CN104107437B - 一种用于治疗乙型病毒性肝炎的rna干扰组合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物及其制备方法。本发明的用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物，对肝脏和血液中的乙型肝炎病毒的DNA和抗原具有非常显著的抑制作用，特异性好，对肝脏、血液及其他组织的副作用小；本发明的制备方法简便易行，除可以应用在本发明的组合物的制备外，还能用于其他核酸类组合物的制备，应用范围广泛。
Description
技术领域
本发明属于乙肝药物领域，具体涉及一种用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物及其制备方法。
背景技术
据估计，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染的人口约高达20亿人-世界人口的三分之一，超过350万人会转为慢性感染。据报道，15～40％的HBV感染的患者会发展为肝硬化，肝衰竭或肝癌（HCC），每年有50万至120万人死于HBV感染。HBV在美国的患病率估计为约0.4％。然而，自愿抽检数据表明在某些外国出生的少数族裔群体患病率超过15％。在20世纪90年代，乙肝病毒相关的诊断门诊和住院治疗人数增加好几倍。同样，住院总费用估计已经从1990年的3.57亿美元增加至2003年的15亿美元，然后保持在13亿美元。
中国有大约1.2亿乙肝病毒携带者，严重困扰着人们的生活、工作和身心健康，每年约30万人因乙肝病毒感染导致肝衰竭、肝硬化、肝癌而死亡。目前市场上的主要药物是干扰素和核苷（酸）类药物，其共同特征是，治疗不彻底、毒性大，病毒对其易产生耐药性，对耐药病株还没有方法可治。迫切需要一种全新的治疗方法。“爱格威”研发的成功将不但具有巨大的经济价值，更具有巨大的科学和社会价值。
治疗HBV的最终目标是抑制或消除HBV，缓和或停止HBV感染引起的肝损伤，防止肝功能衰竭和肝癌的发展。最重要短期和中期治疗目标是最大限度地提高HBV DNA抑制率。但是，彻底根除B型肝炎病毒是困难的，因为它整合到宿主基因组中，产生继续作为潜在复发倾向的cccDNA。聚乙二醇干扰素α-2a（PEG－IFN-α）和干扰素α-2a（IFN-α），核苷类药物（拉米夫定，恩替卡韦和替比夫定）和核苷酸类似物（阿德福韦和替诺福韦）是FDA批准的抗HBV药物市场上常用的药物。干扰素治疗的主要缺点是其显著的副作用，限制其长期使用。它对失代偿期肝硬化与转氨酶正常患者往往是无效的。此外，只有三分之一的患者对PEG-IFN-α抗病毒有效。虽然核苷（酸）类似物抑制HBV复制并能使肝脏坏死性炎症减少，但不能完全根除病毒。此外，停药后，多数患者观察到病毒血症的反弹。此外，长期治疗产生耐药HBV病毒株，导致治疗失败。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物。
本发明的再一目的在于提供上述用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物的制备方法。
本发明的技术方案如下：
一种用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物，其特征在于：包括下列siRNA序列组中的一组或混合：
第一siRNA序列组：
正义链一条，序列为：
5’-GGGUUUUUCUUGUUGACAAdTdTUAUAGGGUUUUUCUUGUUGACAAdTdT-3’
反义链两条，序列均为：5’-UUGUCAACAAGAAAAACCCCG-3’；
第二siRNA序列组：
正义链两条，序列均为：5’-GGGUUUUUCUUGUUGACAAdTdT-3’
反义链一条，序列为：
5’-UUGUCAACAAGAAAAACCCCGUAUAUUGUCAACAAGAAAAACCCCG-3’；
第三siRNA序列组：
正义链一条，序列为：
5’-CCGUGUGCACUUCGCUUCAdTdTUAUACCGUGUGCACUUCGCUUCAdTdT-3’
反义链两条，序列均为：5’-UGAAGCGAAGUGCACACGGUC-3’；
第四siRNA序列组：
正义链两条，序列均为：5’-CCGUGUGCACUUCGCUUCAdTdT-3’
反义链一条，序列为：
5’-UGAAGCGAAGUGCACACGGUCUAUAUGAAGCGAAGUGCACACGGUC-3’；
第五siRNA序列组：
正义链一条，序列为：
5’-mCCGmUGUGmCACUUCGCUUmCAdTdTUAUUmCCGmUGUGmCACUUCGCUUmCAdTdT-3’
反义链两条，序列均为：5’-UGAAGCGAAGUGmCAmCACGGUC-3’；
第六siRNA序列组：
正义链两条，序列均为：5’-mCCGmUGUGmCACUUCGCUUmCAdTdT-3’
反义链一条，序列为：
5’-UGAAGCGAAGUGmCAmCACGGUCuauaUGAAGCGAAGUGmCAmCACGGUC-3’；
第七siRNA序列组：
正义链一条，序列为：
5’-mCCGmUGUGmCACUUCGCUUmCAdTdTUAUUmCCGmUGUGmCACUUCGCUUmCAdTdT-3’
反义链两条，序列均为：5’-UGAAGCGAAGUGCACACGGUC-3’；
第八siRNA序列组：
正义链两条，序列均为：5’-CCGUGUGCACUUCGCUUCAdTdT-3’
反义链一条，序列为：
5’-UGAAGCGAAGUGmCAmCACGGUCuauaUGAAGCGAAGUGmCAmCACGGUC-3’；
第九siRNA序列组：
正义链一条，序列为：
5’-mGGGUUUUUCUUGUUGAmCAAdTdTUAUAmCCGmUGUGmCACUUCGCUUmCAdTdT-3’
反义链两条，序列均为：5’-UGAAGCGAAGUGmCAmCACGGUC-3’；
第十siRNA序列组：
正义链的序列为：5’-mCCGmUGUGmCACUUCGCUUmCAdTdT-3’
反义链的序列为：5’-UGAAGCGAAGUGmCAmCACGGUC-3’；
第十一siRNA序列组：
正义链一条，序列为：
5’-GGGUUUUUCUUGUUGACAAdTdTUAUACCGUGUGCACUUCGCUUCAdTdT-3’
反义链两条，序列分别为：5’-UGAAGCGAAGUGCACACGGUC-3’和5’-UUGUCAACAAGAAAAACCCCG-3’；
第十二siRNA序列组：
正义链的序列为：5’-CCGUGUGCACUUCGCUUCAdTdT-3’
反义链的序列为：5’-UGAAGCGAAGUGCACACGGUC-3’；
第十三siRNA序列组：
正义链一条，序列为：
5’-mGGGUUUUUCUUGUUGAmCAAdTdTUAUAmCCGmUGUGmCACUUCGCUUmCAdTdT-3’
反义链两条，序列分别为：5’-UGAAGCGAAGUGCACACGGUC-3’和5’-UUGUCAACAAGAAAAACCCCG-3’；
上述前面带有m的碱基表示2’-O-甲基化修饰的RNA碱基，dT为胸腺嘧啶脱氧核苷,其他为RNA碱基。
在本发明的一个优选实施方案中，还包括如下重量比的组分：
其中所述B1C1化合物的结构式如下：
上述组分的重量的和与所述siRNA序列组中的一组或混合的重量比为2-10:1。
在本发明的一个优选实施方案中，所述阳离子脂质为DOTMA，所述磷脂为磷脂酰乙醇胺，所述脂质-聚乙二醇为胆固醇聚乙二醇。
本发明的另一技术方案如下：
一种上述用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）将所述siRNA序列组中的一组或混合溶解于水或含有9%蔗糖的水中，得溶液一；
（2）按重量份称取如下组分，并将这些组分溶解于酒精中得溶液二：
其中所述B1C1化合物的结构式如下：
（3）将溶液一与溶液二相互混合均匀后，于室温下进行真空抽滤，使其中的酒精逐渐蒸发；
（4）待大部分的酒精蒸发后，进行均质，得到悬浮液；
（5）将上述悬浮液冻干，形成干燥物，即得所述用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物。
在本发明的一个优选实施方案中，所述阳离子脂质为DOTMA(1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane，氯化三甲铵)，所述磷脂为磷脂酰乙醇胺，所述脂质-聚乙二醇为胆固醇聚乙二醇。
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤（2）中的组分的重量的和与所述siRNA序列组中的一组或混合的重量比为2-10:1，所述溶液一与溶液二的体积比为1:1-0.2。
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤（4）中，均质后的悬浮液中的颗粒大小为5-250nm。
本发明的有益效果是：
1、本发明的用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物，对肝脏和血液中的乙型肝炎病毒性的DNA和抗原具有非常显著的抑制作用；
2、本发明的用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物的特异性好；
3、本发明的用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物对肝脏、血液及其他组织的副作用小；
4、本发明的制备方法简便易行，除可以应用在本发明的组合物的制备外，还能用于其他核酸类组合物的制备，应用范围广泛。
附图说明
图1为本发明的实施例3中的实验结果图；
图2为本发明的实施例4的开始给药后第17天的小鼠肝脏HBV DNA的southern blot实验结果图；
图3为本发明的实施例4的开始给药后第17天的小鼠肝脏HBV DNA的半定量PCR实验比较结果图；
图4为本发明的实施例4的开始给药后第17天的小鼠肝脏HBcAg RNA的qRT-PCR实验比较结果图；
图5为本发明的实施例4的开始给药后第17天的小鼠肝脏HBsAg RNA的qRT-PCR实验比较结果图；
图6为本发明的实施例4的开始给药后第17天的小鼠肝脏ApoB RNA的qRT-PCR实验比较结果图；
图7为本发明的实施例4的给药前的小鼠血液HBeAg含量的比较结果图；
图8为本发明的实施例4的开始给药后第17天的小鼠血液HBeAg含量的比较结果图；
图9为本发明的实施例4的开始给药后第17天的小鼠血液HBsAg含量的比较结果图；
图10为本发明的实施例4的开始给药后的小鼠血液白蛋白含量的比较结果图；
图11为本发明的实施例4的开始给药的小鼠血液碱性磷酸酶含量的比较结果图；
图12为本发明的实施例4的开始给药后的小鼠血液丙氨酸氨基转移酶（ALT）含量的比较结果图；
图13为本发明的实施例4的开始给药后的小鼠血液淀粉酶含量的比较结果图；
图14为本发明的实施例4的开始给药后的小鼠血液总胆红素含量的比较结果图；
图15为本发明的实施例4的开始给药后的小鼠血液中血尿素氮含量的比较结果图；
图16为本发明的实施例4的开始给药后的小鼠血液钙含量的比较结果图；
图17为本发明的实施例4的开始给药后的小鼠血液磷含量的比较结果图；
图18为本发明的实施例4的开始给药后的小鼠血液肌酐含量的比较结果图；
图19为本发明的实施例4的开始给药后的小鼠血液葡萄糖含量的比较结果图；
图20为本发明的实施例4的开始给药后的小鼠血液钠含量的比较结果图；
图21为本发明的实施例4的开始给药后的小鼠血液钾含量的比较结果图；
图22为本发明的实施例4的开始给药后的小鼠血液总蛋白含量的比较结果图；
图23为本发明的实施例4的开始给药后的小鼠血液球蛋白含量的比较结果图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1
B1C1化合物是N,N-二(3-氨丙基)甲胺
（N,N-Bis(3-aminopropyl)methylamine）和环氧化合物在装有搅拌子的玻璃瓶内无溶剂下90℃反应得到。反应时间为90℃下24-72小时。其N,N-二(3-氨丙基)甲胺与环氧烷基化合物（烷基(C12-C14)缩水甘油醚，Alkyl(C12-C14)glycidyl ether[68609-97-2]，Sigma公司）在反应中比例（摩尔比）为1:4。其结果已知从薄层色谱（TLC）上得到证实，反应混合物中只存在一种主要产物。反应物的产物通过提纯后即可应用；
该B1C1化合物的结构式如下：
实施例2
一种用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物，包括下列siRNA序列组中的一组：
第一siRNA序列组：
正义链一条，序列为：
5’-GGGUUUUUCUUGUUGACAAdTdTUAUAGGGUUUUUCUUGUUGACAAdTdT-3’
反义链两条，序列均为：5’-UUGUCAACAAGAAAAACCCCG-3’；
第二siRNA序列组：
正义链两条，序列均为：5’-GGGUUUUUCUUGUUGACAAdTdT-3’
反义链一条，序列为：
5’-UUGUCAACAAGAAAAACCCCGUAUAUUGUCAACAAGAAAAACCCCG-3’；
第三siRNA序列组：
正义链一条，序列为：
5’-CCGUGUGCACUUCGCUUCAdTdTUAUACCGUGUGCACUUCGCUUCAdTdT-3’
反义链两条，序列均为：5’-UGAAGCGAAGUGCACACGGUC-3’；
第四siRNA序列组：
正义链两条，序列均为：5’-CCGUGUGCACUUCGCUUCAdTdT-3’
反义链一条，序列为：
5’-UGAAGCGAAGUGCACACGGUCUAUAUGAAGCGAAGUGCACACGGUC-3’；
第五siRNA序列组：
正义链一条，序列为：
5’-mCCGmUGUGmCACUUCGCUUmCAdTdTUAUUmCCGmUGUGmCACUUCGCUUmCAdTdT-3’
反义链两条，序列均为：5’-UGAAGCGAAGUGmCAmCACGGUC-3’；
第六siRNA序列组：
正义链两条，序列均为：5’-mCCGmUGUGmCACUUCGCUUmCAdTdT-3’
反义链一条，序列为：
5’-UGAAGCGAAGUGmCAmCACGGUCuauaUGAAGCGAAGUGmCAmCACGGUC-3’；
第七siRNA序列组：
正义链一条，序列为：
5’-mCCGmUGUGmCACUUCGCUUmCAdTdTUAUUmCCGmUGUGmCACUUCGCUUmCAdTdT-3’
反义链两条，序列均为：5’-UGAAGCGAAGUGCACACGGUC-3’；
第八siRNA序列组：
正义链两条，序列均为：5’-CCGUGUGCACUUCGCUUCAdTdT-3’
反义链一条，序列为：
5’-UGAAGCGAAGUGmCAmCACGGUCuauaUGAAGCGAAGUGmCAmCACGGUC-3’；
第九siRNA序列组：
正义链一条，序列为：
5’-mGGGUUUUUCUUGUUGAmCAAdTdTUAUAmCCGmUGUGmCACUUCGCUUmCAdTdT-3’
反义链两条，序列均为：5’-UGAAGCGAAGUGmCAmCACGGUC-3’；
第十siRNA序列组：
正义链的序列为：5’-mCCGmUGUGmCACUUCGCUUmCAdTdT-3’
反义链的序列为：5’-UGAAGCGAAGUGmCAmCACGGUC-3’；
第十一siRNA序列组：
正义链一条，序列为：
5’-GGGUUUUUCUUGUUGACAAdTdTUAUACCGUGUGCACUUCGCUUCAdTdT-3’
反义链两条，序列分别为：5’-UGAAGCGAAGUGCACACGGUC-3’和5’-UUGUCAACAAGAAAAACCCCG-3’；
第十二siRNA序列组：
正义链的序列为：5’-CCGUGUGCACUUCGCUUCAdTdT-3’
反义链的序列为：5’-UGAAGCGAAGUGCACACGGUC-3’；
第十三siRNA序列组：
正义链一条，序列为：
5’-mGGGUUUUUCUUGUUGAmCAAdTdTUAUAmCCGmUGUGmCACUUCGCUUmCAdTdT-3’
反义链两条，序列分别为：5’-UGAAGCGAAGUGCACACGGUC-3’和5’-UUGUCAACAAGAAAAACCCCG-3’；
上述前面带有m的碱基表示2’-O-甲基化修饰的RNA碱基，dT为胸腺嘧啶脱氧核苷；
该RNA干扰组合物还包括如下重量比的组分：
上述组分的重量的和与所述siRNA序列组中的一组或混合的重量比为2-10:1。
上述用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物的制备方法，包括如下步骤：
（1）将所述siRNA序列组中的一组溶解于含有0.9%水和5%蔗糖的水中，得溶液一；
（2）按重量份称取如下组分，并将这些组分溶解于酒精中得溶液二：
步骤（2）的组分的重量的和与所述siRNA序列组中的一组或混合的重量比为2-10:1；配制完成后的溶液一与溶液二的体积比为1:1-0.2
（3）将溶液一与溶液二相互混合均匀后，于室温下进行真空抽滤，使其中的酒精逐渐蒸发；
（4）待大部分的酒精蒸发后，进行均质，得到悬浮液，该均质后的悬浮液中的颗粒大小为5-250nm；
（5）将上述悬浮液冻干，形成白色或微黄色的干燥物，即得所述用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物。
上述RNA干扰组合物在施用前，仅需加入适量注射用水，摇动或溶解为悬浮液即可。这种制备方法还可通用的作为其他核酸类药物的制备方法。
实施例3
实施例1中的第一至第十三siRNA序列组的用于治疗乙型病毒性肝炎的siRNA序列组分别编号1至13，并分别进行如下细胞实验；
细胞实验：
（1）细胞转染：将HepG2.2.15细胞接种于96孔培养板中，并在二氧化碳培养箱（5%二氧化碳）中37℃过夜培养，使得第二天早上用于转染的细胞的克隆率大约为40%，将0.5μL siRNA（1μM）用10μL DMEM稀释，同时将0.4μL RFect（Agave Pharma,Inc.西雅图)，为一种商品化的核酸细胞转染助剂）用10μL DMEM稀释并与室温下静置5分钟；将稀释的siRNA和RFect漩涡混合10秒，在室温下静置20分钟，得转染复合物；在每孔含有80μL DMEM的上述96孔培养板中，每个培养孔分别加入20μL的该转染复合物，并在二氧化碳培养箱（5%二氧化碳）中37℃培养细胞；
（2）提取mRNA：转染后一至两天，先用100μL PBS清洗细胞一次，再加入100μL裂解缓冲液（Turbocapture kit，Qiagen）进行裂解；80μL裂解物转移至一96孔mRNA捕获板上，冰在室温下孵育1小时；将裂解物倒掉后，用清洗缓冲液该捕获板，每孔100μL；然后再每个孔中加入80μL洗脱缓冲液，并在65℃下孵育5分钟；再将包含mRNA的洗脱溶液转移至一新的96孔透明板上；
（3）取上述分离的mRNA3μL进行实时RT-PCR，所用试剂盒为SYBR绿一步法实时RT-PCR试剂盒（SensiMix one-step SYBR Green kit，Bioline），具体来说是将上述mRNA与11μL master mix混合（包含2x master mix（包含逆转录酶）7μL，正向和反向引物1μL（6μM），50X SYBR绿0.3μL及水2.7μL）；逆转录反应程序如下：42℃30分钟，95℃15分钟以启动Taq聚合酶，反应热循环如下：95℃15秒，60℃30秒，72℃20秒，基因表达改变使用ΔΔCt方法来分析；
实验结果如图1所示，第一至第十二siRNA序列组与未转染组和对照siRNA转染组相比，均显著降低了细胞中HBV核心抗原RNA和HBV表面抗原RNA的量，由于第十三组与第十二组的结果相差不大，则第十三组的实验结果未示出。
实施例4
在所进行的动物研究中使用的所有操作均经过机构动物管理与使用委员会（IACUC）的批准且符合适用的地区、州和联邦法规。按照实施例1的方法分别制备对应第一至第十三siRNA序列组的RNA干扰组合物，并进行下面的动物实验，该动物实验所用小鼠为HBV转基因小鼠。
动物实验分为五组：
ApoB组，即阴性siRNA组（对应ApoB基因的siRNA，该ApoB基因为肝脏中与HBV完全不相关的基因）；
HBV1组（上述第一至第十三siRNA序列组的RNA干扰组合物中的任选的一个）；
HBV2组（上述第一至第十三siRNA序列组的RNA干扰组合物中的任选的另一个）；
ADV组，即阳性对照组（目前临床上正在应用的抗乙肝药物阿德福韦酯）；
安慰剂组（只含蔗糖溶液）。
上述的ApoB组、siRNA组合物和安慰剂组的给药的剂量是2毫克／公斤体重，总共注射三次，每次相隔七天（第一次注射为0天，总共14天），在最后一次注射三天后(第17天)取血、动物处死后，测定组织其肝炎病毒抑制指标及血液生物化学指标；ADV组中，阿德福韦酯的用法是每日10ｍｇ／公斤体重，口服14天，三天(第17天)后取血和组织测定其肝炎病毒抑制及血液生物化学指标；
其中肝脏HBV DNA分析采用southern blot和半定量PCR进行，肝脏HBV RNA的分析亦采用半定量PCR进行：
其中southern blot的具体步骤如下：肝组织匀浆于裂解液。肝组织（约0.1克）在含有裂解缓冲液（1mM的EDTA，10mM的Tris，10mM NaCl中，0.5％SDS，蛋白酶K）用研磨杵匀浆。为了提取DNA，将匀浆在55℃下孵育12小时，然后，加入等体积的苯酚(Phenol)。将样品混合，并以12,000xg离心10分钟。，然后将氯仿加入上清液，并再次离心。然后用NaCl和乙醇沉淀出DNA。将沉淀出的DNA沉淀溶于含有核糖核酸酶A的TE缓冲液（pH8.0).一定数量的DNA(通常含有40微克DNA)，用HindIII消化酶（NewEngland Biolabs公司，MA）在37℃消化3小时已被证明HBV基因序列是不含HindIII内切位点的。消化的DNA，再萃取，并通过1％TAE琼脂糖凝胶电泳分离。DNA然后被转移到BioDyne B带正电荷的尼龙膜。DNA经UV照射后固定于膜上。杂交使用[32P]CTP-标记的，用HaeⅢ消化的被克隆到pBluescript质粒的HBV基因组作探针。杂交在含有10％PEG-8000，0.05M磷酸钠，0.33毫克/毫升鲑鱼精子DNA，7％的SDS的溶液中在60℃下过夜进行。使用磷成像方法（Optiquant）测定放射性信号并测定放射性条带的密度；
肝脏HBV DNA和肝脏HBV RNA的半定量PCR具体步骤如下：用实时PCR进行，所用引物为HBV3正向引物ATAAAACGCCGCAGACACATC，HBV3反向引物AACCTCCAATCACTCACCAACC，探针为HBV3Taq-manprobe
[6～FAM]-AGCGATAACCAGGACAAGTTGGAGGACA-[BHQ1a～6FAM]；反应体系为25μL，包括12.5μL FullVelocityTM QPCR master mix、0.375μL稀释参考染料(1:500)、0.25μL StratascriptTM RT/RNase block酶混合物和0.5μL FullVelocityTM酶。反应程序为：95℃下2分钟，在95℃下10秒40个循环，在60℃下30秒。使用标准曲线的方法测定。
血液生物化学指标分析采用商品化的对应所需生化指标的ELISA试剂盒（国际免疫诊断，福斯特市，CA）进行测定。
实验结果及结论：如图2至图5、图7至图10所示，HBV1组、HBV2组均对肝脏组织中的乙肝病毒DNA、血液中的HBsAg，HBeAg、肝脏组织中的HBsAg，HBcAg有非常显着的抑制作用，阿德福韦酯对肝脏组织中的乙肝病毒DNA有显着的抑制作用，但对血液中的HBsAg、HBeAg和肝脏组织中的HBsAg、HBcAg没有影响；如图6所示，HBV1组和HBV2组对肝脏中ApoB基因的RNA量没有影响，其特异性良好；如图11至23所示，血液的其他生化指标没有变化，说明HBV1组、HBV2组对肝脏及其他组织的副作用较小。
HBV1、HBV2的乙肝抑制效果（包括病毒DNA、血液及肝组织的抗原）十分显著。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
Claims (7)
1.一种用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物，其特征在于： siRNA序列组如下：
正义链一条，序列为：
5’-GGGUUUUUCUUGUUGACAAdTdTUAUACCGUGUGCACUUCGCUUCAdTdT-3’
反义链两条， 序列分别为：5’-UGAAGCGAAGUGCACACGGUC-3’ 和
5’-UUGUCAACAAGAAAAACCCCG-3’；
上述前面的RNA碱基加上2’-O-甲基化或氟原子的化学修饰，以增加稳定性；dT为胸腺嘧啶脱氧核苷,其他为RNA碱基。
2.如权利要求1 所述的一种用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA 干扰组合物，其特征在于：还包括如下重量比的组分：
阳离子脂质 0.5-3重量份
B1C1化合物 1-10重量份
磷脂 0-5重量份
胆固醇 0-5重量份
脂质-聚乙二醇 2-24重量份；
其中所述B1C1化合物的结构式如下：
上述组分的重量的和与所述siRNA序列组的重量比为2-10:1。
3.如权利要求2所述的一种用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物，其特征在于：所述阳离子脂质为DOTMA，所述磷脂为磷脂酰乙醇胺，所述脂质-聚乙二醇为胆固醇聚乙二醇。
4.一种权利要求2所述的用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）将所述siRNA序列组溶解于水或含有9%蔗糖的水中，得溶液一；
（2）按重量份称取如下组分，并将这些组分溶解于酒精中得溶液二：
阳离子脂质 0.5-3重量份
B1C1化合物 1-10重量份
磷脂 0-5重量份
胆固醇 0-5重量份
脂质-聚乙二醇 2-24重量份；
其中所述B1C1化合物的结构式如下：
（3）将溶液一与溶液二相互混合均匀后，于室温下进行真空抽滤，使其中的酒精逐渐蒸发；
（4）待大部分的酒精蒸发后，进行均质，得到悬浮液，然后高压均质；
（5）将上述悬浮液冻干，形成干燥物，即得所述用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA 干扰组合物。
5.如权利要求4所述的一种用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA干扰组合物的制备方法，其特征在于：所述阳离子脂质为DOTMA，所述磷脂为磷脂酰乙醇胺，所述脂质-聚乙二醇为胆固醇聚乙二醇。
6.如权利要求5所述的一种用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA 干扰组合物的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中的组分的重量的和与所述siRNA 序列组的重量比为2-10:1，所述溶液一与溶液二的体积比为1:1-0.2。
7.如权利要求4所述的一种用于治疗乙型病毒性肝炎的RNA 干扰组合物的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中，均质后的悬浮液中的颗粒大小为5-250nm。
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