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CN101967196A - 一种干扰素融合蛋白及其制备和应用 - Google Patents

一种干扰素融合蛋白及其制备和应用 Download PDF

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CN101967196A
CN101967196A CN2010105396721A CN201010539672A CN101967196A CN 101967196 A CN101967196 A CN 101967196A CN 2010105396721 A CN2010105396721 A CN 2010105396721A CN 201010539672 A CN201010539672 A CN 201010539672A CN 101967196 A CN101967196 A CN 101967196A
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CN
China
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ifn
interferon
fusion protein
rabbit
fragment
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CN2010105396721A
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English (en)
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曹鹏
夏志南
高健
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Abstract

本发明涉及一种干扰素融合蛋白及其制备和应用，所说的干扰素融合蛋白，是由人免疫球蛋白G的Fc片段和人的干扰素相连构成的融合蛋白，或者是人的干扰素通过一个连接肽与人免疫球蛋白的Fc片段连接构成的。该融合蛋白的制备是；分别制得干扰素基因及免疫球蛋白G的Fc片段基因，将其连接后，构建含连接片段的重组表达载体；用重组表达载体转化宿主细胞，培养宿主细胞，然后从细胞培养物中回收和纯化得到重组融合蛋白。本发明的融合蛋白可在制备抗病毒、抗肿瘤和免疫调节药物中应用。

Description

一种干扰素融合蛋白及其制备和应用
技术领域
本发明涉及重组人免疫球蛋白可结晶片段 （crystalizable fragment，Fc）融合干扰素的制备，用这种方法制备的干扰素能明显延长干扰素在体内的作用时间，可用于人类相关疾病的治疗。
背景技术
抗体的Fc结构域通常包含每个链的至少两个重链恒定区结构域，其二聚化形成Fc结构域。Fc结构域负责提供抗体效应功能，包括决定抗体半衰期和在体内的分布固定补体和结合细胞表面Fc受体的能力。Fc结构域的性质使其称为有用的治疗剂。许多研究已将Fc 结构域融合于其他非抗体蛋白质，例如受体蛋白，例如伊纳西普，也可将Fc结构域融合体用做研究试剂，Fc标签其有利于蛋白的检测与纯化。
人IgG免疫球蛋白是体内的主要抗体, 它在人体内的半衰期约为20天, 其稳定性是由于IgG 的Fc片段可与新生Fc受体(FcRn)结合, 避免IgG进入溶酶体中被降解。因此, IgG的Fc片段被用来与活性蛋白连接构成融合蛋白, 以提高活性蛋白的体内半衰期, 达到长效的目的。IgG可通过Fc片段上的补体结合位点激活补体, 起到细胞杀伤作用。根据铰链区的长短及 Fc片段氨基酸序列的不同, 人IgG分为4个亚型（γ1、γ2、γ3和γ4）, 其中IgG Fcγ2具有较低的诱导细胞毒性作用, 而IgG Fcγ1最强。IgG融合蛋白的构建方式大多是将IgG的Fc (Hinge-CH2- CH3)片段或CH(CH1-Hinge-CH2-CH3)片段的N端与活性蛋白的C端相连, 以避免构建融合蛋白可能对活性蛋白生物活性造成的影响。另外, 如果活性蛋白以同源二聚体的形式发挥其生物活性, Fcγ片段及铰链区的半光氨酸构成的分子间二硫键可增强和稳定融合蛋白二聚体的形成。例如人白细胞功能抗原3 (LFA-3), 肿瘤坏死因子受体II(TNFRII), 白细胞介素12(IL-12)等, 这些融合蛋白在保留细胞因子生物功能的同时在动物实验中明显延长细胞因子的半衰期。此外, IgG的融合蛋白可以通过Protein A亲和层析得到高效便捷的纯化。因此尽管很多细胞因子与IgG的融合蛋白还处于研究的前期阶段, 但是由于其高效性、半衰期长及纯化方便的特点已经引起广泛的关注。
干扰素（IFN）是一种多功能细胞因子，其首先被发现的生物活性是抵制抗性病毒感染。多年以来，干扰素的抗病毒活性是其唯一的生物功能。如今，发现干扰素有许多其它生物功能，如作用于细胞的生长、分化和免疫调节等活性可能具有更大的生物学意义。干扰素有两个完全不同的家族，分为I型和II型。I型干扰素主要包括IFNα和IFNβ，II型干扰素为IFNγ。I型干扰素的主要作用是抗病毒，IFNα和IFNβ两者共同用一种受体，但具有完全不同的免疫原性。IFNα主要由人白细胞产生，称为白细胞干扰素，IFNβ主要由成纤维细胞产生，称为成纤维细胞干扰素。IFNα有很多亚型，如IFNα-1、IFNα-2、IFNα-3等约有20种亚型，此外还有亚亚型，如IFNα-1a、IFNα-1b、IFNα-2a、IFNα-2b等，IFNα有几十种之多。IFNβ尚未发现有亚型。II型干扰素主要由T细胞产生；主要活性是参与免疫调节，是体内重要的免疫调节因子，又称免疫干扰素。IFNγ只有一种活性形式的蛋白质，没有其它的亚型。干扰素是具有广泛生物学活性的调节蛋白质，具有抗病毒、免疫调节的作用，对多种肿瘤细胞具有辅助性杀灭或抑制增殖作用，还能抑制癌基因表达从而阻止或减慢正常细胞向肿瘤细胞转化的过程。自80年代开始研制出重组人干扰素以来，目前有60多个国家批准上市。广泛用于乙肝、丙肝；白血病；疱疹、湿疣；肾癌、膀胱癌；淋巴瘤、骨髓瘤、黑色素瘤等多种病毒性疾病和肿瘤的治疗。
但普通干扰素存在某些不够理想之处，由于干扰素分子量小，易被肾小球滤过，所以皮下注射后吸收很快，半衰期短，容易被酶水解等，一般要每天注射或至少每周注射三次，应用不够方便。而干扰素治疗肝炎、肿瘤、类风湿及多发性硬化症等疾病时，治疗周期常常长达数月甚至数年，这种长期大剂量频繁用药增加了病人的痛苦和治疗费用而且易产生发烧、疲乏、食欲减退及流感样症状等毒副作用。
聚乙二醇（PEG）修饰的干扰素是FDA批准的临床上使用的半衰期最长的长效干扰素，PEG与干扰素连接可延长血中干扰素半衰期，使干扰素活性可延续至一周，每周只肌注一次，相当于普通干扰素每日肌注效果，并可提高疗效。但是PEG修饰的IFN价格贵，PEG与干扰素的修饰工艺复杂，从而使聚乙二醇修饰的干扰素成本太高，增大了病人的治疗费用。军事医学科学院生物工程研究所的血清白蛋白与干扰素的融合蛋白专利（公开号CN140518A）中，在血清白蛋白与干扰素蛋白连接中设有连接肽（Gly4Ser）n，n为1-10的整数。在融合蛋白中包含有外源蛋白的序列，外源蛋白序列的存在对其免疫原性和治疗效果的影响尚缺乏文献资料。
鉴于干扰素在体内半衰期短和目前长效干扰素活性较低的特点，本发明设计了一种新型长效干扰素，主要用于抗病毒，提高免疫力和肿瘤治疗等方面。
发明内容
为了克服现有干扰素体内半衰期短和目前长效干扰素活性较低的不足，本发明提供了一种干扰素融合蛋白及其应用，该干扰素融合蛋白能刺激机体对病毒感染的免疫应答、在体内的半衰期长、起最大的治疗作用以及减少传统干扰素的潜在副作用，有效地解决了现有技术存在的问题。
本发明所采用的技术方案是：
一种干扰素融合蛋白，是由人免疫球蛋白G的Fc片段和人干扰素相连构成的融合蛋白，或者是人的干扰素通过一个连接肽与人免疫球蛋白的Fc片段连接构成的融合蛋白。
上述的说的干扰素可以包括干扰素家族的任何成员。在一具体实例中，干扰素是被病毒感染的细胞产生的天然细胞因子，这样的干扰素在“肽生长因子及其受体II”（Sporn and Roberts,Spring-Verlag Heidelberg,New York Inc., USA.PP3-38）中被Vilcek（1991，）称为“干扰素“，这一名称沿用至今。
干扰素的特别实例包括，但不限于干扰素IFN-ɑ-1（IFNA-1）、IFN-a-2（IFNA-2）、IFN-a-4（IFNA-4）、IFN-a-5（IFNA-5）、IFN-a-6（IFNA-6）、IFN-a-7（IFNA-7）、IFN-a-8（IFNA-8）、IFN-a-10（IFNA-10）、IFN-a-12（IFNA-12）、IFN-a-13（IFNA-13）、IFN-a-14（IFNA-14）、IFN-a-16（IFNA-16）、IFN-a-17（IFNA-17）、IFN-a-21（IFNA-21）、IFN-??-1(IFNB-1) IFN- ?? -2（IFNB-2,IL-6）、IFN-γ-1(IL-29)、IFN-γ-2(IL-28A)和IFN-ε等。
SeqID No.2、4、6、8是具体的属于本发明干扰素融合蛋白的几种氨基酸序列，本发明所说的干扰素融合蛋白中的一部分与SeqID No.2、4、6、8有至少90%同源性的序列。
干扰素可直接连在IgG Fc蛋白（hinge铰链区+CH2+CH3）的N末端或C末端形成干扰素类似物，也可以通过连接肽来连接Fc与干扰素以形成任何蛋白，如干扰素-连接肽-Fc，或Fc-连接肽-干扰素。连接肽长度优选是2-100个氨基酸，更优选是5-50个氨基酸，最优选为14-30个氨基酸。连接肽长度可短至Fc对干扰素形成的位阻保持最小，例如（G4S）3-4。连接肽有利于干扰素与其受体结合。
本发明所说的干扰素融合蛋白通过以下方法制备：
（1）分别制得干扰素基因及免疫球蛋白G 的Fc片段基因，
（2）连接干扰素基因和Fc基因；
（3）构建含上述（2）连接片段的重组表达载体；
（4）用上述（3）中得到的重组表达载体转化宿主细胞，
（5）培养宿主细胞，然后从细胞培养物中回收和纯化得到重组融合蛋白（即干扰素融合蛋白）。
在一优选实施方案中，本发明提供一种包含本发明 Fc-IFN融合基因的重组真核表达载体pFc-IFN，以及含有该重组表达载体的宿主细胞pFc-IFN/CHO。
步骤（5）是在适于该融合蛋白的条件下培养用重组表达载体转化的宿主细胞，以及从细胞培养物中回收和纯化该重组融合蛋白的步骤。在一个优选的实施方案中，宿主细胞经细胞培养，离心后，上清液分别用亲和层析和分子筛层析纯化。在一个优选的实施方案中，亲和层析是ProteinA sepharose FF亲和层析柱，分子筛是Superdex 200 PREP grad柱。
另外，本发明还涉及一种哺乳动物细胞生产干扰素融合蛋白的高效低成本的方法，特别是哺乳动细胞生产IgG Fc分别与IFN-a1b，IFN-a2a，IFN-a2b，IFN-a-8（IFNA-8）、IFN-γ-1(IL-29)、IFN-γ-2(IL-28A)和IFN-ε组成的融合蛋白。上述任何一种融合蛋白在血浆中的稳定性很高并且血浆中的半衰期长，其体外，体内的生物保护功能与传统的干扰素相同。
本发明还提供一种干扰素融合蛋白用于制备药物的应用。这些应用包括由上述干扰素融合蛋白组成的药物制剂以及治疗的有效剂量，药物制剂可以是任何药学可接受的能够使干扰素类似物稳定的任何赋形剂形式。药物制剂可以进一步使天然的或重组的人免疫球蛋白和或不同的干扰素类似物。
本发明进一步提供含有本发明干扰素融合蛋白（IFN-Fc融合蛋白）作为活性成分和药学上可接受载体的药物组合物，以及该药物组合物在治疗相关疾病的药物中的用途，包括抗病毒，肿瘤治疗和免疫调节等领域。
本文中提到的Fc-IFN融合蛋白具有Fc-IFN融合蛋白的氨基酸序列，但其中一个或多个氨基酸残基已被不同的氨基酸残基保守的取代，并且所得到的多肽可用于实施本发明。保守氨基酸取代是本领域已知的。造成这样的取代原则包含由Dayholf，MD等所述的取代规则。更具体的说，保守氨基酸取代发生在与其酸性、极性或侧链大小相关联的氨基酸家族内。
生产和操作本文公开的多核苷酸分子的方法是本领域技术人员已知的，并可按照描述的重组技术完成。可用于表达本发明的IFN-Fc融合蛋白序列的表达载体是本领域已知的，其中包括含有特定编码序列的重组噬菌体DNA，质粒DNA和粘粒DNA表达载体，可经加工而含有本发明的多核苷酸分子的典型原核表达质粒包括PUC8, PUC9, PBR322和PBR329, pET系列载体，PQE50等等，可经加工而含有本发明的多核苷酸分子的典型真核表达载体包括蜕皮激素诱导型哺乳动物表达系统，基于鞠细胞病毒启动子-增强子的表达系统，和基于杆状病毒表达系统。
可用于实施本发明的宿主细胞可以是真核或原核细胞。这样的宿主细胞包括单不限于微生物，例如用重组噬菌体DNA，质粒DNA或粘粒DNA载体转化的细菌，或者用重组载体转化的酵母，或者是动物细胞，如用重组病毒载体如杆状病毒感染的昆虫细胞，或用重组病毒载体如腺病毒或痘苗病毒感染的哺乳动物细胞等。例如，可使用大肠杆菌菌株，如BL21菌株。真核细胞包括酵母细胞，但也可有效地利用小鼠、仓鼠、牛、猴或人细胞系等哺乳动物细胞。可用于表达本发明的重组蛋白质的真核宿主细胞包括CHO，和HEK293，NIH-3T3细胞等。
含有本发明的重组融合蛋白质的药物组合物可用于相关疾病的治疗，尤其是在抗病毒，肿瘤治疗和免疫调节等领域。
本领域技术人员可以理解，本发明的药物组合物适用于各种给药方式，例如口服给药，经皮给药，静脉给药，肌肉内给药，局部给药，经鼻给药等。根据所采用的给药方式，可将本发明的重组蛋白药物组合物制成各种合适的剂型，其中包含至少一种有效剂量的本发明的多肽和至少一种药学上可接受的药用载体。
适当剂型的实例为片剂，胶囊，糖衣片剂，粒剂，口服溶液和糖浆，用于皮肤表面的油膏和药贴，气雾剂，鼻喷剂，以及可用于注射的无菌溶液。
含有本发明重组蛋白的药物组合物可以制成溶液或者冻干粉末以用于胃肠外给药，在使用前科加入适当溶剂或其他可药用的载体将粉末重新配置，液体配方一般是缓冲液，等渗溶液和水溶液。
剂型中还包含由其他常规组分，如防腐剂，稳定剂，表面活性剂，缓冲液，调节渗透压的盐，乳化剂，增甜剂，着色剂，调味剂等。本发明药物组合物种使用的稳定剂优选柠檬酸钠，甘氨酸，甘露醇，神经节糖苷等。含有本发明药物组合物的注射水针或冻干粉针更优选的配方包括，Fc-IFN，NaCl 4mg，硫酸盐3.02mg，甘氨酸10mg或甘露醇15mg，注射用水0.5ml。
本发明药物组物种多肽的用量可以再一个较大范围内变动，本领域技术人员可以根据一些一直的因素如根据疾病的种类，病情严重程度，病人体重，剂型，给药途径等因素很容易的加以确定。
本发明的优点：
1)   在分子数相同时与天然IFN相比，具有类似的生物学活性；
2)    在药物的药代实验中显示出显著延长的半衰期和稳定性；
3)     选择免疫球蛋白的Fc片段作为融合片段，避免副作用的产生；
4)     表达量高，稳定性好，易于放大生产，成本低。
本发明的工程细胞株连续传代100代后，仍能稳定分泌表达Fc-IFN融合蛋白，通过悬浮培养方式进行培养，用ELISA方法检测上清中的表达量，统计50余次的数据，表达量均在500-700mg/L。在纯化方面，由于融合蛋白在细胞培养上清中含量高，而纯化工艺中的亲和层析步骤具有很高的纯化效率，每毫升凝胶可以结合50mg的蛋白，易于放大生产。
附图说明
图1：显示信号肽-Fc-IFNɑ2a融合基因的基因拼接流程。
图2：显示PCR扩增信号肽-Fc-IFNɑ2a融合基因。M: 15000bp DNA ladder; 1: 引物pFc1和pIFN2扩增的产物；2: 引物p 3和pIFN2扩增的产物；3: 引物p2和pIFN2扩增的产物；3: 引物p1和p IFN2扩增的产物。
图3：重组质粒pIFNɑ2a-Fc的酶切鉴定结果（1% agrose电泳）。其中泳道M为分子量标准， 1-6: 随机挑取的六株克隆的双酶切。
图4：显示Fc-IFNɑ2a的rProtein A Sepharose Fast Flow 洗脱图。
图5：显示图5：SDS-PAGE检测纯化后的表达产物。M:标准分子量；1：还原型SDS-PAGE；2：非还原型SDS-PAGE。
图6：IFNɑ2a和Fc-IFNɑ2a融合蛋白对病毒攻击细胞的保护试验。
图7：IFNɑ2a和Fc-IFNA2a融合蛋白在37℃时的稳定性。
图8：IFNɑ2a和Fc-IFNɑ2a融合蛋白在50℃时的稳定性。
图9：IFNɑ2a和Fc-IFNɑ2a融合蛋白在72小时的长效作用。
图10：IFNɑ2a和Fc-IFNɑ2a融合蛋白在16天的长效作用。
具体实施方式
SEQ ID NO:1是融合蛋白IgG2 Fc-IFNɑ2a核苷酸序列；
SEQ ID NO:2是编码融合蛋白IgG2 Fc-IFNɑ2a的氨基酸序列；
Seq ID No.3编码免疫球蛋白IgG2 Fc和人IFNa2b融合蛋白 的核苷酸序列；
Seq ID No.4编码免疫球蛋白IgG2 Fc和人IFNa2b融合蛋白的氨基酸序列；
Seq ID No.5编码免疫球蛋白IgG2 Fc和人IFNa1b融合蛋白的核苷酸序列；
Seq ID No.6编码免疫球蛋白IgG2 Fc和人IFNa1b融合蛋白的氨基酸序列；
Seq ID No.7编码免疫球蛋白IgG2 Fc和人IFNa-8融合蛋白的核苷酸序列；
Seq ID No.8编码免疫球蛋白IgG2 Fc和人IFNa-8融合蛋白的氨基酸序列。
实施例1：IFNɑ2a目的基因及人IgG2 Fc（hinge region+CH2+CH3）片段基因的获得
根据IFNɑ2a基因序列（NM_000605），送交基因合成公司合成。以正常人淋巴细胞总RNA为模板，引物为PFc1: 5’ GAC AAG ACC CAC ACC TGT C 3’,PFc2: 5’ GCCGCCAGATCCGCCTCCGCCCTTTCCGGGGCTCAG 3’，RT-PCR扩增IgG2 Fc 片段，反应过程如下，逆转录反应：70℃ 10分钟， 42℃ 30秒 94℃ 5分钟 4℃冷却。PCR反应：94℃变性30秒；55℃退火30秒；72℃延伸1分钟，反应30个循环。然后72℃再延伸5分钟。反应完成后，1%琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR产物。整个基因拼接的流程图如图1所示，图2表示我们得到了预计大小的DNA片段（约1350bp）。
实施例2：重组质粒的构建
1) 重叠延伸拼接技术（over-lap）连接IFNɑ2a和Fc基因：Primers设计如下：根据IFNɑ2a和人IgG2 Fc (hinge region+ CH2+ CH3) cDNA序列设计如下引物：
PFc1: 5’ GAC AAG ACC CAC ACC TGT C 3’
PFc2: 5’ GCCGCCAGATCCGCCTCCGCCCTTTCCGGGGCTCAG 3’
PIFN1:5’TCTGGCGGCGGAGGAAGTGGCGGAGGCTCTGGCTGCGACCTGCCTCAG 3’
PIFN2: 5’ CGCGGATCCTCA CTC TTT GGA CTT CAG 3’
PIFN2含BamH1酶切位点。PFc2 和 PIFN1 中含有甘氨酸-丝氨酸连接肽(Gly3Ser)序列
2）PCR反应体系
在50 μl PCR反应管中建立如下反应体系
10×PCR   buffer 5 μl
cDNA 2 μl(10 ng)
PFc1 (10   mM) 2 μl
PFc2: (10   mM) 2 μl
dNTP 4 μl
Taq酶 0.5μl(2.5U)
Mg离子 3 μl
补H2O至50 μl，
反应条件如下：
    94℃   3 min
    94℃   45 sec
    55℃   30 sec           
    72℃   1 min
    72℃   7 min
    冷却至4℃，
30 Cycles，反应结束后，进行1.0% Agarose电泳鉴定并割胶回收目的条带。
第二轮扩增IFN，在50 μl PCR反应管中建立如下反应体系
10×PCR   buffer 5 μl
IFN 2 μl(10 ng)
PIFN1(10   mM) 2 μl
PIFN2(10   mM) 2 μl
dNTP 4 μl
Taq酶 0.5μl(2.5U)
Mg离子 3 μl
补H2O至50 μl                      
94℃   3 min
    94℃   30 sec
    55℃   30 sec             
    72℃   1 min
    72℃   7 min
    冷却至4℃，
30 Cycles，反应结束后，进行1.0% Agarose电泳鉴定并割胶回收目的条带。
第三轮OVER-LAP PCR扩增Fc-IFN在50 μl PCR反应管中建立如下反应体系
10×PCR   buffer 5 μl
第一，二轮产物 2 μl(10 ng)
PFc1 (10   mM) 2 μl
PIFN2(10   mM) 2 μl
dNTP 4 μl
Tag酶 0.5μl(2.5U)
Mg离子 3 μl
补H2O至50 μl                      
94℃   3 min
    94℃   30 sec
    55℃   30 sec        
    72℃   1 min
    72℃   7 min
    冷却至4℃，
   30 Cycles，反应结束后，进行1.0% Agarose电泳鉴定并割胶回收目的条带。
3）引物延伸合成信号肽序列
P1 5’-CCCAAGCTTGCCACCATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGG-3’
P2 5'-ATCATCCTGTTTCTGGTGGCTACCGCCACCGGAGT-3’
P3 5’-CTACCGCCACCGGAGTGCATTCTGACAAGACCCACACCTGTC-3’
在50 μl PCR反应管中建立如下反应体系
10×PCR   buffer 5 μl
Fc-IFN 2 μl(10 ng)
P1 (10 mM) 2 μl
PIFN2 (10   mM) 2 μl
dNTP 4 μl
Taq酶 0.5μl(2.5U)
Mg离子 3 μl
补H2O至50 μl，
反应条件如下：
    94℃   3 min
    94℃   45 sec
    55℃   30 sec            
    72℃   1 min
    72℃   7 min
    冷却至4℃，
30 Cycles，反应结束后，进行1.0% Agarose电泳鉴定并割胶回收目的条带。
 
在50 μl PCR反应管中建立如下反应体系
10×PCR   buffer 5 μl
第一轮产物 2 μl(10 ng)
P2 (10 mM) 2 μl
PIFN2 (10   mM) 2 μl
dNTP 4 μl
Tag酶 0.5μl(2.5U)
Mg离子 3 μl
补H2O至50 μl，
反应条件如下：
    94℃   3 min
    94℃   45 sec
    55℃   30 sec            
    72℃   1 min
    72℃   7 min
    冷却至4℃，
30 Cycles，反应结束后，进行1.0% Agarose电泳鉴定并割胶回收目的条带。
在50 μl PCR反应管中建立如下反应体系
10×PCR   buffer 5 μl
第二轮产物 2 μl(10 ng)
P1 (10 mM) 2 μl
PIFN2 (10   mM) 2 μl
dNTP 4 μl
Tag酶 0.5μl(2.5U)
Mg离子 3 μl
补H2O至50 μl，
反应条件如下：
    94℃   3 min
    94℃   45 sec
    55℃   30 sec            
    72℃   1 min
    72℃   7 min
    冷却至4℃，
30 Cycles，反应结束后，进行1.0% Agarose电泳鉴定并割胶回收目的条带。
PCR产物经电泳分离后，切胶回收目的片段，随后分别建立如下酶切反应体系：
Fc-IFN片段 16 μl(1μg)
10×Buffer K 2 μl
Hind Ⅲ 1   μl(15U)
BamH I 1 μl(15U)
 补H2O至20 μl，37℃反应8 h。载体pYD7采用同样的酶切体系酶切。
5）酶切产物1%琼脂糖电泳，割胶回收，建立连接体系：s
10×Ligation   Buffer 2 μl
Fc-IFN酶切片段 15 μl(0.2   pmol)
pYD7线性化载体 2 μl(0.03   pmol)
T4 DNA   Ligase 1 μl(350U)
补H2O至20 μl，16℃反应12 h。
6) 将甘油冻存保存的DH5α接种划平板，37℃倒置培养过夜；
7）挑取单克隆至装有3 ml LB的试管中，37℃ 220 rpm振摇12 h；
8）吸取1 ml菌液至1.5 ml离心管中，4℃ 12000g离心3 min，弃上
清；
9）用400μl 0.1mol/l预冷的CaCl2重悬菌体沉淀，12000g离心3 min，
弃上清；用200 μl 0.1mol/l预冷的CaCl2再次重悬菌体沉淀，置冰上过夜；
10）将连接液20 μl全部加入200 μl感受态细菌中，置冰上1h；
11）42℃热休克90 sec，迅速置冰中5 min；加入800 μl 37℃预热的LB培养液；
12）37℃，220 rpm振摇1 h，离心后全部涂布于含50 μg/ml Kan的LB
平板，37℃倒置培养过夜。
13) 随机挑取4个单克隆至含30 μg/ml AMP的3ml LB培养液的试管中，37℃ 220 rpm振摇12 h，菌落PCR鉴定后，抽提质粒(按OMEGA质粒小量抽提试剂盒说明书进行)1.0% Agarose电泳检测纯度并大致定量；
14) BamHI和NdeI进行双酶切，1.0% Agarose电泳鉴定。
15）将重组质粒送至Invitrogen 公司测序，得到正确序列的pYD7和Fc-IFNα2的重组质粒命名为pFc-IFNɑ2a。
图3表示酶切鉴定的结果，表明我们获得了阳性克隆。完整的融合蛋白质Fc-IFNα2a基因和氨基酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。其他序列用类似的方法可以最终获得以下的核苷酸序列分别为SeqID N0:3、5、7，相对应的氨基酸序列分别为SeqID No. 4、6、8。
 实施例3：CHO稳定表达株筛选及鉴定
1)        取10ug大量制备的实施例2中的pFc-IFNɑ2a质粒，利用脂质体Lipofectin2000转染CHO细胞。两天后按1：5的比例传代，加入0.4mg/ml的G418筛选，10天可见克隆形成。随机消化168个边缘明显分开、细胞状态良好的单克隆接种于7个24孔板培养（第一轮筛选）。
2)        取三天后的培养上请用ELISA检测融合蛋白的表达情况，从中选出表达阳性的45个克隆分别接种于2个24孔板（第二轮筛选）及1个6孔板（用于保种），培养4天后，取上清用ELISA检测融合蛋白的表达情况，从中选取表达较高的6个克隆：A2-6、B1-5、C6-3、D5-5、D6-4、D6-5进一步用有限稀释法进行筛选。
3)        分别接种96孔板（5细胞/孔/200ul）(第三轮筛选)，待细胞长满后（大约13天后），去培养上清用ELISA检测融合蛋白的表达情况，B4-3、A6-4、C1-5均为均一的克隆，分别挑取表达较高的6个克隆接种24孔板，各平行届2孔。待细胞长满后，其中一孔用于保种 ，另一孔接种6孔板。待6孔板内的细胞长满后，抽取基因组DNA和总RNA，用PCR鉴定整合入基因组的插入片段的存在情况，用RT-PCR鉴定插入片段的转录（即表达）情况，B4-3、A6-4、C1-5均为正确的克隆。
4)        分别取B4-3、A6-4、C1-5接种96孔板（1细胞/孔/200ul）(第四轮筛选)，待细胞长满后（大约15天后），取培养上请用ELISA检测融合蛋白的表达情况，三个克隆均为均一的克隆，将其中表达最高的分别扩增、保种，进行下一步表达和纯化。pFc-IFNɑ2a转化CHO细胞后，将稳定表达的细胞命名为CHO-FI细胞。
实施例4: 制备Fc-IFNɑ2a融合蛋白
     大规模培养转染的CHO-FI细胞，经离心后上清液用1M的NaOH调节pH至7.3，用以10mM PB(pH7.3)平衡的rProteinA-Sepharose F.F.(Parmacia)亲和层析柱进行吸附，再用同样的缓冲液洗涤亲和柱至280nm的OD值小于0.01。用0.05～0.1M的柠檬酸缓冲液将融合蛋白洗下，收集洗脱峰并立即用200mM Na2HPO4调节PH至7.0。样品浓缩后，上分子筛Superdex 200 prep grade 柱预先用20 mM PBS(含150mMNaCL,pH7.2)缓冲液平衡，将浓缩后的样品上样纯化。亲和层析图为图4，纯化后的蛋白电泳图谱见图5，纯度可达到 98%以上。
实施例5：制备以Fc-IFNɑ2a为活性组分的注射剂/冻干剂
配方： Fc-IFNɑ2a                           100mg
            NaCL                                   8g
            Na2HPO4·12H2O                 5.16g
            NaH2PO4·2H2O                   0.874g
            甘氨酸                                 15g
            甘露醇                                 30g 
            注射用水                              1000ml
            pH值                                    7.2
无菌过滤后分装成0.5ml/支的注射水针剂或冻干，制成冻干粉针。
实施例6：Fc-IFNɑ2a融合蛋白对病毒攻击细胞的保护试验
Fc-IFNɑ2a及其融合蛋白的抗病毒活性由细胞因子保护人胎儿羊膜WISH细胞抵抗疱疹性口炎病毒（VSV）诱导引起的细胞病变程度来确定。WISH细胞（4.5×105细胞/ml）预先置于96孔中（100ul/孔），与3倍梯度稀释的IFNɑ2a或Fc-IFNɑ2a融合蛋白一起在37℃下温育18小时，在ELISA板内测定结晶紫染色的细胞的吸收值可以确定WISH细胞的活性，本分析方法中，IFNɑ2a在半数有效剂量（ED50）0.45± 0.04pm时，其保护VSV诱导引起的WISH细胞病变的能力为50%，而干扰素融合蛋白在半数有效剂量（ED50）0.2±0.3Pm浓度时，具有天然干扰素抗病毒的50%（图6）。由于Fc-IFNɑ2a是二价分子，可推测结果如按照摩尔浓度计算，Fc-IFNɑ2a融合蛋白的比活性是IFNɑ2a的2倍。
实例7：应用酶联免疫分析干扰素类似物
应用用酶联免疫分析测定未知样品中IFNa2a和Fc-IFNa2a的活性并与已知生物活性的干扰素标准品进行比较测定时一种常规方法，Chemicon公司出品的干扰素-ɑ ELISA试剂盒是双抗体夹心法。ChemikineTM山羊抗兔抗体板捕获特异的干扰素-a复合体，复合体中含有的干扰素-a抗体与干扰素a结合，生物偶联的干扰素-a（竞争性配体）、样品或标准品竞争干扰素-a特异抗体结合位点。因此当样品中干扰素-a浓度增加时，被抗体捕获的偶联的干扰素a量降低，用streptavidin碱性磷酸酶偶联的底物反应分析可定量分析，样品中干扰素-a的含量与使与标准品曲线相比较，可以计算出未知样品中的干扰素-a生物活性及含量。并以尿液中分离的人干扰素-a、CHO细胞表达的人重组干扰素-a作为对照确定重组Fc-IFNa2a融合蛋白的生物学活性。
结果表明, Fc-IFNa2a与IFNa2a有相同的生物活性。
实施例8: 测定干扰素类似物在体外生物活性的稳定性
以Fc-IFNɑ2a为例，对Fc-IFNɑ2a在37℃ 和50℃ 条件下，在不同时间点进行稳定性测定，取50U(0.5ng)由细菌表达的人IFNa2a或50U(19.6ng)纯化的人Fc-IFNa2a融合蛋白，置于含有200ul，不含血清及其他组分的RPMI1640培养液中，试管封好口置于水浴中，在不同时间点取出样品，立刻置于-80℃保存，待全部样品收集好后，按标准操作规程以病毒感染WISH细胞进行生物活性测定，并设立好对照。结果如图7表明，IFNɑ2a在37℃下24小时丧失全部活性，但在37℃24小时后，Fc-IFNɑ2a的生物活性没有任何变化，甚至其抗病毒活性在20天后仍保存生物活性的3/4。在50℃条件下，IFN-a-2a在24小时后丧失全部活性，但在6天后，干扰素类似物的生物活性仍然保持原来活性的90%，结果如图7,图8显示干扰素类似物保存时间延长，对环境温度有更好的抗性。
实施例9: 干扰素类似物在血浆中的存留时间
测定了在动物血浆中Fc-IFNa2a和干扰素IFNa2a的存留时间。15ng（约1×103U）人IFN-a-2a加45ng来自CHO细胞表达的IgG Fc或60g（约1×103U）人IFNa2a类似物分别稀释成100ul溶液注射入小鼠体内，然后在不同时间分别采集血液样品（50ul）。实验的最后一天，所有受试的小鼠都采集血液样品500ul，在微型离心管中加入EDTA一起离心，上清液置于-80℃储存。用Chemicon公司的ChemkineTM人干扰素放免试剂盒测试所有采自注射过IFNa2a（对照）。干扰素类似物动物的血清样品。结果显示Fc-IFNa2a比裸露的IFNa2a在血浆中保持更长的未被降解的时间（图9和10）。在注射16天仍然能检测出Fc-IFNa2a的存在，这个结果与免疫球蛋白Fc有14-20天的血浆半衰期一致的。注射Fc-IFNa2a的血浆样品在第16天仍能检测出保护WISH细胞的抗病毒活性，结果显示对照品中没有保护细胞免受病毒攻击的功能。这种长效的生物学功能赋予融合蛋白新的临床用途。

Claims (6)

1.一种干扰素融合蛋白，其特征在于是由人免疫球蛋白G的Fc片段和人的干扰素相连构成的融合蛋白，或者是人的干扰素通过一个连接肽与人免疫球蛋白的Fc片段连接构成的融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的干扰素融合蛋白，其特征在于其中所述干扰素选自IFN-a-1、IFN-a-2、IFN-a-4、IFN-a-5、IFN-a-6、IFN-a-7、IFN-a-8、IFN-a-10、IFN-a-12、IFN-a-13、IFN-a-14、IFN-a-16、IFN-a-17、IFN-a-21、IFN-??-1、 IFN- ?? -2、IFN-γ-1、IFN-γ-2和IFN-ε。
3.根据权利要求1的所述的干扰素融合蛋白，其特征在于，其中所述连接肽为(G4S)3-10。
4.一种干扰素融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
（1）分别制得干扰素基因及免疫球蛋白G的Fc片段基因，
（2）连接干扰素基因和Fc基因；
（3）构建含上述（2）连接片段的重组表达载体；
（4）用上述（3）中得到的重组表达载体转化宿主细胞，
（5）培养宿主细胞，然后从细胞培养物中回收和纯化得到重组融合蛋白。
5.一种药物组合物，其特征在于，由作为活性成分的权利要求1的融合蛋白和药学上可接受的载体组成。
6.权利要求1所述的融合蛋白在制备抗病毒、抗肿瘤和免疫调节药物中的应用。
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