CN103665166A - 犬融合干扰素 - Google Patents
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Abstract
本发明关于一种犬融合干扰素，包含一犬干扰素以及一犬免疫球蛋白Fc片段。该犬干扰素以及该犬免疫球蛋白Fc片段进一步可由一连接子所连接。本发明并关于一种编码该犬融合干扰素的多核苷酸以及该犬融合干扰素的用途。
Description
技术领域
本发明关于动物保健领域，特别是关于一种具有抗病毒活性的犬融合干扰素。
背景技术
干扰素最早是在1957年由英国学者Alick Isaacs和Jean Lindenmann在进行流感病毒试验中所发现，当细胞遭受病毒感染后，会立即制造一种细胞激素，诱发邻近细胞产生抗病毒蛋白，干扰病毒的复制。该细胞激素随后被命名为干扰素(Interferon，IFN)。
干扰素为一种醣蛋白，主要有干扰素α、β、γ三种，可经由不同的病原进行诱发产生，例如：病毒、细菌、立克次体、原虫及双股核苷酸等；诱发后的干扰素不会与病原直接作用，而是经由诱导产生抗病毒蛋白以达到抗病毒的功能，这些抗病毒蛋白包括依赖双股RNA的蛋白激活酶(dsRNA-dependent protein kinase，PKR)、Mx蛋白(Mx protein)及2’，5’-寡腺苷酸合成酶(2’，5’Oligoadenylatesynthetase/RNase L，OAS)等。其中PKR为一种蛋白质激酶，可使eIF2磷酸化，使宿主细胞停止转译病毒蛋白；Mx蛋白则是一种三磷酸鸟苷酸水解酶(GTPase)，可与病毒蛋白结合而干扰病毒的复制及蛋白质的运输；而OAS则可将病毒的双股RNA进行水解。另一方面，干扰素也会诱导邻近细胞产生抗病毒蛋白阻碍病毒感染其他细胞，并让细胞建立抗病毒状态，达成干扰病毒感染的效用。除了具有抗病毒作用外，干扰素还具有抗肿瘤、促进细胞分化和免疫调节等功用。
目前市面上的干扰素制剂，多为针对人类所开发设计，例如：用来治疗人类B型与C型肝炎等病毒性疾病以及卡波西氏瘤(Kaposi’s sarcoma，KS)、黑色素肿瘤(malignant melanoma)等肿瘤疾病上的干扰素。
近年来，受到高龄化、少子化的社会趋势所影响，宠物数量越来越多，也连带带动许多宠物相关行业的发展，其中最普遍的宠物-狗，也逐渐在人类工作上扮演重要角色，根据美国宠物商品制造协会(APPMA)调查显示，美国宠物相关行业的产值在2009年已达520亿美元，其中宠物医疗约占40％(约208亿美元)，宠物药品约占24％(约124.8亿美元)，而在宠物药品中，抗生素制剂及皮肤照护用品约占70％，其余30％则为疫苗及治疗性药物，其中治疗性药物种类少但是价格高，是一个极具有发展潜力的市场。本发明即是针对犬只开发专用之干扰素作为治疗性药物。
发明内容
本发明于第一部分中提供一种犬融合干扰素。由于干扰素属于小分子蛋白质，在体内半衰期短(约2～8小时)且不稳定，因此本发明所提供的犬融合干扰素是将犬干扰素蛋白与半衰期较长的犬免疫球蛋白IgG Fc片段融合，而形成较稳定的犬融合干扰素。于一较佳实施例中，该犬干扰素蛋白以及该犬免疫球蛋白IgG Fc片段是以由甘胺酸(Glycine，G)及丝胺酸(Serine，S)组成的连接子(linker)所连接起来的。于一实施例中，该犬干扰素蛋白为犬干扰素α2，具有如SEQ ID No：2所示之胺基酸序列；该犬免疫球蛋白IgG Fc片段具有如SEQ ID No：4所示之胺基酸序列；而该连接子具有如SEQ ID No：6所示之胺基酸序列；该犬融合干扰素具有如SEQ ID No：8所示之胺基酸序列。
本发明于第二部分中提供一种编码上述犬融合干扰素的多核苷酸。本发明所提供之犬融合干扰素是藉由基因转殖技术而得。首先将编码犬干扰素蛋白的DNA序列，以及编码犬免疫球蛋白IgG Fc片段的DNA序列选殖到表现载体系统中，形成含有编码犬融合干扰素之DNA序列的质体，再将该质体转殖到表现系统中，经诱导蛋白质表现后而得到犬融合干扰素。
于一较佳实施例中，除了将编码犬干扰素蛋白的DNA序列以及编码犬免疫球蛋白IgG Fc片段的DNA序列选殖到表现载体系统中，并将编码由甘胺酸及丝胺酸组成的连接子(linker)的DNA序列选殖到该表现载体系统中，以连接该编码犬干扰素蛋白的DNA序列以及编码犬免疫球蛋白IgG Fc片段的DNA序列。于一实施例中，该编码犬干扰素蛋白的DNA序列具有如SEQ ID No：1所示之序列，该编码犬免疫球蛋白IgG Fc片段的DNA序列具有如SEQ ID No：3所示之序列，而该编码由甘胺酸及丝胺酸组成的连接子(linker)的DNA序列具有如SEQ ID No：5所示之序列；该编码犬融合干扰素的DNA序列具有如SEQ ID No：7所示之序列。
该表现载体可为原核生物表现载体或真核生物表现载体。该原核生物表现载体包含但不限于pET系列表现载体以及pGEX系列表现载体。该真核生物表现载体包含但不限于pcDNA系列表现载体。
该表现系统可为原核生物表现系统(如：细菌)或真核生物表现系统(如：酵母菌、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞等)。于一实施例中，该表现系统为大肠杆菌(Escherichia coli)。于另一实施例中，该表现系统为哺乳动物细胞。可用于本发明犬融合干扰素表现的哺乳动物细胞包含但不限于3T3细胞、中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells，CHO cells)、幼鼠肾细胞(baby hamster kidneycells，BHK cells)、人类子宫颈癌细胞(HeLa cells)，以及人类肝癌细胞(HepG2cells)等。
本发明于第三部分中提供一种犬融合干扰素在制备犬抗病毒药物中的用途。经试验证明，本发明所提供之犬融合干扰素具有诱导细胞产生抗病毒蛋白，以达到抗病毒的效果。于一实施例中，以本发明之犬融合干扰素(CIFNα2-IgG Fc)诱导狗肾脏细胞(MDCK)产生抗病毒蛋白，并分别以西方墨点法以及即时定量PCR(real-timeRT-PCR)分析抗病毒蛋白及其基因的表现量，结果显示，本发明之犬融合干扰素(CIFNα2-IgG Fc)可诱导MDCK细胞产生抗病毒蛋白Mx蛋白，并诱导MDCK细胞增加抗病毒蛋白Mx蛋白、PKR蛋白、OAS蛋白的基因表现量。因此，本发明所提供之犬融合干扰素可诱导抗病毒蛋白的产生并用来制备犬抗病毒药物。
术语“预防、保护、对抗”意谓，相较于未使用本发明犬融合干扰素的动物或细胞样本，使用本发明犬融合干扰素的动物或细胞样本，具有较高的存活率，且该样本内的病毒数量较低。
术语“治疗”意谓，预防或部分预防疾病、症状、病况，及/或部分或完全治愈或缓解疾病、症状、病况、或因疾病所造成的不利影响。
术语“抑制”意谓，与基线相比，在质量或数量上的减少。例如，在本发明的背景下，抑制病毒的复制，是指与基线相比，病毒复制减少。同理，抑制病毒感染，是指与基线相比，减少病毒感染。
本说明书中所述之所有技术性及科学术语，除非另外有所定义，皆为该所属领域具有通常技艺者可共同了解的意义。
本发明以下面的实施例予以示范阐明，但本发明不受下述实施例所限制。
附图说明
图1：为以西方墨点法分析带有pET24a-CIFNα2-IgG Fc质体的大肠杆菌所表现的犬融合干扰素(CIFNα2-IgG Fc)；M：蛋白质分子量标准(Protein Marker)；第1道：以mouse anti 6x His抗体分析；第2道：以rabbit anti canine IFN抗体分析；第3道：以rabbit anti canine IgG抗体分析；第4道：以mouse anti canineIFN抗体分析。
图2A：为pcDNA3载体转染至CHO细胞后，以Zeocin抗生素筛选后以IFA分析之结果；图2B：为带有编码犬融合干扰素基因(CIFNα2-IgG Fc)的质体转染至CHO细胞后，以Zeocin抗生素筛选后以IFA分析之结果。
图3：为以西方墨点法分析带有pcDNA3-CIFNα2-IgG Fc质体的CHO细胞所表现的犬融合干扰素(CIFNα2-IgG Fc)；M：蛋白质分子量标准(Protein Marker)；第1道：以mouse anti canine IFN抗体分析；第2道：以rabbit anti canine IFN抗体分析；第3道：以rabbit anti canine IgG抗体分析；第4道：以mouse anti6x His抗体分析。
图4：为以西方墨点法分析犬融合干扰素(CIFNα2-IgG Fc)所诱导之抗病毒蛋白；A为以rabbit anti Mx protein抗体侦测抗病毒蛋白Mx蛋白；B为α微管蛋白(α-tubulin)(内对照组)；第1道：未处理的MDCK细胞(负对照组)；第2道：以干扰素诱导剂polyI:C处理的MDCK细胞；第3道：以犬融合干扰素(CIFNα2-IgG Fc)处理的MDCK细胞。
图5：为以即时定量PCR(real-time PCR)分析犬融合干扰素(CIFNα2-IgG Fc)诱导MDCK细胞表现抗病毒蛋白Mx蛋白的基因表现量。
图6：为以即时定量PCR(real-time PCR)分析犬融合干扰素(CIFNα2-IgG Fc)诱导MDCK细胞表现抗病毒蛋白PKR蛋白的基因表现量。
图7：为以即时定量PCR(real-time PCR)分析犬融合干扰素(CIFNα2-IgG Fc)诱导MDCK细胞表现抗病毒蛋白OAS蛋白的基因表现量。
具体实施方式
实施例一犬干扰素α2基因(CIFNα2)选殖及其表现载体的构筑
取4x105个狗肾脏细胞(Madin-Darby Canine Kidney，MDCK)接种于6孔细胞培养盘内，培养24小时后转染干扰素诱导剂-聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸(polyinosinic：polycytidylic acid，polyI:C)2μg/well，接着每隔24小时收集细胞一次，并以异硫氰酸胍(guanidine thiocyanate，GTC)法萃取总RNA(totalRNA)。接着将萃取的总RNA进行反转录聚合酶连锁反应(reverse polymerase chainreaction，RT-PCR)；先将20μl萃取之总RNA以70℃作用3分钟后，取15μl总RNA、1μl正向引子、1μl反向引子以及3μl蒸馏水及AMV反转录试剂(AMV RT Kit)，合计总体积为20μl，混合均匀后放入PCR反应器中(Applied Biosystems GeneAmp PCRsystem 2400)，反应条件为先以42℃30秒进行cDNA合成，接着进行PCR反应增殖犬干扰素α2基因片段，以93℃30秒、53℃30秒、72℃1分钟进行35个循环，最后以72℃5分钟完成PCR反应。其中，犬干扰素α2基因(CIFNα2)的特异性引子序列如下：
正向引子(CIFNα2/F1)：
5’-CGGAATTCATGGCCCTGCCCTGCTCC-3’(SEQID NO：9)
EcoRI
反向引子(CIFNα2/R1)：
5’-CCG
TTTCCTCCTCCTGAT-3’(SEQ ID NO：10)。
XhoI
将PCR反应产物以洋菜胶电泳(agarose electrophoresis)分析确认产物片段大小，接着以核酸提取试剂盒(Gel/PCR DNA Fragments Extraction kit，Geneaid公司，台湾)进行PCR产物纯化。接着以载体试剂盒(yT&A Cloning Vector Kit，Yeastern Biotech公司，台湾)选殖RT-PCR产物之DNA片段，分别取8μl PCR产物、3μl蒸馏水、2μl yT&A cloning vector、1μl T4 ligase buffer、1μlT4ligase，混合均匀后置于14℃水浴槽进行接合作用(ligation)12小时，再转形(transformation)至宿主大肠杆菌(E.coli)中，过夜培养后，挑选出带有CIFNα2/yT&A质体的大肠杆菌，并进行定序确认增殖的PCR产物序列确实为犬干扰素α2基因(CIFNα2)，犬干扰素α2基因序列如SEQ ID No：1所示，其胺基酸序列如SEQ ID No：2所示。
接着以快速质粒抽提试剂盒(High-Speed Plasmid Mini Kit，Geneaid公司，台湾)自上述带有CIFNα2/yT&A质体的大肠杆菌中进行CIFNα2/yT&A质体的萃取及纯化。再将上述CIFNα2/yT&A质体、表现载体pET24a以及表现载体pcDNA3分别以限制酶EcoRI以及XhoI进行酶切反应，并以核酸提取试剂盒(Geneaid公司，台湾)纯化酶切后的犬干扰素基因(CIFNα2)及表现载体，接着进行接合反应，将犬干扰素基因(CIFNα2)分别选殖到pET24a载体与pcDNA3载体中形成pET24a-CIFNα2质体与pcDNA3-CIFNα2质体，并将pET24a-CIFNα2质体与pcDNA3-CIFNα2质体分别转形至表现宿主大肠杆菌(E.coli)与转染(transfection)至中国仓鼠卵巢细胞株(CHO cells)中，选出带有pET24a-CIFNα2质体的大肠杆菌及带有pcDNA3-CIFNα2质体的中国仓鼠卵巢细胞株(CHO cells)。
实施例二犬免疫球蛋白IgG Fc片段基因选殖
取新鲜狗脾脏，并以GTC法萃取总RNA。接着将萃取的总RNA进行反转录聚合酶连锁反应(RT-PCR)；先将20μl萃取之总RNA以70℃作用3分钟后，取15μl总RNA、1μl正向引子、1μl反向引子以及3μl蒸馏水及AMV反转录试剂(AMV RT Kit)，合计总体积为20μl，混合均匀后放入PCR反应器中(Applied Biosystems GeneAmp PCRsystem 2400)，反应条件为先以42℃30秒进行cDNA合成，接着进行PCR反应增殖犬免疫球蛋白IgG Fc片段基因，以93℃30秒、53℃30秒、72℃1分钟进行35个循环，最后以72℃5分钟完成PCR反应。其中，犬免疫球蛋白IgG Fc片段基因(Canine IgGFc)的特异性引子序列如下：
正向引子(Canine IgG Fc/F1)：
5’-CGGGATCCACTAAAGTAGACAAGCCAGTG-3’(SEQ ID NO：11)
BamHI
反向引子(Canine IgG Fc/R1)：
5’-CCG
CGTTTACCCGGAGAATGGGAGAG-3’(SEQID NO：12)。
将PCR反应产物以洋菜胶电泳分析确认产物片段大小，接着以核酸提取试剂盒(Geneaid公司，台湾)进行PCR产物纯化。接着以yT&A Cloning Vector Kit(Yeastern Biotech公司，台湾)选殖RT-PCR产物之DNA片段，分别取8μlPCR产物、3μl蒸馏水、2μl yT&A cloning vector、1μlT4ligase buffer、1μlT4ligase，混合均匀后置于14℃水浴槽进行接合作用12小时，再转型至宿主大肠杆菌(E.coli)中，过夜培养后，挑选出带有Canine IgG Fc/yT&A质体的大肠杆菌，并进行定序确认增殖的PCR产物序列确实为犬免疫球蛋白IgG Fc片段基因(Canine IgG Fc)，犬免疫球蛋白IgG Fc片段基因序列如SEQ ID No：3所示，其胺基酸序列如SEQ ID No：4所示。
实施例三犬融合干扰素(CIFNα2-IgG Fc)表现载体的构筑
在本实施例中，将实施例一所得的犬干扰素α2基因(CIFNα2)(SEQ ID No：1)以及实施例二所得的犬免疫球蛋白IgG Fc片段基因(Canine IgG-Fc)(SEQID No：3)以甘胺酸(Glycine，G)及丝胺酸(Serine，S)组成的连接子(linker)的DNA序列(SEQ ID No：5)连接，以构筑犬融合干扰素(CIFNα-IgG Fc)的DNA序列(SEQ ID No：7)。
首先，以PCR反应分别增幅犬干扰素α2基因(CIFNα2)(SEQ ID No：1)以及犬免疫球蛋白IgG Fc片段基因(Canine IgG-Fc)(SEQ ID No：3)，并利用PCR引子设计将甘胺酸及丝胺酸组成的连接子的DNA序列(SEQ ID No：5)分段与犬干扰素α2基因(CIFNα2)以及犬免疫球蛋白IgG Fc片段基因(Canine IgG-Fc)一同进行PCR反应增幅。其中，犬干扰素α2基因(CIFNα2)的特异性引子序列如下：
正向引子(CIFNα2/F2)：
5’-GG
ATGGCCCTGCCCTGCTCC-3’(SEQ ID NO：13)
KpnI
反向引子(CIFNα2-linker/R)：
5’-CGGGATCCACCTGAGCCACCTTTCCTCCTCCTGATTCT-3’(SEQ ID NO：14)；
BamHI连接子部分序列
而犬免疫球蛋白IgG Fc片段基因的特异性引子序列如下：
正向引子(Linker-IgG/F)：
5’-CGGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGCGGTGGAGGATCACCCAAAAGAGAAAATGGA-3’
BamHI 连接子部分序列(SEQ ID NO：15)
反向引子(IgG-Fc/R2)：
5’-CCGCGTTTACCCGGAGAATGGGAGAG-3’(SEQ ID NO：16)。
XhoI
在PCR反应管中加入0.3ng的质体DNA(CIFNα2/yT&A质体或Canine IgG Fc/yT&A质体)、5μl 10x PCR反应液、8μl1.25mM dNTP、1μl50μM5’端正向引子、1μl 50μM3’端反向引子、33μl灭菌水、1μl Taq聚合酶，混合均匀后放入PCR反应器中(Applied Biosystems GeneAmp PCR system 2400)，反应条件为先以94℃5分钟将DNA变性，接着以94℃30秒、57℃30秒、72℃30秒进行30个循环，最后以72℃5分钟完成PCR反应。
将PCR反应产物以洋菜胶电泳分析确认产物片段大小，接着以核酸提取试剂盒(Geneaid公司，台湾)进行PCR产物纯化。再将纯化后的PCR产物犬干扰素α2基因(CIFNα2)以限制酶KpnI以及BamHI进行酶切反应，将纯化后的PCR产物犬免疫球蛋白IgG Fc片段基因(Canine IgG-Fc)以限制酶BamHI以及XhoI进行酶切反应，并将表现载体pcDNA3以限制酶KpnI以及XhoI进行酶切反应后，再以核酸提取试剂盒(Geneaid公司，台湾)纯化酶切后的PCR产物及表现载体，接着进行接合反应，将PCR产物选殖到pcDNA3载体中形成pcDNA3-CIFNα2-IgG Fc质体，并将pcDNA3-CIFNα2-IgG Fc质体转染至中国仓鼠卵巢细胞株(CHO cells)中，选出带有pcDNA3-CIFNα2-IgG Fc质体的中国仓鼠卵巢细胞株(CHO cells)，并进行定序确认增殖的PCR产物序列确实为本实施例犬融合干扰素(CIFNα2-IgG Fc)的DNA序列(SEQ ID No：7)，而本实施例犬融合干扰素(CIFNα2-IgG Fc)的胺基酸序列如SEQ ID No：8所示。
此外，以pcDNA3-CIFNα2-IgG Fc质体为PCR反应的模板，并以下列引子对本实施例犬融合干扰素(CIFNα2-IgG Fc)DNA序列进行增殖：
正向引子(CIFNα2/F1)：
5’-CGGAATTCATGGCCCTGCCCTGCTCC-3’(SEQID NO：9)
EcoRI
反向引子(CIFNα2-IgG/R)：
5’-CCG
TTTACCCGGAGAATGGG-3’(SEQ ID NO：17)。
XhoI
PCR反应条件为先以94℃5分钟将DNA变性，接着以94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒进行30个循环，最后以72℃5分钟完成PCR反应。
接着将PCR反应产物以洋菜胶电泳分析确认产物片段大小，接着以核酸提取试剂盒(Geneaid公司，台湾)进行PCR产物纯化。再将纯化后的PCR产物犬融合干扰素(CIFNα2-IgG Fc)与表现载体pET24a以限制酶EcoRI以及XhoI进行酶切反应，再以核酸提取试剂盒(Geneaid公司，台湾)纯化酶切后的PCR产物及表现载体，接着进行接合反应，将PCR产物选殖到pET24a载体中形成pET24a-CIFNα2-IgG Fc质体，并将pET24a-CIFNα2-IgG Fc质体转形至表现宿主大肠杆菌BL21中，选出带有pET24a-CIFNα2-IgG Fc质体的大肠杆菌BL21，并进行定序确认增殖的PCR产物序列确实为本实施例犬融合干扰素(CIFNα2-IgG Fc)的DNA序列(SEQID No：7)。
实施例四犬融合干扰素(CIFNα-IgG Fc)在原核生物中的表现
将实施例三所得到的pET24a-CIFNα-IgG Fc质体转形至表现宿主大肠杆菌BL21。先取200μl胜任细胞加入5μl实施例三所得到的pET24a-CIFNα-IgG Fc质体，置于冰上30分钟后，再立即放入42℃水浴槽中1分30秒进行热休克(heatshock)，接着放入冰水中，静置5分钟后，再加入800μl LB培养液，37℃水浴培养1小时。再以室温3000xg离心5分钟，去除600μl上清液，并将下层剩余的LB及菌块冲散，取200μl菌液加至含有30μg/ml卡那霉素(kanamycin)或50μg/ml氨苄青霉素(ampicillin)的LB固体培养基上涂抹，37℃过夜培养后，挑选单一菌落进行培养及定序确认转形无误。
将带有实施例三所得到的pET24a-CIFNα-IgG Fc质体的表现宿主大肠杆菌BL21接种至含有30μg/ml卡那霉素(kanamycin)的LB培养基培养12小时后，取1％体积的菌液接种至250ml含有30μg/ml卡那霉素(kanamycin)的LB培养液培养，于37℃下培养至菌液浓度达OD600nm为0.6～0.8时，加入1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)诱导，分别于诱导4、6、8小时收集菌液样本，8小时后以13000xg，4℃，离心10分钟，去除上清液，将菌块以12.5％或10％十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺胶电泳分析(sodiumdodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，并以西方墨点法检测犬融合干扰素(CIFNα2-IgG Fc)蛋白表现的情况。
将上述SDS-PAGE分析后的胶体上的蛋白转印至PVDF膜上，并将转印后的PVDF膜置于封闭缓冲液(blocking buffer，5％Skim milk溶于TBST)中，于室温下作用1小时，以去除非特异性反应，再以TBST(10mM Tris-HCl pH 8.0，150mM NaCl，0.3％Tween 20)清洗三次，每次5分钟，随后分别加入鼠抗6xHis(mouse anti 6xHis)单株抗体(Invitrogen公司，美国)、兔抗犬干扰素(rabbit anti-canine IFN)多株抗体、兔抗犬IgG(rabbit anti-canine IgG)多株抗体以及鼠抗犬干扰素(mouseanti-canine IFN)多株抗体作为初级抗体侦测犬融合干扰素；加入抗体后于室温下作用1小时后，以TBST清洗六次，每次5分钟，再加入已标记碱性磷酸酶(AP)的山羊抗鼠(goat anti mouse)抗体(Sigma公司，美国)或是已标记碱性磷酸酶(AP)的山羊抗兔(goat anti rabbit)抗体(Sigma公司，美国)，作为次级抗体，该抗体事先以含有0.5％skin milk的TBST稀释2000倍，于室温下轻轻摇晃作用1小时后，以TBST清洗6次，每次5分钟，再加AP受质NBT/BCIP(Bio-Rad)呈色约1-2分钟后，倒掉显色剂以清水冲洗终止呈色反应。
西方墨点法分析结果如图1所示，带有犬融合干扰素基因的大肠杆菌菌块可被鼠抗6xHis(mouse anti 6xHis)单株抗体、兔抗犬干扰素(rabbit anti-canine IFN)多株抗体、兔抗犬IgG(rabbit anti-canine IgG)多株抗体以及鼠抗犬干扰素(mouse anti-canine IFN)多株抗体辨认，显示该大肠杆菌含有犬融合干扰素，且本实施例之犬融合干扰素的蛋白质分子量约为51KDa，与西方墨点法分析结果一致。
实施例五犬融合干扰素(CIFNα2-IgG Fc)在真核生物中的表现
将实施例三所得到的pcDNA3-CIFNα2-IgG Fc质体转染至中国仓鼠卵巢细胞株(CHO cells)。取3μg pcDNA3-CIFNα2-IgG Fc质体DNA加入无抗生素且无血清的VP培养基(Invitrogen)中震荡15秒(混合液A)；另外将6μg Lipofectamine试剂(Invitrogen)加入无抗生素且无血清的VP培养基中(混合液B)，于室温下作用5分钟；接着将混合液A加入混合液B中，震荡15秒后于室温下作用30分钟。再将上述混合液(A+B)均匀加入经过隔夜培养的CHO细胞中，将细胞置于37℃、5％CO2培养箱内作用6小时后，去除混合液并加入含有10％胎牛血清(FBS)的F12培养基，将细胞置于37℃、5％CO2培养箱内继续培养48小时。
接着，以博菜霉素(Zeocin)筛选带有犬融合干扰素基因的CHO细胞。将经过转染的CHO细胞株继代培养于24孔细胞培养盘中，以含有10％FBS、100Units/ml青链霉素(Penicillin)、100Units/ml链霉素(Streptomycin)和700μg/ml博菜霉素(Zeocin)的F12培养基培养以进行筛选。接着将细胞以磷酸盐缓冲液(PBS)清洗两次后加入0.125％胰蛋白酶(Trypsin)进行消化，待细胞圆化后，摇晃角瓶使细胞脱落，以培养基将细胞冲散悬浮，细胞培养于37℃、5％CO2培养箱，继代两次后，待活着的细胞约剩一至两成时，将细胞培养基替换成含有50μg/ml博菜霉素(Zeocin)以及10％FBS的F12培养基，待细胞恢复原来生长速度后，以间接免疫荧光染色(Indirect Immunofluorescence Assay，IFA)法以及西方墨点法确认细胞是否带有犬融合干扰素(CIFN-IgG Fc)基因并且表现该重组蛋白。
1.以间接免疫荧光染色(IFA)法检测猪融合重组型干扰素的表现
将转染的CHO细胞接种在24孔细胞培养盘内(2×105cells/well)以含10％FBS的F12培养基培养2天后，以PBS清洗三次后加入80％丙酮(-20℃)，并于4℃下静置30分钟进行细胞固定，再以PBS清洗三次后，加入以PBS稀释5000倍的rabbitanti canine IgG抗体(300μl/well)，置于37℃培养箱中避光作用30分钟，再以PBS清洗三次后，每孔加入300μl以PBS稀释2000倍的goat anti rabbit-FITC抗体，置于37℃培养箱中避光作用30分钟后，以荧光显微镜观察。
荧光显微镜观察结果如图2所示。经过博菜霉素(Zeocin)筛选后存活的CHO细胞带有犬融合干扰素基因，以间接免疫荧光染色(IFA)法分析可观察到荧光讯号(如图2B所示)；而转染pcDNA3-CIFNα2载体的CHO细胞则没有荧光讯号(如图2A所示)。
2.以西方墨点法检测猪融合重组型干扰素的表现
西方墨点法的试验步骤如实施例四所述，分别以鼠抗6xHis(mouse anti 6xHis)单株抗体(Invitrogen公司，美国)、兔抗犬干扰素(rabbit anti-canine IFN)多株抗体、兔抗犬IgG(rabbit anti-canine IgG)多株抗体以及鼠抗犬干扰素(mouseanti-canine IFN)多株抗体作为初级抗体侦测转染的CHO细胞分泌物是否含有犬融合干扰素(CIFNα2-IgG Fc)；并以已标记碱性磷酸酶(AP)的山羊抗鼠(goat antimouse)抗体(Sigma公司，美国)或是已标记碱性磷酸酶(AP)的山羊抗兔(goat antirabbit)抗体(Sigma公司，美国)，作为次级抗体呈色；结果如图3所示，带有犬融合干扰素基因的CHO细胞分泌物可被鼠抗6xHi s(mouse anti 6xHis)单株抗体、兔抗犬干扰素(rabbit anti-canine IFN)多株抗体、兔抗犬IgG(rabbitanti-canine IgG)多株抗体以及鼠抗犬干扰素(mouse anti-canine IFN)多株抗体辨认，显示该CHO细胞含有犬融合干扰素，且本实施例之犬融合干扰素的蛋白质分子量约为51KDa，与西方墨点法分析结果一致。
实施例六犬融合干扰素(CIFNα2-IgG Fc)诱导细胞产生抗病毒蛋白的活性分析
1.以犬干扰素(CIFNα2)、犬融合干扰素(CIFNα2-IgG Fc)及干扰素诱导剂(polyI:C)诱导狗肾脏细胞(MDCK)产生抗病毒蛋白
首先将狗肾脏细胞(MDCK)种于6孔细胞培养盘内(4x105细胞/孔)，于37℃、5％CO2条件下培养24小时，去除上清培养液后，以PBS清洗三次，根据不同组别分别加入100μg犬干扰素α2(Canine IFNα2)、100μg犬融合干扰素(CIFNα2-IgG Fc)及预混好的2.5μg polyI:C与lipofectamine 2000混合液，于37℃、5％CO2条件下培养1小时，再补0.5％DMEM培养液至3ml，接着置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，24小时后分别收集MDCK细胞总蛋白质及细胞总RNA进行分析(每个处理进行3重复)。
2.狗肾脏细胞(MDCK)总蛋白质的萃取
将上述各组MDCK细胞以PBS清洗三次，加入细胞裂解缓冲液(cell lysisbuffer，100μl/孔)，并将细胞培养盘置于室温下，以振荡器(shaker)以120rpm均匀摇晃，摇晃时每隔3-5分钟以手轻拍细胞培养盘使细胞脱落，收集细胞团块及溶液，于4℃下以14000xg离心20分钟，离心后分别取上清液(细胞质内蛋白)及下层细胞碎块，分别置于-20℃备用。并以Protein Assay试剂盒(Bio-Rad公司)进行细胞质内总蛋白的定量。
3.狗肾脏细胞(MDCK)总RNA的萃取
以核酸提取试剂盒(Nucleic Acid Extraction Kit I，FAVORGEN公司)萃取MDCK细胞总RNA。先加入570μlVNE buffer将细胞团块冲散并置于室温作用10分钟，再加入570μl99.9％乙醇，以振荡器(vortex)均匀混合，接着将室温作用完毕之液体加入VNE column中，以8000xg离心1分钟，去掉套管中的液体，加入400μlW1 buffer，以8000xg离心1分钟，去除套管液体，加入600μl Wash buffer，以8000xg离心1分钟，去除套管液体，再次加入600μl Wash buffer，以8000xg离心1分钟，去除套管液体后再以13000xg离心3分钟，去除套管液体，并加入50μlRNase free water回溶RNA，并以13000xg离心3分钟后，将RNA置于-20℃备用。
4.以西方墨点法分析抗病毒蛋白的表现
西方墨点法的试验步骤如实施例四所述；分别以0.05％TBST稀释500倍的兔抗Mx蛋白(rabbit anti Mx1)抗体(GeneTex公司，美国)作为一级抗体，以及以标记有辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗兔(goat anti rabbit-HRP)抗体(以0.05％TBST配置)(KPL公司，美国)作为二级抗体，分别侦测以CHO细胞表现的犬融合干扰素(CIFNα2-IgG Fc)及干扰素诱导剂(polyI:C)处理过的MDCK细胞内，是否含有抗病毒蛋白Mx蛋白。
结果如图4所示，以CHO细胞表现的犬融合干扰素(CIFNα2-IgG Fc)及以干扰素诱导剂(polyI:C)处理过的MDCK细胞内皆含有Mx蛋白，且未处理组的MDCK细胞内没有Mx蛋白的产生，显示MDCK细胞经过本发明犬融合干扰素的处理后可以诱导抗病毒蛋白-Mx蛋白的产生(如图4A所示)。
5.以即时定量PCR(real-time RT-PCR)分析抗病毒蛋白的基因表现量
以QuantiFast SYBR Green RT-PCR Handbook kit(QIAGEN公司，荷兰)将上述所萃取之总RNA(20ng)进行real-time RT-PCR，以分析抗病毒蛋白(Mx蛋白、PKR蛋白、OAS蛋白)的基因表现量。先将上述萃取之总RNA稀释至5ng/μl，接着依序加入12.5μl 2x QuantiFast SYBR Green RT-PCR Master Mix、1μl正向引子、1μl反向引子、QuantiFast RT Mix、模板RNA及RNase-free water，进行real-time RT-PCR反应；各抗病毒蛋白的特异性引子序列如下：
Mx蛋白正向引子(Mx real-time/F)：
5’-ATGAGCCATGACGAGGTTTC-3’(SEQ ID NO：18)
Mx蛋白反向引子(Mx real-time/R)：
5’-TTCAGGAGCCAGCTGTAGGT-3’(SEQ ID NO：19)
PKR蛋白正向引子(PKR real-time/F)：
5’-TGAGCAATGCCAGATACAGTG-3’(SEQ ID NO：20)
PKR蛋白反向引子(PKR real-time/R)：
5’-CCATATCCACCTGAGCCAAT-3’(SEQ ID NO：21)
OAS蛋白正向引子(OAS real-time/F)：
5’-AGCTCGAGAAACGAGGACAG-3’(SEQ ID NO：22)
OAS蛋白反向引子(OAS real-time/R)：
5’-ACTTCAGGGTTGGGTCTGTG-3’(SEQ ID NO：23)
另以管家基因(housekeeping gene)肌动蛋白(actin)的表现量作为对照组：
Actin蛋白正向引子(Actin real-time/F)：
5’-GCGCAAGTACTCTGTGTGGAT-3’(SEQ ID NO：24)
Actin蛋白反向引子(Actin real-time/R)：
5’-GTCGTACTCCTGCTTGCTGAT-3’(SEQ ID NO：25)
Real-time RT-PCR反应条件为：反转录反应(Reverse transcription)50℃10分钟，接着进行PCR起始步骤95℃5分钟，变性(Denaturation)95℃10秒，黏合/延伸(annealing/extension)60℃30秒，共35个循环后完成反应，实验结果则代入下列公式进行计算，并以Sigmastat软体进行分析。公式如下：
2-ΔΔCt＝2-{(CT gene of interest-CT internal control)-(CT gene of interest-CT internal control)}
各抗病毒蛋白的real-time RT-PCR结果分别如图5至图7所示。
如图5所示，分别以20ng大肠杆菌表现纯化的犬干扰素α2(CIFNα2)、犬融合干扰素(CIFNα2-IgG Fc)及CHO细胞表现纯化的犬融合干扰素(CIFNα2-IgGFc)处理MDCK细胞24小时后，以CHO细胞表现纯化的犬融合干扰素(CIFNα2-IgG Fc)处理组所被诱发的Mx蛋白基因表现量最高，为以大肠杆菌表现纯化的犬干扰素α2(CIFNα2)处理组的Mx蛋白基因表现量的7.9倍，且约为未处理组(负对照组)的Mx蛋白基因表现量的41倍(p＜0.05)。
如图6所示，分别以20ng大肠杆菌表现纯化的犬干扰素α2(CIFNα2)、犬融合干扰素(CIFNα2-IgG Fc)及CHO细胞表现纯化的犬融合干扰素(CIFNα2-IgGFc)处理MDCK细胞24小时后，以大肠杆菌表现纯化的犬干扰素α2(CIFNα2)处理组被诱发的PKR蛋白基因表现量最高；而相较于未处理组(负对照组)的PKR蛋白基因表现量，以大肠杆菌表现纯化的犬融合干扰素(CIFNα2-IgG Fc)、CHO细胞表现纯化的犬融合干扰素(CIFNα2-IgG Fc)以及干扰素诱导剂polyI:C处理的MDCK细胞内仍有诱导PKR蛋白的基因表现(p＜0.05)。
如图7所示，分别以20ng大肠杆菌表现纯化的犬干扰素α2(CIFNα2)、犬融合干扰素(CIFNα2-IgG Fc)及CHO细胞表现纯化的犬融合干扰素(CIFNα2-IgGFc)处理MDCK细胞24小时后，以CHO细胞表现纯化的犬融合干扰素(CIFNα2-IgG Fc)处理组被诱发的OAS蛋白基因表现量最高；而相较于未处理组(负对照组)的OAS蛋白基因表现量，以大肠杆菌表现纯化的犬干扰素α2(CIFNα2)、犬融合干扰素(CIFNα2-IgG Fc)以及干扰素诱导剂polyI:C处理的MDCK细胞内仍有诱导OAS蛋白的基因表现(p＜0.05)。
由上述实施例可知，本发明所提供之犬融合干扰素可以诱导犬细胞产生抗病毒蛋白的表现，进而达到抗病毒的效果。
上列详细说明针对本发明之一可行实施例之具体说明，惟该实施例并非用以限制本发明之专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为之等效实施或变更，均应包含于本案之专利范围中。
Claims (9)
1.一种犬融合干扰素，包含一犬干扰素以及一犬免疫球蛋白Fc片段。
2.如权利要求1所述之犬融合干扰素，其特征在于，该犬干扰素以及该犬免疫球蛋白Fc片段是由一连接子所连接。
3.如权利要求1或2所述之犬融合干扰素，其特征在于，该犬干扰素具有如SEQ ID No：2所示之序列。
4.如权利要求1或2所述之犬融合干扰素，其特征在于，该犬免疫球蛋白Fc片段具有如SEQ ID No：4所示之序列。
5.如权利要求2所述之犬融合干扰素，其特征在于，该连接子具有如SEQ ID No：6所示之序列。
6.如权利要求2所述之犬融合干扰素，其特征在于，该犬融合干扰素具有如SEQ ID No：8所示之序列。
7.一种编码如权利要求1所述之犬融合干扰素的多核苷酸。
8.如权利要求7所述之多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸具有如SEQ ID No：7所示之序列。
9.一种如权利要求1所述之犬融合干扰素在制备犬抗病毒药物中的用途。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20140326 |