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CN1384198A - 一种能表达人促生长因子基因的转基因植物的获得方法 - Google Patents

一种能表达人促生长因子基因的转基因植物的获得方法 Download PDF

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CN1384198A
CN1384198A CN 01107400 CN01107400A CN1384198A CN 1384198 A CN1384198 A CN 1384198A CN 01107400 CN01107400 CN 01107400 CN 01107400 A CN01107400 A CN 01107400A CN 1384198 A CN1384198 A CN 1384198A
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CN
China
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hegf
cell strain
gene
plant
somatomedin
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Pending
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CN 01107400
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Inventor
范彬
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  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种能表达人促生长因子基因的转基因植物的获得方法。该方法是将人促生长因子hEGF基因克隆进puc18质粒,得到hEGF/puc18中间载体,再将该中间载体和pPZP111G质粒再连接组成植物表达载体hEGF/pPZP111G,将该植物表达载体转化到根癌农杆菌中,再用该转化后的根癌农杆菌转化目的植物,经筛选得到能表达人促生长因子hEGF基因的植物细胞株,再由细胞株培养为转基因植物。本发明具有工艺简单,成本较低的优点。

Description

一种能表达人促生长因子基因的转基因植物的获得方法
本发明涉及一种能表达人促生长因子基因的转基因植物的获得方法,特别是能表达hEGF基因的转基因植物的获得方法。
目前美容品的美容成分,一般是分别提取人促生长因子如hEGF等和植物中的具美容作用的成分,再将两者混合,工艺复杂,生产成本较高。
本发明的目的是为了克服上述工艺复杂,生产成本较高的缺点而提供一种方法,得到含人促生长因子基因的转基因植物,利用某些具有美容作用的植物如芦荟、胡萝卜、番茄等作生物发生器,在植株内表达具有活性的人促生长因子,同时可利用植物本身的美容成分,从而得到具有良好美容作用的植物提取物,并且方法简单,成本较低。
本发明的目的是这样实现的,先将人促生长因子hEGF基因克隆进puc18质粒,得到hEGF/puc18中间载体,再将该中间载体和pPZP111G质粒再连接组成植物表达载体hEGF/pPZP111G,将该植物表达载体转化到根癌农杆菌中,再用该转化后的根癌农杆菌转化目的植物,经筛选得到能表达人促生长因子hEGF基因的植物细胞株,再由细胞株培养为转基因植物。
用有hEGF/pPZP111G的根癌农杆菌转化芦荟,得到含有hEGF基因的芦荟愈伤组织,再由愈伤组织培育出含hEGF基因的转基因芦荟。
用有hEGF/pPZP111G的根癌农杆菌转化胡萝卜,得到含有hEGF基因的胡萝卜愈伤组织,再由愈伤组织培育出含hEGF基因的转基因胡萝卜。
用有hEGF/pPZP111G的根癌农杆菌转化番茄,得到含有hEGF基因的番茄愈伤组织,再由愈伤组织培育出含hEGF基因的转基因番茄。
下面通过实施例进一步说明本发明的转基因植物的获得方法。本发明所提供的方法步骤如下:
一、从人脑cDNA文库中经PCR法获得hEGF基因,并在5’、3’端分别引入EcoRI和BamHI酶切位点,在5’、3’端分别引入起始码和终止码。
根据hEGF设计一对引物:
正向引物F是5’GCGAATTCATGAATAGTGACTCTGAATG3’,
反向引物R是5’CGGGATCCTTAGCGCAGTTCCCACCAC3’,PCR反应条件为:94℃预变性5分钟,94℃变性40秒,58℃变性40秒,72℃延伸40秒,共30个循环,最后72℃延伸5分钟。PCR产物经EcoRI和BamHI双酶切后连接到载体puc18中,测序后确定组成中间载体hEGF/puc18,保存中间载体hEGF/puc18。
二、构建植物表达载体并转化根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens):
将中间载体hEGF/puc18和pPZP111G质粒双酶切,再连接组成植物表达载体hEGF/pPZP111G,通过冻融法转化到根癌农杆菌LBA4404中。三、转化目的植株1、转化芦荟(Aloeferox Mill好望角芦荟)
挑取含hEGF/pPZP111G的单菌落,放入10ml加100ml/L利福平,300ml/L链霉素,50ml/L硫酸卡那霉素的YEB液体培养基中,于28℃,150r/min恒温振荡培养过夜。当OD600为0.6时收集菌液,4000r/min离心10min,沉淀重悬于1/2 MSO液体培养基中。
将低温处理过的芦荟的子叶和下胚轴切成0.5cm长短,浸没于上述菌液中,5min后取出,吸去多余菌液,接种在附加1mg/L 2,4-D和0.2mg/L激动素(KT)的固体培养基MSD1上,于26℃,黑暗条件下共培养两天。
共培养后吸干外植体表面的菌液,接种到附加50ml/L硫酸卡那霉素和500ml/L羧苄青霉素的MSDI固体培养基上,2-3星期后转接到附加50--100ml/L硫酸卡那霉素和300ml/L羧苄青霉素的MSDI培养基上,诱导抗性愈伤组织的形成,将抗性愈伤组织培养在含100ml/L硫酸卡那霉素和100ml/L羧苄青霉素的MSDI固体培养基上,每2--3星期传代一次,经2-3次继代培养后,把抗性愈伤组织转入附加25ml/L硫酸卡那霉素和100ml/L羧苄青霉素的MSO固体培养基上诱导分化,30天后通过胚状体发育获得抗性植株,抗性植株在广口瓶中生长发育7-8片真叶后,移栽盆中,于温室种植。2、转化胡萝卜(Daucus carota)
挑取含hEGF/pPZP111G的单菌落,放入10ml加100ml/L利福平,300ml/L链霉素,50ml/L硫酸卡那霉素的YEB液体培养基中,于28℃,150r/min恒温振荡培养过夜。当OD600为0.6时收集菌液,4000r/min离心10min,沉淀重悬于1/2 MSO液体培养基中。
将低温处理过的胡萝卜的子叶和下胚轴切成0.5cm长短,浸没于上述菌液中,5min后取出,吸去多余菌液,接种在附加1mg/L 2,4-D和0.2mg/L激动素(KT)的固体培养基MSD1上,于26℃,黑暗条件下共培养两天。
共培养后吸干外植体表面的菌液,接种到附加50ml/L硫酸卡那霉素和500ml/L羧苄青霉素的MSDI固体培养基上,2-3星期后转接到附加50--100ml/L硫酸卡那霉素和300ml/L羧苄青霉素的MSDI培养基上,诱导抗性愈伤组织的形成,将抗性愈伤组织培养在含100ml/L硫酸卡那霉素和100ml/L羧苄青霉素的MSDI固体培养基上,每2--3星期传代一次,经2-3次继代培养后,把抗性愈伤组织转入附加25ml/L硫酸卡那霉素和100ml/L羧苄青霉素的MSO固体培养基上诱导分化,30天后通过胚状体发育获得抗性植株,抗性植株在广口瓶中生长发育7-8片真叶后,移栽盆中,于温室种植。3、转化番茄(Lycopersicon esculentum)
取12天左右的无菌苗小叶(带部分叶柄),在芽分化培养基(MS+1.0mg/LIAA+1.0mg/LZt)预培养2天,用含hEGF/pPZP111G的根癌农杆菌转染,共培养3天,转入选择性芽分化培养基(MS+1.0mg/LIAA+1.0mg/LZt+80mg/L Km+100mg/LCef)中,诱导芽再生,待芽长到3cm时切下,在1/2MS+0.5mg/LNAA+0.1mg/LIBA+0.5g/L活性炭+40mg/L Km+100mg/LCef的培养基上诱导生根。根系长成后,移栽到沙质土中生长。四、检测
用CTAB法提取具硫酸卡那霉素和羧苄青霉素抗性,PCR检测为阳性的转基因植物总DNA,取5μg总DNA用EcoRI消化,经0.8%琼脂糖凝胶电泳分离后,用毛细管法转移到带正电荷的尼龙膜上,用DIG标记的hEGF基因片段为探针,按照DIG DNA Detection Kit说明进行Southern杂交,采用鼠抗人hEGF抗体,常规手段提取经检测的转基因植物的总蛋白后,进行Western检测。

Claims (8)

1、一种含有人促生长因子基因的植物表达载体,其特征在于:是含有人表皮生长因子hEGF的基因的质粒hEGF/pPZP111G。
2、一种用权利要求1所述载体转化的宿主微生物。
3、根据权利要求2所述的宿主微生物,其特征在于所述微生物是根癌农杆菌。
4、一种用权利要求2所述宿主微生物转化的植物细胞株(植物愈伤组织)。
5、根据权利要求4所述的植物细胞株,其特征在于:获得的能表达hEGF基因的细胞株为芦荟的细胞株。
6、根据权利要求4所述的植物细胞株,其特征在于:获得的能表达hEGF基因的细胞株为胡萝卜的细胞株。
7、根据权利要求4所述的植物细胞株方法,其特征在于:获得的能表达hEGF基因的细胞株为番茄的细胞株。
8、一种能表达人促生长因子的转基因植物的获得方法,其特征在于:先将人促生长因子hEGF基因克隆进puc18质粒,得到hEGF/puc18中间载体,再将该中间载体和pPZP111G质粒再连接组成植物表达载体hEGF/pPZP111G,将该植物表达载体转化到根癌农杆菌中,再用该宿主微生物转化目的植物,经筛选得到能表达人促生长因子hEGF基因的植物细胞株,再由细胞株培养为转基因植物。
CN 01107400 2001-04-30 2001-04-30 一种能表达人促生长因子基因的转基因植物的获得方法 Pending CN1384198A (zh)

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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005001094A1 (en) * 2003-06-30 2005-01-06 The Chinese University Of Hong Kong Transgenic plant products comprising human granulocyte colony-stimulating factor and method for preparing the same
CN100398651C (zh) * 2003-11-19 2008-07-02 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 植物偏好型重组人表皮生长因子及利用转基因植物生产其的方法
CN105106929A (zh) * 2005-09-26 2015-12-02 绿色细胞有限公司 用于生产蛋白的转基因芦荟植物及其相关的方法

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PB01 Publication
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