MX2008004001A

MX2008004001A - Plantas de aloe transgenicas para produccion de proteinas y metodos relacionados.

Info

Publication number: MX2008004001A
Application number: MX2008004001A
Authority: MX
Inventors: William J Lowther; Wen-Shuz Yeow; Kevin Lorick; Marisol Pages; Nicola J Lowter
Original assignee: Thegreencell Inc
Priority date: 2005-09-26
Filing date: 2006-09-26
Publication date: 2008-11-26
Also published as: WO2007035966A2; ES2345359T3; HK1216387A1; AU2006292072A1; CN101313071B; US20160160228A1; BRPI0617607B1; CN105106929A; WO2007035966A3; BRPI0617607A2; US9267149B2; JP2009509511A; JP2012196221A; JP5336849B2; DE602006015492D1; CN101313071A; US8816154B2; JP5690776B2; EP1931792B1; CN102851306B

Abstract

Las presentes invenciones proporcionan plantas de áloe transgénicas y construcciones recombinantes para transformar plantas de áloe, aspectos de las cuales, se pueden aplicar a otras monocotiledóneas. Las construcciones recombinantes pueden incluir una o más secuencias de DNA que codifican proteínas mamíferas y por lo menos un promotor capaz de dirigir la expresión de proteínas recombinantes en una planta de áloe. Las presentes invenciones también proporcionan métodos para construir y reproducir una planta de áloe transgénica. Las presentes invenciones incluyen métodos para la transfección de una planta de áloe con varios genes de interés simultáneamente. Los métodos de producción de plantas de áloe de las invenciones pueden proporcionar el potencial para producir en masa de manera más barata y más segura algunos compuestos biológicamente activos que incluyen sustancias biofarmacéuticas para terapia, diagnosis y prevención de enfermedad, y es más accesible a los países menos afluentes. Los métodos de producción de plantas de áloe también pueden producir proteínas para cosméticos.

Description

PLANTAS DE ÁLOE TRANSGÉNICAS PARA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS Y MÉTODOS RELACIONADOS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Breve Descripción de la Invención: La presente invención se relaciona a plantas monocotiledóneas transgénicas y, más particularmente, a plantas de áloe transgénicas y métodos y composiciones para producir una planta de áloe transgénica y métodos para extraer proteínas de las plantas de áloe transgénicas. Descripción de la Técnica Relacionada: Continúa existiendo un mercado creciente para proteínas biológicamente activas muchas de las cuales se utilizan para propósitos terapéuticos. Actualmente, existen más de 160 medicinas basadas en proteínas disponibles. Unas cincuenta adicionales aproximadamente se esperan que sean aprobadas durante el siguiente par de años. La demanda actual para la producción de proteínas terapéuticas ya está superando la capacidad de la industria. Se ha predicho que la industria necesitará incrementar su capacidad de cuatro a cinco veces para superar este obstáculo. Sin embargo, las instalaciones de producción para las proteínas terapéuticas son costosas y toman típicamente un tiempo más largo para construir. Por consiguiente, existe una necesidad por métodos de producción que sean menos costosos y puedan reducir el tiempo requerido para aumentar la producción.

Se utilizan algunos métodos de producción de proteínas basadas en animales. Sin embargo, estos introducen frecuentemente riesgos de salud de las enfermedades. Tales riesgos pueden surgir de la contaminación cruzada con enfermedades que pueden afectar tanto al animal como al usuario final tal como un paciente humano. Por consiguiente, existe una necesidad por un método de producción que eliminará la posibilidad de contaminación cruzada entre el organismo de producción y el usuario final Además, muchos métodos de producción actuales requieren procesamiento extensivo a fin de extraer la proteína terapéutica del animal u otro organismo hospedero en el cual se produjo y obtener el compuesto en una condición donde se puede utilizar por un paciente. Después de la purificación, la proteína se puede combinar con un adyuvante u otro material portador para estabilizar la proteína y permitir la utilización por un paciente. Sin embargo, los procesos de extracción, purificación, resuspensión entre otros involucrados con el procesamiento de una proteína terapéutica son complejos y ¦ difíciles y no puede ser conducente para usar en países subdesarrollados en necesidad de los productos terapéuticos generalmente. Por consiguiente, existe una necesidad por métodos de producción simplificados que puedan eliminar o reducir el procesamiento de posextracción de proteínas terapéuticas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Composiciones y métodos de acuerdo con las presentes invenciones pueden resolver muchas de las necesidades y desventajas discutidas en lo anterior y proporcionarán mejoras y ventajas adicionales como será reconocido por aquellos de habilidad en la técnica en la revisión de la presente descripción. En un aspecto, las presentes invenciones pueden proporcionar una planta de áloe transgénica que incorpora establemente un gen de interés. En otros aspectos, vectores y construcciones novedosas se pueden proporcionar para integrar las secuencias de DNA de interés en el genoma de una planta de áloe. La secuencia de interés puede codificar una proteina biológicamente activa. La proteina biológicamente activa puede ser interferonas , inmunoglobulinas , linfocinas, factores de crecimiento, hormonas, factores sanguíneos, antígenos de histocompatibilidad, enzimas, proteínas cosméticas y otras proteínas mamíferas u otras proteínas de interés'. En algunos aspectos, las proteínas de interés son proteínas humanas. Las plantas de áloe de acuerdo con las presentes invenciones pueden transcribir y traducir el gen de interés en la proteína de interés. En un aspecto, por lo menos algo de la proteína de interés migra a una porción central de la hoja de áloe. En otros aspectos, la proteína de interés puede incluir una secuencia de señal para facilitar su translocación en la porción central de la hoja de áloe. En otros aspectos, se pueden proporcionar metodologías novedosas para el aislamiento de células individuales de una planta de áloe. En todavía otros aspectos, las presentes invenciones pueden proporcionar métodos novedosos para la integración de vectores en una planta de áloe y reproducción de tales plantas de áloe transgénicas. Las plantas de áloe transgénicas que producen proteínas mamíferas de acuerdo con las presentes invenciones pueden proporcionar una alternativa más económicamente viable para la producción de proteínas de interés tal como por ejemplo varias proteínas biológicamente activas y cosméticas. En un aspecto, las proteínas de interés se pueden localizar y/o concentrar dentro del gel de la hoja de áloe. Esta localización de las proteínas de interés puede simplificar la remoción de la proteína de la planta. En este aspecto, la proteína de interés se puede co-extraer junto con la extracción del gel nativo dentro de la porción central de la hoja de áloe. Por consiguiente, las presentes invenciones pueden proporcionar una planta transgénica a partir de la cual las proteínas de interés son generalmente más fácilmente accesibles que aquellas de la mayoría de plantas transgénicas tales como por ejemplo tabaco y maíz. Además, las presentes invenciones pueden proporcionar un método eficiente para el aislamiento de la proteína. En todavía otros aspectos, las proteínas de interés pueden no estar particularmente localizadas dentro de la planta de áloe. Sin embargo, la anatomía y fisiología de la planta de áloe todavía puede proporcionar ciertas ventajas adicionales para la producción de la proteína de interés como será reconocido por aquellos expertos en la técnica en la revisión de la presente descripción . Las plantas de áloe pueden ofrecer varias ventajas sobre los métodos convencionales para producir proteínas de interés en bacterias y levadura. Las ventajas de las plantas de áloe 10 pueden incluir la habilidad para procesar proteínas en maneras que las bacterias y levadura de una célula individual simple son pobremente adecuadas y lo cual puede ser necesario para producir las proteínas en la forma deseada. Este procesamiento puede incluir la modificación química, tal como mediante glicosilación y plegamiento de algunas proteínas por ejemplo. Además, en comparación a otros métodos de producción de proteínas basados sobre células animales, la producción de la planta de áloe puede ofrecer beneficios de costo significantes, ventajas de escalabilidad y un riesgo reducido de contaminación que puede ser nocivo a los humanos . Un gel modificado con proteína de la porción central de la hoja de áloe de una planta de áloe transgénica de acuerdo con las presentes invenciones se puede utilizar directamente de la plante de áloe. Esto puede evitar la necesidad para la extracción relativamente compleja y costosa de las proteínas de interés de materiales de planta nativa. En algunos aspectos, el gel extraído de la hoja se puede utilizar directamente sin la necesidad para la extracción o procesamiento de proteína. El gel puede estar en la forma de médula mecánicamente extraída de un extremo abierto de una hoja rota de una planta de áloe transgénica. Las presentes invenciones pueden proporcionar alternativas económicamente viables para la producción de proteínas humanas y otras mamíferas que son biológicamente activas y/o tienen aplicaciones cosméticas. En la revisión de la presente descripción, aquellos expertos en la técnica reconocerán mejoras y ventajas adicionales de las presentes invenciones. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 ilustra un ejemplo de la anatomía de sección transversal de una hoja de áloe; la Figura 2 ilustra métodos ejemplares para la generación de tejido calloso; la Figura 3 perfila diagramáticamente varias etapas para generar una planta de áloe transgénica; la Figura 4 ilustra diagramáticamente componentes de un vector de plásmido que incluye información de secuencia; la Figura 5 lista la información de secuencia para el promotor de ubiquitina de maíz y destaca regiones del promotor de ubiquitina; las Figuras 6? y 6B ilustran la construcción de un sistema de vector de plásmido de acuerdo con aspectos de las presentes invenciones; las Figuras 7A a 7C ilustran la construcción de otro sistema de vector de plásmido de acuerdo con aspectos de las presentes invenciones; la Figura 8 ilustra la construcción de un sistema de vector de plásmidos adicional de acuerdo con aspectos de las presentes invenciones; y la Figura 9 ilustra la construcción de sistemas de integración de acuerdo con aspectos de las presentes invenciones . Todas las Figuras se ilustran para facilidad de explicación de las enseñanzas básicas de las presentes invenciones solamente; las extensiones de las Figuras con respecto al número, posición, secuencia, relación y composiciones de las diversas modalidades serán explicadas o estarán dentro de la habilidad de la técnica después de la revisión de la siguiente descripción. Además, los diversos protocolos, herramientas y composiciones para practicar las invenciones divulgadas estarán dentro de la habilidad de la técnica después de la revisión de la siguiente descripción.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS INVENCIONES Como se utiliza en la especificación, "un" o "una" pueden significar uno o más. Como se utiliza en la(s) reivindicación (es ) , cuando se utiliza en conjunción con la palabra "que comprende", las palabras "un" o "uno" pueden significar uno o más de uno. Como se utiliza en la presente "otro" puede significar por lo menos un segundo o más. Como se utiliza en la presente una "célula de áloe transformada" significa una célula de planta que se transforma con DNA recombinante, no natural, establemente integrado, por ejemplo mediante la transformación mediada con Agrobacterium o mediante bombardeo utilizando microparticulas -recubiertas con DNA recombinante u otro medio. Una célula de Áloe transformada de estas invenciones puede ser una célula de planta originalmente transformada que existe como un microorganismo o como una célula de planta de progenie que se regenera en tejido diferenciado, por ejemplo en una planta de Áloe transgénica 10 con DNA recombinante no natural, establemente integrado, o semilla o polen derivado de una planta de Áloe transgénica de progenie 10. Como se utiliza en la presente una "plante de áloe transgénica" significa una planta de áloe cuyo genoma ha sido alterado mediante la integración estable de DNA recombinante. Una planta de áloe transgénica 10 incluye una planta de áloe regenerada de una célula de áloe originalmente transformada y plantas de áloe transgénicas de progenie de generaciones posteriores o cruzas de una planta de áloe transformada 10. Como se utiliza en la presente "DNA recombinante" significa DNA que ha sido genéticamente diseñado y construido fuera de una célula que incluye DNA que contiene DNA que ocurre naturalmente, cDNA, DNA sintético y/u otro DNA. Como se utiliza en la presente "promotor" significa DNA regulador para inicializar la transcripción. Un "promotor de planta" es un promotor capaz de iniciar la transcripción en células de áloe si o no su origen es una célula de áloe, por ejemplo es bien conocido que los promotores de Agrobacterium son funcionales en las células de áloe. Asi, los promotores de planta incluyen DNA promotor obtenido de plantas, · virus de planta y bacterias tales como bacterias Agrobacterium y Bradyrhizobium. Ejemplos de promotores bajo control evolutivo incluyen promotores que inician preferentemente la transcripción en ciertos tejidos, tales como hojas, raices o semillas. Tales promotores son referidos como "tejido preferido". Los promotores que inician la transcripción solo en ciertos tejidos son referidos como "tejido especifico". Un promotor especifico de "tipo e célula" conduce principalmente la expresión en ciertos tipos de células en uno o más órganos, por ejemplo, células vasculares en raices u hojas. Un promotor "inducible" o "reprimióle" es un promotor que está bajo control ambiental.

Ejemplos de condiciones ambientales que pueden afectar la transcripción por promotores inducibles incluyen condiciones anaeróbicas, o ciertos químicos, o la presencia de luz. Tejido específico, tejido preferido, tipo de célula específico, y promotores inducibles constituyen la clase de promotores "no constitutivos". Un promotor "constitutivo" es un promotor que es activo bajo la mayoría de condiciones. El promotor puede incluir aumentadores u otros elementos que afectan la iniciación de la transcripción, el sitio de inicio de la transcripción, niveles de transcripción, el sitio de finalización de la transcripción, o cualquier posprocesamiento del ácido ribonucleico resultante. El término "construcción genética" como se utiliza en la presente se define como una secuencia de DNA que comprende un arreglo sintético de por lo menos dos segmentos de DNA para el propósito de crear una planta de áloe transgénica. En una modalidad específica, un segmento es una secuencia reguladora y otro segmento codifica un producto de gen . Como se utiliza en la presente, "operablemente enlazado" significa la asociación de dos o más fragmentos de DNA en una construcción de DNA de modo que la función de uno, por ejemplo DNA que codifica proteína, se controla por el otro, por ejemplo un promotor, secuencia de terminación, etc. El término "transcripción" como se utiliza en la presente se define como la generación de una molécula de RNA de una plantilla de DNA. El término "traducción" como se utiliza en la presente se define como la generación de un polipéptido de una plantilla de RNA. Como se utiliza en la presente "expresado" significa producido, por ejemplo una proteina se expresa en una célula de planta cuando su DNA cognado se transcribe a mRNA que se traduce a la proteina. Las presentes invenciones pueden proporcionar plantas de áloe transgénicas novedosas 10 que expresan varias proteínas de interés, pueden proporcionar métodos y composiciones para producir plantas de áloe transgénicas 10, pueden proporcionar métodos para extraer proteínas de las plantas de áloe transgénicas 10, y pueden proporcionar composiciones novedosas de proteínas de interés y componentes de la planta de áloe transgénica 10. Las proteínas de interés producidas de acuerdo con las presentes invenciones pueden incluir una señal secretora para facilitar su acumulación en la médula 18 o médula de una hoja de áloe 12. En un aspecto, esta acumulación puede ocurrir pro lo menos en parte, dentro de las células musalagenosas de la hoja de una planta de áloe transgénica 10. La médula 18 o pulpa de una hoja de áloe 12 incluye los componentes de la hoja que, por lo menos en parte, se refieren comúnmente como el "gel" cuando se extrae de la hoja de áloe 12. Como se utiliza en la presente, "gel" se referirá a la médula extraída 18 y otros materiales asociados que acompañan la médula 18 conforme se extrae de la hoja de áloe 12 sin considerar el grado de procesamiento subsecuente. De acuerdo con uno o más aspectos de las presentes invenciones, el gel de la hoja de áloe 12 puede tener una composición modificada. En un aspecto particular, la composición del gel se puede modificar para incluir por lo menos . un componente de proteína exógeno a ser referido como un "gel modificado con proteína. La extracción de un gel modificado con proteína con la proteína (s) asociada de interés puede ofrecer fácilmente proteínas accesibles y/o métodos eficientes para el aislamiento de la proteína. El gel modificado con proteína producido y/o extraído de acuerdo con las presentes invenciones se puede utilizar directamente sin la necesidad por la extracción de proteína. Aspectos de las presentes invenciones se ilustran generalmente en las Figuras 1 a la 8 para propósitos ejemplares. Las presentes invenciones proporcionan plantas transgénicas , composiciones y metodologías que - son generalmente aplicables al género de áloe de la familia Liliacae. Típicamente, las presentes invenciones se describen con referencia a la aplicación en las especies se seleccionan del grupo de Áloe vera (barbadensis miller) , Áloe ferox y Áloe arborescence para propósitos ejemplares. El género Áloe generalmente incluye un grupo de plantas monocotiledóneas rosette succulent sin tallo grandes. Estas plantas se refieren generalmente como plantas de áloe 10 para propósitos de la presente descripción. Varios compuestos producidos por las plantas de áloe se han utilizado para propósitos medicinales. Estos compuestos cuando están presentes en un gel modificado con proteína pueden complementar las propiedades medicinales de las proteínas biológicamente activas de una planta de áloe transgénica 10 de acuerdo con las presentes invenciones. La Figura 1 ilustra una sección transversal a través de una hoja 12 de una planta de áloe transgénica 10. Las hojas de la planta de áloe transgénica 10 incluyen una mezcla gelatinosa fácilmente extraíble de proteínas, carbohidratos y agua incluidos en el gel que se deriva principalmente de la médula 18. Esta mezcla gelatinosa se localiza principalmente en la porción central de una hoja de áloe 12. Varios componentes en el gel han mostrado que tienen un número de propiedades y usos medicinales. En un aspecto, el gel y/o médula 18 estabilizan una proteína transgénica producida por una planta de áloe transgénica 10 y se localizan en el gel y/o médula 18. La Figura 1 ilustra particularmente la epidermis 14, la corteza o mesófilo 16 y la médula o pulpa 18. La epidermis 14 forma la capa exterior de las células de la hoja. En un aspecto de las presentes invenciones, una planta de áloe transgénica puede incluir células de áloe en uno o más de estos tejidos que incorporan transciente o establemente una construcción genética que se expresa por la célula de áloe. La corteza 16 incluye células ricas en cloroplastos asi como los fascículos vasculares, xilema y floema. La médula 18 es la parénquima esponjosa compuesta casi exclusivamente de células de corteza grandes y, pro lo menos en parte representa el gel donde puede ser ventajoso incorporar o acumular una o más proteínas transgénicas de interés . La epidermis 14 consiste típicamente de una sola capa exterior de células. Precisamente debajo de la epidermis 14 está la corteza 16 que incluye la red de fascículos vasculares. El soporte exterior de los fascículos vasculares se proporciona generalmente por las células envolventes. Los fascículos vasculares se componente de tres tipos generales de estructuras tubulares, el xilema, el floema y los túbulos pericíclicos grandes asociados. El xilema transporta agua y minerales de las raíces a las hojas de la planta. El floema transporta almidones y otros materiales sintetizados por toda la planta. Los túbulos pericíclicos contienen un látex o zábila que es muy alta en las antraquinonas laxativas, especialmente aloína. Las antraquinonas absorben rayos de luz ultravioletas del sol y previenen el sobrecalentamiento de la porción central de la hoja de áloe 12 que funciona generalmente como el órgano de almacenamiento de agua de la planta de áloe. La porción periciclica de los fascículos vasculares es adherente a la epidermis 14, mientras que el resto de los fascículos vasculares sobre sale en la médula 18. La porción más interior y principal de la hoja de áloe 12 es la médula 18 que, por lo menos en parte, constituye el gel. Para propósitos de extracción de gel, la epidermis 14 y la corteza 16 se pueden considerar generalmente que comprenden la envoltura que contiene el gel. El gel extraído, comprendido sustancialmente de la médula 18, es típicamente una sustancia gruesa y babosa que ha sido históricamente aplicada tópicamente a la piel para propósitos medicinales, tal como por ejemplo terapia para quemaduras y heridas. El gel funciona generalmente como un depósito de materiales para la planta de áloe. La corteza 16 sintetiza típicamente muchos de los carbohidratos y glicoproteínas que son necesarios para la planta de áloe. Los carbohidratos sintetizados en exceso se transportan típicamente a la médula 18 para el almacenamiento junto con agua y algunos minerales. Los carbohidratos se transportan mediante los vasos del floema a las vacuolas grandes dentro de la corteza 16 de las células de la médula 18. El agua luego se extrae osmóticamente de los carbohidratos que permiten a la médula 18 funcionar con el órgano de almacenamiento de agua de la planta de áloe. El gel se extrae relativamente fácil al romper una hoja de áloe 12 a lo largo de su eje longitudinal y triturar la hoja para llevar el gel de la envoltura circundante a través de la rotura. Materiales adicionales se pueden extraer de los tejidos de la hoja junto con el gel. Vista general del Proceso Plantas de áloe transgénicas 10 de acuerdo con una o más de las presentes invenciones incluyen generalmente una o más construcciones de DNA establemente incorporadas dentro de la planta para expresar una o más proteínas de interés. La generación de una planta de áloe transgénica 10 de acuerdo con una o más de las presentes invenciones puede involucrar una variedad de composiciones y métodos novedosos. Típicamente, una o más construcciones de DNA se desarrollan para expresar una o más proteínas en la planta de áloe transgénica 10. En un aspecto, una sola construcción puede expresar un MRN individual. En otros aspectos, una sola construcción puede expresar un mRNA múltiple. En todavía otros aspectos, las construcciones múltiples pueden producir un mRNA múltiple. Cada mRNA puede producir uno o más polipéptido . Para introducir las construcciones en las plantas de áloe, las células de áloe o tejido calloso no diferenciado se utiliza típicamente como se ilustra generalmente en la Figura 2. Las células de áloe y el tejido calloso se derivan típicamente de la raíz o los tejidos de la meristema de la hoja o de una semilla de una planta de áloe. Las construcciones de DNA se introducen en las células de áloe utilizando un intervalo de técnicas y/o construcciones como se ilustra diagramáticamente como en la Figura 3. Algunas técnicas serán reconocidas por aquellos de habilidad en la técnica en la revisión de la presente descripción. Las células de áloe o tejido calloso que incorporan las construcciones deseadas se seleccionan para utilizar varias técnicas. Típicamente, la construcción de DNA incluirá un marcador un marcador seleccionable . Una vez que la construcción deseada se ha introducido establemente en las células de áloe o el tejido calloso, las plantitas de áloe se general típicamente de las células de áloe o el tejido calloso. Las plantitas de áloe que se desarrollan en las plantas de áloe transgénicas viables 10 que contienen las construcciones de DNA pueden producir ya sea constitutivamente o induciblemente la(s) proteína (s) deseada de interés. La proteína de interés se puede localizar en la planta de áloe transgénica 10 o se puede encontrar generalmente por toda la planta de áloe transgénica 10 dependiendo de la proteína particular que se produce y/o la presencia o ausencia de una secuencia de señal asociada con la proteina. Dependiendo de la construcción particular y/o proteínas asociadas de interés, la planta de áloe transgénica 10 luego se puede propagar vegetativamente o sexualmente. Las proteínas se pueden aislar de las plantas de áloe transgénicas 10 utilizando una amplia gamma de técnicas. Las proteínas luego se pueden aislar adicionalmente y/o procesar adicionalmente . Tal procesamiento puede incluir modificación enzimática, modificación química incorporación en un adyuvante adecuado, entre otros procesamientos que serán reconocidos por aquellos de habilidad en la técnica en la revisión de la presente descripción. En un aspecto, las proteínas se pueden procesar de un (precursor) inactivo en una forma activa para aplicaciones específicas de la proteína particular . Aislamiento de células Como se muestra en la secuencia ejemplar ilustrada en la Figura 2, las células de áloe o grupos de células de áloe se aislan típicamente de una planta de áloe previo a la incorporación de la construcción deseada. Los tipos de célula de áloe generalmente elegidos para la incorporación de construcciones de DNA se eligen generalmente basados sobre su potencial regenerativo . Las células meristemáticas de la meristema del brote o la meristema de la raíz de una planta de áloe o células de áloe embriónicas de una semilla de áloe se pueden utilizar. Sin embargo, muchas partes de la planta de áloe retienen el potencial para crecer de nuevo o formar tejido calloso y también se pueden utilizar. Las células se aislan típicamente utilizando una gamma de técnicas que serán reconocidas por aquellos expertos en la técnica en la revisión de la presente invención. Típicamente, las células se aislan mecánicamente de la planta de áloe utilizando un bisturí. Alternativamente, otra técnicas mecánicas o de otra manera se pueden utilizar para aislar las células necesarias como serán reconocidas por aquellos de habilidad en la t técnica en la revisión de la presente descripción. Una vez que una célula de áloe apropiada o grupo de células de áloe se aislan, las células de áloe se desarrollan típicamente en el cultivo para formar el tejido calloso. Aunque ciertas técnicas no pueden requerir que las células de áloe primero se desarrollen en el tejido calloso, el tejido calloso proporciona una fuente de conjunto indiferenciado de células de áloe que retienen el potencial para generar una planta de áloe transgénica 10. El tejido calloso se desarrolla típicamente sobre un medio sólido. Sin embargo, el tejido callos también se puede colocar en un medio de cultivo líquido y desarrollarse en suspensión. Las células meristemáticas se pueden aislar de las puntas de las raíces u hojas de una planta de áloe. Las células de áloe meristemáticas también se pueden aislar de la meristema apical. Típicamente, la planta de áloe de la cual los tejidos se aislan es una planta de áloe sana joven. La planta de áloe se selecciona típicamente a ser no más grande que ocho (8) pulgadas con seis (6) o menos de los brotes primarios. Se forma típicamente una herida sobre un brote de una planta de áloe al cortarlo en segmentos. La superficie herida puede favorecer a las células de áloe a crecer. Es típicamente de manera primaria sobre la superficie del corte que el callo comenzará a crecer. Para aislar las células de áloe de una hoja de áloe 12, los segmentos se cortan típicamente del extremo distal de un brote en crecimiento joven. Porciones del segmento luego se extienden sobre un medio de crecimiento. El tejido de la meristema ápica del brote se deriva de una corte de una pulgada de la base de una planta de áloe joven. Las hojas de áloe 12 se remueven del corte y se extiende. Las células de áloe de la meristema se encuentran dentro de "corte". "Se seleccionan para" o "se aislan" (por su habilidad para continuar el crecimiento sobre la placa de cultivo-que forma el tejido calloso regeneran los brotes. Las células de áloe meristemáticas una vez aisladas luego se cultivan sobre el medio apropiado bajo condiciones que promueven la formación del tejido calloso. El aislamiento de las células de áloe embriónicas de semillas involucra generalmente la remoción del recubrimiento de la semilla para exponer el embrión y la remoción mecánica de las células de a áloe deseadas del embrión. Las semillas de áloe se esterilizan típicamente y las cáscaras exteriores se remueven. Para remover mecánicamente las células de áloe de ya se una planta de áloe o un embrión de áloe, se utiliza típicamente un bisturí. Las células de áloe embriónicas, una vez aisladas del recubrimiento de la semilla luego se cultivan sobre un medio apropiado y bajo condiciones que promueven la formación del tejido calloso. Cuando el tejido calloso se desea, las células de áloe aisladas se cultivan típicamente bajo condiciones que favorecen la formación de tejido calloso como será reconocido por aquellos de habilidad en la técnica en la revisión de la presente descripción. Típicamente, las células de áloe aisladas se extienden y se cultivan en un medio de nutrientes sólido apropiado para formar el tejido calloso que tiene un tamaño de aproximadamente 1 cm en diámetro previo a la transformación. Las células de áloe se cultivan típicamente entre 23 y 26 grados Celsius. Los medios adecuados incluyen un sólido o líquido base que incluirán típicamente nutrientes inorgánicos suplementales - tanto macroelementos (tal como nitrógeno, azufre, fósforo, calcio, magnesio, y potasio, como microelementos (tal como hierro, boro, cobalto, cobre, yodo, magnesio, molibdeno y zinc) : nutrientes orgánicos que incluyen azúcares (sacarosa o maltosa) y vitaminas y cofactores (tiamina, niacina, biotina, piridoxina, mío-inositol entre otros); aminoácidos (tal como hidrolisato de prolina y caseína); así como reguladores de crecimiento principalmente una fuente de auxina (típicamente (NAA) , ácido 1-naftalenacético, (IAA), ácido indol-3-acético o (2,4-D), ácido 2 , 4-diclorofenoxiacético) y una fuente de citoquinina (típicamente (BAP) 6-bencilaminopurina ) . Estos medios y vitaminas son típicamente de manera comercial disponibles en composiciones pre-formuladas con concentraciones variantes de vitaminas y nutrientes inorgánicos y son conocidos, entre otros, como medios MS (Murashige-Skoog) , medios Gamborg, o medios Chu N6. Adicionalmente, las células desarrolladas sobre los platos de Petri requieren típicamente un soporte de matriz sólido tal como agar a ser adicionado a los medios de crecimiento . Formación de Construcciones de DNA Construcciones de DNA adecuadas se introducen típicamente en el tejido calloso derivado de las células de áloe aisladas para permitir la producción de la proteína (s) de interés y mediante la planta de áloe transgénica resultante 10. Las construcciones de DNA también se pueden introducir en células de áloe aisladas o plantas de áloe maduras como puede ser reconocido por aquellos expertos en la técnica en la revisión de la presente descripción. Las construcciones de DNA se incorporan típicamente en un vector de tal como un plásmido o virus para la propagación de la construcción y para la introducción en las células de áloe. Un vector de plásmido ejemplar puede incluir el plásmido vendido bajo el nombre comercial pZErO por Invitrogen (Carlsbad, California) , diagramáticamente ilustrado en la Figura 4 para propósitos ejemplares, y pude incluir uno o más de las unidades funcionales, por ejemplo, de este plásmido. Las construcciones de DNA de acuerdo con las presentes invenciones pueden incluir una secuencia promotora capaz de funcionar en una célula de áloe, una secuencia que codifica una proteina de interés, una secuencia terminadora y un sitio de inicio y de detención traduccional todos de los cuales son capaces de funcionar en una célula de áloe. Estos componentes cuando se configuran y se combinan apropiadamente pueden iniciar la descripción de DNA y la traducción de mRNA en su terminación respectiva en una célula de áloe. La construcción de DNA también puede incluir una señal de secreción. Alternativamente, algunas proteínas de interés, tal como por ejemplo un interferón pueden incluir un dominio, natural o sintético, que dirige el interferón para la secreción. La señal de secreción se escisa típicamente conforme la proteína deja la célula o, en algunos casos, se puede retener por la proteína sin afectar esencialmente la función de la proteína. Las señales secretoras pueden ser adicionadas a una variedad de proteínas que pueden requerir señales secretoras para translocación. Estas señales secretoras se pueden derivar de varias secuencias de secreción de planta. La construcción de DNA o un vector de asociado también pueden incluir por lo menos un marcador seleccionable . En un aspecto, la construcción de DNA puede incluir tanto un primer marcador seleccionable para la propagación del vector de en las bacterias como un marcador seleccionable para el crecimiento en las células de áloe. Además, la construcción de DNA puede incluir otros elementos reguladores también para la expresión en las células de áloe especificas en la planta de áloe 10. Otros componentes de construcción pueden incluir elementos reguladores adicionales, tal como guias e intrones 5' para aumentar la transcripción, regiones no traducidas 3' (tal como señales y sitios de poliadenilación) , DNA para transitar péptidos. Amplificación de una secuencia de DNA deseada, tal como una secuencia que codifica una proteina terapéutica deseada, se puede lograr mediante la reacción en cadena de la polimerasa (ver patentes norteamericanas Nos. 4,683,202 y 5,928,906, cada una incorporada en la presente por referencia) . En la revisión de la presente descripción, aquellos expertos en la técnica reconocerán que las construcciones de DNA, que incluyen las secuencias promotoras, las secuencias reguladores, las secuencias estabilizantes, las secuencias objetivas y/o las secuencias de terminación se pueden modificar para afectar su función utilizando métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica. Como se nota en lo anterior, un promotor que es operable en una célula de áloe se utiliza típicamente. El promotor contiene típicamente elementos genéticos en los cuales las proteínas y moléculas reguladoras se pueden enlazar. Estas proteínas incluyen típicamente RNA polimerasa y otros factores de transcripción. El promotor se enlace operativamente en una ubicación funcional y/u orientación a una secuencia de ácido nucleico para controlar la iniciación y/o expresión transcripcional de la secuencia. El promotor puede o no se puede utilizar en conjunción con un "potenciador" el cual se refiere a una secuencia reguladora de acción cis involucrada en activación transcripcional de una secuencia de ácido nucleico. Naturalmente, será importante emplear un promotor y/o potenciador que dirija efectivamente la expresión del segmento de DNA de por lo menos una célula de tipo de una planta de Áloe 10 en la cual la expresión se desea. Aquellos de habilidad en la técnica de la biología molecular conocen generalmente el uso de promotores, aumentadores , y combinaciones de tipo celular para la expresión de proteínas, por ejemplo, Sambrook y colaboradores (1989), incorporada en la presente por referencia. Los promotores empleados pueden ser constitutivos, específicos de tejido, inducibles, y/o útiles bajo las condiciones apropiadas para dirigir la expresión de nivel alto del segmento de DNA introducido, tal como es ventajoso en la producción a gran escala de las proteínas y/o péptidos recombinantes . El promotor puede ser heterólogo o endógeno. Las construcciones de DNA requieren típicamente señales reguladoras de iniciación y terminación transcripcionales y traduccionales capaces de funcionar en células de áloe. Una gran variedad de secuencias que regulan la iniciación transcripcional se pueden utilizar. Las secuencias de DNA que controlan la iniciación de transcripción pueden proceder de Agrobacterium, virus o plantas. La región de iniciación de transcripción viral 35S del virus del mosaico de coliflor (35S-CaMV) se puede utilizar para las plantas de áloe 10. Los promotores de planta que se pueden utilizar en las plantas de áloe 10 también pueden incluir el promotor de subunidad pequeña ribulosa-1, 5-bisfosfato carboxilasa (RUBISCO) de varias plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas o el promotor de ubiquitina del maíz. Otros promotores adecuados se pueden utilizar y se pueden reconocer por aquellos expertos en la técnica en la revisión de la presente descripción. Si la regulación inducible es deseada, los dominios se pueden obtener de fuentes diferentes para que una región reguladora de una fuente se combine con una mRNA polimerasa que enlaza el dominio de otra fuente. La regulación de la expresión puede ser a una etapa particular de un desarrollo de la planta de áloe transgénica. 10 en una parte específica de la planta de áloe transgénica 10 similar raíces, hojas, semilla, flores, sabia o en una combinación de partes de planta y etapas evolutivas. La regulación de expresión a una etapa particular de desarrollo o tejido pueden requerir elementos de DNA adicionales como será reconocido por aquellos expertos en la técnica en la revisión de la presente descripción. Otros promotores numerosos que son activos en células de planta se han descrito en la literatura y pueden ser utilizables en células de áloe. Estas incluyen promotores presentes en genomas de planta así como promotores de otras fuentes, que incluyen: promotores de nopalina sintasa (NOS) y promotores de octopina sintasa (OCS) llevados en plásmidos que inducen tumores de Agrobacterium tumefaciens ; y promotores de caulimovirus tales como el virus de mosaico de coliflor. Además, varios otros promotores también se han identificado en varias referencias, que incluyen, pero no se limitan a, patentes norteamericanas Nos. 5,858,742 y 5,322,938, que divulgan versiones del promotor constitutivo derivado del virus de mosaico de coliflor (CaMV35S) ; patente norteamericana No. 5,641,876, que divulga un promotor de actina de arroz; publicación de solicitud de patente norteamericana 2002/0192813A1 que divulga elementos 5', 3' e intrón útiles en el diseño de los vectores de expresión de planta efectivos; solicitud de patente norteamericana No. de serie 09/757,089, que divulga un promotor de aldolasa de cloroplasto de maíz solicitud de patente norteamericana No. 08/706,946, que divulga un promotor de glutelina de arroz; solicitud de patente norteamericana No. de Serie 09/757,089, que divulga un promotor de aldolasa de maíz (FDA); y solicitud de patente norteamericana No. de serie 60/310,370, que divulga un promotor de nicotianamina sintasa de maíz, todos de los cuales se incorporan en la presente por referencia. Estos y numeroso otros promotores que funcionan en células de plante y pueden ser operables en una planta de áloe transgénica para la expresión de las proteínas terapéuticas deseadas. Como un ejemplo particular, el promotor de ubiquitina (SEQ. ID. NO. 44) de maíz se puede utilizar. El promotor de ubiquitina de maíz es un elemento grande, casi de 2kb en longitud, compuesto de por lo menos tres regiones generales. La secuencia de la cual se lista en la Figura 5 con las características particularmente relevantes marcadas. La primera sección del promotor de ubiquitina se localiza en el extremo más 5' contiene las regiones de unión de matriz (MARs) que son elementos que interactúan con histonas y otras proteínas nucleares y sirven para "enlazar" secuencias flanqueantes que las hacen más fácilmente accesibles a la maquinaria transcripcional de la célula. También ayudan a aislar las unidades transcripcionales de una a la otra, que es importante en la prevención de la transcripción iniciada en un lugar de "a través de la lectura" en una segunda secuencia. Esto puede ayudar el riesgo de crear mensajes antisentido . La segunda sección contiene elementos aumentadores y el promotor actual. Los elementos aumentadores enlazan los factores de transcripción que son responsables para dirigir la maquinaria transcripcional , el complejo de pol II, para enlazar al promotor e iniciar la transcripción. Mientras que el "promotor" se refiere específicamente a los elementos de DNA esenciales necesarios para interactuar con la maquinaria de iniciación de transcripción de núcleo, el término promotor se utiliza más generalmente para abarcar todos los elementos de DNA involucrados con la iniciación de transcripción, y en este caso el "promotor de ubiquitina" se utiliza aproximadamente para dar a entender todo de la región 2kb o modificaciones de, 5' al gen clonado de interés. La tercera sección contiene un intrón de aproximadamente lkb. Los intrones son regiones de un gen transcrito que se remueven del mensaje traducido final, el mRNA, a través del proceso de empalme. Los intrones también ha sido encontrados que influencian la expresión del gen directamente, al proporcionar elementos aumentadores alternativos, así como al incrementar la traducción de proteína al facilitar la translocación de mensajes de mRNA del núcleo al citoplasma - un proceso relacionado en parte al empalme. Sin embargo, la presencia de intrones en- los sistemas transgénicos no siempre conduce a incrementos en la expresión de mRNA o niveles de proteina traducida. En ciertos aspectos, el intrón de ubiquitina se puede modificar para reducir el tamaño total de los vectores y estimar su efecto sobre la expresión del gen transgénico en el áloe. En otros aspectos de la presente invención, puede ser deseado para la expresión deseada para la expresión preferencial en tejidos verdes de la planta de áloe. Los promotores de interés para tales usos pueden incluir aquellos de genes tales como subunidad pequeña de ribulosa-1 , 5-bisfosfato carboxilasa (Rubisco) de Arabidopsis thaliana (Fischhoff y colaboradores (1992) Pl'ant Mol Biol. 20:81-93), ortofosfato diquinasa de aldolasa y piruvato (PPDK) (Taniguchi y colaboradores (2000) Plant Cell Physiol. 41(1) : 42-48) . Como se nota en lo anterior, los promotores se pueden alterar para contener múltiples "secuencias aumentadoras" para asistir en elevar la expresión del gen. Tales aumentadores son conocidos en la técnica. Al incluir una secuencia aumentadora que con tales construcciones la expresión de la proteina seleccionada se puede aumentar. Estos aumentadores frecuentemente se encuentran 5' al inicio de la transcripción en un promotor que funciona en las células eucarióticas , pero frecuentemente puede ser insertado corriente arriba (5') o corriente abajo (3') a la secuencia de codificación. En algunos' casos, estos elementos-aumentadores 5' son intrones. Particularmente útiles como aumentadores son los intrones 5' de los genes de actina 1 de arroz (ver la patente norteamericana No. 5,641,876) y actina 2 de arroz, el intrón del gen de deshidrogenasa de alcohol de maíz, el intrón del gen 70 de proteína de choque de calor de maíz (patente norteamericana No. 5,593,874) y el gen encogido 1 de maíz. Las construcciones de acuerdo con aspectos de las presentes invenciones pueden incluir un elemento 3' que contiene típicamente una señal y sitio de poliadenilación . Elementos 3' bien conocidos incluyen aquellos de genes de Agrobacterium tumefaciens tales como nos 3' , tml 3' , tmr 3' , tms 3', oes 3', tr7 3', por ejemplo divulgados en la patente norteamericana No. 6,090,627, incorporada en la presente por referencia; elementos 3' de genes de planta tal como proteína de choque de calor de trigo 17 (Triticum aesevitum) (Hspl7 3' ) , un gen de ubiquitina de trigo, un gen de fructosa, 1,6-difosfatasa de trigo, un gen de glutelina de arroz, un gen de lactato deshidrogenasa de arroz y un gen de beta-tubulina de arroz, todos de los cuales se divulgan en la solicitud de patente publicada norteamericana 2002/0192813 Al, incorporada en la presente por referencia; y el gen de ribulosa difosfato carboxilasa de guisante (Pisum sativum) (rbs 3'), y elementos 3' de los gentes dentro de la planta hospedera. Una proteína de interés se puede codificar por un gen estructural incorporado en la construcción de DNA. El gen estructural puede ser un gen mamífero o porciones de un gen mamífero. Genes estructurales de interés pueden codificar interferones , inmunoglobulinas , linfocinas, factores de crecimiento, hormonas, factores sanguíneos, antígenos de histocompatibilidad, enzimas u otras proteínas. La secuencia para el interferón alfa 2 se lista para propósitos ejemplares como SEQ. ID. NO. 33. Los genes estructurales también pueden codificar proteínas marcadoras similares a la proteína fluorescente verde (GFP) de la medusa. La secuencia de DNA de los genes estructurales se puede modificar para permitir la expresión de nivel alto en una planta de áloe 10. El codón sesgó para la planta de áloe 10 fue de diferir del codón sesgo en las especies originales de las cuales el gen estructural se aisló. El gen estructural nativo se puede diseñar para utilizar la producción de la proteína codificada en la planta de de áloe 10s. Además, la secuencia de DNA del gen estructural se puede diseñar para proporcionar la glicosilación apropiada de las plantas de áloe 10 que no interfieren con estructura de la proteína. La terminación de la transcripción y traducción se puede proporcionar mediante una variedad de secuencias de terminación transcripcionales y traduccionales que son capaces de funcionar en una planta de áloe 10. En un aspecto, la secuencia de terminación puede incluir la secuencia del gen de nopalina sintasa (NOS) del Agrobacterium. En otro aspecto, la secuencia de terminación se puede derivar de las secuencias de terminación de los genes y proteínas de áloe nativa . Un gen marcador frecuentemente será integrado en la construcción de DNA. El gen marcador puede permitir a las células que contienen el gen estructural de interés hacer seleccionadas de la población de todas las células que no contienen el gen marcador. Los genes marcadores pueden incluir enzima u otras proteínas que proporcionan resistencia a la canamicina, cloranfenicol . G418 y gentamicina entre otros. Todavía otra secuencia de DNA específicas puede ser necesaria si por ejemplo el Agrobacterium se utiliza como un vector de. Otras regiones pueden estar presentes si el DNA va ser dirigido a un tipo de célula específico. Como es referido en lo anterior, las construcciones de DNA también pueden incluir una señal de secreción. Las construcciones también pueden construir una secuencia de translocación que codifica un péptido de señal que puede dirigir la proteína terapéutica para la remoción de la célula en la cual la proteína se formó. Varias secuencias de señal se ha identificado en la literatura que son funcionales en plantas y, más particularmente, funcionales en plantas monocotiledóneas tales como plantas de áloe. Estas se pueden integrar operablemente en las construcciones o dentro de los genes de interés. En un aspecto, la secuencia secretora de alfa amilasa (SEQ. ID NO. 29) de arroz (Oryza sativa) se pueden utilizar. Esta secuencia de señal es caracterizada en "The alpha-amylase genes in Oryza sativa" Mol Gen Genet . , Abril de 1990; 221 (2 ): 235-4 , la descripción de la cual se incorpora en la presente por referencia en su totalidad. Alternativamente, algunos genes de interés, tales como por ejemplo el interferón, pueden incluir un dominio, natural o sintético, que dirige el interferón para la secreción. La señal de secreción se escisa típicamente conforme la proteína deja la célula o, en algunos . casos se puede retener mediante la proteína sin afectar sustancialmente la función de la proteína. Señales secretoras se pueden adicionar a una variedad de proteínas que pueden requerir señales secretoras para la translocación. Estas secuencias secretoras se pueden derivar de varias secuencias de secreción de planta. Las Figuras 6A a la 6B ilustran un conjunto ejemplar de construcciones para producir una proteína de interés de una planta de áloe. Las construcciones de plásmido se marcan como pzUI (TGC9) . El TGC9 incluye el promotor de ubiquitina de longitud completa que conduce la expresión del interferón alfa 2 humano, y el pzUEK (TGC12) (SEQ. ID. NO. 38), el promotor de ubiquitina de longitud completa que conduce la expresión de una proteina de fusión que contiene eGFP (proteina fluorescente verde mejorada) (SEQ. ID. NO. 31) y la proteina de resistencia a la canamicina. La proteina de fusión combina las propiedades de clasificación de ambas proteínas (selección y visualización) en una. Como se ilustra, el. plásmido pzl (TGC8) se creó mediante la amplificación de PCR del gen interferón alfa 2 humano que utiliza cebadores de PCR que contienen cada uno dos sitios de enzimas de restricción distintos (ver Tabla I para la secuencia de cebador) . El gen de interferón amplificado (IFN) tiene sitios PstI y BamHI 5' flanqueantes y sitios SacI y Xhol 3' . El IFN generado mediante PCR luego se clonó como un fragmento Psti /Xhol en el vector de pZErO para crear la construcción pzl (TGC8) e introducir los sitios BamHI y SacI para el clonado subsecuente. Esta construcción contiene el gen IFN alfa de longitud completa y su secuencia de señal, responsable para dirigir la secreción de la proteína IFN de las células. Estos se representan sobre el Portaobjetos 3. Estos clones generados mediante PCR se secuenciaron para confirmar la ausencia de cualquiera de las mutaciones de DNA. Como se ilustra, el vector de plásmido pzUI (TGC9) se creó al clonar el gen IFN alfa 2 corriente abajo del promotor de ubiquitina de longitud completa. El fragmento Pstl/Xhol IFN se liberó de pzl (TGC 8) y se ligó en pzU (TGCI) para crear la construcción pzUI (TGC9) . Esto se represente sobre el Portaobjetos 3. Como se ilustra, el gen eGFP se amplificó mediante PCR utilizando un conjunto de cebadores que contienen los sitios de restricción BamHI (extremo 5') Xhol (extremo 3') (ver Tabla I para la secuencia cavadora) . Este gen eGFP generado mediante PCR se creo sin un codón de detención (para permitir finalmente la expresión de una proteina de fusión eGFP-kan) . Asi la traducción no termina en el extremo de la secuencia de eGFP. El fragmento amplificado mediante PCR se digirió con las enzimas de restricción BamHI y Xhol y se ligó en los sitios BamHI y Xhol de pZErO, creando pzEnostop (TGC10). Esto se representa sobre el Portaobjetos 3. Los clones generados mediante PCR se secuenciaron para confirmar la ausencia de cualquiera de las mutaciones de DNA. Como se ilustra, el pzEK (TGC11) genera una construcción de fusión entre el gen eGFP y el gen resistente a la canamicina. El eGFP se relacionó como un fragmento de Bamtil/Xhol de pzEnostop (TGC10) y se ligo en pzK (TGC4) para crear la construcción pzEK (TGC11) . El gen eGFP se clona en la estructura y 5' a kan/nos (SEQ. ID. NO. 35) . Como se ilustra, el fragmento de BamHI /Xbal de pzEK (TGC11) , que contiene el cásete eGFP/kan/nos, se clonó en los sitios BamHI y Xbal de pzUI (TGC9) a fin de permitir la expresión del gen de fusión eGFP/kan. La secuencia IFN se remueve de esta manera. Esta nueva construcción, pzUEK (TGC12), expresa la proteina de fusión eGFP/kan del promotor de ubiquitina de longitud completa (representado en el Portaobjetos 4) . Esta proteina de fusión retiene las características de cada una de las proteínas individuales, y así tiene el beneficio obvio de funcionar tanto como marcador visual como agente selectivo en uno. Las Figuras 7? a la 7C ilustran otro conjunto ejemplar de construcciones para producir una proteína de interés de una planta de áloe. Los vectores ilustrados permiten la expresión de dos genes, como un transcripto individual, mientras que todavía se traduce en dos proteínas distintas. Para lograr esto, los dos genes se separan entre sí mediante un elemento IRES de intervención (secuencia de entrada de ribosoma interna) (SEQ. ID. NO. 34). El elemento IRES proporciona un segundo, sitio interno, para la unión y traducción del ribosoma. Este segundo sitio permite transcribir en 3' clonado al elemento IRES, para ser traducidos separadamente. Estos vectores, especialmente pzUSEIrK (TGC 18) (SEQ. ID. NO. 43) y pzUIIrK (TGC 19) (SEQ. ID. NO. 39) , se construyeron en etapas, permitiendo finalmente la expresión de eGFP o IFN (respectivamente) conjuntamente con el marcador de resistencia a la canamicina. Como se ilustra, el vector de pzEnostart (TGC13) se creó primero al amplificar el eGFP mediante PCR (tabla I para las secuencias de cebador) utilizando cebadores que contienen los sitios de enzima de restricción Bam I (extremo 5' ) y SacI (extremo 3' ) . Este producto de PCR se clonó como un fragmento de BamHl/SacI en pZErO. El gen eGFP en esta construcción carece de un sitio de inicio de traducción ATG, ya que esta proteina se expresa como una fusión con la secuencia de señal de alfa amilasa (ver la construcción de pzSE, TGC14) . Esto se representa sobre el Portaobjetos 5. Estos clones generados mediante PCR se secuenciaron para confirmar la ausencia de cualquiera de las mutaciones de DNA. Como se ilustra, la hebra de la secuencia de señal del gen alfa amilasa se sintetizó y luego se hizo de dos hebras mediante el llenado en la utilización de PCR (tabla I para las secuencias de cebador) . La secuencia de señal luego se digirió con las enzimas de restricción PstI y BamKI y se clonó en pzEnostart (TGC 13) . Esto se representa sobre el Portaobjetos 5. La secuencia de señal se clonó en la estructura, 5' a eGFP y proporciona el sitio de iniciación de traducción para la fusión eGFP de secuencia de señal. Los clones pzSE (TGC 14) resultantes se secuenciaron para confirmar la ausencia de cualquiera de las mutaciones de DNA. Como se ilustra, el vector de pzUSE (TGC 15) se construyó para enlazar la fusión (ss)-eGFP de secuencia de señal de alfa amilasa con el promotor de ubiquitina. El cásete de gen que contiene el ss-eGFP de pzSE (TGC14) se clonó como un fragmento PstI/ SacI en pzUI (TGC9) . Esta remplaza el cásete de gen IFN (liberado de pzUI (TGC9) al digerir con enzimas de restricción PstI y SacI) creando pzUSE (TGC15) . Esto se representa sobre el Portaobjetos 5. Como se ilustra, el elemento IRES se amplificó mediante PCR (tabla I para la secuencia cebadoras) de pIRES2-EGFP (Clontech, BD Biosciences) con cebadores que contienen los sitios de restricción SacI (extremo 5' ) y Xhol (extremo 3' ) . El elemento IRES amplificado se clonó como un fragmento SadL/X ol en pZErO para crear pzlr (TGC 16) . Esto se representa sobre el Portaobjetos 6. Estos clones generados mediante PCR se secuenciaron para confirmar la ausencia de cualquiera de las mutaciones de DNA. Como se ilustra, el elemento IRES de pzlr (TGC 16) luego se clonó como un fragmento Sacl/Xhol en pzK (TGC4) para crear pzIrK (TGC 17). De esta manera posesionando la IRES corriente arriba del cásete del gen kan/nos. Como se ilustra, el cásete del gen IRES-kan/nos se clonó como un fragmento de Sacl/ £>al en pzUSE (TGC 15) para crear pzUSEIrK (TGC18). Esto se representa sobre el Portaobjetos 6. Esta construcción expresa eGFP como una fusión con la secuencia de señal de alfa amilasa, dirigiendo el eGFP para la secreción de la célula. Esto hace posible monitorear visualmente el tráfico y la acumulación de proteínas dentro de la planta trasformada. Este vector de también expresa la proteína con resistencia a la canamicina (traducida del elemento IRES interno) y' permite la selección en las plantas transgénicas . Como se ilustra, el cásete del gen IRES-kan/nos también se clonó como un fragmento de Sacl/ j oíl en pzUI (TGC9) para crear pzUIIrK (TGC 19) . Esto se representa sobre el Portaobjetos 7. Esta construcción expresa el IFN alfa 2 con una decencia se señal para la secreción. Este vector de también expresa la proteína con resistencia a la canamicina (traducida del elemento IRES interno) y permite la selección en las plantas transgénicas. Tanto TGC 18 como TGC 19 expresan dos genes como un trascripto individual, eliminando la necesidad para un Segundo promotor, y de esta manera reduciendo el tamaño total del cada vector de. Es importante como la disminución del tamaño total de las construcciones transíectadas incrementa la eficiencia con lo cual estos elementos son capaces de transferirlos al núcleo, conduciendo a la integración estable y la selección de plantas transgénicas. Un sistema promotor individual también reduce el riesgo de interrumpir la expresión del gen flanqueante u otras situaciones que podrían afectar finalmente la expresión del transgen. Los plásmidos listados en lo anterior pueden sustituir otras secuencias de codificación de interés para el alfa interfieren. Como será reconocido por aquellos de habilidad en la técnica, esto se puede sustituir en el mismo sitio o en otras ubicaciones en los plásmidos. Una secuencia de codificación de protrombina (SEQ. ID. NO. 36) también se puede integrar en un v.ector de plásmido de acuerdo con aspectos de las presentes invenciones como se ilustra diagramáticamente en la Figura 8. La protrombina es la proteina precursora a la trombina. Se escisa en 2 sitios mediante el Factor X activado para liberar la trombina activada, una proteina de coagulación que convierte el fibrinógeno soluble en hebras insolubles de fibrina. El cásete de gen de protrombina (1874 pares bases) se amplificó utilizando cebadores de PCR (Tabla I para la secuencia cebadora) . El cásete de gen eGFP se libero del vector de pzUSEIrK (TGC 18) mediante la enzima de restricción BamttI . Las salientes 5' resultantes se removieron subsecuentemente con nucleasa de frijol Mungo para crear extremos despuntados. Los extremos despuntados se desfosforilaron utilizando fosfatasa de intestino de becerro (CIP) al incubar a 50 grados Celsius durante 2 horas, antes de la ligación durante la noche con el cásete del gen de protrombina a 15 grados Celsius. Esto creó el pzUSTIrK (TGC20) (SEQ. ID. NO. 42). Los clones generados con PCR se secuenciaron para confirmar la ausencia de cualquier de las mutaciones de DNA.

Una secuencia de codificación de dermcidina (DCD) (SEQ. ID NO. 30) también se puede integrar en un vector de plásmido de acuerdo con aspectos de las presentes invenciones como también se ilustra diagramáticamente en la Figura 8. La dermcidina fue un péptido antimicrobiano de amplio aspecto recientemente reportado encontrado constitutivamente expresado en las glándulas de sudor. Esta proteina se secreta en el sudor y se transporta a la superficie epidérmica. El cásete de gen de DCD amplificado con PCR tienen sitios de enzima de restricción BamRI flanqueantes (Tabla I para la secuencia cebadora) . El cásete de gen DCD digerido con BamHI se ligó en el sitio BamRI del vector de pzUSEIrK (TGCI 8) que se utilizó para ser ocupado por el eGFP, creado el vector de pzUSDIrK (TGC21) (SEQ. ID. NO. 40) . Los clones generados con PCR se secuenciaron para confirmar la ausencia de cualquiera de la mutación de DNA. Una secuencia de codificación de Hormona de Crecimiento humana (hGH) (SEQ. ID. NO. 32) también se puede •integrar en un vector de plásmido de acuerdo con aspectos de las presentes invenciones como se ilustra también diagramáticamente en la Figura 8. El cásete del gen hGH se creo mediante la amplificación en PCR con los sitios de enzima de restricción BamRI flanqueantes en al (tabla 1 para la secuencia cebadora) . Luego el cásete de gen hGH digerido con BamRI se ligó en sitio BamRI del vector de pzUSEIrK (TGC 18) que se utilizó para ser ocupado por el eGFP, creando el vector de pzUSHIrK (TGC22) (SEQ. ID. NO. 41). Los clones generados con PCR se secuenciaron para confirmar la ausencia de cualquiera de las mutaciones de DNA. Una secuencia de codificación de interferón gamma humano (hlFNg) también se puede integrar en un vector de plásmido de acuerdo con aspectos de las presentes invenciones como también se ilustra diagramáticamente en la Figura 8. El cásete del gen hlFNg se creó mediante la amplificación de PCR con sitios de enzima de restricción Bamtil flanqueantes (Tabla I para la secuencia cebadora) . El cásete de gen hlFNg digerido con Bamtil luego se ligó en el sitio Bamtil del vector de pzUSEIrK (TGC 18) que se utilizó para ser ocupado por el eGFP, cremado el vector de pzUSIfglrK (TGC23) (SEQ. ID. NO. 37). Los clones generados con PCR se secuenciaron para confirmar la ausencia de cualquiera de las mutaciones de DNA.

Tabla I Lista de las secuencias de cebador utilizadas para crear otros genes expresados Nombre del cebador Secuencia de cebador Secuencia I.D. protrombina F AAACCATGGCGCACGTCCGAGGC SEQ. ID. NO. 1 protrombina R CTACTCTCCAAACTGATCAATGA SEQ. ID. NO. 2 dermcidina R GGGGGATCCACCATGAGGTTCATGACTCT SEQ. ID. NO. 3 C dermcidina R GGCGGATCCCTATAGTACTGAGTCAAGG SEQ. ID. NO. 4 hghF GGGGGATCCACCATGGCTACAGGCTCCC SEQ. ID. NO. 5 GG hghR GGCGGATCCCTAGAAGCCACAGCTGCCC SEQ. ID. NO. 6 hifhgF GGGGGATCCACCATGAAATATACAAGTT SEQ. ID. NO. 7 AT hifhgR TCCGGATCCTTAATAAATAGATTTAGA SEQ. ID. NO. 8 IFN pst-bam CAACTGCAGGATCCAACAATGGCCTTGA SEQ. ID. NO. 9 CCTTTGCTTTAC IFN sac-xho CAACTCGAGCTCATTCCTTACTTCTAAAC SEQ. ID. NO. 10 TTTCTTG eGFP bam [codón no de ATAGGATCCGTGAGCAAGGGCGAGGAGC SEQ. ID. NO. 11 inicio] TGTTC eGFP sac [codón no de TATGAGCTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC SEQ. ID. NO. 12 inicio] eGFP f bam [codón no de CAGGGATCCACCATGGTGAGCAAGGGCG SEQ. ID. NO. 13 detención] AGG eGFP r xho [codón no de AGTCTCGAGCTTGTACAGCTCGTCCATGC SEQ. ID. NO. 14 detención] Secuencia de señal AA pst TATCTGCAGACCATGGTGAACAAACACTT SEQ. ID. NO. 15 bam CTTGTCCCTTTCGGTCCTCATCGTCCTCCT TGGCCTCTCCTCCAACTTGACAGCCGGGG GATCC Secuencia de señal AA GTGAATTCGGATCCCCCGGCTGTCAA SEQ. ID. NO. 16 ss-pcr IRES sac ATTGAGCTCAAGCTTCGAATTCTGCAG SEQ. ID. NO. 17 IRES xho ATACTCGAGGTGGCCATATTATCATCGTG SEQ. ID. NO. 18 TTTTTC kan xho ATACTCGAGACCATGATTGAACAAGATG SEQ. ID. NO. 19 GATTGCAC Kan xba ATTTCTAGACCAGAGCCGCCGCCAGCATT SEQ. ID. NO. 20. GACAGG protrombina F AAACCATGGCGCACGTCCGAGGC SEQ. ID. NO. 21 protrombina R CTACTCTCCAAACTGATCAATGA SEQ. ID. NO. 22 dermcidina F GGGGGATCCACCATGAGGTTCATGACTCT SEQ. ID. NO. 23 C dermcidina R GGCGGATCCCTATAGTACTGAGTCAAGG SEQ. ID. NO. 24 hhghF GGGGGATCCACCATGGCTACAGGCTCCC SEQ. ID. NO. 25 GG hghR , GGCGGATCCCTAGAAGCCACAGCTGCCC SEQ. ID. NO. 26 hifhgF GGGGGATCCACCATGAAATATACAAGTT SEQ. ID. NO. 27 AT hifngR TCCGGATCCTTAATAAATAGATTTAGA SEQ. ID. NO. 28 Estas secuencias pueden contener su propia secuencia de señal. Similar a la secuencia en el interferón alfa que se demostró como operable en una planta de áloe, las secuencias de señal nativas dentro ' de la protrombina, Dermcidina (DD), Hormona de Crecimiénto humana (hGH) , e interferón gamma humano (hlFNg) también se pueden demostrar que son funcionales en una planta de áloe. Sin considerar, estas secuencias de codificación de proteínas se pueden clonar en un vector de que contiene la secuencia de señal de alfa amilasa como se ilustra en los ejemplos de la Figura 8. En el desarrollo de las construcciones de las referencias anteriores, todos los vectores utilizados para la transformación se cultivaron en 250 mi de LB 50ug/L de zeocina y se aislaron utilizando el método CsCl. Los vectores luego se utilizaron en estudios de transfección transcientes para asegurar la expresión apropiada de cada construcción. Al transfección que utiliza la pistola de genes se realizó en el maíz, tabaco, y el áloe, y la expresión se monitoreó visualmente para la expresión de eGFP o mediante rt-PCR para la expresión de ya sea el IFN o kan. Transformación Después de que las construcciones de DNA que incluyen el gen de interés y funcional varias unidades de función incorporadas en los vectores se generan, las construcciones de DNA se introducen en las células de áloe utilizando un número de técnicas que serán reconocidas por aquellos expertos en la técnica en la revisión de la presente descripción. Estas construcciones de DNA se diseñan generalmente para promover la formación de plantas de áloe establemente transformadas 10. Métodos numerosos para transformar células de planta con DNA recombinante son conocidos en la técnica y se pueden utilizar en las presentes invenciones. Algunos métodos para la incorporación de construcciones de DNA contenidas en los vectores en las células de áloe o tejidos para crear transformantes de áloe estables pueden incluir la infección con A. tumefaciens o A. rhizogenes, infección con virus deficientes de replicación, transformación biolistica, transformación de protoplasto, transferencia de genes en el polen, inyección en los órganos reproductores, inyección en embriones inmaduros o métodos similares. Actualmente, dos de los métodos más comúnmente utilizados para la transformación de plantas son la transformación mediada con Agrobacterium y transformación biolistica. Las células de áloe transformadas o tejidos callosos se cultivan típicamente en medio de nutriente apropiado para seleccionar las células transformadas. Frecuentemente, un medio de selección incluye una toxina u otro factor de selección que extermina células no transformadas. Varios cambios de medio permitirán la producción de plantas de áloe 10 que contienen el gen de interés como será reconocido por aquellos expertos en la técnica en la revisión de la presente descripción. En la práctica de la transformación de DNA se introduce típicamente en solo un pequeño porcentaje de células de planta objetivo en cualquier experimento de transformación. Los genes marcadores utilizan para proporcionar un sistema eficiente para la identificación de aquellas células que se transforman establemente al recibir e integrar una construcción de DNA transgénica en sus genomas. Los genes marcadores preferidos proporcionan marcadores selectivos que confieren resistencia a un agente selectivo, tal como un antibiótico o herbicida. Cualquiera de los herbicidas a los cuales las plantas de estas invenciones pueden ser resistentes son agentes útiles para marcadores selectivos. Las células potencialmente transformadas se exponen al agente selectivo. En la población de células supervivientes serán aquellas células, donde, generalmente, el gen que confiere resistencia se integra y se expresa en niveles suficientes para permitir la supervivencia celular. Las células se pueden probar adicionalmente para confirmar la integración estable del DNA exógeno. Los genes marcadores selectivos comúnmente utilizados incluyen aquellos que confieren resistencia a antibióticos tal como canamicina y paromomicina (nptll) , higromicina B (aph IV) y gentamicina (aac3 y aacC4 ) o resistencia a los herbicidas tales como glufosinato (bar orpat) y glifosato (aroA o EPSPS) . Ejemplos de tales seleccionables se ilustran en las patentes norteamericanas Nos. 5,550,318; 5,633,435; 5,780,708 y 6,118,047, todas de las cuales se incorporan en la presente por referencia. Los marcadores selecciónateles que proporcionan una habilidad para identificar visualmente los transformantes también se pueden emplear, por ejemplo, un gen que expresa una proteina coloreada o fluorescente tal como luciferasa o proteina fluorescente verde (GFP) o un gen que expresa una beta-glucuronidasa o gen uidA (GUS) para lo cual son conocidos varios sustratos cromogénicos . En general es útil introducir DNA recombinante aleatoriamente, es decir en una ubicación no especifica, en el genoma de una linea de planta objetivo. En casos especiales puede ser útil dirigir la inserción de DNA recombinante a fin de lograr la ¦ integración especifica de sitio, por ejemplo para reemplazar un gen existente en el genoma, para usar un promotor existente en el genoma de la planta, o par insertar un polinucleótido recombinante en un sitio predeterminado conocido por ser activo para la expresión gen. Varios sistemas de recombinación específicos de sitio que existen son conocidos para funcionar implantes que incluyen cre-lox como se divulga en las patente norteamericana No. 4,959,317 y FLP-FRT como se divulga en la patente norteamericana No. 5,527,695, ambas se incorporan en la presente por referencia y se discuten en más detalle enseguida. Para el sistema de transformación de planta basado en Agrobacterium tumefaciens, los elementos adicionales presentes en las construcciones de transformación incluirán las secuencias de limite izquierda y derecha de T-DNA para facilitar la incorporación del polinucleótido recombinante en el genoma de la planta. Con la infección con el agrobacterium (A. tumefaciens ) , el tejido calloso de áloe se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente con un cultivo durante la noche de agrobacterium que incluye el vector de que incorpora la construcción de DNA. El Agrobacterium se cultiva en el medio de selección apropiado. El medio de selección incluye típicamente estreptomicina y canamicina. El medio de selección también puede contener acetosiringona . La acetosiringona en una concentración de 50 uM a 250 uM incrementa típicamente la eficiencia de la infectividad de la monocotiledónea . Después del cultivo sobre el medio de selección, el tejido de áloe infectado se puede transferir a 1 medio en los platos de Petri con ninguna selección para dos días (2) en la oscuridad a 25 grados Celsius. Un medio adecuado ejemplar podría ser el medio MS con acetosiringona. La cefotaxima luego se puede adicionar durante dos (2) días para exterminar el agrobacterium. Las células luego se extienden sobre el medio que contiene 50 mg/L de Canamicina para seleccionar las células y brotes de de áloe transformados que inducen los factores de crecimiento (0.2 mg/L NAA, 2 mg/L BAP) durante cuatro (4) semanas, 16 horas de luz. Los brotes de regeneración luego se pueden transferir al medio de arraigo (1/2 MS con 0.2 mg/L NAA) para desarrollar raices (después de aproximadamente 4 a 6 semanas) antes de ser transferidas al suelo. Con la transformación biolistica, las células de áloe o tejido calloso se bombardean directamente con la construcción de vector. Varias modalidades y aspectos de la transformación biolistica se divulgan en la patente norteamericana Nos. 5,015,580 (soya); 5,550,318 (maíz); 5,538,880 (maíz); 5,914,451 (soya); 6,160,208 (maíz); 6,399,861 (maíz) y 6,153,812 (trigo) y la transformación mediada por Agrobacterium se describe en las patentes norteamericanas Nos. 5,159,135 (algodón); 5,824,877 (soya); 5,591,616 (maíz); y 6,384,301 (soya), todas de las cuales se incorporan en la presente por referencia. Adicionalmente, una variedad de aparatos de transformación biolistica se pueden utilizar tal como por ejemplo un sistema de suministro de partícula Biolistic PDS-1000/He de Bio-Rad, Inc. En este procedimiento, el vector de y la construcción de DNA asociada se puede enlazar al oro y otr.as partículas y se estimula directamente en las células de áloe. Las células de áloe bombardeadas se cultivan sin selección durante 4 días en la oscuridad antes de ser transferidas a los medios de selección. Nuevamente, los medios de selección pueden incluir 50 mg/L de Canamicina. Los transformantes comienzan típicamente a formarse dentro de 8-12 semanas y se pueden transferir a los medio de brotes y de raices durante 8-12 semanas adicionales. Una vez que las raices han comenzado a formarse, las plantitas se pueden transferir al suelo. La transformación también se puede lograr utilizando una variedad de otras técnicas. Tales técnicas incluyen infección viral que utiliza los sistemas vectores virales comprometidos de replicación, electroporación particularmente de células de callo o protoplastos cultivados en el cultivo liquido, y transferencia mediada por PEG o lipidos en los protoplastos. La selección para las transformantes luego podría seguir las mismas etapas básicas como aquellas perfiladas por la transformación biolistica. Una vez introducida en los tejidos callosos de áloe, las construcciones luego se pueden incorporar en el material genético de la planta como se ilustra generalmente en la Figura 3. En otros aspectos, las construcciones se pueden integrar establemente en la parte exterior de la célula del material genético de. las plantas de áloe 10. Dependiendo de la construcción, la proteína de interés puede o no se puede expresar ausente de una alguna forma de inducción de transcripción. En un aspecto, las construcciones una vez introducidas en las células de áloe pueden dirigir la síntesis de proteína o transporte a lo tejidos específicos de la planta de áloe 10. Típicamente, esto ocurre cuando una secuencia de señal objetiva se incluye sobre la proteína de interés . Integración Especifica de Sitio (Cre-Lox) En un aspecto, las presentes invenciones pueden utilizar integración o escisión especifica de sitio de construcciones de DNA introducidas en una planta de áloe. Una ventaja de la integración o escisión especifica de sitio es que se pueden utilizar para superar los problemas asociados con técnicas de transformación convencionales, en las cuales las construcciones de transformación se integran típicamente de manera aleatoria en un genoma hospedero en múltiples I copias. Esta inserción aleatoria de DNA introducido en el genoma de las células hospederas puede ser letal si el DNA extraño se inserta en un gen esencial. Además, la expresión de un transgen se puede influenciar por los "efectos de deposición" causados por el DNA genómico circundante. Además, debido a las dificultades asociadas con las plantas que poseen múltiples copias de transgenes, incluyendo el silenciamiento del gen, recombinación y herencia no predecible, es típicamente deseable controlar el número de copias de las construcciones de DNA insertadas en el genoma de la planta de áloe transgénica 10, frecuentemente solo deseando la inserción de una sola copia de la construcción de DNA. La integración o escisión específica de sitio de los transgenes o partes de transgenes o partes de transgenes se pueden lograr en las plantas por medio de la recombinación homologa (ver, por ejemplo, patente norteamericana No. 5,527,695, específicamente incorporada en la presente por referencia en su totalidad) . La recombinación homologa es una reacción entre cualquier par de secuencias de DNA que tienen una secuencia similar de nucleótidos, donde las dos secuencias interactúan (recombinan) para formar unas especies de DNA recombinantes nuevas. La frecuencia de la recombinación homologa se incrementa conforme la longitud de las secuencias de DNA de nucleótido compartidas se incrementa, y es más alta con moléculas de plásmido linealizadas que con las moléculas de plásmidos circularizadas . La recombinación homologa puede ocurrir entre dos secuencias de DNA que son menos que idénticas, pero la frecuencia de recombinación declina conforme la divergencia entre las dos secuencias se incrementa. Las secuencias de DNA introducidas se pueden dirigir por la vía de la recombinación homologa al enlazar una molécula de DNA de interés a la secuencia que comparte la homología con las secuencias endógenas de la célula hospedera. Una vez que el DNA entra en la célula de áloe, las dos secuencias homologas pueden interactuar para insertar el DNA introducido en el sitio donde las secuencias de DNA genómico homologas se localizaron. Por lo tanto, la elección de las secuencias homologas contenidas en el DNA introducido determinará el sitio donde el DNA introducidos se integra por la vía de la recombinación homologa. Por ejemplo, si la secuencia de DNA de interés se enlaza a la secuencias de DNA que comparten la homología a una sola copia del gen de una célula de áloe hospedara, la secuencia de DNA de interés será insertada por la vía de la recombinación homologa en solamente ese sitio específico individual. Sin embargo, si la secuencia de DNA de interés se enlaza a las secuencias de DNA que comparten la homología a un gen multicopia de la célula eucariótica hospedera, entonces la secuencia de DNA de interés se puede insertar por la vía de la recombinación homologa en cada uno de los sitios específicos donde una copia del gen se localiza. El DNA se puede insertar en el genoma hospedero mediante una reacción de recombinación homologa que involucra ya sea una sola recombinación recíproca (dando por resultado la inserción de la longitud completa del DNA introducido) o a través de una recombinación reciproca doble (dando por resultado la inserción de solo el DNA localizado entre los dos eventos de recombinación) . Por ejemplo, si uno desea insertar un gen extraño en el sitio genómico donde un gen seleccionado se localiza, el DNA introducido debe contener secuencias homologas al gen seleccionado. Un evento de recombinación homólogo individual luego daría por resultado la secuencia de DNA introducida completa que se inserta en el gen seleccionado. Alternativamente, un evento de recombinación doble se puede lograr al flanquear cada lado de la secuencia de DNA de interés (la secuencia propuesta para ser insertada en el genoma) con las secuencias de DNA homologas al gen seleccionado. Un evento de recombinación homólogo que involucra cada una de las regiones flanqueantes homologas dará por resultado la inserción de DNA extraño. Asi, solo aquellas secuencias de DNA localizadas entre las dos regiones que comparten la homología genómica llegan a ser integradas en el genoma. Aunque las secuencias de DNA introducidas se pueden dirigir para la inserción en un sitio genómico específico por la vía de la recombinación homologa, en la recombinación homologa de eucariotes más altos es un evento relativamente raro comparado a los eventos de inserción aleatorios. En las células de áloe, las moléculas de DNA extraño encuentran las secuencias homologas en el genoma de la planta de áloe y se recombinan en una frecuencia de aproximadamente 0.5-4.2 veces 10"4. Así cualquier célula transformada que contiene una secuencia de DNA introducida integrada por la vía de la recombinación homologa también contendrá probablemente números de copias de secuencia de DNA introducido aleatoriamente integradas. Una manera de evitar esas inserciones aleatorias es utilizar un sistema de recombinasa específico de sitio. En general, un sistema de recombinasa especifica de sitio consiste de tres elementos: dos pares de secuencia de DNA (secuencias de recombinación especificas de sitio) y una enzima especifica (la recombinasa especifica de sitio) . La recombinasa especifica de sitio catalizará una reacción de combinación solo entre dos secuencias de recombinación especificas de sitio. Un número de sistemas de recombinasa específicos de sitio diferentes podrían ser empleadas de acuerdo con las presentes invenciones, que incluyen, pero no se limitan a, el sistema Cre/lox de bacteriófago Pl (patente norteamericana No. 5,658,772, específicamente incorporada en la presente por referencia en su totalidad) , el sistema FLP/FRT de levadura (Golic y Lindquist, 1989), la recombinasa Gin de fago Mu (Maeser y Kahmann, 1991), la recombinasa Pin de E. coli (Enomoto ' y colaboradores, 1983), y el sistema R/RS del plásmido pSRl (Araki y colaboradores, 1992). El bacteriófago Pl Cre/lox y los sistemas FLP/FRT de levadura constituyen dos sistemas particularmente útiles para la integración o escisión específica de sitio de los transgenes. En estos sistemas, una recombinasa (Cre o FLP) interactuar específicamente con su secuencia de recombinación específica de sitio respectiva (lox o FRT, respectivamente) para invertir o escisar las secuencias de intervención. La secuencia para cada uno de estos. dos sistemas es relativamente corta (34 bp para lox y 47 bp para FRT) y por lo tanto, conveniente para el uso con los vectores de transformación . La Figura 8 ilustra un protocolo ejemplar particular utilizando un sistema de recombinasa Flp/Frt y Cre/Loxp. En tal sistema, las recombinasas especificas0 de sitio del bacteriófago y levaduras se puede utilizar como herramientas para manipular el DNA tanto en el tubo de prueba como en organismos vivientes. Las combinaciones de sitio de recombinasas /recombinación incluyen Cre-Lox, FLP-FRT, y R-RS, donde Cre, FLP y R son recombinasas, y Lox, FRT, y RS son los sitios de recombinación. Para utilizar ese sistema, una planta transgénica que contiene los sitios específicos para la recombinación es generado. Una planta de áloe transgénica de origen 10 se crea al transfectar un vector de, que expresa un marcador seleccionable y diseñado para contener los sitios Frt y Lox en tándem. Ambos sitio Frt y Lox consisten de tres elementos, una secuencia espadadora de ocho (8) nucleótidos entre dos (2) repeticiones invertidas de trece (13) nucleótidos cada uno. Las repeticiones invertidas sirven como el dominio de enlace de DNA para la recombinasa especifica mientras que el elemento espaciador es variable pero esencial para la recombinación homologa. Al alterar el elemento espaciador de ya sea los sitios LoxP o FRT, múltiples sitio distintos para la recombinación se pueden crear. Al alterar los sitios Frt y Lox un sistema que permite integraciones dirigidas de múltiples sitios se puede crear (como perfilado en la Figura 8). Este sistema puede tener un número de ventajas. La interrupción de los genes endógenos se minimiza después de la generación de la planta de origen inicial. La eficiencia de la transformación se crea mediante la expresión de las recombinasas especificas de sitio. Utilizando los sitios lox y frt en tándem permite la remoción selectiva de los marcadores de selección al retener el gen de interés. Y una vez que una planta de origen ha sido creada la propagación celular y el potencial regenerativo se aumenta. La planta de origen sin embargo es la primera etapa y se crea después de los métodos de transformación estándares (biolisticos o Agrobacterium) . Las plantas transgénicas subsecuentes se crean mediante la co-t ansfección de un vector de que contienen ambos sitios LoxP y Frt asi como el gen de interés seleccionable, con untamente con un vector de que expresa la Cre recombinasa. La expresión de la Cre recombinasa induce la recombinación homologa a través de los sitios LoxP del vector de y la planta de origen. Los transformantes se seleccionan mediante la expresión de marcadores seleccionables y se induce para regenerar. La transformación subsecuente con un vector de que expresa Flp recombinasa puede remover el marcador seleccionable y permite la integración subsecuente en otros sitios Loxp. Producción de planta viable Después de la transformación de las células de Áloe o tejidos de Áloe, las células de Áloe o los tejidos de Áloe transformados se pueden cultivar en plantitas. Las células de áloe que sobreviven a la exposición al agente selectivo, o las células de áloe que han sido registradas positivos en un ensayo de clasificación, se pueden cultivar en medios de regeneración y dejar madurar en plantas de áloe transgénicas 10. El desarrollo de las plantitas de áloe regeneradas de las células de áloe transformadas se pueden transfectar a la mezcla de crecimiento de planta, y endurecerse, por ejemplo, en una cámara ambientalmente controlada a aproximadamente 85% de humedad relativa, 600 ppm de C02, y 25-250 microeinsteins m-2Sy-i ^e UZf previo a la transferencia a un invernadero o cámara de crecimiento para maduración. Las plantas de áloe transformadas 10 se regeneran de aproximadamente 6 semanas a 10 meses después de que un transformante se identifica, dependiendo del tejido inicial. La planta de áloe transformada regenerada 10 o su semilla o plantas de progenie pueden ser probadas típicamente para la expresión del DNA recombinante . La regeneración de una planta de áloe transgénica 10 de un tejido calloso o tejido de la meristema no diferenciado transformado involucra principalmente la manipulación de los factores de crecimiento de auxina y cinetina. La primera etapa es promover el crecimiento del brote. El medio que induce el brote contiene típicamente una concentración baja de auxina (0.2 mg/L NAA) y una concentración relativamente alta de citoquinina (2 mg/L BAP) . La concentración de azúcar reducida a 2% de sacarosa (que afecta la presión osmótica) también puede ayudar en la regeneración de la planta. El medio de células o de brotes se coloca en incubadoras a 25°C con un ciclo de luz de 12 hr/día. Los brotes que comienzan a formarse se escisan de los callos primarios después de que alcanzan una longitud de aproximadamente 2 cm y se colocan en el medio de raíz. Estos brotes también se pueden mantener en el medio de brotes para favorecer el desarrollo de los brotes adicionales. El medio de raíz promueve el desarrollo de raíz y contiene típicamente ½ de medio de MS y una concentración relativamente baja de auxina (0.2 mg/L NAA) . Después de que las raíces comienzan a desarrollarse (1-2 cm) las plantitas se pueden transfectar al suelo y climatizarse a reducir gradualmente la humedad relativa. Una vez generada, las plantas de áloe transgénicas 10 se pueden propagar mediante semillas, métodos de propagación clónales, o de otra manera como será reconocido por aquellos de habilidad en la técnica en la revisión de la presente descripción. Extracción y Purificación de Proteínas de Plantas o Células de Planta Las proteínas o enzimas estructurales introducidas por la vía de vectores en las células de planta y plantas se pueden encontrar en varios tejidos de la planta de áloe 10 que incluyen raíces, tubérculos, hojas, semillas, flores, savia o una combinación de partes de planta y etapas evolutivas. En un aspecto, la proteína o proteínas de interés se concentran en la matriz gelatinosa en la porción central de la hoja. En otro aspecto, la proteína o proteínas de interés son biológicamente activas y proporcionan algún grado de efecto medicinal cuando se extraen de la hoja de áloe 12. En otro aspecto, la proteína o proteínas de interés y la por lo menos una proteína de áloe nativa, carbohidrato y/u otro compuesto encontrado de la matriz gelatinosa actúan sinergísticamente para proporcionar un tratamiento deseado para un paciente. La extracción de proteína puede ser de biomasa total o un tejido particular. La extracción de proteína de las células de planta puede incluir métodos físicos y químicos. La extracción de la proteína de las hojas o sabia puede involucrar la filtración, ultracentrifugación, extracción química y cromatografía de afinidad. En un aspecto, la proteína de interés puede acumularse dentro del gel de la hoja de la planta de áloe transformada 10. Esta región es principalmente agua, aproximadamente 99%, y libre de proteasas nocivas. La extracción del gel es una técnica establecida que será entendida por aquellos de habilidad en la técnica. Algunas de las proteínas, particularmente cosméticos, se puede utilizar para suplementar el gel de áloe directamente y tal vez nunca necesite ser aislado individualmente del gel. EJEMPLOS Metodologías para el Aislamiento de las Células de Planta En un primer ejemplo, el tejido de meristema de brote para el uso directo o para la iniciación del callo se aisla del tallo del áloe, ya sea Áloe vera, Áloe ferox o Áloe arborescence . Las secciones de la hoja se remueven y el tallo se corta lateralmente a través del eje longitudinal de la hoja de áloe. El tejido se esteriliza con una mezcla de Tween 20 (0.05%) e hipoclorito (5%) durante 10 min, seguido por 30 segundos en etanol, enjuagar en 3x de agua estéril. Las secciones luego se extienden con la superficie expuesta colocándose lateralmente a la placa en los medios de MS con agar ((0.8-1%) que contienen varias concentraciones de los factores de crecimiento, auxina y citoquinina, y 2-3% de sacarosa. Las condiciones de crecimiento varían dependiendo del proceso deseado. El cultivo de callo sin el desarrollo del brote se inicia típicamente al cultivar estas secciones en NAA (2-5 mg/L) sin ??? o con baja concentración de BAP (0.2 mg/L). Las células no diferenciadas que van a ser cultivadas a lo largo de las áreas del talo cortado y que se pueden subcultivar y mantener sobre platos separados. La inducción del brote se puede iniciar directamente al colocar tales fragmentos en el medio de brote - medios MS que contiene 0.2 mg/L de NAA (o IAA 0.2 mg/L) y 2mg/L de BAP . Tanto NAA como IAA trabajan como una fuente de auxina y existe un intervalo de concentraciones de tanto auxinas como citocininas que tienen efecto. Las células de callo de embriones inmaduros se desarrollan de semillas comercialmente disponibles. Las semillas primer se esterilizan (etanol 30 segundos, 5% de hipoclorito más 0.05% de Tween 20 durante 15 min y se enjuagan a 3x en agua estéril) . Las semillas esterilizadas luego se dejan durante la noche a 4 grados Celsius en agua. El embrión inmaduro se aisla al remover el recubrimiento de la semilla. Un corte pequeño se hace en una esquina de la semilla en forma de triangulo y el embrión se oprime. Luego se extiende sobre los medios de MS que contienen ya sea auxina sola (NAA 2-5 mg/L) para inducir el callo, o auxina y citoquinina (NAA 0.2 mg/L, BAP 2mg/L) para inducir el callo y la propagación de brotes. La concentración de azúcar es típicamente de 2-3%. Las células de callo de la meristema ápical del brote se desarrolla de un segmento de uno a dos centímetros cortados desde la base de la planta de áloe joven 10 con todas las hojas removidas. El fragmento se esteriliza en la superficie y se vuelve a extender en agar al 1% con los medios MS y auxina y citoquinina (2 mg/L de NAA 0.2 mg/L de BAP) .

La inducción de la célula de callo inicia dentro de 1-2 semanas. Las células luego se aislan de estos cultivos que se utilizan como material de partida para la transformación . Construcciones de DNA i. Vector de Inferieron pBI121 (pBI-UI) de Ubiquitina . El vector binario de Agrobacterium pBI121 se utilizó como la cadena principal para la creación de pBI-UI. El gen interferón alfa 2 gen humano con secuencia de señal se amplificó de las células 293 humanas utilizando los cebadores específicos de gen que contienen los sitios de restricción 5' PstI y 3' Sacl/Xhol. El producto de PCR de interferón 587 bp se clonó en el pZErO y se secuenció. El elemento promotor de ubiquitina (Ubi) 1962 bp de maíz también se clonó en pZErO al amplificar la región del vector pUBI-GFP y clonando los sitios de restricción 5' HindIII y 3' PstI. El fragmento Ubi luego se subclonó en el vector de interferón pZero utilizando HindIII/PstI (pZErO UI) . El cásete de interferón Ubi intacto luego se subclonó en pBI121 utilizando el HindIII/SacI y removiendo del promotor de CaMV 35S y el gen GUS dando por resultado el pBI UI. Este vector retiene las regiones de límite del elemento T derecha e izquierda necesarias para la infección mediada por agrobacterium y la transformación y expresa el gen de resistencia a la canamicina (NPTII) bajo el control del promotor Nos. ii. Interferón IRES de canamicina de Ubiquitina pZErO (pZ UIIK) . Este vector se creó al clonar el promotor Ubi en el vector de clonación pZErO. Detrás de este fragmento se clonó un cásete que contiene el interferón alfa 2 humano c conjuntamente con un IRES (secuencia de entrada ribosomal interna) y el gen de resistencia a la canamicina. Esta unidad se expresa como un transcripto individual pero se traduce como dos proteínas distintas (debido al segundo inicio de iniciación traduccional proporcionado por la IRES) . Esto permite tanto el marcador seleccionable como el interferón a ser expresados bajo el control de promotor Ubi. iii. El sistema de plásmido doble que emplea las recombinasas Cre y Flp. Una planta de origen primero se genera la cual expresa el marcador seleccionable que tiene los sitios cre y flp para la integración dirigida. Una transfección secundaria que introduce los vectores con los genes de interés se dirige a los sitios cre. El material genético no deseado luego se remueve utilizando flp. Introducción de Construcciones de DNA en las Células de Planta Aisladas i. Transferencia de genes mediada con Agrobacterium.

La cepa de Agrobacterium LB4404 (Invitrogen, Carlsbad, CA) se electroporó con el vector pBI UI y los clones positivos seleccionados sobre placas de aga de LB que contienen 50 ug/ml de canamicina y 100 ug/ml estreptomicina. Los clones individuales se cultivaron durante la noche a 30 grados Celsius en medios de -LB que contienen acetosiringona 250 uM. La infección tomó lugar al sumergir los fragmentos de planta o callos en los cultivos durante la noche, manchando en seco sobre el papel de filtro estéril y extendiéndose sobre placas de agar de MS que contienen 250 uM de acetosiringona a 25 grados Celsius en la oscuridad. Dos días después de la infección, el, tejido se transfirió a placas de agar de MS que contienen cefotaxima 200 uM para exterminar el Agrobacterium. El tejido luego se transfirió a las placas de agar de MS que contienen 50 mg/L de canamicina y 0.2 mg/L de NAA t 2 mg/L de BAP para seleccionar los transformantes e inducir la regeneración del brote. El tejido se cultiva en luz a 12 horas a 25 grados Celsius. Los brotes inesperados se cultivan hasta que alcanzan aproximadamente 2 cm en longitud antes de ser escisados y reemplantados sobre los medios de raíz con selección continuada. Las plantitas que expresan genes de interés se analizan para los niveles de expresión y se transfieren al suelo. ii. Transferencia de genes biolistica. Partículas de oro (0.6 - 1 um) se recubren con el vector que incluye la construcción de DNA. Las partículas de oro luego se lavan 15 minutos en etanol al 70% por vórtice y al empaparlas, seguido por 3 lavadas en agua estéril. Las partículas de oro luego se resuspenden en glicerol al 50% a una concentración de 60 mg/ml. Para cubrir el DNA de vector sobre las partículas lavadas, 3 mg de partículas se adicionan a un tubo de microfuga de 1.5 mi. A este se adicionan 5 ul de DNA en una concentración de 1 ug/ul, 50 ul de CaC12 2.5M, y-20 ul de espermidina 0.1 M, y se coloca en vórtice durante 2-3 min. Esto se deja asentar, se gira durante 1-2 segundos y el líquido se remueve. A esto se adiciona 140 ul de etanol al 70%, se gira, y el líquido se descarta. A esto se adiciona 140 ul de etanol al 100%, se gira y el líquido se descarta. Al precipitado se adicionan 48 ul de etanol al 100% y se resuspende suavemente. El aparato de pistola de genes (PDS 1000/He, Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA) se esteriliza utilizando etanol al 70%. El aparato de pistola de genes se ensambla utilizando la distancia de espacio más corta entre el contenedor de macroportador y la pantalla de detección (ajuste recomendado) . Las particular de oro recubiertas (8 ul) se pipetean sobre el centro de los macroportadores . La distancia objetivo se ajustó dependiendo del tejido objetivo (tejido de 6 cm, callos 9 cm) con un disco de ruptura de 600-1100 psi. En un primer ejemplo, después del bombardeo las células se extienden sobre placas de agar de MS que contienen 2 mg/L de NAA sin selección durante 1 semana en la oscuridad a 25 grados Celsius. Las células luego se transfieren a placas de agar de MS que contienen 50 mg/L de canamicina para al selección y auxina (2mg/L de NAA) y citoquinina (0.2 mg/L, 6-bencilaminopurina) durante 4-5 más semanas. Las células se cultivan por 12 horas en luz a 25 grados Celsius. En un segundo ejemplo, el bombardeo de microproyectiles se llevo a cabo sobre una placa de MS (4 g/L de sales de MS, 1 mg/L de material de alimentación de vitamina de MS (1000X), 2 mg/L de NAA, 100 mg/L de mio-inositol, 2.76 g/L de prolina, 30 g/L de sacarosa, 100 mg/L de hidrolizado de caseína, 36.4 g/L de sorbitol, 36.4 g/L de manitol, 2.5 g/L de gelrite, pH 5.8). El callo bombardeado se deja sobre MSOSM durante 1 hora después del bombardeo luego se transfiere al medio de iniciación de MS (4 g/L de sales de MS, 1 mg/L de de material de alimentación de vitamina de MS (1000X), 2 mg/L de NAA, 100 mg/L de mio-inositol , 2 g/L de prolina, 30 g/L de sacarosa, 100 mg/L de hidrolizado de caseína, 2.5 g/L de gelrite, pH 5.-8) . Después de 7-10 días sobre MS, el callo bombardeado se transfirió al medio de selección de MSS (4 g/L de sales de MS, 1 mg/L de material de alimentación de vitamina de MS (1000X), 2 mg/L de NAA, 100 mg/L de mio-inositol, 30 g/L de sacarosa, 2.5 g/L de gelrite, pH 5.8) con 50 mg/L de canamicina para la selección de las células transformadas. Después de 3 semanas, las piezas de callo individuales se transfirieron al medio MSS fresco. Dentro de 6-8 semanas de bombardeo, los clones resistentes a la canamicina emergieron de las piezas de callo seleccionadas . iii. Protoplasto Los protoplastos son células de planta que carecen de su pared celular exterior. La ventaja de crear estas células es para incrementar la eficiencia de transfección y tales células son capaces de fusionarse conjuntamente formando un híbrido celular somático. Los híbridos celulares somáticos podrían mezclar los genes de diferentes plantas llegando potencialmente a algo completamente nuevo. La técnica para utilizar protoplastos de acuerdo con las presentes invenciones puede incluir cultivar las células en el cultivo líquido (2-3 días en fase de crecimiento logarítmica) . Las células luego se giran hacia abajo (1000 x Gravedad por 5 min) . Las células se resuspenden en una solución que contiene celulosa, macerozima, y pectoliasa. Se agitan durante la noche a 25 grados Celsius en la oscuridad. Se centrifugan (600 x Gravedad por 5 min.) y se remueve el sobrenadante. Los protoplastos se resuspenden en medio de cultivo y se giran una vez más para remover las pequeñísimas cantidades de enzimas. Los protoplastos se pueden almacenar o propagar y deben ser utilizados para la transfección o fusión celular somática relativamente rápida. Producción de Plantas Viables que Contienen Construcciones de DNA En un primer ejemplo, los transformantes exitosos se seleccionan inicialmente para su resistencia a las toxinas celulares, por ejemplo canamicina. Las células establemente transfectadas deben expresar tanto el marcador de resistencia como el gen de interés, tal como por ejemplo un interferón que codifica el gen, también para ser capaz de regenerar la planta intacta. Los 50 mg/L de canamicina se adicionan a las placas de agar de MS para iniciar la selección. El curso de la selección depende en parte sobre la velocidad con la cual las células se replican pero puede tomar entre 6 a 10 semanas. Durante este tiempo, el tejido transformado se induce para regenerarse al adicionar 0.2 mg/L de NAA y 2 mg/L de BAP a las placas de agar de MS y favorecer el desarrollo del brote con un ciclo de luz de 12 hr/dia (con presión de selección continua) . Conforme los brotes inesperados comienzan a desarrollarse ellos se pueden analizar para la expresión de gen en aproximadamente 2 cm en longitud. Los brotes que expresan los productos de gen deseados (como es analizado mediante RT-PCR, manchado de Western, y ensayo biológico) se transfieren subsecuentemente a las placas de agar de MS para inducir la formación de raíz (1/2 MS más 0.2 mg/L de NAA) .

En un segundo ejemplo, la regeneración del callo transgénico se logra al transferir aproximadamente 15 piezas pequeñas (aproximadamente 4 mm) al Medio de Regeneración I (4.3 g/L de sales de MS, 1 ml/L de extracto de vitamina de MS (1000X), 100 mg/L de mio-inositol , 60 g/L de sacarosa, 3 g/L de gelrite, pH 5.8) con canamicina esterilizada en filtro adicionada (50 mg/L) y al incubar durante 2-3 semanas a 25 grados Celsius en la oscuridad. Los embriones somáticos madurados se transfieren a la luz sobre el Medio de Regeneración II para germinación (4.3 g/L de sales MS, 1 ml/L de extracto de vitamina de MS (1000X) , 100 mg/L de mio-inositol, 30 g/L de sacarosa, 3 g/L de gelrite, pH 5.8) con canamicina esterilizada en filtro adicionada (50 mg/L) .

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un método para producir en una planta una proteína biológicamente activa exógena a la planta, el método caracterizado porque comprende proporcionar una planta transgénica que comprende una construcción de DNA recombinante que comprende un promotor, una secuencia que codifica la proteína exógena, una secuencia de terminación y una secuencia de translocación que codifica un péptido de señal de secreción, cultivar la planta de modo que la proteína exógena de la construcción de DNA llega a ser expresada, y extraer la proteína de la planta, en donde: (a) la planta es áloe; (b) la planta transgénica se genera mediante un proceso que comprende obtener células de áloe embriónicas de una semilla de áloe, cultivar la células de áloe en cultivo para formar un callo en un medio de nutriente que contiene ácido 1-naftalenacético (NAA) o ácido indol-3-acético (IAA) y ß-bencilaminopurina (BAP) , transformar el callo con la construcción de DNA recombinante, seleccionar las células de áloe transformadas que contienen la construcción de DNA recombinante mientras que se cultiva el callo en un medio de brote y de selección que comprende 0.2 mg/1 de NAA o IAA y 0.2 mg/ml a 2 mg/ml de BAP, cultivar en un medio de raíz que comprende 0.2 mg/1 de NAA o IAA un brote regenerado en el medio de brote y de selección; y una vez que las raíces han comenzado a formarse transferir la plantita al suelo; (c) la construcción de DNA contiene un péptido de señal de secreción de modo que por lo menos una porción de la proteina exógena llega a ser translocalizada en el gel de las hojas de áloe; y (d) la proteina exógena se extrae en el gel de la hoj a .
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el promotor es el promotor de ubiquitina del maíz (Seq. ID No. 44) .
3. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la secuencia de translocación es la secuencia secretora de alfa amilasa (SEQ. ID NO. 29) del arroz (Oryza sativa) .
4. El método de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque la proteina exógena es una proteina terapéutica mamifera seleccionada de oc-interferón, ?-interferón, protrombina, dermicidina u hormona de crecimiento humana.
5. Un método para producir una planta de áloe transgénica para producir en la planta una proteina biológicamente activa exógena a la planta, el método caracterizado porque comprende: cultivar el callo no diferenciado de células de áloe en un medio de nutriente que contiene ácido 1-naftalenacético (NAA) o ácido indol-3-acético (IAA) y 6-bencilaminopurina (BAP); introducir en el callo una construcción de DNA recombinante que comprende un promotor, una secuencia que codifica la proteina exógena, una secuencia de terminación y una secuencia de translocación que codifica un péptido de señal de secreción; cultivar el callo en un medio de brote y de selección que comprende 0.2 mg/l de NAA o IAA y 0.2 a 2 mg/ml de BAP; cultivar en un medio de raíz que comprende 0.2 mg/l de NAA un brote regenerado en el medio de brote y de selección; y una vez que las raices han comenzado a formarse transferir la planta al suelo.
6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el promotor es el promotor de ubiquitina del maíz (Seq. ID. No 44).
7. El método de conformidad con la reivindicación 5 o 6, caracterizado porque la secuencia de t anslocación es la secuencia secretora de alfa amilasa (SEQ. ID NO. 29) del arroz (Oryza sativa) .
8. El método de conformidad con la reivindicación 5, 6 o 7, caracterizado porque el callo es de la semilla de áloe .
9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5-8, caracterizado porque el tejido calloso se bombardea directamente con la construcción de DNA recombinante .
10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5-9, caracterizado porque la proteina exógena es una proteina terapéutica mamifera seleccionada de ot-interferón, ?-interferón, protrombina, dermicidina u hormona de crecimiento humana.
11. Un método para producir en una planta una proteina biológicamente activa exógena a la planta, el método caracterizado porque comprende: proporcionar una planta transgénica que comprende una construcción de DNA recombinante que comprende un promotor, una secuencia que codifica la proteina exógena, una secuencia de terminación y una secuencia de translocación que codifica un péptido de señal de secreción; cultivar la planta de modo que la proteina exógena de la construcción de DNA llega a ser expresada; y extraer la proteina de la planta en donde la planta es áloe, la construcción de DNA contiene un péptido de señal de secreción de modo que por lo menos una porción de la proteina exógena llega a ser translocalizada en el gel de las hojas de áloe, y la proteina exógena se extrae en el gel de la hoja.
12. Una planta de áloe transgénica que comprende una construcción de DNA recombinante , caracterizada porque comprende : un promotor, una secuencia que codifica una proteina exógena, una secuencia de terminación, y una secuencia de translocación que codifica un péptido de señal de secreción; en donde la proteina exógena se expresa de la construcción de DNA, y por lo menos una porción de la proteina exógena se translocaliza de una célula de áloe en el gel de una hoja de áloe de la planta de áloe transgénica.
13. Una composición terapéutica, caracterizada porque comprende: gel de hoja de áloe que contiene una o más proteínas o carbohidratos de áloe nativos y terapéuticos; y una proteína que tiene actividad biológica y exógena al áloe expresada de una construcción de DNA recombinante que comprende: un promotor, una secuencia que codifica una proteína exógena, una secuencia de terminación, y una secuencia de translocación que codifica un péptido de señal de secreción, en donde por lo menos una porción de la proteína exógena ha sido translocalizada de una célula de áloe en el gel de hoja de áloe.
14. Un método para producir proteínas biológicamente activas, caracterizado porque comprende: proporcionar una construcción de DNA que tiene un promotor, una secuencia que codifica una proteina exógena, una secuencia de terminación, y una secuencia de translocación que codifica un péptido de señal de secreción; clonar la construcción de DNA en el genoma de una planta de áloe; propagar la planta de áloe que contiene la construcción de DNA; expresar la proteina exógena de la construcción de DNA, en donde por lo menos una porción de la proteina exógena se translocaliza de una célula de áloe en el gel de una hoja de áloe de la planta de áloe; y extraer la proteina exógena expresada por la construcción de DNA.