjean, L. et al. (2002) Plant Physiol. 130: 179-189; Morant, M.S. et al. (2003) Opinión in Biotechnology 14:151-162). Otros genes que confieren tolerancia a herbicidas incluyen: acetohidroxiácido sintasa ("AHAS"), que ha demostrado conferir resistencia a múltiples tipos de herbicidas ALS a las plantas que expresan al mismo y se ha introducido en una gran variedad de plantas (véase, por ejemplo, Hattori et al. (1995) Mol. Gen. Genet. 246: 419); glutatión reductasa y superóxido dismutasa (Aono et al. (1995) Plant Cell Physiol. 36: 1687); y genes para diversas fosfotransferasas (Datta et al. (1992) Plant Mol. Biol.20: 619). Aunque actualmente hay plantas de cultivo tolerantes a herbicidas disponibles comercialmente, continúa la demanda de mejoras en cada aspecto de la producción de cultivos. Los herbicidas y cultivos disponibles comercialmente en este momento desafortunadamente tienen características particulares que pueden limitar su utilidad en la producción comercial de los cultivos. En particular, los herbicidas individuales tienen espectros de actividad diferentes e incompletos contra las especies de maleza comunes. La familia de herbicidas de acetolactato sintasa, o ALS (también conocida como AHAS) controla las malezas inhibiendo la producción de las cadenas de las ramificaciones de aminoácidos que son esenciales para el crecimiento y desarrollo de las plantas. Específicamente, se unen a la enzima ALS vegetal. Los herbicidas comúnmente utilizados en esta familia incluyen nícosulfurón, rimsulfurón y clorsulfurón, entre otros. Los herbicidas de esta categoría pueden ser bastante específicos del cultivo. Las realizaciones de la invención se relacionan con plantas que son resistentes a los miembros de la clase de herbecidas inhibidores de ALS, que comprende 5 subclases de herbicidas incluyendo, pero en un sentido no limitativo, la familia de herbicidas de suifonilureas (SU) y la familia de herbicidas de imidazolinonas. La clase de herbicidas inhibidores de la síntesis de pigmentos está dirigida a las enzimas que permiten que las plantas sinteticen pigmentos, tales como pigmentos carotenoides o pigmentos de clorofila. La pérdida de pigmentos da como resultado la fotodestrucción de la clorofila y el blanqueamiento de los tejidos vegetales, por lo cual estos herbicidas a menudo se denominan herbicidas "blanqueadores". Un ejemplo de la subclase de herbicidas blanqueadores es la clase inhibidora de HPPD, que inhibe la enzima 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenasa (HPPD) (Lee et al. (1997) Weed Sci. 45:601-609). Los herbicidas de esta familia incluyen, pero en un sentido no limitativo, mesotriona, tembotrione, topramezone y sulcotriona, entre otros. En general, el maíz es tolerante a la mesotriona debido al metabolismo del herbicida (Mitchell et al. (2001) Pest Mgt. Sci. 57:120-128). El mismo sistema de detoxificación puede ofrecer tolerancia a mesotriona y a algunos herbicidas SU (Green y Williams (2004) Proceedings Weed Science Society of America 44:13). Algunas realizaciones de la invención se relacionan con plantas que son resistentes a los miembros de la clase de herbicidas inhibidora de la síntesis de pigmentos. La class de herbicidas inhibidora de la protoporfirinógeno oxidasa (PPO) interfiere con la síntesis de clorofila, dando como resultado compuestos que producen compuestos sumamente activos (radicales libres). Estos compuestos reactivos rompen las membranas celulares que da como resultado la quemadura de hojas asociada con la aplicación de post-emergencia de estos productos. Los herbicidas de esta familia incluyen, pero en un sentido no limitativo, acifluorfén, fomesafén, lactofén, sulfentrazona, carfentrazona, flumiclorac y flumioxazina , entre otros. Algunas realizaciones de la invención se relacionan con plantas que son resistentes a los miembros de la class de herbicidas inhibidora de PPO. Los herbicidas inhibidores del fotosistema II (PSII) tienen un modo de acción que comprende interacción con los componentes de la cadena de transferencia de electrones del fotosistema II. La fotosíntesis requiere de la transferencia de electrones del fotosistema II al fotosistema I. Un paso clave en esta cadena de transferencia de electrones es la reducción de la plastoquinona (PQ) por la proteína D1 en la membrana tilacoide. Los herbicidas inhibidores de PSII se unen a la proteína D1, inhibiendo así la unión de PQ e interrumpiendo el proceso de transferencia de electrones. Como resultado de ello, las plantas no pueden fijar el dióxido de carbono y producir los carbohidratos necesarios para la supervivencia de la planta. El bloqueo de la transferencia de electrones también causa estrés oxidativo y generación de radicales que provocan un rápido daño celular. Los herbicidas inhibidores de PSII está representados por diversas familias de herbicidas, incluyendo las triazinas simétricas, triazinonas (triazinas asimétricas), ureas sustituidas, uracilos, piridazinonas, fenilcarbamatos, nitrilos, benzotiadiazoles, fenilpiridazinas y amidas ácidas. Algunas realizaciones de la invención se relacionan con plantas que son resistentes a miembros de la clase de herbicidas inhibidores de PS II. Los herbicidas de auxinas sintéticos constituyen una clase de herbicidas ampliamente utilizada que imitan las hormonas auxinas naturales producidas por las plantas. Las auxinas regulan muchos procesos en las plantas, incluyendo el crecimiento y la diferenciación celular. Las auxinas generalmente están presentes a bajas concentraciones en la planta. Los herbicidas de auxinas sintéticas imitan las auxinas naturales y causan concentraciones relativamente altas en la célula que dan como resultado una respuesta de crecimiento rápido. Las plantas susceptibles tratadas con estos herbicidas exhiben síntomas que podrían llamarse 'sobredosís de auxinas', y eventualmente mueren como resultado de mayores índices de crecimiento desorganizado y descontrolado. Algunas realizaciones de la invención se relacionan con plantas que son resistentes a los miembros de la clase de herbicidas de auxinas sintéticas. Algunas realizaciones de esta invención se basan en el mapeo fino, clonación y caracterización del gen responsable de un mecanismo importante de resistencia a herbicidas en maíz. Se ha sabido desde principios de la década de 1990 que la tolerancia natural en maíz (Zea mays L.) a un subconjunto de herbicidas de sulfonilureas (nicosulfurón [herbecida Dupont Accent®], rimsulfurón, primisulfurón y tífensulfurón) está controlada por un solo gen (denominado nsf por Kang (1993) Journal of Heredity 84(3): 216-217), con resistencia dominante y sensibilidad recesiva (Harms et al. (1990) Theor. Appl. Genet. 80:353-358; Kang (1993) supra; Green y Uhlrich (1993) Weed Sci.41:508-516; Green y Uhlrich (1994) Pestic. Sci. 40:187-191). Se sabe también que las plantas tolerantes de maíz metabolizan nicosulfurón por hidroxilación, con las características de un citocromo P450 (Fonne-Pfister et al. (1990) Pesticide Biochem. Physiol. 37:165-173; Brown y Cotterman (1994) Chem. Plant Prot. 10:47-81). Se ha sugerido que el gen de maíz responsable de la determinación de tolerancia a algunos herbicidas de sulfonilurea también fuera responsable de la tolerancia a bentazón (Barrett et al. (1997) Role of cytochrome P-450 in herbicide metabolism and selectivity and múltiple herbicide metabolizing cytochrome P-450 activities in maize. En K. K. Hatzios, ed. Regulation of Enzymatic Systems Detoxifying Xenobiotics in Plants. Dordrecht: Kluwer Academic. págs. 35-50; Green (1998) Weed Technology 12:474-477) y a herbicidas inhibidores de HPPD tal como mesotriona (Green y Williams (2004) supra; Williams et al. (2005) Hort Science 40(6): 80 -1805). Avances recientes en el desarrollo del mapa físico y marcadores integrados de maíz (Bortiri et al. (2006) Curr. Opin. Plant Biol. 9(2):164-71) ha permitido el uso de un enfoque de clonación por posición para identificar el locus de Nsf1. El gen de resistencia a Nsf1 de las realizaciones de la presente invención codifica un nuevo gen relacionado con la familia del citocromo P450. Aunque se han descrito múltiples genes P450, difieren ampliamente en sus respuestas a los diferentes patógenos y en cuanto a su acción exacta. Se ha demostrado que el nuevo gen del citocromo P450 que se describe en la presente provee una mayor tolerancia o resistencia a numerosos herbicidas, incluyendo nicosulfurón, rimsulfurón, primisulfurón , tifensulfurón y mesotriona. Compendio de la invención La presente invención está dirigida a realizaciones que incluyen un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido capaz de conferir resistencia a por lo menos un herbicida, en donde dicho polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos con al menos 85, 90 o 95% de identidad, cuando se compara con la SEQ ID N°: 1 basado en el algoritmo de alineación de Needleman-Wunsch, o un complemento de la secuencia de nucleótidos, en donde dicho complemento y dicha secuencia de nucleótidos consisten del mismo número de nucleótidos y son 100% complementarios. Los herbicidas a los cuales el polinucleótido de las realizaciones imparten resistencia incluyen herbicidas que son miembros de la clase inhibidora de ALS; la clase inhibidora de la síntesis de pigmentos; la clase inhibidora de PPO; la clase inhibidora de PS II; y la clase de auxinas sintéticas. El polinucleótido de las realizaciones pueden impartir resistencia a uno o más herbicidas de la misma clase, o de clases diferentes, incluyendo miembros representativos de las 5 clases. Otras realizaciones de la presente invención incluyen un vector que comprende al polinucleótido de las realizaciones y una construcción de ADN recombinante que comprende al polinucleótido de las realizaciones, ligada operativamente a por lo menos una secuencia reguladora. También se incluye una célula vegetal, así como una planta y una semilla cada una de las cuales comprende la construcción de ADN recombinante de una realización de la presente invención. Se incluyen asimismo plantas que comprenden otros polinucleótidos que codifican polipéptidos responsable de los rasgos de interés, tal como polipéptidos que tienen actividad de glifosato N- acetiltransferasa, polipéptidos Bt insecticidas y otros polipéptidos de interés. Las plantas que comprenden estos polinucleótidos incluyen monocotiledóneas y dicotiledóneas, incluyendo, pero en un sentido no limitativo, maíz, trigo, cebada, avena, Panicum virgatum, sorgo, arroz, soja, cañóla, papa, algodón y girasol. Los métodos comprendidos por la presente invención incluyen 1) un método para transformar una célula, que comprende transformar una célula con el polinucleótido de una realización de la presente invención, 2) un método para producir una planta que comprende transformar una célula vegetal con la construcción de ADN recombinante de una realización de la presente invención y regenerar una planta a partir de la célula vegetal transformada y 3) métodos para conferir o mejorar la resistencia a por lo menos un herbicida, que comprende transformar una planta con la construcción de ADN recombinante de una realización de la presente invención, confiriendo o mejorando de esa manera resistencia a por lo menos un herbicida, tal como un herbicida que es miembro de la clase inhibidora de ALS; la clase inhibidora de la síntesis de pigmentos; la clase inhibidora de PPO; la clase inhibidora de PS II; y la clase de auxinas sintéticas. Además, una realización de la invención es un alelo variante de la secuencia Nsf1 en donde un cambio de un aminoácido individual específico (véase el Ejemplo 2) vuelve al gen inoperante, dando como resultado sensibilidad a por lo menos un herbicida inhibidor de ALS o HPPD al cual casi todo el maíz es resistente. Por consiguiente, un método adicional comprendido por la presente invención es un método para usar la variante del gen Nsf1 como marcador en estrategias de cría para evitar la incorporación del alelo sensible. La presente invención también comprende métodos para alterar el nivel de expresión de una proteína capaz de conferir resistencia a por lo menos un herbecida en una célula vegetal que comprende (a) transformar una célula vegetal con la construcción de ADN recombinante de una realización de la presente invención y (b) cultivar la célula vegetal transformada bajo condiciones que son adecuadas para la expresión de la construcción de ADN recombinante, en donde dicha expresión de la construcción de ADN recombinante da como resultado la producción de niveles alterados de una proteína capaz de conferir resistencia a por lo menos un herbecida en el huésped transformado. Los herbicidas para los cuales se puede conferir resistencia incluyen, por ejemplo, herbicidas que son miembros de la clase inhibidora de ALS; la clase inhibidora de la síntesis de pigmentos; la clase inhibidora de PPO; la clase inhibidora de PS II; y la clase de auxinas sintéticas. Los herbicidas para los cuales el polinucleótido de las realizaciones puede conferir o mejorar la resistencia incluyen, pero en un sentido no limitativo, a los herbicidas seleccionados entre la clase de herbicidas inhibidores de ALS tales como nicosulfurón, rimsulfurón, primisulfurón, imazetapir, clorsulfurón, clorimurón etilo, triasulfurón , flumetsulam e imazaquin. Además, dichos herbicidas se pueden seleccionar entre la clase de herbicidas inhibidores de la síntesis de pigmentos, tales como isoxaflutol, topramezone, sulcatriona y tembotriona. Dichos herbicidas también se pueden seleccionar entre la clase de herbicidas inhibidores de PPO, tales como acifluorfén, flumioxán y sulfentrazona. Opcionalmente, dichos herbicidas se pueden seleccionar entre la clase de herbicidas inhibidores de PS II, tales como diurón, linurón, bentazón y clorotolurón. Dichos herbicidas también se pueden seleccionar entre la clase de herbicidas de auxinas sintéticas, tal como dicamba. Los métodos de las realizaciones incluyen un método para determinar la presencia del polinucleotido de las realizaciones o del locus Nsf1 en una planta, que comprende al menos uno entre: (a) aislar moléculas de ácido nucleico de la planta y determinar si está presente el gen Nsf1 al tratar de amplificar secuencias homologas del polinucleotido; o (b) aislar moléculas de ácido nucleico de la planta y efectuar una hibridación Southern o (c) aislar proteínas de la planta y efectuar una transferencia Western usando anticuerpos para la proteína NSF1 o (d) aislar proteínas de la planta y efectuar un ensayo ELISA usando anticuerpos para la proteína NSF1, para determinar así la presencia del polinucleotido de la reivindicación 1 en la planta. Las realizaciones también abarcan plantas con tolerancia mejorada a por lo menos un herbicida, que comprende al gen Nsf1 en una construcción de ADN recombinante. Dichas plantas comprenden además un segundo gen de resistencia a herbicidas que proveen un determinado nivel de tolerancia a un herbicida seleccionado entre la clase de herbicidas seleccionados entre el grupo formado por: (a) la clase inhibidora de ALS; (b) la clase inhibidora de la síntesis de pigmentos; (c) la clase inhibidora de PPO; (d) la clase inhibidora de PS II; y (e) la clase de auxinas sintéticas; de modo tal que la presencia del gen Nsf1 confiere a la planta un mayor nivel de tolerancia al mismo herbicida que el nivel de tolerancia exhibido por una planta que comprende al segundo gen de resistencia a herbicidas pero que no comprende al gen Nsf1. Las realizaciones comprenden asimismo plantas de soja que comprenden al gen Nsf1, en donde dichas plantas de soja también exhiben resistencia al nematodo quístico de soja. Dichas plantas se pueden haber creado mediante técnicas de transformación o cría de plantas y se pueden haber originado a partir de un germoplasma tal como los que se seleccionan del grupo formado por, Peking, PI88788, PI89772, PI90763, PI209332, PI404189A, PI437654, PI438489B, PI467312, PI468916, Hartwig, J87-233, y la progenie derivada de cualquiera de las fuentes enumeradas. Descripción breve de las figuras La Figura 1(a-e) es una alineación de múltiples secuencias de la secuencia del polipéptido de las realizaciones (SEQ ID N°: 2) en comparación con otros polipéptidos de la citocromo P450 (SEQ ID N°: 3-13). La Figura 1d también indica la posición del dominio más comúnmente conservado de la familia del citocromo P450 (SEQ ID N°: 14). Los residuos idénticos en la alineación están indicados con letras mayúsculas. La Figura 2(a-b) es una alineación de múltiples secuencias de la secuencia del polipéptidos de diversas líneas sensibles y resistentes de maíz que muestra el dominio comúnmente conservado de la familia del citocromo P450 (SEQ ID N°: 14) así como variaciones entre las secuencias. Descripción detallada de la invención Las realizaciones de la presente invención proveen composiciones y métodos dirigidos a la inducción de resistencia a herbicidas en plantas. Las composiciones comprenden nuevas secuencias de nucleótidos y de aminoácidos que confieren p aumentan la resistencia a uno o más miembros de una o más clases de herbicidas, incluyendo las clases de herbicidas inhibidores de ALS, inhibidores de PPO, inhibidores de la síntesis de pigmentos, inhibidores de PS II y de auxinas sintéticas, cuyos miembros incluyen, pero en un sentido no limitativo, nicosulfurón , rimsulfurón, primisulfurón y mesotríona. Específicamente, determinadas realizaciones proveen polipéptidos cuya secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID N°: 2, y variantes y fragmentos de la misma. Se proveen además moléculas de ácido nucleico, y variantes y fragmentos de las mismas, que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos que es muestra en la SEQ ID N°: 2.

Un ejemplo de la secuencia de nucleótidos nativa que codifica al polipéptido de la SEQ ID N°: 2 se muestra en la SEQ ID N°: 1. En la presente también se describen plantas, células vegetales, semillas y microorganismos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de las realizaciones. El polipéptido de longitud completa de las realizaciones (SEQ ID N°: 2) comparte grados variables de homología con polipéptidos conocidos de la familia del citocromo P450. En particular, el polipéptido novedoso de las realizaciones comparte homología con las proteínas de citocromo P450 aisladas de Oryza sativa: N° Acceso XP_469850 (SEQ ID N°: 3), ABC69856 (SEQ ID N°: 4); XP_469849 (SEQ ID N°: 11) y XP_469851 (SEQ ID N°: 12); y XP_469852 (SEQ ID N°: 13) y de Lolium rigidum: N° Acceso AAK38080 (SEQ ID N°: 5); AAK38079 (SEQ ID N°: 6); AAK38081 (SEQ ID N°: 7); BAD27508 (SEQ ID N°: 8); BAD27507 (SEQ ID N°: 9) y BAD27506 (SEQ ID N°: 10). La Figura 1 provee una alineación de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID N°: 2 con las proteínas citocromo P450 de O. sativa y L. rigidum (SEQ ID N°: 3- 13). Las alineaciones de aminoácidos efectuadas usando el programa GAP indican que la SEQ ID N°:2 comparte las similitudes de secuencia que se muestran en la Tabla 1 con las proteínas de citocromo P450 de O. sativa y L. rigidum.

Tabla 1: Comparación del péptido NSF1 con otros péptidos de citocromo P450 La familia de genes del citocromo P450 en plantas cataliza reacciones regioespecíficas y/o estereoespecíficas extremadamente diversas y a menudo complejas en la biosíntesis o el catabolismo de moléculas bioactivas en plantas. (Morant et al. (2003) Curr. Opin. Biotech. 14(2): 151-162). Las P450 son proteínas hemo que catalizan la activación de oxígeno molecular usando los electrones del NADPH. En el genoma de Arabidopsis thaliana solamente, se estima que hay más que 300 citocromos P450 (Werck- Reichhart et al. (2000) Trends in Plant Science 5(3): 116-123). Hay características estructurales comunes en los citocromos P450 vegetales y ayudan a identificarlos como tales. Estas características incluyen el motivo F-X-X-G-X-R-X-C-X-G (SEQ ID N°: 14) presente en general cerca del extremo C-terminal (véase la Figura 1d).

Aproximadamente a 150 residuos 5', en general hay otro motivo conservado que le sigue al motivo A/G-G-X-D/E-T-T/S (SEQ ID N°: 15) y corresponde a la región del péptido que es responsable de la unión a oxigeno y de activación. Los ácidos nucleicos y polipéptidos de las realizaciones son de utilidad en métodos que sirven para conferir o mejorar la resistencia a herbicidas de una planta. Por consiguiente, las composiciones y métodos que se describen en la presente son de utilidad para proteger a las plantas contra el daño causado por herbicidas. La "resistencia a herbicidas" significa que una planta o célula vegetal tienen la capacidad para tolerar una mayor concentración de un herbicida que las plantas o células que no son resistentes o para tolerar una determinada concentración de un herbicida por un tiempo más prolongado que las células o plantas que no son resistentes. Es decir, se impide que los herbicidas causen lesiones en las plantas o se minimizan o disminuyen las lesiones causadas por el herbicida, tal como, por ejemplo, la reducción del amarillamiento de las hojas y la pérdida asociada de rendimiento. Los especialistas en la técnica comprenderán que las composiciones y los métodos descritos en la presente pueden usarse junto con otras composiciones y métodos disponibles en la técnica para incrementar o mejorar la resistencia a herbicidas en plantas. El término "mejorar" se refiere a aumentar, incrementar, ampliar, multiplicar, elevar y semejantes. En aspectos particulares, las realizaciones incluyen métodos para conferir o mejorar la resistencia a herbicidas en una planta que comprenden introducir en una planta al menos una construcción de ADN, en donde dicha construcción de ADN comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de resistencia a herbicidas de las realizaciones ligado operativamente a un promotor capaz de dirigir la expresión en la planta. La planta expresa al polipéptido, confiriendo o mejorando de esa manera la resistencia a herbicidas a dicha planta o mejorando el nivel de resistencia inherente de la planta. En realizaciones particulares, el gen confiere o mejora la resistencia a por lo menos un herbicida de las clases de inhibidores de ALS, de inhibidores de la síntesis de pigmentos, de inhibidores de PPO, de inhibidores de PS II o de auxinas sintéticas herbicida, cuyos miembros incluyen, pero en un sentido no limitativo, los herbicidas nicosulfurón, rimsulfurón, primisulfurón, tifensulfurón, bentazón y mesotriona. La expresión de un polipéptido de las realizaciones puede ser dirigida a tejidos vegetales específicos pero generalmente, en el caso de resistencia a herbicidas, se desea una expresión continua en todas las células de la planta. Por ello, si bien se podrían usar muchos promotores en las realizaciones de la invención, en general se utilizan promotores constitutivos. Un promotor constitutivo es un promotor que dirige la expresión de un gen en diversas partes de una planta y en forma continua durante el desarrollo de la planta. Tal como se utiliza en la presente, un "ácido nucleico" incluye un polímero de desoxirríbonucleótidos o ribonucleótidos, tanto en su forma de cadena simple como de cadena doble y, a menos que se limite de otra manera, abarca análogos conocidos (por ejemplo, ácidos nucleicos de péptidos) que tienen la naturaleza esencial de los nucleótidos naturales y que ellos se hibridizan con ácidos nucleicos de cadena simple en una forma similar a la de los nucleótidos naturales. Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en la presente para hacer referencia a un polímero de residuos de aminoácidos. El término se aplica a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos son análogos químicos artificiales de un aminoácido natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos naturales. Los polipéptidos de la invención se pueden producir a partir de un ácido nucleico descrito en la presente o usando técnicas estándar de biología molecular. Por ejemplo, se puede producir una proteína truncada de las realizaciones expresando un ácido nucleico recombinante de las realizaciones en una célula huésped apropiada o, como alternativa, empleando una combinación de procedimientos ex vivo, tales como digestión con proteasas y purificación. Tal como se utilizan en la presente, los términos "que codifica" o "codificado", en el contexto de un ácido nucleico específico, indican que el ácido nucleico comprende la información necesaria para dirigir la traducción de la secuencia de nucleótidos en una proteína específica. La información por la cual está codificada una proteína está especificada por la utilización de codones. Un ácido nucleico que codifica una proteína puede comprender secuencias no traducidas (por ejemplo, intrones) dentro de las regiones traducidas del ácido nucleico o puede carecer tales secuencias intervinientes no traducidas (por ejemplo, como en el ADNc). Las realizaciones de la invención abarcan composiciones de polinucleótidos o proteínas aisladas o sustancialmente purificadas. Un polinucleótido o una proteína "aislada" o "purificada", o una porción con actividad biológica de ésta, está sustancialmente o esencialmente libre de los componentes que habitualmente acompañan o interactúan con el polinucleótido o la proteína, tal como se los halla en su entorno natural. Por consiguiente, un polinucleótido o una proteína aislada o purificada está sustancialmente libre de otro material celular o medio de cultivo cuando es producida medíante técnicas recombinantes, o está sustancialmente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas cuando es sintetizada con medios químicos. Preferentemente, un polinucleótido "aislado" está libre de las secuencias (preferentemente las secuencias que codifican proteínas) que habitualmente rodean los polinucleótidos (es decir, las secuencias ubicadas en los extremos 5' y 3' del polinucleótido) en el ADN genómico del organismo del cual deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en diversas realizaciones, el polinucleótido aislado puede contener menos que 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb aproximadamente de la secuencia de nucleótidos que rodea naturalmente al polinucleótido en el ADN genómico de la célula de la que deriva el polinucleótido. Una proteina que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteína que contienen menos que aproximadamente 30%, aproximadamente 20%, aproximadamente 10%, aproximadamente 5% o aproximadamente 1% (en peso seco) de proteínas contaminantes. Cuando la proteína de las realizaciones, o una porción biológicamente activa de la misma, se produce de forma recombinante, el medio de cultivo preferido representa menos que aproximadamente 30%, aproximadamente 20%, aproximadamente 10%, aproximadamente 5% o aproximadamente 1% (en peso seco) de precursores químicos o sustancias químicas que no son proteínas de interés. Los fragmentos y las variantes de las secuencias de nucleótidos descritas, y las proteínas codificadas por las mismas, también están comprendidos por las realizaciones. El término "fragmento" significa una porción de la secuencia de nucleótidos o una porción de la secuencia de aminoácidos y por ende de la proteína codificada por la misma. Los fragmentos de la secuencia de nucleótidos pueden codificar fragmentos de proteína que retienen la actividad biológica de la proteína nativa y por ende tienen la capacidad para conferir o mejorar la resistencia a por lo menos un herbicida de la clase de herbicidas inhibidores de ALS, inhibidores de PPO, inhibidores de la síntesis de pigmentos, inhibidores de PS II o de auxinas sintéticas. Como alternativa, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos que son de utilidad como sondas de hibridación no codifican necesariamente fragmentos de proteínas que retienen la actividad biológica. Por consiguiente, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos pueden variar entre al menos aproximadamente 15 nucleótidos, aproximadamente 50 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos y hasta la longitud completa de la secuencia de nucleótidos que codifica los polipéptidos de las realizaciones. Un fragmento de una secuencia de nucleótidos que codifica una porción biológicamente activa de un polipéptido de las realizaciones codificará al menos aproximadamente 15, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 40 o aproximadamente 50 aminoácidos contiguos o hasta el número total de aminoácidos presente en un polipéptido de longitud completa de las realizaciones (por ejemplo, 521 aminoácidos para el péptido codificado por la SEQ ID N°: 2). Los fragmentos de una secuencia de nucleótidos que son de utilidad como sondas de hibridación o cebadores para PCR generalmente no necesitan codificar una porción biológicamente activa de una proteína. Tal como se usa en la presente, una "secuencia de longitud completa", con referencia a un polinucleótido específico, significa que tiene la secuencia de ácido nucleico completa de una secuencia nativa. Una "secuencia nativa" se refiere a una secuencia endógena, es decir, una secuencia no modificada por ingeniería genética presente en el genoma de un organismo. Por consiguiente, un fragmento de una secuencia de nucleótidos de las realizaciones puede codificar una porción biológicamente activa de un polipéptido O puede ser un fragmento que se puede usar como sonda de hibridación o cebador de PCR, empleando los métodos que se describirán más adelante. Una porción biológicamente activa de un polipéptido de resistencia a herbicidas se puede preparar aislando una porción de una de las secuencias de nucleótidos de las realizaciones, expresando la porción codificada de la proteina y evaluando la capacidad de la porción codificada de la proteína para conferir o mejorar la resistencia a herbicidas en una planta. Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de una secuencia de nucleótidos de las realizaciones comprenden al menos aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 50, aproximadamente 75, aproximadamente 100 o aproximadamente 150 nucleótidos o hasta el número de nucleótidos presente en una secuencia de nucleótidos de longitud completa como se describe en la presente (por ejemplo, 1563 nucleótidos para la SEQ ID N°: 1). El término "variantes" significa secuencias sustancialmente similares. Para los polinucleótidos, una variante comprende la supresión y/o adición de uno o más nucleótidos en uno o más sitios internos dentro del polinucleótido nativo y/o la sustitución de uno o más nucleótidos en uno o más sitios en dicho polinucleótido nativo. Tal como se lo utiliza en la presente, un polinucleótido o un polipéptido "nativo" comprende una secuencia de nucleótidos o una secuencia de aminoácidos natural, respectivamente. Los especialistas en la técnica comprenderán que las variantes de los ácidos nucleicos de las realizaciones se construirán de modo de mantener el marco de lectura abierto. Para los polinucleótidos, las variantes conservadoras incluyen aquellas secuencias que, debido a la degeneración del código genético, codifican la secuencia de aminoácidos de uno de los polipéptidos de las realizaciones. Las variantes alélicas naturales como las recién mencionadas pueden ser identificadas utilizando técnicas de biología molecular bien conocidas, como, por ejemplo, las técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de hibridación que se describirán más adelante. Las variantes de polinucleótidos también incluyen secuencias de polinucleótidos derivadas mediante síntesis, tal como las que se generan, por ejemplo, utilizando mutagénesís dirigida al sitio pero que aún codifican una proteína de las realizaciones. En general, las variantes de un polinucleótido particular de las realizaciones presentan al menos aproximadamente 40%, aproximadamente 45%, aproximadamente 50%, aproximadamente 55%, aproximadamente 60%, aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% o más identidad de secuencia con dicho polinucleótido particular según se puede determinar con los programas y parámetros de alineación de secuencias que se describen en otra parte de la presente. También se pueden evaluar las variantes de un polinucleótido particular de las realizaciones (es decir, el polinucleótido de referencia) comparando el porcentaje de identidad de secuencia entre el polipéptido codificado por una variante del polinucleótido y el polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Así, por ejemplo, se describen polinucleótidos aislados que codifican un polipéptido con un porcentaje dado de identidad de secuencia con el polipéptido de la SEQ ID N°: 2. El porcentaje de identidad de secuencia entre cualesquiera dos polipéptidos puede calcularse usando los programas de alineación de secuencia y los parámetros descritos en otra parte de la presente documentación. Cuando se evalúa cualquier par de polinucleótidos dado de las realizaciones por comparación del porcentaje de identidad de secuencia compartido por los dos polipéptidos que codifican, el porcentaje de identidad de secuencia entre los dos polipéptidos codificados es de al menos aproximadamente 40%, aproximadamente 45%, aproximadamente 50%, aproximadamente 55%, aproximadamente 60%, aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% o más de identidad de secuencia.

El término "variante" de proteína significa una proteína derivada de la proteína nativa por supresión o adición de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína nativa y/o la sustitución de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína nativa. Las variantes de proteínas comprendidas por las realizaciones son biológicamente activas, es decir aún tienen la actividad biológica deseada de la proteína nativa, es decir, la capacidad para conferir o mejorar la resistencia a herbicidas de una planta según se describe en la presente. Dichas variantes pueden ser el resultado, por ejemplo, de polimorfismos genéticos o de la manipulación humana. Las variantes biológicamente activas de una proteína nativa de las realizaciones tendrán al menos aproximadamente 40%, aproximadamente 45%, aproximadamente 50%, aproximadamente 55%, aproximadamente 60%, aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% o más identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la proteína nativa según se determina con los programas y parámetros de alineación de secuencias que se describen en otra parte de la presente. Una variante con actividad biológica de una proteína de las realizaciones puede diferir de dicha proteína en tan poco como 1-15 residuos de aminoácidos, tan poco como 1-10, tal como 6-10, tan poco como 5, tan poco como 4, 3, 2 o aún 1 residuo de aminoácido. Las proteínas de las realizaciones pueden ser alteradas de diversas maneras, incluyendo sustituciones, supresiones, truncamientos e inserciones de aminoácidos. Los métodos para realizar dichas manipulaciones son conocidos en general en la técnica. Por ejemplo, se pueden preparar variantes y fragmentos de secuencias de aminoácidos de las proteínas de resistencia a herbicidas realizando mutaciones en el ADN. Los métodos para efectuar mutagénesis y alteraciones de polinucleótidos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 82: 488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154: 367-382; Patente de los EE.UU. N° 4.873.192; Walquer y Gaastra, editores (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nueva York), y las referencias citadas en dichas publicaciones. Los lineamientos para efectuar las sustituciones de aminoácidos apropiadas que no afectan la actividad biológica de la proteína de interés se pueden consultar en el modelo de Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Nati. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), incorporada en la presente a modo de referencia. Las sustituciones conservadoras, tales como el intercambio de un aminoácido por otro con propiedades similares, son óptimas. Por consiguiente, los genes y polinucleótidos de las realizaciones incluyen tanto las secuencias naturales como las formas mutantes. De la misma manera, las proteínas de las realizaciones abarcan tanto las proteínas naturales como las variaciones y formas modificadas de las mismas. Dichas variantes continuarán teniendo la capacidad deseada para conferir o mejorar la resistencia de las plantas a por lo menos un herbicida de las clases de herbicidas inhibidores de ALS, inhibidores de PPO, inhibidores de la síntesis de pigmentos, inhibidores de PS II o auxinas sintéticas. Evidentemente, las mutaciones que se efectuarán en el ADN que codifica las variantes no deben desplazar la secuencia fuera del marco de lectura, y preferentemente, no crearán regiones complementarias que puedan producir una estructura de ARNm secundaria. Véase la Patente EP N° 0075444. No se espera que las supresiones, las inserciones y las sustituciones en las secuencias de proteínas comprendidas en la presente produzcan cambios radicales en las características de la proteína. Sin embargo, cuando es difícil predecir por adelantado el efecto exacto de la sustitución, supresión o inserción, el especialista en la técnica comprenderá que el efecto será evaluado examinando las plantas transgénicas que fueron transformadas con la variante de proteína para verificar el efecto sobre las características de resistencia a herbicidas de la planta. Las variantes de polinucleótidos y proteínas también abarcan secuencias y proteínas derivadas mediante procedimientos mutagénicos o recombinogénicos, incluyendo, y a modo de ejemplo, procedimientos tales como entremezclado de ADN. El especialista en la técnica podrá considerar modificaciones que permitan alterar el rango de herbicidas a los cuales responderá la proteina. Con dicho procedimiento se pueden manipular una o más secuencias codificantes diferentes para crear una nueva proteína pesticida que posea las propiedades deseadas. De este modo, se generan bibliotecas de polinucleótidos recombinantes a partir de una población de secuencias polinucleotidicas relacionadas, que comprenden regiones de secuencias que tienen una identidad de secuencia sustancial, y éstas pueden recombinarse en forma homologa in vitro o in vivo. Por ejemplo, con este enfoque, se pueden entremezclar motivos de secuencia que codifican un dominio de interés entre el gen de la proteína de las realizaciones y otros genes de proteínas conocidas para obtener un nuevo gen que codifica una proteína con la propiedad de interés mejorada, tal como una mayor capacidad para conferir o mejorar la resistencia a herbicidas en una planta. En la técnica se conocen estrategias para este entremezclado de ADN. Véanse, por ejemplo, US 2002/0058249; Stemmer (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 91 :10747-10751 ; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391 : 288-291 ; y las Patentes de EE.UU. N°: 5.605.793 y 5.837.458. Los polinucleótidos de las realizaciones se pueden utilizar para aislar las secuencias correspondientes de otros organismos, en particular de otras plantas. De esta manera, se pueden utilizar métodos tales como PCR, hibridación y semejantes para identificar dichas secuencias sobre la base de su homología de secuencia con las secuencias que se describen en la presente. Las secuencias aisladas sobre la base de su identidad de secuencia con las secuencias completas detalladas en la presente, o con variantes y fragmentos de las mismas, están comprendidas en las realizaciones. Dichas secuencias incluyen secuencias que son ortólogas de las secuencias descritas. El término "ortólogos" hace referencia a genes derivados de un gen ancestral común que se encuentra en diferentes especies como resultado de la especiación. Los genes hallados en diferentes especies se consideran ortólogos cuando sus secuencias de nucleótidos y/o las secuencias de proteínas codificadas por las mismas comparten al menos aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% o más identidad de secuencia. Las funciones de los ortólogos a menudo están muy conservadas entre las especies. Por consiguiente, los polinucleótidos aislados que codifican una proteína que confiere o mejora la resistencia a herbicidas en una planta y que se hibridizan bajo condiciones severas con las secuencias descritas en la presente, o con variantes o fragmentos de las mismas, están comprendidos por las realizaciones. En un enfoque basado en PCR, se pueden diseñar cebadores de oligonucleótidos para su uso en reacciones de PCR para amplificar las secuencias de ADN correspondientes a partir de ADNc o ADN genómico extraído de cualquier organismo de interés. Los métodos para diseñar cebadores para PCR y clonación por PCR son conocidos en general en el arte y se describen en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York). Véase también Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Mehods and Applications (Academic Press, Nueva York); Innis y Gelfand, editores (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nueva York); e Innis y Gelfand, editores (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nueva York). Los métodos de PCR conocidos incluyen, y en un sentido no limitativo, métodos para usar cebadores apareados, cebadores anidados, cebadores individuales específicos, cebadores degenerados, cebadores específicos de genes, cebadores específicos de vectores, cebadores con faltas de coincidencia parciales y semejantes. En las técnicas de hibridación, se utiliza la totalidad o una parte de un polinucleótido conocido como sonda, que se hibridizará selectivamente con otros polinucieotidos correspondientes presentes en una población de fragmentos de ADN genómico clonado o fragmentos de ADNc (es decir, bibliotecas de ADN genómico o de ADNc) de un organismo seleccionado. Las sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN u otros oligonucleótidos, y pueden estar marcadas con un grupo detectable, tal como 32P, o con cualquier otro marcador de detección. De este modo, por ejemplo, se pueden preparar sondas de hibridación marcando oligonucleótidos sintéticos basados en los polinucleótidos de las realizaciones. Los métodos para preparar sondas para hibridizar y construir bibliotecas de ADNc y genómicas son conocidos en general en la técnica, y se describen en Sambrook et al. (1989) supra. Por ejemplo, se puede usar el polinucleótido completo que se describe en la presente, o una o más porciones del mismo, como una sonda capaz de hibridizarse específicamente con los polinucleótidos y los ARNm mensajeros correspondientes. Para lograr una hibridación específica bajo diversas condiciones, dichas sondas incluyen secuencias que son únicas y preferentemente son de al menos 10 nucleotidos de longitud aproximadamente, al menos 15 nucleotidos de longitud aproximadamente o al menos 20 nucleotidos de longitud aproximadamente. Estas sondas se pueden usar para amplificar los polinucleótidos correspondientes a partir de un organismo seleccionado por PCR. Esta técnica se puede usar para aislar secuencias codificantes adicionales a partir de un organismo deseado, o como un ensayo diagnóstico para determinar la presencia de secuencias codificantes en un organismo. Las técnicas de hibridación incluyen el examen por hibridación de bibliotecas de ADN plaqueadas (placas o colonias; véase, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) supra. La hibridación de dichas secuencias puede llevarse a cabo bajo condiciones severas. Los términos "condiciones severas" o "condiciones de hibridación severas" hacen referencia a condiciones bajo las cuales una sonda se hibridizará con su secuencia blanco hasta un grado detectable mayor que con otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces respecto del nivel basal). Las condiciones severas dependen de la secuencia y difieren bajo distintas circunstancias. Al controlar la severidad de la hibridación y/o las condiciones de lavado, es posible identificar secuencias blanco que son 100% complementarias con la sonda (análisis de homólogos). Como alternativa, es posible ajustar las condiciones de severidad para permitir un cierto grado de falta de coincidencia entre las secuencias, con el fin de detectar grados de similitud menores (análisis de heterólogos). En general, una sonda tiene menos de aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud, a menudo menos de 500 nucleótidos de longitud. Típicamente, las condiciones severas son aquellas en las que la concentración de sal es menor que aproximadamente 1,5 M de iones Na, típicamente una concentración de entre aproximadamente 0,01 y 1,0 M de iones Na (o de otras sales), a un pH de entre 7,0 y 8,3, donde la temperatura es de al menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (por ejemplo, de entre 10 y 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60°C para sondas largas (por ejemplo, de más de 50 nucleótidos). También se pueden lograr condiciones severas agregando agentes desestabilizadores, tal como formamida. Los ejemplos de condiciones de baja severidad incluyen hibridación con una solución amortiguadora de formamida al 30 a 35%, NaCI 1 M, SDS 1% (dodecilsulfato de sodio) a 37 °C y un lavado en SSC 1X a 2X (SSC 20X = NaCI 3,0 M / citrato trisódico 0,3 M) a 50-55 °C. Los ejemplos de condiciones de severidad moderada incluyen hibridación en formamida 40 a 45%, NaCI 1,0 M, SDS 1% a 37 °C y un lavado en SSC 0,5X a 1X a 55-60 °C. Los ejemplos de condiciones de severidad alta incluyen hibridación en formamida 50%, NaCI 1 M, SDS 1% a 37 °C y un lavado en SSC 0,1X a 60-65 °C durante al menos 30 minutos. Opcionalmente, las soluciones amortiguadoras de lavado pueden comprender SDS entre aproximadamente 0,1% y aproximadamente 1%. La duración de la hibridación generalmente es menor que aproximadamente 24 horas, comúnmente entre aproximadamente 4 y aproximadamente 12 horas. La duración del tiempo de lavado será de un tiempo suficiente como para alcanzar el equilibrio. La especificidad es típicamente una función de los lavados post-hibridación, donde los factores críticos son la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para híbridos de ADN-ADN se puede estimar el punto de fusión térmico (Tm) empleando la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81,5 °C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500/I; donde M es la molaridad de los cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de guanosina y nucleótidos de citosina en el ADN, % form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación y L es la longitud del híbrido en pares de bases. Tm es la temperatura (a una fuerza iónica y un pH específico) a la que 50% de una secuencia blanco complementaria se hibridiza con una sonda que coincide perfectamente. La Tm se reduce en aproximadamente 1 °C por cada 1% de falta de coincidencia; por consiguiente, es posible ajusfar la Tm, las condiciones de hibridación y/o de lavado para efectuar una hibridación con la secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con >90% de identidad, se puede reducir la Tm en 10 °C. Generalmente se seleccionan condiciones severas con temperaturas aproximadamente 5°C menores que la Tm para la secuencia específica y su complemento, a una fuerza iónica y un pH específicos. Sin embargo, las condiciones muy severas pueden emplear una hibridación y/o un lavado a una temperatura 1 , 2, 3 ó 4 °C menor que la Tm; las condiciones de severidad moderada pueden emplear una hibridación y/o un lavado a una temperatura 6, 7, 8, 9 ó 10°C menor que el punto de fusión térmico (Tm); las condiciones de severidad baja utilizan una hibridación y/o un lavado a una temperatura 11 , 12, 13, 14, 15 ó 20°C menor que el punto de fusión térmico (Tm). Usando la ecuación, las condiciones de hibridación y lavado deseadas, y el Tm deseado, los especialistas en la técnica comprenderán que pueden efectuarse variaciones en la severidad de las soluciones de hibridación y/o lavado. Si el grado de falta de coincidencia deseado da como resultado una Tm menor que 45 °C (solución acuosa) o 32 °C (solución de formamida) se prefiere incrementar la concentración de SSC para que se pueda usar una temperatura más alta. Se puede consultar una extensa guia para la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, capitulo 2 (Elsevier, Nueva York); y Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, capítulo 2 (Greene Pubiishing y Wiley-lnterscience, Nueva York). Véase Sambrook et al. (1989) supra. Se pueden utilizar diversos procedimientos para verificar la presencia o ausencia de una secuencia particular de ADN, ARN o de una proteína. Dichos procedimientos incluyen, por ejemplo, transferencias Southern, transferencias Northern, transferencias Western y análisis por ELISA. Técnicas tales como las mencionadas son bien conocidas por los especialistas en la técnica y se pueden consultar numerosas referencias que proveen protocolos detallados. Dichas referencias incluyen Sambrook et al. (1989) supra, y Crowther, J.R. (2001), The ELISA Guidebook, Humana Press, Totowa, NJ, EE.UU.. Los siguientes términos se utilizan para describir las relaciones de secuencias entre dos o más polinucleótidos o polipéptidos: (a) "secuencia de referencia", (b) "ventana de comparación", (c) "identidad de secuencia", (d) "porcentaje de identidad de secuencia". (a) Tal como se utiliza en la presente, una "secuencia de referencia" es una secuencia definida que se utiliza como base para la comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la totalidad de una secuencia específica; por ejemplo, un segmento o la totalidad de la secuencia de un ADNc o un gen, o la secuencia completa del ADNc o el gen. (b) Tal como se utiliza en la presente, una "ventana de comparación" hace referencia a un segmento contiguo y especifico de una secuencia de polinucleótidos, donde la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, faltas de coincidencia o huecos) al compararla con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para una alineación óptima de los dos polinucleótidos. En general, la ventana de comparación comprende al menos aproximadamente 20 nucleótidos contiguos de longitud y opcionalmente puede ser de aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 50, aproximadamente 100 o más larga. Los especialistas en la técnica comprenden que, para evitar una similitud elevada con una secuencia de referencia debido a la inclusión de faltas de coincidencia en la secuencia de polinucleótidos, típicamente se introduce una penalidad de falta de coincidencia y se la sustrae de la cantidad de coincidencias. Los métodos para alinear secuencias de nucleótidos y aminoácidos con fines comparativos son bien conocidos en la técnica. Por consiguiente, la determinación del porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias cualquiera puede realizarse usando un algoritmo matemático. Los ejemplos no limitativos de dichos algoritmos matemáticos son: el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4: 11-17; el algoritmo de homología local de Smith et al. (1981 ) Adv. Appl. Math. 2: 482; el algoritmo de alineación por homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453; el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. 85: 2444-2448; el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 872264, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 90:5873-5877 Se pueden usar implementaciones informáticas de estos algoritmos matemáticos para comparar secuencias con el fin de determinar la identidad de secuencia. Dichas implementaciones incluyen, y en un sentido no limitativo: CLUSTAL en el programa PC/Gene (disponible en Intelligenetics, Mountain View, California); el programa ALIGN (Versión 2.0) y GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el conjunto de Software Wisconsin Genetics, Versión 10 (disponible en Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, California, EE.UU.). Las alineaciones se pueden preparar usando estos programas con los parámetros predeterminados. El programa CLUSTAL está muy bien descripto por Higgins et al., (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65; y Pearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307- 331. El programa ALIGN se basa en el algoritmo de Myers y Miller (1988) supra. Cuando se comparan secuencias de aminoácidos, se puede usar una tabla de ponderación de residuos PAM120, una longitud de penalidad de falta de coincidencia de 12 y una falta de coincidencia de 4 con el programa ALIGN. Los programas BLAST de Altschul et al (1990) J. Mol. Biol. 215:403 se basan en el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) supra. La búsqueda de nucleótidos con BLAST se puede realizar con el programa BLASTN, calificación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homologas de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina de las realizaciones. Las búsquedas de proteínas con BLAST se pueden realizar con el programa BLASTX, calificación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homologas a una proteína o un polipéptido de la invención. Con el fin de obtener alineaciones con faltas de coincidencia para efectuar una comparación, se puede emplear Gapped BLAST (en BLAST 2.0) como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Como alternativa, se puede utilizar PSI-BLAST (en BLAST 2.0) para realizar una búsqueda repetida que detecte interrelaciones distantes entre moléculas. Véase Altschul et al. (1997) supra. Cuando se emplea BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, pueden usarse los parámetros predeterminados de los programas respectivos (por ejemplo, BLASTN para secuencias de nucleótidos, BLASTX para proteínas). Véase www.ncbi.nlm.nih.gov. Las alineaciones también se pueden realizar en forma manual por inspección.

A menos que se indique lo contrario, los valores de identidad/similitud de secuencia proporcionados en la presente hacen referencia a los valores obtenidos utilizando GAP versión 10 con los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleotidos utilizando un peso de falta de coincidencia de 50 y un peso de longitud de 3; y la matriz de calificación de nwsgapdna.cmp; % de identidad y % de similitud para una secuencia de aminoácidos usando un peso de falta de coincidencia de 8 y un peso de longitud de 2 y la matriz de calificación BLOSUM62; o cualquier programa equivalente de los mismos. El término "programa equivalente" significa cualquier programa de comparación de secuencias que, para cualquiera de las dos secuencias en cuestión, genera una alineación que presenta coincidencias de residuos de aminoácidos o nucleotidos idénticos y una identidad de secuencia porcentual idéntica cuando se compara con la alineación correspondiente generada por el programa GAP Versión 10. GAP emplea el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453, para hallar la alineación de dos secuencias completas que maximiza la cantidad de coincidencias y minimiza la cantidad de faltas de coincidencias. GAP considera todas las alineaciones posibles y todas las posiciones de falta de coincidencia, y crea la alineación con la mayor cantidad de coincidencias de bases y la menor cantidad de faltas de coincidencia. Permite proveer una penalidad de creación de faltas de coincidencia y una penalidad de extensión de faltas de coincidencia en unidades de bases coincidentes. GAP debe crear una ganancia a partir de la cantidad de coincidencias, respecto de la penalidad de creación de faltas de coincidencia para cada falta de coincidencia que inserta. Si se selecciona una penalidad de extensión de falta de coincidencia mayor que cero, GAP debe crear además una ganancia para cada falta de coincidencia insertada, que abarca la longitud de la falta de coincidencia multiplicada por la penalidad de extensión de falta de coincidencia. Los valores predeterminados para la penalidad de creación de faltas de coincidencias y la penalidad de la extensión de las faltas de coincidencias en las secuencias de proteínas en la versión 10 del conjunto de software de Wisconsin Genetics GCG son de 8 y 2, respectivamente. Para las secuencias de nucleótidos, el límite de creación de falta de coincidencia predeterminado es de 50, en tanto que el límite de falta de coincidencia predeterminado es de 3. Los límites de creación de faltas de coincidencia y extensión de las faltas de coincidencia pueden expresarse como un número entero seleccionado del grupo de números enteros de 0 a 200. Entonces, por ejemplo, los valores de los límites de creación de faltas de coincidencia y extensión de faltas de coincidencia pueden ser de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o más. GAP presenta un miembro de la familia de mejores alineaciones. Pueden existir muchos miembros de esta familia, pero ningún otro miembro tendrá una mejor calidad. GAP presenta cuatro cifras de mérito para las alineaciones: Calidad, Relación, Identidad y Similitud. La Calidad es la métrica maximizada para la alineación de las secuencias. La Relación es la Calidad dividida por la cantidad de bases en el segmento más corto. El Porcentaje de Identidad es el porcentaje de los símbolos que realmente coinciden. El Porcentaje de Similitud es el porcentaje de símbolos que son similares. Los símbolos que están a lo largo de las faltas de coincidencia son ignorados. Se evalúa una similitud cuando el valor de la matriz de puntuación para un par de símbolos es mayor o igual que 0,50, el umbral de similitud. La matriz de calificación usada en la Versión 10 del paquete de software de Wisconsin Genetics GCG es BLOSUM62 (véase, Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 89:10915). (c) Tal como se utiliza en la presente, la "identidad de secuencia" o "identidad" en el contexto de dos secuencias de polinucleótidos o de polipéptidos se refiere a los residuos en las dos secuencias que son iguales cuando se alinean por correspondencia máxima en la ventana de comparación especificada. Cuando se usa el porcentaje de identidad de secuencia en referencia a proteínas, se reconoce que las posiciones de residuos que no son idénticas comúnmente difieren en sustituciones de aminoácidos conservadoras, donde se sustituyen los residuos de aminoácidos por otros residuos de aminoácidos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobícidad), y por ende, no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en sustituciones conservadoras, puede incrementarse el porcentaje de identidad de secuencia para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Se dice que las secuencias que difieren en dichas sustituciones conservadoras tienen "similitud de secuencia" o "similitud". Los medios para realizar este ajuste son bien conocidos por los especialistas en la técnica. Típicamente, esto comprende evaluar una sustitución conservadora como una falta de coincidencia parcial, en vez de total, lo que incrementa el porcentaje de identidad de secuencia. Por consiguiente, por ejemplo, cuando a un aminoácido idéntico se le asigna un valor de 1 y a una sustitución no conservadora se le asigna un valor de cero, a una sustitución conservadora se le asigna un valor entre cero y 1. El valor de las sustituciones conservadoras se calcula, por ejemplo, como se detalla en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California). (d) Tal como se utiliza en la presente, el "porcentaje de identidad de secuencia" significa el valor determinado por comparación de dos secuencias alineadas de forma óptima en una ventana de comparación, donde la porción de una secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, faltas de coincidencia) en comparación con una secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para una alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando la cantidad de posiciones en las cuales existe una base de ácido nucleico idéntica en ambas secuencias, de modo de obtener la cantidad de posiciones de coincidencia, dividiendo la cantidad de posiciones de coincidencia por la cantidad total de posiciones en la ventana de comparación, y multiplicando la cantidad total de posiciones por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia. El uso del término "polinucleótido" no pretende limitar las realizaciones a los polinucleótidos que comprenden ADN. Los especialistas en la técnica comprenderán que los polinucleótidos pueden comprender ribonucleótidos y combinaciones de ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos. Dichos desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos incluyen tanto moléculas naturales como análogos sintéticos. Los polinucleótidos de las realizaciones también comprenden todas las formas de las secuencias, incluyendo, a modo de ejemplo, formas de cadena simple, formas de cadena doble y semejantes. Los polinucleótidos aislados de la presente invención se pueden incorporar en construcciones de ADN recombinante que se pueden introducir y replicar en una célula huésped. Un "vector" puede ser una construcción tal que incluya un sistema de repiicación y secuencias que permiten la transcripción y traducción de una secuencia que codifica un polipéptido en una célula huésped dada. Se describieron numerosos vectores adecuados para una transfección estable de células vegetales o para establecer plantas transgénicas, por ejemplo, en Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, supl. 1987; Weissbach y Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989; y Flevin et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990. Típicamente, los vectores de expresión en plantas incluyen, por ejemplo, uno o más genes vegetales clonados bajo el control de transcripción de secuencias reguladoras 5' y 3' y un marcador seleccionable dominante. Dichos vectores de expresión en plantas también pueden contener una región reguladora promotora (por ejemplo, una región reguladora que controla una expresión inducible o constitutiva, regulada por el medio ambiente o por el desarrollo o especifica de células o tejidos), un sitio de inicio de la transcripción, un sitio de unión a ribosoma, una señal de procesamiento de ARN, una secuencia de un péptido señal para una expresión dirigida, un sitio de terminación de la transcripción y/o una señal de poliadenilación. Los términos "construcción recombinante", "cásete de expresión", "construcción de expresión", "construcción quimérica", "construcción", "construcción de ADN recombinante" y "fragmento de ADN recombinante" se utilizan indistintamente en la presente y son fragmentos de ácido nucleico. Una construcción recombinante comprende una combinación artificial de fragmentos de ácido nucleico, incluyendo y a modo de ejemplo, secuencias reguladoras y de codificación que no se encuentran juntos en la naturaleza. Por ejemplo, una construcción de ADN recombinante puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificantes que derivan de fuentes diferentes, o secuencias reguladoras y secuencias codificantes que derivan de la misma fuente y dispuestas de una manera distinta de la disposición en que se encuentran en la naturaleza. Dicha construcción se puede usar sola o se puede usar junto con un vector. Si se usa un vector entonces la elección de dicho vector depende del método que se usará para transformar las células huésped según es de conocimiento para el especialista en la técnica. Por ejemplo, se puede usar un vector plásmido. El especialista en la técnica conoce muy bien los elementos genéticos que deben estar presentes en el vector plasmídico, con el fin de transformar, seleccionar y propagar satisfactoriamente las células huésped que contienen a cualquiera de los fragmentos de ácidos nucleicos aislados de la invención. El examen para obtener líneas que presentan el nivel y patrón de expresión deseados de los polinucleótidos o del locus Nsf1 se puede efectuar por amplificación, transferencia Southern del ADN, transferencia Northern de la expresión de ARNm, análisis de inmunotransferencia de la expresión de proteínas, análisis fenotípico y semejantes. El término "construcción de ADN recombinante" se refiere a una construcción de ADN ensamblado con fragmentos de ácido nucleico obtenidos de diferentes fuentes. Los tipos y el origen de los fragmentos de ácido nucleico pueden ser muy diversos. En algunas realizaciones, se proveen también construcciones de ADN que comprenden un promotor ligado operativamente a una secuencia de nucleótidos heteróloga de las realizaciones. Las construcciones de ADN de las realizaciones son de utilidad para generar plantas, células vegetales y microorganismos transformados y en la práctica de métodos para inducir resistencia a los herbicidas inhibidores de ALS y HPPD descritos en la presente. El cásete de expresión incluirá secuencias reguladoras 5' y 3' ligadas operativamente a un polinucleótido de las realizaciones. El término "ligado operativamente" hace referencia a una unión funcional entre dos o más elementos. Las "secuencias reguladoras" se refieren a los nucleótidos ubicados 5' (secuencias no codificantes 5'), dentro o 3' (secuencias no codificantes 3') con respecto a una secuencia de codificación y que pueden afectar la transcripción, el procesamiento de ARN, la estabilidad o traducción de la secuencia de codificación asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir, y a modo de ejemplo, promotores, secuencias directrices de la traducción, intrones y secuencias de reconocimiento de poliadenilación. Por ejemplo, un ligamiento operativo entre un polinucleótido de interés y una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor) es un enlace funcional que permite la expresión del polinucleótido de interés. Los elementos ligados operativamente pueden ser contiguos o no contiguos. Cuando se lo usa con referencia a la unión de dos regiones que codifican proteínas, el término ligado operativamente significa que las regiones codificantes están en el mismo marco de lectura. La secuencia codificante puede contener además una secuencia usada para dirigir la proteína hacia cloroplastos, la vacuola, el retículo endoplasmático o fuera de la célula. Además, el cásete puede contener al menos un gen adicional que será cotransformado en el organismo. Como alternativa, se podrán proporcionar genes adicionales en múltiples construcciones de ADN. Dicho cásete de expresión se provee con una pluralidad de sitios de restricción y/o sitios de recombinación para insertar el polinucleótido que codifica un polipéptido antipatogénico bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras. Además, la construcción de ADN puede contener genes marcadores de selección. La construcción de ADN incluirá, en la dirección de transcripción 5' a 3': una región de inicio de la transcripción (es decir, un promotor), una región de inicio de la traducción, un polinucleótido de las realizaciones, una región de terminación de la traducción y, opcionalmente, una región de terminación de la transcripción funcional en el organismo huésped. Las regiones reguladoras (es decir, los promotores, las regiones de regulación de la transcripción y las regiones de terminación de la traducción) y/o el polinucleótido de la invención podrán ser nativos/análogos respecto de la célula huésped o entre sí. Como alternativa, las regiones reguladoras y/o el polinucleótido de las realizaciones podrán ser heterólogos respecto de la célula huésped o entre sí. Tal como se la usa en la presente, "heteróloga", en referencia a una secuencia, es una secuencia que se origina a partir de una especie extraña, o sí es de la misma especie, está sustancialmente modificada en comparación con su forma nativa, en lo referente a su composición y/o su locus genómico, merced a la intervención humana deliberada. Por ejemplo, un promotor ligado operativamente a un polinucleótido heterólogo es de una especie diferente de la especie de la que deriva el polinucleótido, o, si es de una especie igual/análoga, uno o ambos están sustancialmente modificados respecto de su forma y/o su locus genómico original, o el promotor no es el promotor nativo del polinucleótido ligado operativamente. La región de terminación incluida opcionalmente puede ser nativa respecto de la región de inicio de la transcripción, puede ser nativa respecto del polinucleótido de interés ligado operativamente, puede ser nativa respecto de la planta huésped o puede derivar de otra fuente (es decir, puede ser extraña o heteróloga) respecto del promotor, el polinucleótido de interés, el huésped o cualquier combinación de los mismos. Se pueden usar regiones de terminación convenientes disponibles del plásmido Ti de A. tumefaciens, tales como las regiones de terminación de la octopina sintetasa y la nopalina sintetasa. Véanse también Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141- 149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Bailas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; y Joshi et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:9627-9639. En realizaciones particulares, se usa el terminador del gen del inhibidor de proteasa de papa II (Pinll). Véase, por ejemplo, Keil et al. (1986) Nucí. Acids Res. 14:5641-5650; y An et al. (1989) Plant Cell 1:115-122, incorporados por completo en la presente a modo de referencia. Se puede usar una cantidad de promotores en la práctica de la invención, incluyendo el promotor nativo de la secuencia de polinucleótidos de interés. Los promotores pueden seleccionarse sobre la base del resultado deseado. Se describe un amplio rango de promotores vegetales en la revisión reciente de Potenza et al. (2004) In vitro Cell Dev Biol - Plant 40:1-22, incorporada en la presente a modo de referencia. Por ejemplo, se pueden combinar ácidos nucleicos con promotores constitutivos, con preferencia tisular, inducibles por patógenos u otros para la expresión en plantas. Dichos promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, el promotor nuclear de Rsyn7 y otros promotores constitutivos como se describe en WO 99/43838 y en la Patente de los EE.UU. N° 6.072.050; el promotor nuclear CaMV 35S (Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812); el promotor de actina de arroz (McEIroy et al. (1990) Plant Cell 2: 163-171); el promotor de ubiquitina (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 619-632 y Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675-689); el promotor pEMU (Last et al. (1991 ) Theor. Appl. Genet. 81: 581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3: 2723-2730); el promotor ALS (Patente de EE.UU. N°: 5.659.026) y semejantes. Otros promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, las que se describen en las Patentes de EE.UU. N°: 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121 ; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; y 5.608.142 y 6.177.611. En la técnica se conocen otras modificaciones de secuencia para potenciar la expresión genética en una célula huésped. Éstas incluyen la eliminación de las secuencias que codifican señales de poiiadeniiacion espurias, señales de sitios de separación de exones-intrones, repeticiones tipo transposón y otras secuencias bien caracterizadas de este tipo, que puedan ser perjudiciales para la expresión genética. El contenido de G-C de la secuencia puede ser ajustado en niveles promedio para una célula huésped dada, y puede ser calculado con referencia a genes conocidos que se expresan en dicha célula huésped. Cuando sea posible, la secuencia será modificada con el fin de evitar las estructuras de ARNm secundarias en horquilla predichas. Además, las construcciones de ADN pueden contener secuencias directrices 5'. Dichas secuencias directrices pueden servir para potenciar la traducción. Las directrices de la traducción son conocidas en la técnica e incluyen las siguientes: las directrices de picornavirus, por ejemplo, directriz EMCV (región no codificadora 5' de encefalomiocarditis) (Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU., (16: 6126-6130); directrices potivirus, por ejemplo, directriz TEV (virus del etch de tabaco) (Gallie et al. (1995) Gene 165(2):233-238); la directriz MDMV (virus en mosaico del maíz enano) y la proteína que se une a las cadenas pesadas de la inmunoglobulina humana (BiP) (Macejak et al. (1991) Nature 353:90- 94); la directriz no traducida del ARNm de la proteina de recubrimiento del virus en mosaico de la alfalfa (AMV ARN 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325:622-625); la directriz del virus en mosaico del tabaco (TMV) (Gallie et al. (1989) en Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, Nueva York), págs. 237-256); y directriz del virus moteado clorótico de maíz (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology 81:382-385). Véase también, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968. También se pueden utilizar otros métodos conocidos para mejorar la traducción, por ejemplo, intrones y semejantes. En la preparación de la construcción de ADN, los distintos fragmentos de ADN se pueden manipular para obtener las secuencias de ADN en la orientación apropiada y, cuando resultare apropiado, en el marco de lectura apropiado. Con este fin, pueden emplearse adaptadores o ligadores para unir los fragmentos de ADN, o pueden utilizarse otras manipulaciones para proveer sitios de restricción convenientes, eliminar ADN superfluo, eliminar sitios de restricción o semejantes. Con este propósito, puede utilizarse mutagénesis in vitro, reparación de cebadores, digestiones de restricción, alineación, resustituciones, por ejemplo transiciones y transversiones. En general, la construcción de ADN comprenderá un gen marcador de selección para seleccionar las células transformadas. Los genes marcadores de selección se utilizan para la selección de las células o los tejidos transformados. Los genes marcadores incluyen genes que codifican resistencia a antibióticos, tales como aquellos que codifican la neomicina fosfotransferasa II (NEO) y la higromicina fosfotransferasa (HPT), así como genes que confieren resistencia a compuestos herbicidas, tales como glufosinato de amonio, bromoxinilo, imidazolinonas y 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4- D). Otros marcadores de selección incluyen marcadores fenotípicos, tales como ?-galactosidasa y proteínas fluorescentes tal como la proteína fluorescente verde (GFP) (Su et al. (2004) Biotechnol Bioeng 85: 610-9 y Fetter et al. (2004) Plant Cell 16: 215-28), proteína ciano fluorescente (CYP) (Bolte et al. (2004) J. Cell Science 117: 943-54 y Kato et al. (2002) Plant Physiol 129: 913-42) y la proteína fluorescente amarilla (PhiYFP™ de Evrogen, véase, Bolte et al. (2004) J. Cell Science 117:943-54). Por otros marcadores de selección adicionales, véase en general, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-511 ; Christopherson et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 89: 6314-6318; Yao et al. (1992) Cell 71: 63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6: 2419-2422; Barkley et al. (1980) en The Operon, págs. 177-220; Hu et al. (1987) Cell 48:555-566; Brown et al. (1987) Cell 49:603-612; Figge et al. (1988) Cell 52:713-722; Deuschle et al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 86:5400-5404; Fuerst et al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 86:2549-2553; Deuschle et al. (1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Tesis Ph.D., Universidad de Heidelberg; Reines et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 90: 917-1921 ; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Zambretti et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 89:3952-3956; Baim et al. (1991 ) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 88:5072-5076; Wyborski et al. (1991 ) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry 27:1094- 104; Bonin (1993) Tesis Ph.D., Universidad de Heidelberg; Gossen et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 89:5547-5551; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlín); Gilí et al. (1988) Nature 334:721-724. Estas descripciones se incorporan en la presente a modo de referencia. La lista anterior de genes marcadores de selección no se ofreció en un sentido limitante. Se puede utilizar cualquier gen marcador seleccionable en las realizaciones. El gen de las realizaciones se puede expresar como un transgen con el fin de elaborar plantas resistentes a por lo menos un herbicida de la clase de herbicidas inhibidores de ALS, inhibidores de PPO, inhibidores de la síntesis de pigmentos, inhibidores de PS II o auxinas sintéticas. El uso de los diferentes promotores que se describen en otra parte de esta descripción permitirá su expresión en una forma modulada bajo diferentes circunstancias. Sin embargo, también se puede insertar todo el gen, tanto la secuencia del promotor nativo como de codificación, como un transgen. Finalmente, el uso del gen de las realizaciones como un transgen permitirá una combinación rápida con otras características, tal como resistencia a insectos o fúngicas. En determinadas realizaciones las secuencias de ácido nucleico de las realizaciones se pueden apilar con cualquier combinación de secuencias de polinucleótidos de interés, que pueden ser transgénicas o no transgénicas, con el fin de crear plantas con un fenotipo deseado. Por ejemplo, los polinucleótidos de las realizaciones se pueden apilar con cualesquiera otros polinucleótidos de las realizaciones o con otros genes. Las combinaciones generadas también pueden incluir múltiples copias de cualquiera de los polinucleótidos de interés. Los polinucleótidos de las realizaciones también se pueden apilar con cualquier otro gene o combinación de genes para producir plantas con una variedad de combinaciones de características deseadas incluyendo, y en un sentido no limitativo, características deseables para alimentos para animales, tal como genes para un alto contenido de aceite (por ejemplo, Patente de EE.UU. N°: 6.232.529); aminoácidos balanceados (por ejemplo, hordotioninas (Patentes de EE.UU. N°: 5.990.389; 5.885.801; 5.885.802; y 5.703.409); cebada rica en lisina (Williamson et al. (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106; y WO 98/20122); y proteínas ricas en metionina (Pedersen et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:6279; Kirihara et al. (1988) Gene 71:359; y Musumura et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 123)); mayor digestibilidad (por ejemplo, proteínas de almacenamiento modificadas (Solicitud de Patente de EE.UU. N°: 10/053.410, presentada el 7 de noviembre, 2001); y tiorredoxinas (Solicitud de Patente de EE.UU. N°: 10/005.429, presentada el 3 de diciembre, 2001)), cuyos contenidos se incorporan en la presente a modo de referencia. Los polinucleótidos de la presente invención también pueden apilarse o combinarse con caracteres deseables para obtener resistencia a insectos, enfermedades o herbicidas (por ejemplo, las proteínas tóxicas de Bacillus thuringiensis (Patentes de EE.UU. N°: 5.366.892; 5.747.450; 5.737.514; 5.723.756; 5.593.881; Geiser et al (1986) Gene 48:109); lectinas (Van Damme et al. (1994) Plant Mol. Biol. 24:825); genes de detoxificación de fumonisina (Patente de EE.UU. N°: 5.792.931); genes de avirulencia y resistencia a enfermedades (Jones et al. (1994) Science 266:789; Martin et al. (1993) Science 262:1432; Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089); mutantes de acetolactato sintasa (ALS) que conducen a resistencia a herbicidas tal como las mutaciones S4 y/o Hra (Lee et al., (1988) EMBO J. 7(5): 1241 -1248), resistencia a inhibidores de glutamina sintasa tal como fosfinotricina o basta (por ejemplo, el gen bar; De Block et al. (1987) EMBO J. 6:2513-2518); genes HPPD que confieren tolerancia a herbicidas inhibidores de HPPD tal como mesotriona o isoxaflutol (Matringe et al. (2005) Pest Management Science 61:269-276; Dufourmantel et al., (2007) Plant Biotech. J. 5:118-133; véase también W01997049816), genes de tolerancia a herbicidas inhibidores de PPO (Li y Nicholl (2005) Pest Management Science 61:277-285); genes de resistencia a auxinas sintéticas (Solicitud de Patente de los EE.UU. N°: 2005/014737 y Hermán et al., (2005) J. Biol. Chem. 280: 24759-24767) y resistencia a glifosato (genes de epsps, genes gat tales como los que se describen en la publicación de la Solicitud de Patente de los EE.UU. N°: US2004/0082770, también en WO02/36782 y WO03/092360)); y rasgos deseables para productos de procesamientos o de procesos, tal como gran contenido de aceite (por ejemplo, Patente de los EE.UU. N°: 6.232.529); aceites modificados (por ejemplo, genes de ácido graso desaturasa (Patente de los EE.UU. N°: 5.952.544; WO 94/11516)); almidones modificados (por ejemplo, ADPG pirofosforilasas (AGPasa), almidón sintetasas (SS), enzimas ramificadoras de almidón (SBE) y enzimas desramificadoras de almidón (SDBE)); y polímeros o bioplásticos (por ejemplo, Patente de los EE.UU. N°: 5.602.321 ; beta-cetotiolasa , polihidroxibutirato sintasa y acetoacetil-CoA reductasa (Schubert et al. (1988) J. Bacteriol. 170:5837-5847), que facilitan la expresión de polihidroxialcanoatos (PHA)), cuyas descripciones se incorporan en la presente a modo de referencia. También se podrían combinar los polinucleótidos de la presente invención con polinucleótidos que confieran caracteres de importancia agrícola, tales como esterilidad masculina (por ejemplo, véase la Patente de EE.UU. N°: 5.583.210), fuerza del tallo, tiempo de floración o caracteres de tecnología de transformación, tales como la regulación del ciclo celular o el direccionamiento de genes (por ejemplo, WO 99/61619; WO 00/17364; WO 99/25821 ), cuyas descripciones se incorporan en la presente a modo de referencia. Dichas combinaciones apiladas se pueden preparar empleando cualquier método, incluyendo, a modo de ejemplo, el cruzamiento de plantas por cualquier metodología convencional o TopCross®, o por transformación genética. Si los caracteres se agrupan mediante la transformación genética de las plantas, las secuencias de polinucleótidos de interés pueden combinarse en cualquier momento y en cualquier orden. Por ejemplo, se puede usar una planta transgénica que comprende una o más de las características deseadas como blanco para introducir otras características mediante una posterior transformación. Las características se pueden introducir simultáneamente en un protocolo de cotransformación con los polinucleótidos de interés provistos por cualquier combinación de casetes de transformación. Por ejemplo, si se introducirán dos secuencias, las dos secuencias pueden estar contenidas en casetes transformación separadas (trans) o pueden estar contenidas en el mismo cásete de transformación (cis). La expresión de las secuencias de interés puede ser dirigida por el mismo promotor o por promotores diferentes. En determinados casos, puede ser deseable introducir un cásete de transformación que suprimirá la expresión del polinucleótido de interés. Esto se puede acompañar con cualquier combinación de otros casetes de supresión o casetes de sobreexpresión para generar la combinación deseada de características en la planta. Se considera además que las secuencias de polinucleótidos pueden apilarse en una ubicación genómica deseada usando un sistema de recombinación específico del sitio. Véase, por ejemplo, W099/25821 , W099/25854, WO99/25840, W099/25855 y W099/25853, cuyos contenidos se incorporan en la presente a modo de referencia. Otras realizaciones incluyen plantas que se pueden obtener con un método que comprende: cruzar una planta que contiene al gen Nsf1 como primera planta progenitora, con una planta diferente que no contiene un gen Nsf1 como segunda planta progenitora, para asi obtener una progenie que comprende al gen Nsf1 del primer progenitor; y que además comprende opcionalmente uno o más pasos de cría adicionales para obtener la progenie de una o más generaciones adicionales que comprende al gen Nsf1 del primer progenitor. Dichas plantas de la realización incluyen plantas endogámicas e híbridos. Las semillas de dichas plantas, incluyendo aquellas semillas que son homocigotas y heterocigotas para el gen Nsf1 , y los métodos para obtener los productos vegetales que son el resultado del procesamiento de dichas semillas están comprendidas asimismo en la invención. El uso de dichas semillas en alimentos para consumo humano o para animales o en la producción de un producto de maíz, tal como fécula, harina y aceite, también constituye una realización de la invención. Una "línea ancestral" es una linea progenitora usada como fuente de genes, por ejemplo, para el desarrollo de líneas de élite. La "progenie" comprende los descendientes de la línea ancestral y pueden estar separados de sus ancestros por muchas generaciones de cría. Una "línea de élite" o una "cepa de élite" es una línea superior desde el punto de vista agronómico, que es el resultado de muchos ciclos de cruzamiento y selección de un desempeño agronómico superior. De manera similar, un "germoplasma de élite" es un germoplasma agronómicamente superior, típicamente derivado de y/o capaz de originar una planta con un rendimiento agronómico superior, tal como una línea de maíz o soja de élite existente o recientemente desarrollada. La invención también comprende el uso de marcadores moleculares para mover el gen o transgen en líneas de élite usando técnicas de cría. Los marcadores moleculares se pueden usar en una gran variedad de aplicaciones de cría de plantas (véase, por ejemplo, Staub et al. (1996) Hortscience 31: 729-741; Tanksley (1983) Plant Molecular Biology Repórter. 1: 3-8). Uno de las principales áreas de interés es la de incrementar la eficacia de la retrocruza y la introducción de genes usando una selección asistida por marcadores (MAS). Un marcador molecular que demuestra ligamiento con un locus que afecta una característica fenotípica deseada provee una herramienta útil para la selección de la característica en una población de plantas. Esto es particularmente así cuando el fenotipo es difícil de evaluar, por ejemplo muchas características de resistencia a enfermedades, o cuando el fenotipo aparece en una etapa tardía del desarrollo de las plantas, por ejemplo las características de las semillas. Dado que los ensayos con marcadores de ADN son menos trabajosos, y ocupan menos espacio físico que la determinación del fenotipo a campo, es posible evaluar poblaciones muy grandes, lo que incrementa la probabilidad de hallar un recombinante con el segmento blanco de la línea donante que se ha movido a la línea receptora. Cuanto más próximo está el ligamiento, mayor es la utilidad del marcador, ya que es menos probable que tenga lugar una recombinación entre el marcador y el gen responsable de la característica, lo que puede dar como resultado falsos positivos. Los marcadores flanqueadores disminuyen la probabilidad que tenga lugar una selección falso positivo ya que sería necesario un evento de recombinación doble.

La situación ideal es contar con un marcador en el propio gen, de modo que no pueda tener lugar una recombinación entre el marcador y el gen. Dicho marcador se conoce como un 'marcador perfecto'. Opcionalmente, los ácidos nucleicos de las realizaciones pueden ser dirigidos hacia los cloroplastos para su expresión. De este modo, cuando el ácido nucleico no se inserte directamente en el cloroplasto, el cásete de expresión va a contener además un ácido nucleico que codificará un péptido de tránsito para dirigir el producto génico de interés hacia los cloroplastos. Estos péptidos de tránsito son conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421 ; y Shah et al. (1986) Science 233:478-481). Las secuencias de direccionamiento al cloroplasto son conocidas en la técnica e incluyen la subunidad pequeña de la ribulosa-1 ,5-bifosfato carboxilasa de cloroplasto (Rubisco) (de Castro Silva Filho et al. (1996) Plant Mol. Biol. 30:769-780; Schnell et al. (1991 ) J. Biol. Chem. 266(5):3335-3342); la 5- (enolpiruvil)shiquimato-3-fosfato sintetasa (EPSPS) (Archer et al. (1990) J. Bioenerg. Biomemb. 22(6):789-810); la triptofano sintetasa (Zhao et al. (1995) J. Biol. Chem. 270(11 ):6081 -6087); la plastocianina (Lawrence et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(33):20357-20363); la corismato sintetasa (Schmidt et al. (1993) J. Biol. Chem. 268(36):27447-27457); y la proteína de unión a clorofila a/b del complejo secuestrante de luz (LHBP) (Lamppa et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:14996-14999). Véanse también Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; y Shah et al. (1986) Science 233:478-481). En la técnica se conocen métodos para transformar cloroplastos. Véanse, por ejemplo, Svab et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 87:8526-8530; Svab y Maliga (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 90:913-917; Svab y Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. El método se basa en la administración mediada por una pistola de partículas del ADN que contiene un marcador seleccionable y el direccionamiento del ADN al genoma del plástido por recombinación homologa. Además, la transformación del plástido se puede efectuar mediante la transactivación de un transgen silencioso perteneciente al plásmido, a través de la expresión con preferencia por tejidos de una ARN polimerasa codificada por el núcleo y dirigida hacia el plástido. Dicho sistema se ha descrito en McBride et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU.91:7301-7305. Se puede optimizar la expresión de los ácidos nucleicos que serán dirigidos al cloroplasto teniendo en cuenta las diferencias en la utilización de codones entre el núcleo de la planta y este organela. De este modo, los ácidos nucleicos de interés se pueden sintetizar usando codones preferidos por el cloroplasto. Véase, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. N° 5.380.831, incorporada en la presente a modo de referencia. Los métodos de las realizaciones pueden comprender, y en un sentido no limitativo, la introducción de un polipéptido o polinucleótido en una planta. El término "introducción", significa presentarle el polinucleótido a la planta. En algunas realizaciones, el polinucleótido se presentará de modo tal que la secuencia acceda al interior de una célula de la planta, incluyendo su inserción potencial en el genoma de una planta. Los métodos de la invención no dependen de un método particular para introducir una secuencia en una planta, sino solamente del hecho que el polinucleótido o el polipéptido obtenga acceso al interior de al menos una célula de la planta. Los métodos para introducir polinucleótidos o polipéptidos en plantas son conocidos en la técnica, e incluyen, a modo de ejemplo, métodos de transformación estable, métodos de transformación transitoria y métodos mediados por virus. La "transformación" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico al genoma de un organismo huésped, que da como resultado una herencia genéticamente estable. Los organismos huésped que contienen a los fragmentos de ácido nucleico transformados se conocen como organismos "transgénicos". Una "célula huésped" se refiere a la célula en la cual tiene lugar la transformación de la construcción de ADN recombinante y puede incluir una célula de levadura, una célula bacteriana y una célula vegetal. Los ejemplos de métodos de transformación de plantas incluyen transformación mediada por Agrobacterium (De Blaere et al., 1987, Meth. Enzymol. 143:277) y tecnología de transformación con partículas aceleradas o "pistola de genes" (Klein et al., 1987, Nature (Londres) 327:70-73; Patente de EE.UU. N°: 4.945.050), entre otros. Una "transformación estable" denota que la construcción de nucleótidos introducida en una planta se integra en el genoma de la planta y que puede ser heredada por la progenie de la misma. Por "transformación transitoria" o "expresión transitoria", se interpreta que se introduce un polinucleótido en la planta que no se integra en el genoma o bien, se introduce un polipéptido en una planta. Los protocolos de transformación, y también los protocolos para introducir secuencias de polipéptidos o polinucleótidos en plantas, pueden variar según el tipo de planta o célula vegetal que se desea transformar, es decir monocotiledóneas o dicotiledóneas. Los métodos para introducir polipéptidos o polinucleótidos en células vegetales adecuados incluyen microinyección Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334), electroporación (Riggs et al. (1986) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 83:5602-5606, transformación mediada por Agrobacterium (Patentes de EE.UU. N°: 5.563.055 y 5.981.840), transferencia directa de genes (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722) y aceleración balística de partículas (véase, por ejemplo, Sanford et al., Patentes de EE.UU. N°: 4.945.050; 5.879.918; 5.886.244; y 5.932.782; Tomes et al. (1995) en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, editado por Gamborg y Phillips (Springer-Verlag , Berlín); y McCabe et al. (1988) Biotechnology 6: 923-926; y transformación de Lec1 (WO 00/28058). También véanse Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebolla); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soja); McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soja); Finer y McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P.175-182 (soja); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja); Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 85:4305-4309 (maíz); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559-563 (maíz); Patentes de EE.UU. N°: 5.240.855; 5.322.783 y 5.324.646; Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (maíz); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833-839 (maíz); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (Londres) 3 1.763-764; Patente de los EE.UU. N° 5.736.369 (cereales); Bytebier et al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985) en The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, editado por Chapman et al. (Longman, Nueva York), págs. 197-209 (polen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 y Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformación mediada por fibrillas); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporación); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 y Christou y Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (maíz por Agrobacterium tumefaciens); todos incorporados en la presente a modo de referencia. En la técnica son conocidos los métodos para una inserción dirigida de un polinucleotido en una ubicación específica en el genoma de la planta. En una realización, la inserción del polinucleotido en una ubicación genómica deseada se logra usando un sistema de recombinación especifico del sitio. Véanse, por ejemplo, W099/25821 , W099/25854, WO99/25840, W099/25855 y W099/25853, todas las cuales se incorporan en la presente a modo de referencia. Brevemente, el polinucleotido de las realizaciones se puede alojar en un cásete de transferencia rodeado por dos sitios de recombinación no idénticos. El cásete de transferencia es introducido en una planta que ha incorporado de forma estable en su genoma un sitio blanco que está flanqueado por dos sitios de recombinación no idénticos que se corresponden con los sitios del cásete de transferencia. Se provee una recombinasa apropiada y el cásete de transferencia se integra en el sitio blanco. De este modo, el polinucleotido de interés se integra en una posición cromosómica específica en el genoma de la planta. Las células que han sido transformadas pueden cultivarse para obtener plantas de acuerdo con medios convencionales. Véase, por ejemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas pueden cultivarse luego y polinizarse con la misma cepa transformada o con distintas cepas, y se puede identificar el híbrido resultante que presenta una expresión constitutiva de la característica fenotípica deseada. Pueden cultivarse dos o más generaciones para asegurar que la expresión de la característica fenotípica se mantenga y se herede en forma estable, y luego pueden cosecharse las semillas para asegurar que se haya obtenido la expresión de la característica fenotípica deseada. De este modo, las realizaciones proveen semillas transformadas (también conocidas como "semillas transgénicas") que contienen una construcción de nucleótidos de las realizaciones, por ejemplo, una construcción de ADN de las realizaciones, incorporada en forma estable en su genoma. Tal como se lo usa en la presente, el término planta incluye células vegetales, protoplastos vegetales, cultivos tisulares de células vegetales a partir de los cuales pueden regenerarse plantas de maíz, callos de plantas, masas de plantas y células vegetales que están intactas en plantas o partes de plantas, tales como embriones, polen, óvulos, semillas, hojas, flores, ramas, frutos, granos, espigas, mazorcas, vainas, tallos, raices, ápices de raíces, anteras y semejantes. Los granos hacen referencia a las semillas maduras producidas en los cultivos comerciales, con propósitos distintos del desarrollo o la reproducción de la especie. También se incluye la progenie, las variantes y los mutantes de las plantas regeneradas dentro del alcance de la invención, siempre que dichas partes comprendan los polinucleótidos introducidos. Las realizaciones de la invención se pueden usar para conferir o mejorar la resistencia a herbicidas en plantas, en especial en soja (Glycine max). También pueden ser de interés otras especies de plantas en la práctica de las realizaciones de la invención incluyendo, y en un sentido no limitativo, otras plantas de cultivo monocotiledóneas y dicotiledóneas. El gen de maíz de las realizaciones se encuentra comúnmente en la mayoría de las líneas de maíz comerciales, la mayoría de las cuales son naturalmente tolerantes a por lo menos uno, y habitualmente varios, herbicidas inhibidores de auxinas sintéticas, ALS-, PS II y de síntesis de pigmentos, tal como rimsulfurón, nicosulfurón y mesotriona. Por ello se prevé que la misma tolerancia para determinados herbicidas presente en la mayoría de las líneas de maíz puede extenderse a otras plantas de cultivo utilizando medios transgénicos con el uso del gen Nsf1 endógeno de maíz y variantes del mismo. Hay listados de líneas de maíz con tolerancia o sensibilidad a determinados herbicidas SU que se encuentran ampliamente disponibles, tal como los que se pueden obtener de USDA, ARS, National Genetic Resources Program. Germplasm Resources Information Network (GRIN). [Base de datos en línea] National Germplasm Resources Laboratory, Beltsville, Maryland. [recuperada el 6 de marzo, 2006]: Recuperado de internet: <URL: http://www.ars-grin.gov/cgi- bin/npgs/html/dno_eval_acc.pl?89201 + 153002 + 21 > ; y los listados de las "Líneas de Germoplasma de Maíz" disponible del sitio de internet de Buckler Laboratory [recuperado el 5 de marzo, 2006]: Recuperado de internet: <URL: http'J/www. maizegenetics.net/ind ex. php?page=germplasm/l i n es. html> , y también en artículos de referencia, tal como Kang (1993) J. Heredity. 84(3): 216-217. Cuando corresponda, se podrán optimizar los polinucleótidos para obtener una expresión incrementada en la planta transformada. Es decir, los polinucleótidos se podrán sintetizar usando los codones preferidos por la planta para obtener una expresión mejorada. Véase, por ejemplo, Campbell y Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11, por una descripción del uso de codones preferidos por el huésped. En la técnica existen métodos disponibles para sintetizar genes con preferencia por plantas. Véase, por ejemplo, las Patentes de los EE.UU. N° 5.380.831 y 5.436.391, y Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, incorporadas en la presente a modo de referencia. La presente invención puede usarse para transformar cualquier especie de planta, incluyendo, sin limitaciones, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los ejemplos de plantas de interés incluyen, a modo de ejemplo, maíz (Zea mays), Brassica sp. (por ejemplo, B. napus, B. rapa, B. júncea), alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeno (Sécale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), mijo (por ejemplo, mijo perlado (Pennisetum glaucum), mijo proso (Panicum miliaceum), mijo cola de zorro (Setaria itálica), mijo ahusado (Eleusine coracana)), girasol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), papa (Solanum tuberosum), maní (Arachis hypogaea), algodón (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata (Ipomoea batatus), casava (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucífera), ananá (Ananas comosus), árboles de cítricos (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao), té (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), avocado (Persea americana), higo (Ficus casica), guava (Psidium guajava), mango (Mangifera indica), oliva (Olea europaea), papaya (Carica papaya), anacardio (Anacardium occidentale), macadamia (Macadamia integrifolia), almendra (Prunus amygdalus), remolacha (Beta vulgarís), caña de azúcar (Saccharum spp.), avena (Avena spp.), cebada, palma, coco, semilla de ricino, oliva, habas (por ejemplo, guar, algarroba, fenogreco, soja, habas de jardín, fríjol mungo, fríjol lima, frijol común), arvejas (tal como garbanzos, arvejas de jardín, lentejas, caupí, etc.), verduras, plantas ornamentales y coniferas. Otras plantas de interés para la invención incluyen las que tienen el potencial para su uso como cultivos de biocombustible, incluyendo, pero en un sentido no limitativo, pastos de pradera tal como Panicum virgatum, Pennisetum purpureum, pasto Johnson (Sorghum halepense), Miscanthus spp., así como árboles de álamo híbrido y sauce híbrido. Las verduras incluyen tomate (Lycopersicon esculentum), lechuga (por ejemplo, Lactuca sativa), judías verdes (Phaseolus vulgaris), judías lima (Phaseolus limensis), arvejas (Lathyrus spp.), y miembros de los géneros Cucumis, tales como el pepino (C. sativus), el melón (C. cantalupensis) y el melón musk (C. meló). Las plantas ornamentales incluyen azalea (Rhododendron spp.), hidrangea (Macrophylla hidrangea), hibiscus (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipanes (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), petunias (Petunia hybrida), clavel (Dianthus caryophyllus), pastora roja (Euphorbia pulcherrima) y crisantemo. Las realizaciones proveen no sólo un gen de utilidad en aplicaciones transgénicas, sino secuencias y métodos que permiten usar al gen de resistencia como un marcador en estrategias de cría en maíz. Por ejemplo, se puede identificar al gen de las realizaciones, o al locus que contiene al mismo, en una línea de cultivo destinada a la cría. En general, los criadores desean evitar el uso de líneas de cultivo que son sensibles a herbicidas cuando existe la tolerancia natural habitual. Por consiguiente, la identificación de la secuencia del gen Nsf1 ayudará a los criadores a identificar y evitar la creación de líneas sensibles a herbicidas. Se pueden desarrollar y aplicar marcadores basados en ácidos nucleicos usando muchas tecnologías diferentes. Dichas tecnologías incluyen, y en un sentido no limitativo, polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), repeticiones de secuencia simples (SSR), ADN polimórfico amplificado aleatorio (RAPD), secuencias polimórficas amplificadas cortadas (CAPS) (Rafalski y Tingey, 1993, Trends in Genetics 9:275-280), polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados (AFLP) (Vos et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23:4407-4414), polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) (Brookes, 1999, Gene 234: 77-186), región amplificada caracterizada por una secuencia (SCAR) (Paran y Michelmore, 1993, Theor. Appl. Genet. 85:985-993), sitio marcado con una secuencia (STS) (Onozaki et al., 2004, Euphytica 138:255-262), polimorfismo de conformación de cadena simple (SSCP) (Orita et al., 1989, Proc Nati Acad Sci EE.UU. 86:2766-2770), repetición entre secuencias simples (ISSR) (Blair et al., 1999, Theor. Appl. Genet. 98:780-792), polimorfismo amplificado inter-retrotransposón (IRAP), polimorfismo amplificado de retrotransposón-microsatélite (REMAP) (Kalendar et al. (1999) Theor. Appl. Genet. 98:704-711) y semejantes. Tal como se utiliza en la presente, el término "locus" se refiere generalmente a una región genéticamente definida de un cromosoma que contiene un gen o, posiblemente, dos o más genes tan estrechamente ligados que desde un punto de vista genético se comportan como un solo locus responsable de un fenotipo. Un "gen" hará referencia a un gen específico dentro de dicho locus, incluyendo sus secuencias reguladoras asociadas. Por lo tanto, el locus Nsf1 se refiere a la región cromosómica definida genéticamente por conferir resistencia a por lo menos un herbicida de la clase de herbicidas inhibidores de ALS, inhibidores de PPO, inhibidores de la síntesis de pigmentos, inhibidores de PS II y de auxinas sintéticas. Una realización de la presente invención comprende el aislamiento del gen Nsf1 y la demostración que es el gen responsable del fenotipo conferido por la presencia del locus. Los loci definidos genéticamente, por naturaleza, no lo están con mucha precisión en términos de tamaño como genes, que pueden ser delineados molecularmente. Las unidades, prefijos y símbolos se indican en su forma aceptada SI. A menos que se indique lo contrario, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha y en orientación 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha y en orientación amino a carboxilo, respectivamente. Los rangos numéricos incluyen a los números definidos en el rango. Los aminoácidos se designan de acuerdo con los símbolos de tres letras comúnmente conocidos, o de acuerdo con los símbolos de una sola letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Asimismo, los nucleótidos pueden ser denominados por su código de una única letra comúnmente aceptado. Los términos definidos precedentemente se explican con mayor detalle con referencia a la totalidad de la memoria. Ejemplos Las realizaciones de la invención se definen también en los siguientes ejemplos, en donde todas las partes y los porcentajes son en peso y los grados son Celsius, a menos que se indique de otra manera. Se comprenderá que estos ejemplos, en tanto indican las realizaciones preferidas de la invención, solamente se ofrecen a efectos ilustrativos. A partir de la descripción anterior y de estos ejemplos, el especialista en la técnica puede comprender las características esenciales de las realizaciones de esta invención y, sin apartarse del espíritu y el alcance de la misma, puede efectuar diversos cambios y modificaciones de la misma para adaptarla a diversos usos y condiciones. Por consiguiente, hay diversas modificaciones de la invención, además de las que se presentan y describen en la presente, que serán evidentes para los especialistas en la técnica a partir de la descripción anterior. Tales modificaciones pretenden quedar también dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. La descripción de cada referencia indicada anteriormente se incorpora por completo en la presente a modo de referencia. Ejemplo 1 Identificación del gen Nsf1 mediante clonación por posición Se desarrolló una población BC1 (50% Nsf1/nsf1, 50% nsf1/nsf1, valores esperados) usando al endogámico sensible W703A como progenitor recurrente y ya sea B73 o Q66 como línea resistente. Las plantas fueron rociadas con una solución de nicosulfurón 2,3 mM, agente tensioactivo Kinetic 0,5% v/v en la etapa V3 aproximadamente. También se cultivaron y rociaron progenitores resistentes y sensibles como controles. Con el fin de evitar la clasificación falsa de una planta que posiblemente muriera debido a otras razones que no tuvieran que ver con la aplicación del herbicida, solamente se tomaron y analizaron muestras de la progenie resistente. Se empleó un total de 96 plantas resistentes para el mapeo inicial. Esto fue suficiente para ubicar Nsf1 entre los marcadores umc1766 y umc2036, y por lo tanto en el contig 202 del mapa físico basado en maizeB73 ((recuperado el 6 de marzo, 2006) recuperado de internet <URL: http://www.gramene.org/Zea_mays/cytoview?contig = ctg202&x=44&y= 9>). Sobre la base de las secuencias terminales de BAC de un contig basado en maíz Mol, se identificaron marcadores de CAPS (secuencia polimórfica amplificada y cortada) flanqueadores en los BAC del contig 202. Para un mapeo más fino de este intervalo, se usó un total de 388 plantas resistentes en el paso siguiente. Sobre la base de la secuenciación de los fragmentos subcionados de los BAC en este intervalo, se encontraron dos marcadores CAP flanqueadores sobre BACs superpuestos. Ambos marcadores tenían 2/388 recombinantes. Se secuenciaron y analizaron los dos BACs. Dentro de la región de163 kb de los 2 BACs flanqueados por dos marcadores comerciales, P1 y P2, había varios genes putativos. Para la tercera ronda de mapeo, se usó un total de 2584 plantas resistentes, y se desarrollaron marcadores para separar algunos de dichos genes. Un marcador mostró 11/2584 (0,4%) recombinantes, lo que ayuda a eliminar determinados genes como responsables de la resistencia. Otros dos marcadores tenían cada uno 2 (0,08%) recombinantes, con lo cual se eliminó otro gen más. Finalmente, un marcador entre dos genes tenía un solo recombinante (0,04%), lo que elimina uno de los dos genes. Así se determinó el gen que era el gen de interés. Se determinó que el gen, Nsf1 , presentaba homología con algunos genes del citocromo P450 conocidos en la técnica. Ejemplo 2 Análisis del gen Nsf1 El análisis la secuencia del gen 18 (Nsf1) en el BAC derivado de B73 muestra un marco de lectura abierto de 521 aminoácidos y contiene el motivo de unión a hemo conservado FXXGXXXCXG (SEQ ID N°: 14) presente en todos los citocromos P450 (Figuras 1d y 2b). Con el fin de determinar si el alelo Nsf1 era coherente entre las líneas de maíz, se evaluaron tres líneas de maíz con niveles de sensibilidad desconocidos para nicosulfurón para determinar su reacción y luego evaluar sus secuencias. Las plantas fueron rociadas con una solución de nicosulfurón 2,3 mM, agente tensioactivo Kinetic 0,5% v/v en la etapa V3 aproximadamente. También se cultivaron y rociaron líneas resistentes y sensibles como controles. Los resultados de las pruebas con las tres líneas mostraron que las líneas Q66 y Black Mexican Sweet (BMS) eran resistentes y que la línea A188 era sensible. Estas otras dos líneas resistentes, Q66 y BMS, también poseen este ORF, aunque Q66 difiere de ambas B73 y BMS en 3 aminoácidos (Figura 2a y 2b). Estas tres variantes de aminoácidos están resaltadas con negritas y rectángulos en las Figuras 2a y 2b en la cadena de la secuencia Q66 para mostrar sus posiciones. El análisis de la línea sensible, GA209, muestra una inserción de 392 bp con relación a las líneas resistentes que da como resultado un desplazamiento del marco y un marco de lectura abierto de tan solo 338 aminoácidos (Figura 2b). Un estudio de numerosas líneas sensibles de los EE.UU. mostró que muchas de las líneas sensibles contienen esta misma inserción de ADN desconocido. El análisis de la secuencia de la línea sensible F2 mostró que solamente hay una diferencia de un nucleótido entre B73 (SEQ ID N°: 2) y F2 (SEQ ID N°: 22), que cambia el aminoácido 263 de arginina por treonina (Figura 2b). Este único cambio elimina entonces el fenotipo de resistencia y se espera que las variantes de secuencia con dicho cambio no retengan la actividad biológica. Este cambio es de utilidad en el desarrollo de un SNP para ayudar a los criadores de maíz a evitar este alelo susceptible. El gen Nsf1 es 67% idéntico a un citocromo P450 de arroz que según se describió recientemente controla la sensibilidad a sulfonilurea en dicha planta (N° Acceso: ABC69856, SEQ ID N°: 4). La secuencia genómica de B73 muestra un solo intrón con el borde izquierdo GT y el borde derecho AG esperados. La posición del intrón se muestra en el listado de secuencia en la SEQ ID N°: 16. La clonación de este gen presenta numerosas aplicaciones potencíales. Se podría usar como marcador seleccionable para la transformación en una linea transformable sensible tal como A188 (Ishida et al., (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). Un transgen diseñado para suprimir a la función del gen Nsf1 funcionaría como un marcador selecciónatele dominante negativo. También se podría usar al gen Nsf1 para crear resistencia transgénica en otras plantas, tal como soja, que son sensibles a esta subclase de sulfonilureas. Ejemplo 3: Pruebas con plantas de maíz por su sensibilidad a nicosulfurón Se efectuaron pruebas con tres líneas de maíz con niveles de sensibilidad desconocidos a nicosulfurón para determinar su reacción. Las plantas fueron rociadas con una solución de nicosulfurón 2,3 mM, agente tensioactivo Kinetic 0,5% v/v en la etapa V3 aproximadamente. También se cultivaron y rociaron líneas resistentes y sensibles como controles. Los resultados de las pruebas con las tres líneas mostraron que las líneas Q66 y BMS eran resistentes y que la línea A188 era sensible. Ejemplo 4: Preparación de plantas de soja transgénicas Se usaron las siguientes soluciones madre y medios para la transformación y regeneración de plantas de soja: Soluciones madre Solución madre de sulfato 100 X: 37,0 g de MgS04.7H20, 1,69 g de MnS04.H20, 0,86 g de ZnS04.7H20, 0,0025 g de CuS04.5H20. Solución madre de haluros 100 X: 30,0 g de CaCI2.2H20, 0,083 g de Kl, 0,0025 g de CoCI2.6H20, Solución madre de P, B, Mo 100 X: 18,5 g de KH2P04, 0,62 g de H3B03, 0,025 g de Na2Mo04.2H20 Solución madre de Fe EDTA 100 X: 3,724 g de Na2EDTA, 2,784 g de FeS04.7H20. Solución madre de 2,4-D: 10 mg/ml. Solución madre de vitaminas B5 1000X: 10,0 g de mio-inositol, 0,10 g de ácido nicotínico, 0,10 g de piridoxina HCI, 1 g de tiamina. Medios (por litro) SB196: 10 mi de cada una de las soluciones madre anteriores, 1 mi de solución madre de vitamina B5, 0,463 g de (NH4)2S04, 2,83 g de KN03, 1 mi de solución madre de 2,4-D, 1 g de asparagina, 10 g de sacarosa, pH 5,7. SB103: 1 paquete de mezcla de sales de Murashige y Skoog, 1 mi de solución madre de vitamina B5, 750 mg de MgCI2 hexahidrato, 60 g de maltosa, 2 g de Gelrite, pH 5,7. SB166: SB103 suplementado con 5 g por litro de carbón activado. SB71-4: sales B5 de Gamborg (Gibco-BRL N° catálogo 21153-028), 1 mi de solución madre de vitamina B5, 30 g de sacarosa, 5 g de agar TC, pH 5,7. Se mantuvieron cultivos en suspensión embrionarios de soja en 35 mi de medio líquido (SB196) sobre un agitador rotatorio (150 rpm) a 28 °C con luces fluorescentes que proporcionaban un ciclo de 16 horas de luz diurna/8 horas de luz nocturna. Los cultivos se subcultivaron cada 2 semanas inoculando aproximadamente 35 mg de tejido en 35 mi de medio líquido fresco. Los cultivos en suspensión embrionarios de soja fueron transformados mediante bombardeo con pistola de partículas (véase Klein et al. (1987) Nature 327:70-73) usando el instrumento Biolistic PDS1000/He de DuPont. El plásmido de ADN recombinante usado para expresar Nsf1 se encontraba sobre un plásmido de ADN recombinante separado del gen marcador de selección. Ambos plásmidos de ADN recombinante se coprecipitaron sobre partículas de oro de la siguiente manera. Los ADN en suspensión se agregaron a 50 µ? de una suspensión de partículas de oro de 0,6 pm 20-60 mg/ml y luego se combinaron con 50 µ? de CaCI2 (2,5 M) y 20 µ? de espermidina (0,1 M). La mezcla se agitó usando vortexeo por pulsos 5 veces, se centrifugó en una microcentrífuga durante 10 segundos y se retiró el sobrenadante. Las partículas recubiertas con ADN se lavan luego una vez con 150 µ? de etanol 100%, nuevamente se agitaron por vortexeo por pulsos y se centrifugaron en una microcentrífuga y se resuspendieron en 85 µ? de etanol anhidro. Después se cargan cinco microlitros de partículas de oro recubiertas con ADN sobre cada disco macrotransportador. Se colocan aproximadamente 150 a 250 mg de un cultivo en suspensión de dos semanas en una caja de Petri de 60x15 mm vacía y el líquido residual del tejido se retira con la ayuda de una pipeta. El tejido se colocó a 3,5 pulgadas aproximadamente de una pantalla de retención y cada placa de tejido se bombardeó una vez.

La presión de la ruptura de membrana se ajustó en 650 psi y la cámara se evacuó hasta —28 pulgadas de Hg. Se bombardearon dieciocho placas y, después del bombardeo, se dividió el tejido de cada placa entre dos frascos, se volvieron a colocar en medio líquido y se cultivaron como se describió previamente. Siete días después del bombardeo, el medio líquido se cambió por medio SB196 fresco suplementado con higromicina 50 mg/ml. El medio selectivo se cambió cada semana o cada dos semanas. Siete semanas después del bombardeo, se observó tejido transformado verde creciendo desde las agrupaciones embriogénicas necróticas no transformadas. Se retiró el tejido verde aislado y se lo inoculó en frascos individuales con el fin de generar nuevos cultivos embriogénicos transformados en suspensión, propagados por clonación. Así, cada línea nueva era tratada como un evento de transformación independiente. Estas suspensiones se mantuvieron luego como suspensiones de agrupaciones de embriones en una etapa de desarrollo inmaduro por subcultivo o se regeneraron en plantas completas por maduración y germinación de los embriones somáticos individuales. Las agrupaciones embrionarias transformadas se separaron del cultivo líquido y se colocaron sobre medio de agar sólido (SB166) que no contiene hormonas o antibióticos durante una semana. Los embriones se cultivaron a 26 °C con luz mixta fluorescente e incandescente con un programa de 16 horas diurnas: 8 horas nocturnas. Después de una semana, los cultivos eran transferidos a medio SB103 y luego se mantuvieron bajo las mismas condiciones de crecimiento durante otras 3 semanas adicionales. Antes de la transferencia del cultivo líquido al medio sólido, el tejido de las líneas seleccionadas fue evaluado usando PCR por la presencia del gen quimérico. Los embriones somáticos eran adecuados para la germinación al cabo de 4 semanas y eran retirados entonces del medio de maduración y secados en cajas de Petri vacías por uno a cinco días. Los embriones secos se plantaron en medio SB71-4 y se dejaron germinar bajo las mismas condiciones de luz y germinación que se describieron previamente. Los embriones germinados fueron transferidos a tierra estéril y se cultivaron hasta la madurez. Ejemplo 5 Análisis de plantas transgénicas TO y T1 Pruebas con TO Se crearon dos construcciones diferentes que comprenden al gen Nsf1 para examinar la eficacia herbicida del gen cuando era transformado en soja. Las construcciones Nsf1 se cobombardearon con un inserto 35S.HYG para poder seleccionar el evento usando higromicina. En la etapa de crecimiento V2 a V6, se roció un total de 127 plantas TO con rimsulfurón 35 g/ha. Todos los tratamientos con rimsulfurón fueron aplicados con agente tensioactivo no iónico 0,2% p/p en un volumen de rociado de 287 l/ha. Además de las plantas TO, se incluyeron réplicas de tres controles diferentes: dos positivos y uno negativo. Se evaluaron plantas individuales por su respuesta al herbicida a los diez días después del tratamiento y se les asignaron puntajes de respuesta visual del 1 al 9 (1 = planta muerta al 9 = no se observó ningún efecto). Sobre la base de los puntajes de gran tolerancia al rociado inicial con rimsulfurón, se rociaron cinco eventos TO con una dosis adicional de rimsulfurón de 35 g/ha. Las plantas fueron calificadas por la tolerancia visual usando un puntaje del 1 al 9 a los diez días después de la segunda aplicación. En la generación TO, 4 de 51 eventos mostraron una mayor tolerancia en comparación con los controles diez días después del tratamiento con una dosis de rimsulfurón de 35 g/ha. Tres de los 51 eventos TO mostraron un mayor nivel de tolerancia después de una aplicación adicional de rimsulfurón a 35 g/ha. Dos de estos 51 eventos se llevaron a la generación T1 para efectuar una prueba más extensa con el herbicida. Pruebas con T1 Se llevaron dos eventos de la generación TO a la generación T1 para efectuar pruebas adicionales de eficacia del herbicida con el gen Nsf1. Se cultivaron réplicas de los dos controles, así como plantas T1, en experimentos en invernadero y se rociaron con mesotriona a una de dos dosis (200 g/ha o 50 g/ha), con nicosulfurón (70 g/ha) o con rimsulfurón (35 g/ha) en la etapa de crecimiento V3. Todos los tratamientos con herbicida fueron aplicados con adyuvante de aceite de semillas modificado 1% p/p en un volumen de rociado de 374 l/ha. Las plantas fueron calificadas por su respuesta al herbicida a los ocho días después de la aplicación usando un puntaje de 1 a 9 como se usó en las pruebas con TO. Se desarrolló una prueba ampliada para la eficacia herbicida en un segundo experimento con plantas T1 para los mismos dos eventos que provenían de la generación TO. En la etapa de crecimiento V3, las plantas se rociaron con diferentes tratamientos de herbicidas que típicamente podrían causar un daño sustancial en el cultivo cuando eran aplicados a soja comercial a las dosis examinadas. Todos los tratamientos con herbicida se aplicaron en un volumen de rociado de 287 l/ha. Se aplicó isoxaflutol (140 g/ha), topramezone (140 g/ha) y sulcotriona (140 g/ha) con adyuvante de aceite de semillas modificado 1% p/p. Los tratamientos con diurón (560 g/ha) se aplicaron con adyuvante de aceite de petróleo 1% p/p. Se aplicó acifluorfén (4480 g/ha), sulfentrazona (140 g/ha), flumioxazina (140 g/ha) y dicamba (280 g/ha) con agente tensioactivo no iónico 0,25% p/p. Los tratamientos con rimsulfurón (35 g/ha) se aplicaron con un adyuvante tipo mezcla básico 0,5% p/p. A los ocho y quince días después del tratamiento, las plantas fueron calificadas visualmente por lesiones usando una escala de 0 a 100 (0 = sin lesiones a 100 = planta muerta). Dado que los eventos T1 eran segregantes, solamente se seleccionaron las plantas con los mejores puntajes generales, correspondientes al 75% que según lo esperado iban a contener al transgen. Uno de los dos eventos tenía una tolerancia significativamente mayor en comparación con los controles a los 8 DAT y 15 DAT después de aplicar los tratamientos con acifluorfén, dicamba, diurón, flumioxazina, isoxaflutol, mesotriona, rimsulfurón, sulcotriona, sulfentrazona y topramezone. El segundo evento tenía una tolerancia significativamente mayor en comparación con los controles a los 15 DAT después de aplicar los tratamientos con de acifluorfén, dicamba, isoxaflutol, mesotriona, rimsulfurón, sulcotriona, sulfentrazona y topramezone. Aunque no se determinó el nivel de expresión exacto del gen Nsf1 en los eventos evaluados, las plantas transgénicas de soja que comprende al gen Nsf1 de maíz mostró una mayor tolerancia a un rango de diferentes herbicidas cuando se comparaban directamente con plantas control.

Claims

REIVINDICACIONES: 1. Un polinucleótido aislado, CARACTERIZADO PORQUE comprende: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido capaz de conferir resistencia a por lo menos un herbicida, en donde dicho herbicida es un miembro de una clase de herbicidas seleccionada del grupo formado por: (i) la clase inhibidora de ALS; (¡i) la clase inhibidora de la síntesis de pigmentos; (iii) la clase inhibidora de PPO; (iv) la clase inhibidora de PS II; y (v) la clase de auxinas sintéticas en donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos con al menos 85% de identidad cuando se compara con la SEQ ID N°:1, basado en el algoritmo de alineación de Needleman-Wunsch o (b) un complemento de la secuencia de nucleótidos, donde dicho complemento y la secuencia de nucleótidos consisten del mismo número de nucleótidos y son 100% complementarios; y
2. El polinucleótido aislado de la cláusula 1, CARACTERIZADO PORQUE el polipéptido puede conferir resistencia a por lo menos dos herbicidas, en donde cada herbicida es un miembro de una clase diferente de herbicidas seleccionada del grupo formado por: (a) la clase inhibidora de ALS; (b) la clase inhibidora de la síntesis de pigmentos; (c) la clase inhibidora de PPO; (d) la clase inhibidora de PS II; y (e) la clase de auxinas sintéticas.
3. El polinucleótido aislado de la cláusula 1, CARACTERIZADO PORQUE el polipéptido puede conferir resistencia a por lo menos tres herbicidas, en donde cada herbicida es un miembro de una clase diferente de herbicidas seleccionada del grupo formado por: (a) la clase inhibidora de ALS; (b) la clase inhibidora de la síntesis de pigmentos; (c) la clase inhibidora de PPO; (d) la clase inhibidora de PS II; y (e) la clase de auxinas sintéticas.
4. El polinucleótido aislado de la cláusula 1, CARACTERIZADO PORQUE el polipéptido puede conferir resistencia a por lo menos cuatro herbicidas, en donde cada herbicida es un miembro de una clase diferente de herbicidas seleccionada del grupo formado por: (a) la clase inhibidora de ALS; (b) la clase inhibidora de la síntesis de pigmentos; (c) la clase inhibidora de PPO; (d) la clase inhibidora de PS II; y (e) la clase de auxinas sintéticas.
5. El polinucleótido aislado de la cláusula 1, CARACTERIZADO PORQUE el polipéptido puede conferir resistencia a por lo menos cinco herbicidas, en donde cada herbicida es un miembro de una clase diferente de herbicidas seleccionada del grupo formado por: (a) la clase inhibidora de ALS; (b) la clase inhibidora de la síntesis de pigmentos; (c) la clase inhibidora de PPO; (d) la clase inhibidora de PS II; y (d) la clase de auxinas sintéticas.
6. El polinucleótido de la cláusula 1, CARACTERIZADO PORQUE la secuencia de aminoácidos del polipéptido y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 1 tienen al menos un 90% de identidad basado en el algoritmo de alineación de Needleman-Wunsch.
7. El polinucleótido de la cláusula 1, CARACTERIZADO PORQUE la secuencia de aminoácidos del polipéptido y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 1 tienen al menos un 95% de identidad basado en el algoritmo de alineación de Needleman-Wunsch.
8. El polinucleótido de la cláusula 1, CARACTERIZADO PORQUE la secuencia de nucleótidos comprende la SEQ ID N°: 1.
9. Un vector, CARACTERIZADO PORQUE comprende al polinucleótido de la cláusula 1.
10. Una construcción de ADN recombinante, CARACTERIZADA PORQUE comprende al polinucleótido de la cláusula 1 ligado operativamente a por lo menos una secuencia reguladora.
11. Un método para transformar una célula, CARACTERIZADO PORQUE comprende transformar una célula con el polinucleótido de la cláusula 1.
12. Una célula vegetal, CARACTERIZADA PORQUE comprende la construcción de ADN recombinante de la cláusula 10.
13. Un método para producir una planta, CARACTERIZADO PORQUE comprende transformar una célula vegetal con la construcción de ADN recombinante de la cláusula 10 y regenerar una planta a partir de la célula vegetal transformada.
14. Una planta, CARACTERIZADA PORQUE comprende la construcción de ADN recombinante de la cláusula 10.
15. Una semilla, CARACTERIZADA PORQUE comprende la construcción de ADN recombinante de la cláusula 10.
16. La planta de la cláusula 14, CARACTERIZADA PORQUE dicha planta es una monocotiledónea.
17. La planta de la cláusula 16, CARACTERIZADA PORQUE dicha dicotiledónea se selecciona del grupo formado por maíz, trigo, cebada, avena, Panicum virgatum, sorgo y arroz.
18. La planta de la cláusula 14, CARACTERIZADA PORQUE dicha planta es una dicotiledónea.
19. La planta de la cláusula 18, CARACTERIZADA PORQUE dicha dicotiledónea se selecciona del grupo formado por soja, cañóla, papa, algodón y girasol.
20. La planta de la cláusula 14, CARACTERIZADA PORQUE dicha planta además comprende un segundo gen de resistencia a herbicidas.
21. La planta de la cláusula 14, CARACTERIZADA PORQUE dicha planta además comprende un gen que codifica un polipéptido con actividad glifosato N-acetiltransferasa.
22. La planta de la cláusula 21, CARACTERIZADA PORQUE dicha planta además comprende un segundo gen de resistencia a herbicidas que codifica un polipéptido que confiere tolerancia a inhibidores de ALS.
23. La planta de la cláusula 14, CARACTERIZADA PORQUE dicha planta además comprende un gen que codifica un polipéptido insecticida.
24. Una planta con mayor tolerancia a por lo menos un herbicida, CARACTERIZADA PORQUE comprende la construcción de ADN recombinante de la cláusula 10, en donde dicha planta además comprende un segundo gen de resistencia a herbicidas que provee un nivel de tolerancia a un herbicida seleccionado de una clase de herbicidas seleccionada del grupo formado por: (a) la clase inhibidora de ALS; (b) la clase inhibidora de la síntesis de pigmentos; (c) la clase inhibidora de PPO; (d) la clase inhibidora de PS II; y (e) la clase de auxinas sintéticas; en donde la construcción recombinante de la cláusula 10 le confiere a la planta un mayor nivel de tolerancia al herbicida que el nivel de tolerancia de una planta que comprende al segundo gen de resistencia a herbicidas pero que no comprende la construcción recombinante de la cláusula 10.
25. Un método para conferir o mejorar la resistencia a por lo menos un herbicida, en donde dicho herbicida se selecciona entre clases de herbicidas seleccionadas del grupo formado por: (a) la clase inhibidora de ALS; (b) la clase inhibidora de la síntesis de pigmentos; (c) la clase inhibidora de PPO; (d) la clase inhibidora de PS II; y (e) la clase de auxinas sintéticas; CARACTERIZADO PORQUE comprende transformar una planta con la construcción de ADN recombinante de la cláusula 10, confiriendo o mejorando de esa manera la resistencia a dicho por lo menos un herbicida.
26. Un método para conferir o mejorar la resistencia a por lo menos dos herbicidas, en donde cada herbicida se selecciona entre clases de herbicidas seleccionadas del grupo formado por: (a) la clase inhibidora de ALS; (b) la clase inhibidora de la síntesis de pigmentos; (c) la clase inhibidora de PPO; (d) la clase inhibidora de PS II; y (e) la clase de auxinas sintéticas; CARACTERIZADO PORQUE comprende transformar una planta con la construcción de ADN recombinante de la cláusula 10, confiriendo o mejorando de esa manera la resistencia a dichos por lo menos dos herbicidas.
27. Un método para conferir o mejorar la resistencia a por lo menos tres herbicidas, en donde cada uno de dichos herbicidas se selecciona entre clases de herbicidas seleccionadas del grupo formado por: (a) la clase inhibidora de ALS; (b) la clase inhibidora de la síntesis de pigmentos; (c) la clase inhibidora de PPO; (d) la clase inhibidora de PS II; y (e) la clase de auxinas sintéticas; CARACTERIZADO PORQUE comprende transformar una planta con la construcción de ADN recombinante de la cláusula 10, confiriendo o mejorando de esa manera la resistencia a dichos por lo menos tres herbicidas.
28. Un método para conferir o mejorar la resistencia a por lo menos cuatro herbicidas, en donde cada herbicida se selecciona entre clases de herbicidas seleccionadas del grupo formado por: (a) la clase inhibidora de ALS; (b) la clase inhibidora de la síntesis de pigmentos; (c) la clase inhibidora de PPO; (d) la clase inhibidora de PS II; y (e) la clase de auxinas sintéticas; CARACTERIZADO PORQUE comprende transformar una planta con la construcción de ADN recombinante de la cláusula 10, confiriendo o mejorando de esa manera la resistencia a dichos al menos cuatro herbicidas.
29. Un método para conferir o mejorar la resistencia a por lo menos cinco herbicidas, en donde cada herbicida se selecciona entre clases de herbicidas seleccionadas del grupo formado por: (a) la clase inhibidora de ALS; (b) la clase inhibidora de la síntesis de pigmentos; (c) la clase inhibidora de PPO; (d) la clase inhibidora de PS II; y (e) la clase de auxinas sintéticas; CARACTERIZADO PORQUE comprende transformar una planta con la construcción de ADN recombinante de la cláusula 10, confiriendo o mejorando de esa manera la resistencia a dichos por los menos cinco herbicidas.
30. Un método para alterar el nivel de expresión de una proteína que puede conferir resistencia a por lo menos un herbicida en una célula vegetal, CARACTERIZADO PORQUE comprende: (a) transformar una célula vegetal con la construcción de ADN recombinante de la cláusula 10; y (b) cultivar la célula vegetal transformada bajo condiciones que son adecuadas para expresar la construcción de ADN recombinante, en donde dicha expresión de la construcción de ADN recombinante da como resultado la producción de niveles alterados de una proteína que puede conferir resistencia a por lo menos un herbicida en el huésped transformado; en donde dicho al menos un herbicida se selecciona entre clases de herbicidas seleccionadas del grupo formado por: (i) la clase inhibidora de ALS; (ii) la clase inhibidora de la síntesis de pigmentos; (Mi) la clase inhibidora de PPO; (iv) la clase inhibidora de PS II; y (v) la clase de auxinas sintéticas.
31. Un método para alterar el nivel de expresión de una proteína que puede conferir resistencia a por lo menos dos herbicidas en una célula vegetal, CARACTERIZADO PORQUE comprende: (a) transformar una célula vegetal con la construcción de ADN recombinante de la cláusula 10; y (b) cultivar la célula vegetal transformada bajo condiciones que son adecuadas para expresar la construcción de ADN recombinante, en donde dicha expresión de la construcción de ADN recombinante da como resultado la producción de niveles alterados de una proteína que puede conferir resistencia a dichos al menos dos herbicidas en el huésped transformado; en donde cada uno de dichos al menos dos herbicidas se selecciona entre clases de herbicidas seleccionadas del grupo formado por: (i) la clase inhibidora de ALS; (ii) la clase inhibidora de la síntesis de pigmentos; (iii) la clase inhibidora de PPO; (iv) la clase inhibidora de PS II; y (v) la clase de auxinas sintéticas.
32. Un método para alterar el nivel de expresión de una proteína que puede conferir resistencia a por lo menos tres herbicidas en una célula vegetal, CARACTERIZADO PORQUE comprende: (a) transformar una célula vegetal con la construcción de ADN recombinante de la cláusula 10; y (b) cultivar la célula vegetal transformada bajo condiciones que son adecuadas para expresar la construcción de ADN recombinante, en donde la expresión de la construcción de ADN recombinante da como resultado la producción de niveles alterados de una proteína que puede conferir resistencia a dichos al menos tres herbicidas en el huésped transformado; en donde cada uno de dichos al menos tres herbicidas se selecciona entre clases de herbicidas seleccionadas del grupo formado por: (i) la clase inhibidora de ALS; (ii) la clase inhibidora de la síntesis de pigmentos; (iii) la clase inhibidora de PPO; (¡v) la clase inhibidora de PS II; y (v) la clase de auxínas sintéticas.
33. Un método para alterar el nivel de expresión de una proteína que puede conferir resistencia a por lo menos cuatro herbicidas en una célula vegetal, CARACTERIZADO PORQUE comprende: (a) transformar una célula vegetal con la construcción de ADN recombinante de la cláusula 10; y (b) cultivar la célula vegetal transformada bajo condiciones que son adecuadas para expresar la construcción de ADN recombinante, en donde la expresión de la construcción de ADN recombinante da como resultado la producción de niveles alterados de una proteína que puede conferir resistencia a dichos al menos cuatro herbicidas en el huésped transformado; en donde cada uno de dichos al menos cuatro herbicidas se selecciona entre clases de herbicidas seleccionadas del grupo formado por: (i) la clase inhibidora de ALS; (ii) la clase inhibidora de la síntesis de pigmentos; (iii) la clase inhibidora de PPO; (iv) la clase inhibidora de PS II; y (v) la clase de auxinas sintéticas.
34. Un método para alterar el nivel de expresión de una proteína que puede conferir resistencia a por lo menos cinco herbicidas en una célula vegetal, CARACTERIZADO PORQUE comprende: (a) transformar una célula vegetal con la construcción de ADN recombinante de la cláusula 10; y (b) cultivar la célula vegetal transformada bajo condiciones que son adecuadas para expresar la construcción de ADN recombinante, en donde la expresión de la construcción de ADN recombinante da como resultado la producción de niveles alterados de una proteína que puede conferir resistencia a dichos al menos cinco herbicidas en el huésped transformado; en donde cada uno de dichos al menos cinco herbicidas se selecciona entre clases de herbicidas seleccionadas del grupo formado por: (i) la clase inhibidora de ALS; (ii) la clase inhibidora de la síntesis de pigmentos; (iii) la clase inhibidora de PPO; (iv) la clase inhibidora de PS II; y (v) la clase de auxinas sintéticas.
35. El método de cualquiera de las cláusulas 25-34, CARACTERIZADO PORQUE el herbicida se selecciona entre la clase de herbicidas inhibidores de ALS y se selecciona del grupo formado por: (a) nicosulfurón; (b) rimsulfurón; (c) primisulfurón; (d) imazetapir; (e) clorsulfurón ; (f) clorimurón etilo; (g) triasulfurón; (h) flumetsulam; y (i) imazaquin.
36. El método de cualquiera de las cláusulas 25-34, CARACTERIZADO PORQUE el herbicida se selecciona de la clase de herbicidas inhibidores de la síntesis de pigmentos y se selecciona del grupo formado por: (a) isoxaflutol; (b) topramezone; (c) sulcatriona; y (d) tembotriona.
37. El método de cualquiera de las cláusulas 25-34, CARACTERIZADO PORQUE el herbicida se selecciona de la clase de herbicidas inhibidores de PPO y se selecciona del grupo formado por: (a) acifluorfén; (b) flumioxán; y (c) sulfentrazona.
38. El método de cualquiera de las cláusulas 25-34, CARACTERIZADO PORQUE el herbicida se selecciona de la clase de herbicidas inhibidores de PS II y se selecciona del grupo formado por: (a) diurón; (b) linurón; (c) bentazón; y (d) clorotolurón.
39. El método de cualquiera de las cláusulas 25-34, CARACTERIZADO PORQUE el herbicida es dicamba.
40. Un método para determinar la presencia del polinucleótido de la cláusula 1 en una planta, CARACTERIZADO PORQUE comprende al menos uno entre: (a) aislar moléculas de ácido nucleico a partir de dicha planta y determinar si está presente el gen Nsf1 intentando amplificar secuencias homologas del polinucleótido de la cláusula 1 o (b) aislar moléculas de ácido nucleico a partir de dicha planta y efectuar una hibridación Southern o Northern o (c) aislar proteínas a partir de dicha planta y efectuar una transferencia Western usando anticuerpos contra la proteína NSF1 o (d) aislar proteínas a partir de dicha planta y efectuar un ensayo ELISA usando anticuerpos contra la proteína NSF1, determinando así la presencia del polinucleótido de la cláusula 1 en dicha planta.
41. Un método para determinar la presencia del locus Nsf1 en una planta, CARACTERIZADO PORQUE comprende al menos uno de: (a) aislar moléculas de ácido nucleico a partir de dicha planta y determinar si está presente el gen Nsf1 intentando amplificar secuencias homologas al polinucleótido de la cláusula 1 o (b) aislar moléculas de ácido nucleico a partir de dicha planta y efectuar una hibridación Southern o Northern o (c) aislar proteínas a partir de dicha planta y efectuar una transferencia Western usando anticuerpos contra la proteína NSF1 o (d) aislar proteínas a partir de dicha planta y efectuar un ensayo ELISA usando anticuerpos contra la proteína NSF1, determinando así la presencia del locus Nsf1 en dicha planta.
42. Una planta de soja que comprende al polinucleótido de la cláusula 1, CARACTERIZADA PORQUE dicha planta de soja también exhibe resistencia al nematodo quístico de soja, en donde dicho polinucleótido se ha incorporado mediante técnicas de transformación o de cría de plantas y en donde dicha planta de soja se ha criado a partir de un germoplasma seleccionado del grupo formado por: (a) Peking; (b) PI88788; (c) PI89772; (d) PI90763; (e) PI209332; (f) PI404189A; (g) PI437654; (h) PI438489B; (i) PI467312; (j) PI468916; (k) Hartwig; (!) J87-233; y (m) la progenie derivada de las fuentes (a)