MX2007003767A - Colageno recombinante producido en planta. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan un metodo para producir colageno en una planta y plantas que producen colageno. El metodo se efectua al expresar en la planta por lo menos un tipo de una cadena alfa de colageno en una manera que habilita la acumulacion de la cadena alfa de colageno en un compartimiento subcelular libre de actividad de P4II endogena, para producir asi el colageno en la planta.

Description

COLÁGENO RECOMBINANTE PRODUCIDO EN PLANTA CAMPO Y ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a plantas que producen colágeno y métodos para generar y utilizar las mismas. Más particularmente, la presente invención se relaciona a un procedimiento novedoso para generar plantas capaces de producir niveles altos de cadenas de colágeno hidroxiladas que son capaces de formar fibras de colágeno de tipo I de triple hélice nativas. Los colágenos son las proteínas estructurales principales responsables para la integridad estructural de vertebrados y muchos otros organismos multicelulares. El colágeno de tipo I representa el colágeno fibrilar prototípico y es el tipo de colágeno principal en la mayoría de los tejidos. El colágeno de tipo I es el componente de colágeno predominante de huesos y tendones y se encuentra en grandes cantidades en la piel, aorta y pulmón. Las fibras de colágeno de tipo I proporcionan gran resistencia a la tensión y extensibilidad limitada. La forma molecular más abundante del colágeno de tipo I es un heterotrímero compuesto de dos cadenas alfa diferentes [alfa 1 (I)]2 y alfa 2(1) (Inkinen, 2003) . Todas las moléculas de colágeno fibrilares contienen tres cadenas de polipéptido construidas de un triplete Gly-X-Y de repetición, donde X e Y pueden ser cualquier aminoácido pero son frecuentemente los aminoácidos prolina e hidroxiprolina . Los colágenos que forman fibrilo se sintetizan como procolágenos precursores que contienen propéptidos de extensión N- y C-terminal globulares. La biosíntesis del procolágeno es un proceso complejo que involucra un número de modificaciones postraduccionales diferentes que incluyen la hidroxilación de la prolina y lisina, la glicosilación N-enlazada y O-enlazada y la formación del enlace de disulfuro tanto de intra- como de inter-cadena. Las enzimas que llevan a cabo estas modificaciones actúan en una forma coordinada para asegurar el plegamiento y ensamblado de una molécula helicoidal triple correctamente alineada y térmicamente estable . Cada molécula de procolágeno se ensambla dentro del retículo endoplásmico primitivo de las tres cadenas de polipéptidos constituyentes. Como la cadena de polipéptidos se translocaliza cotraduccionalmente a través de la membrana del retículo endoplásmico, la hidroxilación de los residuos de prolina y lisina ocurre dentro de la región de repetición Gly-X-Y. Una vez que la cadena de polipéptidos se translocaliza completamente en el lumen del retículo endoplásmico el C~propéptido se pliega. Tres cadenas pro-alfa luego se asocian por la vía de sus C-propéptidos para formar una molécula trimérica que permite a la región de repetición de Gly-X-Y formar un punto de nucleación en su extremo C-terminal, asegurando la alineación correcta de las cadenas. La región Gly-X-Y luego se pliega en una dirección C-a-N para formar una triple hélice. La relación temporal entre la modificación de la cadena de polipéptidos y la formación de la triple hélice es crucial ya que la hidroxilación de los residuos de prolina es requerida para asegurar la estabilidad de la triple hélice en la temperatura corporal, una vez formada, la triple hélice no sirve más como un sustrato para la hidroxilación de la enzima. Los C-propéptidos (y a un menor grado los N-propéptidos) mantienen el procolágeno soluble durante su paso a través de la célula (Bulleid y colaboradores, 2000) . Después o durante la secreción de las moléculas de procolágeno en la matriz extracelular, los propéptidos se remueven por la procolágeno N- y C-proteinasas, accionando de esta manera el autoensamble espontáneo de las moléculas de colágeno en fíbrilos (Hulmes, 2002) . La remoción de los propéptidos por las procolágeno N- y C-proteinasas reduce la solubilidad del procolágeno por >10000 veces y es necesario y suficiente iniciar el autoensamble del colágeno en las fibras. Cruciales a este proceso de ensamblado son los péptidos helicoidales no triples cortos llamados telopéptidos en los extremos del dominio helicoidal triple, que asegura el registro correcto de las moléculas de colágeno dentro de la estructura fíbrilar y reduce la concentración crítica para el autoensamble (Bulleid y colaboradores, 2000) . En naturaleza, la estabilidad de la estructura helicoidal triple del colágeno requiere la hidroxilación de las prolinas por la enzima prolil-4-hidroxilasa (P4H) para formar residuos de hidroxiprolina dentro de una cadena de colágeno. Las plantas que expresan cadenas de colágeno son conocidas en la técnica, ver por ejemplo, patente norteamericana No. 6,617,431 y (Merle y colaboradores, 2002, Ruggiero y colaboradores, 2000) . Aunque las plantas son capaces de sintetizar las proteínas que contienen hidroxiprolina la prolil hidroxilasa que es responsable para la síntesis de la hidroxiprolina en las células de planta exhibe especificidad de secuencia de sustrato relativamente suelta como es comparada con la P4H de mamífero, y así la producción del colágeno que contiene hidroxiprolina únicamente en la posición Y de los tripletes Gly-X-Y requiere la co-expresión de la planta de colágeno y los genes P4H (Olsen y colaboradores, 2003) . Un intento para producir colágenos humanos que dependan de la maquinaria de hidroxilación naturalmente presentes en plantas dio por resultado colágeno que es pobre en la hidroxilación de la prolina (Merle y colaboradores, 2002) . Tal colágeno se funde o pierde su estructura helicoidal triple a temperaturas abajo de 30 °C. La co- expresión de colágeno y prolil-hidroxilasa resulta con el colágeno hidroxilado estable que es biológicamente relevante para las aplicaciones a temperaturas corporales (Merle y colaboradores, 2002) . La lisil hidroxilasa (LH, EC 1.14.11.4), galactosiltransferasa (EC 2.4.1.50) y glucosiltransferasa (EC 2.4.1.66) son enzimas involucradas en las modificaciones postraduccionales de los colágenos. De manera secuencial modifican los residuos de lisilo en las posiciones específicas a residuos de hidroxilisilo, galactosilhidroxilisilo y glucosilgalactosil hidroxilisilo. Estas estructuras son únicas para los colágenos y esenciales para su actividad opcional (Wang y colaboradores, 2002). Una enzima humana individual, Lisil hidroxilasa 3 (LH3) puede catalizar todas las tres etapas consecutivas en la formación de carbohidratos enlazados con hidroxilisina (Wang y colaboradores, 2002). Las hidroxílísinas de un colágeno humano expresaron en la forma de tabaco menos de 2% de las hidroxilisinas encontradas en un colágeno bovino (0.04% de residuos/1.88% de residuos) . Esto sugiere que la Lisil hidroxilasa endogénica de planta es incapaz de hidroxilar suficientemente las lisinas en el colágeno. Mientras que se reduce la presente invención a la practica, los presentes inventores descubrieron que la hidroxilación eficiente de las cadenas de colágeno depende del secuestramiento de la cadena de colágeno junto con una enzima capaz de modificar correctamente este polipéptido. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De " acuerdo a un aspecto de la presente invención se proporciona un método para producir colágeno en una planta o una célula de planta aislada que comprende la expresión en la planta o la célula de planta aislada de por lo menos un tipo de una cadena alfa de colágeno y P4H exógena en una manera que permite la acumulación de por lo menos un tipo de la cadena alfa de colágeno y la P4H exógena en un compartimiento subcelular libre de la actividad de P4H endógena, produciendo de esta manera el colágeno en la planta. De acuerdo a un aspecto adicional de la presente invención se proporciona De acuerdo a características adicionales en las modalidades preferidas de la invención descritas enseguida, el método además comprende expresar la LH3 endógena en el compartimiento subcelular libre de la actividad de P4H endógena. De acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas el por lo menos un tipo de cadena alfa de colágeno incluye un péptido de señal para la dirección a un apoplasto o a una vacuola. De acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas el por lo menos un tipo de la cadena alfa de colágeno está libre de una secuencia de dirección o de retención ER. De acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas el por lo menos un tipo de la cadena alfa de colágeno se expresa en una organela que contiene DNA de planta. De acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas la P4H exógena incluye un péptido de señal para la dirección a un apoplasto o a una vacuola. De acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas la P4H exógena está libre de una secuencia de dirección o de retención ER. De acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas la P4H exógena se expresa en una organela que contiene DNA de la planta. De acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas el por lo menos un tipo de la cadena alfa de colágeno es cadena alfa 1. De acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas el por lo menos un tipo de la cadena alfa de colágeno es cadena alfa 2. De acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas el por lo menos un tipo de la cadena alfa de colágeno incluye un propéptido C-terminal y/o N-terminal. De acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas la planta se selecciona del grupo que consiste de Tabaco, Maíz, Alfalfa, Arroz, Papa, Soya, Tomate, Trigo, Cebada, Cañóla y Algodón. De acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas el por lo menos un tipo de la cadena de colágeno o la P4H exógena se expresan en solamente una porción de la planta. De acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas la porción de la planta es hojas, semillas, raíces, tubérculos o tallos. De acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas la P4H exógena es capaz de hidroxilar específicamente la posición Y de los tripletes Gly-X-Y del por lo menos un tipo de la cadena alfa de colágeno . De acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas la P4H exógena es P4H humana . De acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas la planta se somete a una condición de estrés. De acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas la condición de estrés se selecciona del grupo que consiste de sequía, salinidad, lesión, frío y rocío con compuestos que inducen el estrés. De acuerdo a otro aspecto de la presente invención se proporciona una planta genéticamente modificada o célula de planta aislada capaz de acumular una cadena alfa de colágeno que tiene un patrón de hidroxilación idéntico a aquel producido cuando la cadena alfa de colágeno se expresa en las células humanas. De acuerdo a todavía otro aspecto de la presente invención se proporciona una planta genéticamente modificada o célula de planta aislada capaz de acumular una cadena alfa de colágeno en un compartimiento subcelular libre de la • actividad de la P4H endógena. De acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas la planta genéticamente modificada además comprende una P4H exógena. De acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas el por lo menos un tipo de la cadena alfa de colágeno incluye un péptido de señal para la dirección a un apoplasto o a una vacuola. De acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas el por lo menos un tipo de la cadena alfa de colágeno está libre de una secuencia de dirección o de retención ER.

De acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas el por lo menos un tipo de la cadena alfa de colágeno se expresa en una organela que contiene DNA de planta. De acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas la P4H exógena incluye un péptido de señal para la dirección a un apoplasto o a una vacuola . De acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas la P4H exógena está libre de una secuencia de dirección o de retención ER. De acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas la P4H exógena se expresa en una organela que contiene DNA de la planta. De acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas la cadena alfa de colágeno es cadena alfa 1. De acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas la cadena alfa de colágeno es cadena alfa 2. De acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas la cadena alfa de colágeno incluye un propéptido C-terminal y/o N-terminal. De acuerdo a todavía otro aspecto de la presente invención se proporciona un sistema de planta que comprende una primera planta genéticamente modificada capaz de acumular una cadena alfa 1 de colágeno y una segunda planta genéticamente modificada capaz de acumular una cadena alfa 2 de colágeno. De acuerdo a todavía otro aspecto de la presente invención se proporciona un sistema de planta que comprende una primera planta genéticamente modificada capaz de acumular una cadena alfa 1 de colágeno y una cadena alfa 2 de colágeno y una segunda planta genéticamente modificada capaz de acumular P4H. De acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas en por lo menos una de la primera planta genéticamente modificada y la segunda planta genéticamente modificada además comprende una la P4H exógena. De acuerdo a todavía otro aspecto de la presente invención se proporciona un método para producir colágeno fibrilar que comprende: (a) expresar en una primera planta una cadena alfa 1 de colágeno; (b) expresar en una segunda planta una cadena alfa 2 de colágeno, en donde la expresión de la planta y la segunda planta se configuran tal que la cadena alfa 1 de colágeno y la cadena alfa 2 de colágeno son capaces de acumularse en un compartimiento subcelular libre la actividad de la P4H endógena; y (c) cruzar la primera planta y la segunda planta y seleccionar la progenie que expresa la cadena alfa 1 de colágeno y la cadena alfa 2 de colágeno produciendo de esta manera colágeno fibrilar. De acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas el método además comprende expresar una P4H exógena y en cada una de la primera planta y una segunda planta. De acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas cada una de la cadena alfa 1 de colágeno y la cadena alfa 2 de colágeno incluye un péptido de señal para dirigirse a un apoplasto o una vacuola. De acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas cada una de la cadena alfa 1 de colágeno y la cadena alfa 2 de colágeno está libre de una secuencia de dirección o de retención ER. De acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas las etapas (a) y (b) se afectan por la vía de la expresión en una organela que contiene DNA de la planta. De acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas la P4H exógena incluye un péptido de señal para dirigir a un apoplasto o una vacuola. De acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas la P4H exógena está libre de una secuencia de dirección o de retención ER.

De . acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas la P4H exógena se expresa en una organela que contiene DNA de la planta. De acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas cada una de la cadena alfa 1 de colágeno y la cadena alfa 2 de colágeno incluye un propéptido C-terminal y/o N-terminal. De acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas la P4H exógena es capaz de hidroxilar la posición Y de los tripletes Gly-X-Y del por lo menos un tipo de la cadena alfa de colágeno. De acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas la P4H exógena es P4H humana . De acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas la primera planta y la segunda planta se someten a una condición de estrés. De acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas la condición de estrés se selecciona del grupo que consiste de sequía, salinidad, lesión, toxicidad de metal pesado y estrés por frío. De acuerdo a todavía otro aspecto de la presente invención se proporciona un método para producir colágeno fibrilar que comprende: (a) expresar en una primera planta una cadena alfa 1 de colágeno y una cadena alfa 2 de colágeno, en donde la expresión de la primera planta se configura tal que la cadena alfa 1 de colágeno y la cadena alfa 2 de colágeno cada una son capaces de acumularse en un compartimiento subcelular libre de la actividad de la P4H endógena; (b) expresar en una segunda planta una P4H exógena capaz de acumularse en el compartimiento subcelular libre de la actividad de la P4H endógena y (c) cruzar la primera planta y la segunda planta y seleccionar la progenie que expresa la cadena alfa 1 de colágeno, la cadena alfa 2 de colágeno y la P4H produciendo de esta manera el colágeno fibrilar. De acuerdo a todavía otro aspecto de la presente invención se proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica una P4H humana colocada bajo el control transcripcional de un promotor funcional en células de planta. De acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas el promotor se selecciona del grupo que consiste del promotor CaMV 35S, el promotor Ubicuitin, el promotor rbcS y el promotor SVBV. De acuerdo a todavía otro aspecto de la presente invención se proporciona una planta o célula de planta aislada genéticamente modificada que es capaz de expresar la cadena alfa 1 de colágeno, la cadena alfa 2 de colágeno, P4H, LH3 y la proteasa C y/o la proteasa N.

De acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas la cadena alfa 1 de colágeno y la cadena alfa 2 de colágeno cada una son capaces de acumularse en un compartimiento subcelular libre de la actividad de la P4H de planta endógena. De acuerdo a todavía otro aspecto de la presente invención se proporciona una planta o célula de planta aislada genéticamente modificada que es capaz de acumular colágeno que tiene una característica de estabilidad de temperatura idéntica a aquella del colágeno mamífero. De acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas el colágeno es colágeno de tipo 1. De acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas el colágeno mamífero es colágeno humano. De acuerdo a todavía otro aspecto de la presente invención se proporciona una secuencia que codifica el colágeno optimizada para la expresión en una planta. De acuerdo a todavía características adicionales en las modalidades preferidas descritas la secuencia que codifica el colágeno es como se expone por la SEQ ID N0:1. La presente invención se dirige exitosamente a las desventajas de las configuraciones actualmente conocidas al proporcionar una planta capaz de expresar correctamente cadenas de colágeno hidroxiladas que son capaces de ensamblarse en el colágeno que tiene propiedades similares a aquellas del colágeno humano. A menos que de otra manera se defina, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como comúnmente es entendido por uno de habilidad ordinaria en la técnica a la cual esta invención pertenece. Aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente se pueden utilizar en la práctica o prueba de la presente invención, métodos y materiales adecuados se describen enseguida. En caso de conflicto, la especificación de patente, incluyendo las definiciones, lo controlará. Además, los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos únicamente y no se proponen para ser limitativos. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La invención se describe en la presente, a manera de ejemplo únicamente, con referencia a los dibujos acompañantes. Con referencia específica ahora a los dibujos en detalle, se acentúa que los detalles particulares mostrados son a manera de ejemplo y para propósitos de ilustración ilustrativa de las modalidades preferidas de la presente invención únicamente, y se presentan con el fin de proporcionar lo que se cree que es la descripción más útil y fácilmente entendida de los principios y aspectos conceptuales de la invención. En este respecto, ningún intento se hace para mostrar los detalles estructurales de la invención en mayor detalle que lo que es necesario para un entendimiento fundamental de la invención, la descripción tomada con los dibujos que hace evidente a aquellos expertos en la técnica en como las diversas formas de la invención se pueden englobar en la práctica. En los dibujos: Las FIGs. la-d ilustran la construcción de varios casetes de expresión y vectores utilizados para transformar plantas de prueba. Todas las secuencias de codificación sintetizadas como una parte del presente -estudio se optimizaron para la expresión en el tabaco. La FIG. 2 ilustra varios procedimientos de co-transformaciones. Cada cásete de expresión se representa por el nombre corto de la secuencia de codificación. Las secuencias de codificación se especifican en la tabla 1. Cada co-transformación se realizó mediante dos vectores binarios pBINPLUS . Cada rectángulo representa un vector pBINPLUS individual que lleva uno, dos o tres casetes de expresión. El promotor y los terminadores se especifican en el Ejemplo 1. La FIG. 3 es una clasificación de la PCR múltiplex de los transformantes que muestran las plantas que son positivas para la alfa 1 de Colágeno (fragmento de 324bp) o alfa 2 de Colágeno (fragmento de 537bp) o ambos.

La FIG. 4 es el análisis de manchado de western de las plantas transgénicas generadas por las co-transformaciones 2, 3 y 4. Las proteínas solubles totales se extrajeron de los co-transformantes #2, #3 y #4 de tabaco y se probaron con el anticuerpo anti-Colágeno I (#AB745 de Chemicon Inc) . Los marcadores de tamaño fueron #SM0671 de Fermentas Inc. W.T. es un tipo silvestre de tabaco. Las bandas de colágeno positivas son visibles en las plantas que son positivas a la PCR para la alfa 1 o alfa 2 de colágeno de tipo 1 o ambos. La banda de control positiva del colágeno de tipo I 500ng de la placenta humana (#CC050 de Chemicon Inc., extraído de la placenta humana" mediante la digestión de pepsina) representa aproximadamente 0.3% de las proteínas solubles totales (aproximadamente 150 µg) en las muestras de las plantas transgénicas. La banda más grande en aproximadamente 140 kDa en la muestra de colágeno humano es un procolágeno con sus C-propéptido como es detectado por el propéptido anticarboxi terminal del anticuerpo de colágeno de tipo I (#MAB1913 de Chemicon Inc.). La banda más pequeña en aproximadamente 120 kDa en la muestra de colágeno humano es un colágeno sin propéptidos. Debido a su composición inusual las proteínas ricas en prolina (que incluyen colágeno) s consistentemente migran sobre los geles de poliacrilamida como bandas con masa molecular más alta que la esperada. Por lo tanto las cadenas de colágeno sin los propéptidos con un peso molecular de aproximadamente 95kDa migran como una banda de aproximadamente 120 kDa. La FIG. 5 es un análisis del manchado de western de la planta transgénica generada por la co-transformación #8 (que lleva las señales del apoplasto traduccionalmente fusionado a las cadenas de colágeno) . Las proteínas solubles totales se extrajeron de las hojas de tabaco transgénico y se probaron con el anticuerpo anti-Colágeno 1 (#AB745 de Chemicon Inc.) la banda de alfa 2 de colágeno positiva es visible en la planta 8-141. El colágeno de tipo I de la placenta humana (#CC050 de Chemicon Inc.) sirvió como control . Las FIGs. 6a-b ilustran el ensamble de triple hélice de colágeno y la estabilidad térmica como es calificada como el tratamiento con calor y la digestión de Tripsina y Pepsina. En la Figura 6a - la proteína soluble total del tabaco 2-9 (expresa únicamente alfa 1 col y P4H no) y 3-5 (expresa tanto alfa 1+2 col como alfa P4H humana y subunidades beta) se sometieron al tratamiento con calor (15 minutos en 30°C o 43°C) seguido por la digestión de Tripsina (20 minutos en R:T) y se probaron con el anticuerpo anti-Colágeno I en un procedimiento de manchado de Western. Los controles positivos fueron muestras de 500 ng de proteínas solubles totales + colágeno I humano de tabaco w.t. En la Figura 6b - las proteínas solubles totales se extrajeron del tabaco transgénico 13-6 (que expresa las cadenas alfa 1 y alfa 2 de colágeno I - indicadas por flechas, las subunidades alfa y beta de P4H humana y LH3 humana) y se sometieron al tratamiento con calor (20 minutos en 33°C, 38°C o 42°C), se enfriaron inmediatamente sobre hielo para prevenir el reensamblado de la triple hélice y se incubaron con Pepsina durante 30 minutos a temperatura ambiente (aproximadamente 22 °C) seguidos por la prueba con el anticuerpo anti-Colágeno I (#AB745 de Chemicon Inc.) en un procedimiento de manchado de Western estándar. El control positivo fue la muestra de ~50 ng de colágeno I humano (#C050 de Chemicon Inc., extraída de la placenta humana mediante la digestión de pepsina) la cual se adicionó a las proteínas solubles totales extraídas del tabaco w.t. La FIG. 7 ilustra el análisis del manchado del Norte conducido sobre tabaco de tipo silvestre. Los manchados se sondearon con el cDNA de P4H del tabaco. La FIG. 8 es un análisis del manchado de western de las plantas transgénicas generadas por las co-transformaciones 2, 3 y 13. La proteína soluble total se extrajo de los co-transformantes de tabaco y se probaron con los anticuerpos alfa y beta de la P4H antihumana y anti-Colágeno I . DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS La presente invención es de plantas que expresan y acumulan colágeno que se puede utilizar para producir colágeno y fibras de colágeno que exhiben características de colágeno mamífero. Los principios y operación de la presente invención se pueden entender mejor con referencia a los dibujos y descripciones acompañantes. Antes de explicar por lo menos una modalidad de la invención en detalle, va a ser entendido que la invención no se limita en su aplicación a los detalles expuestos en la siguiente descripción o ejemplificada por los ejemplos. La invención es capaz de otras modalidades o de ser practicada o llevada a cabo en varias maneras. También, se va a entender que la fraseología y terminología empleada en la presente es para el propósito de descripción y no se debe considerar limitativa. Las plantas que producen colágeno son conocidas en la técnica. Aunque tales plantas se pueden utilizar para producir cadenas de colágeno así como colágeno, tales cadenas son incorrectamente hidroxiladas y así el autoensamble de las mismas, si en la planta o no, conduce al colágeno que es inherentemente inestable. Mientras que se reduce la presente invención a la práctica, los presentes inventores han ideado un procedimiento de expresión de planta que asegura la hidroxilación correcta de las cadenas de colágeno y así permite la producción en planta de colágeno que imita exactamente las características (por ejemplo estabilidad de temperatura) de colágeno del tipo 1 humano) . Así, de acuerdo a un aspecto de la presente invención se proporciona una planta genéticamente modificada que es capaz de expresar por lo menos un tipo de una cadena alfa de colágeno y acumularla en un compartimiento subcelular que está libre de la actividad de la P4H endógena. Como se utiliza en la presente, la frase "planta genéticamente modificada" se refiere a cualquier planta inferior (por ejemplo musgo) o superior (vascular) o un tejido o una célula de planta aislada del mismo (por ejemplo, de una suspensión de células) que es estable o transientemente transformada con una secuencia de polinucleótidos exógenos. Ejemplos de plantas incluyen Tabaco, Maíz, Alfalfa, Arroz, Papa, Soya, Tomate, Trigo, Cebada, Cañóla, Algodón, Zanahoria así como plantas inferiores tal como musgo. Como se utiliza en la presente, la frase "cadena de colágeno" se refiere a una subunidad de colágeno tal como las cadenas alfa 1 o 2 de fibras de colágeno, preferiblemente fibras de tipo 1. Como se utiliza en la presente, la frase "colágeno" se refiere a un trímero de colágeno ensamblado, que en el caso del colágeno del tipo I incluye dos cadenas alfa 1 y una cadena alfa 2. Una fibra de colágeno es colágeno que está libre de los propéptidos de terminal C y N. Como se utiliza en la presente, la frase "compartimiento subcelular libre de actividad de la P4H endógena" se refiere a cualquier región de compartimientos de la célula que no incluye la P4H de planta o una enzima que tiene la actividad de la P4H similar a la planta. Ejemplos de tales compartimientos subcelulares incluyen la vacuola, apoplasto y citoplasma así como organela tales como el cloroplasto, mitocondria y los similares. Cualquier tipo de cadena de colágeno se puede expresar por la planta genéticamente modificada de la presente invención. Ejemplos incluyen colágenos que forman fibrilar (tipos I, II, III, V, y XI) , colágenos que forman redes (tipos, IV, VIII y X), colágenos asociados con superficies fibrilares (tipos IX, CII y XIV) , colágenos que ocurren como proteínas de transmembrana (tipos XIII y XVII) , o forman filamentos de cuentas periódicas 11-nm (tipo VI) . Para descripción adicional favor de ver Hulmes, 2002. Preferiblemente, la cadena de colágeno expresada es una cadena alfa 1 y/o 2 de colágeno de tipo I . La cadena alfa de colágeno expresada se puede codificar mediante cualquiera de las secuencias de polinucleótidos derivadas de cualquier mamífero. Preferiblemente, las secuencias que codifican las cadenas alfa de colágeno son humanas y se exponen por la SEQ ID Nos: 1 y 4.

Típicamente, las cadenas de colágeno alfa expresadas en las plantas pueden o no pueden incluir sus propéptidos terminales (es decir propéptido C y propéptido N9) . Ruggiero y colaboradores (2000) notan que el procesamiento del procolágeno de la actividad proteolítica de la planta es diferente luego el procesamiento normal en el humano y que el propéptido C se remueve por la actividad proteolítica de la planta aunque el sitio de segmentación es desconocido. La segmentación del propéptido C puede tomar lugar sobre un péptido procolágeno antes del ensamblaje del trímero (asociación de tres C-Propéptidos es esencial para la iniciación del ensamblaje de los trímeros) . La segmentación del N-propéptido mediante la actividad proteolítica de la planta toma lugar en las plantas maduras pero no en las plantítas. Tal segmentación remueve dos aminoácidos de N telopéptido (2 de 17) . Los C-propéptidos (y a un menor grado los N-propéptidos) mantienen el procolágeno soluble durante su paso a través de la célula animal (Bulleid y colaboradores 2000) y se esperan que tengan un efecto similar en la célula de planta. Después o durante la secreción de las moléculas de procolágeno en la matriz extracelular, los propéptidos se remueven por las procolágeno N- y C-proteinasas, accionando de esta manera el autoensamble espontáneo de las moléculas de colágeno en fibrilos (Hulmes, 2002). La remoción de los propéptidos por las procolágeno N- y C-proteinasas reduce la solubilidad del procolágeno por >1000 veces y es necesario y suficiente iniciar el autoensamble del colágeno en las fibras. Crucial a este proceso de ensamblaje son los péptidos helicoidales no triples cortos llamados telopéptidos en los extremos del dominio helicoidal triple, que aseguran el registro correcto de las moléculas de colágeno dentro de la estructura de fibrilar y reducen la concentración crítica para el autoensamble (Bulleid y colaboradores 2000). La técnica previa describe el uso de pepsina para segmentar los propéptidos para la producción del colágeno (Bulleid y colaboradores 2000) . Sin embargo la pepsina daña los telopéptidos y como resultado, la pepsina extraída del colágeno es incapaz de formar estructuras fibrilares ordenadas (Bulleid y colaboradores 2000) . La proteína de disulfuro isomerasa (PDl) que. forma la subunidad beta de la P4H humana se mostró que une al C-propéptido antes de el ensamblaje del trímero de esta manera también actúa como un acompañante molecular durante el ensamblaje de la cadena (Ruggiero y colaboradores 2000) . El uso de procolágeno y N-proteinasa y el Procolágeno C-proteinasa expresado en unas plantas diferentes pueden generar colágeno que es más similar al colágeno humano nativo y puede formar estructuras fibrilares ordenadas.

En un caso donde los N o C propéptidos o ambos se incluyen en la cadena de colágeno expresada, la planta genéticamente modificada de la presente invención también puede expresar la proteasa respectiva (es decir C o N o ambas) . Las secuencias de polinucleótidos que codifican tales proteasas se ejemplifican por la SEQ ID Nos: 18 (proteasa C) y 20 (Proteasa N) . Tales proteasas se pueden expresar tal que se acumulan en el mismo compartimiento subcelular como la cadena de colágeno. La acumulación de la cadena de colágeno expresada en un compartimiento subcelular libre de la actividad de la P4H endógena se puede afectar por la vía de cualquiera de uno de varios procedimientos. Por ejemplo, la cadena de colágeno expresada puede incluir una secuencia de señal para dirigir la proteína expresada a un compartimiento subcelular tal como el apoplasto o una organela (cloroplasto). Ejemplos de secuencias de señal adecuadas incluyen el péptido de transito de cloroplasto (incluido Swiss-Prot entrada P07689, aminoácidos 1 - 57) y el péptido de tránsito Mitocondriano (incluido en Swiss-Prot entrada P46643, aminoácidos 1 - 28) . La sección de ejemplos que siguen proporciona ejemplos adicionales de secuencias de señal adecuadas así como guías para emplear tales secuencias de señal en la expresión de las cadenas de colágeno en las células de planta.

Alternativamente, la secuencia de la cadena de colágeno se puede modificar en cualquier manera que altere la localización celular del colágeno cuando se expresa en plantas . Como se menciona en lo anterior en la presente, la - ER de las plantas incluye una- P4H que es incapaz de hidroxilar correctamente las cadenas de colágeno. Las cadenas alfa de colágeno nativamente incluyen una secuencia de dirección ER que dirige el colágeno expresado en la ER donde se modifica postraduccionalmente (que incluye la hidroxilación incorrecta) . Así, la remoción de la secuencia de dirección ER conducirá a una acumulación citoplásmica de cadenas de colágeno que están libres de la modificación postraduccional que incluyen cualquiera de las hidroxilaciones . El ejemplo 1 de la sección de ejemplos que sigue describe la generación de secuencias de colágeno que están libre de las secuencias ER. Todavía alternativamente, las cadenas de colágeno se pueden expresar y acumular en una organela que contiene DNA tal como el cloroplasto o mitocondria. La descripción adiciona de la expresión de cloroplasto se proporciona enseguida en la presente. Como se menciona en lo anterior en la presente, la hidroxilación de las cadenas alfa es requerida para el ensamblaje de un colágeno de tipo I estable. Puesto que las cadenas alfa expresadas por la planta genéticamente modificada de la presente invención se acumulan en un compartimiento libre de la actividad de la P4H endógena, tales cadenas se deben aislar de la planta, el tejido de la planta o la célula y se hidroxilan in vitro. Tal hidroxilación se puede lograr mediante el método descrito por Turpeenniemi-Hujanen y Myllyla (Concomitant Hydroxilaton of proline and lisien residues in collagen usign purified enzymes in vitro. Biochim Biophys Acta. 16 de Julio de 1984; 800 (1) -.59-65) . Aunque tal hidroxilación in vitro puede conducir a cadenas de colágeno correctamente hidroxiladas, puede ser difícil y costoso lograrla. Para superar las limitaciones de la hidroxilación in vitro, la planta genéticamente modificada de la presente invención preferiblemente co-expresa la P4H que es capaz de hidroxilar correctamente la cadena (s) alfa de colágeno [es decir hidroxilar únicamente la posición de la prolina (Y) de los tripletes Gly-X-Y] . La P4H es una enzima compuesta de dos subunidades, alfa y beta. Ambas son necesarias para formar una enzima activa mientras que la subunidad Beta también posee una función acompañante. La P4H expresada por la planta genéticamente modificada de la presente invención es preferiblemente una P4H humano que se codifica por, por ejemplo, SEQ ID' s NO: 12 y 14. Además, los mutantes de P4H que exhiben la especificidad del substrato aumentada, o los homólogos de P4H también se pueden utilizar. Un homólogo de P4H adecuado se ejemplifica por una Arabidopsis oxidoreductasa identificada por el NCBl acceso NP_179363. La alineación de dos en dos de esta secuencia de proteína y una subunidad alfa de P4H humana conducida por los presentes inventores revelaron la homología más alta entre los dominios funcionales de cualquiera de los homólogos de de P4H conocidos de las plantas. Puesto que la P4H necesita acumularse con la cadena de colágeno expresada, la secuencia de codificación de la misma se modifica preferiblemente por consiguiente (la adición de las secuencias de señal, supresiones que pueden prevenir la dirección ER etc.). En las células mamíferas, el colágeno también se modifica por la Lisil hidroxilasa, galactosiltransferasa y glucosiltransferasa . Estas enzimas secuencialmente modifican los residuos de lisilo en posiciones específicas a los residuos de hidroxilisilo, galactosilhidroxilisilo y glucosilgalactosilhidroxilisilo . Una enzima humana individual, Lisil hidroxilasa 3 (LH3) pude catalizar todas las tres etapas consecutivas en la formación de carbohidratos enlazados con hidroxilisina .

Así, la planta genéticamente modificada de la presente invención preferiblemente también expresa la LH3 de mamífero. Una secuencia que codifica la LH3 tal como aquella expuesta por la SEQ ID NO: 22 se puede utilizar para tales propósitos . La(s) cadena (s) de colágeno y las enzimas modificantes descritas en lo anterior se pueden expresar a partir de un constructor de ácido nucleico establemente integrado o transientemente expresado que incluye secuencia de polinucleótido que codifican las cadenas alfa y/o modifican las enzimas (por ejemplo, P4H y LH3) colocadas bajo el control transcripcional de los promotores funcionales de la planta. Tal construcción de ácido nucleico (que también es llamado en la presente como un constructor de expresión) se puede configurar para la expresión por toda la planta completa, los tejidos de la planta definida o células de la planta definida, o en etapas desarrollo definidas de la planta. Tal constructor también puede incluir marcadores de selección (por ejemplo resistencia al antibiótico), elementos mejoradotes y un origen de replica para la replica bacteriana . Será apreciado que los constructores que incluyen dos insertos expresable (por ejemplo dos tipos de cadena alfa, o una • cadena alfa y P4H) preferiblemente incluyen un promotor individual para cada inserto, o alternativamente tales constructores pueden expresar una quimera de trascripción individual que incluye ambas secuencias de inserto desde un promotor individual. En tal cado, la trascripción quimérica incluye una secuencia IRES entre las dos secuencias de inserto tal que el inserto corriente abajo se puede trasladar desde la misma. Los promotores y mejoradores de expresión funcionales de planta numerosos que pueden ser ya sea tejido específico, desarrolladamente específico, constitutivo o inducible se pueden utiliza por los constructores de la presente invención, algunos ejemplos se proporcionan enseguida en la presente. Como se utiliza en la presente en la especificación y la sección de reivindicaciones que sigue la frase "promotor de planta" o "promotor" incluye un promotor que puede dirigir la expresión de genes en la célula de planta (que incluye organelas que contienen DNA) . Tal promotor se puede derivar de un origen de planta, bacteriano, viral, fungal o animal. Tal promotor puede ser constitutivo, es decir, capaz de dirigir el nivel alto de la expresión de genes en una pluralidad de tejidos de planta, tejido específico, es decir, capaz de dirigir la expresión de genes en un tejido o tejidos de plantas particulares, inducibles, es decir, capaces de dirigir la expresión de genes bajo un estimulo, o quimérica, es decir, formada de porciones de por lo menos dos promotores diferentes . Así, el promotor en planta empleados puede ser un promotor constitutivo, un promotor específico de tejido, un promotor inducible o un promotor quimérico. Ejemplos de promotores de planta constitutivos incluyen, sin que se limite a, promotores CaMC35S y CaMV19S, promotor FM34S, promotor badnavirus baciliforme de caña de azúcar, promotor CsVMV, promotor de actina Arabidopsis ACT2/ACT8, promotor UBQ1 de ubicuitina Arabidopsis, promotor BTH6 de tionina de hoja de cebada y promotor de actina de arroz . Ejemplos de promotores específicos de tejido incluyen, sin que se limite a, promotor de proteína de almacenamiento de faseolina de fríjol promotor de DLEC, promotor PHS, promotor de proteína de almacenamiento de zeína, promotor gama de conglutina de soya, promotor de genes AT2S1, promotor de actina ACTll de Arabidopsis , promotor napA de Brassica napus y promotor de genes de patatina de papa. El promotor inducible es un promotor inducido por un estímulo específico tal como condiciones de estrés que comprenden, por ejemplo, condiciones de luz, temperatura, químicas, de sequía, salinidad alta, choque osmótico, oxidantes o en el caso de patogenicidad e incluyen, sin que se limite a, promotor inducible de luz derivado del gen rbcS de guisante, el promotor del gen rbcS de alfalfa, los promotores DRE, MYC y MYB activos en la sequía; los promotores INT, INPS, presa, Hs hsp 17.7G4 y RD21 activos en la salinidad alta y el estrés osmótico, y los promotores hsr203J y str246C activos en el estrés patogénico. Preferiblemente el promotor utilizado para la presente invención es un promotor constitutivo fuerte tal que la sobre-expresión de los insertos constructores se efectúa después de la transformación de la planta. Será apreciado que cualquiera de los tipos de constructores utilizados en la presente invención se pueden co-transformar en la misma planta utilizando los mismos o diferentes marcadores de selección en cada tipo de construcción. Alternativamente el primer tipo de construcción se puede introducir en una primera planta mientras que el segundo tipo de construcción de construcción se puede introducir en una segunda planta isogénica, después de que las plantas transgénicas resultantes de lo mismo se pueden cruzar y la progenie se selecciona para los transformantes dobles. Las autocrüzas adicionales de tal progenie se pueden emplear para genera líneas homosigosas para ambas construcciones . Existen varios métodos para introducir construcciones de ácido nucleico en plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas (Potryus, I., Annu. Rev. Plant. Physiol., Plant. Mol. Biol. (1991) 42:205-225; Shimamoto colaboradores, Nature (1989) 338:274-276). Tales métodos dependen de ya sea la integración estable de la construcción de ácido nucleico o una porción de la misma en el genoma de la planta, o sobre la expresión transiente de la construcción de ácido nucleico en el caso que esta secuencia no se hereden por una progenie de la planta. Además, existen varios métodos en los que una construcción de ácido nucleico se puede introducir directamente en el DNA de una organela que contiene DNA tal como un cloroplasto. Existen dos métodos principales para efectuar la integración genómica estable de las secuencias exógenas tales como aquellas incluidas dentro de las construcciones de ácido nucleico de la presente invención de los genomas de planta: (i) Transferencia de gen mediada por Agrobacterium: Klee y colaboradores (1987) Aiinu. Rey. Plant Physiol. 38:467-486; Klee and Rogers in Ccli Culture y Somatic Celi Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, eds. Schell, J. , and Vasil, L. K. , Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 2-25; 18 Gatenby, in Plant Biotecbnoiogy, eds. Kung, S. and Arntzen, C. J. , Butterworth Publishers, Boston, Mass. (1989) p. 93-112. (ii) Captación de DNA directa: Paszkowski y colaboradores, en Cell Culture y Somatic Ccli Genetics of Piants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes eds.

Schell, J., and Vasil, L. K. , Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 52-68; que incluyen métodos para la captación directa de DNA en los protoplastos, Toriyama, K. y colaboradores (1988) Bio/Technology 6:1072-1074. Captación de DNA introducida por choque eléctrico breve de las células de planta: Zhang y colaboradores Plant Ceil Rep. (1988) 7:379-384. Fromm y colaboradores Nature (1986) 3 19:791-793. Inyección de DNA en las células o tejidos de la planta mediante bombardeo de partículas, Klein y colaboradores Bio/Technology (1988) 6:559-563; McCabe y colaboradores Bio/Technoiogy (1988) 6:923-926; Sanford, Physioi. Plant. (1990) 79:206-209; por el uso de sistemas de micropipetas : Neuhaus y colaboradores, Theor. Appl. Genet. (1987) 75:30-36; Neuhaus y Spangenberg, Physiol. Piant . (1990) 79:213-217; o por la incubación directa de DNA con el polen germinante, DeWet y colaboradores in Experimental Manipulation of Ovule Tissue, eds. Chapman, G. P. and Manteli, S. H. and Danieis, W. Longman, London, (1985) p. 197-209; and Ohta, Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1986) 83:715-719. El sistema de Agrobacterium incluye el uso de vectores de plásmido que contienen segmentos de DNA definidos que se integran en el DNA genómico de planta. Métodos de incubación del tejido de planta varían dependiendo en las especies de planta y el sistema de suministro de Agrobacterium . Un procedimiento altamente utilizado es el procedimiento de disco de hoja que se puede realizar con cualquier explanta de tejido que proporcione una buena fuente de la iniciación de la diferenciación de planta completa. Horsch y colaboradores es in Plant Molecular Bioiogy Manual AS, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988) p. 1-9. Un procedimiento suplementario emplea el sistema de suministro Agroba cteri um en combinación con la infiltración en vacío. El sistema Agrobacteri um es especialmente viable en la creación de plantas dicotiledóneas transgénicas. Existen varios métodos de transferencia de DNA directa en las células de planta. En la electroporación, los protoplastos se exponen brevemente a un campo eléctrico fuerte. En la microinyección, el DNA se inyecta mecánicamente de manera directa en las células que utilizan micropipetas muy pequeñas. En el bombardeo de micropartículas, el DNA se absorbe sobre los microproyectiles tales como cristales de sulfato de magnesio, partículas de tungstenos o partículas de oro, y los microproyectiles se aceleran físicamente en las células o tejidos de planta. Después se ejerce la propagación de la planta de transformación. El método más común de la propagación de la planta es mediante la semilla. La regeneración por la propagación de la semilla, sin embargo, tiene la deficiencia de que debido a la heterocigosidad existe una falta de uniformidad en cultivo, puesto que la semilla se produce por las plantas de acuerdo a las variaciones genéticas dirigidas por las reglas Mendelianas . Básicamente, cada seminal es genéticamente diferente y cada una crecerá con sus propios rasgos específicos. Por lo tanto, se prefiere que la planta transformada se produzca tal que la planta regenerada tenga los rasgos y características idénticos de la planta transgénica de origen. Por lo tanto, se prefiere que la planta transformada se regenere mediante la micropropagación que proporciona una reproducción consistente, rápida de las plantas transformadas. Los métodos de expresión transientes que se pueden utilizar para expresar transientemente el ácido nucleico aislado incluido dentro de la construcción de ácido nucleico de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, microinyección y bombardeo como se describe en lo anterior pero bajo condiciones que favorecen la expresión transiente, y la expresión mediada viral en donde un vector de virus recombinante empacado o no empacado que incluye la construcción de ácido nucleico se utiliza para infectar los tejidos o células de planta tal que un virus recombinante de propagación establecido en la misma expresa la secuencia de ácido nucleico no viral. Los virus que han sido mostrados por ser útiles para la transformación de los hospederos de planta incluyen CaMV, TMV y BV. La transformación de las plantas que utilizan los virus de planta se describen en U.S. Pat. No. 4,855,237 (BGV) , EP-A 67,553 (TMV), Japanese Published Application No. 63-14693 (TMV), EPA 194,809 (BV) , EPA 278,667 (BV) ; y Gluzman, Y. y colaboradores, Communications in Molecular Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pp. 172-189 (1988) . Las partículas de pseudovirus para el uso en el DNA foráneo de expresión en muchos hospederos, que incluyen plantas, se describe en WO 87/06261. La construcción de los virus de RNA de planta para la introducción y expresión de la secuencias de ácido nucleico exógenas no virales en las plantas se demuestra por las referencias anteriores así como Dawson, W. O. y colaboradores, Virology (1989) 172:285-292; Takamatsu y colaboradores EMBO J. (1987) 6:307-311; French y colaboradores Science (1986) 23 1:1294-1297; and Takamatsu y colaboradores FEBS Letters (1990) 269:73-76. Cuando el virus es un virus de DNA las construcciones se pueden hacer al virus por si mismo. Alternativamente, el virus primero se puede clonar en un plásmido bacteriano para la facilidad de construcción del vector viral deseado del DNA foráneo. El virus luego se puede eliminar del plásmido. Si el virus es un virus de DNA, un origen bacteriano de replica se puede unir al DNA viral, que luego se replica por las bacterias. La trascripción y traducción de este DNA producirá la proteína de recubrimiento que encapsidará el DNA viral. Si el virus es un virus de DNA, el virus generalmente se clona como un cDNA y se inserta en un plásmido. El plásmido luego se utiliza para hacer todas las construcciones. El virus de RNA luego se produce al transcribir la secuencia viral del plásmido y la traducción de los genes virales para producir la proteína (s) de recubrimiento que encapsida el RNA viral. La construcción de los virus de RNA de planta la introducción y expresión en las plantas de las secuencias de ácidos nucleicos exógenas no virales tales como aquellas incluidas en la construcción de la presente invención se demuestran por las referencias anteriores así como en la patente norteamericana No. 5,316,931. En una modalidad, se proporciona un ácido nucleico viral de planta en el que la secuencia de codificación de proteína de recubrimiento nativa ha sido suprimida de un ácido nucleico viral, una secuencia de codificación de proteína de recubrimiento viral de planta no nativa y un promotor no nativo, preferiblemente el promotor subgenómico la secuencia de codificación de proteína de recubrimiento no nativa, capaz de expresar en el hospedero de planta, empacar el ácido nucleico viral de planta recombinante, y asegurar una infección sistémica del hospedero mediante el ácido nucleico viral de planta recombinante, ha sido insertado. Alternativamente, el gen de proteína de recubrimiento se puede inactivar mediante la inserción de la secuencia de ácido nucleico no nativa dentro de él, tal que una proteína se produce. El ácido nucleico viral de planta recombinante puede contener uno o más promotores subgenómicos no nativos adicionales . Cada promotor subgenómico no nativo es capaz de transcribir o expresar genes adyacentes o secuencias de ácido nucleico en el hospedero de planta e incapaces de la recombinación entres sí y los promotores subgenómicos no nativos. Las secuencias de ácido nucleico no nativos (foráneos) se pueden insertar adyacentes al promotor subgenómico viral de planta nativa o los promotores subgenómicos virales de planta nativos y no nativos sin más de una secuencia de ácido nucleico se incluyen. Las secuencias de ácido nucleico no nativo se transcriben o se expresan en la planta hospedera bajo el control del promotor subgenómico para producir los productos deseados. En una segunda modalidad, un ácido nucleico viral de planta recombinante se proporciona como en la primera modalidad excepto que la secuencia de codificación de proteína de recubrimiento nativa se coloca adyacente a uno de los promotores subgenómicos de proteína de recubrimiento no nativos en lugar de una secuencia de codificación de proteína de recubrimiento no nativa. En una tercera modalidad, se proporciona un ácido nucleico viral de planta recombinantes en el que el gen de proteína de recubrimiento nativo está adyacente a su promotor subgenómico y uno o más promotores subgenómicos no nativos han sido insertados en el ácido nucleico viral. Los promotores subgenómicos no nativos insertados son capaces de transcribir o expresar genes adyacentes en un hospedero de planta y son incapaces de la recombinación entre sí y con los promotores subgenómicos nativos. Las secuencias de ácido nucleico no nativo se pueden insertar adyacentes a los promotores virales de plantas subgenómicos no nativos tal que las secuencias se transcriben y se expresan en la planta hospedero bajo el control de los promotores subgenómicos para producir el producto deseado. En una cuarta modalidad, se proporciona un ácido nucleico viral de planta recombinante como en la tercera modalidad excepto que la secuencia de codificación de proteína de recubrimiento nativa se reemplaza por una secuencia de codificación de recubrimiento no nativa. Los vectores virales se encapsidan por las proteínas de recubrimiento codificadas por el ácido nucleico viral de planta recombinante para producir un virus de planta recombinante. El ácido nucleico viral de planta recombinante o el virus de planta recombinante se utiliza para infectar las plantas hospederas apropiadas. El ácido nucleico viral de planta recombinante es capaz de la replica en el hospedero, propagación sistémica en el hospedero, y la transcripción o expresión del (os) gen (es) foráneo (s) (ácido nucleico aislado) en el hospedero 'para producir la proteína deseada. Una técnica para introducir las secuencias de ácido nucleico exógenas al genoma de los cloroplastos es conocida. Esa técnica involucra los procedimientos siguientes. Primero, las células de planta se tratan químicamente para reducir el número de cloroplastos por célula a aproximadamente 1. Luego, el ácido nucleico exógeno se introduce por la vía del bombardeo de partículas en las células con el propósito de introducir por lo menos una molécula de ácido nucleico exógena en los cloroplastos. El ácido nucleico exógeno se selecciona tal que es integrable en el genoma del cloroplasto por la vía de la recombinación homologa que fácilmente se afecta por las enzimas heredadas al cloroplasto. Para este fin, el ácido nucleico exógeno incluye, además de un gen de Interés, por lo menos un alargamiento de ácido nucleico que se deriva del genoma del cloroplasto. Además, el ácido nucleico exógeno incluye un marcador seleccionable, que sirve para los procedimientos de selección secuénciales para determinar todo o sustancialmente todas las copias de los genomas de cloroplasto después de tal selección incluirán el ácido nucleico exógeno. Los detalles adicionales que se relacionen a esta técnica se encuentran en las patentes norteamericanas Nos. 4,945,050; y 5,693,507 que se incorporan en la presente por referencia. Un polipéptido así puede producir mediante el sistema de expresión de proteína del cloroplasto y llegan a ser integrados en la membrana interior del cloroplasto. Los procedimientos de transformación descritos en lo anterior se pueden' utilizar para producir cadenas de colágeno y/o enzimas de modificación así como colágeno ensamblado (con o sin propéptidos) en cualquiera de las especies de planta, o tejido de planta o célula de plantas aisladas derivadas de las mismas. Las plantas preferidas son aquellas que son capaces de acumular grandes cantidades de cadenas de colágeno, colágeno y/o las enzimas de procesamiento descritas en la presente. Tales plantas también se pueden seleccionar de acuerdo a su resistencia a las condiciones de estrés y la facilidad en la que los componentes expresados o colágeno ensamblado se pueden extraer. Ejemplos de plantas preferidas incluyen, Tabaco, Maíz, alfalfa, Arroz, Papa, Soya, Tomate, Trigo, Cebada, Cañóla y Algodón. Las fibras de colágeno se utilizan extensivamente en la industria de la alimentación y cosméticos. Así, aunque los componentes de fibra de colágeno (cadenas alfa) y las enzimas de modificación expresadas por las plantas encuentran utilizada en la síntesis industrial del colágeno, la producción de colágeno completa en las plantas se prefiere por su simplicidad y efectividad de costo.

Varios procedimientos se pueden utilizar para generar el colágeno de tipo I en las plantas. Por ejemplo, la cadena alfa 1 de colágeno se puede aislar de una planta que expresa alfa 1 y P4H de colágeno (y opcionalmente LH3) y se mezcla con una cadena alfa 2 de colágeno que se aisla de una planta que expresa alfa 2 y P4H de colágeno (y opcionalmente LH3 y proteasa C y/o N) . Puesto que la cadena alfa 1 de colágeno por si misma se ensambla en una triple hélice por si misma, puede ser necesario desnaturalizar tal homotrímero antes de mezclar y renaturalizar con la cadena alfa 2 de colágeno. Preferiblemente, una primera planta que expresa alfa 1 y P4H de colágeno (y opcionalmente LH3 y proteasa C y/o N) se puede cruzar con una segunda planta (y preferiblemente isogénica) que exprese alfa 2 de colágeno o alternativamente, una primera planta que exprese ambas cadenas alfa se pueden cruzar con una segunda planta que exprese P4H y opcionalmente LH3 y proteasa C y/o N. Se debe mencionar que aunque los procedimientos de reproducción de planta descritos en lo anterior utilizan dos plantas individualmente transformadas, los procedimientos que utilizan tres o más plantas individualmente transformadas, cada uno que expresan uno o dos componentes también se pueden utilizar. Uno de habilidad ordinaria en la técnica estaría bien consiente de varias técnicas de reproducción de planta y como tal ninguna descripción adicional de tales técnicas se proporciona en la presente. Aunque los procedimientos de reproducción de plantas se prefieren, se debe mencionar que una planta individual que expresa alfa 1 y 2 de colágeno, P4H y LH3 (y opcionalmente proteasa C y/o N) se puede general por la vía de varios eventos de formación cada uno diseñado para introducir uno o más componentes expresables en la célula. En tales casos, la estabilidad de cada evento de transformación se puede verificar utilizando los marcadores de selección específicos . En cualquier caso, la transformación y los procedimientos de reproducción de planta se pueden utilizar para generar cualquier planta, que exprese cualquier número de componentes . Actualmente preferidas son las plantas que expresan cadenas alfa 1 y 2 de colágeno P4H, LH3 y por menos una proteasa (por ejemplo proteasa C y/o N) . Como se describe adicionalmente en la sección de ejemplos que sigue, tales plantas acumulan colágeno que exhibe la estabilidad a temperaturas de hasta 42 °C. La progenie que resulta de la reproducción o alternativamente las plantas transformadas múltiples se puede seleccionar, al verificar la presencia de mRNA exógeno y/o polipéptidos al utilizar sondas de ácido nucleico o proteína (por ejemplo anticuerpos) . El último procedimiento se prefiere puesto que permite la localización de los componentes de polipéptidos expresados (mediante por ejemplo, extractos de plantas fraccionados con el sondeo, y así también verifica un potencial para procesamiento y ensamblaje correcto. Ejemplos de sondas adecuadas se proporcionan en la sección de ejemplos que siguen. Una vez que la progenie que expresa colágeno se identifica, tales plantas se cultivan adicionalmente bajo condiciones que maximizan la expresión de las cadenas de colágeno así como la modificación de las enzimas. Puesto que la acumulación de prolina libre puede facilitar sobre la producción de las proteínas ricas de prolina diferentes que incluyen las cadenas de colágeno expresadas por las plantas genéticamente modificadas de la presente invención, las condiciones de cultivo preferidas son aquellas que incrementan la acumulación de prolina libre en la planta cultivada. La prolina libre se acumula en una variedad de plantas en respuesta a una amplia gama de estreses ambientales que incluyen la desprivación de agua, salinización, baja temperatura, alta temperatura, infección con patógenos, toxicidad de metal pesado, anaerobiosis, deficiencia de nutrientes, contaminación atmosférica, e irradiación UV (Haré y Cress, 1997) .

La prolina libre también se puede cumular en respuesta al tratamiento de la planta o suelo con componentes tales como ABA o compuestos que inducen estrés tales como sal de cobre, paracuato, ácido salicílico y los similares. Así, la progenie que expresa colágeno se puede desarrollar bajo condiciones de estrés diferentes (por ejemplo concentraciones diferentes de NaCl que varía de 50 mM hasta 250 mM) . A fin de aumentar adicionalmente la producción de colágeno, el efecto de varias condiciones de estrés sobre la expresión de colágeno se examinará y se y se optimizará con respecto a la viabilidad de la planta, la biomasa y la acumulación de colágeno. Los tejidos/células de planta preferiblemente se cosechan en madurez, y las fibras de colágeno se aislan utilizando los procedimientos de extracción de la técnica previa bien conocida, un procedimiento tal se detalla enseguida. Las hojas de plantas transgénicas se muelen a un polvo bajo nitrógeno líquido y el homogenado se extrae en 0.5 M de ácido acético que contiene 0.2 M NaCl durante 60 horas a 4°C. El material insoluble se remueve mediante centrifugación. El sobrenadante que contiene el colágeno recombinante se fracciona con sal a 0.4 M y 0.7 M NaCl. El precipitado de 0.7 M NaCl que contiene el colágeno heterotrimérico recombinante, se disuelve en y se dializa contra 0.1 M de' ácido acético y se almacena -20 °C (después de Ruggiero y colaboradores 2000). Los objetivos, ventajas, y características novedosas adicionales de la presente invención llegarán a ser evidentes a uno de habilidad ordinaria en- la técnica en el examen de los siguientes ejemplos, que no se proponen ser limitativos. Adicionalmente, cada una de las diversas modalidades y aspectos de la presente invención como se definen en lo anterior en la presente y se reclaman en la sección de reivindicaciones enseguida encuentran soporte experimental en los siguientes ejemplos. EJEMPLOS La referencia ahora se hace a los siguientes ejemplos, que conjuntamente con las descripciones anteriores, ilustran la invención en un modo no limitativo. Generalmente, la nomenclatura utilizada en la presente y en los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluye las técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y recombinantes de DNA. Tales técnicas se explican completamente en la literatura. Ver por ejemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook y colaboradores, (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes 1-111 Ausubel, R. M. , ed. (1994); Ausubel y colaboradores "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989) ; Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson y colaboradores "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren y colaboradores (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998) ; metodologías como se exponen en las patentes norteamericanas Nos. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 y 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes 1-111 Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocois in Immunology" Volumes 1-111 Coligan J. E., ed. (1994); Stites y colaboradores (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994) ; Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H.

Freeman and Co., New York (1980); los inmunoensayos disponibles se describen extensivamente en la patente y la literatura científica, ver, por ejemplo, las patentes norteamericanas Nos. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 y 5,28 1,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J. , cd. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D. , and Higgins S. J. , eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. 1., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak y colaboradores "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996) ; todas de las cuales se incorporan por referencia como se exponen completamente en la presente. Otras referencias generales se proporcionan por todo este documento. Los procedimientos en la presente se creen que son bien conocidos en la técnica y se proporcionan para la conveniencia del lector. Toda la información contenida en la presente se incorpora en la presente por referencia. EJ?MPLO 1 Constxr cciones y Esquemas de Las construcciones de casetes y vectores de expresión utilizados en este trabajo se ilustran en la Figura la-d. Todas las secuencias de codificación en este trabajo se optimizaron para la expresión en el tabaco y se sintetizaron químicamente con las regiones flanqueantes deseadas (SEQ ID Nos: 1, 4, 7, 12, 14, 16, 18, 20, 22) La Figura la - la codificación de genes sintéticos para Coll y Col2 (SE ID' s 1, 4) fusionadas ya sea a la señal vacuolar o a la señal del apoplasto (codificadas por SEQ ID NO: 7) o sin señales se clonaron en los casetes de expresión compuestos de un promotor rbcAl de crisantemo y 5' UTR (SE ID NO: 10) y un 3' UTR rbcSl de crisantemo y un terminador (SEQ ID NO: 11). Los casetes de expresión completos se clonaron en el sitio de clonación múltiple del vector de transformación de planta pBINPLUS (van Encelen y colaboradores, 1995, Transgenic Res 4: 288-290). Figura lb - la codificación de genes sintéticos para el P4H humano, P4H alfa humano y P4H de planta (SEQ ID NOs: 12, 14 y 16) fusionado ya sea a la señal vacuolar o a la señal del apoplasto (codificada por SEQ ID NO: 7) o sin señales se clonaron en cásete de expresión compuestos del promotor sea CaMV 35S y la secuencia omega TMV y el terminador de Nopalina sintasa Agrobacterium (NOS) llevado por el vector pJD330 (Galili y colaboradores, 1987, Nucleic Acids Res 15: 3257—3273). Los casetes de expresión completa se clonaron en el sitio de clonación múltiple de los vectores pBINPLUS que llevan los casetes de expresión de Coll or Col2. Figura lc - la codificación de genes sintéticos para la proteinasa C y la proteinasa N (SEQ ID NOs: 18, 20) fusionadas ya sea a la señal vacuolar o a la señal de apoplasto (codificada por SEQ ID NO: 7) se clonaron en los casetes de expresión compuestos de un promotor de crisantemo rbcSl y 5' UTR (SEQ ID NO: 10) y 3' UTR y terminador de crisantemo rbcSl (SEQ ID NO: 11) . Los casetes de expresión completes se clonaron el sitio de clonación múltiples del vector de transformación de planta pBINPLUS. Figure Id - la codificación de genes sintéticos para LH3 (SEQ ID NO: 22) con el promotor de virus de banda de vena de fresa de flanqueo (SVBV) (NCBl acceso a AF33 1666 REGIÓN: 623..950 versión AF33 1666.1 Gl : 13345788) y terminado por el terminador de octopina sintasa Agrobacterium (OCS) (NCBl acceso Z37515 REGIÓN: versión 1344. Z37515.1 01:886843) fusionado ya sea a la señal vacuolar o a la señal de apoplasto (codificada por la SEQ ID NO: 7) o sin señales se clonaron en el sitio de clonación múltiples del vector pBINPLUS que lleva los casetes de expresión de Coll y P4H beta. Los esquemas de co-transformaciones que utilizan los casetes de expresión descritos en la Figura 1 y una planta hospedera se ilustra en la Figura 2. Cada inserto de cásete se representa por un nombre corto de la secuencia de codificación. Las secuencias de codificación y la SEQ ID Nos relacionada se describen en la Tabla 1. Cada co-transformación se realiza por los vectores binarios pBINPLUS. Cada rectángulo representa un vector pBINPLUS individual que lleva uno, dos o tres cásete de expresión. Los promotores de promotores y terminadores se especifican en la Figura 1. EJEMPLO 2 Expresión del Colágeno de Planta Las secuencias de polinucleótidos sintéticas que codifican las proteínas listadas en la Tabla 1 enseguida se diseñaron y se optimizaron para la expresión en las plantas de tabaco. Tabla 1 — Lista de proteínas expresadas Péptidos de señal (i) secuencia de señal de vacuola del gen de la cebada para el precursor de aleuraina de Tiol proteasa (NCBl acceso P05167 Gl : 113603) MAHARVLLLALAVLATAAVAVASSSSFADSNPIRPVTDRAASTLA (SEQ ID NO: 24) . (ii) Señal de apoplasto de la endo-1, 4-beta- glucanasa Arabidopsis thaliana (Célula, NCBl acceso CAA67156.1 Gl: 2440033) ; SEQ ID NO. 9, codificado por la SEQ ID NO. 7. Construcción de los plásmidos Los vectores de expresión de planta se construyeron como se enseña en el ejemplo 1, la composición de cada vector de expresión construido se confirmó por la vía del análisis y secuenciación de restricción. Se construyeron vectores de expresión que incluyen los siguientes casetes de expresión: 1. Alfa 1 colágeno 2. Alfa 1 + subunidad beta P4H humana 3. Alfa 1 + subunidad beta P4H humana + LH3 humana 4. Alfa 2 colágeno 5. Alfa 2 colágeno + con subunidad alfa P4H humana 6. Alfa 2 colágeno + con P4H Arabidopsis 7. Subunidad beta P4H humana + LH3 humana 8. Subunidad alfa P4H humana. Cada una' de las secuencias de codificación descritas en lo anterior fueron ya sea fusionadas traduccionalmente a un péptido de transito de vacuola o a un péptido de tránsito de apoplasma o estuvieron libres de cualquiera de las secuencias de transito, caso en el cual la acumulación citoplásmica se espera. Transformación de la planta y clasificación det la PCR Plantas de tabaco (Nicotiana tabacum, Samsun NN) se transformaron con los vectores de expresión descritos en lo anterior de acuerdo al esquema de transformación enseñado en la Figura 2.

Las plantas transgénicas resultantes se clasificaron por la vía de la PCR múltiple utilizando cuatro cebadores que se diseñaron capaces de amplificar un fragmento 324bp de alfa 1 de Colágeno y un fragmento 537bp de alfa 2 de Colágeno (Tabla 2) . La Figura 3 ilustra los resultados de una clasificación de PCR múltiple. Tabla 2 - Lista de cebadores para la PCR múltiple para la amplificación de un fragmento 324bp de alfa 1 de Colágeno y un fragmento 537bp de alfa 2 de Colágeno EJ?MPLO 3 Detección de colágeno humano en plantas de tabaco transgéni cas Las proteínas solubles totales se extrajeron de los transformantes de tabaco 2, 3 y 4 al moler 500 mg de hojas en 0.5 ml Tris-HCl 50 mM pH=7.5 con un cóctel inhibidor de proteasa "completo" (producto #1836145 de Roche Diagnostics GMBH, una tableta por 50 ml de solución reguladora) . El extracto crudo se mezcló con 250 µl de solución reguladora de aplicación de muestra 4X que contiene 10% de beta-mercapto- etanol y 8% de SDS, las muestras se hirvieron durante 7 minutos y se centrifugaron durante 8 minutos en 1300 rpm. 20 µl del sobrenadante se cargaron en un gel de poliacrilamida al 10% 7 se probaron con el anticuerpo anti-Colágeno I (desnaturalizado) (#AB745 de Chemicon Inc.) en un procedimiento de manchado de Western estándar (Figura 4) . W.T. es un tabaco de tipo silvestre. Las bandas de colágeno positivas son visibles en las plantas que son positivas a la PCR para el alfa 1 o el alfa 2 de colágeno de tipo I o ambos. La banda de control positiva de 500ng de colágeno del tipo I de la placenta humana (#CC050 de Chemicon Inc.) representa aproximadamente 0.3% de las proteínas solubles totales (aproximadamente 150 µg) en las muestras de las plantas transgénicas . Las plantas que expresan colágeno en el peso molecular esperado hasta ~1% de las proteínas solubles totales se detectaron cuando el colágeno se dirigió a la vacuola (Figura 4) . La dirección subcelular del colágeno de longitud completa al apoplasto se logró exitosamente (Figura 5) . Las plantas que expresan colágeno en el citoplasma (es decir péptido no objetivo) no se acumuló al colágeno a niveles detectables que muestran que el objetivo subcelular del colágeno en las plantas es crítico para el éxito. Además en contraste a los estudios de Ruggiero y colaboradores 2000 y Merle y colaboradores 2002 los cuales mostraron que el colágeno que carece del N-propéptido se sometió a la proteolisis significante, utilizando el presente procedimiento de proteínas de colágeno de longitud completa con el C-propéptido y el N-propéptido acumulados en los compartimientos subcelulares en niveles altos. Los presentes datos también muestran claramente que la cruza de dos plantas cada una que expresa un tipo de cadena de colágeno diferente es ventajosa en que permite la selección de plantas que expresan niveles óptimos de cada tipo de • cadena y la cruza de plantas subsecuentes para lograr la planta que produce colágeno deseado. El colágeno producido por las plantas de la presente invención incluye las propiedades nativas y por lo tanto se espera que forme una proteína más grande que el control humano que se purificó mediante la proteolisis. El peso molecular calculado de las cadenas alfa 1 y alfa 2 de colágeno sin las hidroxilaciones o glicosilaciones son las siguientes: Coll con propéptidos - 136kDa, Coll sin propéptidos - 95kDa, Coll con propéptidos - |27kDa, col2 sin propéptidos - 92kDa. Como se puede observar en las Figuras 4, las bandas Coll en los transformantes 3-5 y 3-49 parecen más grandes que las bandas Coll en otras plantas. Esto indica que la hidroxilación de prolinas en las cadenas de colágeno por la holoenzima prolina-4-hidroxilasa humana compuesta de subunidades alfa y beta que se co-expresaron en estas plantas y se dirigieron al mismo compartimiento celular como las cadenas de colágeno humana (por ejemplo vacuola). EJEMPLO 4 Ensamble de triple hélice de colágeno y estabilidad térmica en las plantas transgénicas El ensamble de la triple hélice de colágeno y la estabilidad térmica de hélice en las plantas transgénicas se probaron para la desnaturalización térmica seguida por la digestión de tripsina o pepsina del extracto de proteína crudo total de las plantas transgénicas (Figuras 6a-b) . En un primer experimento, las proteínas solubles totales del tabaco 2-9 (que expresan únicamente alfa 1 col y no P4H) y 3-5 (que expresan tanto alfal + 2 col y P4) se extrajeron al moler 500 mg de hojas en 0.5 ml de Tris-HCl 50 mM pH=7.5, al centrifugar durante 10 minutos en 1300 rpm y al recolectar el sobrenadante. 50 µl del sobrenadante se sometieron al tratamiento con calor (15 minutos en 33 °C o 43 °C) y luego se colocaron inmediatamente sobre hielo. La digestión de Tripsina se inició al adicionar a cada muestra 6 µl de 1 mg/ml de Tripsina en Tris-HCl 50 mM pH07.5. Las muestras se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente (aproximadamente 22°C) . La digestión se terminó mediante la adición de 20 µl de solución reguladora de aplicación de muestra 4X que contiene 10% de betamercaptoetanol y 8% de SDS, las muestras se hirvieron durante 7 minutos y se centrifugaron durante 7 minutos a 1300 rpm. 50 µl del sobrenadante se cargaron sobre un gel de poliacrilamida al 10% y se probaron con el anticuerpo anti-Colágeno 1 (#AB745 de Chemicon Inc.) utilizando un procedimiento de manchado de Western estándar. Los controles positivos fueron las muestras de ~500 ng de colágeno I humano (#CC050 de Chemicon Inc., extraído de la placenta humana mediante la digestión de pepsina) que se adicionó a 50 µl de las proteínas solubles totales extraídas del tabaco w.t. Como se muestra en la Figura 6a, la triple hélice de colágeno que se formó en las plantas #3-5 así como el colágeno humano de control fue resistente a la desnaturalización a 33 °C. En contraste, el colágeno formado por las plantas #2-9 se desnaturalizo a 33°C. Esta diferencia en la Estabilidad térmica indica un ensamble de triple hélice exitoso y la hidroxilación de la prolina postraduccional en los transformantes #3-5 que expresan tanto alfa 1 de colágeno como alfa 2 de colágeno así como subunidades beta y alfa P4H. Dos bandas en los transformantes #2-9 pueden representar dímeros o trímeros, que son estables después de 7 minutos de ebullición con SDS y mercaptoetanol . Bandas similares son visibles en el colágeno humano (panel superior) y en los transformantes #3-5. Una explicación posible es un enlace covalente entre dos péptidos en hélices triples diferentes (reticulación) formadas después de la desaminación oxidante de dos lisinas por la Lisina oxidasa. En un segundo experimento, las proteínas solubles del tabaco transgénico 13-6 (que expresan las cadenas alfa 1 y alfa 2 de colágeno 1 - indicadas por flechas, las subunidades alfa y beta P4H humana y LH3 humana) se extrajeron al moler 500 mg de hojas en 0.5 mo de Tris-HCl 100 mM pH=7.5 y NaCl 300 mM, al centrifugar durante 7 minutos a 10000 rpm y a recolectar el sobrenadante 50 µl del sobre nadante se sometió al tratamiento con calor (20 minutos en 33°C, 38 °C o 42°C) y luego se colocó inmediatamente sobre hielo. La digestión de pepsina se inicio al adicionar a cada muestra 4.5 µl de HCl 0.1 M y 4 µl de 2.5 mg/ml de pepsina en ácido acético 10 M. Las muestras se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente (aproximadamente 22°C). La digestión se terminó al adicionar 5 µl de Tris 1 M no regulado. Cada muestra se mezcló con 22 µl de solución reguladora de aplicación de muestra 4X que contiene 10% de beta-mercapto-etanol y 8% de SDS, se hirvieron durante 7 minutos y se centrifugaron durante 7 minutos en 1300 rpm. 40 µl del sobrenadante se cargaron en un gen de poliacrilamida al 10% y se probaron con el anticuerpo anti-Colágeno I (#AB745 de Chemicon Inc.) en un procedimiento de manchado de Western estándar. El control positivo fue la muestra de ~50 ng de colágeno I humano (#CC050 de Chemicon Inc., extraído de la placenta humana mediante la digestión de pepsina) adicionado a las proteínas solubles totales del tabaco w.t. Como se ilustra en la Figura 6b, la triple , hélice de colágeno que se formó en la planta #13-6 fue resistente a la desnaturalización a 42 °C. La segmentación de los propéptidos primero es visible a 33 °C y gradualmente se incrementa en eficiencia cuando la temperatura se eleva a 38 °C y nuevamente a 42 °C. El dominio de triple hélice de colágeno segmentado muestra una migración similar sobre el gel a la migración de la pepsina tratada con colágeno humano. El colágeno humano que se utilizó en este experimento se extrajo de la placenta humana mediante la proteolisis de pepsina y por lo tanto carece de los propéptidos y algunos de los telopéptidos. EJEMPLO 5 Expresión P4H de planta Inducción de la P4H de planta nativa El cDNA de P4H de tabaco se clonó y se utilizó como una sonda para determinar las condiciones y tratamientos que inducirían la expresión P4H endógena. El análisis del manchado del norte (Figura 7) claramente muestra que la P4H se expresa en niveles relativamente altos en el ápice del retoño y en niveles bajos en las hojas. El nivel P4H se indujo significantemente en las hojas 4 horas después del tratamiento de abrasión ("lesionado" en el panel inferior) .

Resultados similares se lograron utilizando otras condiciones de estrés (no mostradas) . Detección de subunidades alfa y beta de P4H humana y cadenas alfa 1 y alfa 2 de colágeno en las plantas de tabaco transgénicas La detección de las subunidades alfa y beta de P4H humana y las cadenas alfa 1 y alfa 2 de colágeno de tipo I en las plantas de tabaco transgénicas se efectuaron utilizando el anticuerpo de subunidad alfa de P4H antihumana (#63-163 de ICN Biomedicals Inc.), el anticuerpo de subunidad beta de P4H antihumano (#MAB2701 de Chemicon Inc.) y el anticuerpo anti-Colágeno I (#AB745 de Chemicon Inc.) . Los resultados de un manchado de Western probado con estos anticuerpos se muestra en la Figura 8. La expresión de las bandas de alfa P4H, beta P4H y alfa 1 y alfa 2 de colágeno I se confirmó en la planta 13-6 (también transformada con LH32 humano) . Los pesos moleculares calculados de la alfa y beta P4H que incluyen el péptido de señal vacuolar son 65.5 kDa y 53.4 kDa respectivamente. Los pesos moleculares calculados de las cadenas alfa 1 y alfa 2 de colágeno con propéptidos, sin las hidroxilaciones o glicosilaciones son 136 kDa y 127 kDa respectivamente. Se aprecia que ciertas características de la invención, que son, por claridad, descritas en el contexto de modalidades separadas, también se puede proporcionar en combinación en una modalidad individual. A la inversa, varias características de la invención, que son, por brevedad, descritas en el contexto de una modalidad individual, también se pueden proporcionar separadamente o en cualquier subcombinación adecuada. Aunque la invención ha sido descrita en conjunción con modalidades específicas de la misma, es evidente que muchas alternativas, modificaciones y variaciones serán evidentes para aquellos expertos en la técnica. Por consiguiente, se propone incluir todas de tales alternativas, modificaciones y variaciones que caen dentro del espíritu y amplio alcance de las reivindicaciones adjuntas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente y números de acceso de GenBank mencionados en esta especificación se incorporan en la presente en su totalidad por referencia en la especificación, al mismo grado como si cada publicación individual, patente o solicitud de patente o número de acceso de GenBank fuera específicamente e individualmente indicado para ser incorporado en la presente por referencia. Además, la cita o identificación de cualquier referencia en esta solicitud no será considerada como una admisión de que tal referencia es disponible como técnica previa a la presente invención. REFERENCIAS (otras referencias son citadas en el documento) 1. Bulleid NJ, John DC, Kadier KE. Recombinant expression systems for the production of collagen. Biochem Soc Trans. 2000;28 (4) : 350-3. Review. PMID: 10961917 [PubMed - indexed for MEDLINE] 2. Haré PD, Cress WA. Metabolic implications of stress-induced proline accumulation in plants . Plant Growth Regulation 1997; 21: 79-102. 3. Hieta R, Myllyharju J. Cloning and characterization of a low molecular weight prolyl 4-hydroxylase from Arabidopsis thaliana. Effective hydroxylation of proline-rich, collagen-like, and hypoxia-inducible transcription factor alpha-like peptides. J Biol Chem. 2002 Jun 28 ; 277 (26) : 23965-71. Epub 2002 Apr 25. PMID: 11976332 [PubMed - indexed for MEDLINE] 4. Hulmes DJ. Building collagen molecules, fibrils, and suprafibrilarr structures. J Struct Biol. 2002 Jan-Feb; 137 (1- 2):2-10. Review. PMID: 12064927 [PubMed - indexed for MEDLINE] 5. Inkinen K. Connective tissue formation in wound healing. An experimental study. Academic Dissertation, September 2003. University of Helsinki, Faculty of Science, Department of Biosciences, División of Biochemistry (ISBN 952-10-1313-3) ttp : //et esis .helsin i . fi/julkaisut/mat/bioti/vk/inkinen/ 6. Mene C, Perret 5, Lacour T, Jonval V, Hudaverdian S, Garrone R, Ruggiero F, Theisen M. Hydroxylated human homotrimeric collagen 1 in Agrobacterium tumefaciens-mediated transient expression and in transgenic tobáceo plant. FEBS Lett. 2002 Mar 27 ; 515 (1-3) : 114-8. PMID: 11943205 [PubMed -indexed for MEDLINE] 7. Olsen D, Yang C, Bodo M, Chang R, Leigh 5, Baez J, Carmichael D, Perala M, Hamalainen ER, Jarvinen M, Polarek J.

Recombinant collagen and gelatin for drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 2003 Nov 28 ; 55 (12 ): 1547-67. PMID: 14623401 [PubMed - in process] 8. Ruggiero F, Expósito JY, Boumat P, Gruber V, Perret S, Comte J, Olagnier B, Garrone R, Theisen M. Triple helix assembly and processing of human collagen produced in transgenic tobáceo plants. FEBS Lett. 2000 Mar 3;469(1) :132-6. PMID: 10708770 [PubMed - indexed for MEDLINE] 9. Tanaka M, Sato K, Uchida T. Plant prolyl hydroxylase recognizes poly(L proline) II helix. J Biol Chem. 1981 Nov 25;256(22) :11397-400. PMID: 6271746 [PubMed - indexed for MEDLINE] 10. Wang C, Luosujarvi H, Heikkinen J, Risteli M, Uitto L, Myllyla R. The third activity for lysyl hydroxylase 3: galactosylation of hydroxylysyl residues in collagens in vitro. Matrix Biol. 2002 Nov; 21 (7) : 559-66. PMID: 12475640 [PubMed - indexed for MEDLINE]

Claims (4)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para producir colágeno en una planta o una célula de planta aislada, caracterizado porque comprende dirigir a una vacuola de la planta o la célula de planta aislada por lo menos un tipo de una cadena de colágeno y una P4H exógena para permitir la hidroxilación del por lo menos un tipo de la cadena de colágeno por la P4H exógena y no por una P4H endógena de la planta o célula de planta aislada, para producir de esta manera el colágeno en la planta. 2. Una planta genéticamente modificada o una célula de planta aislada, caracterizada porque comprende en una vacuola de la misma: (i) por lo menos un tipo de una cadena de colágeno; y (ii) una P4H exógena. 3. Un sistema de planta, caracterizado porque comprende : una primera planta genéticamente modificada que comprende en una vacuola de la misma: (i) una cadena alfa 1 de colágeno; y (ii) una P4H exógena; y una segunda planta genéticamente modificada que comprende en una vacuola de la misma: (i) una cadena alfa 2 de colágeno; y (ii) una P4H exógena. 4. Un método para producir colágeno fibrilar, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar el sistema de planta de la reivindicación 3; (b) cruzar la primera planta y la segunda planta; y (c) seleccionar la progenie que expresa la cadena alfa 1 de colágeno y la cadena alfa 2 de colágeno para producir de esta manera colágeno fibrilar. 5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque cada una de la cadena alfa 1 de colágeno y la cadena alfa 2 de colágeno comprende un péptido de señal para la dirección a la vacuola. 6. Un sistema de planta, caracterizado porque comprende : una primera planta genéticamente modificada que comprende en una vacuola de la misma: (i) una cadena alfa 1 de colágeno; y (ii) una cadena alfa 2 de colágeno; y una segunda planta genéticamente modificada que comprende en una vacuola de la misma una P4H exógena. 7. - El sistema de planta de conformidad con la reivindicación 3 o 6, caracterizado porque cada una de la primera planta genéticamente modificada y la segunda planta genéticamente modificada independientemente expresan un polipéptido exógeno seleccionado del grupo que consiste de LH, proteasa N y proteasa C. 8. Un método para producir colágeno fibrilar, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar el sistema de planta de la reivindicación 6; (b) cruzar la primera planta y la segunda planta y seleccionar la progenie que expresa la cadena alfa 1 de colágeno, la cadena alfa 2 de colágeno y la P4H para producir de esta manera colágeno fibrilar. 9. Una construcción de ácido nucleico, caracterizada porque comprende un polinucleótido que codifica una P4H humana a una señal de dirección de la vacuola, el polinucleótido que es colocado bajo el control transcripcional de un promotor funcional en las células de planta. 10. La construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque el promotor se selecciona del grupo que consiste del promotor CaMV 35S, el promotor de Ubicuitin, el promotor rbcS y el promotor SVBV. 11. Una planta genéticamente modificada o célula de planta aislada, caracterizada porque es capaz de acumular colágeno que tiene una estabilidad de temperatura a 42 °C. 12. La planta genéticamente modificada o célula de planta aislada de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque el colágeno es colágeno de tipo I. 13. La planta genéticamente modificada o célula de planta aislada de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque el colágeno mamífero es colágeno humano. 14. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende expresar un polipéptido exógeno seleccionado del grupo que consiste de LH, proteasa N y proteasa C. 1-5. El método o planta genéticamente modificada de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el por lo menos un tipo de la cadena de colágeno comprende un péptido de señal para la dirección a la vacuola. 16. El método o planta genéticamente modificada de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la cadena de colágeno comprende una cadena alfa de colágeno. 17. El método, planta genéticamente modificada o sistema de planta de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 6 u 8, caracterizado porque la P4H exógena comprende un péptido de señal para la dirección a la vacuola. 18. El método, planta genéticamente modificada o sistema de planta de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 6 u 8, caracterizado porque la P4H exógena comprende la P4H de mamífero. 19. El método o planta genéticamente modificada de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque por lo menos un tipo de cadena alfa de colágeno comprende la cadena alfa 1. 20. El método o planta genéticamente modificada de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque * por lo menos un tipo de cadena alfa de colágeno comprende la cadena alfa 2. 21. El método o planta genéticamente modificada de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el por lo menos un tipo de cadena de colágeno comprende un propéptido C-terminal y/o N-terminal. 22. El método, planta genéticamente modificada o sistema de planta de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 6 u 8, caracterizado porque la P4H exógena es capaz de hidroxilar específicamente la posición Y de los tripletes Gly-X-Y del por lo menos un tipo de cadena de colágeno. 23. El método, planta genéticamente modificada o sistema de planta de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la P4H de mamífero comprende la P4H humana . 24. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la planta se somete a una condición de estrés . 25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la condición de estrés se selecciona del grupo que consiste de sequía, salinidad, lesión, frío y rocío con compuestos que inducen estrés. 26. La planta genéticamente modificada de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque además comprende un polipéptido exógeno seleccionado del grupo que consiste de LH, proteasa N y proteasa C. 27. El método o sistema de planta de conformidad con las reivindicaciones 3, 4, 6 u 8, caracterizado porque cada una de la cadena alfa 1 de colágeno y la cadena alfa 2 de colágeno comprende un propéptido C-terminal y/o N-terminal .