MX2008011375A

MX2008011375A - Metodos para regular mediadores inflamatorios y peptidos utiles en ellos.

Info

Publication number: MX2008011375A
Application number: MX2008011375A
Authority: MX
Inventors: Indu Parikh; Shuji Takashi; Kenneth B Adler; Linda D Martin; Yuehua Li
Original assignee: Biomarck Pharmaceuticals Ltd
Priority date: 2006-03-06
Filing date: 2007-03-06
Publication date: 2008-12-15
Also published as: RU2429004C2; ZA200807626B; EP1991250A4; RU2008139414A; US8563689B1; CN101500593A; US7544772B2; WO2007103368A3; CA2645019A1; WO2007103368A2; AU2007223983A1; SG10201405436WA; CN101500593B; IL193846A0; SG170082A1; BRPI0708672A2; IL193846A; JP2009531307A; EP1991250A2; US20060217307A1

Abstract

La presente invención incluye métodos para modular procesos secretorios de las células. Más específicamente, la presente invención se refiere a modular o reducir la liberación de mediadores inflamatorios desde células inflamatorias, inhibiendo el mecanismo asociado con la liberación de los mediadores inflamatorios desde las vesículas o gránulos en las células inflamatorias. En este sentido, la presente invención describe un mecanismo de señalización intracelular que ilustra varios blancos intracelulares novedosos para la intervención farmacológica en trastornos que involucran la secreción de mediadores inflamatorios desde vesículas de las células inflamatorias. El péptido MANS y sus fragmentos activos son útiles en dichos métodos.

Description

MÉTODOS PARA REGULAR MEDIADORES INFLAMATORIOS Y PEPTIDOS ÚTILES EN ELLOS REFERENCIA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama la prioridad de la solicitud de patente estadounidense No. 11/367,449, presentada el 6 de marzo de 2006, que es una solicitud de continuación en parte de la solicitud de patente estadounidense No. 10/802,644, presentada el 17 de marzo de 2004, que es una solicitud de continuación de la solicitud de patente estadounidense No. 10/180,753, presentada el 26 de junio de 2002, ahora abandonada, que reclama la prioridad de la solicitud provisional de los Estados Unidos No. 60/300,933, presentada el 26 de junio de 2001, cuyas descripciones quedan incorporadas aquí en su totalidad por medio de esta referencia .

DECLARACIÓN SOBRE APOYO FEDERAL Esta invención fue hecha con apoyo del gobierno federal de los Estados Unidos, bajo el número de concesión ROI HL36982, del National Institute of Health (Instituto Nacional de Salud) . El gobierno de los Estados Unidos puede tener ciertos derechos sobre esta invención.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos para modular procesos secretores celulares. Más específicamente, la presente invención se refiere a modular la liberación de mediadores inflamatorios. La presente invención se refiere también al mecanismo de señalamiento intracelular que regula la secreción de mediadores inflamatorios desde vesículas o gránulos unidos a la membrana, en células inflamatorias.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La hipersecreción de moco contribuye a la patogénesis de u gran número de enfermedades inflamatorias de las vías respiratorias, tanto en humanos como en animales no humanos. La secreción incrementada de moco se ve en estados de enfermedad crónica, tales como asma, COPD y bronquitis crónica; en enfermedades genéticas, tales como fibrosis cística; en condiciones alérgicas (atopía, inflamación alérgica) , en bronquioectasis y en varias enfermedades respiratorias infecciosas, agudas, tales como neumonía, rinitis, influenza o en el resfriado común. La hipersecreción de moco que acompaña a muchas de estas enfermedades respiratorias, es la presencia constante de células inflamatorias en las vías respiratorias. Estas células contribuyen en gran medida a la patología de esas enfermedades, mediante el daño a los tejidos efectuado por los mediadores inflamatorios liberados desde esas células. Un ejemplo de dicha destrucción por medio de esta inflamación crónica ocurre en los pacientes con fibrosis cística, en quienes los mediadores liberados desde los neutrófilos (por ejemplo, mieloperoxidasa) inducen la desescamacion del tejido epitelial de las vías respiratorias) La secreción insuficiente de moco también tiene efectos dañinos. El moco de las vías respiratorias actúa como barrera física contra partículas inhaladas, biológicamente activas, y puede ayudar a prevenir la colonización bacteriana de las vías respiratorias e inactiva los productos citotóxicos liberados desde los leucocitos. King y coautores, Respir. Physiol . , 62:47-59 (1985); Vishwanath y Ramphal , Infect. Immun. , 45:197 (1984); Cross y coautores, Lancet 1:1328 (1984) . En los ojos, el moco mantiene una película de lágrima y es importante para la salud y la comodidad del ojo. La secreción de moco en el tracto gastrointestinal también tiene una función citoprotectora . El papel del moco como barrera química, biológica y mecánica significa que la secreción anormalmente baja de moco por las membranas mucosas, es indeseable. Las vías respiratorias de los mamíferos están recubiertas por una capa delgada de moco, producido y secretado por células epiteliales (gobletes) de las vías respiratorias y por glándulas submucosales. En enfermedades de las vías respiratorias, tales como asma, bronquitis crónica y fibrosis cística, la hipersecreción de moco es un síntoma común. El exceso de moco puede contribuir a la obstrucción y la susceptibilidad a las infecciones. Los principales componentes del moco son la mucina, glicoproteínas sintetizadas por células secretoras y almacenadas dentro de los gránulos citoplásmicos . Las mucinas son una familia de glicoproteínas secretadas por las células epiteliales, que incluyen las que se encuentran en los tractos respiratorio, gastrointestinal y reproductor femenino. Las mucinas son las responsables de las propiedades viscoelásticas del moco y se conocen por lo menos ocho genes de mucina. Thornton y coautores, J. Biol . Chem. , 272, 9561-9566 (1997). El daño mucociliar provocado por la hipersecreción de mucina y/o por hiperplasia de célula de mucosa, conduce a que moco obstruya las vías respiratorias , lo que promueve infección crónica, obstrucción del flujo de aire y, algunas veces, la muerte. Muchas enfermedades respiratorias, tales como la bronquitis crónica, la enfermedad pulmonar obstructora crónica, la bronquiectasia , el asma, la fibrosis cística y las infecciones bacterianas están caracterizadas por producción excesiva de mucina. E. Prescott y coautores, Eur. Repir. J. , 8:1333-1338 (1995); K. C. Kim y coautores, Eur. Repir. J. , 10:1438 (1997); D. Steiger y coautores, Am. J. Respir. Cell . Mol. Biol., 12:307-314 (1995) . Mediante un estímulo apropiado, los gránulos de mucina son liberados por medio de un proceso exocitótico, en el que los gránulos se translocan hacia la periferia de la célula, donde las membranas de los gránulos se funden con la membrana del plasma, lo que permite la secreción luminal de los contenidos. A pesar de la importancia patofisiologica obvia de este proceso, los mecanismos de señalización intracelulares que enlazan el estímulo en la superficie de la célula con la liberación del gránulo de mucina, sólo se ha dilucidado recientemente. Ver Li y coautores, Journal of Biological Che istry, 276: 40982-40990 (2001). Se sabe que una gran variedad de agentes y de mediadores inflamatorios/humorales provocan la secreción de mucina. Estos incluyen los agonistas colinérgicos , los mediadores lípidos, los oxidantes, las citocinas, los neuropéptidos , ATP y UTP, los productos bacterianos, la elastasa de neutrófilo y los contaminantes inhalados. Ver Adler y coautores, Res. Immunol . , 149, 245-248 (1998). Es interesante que muchos de estos secretagogos de la mucina también sean conocidos por activar varias quinasas de proteína; y los estudios que examinan la regulación del exceso de secreción de mucina por las células epiteliales de las vías respiratorias, de diversas especies, han implicado consistentemente el involucramiento de la proteína C quinasa (PKC) o la proteína quinasa dependiente de cGMP (PKG) , en el proceso secretor. Ver, por ejemplo, Ko y coautores, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol . 16, 194-198 (1997); Abdullah y coautores, Am. J. Physiol., 273, L201-L210 (1997); Abdullah y coautores, Biochem. J., 316, 943-954 (1996); Larivee y coautores, Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 11, 199-205 (1994); y Fischer y coautores, Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 20, 413-422 (1999) . Las interacciones coordinadas o "entrecruzamiento" entre estas dos proteína quinasas en la regulación de la secreción de mucina sólo se ha demostrado recientemente que implica las proteínas MARCKS. Ver Li y coautores, Journal of Biological Chemistry, 276: 40982-40990 (2001). Sin embargo, los eventos de señalización corriente debajo de la acción coordinada de estas proteína quinasas, que conducen finalmente a la liberación exocitótica de los gránulos de mucina no había sido aclarada completamente. MARCKS, una proteína de aproximadamente 82 kD, tiene tres regiones evolucionalmente conservadas (Aderem y coautores, Nature, 1988; 332:362-364; Thelen y coautores, Nature 1991; 351:320-322; Hartwig coautores, Nature 1992, 356:618-622; Seykora y coautores, J. Biol. Chem. 1996, 271:18797-18802); un extremo N, un dominio de sitio de fosforilación (PSD) y un dominio de múltiple homología 2 (MH2) . El extremo N, una secuencia de 24 aminoácidos, con una porción ácido mirístico fijada a un residuo terminal de glicina, está involucrado en la unión de MARCKS a las membranas (Seykora y coautores, J. Biol . Che . , 1996; 271:18797-18802) y, posiblemente, a la calmodulina (Matsubara y coautores, J". Biol. Chem. 2003 ; 278:48898-48902). Esta secuencia de 24 aminoácidos es conocida como el péptido MANS . El péptido MANS y sus fragmentos activos, pueden competir con la MARCKS natural en células para la unión en la membrana. El involucramiento de la proteína MARCKS en la liberación de mediadores inflamatorios desde los gránulos de los leucocitos de infiltración, es relevante para la inflamación en enfermedades de todos los tejidos y órganos, incluyendo enfermedades pulmonares, caracterizadas por la inflamación de las vías respiratorias en todos los tejidos y los órganos, incluyendo las enfermedades pulmonares caracterizadas por la inflamación de las vías respiratorias, tales como asma, COPD y fibrosis cística. Sin embargo, la inflamación y la secreción de moco en las vías respiratorias son dos procesos separados e independientes (Li y coautores, J. Biol. Chem., 2001, 276:40982-40990; Singer y coautores, Nat. Med. , 2004, 10:193-196): Aunque se puede provocar la producción y la secreción de moco por medio de muchos factores, incluyendo mediadores liberados por las células inflamatorias, no hay una conexión directa conocida entre el exceso de modo y la inflamación .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere al nuevo uso del polipéptido miristoilado de 24 aminoácidos, conocido también como péptido MANS . La invención se refiere también a un nuevo método para bloquear cualquier proceso secretor celular, especialmente aquellos que implican la liberación de mediadores inflamatorios desde células inflamatorias, cuyas trayectorias estimulatorias implican la proteína C quinasa (PKC) , la proteína MARCKS de substrato y la liberación de contenidos desde vesículas o gránulos intracelulares. La presente invención está dirigida a un método para inhibir la liberación exocitótica de por lo menos un mediador inflamatorio, desde por lo menos una célula inflamatoria, que comprende poner en contacto la al menos una célula inflamatoria, célula que comprende el al menos un mediador inflamatorio contenido dentro de una vesícula dentro de la célula, con al menos un péptido seleccionado del grupo que consiste de un péptido MANS y un fragmento activo del mismo, en una cantidad efectiva para reducir la liberación del mediador inflamatorio desde la célula inflamatoria, en comparación con la liberación del mediador inflamatorio desde el mismo tipo de célula inflamatoria, que ocurriría en ausencia del al menos un péptido. La presente invención está dirigida adicionalmente a un método para inhibir la liberación de por lo menos un mediador inflamatorio desde por lo menos una célula inflamatoria en un tejido o fluido de un sujeto, que comprende la administración al tejido y/o al fluido del sujeto, que comprende al menos una célula inflamatoria que comprende por lo menos un mediador inflamatorio contenido dentro de una vesícula dentro de la célula, una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende por lo menos un péptido seleccionado del grupo que consiste de un péptido MA S y un fragmento activo de él, en una cantidad terapéuticamente efectiva para reducir la liberación del mediador inflamatorio desde por lo menos una célula inflamatoria, en comparación con la liberación del mediador inflamatorio desde por lo menos una célula del mismo tipo de célula inflamatoria, que ocurriría en ausencia del al menos un péptido. Más específicamente, inhibir la liberación de un mediador inflamatorio comprende bloquear o reducir la liberación de un mediador inflamatorio desde la célula inflamatoria . Más en particular, la presente invención incluye un método para reducir la inflamación en un sujeto, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende un péptido MANS [es decir, N-miristoil -GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAV (SEQ ID NO: 20)], o un fragmento activo de él. El fragmento activo tiene una longitud de por lo menos seis aminoácidos. Tal como se usa aquí, un "fragmento activo" de una proteína MARCKS es uno que afecte (inhiba o incremente) la liberación mediada por la proteína MARCKS. Se puede seleccionar un fragmento activo del grupo que consi ste de N--miristoil - GAQFKTAAKGEAAAERPGEAA (SEA ID NO: 3) ; N--miristoil - GAQFSKTAAKGEAAAERPGEA (SEQ ID NO: 4) ; N--miristoil - GAQFSKTAAKGEAAAERPGE (SEQ ID NO: 5) ; N--miristoil - GAQFSKTAAKGEAAAERPG (SEQ ID NO : 6) ; N--miristoil - GAQFSKTAAKGEAAAAERP (SEQ ID NO: 7) ; N--miristoil -GAQFSKTAAKGEAAAER (SEQ ID NO : 8); N-miristoil- GAQFSKTAAKGEAAAE (SEQ ID NO : 9) ; N-miristoil -GAQFSKTAAKGEAAA (SEQ ID NO: 10) ; N-miristoil -GAQFSKTAAKGEAA (SEQ ID NO : 11) ; N-miristoil -GAQFSKTAAKGEA (SEQ ID NO : 12); N-miristoil-GAQFSKTAAKGE (SEQ ID NO : 13); N-miristoil -GAQFSKTAAKG (SEQ ID NO: 14; N-miristoil -GAQFSKTAAK (SEQ ID NO : 15); N-miristoil-GAQFSKTAA (SEQ ID NO : 16); N-miristoil -GAQFSKTA (SEQ ID NO : 17) ; N-miristoil -GAQFSKT (SEQ ID NO : 18) y N-miristoil -GAQFSK (SEQ ID NO: 19) . La presencia de la porción miristato N-terminal hidrófoba, en estos péptidos, puede incrementar su compatibilidad con . las membranas de plasma y, presumiblemente, su permeabilidad a ellas; y permitir potencialmente que los péptidos sean absorbidos por las células. La inserción hidrófoba de miristato en una bicapa puede proveer un coeficiente de división, o una constante aparente de asociación con lípidos hasta a 104 NT1, o una energía de unión libre unitaria de Gibbs de aproximadamente 8 Kcal/mol (ver, por ejemplo, Peitzsch, R. M. y McLaughlin, S., 1993, Binding of acilated peptides and fatty acid to phospholipid vesicles: pertinence to miristoilated proteins . (Unión de péptidos acilados y ácidos grasos a vesículas fosfolípidas : pertinencia para las proteínas miristoiladas ) Biochemistry, 32:10436-10443)) que es suficiente, por lo menos en parte, para permitir una división del péptido MANS y los fragmentos de péptido MANS miristoilados , como se describen aquí, en la membrana de plasma de una célula, mientras que otros grupos funcionales adicionales y sus interacciones dentro del péptido MANS (que está miristoilado) y dentro de los fragmentos de péptido MANS miristoilados, pueden potenciar sus permeabilidades de membrana relativas.

Cada uno de los fragmentos puede exhibir coeficientes de división y afinidades para la membrana, que son representativos de su estructura respectiva. Se pueden preparar los fragmentos mediante métodos de síntesis de péptidos, conocidos en la técnica, tales como mediante síntesis de péptidos en fase sólida [ver, por ejemplo, los métodos descritos en Chan, Weng C. y hite, Peter D., Eds . , Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis : A Practical Approach, (Síntesis de péptido Fmoc en fase sólida: Un enfoque práctico), Oxford University Press, Nueva York, Nueva York (2000); y Lloyd-Williams , P y coautores, Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins (Vías químicas para la síntesis de péptidos y proteínas) 1997) ] y se pueden purificar mediante métodos conocidos en la técnica, tales como mediante cromatografía en líquido a alta presión. Se puede confirmar el peso molecular de cada péptido por medio de espectroscopia de masa, mostrando cada uno un pico con una masa molecular apropiada. La eficacia de los péptidos individuales y de las combinaciones de péptidos individuales (por ejemplo, las combinaciones de dos de los péptidos, las combinaciones de tres de los péptidos, las combinaciones de cuatro de los péptidos) en los métodos de esta descripción, puede ser determinada fácilmente sin experimentación indebida, usando los procedimientos descritos en los ejemplos descritos aquí. Una combinación preferida comprenderá dos de los péptidos; una proporción molar preferida de los péptidos puede ser de 50:50 a 99.99 a 0.01, proporción que puede ser determinada fácilmente usando procedimientos descritos en los ejemplos que se dan en la presente. De preferencia el péptido MANS o su fragmento activo está contenido en una composición farmacéutica que es útil para bloquear la inflamación. La presente invención incluye también métodos, para regular un proceso secretor celular en un sujeto, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto que comprende un péptido MANS o un fragmento activo de él, que regule un mediador inflamatorio en un sujeto. La administración generalmente es seleccionada del grupo que consiste de la administración tópica, la administración parenteral, la administración rectal, la administración pulmonar, la inhalación y nasal, o la administración oral; donde la administración pulmonar incluye generalmente un aerosol o bien un inhalador de polvo seco, un inhalador de dosis medida, o bien un nebulizador. La administración de una composición que comprende una cantidad inhibidora de desgranulación del péptido MANS o una cantidad inhibidora de desgranulación de un fragmento activo de él, tal como una composición farmacéutica del péptido MANS o de un fragmento activo de él, para uso en humanos o animales, provee el péptido MANS o su fragmento activo por lo menos al sitio en o sobre un tejido, o una capa que contiene fluido o que contiene moco, en contacto con la superficie de un tejido, donde reside la célula granulocítica inflamatoria, o dentro de la cual una célula granulocítica inflamatoria invadirá; permitiendo de esa manera que el péptido MANS o un fragmento activo de él, haga contacto con la célula granulocítica inflamatoria. En un aspecto, se puede efectuar la administración de dicha composición al primer brote o la primera detección de la inflamación o la primera percepción de la inflamación por el humano o el animal, o al primer cambio perceptible en el nivel de inflamación en un humano o animal, para reducir la cantidad de inflamación que de otra manera ocurriría en ausencia del péptido MA S o su fragmento activo. En otro aspecto, se puede efectuar la administración durante un avance de la inflamación de un tejido en el humano o el animal, para reducir la cantidad de inflamación adicional que ocurriría de otra manera en ausencia del péptido MANS o su fragmento activo. Si bien la cantidad y la frecuencia de la dosis pueden ser determinadas por evaluación clínica, y pueden ser una función de la enfermedad o del origen de la inflamación y la extensión de tejido involucrada y de la edad y las dimensiones del paciente, se anticipa que se puede repetir la dosificación de una composición farmacéutica después de 3 a 8 horas, de preferencia después de 6 a 8 horas a contar de la primera administración de la composición farmacéutica. La presente invención incluye también métodos para reducir la inflamación en un sujeto, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto que inhiba la liberación, relacionada con MARCKS, de mediadores inflamatorios; de manera que se reduzca la liberación de por lo menos un mediador inflamatorio en el sujeto, en comparación con la que ocurriría en ausencia de dicho tratamiento. Tal como se usa aquí, "reducir" significa generalmente una disminución de los efectos de la inflamación. De preferencia se inhiben o bloquean los mediadores inflamatorios mediante los métodos descritos. Otra modalidad de la presente invención incluye métodos para reducir la inflamación en un sujeto, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto que inhiba la liberación, relacionada con MARCKS, de mediadores inflamatorios; de manera que se reduzca la inflamación en el sujeto en comparación con la que ocurriría en ausencia de dicho tratamiento. La presente invención describe también métodos para reducir o inhibir la inflamación en un sujeto, que comprenden la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un péptido MANS o de un fragmento activo de él, efectivo para desmodular un mediador inflamatorio en el sitio de inflamación. El término "inhibir" significa una reducción en la cantidad de secreción del mediador inflamatorio. El término "inhibir por completo" o similares, significa una reducción a cero en la cantidad de secreción de mediador inflamatorio. Nuevamente, como se señaló más arriba, el fragmento activo tiene una longitud de por lo menos seis aminoácidos. El término "proceso exocitótico" significa exocitosis, es decir, un proceso de secreción o excreción celular, en el que se descargan las sustancias contenidas en una vesícula; vesícula que reside dentro de una célula, desde la célula, por fusión de la membrana vesicular con la membrana exterior de la célula. "Desgranulación" significa una reducción en la liberación de los mediadores inflamatorios contenidos dentro de los gránulos de la célula inflamatoria. Así pues, una cantidad inhibidora de la desgranulación, del péptido MANS y/o de un fragmento activo de él, es la cantidad de esos péptidos que es suficiente para reducir la liberación de los mediadores inflamatorios contenidos en los gránulos, en comparación con la liberación en ausencia del mismo péptido. El péptido MANS y sus fragmentos activos pueden ser útiles en la prevención o en la reducción de la cantidad de inflamación en un tejido de un animal, provocada por mediadores inflamatorios. El péptido MANS y sus fragmentos activos pueden ser útiles en la prevención o en la reducción de la cantidad de daños al tejido en un animal, producidos o provocados por mediadores inflamatorios.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las figuras 1A-1D son gráficas de barras que ilustran que la hipersecreción de mucina por las células NHBE es elevada al máximo por la activación tanto de PKC como de PKG. Las figuras 2A-2B demuestran que la proteína MARCKS es un componente clave de la trayectoria secretora de la mucina . Las figuras 3A-3C ilustran una solidificación que ilustra que un oligonucleótido de sentido contrario, dirigido contra MARKCS desregula la expresión de MARCKS y atenúa la hipersecreción de mucina. Las figuras 4A-4B ilustran que la fosforilación dependiente de PKC libera MARCKS desde la membrana de plasma al citoplasma. Las figuras 5A-5C muestran que PKG induce la desfosforilación de MARCKS por activación de PP2A. La figura 6 muestra una gráfica de barras que demuestra que PP2A es el componente esencial de la trayectoria secretora de la mucina. La figura 7 es una solidificación que ilustra que MARCKS se asocia con la actina y la miosina en el citoplasma. La figura 8 ilustra un mecanismo de señalización que controla la secreción de mucina por las células epiteliales de las vías respiratorias humanas. La figura 9 es una gráfica de barras que ilustra la capacidad del péptido MANS de bloquear la secreción de miloperoxidasa desde neutrófilos caninos aislados. La figura 10 es una gráfica de barras que ilustra la capacidad del péptido MANS de bloquear la secreción de' miloperoxidasa desde neutrófilos humanos aislados La figura 11 es una gráfica de barras que muestra que PMA estimula un pequeño incremento en la secreción de MPO desde neutrófilos humanos estimulados por LPS, que se intensifica de una manera que depende de la concentración, por medio de coestimulación con 8-Br-cGMP. La figura 12 es una gráfica de barras que muestra que el estímulo con 8-Br-cGMP tiene poco efecto sobre la secreción de MPO desde los neutrófilos humanos estimulados con LPS, hasta que ocurre una coestimulación con PMA, de una manera que depende de la concentración. La figura 13 es una gráfica de barras que muestra que PMA estimula un pequeño incremento en la secreción de MPO desde neutrófilos caninos estimulados con LPS, que es intensificado de una manera que depende de la concentración, por coestimulación con 8-Br-cGMP. La figura 14 es una gráfica de barras que muestra que la estimulación con 8-Br-cGMP tiene poco efecto sobre la secreción de MPO desde neutrófilos caninos estimulados con LPS, hasta que ocurre una coestimulación con PMA, de una manera que depende de la concentración. La figura 15 es una gráfica de barras que muestra que la coestimulación con PMA+8 -Br-cGMP es necesaria para la secreción máxima de MPO desde los neutrófilos caninos estimulados con LPS .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se describirá ahora la presente invención más completamente en lo que sigue, con referencia a las figuras anexas, en las que están ilustradas las modalidades preferidas de la invención. Sin embargo, la invención puede estar involucradas en diferentes formas y no se debe tomar como limitada a las modalidades expuestas aquí. Más bien se proveen estas modalidades de modo que esta descripción sea total y completa, y lleve el alcance de la invención a quienes sean expertos en la materia. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados aquí tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por quien tenga experiencia ordinaria en la materia a la que pertenece la presente invención. Todas las publicaciones, las solicitudes de patente, las patentes y demás referencias mencionadas aquí, quedan incorporadas en su totalidad aquí por medio de la referencia. El uso de los artículos indefinidos "un", "una" , para describir aquí cualquier aspecto de la presente invención debe interpretarse como si indicara la inclusión de los plurales . La presente invención está dirigida a un método para inhibir la liberación exocitótica de por lo menos un mediador inflamatorio desde por lo menos una célula inflamatoria que comprende poner en contacto por lo menos una célula inflamatoria, célula que comprende por lo menos un mediador inflamatorio contenido dentro de una vesícula dentro de la célula, con al menos un péptido seleccionado del grupo que consiste de un péptido MANS y un fragmento activo de él, en una cantidad efectiva para reducir la liberación del mediador inflamatorio desde la célula inflamatoria, en comparación con la liberación del mediador inflamatorio desde el mismo tipo de célula inflamatoria, que ocurriría en ausencia del al menos un péptido. La presente invención está dirigida adicionalmente a un método para inhibir la liberación de por lo menos un mediador inflamatorio desde por lo menos una célula inflamatoria, en un tenido o un fluido de un sujeto, que comprende la administración al tejido y/o al fluido del sujeto, que comprende por lo menos una célula inflamatoria que comprende por lo menos un mediador inflamatorio contenido dentro de una vesícula dentro de la célula, una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende por lo menos un péptido seleccionado del grupo que consiste de un péptido MANS y un fragmento activo de él, en una cantidad terapéuticamente efectiva para reducir la liberación del mediador inflamatorio desde por lo menos una célula inflamatoria, cuando se compara con la liberación del mediador inflamatorio desde por lo menos una célula inflamatoria del mismo tipo, que ocurriría en ausencia del al menos un péptido. Más específicamente, reducir la liberación de un mediador inflamatorio comprende bloquear o inhibir el mecanismo que libera un mediador inflamatorio desde la célula inflamatoria . El péptido MANS usado en los métodos de la presente, descritos más arriba, comprende SEQ ID NO: 1. El fragmento activo, útil en la presente invención, comprende por lo menos un fragmento de SEQ ID NO: 1 con terminal N miristoilada , que comprende por lo menos seis aminoácidos; donde el primer aminoácido del fragmento comienza en la glicina N-terminal de SEQ ID NO: 1. Más específicamente, se puede seleccionar el fragmento activo del grupo que consiste de: N-miristoil -GAQFKTAAKGEAAAERPGEAA (SEA ID NO: 3); N-miristoil -GAQFSKTAAKGEAAAERPGEA (SEQ ID NO: 4) ; N-miristoil- GAQFSKTAAKGEAAAERPGE (SEQ ID NO: 5) ; N- miristoil -GAQFSKTAAKGEAAAERPG (SEQ ID NO: 6) ; N- miristoil - GAQFSKTAAKGEAAAAERP (SEQ ID NO: 7) ; N- miristoil - GAQFSKTAAKGEAAAER (SEQ ID NO: 8) ; N- miristoil- GAQFSKTAAKGEAAAE (SEQ ID NO: 9) ; N-miristoil -GAQFSKTAAKGEAAA (SEQ ID NO: 10) ; N-miristoil -GAQFSKTAAKGEAA (SEQ ID NO: 11) ; N-miristoil -GAQFSKTAAKGEA (SEQ ID NO: 12) ; N-miristoil-GAQFSKTAAKGE (SEQ ID NO: 13); N-miristoil -GAQFSKTAAKG (SEQ ID NO: 14; N-miristoil -GAQFSKTAAK (SEQ ID NO: 15); N-miristoil-GAQFSKTAA (SEQ ID NO: 16); N-miristoil -GAQFSKTA (SEQ ID NO: 17); N-miristoil -GAQFSKT (SEQ ID NO: 18) y N-miristoil -GAQFSK (SEQ ID NO: 19) . La presente invención está dirigida al contacto y/o la administración del péptido descrito en lo que antecede y en toda la memoria descriptiva, con cualquier célula inflamatoria conocida que pueda estar contenida en el tejido o en el fluido de un sujeto, que contiene por lo menos un mediador inflamatorio contenido dentro de una vesícula en el interior de la célula. La célula inflamatoria de preferencia es un leucocito, más preferible, un granulocito, que puede clasificarse adicionalmente como un neutrófilo, un basófilo, un eosinófilo, o una combinación de ellos. Las células inflamatorias puestas en contacto en el presente método también pueden ser un monocito/ macrófago. La presente invención está dirigida a reducir la liberación de mediadores inflamatorios contenidos dentro de las vesículas de células inflamatorias; y estos mediadores inflamatorios están seleccionados del grupo que consiste de mieloperoxidasa (MPO) , eosinófilo peroxidasa (EPO) , proteína básica principal (MBP) , lisozima, grancima, histamina, proteoglicano, proteasa, un factor quimiotáctico , citocina, un metabolito de ácido araquidónico, defensina, proteína que incrementa la permeabilidad bactericida (BPI), elastasa, catepsina G, catepsina B, catepsina D, beta-D-glucuronidasa , alfa-mannosidasa , fosfolipasa A2, sulfato de condroitina-4 , proteinasa 3, lactoferrina , colagenasa, activador de complemento, receptor de complemento, receptor de N-formilmetionil - leucil - fenilalanina (FMLP) , receptor de laminina, citocroma b558, monocito- factor quimiotáctico, histaminasa, proteína de unión con la vitamina B12, gelatinasa, activador de plasminógeno, beta-D-glucuronidasa, y combinaciones de ellos. De preferencia, estos mediadores inflamatorios están seleccionados del grupo que consiste de mieloperoxidasa (MPO) , eosinófilo. peroxidasa (EPO) , proteína básica principal (MBP) , lisozima, grancima y una combinación de ellas. La presente invención pone en contacto una cantidad efectiva del péptido con una célula inflamatoria; donde la cantidad efectiva se define como una cantidad inhibidora de la desgranulación de péptido MANS, o de un fragmento activo del mismo, que reduzca la cantidad de un mediador inflamatorio liberado desde por lo menos una célula inflamatoria, de alrededor de 1 por ciento a alrededor de 99 por ciento, en comparación con la cantidad liberada desde por lo menos una célula inflamatoria, en ausencia del péptido MANS o de un fragmento activo del mismo. Más preferible, esta cantidad efectiva del péptido puesto en contacto comprende una cantidad inhibidora de la desgranulación, de péptido MANS o de un fragmento activo de él, que reduzca la cantidad de un mediador inflamatorio liberado desde por lo menos una célula inflamatoria, de entre alrededor de 5-50 por ciento a alrededor de 99 por ciento, en comparación con la cantidad liberada desde por lo menos una célula inflamatoria, en ausencia del péptido MANS o de un fragmento activo de él. En una modalidad, la presente invención está dirigida a la administración de por lo menos un péptido que comprende un péptido MANS y un fragmento activo de él, en una cantidad terapéuticamente efectiva, en el tejido o el fluido de un sujeto; donde el sujeto está afligido por una enfermedad respiratoria, que de preferencia es asma, bronquitis crónica o COPD. En otra modalidad, el sujeto puede estar afligido por una enfermedad intestinal, una enfermedad cutánea, una enfermedad autoinmunológica , un síndrome de dolor, y combinaciones de ellas. La enfermedad intestinal puede ser colitis ulcerante, mal de Crohn o síndrome de intestino irritable. El sujeto puede estar afligido con una enfermedad cutánea, tal como erisipela, eczema, psoriasis o acné severo. El sujeto también puede estar afligido con artritis, tal como artritis reumatoide, artritis psoriásica, lupus eritematoso sistémico. Los sujetos afligidos por fibrosis cística también pueden ser tratados por el método y los péptidos de la presente. El método de la presente de preferencia es útil para el tratamiento de sujetos, tales como mamíferos, y de preferencia humanos, caninos, equinos y felinos. El presente método de tratamiento de los sujetos es mediante la administración de uno o más péptidos que incluyen el péptido MA S o un fragmento activo de él, descrito en la presente, que incluye la administración tópica, la administración parenteral , la administración rectal, la administración pulmonar, la administración nasal o la administración oral. Más específicamente, se selecciona la administración pulmonar del grupo de aerosol, inhalador de polvo seco, inhalador de dosis medida y nebulizador. Adicionalmente , el método descrito puede comprender además la administración al sujeto de una segunda molécula, seleccionada del grupo que consiste de un antibiótico, un compuesto antiviral, un compuesto antiparasitario, un compuesto antiinflamatorio y un inmunosupresor . En un aspecto la invención se refiere a un método para administrar una composición farmacéutica. La composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto conocido y un portador aceptable para uso farmacéutico. Una cantidad "terapéuticamente efectiva", cuando se usa aquí, es una cantidad de un compuesto que es suficiente para mejorar los síntomas exhibidos por un sujeto. La cantidad terapéuticamente efectiva variará con la edad y con la condición física del paciente; con la severidad de la condición del paciente que se está tratando; con la duración del tratamiento; con la naturaleza de cualquier tratamiento concurrente; con el portador aceptable para uso farmacéutico empleado y otros factores similares, dentro del conocimiento y la experiencia de quienes sean expertos en la materia. De preferencia los portadores aceptables para uso farmacéutico son formas de dosis sólidas, tales como tabletas o cápsulas. También se pueden usar preparaciones líquidas para administración oral, y se pueden preparar en la forma de jarabes o suspensiones, por ejemplo, soluciones que contienen un ingrediente activo, azúcar y una mezcla de etanol, agua, glicerol y propilenglicol. Si se desea, dichas preparaciones líquidas pueden incluir uno o más de los siguientes: agentes colorantes, agentes saborizantes y sacarina. Adicionalmente , también pueden usarse agentes espesadores, tales como carboximetilcelulosa, así como otros portadores aceptables, cuya selección es conocida en la técnica. Tal como se señaló más atrás, la presente invención se refiere a métodos para regular los procesos secretores celulares, especialmente los que liberan mediadores inflamatorios desde células inflamatorias. Tal como se usa aquí, el término "regular" significa bloquear, inhibir, disminuir, reducir, incrementar, intensificar o estimular. Varios procesos secretores celulares implican la liberación de contenidos desde vesículas o gránulos unidos a la membrana, dentro de células. Una vesícula o un gránulo unidos a la membrana se definen como una partícula intracelular , que primariamente es vesicular (o una vesícula dentro de una célula) y que contiene material almacenado que puede ser secretado. Se ha encontrado que algunos de los contenidos de esas vesículas, tales como las contenidas en las células inflamatorias, son responsables de una variedad de patologías en numerosos tejidos de mamíferos. Algunos de los efectos de esas secreciones parecen incluir daños de tejido previamente sano, durante la inflamación. Esta invención provee un medio para bloquear la secreción de cualquier vesícula unida a la membrana, incluyendo las que se encuentran en células inflamatorias, apuntando a una molécula específica, importante en la trayectoria secretora intracelular, con un péptido sintético. Esta solución puede ser de importancia terapéutica para el tratamiento de una gran variedad de condiciones hipersecretoras e inflamatorias en los humanos y los animales . Más específicamente, la presente invención se dirige a células inflamatorias que contienen los mediadores inflamatorios en uno o más gránulos o vesículas, dentro del citoplasma de las células. Se ponen en contacto las células con uno o más péptidos, que están seleccionados del péptido MA S o un fragmento activo de él, todos los cuales están descritos detalladamente aquí. De preferencia, el contacto del péptido con la célula inflamatoria se efectúa mediante la administración a un sujeto afligido por, o que sufre de, una enfermedad en la que se encuentran presentes estas células inflamatorias en un tejido o fluido específico dentro del tejido. Cuando se administra el péptido o se lo pone en contacto con la célula, el péptido compite por, e inhibe competitivamente, la unión de la proteína MARCKS natural a la membrana de los gránulos o vesículas intracelulares , que contienen los mediadores inflamatorios. Como resultado del bloqueo de la unión de la proteina MARKCS a las vesículas en las células inflamatorias, esas vesículas en estas células no se mueven a la membrana de plasma de las células como normalmente lo harían cuando se las estimula para liberar exocitóticamente sus contenidos de mediadores inflamatorios fuera de las células. De esa manera, el método de la presente invención inhibe el movimiento de las vesículas a la membrana de plasma de las células; lo que, a su vez, reduce la liberación de los mediadores inflamatorios desde las células inflamatorias. La cantidad de mediadores inflamatorios liberados desde las células, se reduce con el tiempo, debido tanto la velocidad de liberación como la cantidad liberada de los mediadores desde las células inflamatorias, dependen de la concentración del péptido administrado, y de su contacto con las células inflamatorias. Un beneficio de la presente invención es que puede combinar una terapia que incluye el bloqueo directo de la secreción del moco, con una terapia antiinflamatoria específica. Un beneficio de la presente invención con respecto a las actuales terapias antiinflamatorias que afectan una supresión general del sistema inmunológico, es que el péptido está pensado para bloquear la secreción sólo de los componentes intracelulares secretados desde células inflamatorias. Así, muchos aspectos del sistema inmunológico todavía deben funcionar, incluso con la inhibición de los mediadores inflamatorios. Los compuestos de la invención pueden regular, es decir, bloquear, la liberación desde las células del mediador inflamatorio. Esta inhibición de la liberación de los mediadores inflamatorios es un medio atractivo para prevenir y tratar una variedad de trastornos, por ejemplo, enfermedades y condiciones patológicas que implican inflamación. De esa manera, los compuestos de la invención pueden ser útiles para el tratamiento de esas condiciones.

Estas comprenden las enfermedades de las vías respiratorias y las enfermedades inflamatorias crónicas incluyendo, pero sin limitación a ellas: osteoartritis , esclerosis múltiple, síndrome de Guillain-Barre , mal de Crohn, colitis ulcerante, psoriasis, enfermedad de injerto contra receptor, lupus eritematoso sistémico y diabetes mellitus dependiente de la insulina. También se pueden usar los compuestos de la invención para tratar otras alteraciones asociadas con la actividad de niveles elevados de mediadores proinflamatorios y enzimas proinflamatorias , tales como las respuestas a diversos agentes infecciosos, y numerosas enfermedades autoinmunes, tales como: artritis reumatoide, síndrome de choque tóxico, diabetes y enfermedad de intestino inflamable. Los usos del péptido y los métodos de la invención incluyen terapias para combatir la inflamación, junto con terapias que combinarán la actividad antiinflamatoria del péptido con su capacidad para bloquear la secreción de moco. Las enfermedades que pueden ser tratadas mediante la capacidad del péptido para bloquear tanto la inflamación cuanto la secreción de moco, incluyen, pero sin limitación a ellas: enfermedades de intestino inflamable, trastornos digestivos (es decir, vesícula inflamada, mal de Menetier) y enfermedades de las vías respiratorias. También se puede usar el péptido para bloquear la liberación de exceso de insulina de las células de la isleta pancreática. Se ha correlacionado a otros mediadores proinflamatorios con una variedad de estados mórbidos que se correlacionan con el flujo entrante de neutrófilos dentro de los sitios de inflamación o de daño. Se ha demostrado que bloquear los anticuerpos es una terapia útil contra los daños al tejido asociado con neutrófilos, en inflamación aguda (Harada y coautores, 1996, Molecular Medicine Today 2, 482). Otras células, además de los neutrófilos, que pueden liberar mediadores inflamatorios, incluyen otros leucocitos, tales como: basófilos, eosinófilos, monocitos y linfocitos; y las terapias pueden ser dirigidas contra la secreción desde esas células. Los neutrófilos, los eosinófilos y los basófilos son, cada uno, un tipo de granulocito ; es decir, un leucocito que tiene gránulos en su citoplasma. Los leucocitos sintetizan varios mediadores inflamatorios, que están empacados y almacenados en gránulos citoplásmicos . Entre estos mediadores están, por ejemplo, la mieloperoxidasa (MPO) en los neutrófilos (Borregaard, N., Cowland, J. B., Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte . Blood, 1997; 89:3503-3521), la eosinófilo peroxidasa (EPO) y la proteína básica principal (MBP) en los eosinófilos (Gleich G. J., Mechanisms of eosinophil -associated inflammation . J. Allergy Clin. Immunol . , 2000, 105:651-663); la lisozima en los monocitos/macrófagos (Hoff, T., Spencker, T . , Emmendoerffer, A., Goppelt-Struebe , M. , Effects of glucocorticoids on the TPA-induced wonocytic differentiation . J. Leukoc. Biol., 1992, 52:173-182; Balboa, M. A., Saez, Y., Balsinde, J., Calcium-independent phospholipase A2 is required for lysozyme secretion in U937 promonocytes . J. Immunol., 2003, 170:5276-5280), y la granzima en las células matadoras naturals (NK) y los linfocitos citotóxicos (Bochan, M. R. , Goebel, W. S., Brahmi , Z., Stably transfected antisense granzyme B and perforin constructs inhibit human granule-mediated lytic ability. Cell Immunol., 1995, 164:234-239; Gong, J. H., Mak, G., Glingemann, H. G., Characterization of a human cell Une (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells. Leukemia 1994, 8:652-658; Maki , G., Klingemann, H. G., Martinson, J. A., Tam, Y. K. , Factors regulating the cytotoxic activity of the human natural killer cell Une, NK-92. J. Hematother. Stem Cell. Res., 2001, 10:369-383, y Takayama, H., Trenn, G., Sitkovsky, M. V., A novel cytotoxic T lyphocyte activation assay. J. Immunol . Methods, 1987, 104:183-190-10). Estos mediadores pueden ser liberados en sitios de daño y pueden contribuir a la inflamación y la reparación, tal como en el pulmón y en algunas otras partes, como resultado de la infiltración de estas células en el tejido del sitio del daño o la enfermedad. Los leucocitos liberan estos gránulos por medio de un mecanismo exocitótico (Burgoyne, R. D., Morgan, A., Secretory granule exocytosis. Physiol . Rev. , 2003, 83:581-632; Logan, M. R., Odemuyiwa S. 0., Moqbel R., Understanding exocytosis in i mune and inflammatory cells: the molecular basis of mediator secretion. J. Allergy Clin. Immunol., 2003 , 111 : 923-932) . Las células troncales, que usualmente no circulan en el torrente sanguíneo, y los basófilos, contienen gránulos citoplásmicos secretorios, que almacenan y pueden liberar, cuando se activa la célula, mediadores inflamatorios preformados (anafilácticos) , tales como histamina, proteoglicanos , tales como heparina y sulfato de condroitina, proteasas, tales como triptasa, quimasa, carboxipeptidasa y proteasa parecida a catepsina G; factores quimiotácticos , citocinas y metabolitos de ácido araquidónico que actúan sobre la vasculatura, el músculo liso, el tejido conector, las glándulas mucosas y las células inflamatorias. Los neutrófilos, conocidos también como leucocitos polimorfonucleares (PMN) constituyen de 50 a 60 por ciento del total de los leucocitos circulantes. Los neutrófilos actúan contra agentes infecciosos, tales como bacterias, hongos, protozoarios , virus, células infectadas viralmente, así como células tumorales que penetran en las barreras físicas del cuerpo, en los sitios de infección o de daño. Los neutrófilos maduran a través de seis etapas morfológicas : mieloblastos , promieloblastos , mielocitos, metanmielocitos , neutrófilos no segmentados (en banda) y neutrófilos segmentados ( funcionalmente activos) . En los neutrófilos, los mediadores inflamatorios están almacenados en gránulos primarios (taurófilos) , secundarios (específicos) y terciarios (gelatinasa) , así como en vesículas secretoras. Entre los numerosos mediadores de inflamación, los gránulos primarios (azurófilos) contienen mieloperoxidasa (MPO) , lisozima, defensinas, proteína que incrementa la permeabilidad bactericida (BPI), elastasa, catepsina G, catepsina B, catepsina D, beta-D-glucuronidasa , alfa-mannosidasa, fosfolipasa A2, sulfato de condoitina-4 y proteinasa 3 (ver, por ejemplo, Artwig J. H., Thelen, M . , Rosen, A., Janney, P. A., Naim, A. C, Anderem, A., MARCKS in an actin filament crosslinking protein regulated by protein kinase C and calcium calmodulin. Nature 1992, 356: 618-622); los gránulos secundarios (específicos) contienen lisozima, lactoferrina , colagenasa, activador complementario, fosfolipasa A2, receptores complementarios, por ejemplo, CR3 , CR4 , receptores de N- formilmetionil - leucil - fenilalaniña (FMLP) , receptores de laminina, citocromo b558 , monocito-factor quimiotáctico, histaminasa y proteína de unión a vitamina B12; y los pequeños gránulos de almacenamiento contienen gelatinasa, activador de plasminógeno , catepsina B, catepsina D, beta-D-glucuronidasa , alfa-mannosidasa y citocromo b558. Los gránulos de neutrófilos contienen sustancias antimicrobianas o citotóxicas, proteinasas neutras, hidrolasas de ácido y un conjunto de receptores de membrana citoplásmica . Entre los constituyentes del gránulo azurofílico, la mieloperoxidasa (MPO) es una enzima crítica en la conversión de peróxido de hidrógeno a ácido hipocloroso. Junto con el peróxido de hidrógeno y un cofactor de haluro, forma un mecanismo microbicida y citotóxico efectivo de los leucocitos: el sistema mieloperoxidasa . Las defensinas, que constituyen de 30 a 50 por ciento de la proteína de gránulo azurofílico, son pequeños péptidos (peso molecular menor que 4000), que son antimicrobianos potentes, que son citotóxicos para una variedad grande de bacterias, hongos y algunos virus. Su toxicidad se puede deber a la permeabilización de la membrana de la célula de destino o blanco, que es similar a otras proteínas formadoras de canal (perforinas) . La proteína que incrementa la permeabilidad bacteriana (BPI) es un miembro de las perforinas. Es altamente tóxica para las bacterias Gram-negativas , pero no lo es para las bacterias Gram-positivas ni para los hongos, y también puede neutralizar la endotoxina, el componente tóxico de lipopolisacárido de la envolvente de la célula bacteriana Gram-negativa .

Los secuestradores de lactofrerrina liberan hierro, previniendo de esa manera el desarrollo de microorganismos ingeridos que sobreviven al proceso de exterminio e incrementan la permeabilidad bacteriana a la lisozima. Las serina proteasas, tales como la elastasa y la catepsina G, hidrolizan las proteínas en las envolventes de la célula bacteriana. Los substratos de granulocito elastasa incluyen entrelazamientos de colágeno y proteoglicanos , así como los componentes de elastina de los vasos sanguíneos, los ligamentos y los cartílagos. La catepsina D divide los proteoglicanos del cartílago; mientras que las granulocito colagenasas son activas en la división del colágeno del tipo I y, en menor grado, el del tipo III, de huesos, cartílagos y tendones. Los productos de descomposición del colágeno tienen actividad quimiotáctica para los neutrófilos, los monocitos y los fibroblastos. La regulación del tejido destructor potencial de las proteasas lisosómicas es mediada por los inhibidores de proteasa, tales como alfa2 -macroglobulina y alfal-antiproteasa . Estas antiproteasas están presentes en el suero y en los fluidos sinoviales. Pueden funcionar uniéndose a los sitios activos de las proteasas y cubriéndolos. Puede ser importante el desequilibrio proteasa-antiproteasa en la patogénesis del enfisema. Los gránulos azurofílicos funcionan predominantemente en el medio intracelular (en la vacuola fagolisosómica) , donde se involucran en la muerte y la degradación de los microorganismos. Los gránulos específicos para neutrófilos son susceptibles de liberar sus contenidos extracelularmente y juegan un papel importante para iniciar la inflamación. Los gránulos específicos representan un depósito intracelular de diversos componentes de membrana de plasma, incluyendo el citocromo b (componente de NADPH oxidasa, una enzima que es responsable de la producción de superóxido) , los receptores para el fragmento complementario iC3b (CR3, CR4), para la laminina y los quimioatractivos de formilmetionil -péptido . Además de otros, está la histaminasa que es relevante para la degradación de la histamina, la proteína que se une a la vitamina, y el activador de plasminógeno , que es el responsable de la formación de plasmina y de la separación de C5a de C5. La importancia de los gránulos de neutrófilo en la inflamación es aparente a partir de los estudios de varios pacientes con anormalidades congénitas de los gránulos. Los pacientes con síndrome de Chédiak-Higashi tienen una anormalidad profunda en la velocidad de establecimiento de una respuesta inflamatoria y tienen gránulos lisosómicos anormalmente grandes. el síndrome congénito de la deficiencia de gránulo específico es un trastorno excesivamente raro, caracterizado por respuestas inflamatorias disminuidas e infecciones bacterianas severas del tejido cutáneo y de los tejidos profundos. Si bien sólo se entienden parcialmente los mecanismos que regulan la secreción exocitótica de estos gránulos, se han identificado varias moléculas claves en el proceso, incluyendo los transitorios intracelulares Ca2+ (Richter y coautores, Proc . Nati. Acad. Sci . USA, 1990; 87:9472-9476; Blackwood y coautores, Biochem J. , 1990, 266:195-200); las proteínas G, las tirosina y proteína quinasas (PK, especialmente PKC) (Smolen y coautores, Biochim. Biophys Acta, 1990; 1052:133-142; Niessen y coautores, Biochim. Biophys. Acta, 1994; 1223:267-273; Naucler y coautores, Petersen y coautores, Chest 2002; 121; 142-150), Rac2 (Abdel -Latif y coautores, Blood 2004; 104:821-839; Lacy y coautores, J". Immunol . , 2003, 170:260-2679) y varíaos SNARE, SNAP y VAMP (Sollner y coautores, Nature 1993, 362:318-324; Lacy, Pharmacol . Ther. , 2005; 107:358-376). Las proteínas SNARE (receptor de proteína por fijación de N-etilmaleimida soluble) son una familia de proteínas asociadas con la membrana, caracterizadas por un dominio de hélice enrollada, alfa-helicoidal, denominada motivo SNARE (Li y coautores, Cell. Mol. Life Sci . , 60:942-960 (2003)) . Estas proteínas se clasifican como v-SNARE y t-SNARE, con base en su localización en la vesícula o en la membrana de blanco; otros esquemas de clasificación definen las R-SNARE y las Q-SNARE, con base en el residuo arginina o glutamina conservado en el centro del motivo SNARE. Las SNARE están localizadas en distintos compartimientos de la membrana de las trayectorias de tráfico secretor y endocítico, y contribuyen a los procesos intracelulares de fusión de la membrana. El dominio t-SNARE consiste de un haz de 4 hélices con una torsión de hélice enrollada. El motivo SNARE contribuye a la fusión de dos membranas. Los motivos SNARE quedan dentro de cuatro clases: los homólogos de sintexina la (t-SNARE) , VAMP-2 (v-SNARE) y los motivos SNARE N- y C-terminales de SNAP-25. Un miembro de cada una de esas clases puede interactuar para formar un complejo SNARE. Se encuentra el motivo SNARE en los dominios N-terminales de ciertos miembros de la familia de la sintaxina, tales como sintaxina la, que se requiere para la liberación de neurotransmisores (Lerman y coautores, Biochemistry, 39:8470-8749 (2000)), y sintexina 6, que se encuentra en las vesículas de transporte endosomico (Misura y coautores, Proc . Nati. Acad. Sci . U.S. A., 99:9184-9189 (2002)). Las proteínas SNAP-25 (proteína asociada con sinaptosoma, de 25 kDa) , son componentes de los complejos SNARE, que pueden tener una función en la especificidad de la fusión de la membrana, y ejecutar directamente la fusión, formando un complejo compacto (el complejo SNARE o complejo central) que reúne la vesícula sináptica y las membranas de plasma. Las SNARE constituyen una gran familia de proteínas que se caracterizan por secuencias de 60 residuos, conocidas como los motivos SNARE, que tienen una elevada propensión a formar hélices enrolladas y con frecuencia preceden a las regiones de transmembrana carboxi -terminales . Se forma el complejo de núcleo sináptico mediante cuatro motivos SNARE (dos procedentes de SNAP-25 y uno de cada una de sinaptobrevina y sintaxina 1) que están estructuradas incompletamente en aislamiento, pero que forman un haz de cuatro hélices paralelas al ensamblarlas. La estructura cristalina del complejo central ha revelado que el haz de hélices está fuertemente torcido y que contiene varios puentes de sal sobre la superficie, así como capas de residuos hidrófobos interiores. Está formada una capa polar en el centro del complejo mediante tres glutaminas (dos de SNAP-25 y una de sintaxina 1) y una arginina (de sinaptobrevina) (Rizo y coautores, Nat. Rev. Neurosci . , 3:641-653 (2002)). Los miembros de la familia SNAP.25 contienen un agrupamiento de residuos de cisteína, que pueden estar palmitoilados para fijarse a la membrana (Risinger y coautores, J. Biol . Chem. , 268:24408-24414 (1993)). La principal función de los neutrófilos es fagocitar y destruir agentes infecciosos. También limitan el desarrollo de algunos microbios, antes del inicio de respuestas inmunológicas adaptativas (específicas) . Si bien los neutrófilos son esenciales para la defensa del huésped, también han sido implicados en la patología de muchas condiciones inflamatorias crónicas, y en daños de reperfusión de isquemia. Las enzimas hidrolíticas de origen neutrófilo y los inhibidores de proteasa inactivados de manera oxidante pueden ser detectados en el fluido aislado de los sitios inflamatorios. Bajo condiciones normales, los neutrófilos pueden migrar a sitios de infección sin daños para los tejidos del huésped. Sin embargo, algunas veces pueden ocurrir daños indeseables a un tejido del huésped. Este daño puede ocurrir por medio de varios mecanismos independientes. Éstos incluyen la activación prematura durante la migración, la liberación extracelular de productos tóxicos durante la muerte de algunos microbios, la eliminación de célula huéspedes infectadas o dañadas, y los detritus, como un primer paso en la remodelación del tejido, o la falla en dar por terminadas las respuestas inflamatorias agudas. El daño por reperfusión de isquemia está asociado con un flujo de entrada de neutrófilos al tejido afectado, y su activación subsiguiente. Esto puede ser disparado por las sustancias liberadas desde las células huéspedes dañadas, o como consecuencia de la generación de superóxido, a través de la xantina oxidasa. Bajo condiciones normales, la sangre puede contener una mezcla de neutrófilos normales, primados, activados y agotados. En un sitio inflamatorio, están presentes principalmente neutrofilos activados y agotados. Los neutrofilos activados tienen producción intensificada de intermediarios de oxígeno reactivo (ROI) . Se ha detectado una subpoblación de neutrofilos con la descarga respiratoria intensificada en la sangre de personas con una infección bacteriana aguda y en pacientes con el síndrome de dificultad respiratoria de adultos (ARDS) . Este es un ejemplo de una paradoja con los neutrofilos. Los neutrofilos han sido implicados en la patología de esta condición, debido a la gran afluencia de estas células hacia los pulmones y al daño en el tejido asociado provocado por los oxidantes y las enzimas hidrolíticas liberadas desde los neutrofilos activados. El perjuicio por la actividad microbicida de los neutrofilos, que ocurre conforme empeora el ARDS, puede ser una respuesta protectora sobre la parte del huésped, que es inducida localmente por los productos inflamatorios. La fase aguda del daño térmico también está asociada con la activación de neutrofilos, y esto va seguido por un perjuicio general en diversas funciones de los neutrofilos. La activación de los neutrofilos por complejos inmunológicos en el fluido sinovial, contribuye a la patología de la artritis reumatoide . La activación crónica de los neutrofilos también puede iniciar el desarrollo de tumores, debido a cierto ROI generado por los neutrofilos, que daña el ADN y las proteasas, promueve la migración de células tumorales. En pacientes que sufren de quemaduras severas, se ha establecido una correlación entre el inicio de la infección bacteriana y la reducción en la proporción y los números absolutos de los neutrofilos positivos para el anticuerpo y los receptores de complemento. También se ha demostrado que los oxidantes de origen de neutrófilos oxidan las lipoproteínas de baja densidad (LDL) , que luego se unen más efectivamente a la membrana de plasma de los macrófagos, a través de los receptores de depurador específicos. La captación de estas LDL oxidadas por los macrófagos puede iniciar la ateroesclerosis . Adicionalmente , se han encontrado neutrófilos primados en personas con hipertensión esencial, mal de Hodgkin, mal de intestino inflamable, psoriasis, sarcoidosis y septicemia, donde la primación se correlaciona con concentraciones altas de TNF-alfa (caquectina) en circulación. Puede ocurrir daño hidrolítico al tejido del huésped y, por lo tanto, pueden ocurrir condiciones inflamatorias crónicas cuando se las pantallas antioxidantes y antiproteasa son vencidas. Se cree que la deficiencia en antiproteasa es responsable de la patología del enfisema. Muchas antiproteasas son miembros de la familia del inhibidor de serina proteasa (SERPIN) . Si bien la circulación es rica en antiproteasas, estas proteínas grandes pueden ser excluidas selectivamente en sitios de inflamación, debido a que los neutrófilos se adhieren a sus blancos. La tensión oxidante puede iniciar daños a los tejidos, reduciendo la concentración de antiproteasas extracelulares por debajo del nivel requerido para inhibir las proteasas liberadas. Los oxidantes clorados y el peróxido de hidrógeno pueden inactivar las antiproteasas, tales como el inhibidor de alfal-proteasa y la alfa2-macroglobulina, que son inhibidores endógenos de elastasa, pero que activan simultáneamente las metaloproteasas latentes, tales como las colagenasas y la gelatinasa, que contribuyen a la inactivación adicional de las antiproteasas . Los constituyentes citoplásmicos de los neutrofilos también pueden ser causa de la formación de anticuerpos citoplásmicos anti -neutrofilos (ANCA) específicos, que están relacionados íntimamente con el desarrollo de vasculitis sistémica y de glomerulonefritis . Los ANCA son anticuerpos dirigidos contra enzimas que se encuentran principalmente dentro de los azurófilos o gránulos primarios de los neutrofilos. Hay tres tipos de ANCA que pueden distinguirse por los patrones que producen por inmunofluorescencia indirecta sobre los neutrofilos normales, fijados con etanol . La fluorescencia citoplásmica granular fina (cANCA) difusa se encuentra típicamente en la granulomatosis de Wegener, en algunos casos de poliarteritis microscópica y en el síndrome de Churg-Strauss y en algunos casos de glomerulonefritis necrosante crescéntica y segmental . El antígeno de destino usualmente es la proteinasa 3. Se encuentra la fluorescencia perinuclear (pANCA) en muchos casos de poliarteritis microscópica y de glomerulonefritis . Estos anticuerpos frecuentemente son dirigidos contra la mieloperoxidasa , pero otros destinos incluyen: elastasa, catepsina G, lactoferrina , lisozima y beta-D-glucuronidasa . El tercer grupo, designado ANCA "atípicos" incluye fluorescencia nuclear de neutrofilos y algunos patrones citoplásmicos inusuales, y aunque unos pocos antígenos de destino son compartidos con pANCA, los demás no han sido identificados todavía. pANCA también se encuentran en un tercio de los pacientes con el mal de Crohn . La incidencia informada de ANCA en artritis reumatoide y SLE varía considerablemente, pero los patrones son predominantemente pANCA y ANCA atípicós. El eosinófilo es un leucocito de etapa terminal, terminalmente diferenciado, que reside predominantemente en el tejido submucosal y es reclutado a sitios de reacciones inmunológicas específicas, que incluyen las enfermedades alérgicas. El citoplasma del eosinófilo contiene grandes gránulos elipsoidales con un núcleo cristalino denso en electrones, y una matriz parcialmente permeable. Además de estos gránulos cristaloides primarios, grandes, hay otro tipo de gránulo que es menor (gránulo pequeño) y carece del núcleo cristalino. Los gránulos específicos grandes de los eosinófilos contienen por lo menos cuatro proteínas catiónicas distintas, que ejercen una variedad de efectos biológicos sobre las células huéspedes y los destinos microbianos: la proteína básica principal (MBP) , la proteína catiónica de eosinófilo (ECP) , la neurotoxina derivada de eosinófilo (EDN) y la eosinófilo peroxidasa (EPO) . Los basófilos contienen aproximadamente una cuarta parte de la proteína básica principal que contienen los eosinófilos junto con cantidades detectables de EDN, ECP y EPO. También se han encontrado cantidades pequeñas de EDN y de ECP en neutrófilos (Gleich G. J. , Mechanis s of eosinophil -associated inflawmation. J. Allergy Clin. Immunol . , 2000, 105:651-663). La MBP parece carecer de actividad enzimática, pero es un polipéptido fuertemente catiónico, que puede ejercer sus actividades tóxicas por medio de interacciones con membranas de lípidos que conducen a su descomposición. Tanto MBP como EPO pueden actuar como inhibidores alostéricos selectivos de la unión agonista a los receptores muscarínicos M2. Estas proteínas pueden contribuir a la disfunción del receptor M2 y a intensificar la bronquioconstriccion mediada por el vago en el asma. La EDN puede dañar específicamente el revestimiento de mielina de las neuronas. La histaminasa, y una variedad de enzimas lisosómicas hidrolíticas , también están presentes en los gránulos grandes específicos de los eosinófilos. Entre las enzimas en gránulos pequeños de los eosinófilos están la arilsulfatasa, la ácido fosfatasa y una metaloproteinasa de 92 kDa, una gelatinasa. Los eosinófilos pueden elaborar citocinas que incluyen las que tienen actividades potenciales de factor de desarrollo de autocrina para los eosinófilos, y las que tienen funciones potenciales en las respuestas inflamatorias agudas y crónicas. Tres citocinas tienen actividades de factor de desarrollo para los eosinófilos: el factor estimulador de colonia de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) ; IL-3 e IL-5. Otras citocinas producidas por eosinófilos humanos, que pueden tener actividades en respuestas inflamatorias agudas y crónicas incluyen: IL-l-alfa, IL-6, IL-8, TNF-alfa y los dos factores de desarrollo transformante: TGF-alfa y TGF-beta. Los eosinófilos contienen gránulos cristaloides que contienen MBP, la proteína catiónica de eosinófilo EPO y neurotoxina derivada de eosinófilo (Gleich, J\ Allergy Clin. Immunol., 2000; 105:651-663). La línea de células promielocíticas humanas HL-60, clon 15, puede ser usada para examinar la secreción de EPO. Esta línea de células fue establecida a partir de un clon de HL-60 que había sido desarrollado a un pH elevado durante dos meses (Fischkoff, Leuk. Res., 1988; 12:679-686), y luego tratado con ácido butírico para permitir que se diferenciasen las células, de modo que exhibieran muchas de las características de los eosinófilos de la sangre periférica, incluyendo la expresión de proteínas de gránulo específicas para eosinófilos (Rosenberg y coautores, J. Exp. Med. , 1989; 170:163-176; Tiffany y coautores, J". Leukoc . Biol . , 1995; 58:49-54; Badewa y coautores, Exp. Biol. Med., 2002; 227:645-651). Los eosinófilos pueden participar en reacciones de hipersensibilidad, especialmente a través de dos mediadores inflamatorios lípidos: el leucotrieno C4 (LTC4) y el factor activador de plaquetas (PAF) . Ambos mediadores contraen el músculo liso de las vías respiratorias, promueven la secreción de moco, alteran la permeabilidad vascular y disparan la infiltración con eosinófilos y neutrófilos. Además de las actividades directas de estos mediadores derivados de eosinófilos, la MBP puede estimular la liberación de histamina desde los basófilos y los mastocitos, y la MBP puede estimular la liberación de EPO desde los mastocitos. Los eosinófilos pueden servir como fuente local de mediadores lípidos específicos, así como inducir la liberación de mediadores desde los mastocitos y los basófilos. El contenido del gránulo de eosinófilo es liberado después de estímulos similares a los gránulos de neutrófilos, por ejemplo, durante la fagocitosis de partículas opsonizadas y mediante factores quimiotácticos . Las enzimas lisosómicas de neutrófilo actúan primariamente sobre el material ingerido en los fagolisosomas , mientras que los contenidos del gránulo de eosinófilo actúan principalmente sobre la estructura de destino extracelular, tales como los parásitos y los mediadores inflamatorios. El desarrollo de monocitos y de macrófagos tiene lugar en la médula ósea y pasa a través de los siguientes 4 pasos: célula troncal; célula troncal depositada; monoblasto; promonocito ; monocito en médula ósea; monocito en sangre periférica; y macrófago en tejidos. La diferenciación del monocito en la médula ósea procede rápidamente (de 1.5 a 3 días) . Durante la diferenciación, se forman gránulos en el citoplasma del monocito, y éstos pueden dividirse como en los neutrófilos, en al menos dos tipos. Sin embargo, son menos y más pequeños que sus contrapartes de neutrófilos (azurofilos y gránulos específicos) . Su contenido enzimático es similar. Las enzimas unidas a gránulo, de los monocitos/macrófagos , incluyen lisozina, acido fosfatasa y beta-glucuronidasa . Como modelo para los estudios in vivo, se usó la secreción de lisozima de células U937. Esta línea de células se deriva del linfoma histiocítico humano, y ha sido usada como línea de células monocíticas, que se puede activar mediante una variedad de agonistas, tales como PMA (Hoff y coautores, J. Leukoc . Biol . , 1992; 52:173-182; Balboa y coautores, J. Immunol . , 2003; 170:5276-5280; Sundstrom y coautores, Int. J. Cáncer, 1976; 17:565-577). Las células asesinas naturales (NK) y los linfocitos citotóxicos contienen gránulos citotóxicos potentes que incluyen la perforina, una proteína formadora de poros, y las granzimas, serina proteasas específicas para los linfocitos. Por ejemplo, la línea de células NK-92 es una línea humana, dependiente de IL-2, establecida de un paciente con linfoma que no es de Hodgkin, rápidamente progresivo (Gong, J. H., Maki , G., Klingemann, H. G., Characterization of a human cell Une (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells. Leukemia, 1994; 8:652-658). Las células NK-92 expresan niveles elevados de moléculas involucradas en la trayectoria citolítica de la perforina-granzima, que se dirige a una amplia variedad de células malignas (Gong y coautores, vide infra, y Maki , G., Glingemann, H. G., Martinson, J. A., Tam, Y. K. , Factors regulating the cytotoxic activity of the human natural kíller cell Une, NK-92. J. Hematother. Stem Cell Res.-, 2001; 10 :369-383) . Las granzimas son serina proteasas exógenas que son liberadas por los gránulos citoplásmicos dentro de células T citotóxicas y dentro de las células asesinas naturales. Las granzimas pueden inducir la apoptosis dentro de células infectadas con virus, destruyéndolas de esa manera. La liberación extracelular de un mediador de la inflamación (mediador inflamatorio) desde un granulocito (o leucocito) y la liberación extracelular de más de un mediador de inflamación (mediador inflamatorio) desde un granulocito (o leucocito) algunas veces se denomina en la presente "desgranulación" . En una modalidad preferida, la liberación de un mediador de la inflamación comprende liberar el mediador desde un gránulo situado en el interior de un granulocito o de un leucocito. La liberación del mediador inflamatorio de preferencia es la liberación de un mediador inflamatorio desde estos gránulos. Los neutrófilos y los macrófagos, al ser cebados por agentes pro-inflamatorios (estimulantes inflamatorios) , tales como TNFa, incrementan dramáticamente su síntesis de proteína MARCKS : hasta 90 por ciento de la nueva proteína formada por los neutrófilos, en respuesta a TNFa o al lipopolisacárido (LPS) en MARCKS (Thelen, M. , Rosen, A. , Nairn, A. C, Aderem, A., Tumor necrosis factor alpha modifies agonist-dependent responses in human neutrophils by inducing the synthesis and miristoilation of a specific protein kinase C substrate. Proc . Nati . Acad. Sci . USA, 1990; 87:5603-5607). De tal manera, MARCKS tiene un papel importante en la liberación subsiguiente de mediadores inflamatorios cuando las células que contienen gránulo, tales como los neutrófilos y los macrófagos, son estimuladas por agonistas, especialmente aquellos que funcionan activando la PKC (Burgoyne y coautores, Physiol. Rev. , 2003; 83-581-632; Logan y coautores, J. Allergy Clin. Immunol . , 2003; 111:923-932; Smolen y coautores, Biochim. Biophys . Acta, 1990; 1052:133-142; Niessen y coautores, Biochim. Biophys. Acta, 1994; 1223:267-273; Naucler y coautores, J. Leukoc . Biol . , 2002 ; 71 : 701-710) . En un aspecto de está invención, la administración de una cantidad inhibidora de la desgranulación, del péptido MANS, o de un fragmento activo de él, como se describe aquí, a un sitio de inflamación en un sujeto; habiendo resultado el sitio de inflamación del inicio de una enfermedad, una condición, un trauma, un cuerpo extraño o una combinación de ellos, en el sitio de inflamación del sujeto, puede reducir la cantidad de un mediador de la inflamación liberado desde los leucocitos de infiltración en el sitio de la inflamación; donde los leucocitos de preferencia son granulocitos . La administración del péptido MANS y/o por lo menos un fragmento activo de él, puede reducir la cantidad de un mediador de la inflamación, liberado desde leucocitos, tales como los granulocitos que se infiltran en el sitio de la inflamación. La cantidad inhibidora de desgranulación del péptido MA S, o la cantidad inhibidora de desgranulación de uno de sus fragmentos activos, es suficiente para reducir o inhibir la liberación exocitótica de mediadores inflamatorios desde los gránulos contenidos dentro de las células inflamatorias que se, infiltran al sitio. Se mide la eficacia inhibidora de la desgranulación en un tiempo después de la administración del péptido MA S o su fragmento, en comparación con el porcentaje de inhibición (es decir, el porcentaje de reducción) de la liberación de los mediadores de la inflamación desde dichas células (leucocitos o granulocitos u otras células inflamatorias) con relación al nivel o la cantidad o la concentración de dichos mediadores de la inflamación, liberados o producidos aproximadamente en el mismo tiempo, en ausencia del péptido MANS y/o en ausencia del fragmento activo de él. Adicionalmente , el personal clínico con experiencia puede determinar si la inflamación en el sitio del tejido se ha reducido midiendo los síntomas y los parámetros de inflamación conocidos como indicadores de la enfermedad, para determinar si se ha administrado una cantidad suficiente o terapéuticamente efectiva del péptido MANS y/o de un fragmento activo de él. Una cantidad inhibidora de la desgranulación, suficiente, es el porcentaje de reducción de un mediador de la inflamación liberado desde un granulocito, en el sitio de la inflamación, que es de alrededor de 1 por ciento a alrededor de 99 por ciento, de preferencia de 5 por ciento a alrededor de 99 por ciento; más preferible, de alrededor de 10 por ciento a alrededor de 99 por ciento; todavía más preferible, de alrededor de 25 por ciento a 99 por ciento; y todavía más preferible, de alrededor de 50 por ciento a alrededor de 99 por ciento de la cantidad del mediador de la inflamación, liberada desde el granulocito, en ausencia del péptido' MANS o de su fragmento activo, probada bajo las mismas condiciones. En un aspecto de esta invención, la administración de una cantidad inhibidora de desgranulación del péptido MANS a un sitio de estimulación inflamatoria en un animal, sitio de estimulación inflamatoria que ha sido creado por la administración de una cantidad estimuladora de la inflamación de un estimulante inflamatorio a dicho sitio, puede reducir la cantidad de un mediador de la inflamación liberada desde un granulocito; granulocito que es estimulado por el estimulante inflamatorio en dicho sitio de estimulación inflamatoria, de alrededor de 1 por ciento a alrededor de 90 por ciento; de preferencia, de 5 por ciento a alrededor de 99 por ciento; más preferible, de alrededor de 10 por ciento a alrededor de 99 por ciento; todavía más preferible, de alrededor de 25 por ciento a 99 por ciento, y más preferible aún, de alrededor de 50 por ciento a alrededor de 99 por ciento de la cantidad del mediador de inflamación liberada desde el granulocito en ausencia del péptido MANS, en presencia de idéntica cantidad estimuladora de inflamación del estimulador inflamatorio. En otro aspecto de esta invención, la administración de una cantidad inhibidora de la desgranulación del péptido MANS a un sitio de estimulación inflamatoria en un animal, sitio de estimulación inflamatoria que ha sido creado por administración de una cantidad estimuladora de inflamación de un estimulador inflamatorio a dicho sitio, puede reducir la cantidad de un mediador de la inflamación, liberado desde un granulocito; granulocito que es estimulado por el estimulador inflamatorio en dicho sitio de estimulación inflamatoria, en 100 por ciento de la cantidad del mediador de inflamación liberada desde el granulocito en ausencia del péptido MANS, en presencia de una cantidad estimuladora de inflamación idéntica del estimulador inflamatorio . Un ejemplo de un estimulador inflamatorio usado en los ejemplos in vi tro de la presente, es el 13 acetato de 12 miristato de forbol (PMA) . La proteína quimioatractiva de monocito (MCP-1) es casi tan efectiva como C5a, y mucho más potente que. IL-8, en la desgranulación de basófilos, lo que da por resultado la liberación de histamina. La liberación de histamina puede ocurrir después de la estimulación con quimioquinas (es decir, citoquinas quimioatractoras) , RANTES y MIP-1. En una modalidad preferida, con relación a la concentración basal del péptido MARCKS presente en el sitio de estimulación inflamatoria, la cantidad inhibidora de la desgranulación, del péptido MA S, administrada a un sitio de estimulación inflamatoria en un animal, comprende de alrededor de 1 vez a alrededor de un millón de veces la concentración del péptido MARCKS en dicho sitio de estimulación inflamatoria, de preferencia de alrededor de una vez a alrededor de 100,000 veces la concentración del péptido MARCKS en dicho sitio de estimulación inflamatoria; más preferible, de alrededor de una vez a alrededor de 10,000 veces la concentración del péptido MARCKS en dicho sitio de estimulación inflamatoria; todavía más preferible, de alrededor de una vez a alrededor de mil veces la concentración del péptido MARCKS en dicho sitio de estimulación inflamatoria; más preferible aún, de alrededor de una vez a alrededor de 100 veces la concentración del péptido MARCKS en dicho sitio de estimulación inflamatoria; y más preferible aún, de alrededor de una vez a alrededor de 10 veces la concentración del péptido MARCKS en el sitio de estimulación inflamatoria. En una modalidad preferida, el granulocito reside en las vías respiratorias de un animal, de preferencia de un humano; y se administra el péptido MA S por inhalación, tal como mediante inhalación de una composición farmacéutica que comprende el péptido MANS, por ejemplo, una composición farmacéutica que comprende el péptido MANS y una solución acuosa; composición que es administrada en la forma de un aerosol, o una composición farmacéutica que comprende el péptido MANS en la forma de un polvo seco; composición que es administrada usando un inhalador de polvo seco. Pueden ser útiles otros métodos y dispositivos conocidos en la técnica para la administración de una solución o polvo por inhalación, tales como, por ejemplo, gotas, rocíos y nebulizadores . En algunas modalidades, es posible que el péptido de la presente invención pueda bloquear procesos secretores que son fisiológicamente importantes, incluyendo funciones secretoras básales. Si bien los inventores no desean atenerse a ninguna teoría en particular de la invención, se cree que los mecanismos que regulan dicha secreción basal son diferentes de las que regulan la secreción estimulada. Alternativamente, los mecanismos secretores básales pueden requerir menos proteína MARCKS que la secreción estimulada. Se puede preservar la secreción basal puesto que todas las terapias para bloquear la secreción mediada por MARCKS no pueden eliminar toda la función MARCKS . Cuando se usa aquí, el término "secuencia de nucleótidos MARCKS" se refiere a cualquier secuencia de nucleótidos derivada un gen que codifique una proteína MARCKS, incluyendo, por ejemplo, una secuencia de ADN o de ARN, la secuencia de ADN del gen, cualquier secuencia de AN transcrita, la secuencia de ARN del transcripto pre-ARNm o ARNm, y ADN o ARN unido a proteína. El suministro preciso del péptido bloqueador de MARCKS puede también sobreponerse a cualquier limitación potencial de los procesos secretores importantes del bloqueo. El suministro de dichos agentes al tracto respiratorio debe obtenerse fácilmente con formulaciones inhaladas. Puesto que estos agentes pueden ser útiles para tratar el mal del intestino inflamable, se puede contemplar el suministro de los agentes bloqueadores al recto/colon/tracto intestinal por medio de enema o de supositorios. Las inyecciones o el suministro transdérmico hacia articulaciones inflamadas puede producir el alivio de pacientes con enfermedades artríticas o autoinmunológicas , limitando la secreción de las células inflamatorias localizadas. La inyección en las áreas que rodean los terminales nerviosos puede inhibir la secreción de ciertos tipos de neurotransmisores , bloqueando la transmisión de dolor severo o los espasmos musculares incontrolados. El suministro del péptido para el tratamiento de enfermedades cutáneas inflamatorias debe obtenerse fácilmente usando diversas formulaciones tópicas conocidas en la técnica. Se ha descubierto que el substrato de C-quinasa rico en alanina miristoilada (MARCKS) , un substrato de PKC ampliamente distribuido, puede ser una molécula reguladora clave que media la liberación del gránulo de mucina por las células epiteliales bronquiales humanas normales ( NHBE) . La secreción de mucina desde esas células se puede elevar al máximo mediante la activación tanto de PKC como de PKG . Se cree que estos MARCKS sirven como punto de convergencia para coordinar las acciones de esas dos proteína quinasas para controlar la liberación del gránulo de mucina. El mecanismo parece implicar la fosforilación de MARCKS dependiente de PKC, que libera MARCKS desde la membrana de plasma hacia el citoplasma, donde, a su vez, es desfosforilada por medio de una proteína fosfatasa 2A (PP2A) que es activada por PKG. Esta desfosforilación puede permitir que MARCKS reobtenga su capacidad de unión a la membrana, lo que permitiría su unión a membranas de los gránulos de mucina citoplásmicos . Además, MARCKS interactúa con actina y miosina en el citoplasma y, de tal manera, puede ser capaz de trabar los gránulos al aparato contráctil celular, mediando de esa manera el movimiento subsiguiente del gránulo y la exocitosis. La secreción del MPO mediador inflamatorio desde los neutrófilos también se puede elevar al máximo por la activación tanto de PKC como de PKG (como se ilustra en las figuras 11 a 15) . Es posible que MARCKS sirva como punto de convergencia para las acciones coordinadoras de estas dos proteína quinasas, que controlan la secreción de los compartimientos unidos a la membrana, en las células inflamatorias (es decir, la secreción de MPO desde los neutrófilos) . La presente invención demuestra que la secreción del mediador inflamatorio MPO desde neutrófilos caninos o humanos fue incrementada por la activación concurrente de PKC y PKG, mientras que la activación de cualquiera de estas quinasas sola fue insuficiente para inducir la respuesta secretora máxima. Una respuesta secretora incrementada a PMA sola fue documentada en células NHBE (figura 1, columna 4) y en los neutrófilos (figura 11) , aunque la magnitud de la respuesta fue mucho menor que la observada por otros en una línea de células de rata parecidas a copa. Ver Abdullah y coautores, supra . Adicionalmente , si bien se informó previamente que un análogo de GMPc podría inducir secreción importante de mucina desde células epiteliales traqueales de cuyos (Fischer y coautores, supra), se debe notar que esa respuesta no alcanzó niveles importantes sino hasta las ocho horas de exposición. Una respuesta secretora con dicho periodo de demora prolongado es improbable que tenga un efecto directo, y probablemente implica nuevamente la síntesis de proteína, en oposición a la liberación de gránulos citoplásmicos preformados y almacenados. No obstante, el efecto sinergístico aparente, que implica la activación cooperante tanto de PKC como de PKG puede sugerir un mecanismo de señalización complejo y restringente , que media la secreción de mucina y/o los mediadores inflamatorios. Los inventores hacen notar que la trayectoria descrita más adelante fue usada para estudiar la liberación del mediador inflamatorio desde neutrófilos, y probablemente es la misma trayectoria que la usada para estudiar las secreciones de las células de copa. Como se hizo notar antes, la presente invención puede ser usada en una formulación, farmacéutica. En algunas modalidades está presente el producto de fármaco en una composición farmacéutica sólida, que puede ser adecuada para administración oral. Se puede formar una composición de materia sólida, de acuerdo con la presente invención, y se puede mezclar con un excipiente y/o diluir con un excipiente. La composición de materia sólida también puede estar encerrada dentro de un portador que, por ejemplo, puede tener la forma de una cápsula, una bolsa, una tableta, un papel u otro contenedor. Cuando el excipiente sirve como diluyente, puede ser un material sólido, semisólido o líquido, que actúe como un vehículo, un portador o un medio para la composición de materia. Varios excipientes adecuados son conocidos por quienes tienen experiencia en la materia, y pueden ser encontrados en el National Formulary, 19:2404-2406 (2000), quedando incorporada aquí en su totalidad la descripción de las páginas 2404 a 2406. Los ejemplos de excipientes adecuados incluyen, pero sin limitación a ellos-, almidones, goma arábiga, silicato de calcio, celulosa microcristalina , metacrilatos , Shellac, polivinilpirrolidona, celulosa, agua, jarabe y metilcelulosa . Las formulaciones de producto fármaco pueden incluir adicionalmente agentes lubricantes, tales como, por ejemplo, talco, estearato de magnesio y aceite mineral; agentes humectantes; agentes emulsificantes y de suspensión; agentes conservadores, tales como hidroxibenzoatos de metilo y de propilo; agentes edulcorantes o agentes saborizantes . También se pueden usar polioles, reguladores y cargas inertes. Los ejemplos de polioles incluyen, pero sin limitación a ellos: manitol, sorbitol, xilitol, sacarosa, maltosa, glucosa, lactosa, dextrosa y similares. Los reguladores adecuados incluyen, pero sin limitación a ellos: fosfato, citrato, tartrato, succinato y similares. Otras cargas inertes que se pueden usar incluyen las que son conocidas en la técnica y son útiles en la fabricación de diversas formas de dosis. Si se desea, las formulaciones sólidas pueden incluir otros componentes, tales como agentes impartidores de volumen y/o agentes de granulación y similares. Los productos fármacos de la invención pueden ser formulados de manera que provean la liberación rápida, sostenida o retardada, del ingrediente activo después de la administración al paciente, empleando procedimientos bien conocidos en la técnica. Para formar tabletas para la administración oral, la composición de materia de la presente invención puede estar hecha por medio de un proceso de compresión directa. En este proceso, se pueden mezclar los ingredientes activos del fármaco con un portador sólido, pulverulento, tal como, por ejemplo: lactosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidón, amilopectina , derivados de celulosa o gelatina, y mezclas de ellos, así como con un agente antifricción, tal como, por ejemplo, estearato de magnesio, estearato de calcio y ceras de polietilenglicol . Se puede prensar la mezcla a tabletas usando una máquina con los troqueles y dados apropiados para obtener el tamaño de tableta deseado. Los parámetros de operación de la máquina pueden' ser seleccionados por un técnico con experiencia. Alternativamente, se pueden formar tabletas para administración oral por medio de un proceso de granulación en húmedo. Se pueden mezclar los ingredientes activos con excipientes y/o con diluyentes. Se pueden moler las sustancias sólidas o se pueden tamizar a un tamaño de partícula deseado. Se puede añadir un agente aglutinador al fármaco. Se puede suspender y homogeneizar el agente aglutinante en un solvente adecuado. También se pueden mezclar el ingrediente activo y los agentes auxiliares con la solución de agente aglutinante. La mezcla seca resultante es humedecida uniformemente con la solución. La humectación hace típicamente que las partículas se agreguen ligeramente, y se prensa la masa resultante a través de un tamiz de acero inoxidable que tenga el tamaño deseado. Luego se seca la mezcla en unidades secadoras controladas, durante el lapso de tiempo determinado, necesario para obtener un tamaño y una consistencia de partículas deseados. Se tamizan los gránulos de la mezcla seca para eliminar cualquier polvo. Se puede añadir a esta mezcla agentes desintegradores, antifricción y/o antiadhesivos. Finalmente, se prensa la mezcla a tabletas, usando una máquina con los troqueles y los dados apropiados para obtener el tamaño de tableta deseado. Los parámetros de operación de la máquina pueden ser seleccionados por los técnicos con experiencia. Si se desean tabletas revestidas, el núcleo preparado como en lo que antecede puede ser revestido con una solución concentrada de azúcar o de polímeros celulósicos, que pueden contener: goma arábiga, gelatina, talco, dióxido de titanio, o una laca disuelta en un solvente orgánico volátil, o una mezcla de solventes. A este revestimiento se pueden añadir diversos tintes, a 'fin de distinguir entre tabletas con compuestos activos diferentes o con diferentes cantidades del compuesto activo presentes. En una modalidad particular, pueden estar presente el ingrediente activo en un núcleo rodeado por una o más capas, incluyendo capas de revestimiento entérico. Se pueden preparar cápsulas de gelatina en las que las cápsulas contengan una mezcla del ingrediente activo y aceite vegetal . Las cápsulas de gelatina dura pueden contener gránulos del ingrediente activo en combinación con un portador sólido pulverulento, tal como, por ejemplo: lactosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidón de papa, almidón de maíz, amilopectina , derivados de celulosa y/o gelatina . Se pueden preparar preparaciones líquidas para administración oral, en la forma de jarabes o de suspensiones; por ejemplo, soluciones que contengan un ingrediente activo, azúcar y una mezcla de etanol, agua, glicerol y propilenglicol . Si se desea, dichas preparaciones líquidas pueden comprender uno o más de los siguientes: agentes colorantes, agentes saborizantes y sacarina. También se pueden usar agentes espesadores, tales como carboximetilcelulosa . En el caso de que se vayan a usar los productos farmacéuticos anteriores para administración parenteral, dicha formulación puede comprender soluciones acuosas estériles para inyección; soluciones no acuosas para inyección, o ambas, que comprenden la composición de materia de la presente invención. Cuando se preparan las soluciones acuosas para inyección, puede estar presente la composición de materia como una sal soluble en agua, aceptable para uso farmacéutico. Las preparaciones parenterales pueden contener antioxidantes, reguladores, bacteriostáticos y solutos que hagan isotónica la formulación con la sangre del receptor a que se destina. Las suspensiones estériles, acuosas y no acuosas pueden comprender agentes de suspensión y agentes espesadores. Las formulaciones pueden estar presentadas en recipientes de una dosis unitaria o de varias dosis, por ejemplo, frascos y ampollas sellados. Pueden prepararse soluciones y suspensiones para inyección, extemporáneas, a partir de polvos, gránulos y tabletas estériles, de la clase previamente descrita. También se puede formular la composición de materia de manera que pueda ser adecuada para administración tópica (por ejemplo, crema para la piel) . Estas formulaciones pueden contener varios excipientes conocidos por los expertos en la materia. Los excipientes adecuados pueden incluir, pero sin limitación a ellos: cera de ésteres cetílicos, alcohol cetílico, cera blanca, monoestearato de glicerilo, propilenglicol , monoestearato, estearato de metilo, alcohol bencílico, laurilsulfato de sodio, glicerina, aceite mineral, agua, carbómero, alcohol etílico, adhesivos de acrilato, adhesivos de poliisobutileno y adhesivos de silicona. Una vez descrita la invención, se la ilustrará con referencia a ciertos ejemplos, que están incluidos aquí únicamente con propósitos ilustrativos, y que no deben considerarse como limitación a la invención.

EJEMPLOS La hipersecreción de mucina desde células NHBE implica la activación de PKC y de PKG Para determinar la función potencial de PKC y/o de PKG en el proceso secretor de mucina, se expusieron células NHBE a los siguientes dos activadores de proteína quinasa específicos: el éster de forbol 13-acetato de 12-miristato de forbol (PMA) para la activación de PKC, y el- análogo cGMP no hidrolizable, 8-Br-cGMP, para la activación de PKG. Los estudios preliminares que examinaron la secreción de mucina en respuesta a la estimulación con PMA, a diversas concentraciones, durante tiempos diferentes (hasta 1 µ? durante dos horas) indicaron que la activación de PKC sola no inducía secreción significativa de mucina desde las células NHBE, si bien se observó repetidamente una respuesta secretora moderada a las concentraciones de PMA de más de 100 nM (0.05<p<0.1) . Además, las células no respondieron a los análogos de cGMP a concentraciones de hasta 500 µ? durante hasta dos horas de exposición. Sin embargo, una combinación de ???+8-Br-cGMP, que afecta la doble activación de PKC y PKG, provocó un incremento rápido en la secreción, duplicándola aproximadamente en el término de 15 minutos de exposición (figura 1A) . Esta respuesta secretora inducida por PMA+8 -Br-cGMP fue dependiente de la concentración, con una estimulación máxima a 100 nM de PMA+1 µ? de 8-Br-cGMP (figuras IB y 1) . En las figuras 1A, IB y 1C, se expusieron las células NHBE al reactivo o los reactivos indicados, o a medio solo (CTL) durante 15 minutos. En la figura ID se preincubaron las células NHBE con el inhibidor indicado durante 15 minutos, y luego se estimularon con 100 µ? de UTP durante 2 horas. Se recogió la mucina secretada en respuesta al tratamiento, y fue analizada mediante ELISA. Los datos están presentados como la media + S. E (n=6 en cada punto) . El asterisco (*) representa significativamente diferente del control con medio (p<0.05); "#" significa diferente del control con medio (0.05<p<0.1) ; y "†" representa significativamente diferente de la estimulación con UTP (CD<0.05) . UTP es un secretagogo de mucina patofisiológicamente relevante, bien definido. Lethem y coautores, Am. J". Respir. Cell Mol. Biol . , 9, 314-322 (1993) . La presente invención demuestra adicionalmente que UTP, a varias concentraciones, de preferencia de 40 a 140 µ?, puede inducir un incremento importante en la secreción de mucina desde las células NHBE, después de una exposición de dos horas. Para determinar si PKC y PKG estuvieron involucradas en la regulación de la secreción de mucina, en respuesta a un estímulo patofisiológico , se investigaron los efectos de los inhibidores de PKC/PKG sobre la secreción de mucina inducida por UTP. Se preincubaron las células NHBE con diversos inhibidores durante 15 minutos, y luego se expusieron a UTP (100 µ?) más el inhibidor, durante dos horas. Se midió la mucina secretada por medio de ELISA. Los resultados indicaron que la secreción de mucina provocada por UTP puede requerir las actividades tanto de PKC como de PKG, cuando se atenuó la respuesta secretora, independientemente, mediante el inhibidor de PKC calfostina C (500 nM) , el inhibidor de PKG Rp-8-Br-PET-cGMP (10 µ?) , o el inhibidor de guanilil ciclasa soluble (GC-S) LY83583 (50 µ?) , pero probablemente no por el inhibidor de proteína quinasa A (PKA) , KT5720 (500 nM) (figura ID) . Aparentemente, la secreción de mucina en las células NHBE puede ser regulada mediante un mecanismo de señalización que involucra a PCK y también a PKG. Para dirigir el involucramiento de PKG en el proceso secretor, se utilizó en estos estudios 8-Br-cGMP. Si bien el efecto fisiológico primario de 8-Br-cGMP es activar PKG, también se ha informado que actúa como agonista para los canales iónicos con compuerta de cGMP en algunas células y, a concentraciones elevadas, para activar cruzadamente PKA.

Para prevenir la posibilidad de que los canales iónicos con compuerta cGMP y/o PKA puedan tener participación en la secreción de mucina por las células NHBE, Rp-8-Br-cG P, se usó un análogo de cGMP único que puede activar los canales iónicos con compuerta cGMP, de manera similar a 8-Br.cGMP, pero que inhibe la actividad de PKG como agonista, para distinguir los efectos de PKG y los canales iónicos con compuerta de cGMP, sobre la liberación de mucina. Como se ilustra en las figuras, particularmente en la figura 1A (columna 11), Rp-8-Br-cGMP no incrementó la secreción de mucina cuando se añadió a las células con PMA. De igual manera, el inhibidor específico de PKA, KT5720 (500 nM) no afectó la secreción de mucina inducida por PMA+8 -Br-cGMP o UTP (figura ID, columna 4) . Estos estudios pueden negar la posibilidad de que los canales iónicos con compuerta de cGMP o PKA estén asociados con la secreción de mucina, lo que indica que la activación de PKG en las células NHBE es el mecanismo mediante el cual 8-Br-cGMP contribuye a incrementar la secreción. Adicionalmente , debido a que la hipersecreción de mucina inducida por UTP puede ser atenuada mediante el inhibidor de guanilil ciclasa soluble (GC-S) LY83583, es probable que la activación de PKG ocurre por medio de la trayectoria de señalización del óxido nítrico (NO) - GC-S -cGMP - PKG, como se ilustró previamente en células epiteliales traqueales de cuyo, diferenciadas, in vi tro. Dada la participación de PKC y de PKG en el proceso secretor de mucina, la presente invención examina los substratos intracelulares potenciales de esas enzimas, que pudieran jugar un papel en los eventos de señalización corriente debajo de la activación de quinasa. Numerosos substratos intracelulares pueden ser fosforilados por PKC o PKG, y la fosforilación por PKC de uno de esos substratos, la proteína MARCKS , parece ser de interés particular. Se ha observado que la fosforilación de MARCKS se correlaciona con una cantidad de procesos celulares que involucran la señalización de PKC y la contracción citoesqueletal, tal como el movimiento de la célula, la mitogénesis y la liberación del transmisor neural . Debido a que el proceso dinámico de secreción requiere de la activación de quinasa y de la translocación de los gránulos intracelulares a la periferia de las células, MARCKS parece ser candidata a una molécula mediadora que conecta la activación PKC/PKG y la exocitosis del gránulo de mucina.

MARCKS es una molécula clave que enlaza la activación de PKC/PKG con la secreción de mucina en las células NHBE Para dirigir el mecanismo de señalización corriente abajo de la activación de la proteína quinasa, se estudió la proteína MARCKS, un substrato celular específico de PKC que pudiera tener participación en el enlazamiento de la activación de quinasa con la liberación del gránulo. Primeramente se confirmó la presencia de MARCKS en las células NHBE por medio de análisis de inmunoprecipitación marcado con ácido [3H] mirístico . Como se ilustra en la figura 2A, se expresó MARCKS en células NHBE, y la mayoría de esta proteína se asoció con la membrana, bajo condiciones no estimuladas. En la figura 2A se marcaron las células con ácido [3H] mirístico y luego se aislaron las fracciones de membrana (canal 1) y citosol (canal 2) mediante centrifugación diferencial. Se puede demostrar de tres maneras diferentes el papel que juega MARCKS como componente regulador clave de la trayectoria secretora de mucina. Como se señaló antes, el involucramiento directo de MARCKS en la secreción de mucina por las células NHBE se puede demostrar mediante tres lineas separadas de evidencia. Primeramente, la secreción de mucina en respuesta a la estimulación por ???-8-Br-cGMP o UTP se inhibió de una manera dependiente de la concentración, por el péptido MA S que tenía las secuencias de aminoácido idénticas a la región N-terminal de MARCKS; mientras que el péptido de control correspondiente (RNS) , que contenía la misma composición de aminoácidos, pero dispuestos en un orden aleatorio, no afectó la secreción. Se sabe que el dominio miristoilado N-terminal de MARCKS media la asociación MARCKS-membrana . Como se indica en la figura 8, MARCKS puede funcionar como un enlazador molecular, interactuando con las membranas de gránulo en su dominio N-terminal y uniéndose a filamentos de actina en su sitio PSD, obstaculizando de esa manera los gránulos al citoesqueleto contráctil para el movimiento y la exocitosis. La figura 8 muestra un mecanismo posible que ilustra que el secretagogo de mucina interactúa con las células epiteliales de las vías respiratorias (de copa) y activa dos proteína quinasas separadas, PKC y PKG. La PKC activada fosforila MARCKS, provocando la translocación de MARCKS de la membrana de plasma al citoplasma; mientras que PKG, activada por medio de la trayectoria del óxido nítrico (NO -> GC-S -> cGMP - PKG, a su vez, activa un PP2A citoplásmico, que desfosforila MARCKS. Esta desfosforilación estabiliza la fijación de MARCKS a las membranas de gránulo. 1 Además, MARCKS también interactúa con la actina y la miosina, enlazando de esa manera los gránulos a la maquinaria contráctil celular para movimiento subsiguiente y liberación exocitótica. La fijación de MARCKS a los gránulos después de que se libera al citoplasma también puede estar guiada por proteínas de destino específicas, o por algunas otras formas de interacciones de proteína a proteína, en las que el dominio N-terminal de MARCKS está involucrado. En cualquier caso, el péptido MANS, o un fragmento activo de él, que comprende por lo menos seis aminoácidos, actuaría para inhibir el apuntamiento competitivo de MARCKS a las membranas de los gránulos de mucina, bloqueando de esa manera la secreción . Una segunda prueba demostró el efecto inhibidor de un oligonucleótido de antisentido, específico para MARCKS, sobre la secreción de mucina. Tal como se muestra en las figuras 3A-3C, el oligonucleótido de antisentido regula descendentemente el mARN de MARCKS y los niveles de proteína en las células NHBE, y atenúa sustancialmente la secreción de mucina, inducida por la activación de PKC/PKG. La inhibición no fue tan dramática como la que se ve con el péptido MANS, que podría deberse a los niveles elevados de proteína MARCKS endógena en células NHBE y la vida media relativamente prolongada del mARN de MARCKS (ti/2 = 4-6 horas) . En las figuras 3A-3C, se trataron las células NHBE con el oligonucleótido de antisentido o el oligonucleótido de control durante tres días, y luego se estimularon con PMA (100 nM) +8-Br-cGMP (1 µ?) durante 15 minutos. Se analizó mediante ELISA la secreción de mucina. Se aisló el ARN total y la proteína de las células tratadas. Se determinó el mARN de ARCKS mediante hibridación Northern, y se determinó la proteína mediante manchado Western. En el PMA (100 nM)+8-Br-cGMP (1 µ?) de la figura 3, es una mancha Northern la que mostró una disminución de alrededor de 15 por ciento en el mARN de MARCKS, en comparación con los controles en el gráfico anexo; la figura 3B es la mancha Western que mostró una disminución de aproximadamente 30 por ciento en la proteína MARCKS en la gráfica anexa; y la figura 3C muestra que se atenuó la hipersecreción de mucina significativamente, por el oligonucleótido de antisentido; mientras que el oligonucleótido de control no tuvo efecto. Los datos están presentados como la media ± S. E. (n = 6 en cada punto) , donde "*" es significativamente diferente del control medio (p<0.05); y " † " es significativamente diferente del estímulo con ???+8-Br-cGMP (p<0.05). Adicionalmente es de notar que el término CTO es el oligonucleótido de control; mientras que el término ASO es un oligonucleótido de antisentido. Se ha demostrado que los oligonucleótidos de antisentido, que son complementarios de los ARN específicos pueden inhibir la expresión de los genes celulares como proteínas. Ver Erickson e Izant, Gene Regulation: Biology Of Antisense RNA And DNA, tomo I, Raven Press, N. Y. 1992. Por ejemplo, se ha informado de la inhibición selectiva de un gen p21 que difirió de un gen normal en un solo nucleótido. Chang y coautores, Biochemistry (1991), 30:8283-8286. Se han propuesto muchas hipótesis para explicar los mecanismos mediante los cuales los oligonucleótidos de antisentido inhiben la expresión del gen; sin embargo, el mecanismo específico involucrado puede depender del tipo de célula estudiado, del ARN al que se dirige, del sitio específico en el ARN de blanco, y la naturaleza química del oligonucleótido . Chiang y coautores, J. Biol . Chem. , 1991, 266:18162-18171; Stein y Cohén, Cáncer Res., 1988, 48:2659-2668. Un tercer experimento indicó que la transfección de células HBE1 con un MARCKS mutante, con omisión de PSD, dio por resultado la represión significativa de la secreción de mucina inducida por la activación de PKC/PKG. La omisión del PSD aboliría la capacidad de MARCKS para unirse a la actina. Tal como se indica en la figura 8, al competir con la MARCKS natural por la unión a la membrana de gránulo, la MARCKS truncada en PSD podría inhibir de esa manera la liberación del gránulo, ya que es incapaz de interactuar con los filamentos de actina. La transfección de estas células con el cADN de MARCKS de tipo silvestre, no incrementó adicionalmente la secreción de mucina. El análisis de mancha Western mostró que el nivel de expresión de MARCKS endógena en las células HBE1 era bastante alto, en comparación con el de las células NHBE, y que la transfección del cADN de MARCKS de tipo silvestre no condujo a incrementos notables en el nivel total de proteína MARCKS en estas células. Esto podría explicar por qué la transfección con MARCKS de tipo silvestre no aumenta adicionalmente la secreción, y también la razón de que la transfección con el MARCKS con omisión de PSD únicamente impide parcialmente la secreción de mucina. Estudios de bloqueo de péptido. - Se preincubaron células NHBE con MANS o con el péptido RNS (1-100 µ?) durante 15 minutos, y luego se añadió PMA (100 nM) +8-Br-cGMP (1 µ?) o UTP (100 µ?) y se incubaron las células durante otros 15 minutos o 2 horas, 4 respectivamente. Se midió la secreción de mucina mediante ELISA. Como se muestra en la figura 2B, la incubación de las células NHBE con el peptido MANS dio por resultado una supresión, dependiente de la concentración, de la secreción de mucina en respuesta a la activación con PKC/PKG o a la estimulación con UTP; mientras que el péptido de control (RNS) puede no haber afectado la secreción a esas concentraciones. En la figura 2B el péptido MANS bloquea la hipersecreción de mucina inducida por ???+8+Br+cGMP o UTP de una manera dependiente de la concentración. Se preincubaron las células NHBE con el péptido indicado durante 15 minutos y luego se expusieron a PMA (100 nM) + 8-Br-cGMP (1 µ?) durante 15 minutos o UTP (100 µ? durante dos horas. Se midió la secreción de mucina mediante ELISA. Se presentan los datos como la media + S. C. (n = 6 en cada punto) ; donde * es significativamente diferente del control medio p<0.05); † es significativamente diferente de la estimulación con ???+8-Br-cGMP (p<0.05) y í es significativamente diferente de la estimulación con UTP (<0.05) . Los efectos del péptido MANS probablemente no estaban relacionados con la toxicidad ni con la represión general de la actividad metabólica celular, ni tampoco MANS ni el péptido RNS afectaron la liberación de lactato deshidrogenasa o la absorción de [3H] desoxiglucosa por las células. Estudios de oligonucleótido de antisentido Para demostrar adicionalmente que MARCKS es un componente de señalización clave de la trayectoria secretora de mucina, se examinó el efecto de un oligonucleótido de antisentido, dirigido contra MARCKS, sobre la secreción de mucina. Como se ilustra en la figura 3, este oligonucleótido de antisentido regula de manera descendente tanto los niveles de mARN como los de proteína de MARCKS en las células NHBE, y atenúa significativamente la secreción de mucina inducida por PMA+8 -Br-cGMP ; mientras que un oligonucleótido de control no tuvo efecto.

MARCKS sirve como una molécula de señalización convergente que media el cruce de las trayectorias de PKC y PKG Colectivamente, los resultados anteriores demostraron que MARCKS estaba involucrado integralmente en el proceso secretor de mucina. A continuación los inventores de la presente determinaron cómo actúa MARCKS como una molécula reguladora clave, sobre la que convergen PKC y PKG para regular la secreción de mucina. Como se ilustra en la figura 5, se fosforiló MARCKS por medio de PKC y se translocó consecuentemente de la membrana al citoplasma. Aquí PKG apareció para inducir la desfosforilación de MARCKS (figura 5A, canal 4 y figura 5B) . Se invirtió esta desfosforilación mediante el inhibidor de PKG Rp-8-Br-PET-cGMP (figura 5A, canal 5) , lo que indica que la desfosforilación fue dependiente de PKG específicamente. En la figura 5 se marcaron las células NHBE con [33P] ortofosfato , y luego se expusieron a los reactivos indicados. La fosforilación de MARCKS en respuesta a los tratamientos fue evaluada por análisis de inmunoprecipitación-. En la figura 5A, 8-Br-cGMP invirtió la fosforilación de MARCKS inducida por PMA, y este efecto de 8-Br-cGMP pudo ser bloqueado mediante Rp- 8 -Br- PET-cGMP (inhibidor de PKG) o ácido okadaico (inhibidor de PP1/2A) . Para la figura 5B, se invirtió la fosforilación inducida por PMA de MARCKS mediante exposición subsiguiente de las células a 8-Br-cGMP. Canal 1, medio solo durante ocho minutos; canal 2, 100 nM de PMA durante 3 minutos; canal 3, 100 nM de PMA durante 3 minutos, y luego con 1 µ? de 8-Br-cGP durante 5 minutos; canal 4, 100 nM de PMA durante 8 minutos; canal 5, medio solo durante 3 minutos, y luego 100 nM de PMA+1 µ? de 8-Br-cGMP durante 5 minutos. En la figura 5C, se atenuó la desfosforilación de MARCKS inducida por 8-Br-cGMP por medio de fostriecin, de una manera dependiente de la concentración. Se cree que PKG actúa para desfosforilar MARCKS por medio de la activación de una proteína fosfatasa. Como se ilustra en la figura 5A (canal 6) el ácido okadaico a 500 nM, una concentración que podría inhibir tanto PP1 como PP2A, bloqueó la desfosforilación de MARCKS inducida por PKG, lo que sugiere que PKG provocó la desfosforilación al activar PP1 y/o PP2A. Otros estudios con fostriecina y el análisis dirigido de las actividades de fosfatasa, indicaron que únicamente se activo PP2A por PKG, y que fue responsable de la eliminación de los grupos fosfato de MARCKS (figura 5C) . Es probable que el ácido okadaico o bien la fosfotriecina , a concentraciones que inhibieron la desfosforilación de MARCKS inducida por PKG, atenuaran la secreción de mucina inducida por ???+8-Br-cGMP o UTP, como se exhibe en la figura 6. La figura 6 ayuda a demostrar que PP2A es un componente esencial de la trayectoria secretora de mucina. Se preincubaron células NHBE con la concentración indicada de fostriecina, ácido okadaico (500 nM) o medio solo, durante 15 minutos, y luego se estimularon con PMA (100 nM) + 8-Br-cGMP (1 µ?) durante 15 minutos, o con UTP (100 µ?) durante dos horas. Se midió la mucina secretada por medio de ELISA. Se presentan los datos como media+S.E. (n = 6 en cada punto), donde * representa significativamente diferente del control con medio (p<0.05); † representa significativamente diferente de la estimulación con PMA+8 -Br-cGMP (p<0.05); y t representa significativamente diferente de la estimulación con UTP (p<0.05) . De esa manera, la desfosforilación de MARCKS por PP2A activado por PKG parece ser un componente esencial de la trayectoria de señalización que conduce a la exocitosis del gránulo de mucina. Para revelar los eventos moleculares mediante los cuales MARCKS enlaza la activación de quinasa con la secreción de mucina, se investigó a profundidad la fosforilación de MARCKS en respuesta á la activación con PKC/PKG. Como se ilustra en la figura 4A, PMA (100 nM) indujo probablemente un incremento significativo (3 a 4 veces) en la fosforilación de MARCKS en células NHBE; y se atenuó esta fosforilación por medio del inhibidor de PKC calfostin C (500 nM) . Una vez fosforilado, se traslocó MARCKS de la membrana de plasma al citoplasma (figura 4B) . Más específicamente, la figura 4A muestra que la activación de PKC, da por resultado la fosforilación de MARCKS en las células NHBE. Se marcaron las células con [32P] ortofosfato durante dos horas y luego se las expuso a los reactivos estimulador y/o inhibidor. Se evaluó la fosforilación de MARCKS en respuesta a los tratamiento, por inmunoprecipitacion, como se describe. Canal 1, control con medio; cana 2, el vehículo, 0.1 por ciento de Me.sub.2SO; canal 3, 100 nM de 4a-PMA; canal 4, 100 nM de PMA; canal 5, 100 nM de PMA+500 nM de calfostin C; canal 6, 500 nM de calfostin C. La figura 4B demuestra que MARCKS fosforilado es traslocado de la membrana de plasma al citoplasma. Se expusieron las células marcadas con 32P a PMA (100 nM) o medio solo durante 5 minutos, y luego se aisló la membrana y las fracciones de citosol. La activación de PKG por medio de 8-Br-cGMP (1 µ?, otro evento de activación de quinasa necesario para provocar la secreción de mucina, no condujo a la fosforilación de MARCKS; sino que, de hecho, se observó el efecto opuesto; la fosforilación de MARCKS inducida por PMA fue revertida por 8-Br-cGMP (figura 5A) . Este efecto de 8-Br.cGMP no se debió a la supresión de la actividad de PKC, ya que la fosforilación inducida por PMA pudo invertirse por adición subsiguiente de 8-Br-cGMP a las células (figura 5B) . Por lo tanto, la activación con PKG probablemente da por resultado la desfosforilación de MARCKS. La investigación ulterior demostró que la desfosforilación de MARCKS inducida por PKG que bloqueada por 500 nM de ácido okadaico, un inhibidor de proteína fosfatasa (tipo 1 y/o 2A (PP1/2A) ) (figura 5A, canal 6) . De esa manera pareció que la desfosforilación era mediada por PP1 y/o PP2A. Para definir el subtipo de proteína fosfatasa involucrado se utilizó un inhibidor novedoso y más específico de PP2A, el fostriecin (CI50 = 3.2 nM) , en estudios adicionales de fosforilación. Tal como se ilustra en la figura 5C, fostriecin inhibió la desfosforilación de MARCKS inducida por PKG, de una manera dependiente de la concentración (1-500 nM) , lo que sugiere que PKG indujo la desfosforilación por medio de la activación de PP2A. Para confirmar la activación ulterior de PP2A por PKG en las células NHBE, se determinaron las actividades citosólicas de PP1 y PP2A, después de exponer 6 las células a 8-Br-cGMP. Se incrementó la actividad de PP2A aproximadamente al triple (de 0.1 a 0.3 mmol/min/mg de proteínas, p<0.01) a concentraciones de 8-Br-cGMP tan bajas como 0.1 µ?; mientras que la actividad de PP1 permaneció invariable. Estos datos indican que PP2A puede ser activado por PKG y es responsable de la desfosforilación de MARCKS . Consecuentemente, esta actividad de PP2A pareció crítica para que ocurriera la secreción de mucina; cuando se bloqueó la desfosforilación de MARCKS inducida por PKG, por medio de ácido okadaico o fostriecin, la respuesta secretora a la activación con PKC/PKG o la estimulación con UTP mejoró (figura 6) .

MARCKS se asocia con actina y miosina en el citoplasma La figura 7 ilustra un análisis de inmunoprecipitacion radiomarcado, que revela que MARCKS puede asociarse con otras dos proteínas (de alrededor de 200 y alrededor de 40 kDa) en el citoplasma. En la figura 7 se marcaron células NHBE con [3H] leucina y [3H] prolina durante la noche, y se preparó la membrana y las fracciones de citosol como se describe bajo el encabezado "Procedimientos experimentales" . Se preaclararon las fracciones aisladas con el anticuerpo de control no inmunológico (6F6) . Luego se dividió el citosol igualmente en dos fracciones y se usó para la inmunoprecipitacion efectuada en presencia de 10 µ? de citocalasina D (Biomol, Plymouth Meeting, PA, E. U. A.) con el anticuerpo anti-MARCKS 2F12 (canal 2) y el anticuerpo de control no inmunológico 6F6 (canal 3), respectivamente. También se determinó la proteína MARCKS en la fracción de membrana por inmunoprecipitación, usando el anticuerpo 2F12 (canal 1) . Se resolvió el complejo de proteína precipitada por medio de electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida al 8 por ciento, y se visualizó mediante auto-radiografía intensificada. Pareció que MARCKS se asociaba con dos proteínas citoplásmicas que tenían masas moleculares de alrededor de 200 y alrededor de 40 kDa, respectivamente. Estas dos proteínas asociadas con MARCKS fueron separadas del gel y analizadas por medio de desabsorción-ionización con láser auxiliado por matriz / tiempo de vuelo de espectrometría de masa / determinación de secuencia interna (Protein/DNA Technology Center de Rockefeller University, NY, E. U. A.) . Se usó la masa de péptido obtenida y los datos de secuencia para buscar bases de datos de proteínas por medio de los programas de Internet ProFound y MS-Fit. Los resultados indican que esas proteínas son: miosina (cadena pesada, sin músculo tipo A) y actina, respectivamente. El análisis de desabsorción-ionización con láser auxiliado por matriz / tiempo de vuelo de espectrometría de masa / secuencia interna indica que estas dos proteínas asociadas con MARCKS eran miosina (cadena pesada, sin músculo tipo A) y actina, respectivamente. Estos estudios sugieren un nuevo paradigma para el mecanismo de señalización que controla la secreción exocitótica de los gránulos de mucina de las vías respiratorias, así como que provee lo que se cree que es la primera evidencia directa que demuestra una función biológica específica de MARCKS en un proceso fisiológico. MARCKS sirve como molécula mediadora clave que regula la liberación del gránulo de mucina en las células epiteliales de las vías respiratorias humanas. Se cree que el inicio de la secreción de mucina en las vías respiratorias requiere de una activación doble y de acciones sinergísticas de PKC y PKG. PKC activada fosforila MARCKS, lo que da por resultado la traslocación de MARCKS de la cara interna de la membrana de plasma, hacia el citoplasma. La activación de PKG, a su vez, activa PP2A, que desfosforila MARCKS en el citoplasma. Debido a que la capacidad de asociación con la membrana, de MARCKS, depende de su estado de fosforilación, esta desfosforilación puede permitir que MARCKS vuelva a obtener su capacidad de unirse a la membrana, y puede permitir que MARCKS se fije a las membranas de los gránulos de mucina citoplásmicos . Al interactuar también con la actina y la miosina en el citoplasma (figura 7) , MARCKS puede ser capaz de obstaculizar los gránulos al aparato contráctil celular, mediando el movimiento del gránulo a la periferia de la célula y la liberación exocitótica subsiguiente. La amplia distribución de MARCKS sugiere la posibilidad de que este mecanismo o un mecanismo similar, pueda regular la secreción de gránulos unidos a la membrana, en diversos tipos de células, bajo condiciones normales o patológicas. La invención se refiere también a un nuevo método para bloquear cualquier proceso secretor exocitótico celular, especialmente los que liberan mediadores inflamatorios desde gránulos contenidos dentro de células inflamatorias, cuyas trayectorias estimuladoras involucran la proteína quinasa C (PKC) , la proteína de substrato MARCKS y liberan los contenidos desde vesículas unidas a la membrana. Específicamente, los inventores han demostrado que la liberación estimulada del mediador inflamatorio miloperoxidasa desde neutrofilos humanos (figura 9) o caninos (figura 10) puede ser bloqueada de una manera que depende de la concentración, por medio del péptido MA S . Específicamente, la figura 9 muestra neutrofilos aislados que fueron estimulados a secretar miloperoxidasa (MPO) con 100 nM de PMA y 10 µ? de 8-Br-cGMP. 100 µ? de péptido MANS disminuyeron la secreción de MPO a niveles de control (*=p<0.05) . 10 µ? de MANS provocan una ligera disminución en la secreción de MPO. 10 o 100 µ? de un pépti'do de control (RNS) no tienen efecto sobre la secreción de MPO. En la figura 10 se estimularon neutrofilos aislados para secretar miloperoxidasa (MPO) con 100 nM de PMA y 10 µ? de 8-Br-cGMP. 100 µ? del péptido MANS disminuyeron la secreción de MPO a niveles de control (*=p<0.05) . 10 µ? de MANS provocan una ligera disminución en la secreción de MPO. 10 o 100 µ? de un péptido de control (RNS) no tienen efecto sobre la secreción de MPO. De esa manera, se puede usar el péptido terapéuticamente para bloquear la liberación de mediadores de la inflamación, secretados desde células inflamatorias que se infiltran en cualquier tejido. Muchos de estos mediadores liberados son responsables de daños extensos al tejido, observados en una variedad de enfermedades inflamatorias crónicas (es decir, enfermedades respiratorias, tales como asma, bronquitis crónica y COPD; enfermedades de intestino inflamable, incluyendo colitis ulcerante y mal de Crohn; enfermedades autoinmunológicas , enfermedades de la piel, tales como erisipela, eczema y acné severo; síndromes artríticos y de dolor, tales como artritis reumatoide y fibromialgia) . Esta invención puede ser útil para tratar enfermedades tales como artritis, bronquitis crónica, COPD y fibrosis cística. Consecuentemente, esta invención es útil para el tratamiento de enfermedades humanas y de animales, especialmente las que afectan a equinos, caninos, felinos y otros animales domésticos. Las figuras 11 a 16 muestran la secreción de MPO para humanos y caninos. En todos estos experimentos, se estimularon neutrofilos aislados con LPS , a una concentración de 1 x 1CT6 M durante 10 minutos, a 37 °C, antes de añadir los estímulos que se indican en las fibras. LPS prepara o ceba las células de manera que puedan responder a un secretagogo . En una modalidad, esta invención describe un método para regular una inflamación en un sujeto, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende un péptido MA S o un fragmento activo de él. En un aspecto de esta modalidad, el fragmento activo de la proteína MANS comprende por lo menos seis aminoácidos. En otro aspecto, la inflamación es provocada por enfermedades respiratorias, enfermedades intestinales, enfermedades cutáneas, enfermedades autoinmunológicas y síndromes de dolor. En otro aspecto, dichas enfermedades espiratorias están seleccionadas del grupo que consiste de asma, broquitas crónica y COPD . En otro aspecto, las enfermedades intestinales están seleccionadas del grupo que consiste de colitis ulcerante, mal de Crohn y síndrome de intestino irritable. En otro aspecto, las enfermedades cutáneas están seleccionadas del grupo que consiste de erisipela, eczema, psoriasis y acné severo. En otro aspecto, la inflamación es provocada por artritis o por fibrosis cística. En otro aspecto, dicho sujeto es un mamífero. Adicionalmente , en otro aspecto, el mamífero está seleccionado del grupo que consiste de humanos, caninos, equinos y felinos. En otro aspecto, dicho paso de administrar se selecciona del grupo que consiste de administración tópica, administración parenteral , administración rectal, administración pulmonar, administración nasal, inhalación y administración oral. En otro aspecto, la administración pulmonar está seleccionada del grupo de aerosol, inhalador de polvo seco, inhalador de dosis medida y nebulizador. En otra modalidad, esta invención describe un método para regular un proceso secretor celular en un sujeto, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende por lo menos un compuesto que comprende un péptido MA S o un fragmento activo de él, que regula un mediador inflamatorio, en un sujeto. En un aspecto de esta modalidad, el fragmento activo de la proteína MANS comprende por lo menos seis aminoácidos. En otro aspecto, la regulación de un proceso secretor celular es bloquear o reducir un proceso secretor celular. En otro aspecto, el mediador inflamatorio es provocado por enfermedades respiratorias, enfermedades intestinales, enfermedades cutáneas, enfermedades autoinmunológicas y síndromes de dolor. En otro aspecto, las enfermedades respiratorias están seleccionadas del grupo que consiste de asma, bronquitis crónica y COPD . En otro aspecto, las enfermedades intestinales están seleccionadas del grupo que consiste de colitis ulcerante, mal de Crohn y síndrome de intestino irritable. En otro aspecto, las enfermedades cutáneas están seleccionadas del grupo que consiste de erisipela, eczema, psoriasis y acné severo. En otro aspecto, el mediador inflamatorio es provocado por artritis o por fibrosis cística. En otro aspecto, dicho sujeto es un mamífero. Adicionalmente , en otro aspecto, el mamífero está seleccionado del grupo que consiste de humanos, caninos, equinos y felinos. En otro aspecto, dicho paso de administrar se selecciona del grupo que consiste de administración tópica, administración parenteral, administración rectal, administración pulmonar, administración nasal, inhalación y administración oral. En otro aspecto, la administración pulmonar está seleccionada del grupo de aerosol, inhalador de polvo seco, inhalador de dosis medida y nebulizador. En otra modalidad, esta invención describe un método para reducir la inflamación en un sujeto, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto que inhiba la liberación, relacionada con MARCKS, de mediadores inflamatorios; de manera que la liberación de los mediadores inflamatorios en el sujeto se reduzca en comparación con la que ocurriría en ausencia de dicho tratamiento. En un aspecto de esta modalidad, el compuesto es por lo menos un fragmento activo de una proteína MARCKS. En otro aspecto, el fragmento activo tiene una longitud de por lo menos seis aminoácidos. En otro aspecto, dicho compuesto es un péptido MANS o un fragmento activo de él. En otro aspecto, dicho compuesto es un oligonucleótido de antisentido, dirigido contra la secuencia de codificación de una proteína MARCKS o un fragmento activo de él . En otro aspecto , el fragmento activo tiene una longitud de por lo menos seis aminoácidos .

En otra modalidad, la invención describe un método para reducir la inflamación en un sujeto, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéuticamente activa, que comprende un compuesto que inhibe la liberación de mediadores inflamatorios, relacionada con MARCKS; de manera que la inflamación en el sujeto se reduzca en comparación con la que ocurriría en ausencia de dicho tratamiento. En otro aspecto, dicho fragmento activo tiene por lo menos seis aminoácidos de largo. En otro aspecto, ese compuesto es un péptido MA S o un fragmento activo de él. En otro aspecto, el compuesto es un oligonucleótido de antisentido, dirigido contra la secuencia codificadora de una proteína MARCKS, o un fragmento activo de él. En otro aspecto, el fragmento activo tiene una longitud de por lo menos seis aminoácidos. La presente invención está destinada a comprender una composición que contiene uno o más del péptido MANS o sus fragmentos activos, y su uso en el tratamiento para inhibir la liberación de mediadores inflamatorios desde gránulos o vesículas de células inflamatorias. En otra modalidad, esta invención describe un método para regular la liberación del gránulo de mucina en un sujeto, que comprende administrar un compuesto que regula la liberación del gránulo de mucina, de manera que se reduzcan los gránulos de mucina en comparación con la que ocurrirían en ausencia de dichos gránulos de mucina. En un aspecto de esta modalidad, el compuesto es un fragmento activo de una proteína MARCKS. En otro aspecto, dicho compuesto es un péptido MANS. En otra modalidad, esta invención describe un método para regular la secreción exocitótica de gránulos de mucina en las vías respiratorias de un sujeto, que comprende: administrar un compuesto que regula la liberación del gránulo de mucina, de manera que se reduzcan los gránulos de mucina en comparación con lo que ocurriría en ausencia de dichos gránulos de mucina. En un aspecto de esta modalidad, dicho compuesto es un fragmento activo de una proteína MARCKS . En otro aspecto, dicho compuesto es un péptido MANS . En otra modalidad, esta invención describe un método para modular la secreción de moco en un sujeto, que comprende: administrar una cantidad terapéutica de una secuencia de antisentido, que sea complementaria de las secuencias que codifican una proteína MARCKS o un fragmento activo de ella; donde la secreción de moco por la célula es inhibida en comparación con la que ocurriría en ausencia de dicha administración. En un aspecto de esta .modalidad, esa secuencia tiene por lo menos dieciocho ácidos nucleicos de largo. En otro aspecto, dicho compuesto es complementario de las secuencias que codifican un péptido MANS o un fragmento activo de él. En otro aspecto, dicha modulación de la secreción de moco consiste en bloquear o reducir la secreción de moco . En otra modalidad, esta invención describe un método para reducir o inhibir la inflamación en un sujeto, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un péptido que comprende el péptido MANS o un fragmento activo de él, efectivo para modular un mediador inflamatorio en el sitio de la inflamación. En un aspecto de esta modalidad, el fragmento activo tiene por lo menos seis aminoácidos de largo. En otro aspecto, dichos 7 mediadores inflamatorios son producidos por células seleccionadas del grupo que consiste de: neutrófilos, basófilos, eosinófilos, monocitos y leucocitos. De preferencia, las células son leucocitos; más preferible, granulocitos ; y todavía más preferible, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, o una combinación de ellos. En otro aspecto, se administra el agente oralmente , parenteralmente , cavitariamente , rectalmente o a través de un pasaje de aire. En otro aspecto, la composición comprende adicionalmente una segunda molécula, seleccionada del grupo que consiste de: un antibiótico, un compuesto antiviral, un compuesto antiparásitos, un compuesto antiinflamatorio y un inmunosupresor . Se puede seleccionar un fragmento activo de un péptido MA S del grupo que consiste de los péptidos miristoilados de: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, y SEQ ID NO 19. En otro aspecto de esta invención, se pueden efectuar los métodos descritos en esta invención mediante el uso de un péptido o su administración, seleccionado del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4. SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO 19 y sus combinaciones. De preferencia se usa o se administra un solo péptido en los métodos descritos aquí .

En respuesta a la activación de la proteína quinasa C (PKC) por medio de un estimulante inflamatorio, se puede atenuar la desgranulación en una célula seleccionada del grupo que consiste de neutrófilos, eosinófilos, monocitos / macrófagos y linfocitos, por medio de preincubación y por coincubación con un péptido idéntico a la región N-terminal de la proteína MARCKS, donde el péptido está seleccionado del grupo que consiste del péptido MANS (SEQ ID NO: 1) y sus fragmentos N-terminales miristoilados (SEQ ID NO: 3 a 19) . Si bien el transcurso del tiempo y las concentraciones pueden variar entre los tipos de células, en todos los casos el péptido MANS atenúa la desgranulación inducida por PKC.

Métodos y materiales Cultivo de células NHBE Se llevó a cabo la expansión, la criopreservación y el cultivo de células NHBE en la interfaz aire / líquido, como se describió previamente. Ver Krunkosky y coautores. Brevemente, se sembraron células NHBE (Clonetics, San Diego, CA, E. U. A.), en matraces de cultivo de tejido T75, abiertos a la atmósfera (500 células por cm2) y se cultivaron hasta que las células alcanzaron una confluencia de 75 a 80 por ciento. Luego se disociaron las células mediante tripsina/EDTA y se congelaron como paso 2. Se inició el cultivo de la interfaz aire / líquido sembrando las células del paso 2 (2 x 104 células por cm2) en insertos de cultivo claros TRANSWELL® (Costar, Cambridge, MA, E. U. A.), que fueron revestidos con revestimiento delgado de colágeno de cola de rata, tipo I (Collaborative Biomedical, Bedford, MA, E. U. A.) . Se cultivaron las células sumergidas en el medio en un ambiente de 95 por ciento de aire y 5 por ciento de C02 , humidificado , durante 5 a 7 días, hasta que fueron casi confluentes. En ese. momento se creó la interfaz aire/líquido retirando el medio apical y alimentando las células basalateralmente . Se renovó diariamente el medio después de esto. Se cultivaron las células durante otros 14 días para permitir una diferenciación plena. Medición mediante ELISA de la secreción de mucina. Antes de la recolección de las muestras de mucina de "línea básica" y "de prueba", se eliminó el moco acumulado en la superficie apical de las células, lavando con solución salina regulada con fosfato, a pH 7.2. ¦ Para recoger la secreción de línea básica se incubaron las células con medio solamente, y se recogió y guardó la mucina secretada en el medio apical. Se dejaron reposar las células durante 24 horas, y luego se las expuso al medio que contenía los reactivos estimulador y/o inhibidor seleccionados (o los controles apropiados) , después de lo cual se recogió la mucina y se reservó como la muestra de prueba. Los tiempos de incubación para la línea básica y la prueba fueron los mismos, pero variaron dependiendo del reactivo de prueba utilizado. Tanto la línea de base como las secreciones de prueba fueron analizadas mediante ELISA utilizando un método de captura de anticuerpos que es conocido en la técnica. Ver, por ejemplo, Harlow y coautores, Antibodies : A Laboratory Manual, páginas 570-573, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (E. U. A.) (1988). El anticuerpo primario para este análisis fue 17Q2 (Babeo, Richmond, CA, E. U. A.), un anticuerpo monoclonal que reacciona específicamente con un epítope de carbohidrato en las mucinas de las vías respiratorias humanas. La proporción de mucina de prueba / línea básica, que es similar a un "índice de secreción" , se usó para cuantificar la secreción, lo que permitió que cada plato de cultivo sirviera como su propio control y, de esa manera, se redujo al mínimo la desviación provocada por la variabilidad entre las concavidades de cultivo. Wright y coautores, Am. J. Physiol., 271, L854-L861 (1996). Se informaron los niveles de secreción de mucina como el porcentaje del control con medio . Análisis de inmunoprecipitación radiomarcado Cuando se marcó con [32P] fosfato, se preincubaron las células durante dos horas en un medio de Eagle modificado de Dulbecco, libre de fosfato, que contenía 0.2 por ciento de albúmina de suero bovino, y luego se marcó con 0.1 mi/mL de [32P] ortofosfato (9000 Ci/mmol, PerkinElmer Life Sciences) durante dos horas. Para marcar con [3H] ácido mirístico o con 3H-aminoácidos , se incubaron las células durante la noche en medio que contenía 50 ??/?? de [3H] ácido mirístico (49 Ci/mmol, PerkinElmer Life Sciences) o 0.2 mCi/mL de [3H] leucina (159 Ci/mmol, PerkinElmer Life Sciences) más 0.4 mCi/mL (3H] prolina (100 Ci/mmol, Perkin Elmer Life Sciences) . Después de marcar, se expusieron las células a reactivos estimuladores durante 5 minutos. Cuando se usó un inhibidor, se preincubaron las células con el inhibidor durante 15 minutos, antes de la estimulación. Al finalizar los tratamientos, se sometieron a lisis las células en un regulador que contenía 50 m de Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 10 por ciento de glicerol, 1 por ciento de Nonidet P-40, 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 1 mM de benzamidina, 10 µ9/p?[- de pepstatina A, y 10 µ9/p?11? de leupeptina. La precipitación de ácido tricloroacético y el conteo de destello pueden determinar la eficiencia de la radiomarcación en cada cultivo. Se llevó a cabo la inmunoprecipitación de MARCKS de acuerdo con el método de Spizz y Blackshear, usando lisatos de células que contenían conteos iguales por minuto. Spizz y coautores, J. Biol . Chem. , 271, 553-562 (199). Se resolvieron las proteínas precipitadas mediante electroforesis en SDS-gel de poliacrilamida, al 8 por ciento, y se visualizó mediante autorradiografía . Se usaron en este análisis el anticuerpo MARCKS anti-humano (2F12) y el anticuerpo de control no inmunológico (6F6) . Para determinar los complejos de MARCKS o de proteína asociada con MARCKS en diferentes fracciones subcelulares , se rasparon células radiomarcadas y tratadas en un regulador de homogeneizacion (50 mM de Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM de NaCl , 1 mM de EDTA, 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 1 mM de benzamidina, 10 µg/mL de peptastin A, 10 µg/mL de leupeptina) y luego se rompió mediante cavitación con nitrógeno (800 libras/pulgada cuadrada [5.51 MPa] durante 20 minutos a 4 °C) . Se centrifugaron los lisatos de célula a 600 x g durante 10 minutos a 4 °C para eliminar los núcleos y las células no rotas. Se separaron los sobrenadantes post -nucleares a membrana y fracciones citosólicas, mediante ultracentrifugación a 400,000 x g, durante 30 minutos, a 4 °C. Se solubilizó la pella de membrana en el regulador de lisis, mediante tratamiento sónico. Luego se llevó a cabo la inmunoprecipitación como se describió más arriba. Peptidos relacionados con MARCKS . Se sintetizó tanto la secuencia N-terminal miristoilada (MA S) como los péptidos de secuencia N-terminal aleatoria (RNS) en Genemed Synthesis, Inc. (San Francisco, CA, E. U. A.); luego se purificó mediante cromatografía en líquido de alta presión (>95 por ciento de pureza) y se confirmó mediante espectroscopia de masa, mostrando cada una un solo pico con una masa molecular apropiada. El péptido MANS consistió de la secuencia idéntica a los primeros 24 aminoácidos de MARCKS, es decir, la región N-terminal miristoilada que media la inserción de MARCKS en las membranas, MA-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID NO: 1 (donde MA = cadena miristato N-terminal) . El péptido de control correspondiente (RNS) contenía la misma composición de aminoácidos que el MANS, pero dispuestos en orden aleatorio, MA-GTAPAAEGAGAEVKRASAEAKQAF (SEQ ID NO: 2) . La presencia de la porción miristato hidrófoba en estos péptidos sintéticos incrementa su permeabilidad a las membranas de plasma, permitiendo que los péptidos sean captados fácilmente por las células. Para determinar los efectos de esos péptidos sobre la secreción de mucina, se preincubaron las células con los péptidos durante 15 minutos, antes de la adición de los secretagogos , y luego se midió mediante ELISA la secreción de mucina. Oligonucleótidos de antisentido El oligonucleótido de antisentido MARCKS y su oligonucleótido de control correspondiente fueron sintetizados en Biognostik GmbH (Góttingen, Alemania) . Se trataron las células NHBE con 5 µ? de oligonucleótido de antisentido o de control, apicalmenté durante tres días (en presencia de 2 µ9/??[_ de lipofectina durante las primeras 24 horas. A continuación se incubaron las células con secretagogos y se midió la secreción de mucina mediante ELISA. Se aisló el ARN total y la proteína de las células tratadas. Se determinó el mARN de MARCKS por medio de hibridación Northern, de acuerdo con procedimientos convencionales, usando cADN de MARCOS humano como sonda. Se determinó el nivel de MARCKS mediante manchado de Western, usando IgGl anti -MARCKS purificada (clon 2F12) como el anticuerpo primario de detección. Transfección transitoria El dominio del sitio de fosforilación (PSD) de MARCKS) contiene los sitios de fosforilación dependientes de PKC y el sitio de unión al filamento de actina. Para construir un cADN de MARCKS con omisión de PSD, se generaron dos fragmentos que flanquean la secuencia PSD (que codifica 25 aminoácidos) mediante reacción de cadena de polimerasa, y luego se ligó a través del sitio Xhol que se fijó a los extremos 5' de las sondas de oligonucleotido designadas para la reacción de cadena de polimerasa. El cADN mutante resultante y el cADN de MARCKS de tipo silvestre fueron insertados cada uno en un vector de expresión de mamífero pcDNA4/TO (Invitrogen, Carlsbad, CA, E. U. A.) . Se confirmaron las construcciones recombinantes aisladas mediante digestos de restricción y formación de secuencia de ADN. HBE1 es una línea de células epiteliales bronquiales humanas, transformadas con virus de papiloma, capaz de secretar mucina cuando se cultiva en la interfaz aire / líquido. Se llevó a cabo la transfección de células HBE1 usando el reactivo de transfección Effectene (Qiagen, Valencia, CA, E. U. A.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se disociaron las células HBE1 diferenciadas, desarrolladas en la interfaz aire / líquido, por medio de tripsina / EDTA y se volvieron a sembrar en placas de cultivo de 12 concavidades, a 1 x 105 células / cm2. Después de incubar durante la noche, se transfectaron las células con el cADN de MARCKS de tipo silvestre, cADN de MARCKS con PSD truncado, o el ADN vector. Se cultivaron las células durante 48 horas para permitir la expresión del gen y luego se expusieron a los secretagogos y se midió mediante ELISA la secreción de mucina. Se llevaron a cabo todas las transfecciones en presencia del plásmido pcDNA4/T0/lacZ (Invitrogen) (proporción de ADN 6:1, ADN total 1 g, proporción de ADN a reactivo Effectene = 1:25) para monitorear las variaciones en la eficiencia de transfección. Los resultados no mostraron diferencia de importancia en las actividades de ß-galactosidasa en los lisatos de célula aislados de las células transfectadas , lo que indica similar eficiencia de transfección entre las diferentes construcciones de ADN (datos no mostrados) . Análisis de la actividad de proteína fosfatasa . Se midieron las actividades de PP1 y PP2A usando un sistema de análisis de proteína fosfatasa (Life Technologies, Inc.), como se muestra en la técnica, con una modificación ligera. Huang y coautores, Adv. Exp . Med. Biol . , 396, 209-215 (1996) . Brevemente, se trataron las células NHBE con 8-Br-cGMP o con medio solo durante cinco minutos. Luego se rasparon las células a un regulador de lisis (50 mM de Tris-HC1 (pH 7.4), 0.1 por ciento de ß-mercaptoetanol , 0.1 m de EDTA, 1 mM de benzamidina, 10 g/mL de pepstatina A, 10 µg/mL de leupeptina) , y se rompió por tratamiento sónico durante 20 segundos a 4 °C. Se centrifugaron los lisatos de célula y se guardaron los sobrenadantes para el análisis de la actividad de fosfatasa. Se llevó a cabo el análisis usando fosforilasa A marcada con 32P, como substrato. Se tomó la cuenta del 32P liberado, mediante destello. Se determinó la concentración de proteína de cada muestra, mediante el análisis de Bradford. Se expresó la actividad de PP2A como la actividad total de fosfatasa de la muestra menos la actividad que queda en presencia de 1 nM de ácido okadaico. Se expresó la actividad de PP1 como la diferencia entre las actividades restantes en presencia de 1 nM y 1 µ? de ácido okadaico, respectivamente. Se informaron las actividades de proteína fosfatasa como nmoles de Pi liberado por minuto / mg de proteína total . Análisis de citotoxicidad Todos los reactivos usados para tratar las células NHBE fueron examinados en cuanto a su citotoxicidad, midiendo la liberación total de lactato deshidrogenasa desde las células. Se llevó a cabo el análisis usando el equipo Promega Cytotox 96, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todos los experimentos fueron efectuados con reactivos a concentraciones no citotóxicas. Análisis estadístico Se analizaron los datos en cuanto a su significación, usando análisis de variación, de una sola manera, con correcciones de Bonferroni posteriores al análisis. Se consideraron las diferencias entre tratamiento como significativas a p<0.05. Aislamiento de PMN de sangre canina Los pasos involucrados en aislar PMN incluyen recolectar 10 mL de sangre con anticoagulante ACD . Luego se formaron capas de 5 mL sobre 3.5 mL de medio de aislamiento PMN, mientras se aseguraba que el medio de aislamiento (IM) PMN estaba a la temperatura ambiente (TA) . A continuación se centrifugó la sangre a la temperatura ambiente durante 30', 550 x g, a 1700 rpm. Se transfirió la banda blanca baja, inferior, a un tubo cónico de centrífuga (CCFT) , de 15 mL Luego se añadió 2V de HEXX con 10 por ciento de suero bovino fetal (PBS) y se centrifugó a la temperatura ambiente durante 10 minutos, a 400 x g, a 1400 rpm. Se volvió a suspender la pella en 5 mL de 1-1ESS con PBS. Se añadió la suspensión de células a 50 mL de CCFT que contenía 20 mL de NH4C1 al 0.88 por ciento, enfriado con hielo, y se invirtió de dos a tres veces. Se centrifugó el producto resultante durante 10 minutos, a 800 x g a 2000 rpm; luego se aspiró y se volvió a suspender en 5 mL de HBSS con FBS . Se examinó la preparación mediante conteo y citospina, y de preferencia para la sangre entera el número de células debe estar entre 109 y 1011 células; y para PMN el número de células debe estar entre 2 y 4 x 107 células. Ver, en general, Wang y coautores, J. Immunol . , "Neurophil -induced changes in the hiomechanical properties of endotelial cells: roles of ICAM-1 and reactive oxygen species, 6487-94 (2000) . Análisis colorimétrico de enzimas Se analizaron muestras en cuanto a la actividad de MPO en places de microtitulación de 96 concavidades, de fondo redondo, usando un equipo de ELISA emparedado (R & D Systems, Minneapolis, ????. E. U. A.). Brevemente, se mezclan 20 microlitros de la muestra con 180 microlitros de mezcla de substrato que contenían 33 mM de fosfato de potasio, pH 6.0, 0.56 por ciento de Tritón X-100, 0.11 mM de peróxido de hidrógeno y 0.36 mM de diclorhidrato de O-dianisidina, en una concavidad individual del microtitulador . Las concentraciones finales en la mezcla de análisis son: 30 mM de fosfato de potasio, pH 6.0; 0.05 por ciento de Tritón X-100, 0.1 mM de peróxido de hidrógeno y 0.32 mM de diclorhidrato de dianisidina. Después de mezclar se incubó la mezcla de análisis a la temperatura ambiente durante 5 minutos, y se determinó la actividad enzimática de MPO espectrofotométricamente a 550 nanómetros . Se analizaron por duplicado las muestras.

Estudios de secreción del mediador inflamatorio Se usaron cuatro tipos o modelos diferentes de leucocitos que secretan contenidos de gránulo específicos en respuesta a la activación de PKC inducida por éster de forbol . Se aislaron los neutrófilos de la sangre humana y se determinó la liberación de MPO in vitro por estas células. También se evaluó la liberación de los mediadores inflamatorios unidos a la membrana, desde líneas de células leucocitos humanos, obtenidas en el comercio. Se usó el clon 15 de la línea de células promielocítica humana HL-60, para determinar la secreción de EPO (Fischkoff, S. A., Graded increase in probability of eosinophilic differentíation of HL-60 prowyelocytic leukemia cells induced by culture under alkaline conditions. Leuk . Res. 1988; 12:679-686; Rosenberg, H. F., Ackerman, S. >J., Teñen, Di G., Human eosinophil cationic protein: molecular cloning of a cytotoxin and helminthotoxin with ríbonuclease activity. J. Exp. Med. , 1989; 170:163-176; Tiffany, H. L . , Li , F . , Rosenberg, H. .F., Hyperglycosylation oí eosinophil ribonucleases in a pro yelocytic leukemia cell Une and in differentiated peripheral blood progenitor cells. J. Leukoc . Biol . , 1995; 58:49-54; Badewa, A . P., Hudson, C. E . , Heiman, S. A . , Regulatory effects of eotaxin, eotaxin-2 and eotaxin-3 on eosinophil degranulation and superoxide anion generation. Exp. Biol. Med. , 2002; 227:645-651). Se usó la línea de células de leucemia monocítica U937 para determinar la secreción de lisozima (Hoff, T . , Spencker, T., Emmendoerffer, A., Goppelt-Struebe , M., Effects of glucocorticoids on the TPA-induced monocytic differentiation. J. Leukoc. Biol., 1992, 52:173-182; Balboa M. A., Saez, Y., Balsinde, J., Calcium-independent phospholipase A2 is required for lysozyme secretion in U937 promonocytes . J. Immunol . , 2003, 170:5276-5280; Sundstrom C, Nilsson, K. , Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell Une (U-937) . Int. J. Cáncer, 1976; 17:565-577). Se usó la línea de células asesinas naturales de linfocito NK-92 para determinar la liberación de granzima (Gong, J. H., Maki, G., Klingemann, H. G., Characterization of a human cell Une (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells. Leukemia, 1994; 8-652-658; Maki, G., Klingemann, H. G., Matinson, J. A., Tam, Y. K. , Factors regulating the cytotoxic activity of the human natural killer cell Une, NK-92. J. Hematother . Stem Cell Res., 2001; 10:369-383; Takayama , H., Trenn, G., Sitkovsky, M. V. , A novel cytotoxic T. lymphocyte activation assay. J. Immunol. Methods, 1987; 104:183-190). En todos los casos, se preincubaron las células con una escala de concentraciones de un péptido sintético idéntico al terminal N de MARCKS, de 24 aminoácidos [péptido con secuencia N-terminal miristoilado con MA S; MA-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ IN NO : 1)], donde MA es miristoílo unido a la amina N-terminal del péptido por medio de una ligadura amida) , o un péptido de control sin sentido [RNS : péptido con secuencia N-terminal aleatoria; MA-GTAPAAEGAGAEVKRASAEAKQAF (SEQ ID NO: 2)], que consiste de los mismos 24 aminoácidos pero dispuestos en una secuencia de orden aleatorio, que posee menos del 13 por ciento de identidad de secuencia con la secuencia del péptido MANS. En cada uno de los tipos de célula, MANS, pero no RNS, atenúa la liberación de los mediadores inflamatorios de una manera que depende de la concentración. Un curso de tiempo útil de observación es de 0.5 a 3.0 horas. Los resultados son consistentes con la región N-terminal de la proteína MARCKS, que está involucrada en las trayectorias intracelulares que conducen a la desgranulación del leucocito . Aislamiento de neutrófilos humanos Estos estudios fueron aprobados por el Consejo de Revisión Institucional (IRB) para estudios humanos de la NCSU. Se aislaron neutrófilos humanos como se describió previamente (ver Takashi , S., Okubo, Y., Horie, S., Contributíon of CD54 to human eosinophil and neutrophil superoxíde production. J. Appl . Physiol . , 2001, 91:613-622), con ligeras modificaciones. Brevemente, se obtuvo sangre venosas heparinizada de voluntarios sanos normales; se diluyó con RPMI-1640 (Cellgro; Mediatech, Ihc . , Herndon, VA, E. U. A.), a una proporción de 1:1; se tendió sobre Histopaque (densidad, 1.077 g/mL; Sigma-Aldrich Co . , St . Louis, MO, E. U. A.) y se centrifugó a 400 g durante 20 minutos a 4 °C. Se retiró cuidadosamente el sobrenadante y las células mononucleares en la interfaz, y se sometieron a lisis los eritrocitos del sedimento, en agua destilada helada. Se lavaron dos veces los granulocitos aislados con solución salina de Hanks equilibrada (HBSS) y se volvieron a suspender en HBSS sobre hielo. Los neutrófilos usados para los experimentos tuvieron una pureza de >98 por ciento, con <2 por ciento de contaminación con eosinófilos, y la viabilidad fue de >99 por ciento, según se determinó mediante la exclusión con tinte azul Trypan. Medición de la actividad MPO de neutrófilos liberados Para medir la liberación de MPO, se formaron alícuotas de neutrófilos humanos purificados en HBSS, a 4 x 106 células /mL en tubos de 15 mL, y se los preincubó con 50 o 100 µ? de MANS o de péptido RNS durante 10 minutos a 37 °C. Se estimularon las células con 100 nM de 13-acetato de 12-miristato de forbol (PMA) durante hasta tres horas. Se estableció una referencia de control (referencia de control de PMA) usando neutrófilos humanos suspendidos en HBSS formado en alícuotas a 4 x 106 células / mL en tubos de 15 mL, y estimuladas con 100 nM de 13-acetato de 12-miristato de forbol (PMA) , en ausencia de MANS o del péptido RNS, durante los mismos periodos de tiempo. Se terminó la reacción colocando los tubos sobre hielo y centrifugando a 400 g durante 5 minutos, a 4 °C.

Se analizó la actividad de MPO en el sobrenadante de células, utilizando tetrametilbencidina (TMB) , con base en una técnica previamente establecida (Abdel-Latif D., Steward M., Macdonald, D. L., Francis, G. A., Dinauer, M. C, Lacy, P., Rac2 is critical for neutrophil primary granule exocytosis. Blood, 2004, 104:832-839). Brevemente, se añadieron 100 µ?_ de solución de substrato TMB a 50 µ?? de sobrenadantes de células o MPO humano estándar (EMD Biosciences, Inc., San Diego, CA, E. U. A.), en una microplaca de 96 concavidades, seguida por incubación a la temperatura ambiente durante 15 minutos. Se terminó la reacción añadiendo 50 µ?? de H2S04 1M, y se leyó la absorbencia a 450 nm en un lector especrofotométrico de microplacas (VERSA max, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, E. U. A.) Estudios de cultivos de leucocitos Se adquirieron de American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD, E. U. A.), tres tipos de líneas de células de leucocitos humanos, específicamente, la línea de células promielocítica HL-60, clon 15, la línea de células monocítica U937 y la línea de células asesinas naturales de linfocitos NK-92. Se mantuvo las células HL-60 clon 15 (ATCC CRL-1964) en un medio que consistía de RPMI1640 con L-glutamina, suplementado con 10 por ciento de suero bovino fetal inactivado con calor (FBS; Gibco; Invitrogen Co . , Carlsbad, CA, E. U. A.), 50 Ul/mL de penicilina, 50 µg/mL de estreptomicina y 25 mM de regulador HEPES, pH 7.8 , a 37 °C, en una atmósfera que contenía 5 por ciento de C02. La diferenciación final con un fenotipo similar a eosinófilo fue iniciada cultivando las células a x 105 células/mL en el medio anterior que contenía 0.5 mM de ácido butírico (Sigma-Aldrich Co . ) durante cinco días, como se describió previamente (Tiffany, H. L., Li , F., Rosenberg, H. F., Hyperglycosylation of eosinophil ribonucleases in a promyelocytic leukemia cell Une and in differentiated peripheral blood progenitor cells. J. Leukoc . Biol . , 1995, 58_49-54; Tiffany, H. L . , Alkhatib, G., Combadiere, C, Berger, E. A., Murphy, P. M., CC chemokine receptors 1 and 3 are differentially regulated by IL-5 during maturation of eosinophilic HL-60 cells, J. Immunol . , 1998, 160:1385-1392). Se desarrollaron células U937 (ATCC CRL-1593.2) a 37 °C en una atmósfera con 5 por ciento de C02, en medio completo que consistía de RPMI 1640 con L-glutamina, suplementado con 10 por ciento de FBS, 50 UI/mL de penicilina y 50 g/mL de estreptomicina. Se mantuvieron las células NK-92 (ATCC CRL-2407) en medio alfa-MEM (Sigma-Aldrich Co . ) , suplementado con 20 por ciento de FBS, 100 U/mL de interleuquina 2 (IL-2) (Chemicon International, Inc., Temecula, CA, E. U. A.), 5 x 10~5 M de 2 -mercaptoetanol , 50 UI/mL de penicilina y 50 µg/mL de estreptomicina, a 37 °C, en una atmósfera que contiene 5 por ciento de C02. Se juzgó la morfología de la célula mediante determinación de las células manchadas con Wright-Giemsa. Se determinó la viabilidad de las células cosechadas para experimentos mediante exclusión con azul tripano y se usaron las poblaciones de células que tuvieron una viabilidad de más del 95 por ciento. Incubación de células para análisis de desgranulación Se lavaron células HL-60, clon 15; U937 y NK-92 y se volvieron a suspender a 2.5 x 106 células/mL en RPMI-1640 libre de rojo fenol (Cellgro; ediatech, Inc.) para todos los análisis de desgranulación. Se preincubaron alícuotas de células en tubos de 15 mL con las concentraciones indicadas de MA S o de péptido RNS durante 10 minutos a 37 °C. Luego se estimularon las células con PMA durante hasta dos horas. Se estableció una referencia de control (referencia de control PMA) , para cada tipo de células, usando células HL-60, clon 15; U937 y NK-92, respectivamente, que fueron lavadas y resuspendidas a 2.5 x 106 células / mL en RPMI-1640 libre de rojo fenol, y estimuladas con PMA, pero en ausencia de MANS o de péptido RNS, durante los mismos periodos de tiempo. Se terminó la reacción colocando tubos sobre hielo y centrifugando las células a 400 g durante 5 minutos, a 4 °C. Para medir el MPO liberado desde los neutrófilos y la lisozima liberada desde las células U937, se pudo cuantificar la secreción, usando como normas MPO humano y ovoalbúmina blanca de nuevo, respectivamente. Para EPO liberado desde las células HL-60, clon 15, y para la granzima liberada desde las células NK-92, no hubo normas disponibles para usar para la cuantificación . Por consiguiente, se midieron tanto los niveles liberados como intracelulares (de las células sometidas a lisis) de EPO y granzima, y se expresaron el EPO liberado y la granzima como porcentaje del total ( intracelular y liberado) para cada uno. Para medir EPO intracelular en las células HL-60 clon 15 y la granzima intracelular en las células NK-92, se tomaron alícuotas apropiadas de células sometidas a lisis con Tritón X-100 al 0.1 por ciento, para la cuantificación de las proteínas de gránulo intracelular, que se describen más abajo. Todos los tratamientos fueron expresados como el porcentaje del control, para reducir al mínimo la variabilidad entre los cultivos . Medición de la liberación de EPO en HL-60 Se analizó la actividad de EPO liberado por las células HL-60 clon 15, usando TMB de acuerdo con una técnica establecida previamente (Lacy, P., Mahmudi -Azer , S., Bablitz, B., Hagen, S. C. Velázquez, J. R., Man, S. F., Moqbel, R., Rapid movilization of intracellularly stored RANTES in response to interferon-gamma in human eosinophils. Blood, 1999, 94:23-32). Así, se añadieron 100 µ!< de solución de substrato TMB a 50 µ?, (^L = microlitro) de muestra en una microplaca de 96 concavidades y se incubó a la temperatura ambiente durante 15 min (min = minutos) . Se dio por finalizada la reacción añadiendo 50 µ?_ de H2S04 1.0M, y se leyó la absorbencia a 450 nm (nm = nanómetros) , en un lector espectrofotométrico de microplacas. Se expresó la cantidad de EPO secretado como el porcentaje del contenidoi total, usando la cantidad obtenida en el mismo número de células sometidas a lisis con Tritón X-100. Medición de la secreción de lisozima de onocitos Se midió la lisozima secretada por las células U937 usando un análisis espectrofotométrico, como se describió previamente (Balboa, M. A., Saez, Y., Balsinde, J., Calcium-independent phospholipase A2 is required for lysozyme secretion in U937 promonocytes . J. Immnol . , 2003; 170-5276-5280) , con ligera modificación. De esa manera, se mezcló 100 µ?^ de muestra con 100 µ?, de una suspensión de Micrococcus lysodeikticus (Sigma-Aldrich Co . ) (0.3 mg/mL en 0.1 M de regulador fosfato de sodio, pH 7.0), en una microplaca de 96 concavidades. Se midió la disminución en la absorbencia a 450 nm, a la temperatura ambiente. Se construyó una curva de calibración usando como norma lisozima de clara de huevo de gallina (EMD Biosciences, Inc.) . Medición de la secreción de granzima en células NK Se sometió a análisis la granzima secretada desde células NK-92, midiendo la hidrólisis del éster tiobencílico de ?a-benciloxicarbonil -L- lisina (BLT) , esencialmente como se describió previamente (Takayama, H., Trenn, G., Sitkovsky, M. V., A novel cytotoxic T. lymphocyte activation assay. J. Im unol. Metods, 1987, 104:183-190). Se transfirió 50 µ]., de sobrenadante a una placa de 96 concavidades, y se añadió al sobrenadante 150 µ?, de solución de BLT (0.2 mM de BLT;, EMD Biosciences Inc., y 0.22 mM de DTNB , Sigma-Aldrich Co . ) (mM = milimolar) en salina regulada con fosfato (PBS, pH 7.2 ) . Se leyó la absorbencia a 410 nm después de la incubación, durante 30 minutos a la temperatura ambiente. Se expresaron los resultados como el porcentaje del contenido total de enzima celular, usando la cantidad obtenida en el mismo número de células sometidas a lisis con Tritón X-100. Análisis estadístico Se determinó la significación estadística de las diferencias entre los diversos grupos de tratamiento, con A OVA de una sola vía. Se tomaron como significativos los valores P de más de 0.05. Liberación de MPO de neutrofilos Se encontró que 100 nM de PMA (como estimulador de la liberación del mediador inflamatorio) incrementaban la liberación de MPO de neutrófilos humanos en aproximadamente el triple, frente al nivel de control a 30 minutos, en referencia al control PMA, incrementándose la liberación de MPO a aproximadamente 5-6 veces después de tres horas. A los 30 minutos, con respecto a la actividad de MPO de control como 100 por ciento, en ausencia de PMA, y en ausencia de PMA más MANS o RNS , la actividad de MPO de la referencia de control PMA fue aproximadamente 275 por ciento, la de PMA más 50 µ? de MANS fue aproximadamente 275 por ciento, y la de 100 µ? de MANS fue aproximadamente 305 por ciento. Así, el péptido MANS no tuvo efecto detectado a los 30 minutos. Sin embargo, a una hora, la concentración mayor de MANS (100 µ?) tuvo un efecto inhibidor significativo (medido aproximadamente a 260 por ciento de control) o una reducción de aproximadamente 25 por ciento en la liberación de MPO frente al nivel de la referencia de control PMA (que se midió aproximadamente a 340 por ciento de control) . La muestra de 50 µ? de MANS midió aproximadamente 290 por ciento de control o aproximadamente 15 por ciento de reducción con respecto a la referencia de control de PMA. En dos horas, y persistiendo a las tres horas, el péptido MANS atenuó significativamente la actividad de MPO de una manera que dependía de la concentración. A las dos horas, la actividad de MPO de la referencia de control PMA fue aproximadamente 540 de control, la de 50 µ? de MANS (que midió aproximadamente 375 por ciento de control) provocó una reducción de aproximadamente 30 por ciento de la liberación de MPO frente a la referencia de control de PMA; y la de 100 µ? de MANS (que midió aproximadamente 295 por ciento de control) provocó una reducción de aproximadamente 45 por ciento en la liberación de MPO frente a la referencia de control de PMA. A las tres horas, la actividad de MPO de la referencia de control PMA fue aproximadamente 560 por ciento de control, la de 50 µ? de MANS (que midió aproximadamente 375 por ciento de control) provocó una reducción de aproximadamente 33 por ciento de la liberación de MPO frente a la referencia de control de PMA; la de 100 µ? de MA S (que midió aproximadamente 320 por ciento de control) provocó una reducción de aproximadamente 40 por ciento de liberación de MPO frente a la referencia de control de PMA. El péptido RNS no afectó la liberación de MPO inducida por PMA, en ninguno de los puntos de tiempo ni a las concentraciones probadas. Liberación de EPO de HL-60 Se intensificó significativamente la actividad de EPO en las células HL-60, clon 15, sobrenadantes, a 1 y 2 horas después de la estimulación con PMA. A una hora, con relación a la actividad de EPO del control como 100 por ciento, la referencia de control de PMA medida a alrededor de 110 por ciento; la muestra que contenía 10 µ? de MANS medida a alrededor de 95 por ciento, para dar una reducción de alrededor de 15 por ciento en la actividad de EPO, con relación a la referencia de control de PMA; la muestra que contenía 50 µ? de MANS medida a alrededor de 78 por ciento para dar una reducción de aproximadamente 30 por ciento en la actividad de EPO con relación a la referencia de control PMA; y la muestra que contenía 100 µ? de MANS medida a alrededor de 65 por ciento para dar una reducción de alrededor de 40 por ciento en la actividad de EPO con relación a la referencia de control PMA. A las dos horas, con relación a la actividad de EPO del control como 100 por ciento, la referencia de control de PMA medida a alrededor de 145 por ciento; la muestra que contiene 10 µ? de Mans medida a alrededor de 130 por ciento, para dar una reducción de alrededor de 10 por ciento en la actividad EPO con relación a la referencia de control PMA; la muestra que contiene 50 µ? de MANS, medida a alrededor de 70 por ciento, dio una reducción de alrededor de 50 por ciento en la actividad EPO con respecto a la referencia de control de PMA, y la muestra que contenía 100 µ? de MANS, medida a alrededor de 72 por ciento, dio una reducción de alrededor de 50 por ciento en la actividad de EPO con relación a la referencia de control PMA. Así pues, tanto a 1 hora como a dos horas, MANS a 50 o a 100 µ? atenuó significativamente la liberación de EPO. El péptido RNS no afectó la liberación de EPO intensificada por PMA, en ninguno de los puntos de tiempo ni a las concentraciones probadas. Liberación de lisozima de U937 Se incrementó la secreción de lisozima por las células U937, mediante estimulación con PMA en una hora después de la incubación, y se incrementó todavía más a las dos horas. A una hora, con relación a la secreción de lisozima por las células U937 de control como 100 por ciento, la referencia de control PMA medida a alrededor de 210 por ciento; la muestra que contenía 10 µ? de MANS medida a alrededor de 170 por ciento, para dar una reducción de alrededor de 20 por ciento en la secreción de lisozima por las células U937 con relación a la referencia de control PMA; la muestra que contenía 50 µ? de MANS, medida a alrededor de 170 por ciento dio una reducción de alrededor de 20 por ciento en la secreción de lisozima por las células U937 con relación a la referencia de control PMA; y la muestra que contenía 100 µ? de MANS medida a alrededor de 115 por ciento, dio una reducción de alrededor de 45 por ciento en la secreción de lisozima por las células U937, con relación a la referencia de control PMA. A las dos horas, con relación a la secreción de lisozima por las células U937 del control como 100 por ciento, la referencia de control de PMA medida a alrededor de 240 por ciento; la muestra que contenía 10 µ? de MANS medida a alrededor de 95 por ciento, dio una reducción de alrededor de 20 por ciento en la secreción de lisozima por las células U937 con elación a la referencia de control PMA; la muestra que contenía 50 µ? de MANS, medida a alrededor de 185 por ciento, dio una reducción de alrededor de 25 por ciento en la secreción de lisozima por las células U937, con relación a la referencia de control PMA; y la muestra que contenía 100 µ? de MANS medida a alrededor de 140 por ciento, dio una reducción de alrededor de 40 por ciento en la secreción de lisozima por las células U937 con relación a la referencia de control PMA. De esa manera, la secreción de lisozima fue atenuada significativamente tanto a una hora como a dos horas después de la estimulación por 100 µ? de MANS, pero no tanto por 50 o 10 µ? de MANS. El péptido RNS no afectó la secreción de lisozima intensificada por PMA, en ninguno de los puntos de tiempo ni a las concentraciones probadas . Liberación de granzima de células NK A una hora, con relación a la secreción de granzima por células NK-92 del control como 100 por ciento, la referencia de control PMA, medida a alrededor de 125 por ciento; la muestra que contenía 10 µ? de MANS medida a alrededor de 115 por ciento, dio una reducción de alrededor de 10 por ciento en la secreción de granzima por células NK-92, con relación a la referencia de control PMA, y la muestra que contenía 100 µ? de MANS, medida a alrededor de 85 por ciento con relación a la referencia de control PMA, dio una reducción de alrededor de 30 por ciento en la secreción de granzima por células NK-92, con relación a la referencia de control PMA. A las dos horas, con relación a la secreción de granzima por las células NK-92 del control como 100 por ciento, la referencia de control medida a alrededor de 220 por ciento, la muestra que contenía 10 µ? de MANS , medida a alrededor de 200 por ciento, dio una reducción de alrededor de 10 por ciento en la secreción de granzima por células NK-92 con relación a la referencia de control PMA; y la muestra que contenía 100 µ? de MANS, medida a alrededor de 80 por ciento, dio una reducción de alrededor de 60 por ciento en la secreción de granzima por las células NK-92 con relación a la referencia de control PMA. De esa manera, la secreción de granzima por las células NK-92 no fue incrementada de manera significativa por PMA a una hora, pero aumento más del doble a las dos horas. 100 µ? de MANS, pero no 10 µ? de MANS, atenuaron la secreción de granzima a 1 y 2 horas después de la incubación. El péptido RNS no afectó la secreción de granzima intensificada por PMA, en ninguno de los puntos de tiempo ni a las concentraciones probadas. Ci totoxicidad Ninguno de los tratamientos generó una respuesta tóxica en las células, según se determinó mediante retención / liberación de LDH (datos no mostrados) (ver también Park, J-a, He, F, Martin L. D., Li , Y., Adler K. B. La elastasa de neutrófilos humanos induce hipersecreción de mucina desde las células epiteliales bronquiales humanas in vitro por medio de un mecanismo mediado por PKC5. Am. J. Pathol . , 2005; 167 : 651-661) .

Los ejemplos precedentes son ilustrativos de la presente invención y no se deben considerar como limitación a ella. La invención está definida por las siguientes reivindicaciones, debiendo incluirse en ellas los equivalentes de las reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES 1. - Un método para inhibir la liberación exocitótica de por lo menos un mediador inflamatorio desde por lo menos una célula inflamatoria, que comprende poner en contacto la al menos una célula inflamatoria, célula que comprende por lo menos un mediador inflamatorio contenido dentro de una vesícula dentro de la célula, con al menos un péptido seleccionado del grupo que consiste de un péptido MANS y un fragmento activo de él, en una cantidad efectiva para reducir la liberación del mediador inflamatorio desde la célula inflamatoria, en comparación con la liberación del mediador inflamatorio desde el mismo tipo de célula inflamatoria, que ocurriría en ausencia del al menos un péptido. 2. - El método de conformidad con la reivindicación 1, en el que el péptido es un péptido MANS que comprende SEQ ID NO: 1. 3. - El método de conformidad con la reivindicación 1, en el que el fragmento activo comprende por lo menos un fragmento N-terminal miristoilado de SEQ ID NO: 1, que comprende por lo menos seis aminoácidos; en el que el primer aminoácido del fragmento comienza en la glicina N-terminal de SEQ ID NO: 1. 4. - El método de conformidad con la reivindicación 3, en el que el fragmento activo se puede seleccionar del grupo que consiste de: N-miristoil -GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAV (SEQ ID NO: 20); N-miristoil -GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAA (SEQ ID NO: 3); N-miristoil- GAQFSKTAAKGEAAAERPGEA (SEQ ID NO: 4); N-miristoil- GAQFSKTAAKGEAAAERPGE (SEQ ID NO: 5); N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAAAERPG (SEQ ID NO: 6); N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAAAERP (SEQ ID NO: 7); N-miristoil -GAQFSKTAAKGEAAAER (SEQ ID NO: 8); N-miristoil- GAQFSKTAAKGEAAAE (SEQ ID NO: 9); N-miristoil -GAQFSKTAAKGEAAA (SEQ ID NO: 10); N-miristoil -GAQFSKTAAKGEAA (SEQ ID NO: 1); N-miristoil -GAQFSKTAAKGEA (SEQ ID NO: 12) ; N-miristoil-GAQFSKTAAKGE (SEQ ID NO: 13) ; N-miristoil -G AQFSKTAAKG (SEQ ID NO: 14); N-miristoil -GAQFSKTAAK (SEQ ID NO: 15); N-miristoil -GAQFSKTAA (SEQ ID NO: 16); N-miristoil -GAQFSKTA (SEQ ID NO: 17); N-miristoil -GAQFSKT (SEQ ID NO: 18); y N-miristoil-GAQFSK (SEQ ID NO: 19) . 5. - El método de conformidad con la reivindicación 1, en el que la célula inflamatoria es un leucocito. 6. - El método de conformidad con la reivindicación 1, en el que la célula inflamatoria es un granulocito. 7. - El método de conformidad con la reivindicación 1, en el que la célula inflamatoria está seleccionada del grupo que consiste de un neutrófilo, un basófilo, un eosinófilo y una combinación de ellos. 8. El método de conformidad con la reivindicación 1, en el que la célula inflamatoria es un monocito o un macrófago . 9. - El método de conformidad con la reivindicación 1, en el que el mediador inflamatorio está seleccionado del grupo que consiste de: mieloperoxidasa (MPO) , eosinófilo peroxidasa (EPO) , proteína básica principal [MBP] , lisozima, granzima, histamina, proteoglicano, proteasa, un factor quimiotáctico , citocina, un metabolito de ácido araquidónico, defensina, proteína incrementadora de la permeabilidad bactericida (BPI) , elastasa, catepsina G, catepsina B, catepsina D, beta-D-glucuronidasa, alfa-mannosidasa, fosfolipasa A2/ 4-sulfato de condroitina, proteinasa 3, lactoferrina , colagenasa, activador de complemento, receptor de complemento, receptor de N- formilmetionil - leucil -fenilalanina (FMLP) , receptor de laminina, citocromo b558 í factor monocito-quimiotáctico , histaminasa, proteína de unión de vitamina B12, gelatinasa, activador de plasminogeno, beta-D-glucuronidasa, y una combinación de ellos. 10. - El método de conformidad con la reivindicación 1, en el que el mediador inflamatorio está seleccionado del grupo que consiste de: mieloperoxidasa (MPO) , eosinófilo peroxidasa (EPO) , proteína básica principal (MBP) , lisozima, granzima y una combinación de ellas. 11. - El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la cantidad efectiva del péptido comprende una cantidad inhibidora de la desgranulación del péptido MANS, o de un fragmento activo del mismo, que reduzca la cantidad de un mediador inflamatorio liberado desde por lo menos una célula inflamatoria, de alrededor de 1 por ciento a alrededor de 99 por ciento, en comparación con la cantidad liberada desde al menos una célula inflamatoria en ausencia del péptido MANS o de un fragmento activo de él. 12. - El método de conformidad con la reivindicación 1, en el que la cantidad efectiva del péptido comprende una cantidad inhibidora de la desgranulación del péptido MANS o un fragmento activo de él, que reduzca la cantidad de un mediador inflamatorio liberada desde por lo menos una célula inflamatoria, de entre alrededor de 5-50 por ciento a alrededor de 99 por ciento, en comparación con la cantidad liberada desde por lo menos una célula inflamatoria, en ausencia del péptido MANS o de un fragmento activo de él. 13. - Un método para inhibir la liberación de por lo menos un mediador inflamatorio desde por lo menos una célula inflamatoria en un tejido y/o un fluido de un sujeto, que comprende : la administración al tejido y/o al fluido del sujeto, en el que el tejido y/o el fluido comprende por lo menos una célula inflamatoria que comprende por lo menos un mediador inflamatorio contenidoi dentro de una vesícula dentro de la célula, una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende por lo menos un péptido seleccionado del grupo que consiste de un péptido MANS y un fragmento activo de él, en una cantidad terapéuticamente efectiva para reducir la liberación del mediador inflamatorio desde por lo menos una célula inflamatoria, en comparación con la liberación del mediador inflamatorio desde por lo menos una célula inflamatoria del mismo tipo, que ocurriría en ausencia de dicho al menos un péptido . 14. - El método de conformidad con la reivindicación 13, en el que la reducción de la liberación de un mediador inflamatorio comprende bloquear o inhibir el mecanismo que libera el mediador inflamatorio de dicha célula inflamatoria. 15. - El método de conformidad con la reivindicación 13, en el que el péptido es un péptido MANS que comprende SEQ ID NO: 1. 16. - El método de conformidad con la reivindicación 13, en el que el fragmento activo' comprende por lo menos un fragmento N-terminal miristoilado de SEQ ID NO: 1, que comprende por lo menos seis aminoácidos; donde el primer aminoácido del fragmento comienza en la glicina N-terminal de SEQ ID NO: 1. 17.- El método de conformidad con la reivindicación 16, en el que se puede seleccionar el fragmento activo del grupo que consiste de: N-miristoil -GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAV (SEQ ID NO: 20) ; N-miristoil -GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAA (SEQ ID NO: 3); N-miristoil- GAQFSKTAAKGEAAAERPGEA (SEQ ID NO: 4); N-miristoil- GAQFSKTAAKGEAAAERPGE (SEQ ID NO: 5) ; N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAAAERPG (SEQ ID NO: 6) ; N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAAAERP (SEQ ID NO: 7); N-miristoil- GAQFSKTAAKGEAAAER (SEQ ID NO: 8); N-miristoil- GAQFSKTAAKGEAAAE (SEQ ID NO: 9) ; N-miristoil -GAQFSKTAAKGEAAA (SEQ ID NO: 10); N-miristoil -GAQFSKTAAKGEAA (SEQ ID NO: 11); N-miristoil- GAQFSKTAAKGEA (SEQ ID NO: 12); N-miristoil-GAQFSKTAAKGE (SEQ ID NO: 13) ; N-miristoil -GAQFSKTAAKG (SEQ ID NO: 14); N-miristoil -GAQFSKTAAK (SEQ ID NO: 15); N-miristoil-GAQFSKTAA (SEQ ID NO: 16); N-miristoil -GAQFSKTA (SEQ ID NO: 17) ; N-miristoil-GAQFSKT (SEQ ID NO: 18) ; y N-miristoil-GAQFSK (SEQ ID NO: 19) . 18.- El método de conformidad con la reivindicación 13, en el que la célula inflamatoria es un leucocito. 19. - El método de conformidad con la reivindicación 13, en el que la célula inflamatoria es un granulocito. 20. - El método de conformidad con la reivindicación 13, en el que la célula inflamatoria está seleccionada del grupo que consiste de un neutrófilo, un basófilo, un eosinófilo y una combinación de ellos. 21. - El método de conformidad con la reivindicación 13, en el que la célula inflamatoria es un monocito o un macrófago. 22. - El método de conformidad con la reivindicación 13, en el que el mediador inflamatorio está seleccionado del grupo que consiste de: mieloperoxidasa (MPO) , eosinófilo peroxidasa (EPO) , proteína básica principal [MBP] , lisozima, granzima, histamina, proteoglicano, proteasa, un factor quimiotáctico, citocina, un metabolito de ácido " araquidonico, defensina, proteína incrementadora de la permeabilidad bactericida (BPI), elastasa, catepsina G, catepsina B, catepsina D, beta-D-glucuronidasa , alfa-mannosidasa, fosfolipasa A2, 4-sulfato de condroitina, proteinasa 3, lactoferrina , colagenasa, activador de complemento, receptor de complemento, receptor de N- formilmetionil - leucil -fenilalanina (FMLP) , receptor de laminina, citocromo b558 , factor monocito-quimiotáctico, histaminasa, proteína de unión de vitamina B12, gelatinasa, activador de plasminógeno, beta-D-glucuronidasa, y una combinación de ellos. 23. - El método de conformidad con la reivindicación 13, en el que el mediador inflamatorio está seleccionado del grupo que consiste de mieloperoxidasa (MPO) , eosinófilo peroxidasa (EPO) , proteína básica principal (MBP) , lisozima, granzima y una combinación de ellas. 24. - El método de conformidad con la reivindicación 13, en el que la cantidad efectiva del péptido comprende una cantidad inhibidora de la desgranulación del péptido MAS o de un fragmento de él, que reduzca la cantidad de un mediador inflamatorio liberada de por lo menos una célula inflamatoria, de alrededor de 1 por ciento a alrededor de 99 por ciento, en comparación con la cantidad liberada desde por lo menos una célula inflamatoria, en ausencia del péptido MANS o de un fragmento activo de él. 25. - El método de conformidad con la reivindicación 13, en el que la cantidad efectiva del péptido comprende una cantidad inhibidora de la desgranulación del péptido MANS o de un fragmento activo de él, que reduzca la cantidad de un mediador inflamatorio liberada desde por lo menos una celda inflamatoria entre alrededor de 5-50 por ciento y alrededor de 99 por ciento, en comparación con la cantidad liberada de por lo menos una célula inflamatoria, en ausencia del péptido MANS o de un fragmento activo de él. 26. - El método de conformidad con la reivindicación 13, en el que el sujeto está afligido por una enfermedad respiratoria . 27. - El método de conformidad con la reivindicación 26, en el que la enfermedad respiratoria está seleccionada del grupo que consiste de asma, bronquitis crónica y COPD. 28. - El método de conformidad con la reivindicación 13, en el que el sujeto es un mamífero. 29.- El método de conformidad con la reivindicación 28, en el que el mamífero está seleccionado del grupo que consiste de humanos, caninos, equinos y felinos. 30. - El método de conformidad con la reivindicación 13, en el que se selecciona la administración del grupo que consiste de: administración tópica, administración parenteral, administración rectal, administración pulmonar, administración nasal y administración oral. 31. - El método de conformidad con la reivindicación 30, en el que la administración pulmonar está seleccionada del grupo de: aerosol, inhalador de polvo seco, inhalador de dosis medida y nebulizador. 32. - El método de conformidad con la reivindicación 13, que comprende adicionalmente la administración al sujeto de una segunda molécula, seleccionada del grupo que consiste de un antibiótico, un compuesto antiviral, un compuesto antiparásitos, un compuesto antiinflamatorio y un inmunosupresor . 33. - El método de conformidad con la reivindicación 13, en el que el sujeto está afligido por una enfermedad seleccionada del grupo que consiste de una enfermedad intestinal, una enfermedad cutánea, una enfermedad autoinmunológica , un síndrome de dolor, y combinaciones de ellas . 34. - El método de conformidad con la reivindicación 33, en el que la enfermedad intestinal está seleccionada del grupo que consiste de colitis ulcerante, mal de Crohn y síndrome de intestino irritable. 35. - El método de conformidad con la reivindicación 33, en el que la enfermedad cutánea está seleccionada del grupo que consiste de erisipela, eczema, psoriasis y acné severo . 36.- El método de conformidad con la reivindicación 13, en el que el sujeto está afligido con artritis o fibrosis