CN102127159A - 植物光能转化效率相关蛋白及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物光能转化效率相关蛋白及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物光能转化效率相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明提供了培育转基因植物的方法，是将所述蛋白的编码基因导入目的植物中，得到生长能力和/或光能转化效率高于所述目的植物的转基因植物。本发明为研究和获得抗高光强胁迫作物新品种提供了遗传学材料和基础。

Description

植物光能转化效率相关蛋白及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及一种植物光能转化效率相关蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

光合作用是光合生物利用太阳能将无机物转化为有机物的过程。光能的吸收、传递和转化是通过镶嵌在叶绿体类囊体膜上的色素蛋白复合物与电子传递体来完成。其中光系统II(PSII)是光合电子传递链上的第一个色素蛋白复合物，起始电子传递，是决定光合效率的重要部位之一。不仅如此，光系统II是光合放氧生物光能转换的重要场所，它催化水的裂解和氧气的释放，完成光合作用过程中最重要的热动力学反应。光系统II复合体包括20多种蛋白亚基和70多个辅助因子，由叶绿体和核基因共同编码组成，这些蛋白按一定的化学计量合成并组装在一起行使光系统II光能转化放氧的功能。因此，光系统II的结构和执行的功能是十分复杂的，而光系统II各亚基和辅助因子正确组装成完整的光系统II复合物是光系统II行使功能的重要前提。光系统II复合物的组装过程，特别是组装复杂的调控机制，一直是光合作用研究中的难点和热点，但这方面的研究进展仍然很缓慢。揭示这些问题对于揭示光合放氧机理具有重要意义，是实现提高植物光能转化利用效率，农业增产的基础。

光系统II复合物的组装和功能的正常行使需要大量辅助因子和调节蛋白的协助，但是到目前为止，仅发现为数不多参与光系统II组装和功能维持的调控因子。近几年的研究已鉴定了几个由核基因编码参与组装调控的因子，如HCF136、LPA1、LPA2等，它们在光系统II组装的不同阶段中起到稳定、协助的作用。但对于光系统II多步骤复杂的组装过程来说，这些发现还很有限。因此探索不同组装阶段的调控因子，并解析它的调控机制，加以应用来提高或有目的的改变光合效率具有非常现实的意义。

光系统II复合物的组装包括：形成反应中心、核心复合物、光系统II单体、二聚体、超级复合物几个主要阶段。在这个过程中核心天线蛋白CP43合成相对独立。在它组装之前，光系统II反应中心D1、D2和CP47形成了一个瞬时的组装中间体，CP43整合后形成光系统II核心复合物，进行后续组装过程，最终形成有功能的光系统II超级复合物。研究表明在缺失CP43的条件下，D1、D2和CP47仅仅可以积累到野生型的12-16％，由它们形成的组装中间体也非常不稳定；如果合成的CP43不能正常的组装进入核心复合物，则组装过程阻滞，不能有效形成有功能的光系统II复合物，导致植株光合效率下降，生长缓慢。因此CP43的正确合成和组装对光系统II复合体形成十分重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物光能转化效率相关蛋白及其编码基因和应用。

本发明提供的蛋白质，来自鼠耳芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物光能转化效率相关的由序列1衍生的蛋白质。

序列表中的序列1由358个氨基酸残基组成。

为了使(a)中的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tagII	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述蛋白的基因也属于本发明的保护范围。

所述基因可为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)序列表中序列3所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码植物光能转化效率相关蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码植物光能转化效率相关蛋白的DNA分子。

所示基因的CDS序列(1077bp)如序列表的序列2所示。

含有以上任一所述基因的重组载体也属于本发明的保护范围，如重组表达载体。可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquit in)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组载体可为将所述基因插入pBI121质粒得到的重组质粒，具体可为将序列2所示的DNA插入pBI121的BamHI和SmaI位点间得到的重组质粒。

含有以上任一所述基因的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

扩增所述基因全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法，是将所述基因导入目的植物中，得到光能转化效率和/或生长能力高于所述目的植物的转基因植物。

所述生长能力具体可为营养生长能力。

所述生长能力具体来说，可通过叶面积体现。

所述基因可通过所述重组表达载体导入所述目的植物中。

所述目的植物可为拟南芥，如光合功能缺陷突变体lpa3。

所述蛋白、所示基因、所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均可应用于调控植物光能转化效率。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获得耐逆性增强的转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、百脉根、拟南芥、水稻(如Kitaake水稻)、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

本发明涉及一种来源于拟南芥的新基因及其功能鉴定和应用，重点涉及该基因在调控植物光能利用效率方面的应用，同时涉及该基因在植物抗高光强胁迫方面的应用，以及培育该基因转基因植株方面的应用。本发明从拟南芥中发现了一个与植物光能利用效率相关的新基因LPA3，该基因编码一个定位于叶绿体的可溶性膜结合蛋白，LPA3基因的缺失突变体表现出生长迟缓，叶色黄绿，光合利用效率明显降低。本发明通过对LPA3基因的分离和基因功能的鉴定分析，确立了LPA3在植物光能利用转化过程中的调控作用，在实际生产中可利用该基因提高光能利用转化效率，为培育抗高光强胁迫的转基因作物新品种奠定了理论和实践基础。本发明从拟南芥中克隆LPA3基因并得到基因过表达植株，并确认其在水稻中具有氨基酸高度同源的基因，为研究和获得抗高光强胁迫作物新品种提供了遗传学材料和基础。

附图说明

图1为GFP融合蛋白检测。

图2为LPA3特异性抗体免疫印迹。

图3为野生型植株、突变体lpa3和LPA3基因过表达植株表型。

图4为野生型、突变体lpa3和LPA3超表达植株的生长量关系图；纵坐标：叶面积(平方厘米)；横坐标：植株(120μmol m^-2s^-1)光强条件下生长时间(天数)；WT：野生型；C-lpa3：LPA3基因过表达植株；lpa3：突变体lpa3。

图5为突变体lpa3和野生型及LPA3超表达植株叶绿素荧光诱导动力学测定；Fo：初始荧光值，Fm：最大荧光值，Fv＝Fm-Fo，Fv/Fm：最大光化学效率；SLP：单饱和脉冲光，ALon：开启激发光，ALoff：关闭激发光。

图6为在不同植株类囊体蛋白中LPA3的表达量；WT：野生型；C-lpa3：LPA3基因过表达植株；lpa3：突变体lpa3。

图7为lpa3突变体叶绿体类囊体膜蛋白复合物分析；条带I，PSII超级复合物区间；条带II为PSII二聚体；条带III为PSII的单体；条带IV为CP43缺失的PSII；条带V为LHCII的单体形式；条带VI为游离蛋白.

图8为LPA3蛋白含量随光强变化的分析；LL：低光强生长条件(20μmol m^-2s^-1)；GL：正常生长光强条件(120μmol m^-2s^-1)；HL：高光强生长条件(1000μmol m^-2s^-1)；Thy：类囊体膜蛋白；Str：叶绿体基质蛋白。

图9为LPA3超表达植株制备过程中的PCR鉴定结果；1：marker；2：LPA3超表达植株；3：突变体lpa3。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

拟南芥光合功能缺陷突变体lpa3：2003年3月购自Nottingham ArabidopsisStock Centre(NASC)；产品号CS31100；原始来源不清。

哥伦比亚生态型拟南芥(Col-0；野生型)：2003年3月购买，种子购自Nottingham Arabidopsis Stock Centre(NASC)，原始来源不清。

农杆菌C58C1：中国科学院植物研究所；Jose′-Antonio Daros and RicardoFlores*(2004)Arabidopsis thaliana has the enzymatic machinery forreplicating representative viroid species of the family Pospiviroidae.PNASVol.101No.17；6792-6797。

实施例1、LPA3基因的发现

1、突变体筛选、表型和遗传学分析

通过测定拟南芥光合功能缺陷突变体lpa3不同生长时期叶面积发现，lpa3生长速率仅为野生型的12％左右，叶色发黄，色素含量显著降低。利用PAM2000进行叶绿素荧光动力学分析表明，Fv/Fm值降至0.42，光系统II最大光化学效率约为野生型的一半。通过T-DNA元件中携带的Bar基因进行PCR扩增验证，确认lpa3中确实有T-DNA插入并筛选到纯合体。

2、LPA3基因的克隆

采用图位克隆的方法将突变位点定位至一个新的基因中。通过RT-PCR及测序分析得到一个新基因。该新基因编码序列表的序列1所示的蛋白质，将序列1所示的蛋白质命名为LPA3(由358个氨基酸残基组成)。将LPA3的编码基因命名为LPA3(CDS长度为1077bp，为序列表的序列2所示的DNA)。在lpa3中，LPA3基因第六个内含子的第一个碱基由G突变为C，导致LPA3基因正常转录本的缺失。

3、LPA3的定位分析

氨基酸序列分析表明LPA3具有58个氨基酸残基组成的叶绿体前导肽，通过GFP融合蛋白细胞定位方法确定LPA3蛋白定位于叶绿体。

4、LPA3基因的序列比对

序列比对显示LPA3在拟南芥基因组中是单拷贝基因。在基因数据库中搜索和蛋白序列比对分析发现，它和水稻中的一个功能未知蛋白XP 1415581有很高的同源性(67％相同氨基酸，80％相似性质)，水稻中的同源蛋白也具有叶绿体前导肽，预示它们可能具有相似的功能。

实施例2、LPA2的组织定位

一、GFP融合蛋白检测

1、载体的构建

PCR方法扩增GFP基因(来源NCBI GeneID：7011691，质粒：pCmGFP)(引物：5’-GCCTCTAGAATGAGTAAAGGAGAAGAAC-3’和5’-AAGCTTCTCGAGTTGTATAGTTCATCC-3’)。XbaI和HindIII双酶切PCR产物及载体pPUC18(Taraka公司；货号D3218)。经连接、转化、鉴定出pPUC18-GFP中间载体。

2、扩增包含LPA3前导肽的序列CLPA3(编码LPA3蛋白N-端区域的DNA序列；编码自氨基末端第1-150位氨基酸残基)，以CLPA3为模板(引物：5’-ATAGGATCCATGGCTATGGCGATTGC-3’和5’-TCCTCTAGAAATCATTATGCCATC-3’)进行PCR扩增，BamHI和XbaI双酶切PCR产物及pPUC18-GFP载体，经连接、转化、鉴定出pPUC18-CLPA3-GFP。

3、用BamHI、XhoI酶切pPUC18-CLPA3-GFP及pBI121双元载体，经连接、转化、鉴定出pBI121-CLPA3-GFP。

4、载体导入农杆菌

制备农杆菌感受态细胞C58C1，在感受态细胞中加入重组质粒，轻轻混匀，冰浴30min，液氮速冻1min，迅速移至37℃融化，加入1ml LB液体培养基，28℃轻摇培养4h。6000r/min离心2min。弃去上清液，重悬菌体后涂布于含40mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上，28℃倒置培养2d。挑取单菌落，接种到液体LB培养基中，28℃，230r/min培养48h，菌液用于保存或侵染。

5、用花浸染法(Clough and Bent，1998)把重组农杆菌导入野生型拟南芥，收获的种子在含有50μg/ml卡那霉素的MS培养基上筛选出可以生长的阳性苗。

6、用激光扫描共聚焦显微镜(LSM510META，Zeiss)观察转基因植株叶肉细胞中GFP的表达，观察时物镜放大倍数为40倍，激发光波长为488nm，带通BP 505-530nm，长通LP 560nm。

结果见图1。LPA3蛋白定位于叶绿体。

二、特异性抗体免疫印迹

1、抗原和抗体的制备

选取LPA3蛋白抗原性高、亲水区氨基酸残基作为抗原(利用原核表达方法制备抗原，免疫兔子产生LPA3的特异性抗血清(抗体)。

1)选取LPA3蛋白抗原性高、C末端亲水区(自碳端第220-340位氨基酸氨基)作为抗原。以序列2所示DNA为模板进行PCR(5’-CCGGCTAGCCTGTTCAATCTTGAGC-3’和5’-TATAAGCTTCGACTTGTATCCC-3’)，将回收的PCR产物用NheI和HindIII酶切，然后连接整合到pET28a(Novagen公司；货号69864-3)上。

2)选阳性克隆测序，经确定没有发生碱基错配的融合载体转化到BL21大肠杆菌中进行抗原表达。使用0.4mM的IPTG在37℃诱导表达3h后，可诱导表达大量的目的蛋白。

3)4℃、5000g离心15min收集细胞。将细菌悬浮在500mM NaCl，20mM NaH₂PO₄，pH 8.0中，置于冰中30min后使用超声波破碎处理。超强表达的融合蛋白经3000g离心30min沉淀下来后，溶解于500mM NaCl，8M urea，20mM NaH₂PO₄，pH8.0的溶液中。

4)在变性条件下采用Ni-NTA agarose亲和层析纯化重组融合蛋白，分子量约为19kDa。将纯化好的的抗原经透析等过程后免疫兔子。取免疫40天的血清，稀释1000倍用表达的抗原进行蛋白免疫印记检测，当上样量成一系列的梯度时，用抗体检测后的信号可以成一线性梯度，说明抗体可以检测抗原的相对含量，抗体可用。

2、LPA3抗体免疫印迹

分别提取野生型拟南芥的总蛋白、叶绿体蛋白、叶绿体基质蛋白、叶绿体类囊体蛋白，用步骤1的抗体进行免疫印记分析，结果见图2。结果表明，野生型拟南芥的总蛋白、叶绿体蛋白、叶绿体基质蛋白、叶绿体类囊体蛋白中，均具有LPA3蛋白。LPA3可能是通过与类囊体膜结合来行使功能的蛋白。

实施例3、超表达植株的获得和鉴定

一、LPA3超表达植株的获得

1、LPA3基因的克隆

以野生型拟南芥的cDNA为模板，用特异性引物对进行PCR扩增，将回收PCR扩增产物与pGEM-T载体(Promega公司产品pGEM-T easy Vector system)连接，转化大肠杆菌DH5α(北京天为时代公司)感受态，挑选阳性克隆测序，结果表明PCR扩增产物具有序列表的序列2所示的LPA3基因的全长cDNA。

特异性引物对：

上游引物::5’-AGGATCCATGGCTATGGCGATTGCGATG-3’；

下游引物：5’-CCCGGGTCAGTTACGCCAATTAGATGATG-3’。

2、重组表达载体的构建

用BamHI和SmaI双酶切pBI121(Takara)，回收骨架载体；用BamHI和SmaI双酶切步骤1的PCR产物，回收酶切产物；将酶切产物与骨架载体连接，经过测序验证，得到重组表达载体(在pBI121的35S启动子下游的BamHI和SmaI酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的LPA3基因的全长cDNA)

3、LPA3超表达植株的获得

将步骤2制备的重组表达载体转化农杆菌C58C1，用花浸染法(floral dipmethod)把重组农杆菌导入到光合功能缺陷突变体lpa3中，收获的种子在含有50μg/ml卡那霉素的MS培养基上筛选出可以生长的阳性苗。

设计针对LPA3基因cDNA和pBI121左臂的引物对(5’-TATTGGCTCTCTAGATGATATACC-3’；5’-TCATGCATTACATGTTAATTATTAC-3’)，对阳性苗进行PCR鉴定，在转化植株中可以看到784bp的条带，在未转化成功的植株中没有相应的目的条带。PCR鉴定结果见图9。结果表明，得到的阳性苗中，确实将目的基因导入了突变体植株，补偿了突变体植株中因为单核苷酸突变引起的不表达。将PCR鉴定阳性的植株命名为LPA3超表达植株。

用pBI121代替重组表达载体，转化农杆菌C58C1，制备转空载体植株，方法同超表达植株的获得。

二、通过不同植株的生理生化比较验证LPA2的功能

1、不同植株的形态分析

比较野生型拟南芥、转空载体植株、光合功能缺陷突变体lpa3和LPA3超表达植株生长40天的形态，如图3所示。LPA3超表达植株的生长量不仅高于光合功能缺陷突变体lpa3，甚至较野生型拟南芥有所提高。转空载体植株与野生型植株的生长量相当。

2、不同植株的生长量分析

用LI-3000A叶面积仪分别测定野生型拟南芥、转空载体植株、光合功能缺陷突变体lpa3和LPA3超表达植株各时期的生长量(每个植株采用10个样本，取三次实验的平均值)，结果见图4。转空载体植株与野生型植株的生长量相当。

3、不同植株的叶绿素荧光动力学曲线

比较野生型拟南芥、转空载体植株、光合功能缺陷突变体lpa3和LPA3超表达植株的叶绿素荧光动力学曲线(每个植株采用10个样本)。取生长4周的野生型拟南芥、光合功能缺陷突变体lpa3和LPA3超表达植株叶片，用PAM(pulseamplitude modulated fluorometer)2000叶绿素荧光测定仪测定光系统II最大光合效率Fv/Fm，慢诱导曲线等参数。

(1)测量前，使植株暗适应至少30min。

(2)打开测量光(measuring light，650nm的脉冲测量红光，脉冲频率为1.6kHz，光强0.8μmolm_-2s_-1)，得最小荧光值Fo；

(3)激发一次单饱和脉冲白光(3000μmol m_-2s_-1，持续800ms，)，确定最大荧光值Fm。PSII的最大光化学效率[Fv/Fm＝(Fm-Fo)/Fm]。

(4)5分钟后，曲线基本稳定，打开活化光(actinic light，光强为120μmolm-2s-1)。7.5分钟时光合作用已达到稳定状态，曲线基本可以稳定，在激活光存在条件下再次打开单饱和白光，脉冲一次，得最大荧光值Fm’。

(5)等曲线回落下来并达到稳定，关闭激活光，再关闭测量光。

野生型、突变体及LPA3超表达植株相应结果图谱见图5。通过荧光动力曲线可以直接得出超表达植株的光能转化利用效率高于突变体植株的结论。转空载体植株不能恢复正常的荧光动力学曲线，最大光化学效率Fv/Fm＝0.45。

步骤1、步骤2和步骤3的结果表明：光合功能缺陷突变体lpa3是由于LPA3的敲除而产生了突变表型；LPA3超表达植株能够恢复并提高植物的光合效率；LPA3超表达植株的生产量大大提高。

4、不同植株中LPA3基因的表达量

(1)抗原和抗体的制备

同实施例2的步骤二的1。

(2)在不同植株类囊体蛋白中LPA3的表达差异

用步骤1的抗体对野生型拟南芥和光合功能缺陷突变体lpa3的类囊体膜进行免疫印记分析。用步骤1的抗体对野生型拟南芥、光合功能缺陷突变体lpa3和LPA3超表达植株的全蛋白进行免疫印记分析。

发现在野生型拟南芥的全蛋白和类囊体膜组分中可以得到约38kDa大小的条带信号，LPA3超表达植株中LPA3累积量增加，而光合功能缺陷突变体lpa3的类囊体膜和全蛋白中均没有相应信号(图6)。说明T-DNA的插入导致LPA3基因完全失活，导致LPA3蛋白不能表达累积，用超表达载体导入LPA3基因可表达出正常的功能蛋白并且累计量有所增加。

实施例4、LPA3蛋白功能的分析

1、类囊体膜的提取

取拟南芥叶片0.5g加入2ml预冷的类囊体膜提取液(400mM sucrose，10mM NaCl，50mM Hepes-KOH，pH7.8，2mM MgCl₂)，4℃研磨，三层滤纸过滤后，5000g两次离心10min，沉淀用500μl提取液悬浮。提取的类囊体膜立即用液氮速冻并储存在-80℃冰柜里，或当时使用。

2、色素定量

叶片用80％丙酮进行抽提，4000rpm离心。测定OD663.2和OD646.8的值，色素含量按照Porra等(1989)方法计算，

[Chl a]＝12.21×OD663-2.81×OD646；

[Chl b]＝20.13×OD646-5.03×OD663；

[Chla+b]＝7.18×OD663+17.32×OD646；

计算叶绿素含量，单位μg/g FW。

3、蓝绿温和胶电泳

提取并经过色素定量的类囊体膜用50mM BisTris-HCl，pH 7.0缓冲液悬浮洗涤，定容为1.0mg Chl/mL，取等量上述缓冲液加2％(w/v)DM，在室温孵育30分钟增容处理类囊体膜，经12,000g，10min除去沉淀.将制备好的类囊体膜蛋白溶液用5％Serva blue G染色，取10μgChl上样到1mm厚、胶浓度为6-12％聚丙烯酰胺凝胶中。电极缓冲液为含50mmol/L Tricine，15mmol/L BisTris，pH7.0的阴极缓冲液和含50mmol/L BisTris-HCl，pH7.0的阳极缓冲液。电泳在连接着4℃循环的SE-260型Hoefer Mighty Small垂直电泳设备上进行。

对于第二向电泳，将经蓝绿温和胶分离的类囊体膜复合物胶条切下用SDS上样缓冲液(8mol/L urea，5％SDS，20％Glycerol，5％β-巯基乙醇，50mmol/L Tris-HCl，pH6.8)室温下处理30min，然后在1mm厚15％的SDS-urea-PAGE胶上进行第二向分离。电泳结束后，用考马斯亮蓝染色。

结果见图7。突变体与野生型类囊体膜上的复合物可以分离出五个条带区间：条带I，PSII超级复合物区间；条带II为PSII二聚体；条带III为PSII的单体；条带IV为CP43缺失的PSII；条带V为LHCII的单体形式；条带VI为游离蛋白。从图上可以看出，在每单位的色素蛋白中，与野生型相比，突变体lpa3的PSII含量明显降低(条带区间I、II和III)。进而放射性同位素标记实验结果表明在lpa3突变体内CP43蛋白的合成量仅为野生型的10％，进一步研究表明新合成的CP43蛋白组装效率降低，而其他核心蛋白D1，D2和CP47合成正常，但相对于野生型周转速率加快。说明LPA3对光系统II的正常组装起着重要的作用，LPA3的缺失导致CP43不能有效组装进入光系统II，从而引起其他核心蛋白周转加快，光系统II核心蛋白累积量降低，不能有效组装成有功能的光系统II复合物，最终导致植株光合效率降低，生长缓慢，生长量显著下降。

实施例5、LPA3调控植物光能利用效率的机理分析

将正常生长光强(120μmol m^-2s^-1)下野生型拟南芥生长4-5周的植株分别在20、120、1000μmol m^-2s^-1光强下光照处理2小时，按实施例4中的方法提取类囊体膜和叶绿体基质蛋白，按实施例2中免疫印迹方法检测蛋白含量。

结果见图8。随着光强增加，以单体形式存在于叶绿体基质的LPA3逐渐减少，与之伴随LPA3以二聚体的形式在类囊体膜上含量增加。通过氨基酸序列分析发现LPA3含有种间高度保守的半胱氨酸残基，表明LPA3很可能以分子间二硫键形式形成二聚体，与叶绿体类囊体膜结合，参与光系统II核心天线蛋白CP43的组装。随着光强增加，LPA3在类囊体膜上结合量增加，促进CP43的组装以适应对光能利用效率增加的需要，反之LPA3以单体游离于基质中，降低组装效率节省系统损耗。说明LPA3通过自身的氧化还原调节参与光系统II组装，从而调控植物的光能利用效率。

序列表

<110>中国科学院植物研究所

<120>植物光能转化效率相关蛋白及其编码基因和应用

<130>CGGNARY102032

<160>3

<210>1

<211>358

<212>PRT

<213>鼠耳芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>1

Met Ala Met Ala Ile Ala Met Leu Pro Ala Leu Phe Ser Ser Pro Ser

1               5                   10                  15

Ile Leu Thr Ser Arg Ile Arg Cys Gly Ala Thr Ala Asn Ser Gly Gly

            20                  25                  30

Ala Ile Ser Ser Thr Ser Ser Asn Ser Asp Pro Arg Arg Gly Val Pro

        35                  40                  45

Leu Tyr Lys Pro Lys Ser Tyr Glu Val Leu Ala Thr Asp Ala Ala Asn

    50                  55                  60

Ser Leu Ala Phe Ala Leu Gln Asp Ser Lys Ser Arg Leu Glu Ile Asp

65                  70                  75                  80

Phe Pro Pro Leu Pro Ser Ser Ile Ser Ser Tyr Lys Gly Ser Ser Asp

                85                  90                  95

Asp Phe Ile Asp Ala Asn Ile Gln Leu Ala Val Thr Val Val Arg Lys

            100                 105                 110

Leu Gln Glu Lys Ile Glu Thr Arg Ala Cys Ile Val Phe Pro Asp Lys

        115                 120                 125

Pro Glu Lys Arg Arg Ala Ser Gln Arg Phe Lys Ala Ala Phe Asp Ser

    130                 135                 140

Val Asp Gly Ile Ser Ile Gly Ser Leu Asp Asp Ile Pro Gly Thr Ser

145                 150                 155                 160

Val Thr Asn Phe Phe Arg Ser Ile Arg Ser Thr Leu Asp Phe Asp Phe

                165                 170                 175

Glu Asp Glu Asn Glu Gly Thr Trp Glu Pro Lys Glu Pro Pro Thr Leu

            180                 185                 190

Tyr Ile Phe Ile Asn Cys Ser Thr Arg Glu Leu Ser Phe Ile Glu Lys

        195                 200                 205

Phe Val Glu Thr Phe Ala Ser Ser Thr Pro Ala Leu Leu Phe Asn Leu

    210                 215                 220

Glu Leu Asp Thr Leu Arg Ala Asp Leu Gly Leu Leu Gly Phe Pro Pro

225                 230                 235                 240

Lys Asp Leu His Tyr Arg Phe Leu Ser Gln Phe Ile Pro Val Phe Tyr

                245                 250                 255

Ile Arg Thr Arg Glu Tyr Ser Lys Thr Val Ala Val Ala Pro Phe Val

            260                 265                 270

Leu Asn Tyr Asn Gly Ala Leu Phe Arg Gln Tyr Pro Gly Pro Trp Gln

        275                 280                 285

Val Met Leu Lys Gln Thr Asp Gly Ser Phe Ala Cys Val Ala Glu Ser

    290                 295                 300

Pro Thr Arg Phe Thr Leu Gly Glu Thr Lys Glu Glu Leu Leu Gln Val

305                 310                 315                 320

Leu Gly Leu Gln Glu Glu Lys Gly Ser Ser Leu Glu Phe Leu Arg Arg

                325                 330                 335

Gly Tyr Lys Ser Ala Thr Trp Trp Glu Glu Asp Val Glu Leu Glu Ala

            340                 345                 350

Ser Ser Asn Trp Arg Asn

        355

<210>2

<211>1077

<212>DNA

<213>鼠耳芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>2

atggctatgg cgattgcgat gttaccggcg ctcttctctt ctccttcgat tctaaccagc    60

agaatcagat gcggagccac cgcaaacagc ggcggcgcaa tctcatctac ttcttctaat    120

tccgatccta ggagaggtgt tcccttgtat aagcccaaat catacgaggt tctagccact    180

gacgccgcca attctctagc tttcgctctc caggattcaa aatctcgttt ggaaatcgat    240

tttccacctt tacccagtag catttcttct tacaagggtt cttcagacga ctttattgat    300

gctaatatac aactggccgt gactgttgtt cgcaaacttc aggagaaaat cgagaccaga    360

gcatgcattg tttttcctga caagcctgag aagcgcaggg cttcgcaacg cttcaaagcg    420

gcatttgatt cggttgatgg cataagtatt ggctctctag atgatatacc tggtacttct    480

gtcaccaatt tctttaggtc cataaggagt accctggact ttgattttga agatgaaaac    540

gaaggaactt gggagcccaa ggagccaccg accctttata tatttatcaa ttgcagcact    600

cgggaactct ctttcataga gaagtttgtg gaaacctttg ccagttcaac cccagctctt    660

ctgttcaatc ttgagctaga tactttgcgt gctgacctag ggcttcttgg ctttccccct    720

aaagatctgc actaccggtt tctttctcaa tttattcccg tcttttatat ccgaaccaga    780

gagtattcaa agacagtggc agtggcacca tttgtgttga actacaacgg agcacttttt    840

cgacaatatc ctgggccatg gcaggtgatg cttaagcaaa ctgatggttc atttgcgtgt    900

gttgcagaaa gccctactcg tttcacgctg ggtgaaacga aggaagagct gttacaggtt    960

ctgggactac aagaagagaa aggaagctca ctcgagttcc tgcgcagggg atacaagtcg    1020

gcaacttggt gggaagagga tgtggagctc gaggcatcat ctaattggcg taactga       1077

<210>3

<211>1324

<212>DNA

<213>鼠耳芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>3

agactgtagc cagtgttatc actaccgtct aaacacagag agagagagag agcaaaaatg    60

gctatggcga ttgcgatgtt accggcgctc ttctcttctc cttcgattct aaccagcaga    120

atcagatgcg gagccaccgc aaacagcggc ggcgcaatct catctacttc ttctaattcc    180

gatcctagga gaggtgttcc cttgtataag cccaaatcat acgaggttct agccactgac    240

gccgccaatt ctctagcttt cgctctccag gattcaaaat ctcgtttgga aatcgatttt    300

ccacctttac ccagtagcat ttcttcttac aagggttctt cagacgactt tattgatgct    360

aatatacaac tggccgtgac tgttgttcgc aaacttcagg agaaaatcga gaccagagca    420

tgcattgttt ttcctgacaa gcctgagaag cgcagggctt cgcaacgctt caaagcggca    480

tttgattcgg ttgatggcat aagtattggc tctctagatg atatacctgg tacttctgtc    540

accaatttct ttaggtccat aaggagtacc ctggactttg attttgaaga tgaaaacgaa    600

ggaacttggg agcccaagga gccaccgacc ctttatatat ttatcaattg cagcactcgg    660

gaactctctt tcatagagaa gtttgtggaa acctttgcca gttcaacccc agctcttctg    720

ttcaatcttg agctagatac tttgcgtgct gacctagggc ttcttggctt tccccctaaa    780

gatctgcact accggtttct ttctcaattt attcccgtct tttatatccg aaccagagag    840

tattcaaaga cagtggcagt ggcaccattt gtgttgaact acaacggagc actttttcga    900

caatatcctg ggccatggca ggtgatgctt aagcaaactg atggttcatt tgcgtgtgtt    960

gcagaaagcc ctactcgttt cacgctgggt gaaacgaagg aagagctgtt acaggttctg    1020

ggactacaag aagagaaagg aagctcactc gagttcctgc gcaggggata caagtcggca    1080

acttggtggg aagaggatgt ggagctcgag gcatcatcta attggcgtaa ctgaacgatg    1140

gccaagtcat ggattcacac ttttggtaag tttgttaagt ctctcaagat tgagatattt    1200

acacttgtat atgtgcaaag ttggtagaga gagtttggga gatgttaatg ggaatgatta    1260

aggatagttt caatatgttt tctatatata actcagtcca attatgatag tgtctgctcc    1320

accc    1324

Claims (10)

1.一种蛋白质，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物光能转化效率相关的由序列1衍生的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)序列表中序列3所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码植物光能转化效率相关蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码植物光能转化效率相关蛋白的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为将权利要求2或3所述基因插入pBI121质粒得到的重组质粒。

6.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的植物中，得到光能转化效率和/或生长能力高于所述目的植物的转基因植物。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述生长能力为营养生长能力。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述生长能力由叶面积体现。

9.如权利要求6至8中任一所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述基因通过权利要求4或5所述重组表达载体导入所述目的植物中；所述目的植物为拟南芥，优选光合功能缺陷突变体1pa3。

10.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述基因、权利要求4或5所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的任意一种在调控植物光能转化效率中的应用。

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